(57)【要約】      （修正有）【課題】非ヒト動物細胞の染色体ＤＮＡ中に対立遺伝子または遺伝子を移入させるための方法を提供する。【解決手段】非ヒト動物系列から単離された非ヒト動物細胞に、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ；（ｂ）非ヒト動物細胞の染色体ＤＮＡにおける標的配列と相互作用するスペーサＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；および（ｃ）非ヒト動物細胞の染色体ＤＮＡにおける標的配列と相同性の配列によってフランキングされる対立遺伝子または遺伝子をコード化する相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型ＤＮＡ配列を導入するステップを含み、ＨＤＲ鋳型ＤＮＡ配列は、また、ｇＲＮＡのＲＮＡスペーサ配列との相互作用を改変する標的配列に対してミスマッチをコード化するＤＮＡ配列を含み、ミスマッチが、細胞の染色体ＤＮＡ中に導入され、非ヒト動物系列に存在しない細胞の染色体ＤＮＡにおける配列を形成する、方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の染色体ＤＮＡ中に外性対立遺伝子を移入させる相同組換え修復（ＨＤＲ）の方法であって、前記細胞に、標的エンドヌクレアーゼ系と、前記外性対立遺伝子を含むＨＤＲ鋳型とを導入するステップを含み、前記標的ヌクレアーゼ系は、前記染色体ＤＮＡにおける内在性コグネイト配列に特異的に結合するＤＮＡ結合メンバーを含み、前記標的ヌクレアーゼ系及び前記ＨＤＲ鋳型が作動することにより、ＨＤＲ鋳型配列に対して同一性を有するように前記染色体ＤＮＡを改変して、前記染色体ＤＮＡ中に、内在性対立遺伝子の代わりに前記外性対立遺伝子を移入させ、
前記標的エンドヌクレアーゼ系及び／又はＨＤＲ鋳型が、ＤＮＡに対する前記標的エンドヌクレアーゼ系の特異的結合を低減する特徴を含む、方法。
【請求項２】
特異的結合を低減する前記特徴が、前記内在性コグネイト配列に対するＤＮＡ結合メンバー配列中のミスマッチ及び／又は前記ＨＤＲ鋳型配列に対するＤＮＡ結合メンバー配列中のミスマッチを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的エンドヌクレアーゼ系が、ヌクレアーゼに融合した複数のＴＡＬエフェクター反復配列（ＴＡＬＥＮ）を含み、前記ＴＡＬＥＮが、反復可変二残基（ＲＶＤ）の配列を含み、及び前記ミスマッチが、前記内在性コグネイト配列に対してＲＶＤの前記配列中に存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的ヌクレアーゼ系が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含み、前記ミスマッチが、前記内在性コグネイト配列に対してｇＲＮＡ配列中に存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記標的ヌクレアーゼ系が、ヌクレアーゼに融合した複数のＴＡＬエフェクター反復配列（ＴＡＬＥＮ）を含み、前記ＴＡＬＥＮが、反復可変二残基（ＲＶＤ）の配列を含み、及び前記ミスマッチが、前記ＨＤＲ鋳型配列に対してＲＶＤの前記配列中に存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記標的ヌクレアーゼ系が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含み、前記ミスマッチが、前記ＨＤＲ鋳型配列に対してｇＲＮＡ配列中に存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記外性対立遺伝子が、天然対立遺伝子であり、及び前記ＨＤＲ鋳型が、前記ミスマッチを含み、前記ミスマッチが、天然に存在しない配列を形成する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記外性対立遺伝子が、ミスマッチを含まず、かつ前記細胞により発現されるＤＮＡを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記外性対立遺伝子が、前記ミスマッチを含み、かつ前記細胞により発現されるＤＮＡを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＤＲ鋳型配列に対して同一性を有するように前記染色体ＤＮＡを改変することによって、改変された染色体ＤＮＡ配列に対し、前記ＤＮＡ結合メンバー配列に前記ミスマッチを形成するように、前記ＤＮＡ結合メンバー配列及び前記内在性コグネイト配列を選択するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記外性対立遺伝子が、天然対立遺伝子であり、及び前記ＨＤＲ鋳型が、前記天然対立遺伝子と、前記染色体ＤＮＡ配列に対して同一性を有するＤＮＡとから構成される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ結合メンバー配列及び前記内在性コグネイト配列を選択するステップが、前記ＨＤＲ鋳型に対して同一性を有するように前記染色体ＤＮＡが改変されるとき、変化しない内在性コグネイト配列に第２のミスマッチを配置することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ結合配列に対して前記内在性コグネイト配列中に前記ミスマッチを配置するように、前記ＤＮＡ結合メンバー配列及び前記内在性コグネイト配列を選択するステップを含み、及び前記ＨＤＲ鋳型配列に対して同一性を有するように前記染色体ＤＮＡを改変するステップが、前記ミスマッチを除去しない、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ミスマッチが、挿入、欠失、又は置換を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記挿入、欠失、又は置換が、１〜２０残基の長さを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記挿入、欠失、又は置換が、１〜２０残基の長さを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ミスマッチが、１つのＳＮＰである、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
複数のミスマッチを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的エンドヌクレアーゼ系が、ＴＡＬＥＮのペアを含み、前記ＴＡＬＥＮは、前記ペアの間にスペーサ配列を有する前記染色体ＤＮＡに局在化し、前記特徴が、前記スペーサ配列の長さに変化を生成して、前記ＴＡＬＥＮペアによる前記ＤＮＡの切断を阻止するように、前記ＨＤＲ鋳型を選択するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記スペーサ長さが、欠失により減少するか、又は挿入により増加する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、初代細胞、初代体細胞、接合子、生殖細胞、幹細胞、卵母細胞、精子、及び胚からなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヌクレアーゼ系が、ｍＲＮＡとして前記細胞中に導入される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が、家畜細胞である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、ヒト以外の脊椎動物、霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギ、魚類、イヌ、マウス、ネコ、ラット、又は実験動物である、請求項１〜２３のいずれ一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、前記外性対立遺伝子に対して同型接合である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法により作製される細胞。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の標的ヌクレアーゼ系及びＨＤＲ鋳型を含むキット。
【請求項２８】
ＳＮＰでの変化によって操作された遺伝子修飾動物であって、前記動物の染色体ＤＮＡ中に内在性対立遺伝子を有する品種に属し、別の種又は別の品種の動物にみいだされる外性対立遺伝子を含み、前記外性対立遺伝子は、前記内在性対立遺伝子に対してＳＮＰに変化を有する、遺伝子修飾動物。
【請求項２９】
前記内在性対立遺伝子に対して複数のＳＮＰを含む、請求項２８に記載の動物。
【請求項３０】
細胞の染色体ＤＮＡにランディングパッドを形成する方法であって、前記細胞に標的ヌクレアーゼ系及びＨＤＲ鋳型を導入するステップを含み、前記標的ヌクレアーゼ系は、前記染色体ＤＮＡにおける内在性コグネイト配列に特異的に結合するＤＮＡ結合メンバーを含み、前記標的ヌクレアーゼ系及び前記ＨＤＲ鋳型が作動することにより、ＨＤＲ鋳型配列に対して同一性を有するように前記染色体ＤＮＡを改変し、前記ＨＤＲ鋳型配列が、ランディングパッドを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年８月２７日に提出された米国仮特許出願第６１／８７０，４０１号明細書に対する優先権を主張する。尚、上記出願は、参照により本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
連邦政府の援助に関する記載
本明細書に記載する研究の諸要素は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金１Ｒ４３ＲＲ０３３１４９−０１Ａ１及びＵＳＤＡ−国立食品・農業研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）からの生物工学リスク評価プログラム（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｉｓｋ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）競争型助成金番号２０１２−３３５２２−１９７６６による支援を受けた。米国政府は、本発明に関して一定の権利を有し得る。
【０００３】
技術分野は、ゲノム修飾細胞及び動物を作製する材料及び方法、並びにそのための研究ツールに関する。
【背景技術】
【０００４】
最初のトランスジェニックブタが作出されて以来、多様な方法で家畜を遺伝子操作するための１８０を超える試験が報告されている。動物遺伝子工学は、伝統的に、発現カセットのランダム挿入（低効率及び予測不可能な発現という問題を有する）、又は連結選択マーカを用いた相同性組換え（効率は１０４分の１）によって実施されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により媒介される種のゲノムに、挿入及び／又は欠失（ｉｎｄｅｌ）を導入することによって、遺伝子機能を破壊するために、３つの最新の標的エンドヌクレアーゼ技術、すなわち、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及び規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）／ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が使用されている。特に、ＴＡＬＥＮ誘導の遺伝子破壊は、モデル生物から穀物家畜及びヒトまで多様な種において立証されている。しかし、ＮＨＥＪにより誘導されるｉｎｄｅｌは、サイズ及び配列にばらつきがあるため、機能が破壊されたクローンのスクリーニングを困難にし、正確な改変を達成することができない。ＴＡＬＥＮ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介の相同組換え修復（ＨＤＲ）は、下等真核生物モデル（酵母、ゼブラフィッシュ）、及び最近ではマウスにおいて、明確なヌクレオチド変化の導入を支持している。これらは、長継代細胞又は始原生殖細胞を修飾して、トランスジェニック動物の作製を可能にするモデルである。
【０００６】
本明細書では、ブタ、ヤギ、及びウシゲノムを用いた約１５の異なる実施例において、様々な遺伝子の正確かつ高頻度の編集を立証する。一部の実施形態では、遺伝子編集物は、種又はクレード内に存在する対立遺伝子と識別不能であり、マーカなしの非減数分裂対立遺伝子移入の最初の証明を提供する。家畜のゲノムのいくつかの商業的に重要な遺伝子座において、高効率かつ正確な遺伝子編集が達成され、これは、農業、研究ツール、又は生物医学の用途に有用である。
【０００７】
これらの方法は、プラスミド、ｒＡＡＶ及びオリゴヌクレオチド鋳型を用いたＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９刺激相同組換え修復（ＨＤＲ）を含むように、家畜遺伝子編集ツールボックスを拡張した。実施例の１つは、ウシＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子を、有角ホルスタイン繊維芽細胞に移入させたことを明らかにする。この実施例は、角のない多様な乳牛の品種を作出することができることを立証する。しかも、この変化は、動物の他の遺伝子、又はゲノムの他の部分を妨害することなく、生成することができる。単一のヌクレオチド改変又は小さなｉｎｄｅｌ（置換、挿入及び／又は欠失を意味する用語）を、ＴＡＬＥＮｍＲＮＡ及び／又はオリゴヌクレオチドトランスフェクションを用いて、集団中１０〜５０％の効率で、ブタ、ヤギ、及びウシ線維芽細胞の約１４の他の遺伝子に導入した。選択した編集物のいくつかは、初めて、単一塩基対（ｂｐ）の改変を含み、天然に存在する性能増強又は疾患耐性対立遺伝子を模倣した。選択なしで増殖した最大７０％の線維芽コロニーは、意図する編集物を保有し、そのうち半分超が、同型接合であった。これらの効率は非常に高いため、リポータなし及び／又は選択マーカなしでも上記の変化を生成することができる。編集した線維芽細胞を用いて、ＤＡＺＬ及びＡＰＣ遺伝子にノックアウト対立遺伝子を有するブタを作出することにより、それぞれ不妊及び結腸癌をモデル化した。これらの方法は、研究、農業及び生物医学用途のための家畜細胞、大型哺乳動物、及び家畜において選択対立遺伝子の減数分裂なし種内及び種間移入を立証している。
【０００８】
下記の特許出願は、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込むものとし、矛盾が生じる場合には本明細書が優先される：米国特許出願公開第２０１０／０１４６６５５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１０５１４０号明細書、米国特許出願公開第２０１１／００５９１６０号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１９７２９０号明細書、及び米国特許出願公開第２０１３／０１１７８７０号明細書。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用いる一般的方法を示す。
【図２】Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ）を用いる一般的方法を示す。
【図３】ＴＡＬＥＮの作動理論を示し、この理論によって、何故これらがＳＮＰ変化を生成する上で一般に無効であり；類似のプロセスが、他の標的エンドヌクレアーゼに適用されるかを説明する。
【図４】ＳＮＰ編集物を作製するのに有効な標的エンドヌクレアーゼを作製及び使用する一般的方法を示す。
【図５】ＳＮＰ編集物を作製するのに有効な標的エンドヌクレアーゼを作製及び使用する別の方法を示す。
【図６】ＰＯＬＬＥＤのＴＡＬＥＮ媒介移入を示す。パネルａ）ホルスタイン（Ｈｏｌｓｔｅｉｎ）（ＨＯＲＮＥＤ）細胞にＰｏｌｌｅｄ対立遺伝子を移入させる戦略の概略図。ＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子（下部）は、１０ｂｐ欠失（図示していない）を有する、２１２ｂｐのタンデム反復配列（水平方向矢印）である。ＴＡＬＥＮは、ＨＯＲＮＥＤ対立遺伝子（鉛直方向矢印）を特異的にターゲティングするように作製し、この遺伝子は、ＰＯＬＬＥＤ  ＨＤＲプラスミドを用いた相同組換えにより修復することができる。パネルｂ）ＰＯＬＬＥＤの同型接合又は異型接合移入を含むコロニーの代表的イメージ。次の３つのプライマーセットを候補コロニーの陽性分類のために用いた：Ｆ１＋Ｒ１、Ｆ２＋Ｒ２及びＦ１＋Ｐ（ＰＯＬＬＥＤ特異的）。ＰＣＲ産物の同一性を、Ｆ１＋Ｒ１アンプリコンを配列決定することにより確認した。
【図７】ＴＡＬＥＮの供給源としてのトランスフェクトｍＲＮＡの評価のために作成した実験データのプロットである。非修飾ｍＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄ  ｍＲＮＡ）又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）のいずれかによりコード化された線維芽細胞に、ＴＡＬＥＮを導入した。２つの量の各ＴＡＬＥＮ調製物を細胞にトランスフェクトしてから、３０℃又は３７℃で３日培養した後、ｉｎｄｅｌの分析に付し、ＮＨＥＪの割合（％）を記録した。
【図８Ａ】ＴＡＬＥＮのｍＲＮＡ供給源が、オリゴドナーを用いた効率的かつ一貫したＨＤＲを刺激したことを示すプロットである。各チャートは、オリゴドナー鋳型と、プラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡとして送達されたＴＡＬＥＮを用いて、線維芽細胞中の特定の遺伝子座（例えば、ｓｓＩＬ２ＲＧ；Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａの場合「ｓｓ」、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓの場合、「ｂｔ」）のターゲティング結果を示す。（差し込み図）オリゴドナー鋳型の図であり、ここで、陰影を付けたボックスは、ＴＡＬＥＮ結合部位を表し、スペーサは白で示す。各オリゴは、ＲＦＬＰ分析のための新規制限部位を導入する４ｂｐの挿入（ｉｎｓ４）又は欠失（ｄｅｌ４）のいずれかを含有する。推定ＢＭは、保存された−１チミジン（ＴＡＬＥＮ結合部位に対して）を、表示のヌクレオチドで置換する。線維芽細胞は、３μＭのそれらのコグネイトオリゴ−相同鋳型と一緒に、ＴＡＬＥＮコード化プラスミド（３μｇ）又はｍＲＮＡ（１μｇ）のいずれかでトランスフェクトした。次に、細胞を３７℃又は３０℃で３日間インキュベートした後、１０日目まで３７℃で拡大させた。ＴＡＬＥＮ活性を３日目にＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより測定し（３日目Ｓｕｒｖｅｙｏｒ）、ＨＤＲを３日目及び１０日目にＲＦＬＰ分析により測定した（３日目％ＨＤＲ及び１０日目％ＨＤＲ）。バーは各々、３回の反復実験からの平均及びＳＥＭを示す。
【図８Ｂ】オリゴヌクレオチド鋳型を含むＴＡＬＥＮ誘導ＨＤＲの動態学を評価するために作成した実験データのプロットである。細胞を、ＴＡＬＥＮコード化ｍＲＮＡ又はプラスミドＤＮＡのいずれか、及びＬＤＬＲ若しくはＡＰＣ遺伝子をターゲティングする４塩基対挿入を有するオリゴによりトランスフェクトした。パネルａ）表示時点での細胞集団に対するＲＦＬＰ分析。パネルｂ）パネルａからの結果をデンシトメトリにより定量し、時間の関数として、平均をＳＥＭ（ｎ＝３）と共にプロットした。ＨＤＲシグナルは、トランスフェクションから１２時間後に初めて出現し、時間経過と共に蓄積した。
【図９】ＨＤＲの頻度に対する突然変異タイプの影響を評価するために作成した実験データのプロットである。パネルａ）野生型ｓｓＬＤＲ（配列番号１）並びにｓｓＬＤＬＲをターゲティングするのに用いられる５つのオリゴの配列（上から下：配列番号２、３、４、５、及び６）。ＴＡＬＥＮ結合部位は、ボックスで囲んだ文字で示し、新規ＢａｍＨＩ部位には下線を引く。ＢＭ及び挿入を含むＳＮＰは、サークルで囲んだ。パネルｂ）細胞をＬＤＬＲ２．１  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ（１μｇ）及びオリゴ（最終２μＭ）でトランスフェクトした。３日目のＨＤＲをＲＦＬＰ分析により決定し、ＳＥＭを含む平均（ｎ＝３）をプロットした。パネルｃ）ウシ細胞をｂｔＲｏｓａ１．２  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡと、４１＿ｍｌｏｘＰ又は６０＿ｌｏｘＰオリゴのいずれか（最終２μＭ）でトランスフェクトした。４１及び６０の数字は、相同的塩基の数を指す。各オリゴは、３４ｂｐ  ｌｏｘＰ部位、すなわち修飾（ｍｌｏｘＰ）又は野生型（ｌｏｘＰ）形態のいずれかをスペーサの中央に含有する。
【図１０】イボイノシシ由来のｐ６５Ｓ５３１Ｐ突然変異を在来のブタに移入させるためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲを示す。パネルａ）Ｓ５３１Ｐミスセンス突然変異を、ブタｐ６５のヌクレオチド１５９１でのＴ−Ｃトランジッションにより誘発する。Ｓ−Ｐ  ＨＤＲ鋳型は、新規ＸｍａＩ部位を導入し、ＲＦＬＰスクリーニングを可能にする原因ＴＣトランジッション突然変異（拡大文字）を含む。パネルｂ）細胞を、Ｓ−Ｐ−ＨＤＲオリゴ（２μＭ）、２つの量のｈＣａｓ９コード化プラスミド（０．５μｇ又は２．０μｇ）；及び５つの量のＧ２Ａ転写プラスミド（０．０５〜１．０μｇ）でトランスフェクトした。各トランスフェクションからの細胞を６０：４０に分割して、３０及び３７℃でそれぞれ３日間培養した後、１０日目まで３７℃で培養を延長した。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより、１６〜３０％の活性が判明した。パネルｃ及びｄ）３日目及び１０日目にサンプリングした細胞のＲＦＬＰ分析。１９１及び１１８ｂｐの予測切断産物を黒い矢印で示す。２つのｇＲＮＡ配列は、ｐ６５＿Ｇ１Ｓ（配列番号７）及びｐ６５＿Ｇ２Ａ（配列番号８）である。野生型ブタｐ６５は配列番号９であり、相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型Ｓ−Ｐ−ＨＤＲ（配列番号１０）とアラインメントして示す。ｐ６５ＤＮＡに結合する左ＴＡＬＥＮ配列及び右ＴＡＬＥＮ配列は、それぞれ配列番号１１及び１２である。
【図１１】ＴＡＬＥＮ及びＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲの比較のための実験データを示す。パネルａ）ＡＰＣ１４．２  ＴＡＬＥＮ（配列番号１３及び１４）並びにｇＲＮＡ配列ＡＰＣ１４．２  Ｇ１ａ（配列番号１５）を野生型ＡＰＣ配列（配列番号１６）と比較して示す。その下に、ＨＤＲオリゴ（配列番号１７）を示し、これは、４ｂｐ挿入（ボックスで囲んだ）を送達して、新規ＨｉｎｄＩＩＩ部位をもたらす。ＨＤＲ鋳型並びに、ＴＡＬＥＮｍＲＮＡ、ｈＣａｓ９コード化プラスミドＤＮＡ及びｇＲＮＡ発現プラスミド；又はｈＣａｓ９コード化ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ発現プラスミドで、細胞をトランスフェクトし、３０又は３７℃のいずれかで３日間培養した後、１０日目まで３７℃で拡大させた。パネルｂ）ＲＦＬＰ及びＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ結果を示すチャート。
【図１２】オリゴドナーを用いたＳＮＰ移入についての実験データを示す。パネルａ）は、ブタＬＤＬＲ及びＧＤＦ８について、ブロック突然変異（ＢＭ）有り又はなしでのＨＤＲ対立遺伝子の維持を示すプロットである。各オリゴは、ＭＢ有り又はなしで同じＳＮＰ／制限３１３部位を有した。平均相同組換え及びＳＥＭ（ｎ＝３）を示す。パネルｂ）は、和牛（Ｗａｇｙｕ）線維芽細胞へのミオスタチンＣ３１３Ｙの移入の結果を示す。Ｃ３１３Ｙミスセンス突然変異は、ウシミオスタチンのヌクレオチド９３８でのＧ−Ａトランジッション（拡大文字により示す）によって誘発する。ＨＤＲ鋳型（標識ドナー、配列番号１８）は、ＲＦＬＰスクリーニングのための新規ＥｃｏＲＩ部位を導入するために、ＴからＣへのトランジッション（サークルで囲む）も含む。２つの左ＴＡＬＥＮは、遺伝子座に対して設計され、ｂｔＧＤＦ８３．６−Ｇ（配列番号１９）は、野生型対立遺伝子（Ｗｔ）（配列番号２０）をターゲティングし、また、ｂｔＧＤＦ８３．６−Ａ（配列番号２１）は、突然変異対立遺伝子（Ｃ３１３Ｙ）をターゲティングし：いずれも共通の右ＴＡＬＥＮを有する。トランスフェクション、培養及び測定は前述のように実施した。ｂｔＧＤＦ８３．６−Ｇ（ｎ＝３０）及びｂｔＧＤＦ８３．６−Ａ（ｎ＝５）についての平均及びＳＥＭは、それぞれ１２及び３回の生物学的反復実験を代表する。両側スチューデントｔ検定を用いて、群同士の平均を比較し；ｐ値を示す。
【図１３】ＴＡＬＥＮ刺激ＨＤＲ対立遺伝子の配列分析の結果を示すプロットである。野生型リードに対し、完全な、意図するＨＲリードのカウントを挿入（パネルａ）及びＳＮＰ対立遺伝子（パネルｂ）についてプロットする。標的遺伝子座、時点、並びにＢＭがオリゴに含まれていたか否かを表示する。パネルｃ）ｂｔＧＤＦ８及びｐ６５からのリードを標的ＳＮＰの組込みについて選別した後、追加突然的変異を含むもの（ｉＳＮＰ＋Ｍｕｔ）に対して、意図したもの（ｉＳＮＰ）を分類し、リード総数に対してプロットした。
【図１４】ＨＤＲ対立遺伝子の配列分析についての結果を示すプロットである。正しい挿入（パネルａ）又はＳＮＰ対立遺伝子（パネルｂ）を含有する配列決定リードをＢＭの組込みについて分析した。標的遺伝子座、時点、並びにＢＭがオリゴに含まれていたか否かを、各グラフの下に示す。パネルｃ）図１３パネルｃのデータを突然変異タイプによりさらに分類し、比較した。ｉＳＮＰのみを含むリードもあれば、ｉｎｄｅｌを伴うもの（ｉＳＮＰ＋ｉｎｄｅｌ）、又は意図されないＳＮＰを伴うもの（ｉＳＮＰ＋ｕＳＮＰ）もあった。
【図１５】ＥＩＦ４ＧＩ遺伝子においてＨＤＲ対立遺伝子を安定化するためのＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合部位に配置された複数のＳＮＰについての実験データを示す。パネルａ）は、野生型ＥＩＦ４ＧＩ  Ｗｔ−ＮＬ（配列番号２３）の一部と、野生型ＥＩＦ４ＧＩを切断して、相同組換えを刺激するように設計したＴＡＬＥＮのペア（配列番号２４及び２５）を示す。また、３つのＳＮＰ（下線を引いた拡大文字）をゲノムに導入するために用いるドナーオリゴ、ＤＦ−ＨＤＲのコア配列（配列番号２６）をＷｔ配列とアラインメントする。第３のＳＮＰは、新規ＥａｇＩ制限部位を形成し、これをＲＦＬＰ分析に用いた。ブタ線維芽細胞を、ＥＩＦ４ＧＩ１４．１  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ（２μｇ）及びＤＦ−ＨＤＲ（２μＭ）でトランスフェクトしてから、３０℃で３日間培養した後、分析及びコロニー増殖に付した。パネルｂ）は、トランスフェクションから３日後の集団に対するＲＦＬＰ分析を示す。３４４，１７７及び１６７ｂｐの予測産物サイズを、黒い三角形で示す。パネルｃ）は、単離した細胞クローンに対するＲＦＬＰアッセイを示す。３日目の細胞を用いて、希釈クローニングによるモノクローナルコロニーを取得した。異型接合（白い三角形）又は同型接合（黒い三角形）ＨＤＲ対立遺伝子を有するコロニーの例を示す。
【図１６】ＳＮＰ  ＨＤＲ対立遺伝子のための低温処理維持についてのデータのプロットである。ブタ線維芽細胞をＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ（１μｇ）及びオリゴ（３μＭ）でトランスフェクトした。２つの独立したトランスフェクションからの細胞を各反復実験についてプールし、６ウェルプレートの６つのウェルに均等に配分した後、３０℃で培養した。トランスフェクションから１〜７日後（６日目を除き、Ｘ軸に沿って１Ｄ〜７Ｄ）のＲＦＬＰ分析のために、これらの集団からサンプルを採取し、残る細胞を３７℃で移入した。各条件についてのサンプルをＲＦＬＰ分析のために１２日目に再度採取した。最初の採取時と、再度１２日目の平均ＨＤＲ及びＳＥＭ（ｎ＝３）を示す。
【図１７】ＳＮＰを導入する場合、正しい対立遺伝子の頻度を改善するための意図的ＲＶＤミスマッチと一緒に作製したＴＡＬＥＮについての実験結果を示す。パネルａ）は、ｃａＣＬＰＧ領域をターゲティングするように設計されたＴＡＬＥＮペア（ｃａＣＬＰＧ１．１、上から下、左から右に、配列番号２７〜２９）を示す。オリゴ駆動ＨＤＲを用いて、要望されるアデニンをグアニンＳＮＰに導入した（標的アデニンをボックスで囲む）。要望されるＳＮＰは、ＡｖａＩＩ制限部位の喪失により、遺伝子型決定が可能になった。各ＴＡＬＥＮモノマーは、それぞれの結合位置の上方に陰影を付けて示す。パネルｂ）ｃａＣＬＰＧ野生型配列を示す（配列番号３１）。ＡｖａＩＩに対して耐性の単一細胞由来コロニーの各対立遺伝子を配列決定した（上から下に、配列番号３２〜４５の１４の配列）。目的のＳＮＰ（ボックスで囲む）を含む対立遺伝子は全て、欠失（ＡｖａＩＩ耐性対立遺伝子配列中にダッシュで示す）又は挿入（ＷＴ配列中にダッシュで示す）も含有した。パネルｃ）では、意図的ミスマッチ（サークルで囲んだ斜体）をＲＶＤ配列に導入した（上から下に、タンパク質配列：配列番号４６〜５３として示される）。要望されるＳＮＰ（ボックスで囲む）は、ＴＡＬＥＮの右モノマーにあった。パネルｄ）は、ＣｅｌＩアッセイにより測定したＴＡＬＥＮ活性を示す。非相同末端結合の割合（ＮＨＥＪ（％））を各々について表示する。測定した。パネルｅ）は、ｃａＣＬＰＧ１．１ｃを用いて生成されたＡｖａＩＩ耐性単一細胞由来コロニーの配列決定した対立遺伝子（上から下に、配列番号５４〜５９の６つの配列）との、ｃａＣＬＰＧ野生型配列（配列番号６０）のアラインメントを両方示す。要望されるＳＮＰをボックスで囲む。コロニー３７及び７８は、要望のＳＮＰに対して異型接合であり、追加的ｉｎｄｅｌを示さなかった。コロニー１４２は、要望のＳＮＰに対して同型接合であったが、１つの対立遺伝子に４ｂｐ挿入を含有した。
【図１８】標的エンドヌクレアーゼに、ミスマッチ有り又はなしのＳＮＰを移入させる実験の結果を示す。パネルａ）は、Ｋ３２３Ａ周辺のウシＤＧＡＴ配列（配列番号６１及び６２）の概略図を示す。グレイの矢印は、ＤＧＡＴ配列に結合するＴＡＬＥＮモノマーを示す。左アームは、１６ＲＶＤからなり、右アームは、１５ＲＶＤからなり、スペーサは長さ１６塩基対である。ボックスで囲んだＧＣ及びｇｇａ  ｇｃｔは、標的塩基対である。ＤＧＡＴオリゴは、ＧＣをＡＡに変換して、要望されるＤＧＡＴ突然変異体を形成する。ＨＤＲのマーカとして、ボックスで囲んだＧＧＧＡＧＣは、ＡＡＧＣＴＴに変換され、これが、新規ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を形成する。この変化がスペーサ内であるため、ＴＡＬＥＮ結合に影響を与えず、従って、意図的ミスマッチ結果を妨害しないはずである。パネルｂ）ＤＧＡＴ  ＴＡＬＥＮ  ＲＶＤ配列（上から下に：配列番号６３〜７０）。ｂｔＤＧＡＴ  １４．２は、ＲＶＤに意図的ミスマッチを一切含まない。ｂｔＤＧＡＴ  １４．４、１４．５及び１４．６は各々、左ＴＡＬＥＮモノマーの１、３、若しくは５位（サークルで囲む）のいずれかに１つの意図的ＲＶＤミスマッチを含有する。パネルｃ）ウシ線維芽細胞を１ｕｇのｔａｌｅｎ及び０．４ｎモルのオリゴでトランスフェクトした。トランスフェクションから３日後、細胞を溶解させ、ＤＧＡＴ配列をＰＣＲにより増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化してから、アクリルアミドゲル上に泳動させた。ＨＤＲの効率（％）をデンシトメトリ（ＨＲ）により決定した。パネルｄ）コロニーの配列分析は、オリジナル１４．２ＴＡＬＥＮと共に実施する。該当部位にオーバーラップするｉｎｄｅｌのために、１２コロニーのうち、ＨｉｎｄＩＩＩ  ＲＦＬＰについて陽性であり、しかも、要望される突然変異を含有したものは１つもなかった。（上から下に、配列番号７１〜７９、８１）。パネルｅ）ＴＡＬＥＮ１４．５及び１４．６から得られたコロニーは、正しいＤＧＡＴ突然変異及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を生成した。これら２つのＴＡＬＥＮペアは、合わせて２つの同型接合（ＨＨ）コロニーと３つの異型接合（Ｈｈ）コロニーを生成した。ＴＡＬＥＮ１４．４は、正しいＤＧＡＴ突然変異を含むコロニーを全く生成しなかった（データは、示していない）（上から下に、配列番号８２〜８７）。
【図１９】ＴＡＬＥＮ−ＨＤＲ／ＲＭＣＥの方法を示す。ｆｌｏｘｅｄカセットを、オリゴと適合性のＴＡＬＥＮ、ｌｏｘＰオリゴ及びＣｒｅリコンビナーゼの供給源と一緒にトランスフェクトした。棒グラフは、ＹＦＣ−Ｃｒｅ及びｍＣｈｅｒｒｙをトランスフェクションに含有させた場合に、この方法により生成されたプロマイシン耐性コロニーの数を示す。ＳＲＹ遺伝子座へのターゲティングを確認するために、３７０ｂｐ産物をもたらすであろう推定結合部（表示）を横断して、ＰＣＲを実施した。この産物は、Ｃｒｅが含まれた場合にのみ明確に見える。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
標的エンドヌクレアーゼなどの遺伝子編集ツールは、遺伝子改変動物を作製する上で有用である。ただ１つの塩基においてネイティブ対立遺伝子を変化させるためにこれらのツールを使用することは、従来の方法では困難、又は不可能である。本明細書では、一塩基でのこれらの編集物、又は複数の一塩基編集物を作製するための新規の技術を記載する。これらの方法は、一塩基多型（ＳＮＰ）又は複数のＳＮＰしか相違しない対立遺伝子の移入に有用である。１品種又は種からのＳＮＰを別の品種又は種に移入させる能力は、重要な新しい機会を創出すると考えられる。ＳＮＰという用語は、２つの対立遺伝子をアラインメントして比較した場合、同じ相対部位での１塩基の相違を指し；本明細書では、この用語は、いくつかの文脈において、単一塩基変化を意味するのにも用いられる。
【００１１】
図１は、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用いる一般的方法を示す。ＴＡＬＥＮペアが表示され；他の方法では、単一のＴＡＬＥＮを使用する。標的部位をｄｓＤＮＡ中に選択する。左右のＴＡＬＥＮは、標的部位とマッチするように選択された反復可変二残基（ＲＶＤ）を含むＴＡＬ−エフェクター反復配列によって作製する。ＲＶＤは、それらのコグネイト配列とマッチするように設計される。Ｆｏｋｌなどのエンドヌクレアーゼを、スペーサを用いてＴＡＬ−エフェクター部分と結合させる。左ＴＡＬＥＮ及び右ＴＡＬＥＮは、ｄｓＤＮＡの相同的塩基対合を考慮して設計する。ＴＡＬＥＮを細胞に導入すると、意図する標的部位に特異的に結合する。これらは、典型的に、遺伝子にターゲティングさせるが、他の目的のために遺伝子を破壊するか、若しくはその配列を変化させるために、実際の結合部位は、適宜、プロモータ、イントロン、エクソン、又はその他の部位であってもよい。ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡに二本鎖切断を生成し、これは後に、細胞においてＤＮＡ修復機構によって修復される。切断部位周辺のＤＮＡに対して実質的相同性を有するＤＮＡが存在する場合には、細胞機構は、そのＤＮＡを、修復プロセスを誘導（ガイド）する鋳型として用いることもでき；このプロセスは、相同組換え修復であり、ガイドはＨＤＲ鋳型である。鋳型がない場合、細胞は、それ自体でうまく修復するか、又はｉｎｄｅｌを形成してもよい。
【００１２】
図２は、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを使用する一般的方法を示す。プロトスペーサ隣接モチーフ付近の標的ＤＮＡを選択する。ｔｒａｃｒＲＮＡ及びスペーサＲＮＡを「単一ガイドＲＮＡ」分子に組み合わせると、これは、Ｃａｓ９及び標的配列の両方と複合体を形成して、その中に、二本鎖配列特異的切断を導入する。ｇＲＮＡ−ｔａｒｃＲＮＡを含むＣａｓ９を発現するベクターは、公知であり、容易に入手可能である。ＴＡＬＥＮと同様に、細胞修復機構は、ｄｓＤＮＡ切断を完全に、又はｉｎｄｅｌを伴って修復し得る。好適なＨＤＲ鋳型が存在する場合、鋳型は、修復を誘導し、ネイティブＤＮＡに変化を形成することができる。
【００１３】
図３は、標的エンドヌクレアーゼの作動理論を示し、何故これらがＳＮＰ変化を生成する上で一般に無効であり；類似のプロセスが、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに適用されるかを説明する。ネイティブ二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を示し、これは、ＴＡＬＥＮペア及び相同組換え修復（ＨＤＲ）＿鋳型に曝露される。ＴＡＬＥＮは、標的遺伝子に結合しなければならない。次に、これらは、ネイティブＤＮＡを切断して、放出され得る。切断された後、ネイティブＤＮＡは、不完全に修復されているためにｉｎｄｅｌを有する場合がある。２、３の塩基のｉｎｄｅｌであっても、ＴＡＬＥＮによる修復ＤＮＡの再結合を大幅に低減するのに十分であってもよい。もう一つの可能性は、修復プロセスによって、切断ＤＮＡをそのネイティブ配列に戻すことである。或いは、配列中に成功したＨＤＲ駆動変化があるために、ＨＤＲ鋳型と同じである可能性もある。しかし、改変されたＤＮＡは、ＴＡＬＥＮによる再結合及び再切断を受ける。実際に、切断ＤＮＡは、すでにアンコイルされ、切断が可能な状態であるが、ネイティブＤＮＡは、そのように可能な状態ではない場合もある。編集の動態は、ＨＤＲ鋳型の参加を必要とするが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による切断の修復には必要ではない。従って、修復の動態は、ＳＮＰ、又はネイティブ遺伝子に対する他の小さな変化が要望される場合、編集プロセスを望ましくない結果に至らせると考えられる。
【００１４】
図４は、ＳＮＰ編集物を作製するのに有効な標的エンドヌクレアーゼを作製及び使用する一般的方法を示す。有効な一戦略は、要望されるＳＮＰ（又は他の改変残基）が、エンドヌクレアーゼ系のＤＮＡ結合部分のコグネイト領域にあるように、標的エンドヌクレアーゼを設計することである。ＨＤＲ鋳型は、要望されるＳＮＰが、ＲＶＤ又は他のＤＮＡ結合部分とのミスマッチであるように、ＳＮＰに変化を誘導する。
【００１５】
さらに、変化を任意選択でＨＤＲ鋳型に加えることによって、さらなるミスマッチを形成してもよい。ＤＮＡ結合メンバーの特異的結合を低減するためのＨＤＲ配列を設計する実施形態は、内在性染色体ＤＮＡとアラインメントしたＨＤＲ鋳型配列にミスマッチを配置するステップを含む。このミスマッチは、１〜６残基の挿入、欠失、置換、挿入及び／又は１〜６残基の欠失、１〜６０残基の置換、ただ１つのＳＮＰ、１つ又は複数のＳＮＰを含んでよい。当業者は、明示した限界内のあらゆる値及び範囲が考慮されることは直ちに理解されよう。天然に存在する対立遺伝子の移入に関連して、ミスマッチは、天然に存在する対立遺伝子中に存在するもの以外にあってもよい。
【００１６】
図５は、ＳＮＰ編集物を作製するのに有効な標的エンドヌクレアーゼを作製及び使用する別の一般的方法を示す。標的エンドヌクレアーゼの一方（及び／又は適用可能であれば、両方）のＤＮＡ結合配列を、内在性ＤＮＡとの意図的ミスマッチと共に作製する。ＴＡＬＥＮでは、ＲＶＤは、ミスマッチであるように選択する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９において、ガイド配列は、１つ又は複数のミスマッチを有する。移入プロセスの生物学的目標である変化に関して、要望されるＳＮＰは、ＤＮＡ結合ドメインの内側及び／又は外側であってもよい。結合の低減を引き起こすことは、ありそうにない手法であると思われる。しかし、実際に、実験から、初期結合段階で駆動効率を下げることが有用であることが判明している。
【００１７】
図４及び５の実施例を組み合わせてもよい。内在性ＤＮＡとの結合を低減するために、ＴＡＬＥＮ若しくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をミスマッチと共に設計する、及び／又はＨＤＲ鋳型は、標的エンドヌクレアーゼとの特異的結合を低減するためにミスマッチを導入することができ、及び／又はＤＮＡ結合ドメインに対するコグネイト配列中にミスマッチを形成するように、内在性ＤＮＡ上の部位を選択することができる。天然に存在する対立遺伝子の移入に関連して、ミスマッチは、天然に存在する対立遺伝子中に存在するもの以外にあってもよい。従って、本方法は、天然に存在する対立遺伝子を選択するステップ、その対立遺伝子の少なくとも一部を含むＨＤＲ鋳型を作製するステップ、並びにＨＤＲ鋳型及び／又はＤＮＡ結合ドメインに１つ又は複数のミスマッチを形成するステップを含むであろう。
【００１８】
ＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子の移入
酪農場オペレータ及び家畜の健康状態を保護するために、米国、欧州、及びその他の地域において、大部分の乳牛から角が常用的に手で除去されている。除角は痛みを伴い、動物のストレスを一時的に増大させ、動物生産に経費を加算することになり、後の負傷から動物を保護する意図であるにもかかわらず、一部には除角の実施が残酷であるという見方もある。一部の肉用種は、天然に無角であり（例えば、アンガス（Ａｎｇｕｓ））、ＰＯＬＬＥＤと呼ばれる形質が優性である。本明細書に記載する技術は、除角を受ける必要がない動物を提供することによって動物の健康状態を改善する。無角化を付与する２つの対立遺伝子変異体が、染色体１で近年同定されている。これらの突然変異のいずれかを有する乳牛は稀であり、一般に、その有角の対応種よりも、乳牛の遺伝的選抜指数（ｄａｉｒｙ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｉｃｅｓ）がはるかに低い。有角種へのＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子の減数分裂移入は、伝統的な交雑育種によって達成することができるが、交雑育種した動物の遺伝的メリットは、生産性を回復するために、選択的育種の長期にわたる多数の世代を経ることになり、しかもそれを必要とする。
【００１９】
しかし、動物において無角化をもたらすこと、及び動物のゲノムを妨害することなくそうすることは可能である。セルティック（Ｃｅｌｔｉｃ）ＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子（１０ｂｐを置換する２１２ｂｐの重複）の非減数分裂移入を有角雄子牛由来の線維芽細胞で達成した。Ｃｅｌｔｉｃ  ＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子を含む１５９４ｂｐ断片を含有するプラスミドＨＤＲ鋳型をアンガス（Ａｎｇｕｓ）種から取得した（図６、パネルａ）。ＴＡＬＥＮは、それらが、ＨＯＲＮＥＤ対立遺伝子を切断することができるが、ＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子は影響されないまま残すように設計した。驚くことに、この実験は、ｍＲＮＡとして送達されるＴＡＬＥＮのペアが、プラスミド発現カセットと比較して類似の活性を有することを明らかにした（図７）。従って、ＴＡＬＥＮ発現プラスミドのゲノム組込みの可能性を排除するように、ｍＲＮＡとしてＴＡＬＥＮを送達する実験を実施した。２２６コロニーのうち５つ（２％）が、図６のパネルｂに示す各ＰＣＲ試験を通過し、ＰＯＬＬＥＤの移入を確認した。５つのクローンのうちの３つが、ＰＯＬＬＥＤ移入について同型接合であり、配列決定によって、意図する対立遺伝子と１００％同一であることを確認した。２０１４年１月１４日に提出された米国特許出願第１４／１５４，９０６号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）は、無角化に関するさらなる情報を提供する。
【００２０】
ブタ、ヤギ及びウシゲノムへの対立遺伝子の移入
プラスミド鋳型は、ＰＯＬＬＥＤ及びＧＤＦ８の移入のために有効であったが、本発明者らは、多くの望ましい対立遺伝子がＳＮＰに対応すると考える。第１群の実験では、そのコグネイトＴＡＬＥＮ結合部位にオーバーラップを有し、さらには、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析のためのスペーサ領域に４ｂｐのｉｎｄｅｌを導入したオリゴヌクレオチド鋳型を使用した。初代線維芽細胞をプラスミド−又はｍＲＮＡコード化ＴＡＬＥＮ及びオリゴ鋳型でトランスフェクトした後、３０又は３７℃のいずれかで３日インキュベートした。ｍＲＮＡとして送達したＴＡＬＥＮは一貫して、３０℃でインキュベートした細胞中のプラスミドより性能が優れていた（図８Ａ）。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイにより測定した相当程度のＴＡＬＥＮ活性にもかかわらず、ＨＤＲは、一貫して、ＴＡＬＥＮをｍＲＮＡとして送達したとき、プラスミドと比較して高かった（＞２倍）。この観察は、意外であり、好都合な動態の結果であった可能性があり；例えば、ｍＲＮＡからのＴＡＬＥＮは、より高速で翻訳されるため、オリゴ分解の前に鋳型を使用することができたことが推測された。しかし、経時的実験から、プラスミド及びｍＲＮＡによりコード化されるＴＡＬＥＮ同士の間で、ＨＤＲの開始にほとんど差がないことが判明した（図８Ｂ）。３０℃でＴＡＬＥＮｍＲＮＡを用いた反復実験の間で、蓄積突然変異及び全ＨＤＲのレベルは同等であり、これは、突然変異型対立遺伝子の大部分が、意図する移入と一致したことを示唆している。
【００２１】
以前の研究では、ＴＡＬＥＮ誘導ｉｎｄｅｌは、選択法又はマーカを用いない限り、長時間の培養後５０〜９０％低下した（Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＴＡＬＥＮ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｉｎ  ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０９：１７３８２−１７３８７  （２０１２）、本明細書では「Ｃａｒｌｓｏｎ  ２０１２」）。言い換えれば、ｉｎｄｅｌを作製することができても、これらは往々にして安定しておらず、安定した変化をみいだすために、選択マーカ法を用いなければならなかった。対照的に、本明細書において、選択的濃縮なしで、３日目及び１０日目に測定したとき、４つの遺伝子座でのＨＤＲレベルがほぼ同等であることが観察され、これは、これらのＨＤＲｉｎｄｅｌ対立遺伝子が培養物中で安定していたことを示している（図８Ａ）。４つの遺伝子座全てで、一貫して高い割合（２５〜５０％）及び安定性の遺伝子編集物は、編集細胞が、選択的濃縮、リポータ又は選択マーカなしの希釈法クローニングにより回収可能であることを示唆した。８つの個別の遺伝子座における明確なｉｎｄｅｌ対立遺伝子について約１，０００コロニーの分析を含むさらなる実験研究によって、１０〜６５％の回収率（平均４２％）が明らかにされたが、ここで、コロニーの３２％以下が意図する編集物について同型接合である（表１）。データは、ｍＲＮＡとしてＴＡＬＥＮを細胞に導入することは、効率及び安定性のために有益であり；また、３０℃で長時間の培養時間も有益であったことを示す。
【００２２】
本明細書で用いる場合、リポータという用語は、リポータ及び選択マーカをコード化する遺伝子又はトランスジーンを指す。本明細書で用いる場合、選択マーカという用語は、正又は負の生存選択基準いずれかにより単離を可能にする形質を付与する、遺伝子発現生体分子を指す。リポータは、例えば、蛍光マーカ、例えば、緑色蛍光タンパク質及び黄色蛍光タンパク質であってもよい。リポータは、選択マーカ、例えば、プロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスフトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、又はキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）であってもよい。表現型マーカは、認識可能な表現型形質（例えば、エピトープ若しくは色）、増殖速度、及び／又は生存性にもとづくマーカである。
【００２３】
遺伝子編集物の差次的安定性
ＮＨＥＪ又はＨＤＲによる安定なＳＮＰの移入を有することが可能であるか否かはわかっていなかった。表１に示すように、ＨＤＲの３日目レベル（７〜１８％）、並びにウシ及びブタＧＤＦ８又はブタｐ６５内の意図するＳＮＰ対立遺伝子を含む細胞クローンの単離（３〜１５％）はいずれも、ｉｎｄｅｌ対立遺伝子の場合より有意に低く、ＨＤＲは、１０〜約５０％の範囲であった。このデータは、ＴＡＬＥＮスペーサ領域における少なくとも４ｂｐの導入又は排除が、ＴＡＬＥＮスペーサ長さの制約と一致して、遺伝子座の切断を低減すると予想されるため、ｉｎｄｅｌは、ＳＮＰよりも安定しているという仮説を示唆するものであった。さらには、同じ遺伝子座内にオリゴを含むＨＤＲ頻度の比較によれば、４ｂｐ挿入対立遺伝子でさえ、ＳＮＰ対立遺伝子より効率的であった（図９）。また、この仮定は、何故配列解析によって、ＧＤＦ８又はブタｐ６５について単離されたＳＮＰ陽性コロニーのほぼ半分が、ＴＡＬＥＮ間隔を変化させると予想されるｉｎｄｅｌを同時に保有するかが明らかにされたかを説明するものでもあった。それにもかかわらず、遺伝子座にそれ以上の変化なしに、最大で約５％のレベルで、ＧＤＦ８（ブタ及びウシの両方）ではＧ９３８Ａ、及びブタｐ６５ではＴ１５９１Ｃの同型接合変換を有するコロニーを回収することができた（表１）。また、ヒツジＦｅｃＢ及びＣａｌｌｉｐｙｇｅ遺伝子座の小さな多型をヤギゲノムに移入させることも可能であった。単一ヌクレオチド又は１〜３ヌクレオチドを正確に改変するこうした能力は、意外であると同時に、有意でもあった。比較として、ｐ６５のＴ１５９１Ｃ部位とオーバーラップするＣＲＩＳＰＲｇＲＮＡを設計して、２つのプラットフォームを用いた移入を比較することも可能であった。意図する部位でのＤＳＢの効率的な生産にもかかわらず、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介のＨＤＲは、３日目に６％より低く、１０日目に検出限界を下回った（図１０）。さらに、ＣＲＩＳＰＲ媒介のＨＤＲを含む修飾クローンの回収は、ＴＡＬＥＮ切断部位がＳＮＰ部位から３５ｂｐ離れていても、ＴＡＬＥＮを含むものより低かった（表１）。第２遺伝子座であるｓｓＡＰＣ１４．２へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導ターゲティングの分析は、より効率的であったが、この部位でＴＡＬＥＮにより誘導されるＨＤＲのレベルには達しなかった（約３０対６０％）（図１１）。
【００２４】
対立遺伝子の移入及び移入したＳＮＰ対立遺伝子を安定化するための戦略
ＴＡＬ結合部位直前に位置する５’チミジンヌクレオチドの保存を仮定して、オリゴＨＤＲ鋳型におけるこれらの塩基の改変（ブロック突然変異（ＢＭ）と呼ぶ）が、編集対立遺伝子の再切断を阻害すると推論した。驚くことに、ＢＭは、ブタＬＤＬＲ又はＧＤＦ８遺伝子座でのＳＮＰ対立遺伝子の維持に何ら有意な影響を及ぼさなかった（図１２、パネルａ）。これは、オリゴ鋳型ＨＤＲの変換路がかなり短く、ＢＭを組み込まないか、又は５’−チミジンの改変が、ＴＡＬＥＮ活性を完全には無効にしないかのいずれかであることを示唆した。
【００２５】
オリゴ及びＴＡＬＥＮｍＲＮＡでトランスフェクトした細胞の集団からの標的部位にフランキングする２００〜２５０ｂｐアンプリコンについて、ＩＬＬＵＭＩＮＡ大規模シークエンシングを実施した。ブタ及びウシにおける５つの遺伝子座から得られた結果から、挿入対立遺伝子が一般に、集団において、より優勢かつ安定的であったことが判明した（図１３）。ＢＭは、培養物中で意図する対立遺伝子の保存にほとんど影響しなかったが、挿入編集物に対して、ＳＮＰ編集対立遺伝子へのＢＭの組込みへの若干の偏りがあった（図１４）。本発明者らのコロニー分析により、ｂｔＧＤＦ８及びｐ６５における意図ＳＮＰ（ｉＳＮＰ）、Ｇ９３８Ａ又はＴ１５９１Ｃ変換の組込みに基づいて分類したリードから、ｉＳＮＰのほぼ半数のリードが、追加突然変異（ｉＳＮＰ＋Ｍｕｔ）を有し（図１３、パネルｂ）、その大部分がｉｎｄｅｌであった（図１４）ことが明らかにされた。スペーサにｉｎｄｅｌを有するｉＳＮＰｂｔＧＤＦ８リードの大部分が、１つ又は両方のＢＭも含有し（データは、示していない）、これは、保存された５’−チミジンの修飾が、再切断と、それに続くｉｎｄｅｌ生成を抑制することができなかったことを証明している。従って、この塩基は、保存により示唆されるほどＴＡＬＥＮ結合にとって重要ではないに違いなく、前述するようにＢＭが対立遺伝子を保存する能力がないという分子基盤を提供する。
【００２６】
ＳＮＰ編集物の再切断を低減するための別の戦略は、その結合部位が標的ＳＮＰとオーバーラップするようにＴＡＬＥＮを設計することである。ウシＧＤＦ８へのＧ９３８Ａ  ＳＮＰの移入用のＴＡＬＥＮ結合部位内のＲＶＤ／ヌクレオチドミスマッチの影響を評価した。２ペアのＴＡＬＥＮを作製し、１つは、野生型「Ｇ」対立遺伝子（ｂｔＧＤＦ８３．６−Ｇ）に結合させ、もう１つは、意図する「Ａ」対立遺伝子（ｂｔＧＤＦ８３．６−Ａ）に結合させた（図１２のパネルｂ）。各ＴＡＬＥＮペアを有するＨＤＲは、３日目で同等であったが、１２日目で測定したレベルは、野生型「Ｇ」対立遺伝子に結合したＴＡＬＥＮを用いた方が有意に高く、再切断が、修復対立遺伝子を完全にターゲティングするｂｔＧＤＦ８３．６−Ａの方が優勢であったことを示す。様々なＲＶＤ／ヌクレオチドミスマッチは、野生型「Ｇ」ＴＡＬＥＮに用いたＮＮ−ＲＶＤが、Ｇ及びＡヌクレオチドの両方に結合することができるため、ＨＤＲ対立遺伝子の維持に、より大きな影響をもたらし得る。ブタＥＩＦ４Ｇ１の修飾の場合、単離したコロニーの７０％近くが編集対立遺伝子を含有し、その半分超が同型接合であったことから、３つのＲＶＤ／ヌクレオチドミスマッチは、ＨＤＲ−編集物の保護のために十分であったことがわかった（表１及び図１５）。従って、再切断に抵抗するための標的遺伝子座の意図的改変は、編集物を保存する上で有効な戦略である。
【００２７】
遺伝子編集は、動的プロセスであると仮定した。ＴＡＬＥＮ切断及び再切断は、ＮＨＥＪ、オリゴ鋳型を有するＨＤＲ、及び鋳型として姉妹染色体を有するＨＤＲを用いた修復によって流れ込むと立論する。観察されるＳＮＰ対立遺伝子の消失は、低温処理の延長、ＴＡＬＥＮｍＲＮＡトランスフェクションからのＴＡＬＥＮ活性のバーストよりも持続させるのに十分長く細胞増殖を低速にすることによって、低減され得ると仮定した。実際に、また驚くことに、この延長は、延長培養後に回収したＳＮＰＨＤＲ編集対立遺伝子のレベルをほぼ３倍にした（図１６）。
【００２８】
生物医学用途のために、要望される機能性を形成する重要な塩基以外の塩基の改変は、要望の表現型が達成され、しかも他の変化が、明らかに機能的関連性のないものであれば、許容される。しかし、本発明者らは、農業で用いられる動物の場合、それ以上の変化なしで天然（ネイティブ）対立遺伝子を複製するか、又はそれ以上の変化なしで意図する編集物のみを作製することが望ましいと考える。ミスマッチを、成功したＨＤＲ構築物の移入から取得する手法とは対照的に、ミスマッチは、ＲＶＤ配列の変化から得ることができる。ＴＡＬＥＮの場合、このプロセスは、ネイティブ対立遺伝子において対応するヌクレオチドと結合しないＲＶＤと一緒に、ＴＡＬＥＮモノマーを構築する必要がある（図１７、パネルｃ）。要望の再切断を阻止するために、ヌクレアーゼ（この場合、ＴＡＬＥＮ）の設計におけるミスマッチのこのコンセプトは新規であり、以下の理論の下で作用する。ＴＡＬＥＮは、その結合活性がほぼ排除される前に、その結合領域中のいくつかのミスマッチしか許容することができない。従って、依然として切断するネイティブ対立遺伝子と共に意図的ミスマッチを有するＴＡＬＥＮを作製することができるが、形成されるミスマッチが増えると、結合が無効になるであろう。意図的ミスマッチの理論は、要望される対立遺伝子の移入後に、新規のミスマッチが、ＴＡＬＥＮコードにおける改変ミスマッチに追加の作用をもたらし、重要な転換点を通過して、ＴＡＬＥＮを不活性にするというものである。直観に反して、ＲＶＤの意図的ミスマッチによる標的に対するヌクレアーゼ親和性の低下は、特定の突然変異を一塩基多型（ＳＮＰ）まで移入させ、再切断の結果として、不要なｉｎｄｅｌを減らす戦略を提供する。
【００２９】
一例として、ＴＡＬＥＮペア（ｃａＣＬＩＰＧ１．１）は、ヤギ（Ｃａｐｒａ  ａｅｇａｇｒｕｓ  ｈｉｒｃｕｓ）ゲノムにおいてＣＬＰＧ遺伝子座をターゲティングするように、ゼロミスマッチで設計した（図１７のパネルａ）。所望の突然変異は、アデニンからグアニンＳＮＰであり、これは、後ろ四半部筋肉肥大の増大に関連している。ＳＮＰは、ＡｖａＩＩ制限部位の消失のために、コロニーの容易な遺伝子型決定を可能にした。初期制限消化アッセイは、有望な結果を有するいくつかのコロニーを示したが、各コロニーの対立遺伝子を配列決定したところ、各々が、要望されるＳＮＰ以外に、不要なｉｎｄｅｌを含有したため、意図する産物は、１４のうちゼロであった（図１７のパネルｂ及び意図的ミスマッチを用いた成功率と題する表２）。意図的ミスマッチ手法を試験するために、さらに３つのＴＡＬＥＮペアを、異なる数及び位置の意図的ミスマッチと一緒に作製した（図１７のパネルｃ）。これらのＴＡＬＥＮは、オリジナルのｃａＣＬＰＧ１．１  ＴＡＬＥＮペアと同様の頻度で野生型対立遺伝子を切断することができた（図１７のパネルｄ）。ＨＤＲに対する作用及び不要なｉｎｄｅｌの減少を観察するために、個々のコロニーを、ｃａＣＬＰＧ１．１（２つのミスマッチ）及びＨＤＲ鋳型でトランスフェクトした細胞から取得した。オリジナルｃａＣＬＰＧ１．１  ＴＡＬＥＮを用いた結果とは対照的に、１５のＡｖａＩＩ耐性コロニーのうち３つ（２０％）が、要望されるＳＮＰについて陽性であり、追加的突然変異を含まなかった（３／１５＝２０％）（図１７のパネルｅ及び表２）。従って、意図する対立遺伝子の誘導は、意図的ミスマッチに依存的であった。
【００３０】
別の例では、ウシＤＧＡＴ遺伝子において、特に２つの塩基を改変することを意図した。ＣＬＰＧ遺伝子座と同様に、ＨｉｎｄＩＩＩ部位について陽性であった０／１２ＲＦＬＰコロニーがｉｎｄｅｌを含まなかったことから、意図的ミスマッチなしで要望の突然変異を移入させる試みは失敗した（図１８パネル及び表２）。意図的ミスマッチ法を用いたところ、集団レベルで総合的割合のＨＤＲを認めた（図１８のパネルｃ）。しかし、個々のコロニーからの配列決定により、３つの意図的ミスマッチ設計のうち２つが成功し、それぞれ１４．５及び１４．６について２／１２及び３／１２の正しい対立遺伝子が得られることが明らかとなった（図１８のパネルｅ及び表２）。ＣＬＰＧ遺伝子座と同様に、意図した対立遺伝子の誘導は、ＲＶＤコード化された意図的ミスマッチに応じて変動した。表１に示すデータは、ＴＡＬＥＮＳをコード化するｍＲＮＡを、ＨＤＲを指令するための鋳型としてのオリゴヌクレオチドと組み合わせて、ゲノム編集戦略のためのいくつかの基準を達成したことを明らかにした：１）標的ヌクレオチドのみが変化し、ｍＲＮＡトランスフェクションは、プラスミドＤＮＡの意図しない組込みを回避したこと、２）ＳＮＰについての約１０％から、いくつかのより大型の改変については約５０％まで；遺伝子編集物は効率的であったこと、並びに３）本方法は、信頼性があり；１６／１６部位（１５遺伝子）の標的改変が達成されたこと。本明細書に報告される効率及び正確さは、非常に驚くべきものである。
【００３１】
遺伝子編集における２つの懸念事項は、標的部位での変化を安定化することと、意図しない部位の修飾を回避することである。第１に関して、単一塩基対、すなわちＳＮＰの変化を指令するＨＤＲ編集物が消失し得るというエビデンスが認められた（図１２及び図１３のパネルｂ）。標的ＤＮＡ配列の前に位置するチミジンが、ＴＡＬ結合に影響を与えるという推測に基づいて、ＢＭを導入することにより、移入した対立遺伝子の再切断をブロックすることを試みた。しかし、ＢＭは、ＴＡＬＥＮ活性及び編集対立遺伝子の再切断を阻止しないことが判明した（図１２並びに図１４及び１５）。対照的に、複数のＳＮＰ又は追加配列の導入（図８Ａ及び図１５）の導入の結果、より安定なＨＤＲ２２６編集物が得られた。驚くことに、低温培養の延長によって、移入したＳＮＰ対立遺伝子の安定化が達成されることがわかった。低温処理は、細胞周期のＧ１相を延長することにより細胞増殖を低速にし、そのため、この処理は、細胞周期依存的に姉妹染色体鋳型修復に対して、オリゴ−ＨＤＲを差次的に促進すると立論される。機構とは関係なく、この手法は、ＳＮＰ対立遺伝子の正確な移入を有する細胞を回収する簡単な戦略を提供する。
【００３２】
正確な遺伝子編集によって様々な目的が達成された（表１）。生物医学関連性を有する遺伝子のノックアウトは、４ｂｐ  ｉｎｄｅｌを有するコード配列を分断することによって達成された。この戦略は、信頼性があり、一般に、クローンの約４０％（２６〜６０％の範囲）においてＨＤＲ編集物をもたらし、そのうち、最大で１／３は同型接合であった。同様の頻度で、修復されるｌｏｘＰ（ｍｌｏｘＰ）部位をウシ及びブタのＲＯＳＡ２６及びＳＲＹ遺伝子座に組み込んだ。これは、リコンビナーゼ依存的カセット交換法により、家畜への新規配列の挿入のためのランディングパッド（ｌａｎｄｉｎｇ  ｐａｄ）（セイフハーバー（ｓａｆｅ  ｈａｒｂｏｕｒ）とも呼ばれる）として用いることができる。これまで、ＮＨＥＪ編集物のみが、家畜のＹ染色体について立証されていたが、ＴＡＬＥＮは、少なくともマウスにおいて証明されたように、ノックアウト／ノックインの直接的刺激に好適である。また、種／品種間にナイーブ対立遺伝子の移入もあった。これは、和牛（Ｗａｇｙｕ  ｃａｔｔｌｅ）及びランドレース（Ｌａｎｄｒａｃｅ）ブタのゲノムへのＧＤＦ８（それぞれ、ピエモンテ牛（Ｐｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅ）及びベルギアン・ブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｃａｔｔｌｅ）由来のＳＮＰ  Ｇ９３８Ａ２３、２５又は８２１ｄｅｌ１１２３−２５）の筋肉肥大突然変異を含む。
【００３３】
場合により、標準プラスミドベクター及び相同組換えカセットを用いてターゲティングする遺伝子は、トランスジーン送達に適していないであろう。場合により、反復エレメント又は低情報量（ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）ＤＮＡによって取り囲まれる部位にトランスジーンを配置しようとすることを含み得る。これらの場合では、ユニークな配列の小さな領域にトランスジーンを組み込むのに、オリゴＨＤＲによって必要とされる短い相同性が好ましいこともある。しかし、オリゴＨＤＲ用のカーゴ容量は、トランスジーンを送達する上で十分ではない。この問題を回避するために、本発明者らは、小さな挿入（例えば、ｌｏｘＰ部位）の送達用のオリゴＨＤＲの効率と、トランスジーンの部位特異的挿入のためのリコンビナーゼ依存的カセット交換（ＲＭＣＥ）の大きなカーゴ容量を組み合わせることを試みた。リコンビナーゼ依存的カセット交換（ＲＭＣＥ）は、部位特異的組換えプロセス（ＳＳＲ）の特徴に基づく方法である。このプロセスは、標的組込みによる高等真核生物ゲノムの系統的な反復修飾を可能にする。この結果は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含む類似カセットへの既存の遺伝子カセットの完全な交換によるＲＭＣＥを用いて達成される。
【００３４】
家畜などの高等脊椎動物において遺伝子修飾動物を作製する目的でＲＭＣＥを使用することには問題がある。重要な問題は、老化前の初代家畜細胞の短い寿命に起因するものであり、この方法は、単一の処理で実施しなければならない。一部の他のタイプの細胞では、ＲＭＣＥ方法を連続的に実施することが可能であり、この場合、挿入したＬｏｘＰ部位を有する細胞クローンを単離した後、ＲＣＭＥ機構によるトランスフェクション、続いて、クローンの単離を実施して、正しいターゲティングイベントを有するものをみいだす。本出願人は、４つの成分：１）ＳＲＹ  ＴＡＬＥＮ、２）２つのＲＭＣＥ適合性ｌｏｘＰ部位を含むＳＲＹとの相同性を有するオリゴ、３）ＲＭＣＥ適合性トランスジーン、及び４）Ｃｒｅリコンビナーゼの供給源で、初代線維芽細胞を同時にトランスフェクトすることによって、このプロセスを実施しようと試みた。図１９において、ＲＭＣＥトランスジーンは、組込みイベントについての選択を可能にするプロマイシン耐性遺伝子であった。プロマイシン耐性コロニーの数は、ＹＦＣ−Ｃｒｅが供給されたとき、ＹＦＣ−Ｃｒｅの代わりにｍＣｈｅｒｒｙ発現カセットを含有する対照群とは対照的に、有意に増加した。プロマイシン耐性コロニー（３０℃又は３７℃のいずれかで３日間処理した細胞から選択）のうち、８％（ｎ＝９５）及び４％（ｎ＝９５）が、ＲＭＣＥベクターの正しいターゲティングについて陽性であった。これらの結果から、ＴＡＬＥＮ、ｌｏｘＰ部位を含むＨＤＲ鋳型、ｌｏｘＰによってフランキングされる目的のトランスジーン、並びにＴＡＬＥＮ標的遺伝子座へのＲＭＣＥ媒介組換えをもたらすＣｒｅ−リコンビナーゼｍＲＮＡを同時に提供することが可能であることが証明された。
【００３５】
本発明の実施形態は、例えば、外性遺伝子のためのランディングパッドである、宿主細胞又は胚に導入される配列と一緒にＨＤＲ鋳型を用いる相同性依存型修復の方法を含む。ランディングパッドという用語は、その慣用的意味に従い、部位特異的認識配列、又は宿主細胞のゲノムに安定に組み換えられる部位特異的組換え部位を指す。宿主ゲノム中の異種部位特異的組換え配列の存在によって、リコンビナーゼが、宿主ゲノムへの異種ポリヌクレオチド又は外性の部位特異的挿入を媒介することを可能にする。
【００３６】
実施形態は、キット、使用、組成物、並びに細胞の染色体ＤＮＡ中にランディングパッドを形成する方法を包含し、この方法は、標的ヌクレアーゼ系及びＨＤＲ鋳型を細胞に導入するステップを含み、標的ヌクレアーゼ系は、染色体ＤＮＡ中の内在性コグネイト配列に特異的に結合するためのＤＮＡ結合メンバーを含み、標的ヌクレアーゼ系及びＨＤＲ鋳型が作動することにより、ＨＤＲ鋳型配列に対して同一性を有するように染色体ＤＮＡを改変し、ＨＤＲ鋳型配列は、ランディングパッドを含む。本方法は、初代細胞又は胚に適用することができる。実施形態は、標的ヌクレアーゼ、ランディングパッドをコード化するＨＤＲ鋳型、ランディングパッドと適合性の外性遺伝子、並びにランディングパッドと適合性のリコンビナーゼの供給源を含み；これらは、全てを同時に導入してもよい。同時という用語は、細胞を複数回連続的に処理する仮定の工程とは対照的であり；この用語は、文字通りに同時導入、又は同時に生体活性である因子の全てを有するように計算された導入を指すという認識で、文脈中に維持されなければならない。ランディング部位は、例えば、ＲＭＣＥ適合性ｌｏｘＰ部位、ＦＲＴ、ｒｏｘ、ＶｌｏｘＰ、ＳｌｏｘＰであってよい。リコンビナーゼは、例えば、Ｃｒｅ、ＦＬＰ、Ｄｒｅであってよい。
【００３７】
他の実験において、動物の健康状態の改善のために、ＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子を肉牛品種から、有角乳牛由来細胞中に移入した。アフリカブタコレラウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）抵抗力のための候補ＳＮＰ対立遺伝子（ｐ６５３９のＴ１５９１Ｃ）をイボイノシシから在来のブタ細胞のゲノムに移入して、繁殖力の増強（ＦｅｃＢ；ＢＭＰＲ−ＩＢ）及び片親起源依存的筋肉肥大（Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ）の原因となるヒツジＳＮＰをヤギゲノムに移入させた。このような移入は、これまで、育種によって不可能であったため、近縁種における明確な遺伝子作用の評価を可能にするであろう。非減数分裂対立遺伝子移入は、従来、選択的濃縮なしでは不可能であったが、本明細書で報告する効率は、以前得られたＷＩＴＨ選択より１０３〜１０４倍高い。このような高レベルの非選択単一対立遺伝子移入は、一世代の家畜において複数の対立遺伝子を改変して、遺伝子改良に及ぼされる長期世代間隔の影響を低減することが実現可能であることを示唆している。さらに、同型接合性に対する効率的編集は、育種間隔当たりの移入の速度を大幅に高めるであろう。
【００３８】
本明細書に記載する本発明のさらなる詳細事項として、カスタマイズしたエンドヌクレアーゼを用いて、２つの独立した遺伝子座に正確な編集物を有する生存動物を作製した。ＤＡＺＬ遺伝子を破壊するように編集されたブタは、生殖細胞移植によるヒト妊性の回復を研究するため、又はブタ、ヤギ、及びげっ歯類において立証されるように遺伝子修飾生殖系列幹細胞の移入による遺伝子修飾子孫の生産のためのモデル化として有用である。ＡＰＣの遺伝子編集対立遺伝子は、治療薬、外科的介入又は検出方法の前臨床評価のための結腸癌のサイズ関連モデルを提供する。これらの結果は、多型、並びに家畜への天然多型を模倣する改変などの遺伝子修飾の導入を明らかにする。遺伝子編集技術は、動物タンパク質に対し増大する世界的需要を満たすのに役立つ種内及び種間対立遺伝子移入によって、農業製品の遺伝子改良を加速する上で有用である。これは、さらに、薬剤及びデバイス試験のための明確な遺伝子学を用いた大型動物の開発、又は治療用細胞及び臓器の開発にも有用である。他の用途として、先天性及び感染性疾患の機序を理解するための、並びに遺伝子編集及び制御のための方法を改善するための研究に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いることができる細胞の作製が挙げられる。
【００３９】
ヌクレアーゼ系による再編集を回避するための遺伝子編集
実験結果は、標的（エンド）ヌクレアーゼ系が、意図するコグネイト部位でｄｓＤＮＡを効果的に切断していることを示唆した。データの解析から、ヌクレアーゼが、既に鋳型化された部位に結合して、その部位を再切断し、ｄｓＤＮＡをその元の配列に復帰させることが示された。標的ヌクレアーゼ系は、タンパク質−ＤＮＡ結合又は核酸−ＤＮＡ結合のいずれかによって、コグネイトＤＮＡに結合するモチーフを含む。実験から、多型を含有する鋳型を選択して、標的ヌクレアーゼによる再結合又は再切断を妨げ、これによって、正確に移入した細胞クローンの数を有意に増加できることが立証された。
【００４０】
再結合を低減するための実施形態は、細胞の染色体ＤＮＡに外性対立遺伝子を移入させるための相同組換え修復（ＨＤＲ）の方法を含み、この方法は、標的ヌクレアーゼ系と、外性対立遺伝子を含むＨＤＲ鋳型とを、細胞に導入することを含み、標的ヌクレアーゼ系は、染色体ＤＮＡ中の内在性コグネイト配列に特異的に結合するためのＤＮＡ結合メンバーを含み、標的ヌクレアーゼ系及びＨＤＲ鋳型が作動することにより、ＨＤＲ鋳型配列に対して同一性を有すると共に、内在性対立遺伝子の代わりに染色体ＤＮＡに外性対立遺伝子を移入させるように染色体ＤＮＡを改変する。一実施形態では、ＨＤＲ鋳型配列は、一旦移入したゲノム配列に対するＤＮＡ結合メンバーの特異的結合を低減することを意図する多型を導入するように設計される。或いは、標的ヌクレアーゼのＤＮＡ結合メンバーは、内在性又は外性配列に存在しないヌクレオチド配列を認識するように設計することもできる。この不安定な（ｈｏｂｂｌｅｄ）ＤＮＡ結合メンバーは、内在性対立遺伝子の切断を可能にするのに十分であるが、ＨＤＲ鋳型からの意図する多型は、標的部位をさらに改変して、正確に移入した対立遺伝子の再切断を低減する。これによって、そうした正確な移入イベントを含有する集団内に、より高頻度の細胞クローンが生じる。
【００４１】
対立遺伝子という用語は、１遺伝子の２つ以上の形態の１つを意味する。生物の集団又は種は、典型的に、様々な個体同士の間で、各遺伝子座に複数の対立遺伝子を含む。１遺伝子座での対立遺伝子変異は、集団内に存在する対立遺伝子の数（多型）、又は異型接合体の割合として測定可能である。本明細書で用いる場合、天然の対立遺伝子という用語は、改変された同じ種の生物において天然にみいだされる対立遺伝子を意味する。新規対立遺伝子という用語は、非天然対立遺伝子を意味する。ヤギに配置されたヒト対立遺伝子は、新規対立遺伝子である。合成対立遺伝子という用語は、まだ天然にみいだされていない対立遺伝子を意味する。外性対立遺伝子は、生物に導入されるものであり、内在性対立遺伝子は、細胞中に既に存在するもので、通常、その野生型の修飾されていない状態で、生物に存在するものである。異型接合である動物は、２つの遺伝子を有する。場合により、異型接合動物に既に存在する対立遺伝子に対して同型接合の動物を作製するために、外性対立遺伝子を導入することが望ましい。種間対立遺伝子の移動とは、１動物種から別の種への移動を、種内とは、同じ種の動物間の移動を意味する。外性対立遺伝子という用語は、広義であり、例えば、ネイティブ、新規又は合成ＳＮＰ又はｉｎｄｅｌ、リポータ、エンドヌクレアーゼ消化部位、プロモータ、及びベクターを有するＤＮＡを含む。
【００４２】
相同組換え修復（ＨＤＲ）は、ｓｓＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）病変を修復するための細胞内の機構である。この修復機構は、病変部位に対して有意な相同性を有する配列を有するＨＤＲ鋳型が存在するとき、細胞によって使用され得る。特異的結合は、この用語が生物学の分野で一般に用いられているように、非標的配列と比較して、比較的高い親和性で、標的に結合する分子であって、一般に、複数の非共有結合相互作用、例えば、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などを含む分子を指す。特異的結合は、基質との結合及び基質からの放出のプロセスを含み；そのため、これは、基質との結合及び基質からの放出の効率の変化、並びに基質との結合の強度によって影響され得る。従って、特異的結合の低減は、結合イベントの数を減じる基質に対する親和性の低下によるものか、又は結合が維持される期間を減じる基質との結合の強度の低下に起因し得る。標的エンドヌクレアーゼに関連して、特定の理論に束縛されるものではないが、エンドヌクレアーゼ又はＤＮＡに対するガイド配列の特異的結合の変化は、実際の結合に影響し得るだけではなく、標的及び／若しくは鋳型ＤＮＡ又はＲＮＡと複合体を形成するプロセス（完全には理解されていない）にも関与し得る。従って、染色体レベルでの実際のイベントが実際のＤＮＡと比較して増減を伴う場合であっても、特異的結合は、実際のＤＮＡ結合イベントに対して測定することができ、これらのプロセスを操作するのに有用な特徴である。特異的ハイブリダイゼーションは、相補的配列を有する核酸同士の特異的結合の形態である。また、タンパク質も、例えば、ＴＡＬＥＮ若しくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系において、又はＧａｌ４モチーフにより、ＤＮＡに特異的に結合することができる。対立遺伝子の移入とは、鋳型誘導方法により、内在性対立遺伝子に対して外性対立遺伝子をコピーするプロセスを指す。内在性対立遺伝子は、一部の状況では、実際に切除し、外性核酸対立遺伝子で置換してもよいが、本発明の理論は、このプロセスがコピー機構であるというものである。対立遺伝子は遺伝子ペアであることから、それらの間には有意な相同性がある。対立遺伝子は、タンパク質をコード化する遺伝子であってもよく、或いは生体活性ＲＮＡ鎖のコード化又は調節タンパク質若しくはＲＮＡを受けるための部位の提供など、他の機能を有し得る。
【００４３】
ＨＤＲ鋳型は、移入させる対立遺伝子を含む核酸である。鋳型は、ｄｓＤＮＡ又は一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であってよい。ｓｓＤＮＡ鋳型は、好ましくは約２０〜約５０００残基であるが、それ以外の長さを用いることもできる。当業者は、明示した範囲内のあらゆる範囲及び値；例えば、５００〜１５００残基、２０〜１００残基が考慮されることを直ちに理解されよう。鋳型は、内在性対立遺伝子に隣接するＤＮＡに対する相同性を提供するフランキング配列をさらに含んでもよい。鋳型は、標的ヌクレアーゼ系に結合する、従って、この系のＤＮＡ結合メンバー用のコグネイト結合部位である配列を含んでもよい。コグネイトという用語は、典型的に相互作用する２つの生体分子、例えば、受容体及びそのリガンドを指す。ＨＤＲプロセスに関連して、生体分子の１つは、意図する、例えば、コグネイト、ＤＮＡ部位又はタンパク質部位と結合する配列を用いて設計してもよい。
【００４４】
標的ヌクレアーゼ系との特異的結合を低減するための一実施形態は、内在性ＤＮＡとのアラインメントに対して、ＨＤＲ鋳型に変化を形成するステップを含む。１タイプの変化は、コグネイトメンバー同士の間にミスマッチを形成するように設計する。１つの変化は、１つ又は複数の残基の挿入又は欠失である。別の変化は、１残基を、結合を促進しない別の残基で置換することである。残基という用語は、分子鎖における単位、例えば、タンパク質中のアミノ酸又は核酸中の塩基を指す。変化を形成する１つの場所は、系のＤＮＡ結合メンバー用のコグネイト結合部位である。
【００４５】
別のタイプの変化は、スペーサと作動する系、例えば、ＴＡＬＥＮペアにおいて、スペーサ中に変化を形成することによって、ヌクレアーゼの動作を妨害するように設計するものであり、この変化はスペーサ領域内に形成してよい。これらの変化は、欠失を含んでもよく、例えば、これによって、ヌクレアーゼの切断形成が妨害される。こうした多様な変化は、配列をアラインメントしたとき、ミスマッチを生じることから、一般に、本明細書においてミスマッチと呼ばれ；これに関連して、欠失、挿入、又は置換はミスマッチである。当業者は、ミスマッチが、特異性によって容易にみいだされるように、常用的に配列のアラインメントを行う。ヌクレアーゼのペアは、共同性をもたらす間隔を必要とし；それらの活性は、スペーサへの付加又は除去により破壊することができる。
【００４６】
別の実施形態は、外性対立遺伝子において、ミスマッチを配置する。この系のＤＮＡ結合メンバーは、少なくとも部分的に内在性対立遺伝子とオーバーラップする部位で結合するように設計する。一旦これを移入させて、外性対立遺伝子と同一性を有するようにすると、ＤＮＡ結合メンバーは結合を低減した。従って、ＤＮＡ結合メンバーのコグネイト部位は、好ましい内在性対立遺伝子から、好ましくない外性対立遺伝子へと変化する。コグネイト部位は、対立遺伝子の全部、又はその一部のみを含み得る。外性対立遺伝子へのミスマッチの導入は、外性対立遺伝子の移入を安定化するのに必要であることは意外である。明らかに、再切断の問題は、移入した対立遺伝子の安定性に非常に大きな影響をもたらす。この影響を示すデータは、同等の効率でのプロセスが従来の方法では利用可能でなかったため、これまで他者によって得られていなかた。
【００４７】
いくつかの実施形態は、ＨＤＲ鋳型形成法を用いて、残基の挿入、欠失、又は置換によりこれらの様々な場所でのミスマッチを形成するステップを含む。例えば、１〜６０個の残基を挿入、欠失、又は置換してよい。当業者は、明示した範囲内のあらゆる範囲及び値；例えば、１〜３残基、少なくとも１０残基、４残基、４〜２０残基などが考慮されることを直ちに理解されよう。これらのうち１つ又は複数、例えば、１箇所での挿入、別の箇所での欠失、及びその他の箇所での置換を組み合わせることができる。
【００４８】
いくつかの実施形態は、内在性染色体ＤＮＡとアラインメントしたとき、ＤＮＡ結合メンバー配列中にミスマッチを配置するように標的エンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合メンバーを設計するステップを含む。このミスマッチは、典型的に、外性ＤＮＡについてのミスマッチであろう。これらのミスマッチは、標的ヌクレアーゼの再結合を低減する。既述したこの方法、例えば、外性対立遺伝子の移入位置；ＤＮＡ結合コグネイトにおいてミスマッチを有するＨＤＲ鋳型；又は間隔を変えるためにスペーサ領域内で、選択されるエンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合部位と組み合わせて、さらなるミスマッチを使用してもよい。
【００４９】
これらの様々な実施形態は、リポータを含まない系において、並びに、ＳＮＰ又はＳＮＰに関連する実施形態を作製するために、実施することができる。細胞又は動物は、例えば、脊椎動物、家畜、霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギ、魚、イヌ、マウス、ネコ、ラット、及び実験動物であってよい。
【００５０】
ＳＮＰ
これらの実験結果は、染色体ＤＮＡ中に一塩基多型（ＳＮＰ）を配置するための方法を提供する。ＳＮＰは、予定位置に配置することができる。配置に対するこの制御は、先例がない。例えば、ＳＮＰは、他のＳＮＰなしで、又は他の位置での修飾なしに、内在性対立遺伝子中に配置することができる。これに加え、また重要なことには、内在性対立遺伝子を、１ＳＮＰしか違わない外性対立遺伝子で置換することもできる。そして、この置換は、細胞のゲノム中の任意の位置の染色体ＤＮＡに対する最小の改変で実施する。１つ又は複数のＳＮＰを移入させることができる。
【００５１】
一実施形態は、細胞の染色体ＤＮＡ中に一塩基多型（ＳＮＰ）を形成する方法であり、この方法は、標的ヌクレアーゼ系及びＨＤＲ鋳型を細胞に導入するステップを含み、標的ヌクレアーゼ系は、染色体ＤＮＡ中の内在性コグネイト配列に特異的に結合するためのＤＮＡ結合メンバーを含み、標的ヌクレアーゼ系及びＨＤＲ鋳型が作動して、ＨＤＲ鋳型配列に対して同一性を有するように染色体ＤＮＡを改変し、ＨＤＲ鋳型配列は、ＳＮＰを含む。ＨＤＲ鋳型は、複数のＳＮＰ又はただ１つのＳＮＰを含んでもよい。例えば、挿入、欠失、又は置換などの他の変化が存在してもよい。又は、変化は、内在性対立遺伝子に移入させる単一ＳＮＰ、又は１つ又は複数のＳＮＰに限定してもよい。ＨＤＲ鋳型配列は、内在性対立遺伝子との配列アラインメントにＳＮＰを含む外性対立遺伝子によって、内在性対立遺伝子を置換する外性対立遺伝子を含んでもよい。
【００５２】
別の実施形態は、標的ヌクレアーゼ系のＤＮＡ結合メンバーのためのコグネイト部位にＳＮＰを配置するステップを含む。ＳＮＰは、ＤＮＡ結合メンバーとの結合を低減するように選択することができる。このようにして、１つ、又は複数のＳＮＰを配置してよい。さらなる変化、ＳＮＰ、又はその他が対立遺伝子に存在してもよく、又は存在しなくてもよい。染色体ＤＮＡは、他の変化が全てなくてもよい。
【００５３】
いくつかの実施形態は、遺伝子修飾動物、内在性対立遺伝子を有する動物の品種に属する動物、内在性対立遺伝子から、別の種又は別の動物品種にみいだされる外性対立遺伝子へと動物の染色体ＤＮＡを変化させるような、ＳＮＰでの遺伝子変化を含む動物を包含する。動物は、以下のうち１つ又は複数を含んでよい：内在性対立遺伝子から、別の種又は別の動物品種にみいだされる外性対立遺伝子へと動物の染色体ＤＮＡを変化させる複数のＳＮＰ；さらに、リポータを含まないこと；多型、１つ又は複数のＳＮＰに対して同型接合であること；家畜、霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、鳥類、ニワトリ、ウサギ、魚類、イヌ、マウス、ネコ、ラット、及び実験動物。
【００５４】
これらの様々な実施形態は、リポータを含まない系において、並びにＳＮＰ又はＳＮＰに関する実施形態を作製するために、実施することができる。細胞又は動物は、例えば、家畜、霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、鳥類、ニワトリ、ウサギ、魚類、イヌ、マウス、ネコ、ラット、及び実験動物であってよい。
【００５５】
標的ヌクレアーゼ系
転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）などのゲノム編集ツールは、生物工学、遺伝子療法及び多くの生物の機能的ゲノム研究の分野に影響を与えた。最近では、ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）が、相補的ＲＮＡ分子によるその標的部位に向けられた。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ系は、ＲＧＥＮである。ｔｒａｃｒＲＮＡは、別のこうしたツールである。これらは、標的ヌクレアーゼ系の例であり：これらの系は、ヌクレアーゼを標的部位に局在化するＤＮＡ結合メンバーを有する。次に、部位は、ヌクレアーゼにより切断される。ＴＡＬＥＮ及びＺＦＮは、ＤＮＡ結合メンバーに融合されるヌクレアーゼを有する。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲは、標的ＤＮＡ上に互いにみいだされるコグネイトである。ＤＮＡ結合メンバーは、染色体ＤＮＡ中にコグネイト配列を有する。ＤＮＡ結合メンバーは、典型的に、意図する部位にもその付近にも核酸分解作用が起こらないように、意図するコグネイト配列を考慮して設計される。いくつかの実施形態は、こうした系の全て、限定はしないが、以下：ヌクレアーゼ再切断を最小化する実施形態、意図する残基に正確にＳＮＰを作製する実施形態、並びにＤＮＡ結合部位で移入させる対立遺伝子の配置などに適用可能である。
【００５６】
ＴＡＬＥＮ
ＴＡＬＥＮという用語は、本明細書で用いる場合、広義であり、例えば、Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐａｃｔ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ＴＡＬＥＮｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．４：１７６２  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２（２０１３）に記載されているように、別のＴＡＬＥＮからの支援なしで二本鎖ＤＮＡを切断することができるモノマーＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語はまた、同じ部位でＤＮＡを切断するように、一緒に作動するように操作されたＴＡＬＥＮのペアの一方又は両方のメンバーを指すためにも用いられる。一緒に作動するＴＡＬＥＮは、左ＴＡＬＥＮ及び右ＴＡＬＥＮと呼ばれることもあり、これは、ＤＮＡ又はＴＡＬＥＮペアの螺旋方向（ｈａｎｄｅｄｎｅｓｓ）に関して言う。
【００５７】
ＴＡＬの暗号が報告されており（ＰＣＴ公開国際公開第２０１１／０７２２４６号パンフレット）、ここで、各ＤＮＡ結合反復配列は、標的ＤＮＡ配列において１塩基対を認識することを担う。残基をアセンブリングして、ＤＮＡ配列をターゲティングしてもよい。手短には、ＴＡＬＥＮの結合用の標的部位を決定し、ヌクレアーゼと、標的部位を認識する一連のＲＶＤとを含む融合分子を作出する。結合すると、ヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断し、これによって、細胞修復機構が作動して、切断末端での遺伝子修飾を実施することができる。ＴＡＬＥＮという用語は、転写活性化様（ＴＡＬ）エフェクター結合ドメインとヌクレアーゼドメインとを含むタンパク質を指し、それ自体で機能的なモノマーＴＡＬＥＮ、並びに別のモノマーＴＡＬＥＮとの二量体化を必要とする他のＴＡＬＥＮを含む。二量体化によって、両方のモノマーＴＡＬＥＮが同一であれば、ホモ二量体ＴＡＬＥＮを得ることができ、また、モノマーＴＡＬＥＮが異なる場合には、ヘテロ二量体ＴＡＬＥＮを得ることができる。
【００５８】
一部の実施形態では、モノマーＴＡＬＥＮを用いることができる。ＴＡＬＥＮは、典型的に、スペーサを含む二部認識部位にわたる二量体として機能し、これにより、２つのＴＡＬエフェクタードメインが、各々ＦｏｋＩ制限酵素の触媒ドメインに融合し、それぞれ得られたＴＡＬＥＮのＤＮＡ認識部位が、スペーサ配列により分離され、各ＴＡＬＥＮモノマーと認識部位の結合によって、ＦｏｋＩが二量体化すると共に、スペーサ内に二本鎖切断を生成することを可能にする。また、モノマーＴＡＬＥＮを構築することもできるが、これは、単一のＴＡＬエフェクターが、機能するのに二量体化を必要としないヌクレアーゼに融合するように実施する。例えば、１つのこのようなヌクレアーゼは、２つのモノマーが単一ポリペプチドとして発現されるＦｏｋＩの一本鎖変異体である。他の天然に存在する、又は操作されたモノマーヌクレアーゼも、この役割を果たすことができる。モノマーＴＡＬＥＮに用いられるＤＮＡ認識ドメインは、天然に存在するＴＡＬエフェクターから取得することができる。或いは、ＤＮＡ認識ドメインは、特定のＤＮＡ標的を認識するように操作することもできる。操作された一本鎖ＴＡＬＥＮは、１つの操作ＤＮＡ認識ドメインしか必要としないため、構築及び配置がより容易であると考えられる。二量体ＤＮＡ配列特異的ヌクレアーゼは、２つの異なるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、１つのＴＡＬエフェクター結合ドメインと、別のタイプの分子からの１つの結合ドメイン）を用いて、作製することができる。ＴＡＬＥＮは、スペーサを含む二部認識部位にわたり二量体として機能し得る。このヌクレアーゼアーキテクチャは、例えば、１つのＴＡＬＥＮモノマー及び１つのジンクフィンガーヌクレアーゼモノマーから作製される標的特異的ヌクレアーゼのためにも用いることができる。このような場合、ＴＡＬＥＮ及びジンクフィンガーヌクレアーゼモノマーのＤＮＡ認識部位を、適切な長さのスペーサにより分離することができる。２つのモノマーの結合によって、ＦｏｋＩが二量体化すると共に、スペーサ配列内に二本鎖切断を生成することを可能にすることができる。ジンクフィンガー以外のＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ホメオドメイン、ｍｙｂ反復配列又はロイシンジッパなどもＦｏｋＩに融合して、機能的ヌクレアーゼを形成するためにＴＡＬＥＮモノマーとのパートナーとしての役割を果たすことができる。
【００５９】
ヌクレオチドという用語は、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼを含む。エンドヌクレアーゼという用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子内の核酸同士の結合の加水分解（切断）を触媒することができる任意の野生型又は変異型酵素を指す。エンドヌクレアーゼの非限定的例として、ＦｏｋＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｂｖＣｌ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、ＡｌｗＩなどのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼを含む。エンドヌクレアーゼは、長さが約１２〜４５塩基対（ｂｐ）、より好ましくは、典型的には１４〜４５ｂｐのポリヌクレオチド認識部位を有するとき、レアカット（ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｉｎｇ）エンドヌクレアーゼも含む。レアカットエンドヌクレアーゼは、既定の遺伝子座でＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する。レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＦｏｋＩ又は化学エンドヌクレアーゼなどの制限酵素の触媒ドメインと、操作ジンクフィンガードメインの融合物から得られるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であってよい。化学エンドヌクレアーゼの場合、特定の標的配列を認識し、これによって、特定の配列に切断活性をターゲティングする核酸のポリマー又は別のＤＮＡのいずれかに、化学又はペプチドクリーバ（ｃｌｅａｖｅｒ）を結合させる。化学エンドヌクレアーゼはまた、オルトフェナントロリンのコンジュゲートなどの合成ヌクレアーゼ、ＤＮＡ切断分子、及び特定のＤＮＡ配列に結合することがわかっているトリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）も包含する。こうした化学エンドヌクレアーゼは、本発明の用語「エンドヌクレアーゼ」に含まれる。こうしたエンドヌクレアーゼの例として、以下のものが挙げられる：Ｉ−Ｓｅｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｈｕ  Ｌ  Ｉ−Ｃｒｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｅｅ  Ｌ  ＰＩ−Ｔｔｉ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｔｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｓｅｅ  ＩＬ  １−Ｓｅｅ  ＩＩＩ、ＨＯ、ＰＩ−Ｃｉｖ  Ｉ、ＰＩ−Ｃｔｒ  Ｌ  ＰＩ−Ａａｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｂｓｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｈａ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｒａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍａｖ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｅｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｆｕ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｆｌ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｇａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｇｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｉｎ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｋａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｌｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｍａ  Ｉ、ＰＩ−  ３０  Ｍｓｈ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｘｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｎｐｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｆｕ  Ｌ  ＰＩ−Ｒｍａ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｐｂ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｓｐ  Ｌ  ＰＩ−Ｆａｅ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｊａ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｈｏ  Ｌ  ＰＩ−Ｔａｇ  Ｌ  ＰＩ−Ｔｈｙ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｋｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｓｐ  Ｉ、Ｉ−ＭｓｏＩ。
【００６０】
鋳型組換え修復のための延長低温処理
実験は、驚くことに、低温培養の延長期間が、鋳型形成プロセスの効率を高める得ることを明らかにした。低温細胞培養は、二本鎖ＤＮＡ切断を導入するために、最大約３日にわたって有用であることが知られている。この作用についての従来の理論は、活性酵素を希釈するか、又は分裂を阻害することによって、ＤＮＡを安定化するという考えを中心に展開する。
【００６１】
しかし、本明細書に示すデータは、これら他の理論と一致しない。そうではなく、低温処理は、姉妹染色体により誘導される改変染色体の再修復を最小限にすることが考えられる。言い換えれば、成功する組込みがあるとしても、細胞は、改変部位の姉妹染色体を用いて、変化した対立遺伝子を元に戻し得る。さらに、これらのデータは、初めて、低温処理を用いて、鋳型形成プロセスに影響を与え得ることを証明するものである。実験の意外な側面は、延長した低温培養が、鋳型を細胞ＤＮＡにコピーする効率を改善しないことであった。低温培養が改善したのは、コピーされた後の外性対立遺伝子の安定性であった。実際に、このプロセスは、ＳＮＰ  ＨＤＲ編集対立遺伝子のレベルをほぼ３倍にした。この現象の作動理論は、前文に論じている。
【００６２】
一実施形態は、細胞の染色体ＤＮＡを変化させる鋳型組換え修復の低温方法であり、この方法は、生存細胞に、標的ヌクレアーゼ系及び核酸鋳型を導入するステップを含み、標的ヌクレアーゼ系及び鋳型が作動することにより、鋳型配列に対して同一性を有するように染色体ＤＮＡを改変し、生存細胞は、所定時間にわたって、生理学的温度を下回る低温培養温度で維持される。培養の長さは、必要に応じて、例えば、３日超〜３１日、又は７２〜８００時間まで変動し得る。当業者は、明示される範囲内のあらゆる範囲及び値（例えば、８０〜６００時間、４日〜１５日、３．１日〜２週間など）が考慮されることを直ちに理解されよう。約２０℃での延長培養時間が成功している（データは、示していない）。低温培養温度は、２０〜３４℃である。当業者は、明示される範囲内のあらゆる範囲及び値（例えば、２１〜３０℃）が考慮されることを直ちに理解されよう。さらなる実施形態は、培養物を範囲内の特定の温度で維持するステップ、並びに培養温度を範囲内に保持しながら変化させるステップを含む。これに関連して「ある範囲内に維持する」という用語は、これらの実施形態の両方を含む。実施形態は、細胞に導入した対立遺伝子の安定性（例えば、５回を超える細胞分裂、又は少なくとも３回の細胞分裂、又は３〜１０回の細胞分裂にわたる安定性）をもたらす。当業者は、明示される範囲内のあらゆる範囲及び値が考慮されることを直ちに理解されよう。
【００６３】
遺伝子編集対立遺伝子を含む生物医学モデル動物の生産
生存動物に輸送するために、ブタゲノム中の２つの遺伝子編集遺伝子座（ＡＰＣ及びＤＡＺＬ）を選択した。大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子中の突然変異は、家族性腺腫様ポリポーシス（ＦＡＰ）の原因であるだけでなく、大部分の散発性結腸直腸癌において速度を制限する役割も果たす。Ｄａｚｌ（ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ−ｌｉｋｅ）は、脊椎動物において生殖細胞分化に重要なＲＮＡ結合タンパク質である。ＤＡＺＬ遺伝子は、妊性と関連しており、不妊モデル並びに精子形成停止に有用である。ＤＡＺＬ又はＡＰＣのＨＤＲ編集対立遺伝子を含むコロニーを、クロマチン移入によるクローニングのためにプールした。各プールは、３つの移入から２件の妊娠を達成し、そのいずれの妊娠も、分娩日まで完遂した。ＤＡＺＬ修飾細胞から合計８匹の子豚が生まれ、その各々が、ＨＤＲ対立遺伝子又はＮＨＥＪから生じた欠失のいずれかと一致する選択コロニーの遺伝子型を表した。ＤＡＺＬ子豚のうち３匹は、死産であった。ＡＰＣ修飾細胞からの６匹の子豚のうち、１匹は死産で、３匹は、１週間以内に死に、もう１匹が３週間後に死んだが、全て原因不明であり、恐らくクローニングに関連すると考えられる。６匹のＡＰＣ子豚は全て、意図するＨＤＲ編集対立遺伝子に対して異型接合であり、１匹を除く全てが、第２対立遺伝子に３ｂｐのフレーム内挿入又は欠失のいずれか１つを有した。残る子豚は、精子形成停止（ＤＡＺＬ−／−ファウンダ）又は結腸癌（ＡＰＣ＋／−ファウンダ）の発生の表現型分析のために飼育した。
【００６４】
鋳型駆動移入方法を本明細書に詳述する。本明細書の実施形態は、ＡＰＣ若しくはＤＡＺＬ対立遺伝子を非ヒト動物、又は任意の種の細胞に配置することを目的とした、例えば、ＨＤＲ鋳型による、鋳型駆動移入を含む。
【００６５】
この方法、及び複数の方法は、本明細書において一般に、細胞及び動物に関連する。これらは、脊椎動物、家畜、偶蹄類（ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌ）、霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、鳥類、ニワトリ、ウサギ、魚類、イヌ、マウス、ラット、ネコ又は実験動物からなる群から選択してよい。家畜という用語は、食品又は生物材料のための産物として飼育される家畜化動物を意味する。偶蹄類（ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌ）という用語は、ウシ目（Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）の有蹄動物を意味し、例えば、偶数の蹄、通常２つ、又は時に４つをそれぞれの肢に有するウシ、シカ、ラクダ、カバ、ヒツジ、ブタ及びヤギが挙げられる。
【００６６】
リコンビナーゼ
本発明の実施形態は、リコンビナーゼ（例えば、ＲｅｃＡタンパク質、Ｒａｄ５１）又はＤＮＡ組換えに関連する他のＤＮＡ結合タンパク質を含む標的ヌクレアーゼ系の投与を含む。リコンビナーゼは、核酸断片とフィラメントを形成し、実際には、配列と実質的に相同性のＤＮＡ配列をみいだすために、細胞ＤＮＡを捜索する。例えば、リコンビナーゼを、ＨＤＲの鋳型として役立つ核酸配列と組み合わせてもよい。続いて、リコンビナーゼをＨＤＲ鋳型と結合させることにより、フィラメントを形成させ、これを細胞に配置する。リコンビナーゼ及び／又はリコンビナーゼと結合するＨＤＲ鋳型は、タンパク質、ｍＲＮＡとして、又はリコンビナーゼをコード化するベクターと一緒に、細胞又は胚に配置してもよい。米国特許出願公開第２０１１／００５９１６０号明細書（米国特許出願第１２／８６９，２３２号明細書）の開示内容は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込むものとし；矛盾する場合は、本明細書が優先される。リコンビナーゼという用語は、細胞において、２つの比較的長いＤＮＡ鎖間でのＤＮＡの比較的短い部分の結合を酵素的に触媒する遺伝子組換え酵素を指す。リコンビナーゼとしては、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、ＲｅｃＡ、ＲＡＤ５１、Ｃｒｅ、及びＦＬＰが挙げられる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位間のＤＮＡの部位特異的組換えを触媒する、Ｐ１バクテリオファージ由来のＩ型トポイソメラーゼである。Ｈｉｎリコンビナーゼは、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）にみいだされる１９８アミノ酸から構成される２１ｋＤタンパク質である。Ｈｉｎは、ＤＮＡ切断及び組換えを開始するために、活性部位セリンに依存する、ＤＮＡインベルターゼのセリンリコンビナーゼファミリーに属する。ＲＡＤ５１は、ヒト遺伝子である。この遺伝子によりコード化されるタンパク質は、ＤＮＡ二本鎖切断の修復を補助するＲＡＤ５１タンパク質ファミリーのメンバーである。ＲＡＤ５１ファミリーメンバーは、細菌ＲｅｃＡ及び酵母Ｒａｄ５１遺伝子に対して相同性である。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位によってフランキングされる特定の配列を欠失するように、実験において用いられる酵素である。ＦＬＰは、パン酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μプラスミドに由来するＦｌｉｐｐａｓｅ組換え酵素（ＦＬＰ又はＦｌｐ）を指す。
【００６７】
本明細書において、「ＲｅｃＡ」又は「ＲｅｃＡタンパク質」は、同じ機能、特に：（ｉ）オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長のためのそれらの相同的標的上に適正に配置する能力；（ｉｉ）ＤＮＡ合成のために二重螺旋核酸をトポロジー的に生成する能力；及び（ｉｉｉ）効率的に相補的配列をみいだして結合するＲｅｃＡ／オリゴヌクレオチド又はＲｅｃＡ／ポリヌクレオチドの能力のほぼ全部又は大部分を有するＲｅｃＡ様組換えタンパク質のファミリーを指す。最もよく特性決定されているＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来し；このタンパク質のオリジナル対立遺伝子形態以外にも、いくつかの突然変異型ＲｅｃＡ様タンパク質（例えば、ＲｅｃＡ８０３）が同定されている。さらに、多くの生物が、ＲｅｃＡ様鎖転移タンパク質を有し、そのような生物として、例えば、酵母、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ヒトを含む哺乳動物、及び植物が挙げられる。これらのタンパク質としては、例えば、Ｒｅｃ１、Ｒｅｃ２、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５１Ｅ、ＸＲＣＣ２及びＤＭＣ１が挙げられる。組換えタンパク質の一実施形態は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質である。或いは、ＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異型ＲｅｃＡ−８０３タンパク質、別の細菌に由来するＲｅｃＡタンパク質、又は別の生物に由来する相同組換えタンパク質であってもよい。
【００６８】
移入のための対立遺伝子
対立遺伝子移入は、多くの重要な用途を有する。以下の対立遺伝子移入に関する表、及び表１（ＨＤＲ対立遺伝子を有するコロニーの回収の頻度）は、特定の遺伝子及びそれらの用途を記載する。本明細書を読んだ当業者は、移入並びにその結果得られる細胞及び動物を作製及び使用することができるであろう。当業者は、本明細書に記載する方法を、鋳型又は破壊の標的としてこれら対立遺伝子を使用するために容易に適用することができよう。いくつかの実施形態は、遺伝子修飾細胞又は動物（例えば、実験動物、Ｆ０ファウンダ、若しくは動物系列）を作製するステップを含み、それらのゲノムは、例えば、内在性対立遺伝子を、表１又は対立遺伝子移入に関する表からの対立遺伝子で置換する挿入又は鋳型駆動対立遺伝子移入によって、表１又は対立遺伝子移入に関する表からの遺伝子を受けている。家畜生産に利点をもたらすいくつかの遺伝子の対立遺伝子が報告されているが、頻度が非常に低いか、又は一部の品種若しくは種には存在しない（項目１〜９を参照のこと）。これら対立遺伝子の移入は、生産特性にとって重要な価値がある。例えば、肉牛品種からのＰｏｌｌｅｄ対立遺伝子（項目１）は、無角牛をもたらすが、乳牛品種には、この対立遺伝子がないため、角があり、生産作業要領として除角する必要がある。有角（乳牛）品種への肉牛品種由来対立遺伝子の移入によって、生産及び動物の健康状態の両方に価値がある無角乳牛が得られることになる。他の例は、食肉（項目４〜６）及び牛乳（項目７〜８）などの農産物の特徴を高め、又は増強することができる対立遺伝子に関する。項目９は、疾患耐性に有用である。
【００６９】
多くの商業的及び一般的に使用されている動物品種は、望ましい特徴を確立するために、注意深く育種されているが、育種の過程で、遺伝子エラーが蓄積し、その結果、繁殖力の減少のために、又は流産の増加により、それらの繁殖成功度が低下する。動物の集団には、いくつかの遺伝子に有害な対立遺伝子が存在する。本明細書の他所で説明するように、本発明の技術は、遺伝子ツール又は減数分裂組換えから得られる他の修飾なしに、標的動物において意図する位置でのみ対立遺伝子を改変することを可能にする。従って、初めて、動物のゲノムを破壊することなく、従って、形質を破壊したり、意図しない結果を引き起こしたりすることなく、家畜及び動物品種に蓄積した遺伝子エラーを一掃することが可能になる。育畜の遺伝子制御のために、一部の遺伝子の対立遺伝子を用いて、動物繁殖力を制御することができる（項目２〜３）。育種という用語は、選択及び育種を通じて、互いに類似し、それらの形質を均質にその子孫に受け渡すようになった家畜を指す技術用語である。
【００７０】
多くの有用な動物モデルを作製することができる。いくつかの対立遺伝子は有用であり、対立遺伝子移入に関する表の項目１０〜３９を参照されたい。これらのいくつかは、動物において確立されている。他の遺伝子は、ヒト疾患を引き起こすことがわかっており、従って、家畜、実験動物、又は他の動物にこれら対立遺伝子を移入させることは、ヒト疾患の生物医学的モデルを作出するのに有用である。
【００７１】
本発明の実施形態は、遺伝子改変された動物を作製する方法を含み、前記方法は、胚又は細胞を、ＴＡＬＥＮをコード化するｍＲＮＡに曝露するステップであって、そのＴＡＬＥＮは、胚又は細胞における標的染色体部位に特異的に結合する、ステップ、代理母において細胞をクローニングするか、又は代理母に胚を移植し、これによって、代理母が、リポータ遺伝子なしで、しかもＴＡＬＥＮ標的染色体部位でのみ遺伝子修飾されている動物を妊娠するステップを含み、対立遺伝子は、以下からなる群のメンバーである：（ａ）角ｐｏｌｌｅｄ遺伝子座（ｂ）妊性欠損について劣性の遺伝子、例えば、ＣＷＣ１５及び／又はＡｐａＦ１（ｃ）家畜形質、例えば、食肉生産を増強する遺伝子（ＧＤＦ８、ＩＧＦ２、ＳＯＣＳ２、若しくはその組合せ）及び／又は牛乳生産を増強する遺伝子（ＤＧＡＴ１及び／又はＡＢＣＧ２）（ｄ）アフリカブタコレラに耐性の遺伝子（Ｐ６５／ＲＥＬＡ）（ｅ）動物サイズを変化させる遺伝子（ＰＬＡＧ１、ＧＨＲＨＲ）（ｆ）腫瘍増殖を増強する遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、Ｓｍａｄ４、ＢＵＢ１Ｂ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＳＴ１４若しくはそれらの組合せ）（ｇ）癌の動物モデルのためのヒト癌遺伝子（例えば、ＡＫＴ１、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ／Ｂ若しくはそれらの組合せ）（ｈ）高コレステロール血症の動物モデルにおける遺伝子（動脈硬化、発作、及びアルツハイマー病モデルを誘導するため）、例えば、ＬＤＬＲ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＢ若しくはそれらの組合せ（ｉ）炎症性腸疾患、例えば、ＮＯＤ２（ｊ）脊椎破裂、例えば、ＶＡＮＧＬ１及び／又はＶＡＮＧＬ２（ｋ）肺高血圧症、例えば、ｍｉＲ−１４５（ｌ）心臓欠陥の遺伝子、例えば、ＢＭＰ１０、ＳＯＳ１、ＰＴＰＮ１１、Ｎｒｇ１、Ｋｉｒ６．２、ＧＡＴＡ４、Ｈａｎｄ２、若しくはそれらの組合せ（ｌ）セリアック病遺伝子、例えば、ＨＬＡ−ＤＱＡ１。
【００７２】
【表１】
2020089386.tif 000003
【００７３】
【表２】
2020089386.tif 000004
【００７４】
【表３】
2020089386.tif 000005
【００７５】
【表４】
2020089386.tif 000006
【００７６】
一切のリポータなしで遺伝子修飾した動物；いくつかのＴＡＬＥＮ技術；対立遺伝子移入
本発明のいくつかの実施形態は、リポータ及び／又は選択マーカの使用なしで細胞若しくは胚を修飾する方法に関する。一般に、ＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９修飾は、数日の時間枠にわたって不安定であることが観察された。従って、変化を安定化するために本明細書に記載される方法、並びに米国特許出願公開第２０１３／０１１７８７０号明細書に記載される他の方法：例えば、直接的ｍＲＮＡ導入及び／又はｓｓＤＮＡ鋳型の使用を用いることができる。直接的導入、例えば、直接的ｍＲＮＡ導入という用語は、ｍＲＮＡ材料の導入を指す。対照的に、ｍＲＮＡをコード化するベクターを用いた導入は、間接的導入と呼ぶ。多くの直接的導入方法が知られており、例えば、電気泳動、トランスフェクション、リポフェクション、リポソーム、ヌクレオフェクション、パーティクルガン、ナノ粒子、脂質トランスフェクション、電気細胞融合、及び直接的インジェクションが挙げられる。
【００７７】
初めに修飾動物を作出した後、これを新たなトランスジェニック系列の基礎を形成するために育種する必要なしに、修飾細胞又は胚からファウンダ動物を直ちに作出することができる。ファウンダ又はファウンダ動物という用語は、クローニング細胞又は修飾された処理／注入胚から直接発生する第１世代（「Ｆ０」）トランスジェニック動物を指すために用いられる。本明細書に報告される方法は、染色体標的部位のみで遺伝子修飾され、しかも育種及び／又は同種繁殖の中間ステップなしで、ファウンダの作出を可能にする。さらに、いくつかの実施形態は、修飾に対して同型接合であるファウンダを含む。ファウンダは、細胞及び／又は胚をリポータ遺伝子に一切曝露することなく（及び／又は選択マーカ遺伝子なしで）、調製することができる。
【００７８】
遺伝子修飾動物を作製する方法は、培養細胞、例えば、初代家畜細胞にＴＡＬＥＮ及び／又はベクターを導入するステップを含む。ＴＡＬＥＮは、特定の染色体部位に向かい、この部位で遺伝子改変を引き起こす。また、細胞に、ＨＤＲ鋳型を、例えば、二本鎖ベクター、一本鎖ＤＮＡとして導入するか、又はｓｓヌクレオチドとして直接導入してもよい。続いて、培養細胞を培養することにより、クローン細胞のコロニーを形成する。コロニーをＰＣＲにより試験し、及び／又は配列決定するか、或いは遺伝子修飾についてアッセイするが、その際、好ましくはリポータ遺伝子なし、及び／又は選択マーカなしで行う。意図する部位で遺伝子修飾されたコロニーから細胞を採取し、クローニングに使用する。例えば、１０〜５０，０００個の細胞を用いて、１０〜５０，０００個の胚を作製し、これらを、サロゲートに、例えば、サロゲート当たり胚１〜５００個のセットで移植する。当業者は、明示した範囲内のあらゆる範囲及び値が考慮されることを直ちに理解されよう。いくつかの実施例は、リポータ遺伝子なしで、細胞をＴＡＬＥＮに曝露し、クローン細胞のコロニーを形成した後、コロニーのメンバーのサブセットを試験することによって、染色体標的部位に修飾を含むコロニーをみいだすステップを含む。
【００７９】
遺伝子修飾動物
当技術分野で公知の様々な技術を用いて、核酸構築物を非ヒト動物に導入し、核酸構築物がゲノムに組み込まれたファウンダ動物を作製することができる。このような技術として、限定はしないが、前核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号明細書）、生殖細胞へのレトロウイルス媒介遺伝子移入、胚幹細胞への遺伝子ターゲティング、胚のエレクトロポレーション、精子媒介遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４２３０−１４２３５；Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．，１８：１９−２３）、並びに体細胞、例えば、卵丘細胞若しくは哺乳動物細胞、又は成体、胎児、若しくは胚幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質転換、それに続く核移植が挙げられる。前核マイクロインジェクション、精子媒介遺伝子移入、及び体細胞移植は、特に有用な技術であり、さらには、細胞質注入、始原生殖細胞移植、及び胚盤胞キメラ生産（生殖細胞を胚中で増殖させる）などが挙げられる。
【００８０】
典型的に、前核マイクロインジェクションの場合、核酸構築物を受精卵に導入し；１又は２個の細胞受精卵を、精子頭部からの遺伝材料を含有する前核として使用すれば、原形質内で卵を見ることができる。前核段階の受精卵は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで取得（すなわち、ドナー動物の卵管から手術により回収）することができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精卵を生産することができる。例えば、ブタの場合、成熟卵母細胞を、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ  ５ウェル受精ディッシュにおける５００μｌのＭｉｎｉｔｕｂｅ  ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ  ＭＥＤＩＵＭ  ＳＹＳＴＥＭ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）中で受精させることができる。体外受精（ＩＶＦ）のための調製では、新しく採取した、又は凍結させたイノシシ精液を洗浄し、４×１０５個の精子までＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ  Ｍｅｄｉｕｍ中に再懸濁させることができる。精子濃度は、コンピュータ支援精液分析（ＳＰＥＲＭＶＩＳＩＯＮ，Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）により分析することができる。最終体外受精は、イノシシに応じて、約４０運動精子／卵母細胞の最終濃度にて１０μｌ容量で実施することができる。５．０％ＣＯ２雰囲気中３８．７℃で全ての受精用卵を６時間インキュベートする。受精から６時間後、推定受精卵をＮＣＳＵ−２３中で２回洗浄した後、０．５ｍＬの同じ培地に移した。この系は、ほとんどのイノシシで、２０〜３０％の胚盤胞をルーティンに産生することができ、１０〜３０％の多精受精率である。
【００８１】
体細胞核移入の場合、遺伝子改変細胞又は割球、例えば、胚割球、胎児線維芽細胞、成体耳線維芽細胞、又は果粒膜細胞を、除核卵母細胞に導入して、結合細胞を作製することができる。一部の慣例では、第２減数分裂で停止した卵母細胞を「卵」と呼ぶ。胚を生成した（例えば、卵母細胞を融合及び活性化することにより）後、活性化から約２０〜２４時間後に、胚をレシピエント雌の卵管に移入する。標準的育種技術を用いて、初期異型接合ファウンダ動物からの標的核酸に対して同型接合である動物を作出することができる。
【００８２】
ベクター及び核酸
様々な核酸を細胞に導入することができる。本明細書で用いる場合、核酸という用語は、二本鎖又は一本鎖（すなわち、センス又はアンチセンス一本鎖）である、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び核酸類似体、並びに核酸を包含する。核酸類似体は、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、又は溶解度を改善するために、塩基部分、糖部分、リン酸骨格で修飾することができる。モルホリノ核酸を生成するためには、デオキシリボースリン酸骨格を修飾することができる。さらに、デオキシリン酸骨格を例えば、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエート骨格、ホスホロアミダイト、又はアルキルホスホトリエステル骨格で置換することもできる。核酸配列は、発現用プロモータなどの調節領域に作動可能に連結することができる。本明細書で用いる場合、作動可能に結合したとは、標的核酸の転写を可能にするか、又は促進するような方法での核酸配列に対する調節領域の配置を指す。任意のタイプのプロモータを標的核酸配列に作動可能に連結することができる。プロモータの例として、限定はしないが、組織特異的プロモータ、構成性プロモータ、及び特定の刺激因子に対して応答性又は非応答性のプロモータが挙げられる。
【００８３】
ＳｓｓＩ  ＣｐＧメチラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて、核酸構築物をメチル化することができる。一般に、核酸構築物をバッファー中のＳ−アデノシルメチオニン及びＳｓｓＩ  ＣｐＧメチラーゼと一緒に、３７℃でインキュベートすることができる。高度メチル化は、１単位のＨｉｎＰ１Ｉエンドヌクレアーゼと一緒に構築物を３７℃で１時間インキュベートした後、アガロースゲル電気泳動によりアッセイすることにより、確認することができる。
【００８４】
核酸構築物は、任意のタイプの胚、胎児、又は成体偶蹄類細胞、例えば、卵母細胞若しくは卵、始原細胞、成体若しくは胚幹細胞、始原生殖細胞などの生殖細胞、ＰＫ−１５細胞などの腎細胞、膵島細胞、β細胞、肝細胞、又は皮膚線維芽細胞などの線維芽細胞に、様々な技術を用いて導入することができる。技術の非限定的例として、トランスポゾン系、細胞に感染することができる組換えウイルス、又はリポソームの使用、或いは他の非ウイルス方法、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、又はリン酸カルシウム沈殿が挙げられ、これらは、核酸を細胞に送達することができる。トランスポゾン系の場合、核酸構築物の転写単位、すなわち標的核酸配列に作動可能に連結した調節領域をトランスポゾンの逆方向反復配列によってフランキングさせる。いくつかのトランスポゾン系として、例えば、以下：Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（米国特許第６，６１３，７５２号明細書及び米国特許出願公開第２００５／０００３５４２号明細書を参照）；Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１：６８７３）；Ｔｏｌ２（Ｋａｗａｋａｍｉ（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ７；Ｍｉｎｏｓ（Ｐａｖｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２）；Ｈｓｍａｒ１（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７））Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２７：４５８９）が挙げられ；並びに、マウス、ヒト、及びブタ細胞などの細胞に核酸を導入するためのＰａｓｓｐｏｒｔが開発されている。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ及びＰａｓｓｐｏｒｔトランスポゾンが特に有用である。トランスポザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）を、標的核酸と同じ核酸構築物上にコード化されたタンパク質として送達し、個別の核酸構築物に導入するか、又はｍＲＮＡ（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写及びキャップｍＲＮＡ）として提供することができる。
【００８５】
核酸をベクターに組み込むことができる。ベクターは、担体から標的ＤＮＡに移動するように設計した任意の特異的ＤＮＡセグメントを含む、広義の用語である。ベクターは、発現ベクター、又はベクター系と呼ばれることもあり、ベクター系は、ゲノム、或いはその他の標的ＤＮＡ配列、例えば、エピソーム、プラスミド、又はウイルス／ファージＤＮＡセグメントなどへのＤＮＡ挿入を実施するのに必要な成分の組である。動物への遺伝子送達に用いられるベクター系、例えば、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノ関連ウイルス及び組込み用ファージウイルス）、並びに非ウイルスベクター（例えば、トランスポゾン）は、次の２つの基本的成分を有する：１）ＤＮＡ（又はｃＤＮＡに逆転写されるＲＮＡ）からなるベクター、並びに２）ベクター及びＤＮＡ標的配列の両方を認識し、標的ＤＮＡ配列にベクターを挿入するトランスポザーゼ、リコンビナーゼ、又は他のインテグラーゼ酵素。ベクターは、ほとんどの場合、１つ又は複数の発現制御配列を含む１つ又は複数の発現カセットを含有し、発現制御配列は、別のＤＮＡ配列又はｍＲＮＡそれぞれの転写及び／又は翻訳を制御及び調節するＤＮＡ配列である。
【００８６】
多くの異なるタイプのベクターが知られている。例えば、プラスミド及びウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターが知られている。哺乳動物発現プラスミドは、典型的に、複製起点、好適なプロモータ及び任意のエンハンサー、並びに任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、転写終結配列、並びに５’フランキング非転写配列を有する。ベクターの例として、以下：プラスミド（別のタイプのベクターのキャリアであってもよい）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ−１、ＳＩＶ若しくはＦＩＶ）、レトロウイルス（例えば、ＡＳＶ、ＡＬＶ若しくはＭｏＭＬＶ）、及びトランスポゾン（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｐ−エレメント、Ｔｏｌ−２、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ、ｐｉｇｇｙＢａｃ）が挙げられる。
【００８７】
本明細書で用いる場合、核酸という用語は、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方を指し、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡ、並びに天然に存在し、化学的に修飾された核酸、例えば、合成塩基又は代替骨格などが挙げられる。核酸分子は、二本鎖又は一本鎖（すなわち、センス又はアンチセンス一本鎖）であってもよい。トランスジェニックという用語は、本明細書において広義に用いられ、遺伝子工学を用いて、遺伝物質が改変された、遺伝子修飾生物又は遺伝子操作生物を指す。従って、ノックアウト偶蹄類は、外性遺伝子又は核酸が、その動物又はその子孫に発現されるか否かには関係なく、トランスジェニックである。
【００８８】
本明細書に記載する核酸配列は、ＤＮＡ及びＲＮＡ配列の両方を示すことを意図し、慣行に従い、略語「Ｔ」は、場合に応じて、ＤＮＡ又はＲＮＡの「Ｔ」又は「Ｕ」を表し得る。ポリヌクレオチドは、少なくとも３つのヌクレオチドサブユニットの核酸分子である。ポリヌクレオチド類似体又はポリ核酸は、化学的に修飾したポリヌクレオチド又はポリ核酸である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド類似体は、ポリヌクレオチドの糖−リン酸骨格の部分を別の官能基で置換することにより作製することができる。モルホリノ修飾ポリヌクレオチド（本明細書において「モルホリノ」と呼ばれる）は、塩基が、モルホリノ−ホスホロジアミデート骨格と連結しているポリヌクレオチド類似体である（例えば、米国特許第５，１４２，０４７号明細書及び同第５，１８５，４４４号明細書を参照）。モルホリノに加え、ポリヌクレオチド類似体の他の例として、以下のものが挙げられる：塩基がポリビニル骨格と連結している類似体、プソイドペプチド２−アミノエチル−グリシン基により形成されるアミド結合と塩基が連結しているペプチド核酸（ＰＮＡ）、ヌクレオシドサブユニットがメチルホスホン酸基と連結している類似体、ヌクレオシドサブユニットと連結するリン酸残基が、ホスホロアミデート基により置換される類似体、並びにホスホロチオエート化ＤＮＡ、２’Ｏ−メチル基を有する糖部分を含有する類似体）。本発明のポリヌクレオチドは、公知及び常用的に使用されている固相合成の技術を用いて、生成することができる。或いは、このような合成に好適な他の方法を用いることができる（例えば、一般的分子クローニング及び化学的核酸合成技術）。また、同様の技術を用いて、モルホリノ又はホスホロチオエート誘導体などのポリヌクレオチド類似体を調製することもできる。さらに、ポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド類似体は、市販のものを取得することもできる。オリゴヌクレオチドの場合、薬学的に許容される組成物の例として、例えば、以下：（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウムなどのカチオンを用いて形成される塩；（ｂ）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸を用いて形成される酸付加塩（ｃ）例えば、有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸によって形成される塩；並びに（ｄ）元素アニオン、例えば、塩素、臭素、及びヨウ素から形成される塩などの塩がある。
【００８９】
配列アラインメントは、類似性の領域をみいだすために、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質の配列を配置する方法である。アラインメントしたヌクレオチド又はアミノ酸残基の配列は、典型的に、行列内の行として表され、同一又は類似文字が連続した列に並ぶように、残基間にギャップが挿入される。
【実施例】
【００９０】
実施例１  ＴＡＬＥＮの設計及び作製
オンラインツール「ＴＡＬ  ＥＦＦＥＣＴＯＲ  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＴＡＲＧＥＴＥＲ」を用いて、候補ＴＡＬＥＮ標的ＤＮＡ配列及びＲＶＤ配列を同定した。次に、ｐＣＧＯＬＤＹＴＡＬＥＮ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ  ３８１４３）及びＲＣＩｓｃｒｉｐｔ−ＧＯＬＤＹＴＡＬＥＮ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ  ３８１４３）を用いて、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙプロトコルに従うことにより、最終目的ベクターとして（Ｃａｒｌｓｏｎ  ２０１２）、ＴＡＬＥＮ  ＤＮＡトランスフェクション又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ転写用のプラスミドを構築した。最終ｐＣ−ＧｏｌｄｙＴＡＬＥＮベクターは、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＨＩＰＵＲＥ  ＰＬＡＳＭＩＤ  ＭＩＤＩＰＲＥＰ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて調製し、使用前に配列決定した。ＱＩＡＰＲＥＰ  ＳＰＩＮ  ＭＩＮＩＰＲＥＰ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製した集成ＲＣＩｓｃｒｉｐｔベクターをＳａｃＩにより線状化して、本明細書の他所に既述したｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ３  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ転写用の鋳型として用いた。以前に記載されている（Ｃａｒｌｓｏｎ  ２０１２）ように、修飾ｍＲＮＡをＲＣＩｓｃｒｉｐｔ−ＧＯＬＤＹＴＡＬＥＮベクターから合成し、３’−０−Ｍｅｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  ＲＮＡ  キャプ類似体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、５−メチルシチジン三リン酸プソイドウリジン三リン酸（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びアデノシン三リン酸グアノシン三リン酸から構成されるリボヌクレオチドカクテルを置換する。最終的ヌクレオチド反応濃度は、キャップ類似体については６ｍＭ、グアノシン三リン酸については１．５ｍＭ、及び他のヌクレオチドについては７．５ｍＭである。得られたｍＲＮＡをＤＮＡｓｅ処理した後、ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＣＬＥＡＮＵＰ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた精製に付した。
【００９１】
実施例２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の設計及び作製
遺伝子特異的ｇＲＮＡ配列を、Ｃｈｕｒｃｈ  ｌａｂ  ｇＲＮＡベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ：４１８２４）に、その方法に従ってクローニングした。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ｈＣａｓ９プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ：４１８１５）、又はＲＣＩｓｃｒｉｐｔ−ｈＣａｓ９から合成されるｍＲＮＡの同時トランスフェクションのいずれかにより取得した。このＲＣＩｓｃｒｉｐｔ−ｈＣａｓ９は、ｈＣａｓ９プラスミド（ｈＣａｓ９ｃＤＮＡを包含する）からのＸｂａＩ−ＡｇｅＩ断片をＲＣＩｓｃｒｉｐｔプラスミドにサブクローニングすることにより構築した。ｍＲＮＡの合成は、ＫｐｎＩを用いて線状化を実施した以外、上記と同様に実施した。
【００９２】
実施例３  ドナー修復鋳型の調製
Ａ）ＢＢ−ＨＤＲ（１，６２３ｂｐ）プラスミド．ベルギアン・ブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）対立遺伝子を含む１，６９５ｂｐ断片を、ベルギアン・ブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した（ｂｔＧＤＦ８  ＢＢ  ５−１：５’−ＣＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＣＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＴＣ（配列番号８８）；ｂｔＧＤＦ８  ＢＢ  ３−１：５’−ＧＴＧＴＧＣＣＡＴＣＣＣＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＡＡ（配列番号８９））後、ＰＣＲ  ２．１ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にＴＯＰＯクローニングした。このプラスミドを、分析用プライマーセットの陽性対照鋳型として、並びに以下のプライマー（ＢＢ  ｄｅｌ  ＨＲ  １６２３  ５−１：５’−ＧＡＴＧＴＡＴＴＣＣＴＣＡＧＡＣＴＴＴＴＣＣ（配列番号９０）；ＢＢ  ｄｅｌ  ＨＲ  １６２３  ３−１：５’−  ＧＴＧＧＡＡＴＣＴＣＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡ、配列番号９１）を用いたＰＣＲによる１，６２３ｂｐ  ＢＢ−ＨＤＲ鋳型の誘導のために用いた後、前述のようにＴＯＰＯクローニングした。各プラスミドを使用前に配列確認した。Ｆａｓｔ−Ｉｏｎ  ＭＩＤＩ  ＰＬＡＳＭＩＤ  ＥＮＤＯ−ＦＲＥＥ  ｋｉｔ（ＩＢＩ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、トランスフェクション用プラスミドを調製した。ｒＡＡＶパッケージング．ＢＢ−ＨＤＲをｐＡＡＶ−ＭＣＳにクローニングした後、ＡＤＥＮＯ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＶＩＲＵＳ  ＨＥＬＰＥＲ−ＦＲＥＥ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、パッケージングした。手短には、１０ｃｍディッシュＡＡＶ−２９３細胞を各々５μｇのｐＡＡＶ−Ｈｅｌｐｅｒ、ｐＡＡＶ−ＲＣ及びＡＡＶ−ＢＢ−ＨＤＲプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、細胞をこすり取ることにより、プレートから除去し、１ｍｌの増殖培地に導入した。３回の凍結−乾燥サイクルによりウイルス粒子を放出させた後、微量遠心機において最大速度で５分間の遠心分離に付した。上澄みを吸収した後、標的細胞の感染のために直接使用した。
【００９３】
Ｂ）Ｐｏｌｌｅｄ１５９２鋳型．３８３ＰＯＬＬＥＤ対立遺伝子を含む１，７８４ｂｐ断片を、アンガス牛ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増殖した（Ｆ１：５’−ＧＧＧＣＡＡＧＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号９２）；Ｒ１−５’−ＴＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＴＡＧＣＡＧＧＡＴＴＣＡ、配列番号９３）後、ＰＣＲ  ２．１ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にＴＯＰＯクローニングした。このプラスミドを、分析用プライマーセットの陽性対照鋳型として、並びに以下のプライマー（１５９４  Ｆ：５’−ＡＴＣＧＡＡＣＣＴＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＣＡＴＴＧ、配列番号９４；  Ｒ１：５’−  ＴＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＴＡＧＣＡＧＧＡＴＴＣＡ、配列番号９５）を用いたＰＣＲによる１，５９２ｂｐ  ＨＤＲ鋳型の誘導のために用いた後、前述のようにＴＯＰＯクローニングした。各プラスミドを使用前に配列確認した。Ｆａｓｔ−Ｉｏｎ  ＭＩＤＩ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｅｎｄｏ−Ｆｒｅｅ  ｋｉｔ（ＩＢＩ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、トランスフェクション用プラスミドを作製し、５μｇ又は１０μｇを２μｇのＨＰ１．３  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡと一緒にトランスフェクトした。オリゴヌクレオチド鋳型．全てのオリゴヌクレオチド鋳型は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより合成されたものであり、１００ｎモル合成物を標準的脱塩により精製した後、ＴＥ中に４００μＭまで再懸濁させた。
【００９４】
実施例４  組織培養及びトランスフェクション
ブタ又は家畜線維芽細胞を、１０％胎仔ウシ血清、１００Ｉ．Ｕ．／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシン、並びに２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ中の、５％ＣＯ２で、３７若しくは３０℃（表示の通り）に維持した。トランスフェクションのために、別に記載のない限り、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｍｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたトランスフェクションを通じて、全てのＴＡＬＥＮ及びＨＤＲ鋳型を送達した。手短には、１００％密集に達した低継代オサボー（Ｏｓｓａｂａｗ）、ランドレース（Ｌａｎｄｒａｃｅ）、和牛（Ｗａｇｙｕ）、又はホルスタイン（Ｈｏｌｓｔｅｉｎ）線維芽細胞を１：２に分割し、翌日７０〜８０％密集で回収した。各トランスフェクションは、プラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡ及びオリゴと混合したバッファー「Ｒ」中に再懸濁させた５００，０００〜６００，０００細胞からなり、次のパラメータ：入力電圧；１８００Ｖ；パルス幅；２０ｍｓ；及びパルス数；１により１００μｌチップを用いてエレクトロポレーションした。典型的に、２〜４μｇのＴＡＬＥＮ発現プラスミド又は１〜２μｇのＴＡＬＥＮｍＲＮＡ及び２〜３μＭの目的遺伝子に特異的なオリゴが各トランスフェクションに含まれた。これらの量からの誘導を図面の説明に記載する。トランスフェクション後、３０若しくは３７℃のいずれかでそれぞれ３日間の培養のために、細胞を６ウェルディッシュの２つの個別のウェルに６０：４０で分割した。３日後、細胞集団を拡大し、３７℃で少なくとも１０日目まで編集物の安定性を評価した。
【００９５】
実施例５  細胞クローンの希釈物単離
トランスフェクションから３日後、５０〜２５０細胞を１０ｃｍディッシュに接種し、個別のコロニーが直径約５ｍｍに達するまで培養した。この時点で、ＰＢＳ中に１：５（ｖｏｌ／ｖｏｌ）希釈した６ｍｌのＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、コロニーを吸引し、２４ウェルディッシュに移した後、同じ４２０条件下で培養した。密集に達したコロニーを回収し、冷凍保存及び遺伝子型決定のために分割した。サンプル調製物：３日目及び１０日目のトランスフェクト細胞集団を６ウェルディッシュのウェルから回収し、１０〜３０％を５０μｌの１×ＰＣＲ適合性溶解バッファー：２００μｇのプロテイナーゼＫを新しく補充した１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＣｌｐＨ８．０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．４５％ＴｒｙｔｏｎＸ−１００（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、０．４５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）中に再懸濁させた。溶解物をサーマルサイクラー中で次のプログラム：５５℃で６０分、９５℃で１５分を用いて、処理した。希釈クローニングからのコロニーサンプルを、２０〜３０μｌの溶解バッファーを用いて、前述のように処理した。
【００９６】
実施例６  和牛（Ｗａｇｙｕ）線維芽細胞におけるプラスミド及びｒＡＡＶ  ＨＤＲ
低継代和牛（Ｗａｇｙｕ）線維芽細胞を、７０〜９０％密集まで培養した後、以前に記載されている（Ｃａｒｌｓｏｎ  ２０１２）ように、７５０ｎｇのＳＬＥＥＰＩＮＧ  ＢＥＡＵＴＹトランスポゾン成分と一緒に、各々２μｇのＴＡＬＥＮ発現プラスミド（ｂｔＧＤＦ８３．１Ｌ＋ＮＲ，）を用いたＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＩＯＮ（Ｌｏｎｚａ）によりトランスフェクトした。プラスミドＨＤＲ鋳型を用いた条件の場合、２μｇのＢＢ−ＨＤＲプラスミドもトランスフェクションに含んだ。トランスフェクトした細胞は、３０又は３７℃での培養のために、６ウェルプレートの２つのウェルに分割した。ｒＡＡＶ  ＨＤＲ鋳型を用いた条件の場合、トランスフェクションから２時間後、１５０μｌのウイルス溶解物を各ウェルに添加した。３日のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理により回収し、その一部を３日目にＨＤＲの分析のために溶解させ、残りは、以前に記載されている（Ｃａｒｌｓｏｎ  ２０１２）ように、コロニー単離のために平板培養した。
【００９７】
実施例７  突然変異検出及びＲＦＬＰ分析
意図する部位にフランキングするＰＣＲを、１μｌの細胞溶解物と共に、ＰＬＡＴＩＮＵＭ  ＴＡＱ  ＤＮＡ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ  ＨＩＦＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造者の推奨事項に従い実施した。前述のように、１０ｕｌのＰＣＲ産物を用いて、ＳＵＲＶＥＹＯＲ  ＭＵＴＡＴＩＯＮ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  Ｋｉｔ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）により、集団中の突然変異の頻度を分析した。表示の制限酵素を用いて、１０μｌの上記ＰＣＲ反応物に対してＲＦＬＰ分析を実施した。ＳＵＲＶＥＹＯＲ及びＲＦＬＰ反応物を１０％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル上で分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。バンドの密度測定を、ＩｍａｇｅＪを用いて実施し；ＳＵＲＶＥＹＯＲ反応物の突然変異率をＧｕｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０４９に記載のように計算した。ＨＤＲの割合（％）は、ＲＦＬＰ断片の強度和を、親バンド＋ＲＦＬＰ断片の強度和で割ることにより算出した。ｍｌｍｏｘＰ挿入の分析の場合、挿入部位にわたる小ＰＣＲ産物を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、野生型対立遺伝子に対する挿入物をサイズにより識別し、定量することができた。ＰＣＲ産物を１Ｘ  ＭＹＴＡＱ  ＲＥＤ  Ｍｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）により増幅して、２．５％アガロースゲル上で分離した以外は、コロニーのＲＦＬＰ分析を同様に処理した。ＧＤＦ８  Ｇ９３８Ａのみ（オリゴには、新規のＲＦＬＰが欠如している）の移入のためのコロニーの分析のために、異型接合及び同型接合移入を識別することができる３つのプライマーアッセイにより、コロニーを初めにスクリーニングした。手短には、ブタ又はウシコロニーからの溶解物を、以下のプライマー及びプログラムを使用し、１Ｘ  ＭＹＴＡＱ  ＲＥＤ  ＭＩＸ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を用いたＰＣＲにより分析した。ウシＧＤＦ８（外部Ｆ１：５’−ＣＣＴＴＧＡＧＧＴＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧ、配列番号９６、外部Ｒ１：５’−ＴＴＣＡＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＧＣ、配列番号９７、内部Ｆ１：５’−ＴＡＡＧＧＣＣＡＡＴＴＡＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＣＴＡ、配列番号９８；及び３５サイクルの（９５℃、２０秒；６２℃、２０秒；７２℃、６０秒）。ブタＧＤＦ８：外部Ｆ１：５’−ＣＣＴＴＴＴＴＡＧＡＡＧＴＣＡＡＧＧＴＡＡＣＡＧＡＣＡＣ、配列番号９９、外部Ｒ１：５’−  ＴＴＧＡＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＴＧＧＧＡＧ、配列番号１００  内部Ｆ１：５’−ＴＡＡＧＧＣＣＡＡＴＴＡＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＴＡ、配列番号１０１；及び３５サイクルの（９５℃、２０秒；５８℃、２０秒；７２℃、６０秒）。候補からのアンプリコンを直接配列決定し、及び／又はＴＯＰＯクローニングした（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）後、サンガー法（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシングにより配列決定した。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型を用いたＴＡＬＥＮ媒介ＨＤＲを検出するために、１μｌのＰＣＲ溶解物（１，０００細胞／ｕｌ）又はその１：１０希釈物１μｌのいずれかを、ＰＣＲプライマーｂｔ  ＧＤＦ８  ＢＢ  ５−１（プライマー「ｃ」）及びプライマー「ｃ」（ＢＢ−Ｄｅｔｅｃｔ  ３−１−  ５’−ＧＣＡＴＣＧＡＧＡＴＴＣＴＧＴＣＡＣＡＡＴＣＡＡ、配列番号１０２��を用いたＰＣＲ反応物に添加した後、１Ｘ  ＭＹＴＡＱ  ＲＥＤ  ＭＩＸ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を用いたＰＣＲに４０サイクル（９  ４５９  ５℃、２０秒；６６℃、２０秒；７２℃、６０秒）付した。ＰＣＲにより同定されるコロニー中のＨＤＲを確認するために、全遺伝子座の増幅を、プライマーｂｔ  ＧＤＦ８  ＢＢ  ５−１及びｂｔ  ＧＤＦ８  ＢＢ  ３−１を用いて実施した後、ＴＯＰＯクローニング（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び配列決定した。
【００９８】
実施例８
ＰＯＬＬＥＤ移入の検出を、１Ｘ  ＭｙＴａｑ  Ｒｅｄ  ＭＩＸ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用し、Ｆ１プライマー（前文参照）及び「Ｐ」プライマー（５’−ＡＣＧＴＡＣＴＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣ、配列番号１０３）を用いた３８サイクル（９５℃、２５秒；６２℃、２５秒；７２℃、６０秒）のＰＣＲにより、実施した。（Ｆ２：５’−ＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＴＴＣＴＴＧＧ、配列番号１０４；Ｒ２−５’−ＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＴＣＴＴＧＧＧＴＧＴ、配列番号１０５）を用いて、実施した。両試験を通過した候補を、フランキングＦ１及びＲ１プライマーを用いたＰＣＲにより解析した後、ＴＯＰＯクローニング及び配列決定した。ＦｅｃＢ移入の検出をヒツジについて以前に記載されているように実施した。Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ移入をＡＶＡＩＩ  ＲＦＬＰアッセイにより検出した。図６の結果を参照されたい。
【００９９】
実施例９  アンプリコン配列決定及び解析
トランスフェクトした集団からＤＮＡを分離し、１００〜２５０ｎｇを、５０μｌのＰＬＡＴＩＮＵＭ  ＴＡＱ  ＤＮＡ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ  ＨＩＧＨ  ＦＩＤＥＬＩＴＹ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（製造者の推奨事項に従いアセンブリングした）に添加した。各サンプルに、マルチプレックスシーケンシングを可能にするユニークなバーコードを含むプライマーセットを割り当てた。ＰＣＲ産物の一部を２．５％アガロースゲル上に分離してサイズを確認した後、ＭＩＮＥＬＵＴＥ  ＰＣＲ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＰＣＲクリーンアップを実施した。サンプルを定量し、配列決定のための単一のサンプル中にプールした。合わせた単一サンプルに２５％ＰｈｉＸ（配列多様性のために）を加え、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭＩＳＥＱシーケンサで配列決定することにより、１５０塩基対ペアエンドリードを生成した。ＦＡＳＴＱＣを用いて、リード品質を評価した。オーバーラップエンドを有するリードペアを、ＥＡ−ＵＴＩＬＳパッケージからのＦＡＳＴＱ−ＪＯＩＮを用いて結合した。カスタムＰＥＲＬスクリプトを用いて、結合リードを逆多重化し、挿入タイプをカウントする。逆多重化ステップには、フォワード及びリバースプライマーとの厳密なマッチが必要とされた。クローン化動物をＲＦＬＰアッセイ及び配列決定により遺伝子型決定した。本実施例及び他におけるブタを、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａとの契約に従いクローニングした。
【０１００】
実施例１０  ＴＡＬＥＮの供給源としてのトランスフェクトｍＲＮＡの評価
図７を参照して、非修飾ｍＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄ  ｍＲＮＡ）又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）のいずれかによりコード化したブタ線維芽細胞に、Ｐ６５＿１１．１  ＴＡＬＥＮを導入した。２つの量の各ＴＡＬＥＮ調製物をヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ）により細胞にトランスフェクトし、３０℃又は３７℃で３日培養した後、ｉｎｄｅｌの分析に付した。ＮＨＥＪの割合（％）は、３０℃でインキュベートした全ｍＲＮＡトランスフェクションについて同様であったが、用量応答は、３７℃でインキュベートしたトランスフェクト細胞に認めることができた。特に、３０℃でインキュベートした全ての群でのｍＲＮＡトランスフェクションは、同じ条件下でプラスミドＤＮＡとしてトランスフェクトしたＴＡＬＥＮより、性能が有意に優れていた。この試験において修飾ｍＲＮＡ及び非修飾ｍＲＮＡの間にほとんど差はなかった。Ｐ６５＿１１．１  ＴＡＬＥＮ：
【化１】
2020089386.tif 000007
（配列番号１０６）、下線は、ＴＡＬＥＮ結合部位を示す。
【０１０１】
実施例１１  ＴＡＬＥＮの動態は、オリゴヌクレオチド鋳型を有するＨＤＲを誘導した。
図８Ａを参照すると、ＴＡＬＥＮのｍＲＮＡは、オリゴドナーを用いた効率的かつ一貫したＨＤＲを刺激した。各チャートは、オリゴドナー鋳型と、プラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡとして送達されたＴＡＬＥＮを用いて、線維芽細胞中の特定の遺伝子座（例えば、ｓｓＩＬ２ＲＧ；Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａの場合には「ｓｓ」、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓの場合には「ｂｔ」）のターゲティング結果を示す。（差し込み図）オリゴ鋳型の図であり、ここで、陰影を付けたボックスは、ＴＡＬＥＮ結合部位を表し、スペーサは白で示す。各オリゴは、ＲＦＬＰ分析のための新規制限部位を導入する４ｂｐの挿入（ｉｎｓ４）又は欠失（ｄｅｌ４）のいずれかを含有する。推定ＢＭは、保存−１チミジン（ＴＡＬＥＮ結合部位に対して）を、表示のヌクレオチドで置換する。線維芽細胞は、３μＭのそれらのコグネイトオリゴ相同鋳型と一緒に、ＴＡＬＥＮコード化プラスミド（３μｇ）又はｍＲＮＡ（１μｇ）のいずれかでトランスフェクトした。次に、細胞を３７℃又は３０℃で３日間インキュベートした後、１０日目まで３７℃で拡大した。ＴＡＬＥＮ活性を３日目にＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより測定し（３日目Ｓｕｒｖｅｙｏｒ）、ＨＤＲを３日目及び１０日目にＲＦＬＰ分析により測定した（３日目％ＨＤＲ及び１０日目％ＨＤＲ）。バーは各々、３回の反復実験からの平均及びＳＥＭを示す。
【０１０２】
図８Ｂを参照して、ブタ線維芽細胞を、ＴＡＬＥＮコード化ｍＲＮＡ又はプラスミドＤＮＡのいずれか、及びＬＤＬＲ若しくはＡＰＣ遺伝子をターゲティングする４塩基対挿入を有するオリゴによりトランスフェクトした。続いて、各トランスフェクションからの細胞を７つの２４ウェルプレートウェルに均等に分割し、３０℃で培養した後、表示の時点でＲＦＬＰにより分析した。パネルａ）表示時点での細胞集団に対するＲＦＬＰ分析。パネルｂ）パネルａからの結果をデンシトメトリにより定量し、時間の関数として、平均をＳＥＭ（ｎ＝３）と共にプロットした。ＨＤＲシグナルは、トランスフェクションから１２時間後に初めて出現し、時間経過と共に蓄積した。ＬＤＬＲでのＨＤＲの開始は、ＴＡＬＥＮ供給源に非依存的であったが、２４時間〜７２時間のＨＤＲの速度は、プラスミドＤＮＡと比較して、ｍＲＮＡを用いた場合、はるかに高かった。
【０１０３】
実施例１２  ＨＤＲの頻度に対する突然変異タイプの影響
図９を参照して、パネルａ）ｓｓＬＤＬＲをターゲティングするのに用いられる５つのオリゴの配列。オリゴは、長さ及び突然変異のタイプが異なる。ＴＡＬＥＮ結合部位は、ボックスで囲んだ文字で示し、新規のＢａｍＨＩ部位には下線を引く。ＢＭ及び挿入を含むＳＮＰは、サークルで囲んだ。パネルｂ）細胞をＬＤＬＲ２．１  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ（１μｇ）及びオリゴ（最終２μＭ）でトランスフェクトした。３日目のＨＤＲをＲＦＬＰ分析により決定し、ＳＥＭを含む平均（ｎ＝３）をプロットした。結果は、挿入対立遺伝子が、ＳＮＰ又は欠失より効率的に組み込まれるが、４６〜９０ｂｐの相同性長さは、ＨＤＲ効率に無視できる影響しか及ばさなかったことを示唆している。ｃ）ウシ細胞をｂｔＲｏｓａ１．２  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡと、４１＿ｍｌｏｘＰ又は６０＿ｌｏｘＰオリゴのいずれか（最終２μＭ）でトランスフェクトした。４１及び６０の数字は、相同的塩基の数を指す。各オリゴは、３４ｂｐ  ｌｏｘＰ部位、すなわち修飾（ｍｌｏｘＰ）又は野生型（ｌｏｘＰ）形態のいずれかをスペーサの中央に含有する。３日目及び１５日目のデンシトメトリは、ｌｏｘＰ部位の挿入が、効率的かつ安定していることを示している。
【０１０４】
実施例１３  イボイノシシ由来のｐ６５  Ｓ５３１Ｐ突然変異を在来のブタに移入させるためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲ
図１０を参照して、パネルａ）Ｓ５３１Ｐミスセンス突然変異を、ブタｐ６５のヌクレオチド１５９１でのＴ−Ｃトランジッションにより誘発する。Ｓ−Ｐ  ＨＤＲ鋳型は、新規ＸｍａＩ部位を導入し、ＲＦＬＰスクリーニングを可能にする原因ＴＣトランジッション突然変異（拡大文字）を含む。２つのｇＲＮＡ配列（ｐ６５＿Ｇ１Ｓ及びｐ６５＿Ｇ２Ａ）を、以前の実験で用いたｐ６５．８ＴＡＬＥＮと一緒に示す。パネルｂ）ランドレース線維芽細胞を、Ｓ−Ｐ−ＨＤＲオリゴ（２μＭ）、２つの量のｈＣａｓ９コード化プラスミド（０．５μｇ又は２．０μｇ）；及び５つの量のＧ２Ａ転写プラスミド（０．０５〜１．０μｇ）でトランスフェクトした。各トランスフェクションからの細胞を３０及び３７℃でそれぞれ３日間の培養のために６０：４０に分割した後、１０日目まで３７℃で培養を延長した。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより、１６〜３０％の活性が判明した。パネルｃ及びｄ）３日目及び１０日目にサンプリングした細胞のＲＦＬＰ分析。１９１及び１１８ｂｐの予測切断産物を黒い矢印で示す。二本鎖切断（ＤＳＢ）が標的ＳＮＰに接近しているにもかかわらず、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲは、Ｓ５３１Ｐの移入についてＴＡＬＥＮより非効率的であった。また、各ｇＲＮＡ配列を用いて、個別のコロニーを分析した（データは、示していない）。
【０１０５】
図１１を参照して、ブタＡＰＣでのＴＡＬＥＮ及びＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲの比較のために実験を実施した。パネルａ）ＡＰＣ１４．２  ＴＡＬＥＮ及びｇＲＮＡ配列ＡＰＣ１４．２  Ｇ１ａを野生型ＡＰＣ配列と比較して示す。その下に、ＨＤＲオリゴを示し、これは、４ｂｐ挿入（オレンジ色の文字）を送達して、新規ＨｉｎｄＩＩＩ部位をもたらす。次に、２μＭのオリゴＨＤＲ鋳型と、１μｇのＴＡＬＥＮｍＲＮＡ、各々１μｇのｈＣａｓ９コード化プラスミドＤＮＡ及びｇＲＮＡ発現プラスミド；又は１μｇのｈＣａｓ９コード化ｍＲＮＡ及び０．５μｇのｇＲＮＡ発現プラスミドのいずれかでトランスフェクトしたブタ線維芽細胞を分割し、３０又は３７℃のいずれかで３日間培養した後、１０日目まで３７℃で拡大した。パネルｂ）ＲＦＬＰ及びＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ結果を示すチャート。以前決定したように、ＴＡＬＥＮ刺激ＨＤＲは３０℃で最も効率的であったが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲは、３７℃で最も効率的であった。この遺伝子座の場合、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより測定された類似のＤＮＡ切断頻度にもかかわらず、ＨＤＲの刺激について、ＴＡＬＥＮは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系より有効であった。ＴＡＬＥＮとは対照的に、ｈＣａｓ９をｍＲＮＡとして送達した場合、プラスミドと比較して、ＨＤＲにほとんど差はなかった。
【０１０６】
実施例１４  オリゴドナーを用いたＳＮＰ移入
図１２を参照して、パネルａ）ＨＤＲ対立遺伝子の維持に対するブロック突然変異（ＢＭ）の影響を、ブタＬＤＬＲ及びＧＤＦ８において評価した。ブロック突然変異有り又はなしで同じＳＮＰ／制限３１３部位を導入するために、各オリゴを設計した。最初に３０℃で３日間培養したトランスフェクトした集団中でＨＲを定量した後、ＲＦＬＰアッセイにより１２日目まで３７℃でさらに維持した。平均及びＳＥＭ（ｎ＝３）を示す。パネルｂ）和牛（Ｗａｇｙｕ）線維芽細胞へのミオスタチンＣ３１３Ｙの移入。Ｃ３１３Ｙミスセンス突然変異は、ウシミオスタチンのヌクレオチド９３８でのＧ−Ａトランジッション（拡大文字により示す）によって誘発する。ＨＤＲ鋳型は、ＲＦＬＰスクリーニングのための新規ＥｃｏＲＩ部位を導入するために、ＴからＣへのトランジッション（サークルで囲む）も含む。２つの左ＴＡＬＥＮは、遺伝子座に対して設計され、ｂｔＧＤＦ８３．６−Ｇは、野生型対立遺伝子（Ｗｔ）をターゲティングし、また、ｂｔＧＤＦ８３．６−Ａは、突然変異対立遺伝子（Ｃ３１３Ｙ）をターゲティングし：いずれも共通の右ＴＡＬＥＮを有する。トランスフェクション、培養及び測定は前述のように実施した。ｂｔＧＤＦ８３．６−Ｇ（ｎ＝３０）及びｂｔＧＤＦ８３．６−Ａ（ｎ＝５）についての平均及びＳＥＭは、それぞれ１２及び３回の生物学的反復実験を代表する。両側スチューデントｔ検定を用いて、群同士の平均を比較し；ｐ値を示す。
【０１０７】
実施例１５  ＳＮＰ
図１３は、ＴＡＬＥＮ刺激ＨＤＲ対立遺伝子の配列分析の結果を示すプロットである。ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ及びオリゴトランスフェクト細胞集団から得られた標的部位（合計２００〜２５０ｂｐ）にフランキングするＰＣＲアンプリコンをＩＬＬＵＭＩＮＡシーケンシングにより配列決定した。総リードカウントは、サンプル当たり１０，０００３２８〜４００，０００の範囲であった。野生型リードに対し、完全な、意図するＨＲリードのカウントを、挿入（パネルａ）及びＳＮＰ対立遺伝子（パネルｂ）についてプロットする。標的遺伝子座、時点、並びにＢＭがオリゴに含まれていたか否かを下に示す（パネルｃ）。ｂｔＧＤＦ８及びｐ６５からのリードを標的ＳＮＰの組込みについて選別した後、追加突然変異を含むもの（ｉＳＮＰ＋Ｍｕｔ）に対して、意図するもの（ｉＳＮＰ）を分類し、リード総数に対してプロットした。
【０１０８】
実施例１６  ＨＤＲ対立遺伝子の配列分析
図１４を参照して、正しい挿入（パネルａ）又はＳＮＰ対立遺伝子（パネルｂ）を含有する配列決定リードをＢＭの組込みについて分析した。標的遺伝子座、時点、並びにＢＭがオリゴに含まれていたか否かを、各グラフの下に示す。一般に、最も頻繁には５’ＢＭがＨＤＲ変換路に組み込まれた後、両方のＢＭ、又は３’ＢＭのみが組み込まれた。ＬＤＬＲへの意図する突然変異が、４ｂｐ挿入対立遺伝子と比較して、ＳＮＰである場合、ＢＭの分布は、両ＢＭの組込みに幾分傾く。また、興味深いことに、ｂｔＧＤＦ８について意図するリードの大部分は、少なくとも一方のＢＭを組み込んだが、３’ＢＭを単独で有するものは稀であることに留意されたい。従って、ＢＭは、培養物中に意図するＳＮＰ（ｉＳＮＰ）対立遺伝子を維持する頻度に対して有意な影響をもたらさないが、他の遺伝子座に対するその濃縮は、これらが、ＴＡＬＥＮ再切断からいくらかの防御をもたらした可能性を示唆している。ｃ）図１３パネルｃのデータを突然変異タイプによりさらに分類し、比較した。ｉＳＮＰのみを含むリードもあれば、ｉｎｄｅｌを伴うもの（ｉＳＮＰ＋ｉｎｄｅｌ）、又は意図しないＳＮＰを伴うもの（ｉＳＮＰ＋ｕＳＮＰ）もあった。ＢＭが鋳型に含まれない場合、ｉＳＮＰ＋ｉｎｄｅｌの頻度にいくらかの上昇が見られ、ｉｎｄｅｌの大部分はスペーサ領域内に位置し、これは、既に変換された対立遺伝子の再切断の結果であると考えられる。
【０１０９】
実施例１７  ＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合部位における複数のＳＮＰがＨＤＲ対立遺伝子を安定化する
図１５を参照して、ＥＩＦ４ＧＩ遺伝子は、ＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合部位における複数のＳＮＰで安定化された。パネルａ）野生型ＥＩＦ４ＧＩ  Ｗｔ−ＮＬの一部を示す。野生型ＥＩＦ４ＧＩを切断して、相同組換えを刺激するように、ＴＡＬＥＮのペアを設計した。また、３つのＳＮＰ（赤い拡大文字）をゲノムに導入するために用いるドナーオリゴ、ＤＦ−ＨＤＲのコア配列をＷｔ配列とアラインメントする。第３のＳＮＰは、新規ＥａｇＩ制限部位を形成し、これをＲＦＬＰ分析に用いた。ブタ線維芽細胞を、ＥＩＦ４ＧＩ１４．１  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ（２μｇ）及びＤＦ−ＨＤＲ（２μＭ）でトランスフェクトした後、３０℃で３日間培養した後、分析及びコロニー増殖に付した。パネルｂ）トランスフェクションから３日後の集団に対するＲＦＬＰ分析。３４４，１７７及び１６７ｂｐの予測産物サイズを、黒い三角形で示す。パネルｃ）単離した細胞クローンに対するＲＦＬＰアッセイ。３日目の細胞を用いて、希釈クローニングによるモノクローナルコロニーを取得した。異型接合（白い三角形）又は同型接合（黒い三角形）ＨＤＲ対立遺伝子を有するコロニーの例を示す。
【０１１０】
実施例１８  ＳＮＰ  ＨＤＲ対立遺伝子の維持のための低温処理
図１６を参照して、ブタ線維芽細胞をＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ（１μｇ）及びオリゴ（３μＭ）でトランスフェクトした。２つの独立したトランスフェクションからの細胞を各反復実験についてプールし、６ウェルプレートの６ウェルに均等に配分した後、３０℃で培養した。トランスフェクションから１〜７日後（６日目を除き、Ｘ軸に沿って１Ｄ〜７Ｄ）のＲＦＬＰ分析のために、これらの集団からサンプルを採取し、残る細胞を３７℃で移入した。各条件についてのサンプルをＲＦＬＰ分析のために１２日目に再度採取した。最初の採取時及び１２日目の平均ＨＤＲ及びＳＥＭ（ｎ＝３）を示す。
【０１１１】
【表５】
2020089386.tif 000008
【０１１２】
実施例１９  ＳＮＰの移入のための意図的ＲＶＤミスマッチ
図１７を参照して、パネルａ）ｃａＣＬＰＧ領域をターゲティングするように、ＴＡＬＥＮペア（ｃａＣＬＰＧ１．１）を設計した。オリゴ駆動ＨＤＲを用いて、要望されるアデニンをグアニンＳＮＰに導入した（標的アデニンをボックスで囲む）。要望されるＳＮＰは、ＡｖａＩＩ制限部位の喪失により、遺伝子型決定が可能になった。各ＴＡＬＥＮモノマーは、それぞれの結合位置の上方に陰影を付けて示す。Ｎ及びＣ末端をＮ及びＣでそれぞれ示す。ｂ）ＡｖａＩＩに対して耐性であった単一細胞由来コロニーの各対立遺伝子を配列決定した（ＡｖａＩＩ耐性対立遺伝子のみを示す）。目的のＳＮＰ（ボックスで囲む）を含む対立遺伝子は全て、欠失（ＡｖａＩＩ耐性対立遺伝子配列中にダッシュで示す）又は挿入（ＷＴ配列中にダッシュで示す）も含有した。ｃ）再結合、並びに後に起こる再切断の可能性を低減するために、意図的ミスマッチ（サークルで囲んだ斜体）をＲＶＤ配列に導入した。ミスマッチは、ＴＡＬＥＮの右モノマーにおける要望のＳＮＰ（ボックスで囲む）に結合するであろうＲＶＤの直前及び／又は直後のＲＶＤに配置した。ｄ）ＴＡＬＥＮ活性をＣｅｌＩアッセイにより測定した。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の割合（％）は、１．１及び１．１ｂと同等であった（２８％）が、１．１ａ及び１．１ｃ（それぞれ３０％及び３１％）の方が１．１より高かった。ｅ）ｃａＣＬＰＧ１．１ｃを用いて生成されたＡｖａＩＩ耐性単一細胞由来コロニーの両方の対立遺伝子を配列決定した。要望されるＳＮＰをボックスで囲む。コロニー３７及び７８は、要望のＳＮＰに対して異型接合であったが、追加的ｉｎｄｅｌは全く示さなかった。コロニー１４２は、要望のＳＮＰに対して同型接合であったが、１つの対立遺伝子に４ｂｐ挿入を含有した。
【０１１３】
実施例２０  ＳＮＰ移入に必要なミスマッチ
図１８を参照して、ミスマッチは、ＳＮＰ移入に必要であった。Ｋ３２３Ａ周辺のウシＤＧＡＴ配列の概略図。グレイの矢印は、ＤＧＡＴ配列に結合するＴＡＬＥＮモノマーを示す。左アームは、１６ＲＶＤからなり、右アームは、１５ＲＶＤからなり、スペーサは長さ１６塩基対である。ボックスで囲んだＧＣ及びｇｇａｇｃｔは、標的塩基対である。ＤＧＡＴオリゴは、ＧＣをＡＡに変換して、要望されるＤＧＡＴ突然変異体を形成する。ＨＤＲのマーカとして、ボックスで囲んだＧＧＧＡＧＣは、ＡＡＧＣＴＴに変換され、これが、新規ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を形成する。この変化がスペーサ内であるため、ＴＡＬＥＮ結合に影響を与えず、従って、意図的ミスマッチ結果を妨害しないはずである。ｂ）ＤＧＡＴ  ＴＡＬＥＮ  ＲＶＤ配列。ｂｔＤＧＡＴ  １４．２は、ＲＶＤに意図的ミスマッチを一切含まない。ｂｔＤＧＡＴ  １４．４、１４．５及び１４．６は、左ＴＡＬＥＮモノマーの１、３、若しくは５位（サークルで囲む）のいずれかに１つの意図的ＲＶＤミスマッチを含有する。ｃ）ウシ線維芽細胞を１ｕｇのｔａｌｅｎ及び０．４ｎモルのオリゴでトランスフェクトした。トランスフェクションから３日後、細胞を溶解させ、ＤＧＡＴ配列をＰＣＲにより増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化してから、アクリルアミドゲル上で泳動させた。ＨＤＲの効率（％）をデンシトメトリ（ＨＲ）により決定した。ｄ）コロニーの配列分析は、オリジナル１４．２ＴＡＬＥＮと共に実施する。該当部位にオーバーラップするｉｎｄｅｌのために、１２コロニーのうち、ＨｉｎｄＩＩＩ  ＲＦＬＰについて陽性であったもので、要望される突然変異を含有したものは１つもなかった。ｅ）ＴＡＬＥＮ１４．５及び１４．６から得られたコロニーは、正しいＤＧＡＴ突然変異及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を生成した。これら２つのＴＡＬＥＮペアは、合わせて２つの同型接合（ＨＨ）コロニーと３つの異型接合（Ｈｈ）コロニーを生成した。ＴＡＬＥＮ１４．４は、正しいＤＧＡＴ突然変異を含むコロニーを全く生成しなかった（データは、示していない）。
【０１１４】
実施例２１  オールインワンＴＡＬＥＮ−ＨＤＲ／Ｃｒｅ−ＲＭＣＥ
図１９は、ＴＡＬＥＮ−ＨＤＲ／ＲＭＣＥのプロセスを示す。ｆｌｏｘｅｄカセットを、オリゴと適合性のＴＡＬＥＮ、ｌｏｘＰオリゴ及びＣｒｅリコンビナーゼの供給源と一緒にトランスフェクトした。この方法を機能させるために、ＴＡＬＥＮは、標的遺伝子座を切断してから、ｌｏｘＰオリゴによる修復の後、修復部位へのＣｒｅ−媒介ＲＭＣＥを実施しなければならない。棒グラフは、ＹＦＣ−Ｃｒｅ及びｍＣｈｅｒｒｙをトランスフェクションに含有させた場合に、この方法により生成されたプロマイシン耐性コロニーの数を示す。ＳＲＹ遺伝子座へのターゲティングを確認するために、３７０ｂｐ産物をもたらすであろう推定結合部（表示の通り）を横断して、ＰＣＲを実施した。この産物は、Ｃｒｅが含まれた場合にのみ明確に見える。この実験セットの場合、次の条件を使用した：１ｕｇのＳＲＹ  ＴＡＬＥＮ＋０．３ｎモルのＳＳＣＹ＿ＬｏｘＰオリゴ＋ＣＬＰ−ＹＦＰ−Ｃｒｅ（０．５ｕｇ）＋Ｆｌｏｘｅｄ  ＰＴＫ（２ｕｇ）でトランスフェクトした６００，０００個の細胞。陰性対照は、ＣＬＰ−ＹＦＰ−Ｃｒｅの代わりに０．５ｕｇのｍＣｈｅｒｒｙプラスミドを有した。ＳＳＣＹ＿ＬｏｘＰオリゴ：
ＴＴＴＴＡＴＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＣＡＣＡＴＡＴＡＴＡＴＧＡＡＡＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＴＧＡＣＡＧＴＡＴＴＡＡＴＧＧＣＣＴＧＡＡＣＣＴＡＧＣＣＡＧＡＡＣＴ（配列番号８０）
【０１１５】
さらなる開示
本明細書に記載する特許、特許出願、参考文献、及び刊行物は全て、本明細書に参照により組み込むものとし、矛盾が生じる場合には本明細書が優先される。以下は、本明細書に記載する本発明の実施形態の例である。
【０１１６】
いくつかの実施形態は、標的エンドヌクレアーゼの使用のための低温条件に関する。例えば；１．細胞の染色体ＤＮＡを変化させるための鋳型組換え修復の低温方法であって、生存細胞に、標的ヌクレアーゼ系及び核酸鋳型を導入するステップを含み、標的ヌクレアーゼ系及び鋳型が作動することにより、鋳型配列に対して同一性を有するように染色体ＤＮＡを改変し、その際、生存細胞が、導入の時点から数えて３日を超える所定の期間にわたって、生理学的温度を下回る低温培養温度で維持される、方法。２．染色体ＤＮＡへの鋳型配列の安定な組込みを増大させる低温培養を含む、１に記載の方法。３．低温培養温度が２０〜３４℃の範囲に維持される、１に記載の方法。４．期間が３日を超える、１に記載の方法。５．期間が３日超〜６週間の範囲である、１に記載の方法。６．細胞を鋳型配列について試験するステップをさらに含む、１に記載の方法。７．標的ヌクレアーゼ系が、Ｃａｓ９及び規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）、又はヌクレアーゼに結合した複数のＴＡＬエフェクター反復配列（ＴＡＬＥＮ）を含む、１に記載の方法。８．核酸ガイドがｓｓＤＮＡである、６に記載の方法。９．１つ又は複数のヌクレアーゼ、核酸ガイド、及び核酸鋳型が、ｍＲＮＡとして細胞に導入される、１に記載の方法。１０．細胞が、初代細胞、初代体細胞、卵、精子、接合子、生殖細胞、幹細胞、卵母細胞、精子、及び胚からなる群から選択される、１に記載の方法。１１．動物が、鋳型配列に対して同型接合である、１に記載の方法。１２．１に記載の方法により作製される細胞。
【０１１７】
また、例えば；１．細胞の染色体ＤＮＡを変化させるための鋳型組換え修復の方法であって、生存細胞に、標的ヌクレアーゼ系、核酸鋳型、及び細胞増殖を阻害するための低温因子を導入するステップを含み、標的ヌクレアーゼ系及び鋳型が作動することにより、鋳型配列に対して同一性を有するように染色体ＤＮＡを改変する、方法。２．細胞増殖を阻害するための低温因子が、低温誘導性ＲＮＡタンパク質（ＣＩＲＰ）を含む、１に記載の方法。Ｎｉｓｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，（１９９７）：１３７（４）：８９９−９０８を参照されたい。３．細胞周期阻害物質が、細胞を含む培養物への配置により導入される、１に記載の方法。４．細胞周期阻害物質が、タンパク質、ＲＮＡ、ＭＲＮＡとして、又は細胞周期阻害物質をコード化するベクターを介して導入される、１に記載の方法。５．鋳型がＨＤＲ鋳型である、４に記載の方法。６．鋳型がｓｓＤＮＡである、１に記載の方法。７．ヌクレアーゼ系及び核酸鋳型の１つ又は複数が、ｍＲＮＡとして細胞に導入される、１に記載の方法。８．細胞が、初代細胞、初代体細胞、接合子、生殖細胞、幹細胞、及び胚からなる群から選択される、１に記載の方法。９．１〜８のいずれかに記載の方法に従って作製される遺伝子修飾動物。１０．１〜９のいずれかに記載の方法により作製されるファウンダ動物。１１．１〜１０のいずれかに記載の方法により作製される細胞。
【０１１８】
極めて明らかであるように、本明細書に記載する様々な対立遺伝子及び遺伝子修飾が考慮される。これらの実施形態は、例えば、以下を含む：１．繁殖力増大をもたらす遺伝性外性対立遺伝子及び／又は片親起源依存的筋肉肥大をもたらす遺伝性外性対立遺伝子を含む非ヒト動物。２．ヤギである１に記載の動物。３．家畜、霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギ、魚類、イヌ、マウス、ネコ、ラット、及び実験動物からなる群から選択される、１に記載の動物。４．蛍光マーカ、選択マーカ、及び発現性マーカを含まない、１に記載の動物。５．繁殖力増大対立遺伝子がＦｅｃＢ；ＢＭＰＲ−ＩＢである、１に記載の動物。６．筋肉肥大対立遺伝子がＣａｌｌｉｐｙｇｅである、１に記載の動物。７．動物が外性対立遺伝子に対して同型接合である、１に記載の動物。
【０１１９】
さらに、例えば、１．ＡＰＣに対する外性対立遺伝子を含む非ヒト動物。２．対立遺伝子が癌表現型に関する、１に記載の動物。３．対立遺伝子がヒト対立遺伝子である、１に記載の動物。４．実験動物モデルである、１に記載の動物。５．ブタ、ミニブタ、オッサボウ（Ｏｓｓａｂｏｗ）ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、及びヤギからなる群から選択される、１に記載の動物。６．ファウンダである、１に記載の動物。７．外性対立遺伝子の移入以外の染色体変化がない、１に記載の動物。８．標的ヌクレアーゼ系を有する外性対立遺伝子のＨＤＲ鋳型組換え移入を含む、１に記載の動物を作成する方法。９．外性対立遺伝子が、癌表現型に関連するヒト対立遺伝子であるように選択される、８に記載の方法。
【０１２０】
さらに、例えば、１．「ＨＤＲ対立遺伝子を有するコロニーの回収の頻度」と題する表１から選択される外性対立遺伝子を含む動物。２．動物に対立遺伝子を移入させるステップを含む方法であって、対立遺伝子が、前記表１に記載の群から選択されるか、又は以下の通りである、方法。３．対立遺伝子が、ＬＤＬＲ（例えば、コレステロールモデル化のため）；ＤＡＺＬ（例えば、不妊に関する）；ＡＰＣ（例えば、癌モデル化のため）；ｐ５３；ＲＡＧ２（例えば、免疫抑制のためのノックアウト）；ＩＬ−２（例えば、免疫抑制のためのノックアウト）（表に記載していない）；免疫抑制のためのＲＡＧ２及びＩＬ−２の二重ノックアウト（表に記載していない）；ＲＯＳＡ（例えば、セーフハーバ（ｓａｆｅ  ｈａｒｂｏｒ）に関する）；ＳＲＹ（例えば、性別選択を目的とするＹ染色体に対する修飾のため）；ＫＩＳＳ  ＯＲ  ＫＩＳＳＲ（例えば、成熟又はその阻止、例えば、ノックアウトのため）；ＧＤＦ８（例えば、動物の筋肉を増大するため）；ＥＩＦ４Ｇ（例えば、口蹄疫（ＦＭＤＶ）に対する耐性のため）；アフリカブタコレラに対する耐性のためのｐ６５；双子出産（種間移入を含む）のためのｃａＦｅｃＢ；乳牛の価値を高めるためのジグリセリドアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）ノックアウト；乳牛の価値を高めるためのＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）；成熟期、身長及び体重に影響を与えるための多形腺腫遺伝子（ＰＬＡＧ１）；乳汁のアレルゲン性を抑制するためのβラクトグロブリン、鳥類の卵のアレルゲン性を抑制するためのオボムコイド、オボアルブミン、オボトランスフェリン、又はリゾチームである、１に記載の動物又は２に記載の方法。４．１又は３に記載の動物の使用。５．３に記載の移入対立遺伝子を含むブタ、ヒツジ、ヤギ、又はウシ。６．１〜５のいずれかに記載の細胞。７．脊椎動物、家畜、霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギ、魚類、イヌ、マウス、ネコ、ラット、及び実験動物である、６に記載の細胞又は動物。
【０１２１】
さらに、例えば、１．細胞の染色体ＤＮＡにおいて一塩基多型（ＳＮＰ）を形成する方法であって、細胞に、標的ヌクレアーゼ系及びＨＤＲ鋳型を導入するステップを含み、標的ヌクレアーゼ系は、染色体ＤＮＡにおける内在性コグネイト配列に特異的に結合するＤＮＡ結合メンバーを含み、標的ヌクレアーゼ系及びＨＤＲ鋳型が作動することにより、ＨＤＲ鋳型配列に対して同一性を有するように染色体ＤＮＡを改変し、ＨＤＲ鋳型配列が、１つのＳＮＰを含む、方法。２．ＨＤＲ鋳型配列が複数のＳＮＰを含む、１に記載の方法。３．ＨＤＲ鋳型配列が、内在性対立遺伝子を置換する外性対立遺伝子を含み、外性対立遺伝子が、内在性対立遺伝子との配列アラインメントにおいてＳＮＰを含む、１又は２に記載の方法。４．外性対立遺伝子の外部にＳＮＰを含まない、１〜３のいずれかに記載の方法。５．ＨＤＲ鋳型配列が、外性対立遺伝子における１つ又は複数のＳＮＰを除いて、染色体ＤＮＡと同一である、４に記載の方法。６．ただ１つのＳＮＰが存在する、５に記載の方法。７．ＨＤＲ鋳型が、ＤＮＡ結合メンバーとＨＤＲ鋳型との特異的結合を低減するように設計され、ＨＤＲ鋳型配列が、染色体ＤＮＡとアラインメントされたとき、ＳＮＰを含む、１〜６のいずれかに記載の方法。
【０１２２】
例えば：別の種又は別の品種から選択される遺伝子の対立遺伝子を含む第１品種由来の遺伝子修飾動物であって；第１品種の動物が、対立遺伝子以外の遺伝子変化を含まない遺伝子修飾動物；本明細書に記載の動物を作製する方法。
【０１２３】
例えば：１．細胞の染色体ＤＮＡ中に外性対立遺伝子を移入させる相同組換え修復（ＨＤＲ）の方法であって、細胞に、標的エンドヌクレアーゼ系と、外性対立遺伝子を含むＨＤＲ鋳型とを導入するステップを含み、標的ヌクレアーゼ系は、染色体ＤＮＡにおける内在性コグネイト配列に特異的に結合するＤＮＡ結合メンバーを含み、標的ヌクレアーゼ系及びＨＤＲ鋳型が作動することにより、ＨＤＲ鋳型配列に対して同一性を有するように染色体ＤＮＡを改変して、染色体ＤＮＡ中に、内在性対立遺伝子の代わりに外性対立遺伝子を移入させ、標的エンドヌクレアーゼ系及び／又はＨＤＲ鋳型が、ＤＮＡに対する標的エンドヌクレアーゼ系の特異的結合を低減する特徴を含む、方法。２．特異的結合を低減する特徴が、内在性コグネイト配列に対するＤＮＡ結合メンバー配列中のミスマッチ及び／又はＨＤＲ鋳型配列に対するＤＮＡ結合メンバー配列中のミスマッチを含む、１に記載の方法。３．標的エンドヌクレアーゼ系が、ヌクレアーゼに融合した複数のＴＡＬエフェクター反復配列（ＴＡＬＥＮ）を含み、ＴＡＬＥＮが、反復可変二残基（ＲＶＤ）の配列を含み、及びミスマッチが、内在性コグネイト配列に対してＲＶＤの配列中に存在する、２に記載の方法。４．標的ヌクレアーゼ系が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含み、ミスマッチが、内在性コグネイト配列に対してｇＲＮＡ配列中に存在する、２〜３に記載の方法。５．標的ヌクレアーゼ系が、ヌクレアーゼに融合した複数のＴＡＬエフェクター反復配列（ＴＡＬＥＮ）を含み、ＴＡＬＥＮが、反復可変二残基（ＲＶＤ）の配列を含み、及びミスマッチが、ＨＤＲ鋳型配列に対してＲＶＤの配列中に存在する、２〜４に記載の方法。６．標的ヌクレアーゼ系が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含み、ミスマッチが、ＨＤＲ鋳型配列に対してｇＲＮＡ配列中に存在する、２〜５に記載の方法。７．外性対立遺伝子が、天然対立遺伝子であり、及びＨＤＲ鋳型が、ミスマッチを含み、ミスマッチが、天然に存在しない配列を形成する、２〜６に記載の方法。８．外性対立遺伝子が、ミスマッチを含まず、かつ細胞により発現されるＤＮＡを含む、２〜７に記載の方法。９．外性対立遺伝子が、ミスマッチを含み、かつ細胞により発現されるＤＮＡを含む、２〜８に記載の方法。１０．ＨＤＲ鋳型配列に対して同一性を有するように染色体ＤＮＡを改変することによって、改変された染色体ＤＮＡ配列に対し、ＤＮＡ結合メンバー配列にミスマッチを形成するように、ＤＮＡ結合メンバー配列及び内在性コグネイト配列を選択するステップを含む、２〜９に記載の方法。１１．外性対立遺伝子が、天然対立遺伝子であり、かつＨＤＲ鋳型が、天然対立遺伝子と、染色体ＤＮＡ配列に対して同一性を有するＤＮＡとから構成される、１〜８に記載の方法。１２．ＤＮＡ結合メンバー配列及び内在性コグネイト配列を選択するステップが、ＨＤＲ鋳型に対して同一性を有するように染色体ＤＮＡが改変されるとき、変化しない内在性コグネイト配列に第２のミスマッチを配置することをさらに含む、１〜８に記載の方法。１３．ＤＮＡ結合配列に対して内在性コグネイト配列中にミスマッチを配置するように、ＤＮＡ結合メンバー配列及び内在性コグネイト配列を選択するステップを含み、及びＨＤＲ鋳型配列に対して同一性を有するように染色体ＤＮＡを改変するステップが、ミスマッチを除去しない、２〜１１に記載の方法。１４．ミスマッチが、挿入、欠失、又は置換を含む、２〜１３に記載の方法。１５．挿入、欠失、又は置換が、１〜２０残基の長さを有する、１〜１２に記載の方法。１６．挿入、欠失、又は置換が、１〜２０残基の長さを有する、１〜１４に記載の方法。１７．ミスマッチが、１つのＳＮＰである、２に記載の方法。１８．複数のミスマッチを含む、２に記載の方法。１９．標的エンドヌクレアーゼ系が、ＴＡＬＥＮのペアを含み、これらのＴＡＬＥＮは、ペアの間にスペーサ配列を有する染色体ＤＮＡに局在化し、特徴が、スペーサ配列の長さに変化を生成して、ＴＡＬＥＮペアによるＤＮＡの切断を阻止するように、ＨＤＲ鋳型を選択するステップを含む、１〜１６に記載の方法。２０．スペーサ長さが、欠失により減少するか、又は挿入により増加する、１７に記載の方法。２１．スペーサ長さが、１〜６０の範囲の残基数だけ増減する、１７に記載の方法。２２．細胞が、初代細胞、初代体細胞、接合子、生殖細胞、幹細胞、卵母細胞、精子、及び胚からなる群から選択される、１〜１９のいずれかに記載の方法。２３．ＨＤＲ鋳型がｓｓＤＮＡである、１〜２０のいずれかに記載の方法。２４．ヌクレアーゼ系が、ｍＲＮＡとして細胞中に導入される、１〜２１のいずれかに記載の方法。２５．標的ヌクレアーゼ系が、結合タンパク質を有する内在性コグネイト配列に特異的に結合する、１〜２２のいずれかに記載の方法。２６．外性対立遺伝子がＡＰＣ対立遺伝子を含む、１〜２３のいずれかに記載の方法。２７．リポータ、蛍光マーカ、選択マーカ、及び発現性マーカを含まない、１〜２４のいずれかに記載の方法。２８．細胞が、家畜細胞である、１〜２５のいずれかに記載の方法。２９．細胞が、脊椎動物、家畜、霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギ、魚類、イヌ、マウス、ネコ、ラット、及び実験動物に由来する、１〜２５のいずれかに記載の方法。３０．動物が、外性対立遺伝子に対して同型接合である、１〜２８のいずれかに記載の方法。３１．遺伝子修飾動物を作製する方法であって、１〜３０のいずれかに記載の方法により修飾された細胞をクローニングするステップを含む方法。３２．動物が、ファウンダである、１〜３０のいずれかに記載の方法。３３．１〜３２のいずれかに記載の方法に従い作製される遺伝子修飾動物。３４．１〜３３のいずれかに記載の方法に従い作製されるファウンダ動物。３５．１〜３０のいずれかに記載の方法により作製される細胞。３６．１〜３４のいずれかに記載の標的ヌクレアーゼ系及びＨＤＲ鋳型を含むキット。３７．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究のための細胞を作製するステップ、又は動物生産に使用するための細胞を作製するステップを含む、１〜３５のいずれかに記載の使用。３８．遺伝子修飾動物であって、動物の染色体ＤＮＡ中に内在性対立遺伝子を有する品種に属し、ＳＮＰに変化を含み、ＳＮＰが、別の種又は別の品種の動物にみいだされる外性対立遺伝子に対して、内在性対立遺伝子中にある、遺伝子修飾動物。同様に、２．遺伝子修飾動物���あって、動物の染色体ＤＮＡ中に内在性対立遺伝子を有する品種に属し、別の種又は別の品種の動物にみいだされる外性対立遺伝子を含み、外性対立遺伝子は、内在性対立遺伝子に対してＳＮＰに変化を有する、遺伝子修飾動物。言い換えれば、修飾動物は、１つのＳＮＰを有するために、通常その品種にみいだされない対立遺伝子を有しており、対立遺伝子は、任意の他の品種又は種に由来する。変化は、ＳＮＰのみであるか、又は他の変化があってもよく、ＳＮＰは、要望される対立遺伝子と酷似している必要はない。ＳＮＰは、ランダムプロセスの結果ではないが、意図する結果である。３９．複数のＳＮＰを含む、３８に記載の動物。４０．外性対立遺伝子に対して動物の染色体ＤＮＡ中にさらに変化を含む、３８に記載の動物。４１．リポータを含まない、３８〜４０のいずれかに記載の動物。４２．１つ及び／又は複数のＳＮＰに対して同型接合である、３８〜４１のいずれかに記載の動物。４３．脊椎動物、家畜、霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギ、魚類、イヌ、マウス、ネコ、ラット、及び実験動物から選択される、３８〜４２のいずれかに記載の動物。４４．細胞の染色体ＤＮＡにランディングパッドを形成する方法であって、細胞に標的ヌクレアーゼ系及びＨＤＲ鋳型を導入するステップを含み、標的ヌクレアーゼ系は、染色体ＤＮＡにおける内在性コグネイト配列に特異的に結合するＤＮＡ結合メンバーを含み、標的ヌクレアーゼ系及びＨＤＲ鋳型が作動することにより、ＨＤＲ鋳型配列に対して同一性を有するように染色体ＤＮＡを改変し、ＨＤＲ鋳型配列が、ランディングパッドを含む、方法。
【０１２４】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月14日(2020.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト動物細胞の染色体ＤＮＡ中に対立遺伝子または遺伝子を移入させるための方法であって、
非ヒト動物系列から単離された非ヒト動物細胞に、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ；
（ｂ）非ヒト動物細胞の染色体ＤＮＡにおける標的配列と相互作用するスペーサＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；および
（ｃ）非ヒト動物細胞の染色体ＤＮＡにおける標的配列と相同性の配列によってフランキングされる対立遺伝子または遺伝子をコード化する相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型ＤＮＡ配列
を導入するステップを含み、
前記導入するステップが、染色体ＤＮＡにおける標的配列でＨＤＲ鋳型ＤＮＡ配列に対して同一性を有するように非ヒト動物細胞の染色体ＤＮＡを改変し、それによって細胞の染色体ＤＮＡ中に対立遺伝子または遺伝子を移入させ、
ＨＤＲ鋳型ＤＮＡ配列は、また、ｇＲＮＡのＲＮＡスペーサ配列との相互作用を改変する標的配列に対してミスマッチをコード化するＤＮＡ配列を含み、ミスマッチが、細胞の染色体ＤＮＡ中に導入され、非ヒト動物系列に存在しない細胞の染色体ＤＮＡにおける配列を形成する、
方法。
【請求項２】
ミスマッチが、動物系列と同じ品種に存在しない細胞の染色体ＤＮＡにおける配列を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的配列が、内在性対立遺伝子の少なくとも一部をコード化し、ＨＤＲ鋳型ＤＮＡ配列が、細胞の染色体ＤＮＡにおける標的配列と相同性の配列によってフランキングされる内在性対立遺伝子と相同性の天然対立遺伝子をコード化し、天然対立遺伝子が、内在性対立遺伝子を置換する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
非ヒト動物細胞が、初代細胞、初代体細胞、接合子、生殖細胞、幹細胞、卵母細胞または精子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼがｍＲＮＡとして細胞中に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
非ヒト動物系列が、非ヒト脊椎動物系列、非ヒト霊長類系列、ブタ系列、ウシ系列、ウマ系列、ヒツジ系列、ヤギ系列、鳥類系列、ニワトリ系列、ウサギ系列、魚類系列、イヌ系列またはネコ系列である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
非ヒト動物細胞が非ヒト動物細胞の染色体ＤＮＡへの対立遺伝子または遺伝子移入について同型接合である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
標的配列が、形質に関連するタンパク質をコード化するまたは遺伝子座の一部である内在性対立遺伝子の少なくとも一部をコード化し、ＨＤＲ鋳型ＤＮＡ配列が、内在性対立遺伝子と相同性である、および細胞の染色体ＤＮＡにおける標的配列と相同性の配列によってフランキングされる形質の増強に関連する遺伝子座をコード化するまたはその一部である、異なる対立遺伝子をコード化し、異なる対立遺伝子が、内在性対立遺伝子を置換し、形質が角増殖形質、食肉形質、食肉生産形質、牛乳生産形質、乳牛形質または疾患耐性形質である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
標的配列が、内在性対立遺伝子の少なくとも一部をコード化し、ＨＤＲ鋳型ＤＮＡ配列が、細胞の染色体ＤＮＡにおける標的配列と相同性の配列によってフランキングされる内在性対立遺伝子と相同性の対立遺伝子をコード化し、対立遺伝子と相同性の対立遺伝子が、内在性対立遺伝子を置換し、内在性対立遺伝子と相同性の対立遺伝子が、非ヒト動物系列と同じ種の動物からである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
標的配列が、内在性対立遺伝子の少なくとも一部をコード化し、ＨＤＲ鋳型ＤＮＡ配列が、細胞の染色体ＤＮＡにおける標的配列と相同性の配列によってフランキングされる内在性対立遺伝子と相同性の対立遺伝子をコード化し、内在性対立遺伝子と相同性の対立遺伝子が、内在性対立遺伝子を置換し、内在性対立遺伝子と相同性の対立遺伝子が、非ヒト動物系列と同じ品種の動物由来でない、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ミスマッチが、ｇＲＮＡへの結合を促進しない塩基でのＤＮＡ塩基の置換を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記置換が、１〜５塩基対置換を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ミスマッチが、ＤＮＡ塩基の挿入または欠失を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ミスマッチが、１〜５ＤＮＡ塩基の挿入を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ミスマッチが、１〜５ＤＮＡ塩基の欠失を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
標的配列が、内在性対立遺伝子の少なくとも一部をコード化し、ＨＤＲ鋳型ＤＮＡ配列が、細胞の染色体ＤＮＡにおける標的配列と相同性の配列によってフランキングされる内在性対立遺伝子と相同性の対立遺伝子をコード化し、内在性対立遺伝子と相同性の対立遺伝子が、内在性対立遺伝子を置換し、ミスマッチが、内在性対立遺伝子と相同性の対立遺伝子内に位置する一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
標的配列が、内在性対立遺伝子の少なくとも一部をコード化し、ＨＤＲ鋳型ＤＮＡ配列が、細胞の染色体ＤＮＡにおける標的配列と相同性の配列によってフランキングされる内在性対立遺伝子と相同性の対立遺伝子をコード化し、内在性対立遺伝子と相同性の対立遺伝子が、内在性対立遺伝子を置換し、ミスマッチが、内在性対立遺伝子と相同性の対立遺伝子内に位置するＳＮＰからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
標的配列が、内在性対立遺伝子の少なくとも一部をコード化し、ＨＤＲ鋳型ＤＮＡ配列が、細胞の染色体ＤＮＡにおける標的配列と相同性の配列によってフランキングされる内在性対立遺伝子と相同性の対立遺伝子をコード化し、内在性対立遺伝子と相同性の対立遺伝子が、内在性対立遺伝子を置換し、ミスマッチが、内在性対立遺伝子と相同性の対立遺伝子内に位置する複数のＳＮＰを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
標的配列が、内在性対立遺伝子の少なくとも一部をコード化し、ＨＤＲ鋳型ＤＮＡ配列が、細胞の染色体ＤＮＡにおける標的配列と相同性の配列によってフランキングされる内在性対立遺伝子と相同性の対立遺伝子をコード化し、内在性対立遺伝子と相同性の対立遺伝子が、内在性対立遺伝子を置換し、ミスマッチが、内在性対立遺伝子と相同性の対立遺伝子内に位置する複数のＳＮＰからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
対立遺伝子がＳＮＰである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ミスマッチが、天然に存在しない配列を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
染色体ＤＮＡにおける標的配列に対するｇＲＮＡにおいてミスマッチをさらに含む、請求項１に記載の方法。