(57)【要約】      （修正有）【課題】CHST15遺伝子の発現を抑制するRNAi分子を含む、低侵襲的に投与可能な組成物の提供。【解決手段】CHST15遺伝子の発現を抑制するRNAi分子とN-アセチル化キトサンとを含む複合体。CHST15遺伝子の発現を抑制するRNAi分子とN-アセチル化キトサンとを含む複合体を製造する方法であって、(a)該RNAi分子とキトサンとを混合して、複合体を形成させる工程、(b)工程(a)で得られた複合体を乾燥する工程、及び(c)工程(b)で得られた乾燥した複合体中のキトサンをアセチル化する工程を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
CHST15遺伝子の発現を抑制するRNAi分子とN-アセチル化キトサンとを含む複合体。
【請求項２】
前記RNAi分子がsiRNA又はshRNAである、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記RNAi分子が、配列番号1に示される塩基配列を含むアンチセンス鎖と、該アンチセンス鎖に相補的な塩基配列を含むセンス鎖とを含む、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
CHST15遺伝子の発現を抑制するRNAi分子とN-アセチル化キトサンとを含む複合体を製造する方法であって、
(a)該RNAi分子とキトサンとを混合して、複合体を形成させる工程、
(b)工程(a)で得られた複合体を乾燥する工程、及び
(c)工程(b)で得られた乾燥した複合体中のキトサンをアセチル化する工程
を含む、方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体を含む、疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項６】
経口投与又は経直腸投与用の、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記疾患が、消化管の炎症性疾患又は粘膜障害である、請求項５又は６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記炎症性疾患又は粘膜障害が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、食道炎、胃腸炎、NSAID誘発腸炎、腸管ベーチェット病、単純性潰瘍、消化管癌に対する内視鏡的切除後の人工潰瘍、膠原病に伴う腸炎、放射線による腸炎、虚血性腸炎、逆流性食道炎、バレット食道、薬剤性食道炎若しくは胃腸炎、並びに薬剤抵抗性若しくは不応性の消化性潰瘍からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、CHST15遺伝子の発現を抑制するRNAi分子とN-アセチル化キトサンとを含む複合体、その製造方法、及びそれを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸及び小腸の粘膜に慢性の炎症又は潰瘍を引き起こす疾患を総称して炎症性腸疾患と呼ぶ。炎症性腸疾患としては、代表的なものに潰瘍性大腸炎及びクローン病があり、いずれも難病である。潰瘍性大腸炎は、主に大腸の粘膜に潰瘍やびらんを生じる炎症性疾患であり、出血性下痢、腹痛、発熱をはじめとする種々の全身症状を示す。また、クローン病は口腔から肛門まで消化管全域にわたって非連続的に潰瘍や炎症を生じる炎症性疾患であり、腹痛、発熱、慢性下痢、栄養障害などの全身症状を示す。
【０００３】
硫酸転移酵素であるCarbohydrate sulfotransferase 15(CHST15)(GalNAc4S-6ST又はN-acetylgalactosamine 4-sulfate 6-O-sulfotransferaseとも称される)は、コンドロイチン硫酸-A(CS-A)のGalNAc(4SO4)残基の6位に硫酸塩を転移し、高度に硫酸化されたコンドロイチン硫酸-E(CS-E)を合成する、II型の膜貫通型ゴルジタンパク質である。本発明者は、CHST15遺伝子の発現を抑制するsiRNA(CHST15 siRNA)を大腸炎の動物モデルに大腸粘膜下投与したところ、大腸においてCHST15遺伝子発現が低下し、潰瘍、炎症及び線維化の抑制を含めた治療効果が見られたこと、またヒトクローン病患者においても治療効果が見られたことを報告した(特許文献１〜３及び非特許文献１〜２)。さらに、局所投与したCHST15 siRNAは、拡張型心筋症及び膵臓癌にも効果があることが最近報告されている(非特許文献３〜６)。
【０００４】
siRNAなどの核酸医薬は、ヌクレアーゼなどの酵素によって分解されやすいため、例えば注射によって罹患部位に局所投与されるか、又は特別なドラッグデリバリーシステムを用いて投与されることが多い。しかし局所投与は投与できる部位が限定され、また医師による投与を必要とするため、より多くの部位へ簡便にかつ低侵襲的に投与できる形態の製剤、例えば経口投与製剤の開発が望まれている。
【０００５】
キトサンは、甲殻類や昆虫類等の節足動物の外殻及び真菌の細胞壁の主要構成成分であるキチンの脱アセチル化により生成することができる高分子多糖類である。特許文献４及び５は、キトサン及びsiRNAを含む、siRNA送達用組成物を開示している。しかし、特許文献４及び５は、キトサンをアセチル化して、得られたアセチル化キトサンをsiRNAと組み合わせることについて全く記載していない。また、非特許文献７は、N-アセチル化キトサン及びプラスミドDNAを含む複合体が、経口投与により腸に送達されることを報告している。しかし、非特許文献７は、siRNAなどのRNAi分子をN-アセチル化キトサンと組み合わせた複合体について全く記載していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第WO 2009/004995号
【特許文献２】国際公開第WO 2009/084232号
【特許文献３】国際公開第WO 2014/013535号
【特許文献４】特表2010-503640号公報(国際公開第WO 2008/031899号)
【特許文献５】特表2014-518875号公報(国際公開第WO 2012/159215号)
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kiryu H, et al., Bioinformatics 27(13): 1788-1797 (2011)
【非特許文献２】Suzuki K, et al., 米国消化器病週間(DDW)2014, 要旨集, Su1078 (2014)
【非特許文献３】Watanabe K, et al., Cell Signal 27(7): 1517-1524 (2015)
【非特許文献４】Nishimura M, et al., 2015年米国臨床腫瘍学会年会(ASCO Annual Meeting), 要旨集, e22201 (2015)
【非特許文献５】Nishimura M, et al., 米国消化器病週間(DDW)2015, 要旨集, Mo1043 (2015)
【非特許文献６】Nishimura M, 欧州消化器病週間(UEGW)2015, 要旨集 (2015)
【非特許文献７】Kai E, et al., Pharmaceutical Research 21: 838-843 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、CHST15遺伝子の発現を抑制するRNAi分子を含む、低侵襲的に投与可能な組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、CHST15遺伝子の発現を抑制するsiRNAとN-アセチル化キトサンとを含む複合体を経口投与すると、驚くべきことに、該複合体は、小腸及び大腸に効率的に送達され、CHST15遺伝子発現を抑制すること、また、小腸炎及び大腸炎に対して治療効果を奏することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は以下を包含する。
[１]CHST15遺伝子の発現を抑制するRNAi分子とN-アセチル化キトサンとを含む複合体。
[２]前記N-アセチル化キトサンのアセチル化度が、70〜100％である、[１]に記載の複合体。
[３]前記RNAi分子がsiRNAである、[１]又は[２]に記載の複合体。
[４]前記RNAi分子が、配列番号1に示される塩基配列を含むアンチセンス鎖と、該アンチセンス鎖に相補的な塩基配列を含むセンス鎖とを含む、[１]〜[３]のいずれかに記載の複合体。
[５]CHST15遺伝子の発現を抑制するRNAi分子とN-アセチル化キトサンとを含む複合体を製造する方法であって、
(a)該RNAi分子とキトサンとを混合して、複合体を形成させる工程、
(b)工程(a)で得られた複合体を乾燥する工程、及び
(c)工程(b)で得られた乾燥した複合体中のキトサンをアセチル化する工程
を含む、方法。
[６][１]〜[４]のいずれかに記載の複合体を含む、消化管の炎症性疾患又は粘膜障害を治療又は予防するための、医薬組成物。
[７]経口投与又は経直腸投与用の、[６]に記載の医薬組成物。
[８]前記炎症性疾患又は粘膜障害が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、食道炎、胃腸炎、NSAID誘発腸炎、腸管ベーチェット病、単純性潰瘍、消化管癌に対する内視鏡的切除後の人工潰瘍、膠原病に伴う腸炎、放射線による腸炎、虚血性腸炎、逆流性食道炎、バレット食道、薬剤性食道炎若しくは胃腸炎、並びに薬剤抵抗性若しくは不応性の消化性潰瘍からなる群から選択される、[６]又は[７]に記載の医薬組成物。
【００１１】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-216482号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、CHST15遺伝子の発現を抑制するRNAi分子を含む、低侵襲的に投与可能な組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】DSS(デキストラン硫酸ナトリウム)誘発大腸炎モデルマウスにおける疾患活動指数(DAI)を示すグラフである。
【図２】DSS誘発大腸炎モデルマウスにおける結腸の長さを示すグラフである。
【図３】DSS誘発大腸炎モデルマウスにおけるHE染色した結腸切片の代表的な顕微鏡写真である。
【図４】DSS誘発大腸炎モデルマウスにおける結腸の組織学的スコアを示すグラフである。
【図５】DSS誘発大腸炎モデルマウスにおける結腸のCHST15遺伝子発現を示すグラフである。
【図６】NSAID(非ステロイド性抗炎症薬)誘発小腸炎モデルマウスにおける空腸のCHST15遺伝子発現を示すグラフである。
【図７】NSAID誘発小腸炎モデルマウスにおける空腸の潰瘍スコアを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
＜複合体＞
本発明は、CHST15遺伝子の発現を抑制するRNAi分子とN-アセチル化キトサンとを含む複合体を提供する。
【００１６】
本発明で用いるRNAi分子は、CHST15遺伝子の発現を抑制することができる。本明細書において、CHST15遺伝子は、特に限定しないが、動物由来であってよく、例えば哺乳動物(例えばヒト、サル、ウシ、マウス、ラット、イヌなど)に由来するものであってよい。
【００１７】
ヒトCHST15遺伝子の塩基配列は、例えばGenBankアクセッション番号NM_015892において取得することができる。ヒトCHST15遺伝子の塩基配列を配列番号5に、該遺伝子によってコードされるCHST15タンパク質のアミノ酸配列を配列番号6に示す。
【００１８】
本明細書において、CHST15タンパク質には、配列番号6に示されるアミノ酸配列と高い同一性(例えば80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上又は98％以上)を有し、かつ、配列番号6に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が有する活性(例えば硫酸転移活性)を保持するタンパク質が含まれる。CHST15遺伝子には、ヒト以外の生物における、このようなCHST15タンパク質をコードする遺伝子が含まれる。
【００１９】
またCHST15遺伝子には、例えば、配列番号5に示される塩基配列からなるDNAに対応するヒト以外の生物における内在性のCHST15遺伝子(ヒトCHST15遺伝子のオルソログなど)が含まれる。当業者は、配列番号5に示される塩基配列を基に、ヒト以外の生物における内在性のCHST15遺伝子を適宜取得することができる。ヒト以外の生物における内在性のCHST15遺伝子は、一般に、配列番号5に示されるDNAと高い同一性(例えば80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上又は98％以上の同一性)を有し得る。例えば、マウス、ラット、ウシ、及びイヌのCHST15遺伝子の塩基配列は、それぞれ、GenBankアクセッション番号NM_029935.5、NM_173310.3、XM_005225861.2及びXM_544058.6において取得できる。
【００２０】
配列同一性は、当業者であれば適宜決定できる。配列同一性の決定は、2つの配列をアライメントすることを含み得る。そのような配列アラインメントを実行するための適切なコンピュータプログラムとして、特に限定されないが、Vector NTI(登録商標)(サーモフィッシャーサイエンティフィック)及びClustalWプログラム(Thompson JD, et al., Nucleic Acids Research 22(22): 4673-4680; Larkin, et al., Bioinformatics 23(21): 2947-2948(2007))が挙げられる。ClustalWプログラムは、例えば、DNA Data Bank of Japan(DDBJ)のウェブページ中で利用可能である。アラインメントを作製した後、2つの配列間の配列同一性％を算出することができる。典型的には、ソフトウェアは配列比較の一部としてこれを行い、数値的な結果を生成する。
【００２１】
本発明において、RNAi分子は、CHST15遺伝子の発現を抑制することができる。本明細書において「RNAi分子」とは、生体内においてRNAi(RNA干渉; RNA inteference)を誘導し、標的遺伝子(本発明ではCHST15)の転写産物の分解などを介してその遺伝子の発現を抑制(サイレンシング)することができるRNA分子をいう(Fire A. et al., Nature 391, 806-811 (1998))。RNAi分子の具体例としては、siRNA、shRNAなどが挙げられる。「siRNA」は、標的遺伝子のmRNA配列の一部に相補的な配列を含むアンチセンス鎖と、該アンチセンス鎖に相補的(標的遺伝子の配列の一部と相同)な配列を含むセンス鎖とがハイブリダイズして形成される二本鎖RNAである。「shRNA」は、適当な配列を有する短いスペーサー配列によって前記siRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖が連結された一本鎖RNAをいう。つまり、shRNAは、一分子内でセンス領域とアンチセンス領域が互いに塩基対合してステム構造を形成し、同時に前記スペーサー配列がループ構造を形成ことによって、分子全体としてヘアピン型のステム−ループ構造を形成している。
【００２２】
本明細書において、標的遺伝子発現の抑制は、標的遺伝子の発現をその遺伝子のmRNA又はタンパク質の発現量を指標に判定した場合に、RNAi分子を導入しない場合又は無関係な対照RNAi分子を導入した場合に対して、100％抑制される場合のみならず、75％以上、50％以上又は20％以上抑制されることも意味する。mRNA発現量は、例えばノザンハイブリダイゼーション又はリアルタイムPCRにより測定することができ、タンパク質発現量は、例えばウエスタンブロッティング、ELISA又はタンパク質の活性測定により、当業者であれば適宜測定することができる。遺伝子発現量の具体的な測定方法は、Green, MR and Sambrook, J, (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkにも記載されている。
【００２３】
RNAi分子の配列は、標的遺伝子(CHST15遺伝子)の塩基配列を基に、当業者であれば適宜設計することができる。例えば、アンチセンス鎖が、標的遺伝子mRNA中のコーディング領域又は5'若しくは3'非翻訳領域(UTR)などの一部に相補的な配列を含むように、アンチセンス鎖の配列を設計し、センス鎖が、上記アンチセンス鎖に相補的な配列を含むように、センス鎖の配列を設計し得る。
【００２４】
本明細書において「相補的」とは、2つの塩基間で(例えばワトソン・クリック型の)塩基対合をし得る関係を意味し、例えば、アデニンとチミン又はウラシルとの関係、並びにシトシンとグアニンとの関係をいう。本明細書において相補的とは、完全に相補的であることが好ましいが、完全に相補的である必要はなく、RNAi分子が標的遺伝子発現を抑制する能力を保持する限り、1個以上(例えば1〜5個又は1〜3個)のミスマッチを含んでいてもよい。ミスマッチとは、アデニンとチミン又はウラシルとの関係並びにシトシンとグアニンとの関係以外の関係を指す。
【００２５】
siRNAなどのRNAi分子は、末端に数個(例えば、2〜5個)のヌクレオチドの一本鎖部分(オーバーハング)を有する場合にRNAi活性が高いことが一般に知られている。そのため、本発明で用いるRNAi分子は、末端に数個のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのオーバーハングを有することが好ましい。例えば、RNAi分子は、2ヌクレオチドの3'オーバーハングを有し得る。具体的には、RNAi分子は、2個のリボヌクレオチド(例えばAU又はAG)からなる3'オーバーハングを有していてもよい。
【００２６】
RNAi分子を構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ、例えば20〜50塩基長、20〜40塩基長又は20〜30塩基長であってよいが、特に限定されず、互いに同じ長さでも異なる長さでもよい。本発明では、好ましくは、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ25〜29塩基長、例えば27塩基長であってよい。
【００２７】
具体的には、RNAi分子は、配列番号1に示される塩基配列を含むアンチセンス鎖と、該アンチセンス鎖に相補的な塩基配列を含むセンス鎖とを含み得る。この場合、センス鎖は、配列番号1に完全に相補的な配列である、配列番号2に示される塩基配列を含むことが好ましい。
【００２８】
より具体的には、アンチセンス鎖は、配列番号3に示される塩基配列からなってよく、これは、配列番号1に示される塩基配列の3'末端にリボヌクレオチドAUが付加した配列である。センス鎖は、配列番号4に示される塩基配列からなってよく、これは、配列番号2に示される塩基配列の3'末端にリボヌクレオチドAGが付加した配列である。
【００２９】
RNAi分子のヌクレオチドは、全てがリボヌクレオチドであることが好ましいが、数個(例えば1〜5個、1〜3個又は1〜2個)がデオキシリボヌクレオチドであってもよい。RNAi分子のヌクレオチドはまた、天然のヌクレオチドに加えて、例えばRNAi分子の安定性を向上させるために、ハロゲン(フッ素、塩素、臭素又はヨウ素)、メチル、カルボキシメチル又はチオ基などの基を有する修飾ヌクレオチドであってもよい。
【００３０】
RNAi分子を構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖は、市販の核酸合成機を用いて適宜製造することができる。製造されたセンス鎖及びアンチセンス鎖は、好ましくは等モル比で混合して、互いにハイブリダイズさせ、RNAi分子を製造してもよい。また、メーカー(例えば、BioSpring、タカラバイオ、Sigma-Aldrichなど)の受託製造サービスを利用してRNAi分子を製造してもよい。
【００３１】
次に、本発明における「キトサン」は、グルコサミンと少量のN-アセチルグルコサミンとが重合した構造を有する高分子多糖類である。キトサンは、カニ、エビなど甲殻類の殻から得ることができるキチンを、濃アルカリ溶液と加熱して脱アセチル化することによって得ることができる。キトサンは、様々なアセチル化度及び分子量で、例えばCarbosynth社又はフナコシ社などで市販されている。本明細書においてキトサンのアセチル化度は、通常0〜30％、例えば20％以下、10％以下又は5％以下であり得る。本明細書においてキトサンの分子量は、特に限定されず、低分子量キトサン(例えば、分子量2000Da〜100kDa)であっても、高分子量キトサン(例えば、分子量100kDa〜10,000kDa又はそれ以上)であっても、又は様々な分子量の混合物であってもよい。
【００３２】
「N-アセチル化キトサン」は、上記キトサンのアミノ基の一部又は全部がアセチル化された高分子多糖類である。本明細書においてN-アセチル化キトサンのアセチル化度は、通常70〜100％、例えば80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上であってよい。キトサン及びN-アセチル化キトサンのアセチル化度は、コロイド滴定、赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクトル(NMR)、元素分析などによって決定することができる。
【００３３】
CHST15遺伝子発現を抑制するRNAi分子とN-アセチル化キトサンとを含む複合体中のRNAi分子とN-アセチル化キトサンとの結合の様式は特に限定しないが、RNAi分子はアニオン性ポリマーであり、N-アセチル化キトサンはカチオン性ポリマーであるため、両者は静電的相互作用で複合体を形成することが想定される。上記複合体において、RNAi分子と、N-アセチル化キトサンを構成しているグルコサミン単位との比(モル比)は、1:200〜1:5、1:100〜1:5、又は1:50〜1:10であってよい。
【００３４】
CHST15遺伝子発現を抑制するRNAi分子とN-アセチル化キトサンとを含む複合体を製造する方法の一例は、以下の「製造方法」の節に記載されている。本発明の複合体は、特別なドラッグデリバリーシステムを必要とせずに、低侵襲的な投与方法、例えば経口投与によって、RNAi分子を細胞に送達することができる。
【００３５】
＜製造方法＞
本発明はまた、CHST15遺伝子の発現を抑制するRNAi分子とN-アセチル化キトサンとを含む複合体を製造する方法を提供する。本方法は、(a)該RNAi分子とキトサンとを混合して、複合体を形成させる工程、(b)工程(a)で得られた複合体を乾燥する工程、及び(c)工程(b)で得られた乾燥した複合体中のキトサンをアセチル化する工程を含む。
【００３６】
キトサンとしては、アセチル化度0〜30％、例えば20％以下、10％以下又は5％以下のキトサンを使用し得る。キトサンは、例えば酸水溶液に溶解することによって、キトサン溶液として提供し得る。酸の種類は特に限定されないが、酢酸又は塩酸などが挙げられ、好ましくは酢酸である。酸水溶液は、例えば1％(v/v)〜10％(v/v)、好ましくは2％(v/v)〜8％(v/v)の濃度であってよい。キトサンは、酸水溶液に対して0.1％(w/v)〜10％(w/v)、好ましくは1％(w/v)〜8％(w/v)の濃度で溶解し得る。酸水溶液へのキトサンの溶解方法は特に限定されず、撹拌などの常法により溶解すればよい。溶解時の温度は室温、例えば15〜30℃であってよい。溶解時間はキトサンの分子量及びアセチル化度などによって異なり、適宜設定し得る。こうして得られたキトサン溶液のpHは、アルカリ溶液、例えば水酸化ナトリウム溶液によって3.0〜5.0、好ましくは3.5〜4.5、より好ましくは4.0〜4.3に調整し得る。次いで、キトサン溶液は、水、例えば滅菌水によって適宜希釈してもよい。次いで、キトサン溶液は、孔径0.5〜2μm、例えば1μmのフィルター(例えばセルロースフィルター)でろ過してろ液をその後の工程に使用してもよい。
【００３７】
CHST15遺伝子の発現を抑制するRNAi分子は、通常、適切な緩衝液中にRNAi分子を含む溶液としてメーカーの受託製造によって提供され得る。
【００３８】
該RNAi分子とキトサンとは混合され、例えば静電的相互作用によって、複合体(RNAi分子/キトサン複合体)を形成させる。RNAi分子/キトサン複合体において、RNAi分子とキトサンを構成しているグルコサミン単位との比(モル比)は、1:200〜1:5、1:100〜1:5、又は1:50〜1:10であってよい。RNAi分子とキトサンとの混合は、例えば、RNAi分子を含む溶液とキトサン溶液とを混合し撹拌することによって行ってよい。
【００３９】
得られたRNAi分子/キトサン複合体は、凍結乾燥、減圧乾燥などの任意の公知の乾燥法によって乾燥される。好ましくは、乾燥は凍結乾燥である。凍結乾燥は、該複合体を含む溶液を、テフロン（登録商標）ディッシュなどの基板にフローキャストした後に行ってもよい。凍結乾燥は、市販の凍結乾燥機を用いて適宜行うことができる。
【００４０】
次に、乾燥したRNAi分子/キトサン複合体中のキトサンをアセチル化剤を用いてアセチル化する。アセチル化剤としては、無水酢酸及び塩化アセチルなどがあるが、無水酢酸が好ましい。アセチル化剤は、メタノールなどの有機溶媒中の溶液として用いてよい。アセチル化剤は、例えば0.5〜10％(v/v)、好ましくは1〜5％(v/v)の濃度であってよい。アセチル化は、このようなアセチル化剤を、乾燥したRNAi分子/キトサン複合体に添加することによって行ってよい。アセチル化の反応時間は、1〜5時間、好ましくは2〜4時間であってよい。アセチル化は窒素ガス中で行ってもよい。アセチル化時の温度は室温、例えば15〜30℃であってよい。このようなアセチル化処理によって、RNAi分子とN-アセチル化キトサンとを含む複合体を得ることができる。N-アセチル化キトサンのアセチル化度は、通常70〜100％、例えば80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上であってよい。
【００４１】
得られたRNAi分子とN-アセチル化キトサンとを含む複合体は、凍結乾燥、減圧乾燥などの任意の乾燥法によって乾燥されてもよい。好ましくは、乾燥は凍結乾燥である。乾燥させた複合体には、さらに粉砕、顆粒化などの処理を施してもよい。
【００４２】
＜医薬組成物＞
本発明はまた、CHST15遺伝子の発現を抑制するRNAi分子とN-アセチル化キトサンとを含む複合体を含む、疾患の治療又は予防のための医薬組成物を提供する。本明細書において「治療」とは疾患若しくは症状を治癒、軽減、又は改善することを意味し、「予防」とは疾患若しくは症状の発症を阻止、抑制、又は遅延することを意味する。
【００４３】
対象となる疾患は、本発明の複合体が効果を示す限り特に限定されないが、例えば、炎症性疾患又は粘膜障害であり得る。炎症性疾患は、炎症を伴う疾患を指す。粘膜障害は、粘膜の病変を意味し、潰瘍、びらん、浮腫などを含み得る。疾患の場所は身体におけるいずれの場所であってもよく、好ましくは消化管であってよい。消化管は、例えば、食道、胃、及び腸(小腸及び大腸)であってよい。小腸は、十二指腸、空腸及び回腸を含み、大腸は、盲腸、結腸及び直腸を含む。
【００４４】
疾患は、薬物(例えば、非ステロイド性抗炎症薬)によって誘発される疾患であってもよい。非ステロイド性抗炎症薬(NSAID: Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug)は、解熱剤、鎮痛剤、抗炎症剤として広く用いられているが、同時に消化管粘膜障害などの副作用を有し得ることが知られている。
【００４５】
具体的には、疾患としては、炎症性腸疾患(例えば潰瘍性大腸炎、クローン病)、食道炎、胃腸炎、NSAID誘発腸炎(例えばNSAID誘発小腸炎)、腸管ベーチェット病、単純性潰瘍、消化管癌に対する内視鏡的切除後の人工潰瘍、膠原病に伴う腸炎、放射線による腸炎、虚血性腸炎、逆流性食道炎、バレット食道、薬剤性食道炎若しくは胃腸炎、並びに薬剤抵抗性若しくは不応性の消化性潰瘍(ヘリコバクター・ピロリ除菌療法抵抗性潰瘍を含む)などが挙げられる。好ましくは、疾患は、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、胃腸炎又はNSAID誘発腸炎であり得る。潰瘍性大腸炎は、主に大腸の粘膜に潰瘍やびらんを生じる炎症性疾患である。クローン病は口腔から肛門まで消化管全域にわたって非連続的に潰瘍や炎症を生じる炎症性疾患である。
【００４６】
NSAIDとしては、消化管粘膜障害を引き起こし得るものであれば特に限定しないが、サリチル酸系(例えば、アスピリン及びサリチル酸ナトリウム)、フェナム酸系(例えば、メフェナム酸)、アリール酢酸系(例えば、インドメタシン、エトドラク、ジクロフェナクナトリウム、スリンダク、マレイン酸プログルメタシン及びアセメタシン)、プロピオン酸系(例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン及びザルトプロフェン)、オキシカム系(例えば、ピロキシカム、メロキシカム及びロルノキシカム)並びに塩基性抗炎症薬(塩酸チアラミド、エモルファゾン)などが挙げられる。本明細書においてNSAIDは、アリール酢酸系が好ましく、インドメタシンがより好ましい。
【００４７】
医薬組成物は、製剤分野において通常使用される任意の製剤補助剤を含んでもよい。製剤補助剤としては、製薬上許容される、担体(固体又は液体担体)、賦形剤、安定化剤、乳化剤、界面活性剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤、着色剤、矯味剤、保存剤、緩衝剤などの、様々な薬物担体又は添加剤を用いることができる。具体的には、製剤補助剤としては、水、生理食塩水、他の水性溶媒、製薬上許容される有機溶媒、マンニトール、微結晶セルロース、デンプン、ブドウ糖、カルシウム、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、水溶性デキストリン、カルボキシメチルスターチナトリウム、アラビアゴム、ペクチン、キサンタンガム、カゼイン、ゼラチン、寒天、プロピレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。製剤補助剤は、製剤の剤形に応じて適宜又は組み合わせて選択され得る。
【００４８】
本発明に係る医薬組成物は、経口投与又は非経口投与(例えば、経直腸投与、経粘膜投与、静脈内投与、動脈内投与、若しくは経皮投与)することができるが、特に経口投与及び経直腸投与が好ましい。
【００４９】
経口投与に適した剤形としては、例えば、固形剤(錠剤、丸剤、舌下剤、カプセル剤、トローチ剤、ドロップ剤を含む)、顆粒剤、散剤、粉剤、液剤などを挙げることができる。固形剤は、当該分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠又は多層錠としてもよい。このような剤皮は、例えば、身体における目的の場所で有効成分を放出させること又は有効成分の吸収性を高めることを目的としたものであり得る。
【００５０】
非経口投与では、それぞれの投与方法に適した剤形を適宜用いることができるが、非経口投与に適した剤形としては、例えば、坐剤、注射剤、点滴剤、塗布剤、点眼剤、点鼻剤、吸入剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、硬膏剤などを挙げることができる。
【００５１】
本発明の医薬組成物は、目的とする疾患の治療又は予防のために製薬上有効な量で生体に投与することができる。本明細書において「製薬上有効な量」とは、本発明の医薬組成物に含まれるRNAi分子が、対象とする疾患を治療又は予防する上で必要な用量であって、かつ投与する生体に対して有害な副作用がほとんどないか又は全くない用量をいう。具体的な投与量は、個々の被験体に応じて、病気の進行度若しくは重症度、全身の健康状態、年齢、性別、体重及び処置に対する耐性などに基づき、例えば医師の判断により決定される。例えば、本発明の医薬組成物を経口的に投与する場合、CHST15遺伝子の発現を抑制するRNAi分子の重量で、通常は0.001〜1000mg/体重kg/日、例えば0.01〜100mg/体重kg/日又は0.1〜10mg/体重kg/日となる量で投与してもよい。本発明の医薬組成物は、例えば医師が決定した治療計画に基づいて、単回投与することができるが、一定の時間間隔、例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、6ヶ月又は1年などの間隔で、被験体に対して、数回又は数十回に分けて投与することもできる。
【００５２】
本発明の医薬組成物は、他の薬物(例えば本発明の医薬組成物の治療若しくは予防対象疾患に対する薬物、又はNSAID)と併用して投与してもよい。これらと併用する場合は、同時に投与するための配合剤として、あるいは独立して投与するために組み合わされた別個の製剤として使用してもよい。併用は、同時投与及び連続投与を含む。
【００５３】
本発明の医薬組成物を投与する被験体は、動物、例えば哺乳動物(例えばヒト、サル、ウシ、マウス、ラット、イヌなど)であってよい。治療又は予防対象の疾患が、薬物(例えばNSAID)によって誘発される疾患である場合は、被験体は、当該薬物の投与を受けている患者であってよい。
【００５４】
本発明は、本発明に係る医薬組成物をそれを必要とする被験体に投与することを含む、疾患の治療又は予防方法も提供する。また本発明は、CHST15遺伝子の発現を抑制するRNAi分子とN-アセチル化キトサンとを含む複合体を含む、炎症性疾患治療若しくは予防剤又は粘膜治癒促進剤にも関する。本発明は、CHST15遺伝子の発現を抑制するRNAi分子とN-アセチル化キトサンとを含む複合体を、製薬上許容される担体と混合する工程を含む、本発明に係る医薬組成物の製造方法も提供する。
【００５５】
CHST15遺伝子の発現を抑制するRNAi分子とN-アセチル化キトサンとを含む複合体を含む、医薬組成物は、消化管の炎症性疾患又は粘膜障害の治療又は予防において特に有用である。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５７】
[実施例1]
DSS誘発急性大腸炎モデルマウスに投与したCHST15 siRNA/N-アセチル化キトサン複合体の効果
デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)で誘発した大腸炎モデルマウスに経口投与したCHST15 siRNA/N-アセチル化キトサン複合体のRNAi効果及び治療効果を検討した。本DSS誘発性大腸炎モデルは、マウス潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患の標準的実験モデルとして広く用いられている。
【００５８】
＜材料と方法＞
(siRNA/N-アセチル化キトサン複合体)
CHST15 siRNA/N-アセチル化キトサン複合体及び陰性対照siRNA(N.C.)/N-アセチル化キトサン複合体の調製方法を以下に説明する。具体的な調製方法は、プラスミドDNAの代わりにsiRNAを使用したことを除いて、Kai E et al., Pharmaceutical Research 21: 838-843 (2004)に記載の方法に準じた。
【００５９】
キトサンは、Carbosynth社(英国)製で、脱アセチル化度最小90％(すなわち、アセチル化度10％以下)であった。2gのキトサンを、50mLの5％(v/v)酢酸中に溶解し、pHが4.2になるように2M 水酸化ナトリウムを添加した後、滅菌水で体積を100mLにして、キトサン溶液(2％w/v)を得た。このキトサン溶液を、減圧下でセルロースフィルター(孔径1μm)を用いてろ過し、ろ液を使用まで室温で保存した。
【００６０】
本実施例で用いた、CHST15遺伝子の発現を抑制するsiRNA(CHST15 siRNA)のアンチセンス鎖及びセンス鎖は、それぞれ配列番号3及び4に示される塩基配列からなる。陰性対照siRNAの2本のRNA鎖は、それぞれ配列番号7及び8に示される塩基配列からなる。CHST15 siRNA及び陰性対照siRNAは、BioSpring社(ドイツ)に合成依頼して製造した。
【００６１】
上記キトサン溶液(2％ w/v)を、CHST15 siRNA溶液又は陰性対照siRNA溶液と穏やかに混合し、CHST15 siRNA/キトサン複合体又は陰性対照 siRNA/キトサン複合体を含む溶液(100mg siRNA/mL)を得た。溶液中で、CHST15 siRNAと、キトサンを構成しているグルコサミン単位との比(モル比)は、約1:21であった。次いで、この溶液をテフロン（登録商標）ディッシュ(直径60mm)にフローキャストし、一晩凍結乾燥した。凍結乾燥した複合体を、メタノール中の3％(v/v)無水酢酸を用いて、室温にて窒素ガス中で3時間N-アセチル化した。得られた生成物を一晩凍結乾燥し、CHST15 siRNA/N-アセチル化キトサン複合体、及び陰性対照siRNA(N.C.)/N-アセチル化キトサン複合体を得た。
【００６２】
(動物)
8週齢の雌性C57BL/6Jマウスを日本SLC(静岡、日本)から得た。本実施例で用いた全ての動物は、動物実験に関する日本薬理学会指針にしたがって飼育した。動物は、慣用の条件下、具体的には、清潔なケージ内で、制御された室温(22〜28℃)及び湿度(35〜55％)の下で、動物施設において維持した。動物は、ケージ1個あたり最大3匹のマウスを有する、ポリカーボネートケージ(KN-600、夏目製作所、日本)中で飼育した。マウスには滅菌した通常の食餌、及び蒸留水を自由に与えた。
【００６３】
(大腸炎の誘発)
デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)はMP Biomedicals社から購入した。2.5％(w/v)DSS水溶液をマウスに3日間(DSS水溶液をマウスに与えた初日を0日目として、0、1及び2日目に)自由に与えて、急性大腸炎を誘発した。
【００６４】
(siRNA/N-アセチル化キトサン複合体の投与)
処置群は以下の3群からなった。
・第1群: 正常(DSS無し、複合体投与無し)
・第2群: DSS誘発大腸炎、陰性対照siRNA(N.C.)/N-アセチル化キトサン複合体投与
・第3群: DSS誘発大腸炎、CHST15 siRNA/N-アセチル化キトサン複合体投与
【００６５】
各群は、5匹のマウスからなった。0、1及び2日目に、第2群及び第3群の大腸炎を誘発したマウスにそれぞれN.C./N-アセチル化キトサン複合体及びCHST15 siRNA/N-アセチル化キトサン複合体を経口投与した。投与は、生理食塩水(大塚製薬工場、日本)をビヒクルとして使用し、1日1回、マウス1匹あたり10μg siRNAの用量(10mL/kgの体積中)で行った。3日目に、マウスを屠殺し、複合体の有効性を評価した。
【００６６】
(疾患活動指数の測定)
疾患活動指数(DAI)を、3日目のマウスにおいて体重減少、便潜血及び便の硬さについて評価した指数を合計することによって計算した。体重減少、便潜血及び便の硬さの評価基準を表1に示す。
【００６７】
【表１】
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【００６８】
(組織病理)
遠位結腸(大腸)の約1.5〜2.0cmを10％中性緩衝ホルマリン(和光純薬工業、日本)中で固定し、パラフィンに包埋し、4μm切片にしてHE染色を行った。切片を顕微鏡下で観察した。組織学的スコアを、腸管上皮損傷及び炎症性浸潤について評価した指数を合計することによって計算した。腸管上皮損傷及び炎症性浸潤の評価基準を表2に示す。
【００６９】
【表２】
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【００７０】
(定量的RT-PCR)
全RNAを、RNAiso(タカラバイオ、日本)を用いて製造業者の説明書にしたがって結腸サンプルから抽出した。4.4mM MgCl2(F. Hoffmann-La Roche、スイス)、40U RNaseインヒビター(東洋紡、日本)、0.5mM dNTP(Promega、米国)、6.28μM ランダムヘキサマー(Promega)、5×ファーストストランドバッファー(Promega)、10mM ジチオスレイトール(Invitrogen)及び200U MMLV-RT(Invitrogen)を含有する反応混合物を用いて最終体積20μL中で、1μgのRNAを逆転写した。反応を37℃で1時間行い、その後、99℃で5分処理した。リアルタイムPCR DICE及びSYBRプレミックスTaq(タカラバイオ)を用いてリアルタイムPCRを行った。用いたプライマーの配列を、CHST15遺伝子について配列番号9及び10に、TNF-α遺伝子について配列番号11及び12に、MCP-1遺伝子について配列番号13及び14に、ROR-γ遺伝子について配列番号15及び16に、36B4遺伝子について配列番号17及び18に示す。相対的mRNA発現レベルを計算するため、各遺伝子(CHST15、TNF-α、MCP-1及びROR-γ)の発現を参照遺伝子36B4の発現に対して正規化した。
【００７１】
(統計的検定)
DAI、結腸の長さ、組織学的スコア、及び相対的遺伝子発現レベルについて、GraphPad Prism 4(GraphPad Software、米国)を用いてボンフェローニ多重比較検定を使用して統計的検定を行った。P値＜0.05を統計的に有意であると見なした。片側t検定がP値＜0.05を返した場合、ある傾向を推測した。結果を平均±標準偏差として表した。図面では、P値＜0.05を「*」、P値＜0.01を「**」、P値＜0.001を「***」、P値≧0.05を「n.s.」(有意差無し)と表した。
【００７２】
＜結果＞
(疾患活動指数)
疾患活動指数(DAI)の結果を図1に示す。大腸炎モデルマウスのN.C.投与群(第2群)において測定されたDAIは、正常(第1群)と比較して、有意に増加した。大腸炎モデルマウスのCHST15 siRNA投与群(第3群)は、N.C.投与群(第2群)と比較して、DAIの有意な低減を示した。この結果から、CHST15 siRNA/N-アセチル化キトサン複合体は、大腸炎の活動性を抑制することが示された。
【００７３】
(結腸の長さ)
結腸の長さの結果を図2に示す。結腸の長さは、3日目の大腸炎モデルマウスのN.C.投与群(第2群)において、正常(第1群)と比較して、有意に短かった。一方、大腸炎モデルマウスのCHST15 siRNA投与群(第3群)において、N.C.投与群(第2群)と比較して、結腸の長さは有意に長かった。この結果から、CHST15 siRNA/N-アセチル化キトサン複合体は、大腸炎による結腸の短縮からの保護をもたらすことが示された。
【００７４】
(組織学的解析)
HEで染色した結腸切片を用いて、腸管上皮損傷及び炎症性浸潤を評価した。HE染色切片の代表的な顕微鏡写真を図3に示す。重度の潰瘍は3日目にどの群でも観察されなかったが、炎症性浸潤を伴う局所的潰瘍性病変は、大腸炎モデルマウスのN.C.投与群(第2群)において観察された(図3A)。これらの病変は全て、固有層に見られ、第2群における杯細胞の喪失を伴った。大腸炎モデルマウスのCHST15 siRNA投与群(第3群)では、わずかに陰窩損傷及び炎症性浸潤が低減した(図3B)。組織学的スコアも、大腸炎モデルマウスのCHST15 siRNA投与群(第3群)において、N.C.投与群(第2群)と比較して有意に低減した(図4)。これらの結果から、CHST15 siRNA/N-アセチル化キトサン複合体は、大腸炎に対して組織学的にも治療効果を有すること、さらに、炎症を誘発しないことが示された。
【００７５】
(遺伝子発現解析)
CHST15遺伝子発現の結果を図5に示す。結腸におけるCHST15 mRNAは、大腸炎モデルマウスのN.C.投与群(第2群)において、正常(第1群)と比較して有意に増加した。一方、大腸炎モデルマウスのCHST15 siRNA投与群(第3群)は、N.C.投与群(第2群)と比較して、結腸におけるCHST15 mRNAの有意な低減を示した。また、大腸炎モデルマウスのCHST15 siRNA投与群(第3群)とN.C.投与群(第2群)との間で、炎症によって発現が増加することが知られている、TNF-α、MCP-1及びROR-γ mRNAレベルに有意差はなかった。これらの結果から、CHST15 siRNA/N-アセチル化キトサン複合体は、結腸(大腸)においてCHST15 mRNAを特異的に低減すること、さらに、炎症を誘発しないことが示された。
【００７６】
[実施例2]
NSAID誘発小腸炎モデルマウスに投与したCHST15 siRNA/N-アセチル化キトサン複合体の効果
非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)は、副作用として消化管に粘膜障害及び炎症を誘発することが分かっている。本実施例では、NSAIDであるインドメタシンで誘発した小腸炎モデルマウスに対する、経口投与したCHST15 siRNA/N-アセチル化キトサン複合体のRNAi効果及び治療効果を検討した。
【００７７】
(N-アセチル化キトサン/siRNA複合体) 
実施例1に記載した方法によって、CHST15 siRNA/N-アセチル化キトサン複合体、及び陰性対照siRNA(N.C.)/N-アセチル化キトサン複合体を製造した。
【００７８】
(動物)
7〜8週齢の雌性C57BL/6Jマウスを日本SLC(静岡、日本)から得た。飼育条件は実施例1に記載したものと同様とした。
【００７９】
(小腸炎の誘発)
0日目に、NSAIDであるインドメタシン(和光純薬工業)を、マウス体重1kgあたり10mgの用量で皮下投与し、小腸炎を誘発した。
【００８０】
(N-アセチル化キトサン/siRNA複合体の投与)
処置群は以下の4群からなった。
・第1群: 正常(NSAID無し、複合体投与無し)
・第2群: NSAID誘発小腸炎、偽(Mock)投与
・第3群: NSAID誘発小腸炎、陰性対照siRNA(N.C.)/N-アセチル化キトサン複合体投与
・第4群: NSAID誘発小腸炎、CHST15 siRNA/N-アセチル化キトサン複合体投与
【００８１】
各群は、4匹のマウスからなった。第2群のマウスにはビヒクルである生理食塩水(大塚製薬工場、日本)を投与し、第3群及び第4群のマウスにはそれぞれN.C./N-アセチル化キトサン複合体及びCHST15 siRNA/N-アセチル化キトサン複合体を強制経口投与した。投与は、NSAID投与(小腸炎誘発)後に、0日目に1回、マウス1匹あたり10μg siRNAの用量で行った。1日目に、マウスを屠殺し、複合体の有効性を評価した。
【００８２】
(複合体の有効性の評価方法)
結腸の代わりに空腸を用いたことを除いて、実施例1に記載したのと同様の方法で、定量的RT-PCRによってCHST15 mRNA発現レベルを決定した。空腸において目に見える潰瘍の数をカウントして、潰瘍スコアを決定した。統計的検定は、実施例1に記載したのと同様の方法で行った。
【００８３】
＜結果＞
(遺伝子発現解析)
CHST15遺伝子発現解析の結果を図6に示す。空腸(小腸)におけるCHST15 mRNAは、小腸炎モデルマウスの偽投与群(第2群)及びN.C.投与群(第3群)において、正常(第1群)と比較して有意に増加した。一方、小腸炎モデルマウスのCHST15 siRNA投与群(第4群)は、偽投与群(第2群)及びN.C.投与群(第3群)と比較して、空腸におけるCHST15 mRNAの有意な低減を示した。この結果から、CHST15 siRNA/N-アセチル化キトサン複合体は、空腸(小腸)においてCHST15 mRNAを低減することが示された。
【００８４】
(潰瘍スコア)
潰瘍スコア(潰瘍数)の結果を図7に示す。空腸(小腸)における潰瘍数は、小腸炎モデルマウスの偽投与群(第2群)及びN.C.投与群(第3群)において、正常(第1群)と比較して有意に増加した。一方、小腸炎モデルマウスのCHST15 siRNA投与群(第4群)は、偽投与群(第2群)及びN.C.投与群(第3群)と比較して、空腸における潰瘍数の有意な低減を示した。この結果から、CHST15 siRNA/N-アセチル化キトサン複合体は、空腸(小腸)におけるNSAID誘発性潰瘍の数を低減し、NSAID誘発小腸炎を抑制する効果を有することが示された。
【００８５】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2020079270.tif 000004
【図２】
2020079270.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
2020079270000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月3日(2020.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。