(57)【要約】【課題】真空駆動式微細流体装置の液滴形成速度を、より正確で、使用しやすく、接近可能な方式で調節する方法を導入することである。より具体的に、特定の粘度比、密度比、界面張力および水/オイル溶液と表面処理された疎水性ガラス/PDMSとの間の接触角において、真空駆動式微細流体装置の高度に単分散された液滴の形成速度を調節する方法を提供する。【解決手段】実験の必要性に最も適合した特定の液滴形成速度をターゲットとして、真空システムを利用した長方形マイクロチャネルを有する微細流体集束装置を最適化する方法であって、１)分散相注入口と誘導管で構成された分散相チャネルの末端に、連続相注入口と誘導管で構成された２つの連続相チャネルがそれぞれ垂直に連結され、分散相チャネルおよび２つの連続相チャネルの連結部位で生成された液滴が収集チャネルに排出される構造を含む、長方形マイクロチャネルを有する微細流体集束装置を提供する段階；２)所望する速度の液滴が生成されるように、分散相チャネルおよび２つの連続相チャネルの連結部位を基準に、分散相チャネルおよび連続相チャネルの高さと分散相チャネルの幅を決定する段階；３)前記分散相チャネルに水溶液を注入し、前記連続相チャネルにオイルを注入する段階；および４)真空圧力を加える段階；を含む。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実験の必要性に最も適合した特定の液滴形成速度をターゲットとして、真空システムを利用した長方形マイクロチャネルを有する微細流体集束装置を最適化する方法であって、
１)分散相注入口と誘導管で構成された分散相チャネルの末端に、連続相注入口と誘導管で構成された２つの連続相チャネルがそれぞれ垂直に連結され、分散相チャネルおよび２つの連続相チャネルの連結部位で生成された液滴が収集チャネルに排出される構造を含む、長方形マイクロチャネルを有する微細流体集束装置を提供する段階；
２)所望する速度の液滴が生成されるように、分散相チャネルおよび２つの連続相チャネルの連結部位を基準に、分散相チャネルおよび連続相チャネルの高さと分散相チャネルの幅を決定する段階；
３)前記分散相チャネルに水溶液を注入し、前記連続相チャネルにオイルを注入する段階；および
４)真空圧力を加える段階；
を含む、方法。
【請求項２】
連続および分散相チャネルの高さが15μｍ〜30μｍである、請求項１に記載の微細流体集束装置を最適化する方法。
【請求項３】
分散相チャネルの幅が15μｍ〜30μｍである、請求項１に記載の微細流体集束装置を最適化する方法。
【請求項４】
連続および分散相チャネルの高さが20μｍまたは25μｍである、請求項１に記載の微細流体集束装置を最適化する方法。
【請求項５】
連続および分散相チャネルの高さが25μｍであり、分散相チャネルの幅がそれぞれ、15、20、25または30μｍである、請求項１に記載の微細流体集束装置を最適化する方法。
【請求項６】
分散相チャネルおよび連続相チャネルの高さが25μｍであり、分散相チャネルの幅がそれぞれ、15、20、25または30μｍである、請求項１に記載の微細流体集束装置を最適化する方法。
【請求項７】
連続および分散相チャネルの高さが20μｍであり、分散相チャネルの幅が25μｍである、請求項１に記載の微細流体集束装置を最適化する方法。
【請求項８】
前記の段階４)は、流動状態(flow regime)が連続的なコ-フロー状態に変わるまで、真空圧力を加えることである、請求項１に記載の微細流体集束装置を最適化する方法。
【請求項９】
真空圧力が-0.5バー(bar)である、請求項６に記載の微細流体集束装置を最適化する方法。
【請求項１０】
真空圧力が-0.19バー(bar)である、請求項７に記載の微細流体集束装置を最適化する方法。
【請求項１１】
請求項１〜10のいずれか一項による方法を遂行する、液滴生成装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドリッピング(dripping)/ジェッティング(jetting)からコ-フロー(co-flow)転移点に変更させることにより、長方形マイクロチャネルを有する微細流体集束装置(microfluidic flow-focusing device)において、液滴形成速度(droplet formation rates)の生成を最適化する方法に関する。より具体的に、本発明は、微細流体使用者がオイル-水接合部(oil-to-water junction)において連続および分散相のチャネル寸法を変化させることで、より正確にエンジニアリングされた液滴形成速度をターゲットとする方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
エマルジョンは、液体の液滴が他の液体に懸濁され、２つの液体が他の液体内で溶解されない２相システムを指す。エマルジョンの一般的な例としては、水-連続溶液(a water-continuous solution)に分散されたオイル液滴(oil droplets)またはその反対の場合を含む。分散相は、他の溶液において液滴形態で分布された液相を指す。連続相は、液滴が分散されている周辺の流体を指す。
液滴-基盤微細流体工学は、生化学的試薬をカプセル化し、精密に調節された単分散されたエマルジョンにおいて小型化された反応を遂行するためのより大衆的なプラットフォームとなっている。微細流体工学ドロップメイキング(Microfluidic drop-making)技術は、酵素反応速度分析、高効率スクリーニング、ハイドロゲルビーズ形成およびポリマー粒子合成といった多くの生物学的および化学的分析に用いられる。
このように、微細流体工学の使用が、臨床、製薬および生物工学応用のための多くの分野の全般にわたって広く普及するにつれ、真空圧力システムのように、エマルジョンを生成するための、より便利かつ接近可能で、使用者親和的な実験装置が要求される。
【０００３】
熟練していない微細流体使用者の場合、真空システムを具現することは、注射器ポンプのような他の通常的な液滴分散方法と比較して高度に単分散された液滴を製造するための、より便利な実験装置とみなされる。また、真空システムは、手動ガスバルブを用いて作動させることができるため、システム内圧力変化の影響が即刻的である反面、自動化されたソフトウェアで作動する注射器ポンプの場合、流速の変化に時間の遅延が発生する。
【０００４】
多数の異なる微細流体装置の構成が開発されたが、微細流体液滴形成の最も一般的な方法は、同軸(coaxial)、Ｔ-ジャンクション(時には、Ｙ-ジャンクション)および流体集束(flow-focusing)といった幾何学的構造を含む。同軸微細流体装置は、内側分散相と外側連続相を同一の方向に流体力学的に駆動する構造を含む。Ｔ-ジャンクション(T-junction)微細流体装置は、３つのチャネルを用いるが、連続相チャネル交差流の分散相側面チャネルと収束する。流体集束微細流体装置は、２つの連続相側面チャネルが中央分散相チャネルと収束する構造を用いて、通過する流体を流体力学的に単一収集チャネルに集中させることができる。
【０００５】
水溶液は、２つ以上の成分からなることができる。水溶液内でカプセル化された試薬の通常的な例としては、多糖類、生物学的細胞、ビーズ、ヘキサン、タンパク質、酵素、抗体、蛍光で標識されたプローブおよび分析のためのその他生化学試薬が含まれるが、これに限定されるものではない。
【０００６】
一部実施例において、水溶液はまた、界面活性剤を含むことができる。界面活性剤は、懸濁された液体液滴および周辺流体の界面張力(interfacial tension)を減少させて、溶液内の分散された液滴の癒着(coalescence)を減少させるのに用いられる物質である。非-イオン性界面活性剤またはリン酸塩緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)が、時に界面活性剤として用いられることもあり得る。界面活性剤は、約１％、３％、５％、10％、15％、20％、約25％v/vまたはその間の任意の値の範囲で水溶液に添加することができる。
【０００７】
本発明において、連続相チャネルには、オイル溶液が挿入される。オイル溶液の一般的な例としては、ミネラルオイルのような工業用オイル、およびグレープシード油、オリーブ油、大豆油、およびキャノーラ油といった食用油を例示することができる。前述した例以外のオイル溶液は、微細流体研究以外の分野において広範囲に用いられる。また、オイルは、炭素、シリコンおよび酸素から選択された原子を含むバックボーン構造を有する少なくとも一つの有機またはオルガノシリコン化合物を含むこともできる。全体的に、オイル溶液は、多様な有機化合物の混合物、オルガノシリコン化合物の混合物、または、これらの任意の組み合わせを含むこともできる。特定の条件および装置の必要に応じて、油溶液は異なる化学構造及び分子量を有する化合物の任意の適切な混合物を含むこともできる。
【０００８】
オイル溶液は下記有機化合物またはこれらの組み合わせのうち任意のものを含むことができる：イソセタン、２-(トリフルオロメチル)-３-エトキシドデカフルオロヘキサン(HFE-7500、3MTM、NovecTM)、ヘプタメチルノナン(HMN)、ビス(２-エチルヘキシル)カーボネート、(トリデカフルオロ-１,１,２,２-テトラヒドロオクチル)テトラメチルジシロキサンまたはシリコーンオイル等。
あらゆる微細流体装置は、各実験の要求を満足させるために、微細に調整されなければならない。したがって、粘度比(viscosity ratio)、流速比(flow rate ratio)、界面張力(interfacial tension)、チャネル幾何学的構造および曲率といった微細流体装置の作動パラメータ(operating parameters)だけでなく、連続および分散相の化学的および物理的特性を慎重に選択して設計しなければならない。言い換えると、微細流体液滴形成を効果的に最適化するために、使用者はドロップメーカー装置に加えられる異なる物理的な力を理解しなければならない。
【０００９】
しかし、微細流体使用者は、各相の流速を正確に管理し、チャネル縦横比(channel aspect ratio)、曲率、界面張力(interfacial tension)、および各流体の動的粘度(dynamic viscosity)の最適値を見つけ出すのに困難を経験し、意図された液滴形成速度のレベルを生成するのに失敗することをしばしば報告している。
また、ソフトリソグラフィ、ラピッドプロトタイピング(rapid prototyping)および微細製作法(microfabrication)の工程において、フォトマスクデザインからマスターシリコンウェハ上にエンコードされたフィーチャー(features encoded)に、意図されなかった変更が加えられることがあり得る。ソフトおよびハードベーキング時間、フォトマスクのUV露出時間と位置、プロピレングリコールメチルエーテルアセテート(PGMEA)溶媒における現像時間といった装置の製作工程に用いられるパラメータは、あらゆるポリジメチルシロキサン(PDMS)チップのデザイン変更に寄与することができる。チャネルがマイクロ-レベルおよび甚だしくはナノ-レベルで構成されるため、マスターのこのような可変性は、液滴形成速度および大きさおよび各相(phase)の流速において顕著な差を誘発することができる。
【００１０】
特許文献１（韓国公開公報KR10-2015-0051487）は、２相(phase)両方の毛細管定数および流速を調節しながら、より狭い分布図および優れた単分散性特性を有する、より微細な液滴を製造する方法を報告している。分散相としてカルボン酸基を含む多糖類が含有された水溶液を使用した。連続相としてカルシウムイオンを含むオイル溶液を使用した。微細流体工学使用者が各相(phase)の流速のような実験に用いられる多様な変数を調整するのに困難であった。
したがって、特に、真空駆動システムのような、より簡単な実験装置において、より正確かつ使用者親和的な方法で、ターゲットとなる速度(すなわち、所望する生産量を最大に達成する速度)の液滴を生成する方法に対する要求が強くなっている。
レイリー-プラトー不安定性(Rayleigh-Plateau instability)によると、流体のジェット流に摂動(perturbation)があるとき、ジェットのより薄い領域においてラプラス(Laplace)圧力が増加する。界面の屈曲により、内部圧力が増加するにつれて、薄い領域がさらに薄くなり、液滴ピンチオフ(droplet pinchoff)を誘発する。ジェット内の液滴破裂(droplet breakage)と関連した流体力学は、ジェット不安定性を促進させる界面張力と、摂動に抵抗する流体の粘性抗力(viscous drag)との間の競争を示す。一般的に、ドリッピング状態において、液滴生成は、円筒形ジェットが破損して落ちる際に表面張力が減少するため、低い単分散性を示す。
【００１１】
２つの無次元数(dimensionless numbers)、キャピラリー数(Capillary number)とウェーバー数(Weber number)を用いて、微細流体装置内部の流体の流れを特性化することができる。キャピラリー数(Ca)は、表面張力の影響に対する流体の粘度を示すのに対し、ウェーバー数(We)は、表面張力の影響に対する流体の慣性力を示す。キャピラリー数およびウェーバー数は、流速、粘度、界面張力、チャネル寸法、真空圧力といった作動パラメータの値を基に変更される。キャピラリー数が１よりも大きいとき、粘性力(viscous forces)が界面張力よりも優勢であり、キャピラリの数が１よりも小さいとき、界面張力は粘性力を凌駕する。“キャピラリー数”(Ca)は、次の方程式で定義される：
【００１２】
【数１】
2020089870.tif 000002
【００１３】
(ここで、μ(ミュー)は流体の動的粘度(dynamic viscosity)であり、Ｑは流速であり、γ(ガンマ)は界面張力(interfacial tension)であり、ｗはチャネルの幅、ｈはチャネルの高さである。)
【００１４】
前述したように、ウェーバー数(We)は、慣性力と表面張力の影響との間の均衡を測定する。ウェーバー数が１よりも大きいとき、慣性力は界面張力よりも優勢であり、ウェーバー数が１より小さければ、界面張力が慣性力を凌駕する。“ウェーバー数”(We)は、次の方程式で定義される：
【００１５】
【数２】
2020089870.tif 000003
【００１６】
(ここで、ρ(ロー)は流体の密度であり、ｖはその速度であり、ｌはその特性長さ(典型的に、液滴の直径)であり、σ(シグマ)は表面張力である。)
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】韓国特許出願公開第10-2015-0051487号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、真空駆動式微細流体装置の液滴形成速度を、より正確で、使用しやすく、接近可能な方式で調節する方法を導入することである。より具体的に、本発明は、特定の粘度比、密度比、界面張力および水/オイル溶液と表面処理された疎水性ガラス/PDMSとの間の接触角において、真空駆動式微細流体装置の高度に単分散された液滴の形成速度を調節する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
これと関連して、本発明者は、長方形マイクロチャネルを有する真空駆動微細流体集束装置を用いて液滴を生成する方法において、チャネルの寸法と前記液滴の形成速度との相関関係を具体的に調査した。実験の結果、連続および分散相チャネルの高さと中心分散相チャネルの幅を調節することにより、液滴がターゲットとなる速度(すなわち、所望する生産量を最大に達成する速度)に調節され、生成することができることを示すことから、本発明を完成するに至った。
本発明において導入された最適化する方法を用いることにより、微細流体使用者がより精密にエンジニアリングされた液滴速度/大きさ、ならびに連続および分散相の流速をターゲットとするために、それらの装置を適応化させ、微細調整するものと期待される。
【００２０】
本発明は、実験の必要性に最も適合した特定の液滴形成速度をターゲットとして、真空システムを利用した長方形マイクロチャネルを有する微細流体集束装置を最適化する方法であって、
１)分散相注入口と誘導管で構成された分散相チャネルの末端に、連続相注入口と誘導管で構成された２つの連続相チャネルがそれぞれ垂直に連結され、分散相チャネルおよび２つの連続相チャネルの連結部位で生成された液滴が収集チャネルに排出される構造を含む、長方形マイクロチャネルを有する微細流体集束装置を提供する段階；
２)所望する速度の液滴が生成されるように、分散相チャネルおよび２つの連続相チャネルの連結部位を基準に、分散相チャネルおよび連続相チャネルの高さと分散相チャネルの幅を決定する段階；
３)前記分散相チャネルに水溶液を注入し、前記連続相チャネルにオイルを注入する段階；および
４)真空圧力を加える段階；
を含む、方法を提供する。
【００２１】
本発明の方法は、連続および分散相チャネルの高さおよび幅、特に、オイル-水接合部において分散相チャネルおよび連続相チャネルの高さを調整する。より具体的に、この方法は、真空システムを利用した長方形マイクロチャネルを有する微細流体集束装置において液滴を生成することに関連したものであって、ターゲットとなる速度(すなわち、所望する生産量を最大に達成する速度)の液滴を、より使用者親和的であり、使用しやすく、接近可能な方法で生成させる効果を有する。本発明は、流体の流体力学的原理に慣れていない微細流体使用者がより精密に調節された液滴速度/大きさ、ならびに連続および分散相の流速を効果的に生成することができるようにする。
本質的に、本発明の最適化された方法により、真空駆動システムのような単純化された実験装置を使用する際に、ターゲットとなる速度(すなわち、所望する生産量を最大に達成する速度)の液滴を生成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】aは、本発明に用いられる微細流体ドロップメーカーデザインの概略図を示す。bおよびcは、中央分散相チャネル(“水”と表示)と２つの連続相側面チャネル(“オイル”と表示)の境界面の断面図を示す。より具体的に、bは、分散相チャネルの幅が20μｍであり、分散相チャネルおよび連続相チャネルの高さが25μｍである、水およびオイルチャネルの縦横比(aspect ratio)を示す。cは、分散相チャネルの幅が25μｍであり、分散相チャネルおよび連続相チャネルの高さが20μｍである、縦横比を示す。
【図２】本発明を開発するために用られたすべての微細流体集束装置に対するオイル-水接合部の平面図および液滴形成/ピンチオフ点(pinchoff point)を示す。より具体的に、図面は、中央分散相チャネル(“水(タンパク質溶液)”と表示)の末端に、２つの連続相側面チャネル(“オイル(HFE-7500＋２％フルオロ化界面活性剤”と表示)が垂直に連結され、その界面で液滴が生成され(たとえば、“液滴形成”と表示された点線)、形成された液滴は収集チャネルに排出されることを示す。二つの側面オイルチャネルの幅は25μｍであり、中央水チャネルの幅は多様である。収集チャネルの幅は37μｍであり、収集チャネルの高さは水およびオイルチャネルの高さに応じて変わる。
【図３】真空駆動システムにおいて液滴を生成するのに用いられる実験装置の模式図を示す。分散相に挿入された水溶液と連続相に挿入されたオイルは、オイル-水界面(oil-to-water interface)または液滴ピンチオフ(droplet pinchoff)で交わって液滴を形成し、生成された液滴は、収集管を介して、注射器内部に位置した、PCRチューブに収集される。
【図４】オイル-水接合部における液滴形成の１ミリ秒イメージシーケンスを示す。２つのイメージシーケンスにおいて、分散相チャネルおよび連続相チャネルの高さは25μｍであるのに対し、分散相チャネルの幅は異なる(15μｍまたは20μｍ)。２つのシーケンスともに10,000fpsのフレーム速度が使用された。オイル-水接合部において連続および分散相チャネルの高さが25μｍであり、中央分散相チャネルの幅が15μｍであるドロップメーカーにおいては833液滴/秒の液滴形成が発生した。同様に、オイル-水接合部において連続および分散相チャネルの高さが25μｍであり、中央分散相チャネルの幅が20μｍであるドロップメーカーにおいては909液滴/秒の液滴形成が発生した。
【図５】真空圧力が増加するにつれて発生し得る、異なる流動状態(flow regime)を示す。互いに異なる流動状態は、次のように定義される：ドリッピング状態(-0.06bar、ａに該当)、ジェッティング状態(-0.40bar、ｂに該当)、およびコ-フロー状態(-0.60bar、ｃに該当)。
【図６】分散相チャネルおよび連続相チャネルの高さが20μｍであり、分散相チャネルの幅が、それぞれカラーコーディングを通じて差別化された、15μｍ、20μｍ、25μｍ、または30μｍであるドロップメーカーに対して異なる真空圧力で記録されたすべての液滴形成速度のグラフを示す。
【図７】分散相チャネルおよび連続相チャネルの高さが25μｍであり、分散相チャネルの幅が、それぞれカラーコーディングを通じて差別化された、15μｍ、20μｍ、25μｍ、または30μｍであるドロップメーカーに対して異なる真空圧力で記録されたすべての液滴形成速度のグラフを示す。
【図８】オイル-水界面において同一の断面積を有するドロップメーカーの形成速度の比較を示す。より具体的に、グラフは、次のような寸法を有するドロップメーカーを比較する：１)分散相チャネルおよび連続相チャネルの高さが25μｍであり、分散相チャネルの幅が20μｍ、および、２)分散相チャネルおよび連続相チャネルの高さが20μｍであり、分散相チャネルの幅が25μｍ。20μｍの高さの連続および分散相チャネルならびに25μｍの幅の中央分散相チャネルを有するドロップメーカーに対するドリッピング/ジェッティングからコ-フローへの転移平均値は-0.19barである。25μｍの高さの連続および分散相チャネルならびに20μｍの幅の中央分散相チャネルを有するドロップメーカーに対するドリッピング/ジェッティングからコ-フローへの転移平均値は-0.50barである。ドリッピング/ジェッティングからコ-フローへの転移平均値は、少なくとも３〜５つの特有な微細流体ドロップメーカーの値を平均することで得られた。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書において用いられる用語は、下記のように定義することができる。
用語“液滴(droplet)”は、エマルジョンの連続相のような非混和性流体で囲まれた、典型的に球形形状を有する小さな体積の液体と定義される。
用語“微細液滴(microdroplet)”は、１マイクロリットル以下、典型的に１マイクロリットル〜１ピコリットルの間の体積を有する液滴と定義される。択一的に、微細液滴は、約200マイクロメートルの直径を有する液滴を指す。
用語“油”は、水(または水溶液)またはこれらの混合物と非混和性の任意の液体との化合物を指し、典型的に、高含量の炭素を含有する。
用語“チャネル”は、流体が流れる通路と定義される。チャネルは、毛細管のようなチューブおよびチップ、またはこれらの組み合わせのような平面上に形成され得る。本明細書において、チャネルは、直線、ジグザグ、または螺旋型のパターンで平面流経路(planar flow route)に沿って延長され得る。
用語“ドリッピング/ジェッティングからコ-フローへの転移”は、分散相の粘性応力(viscous stresses)が界面張力よりも優勢であって、液滴がこれ以上観測されない臨界点と定義され、分散相は、接合部が連続相によって破裂されていない流れで運搬される。
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書に記載された図面は、微細流体ドロップメーキングに慣れていない者に、本発明の思想を十分に明瞭にするための例として提供される。したがって、本発明は、提示された図面に限定されず、他の形態で具体化され得、前記図面は、本発明の科学的原理および思想を明確にするために、誇張して図示され得る。
用語“ターゲットとなる速度”または“所望する速度”は、意図された液滴の生産量を最大に達成する形成速度と定義される。ドロップメーカーのデザインに応じて、液滴の形成速度は、300、500、800、1,500、または2,000液滴/秒となることができる。液滴生成の技術分野において、意図された液滴の形成速度は、具体的な使用目的および形態に応じて異なる。たとえば、DNAオリゴ体のカプセル化を含む生化学的分析の場合、与えられた特定のドロップメーカーのデザインにおいて可能な最も高い液滴生成速度がターゲットとなるであろう。
他に定義されない限り、技術的または科学的用語を含め、本発明において用いられるすべての用語は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者によって通常的に理解されるものと同一のものを意味する。本発明の要旨を不必要に曖昧にし得る構成についての説明は、以下の説明および添付図面から省略する。
【００２５】
本発明は、実験の必要性に最も適合した特定の液滴形成速度をターゲットとして、真空システムを利用した長方形マイクロチャネルを有する微細流体集束装置を最適化する方法であって、
１)分散相注入口と誘導管で構成された分散相チャネルの末端に、連続相注入口と誘導管で構成された２つの連続相チャネルがそれぞれ垂直に連結され、分散相チャネルおよび２つの連続相チャネルの連結部位で生成された液滴が収集チャネルに排出される構造を含む、長方形マイクロチャネルを有する微細流体集束装置を提供する段階；
２)所望する速度の液滴が生成されるように、分散相チャネルおよび２つの連続相チャネルの連結部位を基準に、分散相チャネルおよび連続相チャネルの高さと分散相チャネルの幅を決定する段階；
３)前記分散相チャネルに水溶液を注入し、前記連続相チャネルにオイルを注入する段階；および
４)真空圧力を加える段階；
を含む、方法を提供する。
【００２６】
一つの特定の態様において、本発明は、実験の必要性に最も適合した特定の液滴形成速度をターゲットとして、真空システムを利用した長方形マイクロチャネルを有する微細流体集束装置を最適化する方法であって、
１)ラピッドプロトタイピング、ソフトリソグラフィ、フォトリソグラフィ、および高解像度印刷の標準プロトコルを用いて、製作されたPDMSを提供する段階；
２)多様なスピン速度およびフォトレジストの組成物を用いて、エポキシ基盤のネガティブフォトレジストSU-8のフィルムの厚みを変更することにより、変わったPDMS装置のチャネルの高さを提供する段階；
３)緩衝食塩水およびウシ血清アルブミン(Bovine Serum Albumin)のようなタンパク質の混合物である水溶液、およびポリエチレングリコール(PEG)系フルオロ化界面活性剤を含有するオイル溶液を提供する段階；
４)水とオイルとの間の動的粘度比(dynamic viscosity ratio)が約１であり、表面処理された疎水性PDMSと水の接触角、および表面処理された疎水性ガラスと水の接触角が類似したレベルの疎水性を示し、水溶液の高タンパク質濃度により界面張力(interfacial tension)が比較的小さいとき、生成される圧力および特定のチャネル寸法に相応する記録された液滴形成速度を提供する段階；
【００２７】
５)分散相チャネルの末端に、２つの側面オイルチャネルが垂直に連結され、各相(phase)に相当する水/オイル注入口を有し、オイル-水接合部または分散相チャネルと２つの連続相チャネルの連結部位で生成された液滴が収集チャネルに、次いで、１mLチューブまたはPCRチューブのような収集チューブに排出されることを含む長方形マイクロチャネルを有する微細流体集束装置を提供する段階；
６)各オイル-水界面の寸法の少なくとも３〜５つのドロップメーカーに対し、8,000〜16,000fpsのフレーム速度で高速カメラにより獲得されたイメージシーケンスを用いて、液滴生成速度とドリッピング/ジェッティングからコ-フローへの転移を決定する段階；
７)所望する速度の液滴を生産するために、オイル-水接合部または分散相チャネルおよび２つの連続相チャネルの連結部位を基準に、連続および分散相チャネルの高さと中央分散相チャネルの幅を決定する段階；
８)ピペットチップを用いて、水溶液を分散相チャネルに伝達し、オイル溶液を連続相チャネルに伝達する段階；
９)手動ガスバルブまたは自動化されたソフトウェアで作動され、圧力ゲージで測定される真空圧力を、真空コネクタおよび３-アームジャンクション(arm junction)を用いて加える段階；
を含む、方法を提供する。
【００２８】
連続および分散相チャネルの高さ、および分散相チャネルの幅は、所望する液滴形成速度に応じて適切に調整され得る。分散相チャネルおよび連続相チャネルの高さおよび幅は、独立して、または同一に５μｍ〜40μｍとなることができるが、これに制限されない。
装置の記録された液滴形成速度は、チャネルの幅を変化させる場合よりも、連続および分散相チャネルの高さを変化させる場合、液滴形成に及ぼす影響が大きいということを示した。
このように、オイル-水界面におけるチャネル寸法は、前述した傾向により修正され得る。分散相チャネルおよび連続相チャネルの高さを増加させることにより、より高い液滴形成速度が達成され得る。反対に、分散相チャネルおよび連続相チャネルの高さを減少させることにより、より小さな液滴形成速度が達成され得る。
【００２９】
データが、連続および分散相の高さおよび幅が20μｍから25μｍを有する装置に局限されたが、液滴形成速度の同一の傾向が、オイル-水接合部で中央分散相チャネルの幅が15μｍ〜30μｍであり、分散相チャネルおよび連続相チャネルの高さが15μｍ〜30μｍの範囲を有する微細流体装置において観察することができる。
比較的高い生成速度をモデリングするために、25μｍの寸法が分散相および連続相の高さとして用いられ、20μｍが分散相チャネルの幅として用いられた。
対照的に、比較的低い形成速度をモデリングするために、20μｍの寸法が連続および分散相チャネルの高さとして用いられ、25μｍが中央分散相チャネルの幅として用いられた。
分散相チャネルおよび連続相チャネルの高さおよび分散相チャネルの幅を変更することにより、ドロップメーカーデザインの流体力学に慣れていない微細流体使用者は、単にオイル-水界面における分散および連続相チャネルの幅および最適の高さを決定することにより、特定の液滴形成速度をターゲットとすることができる。
【００３０】
真空圧力は、所望する速度で液滴形成をよりうまく達成するように調整され得る。比較的低い真空圧力において、本発明は、液滴がドリッピング状態にある。真空圧力が増加するにつれて、本発明は、ドリッピング状態(dripping regime)からジェッティング状態(jetting regime)に転移する。その後、臨界点において、本発明は、連続および分散相がともに破裂していない流れで運搬され、液滴がこれ以上生成されないコ-フロー状態(co-flow regime)に到達する。したがって、コ-フロー状態(co-flow regime)が発生しない範囲内で、最適の真空圧力を見出すことが好ましい。コ-フローが発生する真空圧力は、粘度比、流速比、界面張力等といった微細流体装置の多様な作動パラメータにより影響を受ける。
【００３１】
しかし、連続相および分散相として用いられる溶液の組成が固定されている場合、前述したパラメータは、操作することが困難な場合がしばしばある。容易な代案は、チャネル寸法と縦横比を変更し、最適な液滴形成速度を生成することである。分散相チャネルの高さが増加すると、コ-フローが起こる真空圧力が増加する。たとえば、コ-フロー状態が発生する圧力は、-0.19bar〜-0.50barの範囲であり得る。この情報を用いて、使用者は、単に水およびオイルチャネルの寸法を調整することにより、実験の必要性に最も適合した所望する液滴形成速度を達成することができる。
典型的に、流体がジェッティング状態にあるとき、流体の慣性力は、界面張力を超過し、流体は“ジェット”の形態で流れる。レイリー-プラトー不安定性によると、ジェットが妨害を受けていない状態で放置されたり、ジェッティング流体の進入部から比較的遠く離れた地点においてジェットと相互作用する追加的な流体がない場合、破裂して液滴を形成し得るが、これは常に起こるものではない。対照的に、流体が“ドリッピング”状態にあるとき、界面張力は流体の粘性応力(viscous stresses)よりも優勢であるため、チャネルに進入する際に、液滴分散(droplet dispersion)を起こす。
【００３２】
連続および分散相チャネルの高さが増加するにつれて、二相両方(both phases)の流体力学抵抗が減少し、これは、低い高さの装置に比べて、高い高さの装置について同一の真空圧力に比べて流速がさらに高いことをを意味する。(高さは、長方形マイクロチャネルのチャネル抵抗を決定する際に、幅よりもさらに重要なパラメータである。)
本発明に用いられるオイル溶液は、界面活性剤を含む。連続相に含まれている界面活性剤は、凝集を減少させ、チャネル湿潤を促進させることにより、液滴分散を促進させ、安定化させる。本発明に用いられる界面活性剤の種類は、実施例で用いられているソルビタンモノオレエートのように、本発明の目的を達成することができるならば限定されない。
【００３３】
実験に使用された微細流体装置は、ポリマー、たとえば、硬化剤と混合された、ポリジメチルシロキサン(PDMS)またはポリテトラフルオロエチレン(PTFEまたはテフロン(Teflon(登録商標))などといったエラストマー(elastomers)を基盤に製造され得る。たとえば、PDMSまたは他のソフトリソグラフィ技術を用いて流体システムを別途に製造することにより、微細流体チャネルが具現され得る。
ポリマーの他の非限定的な例として、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロライド、環状オレフィンコポリマー(COC)、ポリテトラフルオロエチレン、フルオロ化ポリマー(fluorinated polymer)、ポリジメチルシロキサンのようなシリコン、ポリビニリデンクロライド、ビスベンゾシクロブテン(BCB)、ポリイミド、ポリイミドのフルオロ化誘導体等を例として挙げることができる。
本発明のチャネルは、多様なコーティング物質で処理され得る。たとえば、チャネルのうち一部または全部に疎水性または親水性の性質を付与するために、チャネルの表面は、シロキサンのようなコーティング物質で処理される。
【実施例】
【００３４】
以下、製造例および実施例を通じて、本発明をさらに詳細に説明する。しかし、説明は、単に本発明をより詳細に説明するためのものであって、本発明の権利範囲が下記製造例および実施例に限定されるものではない。
【００３５】
〔製造例１：液滴生成装置〕
本実施例において、使用された微細流体集束装置は、ラピッドプロトタイピング、ソフトリソグラフィおよびフォトリソグラフィの標準プロトコルを用いて、PDMS(ポリジメチルシロキサン)で製造された。
オーブン内でPDMSを65℃で硬化させた後、水およびオイル入口と収集出口(collection outlets)に１mmの大きさのホールを穿孔した。PDMSスラブ(slab)をスライドガラス上にプラズマ結合させ、チャネルをAquapel(PPG Industries製造)で処理して疎水性にした。
本実施例において製造された微細流体集束装置は、図１aに示されるように、分散相チャネルの末端に２つの連続相チャネルが垂直に連結されたオイル-水界面構造を使用する。
【００３６】
本実施例においては、液滴形成速度に対する連続および分散相チャネルの寸法の効果を検証するために、分散相チャネルと２つの連続相チャネルとの連結部位を基準に、連続および分散相チャネルの高さと中央分散相チャネルの幅が異なる複数個の微細流体集束装置を製造した。より具体的に、SU-8フィルムの膜厚を調整するために、異なるスピン速度およびフォトレジストを用いて、チャネルの高さを変更した。また、分散相チャネルの幅は、フォトマスクデザインを変更し、高解像度印刷を用いて調節された。分散相チャネルおよび連続相チャネルの高さは20μｍまたは25μｍとなるように製造し、分散相チャネルの幅が15μｍ、20μｍ、25μｍまたは30μｍとなるように製造した。
オイル-水接合部において、25μｍの高さの水およびオイルチャネルを有し、15μｍの幅の中央水チャネルを有する例示的な微細流体装置の断面が図１bに示されている。同様に、オイル-水接合部において、15μｍの高さの水およびオイルチャネルを有し、25μｍの幅の中央水チャネルを有する例示的な微細流体装置の断面が図１cに示されている。
【００３７】
本発明に使用されたすべてのPDMS微細流体装置は、連続相チャネルの幅が25μｍで、収集チャネルの幅が37μｍとなるように製造された。２つの側面オイルチャネルおよび中央水チャネルが収斂するオイル-水接合部の平面図が図２に示されている。
分散相としては、69.9％の純水(DI water)、10％のトリス緩衝食塩水溶液(Sigma-Aldrich、MO)、20％のグリセロール(Sigma-Aldrich、MO)およびTBS、ならびに0.1％の蛍光添加剤およびウシ血清アルブミン(Sigma-Aldrich、MO)からなる水溶液(タンパク質溶液)が用いられた。連続相としては、PEG系フルオロ系界面活性剤(２体積％)および２-(トリフルオロメチル)-３-エトキシドデカフルオロヘキサン(HFE-7500、Novec 7500、3M、MN)からなるオイル溶液が用いられた。流体(水溶液およびオイル)の物理的特性についての詳細な要約は、下記［表１］のとおりである。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
200μリットルのピペットチップを用いて、分散相注入口および連続相注入口に、水溶液(タンパク質溶液)およびオイル(HFE-7500＋２％界面活性剤)がそれぞれ挿入された。その後、真空圧力を加えることにより、液滴が生成された。生成された液滴は、収集チャネルを介して排出され、注射器内部のPCRチューブに収集された。図３は、本発明の実験装置のより詳細な様子を示す。
【００４０】
〔実施例１〕
液滴形成速度に対するチャネル寸法の影響を観察するために、25μｍの高さのオイルおよび水チャネルと15μｍの幅の中央水チャネルとを有するPDMS微細流体集束装置、および、25μｍの高さの水およびオイルチャネルと20μｍの幅の中央水チャネルとを有するまた別の微細流体装置が製造された。液滴生成の間、-0.26bar〜-0.27barの真空圧力が２つの装置に加えられた。
液滴形成速度は、10,000fpsのフレーム速度で記録された高速カメラにより獲得されたイメージシーケンスを用いて計算された。特定の真空圧力における液滴形成速度を見出すために、少なくとも３〜５つの液滴が平均された。その結果を図４に示す。
図４において、使用された両方の装置は、連続および分散相チャネルの高さは同一の25μｍを有するのに対し、中央水チャネルの幅は５μｍの差があった。より狭い幅(15μｍ)を有するドロップメーカーは833ドロップ(drop)/秒の形成速度を生成したのに対し、より広い幅(20μｍ)を有するドロップメーカーは909の形成速度を生成した。
【００４１】
しかし、分散相チャネルの幅が33.3％(15μｍから20μｍに)増加したにもかかわらず、液滴形成速度(秒あたりドロップ(drops per second))は、わずか9.1％のみ増加した。したがって、分散相の幅の変化に対する液滴生成速度の差は、連続および分散相チャネルの高さの変化に対する液滴速度の差と比較して、それほど重要でないものとみなされる。
この実施例において上述した例は、図６および７に示された、より大きなデータセットにおいて観察された一般的な傾向の代表サンプルとして作用する。
【００４２】
〔実施例２〕
25μｍの高さの連続および分散相チャネルおよび15μｍの幅の中央分散相チャネルを有するPDMS微細流体集束装置が、３つの類型の流動状態(flow regimes)を観察するために準備された。水溶液(タンパク質溶液)が分散相として挿入され、ポリエチレングリコール(PEG)系フルオロ化界面活性剤を含有したオイル溶液が連続相として用いられた。真空圧力を加えて２つの流体をエマルジョンが生成される収集チャネル(collection channel)に流体力学的に集中させた。真空圧力は手動ガスバルブを用いて調整され、圧力値は圧力ゲージを用いて測定した。
ドリッピング状態が-0.06barの真空圧力で観察された。ジェット状態が-0.40barの真空圧力で観察された。コ-フロー状態が-0.60barの真空圧力で観察された。これらの流動状態は、図５a、bおよびcにそれぞれ示されている。強い真空圧力が加えられながら、装置がドリッピング/ジェッティングからコ-フローへの転移に達すると、液滴がこれ以上生成されず、代わりに、２つの流体が連続流で運搬される。
【００４３】
〔実施例３〕
連続および分散相チャネルの高さが20μｍまたは25μｍであり、中心分散相チャネルの幅が15μｍ、20μｍ、25μｍまたは30μｍであるPDMS微細流体集束装置が、チャネルの高さの変化に対する形成速度の差を観察するために製造された。水溶液(タンパク質溶液)が分散相として挿入され、ポリエチレングリコール(PEG)系フルオロ化界面活性剤を含有したオイル溶液が連続相として用いられた。
連続および分散相チャネルの高さが20μｍであり、中央分散相チャネルの幅が15μｍ、20μｍ、25μｍまたは30μｍである微細流体装置において、真空圧力に対する記録されたすべての液滴形成速度が図６に示される。連続および分散相チャネルの高さが25μｍであり、中央分散相チャネルの幅が15μｍ、20μｍ、25μｍまたは30μｍである微細流体集束装置において、真空圧力に対する記録されたすべての液滴速度は、図７に示される。
【００４４】
連続および分散相チャネルの高さが20μｍであり、中央分散相チャネルの幅が15μｍであるとき、最大液滴形成速度は約380液滴/秒であった。連続および分散相チャネルの高さが20μｍであり、中央分散相チャネルの幅が20μｍであるとき、最大液滴形成速度は約570液滴/秒であった。連続および分散相チャネルの高さが20μｍであり、中央分散相チャネルの幅が25μｍであるとき、最大液滴形成速度は約220液滴/秒であった。連続および分散相チャネルの高さが20μｍであり、中央分散相チャネルの幅が30μｍであるとき、最大液滴形成速度は約570液滴/秒であった。前述した最大形成速度は、すべて図６に示される。
【００４５】
連続および分散相チャネルの高さが25μｍであり、中央分散相チャネルの幅が15μｍであるとき、最大液滴形成速度は約2,500液滴/秒であった。連続および分散相チャネルの高さが25μｍであり、中央分散相チャネルの幅が20μｍであるとき、最大液滴形成速度は約2,250液滴/秒であった。連続および分散相チャネルの高さが20μｍであり、中央分散相チャネルの幅が25μｍであるとき、最大液滴形成速度は約2,600液滴/秒であった。連続および分散相チャネルの高さが20μｍであり、中央分散相チャネルの幅が30μｍであるとき、最大液滴形成速度は約1,250液滴/秒であった。前述した最大形成速度は、すべて図７に示される。
図６および図７は、チャネルの高さが、チャネルの幅よりも、液滴形成速度を決定するにあたってはるかに重要な要素であることを示す。より具体的に、高さが25.0％増加(20μｍから25μｍに増加)したとき、最大液滴生成速度は約4.3倍増加した。
【００４６】
〔実施例４〕
チャネル縦横比の効果に対する液滴形成速度の変化をさらに十分に理解するために、オイル-水界面において同一の断面積を有するPDMS微細流体集束装置がそれぞれ製造された。より具体的に、25μｍの高さの連続および分散相チャネルと20μｍの幅の中心水チャネルとを有する微細流体装置、および、20μｍの高さの連続および分散相チャネルと25μｍの幅の中央分散相チャネルとを有するまた別の微細流体装置が構成された。水溶液(タンパク質溶液)が分散相として挿入され、ポリエチレングリコール(PEG)系フルオロ化界面活性剤を含むオイル溶液が連続相として用いられた。真空圧力を加え、２つの流体を流体力学的に収集チャネルに集中させることにより、液滴生産が遂行された。
【００４７】
図８に示されるように、25μｍの高さの連続および分散相チャネルと20μｍの幅の中央分散相チャネル(図８において□で表示)を有する微細流体装置は、真空圧力が-0.5barに達したときにコ-フロー状態(co-flow regime)となった。しかし、20μｍの高さの連続および分散相チャネルと25μｍの幅の中央分散相チャネル(図８において×で表示)を有する微細流体装置は、真空圧力が-0.19barに達したときにコ-フロー状態(co-flow regime)となった。ドリッピング/ジェッティングからコ-フローへの転移は、２つの装置において、少なくとも３〜５ドロップメーカーを平均して決定した。したがって、２つの装置が、同一の断面積であるが反対の寸法を有することを考慮すると、高さの高いドロップメーカーデザインは、同一の断面積を有するが高さの低いドロップメーカーデザインよりも、実質的により高い液滴形成速度を示した。
【００４８】
このように、特定の液滴形成速度は、オイル-水界面において連続および分散相チャネルの寸法を単に変更することにより、ターゲットとなり得る。液滴の形成速度を増加させるために、連続および分散相チャネルの高さが適切な程度に増加され得る。反対に、液滴の形成速度を減少させるために、連続および分散相チャネルの高さが適切な程度に低くなり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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