(57)【要約】      （修正有）【課題】液漏れを起こすデバイス個体が減少し、歩留まりが上昇する膜組み込み型マイクロ流体デバイスの新規製造方法を提供する。【解決手段】マイクロ流路パターンを有するシリコーンゴムの基板に、切込みを入れる工程と、切込みの切込み口が開かれるように基板を曲げた状態に保持しながら、基板にプラズマ処理またはコロナ放電処理を施す工程と、切込みに多孔膜を挟み込んで切込み面を圧着させる工程とを含む、膜組み込みマイクロ流体デバイスの製造方法。【選択図】図１
2020028962.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流路パターンを有するシリコーンゴムの基板に、切込みを入れる工程と、
前記切込みの切込み口が開かれるように前記基板を曲げた状態に保持しながら、前記基板にプラズマ処理またはコロナ放電処理を施す工程と、
前記切込みに多孔膜を挟み込んで切込み面を圧着させる工程と
を含む、膜組み込みマイクロ流体デバイスの製造方法。
【請求項２】
前記シリコーンゴムはポリジメチルシロキサンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記圧着の際に、前記切込み内に追加のシリコーンまたはそのプレポリマーが含まれない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記多孔膜の膜面のみが流路内空間に晒され膜縁は流路内空間に晒されないような配置で、前記切込みに前記多孔膜が挟み込まれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記切込みを入れる工程の前に、前記マイクロ流路パターンを有するシリコーンゴムの基板を作製する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記マイクロ流路パターンを有するシリコーンゴムの基板を作製する工程は、２つのシリコーンゴム基板材を重ね合わせて、加熱することにより接合することを含み、前記２つのシリコーンゴム基板材のうちの少なくとも一方が、表面に凹に成型された流路を有しており、前記流路を有する表面が他方のシリコーンゴム基板材の表面と対面してマイクロ流路パターンを形成する、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマイクロ流体デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤を血流から標的組織へと送達するために、ナノ粒子等を用いるドラッグデリバリーシステムが広く利用されている。効果的なドラッグデリバリーシステムの開発のためには、実験的に観察される薬剤の血管透過性と、各種物理的パラメータとの関係を解明することが重要となる。
【０００３】
ナノ粒子はインビボで血管壁の小孔を透過できるが、血管壁の小孔の大きさおよび形状ならびに血管外間質の組成は不均一でありかつ正確に把握することが困難であるため、従来からの動物試験では、透過に関して各種物理的パラメータ（例えば小孔のサイズとナノ粒子のサイズ）の影響や相互作用を正確に分析することができなかった。動物試験には倫理的な問題や効率性の問題も付随し得る。
【０００４】
一方、例えばセルカルチャーインサートを用いる、培養細胞に基づくインビトロアッセイは、少なくとも倫理的な問題は回避できるし、定義された（疑似）間質組成の下で試験を行えるという利点がある。しかしながら、そのようなアッセイは、現実の血管からかけ離れた大きなサイズの器具で実験を行うことになること、血流およびそれに伴う流圧の存在も再現できないこと、インサート上で培養細胞が均一にならない場合にデータの信頼性が失われること（例えば、インサートの外縁付近では細胞密度が疎になる傾向がある）といった欠点もある。また、培養細胞に基づくインビトロアッセイでも、各種物理的パラメータの影響や相互作用を正確に分析することができないという問題は本質的に残存する。
【０００５】
本発明者らは、シリコーンゴムの基板に人工の多孔膜を組み込んだマイクロ流体デバイスを開発し、この多孔膜の微小孔を通じたナノ粒子の透過挙動を測定することにより、動物実験や細胞実験で観察され得る透過性を具体的な物理的パラメータと関連付けられることを報告し、そのような手法によってナノ医薬を合理的に設計することを提案してきた（非特許文献１）。
【０００６】
多孔膜を組み込んだマイクロ流体デバイスは、膜上で血管内皮細胞の層を培養して疑似的な血管壁を構築して細胞層の物質透過性を評価することに用いることができる。あるいは、多孔膜そのものを血管壁とみなして透過性評価に応用することも可能である（非特許文献１）。このような膜組み込みマイクロ流体デバイスは、現実の血管と同等のサイズおよび液流を模倣しながら、透過性を精密評価することを可能にした。
【０００７】
初期の膜組み込みデバイスは、膜を観察面に対して平行に組み込むものであった（例えば非特許文献１、２）。従って、試料（粒子）は透過の際に観察面に対して垂直に移動することとなっていた。すなわち、そのようなデバイスにおいて透過とは、顕微鏡レンズに向かう方向に、または顕微鏡レンズから離れる方向に、粒子が膜を横切ることを意味し、顕微観察時に透過量を定量評価しにくいという問題があった。発明者らは、膜を観察面に対して垂直に組み込む手法を開発してその問題を解決し（非特許文献３）、疑似血中環境下でのナノ粒子の血管漏出性評価に応用してきた（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Anal. Sci. 2016, 32, 1307-1314
【非特許文献２】Anal. Chem. 2001, 73, 5207-5213
【非特許文献３】20th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, October 9-13, 2016, Dublin, Ireland, pp. 1023-1024
【非特許文献４】21st International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, October 22-26, 2017, Savannah, Georgia, USA, pp. 1211-1212
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したマイクロ流体デバイスは、マイクロ流路パターンを有するシリコーンゴムの基板を主体とする。この基板は、シリコーンゴムを形成する反応のための原料と重合開始剤とを混合し、この混合物を鋳型に流し込んで加熱することを含む方法によって作製することができる。膜が観察面に対して垂直に組み込まれたタイプのデバイス（以下、「垂直膜組み込み型デバイス」という）は、従来は、上記加熱を行っていったん硬化させた後の基板に、切込みを入れ、その切込みに多孔膜を挟み込んだのちに再度加熱することによって切込み面を接合させて製造していた（非特許文献３）。
【００１０】
本発明者は、上記のように基板に切込みを入れた後に、切込み口が開かれるように基板を曲げた状態に保持しながら基板にプラズマ処理を施し、その後多孔膜を挟み込んで切込み面を圧着させるという工程により膜組み込みデバイスを製造すると、液漏れを起こすデバイス個体が減少し歩留りが上昇することを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は以下の実施形態を含む。
［１］
マイクロ流路パターンを有するシリコーンゴムの基板に、切込みを入れる工程と、
前記切込みの切込み口が開かれるように前記基板を曲げた状態に保持しながら、前記基板にプラズマ処理またはコロナ放電処理を施す工程と、
前記切込みに多孔膜を挟み込んで切込み面を圧着させる工程と
を含む、膜組み込みマイクロ流体デバイスの製造方法。
［２］
前記シリコーンゴムはポリジメチルシロキサンを含む、［１］に記載の方法。
［３］
前記圧着の際に、前記切込み内に追加のシリコーンまたはそのプレポリマーが含まれない、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
前記多孔膜の膜面のみが流路内空間に晒され膜縁は流路内空間に晒されないような配置で、前記切込みに前記多孔膜が挟み込まれる、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
前記切込みを入れる工程の前に、前記マイクロ流路パターンを有するシリコーンゴムの基板を作製する工程をさらに含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
前記マイクロ流路パターンを有するシリコーンゴムの基板を作製する工程は、２つのシリコーンゴム基板材を重ね合わせて、加熱することにより接合することを含み、前記２つのシリコーンゴム基板材のうちの少なくとも一方が、表面に凹に成型された流路を有しており、前記流路を有する表面が他方のシリコーンゴム基板材の表面と対面してマイクロ流路パターンを形成する、［５］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の実施形態により、膜組み込みマイクロ流体デバイス、特に垂直膜組み込み型デバイスの製造に関して、液漏れを起こすデバイス個体を減少させて歩留りを向上させることができる。従来の製造方法も、接触されたシロキサン骨格同士を架橋するという点では本質的に同じであったため、本発明の実施形態のようにプラズマ処理により架橋を行うことによって液漏れが減少することは必ずしも予測できなかった。また、非特許文献２は、それぞれ流路を有する２つのシリコーン基板材を上下に重ね合わせ、その際に間に多孔膜をサンドイッチすることにより上下の流路を多孔膜で隔てたマイクロ流路デバイスを記載しており、上下の基板材の接合のために酸素プラズマ処理を使用したが、液漏れが起こる問題があったことを記載している。非特許文献２は、基板材の酸素プラズマ処理後に、多孔膜の縁にシリコーンのプレポリマーを加えてから上記のようなサンドイッチを形成し、６５℃で１時間加熱することにより、液漏れの問題を解決したことを報告している。このような非特許文献２の教示に鑑みると、本発明の実施形態においてプレポリマーの追加なしで液漏れの減少が得られたことはさらに予測外であった。
【００１３】
また、本発明の実施形態により、膜組み込みマイクロ流体デバイス、特に垂直膜組み込み型デバイスの製造を、従来と比べて著しく短時間で行うことができ、エネルギー消費およびコストも抑えることができる。さらに、本発明の実施形態により、例えばマトリゲル被覆多孔膜のような、熱により変性または破壊されるおそれがある成分を含む多孔膜もデバイスに組み込むことができるようになる。例えば、細胞培養に用いられる様々な足場分子で膜をコートし、そのままデバイスに組み込める。膜組み込みに加熱を要していた従来法では、コーティングの実施は膜を組み込んだ後にせざるを得なかったため、流路内面の全域にそのような足場分子を分布させることになっていたが、本法では膜面のみに足場分子を局在させることができる。複数の膜を組み込むことにより、異なる種類の足場分子を同一流路内の任意の位置に配することも可能となる。このように、膜組み込みマイクロ流体デバイスの設計の自由度が格段に向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、マイクロ流路パターンを有するシリコーンゴムの基板にカミソリで切込みを入れ（ａ）、切込み口が開かれるように基板を曲げた状態に保持し（ｂ）、基板にプラズマ処理を施し（ｃ）、切込みに多孔膜を挟み込み（ｄ）、多孔膜を挟んだシリコーンゴム基質同士を圧着させて（ｅ）垂直膜組み込み型マイクロ流体デバイスを得る、一実施形態における製造工程を示す。
【図２】図２（ａ）は、一実施形態の方法により製造された垂直膜組み込み型マイクロ流体デバイスの概観（上）、および多孔膜組み込み部の拡大図（下）を示す。図２（ｂ）は、下側流路にゲニピン架橋コラーゲンゲル（黒く見えている）を充填し上側流路に蛍光標識ナノ粒子（白く見えている）の懸濁液を流した実験の様子を示す。図２（ｃ）は、（ｂ）の実験において多孔膜を透過した蛍光標識ナノ粒子の累積量を定量化した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示において、「上」、「下」、「第１」、「第２」といった用語は、複数ある要素または工程を区別する便宜のために用いられており、必ずしも絶対的な位置関係や順序を特定する意図のものではない。例えば、同じ水平面上に位置する２つの流路を上側流路および下側流路と呼ぶことがあり、その場合、上側流路と下側流路という呼称を入れ替えたとしても構造上何ら変わりないということがあり得る。
【００１６】
本開示は、一実施形態において、マイクロ流路パターンを有するシリコーンゴムの基板に切込みを入れる工程と、その切込みの切込み口が開かれるように上記基板を曲げた状態に保持しながら、基板にプラズマ処理を施す工程と、切込みに多孔膜を挟み込んで切込み面を圧着させる工程とを含む、膜組み込みマイクロ流体デバイスの製造方法を提供する。本開示におけるマイクロ流体デバイスは、シリコーンゴムをデバイス本体すなわち基板とするものである。本開示におけるシリコーンゴムは、典型的にはポリジメチルシロキサンを含むものであり、ポリジメチルシロキサンからなるものであってもよい。少なくとも一部のメチル基が例えばビニル基またはフェニル基のような他の置換基に置き換えられたものであってもよい。プラズマ処理またはコロナ放電処理により、これらの炭化水素基が除去されてシラノール基が形成され、それらシラノール基同士が架橋することによりシリコーンゴム基質同士の接合が起こると考えられる。
【００１７】
基板は、通常は略平板状の外形を有している。平板は縦２５ｍｍ以内×横７５ｍｍ以内の大きさであることが好ましく、縦２０ｍｍ以内×横３０ｍｍ以内の大きさであることがより好ましい。「縦」「横」という用語は、平板を長方形平板に限定する意図ではない。平板の厚さは、２０ｍｍ以内であることが好ましく、１０ｍｍ以内であることがより好ましい。これらの寸法とすることによって、顕微鏡による観察が行いやすくなる。
【００１８】
シリコーンゴムの基板に切込みを入れることは、典型的には、鋭利な刃をシリコーンゴムの基質の中途まで挿入することによって達成される（図１ａ）。切込みとは、刃が貫通してシリコーンゴム基質が完全に２つのブロックに切断されるのではなく、刃が貫通せず切られていない部分が残ることによって刃の両側の基質ブロックがつながっていることを意味する。この目的のために使用され得る切込み手段としては、カミソリが好適であるが、これに限定されない。
【００１９】
切込み面は通常、図１ａ右に示すように、基板の表面に対して垂直すなわち９０°であるが、基板表面に対する切込み面の角度を例えば４５°〜９０°の範囲で変動させてもよい。切込み面の角度は、組み込まれた後の多孔膜の角度に相当することが理解される。基板内の流路が略水平面方向に展開し、多孔膜がこのように略垂直に基板に組み込まれて流路を隔てていれば、顕微鏡のレンズを垂直方向すなわち基板の厚さ方向に向けることにより、多孔膜を透過する粒子をリアルタイムで観察することが可能になる。
【００２０】
マイクロ流体デバイスの流路とは、当業者に通常理解されるように、外部から（通常はポートを通じて）マイクロリットル単位の量の液体を流し入れて満たすことができる、基板内部に形成された空間である。流路中の液は流れ続けさせることもできるし、滞留させることもできる。液体ではなくゲル状の物質で流路を満たすこともできる。
【００２１】
切込みを入れられた基板は、続いて、その切込み口が開かれるように曲げた状態に保持される（図１ｂ）。この状態は例えば、基板の全長より短い間隔で固定された２つの突起物（例えばアクリル棒）を用意し、基板の一方の端を一方の突起に留め、基板の他方の端を他方の突起に留めることにより、切込み口側を凸面として基板を反らせて保持することによって、達成することができる。図１ｂ右においては、試料台およびそれに固定された２つの突起物を黒色で示している。基板はこの状態のまま、プラズマ処理またはコロナ放電処理に付される（図１ｃ）。
【００２２】
当業者に知られるように、プラズマ処理には、密閉された試料チャンバー内を減圧させてから実施する真空（低圧）プラズマ処理と、試料チャンバー内を大気圧のままにして実施する大気圧プラズマ処理とがあり、本実施形態においてはどちらも使用可能であるが、真空プラズマ処理が特に好ましい。プラズマのソースガスとしては、空気、窒素、ヘリウム、アルゴン、およびこれらのいずれかの混合物が挙げられるが、これに限定されない。空気は特に好ましいソースガスである。
【００２３】
コロナ放電処理は、平行平板型の電極が通常用いられるプラズマ処理とは異なり、尖った電極から大気中で放電を起こさせて試料に照射して表面改質を行うものである。コロナ放電処理もプラズマの発生を利用するものであり、プラズマ処理の代わりに使用することができる。プラズマ処理またはコロナ放電処理を行う時間は、通常は１０秒〜５分間であり、好ましくは２０秒〜１分間である。
【００２４】
好ましいプラズマ処理条件の一例は、空気をソースガスとして、圧力設定０．５ｔｏｒｒ、ガス流量３０ｓｃｃｍ、電力８０Ｗ、周波数５０ｋＨｚで３０秒間行うものである。当業者は通常の知識に基づいてこれらのパラメータを調節することができる。例えば、０．１〜１００ｔｏｒｒ、より好ましくは０．３〜１０ｔｏｒｒの圧力設定、１〜１００ｓｃｃｍ、より好ましくは５〜５０ｓｃｃｍのガス流量、および／または１０〜３００Ｗ、より好ましくは５０〜１００Ｗの電力の範囲内で適宜調節してもよい。
【００２５】
プラズマ処理またはコロナ放電処理の後に、切込みに多孔膜を挟み込んで（図１ｄ）切込み面同士を圧着させる（図１ｅ）。この工程は、プラズマ処理またはコロナ放電処理の後２時間以内に行うことが好ましく、より好ましくは１時間以内、さらに好ましくは２０分以内、特に好ましくは５分以内に行われる。圧着は、切込み部分に隣接するシリコーンゴム基質自体の弾性によって自ずと達成され得るが、例えば指で圧力を加えてもよい。圧着は通常は１分以内、例えば３０秒以内で完了し得る。
【００２６】
多孔膜自体は、受動的に挟み込まれるものであり、シリコーンゴムと積極的に架橋を形成してもしなくてもよいので、多孔膜の素材は本質的に限定されない。多孔膜は、典型的には合成樹脂で構成される。合成樹脂の例としては、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリロニトリル、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリアミド等、およびそれらの混合物が挙げられるが、これに限定されない。多孔膜がポリエステルまたはポリカーボネートを含む、あるいは多孔膜がポリエステルまたはポリカーボネートからなることが特に好ましい。ポリエステルは好ましくはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）である。
【００２７】
本開示において、液漏れとは、デバイスの流路内に入れられた液体が流路以外の領域（例えばシリコーンゴム基質と多孔膜との境界面）へと漏出することを意味する。液が多孔膜を透過して１つの流路から別の流路に移ることは液漏れに含まれない。
【００２８】
上述したように、加熱により切込み面を接合させる従来の製造方法も、接触されたシロキサン骨格同士を架橋するという点では本質的に同じであったため、本実施形態のようにプラズマ処理により架橋を行うことによって液漏れが減少して歩留りが上昇することは必ずしも予測できなかった。特定の理論に拘束されるわけではないが、切込み口を開いてプラズマ処理またはコロナ放電処理を行う際に、切込み断面だけでなくその近傍の流路内壁もプラズマに晒されて親水性を獲得し、その流路内壁に新たに付与された親水性が、完成品デバイスにおいて流路からの液漏れを起こりにくくする可能性が考えられる。また、２つの基板材の間に膜をサンドイッチするのではなく１つの基板の切込みに膜を挿入する本実施形態では、シリコーンゴム基質の弾性により切込み面が自ら元の状態に修復しようとする作用が働き、結果として液漏れの減少につながる可能性も考えられる。加熱による架橋は時間がかかるものの、プラズマ処理による表面活性化後の架橋は短時間で完了するため、押し開かれていた切込み口が弾性により自ら修復する過程と分子架橋が起こる過程とがうまく同調する可能性が考えられる。
【００２９】
典型的には、多孔膜は、マイクロ流路の少なくとも一部において、１つの空間を２つに隔てるかたちで挿入されることが理解される。また、上述した切込みも、多孔膜のそのような挿入を可能にする位置に入れられることが理解される。デバイスを用いてどのような実験を行うことが意図されているかにもよるが、例えば、比較的太い流路を、より細い２つの流路に隔てるように多孔膜が挿入され得る。あるいは、１つの流路を多孔膜で塞き止めるかたちで多孔膜を挿入して、その流路を通る液が多孔膜を通過することを強制する構成にすることもできる。
【００３０】
多孔膜は、切込みの断面積よりも小さい面積であることが好ましい。多孔膜は、切込みに挟み込まれた際にシリコーンゴムの基板からはみ出ない寸法であることが好ましい。多孔膜は、その外縁が流路内空間に露出しない状態でデバイスに組み込まれることが好ましい。すなわち、多孔膜の膜面のみが流路内空間に晒され、膜縁は流路内空間に晒されないような配置で、多孔膜が切込みに挟み込まれていることが好ましい。
【００３１】
切込みに多孔膜を挟み込んで切込み面を圧着させる際に、切込み内に追加のシリコーンまたはそのプレポリマーを含ませる必要はない。むしろ、切込み内にシリコーンまたはそのプレポリマーを加えないで圧着を行うことが好ましい。圧着の際に切込み内に入っているのは多孔膜のみであることが好ましい。
【００３２】
多孔膜の厚さは、２００μｍ以下であることが好ましい。多孔膜が過度に厚いと、生体組織モデルとしての意義が薄れる可能性がある。多孔膜の厚さは、より好ましくは１００μｍ以下であり、さらに好ましくは５０μｍ以下であり、特に好ましくは２０μｍ以下である。多孔膜の厚さは、特に決まった下限は有さないが、通常は０．５μｍ以上であり、例えば１μｍ以上あるいは５μｍ以上であり得る。
【００３３】
多孔膜の小孔の孔径および孔密度は、ユーザーが意図する実験の目的によって様々であり得、特に限定されない。例えば孔径は０．０５〜１０μｍであり得、０．１〜１μｍが好適である。多種多様な多孔膜が市販されており、それを本実施形態に利用することができる。例えば、市販のセルカルチャーインサートの底部は多孔性であり、これを切り出して得た多孔膜を本実施形態のマイクロ流体デバイスに組み込むことができる。あるいは、トラックエッチング法のような手法を用いて多孔膜を調製してもよい。
【００３４】
シリコーンゴムの基板内部にマイクロ流路パターンを形成する方法は当業者に知られている。例えば、適切な素材で作製された流路鋳型を、必要に応じて型枠と組み合わせて、そこにシリコーンのプレポリマーを流し入れ、シリコーンを鋳型の形状に合わせて硬化させることにより、表面に凹に成型されたマイクロ流路パターンを有する基板材を得ることができる。この基板材の流路側表面を、もう１つの基板材の平坦な表面と対面させて接合すれば、基質表面ではなく基質内部に流路空間を有する基板を得ることができる。この接合は、例えば約１００℃で３０分程度加熱することによって好ましく行うことができるが、接合方法はこれに限定されない。上記鋳型の素材は当業者が通常の知識に基づいて適宜選択することができるが、描画ソフトウェアと組み合わせたレーザー加工技術によりマイクロメートル規模の流路を精密に加工することに適していることからアクリル樹脂が特に好ましい。基板表面から各流路へと穴を貫通させることにより、流路内を充填することや流路内に液流を発生させることを可能にするポートを形成することができる。
【００３５】
したがって、本方法の一実施形態は、上記切込みを入れる工程に先立って、マイクロ流路パターンを有するシリコーンゴムの基板自体を作製する工程をさらに含む。一例においてこの工程は、２つのシリコーンゴム基板材を重ね合わせて、加熱することにより接合することを含み、その２つのシリコーンゴム基板材のうちの少なくとも一方が、表面に凹に成型された流路を有しており、この流路を有する表面が他方のシリコーンゴム基板材の表面と対面してマイクロ流路パターンを形成する。上記接合のための加熱の温度は通常６０℃以上であり、好ましくは６５℃以上であり、より好ましくは９０℃以上であり、例えば１００℃以上である。
【００３６】
本発明の実施形態に係る方法は、切込みに多孔膜を挟み込んで圧着させる時点以降においては、基板および多孔膜を６０℃以上で加熱することを含まないことが好ましい。本発明の実施形態に係る方法は、マイクロ流路パターンを有するシリコーンゴムの基板に切込みを入れる時点以降、基板および多孔膜を６０℃以上で加熱することを一切含まないことがより好ましい。これらの時点以降の工程は、すべて室温で実施されることが好ましい。室温は通常４〜３６℃であり、好ましくは１０〜３０℃である。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例を示して本発明の実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。なお、特に明記されていない限り、実施例における実験操作は室温で行った。
【００３８】
［膜組み込みマイクロ流体デバイスの作製］
鋳型の作製
まず、レーザー加工機（ＨＡＪＩＭＥ、オーレーザー）を用いて、厚さ１ｍｍのアクリル板（クラレックス、日東樹脂工業）を縦７６ｍｍ、横２６ｍｍの長方形に加工した。加工パラメータは、出力１６％、切断速度６ｍｍ／ｓ、切断回数１回に設定した。加工したこの長方形アクリル板を、流路パターンを有さない下基板材の鋳型とした。
【００３９】
次に、厚さ０．２ｍｍのアクリル板（クラレックス、日東樹脂工業）をＨ字流路パターンに加工した。加工パラメータは、出力８％、切断速度６ｍｍ／ｓ、切断回数１回に設定した。Ｈ字の高さは１０ｍｍ、中央の横線の幅は３．０ｍｍ、左右の縦線の幅はそれぞれ０．６ｍｍ、左右の縦線同士の間の距離は４．０ｍｍとした。Ｈ字加工アクリル板のそりをなくすために、それをスライドガラスに挟み、１ｋｇの重りをのせて、卓上型送風乾燥器（ＭＤ−１００、ヨネザワ）中でベイクした（８０℃、１時間）。ベイク後のＨ字加工アクリル板を、アクリル用接着剤（アクリサンデー）とテルモシリンジ（１ｍＬ）を用いて、上述したものと同じ長方形アクリル板（１ｍｍ厚）に貼り付けた。その際には、まずニプロブラント針（２７Ｇ、０２−１６５、ニプロ）を用いて長方形アクリル板に１滴接着剤を垂らし、そこにＨ字をのせて固定した。その後テルモ注射針（２７Ｇ、刃先あり）を用いて、Ｈ字の先端から少量ずつ接着剤を注入し、完全に接着させた。１つの長方形アクリル板に、２つのＨ字アクリル板を並べて貼り付けた（［Ｈ  Ｈ］）。貼り付け後、循環式恒温乾燥機（ＭＯＶ−１０２Ｆ、三洋電機）中でベイクした（６５℃、３０分）。長方形アクリル板にＨ字アクリル板が貼り合わされたこの合板を、流路パターンを有する上基板材の鋳型とした。
【００４０】
基板材の作製
ポリジメチルシロキサンＰＤＭＳ（ＳＩＬＰＯＴ１８４、東レ・ダウコーニング）の主剤と硬化剤を１０：１の重量比でバランストレイ（１−５２３３−０１、アズワン）に入れ、デスペット（６−７６０−０２、アズワン）でよくかき混ぜた。その後真空デシケータ（ＶＳ、アズワン）と真空ポンプ（ＤＡＰ−６Ｄ、ＵＬＶＡＣ）を用いて約２０分間脱泡してプレポリマーを調製した。型枠と同じ寸法の２ｍｍ厚アクリル板を用意して、その上に、ベンコット（適当な大きさに切った不織布）、上記で作製された鋳型、および型枠をこの順で重ね、四方をクリップでとめた。上基板材の鋳型には厚さ２ｍｍの型枠、下基板材の鋳型には厚さ４ｍｍの型枠を重ねた。
【００４１】
上基板材の鋳型に対しては約３．２ｇのＰＤＭＳプレポリマー、下基板材の鋳型に対しては約６．４ｇのＰＤＭＳプレポリマーを、それぞれ型枠の枠内を埋めるように流し込んだ。その後４０分ほど真空デシケータ中で脱泡した。脱泡後、循環式恒温乾燥機に入れ、ファーストベイク（６５℃、１時間）を行った。それぞれ縦７４ｍｍ×横２４ｍｍの上基板材および下基板材が得られた。前者の表面には２つのＨ字状流路が凹に型取られている。
【００４２】
基板（デバイス本体）の作製
ファーストベイク後のＰＤＭＳ基板材を鋳型・型枠から外して、エタノールで洗浄したスライドガラス上に載せた。ＰＤＭＳ基板材から、１８×２３ｍｍの長方形を２つずつカッターで切り出した。すなわち、上基板材については、上記で得られた７４ｍｍ×２４ｍｍの基板材から、Ｈ字流路をそれぞれ１つ有する２つの上基板材を切り出した。さらに、上基板材については、ハトメで基板材上面からＨ字流路の末端部分に向けて穴を貫通させ、ポートを作製した。上記１８×２３ｍｍの寸法に揃えられた上基板および下基板を、空気が入らないようにしながら重ね合わせ、卓上型送風乾燥器に入れ、セカンドベイク（１００℃、３０分）を行って接合させた。上基板材の下面（流路側）と下基板材の平坦な上面が貼り合わされて、内部にＨ字流路が形成されたデバイス本体が得られた。以下、このデバイス本体を基板と呼ぶ。
【００４３】
多孔膜の組み込み
上記セカンドベイク後の基板を顕微鏡下で観察しながら、カミソリの刃を基板の上表面から垂直に押し下げて、Ｈ字の横線に相当する流路を２つの流路に分断するかたちで深さ３ｍｍの切込みを入れた。カミソリの刃は、Ｈ字の横線に相当する流路を、約１５０μｍ幅の流路（上側流路という）と約２８５０μｍ幅の流路（下側流路という）とに分断し、さらにＨ字の横線の延長線上のＰＤＭＳ基質に切り込むこととなる（図１ａ参照）。
【００４４】
カミソリの刃を引き抜いた後、切込み口が開かれるように基板を曲げた状態に保持した。これは、図１ｂ右側に示すように、試料台にアクリル棒を２本貼りつけ、その間に、切込み口を開けた状態で基板を反らせて保持することによって達成した。つまり、２本のアクリル棒の間隔が、基板の長さよりも短いので、基板がブリッジをしたような状態で固定された。このように切込み口を開けた状態で、基板を試料台ごと真空プラズマ装置（ＣＵＴＥ−１ＭＰＲ、ＦＥＭＴＯ  ＳＣＩＥＮＣＥ）の試料チャンバーに入れ、３０秒間プラズマ処理した（試料チャンバー容量：３．６Ｌ（Ｗ１５０ｍｍ×Ｄ２００ｍｍ×Ｈ１２０ｍｍ）、ソースガス：空気、圧力設定：０．５ｔｏｒｒ（ソースガスの流入により実測値は約０．６５ｔｏｒｒ）、ガス流量：３０ｓｃｃｍ、電力：８０Ｗ）（図１ｃ）。別途、ＰＥＴ多孔膜（孔径３μｍ、セルカルチャーインサート（コーニング社３５３０９１）の底部）を２ｍｍ×７ｍｍの大きさにカットしておいた。この多孔膜を、上記プラズマ処理後１分以内に基板の切込み口に差し込み（図１ｄ）、切込み口が閉じた後に手で基板を左右から１０秒間押さえながら切込み面を圧着させて、膜を挟んだ基板の切込み断面を接合させた（図１ｅ）。このようにして膜組み込みマイクロ流体デバイスを得た。
【００４５】
［ナノ粒子の透過性評価］
２×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１６ｍＭのゲニピン溶液２００μＬに、１％コラーゲンＩ溶液（３０７−３１６１１、日本ハム）を２００μＬ加え、ボルテックスで混合し、氷浴中に静置した。透過試験を行うために、この混合溶液を膜組み込みマイクロ流体デバイスの下側流路に充填して、疑似間質とした。充填は以下の手順で行った。まず、デバイスを１時間以上脱気しておいた。顕微鏡のステージ部分に取り付けられた温調プレート（ＴＰ−ＣＨ１１０Ｒ、東海ヒット）を４℃に設定し、その上にデバイスを設置した。マイクロピペットで上記ゲニピン・コラーゲン溶液を３０μＬとり、これを下側流路のポートからデバイスに注入した。その後、デバイスをインキュベーター（ＳＣＡ−８０ＤＳ、アステック）に移し温めることによって（３７℃、１時間）ゲニピン架橋コラーゲンゲルを固化させた。
【００４６】
膜組み込みマイクロ流体デバイスの上側流路にシリンジポンプ（ＬＥＧＡＴＯ１１１、ＫＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を接続して、ナノ粒子の懸濁液を流すことにより透過試験を行った。一例において、ＰＢＳに懸濁した蛍光標識デキストラン（平均分子量７００００）をモデルナノ粒子として試験に使用した。シリンジポンプはモードを「Ｉｎｆｕｓｅ  Ｏｎｌｙ」、ターゲットを「Ｎｏ  ｔａｒｇｅｔ」に設定し、マイクロシリンジ（１７５０ＴＬＬ、ハミルトン）を設置した。実験に用いる流量は、毛細血管の線速度をもとに算出した。倒立顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス）とＣＭＯＳカメラ（ＯＲＣＡ−Ｆｌａｓｈ４．０Ｖ２、浜松ホトニクス）で観察を行い、ナノ粒子懸濁液が上側流路に充填されてから１時間にわたり１０分ごとに蛍光画像を撮影した。顕微鏡には１０倍の対物レンズを用い、カメラは、ビニングを４、露光時間を１００ｍｓに設定した。
【００４７】
作製された膜組み込みマイクロ流体デバイスの一例の概観、および流路と多孔膜部分の拡大図、ならびに蛍光標識ナノ粒子の膜透過を経時的に定量化した結果の例を図２に示す。基板の切込みに多孔膜を挟んで約１００℃で約１時間ベイクしていた従来の作製方法と比べて、切込み口が開かれるように基板を曲げた状態に保持しながら基板にプラズマ処理を施す本実施例の作製方法では、液漏れを起こすデバイス個体の減少すなわち歩留りの有意な向上が認識された。図２（ａ）および（ｂ）において、黒矢印は多孔膜の挿入位置を示し、＊および＊＊は多孔膜で隔てられた２つの流路を示し（それぞれ上側流路および下側流路）、白矢印は、多孔膜のコラーゲンゲル側に透過した蛍光標識ナノ粒子を示している。図２（ｃ）に示すように、経時的な透過量を正確に測定することができた。本システムを用いて、ナノ粒子の粒径、多孔膜の孔径、各流路を満たす物質の組成、多孔膜表面コーティングの組成、流速など、各種パラメータが透過率に与える影響を正確に分析することができる。
【００４８】
［マトリゲル被覆膜組み込みマイクロ流体デバイスの作製と評価］
この実施例では、マトリゲルでコーティングされた多孔膜をマイクロ流体デバイスに組み込んだ。鋳型、基板材、および基板の作製は、上記の実施例と実質的に同様にして行った。ただし、上基板材と下基板材の接合は、上記のような加熱処理ではなく、接合させる表面を真空プラズマ処理したあと上下基板材を重ね合わせて、手で１０秒間圧着させることによって行った。
【００４９】
マトリゲルコーティング済みの多孔膜は、マトリゲルインベージョンチャンバー（３５４４８１、コーニング）の底部からメスとはさみで切り出したものを利用した。基板の切込みの形成、プラズマ処理、膜の挿入等は、上記の実施例と実質的に同様にして行い、マトリゲル被覆膜組み込みマイクロ流体デバイスを得た。以上のプロセスは全て室温で行われ、このマトリゲルは６０℃以上の高熱には一切晒されていないため、マトリゲル中の生体分子は無傷である。
【００５０】
実用性の確認のために、以下の実験を行った。すなわち、膜で区切られた２本の流路の一方にＰＢＳを導入した。もう一方の流路には、蛍光標識デキストラン（平均分子量１００００）の溶液を、シリンジポンプを用いて１μＬ／分の流速で送液した。蛍光顕微鏡で経時観察したところ、デキストランが膜を透過して他方の流路に拡散する様子が確認された。流路からの液漏れもなく、本デバイスでナノ粒子の透過性を評価できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の実施形態は、医学・生物学・薬学の研究用デバイス、マイクロリアクター、およびドラッグデリバリーシステム開発の分野などで利用することができる。本発明の実施形態は、血管透過性だけでなく他の様々な生物学的モデルシステムの構築のためにも利用され得る。
【図１】
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【図２】
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