(57)【要約】      （修正有）【課題】一塩基多型（ＳＮＰ）を含む遺伝子の対立遺伝子多様体の発現を選択的に低下させるための方法、化合物及び組成物の提供。【解決手段】一塩基多型部位を標的とする１２〜３０連結ヌクレオシドから成る修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、修飾オリゴヌクレオチドには、デオキシヌクレオシドギャップの５’末端に位置する５’ウィング領域、及びデオキシヌクレオシドの３’末端に位置する３’ウィング領域を有するウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５、又はギャップの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション１、２、３、４、５、６、７、８、又は９が一塩基多型と一致している化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一塩基多型部位を標的とする１２〜３０連結ヌクレオシドから成る修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、修飾オリゴヌクレオチドには、デオキシヌクレオシドギャップの５’末端に位置する５’ウィング領域、及びデオキシヌクレオシドの３’末端に位置する３’ウィング領域を有するウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５、又はギャップの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション１、２、３、４、５、６、７、８、又は９が一塩基多型と一致している化合物。
【請求項２】
一塩基多型部位が疾患と関連する突然変異対立遺伝子上にある、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
一塩基多型部位が識別用多型を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが１２〜２０連結ヌクレオシドから成る、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが１５〜２０連結ヌクレオシドから成る、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが１５〜１９連結ヌクレオシドから成る、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション８、９、若しくは１０、又はギャップの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション４、５、若しくは６が一塩基多型と一致する、請求項１、４、５、及び６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
ギャップ領域が７〜１１ヌクレオシド長であり、５’ウィング領域が１〜６核酸塩基長、及び３’ウィング領域が１〜６核酸塩基長である、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
ウイング−ギャップ−ウイングモチーフが、５−１０−５、２−９−６、３−９−３、３−９−４、３−９−５、４−７−４、４−９−３、４−９−４、４−９−５、４−１０−５、４−１１−４、４−１１−５、５−７−５、５−８−６、５−９−３、５−９−５、５−１０−４、５−１０−５、６−７−６、６−８−５、及び６−９−２から成る群の任意の１つである、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
ウイング−ギャップ−ウイングモチーフが、２−９−６、４−９−５、及び４−１１−４から成る群の任意の１つである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
少なくとも１つのヌクレオシド間連結が修飾ヌクレオシド間連結である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
各ヌクレオシド間連結がホスホロチオ酸ヌクレオシド間連結である、請求項２に記載の化合物。
【請求項１３】
少なくとも１つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
修飾核酸塩基が５’−メチルシトシンである、請求項５に記載の化合物。
【請求項１５】
少なくとも１つのウィング領域の少なくとも１つのヌクレオシドに修飾糖又は糖代用が含まれている、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
各ウィング領域の各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている、請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
糖又は糖代用が２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖である、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
ウィング領域の少なくとも１つに４’〜２’二環式ヌクレオシドが含まれ、残りのウィングのヌクレオシドの少なくとも１つが非二環式２’−修飾ヌクレオシドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１９】
非二環式２’−修飾ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドである、請求項１６に記載の化合物。
【請求項２０】
４’〜２’二環式ヌクレオシドが４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’二環式ヌクレオシドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項２１】
修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１７連結ヌクレオシドから成り、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション９が識別用多型と一致する、請求項１に記載の化合物。
【請求項２２】
ウィング−ギャップ−ウィングモチーフが２−９−６である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
１８連結ヌクレオシドから成り、識別用多型部位と９０％相補的である修飾オリゴヌクレオチドを含み、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション９が識別用多型と一致し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドに２’−Ｏ−メトキシエチル糖が含まれ、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフが４−９−５である化合物。
【請求項２４】
１９連結ヌクレオシドから成り、識別用多型部位に対し９０％相補的である修飾オリゴヌクレオチドを含み、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション１０が識別用多型と一致し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドに２’−Ｏ−メトキシエチル糖が含まれ、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフが４−１１−４である化合物。
【請求項２５】
１５〜１９連結ヌクレオシドから成り、識別用多型部位と相補的である修飾オリゴヌクレオチドであって、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４が識別用多型と一致している修飾オリゴヌクレオチド；及び、
少なくとも１つの高度親和性糖修飾；
を含む化合物。
【請求項２６】
修飾オリゴヌクレオチドが一塩基多型部位と１００％相補的である、請求項１に記載の
化合物。
【請求項２７】
少なくとも１つのウィング領域に高度親和性糖修飾が含まれる、請求項１に記載の化合物。
【請求項２８】
高度親和性糖修飾が二環式糖である、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
二環式糖に４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれる、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３０】
修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション２、３、６、９、１０、１１、１３、又は１４の少なくとも１つに、少なくとも１つの高度親和性糖修飾が含まれる、請求項２５に記載の化合物。
【請求項３１】
修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、オリゴヌクレオチドのポジション２、３、１３、及び１４の少なくとも１つに、少なくとも１つの高度親和性糖修飾が含まれる、請求項２５に記載の化合物。
【請求項３２】
修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、オリゴヌクレオチドのポジション２、３、１３、及び１４それぞれに、少なくとも１つの高度親和性糖修飾が含まれる、請求項３１に記載の化合物。
【請求項３３】
高度親和性糖修飾が二環式糖である、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３４】
二環式糖に４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれる、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３５】
ウイング−ギャップ−ウイングモチーフが３−９−３、４−９−４、及び５−９−５から成る群のいずれかである、請求項２５に記載の化合物。
【請求項３６】
１５、１７、又は１９連結ヌクレオシドから成り、識別用多型部位と完全に相補的である修飾オリゴヌクレオチドであって、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション６、８、１０、又は１４が識別用多型と一致している修飾オリゴヌクレオチド；及び
少なくとも１つの高度親和性糖修飾；
を含む化合物。
【請求項３７】
修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション２、３、６、９、１０、１１、１３、又は１４の少なくとも１つに、少なくとも１つの高度親和性糖修飾が含まれる、請求項３６に記載の化合物。
【請求項３８】
高度親和性糖修飾が二環式糖である、請求項３７に記載の化合物。
【請求項３９】
二環式糖に４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれる、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４０】
ウイング−ギャップ−ウイングモチーフが３−９−３、４−９−４、及び５−９５から成る群のいずれかである、請求項３６に記載の化合物。
【請求項４１】
１５連結ヌクレオシドから成り、識別用多型と９０％相補的である修飾オリゴヌクレオチドであって、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション８が識別用多型と一致している、修飾オリゴヌクレオチド；及び
少なくとも１つの高度親和性糖修飾；
を含む化合物。
【請求項４２】
修飾オリゴヌクレオチドが識別用多型と１００％相補的である、請求項４１に記載の化合物。
【請求項４３】
修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドポジション２、３、１３、及び１４それぞれに、少なくとも１つの高度親和性糖修飾を含む、請求項４１に記載の化合物。
【請求項４４】
高度親和性糖修飾が二環式糖である、請求項４３に記載の化合物。
【請求項４５】
二環式糖に４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれる、請求項４４に記載の化合物。
【請求項４６】
ウイング−ギャップ−ウイングモチーフが３−９−３である、請求項４１に記載の化合物。
【請求項４７】
識別用多型部位に対し相補的である修飾オリゴヌクレオチドであって、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５が識別用多型と一致する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を、細胞、組織、又は動物に投与することを含む、細胞、組織、又は動物における一塩基多型を含む遺伝子の対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減する方法。
【請求項４８】
修飾オリゴヌクレオチドが一塩基多型に対し９０％相補的である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
修飾オリゴヌクレオチドが一塩基多型に対し９５％相補的である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
修飾オリゴヌクレオチドが一塩基多型に対し１００％相補的である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
一塩基多型部位が１２〜３０核酸塩基長である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
一塩基多型部位が１５〜２５核酸塩基長である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
一塩基多型部位が１７〜２２核酸塩基長である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
一塩基多型部位が１７核酸塩基長である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
一塩基多型部位が１８核酸塩基長である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
一塩基多型部位が１９核酸塩基長である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５７】
一塩基多型部位が２０核酸塩基長である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５８】
対立遺伝子多様体が疾患と関連している、請求項４７に記載の方法。
【請求項５９】
疾患がハンチントン病である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
修飾オリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項４７に記載の方法。
【請求項６１】
少なくとも１つのヌクレオシド間連結が修飾ヌクレオシド間連結である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
各ヌクレオシド間連結がホスホロチオ酸ヌクレオシド間連結である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
少なくとも１つのヌクレオシドに修飾核酸塩基が含まれる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
少なくとも１つの修飾核酸塩基が５’−メチルシトシンである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
少なくとも１つのヌクレオシドに修飾糖が含まれる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
修飾糖が高度親和性糖修飾である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
高度親和性糖修飾が二環式糖である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
各二環式糖に４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれる、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドポジション２、３、１３、及び１４のうち少なくとも１つに、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジを含む二環式糖を有するヌクレオシドが含まれる、請求項６０に記載の方法。
【請求項７０】
修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドポジション２、３、１３、及び１４のそれぞれに、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジを含む二環式糖が含まれる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
少なくとも１つの修飾糖に２’−Ｏ−メトキシエチルが含まれる、請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
修飾オリゴヌクレオチドのウィングセグメントに位置する各ヌクレオシドに２’−Ｏ−メトキシエチル修飾が含まれる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
ウイング−ギャップ−ウイングモチーフが、２−９−６、３−９−３、３−９−４、３−９−５、４−７−４、４−９−４、４−９−５、４−１０−５、４−１１−４、４−１１−５、５−７−５、５−８−６、５−９−３、５−９−５、５−１０−４、５−１０−５、６−７−６、６−８−５、及び６−９−２から成る群のいずれかである、請求項４７に記載の方法。
【請求項７４】
修飾オリゴヌクレオチドはリボザイム、二本鎖ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡではない、請求項４７に記載の方法。
【請求項７５】
一塩基多型部位が疾患と関連する突然変異対立遺伝子である、請求項４７に記載の方法。
【請求項７６】
一塩基多型部位が識別用多型を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項７７】
修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが１２〜２０連結ヌクレオシドから成る、請求項４７に記載の方法。
【請求項７８】
修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが１５〜１９連結ヌクレオシドから成る、請求項４７に記載の方法。
【請求項７９】
ギャップ領域が７〜１１ヌクレオシド長であり、５’ウィング領域が１〜６核酸塩基長であり、３’ウィング領域が１〜６核酸塩基長である、請求項４７に記載の方法。
【請求項８０】
少なくとも１つのウィング領域の少なくとも１つのヌクレオシドに修飾糖又は糖代用が含まれる、請求項４７に記載の方法。
【請求項８１】
各ウィング領域の各ヌクレオシドに修飾糖又は糖代用が含まれる、請求項４７に記載の方法。
【請求項８２】
糖又は糖代用物が２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
ウィング領域の少なくとも１つに４’〜２’二環式ヌクレオシドが含まれ、残りのウィングのヌクレオシドの少なくとも１つが非二環式２’−修飾ヌクレオシドである、請求項４７に記載の方法。
【請求項８４】
非二環式−２’−修飾ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
４’〜２’二環式ヌクレオシドが４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’二環式ヌクレオシドである、請求項４７に記載の方法。
【請求項８６】
識別用多型に対し相補的である修飾オリゴヌクレオチドであって、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５が識別用多型と一致する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を、細胞、組織、又は動物に投与することを含む、細胞、組織、又は動物における一塩基多型を含む遺伝子の対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減する方法。
【請求項８７】
１２〜３０連結ヌクレオシドから成り、識別用多型と相補的である修飾オリゴヌクレオチドであって、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５が識別用多型と一致する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を、細胞、組織、又は動物に投与することを含む、細胞、組織、又は動物に一塩基多型を含む遺伝子の、突然変異対立遺伝子である対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減する方法。
【請求項８８】
突然変異対立遺伝子が、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、アレキサンダー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＡ）、脊髄小脳失調症、捻転ジストニア、心筋症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝疾患、肝細胞癌、全身性エリテマトーデス、高コレステロール血症、乳癌、喘息、１型糖尿病、関節リウマチ、グレーブス病、ＳＬＥ、球脊髄性筋萎縮症、ケネディ病、進行性の小児期後嚢下の白内障、コレステロール胆石症、関節硬化症、心血管疾患、主要な高カルシウム尿症、α−サラセミア、強迫性障害、不安、併存するうつ病、先天性の視覚的な欠陥、高血圧、メタボリックシンドローム、前立腺がん、先天性筋無力症候群、末梢動脈疾患、心房細動、散発性褐色細胞腫、先天奇形、マチャド−ジョセフ病、ハンチントン病、常染色体優性網膜色素変性症から成る群の任意の疾患と関連している、請求項８１に記載の方法。
【請求項８９】
１２〜３０連結ヌクレオシドから成り、識別用多型と相補的である修飾オリゴヌクレオチドであって、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５が識別用多型と一致する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を、細胞、組織、又は動物に投与することを含む、細胞、組織、又は動物に一塩基多型を含む遺伝子の、ハンチントン病と関連している対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減することを含む、ハンチントン病の治療方法。
【請求項９０】
修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション８、９、若しくは１０、又はギャップの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション４、５、若しくは６が一塩基多型と一致する、請求項４７、８６、８７、及び８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４が識別用多型と一致し；及び
修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション２、３、６、９、１０、１１、１３、又は１４のうち少なくとも１つのヌクレオシドが高度親和性糖修飾を含む、
１５〜１９連結ヌクレオシドから成り、識別用多型部位に対し相補的な修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物。
【請求項９２】
識別用多型と一致するヌクレオシドに高度親和性糖修飾が含まれる、請求項９１に記載の化合物。
【請求項９３】
識別用多型と一致するヌクレオシドの５’側に直隣接する、及び５’末端に存在するヌクレオシドに高度親和性糖修飾が含まれる、請求項９１又は９２に記載の化合物。
【請求項９４】
識別用多型と一致するヌクレオシドの３’側に直隣接する、及び３’末端に存在するヌクレオシドに高度親和性糖修飾が含まれる、請求項９１〜９３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９５】
修飾オリゴヌクレオチドが一塩基多型部位と１００％相補的である、請求項９１に記載の化合物。
【請求項９６】
高度親和性糖修飾が二環式糖である、請求項９１に記載の化合物。
【請求項９７】
二環式糖に４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれる、請求項９６に記載の化合物。
【請求項９８】
修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション２、３、１３、及び１４の少なくとも１つのヌクレオシドに高度親和性糖修飾が含まれる、請求項９１に記載の化合物。
【請求項９９】
修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション２、３、１３、及び１４の各ヌクレオシドに高度親和性糖修飾が含まれる、請求項９８に記載の化合物。
【請求項１００】
高度親和性糖修飾が二環式糖である、請求項９９に記載の化合物。
【請求項１０１】
高度二環式糖に４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれる、請求項１００に記載の化合物。
【請求項１０２】
請求項９１〜１０１のいずれかに記載の化合物を、細胞、組織、又は動物に投与することを含む、細胞、組織、又は動物中の一塩基多型を含む遺伝子の対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列リスト
本願は、電子様式の配列リストと共に出願される。配列リストは２０１１年２月７日に作成され、容量が３２２ＫｂのＢＩＯＬ０１２４ＷＯＳＥＱ．ｔｘｔと題したファイルとして提供される。電子様式による配列リストの本情報は、その全体を引用により本明細書に含めるものとする。
【０００２】
本発明の実施形態は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減するための方法、化合物、及び組成物を提供する。この方法、化合物、及び組成物は、疾患の治療、予防又は改善のために有益である。
【背景技術】
【０００３】
遺伝病は、遺伝子又は染色体の異常により起こる。異常には、挿入、欠失、及び伸長が含まれる。ハンチントン病（ＨＤ）は、伸長に起因する遺伝病の一例である。ＨＤは、優性遺伝する進行性神経変性障害で、ハンチンチン遺伝子（ＨＴＴ）における多型トリヌクレオチド（ＣＡＧ）トラクトの伸長という突然変異の結果生じる。一般集団における平均的ＣＡＧトラクトのサイズは、１７〜２６リピート（野生型対立遺伝子）であるが、ＨＤ患者においては、ＣＡＧトラクトは３６又はそれ以上のリピートに伸長している（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｇｒｏｕｐ  １９９３、Ｃｅｌｌ、７２（６）：９７１−８３）。ＨＴＴ遺伝子はＨＴＴタンパク質をコードし、ＣＡＧトラクト伸長の結果、タンパク質のＮ末端近接においてポリグルタミンリピート数が異常増加する。個体はＨＴＴ遺伝子を２つ保有するが、突然変異対立遺伝子が１つ存在するだけでＨＤを発症する。
【０００４】
ＨＴＴタンパク質は、中枢神経系発達の期間ある役割を担い、細胞においては保護的役割を担っているようである。マウスモデルにおいて、ＨＴＴ遺伝子の構成的なノックアウトは胚発生中では致命的であり（Ｎａｓｉｒら、１９９５、Ｃｅｌｌ、８１（５）：８１１−２３）、一方、成体のＨＴＴ遺伝子不活性化は、脳及び精巣における進行性細胞死へと導く（Ｄｒａｇａｔｓｉｓら、２０００、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ、２６：３００−３０６）。よって、野生型対立遺伝子のハンチンチン発現を低減させることにより負の結果を生じる可能性がある。
【０００５】
ＨＤ同様、突然変異対立遺伝子を選択的に低減させる戦略が有益となる疾患がいくつか存在する。よって、正常な細胞過程において必要であると思われる野生型多様体に対し、ＨＴＴの場合のように、疾患の原因となる突然変異対立遺伝子多様体が発現するのを選択的に低減させるというニーズは未だ満たされていない。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１−１】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−２】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−３】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−４】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−５】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
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【図１−３３】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
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【図１−９８】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−９９】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１００】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１０１】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１０２】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１０３】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１０４】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１０５】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１０６】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１０７】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１０８】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１０９】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１１０】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
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【図１−１２０】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
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【図１−１２２】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
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【図１−１２４】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１２５】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１２６】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
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【図１−１３０】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１３１】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１３２】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１３３】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１３４】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１３５】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１３６】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１３７】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１３８】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１３９】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１４０】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１４１】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１４２】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１４３】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１４４】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１４５】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１４６】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１４７】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１４８】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１４９】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１５０】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１５１】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１５２】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１５３】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１５４】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１５５】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１５６】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１５７】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１５８】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１５９】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１６０】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【図１−１６１】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む遺伝子の対立遺伝子多様体の発現を選択的に低下させるための方法、化合物及び組成物を提供する。この方法、化合物、及び組成物は、疾患の治療、予防又は改善に有益である。ＳＮＰは、その発現が疾患の原因となり得る突然変異対立遺伝子に関連している。ある実施形態では、突然変異対立遺伝子の発現による遺伝子産物が、疾患の起因となる突然変異タンパク質凝集をもたらす。ある実施形態では、突然変異対立遺伝子の発現による遺伝子産物が、疾患の起因となる機能の獲得をもたらす。
【０００８】
ある実施形態では、突然変異対立遺伝子のｍＲＮＡ及びタンパク質発現の選択的低減は、アンチセンス化合物で突然変異対立遺伝子に位置するＳＮＰを標的とすることにより達成される。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０００９】
ある実施形態では、ＳＮＰを含む遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するよう設計されたアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物の有効性及び選択性並びに集団遺伝子学に基づき作られている。
【００１０】
発明の詳細な説明
前記の概要及び以下の詳細な説明は、単に典型例を示しかつ説明することのみを目的とするのであって、請求項に記載の本発明の範囲を制限するものではないと理解されるべきである。本明細書では、特段の記述がない限り、単数の使用には複数も含まれる。本明細書で使用される「又は」は、特段の記述がない限り「及び／又は」の意味である。さらに、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、並びに、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「に含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」等のその他の表現の利用は、制限を意味しない。また、「要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）」又は「コンポーネント（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」等の用語には、特段の記述がない限り、１つのユニットを含む要素及びコンポーネントと、２以上のサブユニットを含む要素及びコンポーネントの両方が包含される。
【００１１】
本明細書のセクションの見出しは構成目的でのみ使用されており、本明細書に記載の主題項目を制限するものと解釈されるべきではない。特許文献、特許出願書類、学術論文、書籍、及び約定等を含むがこれに限定されない、本願で引用されたすべての文献、又は文献の一部は、本明細書で論じる文献の部分並びにその全体を、引用により明示的に本明細書に含めるものとする。
【００１２】
定義
特定の定義が付与されない限り、本明細書に記載の分析化学、有機合成化学、及び医薬・製薬化学との関連で利用される命名法、及び手順と技法は、当業者に周知であり、また当技術分野で一般に使用されている。化学合成及び化学分析には、標準的技法が用いられ得る。可能であれば、全ての特許文献、特許出願書類、公開特許出願書類及びその他の刊行物、ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号及び国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）等のデータベースを通じて取得可能な関連する配列情報、並びに本明細書での開示全体にわたり言及されるその他のデータは、本明細書で論じる文献の部分並びにその全体を、引用により含めるものとする。
【００１３】
特段の指示がない限り、以下の用語には以下の意味が含まれる。
【００１４】
「２’−Ｏ−メトキシエチル」（２’−ＭＯＥ及び２’−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３とも称される）は、フロシル環の２’位のＯ−メトキシ−エチル修飾を指している。２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖とは、修飾された糖のことである。
【００１５】
「２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド」は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖部分を含むヌクレオチドという意味である。
【００１６】
「５−メチルシトシン」は、メチル基を５’位に結合させ修飾したシトシンを意味する。５−メチルシトシンは、修飾された核酸塩基である。
【００１７】
「活性薬剤」は、個体への投与時に治療効果をもたらす医薬組成物における１つの物質又は複数の物質を意味する。例えば、ある実施形態では、対立遺伝子多様体を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、活性薬剤である。
【００１８】
「活性標的領域」又は「標的領域」は、１又は複数の活性アンチセンス化合物が標的とする領域を意味する。「活性アンチセンス化合物」は、標的の核酸レベル又はタンパク質レベルを低減するアンチセンス化合物を意味する。
【００１９】
「同時に投与される」とは、２つ薬剤の医薬効果が同時に患者に現れるよう２つの薬剤を同時に投与することを指している。同時投与においては、両方の薬剤を１つの医薬組成物で、同じ用量の剤形で、又は同じ投与経路により投与する必要はない。両方の薬剤の効果が同時に現れる必要もない。効果は一定期間重複する必要があるだけで、同延的である必要はない。
【００２０】
「投与する」は、個体に対し医薬剤を提供するという意味であり、医療専門家による投与及び自己投与を含むが、これに限定されない。
【００２１】
「対立遺伝子」は、遺伝子対の片方、又は、特定の染色体上の１つの遺伝子座又はマーカーに存在し得るＤＮＡ配列の、一連の異なる様式の１つのメンバーを意味する。二倍体生物若しくは細胞又は常染色体では、各対立遺伝子対は通常、一対の相同染色体上の対応する位置（遺伝子座）を占め、一つは母親から継承され、もう１つは父親から継承される。これらの対立遺伝子座が同じであれば、有機体又は細胞は、対立遺伝子に関して「ホモ接合的である」と称し、もし異なれば、有機体又は細胞は対立遺伝子に関して「ヘテロ接合的である」と称す。「メジャー対立遺伝子」は、ヒト集団のうち統計的に有意な割合の個体群に存在するヌクレオチドを含む対立遺伝子を指している。「マイナー対立遺伝子」は、ヒト集団のうち比較的少数の個体群に存在するヌクレオチドを含む対立遺伝子を指している。「野生型対立遺伝子」は、遺伝子産物の疾患又は機能障害に典型的には関連しない遺伝子型を指している。「突然変異対立遺伝子」は、遺伝子産物の疾患又は機能障害に関連する遺伝子型を指している。
【００２２】
「対立遺伝子多様体」は、１つの遺伝子座に存在する遺伝子又はＤＮＡ配列のペアの片方を指している。例えば、対立遺伝子多様体は、メジャー対立遺伝子又はマイナー対立遺伝子のいずれかを指していることがある。
【００２３】
「改善」は、関連する疾患、障害又は状態の少なくとも１つの兆し、兆候、症状を低下させることを指している。兆しの程度は、当業者に既知の主観的又は客観的測定により決定され得る。
【００２４】
「動物」は、マウス、ラット、ラビット、犬、ネコ、豚、並びに、サル及びチンパンジ
ーを含むがこれに限定されない非ヒト霊長類等のヒト又は非ヒト動物を指しているが、これに限定されない。
【００２５】
「抗体」は、抗体と抗原が互いに相手に関して定められているという具合に、抗原と特異的に反応することにより特徴付けられる分子を指している。抗体は、重鎖、軽鎖、Ｆａｂ領域及びＦｃ領域等の完全な抗体分子又は任意の断片若しくはその領域を指す場合もある。
【００２６】
「アンチセンス活性」は、アンチセンス化合物がその標的核酸にハイブリダイズすることに起因する、検出可能又は測定可能な任意の活性を意味する。ある実施形態では、アンチセンス活性とは、標的核酸又は標的核酸によりコードされるタンパク質の量又は発現を低下させることである。
【００２７】
「アンチセンス化合物」は、水素結合により、標的核酸とハイブリダイズすることができるオリゴマー化合物を意味する。
【００２８】
「アンチセンス阻害」は、アンチセンス化合物の不存在下における標的核酸のレベル又は標的タンパク質のレベルと比較して、標的核酸に対して相補的なアンチセンス化合物の存在下における標的核酸のレベル又は標的タンパク質のレベルを低減させることを意味する。
【００２９】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸の対応する領域又はセグメントへのハイブリダイゼーションを可能にする核酸塩基配列を有する単鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
【００３０】
「二環式糖」は、２つの環原子の架橋により修飾されたフロシル環を意味する。二環式糖は、修飾された糖である。
【００３１】
「二環式ヌクレオシド」は、糖環の２つの炭素原子を結合させて、二環式環系を形成するブリッジを含む糖部分を有するヌクレオシドのことである。ある実施形態では、ブリッジは、糖環の４’位炭素と２’位炭素を結合させる。
【００３２】
「キャップ構造」又は「末端キャップ部分」は、アンチセンス化合物のいずれかの末端に組み込まれている化学的修飾を意味する。
【００３３】
「ｃＥｔ」又は「拘束エチル」は、４’位炭素及び２’位炭素を結合し、化学式が４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’であるブリッジを含む糖部分を有する二環式ヌクレオシドのことである。
【００３４】
「化学的に異なる領域」は、同じアンチセンス化合物の別の領域とは多少なりとも化学的に異なるアンチセンス化合物の領域を指している。例えば、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチドを有する領域は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾のないヌクレオチドを有する領域とは化学的に異なる。
【００３５】
「キメラアンチセンス化合物」は、少なくとも２つの化学的に異なる領域を有するアンチセンス化合物を意味する。
【００３６】
「共投与」は、個体に対し、２又はそれ以上の医薬剤を投与することを意味する。２又はそれ以上の医薬剤は、単一の医薬組成物でもよく、又は別々の医薬組成物であってもよい。２又はそれ以上の医薬剤は、同じ投与経路を通じて投与してもよく、又は異なる投与
経路を通じて投与してもよい。併用又は連続投与も共投与に含まれる。
【００３７】
「相補性」とは、第１の核酸と第２の核酸の核酸塩基対形成能を意味する。
【００３８】
「近接する核酸塩基」とは、互いに直隣接である核酸塩基を意味する。
【００３９】
「識別用多型」とは、核酸配列の野生型と突然変異対立遺伝子を識別できるヌクレオチド配列の多様性を意味する。識別用多型には、配列中の１若しくは小数のヌクレオチドの挿入若しくは欠失、又は配列中の１若しくは少数のヌクレオチドの変更が含まれ得る。識別用多型又は多型対立遺伝子は、１又は複数のその他の多型又は多型対立遺伝子と連鎖不均衡であり得る。
【００４０】
「希釈剤」は、薬理活性を欠いているが、薬剤的に必要又は望ましい組成物の成分を意味する。例えば、注入された組成物の希釈剤は、生理食塩水等の液体であり得る。
【００４１】
「用量」は、単回投与で、又は指定された期間の投与で提供される投薬量を意味する。ある実施形態では、用量は、１回、２回、又はそれ以上のボーラス、錠剤、又は注射により投与してもよい。例えば、皮下投与が望ましいある実施形態では、所望の投与量は、単回注射では容易に処置できない量であり、従って、所望の量を投与するために、２回又はそれ以上の注射投与を行ってもよい。ある実施形態では、長時間にわたり又は連続的に点滴注入により医薬剤を投入する。用量は、時間毎、日毎、週毎、又は月毎の投薬量としてもよい。
【００４２】
「有効量」は、医薬剤を必要とする個体において所望の身体的効果を生じさせるのに十分な活性医薬剤の量を意味する。有効量は、治療対象である個体の健康及び身体的状態、治療対象である個体の分類学上のグループ、組成物の製剤、個体の医学的状態の評価、及びその他の関連する要因により、個体間で異なる。
【００４３】
「完全に相補的である」又は「１００％相補的である」とは、第１の核酸の各核酸塩基が第２の核酸中に相補的核酸塩基を有することを意味する。ある実施形態では、第１の核酸はアンチセンス化合物であり、標的核酸は第２の核酸である。
【００４４】
「ギャップマー（Ｇａｐｍｅｒ）」は、ＲＮａｓｅＨ切断をサポートする複数のヌクレオシドを有する内部領域が１又は複数のヌクレオシドを有する外部領域間に位置し、内部領域を構成するヌクレオシドは、外部領域を構成する１又は複数のヌクレオシドとは化学的に異なる、キメラアンチセンス化合物を意味する。内部領域は「ギャップ（ｇａｐ）」と称され、外部領域は、「ウィングス（ｗｉｎｇｓ）」と称される。
【００４５】
「ギャップ拡大型（Ｇａｐ−ｗｉｄｅｎｅｄ）」とは、１〜６個のヌクレオシドを有する５’及び３’ウィングセグメントの間に、及び直隣接するよう位置づけられている、１２個又はそれ以上の近接２’−デオキシリボヌクレオシドのギャップセグメントを有するキメラアンチセンス化合物のことである。
【００４６】
「遺伝子産物」は、遺伝子の発現の結果生じる、ＲＮＡ又はタンパク質等の生化学物質を指している。
【００４７】
「ハプロタイプ」は、通常共に遺伝される、一染色体上の密接に関連する対立遺伝子群を意味する。例えば、染色体上の核酸配列の最初の部位にある多型対立遺伝子が、ランダムな相関（例えば、「連鎖均衡」）での予測とは異なる頻度で、同じ染色体上の２番目の部位の別の多型対立遺伝子と関連しているのが認められる場合がある。このような２つの
多型対立遺伝子は、「連鎖不均衡」として記載され得る。ハプロタイプには、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の対立遺伝子が含まれ得る。組み換えイベントが起こらない限り、染色体の所定のセグメント沿いのハプロタイプ中の対立遺伝子群は、一般的には共に子孫に継承される。
【００４８】
「高度親和性糖修飾」は修飾された糖部分であり、糖部分がヌクレオシドに含まれ、ヌクレオシドがアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み入れられた場合、アンチセンスオリゴヌクレオチド：ＲＮＡ二本鎖の安定性（Ｔｍにより測定）が、ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖の安定性に比べて増加する。
【００４９】
「高度親和性糖修飾ヌクレオシド」は、修飾されたヌクレオシドを含むヌクレオシドであり、ヌクレオシドがアンチセンス化合物に組み入れられた場合、アンチセンス化合物の相補的ＲＮＡ分子に対する結合親和性（Ｔｍにより測定）が増加する、修飾された糖の部分を含むヌクレオシドである。本発明のある実施形態では、少なくとも１つの糖修飾高度親和性ヌクレオシドは、本明細書にその全体が引用により含まれるＦｒｅｉｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９７、２５、４４２９−４４４３）の記載による方法に従って決定される相補的ＲＮＡに対するヌクレオシド毎に少なくとも１〜４度の融解温度差ΔＴｍをもたらす。別の実施形態では、高度親和性糖修飾の少なくとも１つは、修飾毎に約２度若しくはそれ以上、３度若しくはそれ以上、又は４度若しくはそれ以上をもたらす。本発明のコンテキストにおいて、糖修飾高度親和性ヌクレオシドの実施例として、（ｉ）２’−置換及び４’〜２’二環式ヌクレオシドを含む、特定の２’−修飾ヌクレオシド、及び（ｉｉ）修飾されたテトラヒドロピラン及びトリシクロＤＮＡヌクレオシド等、修飾毎に結合親和性を増加させる他の特定の非リボフラノシルヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。糖修飾高度親和性ヌクレオシドの他の修飾に関しては、Ｆｒｅｉｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９７、２５、４４２９−４４４３）を参照のこと。
【００５０】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸分子のアニーリングを意味する。ある実施形態では、相補的核酸分子には、アンチセンス化合物及び標的核酸が含まれる。
【００５１】
「直隣接の」とは、直接隣接する要素の間に介入するものが何も存在しないことである。
【００５２】
「個体の」とは、治療又は療法のために選択されたヒト又は非ヒト動物のことである。
【００５３】
「ヌクレオシド間連結」とは、ヌクレオシド間の化学結合のことである。
【００５４】
「連結ヌクレオシド」とは、互いに結合する隣接のヌクレオシドのことである。
【００５５】
「ミスマッチ」又は「非相補的核酸塩基」は、第１の核酸が第２の核酸又は標的核酸の対応する核酸塩基と対形成できないことを指している。
【００５６】
「修飾ヌクレオシド間連結」は、自然発生するヌクレオシド間結合（すなわち、ホスホジエステルヌクレオシド間結合）の置換又は任意の変更を指している。
【００５７】
「修飾核酸塩基」は、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、又はウラシル以外の任意の核酸塩基を指している。「非修飾核酸塩基」は、プリンベースのアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジンベースのチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を指している。
【００５８】
「修飾ヌクレオチド」は、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間連結、又は修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオチドを意味する。「修飾ヌクレオシド」は、修飾糖部分又は修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオシドを意味する。
【００５９】
「修飾オリゴヌクレオチド」は、修飾ヌクレオシド間連結、修飾糖、又は修飾核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
【００６０】
「修飾糖」は、天然の糖の置換又は変更を指している。
【００６１】
「モチーフ」は、アンチセンス化合物の化学的に異なる領域のパターンを意味する。
【００６２】
「自然に発生するヌクレオシド間連結」は、３’〜５’ホスホジエステル結合を意味する。
【００６３】
「天然の糖部分」は、ＤＮＡ（２’−Ｈ）又はＲＮＡ（２’−ＯＨ）に認められる糖を意味する。
【００６４】
「核酸分解酵素抵抗性修飾」は、オリゴヌクレオチドに組み入れられた場合、細胞核酸分解酵素（例えば、エキソ又はエンド核酸分解酵素）下でオリゴヌクレオチドがより安定的に分解されるようにする、糖修飾又は修飾ヌクレオシド間連結を意味する。核酸分解酵素抵抗性修飾の実施例として、ホスホロチオ酸ヌクレオシド間連結、二環式糖修飾、２’−修飾ヌクレオチド、又は中性のヌクレオシド間連結が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
「核酸」は、単量体のヌクレオチドで構成される分子を指している。核酸には、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、一本鎖核酸、二本鎖核酸、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれる。
【００６６】
「核酸塩基」は、もう１つの核酸塩基と対形成できるヘテロ環式部分を意味する。
【００６７】
「核酸塩基配列」は、任意の糖、連結、又は核酸塩基修飾から独立した隣接する核酸塩基の順序を意味する。
【００６８】
「ヌクレオシド」は、糖に連結する核酸塩基を意味する。
【００６９】
「模倣ヌクレオシド」は、糖又は糖と塩基を置換するために使用される構造を含み、例えばモルホリノ糖、シクロヘキセニル糖、シクロヘキシル糖、テトラヒドロピラニル糖、ビシクロ糖又はトリシクロ糖の模倣物、例えば、非フラノース糖ユニットを有するヌクレオシドの模倣物等のオリゴマー化合物の１又は複数の位置において必ずしも連結は認められない。模倣ヌクレオチドは、ヌクレオシドを置換するために使用される構造を含み、例えば、ペプチド核酸又はモルフォリノ類（−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は他の非ホスホジエステル連結に結合するモルフォリノ類）等のオリゴマー化合物の１又は複数の位置において連結が認められる。糖代用は、わずかに広義な模倣ヌクレオシドという用語と重複しているが、糖ユニット（フラノース環）の置換を示すことを意図したものである。本明細書で提供されるテトラヒドロピラニル環は、フラノース糖基がテトラヒドロピラニル環系で置換された糖代用の一例を示している。
【００７０】
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分と共有結合的に結合したリン酸基を有するヌクレオシドを意味する。
【００７１】
「オリゴマー化合物」又は「オリゴマー」は、核酸分子の少なくとも１つの領域とハイブリダイズできる、連結された単量体サブユニットのポリマーを意味する。
【００７２】
「オリゴヌクレオチド」は、それぞれが修飾又は非修飾であり得、互いに独立した、連結ヌクレオシドのポリマーを意味する。
【００７３】
「非経口投与」は、注射又は注入による投与を意味する。非経口投与には、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は髄腔内若しくは脳室内投与等の頭蓋内投与が含まれる。
【００７４】
「ペプチド」は、アミド結合により少なくとも２つのアミノ酸を連結することで形成される分子を意味する。ペプチドは、ポリペプチド及びタンパク質を指している。
【００７５】
「医薬組成物」は、個体に投与するのに好適な物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物には、１又は複数の活性医薬剤及び滅菌水溶液が含まれ得る。
【００７６】
「薬剤的に許容できる塩」は、生理的かつ薬剤的に許容できるアンチセンス化合物の塩、すなわち、親オリゴヌクレオチドの所望の生物活性を保有し、それに対し所望でない毒素学的効果を与えない塩を意味する。
【００７７】
「ホスホロチオ酸連結」は、ホスホジエステル結合を、硫黄原子との非架橋酸素原子の１つと置き換えることにより修飾されたヌクレオシド間の連結を意味する。ホスホロチオ酸（Ｐ＝Ｓ）は、修飾ヌクレオシド間連結である。
【００７８】
「部分」とは、核酸のうち定められた数の隣接（すなわち、連結）核酸塩基を意味する。ある実施形態では、１つの部分は、標的核酸のうち定められた数の隣接核酸塩基である。ある実施形態では、１つの部分は、アンチセンス化合物のうち定められた数の隣接核酸塩基である。
【００７９】
「予防する」は、数分から無期限に至るまでの一定の期間における、疾患、障害、又は状態の発生又は発達を遅延又は未然に防ぐことを指している。要望はまた、疾患、障害又は状態の発達のリスクを低減することも意味する。
【００８０】
「プロドラッグ」は、内在酵素若しくは他の化学物質の作用又は条件により、身体又はその細胞内で活性化する不活性な形態で調製された治療剤を意味する。
【００８１】
「対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減させる」とは、対立遺伝子群のうち他の異なる対立遺伝子よりも、ある対立遺伝子の発現を低減させることを意味する。例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む突然変異対立遺伝子を、ＳＮＰを含まない野生型対立遺伝子よりも多く低減され得る。
【００８２】
「副作用」は、所望の効果以外の、治療に起因し得る身体的反応を意味する。ある実施形態では、副作用には、注射部位反応、肝機能検査の異常、腎機能異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系の異常、筋障害、及び倦怠感等が含まれる。例えば、血清アミノトランスフェラーゼ値の上昇は、肝臓毒性又は肝機能異常を示すことがある。例えば、ビリルビンの増加は、肝臓毒性又は肝機能異常を示している場合がある。
【００８３】
「一塩基多型」又は「ＳＮＰ」は、同種の個体のゲノム間の一塩基の変動を意味する。いくつかの場合、ＳＮＰは一塩基の欠失又は挿入であり得る。一般に、ＳＮＰはゲノムで比較的頻繁に発生し、よって、遺伝的多様性に寄与している。ＳＮＰは、他の多型よりも
突然変異としては安定しており、そのため、マーカーと未知の多様体間の連鎖不均衡を用いて疾患の原因となる突然変異をマッピングする関連研究に利用される。ＳＮＰの位置は、一般に、高度に保存された配列に隣接している。個体は、各ＳＮＰ部位の対立遺伝子に対してホモ接合的又はヘテロ接合的であり得る。ヘテロ接合的ＳＮＰ対立遺伝子は識別用多型となり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドでＳＮＰを標的対象とすることもできる。すなわち、ＳＮＰは、アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０とアニールする（又は、一致する）ということである。ハイブリダイゼーションを促進するためには、アンチセンスオリゴヌクレオチドの残りの塩基も、ＳＮＰ部位に対し十分な相補性を有していなければならない。
【００８４】
「一塩基多型位置」又は「ＳＮＰ位置」は、参照配列上のＳＮＰのヌクレオチド位置を指している。
【００８５】
「一塩基多型部位」又は「ＳＮＰ部位」は、アンチセンス化合物の標的対象である標的核酸に含まれるＳＮＰ周辺のヌクレオチドを指している。
【００８６】
「一本鎖オリゴヌクレオチド」は、相補的鎖にハイブリダイズされないオリゴヌクレオチドを意味する。
【００８７】
「特異的にハイブリダイズ可能な」とは、特異的結合が所望される条件下、すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ及び治療の場合は身体的条件下で、非標的核酸への効果が最小又は皆無であることを示しつつ、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸の間では所望の効果を導入するのに十分な度合いの相補性が存在するアンチセンス化合物を指している。
【００８８】
「標的とする」又は「標的とされた」とは、標的核酸に特異的にハイブリダイズし、所望の効果を導入するアンチセンス化合物の設計及び選択の過程を意味する。
【００８９】
「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」、及び「標的ＲＮＡ転写」は全て、アンチセンス化合物の標的対象となり得る核酸を指している。
【００９０】
「標的セグメント」は、アンチセンス化合物の標的対象となる標的核酸のヌクレオチド配列を意味する。例えば、本願の目的のためには、標的セグメントはＳＮＰ部位内に存在してもよい。「５’標的部位」は、標的セグメントの最も５’側ヌクレオチドを指している。「３’標的部位」は、標的セグメントの最も３’側ヌクレオチドを指している。
【００９１】
「治療的有効量」は、個体に対し治療的有効性を与える医薬剤の量を意味する。
【００９２】
「治療する」とは、疾患、障害、又は状態の変化又は改善を有効にする医薬組成物を投与することを指している。
【００９３】
「非修飾ヌクレオチド」は、自然に発生する核酸塩基、糖部分、及びヌクレオシド間連結から成るヌクレオチドを意味する。ある実施形態では、非修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオチド（すなわち、β−Ｄ−リボヌクレオシド）又はＤＮＡヌクレオチド（すなわち、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド）である。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
本発明の実施形態は、遺伝子又はＤＮＡ配列の対立遺伝子多様体のｍＲＮＡ及びタンパク質発現を選択的に阻害するための方法、化合物、及び組成物を提供する。ある実施形態
では、対立遺伝子多様体には、一塩基多型（ＳＮＰ）が含まれる。ある実施形態では、ＳＮＰは識別用多型である。ある実施形態では、ＳＮＰが突然変異対立遺伝子と関連している。ある実施形態では、ＳＮＰは、疾患と関連しているか、又は疾患の原因である別の多型と連鎖不均衡にある。ある実施形態では、突然変異対立遺伝子は疾患と関連している。ある実施形態では、突然変異対立遺伝子のｍＲＮＡ及びタンパク質発現が疾患と関連している。
【００９５】
ある実施形態では、突然変異対立遺伝子の発現された遺伝子産物は、疾患の原因である突然変異タンパク質凝集を生じさせる。ある実施形態では、突然変異対立遺伝子の発現された遺伝子産物は、疾患の原因である機能を獲得させる。ある実施形態では、タンパク質毒性機能獲得を生じさせる常染色体優性突然変異を有する遺伝子は、アルツハイマー病に関与するアミロイド前駆体タンパク質をコードするＡＰＰ遺伝子（Ｇｅｎｅ、３７１：６８、２００６）、クロイツフェルト・ヤコブ病及び致死性家族性不眠症に関与しているプリオンタンパク質をコードするＰｒＰ遺伝子（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７、３：１００９）、アレクサンダー病に関与するグリア線維性酸性タンパク質をコードするＧＦＡＰ遺伝子（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００６、２６：１１１６２３）、パーキンソン病に関与するα−シヌクレインのタンパク質をコードするα−シヌクレイン遺伝子（Ｊ．ＣＬＩＮ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２００３、１１１：１４５）、筋萎縮性側索硬化症に関与するＳＯＤ−１タンパク質をコードするＳＯＤ−１遺伝子（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２８１：１８５１）、歯状赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＡ）に関与するアトロフィン−１タンパク質をコードするアトロフィン−１遺伝子（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００１、７：４７９）、脊髄小脳失調症−１（ＳＣＡ１）に関与するアタキシン−１タンパク質をコードするＳＣＡ１遺伝子（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、２００３、１２：９５３）、ペリツェウスメルツバッハー病に関与するプロテオリピドタンパク質をコードするＰＬＰ遺伝子（ＮｅｕｒｏＭｏｌ  Ｍｅｄ．、２００７、４：７３）、捻転ジストニアに関与するトーシンＡタンパク質をコードするＤＹＴ１遺伝子（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２０００、８７７：３７９）、並びに、心筋症を含むタンパク質凝集疾患に関与するα−Ｂの結晶タンパク質をコードする遺伝子のα−Ｂ結晶タンパク質遺伝子（Ｃｅｌｌ、２００７、１３０：４２７）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝疾患及び肝細胞癌に関与するα１−アンチトリプシンタンパク質をコードするα１−アンチトリプシン遺伝子（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ
Ｊ  Ｍｅｄ、２００２、３４６：４５）、全身性エリテマトーデスに関与する白血球チロシンキナーゼタンパク質をコードするＬｔｋ遺伝子（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．２００４、１３：１７１）、高コレステロール血症に関与するＰＣＳＫ９タンパク質をコードするＰＣＳＫ９遺伝子（Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．２００９、３０：５２０）、乳癌に関与するプロラクチン受容体タンパク質をコードするプロラクチン受容体遺伝子（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｓｃｉ．２００８、１０５：４５３３）、ＣＯＰＤ及び喘息に関与するケモカインＣＣＬ５をコードするＣＣＬ５遺伝子（Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ．２００８、３２：３２７）、１型糖尿病、関節リウマチ、グレーブス病、及びＳＬＥに関与するＰＴＰＮ２２タンパク質をコードするＰＴＰＮ２２遺伝子（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｓｃｉ．２００７、１０４：１９７６７）、球脊髄性筋萎縮症又はケネディ病に関与するアンドロゲン受容体タンパク質をコードするアンドロゲン受容体遺伝子（Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００８、１０８：２４５）、進行性の小児後嚢下白内障に関与するクロマチン修飾タンパク質−４ＢをコードするＣＨＭＰ４Ｂ（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ、２００７、８１：５９６）、コレステロール胆石症、関節硬化症、及び糖尿病に関与するファルネソイドＸ受容体タンパク質をコードするＦＸＲ／ＮＲ１Ｈ４遺伝子（Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００７、２１：１７６９）、心血管疾患に関与するＡＢＣＡ１タンパク質をコードするＡＢＣＡ１遺伝子（Ｔｒａｎｓｌ．Ｒｅｓ．２００７、１４９：２０５）、原発性高カルシウム尿症に関与するカルシウム感知受容体タンパク質をコードするＣａＳＲ遺伝子（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．２００７、７１：１１５５）、α−サラセミアに関与するα−グロビンタンパク質をコードする
α−グロビン遺伝子（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６、３１２：１２１５）、強迫性障害に関与するＨＴＴＬＰＲタンパク質をコードするｈｔｔｌｐｒ遺伝子（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００６、７８：８１５）、不安障害及び併発うつ病等のストレス性障害におけるアルギニンバソプレッシンタンパク質をコードするＡＶＰ遺伝子（ＣＮＳ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ、２００６、５：１６７）、先天性の視覚的な欠陥、高血圧、メタボリックシンドロームに関与するＧタンパク質をコードするＧＮＡＳ遺伝子（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２００６、２７：２６０）、大うつ病素因に関与するＡＰＡＦ１タンパク質をコードするＡＰＡＦ１遺伝子（Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、２００６、１１：７６）、乳癌及び前立腺癌に関与するＴＧＦ−β１タンパク質をコードするＴＧＦ−β１遺伝子（Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．２００４、１３：７５９）、先天性筋無力症候群に関与するアセチルコリン受容体をコードするＡＣｈＲ遺伝子（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２００４、６２：１０９０）、末梢動脈疾患のリスクに関与するアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体タンパク質をコードするＰ２Ｙ１２遺伝子（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００３、１０８：２９７１）、心房細動に関与するＬＱＴ１タンパク質をコードするＬＱＴ１遺伝子（Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ、２００３、１００：１０９）、散発性褐色細胞腫に関与するＲＥＴタンパク質をコードするＲＥＴプロトオンコジーン（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、２００３、８８：４９１１）、様々な先天性奇形に関与するフィラミンＡタンパク質をコードするフィラミンＡ遺伝子（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２００３、３３：４８７）、筋萎縮性側索硬化症に関与するＴＤＰ−４３タンパク質をコードするＴＡＲＤＢＰ遺伝子（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅ．ｔ２０１０、１９：６７１）、マチャド−ジョセフ病に関与するアタキシン−３タンパク質をコードするＳＣＡ３遺伝子（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２００８、３：ｅ３３４１）、脊髄小脳失調症７型に関与するアタキシン−７タンパク質をコードするＳＣＡ７遺伝子（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２００９、４：ｅ７２３２）、及びハンチントン病に関与するハンチンチンタンパク質をコードするＨＴＴ遺伝子（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．１９９６、３：１８３）であり、並びに、炭酸脱水酵素４タンパク質をコードするＣＡ４遺伝子、円錐ロッドホメオボックス転写因子タンパク質をコードするＣＲＸ遺伝子、網膜ファスシンホモログ２タンパク質をコードするＦＳＣＮ２遺伝子、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ１タンパク質をコードするＩＭＰＤＨ１遺伝子、核内受容体サブファミリー２グループＥ３タンパク質をコードするＮＲ２Ｅ３遺伝子、神経網膜ロイシンジッパータンパク質をコードするＮＲＬ遺伝子、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシング因子３タンパク質をコードするＰＲＰＦ３（ＲＰ１８）遺伝子、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシング因子８タンパク質をコードするＰＲＰＦ８（ＲＰ１３）遺伝子、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシング因子３１タンパク質をコードするＰＲＰＦ３１（ＲＰ１１）遺伝子、ペリフェリン２タンパク質をコードするＲＤＳ遺伝子、ロッド外膜タンパク質１タンパク質をコードするＲＯＭ１遺伝子、ロドプシンタンパク質をコードするＲＨＯ遺伝子、ＲＰ１タンパク質をコードするＲＰ１遺伝子、その全てが常染色体優性網膜色素変性症の疾患に関与している、網膜色素変性症のＧＴＰアーゼ調節タンパク質をコードするＲＰＧＲ遺伝子である（Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．、２００８、６１３：２０３）。
【００９６】
ある実施形態では、突然変異対立遺伝子のｍＲＮＡ及びタンパク質発現の選択的低減は、アンチセンス化合物で突然変異対立遺伝子に局在しているＳＮＰを標的とすることにより達成される。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、リボザイム、二本鎖ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡではない。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１又は複数の修飾糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間連結を有してもよい。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＮＰ部位に対し相補的である。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＮＰ部位に対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的である。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＮＰ部位に対し１００％相補的である。ある実施形態では、ＳＮＰ部位は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０核酸塩基長である。ある実施形態では、ＳＮＰは、アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０とアニールする。
【００９７】
ある実施形態では、ＳＮＰを含む遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するよう設計されたアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物の有効性及び選択性並びに集団遺伝学に基づいて作成される。
【００９８】
ある実施形態では、ＳＮＰを含む遺伝子の対立遺伝子多様体のｍＲＮＡ及びタンパク質発現の選択的低減は、細胞又は組織で起こる。ある実施形態では、細胞又は組織は動物のである。ある実施形態では、動物はヒトである。
【００９９】
ある実施形態では、本明細書に記載するのは、一塩基多型部位を標的とする１２〜３０の連結ヌクレオシドから成る修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む化合物であり、修飾オリゴヌクレオチドには、デオキシヌクレオシドのギャップの５’末端に位置する５’ウィング領域及びデオキシヌクレオシドギャップの３’末端に位置する３’ウィング領域を有するウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、若しくは１５、又はギャップの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション１、２、３、４、５、６、７、８、若しくは９が一塩基多型と一致している。
【０１００】
ある実施形態では、一塩基多型部位は、疾患と関連している突然変異対立遺伝子上にある。ある実施形態では、一塩基多型部位には識別用多型が含まれる。
【０１０１】
ある実施形態では、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２〜２０連結ヌクレオシドから成る。ある実施形態では、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５〜２０連結ヌクレオシドから成る。ある実施形態では、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５〜１９連結ヌクレオシドから成る。
【０１０２】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション８、９、若しくは１０、又はギャップの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション４、５、若しくは６が一塩基多型と一致している。
【０１０３】
ある実施形態では、ギャップ領域は７〜１１ヌクレオシド長であり、５’ウィング領域は１〜６核酸塩基長であり、３’ウィング領域は１〜６核酸塩基長である。
【０１０４】
ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、５−１０−５、２−９−６、３−９−３、３−９−４、３−９−５、４−７−４、４−９−３、４−９−４、４−９−５、４−１０−５、４−１１−４、４−１１−５、５−７−５、５−８−６、５−９−３、５−９−５、５−１０−４、５−１０−５、６−７−６、６−８−５、及び６−９−２から成る群の任意の１つである。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、４−９−５、及び４−１１−４から成る群の任意の１つである。
【０１０５】
ある実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシド間連結は、修飾ヌクレオシド間連結
である。ある実施形態では、各ヌクレオシド間連結はホスホロチオ酸ヌクレオシド間連結である。
【０１０６】
ある実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシドには修飾核酸塩基が含まれる。ある実施形態では、修飾核酸塩基は、５’−メチルシトシンである。
【０１０７】
ある実施形態では、少なくとも１つのウィング領域の少なくとも１つのヌクレオシドには、修飾糖又は糖代用が含まれる。ある実施形態では、各ウィング領域の各ヌクレオシドには、修飾糖又は糖代用が含まれる。ある実施形態では、糖又は糖代用は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖である。
【０１０８】
ある実施形態では、少なくとも１つのウィング領域には、４’〜２’の二環式ヌクレオシドが含まれ、残りのウィングヌクレオシドの少なくとも１つには非二環式２’−修飾ヌクレオシドが含まれる。
【０１０９】
ある実施形態では、非二環式２’−修飾ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドである。
【０１１０】
ある実施形態では、４’〜２’二環式ヌクレオシドは、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’二環式ヌクレオシドである。
【０１１１】
ある実施形態では、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは１７連結ヌクレオシドから成り、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、オリゴヌクレオチドのポジション９が識別用多型と一致している。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは２−９−６である。
【０１１２】
ある実施形態では、本明細書に記載されるのは、１８連結ヌクレオシドから成り、識別用多型と９０％相補的である修飾オリゴヌクレオチドを含み、修飾オリゴヌクレオチドはウイング−ギャップ−ウイングモチーフを含み、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション９が識別用多型と一致しており、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドには２’−Ｏ−メトキシエチル糖が含まれ、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは４−９−５である化合物である。
【０１１３】
ある実施形態では、本明細書に記載されるのは、１９連結ヌクレオシドから成り、識別用多型と９０％相補的である修飾ヌクレオチドを含み、修飾オリゴヌクレオチドはウイング−ギャップ−ウイングモチーフを含み、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション１０が識別用多型と一致しており、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフが４−１１−４である化合物である。
【０１１４】
ある実施形態では、本明細書に記載されるのは、１５〜１９連結ヌクレオシドから成り、識別用多型に対し完全に相補的である修飾オリゴヌクレオチドであって、修飾オリゴヌクレオチドがウイング−ギャップ−ウイングモチーフを含み、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４が識別用多型と一致している修飾オリゴヌクレオチド、及び少なくとも１つの高度親和性糖修飾を含む化合物である。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは一塩基多型部位に対して１００％相補的である。
【０１１５】
ある実施形態では、少なくとも１つのウィング領域に高度親和性糖修飾が含まれる。ある実施形態では、高度親和性糖修飾は、二環式糖である。ある実施形態では、二環式糖に
は、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれる。
【０１１６】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション２、３、６、９、１０、１１、１３、又は１４のうち少なくとも１つに、少なくとも１つの高度親和性糖修飾が含まれる。
【０１１７】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション２、３、１３、及び１４のうち少なくとも１つに、少なくとも１つの高度親和性糖修飾が含まれる。
【０１１８】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドポジション２、３、１３、及び１４それぞれに、少なくとも１つの高度親和性糖修飾が含まれる。
【０１１９】
ある実施形態では、高度親和性糖修飾は二環式糖である。ある実施形態では、二環式糖には４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれる。
【０１２０】
ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、３−９−３、４−９−４、及び５−９−５から成る群のいずれかである。
【０１２１】
ある実施形態では、本明細書に記載されるのは、１５、１７、又は１９連結ヌクレオシドから成り、識別用多型に対し完全に相補的である修飾オリゴヌクレオチドであって、修飾オリゴヌクレオチドがウイング−ギャップ−ウイングモチーを含み、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション６、８、１０、又は１４が識別用多型と一致している修飾オリゴヌクレオチド、及び少なくとも１つの高度親和性糖修飾を含む化合物である。
【０１２２】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション２、３、６、９、１０、１１、１３、又は１４のうち少なくとも１つに、少なくとも１つの高度親和性糖修飾が含まれる。
【０１２３】
ある実施形態では、高度親和性糖修飾は二環式糖である。ある実施形態では、二環式糖には４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれる。
【０１２４】
ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、３−９−３、４−９−４、及び５−９５から成る群のいずれかである。
【０１２５】
ある実施形態では、本明細書に記載されるのは、１５連結ヌクレオシドから成り、識別用多型と９０％相補的である修飾オリゴヌクレオチドであって、修飾オリゴヌクレオチドがウイング−ギャップ−ウイングモチーフを含み、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション８が識別用多型と一致している修飾オリゴヌクレオチド、及び少なくとも１つの高度親和性糖修飾を含む化合物である。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、識別用多型に対し１００％相補的である。
【０１２６】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドポジション２、３、１３、及び１４それぞれに、少なくとも１つの高度親和性糖修飾が含まれる。
【０１２７】
ある実施形態では、高度親和性糖修飾は二環式糖である。ある実施形態では、二環式糖には４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれる。
【０１２８】
ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは３−９−３である。
【０１２９】
ある実施形態では、本明細書に記載されるのは、細胞、組織、又は動物における一塩基多型を含む遺伝子の対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減する方法であり、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５が識別用多型と一致する、識別用多型に対し相補的な修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を、細胞、組織、又は動物に投与することが含まれる。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは単一の識別用多型に対し９０％相補的である。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、一塩基多型部位に対し９５％相補的である。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、一塩基多型部位に対し１００％相補的である。
【０１３０】
ある実施形態では、一塩基多型部位は１２〜３０核酸塩基長である。ある実施形態では、一塩基多型部位は１５〜２５核酸塩基長である。ある実施形態では、一塩基多型部位は１７〜２２核酸塩基長である。ある実施形態では、一塩基多型部位は１７核酸塩基長である。ある実施形態では、一塩基多型部位は１８核酸塩基長である。ある実施形態では、一塩基多型部位は１９核酸塩基長である。ある実施形態では、一塩基多型部位は２０核酸塩基長である。
【０１３１】
ある実施形態では、対立遺伝子多様体は疾患と関連している。ある実施形態では、疾患はハンチントン病である。
【０１３２】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【０１３３】
ある実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシド間連結が、修飾ヌクレオシド間連結である。ある実施形態では、各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオ酸ヌクレオシド間連結である。
【０１３４】
ある実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシドには修飾核酸塩基が含まれる。ある実施形態では、少なくとも１つの修飾核酸塩基は、５’−メチルシトシンである。
【０１３５】
ある実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシドには修飾糖が含まれる。ある実施形態では、修飾糖は高度親和性糖修飾である。ある実施形態では、高度親和性糖修飾は二環式糖である。ある実施形態では、各二環式糖には４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれる。
【０１３６】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えた修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドポジション２、３、１３、及び１４の少なくとも１つに、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジを含む二環式糖を有するヌクレオシドが含まれる。
【０１３７】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えた修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドポジション２、３、１３、及び１４それぞれに、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジを含む二環式糖が含まれる。
【０１３８】
ある実施形態では、少なくとも１つの修飾糖には、２’−Ｏ−メトキシエチルが含まれる。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドのウィングセグメントに位置する各ヌクレオシドには、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾が含まれる。
【０１３９】
ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−４、３−９−５、４−７−４、４−９−４、４−９−５、４−１０−５、４−１１−４、４−１１−５、５−７−５、５−８−６、５−９−３、５−９−５、５−１０−４、５−１０−５、６−７−６、６−８−５、及び６−９−２から成る群のいずれかである。
【０１４０】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、リボザイム、二本鎖ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡではない。
【０１４１】
ある実施形態では、一塩基多型部位は、疾患と関連する突然変異対立遺伝子上に存在する。ある実施形態では、一塩基多型部位には、識別用多型が含まれる。
【０１４２】
ある実施形態では、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２〜２０の連結ヌクレオシドから成る。ある実施形態では、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５〜１９の連結ヌクレオシドから成る。
【０１４３】
ある実施形態では、ギャップ領域は７〜１１ヌクレオシド長であり、５’ウィング領域は１〜６核酸塩基長であり、及び３’ウィング領域は１〜６核酸塩基長である。
【０１４４】
ある実施形態では、少なくとも１つのウィング領域の少なくとも１つのヌクレオシドには、修飾糖又は糖代用が含まれる。
【０１４５】
ある実施形態では、各ウィング領域の各ヌクレオシドには、修飾糖又は糖代用が含まれる。ある実施形態では、糖又は糖代用は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖である。
【０１４６】
ある実施形態では、少なくとも１つのウィング領域には、４’〜２’二環式ヌクレオシドが含まれ、残りのウィングヌクレオシドのうち少なくとも１つが、非二環式２’−修飾ヌクレオシドである。
【０１４７】
ある実施形態では、非二環式２’−修飾ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドである。
【０１４８】
ある実施形態では、４’〜２’二環式ヌクレオシドは４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’二環式ヌクレオシドである。
【０１４９】
ある実施形態では、本明細書に記載されるのは、細胞、組織、又は動物において一塩基多型を含む遺伝子の対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減する方法であり、修飾オリゴヌクレオチドにウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５が識別用多型と一致する、識別用多型に対し相補的な修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を、細胞、組織、又は動物に投与することが含まれる。
【０１５０】
ある実施形態では、本明細書に記載されるのは、細胞、組織、又は動物において一塩基多型を含む遺伝子の、突然変異対立遺伝子である対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減する方法であり、１２〜３０連結ヌクレオシドから成り、識別用多型に対し相補的な修飾オリゴヌクレオチドであって、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えたポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５が識別用多型と一致している修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を、細胞、組織、又は動物に投与することが含まれる。
【０１５１】
ある実施形態では、突然変異対立遺伝子は、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、アレキサンダー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＡ）、脊髄小脳失調症、捻転ジストニア、心筋症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝疾患、肝細胞癌、全身性エリテマトーデス、高コレステロール血症、乳癌、喘息、１型糖尿病、関節リウマチ、グレーブス病、ＳＬＥ、球脊髄性筋萎縮症、ケネディ病、進行性の小児期後嚢下の白内障、コレステロール胆石症、関節硬化症、心血管疾患、原発性高カルシウム尿症、α−サラセミア、強迫性障害、不安、併存するうつ病、先天性の視覚的な欠陥、高血圧、メタボリックシンドローム、前立腺がん、先天性筋無力症候群、末梢動脈疾患、心房細動、散発性褐色細胞腫、先天奇形、マチャド−ジョセフ病、ハンチントン病、及び常染色体優性網膜色素変性症から成る群の任意の疾患と関連している。
【０１５２】
ある実施形態では、本明細書に記載されるのは、細胞、組織、又は動物における一塩基多型を含む遺伝子の、ハンチントン病に関連する対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減することが含まれるハンチントン病の治療法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドから成り、識別用多型に対して相補的である修飾オリゴヌクレオチドであって、修飾オリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５が識別用多型と一致している修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を、細胞、組織、又は動物に投与することが含まれる。
【０１５３】
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション８、９、若しくは１０、又は、ギャップの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション４、５、又は６が一塩基多型と一致している。
【０１５４】
一塩基多型（ＳＮＰ）
一塩基多型（ＳＮＰ）は、遺伝的異質性の主要なソースを表すＤＮＡ配列中における１塩基対の代替である（Ｇｅｎｅ．１９９９、２３４：１７７）。ＳＮＰ遺伝子型同定は、このような遺伝的多様体を調べるのに重要なツールである（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０００、１０：８９５；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００、１８：７７）。ある実施形態では、ＳＮＰを含む遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するよう設計されたアンチセンス化合物は、有効性、選択性、及び集団遺伝学の適用内容に基づき選択された。
【０１５５】
有効性
ある実施形態では、ＳＮＰを含む遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するよう設計されたアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物の有効性に基づいて作成される。有効性とは、一般に、標的配列領域のアンチセンス阻害に対する感受性を指している。ある実施形態では、特定のＳＮＰ部位は、アンチセンス阻害に特異的に敏感であり得る。そのような感受性の高い特定のＳＮＰ部位は、遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するためのアンチセンス化合物の標的となり得る。有効性は、ベンチマークオリゴヌクレオチドによる突然変異体ｍＲＮＡの阻害度と比較した、ＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる突然変異体ｍＲＮＡの阻害度により示される。
【０１５６】
選択性
ある実施形態では、ＳＮＰを含む遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するよう設計されたアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物の選択性に基づき作成される。選択性とは、一般に、野生型ＨＴＴタンパク質をコードするＲＮＡと比べ、突然変異体ＨＴＴタンパク質をコードするＲＮＡ中の１又は複数の識別用多型（ＳＮＰ）を優先的に標的と
する特定の配列、モチーフ、及び化学修飾を含むアンチセンス化合物を指している。ある実施形態では、特定の配列、モチーフ、及び化学修飾は、ＳＮＰを含む遺伝子の対立遺伝子多様体を低減するのに特異的に選択する。特定の配列、モチーフ、及び化学修飾は、遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するのに利用される。選択性は、マイナー対立遺伝子又は野生型対立遺伝子と比較した、メジャー対立遺伝子又は突然変異対立遺伝子の発現を優先的に阻害するＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力により示される。
【０１５７】
集団遺伝学
ある実施形態では、ＳＮＰを含む遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するよう設計されたアンチセンス化合物は、疾患を患う集団の集団遺伝学に基づき作成される。集団遺伝学とは、特定の疾患を患う患者の疾患染色体にＳＮＰが現れる頻度を意味する。ある実施形態では、疾患はハンチントン病である。アンチセンス化合物の有効性及び選択性が等しい場合、集団遺伝学的により関連性のあるＳＮＰ標的の方が、疾患染色体との関連が弱いＳＮＰよりも好ましい。
【０１５８】
アンチセンス化合物
オリゴマー化合物には、限定されないが、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、模倣オリゴヌクレオチド、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びｓｉＲＮＡｓが含まれてもよい。オリゴマー化合物は、標的核酸に対する「アンチセンス」でもよく、それはすなわち、水素結合により標的核酸をハイブリダイズできるということである。
【０１５９】
ある実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、リボザイム、二本鎖ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡではない。
【０１６０】
ある実施形態では、アンチセンス化合物は、５’から３’方向へ進む場合、標的対象である標的核酸の逆相補的標的セグメントを含む核酸塩基配列を有する。係る実施形態の特定の形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’から３’方向へ進む場合、標的対象である標的核酸の逆相補的標的セグメントを含む核酸塩基配列を有する。
【０１６１】
ある実施形態では、アンチセンス化合物は、１２〜３０サブユニット長である。言い換えれば、アンチセンス化合物は、１２〜３０連結サブユニットである。他の実施形態では、アンチセンス化合物は、８〜８０、１２〜５０、１５〜３０、１８〜２４、１９〜２２、又は２０連結サブユニットである。係る実施形態の特定の形態では、アンチセンス化合物は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、若しくは８０連結サブユニット長、又は上記の任意の２つの値により定められる範囲である。いくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、連結サブユニットは、ヌクレオシドである。
【０１６２】
ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを短縮又は切断してもよい。例えば、単一サブユニットを、５’末端（５’トランケーション）、又は代わりに３’末端（３’トランケーション）から欠失させてもよい。核酸を標的とするアンチセンス化合物を短縮又は切断するのに、アンチセンス化合物の５’末端から２つのサブ
ユニットを欠失させてもよく、又は代わりに、アンチセンス化合物の３’末端から２つのサブユニットをさせてもよい。その代替として、欠失ヌクレオシドをアンチセンス化合物内に分散させてもよく、例えば、１つのヌクレオシドを５’末端から欠失させ、もう１つのヌクレオシドを３’末端から欠失させたアンチセンス化合物でもよい。
【０１６３】
単一の追加サブユニットが、伸張されたアンチセンス化合物に存在する場合、追加サブユニットはアンチセンス化合物の５’末端又は３’末端に局在してもよい。２又はそれ以上の追加サブユニットが存在する場合、例えば、２つのサブユニットを５’末端に追加（５’末端挿入）するか、又は代わりに３’末端に追加（３’末端挿入）したアンチセンス化合物で、互いに隣接してもよい。その代替として、追加サブユニットをアンチセンス化合物内に分散させてもよく、例えば、１つのサブユニットを５’末端に挿入し、もう１つのサブユニットを３’末端に挿入したアンチセンス化合物でもよい。
【０１６４】
アンチセンスオリゴヌクレオチド等のアンチセンス化合物の長さを伸張若しくは短縮し、及び／又は活性を除去することなくミスマッチ塩基を導入することは可能である。例えば、Ｗｏｏｌｆら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：７３０５−７３０９、１９９２）は、一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドの１３〜２５核酸塩基長が、卵母細胞注入モデルで標的ＲＮＡの切断を誘導できるかどうかを試験した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの末端付近に８個又は１１個のミスマッチ塩基を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの２５核酸塩基長は、ミスマッチを含まないアンチセンスオリゴヌクレオチドと比べると程度では劣るが、標的ｍＲＮＡの特異的切断を導くことができた。同様に、１個又は３個のミスマッチを有するものを含め、１３核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、標的特異的切断が達成された。
【０１６５】
Ｇａｕｔｓｃｈｉら（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３：４６３−４７１、３月号、２００１年）は、ｂｃｌ−２ｍＲＮＡに対し１００％相補性を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでｂｃｌ−２及びｂｃｌ−ｘＬ双方の発現を低減するｂｃｌ−ｘＬ  ｍＲＮＡに対し３個ミスマッチを有するオリゴヌクレオチドの能力を示した。さらに、このオリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性である可能性を示した。
【０１６６】
ＭａｈｅｒとＤｏｌｎｉｃｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１６：３３４１−３３５８、１９８８）は、一連のタンデム型１４核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに、２個又は３個のタンデム型アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列から成る２８及び４２核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドそれぞれに対し、ウサギ網状赤血球アッセイにおいてヒトＤＨＦＲの翻訳を停止させる能力を試験した。３つの１４核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドはそれぞれ、２８又は４２核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドより程度は劣るが、単独で翻訳を阻害することができた。
【０１６７】
しかしながら、対立遺伝子多様体の発現の選択的低減は、標的核酸に含まれるＳＮＰが、アンチセンス化合物のミスマッチの塩基ではなく、相補的塩基とアニールする場合に最適となる。さらに、選択性は一般に、ＳＮＰ部位とアンチセンス化合物の間にほとんどミスマッチが存在しない場合に向上する。しかし、特定の数のミスマッチは許容範囲にあるといえる。
【０１６８】
アンチセンス化合物モチーフ
ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、阻害活性の強化、標的核酸への結合親和性の増加、又はｉｎ  ｖｉｖｏ核酸分解酵素による分解への耐性等の特性をアンチセンス化合物に付与するために、パターンやモチーフを調整した化学修飾サブユニットを有する。
【０１６９】
キメラアンチセンス化合物には、典型的に、核酸分解酵素による分解への耐性の向上、細胞吸収の増加、標的核酸への結合性親和性の増加、及び／又は阻害活性の強化のために修飾された少なくとも１つの領域が含まれる。キメラアンチセンス化合物の第２領域は、任意選択的に、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する、細胞エンド核酸分解酵素ＲＮａｓｅＨの基質として機能し得る。
【０１７０】
ギャップマーモチーフを有するアンチセンス化合物は、キメラアンチセンス化合物と考えられる。ギャップマーでは、ＲＮａｓｅＨ切断をサポートする複数のヌクレオチドを有する内部領域が、内部領域のヌクレオシドとは化学的に異なる複数のヌクレオチドを有する外部領域の間に位置する。ギャップマーモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ギャップセグメントは通常、エンド核酸分解酵素切断の基質として機能し、一方で、ウィングセグメントには修飾ヌクレオシドが含まれる。ＳＮＰを含む遺伝子の対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ＳＮＰはギャップセグメント内で核酸塩基とアニールする。
【０１７１】
ある実施形態では、ＳＮＰは、アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４の核酸塩基とアニールするか、又はそれらに対し相補的である。この場合、ポジションとは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えた、アンチセンスオリゴヌクレオチド内の核酸塩基の定位を指している。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド内の最も５’末端側核酸塩基は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの最初のポジションにある。ある実施形態では、ＳＮＰは、（５’末端から数えて）アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション６、７、８、９、又は１０にある核酸塩基とアニールするか、又はそれらに対し相補的である。ある実施形態では、ＳＮＰは、（５’末端から数えて）アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション９又は１０にある核酸塩基とアニールするか、又はそれらに対し相補的である。
【０１７２】
ある実施形態では、ＳＮＰは、ギャップセグメントのポジション１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０にある核酸塩基とアニールする。この場合ポジションは、ギャップセグメントの５’末端から数えて、ギャップセグメント内の核酸塩基の定位を指している。例えば、ギャップセグメント内の最も５’末端側核酸塩基は、ギャップセグメントの最初のポジションにある。ある実施形態では、ＳＮＰは、ギャップセグメントの５’末端から数えてポジション４、５、６、又は７にある核酸塩基とアニールする。ある実施形態では、ＳＮＰは、ギャップセグメントの５’末端から数え始めて４又は５番目のポジションにある核酸塩基とアニールする。
【０１７３】
ある実施形態では、ギャップマーの領域は、それぞれ異なる領域を含む糖部分のタイプにより区別される。ある実施形態では、ギャップマーの領域を区別するために用いられる糖部分のタイプには、β−Ｄ−リボヌクレオシド、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド、２’−修飾ヌクレオシド（２’−修飾ヌクレオシドには、とりわけ、２’−ＭＯＥ及び２’−Ｏ−ＣＨ３が含まれてもよい）、及び二環式糖修飾ヌクレオシド（二環式糖修飾ヌクレオシドには、４’−（ＣＨ２）ｎＯ−２’ブリッジを有するものが含まれてもよく、式中、ｎ＝１又はｎ＝２である）が含まれ得る。二環部分は、化学式４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’を有するｃＥｔであってもよい。
【０１７４】
ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、しばしば「Ｘ−Ｙ−Ｚ」と記述され、「Ｘ」は５’ウィング領域の長さを表し、「Ｙ」はギャップ領域の長さを表し、「Ｚ」は、３’ウィング領域の長さを表している。本明細書で使用される、「Ｘ−Ｙ−Ｚ」と記載されるギャップマーは、ギャップセグメントが５’ウィングセグメント及び３’ウィングセグメントそれぞれに直隣接するよう位置づけられた配置を有している。よって、５’ウィングセグメントとギャップセグメントの間に、又はギャップセグメントと３’ウィングセグ
メントの間に媒介ヌクレオチドは存在しない。本明細書に記載の任意のアンチセンス化合物は、ギャップマーモチーフを有し得る。いくつかの実施形態では、Ｘ及びＺは同じであり、他の実施形態では、それらは異なる。ある実施形態では、Ｙは８ヌクレオチドと１５ヌクレオチドの間である。ある実施形態では、Ｙはデオキシヌクレオチドから成る。Ｘ、Ｙ、又はＺは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、又はそれ以上のヌクレオチドのいずれかであり得る。よって、本発明のギャップマーには、例えば、１−１０−１、１−１８−１、２−８−２、２−９−６、２−１０−２、２−１３−５、２−１６−２、３−９−３、３−９−５、３−１０−３、３−１４−３、４−８−４、４−９−５、４−１０−５、４−１１−４、４−１２−３、４−１２−４、５−８−５、５−９−５、５−１０−４、５−１０−５、又は６−８−６が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７５】
ある実施形態では、アンチセンス化合物には、ウィングギャップ又はギャップ−ウィング配置、すなわち、上記のギャップマー配置のＸ−Ｙ又はＹ−Ｚ配置を有する「ウィングマー」モチーフが存在する。よって、本発明のウィングマー配置には、例えば、５−１０、８−４、４−１２、１２−４、３−１４、１６−２、１８−１、１０−３、２−１０、１−１０、８−２、２−１３、５−１３、５−８、又は６−８が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７６】
ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、２−９−６ギャップマーモチーフ又は６−９−２ギャップマーモチーフを有する。
【０１７７】
ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、３−９−３ギャップマーモチーフを有する。
【０１７８】
ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、３−９−５ギャップマーモチーフ又は５−９−３ギャップマーモチーフを有する。
【０１７９】
ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、４−９−５ギャップマーモチーフ又は５−９−４ギャップマーモチーフを有する。
【０１８０】
ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、４−１０−５ギャップマーモチーフ又は５−１０−４ギャップマーモチーフを有する。
【０１８１】
ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、４−１１−４ギャップマーモチーフを有する。
【０１８２】
ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、５−９−５ギャップマーモチーフを有する。
【０１８３】
ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、５−８−６ギャップマーモチーフ又は６−８−５ギャップマーモチーフを有する。
【０１８４】
ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、６−７−６ギャップマーモチーフを有する。
【０１８５】
ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、６−８−５ギャップマーモチーフ又は５−８−６ギャップマーモチーフを有する。
【０１８６】
ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、３−９−４ギャップマー
モチーフ又は４−９−３ギャップマーモチーフを有する。
【０１８７】
ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、５−７−５ギャップマーモチーフを有する。
【０１８８】
ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、４−７−４ギャップマーモチーフを有する。
【０１８９】
ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、５−１０−５ギャップマーモチーフを有する。
【０１９０】
ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、ギャップ拡大型モチーフを有する。
【０１９１】
特定の混合ウィング
ある実施形態では、本発明は、１つのウィングの少なくとも１つのヌクレオシドに、同じウィングの少なくとも１つの他のヌクレオシドと比較して、異なる修飾が施されているギャップマー化合物を提供する。アンチセンス化合物は、混合ウィングアンチセンス化合物と称される（国際公開第２００８／０４９０８５号を参照のこと）。ある実施形態では、３’ウィングの１又は複数のヌクレオシドの修飾（又は非修飾）は、３’ウィングの１又は複数の他のヌクレオシドの修飾（又は非修飾）とは異なる。アンチセンス化合物は、３’混合ウィングギャップマーと称され得る。ある実施形態では、５’ウィングの１又は複数のヌクレオシドの修飾（又は非修飾）は、５’ウィングの１又は複数の他のヌクレオシドの修飾（又は非修飾）と異なる。アンチセンス化合物は、５’混合ウィングギャップマーと称され得る。ある実施形態では、３’ウィングの１又は複数のヌクレオシドの修飾（又は非修飾）は、３’ウィングの１又は複数の他のヌクレオシドの修飾（又は非修飾）と異なり、５’ウィングの１又は複数のヌクレオシドの修飾（又は非修飾）は、５’ウィングの１又は複数の他のヌクレオシドの修飾（又は非修飾）とは異なる。アンチセンス化合物は、３’、５’混合ウィングギャップマーと称され得る。係る実施形態では、３’ウィングと５’ウィングにおける修飾及び修飾の組み合わせは、同じであってもよく、又は異なってもよい。
【０１９２】
ある実施形態では、混合ウィング化合物は所望の特性を有する。特定のヌクレオシド修飾は、アンチセンス化合物に所望の特性、例えば、標的ヘの親和性向上又は核酸分解酵素耐性を付与するだけでなく、毒素性の増加等の望ましくない特性ももたらす。特定の他のヌクレオシド修飾を組み入れる結果、異なる特性プロファイルを有するアンチセンス化合物となる。ある実施形態では、所望の特徴を最適化し、及び／又は望ましくない特徴を最小化するために、片方又は両方のウィングで修飾を組み合わせることもできる。ある実施形態では、混合ウィングアンチセンス化合物のウィングには、非修飾ヌクレオシドを含むアンチセンス化合物と比べて、標的核酸用アンチセンス化合物の親和性を増加させる第１の修飾を含む１又は複数のヌクレオシドが含まれ、また、全てに第１の修飾が含まれるヌクレオシドを含有するウィングを有するアンチセンス化合物と比べて、毒素性の低減をもたらす第２の修飾が含まれる１又は複数のヌクレオシドが含まれる。
【０１９３】
ある実施形態では、アンチセンス化合物には、少なくとも１つのＭＯＥ置換ヌクレオシド及び少なくとも１つの高度親和性修飾が含まれる少なくとも１つのウィングが含まれる。ある実施形態では、少なくとも１つのＭＯＥ置換ヌクレオシド及び少なくとも１つの高度親和性は、３’ウィングに存在する。係る実施形態の特定の形態では、少なくとも１つのＭＯＥ置換ヌクレオシド及び少なくとも１つの高度親和性は、５’ウィングに存在する。
【０１９４】
ある実施形態では、アンチセンス化合物は、５’ウィング及び／又は３’ウィングに、１、２、又は３個の高度親和性修飾を含む。
【０１９５】
標的核酸、標的領域及びヌクレオチド配列
ある実施形態では、ハンチンチンの対立遺伝子多様体は選択的に低減される。ハンチンチンをコードするヌクレオチド配列には、以下が含まれるが、これらに限定されない。すなわち、１５６６０００〜１７６８０００のヌクレオチドから切断され（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿００６０５１と置換）、配列番号１として本明細書に組み入れられたＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿００６０８１．１８、及び配列番号２として本明細書に組み入れられたＮＭ００２１１１．６である。
【０１９６】
本明細書に含まれる実施形態の各配列番号に記載の配列は、糖部分に対する任意の修飾、ヌクレオシド間連結、又は核酸塩基からは独立していると理解される。そのように、配列番号により定義されるアンチセンス化合物には、糖部分に対する１又は複数の修飾、ヌクレオシド間連結、又は核酸塩基が独立して含まれ得る。Ｉｓｉｓ番号（Ｉｓｉｓ  Ｎｏ）により記載されるアンチセンス化合物は、核酸塩基配列及びモチーフの組み合わせを示す。
【０１９７】
ある実施形態では、標的領域は、構造的に定義される標的核酸の領域である。例えば、標的核酸には、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、エキソン、イントロン、エキソン／イントロン交差、コード領域、翻訳開始領域、翻訳終了領域、又はその他に定義される核酸領域が含まれ得る。構造的に定義されるハンチンチン領域は、ＮＣＢＩ等の配列データベースからアクセッション番号により入手可能であり、係る情報は、本明細書に引用により組み入れられる。ある実施形態では、標的領域には、標的領域内の１つの標的セグメントの５’標的部位から、同じ標的領域内の別の標的セグメントの３’標的部位までの配列が含まれ得る。
【０１９８】
標的決定には、所望の効果を生じるよう、アンチセンス化合物がハイブリダイズする少なくとも１つの標的セグメントの決定が含まれる。ある実施形態では、所望の効果は、特定の対立遺伝子多様体のｍＲＮＡ標的核酸レベルの低減である。ある実施形態では、所望の効果は、標的核酸によりコードされるタンパク質のレベル又は特定の対立遺伝子多様体に関連する表現型変異の低減である。
【０１９９】
標的領域には、１又は複数の標的セグメントが含まれる。標的領域内の複数の標的セグメントは、重複してもよい。それに代わり、標的領域内の複数の標的セグメントは、重複していなくてもよい。ある実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、約３００個以下のヌクレオチドで分離される。ある実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上の約２５０個、約２００個、約１５０個、約１００個、約９０個、約８０個、約７０個、約６０個、約５０個、約４０個、約３０個、約２０個、若しくは約１０個、又は各個数以下の、又はおよそ各個数以下の、又はこれら任意の２つの値により定められる範囲の個数のヌクレオチドで分離される。ある実施形態では標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上の５個以下又は約５個以下のヌクレオチドで分離される。ある実施形態では、標的セグメントは隣接している。本明細書に列記される任意の５’標的部位又は３’標的部位のいずれかが核酸の開始点となる範囲により定義される標的領域について考察が行われる。
【０２００】
好適な標的セグメントは、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、イントロン、エキソン、又はエキソン／イントロン交差内に認められる。開始コドン又は終止コドンを含む標的セグメントも好適な標的セグメントでもある。好適な標的セグメントは、開始コドン又
は終止コドン等、構造的に定義される特定の領域を特異的に排除することもできる。
【０２０１】
好適な標的セグメントの決定には、ゲノム全体の中で、標的核酸配列とその他の配列を比較することが含まれ得る。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、異なる核酸間の類似領域を同定できる。この比較により、選択された標的核酸以外の配列（すなわち、非標的配列又は対象外配列）に非特異的にハイブリダイズできるアンチセンス化合物配列の選択を防ぐことができる。
【０２０２】
細胞株
ある実施形態では、以下に記載の実験において、ＧＭ０４２８１細胞株、ＧＭ０２１７１細胞株、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞株が使われる。ＧＭ０４２８１細胞株は、１７リピートを含む野生型ＨＴＴ対立遺伝子及び６９リピートを含む突然変異ＨＴＴ対立遺伝子を有する。細胞株は、両親もまた疾患を患う患者由来である。ＧＭ０２１７１細胞株は、ＧＭ０４２８１に対する対照群として選ばれた。この細胞株は、片親のみ疾患を有する娘由来である。この娘はＨＤを発症していないが、発症リスクありと考えられた。ＧＭ０２１７３Ｂ細胞株も患者由来であり、ハロタイプ試験の対照として使用された。
【０２０３】
表１は、ＧＭ０４２８１細胞株、ＧＭ０２１７１細胞株、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞株で発見されたＳＮＰを示している。また、各ＳＮＰ位置で発見された対立遺伝子多様体、各細胞株の遺伝子型、及び特定の対立遺伝子多様体を有するＨＤ患者の割合も示している。例えば、ＳＮＰｒｓ６４４６７２３の２つの対立遺伝子多様体はＴとＣである。ＧＭ０２１７１細胞株は、ホモ接合型ＣＣであり、ＧＭ０２１７３細胞株は、ヘテロ接合型ＴＣであり、ＧＭ０４２８１細胞株は、ホモ接合型ＴＴである。ＨＤ患者の５０％が、ＳＮＰ位置ｒｓ６４４６７２３にＴを有している。
【０２０４】
【表１−１】
2020089382.tif 000002
【表１−２】
2020089382.tif 000003
【表１−３】
2020089382.tif 000004
【０２０５】
ハイブリダイゼーション
いくつかの実施形態では、本明細書で開示するアンチセンス化合物とＳＮＰ部位の間で起こる。ハイブリダイゼーションの最も一般的なメカニズムは、核酸分子の相補的核酸塩基間の水素結合（例えば、ワトソン−クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティー
ン水素結合等）を含む。
【０２０６】
ハイブリダイゼーションは、様々な状況下で起こり得る。ストリンジェント条件は配列に依存し、ハイブリダイゼーション対象の核酸分子の性質及び構成により決定する。
【０２０７】
ある実施形態では、本明細書で提供するアンチセンス化合物は、特定の対立遺伝子多様体の核酸と特異的にハイブリダイズする。
【０２０８】
相補性
所望の効果（例えば、対立遺伝子多様体の遺伝子産物の選択的低減）を生じるよう相当数のアンチセンス化合物の核酸塩基が、標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合し得る場合、アンチセンス化合物及び標的核酸は互いに相補的である。
【０２０９】
アンチセンス化合物と標的核酸の間の非相補的核酸塩基は、アンチセンス化合物が標的核酸と特異的にハイブリダイズできる状態が維持される限り、許容され得る。さらに、アンチセンス化合物は、介入セグメント又は隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないよう（例えば、ループ構造、ミスマッチ又はヘアピン構造）、１又は複数の標的核酸のセグメントとハイブリダイズすることもできる。
【０２１０】
ある実施形態では、本明細書で提供するアンチセンス化合物、又はその特異的部分は、標的核酸、標的領域、標的セグメント、ＳＮＰ部位、又はその特異的部分に対し、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相補的であるか、又は少なくともそうである。標的核酸を有するアンチセンス化合物の相補性割合は、通常の方法により決定し得る。例えば、アンチセンス化合物の２０個の核酸塩基のうち１８個が標的領域と相補的であり、よって特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、９０％の相補性を表す。本実施例において、残りの非相補的核酸塩基をクラスター化してもよく、又は相補的核酸塩基と共に分散させてもよく、互いに又は相補的核酸塩基と隣接する必要はない。そのように、標的核酸に対し完全に相補的である２つの領域と隣接する４つの非相補的核酸塩基を有する１８核酸塩基長であるアンチセンス化合物は、標的核酸に対し総じて７７．８％相補的であり、よって本発明の範囲内に当する。標的核酸の領域を有するアンチセンス化合物の相補性割合は、通常用いられるＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所的アラインメントサーチツール）及び当技術分野で既知のＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０、２１５、４０３−４１０；ＺｈａｎｇとＭａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９９７、７、６４９−６５６）により決定され得る。相同性割合、配列同一性又は相補性は、例えば、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１、２、４８２−４８９）のアルゴリズムを使用し、Ｇａｐプログラム（ウィスコンシン配列解析パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ）、Ｕｎｉｘ用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ社、ウィスコンシン州マジソン、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ）のデフォルト設定により決定し得る。
【０２１１】
ある実施形態では、本明細書で提供されるアンチセンス化合物、又はその特異的部分は、標的核酸、ＳＮＰ部位、標的領域、標的セグメント、又はその特異的部分に対して完全に相補的（すなわち、１００％相補的）である。本明細書で使用される「完全に相補的」は、アンチセンス化合物の各核酸塩基が、標的核酸の対応する核酸塩基と正確な塩基対を形成し得るという意味である。例えば、２０核酸塩基アンチセンス化合物は、アンチセンス化合物に対し完全に相補的である標的核酸の対応する２０核酸塩基部分が存在すれば、４００核酸塩基長である標的配列に対して完全に相補的である。完全に相補的であるとい
う用語はまた、第１及び／又は第２の核酸の特異的部分に関連して用いられ得る。例えば、３０核酸塩基アンチセンス化合物の２０核酸塩基部分は、４００核酸塩基長である標的配列に対して「完全に相補的」であり得る。もし標的配列が対応する２０核酸塩基部分を有し、各核酸塩基がアンチセンス化合物の２０核酸塩基部分に対し相補的であるなら、３０核酸塩基オリゴヌクレオチドの２０核酸塩基部分は完全に相補的である。同時に、３０核酸塩基アンチセンス化合物全体が標的配列に対して完全に相補的であってもなくてもよいが、それは、アンチセンス化合物の残りの１０核酸塩基も標的配列に対して相補的であるかどうかによる。
【０２１２】
非相補的核酸塩基の位置は、アンチセンス化合物の５’末端又は３’末端であり得る。その代わりとして、１又は複数の非相補的核酸塩基は、アンチセンス化合物内の位置であってもよい。２又はそれ以上の非相補的核酸塩基が存在する場合、隣接（すなわち、連結）又は非隣接であってもよい。１つの実施形態では、非相補的核酸塩基はギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのウィングセグメントに局在する。
【０２１３】
ある実施形態では、核酸塩基長が１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０、又はそれ以下であるアンチセンス化合物には、標的核酸、ＳＮＰ部位、又はその特異的部分と関連する６以下、５以下、４以下、３以下、２以下又は１以下の非相補的核酸塩基が含まれる。
【０２１４】
ある実施形態では、核酸塩基長が１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０、又はそれ以下であるアンチセンスオリゴヌクレオチドには、標的核酸、ＳＮＰ部位、又はその特異的部分と関連する６以下、５以下、４以下、３以下、２以下又は１以下の非相補的核酸塩基が含まれる。
【０２１５】
本明細書で提供されるアンチセンス化合物にはまた、標的核酸の部分に対して相補的なものが含まれる。本明細書で使用される「部分」は、標的核酸の領域又はセグメント内の定められた数の隣接（すなわち、連結）核酸塩基を指している。「部分」はまた、アンチセンス化合物の定められた数の隣接核酸塩基を指し得る。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも８核酸塩基部分に対し相補的である。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも１２核酸塩基部分に対して相補的である。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも１５核酸塩基部分に対し相補的である。標的セグメントの少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、若しくはそれ以上の核酸塩基部分、又はこれら数値の任意の２つの値により定められる範囲に対し相補的であるアンチセンス化合物についても考察が行われる。
【０２１６】
同一性
本明細書で提供されるアンチセンス化合物はまた、特定のヌクレオチド配列、配列番号、又は特定のＩｓｉｓ番号で表される化合物若しくはその部分により表される化合物に対し、定められた割合の同一性を有し得る。本明細書で使用されるように、アンチセンス化合物は、核酸塩基の対形成能が同じであれば、本明細書で開示する配列に対して同一である。例えば、開示されるＤＮＡ配列のチミジンの代わりにウラシルを含むＲＮＡは、ウラシルとチミジン双方ともアデニンと対形成するため、ＤＮＡ配列と同一であると考えられる。本明細書に記載のアンチセンス化合物の短縮版又は伸張版、並びに本明細書で提供されるアンチセンス化合物と関連する非同一塩基を有する化合物についても考察が行われる。非同一塩基は互いに隣接してもよく、又はアンチセンス化合物全体に分散してもよい。アンチセンス化合物の同一性割合は、比較対象の配列と関連する同一の塩基対形成を有す
る塩基数に従って算出される。
【０２１７】
ある実施形態では、アンチセンス化合物、又はその部分は、本明細書で開示される１又は複数のアンチセンス化合物又は配列番号、又はその部分に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である。
【０２１８】
ある実施形態では、アンチセンス化合物の部分は、標的核酸の等長部分と比較される。ある実施形態では、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５核酸塩基部分を、標的核酸の等長部分と比較する。
【０２１９】
ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの部分は、標的核酸の等長部分と比較される。ある実施形態では、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５核酸塩基部分を、標的核酸の等長部分と比較する。
【０２２０】
修飾
ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの核酸塩基（塩基ともいう）部分は、通常、ヘテロ環式塩基部分である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合的に連結するリン酸基をさらに含んだヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むこれらヌクレオシドでは、リン酸基は、糖の２’、３’又は５’ヒドロキシ部分と連結し得る。オリゴヌクレオチドは、互いに隣接するヌクレオシドを共有結合的に連結させて形成され、線状高分子オリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチド構造において、リン酸基は一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結を形成するものと称される。
【０２２１】
アンチセンス化合物の修飾には、ヌクレオシド間連結、糖部分、若しくは核酸塩基の置換又は変更が含まれる。例えば、細胞取込の向上、核酸標的への親和性向上、核酸分解酵素存在下での安定性向上、又は阻害活性の向上等の所望の特性の故に、修飾アンチセンス化合物は天然様式よりも好まれることが多い。
【０２２２】
化学的に修飾されたヌクレオシドはまた、標的核酸を対象とする短縮又は切断されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を向上させるために用いられ得る。その結果、より短いアンチセンス化合物でも化学修飾ヌクレオシドを有するのであれば、同等の結果が得られ得る。
【０２２３】
化学修飾ヌクレオシドはまた、対立遺伝子多様体の遺伝子産物の発現低減における選択性を向上させるためにも用いられ得る。
【０２２４】
修飾ヌクレオシド間連結
ＲＮＡ及びＤＮＡの天然に発生するヌクレオシド間連結は、３’から５’へのホスホジエステル連結である。例えば、細胞取込みの向上、標的核酸への親和性向上、及び核酸分解酵素存在下での安定性向上等の所望の特性の故に、天然発生ヌクレオシド間連結を有するアンチセンス化合物よりも、１又は複数の修飾ヌクレオシド間連結、すなわち、非天然発生のヌクレオシド間連結を有するアンチセンス化合物が選ばれることが多い。
【０２２５】
修飾ヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子を持つヌクレオシド間連結、並びにリン原子を持たないヌクレオシド間連結が含まれる。典型的なリン含有ヌクレオシド間連結には、ホスホジエステル類、ホスホトリエステル類、メチルホスホン
酸類、ホスホロアミド酸、及びホスホロチオ酸が含まれるが、これらに限定されない。リン含有及び非リン含有連結の製造方法は周知である。
【０２２６】
ある実施形態では、アンチセンス化合物には、１又は複数の修飾ヌクレオシド間連結が含まれる。ある実施形態では、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオ酸連結である。ある実施形態では、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオ酸ヌクレオシド間連結である。
【０２２７】
修飾糖部分
本発明のアンチセンス化合物には、糖基が修飾された、１又は複数のヌクレオシドが任意選択的に含まれ得る。糖修飾ヌクレオシドは、アンチセンス化合物に対し、核酸分解酵素安定性の向上、結合親和性の増加、対立遺伝子多様体の選択性の向上、又はその他いくつかの有益な生物特性をもたらす可能性がある。ある実施形態では、ヌクレオシドには、化学的に修飾されたリボフラノース環部分が含まれる。化学的に修飾されたリボフラノース環の実施例として、置換基（５’及び２’置換基、二環式核酸（ＢＮＡ）を形成する非ジェミナル環原子の架橋、リボシル環の酸素原子のＳ、Ｎ（Ｒ）又はＣ（Ｒ１）（Ｒ）２との置換（Ｒ＝Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル又は保護基）及びそれらの組み合わせの挿入が含まれるが、これらに限定されない。化学修飾糖の実施例には、２’−Ｆ−５’−メチル置換ヌクレオシド（その他の開示された５’、２’−ｂｉｓ置換ヌクレオシドに関しては、２００８年８月２１日に公開されたＰＣＴ国際出願の国際公開第２００８／１０１１５７号を参照のこと）又はリボシル環の酸素原子をＳと、さらに２’位置換（２００５年６月１６日に公開された米国特許出願公開第２００５−０１３０９２３号を参照のこと）又は、代替としてＢＮＡの５’位置換（２００７年１１月２２日に公開されたＰＣＴ国際出願の国際公開第２００７／１３４１８１号では、ＬＮＡが、例えば、５’−メチル又は５’−ビニル基で置換されている）が含まれる。
【０２２８】
修飾糖部分を有するヌクレオシドの実施例として、５’−ビニル、５’−メチル（Ｒ又はＳ）、４’−Ｓ、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３及び２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３置換基を含むヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。２’位置換基はまた、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ＯＣＦ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、及びＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択され得、式中Ｒｍ及びＲｎはそれぞれ、独立して、水素又は置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである。
【０２２９】
本明細書で使用される「二環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを指している。二環式ヌクレオシドの実施例には、４’と２’リボシル環原子間のブリッジを含有するヌクレオシドが含まれるが、これに限定されない。ある実施形態では、本明細書で提供されるアンチセンス化合物には、ブッリジに４’〜２’二環式ヌクレオシドが含まれる、１又は複数の二環式ヌクレオシドが含まれる。４’〜２’二環式ヌクレオシドの実施例として、以下の化学式のうち１つが含まれるが、これらに限定されない。すなわち、４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ２）−Ｓ−２’；４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’及び４’−Ｃ−Ｈ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’（及びその類似体；２００８年７月１５日に発行された米国特許第７，３９９，８４５号を参照のこと）；４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’（及びその類似体；２００９年１月８日に公開された国際公開第２００９／００６４７８号を参照のこと）；４’−ＣＨ２−Ｎ（ＯＣＨ３）−２’（及びその類似体；２００８年１２月１１日に公開された国際公開第２００８／１５０７２９号を参照のこと）；４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−２’（２００４年９月２日に公開された米国特許出願公開第２００４−０１７１５７０号を参照のこと）；Ｒが水素、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、又は保護基である４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（２００８年９月２３日に発行された米国
特許第７，４２７，６７２号を参照のこと）；４’−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）−２’（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００９、７４、１１８−１３４を参照のこと）；及び４’−ＣＨ２−Ｃ（＝ＣＨ２）−２’（及びその類似体；２００８年１２月８日に公開された国際公開第２００８／１５４４０１号を参照のこと）である。例えば、Ｓｉｎｇｈら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９８、４、４５５−４５６；Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９８、５４、３６０７−３６３０；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０００、９７、５６３３−５６３８；Ｋｕｍａｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９８、８、２２１９−２２２２；Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９８、６３、１００３５−１００３９；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２９（２６）８３６２−８３７９（２００７年７月４日）；米国特許第７，０５３，２０７号；第６，２６８，４９０号；第６，７７０，７４８号；第６，７９４，４９９号；第７，０３４，１３３号；及び第６，５２５，１９１号；Ｅｌａｙａｄｉら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｎｓ．Ｄｒｕｇｓ、２００１、２、５５８−５６１；Ｂｒａａｓｃｈら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２００１、８、１−７；及びＯｒｕｍら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００１、３、２３９−２４３；及び米国特許第６，６７０，４６１号；国際公開第２００４／１０６３５６号；国際公開第９４／１４２２６号；国際公開第２００５／０２１５７０号；米国特許出願公開第２００４−０１７１５７０号；米国特許出願公開第２００７−０２８７８３１号；米国特許出願公開第２００８−００３９６１８号；米国特許第７，３９９，８４５号；米国特許出願第１２／１２９，１５４号；第６０／９８９，５７４号；第６１／０２６，９９５号；第６１／０２６，９９８号；第６１／０５６，５６４号；第６１／０８６，２３１号；第６１／０９７，７８７号；第６１／０９９，８４４号；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１号；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４号；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２号；及びＰＣＴ国際出願の国際公開第２００７／１３４１８１号を参照のこと。前記二環式ヌクレオシドは、例えば、α−Ｌ−リボフラノース及びβ−Ｄ−リボフラノース及びβ−Ｄ−リボフラノースを含む、１又は複数の立体化学糖配置を有するよう調製され得る（国際出願ＰＣＴ／ＤＫ９８／００３９３、１９９９年３月２５日に国際公開第９９／１４２２６号として公開）。
【０２３０】
ある実施形態では、ＢＮＡヌクレオシドの二環式糖部分には、ペントフラノシル糖部分の４’位と２’位の間に少なくとも１つのブリッジを有する化合物が含まれるがこれに限定されず、ブリッジは、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−，−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−，−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−，−Ｃ（＝ＮＲａ）−，−Ｃ（＝Ｏ）−，−Ｃ（＝Ｓ）−，−Ｏ−，−Ｓｉ（Ｒａ）２−，−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−，及び−Ｎ（Ｒａ）−から独立して選択される１又は２〜４連結基を独立して含み、
式中、
ｘは０，１、又は２；
ｎは１、２、３、又は４であり；
Ｒａ及びＲｂはそれぞれ、独立して、水素、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ２０アリール、複素環基、置換複素環基、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ５〜Ｃ７脂環式基、置換Ｃ５〜Ｃ７脂環式基、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｊ１）、又はスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）であり；並びに
Ｊ１及びＪ２はそれぞれ、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環基、置換複素環基、Ｃ１〜Ｃ１２アミ
ノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル又は保護基である。
【０２３１】
ある実施形態では、二環式糖部分のブリッジは、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−又は−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−である。ある実施形態では、ブリッジは、４’−ＣＨ２−２’、４’−（ＣＨ２）２−２’、４’−（ＣＨ２）３−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’及び４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’−であり、式中Ｒは、独立して、水素、保護基、又はＣ１〜Ｃ１２アルキルである。
【０２３２】
ある実施形態では、二環式ヌクレオシドは、異性体配置によりさらに定義される。例えば、４’−２’メチレン−オキシブリッジを含むヌクレオシドは、α−Ｌ配置又はβ−Ｄ配置にあってもよい。先に、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ’ｓは、アンチセンス活性を示したアンチセンスオリゴヌクレオチドにすでに組み入れられた（Ｆｒｉｅｄｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３、２１、６３６５−６３７２）。
【０２３３】
ある実施形態では、二環式ヌクレオシドには、下記に示すように、
（Ａ）α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｂ）β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、及び（Ｆ）メチル（メチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｇ）メチレン−チオ（４’−ＣＨ２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、（Ｈ）メチレン−アミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｉ）メチル炭素環（４’−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−２’）ＢＮＡ、（Ｊ）プロピレン炭素環（４’−（ＣＨ２）３−２’）ＢＮＡ、及び（Ｋ）エチレン炭素環（４’−ＣＨ２−ＣＨ２−２’）（カルバＬＮＡ又は“ｃＬＮＡ”）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３４】
【化１】
2020089382.tif 000005
式中、Ｂｘは塩基部分であり、Ｒは独立して水素、保護基又はＣ１〜Ｃ１２アルキルである。
【０２３５】
ある実施形態では、式Ｉを有する二環式ヌクレオシドは、
【化２】
2020089382.tif 000006
であり、式中、 
Ｂｘは複素環塩基部分であり；
−Ｑａ−Ｑｂ−Ｑｃ−は、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−ＣＨ２であり；
ＲｃはＣ１〜Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基であり；並びに
Ｔａ及びＴｂはそれぞれ、独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合基、反応性リン基、リン部分又は支持体への共有結合的付着である。
【０２３６】
ある実施形態では、式ＩＩを有する二環式ヌクレオシドは、
【化３】
2020089382.tif 000007
であり、式中
Ｂｘは、複素環塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂはそれぞれ、独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合基、反応性リン基、リン部分又は支持体への共有結合的付着であり；
Ｚａは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオール又は置換チオである。
【０２３７】
ある実施形態では、置換基はそれぞれ独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪｃ、ＮＪｃＪｄ、ＳＪｃ、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊｃ、及びＮＪｅＣ（＝Ｘ）ＮＪｃＪｄから独立して選択される置換基を有する一置換又はポリ置換であり、式中、各Ｊｃ、Ｊｄ及びＪｅは、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、又は置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは酸素又はＮＪｃである。
【０２３８】
ある実施形態では、式ＩＩＩを有する二環式ヌクレオシドは、
【化４】
2020089382.tif 000008
であり、式中、
Ｂｘは複素環塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂはそれぞれ、独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合基、反応性リン基、リン部分又は支持体への共有結合的付着であり；
Ｚｂは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ
１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、又は置換アシル（Ｃ（＝Ｏ）−）である。
【０２３９】
ある実施形態では、式ＩＶを有する二環式ヌクレオシドは、
【化５】
2020089382.tif 000009
であり、式中、
Ｂｘは複素環塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂはそれぞれ、独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合基、反応性リン基、リン部分又は支持体への共有結合的付着であり；
Ｒｄは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル又は置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルであり；
ｑａ、ｑｂ、ｑｃ及びｑｄはそれぞれ、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル又は置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル又は置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキルである。
【０２４０】
ある実施形態では、式Ｖを有する二環式ヌクレオシドは、
【化６】
2020089382.tif 000010
であり、式中、
Ｂｘは複素環塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂはそれぞれ、独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合基、反応性リン基、リン部分又は支持体への共有結合的付着であり；
ｑａ、ｑｂ、ｑｅ及びｑｆはそれぞれ、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ又はＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋであり；
又はｑｅ及びｑｆは共に＝Ｃ（ｑｇ）（ｑｈ）であり；
ｑｇ及びｑｈはそれぞれ、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル又は置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキルである。
【０２４１】
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ単量体アデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン及びウラシルの合成及び製造、並びにそれらのオリゴマー化、さらに核酸認識特性についてはすでに記載がある（Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９８、５４、３６０７−３６３０）。また、ＢＮＡ及びその製造も
、国際公開第９８／３９３５２号及び第９９／１４２２６号）に記載されている。
【０２４２】
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡの類似体、メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ及び２’−チオ−ＢＮＡｓもすでに製造されている（Ｋｕｍａｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９８、８、２２１９−２２２２）。オリゴデオキシリボヌクレオチド二本鎖を核酸ポリメラーゼの基質として含むロックヌクレオシド縁体の製造に関する記載もある（Ｗｅｎｇｅｌら、国際公開第９９／１４２２６号）。さらに、２’−アミノ−ＢＮＡの合成、立体配置的制限のある新規の高度親和性オリゴヌクレオチド類似体についても、当技術分野ではすでに記載が存在する（Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９８、６３、１００３５−１００３９）。加えて、２’−アミノ−及び２’−メチルアミノ−ＢＮＡ’ｓはすでに製造されており、それらの相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ鎖との二本鎖の熱安定性も先に報告されている。
【０２４３】
ある実施形態では、式ＶＩを有する二環式ヌクレオシドは、
【化７】
2020089382.tif 000011
であり、式中、
Ｂｘは複素環塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂはそれぞれ、独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合基、反応性リン基、リン部分又は支持体への共有結合的付着であり；
ｑｉ、ｑｊ、ｑｋ及びｑｌはそれぞれ、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシル、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ又はＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋ；並びに
ｑｉ及びｑｊ又はｑｌ及びｑｋは共にＣ（ｑｇ）（ｑｈ）であり、式中、ｑｇ及びｑｈはそれぞれ、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル又は置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキルである。
【０２４４】
４’−（ＣＨ２）３−２’ブリッジを有する、１つの炭素環二環式ヌクレオシド及びアルケニル類似体ブリッジ４’−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−２’については記載がある（Ｆｒｉｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９７、２５（２２）、４４２９−４４４３；Ａｌｂａｅｋら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００６、７１、７７３１−７７４０）。炭素環二環式ヌクレオシドの合成及び製造、並びにそれらのオリゴマー化及び生化学研究についても、すでに記載されている（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７、１２９（２６）、８３６２−８３７９）。
【０２４５】
本明細書で使用されている「４’−２’二環式ヌクレオシド」又は「４’〜２’二環式ヌクレオシド」は、糖環の２’位炭素原子と４’位炭素原子を結合させるフラノース環の２個の炭素原子を結合するブリッジを構成するフラノース環を含む環ヌクレオシドを指している。
【０２４６】
本明細書で使用されている「単環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分ではない修飾糖部
分を含むヌクレオシドを指している。ある実施形態では、ヌクレオシドの糖部分、又は糖部分類似体は、任意の部位で修飾又は置換されてもよい。
【０２４７】
本明細書で使用されている「２’−修飾糖」は、２’位で修飾されたフラノシル糖を意味する。ある実施形態では、修飾には、置換及び非置換アルコキシ、置換及び非置換チオアルキル、置換及び非置換アミノアルキル、置換及び非置換アルキル、置換及び非置換アリル、並びに置換及び非置換アルキニル等のハロゲン化合物から選択される置換基を含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、２’修飾は、ｎ及びｍが１〜約１０である、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２を含む置換基から選択されるが、これらに限定されない。他の２’置換基もまた、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３，ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、薬物動態特性を改善するための基、又はアンチセンス化合物の薬物動態特性を改善するための基、及び類似の特性を有するその他の置換基から選択され得る。ある実施形態では、修飾ヌクレオシドには２’−ＭＯＥ側鎖が含まれる（Ｂａｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、２７２、１１９４４−１２０００）。２’−ＭＯＥ置換基は、非修飾ヌクレオシド、並びに、２’−Ｏ−メチル、Ｏ−プロピル、及びＯ−アミノプロピル等の他の修飾ヌクレオシドと比較して、結合親和性を改善したものとして記述されている。２’−ＭＯＥ置換基を有するオリゴヌクレオチドはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏ利用に有望な特徴を有する、遺伝子発現のアンチセンス阻害剤となることが示されている（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６−５０４；Ａｌｔｍａｎｎら、Ｃｈｉｍｉａ、１９９６、５０、１６８−１７６；Ａｌｔｍａｎｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、１９９６、２４、６３０−６３７；及びＡｌｔｍａｎｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９７、１６、９１７−９２６）。
【０２４８】
本明細書で使用される「修飾テトラヒドロピランヌクレオシド」又は「修飾ＴＨＰヌクレオシド」は、６員環テトラヒドロピランの「糖」を、正常なヌクレオシドのペントフラノシル残基（糖代用物）と置換したヌクレオシドを意味する。修飾ＴＨＰヌクレオシドには、以下が含まれるがこれらに限定されない。すなわち、当技術分野でヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、アニトール核酸（ＡＮＡ）、マニトール核酸（ＭＮＡ）（Ｌｅｕｍａｎｎ、ＣＪ．Ｂｉｏｏｒｇ．＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００２）１０：８４１−８５４を参照のこと）と称されているもの、フルオロＨＮＡ（Ｆ−ＨＮＡ）又は式Ｘを有する諸化合物、
【化８】
2020089382.tif 000012
式中、式Ｘの少なくとも１つのテトラヒドロピランヌクレオシド類似体それぞれは独立して、
Ｂｘは複素環塩基部分であり；
Ｔ３及びＴ４はそれぞれ、独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であるか、又はＴ３及びＴ４のうちいずれ
か一方が、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であり、かつＴ３及びＴ４のもう片方は、水素、ヒドロキシル保護基、連結結合基、若しくは５’若しくは３’末端基であり；
ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６及びｑ７はそれぞれ、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル又は置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルであり；並びに
Ｒ１及びＲ２のうちいずれか片方は水素であり、もう片方はハロゲン、置換又は非置換アルコキシ、式中ＸはＯ、Ｓ又はＮＪ１であり、Ｊ１、Ｊ２及びＪ３はそれぞれ独立して水素又はＣ１〜Ｃ６アルキルであるＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２及びＣＮから選択される。
【０２４９】
ある実施形態では、式Ｘの修飾ＴＨＰヌクレオシドは、式中ｑｍ、ｑｎ、ｑｐ、ｑｒ、ｑｓ、ｑｔ及びｑｕがそれぞれ水素であるものとして提供される。ある実施形態では、ｑｍ、ｑｎ、ｑｐ、ｑｒ、ｑｓ、ｑｔ及びｑｕの少なくとも１つは、水素以外である。ある実施形態では、ｑｍ、ｑｎ、ｑｐ、ｑｒ、ｑｓ、ｑｔ及びｑｕの少なくとも１つはメチルである。ある実施形態では、式ＸのＴＨＰヌクレオシドは、式中Ｒ１及びＲ２のうち片方をＦとして提供される。ある実施形態では、Ｒ１はフルオロ、Ｒ２は水素である；Ｒ１はメトキシ、Ｒ２は水素である；及びＲ１はメトキシエトキシ、Ｒ２は水素である。
【０２５０】
本明細書で使用される「２’−修飾」又は「２’−置換」は、２’位に水素又はＯＨ以外の置換基を含む糖を含有するヌクレオシドを指している。２’−修飾ヌクレオシドには、糖環の２つの炭素原子を結合させるブリッジが、糖環の２’炭素と別の炭素を結合させる二環式ヌクレオシド；及び、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、−ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、式中Ｒｍ及びＲｎはそれぞれ独立して水素又は置換若しくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであるＯ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）又はＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）等の非架橋２’置換基を有するヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。２’修飾ヌクレオシドにはさらに、例えば、糖の他の部位及び／又は核酸塩基等にその他の修飾が含まれてもよい。
【０２５１】
本明細書で使用される「２’−Ｆ」は、２’位にフルオロ基を有する糖を含有するヌクレオシドを指している。
【０２５２】
本明細書で使用される「２’−ＯＭｅ」又は「２’−ＯＣＨ３」又は「２’−Ｏ−メチル」はそれぞれ、糖環の２’位に−ＯＣＨ３基を持つ糖を含有するヌクレオシドを指している。
【０２５３】
本明細書で使用される「ＭＯＥ」又は「２’−ＭＯＥ」又は「２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３」又は「２’−メトキシエチル」はそれぞれ、糖環の２’位に−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３基を含む糖を含有するヌクレオシドを指している。
【０２５４】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、複数の連結ヌクレオシドを含む化合物を指している。ある実施形態では、１又はそれ以上の複数ヌクレオシドは修飾されている。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドには、１又は複数のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）及び／又はデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）が含まれる。
【０２５５】
その他のビシクロ及びトリシクロ糖代用環系の多くはまた、当技術分野において、アンチセンス化合物への組み入れのためヌクレオシドを修飾するために使用され得るとして既知である（例えば、レビュー記事：Ｌｅｕｍａｎｎ、Ｊ．Ｃ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２、１０、８４１−８５４を参照のこと
）。環系は、活性向上のために様々な追加置換を行うことができる。
【０２５６】
修飾糖の製造方法は、当業者の周知である。
【０２５７】
修飾糖部分を有するヌクレオチドでは、核酸塩基部分（天然、修飾、又はそれらの組み合わせ）は、適切な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持される。
【０２５８】
ある実施形態では、アンチセンス化合物には、修飾糖部分を有する１又は複数のヌクレオチドが含まれる。ある実施形態では、修飾糖部分は、２’−ＭＯＥである。ある実施形態では、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフで配列される。ある実施形態では、修飾糖部分は、ｃＥｔである。ある実施形態では、ｃＥｔ修飾ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフのウィング全体に配列される。
【０２５９】
修飾核酸塩基
核酸塩基（又は塩基）の修飾又は置換は、天然発生又は合成未修飾の核酸塩基とは構造的に判別可能であるが、機能的には相互互換的である。天然及び修飾核酸塩基双方は、水素結合に関与し得る。核酸塩基修飾は、核酸分解酵素安定性、結合親和性、対立遺伝子多様体の選択性向上、又はアンチセンス化合物に対し有益なその他複数の生物特性を与えることができる。修飾核酸塩基には、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）等の合成及び天然核酸塩基が含まれる。５−メチルシトシン置換を含む特定の核酸塩基置換は、特に、標的核酸のアンチセンス化合物の結合親和性を向上させるのに有益である。例えば、５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃の差で、核酸二本鎖の安定性を向上させることはすでに示されている（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．及びＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、１９９３、２７６−２７８）。
【０２６０】
追加の修飾核酸塩基には、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンとグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニンとグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−Ｃo
Ｃ−ＣＨ３）ウラシルとシトシン及びピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン類とグアニン類、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル類とシトシン類、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニンと７−デアザアデニン及び３−デアザグアニンと３−デアザアデニンが含まれる。
【０２６１】
複素環塩基部分にはまた、プリン又はピリミジン塩基が、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドン等、他の複素環と置換されたものが含まれてもよい。アンチセンス化合物の結合親和性向上に特に有益な核酸塩基には、２アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシン等の、５−置換ピリミジン類、６−アザピリミジン類及びＮ−２，Ｎ−６及びＯ−６置換プリン類が含まれる。
【０２６２】
ある実施形態では、アンチセンス化合物には、１又は複数の修飾核酸塩基が含まれる。ある実施形態では、ギャップ拡大型アンチセンスオリゴヌクレオチドには、１又は複数の修飾核酸塩基が含まれる。ある実施形態では、修飾核酸塩基は、５−メチルシトシンであ
る。ある実施形態では、各シトシンは５−メチルシトシンである。
【０２６３】
医薬組成物製剤のための組成物及び方法
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物の調製又は製剤のために薬剤的に許容できる活性又は不活性物質と混合してもよい。医薬組成物製剤のための組成物及び製剤方法は、投与経路、疾患の度合い、又は投与量等、数多くの基準によるがこれらに限定されない。
【０２６４】
アンチセンス化合物は、アンチセンス化合物を薬剤的に許容できる好適な希釈剤又は担体と結合させることにより医薬組成物として利用可能となる。薬剤的に許容可能な希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。ＰＢＳは、非経口的に送達される組成物での利用に適した希釈剤である。従って、ある実施形態では、本明細書に記載の方法に使用されるのは、アンチセンス化合物及び薬剤的に許容できる希釈剤を含む医薬組成物である。ある実施形態では、薬剤的に許容できる希釈剤は、ＰＢＳである。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０２６５】
アンチセンス化合物を含む医薬組成物には、任意の薬剤的に許容できる塩類、エステル類、若しくはエステル類の塩類、又は、ヒトを含む動物への投与で生物活性な代謝産物又はその残留物を（直接的又は間接的に）与えることができる任意の他のオリゴヌクレオチドが包含される。従って、例えば、本明細書の開示にはまた、アンチセンス化合物の薬剤的に許容できる塩類、プロドラッグ、プロドラッグの薬剤的に許容できる塩類、及びその他の生物学的同等物も含まれる。薬剤的に許容できる好適な塩類には、ナトリウム塩及びカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６６】
プロドラッグには、活性アンチセンス化合物を形成するために、体内の内在性核酸分解酵素により切断されたアンチセンス化合物の片方の端又は両端に、追加のヌクレオシドを組み入れることが含まれ得る。
【０２６７】
共役アンチセンス化合物
アンチセンス化合物を、活性、細胞分布、対立遺伝子多様体の選択性、又は結果として得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞取込等を向上させる、１又は複数の部分又は共役体と共有結合的に連結させてもよい。典型的な共役基には、コレステロール部分及び脂質部分が含まれる。追加の共役基には、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び染料が含まれる。
【０２６８】
アンチセンス化合物に対し、例えば核酸分解酵素安定性等の特性を向上させるために、アンチセンス化合物の片方の端又は両末端に通常は付着している、１又は複数の安定化基を有するよう修飾することもできる。安定化基には、キャップ構造が含まれる。これら末端修飾は、末端核酸を有するアンチセンス化合物をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、送達及び／又は細胞内の局所化を支援することができる。キャップは、５’末端（５’−キャップ）、又は３’末端（３’−キャップ）、又は両末端に存在し得る。キャップ構造は、当技術分野において周知であり、例えば、逆位デオキシ脱塩基キャップが含まれる。さらに、核酸分解酵素安定性を供与するためにアンチセンス化合物の片方の端又は両端をキャップするのに使用され得る３’及び５’安定化基には、２００３年１月１６日に公開された国際公開第０３／００４６０２号に開示されたものも含まれる。
【０２６９】
細胞培養及びアンチセンス化合物処理
アンチセンス化合物が標的核酸のレベル、活性、又は発現に対してもたらす効果を、様々な種類の細胞でｉｎ  ｖｉｔｒｏに試験することができる。解析に使用される細胞の種
類は、市販の業者（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社、バージニア州マナッサス；Ｚｅｎ−Ｂｉｏ社、ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社、メリーランド州ウォーカーズビル）から入手可能であり、市販の試薬（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、業者のマニュアルに従って培養する。細胞の種類には、例えば、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、及び初代肝細胞が含まれるが、これらに限定されない。細胞株の例として、ＧＭ０４２８１、ＧＭ０２１７１、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞が含まれる。
【０２７０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
本明細書に記載されるのは、他のアンチセンス化合物処理のために適切に修飾され得るアンチセンスオリゴヌクレオチドを有する細胞の処理方法である。
【０２７１】
細胞は、一般に、培養中で約６０〜８０％コンフルエントに達したときに、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理される。
【０２７２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞に導入するために通常用いられる１つの試薬として、カチオン性脂質トランスフェクション試薬ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ１でＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）と混合し、所望のアンチセンスオリゴヌクレオチド最終濃度と、通常１００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドにつき２〜１２μｇ／ｍＬの範囲にあるＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ濃度を得る。
【０２７３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞に導入するために用いられる別の試薬として、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ１血清使用量低減培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）でＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥと混合し、所望のアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度と、通常１００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドにつき２〜１２μｇ／ｍＬの範囲にあるＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ濃度を得る。
【０２７４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞に導入するために用いられる別の技法には、電気穿孔が含まれる。
【０２７５】
細胞は、通常の方法により、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理される。細胞は、典型的に、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理の１６〜２４時間後に収穫され、その時点で、標的核酸のＲＮＡ又はタンパク質レベルを、当技術分野で既知であり、本明細書に記載される方法で測定される。一般に、複数の複製物で処理を行う場合、データは複製物処理の平均として提示される。
【０２７６】
使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株により異なる。特定の細胞株に最適なアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を決定する方法は、当技術分野で周知である。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥで形質移入される場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的に、１ｎＭ〜３００ｎＭの範囲の濃度で使用される。電気穿孔を用いて形質移入される場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、６２５〜２０，０００ｎＭの範囲の高濃度で使用される。
【０２７７】
ＲＮＡ単離
ＲＮＡ解析は、全細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで行うことができる。ＲＮＡ単
離法は、当技術分野で周知である。ＲＮＡは、当技術分野で周知の方法、例えば、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、製造者が推奨するプロトコルに従って調製される。
【０２７８】
標的レベル又は発現の阻害の解析
標的核酸の低減、阻害、又は発現を、当技術分野で既知の様々な方法でアッセイすることが可能である。例えば、標的核酸レベルを、ノーザンブロット解析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又は定量的リアルタイムＰＣＲ等により定量化することができる。ＲＮＡ解析は全細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで行うことができる。ＲＮＡ単離法は、当技術分野で周知である。ノーザンブロット解析もまた、当技術分野で日常的に行われている。定量的リアルタイムＰＣＲは、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（カリフォルニア州フォースター市）から購入可能なＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７６００、
７７００、又は７９００配列検知システム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、製造業者のマニュアルに従って従来通りに行うことができる。
【０２７９】
標的ＲＮＡレベルの定量的リアルタイムＰＣＲ解析
標的ＲＮＡレベルの定量は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７６００、７７００、又は７９００配
列検知システム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォースター市）を用いた定量的リアルタイムＰＣＲにより、製造業者のマニュアルに従って行うことができる。定量的リアルタイムＰＣＲ法は、当技術分野で周知である。
【０２８０】
リアルタイムＰＣＲの前に、単離されたＲＮＡに対し、相補的ＤＮＡを（ｃＤＮＡ）を生成し、その後リアルタイムＰＣＲ増幅用の基板として使用されている逆転写酵素（ＲＴ）反応を行う。ＲＴ及びリアルタイムＰＣＲ反応は、同じサンプルウェルで連続して行われる。ＲＴ及びリアルタイムＰＣＲ試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州カールスバッド）から取得する。ＲＴリアルタイムＰＣＲ反応は、当業者に周知の方法で行われる。
【０２８１】
リアルタイムＰＣＲで得られる遺伝子（又は、ＲＮＡ）標的量は、シクロフィリンＡ等、発現が定常化している遺伝子の発現レベルを用いて、又はＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて全ＲＮＡを定量化するかのいずれかにより正規化される。シクロフィリンＡの発現は、リアルタイムＰＣＲにより、標的と同時に反応、増幅させることで、又は別々に行うことで定量化される。全ＲＮＡの定量化は、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ  ＲＮＡ定量化試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、オレゴン州ユージーン）を用いて行う。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮによるＲＮＡを定量化の方法は、Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｊ．ら、（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８、２６５、３６８−３７４）により教授されている。ＣＹＴＯＦＬＵＯＲ  ４０００インスツルメント（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ蛍光を測定する。
【０２８２】
標的核酸にハイブリダイズするよう、プローブ及びプライマーを設計する。リアルタイムＰＣＲプローブ及びプライマーを設計する方法は、当技術分野で周知であり、ＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォースター市）等のソフトウェアの利用も含まれ得る。
【０２８３】
タンパク質レベルの解析
標的核酸の低減、阻害、又は発現は、標的タンパク質レベルを測定することによりアッセイ可能である。標的タンパク質レベルは、免疫沈降、ウェスタンブロット分析（免疫ブロット）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、定量タンパク質アッセイ、タンパク
質活性アッセイ（例えば、カスパーゼ活性アッセイ）、免疫組織化学、免疫細胞化学又は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）等、当技術分野で周知の様々な方法で評価し又は定量化することができる。標的に向けられる抗体は、抗体のＭＳＲＳカタログ（Ａｅｒｉｅ社、ミシガン州バーミンガム）等、様々なソースで同定し、そこから取得することができ、或いは、当技術分野で周知の従来のモノクロナール又はポリクロナール抗体の生成方法を介して調製することもできる。マウス、ラット、サル、及びヒトタンパク質の検知に有益な抗体は、市販されている。
【０２８４】
アンチセンス化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ試験
アンチセンス化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子産物を選択的に低減又はその発現を阻害し、疾患症状の寛解等の表現型変異をもたらす能力を評価するために、動物で試験される。試験は、正常な動物、又は実験用疾患モデルで行ってもよい。動物への投与のために、リン酸緩衝生理食塩水等の薬剤的に許容できる希釈剤でアンチセンスオリゴヌクレオチドを調製する。投与には、腹腔内、静脈内、及び皮下投与等の非経口投与経路が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチド用量及び投与回数の算出は、当業者であれば可能であり、投与経路及び動物の体重等の要因により決められる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの処理期間終了後、ＲＮＡ又はタンパク質を組織から単離し、標的核酸又はタンパク質発現における変化を測定する。
【０２８５】
投与
ある実施形態では、本明細書に記載の化合物及び組成物の投与方法は多数存在し得るが、それは、局所的処理又は全身性処理が所望であるかどうか、また処理対象の領域次第である。投与は、局所的（眼部、膣部、直腸部、鼻腔内部を含む）、経口、肺（粉末の吸入もしくは吹込又はエアロゾルを含む、噴霧器、気管内、鼻腔内、表皮性、経皮性を含む）又は、点滴、静脈内注射、若しくは皮下、腹腔内、眼内、硝子体内や筋肉内注射等の非経口であり得る。
【０２８６】
ある実施形態では、本明細書に記載の化合物及び組成物は、非経口で投与される。
【０２８７】
ある実施形態では、非経口投与は注入により行われる。注入は、長期若しくは連続、又は短期若しくは断続的であり得る。ある実施形態では、注入される医薬剤は、ポンプで送達される。ある実施形態では、非経口投与は注射により行われる。
【０２８８】
ある実施形態では、化合物及び組成物は中枢神経に送達される。ある実施形態では、化合物及び組成物は脳脊髄液に送達される。ある実施形態では、化合物及び組成物は脳実質に送達される。ある実施形態では、化合物及び組成物は、髄腔内投与又は脳室内投与により動物に送達される。実質内投与、随腔内投与、脳室内投与により、本明細書に記載の化合物及び組成物を中枢神経系内に広汎に分布させることができる。
【０２８９】
ある実施形態では、非経口投与は注射により行われる。注射は、シリンジ又はポンプで送達されてもよい。ある実施形態では、注射はボラス注射である。ある実施形態では、注射は、線条体、尾状核、大脳皮質、海馬、小脳等の組織に直接投与する。
【０２９０】
ある実施形態では、ボラス注射等、医薬剤を特異的に局所化する方法は、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０の要因により、有効濃度中央値（ＥＣ５０）を低下させる。ある実施形態では、アンチセンス化合物の医薬剤は本明細書でさらに記載される。ある実施形態では、標的組織は脳組織である。ある実施形態では、標的組織は線条体組織である。ある実施形態では、ＥＣ５０を低下させることで、薬剤を必要とする患者に薬剤効果をもたらすのに必要な用量を低減するため、ＥＣ５０を低下させることは望ましい。
【０２９１】
ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、注射又は注入により、毎月、２ヶ月毎、９０日毎、３ヶ月毎、６ヶ月毎、１年に２回、又は１年に１回送達される。
【０２９２】
特定の化合物及び表示
本明細書で提供されるのは、突然変異対立遺伝子の阻害有効性及び選択性向上を提供する化合物及び方法である。有効性とは、ベンチマークヌクレオチドによる突然変異ｍＲＮＡの阻害度と比較した、ＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる突然変異ｍＲＮＡの阻害度で表される。選択性とは、マイナー対立遺伝子又は野生型対立遺伝子と比較して、メジャー対立遺伝子又は突然変異対立遺伝子の発現を優先的に阻害する、ＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力により示される。各ＳＮＰ位置に異なる遺伝子型を有する３つの細胞株を利用することで、アンチセンスオリゴヌクレオチドを標的とする有効かつ選択的ＳＮＰを提供する設計ルールの決定が促進された。
【０２９３】
ある実施形態では、化合物は、本明細書でさらに記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＮＰ又は識別用多型を優先的に標的とする。様々な長さのオリゴヌクレオチドを試験し、ＳＮＰを標的とするのに有益な特定の長さを決定した。
【０２９４】
ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２〜３０核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２〜２５核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２〜２１核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２〜２０核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１３〜２０核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１４〜２０核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５〜２０核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２〜１９核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１３〜１９核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１４〜１９核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５〜１９核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１６〜１９核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１７〜１９核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０核酸塩基長である配列を有する。
【０２９５】
様々な長さのオリゴヌクレオチドに関して、ＳＮＰ位置に対して相補的なヌクレオシドの位置をギャップ及びウィング内で移動させ、その効果を試験した。アンチセンスオリゴヌクレオチド内の特定の位置は、ＳＮＰを標的とするのに有益であることが示された。
【０２９６】
ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、又は少なくとも１９核酸塩基長であり、ＳＮＰは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて６〜１５番目のポジション、及び／又はギャップの５’末端から数えて１〜９番目のポジションに相補的である。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、又は少なくとも１９核酸塩基長であり、ＳＮＰは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１４番目のポジション、及び／又はギャップの５’末端から数えて１〜９番目のポジションに相補的で
ある。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、又は少なくとも１９核酸塩基長であり、ＳＮＰは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１４番目のポジション、及び／又はギャップの５’末端から数えて４〜７番目のポジションに相補的である。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、又は少なくとも１９核酸塩基長であり、ＳＮＰは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１０番目のポジション、及び／又はギャップの５’末端から数えて４〜６番目のポジションに相補的である。
【０２９７】
ある実施形態では、ＳＮＰは、オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８、９、又は１０番目のポジションに対し、又はギャップの５’末端から数えて４、５、又は６番目のポジションに対して相補的である。オリゴヌクレオチドの様々な長さに関して、ギャップ、５’ウィング、及び３’ウィングの長さの効果を試験した。
【０２９８】
あるウィング−ギャップ−ウィング組み合わせが、ＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにとって有益であることが示された。ある実施形態では、ギャップは７〜１１核酸塩基長であり、各ウィングは独立して１〜６核酸塩基長である。ある実施形態では、ギャップは、７〜１１核酸塩基長であり、各ウィングは独立して２〜６核酸塩基長である。ある実施形態では、ギャップは、８〜１１核酸塩基長であり、各ウィングは独立して２〜６核酸塩基長である。ある実施形態では、ギャップは、９〜１１核酸塩基長であり、各ウィングは独立して２〜６核酸塩基長である。ある実施形態では、ギャップは、９核酸塩基長であり、各ウィングは独立して２〜６核酸塩基長である。ある実施形態では、ギャップは、１０核酸塩基長であり、各ウィングは独立して２〜６、又は４〜５核酸塩基長である。ある実施形態では、ギャップは、１１核酸塩基長であり、各ウィングは独立して２〜６、又は４〜５核酸塩基長である。ある実施形態では、ウィング−ギャップ−ウィング配置は、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４のうちいずれか１つである。
【０２９９】
様々な長さのオリゴヌクレオチドに関して、特定の化学物質の効果を試験した。特定の化学修飾は、ＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにとって有益であることが示された。ある実施形態では、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ウィングの各ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥ修飾を有する。ある実施形態では、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ウィングの各ヌクレオシドは、高度親和性修飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ウィングギャップマーと混合する。実施形態では、３’ウィング及び５’ウィングにおける修飾及び修飾の組み合わせは、同じであっても異なっていてもよい。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ウィングに１又は複数の２’−ＭＯＥ修飾を有し、及び／又はウィングに１又は複数の高度親和性修飾を有する。ある実施形態では、高度親和性修飾は、ｃＥｔ修飾である。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの（５’末端から数えて）２、３、１３、及び１４番目のポジションに高度親和性修飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのウィングに１、２、３、又は４の高度親和性修飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’ウィング及び３’ウィングにそれぞれ独立して、１、２、３、又は４の高度親和性修飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’ウィング及び３’ウィングのいずれか片方又は両方に、（５’ウィングの５’末端及び３’ウィングの３’末端から数えて）２及び３番目のポジションに高度親和性糖修
飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’ウィング及び３’ウィングのいずれか片方又は両方に、（５’ウィングの５’末端及び３’ウィングの３’末端から数えて）２、３及び４番目のポジションに高度親和性糖修飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’ウィング及び／又は３’ウィングの（５’ウィングの５’末端及び３’ウィングの３’末端から数えて）１番目のポジションに高度親和性糖修飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’ウィング及び３’ウィングの（５’ウィングの５’末端及び３’ウィングの３’末端から数えて）１番目のポジション及びウィングの他のポジションの少なくとも１つに高度親和性糖修飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’ウィング及び３’ウィングの少なくともいずれかにおいて、２’−ＭＯＥと高度親和性糖修飾が交互に現れる。
【０３００】
ある実施形態では、化合物には、上記の１又は複数の設計ルールを取り入れたアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。
【０３０１】
ある実施形態では、化合物には、１２〜３０連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて６〜１５番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて１〜９番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、一塩基多型部位には、識別用多型が含まれる。ある実施形態では、一塩基多型部位は、突然変異対立遺伝子上にある。ある実施形態では、突然変異対立遺伝子は疾患と関連する。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３０２】
ある実施形態では、化合物には、１２〜２０連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて６〜１５番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて１〜９番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３０３】
ある実施形態では、化合物には、１２〜２０連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１４番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて１〜９番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−
５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３０４】
ある実施形態では、化合物には、１２〜２０連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１４番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて４〜７番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３０５】
ある実施形態では、化合物には、１２〜２０連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１０番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて４〜６番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３０６】
ある実施形態では、化合物には、１２〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１０番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて４〜６番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３０７】
ある実施形態では、化合物には、１３〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１０番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて４〜６番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３０８】
ある実施形態では、化合物には、１４〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１０番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて４〜６番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３０９】
ある実施形態では、化合物には、１５〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて６〜１５番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて１〜９番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３１０】
ある実施形態では、化合物には、１５〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１０番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて４〜６番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３１１】
ある実施形態では、化合物には、１５〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えてポジション６、８、９、１０、１１、又は１４が一塩基多型と一致し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３１２】
ある実施形態では、化合物には、１５〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、ギャップセグメントのポジション１、４、５、６、７、又は９が一塩基多型と一致し、各ウィングセ
グメントの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３１３】
ある実施形態では、化合物には、１５〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション６、７、８、９、１０、１１、又は１２が一塩基多型と一致し、５’及び３’ウィングセグメントのポジション２及び３に、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３１４】
ある実施形態では、化合物には、１５〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、ギャップセグメントのポジション３、４、５、６、７、８、又は９が一塩基多型と一致し、５’及び３’ウィングセグメントのポジション２及び３に、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３１５】
化合物には、１５〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション６、７、８、９、１０、１１、又は１２が一塩基多型と並列し、アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション２、３、１３、及び１４に４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３１６】
化合物には、１５〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、ギャップセグメントのポジション３、４、５、６、７、８、又は９が一塩基多型と一致し、アンチセンスアンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション２、３、１３、及び１４に４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３１７】
ある実施形態では、化合物には、１７〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション８、９又は１０が一塩基多型と一致し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドに２’−Ｏ−メトキシエチル糖が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３１８】
ある実施形態では、化合物には、１７〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセン
スオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、ギャップセグメントのポジション５、６又は７が一塩基多型と一致し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドに２’−Ｏ−メトキシエチル糖が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３１９】
ある実施形態では、化合物には、１７〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション８、９、又は１０が一塩基多型と一致し、５’及び３’ウィングセグメントのポジション２及び３に４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３２０】
ある実施形態では、化合物には、１７〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、ギャップセグメントのポジション５、６、又は７が一塩基多型と一致し、５’及び３’ウィングセグメントのポジション２及び３に４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３２１】
化合物には、１７〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドのポジション８、９、又は１０が一塩基多型と一致し、アンチセンスアンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション２、３、１３、及び１４に４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３２２】
化合物には、１７〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、ギャップセグメントのポジション５、６、又は７が一塩基多型と一致し、アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション２、３、１３、及び１４に４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。
【０３２３】
ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１１〜２０連結ヌクレオシド長であり、独立して、５’及び３’ウィングに２〜５連結ヌクレオシド、ギャップに７〜１１連結ヌクレオシドを有する。ＳＮＰは、（アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて）アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４に、又はギャップセグメントの５’末端から数えて、ポジション１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に相補的である。
【０３２４】
ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５〜１９ヌクレオシド長で
あり、独立して、５’及び３’ウィングに２〜５連結ヌクレオシド、ギャップに７〜１１連結ヌクレオシドを有する。ＳＮＰは、（アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて）アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション６、７、８、９、又は１０に、又はギャップセグメントの５’末端から数えてポジション４、５、６、又は７に相補的である。
【０３２５】
ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１７連結ヌクレオシド長であり、独立して、５’及び３’ウィングセグメントに２〜５連結ヌクレオシド、ギャップセグメントに９〜１１連結ヌクレオシドを有する。ＳＮＰは、（アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて）アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション８、９、又は１０に、又は（ギャップセグメントの５’末端から数えて）ポジション５、６、又は７に相補的である。
【０３２６】
ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１８連結ヌクレオシド長であり、独立して、５’及び３’ウィングセグメントに２〜５連結ヌクレオシド、ギャップセグメントに９〜１１連結ヌクレオシドを有する。ＳＮＰは、（アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて）アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション８、９、又は１０に、又は（ギャップセグメントの５’末端から数えて）ポジション５、６、又は７に相補的である。
【０３２７】
ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１９連結ヌクレオシド長であり、独立して、５’及び３’ウィングセグメントに２〜５連結ヌクレオシド、ギャップセグメントに９〜１１連結ヌクレオシドを有する。ＳＮＰは、（アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて）アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション８、９、又は１０に、又は（ギャップセグメントの５’末端から数えて）ポジション５、６、又は７に相補的である。
【０３２８】
ある実施形態では、本発明は、本明細書に記載の１又は複数の医薬組成物を投与することを含む、個体の治療方法を提供する。ある実施形態では、個体は、疾患又は障害と関連する対立遺伝子多様体を有する。本明細書で提供される医薬組成物は、優先的にＳＮＰを標的とする。ある実施形態では、ＳＮＰは識別用多型である。
【０３２９】
ＳＮＰが疾患関連対立遺伝子に特異的であるかどうか、またさらに具体的に、ヘテロ接合体の患者の対立遺伝子のＳＮＰ多様体が、遺伝子のｍＲＮＡの隔離領域にある疾患誘発性突然変異と同じ対立遺伝子上に存在するかどうかを決定する方法については、すでに記述がある（国際公開第２００８／１４７９３０号及び国際公開第２００８／１４３７７４号）。
【０３３０】
ＳＮＰに関連する疾患については、特定の遺伝子に関して記載されている。ある実施形態では、遺伝子及び関連疾患は以下のいずれかである。すなわち、アルツハイマー病に関与するアミロイド前駆体タンパク質をコードするＡＰＰ遺伝子（Ｇｅｎｅ、３７１：６８、２００６）；クロイツフェルト・ヤコブ病及び致死性家族性不眠症に関与するプリオンタンパク質をコードするＰｒＰ遺伝子（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７、３：１００９）；アレキサンダー病に関与するグリア線維性酸性タンパク質をコードするＧＦＡＰ遺伝子（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００６、２６：１１１６２３）；パーキンソン病に関与するα−シヌクレインのタンパク質をコードするα−シヌクレイン遺伝子（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００３、１１１：１４５）；筋萎縮性側索硬化症に関与するＳＯＤ−１タンパク質をコードするＳＯＤ−１遺伝子（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２８１：１８５１）；歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮（ＤＲＰＡ）に関与するアトロフィン−１タンパク質をコードするアトロフィン−１遺伝子（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００１、７：４７９
）；脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）に関与するアタキシン−１タンパク質をコードするＳＣＡ１遺伝子（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００３、１２：９５３）；ペリツェウスメルツバッハー病に関与するプロテオリピドタンパク質をコードするＰＬＰ遺伝子（ＮｅｕｒｏＭｏｌ  Ｍｅｄ．、２００７、４：７３）；捻転ジストニアに関与するトーシンＡタンパク質をコードするＤＹＴ１遺伝子（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２０００、８７７：３７９）；及び心筋症を含むタンパク質凝集疾患に関与するα−Ｂの結晶タンパク質をコードするα−Ｂ結晶遺伝子（Ｃｅｌｌ、２００７、１３０：４２７）；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝疾患及び肝細胞癌に関与するα１−アンチトリプシンタンパク質をコードするα−１アンチトリプシン遺伝子（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２００２、３４６：４５）；全身性エリテマトーデスに関与する白血球チロシンキナーゼタンパク質をコードするＬｔｋ遺伝子（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．２００４、１３：１７１）；高コレステロール血症に関与するＰＣＳＫ９タンパク質をコードするＰＣＳＫ９遺伝子（Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．２００９、３０：５２０）；乳房腫瘍に関与するプロラクチン受容体タンパク質をコードするプロラクチン受容体遺伝子（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｓｃｉ．２００８、１０５：４５３３）；ＣＯＰＤ及び喘息に関与するケモカインＣＣＬ５をコードするＣＣＬ５遺伝子（Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．２００８、３２：３２７）；１型糖尿病、関節リウマチ、グレーブス病、ＳＬＥに関与するＰＴＰＮ２２タンパク質をコードするＰＴＰＮ２２遺伝子（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｓｃｉ．２００７、１０４：１９７６７）；脊髄延髄筋萎縮又はケネディ病に関与するアンドロゲン受容体タンパク質をコードするアンドロゲン受容体遺伝子（Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００８、１０８：２４５）；進行性小児後嚢下白内障に関与するクロマチン修飾タンパク質−４ＢをコードするＣＨＭＰ４Ｂ遺伝子（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、２００７、８１：５９６）；コレステロール胆石疾患、関節硬化症、及び糖尿病に関与するファルネソイドＸ受容体タンパク質をコードするＦＸＲ／ＮＲ１Ｈ４遺伝子（Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、２００７、２１：１７６９）；心血管疾患に関与するＡＢＣＡ１タンパク質をコードするＡＢＣＡ１遺伝子（Ｔｒａｎｓｌ．Ｒｅｓ．２００７、１４９：２０５）；原発性高カルシウム尿症に関与するカルシウム感知受容体タンパク質をコードするＣａＳＲ遺伝子（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．２００７、７１：１１５５）；α−サラセミアに関与するα−グロビンタンパク質をコードするα−グロビン遺伝子（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６、３１２：１２１５）；強迫性障害に関与するＨＴＴＬＰＲタンパク質をコードするｈｔｔｌｐｒ遺伝子（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００６、７８：８１５）；不安障害及び併存するうつ病等のストレス関連障害に関与するアルギニンバソプレシンタンパク質をコードするＡＶＰ遺伝子（ＣＮＳ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ、２００６、５：１６７）；先天性の視覚的な欠陥、高血圧、メタボリックシンドロームに関与するＧタンパク質をコードするＧＮＡＳ遺伝子（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．、２００６、２７：２６０）；大うつ病素因に関与するＡＰＡＦ１タンパク質をコードするＡＰＡＦ１遺伝子（Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、２００６、１１：７６）；乳癌及び前立腺癌に関与するＴＧＦ−β１タンパク質をコードするＴＧＦ−β１遺伝子（Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．２００４、１３：７５９）；先天性筋無力症症候群に関与するアセチルコリン受容体をコードするＡＣｈＲ遺伝子（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２００４、６２：１０９０）；末梢動脈疾患のリスクに関与するアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体タンパク質をコードするＰ２Ｙ１２遺伝子（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００３、１０８：２９７１）；心房細動に関与するＬＱＴ１タンパク質をコードするＬＱＴ１遺伝子（Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ、２００３、１００：１０９）；散発性褐色細胞腫に関与するＲＥＴタンパク質をコードするＲＥＴプロトオンコジーン（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、２００３、８８：４９１１）；様々な先天性奇形に関与するフィラミンＡタンパク質をコードするフィラミンＡ遺伝子（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２００３、３３：４８７）；筋萎縮性側索硬化症に関与するＴＤＰ−４３タンパク質をコードするＴＡＲＤＢＰ遺伝子（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅ．ｔ、２０１０、１９：６７１）；マチャド−ジョ
セフ病に関与するアタキシン−３タンパク質をコードするＳＣＡ３遺伝子（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２００８、３：ｅ３３４１）；脊髄小脳失調症７型に関与するアタキシン−７タンパク質をコードするＳＣＡ７遺伝子（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２００９、４：ｅ７２３２）；ハンチントン病に関与するハンチンチンタンパク質をコードするＨＴＴ遺伝子（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．、１９９６、３：１８３）；及び、炭酸脱水酵素４タンパク質をコードするＣＡ４遺伝子、円錐ロッドホメオボックス転写因子タンパク質をコードするＣＲＸ遺伝子、網膜ファスシン相同体２タンパク質をコードするＦＳＣＮ２遺伝子、イノシン一リン酸脱水素酵素１タンパク質をコードするＩＭＰＤＨ１遺伝子、核受容体サブファミリー２グループＥ３タンパク質をコードするＮＲ２Ｅ３遺伝子、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシング因子３タンパク質をコードするＰＲＰＦ３（ＲＰ１８）遺伝子、神経網膜ロイシンジッパータンパク質をコードするＮＲＬ遺伝子、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシング因子８タンパク質をコードするＰＲＰＦ８（ＲＰ１３）遺伝子、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシング因子３１タンパク質をコードするＰＲＰＦ３１（ＲＰ１１）遺伝子、ペリフェリン２タンパク質をコードするＲＤＳ遺伝子、ロッド外膜タンパク質１タンパク質をコードするＲＯＭ１遺伝子、ロドプシンタンパク質をコードするＲＨＯ遺伝子、ＲＰ１タンパク質をコードするＲＰ１遺伝子、網膜色素変性症のＧＴＰアーゼ調節タンパク質で、そのすべてが常染色体優性網膜色素変性症疾患に関与する、ＲＰＧＲ遺伝子（Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、２００８、６１３：２０３）である。
【０３３１】
ある実施形態では、疾患は神経変性障害である、ある実施形態では、神経変性障害はハンチントン病である。ある実施形態では、標的ＳＮＰは、１又は複数のｒｓ６４４６７２３、ｒｓ３８５６９７３、ｒｓ２２８５０８６、ｒｓ３６３０９２、ｒｓ９１６１７１、ｒｓ６８４４８５９、ｒｓ７６９１６２７、ｒｓ４６９００７３、ｒｓ２０２４１１５、ｒｓ１１７３１２３７、ｒｓ３６２２９６、ｒｓ１００１５９７９、ｒｓ７６５９１４４、ｒｓ３６３０９６、ｒｓ３６２２７３、ｒｓ１６８４３８０４、ｒｓ３６２２７１、ｒｓ３６２２７５、ｒｓ３１２１４１９、ｒｓ３６２２７２、ｒｓ３７７５０６１、ｒｓ３４３１５８０６、ｒｓ３６３０９９、ｒｓ２２９８９６７、ｒｓ３６３０８８、ｒｓ３６３０６４、ｒｓ３６３１０２、ｒｓ２７９８２３５、ｒｓ３６３０８０、ｒｓ３６３０７２、ｒｓ３６３１２５、ｒｓ３６２３０３、ｒｓ３６２３１０、ｒｓ１０４８８８４０、ｒｓ３６２３２５、ｒｓ３５８９２９１３、ｒｓ３６３１０２、ｒｓ３６３０９６、ｒｓ１１７３１２３７、ｒｓ１００１５９７９、ｒｓ３６３０８０、ｒｓ２７９８２３５、ｒｓ１９３６０３２、ｒｓ２２７６８８１、ｒｓ３６３０７０、ｒｓ３５８９２９１３、ｒｓ１２５０２０４５、ｒｓ６４４６７２３、ｒｓ７６８５６８６、ｒｓ３７３３２１７、ｒｓ６８４４８５９、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ１１４３６４６、ｒｓ２２８５０８６、ｒｓ２２９８９６９、ｒｓ４６９００７２、ｒｓ９１６１７１、ｒｓ３０２５８４９、ｒｓ７６９１６２７、ｒｓ４６９００７３、ｒｓ３８５６９７３、ｒｓ３６３０９２、ｒｓ３６２３１０、ｒｓ３６２３２５、ｒｓ３６３１４４、ｒｓ３６２３０３、ｒｓ３４３１５８０６、ｒｓ３６３０９９、ｒｓ３６３０８１、ｒｓ３７７５０６１、ｒｓ２０２４１１５、ｒｓ１０４８８８４０、ｒｓ３６３１２５、ｒｓ３６２２９６、ｒｓ２２９８９６７、ｒｓ３６３０８８、ｒｓ３６３０６４、ｒｓ３６２２７５、ｒｓ３１２１４１９、ｒｓ３０２５８４９、ｒｓ３６３０７０、ｒｓ３６２２７３、ｒｓ３６２２７２、ｒｓ３６２３０６、ｒｓ３６２２７１、ｒｓ３６３０７２、ｒｓ１６８４３８０４、ｒｓ７６５９１４４、ｒｓ３６３１２０、及びｒｓ１２５０２０４５である。ある実施形態では、化合物は、ＩＳＩＳ４６００６５、ＩＳＩＳ４５９９７８、ＩＳＩＳ４６００２８、ＩＳＩＳ４６０２０９、ＩＳＩＳ４６０２０８、及びＩＳＩＳ４６０２０６である。
【０３３２】
治療的有効量
ある実施形態では、突然変異ハンチンチン対立遺伝子を標的とするアンチセンス化合物の治療的有効量投与には、アンチセンス化合物投与に対する個体反応を測定するため、個体の遺伝子産物の発現をモニタリングすることを伴う。ある実施形態では、遺伝子産物は
ハンチンチンｍＲＮＡ又はタンパク質である。アンチセンス化合物の投与に対する個体の反応により、医師は、治療的介入の量及び期間を決定する。
【０３３３】
ある実施形態では、突然変異核酸を標的とするアンチセンス化合物の投与により、ｍＲＮＡ又はタンパク質発現が、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９％、又はこれら値のうち任意の２つの値により定められる範囲の割合で低減する。ある実施形態では、突然変異核酸はハンチンチン核酸であり、ｍＲＮＡはハンチンチンｍＲＮＡであり、タンパク質はハンチンチンタンパク質である。
【０３３４】
ある実施形態では、突然変異対立遺伝子を標的とするアンチセンス化合物を含有する医薬組成物は、ハンチントン病、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、ハンチントン病、アレクサンダー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、歯状赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脊髄小脳失調症１型、ペリツェウス・メルツバッハー病、捻転ジストニア、心筋症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝疾患及び肝細胞癌、ＳＬＥ、高コレステロール血症、乳腺腫瘍、喘息、１型糖尿病、関節リウマチ、グレーブス病、球脊髄性筋萎縮症、ケネディ病、進行性小児期後嚢下白内障、コレステロール胆石症、関節硬化症、心血管疾患、原発性高カルシウム尿症、α−サラセミア、ＯＣＤ、ストレス関連障害（不安障害及び併存うつ病を含む）、先天性の視覚的欠陥、高血圧、メタボリックシンドローム、大うつ病、乳癌、前立腺癌、先天性筋無力症候群、末梢動脈症候群、心房細動、散発性褐色細胞腫、先天性奇形、ＮＪＤ、ＳＣＡ７、及び常染色体優性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）のいずれかの疾患を患っている、又はいずれかの疾患にかかりやすい患者を治療するための薬物を調製するのに使用される。
【０３３５】
特定の併用治療
ある実施形態では、本発明の１又は複数の医薬組成物は、１又は複数の他の医薬剤と共投与される。ある実施形態では、係る１又は複数の他の医薬剤は、本発明の１又は複数の医薬組成物と同様、同じ疾患、障害又は状態を治療するよう設計される。ある実施形態では、係る１又は複数の他の医薬剤は、本発明の１又は複数の医薬組成物とは異なる疾患、障害又は状態を治療するよう設計される。ある実施形態では、係る１又は複数の他の医薬剤は、本発明の１又は複数の医薬組成物の所望でない副作用を治療するよう設計される。ある実施形態では、本発明の１又は複数の医薬組成物は、他の医薬剤の所望でない作用を処置するために、別の医薬剤と共投与される。ある実施形態では、本発明の１又は複数の医薬組成物は、併用効果を生じさせるために、別の医薬剤と共投与される。ある実施形態では、本発明の１又は複数の医薬組成物は、相乗効果を生じさせるために、別の医薬剤と共投与される。
【０３３６】
ある実施形態では、本発明の１又は複数の医薬組成物及び１又は複数の他の医薬剤は、同時に投与される。ある実施形態では、本発明の１又は複数の医薬組成物及び１又は複数の他の医薬剤は、別々に投与される。ある実施形態では、本発明の１又は複数の医薬組成物及び１又は複数の他の医薬剤を併せて単剤として製剤する。ある実施形態では、本発明の１又は複数の医薬組成物及び１又は複数の他の医薬剤は、別々に製剤する。
【実施例】
【０３３７】
非限定開示及び引用により含める
本明細書に記載の特定の化合物、組成物及び方法は、特定の実施形態に従って具体的に記載したが、以下の実施例は、本明細書に記載の化合物を例示することのみを目的とし、それを制限することを意図しない。本明細書で言及する特許、出願、刊行物、及びその他の公開文献は、その全体を引用により本明細書に含めるものとする。
【実施例１】
【０３３８】
ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子配列における一塩基多型（ＳＮＰ）
本明細書で配列番号１（ヌクレオチドの１５６６０００〜１７６８０００まで切断されたＮＴ＿００６０８１．１８）と指定したＨＴＴ遺伝子配列を、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ配列データベース（ＣｌｕｓｔａｌＷ２、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて、本明細書で配列番号２（ＮＭ＿００２１１１．６）と指定したＨＴＴｍＲＮＡと一致させ、その結果を図１に示した。ＨＴＴ遺伝子と関連するＳＮＰ位置（Ｈａｙｄｅｎら、国際公開第２００９／１３５３２２号により同定）を２本の配列にマップし、図１では、本明細書に引用により含まれる、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｓｎｐ）のＥｎｔｒｅｚ  ＳＮＰデータベースから取得した参照ＳＮＰのＩＤ番号別に示した。表２では、各ＳＮＰのさらなる詳細を提供する。「参照ＳＮＰのＩＤ番号」又は「ＲＳ番号」は、本明細書に含まれるＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚ  ＳＮＰデータベースから取得した各ＳＮＰの指定番号である。「ＳＮＰ位置」は、配列番号１のＳＮＰのヌクレオチド位置を指している。「多型」は、ＳＮＰ位置のヌクレオチド多様体のことである。「メジャー対立遺伝子」とは、メジャー対立遺伝子と関連するヌクレオチド、又はヒト集団の中の統計的に有意な割合の個体集団に存在するヌクレオチドのことである。「マイナー対立遺伝子」は、マイナー対立遺伝子と関連するヌクレオチド、又はヒト集団の中の比較的少数の個体集団に存在するヌクレオチドのことである。
【０３３９】
【表２−１】
2020089382.tif 000013
【表２−２】
2020089382.tif 000014
【実施例２】
【０３４０】
ハンチンチン遺伝子ＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド及びＣｏｒｉｅｌｌ製繊維芽細胞株（ＧＭ０４２８１、ＧＭ０２１７１、及びＧＭ０２１７３Ｂ）のＨＴＴｍＲＮＡの阻害の設計
表１に提示されたＳＮＰ位置と重複するヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、Ｃｏｒｉｅｌｌ製の３つのハンチンチン患者由来繊維芽細胞株、ＧＭ０４２８１、ＧＭ０２１７１、及びＧＭ０２１７３Ｂ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈより取得）における有効性を試験した。ウェルあたり２０，０００個の細胞密度のＧＭ０４２８１培養細胞又はＧＭ０２１７１培養細胞又はＧＭ０２１７３Ｂ培養細胞を、電気穿孔を用いて、１０，０００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約２４時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、プライマープローブセットＲＴ２６１７（配列番号３として指定されている順方向配列ＣＴＣＣＧＴＣＣＧＧＴＡＧＡＣＡＴＧＣＴ；配列番号４として指定されている逆方向配列ＧＧＡＡＡＴＣＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧ；配列番号５として指定されているプローブ配列ＴＧＡＧＣＡＣＴＧＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＧＡＴＡＴＣＧＧＧＡＸ）を用いて、定量リアルタイムＰＣＲによりＨＴＴｍＲＮＡレベルを測定した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを調整した。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡの阻害度として提示されている。
【０３４１】
各試験には、ＩＳＩＳ３８７９１６（ＴＣＴＣＴＡＴＴＧＣＡＣＡＴＴＣＣＡＡＧ、５−１０−５ＭＯＥ（配列番号６））及びＩＳＩＳ３８８８１６（ＧＣＣＧＴＡＧＣＣＴＧＧＧＡＣＣＣＧＣＣ、５−１０−５ＭＯＥ（配列番号７））が、各ＳＮＰ位置と重複するヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性の比較対象となり得るベンチマークオリゴヌクレオチドとして含まれた。
【０３４２】
表３及び表４のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−９−５ＭＯＥギャップマーとして設計された。ギャップマーは１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、その両端（５’末端及び３’末端）は、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウィングと隣接している。５’ウィングセグメントの各ヌクレオチド及び３’ウィングセグメントの各ヌクレオチドは、２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマーの中ではすべて、ヌクレオシド間連結はホスホロチオ酸（Ｐ＝Ｓ）連結である。各ギャップマーの中ではすべて、全シトシン核酸塩基は５−メチルシトシンである。
【０３４３】
オリゴヌクレオチドについては、表３にさらに記載した。各細胞株のアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＨＴＴｍＲＮＡの阻害度については、表４に示した。「標的対立遺伝子」は、ギャップマーが、ＳＮＰ位置のメジャー対立遺伝子を標的としているのか、又はマイナー対立遺伝子を標的としているのかを示している。括弧内の数字は、オリゴヌクレオチドの５’末端から数えた、ＳＮＰ位置と相対するギャップマーのヌクレオチド位置を示している。「開始部位」は、ギャップマーが標的とする最も５’末端側ヌクレオチドを示す。「終止部位」は、ギャップマーが標的とする最も３’末端側ヌクレオチドを示す。表３及び表４に列挙された各ギャップマーは、配列番号１であるヒトＨＴＴｐｒｅ−ｍＲＮＡを標的とする。
【０３４４】
【表３−１】
2020089382.tif 000015
【表３−２】
2020089382.tif 000016
【表３−３】
2020089382.tif 000017
【表３−４】
2020089382.tif 000018
【表３−５】
2020089382.tif 000019
【０３４５】
【表４−１】
2020089382.tif 000020
【表４−２】
2020089382.tif 000021
【表４−３】
2020089382.tif 000022
【表４−４】
2020089382.tif 000023
【表４−５】
2020089382.tif 000024
【実施例３】
【０３４６】
Ｃｏｒｉｅｌｌ製繊維芽細胞株のヒトハンチンチンｍＲＮＡレベルの用量依存的アンチセンス阻害
実施例２に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、ＧＭ０４２８１細胞株、ＧＭ０２１７１細胞株、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞株において様々な用量で試験した。各細胞株を、ウェルあたり２５，０００個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表５、表６、及び表７に記載したように、７５０ｎＭ、１，５００ｎＭ、３，０００ｎＭ、６，０００ｎＭ、及び１２，０００ｎＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約１６時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトＨＴＴプライマープローブセットＲＴＳ２６１７を用いて、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調製された。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として示した。ＩＣ５０値も表５、表６、及び表７で提供されている。
【０３４７】
【表５】
2020089382.tif 000025
【０３４８】
【表６】
2020089382.tif 000026
【０３４９】
【表７】
2020089382.tif 000027
【実施例４】
【０３５０】
Ｃｏｒｉｅｌｌ製繊維芽細胞株におけるヒトハンチンチンｍＲＮＡレベルの用量依存的アンチセンス阻害
実施例２に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、ＧＭ０４２８１細胞株、ＧＭ０２１７１細胞株、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞株において様々な用量で試験した。各細胞を、ウェルあたり２５，０００個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表８、表９、及び表１０に記載されているように、７５０ｎＭ、１，５００ｎＭ、３，０００ｎＭ、６，０００ｎＭ、及び１２，０００ｎＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約１６時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトＨＴＴプライマープローブセットＲＴＳ２６１７を用いて、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調製された。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として示した。ＩＣ５０値も表８、表９、及び表１０で提供されている。
【０３５１】
【表８−１】
2020089382.tif 000028
【表８−２】
2020089382.tif 000029
【０３５２】
【表９】
2020089382.tif 000030
【０３５３】
【表１０】
2020089382.tif 000031
【実施例５】
【０３５４】
ＧＭ０４２８１細胞におけるヒトＨＴＴのアンチセンス阻害
追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、実施例４に記載の研究から選抜したギャップマーに基づき設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、表８、表９、表１０に記載のオリジナルギャップマーの少し上流及び下流（すなわち「マイクロウォーク」）に移動させたギャップマーを作成することにより設計された。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ＭＯＥを共通とし、加えて様々なモチーフで、すなわち２−９−６ＭＯＥ、３−９−３ＭＯＥ、３−９−４ＭＯＥ、３−９−５ＭＯＥ、４−１０−５ＭＯＥ、４−１１−４ＭＯＥ、４−７−４ＭＯＥ、４−９−４ＭＯＥ、４−９−５ＭＯＥ、５−１０−４ＭＯＥ、５−７−５ＭＯＥ、５−８−６ＭＯＥ、５−９−３ＭＯＥ、５−９−５ＭＯＥ、６−７−６ＭＯＥ、６−９−２ＭＯＥ、及び６−８−５ＭＯＥで作成された。
【０３５５】
さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＮＰ ＲＳ番号がｒｓ２８５７９３６
、ｒｓ１２５０６２００、ｒｓ７６２８５５、及びｒｓ１００６７９８であるものを標的とするよう設計された（表２を参照のこと）。オリゴヌクレオチドは、メジャー対立遺伝子又はマイナー対立遺伝子のいずれかを標的とし、ＳＮＰ位置がギャップマーのポジション８又は１０のいずれかと相対するよう設計された。
【０３５６】
これらギャップマーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。ウェルあたり２５，０００個の細胞密度のＧＭ０４２８１培養細胞を、電気穿孔を用いて、１０，０００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約２４時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整した。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として表１１〜１９に提示されている。
【０３５７】
ギャップマーＩＳＩＳ４３５８６９、ＩＳＩＳ４３５８７０、ＩＳＩＳ４３５８７４、ＩＳＩＳ４３５８７９、及びＩＳＩＳ４３５８９０には、表の中で＊印を付した。新たに
設計されたギャップマーの一部は、これらを元に設計されている。ＩＳＩＳ３８７９１６は、各ＳＮＰ位置と重複するヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性の比較対象となり得るベンチマークオリゴヌクレオチドとして本研究に含まれた。
【０３５８】
共通のＭＯＥオリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチド長である。
【０３５９】
２−９−６ギャップマーは、１７ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、２個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に隣接し、６個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。
【０３６０】
３−９−３ギャップマーは、１５ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ３個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向及び３’方向に隣接している。
【０３６１】
３−９−４ギャップマーは、１６ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、３個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に、４個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。
【０３６２】
３−９−５ギャップマーは、１７ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、３個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に、５個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。
【０３６３】
４−１０−５ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、１０個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、４個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に、５個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。
【０３６４】
４−１１−４ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、１１個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ４個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向及び３’方向に隣接している。
【０３６５】
４−７−４ギャップマーは、１５ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、７個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ４個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向及び３’方向に隣接している。
【０３６６】
４−９−４ギャップマーは、１７ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ４個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向及び３’方向に隣接している。
【０３６７】
４−９−５ギャップマーは、１８ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、４個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に、５個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。
【０３６８】
５−１０−４ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、１０個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、５個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に、４個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。
【０３６９】
５−７−５ギャップマーは、１７ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、７個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向及び３’方向に隣接している。
【０３７０】
５−８−６ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、８個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、５個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に、６個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。
【０３７１】
５−９−３ギャップマーは、１７ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、５個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に、３個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。
【０３７２】
５−９−５ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向及び３’方向に隣接している。
【０３７３】
６−７−６ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、７個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ６個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向及び３’方向に隣接している。
【０３７４】
６−９−２ギャップマーは、１７ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、６個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に、２個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。
【０３７５】
６−８−５ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、８個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、６個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に、５個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。
【０３７６】
各モチーフに関して、５’ウィングセグメントの各ヌクレオチド及び３’ウィングセグメントの各ヌクレオチドは２’−ＭＯＥ修飾を有する。ギャップマーの中ではすべて、ヌクレオシド間連結はホスホロチオ酸（Ｐ＝Ｓ）連結である。各ギャップマーの中ではすべて、全シトシン核酸塩基は５−メチルシトシンである。
【０３７７】
標的対象のＳＮＰに従って、オリゴヌクレオチドを表にまとめた。「開始部位」は、ギャップマーが標的とする最も５’末端側ヌクレオチドを示す。「終止部位」は、ギャップマーが標的とする最も３’末端側ヌクレオチドを示す。「標的対立遺伝子」は、ギャップマーがメジャー対立遺伝子を標的としているのか、又はマイナー対立遺伝子を標的としているかを示す。括弧内の数字は、ＳＮＰ位置と相対するオリゴヌクレオチドの位置を示している。
【０３７８】
【表１１】
2020089382.tif 000032
【０３７９】
【表１２】
2020089382.tif 000033
【０３８０】
【表１３】
2020089382.tif 000034
【０３８１】
【表１４】
2020089382.tif 000035
【０３８２】
【表１５−１】
2020089382.tif 000036
【表１５−２】
2020089382.tif 000037
【０３８３】
【表１６−１】
2020089382.tif 000038
【表１６−２】
2020089382.tif 000039
【０３８４】
【表１７−１】
2020089382.tif 000040
【表１７−２】
2020089382.tif 000041
【０３８５】
【表１８−１】
2020089382.tif 000042
【表１８−２】
2020089382.tif 000043
【０３８６】
【表１９】
2020089382.tif 000044
【実施例６】
【０３８７】
Ｃｏｒｉｅｌｌ製繊維芽細胞株におけるヒトハンチンチンｍＲＮＡレベルの用量依存的アンチセンス阻害
実施例５に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、ＧＭ０４２８１細胞株、ＧＭ０２１７１細胞株、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞株において様々な用量で試験した。各細胞株を、ウェルあたり２５，０００個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表２０、表２１、及び表２２に記載されているように、７５０ｎＭ、１，５００ｎＭ、３，０００ｎＭ、６，０００ｎＭ、及び１２，０００ｎＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約１６時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトＨＴＴプライマープローブセットＲＴＳ２６１７を用いて、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として示した。ＩＣ５０値も表２０、表２１、及び表２２で提供されている。
【０３８８】
【表２０−１】
2020089382.tif 000045
【表２０−２】
2020089382.tif 000046
【０３８９】
【表２１−１】
2020089382.tif 000047
【表２１−２】
2020089382.tif 000048
【０３９０】
【表２２−１】
2020089382.tif 000049
【表２２−２】
2020089382.tif 000050
【実施例７】
【０３９１】
ＧＭ０４２８１細胞及びＧＭ０２１７１細胞におけるヒトＨＴＴのアンチセンス阻害
追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、実施例２に記載の研究から選抜されたギャップマーに基づき設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、表４に記載のオリジナルギャップマーの少し上流及び下流（すなわち「マイクロウォーク」）に移動させたギャップマーを作成することにより設計された。
【０３９２】
ギャップマーは、ＧＭ０４２８１細胞株及びＧＭ０２１７１細胞株で試験された。ウェルあたり２５，０００個の細胞密度のＧＭ０４２８１培養細胞又はＧＭ０２１７１培養細
胞を、電気穿孔を用いて、１０，０００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約２４時間処置した後ＲＮＡを細胞から単離し、プライマープローブセットＲＴ２６１７を用いて、定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整した。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として提供されている。
【０３９３】
新たに設計されたオリゴヌクレオチドの由来元であるギャップマーもまたアッセイに含まれた。これらの親ギャップマー、すなわち、ＩＳＩＳ４３５２９４、ＩＳＩＳ４３５２９５、ＩＳＩＳ４３５３０１、ＩＳＩＳ４３５３０３、ＩＳＩＳ４３５３０４、ＩＳＩＳ４３５３０５、ＩＳＩＳ４３５３０８、ＩＳＩＳ４３５３３０、ＩＳＩＳ４３５３３１、ＩＳＩＳ４３５３３７、ＩＳＩＳ４３５３３９、ＩＳＩＳ４３５３４０、ＩＳＩＳ４３５３４１、ＩＳＩＳ４３５３４４、ＩＳＩＳ４３５８６２、ＩＳＩＳ４３５８６３、ＩＳＩＳ４３５８６４、ＩＳＩＳ４３５８６６、ＩＳＩＳ４３５８６７、ＩＳＩＳ４３５８６８、ＩＳＩＳ４３５８７１、ＩＳＩＳ４３５８７３、ＩＳＩＳ４３５８７５、ＩＳＩＳ４３５８７６、ＩＳＩＳ４３５８７８、ＩＳＩＳ４３５８８０、ＩＳＩＳ４３５８８１、ＩＳＩＳ４３５８８２、ＩＳＩＳ４３５８８４、ＩＳＩＳ４３５８９０、及びＩＳＩＳ４３５８９７には、表の中で＊印を付した。ＩＳＩＳ３８７９１６は、各ＳＮＰ位置と重複するヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性の比較対象となり得るベンチマークオリゴヌクレオチドとして本研究に含まれた。
【０３９４】
表２３〜４８のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−９−５ＭＯＥギャップマーとして設計された。５−９−５ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向及び３’方向に隣接している。５’ウィングセグメントの各ヌクレオチド及び３’ウィングセグメントの各ヌクレオチドは、２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマーの中ではすべて、ヌクレオシド間連結はホスホロチオ酸（Ｐ＝Ｓ）連結である。各ギャップマーの中ではすべて、全シトシン核酸塩基は５−メチルシトシンである。
【０３９５】
標的とするＳＮＰ部位に従って、ギャップマーを表２３〜４８にまとめた。「開始部位」は、ギャップマーが標的とする最も５’末端側ヌクレオチドを示す。「終止部位」は、ギャップマーが標的とする最も３’末端側ヌクレオチドを示す。「標的対立遺伝子」は、ギャップマーがメジャー対立遺伝子を標的としているのか、又はマイナー対立遺伝子を標的としているかを示す。括弧内の数字は、ＳＮＰ位置に相対するオリゴヌクレオチドの位置を示している。
【０３９６】
【表２３】
2020089382.tif 000051
【０３９７】
【表２４】
2020089382.tif 000052
【０３９８】
【表２５】
2020089382.tif 000053
【０３９９】
【表２６】
2020089382.tif 000054
【０４００】
【表２７】
2020089382.tif 000055
【０４０１】
【表２８】
2020089382.tif 000056
【０４０２】
【表２９】
2020089382.tif 000057
【０４０３】
【表３０】
2020089382.tif 000058
【０４０４】
【表３１】
2020089382.tif 000059
【０４０５】
【表３２】
2020089382.tif 000060
【０４０６】
【表３３】
2020089382.tif 000061
【０４０７】
【表３４−１】
2020089382.tif 000062
【表３４−２】
2020089382.tif 000063
【０４０８】
【表３５】
2020089382.tif 000064
【０４０９】
【表３６】
2020089382.tif 000065
【０４１０】
【表３７】
2020089382.tif 000066
【０４１１】
【表３８】
2020089382.tif 000067
【０４１２】
【表３９】
2020089382.tif 000068
【０４１３】
【表４０】
2020089382.tif 000069
【０４１４】
【表４１】
2020089382.tif 000070
【０４１５】
【表４２】
2020089382.tif 000071
【０４１６】
【表４３】
2020089382.tif 000072
【０４１７】
【表４４】
2020089382.tif 000073
【０４１８】
【表４５】
2020089382.tif 000074
【０４１９】
【表４６】
2020089382.tif 000075
【０４２０】
【表４７】
2020089382.tif 000076
【０４２１】
【表４８】
2020089382.tif 000077
【実施例８】
【０４２２】
Ｃｏｒｉｅｌｌ製繊維芽細胞株のヒトハンチンチンｍＲＮＡレベルの用量依存的アンチセンス阻害
実施例７に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、ＧＭ０４２８１細胞株、ＧＭ０２１７１細胞株、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞株において様々な用量で試験した。各細胞株を、ウェルあたり２５，０００個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表４９、表５０、及び表５１に記載されているように、７５０ｎＭ、１，５００ｎＭ、３，０００ｎＭ、６，０００ｎＭ、及び１２，０００ｎＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約１６時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトＨＴＴプライマープローブセットＲＴＳ２６１７を用いて、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として示した。ＩＣ５０値も表４９、表５０、及び表５１で提供されている。
【０４２３】
【表４９】
2020089382.tif 000078
【０４２４】
【表５０−１】
2020089382.tif 000079
【表５０−２】
2020089382.tif 000080
【０４２５】
【表５１−１】
2020089382.tif 000081
【表５１−２】
2020089382.tif 000082
【実施例９】
【０４２６】
マイクロウォークにより設計されたオリゴヌクレオチドによるＧＭ０４２８１細胞のヒトＨＴＴのアンチセンス阻害
追加のギャップマーを、実施例４に記載の研究から選択されたギャップマーに基づき設計した。これらギャップマーは、表８、表９、表１０に記載のオリジナルギャップマーの少し上流及び下流（すなわち「マイクロウォーク」）に移動させたギャップマーを作成することにより設計された。ギャップマーはまた、３−９−３又は５−９−５モチーフで、及び様々なヌクレオシド位置の拘束６（Ｓ）−ＣＨ３−二環式核酸（ＢＮＡ）分子で作成された。
【０４２７】
これらのギャップマーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験された。ウェルあたり２５，０００個の細胞密度のＧＭ０４２８１培養細胞を、電気穿孔を用いて、５，０００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約２４時間処置した後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として示した。
【０４２８】
表５２〜５６のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、３−９−３又は５−９−５ギャップマーとして設計された。親ギャップマー、すなわちＩＳＩＳ４３５８６９、ＩＳＩＳ４３５８７０、ＩＳＩＳ４３５８７４、ＩＳＩＳ４３５８７９、及びＩＳＩＳ４３５８９０は、新たに設計されたギャップマーの由来元であるが、表の中で＊印を付した。ＩＳＩＳ３８７９１６は、各ＳＮＰ位置と重複するヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性の比較対象となり得るベンチマークオリゴヌクレオチドとして本研究に含まれた。
【０４２９】
３−９−３ギャップマーは、１５ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオシドから成り、それぞれ３個の糖修飾ヌクレオシドを含むウィングと、５’方向及び３’方向に隣接している。
【０４３０】
５−９−５ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオシドから成り、それぞれ５個の糖修飾ヌクレオシドを含むウィングと、５’方向及び３’方向に隣接している。
【０４３１】
各ギャップマーの中ではすべて、ヌクレオシド間連結はホスホロチオ酸（Ｐ＝Ｓ）連結である。各ギャップマーの中ではすべて、全シトシン核酸塩基は５−メチルシトシンである。表５２〜５６の中で太字及び下線を引いたヌクレオチドは、各ギャップマーにおける６（Ｓ）−ＣＨ３−ＢＮＡ分子（例えば、ｃＥｔ分子）の位置を示している。イタリック体のヌクレオチドは、ＭＯＥサブユニットである。
【０４３２】
「開始部位」は、ギャップマーが標的とする最も５’末端側ヌクレオチドを示している。「終止部位」は、ギャップマーが標的とする最も３’末端側ヌクレオチドを示している。「標的対立遺伝子」は、ギャップマーがメジャー対立遺伝子を標的としているのか、又はマイナー対立遺伝子を標的としているかを示す。括弧内の数字は、ＳＮＰ位置に相対するオリゴヌクレオチドの位置を示している。
【０４３３】
【表５２−１】
2020089382.tif 000083
【表５２−２】
2020089382.tif 000084
【０４３４】
【表５３】
2020089382.tif 000085
【０４３５】
【表５４】
2020089382.tif 000086
【０４３６】
【表５５】
2020089382.tif 000087
【０４３７】
【表５６】
2020089382.tif 000088
【実施例１０】
【０４３８】
Ｃｏｒｉｅｌｌ製繊維芽細胞株のヒトハンチンチンｍＲＮＡレベルの用量依存的アンチセンス阻害
実施例９に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、ＧＭ０４２８１細胞株、ＧＭ０２１７１細胞株、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞株において様々な用量で試験した。各細胞株を、ウェルあたり２５，０００個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表７５、表５８、及び表５９に記載されているように、３１２．５ｎＭ、６２５ｎＭ、１，２５０ｎＭ、２，５００ｎＭ、５，０００ｎＭ、及び１０，０００ｎＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約１６時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトＨＴＴプライマープローブセットＲＴＳ２６１７を用いて、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として提示されている。ＩＣ５０値も表５７、表５８、及び表５９で提供されている。
【０４３９】
【表５７】
2020089382.tif 000089
【０４４０】
【表５８】
2020089382.tif 000090
【０４４１】
【表５９−１】
2020089382.tif 000091
【表５９−２】
2020089382.tif 000092
【実施例１１】
【０４４２】
マイクロウォークで設計されたオリゴヌクレオチドによるＧＭ０４２８１細胞及びＧＭ０２１７１細胞におけるヒトＨＴＴの用量依存的アンチセンス阻害
追加のギャップマーを、実施例１０に記載の研究から選抜されたギャップマーに基づき設計した。これらのギャップマーは、表５７，表５８、及び表５９に記載のオリジナルギャップマーの少し上流及び下流（すなわち「マイクロウォーク」）に移動させたギャップマーを作成することにより設計された。ギャップマーはまた、４−９−４ＭＯＥ又は５−９−５ＭＯＥモチーフで、及び様々なヌクレオチド位置の拘束６（Ｓ）−ＣＨ３−二環式核酸（ＢＮＡ）分子で作成された。
【０４４３】
これらギャップマーは、ＧＭ０４２８１細胞株及びＧＭ０２１７１細胞株で試験された。ウェルあたり２５，０００個の細胞密度のＧＭ０４２８１培養細胞又はＧＭ０２１７１培養細胞を、電気穿孔を用いて２，５００ｎＭ又は５，０００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約２４時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、定量リアルタイムＰＣＲでＨＴＴｍＲＮＡレベルを測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として示された。
【０４４４】
表６０、表６１、及び表６２のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、３−９−３、４−９−４、又は５−９−５ＭＯＥギャップマーとして設計された。親ギャップマー、
すなわちＩＳＩＳ４３５８９０、ＩＳＩＳ４６０２１０、ＩＳＩＳ４３５８７９、ＩＳＩＳ４６０２０９、ＩＳＩＳ４３５８７０、及びＩＳＩＳ４６０２０７は、新たに設計されたギャップマーの由来元であるが、表の中では＊印を付した。ＩＳＩＳ３８７９１６は、各ＳＮＰ位置と重複するヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性の比較対象となり得るベンチマークオリゴヌクレオチドとして本研究に含まれた。
【０４４５】
３−９−３ギャップマーは、１５ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ３個のヌクレオチドを含むウィングと、５’方向及び３’方向に隣接している。
【０４４６】
４−９−４ギャップマーは、１７ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ４個のヌクレオチドを含むウィングと、５’方向及び３’方向に隣接している。
【０４４７】
５−９−５ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウィングと、５’方向及び３’方向に隣接している。
【０４４８】
各ギャップマーの中ではすべて、ヌクレオシド間連結はホスホロチオ酸（Ｐ＝Ｓ）連結である。各ギャップマーの中ではすべて、全シトシン核酸塩基は５−メチルシトシンである。表６０、表６１、及び表６２の中で、太字及び下線を引いたヌクレオチドは、各ギャップマーにおける６（Ｓ）−ＣＨ３−ＢＮＡ分子（例えば、ｃＥｔ分子）の位置を示している。イタリック体のヌクレオチドは、ＭＯＥサブユニットである。
【０４４９】
標的とするＳＮＰ部位に従って、ギャップマーを表６０、表６１、及び表６２にまとめた。「開始部位」は、ギャップマーが標的とする最も５’末端側ヌクレオチドを示す。「終止部位」は、ギャップマーが標的とする最も３’末端側ヌクレオチドを示す。「標的対立遺伝子」は、ギャップマーがメジャー対立遺伝子を標的としているのか、又はマイナー対立遺伝子を標的としているかを示す。括弧内の数字は、ＳＮＰ位置と相対するオリゴヌクレオチドの位置を示している。
【０４５０】
【表６０】
2020089382.tif 000093
【０４５１】
【表６１】
2020089382.tif 000094
【０４５２】
【表６２−１】
2020089382.tif 000095
【表６２−２】
2020089382.tif 000096
【実施例１２】
【０４５３】
Ｃｏｒｉｅｌｌ製繊維芽細胞株のヒトハンチンチンｍＲＮＡレベルの用量依存的アンチセンス阻害
実施例１１に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、ＧＭ０４２８１細胞株、ＧＭ０２１７１細胞株、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞株において様々な用量で試験した。各細胞株を、ウェルあたり２５，０００個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表６３、表６４、及び表６５に記載されているように、６２５ｎＭ、１，２５０ｎＭ、２，５００ｎＭ、５，０００ｎＭ、及び１０，０００ｎＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約１６時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトＨＴＴプライマープローブセットＲＴＳ２６１７を用いて、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として示した。ＩＣ５０値も表６３、表６４、及び表６５で提供されている。
【０４５４】
【表６３−１】
2020089382.tif 000097
【表６３−２】
2020089382.tif 000098
【０４５５】
【表６４】
2020089382.tif 000099
【０４５６】
【表６５−１】
2020089382.tif 000100
【表６５−２】
2020089382.tif 000101
【実施例１３】
【０４５７】
有効性及び選択性に基づくアンチセンスオリゴヌクレオチドの選択戦略
上記の各研究由来のギャップマーを、有効性及び選択性に基づくさらなる解析のために選抜した。
【０４５８】
有効性は、ベンチマークオリゴヌクレオチであるＩＳＩＳ３８７９１６により達成されるＨＴＴｍＲＮＡの阻害度と比較した、ＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにより達成されるＨＴＴｍＲＮＡの阻害度に基づいた。
【０４５９】
選択性は、マイナー対立遺伝子ではなく、メジャー対立遺伝子の発現を阻害するＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力に基づいた。各ＳＮＰ位置に異なる遺伝子型を有する３つの細胞株を利用することにより、このプロセスを促進させた。
【０４６０】
ＩＳＩＳ４６００６５（５’−ＡＴＡＡＡＴＴＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＧ−３’（配列番号１９９））は、オリゴヌクレオチドのポジション９のＳＮＰｒｓ７６８５６８６（メジャー対立遺伝子Ａ、マイナー対立遺伝子Ｇ）を標的とする４−９−５ＭＯＥギャップマーである。ＧＭ０４２８１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ７６８５６８６でホモ接合ＡＡである。ＧＭ０２１７３Ｂ細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ７６８５６８６でヘテロ接合ＡＧである。ＧＭ０２１７１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ７６８５６８６のホモ接合ＧＧである。よって、ＩＳＩＳ４６００６５は、ＧＭ０４２８１においてＨＴＴｍＲＮＡを阻害する可能性があり、ＧＭ０２１７３においてはＨＴＴｍＲＮＡ阻害の可能性は低く、ＧＭ０２１７１においては有意なＨＴＴｍＲＮＡ阻害はほとんど認められない若しくは皆無であれば、選択性が示されたことになる。表２０、２１、及び２２から引用し、また下記の表６６に示したＩＣ５０値により、ホモ接合ＡＡ細胞株において発現が最も低減し、ヘテロ接合ＡＧ細胞株において適度に低減され、ホモ接合ＧＧ細胞株ではあまり低減されなかったという、
３つの細胞株における阻害度の違いが確認された。ＩＣ５０は、５０％阻害ＨＴＴｍＲＮＡに求められるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度である。ＩＣ５０値の単位は、μＭである。
【０４６１】
【表６６】
2020089382.tif 000102
【０４６２】
ＩＳＩＳ４５９９７８（５’−ＡＣＡＧＴＧＣＴＡＣＣＣＡＡＣＣＴ−３’（配列番号１７４））は、オリゴヌクレオチドのポジション９のＳＮＰｒｓ４６９００７２（メジャー対立遺伝子Ｔ、マイナー対立遺伝子Ｇ）を標的とする２−９−６ＭＯＥギャップマーである。ＧＭ０４２８１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ４６９００７２でホモ接合ＴＴである。ＧＭ０２１７３Ｂ細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ４６９００７２でヘテロ接合ＴＧである。ＧＭ０２１７１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ４６９００７２でホモ接合ＧＧである。よって、ＩＳＩＳ４５９９７８は、ＧＭ０４２８１においてＨＴＴｍＲＮＡを阻害する可能性があり、ＧＭ０２１７３においてはＨＴＴｍＲＮＡ阻害の可能性は低く、ＧＭ０２１７１においては有意なＨＴＴｍＲＮＡ阻害はほとんど認められない若しくは皆無であれば、選択性が示されたことになる。表２０、表２１、及び表２２から引用し、また下記の表６７に示したＩＣ５０値により、ホモ接合ＴＴ細胞株において発現が最も低減し、ヘテロ接合ＴＧ細胞株において適度に低減され、ホモ接合ＧＧ細胞株ではあまり低減されなかったという、３つの細胞株における阻害度の違いが確認された。ＩＣ５０は、５０％阻害ＨＴＴｍＲＮＡに求められるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度である。ＩＣ５０値の単位は、μＭである。
【０４６３】
【表６７】
2020089382.tif 000103
【０４６４】
ＩＳＩＳ４６００２８（５’−ＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＧＣＡ−３’（配列番号１４９）)は、オリゴヌクレオチドのポジション１０のＳＮＰｒｓ３６２３０６（メ
ジャー対立遺伝子Ｇ、マイナー対立遺伝子Ａ）を標的とする４−１１−４ＭＯＥギャップマーである。ＧＭ０４２８１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ３６２３０６でホモ接合ＧＧである。ＧＭ０２１７３Ｂ細胞株及びＧＭ０２１７１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ３６２３０６でヘテロ接合ＧＡである。よって、ＩＳＩＳ４６００２８は、ＧＭ０４２８１においてＨＴＴｍＲＮＡを阻害する可能性があり、ＧＭ０２１７３及びＧＭ０２１７１においてはＨＴＴｍＲＮＡ阻害の可能性は低くければ、選択性が示されたことになる。表２０、表２１、及び表２２から引用し、下記の表６８に示したＩＣ５０値により、ホモ接合ＧＧ細胞株において発現が最も低減し、ヘテロ接合ＡＧ細胞株においてあまり低減されなかったという、ＧＭ０４２８１細胞株とＧＭ０２１７３及びＧＭ０２１７１細胞株の阻害度の違いが確認された。ＩＣ５０は、５０％阻害ＨＴＴｍＲＮＡに求められるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度である。ＩＣ５０値の単位は、μＭである。
【０４６５】
【表６８】
2020089382.tif 000104
【実施例１４】
【０４６６】
有効性及び選択性に基づくｃＥｔモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの選択戦略
上記の各研究由来のギャップマーを、有効性及び選択性に基づくさらなる解析のために選抜した。
【０４６７】
有効性は、ベンチマークオリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ３８７９１６により達成されるＨＴＴｍＲＮＡの阻害度と比較した、ＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにより達成されるＨＴＴｍＲＮＡの阻害度を基にした。
【０４６８】
選択性は、マイナー対立遺伝子ではなく、メジャー対立遺伝子の発現を阻害するＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を基にした。各ＳＮＰ位置に異なる遺伝子型を有する３つの細胞株を利用することにより、このプロセスを促進させた。
【０４６９】
ＩＳＩＳ４６０２０９（５’−ＴＡＡＡＴＴＧＴＣＡＴＣＡＣＣ−３’（配列番号２０３）)は、オリゴヌクレオチドのポジション８のＳＮＰｒｓ７６８５６８６（メジャー対
立遺伝子Ａ、マイナー対立遺伝子Ｇ）を標的とし、ポジション２、３、１３、及び１４にｃＥｔサブユニットを有する３−９−３ギャップマーである。ＧＭ０４２８１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ７６８５６８６でホモ接合ＡＡである。ＧＭ０２１７３Ｂ細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ７６８５６８６でヘテロ接合ＡＧである。ＧＭ０２１７１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ７６８５６８６でホモ接合ＧＧである。よって、ＩＳＩＳ４６０２０９は、ＧＭ０４２８１においてＨＴＴｍＲＮＡを阻害する可能性があり、ＧＭ０２１７３においてはＨＴＴｍＲＮＡ阻害の可能性は低く、ＧＭ０２１７１においては有意なＨＴＴｍＲＮＡ阻害はほとんど認められない若しくは皆無であれば、選択性が示されたことになる。表５７、表５８、及び表５９から引用し、下記の表６９に示したＩＣ５０値により、ホモ接合ＡＡ細胞株において発現が最も低減し、ヘテロ接合ＡＧ細胞株において適度に低減され、ホモ接合ＧＧ細胞株ではあまり低減されなかったという、３つの細胞株における阻害度の違いが確認された。ＩＣ５０は、５０％阻害ＨＴＴｍＲＮＡに求められるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度である。ＩＣ５０値の単位は、μＭである。
【０４７０】
【表６９】
2020089382.tif 000105
【０４７１】
ＩＳＩＳ４６０２０８（５’−ＣＡＧＴＧＣＴＡＣＣＣＡＡＣＣ−３’（配列番号１７
７））は、オリゴヌクレオチドのポジション８のＳＮＰｒｓ４６９００７２（メジャー対立遺伝子Ｔ、マイナー対立遺伝子Ｇ）を標的とし、ポジション２、３、１３、及び１４にｃＥｔサブユニットを有する３−９−３ギャップマーである。ＧＭ０４２８１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ４６９００７２でホモ接合ＴＴである。ＧＭ０２１７３Ｂ細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ４６９００７２でヘテロ接合ＴＧである。ＧＭ０２１７１細胞株は、ＳＮＰｒｓ４６９００７２のホモ接合ＧＧである。よって、ＩＳＩＳ４６０２０８が、ＧＭ０４２８１においてＨＴＴｍＲＮＡを阻害する可能性があり、ＧＭ０２１７３においてはＨＴＴｍＲＮＡ阻害の可能性は低く、ＧＭ０２１７１においては有意なＨＴＴｍＲＮＡ阻害はほとんど認められない若しくは皆無であれば、選択性が示されたことになる。表５７、表５８、及び表５９から引用し、下記の表７０に示したＩＣ５０値により、ホモ接合ＴＴ細胞株において発現が最も低減し、ヘテロ接合ＴＧ細胞株において適度に低減され、ホモ接合ＧＧ細胞株ではあまり低減されなかったという、３つの細胞株における阻害度の違いが確認された。ＩＣ５０は、５０％阻害ＨＴＴｍＲＮＡに求められるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度である。ＩＣ５０値の単位は、μＭである。
【０４７２】
【表７０】
2020089382.tif 000106
【０４７３】
ＩＳＩＳ４６０２０６（５’−ＧＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＧ−３’（配列番号２３１））は、オリゴヌクレオチドのポジション８のＳＮＰｒｓ３６２３０６（メジャー対立遺伝子Ｇ、マイナー対立遺伝子Ａ）を標的とし、ポジション２、３、１３、及び１４にｃＥｔサブユニットを有する３−９−３ギャップマーである。ＧＭ０４２８１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ３６２３０６でホモ接合ＧＧである。ＧＭ０２１７３Ｂ及びＧＭ０２１７１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ３６２３０６でヘテロ接合ＧＡである。よって、ＩＳＩＳ４６０２０６が、ＧＭ０４２８１においてＨＴＴｍＲＮＡを阻害する可能性があり、ＧＭ０２１７３及びＧＭ０２１７１においてはＨＴＴｍＲＮＡ阻害の可能性は低くなれば、選択性が示されたことになる。表５７、表５８、及び表５９から引用し、下記の表７１に示したＩＣ５０値により、ホモ接合ＧＧ細胞株において発現が最も低減し、ヘテロ接合ＡＧ細胞株においてはあまり低減されなかったという、ＧＭ０４２８１細胞株とＧＭ０２１７３Ｂ及びＧＭ０２１７１細胞株の阻害度の違いが確認された。ＩＣ５０は、５０％阻害ＨＴＴｍＲＮＡに求められるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度である。ＩＣ５０値の単位は、μＭである。
【０４７４】
【表７１】
2020089382.tif 000107
【実施例１５】
【０４７５】
ハンチントン病に関連する様々な細胞株とマウスモデルにおけるＳＮＰの比較
ハンチントン病と関連する様々なＳＮＰ位置の遺伝子型を、上記実施例で使用された３つのＣｏｒｉｅｌｌ製細胞株の間で、並びにＧＭ０４０２２繊維芽細胞、ＢＡＣＨＤマウスモデル及びＹＡＣ１８マウスモデルと比較した。
【０４７６】
ドナー患者のＧＭ０４０２２繊維芽細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ３６３１２５（ＮＣＢＩ
Ｅｎｔｒｅｚ  ＳＮＰデータベース）でヘテロ接合であり、Ａ対立遺伝子（アデニン）及びＣ対立遺伝子（シトシン）を配列番号２のヌクレオチド５３１０に有していた（ｖａｎ  Ｂｉｌｓｅｎ，Ｐ．Ｈ．Ｊ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１９：７１０−７１８、２００８）。ＹＡＣ１８マウスは、ヒトハンチンチン遺伝子を含有するＹＡＣ導入遺伝子で開発した（Ｈｏｄｇｓｏｎ，ら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：１８７５−８５、１９９６）。ＢＡＣＨＤマウスは、バクテリア人工染色体のコントロール下で、９７グルタミン反復で全長突然変異ハンチンチン遺伝子を発現させて開発した（Ｇｒａｙ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ．２８：６１８２−９５、２００８）。４つの細胞株及びマウスモデルにおける指定ＳＮＰ位置の遺伝子型を比較できるよう表７２に示した。
【０４７７】
【表７２−１】
2020089382.tif 000108
【表７２−２】
2020089382.tif 000109
【実施例１６】
【０４７８】
ＢａｃＨＤ皮質ニューロンで測定された対立遺伝子特異的阻害
ヒトＨＴＴのＳＮＰｒｓ７６８５６８６を標的とするＩＳＩＳ４６０２０９（５’−ＴＡＡＡＴＴＧＴＣＡＴＣＡＣＣ−３’（配列番号２０３））、及びＩＳＩＳ３８７９１６（ＴＣＴＣＴＡＴＴＧＣＡＣＡＴＴＣＣＡＡＧ（配列番号６））で、非ヒト又はマウスＳＮＰ標的部位を有しないアンチセンスオリゴヌクレオチドのＨｔｔタンパク質レベルに対する効果について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。ＩＳＩＳ３８７９１６を、ミスマッチ１つを有する標的の開始部位５７６３で、ネズミＨｔｔｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＭ＿０１０４１４．１、本明細書で配列番号２８６と指定）と相互反応させる。ＩＳＩＳ４６０２０９を、３つのミスマッチを有する標的開始部位６８６６で、ネズミＨｔｔｍＲＮＡと相互反応させる。
【０４７９】
ヒトＨｔｔ及びマウスＨｔｔを発現する原発性ＢａｃＨＤ皮質ニューロンを、以下のように単離した。Ｅ１５．５〜Ｅ１７．５の妊娠マウスから胚を切除した。皮膚を切除して、氷冷二価遊離ハンクス平衡塩類溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１４０２５−１３４）に浸した。皮膚を細かく切り、３７℃で８分間、０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、２５３００−１２０）で消化させた。完全ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１０８８８−０２２）を追加し、消化を中断した。培地で細胞を再懸濁し、ＤＮＡｓｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１８０４７−０１９）で処理した。１００ｕｌのピペットチップを介して滴定した後、細胞をｎｅｕｒｏｂａｓａｌ
培地の中でＢ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１７５０４−０４４）で再懸濁し、カウントした。ウェルあたり１．７×１０５細胞をポリ−Ｄ−リジン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、３５４２１０）でプレコートしたウェルプレート２４枚に播種した。ニューロンは、２日目にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、Ｂ２７を使い、２００μｌのｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地で培養した。
【０４８０】
ＩＳＩＳ４６０２０９又はＩＳＩＳ３８７９１６を、０．７μＭ、１．４μＭ又は１．５μＭ最終濃度で、ｄｉｖｉｓｉｏｎ２でニューロンへと培養された補足培地に加えた。８日後に、セルスクレーパーを用いて１ｍＬの培地に細胞を収穫した。２，５００ｒｐｍで５分間４℃で細胞を遠心分離し、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ＝８．０、１５０ｍＭＮａｃｌ、１％Ｉｇｅｐａｌ、４０ｍＭβ−グリセロリン酸塩、１０ｍＭＮａＦ、１×ロッシュ完全プロテアーゼ阻害（Ｒｏｃｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、及び８００μＭ  ＰＭＳＦの緩衝液でペレットを再懸濁した。１５分間インキュベートした後、ライセートを遠心分離し、タンパク質濃度をＤＣアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。
【０４８１】
タンパク質ライセートを低ビス濃度ゲルで電気泳動し、ハンチンチン対立遺伝子を分離した（分解ゲル−２００１：アクリルアミド：ＢＩＳ（１０％アクリルアミド、０．５％ＢＩＳ、３７５ｍＭＴｒｉｓ  ｐＨ８．８；濃縮用ゲル−４％アクリルアミド−ＢＩＳ（２９：１）、１５６ｍＭＴｒｉｓ  ｐＨ６．８；泳動用緩衝液−２５ｍＭＴｒｉｓ，１９０ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ＋１０μＭβ−メルカプトエタノール（用時調製））。電気泳動の後、ゲル中のタンパク質をニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ  Ｅｘｔｒａ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ社）に９０Ｖで４０分間移動させ、試料を濃縮ゲルに浸透させ、その後１９０Ｖで２．５時間タンパク質を分解した。
【０４８２】
ヒトＨｔｔ及びマウスカルネキシンタンパク質に特異的な原発性抗体を１：１０，０００希釈で使用した。ＨＲＰ標識抗マウス二次抗体（１：１０，０００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ研究所）を使用して、スーパーシグナルウェストピコ化学発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてタンパク質を可視化した。ＩｍａｇｅＪのソフトウェアを用いてタンパク質のバンドを定量化し、カルネキシンのレベルに正規化した。タンパク質のバンドをＩｍａｇｅＪのソフトウェアを用いて定量化した。表７３では、陰性対照試料に対する阻害度の推定値を示した。また、ヒトＨｔｔタンパク質及びマウスＨｔｔのタンパク質の阻害度の比較を示した。
【０４８３】
【表７３】
2020089382.tif 000110
【実施例１７】
【０４８４】
Ｃｏｒｉｅｌｌ製の繊維芽細胞株におけるヒトハンチンチンｍＲＮＡレベルの用量依存
的アンチセンス阻害
実施例３、４、１０，及び１２に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、ＧＭ０４２８１細胞株、ＧＭ０２１７１細胞株、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞株において様々な用量で試験した。各細胞株を、ウェルあたり２５，０００個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表７２、表７３、及び表７４に記載されているように、０．４７４７ｎＭ、１．５０１１ｎＭ、４．７４６３ｎＭ、１５．００７９ｎＭ、４５．４５５ｎＭ、１５０．０５２７ｎＭ、４７４．４６７３ｎＭ、１，５００．２７ｎＭ、４，７４３．８３３ｎＭ、及び１５，０００ｎＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約１６時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトＨＴＴプライマープローブセットＲＴＳ２６１７を用いて、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として提示されている。ＩＣ５０値も表７２、表７３、及び表７４で提供されている。
【０４８５】
【表７４】
2020089382.tif 000111
【０４８６】
【表７５】
2020089382.tif 000112
【０４８７】
【表７６】
2020089382.tif 000113
【実施例１８】
【０４８８】
分子ビーコンアッセイによるヒトハンチンチンのＳＮＰを標的とするＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの特異性検証
実施例１７に記載の研究由来のギャップマーの一部をＧＭ０４０２２繊維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ製）で試験した。
【０４８９】
ＩＳＩＳ４３５８７９、ＩＳＩＳ４６０２０９、及びＩＳＩＳ４７６３３３により、ＧＭ０４０２２繊維芽細胞のＨＴＴｍＲＮＡの対立遺伝子特異的抑制を検証するために、ｖａｎ  Ｂｉｌｓｅｎらによる文献（ｖａｎ  Ｂｉｌｓｅｎ、Ｐ．Ｈ．Ｊ．ら、Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１９：７１０−７１８、２００８）に記載の分子ビーコンアッセイを、蛍光体及び消光剤と連結した「分子ビーコン」合成オリゴヌクレオチドを用いて行った。ＧＭ０４０２２繊維芽細胞を電気穿孔で、表７５〜７７に記載されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を０．０６μＭ、０．１９μＭ、０．５６μＭ、１．６７μＭ、５μＭ及び１５μＭとし、ＩＳＩＳ４３５８７９、ＩＳＩＳ４６０２０９又はＩＳＩＳ４７６３３３で形質移入した。ベンチマークオリゴヌクレオチドとしてＩＳＩＳ３８７９１６をアッセイに含めた。アニーリング温度５６．５℃でＡ対立遺伝子用の分子ビーコンのｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを行った。アニーリング温度６２．０℃でＣ対立遺伝子用の分子ビーコンのｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを行った。プライマープローブセットＲＴ２６１７を用いて、ＨＴＴｍＲＮＡの総低減量を測定した。アッセイの結果は、表７７〜７９に、ＰＢＳ対照に対する阻害度として提示した。結果として、ＳＮＰ特異的ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、Ａ対立遺伝子と比べて、ｒｓ７６８５６８６のＣ対立遺伝子を特異的に標的とすることが示された（表８０）。
【０４９０】
【表７７−１】
2020089382.tif 000114
【表７７−２】
2020089382.tif 000115
【０４９１】
【表７８】
2020089382.tif 000116
【０４９２】
【表７９】
2020089382.tif 000117
【０４９３】
【表８０】
2020089382.tif 000118
【実施例１９】
【０４９４】
ＢＡＣＨＤマウス及びＹＡＣ１８マウス由来の皮質ニューロンで測定した対立遺伝子特異的阻害
ヒト対立遺伝子特異的ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドのスクリーニングに有望なＳＮＰを同定するために、ＹＡＣ１８マウス及びＢＡＣＨＤマウスのＨＴＴｍＲＮＡをＧｏｌｄｅｎｇａｔｅ９６ＳＮＰアッセイにより配列決定した。ＢＡＣマウス及びＹＡＣマウスは、いくつかの主要ＳＮＰ位置（表７２）に異なる対立遺伝子を擁し、よって、対立遺伝子特異的ノックダウンのスクリーニングツールとして用いられ得ると判断した。マウス種における標的に選ばれた各ＳＮＰ位置もヒトＨＤ染色体と比較した。各標的に関して、ヒトＨＤ集団の約５０％は、ＹＡＣ１８マウスではなく、ＢＡＣＨＤマウスで発現する標的に対しヘテロ接合である。
【０４９５】
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチド（実施例２、９、１７及び１８に記載）の対立遺伝子特異性を検証するために、アンチセンスオリゴヌクレオチド類、すなわち、ＳＮＰｒｓ３６２３３１を標的とするＩＳＩＳ４６０２０７、ＳＮＰｒｓ７６８５６８６を標的とするＩＳＩＳ４６０２０９、ＳＮＰｒｓ７６８５６８６を標的とするＩＳＩＳ４３５８７９、ＳＮＰｒｓ７６８５６８６を標的とするＩＳＩＳ４７６３３３、ＳＮＰｒｓ２２９８９６９を標的とするＩＳＩＳ４６０２１０、ＳＮＰｒｓ４６９００７２を標的とするＩＳＩＳ４３５８７４、ＳＮＰｒｓ４６９００７２を標的とするＩＳＩＳ４６０２０８、ＳＮＰｒｓ２０２４１１５を標的とするＩＳＩＳ４３５３３１、及びＳＮＰｒｓ３６３０８８を標的とするＩＳＩＳ４３５８７１に対し、これらがＢＡＣＨＤ及びＹＡＣ１８皮質ニューロンのＨＴＴタンパク質レベルに及ぼす効果について試験した。ＩＳＩＳ３８７９１６は、ヒト又はマウスＳＮＰ標的部位を有さず、ベンチマークとして使用した。ＩＳＩＳ３８７９１６を、ミスマッチ１つを有する標的開始部位５７６３で、マウスＨＴＴｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＭ＿０１０４１４．１、本明細書において配列番号２８６と指定）と相互反応させた。対立遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドでの治療により、ＹＡＣ１８ニューロンにおいてではなく、ＢＡＣＨＤニューロンにおいてＨＴＴｍＲＮＡを有意に阻害することが予測された。また、ＩＳＩＳ３８７９１６での治療により両セットのニューロンにおいてＨＴＴｍＲＮＡを阻害することが予測された。
【０４９６】
ＹＡＣ１８培養物は、ＹＡＣ１８（ライン６０、＋／＋）の雄マウスで交配させたＥ１
６．５の妊娠雌マウスＹＡＣ１８（ライン６０，＋／＋）から作成した。よって、子孫はすべてホモ接合型ＹＡＣ１８（ライン６０）であり、プールド皮質培養を促進する。ＢＡＣＨＤのＥ１６．５胚を、妊娠ＢＡＣＨＤ（＋／−）雄マウスと交配させた妊娠ＢＡＣＨＤ（＋／−）マウスから単離し、マウス胎仔単独培養して遺伝子型同定を行った。試料の相互汚染防止のため、単一皮質を単離した。分離された各皮質を用いて、６ウェルプレートの５つのウェルに播種した。遺伝子型同定後、ＡＳＯ処置にはＢＡＣＨＤ（＋／−）培養のみを用いた。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ｄｉｖｉｓｉｏｎ２でニューロンへと培養された補足培地に加えた。８日後に、セルスクレーパーを用いて１ｍＬの培地に細胞を収穫した。２，５００ｒｐｍで５分間４℃で細胞を遠心分離し、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ＝８．０、１５０ｍＭ Ｎａｃｌ、１％Ｉｇｅｐａｌ、４０ｍＭβ−グリセロリン
酸塩、１０ｍＭ ＮａＦ、１×ロッシュ完全プロテアーゼ阻害（Ｒｏｃｈｅ  ｃｏｍｐｌ
ｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、及び８００μＭ ＰＭＳＦの緩衝液でペレットを再懸濁した。１５分間インキュベート
した後、ライセートを遠心分離し、タンパク質濃度をＤＣアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。
【０４９７】
タンパク質ライセートを低ビス濃度ゲルで電気泳動し、ハンチンチン対立遺伝子を分離した（分解ゲル−２００１：アクリルアミド：ＢＩＳ（１０％アクリルアミド、０．５％ＢＩＳ、３７５ｍＭＴｒｉｓ  ｐＨ８．８；濃縮用ゲル−４％アクリルアミド−ＢＩＳ（２９：１）、１５６ｍＭＴｒｉｓ  ｐＨ６．８；泳動用緩衝液−２５ｍＭＴｒｉｓ、１９０ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ＋１０μＭβ−メルカプトエタノール（用時調製））。電気泳動の後、ゲル中のタンパク質をニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ−ＣＥｘｔｒａ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ社）に９０Ｖで４０分間移動させ、試料を濃縮ゲルに浸透させ、その後１９０Ｖで２．５時間タンパク質を分解した。
【０４９８】
ヒトＨＴＴ及びマウスカルネキシンタンパク質に特異的な原発性抗体を１：１０，０００希釈で使用した。ＨＲＰ標識抗マウス二次抗体（１：１０，０００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ研究所）を使用して、スーパーシグナルウェストピコ化学発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてタンパク質を可視化した。ＩｍａｇｅＪのソフトウェアを用いてタンパク質のバンドを定量化し、カルネキシンのレベルに正規化した。表８１〜９１では、未処理対照試料に対する阻害度を示した。また、ＢＡＣＨＤニューロン及びＹＡＣ１８ニューロンにおけるヒトＨＴＴタンパク質レベルの阻害度を提示した。
【０４９９】
【表８１】
2020089382.tif 000119
【０５００】
【表８２】
2020089382.tif 000120
【０５０１】
【表８３】
2020089382.tif 000121
【０５０２】
【表８４】
2020089382.tif 000122
【０５０３】
【表８５】
2020089382.tif 000123
【０５０４】
【表８６】
2020089382.tif 000124
【０５０５】
【表８７】
2020089382.tif 000125
【０５０６】
【表８８】
2020089382.tif 000126
【０５０７】
【表８９】
2020089382.tif 000127
【０５０８】
【表９０】
2020089382.tif 000128
【０５０９】
【表９１】
2020089382.tif 000129
【図１−１】
2020089382.tif 000130
【図１−２】
2020089382.tif 000131
【図１−３】
2020089382.tif 000132
【図１−４】
2020089382.tif 000133
【図１−５】
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【図１−６】
2020089382.tif 000135
【図１−７】
2020089382.tif 000136
【図１−８】
2020089382.tif 000137
【図１−９】
2020089382.tif 000138
【図１−１０】
2020089382.tif 000139
【図１−１１】
2020089382.tif 000140
【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
2020089382.tif 000149
【図１−２１】
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【図１−２２】
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【図１−２３】
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【図１−２４】
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【図１−２５】
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【図１−２６】
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【図１−２７】
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【図１−２８】
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【図１−２９】
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【図１−３０】
2020089382.tif 000159
【図１−３１】
2020089382.tif 000160
【図１−３２】
2020089382.tif 000161
【図１−３３】
2020089382.tif 000162
【図１−３４】
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【図１−３５】
2020089382.tif 000164
【図１−３６】
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【図１−３７】
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【図１−３８】
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【図１−３９】
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【図１−４０】
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【図１−４１】
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【図１−４２】
2020089382.tif 000171
【図１−４３】
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【図１−４４】
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【図１−４５】
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【図１−４６】
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【図１−４７】
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【図１−４８】
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【図１−４９】
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【図１−５０】
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【図１−５１】
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【図１−５２】
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【図１−５３】
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【図１−５４】
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【図１−５５】
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【図１−５６】
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【図１−５７】
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【図１−５８】
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【図１−５９】
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【図１−６０】
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【図１−６１】
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【図１−６２】
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【図１−６３】
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【図１−６４】
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【図１−６５】
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【図１−６６】
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【図１−６７】
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【図１−６８】
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【図１−６９】
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【図１−７０】
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【図１−７１】
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【図１−７２】
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【図１−７３】
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【図１−７４】
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【図１−７５】
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【図１−７６】
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【図１−７７】
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【図１−７８】
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【図１−７９】
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【図１−８０】
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【図１−８１】
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【図１−８２】
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【図１−８３】
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【図１−８４】
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【図１−８５】
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【図１−８６】
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【図１−８７】
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【図１−８８】
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【図１−８９】
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【図１−９０】
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【図１−９１】
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【図１−９２】
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【図１−９３】
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【図１−９４】
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【図１−９５】
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【図１−９６】
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【図１−９７】
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【図１−９８】
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【図１−９９】
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【図１−１００】
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【図１−１０１】
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【図１−１０２】
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【図１−１０３】
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【図１−１０４】
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【図１−１０５】
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【図１−１０６】
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【図１−１０７】
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【図１−１０８】
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【図１−１０９】
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【図１−１１０】
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【図１−１１１】
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【図１−１１２】
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【図１−１１３】
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【図１−１１４】
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【図１−１１５】
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【図１−１１６】
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【図１−１１７】
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【図１−１１８】
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【図１−１１９】
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【図１−１２０】
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【図１−１２１】
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【図１−１２２】
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【図１−１２３】
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【図１−１２４】
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【図１−１２５】
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【図１−１２６】
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【図１−１２７】
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【図１−１２８】
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【図１−１２９】
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【図１−１３０】
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【図１−１３１】
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【図１−１３２】
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【図１−１３３】
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【図１−１３４】
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【図１−１３５】
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【図１−１３６】
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【図１−１３７】
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【図１−１３８】
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【図１−１３９】
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【図１−１４０】
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【図１−１４１】
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【図１−１４２】
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【図１−１４３】
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【図１−１４４】
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【図１−１４５】
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【図１−１４６】
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【図１−１４７】
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【図１−１４８】
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【図１−１４９】
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【図１−１５０】
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【図１−１５１】
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【図１−１５２】
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【図１−１５３】
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【図１−１５４】
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【図１−１５５】
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【図１−１５６】
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【図１−１５７】
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【図１−１５８】
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【図１−１５９】
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【図１−１６０】
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【図１−１６１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月25日(2020.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。