(57)【要約】  【課題】擬塑性に優れた３Ｄプリンティングシステム用インクを提供する。  【解決手段】シルクナノファイバー、並びに、天然高分子及び／又は合成高分子を含む、３Ｄプリンティングシステム用インク。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シルクナノファイバー、並びに、天然高分子及び／又は合成高分子を含む、３Ｄプリンティングシステム用インク。
【請求項２】
シルクナノファイバーの濃度は、０．１質量％以上である、請求項１に記載の３Ｄプリンティングシステム用インク。
【請求項３】
天然高分子及び／又は合成高分子が、多糖類、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ポリ（アミノ酸）、ポリ乳酸、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、キトサン、ポリグルタミン酸、アルブミン、ゼラチン、デキストラン、プルラン、カラギーナン、コラーゲン、カードラン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、フコイダン、アミロース、アミロペクチン、ペクチン、及びポリビニルアルコール、並びにそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の３Ｄプリンティングシステム用インク。
【請求項４】
天然高分子及び／又は合成高分子の濃度は、０．１質量％以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の３Ｄプリンティングシステム用インク。
【請求項５】
ｐＨが２．０〜１４．０である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の３Ｄプリンティングシステム用インク。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３Ｄプリンティングシステム用インクに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療などの様々な分野への応用を目指した、３次元細胞培養技術が発達しており、中でも複雑な組織を再現することが可能であるため、３Ｄバイオプリンティングが注目されている。
【０００３】
３Ｄバイオプリンティングとは、細胞含有ゲル材料を目的箇所に層状に吐出し、ゲル化させながら定着させ、積層していくことによって、細胞が３次元的に配置された３次元ゲル構造体を作製する技術であり、コンピュータを用いて細胞の密度や配置を高精度で制御することが可能である。
【０００４】
プリンティング技術には主に、インクジェット式、レーザー光式、押し出し式の三つのタイプが存在しており（非特許文献１）、中でも押し出し式３Ｄプリンティングにおいてインクの粘度は重要なパラメーターとなる。インクが低粘度であると、液体の状態で基盤上にプリントされることにより、造形物の形状の変形が発生しやすく造形が不安定になるという問題がある。また、インクが高粘度であると、基板上での形状維持には適しているものの、ノズルからの吐出時に高い圧力が必要となり、細胞生存率が低下してしまうという問題がある。
【０００５】
従って、ノズルからの吐出時には粘度が低く、且つ、プリント後の基板上では粘度が高い、いわゆる擬塑性に優れた３Ｄプリンティングシステム用インクの開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】V.K. Lee, G. Dai,”Printing of Three-Dimensional Tissue Analogs for Regenerative Medicine”, Ann Biomed Eng 45(1) (2017) 115-131.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、擬塑性に優れた３Ｄプリンティングシステム用インクを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、シルクナノファイバー、並びに、天然高分子及び／又は合成高分子を含有する３Ｄプリンティングシステム用インクによれば、上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、下記の３Ｄプリンティングシステム用インクに関する。
１．シルクナノファイバー、並びに、天然高分子及び／又は合成高分子を含む、３Ｄプリンティングシステム用インク。
２．シルクナノファイバーの濃度は、０．１質量％以上である、項１に記載の３Ｄプリンティングシステム用インク。
３．天然高分子及び／又は合成高分子が、多糖類、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ポリ（アミノ酸）、ポリ乳酸、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、キトサン、ポリグルタミン酸、アルブミン、ゼラチン、デキストラン、プルラン、カラギーナン、コラーゲン、カードラン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、フコイダン、アミロース、アミロペクチン、ペクチン、及びポリビニルアルコール、並びにそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種である、項１又は２に記載の３Ｄプリンティングシステム用インク。
４．天然高分子及び／又は合成高分子の濃度は、０．１質量％以上である、項１〜３のいずれか１項に記載の３Ｄプリンティングシステム用インク。
５．ｐＨが２．０〜１４．０である、項１〜４のいずれか１項に記載の３Ｄプリンティングシステム用インク。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の３Ｄプリンティングシステム用インクは、シルクナノファイバー、並びに、天然高分子及び／又は合成高分子を含有することにより、優れた擬塑性を示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】シルクナノファイバー、ヒアルロン酸が、溶液の剪断速度に対する粘度に与える影響を示す図である。
【図２】シルクナノファイバー、アルギン酸が、溶液の剪断速度に対する粘度に与える影響を示す図である。
【図３】シルクナノファイバー、キトサンが、溶液の剪断速度に対する粘度に与える影響を示す図である。
【図４】シルクナノファイバー、ポリビニルアルコールが、溶液の剪断速度に対する粘度に与える影響を示す図である。
【図５】シルクナノファイバーの濃度が、溶液の剪断速度に対する粘度に与える影響を示す図である。
【図６】シルクナノファイバー、フェノール性水酸基導入ヒアルロン酸が、溶液の剪断速度に対する粘度に与える影響を示す図である。
【図７】オートクレーブ処理の有無が、溶液の剪断速度に対する粘度に与える影響を示す図である。
【図８】ゲル化時間の検討結果を示す図である。
【図９】格子形状の３Ｄプリンティングの設計図を示す図である。
【図１０】３Ｄプリンティングシステム用インクを用いて作製した格子形状の構造物を示す図である。
【図１１】３Ｄプリンティングシステム用インクを用いて作製した格子形状の構造物を示す図である。
【図１２】３Ｄプリンティングシステム用インクを用いて作製した格子形状の構造物を示す図である。
【図１３】３Ｄプリンティングシステム用インクを用いて作製した格子形状の構造物を示す図である。
【図１４】ディスク形状の３Ｄプリンティングの設計図を示す図である。
【図１５】３Ｄプリンティングシステム用インクを用いて作製したディスク形状の構造物を示す図である。
【図１６】３Ｄプリンティングシステム用インクを用いて作製したディスク形状の構造物を示す図である。
【図１７】３Ｄプリンティングシステム用インクを用いて作製したディスク形状の構造物を示す図である。
【図１８】３Ｄプリンティングシステム用インクを用いて作製したディスク形状の構造物を示す図である。
【図１９】リング１形状、リング２形状、及び、直方体の３Ｄプリンティングの設計図を示す図である。
【図２０】３Ｄプリンティングシステム用インクを用いて作製したリング１形状、リング２形状、及び、直方体の構造物を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の３Ｄプリンティングシステム用インクは、シルクナノファイバー、並びに、天然高分子及び／又は合成高分子を含有することを特徴とする。上記構成を備える本発明の３Ｄプリンティングシステム用インクは、シルクナノファイバーを含有するので、ノズルからの吐出時には粘度が低く、且つ、プリント後の基板上では粘度が高くなっており、高い擬塑性を示すことができる。また、本発明の３Ｄプリンティングシステム用インクは、天然高分子及び／又は合成高分子を含有するので、基板上での粘度が高くなっており、３Ｄプリンティングにより形成される３次元ゲル構造体の造形を安定させることができる。
【００１３】
本明細書において、擬塑性とは、剪断等により物質に対する圧力が増加すると、物質の粘度が低下して流動性が増加し、圧力が減少すると、物質の粘度が増加して流動性が低下する性質を意味する。
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１５】
１．３Ｄプリンティングシステム用インク
本発明の３Ｄプリンティングシステム用インクは、シルクナノファイバー、並びに、天然高分子及び／又は合成高分子を含む。
【００１６】
シルクナノファイバーとしては特に限定されず、シルクを解繊して得られる微細繊維を用いることができる。より具体的には、天然物から精製したものや商業的に入手可能なものなどを使用することができる。なお、シルクは主にフィブロインとセリシンの２種類のタンパク質から構成されるが、本発明に用いられるシルクナノファイバーはセリシンを含んでいてもよく、セリシンを含んでいなくてもよい。
【００１７】
上記シルクナノファイバーは、例えば、例えば、シルクを含有する溶液から、電界紡糸や湿式紡糸する方法により得られるシルクナノファイバーを用いることにより製造することができる。
【００１８】
シルクナノファイバーの平均短径は、０．０１ｎｍ以上が好ましく、０．１ｎｍ以上がより好ましく、１ｎｍ以上が更に好ましく、５ｎｍ以上が特に好ましい。また、シルクナノファイバーの平均短径は、５００ｎｍ以下が好ましく、３００ｎｍ以下がより好ましく、２００ｎｍ以下が更に好ましく、１００ｎｍ以下が特に好ましい。シルクナノファイバーの平均短径の上限が上記範囲であると、３Ｄプリンティングシステム用インクの粘度が高くなり過ぎず、ノズルからの吐出時の圧力がより一層低減される。また、シルクナノファイバーの平均短径の下限が上記範囲であると、３Ｄプリンティングシステム用インクの擬塑性がより一層向上する。
【００１９】
３Ｄプリンティングシステム用インク中のシルクナノファイバーの濃度は、０．１質量％以上が好ましく、０．５質量％以上がより好ましく、０．８質量％以上が更に好ましい。また、３Ｄプリンティングシステム用インク中のシルクナノファイバーの濃度は、１０．０質量％以下が好ましく、５．０質量％以下がより好ましい。シルクナノファイバーの濃度の上限が上記範囲であると、３Ｄプリンティングシステム用インクの粘度が高くなり過ぎず、ノズルからの吐出時の圧力がより一層低減される。また、シルクナノファイバーの濃度の下限が上記範囲であると、３Ｄプリンティングシステム用インクの擬塑性がより一層向上する。
【００２０】
天然高分子及び合成高分子としては特に限定されず、例えば、多糖類、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ポリ（アミノ酸）、ポリ乳酸、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、キトサン、ポリグルタミン酸、アルブミン、ゼラチン、デキストラン、プルラン、カラギーナン、コラーゲン、カードラン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、フコイダン、アミロース、アミロペクチン、ペクチン、シルクフィブロイン、及びポリビニルアルコールが好ましく、多糖類、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ポリ（アミノ酸）、ポリ乳酸、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、キトサン、ポリグルタミン酸、アルブミン、ゼラチン、デキストラン、プルラン、カラギーナン、コラーゲン、カードラン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、フコイダン、アミロース、アミロペクチン、ペクチン、及びポリビニルアルコール等がより好ましい。また、誘導体としては特に限定されず、架橋性の官能基が導入されたものが好ましい。架橋性の官能基としては、例えば、フェノール性水酸基、ベンゾフェノン基、メタクリロイル基等が挙げられる。これらの中でも、３Ｄプリンティングシステム用インクの擬塑性がより一層向上する点で、ヒアルロン酸、アルギン酸、キトサン、ポリビニルアルコール、ゼラチン及びこれらのフェノール性水酸基導入体が好ましい。
【００２１】
上記天然高分子又は合成高分子は、一種単独で用いてもよいし、二種以上を混合して使用してもよい。
【００２２】
３Ｄプリンティングシステム用インク中の天然高分子溶液又は合成高分子溶液中の天然高分子又は合成高分子の濃度は、０．１質量％以上が好ましく、０．３質量％以上がより好ましく、１．０質量％以上が更に好ましく、２．０質量％以上が特に好ましい。また、天然高分子溶液又は合成高分子溶液中の天然高分子又は合成高分子の濃度は、３０．０質量％以下が好ましく、１５．０質量％以下がより好ましく、１０．０質量％以下が更に好ましい。天然高分子又は合成高分子の濃度の上限が上記範囲であると、３Ｄプリンティングシステム用インクの擬塑性がより一層向上する。また、天然高分子又は合成高分子の濃度の下限が上記範囲であると、３Ｄプリンティングシステム用インクの粘度が高くなり過ぎず、ノズルからの吐出時の圧力がより一層低減される。
【００２３】
なお、３Ｄプリンティングシステム用インク中に天然高分子及び合成高分子が二種以上含まれる場合、上記の濃度は、３Ｄプリンティングシステム用インク中に含まれる全ての天然高分子及び合成高分子の合計の濃度を意味する。
【００２４】
本発明の３Ｄプリンティングシステム用インクのｐＨは、２．０〜１４．０であることが好ましく、３．０〜１２．０であることがより好ましく、４．０〜７．０であることが更に好ましい。ｐＨが上記範囲であることにより、３Ｄプリンティングシステム用インクの擬塑性がより一層向上する。
【００２５】
本発明の３Ｄプリンティングシステム用インクは、シルクナノファイバー、天然高分子及び／又は合成高分子の他に、その他の成分を含有していてもよい。このようなその他の成分としては、分子間に架橋を形成させる反応を触媒する酵素、光重合開始剤、光増感剤等が挙げられる。
【００２６】
分子間に架橋を形成させる反応を触媒する酵素としては特に限定されず、例えば、西洋わさび由来ぺルオキシターゼ（ＨＲＰ）、トランスグルタミナーゼ、チロシナーゼ等が挙げられる。これらの中でも、３Ｄプリンティングシステム用インクの吐出後のゲル化時間がより一層早くなる点で、西洋わさび由来ぺルオキシターゼが好ましい。
【００２７】
３Ｄプリンティングシステム用インク中のＨＲＰ酵素の含有量は、０．１〜１００００Ｕ／ｍｌが好ましく、０．５〜２０００Ｕ／ｍｌがより好ましく、１〜５００Ｕ／ｍｌが更に好ましい。ＨＲＰ酵素の含有量の上限が上記範囲であると、ＨＲＰ酵素を過剰に添加することなく３Ｄプリンティングシステム用インクのゲル化時間をより一層早くすることができる。また、ＨＲＰ酵素の含有量の下限が上記範囲であると、３Ｄプリンティングシステム用インクのゲル化時間がより一層早くなる。
【００２８】
本発明の３Ｄプリンティングシステム用インクは、擬塑性に優れているため、３Ｄプリンティングシステムに用いるためのインクに好適に用いることができる。
【００２９】
２．３Ｄプリンティングシステム用インクの製造方法
本発明の３Ｄプリンティングシステム用インクを製造する製造方法としては、シルクナノファイバー分散液を調製する工程を含む製造方法が挙げられる。
【００３０】
シルクナノファイバー分散液を調製する調製方法としては、特に制限されず、溶媒中にシルクナノファイバーを従来公知の方法により添加して分散させる調製方法が挙げられる。
【００３１】
溶媒としては、シルクナノファイバーを分散することができれば特に制限されず、例えば、水、体液とほぼ等張とした水溶液、水と有機溶媒との混合物などが挙げられる。これらの中でも、安全性に優れる点で水が好ましい。すなわち、シルクナノファイバー分散液として、シルクナノファイバー水分散液を用いることが好ましい。また、本発明の３Ｄプリンティングシステム用インクの動物細胞の生存性がより一層向上する点で、体液とほぼ等張とした水溶液が好ましい。
【００３２】
シルクナノファイバー分散液のｐＨは、２．０〜１４．０であることが好ましく、３．０〜１２．０であることがより好ましく、４．０〜８．０であることが更に好ましい。ｐＨが上記範囲であることにより、３Ｄプリンティングシステム用インクの擬塑性がより一層向上する。
【００３３】
シルクナノファイバー分散液中のシルクナノファイバーの濃度は、０．１質量％以上が好ましく、０．５質量％以上がより好ましい。また、シルクナノファイバー分散液中のシルクナノファイバーの濃度は、１０．０質量％以下が好ましく、５．０質量％以下がより好ましい。シルクナノファイバー分散液中のシルクナノファイバーの濃度の上限が上記範囲であると、３Ｄプリンティングシステム用インクの粘度が高くなり過ぎず、ノズルからの吐出時の圧力がより一層低減される。また、シルクナノファイバー分散液中のシルクナノファイバーの濃度の下限が上記範囲であると、３Ｄプリンティングシステム用インクの擬塑性がより一層向上する。
【００３４】
本発明の３Ｄプリンティングシステム用インクの製造方法としては、さらにシルクナノファイバー分散液と、天然高分子及び／又は合成高分子とを混合する工程を含んでいることが好ましい。天然高分子又は合成高分子としては、上述の天然高分子又は合成高分子を用いることができる。天然高分子及び／又は合成高分子は、シルクナノファイバー分散液に溶解させてもよく、天然高分子及び／又は合成高分子を適当な溶媒に溶解させて、天然高分子及び／又は合成高分子を含む高分子溶液とした後にシルクナノファイバー分散液と混合してもよい。
【００３５】
天然高分子及び／又は合成高分子を適当な溶媒に溶解させる場合、溶媒としては、天然高分子及び／又は合成高分子を溶解することができれば特に制限されず、例えば、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水と有機溶剤との混合物などが挙げられる。上記有機溶剤としては特に限定されず、例えば、エタノール、グリセリン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。天然高分子及び／又は合成高分子を含む高分子溶液のｐＨは、２．０〜１４．０であることが好ましく、３．０〜１２．０であることがより好ましく、５．０〜８．０であることが更に好ましい。ｐＨが上記範囲であることにより、３Ｄプリンティングシステム用インクの擬塑性がより一層向上する。
【００３６】
高分子溶液中の天然高分子溶液及び／又は合成高分子の濃度は０．１質量％以上が好ましく、０．３質量％以上がより好ましく、１．０質量％以上が更に好ましく、２．０質量％以上が特に好ましい。また、高分子溶液中の天然高分子及び／又は合成高分子の濃度は、３０．０質量％以下が好ましく、１５．０質量％以下がより好ましく、１０．０質量％以下が更に好ましい。高分子溶液中の天然高分子及び／又は合成高分子の濃度の上限が上記範囲であると、３Ｄプリンティングシステム用インクの擬塑性がより一層向上する。また、高分子溶液中の天然高分子及び／又は合成高分子の濃度の下限が上記範囲であると、３Ｄプリンティングシステム用インクの粘度が高くなり過ぎず、ノズルからの吐出時の圧力がより一層低減される。
【実施例】
【００３７】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されない。また各図表において、シルクナノファイバー、ヒアルロン酸、アルギン酸、キトサン、ポリビニアルコール、フェノール性水酸基導入ヒアルロン酸、およびセルロースナノファイバーは、それぞれＳＮＦ、ＨＡ、Ａｌｇ、Ｃｈｉｔｏｓａｎ、ＰＶＡ、ＨＡ−Ｐｈ、ＣＮＦと表記することがある。
【００３８】
試験例１（シルクナノファイバー及び天然高分子又は合成高分子が、溶液の剪断速度に対する粘度に与える影響）
シルクナノファイバーを濃度１．０質量％となるようにＰＢＳ（Phosphate buffered saline）溶液と混合し、十分に攪拌して、シルクナノファイバー分散液を調製した。シルクナノファイバーは、ながすな繭株式会社製のシルクナノファイバーを用いた。
【００３９】
次いで、ＰＢＳを溶媒として、ヒアルロン酸（図１：実施例１（１．５質量％）、実施例２（０．５質量％））、アルギン酸（図２：実施例３（１．５質量％）、実施例４（０．５質量％））、キトサン（図３：実施例５（１．５質量％）、実施例６（０．５質量％））、または、ポリビニアルコール（図４：実施例７（６．０質量％）、実施例８（３．０質量％））の溶液を調製した。ＰＢＳを溶媒として調製したシルクナノファイバー分散液と上記溶液を図１〜４に示す最終濃度となるようにそれぞれ混合し、十分に撹拌した。
【００４０】
次いで、１回あたり８００μｌの溶液を用いて、円盤式レオメーターによりそれぞれの溶液の粘度測定を行った（ｎ＝３）。測定条件は、ギャップ５００μｍ、剪断速度１〜１０００Ｓ−１、測定温度３７℃とした。ただし、キトサンは酸性条件でのみ溶解するため、ＨＣｌを用いてｐＨを４．６〜４．８付近に調整し、溶解させた。また、ポリビニルアルコールは８０．０℃に設定したオイルバス中で加温して溶解させた。
【００４１】
以上の方法により、実施例１（図１のＳＮＦ１．０質量％＋ＨＡ１．５質量％）、実施例２（図１のＳＮＦ１．０質量％＋ＨＡ０．５質量％）、実施例３（図２のＳＮＦ１．０質量％Ａｌｇ１．５質量％）、実施例４（図２のＳＮＦ１．０質量％Ａｌｇ０．５質量％）、実施例５（図３のＳＮＦ１．０質量％Ｃｈｉｔｏｓａｎ１．５質量％）、実施例６（図３のＳＮＦ１．０質量％Ｃｈｉｔｏｓａｎ０．５質量％）、実施例７（図４のＳＮＦ１．０質量％ＰＶＡ６．０質量％）、及び、実施例８（図４のＳＮＦ１．０質量％ＰＶＡ３．０質量％）の溶液を調製し、粘度を測定した。
【００４２】
また、比較例として、ＰＢＳを溶媒として、ヒアルロン酸（図１：比較例１（ＨＡ０．５質量％））、アルギン酸（図２：比較例２（Ａｌｇ１．５質量％）、比較例３（Ａｌｇ０．５質量％））、キトサン（図３：比較例４（Ｃｈｉｔｏｓａｎ１．５質量％）、比較例５（Ｃｈｉｔｏｓａｎ０．５質量％）の溶液を調製し、試験例１と同様の条件で粘度を測定した。また、図１〜４に、比較例５（ＳＮＦ１．０質量％）の粘度の測定結果を示した。
【００４３】
＜結果＞
シルクナノファイバーと、天然高分子又は合成高分子とを用いた場合、静止時にはシルクナノファイバーのみ又は高分子のみの場合と比べて非常に高い粘度を示すが、剪断速度の上昇に従い粘度は大きく減少することが分かった（図１〜４）。シルクナノファイバーと天然高分子及び／又は合成高分子とを含む３Ｄプリンティングシステム用インクを使用した場合、ノズルからインクが吐出される時には、ノズル内でインクの粘度が低下するため、低い圧力でインクを押し出すことが可能になり、細胞への負荷や目詰まりによるプリントの乱れを抑制することができる。一方、吐出後には粘度が復活するため、造形物が安定すると考えられる。この結果からシルクナノファイバーに天然高分子及び／又は合成高分子を組み合わせることによって、擬塑性が向上することが分かった。
【００４４】
試験例２（シルクナノファイバー及びアルギン酸を含む溶液において、シルクナノファイバーの濃度が、溶液の剪断速度に対する粘度に与える影響）
試験例１と同様にして、ＰＢＳを溶媒として調製したシルクナノファイバー分散液およびアルギン酸水溶液を、図５に示す最終濃度となるようにそれぞれ混合し、十分に撹拌し、試験例１と同様の条件で粘度を測定した。
【００４５】
以上の方法により、実施例９（図５：ＳＮＦ１．０質量％Ａｌｇ１．５質量％）、及び、実施例１０（図５：ＳＮＦ０．５質量％Ａｌｇ１．５質量％）の溶液を調製し、試験例１と同様の条件で粘度を測定した。
【００４６】
また、ＰＢＳを溶媒として、比較例として、アルギン酸（図５：比較例６（Ａｌｇ１．５質量％））、シルクナノファイバー（図５：比較例７（ＳＮＦ１．０質量％）、比較例７（ＳＮＦ０．５質量％）、比較例８（ＳＮＦ０．１質量％））の溶液を調製し、試験例１と同様の条件で粘度を測定した。
【００４７】
＜結果＞
シルクナノファイバーの濃度が１．０質量％又は０．５質量％の場合、アルギン酸と併用することによって、静止時には、シルクナノファイバーのみ又はアルギン酸のみの場合と比べて非常に高い粘度を示すが、剪断速度の上昇に従い粘度は大きく減少しており、擬塑性を示すことが分かった（図５）。
【００４８】
試験例３（シルクナノファイバーとフェノール性水酸基導入ヒアルロン酸が、溶液の剪断速度に対する粘度に与える影響）
以下の手順に従って、ヒアルロン酸にフェノール性水酸基を導入した。ｐＨ６．０の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液を作製し、これにヒアルロン酸ナトリウムを溶解した。さらに、少量のミリＱ水にそれぞれ溶解させたＷＳＣＤ・ＨＣｌ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）およびチラミン塩酸塩を混合し、２４時間撹拌した。ＮａＯＨによりｐＨ８．６として反応を停止させた。十分量のアセトンに反応溶液を添加しフェノール性水酸基導入ヒアルロン酸（ＨＡ−Ｐｈ）を析出させた。析出したＨＡ−Ｐｈを８０％エタノールで洗浄した。この操作は、洗浄後のエタノール溶液の吸光度を測定し、チラミンの存在を示す２７５ｎｍ付近にピークが見られなくなるまで行った。１００％エタノールで脱水後、得られたＨＡ−Ｐｈを真空乾燥させてエタノールを除去し、４℃で保存した。反応組成を以下の表１に示す。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
上記で調製したＨＡ−ＰｈおよびＰＢＳを溶媒として調製したシルクナノファイバー分散液を、図６に示す最終濃度となるようにそれぞれ混合し、十分に撹拌し、試験例１と同様の条件で粘度を測定した。
【００５１】
以上の方法により、実施例１１（図６：ＳＮＦ１．０質量％ＨＡ−Ｐｈ１．５質量％）、及び、実施例１２（図６：ＳＮＦ０．５質量％ＨＡ−Ｐｈ１．５質量％）の溶液を調製し、試験例１と同様の条件で粘度を測定した。
【００５２】
また、比較例として、ＰＢＳを溶媒として、シルクナノファイバー（図６：比較例９（ＳＮＦ１．０質量％）、比較例１０（ＳＮＦ０．５質量％））の溶液を調製し、試験例１と同様の条件で粘度を測定した。
【００５３】
＜結果＞
シルクナノファイバーとＨＡ−Ｐｈを用いた場合、静止時にはシルクナノファイバーのみの場合と比べて非常に高い粘度を示すが、剪断速度の上昇に従い粘度は大きく減少することが分かった（図６）。この結果からシルクナノファイバーにフェノール性水酸基を導入した天然高分子又は合成高分子を組み合わせることによって、擬塑性が向上することが分かった。
【００５４】
試験例４（オートクレーブ処理の有無が、溶液の剪断速度に対する粘度に与える影響）
ナノファイバー溶液をバイオプリンティングに応用するためには、滅菌処理を行う必要がある。一般的にナノファイバー溶液は、乾燥過程で凝集体の形成が起こることで分散性を失い、乾燥後のナノファイバーを溶媒中に再分散させることも困難である。そのため、一度乾燥処理を行うエタノール滅菌は適用できない。よって、本試験では、シルクナノファイバーをオートクレーブにより加熱滅菌することによる影響を確認した。
【００５５】
シルクナノファイバーを濃度１．０質量％となるようにＰＢＳ溶液と混合し、十分に撹拌し、試験例１と同様の条件で粘度を測定した（参考例１  図７：ＳＮＦ）。また、比較例１１で調製したシルクナノファイバー溶液をスクリュー管に詰め、オートクレーブにより１２１℃で２０分間加熱を行った後、試験例１と同様の条件で粘度を測定した（参考例２  図７：ＳＮＦ（ａｕｔｏｃｌａｖｅｄ））。
【００５６】
また、シルクナノファイバーに代えて、セルロースナノファイバーを用いたこと以外は同様に、セルロースナノファイバーを用いて粘度を測定し（比較参考例１  図７：ＣＮＦ）、オートクレーブにより加熱して粘度を測定した（比較参考例２  図７：ＣＮＦ（ａｕｔｏｃｌａｖｅｄ））。
【００５７】
＜結果＞
シルクナノファイバーと比較してセルロースナノファイバーはオートクレーブ処理により粘度が大きく上昇することが分かった（図７）。この結果から、シルクナノファイバーは加熱後の変性が少ない素材であるといえ、オートクレーブによる加熱滅菌処理を行えることから、これまで多くバイオインクとして用いられてきたセルロースナノファイバーの代替となりうる有用なバイオインク素材であると考えられる。
【００５８】
試験例５（ゲル化時間の検討）
吐出後の３Ｄプリンティングシステム用インクがゲル化するまでの時間（ゲル化時間）が遅いと、３Ｄプリンティングシステム用インクが流れ落ちることにより、造形精度が下がると考えられる。本試験では、ゲル化促進の手段として、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ （ＨＲＰ）の酵素反応を用いた際のゲル化時間の影響を確認した。
【００５９】
ＰＢＳを溶媒として、シルクナノファイバー、フェノール性水酸基導入ヒアルロン酸（ＨＡ−Ｐｈ）、及び、ＨＲＰのそれぞれの分散液又は溶液を調製した。次いで、上記分散液又は溶液を、表２に示す濃度となるようにそれぞれ混合し、十分に撹拌して、実施例１３（図８：ＳＮＦ（＋）ＨＲＰ１Ｕ／ｍＬ）、実施例１４（図８：ＳＮＦ（＋）ＨＲＰ５Ｕ／ｍＬ）、実施例１５（図８：ＳＮＦ（＋）ＨＲＰ１０Ｕ／ｍＬ）、比較例１１（図８：ＳＮＦ（−）ＨＲＰ１Ｕ／ｍＬ）、比較例１２（図８：ＳＮＦ（−）ＨＲＰ５Ｕ／ｍＬ）、比較例１３（図８：ＳＮＦ（−）ＨＲＰ１０Ｕ／ｍＬ）の試料を調製した。上述の方法により調製した試料を、２４ウェルプレートに４００μＬずつ入れた。次いで、ポンプより送り出した空気を１Ｍの過酸化水素溶液に通すことで過酸化水素蒸気を発生させ、当該蒸気に試料を撹拌した状態で曝露し、それぞれの試料が盛り上がった時点でゲル化とみなし、ゲル化時間を測定した。蒸気中の過酸化水素濃度は１４ｐｐｍであった。測定は３回行い、平均値を測定値とした。結果を図８に示す。
【００６０】
【表２】
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【００６１】
＜結果＞
図８から、ゲル化時間はＨＲＰ濃度に依存することが分かった。また、実施例１３と、実施例１４及び１５を対比することにより、ＨＲＰ濃度を５Ｕ／ｍＬ又は１０Ｕ／ｍＬとすると、１．０Ｕ／ｍＬとした場合よりもゲル化時間が著しく早くなることが分かった。また、実施例１４と実施例１５とを対比することにより、ＨＲＰ濃度が５Ｕ／ｍＬである場合と、１０Ｕ／ｍＬである場合とでは、ゲル化時間に大きな差がないことが分かった。また、実施例１３〜１５及び比較例１１〜１３を対比することにより、シルクナノファイバーを含有する試料の方が、ゲル化時間が早く、この傾向は、特にＨＲＰ濃度が低い場合に顕著であることが分かった。
【００６２】
試験例６（３Ｄプリンティングシステム用インクを用いた３Ｄプリンティング）
３Ｄプリンティングシステム用インクを用いて構造物を作製し、プリントの安定性（造形精度）について試験を行った。
【００６３】
フェノール性水酸基導入ヒアルロン酸（ＨＡ−Ｐｈ）、シルクナノファイバー水分散液、および西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を、下記の組成となるようにＰＢＳに溶解させた。
［実施例１６］（ＳＮＦ（＋））: ＨＡ−Ｐｈ(１．５％)、シルクナノファイバー(１．０％)、ＨＲＰ(５Ｕ／ｍＬ)
［比較例１４］（ＳＮＦ（−））: ＨＡ−Ｐｈ(１．５％)、ＨＲＰ(５Ｕ／ｍＬ)
【００６４】
実施例１６及び比較例１４の組成の３Ｄプリンティングシステム用インクを用いて、ポンプより送り出した空気を１Ｍの過酸化水素溶液に通すことで過酸化水素蒸気を発生させ、当該蒸気に曝露させつつ、以下に示すプリント条件に基づいて、格子、ディスク、リング、直方体の形状の３Ｄプリンティングを行った。
【００６５】
（条件）
針内径０．２２ｍｍ、ノズル移動速度２１．９ｍｍ／ｓ、１層の厚み０．１ｍｍ、ファイバーの幅０．２２ｍｍ、インク吐出速度３．００ｍｌ／ｈｒ、線速度２１．９ｍｍ／ｓ、蒸気中の過酸化水素濃度１４ｐｐｍ
（構造物の形状）
格子：１辺２０ｍｍ、高さ２．０ｍｍ
ディスク：直径１５ｍｍ、厚さ３．０ｍｍ 
リング１：外短径１０ｍｍ、外長径６０ｍｍ、内短径６ｍｍ、外長径４０ｍｍ
リング２：外短辺１０ｍｍ、外長辺６０ｍｍ、内短径２ｍｍ、長短径４０ｍｍ
直方体：長辺３５ｍｍ、短辺１０ｍｍ
【００６６】
以下の図に結果を示す。
［格子］設計図（図９）；実施例１６（図１０及び図１１）；比較例１４（図１２及び図１３）
[ディスク]設計図（図１４）；実施例１６（図１５及び図１６）；比較例１４（図１７及び図１８）
[リング１、リング２、直方体]設計図（図１９）；実施例１６（図２０）
【００６７】
＜結果＞
シルクナノファイバーを含有しない比較例１４のインクで作製したゲル構造物の形状は、シルクナノファイバーを含有する実施例１６のインクで作製したゲル構造物の形状と対比して、歪な形状となった。図１２及び図１３の結果から、比較例１４のインクで作製した格子の形状のゲル構造物は、吐出後に溶液が広がり、網目の部分が潰れることが分かった。図１７及び図１８の結果から、比較例１４のインクで作製したディスクの形状のゲル構造物は、厚みのある構造であるため、基盤となるディッシュから離れるに従い、プリントが不安定となり、結果としてディスク上面が平らにならず、丸みを帯びることが分かった。これは、インクの吐出時に、針先にゲルが付着し、作製したゲルがそれに引きずられてしまったためであると考えられる。一方、図１０、図１１、図１５、図１６、図２０の結果から、シルクナノファイバーを含有する実施例１６のインクで作製したゲル構造物の形状は、安定することが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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