(57)【要約】      （修正有）【課題】マラリアワクチン抗原として有用なポリペプチド等の提供。【解決手段】以下のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、および前記ポリペプチドを含むマラリアワクチン。（ａ）特定な配列からなるアミノ酸配列、（ｂ）特定な配列からなるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１、２もしくは３個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列、及び（ｃ）特定な配列からなるアミノ酸配列と９５％以上、更に好ましくは９７％以上、より好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド：
（ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１、２もしくは３個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列、及び
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９５％以上、更に好ましくは９７％以上、より好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドが担体と連結されてなるポリペプチド。
【請求項３】
担体が、ウイルス粒子、脂質粒子、もしくは担体蛋白質である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
マラリアワクチン抗原として使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、マラリアワクチン。
【請求項６】
更に、ＣＳＰ、ＴＲＡＰ、ＭＳＰ１、ＡＭＡ−１、ＳＥＲＡ５、Ｒｉｐｒ、ＥＢＡ１７５、ＲＨ５、Ｐｆｓ２５及びＰｆｓ２３０から選択される少なくとも一つのマラリアワクチン抗原を含む、又は前記少なくとも一つのマラリアワクチン抗原と併用して投与される、請求項５に記載のマラリアワクチン。
【請求項７】
更に、ポリオ、ジフテリア、百日咳及び破傷風から選択される少なくとも一つの感染症に対するワクチン抗原を含む、又は前記少なくとも一つのワクチン抗原と併用して投与される、請求項５又は６に記載のマラリアワクチン。
【請求項８】
マラリア原虫の感染予防、マラリア原虫感染後の発症予防、又はマラリア感染症の治療のための請求項５〜７のいずれか一項に記載のマラリアワクチン。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドが、宿主細胞における発現を可能にするプロモーター及び／又は調節エレメントに連結されてなる、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項９もしくは１０に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１１に記載の発現ベクターを含むマラリアワクチン。
【請求項１３】
請求項１１に記載のベクターにより形質転換された組換え宿主細胞。
【請求項１４】
細菌、酵母、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド、請求項９もしくは１０に記載のポリヌクレオチド、請求項１１に記載の発現ベクター、又は請求項１５に記載の抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マラリア原虫への感染又はマラリア感染症の発症を予防するためのワクチン用抗原等に関する。 
【背景技術】
【０００２】
マラリア感染症は、Plasmodium falciparum 等のPlasmodium属の原虫を寄生病原体とする感染症であり、熱帯及び亜熱帯地域で広く蔓延している。マラリア感染症は、ハマダラカを介して人体に侵入したマラリア原虫が、スポロゾイト（sporozoite）期、肝臓期、および赤血球期を経て増殖することにより引き起こされるが、それぞれの時期において、体内でマラリア原虫由来のタンパク質が産生される。当該タンパク質を抗原とする抗体の産生を誘導するワクチンを得ることができれば、マラリア原虫を攻撃し、その感染、及び感染後の体内における増殖を抑制することが可能である。現在、世界中でマラリアワクチンの研究開発が行われているが、未だ実用化に至っていないのが現状である。GAMAともよばれるGPI-anchored micronemal antigen （PlasmoDB gene code: PF3D7_0828800 (http://plasmodb.org/)）は、熱帯熱マラリア原虫のメロゾイト（merozoite）期に発現が予測されているタンパク質の一つであり、マラリアワクチン抗原としての利用が検討されている（非特許文献１、２、及び特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０１１３８１号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Eukaryotic Cell, Dec. 2009, 1869-1879
【非特許文献２】Nature (London, United Kingdom) (2002), 419(6906), 527-531
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、マラリアワクチン抗原として有用なポリペプチド等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意検討を行った結果、マラリア原虫由来のタンパク質GAMAのフラグメントを抗原として得られる抗体が、マラリア原虫の増殖阻害活性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、以下に関する：
〔１〕  以下のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド：
（ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１、２もしくは３個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列、及び
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９５％以上、更に好ましくは９７％以上、より好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列。
〔２〕  前記１に記載のポリペプチドが担体と連結されてなるポリペプチド。
〔３〕  担体が、ウイルス粒子、脂質粒子、もしくは担体蛋白質である、前記２に記載のポリペプチド。
〔４〕  マラリアワクチン抗原として使用するための、前記１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔５〕  前記１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、マラリアワクチン。
〔６〕  更に、ＣＳＰ、ＴＲＡＰ、ＭＳＰ１、ＡＭＡ−１、ＳＥＲＡ５、Ｒｉｐｒ、ＥＢＡ１７５、ＲＨ５、Ｐｆｓ２５及びＰｆｓ２３０から選択される少なくとも一つのマラリアワクチン抗原を含む、又は前記少なくとも一つのマラリアワクチン抗原と併用して投与される、前記５に記載のマラリアワクチン。
〔７〕  更に、ポリオ、ジフテリア、百日咳及び破傷風から選択される少なくとも一つの感染症に対するワクチン抗原を含む、又は前記少なくとも一つのワクチン抗原と併用して投与される、前記５又は６に記載のマラリアワクチン。
〔８〕  マラリア原虫の感染予防、マラリア原虫感染後の発症予防、又はマラリア感染症の治療のための前記５〜７のいずれか一項に記載のマラリアワクチン。
〔９〕  前記１に記載のポリペプチドをコードする核酸配列からなるポリヌクレオチド。
〔１０〕  前記９に記載のポリヌクレオチドが、宿主細胞における発現を可能にするプロモーター及び／又は調節エレメントに連結されてなる、ポリヌクレオチド。
〔１１〕  前記９又は１０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔１２〕  前記９もしくは１０に記載のポリヌクレオチド、又は前記１１に記載の発現ベクターを含むマラリアワクチン。
〔１３〕  前記１１に記載のベクターにより形質転換された組換え宿主細胞。
〔１４〕  細菌、酵母、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、前記１３に記載の宿主細胞。
〔１５〕  前記１に記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。
〔１６〕  前記１〜４のいずれかに記載のポリペプチド、前記９もしくは１０に記載のポリヌクレオチド、前記１１に記載の発現ベクター、又は前記１５に記載の抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、マラリアワクチン抗原として有用なポリペプチド、当該ポリペプチドを含むマラリアワクチン等を提供することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】GAMAもしくはGAMAのフラグメントをウサギに免疫して得られたポリクローナルIgG抗体のマラリア原虫増殖阻害率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．定義
本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138:9(1984) 〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）および当該分野における慣用記号に従う。
【００１０】
GPI-anchored micronemal antigen（GAMAとも呼ばれる）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列、PlasmoDB gene code: PF3D7_0828800 (http://plasmodb.org/)又は、NCBI Reference Sequence:XP_001349238（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）で特定され得る、熱帯熱マラリア原虫のメロゾイト（merozoite）期に発現が予測されているタンパク質である。本明細書において、GAMAには、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、および配列番号２のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質が含まれる。
ここで実質的に同一のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１、２もしくは３個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列、及び
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上、更に好ましくは９７％以上、より好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
が挙げられる。
【００１１】
本明細書において、GAMA遺伝子とは、前記GAMAをコードするポリヌクレオチドであれば特に限定はなく、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれ得る。GAMA遺伝子として、具体的には、配列番号１、PlasmoDB gene code: PF3D7_0828800 (http://plasmodb.org/)）及びNCBI Reference Sequence: XM_001349202（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）に記載の塩基配列で示されるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００１２】
本明細書において、「配列同一性」とは、２つのタンパク質間の、配列の同一性をいう。当該「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のタンパク質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、Clustal Wアルゴリズム（Nucleic Acid Res., 22(22):4673-4680(1994)）を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
【００１３】
２．ポリペプチド
本発明は、マラリアワクチン抗原として有用な、前述のGAMAのアミノ酸配列の一部からなるフラグメントに関する。具体的には、配列番号２で示されるアミノ酸配列の第６０２番目〜第７１５番目のアミノ酸配列、すなわち配列番号４で示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、本発明のポリペプチドと言う場合がある）である。
ここで、配列番号４で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１、２もしくは３個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列、及び
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９５％以上、更に好ましくは９７％以上、より好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
が挙げられる。
【００１４】
アミノ酸の変異数および変異部位は、得られるポリペプチドがもとのアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の免疫学的活性を保持するよう選択することが好ましい。免疫学的活性を消失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、欠失、付加又は挿入されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡ Ｓｔａｒ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の５％以内であり、好ましくは全アミノ酸の３％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるポリペプチドが、置換前のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の免疫学的活性を保持するよう選択することが好ましい。この置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点から、アミノ酸の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、両親媒性などにおいて置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、ＰｈｅおよびＴｒｐは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、ＡｓｐおよびＧｌｕは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またＬｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
【００１５】
すなわち、好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、
（ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１、２もしくは３個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の免疫学的活性を保持するポリペプチド、及び
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９５％以上、更に好ましくは９７％以上、より好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の免疫学的活性を保持するポリペプチド、
から選択されるポリペプチドである。
【００１６】
本明細書において、「配列番号Ｘで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の免疫学的活性」（ここで、Ｘは整数である）における「免疫学的活性」とは、マラリア原虫に対する免疫応答の誘導活性を意味する。「配列番号Ｘで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の免疫学的活性を有する」ポリペプチドとは、配列番号Ｘで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの効果の、７０％、８０％、９０％、または９５％以上の効果を示すポリペプチドを意味する。ポリペプチドの免疫学的活性は、当業者に周知の方法で確認することができ、例えば、実施例に記載の方法に準じて当該ポリペプチドを免疫して得られた抗体のマラリア原虫増殖阻害活性を調べることにより、確認することができる。あるいは、マラリア感染症の動物モデルに当該ポリペプチドを投与して確認することもできる。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、適宜当業者に周知の担体を、架橋構造を介して化学的共有結合により連結（コンジュゲート）、もしくはキメラペプチドとしてハイブリッドさせることができ、本発明のポリペプチド及び担体のコンジュゲート体やハイブリッド体もまた、本発明の範疇である。
【００１８】
ここで用いられる担体としては、例えばウイルス様粒子、リポソーム等の脂質粒子、キーホールリンペットヘモシアニン、又は、ウシ血清アルブミン、CRM197もしくは緑膿菌細胞外毒素A等の担体タンパク質が挙げられる。
【００１９】
架橋構造（リンカー）、すなわち本発明のポリペプチド及び担体を連結する化学的共有結合を形成するための架橋剤としては、ホモ二機能性架橋剤又はヘテロ二機能性架橋剤が挙げられる。例えば、ホモ二機能性架橋剤としてはスベリン酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル（N,N'-disuccinimidyl suberate）や1,4-ビスマレイミドブタン（1,4-bis(maleimido)butane）、ヘテロ二機能性架橋剤としては4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸3-スルホ-N-スクシンイミジルナトリウム（3-Sulfo-N-succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Sodium Salt）や1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride）等が挙げられる。
【００２０】
本発明のポリペプチド及び担体のハイブリッド体は、本発明のポリペプチドおよび担体のアミノ酸配列またはこれをコードする核酸配列に基づき、本発明のポリペプチドと同様に製造することができる。
【００２１】
３．ポリヌクレオチド
本発明の態様として、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列からなるポリヌクレオチド（以下、本発明のポリヌクレオチドという）が挙げられる。具体的には、配列番号２で示されるアミノ酸配列の第６０２番目〜第７１５番目のアミノ酸配列、すなわち配列番号４で示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と実施的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであれば特に限定はなく、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれでもよく、また一本鎖の核酸配列及び二本鎖の核酸配列を共に含む。
ここで実施的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸配列からなるポリヌクレオチドとしては、配列番号４において、
（ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１、２もしくは３個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列、及び
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９５％以上、更に好ましくは９７％以上、より好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
をコードする核酸配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２２】
本発明のポリヌクレオチドの一例として、配列番号３で示される核酸配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドのさらなる例として、配列番号６で示される核酸配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。尚、本明細書において、配列番号３等の配列表で示される核酸配列は、便宜的にＤＮＡ配列であるが、ＲＮＡ配列の場合には、チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）として解する。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞において本発明のポリペプチドの発現を可能にするプロモーター及び/又は調節エレメントに連結されていてもよく、タンパク質コード領域として本発明のポリヌクレオチドを含み、かつプロモーター及び／又は調節エレメントに連結されたポリヌクレオチドもまた、本発明の範疇に含まれる。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチドが２本鎖の場合、前記本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、本発明のポリペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。すなわち本発明の範疇には、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターも含まれる。
【００２５】
前記発現ベクターは、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、ｐＣＥＰ４、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲＣ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
【００２６】
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期プロモーターなど）を有するＧＳＴ融合タンパクベクター（ｐＧＥＸ４Ｔなど）や、Ｍｙｃ、Ｈｉｓなどのタグ配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓなど）、さらにはチオレドキシンおよびＨｉｓタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ｐＥＴ３２ａ）などを用いることができる。
【００２７】
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＡＤ４９４（ＤＥ３）株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、Ｌ９２９細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、２９３−ＥＢＮＡ細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはｓｆ９などが挙げられる。
【００２８】
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin；Gibco-BRL社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
【００２９】
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。得られたポリペプチドは、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のポリペプチドを、前述のチオレドキシンやＨｉｓタグ、ＧＳＴ等との融合ポリペプチドとして発現させた場合は、これら融合ポリペプチドやタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
【００３０】
また、本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子治療用ベクター等に組込むことにより、動物に投与することができる。本発明のポリヌクレオチドを組み込んだ遺伝子治療用ベクターもまた、本発明の発現ベクターの範疇である。
【００３１】
遺伝子治療用ベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルスなどのウイルスベクターが挙げられる。この中では、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスが特に好ましい。また、非ウイルスベクターであるプラスミドも利用可能である。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドを発現させた細胞は、本発明のポリペプチドをインビボで産生することが可能である。すなわち、本発明のポリヌクレオチド又は本発明の発現ベクターは、それ自体マラリアワクチンとして利用することができる。
【００３３】
４．ポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に発現させて製造する遺伝子組み換え法、無細胞系合成システムを使用する方法、化学的に合成する方法等、当業者に周知の方法で製造することができる。以下に説明する。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号３の遺伝子配列情報に基づいて、ＤＮＡクローニング、発現ベクターの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのポリペプチドの回収の操作により得ることができる。当該発現ベクター及び宿主細胞としては、前述のものを挙げることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、文献記載の方法（Molecular Cloning,T.Maniatis et al.,CSH Laboratory(1983),DNA Cloning,DM.Glover,IRL PRESS(1985)）などに準じて行うことができる。
【００３５】
また、本発明のポリペプチドは、無細胞系タンパク質合成システムを利用して製造することができる。無細胞系タンパク質合成システムとしては、コムギ胚芽抽出物を利用した国際公開第０５／０３０９５４号に記載の方法など、当業者に周知の方法を適宜用いることができる。国際公開第０５／０３０９５４号に記載の方法は、リボソーム等を含む成分をコムギ胚芽から抽出し、この抽出液に転写、または翻訳鋳型、基質となる核酸、アミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、及びその他の有効因子を加えて試験管内で行う方法である。このうち、鋳型としてＲＮＡを用いるもの（これを以下「無細胞翻訳系」と称することがある）と、ＤＮＡを用い、ＲＮＡポリメラーゼ等転写に必要な酵素をさらに添加して反応を行うもの（これを以下「無細胞転写／翻訳系」と称することがある）がある。本発明のポリペプチドの製造においては、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡから転写されたＲＮＡを翻訳鋳型として、あるいは本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡを試験管内での翻訳鋳型作成のための転写鋳型として、用いることができる。翻訳鋳型は、本発明のポリヌクレオチドに加え、ＲＮＡポリメラーゼ認識配列（例えば、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７プロモーター）、当該合成システムにおける翻訳活性を高める配列（例えば、Ω配列またはＥ０１配列）を含み得る。ここで用いられるコムギ胚芽抽出物含有液はWEPRO（登録商標；セルフリーサイエンス社製）として市販されているものを使用することができる。あるいは、例えばJohnston,F.B.et al.,Nature,179,160-161(1957)に記載の方法に従って、コムギ胚芽抽出液を調製することができる。また、単離した胚芽からのコムギ胚芽抽出物含有液の抽出方法としては、例えば、Erickson,A.H.etal.,(1996)Meth.In Enzymol., 96,38-50等に記載の方法を用いることができる。その他、国際公開第０３／０６４６７１号に記載の方法が例示される。具体的には本明細書実施例に示されるとおり、配列番号６で示される核酸配列からなるポリヌクレオチドを含むＤＮＡまたはこれから転写されたＲＮＡを使用することができ、当該ＤＮＡまたはＲＮＡのようなポリヌクレオチドもまた、本発明の一態様として挙げられる。
【００３６】
あるいは、本発明のポリペプチドは、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて製造することができる。具体的には、文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2，Academic Press Inc.，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成，広川書店，1991）などに記載されている化学的方法が挙げられる。例えば、本発明のポリペプチドは、Ｆｍｏｃ法またはＢｏｃ法を用いて固相合成機で製造する方法や、Ｂｏｃ−アミノ酸またはＺ−アミノ酸を液相合成法で逐次縮合させて製造する方法により製造することができる（Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシカルボニル基、Ｂｏｃはｔ−ブトキシカルボニル基、Ｚはベンジルオキシカルボニル基をそれぞれ表わす）。得られたポリペプチドは、通常のペプチド化学に用いられる方法に準じて精製することができる。例えば、種々のクロマトグラフィー（例えば、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過、もしくは逆相クロマトグラフィー）、または再結晶などで精製することができる。例えば、再結晶溶媒としては、メタノール、エタノールもしくは２−プロパノールなどのアルコール系溶媒、ジエチルエーテルなどのエーテル系溶媒、酢酸エチルなどのエステル系溶媒、ベンゼンもしくはトルエンなどの芳香族炭化水素系溶媒、アセトンなどのケトン系溶媒、ヘキサンなどの炭化水素系溶媒、ジメチルホルムアミドもしくはアセトニトリルなどの非プロトン系溶媒、水、またはこれらの混合溶媒などを用いることができる。その他精製方法としては、実験化学講座（日本化学会編、丸善）１巻などに記載された方法などを用いることができる。
【００３７】
５．抗体
本発明の一態様として、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体（以下、本発明の抗体という）が挙げられる。本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、およびＦａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーなどによって生成されるフラグメントのような抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
【００３８】
抗体の製造方法は、すでに当業者に周知であり、本発明の抗体も、周知の方法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12-11.13; Antibodies: A Laboratory Manual, Second Edition, Edward A. Greenfield, Cold Spring Harber Laboratory Press, New York 2013）。
【００３９】
具体的には、ポリクローナル抗体は、遺伝子組み換え法、無細胞系合成システムによる方法、化学的合成による方法等の当業者に周知の方法に従って製造した本発明のポリペプチドを用いて、家兎などの非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドをマウスなどの非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4-11.11; Antibodies: A Laboratory Manual, Second Edition, Edward A. Greenfield, Cold Spring Harber Laboratory Press, New York 2013）。
【００４０】
本発明のポリペプチドに対する抗体の作製は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム−パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
【００４１】
以上のように本発明のポリペプチドを用いて常法により適宜動物を免疫することにより、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体、さらにはGAMAの活性を中和する抗体が容易に作製できる。抗体の用途としては、マラリア原虫感染による重篤な疾患の発症抑制、アフィニティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙げられる。免疫学的診断は、イムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。 
【００４２】
６．医薬組成物
本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明の発現ベクター、または本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体は、マラリア原虫の感染予防、マラリア原虫感染後の発症予防、又はマラリア感染症の治療に有用である。すなわち、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明の発現ベクター、または本発明の抗ポリペプチド抗体を含む医薬組成物も又、本発明の一態様である。ある実施形態において、本発明の医薬組成物は、マラリアワクチンである。
【００４３】
本発明の医薬組成物は、獲得免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー又は適当なアジュバントを含んでいても良い。あるいは、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明の発現ベクター、または本発明の抗ポリペプチド抗体及びキャリアーを含む組成物を、アジュバントを含む組成物と混合して投与、又は併用して投与することもできる。すなわち、本発明の医薬組成物は、アジュバントの組成物と組み合わせてなるキットとして提供されてもよい。
【００４４】
アジュバントとしては、文献（Nature Medicine, 19, 1597-1608, 2013）に記載のものなどが応用可能であり、具体的には、ウイルスや菌体由来成分又はその誘導体、サイトカイン、植物由来成分又はその誘導体、海洋生物由来成分又はその誘導体、水酸化アルミニウムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオールの如き界面活性剤、ポリアニオン等を挙げることができる。
【００４５】
前記において「菌体由来成分又はその誘導体」とは、具体的には、例えば（ｉ）細菌の死菌、（ｉｉ）細菌由来の細胞壁骨格（Cell Wall Skeleton, ＣＷＳと略する）、（ｉｉｉ）菌体由来の特定の成分又はその誘導体等に分類される。
ここで（ｉ）細菌の死菌としては、例えば溶連菌粉末（例えばピシバニール；中外製薬株式会社）、死菌浮遊物カクテル（例えばブロンカスマ・ベルナ；三和化学研究所）、あるいはヒト型結核菌の死菌等が挙げられる。
（ｉｉ）細菌由来のＣＷＳとしては、マイクバクテリア属由来のＣＷＳ（例えばマイコバクテリア属ウシ型結核菌であるＢＣＧ株のＣＷＳ）、ノカルディア属由来のＣＷＳ（例えばノカルディア・ノブラのＣＷＳ）、あるいはコリネバクテリア属由来のＣＷＳ等が挙げられる。
（ｉｉｉ）菌体由来の特定の成分又はその誘導体としては、例えば菌体由来多糖類であるヒト型結核菌由来多糖類成分（例えばアンサー；ゼリア新薬工業株式会社）や担子菌由来多糖類（例えばレンチナン；味の素、クレスチン；三共株式会社、担子菌カワラタケ）、またムラミルジペプチド（ＭＤＰ）関連化合物、リポ多糖（ＬＰＳ）、リピドＡ関連化合物（ＭＰＬ）、糖脂質トレハロースジマイコレート（ＴＤＭ）、細菌由来のＤＮＡ（例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド）、ウイルス由来の核酸、あるいはこれらの誘導体（例えばpoly I:C）などが挙げられる。
【００４６】
これら菌体由来成分及びその誘導体は、既に市販されているものであればそれを入手するか、又は公知文献（例えばCancer Res., 33, 2187-2195 (1973), J. Natl. Cancer Inst., 48, 831-835 (1972, J. Bacteriol., 94, 1736-1745 (1967), Gann, 69, 619-626 (1978), J. Bacteriol., 92, 869-879 (1966), J. Natl. Cancer Inst., 52, 95-101 (1974)）等に基き単離又は製造することが可能である。
【００４７】
前記において「サイトカイン」とは、例えばＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１８、あるいはＩＬ−１５などが挙げられる。これらのサイトカインは、天然品であっても遺伝子組換え品であっても良い。これらのサイトカインは、既に市販されていればそれを入手して使用することができる。また遺伝子組換え品であれば、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、あるいはＤＤＢＪ等のデータベースにおいて登録されている各塩基配列に基き、常法により所望の遺伝子をクローニングし、適当な発現ベクターに連結して作製された組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、発現・生産することができる。
【００４８】
前記において「植物由来成分又はその誘導体」とは、例えばサポニン由来成分であるＱｕｉｌ Ａ（Accurate Chemical & Scientific Corp）、ＱＳ−２１（Aquila Biopharmaceuticals inc.）、あるいはグリチルリチン（SIGMA-ALDRICHなど）などが挙げられる。
【００４９】
前記において「海洋生物由来成分又はその誘導体」とは、例えば海綿由来の糖脂質であるα−ガラクトシルセラミドなどが挙げられる。
【００５０】
本発明の医薬組成物の剤型としては、具体的には、油乳濁液（エマルション製剤）リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤、マイクロスフェアー製剤、マイクロカプセル製剤等の剤型などが挙げられる。
【００５１】
前記において油乳濁液（エマルション製剤）としては、例えば油中水型（ｗ／ｏ）エマルション製剤、水中油型（ｏ／ｗ）エマルション製剤、水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルション製剤などが挙げられる。ここで油中水型（ｗ／ｏ）エマルション製剤は、有効成分を水の分散相に分散させた形態をとる。水中油型（ｏ／ｗ）エマルション製剤は、有効成分を水の分散媒に分散させた形態をとる。また水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルション製剤は、有効成分を最内相の水の分散相に分散させた形態をとる。このようなエマルション製剤の調製は、例えば、特開平８−９８５号公報、特開平９−１２２４７６号公報等を参考にして行うことができる。
【００５２】
前記においてリポソーム製剤とは、有効成分を脂質二重膜構造のリポソームで水相内または膜内に包み込んだ形の微粒子である。リポソームを作るための主要な脂質としては、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン等が挙げられ、これにジセチルホスフェート、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン等を加えてリポソームに荷電を与えて安定化させる。リポソームの調製方法としては、超音波法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、フレンチプレスエクストラクション法等が挙げられる。
【００５３】
前記においてマイクロスフェアー製剤は、均質な高分子マトリックスから構成され、該マトリックス中に有効成分が分散された形の微粒子である。マトリックスの材料としては、アルブミン、ゼラチン、キチン、キトサン、デンプン、ポリ乳酸、ポリアルキルシアノアクリレート等の生分解性高分子が挙げられる。マイクロスフェアー製剤の調製方法としては公知の方法（Eur. J. Pharm. Biopharm. 50: 129-146, 2000, Dev. Biol. Stand. 92: 63-78, 1998、Pharm. Biotechnol. 10:1-43, 1997）等に従えばよく特に限定されない。
【００５４】
前記においてマイクロカプセル製剤は、有効成分を芯物質として被膜物質で覆った形の微粒子である。被膜物質に用いられるコーティング材料としては、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、エチルセルロース、ゼラチン、ゼラチン・アラビアゴム、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース等の膜形成性高分子が挙げられる。マイクロカプセル製剤の調製方法は、コアセルベーション法、界面重合法等が挙げられる。
【００５５】
本発明の医薬組成物は、マラリア原虫の感染予防、マラリア原虫感染後の発症予防、又はマラリア感染症の治療のために有用である。ここで、「マラリア原虫の感染予防」とは、マラリア原虫が宿主へ感染することを防ぐことである。「マラリア原虫感染後の発症予防」とは、マラリア原虫の感染によって宿主が示す様々な症状の発現を防ぐことであり、例えば、高熱や頭痛、吐き気、意識障害や腎不全等の症状が含まれる。「マラリア感染症の治療」とは、マラリア原虫の感染によって引き起こされる症状を治癒あるいは軽快させることである。
【００５６】
医薬組成物の対象者への投与形態、投与経路などは、その目的及び投与対象者に応じて、適宜決定できる。例えば注射剤、経皮剤、吸入・点鼻剤、経口剤などの適当な投与形態で、静脈、動脈、皮下、筋肉内、経皮、経鼻、経口的に投与することができる。一般的にワクチンとしては注射剤の筋肉内投与が汎用されており、かかる投与形態および投与経路は本発明の医薬組成物にも適応可能である。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等）のいずれの方法も適用することができる。
【００５８】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに本発明のポリヌクレオチドを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。その他の方法としては、発現プラスミドを直接投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターをワクチンとして作用させるには、当該ポリヌクレオチド等を直接体内に導入する in vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外で当該ポリヌクレオチド等を導入しその細胞を体内に戻す ex vivo法がある（日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等）。中でも、In vivo法がより好ましい。
【００６０】
In vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、医薬上許容されるキャリアー（担体）を加えてもよい。また、本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）としてもよく、この場合、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。本発明の医薬組成物は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入されたウイルスで感染された細胞培養液の形態とすることもできる。
【００６１】
各種製剤中の有効成分の投与量および投与スケジュールは、投与目的、対象者の年齢、体重などにより適宜調節することができる。例えば、本発明のポリペプチドの投与量は、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ〜１０ｍｇである。
【００６２】
本発明の医薬組成物の投与スケジュールは、投与目的、対象者の年齢、体重などにより適宜調節することができる。例えば、投与回数は１回であってもよく、数日もしくは数週間隔で複数回（例えば２〜５回）投与してもよい。また、第１期の投与として、１回または複数回（例えば２〜５回）の投与を行い、免疫応答の維持または強化に必要とされる期間後に（例えば１年〜１０年後）に、第２期の投与として１回または複数回（例えば２〜５回）の投与を行ってもよい。
【００６３】
本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドに、１又は複数の当業者に公知の他のマラリアワクチン抗原を適宜選択し、組合せることもできる。本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドに加えて他のマラリアワクチン抗原を含んでもよく、他のマラリアワクチン抗原と併用して投与してもよい。併用する場合、本発明の医薬組成物と他のマラリアワクチン抗原を含む組成物とは、混合して投与しても、別々に投与してもよい。すなわち、本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドを含む組成物と他のマラリアワクチン抗原を含む組成物とを組み合わせてなるキットの形態で提供されてもよい。他のマラリアワクチン抗原としては、ＣＳＰ、ＴＲＡＰ、ＭＳＰ１、ＡＭＡ−１、ＳＥＲＡ５、Ｒｉｐｒ、ＥＢＡ１７５、ＲＨ５、Ｐｆｓ２５及びＰｆｓ２３０、並びにこれらの類縁体等が挙げられる。当該類縁体としては、抗原タンパク質の断片ペプチド（部分ペプチド）、抗原タンパク質もしくはその断片ペプチドにおいて１又は複数、好ましくは１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたもの、これらの抗原タンパク質もしくはその断片ペプチドの１又は複数、好ましくは１又は数個が融合されたポリペプチド等を挙げることができる。
【００６４】
本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドに、１又は複数の当業者に公知の他の感染症ワクチン抗原を適宜選択し、組合せることもできる。本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドに加えて他の感染症ワクチン抗原を含んでもよく、他の感染症ワクチン抗原と併用して投与してもよい。併用する場合、本発明の医薬組成物と他の感染症ワクチン抗原を含む組成物とは、混合して投与しても、別々に投与してもよい。すなわち、本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドを含む組成物と他の感染症ワクチン抗原を含む組成物とを組み合わせてなるキットの形態で提供されてもよい。当該感染症としては、ポリオ、ジフテリア、百日咳、破傷風等が挙げられる。これらの感染症ワクチン抗原については当業者に周知のものを適宜選択することができるが、百日咳菌防御抗原、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、不活化ポリオウイルスを挙げることができる。
【００６５】
また、本発明は、本発明の医薬組成物をヒトに投与することを含む、マラリア原虫の感染予防方法、マラリア原虫感染後の発症予防方法、又はマラリア感染症の治療方法を包含する。
【実施例】
【００６６】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【００６７】
実施例１
コムギにコドン改変したGAMA合成ＤＮＡのＣ末端にＨｉｓタグを付加した配列を組み込んだｐＥＵ−Ｅ０１−ＭＣＳベクター、およびGAMAコドン改変ＤＮＡからサブクローニングした８種類の分断体のＣ末端にＨｉｓタグを付加した配列を組み込んだｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＴＥＶ−Ｎ２ベクター、を鋳型として転写を行った。いずれのペプチドも、Ｎ末端にＭｅｔ、Ｃ末端に６×Ｈｉｓをコードする配列を付加した配列を鋳型として合成した。
【００６８】
配列番号２で示されるアミノ酸配列の第２５番目〜７１５番目のアミノ酸をコードするコムギコドン配列を配列番号５に、第６０２番目〜第７１５番目のアミノ酸（配列番号４）をコードするコムギコドン配列を配列番号６に、それぞれ示す。得られたｍＲＮＡの全量をコムギ胚芽無細胞タンパク質合成キットWEPRO（登録商標）7240H（セルフリーサイエンス社）を用いてタンパク質合成を行った。得られたタンパク質合成反応液をニッケルセファロース６ Fast Flow（GE Healthcare）を用いてアフィニティー精製した。０．１４ｍｇのポリペプチドを含む抗原溶液を同容量のフロイント完全アジュバントと混合し、ウサギ皮下に感作した。さらに初回感作の４週間後に０．１ｍｇのポリペプチドを含む抗原溶液を同容量のフロイント完全アジュバントと混合し、皮下に追加感作した。初回感作６週間後に採血し、血清を調製した。HiTrap protein G Sepharose column (GE Healthcare)を用いて血清からＩｇＧを精製し、さらに正常ヒト赤血球を添加し、非特異的に赤血球に結合するＩｇＧを除去したものをポリクローナル抗体とした。ポリクローナル抗体、ヒト赤血球、およびマラリア原虫感染赤血球を２５時間混合培養し、サイバーグリーンで原虫の核を染色した後、マラリア原虫感染赤血球数をＦＡＣＳを用いて定量した。マラリア原虫増殖阻害率は、抗体未処置群のマラリア原虫感染赤血球数を１００とした時の各抗体処置群のマラリア原虫感染赤血球数を求め、さらに１００から除して算出した。
【００６９】
試験した全長GAMA及び８種類の分断体（抗原ペプチド）は以下のとおりである。
GAMA full(全長GAMA)：配列番号２の第２５番目〜第７１５番目のアミノ酸配列からなるペプチド
GAMA 1-1：配列番号２の第２５番目〜第１２９番目のアミノ酸配列からなるペプチド
GAMA 1-2：配列番号２の第１３０番目〜第２４１番目のアミノ酸配列からなるペプチド
GAMA 1-3：配列番号２の第２４２番目〜第３７２番目のアミノ酸配列からなるペプチド
GAMA 1-4：配列番号２の第４６５番目〜第６０１番目のアミノ酸配列からなるペプチド
GAMA 1-5：配列番号２の第６０２番目〜第７１５番目のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号４）
GAMA 2-1：配列番号２の第７６番目〜第１８４番目のアミノ酸配列からなるペプチド
GAMA 2-2：配列番号２の第１８５番目〜第３０６番目のアミノ酸配列からなるペプチド
GAMA 2-3：配列番号２の第５３３番目〜第６５８番目のアミノ酸配列からなるペプチド
【００７０】
結果を図１に示す。この結果から、GAMA1-5のペプチドがマラリア原虫増殖阻害活性を示し、全長GAMAよりも高いマラリア原虫増殖阻害活性を示すことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、および抗体は、マラリア感染症への感染又はマラリア感染症の発症の予防に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００７２】
配列番号３：配列番号２の第６０２番目〜第７１５番目のアミノ酸配列をコードする核酸配列
配列番号４：配列番号２の第６０２番目〜第７１５番目のアミノ酸配列
配列番号５：配列番号２の第２５番目〜第７１５番目のアミノ酸配列をコードするコムギコドン配列
配列番号６：配列番号２の第６０２番目〜第７１５番目のアミノ酸配列をコードするコムギコドン配列
【図１】
2020028219.tif 000003
【配列表】
2020028219000001.app