(57)【要約】【課題】神経膠芽腫のためのＥＧＦＲ指向ＣＡＲ療法の提供。【解決手段】神経膠芽腫（ＧＢ）は、相変わらず最も高悪性度の原発性悪性脳腫瘍である；乳癌脳転移（ＢＣＢＭ）などの脳転移も高悪性度であり、予後不良に関連する。キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）によって改変された免疫細胞の養子移入は、有望な抗癌アプローチとして登場したが、ＣＡＲによって操作された細胞が脳癌を処置する潜在的な有用性は、調査されていない。本開示は、ＧＢおよびＢＣＢＭなどの脳癌をはじめとした様々な癌の処置において、ＣＡＲを発現している細胞を使用するための組成物および方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年４月６日に出願された米国仮出願番号第６２／１４３，７４４号への米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での優先権を主張しており、この仮出願の内容は、その全体が参考として本明細書によって援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
脳癌は、危険であり、処置が困難である。神経膠芽腫（ＧＢ）は、最も一般的かつ最も高悪性度の原発性脳腫瘍である。脳の癌は、それが別の起源からの転移の結果である場合にもリスクをもたらす；例えば、乳癌脳転移（ＢＣＢＭ）は、転移性乳癌を有する患者において一般的である。化学療法、放射線照射および外科的切除を行ったとしても、ＧＢ患者の全生存期間中央値は、たった１４．６ヶ月である（Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ら（２０１２）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２３：１０４３−１０５３）。ＢＣＢＭも同様に、利用可能な処置に対して非常に抵抗性であり、患者の予後不良を示す。従来の治療は、通常、特異性を欠き、周囲の脳実質および全身組織に対して損傷を引き起こすことがあり、それらの治療の使用を制限する要因となっている（Ｉｍｐｅｒａｔｏ，Ｊ．Ｐ．ら（１９９０）Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．２８：８１８−８２２）。ＧＢに対する免疫ベースの治療は、従来の処置に対する有望な別の選択肢であり、持続可能な抗腫瘍応答をもたらすという長期間の利点を有する可能性とともに局在性の腫瘍細胞と浸潤性の腫瘍細胞の両方を標的化する可能性を有する（Ｍｅｌｌｍａｎ，Ｉ．ら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  ４８０：４８０−４８９）。上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）は、ＧＢを含む様々な腫瘍において重要な役割を果たす。ＥＧＦＲは、ＧＢにおいて最も頻繁に増幅される遺伝子であるが、正常な脳組織におけるその発現は、検出不可能であるかまたは極端に低い（Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｄ．Ｗ．ら（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１：１８０７−１８１２；Ｓａｌｏｍｏｎ，Ｄ．Ｓ．ら（１９９５）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１９：１８３−２３２）。ＥＧＦＲにリガンドが結合すると、レセプターのホモ二量体およびヘテロ二量体が形成され、いくつかの重要なチロシン残基が自己リン酸化して、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路、ＰＬＣγ−ＰＫＣ経路およびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を含むいくつかの細胞内の下流のシグナル伝達経路が活性化し、結果として、細胞の増殖、運動および生存が生じる（Ｚａｎｄｉ，Ｒ．ら（２００７）Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  １９：２０１３−２０２３）。ＥＧＦＲ増幅腫瘍のおよそ２０〜４０％は、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ変異体（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）を有し、これは、細胞外のリガンド結合ドメインにおけるエキソン２〜７の欠失を含む（Ａｌｄａｐｅ，Ｋ．Ｄ．ら（２００４）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６３：７００−７０７；Ｂｉｅｒｎａｔ，Ｗ．ら（２００４）Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１４：１３１−１３６；Ｆａｎ，Ｑ．Ｗ．ら（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２４：４３８−４４９；Ｓｕｇａｗａ，Ｎ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：８６０２−８６０６）。この変異型は、リガンドの非存在下において恒常的な活性化を示すことにより、腫瘍を促進するシグナル伝達経路を活性化する（Ｏｈｎｏ，Ｍ．ら（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．１０１：２５１８−２５２４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ら（２０１２）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２３：１０４３−１０５３
【非特許文献２】Ｉｍｐｅｒａｔｏ，Ｊ．Ｐ．ら（１９９０）Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．２８：８１８−８２２
【非特許文献３】Ｍｅｌｌｍａｎ，Ｉ．ら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  ４８０：４８０−４８９
【非特許文献４】Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｄ．Ｗ．ら（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１：１８０７−１８１２
【非特許文献５】Ｓａｌｏｍｏｎ，Ｄ．Ｓ．ら（１９９５）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１９：１８３−２３２
【非特許文献６】Ｚａｎｄｉ，Ｒ．ら（２００７）Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  １９：２０１３−２０２３
【非特許文献７】Ａｌｄａｐｅ，Ｋ．Ｄ．ら（２００４）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６３：７００−７０７
【非特許文献８】Ｂｉｅｒｎａｔ，Ｗ．ら（２００４）Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１４：１３１−１３６；Ｆａｎ，Ｑ．Ｗ．ら（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２４：４３８−４４９
【非特許文献９】Ｓｕｇａｗａ，Ｎ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：８６０２−８６０６
【非特許文献１０】Ｏｈｎｏ，Ｍ．ら（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．１０１：２５１８−２５２４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
開示の要旨
神経膠芽腫（ＧＢ）は、相変わらず最も高悪性度の原発性悪性脳腫瘍である。キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）によって改変された免疫細胞の養子移入は、有望な抗癌アプローチとして登場したが、ＣＡＲによって操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞がＧＢを処置する潜在的な有用性は、調査されていない。ＧＢ患者のおよそ５０％由来の腫瘍が、野生型ＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲ）を発現し、より少ない症例においてｗｔＥＧＦＲおよび変異型ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する；しかしながら、以前に報告されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを標的化することだけに焦点を当てている。
【０００５】
本開示の態様は、（ａ）抗原結合ドメイン；（ｂ）ヒンジドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；および（ｄ）細胞内ドメインを含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）に関する。本開示は、（ａ）野生型上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）および変異上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）（「ｗｔＥＧＦＲおよび変異ＥＧＦＲ」）の両方または野生型上皮成長因子レセプターもしくは変異上皮成長因子レセプターを認識した抗ＥＧＦＲ抗体の抗原結合ドメイン；（ｂ）ヒンジドメインポリペプチド；（ｃ）共刺激ポリペプチド；および（ｄ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、あるいはそれらから本質的になるか、またはなおもさらにはそれらからなる新規ＣＡＲ、すなわち上皮成長因子レセプター（「ＥＧＦＲ」）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を提供する。１つの態様において、共刺激分子は、細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。非限定的な例としては、ＣＤ８、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域、ＣＤ２８共刺激分子、ＯＸ４０、ＩＣＯＳおよびＣＤ２７が挙げられる。１つの態様において、抗ＥＧＦＲ抗体の抗原結合ドメインは、抗ＥＧＦＲ重鎖（ＨＣ）可変領域および抗ＥＧＦＲ軽鎖（ＬＣ）可変領域を含む。なおもさらなる態様において、ＥＧＦＲ  ＣＡＲはさらに、抗ＥＧＦＲ  ＨＣ可変領域と抗ＥＧＦＲ  ＬＣ可変領域との間に配置されたリンカーポリペプチドを含むか、あるいはそれから本質的になるか、またはなおもさらにはそれからなる。そのＣＡＲは、検出可能な標識または精製マーカーをさらに含み得る。
【０００６】
ＥＧＦＲ  ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドおよびそれらの相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｓ）ならびに各々の等価物が、さらに本明細書中に開示される。それらのポリヌクレオチドおよび／またはＥＧＦＲ  ＣＡＲを含むベクターおよび宿主細胞が、本明細書中に提供される。それらのベクターは、プラスミドまたはベクターである。それらの細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。１つの態様において、それらの細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。それらの細胞は拡大され得るので、それらの細胞の拡大された集団が、さらに本明細書中に提供される。それらの細胞は、１つの態様において、Ｔ細胞などの細胞の活性化された集団である。
【０００７】
これらの組成物の診断的および治療的な使用が、さらに本明細書中に提供される。例えば、ｗｔＥＧＦＲもしくは変異ＥＧＦＲまたはｗｔＥＧＦＲおよび変異ＥＧＦＲを細胞表面上に発現している細胞および／または腫瘍あるいはＥＧＦＲを発現している幹細胞のうちの１つまたはそれを超えるものの成長を阻害する方法が提供され、その方法は、これらの細胞を、有効量の、本明細書中に記載されるようなＥＧＦＲ  ＣＡＲを含む単離された細胞と接触させることによって行われる。その細胞は、腫瘍細胞、例えば、神経膠芽腫または癌幹細胞、例えば、神経膠芽腫幹細胞であり得る。その接触は、インビトロまたはインビボであり得る。その方法は、インビトロで行われるとき、新しい治療または併用療法をスクリーニングするのに有用である。その方法は、インビボでは、ＥＧＦＲを発現する癌、例えば、脳癌、例えば、神経膠芽腫または別の癌（例えば、乳癌）の脳転移に罹患している患者を処置するのに有用である。
【０００８】
別の態様において、本開示は、ｗｔＥＧＦＲもしくは変異ＥＧＦＲまたはｗｔＥＧＦＲおよび変異ＥＧＦＲを細胞表面上に発現している１つまたはそれを超える細胞の成長の阻害を必要とする被験体において、そのような細胞の成長を阻害する方法を提供する。この方法は、有効量の、本明細書中に記載されるようなＥＧＦＲ  ＣＡＲを含む単離された細胞をその被験体に投与する工程を含むか、あるいはその工程から本質的になるか、またはなおもさらにはその工程からなる。ＥＧＦＲを発現している細胞は、腫瘍細胞または癌幹細胞、例えば、神経膠芽腫または神経膠芽腫幹細胞であり得る。ＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している単離された細胞は、それらの細胞を投与される被験体にとって自家であり得る。癌の処置を必要とする被験体に、有効量の、本明細書中に記載されるようなＥＧＦＲ  ＣＡＲを含む単離された細胞を投与することによって、その被験体において癌を処置する方法がなおもさらに提供され、ここで、その癌細胞は、ｗｔＥＧＦＲもしくは変異ＥＧＦＲまたはｗｔＥＧＦＲおよび変異ＥＧＦＲを発現している。これらの方法の単離された細胞は、ＮＫ細胞および／またはＴ細胞であり得、処置される被験体にとって自家であり得る。さらなる態様において、それらの細胞は、処置している医師によって決定される任意の適切な経路によって投与され、それらには、頭蓋内注射、静脈内投与が含まれるが、これらに限定されない。
【０００９】
本明細書中に記載されるようなＥＧＦＲ  ＣＡＲならびにＥＧＦＲタンパク質もしくはそのフラグメントおよび／または変異ＥＧＦＲタンパク質もしくはそのフラグメントを含む単離された複合体が、なおもさらに提供される。別の態様において、本明細書中に記載されるようなＥＧＦＲ  ＣＡＲおよびｗｔＥＧＦＲもしくは変異ＥＧＦＲまたはｗｔＥＧＦＲおよび変異ＥＧＦＲを発現している細胞を含む単離された複合体が、本明細書中に提供される。
【００１０】
本開示のさらなる態様は、本明細書中に記載されるＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）および腫瘍退縮単純ヘルペスウイルスを含む組成物および併用癌治療に関する。いくつかの実施形態は、腫瘍または癌を処置する方法に関し、ここで、ＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している細胞と腫瘍退縮単純ヘルペスウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｈｅｒｅｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ）の両方が、それを必要としている患者に投与される。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している細胞は、腫瘍退縮単純ヘルペスウイルスと同時に投与される；他の実施形態において、ＥＧＦＲ
ＣＡＲを発現している細胞は、腫瘍退縮単純ヘルペスウイルスの投与の前または後に投与される。
【００１１】
１つまたはそれを超える上記組成物を含むキットがさらに提供される。それらを診断的または治療的に使用するための指示書がさらに提供される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）野生型上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）もしくは変異上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）のいずれかまたは野生型上皮成長因子レセプターおよび変異上皮成長因子レセプターの両方（「ｗｔＥＧＦＲおよび／または変異ＥＧＦＲ」）を認識した抗ＥＧＦＲ抗体の抗原結合ドメイン；（ｂ）ヒンジドメインポリペプチド；（ｃ）共刺激分子または共刺激ポリペプチド；および（ｄ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、あるいはそれらの各々の等価物を含む、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）。
（項目２）
前記共刺激分子が、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域、ＣＤ２８共刺激分子、ＯＸ４０、ＩＣＯＳおよびＣＤ２７、またはそれらの各々の等価物の群から選択される分子またはポリペプチドを含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目３）
前記抗ＥＧＦＲ抗体の前記抗原結合ドメインが、抗ＥＧＦＲ重鎖（ＨＣ）可変領域および抗ＥＧＦＲ軽鎖（ＬＣ）可変領域またはそれらの各々の等価物を含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目４）
前記ＨＣ可変領域が、
【化２９】
2020156522.tif 000002
またはその等価物を含む、項目３に記載のＣＡＲ。
（項目５）
前記ＬＣ可変領域が、
【化３０】
2020156522.tif 000003
またはその等価物を含む、項目３または４に記載のＣＡＲ。
（項目６）
前記抗ＥＧＦＲ  ＨＣ可変領域と前記抗ＥＧＦＲ  ＬＣ可変領域との間に配置されたリンカーポリペプチドをさらに含む、項目３に記載のＣＡＲ。
（項目７）
前記リンカーポリペプチドが、
【化３１】
2020156522.tif 000004
またはその等価物を含む、項目６に記載のＣＡＲ。
（項目８）
前記ＥＧＦＲ結合ドメインのアミノ末端にシグナルポリペプチドをさらに含む、項目１〜３のいずれかに記載のＣＡＲ。
（項目９）
前記ヒンジポリペプチドが、
【化３２】
2020156522.tif 000005
またはその等価物を含む、項目１〜３のいずれかに記載のＣＡＲ。
（項目１０）
前記ＣＤ２８共刺激分子が、ＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＣＤ２８細胞内ドメインまたはそれらの各々の等価物を含む、項目２に記載のＣＡＲ。
（項目１１）
前記ＣＡＲに付着された検出可能なマーカーおよび／または精製マーカーをさらに含む、項目１〜３のいずれかに記載のＣＡＲ。
（項目１２）
等価なポリペプチドが、前記ポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸同一性であるか、または該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖と少なくとも８０％同一のポリヌクレオチドによってコードされるか、または高ストリンジェンシーの条件下で該ポリヌクレオチドまたはその相補鎖にハイブリダイズし、ここで、高ストリンジェンシーの条件は、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４×ＳＳＣ〜約８×ＳＳＣの洗浄液を含む、項目１〜３、５または６のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
（項目１３）
項目１〜３、５または６のいずれか１項に記載のＣＡＲをコードする、単離された核酸。
（項目１４）
項目１３に記載の単離された核酸配列を含む、ベクター。
（項目１５）
前記ベクターが、プラスミドである、項目１４に記載のベクター。
（項目１６）
前記ベクターが、ウイルスベクターである、項目１４に記載のベクター。
（項目１７）
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される、項目１４に記載のベクター。
（項目１８）
前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、項目１４に記載のベクター。
（項目１９）
検出可能な標識および／または精製マーカーをさらに含み、該検出可能な標識は、必要に応じて、天然に存在するポリヌクレオチドではない、項目１４〜１８のいずれか１項に記載のベクター。
（項目２０）
項目１〜３、５または６のいずれか１項に記載のＣＡＲを含む、単離された細胞。
（項目２１）
項目１３に記載の単離された核酸を含む、単離された細胞。
（項目２２）
項目１４に記載のベクターを含む、単離された細胞。
（項目２３）
前記細胞が、原核細胞または真核細胞である、項目２０に記載の単離された細胞。
（項目２４）
前記細胞が、原核細胞または真核細胞である、項目２１に記載の単離された細胞。
（項目２５）
前記細胞が、原核細胞または真核細胞である、項目２２に記載の単離された細胞。
（項目２６）
前記細胞が、真核細胞である、項目２３に記載の単離された細胞。
（項目２７）
前記細胞が、真核細胞である、項目２４に記載の単離された細胞。
（項目２８）
前記細胞が、真核細胞である、項目２５に記載の単離された細胞。
（項目２９）
前記真核細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ウシ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、マウス細胞、ウマ細胞またはヒト細胞から選択される、項目２６に記載の単離された細胞。
（項目３０）
前記真核細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ウシ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、マウス細胞、ウマ細胞またはヒト細胞から選択される、項目２７に記載の単離された細胞。
（項目３１）
前記真核細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ウシ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、マウス細胞、ウマ細胞またはヒト細胞から選択される、項目２８に記載の単離された細胞。
（項目３２）
前記細胞が、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の群から選択される、項目２９に記載の単離された細胞。
（項目３３）
前記細胞が、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の群から選択される、項目３０に記載の単離された細胞。
（項目３４）
前記細胞が、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の群から選択される、項目３１に記載の単離された細胞。
（項目３５）
項目１〜３のいずれか１項に記載のＣＡＲならびにＥＧＦＲタンパク質もしくはそのフラグメントおよび／または変異ＥＧＦＲタンパク質もしくはそのフラグメントを含む、単離された複合体。
（項目３６）
項目１〜３のいずれか１項に記載のＣＡＲならびにｗｔＥＧＦＲおよび／または変異ＥＧＦＲを発現する細胞を含む、単離された複合体。
（項目３７）
キャリアおよび項目１〜３のいずれか１項に記載の１つまたはそれを超えるＣＡＲを含む、組成物。
（項目３８）
前記キャリアが、薬学的に許容され得るキャリアまたは固体支持体である、項目３７に記載の組成物。
（項目３９）
項目１〜３のいずれか１項に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を細胞に導入する工程を含む、ＥＧＦＲ  ＣＡＲ細胞を作製する方法。
（項目４０）
前記ＥＧＦＲ  ＣＡＲによって形質導入された細胞を単離する工程をさらに含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記細胞が、哺乳動物細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、マウス細胞、ネコ細胞、ウマ細胞またはヒト細胞からなる群の細胞、および必要に応じてＴ細胞またはＮＫ細胞である、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
項目４０または４１に記載の方法によって作製された、単離されたＣＡＲ細胞。
（項目４３）
ＥＧＦＲおよび／または変異ＥＧＦＲを細胞表面上に発現する細胞の成長を阻害する方法であって、該細胞を有効量の項目４２に記載の単離された細胞と接触させる工程を含む、方法。
（項目４４）
前記細胞が、腫瘍細胞または癌幹細胞である、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記腫瘍細胞が、（ｉ）神経膠芽腫もしくは神経膠芽腫幹細胞および／または（ｉｉ）乳癌脳転移もしくは乳癌脳転移幹細胞から必要に応じて選択される脳癌由来の細胞である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
ＥＧＦＲおよび／または変異ＥＧＦＲを細胞表面上に発現する細胞の成長の阻害を必要とする被験体において該細胞の成長を阻害する方法であって、該被験体に有効量の項目４２に記載の単離された細胞を投与する工程を含む、方法。
（項目４７）
前記細胞が、腫瘍細胞または幹細胞である、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記腫瘍細胞が、（ｉ）神経膠芽腫もしくは神経膠芽腫幹細胞および／または（ｉｉ）乳癌脳転移もしくは乳癌脳転移幹細胞から必要に応じて選択される脳癌由来の細胞である、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記単離された細胞が、該細胞を投与される被験体にとって自家である、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
癌の処置を必要とする被験体において癌を処置するための方法であって、ここで、該癌細胞は、ＥＧＦＲおよび／または変異ＥＧＦＲを発現し、該方法は、該被験体に有効量の項目４２に記載の単離された細胞を投与する工程を含む、方法。
（項目５１）
前記単離された細胞が、処置される被験体にとって自家である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記細胞が、頭蓋内注射または静脈内投与によって投与される、項目５０に記載の方法。
（項目５３）
前記被験体が、哺乳動物、マウス、イヌ、ウシ、マウス、ネコ、ウマまたはヒトの群から選択される、項目５０に記載の方法。
（項目５４）
被験体が、抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲ治療に応答する可能性があるかまたは応答する可能性がないかを判定するための方法であって、該方法は、患者から単離された癌細胞を有効量の抗ＥＧＦＲ抗体および変異ＥＧＦＲ抗体と接触させる工程、該癌細胞に結合した任意の抗体の存在を検出する工程を含み、ここで、該癌細胞に結合した抗体の存在は、該被験体が、該抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲ治療に応答する可能性があることを示唆し、該癌細胞に結合した抗体が存在しないことは、該被験体が、該抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲ治療に応答する可能性がないことを示唆する、方法。
（項目５５）
前記抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲ治療に応答する可能性があると判定された被験体に有効量の項目２６に記載の細胞を投与する工程をさらに含む、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記癌細胞が、（ｉ）神経膠芽腫細胞もしくは神経膠芽腫幹細胞および／または（ｉｉ）乳癌転移もしくは乳癌転移幹細胞から必要に応じて選択される脳癌由来の細胞である、項目５４または５５に記載の方法。
（項目５７）
前記被験体が、哺乳動物、ウマ、ネコ、イヌ、ウシ、マウスまたはヒトの群から選択される、項目５４または５５に記載の方法。
（項目５８）
有効量の抗癌治療を行う工程をさらに含む、項目５４または５５に記載の方法。
（項目５９）
前記抗癌治療が、放射線療法、手術または化学療法のうちの１つまたはそれを超えるものを含む、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲ治療が、一次治療、二次治療、三次治療、四次治療の群から選択される、項目５０に記載の方法。
（項目６１）
項目１〜３のいずれか１項に記載の１つまたはそれを超えるＣＡＲおよび必要に応じて使用の指示書を含む、キット。
（項目６２）
腫瘍退縮単純ヘルペスウイルスをさらに含む、項目６１に記載のキット。
（項目６３）
癌の処置を必要とする被験体において癌を処置するための方法であって、有効量の項目４２に記載の単離された細胞および有効量の腫瘍退縮単純ヘルペスウイルスまたはそれらの各々の等価物を被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目６４）
前記単離された細胞が、ＮＫ細胞である、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記単離された細胞が、放射線照射された細胞である、項目６３または６４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６６）
前記単離された細胞が、１０００ｃＧｙの線量で放射線照射された細胞である、項目５５に記載の方法。
（項目６７）
前記腫瘍退縮単純ヘルペスウイルスが、ＨＳＶ−１であるかまたはＨＳＶ−１由来である、項目６３に記載の方法。
（項目６８）
前記有効量の単離された細胞が、前記有効量の腫瘍退縮単純ヘルペスウイルスの前に投与される、項目６３に記載の方法。
（項目６９）
前記有効量の腫瘍退縮単純ヘルペスウイルスが、複数の日にわたって投与される、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記癌が、脳癌である、項目６３に記載の方法。
（項目７１）
前記脳癌が、神経膠芽腫または乳癌脳転移から選択される、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
項目４２に記載の単離された細胞および使用の指示書ならびに必要に応じて腫瘍退縮ヘルペスウイルスを含む、癌を処置するためのキット。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｂは、ＧＢおよびＧＢ幹細胞上のＥＧＦＲの発現を示している。（図１Ａ）神経膠腫細胞株（Ｕ２５１、ＬＮ２２９およびＧｌｉ３６ｄＥＧＦＲ）および神経膠腫幹細胞（ＧＢ３０、ＧＢ８３、ＧＢ３２６、ＧＢ１１２３、ＧＢ８４Ｖ３ＳＬ、ＧＢ１５７Ｖ３ＳＬおよびＧＢ１９）上の表面ＥＧＦＲ発現をフローサイトメトリーによってモニターした。ＮＫ細胞株であるＮＫＬおよびＮＫ−９２をネガティブコントロールとした。（図１Ｂ）図１Ａにおいて特定された神経膠腫細胞株および神経膠腫幹細胞におけるＲＴ−ＰＣＲによるＥＧＦＲ  ｍＲＮＡ発現の測定。フロープロットおよびデータは、３つの独立した実験の代表である。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｂは、ＧＢおよびＧＢ幹細胞上のＥＧＦＲの発現を示している。（図１Ａ）神経膠腫細胞株（Ｕ２５１、ＬＮ２２９およびＧｌｉ３６ｄＥＧＦＲ）および神経膠腫幹細胞（ＧＢ３０、ＧＢ８３、ＧＢ３２６、ＧＢ１１２３、ＧＢ８４Ｖ３ＳＬ、ＧＢ１５７Ｖ３ＳＬおよびＧＢ１９）上の表面ＥＧＦＲ発現をフローサイトメトリーによってモニターした。ＮＫ細胞株であるＮＫＬおよびＮＫ−９２をネガティブコントロールとした。（図１Ｂ）図１Ａにおいて特定された神経膠腫細胞株および神経膠腫幹細胞におけるＲＴ−ＰＣＲによるＥＧＦＲ  ｍＲＮＡ発現の測定。フロープロットおよびデータは、３つの独立した実験の代表である。
【００１３】
【図２−１】図２Ａ〜２Ｂは、ＥＧＦＲ特異的ＣＡＲの作製およびＣＡＲを形質導入されたＮＫ細胞上のその発現の検出を示している。（図２Ａ）ＥＧＦＲ−ＣＡＲレンチウイルスの構築物の模式図。（図２Ｂ）ＥＧＦＲ−ＣＡＲ構築物（それぞれＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲおよびＮＫＬ−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ）または空のベクター構築物（ＥＶ）を形質導入されたＮＫ−９２およびＮＫＬ細胞の表面上のキメラＥＧＦＲ  ｓｃＦｖの発現。細胞をＧＦＰ発現によってＦＡＣＳで選別し、次いで、その細胞を抗マウスＦａｂ抗体（実線）またはＩｇＧアイソタイプコントロール（破線）で染色した後、フローサイトメトリーによって解析した。ＳＰ、シグナルペプチド；ＶＨ、重鎖；ＶＬ、軽鎖；ＳｃＦｖ、一本鎖可変フラグメント。フロープロットおよびデータは、３つの独立した実験の代表である。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｂは、ＥＧＦＲ特異的ＣＡＲの作製およびＣＡＲを形質導入されたＮＫ細胞上のその発現の検出を示している。（図２Ａ）ＥＧＦＲ−ＣＡＲレンチウイルスの構築物の模式図。（図２Ｂ）ＥＧＦＲ−ＣＡＲ構築物（それぞれＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲおよびＮＫＬ−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ）または空のベクター構築物（ＥＶ）を形質導入されたＮＫ−９２およびＮＫＬ細胞の表面上のキメラＥＧＦＲ  ｓｃＦｖの発現。細胞をＧＦＰ発現によってＦＡＣＳで選別し、次いで、その細胞を抗マウスＦａｂ抗体（実線）またはＩｇＧアイソタイプコントロール（破線）で染色した後、フローサイトメトリーによって解析した。ＳＰ、シグナルペプチド；ＶＨ、重鎖；ＶＬ、軽鎖；ＳｃＦｖ、一本鎖可変フラグメント。フロープロットおよびデータは、３つの独立した実験の代表である。
【００１４】
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、ＥＧＦＲ−ＣＡＲによって改変されたＮＫ−９２およびＮＫＬ細胞がＥＧＦＲ＋ＧＢ細胞株の細胞を認識し、殺滅することを示している。（図３Ａ）標準的なクロム−５１放出アッセイを使用したときの、Ｇｌｉ３６ｄＥＧＦＲ、ＬＮ２２９またはＵ２５１細胞に対する、空のベクター（ＥＶ）を形質導入されたまたはＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２およびＮＫＬ細胞の細胞傷害活性。（図３Ｂ）ＥＬＩＳＡアッセイを使用したときの、Ｇｌｉ３６ｄＥＧＦＲ、ＬＮ２２９またはＵ２５１細胞の非存在下または存在下における、空のベクターＥＶを形質導入されたまたはＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２およびＮＫＬ細胞のＩＦＮ−γの放出。３つの独立した実験の代表的なデータが示されている。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【００１５】
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、ＥＧＦＲ−ＣＡＲによって改変されたＮＫ−９２およびＮＫＬ細胞が、ＥＧＦＲ＋ＧＢ幹細胞の増強された溶解を示すことを示している。（図４Ａ）クロム−５１放出アッセイを使用したときのＧＢ１１２３、ＧＢ３０、ＧＢ１５７Ｖ３ＳＬおよびＧＢ８４Ｖ３ＳＬ  ＧＢ幹細胞に対するＮＫ−９２−ＥＶまたはＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞（上のパネル）およびＮＫＬ−ＥＶまたはＮＫＬ−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞（下のパネル）の細胞傷害活性。（図４Ｂ）ＧＢ幹細胞と共培養したときのＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲまたはＮＫ−９２−ＥＶ細胞（上のパネル）およびＮＫＬ−ＥＶまたはＮＫＬ−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞（下のパネル）によるＩＦＮ−γ分泌のＥＬＩＳＡ解析。３つの独立した実験の代表的なデータが示されている。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【００１６】
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞の増強された標的認識が、細胞表面上のＥＧＦＲの発現に依存することを示している。（図５Ａ）空のベクターまたはｗｔＥＧＦＲもしくはＥＧＦＲｖＩＩＩを含むベクターでトランスフェクトされたＧＢ１９細胞の表面上のＥＧＦＲ発現を検出するための抗ＥＧＦＲ抗体（実線）またはＩｇＧアイソタイプコントロール（点線）を使用したフローサイトメトリー。（図５Ｂ）図５Ａに示されたＧＢ１９、ＧＢ１９−ｗｔＥＧＦＲおよびＧＢ１９−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞に対するＮＫ−９２−ＥＶまたはＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ（上のパネル）およびＮＫＬ−ＥＶまたはＮＫＬ−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ（下のパネル）の細胞傷害性。ＧＢ１９細胞をＮＫ−９２またはＮＫＬ細胞と、様々なエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で４時間インキュベートした。腫瘍溶解を、クロム−５１放出アッセイを使用して測定した。（図５Ｃ）ＮＫＬ−ＥＶまたはＮＫＬ−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ（左）およびＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲまたはＮＫ−９２−ＥＶ細胞（右）を同数のＧＢ１９−ベクター細胞またはＧＢ１９−ＥＧＦＲ細胞と２４時間共培養した。次いで、上清を、ＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮ−γ分泌を計測するために回収した。フロープロットおよびデータは、３つの独立した実験の代表である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【００１７】
【図６】図６Ａ〜６Ｅは、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞が、同所ヒト神経膠腫幹細胞のインビボでの成長を抑制し、神経膠腫を有するマウスの生存時間を延長し、他の器官および組織に移動せずに脳に局在化することを示している。（図６Ａ）ＧＢ３０腫瘍を有するマウスの脳の生物発光イメージング。ルシフェラーゼを発現しているＧＢ３０細胞を定位的（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ）注射によってＮＳＧマウスに接種した（０日目）。接種の７日後、マウスの頭蓋内に、空のベクターを形質導入されたＮＫ−９２細胞（ＮＫ−９２−ＥＶ）、ＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２細胞（ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ）またはハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ；ネガティブコントロール）を１回注入した。（図６Ｂ）図６Ａからの光子／秒／マウスという単位での定量の要約。＊はｐ＜０．０５を示す。（図６Ｃ）ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞で処置されたＧＢ３０を有するマウスは、カプラン・マイヤー生存曲線によって測定されたとき、ＮＫ−９２−ＥＶ細胞またはＨＢＳＳで処置されたマウスと比べて有意に延長された全生存を示した（＊＊ｐ＜０．０１）（各群ｎ＝５）。（図６Ｄ）ＧＢ３０を有するマウスの脳にＣＡＲ  ＮＫ細胞を頭蓋内注射した３日後の肝臓、肺、血液、脾臓、骨髄（ＢＭ）および脳におけるＣＤ５６＋ＣＤ３−ヒトＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞の存在のフローサイトメトリーによる判定。（図６Ｅ）ＧＢ３０を有するマウスの脳にＣＡＲ  ＮＫ細胞を頭蓋内注射した３日後の肝臓、肺、血液、脾臓、骨髄（ＢＭ）および脳におけるＥＧＦＲ−ＣＡＲの発現のＲＴ−ＰＣＲによる測定。ＮＣ＝ネガティブコントロール（ＤＮＡ鋳型を加えなかった）；ＰＣ＝ポジティブコントロールであるＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【００１８】
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、同所異種移植ＧＢモデルにおいて、ＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２細胞が、ｗｔＥＧＦＲを発現しているＧＢ腫瘍の成長を阻害し、腫瘍を有するマウスの生存を延長することを示している。（図７Ａ）Ｕ２５１腫瘍を有するマウスの脳の生物発光イメージング。ルシフェラーゼを発現している１０５個のＵ２５１細胞を、定位的注射によってＮＳＧマウスの頭蓋内に植え込んだ（０日目）。接種後の１０、４０、７０日目に、マウスの頭蓋内に、ＮＫ−９２−ＥＶ細胞、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞またはネガティブコントロールとしてＨＢＳＳを注入した。マウスの脳の生物発光イメージングを１００日目に撮影した。（図７Ｂ）図７Ａからの光子／秒／マウスという単位での定量の要約。＊＊はｐ＜０．０１を示す。（図７Ｃ）ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞で処置されたＵ２５１を有するマウスは、カプラン・マイヤー生存曲線によって測定されたとき、ＮＫ−９２−ＥＶ細胞（＊ｐ＜０．０５）またはＨＢＳＳ（＊＊ｐ＜０．０１）で処置されたマウスと比べて有意に延長された全生存を示した（各群ｎ＝５）。
【００１９】
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ初代ＮＫ細胞が、ＥＧＦＲ＋ＧＢ細胞および患者由来ＧＢ幹細胞の増強された全滅を示すことを示している。（図８Ａ）ＥＧＦＲ−ＣＡＲによって改変された初代ＮＫ細胞（初代ＮＫ−ＣＡＲ）が、ｍｏｃｋを形質導入された初代ＮＫ細胞（初代ＮＫ−ＥＶ）と比較して、ＥＧＦＲ＋Ｇｌｉ３６ｄＥＧＦＲおよびＵ２５１  ＧＢ細胞株に対して高い細胞溶解活性を示した。（図８Ｂ）ＥＧＦＲ−ＣＡＲによって改変されたＮＫ細胞（初代ＮＫ−ＣＡＲ）は、ｍｏｃｋを形質導入された初代ＮＫ細胞（初代ＮＫ−ＥＶ）と比較して、ＥＧＦＲ＋患者由来ＧＢ３０およびＧＢ１５７Ｖ３ＳＬ幹細胞に対して高い細胞傷害性を示した。示されているデータは、異なる健康ドナーから単離されたＮＫ細胞を調べたときの、同様の結果であった３つの実験の代表である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【００２０】
【図９−１】図９Ａ〜９Ｃは、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞の標的認識の増強は、細胞表面上のＥＧＦＲの発現に依存することを示している。（図９Ａ）空のベクター（ＥＶ；左）、ｗｔＥＧＦＲ（中央）またはＥＧＦＲｖＩＩＩ（右）を形質導入された２９３Ｔ細胞の、抗ＥＧＦＲ抗体（実線）またはＩｇＧアイソタイプコントロール（点線）を使用したフローサイトメトリー解析。（図９Ｂ）２９３Ｔ−ＥＶ（左）、２９３Ｔ−ＥＧＦＲ（中央）および２９３Ｔ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ（右）細胞に対するＮＫ−９２−ＥＶまたはＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ（上のパネル）およびＮＫＬ−ＥＶまたはＮＫＬ−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ（下のパネル）の細胞傷害性。２９３Ｔ細胞をＮＫ細胞と様々なエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で４時間インキュベートした。腫瘍溶解を、クロム−５１放出アッセイを使用して測定した。（図９Ｃ）標的細胞とエフェクター細胞との２４時間のコインキュベーションの後、その共培養物の上清を、ＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮ−γ分泌について計測した。示されているデータは、同様の結果であった３つの実験の代表である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【図９−２】図９Ａ〜９Ｃは、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞の標的認識の増強は、細胞表面上のＥＧＦＲの発現に依存することを示している。（図９Ａ）空のベクター（ＥＶ；左）、ｗｔＥＧＦＲ（中央）またはＥＧＦＲｖＩＩＩ（右）を形質導入された２９３Ｔ細胞の、抗ＥＧＦＲ抗体（実線）またはＩｇＧアイソタイプコントロール（点線）を使用したフローサイトメトリー解析。（図９Ｂ）２９３Ｔ−ＥＶ（左）、２９３Ｔ−ＥＧＦＲ（中央）および２９３Ｔ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ（右）細胞に対するＮＫ−９２−ＥＶまたはＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ（上のパネル）およびＮＫＬ−ＥＶまたはＮＫＬ−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ（下のパネル）の細胞傷害性。２９３Ｔ細胞をＮＫ細胞と様々なエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で４時間インキュベートした。腫瘍溶解を、クロム−５１放出アッセイを使用して測定した。（図９Ｃ）標的細胞とエフェクター細胞との２４時間のコインキュベーションの後、その共培養物の上清を、ＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮ−γ分泌について計測した。示されているデータは、同様の結果であった３つの実験の代表である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【００２１】
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｂは、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞の効果がＥＧＦＲ遮断抗体（Ａｂ）によって鈍ることを示している。（図１０Ａ）ＥＧＦＲ特異的モノクローナル抗体５２８またはＩｇＧ一致アイソタイプコントロール抗体で前処理されたＧＢ３０細胞（左）またはＵ２５１細胞（右）に対するＮＫ−９２−ＥＶまたはＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲの細胞傷害性。標的細胞を、前処理されたＮＫ−９２−ＥＶまたはＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞と様々なエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で４時間インキュベートした。腫瘍溶解を、クロム−５１放出アッセイを使用して測定した。（図１０Ｂ）標的細胞とエフェクター細胞との２４時間のコインキュベーションの後、その共培養物の上清を、ＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮ−γ分泌について計測した。示されているデータは、同様の結果であった３つの実験の代表である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。Ａｂ＝ＥＧＦＲ特異的モノクローナル抗体５２８；ｉｓｏ＝ＩｇＧ一致アイソタイプコントロール抗体。
【図１０−２】図１０Ａ〜１０Ｂは、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞の効果がＥＧＦＲ遮断抗体（Ａｂ）によって鈍ることを示している。（図１０Ａ）ＥＧＦＲ特異的モノクローナル抗体５２８またはＩｇＧ一致アイソタイプコントロール抗体で前処理されたＧＢ３０細胞（左）またはＵ２５１細胞（右）に対するＮＫ−９２−ＥＶまたはＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲの細胞傷害性。標的細胞を、前処理されたＮＫ−９２−ＥＶまたはＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞と様々なエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で４時間インキュベートした。腫瘍溶解を、クロム−５１放出アッセイを使用して測定した。（図１０Ｂ）標的細胞とエフェクター細胞との２４時間のコインキュベーションの後、その共培養物の上清を、ＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮ−γ分泌について計測した。示されているデータは、同様の結果であった３つの実験の代表である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。Ａｂ＝ＥＧＦＲ特異的モノクローナル抗体５２８；ｉｓｏ＝ＩｇＧ一致アイソタイプコントロール抗体。
【００２２】
【図１１】図１１は、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞が、腫瘍内注射後に腫瘍領域に位置することを示している。ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞を、ＧＢ３０の植え込みの７日後にマウスの脳の腫瘍内に注射した。マウスの脳を３日後に回収し、パラフィンで包埋し、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色に向けて処理した。Ｈ＆Ｅ染色は、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞が腫瘍領域の内部にだけ存在することを示した。２０×、４０×および１００×の拡大像が示されている（対物レンズ：２×、４×または１０×；接眼レンズ：１０×）。
【００２３】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、乳癌細胞株および乳癌組織におけるＥＧＦＲの発現を示している。乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＣＦ−７）の細胞表面上のＥＧＦＲの発現をフローサイトメトリーによって検出した（図１２Ａ）。ＥＧＦＲ発現に関するヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色および免疫組織化学（ＩＨＣ）を、原発性乳癌および脳転移を有する患者由来の腫瘍組織に対して行った（図１２Ｂ）。
【００２４】
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｅは、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞が、乳癌細胞株のＥＧＦＲ陽性細胞を認識し、溶解することを実証している。ＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２細胞上のＥＧＦＲ  ｓｃＦｖの発現を、ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２ポリクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーによって測定した（図１３Ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８またはＭＣＦ−７細胞の非存在下または存在下における、空のベクター（ＥＶ）を形質導入されたまたはＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２細胞によるＩＦＮ−γ放出を、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。＊＊Ｐ＜０．０１（図１３Ｂ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１３Ｃ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（図１３Ｄ）またはＭＣＦ−７（図１３Ｅ）細胞に対する空のベクター（ＥＶ）を形質導入されたまたはＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２細胞の細胞傷害活性を、標準的なクロム−５１放出アッセイを使用して行った。（Ｅ、エフェクター細胞；Ｔ、標的細胞）
【００２５】
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｄは、ＥＧＦＲ＋乳癌細胞で刺激されたときの、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ初代ＮＫ細胞の増強された細胞傷害性およびＩＦＮ−γ産生を示している。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８またはＭＣＦ−７細胞の非存在下または存在下における、空のベクター（ＥＶ）を形質導入されたまたはＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入された初代ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ放出を、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した（図１４Ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１４Ｂ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（図１４Ｃ）またはＭＣＦ−７（図１４Ｄ）細胞に対する空のベクター（ＥＶ）を形質導入されたまたはＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入された初代ＮＫ細胞の細胞傷害活性を、標準的なクロム−５１放出アッセイを使用して行った。（Ｅ、エフェクター細胞；Ｔ、標的細胞）
【００２６】
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、ｏＨＳＶ−１のみで、乳癌細胞株の腫瘍細胞を溶解し、全滅させることができることを示している。４８時間の共培養後の乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８またはＭＣＦ−７）に対するｏＨＳＶ−１の用量依存的細胞傷害性をＭＴＳによって検出した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１（図１５Ａ）。図１５Ｂは、種々の時間にわたって共培養した後の乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８またはＭＣＦ−７に対するｏＨＳＶ−１の細胞傷害性のＭＴＳアッセイを示している。図１５Ｃは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＢＲｌｕｃ−ＥＧＦＰ細胞とｏＨＳＶ−１との共培養物の培地中のルシフェラーゼレベルの測定値を示している。
【００２７】
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｂは、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞とｏＨＳＶ−１との併用処置によって、インビトロにおいて乳癌腫瘍細胞がより効率的に全滅されることを明らかにしている。腫瘍細胞を、ＣＡＲ細胞のみで処置するか、ｏＨＳＶ−１のみで処置するか、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞で４時間処置した後、ｏＨＳＶ−１で処置するか（ＣＡＲ＋ｏＨＳＶ）、またはｏＨＳＶで４時間処置した後、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞で処置した（ｏＨＳＶ＋ＣＡＲ）。ＣＢＲｌｕｃ−ＥＧＦＰを発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞の全滅を、種々の時点において、上清へのルシフェラーゼ放出によって計測した（図１６Ａ）。共培養した後の４日目のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＢＲｌｕｃ−ＥＧＦＰ細胞に残存するルシフェラーゼの相対的光量単位によって測定されたとき、ｏＨＳＶ−１と併用されたＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞（ＣＡＲ＋ｏＨＳＶまたはｏＨＳＶ＋ＣＡＲ）は、順序に関係なく、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞のみ（ＣＡＲ）またはｏＨＳＶ−１のみ（ｏＨＳＶ）よりも多くのＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞を全滅させた。＊＊Ｐ＜０．０１（図１６Ｂ）。データは、３つの独立した実験の代表である。
【００２８】
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｂは、ＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２細胞がＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の成長を阻害すること、および腫瘍を有するマウスの生存を延長したことを実証している。ＢＣＢＭ腫瘍を有するマウスの脳の生物発光イメージング。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＢＲｌｕｃ−ＥＧＦＰ細胞を定位的注射によってＮＳＧマウスに接種した（０日目）。接種の１０日後、マウスの頭蓋内に、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２、ｏＨＳＶ−１、ＮＫ−９２−ＥＶまたはＨＢＳＳを１回注入した。１５日目に、併用処置群のマウスにｏＨＳＶ−１を注射した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＢＲｌｕｃ−ＥＧＦＰ細胞の接種の４週間後、マウスの腹腔内にＤ−ルシフェリンを注入し、インビボイメージングシステムを使用して画像化した（図１７Ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＢＲｌｕｃ−ＥＧＦＰ腫瘍を有するマウスを、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞で腫瘍内処置した後、ｏＨＳＶ−１注射を行うか（ＣＡＲ＋ｏＨＳＶ）、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞のみで腫瘍内処置するか（ＣＡＲ）、ｏＨＳＶ−１のみで腫瘍内処置するか、またはＨＢＳＳコントロールで腫瘍内処置した。結果として、カプラン・マイヤー生存曲線によって測定されたとき、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞に続くｏＨＳＶ−１注射が、残りの処置よりも有意に長い全生存を示した（各群ｎ＝５）（図１７Ｂ）。
【００２９】
【図１８】図１８は、ヒト初代ＮＫ細胞におけるレンチウイルスの形質導入効率を示している。ヒト初代ＮＫ細胞にＥＧＦＲ−ＣＡＲレンチウイルスを感染させた後、ＧＦＰ（＋）細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって測定した。
【００３０】
【図１９】図１９は、乳癌細胞に応答した、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞の表面上の活性化マーカーの発現の変化を示している。乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＣＦ−７）と一晩共培養した後のＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞におけるＣＤ２７およびＣＤ６９の表面発現を、フローサイトメトリーによって測定した。
【００３１】
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｂは、ｏＨＳＶのみによる乳癌細胞の溶解を実証している。４日間の共培養後のｏＨＳＶによる乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の溶解が、顕微鏡下の明視野像によって実証された（図２０Ａ）。ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ９２細胞をｏＨＳＶ−１で４日間処置したところ、顕微鏡検査から、ｏＨＳＶ−１が、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞の増殖および生存能に対して明白な効果を及ぼさないことが示された（図２０Ｂ）。
【００３２】
【図２１】図２１は、ｏＨＳＶ、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞およびそれらの組み合わせによる乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の溶解を示している。「ＭＤＡ−ＭＢ−２３１＋ＣＡＲ＋ｏＨＳＶ」は、４時間のＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞の処置の後のｏＨＳＶ−１処置を表している。「ＭＤＡ−ＭＢ−２３１＋ｏＨＳＶ＋ＣＡＲ」は、４時間のｏＨＳＶ−１の処理の後のＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞の処置を表している。
【００３３】
【図２２】図２２は、ビヒクル、ＮＫ−９２細胞、ｏＨＳＶ、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞、およびｏＨＳＶとＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞との併用で処置された頭蓋内異種移植ＧＢ腫瘍から放出された光子の定量を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
詳細な説明
本開示は、記載される特定の態様に限定されず、したがって当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。本開示の範囲は、添付の請求項によってのみ限定されるので、本明細書中で使用される用語は、単に特定の態様を説明する目的であって、限定を意図していないことも理解されるべきである。
【００３５】
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語が、本技術が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料を本技術の実施または試験において使用できるが、好ましい方法、デバイスおよび材料がここに記載される。本明細書に引用されるすべての技術的刊行物および特許公報は、そのすべてが参照により本明細書中に援用される。本明細書中のいかなる記載も、本技術が、先行発明を理由にそのような開示に先行する権利がないことを自認するものとして解釈されるべきでない。
【００３６】
本技術の実施は、別段示されない限り、当該分野の技術の範囲内である、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来の手法を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ編（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９１）ＰＣＲ  １：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９５）ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ編（１９９９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２００５）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｇａｉｔ編（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第４，６８３，１９５号；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６））；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ編（１９８７）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｋｒｉｄｅｓ編（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ；Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ編（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；およびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇら編（１９９６）Ｗｅｉｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照のこと。
【００３７】
範囲を含むすべての数値の明示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は、必要に応じて、１．０または０．１という一定数量ずつ、あるいは＋／−１５％あるいは１０％あるいは５％あるいは２％の変動で（＋）または（−）変動する近似値である。必ずしも明示的に述べられないが、すべての数値の明示は、用語「約」が先行すると理解されるべきである。必ずしも明示的に述べられないが、本明細書中に記載される試薬は、単に例示的なものであることおよびそのような試薬の等価物が当該分野で公知であることも理解されるべきである。
【００３８】
本技術がポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体に関するとき、そのようなものの等価物または生物学的等価物は、明示的な列挙なしに、かつ別段意図されない限り、本技術の範囲内であると意図されると推測されるべきである。
定義
【００３９】
明細書および請求項において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」は、それらの混合物を含む複数の細胞を含む。
【００４０】
本明細書中で使用されるとき、用語「動物」とは、例えば、哺乳動物および鳥類を含むカテゴリーである、生存している多細胞の脊椎動物のことを指す。用語「哺乳動物」は、ヒトと非ヒト哺乳動物の両方を含む。
【００４１】
用語「被験体」、「宿主」、「個体」および「患者」は、ヒト被験体および動物被験体、例えば、ヒト、動物、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、マウス、ウマおよびウシのことを指すために本明細書中で交換可能に使用される。いくつかの実施形態において、被験体は、ヒトである。
【００４２】
本明細書中で使用されるとき、用語「抗体」とは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子のことを集合的に指し、例として、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、それらの組み合わせ、および任意の脊椎動物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ヤギ、ウサギおよびマウス）ならびに非哺乳動物種（例えば、サメ免疫グロブリン）における免疫応答において産生される同様の分子が挙げられるが、これらに限定されない。別段明確に示されない限り、用語「抗体」は、目的の分子（または高度に類似した目的の分子の群）に特異的に結合するインタクトな免疫グロブリンおよび「抗体フラグメント」または「抗原結合フラグメント」を、他の分子への結合を実質的に排除する程度に含む（例えば、生物学的サンプル中の他の分子に対する結合定数よりも少なくとも１０３Ｍ−１高い、少なくとも１０４Ｍ−１高いまたは少なくとも１０５Ｍ−１高い、目的の分子に対する結合定数を有する抗体および抗体フラグメント）。用語「抗体」は、遺伝的に操作された形態、例えば、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ結合体抗体（例えば、二重特異性抗体）も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７も参照のこと。
【００４３】
抗体構造に関して、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。軽鎖には、２つのタイプ、ラムダ（λ）およびカッパー（κ）がある。抗体分子の機能活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）がある：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ。重鎖および軽鎖の各々は、定常領域および可変領域を含む（これらの領域は、「ドメイン」としても知られる）。重鎖可変領域および軽鎖可変領域は一体となって抗原に特異的に結合する。軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含む。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、定義されている（参照により本明細書に援用される、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ
Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１を参照のこと）。Ｋａｂａｔデータベースが、現在、オンラインで維持されている。種々の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成している軽鎖と重鎖とが組み合わさったフレームワーク領域は、主としてβシートコンフォメーションをとり、ＣＤＲは、βシート構造を接続するループを形成し、場合によっては、βシート構造の一部を形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性の相互作用によってＣＤＲを正しい向きに位置決めする骨格を形成するように作用する。
【００４４】
ＣＤＲは、主に抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは、通常、Ｎ末端から順にナンバリングされたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称され、通常、特定のＣＤＲが位置する鎖によって特定される。したがって、ＶＨＣＤＲ３は、それが見られる抗体の重鎖の可変ドメインに位置するのに対して、ＶＬＣＤＲ１は、それが見られる抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ１である。ＥＧＦＲに結合する抗体は、特異的なＶＨ領域配列およびＶＬ領域配列を有し、ゆえに、特異的なＣＤＲ配列を有する。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対して異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。ＣＤＲは、抗体ごとに異なるが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置しか、抗原結合に直接関わらない。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。
【００４５】
本明細書中で使用されるとき、用語「抗原」とは、特定の液性免疫または細胞性免疫の生成物（例えば、抗体分子またはＴ細胞レセプター）によって特異的に結合され得る化合物、組成物または物質のことを指す。抗原は、任意のタイプの分子であり得、それらとしては、例えば、ハプテン、単純な中間代謝産物、糖（例えば、オリゴ糖）、脂質およびホルモン、ならびに高分子、例えば、複合糖質（例えば、多糖類）、リン脂質およびタンパク質が挙げられる。抗原の通常のカテゴリーとしては、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫および他の寄生生物の抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片拒絶反応に関わる抗原、トキシン、ならびに他の多岐にわたる抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書中で使用されるとき、用語「抗原結合ドメイン」とは、抗原標的に特異的に結合し得る任意のタンパク質ドメインまたはポリペプチドドメインのことを指す。
【００４７】
用語「キメラ抗原レセプター」（ＣＡＲ）は、本明細書中で使用されるとき、抗原に結合することができる細胞外ドメイン、その細胞外ドメインが由来するポリペプチドと異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質のことを指す。「キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）」は、時折、「キメラレセプター」、「Ｔボディ」または「キメラ免疫レセプター（ＣＩＲ）」と呼ばれる。「抗原に結合することができる細胞外ドメイン」は、ある特定の抗原に結合し得る任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。「細胞内ドメイン」は、細胞において生物学的プロセスの活性化または阻害を引き起こすようにシグナルを伝達するドメインとして機能すると知られている任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。「膜貫通ドメイン」は、細胞外ドメインとシグナル伝達ドメインとを連結するように機能し得る、細胞膜にまたがると知られている任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。キメラ抗原レセプターは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間のリンカーとして働く「ヒンジドメイン」を必要に応じて含み得る。各ドメインの構成要素をコードする非限定的な例示的なポリヌクレオチド配列が、本明細書中に開示され、例えば、以下である：
ヒンジドメイン：ＩｇＧ１重鎖ヒンジ配列：
【化１】
2020156522.tif 000006
膜貫通ドメイン：ＣＤ２８膜貫通領域：
【化２】
2020156522.tif 000007
細胞内ドメイン：４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域：
【化３】
2020156522.tif 000008
細胞内ドメイン：ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域：
【化４】
2020156522.tif 000009
細胞内ドメイン：ＣＤ３ゼータシグナル伝達領域：
【化５】
2020156522.tif 000010
【００４８】
例示的な各ドメイン構成要素のさらなる実施形態は、上に開示された核酸配列によってコードされるタンパク質と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他のタンパク質を含む。さらに、そのようなドメインの非限定的な例が、本明細書中に提供される。
【００４９】
頭字語「ＥＧＦＲ」は、上皮成長因子レセプターを表す。ＥＧＦＲは、ＥｒｂＢ−１およびＨＥＲ１としても知られている。ＥＧＦＲは、細胞表面レセプターの上皮成長因子ファミリーの細胞表面レセプターである。用語「ＥＧＦＲ」とは、この名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、および本明細書中に開示されるようなＥＧＦＲの任意のアイソフォームと少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことも指す。アイソフォーム１は、基準の（ｃａｎｏｎｃｉａｌ）配列である；ゆえに、以下のすべての位置的情報は、下記に開示されるアミノ酸配列について言及している。
【００５０】
ＥＧＦＲアイソフォーム１，Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ００５３３−１：
【化６】
2020156522.tif 000011
【００５１】
結合部位としては、７４５および８５５位が挙げられるがこれらに限定されない；活性部位としては、８３７位が挙げられるがこれに限定されない；他の目的の部位としては、１０１６位が挙げられるがこれに限定されない。ＥＧＦＲアイソフォーム２（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ００５３３−２）は、４０４〜４０５位にＦＬからＬＳへの置換を有し、４０６〜１２１０位の領域を欠失している。ＥＧＦＲアイソフォーム４（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ００５３３−４）は、６２８位にＣからＳへの置換を有し、６２９〜１２１０位の領域を欠失している。ＥＧＦＲアイソフォーム３（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ００５３３−３）は、下記の配列に基づくと、６２８〜７０５位が異なり、７０６〜１２１０位の領域を欠失している。
【００５２】
ＥＧＦＲアイソフォーム３，Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ００５３３−３：
【化７】
2020156522.tif 000012
【化８】
2020156522.tif 000013
【００５３】
ＥＧＦＲｖＩＩＩは、多形神経膠芽腫（ＧＢ）を有するかなりの比率の患者において発現されると報告されているＥＧＦＲの変異型である。Ｇａｎら、２０５３５０−５３７０は、この変異型が、他の腫瘍においても同様に発現されると報告している。用語「変異ＥＧＦＲ」とは、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはこの名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、および本明細書中に示されるようなＥＧＦＲｖＩＩＩまたは本明細書中でさらに定義されるようなその等価物と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことを指し得る。
【００５４】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ，Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ００５３３［３０−２９７］：
【化９】
2020156522.tif 000014
【化１０】
2020156522.tif 000015
【００５５】
用語「変異ＥＧＦＲ」とは、１つまたはそれを超える以下の変異を有するバリアントを含むがこれらに限定されない、ＥＧＦＲの任意のアイソフォームの天然バリアントのことを指し得る：９８位におけるＲからＱ、２６６位におけるＰからＲ、４２８位におけるＧからＤ、５２１位におけるＲからＫ、６７４位におけるＶからＩ、７０９位におけるＥからＡ、７０９位におけるＥからＧ、７０９位におけるＥからＫ、７１９位におけるＧからＡ、７１９位におけるＧからＣ、７１９位におけるＧからＤ、７１９位におけるＧからＳ、７２４位におけるＧからＳ、７３４位におけるＥからＫ、７４６〜７５２位におけるＥＬＲＥＡＴＳからＤ、７４６〜７５１位におけるＥＬＲＥＡＴからＡ、７４６〜７５０位の欠失、７４６位の欠失、７４７〜７５１位の欠失、７４７〜７４９位の欠失、７４７位におけるＬからＦ、７４８位におけるＲからＰ、７５２〜７５９位の欠失、７６８位におけるＳからＩ、７６９位におけるＶからＭ、７８７位におけるＱからＲ、７９０位におけるＴからＭ、８３３位におけるＬからＶ、８３４位におけるＶからＬ、８３５位におけるＨからＬ、８３８位におけるＬからＶ、８５８位におけるＬからＭ、８５８位におけるＬからＲ、８６１位におけるＬからＱ、８７３位におけるＧからＥ、９６２位におけるＲからＧ、９８８位におけるＨからＰ、１０３４位におけるＬからＲ、１２１０位におけるＡからＶおよび／または任意の１つの特定の位置における異なるアミノ酸の置換もしくは欠失。
【００５６】
「組成物」は、一般に、活性な作用物質、例えば、化合物または組成物と、天然に存在するまたは天然に存在しない不活性な（例えば、検出可能な作用物質または標識）または活性なキャリア（例えば、アジュバント、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなど）との組み合わせを意図しており、薬学的に許容され得るキャリアを含む。また、キャリアには、薬学的賦形剤および添加物であるタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質および炭水化物（例えば、糖（単糖類、二糖類、三糖類、四糖類およびオリゴ糖を含む）；誘導体化糖（例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖など）；および多糖類または糖ポリマー）が含まれ、これらは、単独でまたは組み合わせて存在し得、単独でまたは組み合わせて１〜９９．９９重量％または容量％を構成する。例示的なタンパク質賦形剤としては、血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどが挙げられる。緩衝能としても機能し得る代表的なアミノ酸／抗体構成要素としては、アラニン、アルギニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが挙げられる。炭水化物賦形剤も、本技術の範囲内と意図されており、それらの例としては、単糖類（例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど）；二糖類（例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど）；多糖類（例えば、ラフィノース、メレチトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど）；およびアルジトール（例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール  ソルビトール（グルシトール）およびミオイノシトール）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５７】
用語「コンセンサス配列」とは、本明細書中で使用されるとき、複数のひと続きの配列をアラインメントすることによって決定され、それらの複数の配列の対応する各位置において優勢なアミノ酸または塩基の選択肢に相当する理想的な配列を定義する、アミノ酸配列または核酸配列のことを指す。それらの複数のひと続きの配列の配列に応じて、それらのひと続きの配列に対するコンセンサス配列は、各配列に０個、１個、数個のまたはそれより多い置換だけ異なり得る。また、それらの複数のひと続きの配列の配列に応じて、それらのひと続きの配列に対して、１つより多いコンセンサス配列が決定され得る。コンセンサス配列の生成は、集中的な数学的解析にかけられた。様々なソフトウェアプログラムを使用して、コンセンサス配列が決定され得る。
【００５８】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＣＤ８αヒンジドメイン」とは、この名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、および本明細書中に示されるようなＣＤ８αヒンジドメイン配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことを指す。ヒト、マウスおよび他の種のＣＤ８αヒンジドメインの配列例は、Ｐｉｎｔｏ，Ｒ．Ｄ．ら（２００６）Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１１０：１６９−１７７に提供されている。ＣＤ８αヒンジドメインに関連する配列は、Ｐｉｎｔｏ，Ｒ．Ｄ．ら（２００６）Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１１０：１６９−１７７に提供されている。そのような配列の非限定的な例としては、以下が挙げられる：
ヒトＣＤ８アルファヒンジドメイン、
【化１１】
2020156522.tif 000016
マウスＣＤ８アルファヒンジドメイン、
【化１２】
2020156522.tif 000017
ネコＣＤ８アルファヒンジドメイン、
【化１３】
2020156522.tif 000018
【００５９】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＣＤ８α膜貫通ドメイン」とは、この名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、および本明細書中に示されるようなＣＤ８α膜貫通ドメイン配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことを指す。ヒトＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖のアミノ酸位置１８３〜２０３（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１７５９．３）、またはマウスＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖のアミノ酸位置１９７〜２１７（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１０７４５７９．１）、およびラットＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖のアミノ酸位置１９０〜２１０（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿１１３７２６．１）に関連するフラグメント配列が、ＣＤ８α膜貫通ドメインのさらなる配列例を提供する。列挙された各ＮＣＢＩに関連する配列は、以下のとおり提供される：
【化１４】
2020156522.tif 000019
【００６０】
本明細書中で使用されるとき、用語「４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域」とは、この名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、および本明細書中に示されるような４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことを指す。４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域の配列例は、米国特許出願公開第２０１３０２６６５５１Ａ１（米国特許出願第１３／８２６，２５８号として出願）に提供されている。米国特許出願ＵＳ１３／８２６，２５８号に開示されている関連の４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域の配列は、以下のとおり開示されている：
４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域：
【化１５】
2020156522.tif 000020
【００６１】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＣＤ２８膜貫通ドメイン」とは、この名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、および本明細書中に示されるようなＣＤ２８膜貫通ドメイン配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、あるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことを指す。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＭ＿００６７１２８６２．２およびＸＭ＿００９４４４０５６．１に関連するフラグメント配列は、ＣＤ２８膜貫通ドメインのさらなる非限定的な配列例を提供する。列挙された各アクセッション番号に関連する配列は、本明細書中の上で言及された配列のとおり提供される。
【００６２】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域」とは、この名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、および本明細書中に示されるＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことを指す。ＣＤ２８共刺激領域は、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインの配列例は、米国特許第５，６８６，２８１号；Ｇｅｉｇｅｒ，Ｔ．Ｌ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ９８：２３６４−２３７１（２００１）；Ｈｏｍｂａｃｈ，Ａ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７：６１２３−６１３１（２００１）；Ｍａｈｅｒ，Ｊ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：７０−７５（２００２）；Ｈａｙｎｅｓ，Ｎ．Ｍ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：５７８０−５７８６（２００２）；Ｈａｙｎｅｓ，Ｎ．Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １００：３１５５−３１６３（２００２）に提供されている。非限定的な例としては、下記のＣＤ２８配列の残基１１４〜２２０：
【化１６】
2020156522.tif 000021
およびその等価物が挙げられる。
【００６３】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域」とは、この名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、および本明細書中に示されるようなＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことを指す。ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域の非限定的な配列例は、米国特許出願公開第２０１５／００１７１４１Ａ１号に提供されており、例示的なポリヌクレオチド配列を下記に提供する。
ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域：
【化１７】
2020156522.tif 000022
【００６４】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域」とは、この名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、および本明細書中に示されるようなＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは９０％の配列同一性、あるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことを指す。ＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域の非限定的な配列例は、米国特許出願公開第２０１２／２０１４８５５２Ａ１号に開示されており、下記に提供される例示的な配列を含む。
ＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域、配列番号７２：
【化１８】
2020156522.tif 000023
【００６５】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン」とは、この名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、および本明細書中に示されるようなＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことを指す。ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの配列例は、米国特許出願ＵＳ１３／８２６，２５８号に提供されている。ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインに関連する配列は、以下のとおり列挙される：
【化１９】
2020156522.tif 000024
【００６６】
本明細書中で使用されるとき、用語「Ｂ細胞」とは、適応免疫系の液性免疫におけるリンパ球の１種のことを指す。Ｂ細胞は主として、抗原相互作用による活性化後に、抗体を産生する、抗原提示細胞として働く、サイトカインを放出する、および記憶Ｂ細胞を発生させる働きをする。Ｂ細胞は、細胞表面上のＢ細胞レセプターの存在によって、Ｔ細胞などの他のリンパ球と区別される。Ｂ細胞は、単離され得るか、または商業的に入手可能な供給源から入手され得る。商業的に入手可能なＢ細胞株の非限定的な例としては、株ＡＨＨ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−８１４６ＴＭ）、ＢＣ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２２３０ＴＭ）、ＢＣ−２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２２３１ＴＭ）、ＢＣ−３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２２７７ＴＭ）、ＣＡ４６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１６４８ＴＭ）、ＤＧ−７５［Ｄ．Ｇ．−７５］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２６２５ＴＭ）、ＤＳ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１１１０２ＴＭ）、ＥＢ−３［ＥＢ３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−８５ＴＭ）、Ｚ−１３８（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−３００１）、ＤＢ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２８９）、Ｔｏｌｅｄｏ（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−２６３１）、Ｐｆｉｆｆｅｒ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６３２）、ＳＲ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２６２）、ＪＭ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０４２１）、ＮＦＳ−５  Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６９３）；ＮＦＳ−７０  Ｃ１０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６９４）、ＮＦＳ−２５  Ｃ−３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６９５）およびＳＵＰ−Ｂ１５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９２９）が挙げられる。さらなる例としては、未分化大細胞リンパ腫に由来する細胞株、例えば、ＤＥＬ、ＤＬ−４０、ＦＥ−ＰＤ、ＪＢ６、Ｋａｒｐａｓ２９９、Ｋｉ−ＪＫ、Ｍａｃ−２Ａ  Ｐｌｙ１、ＳＲ−７８６、ＳＵ−ＤＨＬ−１、−２、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０および−１６、ＤＯＨＨ−２、ＮＵ−ＤＨＬ−１、Ｕ−９３７、Ｇｒａｎｄａ５１９、ＵＳＣ−ＤＨＬ−１、ＲＬ；ホジキンリンパ腫に由来する細胞株、例えば、ＤＥＶ、ＨＤ−７０、ＨＤＬＭ−２、ＨＤ−ＭｙＺ、ＨＫＢ−１、ＫＭ−Ｈ２、Ｌ４２８、Ｌ５４０、Ｌ１２３６、ＳＢＨ−１、ＳＵＰ−ＨＤ１、ＳＵ／ＲＨ−ＨＤ−ｌが挙げられるがこれらに限定されない。そのような商業的に入手可能な細胞株の非限定的な例示的な供給源としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎすなわちＡＴＣＣ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）およびＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）が挙げられる。
【００６７】
本明細書中で使用されるとき、用語「Ｔ細胞」とは、胸腺において成熟するリンパ球の１種のことを指す。Ｔ細胞は、細胞性免疫において重要な役割を果たし、細胞表面上のＴ細胞レセプターの存在によってＢ細胞などの他のリンパ球と区別される。Ｔ細胞は、単離され得るか、または商業的に入手可能な供給源から入手され得る。「Ｔ細胞」には、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびガンマ−デルタＴ細胞をはじめとした、ＣＤ３を発現しているすべてのタイプの免疫細胞が含まれる。「細胞傷害性細胞」には、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および好中球が含まれ、これらの細胞は、細胞傷害性の応答を媒介することができる。商業的に入手可能なＴ細胞株の非限定的な例としては、株ＢＣＬ２（ＡＡＡ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０２ＴＭ）、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９００ＴＭ）、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０１ＴＭ）、ＢＣＬ２  Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９９ＴＭ）、Ｎｅｏ  Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９８ＴＭ）、ＴＡＬＬ−１０４細胞傷害性ヒトＴ細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１１３８６）が挙げられる。さらなる例としては、成熟したＴ細胞株、例えば、Ｄｅｇｌｉｓ、ＥＢＴ−８、ＨＰＢ−ＭＬｐ−Ｗ、ＨＵＴ７８、ＨＵＴ１０２、Ｋａｒｐａｓ３８４、Ｋｉ２２５、Ｍｙ−Ｌａ、Ｓｅ−Ａｘ、ＳＫＷ−３、ＳＭＺ−１およびＴ３４；および未熟なＴ細胞株、例えば、ＡＬＬ−ＳＩＬ、Ｂｅ１３、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＣＭＬ−Ｔ１、ＤＮＤ−４１、ＤＵ．５２８、ＥＵ−９、ＨＤ−Ｍａｒ、ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｈ−ＳＢ２、ＨＴ−１、ＪＫ−Ｔ１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋａｒｐａｓ４５、ＫＥ−３７、ＫＯＰＴ−Ｋ１、Ｋ−Ｔ１、Ｌ−ＫＡＷ、Ｌｏｕｃｙ、ＭＡＴ、ＭＯＬＴ−１、ＭＯＬＴ３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ１３、ＭＯＬＴ−１６、ＭＴ−１、ＭＴ−ＡＬＬ、Ｐ１２／Ｉｃｈｉｋａｗａ、Ｐｅｅｒ、ＰＥＲ０１１７、ＰＥＲ−２５５、ＰＦ−３８２、ＰＦＩ−２８５、ＲＰＭＩ−８４０２、ＳＴ−４、ＳＵＰ−Ｔ１〜Ｔ１４、ＴＡＬＬ−１、ＴＡＬＬ−１０１、ＴＡＬＬ−１０３／２、ＴＡＬＬ−１０４、ＴＡＬＬ−１０５、ＴＡＬＬ−１０６、ＴＡＬＬ−１０７、ＴＡＬＬ−１９７、ＴＫ−６、ＴＬＢＲ−１、−２、−３および−４、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２（ＣＣＬ−１２０．１）、Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５３）、Ｊ４５．０１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９９０）、Ｊ．ＣａＭ１．６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０６３）、ＲＳ４；１１（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１８７３）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣ  ＣＲＭ−ＣＣＬ−１１９）；および皮膚Ｔ細胞性リンパ腫株、例えば、ＨｕＴ７８（ＡＴＣＣ  ＣＲＭ−ＴＩＢ−１６１）、ＭＪ［Ｇ１１］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８２９４）、ＨｕＴ１０２（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１６２）が挙げられるがこれらに限定されない。Ｋ５６２赤白血病、ＴＨＰ−１単球性白血病、Ｕ９３７リンパ腫、ＨＥＬ赤白血病、ＨＬ６０白血病、ＨＭＣ−１白血病、ＫＧ−１白血病、Ｕ２６６ミエローマなどの他の白血病およびリンパ腫に由来する細胞株と同様に、ＲＥＨ、ＮＡＬＬ−１、ＫＭ−３、Ｌ９２−２２１を含むがこれらに限定されないヌル白血病細胞株も、免疫細胞の別の商業的に入手可能な起源である。そのような商業的に入手可能な細胞株の非限定的な例示的な供給源としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎすなわちＡＴＣＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）およびＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）が挙げられる。
【００６８】
本明細書中で使用されるとき、ナチュラルキラー細胞としても知られる用語「ＮＫ細胞」とは、骨髄を起源とし、自然免疫系において決定的な役割を果たすリンパ球の１種のことを指す。ＮＫ細胞は、抗体および細胞表面上の主要組織適合遺伝子複合体の非存在下でさえも、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞または他のストレスを受けた細胞に対して迅速な免疫応答をもたらす。ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−２４０７）およびＮＫＬ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら（１９９６）２４（３）：４０６−４１４に記載されている）が、ＮＫ細胞の具体例である。ＮＫ細胞は、単離され得るか、または商業的に入手可能な供給源から入手され得る。市販のＮＫ細胞株の非限定的な例としては、株ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０７ＴＭ）、ＮＫ−９２ＭＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０８ＴＭ）が挙げられる。さらなる例としては、ＮＫ株ＨＡＮＫ１、ＫＨＹＧ−１、ＮＫＬ、ＮＫ−ＹＳ、ＮＯＩ−９０およびＹＴが挙げられるがこれらに限定されない。そのような商業的に入手可能な細胞株の非限定的な例示的な供給源としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎすなわちＡＴＣＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）およびＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）が挙げられる。
【００６９】
本明細書中で使用されるとき、用語「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」は、任意の長さの多量体型のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドのことを指すために交換可能に使用される。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖または多重鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリン塩基およびピリミジン塩基あるいは他の天然の、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然のまたは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
用語「コードする」とは、この用語が核酸配列に適用されるとき、天然の状態であっても、当業者に周知の方法によって操作されたときであっても、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドであって、転写および／または翻訳されてポリペプチドおよび／またはそのフラグメントに対するｍＲＮＡを生成し得るポリヌクレオチドのことを指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補鎖であり、コード配列は、それから推定され得る。
【００７１】
本明細書中で使用されるとき、シグナルペプチドまたはシグナルポリペプチドという用語は、新たに合成された分泌ポリペプチドもしくは分泌タンパク質または膜ポリペプチドもしくは膜タンパク質の通常はＮ末端に存在するアミノ酸配列を意図している。それは、ポリペプチドに、細胞膜を横断するようにまたは細胞膜に入るように指示するように働き、その後、除去される。そのようなものの例は、当該分野で周知である。非限定的な例は、米国特許第８，８５３，３８１号および同第５，９５８，７３６号に記載されているものである。
【００７２】
本明細書中で使用されるとき、用語「ベクター」とは、種々の宿主間を移動するようにデザインされた（ｄｅｉｇｎｅｄ）核酸構築物のことを指し、それらとしては、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、ＢＡＣ、ＹＡＣなどが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、プラスミドベクターは、商業的に入手可能なベクターから調製され得る。他の実施形態において、ウイルスベクターは、当該分野で公知の手法に従って、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶなどから作製され得る。１つの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００７３】
用語「プロモーター」とは、本明細書中で使用されるとき、遺伝子などのコード配列の発現を制御する任意の配列のことを指す。プロモーターは、例えば、構成性、誘導性、抑制性または組織特異的であり得る。「プロモーター」は、転写の開始および速度を制御するポリヌクレオチド配列の領域である調節配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および調節分子が結合し得る遺伝的エレメントを含み得る。
【００７４】
本明細書中で使用されるとき、用語「単離された細胞」とは、一般に、組織の他の細胞から実質的に分離された細胞のことを指す。「免疫細胞」には、例えば、骨髄において産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ））、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）および骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）が含まれる。「Ｔ細胞」には、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびガンマ−デルタＴ細胞をはじめとした、ＣＤ３を発現しているすべてのタイプの免疫細胞が含まれる。「細胞傷害性細胞」には、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および好中球が含まれ、これらの細胞は、細胞傷害性の応答を媒介することができる。
【００７５】
本明細書中で使用されるとき、用語「単離された細胞」とは、一般に、組織の他の細胞から実質的に分離された細胞のことを指す。この用語には、原核細胞および真核細胞が含まれる。
【００７６】
「免疫細胞」には、例えば、骨髄において産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ））、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）および骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）が含まれる。「Ｔ細胞」には、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびガンマ−デルタＴ細胞をはじめとした、ＣＤ３を発現しているすべてのタイプの免疫細胞が含まれる。「細胞傷害性細胞」には、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および好中球が含まれ、これらの細胞は、細胞傷害性の応答を媒介することができる。
【００７７】
用語「形質導入する」または「形質導入」とは、この用語がキメラ抗原レセプター細胞の作製に適用されるとき、外来ヌクレオチド配列を細胞に導入するプロセスのことを指す。いくつかの実施形態において、この形質導入は、ベクターを介して行われる。
【００７８】
本明細書中で使用されるとき、細胞に関する用語「自家」とは、単離され、再度同じ被験体（レシピエントまたは宿主）に注入される細胞のことを指す。「同種異系」とは、非自家の細胞のことを指す。
【００７９】
「有効量」または「効果的な量」とは、哺乳動物または他の被験体を処置するために投与されたとき、疾患に対してそのような処置をもたらすのに十分である、ある作用物質の量または２つもしくはそれを超える作用物質の合計量のことを指す。「有効量」は、そ（れら）の作用物質、疾患およびその重症度、ならびに処置される被験体の年齢、体重などに応じて変動する。
【００８０】
本明細書中で使用されるとき、用語「癌」とは、他の身体部分に浸潤するまたは広がる潜在能力を有する異常な細胞成長に関わる疾患群のいずれか１つのことを指す。癌は、被験体の身体の種々の部分に影響し得る。癌の非限定的な例としては、乳癌、卵巣癌、白血病、リンパ腫、神経膠芽腫および星状細胞腫が挙げられる。ある特定の実施形態において、脳を起源とする癌および／または他の身体部分から脳に生じる癌の転移が、本開示に関連する。例えば、「神経膠芽腫」（ＧＢ）は、アストロサイトから生じる高度に悪性の腫瘍である；これは、細胞の急速な増殖および血管新生が原因であると推測される。「固形腫瘍」は、嚢腫または液体の領域を通常含まない異常な組織の塊である。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。種々のタイプの固形腫瘍が、それらを形成する細胞のタイプにちなんで命名されている。固形腫瘍の例としては、肉腫、癌腫およびリンパ腫が挙げられる。
【００８１】
本明細書中で使用されるとき、用語「含む」は、組成物および方法が、列挙されるエレメントを含み、他のものを排除しないことを意味すると意図される。「〜から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用されるとき、意図される用途での組み合わせに対して、任意の本質的に重要な他のエレメントを排除することを意味するものとする。例えば、本明細書中で定義されるようなエレメントから本質的になる組成物は、単離方法および精製方法由来の微量の夾雑物および薬学的に許容され得るキャリア（例えば、リン酸緩衝食塩水、保存剤など）を排除しないであろう。「〜からなる」は、微量元素より多い他の成分を排除することおよび本明細書中に開示される組成物を投与するための実質的な方法工程を排除することを意味するものとする。これらの各移行語によって定義される態様は、本開示の範囲内である。
【００８２】
本明細書中で使用されるとき、用語「検出可能なマーカー」とは、検出可能なシグナルを直接または間接的に生成することができる少なくとも１つのマーカーのことを指す。このマーカーの非網羅的リストとしては、例えば、比色、蛍光、ルミネセンス（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、発色団（例えば、蛍光色素、発光色素）、電子顕微鏡法または電気的特性（例えば、導電率、アンペロメトリー、ボルタンメトリー、インピーダンス）によって検出される電子密度を有する基、検出可能な基（例えば、物理的特性および／または化学的特性の検出可能な改変を誘導するのに十分なサイズの分子を有するもの）によって検出可能なシグナルを生成する酵素が挙げられ、そのような検出は、光学的方法（例えば、回折、表面プラズモン共鳴、表面変化（ｓｕｒｆａｃｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）、接触角変化）または物理的方法（例えば、原子間力分光法、トンネル効果）または放射性分子（例えば、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉ）によって達成され得る。
【００８３】
本明細書中で使用されるとき、用語「精製マーカー」とは、精製または識別に有用な少なくとも１つのマーカーのことを指す。このマーカーの非網羅的リストとしては、Ｈｉｓ、ｌａｃＺ、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ＮｕｓＡ、ＢＣＣＰ、ｃ−ｍｙｃ、ＣａＭ、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｃｈｅｒｒｙ、チオレドキシン、ポリ（ＮＡＮＰ）、Ｖ５、Ｓｎａｐ、ＨＡ、キチン結合タンパク質、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、ＳｔｒｅｐまたはＳ−タンパク質が挙げられる。好適な直接的または間接的な蛍光マーカーとしては、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｃｈｅｒｒｙ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＮＰ、ＡＭＣＡ、ビオチン、ジゴキシゲニン、Ｔａｍｒａ、テキサスレッド、ローダミン、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣまたは他の任意の蛍光色素もしくはハプテンが挙げられる。
【００８４】
本明細書中で使用されるとき、用語「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが、その後、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスのことを指す。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。遺伝子の発現レベルが、細胞サンプル中または組織サンプル中のｍＲＮＡまたはタンパク質の量を計測することによって測定され得る。１つの態様では、１つのサンプル由来のある遺伝子の発現レベルは、コントロールサンプルまたは参照サンプル由来のその遺伝子の発現レベルと直接比較され得る。別の態様では、１つのサンプル由来のある遺伝子の発現レベルは、化合物を投与した後の同じサンプル由来のその遺伝子の発現レベルと直接比較され得る。
【００８５】
本明細書中で使用されるとき、「相同性」もしくは「同一」、パーセント「同一性」または「類似性」は、２つまたはそれを超える核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において使用されるとき、同じである２つもしくはそれを超える配列もしくは部分配列について言及しているか、または特定の領域にわたって特定のパーセンテージのヌクレオチドもしくはアミノ酸残基が同じである、例えば、少なくとも６０％の同一性、好ましくは、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える同一性を有する、２つもしくはそれを超える配列もしくは部分配列について言及している（例えば、本明細書中に記載される抗体をコードするヌクレオチド配列または本明細書中に記載される抗体のアミノ酸配列）。相同性は、比較目的でアラインメントされ得る各配列における位置を比較することによって決定され得る。比較される配列におけるある位置が、同じ塩基またはアミノ酸によって占められているとき、それらの分子は、その位置において相同である。配列間の相同性の程度は、配列が共有する一致の数または相同な位置の数の関数である。アラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７．１８，Ｔａｂｌｅ  ７．７．１に記載されているものを用いて決定され得る。好ましくは、デフォルトのパラメータが、アラインメントに使用される。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトのパラメータを用いるＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトのパラメータを用いるＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０配列；選別＝高スコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴに見られる。用語「相同性」または「同一」、パーセント「同一性」または「類似性」は、試験配列の相補鎖にも言及するか、または試験配列の相補鎖にも適用され得る。それらの用語は、欠失および／または付加を有する配列ならびに置換を有する配列も含む。本明細書中に記載されるように、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを説明し得る。好ましくは、少なくとも約２５アミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域にわたって、またはより好ましくは少なくとも５０〜１００アミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域にわたって、同一性が存在する。「無関係な」または「非相同」配列は、本明細書中に開示される配列のうちの１つと４０％未満の同一性あるいは２５％未満の同一性を共有する。
【００８６】
句「一次」または「二次」または「三次」とは、患者が受ける処置の順序のことを指す。一次治療レジメンは、最初に行う処置であるのに対して、二次または三次治療は、それぞれ一次治療の後または二次治療の後に行われる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅは、一次治療を「ある疾患または症状に対する最初の処置」と定義している。癌を有する患者では、主要な処置は、手術、化学療法、放射線療法またはこれらの治療の組み合わせであり得る。一次治療は、当業者には「主な治療および主な処置」とも称されている。２００８年５月１日に最後に訪れたＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖを参照のこと。一般的には、ある患者が一次治療に対してポジティブな臨床反応もしくは亜臨床（ｓｕｂ−ｃｌｉｎｉｃａｌ）反応を示さなかったかまたは一次治療が停止されたことを理由に、その後、その患者には化学療法レジメンが行われる。
【００８７】
１つの態様において、抗体またはそのフラグメントの「等価物」または「生物学的等価物」という用語は、ＥＬＩＳＡまたは他の好適な方法によって測定される、抗体がそのエピトープタンパク質またはそのフラグメントに選択的に結合する能力を意味する。生物学的に等価な抗体としては、参照抗体と同じエピトープに結合する、抗体、ペプチド、抗体フラグメント、抗体バリアント、抗体誘導体および抗体模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
別段意図されない限り、本開示が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体に関するとき、そのようなものの等価物または生物学的等価物は、本開示の範囲内であると意図されることが、明示的な詳説なしに推測されるべきである。本明細書中で使用されるとき、用語「その生物学的等価物」は、参照タンパク質、抗体、ポリペプチドまたは核酸に言及しているとき、「その等価物」と同義であると意図されており、所望の構造または機能性をなおも維持しつつ、最小の相同性を有するものを意図している。明確に本明細書中に列挙されない限り、本明細書中に言及される任意のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、それらの等価物も含むと企図される。例えば、ある等価物は、少なくとも約７０％の相同性もしくは同一性または少なくとも８０％の相同性もしくは同一性、あるいは少なくとも約８５％あるいは少なくとも約９０％あるいは少なくとも約９５％あるいは９８％のパーセント相同性または同一性を意図し、参照タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と実質的に等価な生物学的活性を示す。あるいは、ポリヌクレオチドについて言及しているとき、その等価物は、ストリンジェントな条件下において参照ポリヌクレオチドまたはその相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
【００８９】
別の配列に対してある特定のパーセンテージ（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、アラインメントされたとき、そのパーセンテージの塩基（またはアミノ酸）がそれらの２つの配列を比較したとき同じであることを意味する。アラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７．１８，Ｔａｂｌｅ  ７．７．１に記載されているものを用いて決定され得る。好ましくは、デフォルトのパラメータが、アラインメントに使用される。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトのパラメータを用いるＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトのパラメータを用いるＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０配列；選別＝高スコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴに見られる。
【００９０】
「ハイブリダイゼーション」とは、１つまたはそれを超えるポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応のことを指す。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対形成、フーグスティーン結合によってまたは他の任意の配列特異的様式で生じ得る。その複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本またはそれを超える鎖、自己ハイブリダイズしている１本の鎖またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始などのより大きなプロセスまたはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断における工程を構成し得る。
【００９１】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては：約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４×ＳＳＣ〜約８×ＳＳＣの洗浄液が挙げられる。中程度のハイブリダイゼーション条件の例としては：約４０℃〜約５０℃のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの緩衝液濃度；約３０％〜約５０％のホルムアミド濃度；および約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの洗浄液が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては：約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水の洗浄液が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は、５分〜２４時間であり、１回、２回またはそれを超える洗浄工程を伴い、洗浄インキュベーション時間は、約１、２または１５分である。ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝液である。他の緩衝系を用いるＳＳＣの等価物も使用され得ると理解される。
【００９２】
「腫瘍組織タイプに対応する正常細胞」とは、腫瘍組織と同じ組織タイプ由来の正常細胞のことを指す。非限定的な例は、肺腫瘍を有する患者由来の正常な肺細胞または結腸腫瘍を有する患者由来の正常な結腸細胞である。
【００９３】
用語「単離された」とは、本明細書中で使用されるとき、他の材料を実質的に含まない分子または生物製剤または細胞材料のことを指す。１つの態様において、用語「単離された」とは、天然の起源に存在する他のＤＮＡもしくはＲＮＡまたはタンパク質もしくはポリペプチドまたは細胞もしくは細胞小器官または組織もしくは器官からそれぞれ分離された、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質もしくはポリペプチド（例えば、抗体またはその誘導体）または細胞もしくは細胞小器官または組織もしくは器官のことを指す。用語「単離された」とは、組換えＤＮＡ法によって生成されるとき、細胞材料、ウイルス材料もしくは培養液を実質的に含まない核酸もしくはペプチド、または化学的に合成されるとき化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸もしくはペプチドのことも指す。さらに、「単離された核酸」は、フラグメントとしては天然に存在せず、天然の状態で見られない、核酸フラグメントを含むと意味される。用語「単離された」は、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドのことを指すためにも本明細書中で使用され、精製されたポリペプチドと組換えポリペプチドの両方を包含すると意味される。用語「単離された」は、他の細胞または組織から単離された細胞または組織のことを指すためにも本明細書中で使用され、培養された細胞または組織と操作された細胞または組織の両方を包含すると意味される。
【００９４】
本明細書中で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」とは、Ｂリンパ球の単一クローンまたは単一抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生される抗体のことを指す。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって、例えば、ミエローマ細胞と免疫脾臓細胞との融合物からハイブリッド抗体形成細胞を形成することによって、作製される。モノクローナル抗体には、ヒト化モノクローナル抗体が含まれる。
【００９５】
用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、その最も広い意味で交換可能に使用され、２つまたはそれを超えるサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログまたはペプチド模倣物の化合物のことを指す。それらのサブユニットは、ペプチド結合によって連結され得る。別の態様において、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル結合、エーテル結合などによって連結され得る。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならないが、タンパク質の配列またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書中で使用されるとき、用語「アミノ酸」とは、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸もしくは合成アミノ酸のことを指し、それらには、グリシンおよびＤ光学異性体とＬ光学異性体の両方、アミノ酸アナログならびにペプチド模倣物が含まれる。
【００９６】
用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、任意の長さの多量体型のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかまたはそれらのアナログのヌクレオチドのことを指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を発揮し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメント（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド構造に対する修飾は、存在する場合、ポリヌクレオチドの組み立ての前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合体化などによって重合後にさらに修飾され得る。また、この用語は、二本鎖分子と一本鎖分子の両方のことを指す。別段特定されないかまたは要求されない限り、ポリヌクレオチドであるこの技術の任意の態様は、二本鎖型と、二本鎖型を構成すると知られているかまたは予測される２本の相補的な各一本鎖型との両方を包含する。
【００９７】
本明細書中で使用されるとき、用語「精製された」は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ、相対的な用語と意図されている。したがって、例えば、精製された核酸、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体または他の活性な化合物は、タンパク質または他の夾雑物から全体的または部分的に単離されたものである。一般に、実質的に精製されたペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または本開示の範囲内で使用するための他の活性な化合物は、治療的投与用の完全な薬学的製剤における、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体または他の活性な化合物と、薬学的キャリア、賦形剤、緩衝剤、吸収促進剤、安定剤、保存剤、アジュバントまたは他の副成分（ｃｏ−ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）との混合または製剤化の前の調製物に存在するすべての高分子種の８０％超を構成する。より一般的には、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体または他の活性な化合物は、他の製剤成分との混合の前の精製された調製物に存在するすべての高分子種の９０％超、しばしば９５％超になるように精製される。他の場合、精製された調製物は、本質的に均一であり得、ここで、他の高分子種は、従来の手法では検出不可能である。
【００９８】
本明細書中で使用されるとき、用語「特異的結合」は、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性での抗体と抗原との接触を意味する。ある特定の態様において、抗体は、少なくとも約１０−７Ｍ、好ましくは、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍの親和性で結合する。
【００９９】
本明細書中で使用されるとき、用語「組換えタンパク質」とは、組換えＤＮＡ法によって作製されたポリペプチドのことを指し、ここで、一般に、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、好適な発現ベクターに挿入され、そしてそれを用いて宿主細胞を形質転換して、異種タンパク質が生成される。
【０１００】
本明細書中で使用されるとき、被験体において疾患を「処置する」または被験体における疾患の「処置」とは、（１）疾患にかかりやすい被験体または疾患の症候をまだ示していない被験体においてその症候または疾患の発生を予防すること；（２）疾患を阻害することまたはその発症を阻止すること；または（３）疾患または疾患の症候を回復させるかまたは後退させることを指す。当該分野で理解されているように、「処置」は、有益な結果または所望の結果（臨床結果を含む）を得るためのアプローチである。本技術の目的のために、有益な結果または所望の結果としては、検出可能であるか検出不可能であるかを問わず、１つまたはそれを超える症候の軽減または回復、症状（疾患を含む）の程度の低下、症状（疾患を含む）の安定した（すなわち、悪化しない）状態、症状（疾患を含む）の遅延または緩徐化、症状（疾患を含む）の進行、回復または寛解、過程および緩解（部分的であるか全体的であるかを問わない）のうちの１つまたはそれを超えるものが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１０１】
本明細書中で使用されるとき、細胞、組織または器官に関する用語「過剰発現する」は、コントロール細胞、コントロール組織（ｉｓｓｕｅ）または器官において産生される量を超える量までのタンパク質を表現している。過剰発現されるタンパク質は、宿主細胞にとって内在性であり得るか、または宿主細胞にとって外来性であり得る。
【０１０２】
本明細書中で使用されるとき、用語「リンカー配列」は、１〜１０回あるいは約８回あるいは約６回あるいは約５回または４回あるいは３回あるいは２回繰り返され得る、１〜１０個またはあるいは８個のアミノ酸あるいは６個のアミノ酸あるいは５個のアミノ酸を含む任意のアミノ酸配列に関する。リンカー配列の非限定的な例は、当該分野で公知であり、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ；トリペプチドＥＦＭ；またはＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔである。
【０１０３】
本明細書中で使用されるとき、用語「エンハンサー」は、本明細書中で使用されるとき、発現される核酸配列に対する位置および向きに関係なく核酸配列の転写を増強するか、改善するかまたは回復させる配列エレメントを表す。エンハンサーは、単一のプロモーターからの転写または同時に１つより多いプロモーターからの転写を高め得る。転写を改善するというこの機能が保持されるかまたは実質的に保持される限り（例えば、野生型の活性、すなわち、完全長配列の活性の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％）、野生型エンハンサー配列の任意の切断された、変異されたまたはその他の方法で改変されたバリアントも、上記の定義の範囲内である。
【０１０４】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＷＰＲＥ」または「ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント」とは、この名称に関連する特定のヌクレオチドフラグメント、および本明細書中に示されるようなＷＰＲＥ配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことを指す。例えば、ＷＰＲＥとは、ウッドチャック肝炎ウイルスゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０４５１４）に存在するヒトＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＢＶＰＲＥ）に類似の領域のことを指し、このゲノム配列の１０９３〜１６８４位の５９２ヌクレオチドが転写後調節領域に対応する（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７２，ｐ．５０８５−５０９２，１９９８）。レトロウイルスベクターを用いた解析から、目的の遺伝子の３’末端の非翻訳領域に挿入されたＷＰＲＥが、産生されるタンパク質の量を５〜８倍増加させることが明らかになった。ＷＰＲＥの導入によってｍＲＮＡの分解が抑制されることも報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７３，ｐ．２８８６−２８９２，１９９９）。ｍＲＮＡを安定化することによってアミノ酸翻訳の効率を高めるＷＰＲＥなどのエレメントも、広い意味においてエンハンサーであると考えられる。
【０１０５】
用語「腫瘍退縮」は、ウイルスに関して使用されるとき、癌細胞に優先的に感染し、癌細胞を殺滅するウイルスのことを説明する。「ヘルペスウイルス」とは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のような）を含むがこれらに限定されない、ヘルペスウイルス科の任意のメンバーのことを指す。非限定的な例示的な腫瘍退縮ヘルペスウイルスおよびその使用が、本明細書中に記載される。例えば、Ｇ２０７、ＨＳＶ１７１６、ＮＶ１０２０、タリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｌａｈｅｒｐａｒｖｅｃ）（「Ｔ−ＶＥＣ」または「Ｏｎｃｏｖｅｘ−ＧＭＣＳＦ」）はすべて、臨床試験において試験された。Ｖａｒｇｈｅｓｅら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．９（１２）：９６７−９７８を参照のこと。
省略形のリスト
ＣＡＲ：キメラ抗原レセプター
ＩＲＥＳ：内部リボソーム侵入部位
ＭＦＩ：平均蛍光強度
ＭＯＩ：感染効率
ＰＢＭＣ：末梢血単核球
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ｓｃＦｖ：一本鎖可変フラグメント
ＧＢ：神経膠芽腫
ＢＣＢＭ：乳癌脳転移
ｏＨＳＶ：腫瘍退縮単純ヘルペスウイルス
本開示を実施するための形態
キメラ抗原レセプターおよびその使用
組成物
【０１０６】
本開示は、細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含むかまたはそれらから本質的になる、野生型ＥＧＦＲおよび／または変異ＥＧＦＲに結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を提供する。細胞外ドメインは、標的特異的結合エレメント（そうでない場合は抗原結合ドメインと称される）を含む。細胞内ドメインまたは細胞質ドメインは、共刺激シグナル伝達領域およびゼータ鎖部分を含む。ＣＡＲは、必要に応じて、最大３００アミノ酸、好ましくは、１０〜１００アミノ酸、より好ましくは、２５〜５０アミノ酸のスペーサードメインをさらに含み得る。１つの態様において、本開示は、（ａ）野生型上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）もしくは変異上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）のいずれかまたは野生型上皮成長因子レセプターおよび変異上皮成長因子レセプターの両方（「ｗｔＥＧＦＲおよび／または変異ＥＧＦＲ」）を認識する抗ＥＧＦＲ抗体の抗原結合ドメイン；（ｂ）ヒンジドメインポリペプチド；（ｃ）共刺激分子または共刺激ポリペプチド；および（ｄ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、あるいはそれらから本質的になるか、またはなおもさらにはそれらからなるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を提供する。
【０１０７】
抗原結合ドメイン。ある特定の態様において、本開示は、野生型ＥＧＦＲおよび／または変異ＥＧＦＲに特異的な抗原結合ドメインを含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもそれからなるＣＡＲを提供する。１つの態様において、変異ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩである。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、ｗｔＥＧＦＲ抗体および／または変異ＥＧＦＲ抗体の抗原結合ドメインを含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもそれからなる。さらなる実施形態において、抗原結合ドメインは、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むか、あるいはそれらから本質的になるか、またはなおもさらにはそれらからなり、そしてその抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、抗ＥＧＦＲ抗体の抗原結合ドメインを含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもそれからなる。抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、当該分野で公知であり、上に記載されている。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、上記抗体の重鎖可変領域は、
【化２０】
2020156522.tif 000025
もしくはその等価物またはこのポリペプチドによってコードされるポリヌクレオチド：
【化２１】
2020156522.tif 000026
【化２２】
2020156522.tif 000027
もしくはその等価物を含むかまたはそれらから本質的になるかまたはそれらからなる。
【０１０９】
上記ポリペプチドまたはその各々の等価物は、その後に、カルボキシ末端においてさらなる５０アミノ酸あるいは約４０アミノ酸あるいは約３０アミノ酸あるいは約２０アミノ酸あるいは約１０アミノ酸あるいは約５アミノ酸あるいは約４または３または２または１アミノ酸が続き得る。
【０１１０】
他の態様では、ＬＣ可変領域は、
【化２３】
2020156522.tif 000028
もしくはその等価物またはポリヌクレオチド：
【化２４】
2020156522.tif 000029
によってコードされるポリペプチドまたはその等価物を含むか、あるいはそれらから本質的になるか、またはなおもさらにはそれらからなる。
【０１１１】
上記ポリペプチドまたはそれらの各々の等価物は、その後に、カルボキシ末端においてさらなる５０アミノ酸あるいは約４０アミノ酸あるいは約３０アミノ酸あるいは約２０アミノ酸あるいは約１０アミノ酸あるいは約５アミノ酸あるいは約４または３または２または１アミノ酸が続き得る。
【０１１２】
その等価物は、ＣＡＲに対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドの相補鎖に高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含み、ここで、高ストリンジェンシーの条件は、約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水の洗浄液を含む。
【０１１３】
代替の実施形態は、他のＥＧＦＲ抗体のＣＤＲ由来の適切なＣＤＲとともにＬＣ可変領域の１つまたはそれを超えるＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を含む。およびその各々の等価物。したがって、一例として、ＬＣ可変領域のＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、別の抗ＥＧＦＲ抗体のＬＣ可変領域のＣＤＲ３と組み合わされ得、いくつかの態様では、さらなる５０アミノ酸あるいは約４０アミノ酸あるいは約３０アミノ酸あるいは約２０アミノ酸あるいは約１０アミノ酸あるいは約５アミノ酸あるいは約４または３または２または１アミノ酸をカルボキシ末端に含み得る。
【０１１４】
膜貫通ドメイン。膜貫通ドメインは、天然の起源または合成の起源のいずれかに由来し得る。起源が天然である場合、そのドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来してもよい。本発明において特に有用な膜貫通領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＴＣＲに由来し得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、その場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含み得る。好ましくは、合成の膜貫通ドメインの各末端には、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが見られる。必要に応じて、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、好ましくは、２〜１０アミノ酸長が、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間に連結を形成し得る。グリシン−セリンのダブレットは、特に安定したリンカーを提供する。１つの態様において、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインであり、そのようなドメインの非限定的な例は、上に記載されている。別の態様において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αヒンジドメインに連結されたＣＤ８α膜貫通ドメインである。
【０１１５】
細胞質ドメイン。ＣＡＲの細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置された免疫細胞の少なくとも１つの従来のエフェクター機能の活性化に関与する。細胞内シグナル伝達ドメインとは、エフェクター機能のシグナルを伝達し、免疫細胞に対して特定の機能を発揮するように指示するタンパク質の一部分のことを指す。シグナル伝達ドメイン全体を使用してもよいし、シグナル伝達ドメインの切断された部分がエフェクター機能のシグナルを伝達するのに十分である限り、その切断された部分を使用してもよい。ＴＣＲおよびコレセプターならびにそれらの誘導体またはバリアントの細胞質の配列が、ＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインとして機能し得る。本発明において特に有用な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＦｃＲ、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄに由来し得る。ＴＣＲを通じて生成されるシグナルは、単独では、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であるので、２次シグナルまたは共刺激シグナルも必要とされ得る。したがって、共刺激シグナル伝達分子（ＣＤ８α、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを含むがこれらに限定されない）の細胞内領域も、ＣＡＲの細胞質ドメインに含められ得る。１つの態様において、細胞内ドメインは、ＣＤ２８細胞内ドメインである。別の態様において、細胞内ドメインは、ＣＤ８α細胞内ドメインである。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、キメラ抗原レセプターの細胞活性化部分は、ＣＤ８タンパク質、ＣＤ２８タンパク質、４−１ＢＢタンパク質およびＣＤ３−ゼータタンパク質からなる群より選択される１つまたはそれを超えるタンパク質またはそのフラグメントを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなるＴ細胞シグナル伝達ドメインである。
【０１１７】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＥＧＦＲおよび変異ＥＧＦＲに結合する抗体の抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、共刺激シグナル伝達領域ならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもそれらからなる。さらなる実施形態において、共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域もしくは４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域のいずれかまたはＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域および４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域の両方を含む。ＣＡＲは、シグナルポリペプチドをさらに含み得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含み得る。
【０１１９】
ＥＧＦＲ  ＣＡＲならびにＥＧＦＲタンパク質もしくはそのフラグメントおよび／または変異ＥＧＦＲタンパク質もしくはそのフラグメントを含む単離された複合体も本明細書中に提供される。本明細書中に記載されるようなＣＡＲ、ｗｔＥＧＦＲおよび／または変異ＥＧＦＲを発現している細胞を含む単離された複合体が、なおもさらに提供される。
ポリヌクレオチドおよび宿主細胞
【０１２０】
本開示は、上に記載されたようなＥＧＦＲ  ＣＡＲをコードする単離された核酸およびこれらの配列の相補鎖も提供する。それらの核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは修飾された核酸であり得る。それらの核酸は、ベクター、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターに組み込まれ得る。１つの態様において、ベクターは、ｐＣＤＨベクターである。
【０１２１】
本開示は、本明細書中に記載されるようなＥＧＦＲ  ＣＡＲ、またはそのＣＡＲをコードするポリヌクレオチドもしくはそれらの相補鎖、またはそれらのポリヌクレオチドもしくはそれらの相補鎖を含むベクターを含む単離された宿主細胞（原核細胞または真核細胞）も提供する。原核細胞の非限定的な例としては、細菌、例えば、大腸菌の細胞が挙げられる。真核細胞の非限定的な例としては、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、幹細胞、２９３Ｔ細胞  ＮＫ−９２細胞およびＮＫＬ細胞が挙げられる。それらの細胞は、任意の種、例えば、動物、哺乳動物、ヒト、マウス、ウマ、ウシ、ネコまたはイヌに由来し得る。それらの細胞は、処置される患者から単離され得る。ゆえに、それらは、自家または同種異系であり得る。形質転換された単離された細胞は、診断的または治療的に使用され得る。
【０１２２】
単離された核酸は、検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含み得る。それらの核酸は、キャリア、例えば、固体支持体または薬学的に許容され得るキャリアと組み合わされ得る。それらは、本明細書中に記載されるようなＣＡＲを調製するのに有用である。
ＣＡＲを調製するためのプロセス
【０１２３】
本開示の態様は、ＥＧＦＲ  ＣＡＲを含む単離された細胞およびそのような細胞を作製する方法に関する。その細胞は、原核細胞または真核細胞である。１つの態様において、細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。真核細胞は、任意の好ましい種由来の細胞、例えば、動物細胞、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、ウマ、ネコまたはイヌ細胞）であり得る。
【０１２４】
特定の実施形態において、単離された細胞は、野生型ＥＧＦＲおよび／または変異ＥＧＦＲを特異的に認識した抗体の抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、共刺激分子（例えば、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域）ならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる外来性ＣＡＲを含むか、あるいはそれらから本質的になるか、またはなおもさらにはそれらからなる。ある特定の実施形態において、単離された細胞は、Ｔ細胞、例えば、動物Ｔ細胞、哺乳動物Ｔ細胞、ネコＴ細胞、イヌＴ細胞またはヒトＴ細胞である。ある特定の実施形態において、単離された細胞は、ＮＫ細胞、例えば、動物ＮＫ細胞、哺乳動物ＮＫ細胞、ネコＮＫ細胞、イヌＮＫ細胞またはヒトＮＫ細胞である。
【０１２５】
ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している細胞を作製する方法が開示され、その方法は、（ｉ）細胞または単離された細胞の集団に、抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入する工程を含むかあるいはその工程から本質的になる。その細胞は、本明細書中に記載されるようなウイルスベクターを用いて、または“Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ  ｍｏｄｉｆｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｗｉｔｈ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ”と題された、Ｒｉｅｔら（２１０３）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９６９：１８７−２０１に記載されている技術を用いて、形質導入され得る。さらなる態様において、その方法は、ＥＧＦＲ結合ドメインを発現する細胞を選択することによってＣＡＲを発現する細胞を選択する工程をさらに含む。選択は、それらの細胞の表面上に発現されたＥＧＦＲ結合ドメインを選択的に認識して、それに結合する抗ＥＧＦＲ抗体を使用することによって達成され得る。いくつかの実施形態において、単離された細胞は、Ｔ細胞、動物Ｔ細胞、哺乳動物Ｔ細胞、ネコＴ細胞、イヌＴ細胞またはヒトＴ細胞であり、それによって、ＥＧＦＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が作製される。ある特定の実施形態において、単離された細胞は、ＮＫ細胞、例えば、動物ＮＫ細胞、哺乳動物ＮＫ細胞、ネコＮＫ細胞、イヌＮＫ細胞またはヒトＮＫ細胞であり、それによって、ＥＧＦＲ  ＣＡＲ  ＮＫ細胞が作製される。
【０１２６】
Ｔ細胞またはＮＫ細胞の起源。本発明のＴ細胞の拡大および遺伝的改変の前に、Ｔ細胞の起源を、被験体または培養物から入手し得る。Ｔ細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む、被験体におけるいくつかの起源から得ることができる。
【０１２７】
妥当な細胞を単離する方法は、当該分野で周知であり、本願に容易に適用できる；例示的な方法は、下記の実施例に記載されている。本開示に対して使用するための単離方法としては、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）システム；ＳＴＥＭｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＥａｓｙＳｅｐＴＭ、ＲｏｂｏＳｅｐＴＭ、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐＴＭ、ＳｅｐＭａｔｅＴＭ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＭＡＣＳＴＭ細胞分離キットならびに他の商業的に入手可能な細胞分離キットおよび細胞単離キットが挙げられるが、これらに限定されない。免疫細胞の特定の部分集団が、ユニークな細胞表面マーカーに特異的な、そのようなキットにおいて利用可能なビーズまたは他の結合剤を使用することによって単離され得る。例えば、ＭＡＣＳＴＭＣＤ４＋およびＣＤ８＋マイクロビーズは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するために使用され得る。
【０１２８】
あるいは、細胞は、Ｔ細胞の場合、株ＢＣＬ２（ＡＡＡ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０２ＴＭ）、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９００ＴＭ）、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０１ＴＭ）、ＢＣＬ２  Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９９ＴＭ）、Ｎｅｏ  Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９８ＴＭ）；およびＮＫ細胞の場合、株ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０７ＴＭ）、ＮＫ−９２ＭＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０８ＴＭを含むがこれらに限定されない、商業的に入手可能な細胞培養物を通じて得てもよい。
【０１２９】
ベクター。ＣＡＲは、ベクターを用いて調製され得る。例示的なベクターの調製および前記ベクターを用いたＣＡＲを発現している細胞の作製は、下記の実施例において詳細に論じられる。要約すると、ＣＡＲをコードする天然の核酸または合成の核酸の発現は一般に、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸またはその一部をプロモーターに作動可能に連結し、その構築物を発現ベクターに組み込むことによって、達成される。それらのベクターは、真核生物における複製およびインテグレーションに好適であり得る。
【０１３０】
ベクターおよび／または外来性核酸を含む細胞を作製するための方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。外来性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法またはそうでない場合は本発明の阻害剤に細胞を曝露するために使用される方法に関係なく、宿主細胞における組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、種々のアッセイが行われ得る。そのようなアッセイとしては、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ；「生化学的」アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬｌＳＡおよびウエスタンブロット）または本発明の範囲内に入る、作用物質を特定するための本明細書中に記載されるアッセイによる、例えば、特定のペプチドの有無の検出が挙げられる。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、単離された核酸配列は、ｗｔＥＧＦＲおよび変異ＥＧＦＲのいずれかまたは両方を認識する抗ＥＧＦＲ抗体の抗原結合ドメイン、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域ならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなるＣＡＲをコードする。特定の実施形態において、単離された核酸配列は、抗ＥＧＦＲ抗体の抗原結合ドメインに続いて、ヒンジ領域、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域、それに続いてＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをコードする配列を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなる。さらなる態様において、抗原結合ドメインは、必要に応じてリンカーポリペプチド（ｐｏｌｙｅｐｔｉｄｅ）によって接続されるＨＣ可変領域およびＬＣ可変領域を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、単離された核酸は、抗生物質耐性を付与するポリヌクレオチドを含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、単離された核酸配列は、ベクターに含められる。ある特定の実施形態において、ベクターは、プラスミドである。他の実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。特定の実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
【０１３４】
例示的なベクターの調製および前記ベクターを用いたＣＡＲを発現している細胞の作製は、下記の実施例において詳細に論じられる。要約すると、ＣＡＲをコードする天然の核酸または合成の核酸の発現は一般に、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸またはその一部をプロモーターに作動可能に連結し、その構築物を発現ベクターに組み込むことによって、達成される。それらのベクターは、真核生物における複製およびインテグレーションに好適であり得る。ベクターおよび／または外来性核酸を含む細胞を作製するための方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【０１３５】
１つの態様において、用語「ベクター」は、非分裂細胞および／またはゆっくり分裂する細胞に感染するおよび形質導入する能力ならびに標的細胞のゲノムにインテグレートする能力を保持する組換えベクターを意図している。いくつかの態様において、ベクターは、野生型ウイルスに由来するかまたは野生型ウイルスに基づく。さらなる態様において、ベクターは、野生型レンチウイルスに由来するかまたは野生型レンチウイルスに基づく。そのようなウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などの他のレトロウイルスが、ベクター骨格のための基礎として使用され得ることが企図される。本開示に係るウイルスベクターは、特定のウイルスの構成要素に限定される必要がないことが明らかであり得る。ウイルスベクターは、２つまたはそれを超える異なるウイルスに由来する構成要素を含み得、合成の構成要素も含み得る。ベクターの構成要素は、所望の特徴、例えば、標的細胞の特異性が得られるように操作され得る。
【０１３６】
本開示の組換えベクターは、霊長類および非霊長類に由来する。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。非霊長類レンチウイルスの群には、原型である「スローウイルス」のビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連のヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ならびに最近報告されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。従来技術の組換えレンチウイルスベクターは、当該分野で公知であり、例えば、参照により本明細書中に援用される、米国特許第６，９２４，１２３号；同第７，０５６，６９９号；同第７，０７，９９３号；同第７，４１９，８２９号および同第７，４４２，５５１号を参照のこと。
【０１３７】
米国特許第６，９２４，１２３号は、ある特定のレトロウイルス配列が標的細胞のゲノムへのインテグレーションを容易にすることを開示している。この特許は、各レトロウイルスゲノムが、ビリオンタンパク質および酵素をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖと呼ばれる遺伝子を含むことを教示している。これらの遺伝子は、両端において、末端反復配列（ＬＴＲ）と呼ばれる領域に隣接している。ＬＴＲは、プロウイルスのインテグレーションおよび転写に関与する。ＬＴＲは、エンハンサー−プロモーター配列としても働く。換言すれば、ＬＴＲは、ウイルス遺伝子の発現を制御し得る。レトロウイルスＲＮＡのキャプシド形成は、ウイルスゲノムの５’末端に位置するプサイ配列によって生じる。ＬＴＲ自体は、全く同じ配列であり、Ｕ３、ＲおよびＵ５と呼ばれる３つのエレメントに分けられ得る。Ｕ３は、そのＲＮＡの３’末端に特有の配列に由来する。Ｒは、そのＲＮＡの両端において繰り返される配列に由来し、Ｕ５は、そのＲＮＡの５’末端に特有の配列に由来する。それらの３つのエレメントのサイズは、異なるレトロウイルスの間で大幅に異なり得る。ウイルスゲノムの場合、ポリ（Ａ）付加（終止）の部位は、右側のＬＴＲにおけるＲとＵ５との境界に存在する。Ｕ３は、プロウイルスの転写性調節領域の大部分を含み、それらの領域は、細胞の転写活性化タンパク質および場合によってはウイルスの転写活性化タンパク質に応答するプロモーター配列および複数のエンハンサー配列を含む。
【０１３８】
構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ自体に関して、ｇａｇは、ウイルスの内部構造タンパク質をコードする。Ｇａｇタンパク質は、タンパク分解性にプロセシングされて、成熟タンパク質ＭＡ（マトリックス）、ＣＡ（キャプシド）およびＮＣ（ヌクレオカプシド）になる。ｐｏｌ遺伝子は、ゲノムの複製を媒介する、ＤＮＡポリメラーゼ、関連するＲＮａｓｅＨおよびインテグラーゼ（ＩＮ）を含む逆転写酵素（ＲＴ）をコードする。
【０１３９】
ウイルスベクター粒子の産生のために、ベクターＲＮＡゲノムは、宿主細胞において、それをコードしているＤＮＡ構築物から発現される。ベクターゲノムによってコードされないそれらの粒子の構成要素は、宿主細胞において発現されるさらなる核酸配列（通常、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子のいずれかまたは両方を含む「パッケージングシステム」）によってトランスで提供される。ウイルスベクター粒子の産生のために必要な配列セットは、一過性のトランスフェクションによって宿主細胞に導入されてもよいし、宿主細胞ゲノムにインテグレートされてもよいし、または方法の組み合わせで提供されてもよい。関連する手法は、当業者に公知である。
【０１４０】
本開示において使用するためのレトロウイルスベクターとしては、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．製のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＬｅｎｔｉシリーズバージョン４、６および６．２「ＶｉｒａＰｏｗｅｒ」システム；Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが研究室で作製し使用するｐＨＩＶ−７−ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製の「Ｌｅｎｔｉ−Ｘ」レンチウイルスベクターｐＬＶＸ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製のｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ；Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のｐＬｅｍｉＲ；およびＣｈａｒｉｔe  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ（ＣＢＦ），Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙが研究室で作製し使用するｐＬＶが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４１】
外来性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法またはそうでない場合は本開示の阻害剤に細胞を曝露するために使用される方法に関係なく、宿主細胞における組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、種々のアッセイが行われ得る。そのようなアッセイとしては、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ；「生化学的」アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬｌＳＡおよびウエスタンブロット）または本開示の範囲内に入る作用物質を特定するための本明細書中に記載されるアッセイによる、例えば、特定のペプチドの有無の検出が挙げられる。
【０１４２】
パッケージングベクターおよび細胞株。ＣＡＲは、パッケージングベクターおよび細胞株を用いることによって、レトロウイルスパッケージングシステムにパッケージングされ得る。そのパッケージングプラスミドとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。パッケージングベクターは、細胞への遺伝物質の送達を容易にするエレメントおよび配列を含む。例えば、レトロウイルス構築物は、複製不能レトロウイルスベクターをパッケージングするために必要なすべてのビリオンタンパク質をトランスでコードする複製不能レトロウイルスゲノムに由来する、複製可能ヘルパーウイルスを生成せずに複製不能レトロウイルスベクターを高力価でパッケージングできるビリオンタンパク質を生成するための、少なくとも１つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含むパッケージングプラスミドである。そのレトロウイルスＤＮＡ配列は、そのウイルスのウイルス５’ＬＴＲの天然のエンハンサーおよび／またはプロモーターをコードする領域を欠き、ヘルパーゲノムのパッケージングに関与するプサイ機能配列と３’ＬＴＲの両方を欠くが、外来のポリアデニル化部位、例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化部位、ならびにウイルスの産生が望まれる細胞型において効率的な転写を指示する外来のエンハンサーおよび／またはプロモーターをコードする。レトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）などの白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）である。外来のエンハンサーおよびプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）前初期（ＩＥ）エンハンサーおよびプロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）のエンハンサーおよびプロモーター（Ｕ３領域）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＵ３領域、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）のＵ３領域、または天然のモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターに結合されたＨＣＭＶ  ＩＥエンハンサーであり得る。レトロウイルスパッケージングプラスミドは、プラスミドベースの発現ベクターによってコードされる２つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列からなり得、例えば、第１のヘルパー配列は、エコトロピックなＭＭＬＶまたはＧＡＬＶのｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするｃＤＮＡを含み、第２のヘルパー配列は、ｅｎｖタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。Ｅｎｖ遺伝子は、宿主範囲を決定し、ゼノトロピック、アンフォトロピック、エコトロピック、ポリトロピック（ミンクフォーカス形成）または１０Ａ１マウス白血病ウイルスのｅｎｖタンパク質、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ｅｎｖタンパク質、ヒト免疫不全ウイルスｅｎｖ（ｇｐ１６０）タンパク質、水胞性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｔｕｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＶＳＶ）Ｇタンパク質、ヒトＴ細胞白血病（ＨＴＬＶ）ＩおよびＩＩ型ｅｎｖ遺伝子産物、１つまたはそれを超える上述のｅｎｖ遺伝子の組み合わせに由来するキメラエンベロープ遺伝子または上述のｅｎｖ遺伝子産物の細胞質および膜貫通をコードするキメラエンベロープ遺伝子、ならびに所望の標的細胞上の特異的な表面分子に対するモノクローナル抗体をコードする遺伝子に由来し得る。
【０１４３】
パッケージングプロセスでは、パッケージングプラスミドおよびＥＧＦＲを発現するレトロウイルスベクターを、ウイルスを産生できる哺乳動物細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞、例えば、２９３細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３，ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．））の第１の集団に一過性にコトランスフェクトして、高力価の組換えレトロウイルス含有上清を生成する。本発明の別の方法では、次いで、この一過性にトランスフェクトされた第１の細胞集団を、哺乳動物の標的細胞、例えば、ヒトリンパ球と共培養して、標的細胞に外来遺伝子を高効率で形質導入する。本発明のなおも別の方法では、上に記載された一過性にトランスフェクトされた第１の細胞集団の上清を、哺乳動物の標的細胞、例えば、ヒトリンパ球または造血幹細胞とともにインキュベートして、標的細胞に外来遺伝子を高効率で形質導入する。
【０１４４】
別の態様において、パッケージングプラスミドは、ウイルスを産生できる哺乳動物細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞、例えば、２９３細胞）の第１の集団において安定に発現される。レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、選択可能マーカーとのコトランスフェクションまたは偽型ウイルスによる感染のいずれかによって細胞に導入される。両方の場合において、ベクターはインテグレートする。あるいは、ベクターは、エピソームとして維持されるプラスミドとして導入され得る。高力価の組換えレトロウイルス含有上清が生成される。
【０１４５】
Ｔ細胞またはＮＫ細胞の活性化および拡大。望ましいＣＡＲを発現するようにＴ細胞またはＮＫ細胞を遺伝的に改変する前であるか後であるかに関係なく、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号に記載されている方法などの広く知られている方法を用いて広く活性化され、拡大され得る。妥当な細胞を活性化する方法は、当該分野で周知であり、本願に容易に適合され得る；例示的な方法は、下記の実施例に記載されている。エキソビボにおけるＥＧＦＲ抗原での刺激は、ＣＡＲを発現している選択されたＴ細胞の部分集団を活性化し、拡大し得る。あるいは、それらのＴ細胞は、ＥＧＦＲ抗原との相互作用によってインビボで活性化され得る。したがって、さらなる態様において、本開示は、ＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している単離された拡大された細胞集団を提供する。
【０１４６】
本開示に関して使用するための単離方法としては、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）システム活性化および拡大キット；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＰｈｏｓｆｌｏｗＴＭ活性化キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ
ＭＡＣＳＴＭ活性化／拡大キット、および妥当な細胞の活性化部分に特異的な他の商業的に入手可能な細胞キットが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなキットにおいて利用可能なビーズまたは他の作用物質を使用することによって、免疫細胞の特定の部分集団が、活性化または拡大され得る。例えば、α−ＣＤ３／α−ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）が、単離されたＴ細胞の集団を活性化し、拡大するために使用され得る。
【０１４７】
上で開示されたように、キメラ抗原レセプターは、抗原認識部分および細胞活性化部分を含む。本開示の態様は、野生型ＥＧＦＲおよび変異ＥＧＦＲに特異的な抗原結合ドメインを含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）に関する。
使用方法
【０１４８】
治療用途。本開示のＣＡＲ  Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂａｓｔｏｍａ）などのＥＧＦＲを発現する腫瘍および癌を処置するために使用され得る。本開示のＥＧＦＲ  ＣＡＲ細胞は、単独で、または希釈剤、公知の抗癌治療（化学療法薬、手術および／または放射線照射）および／もしくは他の構成要素（例えば、サイトカインまたは免疫賦活性の他の細胞集団）と組み合わせて、投与され得る。本開示の方法は、一次、二次、三次または四次治療であり得る。
【０１４９】
本開示の方法の態様は、腫瘍の成長の阻害を必要とする被験体において腫瘍の成長を阻害するための方法および／またはそれを必要とする癌患者を処置するための方法に関する。いくつかの実施形態において、腫瘍は、固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、腫瘍／癌は、神経膠芽腫または神経膠芽腫幹細胞である。ある特定の実施形態において、これらの方法は、被験体または患者に、有効量の本明細書中に記載されるような単離された細胞、例えば、ＥＧＦＲ  ＣＡＲを含む単離された細胞を投与する工程を含むかあるいはその工程から本質的になるかまたはなおもさらにその工程からなる。なおもさらなる実施形態において、単離された細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、単離された細胞は、処置される被験体または患者にとって自家である。さらなる態様において、腫瘍は、ＥＧＦＲ抗原を発現し、被験体は、本明細書中に記載される診断などの診断によって治療のために選択された被験体である。さらなる態様において、単離された細胞は、神経膠芽腫または神経膠芽腫幹細胞の成長を阻害するために被験体の脳に直接注射または注入される。
【０１５０】
本発明のＥＧＦＲ  ＣＡＲを含む薬学的組成物は、処置または予防されるべき疾患にとって適切な様式で投与され得る。任意の適切な投与方法、例えば、直接注射および／または静脈内注射などによる全身性の方法が、用いられ得る。投与の量および頻度は、患者の症状ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度などの因子によって決定され得るが、適切な投与量は、臨床試験によって決定され得る。腫瘍の成長を阻害する方法は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマおよび他の種を含むがこれらに限定されない被験体に適用され得る。
【０１５１】
１つの実施形態において、本開示は、患者が、ＥＧＦＲ  ＣＡＲ治療に応答する可能性があるかまたは可能性がないかを判定するための方法を提供し、その方法は、その患者から単離された腫瘍サンプルを有効量のＥＧＦＲ抗体と接触させる工程、およびその腫瘍サンプルに結合した任意の抗体の存在を検出する工程を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなり、ここで、その腫瘍サンプルに結合した抗体の存在は、その患者が、ＥＧＦＲ  ＣＡＲ治療に応答する可能性があることを示唆し、その腫瘍サンプルに結合した抗体が存在しないことは、その患者が、ＥＧＦＲ  ＣＡＲ治療に応答する可能性がないことを示唆する。別の実施形態において、その方法は、ＥＧＦＲ  ＣＡＲ治療に応答する可能性があると判定された患者に対して有効量のＥＧＦＲ  ＣＡＲ治療を行う工程をさらに含む。この方法では、患者は、脳癌に罹患している可能性がある。いくつかの実施形態において、この脳癌は、神経膠芽腫または別の癌（例えば、乳癌）の転移である。１つの態様において、サンプルは、癌を有すると診断された被験体、癌を有すると疑われる被験体または癌を有するリスクがある被験体から得られる。
【０１５２】
１つの態様において、検出は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリーまたはＥＬＩＳＡのうちの１つまたはそれを超えるものを含むか、あるいはそれらから本質的になるか、またはなおもさらにはそれらからなる。
【０１５３】
１つの態様において、上記方法は、被験体から生物学的サンプルを単離する工程を含むか、あるいはその工程から本質的になるか、またはなおもさらにはその工程からなる。さらなる態様では、Ｔ細胞またはＮＫ細胞が、被験体から単離され、ＥＧＦＲ  ＣＡＲをコードする単離された核酸を形質導入され、形質導入された細胞の拡大された集団を、本明細書中に記載されるような方法を用いて、被験体への投与のために調製する。
【０１５４】
１つの態様において、被験体は、ヒト患者などの哺乳動物である。
組成物およびキャリア
【０１５５】
本発明のさらなる態様は、キャリアおよび１つまたはそれを超える生成物、例えば、ＥＧＦＲ  ＣＡＲ、ＥＧＦＲ  ＣＡＲを含む単離された細胞、ＥＧＦＲ  ＣＡＲをコードする単離された核酸もしくはそれらの相補鎖および／または単離された核酸を含むベクターを含む組成物に関する。それらのキャリアは、固体キャリアまたは液体キャリア、例えば、薬学的に許容され得るキャリアであり得る。
【０１５６】
簡潔には、本発明の薬学的組成物は、１つの態様において、本明細書中に記載されるような細胞集団を、１つまたはそれを超える薬学的にまたは生理的に許容され得るキャリア、希釈剤もしくは賦形剤または固体支持体と組み合わせて含む特許請求される組成物のうちのいずれか１つを含むがこれらに限定されない。そのような組成物は、緩衝液（例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など）；炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール）；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）；酸化防止剤；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含み得る。本開示の組成物は、経口投与、静脈内投与、局所投与、経腸投与および／または非経口投与のために製剤化され得る。ある特定の実施形態において、本開示の組成物は、静脈内投与のために製剤化される。
【０１５７】
簡潔には、本発明の薬学的組成物は、１つまたはそれを超える薬学的にまたは生理的に許容され得るキャリア、希釈剤または賦形剤とともに、本明細書中に記載されるような特許請求される組成物のうちのいずれか１つを含むがこれらに限定されない。そのような組成物は、緩衝液（例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など）；炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール）；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）；酸化防止剤；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含み得る。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与のために製剤化される。
【０１５８】
本発明の薬学的組成物は、処置または予防されるべき疾患にとって適切な様式で投与され得る。投与の量および頻度は、患者の症状ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度などの因子によって決定され得るが、適切な投与量は、臨床試験によって決定され得る。
併用療法
【０１５９】
本開示の態様は、本明細書中に開示されるＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している細胞および腫瘍退縮単純ヘルペスウイルスが関わる併用療法に関する。臨床研究から、腫瘍退縮ヘルペスウイルスは、単独で投与されるとき、限られた有効性で働くことが実証された。本明細書中に提供される実験および開示は、ＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している細胞に対する有望な結果を実証する。本出願人は、ＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している細胞と腫瘍退縮単純ヘルペスウイルスの両方の投与が相乗効果を有することを見出した。理論に拘束されるものではないが、ＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している細胞は、腫瘍退縮ヘルペスウイルスによる感染および破壊のために、癌細胞がより接近可能になる腫瘍組織の構造の破壊を促進し得ると推測される。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、併用療法において使用するために企図されるＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞から必要に応じて選択される、単離された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、これらのＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している細胞は、放射線照射される。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している細胞は、１〜１００００ｃＧｙ、例えば、１ｃＧｙ、５ｃＧｙ、１０ｃＧｙ、５０ｃＧｙ、１００ｃＧｙ、５００ｃＧｙ、１０００ｃＧｙ、５０００ｃＧｙもしくは１００００ｃＧｙ超、または１ｃＧｙ、５ｃＧｙ、１０ｃＧｙ、５０ｃＧｙ、１００ｃＧｙ、５００ｃＧｙ、１０００ｃＧｙ、５０００ｃＧｙもしくは１００００ｃＧｙ未満（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎｋ）、または約１ｃＧｙ、５ｃＧｙ、１０ｃＧｙ、５０ｃＧｙ、１００ｃＧｙ、５００ｃＧｙ、１０００ｃＧｙ、５０００ｃＧｙもしくは１００００ｃＧｙ（であるがこれらに限定されない）の線量で放射線照射される。いくつかの実施形態において、放射線量は、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間もしくはそれを超える時間を超えるまで、または約１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間もしくはそれを超える時間にわたって、ＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している細胞の完全な活性を維持しつつ、それらの細胞が増殖されるように最適化される。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している細胞は、ｏＨＳＶを全滅させないまたは排除しないように改変される（放射線照射または他の手段によって）。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、腫瘍退縮単純ヘルペスウイルスは、臨床試験を受けた、本明細書中の上記に開示される１つまたはそれを超える腫瘍退縮ヘルペスウイルスである。いくつかの実施形態において、腫瘍退縮単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２に由来する。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している細胞は、腫瘍退縮単純ヘルペスウイルスと同時、または腫瘍退縮単純ヘルペスウイルスの前もしくは後に投与される。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している細胞が、最初に投与される。他の実施形態において、腫瘍退縮単純ヘルペスウイルスが、最初に投与される。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している細胞は、単回または複数回投与される。いくつかの実施形態において、腫瘍退縮単純ヘルペスウイルスは、単回または複数回投与される。１つの実施形態において、ＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している細胞（ｖｅｌｌｓ）が最初に投与された後、１日またはそれを超える日数にわたって、腫瘍退縮単純ヘルペスウイルスが投与される。
キット
【０１６３】
本明細書中に記載されるようなＥＧＦＲ  ＣＡＲ、ＥＧＦＲ  ＣＡＲをコードする単離された核酸もしくはそれらの相補鎖、それらの核酸を含むベクター、本明細書中に記載されるような単離された細胞、または本明細書中に記載されるような単離された複合体のうちの１つまたはそれを超えるものを含むキットが、本明細書中にさらに提供される。
【０１６４】
以下の実施例は、本開示を例証することを目的としており、本開示を限定することを目的としていない。
【実施例】
【０１６５】
実験１−ＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している細胞の作製および特徴付け
細胞培養
ヒトＧＢ細胞株［Ｇｌｉ３６デルタＥＧＦＲ（Ｇｌｉ３６ｄＥＧＦＲ）、Ｕ２５１およびＬＮ２２９］およびヒト患者由来ＧＢ幹細胞（ＧＢ１１２３、ＧＢ３０、ＧＢ８３およびＧＢ３２６）（Ｍａｏ，Ｐ．ら（２０１３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１０：８６４４−８６４９）を本研究において使用した。ＧＢ８４Ｖ３ＳＬ、ＧＢ１５７Ｖ３ＳＬおよびＧＢ１９も、同じプロトコルを用いてＧＢ患者から確立した（Ｍａｏ，Ｐ．ら（２０１３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１０：８６４４−８６４９）。すべてのＧＢ細胞株、２９３Ｔ細胞およびＰｈｏｅｎｉｘ細胞を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）が補充されたＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で培養した。ＧＢ幹細胞は、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、Ｂ２７（１：１００）、ヘパリン（５μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）が補充されたＤＭＥＭ−Ｆ−１２培地中で培養した。上記の抗生物質のストックおよびサイトカインのストックのすべてをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ヒトＮＫ細胞株ＮＫ−９２およびＮＫＬを、２０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）および１５０ＩＵ／ｍＬ組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ−２（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）が補充されたＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。
マウス
【０１６６】
６〜８週齢のＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウス（ＮＳＧ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。すべての動物実験が、Ｔｈｅ  Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに承認され、それらの方法は、承認されたガイドラインに従って行われた。マウスを、ＧＢの疾患進行について頻繁にモニターし、神経学的障害で瀕死になり、明白に体重減少したとき、屠殺した。
抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲレンチウイルス構築物の作製
【０１６７】
抗ＥＧＦＲ一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を、ｗｔＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの両方を認識するマウスモノクローナル抗体５２８を産生するハイブリドーマ細胞株から得た（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｈ．ら（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＣＩＩ  ５３：４９７−５０９；Ｈｕｍｐｈｒｅｙ，Ｐ．Ａ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：４２０７−４２１１）。重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域に対するコーディングドメイン配列を別々に増幅し、リンカーを用いて一部重複するＰＣＲ反応によってアセンブルした。ＶＨ−リンカー−ＶＬフラグメントを、レトロウイルスベクターから切り出されたＣＤ２８−ＣＤ３ζ部分（Ｐｕｌｅ，Ｍ．Ａ．ら（２００５）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１２：９３３−９４１）にインフレームで組み込んだ。次いで、抗ＥＧＦＲ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−ＣＤ３ζフラグメント全体を、ｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ｃｏｐＧＦＰ（ｐＣＤＨ，Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）と命名されたレンチウイルスベクターにライゲートして、ｐＣＤＨ−ＥＧＦＲ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ（ｐＣＤＨ−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ）構築物を作製した。
レンチウイルスの作製およびＮＫ細胞の形質導入
【０１６８】
ＮＫ細胞（ＮＫ−９２およびＮＫＬ）に感染させるためのレンチウイルスを作製するために、２９３Ｔ細胞を、リン酸カルシウムトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、パッケージング構築物ｐＣＭＶ−ＶＳＶＧおよびｐＣＭＶ−ＤＲ９とともに、上述のｐＣＤＨ−ＥＧＦＲ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−ＣＤ３ζプラスミドまたはｍｏｃｋ  ｐＣＤＨベクターでコトランスフェクトした。トランスフェクションおよび感染手順は、以前に公開されたプロトコル（Ｃｈｕ，Ｊ．ら（２０１４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２８：９１７−９２７）から改変した。
ｗｔＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩを安定に発現するＧＢ１９幹細胞の作製
【０１６９】
Ｐｈｏｅｎｉｘ細胞を、リン酸カルシウムトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、Ｓａｒａ３パッケージングプラスミドとともに、ｐＢＡＢＥ−ｗｔＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲ発現構築物）またはｐＢＡＢＥ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現構築物）またはｐＢＡＢＥ空ベクターでコトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、感染性の上清を回収して、ポリブレン（８μｇ／ｍＬ）の存在下においてＧＢ１９幹細胞に感染させた。レトロウイルスを、ＧＢ１９幹細胞への感染のために無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中に産生させ、その後、ＧＦＰ陽性のＧＢ１９−ｗｔＥＧＦＲまたはＧＢ１９−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて選別した。
フローサイトメトリー
【０１７０】
ＥＧＦＲ−ＣＡＲのＮＫ細胞表面発現を評価するために、形質導入されたＮＫ細胞を、４％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄し、以前に報告されたように（Ｃｈｕ，Ｊ．ら（２０１４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２８：９１７−９２７）、ビオチン標識ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２ポリクローナル抗体またはアイソタイプコントロールとして通常のポリクローナルヤギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）とインキュベートした。次いで、細胞を再度洗浄し、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合体化ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で染色した。ＧＢ細胞表面上のｗｔＥＧＦＲおよび／またはＥＧＦＲｖＩＩＩの発現を測定するために、それらの細胞を、野生型ＥＧＦＲとその変異型（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）の両方を認識するマウスモノクローナル抗ヒトＥＧＦＲ（クローンＨ１１，ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）とインキュベートした後、ＡＰＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体で染色した。
逆転写ＰＣＲ
【０１７１】
神経膠腫細胞におけるＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの発現を検出するために、ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてその細胞株から抽出し、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）で定量した。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ
Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて逆転写物を生成し、ＧｏＴａｑ（登録商標）Ｆｌｅｘｉ
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてＰＣＲを行った。順方向プライマーは、
【化２５】
2020156522.tif 000030
であり、逆方向プライマーは、
【化２６】
2020156522.tif 000031
である。ＰＣＲ反応のパラメータは、９５℃５分、および９５℃４０秒、５５℃４０秒、７２℃１分を３５サイクル、および７２℃で１０分間の最終的な伸長である。
細胞傷害アッセイ
【０１７２】
標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを、以前に報告されたように（Ｙｕ，Ｊ．ら（２０１０）Ｂｌｏｏｄ  １１５：２７４−２８１）行った。簡潔には、標的細胞を、５１Ｃｒで標識し、９６ウェルＶ底プレートのウェルにおいて３７℃で４時間、改変されたＮＫ細胞と様々なエフェクター／標的比（Ｅ／Ｔ）で共培養した。上清を回収し、液体シンチレーションカクテル（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含むシンチレーションバイアルに移し、５１Ｃｒの放出をＢｅｃｋｍａｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  ＬＳ−６５００において計測した。
完全培地中または１％ＳＤＳ中でインキュベートされた標的細胞を使用して、それぞれ自発的なまたは最大の５１Ｃｒ放出を測定した。特異的細胞溶解のパーセンテージを、標準的な式：１００×（実験による放出のｃｐｍ−自発的な放出のｃｐｍ）／（最大の放出のｃｐｍ−自発的な放出のｃｐｍ）を用いて算出した。
ＩＦＮ−γ放出アッセイ
【０１７３】
１×１０６個の標的細胞を、同数のＮＫエフェクター細胞とともに、９６ウェルＶ底プレートにおいて２４時間インキュベートした。無細胞上清を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）製のキットを製造者のプロトコルに従って用いて酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によってＩＦＮ−γの分泌についてアッセイした。図面に示されているデータは、同様の結果だった３つの代表的な実験のうちの１つの３つ組のウェルの平均値である。
ＮＳＧマウスにおける同所ヒトＧＢ３０異種移植片の処置
【０１７４】
ＧＢ３０ＧＢ幹細胞に、先に記載されたように（Ｈｅ，Ｓ．ら（２０１３）Ｂｌｏｏｄ
１２１：４６６３−４６７１）、ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）を発現するＰｉｎｃｏ−ｐＧＬ３−ｌｕｃ／ＧＦＰウイルスをレトロウイルス的に形質導入した。ＧＦＰ陽性細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて選別し、「ＧＢ３０−ＦＦＬ」細胞と命名した。ＮＳＧマウスを麻酔し、定位装置において固定し、ブレグマに対して２ｍｍ外側および１ｍｍ腹側に３．２５ｍｍの深さの穿頭孔を開け、２μｌのハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）中の５×１０４個のＧＢ３０−ＦＦＬ細胞を植え込んだ。７日目に、５μｌのＨＢＳＳ中の、２×１０６個のエフェクター細胞（放射線照射されていない）、すなわちＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２細胞（ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ）またはｍｏｃｋを形質導入されたＮＫ−９２細胞（ＮＫ−９２−ＥＶ）をマウスの頭蓋内に注射した。５μｌのＨＢＳＳのみで処置したマウスをコントロールとして使用した。マウスを毎日モニターし、罹患の徴候を示したら、安楽死させた。ＧＢ３０−ＦＦＬ細胞接種の２週間後、Ｄ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ体重；Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をマウスの腹腔内に（ｉ．ｐ．）注入し、イソフルランで麻酔し、生体画像化ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を備えるインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ−１００，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて画像化した。
ＮＳＧマウスにおける同所ヒトＵ２５１異種移植片の処置
【０１７５】
Ｕ２５１  ＧＢ細胞に、先に記載されたように（Ｈｅ，Ｓ．ら（２０１３）Ｂｌｏｏｄ
１２１：４６６３−４６７１）、ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）を発現するＰｉｎｃｏ−ｐＧＬ３−ｌｕｃ／ＧＦＰウイルスをレトロウイルス的に形質導入した。ＧＦＰ陽性細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて選別し、「Ｕ２５１−ＦＦＬ」細胞と命名した。ＮＳＧマウスを麻酔し、定位装置において固定し、ブレグマに対して２ｍｍ外側および１ｍｍ腹側に３．２５ｍｍの深さの穿頭孔を開け、その穿頭孔を通じて、２μｌのハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）中の１０５個のＵ２５１−ＦＦＬ細胞を０日目に接種した。１０、４０、７０日目に、５μｌのＨＢＳＳ中の、２×１０６個のエフェクター細胞、すなわちＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２細胞（ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ）またはｍｏｃｋを形質導入されたＮＫ−９２細胞（ＮＫ−９２−ＥＶ）をマウスの頭蓋内に注射した。５μｌのＨＢＳＳのみで処置したマウスをコントロールとして使用した。マウスを毎日モニターし、罹患の徴候を示したら、安楽死させた。Ｕ２５１−ＦＦＬ細胞接種の１００日目に、Ｄ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ体重；Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をマウスの腹腔内に（ｉ．ｐ．）注入し、イソフルランで麻酔し、生体画像化ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を備えるインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ−１００，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて画像化した。
ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞の器官および組織分布アッセイ
【０１７６】
２×１０６個のＮＫ−９２  ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞を、腫瘍の植え込みの７日後に、３匹のＧＢ３０を有するマウスの頭蓋内に注射した。３日後、すべてのマウスを屠殺し、肝臓、肺、脾臓、骨髄、血液および脳を回収した。器官または組織の半分を、ＤＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いるゲノムＤＮＡの単離のために使用し、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ｓｃＦｖ領域を増幅するためのプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ順方向プライマーは、
【化２７】
2020156522.tif 000032
であり、逆方向プライマーは、
【化２８】
2020156522.tif 000033
であった。ＰＣＲ反応のパラメータは、９５℃５分、および９５℃４０秒、５５℃４０秒、７２℃１分を３５サイクル、および７２℃で１０分間の最終的な伸長であった。
【０１７７】
器官または組織の他方の半分を、Ｐｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）における密度勾配遠心分離を用いて単核免疫細胞を単離するために使用した。回収された免疫細胞を、Ｖ４５０マウス抗ヒトＣＤ３ｅおよびＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ５６抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で表面染色して、特定の器官または組織におけるＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞の存在を判定した。
統計解析
【０１７８】
正規分布の場合、対応のないスチューデントｔ検定を用いて、独立した２つの群を連続したエンドポイントについて比較した。独立した３つまたはそれを超える群を比較するときは、１元配置分散分析を用いた。インビボ生物発光強度などの非正規分布のエンドポイントの場合、クラスカル・ワリス検定を用いて、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ群の中央値とＮＫ−９２−ＥＶおよびＨＢＳＳ処置群の中央値を比較した。生存データの場合、カプラン・マイヤー曲線をプロットし、ログランク検定を用いて比較した。すべての検定が両側の検定である。多重比較の場合、ボンフェローニ法を用いてＰ値を調整した。０．０５未満のＰ値を有意であるとみなした。
【０１７９】
ｗｔＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩを安定に発現している２９３Ｔ細胞株の作製。Ｐｈｏｅｎｉｘ細胞を、リン酸カルシウムトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて、Ｓａｒａ３パッケージングプラスミドとともに、ｐＢＡＢＥ−ｗｔＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲ発現構築物）、ｐＢＡＢＥ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現構築物）またはｐＢＡＢＥ空ベクターでコトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、上清を回収して、ポリブレン（８μｇ／ｍＬ）の存在下において２９３Ｔ細胞に感染させた。ＧＦＰ陽性細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて選別した。
【０１８０】
レンチウイルスの作製および初代ＮＫ細胞の形質導入。レンチウイルスを、先に報告されたように（Ｃｈｕ，Ｊ．ら（２０１４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２８：９１７−９２７）作製し、４℃、２０，０００ｇで９０分間、超遠心機によって濃縮し、１×ＰＢＳで再懸濁した。ヒト初代ＮＫ細胞を、以前に報告されたように（Ｈｅ，Ｓ．ら（２０１３）Ｂｌｏｏｄ  １２１：４６６３−４６７１）、健康ドナーの末梢血ロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｃｋ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏ）から単離し、２０００ｒｐｍおよび３２℃での２時間の連続した３回の遠心分離（遠心分離ごとに静かに再懸濁する）によってレンチウイルス（ＭＯＩ＝２．５）に感染させ、ＧＦＰ陽性細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて選別した。標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを行うことにより、ＥＧＦＲ−ＣＡＲプラスミドまたはコントロールベクターを形質導入された初代ＮＫ細胞の、Ｕ２５１およびＧｌｉ３６ｄＥＧＦＲ  ＧＢ細胞株ならびにＧＢ３０およびＧＢ１５７Ｖ３ＳＬ患者由来ＧＢ幹細胞に対する細胞傷害性を評価した。
【０１８１】
抗体ブロッキングアッセイ。ＧＢ３０幹細胞およびＵ２５１細胞株を、３７℃で３０分間、１０μｇ／ｍｌのＥＧＦＲ中和抗体（クローン５２８，ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）またはアイソタイプ一致抗体で前処理した。次いで、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを行うことにより、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞およびコントロール細胞の、５２８抗体またはＩｇＧで前処理された標的細胞に対する細胞傷害性を評価した。５２８抗体またはＩｇＧで前処理された１×１０６個の標的細胞を、同数のＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞またはコントロール細胞とともに９６ウェルＶ底プレートにおいて２４時間インキュベートした後の無細胞上清におけるＥＬＩＳＡによって、ＩＦＮ−γの分泌も定量した。
【０１８２】
ＧＢ３０を有するマウスの脳切片のヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色。０日目に、ＮＳＧマウスの頭蓋内に５×１０４個のＧＢ３０細胞を注射した。７日目に、それらのマウスの頭蓋内に、５μｌのＨＢＳＳ中の２×１０６個のＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞を注射した。１０日目に、それらのマウスを屠殺し、脳組織を回収し、１０％ホルマリンに２４時間浸漬し、次いで、脳をパラフィンに包埋し、Ｈ＆Ｅ染色に向けて処理した。
結果
ＧＢ細胞株上および患者由来ＧＢ幹細胞上のＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩの発現
【０１８３】
ＧＢ細胞株および患者由来ＧＢ幹細胞のパネル上のｗｔＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩの表面発現を評価するために、インタクトな細胞を、ｗｔＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの両方を認識するＥＧＦＲ特異的抗体で染色した後、フローサイトメトリー解析を行った。図１Ａに示されているように、ＥＧＦＲが、ＧＢ細胞株（Ｇｌｉ３６ｄＥＧＦＲ、Ｕ２５１およびＬＮ２２９）、患者由来ＧＢ間葉系（ＭＥＳ）幹細胞（ＧＢ３０、ＧＢ８３、ＧＢ１１２３およびＧＢ３２６）およびＧＢ前神経（ＰＮ）幹細胞（ＧＢ８４Ｖ３ＳおよびＧＢ１５７Ｖ３ＳＬ）の表面上に発現された。ｗｔＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩの転写物が、これらの細胞において発現されたかをさらに評価するために、本出願人は、特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲを行い、ｗｔＥＧＦＲ  ｍＲＮＡが２つのＧＢ細胞株Ｕ２５１およびＬＮ２２９において発現されたことを観察した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｍＲＮＡは、ＧＢ細胞株Ｇｌｉ３６ｄＥＧＦＲ、および本出願人がＧＢ患者から作製した６つのＧＢ幹細胞（Ｍａｏ，Ｐ．ら（２０１３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１０：８６４４−８６４９）：ＧＢ３０、ＧＢ８３、ＧＢ１１２３、ＧＢ３２６、ＧＢ８４Ｖ３ＳＬおよびＧＢ１５７Ｖ３ＳＬにおいて検出可能であった（図１Ｂ）。対照的に、１つのＧＢ幹細胞ＧＢ１９（前神経）ならびに２つのＮＫ細胞株ＮＫ−９２およびＮＫＬにおけるＥＧＦＲ発現は、フローサイトメトリー解析またはＲＴ−ＰＣＲによって検出不可能だった（図１Ａ、１Ｂ）。
ＥＧＦＲ−ＣＡＲを発現するＮＫ−９２およびＮＫＬ  ＮＫ細胞の作製
【０１８４】
第２世代のＥＧＦＲ特異的ＣＡＲ構築物をｐＣＤＨレンチウイルスベクター骨格において作製した。この構築物は、シグナルペプチド（ＳＰ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、リンカー、軽鎖可変領域（ＶＬ）、ヒンジ、ＣＤ２８膜貫通および細胞内ドメイン、ならびにＣＤ３ζシグナル伝達部分を順に含む（図２Ａ）。ＮＫ−９２  ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞およびＮＫＬ  ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞を作製するために、それぞれＮＫ−９２細胞株およびＮＫＬ細胞株にＥＧＦＲ−ＣＡＲ構築物を形質導入した。形質導入された細胞を、そのベクターによって発現されたＧＦＰの発現について選別した。形質導入されたＮＫ−９２細胞およびＮＫＬ細胞上でのＥＧＦＲ−ＣＡＲの細胞表面発現を検証するために、抗ＥＧＦＲのｓｃＦｖ部分を認識するヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体を用いてフローサイトメトリー解析を行った。図２Ｂのデータは、空のベクターを形質導入された細胞を超える、ＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２およびＮＫＬ細胞における細胞表面のＥＧＦＲ−ＣＡＲ発現の明白な増加を示し、空のベクターを形質導入された細胞のＥＧＦＲ−ＣＡＲ発現は、検出不可能であった。
ＥＧＦＲ＋ＧＢ細胞株に対する、ＥＧＦＲ−ＣＡＲによって改変されたＮＫ細胞の細胞傷害性およびＩＦＮ−γ産生の有効性
【０１８５】
ＥＧＦＲ−ＣＡＲおよびｍｏｃｋを形質導入されたＮＫ細胞の、ＧＢ細胞に対する細胞傷害性を、エフェクター細胞と標的細胞との様々な比における標準的なクロム放出アッセイを用いて評価した。図３Ａ〜３Ｂは、コントロールＮＫ−９２−ＥＶ細胞と比較したとき、ＥＧＦＲ＋Ｇｌｉ３６ｄＥＧＦＲ、Ｕ２５１およびＬＮ２２９細胞に対するＮＫ−９２  ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞の有意に増強された細胞傷害性を示している（図３Ａ、上のパネル）。同様のデータが、ＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫＬ細胞株を用いた実験において観察された（図３Ａ、下のパネル）。ＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたヒト初代ＮＫ細胞も、ＥＧＦＲ＋Ｇｌｉ３６ｄＥＧＦＲおよびＵ２５１ＧＢ細胞株に対して、コントロール細胞よりも有意に強力な細胞傷害性を示した（図８Ａ）。観察された細胞溶解活性の増強が、ＩＦＮ−γ分泌の同様の有意な増加を伴うかを判定するために、本出願人は、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞をＥＧＦＲ＋神経膠腫細胞（Ｇｌｉ３６ｄＥＧＦＲ、Ｕ２５１およびＬＮ２２９）細胞と２４時間共培養し、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡによって計測した。図３Ｂに示されているように、ＥＧＦＲ−ＣＡＲによって改変されたＮＫ−９２またはＮＫＬ細胞とｍｏｃｋを形質導入されたＮＫ−９２またはＮＫＬ細胞の両方が、単独でインキュベートされたとき、低レベルまたは無視できるレベルのＩＦＮ−γを自発的に産生した。これらの細胞をＥＧＦＲ＋神経膠腫細胞（Ｇｌｉ３６ｄＥＧＦＲ、Ｕ２５１およびＬＮ２２９）とともに培養すると、ＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２またはＮＫＬ細胞株とｍｏｃｋを形質導入されたＮＫ−９２またはＮＫＬ細胞株の両方においてＩＦＮ−γが誘導され、ＥＧＦＲ−ＣＡＲによって改変されたＮＫ−９２またはＮＫＬ細胞によって産生されたＩＦＮ−γのレベルは、ｍｏｃｋを形質導入されたＮＫ−９２またはＮＫＬ細胞によって産生されたＩＦＮ−γのレベルよりもそれぞれ有意に高かった（図３Ｂ）。これらの結果は、上述の細胞傷害性データと一致し、これらを合わせると、ＥＧＦＲ−ＣＡＲによる改変が、ＥＧＦＲ＋神経膠腫細胞に応答するＮＫ細胞のエフェクター機能を有意に高め得ることが示唆される。
ＧＢ患者に由来するＥＧＦＲ＋ＧＢ幹細胞に対する、ＥＧＦＲ−ＣＡＲによって改変されたＮＫ細胞の細胞傷害性およびＩＦＮ−γの産生の有効性
【０１８６】
本出願人は、次に、ＥＧＦＲ−ＣＡＲによって改変されたＮＫ−９２およびＮＫＬ細胞が、内在性のＥＧＦＲタンパク質の表面発現を有する患者由来ＧＢ幹細胞を溶解する能力を評価した。ＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２細胞は、ｍｏｃｋを形質導入されたＮＫ細胞と比べて、ＥＧＦＲ＋ＧＢ間葉系幹細胞（ＧＢ１１２３およびＧＢ３０）およびＧＢ前神経幹細胞（ＧＢ１５７Ｖ３ＳＬおよびＧＢ８４Ｖ３ＳＬ）を殺滅する有意に増強された能力を示した（図４Ａ、上のパネル）。同様のデータが、ＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫＬ細胞を用いて繰り返された実験において観察された（図４Ａ、下のパネル）。ＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入された初代ＮＫ細胞も、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する患者由来幹細胞ＧＢ３０およびＧＢ１５７Ｖ３ＳＬに対して、コントロール細胞よりも有意に強力な細胞傷害性を示した（図８Ｂ）。同様に、ＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２およびＮＫＬ細胞は、ＥＧＦＲ＋ＧＢ幹細胞と共培養したとき、ｍｏｃｋを形質導入されたＮＫ−９２（図４Ｂ、上のパネル）およびＮＫＬ細胞（図４Ｂ、下のパネル）と比べて、有意に多いＩＦＮ−γを産生した。これらの結果から、ＥＧＦＲ−ＣＡＲによるＮＫ細胞の改変は、未改変ＮＫ細胞コントロールと比べて、ＥＧＦＲ＋ＧＢ幹細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性およびＩＦＮ−γの産生を有意に増強できることが示唆される。
ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞の増強された細胞傷害性およびＩＦＮ−γ産生は、標的細胞上のＥＧＦＲの表面発現に依存する
【０１８７】
本出願人は、次に、ＧＢ細胞によって引き起こされる、ＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２またはＮＫＬ細胞における増強された細胞溶解活性およびＩＦＮ−γ産生が、細胞表面ＥＧＦＲ抗原の発現に依存するかを調査した。試験されたＧＢ細胞のうち、ＧＭＢ１９幹細胞だけが、ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩをそれらの表面上に発現しなかった。したがって、本出願人は、この細胞株を使用することにより、ＧＢ１９細胞における強制的なｗｔＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩの過剰発現が、ＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２またはＮＫＬ細胞に対するそれらの感度を変化させるのに十分であるかを調べた。この目的のために、本出願人は、レトロウイルス感染によってｗｔＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩをＧＢ１９細胞上に過剰発現させ、フローサイトメトリー解析によって確認した（図５Ａ）。ＥＧＦＲ発現を欠く標的ＧＢ１９細胞またはｍｏｃｋを形質導入されたＮＫ−９２およびＮＫＬエフェクター細胞と比べて、ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩを外因的に（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓｌｙ）過剰発現するＧＢ１９細胞に対するＥＧＦＲ−ＣＡＲによって改変されたＮＫ−９２およびＮＫＬ細胞の細胞傷害活性が有意に上昇した（図５Ｂ）。同様に、ＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２およびＮＫＬ細胞は、ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現しているＧＢ１９細胞と共培養したとき、ＥＧＦＲの過剰発現を欠く標的ＧＢ１９細胞またはｍｏｃｋを形質導入されたＮＫ−９２およびＮＫＬエフェクター細胞と比べて、有意に高レベルのＩＦＮ−γを分泌した（図５Ｃ）。これらの結果から、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞による、ｗｔＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しているＧＢ細胞の認識および排除の増加が、ＥＧＦＲ依存的様式で生じることが示唆される。また、これらの結果は、２９３Ｔ細胞における強制的なＥＧＦＲ発現が、空のベクターを形質導入されたＮＫ−９２細胞と比べて、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞の細胞傷害性およびＩＦＮ−γ産生を増加させたことを示す確証的実験と一致した（図９Ａ〜９Ｃ）。さらに、本出願人は、ＧＢ３０およびＵ２５１細胞をＥＧＦＲ中和抗体（ｓｃＦｖ起源と同じクローン）で前処理した後、その前処理された腫瘍細胞とｍｏｃｋ細胞またはＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞と共培養した。クロム−５１放出アッセイは、ＥＧＦＲ遮断抗体が、アイソタイプ一致コントロール抗体と比べて、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲにおける細胞傷害性とＩＦＮ−γ産生の両方の増強を鈍らせたことを示した（図１０）ことから、本出願人がＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞に対して特定した効果がＥＧＦＲ依存性であることがさらに確認された。
ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞は、２つの同所異種移植ＧＢモデルにおいて、ＧＢ腫瘍の成長を阻害し、腫瘍を有するマウスの生存を延長する
【０１８８】
ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞の潜在的な治療用途にさらに応えるために、本出願人は、それらの抗腫瘍活性をインビボにおいて調べた。本出願人は、ホタルルシフェラーゼをＮＳＧマウスの脳内に発現するように遺伝的に操作された、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しているＧＢ３０神経膠腫幹細胞（ＧＢ３０−ＦＦＬ）を頭蓋内に植え込むことによって同所神経膠腫を確立した。ホタルルシフェラーゼの発現によって、インビボ生物発光イメージングを介して腫瘍の成長をモニターすることが可能になった。潜在的な全身毒性を最小限にするために、本出願人は、腫瘍細胞の植え込みの７日後にＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲを腫瘍内に注射した。図６Ａ〜６Ｂに示されているように、ＥＧＦＲ−ＣＡＲまたはｍｏｃｋを形質導入されたＮＫ−９２細胞を投与されたマウスは、生物発光イメージングによって測定されたとき、ＨＢＳＳを注射されたマウスと比べて、有意に低い腫瘍成長を示した。しかしながら、重要なことには、腫瘍成長の減少は、ｍｏｃｋを形質導入されたＮＫ−９２細胞で処置されたマウスより、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞で処置されたマウスにおいて有意に大きかった。これらのデータと一致して、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞で処置されたマウスは、ｍｏｃｋを形質導入されたＮＫ−９２細胞またはＨＢＳＳで処置されたマウスよりも有意に長く生存した（ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲで処置されたマウスとＮＫ−９２−ＥＶで処置されたマウスとの間で３８日  対  ２３日という生存期間中央値、ｐ＜０．０１；ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲで処置されたマウスとＨＢＳＳで処置されたマウスとの間で３８日  対  １７日という生存期間中央値、ｐ＜０．０１）（図６Ｃ）。ｗｔＥＧＦＲを発現しているＧＢ腫瘍に対するＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞の治療効果にさらに応えるために、本出願人は、ｗｔＥＧＦＲを発現しているＵ２５１−ＦＦＬ細胞をＮＳＧマウスの頭蓋内に植え込むことによって同所ＧＢモデルを確立した。本出願人は、腫瘍細胞の植え込みの１０日後、４０日後および７０日後に、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞、ＮＫ−９２−ＥＶ細胞、またはビヒクルコントロールとしてＨＢＳＳを腫瘍内に注射した。図７Ａ〜７Ｂに示されているように、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞を腫瘍内に注射されたマウスの腫瘍量は、ＨＢＳＳまたはＮＫ−９２−ＥＶ細胞を注入されたマウスと比べて有意に減少した。さらに、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞で処置されたマウスは、ＮＫ−９２−ＥＶ細胞またはＨＢＳＳを投与されたマウスよりも有意に長く生存した（ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲで処置されたマウスとＮＫ−９２−ＥＶ細胞で処置されたマウスとの間で１８７日  対  １５０日という生存期間中央値、ｐ＜０．０５；ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲで処置されたマウスとＨＢＳＳで処置されたマウスとの間で１８７日  対  １３８日という生存期間中央値、ｐ＜０．０１）（図７Ｃ）。まとめると、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞は、ｗｔＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しているＧＢをインビボにおいて効率的に標的化でき、排除できた。
頭蓋内注射後のＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞の遊走の評価
【０１８９】
ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞の頭蓋内注射の安全性を評価するために、本出願人は、まず、頭蓋内注射後の細胞の全身分布を解析した。本出願人は、フローサイトメトリー解析およびより高感度のＰＣＲアプローチを試みることにより、ＧＢ３０を有するマウスへの頭蓋内注射の３日後に回収した種々の器官および組織におけるＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞の分布を評価した。図６Ｄに示されているように、ＣＤ５６＋細胞は、脳においてのみ特定することができ、脳内の全免疫浸潤細胞のたった１０．２％しか構成していなかった。同様に、ＰＣＲ解析は、脳以外の試験されたいずれの器官部位においてもＥＧＦＲ−ＣＡＲの発現を検出できなかった（図６Ｅ）。合わせると、これらのデータから、ヒトＧＢの同所マウスモデルにおけるＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞の頭蓋内投与は、エフェクター細胞が頭蓋外に遊走することなく行うことができることが示唆される。本出願人は、次に、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞を腫瘍内に注入された、ＧＢ３０を有するマウスの脳切片のヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。その結果は、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞が、腫瘍内にのみ分布することを示した（図１１）。
考察
【０１９０】
本研究では、本出願人は、ヒトＧＢを頭蓋内で標的化するためのＥＧＦＲ−ＣＡＲによって改変されたヒトＮＫ−９２細胞を利用する、ＧＢに対する新規の有望なストラテジーを開発した。ＧＢ患者由来の腫瘍は、ｗｔＥＧＦＲまたはｗｔＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの両方のいずれかを発現する（Ｆａｎ，Ｑ．Ｗ．ら（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２４：４３８−４４９）ことから、この表面タンパク質の両方の形態を標的化することが、より広い用途を有するかまたは１つだけを標的化するよりも有効であることが示唆される。本出願人は、本出願人の同所前臨床モデルにおいて、ＥＧＦＲ−ＣＡＲによって改変されたＮＫ−９２細胞の頭蓋内注射のインビボにおける有効性および安全性も実証した。
【０１９１】
ＣＡＲ  Ｔ細胞は、難治性慢性リンパ性白血病および急性リンパ芽球性白血病を処置するために効果的に使用されており、これらの高度に薬物抵抗性の腫瘍に対する強力な新しい治療様式である（Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．ら（２０１１）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３６５：７２５−７３３；Ｇｒｕｐｐ，Ｓ．Ａ．ら（２０１３）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３６８：１５０９−１５１８；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，Ｒ．Ｊ．ら（２０１３）Ｓｃｉ
Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．５：１７７ｒａ１３８；Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ，Ｅ．Ｐ．ら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９：７３−７８）。また、いくつかの研究が、ＧＢを処置するためのＣＡＲ  Ｔ細胞の使用を実証した（Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ら（２０１２）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２３：１０４３−１０５３；Ｏｈｎｏ，Ｍ．ら（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．１０１：２５１８−２５２４；Ａｈｍｅｄ，Ｎ．ら（２０１０）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１６：４７４−４８５）。しかし、これらの研究は、ＥＧＦＲｖＩＩＩの標的化だけに焦点を当てていた。さらに、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、サイトカイン関連の有害事象および腫瘍溶解症候群を引き起こし得（Ｇｒｕｐｐ，Ｓ．Ａ．ら（２０１３）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３６８：１５０９−１５１８；Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ら（２０１０）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１８：８４３−８５１）、それによって、かなりの毒性がもたらされ得るか、または患者が死に至り得る。さらに、自家ＣＡＲ  Ｔ細胞の作製は、高価かつ時間のかかるアプローチである。したがって、ｗｔＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの両方を標的化するＣＡＲ  ＮＫ細胞をＧＢ処置のために利用することが、優良な代替アプローチである。
【０１９２】
ＣＡＲで操作されたＮＫ細胞株（例えば、本研究で使用されたＮＫ−９２）は、種々のＧＢ患者を広く処置する再生可能な既製品を提供できる可能性を秘めている。本出願人の本研究は、ＧＢに対するＣＡＲによって改変されたＮＫ−９２細胞の利用を研究した初めての研究である。ＣＡＲによって改変されたＮＫ−９２細胞は、他の癌を効果的に標的化すると示されている。例えば、Ｅｓｓｅｒらは、神経芽細胞腫（ＮＢ）細胞上に高レベルで発現されるジシアロガングリオシドＧＤ２に対するＣＡＲを安定に発現するようにＮＫ−９２細胞を操作した（Ｅｓｓｅｒ，Ｒ．ら（２０１２）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．１６：５６９−５８１）。ＮＫ−９２細胞上のＧＤ２−ＣＡＲの発現が、親ＮＫ−９２細胞による殺滅に抵抗性だった、ＧＤ２を発現しているＮＢ細胞の特異的排除を増強したことから、ＮＢに対するＧＤ２−ＣＡＲ  ＮＫ細胞の潜在的な臨床的有用性が実証された。本出願人は、最近、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞を標的化するための、ＣＳ１−ＣＡＲを発現するＮＫ−９２細胞を開発し、これらの操作されたＮＫ−９２細胞が、ＭＭ細胞とインビトロにおいて共培養されたとき、細胞溶解およびＩＦＮ−γ産生の増強を示すことができたことを実証した（Ｃｈｕ，Ｊ．ら（２０１４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２８：９１７−９２７）。重要なことに、高悪性度の同所ＭＭ異種移植マウスモデルにおいて、ＣＳ１−ＣＡＲによって改変されたＮＫ−９２細胞の養子移入は、ヒトＩＭ９  ＭＭ細胞の播種をインビボにおいて効率的に妨害し、また、ＩＭ９を有するマウスの全生存時間を有意に延長した（Ｃｈｕ，Ｊ．ら（２０１４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２８：９１７−９２７）。
【０１９３】
本出願人の知る限りでは、これは、ＧＢ処置のためにｗｔＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの両方を標的化するＣＡＲ免疫細胞の可能性を研究した最初の研究である。本出願人は、ｗｔＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩのいずれかを発現しているＧＢ細胞をインビトロにおいて効率的に溶解する、ＥＧＦＲ−ＣＡＲで操作されたＮＫ−９２およびＮＫＬ細胞ならびに初代ＮＫ細胞を作製した。両方の分子が、神経膠腫発生（ｇｌｉｏｍａｇｅｎｅｓｉｓ）に寄与する役割を果たす。ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現している細胞は、一般に、同じ患者においてｗｔＥＧＦＲを発現している細胞と共存する。Ｂｉｅｒｎａｔは、ＥＧＦＲ＋ＧＢバイオプシーの４０％（２０個のうち８個）がＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性であると示したが、たった１５％（２０個のうち３個）しかＥＧＦＲｖＩＩＩ増幅が優勢でなかったことを報告したことから、ＥＧＦＲｖＩＩＩを選択的に標的化することに基づく治療的アプローチとして、限定的な有効性しか達成できなかったことが示唆される（Ｂｉｅｒｎａｔ，Ｗ．ら（２００４）Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１４：１３１−１３６）。別の研究では、５８個のＧＢ腫瘍のうち、８３％（４８／５８）が、ＩＨＣによってｗｔＥＧＦＲを染色した。さらに、これらのサンプルの１９％（１１／５８）が、ｗｔＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩの二重陽性だった（Ｆａｎ，Ｑ．Ｗ．ら（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２４：４３８−４４９）。これらの２つの研究は、かなりの部分のＧＢ患者が、ｗｔＥＧＦＲを発現している細胞およびＥＧＦＲｖＩＩＩを発現している細胞を有することを実証している。したがって、ｗｔＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩのいずれかを選択的に標的化してＧＢを処置する治療的アプローチに対し、ここに記載されたＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ治療は、ｗｔＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの両方を標的化する。上で述べたように、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しているＧＢに対して良好な抗腫瘍活性をインビトロとインビボの両方において示す（Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ら（２０１２）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２３：１０４３−１０５３；Ｏｈｎｏ，Ｍ．ら（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．１０１：２５１８−２５２４；Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．ら（２０１４）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０：９７２−９８４）。本出願人は、ｗｔＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの両方を標的化するアプローチが、ｗｔＥＧＦＲを発現している腫瘍細胞だけを有するＧＢ患者だけでなく、ｗｔＥＧＦＲを発現している腫瘍細胞とＥＧＦＲｖＩＩＩを発現している腫瘍細胞の両方を有するＧＢ患者も処置するのに有効であるはずであると考える。この目的のために、本出願人は、ｗｔＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの両方を標的化するＥＧＦＲ−ＣＡＲを発現するようにＮＫ−９２細胞を操作し、ｗｔＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しているＧＢ細胞をインビトロおよび／またはインビボにおいて効率的に排除できたことを実証した。
【０１９４】
神経膠腫細胞上のｗｔＥＧＦＲならびにＥＧＦＲｖＩＩＩを標的化することの潜在的な難点は、正常な組織上にｗｔＥＧＦＲが存在する点である。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、高レベルのｗｔＥＧＦＲを発現し得る正常な上皮細胞上には発現されないので、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の全身注入は、比較的安全であると考えられている。しかしながら、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲまたは初代ＮＫ細胞の全身投与は、ｗｔＥＧＦＲを発現している正常な細胞に対する影響に起因して重大な全身毒性をもたらし得る。このリスクを最小限にするために、本出願人は、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞を頭蓋内に注射して、それらの移動を限定したところ、これらのＣＡＲ細胞が、脳以外の組織では検出不可能なままであることが実証された。このストラテジーのさらなる裏付けにおいて、最近の研究は、ｗｔＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの両方を標的化するＥＧＦＲ抗体由来のトキシン結合体化ｓｃＦｖの頭蓋内送達によって、ｗｔＥＧＦＲを発現しているかまたはｗｔＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩとを同時発現している頭蓋内神経膠芽腫異種移植片に対して強い抗腫瘍効果がもたらされることを示した。この局所投与は、明白な全身毒性を引き起こさなかった（Ｃｈａｎｄｒａｍｏｈａｎ，Ｖ．ら（２０１３）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９：４７１７−４７２７）。さらに、本出願人のＨ＆Ｅ染色も、脳内の植え込まれた腫瘍に注射されたＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞が、その腫瘍領域に存在することを示した。しかしながら、ＮＫ−９２は、リンパ腫細胞株であるので、将来の臨床応用では、ＣＡＲを備えたＮＫ−９２細胞は、患者に注入する前に放射線照射されるべきである。いくつかの前臨床試験は、１０Ｇｙの放射線照射を受けたＮＫ−９２−ＣＡＲ細胞が、放射線照射されていない細胞と比べて、インビトロおよびインビボにおいて同様の効果を示したことを実証した（Ｕｈｅｒｅｋ，Ｃ．ら（２００２）Ｂｌｏｏｄ  １００：１２６５−１２７３；Ｓｃｈｏｎｆｅｌｄ，Ｋ．ら（２０１５）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２３：３３０−３３８）。あるいは、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ初代ＮＫ細胞は、本出願人が示したように、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ初代ＮＫ細胞がＧＢ細胞を全滅させるほど強力であると考えられるべきである。重要なことに、膜結合型ＩＬ−１５（ｍｂＩＬ１５）または膜結合型ＩＬ−２１（ｍｂＩＬ２１）を発現する遺伝的に操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）が、初代ＮＫ細胞を首尾良く拡大するために最近使用された（Ｊｏｒｄａｎ，Ｃ．Ｔ．（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４：２０３−２０５；Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｃ．ら（２００９）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４：ｅ７７５２）。
【０１９５】
重要なことに、本出願人の研究において、本出願人は、試験された患者由来ＧＢ幹細胞の大部分の細胞上に内在性ＥＧＦＲｖＩＩＩが高発現していることを観察したことから、それらの細胞は、コントロールベクターを形質導入されたＮＫ−９２細胞よりもＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞による溶解に対してより感受性である。ＧＢ幹細胞は、原発性ＧＢの生物学的特徴および病理学的特徴を反映する腫瘍細胞の部分集団であり、自己複製、多系列分化および腫瘍集団全体の再生を起こす能力を保持する（Ｊｏｒｄａｎ，Ｃ．Ｔ．（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４：２０３−２０５）。ＧＢ幹細胞は、腫瘍のイニシエーション、伝播、再発ならびに化学療法抵抗性および放射線抵抗性に関与すると考えられている。ＧＢ幹細胞を標的化することは、ＧＢ再発の予防における重要な局面であると考えられている。実際に、本出願人のインビボデータは、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞の１回の投与が、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現している患者由来ＧＢ幹細胞を植え込まれたマウスの生存時間を有意に延長することを示している。したがって、本出願人は、本出願人の研究が、インビトロと２つの異種移植マウスモデルの両方においてＧＢ細胞およびＧＢ幹細胞を標的化するためにＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞を使用することが、再発したヒトＧＢをクリニックにおいて潜在的に処置するのに非常に妥当であることを実証していると考える。
【０１９６】
ＧＢは、異なる分子サブタイプから構成される。間葉系（ＭＥＳ）ＧＢおよび前神経（ＰＮ）ＧＢが、ＧＢの最も重要なサブタイプとして同定された（Ｍａｏ，Ｐ．ら（２０１３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１０：８６４４−８６４９；Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｃ．ら（２００９）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４：ｅ７７５２；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｈ．Ｓ．ら（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ９：１５７−１７３；Ｖｅｒｈａａｋ，Ｒ．Ｇ．ら（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １７：９８−１１０）。本出願人の実験では、すべてのＭＥＳおよび本出願人が試験した３つのＰＮ  ＧＢ幹細胞（ＧＳＣ）のうちの２つが、フローサイトメトリーによってＥＧＦＲ発現について陽性だった。ＰＣＲ解析は、これらのＧＢ幹細胞のすべてがＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する一方で、ＧＢ非幹細胞株は、通常ｗｔＥＧＦＲだけを発現する（Ｇｌｉ３６ｄＥＧＦＲにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩの異所的な過剰発現を除く）ことをさらに実証した。これらの知見と一致して、本出願人のインビトロデータは、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ細胞が、ＰＮまたはＭＥＳ  ＥＧＦＲ＋ＧＳＣとともにインビトロで培養されたとき、ＩＦＮ−γ分泌および細胞傷害性の増強を示すことを実証している。ＭＥＳ  ＧＳＣは、インビトロにおいてより高悪性度であり、インビボにおいて直ちに頭蓋内異種移植片を生じることができる（Ｍａｏ，Ｐ．ら（２０１３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１０：８６４４−８６４９）。ＭＥＳ  ＧＳＣは、ＰＮ  ＧＳＣと比べて放射線照射に顕著な抵抗性も示す（Ｍａｏ，Ｐ．ら（２０１３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１０：８６４４−８６４９）。本出願人のインビボデータは、ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ細胞が、高悪性度のＧＢ３０  ＭＥＳ  ＧＳＣ異種移植モデルにおいて有効性を示すことを実証した。
【０１９７】
結論として、本出願人は、ＧＢにおけるｗｔＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの両方を標的化するＣＡＲ  ＮＫ細胞の作製に成功した。このＥＧＦＲ−ＣＡＲを備えたＮＫ細胞は、ＧＢ細胞および／またはそれらの幹細胞をインビトロおよび／またはインビボで効率的かつ特異的に認識し、全滅させる。本出願人の研究は、単独でまたは他のアプローチと併用して局所的に投与され得る、再発したＧＢを処置するためのＥＧＦＲ−ＣＡＲによって改変されたＮＫ−９２細胞の臨床応用を裏付ける。
実験２−ＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現している細胞とｏＨＳＶとの併用
細胞培養
【０１９８】
ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＣＦ−７、ならびに２９３ＴおよびＰｈｏｅｎｉｘ細胞を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）が補充されたＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で培養した。ヒトＮＫ細胞株ＮＫ−９２および初代ＮＫ細胞（ＣｏｌｕｍｂｕｓにあるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓから入手した）を、２０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）および２００ＩＵ／ｍＬ組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ−２（Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭＯ）が補充されたＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。
マウス
【０１９９】
６〜８週齢のＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。すべての動物実験が、Ｔｈｅ  Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに承認された。マウスを、疾患進行について毎日モニターし、神経学的障害で瀕死になるか明白に体重減少したとき、屠殺した。
ＥＧＦＲ−ＣＡＲレンチウイルスの構築物の作製
【０２００】
抗ＥＧＦＲ一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を、ｗｔＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの両方に対して特異的なモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ配列から得た。Ｓｏｆｆｉｅｔｔｉら（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２４９（１０）：１３５７−１３６９を参照のこと。ＶＨ−リンカー−ＶＬフラグメントを、レトロウイルスベクターから切り出されたＣＤ２８−ＣＤ３ζ部分にインフレームで組み込んだ。次いで、抗ＥＧＦＲ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−ＣＤ３ζフラグメント全体を、ｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ｃｏｐＧＦＰ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）と命名されたレンチウイルスベクターにライゲートして、ｐＣＤＨ−ＥＧＦＲ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ（ｐＣＤＨ−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ）構築物を作製した。
レンチウイルスの作製およびＮＫ−９２細胞の形質導入：
【０２０１】
ＮＫ−９２細胞に感染させるためのレンチウイルスを作製するために、２９３Ｔ細胞を、リン酸カルシウムトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、パッケージング構築物ｐＣＭＶ−ＶＳＶＧおよびｐＣＭＶ−ＤＲ９とともに、上述のｐＣＤＨ−ＥＧＦＲ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−ＣＤ３ζプラスミドまたはｍｏｃｋ
ｐＣＤＨベクターでコトランスフェクトした。トランスフェクションおよび感染の手順は、Ｃｈｕら（２０１４）Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＡＣＲ，２０（１５）：３９８９−４０００のプロトコルから改変した。
ＣＢＲｌｕｃ−ＥＧＦＰを安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の作製：
【０２０２】
ＣＢＲｌｕｃ−ＥＧＦＰを安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、Ｃｈｕら（２０１４）のプロトコルに従ってΔＵ３ＣＢＲｌｕｃ−ＥＧＦＰベクター（Ｄｒ．ＪＦ  ＤｉＰｅｒｓｉｏからの寛大な寄贈品）によるレトロウイルストランスフェクションによって作製した。次いで、ＥＧＦＰ陽性乳癌細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて選別し、拡大することにより、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＢＲｌｕｃ−ＥＧＦＰ細胞を得た。
フローサイトメトリー解析：
【０２０３】
乳癌細胞株の表面上のＥＧＦＲ発現を測定するために、細胞をマウスモノクローナル抗ヒトＥＧＦＲ（クローンＨ１１，ＤＡＫＯ）抗体とインキュベートした後、ＡＰＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体で染色した。ＥＧＦＲ−ＣＡＲの表面発現を、Ｃｈｕら（２０１４）に記載されているようにフローサイトメトリーによって評価した。
ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色および免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ：
【０２０４】
原発性乳癌と脳転移の両方を有する患者由来の腫瘍組織のパラフィン包埋切片を、ＩＨＣのためにＨＥまたは抗野生型ＥＧＦＲ抗体（１：２０００，ＤＡＫ−Ｈ１−ＷＴ；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で染色した。自動免疫染色機（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＸＴ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を製造者の指示書に従って使用した。Ｌｅｉｃａレーザー共焦点顕微鏡（ＳＰ５Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって切片を可視化し、写真撮影した。
細胞傷害アッセイ
【０２０５】
標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを、以前に報告されたように（Ｙｕ，Ｊ．ら（２０１０）Ｂｌｏｏｄ  １１５：２７４−２８１）行った。特異的細胞溶解のパーセンテージを、標準的な式：１００×（実験による放出のｃｐｍ−自発的な放出のｃｐｍ）／（最大の放出のｃｐｍ−自発的な放出のｃｐｍ）を用いて算出した。
ＩＦＮ−γ放出アッセイ
【０２０６】
１×１０６個の標的細胞を、同数のエフェクター細胞と、９６ウェルＶ底プレートのウェルにおいて２４時間インキュベートした。無細胞上清を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）製のキットを製造者のプロトコルに従って用いて酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によってＩＦＮ−γの分泌についてアッセイした。図面に示されているデータは、同様の結果だった３つの代表的な実験のうちの１つからの３つ組のウェルの平均値である。
ＭＴＳアッセイ
【０２０７】
乳癌細胞株の細胞（５×１０３個）を９６ウェル平底培養プレートに播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中において３７℃でインキュベートした。処理の終わりに、迅速なテトラゾリウムベースのＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム内塩）比色アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６細胞増殖アッセイキット；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を製造者の指示書に従って用いて細胞生存率を測定した。Ｈａｙｏｎら（２００３）Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ４４（１１）：１９５７−１９６２を参照のこと。すべての実験が、別個の３回において少なくとも３つ組で行われた。
ルシフェラーゼアッセイ
【０２０８】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＢＲｌｕｃ−ＥＧＦＰ細胞（５×１０３個）を９６ウェル平底培養プレートに播種し、異なる処理とともに１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中において３７℃でインキュベートした。種々の時点において、Ｆｕら（２０１０）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．５（７）：ｅ１１８６７に記載されているように、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、２０μＬの培養液をルシフェラーゼアッセイのために直接回収した。４日目に、細胞ペレットをＰＢＳで２回すすぎ、次いで、３０μＬの１×受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解した。溶解産物を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１分）によってペレットにし、上清を回収してルシフェラーゼ活性を計測した。
ＮＳＧマウスにおける乳癌脳浸潤の処置
【０２０９】
０日目に、ＮＳＧマウスを麻酔し、定位装置において固定し、２μＬのハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）中の１×１０５個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＢＲｌｕｃ−ＥＧＦＰ細胞を、ブレグマに対して２ｍｍ右外側および１ｍｍ腹側に３．２５ｍｍの深さの穿頭孔を開けたマウスの脳に注射した。１０日目に、５μｌのＨＢＳＳ中の、２×１０６個のエフェクター細胞、すなわちＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２細胞（ＮＫ−９２−ＥＧＦＲ−ＣＡＲ）または空のベクターを形質導入されたＮＫ−９２細胞（ＮＫ−９２−ＥＶ）をマウスの腫瘍内に注射した。ｏＨＳＶ−１のみの群には、５μｌのＨＢＳＳ中の２×１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）のｏＨＳＶ−１（ｒＱＮｅｓｔｉｎ３４．５）（Ｋａｍｂａｒａら（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５（７）：２８３２−２８３９を参照のこと）を腫瘍内に注射した。５μｌのＨＢＳＳで処置されたマウスをコントロールとして使用した。１５日目に、ＣＡＲ＋ｏＨＳＶ−１処置群のマウスの腫瘍内に２×１０５ｐｆｕのｏＨＳＶ−１を注射した。マウスを毎日モニターし、罹患の徴候を示したら、安楽死させた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＢＲｌｕｃ−ＥＧＦＰ細胞を接種した４週間後、Ｄ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ体重；Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）をマウスの腹腔内に（ｉ．ｐ．）注入し、イソフルランで麻酔し、生体画像化ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を備えるインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ−１００，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて画像化した。
統計
【０２１０】
データ変換ありまたはなしで正規分布した場合、対応のないスチューデントｔ検定を用いて、独立した２つの群を、連続したエンドポイントについて比較した。３つまたはそれを超える群を比較するために、１元配置分散分析を用いた。生存データの場合、カプラン・マイヤー解析を用いて生存関数を推定し、ログランク検定を用いて２群間の生存時間を比較した。すべての検定が両側の検定であった。多重比較の場合、ホルム法を用いてＰ値を調整した。０．０５未満のＰ値を統計学的に有意であるとみなした。
結果
乳癌細胞株ならびに原発性組織および転移性組織におけるＥＧＦＲの発現
【０２１１】
乳癌細胞株におけるＥＧＦＲの表面発現を評価するために、細胞をＥＧＦＲ特異的抗体で染色した後、フローサイトメトリー解析を行った。図１２Ａに示されているように、ＥＧＦＲは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＣＦ−７細胞株の表面上に発現されたが、レベルは、ＭＣＦ−７細胞上で明らかにより低かった。次いで、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色によって腫瘍細胞の存在を確認した後、転移性乳癌と診断された２例の患者の原発腫瘍組織および対応する脳転移病変における免疫組織化学（ＩＨＣ）によってＥＧＦＲの発現を評価した（図１２Ｂ、上の２列）。表面のＥＧＦＲ発現は、一次病変由来の腫瘍細胞上だけでなく、脳転移由来の病変上にも観察された（図１２Ｂ、下の２列）。
ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２および初代ＮＫ細胞の増強された細胞傷害性およびＩＦＮ−γ産生
【０２１２】
本出願人は、第２世代のＥＧＦＲ−ＣＡＲ構築物をｐＣＤＨレンチウイルス骨格において作製した。この構築物は、シグナルペプチド、ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ、ヒンジ領域、ＣＤ２８およびＣＤ３ζを順に含む。ＮＫ−９２および健康ドナー由来の初代ＮＫ細胞に、ＣＡＲを発現するレンチウイルスを形質導入し、そのベクターによるＧＦＰの発現に基づいて選別した。本出願人は、抗ＥＧＦＲのｓｃＦｖ部分を認識するヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体を用いてフローサイトメトリー解析を行った。図１３Ａは、ＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２細胞の表面上のＥＧＦＲ−ＣＡＲの発現を示しており、その発現は、ＮＫ−９２−ＥＶ細胞（空のベクターｐＣＤＨを形質導入されたＮＫ−９２細胞）上では検出不可能だった。次に、本出願人は、ＥＧＦＲ−ＣＡＲの発現が、ＮＫ−９２および初代ＮＫ細胞に、ＩＦＮ−γ産生および細胞溶解活性の増強をもたらし得るかを調査した。本出願人は、ＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２および初代ＮＫ細胞（図１８）が、空のベクターを形質導入された対応するエフェクター細胞と比べて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞またはＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞と共培養されたとき、有意に高いレベルのＩＦＮ−γを分泌したことを観察した（図１３Ｂ、１４Ａ）。興味深いことに、このＩＦＮ−γ分泌の変化は、ＥＧＦＲ発現のレベルがより低いＭＣＦ−７細胞を標的として使用したとき、それほど識別可能でなかった。さらに、これらの３つの細胞株と共培養したとき、本出願人は、ｍｏｃｋを形質導入されたＮＫ−９２エフェクター細胞（図１３Ｃ〜１３Ｅ）または初代ＮＫ細胞の細胞傷害活性と比べて、それぞれＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２およびドナー由来の初代ＮＫ細胞の細胞傷害活性の有意な増加を観察した（図１４Ｂ〜１４Ｄ）。エフェクター細胞の活性化を計測するためにＣＤ６９表面発現を用いたとき、本出願人は、ＥＧＦＲ発現を有する腫瘍細胞が、ＥＧＦＲ−ＣＡＲを形質導入されたＮＫ−９２細胞を活性化し得、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を使用したとき、ＭＣＦ−７細胞を使用したときよりもより高い活性化であったことも観察した。本出願人は、別のＮＫ細胞活性化マーカーであるＣＤ２７の発現も検出したところ、ＣＤ２７は、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞の表面上に発現されなかったことを観察した（図１９）。
ｏＨＳＶ−１による乳癌細胞株の溶解
【０２１３】
本出願人は、脳に輸送されて転移性脳腫瘍を形成する能力を有する乳癌細胞をｏＨＳＶ−１のみで溶解し破壊できるかを調査した。図１５Ａに示されているように、ｏＨＳＶ−１は、４８時間の共培養の後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＣＦ−７細胞の生存率を用量依存的様式で低下させ、この効果は、種々の時点において観察された（図１５Ｂ）。顕微鏡解析は、４日間の共培養の後、ｏＨＳＶ−１のみでこれらの乳癌細胞株の細胞を溶解できたことを示した（図２０Ａ）。これは、ルシフェラーゼを発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＢＲｌｕｃ−ＥＧＦＰ）を用いて確認され、ｍｏｃｋ感染群と比べて、より高いレベルのルシフェラーゼがｏＨＳＶ−１感染を受けた群の上清中で検出された（４日目においてＰ＜０．０１）（図１５Ｃ）。一方、ｏＨＳＶ−１は、鏡検によって測定されたとき、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２エフェクター細胞を溶解しなかったか、またはそのエフェクター細胞のアポトーシスを誘導しなかった（図２０Ｂ）。
ｏＨＳＶ−１と併用されるＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞は、インビトロにおいて癌細胞のより効率的な全滅をもたらす
【０２１４】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞のみまたはｏＨＳＶ−１との併用で処置したとき（ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞で４時間処置した後のｏＨＳＶ−１処置またはその逆）、ＭＴＳアッセイは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株が、すべての状況下において効率的に殺滅されたことを示唆した；しかしながら、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞とｏＨＳＶ−１との併用は、より効率的な殺滅をもたらした（データ示さず）。次いで、本出願人は、種々の処置後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＢＲｌｕｃ−ＥＧＦＰ細胞の上清中のルシフェラーゼ活性を計測することによって殺滅を評価した。ルシフェラーゼは、急速に分解されたことが見出され（図示せず）、ゆえに、ルシフェラーゼアッセイによって、累積的な殺滅ではなくダイナミックなリアルタイムの殺滅を測定することが可能であった。これに基づいて、本出願人は、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞のみおよびｏＨＳＶ−１と併用されたＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞が、ｏＨＳＶ−１のみよりも迅速な溶解を引き起こしたことを観察した（図５Ａ）。４日間共培養した後に残ったＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＢＲｌｕｃ−ＥＧＦＰ細胞（細胞ペレット）においてルシフェラーゼ活性を計測したとき、本出願人は、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞のみ、ｏＨＳＶ−１のみ、またはｏＨＳＶ−１と併用されたＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞のすべてが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＢＲｌｕｃ−ＥＧＦＰ細胞の実質的な殺滅に導き、ｏＨＳＶ−１とＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞との併用は、順序に関係なく、単独療法よりも有効であったことを見出した（図１６Ｂ）。同様の結果が、鏡検によって観察された（図２１）。ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のいくつかを急速に破壊したが、これらの細胞のサブセットは、５日後でも元の細胞の形状および完全性をなおも維持した。ｏＨＳＶ−１は、まず標的癌細胞を凝集させ、次いで、それらの細胞を徐々に溶解した（図２１）。しかしながら、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ
ＮＫ−９２細胞とｏＨＳＶ−１との併用は、特にＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞に続くｏＨＳＶ−１処置の群において、よりロバストな細胞の殺滅をもたらした（列５、図２１）。注目すべきことに、５１Ｃｒ放出アッセイ（図１３Ｃ）およびルシフェラーゼデータ（図１６Ｂ）と一致して、顕微鏡解析は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が、ＮＫ−９２−ＥＶ細胞による殺滅に抵抗性であることを実証した。
ｏＨＳＶ−１と併用されたＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞は、頭蓋内モデルにおいてＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞のより効率的な殺滅をもたらす
【０２１５】
ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞、ｏＨＳＶ−１のみ、または両方の併用の治療的応用の可能性をさらに裏付けるために、本出願人は、それらの抗腫瘍活性をインビボにおいて調べた。本出願人は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＢＲｌｕｃ−ＥＧＦＰ細胞をＮＳＧマウスの脳内に植え込むことによって、乳癌の頭蓋内モデルを確立した。それらの細胞におけるカブトムシ赤色ルシフェラーゼの発現によって、インビボ生物発光イメージングを介して腫瘍成長をモニターすることが可能になった。潜在的な全身毒性を最小限にするために、本出願人は、腫瘍細胞の植え込み後の１０日目に、放射線照射されていないＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞またはｏＨＳＶ−１を腫瘍内に、およびＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２とｏＨＳＶ−１との併用群の場合は１５日目にｏＨＳＶ−１を注射した。図１７Ａおよび図２２に示されているように、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２、ｏＨＳＶ−１またはそれらの組み合わせを投与されたマウスは、ｍｏｃｋを形質導入されたＮＫ−９２−ＥＶまたはビヒクル（ＨＢＳＳ）を注射されたマウスと比べて、有意に減少した腫瘍成長を有した。重要なことに、腫瘍成長の減少は、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２のみまたはｏＨＳＶ−１のみで処置されたマウスよりも、ｏＨＳＶ−１と併用されたＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２で処置されたマウスにおいてより明白だった。これらのデータと一致して、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２＋ｏＨＳＶ−１で処置されたマウスは、ｏＨＳＶ−１のみ（Ｐ＜０．０１）、ｍｏｃｋを形質導入されたＮＫ−９２（Ｐ＜０．００１）またはＨＢＳＳ（Ｐ＜０．００１）で処置されたマウスよりも有意に長く生存した一方で、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２＋ｏＨＳＶ−１の群とＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２のみの群との差異は、同じ傾向を示し、有意な閾値の境界にあった（Ｐ＝０．０７５７）。ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２とｏＨＳＶ−１との併用、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２、ｏＨＳＶ−１、ＮＫ−９２−ＥＶおよびＨＢＳＳに対する５つの群の生存期間中央値は、それぞれ８０、６１、５５、４３および４２日であった（図１７Ｂ）。
考察
【０２１６】
これらのデータは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を予め接種されたマウスにＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞、ｏＨＳＶ−１またはその両方の組み合わせを腫瘍内投与すると、抗腫瘍効果がもたらされ、それらの組み合わせが、腫瘍成長をより効率的に抑制し、腫瘍を有するマウスを有意に長く生存させたことを実証している。
【０２１７】
本出願人は、この併用が、癌を標的化するための有効なアプローチであると考える。理論に拘束されるものではないが、本出願人は、この併用アプローチの標的が、全部ではないがほとんどの癌において再発、処置抵抗性および転移に関与する細胞集団である癌幹細胞（ＣＳＣ）であると推測する。さらに、本出願人は、開示されるアプローチが、不均一な腫瘍集団に適応し得ると結論を下す。
【０２１８】
すなわち、（上記の本明細書中に開示された乳癌の実施例を考慮して）、ＥＧＦＲを発現している細胞は、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ細胞によって標的化されるが、ｏＨＳＶ−１は、ＥＧＦＲ陰性腫瘍細胞も殺滅し得る。乳癌は、ＥＧＦＲ、ＰＲおよびＨＥＲ２の発現が不均一である。本発明者らの実験において使用された乳癌細胞株は、野生型ＥＧＦＲを発現するが、それらの各細胞株は、これを異なる程度に発現する。一方、それらは、異なる遺伝子発現プロファイリング［ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８：ＥＲ−、ＰＲ−、ＨＥＲ２−（トリプルネガティブ）；ＭＣＦ−７：ＥＲ＋、ＰＲ＋／−、ＨＥＲ２−］および異なる生物学的挙動を有する。トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）は、高悪性度の自然経過ならびに転移に対する高い感受性に関連する。ＴＮＢＣを有する患者は、「従来の」治療標的を欠き、他のタイプの乳癌よりも予後が不良である。実際に、ＴＮＢＣの生存期間中央値は、たった４．９ヶ月である。ｏＨＳＶは、一般的なＢＣＢＭ集団にとって有効であるので、上記の本明細書に記載された併用アプローチは、非ＴＮＢＣとＴＮＢＣの両方のＢＣＢＭを標的化するはずであるが、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ細胞は、ＥＧＦＲ＋集団を標的化する際により有効である。このような結論はさらに、本質的にすべてのタイプの癌に一般化できる。
【０２１９】
これらのデータはさらに、ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞が、迅速に乳癌細胞を標的化し、攻撃し得る一方で、ｏＨＳＶ−１は、ゆっくりであるが絶え間なく癌細胞に感染し、破壊し得ることを示した。ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞は、通常、数時間で標的細胞を認識し、攻撃し得るが、この細胞株は、元々、ホジキンリンパ腫を有さない患者から確立されたので、放射線照射されなければならないため、数日間しか生存できない。放射線照射後の最大４８時間、完全な細胞傷害活性を維持しつつ、ＮＫ−９２細胞の（ｏｓｆ）増殖を抑制するために、１０００ｃＧｙという放射線量が最適化された。それに対し、ｏＨＳＶは、効果が長時間持続できるにもかかわらず、標的細胞に侵入し、複製し、腫瘍細胞を破壊するには約４日かかり得る。さらに、ＣＡＲによって改変されたＮＫ細胞は、腫瘍組織の構造を破壊し得、腫瘍細胞間の結合を減少させ得、癌細胞膜の透過性を高め得るので、ｏＨＳＶ−１と併用したとき、癌細胞におけるウイルスの分布および複製を高め得る。
等価物
【０２２０】
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、この技術が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。
【０２２１】
本明細書中に例証的に記載された本技術は、本明細書中に具体的に開示されていない任意のエレメント、限定の非存在下において適切に実施され得る。したがって、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、拡張的に無制限に解釈されるものとする。さらに、本明細書中で使用される用語および表現は、説明の用語として使用されているのであって、限定の用語としては使用されておらず、そのような用語および表現の使用には、示されるおよび記載される特徴またはその一部の任意の等価物を排除する意図はなく、様々な改変が、特許請求される本技術の範囲内で可能であることが認識される。
【０２２２】
したがって、本明細書中に提供される材料、方法および例は、好ましい態様の代表であり、例示的なものであり、本技術の範囲に対する限定と意図されていないことが理解されるべきである。
【０２２３】
本技術は、本明細書中で広く一般的に説明された。その一般的な開示の範囲内に入るより狭い種および亜属の分類の各々も、本技術の一部を形成する。これには、削除される材料が本明細書に明確に列挙されているか否かに関係なく、条件付きでの、またはその属から任意の主題を除くネガティブな限定付きでの本技術の一般的な説明が含まれる。
【０２２４】
さらに、本技術の特徴または態様が、マーカッシュ群で説明されている場合、当業者は、本技術が、そのマーカッシュ群の任意の個別のメンバーまたはメンバーのサブグループでも説明されていると認識する。
【０２２５】
本明細書中で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、各々が個別に参照により援用されたのと同一程度に、それらの全体が参照により明白に援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。
【０２２６】
他の態様は、以下の特許請求の範囲に示される。
【図１−１】
2020156522.tif 000034
【図１−２】
2020156522.tif 000035
【図２−１】
2020156522.tif 000036
【図２−２】
2020156522.tif 000037
【図３】
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【図４】
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【図５】
2020156522.tif 000040
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
2020156522000001.app
【外国語明細書】
2020156522000001.pdf