(57)【要約】【課題】本発明は、ＲＡＮＫＬ発現細胞が可視化された非ヒト遺伝子改変動物、ＲＡＮＫＬ発現細胞が欠損された非ヒト遺伝子改変動物、及びその作製方法を提供する。【解決手段】一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれており、一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、ＲＡＮＫＬ発現細胞において、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ発現するように組み込まれており、ＲＡＮＫＬ発現細胞で前記蛍光タンパク質が発現している、非ヒト遺伝子改変動物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれており、
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、ＲＡＮＫＬ発現細胞において、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ発現するように組み込まれており、
ＲＡＮＫＬ発現細胞で前記蛍光タンパク質が発現している、非ヒト遺伝子改変動物。
【請求項２】
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれている非ヒト遺伝子改変動物と、
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、ＲＡＮＫＬ発現細胞において、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ発現するように組み込まれている非ヒト遺伝子改変動物と
を交配することによって、ＲＡＮＫＬ発現細胞で前記蛍光タンパク質が発現している非ヒト遺伝子改変動物を得る、非ヒト遺伝子改変動物の作製方法。
【請求項３】
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにテトラサイクリン制御性トランス活性化因子遺伝子又はリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子遺伝子が組み込まれており、
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、テトラサイクリン応答因子と、前記テトラサイクリン応答因子の下流に位置し、かつ前記テトラサイクリン応答因子に制御される最小プロモーターと、前記最小プロモーターの下流に位置し、かつ前記最小プロモーターに発現を制御されるリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子とが組み込まれており、
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、ＲＡＮＫＬ発現細胞において、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ発現するように組み込まれている、非ヒト遺伝子改変動物。
【請求項４】
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにテトラサイクリン制御性トランス活性化因子遺伝子が組み込まれており、
Ｔｅｔ系化合物の非存在下においては、ＲＡＮＫＬ発現細胞で前記蛍光タンパク質が発現し、Ｔｅｔ系化合物の存在下においては、ＲＡＮＫＬ発現細胞で前記蛍光タンパク質が発現しない、請求項３に記載の非ヒト遺伝子改変動物。
【請求項５】
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにテトラサイクリン制御性トランス活性化因子遺伝子又はリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子遺伝子が組み込まれている非ヒト遺伝子改変動物と、
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、テトラサイクリン応答因子と、前記テトラサイクリン応答因子の下流に位置し、かつ前記テトラサイクリン応答因子に制御される最小プロモーターと、前記最小プロモーターの下流に位置し、かつ前記最小プロモーターに発現を制御されるリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子とが組み込まれており、かつ、
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、ＲＡＮＫＬ発現細胞において、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ発現するように組み込まれて非ヒト遺伝子改変動物と
を交配することによって、Ｔｅｔ系化合物濃度を制御することにより、ＲＡＮＫＬ発現細胞における前記蛍光タンパク質の発現が制御される非ヒト遺伝子改変動物を得る、非ヒト遺伝子改変動物の作製方法。
【請求項６】
刺激物質存在下で細胞死を引き起こす細胞死誘導分子がＲＡＮＫＬ発現細胞中で発現している非ヒト動物に、前記刺激物質を投与することにより、ＲＡＮＫＬ発現細胞を細胞死させることによって、ＲＡＮＫＬ発現細胞を欠損した非ヒト動物を作製する方法であり、
前記非ヒト動物は、
（ｉ）  一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、ＲＡＮＫＬ発現細胞で発現している第１の遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれており、かつ
（ｉｉ）  一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ、ＲＡＮＫＬ発現細胞で発現している第２の遺伝子のプロモーターの制御下で細胞死誘導分子が発現するように、２つのｌｏｘＰ配列と前記細胞死誘導分子をコードする遺伝子とが組み込まれており、
前記第１の遺伝子又は前記第２の遺伝子がＴｎｆｓｆ１１遺伝子である、非ヒト動物の作製方法。
【請求項７】
前記非ヒト動物が、
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、前記第１の遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれている非ヒト動物と、
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ、前記第２の遺伝子のプロモーターの制御下で前記細胞死誘導分子が発現するように、２つのｌｏｘＰ配列と前記細胞死誘導分子をコードする遺伝子とが組み込まれている非ヒト動物と、
を交配して得られた個体である、請求項６に記載の非ヒト動物の作製方法。
【請求項８】
前記刺激物質がジフテリア毒素であり、かつ前記細胞死誘導分子がジフテリア毒素受容体である、又は
前記刺激物質がガンシクロビルであり、かつ前記細胞死誘導分子が単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼである、請求項６又は７に記載の非ヒト動物の作製方法。
【請求項９】
刺激物質存在下で細胞死を引き起こす細胞死誘導分子がＲＡＮＫＬ発現細胞中で発現している非ヒト動物であって、
（ｉ）  一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、ＲＡＮＫＬ発現細胞で発現している第１の遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれており、かつ
（ｉｉ）  一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ、ＲＡＮＫＬ発現細胞で発現している第２の遺伝子のプロモーターの制御下で細胞死誘導分子が発現するように、２つのｌｏｘＰ配列と前記細胞死誘導分子をコードする遺伝子とが組み込まれており、
前記第１の遺伝子又は前記第２の遺伝子がＴｎｆｓｆ１１遺伝子である、非ヒト動物。
【請求項１０】
前記刺激物質がジフテリア毒素であり、前記細胞死誘導分子がジフテリア毒素受容体であり、げっ歯類である、請求項９に記載の非ヒト動物。
【請求項１１】
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターの制御下でジフテリア毒素受容体が発現するように、２つのｌｏｘＰ配列とジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子とが組み込まれている、げっ歯類の遺伝子改変動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＲＡＮＫＬ発現細胞が可視化された非ヒト遺伝子改変動物、ＲＡＮＫＬ発現細胞が欠損された非ヒト遺伝子改変動物、及びこれらの作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＦ−κＢリガンド受容体アクチベーターであるＲＡＮＫＬは、ＴＮＦスーパーファミリーに属するサイトカインの一種であり、特定系列の細胞膜表面に発現する。ＲＡＮＫＬは、破骨細胞分化に必須のサイトカインであり、骨芽細胞や骨細胞といった骨組織を構成する細胞に広く発現している。ＲＡＮＫＬは、骨組織細胞以外にも、リンパ節ストローマ細胞の一種であるＭＲＣ（Marginal Reticular cell）で発現しており(非特許文献１)、リンパ節形成(非特許文献２)や胸腺上皮細胞分化(非特許文献３)にも関与している。また、ＲＡＮＫＬは、腸管Ｍｉｃｒｏｆｏｌｄ細胞（Ｍ細胞）の分化（非特許文献４）にも関与している。このように、ＲＡＮＫＬは、骨以外の臓器中の多くの系列の細胞に発現しており、多岐にわたる生理活性を有することが知られている。
【０００３】
ＲＡＮＫＬの生理機能を解明するために、生体内のＲＡＮＫＬ発現細胞（ＲＡＮＫＬ陽性細胞）の可視化が試みられている。例えば、抗ＲＡＮＫＬ抗体を用いた免疫染色法や、ＲＡＮＫＬをコードするＴｎｆｓｆ１１遺伝子のｍＲＮＡを標的としたＦＩＳＨ（Fluorescense in situ Hybrydization)により、ＲＡＮＫＬ発現細胞を可視化する方法が知られている。しかし、細胞表面上のＲＡＮＫＬ分子は、内在性プロテアーゼにより容易に切断される。このため、抗ＲＡＮＫＬ抗体を用いてＲＡＮＫＬ発現細胞を標識し、フローサイトメトリや磁気ビーズ法を用いて生体組織から分離することは、極めて困難であった。
【０００４】
ＲＡＮＫＬの生理機能を解明するために、各臓器に存在する固有のＲＡＮＫＬ発現細胞を欠失したモデル動物は非常に有用である。これまで、２系統のTnfsf11flox/floxマウスが作製されており（非特許文献５及び６）、細胞系列特異的なＲＡＮＫＬ欠損マウスが報告されている。また、ＲＡＮＫＬ中和抗体投与や、ＲＡＮＫＬ機能阻害作用を持つ低分子化合物の投与により時期特異的なＲＡＮＫＬ機能の抑制も報告されている（非特許文献７）。また、ＲＡＮＫＬ受容体であるＲＡＮＫについても、細胞系列特異的なＲＡＮＫＬ欠損マウスモデルが報告されている（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Katakai, et al., Journal of Immunology, 2008, vol.181, p.6189-6200.
【非特許文献２】Kong, et al., Nature, 1999, vol.397, p.315-323.
【非特許文献３】Rossi, et al., Journal of Experimental Medicine, 2007, vol.204(6), p.1267-1272.
【非特許文献４】Nagashima, et al., Nature Immunology, 2017, vol.18(6), p.675-682.
【非特許文献５】Nakashima, et al., Nature Medicine, 2011, vol.17(10), p.1231-1234.
【非特許文献６】Xiong, et al., Nature Medicine, 2011, vol.17(10), p.1235-1241.
【非特許文献７】Guerrini, et al., Immunity, 2015, vol.43, p.1174-1185.
【非特許文献８】Hanada, et al., Nature, 2009, vol.462, p.505-509.
【非特許文献９】Schonig, et al., Nucleic Acids Research, 2002, vol.30(23), e134.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＲＡＮＫＬ発現細胞が可視化された非ヒト遺伝子改変動物、ＲＡＮＫＬ発現細胞が欠損された非ヒト遺伝子改変動物、及びその作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターの下流にＤＮＡリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を挿入したTnfsf11Cre/+ノックインマウスと、レポーターマウス系統Rosa26-tdTomatoマウスとを交配することにより、生体内においてＲＡＮＫＬ発現履歴を持つ細胞が可視化されたTnfsf11-Cre;Rosa26-tdTomatoマウスを得られることを見出した。さらに、本発明者らは、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムとテトラサイクリン（Ｔｅｔ）発現誘導システムを用いて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターの下流にＴｅｔ制御性トランス活性化因子（tetracycline Trans Activator：ｔＴＡ）遺伝子を挿入したTnfsf11tTA/+ノックインマウスと、ＬＣ−１マウス（TetO-Creマウス：非特許文献９）とを交配しTnfsf11-tTA;LC-1マウスを得、さらにこのTnfsf11-tTA;LC-1マウスと、Rosa26-tdTomatoマウスとを交配することにより、生体内においてRANKL発現履歴を持つ細胞をＴｅｔ系化合物濃度依存的に可視化することができるTnfsf11-tTA;LC-1;Rosa26-tdTomatoマウスを得られることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
また、本発明者らは、Ｐｒｘ１遺伝子のプロモーターの下流にＤＮＡリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を挿入したPrx1Cre/+ノックインマウスと、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターの下流に、互いに向きの異なる２つのｌｏｘＰ配列に挟まれたジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）遺伝子が逆位に組み込まれたTnfsf11iDTR/+ノックインマウスと、を交配させることにより、ジフテリア毒素刺激によってＲＡＮＫＬ発現細胞を欠損させることができる非ヒト動物が作製できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の非ヒト遺伝子改変動物の作製方法等を提供するものである。
［１］  一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれており、
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、ＲＡＮＫＬ発現細胞において、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ発現するように組み込まれており、
ＲＡＮＫＬ発現細胞で前記蛍光タンパク質が発現している、非ヒト遺伝子改変動物。
［２］  一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれている非ヒト遺伝子改変動物と、
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、ＲＡＮＫＬ発現細胞において、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ発現するように組み込まれている非ヒト遺伝子改変動物と
を交配することによって、ＲＡＮＫＬ発現細胞で前記蛍光タンパク質が発現している非ヒト遺伝子改変動物を得る、非ヒト遺伝子改変動物の作製方法。
［３］  一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにテトラサイクリン制御性トランス活性化因子遺伝子又はリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子遺伝子が組み込まれており、
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、テトラサイクリン応答因子と、前記テトラサイクリン応答因子の下流に位置し、かつ前記テトラサイクリン応答因子に制御される最小プロモーターと、前記最小プロモーターの下流に位置し、かつ前記最小プロモーターに発現を制御されるリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子とが組み込まれており、
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、ＲＡＮＫＬ発現細胞において、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ発現するように組み込まれている、非ヒト遺伝子改変動物。
［４］  一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにテトラサイクリン制御性トランス活性化因子遺伝子が組み込まれており、
Ｔｅｔ系化合物の非存在下においては、ＲＡＮＫＬ発現細胞で前記蛍光タンパク質が発現し、Ｔｅｔ系化合物の存在下においては、ＲＡＮＫＬ発現細胞で前記蛍光タンパク質が発現しない、前記［３］の非ヒト遺伝子改変動物。
［５］  一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにテトラサイクリン制御性トランス活性化因子遺伝子又はリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子遺伝子が組み込まれている非ヒト遺伝子改変動物と、
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、テトラサイクリン応答因子と、前記テトラサイクリン応答因子の下流に位置し、かつ前記テトラサイクリン応答因子に制御される最小プロモーターと、前記最小プロモーターの下流に位置し、かつ前記最小プロモーターに発現を制御されるリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子とが組み込まれており、かつ、
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、ＲＡＮＫＬ発現細胞において、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ発現するように組み込まれて非ヒト遺伝子改変動物と
を交配することによって、Ｔｅｔ系化合物濃度を制御することにより、ＲＡＮＫＬ発現細胞における前記蛍光タンパク質の発現が制御される非ヒト遺伝子改変動物を得る、非ヒト遺伝子改変動物の作製方法。
［６］  刺激物質存在下で細胞死を引き起こす細胞死誘導分子がＲＡＮＫＬ発現細胞中で発現している非ヒト動物に、前記刺激物質を投与することにより、ＲＡＮＫＬ発現細胞を細胞死させることによって、ＲＡＮＫＬ発現細胞を欠損した非ヒト動物を作製する方法であり、
前記非ヒト動物は、
（ｉ）  一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、ＲＡＮＫＬ発現細胞で発現している第１の遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれており、かつ
（ｉｉ）  一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ、ＲＡＮＫＬ発現細胞で発現している第２の遺伝子のプロモーターの制御下で細胞死誘導分子が発現するように、２つのｌｏｘＰ配列と前記細胞死誘導分子をコードする遺伝子とが組み込まれており、
前記第１の遺伝子又は前記第２の遺伝子がＴｎｆｓｆ１１遺伝子である、非ヒト動物の作製方法。
［７］  前記非ヒト動物が、
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、前記第１の遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれている非ヒト動物と、
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ、前記第２の遺伝子のプロモーターの制御下で前記細胞死誘導分子が発現するように、２つのｌｏｘＰ配列と前記細胞死誘導分子をコードする遺伝子とが組み込まれている非ヒト動物と、
を交配して得られた個体である、前記［６］の非ヒト動物の作製方法。
［８］  前記刺激物質がジフテリア毒素であり、かつ前記細胞死誘導分子がジフテリア毒素受容体である、又は
前記刺激物質がガンシクロビルであり、かつ前記細胞死誘導分子が単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼである、前記［６］又は［７］の非ヒト動物の作製方法。
［９］  刺激物質存在下で細胞死を引き起こす細胞死誘導分子がＲＡＮＫＬ発現細胞中で発現している非ヒト動物であって、
（ｉ）  一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、ＲＡＮＫＬ発現細胞で発現している第１の遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれており、かつ
（ｉｉ）  一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ、ＲＡＮＫＬ発現細胞で発現している第２の遺伝子のプロモーターの制御下で細胞死誘導分子が発現するように、２つのｌｏｘＰ配列と前記細胞死誘導分子をコードする遺伝子とが組み込まれており、
前記第１の遺伝子又は前記第２の遺伝子がＴｎｆｓｆ１１遺伝子である、非ヒト動物。
［１０］  前記刺激物質がジフテリア毒素であり、前記細胞死誘導分子がジフテリア毒素受容体であり、げっ歯類である、前記［９］の非ヒト動物。
［１１］  一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターの制御下でジフテリア毒素受容体が発現するように、２つのｌｏｘＰ配列とジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子とが組み込まれている、げっ歯類の遺伝子改変動物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ＲＡＮＫＬ発現細胞のみを蛍光によって可視化した非ヒト遺伝子改変動物を提供できる。当該非ヒト遺伝子改変動物及びこれから採取された生体試料は、ＲＡＮＫＬ発現細胞の機能解析のツールとして非常に有用である。
【００１１】
また、本発明により、外部からの特定の刺激によってＲＡＮＫＬ発現細胞を選択的に欠損させる非ヒト動物を作製することができ、作製されたＲＡＮＫＬ発現細胞特異的欠損非ヒト動物は、ＲＡＮＫＬの機能解析のツールとして非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１において、Tnfsf11-Cre;Rosa26-tdTomatoマウスの胎児の大腿骨骨原基を、ＤＡＰＩ染色した蛍光画像である。
【図２】実施例２において、Tnfsf11-tTA;LC-1;Rosa26-tdTomatoマウス（Ｅ１５及びＰ２）の大腿骨のＤＡＰＩ染色した蛍光画像及びＤｏｘ投与スケジュールを示した図である。
【図３】実施例２において、Tnfsf11-tTA;LC-1;Rosa26-tdTomatoマウスの鼠径部リンパ節の蛍光画像及びＤｏｘ投与スケジュールを示した図である。
【図４】実施例３において、ジフテリア毒素処理したPrx1-Cre;Tnfsf11-iDTRfloxマウス胎児の骨組織の、ＴＲＡＰ染色及びｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色した染色画像である。
【図５】実施例３において、ジフテリア毒素処理した日齢１日のPrx1-Cre;Tnfsf11-iDTRfloxマウスの骨髄腔組織の、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ４５．２抗体、及びＤＡＰＩを用いた染色画像である。
【図６】実施例３において、ジフテリア毒素処理した日齢１日のPrx1-Cre;Tnfsf11-iDTRfloxマウスの、骨髄領域全体に対する、ＣＤ３１陽性領域の割合（Ａ）及び骨髄領域に対するＣＤ４５．２陽性領域の割合（Ｂ）の測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜ＲＡＮＫＬ発現細胞が可視化された遺伝子改変動物＞
ＲＡＮＫＬ発現細胞のみに蛍光タンパク質を発現させることにより、ＲＡＮＫＬ発現細胞のみを可視化することができる。このＲＡＮＫＬ発現細胞が可視化された細胞は、ＲＡＮＫＬ発現細胞のみに蛍光タンパク質を発現させた遺伝子改変動物（ＲＡＮＫＬ発現細胞可視化遺伝子改変動物）から採取できる。ＲＡＮＫＬ発現細胞可視化遺伝子改変動物又はこれから採取された可視化されたＲＡＮＫＬ発現細胞は、ＲＡＮＫＬ発現細胞の生理的機能やＲＡＮＫＬ自体の機能解析のためのツールとして有用である。
【００１４】
ＲＡＮＫＬ発現細胞可視化遺伝子改変動物のうち、定常的にＲＡＮＫＬ発現細胞が可視化されている遺伝子改変動物は、例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いて作製することができる。具体的には、当該遺伝子改変動物は、一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれており、かつ、一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、ＲＡＮＫＬ発現細胞において、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ発現するように組み込まれている。ＲＡＮＫＬ発現細胞では、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターの制御下でＣｒｅが発現しており、このＣｒｅによって、蛍光タンパク質が発現している。
【００１５】
ＲＡＮＫＬ発現細胞可視化遺伝子改変動物は、例えば、一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれている遺伝子改変動物（Tnfsf11-Cre遺伝子改変動物）と、一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、ＲＡＮＫＬ発現細胞において、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ発現するように組み込まれている遺伝子改変動物（蛍光タンパク質遺伝子導入改変動物）と、を交配させることにより、後代個体として得ることができる。
【００１６】
Tnfsf11-Cre遺伝子改変動物は、ゲノムＤＮＡ中のＴｎｆｓｆ１１遺伝子領域（Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のコーディング領域）のうちの開始メチオニンを含む領域を、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子（リコンビナーゼＣｒｅをコードする塩基配列からなるＤＮＡ２本鎖断片）に置換することにより作製できる。Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによってリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が発現する遺伝子改変であればよく、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子領域の全領域を、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子に置換してもよく、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子領域のうちの開始メチオニンを含む部分領域のみを、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子領域に置換してもよい。好ましくは、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターの直下の開始メチオニンの下流に、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を挿入する。
【００１７】
使用されるリコンビナーゼＣｒｅは、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いた遺伝子改変において使用可能ないずれのリコンビナーゼＣｒｅであってもよい。使用されるリコンビナーゼＣｒｅとしては、大腸菌Ｐ１ファージ由来のリコンビナーゼＣｒｅ又はその改変体を用いることが好ましい。当該改変体は、リコンビナーゼ活性が保持されているものであればよく、例えば、大腸菌Ｐ１ファージ由来のリコンビナーゼＣｒｅの１又は複数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入した変異体や、大腸菌Ｐ１ファージ由来のリコンビナーゼＣｒｅ又はその変異体のＮ末端若しくはＣ末端がペプチドで修飾された修飾体であって、リコンビナーゼ活性が保持されているものが挙げられる。
【００１８】
Tnfsf11-Cre遺伝子改変動物が備えるリコンビナーゼＣｒｅは、そのＮ末端若しくはＣ末端に他のタンパク質を連結させたキメラタンパク質として発現させてもよい。この場合、リコンビナーゼＣｒｅとその他のタンパク質とを、自己切断ペプチドを含むリンカーで連結させることにより、リコンビナーゼＣｒｅを当該他のタンパク質と分離した状態でＲＡＮＫＬ発現細胞内に存在させることができる。自己切断ペプチドとしては、２Ａペプチド等が挙げられる。具体的には、リコンビナーゼＣｒｅとその他のタンパク質とを自己切断ペプチドを含むリンカーで連結させたタンパク質をコードする遺伝子で、ゲノムＤＮＡ中のＴｎｆｓｆ１１遺伝子領域のうちの開始メチオニンを含む領域を置換する。当該遺伝子は、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子とその他のタンパク質をコードする遺伝子とを、読み枠が同じとなるように、自己切断ペプチドを含むリンカーをコードする塩基配列（自己切断ペプチドが２Ａペプチドの場合、２Ａペプチドをコードする塩基配列であるＰ２Ａ配列を含む塩基配列）を介して連結させて得ることができる。
【００１９】
当該他のタンパク質としては、例えば、蛍光タンパク質が挙げられる。前記（ｉ）の遺伝子改変において、ＲＡＮＫＬ発現細胞内でリコンビナーゼＣｒｅと蛍光タンパク質とを自己切断ペプチドを含むリンカーで連結させたタンパク質を発現させた場合には、リコンビナーゼＣｒｅの発現の有無を、当該蛍光タンパク質から発される蛍光で判別することができる。
【００２０】
蛍光タンパク質遺伝子導入改変動物は、ＲＡＮＫＬ発現細胞で発現している遺伝子のプロモーターの制御下で蛍光タンパク質が発現するように、２つのｌｏｘＰ配列と蛍光タンパク質をコードする遺伝子とを組み込む遺伝子改変により作製できる。蛍光タンパク質をコードする遺伝子をプロモーターの下流に組み込む遺伝子（蛍光タンパク質導入用遺伝子）としては、ＲＡＮＫＬ発現細胞で発現している遺伝子であってＴｎｆｓｆ１１遺伝子以外の遺伝子であれば特に限定されるものではない。当該蛍光タンパク質導入用遺伝子としては、蛍光タンパク質遺伝子が導入される細胞への影響を抑えるために、細胞の生存や増殖に必須ではない遺伝子であることが好ましい。当該遺伝子としては、例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子等が挙げられる。
【００２１】
２つのｌｏｘＰ配列と蛍光タンパク質をコードする遺伝子とを組み込む遺伝子改変としては、例えば、蛍光タンパク質導入用遺伝子のプロモーターの下流、好ましくは当該プロモーターの直下の開始メチオニンの下流に、互いに向きの異なる２つのｌｏｘＰ配列に挟まれた蛍光タンパク質をコードする遺伝子を逆位に組み込む改変が挙げられる。当該遺伝子改変により、ＲＡＮＫＬ発現細胞中では、当該プロモーターの下流に互いに向きの異なる２つのｌｏｘＰ配列が組み込まれており、かつこれらのｌｏｘＰ配列によって挟まれた領域に蛍光タンパク質をコードする遺伝子が逆位に挿入されている。当該遺伝子改変では、蛍光タンパク質をコードする遺伝子は逆位に挿入されているために、リコンビナーゼＣｒｅ非存在下では、当該蛍光タンパク質は発現しない。この遺伝子改変と共にTnfsf11-Cre遺伝子改変を備えるＲＡＮＫＬ発現細胞では、リコンビナーゼＣｒｅによって前記２つのｌｏｘＰ配列に挟まれた領域が反転し、蛍光タンパク質が発現する。
【００２２】
２つのｌｏｘＰ配列と蛍光タンパク質をコードする遺伝子とを組み込む遺伝子改変としては、例えば、蛍光タンパク質導入用遺伝子のプロモーターの下流に、互いに向きの同じ２つのｌｏｘＰ配列に挟まれた転写停止配列と、これらのｌｏｘＰ配列の下流に蛍光タンパク質をコードする遺伝子と、を挿入する改変も挙げられる。当該遺伝子改変により、ＲＡＮＫＬ発現細胞中では、当該プロモーターの下流に、互いに向きの同じ２つのｌｏｘＰ配列に挟まれた転写停止配列を介して蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挿入されている。当該改変では、互いに向きの同じ２つのｌｏｘＰ配列に挟まれた転写停止配列は、当該プロモーターの直下の開始メチオニンの下流に挿入されてもよく、当該開始メチオニンの上流に挿入されてもよい。当該遺伝子改変では、蛍光タンパク質をコードする遺伝子と当該プロモーターの間に転写停止配列が存在するため、リコンビナーゼＣｒｅ非存在下では、当該蛍光タンパク質は発現しない。この遺伝子改変と共にTnfsf11-Cre遺伝子改変を備えるＲＡＮＫＬ発現細胞では、リコンビナーゼＣｒｅによって前記２つのｌｏｘＰ配列に挟まれた領域が切り出されて、蛍光タンパク質が発現する。なお、転写停止配列としては、例えば、ｐｏｌｙＡ配列、ストップコドンを含む配列等が挙げられる。
【００２３】
ＲＡＮＫＬ発現細胞可視化遺伝子改変動物のうち、特定の条件下でのみＲＡＮＫＬ発現細胞が可視化されている遺伝子改変動物は、例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムとＴｅｔ発現誘導システムを用いて作製することができる。Ｔｅｔ発現誘導システムは、Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムであってもよく、Ｔｅｔ−ＯＮシステムであってもよい。Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムは、Ｔｅｔ系化合物の非存在下で、ｔＴＡがＴＲＥ（テトラサイクリン応答因子）に結合し、ＴＲＥの下流の遺伝子発現を制御する最小プロモーターを活性化する。Ｔｅｔ−ＯＮシステムは、Ｔｅｔ系化合物の存在下で、ｒｔＴＡ（リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子）がＴＲＥに結合し、ＴＲＥの下流の遺伝子発現を制御する最小プロモーターを活性化する。このＴｅｔ発現誘導システムが用いられたＲＡＮＫＬ発現細胞可視化遺伝子改変動物（Ｔｅｔ制御ＲＡＮＫＬ発現細胞可視化遺伝子改変動物）は、具体的には、一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにｔＴＡ遺伝子又はｒｔＴＡ遺伝子が組み込まれており、一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、ＴＲＥと、前記ＴＲＥの下流に位置し、かつ前記ＴＲＥに制御される最小プロモーターと、前記最小プロモーターの下流に位置し、かつ前記最小プロモーターに発現を制御されるリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子とが組み込まれており、一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、ＲＡＮＫＬ発現細胞において、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ発現するように組み込まれている。
【００２４】
Ｔｅｔ制御ＲＡＮＫＬ発現細胞可視化遺伝子改変動物は、例えば、下記の３種の遺伝子改変動物を互いに順次交配させることにより、後代個体として得ることができる。
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにｔＴＡ遺伝子又はｒｔＴＡ遺伝子が組み込まれている遺伝子改変動物（Tnfsf11-tTA遺伝子改変動物又はTnfsf11-rtTA遺伝子改変動物）。
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、ＴＲＥと、前記ＴＲＥの下流に位置し、かつ前記ＴＲＥに制御される最小プロモーターと、前記最小プロモーターの下流に位置し、かつ前記最小プロモーターに発現を制御されるリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子とが組み込まれている遺伝子改変動物（TRE-Cre遺伝子改変動物）。
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、ＲＡＮＫＬ発現細胞において、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ発現するように組み込まれている遺伝子改変動物（蛍光タンパク質遺伝子導入改変動物）。
【００２５】
Ｔｅｔ制御ＲＡＮＫＬ発現細胞可視化遺伝子改変動物は、TRE-Cre遺伝子改変動物と蛍光タンパク質遺伝子導入改変動物を交配し、得られた後代個体のうち、TRE-Cre遺伝子改変と蛍光タンパク質遺伝子導入改変の両方を備える個体と、Tnfsf11-tTA遺伝子改変動物又はTnfsf11-rtTA遺伝子改変動物とを交配して得ることができる。また、Ｔｅｔ制御ＲＡＮＫＬ発現細胞可視化遺伝子改変動物は、Tnfsf11-tTA遺伝子改変動物又はTnfsf11-rtTA遺伝子改変動物と蛍光タンパク質遺伝子導入改変動物とを交配し、得られた後代個体のうち、Tnfsf11-tTA遺伝子改変又はTnfsf11-rtTA遺伝子改変と蛍光タンパク質遺伝子導入改変との両方を備える個体と、TRE-Cre遺伝子改変動物とを交配して得ることができ、Tnfsf11-tTA遺伝子改変動物又はTnfsf11-rtTA遺伝子改変動物とTRE-Cre遺伝子改変動物とを交配し、得られた後代個体のうち、Tnfsf11-tTA遺伝子改変又はTnfsf11-rtTA遺伝子改変とTRE-Cre遺伝子改変との両方を備える個体と、蛍光タンパク質遺伝子導入改変動物とを交配して得ることもできる。
【００２６】
Tnfsf11-tTA遺伝子改変動物は、ゲノムＤＮＡ中のＴｎｆｓｆ１１遺伝子領域のうちの開始メチオニンを含む領域を、ｔＴＡ遺伝子（ｔＴＡをコードする塩基配列からなるＤＮＡ２本鎖断片）に置換することにより作製できる。同様に、Tnfsf11-rtTA遺伝子改変動物は、ゲノムＤＮＡ中のＴｎｆｓｆ１１遺伝子領域のうちの開始メチオニンを含む領域を、ｒｔＴＡ遺伝子（ｒｔＴＡをコードする塩基配列からなるＤＮＡ２本鎖断片）に置換することにより作製できる。Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによってｔＴＡ遺伝子又はｒｔＴＡ遺伝子が発現する遺伝子改変であればよく、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子領域の全領域を、ｔＴＡ遺伝子又はｒｔＴＡ遺伝子に置換してもよく、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子領域のうちの開始メチオニンを含む部分領域のみを、ｔＴＡ遺伝子又はｒｔＴＡ遺伝子に置換してもよい。好ましくは、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターの直下の開始メチオニンの下流に、ｔＴＡ遺伝子又はｒｔＴＡ遺伝子を挿入する。
【００２７】
本発明において用いられるｔＴＡとしては、特に限定されるものではなく、Ｔｅｔ発現誘導システムにおいて使用されている公知のｔＴＡやその改変体を適宜用いることができる。同様に、本発明において用いられるｒｔＴＡとしては、特に限定されるものではなく、Ｔｅｔ発現誘導システムにおいて使用されている公知のｒｔＴＡやその改変体を適宜用いることができる。
【００２８】
TRE-Cre遺伝子改変動物は、ゲノムＤＮＡ中のＲＡＮＫＬ発現細胞で発現している遺伝子のうちＴｎｆｓｆ１１遺伝子以外の遺伝子領域に、ＴＲＥ−Ｃｒｅ断片（ＴＲＥと、前記ＴＲＥの下流に位置し、かつ前記ＴＲＥに制御される最小プロモーターと、前記最小プロモーターの下流に位置し、かつ前記最小プロモーターに発現を制御されるリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子領域と、をコードする塩基配列からなるＤＮＡ２本鎖断片）を置換することにより作製できる。ＴＲＥは、ＴｅｔＯ反復配列を有しており、Ｔｅｔ系化合物と結合していないｔＴＡ又はＴｅｔ系化合物と結合しているｒｔＴＡが結合することによってＴＲＥの下流の最小プロモーターの下流の遺伝子発現を誘導する分子である。本発明において用いられるＴＲＥとしては、特に限定されるものではなく、Ｔｅｔ発現誘導システムにおいて使用されている公知のＴＲＥやその改変体を適宜用いることができる。
【００２９】
本発明及び本願明細書において、最小プロモーターとは、転写の開始部位を決定するが、単独では転写を開始することができない部分的プロモーターを意味する。最小プロモーターとしては、特に限定されるものではなく、例えば、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等のタンパク質発現において汎用されているプロモーターの部分プロモーターを用いることができる。
【００３０】
ＴＲＥ−Ｃｒｅ断片のゲノムＤＮＡへの導入の有無の識別が容易であるため、当該断片には、蛍光タンパク質遺伝子や、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ等の酵素マーカーをコードする遺伝子が含まれていてもよい。例えば、これらの遺伝子を、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子と直接又はＴ２Ａ自己消化ペプチドをコードするＤＮＡ断片を介して連結させてもよい。また、蛍光タンパク質や酵素マーカーをコードする遺伝子の遺伝子領域を、ＴＲＥの上流側に備えるＴＲＥ−Ｃｒｅ断片を、ゲノムＤＮＡ中のＲＡＮＫＬ発現細胞で発現している遺伝子のうちＴｎｆｓｆ１１遺伝子以外の遺伝子領域に挿入してもよい。また、蛍光タンパク質や酵素マーカーをコードする遺伝子は、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子とＩＲＥＳ（Internal Ribosomal Entry Site）等のバイシストロニック発現エレメントで連結されていてもよい。
【００３１】
Tnfsf11-Cre遺伝子改変動物、蛍光タンパク質遺伝子導入改変動物、Tnfsf11-tTA遺伝子改変動物、Tnfsf11-rtTA遺伝子改変動物、及びTRE-Cre遺伝子改変動物は、外来遺伝子を、ゲノム上の外来遺伝子を導入したい目的の領域の上流及び下流と相同な塩基配列で挟んだＤＮＡ断片を用いた相同組み換え法や、ゲノム編集を利用した方法など、公知の遺伝子改変技術を利用して作製することができる。ゲノム編集のためのヌクレアーゼとしては、ＺＦＮ（Zinc-Finger Nuclease）、ＴＡＬＥＮ（Transcription Activator-Like Effector Nuclease）、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）／Ｃａｓ９（Crispr Associated protein 9）等がある。
【００３２】
蛍光タンパク質遺伝子導入改変動物やTRE-Cre遺伝子改変動物としては、公知の遺伝子改変動物を用いてもよい。例えば、TRE-Cre遺伝子改変動物としては、ＬＣ−１マウス（TetO-Creマウス：非特許文献９）を用いることができる。
【００３３】
ＲＡＮＫＬ発現細胞可視化遺伝子改変動物の動物種は、ヒト以外であれば特に限定されるものではなく、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物や、ニワトリ、ウズラ、カモ等の鳥類等が挙げられる。実験ツールとして汎用されていることから、マウスやラット等のげっ歯類が好ましい。
【００３４】
Ｔｅｔ制御ＲＡＮＫＬ発現細胞可視化遺伝子改変動物、並びに当該動物から採取された組織及び細胞では、Ｔｅｔ系化合物の濃度依存的にＲＡＮＫＬ発現細胞において蛍光タンパク質が発現して可視化される。Ｔｅｔ制御ＲＡＮＫＬ発現細胞可視化遺伝子改変動物のうち、ｔＴＡ遺伝子が導入された遺伝子改変動物（Ｔｅｔ−ＯＦＦ−ＲＡＮＫＬ発現細胞可視化遺伝子改変動物）では、Ｔｅｔ系化合物非存在下でＲＡＮＫＬ発現細胞が可視化されており、Ｔｅｔ系化合物を投与することにより、ＲＡＮＫＬ発現細胞が非可視化される。Ｔｅｔ制御ＲＡＮＫＬ発現細胞可視化遺伝子改変動物のうち、ｒｔＴＡ遺伝子が導入された遺伝子改変動物（Ｔｅｔ−ＯＮ−ＲＡＮＫＬ発現細胞可視化遺伝子改変動物）では、Ｔｅｔ系化合物非存在下ではＲＡＮＫＬ発現細胞は可視化されず、Ｔｅｔ系化合物を投与することによりＲＡＮＫＬ発現細胞が可視化される。つまり、Ｔｅｔ制御ＲＡＮＫＬ発現細胞可視化遺伝子改変動物へのＴｅｔ系化合物の投与時期を制御することにより、目的の時期にのみＲＡＮＫＬ発現細胞を可視化することができる。
【００３５】
本発明及び本願明細書において、Ｔｅｔ系化合物とは、Ｔｅｔと同様に、ｔＴＡに結合することによってｔＴＡがＴｅｔＯ配列に結合することを阻害する、また、ｒｔＴＡに結合することによってｒｔＴＡをＴｅｔＯ配列に結合させる機能を備える化合物であり、Ｔｅｔとその類縁体が含まれる。Ｔｅｔ類縁体としては、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）、アンヒドロテトラサイクリン、シアノテトラサイクリン等が挙げられる。
【００３６】
＜ＲＡＮＫＬ発現細胞を欠損した非ヒト動物及びその作製方法＞
ＲＡＮＫＬ発現細胞を欠損した非ヒト動物（以下、「ＲＡＮＫＬ発現細胞欠損動物」ということがある。）は、刺激物質存在下で細胞死を引き起こす細胞死誘導分子がＲＡＮＫＬ発現細胞中で発現している非ヒト動物（以下、「細胞死誘導分子発現動物」）に、前記刺激物質を投与することにより、ＲＡＮＫＬ発現細胞を細胞死させることによって作製できる。当該方法では、ＲＡＮＫＬ発現細胞を欠損させる時期を外部からの刺激物質投与によって制御できる。
【００３７】
前記細胞死誘導分子発現動物は、細胞死誘導分子をＲＡＮＫＬ発現細胞内で発現させるために、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムを利用している。具体的には、当該細胞死誘導分子発現動物は、下記（ｉ）及び（ｉｉ）の遺伝子改変を備える。これらの遺伝子改変を備えることにより、当該細胞死誘導分子発現動物のＲＡＮＫＬ発現細胞では、細胞死誘導分子が発現している。
【００３８】
（ｉ）  一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、ＲＡＮＫＬ発現細胞で発現している第１の遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれている。
（ｉｉ）  一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ、ＲＡＮＫＬ発現細胞で発現している第２の遺伝子のプロモーターの制御下で細胞死誘導分子が発現するように、２つのｌｏｘＰ配列と前記細胞死誘導分子をコードする遺伝子とが組み込まれている。
【００３９】
ここで、第１の遺伝子と第２の遺伝子のいずれか一方を、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子とする。これにより、ＲＡＮＫＬ発現細胞を特異的に欠損させた非ヒト動物を作製することができる。第１の遺伝子と第２の遺伝子のいずれか一方がＴｎｆｓｆ１１遺伝子であれば、残る他方の遺伝子は、ＲＡＮＫＬ発現細胞で発現する遺伝子であれば、特に限定されるものではない。例えば、ＲＡＮＫＬ発現細胞で特異的に発現する遺伝子であってもよく、ＲＡＮＫＬ発現細胞以外の細胞でも発現する遺伝子であってもよい。
【００４０】
前記（ｉ）の遺伝子改変は、具体的には、ゲノムＤＮＡ中の第１の遺伝子領域（第１の遺伝子のコーディング領域）のうちの開始メチオニンを含む領域を、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子（リコンビナーゼＣｒｅをコードする塩基配列からなるＤＮＡ２本鎖断片）に置換することにより行う。前記（ｉ）の遺伝子改変は、第１の遺伝子のプロモーターによってリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が発現する遺伝子改変であればよく、第１の遺伝子領域の全領域を、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子に置換してもよく、第１の遺伝子領域のうちの開始メチオニンを含む部分領域のみを、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子領域に置換してもよい。
【００４１】
前記（ｉ）の遺伝子改変を備える動物のＲＡＮＫＬ発現細胞内では、リコンビナーゼＣｒｅが発現している。本発明において使用されるリコンビナーゼＣｒｅは、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いた遺伝子改変において使用可能ないずれのリコンビナーゼＣｒｅであってもよい。具体的には前記で挙げられたものを用いることができる。
【００４２】
前記（ｉ）の遺伝子改変において、リコンビナーゼＣｒｅは、そのＮ末端若しくはＣ末端に他のタンパク質を連結させたキメラタンパク質として発現させてもよい。この場合、リコンビナーゼＣｒｅとその他のタンパク質とを、自己切断ペプチドを含むリンカーで連結させることにより、リコンビナーゼＣｒｅを当該他のタンパク質と分離した状態で標的細胞内に存在させることができる。自己切断ペプチドとしては、２Ａペプチド等が挙げられる。具体的には、リコンビナーゼＣｒｅとその他のタンパク質とを自己切断ペプチドを含むリンカーで連結させたタンパク質をコードする遺伝子で、ゲノムＤＮＡ中の第１の遺伝子領域のうちの開始メチオニンを含む領域を置換する。当該遺伝子は、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子とその他のタンパク質をコードする遺伝子とを、読み枠が同じとなるように、自己切断ペプチドを含むリンカーをコードする塩基配列（自己切断ペプチドが２Ａペプチドの場合、２Ａペプチドをコードする塩基配列であるＰ２Ａ配列を含む塩基配列）を介して連結させて得ることができる。
【００４３】
前記（ｉｉ）の遺伝子改変は、リコンビナーゼＣｒｅによる組み換え反応後に、前記第２の遺伝子のプロモーターの制御下で細胞死誘導分子が発現するような遺伝子改変であれば、特に限定されるものではない。すなわち、リコンビナーゼＣｒｅによる組み換え反応後に、第２の遺伝子領域（第２の遺伝子のコーディング領域）のうちの開始メチオニンを含む領域が、細胞死誘導分子をコードする遺伝子（細胞死誘導分子をコードする塩基配列からなるＤＮＡ２本鎖断片）に置換されていればよい。前記（ｉｉ）の遺伝子改変は、リコンビナーゼＣｒｅによる組み換え反応後において、第２の遺伝子領域の全領域が、細胞死誘導分子をコードする遺伝子に置換されるような改変であってもよく、第２の遺伝子領域のうちの開始メチオニンを含む部分領域のみが、細胞死誘導分子をコードする遺伝子に置換されるような改変であってもよい。
【００４４】
前記（ｉｉ）の遺伝子改変において、リコンビナーゼＣｒｅによる組み換え反応後に第２の遺伝子のプロモーターの制御下で発現させる細胞死誘導分子としては、細胞外から刺激物質によって刺激した場合に、当該分子を発現している細胞に細胞死を誘導することができる分子であれば特に限定されるものではない。例えば、刺激物質をジフテリア毒素とした場合には、ジフテリア毒素受容体を細胞死誘導分子として用いることができる。また、刺激物質をガンシクロビルとした場合には、単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）又はその改変体を細胞死誘導分子として用いることができる。特に、非ヒト動物がマウスやラットのげっ歯類の場合には、刺激物質をジフテリア毒素とした場合には、ジフテリア毒素受容体を細胞死誘導分子として用いることが好ましい。
【００４５】
細胞死誘導分子として用いられるジフテリア毒素受容体は、いずれかの生物に発現している天然型のジフテリア毒素受容体であってもよく、この天然型のジフテリア毒素受容体の改変体であってもよい。天然型のジフテリア毒素受容体の改変体としては、ジフテリア毒素の存在下で細胞死を誘導できるものであればよく、例えば、天然型のジフテリア毒素受容体の１又は複数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入した変異体や、天然型のジフテリア毒素受容体又はその変異体のＮ末端若しくはＣ末端がペプチドで修飾された修飾体であって、ジフテリア毒素受容体として機能するものが挙げられる。
【００４６】
細胞死誘導分子として用いられるＨＳＶ−ＴＫの改変体としては、ガンシクロビルの存在下で細胞死を誘導できるものであればよく、例えば、ＨＳＶ−ＴＫの１又は複数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入した変異体や、ＨＳＶ−ＴＫ又はその変異体のＮ末端若しくはＣ末端がペプチドで修飾された修飾体であって、ガンシクロビルの存在下で細胞死を誘導できるものが挙げられる。
【００４７】
前記（ｉｉ）の遺伝子改変において、リコンビナーゼＣｒｅによる組み換え反応後に第２の遺伝子のプロモーターの制御下で発現させる細胞死誘導分子は、その他のタンパク質と連結させたキメラタンパク質として発現させてもよい。この場合には、細胞死誘導分子とその他のタンパク質とを、自己切断ペプチドを含むリンカーで連結させることにより、細胞死誘導分子を当該他のタンパク質と分離した状態でＲＡＮＫＬ発現細胞内に存在させることができる。自己切断ペプチドとしては、２Ａペプチド等の公知の自己切断ペプチドを用いることができる。具体的には、細胞死誘導分子とその他のタンパク質とを自己切断ペプチドを含むリンカーで連結させたタンパク質をコードする遺伝子で、ゲノムＤＮＡ中の第２の遺伝子領域のうちの開始メチオニンを含む領域を置換する。当該遺伝子は、細胞死誘導分子をコードする遺伝子とその他のタンパク質をコードする遺伝子とを、読み枠が同じとなるように、自己切断ペプチドを含むリンカーをコードする塩基配列（自己切断ペプチドが２Ａペプチドの場合、２Ａペプチドをコードする塩基配列であるＰ２Ａ配列を含む塩基配列）を介して連結させて得ることができる。
【００４８】
当該他のタンパク質としては、例えば、蛍光タンパク質が挙げられる。前記（ｉｉ）の遺伝子改変において、リコンビナーゼＣｒｅによる組み換え反応後のＲＡＮＫＬ発現細胞内で、細胞死誘導分子と蛍光タンパク質とを自己切断ペプチドを含むリンカーで連結させたタンパク質を発現させる場合には、前記（ｉ）及び（ｉｉ）の遺伝子改変を備えるＲＡＮＫＬ発現細胞における細胞死誘導分子の発現の有無を、当該蛍光タンパク質から発される蛍光で判別することができる。すなわち、当該蛍光タンパク質は、細胞死誘導分子発現のマーカーとして機能し得る。
【００４９】
前記（ｉｉ）の遺伝子改変において使用されるｌｏｘＰ配列は、前記（ｉ）の遺伝子改変により発現するリコンビナーゼＣｒｅが認識可能な配列であればよく、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いた遺伝子改変において使用可能なｌｏｘＰ配列の中から、適宜選択して用いることができる。例えば、大腸菌Ｐ１ファージ由来の３４ｂｐのｌｏｘＰ配列又はその改変体を用いることができる。前記（ｉｉ）の遺伝子改変において使用される２つのｌｏｘＰ配列は、同種のものであってもよく、異種のものであってもよい。
【００５０】
前記（ｉｉ）の遺伝子改変としては、例えば、第２の遺伝子のプロモーターの下流、好ましくは第２の遺伝子のプロモーターの直下の開始メチオニン（第２の遺伝子の開始メチオニン）の下流に、互いに向きの異なる２つのｌｏｘＰ配列に挟まれた細胞死誘導分子をコードする遺伝子を逆位に組み込む改変が挙げられる。当該遺伝子改変により、ＲＡＮＫＬ発現細胞中では、第２の遺伝子のプロモーターの下流に互いに向きの異なる２つのｌｏｘＰ配列が組み込まれており、かつこれらのｌｏｘＰ配列によって挟まれた領域に細胞死誘導分子をコードする遺伝子が逆位に挿入されている。当該遺伝子改変では、細胞死誘導分子をコードする遺伝子は逆位に挿入されているために、リコンビナーゼＣｒｅ非存在下では、当該細胞死誘導分子は発現しない。この遺伝子改変と共に前記（ｉ）の遺伝子改変を備える細胞では、リコンビナーゼＣｒｅによって前記２つのｌｏｘＰ配列に挟まれた領域が反転し、第２の遺伝子のプロモーターの制御下で細胞死誘導分子が発現する。
【００５１】
前記（ｉｉ）の遺伝子改変としては、例えば、第２の遺伝子のプロモーターの下流に、互いに向きの同じ２つのｌｏｘＰ配列に挟まれた転写停止配列と、これらのｌｏｘＰ配列の下流に前記細胞死誘導分子をコードする遺伝子と、を挿入する改変も挙げられる。当該遺伝子改変により、ＲＡＮＫＬ発現細胞中では、第２の遺伝子のプロモーターの下流に、互いに向きの同じ２つのｌｏｘＰ配列に挟まれた転写停止配列を介して細胞死誘導分子をコードする遺伝子が挿入されている。当該改変では、互いに向きの同じ２つのｌｏｘＰ配列に挟まれた転写停止配列は、第２の遺伝子のプロモーターの直下の開始メチオニンの下流に挿入されてもよく、当該開始メチオニンの上流に挿入されてもよい。当該遺伝子改変では、細胞死誘導分子をコードする遺伝子と第２の遺伝子のプロモーターの間に転写停止配列が存在するため、リコンビナーゼＣｒｅ非存在下では、当該細胞死誘導分子は発現しない。この遺伝子改変と共に前記（ｉ）の遺伝子改変を備える細胞では、リコンビナーゼＣｒｅによって前記２つのｌｏｘＰ配列に挟まれた領域が切り出されて、第２の遺伝子のプロモーターの制御下で細胞死誘導分子が発現する。なお、転写停止配列としては、例えば、ｐｏｌｙＡ配列、ストップコドンを含む配列等が挙げられる。
【００５２】
前記（ｉｉ）の遺伝子改変においては、さらに、第２の遺伝子のプロモーターの下流であり、かつ２つのｌｏｘＰ配列の上流に、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を、第２の遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるように挿入してもよい。この蛍光タンパク質は、リコンビナーゼＣｒｅによる組み換え反応の前であっても発現するため、この蛍光タンパク質から発される蛍光を指標として、前記（ｉｉ）の遺伝子改変の有無を確認することができる。すなわち、当該蛍光タンパク質は、前記（ｉｉ）の遺伝子改変のマーカーとして機能する。
【００５３】
蛍光タンパク質をコードする遺伝子が２つのｌｏｘＰ配列の上流に挿入された場合には、リコンビナーゼＣｒｅによる組み換え反応後には、当該蛍光タンパク質が細胞死誘導分子のＮ末端に連結したキメラタンパク質が発現する。そこで、蛍光タンパク質をコードする遺伝子の下流であり、かつ２つのｌｏｘＰ配列の上流に、当該蛍光タンパク質をコードする遺伝子と同じ読み枠となるように自己切断ペプチドをコードする塩基配列を設けておくことが好ましい。蛍光タンパク質と細胞死誘導分子の間に自己切断ペプチドがあるため、細胞死誘導分子を当該蛍光タンパク質と分離した状態でＲＡＮＫＬ発現細胞内に存在させることができる。なお、細胞死誘導分子を細胞死誘導分子発現のマーカーとなる蛍光タンパク質と共に発現させる場合には、細胞死誘導分子発現のマーカーとなる蛍光タンパク質と、前記（ｉｉ）の遺伝子改変のマーカーとなる蛍光タンパク質とは、両者を区別して検出するために、互いに蛍光特性の異なる蛍光物質とすることが好ましい。
【００５４】
前記（ｉ）の遺伝子改変と前記（ｉｉ）の遺伝子改変は、外来遺伝子を、ゲノム上の外来遺伝子を導入したい目的の領域の上流及び下流と相同な塩基配列で挟んだＤＮＡ断片を用いた相同組み換え法や、ゲノム編集を利用した方法など、公知の遺伝子改変技術を利用して行うことができる。ゲノム編集のためのヌクレアーゼとしては、ＺＦＮ（Zinc-Finger Nuclease）、ＴＡＬＥＮ（Transcription Activator-Like Effector Nuclease）、CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）／Ｃａｓ９（Crispr Associated protein 9）等がある。
【００５５】
ＲＡＮＫＬ発現細胞欠損動物の作製に用いられる細胞死誘導分子発現動物は、遺伝子組み換え技術により、前記（ｉ）の遺伝子改変と前記（ｉｉ）の遺伝子改変を順次又は同時に導入することによって作製することができる。
【００５６】
当該細胞死誘導分子発現動物では、前記（ｉ）及び（ｉｉ）の遺伝子改変は、いずれも一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて存在する、ヘテロ接合型である。このため、一般的には、当該細胞死誘導分子発現動物のＲＡＮＫＬ発現細胞でも、第１の遺伝子と第２の遺伝子はいずれも改変されていない相同染色体により発現している。このため、当該細胞死誘導分子発現動物は、前記（ｉ）及び（ｉｉ）の遺伝子改変を導入する前の動物と同様に、通常の飼育方法で飼育することができる。
【００５７】
当該細胞死誘導分子発現動物は、前記（ｉ）の遺伝子改変のみを備える非ヒト動物（以下、「遺伝子改変動物（ｉ）」ということがある。）と、前記（ｉｉ）の遺伝子改変のみを備える非ヒト動物（以下、「遺伝子改変動物（ｉｉ）」ということがある。）を交配することによって得ることもできる。遺伝子改変動物（ｉ）と遺伝子改変動物（ｉｉ）の表現型はいずれも、これらの遺伝子改変を導入する前の動物の表現型とほぼ同じであり、これらの遺伝子改変動物も、前記（ｉ）及び（ｉｉ）の遺伝子改変を導入する前の動物と同様に、通常の飼育方法で飼育することができる。
【００５８】
前記（ｉ）及び（ｉｉ）の遺伝子改変が導入された細胞死誘導分子発現動物に、刺激物質を投与することにより、ＲＡＮＫＬ発現細胞欠損動物が作製される。刺激物質の投与は、静脈注射等の一般的にマウスやラットのような実験動物に投与する際に使用される方法で行うことができる。
【００５９】
前記（ｉ）及び（ｉｉ）の遺伝子改変が導入された細胞死誘導分子発現動物やこれを刺激物質で刺激して得られるＲＡＮＫＬ発現細胞欠損動物の動物種は、ヒト以外であれば特に限定されるものではなく、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物や、ニワトリ、ウズラ、カモ等の鳥類等が挙げられる。なかでも、実験動物として汎用されていること、及びジフテリア毒素を刺激物質とし、ジフテリア毒素受容体を細胞死誘導分子として用いることができることから、げっ歯類が好ましく、マウス又はラットがより好ましい。
【００６０】
例えば、一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターの制御下でジフテリア毒素受容体が発現するように、２つのｌｏｘＰ配列とジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子とが組み込まれており、かつ、一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、ＲＡＮＫＬ発現細胞で発現する遺伝子のうち、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子以外の遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれているように遺伝子改変されたげっ歯類の遺伝子改変動物に、ジフテリア毒素を投与すると、ＲＡＮＫＬ発現細胞に特異的に細胞死が誘導される。この結果、ＲＡＮＫＬ発現細胞を特異的に欠損させたげっ歯類の遺伝子改変動物を作製できる。ＲＡＮＫＬ発現細胞を特異的に欠損させたげっ歯類の遺伝子改変動物の作製のためにジフテリア毒素を投与されるげっ歯類の遺伝子改変動物としては、一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターの下流に、互いに向きの異なる２つのｌｏｘＰ配列が組み込まれており、かつこれらのｌｏｘＰ配列によって挟まれた領域にジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子が逆位に挿入されており、一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、ＲＡＮＫＬ発現細胞で発現する遺伝子のうち、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子以外の遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれているげっ歯類の遺伝子改変動物が好ましい。
【００６１】
ジフテリア毒素投与によりＲＡＮＫＬ発現細胞を特異的に欠損させることができる遺伝子改変げっ歯類は、一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターの下流に、互いに向きの異なる２つのｌｏｘＰ配列が組み込まれており、かつこれらのｌｏｘＰ配列によって挟まれた領域にジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子が逆位に挿入されているげっ歯類の遺伝子改変動物（Tnfsf11-iDTRflox遺伝子改変げっ歯類）と、一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、ＲＡＮＫＬ発現細胞で発現する遺伝子のうち、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子以外の遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれているげっ歯類の遺伝子改変動物と、を交配させることによって得ることができる。
【００６２】
一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、リコンビナーゼＣｒｅ存在下でのみ、ＲＡＮＫＬ発現細胞で発現する遺伝子のうち、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子以外の遺伝子のプロモーターの制御下でジフテリア毒素受容体が発現するように、２つのｌｏｘＰ配列とジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子とが組み込まれており、かつ、一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれているように遺伝子改変されたげっ歯類の遺伝子改変動物に、ジフテリア毒素を投与することによっても、ＲＡＮＫＬ発現細胞を特異的に欠損させたげっ歯類の遺伝子改変動物を作製できる。ＲＡＮＫＬ発現細胞を特異的に欠損させたげっ歯類の遺伝子改変動物の作製のためにジフテリア毒素を投与されるげっ歯類の遺伝子改変動物としては、一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、ＲＡＮＫＬ発現細胞で発現する遺伝子のうち、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子以外の遺伝子のプロモーターの下流に、互いに向きの異なる２つのｌｏｘＰ配列が組み込まれており、かつこれらのｌｏｘＰ配列によって挟まれた領域にジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子が逆位に挿入されており、一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれているげっ歯類の遺伝子改変動物が好ましい。
【００６３】
ジフテリア毒素投与によりＲＡＮＫＬ発現細胞を特異的に欠損させることができる遺伝子改変げっ歯類は、一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、ＲＡＮＫＬ発現細胞で発現する遺伝子のうち、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子以外の遺伝子のプロモーターの下流に、互いに向きの異なる２つのｌｏｘＰ配列が組み込まれており、かつこれらのｌｏｘＰ配列によって挟まれた領域にジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子が逆位に挿入されているげっ歯類の遺伝子改変動物と、一対の相同染色体のうちの１本のみにおいて、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるようにリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれているげっ歯類の遺伝子改変動物（Tnfsf11-Cre遺伝子改変げっ歯類）と、を交配させることによって得ることができる。
【実施例】
【００６４】
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
なお、以降の動物実験は、北海道大学の動物実験倫理委員会の承認のもと、北海道大学動物実験に関する規定に従い行った。
【００６５】
［実施例１］
定常的にＲＡＮＫＬ発現細胞が可視化されている遺伝子改変マウスを作製した。
【００６６】
＜Tnfsf11-Creマウスの作製＞
リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子の下流に赤色蛍光タンパク質ＫｕＯ（Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ）遺伝子をＰ２Ａ配列（２Ａペプチドをコードする塩基配列）を介して連結させ、かつＫｕＯ遺伝子の下流にｐｏｌｙＡ配列を設けた塩基配列（Cre-P2A-KuO-polyAコード配列）からなるＤＮＡ断片を、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子の開始メチオニンにノックインしたTnfsf11-Creマウスを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集技術により作成した。配列番号１からなる塩基配列（5'-CCCGAACTCCGGGCGCCGCGCCATGCGCCGGGCCAGCCGAGACTACGGC-3'）を、ＣＲＩＳＰＲ標的配列とした。配列番号１中、１６〜１８番目の領域がＰＡＭであり、１９〜３８番目の領域がｓｇＲＮＡであり、２１番目と２２番目の塩基の間が切断部位である。
【００６７】
まず、マウスのＴｎｆｓｆ１１遺伝子（アクセッション番号：ＮＭ＿０１１６１３．３）のエキソン１を含む９９８ｂｐの断片を増幅するプライマーを用いたＰＣＲにより、マウス細菌性人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーＰＲＣＩ２３（Thermofischer scientific社製）をスクリーニングし、制限酵素マッピングによる結果から、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子座を全て含むクローンRP23-189L24を同定した。以降はこのクローンを、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子座のゲノムＤＮＡの供給源として使用した。
【００６８】
相同組換えに使用したターゲティングベクターは、上流から、５’相同性アーム（ＢｏｘＡと命名した）、Cre-P2A-KuO断片、ＳＶ４０ポリＡシグナル、及び３’相同性アーム（ＢｏｘＢと命名した）から構成されたＤＮＡ断片を、ｐ０６Ａ５シャトルベクターにクローン化したものを用いた。ＢｏｘＡは、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のエキソン１のＡＴＧ翻訳開始部位のすぐ５’側に位置する９９８ｂｐの断片からなり、ＢＡＣクローンRP23-189L24からのＰＣＲによってその３’末端にＡｓｃＩ部位を有するように増幅された。ＫｕＯ配列は、ヒト化ＫｕＯ（ｐｈＫＯ１−Ｓ１）ベクター（AM-V0044、MBL社製）からクローン化された。ストップコドンとｐｏｌｙＡ配列を含むＣｒｅ配列は、Cre-IRES-EGFP-polyA p06A5シャトルベクター（パスツール研究所のLucie Peduto博士から供与）からクローン化された。Cre-P2A-KuO-polyAコード配列を、ＡｓｃＩ部位を介してＢｏｘＡに融合させ、ＰｍｅＩ部位を介してＢｏｘＢに融合させた。ＢｏｘＢは、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のエキソン１のＡＴＧ翻訳開始部位のすぐ３’側に位置する１０１０ｂｐの断片からなり、ＢＡＣクローンRP23-189L24からのＰＣＲによって増幅された。
【００６９】
環状のターゲティングベクター（終濃度１０ｎｇ／μＬ）と、Ｃａｓ９タンパク質（New England Biolabs社製、終濃度３０ｎｇ／μＬ）と、ｓｇＲＮＡ（ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（いずれも、FASMAC社製、終濃度０．６１ｐｍｏｌ／μＬ）との混合物を、ＢＤＦ１マウスの前核期の卵の核にマイクロインジェクションし、この卵を偽妊娠雌性ＩＣＲマウスの卵管に移植した。この結果、生まれた子供101匹のうちの１匹が、正確に、標的のＴｎｆｓｆ１１遺伝子座を有していた。最初のスクリーニングは、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子座の断片を増幅するＰＣＲによって行った。Ｃｒｅ組換え用断片が正しく挿入されていることも、ＤＮＡ配列によって確認された。Ｃｒｅ組換え用断片が正しく挿入されていることが確認されたマウス（Tnfsf11-Creマウス）及びこのマウスから得られたマウスの遺伝子型を、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のエキソン１の周辺をＰＣＲして確認した。得られたTnfsf11-Creマウスを、C57/BL6Jマウスに６回以上戻し交配した。
【００７０】
＜Tnfsf11-Cre;Rosa26-tdTomatoマウスの作製＞  
得られたTnfsf11-Creマウスを、Rosa26-tdTomatoマウスと交配し、蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏが発現している後代個体（Tnfsf11-Cre;Rosa26-tdTomatoマウス）を得た。なお、Rosa26-tdTomatoマウスは、Ｒｏｓａ２６遺伝子のプロモーターの下流に、互いに向きの同じ２つのｌｏｘＰ配列に挟まれたストップコドンがあり、その下流に蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子が挿入されている。Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子のプロモーターの下流にＣｒｅが導入された遺伝子改変と、Ｒｏｓａ２６遺伝子のプロモーターの下流に蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子が導入された遺伝子改変の両方を含む後代個体では、ｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光を指標として、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子が発現する細胞を識別することができる。
【００７１】
得られたTnfsf11-Cre;Rosa26-tdTomatoマウスの胎齢１３．５日から１６．５日（Ｅ１３．５〜Ｅ１６．５）の胎児の大腿骨骨原基を採取し、ＤＡＰＩを用いて染色を行った。結果を図１に示す。この結果、ＲＡＮＫＬ発現細胞は最初にＥ１４．５の軟骨膜に出現し、時間経過とともに細胞数を増やしながら骨原基内へ侵入することが確認された。
【００７２】
［実施例２］
Ｄｏｘ濃度を調節することによりＲＡＮＫＬ発現細胞の可視化が制御されている遺伝子改変マウスを作製した。
【００７３】
＜Tnfsf11-tTAマウスの作製＞
ｔＴＡ遺伝子のコーディング領域（ｔＴＡ配列）からなるＤＮＡ断片（tTA断片）を、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子の開始メチオニンにノックインしたTnfsf11-Creマウスを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集技術により作成した。ｔＴＡ配列は、ｔＴＡ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター（ＩＤ１８７８３：Ａｄｄｇｅｎｅより購入）からクローン化された。具体的には、Cre-P2A-KuO断片に代えてｔＴＡ断片を用い、配列番号１からなる塩基配列をＣＲＩＳＰＲ標的配列として、実施例１におけるTnfsf11-Creマウスの作製と同様にして作製した。
【００７４】
＜Tnfsf11-tTA;LC-1;Rosa26-tdTomatoマウスの作製＞
まず、LC-1マウスとRosa26-tdTomatoマウスとを交配し、ＴＲＥ−Ｃｒｅ遺伝子改変とｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子改変の両方を備える後代個体（LC-1;Rosa26-tdTomatoマウス）を得た。
次いで、LC-1;Rosa26-tdTomatoマウスとTnfsf11-tTAマウスとを交配し、Ｔｎｆｓｆ１１−ｔＴＡ遺伝子改変とＴＲＥ−Ｃｒｅ遺伝子改変とｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子改変の全てを備える後代個体（Tnfsf11-tTA;LC-1;Rosa26-tdTomatoマウス）を得た。
【００７５】
Tnfsf11-tTA;LC-1;Rosa26-tdTomatoマウスでは、Ｔｅｔ系化合物非存在下で、ＲＡＮＫＬ発現細胞内ではｔＴＡが発現し、このｔＴＡによりＣｒｅの発現が誘導された結果、ｔｄＴｏｍａｔｏが発現する。つまり、Tnfsf11-tTA;LC-1;Rosa26-tdTomatoマウスでは、Ｔｅｔ系化合物を投与していない状態ではｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光を指標としてＲＡＮＫＬ発現細胞を識別することができ、細胞内濃度が充分に高くなるようにＴｅｔ系化合物を投与すると、ｔｄＴｏｍａｔｏの発現が抑制され、ＲＡＮＫＬ発現細胞は視認できなくなる。すなわち、Tnfsf11-tTA;LC-1;Rosa26-tdTomatoマウスでは、Ｔｅｔ系化合物濃度を調節することにより、ＲＡＮＫＬ発現履歴を持つ細胞の任意時期における標識と生体内における追跡が可能になる。
【００７６】
得られたTnfsf11-tTA;LC-1;Rosa26-tdTomatoマウスを胎児期（胎齢１５日まで）はＴｅｔ系化合物を投与せずに飼育し、出生から出生後２日目（日齢２日）までをＤｏｘを経口投与して飼育した。Ｄｏｘの経口投与は、最終Ｄｏｘ濃度が１ｍｇ/ｍＬの飲料水を自由摂取させることにより行った。胎齢１５日（Ｅ１５）と日齢２日（Ｐ２）のマウスの大腿骨を採取し、ＤＡＰＩ染色した。
【００７７】
Tnfsf11-tTA;LC-1;Rosa26-tdTomatoマウスの大腿骨の蛍光画像を図２に示す。図２のうち、Ｐ２マウスで確認されているｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞は、Ｅ１５マウスで確認されているｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞に由来する。Ｅ１５マウスでは、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞は大部分が骨膜細胞であったのに対して、Ｐ２マウスでは、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞は骨膜細胞に加えて、骨髄ストロー真細胞、骨芽細胞、骨細胞にも存在していた。これらの結果から、胎仔ＲＡＮＫＬ発現細胞は、複数の間葉系細胞系列へ分化することが確認された。
【００７８】
Tnfsf11-tTA;LC-1;Rosa26-tdTomatoマウスを、胎児期から日齢２８日までＴｅｔ系化合物を投与せずに飼育したマウスと、胎児期から胎齢１２日までＴｅｔ系化合物を投与せずに飼育して以降は日齢２８日までＤｏｘを経口投与して飼育したマウスと、胎児期はＤｏｘを経口投与して飼育し、出生から日齢２８日まではＴｅｔ系化合物を投与せずに飼育したマウスについて、鼠径部リンパ節を採取し、ｔｄＴｏｍａｔｏの発現を観察した。なお、胎児期及び乳児期におけるＤＯＸの経口摂取は、母マウスに最終Ｄｏｘ濃度が１ｍｇ/ｍＬの飲料水を自由摂取させることにより行い、幼児期以降におけるＤＯＸの経口摂取は、１ｍｇ/ｍＬの飲料水を自由摂取させることにより行った。
【００７９】
Tnfsf11-tTA;LC-1;Rosa26-tdTomatoマウスの鼠径部リンパ節の蛍光画像及びＤｏｘ投与スケジュールを図３に示す。図３中、上段は、日齢２８日のマウスリンパ節でｔｄＴｏｍａｔｏにより標識されたＲＡＮＫＬ発現履歴を持つ間葉系細胞の蛍光画像である。中段は、受精直後から胎齢１２日まで標識され、日齢２８日のリンパ節でｔｄＴｏｍａｔｏにより標識されたＲＡＮＫＬ発現履歴を持つ細胞の蛍光画像である。下段は、出生直後より日齢２８日までｔｄＴｏｍａｔｏにより標識されたＲＡＮＫＬ発現履歴を持つ細胞の蛍光画像である。胎齢１２日以降、出生直後までにＲＡＮＫＬ発現履歴を持つ間葉系細胞が、リンパ節ストローマ細胞に分化することがわかった。
【００８０】
［実施例３］
ＲＡＮＫＬ発現細胞を欠損したマウスを作製した。
【００８１】
＜Tnfsf11-iDTRfloxマウスの作製＞
互いに向きの異なる２つのｌｏｘＰ配列（内向きｌｏｘＰ配列）によって挟まれたリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子（Vloxp-Cre-Vloxpコード配列）からなるＤＮＡ断片（Vloxp-Cre-Vloxp断片）を、Ｔｎｆｓｆ１１遺伝子の開始メチオニンにノックインしたTnfsf11-iDTRfloxマウスを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集技術により作成した。具体的には、Cre-P2A-KuO断片に代えてVloxp-Cre-Vloxp断片を用い、配列番号１からなる塩基配列をＣＲＩＳＰＲ標的配列として、実施例１におけるTnfsf11-Creマウスの作製と同様にして作製した。
【００８２】
＜Prx1-Creマウス＞
リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子をコードする塩基配列（ストップコドンとｐｏｌｙＡ配列を含むＣｒｅ配列）からなるＤＮＡ断片を、Ｐｒｘ１遺伝子のプロモーターに発現制御されるようにノックインされたPrx1-Creマウスは、米国のJackson研究所（https://www.jax.org/）から購入したものを用いた。Prx1-Creマウスは、四肢間葉系に特異的にＣｒｅが発現するマウスである。
【００８３】
＜Prx1-Cre;Tnfsf11-iDTRfloxマウスの作製＞
得られたTnfsf11-iDTRfloxマウスとジャクソン研究所より導入したPrx1-Creマウスとを交配し、Prx1-Cre遺伝子と、Tnfsf11-iDTRflox遺伝子導入改変の両方を備える後代個体を得、これをPrx1-Cre;Tnfsf11-iDTRfloxマウスとした。当該マウスは、Ｐｒｘ１遺伝子とＴｎｆｓｆ１１遺伝子の両方が発現している細胞（すなわち、ＲＡＮＫＬ発現細胞）において、特異的にＤＴＲを発現している。
【００８４】
得られたPrx1-Cre;Tnfsf11-iDTRfloxマウスに対して、胎齢１３．５日と胎齢１４．５日に、エンドトキシンフリーのＰＢＳ（リン酸生理食塩水）で希釈したジフテリア毒素（ＤＴｘ：Merck社製）を投与（２０ｍｇ／ｋｇ体重／日）した。ＤＴｘは、妊娠母親マウスに腹腔内投与した。その後、胎齢１６．５日に骨組織を採取し、ＴＲＡＰ染色及びｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色を行った。また、胎齢１３．５日と胎齢１４．５日に同様にしてＤＴｘ処理したPrx1-Cre;Tnfsf11-iDTRfloxマウスに対して、出生後１日目（日齢１日）に骨髄腔組織を採取し、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ４５．２抗体及びＤＡＰＩを用いて免疫染色を行った。対照としてＤＴｘ投与をしなかったPrx1-Cre;Tnfsf11-iDTRfloxマウスについても骨組織及び骨髄腔組織を採取し、染色処理を行った。ＣＤ３１は、リンパ管内皮細胞マーカーであり、ＣＤ４５．２は、成熟リンパ球や単球マーカーである。
【００８５】
骨組織に対する染色結果を図４に示す。図４中、「Control」がＤＴｘ投与をしなかったPrx1-Cre;Tnfsf11-iDTRfloxマウス（コントロールマウス）の画像であり、「ablated」がＤＴｘ投与したPrx1-Cre;Tnfsf11-iDTRfloxマウスの画像である。ＴＲＡＰ染色では破骨細胞が赤く染色され、ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色ではカルシウム沈着が黒く染色される。図４に示すように、ＤＴｘ投与によりＲＡＮＫＬ発現細胞を除去したマウス（図中、「ablated」）では、コントロールマウスに比べて、破骨細胞が少なかった。
【００８６】
また、骨髄腔組織に対する染色結果を図５に示す。図５中、白破線で囲われた領域が骨髄腔組織である。これらの骨髄腔組織の染色画像から、画像解析により、抗ＣＤ３１抗体で染色された領域（ＣＤ３１陽性領域）と抗ＣＤ４５．２抗体で染色された領域（ＣＤ４５．２陽性領域）を測定し、骨髄領域に対するＣＤ３１陽性領域の割合及び骨髄領域に対するＣＤ４５．２陽性領域の割合を求めた。比較対象として、ＲＡＮＫＬ遺伝子ノックアウトマウスについても同様に割合を求めた。結果を図６に示す。
【００８７】
図５及び６中、「Control」はＤＴｘ投与をしなかったPrx1-Cre;Tnfsf11-iDTRfloxマウスの結果であり、「fOci ablated」がＤＴｘ投与したPrx1-Cre;Tnfsf11-iDTRfloxマウスの結果であり、「RANKL KO」がＲＡＮＫＬ遺伝子ノックアウトマウスの結果である。図６（Ａ）に示すように、ＣＤ３１陽性領域はいずれのマウスでも特に差はなかったが、図６（Ｂ）に示すように、ＣＤ４５．２陽性領域は、ＤＴｘ投与によりＲＡＮＫＬ発現細胞を除去したマウスやＲＡＮＫＬ遺伝子ノックアウトマウスは、コントロールマウスに比べて少なくなっており、骨髄腔の形成不全が確認された。これらの結果は、胎児においてＲＡＮＫＬが、破骨細胞を誘導することにより骨髄腔の形成に寄与していることを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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