(57)【要約】【課題】食経験豊富な食品素材の中から優れた破骨細胞分化抑制作用を有し、骨吸収性疾患に有効な内服剤及び飲食品組成物を開発すること。【解決手段】４’−デメチルノビレチンを有効成分として含有する、破骨細胞分化抑制剤、破骨細胞分化抑制用の飲食品組成物、並びに、骨吸収性疾患の予防、治療又は改善用の内服剤、飲食品組成物を提供する。４’−デメチルノビレチンはカンキツ果皮成分であるノビレチンの代謝産物の一つであるため、本発明の破骨細胞分化抑制剤、内服剤又は飲食品組成物は副作用の心配がない。【選択図】図３Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
４’−デメチルノビレチンを有効成分として含有する破骨細胞分化抑制剤。
【請求項２】
４’−デメチルノビレチンを有効成分として含有する破骨細胞分化抑制用の飲食品組成物。
【請求項３】
４’−デメチルノビレチンを有効成分として含有する、骨吸収性疾患の予防又は治療用の内服剤。
【請求項４】
４’−デメチルノビレチンを有効成分として含有する、骨吸収性疾患の予防又は改善用の飲食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４’−デメチルノビレチンを有効成分として含有することにより破骨細胞分化抑制作用を有し、骨吸収性疾患に有効な内服剤及び飲食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨細胞には、骨を作る骨芽細胞と骨を壊す破骨細胞があり、これらの細胞の働きが常に繰り返されることで、骨が再構築されている。しかしながら、骨粗鬆症においては、これらのバランスが崩れ、骨形成量に比べて相対的に破骨細胞による骨吸収量が上回って骨量が減少し、骨粗鬆症発症につながる（例えば、非特許文献１参照）。破骨細胞は単球・マクロファージ系前駆細胞から分化し、骨に存在するマクロファージ系細胞が破骨細胞前駆細胞と考えられている（例えば、非特許文献２参照）。また、歯周病における歯槽骨吸収についても、破骨細胞の活性化によるものであることが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。したがって、破骨細胞分化抑制作用を持つ成分は、骨粗鬆症や歯周病等の骨吸収性疾患に有効であると考えられる。
【０００３】
一方、骨吸収を抑制する薬剤として経口ビスホスホネート製剤やカルシトニン製剤が用いられているが、前者については顎の骨(顎骨)の炎症（例えば、非特許文献４参照）や、後者についてはポリペプチド製剤であるためショック症状などの副作用のおそれがある。骨粗鬆症治療薬については長期的な服用を必要とする薬剤であることから、特に安全性が強く求められている。そのような中で、日々摂取可能な食品素材の中から、破骨細胞分化抑制作用を有し、骨粗鬆症の治療に有効な成分がいくつか報告されている（例えば、特許文献１、２参照）。しかしながら、これらは十分に効果を発揮するには至っていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】禹済泰ら、生物機能開発研究所紀要、第4号、p.11-14（2004年）
【非特許文献２】高橋直之、日本整形外科学会雑誌、第88巻、p.855-859（2014年）
【非特許文献３】臼井通彦ら、日本歯周病学会会誌、第57巻、p.120-125（2015年）
【非特許文献４】浦出雅裕、日本口腔外科学会雑誌、第56巻、第5号、p.292-297（2010年）
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2009-215250号公報
【特許文献２】特開2009-107995号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決し、安全な食品素材の中から優れた破骨細胞分化抑制作用を有し、骨粗鬆症や歯周病における歯槽骨吸収等の骨吸収性疾患に有効な内服剤及び飲食品組成物を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ポリメトキシフラボノイドであるノビレチンは、カンキツ特有のフラボノイドであるが、近年、がん予防、老化抑制、抗動脈硬化作用等さまざまな生理作用が知られるようになってきた。
【０００８】
本発明者らは、ノビレチンを多く含有するカンキツ類の果皮を用い、特定種類の麹菌で発酵することにより、主成分のノビレチンが４’−デメチルノビレチンに変換することを明らかにした。また、本発明者らは、４’−デメチルノビレチンが、優れた記憶改善作用を有することも見出した（特許第5667561号明細書参照）。本発明者らは、さらに４’−デメチルノビレチンの機能性について、検討を重ねた結果、強い破骨細胞分化抑制作用のあることを認めた。
【０００９】
即ち、本発明は、４’−デメチルノビレチンを有効成分として含有する破骨細胞分化抑制剤に関する。
また本発明は、４’−デメチルノビレチンを有効成分として含有する破骨細胞分化抑制用の飲食品組成物に関する。
また本発明は、４’−デメチルノビレチンを有効成分として含有する、骨吸収性疾患の予防又は治療用の内服剤に関する。
また本発明は、４’−デメチルノビレチンを有効成分として含有する、骨吸収性疾患の予防又は改善用の飲食品組成物に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、４’−デメチルノビレチンを有効成分として含有してなる、骨粗鬆症や歯周病における歯槽骨吸収等の骨吸収性疾患に有効な内服剤及び飲食品組成物を提供することを可能とする。
【００１１】
また、４’−デメチルノビレチンはカンキツ果皮の麹菌発酵物から得られた食品由来の安全な成分であるため、本発明の内服剤及び飲食品組成物は食経験が豊富で副作用の心配がない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】sRANKL添加による破骨細胞分化誘導を示す顕微鏡像図である。（実施例３）図中、左は陰性対照（無添加）、右はsRANKL 300ng/ml添加、の結果を示す。
【図２】4'-デメチルノビレチン単離物の添加による破骨細胞分化抑制作用を示す顕微鏡像図である。（実施例３）図中、左上は陰性対照（無添加）、右上はsRANKL 300ng/ml添加、左下はsRANKL＋４’−デメチルノビレチン、右下はsRANKL＋ノビレチン添加、の結果を示す。
【図３Ａ】４’−デメチルノビレチン単離物の添加による破骨細胞分化抑制作用を示すグラフである。（実施例３）図中、縦軸は破骨細胞分化の割合（％）を示し、棒グラフは左から陰性対照（無添加）、sRANKL添加、４’−デメチルノビレチン5,10,20μＭ添加、ノビレチン5,10,20μＭ添加、の結果を示し、バーは標準偏差を示す。＊＊は同濃度のノビレチン添加区に対して有意差（ｐ＜0.01）があることを示す。
【図３Ｂ】４’−デメチルタンゲレチン単離物の添加による破骨細胞分化抑制作用を示すグラフである。（実施例３）図中、縦軸は破骨細胞分化の割合（％）を示し、棒グラフは左から陰性対照（無添加）、sRANKL添加、４’−デメチルタンゲレチン5,10,20μＭ添加、タンゲレチン5,10,20μＭ添加、の結果を示し、バーは標準偏差を示す。＊＊は同濃度のタンゲレチン添加区に対して有意差（ｐ＜0.01）あることを、＊は同濃度のタンゲレチン添加区に対して有意差（ｐ＜0.05）があることを、それぞれ示す。
【図４】４’−デメチルノビレチン含有組成物による破骨細胞分化抑制作用を示す顕微鏡像図である。（実施例３）図中、左上は陰性対照（無添加）、右上はsRANKL 300ng/ml添加、左下はsRANKL＋４’−デメチルノビレチン含有組成物10μg/ml添加、右下はsRANKL＋４’−デメチルノビレチン含有組成物20μg/ml添加、の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本発明の実施形態は、４’−デメチルノビレチンを有効成分として含有する破骨細胞分化抑制剤に関する。
本発明のもう一つの実施形態は、骨吸収性疾患の予防、治療又は改善用の内服剤、並びに、これらの用途に用いられる飲食品組成物に関する。
【００１４】
〔４’−デメチルノビレチン〕
４’−デメチルノビレチン（式１）は市販されていないが、合成品を用いることができる。あるいは、先に報告した特許第5667561号明細書に記載の方法により、ノビレチンを含有するカンキツ類、特に果皮を用いた麹菌発酵により得られた４’−デメチルノビレチン純品（単離物）または4'-デメチルノビレチン含有組成物を用いることができる。合成品よりも、麹菌発酵によるノビレチンの生物変換を利用する特許第5667561号明細書の方法の方が簡便かつ安価なため、好適である。
【００１５】
【化１】
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【００１６】
４’−デメチルノビレチンは、ノビレチンが体内で吸収された後にできる代謝産物の一つでもある。カンキツ果皮はマーマレード、砂糖煮などのお菓子の原料として利用され、また、ノビレチン含量の高いマンダリンオレンジ（Citrus reticulata）はチンピとして長年の食経験があり、４’−デメチルノビレチンおよびその含有組成物は、副作用の心配がなく、安心して経口摂取することができる。
【００１７】
特許第5667561号明細書に記載された方法に準じた、４’−デメチルノビレチンおよびその含有組成物の製造方法について、以下に説明する。
【００１８】
〔発酵原料〕
麹菌発酵の原料は、ポリメトキシフラボノイドであるノビレチンを含有するカンキツ類の‘果実’（果皮、果汁、果肉、種子などを含む果実全体）であるが、特には、ノビレチンの含有率、廃棄物の有効利用の観点から、‘果皮’を用いることが望ましい。
【００１９】
また、カンキツ類の種類としては、ノビレチンを含有するカンキツ類であれば、如何なる品種、系統のもの（例えば、ポンカン、シークワーシャ、タンジェリン、タチバナなど）も用いることもできる。
【００２０】
なお、発酵原料としては、カンキツ類の植物体の他の部分（例えば、葉、芽、茎、花、など）を含むものを用いてもよいが、ノビレチンの含有率の点でこれらを含まないものであることが望ましい。
【００２１】
上記カンキツ類は、好ましくは、収穫・採取した生のもの、水洗いしたもの、を用いることが望ましいが、乾燥、凍結、長期保存したものなどであっても用いることができる。また、カンキツ類はそのままの形態で用いてもよいが、刻むか、砕片化するか、擂潰するか、といった破砕処理の内の少なくとも１種類を行うことが望ましい。
【００２２】
当該破砕処理は、カンキツ類をいくつかの破片に大きめに刻むこと、細かい小片に細断すること、破砕すること、擂り潰すこと、粉末状にすること、等、幅広い行為を含むものである。好ましくは、１〜数ｃｍ程度に大きめに刻んだ状態にすることによって、行うことができる。
【００２３】
またさらには、上記発酵原料から、予めノビレチンを抽出して得た抽出物（エキス、乾燥物）や、純品のノビレチンとして単離したものを、発酵に用いることもできる。なお、上記発酵原料は、後記の麹菌発酵を行う前に加熱処理を行って、原料中の雑菌を殺菌しておくことが好ましい。
【００２４】
〔麹菌発酵〕
前記発酵原料を発酵させる麹菌としては、例えばアスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）、リゾプス属糸状菌（別名クモノスカビ）、などを用いることができる。また、これらを混合させて用いてもよい。
【００２５】
前記麹菌のうち好ましくは、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、を用いると、４’−デメチルノビレチンを高い含有率で得ることができる。
【００２６】
発酵原料へ前記麹菌を接種する方法としては、麹菌の胞子を発酵原料に直接振りかけて付着させることができる。また、予め前記麹菌を液体培養により予備発酵した培地を、発酵原料全体に行き渡るように接種してもよい。
【００２７】
前記麹菌を発酵原料に接種する場合の発酵条件としては、好気的条件で行うことが望ましいことから、例えば有底円筒状の底部が広く深さが浅い容器が好適である。このような容器の底部に、発酵原料を万遍なく広げ、空気との接触面積が大きくなるようにするとよい。
【００２８】
発酵温度としては、前記麹菌の生育に好適な条件として、好ましくは１０〜４０℃、より好ましくは２０〜４０℃、さらに好ましくは２５〜３２℃で行われる。加えて、前記麹菌の生育に好適な条件として、暗所で発酵させるのが好ましい。また、原料中に十分な水分が含まれている状態であることが好ましい。
【００２９】
４’−デメチルノビレチンを多量に得るための発酵期間としては、好ましくは２〜２１日間とすることができ、より好ましくは３〜１４日間、さらに好ましくは４〜１２日間である。この発酵期間が２日間未満の場合には、前記麹菌による発酵がほとんど進行していないことから十分な４’−デメチルノビレチンが得られない。また、逆に２１日間を超える場合には、微生物変換により生成された４’−デメチルノビレチンの分解が進み、またカンキツ由来の好ましい芳香が消失する。
【００３０】
また、当該麹菌発酵においては、麹菌から分泌される酵素によって、ノビレチンがデメチル化され、４’−デメチルノビレチンへと変換させるものである。従って、麹菌発酵を行う代わりに、当該麹菌もしくは発酵後に得られる発酵物から溶液抽出を行ってノビレチンをデメチル化する酵素を含む酵素液を得、当該酵素を用いて前記原料と酵素反応を行って反応物を得ることで、４’−デメチルノビレチンを得ることも可能である。具体的には、当該麹菌発酵後の発酵物からの水溶解物を回収し、粗酵素液として用いることで、酵素反応を行うことができる。
【００３１】
上記の麹菌発酵を行うことによって、発酵原料に含有されるポリメトキシフラボノイドであるノビレチンは、すべて４'−デメチルノビレチンに変換される。具体的には、前記原料を麹菌発酵することによって、４'−デメチルノビレチンが乾燥重量あたり約０．５〜１．５質量％（具体的には、約１質量％）という、高い含有率の麹菌発酵物を得ることができる。従って、ここで得られた麹菌発酵物を、得られたそのままの形態で、もしくは、加工（例えば、細片化、擂潰、粉末化、乾燥、など）して、本実施形態の破骨細胞分化抑制剤、内服剤及び飲食品組成物の有効成分として用いることができる。
【００３２】
〔溶液抽出〕
なお、純度の点を鑑みると、本実施形態の破骨細胞分化抑制剤、内服剤及び飲食品組成物の製造においては、前記麹菌発酵の後に得られる発酵物から溶液抽出を行って、抽出物を得ることが望ましい。
【００３３】
当該溶液抽出は、前記麹菌発酵物に対して直接行うこともできるが、前記麹菌発酵物について、さらに細片化、破砕、擂潰、粉末化等の前処理の内の少なくとも１種類を施して得られたものに対して溶液抽出を行うことが望ましい。
【００３４】
溶液抽出に用いる溶媒は、水、緩衝液、有機溶媒、又はこれらの含水溶媒を用いることができる。有機溶媒としては、例えば、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ブタノールのような低級脂肪族アルコールや、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム等が挙げられる。これらの溶媒の中でも、水、エタノールあるいは含水エタノールが、抽出効率や取り扱いやすさ、安全性の面で特に好ましい。また、特には、終濃度５５％以上、好ましくは終濃度６０％以上、さらに好ましくは終濃度８０％以上（いずれもv/v）の含水エタノールを用いて抽出を行うことで、不純物である多糖類の溶出を抑制でき、４’−デメチルノビレチンの抽出効率を向上できるため好ましい。
【００３５】
抽出条件としては、前記原料（好ましくは砕片化物）に対して、前記溶媒を、１〜５０倍量、好ましくは２〜１５倍量（いずれも質量比）加え、０℃〜溶媒の沸点の温度条件、好ましくは室温〜溶媒の沸点以下の温度条件で、５分間〜１ヶ月間、好ましくは２０分間〜１週間、浸漬もしくは振盪することにより、４’−デメチルノビレチンを抽出することが可能である。得られた抽出液は、凍結乾燥やエバポレータ等を用いて乾燥させることで、濃縮乾固物とすることができる。
【００３６】
また、溶液抽出は、異なる複数の溶媒で、複数回行うこともできる。例えば、一度目の抽出を水や低濃度の含水アルコールといった低濃度の溶媒で行った後に、先の溶媒より高い濃度の溶媒を用いて二度目の抽出を行うことで、４’−デメチルノビレチンの抽出効率を向上させることができる。
【００３７】
上記により得られた抽出物（前記抽出液や濃縮乾固物）は、優れた破骨細胞分化抑制作用及び骨粗鬆症や歯周病における歯槽骨吸収といった骨吸収性疾患の予防、治療又は改善作用を有するため、そのまま本実施形態の破骨細胞分化抑制剤、内服剤又は飲食品組成物の有効成分として用いることができる。
【００３８】
〔精製〕
また、上記抽出物をさらに精製することによって、４’−デメチルノビレチン含有量をさらに高めることができる。精製手段としては、例えば液−液分離抽出や、シリカゲル、化学修飾シリカゲル、活性炭、合成吸着樹脂担体等によるカラム精製などが挙げられる。以下に一実施形態として、含水エタノールを用いて溶液抽出を行った場合の好適な精製条件の一例を示す。
【００３９】
まず、抽出液からエタノールを除去し、得られたエタノール除去液を、水で平衡化した多孔性合成吸着樹脂（例えば、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製））のカラムに供する。そして、水溶出する成分を除去した後、さらに３０〜３５％（v/v）エタノールで溶出される液を除去する。次に、４４〜４６％（v/v）エタノールで溶出される成分を回収することにより、４’−デメチルノビレチン高含有組成物を得ることができる。上記に記載した好適な条件で抽出および精製を行うことにより、４’−デメチルノビレチン１５％（w/w）以上を高含有する組成物を得ることができる。
【００４０】
また、上記のように得られた４’−デメチルノビレチン含有組成物は、さらにＯＤＳカラムクロマトグラフィー（例えば４５％メタノール溶出）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（例えばヘキサン／エタノール（７：３））、ＯＤＳ−ＨＰＬＣ（例えば３７％（v/v）アセトニトリル・水の混合溶媒）などに供し、目的ピークを採取することで、４’−デメチルノビレチンの純品を単離することができる。
【００４１】
上記により得られる４’−デメチルノビレチンは、４’位が脱メチル化したノビレチンのモノデメチル体である。４’−デメチルノビレチンは脱メチル化により極性が高くなり、ノビレチンに比べてアルコール、水への溶解性に優れる。また、４’−デメチルノビレチンは、ノビレチンに比べて優れた破骨細胞分化抑制作用を有し、骨粗鬆症や歯周病における歯槽骨吸収といった骨吸収性疾患に有効である。
【００４２】
〔破骨細胞分化抑制剤、内服剤及び飲食品組成物〕
本実施形態の破骨細胞分化抑制剤は、４’−デメチルノビレチンを有効成分として含有することを特徴とする。
本実施形態の内服剤は、４’−デメチルノビレチンを有効成分として含有し、骨吸収性疾患の予防又は治療用であることを特徴とする。
本実施形態の飲食品組成物は、４’−デメチルノビレチンを有効成分として含有し、破骨細胞分化抑制作用を有し、骨吸収性疾患の予防又は改善用であることを特徴とする。
【００４３】
上記の４’−デメチルノビレチンは、上記の方法により得られる各組成物（‘発酵物を直接含有する組成物’、‘溶液抽出物’、‘高含有組成物’、‘精製物’など）や単離物を、有効成分として各種原料に混合することで、本実施形態の破骨細胞分化抑制剤や内服剤、飲食品組成物を製造することができる。なお、「内服剤」には医薬品及び医薬部外品が含まれる。また、「飲食品組成物」には一般的な飲食品と機能性食品、機能性飲料が含まれる。
【００４４】
本実施形態の破骨細胞分化抑制剤、内服剤、飲食品組成物を経口摂取する場合の４’−デメチルノビレチンの有効摂取量としては、体重60kgの成人１日あたり、1mg以上、好ましくは5mg以上、経口摂取することにより、優れた破骨細胞分化抑制作用、並びに骨吸収性疾患に対する優れた予防・治療・改善作用を得ることができる。従って、この必要量を確保できる形態や摂取方法（回数、量）で、本発明の破骨細胞分化抑制剤、内服剤又は飲食品組成物を摂取することで、上記薬理作用が得られることが期待される。ただし、対象の年齢、体重、症状、摂取スケジュール、製剤形態などにより、摂取量を適宜決定することが望ましい。
【００４５】
また、破骨細胞分化抑制剤、内服剤、飲食品組成物における４’−デメチルノビレチンの含有量としては、上記必要な摂取量を担保できるように含有するものであればよいが、具体的には、0.001質量％以上、好ましくは0.01質量％以上、さらに好ましくは0.1質量％以上となるように含有させることができる。また、上限としては、20質量％以下を挙げることができる。
【００４６】
破骨細胞分化抑制剤、内服剤の形態としては、例えば粉末状、細粒状、顆粒状、練歯磨き粉状などとすることができ、これらをカプセルに充填する形態の他、水に分散させた液状の形態、クリーム状、賦形剤等と混和して得られる錠剤の形態とすることもできる。
【００４７】
本実施形態の破骨細胞分化抑制剤、内服剤には、４’−デメチルノビレチンまたはその含有組成物以外にも、本発明の効果を奏する範囲内で、各種担体や添加剤、他の薬効成分などが含まれていても良い。
【００４８】
また、飲食品組成物の形態としては、種々の食品原料や添加剤などと混合して、例えば、ビスケット、スナック菓子、ガム、チュアブル錠、清涼飲料水、ドリンク、スープ、ゼリー、キャンディ等の形態とすることができる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を挙げて本発明の実施形態を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。
【００５０】
＜実施例１＞  ４’−デメチルノビレチン含有組成物の調製
特許第5667561号明細書に記載の方法により、ポンカン果皮を麹菌発酵することによりノビレチン変換物４’−デメチルノビレチン含有組成物を調製した。
【００５１】
すなわち、ポンカン果皮10ｋｇを刻んで細片化し、蒸煮処理により滅菌処理を行った。得られたポンカン果皮に、全体に行き渡るようにアスペルギルス・アワモリ（（株）ビオック製）を接種した。そして、30℃の恒温室内にて麹菌発酵を好気的に5日行うことで、麹菌発酵物を得た。
【００５２】
得られた麹菌発酵物5kgに対して水60Lを添加し、100℃において1時間熱水抽出した後、熱水抽出液を得た。得られた抽出液を、あらかじめ水で平衡化したダイヤイオンHP20（多孔性合成吸着樹脂カラム）に供し、3Ｌの水で非吸着成分を除いた後、さらに2Ｌの35％（v/v）エタノールで溶出する成分を除いた。次いで、2Ｌの45％（v/v）エタノールで溶出する成分を回収した。当該回収物をさらにエバポレータで濃縮乾固して、４’-デメチルノビレチン含有組成物（４’−デメチルノビレチン含量19.1％）を得た。
【００５３】
＜実施例２＞  ４’−デメチルノビレチン単離物の調製
実施例１により得られた４’−デメチルノビレチン含有組成物2ｇを20％（v/v）メタノールに溶解し、ODSカラムクロマトグラフィー（内径20mmφ、長さ30cmカラムに和光ゲル50C18を30ｇ詰めた）に供した。40％（v/v）メタノールで溶出する成分を除去し、60％（v/v）メタノールで溶出する成分を得た。
【００５４】
次いで、得られた成分について、展開溶媒ヘキサン／エタノール＝7：3の条件で分取TLCクロマトグラフィー（シリカゲル70PF254プレートワコー、膜厚0.75ｍｍ、和光純薬製）を行い、４’−デメチルノビレチンを含む画分を、UVランプを用いて確認しながら採取した。
【００５５】
そして、得られた画分を、分取HPLCカラム（TSK GEL ODS、東ソー社製、4.6mm×25cm）に供し、37％（v/v）アセトニトリルの移動層によって、純品の４’−デメチルノビレチン20mgを単離した。
【００５６】
＜実施例３＞ 破骨細胞分化抑制作用の検討
被検物として実施例２で得られた４’−デメチルノビレチン単離物を用い、破骨細胞分化抑制作用を調べた。破骨細胞分化用細胞としてRAW264.7細胞（マウスマクロファージ様細胞）を用いた。
【００５７】
細胞は5％CO2存在下、37℃のインキュベータ中で、10％牛胎児血清を含むDMEM培地にて培養し、0.1％EDTAを含む0.25％トリプシン処理により3日〜4日毎に継代を行った。
【００５８】
RAW264.7細胞を96ウエルプレートに播種（1×103cell/well）し、sRANKL（終濃度300ng/ml、和光純薬製）と共に４’−デメチルノビレチン単離物（終濃度５μＭ）を添加して、培養を行った。比較対照として、４’−デメチルノビレチンの代わりに等量のノビレチン（和光純薬製）を添加した。
【００５９】
5日後に破骨細胞特異的TRAP染色を実施した。すなわち、各ウェルの培養液を除去してPBSで洗浄後、細胞をウェルに固定し、酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（TRAP）染色キットを用いて染色後、顕微鏡観察を行った。赤色染色性（TRAP染色陽性）の多核細胞を破骨細胞として、全細胞中の破骨細胞の割合を破骨細胞分化の指標とした。無添加（陰性対照）に対する、被検物添加における破骨細胞分化の割合から、被検物による破骨細胞分化抑制効果を評価した。
【００６０】
図１は、sRANKL無添加時とsRANKL300ng/ml添加時のTRAP染色の結果を示す顕微鏡像図である。図１において、左は陰性対照（無添加）、右はsRANKL 300ng/ml添加、の結果を示す。図１のように、sRANKL300ng/ml添加により破骨細胞へと分化する細胞（TRAP染色陽性の多核細胞）が多く見られたことから、本実施例ではsRANKL300ng/ml添加による破骨細胞分化誘導に対する抑制作用を検討した。
【００６１】
図２は、４’−デメチルノビレチン単離物の添加による破骨細胞分化抑制作用を示す顕微鏡像図である。図２において、左上は陰性対照（無添加）、右上はsRANKL 300ng/ml添加、左下はsRANKL＋４’−デメチルノビレチン、右下はsRANKL＋ノビレチン添加、の結果を示す。sRANKL添加区（図２右上）では破骨細胞へと分化する細胞（TRAP染色陽性の多核細胞）が多く占めたが、４’−デメチルノビレチン5μM添加（図２左下）によってTRAP染色陽性多核細胞は全く見られなかった。このことから、４’−デメチルノビレチンの添加により強い破骨細胞分化抑制効果が奏されることが分かった。また、ノビレチン5μM添加区（図２右下）においても、sRANKL添加区（図２右上）に比べて明らかなTRAP染色陽性多核細胞の減少が認められたが、４’−デメチルノビレチン添加区（図２左下）に比べるとその減少の程度は弱かった。したがって、ノビレチンにおいても破骨細胞分化抑制作用は認められるが、４’−デメチルノビレチンの方が明らかに強い破骨細胞分化抑制作用を有していることが示された。
【００６２】
そこで、上記において、４’−デメチルノビレチン又はノビレチンの終濃度を5、10、20μＭとしてTRAP染色を行った。TRAP染色陽性多核細胞（破骨細胞）数を顕微鏡観察によりカウントし、破骨細胞分化抑制作用の指標として全細胞中の破骨細胞の割合を算出することにより、被検物による破骨細胞分化抑制作用の評価を行った。また、比較対照として４’−デメチルタンゲレチン又はタンゲレチンを用いた。４’−デメチルタンゲレチンは、特許第5667561号明細書に記載の方法で麹菌発酵物から精製することにより得られた純品を用いた。
【００６３】
その結果を図３Ａ、図３Ｂに示す。図３Ａは４’−デメチルノビレチン添加による破骨細胞分化抑制作用を示すグラフである。図３Ａにおいて、棒グラフは左から陰性対照（無添加）、ｓRANKL 300ng/ml添加、４’−デメチルノビレチン5,10,20μM添加、ノビレチン5,10,20μM添加、の結果を示す。また、＊＊は同濃度のノビレチン添加区に対して有意差（ｐ＜0.01）があることを示す。図３Ｂは４’−デメチルタンゲレチン添加による破骨細胞分化抑制作用を示すグラフである。図３Ｂにおいて、棒グラフは左から陰性対照（無添加）、ｓRANKL 300ng/ml添加、４’−デメチルタンゲレチン5,10,20μM添加、タンゲレチン5,10,20μM添加、の結果を示す。また、＊＊は同濃度のタンゲレチン添加区に対して有意差（ｐ＜0.01）があることを示し、＊は同濃度のタンゲレチン添加区添加区に対して有意差（ｐ＜0.05）があることを示す。図３Ａ、図３Ｂにおいて、縦軸は破骨細胞分化の割合（％）を示し、バーは標準偏差を示す。
【００６４】
図３Ａにおいて、ノビレチンは終濃度5〜20μMの範囲において、ｓRANKL添加区に比べて用量依存的に破骨細胞分化抑制作用を示した。しかしながら、４’−デメチルノビレチン添加区では、終濃度5〜20μMの範囲で全くTRAP染色陽性多核細胞が認められず、ノビレチンに比べて著しく強い破骨細胞分化抑制作用が認められた。一方、図３Ｂでは、４’−デメチルタンゲレチンは、タンゲレチンに比べると比較的強い破骨細胞分化抑制作用を示したが、図３Ａに示されるノビレチンと比べて大きな違いはなかった。このように、ノビレチンをデメチル化したことによる破骨細胞分化に対する抑制効果の著しい上昇は、同じカンキツ果皮成分由来のポリメトキシフラボノイドであるタンゲレチンのデメチル化による変化とは全く異なる顕著なものであることが示された。
【００６５】
さらに、４’−デメチルノビレチン単離物の代わりに、実施例１で得られた４’−デメチルノビレチン含有組成物（４’−デメチルノビレチン含量19.1％）を添加したこと以外は、上記と同様にして、破骨細胞への分化に対する効果について検討した。
【００６６】
結果を図４に示す。図４は、４’−デメチルノビレチン含有組成物による破骨細胞分化抑制作用を示す顕微鏡像図である。図４において、左上は陰性対照（無添加）、右上はsRANKL 300ng/ml添加、左下はsRANKL＋４’−デメチルノビレチン含有組成物10μg/ml添加、右下はsRANKL＋４’−デメチルノビレチン含有組成物20μg/ml添加、の結果を示す。図４において、sRANKL添加区（図４右上）ではTRAP染色陽性の多核細胞が多く占めたのに対し、sRANKLとともに４’−デメチルノビレチン含有組成物を終濃度で10μg/ml（図４左下）または20μg/ml（図４右下）添加した場合は、各々TRAP染色陽性多核細胞は全く見られなかった。このことから、４’−デメチルノビレチン含有組成物においても、単離物と同様に強い破骨細胞分化抑制作用を有することが示された。
【００６７】
以上の実施例から、４’−デメチルノビレチンは非常に強い破骨細胞分化抑制作用を有するものと認められた。ノビレチンに比べてもその効果は顕著であった。
【００６８】
＜実施例４＞  内服剤（錠剤）の製造
常法により、以下に示す配合の錠剤を製造した。
1粒（200mg）中の各成分含量
４’−デメチルノビレチン  20 mg
乳清カルシウム            80 mg
乳糖                      70 mg
結晶セルロース            20 mg
炭酸カルシウム             5 mg
ショ糖エステル             5 mg
合計                     200 mg
【００６９】
＜実施例５＞  飲料の製造
常法により、以下に示す配合の飲料を製造した。
180ml中の各成分含量
実施例１の４’-デメチルノビレチン含有組成物   0.026 g
（４’−デメチルノビレチンとして5 mg）
りんご濃縮果汁                                5     g
乳糖                                          2     g
果糖ブドウ糖液糖                              5     g
酸味料（クエン酸）                            0.3   g
甘味料（スクラロース）                        0.01  g
保存料（安息香酸Na）                          0.03  g
水                                            残分
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明により、食経験が豊富で副作用の心配がない原料である４’−デメチルノビレチンを有効成分として含有し、破骨細胞分化抑制作用を有する医薬品、医薬部外品及び飲食品組成物を提供することを可能とする。従って、本発明は、骨粗鬆症治療や歯周病における歯槽骨吸収等の骨吸収性疾患に有効な医薬品や医薬部外品、また、その予防・改善のための飲食品組成物に利用されることが期待される。骨粗鬆症については加齢が原因で起こることが多く、その予防や治療は長期に亘るため、特に、副作用の心配が少ない内服剤が求められる。そのような中で、食品素材由来の原料を用いる本発明は、長寿社会を迎えた現代において、QOLを保つための素材として大きな需要が期待されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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