(57)【要約】【課題】高血糖症に関連する症状を改善するための組成物、及び該組成物による治療方法の提供。【解決手段】特定の配列を有するポリペプチド｛亜鉛−α２−糖蛋白質（ＺＡＧ）｝又はその機能的断片を投与することにより、高血糖症に関連する症状を改善するための組成物、及び該組成物による治療方法。該ポリペプチドは、静脈内に、皮下に、腹腔内に、又は経口的に投与されることが好ましく、該ポリペプチドは、β3作動物質又はβ3-アドレナリン作動性受容体拮抗物質と組み合わせて投与されることが好ましい高血糖症に関連する症状の改善する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の高血糖症の症状を改善する方法であって、該方法が、そのような治療を必要としている該対象に、約10日間またはそれ以上の期間、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片の治療的に有効な投与量を投与する段階を含み、治療後に高血糖症に関連する症状の改善がある、方法。
【請求項２】
前記治療が、10日間の前記ポリペプチドの連日投与を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記治療が、21日間の前記ポリペプチドの連日投与を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドを、1日おき、2日毎または3日毎に、最長21日間投与する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
症状の前記改善が、治療前の血清レベルと比較した場合の、血清グルコースレベルの低下、血清トリグリセリドレベルの低下、血清インスリンレベルの低下、および血清非エステル化脂肪酸レベルの低下からなる群より選択される1種または複数種の徴候を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
症状の前記改善が、治療前の体温と比較した場合の、治療開始から4日以内の約0.4℃〜1℃の体温上昇を含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
症状の前記改善が、治療前の血漿インスリンレベルと比較した場合の、治療開始から3日以内の血漿インスリンレベルの低下を含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
治療前の血漿インスリンレベルと比較して、血漿インスリンレベルが36％低下する、請求項7記載の方法。
【請求項９】
治療前の血漿グルコースレベルおよび血漿トリグリセリドレベルと比較して、血漿グルコースレベルおよび血漿トリグリセリドレベルが約36％低下する、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
症状の前記改善が、治療開始から3日以内の、静脈内グルコース(2g/kg)に応答した血中グルコースレベルおよびインスリン分泌の正常化を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
症状の前記改善が、治療前の膵臓インスリンレベルと比較した場合の、膵臓インスリンレベルの上昇を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
症状の前記改善が、治療前の脱共役タンパク質-1(UCP1)および脱共役タンパク質-3(UCP3)の発現と比較した場合の、褐色脂肪組織におけるUCP1およびUCP3の発現増大を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
症状の前記改善が、治療前のUCP3の発現と比較した場合の、骨格筋におけるUCP3の発現増大を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドを1日2回投与する、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドを、静脈内に、皮下に、腹腔内に、または経口的に投与する、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドを3日に1回投与する、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドをβ3作動物質と組み合わせて投与する、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
前記β3作動物質がBRL37344である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリペプチドをβ3-アドレナリン作動性受容体(β3-AR)拮抗物質と組み合わせて投与する、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
前記β3-AR拮抗物質がSR59230Aである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドがグリコシル化される、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
対象の血漿インスリンレベルを低下させる方法であって、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片の治療的に有効な投与量を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、最長10日間、前記対象に投与され、治療後に血漿インスリンレベルが低下する、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、最長21日間、前記対象に投与され、治療後に血漿インスリンレベルが低下する、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
血漿インスリンレベルの前記低下が、前記ポリペプチドの投与から3日以内に起こる、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリペプチドの投与前の血漿インスリンレベルと比較して、血漿インスリンレベルが36％低下する、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリペプチドの投与前の血漿グルコースレベルおよび血漿トリグリセリドレベルと比較して、血漿グルコースレベルおよび血漿トリグリセリドレベルが36％低下する、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリペプチドをβ3作動物質と組み合わせて投与する、請求項22記載の方法。
【請求項２９】
前記β3作動物質がBRL37344である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリペプチドをβ3-アドレナリン作動性受容体(β3-AR)拮抗物質と組み合わせて投与する、請求項22記載の方法。
【請求項３１】
前記β3-AR拮抗物質がSR59230Aである、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリペプチドがグリコシル化される、請求項22記載の方法。
【請求項３３】
SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片を対象に投与する段階を含む、該対象の骨格筋量を増加させる方法。
【請求項３４】
前記骨格筋が腓腹筋またはヒラメ筋である、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが、最長10日間、前記対象に投与され、治療後に骨格筋量が増加する、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが、最長21日間、前記対象に投与され、治療後に骨格筋量が増加する、請求項33記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリペプチドをβ3作動物質と組み合わせて投与する、請求項33記載の方法。
【請求項３８】
前記β3作動物質がBRL37344である、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
前記ポリペプチドをβ3-アドレナリン作動性受容体(β3-AR)拮抗物質と組み合わせて投与する、請求項33記載の方法。
【請求項４０】
前記β3-AR拮抗物質がSR59230Aである、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
前記ポリペプチドがグリコシル化される、請求項33記載の方法。
【請求項４２】
前記対象が、癌、AIDS、敗血症、COPD、腎不全、関節炎、うっ血性心不全、筋ジストロフィー、糖尿病、または加齢によるサルコペニアを有する、請求項33記載の方法。
【請求項４３】
体重低下または肥満軽減をもたらすために対象を治療する方法であって、そのような治療を必要としている該対象に、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片と組み合わせて、β3作動物質の治療的に有効な投与量を投与する段階を含む、方法。
【請求項４４】
前記β3作動物質がBRL37344である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリペプチドがグリコシル化される、請求項43記載の方法。
【請求項４６】
体重低下または肥満軽減をもたらすために対象を治療する方法であって、そのような治療を必要としている該対象に、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片と組み合わせて、β3-アドレナリン作動性受容体(β3-AR)拮抗物質の治療的に有効な投与量を投与する段階を含む、方法。
【請求項４７】
前記β3-AR拮抗物質がSR59230Aである、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
前記ポリペプチドがグリコシル化される、請求項46記載の方法。
【請求項４９】
SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドと、β3作動物質とを含む、薬学的組成物。
【請求項５０】
SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドと、β3-アドレナリン作動性受容体(β3-AR)拮抗物質とを含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、全体として、高血糖症および肥満の薬剤および治療、ならびに、より具体的には、高血糖症に関連する症状を改善するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景情報
糖尿病は、糖尿病患者の高い血中グルコースレベルによって数ある中でも顕在化するグルコース代謝障害を特徴とする。根底にある欠陥によって、糖尿病は2つの主要なグループに分類される。1型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病(IDDM)は、患者が膵臓腺中のインスリン産生β細胞を欠く場合に発生する。2型糖尿病またはインスリン非依存性糖尿病(NIDDM)は、β細胞機能が障害されインスリン作用が変化した患者において発生する。
【０００３】
1型糖尿病および2型糖尿病の両方とも、骨格筋量の減少を伴い、これは、ユビキチン-プロテアソーム経路の活性の上昇による筋原線維タンパク質の崩壊の増加が原因と考えられている。これは1型糖尿病で特に広く認められるが、インスリン欠乏によって部分的に説明されているにすぎず、かつdb/dbマウスにおける実験的研究により、インスリン抵抗性が筋消耗を引き起こすことが示されている。
【０００４】
骨格筋の減少は、重症の低インスリン血症(ストレプトゾトシンによって誘発)マウスモデルと重症のインスリン抵抗性(ob/ob)糖尿病マウスモデルの両方において発生する。糖尿病における筋肉タンパク質減少は、タンパク質合成の抑制および骨格筋におけるタンパク質分解の増加の両方に関連している。タンパク質分解の増加は、カスパーゼ-3およびプロテアソームの両方の活性上昇に関連している。
【０００５】
肥満は、インスリン抵抗性および2型糖尿病に関連している。カテコールアミンによって誘発される脂肪分解の障害およびホルモン感受性リパーゼ(HSL)発現の減少が、肥満の脂肪細胞において観察されており、これは、増加した脂肪組織貯蔵の発達または維持に寄与していることが示唆されている。一方、悪液質対象に由来する脂肪細胞は、HSLの発現増大と共に脂肪分解応答の2〜3倍の増大を示す。
【０００６】
亜鉛-α2-糖タンパク質(ZAG)は、癌性悪液質において脂肪減少を誘発する能力を有する脂質動員因子(LMF)として同定されている。ZAGは、β3-アドレナリン作動性受容体との相互作用によって、白色脂肪細胞における脂肪分解を誘発することが示された一方で、インビボで、褐色脂肪組織(BAT)における脱共役タンパク質-1(UCP-1)の発現を増大させ、体脂肪の減少を誘発した。いくつかの腫瘍のほかに、ZAGは、白色脂肪組織(WAT)およびBATによっても産生され、その発現は悪液質において上方調節されている。一方、肥満ヒトの脂肪組織におけるZAG発現は、非肥満対象で認められるものの30％にすぎなかった。このことから、WATにおけるZAG発現の減少が、肥満の特徴のいくつかの原因であり得ることが示唆される。確かに、マウスの両方のZAG対立遺伝子を不活性化すると、体重が増加し、これは、高脂肪食をこれらの動物に与えた場合により顕著であった。様々な作用物質に対する脂肪分解応答は、ZAG欠損動物に由来する脂肪細胞において有意に減少していた。
【０００７】
これまで、ZAGの脂質動員効果に関する研究はすべて、ヒトZAGを用いてマウスにおいて実施されてきたが、マウスとヒトのZAGアミノ酸配列の同一性はわずか58.6％である。ラットとマウスの配列相同性は88.5％であるため、このことから、ヒトZAGがマウス受容体に結合する場合、それはラットでも当然有効であることが示唆される。本発明の研究では、成熟した雄ウィスターラットにおけるヒトZAGの抗肥満効果を調査する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、亜鉛-α2-糖タンパク質(ZAG)が、2型糖尿病のモデルとしての肥満高血糖性(ob/ob)成体マウスおよび成熟したウィスターラットの体重およびインスリン応答性に対して影響を与えるという知見に基づいている。このような知見は、高血糖症に関連する症状を改善するための方法において有用である。
【０００９】
したがって、本発明は、対象の高血糖症の症状を改善する方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要としている対象に、約10日間またはそれ以上の期間、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片の治療的に有効な投与量を投与して、高血糖症に関連する症状の改善を治療後にもたらす段階を含む。1つの態様において、治療は、10日間にわたる連日投与を含む。別の態様において、ポリペプチドは、毎日、1日おき、2日毎または3日毎に、最長10日間またはそれ以上の期間、投与される。別の態様において、ポリペプチドは、1日2回投与される。ポリペプチドは、静脈内に、皮下に、腹腔内に、または経口的に投与されてよい。別の態様において、ポリペプチドは、β3-アドレナリン作動性受容体(β3-AR)拮抗物質およびβ3作動物質からなる群より選択される1種または複数種の作用物質と組み合わせて投与される。1つの態様において、β3-AR拮抗物質はSR59230Aである。別の態様において、β3作動物質は、AMNI-BRL37344(BRL37344)である。別の態様において、ポリペプチドは、グリコシル化される。
【００１０】
高血糖症に関連する症状の改善には、限定されるわけではないが、治療前の血清レベルと比較した場合の、血清グルコースレベルの低下、血清トリグリセリドレベルの低下、血清インスリンレベルの低下、および血清非エステル化脂肪酸レベルの低下が含まれる。1つの態様において、症状の改善には、治療前の体温と比較した場合の、治療開始から1日以内の約0.4℃〜1℃の体温上昇が含まれる。別の態様において、症状の改善には、治療前の血漿インスリンレベルと比較した場合の、治療開始から3日以内の血漿インスリンレベルの低下が含まれる。血漿インスリンレベルならびに/または血漿グルコースレベルおよび血漿トリグリセリドレベルは、治療前の血漿インスリンレベルならびに/または血漿グルコースレベルおよび血漿トリグリセリドレベルと比較して36％ほども低下し得る。別の態様において、症状の改善は、治療開始から3日以内の、静脈内グルコース(2g/kg)に応答した血中グルコースレベルおよびインスリン分泌の正常化を含む。別の態様において、症状の改善は、治療前の膵臓インスリンレベルと比較した場合の、膵臓インスリンレベルの上昇を含む。さらに別の態様において、症状の改善は、治療前の脱共役タンパク質-1(UCP1)および脱共役タンパク質-3(UCP3)の発現と比較した場合の、褐色脂肪組織におけるUCP1およびUCP3の発現増大を含む。さらに別の態様において、症状の改善は、治療前のUCP3の発現と比較した場合の、骨格筋におけるUCP3の発現増大を含む。別の態様において、ポリペプチドは、グリコシル化される。
【００１１】
別の局面において、本発明は、対象の血漿インスリンレベルを低下させる方法を提供する。この方法は、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片の治療的に有効な投与量を対象に投与する段階を含む。1つの態様において、ポリペプチドは、最長10日間、対象に投与され、治療後に血漿インスリンレベルは低下する。別の態様において、ポリペプチドは、最長21日間、対象に投与され、治療後に血漿インスリンレベルは低下する。別の態様において、血漿インスリンレベルの低下は、ポリペプチドの投与から3日以内に起こる。別の態様において、ポリペプチドは、β3-アドレナリン作動性受容体(β3-AR)拮抗物質およびβ3作動物質からなる群より選択される1種または複数種の作用物質と組み合わせて投与される。1つの態様において、β3-AR拮抗物質はSR59230Aである。別の態様において、β3作動物質は、AMNI-BRL37344(BRL37344)である。別の態様において、ポリペプチドは、グリコシル化される。
【００１２】
別の局面において、本発明は、対象の骨格筋量を増加させる方法を提供する。この方法は、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片を対象に投与する段階を含む。1つの態様において、骨格筋は、腓腹筋またはヒラメ筋である。別の態様において、ポリペプチドは、最長10日間、対象に投与され、治療後に骨格筋量は増加する。別の態様において、ポリペプチドは、最長21日間、対象に投与され、治療後に骨格筋量は増加する。別の態様において、ポリペプチドは、β3-アドレナリン作動性受容体(β3-AR)拮抗物質およびβ3作動物質からなる群より選択される1種または複数種の作用物質と組み合わせて投与される。1つの態様において、β3-AR拮抗物質はSR59230Aである。別の態様において、β3作動物質は、AMNI-BRL37344(BRL37344)である。別の態様において、ポリペプチドは、グリコシル化される。
【００１３】
別の局面において、本発明は、体重低下または肥満軽減をもたらすために対象を治療する方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要としている対象に、β3-アドレナリン作動性受容体(β3-AR)拮抗物質およびβ3作動物質からなる群より選択される1種または複数種の作用物質と組み合わせて、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片の治療的に有効な投与量を投与する段階を含む。1つの態様において、β3-AR拮抗物質はSR59230Aである。別の態様において、β3作動物質は、AMNI-BRL37344(BRL37344)である。別の態様において、ポリペプチドは、グリコシル化される。
【００１４】
別の局面において、本発明は、体重低下または肥満軽減をもたらすために対象を治療する方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要としている対象に、β3-アドレナリン作動性受容体(β3-AR)拮抗物質およびβ3作動物質からなる群より選択される1種または複数種の作用物質と組み合わせて、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片の治療的に有効な投与量を投与する段階を含む。1つの態様において、β3-AR拮抗物質はSR59230Aである。別の態様において、β3作動物質は、AMNI-BRL37344(BRL37344)である。別の態様において、ポリペプチドは、グリコシル化される。
【００１５】
別の局面において、本発明は、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドと、β3-アドレナリン作動性受容体(β3-AR)拮抗物質およびβ3作動物質からなる群より選択される作用物質とを含む、薬学的組成物を提供する。1つの態様において、β3-AR拮抗物質はSR59230Aである。別の態様において、β3作動物質は、AMNI-BRL37344(BRL37344)である。別の態様において、ポリペプチドは、グリコシル化される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
（図１Ａ）ZAGの特徴付けならびにob/obマウスの脂肪分解および体重に対するその効果を示す絵図面である。293細胞培地中の全タンパク質および説明する通りに精製したZAGを示す、12％SDS-PAGE後のクーマシー染色。
（図１Ｂ）培地におけるZAGの発現および精製されたZAGを示すウェスタンブロットの結果を示す絵図面である。
（図１Ｃ）体重減少を経たMAC16マウスの脂肪組織および肝臓組織におけるZAG mRNAレベルを示すグラフ図である。P<0.01。
（図１Ｄ）イソプレナリン(Iso)およびZAGに応答した、非肥満マウス(■)およびob/obマウス(□)に由来する精巣上体脂肪細胞における脂肪分解の結果を示すグラフ図である。非肥満マウスとの差を*p<0.05、**p<0.01、および***p<0.001として示す。
（図１Ｅ）処置無し(■)、イソプレナリン(10μM)(□)、または
2020172540.tif 000002
のいずれかを施した肥満(ob/ob)マウスおよび非肥満(non ob)マウスに由来する精巣上体(ep)沈着物、皮下(s.c.)沈着物、および内臓(vis)沈着物から得た脂肪細胞における脂肪分解の結果を示すグラフ図である。精巣上体脂肪細胞との差を**p<0.01として示す。
（図１Ｆ）方法において説明するような、PBS(◆)と比較した、ob/obマウスの体重に対するZAG(■)の効果を示すグラフ図である。0時点かつPBS対照との体重差を***p<0.001として示す。
（図１Ｇ）PBS対照(■)と比較した、eに示すマウスの体温に対するZAG(□)の効果を示すグラフ図である。対照との差を***p<0.001として示す。
（図２Ａ）ZAGで処置したob/obマウスの耐糖能、脂肪細胞および腓腹筋中へのグルコース取込みを示すグラフ図である。グルコース(2g/kg)の静脈内投与後3日間ZAG(■)またはPBS(◆)のいずれかで処置した、摂食状態のob/obマウスの血漿グルコースレベル。PBSと比べてp<0.001。グルコース投与後、間隔を空けて尾静脈から血液試料を採取し、グルコースおよびインスリンの測定のために使用した。
（図２Ｂ）グルコース(1g/kg)の経口投与後にZAGで処置したob/obマウスの血漿インスリンレベルを示すグラフ図である。PBSと比べてp<0.001。
（図２Ｃ）0nMインスリン(■)、1nMインスリン(□)、または
2020172540.tif 000003
の存在下で5日間ZAGで処置したob/obマウスの精巣上体(ep)脂肪細胞、内臓(vis)脂肪細胞、および皮下(s.c.)脂肪細胞中へのグルコース取込みを示すグラフ図である。ZAGの存在下での差を***p<0.001として示す。
（図２Ｄ）インスリン(100nM)の不在下または存在下で5日間、ZAGまたはPBSのいずれかで処置したob/obマウスの腓腹筋中への2-デオキシ-D-グルコース取込みを示すグラフ図である。インスリンの存在下での差を*p<0.05または**p<0.01として示し、ZAGの存在下での差を***p<0.001として示す。
（図２Ｅ）ob/obマウスの骨格筋におけるタンパク質の合成および分解に対するZAGの影響を示す絵図面である。ob/obマウスを5日間処置した後、骨格筋を取り出し、GLUT4発現に関してウェスタンブロットを行った。
（図３Ａ）ob/obマウスの骨格筋におけるタンパク質の合成および分解に対するZAGの影響を示すグラフ図である。ob/obマウスを5日間処置した後、骨格筋を取り出し、タンパク質合成の測定のために使用した。PBS対照または非肥満動物との差を***p<0.001として示す。
（図３Ｂ）ob/obマウスの骨格筋におけるタンパク質の合成および分解に対するZAGの影響を示すグラフ図である。ob/obマウスを5日間処置した後、骨格筋を取り出し、タンパク質分解の測定のために使用した。PBS対照または非肥満動物との差を***p<0.001として示す。
（図３Ｃ）ob/obマウスの骨格筋におけるタンパク質の合成および分解に対するZAGの影響を示すグラフ図である。ob/obマウスを5日間処置した後、骨格筋を取り出し、キモトリプシン様酵素活性の測定のために使用した。PBS対照または非肥満動物との差を***p<0.001として示す。
（図３Ｄ）ob/obマウスの骨格筋におけるタンパク質の合成および分解に対するZAGの影響を示す絵図面である。ob/obマウスを5日間処置した後、骨格筋を取り出し、20Sプロテアソームαサブユニットの発現に関してウェスタンブロットを行った。
（図３Ｅ）ob/obマウスの骨格筋におけるタンパク質の合成および分解に対するZAGの影響を示す絵図面である。ob/obマウスを5日間処置した後、骨格筋を取り出し、p42発現に関してウェスタンブロットを行った。
（図３Ｆ）ob/obマウスの骨格筋におけるタンパク質の合成および分解に対するZAGの影響を示す絵図面である。ob/obマウスを5日間処置した後、骨格筋を取り出し、ミオシン発現に関してウェスタンブロットを行った。
（図３Ｇ）ob/obマウスの骨格筋におけるタンパク質の合成および分解に対するZAGの影響を示す絵図面である。ob/obマウスを5日間処置した後、骨格筋を取り出し、アクチン発現に関してウェスタンブロットを行った。
（図４Ａ）PBSまたはZAGのいずれかで5日間処置した後のob/obマウスの腓腹筋中のホスホPKRをウェスタンブロットすることにより、骨格筋中の異化シグナル伝達経路に対するZAGの影響を示す絵図面である。全形態(total form)のこれらのタンパク質は、ローディングコントロールとして役立つ。PBS対照との差を***p<0.001として示し、非肥満マウスとの差を#p<0.001として示す。
（図４Ｂ）PBSまたはZAGのいずれかで5日間処置した後のob/obマウスの腓腹筋中のホスホeIF2aをウェスタンブロットすることにより、骨格筋中の異化シグナル伝達経路に対するZAGの影響を示す絵図面である。全形態のこれらのタンパク質は、ローディングコントロールとして役立つ。PBS対照との差を***p<0.001として示し、非肥満マウスとの差を#p<0.001として示す。
（図４Ｃ）PBSまたはZAGのいずれかで5日間処置した後のob/obマウスの腓腹筋中のホスホPLA2をウェスタンブロットすることにより、骨格筋中の異化シグナル伝達経路に対するZAGの影響を示す絵図面である。全形態のこれらのタンパク質は、ローディングコントロールとして役立つ。PBS対照との差を***p<0.001として示し、非肥満マウスとの差を#p<0.001として示す。
（図４Ｄ）PBSまたはZAGのいずれかで5日間処置した後のob/obマウスの腓腹筋中のホスホp38MAPKをウェスタンブロットすることにより、骨格筋中の異化シグナル伝達経路に対するZAGの影響を示す絵図面である。全形態のこれらのタンパク質は、ローディングコントロールとして役立つ。PBS対照との差を***p<0.001として示し、非肥満マウスとの差を#p<0.001として示す。
（図４Ｅ）PBSまたはZAGのいずれかで5日間処置した後のob/obマウスの腓腹筋中のカスパーゼ-3(■)およびカスパーゼ-8(□)の活性に基づいて、骨格筋中の異化シグナル伝達経路に対するZAGの影響を示すグラフ図である。
（図５Ａ）ZAGに応答したHSLおよびATGLの発現を示す絵図面である。ウェスタンブロットは、処置無し(Con)の3時間後、またはイソプレナリン(10μM)単独もしくはZAG(0.46μM)単独で処置の3時間後、またはZAGによる5日間処置後のPD98059(25μM)存在下3時間後の非肥満マウスの脂肪細胞中のホスホHSLの発現を示す。
（図５Ｂ）ZAGによる5日間処置後の精巣上体(ep)脂肪細胞の免疫ブロットによってHSLの発現を示す絵図面である。
（図５Ｃ）ZAGによる5日間処置後の皮下(sc)脂肪細胞の免疫ブロットによってHSLの発現を示す絵図面である。
（図５Ｄ）ZAGによる5日間処置後の内臓(vis)脂肪細胞の免疫ブロットによってHSLの発現を示す絵図面である。
（図５Ｅ）ZAGによる5日間処置後の精巣上体脂肪細胞におけるATGL発現を示す絵図面である。
（図５Ｆ）ZAGによる5日間処置後の皮下脂肪細胞におけるATGL発現を示す絵図面である。
（図５Ｇ）ZAGによる5日間処置後の内臓脂肪細胞におけるATGL発現を示す絵図面である。
（図５Ｈ）ZAGによる5日間処置後の精巣上体脂肪細胞におけるERK発現を示す絵図面である。
（図５Ｉ）ZAGによる5日間処置後の皮下脂肪細胞におけるERK発現を示す絵図面である。
（図５Ｊ）ZAGによる5日間処置後の内臓脂肪細胞におけるERK発現を示す絵図面である。
（図５Ｋ）PBSまたはZAGのいずれかで5日間処置したob/obマウスに由来する精巣上体(ep)沈着物、皮下(sc)沈着物、および内臓(vis)沈着物から得た脂肪細胞の、BRL37344の脂肪分解作用に対する応答を示すグラフ図である。PBS対照との差を***p<0.001として示し、PD98059存在下での差を#p<0.001として示す。
（図６Ａ）ZAGによる5日間のob/obマウス処置が、WAT中のZAGおよびHSL、BAT中のUCP1およびUCP3、ならびに腓腹筋中のUCP3の発現に与える影響を示す絵図面である。ep、sc、およびvisの脂肪細胞中のZAG発現を示すウェスタンブロット。0日は、脂肪細胞がマウスから採取された日を表す。
（図６Ｂ）方法において説明する通りにRMPI培地中に懸濁させた精巣上体脂肪細胞中のZAG発現を示す絵図面である。次いで、これらの試料を一日間隔で取り出し、ZAG発現に関してウェスタンブロットした。0日は、脂肪細胞がマウスから採取された日を表す。
（図６Ｃ）方法において説明する通りにRMPI培地中に懸濁させた精巣上体脂肪細胞中のHSL発現を示す絵図面である。次いで、これらの試料を一日間隔で取り出し、HSL発現に関してウェスタンブロットした。0日は、脂肪細胞がマウスから採取された日を表す。
（図６Ｄ）マウスから採取されたBAT中のUCP1発現を示す絵図面である。PBS処置マウスとの差を***p<0.001として示す。
（図６Ｅ）マウスから採取されたBAT中のUCP3発現を示す絵図面である。PBS処置マウスとの差を***p<0.001として示す。
（図６Ｆ）マウスから採取された腓腹筋中のUCP3発現を示す絵図面である。PBS処置マウスとの差を***p<0.001として示す。
（図７Ａ）21日間の研究の間のob/obマウスの体重減少を示すグラフ図である。ZAGは、1日目、4日目、5日目、8日目、13日目、16日目、18日目、および19日目に注射し、PBSは同じ時点に注射した。
（図７Ｂ）ZAGで処置する間のob/obマウス(体重80〜90g)の体重変化(g)を示すグラフ図である。
（図７Ｃ）21日間の研究の間のob/obマウスの体温上昇を示すグラフ図である。ZAGは、1日目、4日目、5日目、8日目、13日目、16日目、18日目、および19日目に注射し、PBSは同じ時点に注射した。
（図８Ａ）処置の最初の5日間の間の、尿中グルコース排泄の漸進的減少を示すグラフ図である。
（図８Ｂ）21日間の研究の間の、尿中グルコース排泄の漸進的減少を示すグラフ図である。
（図９）ZAGで処置されたobマウスおよびZAGで処置されていないobマウスに由来し、最長5日間培養された単離脂肪細胞からの、イソプレナリン(iso)によって促進されたグリセロール放出を示すグラフ図である。
（図１０）T. Araki et al. (1988)「Complete amino acid sequence of human plasma Zn-α2-glycoprotein and its homology to histocompatibility antigens」によって公開されている、ヒト血漿Zn-α2-糖タンパク質のアミノ酸配列全体(SEQ ID NO: 1)を示す絵図面である。
（図１１）SR59230A(10μM)または抗ZAG抗体(1:1000)(IgG)の不在下または存在下でのイソプレナリン(10μM)と比較して、単離されたラット精巣上体脂肪細胞中のヒトZAGの脂肪分解活性を示すグラフ図である。各値は、5回の別々の調査の平均である。対照との差をb、p<0.01またはc、p<0.001として示し、ZAG単独との差をe、p<0.01またはf、p<0.001として示す。
（図１２Ａ）10日間にわたる、雄ウィスターラットの体重に対する、100μl PBS中ZAG(50μg/100g体重(b.w.))(■)またはPBS単独(◆)のいずれかの静脈内連日投与の効果を示すグラフ図である。この実験のプロトコールは方法のセクションで示す。
（図１２Ｂ）図12Aで説明した通りにZAG(■)またはPBS(◆)のいずれかを投与された雄ウィスターラットの体温を示すグラフ図である。
（図１２Ｃ）インスリン(60μU/ml)の不在下または存在下で、図12Aに示す通りに、10日間ZAG(白い(open)棒)またはPBS(黒い(closed)棒)のいずれかで10日間処置した後の雄ウィスターラットの精巣上体脂肪細胞中への2-デオキシ-D-グルコースの取込みを示すグラフ図である。
（図１２Ｄ）インスリン(60μU/ml)の不在下または存在下で、ZAGまたはPBSのいずれかで10日間処置した後の雄ウィスターラットの腓腹筋およびBAT中へのグルコース取込みを示すグラフ図である。ZAG処置動物とPBS処置動物の差をa、p<0.05、b、p<0.01、またはc、p<0.001として示し、インスリンの存在下での差をf、p<0.001として示す。
（図１２Ｅ）ZAGを投与されたob/obマウスにおける組織Rgを示すグラフ図である。c、PBSと比べてp<0.001。
（図１３Ａ）図12に示す通りにPBSまたはZAGのいずれかで10日間処置された雄ウィスターラットのBATにおけるGLUT4発現を示すウェスタンブロットの絵図面である。ZAG処置動物とPBS処置動物の差をc、p<0.001として示す。
（図１３Ｂ）図12に示す通りにPBSまたはZAGのいずれかで10日間処置された雄ウィスターラットのWATにおけるGLUT4発現を示すウェスタンブロットの絵図面である。ZAG処置動物とPBS処置動物の差をc、p<0.001として示す。
（図１３Ｃ）図12に示す通りにPBSまたはZAGのいずれかで10日間処置された雄ウィスターラットの腓腹筋におけるGLUT4発現を示すウェスタンブロットの絵図面である。ZAG処置動物とPBS処置動物の差をc、p<0.001として示す。
（図１４Ａ）図12に示す通りにPBSまたはZAGのいずれかで10日間処置された雄ウィスターラットのBATにおけるUCP1およびUCP3の発現を示すウェスタンブロットの絵図面である。ZAG処置動物とPBS処置動物の差をc、p<0.001として示す。
（図１４Ｂ）図12に示す通りにPBSまたはZAGのいずれかで10日間処置された雄ウィスターラットのWATにおけるUCP1およびUCP3の発現を示すウェスタンブロットの絵図面である。ZAG処置動物とPBS処置動物の差をc、p<0.001として示す。
（図１５Ａ）図12に示す通りにPBSまたはZAGのいずれかで10日間処置された雄ウィスターラットの精巣上体脂肪組織におけるATGLの発現を示すウェスタンブロットの絵図面である。ZAG処置動物とPBS処置動物の差をc、p<0.001として示す。
（図１５Ｂ）図12に示す通りにPBSまたはZAGのいずれかで10日間処置された雄ウィスターラットの精巣上体脂肪組織におけるHSLの発現を示すウェスタンブロットの絵図面である。ZAG処置動物とPBS処置動物の差をc、p<0.001として示す。
（図１６Ａ）腓腹筋におけるZAG発現を示すウェスタンブロットの絵図面である。組織は、図12に示す通りにPBSまたはZAGのいずれかで10日間処置した雄ウィスターラットから採取した。ZAG処置動物とPBS処置動物の差をc、p<0.001として示す。
（図１６Ｂ）WATにおけるZAG発現を示すウェスタンブロットの絵図面である。組織は、図12に示す通りにPBSまたはZAGのいずれかで10日間処置した雄ウィスターラットから採取した。ZAG処置動物とPBS処置動物の差をc、p<0.001として示す。
（図１６Ｃ）BATにおけるZAG発現を示すウェスタンブロットの絵図面である。組織は、図12に示す通りにPBSまたはZAGのいずれかで10日間処置した雄ウィスターラットから採取した。ZAG処置動物とPBS処置動物の差をc、p<0.001として示す。
（図１７Ａ）図12に示す通りにPBSまたはZAGのいずれかで10日間処置された雄ウィスターラットの腓腹筋におけるリン酸化型PKRおよび全形態のPKRの発現を示すウェスタンブロットの絵図面である。濃度測定解析は、リン酸化型と全形態の比であり、PBSで処置したラットの場合の値に対する比率(％)として表している。
（図１７Ｂ）図12に示す通りにPBSまたはZAGのいずれかで10日間処置された雄ウィスターラットの腓腹筋におけるeIF2αの発現を示すウェスタンブロットの絵図面である。濃度測定解析は、リン酸化型と全形態の比であり、PBSで処置したラットの場合の値に対する比率(％)として表している。
（図１８Ａ）様々な濃度のグルコースの存在下で、4時間ZAGで処置したC2C12筋管およびZAGで処置しなかったC2C12筋管におけるフェニルアラニン放出を示すグラフ図である。統計学的に有意なcは、対照と比べてP<0.001であり;fは、グルコース単独と比べてP<0.001である。
（図１８Ｂ）様々な濃度のグルコースの存在下で、4時間ZAGで処置したC2C12筋管およびZAGで処置しなかったC2C12筋管におけるタンパク質合成を示すグラフ図である。統計学的に有意なcは、対照と比べてP<0.001であり;fは、グルコース単独と比べてP<0.001である。
（図１９）様々な濃度のグルコースの存在下ならびにSR59230Aの存在下および不在下で、ZAGで処置したC2C12筋管およびZAGで処置しなかったC2C12筋管におけるフェニルアラニン放出を示すグラフ図である。統計学的に有意なbは、対照と比べてP<0.01、cはP<0.001であり;eは、グルコース単独と比べてP<0.05、fはP<0.001である。
（図２０）様々な濃度のグルコースの存在下ならびにSR59230Aの存在下および不在下で、ZAGで処置したC2C12筋管およびZAGで処置しなかったC2C12筋管におけるタンパク質合成を示すグラフ図である。統計学的に有意なbは、対照と比べてP<0.01、cはP<0.001であり;eは、グルコース単独と比べてP<0.05、fはP<0.001であり;Iは、グルコース+SRと比べてP<0.001である。
（図２１）ZAGの存在下および不在下で様々な濃度のグルコースで処置したC2C12筋管におけるROS活性を示すグラフ図である。統計学的に有意なcは、対照と比べてP<0.001であり;fは、グルコース単独と比べてP<0.001である。
（図２２Ａ）ZAGの存在下および不在下でグルコースで処置したC2C12筋管中のPKRを示すウェスタンブロットの絵図面である。統計学的に有意なcは、対照と比べてP<0.001であり;fは、グルコース単独と比べてP<0.001である。
（図２２Ｂ）ZAGの存在下および不在下でグルコースで処置したC2C12筋管中のeIF2αを示すウェスタンブロットの絵図面である。統計学的に有意なcは、対照と比べてP<0.001であり;fは、グルコース単独と比べてP<0.001である。
（図２３Ａ）ZAGで処置したob/obマウスおよびZAGで処置しなかったob/obマウスにおけるインスリン耐性試験の結果を示すグラフ図である。統計学的に有意なbはZAG処置と比べてP<0.05であり、cはP<0.001である。
（図２３Ｂ）ZAGで処置したob/obマウスおよびZAGで処置しなかったob/obマウスにおけるインスリン耐性試験の結果を示すグラフ図である。統計学的に有意なbはZAG処置と比べてP<0.05であり、cはP<0.001である。
（図２４）ob/obマウスにおけるD-[U-14Cグルコース]の14CO2への酸化を示すグラフ図である。
（図２５）ob/obマウスにおける[14Cカルボキシ]トリオレインからの14CO2産生を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、組換えヒト亜鉛-α2-糖タンパク質(ZAG)が、ob/obマウスおよびウィスターラットにおいて、食物摂取に対する影響なしに、体重の減少およびインスリン応答性の上昇をもたらすという観察結果に基づいている。したがって、本発明は、対象の高血糖症の症状を改善するため、対象の血漿インスリンレベルを低下させるため、および対象の骨格筋量を増加させるための方法を提供する。また、対象の体重低下または肥満軽減をもたらすための組合せ治療も提供される。
【００１８】
本発明の組成物および方法を説明する前に、本発明は、説明される特定の組成物、方法、および実験条件に限定されず、したがって、組成物、方法、および条件は変化し得ることを理解すべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲においてのみ限定されるため、本明細書において使用される専門用語は、特定の態様のみを説明することを目的とし、限定することを意図しないことも理解すべきである。
【００１９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈において特に規定がない限り、複数の指示内容を含む。したがって、例えば、「その方法」への言及は、1つもしくは複数の方法、および/または、本開示などを読むと当業者には明らかになると考えられる、本明細書において説明するタイプの段階を含む。
【００２０】
他に規定されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において説明されるものと同様または等価な任意の方法および材料を、本発明の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に説明する。
【００２１】
ZAGの完全なアミノ酸配列は、T. Araki et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85, 679-683による「Complete amino acid sequence of human plasma Zinc-α2-glycoprotein and its homology to histocompatibility antigens」という表題の論文において報告されており、この論文中で、この糖タンパク質は、3種の独特なドメイン構造(A、B、およびC)を有するアミノ酸残基276個の単一ポリペプチド鎖からなり、3つのグリコシル化部位におけるN結合型グリカンと共に2つのジスルフィド結合を含むものとして示された。ポリペプチド構成要素のこのアミノ酸配列は、添付図面の図10に記載する。異なる体液または組織から単離された場合、ヒトZAGの組成はいくらか変化し得ることがいくつかの後続の刊行物によって示されたが、本資料の調製物はすべて、実質的に同じ免疫学的特徴を有する。H. Ueyama, et al. (1991)「Cloning and nucleotide sequence of a human Zinc-α2-glycoprotein cDNA and chromosomal assignment of its gene」、Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 696-703によって報告されている通りに、ZAGのcDNAは、ヒトの肝臓および前立腺のライブラリーから単離されており、また、この遺伝子も、Ueyama et al., (1993)「Molecular cloning and chromosomal assignment of the gene for human Zinc-α2-glycoprotein”, Biochemistry 32, 12968-12976」によって報告されている通りに、単離されている。また、H. Ueyama et al.は、J. Biochem. (1994) 116, 677-681において、ラットおよびマウスの肝臓に由来するZAG cDNAに関する研究も説明しており、これらは、対応するmRNAによって発現される糖タンパク質と共に、配列決定され、ヒト材料と比較されている。異なる種から予想されるように、細部の差異は存在したものの、程度の高いアミノ酸配列相同性が見出され、ヒト対応物との同一性は50％を上回った(糖タンパク質のドメインB内の同一性は70％を上回った)。やはり、ヒトZAG、ラットZAG、およびマウスZAGの間で共通の免疫学的特性が観察されている。
【００２２】
上記の精製されたZAGは、Ohkubo et al. (Ohkubo et al. (1988)「Purification and characterisation of human plasma Zn-α2-glycoprotein」Prep. Biochem., 18, 413-430)によって説明されている方法に実質的に従って、新鮮なヒト血漿から調製した。場合によっては、単離された脂質動員因子またはZAGの断片が、脂肪分解活性も脂質動員活性も失わずに作製され得ること、および、同じくこの活性に実質的に影響を及ぼさないと考えられる様々な付加、欠失、または置換を起こしてよいことが理解されると考えられる。したがって、本発明の方法は、ZAGの機能的断片の使用も含む。これらの治療的応用で使用される糖タンパク質またはその断片はさらに、例えばH. Ueyama et al. (1994)「Structure and Expression of Rat and Mouse mRNAs for Zn-α2-glycoprotein」J. Biochem., 116, 677-681において公開されているZn-α2-糖タンパク質の公知のcDNA配列におそらく基づいた、当技術分野において周知であるような組換えDNA技術によっても作製され得る。さらに、これらの治療的応用で使用される糖タンパク質またはその断片は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化など、ならびに当技術分野において公知の他の修飾(天然に存在するものおよび天然に存在しないものの両方)をさらに含んでよい。
【００２３】
その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,890,899号に開示されている通り、ZAGは、哺乳動物において体重低下または肥満軽減をもたらすことが以前に示されている。さらに、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第20060160723号に開示されている通り、ZAGおよび/またはその断片の類似した特徴を有する脂質動員物質もまた、哺乳動物において体重低下または肥満軽減をもたらすために使用されていることが観察されている。本発明は、ZAGおよび/またはその機能的断片が、脂肪細胞および骨格筋のインスリン応答性を高め、処置中に体重低下または肥満軽減が観察されるかどうかに関わらず、タンパク質分解の減少と相まったタンパク質合成の増加を通じて筋量の増加をもたらすことを実証する。したがって、本発明の方法は、任意の検出可能な体重低下または肥満軽減に先立って、高血糖症および/または筋消耗性疾患に関連する症状に対して検出可能な効果を提供することが企図される。
【００２４】
したがって、1つの局面において、本発明は、対象の高血糖症の症状を改善する方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要としている対象に、最長10日間またはそれ以上の期間、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片の治療的に有効な投与量を投与する段階を含む。例えば、治療計画は、数ヶ月(例えば、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、もしくは12ヶ月)、または数年間でよい。1つの態様において、ポリペプチドは、最長21日間またはそれ以上の期間、投与される。別の態様において、症状の改善は、治療開始から数日(例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、もしくは7日)、数週(例えば、1週、2週、3週、もしくは4週)、または数ヶ月(例えば、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、もしくは12ヶ月)以内に認めることができる。別の態様において、治療計画は約10日間であり、治療後に高血糖症に関連する症状の改善がある。別の態様において、治療計画は約21日間であり、治療後に高血糖症に関連する症状の改善がある。
【００２５】
本明細書において使用される「対象」という用語は、本発明の方法が実施される任意の個体または患者を意味する。一般に、対象はヒトであるが、対象は動物でもよいことが当業者には認識されるであろう。したがって、げっ歯動物(マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットを含む)、ネコ、イヌ、ウサギ、雌ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどを含む家畜、および霊長類(サル、チンパンジー、オランウータン、およびゴリラを含む)などの哺乳動物を含む他の動物が、対象の定義に含まれる。
【００２６】
高血糖症および/またはそれに関連する障害の例示的な特徴付けには、糖尿病前症、2型糖尿病、1型糖尿病、耐糖能障害、多嚢胞性卵巣症候群、非アルコール性脂肪性肝疾患、筋消耗性疾患、検出可能な高血糖症をもたらさないインスリン抵抗性状態、妊娠糖尿病、心血管リスク、および心筋梗塞が含まれるが、それらに限定されるわけではない。例示的な筋消耗性疾患には、癌、AIDS、敗血症、COPD、腎不全、関節炎、うっ血性心不全、筋ジストロフィー、糖尿病、加齢によるサルコペニア、重度の外傷(例えば、肢の整形外科的不動)、代謝性アシドーシス、脱神経性萎縮、および無重量感が含まれるが、それらに限定されるわけではない。高血糖症および/または糖尿病を有する対象は、正常体重または平均体重であり得ることを理解すべきである。「やせた糖尿病患者」と呼ばれるこのような個体は、体重増加も肥満も示さずに、高血糖症および/または糖尿病に関連する1つまたは複数の症状をしばしば提示する。さらに、過体重または肥満である糖尿病患者の一定の比率は、実際には、糖尿病に加えて過体重/肥満を伴うやせた糖尿病患者である。
【００２７】
「治療的有効量」または「有効量」という用語は、研究者、獣医、医師、または他の臨床医が求めている組織、系、動物、またはヒトの生物学的応答または医学的応答を引き出すと考えられる、化合物または薬学的組成物の量を意味する。
【００２８】
「投与」または「投与する」という用語は、治療を必要とする対象に本発明の化合物または薬学的組成物を提供する行動を含むように定義される。「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、本明細書において使用される場合、経腸投与および局所投与以外の投与様式を意味し、通常は経口または注射により、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内の注射および輸注を含む。「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」、および「末梢に投与される」という語句は、本明細書において使用される場合、中枢神経系への直接投与以外の化合物、薬物、または他の材料の投与を意味し、その結果、それは対象の身体に入り、したがって、代謝および他の同様のプロセス、例えば、皮下投与に供される。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「改善する」または「治療する」とは、高血糖症に関連する臨床的徴候および/または症状が、実施した行為の結果として低減することを意味する。モニターする徴候または症状は、高血糖症に特徴的であり、それらの徴候および状態をモニターするための方法と同様に、当業者には周知であると考えられる。高血糖症に関連する例示的な症状には、正常対象または高血糖症を有さない対象と比較した場合の、血清グルコースレベルの上昇、血清トリグリセリドレベルの上昇、血清インスリンレベルの上昇、および血清非エステル化脂肪酸(NEFA)レベルの上昇が含まれるが、それらに限定されるわけではない。したがって、高血糖症に関連する症状の改善には、血清グルコースレベルの低下、血清トリグリセリドレベルの低下、血清インスリンレベルの低下、血清非エステル化脂肪酸レベルの低下、血漿インスリンレベルの低下、膵臓インスリンレベルの上昇、および骨格筋量の増加が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「低減する(reduce)」および「阻害する」という用語は一緒に使用される。これは、場合によっては、特定のアッセイ法の検出レベルを下回って減少(decrease)を低減(reduce)できることが認識されているためである。したがって、発現レベルまたは活性が、あるアッセイ法の検出レベルを下回って「低減」されているか、または完全に「阻害されている」かは常に明らかであるとは限らない場合がある。それでもなお、本発明の方法による治療の後に、例えば血清インスリンのレベルが、治療前のレベルから少なくとも低下していることは、はっきりと判定できる。
【００３１】
ZAGは、いくつかの生物学的役割の原因とされているが、脂質の動員および利用を調節するアディポカインとしての役割が、身体組成を調節する上で最も重要である。以前の研究により、タンパク質合成の増加は、β-アドレナリン受容体との相互作用を通じた環状AMPの増加に起因するのに対し、タンパク質分解の減少は、ユビキチン-プロテアソームタンパク質分解経路の活性低下に起因することが示唆された。db/dbマウスにおける研究により、インスリン抵抗性が、ユビキチン-プロテアソーム経路の活性上昇を通じて筋消耗を引き起こすことが示されている。PKRおよびeIF2αの両方のリン酸化が増加すると、翻訳開始を妨害することによってタンパク質合成が減少するのに対し、PKRが活性化されると、核因子κB(NF-κB)の活性化を通じてタンパク質分解が増加して、プロテアソームサブユニットの発現を増大させる。高レベルの細胞外グルコースの存在下で筋管を用いたインビトロの研究により、PKRの活性化が、p38MAPKの活性化および活性酸素種(ROS)の形成を招くことが示された。p38MAPKは、cPLA2のSer-505の位置をリン酸化および活性化して、ROS供給源であるアラキドン酸の放出を引き起こすことができる。骨格筋におけるp38MAPKの過剰活性化が、食餌誘発性の肥満モデルにおいて観察されている。さらに、カスパーゼ-3活性は、糖尿病動物の骨格筋において上昇していることも示されており、これは、PKRを切断して活性化をもたらすことができるため、シグナル伝達カスケードの一部分であり得る。理論に拘束されるわけではないが、ZAGがこれらのシグナル伝達経路を弱める能力は、筋量を増加させるその能力に関する説明を与える。
【００３２】
したがって、別の局面において、本発明は、対象の骨格筋量を増加させる方法を提供する。この方法は、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片を対象に投与する段階を含む。
【００３３】
さらに、ZAGは、成体雄マウスにおいてグルコース酸化を増加させ、組織グルコース代謝速度を速めることも示されている。このグルコース利用の増大は、ZAGを投与されたob/obマウスにおける血中グルコースレベルおよび血中インスリンレベルの両方の降下の説明となると思われる。また、トリグリセリド利用も、ZAGを投与されたマウスにおいて増加していた。これは、脂肪分解の増加を示す血漿グリセロールの増加にもかかわらず、血漿非エステル化脂肪酸(NEFA)および血漿トリグリセリド(TG)が減少していることの説明となると思われる。この脂質利用の増加は、体温上昇をもたらす、BAT中のUCP1およびUCP3ならびに骨格筋中のUCP3の発現増大から予想される。したがって、1つの態様において、高血糖症に関連する症状の改善には、治療期間中の約0.5℃〜約1℃の体温上昇も含まれる。1つの態様において、体温上昇は、治療開始から4日以内に起こる。別の態様において、ZAGの存在の結果として、血中グルコースを制御するのに必要とされるインスリンが減るため、高血糖症に関連する症状の改善には、治療前の膵臓インスリンレベルと比較した場合の、膵臓インスリンの増加も含まれる。
【００３４】
したがって、ZAGは、脂肪分解ホルモンによって誘発されるものに類似したGTP依存性プロセスにおいて、マウスの白色脂肪細胞における脂肪分解を誘発できる脂質動員因子として同定される。本明細書において提示するデータは、ラットZAGとヒトZAGの配列相同性は59.4％にすぎないという事実はあるものの、ZAGがラット脂肪細胞において同様の脂肪分解効果を有し、さらに、成熟雄ラットにおいて体重および屠体脂肪の減少をもたらすことを示すことによって、これらの知見を裏付ける。
【００３５】
ZAGはまた、血漿インスリンレベルの低下を含めて糖尿病状態の代謝特徴のいくつかを阻止し、耐糖能試験の応答を改善した。したがって、別の局面において、本発明は、対象の血漿インスリンレベルを低下させる方法を提供する。この方法は、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片の治療的に有効な投与量を対象に投与する段階を含む。1つの態様において、血漿インスリンの減少は、治療開始から3日以内に起こる。別の態様において、治療計画は、10日またはそれ以上の間、実施される。別の態様において、治療計画は、21日またはそれ以上の間、実施される。
【００３６】
さらに、ZAGは、β3-アドレナリン作動性刺激物の脂肪分解作用に対する精巣上体脂肪細胞の応答性を高める。ZAGはまた、肥満のインスリン耐性状態では低下していることが見出されている、精巣上体脂肪組織におけるHSLおよびATGLの発現を増大させる。HSLおよびATGLの発現を調節する因子は公知ではない。しかしながら、特異的ERK阻害物質であるPD98059がZAGに応答してHSL発現を下方調節したことから、このプロセスにおけるMAPKの役割が示唆された。MAPKホスファターゼ-1を欠くマウスは、WAT中のERKおよびp38MAPKの活性が上昇しており、エネルギー消費が亢進しているため、食餌誘発性肥満に抵抗性である。以前の研究により、ZAGに誘発された骨格筋でのUCP3発現におけるMAPKの役割が示唆されている。ERK活性化は、HSLのセリン残基、例えば、プロテインキナーゼAによってリン酸化される部位の内の1つであるSer-600をリン酸化することによって、脂肪細胞における脂肪分解を調節し得る。
【００３７】
本明細書において提示する結果から、ラットへのZAG投与もまた、ラットにおけるATGLおよびHSLの発現を増大させることが示される。ATGLノックアウトマウスは、正常なインスリン感受性を示したにもかかわらず、多量の脂肪沈着物を有し、イソプロテレノールに応答したWATからのNEFA放出は減少していたため、ATGLは、肥満における過剰な脂肪貯蔵において重要であり得る。一方、HSL欠損マウスは、正常な食餌を給餌された場合、野生型動物と同様の体重を有していた。しかしながら、ヒトWATにおけるATGLおよびHSLの両方の発現は、インスリン感受性状態と比較して、肥満のインスリン抵抗性状態において低下しており、体重低下はまた、mRNAレベルおよびタンパク質レベルを低下させた。
【００３８】
したがって、1つの態様において、高血糖症に関連する症状の改善には、治療期間中の褐色脂肪組織における脱共役タンパク質-1(UCP1)および脱共役タンパク質-3(UCP3)の発現増大も含まれる。別の態様において、高血糖症に関連する症状の改善には、治療期間中の骨格筋におけるUCP3の発現増大も含まれる。
【００３９】
エネルギーシンクがなくても、遊離されたNEFAは脂肪細胞において再合成されてトリグリセリドに戻ると思われるため、脂肪分解の促進だけでは、体脂肪貯蔵は枯渇しないと思われる。体脂肪を減少させるために、ZAGは、血漿グリセロールの増加によって示されるように脂肪分解を増加させるだけでなく、トリグリセリドおよびNEFAの血漿レベルの低下によって示されるように脂質利用も増加させる。ZAGで処置したラットの体温が0.4℃上昇することによって証明される通り、このエネルギーは、熱に向けられる。エネルギー利用の増加は、ZAG投与後にBATおよびWATの両方で示されているUCP1の発現増大に起因する可能性が最も高い。UCP1の発現増大は、NEFAの血漿レベルを低下させると予想され、これは、それらがBATにおける熱産生のための主要基質であるためである。また、BATは、高いグルコース利用能も有し、これは、血中グルコースの減少をある程度説明し得る。さらに、骨格筋およびWATにおけるGLUT4発現も増大していた。これは、インスリンの存在下でグルコース取込み増加を実現するのに寄与する。ZAGで処置したマウスにおいて、脳、心臓、BAT、および腓腹筋によるグルコース利用/酸化の増加、ならびにD-[U-14C]グルコースおよび[14Cカルボキシ]トリオレインからの14CO2産生の増加があった(図24)。また、ZAG投与後のob/obマウスのBATによる酸素取込みは3倍に増加していた。
【００４０】
ZAGは、精巣上体脂肪細胞におけるHSL発現を増大させたが、皮下脂肪細胞でも内臓脂肪細胞でも増大はなかった。脂肪トリグリセリドリパーゼ(ATGL)の発現に関して、同様の状況が観察された。HSLおよびATGLの発現は、活性(ホスホ)型ERKの発現と相関関係があった。精巣上体脂肪細胞におけるHSLおよびATGLの発現は、β3作動物質BRL37344に対する脂肪分解応答の高まりと相関関係があった。この結果から、ZAGがβ3作動物質と相乗的に作用し得ることが示唆される。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「作動物質」という用語は、完全または部分的な薬理学的応答を誘発できる作用物質または類似体を意味する。例えば、作動物質は、受容体に生産的に結合し、それに対する生理学的反応を模倣することができる。したがって、本発明の方法は、BRL37344のようなβ3作動物質と組み合わせて、ZAGまたはその断片を投与する段階をさらに含んでよい。
【００４２】
ZAGによるラット脂肪細胞における脂肪分解の誘発は、β3-ARによって媒介されることが示唆されており、脂肪組織および除脂肪体重に対するZAGの影響もまた、β3-ARを刺激するその能力の寄与による可能性がある。ZAGによるUCP1発現の誘発は、β3-ARとの相互作用によって媒介されることが示されている。WATにおけるUCP1発現の増大もまた、β3-AR作動物質CL316,243の場合に起こるように、褐色脂肪細胞前駆体の再構築を介したβ3-ARの影響であり得る。ノックアウトマウスを使用して、β3-AR刺激の抗肥満効果は、WATから放出されたNEFAのUCP1依存性分解を通して、BAT中のUCP1が主に寄与し、それより低い貢献度でUCP2およびUCP3が寄与するとした。動物の末梢組織中へのグルコース取込みは寒冷曝露によって促進され、同様にβ3-ARによって媒介される効果である。しかしながら、β3-ARは、ヒト皮下腹部脂肪組織における脂肪分解および栄養血流を制御する際にβ1-ARサブタイプおよびβ2-ARサブタイプよりも目立たない役割を果たすため、β3-ARのターゲティングは、げっ歯動物よりもヒトにおいてより困難である。しかしながら、これにもかかわらず、β3-AR作動物質CL316,243は、健常な若年男性ボランティアにおいて脂肪酸化を増加させることが示されている。これは、BATに由来する形質膜中のβ3-ARの数を増加させるβ-アドレナリン作動物質の能力に起因する可能性がある。
【００４３】
最近の結果から、脂肪組織におけるZAG発現は、傍分泌様式で作用することにより、循環血中ZAGよりも局所的に重要となり得ることが示唆されている。したがって、ヒトにおいて、内臓脂肪および皮下脂肪中のZAGのmRNAレベルは、BMI、体脂肪量、およびインスリン抵抗性と負の相関関係があり、ELISAによって測定された血清レベルは、脂肪症のパラメーター(BMIおよび胴囲)ならびにインスリン抵抗性と正の相関関係があった。したがって、腓腹筋、WAT、およびBATにおいてそれ自身の発現を誘発するZAGの能力は、脂肪分解およびエネルギー利用を増加させるその能力のために不可欠であり得る。
【００４４】
これらの結果から、ラットにおいて脂質を動員および利用するZAGの能力の証拠が提供されて、種に依存しない効果が確認され、かつ、ヒトにおける抗肥満物質としてそれが有用であり得ることが示唆される。したがって、別の局面において、本発明は、体重低下または肥満軽減をもたらすために対象を治療する方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要としている対象に、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片と組み合わせて、β3作動物質の治療的に有効な投与量を投与する段階を含む。別の態様において、体重低下または肥満軽減をもたらすために対象を治療する方法は、そのような治療を必要としている対象に、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片と組み合わせて、β3-AR拮抗物質の治療的に有効な投与量を投与する段階を含む。
【００４５】
すべての方法は、活性成分(例えば、ZAGまたはZAGの機能的断片)を、1種または複数種の補助成分を構成する薬学的に許容される担体と結びつける段階をさらに含んでよい。したがって、本発明はまた、高血糖症に関連する症状を有する対象を治療する際に使用するための薬学的組成物も提供する。1つの態様において、組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤の希釈液と共に、治療的有効量の上記のZAGもしくは糖タンパク質脂質動員因子、または脂肪分解について活性なその断片を活性構成成分として含む。
【００４６】
対象に投与するための組成物を製剤化するのに有用な薬学的に許容される担体は当技術分野において周知であり、例えば、水もしくは緩衝化生理食塩水などの水溶液、または、グリコール、グリセロール、オリーブ油のような油、もしくは注射可能な有機エステルなどの他の溶媒もしくはビヒクルが含まれる。薬学的に許容される担体は、例えば、結合体の吸収を安定させるか、または増加させるように作用する生理学的に許容される化合物を含んでよい。このような生理学的に許容される化合物には、例えば、グルコース、スクロース、もしくはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸もしくはグルタチオンなどの抗酸化物質、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定化剤もしくは賦形剤が含まれる。当業者は、生理学的に許容される化合物を含む薬学的に許容される担体の選択が、例えば、治療物質の物理化学的特徴および組成物の投与経路に依存することを知っているはずである。この投与経路は、経口的もしくは非経口的、例えば、静脈内でよく、注射、挿管、または当技術分野において公知である他のそのような方法によってよい。また、薬学的組成物は、診断薬、栄養物質、毒素、または治療物質、例えば、癌化学療法剤および/またはビタミンなどの第2の(またはさらに別の)化合物も含んでよい。
【００４７】
経口投与に適した本発明の製剤は、粉末もしくは顆粒の形態の所定の量の活性化合物をそれぞれ含むカプセル剤、カシェ剤、錠剤、もしくはロゼンジなど個別の単位として;または、1回分のシロップ剤、エリキシル剤、乳剤など、水性液体もしくは非水性液体に溶かした活性化合物の懸濁剤として、提供されてよい。
【００４８】
したがって、別の局面において、本発明は、高血糖症に関連する症状および/または状態を治療するためのヒト医学において有用な医薬を製造するための、本明細書において定義するZAGまたは脂質動員物質の使用を提供する。このような医薬はまた、筋肉発達を促進し筋量を増加させるため、血清グルコースレベルを低下させるため、血清トリグリセリドレベルを低下させるため、血清インスリンレベルを低下させるため、血清非エステル化脂肪酸レベルを低下させるため、血漿インスリンレベルを低下させるため、かつ/または膵臓インスリンレベルを上昇させるためにも有用であり得る。
【００４９】
本発明の方法を実践する際に投与されるべき化合物または組成物の総量は、ボーラスもしくは比較的短期間に及ぶ輸注のいずれかとして単一用量として対象に投与されてもよいか、または、複数用量を長期間にわたって(例えば、1日1回、1日2回など)投与する、分割された治療プロトコールを用いて投与されてもよい。当業者は、対象の高血糖症に関連する症状を治療するためのZAGまたはその機能的断片の量が、対象の年齢および全体的健康状態、ならびに投与経路および施そうとする治療回数を含む多数の因子に依存することを知っているはずである。これらの因子を考慮して、当業者は、必要に応じて具体的な用量を調整する。一般に、薬学的組成物の処方ならびに投与の経路および頻度は、第I相および第II相の臨床試験を用いて最初に決定される。
【００５０】
したがって、一定の態様において、本発明の方法は、間隔を空けた治療計画を含む。ob/obマウスにおける長期のZAG連日投与により、体重減少が停止されることが観察された。したがって、1つの態様において、治療は1日おきに施される。別の態様において、治療は2日毎に施される。別の態様において、治療は3日毎に施される。別の態様において、治療は4日毎に施される。
【００５１】
したがって、本発明は、ZAG投与が約3〜4日間中断され、続いて再輸注される場合、さらなる体重減少および/または高血糖症に関連する症状の改善が起こることを実証する。理論に拘束されるわけではないが、これは、過剰な量が投与されているため、またはTNFで認められるように受容体脱感作が存在するためである可能性がある。各群マウス2匹を用いた予備研究を実施したところ、約3週間で90gマウスから8〜10gの体重減少が観察された。したがって、より少ない投与量のZAGまたはその機能的断片が、肥満の低減または体重低下が観察可能になる前に、対象の高血糖症の症状を改善するために使用され得ることが企図される。
【００５２】
以下の実施例は、本発明の利点および特徴をさらに例示するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図しない。それらは、使用され得るものを代表するものの、当業者に公知である他の手順、方法論、または技術を代わりに使用してもよい。
【実施例】
【００５３】
実施例1
亜鉛-α2-糖タンパク質は高血糖症を軽減する
亜鉛-α2-糖タンパク質(ZAG)が肥満および高血糖症を軽減する能力を評価するために、ob/obマウスにZAGを投与したところ、体重減少および体温上昇が誘発され、エネルギー消費の増加が示唆された。褐色脂肪組織における脱共役タンパク質-1および脱共役タンパク質-3の発現は増大したのに対し、脂肪分解の増加を示すグリセロールは増加したものの、グルコース、トリグリセリド、および非エステル化脂肪酸の血清レベルは低下した。脂肪細胞および骨格筋中へのグルコース取込みの増加と共に、血漿インスリンの減少および静脈内グルコースに対する応答の改善があった。精巣上体脂肪細胞中のホルモン感受性リパーゼの発現は増大した。タンパク質合成の増加および分解の減少が原因で、骨格筋量の増加があった。このことから、高血糖症の治療においてZAGが有効であり得ることが示唆される。
【００５４】
ダルベッコ改変イーグル(DMEM)培地およびFreestyle培地はInvitrogen(Paisley, UK)から購入し、ウシ胎児血清はBiosera (Sussex, UK)から購入した。2-[1-14C]デオキシ-D-グルコース(比放射能(sp.act.)1.85GBq mmol-1)およびL-[2,6-3H]フェニルアラニン(比放射能37Bq mmol-1)は、American Radiolabeled Chemicals (Cardiff, UK)から入手した。ホスホ(Thr-202)ERK1および全ERK1、全p38MAPK、ホスホHSL(Ser-552)、グルコース輸送担体4(GLUT4)、脂肪トリグリセリドリパーゼ、ホルモン感受性リパーゼ、およびホスホPLA2(Ser-505)、ならびにヒトATGLに対するウサギポリクローナル抗体は、Abcam(Cambridge, UK)から購入した。完全長ヒトZAGに対するマウスモノクローナル抗体はSanta Cruz(California, USA)から入手し、II型ミオシン重鎖に対するマウスモノクローナル抗体はNovacastra (Leica Biosystems, Newcastle, UKを介して)から入手した。20Sプロテアソームαサブユニットおよびp42に対するマウスモノクローナル抗体は、Affiniti Research Products (Exeter, UK)から入手した。ホスホ(Thr-180/Tyr-182)p38MAPKに対するマウスモノクローナル抗体、ならびに全PKRおよびホスホ(Thr-451)PKR、ホスホ(Ser-162)eIF2α、および全eIF2αに対するウサギポリクローナル抗血清は、New England Biosciences (Herts, UK)から入手した。UCP1、UCP3、および全PKRに対するポリクローナルウサギ抗体、ならびにPHOSPHOSAFE(商標)Extraction Reagentは、Calbiochem(Merk Chemicals, Nottingham, UKを介して)から入手した。ペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗ウサギ抗体およびウサギ抗マウス抗体は、Dako(Cambridge, UK)から購入した。マウスβアクチンに対するポリクローナルウサギ抗体およびトリグリセリドアッセイキットは、Sigma Aldrich (Dorset, UK)から購入した。ハイボンド(Hybond)Aニトロセルロース膜および高感度ケミルミネッセンス(ECL)発色キットは、Amersham Pharmacia Biotech(Bucks, UK)から入手した。NEFA用のWAKO比色アッセイキットはAlpha Laboratories(Hampshire, UK)から購入し、マウスインスリンELISAキットはDRG(Marburg, Germany)から購入した。Boots(Nottingham, UK) 血漿グルコースキットを用いて、グルコース測定を行った。
【００５５】
組換えZAGの作製
HEK293F細胞を、発現ベクターpcDNA3.1中の完全長ヒトZAG cDNAでトランスフェクトし、37℃、大気中CO2濃度5％の雰囲気下、FreeStyle培地中で維持した。ZAGが培地中に分泌され、これを採取した。最大タンパク質レベル(16μgml-1)は14日間の培養後に得られた。ZAGを精製するために、培地(200ml)を700gで15分間遠心分離して細胞を除去し、カットオフ値10kDaのAmicon Ultra-15遠心ろ過機を用いて体積1mlの無菌PBS中に濃縮した。この濃縮物(タンパク質約2mg)を、20mlの10mM Tris, pH8.8中に懸濁したDEAEセルロース2gに添加し、4℃で2時間攪拌した。DEAEセルロースはZAGを結合した。遠心分離(1500gで15分間)によってこれを沈降させ、0.3M NaClを含む20mlの10mM Tris, pH8.8と共に4℃で30分間攪拌することによってZAGを溶出させた。この溶出物を洗浄し、Amicon遠心ろ過機を用いて無菌PBS中で体積1mlに濃縮した。LAL Pyrogentシングルテストキット(Lonza, Bucks, UK)を用いて測定される通りに、精製されたZAGはエンドトキシンを含まなかった。
【００５６】
細胞培養およびZAG精製
先に説明した通りに95％酸素:5％CO2の雰囲気下で、1.5mgml-1コラゲナーゼ、および4％ウシ血清アルブミンを含むクレブスリンガー重炭酸緩衝液中、37℃で2時間インキュベーションすることによって、刻んだ脂肪沈着物から白色脂肪細胞の単細胞懸濁物を調製した。経時変化研究のために、10％ウシ胎児血清を含むDMEM中に、細胞105個/mlの濃度で脂肪細胞を懸濁し、37℃、大気中CO2濃度10％の雰囲気下で維持した。ヒトZAGを含むプラスミドでトランスフェクトされたヒト293細胞を、FreeStyle培地中に細胞105個/mlの濃度で播種し、37℃、大気中CO2濃度5％の雰囲気下で維持した。最大タンパク質レベル(16μgml-1)は14日間の培養後に得られた。次いで、培地(200ml)を700gで15分間遠心分離して細胞を除去し、カットオフ値10kDaのAmicon Ultra-15遠心ろ過機を用いて体積1mlの無菌PBS中に濃縮した。この試料(約2mg)のタンパク質濃度を測定した後、20mlの10mM Tris, pH8.8中に懸濁したDEAEセルロース2gにそれを添加し、4℃で2時間攪拌した。負に帯電したZAGはDEAEセルロースに結合する。これを遠心分離(1500gで15分間)によって沈降させ、0.3M NaClを含む20mlの10mM Tris、pH8.8と共に4℃で30分間攪拌することによって溶出させた。上清を洗浄し、Amicon遠心ろ過機を用いて無菌PBS中で体積1mlに濃縮した。
【００５７】
動物―マウス
Aston Universityで維持されている集団に由来するホモ接合性肥満(ob/ob)マウスを本研究において使用した。Aston ob/obマウスの起源および特徴は以前に説明されている。雄マウス(20〜21週齢、体重90〜100g)を、12時間明期:12時間暗期のサイクル下の22±2℃に空調された部屋に置いたケージ1個当たり3匹にグループ分けし、ラットおよびマウスの飼育用餌(Special Diet Services, Witham, UK)および水道水を適宜与えた。PBS(100μl)に溶かしたZAG(35μg)を1日2回、静脈内投与によってそれらに投与し、体重ならびに食物および水の摂取量を毎日モニターした。対照マウスにはPBSのみを与えた。直腸温度計(RS Components, Northants, UK)を用いて、体温を毎日測定した。動物実験はすべて、英国動物(科学的処置)法1986(U.K. Animals (Scientific Procedures) Act 1986)に従って実施した。ZAG投与後に有害作用は全く観察されなかった。
【００５８】
動物―ラット
体重540±82.5gの雄成熟ウィスターラット(本発明者ら自身の集団に由来する1歳)を個別に収容し、PBS(100μl)に溶かしたZAG(体重100g当たり50μg)または対照としてのPBS(100μl)のいずれかを1日1回静脈内投与して処置した。食物および水の摂取量ならびに体重の両方を毎日測定した。動物は、食物(Special Diet Services, Essex, UK)および水に適宜、自由に接近できるようにした。動物実験は、英国内務省(British Home Office)によって課される福祉条件下で実施した。10日間の処置後、動物を屠殺し、体組成を測定した。重量が一定になるまで、動物を80〜90℃まで7日間加熱した。次いで、湿重量と乾燥重量の差から、水含有量を決定した。Lundholm et al (14)によって説明されている通りに、クロロホルム:メタノール(1:1)、エタノール/アセトン(1:1)、およびジエチルエーテル(各120ml)を順番に用いて、乾燥した屠体から脂質を抽出した。溶媒を蒸発させ、脂肪を計量した。屠体の初期重量と水および脂肪の重量との差として、脂肪以外の屠体質量を計算した。
【００５９】
脂肪分解アッセイ法
分析しようとする試料を、クレブスリンガー重炭酸緩衝液(pH7.2)1ml中で105〜2×105個の脂肪細胞と共に2時間インキュベートした。放出されたグリセロールの濃度を、Wieland(Wieland, O. Glycerol UV method. In Methods of Enzymatic Analysis(Bergmeyer, H.U.編)(Academic Press, London, UK, pp 1404-1409, 1974))の方法を用いて酵素学的に測定した。脂肪細胞のみを含む対照試料を分析して、自発的グリセロール放出を測定した。活性は、放出されたグリセロール(μmol)/脂肪細胞105個/2時間として表した。
【００６０】
血清代謝産物の測定
Wako-ASC-ACODキット(Wako Chemical GmbH, Neuss, Germany)を用いて、非エステル化脂肪酸(NEFA)を測定した。トリグリセリドはTriglycerideキット(Sigma Chemical Co., Poole, United Kingdom)を用いて測定し、3-ヒドロキシブチラートは、定量的酵素学的測定キット(Sigma)を用いて測定した。グルコースは、グルコース分析機器(Beckman, Irvine, Calif.)を用いて測定し、グリセロールは、Academic Press, Londonによって出版された(1974)「Methods of Enzymatic Analysis」(Bergmeyer, H. U.編) 第3巻、pp1404-1409,において説明されているWielandの方法を用いて酵素学的に測定した。
【００６１】
マウス脂肪細胞形質膜の単離
典型的な手順では、白色脂肪細胞は、250mMスクロース、2mMエチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'(EGTA)、10mM Tris-HCl(pH7.4)中で細胞を洗浄することを除いては前述した通りに、マウス精巣上体脂肪パッドから単離した。上記の緩衝液20ml中に脂肪細胞を再懸濁し、吸引して少なくとも10回Swinnyフィルターを通過させることによってホモジナイズした。次いで、この細胞ホモジネートを300gで5分間遠心分離し、堅い脂肪層(fat cake)を表面から除去し、残存する沈殿物および下澄を清潔な試験管に移した。これらを30,000g、4℃で1時間遠心分離し、形成された膜沈殿物をスクロース緩衝液(200〜400μl)中に再懸濁した。形質膜を、PERCOLL(商標)コロイドシリカ粒子の自己形成勾配を用いて、他の細胞小器官膜から分別した。構成成分は、膜懸濁液と共に32:7:1の比率で混合した、250mMスクロース、2mM EGTA、10mM Tris-HCl、pH7.4; PERCOLL(商標);および2Mスクロース、8mM EGTA、80mM Tris-HCl、pH7.4であった(合計体積8ml)。この混合物を10,000g、4℃で30分間遠心分離した。この勾配を0.75mlずつに分割し、コハク酸デヒドロゲナーゼ、NADH-シトクロムcレダクターゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、および5'-ヌクレオチダーゼの存在について各ポーションを分析して、形質膜画分の位置を特定した。これらの膜画分を150mM NaCl、1mM EGTA、10mM Tris-HCl、pH7.4中に再懸濁し、10,000g、4℃で2分間、遠心分離した。このプロセスを2回繰り返した。次いで、洗浄した形質膜を、10mM Tris-HCl、pH7.4、250mMスクロース、2mM EGTA、および4μMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)中で1〜2mg/mlの濃度に希釈し、液体窒素中で急速凍結し、使用するまで-70℃で保存した。
【００６２】
ラット脂肪細胞における脂肪分解活性
説明されている通りに(Beck SA, et al. Production of lipolytic and proteolytic factors by a murine tumor-producing cachexia in the host. Cancer Res 47:5919-5923, 1987)、コラゲナーゼ消化を利用して、雄ウィスターラット(400g)の細かく刻んだ精巣上体脂肪組織から白色脂肪細胞を調製した。脂肪分解活性は、クレブスリンガー重炭酸緩衝液(pH7.2)1ml中で2時間、105〜2×105個の脂肪細胞をインキュベートすることによって測定し、脂肪分解の程度は、放出されたグリセロールを測定することによって決定した(Wieland O. Glycerol UV method. Methods of Enzymatic Analysis, Bergmeyer HU.編、Academic Press, London, pp 1404-1409, 1974)。自発的グリセロール放出は、脂肪細胞のみをインキュベートすることによって測定した。脂肪分解活性は、放出されたグリセロール(μmol)/脂肪細胞105個/2時間として表した。
【００６３】
ゲル電気泳動
ゲルは、Laemmliの方法に従って調製し、通常、5％濃縮ゲルおよび15％SDS-PAGE分離ゲル(変性条件もしくは還元条件)または10％SDS-PAGE分離ゲル(非変性条件もしくは非還元条件)からなった。1〜5μg/レーンの試料を添加した。クーマシーブリリアントブルーR-250または銀のいずれかで染色することによって、バンドを可視化した。0.0625M Tris-HCl、pH6.8、10％グリセロール、1％SDS、0.01％ブロモフェノールブルー、および5％ 2-メルカプトエタノール中、100℃で5分間加熱することによって、試料を還元条件用に調製した。
【００６４】
脂肪細胞中へのグルコース取込み
単離した脂肪細胞(5×104個)をクレブスリンガー重炭酸緩衝液、pH7.2(KRBS)1ml中で2回洗浄し、18.5MBq 2-[1-14C]デオキシ-D-グルコースおよび非放射性2-デオキシ-D-グルコースを最終濃度0.1mMまで含むKRBS 0.5ml中、室温で10分間、さらにインキュベートした。氷冷したグルコース無添加KRBS 1mlを添加することによって取込みを終結させ、細胞をKRBS 1mlで3回洗浄し、1M NaOH 0.5mlの添加によって溶解し、室温で少なくとも1時間放置した後、液体シンチレーション計数によって放射能を測定した。
【００６５】
腓腹筋中へのグルコース取込み
腓腹筋をクレブス・ヘンゼライト重炭酸緩衝液中、37℃で45分間、インキュベートし、次いで、185M Bq 2-[1-14C]デオキシ-D-グルコースおよび非放射性2-デオキシ-D-グルコースを最終濃度0.1mMまで含むクレブス・ヘンゼライト緩衝液5ml中でさらに10分間、インキュベートした。次いで、筋肉を取り出し、0.9％NaCl中で5分間洗浄し、続いて、1M NaOH 0.5ml中に溶解させ、液体シンチレーション計数によって放射能を測定した。
【００６６】
ヒラメ筋中へのグルコース取込み
ヒラメ筋をクレブス・ヘンゼライト重炭酸緩衝液中、37℃で45分間、インキュベートし、次いで、185MBq 2-[1-14C]デオキシ-D-グルコースおよび非放射性2-デオキシ-D-グルコースを最終濃度0.1mMまで含むクレブス・ヘンゼライト緩衝液5ml中でさらに10分間、インキュベートした。次いで、筋肉を取り出し、0.9％NaCl中で5分間洗浄し、続いて、1M NaOH 0.5ml中に溶解させ、液体シンチレーション計数によって放射能を測定した。
【００６７】
筋肉におけるタンパク質の合成および分解
筋肉におけるタンパク質の合成および分解を測定するための方法は、以前に説明されている(Smith, K.L.およびTisdale, M.J. Increased protein degradation and decreased protein synthesis in skeletal muscle during cancer cachexia. Br. J. Cancer 67, 680-685 (1993))。結紮糸を用いて腓腹筋を切り出し、フェノールレッドを含まずO2:CO2(19:1)で飽和させたRPMI 1640培地中、37℃で30分間インキュベートし、次いで、PBSで洗浄した。フェノールレッドを含まずO2:CO2(19:1)で飽和させたRPMI/640中、37℃で筋肉をインキュベートした2時間を利用して、酸不溶性材料中へのL-[2,6-3H]フェニルアラニン(640MBq)の組入れに基づいてタンパク質合成を測定した。次いで、筋肉を非放射性培地中ですすいで、ブロットし、2％過塩素酸中でホモジナイズした。タンパク質に結合した放射能の量を酸可溶性放射能の量で割ることにより、タンパク質合成の比率を算出した。5mMグルコースおよび0.5mMシクロヘキシミドを含む酸素添加されたクレブス・ヘンゼライト緩衝液(pH7.4)3ml中での2時間にわたって腓腹筋からのチロシン放出に基づいて、タンパク質分解を測定した。
【００６８】
プロテアソーム活性およびカスパーゼ活性の測定
プロテアソームの「キモトリプシン様」活性は、筋管に関して以前に説明されている通りに(Whitehouse, A.S.およびTisdale, M.J. Increased expression of the ubiquitin-proteasome pathway in murine myotubes by proteolysis-inducing factor (PIF) is associated with activation of the transcription factor NF-κB. Br. J. Cancer 89, 1116-1122 (2003))、蛍光原基質N-スクシニルLys Lys Val Tyr. AMC(SEQ ID NO: 2)からの、励起波長360nmおよび発光波長460nmにおける7-アミド-4-メチルクマリン(AMC)の放出を測定することにより、蛍光分析によって測定した。20mM Tris、pH7.5、2mM ATP、5mM MgCl2、および50mM DTT中、4℃で腓腹筋をホモジナイズし、超音波処理し、18,000g、4℃で10分間遠心分離して不溶性材料を沈殿させ、得られた上清を、プロテアソーム阻害物質であるラクタシスチン(10μM)の存在下または不在下での「キモトリプシン様」酵素活性を測定するために使用した。ラクタシスチンで抑制可能な活性のみを、真のプロテアソーム活性とみなした。カスパーゼ-3(AcAspGluValAsp-CHO)(SEQ ID NO: 5)またはカスパーゼ-8(Ile Glu Phe Thr Asp-CHO)(SEQ ID NO: 6)の阻害物質(100μM)の存在下または不在下で、上記から得た上清(タンパク質50μg)およびカスパーゼ-3基質またはカスパーゼ-8基質のいずれか(10μM)を37℃で1時間使用して、AcAsp.Gly.Val.Asp.AMC (SEQ ID NO: 3)からのAMCの放出に基づいてカスパーゼ-3の活性を測定し、特異的基質Z-Ile Glu Phe Thr Asp-AFC(SEQ ID NO: 4)からの7-アミノ-4-トリフルロメチルクマリン(AFC)の放出に基づいてカスパーゼ-8の活性を測定した。AFCに起因する蛍光増加を前述の通りに測定し、励起波長400nmおよび発光波長505nmを用いて、AFCに起因する蛍光増加を測定した。カスパーゼ阻害物質の不在下での値と存在下での値の差を活性の指標とした。
【００６９】
ウェスタンブロット解析
新しく切り出した腓腹筋をPBS中で洗浄し、室温で5分間、PHOSPHOSAFE(商標)抽出試薬中に溶解し、続いて、4℃で超音波処理した。18,000g、4℃で5分間の遠心分離によって溶解物を清澄化し、細胞質タンパク質の試料(5μg)を、180Vで約1時間の12％ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離させた。これに続いて、0.45μmニトロセルロース膜に移し、次いで、この膜を4℃で一晩、Tris緩衝生理食塩水(pH7.5)中5％Marvelでブロックした。抗ミオシン(1:250)以外は、一次抗体および二次抗体の両方とも希釈率1:1000で使用した。室温で1時間インキュベーションし、ECLによって顕色させた。濃度計によってブロットを調査して、差を定量化した。
【００７０】
ZAGまたはPBSで5日間処置したラットから切り出した精巣上体のWAT、BAT、および腓腹筋の試料を0.25Mスクロース、1mM HEPES、pH7.0、および0.2M EDTA中でホモジナイズし、次いで、4,500rpmで10分間遠心分離した。細胞質タンパク質(10μg)の試料を12％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離させ、次いで、4℃で一晩、Tris緩衝生理食塩水(pH7.5)中5％Marvelでブロックしておいた0.45μmニトロセルロース膜にこれらのタンパク質を移し、PBS中0.1％Tweenで15分間の洗浄を4回行った後、室温で1時間、二次抗体とのインキュベーションを実施した。顕色はECLによって行った。
【００７１】
統計学的解析
これらの結果を、少なくとも3回の反復実験の平均値±SEMとして示す。群間の平均値の差は、一元配置分散分析(ANOVA)とそれに続くテューキー・クレーマー(Tukey-Kramer)の多重比較試験によって決定した。0.05未満のP値を有意とみなした。
【００７２】
結果―マウス
ZAGの精製により、純度が95％を上回る(図1A)産生物が得られ、イムノブロッティングによってZAGであることが確認された(図1B)。ZAGは、精巣上体脂肪細胞において脂肪分解を促進したが(図1D)、皮下沈着物および内臓沈着物の両方に由来する脂肪細胞において、脂肪分解作用は、基本レベルよりは有意に高かったものの、かなり低かった(図1E)。ZAGの方が、モル濃度ベースで、イソプレナリンよりも脂肪分解を誘発する上で強力であったが、どの脂肪細胞群においても、イソプレナリンとZAGとで脂肪分解を促進する程度に有意な差はなかった。5日間にわたるob/obマウスの体重に対するZAGの効果を図1Fに示す。対照動物の体重は変化がないままであったのに対し、ZAGで処置した動物は漸進的な体重減少を示し、その結果、5日後には、実験の過程を通じて食物(PBS 32±3.1g;ZAG 30±2.5g)および水(PBS 140±8.2ml;ZAG 135±3.2ml)の摂取量は等しかったにもかかわらず、これらの群の間で3.5gの体重差があった。4日間のZAG投与後に、基礎代謝率の上昇を示す、0.4℃の有意な体温上昇があった(図1G)。血漿代謝産物レベルの測定により、ZAG処置動物における代謝基質利用の増加が示唆される(表1)。したがって、脂肪分解の増加を示すグリセロール濃度上昇にもかかわらず、ZAG処置動物において、血漿中のグルコース、トリグリセリド(TG)、および非エステル化脂肪酸(NEFA)の有意な減少があった。血漿インスリンレベルが36％減少したことから、糖尿病状態を軽減させる際にZAGが有効であることが示唆された。様々な組織中のZAG mRNAレベルを図1Cに示す。
【００７３】
（表１）ZAGで120時間処置したob/obマウスにおける血漿代謝産物レベルおよび血漿インスリンレベル
2020172540.tif 000004
【００７４】
これを調査するために、3日間のZAG投与後に給餌動物において耐糖能試験を実施した(図2A)。PBS対照では血中グルコースレベルが有意に上昇していたのに対し、ZAG処置動物では少ししか上昇しておらず、研究過程を通して対照群よりも有意に低いままであった。さらに、血漿インスリンレベルも、研究開始時のZAG処置動物において有意に低く、60分間の観察の間、そのままであった(図2B)。ZAG投与により、インスリン不在下での精巣上体脂肪細胞、内臓脂肪細胞、および皮下脂肪細胞中へのグルコース取込みが増加し、また、低濃度(1nM)インスリンの存在下での精巣上体脂肪細胞および内臓脂肪細胞中へのグルコース取込みも増加した(図2C)。腓腹筋中へのグルコース取込みもまた、インスリン(100nM)の不在下および存在下の両方のZAG処置動物において有意に亢進していた(図2D)。ZAG処置マウスの腓腹筋におけるグルコース取込みは、非処置動物のインスリンへの応答よりも大きかった。
【００７５】
またZAG投与により、骨格筋萎縮に対する高血糖症の影響も弱まった。したがって、ZAGで処置したob/obマウスは、腓腹筋およびヒラメ筋の両方の湿重量の有意な増加を示した(表1)。これは、ヒラメ(soles)筋における2倍を超えるタンパク質合成増加(図3A)およびタンパク質分解の60％の減少(図3B)と関連付けられた。ZAGで処置したマウスに由来する腓腹筋は、プロテアソーム「キモトリプシン様」酵素活性の活性低下(図3C)(非肥満マウスで見出された活性と有意な差はなかった)、ならびに20Sプロテアソームα-サブユニット(図3D)およびp42、すなわち19S調節因子のATPアーゼサブユニット(図3E)の両方の発現低下(ユビキチン-プロテアソーム経路の活性低下を示唆する)を示した。ミオシンレベルはZAG処置マウスで上昇していたのに対し(図3F)、アクチンレベルは変化しなかった(図3G)。さらに、腫瘍分解(catabolic)因子によって誘発される筋肉萎縮および高レベルの細胞外グルコースの原因であることが示されているリン酸化型dsRNA依存性プロテインキナーゼ(PKR)(図4A)および真核生物開始因子2α(eIF2α)(図4B)のレベルの低下があった。ホスホリパーゼA2(PLA2)(図4C)、p38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(図4D)ならびにカスパーゼ-3およびカスパーゼ-8(図4E)を含む、この経路の他の酵素もまた、ZAGで処置したob/obマウスの腓腹筋において弱まっていた。これらの変化は、ZAGに応答した筋肉中の異化シグナル伝達の低減と対応していた。
【００７６】
細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)阻害物質PD9805914によって完全に弱められる、脂肪細胞におけるホスホHSLの発現をZAGは増大させたが、イソプレナリンは増大させなかった。ZAGは、精巣上体脂肪細胞におけるHSL発現を増大させたが、皮下脂肪細胞でも内臓脂肪細胞でも増大はなかった(図5B〜5D)。脂肪トリグリセリドリパーゼ(ATGL)の発現に関して、同様の状況が観察された(図5E〜5G)。HSLおよびATGLの発現は、活性(ホスホ)型ERKの発現と相関関係があった(図5H〜5J)。精巣上体脂肪細胞におけるHSLおよびATGLの発現は、β3作動物質BRL37344に対する脂肪分解応答の高まりと相関関係があった(図5K)。この結果から、ZAGがβ3作動物質と相乗的に作用し得ることが示唆される。
【００７７】
以前に報告されている通りに、ZAGを投与すると、脂肪組織におけるその発現が増大した(図6A)。ZAG発現は、ZAGの不在下でさらに3日間組織培養した間、高いままであった(図6B)。脂肪細胞におけるHSL発現もまた、ZAGの不在下で3日間組織培養した間、高かった(図6C)。ZAG投与により、BAT(図6D)におけるUCP1(図6D)およびUCP3(図6E)の発現ならびに骨格筋(図6F)におけるUCP3の発現が増大した。脱共役タンパク質の発現増大は、観察されているように、代謝基質を熱に変えることが予想された(図1G)。
【００７８】
21日後、ob/obマウスの血漿代謝産物レベルを観察した(表2)。モニターしたパラメーターを表3に示す。血中グルコースのさらなる低下(2.03mMから15.2mMへ)およびグリセロールの増加(対照のレベルが以前よりも低いため、より大きいように見える)が観察された。NEFAも、TGも、インスリンも、5日目(表1)と比較した場合の変化は21日目に観察されなかった。ZAG処置動物の膵臓には、はるかに多くのインスリンが存在し、血漿インスリンの低下を示しているが、これは、(例えば、膵臓β細胞に対する毒素を用いた場合に起こると思われるような)インスリン産生の低下に起因するのではなく、むしろ、ZAG処置動物では血中グルコースを制御するのに必要とされるインスリンが少ないことに起因することに注目した。
【００７９】
（表２）ZAGで処置したob/obマウスにおける21日目の血漿代謝産物レベルおよび血漿インスリンレベル
2020172540.tif 000005
【００８０】
（表３）ZAGで処置したob/obマウスにおいて21日目にモニターしたパラメーター
2020172540.tif 000006
【００８１】
さらに、ob/obマウスの体温は、4日以内に0.5℃〜1℃上昇し(図1G)、最大量の体重をそれらが失う直前に38.1℃に達して横ばい状態になった(図7)。これは、対照動物での0.33±0.12gからZAG処置動物での0.52±0.08gに増加する、褐色脂肪組織の重量と相関関係があると思われる(図7)。腓腹筋の重量もまた、0.2±0.05gから0.7±0.1gに増加したのに対し、尿中グルコース排泄は漸進的に減少した(図8Aおよび8B)。
【００８２】
結果―ラット
イソプレナリンと比較した、ラット精巣上体脂肪細胞に対するヒトZAGの脂肪分解作用を図11に示す。233〜700nMの間の濃度で、ZAGは、用量に関連したグリセロール放出増加をもたらし、これは抗ZAGモノクローナル抗体によって弱められたことから、作用の特異性が示された。ラット脂肪細胞における脂肪分解の程度は、マウスで以前に報告されているものと同様であった。マウスの場合のように、ZAGの脂肪分解作用は、β3-アドレナリン作動性受容体(β3-AR)拮抗物質SR59230Aによって完全に弱められたことから、ZAGの作用がβ3-ARによって媒介されることが示唆された。これらの結果から、ラットにおいて脂肪減少を誘発する際にZAGが有効で有り得ることが示唆される。
【００８３】
ZAG(50μg/100g体重)の1日1回の静脈注射が成熟雄ウィスターラット(540±83g)の体重に与える影響を図12Aに示す。同じ体積の溶媒(PBS)を投与された対照ラットと比較して、ZAGを投与されたラットは漸進的な体重減少を示し、その結果、10日後には、PBSで処置したラットは13gの体重増加を示したのに対し、ZAGで処置した動物は5gの体重減少を示した(表4)。研究の過程で2群間の食物摂取量(ZAG:102±32g; PBS:98±25g)にも水摂取量(ZAG:135±35ml; PBS:125±25ml)にも差はなかったが、ZAGで処置した動物は一貫して0.4℃の体温上昇を示し、これはZAGの最初の投与から24時間以内に顕著であったことから(図12B)、エネルギー消費の亢進が示された。身体組成の分析(表4)により、ZAGによって誘発された体重減少が、除脂肪体重の顕著な増加によってある程度相殺される屠体脂肪の減少に起因することが示された。脂肪分解の増加を示す血漿グリセロール濃度の50％の増加がZAGで処置したラットにおいてあった(表5)が、非エステル化脂肪酸(NEFA)の血漿レベルは55％低下したことから、利用の増加が示唆された。また、グルコースおよびトリグリセリドの血漿レベルが36〜37％低下したことからも(表5)、利用の増加が示唆された。10日間ZAGで処置したラットの精巣上体脂肪細胞中への2-デオキシグルコースの取込みの有意な増加があり、これはインスリンの存在下で増加した(図12C)。しかしながら、ZAG処置動物またはPBS処置動物に由来する脂肪細胞中へのインスリンの存在下でのグルコース取込みには有意な差がなかった(図12C)。ZAGで処置したラットの腓腹筋およびBAT中へのグルコース取込みは、PBS対照と比較して有意ではなく少しの増加であったが、インスリンの存在下では取込みは有意に増加した(図12D)。これらの結果から、血中グルコースの減少は、BAT、WAT、および骨格筋による利用の増加に起因し、これは、3種すべての組織におけるグルコース輸送担体4(GLUT4)の発現増大によって裏付けられる(図13)。
【００８４】
（表４）PBSまたはZAGいずれかによる処置後の雄ラットの身体組成
2020172540.tif 000007
PBSで処置した動物からの差をa、p<0.05またはb、p<0.01として示す。
【００８５】
（表５）PBSまたはZAGのいずれかで10日間処置したラットにおける血漿代謝産物レベルおよび血漿インスリンレベル
2020172540.tif 000008
PBSで処置した動物からの差をa、p<0.05;b、p<0.01;またはc、p<0.001のいずれかとして示す。
【００８６】
ZAG投与により、BATおよびWATの両方における脱共役タンパク質(UCP)-1および脱共役タンパク質(UCP)-3の発現がほぼ2倍に増大し(図13Aおよび13B)、これは基質利用の増加に寄与すると思われる。また、ZAGで処置したラットにおいて、精巣上体脂肪組織における脂肪分解酵素脂肪トリグリセリドリパーゼ(ATGL)およびホルモン感受性リパーゼ(HSL)の発現増大もあり(図15)、やはり2倍の増大であった。ATGLは、トリアシルグリセロール分子中の最初のエステル結合を加水分解してジアシルグリセロールを形成するのに主に関与しており、ジアシルグリセロールのモノアシルグリセロールへの変換はHSLによって実施される。ZAGの発現はまた、ZAGで10日間処置したラットの骨格筋(図16A)、WAT(図16B)、およびBAT(図16C)においても有意に増大していたことから、外因性ZAGが末梢組織におけるそれ自身の産生を増強することが示される。
【００８７】
ZAGを投与されたラットの腓腹筋中のα-サブユニットにおいてdsRNA依存性プロテインキナーゼ(PKR)および真核生物開始因子2(eIF2)の両方のリン酸化型の有意な発現低下があったのに対し、総量は変化しなかった(図17Aおよび図17B)。同様の変化が、ZAGを投与されたob/obマウスでも観察されており(結果は発表していない)、骨格筋におけるタンパク質分解の抑制およびタンパク質合成の増加と一致していた。
【００８８】
実施例2
亜鉛-α2-糖タンパク質の間欠的投与
ob/obマウスにおける長期のZAG連日投与により、体重減少が停止されることが観察された。したがって、3〜4日中断し、続いてZAGを再輸注すると、継続的な体重減少および高血糖症に関連する症状の改善がもたらされることが確認された。
【００８９】
理論に限定されることを望むものではないが、対象が過剰な量のZAGを受け取っている、またはTNFで認められるように受容体脱感作が存在する可能性がある。各群マウス2匹を用いた予備研究を実施して、ZAG送達の最適な日程計画を決定した。90gマウスからの8〜10gの体重減少が約3週間で観察された。
【００９０】
5日間のZAG投与後、脂肪細胞をマウスから採取し、ZAGの不在下で培養した後に、イソプレナリン(iso)に対するそれらの応答性を測定した(図9)。ZAG処置マウスの方が、isoに対する応答性が高く、これは、さらに4日間(すなわち、ZAGおよびHSLの発現が増大する時点)継続し、その後、5日目(すなわち、発現が増大しない時点)に、PBS対照の値まで低下する。
【００９１】
実施例3
亜鉛-α2-糖タンパク質は、ob/obマウスにおける筋肉萎縮を弱める
本実施例は、新しく開発されたインビトロモデル(Russell et al, Exp. Cell Res. 315, 16-25, 2009)を用いて、ob/obマウスにおける筋肉萎縮をZAGが弱めるメカニズムを実証する。これは、高濃度のグルコース(10mMまたは25mM)に供されたマウス筋管を使用する。図18に示す通りに、高グルコースは、タンパク質分解の増加を促進し(図18A)、タンパク質合成を抑制し(図18B)、これらの効果は両方ともZAG(25μg/ml)によって完全に弱められた。したがって、拮抗物質SR59230Aを用いて、ZAGの効果がβ3-ARによって媒介されるか判定した。しかしながら、SR化合物(すなわちSR59230A)はまた、β-作動物質として作用することもでき、これらの実験においてはそのように思われた。したがって、10mMグルコースおよび25mMグルコースの両方によって誘発されるタンパク質分解は、ZAGおよびSR化合物の両方によって弱められ、その組合せは、拮抗的というよりはむしろ相加的であった(図19)。タンパク質合成に関して(図20)、SR化合物はZAGと同様に思われ、反対の徴候はないが、10mMグルコースを伴うと、SR化合物はタンパク質合成の抑制の強化を引き起こす。
【００９２】
実施例4
亜鉛-α2-糖タンパク質はROS形成を弱める
活性酸素種(ROS)の形成が、高グルコース負荷によって誘発されるタンパク質分解において重要であることが示されている。図21のデータから、グルコースによって産生されるROSの増加をZAGが完全に弱めることが示され、タンパク質分解の減少と対応している(図18A)。また、高グルコースは、ob/obマウスの骨格筋において認められるように、PKR活性化(リン酸化)(図22A)およびその後のeIF2αリン酸化(図22B)も誘発し、これもまたZAGによって弱められた。これらの結果から、このインビトロモデルが、ZAGが分子レベルでどのように筋量に影響を及ぼすかを研究するのに有用であることが示される。
【００９３】
実施例5
亜鉛-α2-糖タンパク質は、インスリン耐性を増大させる
また、インスリン耐性試験も、3日間ZAGを投与されたob/obマウスにおいて実施した(図23)。腹腔内注射によって2種の用量のインスリン(10U/kgおよび20U/kg)を動物に投与し、その後の60分間にわたって血中グルコースを測定した。図から分かる通りに(図23A)、ZAGで処置した動物は、PBSを与えられたものよりも高いインスリン(10U/kg)感受性を示した。より高いインスリン濃度(20U/kg)では、この差は消失した(図23B)。20U/kg+PBSの場合のグルコース消失曲線は、10U/kg+ZAGのものとほぼ同一であった。したがって、この用量レベルでは、ZAGは、インスリンの所要量を50％減少させるが、より多くのインスリンを与えることによってこれに打ち勝つことができる。
【００９４】
実施例6
亜鉛-α2-糖タンパク質の5日間の投与
添付書類1に示すデータは、5日間毎日、1日当たり35μgのZAGを静脈内投与した5日間の研究から得たものである。実験終了時に、組織を採取しブロットするか、または単離した脂肪細胞を用いて機能的アッセイ法を実施した。図6Aにおいて確認できる通りに、ZAG投与により、精巣上体脂肪(ep)、皮下脂肪(sc)、および内臓脂肪(vis)におけるその発現が約2倍に増大した。ep脂肪細胞を調製し、組織培養状態で(RPMI 1640+10％FCS)維持した場合、ZAGを培地に添加しなかったにもかかわらず、さらに3日間、ZAG発現は維持された(図6B)。さらに、ZAGで処置したマウスに由来する脂肪細胞は、イソプレナリン(10μM)に対する応答の増大も示し、これもまた、ZAGの不在下、組織培養状態で4日間維持された(図9)。イソプレナリンに対する応答の増大は、ZAGによるHSLの発現増大に起因し、これもまた、ZAGの不在下、組織培養状態で4日間維持された(図6C)。これらの結果から、ZAGの効果は、ZAGの使用をやめてからさらに3日間維持され、したがって、毎日投与する必要はないことが示される。実際に、上述した通りに、過剰なZAGは、応答の増大よりもむしろ耐性をもたらす可能性の方が高い。
【００９５】
HSLの発現増大は、ATGL(図5E〜5G)のように、5日間のZAG投与後にep脂肪細胞で認められるだけであった(図5B〜5D)。ep脂肪組織でのみpERK発現の増大があり(図5H〜5J)、pERKの阻害物質(PD98059 10μM)は、ZAGと共に3時間インキュベートしたep脂肪細胞におけるHSLの発現増大を弱めた(図5A)。ZAGは、BAT(図6Dおよび6E)および筋肉(図6F)におけるUCP1およびUCP3の発現を増大させた。これは、体温が上昇したことならびに脂肪分解の増加にもかかわらず血清中のTGおよびNEFAが降下したことの原因であると思われる。
【００９６】
上記の実施例を参照して本発明を説明したが、修正および変更は、本発明の精神および範囲内に包含されることが理解されると考えられる。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１Ａ】
2020172540.tif 000009
【図１Ｂ】
2020172540.tif 000010
【図１Ｃ】
2020172540.tif 000011
【図１Ｄ】
2020172540.tif 000012
【図１Ｅ】
2020172540.tif 000013
【図１Ｆ】
2020172540.tif 000014
【図１Ｇ】
2020172540.tif 000015
【図２Ａ】
2020172540.tif 000016
【図２Ｂ】
2020172540.tif 000017
【図２Ｃ】
2020172540.tif 000018
【図２Ｄ】
2020172540.tif 000019
【図２Ｅ】
2020172540.tif 000020
【図３Ａ】
2020172540.tif 000021
【図３Ｂ】
2020172540.tif 000022
【図３Ｃ】
2020172540.tif 000023
【図３Ｄ】
2020172540.tif 000024
【図３Ｅ】
2020172540.tif 000025
【図３Ｆ】
2020172540.tif 000026
【図３Ｇ】
2020172540.tif 000027
【図４Ａ】
2020172540.tif 000028
【図４Ｂ】
2020172540.tif 000029
【図４Ｃ】
2020172540.tif 000030
【図４Ｄ】
2020172540.tif 000031
【図４Ｅ】
2020172540.tif 000032
【図５Ａ】
2020172540.tif 000033
【図５Ｂ】
2020172540.tif 000034
【図５Ｃ】
2020172540.tif 000035
【図５Ｄ】
2020172540.tif 000036
【図５Ｅ】
2020172540.tif 000037
【図５Ｆ】
2020172540.tif 000038
【図５Ｇ】
2020172540.tif 000039
【図５Ｈ】
2020172540.tif 000040
【図５Ｉ】
2020172540.tif 000041
【図５Ｊ】
2020172540.tif 000042
【図５Ｋ】
2020172540.tif 000043
【図６Ａ】
2020172540.tif 000044
【図６Ｂ】
2020172540.tif 000045
【図６Ｃ】
2020172540.tif 000046
【図６Ｄ】
2020172540.tif 000047
【図６Ｅ】
2020172540.tif 000048
【図６Ｆ】
2020172540.tif 000049
【図７Ａ】
2020172540.tif 000050
【図７Ｂ】
2020172540.tif 000051
【図７Ｃ】
2020172540.tif 000052
【図８Ａ】
2020172540.tif 000053
【図８Ｂ】
2020172540.tif 000054
【図９】
2020172540.tif 000055
【図１０】
2020172540.tif 000056
【図１１】
2020172540.tif 000057
【図１２Ａ】
2020172540.tif 000058
【図１２Ｂ】
2020172540.tif 000059
【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
2020172540.tif 000061
【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月14日(2020.8.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
別の局面において、本発明は、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドと、β3-アドレナリン作動性受容体(β3-AR)拮抗物質およびβ3作動物質からなる群より選択される作用物質とを含む、薬学的組成物を提供する。1つの態様において、β3-AR拮抗物質はSR59230Aである。別の態様において、β3作動物質は、AMNI-BRL37344(BRL37344)である。別の態様において、ポリペプチドは、グリコシル化される。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
対象の高血糖症の症状を改善する方法であって、該方法が、そのような治療を必要としている該対象に、約10日間またはそれ以上の期間、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片の治療的に有効な投与量を投与する段階を含み、治療後に高血糖症に関連する症状の改善がある、方法。
［２］
前記治療が、10日間の前記ポリペプチドの連日投与を含む、［1］記載の方法。
［３］
前記治療が、21日間の前記ポリペプチドの連日投与を含む、［1］記載の方法。
［４］
前記ポリペプチドを、1日おき、2日毎または3日毎に、最長21日間投与する、［1］記載の方法。
［５］
症状の前記改善が、治療前の血清レベルと比較した場合の、血清グルコースレベルの低下、血清トリグリセリドレベルの低下、血清インスリンレベルの低下、および血清非エステル化脂肪酸レベルの低下からなる群より選択される1種または複数種の徴候を含む、［1］記載の方法。
［６］
症状の前記改善が、治療前の体温と比較した場合の、治療開始から4日以内の約0.4℃〜1℃の体温上昇を含む、［1］記載の方法。
［７］
症状の前記改善が、治療前の血漿インスリンレベルと比較した場合の、治療開始から3日以内の血漿インスリンレベルの低下を含む、［1］記載の方法。
［８］
治療前の血漿インスリンレベルと比較して、血漿インスリンレベルが36％低下する、［7］記載の方法。
［９］
治療前の血漿グルコースレベルおよび血漿トリグリセリドレベルと比較して、血漿グルコースレベルおよび血漿トリグリセリドレベルが約36％低下する、［7］記載の方法。
［１０］
症状の前記改善が、治療開始から3日以内の、静脈内グルコース(2g/kg)に応答した血中グルコースレベルおよびインスリン分泌の正常化を含む、［1］記載の方法。
［１１］
症状の前記改善が、治療前の膵臓インスリンレベルと比較した場合の、膵臓インスリンレベルの上昇を含む、［1］記載の方法。
［１２］
症状の前記改善が、治療前の脱共役タンパク質-1(UCP1)および脱共役タンパク質-3(UCP3)の発現と比較した場合の、褐色脂肪組織におけるUCP1およびUCP3の発現増大を含む、［1］記載の方法。
［１３］
症状の前記改善が、治療前のUCP3の発現と比較した場合の、骨格筋におけるUCP3の発現増大を含む、［1］記載の方法。
［１４］
前記ポリペプチドを1日2回投与する、［1］記載の方法。
［１５］
前記ポリペプチドを、静脈内に、皮下に、腹腔内に、または経口的に投与する、［1］記載の方法。
［１６］
前記ポリペプチドを3日に1回投与する、［1］記載の方法。
［１７］
前記ポリペプチドをβ3作動物質と組み合わせて投与する、［1］記載の方法。
［１８］
前記β3作動物質がBRL37344である、［17］記載の方法。
［１９］
前記ポリペプチドをβ3-アドレナリン作動性受容体(β3-AR)拮抗物質と組み合わせて投与する、［1］記載の方法。
［２０］
前記β3-AR拮抗物質がSR59230Aである、［19］記載の方法。
［２１］
前記ポリペプチドがグリコシル化される、［1］記載の方法。
［２２］
対象の血漿インスリンレベルを低下させる方法であって、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片の治療的に有効な投与量を該対象に投与する段階を含む、方法。
［２３］
前記ポリペプチドが、最長10日間、前記対象に投与され、治療後に血漿インスリンレベルが低下する、［22］記載の方法。
［２４］
前記ポリペプチドが、最長21日間、前記対象に投与され、治療後に血漿インスリンレベルが低下する、［22］記載の方法。
［２５］
血漿インスリンレベルの前記低下が、前記ポリペプチドの投与から3日以内に起こる、［22］記載の方法。
［２６］
前記ポリペプチドの投与前の血漿インスリンレベルと比較して、血漿インスリンレベルが36％低下する、［24］記載の方法。
［２７］
前記ポリペプチドの投与前の血漿グルコースレベルおよび血漿トリグリセリドレベルと比較して、血漿グルコースレベルおよび血漿トリグリセリドレベルが36％低下する、［24］記載の方法。
［２８］
前記ポリペプチドをβ3作動物質と組み合わせて投与する、［22］記載の方法。
［２９］
前記β3作動物質がBRL37344である、［28］記載の方法。
［３０］
前記ポリペプチドをβ3-アドレナリン作動性受容体(β3-AR)拮抗物質と組み合わせて投与する、［22］記載の方法。
［３１］
前記β3-AR拮抗物質がSR59230Aである、［30］記載の方法。
［３２］
前記ポリペプチドがグリコシル化される、［22］記載の方法。
［３３］
SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片を対象に投与する段階を含む、該対象の骨格筋量を増加させる方法。
［３４］
前記骨格筋が腓腹筋またはヒラメ筋である、［33］記載の方法。
［３５］
前記ポリペプチドが、最長10日間、前記対象に投与され、治療後に骨格筋量が増加する、［33］記載の方法。
［３６］
前記ポリペプチドが、最長21日間、前記対象に投与され、治療後に骨格筋量が増加する、［33］記載の方法。
［３７］
前記ポリペプチドをβ3作動物質と組み合わせて投与する、［33］記載の方法。
［３８］
前記β3作動物質がBRL37344である、［37］記載の方法。
［３９］
前記ポリペプチドをβ3-アドレナリン作動性受容体(β3-AR)拮抗物質と組み合わせて投与する、［33］記載の方法。
［４０］
前記β3-AR拮抗物質がSR59230Aである、［39］記載の方法。
［４１］
前記ポリペプチドがグリコシル化される、［33］記載の方法。
［４２］
前記対象が、癌、AIDS、敗血症、COPD、腎不全、関節炎、うっ血性心不全、筋ジストロフィー、糖尿病、または加齢によるサルコペニアを有する、［33］記載の方法。
［４３］
体重低下または肥満軽減をもたらすために対象を治療する方法であって、そのような治療を必要としている該対象に、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片と組み合わせて、β3作動物質の治療的に有効な投与量を投与する段階を含む、方法。
［４４］
前記β3作動物質がBRL37344である、［43］記載の方法。
［４５］
前記ポリペプチドがグリコシル化される、［43］記載の方法。
［４６］
体重低下または肥満軽減をもたらすために対象を治療する方法であって、そのような治療を必要としている該対象に、SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドまたはその断片と組み合わせて、β3-アドレナリン作動性受容体(β3-AR)拮抗物質の治療的に有効な投与量を投与する段階を含む、方法。
［４７］
前記β3-AR拮抗物質がSR59230Aである、［46］記載の方法。
［４８］
前記ポリペプチドがグリコシル化される、［46］記載の方法。
［４９］
SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドと、β3作動物質とを含む、薬学的組成物。
［５０］
SEQ ID NO: 1に示す配列を有するポリペプチドと、β3-アドレナリン作動性受容体(β3-AR)拮抗物質とを含む、薬学的組成物。