(57)【要約】      （修正有）【課題】がん幹細胞を特異的に検出するための検出剤、がん幹細胞特異的に提示される腫瘍抗原ペプチド、これを有効成分として含有するがんの予防および／または治療に有用な医薬組成物の提供。【解決手段】ＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドであって該タンパク質のアミノ酸配列中の連続する８〜１４アミノ酸からなるペプチド、前記ペプチドの少なくとも一つをエピトープペプチドの一つとして含む、複数のエピトープペプチドを連結したポリエピトープペプチド、前記ペプチドもしくはポリエピトープペプチドの少なくともひとつをコードするポリヌクレオチド、およびこれらを有効成分として含有する医薬組成物、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することを特徴とするがんの予防および／または治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｙ０−Ｘ０−Ｚ０
で表されるペプチドであって、
Ｘ０が、以下の（１）〜（４）：
（１）ＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドであって、該タンパク質のアミノ酸配列中の連続する８〜１４アミノ酸からなり、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンであり、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンであるペプチド；
（２）（１）の部分ペプチドにおいて、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンに置換されているペプチド；
（３）ＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドであって、該タンパク質のアミノ酸配列中の連続する８〜１４アミノ酸からなり、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンであり、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンであるペプチド；または
（４）（３）の部分ペプチドにおいて、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンに置換されているペプチド；
のいずれかであり、
Ｙ０およびＺ０が、互いに独立して０個から数個のアミノ酸からなるペプチド
である、前記ペプチド。
【請求項２】
Ｘ０が、以下の（１’）〜（４’）：
（１’）ＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドであって、該タンパク質のアミノ酸配列中の連続する８〜１１アミノ酸からなり、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンであり、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンであるペプチド；
（２’）（１’）の部分ペプチドにおいて、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンに置換されているペプチド；
（３’）ＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドであって、該タンパク質のアミノ酸配列中の連続する８〜１１アミノ酸からなり、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンであり、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンであるペプチド；または
（４’）（３’）の部分ペプチドにおいて、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンに置換されているペプチド；
のいずれかであり、
Ｙ０およびＺ０が、互いに独立して
０個もしくは１個のアミノ酸であるか；または
０〜３個のアミノ酸からなるペプチドであって、ここでＹ０−Ｘ０−Ｚ０が全体で９〜１４アミノ酸長であるＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドもしくはそのＸ０ホモログとなる；
であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｘ０が、配列番号３〜５８、６０、６５、６６、６９〜７８および８０〜８５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
Ｘ０が、配列番号３〜５８、６０、６５、６６、６９〜７８および８０〜８５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなり、Ｙ０およびＺ０が存在しない、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項５】
Ｘ０が、配列番号８、２７〜５８、６０、７１および８１のいずれかで表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がメチオニン、ロイシンもしくはイソロイシンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、バリンもしくはイソロイシンに置換されているアミノ酸配列からなり、Ｙ０およびＺ０が存在しない、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項６】
Ｘ０が、配列番号３〜２６、５３、５８、７８および８０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がメチオニンもしくはチロシンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンに置換されているアミノ酸配列からなり、Ｙ０およびＺ０が存在しない、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項７】
Ｘ０が、請求項４〜６のいずれか一項に記載のＸ０であり、Ｙ０またはＺ０のいずれか一方が１個のアミノ酸であり、もう一方が存在しない、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項８】
Ｙ０−Ｘ０−Ｚ０で表されるペプチドが、配列番号４、６、９、１２、１４、１５、２０、２３、２４、２９〜３３、３５、３７、３８、４７、５７、６０、６５〜６８、７１〜７５および７７〜８０のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項９】
Ｙ０−Ｘ０−Ｚ０で表されるペプチドが、配列番号４、２０、２９〜３３、３５、３７、３８、４７、５７、６０、６５〜６８および７１〜７３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０】
Ｙ０−Ｘ０−Ｚ０で表されるペプチドが、配列番号４、６、９、１２、１４、１５、２０、２３、２４、４７、６５〜６８、７４、７５および７７〜８０のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１】
Ｙ０−Ｘ０−Ｚ０で表されるペプチドが、配列番号４、２０、４７および６５〜６８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２】
複数のエピトープペプチドが連結されたポリエピトープペプチドであって、該エピトープペプチドとして、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチドを少なくとも１つ含む、前記ポリエピトープペプチド。
【請求項１３】
ＦＡＭ８３Ｂ遺伝子の発現産物を検出するためのＦＡＭ８３Ｂ検出剤を含む、がん幹細胞検出剤。
【請求項１４】
心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸および血液からなる群から選択される１または２以上の生体試料に由来する細胞を含む細胞集団においてがん幹細胞を検出するための、請求項１３に記載のがん幹細胞検出剤。
【請求項１５】
ＦＡＭ８３Ｂ遺伝子の発現産物が、ｍＲＮＡおよび／または内在性ポリペプチドである、請求項１３または１４に記載のがん幹細胞検出剤。
【請求項１６】
ＦＡＭ８３Ｂ遺伝子の発現産物がｍＲＮＡであり、ＲＴ−ＰＣＲ法により検出することを含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のがん幹細胞検出剤。
【請求項１７】
ＦＡＭ８３Ｂ遺伝子の発現産物が内在性ポリペプチドであり、該内在性ポリペプチドと特異的に反応するＦＡＭ８３Ｂ検出剤により検出することを含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のがん幹細胞検出剤。
【請求項１８】
ＦＡＭ８３Ｂ検出剤が、抗体である、請求項１７に記載のがん幹細胞検出剤。
【請求項１９】
ＦＡＭ８３Ｂ検出剤が、ＦＡＭ８３Ｂ遺伝子の発現産物であるｍＲＮＡを検出するための前記遺伝子に相補的な塩基配列を有するプローブおよび／またはプライマーである、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のがん幹細胞検出剤。
【請求項２０】
請求項１３〜１９のいずれか一項に記載のがん幹細胞検出剤を使用して、検査対象においてがん幹細胞を検出する方法。
【請求項２１】
（ｉ）がん治療薬の候補化合物を、対象に投与する前に、該対象におけるＦＡＭ８３Ｂ遺伝子の発現産物の検出量Ａを測定する工程、
（ｉｉ）前記候補化合物を前記対象細胞集団に投与した後に、該対象におけるＦＡＭ８３Ｂ遺伝子の発現産物の検出量Ｂを測定する工程、および
（ｉｉｉ）前記検出量ＡとＢとを比較し、該検出量ＡがＢより有意に大きい場合に、前記候補化合物を、がん幹細胞を標的とすることを特徴とするがん治療薬候補であると判定する工程、
を含む、がん治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項１２に記載のポリエピトープペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載の発現ベクターを含む、遺伝子導入用組成物。
【請求項２５】
以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項１２に記載のポリエピトープペプチド、
（ｂ）請求項２２に記載のポリヌクレオチド、
（ｃ）請求項２３に記載の発現ベクター、
（ｄ）ＦＡＭ８３Ｂタンパク質、ＦＡＭ８３Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
のいずれかを有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチド、および／または、請求項１２に記載のポリエピトープペプチドを有効成分として含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
アジュバントをさらに含む、請求項２５または２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
がんの予防および／または治療剤である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
がんの予防および／または治療用ワクチンである、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項１２に記載のポリエピトープペプチド、
（ｂ）請求項２２に記載のポリヌクレオチド、
（ｃ）請求項２３に記載の発現ベクター、
（ｄ）ＦＡＭ８３Ｂタンパク質、ＦＡＭ８３Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
のいずれかを有効成分として含有する、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤。
【請求項３１】
（Ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項１２に記載のポリエピトープペプチド、あるいは、
（Ｂ）前記（Ａ）のペプチドおよび／またはポリエピトープペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドと、抗原提示能を有する細胞とを、in vitroで接触させることを含む、抗原提示細胞の製造方法。
【請求項３２】
（Ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項１２に記載のポリエピトープペプチド、あるいは、
（Ｂ）前記（Ａ）のペプチドおよび／またはポリエピトープペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド
と、末梢血リンパ球とを、in vitroで接触させることを含む、細胞障害性Ｔ細胞の誘導方法。
【請求項３３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチドとＨＬＡとを含む、ＨＬＡマルチマー。
【請求項３４】
請求項３３に記載のＨＬＡマルチマーを含む、診断薬。
【請求項３５】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチドとＨＬＡとの複合体を認識する、Ｔ細胞受容体様抗体。
【請求項３６】
請求項３５に記載のＴ細胞受容体様抗体を含有する腫瘍検出剤。
【請求項３７】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチドとＨＬＡとの複合体を認識する、キメラ抗原受容体。
【請求項３８】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチドとＨＬＡとの複合体を認識するＴ細胞受容体を含む、人工ＣＴＬ。
【請求項３９】
請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の医薬組成物を用いたがんの処置方法が有効な治療対象患者を選択するための診断薬であって、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載のがん幹細胞検出剤、請求項３３に記載のＨＬＡマルチマーおよび／または請求項３５に記載のＴ細胞受容体様抗体を含む、前記診断薬。
【請求項４０】
（Ｉ）細胞のライセートから、抗ＭＨＣ抗体を用いてＭＨＣとナチュラルペプチドとの複合体を単離する工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた複合体からナチュラルペプチドを単離する工程、および、
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られたナチュラルペプチドを配列解析する工程を含む、ナチュラルペプチドを同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん幹細胞に特異的に発現する遺伝子を利用したがん幹細胞を検出するための検出剤、およびがんの予防および／または治療剤として有用な、該遺伝子由来の腫瘍抗原ペプチドおよびそれらの利用に関する。さらに本発明は、かかる腫瘍抗原ペプチドをスクリーニングする方法に関する。また、本発明は、細胞に抗原提示されているナチュラルペプチドを同定する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに開発された抗がん剤の治療効果は十分ではなく、がんを完治できる確率は極めて低い。その原因として、がん組織の根幹をなす細胞を、従来の治療剤が選択的にターゲッティングできていないことが挙げられる。近年になって、かかる「がん組織の根幹をなす細胞」として、がん幹細胞の存在が報告されている。がん幹細胞は、がんの発生、再発および転移に関わる原因細胞と考えられており、したがってがん幹細胞をターゲッティングすることができれば、がんの増殖、再発および転移を効果的に抑制できる可能性が高いと期待される。すなわち、がん幹細胞の検出技術とがん幹細胞を標的とする新規治療剤の開発は、がん医療にとって重要な課題となっている。
【０００３】
一方、生体による腫瘍細胞やウイルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、とりわけ細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が重要な働きをしている。例えば腫瘍細胞の排除の場合、ＣＴＬは、腫瘍細胞上の抗原ペプチド（腫瘍抗原ペプチド）と主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ：Major Histocompatibility Complex）クラスＩ抗原（ヒトの場合はＨＬＡクラスＩ抗原と称する）との複合体を認識し、腫瘍細胞を攻撃・破壊する。つまり腫瘍抗原ペプチドは、腫瘍に特有のタンパク質、すなわち腫瘍抗原タンパク質が細胞内で合成された後、プロテアーゼにより細胞内で分解されることによって生成される。そして生成された腫瘍抗原ペプチドは、小胞体内でＭＨＣクラスＩ抗原（ＨＬＡクラスＩ抗原）と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示される。この抗原提示に係る複合体を腫瘍特異的なＣＴＬが認識し、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍効果を示す。このような一連の作用の解明に伴い、腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドをいわゆるがん免疫療法剤（がんワクチン）として利用することにより、がん患者の体内のがん特異的ＣＴＬを増強させる治療法が開発されつつある。
中でも特に、がん幹細胞を免疫的に排除することが可能な新しいがんワクチンの開発が望まれている（例えば特許文献１）。
【０００４】
ＦＡＭ８３Ｂ（family with sequence similarity 83, member B）は乳癌、子宮頚部癌、肺癌、甲状腺癌、大腸癌、精巣腫瘍、卵巣癌等の癌部において、各非癌部と比較して、発現が著しく上昇していることが知られている。ＦＡＭ８３Ｂが人為的に導入されたヒト乳腺由来上皮細胞は、免疫不全マウスにおいてがんを形成する。また、乳癌細胞においてＦＡＭ８３Ｂの発現を抑制すると、in vitroおよびin vivoのいずれにおいても、細胞増殖が抑制される。以上のことより、ＦＡＭ８３Ｂは、乳癌、子宮頚部癌、肺癌、甲状腺癌、大腸癌、精巣腫瘍、卵巣癌等において、がんの発生、形成および増殖に深く関与している癌遺伝子である可能性が指摘されている（例えば非特許文献１〜５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０５０２６８号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】R. Cipriano, et al., J. Clin. Invest. 2012, 122(9), 3197-3210
【非特許文献２】M. Hilger, et al., J. Proteome Res. 2012, 11, 982-994
【非特許文献３】R. Cipriano, et al., Oncotarget 2013, 4, 728-738
【非特許文献４】R. Cipriano, et al., Oncogene 2013, 1-9
【非特許文献５】S. Grant, et al., J. Clin. Invest. 2012, 122(9), 3048-3051
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、がん幹細胞を特異的に検出するための検出剤、がん幹細胞特異的に提示される腫瘍抗原ペプチド、これを有効成分として含有するがんの予防および／または治療に有用な医薬組成物、およびかかる腫瘍抗原ペプチドをスクリーニングする方法等を提供することにある。また、本発明の他の目的は、細胞に抗原提示されているナチュラルペプチドを同定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
腫瘍細胞、とくにがん幹細胞に特異的に抗原提示されるペプチドを探索する中で、がん幹細胞に特異的に発現するタンパク質の配列中にＨＬＡと結合すると予測されるエピトープ領域が複数存在したとしても、当該タンパク質のどの部分が実際に生体内でＨＬＡと結合して細胞表面に抗原提示され得るか同定することは容易ではない。そこで、本発明者らはかかる課題を解決するため、実際にがん幹細胞に抗原提示されているペプチド（ナチュラルペプチド）を直接同定する方法を開発し、いくつかのナチュラルペプチドを同定した。そしてかかるペプチドのうち、がん幹細胞のみに特異的に抗原提示されているペプチドがＦＡＭ８３Ｂタンパク質由来のペプチドであることを見出し、さらに鋭意研究を続け、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は下記に掲げるものに関する：
［１］Ｙ０−Ｘ０−Ｚ０
で表されるペプチドであって、
Ｘ０が、以下の（１）〜（４）：
（１）ＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドであって、該タンパク質のアミノ酸配列中の連続する８〜１４アミノ酸からなり、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンであり、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンであるペプチド；
（２）（１）の部分ペプチドにおいて、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンに置換されているペプチド；
（３）ＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドであって、該タンパク質のアミノ酸配列中の連続する８〜１４アミノ酸からなり、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンであり、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンであるペプチド；または
（４）（３）の部分ペプチドにおいて、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンに置換されているペプチド；
のいずれかであり、
Ｙ０およびＺ０が、互いに独立して０個から数個のアミノ酸からなるペプチド
である、前記ペプチド。
【００１０】
［２］Ｘ０が、以下の（１’）〜（４’）：
（１’）ＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドであって、該タンパク質のアミノ酸配列中の連続する８〜１１アミノ酸からなり、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンであり、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンであるペプチド；
（２’）（１’）の部分ペプチドにおいて、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンに置換されているペプチド；
（３’）ＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドであって、該タンパク質のアミノ酸配列中の連続する８〜１１アミノ酸からなり、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンであり、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンであるペプチド；または
（４’）（３’）の部分ペプチドにおいて、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンに置換されているペプチド；
のいずれかであり、
Ｙ０およびＺ０が、互いに独立して
０個もしくは１個のアミノ酸であるか；または
０〜３個のアミノ酸からなるペプチドであって、ここでＹ０−Ｘ０−Ｚ０が全体で９〜１４アミノ酸長であるＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドもしくはそのＸ０ホモログとなる；
であることを特徴とする、［１］のペプチド。
【００１１】
［３］Ｘ０が、配列番号３〜５８、６０、６５、６６、６９〜７８および８０〜８５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、［１］または［２］のペプチド。
［４］Ｘ０が、配列番号３〜５８、６０、６５、６６、６９〜７８および８０〜８５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなり、Ｙ０およびＺ０が存在しない、［１］または［２］のペプチド。
［５］Ｘ０が、配列番号８、 ２７〜５８、６０、７１および８１のいずれかで表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がメチオニン、ロイシンもしくはイソロイシンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、バリンもしくはイソロイシンに置換されているアミノ酸配列からなり、Ｙ０およびＺ０が存在しない、［１］または［２］のペプチド。
【００１２】
［６］Ｘ０が、配列番号３〜２６、５３、５８、 ７８および８０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がメチオニンもしくはチロシンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンに置換されているアミノ酸配列からなり、Ｙ０およびＺ０が存在しない、［１］または［２］のペプチド。
［７］Ｘ０が、［４］〜［６］のＸ０であり、Ｙ０またはＺ０のいずれか一方が１個のアミノ酸であり、もう一方が存在しない、［１］または［２］のペプチド。
【００１３】
［８］Ｙ０−Ｘ０−Ｚ０で表されるペプチドが、配列番号４、６、９、１２、１４、１５、２０、２３、２４、２９〜３３、３５、３７、３８、４７、５７、６０、６５〜６８、７１〜７５および７７〜８０のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、［１］〜［３］のペプチド。
［９］Ｙ０−Ｘ０−Ｚ０で表されるペプチドが、配列番号４、２０、２９〜３３、３５、３７、３８、４７、５７、６０、６５〜６８および７１〜７３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、［１］〜［３］のペプチド。
［１０］Ｙ０−Ｘ０−Ｚ０で表されるペプチドが、配列番号４、６、９、１２、１４、１５、２０、２３、２４、４７、６５〜６８、７４、７５および７７〜８０のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、［１］〜［３］のペプチド。
［１１］Ｙ０−Ｘ０−Ｚ０で表されるペプチドが、配列番号４、２０、４７および６５〜６８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、［１］〜［３］のペプチド。
［１２］複数のエピトープペプチドが連結されたポリエピトープペプチドであって、該エピトープペプチドとして、［１］〜［１１］のペプチドを少なくとも１つ含む、前記ポリエピトープペプチド。
【００１４】
［１３］ＦＡＭ８３Ｂ遺伝子の発現産物を検出するためのＦＡＭ８３Ｂ検出剤を含む、がん幹細胞検出剤。
［１４］心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸および血液からなる群から選択される１または２以上の生体試料に由来する細胞を含む細胞集団においてがん幹細胞を検出するための、［１３］のがん幹細胞検出剤。
［１５］ＦＡＭ８３Ｂ遺伝子の発現産物が、ｍＲＮＡおよび／または内在性ポリペプチドである、［１３］または［１４］のがん幹細胞検出剤。
［１６］ＦＡＭ８３Ｂ遺伝子の発現産物がｍＲＮＡであり、ＲＴ−ＰＣＲ法により検出することを含む、［１３］〜［１５］のがん幹細胞検出剤。
［１７］ＦＡＭ８３Ｂ遺伝子の発現産物が内在性ポリペプチドであり、該内在性ポリペプチドと特異的に反応するＦＡＭ８３Ｂ検出剤により検出することを含む、［１３］〜［１５］のがん幹細胞検出剤。
［１８］ＦＡＭ８３Ｂ検出剤が、抗体である、［１７］のがん幹細胞検出剤。
［１９］ＦＡＭ８３Ｂ検出剤が、ＦＡＭ８３Ｂ遺伝子の発現産物であるｍＲＮＡを検出するための前記遺伝子に相補的な塩基配列を有するプローブおよび／またはプライマーである、［１３］〜［１６］のがん幹細胞検出剤。
【００１５】
［２０］［１３］〜［１９］のがん幹細胞検出剤を使用して、検査対象においてがん幹細胞を検出する方法。
［２１］（ｉ）がん治療薬の候補化合物を、対象に投与する前に、該対象におけるＦＡＭ８３Ｂ遺伝子の発現産物の検出量Ａを測定する工程、
（ｉｉ）前記候補化合物を前記対象細胞集団に投与した後に、該対象におけるＦＡＭ８３Ｂ遺伝子の発現産物の検出量Ｂを測定する工程、および
（ｉｉｉ）前記検出量ＡとＢとを比較し、該検出量ＡがＢより有意に大きい場合に、前記候補化合物を、がん幹細胞を標的とすることを特徴とするがん治療薬候補であると判定する工程、
を含む、がん治療薬のスクリーニング方法。
［２２］［１］〜［１１］のペプチドまたは［１２］のポリエピトープペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド。
［２３］［２２］のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
［２４］［２３］の発現ベクターを含む、遺伝子導入用組成物。
【００１６】
［２５］以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）［１］〜［１１］のペプチドまたは［１２］のポリエピトープペプチド、
（ｂ）［２２］のポリヌクレオチド、
（ｃ）［２３］の発現ベクター、
（ｄ）ＦＡＭ８３Ｂタンパク質、ＦＡＭ８３Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
のいずれかを有効成分として含む、医薬組成物。
［２６］［１］〜［１１］のペプチド、および／または、［１２］のポリエピトープペプチドを有効成分として含む、［２５］の医薬組成物。
［２７］アジュバントをさらに含む、［２５］または［２６］の医薬組成物。
［２８］がんの予防および／または治療剤である、［２５］〜［２７］の医薬組成物。
［２９］がんの予防および／または治療用ワクチンである、［２５］〜［２８］の医薬組成物。
【００１７】
［３０］以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）［１］〜［１１］のペプチドまたは［１２］のポリエピトープペプチド、
（ｂ）［２２］のポリヌクレオチド、
（ｃ）［２３］の発現ベクター、
（ｄ）ＦＡＭ８３Ｂタンパク質、ＦＡＭ８３Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
のいずれかを有効成分として含有する、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤。
［３１］（Ａ）［１］〜［１１］のペプチドまたは［１２］のポリエピトープペプチド、あるいは、
（Ｂ）前記（Ａ）のペプチドおよび／またはポリエピトープペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドと、抗原提示能を有する細胞とを、in vitroで接触させることを含む、抗原提示細胞の製造方法。
【００１８】
［３２］（Ａ）［１］〜［１１］のペプチドまたは［１２］のポリエピトープペプチド、あるいは、
（Ｂ）前記（Ａ）のペプチドおよび／またはポリエピトープペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド
と、末梢血リンパ球とを、in vitroで接触させることを含む、細胞障害性Ｔ細胞の誘導方法。
［３３］［１］〜［１１］のペプチドとＨＬＡとを含む、ＨＬＡマルチマー。
［３４］［３３］のＨＬＡマルチマーを含む、診断薬。
［３５］［１］〜［１１］のペプチドとＨＬＡとの複合体を認識する、Ｔ細胞受容体様抗体。
【００１９】
［３６］［３５］に記載のＴ細胞受容体様抗体を含有する腫瘍検出剤。
［３７］［１］〜［１１］のペプチドとＨＬＡとの複合体を認識する、 キメラ抗原受容体。
［３８］［１］〜［１１］のペプチドとＨＬＡとの複合体を認識するＴ細胞受容体を含む、人工ＣＴＬ。
【００２０】
［３９］［２５］〜［２９］の医薬組成物を用いたがんの処置方法が有効な治療対象患者を選択するための診断薬であって、［１３］〜［１９］のがん幹細胞検出剤、［３３］のＨＬＡマルチマーおよび／または［３５］のＴ細胞受容体様抗体を含む、前記診断薬。
［４０］（Ｉ）細胞のライセートから、抗ＭＨＣ抗体を用いてＭＨＣとナチュラルペプチドとの複合体を単離する工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた複合体からナチュラルペプチドを単離する工程、および、
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られたナチュラルペプチドを配列解析する工程を含む、ナチュラルペプチドを同定する方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、がん幹細胞を特異的に攻撃するＣＴＬの誘導剤として有用な腫瘍抗原ペプチド、およびこれを有効成分として含有するがんの予防および／または治療に有用な医薬組成物等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ヘキスト３３３４２／ＰＩ染色したヒト大腸がん細胞株（ＳＷ４８０）のベラパミル（Verapamil）有無によるフローサイトメトリーの結果を示す。
【図２−１】図２−１は、ＳＷ４８０−ＳＰクローン細胞株およびＳＷ４８０−ＭＰクローン細胞株からそれぞれ単離した１細胞を培養し、ヘキスト３３３４２／ＰＩ染色したフローサイトメトリーの結果を示す。
【図２−２】図２−２は、ＳＷ４８０−ＳＰクローン細胞株およびＳＷ４８０−ＭＰクローン細胞株それぞれの共焦点顕微鏡画像を示す。
【図３】図３は、ＳＷ４８０−ＳＰクローン細胞株およびＳＷ４８０−ＭＰクローン細胞株それぞれをマウスに移植し、形成された腫瘍を評価した結果を示す。
【図４】図４は、ＳＷ４８０−ＳＰクローン細胞株およびＳＷ４８０−ＭＰクローン細胞株それぞれのライセートから、抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体を用いてＨＬＡとペプチドとの複合体を免疫沈降し、それから単離したペプチドをマススペクトロメトリーを用いて配列解析した結果を示す。
【図５】図５は、ＳＷ４８０−ＳＰおよびＳＷ４８０−ＭＰそれぞれのｍＲＮＡを抽出しＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の検討を行った際の電気泳動の写真を示す。ＳＷ４８０−ＳＰクローン細胞株に特異的な遺伝子としてＦＡＭ８３Ｂ遺伝子が確認された。
【図６】図６は、ＦＡＭ８３Ｂのヒト成人正常組織由来ｍＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す。
【図７】図７は、ＦＡＭ８３Ｂの種々のがん細胞株由来ｍＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す。
【図８】図８は、ＩＦＮ−γをコートしたＥＬＩＳＰＯＴプレートを用いた種々のペプチドによりパルスしたＴ２−Ａ２４細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。
【図９】図９は、ＰＢＭＣから誘導したエフェクター細胞（ＣＴＬ）の、種々のペプチドをパルスしたＴ２−Ａ２４細胞に対する細胞傷害活性を評価した結果を示す。エフェクター細胞は、配列番号３で示されるＦＡＭ８３Ｂペプチドで誘導したものを用いた。
【図１０】図１０は、配列番号４で表されるペプチド（Ｆ２３＿１０）の、インターフェロンγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるin vitroでのＣＴＬ誘導能力の評価結果を示す。縦軸は一定の播種細胞数あたりのスポット数を表す。ＡはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウス、ＢはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウスを利用した試験の結果をそれぞれ示す。また、黒棒（「w/ Peptide」）および白棒（「w/o」）は、それぞれ、ペプチド投与マウス由来の脾細胞を投与ペプチドの存在下および非存在下で再刺激培養した結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差は、各ペプチドの投与によってマウス生体内で誘導されたペプチド特異的ＣＴＬの数を示す。
【図１１】図１１は、配列番号６５で表されるペプチド（Ｆ６２＿１０）の、インターフェロンγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるin vitroでのＣＴＬ誘導能力の評価結果を示す。縦軸、Ａ、Ｂ、黒棒および白棒は、それぞれ、図１０と同じものを示す。
【図１２】図１２は、配列番号６６で表されるペプチド（Ｆ１４８＿９）の、インターフェロンγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるin vitroでのＣＴＬ誘導能力の評価結果を示す。縦軸、Ａ、Ｂ、黒棒および白棒は、それぞれ、図１０と同じものを示す。
【図１３】図１３は、配列番号６７で表されるペプチド（Ｆ２３９＿１２）の、インターフェロンγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるin vitroでのＣＴＬ誘導能力の評価結果を示す。縦軸、Ａ、Ｂ、黒棒および白棒は、それぞれ、図１０と同じものを示す。
【図１４】図１４は、配列番号６８で表されるペプチド（Ｆ３０５＿１２）の、インターフェロンγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるin vitroでのＣＴＬ誘導能力の評価結果を示す。縦軸、Ａ、Ｂ、黒棒および白棒は、それぞれ、図１０と同じものを示す。
【図１５】図１５は、配列番号２０で表されるペプチド（Ｆ４７５＿１０）の、インターフェロンγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるin vitroでのＣＴＬ誘導能力の評価結果を示す。縦軸、Ａ、Ｂ、黒棒および白棒は、それぞれ、図１０と同じものを示す。
【図１６】図１６は、配列番号４７で表されるペプチド（Ｆ４７６＿９）の、インターフェロンγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるin vitroでのＣＴＬ誘導能力の評価結果を示す。縦軸、Ａ、Ｂ、黒棒および白棒は、それぞれ、図１０と同じものを示す。
【図１７】図１７は、配列番号３５で表されるペプチド（Ｆ１３１＿９）および配列番号１２（Ｆ２４５＿１１）で表されるペプチドの、インターフェロンγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるin vitroでのＣＴＬ誘導能力の評価結果を示す。縦軸、黒棒および白棒は、それぞれ、図１０と同じものを示す。Ａ２はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウス、Ａ２４はＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウスを利用した試験の結果をそれぞれ示す。
【図１８】図１８は、ＨＬＡ−Ａ０２に対して高い親和性を示したペプチドの、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウスを利用した、インターフェロンγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるin vitroでのＣＴＬ誘導能力の評価結果を示す。縦軸、黒棒および白棒は、それぞれ、図１０と同じものを示す。
【図１９】図１８は、ＨＬＡ−Ａ２４に対して高い親和性を示したペプチドの、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウスを利用した、インターフェロンγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるin vitroでのＣＴＬ誘導能力の評価結果を示す。縦軸、黒棒および白棒は、それぞれ、図１０と同じものを示す。
【図２０】図２０は、ＨＬＡ−Ａ２４テトラマーアッセイの結果を示す。図２０−１は患者Ａの、図２０−２は患者Ｂの結果を表す。Ａ）は主にリンパ球ゲートを、Ｂ）はＡ）中のＣＤ８陽性Ｔ細胞ゲートを示す。Ｃ）はテトラマーアッセイの結果を示す図であり、Ｂ）中のテトラマー染色の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下本発明について詳細に説明する。
本発明において「エピトープペプチド」とは、ＭＨＣ（ヒトにおいてはＨＬＡ）と結合して、細胞表面に抗原提示され、かつ抗原性を有する（Ｔ細胞に認識され得る）ペプチドを意味する。エピトープペプチドには、ＭＨＣクラスＩと結合して抗原提示され、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に認識されるエピトープペプチドであるＣＴＬエピトープペプチド、およびＭＨＣクラスＩＩと結合して抗原提示され、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に認識されるエピトープペプチドであるヘルパーエピトープペプチドが含まれる。
【００２４】
エピトープペプチドのうち、腫瘍細胞において特異的にあるいは過剰に発現しているタンパク質由来のペプチドを、特に腫瘍抗原ペプチドという。抗原提示とは、細胞内に存在するペプチドがＭＨＣと結合し、このＭＨＣ／抗原ペプチド複合体が細胞表面に局在化する現象をいう。上述のとおり、細胞表面に提示された抗原はＴ細胞などにより認識された後、細胞性免疫や液性免疫を活性化することが知られており、ＭＨＣクラスＩに提示された抗原は、細胞性免疫を活性化するとともに、ナイーブＴ細胞のＴ細胞受容体に認識され、ナイーブＴ細胞を、細胞傷害活性を有するＣＴＬへと誘導するため、免疫療法に用いられる腫瘍抗原ペプチドとしては、ＭＨＣクラスＩと結合し、抗原提示されるペプチドが好ましい。
【００２５】
本発明において、「腫瘍（tumor）」は、良性腫瘍および悪性腫瘍（がん、悪性新生物）を含む。がん（cancer）は、造血器の腫瘍、上皮性の悪性腫瘍(癌、carcinoma）と非上皮性の悪性腫瘍(肉腫、sarcoma）とを含む。本発明において「がん幹細胞」とは、がん組織中に存在する細胞のうち、幹細胞様の性質を示す細胞のことをいい、がんの発生、再発および転移に関わる原因細胞であると考えられている細胞である。一般的に「がん幹細胞」はがん組織中に僅かしか存在しないため、他の細胞と区別することが困難であるが、当該技術分野においてはがん幹細胞を単離／濃縮する方法は知られており、例えばＳＰ分画法などが挙げられる。したがって本発明において「がん幹細胞」は、公知のがん幹細胞単離／濃縮法により単離／濃縮された細胞集団を意味し得る。
【００２６】
（１）本発明のナチュラルペプチドの同定方法
本発明は一側面において、実際に細胞表面に抗原提示されているナチュラルペプチドを単離／同定する方法に関する。
本発明において、「ナチュラルペプチド」は、実際に細胞表面に抗原提示されているペプチドのことをいう。また「ナチュラル抗原ペプチド」は、ナチュラルペプチドのうち抗原性が確認できたものをいう。このナチュラル抗原ペプチドをがん細胞から単離し、配列およびその由来を決定することにより、ＣＴＬを用いたがんの標的治療に有用な知見を得ることが可能である。
【００２７】
本方法は、ナチュラルペプチドを提示している細胞を溶解し、その溶解物（ライセート）からＭＨＣとナチュラルペプチドとの複合体を単離する工程を含む。
本方法に用いる細胞は、ナチュラルペプチドを提示する細胞、すなわちＭＨＣを発現する細胞であればとくに限定されないが、好ましくは腫瘍細胞、より好ましくはがん組織由来の腫瘍細胞、さらに好ましくはがん幹細胞である。とくにがん幹細胞を用いた場合、実際にがん幹細胞に抗原提示されているナチュラル抗原ペプチドを同定できるため、確実にがん幹細胞を標的とするＣＴＬを誘導可能な腫瘍抗原ペプチドを得ることが可能となり、非常に有用である。
【００２８】
ＭＨＣとナチュラルペプチドとの複合体を単離する方法としては、とくに限定されず、当該技術分野において公知のタンパク質単離法を用いることができる。具体的には、これに限定するものではないが、細胞内に豊富に存在するペプチドのうちＭＨＣに結合したペプチドのみを選択する必要があることから、ＭＨＣに対する特異抗体を用いた免疫沈降法によるペプチド／ＭＨＣ複合体の抽出法が好ましい。
適切な抗ＭＨＣ抗体は、用いた細胞などにより変化し得、当業者であれば目的や実験条件に応じて最適なものを選択し得る。具体的には例えば、ヒトの細胞を用いた場合、抗ＭＨＣ抗体としては抗ＨＬＡ抗体を用いる。抗ＨＬＡ抗体としては、これに限定するものではないが、例えば抗ＨＬＡ−Ａ０２抗体、抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体などの、ＨＬＡクラスＩに対する抗体が挙げられる。
【００２９】
本方法は、上記ＭＨＣとナチュラルペプチドとの複合体から、ナチュラルペプチドを単離する工程をさらに含む。複合体をＭＨＣ分子とナチュラルペプチドとに分離する方法は、ナチュラルペプチドの構造を変化させるものでなければ特に限定されず、当業者であれば適切な方法を選択することが可能である。具体的には、これに限定するものではないが、例えば弱酸を用いたペプチド単離が挙げられる。
【００３０】
さらに本方法は、上記単離ナチュラルペプチドの配列を解析する工程を含む。短鎖ペプチドの配列を解析する方法は当該技術分野において公知であり、当業者であれば適切な方法を選択することが可能である。具体的には、これに限定するものではないが、例えば液体クロマトグラフィーとタンデムマススペクトロメトリーを組み合わせたペプチド配列解析法が挙げられる。
以上の工程により、実際に細胞表面に抗原提示されているナチュラルペプチドを同定することができる。
【００３１】
本発明の好ましい一態様において、ナチュラルペプチドの抗原性を確認する工程をさらに含む。ペプチドの抗原性を確認する方法は、当該技術分野において公知であり、当業者であれば適切な方法を選択することが可能である。具体的には、これに限定するものではないが、例えば細胞傷害性試験、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、ＴＣＲ様抗体を用いたアッセイなどが挙げられる。ペプチドの抗原性の確認は、好ましくはナチュラルペプチドの配列が同定された後に行われるが、同定される前に行われてもよいし、ナチュラルペプチドの同定とは独立して行われてもよい。本発明の方法により同定されたナチュラルペプチドに対して、かかる工程によりさらに抗原性の確認を行うことで、前記ナチュラルペプチドをナチュラル抗原ペプチドとして同定することができる。
【００３２】
本発明者らは、上記方法により、ヒトがん幹細胞において抗原提示されているナチュラル抗原ペプチドを解析した。その結果、がん幹細胞において抗原提示されているナチュラル抗原ペプチドとして、ＦＡＭ８３Ｂタンパク質に由来するペプチド（配列番号３）が同定された。かかる知見をもとにさらに研究を進めた結果、ＦＡＭ８３Ｂ遺伝子ががん幹細胞において特異的に高発現しており、がん幹細胞に対する分子標的治療の有用な候補遺伝子であることを見出した。ＦＡＭ８３Ｂが腫瘍抗原であること、更にはＦＡＭ８３Ｂ由来のペプチドが腫瘍細胞表面にＨＬＡクラスＩ抗原と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示されていることは、これまで全く知られていなかった新たな知見である。
【００３３】
（２）本発明のペプチド
本明細書において、「ヒトＦＡＭ８３Ｂタンパク質」は、J Proteome Res. 2012;11:982-94やJ Clin Invest. 2012;122:3197-210で報告されている公知のタンパク質を意味し、具体的には配列番号２に記載のアミノ酸配列（Genbank Accession No: NP_001010872.1）で表されるタンパク質、およびそのホモログをいう。当該ホモログとしては、例えばスプライシングバリアント、個体差に基づくＳＮＰ等のバリアント等が挙げられる。具体的には、（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１又は複数、好ましくは１〜数個、更に好ましくは、１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１もしくは２個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。そのようなバリアントとして、配列番号２において第６４０番目のアミノ酸がスレオニン（Ｔ）に置換され、第９０７番目のアミノ酸配列がアスパラギン（Ｎ）に置換されたアミノ酸配列からなるGenbank Accession No.:BC112275のタンパク質等を例示することができる。本明細書において単に「ＦＡＭ８３Ｂタンパク質」といった場合は、別段の記載のない限り、ヒトＦＡＭ８３Ｂタンパク質を意味する。
【００３４】
ヒトＦＡＭ８３Ｂタンパク質として、好ましくは配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は前記タンパク質において、１〜３個、好ましくは１もしくは２個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。さらに好ましくは配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。
本発明のペプチドは、一態様において、ヒトＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドであって、ＭＨＣ、特にＨＬＡと結合するペプチド、好ましくはＭＨＣ、特にＨＬＡにより抗原提示されるペプチド、さらに好ましくはＭＨＣ、特にＨＬＡにより抗原提示されてＣＴＬを誘導可能なペプチドを含む。ＨＬＡにはいくつかの型が存在するが、本発明のペプチドは、好ましくはＨＬＡクラスＩに結合可能であり、より好ましくはＨＬＡ−Ａ０２またはＨＬＡ−Ａ２４に結合可能であり、さらに好ましくはＨＬＡ−Ａ０２およびＨＬＡ−Ａ２４の両方に結合可能である。本発明のペプチドは、ＭＨＣに結合する前にプロセシングなどの処理を経てもよく、それらの処理の結果エピトープペプチドを生成するようなペプチドも本発明のペプチドに含まれる。したがって、本発明のペプチドは、エピトープペプチドのアミノ酸配列を含む配列であれば、アミノ酸長は特に限定されない。しかしながら、本発明のペプチドそのものがエピトープペプチドであることが好ましく、したがってアミノ酸長は約８〜１４アミノ酸程度が好ましく、約８〜１１アミノ酸程度がより好ましく、約９〜約１１アミノ酸程度が特に好ましい。
【００３５】
ヒトのＭＨＣクラスＩであるＨＬＡクラスＩと結合するエピトープペプチドは、約８〜１４アミノ酸長、好ましくは約９〜１１アミノ酸長であり、その配列中に結合するＨＬＡ特有の結合モチーフを有することが知られている。例えばＨＬＡ−Ａ０２と結合するペプチドは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンであり、および／またはＣ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンであるという結合モチーフを有し、ＨＬＡ−Ａ２４と結合するペプチドは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンであり、および／またはＣ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンであるという結合モチーフを有する。
【００３６】
したがって本発明のペプチドは、好ましい一態様において、ＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドであって、該タンパク質のアミノ酸配列中の連続する８〜１４アミノ酸からなり、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンであり、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンであるペプチドであるエピトープペプチドを含み、より好ましくは該エピトープペプチドそのものである。中でも特に好ましいのは、配列番号８、２７〜５８、６０、７１および８１のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるエピトープペプチドである。
【００３７】
また、別の好ましい一態様において、前記部分ペプチドにおいて、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンに置換されているペプチドであるエピトープペプチドを含み、より好ましくは該エピトープペプチドそのものである。中でも特に好ましいのは、配列番号８、２７〜５８、６０、７１および８１のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンに置換されているエピトープペプチドである。
【００３８】
本発明のペプチドは、別の好ましい一態様において、ＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドであって、該タンパク質のアミノ酸配列中の連続する８〜１４アミノ酸からなり、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンであり、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンであるペプチドであるエピトープペプチドを含み、より好ましくは該エピトープペプチドそのものである。中でも特に好ましいのは、配列番号３〜２６、５３、５８、６７および７８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるエピトープペプチドである。
【００３９】
また、別の好ましい一態様において、前記部分ペプチドにおいて、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンに置換されているペプチドであるエピトープペプチドを含み、より好ましくは該エピトープペプチドそのものである。中でも特に好ましいのは、配列番号３〜２６、５３、５８、６７および７８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンに置換されているエピトープペプチドである。
【００４０】
本発明のペプチドは、別の好ましい一態様において、上記の部分ペプチドまたは置換された部分ペプチドにおいて、さらにＮ末端および／またはＣ末端に１個から数個のアミノ酸が付加されたペプチドである。
中でも特に好ましいのは、配列番号８、２７〜５８、６０、７１および８１のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、該ペプチドにおいてＮ末端から第２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンに置換されているペプチド、配列番号３〜２６、５３、５８、６７および７８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドあるいは該ペプチドにおいてＮ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンに置換されているペプチドにおいて、さらにＮ末端および／またはＣ末端に１個から数個のアミノ酸が付加されたペプチドである。
【００４１】
したがって、本発明のペプチドは一態様において、
Ｙ０−Ｘ０−Ｚ０
と表すことが可能である。ここで、Ｘ０、Ｙ０およびＺ０はいずれもペプチドである。
かかる態様において、Ｘ０は以下の（１）〜（４）：
（１）ＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドであって、該タンパク質のアミノ酸配列中の連続する８〜１４アミノ酸、好ましくは８〜１１アミノ酸からなり、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンであり、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンであるペプチド；
（２）（１）の部分ペプチドにおいて、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンに置換されているペプチド；
（３）ＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドであって、該タンパク質のアミノ酸配列中の連続する８〜１４アミノ酸、好ましくは８〜１１アミノ酸からなり、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンであり、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンであるペプチド；または
（４）（３）の部分ペプチドにおいて、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンに置換されているペプチド；
から選択されるペプチドである。ここで（２）は（１）の置換ホモログであり、（４）は（３）の置換ホモログであるため、Ｘ０が（２）または（４）のペプチドであるＹ０−Ｘ０−Ｚ０を特に、「Ｘ０ホモログ」という。
【００４２】
また、Ｙ０およびＺ０は、互いに独立して、０から数個のアミノ酸からなる任意のペプチドである。ここで、「０から数個のアミノ酸」は、具体的には０〜５個のアミノ酸を意味し、例えば０個、１個、２個、３個、４個あるいは５個のアミノ酸が挙げられ、更に好ましくは、０個、１個、２個もしくは３個のアミノ酸が挙げられ、特に好ましいのは０個もしくは１個である。本発明において、Ｙ０および／またはＺ０が「存在しない」という場合、Ｙ０および／またはＺ０が０個のアミノ酸からなるペプチドである場合を意味する。
ここでＹ０および／またはＺ０を構成するアミノ酸には特に限定が無く、タンパク質を構成する天然アミノ酸２０種類の任意のものが挙げられるが、好ましくは、生体内に存在する酵素によって切断され得るアミノ酸を挙げることができる。また、ＦＡＭ８３Ｂタンパク質のアミノ酸配列において前記部分ペプチドのＮ末端側および／またはＣ末端側のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列であることが望ましい。
【００４３】
したがって中でもさらに特に好ましいのは、Ｘ０が配列番号８、２７〜５８、６０、７１および８１のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、該ペプチドにおいてＮ末端から第２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンに置換されているペプチド、配列番号３〜２６、５３、５８、７８および８０のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、あるいは該ペプチドにおいてＮ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンに置換されているペプチドのいずれかであり、さらにＹ０および／またはＺ０が１個のアミノ酸である場合であり、さらに好ましくは、Ｙ０またはＺ０のいずれか一方が１個のアミノ酸であり、もう一方が存在しない場合である。
【００４４】
また、別の好ましい一態様において、Ｘ０が、８〜１１アミノ酸からなる上記（１）〜（４）のいずれかであり、Ｙ０および／またはＺ０が、互いに独立して０〜３個のアミノ酸からなるペプチドであり、Ｙ０−Ｘ０−Ｚ０が全体で９〜１４アミノ酸長であるＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドをまたはそのＸ０ホモログを構成する場合が挙げられる。かかる態様は、これに限定するものではないが、例えばＸ０が配列番号３〜５８、６０、６５、６６、６９〜７８および８０〜８５のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチドであって、かかるＸ０のＮ末端側および／またはＣ末端側に０~３個のアミノ酸からなるペプチドＹ０および／またはＺ０が付加されているが、かかるＹ０−Ｘ０−Ｚ０もまたＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドとなる場合が挙げられる。
【００４５】
本発明のペプチドは、好ましい一態様において、Ｘ０が、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６０、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８および配列番号８０のいずれかに記載のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるペプチドを含む。この態様において、より好ましくは、本発明のペプチド（すなわちＹ０−Ｘ０−Ｚ０）がいずれも上記ＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドとなる。かかるより好ましい態様において、例えば本発明のペプチドは、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６０、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９および配列番号８０のいずれかに記載のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００４６】
配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６０、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９および配列番号８０で表されるペプチドはそれぞれ、上記ＦＡＭ８３Ｂのアミノ酸位置２３〜３２の１０アミノ酸、１０７〜１１６の１０アミノ酸、１７６〜１８５の１０アミノ酸、２４５〜２５５の１１アミノ酸、２７６〜２８６の１１アミノ酸、３０５〜３１３の９アミノ酸、４７５〜４８４の１０アミノ酸、９３９〜９４７の９アミノ酸、９７１〜９７９の９アミノ酸、５５〜６５の１１アミノ酸、６３〜７１の９アミノ酸、８６〜９５の１０アミノ酸、１０３〜１１１の９アミノ酸、１１４〜１２４の１１アミノ酸、１３１〜１３９の９アミノ酸、１５１〜１６０の１０アミノ酸、１７９〜１８９の１１アミノ酸、４７６〜４８４の９アミノ酸、７９９〜８０８の１０アミノ酸、２５６〜２６６の１１アミノ酸、６２〜７１の１０アミノ酸、１４８〜１５６の９アミノ酸、２３９〜２５０の１２アミノ酸、３０５〜３１６の１２アミノ酸、５５〜６４の１０アミノ酸、２３１〜２４０の１０アミノ酸、２５７〜２６６の１０アミノ酸、１８〜２７の１０アミノ酸、４７〜５６の１０アミノ酸、１４９〜１５８の１０アミノ酸、１５３〜１６３の１１アミノ酸、２３８〜２５０の１３アミノ酸および２３９〜２４８の１０アミノ酸からなるペプチドであり、いずれのペプチドも、ＨＬＡ−Ａ０２および／またはＨＬＡ−Ａ２４と結合可能であり、かつＣＴＬ誘導能を有することが本発明者らにより見出されたものである。
【００４７】
さらに好ましい一態様において、Ｘ０が配列番号４、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６０、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３および配列番号８０に記載のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるペプチドを含む。この態様において、より好ましくは、本発明のペプチド（すなわちＹ０−Ｘ０−Ｚ０）がいずれも上記ＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドとなる。かかるより好ましい態様において、例えば本発明のペプチドは、配列番号４、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６０、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７１、配列番号７２および配列番号７３に記載のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００４８】
配列番号４、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６０、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７１、配列番号７２および配列番号７３で表されるペプチドはそれぞれ、上記ＦＡＭ８３Ｂのアミノ酸位置２３〜３２の１０アミノ酸、４７５〜４８４の１０アミノ酸、５５〜６５の１１アミノ酸、６３〜７１の９アミノ酸、８６〜９５の１０アミノ酸、１０３〜１１１の９アミノ酸、１１４〜１２４の１１アミノ酸、１３１〜１３９の９アミノ酸、１５１〜１６０の１０アミノ酸、１７９〜１８９の１１アミノ酸、４７６〜４８４の９アミノ酸、７９９〜８０８の１０アミノ酸、２５６〜２６６の１１アミノ酸、６２〜７１の１０アミノ酸、１４８〜１５６の９アミノ酸、２３９〜２５０の１２アミノ酸、３０５〜３１６の１２アミノ酸、５５〜６４の１０アミノ酸、２３１〜２４０の１０アミノ酸および２５７〜２６６の１０アミノ酸からなるペプチドであり、いずれのペプチドも、ＨＬＡ−Ａ０２と結合可能であり、かつＣＴＬ誘導能を有することが本発明者らにより見出されたものである。
【００４９】
別のさらに好ましい一態様において、Ｘ０が、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号４７、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８および配列番号８０に記載のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるペプチドを含む。この態様において、より好ましくは、本発明のペプチド（すなわちＹ０−Ｘ０−Ｚ０）がいずれも上記ＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドとなる。かかるより好ましい態様において、例えば本発明のペプチドは、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号４７、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９および配列番号８０に記載のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００５０】
配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号４７、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９および配列番号８０で表されるペプチドはそれぞれ、上記ＦＡＭ８３Ｂのアミノ酸位置２３〜３２の１０アミノ酸、１０７〜１１６の１０アミノ酸、１７６〜１８５の１０アミノ酸、２４５〜２５５の１１アミノ酸、２７６〜２８６の１１アミノ酸、３０５〜３１３の９アミノ酸、４７５〜４８４の１０アミノ酸、９３９〜９４７の９アミノ酸、９７１〜９７９の９アミノ酸、４７６〜４８４の９アミノ酸、６２〜７１の１０アミノ酸、１４８〜１５６の９アミノ酸、２３９〜２５０の１２アミノ酸、３０５〜３１６の１２アミノ酸、１８〜２７の１０アミノ酸、４７〜５６の１０アミノ酸、１４９〜１５８の１０アミノ酸、１５３〜１６３の１１アミノ酸、２３８〜２５０の１３アミノ酸および２３９〜２４８の１０アミノ酸からなるペプチドであり、いずれのペプチドも、ＨＬＡ−Ａ０２４と結合可能であり、かつＣＴＬ誘導能を有することが本発明者らにより見出されたものである。
【００５１】
また、別の好ましい一態様において、Ｘ０が、配列番号４、配列番号１５、配列番号２０、配列番号４７、配列番号６５、配列番号６６および配列番号８０に記載のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるペプチドを含む。この態様において、より好ましくは、本発明のペプチド（すなわちＹ０−Ｘ０−Ｚ０）がいずれも上記ＦＡＭ８３Ｂタンパク質の部分ペプチドとなる。かかるより好ましい態様において、例えば本発明のペプチドは、配列番号４、配列番号２０、配列番号４７、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７および配列番号６８に記載のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００５２】
配列番号４、配列番号２０、配列番号４７、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８で表されるペプチドはそれぞれ、上記ＦＡＭ８３Ｂのアミノ酸位置２３〜３２の１０アミノ酸、４７５〜４８４の１０アミノ酸、４７６〜４８４の９アミノ酸、６２〜７１の１０アミノ酸、１４８〜１５６の９アミノ酸、２３９〜２５０の１２アミノ酸、３０５〜３１６の１２アミノ酸からなるペプチドであり、いずれのペプチドも、ＨＬＡ−Ａ０２およびＨＬＡ−Ａ２４の両方と結合可能であり、かつＣＴＬ誘導能を有することが本発明者らにより見出されたものである。
【００５３】
本発明のペプチドは、そのＮ末端および／またはＣ末端が修飾されていてもよい。当該修飾として具体的には、Ｎ−アルカノイル化（例えば、アセチル化）、Ｎ−アルキル化（例えば、メチル化）、Ｃ末端アルキルエステル（例えば、エチルエステル）、およびＣ末端アミド（例えばカルボキサミド）等が挙げられる。
本発明のペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる既知の方法に準じて行うことができる。かかる既知の方法としては文献（Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966； The Proteins，Vol 2，Academic Press Inc.，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成，広川書店，1991、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）などに記載されている方法が挙げられる。
【００５４】
本発明のペプチドは、後述するＣＴＬ誘導方法や、ヒトモデル動物を用いたアッセイ（ＷＯ０２／４７４７４号公報、Int J. Cancer:100,565-570 (2002)）等に供することにより、in vivoでの活性を確認することができる。
【００５５】
本発明のペプチドには、さらに、前記本発明のペプチドを少なくとも１つ含む複数のエピトープペプチドを連結したペプチド（ポリエピトープペプチド）も含まれる。したがって、該ポリエピトープペプチドであって、ＣＴＬ誘導活性を有するペプチドも、本発明のペプチドの具体例として例示することができる。
本発明のポリエピトープペプチドは、具体的には、
（ｉ）本発明のペプチド（エピトープペプチド）および任意の本発明のペプチド以外の１または２以上のＣＴＬエピトープペプチドを直接、または適宜スペーサーを介して連結したペプチド、
（ｉｉ）本発明のペプチドおよび任意の１または２以上のヘルパーエピトープペプチドを直接、または適宜スペーサーを介して連結したペプチド、若しくは、
（ｉｉｉ）上記（ｉ）に記載のポリエピトープペプチドに、さらに１または２以上ヘルパーエピトープペプチドを、直接、または適宜スペーサーを介して連結したペプチド
であって、抗原提示細胞内にてプロセッシングを受け、生じたエピトープペプチドが抗原提示細胞に提示され、ＣＴＬ誘導活性を導くペプチドとして定義され得る。
【００５６】
ここで、（ｉ）における本発明のペプチド以外のＣＴＬエピトープペプチドとしては特に限定はないが、具体的には、例えば本発明に含まれない他のヒトＦＡＭ８３Ｂ由来のエピトープペプチドや、ヒトＯＲ７Ｃ１、ヒトＤＮＡＪＢ８由来のエピトープペプチド（例えば、国際公開パンフレット：ＷＯ２０１０／０５０１９０に記載されたペプチド）などが挙げられる。
スペーサーとしては、抗原提示細胞内におけるプロセッシングに悪影響を及ぼさないものであれば特に限定されず、好ましくはそれぞれのエピトープペプチドとペプチド結合で連結されるリンカーであり、例えばいくつかのアミノ酸が連結したペプチドリンカーや、両端にアミノ基およびカルボキシル基を有するリンカーなどが挙げられる。具体的にはグリシンリンカーやＰＥＧ（ポリエチレングリコール）リンカーなどが挙げられ、グリシンリンカーとしてはポリグリシン（例えばグリシン６個からなるペプチド；Cancer Sci, vol.103, p150-153）が挙げられ、ＰＥＧリンカーとしては、ＰＥＧの両端にアミノ基およびカルボキシ基を有する化合物由来のリンカーが挙げられる（例えば、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＯＯＨ；Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 7551-7556）。
【００５７】
本発明のポリエピトープペプチドに含まれる本発明のエピトープペプチドは、１種または２種以上が選択されてよい。すなわち、同一のエピトープペプチドが複数個連結されていてもよいし、複数の異なるエピトープペプチドが連結されたものであってもよい。当然ながら、２種以上のエピトープペプチドが選択される場合であっても、選択されたエピトープペプチドのうちの１種または２種以上が複数個連結されてもよい。本発明のペプチド以外のエピトープペプチドについても、同様に複数種および／または複数個のエピトープペプチドが連結されてよい。本発明のポリエピトープペプチドは、２〜１２個のエピトープペプチドが連結されたものであってよく、好ましくは２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個のエピトープペプチドが連結されており、最も好ましくは２個のエピトープペプチドが連結されている。
ここで、本発明のペプチドに連結させるエピトープペプチドがヘルパーエピトープペプチドの場合、用いられるヘルパーエピトープペプチドとしては、例えばＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが挙げられる。また当該ヘルパーエピトープペプチドの長さとしては、１３〜３０アミノ酸程度、好ましくは１３〜１７アミノ酸程度を挙げることができる。
【００５８】
このような複数のエピトープペプチドを連結させたペプチド（ポリエピトープペプチド）もまた、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。またこれら複数のエピトープペプチドを連結させたポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて、通常のＤＮＡ合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。
すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに挿入し、得られた組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培養し、培養物より目的の複数のエピトープを連結させたポリエピトープペプチドを回収することにより製造することができる。これらの手法は、前述のように文献（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory(1983)、DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS(1985)）に記載の方法などに準じて行うことができる。
【００５９】
以上のようにして製造された複数のエピトープペプチドを連結させたポリエピトープペプチドを、前述のin vitroアッセイや、ＷＯ０２／４７４７４号公報およびInt J. Cancer:100,565-570 (2002)（これらの文献は引用により本願の一部を構成する）に記述のヒトモデル動物を用いたin vivoアッセイに供すること等によりＣＴＬ誘導活性を確認することができる。
本発明のペプチド（ポリエピトープペプチドを含む）は、本明細書に記載のとおり、がんの予防および／または治療などに有用であり、医薬組成物の有効成分とすることができる。また、本発明のペプチドは、がんの予防および／または治療のためのものであってもよい。さらに、本発明は、がんの予防および／または治療のための医薬の製造への本発明のペプチドの使用にも関する。
【００６０】
（３）本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、前記本発明のペプチドを少なくとも１つコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡやｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、または合成ＤＮＡのいずれであってもよい。また１本鎖、２本鎖のいずれの形態であってもよい。具体的には、これに限定するものではないが例えば配列番号３〜８５に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、および配列番号３〜８５から選択される任意の２以上のペプチド、または配列番号３〜８５から選択されるペプチドおよびヘルパーエピトープを連結させたポリエピトープペプチドを、それぞれ発現可能なようにコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドなどが挙げられる。
【００６１】
本発明のポリヌクレオチドは、１本鎖および２本鎖のいずれの形態もとることができる。本発明のポリヌクレオチドが２本鎖の場合、前記本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、本発明のペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。すなわち本発明のポリヌクレオチドの範疇には、本発明の２本鎖型ポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入して作製された組換え発現ベクターも含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のとおり、がんの予防および／または治療などに有用であり、医薬組成物の有効成分とすることができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、がんの予防および／または治療のためのものであってもよい。さらに、本発明は、がんの予防および／または治療のための医薬の製造への本発明のポリヌクレオチドの使用にも関する。
【００６２】
本発明で用いる発現ベクターは、用いる宿主や目的等に応じて様々なものを用いることができ、当業者であれば適宜選択することができる。本発明で用い得る発現ベクターとしては、例えばプラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、ｐＣＥＰ４、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
【００６３】
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していてもよい。また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていてもよい。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期プロモーターなど）を有するＧＳＴ融合タンパク質ベクター（ｐＧＥＸ４Ｔなど）や、Ｍｙｃ、Ｈｉｓなどのタグ配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓなど）、さらにはチオレドキシンおよびＨｉｓタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ｐＥＴ３２ａ）などを用いることができる。
【００６４】
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。したがって、本発明には、前記発現ベクターを含む遺伝子導入用組成物が包含される。
形質転換に用いられる宿主としては、本発明のポリペプチドが有する機能を損なわない限りいかなる細胞を用いてもよく、例えば大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、E.coli  Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＡＤ４９４（ＤＥ３）株などが挙げられる。また酵母としては、Saccharomyces cerevisiaeなどが挙げられる。動物細胞としては、Ｌ９２９細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３−ＥＢＮＡ細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはｓｆ９などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いればよい。具体的にはリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
【００６５】
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、本発明のペプチドを製造することができる。得られたペプチドは、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のペプチドを、前述のチオレドキシンやＨｉｓタグ、ＧＳＴ等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもＲＮＡの形態であっても良い。これら本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列情報およびそれによりコードされるＤＮＡの配列情報に基づき、当該技術分野において知られた通常の方法を用いて容易に製造することができる。具体的には、通常のＤＮＡ合成やＰＣＲによる増幅などによって、製造することができる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、前記エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００６６】
（４）本発明のペプチドを有効成分とするＣＴＬ誘導剤／医薬組成物
本発明のペプチドはＣＴＬ誘導活性を有し、腫瘍抗原ペプチドとして、ＣＴＬ誘導剤となり得る。また上述のとおり、本発明者らによりＦＡＭ８３Ｂタンパク質が腫瘍抗原であること、ＦＡＭ８３Ｂタンパク質由来のペプチドが腫瘍細胞表面にＨＬＡクラスＩ抗原と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示されていることが初めて見出された。したがって、ＦＡＭ８３Ｂタンパク質そのものもまたＣＴＬ誘導剤となり得る。
すなわち、ＨＬＡ−Ａ０２抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原が陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、in vitroで本発明のペプチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質を添加して刺激することにより、該ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ０２抗原陽性細胞、またはＨＬＡ−Ａ２４抗原陽性細胞を特異的に認識するＣＴＬを誘導することができる（J.Immunol.,154,p2257,1995）。ここでＣＴＬの誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に反応してＣＴＬが産生する種々のサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）の量を、例えばＥＬＩＳＡ法などによって測定することにより、確認することができる。また５１Ｃｒで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するＣＴＬの傷害性を測定する方法（５１Ｃｒリリースアッセイ、Int.J.Cancer,58:p317,1994）によっても確認することができる。
また、Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987、N. Eng. J. Med, 333, 1038-1044, 1995等に記載の方法により、ＣＴＬクローンを樹立することもできる。
【００６７】
本発明のペプチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質によって誘導されたＣＴＬは、本発明のペプチドおよび／または他のＦＡＭ８３Ｂタンパク質由来のエピトープペプチドを抗原として提示する細胞に対する傷害作用やリンフォカインの産生能を有する。本発明のペプチドは上述のとおり腫瘍抗原ペプチドであり、またＦＡＭ８３Ｂタンパク質は細胞内で分解されて腫瘍抗原ペプチドを生じるため、それら機能を介して抗腫瘍作用、好ましくは抗がん作用を発揮することができる。したがって本発明のペプチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質ならびにそれにより誘導されたＣＴＬは、がんの予防および／または治療のための医薬や医薬組成物の有効成分とすることができる。
本発明のペプチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質を有効成分として含有するＣＴＬ誘導剤をがん患者に投与すると、抗原提示細胞のＨＬＡ−Ａ０２抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原に本発明のペプチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質由来のエピトープペプチドが提示され、ＨＬＡ−Ａ０２抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原と提示されたペプチドとの結合複合体特異的ＣＴＬが増殖してがん細胞を破壊することができ、その結果、がんを予防および／または治療することができる。したがって、本発明のペプチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質を有効成分とするＣＴＬの誘導剤は、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ０２抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原陽性の対象であって、ＦＡＭ８３Ｂ陽性のがんに罹患している対象に対して使用することができる。ＦＡＭ８３Ｂ陽性のがんとしては、例えば大腸癌、肺癌、乳癌、口腔癌、子宮頚部癌、甲状腺癌、精巣腫瘍、卵巣癌等のがん（腫瘍）などが挙げられ、本発明のＣＴＬ誘導剤は、これらのがんの予防および／または治療のために使用することができる。
【００６８】
ここでがんの「予防」には、患者のがんへの罹患の予防だけでなく、手術により原発巣の腫瘍を切除した患者における再発予防、手術、放射線療法もしくは薬物療法等のがん治療により完全に除去できなかった腫瘍の転移防止等が含まれる。また、がんの「治療」には、がんを縮小させるがんの治癒・症状改善のみでなく、がん細胞の増殖、腫瘍の拡大もしくは原発巣からのがん細胞の転移を抑制する進行防止等が含まれる。
【００６９】
本発明のペプチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質を有効成分とするＣＴＬ誘導剤は、例えば配列番号２に記載のＦＡＭ８３Ｂ陽性のがんに罹患している、ＨＬＡ−Ａ０２またはＨＬＡ−Ａ２４陽性のがん患者に対して特に有効である。具体的には、例えば、大腸癌、肺癌、卵巣癌等のがん（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。したがって、本発明のペプチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質を有効成分として含む医薬組成物もまた、本発明に包含される。かかる医薬組成物は、好ましくはがんの予防および／または治療用の組成物、すなわちがんの予防および／または治療剤である。また、本発明の医薬組成物は、がん細胞（好ましくはがん幹細胞）に特異的なＣＴＬを誘導、すなわちがん細胞特異的な細胞性免疫を活性化することによりがんを予防および／または治療するものであるため、好ましくはがんの予防および／または治療用ワクチンである。
【００７０】
本発明のペプチドを有効成分とする医薬組成物は、単一のＣＴＬエピトープ（本発明のペプチド）を有効成分とするものであっても、また他のペプチド（ＣＴＬエピトープやヘルパーエピトープ）と連結したポリエピトープペプチドを有効成分とするものであってもよい。近年、複数のＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結したポリエピトープペプチドが、in vivoで効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1998, 161: 3186-3194（本文献は引用により本願の一部を構成する）には、がん抗原タンパク質ＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２、−Ａ３、−Ａ１１、−Ｂ５３拘束性ＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結した約３０ｍｅｒのポリエピトープペプチドが、in vivoでそれぞれのＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬを誘導したことが記載されている。またＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたポリエピトープペプチドにより、効率的にＣＴＬが誘導されることも示されている。このようなポリエピトープペプチドの形態で投与した場合、ポリエピトープペプチドが抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、がん細胞を破壊する。このようにしてがんの治療または予防が促進される。
【００７１】
本発明のペプチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質を有効成分とする医薬組成物は、細胞性免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントと混合して投与、または併用して投与することができる。
【００７２】
アジュバントとしては、文献（例えば、Clin Infect Dis.:S266-70, 2000)に記載のものなど、当該技術分野において既知のアジュバントが適用可能であり、具体的には、例えば、ゲルタイプとして水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびリン酸カルシウムなど、菌体タイプとしてＣｐＧ、モノホスホリルリピドＡ（monophosphoryl lipid A；ＭＰＬ）、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、百日咳毒素およびムラミルジペプチド（Muramyl dipeptide；ＭＤＰ）など、油乳濁液タイプ（エマルション製剤）としてフロイント不完全アジュバント、ＭＦ５９およびＳＡＦなど、高分子ナノ粒子タイプとして免疫刺激複合体（Immunostimulatory complex；ISCOMs）、リポソーム、生分解性マイクロスフェア（Biodegradable microsphere）およびサポニン由来のＱＳ−２１など、合成タイプとして非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチドアナログ(Muramyl peptide analogue）、ポリホスファゼンおよび合成ポリヌクレオチドなど、サイトカインタイプとしてＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２などを挙げることができる。
また、本発明のペプチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質を有効成分とするＣＴＬ誘導剤／医薬組成物の剤形としては、特に限定はないが、油乳濁液（エマルション製剤）、高分子ナノ粒子、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤、マイクロスフェア製剤、マイクロカプセル製剤などが挙げられる。
【００７３】
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などの既知の任意の投与方法が挙げられる。製剤中の本発明のペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
本発明のペプチドを実際に医薬として作用させる手法としては、当該ペプチドを直接体内に導入するin vivo法の他に、ヒトからある種の細胞を採集し体外で本発明のペプチドを作用させ、その細胞を体内に戻すex vivo法があり（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）、当業者であれば、かかる手法に適切な細胞、投与方法、投与形態および投与量を選択することができる。
【００７４】
（５）本発明のポリヌクレオチドを有効成分とするＣＴＬ誘導剤／医薬組成物
本発明のポリヌクレオチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させた細胞は、本発明のペプチドおよび／または他のＦＡＭ８３Ｂタンパク質由来のエピトープペプチドを抗原として提示する細胞となるため、Ｔ細胞受容体を介してＴ細胞に認識されるという特徴を有する。したがって、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまたＣＴＬの誘導剤となり得る。誘導されたＣＴＬは、本発明のペプチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質によって誘導されたＣＴＬと同様に、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍作用、好ましくは抗がん作用を発揮することができる。したがって本発明のポリヌクレオチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、がんの治療または予防のための医薬や医薬組成物の有効成分とすることができる。本発明のポリヌクレオチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有するＣＴＬの誘導剤は、例えば、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドをがん患者に投与し発現させることで、がんを治療および／または予防し得るものである。
【００７５】
例えば発現ベクターに組み込まれた本発明のポリヌクレオチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドを以下の方法によりがん患者に投与すると、抗原提示細胞内で腫瘍抗原ペプチドが高発現する。その後、生じた腫瘍抗原ペプチドがＨＬＡ−Ａ０２抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示されることにより、がん特異的ＣＴＬが体内で効率的に増殖し、がん細胞を破壊する。以上のようにして、がんの治療または予防が達成される。したがって、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物もまた、本発明に包含される。かかる医薬組成物は、好ましくはがんの予防および／または治療用の組成物、すなわちがんの予防および／または治療剤である。また、本発明の医薬組成物は、がん細胞（好ましくはがん幹細胞）に特異的なＣＴＬを誘導、すなわちがん細胞特異的な細胞性免疫を活性化することによりがんを予防および／または治療するものであるため、好ましくはがんの予防および／または治療用ワクチンである。
【００７６】
本発明のポリヌクレオチドを有効成分とするＣＴＬ誘導剤／医薬組成物は、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ０２抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原陽性の対象であって、ＦＡＭ８３Ｂ陽性のがんに罹患した対象に対して使用することができる。ＦＡＭ８３Ｂ陽性のがんとしては、例えば大腸癌、肺癌、乳癌、口腔癌、子宮頚部癌、甲状腺癌、精巣腫瘍、卵巣癌等のがん（腫瘍）などが挙げられ、本発明のＣＴＬ誘導剤は、これらのがんの予防または治療のために使用することができる。
本発明のポリヌクレオチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与し細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）のいずれの方法も適用することができる。したがって、本発明の医薬組成物の一態様において、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが有効成分として含有される。
【００７７】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに本発明のＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００７８】
本発明のポリヌクレオチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドを実際に医薬として作用させるには、当該ポリヌクレオチドを直接体内に導入するin vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外で本発明のポリヌクレオチドを該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo法がある（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）。in vivo法がより好ましい。
本発明のポリヌクレオチドおよび／またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドをin vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路および投与形態を適宜選択して投与し得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に注射可能な形態で投与することができる。in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明のポリヌクレオチドを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、医薬上許容されるキャリアー（担体）を加えてもよい。また、本発明のポリヌクレオチドを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
【００７９】
製剤中の本発明のポリヌクレオチドの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、ポリヌクレオチドの含量として、０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇの本発明のポリヌクレオチドを、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
当業者であれば、好適な細胞、ベクター、投与方法、投与形態および投与量を適宜選択することが可能である。
【００８０】
また近年、複数のＣＴＬエピトープ（腫瘍抗原ペプチド）を連結したポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが、in vivoで効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1999, 162: 3915-3925（本文献は引用により本願の一部を構成する）には、ＨＢＶ由来ＨＬＡ−Ａ０２拘束性抗原ペプチド６種類、ＨＬＡ−Ａ１１拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープを連結したエピトープペプチドをコードするＤＮＡ（ミニジーン）が、in vivoでそれぞれのエピトープに対するＣＴＬを効果的に誘導したことが記載されている。
したがって、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを１種または２種以上連結させることにより、また場合によっては他のペプチドをコードするポリヌクレオチドも連結させることにより作製されたポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込むことにより、ＣＴＬの誘導剤の有効成分とすることができる。このようなＣＴＬの誘導剤も、前記と同様の投与方法および投与形態をとることができる。
【００８１】
（６）本発明の抗原提示細胞
前記した本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは、例えば、以下のようにin vitroで利用することができる。すなわち本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドのいずれかと抗原提示能を有する細胞とをin vitroで接触させることにより、抗原提示細胞を作製することができる。したがって本発明の一態様において、細胞表面にＨＬＡ−Ａ０２抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示させた抗原提示細胞、およびその製造方法を提供するものである。上述のとおり、本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドはがんを予防および／または治療するために利用することが可能である。したがって本態様の抗原提示細胞またはその製造方法は、好ましくはがん患者由来の単離された細胞を利用するものである。具体的には、がん患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞と、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかをin vitroで接触させることにより、当該細胞の細胞表面にＨＬＡ−Ａ０２抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示させた抗原提示細胞を製造する。
【００８２】
ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示することの可能なＭＨＣ、好ましくはＨＬＡ、より好ましくはＨＬＡ−Ａ０２抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原を細胞表面に発現する細胞であれば特に限定されないが、これらのうち、プロフェッショナル抗原提示細胞が好ましく、特に抗原提示能が高いとされる樹状細胞がより好ましい。
また、前記抗原提示能を有する細胞から本発明の抗原提示細胞を調製するために添加される物質としては、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれであってもよい。
本発明の抗原提示細胞は、例えば、がん患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明のペプチドをin vitroでパルスして、ＨＬＡ−Ａ０２抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示させることにより得られる(Cancer Immunol.Immunother.,46:82,1998、J. Immunol.,158,p1796,1997、Cancer Res.,59,p1184,1999）。樹状細胞を用いる場合は、例えば、がん患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明のペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
【００８３】
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明のポリヌクレオチドを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、当該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であっても、ＲＮＡの形態であってもよい。具体的には、ＤＮＡの場合はCancer Res.,56:p5672,1996やJ.Immunol.,161: p5607,1998（これらの文献は引用により本願の一部を構成する）などを参考にして行うことができ、またＲＮＡの場合はJ.Exp.Med., 184: p465,1996（本文献は引用により本願の一部を構成する）などを参考にして行うことができる。
【００８４】
前記抗原提示細胞はＣＴＬの誘導剤の有効成分とすることができる。当該抗原提示細胞を有効成分として含有するＣＴＬの誘導剤は、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与などが挙げられる。このような抗原提示細胞を有効成分として含有してなるＣＴＬの誘導剤を患者の体内に戻すことにより、ＦＡＭ８３Ｂ陽性のがんに罹患している患者の体内で、本発明のペプチドを抗原提示するがん細胞に特異的なＣＴＬが効率良く誘導され、結果として本発明のペプチドを抗原提示するＦＡＭ８３Ｂ陽性のがんを治療することができる。
【００８５】
（７）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは、例えば以下のようにin vitroで利用することができる。すなわち本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドのいずれかと末梢血リンパ球とをin vitroで接触させることにより、ＣＴＬを誘導することができる。したがって本発明の一態様において、本発明のペプチドを抗原提示する細胞を特異的に傷害するＣＴＬおよびその誘導方法を提供するものである。上述のとおり、本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドはがんを予防および／または治療するために利用することが可能である。したがって本態様のＣＴＬおよびその誘導方法には、好ましくは癌患者由来の末梢血リンパ球を利用するものである。具体的には、がん患者由来の末梢血リンパ球と、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかをin vitroで接触させることにより、本発明のペプチドを抗原提示する細胞を特異的に傷害するＣＴＬを誘導する。
【００８６】
例えばメラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養して、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159,1994）。またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞を、in vitroで腫瘍抗原ペプチドＴＲＰ−２により刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを増殖させ、該ＣＴＬをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J.Exp.Med.,185:453,1997）。これは、抗原提示細胞のＭＨＣと腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬをin vitroで増殖させた結果に基づくものである。したがって、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、in vitroで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的ＣＴＬを増やした後、このＣＴＬを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。
【００８７】
当該ＣＴＬは、がんの治療剤または予防剤の有効成分とすることができる。該治療剤または予防剤は、ＣＴＬを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与などが挙げられる。このようなＣＴＬを有効成分として含有してなるがんの治療または予防剤を患者の体内に戻すことにより、本発明のＦＡＭ８３Ｂ陽性のがんに罹患した患者の体内でＣＴＬによるがん細胞の傷害作用が促進され、がん細胞を破壊することにより、がんを治療することができる。
【００８８】
本発明のＣＴＬは、腫瘍細胞に抗原提示されている本発明のペプチドとＨＬＡとの複合体を標的として細胞傷害活性を発揮することができる。すなわち本発明のＣＴＬのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、本発明のペプチドとＨＬＡとの複合体を認識するものである。近年、ＣＴＬに発現する特定のペプチド−ＨＬＡ複合体を認識するＴＣＲの遺伝子をクローニングし、当該ＴＣＲ遺伝子をがん患者より採取したＣＤ８＋Ｔ細胞に遺伝子導入して人工的にＣＴＬを作製し、大量に培養した後、患者体内に戻す養子免疫療法が考案されている（例えばOchi et al., Blood. 2011 Aug 11;118(6):1495-503など）。本発明において、「人工ＣＴＬ」という場合、前述のようにペプチドとＨＬＡとの複合体を認識するＴＣＲをコードする遺伝子を、Ｔ細胞に遺伝子導入して作製されたＣＴＬを意味し、これもまた上述の天然のＣＴＬと同様にがんの治療に用いることができるものである。したがってかかる人工ＣＴＬもまた、本発明のＣＴＬに包含される。かかる態様において、人工ＣＴＬに遺伝子導入される、本発明のペプチドとＨＬＡとの複合体を認識するＴＣＲは、該複合体に対する結合親和性や細胞傷害活性を上げるために、適宜改変されてもよい。したがって、「人工ＣＴＬ」には、本発明のペプチドとＨＬＡとの複合体を認識するＴＣＲをコードする遺伝子を、適宜遺伝子改変したのち患者由来のＴ細胞に遺伝子導入したＣＴＬも包含される。人工ＣＴＬの作製には、当該技術分野において知られた方法を用いることができる。
【００８９】
（８）本発明のペプチドを用いた腫瘍特異的ＣＴＬ検出剤
本発明のペプチド、特に配列番号３〜８５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、腫瘍特異的ＣＴＬに認識されるため、腫瘍特異的ＣＴＬ検出剤の成分として有用である。したがって、本発明はまた、本発明のペプチドを含む、腫瘍特異的ＣＴＬ検出剤に関する。一態様において、本発明の腫瘍特異的ＣＴＬ検出剤は、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ０２またはＨＬＡ−Ａ２４とを含有するＨＬＡマルチマー（モノマー、ダイマー、テトラマー、ペンタマーおよびデキストラマー）を含む。
【００９０】
例えば、ＨＬＡテトラマーとは、ＨＬＡのα鎖とβ２ミクログロブリンをペプチド（エピトープペプチド）と会合させた複合体（ＨＬＡモノマー）をビオチン化し、アビジンに結合させることにより４量体化したものを指す（Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996))。 現在では種々の抗原ペプチドを含有するＨＬＡテトラマーが市販されており（例えば（株）医学生物学研究所より）、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ０２またはＨＬＡ−Ａ２４とを含有するＨＬＡテトラマーを容易に作製することができる。また、ＨＬＡダイマーおよびＨＬＡペンタマーも同様な原理に基づいており、これらにおいては、それぞれ、前記ＨＬＡモノマーが２量体化および５量体化されている。したがって、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ０２またはＨＬＡ−Ａ２４とを含有するＨＬＡマルチマーもまた、本発明の一態様である。
【００９１】
具体的には、例えば配列番号３〜８５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ０２またはＨＬＡ−Ａ２４とを含有するＨＬＡテトラマーが挙げられる。当該ＨＬＡテトラマーは、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡等の既知の検出手段により結合したＣＴＬを容易に選別または検出することができるように蛍光標識されていることが好ましい。具体的には、例えばフィコエリスリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ペリジニンクロロフィルプロテイン（ＰｅｒＣＰ）などにより標識されたＨＬＡテトラマーが挙げられる。
【００９２】
ＨＬＡテトラマーの製法例としては、例えば、Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996)などの文献に記載のものが挙げられ、簡単に述べると以下のようになる。
まずタンパク質を発現可能な大腸菌や哺乳動物細胞に、ＨＬＡ−Ａ２４あるいはＨＬＡ−Ａ０２のα鎖発現ベクターおよびβ２ミクログロブリン発現ベクターを導入し発現させる。ここでは大腸菌（例えばＢＬ２１）を用いることが好ましい。得られた単量体ＨＬＡ−Ａ２４あるいはＨＬＡ−Ａ０２複合体と本発明のペプチドとを混合し、可溶性のＨＬＡ−ペプチド複合体を形成させる。次にＨＬＡ−ペプチド複合体におけるＨＬＡ−Ａ０２あるいはＨＬＡ−Ａ２４のα鎖のＣ末端部位の配列をＢｉｒＡ酵素によりビオチン化する。このビオチン化されたＨＬＡ−ペプチド複合体と蛍光標識されたアビジンとを４：１のモル比で混合することにより、ＨＬＡテトラマーを調製することができる。なお、前記各ステップにおいて、ゲルろ過等によるタンパク精製を行うことが好ましい。
【００９３】
（９）がん幹細胞検出剤
上述のとおり、本発明者らはＦＡＭ８３Ｂががん幹細胞において特異的に高発現していることを初めて見出した。すなわち本発明者らにより、ＦＡＭ８３Ｂは、がん幹細胞を含まないがん細胞や、通常の体細胞においては発現が見られないが、がん幹細胞においては高発現している遺伝子であることが初めて明らかとなった。かかる知見からＦＡＭ８３Ｂは、がん細胞、特にがん幹細胞を識別するためのマーカーとして利用可能であることが見出された。したがって本発明は一側面において、ＦＡＭ８３Ｂの発現産物を検出するためのＦＡＭ８３Ｂ検出剤を含む、がん幹細胞検出剤に関する。
【００９４】
本発明において、単にＦＡＭ８３Ｂという場合、別段の記載のない限りＦＡＭ８３Ｂ遺伝子を意味する。好ましくはヒトＦＡＭ８３Ｂ遺伝子であるが、そのホモログであってもよい。
本発明において「遺伝子の発現」とは、該遺伝子の転写を起点とする一連の生体反応をいい、「発現産物」とは、例えばｍＲＮＡや内在性ポリペプチドなど、この一連の生体反応によって生成される分子をいう。遺伝子の発現産物である内在性ポリペプチドは、好ましくは当該遺伝子の発現により最終的に産生されるタンパク質である。
本発明において「ＦＡＭ８３Ｂ検出剤」とは、ＦＡＭ８３Ｂ遺伝子またはその発現産物を、定性的および／または定量的に検出するための剤を意味する。
【００９５】
本発明のがん幹細胞検出剤は、ＦＡＭ８３Ｂの発現産物を検出するためのＦＡＭ８３Ｂ検出剤を含む。検出対象においてＦＡＭ８３Ｂの発現産物が検出された場合、検出対象ががん幹細胞を有する、すなわちがん幹細胞が検出されたと決定できる。本発明のがん幹細胞検出剤は、in vivoでもin vitroでも用いることが可能であるが、好ましくは生物個体（検査対象）から採取された生体試料由来の細胞集団（検出対象）に対してin vitroで用いる。この場合、検出対象である生体試料由来の細胞集団においてがん幹細胞が検出されたことは、すなわち検査対象である生体試料が採取された生物個体においてもがん幹細胞が検出された、すなわち該生物個体ががん幹細胞を有することを意味する。したがって、後述するように、本発明のがん幹細胞検出剤を使用して、検査対象においてがん幹細胞を検出する方法も本発明に包含される。
検査対象である生物個体は、腫瘍を有し得る生物個体であればいかなる生物個体であってもよいが、好ましくはヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの齧歯類、チンパンジーなどの霊長類、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの偶蹄目、ウマなどの奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコなど）の個体であり、より好ましくはヒトの個体である。
検出対象の細胞集団は、上記検査対象から得られた任意の生体試料由来の細胞集団に対して用いることが可能であるが、好ましくはヒトから得られた生体試料に由来する細胞集団であり、より好ましくは組織の細胞においてＦＡＭ８３Ｂがほとんど発現していないことが確認されている、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸および血液からなる群から選択される１または２以上の生体試料に由来する細胞を含む細胞集団である。
【００９６】
本発明のがん幹細胞検出剤に含まれるＦＡＭ８３Ｂ検出剤は、検出する発現産物に依拠して変化し得、当業者であれば適宜最適なものを選択し得る。具体的には、例えば発現産物がｍＲＮＡである場合、当該技術分野において公知である任意のｍＲＮＡ検出法を用いることができ、これに限定するものではないが、例えばＲＴ−ＰＣＲ法、in situハイブリダイゼーション法、ノーザンブロッティング法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲなどが挙げられ、中でも検出感度の高さ、実験手技の簡便さなどから、ＲＴ−ＰＣＲ法が好ましい。例えば発現産物が内在性ポリペプチド（好ましくはＦＡＭ８３Ｂタンパク質）である場合は、これに限定するものではないが、例えばウェスタンブロッティング法、免役組織染色法などが挙げられる。用いるＦＡＭ８３Ｂ検出剤は、検出する発現産物や採用する検出法に依存して変化し得、当業者は適宜最適なものを選択し得る。具体的には、例えば内在性ポリペプチドを検出する場合はＦＡＭ８３Ｂ特異抗体（好ましくはモノクローナル抗体）など、ｍＲＮＡを検出する場合は配列番号１に相補的な塩基配列を有するプローブおよび／またはプライマーなどが挙げられるが、これに限定するものではない。また検出する発現産物は、単一の発現産物であっても複数の発現産物を組み合わせて用いてもよい。
【００９７】
（１０）本発明のペプチドとＭＨＣとの複合体を認識するＴ細胞受容体様抗体
上述のとおり本発明のペプチドは、がん細胞、特にがん幹細胞によりＣＴＬエピトープペプチドとして提示される。この際、ＭＨＣと複合体を形成して細胞表面に提示されるため、当該複合体を認識する抗体を用いることで、本発明のペプチドを腫瘍マーカーとして利用できる。このような抗体としては、例えば、本発明のペプチドとＨＬＡとの複合体、好ましくはＨＬＡ−Ａ２４もしくはＨＬＡ−Ａ０２との複合体を認識するＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）様抗体が挙げられる。したがって、本発明はまた、本発明のペプチドとＭＨＣとの複合体を認識するＴ細胞受容体様抗体にも関する。
本発明において「ＴＣＲ様抗体」は、断片化された抗原由来のペプチドと主要組織適合性抗原複合体（ＭＨＣ）分子との複合体（ｐＭＨＣ）に対してＴＣＲ様の結合力（抗原認識能）を有する分子である。例えば、Eur J Immunol. 2004;34:2919-29等で報告されているように、腫瘍抗原由来のペプチドとＭＨＣとの複合体を認識するＴＣＲ様抗体は、ＣＴＬが標的とし得る腫瘍抗原ペプチドを提示しているがん細胞、がん細胞を貪食してＭＨＣクラスＩ上に腫瘍抗原ペプチドを提示している樹状細胞などを認識することができる。
【００９８】
また、ウイルス等由来のペプチドとＭＨＣとの複合体を認識する前記ＴＣＲ様抗体は、提示した抗原が感染細胞上でどの様な提示動態およびＣＴＬ応答等を示すのかを、定量的・経時的に解析できる。
前記ＴＣＲ様抗体は、Eur J Immunol. 2004;34:2919-29等で記載されている方法で作製することができる。例えば、ＭＨＣとペプチド複合体をマウス等の動物に免疫することにより複合体特異的な抗体を取得できる。また、ファージディスプレイ法を利用して複合体特異的抗体を取得することも可能である。
【００９９】
上述のとおり、本発明のペプチドを提示するＭＨＣ複合体を認識することにより、該ＭＨＣ複合体を細胞表面に提示する腫瘍細胞を検出することが可能である。したがって本発明は、上記ＴＣＲ様抗体を含む腫瘍検出剤にも関する。また本発明のペプチドは、腫瘍細胞の他、抗原提示細胞、特に樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞にも同様に提示されるため、上記ＴＣＲ様抗体は、本発明のペプチドを提示する抗原提示細胞等の検出にも有用である。
また上述のとおり本発明のペプチドは、がん細胞、特にがん幹細胞によりＣＴＬエピトープペプチドとして提示されるため、本発明のペプチドとＨＬＡとの複合体、好ましくはＨＬＡ−Ａ２４もしくはＨＬＡ−Ａ０２との複合体を認識するＴＣＲ様抗体は、対象におけるがんの予防および／または治療剤としても有用である。したがって、本発明はまた、本発明のＴＣＲ様抗体を含む、がんの予防および／または治療剤にも関する。
【０１００】
さらに、近年、腫瘍抗原に特異的なモノクローナル抗体の一部に遺伝子操作を加えて改変したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を患者由来のＴ細胞に遺伝子導入し、この遺伝子改変Ｔ細胞を体外で増幅培養した後に患者に輸注するという新たな免疫細胞治療法が考案されている（Nat Rev Immunol. 2012;12:269-81）。具体的には、患者から採取された末梢血単核球を抗ＣＤ３抗体とＩＬ−２等の存在下で培養することによりＴ細胞を活性化したのち、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなどの形質転換用ベクターを用いてＣＡＲをコードする遺伝子をＴ細胞に導入することにより、遺伝子改変Ｔ細胞を作製する。
本発明において、「キメラ抗原受容体」は、がん細胞の細胞表面に存在する分子を認識する抗体の抗体可変領域の軽鎖と重鎖を直列に結合させた単鎖抗体（ｓｃＦｖ）をＮ末端側に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体を構成する分子のうちＣＤ３ζ鎖をＣ末端側に持つように設計されたキメラタンパク分子である。このキメラ抗原受容体は、ｓｃＦｖ領域で特定の抗原を認識すると、ＣＤ３ζ鎖を介してＴ細胞の活性化が生じる。Ｔ細胞の活性化を増強するために、ｓｃＦｖとζ鎖の間に１または２以上の共刺激分子（例えばＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳなど）を組み込んでもよい。本発明においては、ｓｃＦｖとして、本態様のＴＣＲ様抗体（ＴＣＲ様抗体から設計され得る抗体分子またはその断片を含む）を用いてＣＡＲを作製することができる。腫瘍抗原由来のペプチドとＭＨＣとの複合体を認識するＣＡＲは、ＣＴＬが標的とし得る腫瘍抗原ペプチドを提示しているがん細胞、がん細胞を貪食してＭＨＣクラスＩ上に腫瘍抗原ペプチドを提示している樹状細胞などを認識することができるため、前記ＣＡＲを導入した遺伝子改変Ｔ細胞は、人工ＣＴＬと同様に、前記腫瘍抗原に特異的ながんの予防および／または治療剤として有用である。したがって、本発明はまた、本発明の腫瘍抗原由来のペプチドとＭＨＣとの複合体を認識するＣＡＲを導入した遺伝子改変Ｔ細胞または人工ＣＴＬを含む、がんの予防および／または治療剤にも関する。
【０１０１】
（１１）腫瘍の検出方法（検査方法、診断方法）
本発明は、前述した本発明のＣＴＬ検出剤、あるいはがん幹細胞検出剤または腫瘍検出剤を利用した腫瘍の検出方法（検査方法、診断方法）を提供するものである。
本発明のＣＴＬ検出剤を用いる本発明の検出方法（診断方法）は、典型的には、被験者の血液を採取するか、若しくは腫瘍が疑われる被験組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこに含まれるＦＡＭ８３Ｂ由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＣＴＬの量を、本発明のＣＴＬ検出剤によって検出・測定することにより、大腸癌、肺癌、乳癌、口腔癌、子宮頚部癌、甲状腺癌、精巣腫瘍、卵巣癌等のＦＡＭ８３Ｂ陽性のがん（腫瘍）の罹患の有無またはその程度を検出、検査または診断するものである。
【０１０２】
本発明のがん幹細胞検出剤を用いる本発明の検出方法（検査方法、診断方法）は、典型的には、被験者の血液を採取するか、若しくは腫瘍が疑われる被験組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこに含まれるＦＡＭ８３Ｂ発現産物の量を、本発明のがん幹細胞検出剤によって検出・測定することにより、大腸癌、肺癌、乳癌、口腔癌、子宮頚部癌、甲状腺癌、精巣腫瘍、卵巣癌等のＦＡＭ８３Ｂ陽性のがん（腫瘍）の罹患の有無またはその程度を検出、検査または診断するものである。
本発明の腫瘍検出剤を用いる本発明の検出方法（検査方法、診断方法）は、典型的には、被験者の血液を採取するか、若しくは腫瘍が疑われる被験組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこに含まれるＦＡＭ８３Ｂ由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を提示する細胞の量を、本発明の腫瘍検出剤によって検出・測定することにより、大腸癌、肺癌、乳癌、口腔癌、子宮頚部癌、甲状腺癌、精巣腫瘍、卵巣癌等のＦＡＭ８３Ｂ陽性のがん（腫瘍）の罹患の有無またはその程度を検出、検査または診断するものである。
【０１０３】
本発明の検出（検査、診断）方法は、例えば腫瘍を有する患者において、該腫瘍の改善のために治療薬を投与した場合における、該腫瘍の改善の有無またはその程度を検出（検査、診断）することもできる。さらに本発明の検出（検査、診断）方法は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを有効成分とする医薬を有効に適用できる治療対象患者の選択や、当該医薬による治療効果の予測や判定などにも利用できる。また、本発明の腫瘍検出剤を用いる態様においては、本発明のペプチドを有効成分とするがんワクチンを投与することにより患者生体内で誘導されるＣＴＬが実際に標的とし得る、腫瘍抗原ペプチドを提示しているがん細胞を検出することが可能である。
【０１０４】
本発明のＣＴＬ検出剤を用いる本発明の検出（検査）方法の特定の態様は、次の（ａ）および（ｂ）、および任意に（ｃ）の工程を含むものである：
（ａ）被験者から得られた生体試料と本発明のＣＴＬ検出剤とを接触させる工程、
（ｂ）該生体試料中のＦＡＭ８３Ｂ由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＣＴＬの量を、上記ＣＴＬ検出剤が結合した細胞の量を指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の結果をもとに、がんの罹患を判断する工程。
本発明のＣＴＬ検出剤を用いる本発明の診断方法の特定の態様は、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の工程を含む。
【０１０５】
本発明のがん幹細胞検出剤を用いる本発明の検出（検査）方法の特定の態様は、次の（ｄ）および（ｅ）、および任意に（ｆ）の工程を含むものである：
（ｄ）被験者から得られた生体試料と本発明のがん幹細胞検出剤とを接触させる工程、
（ｅ）該生体試料中のＦＡＭ８３Ｂ発現産物の量を測定する工程、
（ｆ）（ｅ）の結果をもとに、がんの罹患を判断する工程。
本発明のがん幹細胞検出剤を用いる本発明の診断方法の特定の態様は、上記（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の工程を含む。
本発明のがん幹細胞検出剤を用いるがん幹細胞を検出する方法の態様は、上記（ｄ）、（ｅ）の工程および（ｆ）に代えて下記（ｆ’）の工程を含む：
（ｆ’）（ｅ）の結果をもとに、生体試料中のがん幹細胞の存在または不存在を決定する工程。
ここで用いられる生体試料としては、被験者の生体組織（がん細胞の存在が疑われる組織およびその周辺組織、または血液など）から調製される試料を挙げることができる。具体的には、該組織から採取された組織細胞を含む試料などを挙げることができる。
【０１０６】
本発明の腫瘍検出剤を用いる本発明の検出（検査）方法の特定の態様は、次の（ｇ）および（ｈ）、および任意に（ｉ）の工程を含むものである：
（ｇ）被験者から得られた生体試料と本発明の腫瘍検出剤とを接触させる工程、
（ｈ）該生体試料中のＦＡＭ８３Ｂ由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を提示する細胞の量を、上記腫瘍検出剤が結合した細胞の量を指標として測定する工程、
（ｉ）（ｈ）の結果をもとに、がんの罹患を判断する工程。
本発明の腫瘍検出剤を用いる本発明の診断方法の特定の態様は、上記（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）の工程を含む。
ここで用いられる生体試料としては、被験者の生体組織（がん細胞の存在が疑われる組織およびその周辺組織、または血液など）から調製される試料を挙げることができる。具体的には、該組織から採取された組織細胞を含む試料などを挙げることができる。
【０１０７】
本発明のＣＴＬ検出剤を用いる本発明の検出方法（検査方法、診断方法）の一態様は、生体試料中の本発明のペプチド特異的ＣＴＬを検出し、その量を測定することによって実施される。具体的には、文献（Science,274:p94,1996、本文献は引用により本願の一部を構成する）に記載の方法に従って蛍光標識したＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体の４量体（ＨＬＡテトラマー）を作製し、これを用いてがんが疑われる患者の末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的ＣＴＬをフローサイトメーターにより定量することにより行うことができる。
【０１０８】
腫瘍の有無の予測、判定、判断または診断は、例えば、被験者の血液や腫瘍が疑われる被験組織における本発明のペプチド特異的ＣＴＬの量、または、本発明のペプチドを提示する細胞の量を測定することにより行うことができる。その際、場合によっては正常な対応組織におけるＦＡＭ８３Ｂ遺伝子発現レベル、本発明のペプチドレベルまたはＣＴＬレベル等を基準値として、該基準値と被験者から得られた試料における前記レベルとを比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。
ここで被験者の被験組織と正常な対応組織との前記レベルの比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行わない場合は、複数（少なくとも２つ、好ましくは３以上、より好ましくは５以上）の正常な組織を用いて均一な測定条件で測定して得られた本発明のペプチド特異的ＣＴＬの量または本発明のペプチドを提示する細胞の量の平均値または統計的中間値を、正常者の値すなわち基準値として、比較に用いることができる。
【０１０９】
被験者が、がんに罹患しているかどうかの判断は、例えば該被験者の組織における本発明のペプチド特異的ＣＴＬの量、または、本発明のペプチドを提示する細胞が、正常者のそれらのレベルと比較して例えば２倍以上、好ましくは３倍以上多いことを指標として行うことができる。
また、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを投与されている被験者において、本発明のペプチド特異的ＣＴＬの量を測定することにより、実際にＣＴＬが誘導されているか否かを判定することも可能である。例えば、該被験者の組織における本発明のペプチド特異的ＣＴＬの量が、正常者のそれらのレベルと比較して例えば２倍以上、好ましくは３倍以上多いことを指標として、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドによる治療が有効であると判定することができる。本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドは、主にワクチンとして作用し、ＣＴＬを誘導することにより抗腫瘍作用を発揮すると考えられることから、ＣＴＬの誘導は、投与した本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドがワクチンとして作用しているか否かを確認するためのいわゆるＰＯＭ（Proof of Mechanism）マーカーとして用いることができる。したがって本発明のＣＴＬ検出剤は、ＰＯＭマーカーとしてのＣＴＬを検出することにより、投与対象において投与したペプチドまたはポリヌクレオチドがワクチンとして作用しているか否かを確認するための診断薬として用いることができる。
【０１１０】
（１２）がんの予防および／または治療方法
本発明はまた、対象におけるがんを予防および／または治療する方法であって、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＣＴＬ、抗原提示細胞、ＴＣＲ様抗体、人工ＣＴＬ、遺伝子改変Ｔ細胞からなる群から選択される有効成分の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法にも関する。
本発明における「対象」は、がんに罹患し得る生物個体であればいかなる生物個体であってもよいが、好ましくはヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの齧歯類、チンパンジーなどの霊長類、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの偶蹄目、ウマなどの奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコなど）の個体であり、より好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、がんの予防および／または治療が企図される場合には、典型的にはがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。本発明の一態様において、対象はＨＬＡ−Ａ０２陽性またはＨＬＡ−Ａ２４陽性である。本発明の一態様において、対象はＦＡＭ８３Ｂ陽性のがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する。本発明の一態様において、対象はＨＬＡ−Ａ０２陽性またはＨＬＡ−Ａ２４陽性であり、かつ、ＦＡＭ８３Ｂ陽性のがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する。
【０１１１】
本発明の予防／治療方法に用いる本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＣＴＬ、抗原提示細胞、ＴＣＲ様抗体、人工ＣＴＬ、および遺伝子改変Ｔ細胞としては、本明細書に記載の任意のものが挙げられる。本発明における有効量とは、例えば、がんの症状を低減し、またはその進行を遅延もしくは停止する量であり、好ましくは、がんを抑制し、または治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラットなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。有効成分の具体的な用量は、それを必要とする対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
【０１１２】
具体的な用量としては、例えば、本発明のペプチドの場合、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。また、本発明のポリヌクレオチドの場合、通常、０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。また、本発明のＴＣＲ様抗体の場合、通常、０．０００１ｍｇ〜２０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜２０００ｍｇであり、これを１週間〜４週間に１回投与するのが好ましい。本発明の遺伝子改変Ｔ細胞または人工ＣＴＬの場合、通常、１×１０４〜１×１０８、好ましくは１×１０５〜１×１０７であり、これを１日〜４週間に１回投与するのが好ましい。また、投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などの既知の任意の適切な投与方法を用いることができる。また、本発明のペプチドやヌクレオチドを直接体内に投与するin vivo法の他、ヒトからある種の細胞を採集し、体外で本発明のペプチドやポリヌクレオチドを用いてＣＴＬや抗原提示細胞を誘導した後、これらの細胞を体内に戻すex vivo法を用いることもできる。
【０１１３】
本発明の予防／治療方法の一態様は、投与する工程の前に、ＨＬＡ−Ａ０２陽性またはＨＬＡ−Ａ２４陽性の対象を予防／治療の対象として選択する工程をさらに含む。本発明のこの態様は、上記選択する工程の前に、対象のＨＬＡ型を決定する工程をさらに含んでもよい。対象のＨＬＡ型の決定は、既知の任意の手法により行うことができる。また、本発明の予防／治療方法の一態様は、投与する工程の前に、ＦＡＭ８３Ｂ陽性のがんを有する対象を予防／治療の対象として選択する工程をさらに含む。本発明のこの態様は、上記選択する工程の前に、対象におけるＦＡＭ８３Ｂ陽性のがんを検出する工程をさらに含んでもよい。対象におけるＦＡＭ８３Ｂ陽性のがんの検出は、上記（１０）に記載の腫瘍の検出方法を用いることができる。
【０１１４】
本発明の予防／治療方法の一態様は、投与する工程の前に、ＨＬＡ−Ａ０２陽性またはＨＬＡ−Ａ２４陽性であり、かつ、ＦＡＭ８３Ｂ陽性のがんを有する対象を予防／治療の対象として選択する工程をさらに含む。本発明のこの態様は、上記選択する工程の前に、対象のＨＬＡ型を決定する工程および対象におけるＦＡＭ８３Ｂ陽性のがんを検出する工程をさらに含んでもよい。ＨＬＡ−Ａ０２陽性またはＨＬＡ−Ａ２４陽性であり、かつ、ＦＡＭ８３Ｂ陽性のがんを有する対象は、本発明のペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物を有効に適用できる対象である。したがって上記（１１）に記載の腫瘍の検出方法に用いることができる腫瘍特異的ＣＴＬ検出剤または腫瘍検出剤は、本発明の医薬組成物を用いたがんの処置方法が有効な治療対象を選択する、いわゆるコンパニオン診断用の診断薬として使用可能である。
【０１１５】
また、本発明の予防／治療方法の一態様は、本発明の医薬組成物を投与した患者において、本発明の医薬組成物による治療が有効であるか否かを判定し、本発明の医薬組成物による治療が有効な治療対象を選択する工程をさらに含んでもよい。上記（１１）に記載されるとおり、本発明の医薬組成物を投与した場合に本発明のペプチド特異的ＣＴＬが誘導される対象は、本発明のペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物による治療が有効である対象、すなわち本願医薬組成物を有効に適用できる対象であり、本発明のペプチド特異的ＣＴＬの誘導は、本発明の医薬組成物の治療効果を予測または判定するためのサロゲートマーカーとして用いることができる。したがって、上記（１１）に記載の腫瘍の検出方法に用いることができる腫瘍特異的ＣＴＬ検出剤は、本発明の医薬組成物を投与した患者における有効な治療対象を選択するための診断薬、または、上記サロゲートマーカーとしてのＣＴＬを検出することにより、本発明の医薬組成物を投与した患者における当該医薬組成物の治療効果を予測または判定するための診断薬として使用可能である。
【０１１６】
（１３）がん幹細胞を標的とするがん治療薬のスクリーニング方法
本発明のがん幹細胞検出剤を用いる態様において、検出対象におけるＦＡＭ８３Ｂ発現産物の発現量は、検出対象中のがん幹細胞の量と相関していると考えられる。したがって、検出対象に対してがん治療薬の候補化合物を投与する前後におけるＦＡＭ８３Ｂ発現産物の発現量を比較することで、投与した候補化合物ががん幹細胞を標的とするがん治療薬として有用であるか否かを判定することができる。
【０１１７】
本発明のスクリーニング方法は、以下の工程（Ｉ）、（ＩＩ）および任意に（ＩＩＩ）を含むものである：
（Ｉ）がん治療薬の候補化合物を、対象に投与する前に、該対象におけるＦＡＭ８３Ｂ遺伝子の発現産物の検出量Ａを測定する工程、
（ＩＩ）前記候補化合物を前記対象細胞集団に投与した後に、該対象におけるＦＡＭ８３Ｂ遺伝子の発現産物の検出量Ｂを測定する工程、および
（ＩＩＩ）前記検出量ＡとＢとを比較し、該検出量ＡがＢより有意に大きい場合に、前記候補化合物を、がん幹細胞を標的とすることを特徴とするがん治療薬候補であると判定する工程。
本発明のスクリーニング方法の特定の態様は、上記工程（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を含む。ここで工程（Ｉ）および（ＩＩ）の検出量を測定する工程は、それぞれ上記検出（検査、診断）方法における工程（ｄ）および（ｅ）を含む。
【０１１８】
本明細書中で言及する全ての特許、出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【０１１９】
実験例１：ヒト大腸がん細胞のＳＰ画分の検出とサブクローニング
ａ）試薬の調製
培地として５％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ（HyClone Laboratories社））補充ＤＭＥＭ（Sigma-Alldrich社）培地を調製し、３７℃に温めておいた。ベラパミル（Sigma-Aldrich社）は５０ｍＭに調整し、５％ＦＣＳ補充ＤＭＥＭ培地で、５ｍＭに希釈した。ヘキスト３３３４２（Lonza社）は５％ＦＣＳ補充ＤＭＥＭ培地で２５０μｇ／ｍＬに調整した。ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｑｉａｇｅｎ社）はＤＤＷで１ｍｇ／ｍＬに調整し、０．２μｍのフィルターでろ過滅菌した。
【０１２０】
ｂ）フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）用の細胞の調整
ヒト大腸がん細胞株（ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ））を４ｍＬの５％ＦＣＳ補充ＤＭＥＭ培地で懸濁し、細胞数を数えた。さらに５％ＦＣＳ補充ＤＭＥＭ培地を加えて細胞濃度を１０×１０６個／ｍＬに調整し、検体を得た。検体の一部を用いて分注し、主検体にはベラパミルを添加せず（ベラパミル（−）サンプル）、副検体にはベラパミルを最終濃度７５μＭになるように添加した（ベラパミル（＋）検体）。その後、ベラパミル（＋）検体およびベラパミル（−）検体にヘキスト３３３４２の最終濃度が５．０μＭとなるようにヘキスト３３３４２溶液を添加した。
両検体を３７℃で９０分間振盪培養後、氷上にて冷却した。１５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上清を取り除いた。５％ＦＣＳ補充１×ＰＢＳで懸濁して、氷冷しておいたＦＡＣＳチューブに移した。再び１５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上清を取り除き、５％ＦＣＳ補充１×ＰＢＳで懸濁した。同様の洗浄を１回繰り返した後、２ｍＭのＥＤＴＡ入り２％ＦＣＳ補充１×ＰＢＳ２ｍＬで懸濁した。ＤＮａｓｅ  Ｉ液を２μＬ加え、混和後、ＦＡＣＳ用フィルター（ベクトン・ディッキンソン（BD）社）にて細胞集塊を除去した。１ｍｇ／ｍＬのプロピジウム・アイオダイド（ＰＩ）（Sigma-Aldrich社）を２μＬ添加後、フローサイトメーターとしてBD FACS Aria II special edition（登録商標）（BD社）を用い、流動速度１０００〜２０００個／秒で解析した。
【０１２１】
ｃ）フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）
ＦＡＣＳの操作は取扱説明書に従って行った。
先ず、ベラパミル（−）検体の細胞を解析し、主体となる細胞群（main population（ＭＰ））と比較して、発光強度の低い細胞群（side population（ＳＰ））細胞を検出した（図１）。ＳＰ細胞がＡＢＣトランスポーター特異的にヘキスト３３３４２色素低染色性であることを確認するため、ベラパミル（＋）検体を同じ条件で解析し、ＳＰ細胞が消失することを確認した（図１）。
ＳＰ細胞を単離し、細胞を４℃、１５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を取り除いた後、１００〜２００μＬの１×ＰＢＳで懸濁した。
【０１２２】
ｄ）単一細胞レベルでのサブクローニング
ＳＷ４８０由来ＳＰ細胞を前記ｃ）にて検出し、そのＳＰおよびＭＰ細胞画分をそれぞれ９６ウェルプレートに１細胞／１ウェルになるようにシングルセルソーティングを行った（図２−１）。各ウェルには１％ペニシリン・ストレプトマイシン添加１０％ＦＣＳ補充ＤＭＥＭ培地を予め入れておいた。
２〜３週間培養後、各ウェルにおいて増殖した細胞株をそれぞれ、ＳＷ４８０−ＳＰクローン細胞株、ＳＷ４８０−ＭＰクローン細胞株とした。「ＳＷ４８０−ＳＰ−Ｘ」または「ＳＷ４８０−ＭＰ−Ｙ」のＸおよびＹはそれぞれクローン番号とする。
共焦点顕微鏡でその形態を観察したところ、ＭＰクローン細胞株は主に単層で増殖し、各細胞は紡錘形を示した。一方で、ＳＰクローン細胞株は重層化傾向を示し、各細胞は円形〜類円形を示した。得られた代表的なＳＰクローンおよびＭＰクローンの顕微鏡画像を図２−２に示す。
【０１２３】
実験例２：腫瘍形成能実験
実験例１で得られたＳＷ４８０−ＳＰおよびＳＷ４８０−ＭＰクローン細胞株それぞれのin vivoにおける造腫瘍能を確認するために、ＳＰクローンおよびＭＰクローンそれぞれの代表的な３クローンを用いて、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウス（オリエンタル工房社）に移植した。
具体的には、同数のＳＰおよびＭＰクローン細胞をそれぞれ氷上で１００μＬの１×ＰＢＳに懸濁し、１００μＬのマトリゲル（BD社）と混和した。１００μＬの細胞マトリゲル混合液をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（オリエンタル工房社）の背部皮下にＳＰおよびＭＰクローン細胞をそれぞれ、１００個、１０００個、１００００個、各グループ５匹にて接種し、腫瘍形成を観察した。腫瘍長径・短径の長さを測り、腫瘍体積を（体積＝長径×短形２／２）の計算式にて算出した。１００００個移植したマウスの腫瘍増大曲線を図３に示す。
【０１２４】
その結果、１００００個細胞移植群において、細胞接種後８週間にてＳＷ４８０−ＭＰクローン移植群では腫瘍形成が全くみられなかった。一方、ＳＷ４８０−ＳＰクローン移植群では全てのマウスで腫瘍形成が観察され、作った腫瘍の体積はＳＷ４８０−ＭＰクローン群と比較して有意に高かった（図３）。これはがん幹細胞が腫瘍形成の大きな要因であり、ＳＰクローン細胞にがん幹細胞が濃縮されるという見解（Kondo T, Setoguchi T, Taga T. Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 20:781-786, 2004）と一致する。
【０１２５】
実験例３：ヒト大腸癌ＳＰ細胞のＨＬＡ−Ａ２４結合ナチュラルペプチドの同定
以下の手順にてヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０のＳＰ画分細胞にのみ特異的に提示されるＨＬＡ−Ａ２４結合ナチュラルペプチドの溶出と配列解析とを行った。
ａ）細胞株
前記大腸がん細胞株由来クローンであるＳＷ４８０−ＭＰおよびＳＷ４８０−ＳＰ系統は、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン・ストレプトマイシン（Gibco社）を添加したＤＭＥＭ培地にて培養し、細胞数をそれぞれ１．５×１０９〜１．８×１０９個の範囲とした。
【０１２６】
ｂ）抗体
抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体（C7709A2）を産生するハイブリドーマは、P. G. Coulie博士（de Duve Institute, Brussel）より供与されたものである。ハイブリドーマを、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン・ストレプトマイシン、５５μＭの２−メルカプトエタノール（Gibco社）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Gibco社）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Sigma-Aldrich社）および２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Gibco社）を添加したＲＰＭＩ−１６４０（Sigma-Aldrich社）培地にて培養し、培養上清からセルロースチューブとポリエチレングリコール（PEG-20000）とを用いた逆浸透法により濃縮抗体を得た。濃縮抗体は０．０３％アジ化ナトリウムとプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Diagnostics社）とを添加し、４℃にて保存した。
【０１２７】
ｃ）抗体とビーズの結合
３０〜４０ｍＬの濃縮抗体を、３ｍＬのプロテインＡセファロースビーズ（GE Healthcare社）と４℃で一晩撹拌し結合させ、その後０．１Ｍのホウ酸と０．２Ｍのトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．２）とで洗浄した。抗体とビーズとは２０ｍＭのピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩含有トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．３）にて６０〜９０分間室温で撹拌し共有結合させた。
ｄ）ＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチドの免疫沈降
０．５％ＮＰ−４０、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８）、１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよびプロテアーゼ阻害剤を含んだ緩衝液を用いて、実験例３ａ）の細胞（ＳＷ４８０−ＳＰおよびＳＷ４８０−ＭＰ）をそれぞれ溶解した。細胞溶解液は段階的に遠心分離を行い（２０００ｇで１０分間、３８０００ｇで３０分間、１０００００ｇで９０分間）、上清を回収した。回収した上清は０．５ｍＬのプロテインＡセファロース懸濁液カラムを通過させ、プロテインＡセファロースと非特異的に結合する成分を除去した後、実験例３ｃ）で作製した抗体結合プロテインＡセファロースビーズと混合し、４℃にて一晩ゆっくりと撹拌しながら、ナチュラルペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を抗体ビーズに結合させた。
【０１２８】
その後、抗体ビーズは４種類の緩衝液（［１］０．００５％のＮＰ−４０、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡおよびプロテアーゼ阻害剤；［２］５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）および１５０ｍＭの塩化ナトリウム；［３］５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）および４５０ｍＭの塩化ナトリウム；ならびに［４］５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０））を用いて段階的に洗浄した後、抗体に結合したペプチドおよびＨＬＡ−Ａ２４分子を１０％酢酸処理にて溶出させた。続いて目的とするペプチドのみを３ｋＤａカットオフフィルター（Millipore社）により抽出した。このペプチド含有抽出液を濃縮乾燥し、０．１％ギ酸を溶媒として再溶解し、サンプルとした。
【０１２９】
ｅ）溶出ペプチドの配列解析
実験例３ｄ）で得られたサンプルを、ナノフローＨＰＬＣ（Kya Technologies Corporation社）にて分画し、ＭＡＬＤＩ基質へスポットした後、マススペクトロメーター（Applied Biosystems社；MDS SCIEX 4800 MALDI TOF/TOF）にて解析した。マススペクトロメトリー解析およびペプチド配列解析には、Applied Biosystems 4000 Series Explorer software（ver. 3.5.3）、ProteinPilot 3.0ソフトウェア（Applied Biosystems社）、およびipi.HUMAN FASTA タンパクデータベース（ver. 3.71）を使用した。得られたペプチド配列のうち、ＳＷ４８０−ＳＰに特異的であったもののうち、実験例４以降にて後述するＦＡＭ８３Ｂ遺伝子に由来するペプチドの配列および解析スペクトラムを図４に示す。
【０１３０】
ｆ）考察
抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体による免疫沈降とマススペクトロメトリー解析とを組み合わせた手法により、ＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチドの同定が可能であった。これらは大腸がん細胞の表面に提示されているナチュラルペプチドであると考えられる。また、ＭＰ分画細胞においても同様の手法を用いて解析を行い、両者を比較することにより、ＳＰ分画細胞に特異的に抗原提示されているナチュラルペプチドとして配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するナチュラルペプチドなどが同定された。これらのナチュラルペプチドは、がんのＳＰ分画細胞に特異的に抗原提示されているペプチドとしては初めての同定となる。
【０１３１】
実験例４：ＨＬＡ−Ａ２４結合ナチュラルペプチドをコードする遺伝子の発現
ａ）ＳＰ特異的な遺伝子発現
実験例３ｅ）にてＳＰ分画細胞に特異的なＨＬＡ−Ａ２４結合ナチュラルペプチドが複数同定された。このペプチドは大きく２つのグループに分類されると考えられる。すなわち、ペプチドをコードする遺伝子がＳＰ分画細胞特異的に発現しているグループと、ペプチドをコードする遺伝子はＳＰ分画細胞、ＭＰ分画細胞ともに発現しているが、タンパク質発現レベルまたはペプチドプロセシングの差から、ＭＰではナチュラルペプチドとしてＨＬＡ−Ａ２４によって抗原提示されないグループである。
上記で同定されたナチュラルペプチドをこの分類目的において分類するため、ＳＷ４８０−ＳＰおよびＳＷ４８０−ＭＰそれぞれのｍＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の検討を行ったところ、ＳＰ分画細胞特異的に発現する遺伝子の１つとしてＦＡＭ８３Ｂ遺伝子を確認した。遺伝子発現解析の結果を図５に示す。ｍＲＮＡ抽出と逆転写にはそれぞれTRIzol（Invitrogen社）およびSuperScript（登録商標）III Reverse Transcriptase（Invitrogen社）を製品添付書に従って使用した。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーおよびサーマルサイクラーの条件を表１に示す。ＲＴ−ＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲルを用いて、１００Ｖで２５分間電気泳動を行った。
【０１３２】
【表１】
2020089369.tif 000002
【０１３３】
ｂ）正常細胞でのＦＡＭ８３Ｂ遺伝子発現
実験例４ａ）で確認されたＦＡＭ８３Ｂについて、ヒト成人正常細胞において発現を調査した。ヒト成人正常組織由来ｍＲＮＡパネルをクロンテック社から入手し、これを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ｍＲＮＡパネルには、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸、末梢血単核球の各成人正常細胞および組織由来のｍＲＮＡが含まれている。
まず、SuperScript（登録商標）III逆転写酵素（インビトロジェン社製）を用いて、キットのプロトコルに従ってｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを、順行（Ｆｗ）プライマーおよび逆行（Ｒｖ）プライマー（表１）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによりＦＡＭ８３ＢのｃＤＮＡを増幅した。またコントロールとして、ＧＡＰＤＨのｃＤＮＡを同様の方法で増幅した。ＰＣＲ条件を表１に示す。増幅した増幅物に対して１．５％アガロースゲルを用いて、１００Ｖで２５分間電気泳動を行った。結果を図６に示す。
【０１３４】
ｃ）がん細胞株におけるＦＡＭ８３Ｂ遺伝子発現
大腸がん細胞株４種類（ＨＴ１５、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、Ｃｏｌｏ２０５）、乳がん細胞株２種類（ＭＣＦ７、ＨＭＣ１）、口腔がん細胞株２種類（ＨＳＣ３、ＨＳＣ４）、肺がん細胞株１種類（ＬＨＫ２）、膵がん細胞株１種類（Ｐａｎｃ１）、メラノーマ細胞株２種類（１１０２ｍｅｌ、ＬＧ２ｍｅｌ）におけるＦＡＭ８３Ｂ遺伝子発現を実験例４ｂ）と同様の手法により確認した。結果を図７に示す。
【０１３５】
ｄ）考察
実験例３ｅ）で得られた８種類のＨＬＡ−Ａ２４結合ナチュラルペプチドが由来するタンパク質をコードする遺伝子のうち、ＦＡＭ８３ＢのみがＳＰ特異的な発現パターンを示した。ＦＡＭ８３Ｂ遺伝子は新規がん遺伝子としての報告があるが、ＳＰ特異的な遺伝子発現については知られていない。さらにＦＡＭ８３Ｂ遺伝子は各種臓器における正常細胞には発現がみられず、逆に多くの上皮性悪性腫瘍細胞株において発現が確認された（図６および図７）。すなわち、ＦＡＭ８３Ｂ遺伝子およびその産物であるペプチドは、がんの治療標的として理想的な資質を有すると考えられる。
【０１３６】
実験例５：細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導
ａ）ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の分離
インフォームドコンセントを得たＨＬＡ−Ａ２４陽性大腸がん患者またはＨＬＡ−Ａ２４陽性健常者の末梢血をヘパリン添加５０ｍＬシリンジにて採血した。全血を、リンフォプレップ（Nycomed社）を１３ｍＬ添加した５０ｍＬチューブ（ファルコン社）に重層し、２０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離した。リンフォプレップ層上に沈殿したＰＢＭＣ層をピペットにて回収し、ＰＢＳにて３回洗浄し、ヒトＰＢＭＣとした。
【０１３７】
ｂ）ＣＤ８陽性細胞（ＣＤ８＋）およびＣＤ８陰性細胞（ＣＤ８−）の分離
前記のように分離したＰＢＭＣを１０ｍＬのＡＩＭ−Ｖ培養液（Life Technologies社）に懸濁後、１０ｃｍプラスチックシャーレにて約２時間３７℃にて培養した。１０ｃｍシャーレをゆるやかに振盪し、浮遊細胞をＡＩＭ−Ｖ培養液とともに回収し、１５ｍＬチューブにて１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られたペレットに、１６０μＬの２ｍＭのＥＤＴＡ添加０．１％ＢＳＡ補充ＰＢＳに懸濁し、４０μＬのＣＤ８マイクロビーズ（Miltenyi Biotec社）を添加、混和後、４℃にて１５分間培養し、２ｍＭのＥＤＴＡ添加０．１％ＢＳＡ補充ＰＢＳ５ｍＬにて洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペレットに、２ｍＭのＥＤＴＡ添加０．１％ＢＳＡ補充ＰＢＳ１ｍＬを添加、混和し、マグネット装着カラムに添加し、２ｍＭのＥＤＴＡ添加０．１％ＢＳＡ補充ＰＢＳにより５回洗浄後、カラムをマグネットから脱着しＣＤ８＋細胞を回収した。カラムに付着しなかった細胞をＣＤ８−細胞とした。
【０１３８】
ｃ）合成ペプチドによるＣＤ８＋細胞刺激
ＣＤ８−細胞およびＣＤ８＋細胞を、１０％ヒトＡＢ血清（ＨＳ）添加ＡＩＭ−Ｖ培養液にて培養した。一部のＣＤ８−細胞に、１ｍｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（WAKO chemicals社）および１００Ｕ／ｍＬのインターロイキン２（ＩＬ−２）（武田薬品工業社）を添加し、７日間培養し、ＰＨＡ−ｂｌａｓｔ細胞を作製した。ＰＨＡ−ｂｌａｓｔ細胞に、実験例３ｅ）にて同定されたＦＡＭ８３Ｂ由来の配列（配列番号３）を有する合成ペプチドを２０μｇ／ｍＬ添加し、室温にて１時間培養した。ペプチドパルスＰＨＡ−ｂｌａｓｔ細胞を放射線照射機（Softex社）にて１００Ｇｙ照射し、１０ｍＬのＰＢＳ添加後、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペレットを１ｍＬの１０％ＨＳ添加ＡＭＩ−Ｖに懸濁し、細胞濃度を計算した。４×１０５個のＰＨＡ−ｂｌａｓｔ細胞を、２×１０６個のＣＤ８＋細胞に添加し、１ｍＬの１０％ＨＳ添加ＡＩＭ−Ｖにて１週間３７℃にて培養した。７日目に、同様にペプチドパルスしたＰＨＡ−ｂｌａｓｔ細胞を１００Ｇｙの放射線で照射し、ＣＤ８＋細胞に添加した。８日目、ＣＤ８＋細胞に、２０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を添加した。同様のＰＨＡ−ｂｌａｓｔ細胞による刺激を１４日目に行った。
【０１３９】
実験例６：インターフェロン（ＩＦＮ）−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ａ）ＥＬＩＳＰＯＴプレートの作製
実験は、Human IFNγ ELISPOT set（BD社）を使用して行った。ＥＬＩＳＰＯＴプレートに、２００倍希釈した抗ＩＦＮγ抗体を４℃で一晩静置してコートした。１０％ＦＣＳ補充ＲＰＭＩ（Sigma-Aldrich社）にてプレートを室温にて２時間培養し、ブロッキングし、ＥＬＩＳＰＯＴプレートとした。
【０１４０】
ｂ）細胞培養
２０μｇ／ｍＬの濃度にて各ペプチドを、ヒトリンパ芽球様細胞Ｔ２細胞にＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子を導入して発現させた細胞株であるＴ２−Ａ２４細胞（葛島先生、愛知県がんセンターより供与）に室温にて１時間パルスした。ペプチドパルス群は［１］ペプチドパルス無し、［２］ＨＩＶペプチドパルス、［３］ＦＡＭ８３Ｂペプチドパルスの３群とした。ペプチドパルス後ＰＢＳ添加、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞ペレットを５×１０５個／ｍＬになるように懸濁し、ＥＬＩＳＰＯＴプレートに各ウェル５×１０４個ずつ播種した。ＣＴＬを各ウェル５×１０４個播種し、３７℃にて一晩培養した。
【０１４１】
ｃ）スポットの検出
一晩培養したＥＬＩＳＰＯＴプレートから培養液および細胞を除去後、Milli Q水にて２回、wash bufferにて３回洗浄した。各ウェルに２５０倍希釈したビオチン化検出抗体を添加、室温にて２時間培養した。Wash bufferにて３回洗浄後、１００倍希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジンを各ウェルに添加、室温にて１時間培養した。Wash bufferにて３回洗浄およびＰＢＳにて２回洗浄後、発色試薬を各ウェルに添加、室温にて１５〜３０分間発色反応を行った。十分な可視スポット形成を確認後、Milli Q水にて洗浄し、反応を終了した。ニトロセルロース膜を乾燥後、KS ELISPOT（ZEISS社）にて検出、撮影した。図８に見られるように、ＦＡＭ８３Ｂペプチドパルス群にてＩＦＮγスポットが検出された。
【０１４２】
実験例７：細胞傷害試験
ａ）カルセイン染色
Ｔ２−Ａ２４細胞およびＨＬＡ−ｃｌａｓｓ  Ｉ欠失の白血病細胞Ｋ５６２（ATCCから入手）を１×１０６個／ｍＬの細胞濃度で、１０％ＦＢＳ補充ＲＰＭＩに懸濁した。カルセイン（Dojindoから入手）を最終濃度１０μｇ／ｍＬで添加し、３７℃で３０分間培養した。１０ｍＬの１０％ＦＢＳ補充ＲＰＭＩにて３回洗浄した。
【０１４３】
ｂ）ＣＴＬとの共培養
カルセイン染色したＴ２−Ａ２４細胞に、２０μｇ／ｍＬの濃度にて各ペプチドを室温にて１時間パルスした。ペプチドパルス群は、［１］ペプチドパルス無し、［２］ＨＩＶペプチドパルス、［３］ＦＡＭ８３Ｂペプチドパルスの３群とした。ペプチドパルス後、ＰＢＳにて２回洗浄した。各群細胞を１×１０４個／５０μＬの各ウェルに播種した。各ウェルに播種された細胞の蛍光強度（０時間）をテラスキャン（ミネルバテック社）にて測定した。
０時間測定後、エフェクター細胞（ＣＴＬ）をエフェクター／ターゲット比（E/T ratio）３、１０、３０となるように各個数のＣＴＬを各ウェルに播種した。自然遊離ウェルとして８０℃にて不活化したヒトＰＢＭＣを播種した。最大遊離ウェルには２％のＮＰ−４０添加ＰＢＳを添加した。３７℃で４時間〜６時間培養後、各ウェルの蛍光強度をテラスキャンにて測定した。細胞傷害活性を下記計算式にて計算した。
細胞傷害活性＝（実験群の遊離量−実験群の自然遊離量）／（実験群の最大遊離量−実験群の自然遊離量）×１００
図９に示すとおり、ＣＴＬは、［１］ペプチドパルス無し群、［２］ＨＩＶペプチドパルス群、Ｋ５６２と比較して［３］ＦＡＭ８３Ｂペプチドパルス群に対して高い細胞傷害活性を示した。このことは、ＣＴＬがＦＡＭ８３Ｂペプチドに対して特異的細胞傷害活性を示す事を示唆する。
【０１４４】
実験例８：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＨＬＡ−Ａ＊２４：０２結合モチーフを有するＦＡＭ８３Ｂ由来ペプチド
ＭＨＣとペプチドの結合予測プログラムであるＢＩＭＡＳ（http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/）、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（http://www.syfpeithi.de/）およびＩＥＤＢ（MHC-I processing predictions；http://www.iedb.org/）などを用いて、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１および／またはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２への結合が予測されるＦＡＭ８３Ｂ由来のペプチド（配列番号３〜３５、３７〜４１、４３〜６０および６５〜８５で表されるペプチド）を抽出した。これらペプチドをＦｍｏｃ法で化学合成した。合成したペプチドを以下の表２−１および２−２に示す。Ｓｔａｒｔは、合成したペプチドのＮ末端アミノ酸の、ＦＡＭ８３Ｂ（配列番号２）におけるアミノ酸位置を示し、Ｅｎｄは合成したペプチドのＣ末端アミノ酸の、ＦＡＭ８３Ｂ（配列番号２）におけるアミノ酸位置を示す。Ｌｅｎｇｔｈは合成したペプチドのアミノ酸数を表す。
【０１４５】
【表２−１】
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【０１４６】
【表２−２】
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【０１４７】
実施例９：ＦＡＭ８３Ｂ由来ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１あるいはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２結合性評価
ＦＡＭ８３Ｂ由来ペプチドの各ＨＬＡ分子への結合性評価はＭＨＣクラスＩ発現安定化試験によって実施した。当試験ではヒトリンパ芽球様細胞株であるＴ２―Ａ２４細胞を利用した。Ｔ２細胞は細胞質から小胞体へのペプチドの輸送に関与するtransporter associated with antigen processing（ＴＡＰ）を欠損している。ＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＨＬＡ−Ａ＊２４：０２）は、ペプチドが結合していない状態（empty MHC class I）では、構造が不安定であることが知られる。通常、Ｔ２細胞は細胞表面に低レベルのempty MHC class I分子しか発現できない。しかし、ＭＨＣクラスＩ分子に結合可能なペプチドを添加すると、empty MHC class I分子は該ペプチドと結合して細胞表面で安定化して存在できる。したがって、細胞表面ＭＨＣクラスＩ発現レベルはペプチドのＭＨＣクラスＩ結合親和性に依存することとなる。
【０１４８】
Ｔ２−Ａ２４細胞は、３７℃、５％ＣＯ２下で継代培養した。ペプチドは、合成したＦＡＭ８３Ｂ由来ペプチド、ＨＬＡ−Ａ０２ポジティブコントロールとしてＭｅｌａｎ  Ａ  Ａ２７Ｌペプチド（アミノ酸配列：ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号６１）、ＨＬＡ−Ａ２４ポジティブコントロールとしてＨＩＶ５８４−５９２ペプチド（アミノ酸配列：ＲＹＬＲＤＱＱＬＬ；配列番号６２）、ＨＬＡ−Ａ０２ネガティブコントロールとしてＭＡＧＥ−１１６１−１６９ペプチド（アミノ酸配列：ＥＡＤＰＴＧＨＳＹ；配列番号６３）、ＨＬＡ−Ａ２４ネガティブコントロールとしてＶＳＶ５２−５９ペプチド（アミノ酸配列：ＲＧＹＶＹＱＧＬ；配列番号６４）をそれぞれ１００μｇ／ｍＬの濃度で用いて結合性を評価した。これらペプチドはＤＭＳＯに溶解され、さらに、ＲＰＭＩ１６０培地で２００倍に希釈された。細胞懸濁液とペプチド溶液とを混合し、５％ＣＯ２、２６℃の条件で１６〜１８時間培養した。温度を３７℃にして、さらに３時間共培養した後、遠心分離して上清を除き、細胞を単離した。単離した細胞を、３％ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣで蛍光標識した抗ＨＬＡ−Ａ０２抗体（clone:BB7.2；医学生物学研究所）または抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体（clone:17A10；医学生物学研究所）を加え、室温で３０分静置した。その後、細胞を、３％ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液を加え、室温で１０分間静置することで細胞を固定した。固定した細胞は、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｎ）にて、ＦＩＴＣ蛍光強度を計測した。平均蛍光強度（mean fluorescence intensity；ＭＦＩ）の溶媒比を算出した。
【０１４９】
ＨＬＡ結合試験の結果を表３に示す。表３に示すとおり、配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２９〜３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６０および配列番号６５〜７３で表されるペプチドのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に対するＭＦＩが１．５以上を示し、配列番号３〜６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１４〜１６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号６５〜７０および配列番号７４〜８０で表されるペプチドのＨＬＡ−Ａ＊２４：０２に対するＭＦＩが１．５以上を示し、配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号３５、配列番号４７および配列番号６５〜７０で表されるペプチドのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＨＬＡ−Ａ＊２４：０２の両方に対するＭＦＩが１．５以上を示した。
【０１５０】
【表３】
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【０１５１】
実施例１０：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウスおよびＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウスを用いた、in vivoでのＣＴＬ誘導能の評価
実施例９においてＨＬＡ−Ａ＊０２：０１またはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２に対するＭＦＩが１．５以上のＦＡＭ８３Ｂ由来ペプチドについて、ＣＴＬ誘導能を、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウスあるいはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウスを用いたin vivoのＣＴＬ誘導試験によって評価した。
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＣｒＨＬＡ−Ａ２．１ＤＲ１）は、マウスのＭＨＣを欠損し、ヒトのＭＨＣであるＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１：０１を発現するマウスであり、本マウスを用いることで、ヒトでＣＴＬを誘導し得るペプチドの選択が可能である。また、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウスはヒトのＭＨＣであるＨＬＡ−Ａ＊２４：０２を発現するマウスであり、本マウスを用いることで、ヒトでＣＴＬを誘導し得るペプチドの選択が可能である。そこで、各ペプチドがＣＴＬ誘導活性を有するか否かは、上記マウスへのペプチド投与によって投与ペプチドに反応可能なＴ細胞が誘導されるか否かで判断した。
【０１５２】
具体的には、次のとおり行った。まず、ペプチドをジメチルスルホキシドで８０ｍｇ／ｍＬに溶解したのち注射用水で希釈し、等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡあるいはＩＳＡ５１ＶＧ）と混合し、エマルション化させた。エマルション化させたペプチドは、マウスの尾根部皮内に２５０μｇ／箇所の用量で２箇所投与した。１週間後に、マウスをＣＯ２ガスにより安楽死させたのち脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ＩＦＮγ産生の測定には、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイキット（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いた。脾細胞調製の前日に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを抗ＩＦＮγ抗体で処理し、当日に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地でブロッキングした。調製した脾細胞を０．２５〜１．０×１０６個／ウェルで、ブロッキングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種した。投与したＦＡＭ８３Ｂ由来ペプチドを、ＤＭＳＯで４０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに１０％ＲＰＭＩ１６４０培地で２０μｇ／ｍＬに希釈した。希釈したペプチドを、５０μＬ／ウェルでそのペプチドを投与した動物に由来する脾細胞に添加した。ペプチドを添加した脾細胞を、１６〜１８時間、３７℃、５％ＣＯ２下で培養することでin vitroにおけるペプチド再刺激を加えた。培養後に上清を除き、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、添付のプロトコールに従って発色させた。発色したスポット数は、ＫＳ−ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。
【０１５３】
ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果は図１０〜図１９に示す。
本試験の結果、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞において、ペプチド特異的なＩＦＮγ産生が確認されたことより、配列番号４、２０、２９〜３３、３５、３７、３８、４７、５７、６０、６５〜６８および７１〜７３で表されるＦＡＭ８３Ｂ由来の各ペプチドがＣＴＬ誘導能を持つことがわかった。また、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウス由来の脾細胞において、ペプチド特異的なＩＦＮγ産生が確認されたことより、配列番号４、６、９、１２、１４、１５、２０、２３、２４、４７、６５〜６８、７４、７５および７７〜８０で表されるＦＡＭ８３Ｂ由来のペプチドがＣＴＬ誘導能を持つことがわかった。したがって、配列番号４、２０、４７および６５〜６８で表されるＦＡＭ８３Ｂ由来の各ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ０２型およびＨＬＡ−Ａ２４型の両方の対象においてＣＴＬ誘導能を有することが示された。
【０１５４】
実施例１１：ＨＬＡ−Ａ２４テトラマーアッセイ
ａ）ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の分離
インフォームドコンセントを得たＨＬＡ−Ａ２４陽性がん患者の末梢血をヘパリン添加５０ｍＬシリンジにて採血した。全血を、リンフォプレップ（Axis-Shield PoC AS社）を１５ｍＬ添加したLeucosepリンパ球分離チューブ５０ＭＬ（グライナー社）に重層し、１０００ｇで３０分間遠心分離した。リンフォプレップ層上に沈殿したＰＢＭＣ層をピペットにて回収し、ＰＢＳにて３回洗浄し、ヒトＰＢＭＣとした。
【０１５５】
ｂ）ＭＬＰＣ
前記のように分離したＰＢＭＣを２ｍＬのＡＩＭ−Ｖ培養液（Life Technologies社）に懸濁後、２４ウェルプレートにて約１時間３７℃で培養した。リンパ球が沈んだことを確認し、１ｍＬ培養液を捨てた。ＦＡＭ８３Ｂ（Ｆ４７６＿９：配列番号４７）ペプチド４０μｇ／ｍＬを添加後ピペッティングし、室温で３０分静置した。３７℃に温めておいた１０％ヒトＡＢ血清（ＨＳ）添加ＡＩＭ−Ｖにインターロイキン２（ＩＬ−２）５０Ｕ／ｍＬを加えた培養液を１ｍＬ添加し、ピペッティングした後に３７℃で７日間培養した。
【０１５６】
ｃ）テトラマーアッセイ
７日間培養後のＰＢＭＣを１５ｍＬチューブ（BD社）に回収し、１×ＰＢＳを培養液の２倍量入れた後に１５００ｒｐｍ、５分、室温で遠心分離した。上澄みを捨てて、溶血用Lysing Buffer（BD社）を１０倍希釈した溶液を２ｍＬ入れてピペッティングし、室温１５分静置した。１５００ｒｐｍ、５分、室温で遠心分離し、上澄みを除いた後に１×ＰＢＳを２ｍＬ入れ、再び１５００ｒｐｍ、５分、室温で遠心分離した。上澄みを捨てて２％ＦＢＳ（Thermo社）を加えた１×ＰＢＳを１ｍＬ入れてセルカウントを行った。５ｍＬ  ＦＡＣＳチューブ（BD社）に１０５〜１０６個／１００μＬとなるように調整した細胞を、機器調整用４本とネガティブコントロール用１本、ＦＡＭ８３Ｂテトラマー用１本の計６本に１００μＬずつ分注した。ネガティブコントロールチューブにはＨＩＶ−ＰＥ、ＨＩＶ−ＦＩＴＣテトラマー（MBL社）を各５μＬずつ添加し、ＦＡＭ８３ＢテトラマーチューブにはＨＩＶ−ＦＩＴＣ、ＦＡＭ８３Ｂ（Ｆ４７６＿９）−ＰＥテトラマー（MBL社）を各５μＬずつ添加して氷上で１時間、遮光でインキュベートした。ＣＤ８−ＰＣ５（ベックマン・コールター社）を上記それぞれのチューブに３μＬずつ添加した。また、機器調整用チューブにはＣＤ８−ＦＩＴＣ（ベックマン・コールター社）、ＣＤ８−ＰＥ（BD社）そしてＣＤ８−ＰＣ５を各チューブに３μＬずつ入れた。ＣＤ８添加後は氷上で１時間、遮光でインキュベートを行った。インキュベーション後、２％ＦＢＳ入りＰＢＳ１ｍＬを各チューブに添加し、１５００ｒｐｍ、５分、４℃で遠心分離した。この洗浄をもう一度繰り返し、１％ホルマリン（和光社）入りＰＢＳ液を５００μＬ添加した。サンプルはFACS Calibur（BD社）にて解析を行った。
【０１５７】
結果を図２０に示す。患者Ａから採取したＰＢＭＣおよび患者Ｂから採取したＰＢＭＣの両方において、ネガティブコントロールであるＨＩＶ−ＰＥテトラマー陽性細胞数と比較して、ＦＡＭ８３Ｂ−ＰＥテトラマー陽性細胞が有意に多く観察された（患者Ａ：１．６６％、患者Ｂ：２．３６％）。これは、各患者由来のＰＢＭＣにＦ４７６＿９ペプチドを添加してインキュベートすることによりＣＴＬが誘導されたこと、該ＣＴＬをＦＡＭ８３Ｂ−ＰＥテトラマーにより検出できたことを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１５８】
本発明により、細胞に実際に抗原提示されているナチュラルペプチドの同定方法が提供される。かかる方法を用いることで、ペプチドワクチンにより誘導されたCTLが確実に癌細胞を殺傷し、効果の高い癌ワクチンの開発に寄与するものである。またかかる方法を用いて同定されたがん幹細胞特異的ナチュラルペプチドから、がん幹細胞において特異的にＦＡＭ８３Ｂが発現していることが特定できたことから、ＦＡＭ８３Ｂをマーカーとしてがん幹細胞を特定することが可能となる。さらに同遺伝子由来のナチュラル抗原ペプチドは、少量でも大きな効果を有するがんの予防および／または治療剤として有用である。  また、本発明により、ＣＴＬの誘導活性を有するＦＡＭ８３Ｂ由来の腫瘍抗原ペプチド等が提供される。本発明のペプチドは、がんの予防および／または治療剤として有用である。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月4日(2020.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３、４、６、９、１２、１４、１５、２０、２３、２４、２９〜３３、３５、３７、３８、４７、５７、６０、６５〜６８、７１〜７５および７７〜８０のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、ペプチド。
【請求項２】
複数のエピトープペプチドが連結されたポリエピトープペプチドであって、該エピトープペプチドとして、請求項１に記載のペプチドを少なくとも１つ含む、前記ポリエピトープペプチド。
【請求項３】
請求項１のペプチドまたは請求項２に記載のポリエピトープペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターを含む、遺伝子導入用組成物。
【請求項６】
請求項１に記載のペプチドとＨＬＡとを含む、ＨＬＡマルチマー。
【請求項７】
請求項６に記載のＨＬＡマルチマーを含む、診断薬。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチドとＨＬＡとの複合体を特異的に認識する、Ｔ細胞受容体様抗体。
【請求項９】
請求項８に記載のＴ細胞受容体様抗体を作製するための方法であって、ファージディスプレイ法を利用して前記複合体を特異的に認識する前記Ｔ細胞受容体様抗体を取得することを含む、前記方法。
【請求項１０】
請求項８に記載のＴ細胞受容体様抗体を含有する腫瘍検出剤。
【請求項１１】
請求項８に記載のＴ細胞受容体様抗体を含有する腫瘍検出剤を作製するための方法であって、請求項９に記載の方法を含む、前記方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のペプチドとＨＬＡとの複合体を特異的に認識する、キメラ抗原受容体。
【請求項１３】
請求項１に記載のペプチドとＨＬＡとの複合体を特異的に認識するキメラ抗原受容体を作製するための方法であって、
ファージディスプレイ法を利用して前記複合体を特異的に認識する請求項８に記載のＴ細胞受容体様抗体を取得すること、および
前記Ｔ細胞受容体様抗体の抗体可変領域の軽鎖と重鎖を含む単鎖抗体（ｓｃＦｖ）をＮ末端側に、ＣＤ３ζ鎖をＣ末端側に含む、キメラ抗原受容体を作製すること
を含む、前記方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のペプチドとＨＬＡとの複合体を特異的に認識するＴ細胞受容体を含む、人工ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）。
【請求項１５】
請求項１に記載のペプチドとＨＬＡとの複合体を特異的に認識するＴ細胞受容体を含む人工ＣＴＬを作製するための方法であって、前記Ｔ細胞受容体をコードする遺伝子をＴ細胞に遺伝子導入することを含む、前記方法。
【請求項１６】
請求項８に記載のＴ細胞受容体様抗体を含む、診断薬。