(57)【要約】【課題】本発明は、真核細胞においてＷｎｔシグナル伝達を増大するための、真核細胞の表面上のＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３タンパク質の細胞外ドメインとの抗体結合によるＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３活性の調節を提供する。【解決手段】膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外ドメインと特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、（ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３からなる群から選択され、（ｂ）抗体の、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外ドメインとの結合が、真核細胞においてＷｎｔシグナル伝達を増大し、ここで、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼが、真核細胞の表面上にある、単離抗体またはその抗原結合断片。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外ドメインと特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３からなる群から選択され、
（ｂ）抗体の、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外ドメインとの結合が、真核細胞においてＷｎｔシグナル伝達を増大し、ここで、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼが、真核細胞の表面上にある、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
増大したＷｎｔシグナル伝達が、インビトロアッセイにおいて検出することができる、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項３】
少なくとも１種の遺伝子改変されたポリペプチドを含む、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項４】
抗体または抗原結合断片のアミノ末端からカルボキシル末端に、３つの領域：
（ａ）配列番号３１；配列番号３７；配列番号４３；配列番号４９；配列番号５５；配列番号６１；配列番号９１；配列番号９７；配列番号１０３；配列番号１０９；配列番号１１５；配列番号１２１；配列番号１２７；配列番号１３３；配列番号１３９；配列番号１４５；配列番号１５１および配列番号１５７からなる群から選択されるペプチド配列を有する第１の領域と、
（ｂ）配列番号３２；配列番号３８；配列番号４４；配列番号５０；配列番号５６；配列番号６２；配列番号９２；配列番号９８；配列番号１０４；配列番号１１０；配列番号１１６；配列番号１２２；配列番号１２８；配列番号１３４；配列番号１４０；配列番号１４６；配列番号１５２；および配列番号１５８からなる群から選択されるペプチド配列を有する第２の領域と、
（ｃ）配列番号３３；配列番号３９；配列番号４５；配列番号５１；配列番号５７；配列番号６３；配列番号９３；配列番号９９；配列番号１０５；配列番号１１１；配列番号１１７；配列番号１２３；配列番号１２９；配列番号１３５；配列番号１４１；配列番号１４７；配列番号１５３；および配列番号１５９からなる群から選択されるペプチド配列を有する第３の領域と
を含む、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項５】
抗体または抗原結合断片のアミノ末端からカルボキシル末端に、３つの領域：
（ａ）配列番号３４；配列番号４０；配列番号４６；配列番号５２；配列番号５８；配列番号６４；配列番号９４；配列番号１００；配列番号１０６；配列番号１１２；配列番号１１８；配列番号１２４；配列番号１３０；配列番号１３６；配列番号１４２；配列番号１４８；配列番号１５４；および配列番号１６０からなる群から選択されるペプチド配列を有する第１の領域と、
（ｂ）配列番号３５；配列番号４１；配列番号４７；配列番号５３；配列番号５９；配列番号６５；配列番号９５；配列番号１０１；配列番号１０７；配列番号１１３；配列番号１１９；配列番号１２５；配列番号１３１；配列番号１３７；配列番号１４３；配列番号１４９；配列番号１５５；および配列番号１６１からなる群から選択されるペプチド配列を有する第２の領域と、
（ｃ）配列番号３６；配列番号４２；配列番号４８；配列番号５４；配列番号６０；配列番号６６；配列番号９６；配列番号１０２；配列番号１０８；配列番号１１４；配列番号１２０；配列番号１２６；配列番号１３２；配列番号１３８；配列番号１４４；配列番号１５０；配列番号１５６；および配列番号１６２からなる群から選択されるペプチド配列を有する第３の領域と
を含む、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項６】
（ａ）１種または複数のポリペプチドを含み、
（ｂ）少なくとも１種のポリペプチドが、抗体または抗原結合断片のアミノ末端からカルボキシル末端に、３つの領域：
（１）配列番号３１；配列番号３７；配列番号４３；配列番号４９；配列番号５５；配列番号６１；配列番号９１；配列番号９７；配列番号１０３；配列番号１０９；配列番号１１５；配列番号１２１；配列番号１２７；配列番号１３３；配列番号１３９；配列番号１４５；配列番号１５１および配列番号１５７からなる群から選択されるペプチド配列を有する第１の領域と、
（２）配列番号３２；配列番号３８；配列番号４４；配列番号５０；配列番号５６；配列番号６２；配列番号９２；配列番号９８；配列番号１０４；配列番号１１０；配列番号１１６；配列番号１２２；配列番号１２８；配列番号１３４；配列番号１４０；配列番号１４６；配列番号１５２；および配列番号１５８からなる群から選択されるペプチド配列を有する第２の領域と、
（３）配列番号３３；配列番号３９；配列番号４５；配列番号５１；配列番号５７；配列番号６３；配列番号９３；配列番号９９；配列番号１０５；配列番号１１１；配列番号１１７；配列番号１２３；配列番号１２９；配列番号１３５；配列番号１４１；配列番号１４７；配列番号１５３；および配列番号１５９からなる群から選択されるペプチド配列を有する第３の領域と
を含み、
（ｂ）少なくとも１種のポリペプチドが、抗体または抗原結合断片のアミノ末端からカルボキシル末端に、３つの領域：
（１）配列番号３４；配列番号４０；配列番号４６；配列番号５２；配列番号５８；配列番号６４；配列番号９４；配列番号１００；配列番号１０６；配列番号１１２；配列番号１１８；配列番号１２４；配列番号１３０；配列番号１３６；配列番号１４２；配列番号１４８；配列番号１５４；および配列番号１６０からなる群から選択されるペプチド配列を有する第１の領域と、
（２）配列番号３５；配列番号４１；配列番号４７；配列番号５３；配列番号５９；配列番号６５；配列番号９５；配列番号１０１；配列番号１０７；配列番号１１３；配列番号１１９；配列番号１２５；配列番号１３１；配列番号１３７；配列番号１４３；配列番号１４９；配列番号１５５；および配列番号１６１からなる群から選択されるペプチド配列を有する第２の領域と、
（３）配列番号３６；配列番号４２；配列番号４８；配列番号５４；配列番号６０；配列番号６６；配列番号９６；配列番号１０２；配列番号１０８；配列番号１１４；配列番号１２０；配列番号１２６；配列番号１３２；配列番号１３８；配列番号１４４；配列番号１５０；配列番号１５６；および配列番号１６２からなる群から選択されるペプチド配列を有する第３の領域と
を含む、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項７】
抗体または抗原結合断片のペプチド配列が、配列番号３；配列番号５；配列番号６７；配列番号６９；配列番号７１；配列番号７３；配列番号７５；配列番号７７；配列番号７９；配列番号８１；配列番号８３；配列番号８５；配列番号８７；および配列番号８９からなる群から選択される配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項８】
抗体または抗原結合断片のペプチド配列が、配列番号４；配列番号６；配列番号６８；配列番号７０；配列番号７２；配列番号７４；配列番号７６；配列番号７８；配列番号８０；配列番号８２；配列番号８４；配列番号８６；配列番号８８；および配列番号９０からなる群から選択される配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項９】
（ａ）１種または複数のポリペプチドを含み、
（ｂ）少なくとも１種のポリペプチドが、配列番号３；配列番号５；配列番号６７；配列番号６９；配列番号７１；配列番号７３；配列番号７５；配列番号７７；配列番号７９；配列番号８１；配列番号８３；配列番号８５；配列番号８７；および配列番号８９からなる群から選択される配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有し、
（ｂ）少なくとも１種のポリペプチドが、配列番号４；配列番号６；配列番号６８；配列番号７０；配列番号７２；配列番号７４；配列番号７６；配列番号７８；配列番号８０；配列番号８２；配列番号８４；配列番号８６；配列番号８８；および配列番号９０からなる群から選択される配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項１０】
Ｗｎｔシグナル伝達の増大から利益を受ける疾患またはその他の適応症の治療において医薬として使用するための、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項１１】
Ｗｎｔシグナル伝達の増大から利益を受ける疾患またはその他の適応症が、粘膜炎短腸症候群、胃腸管粘膜における細菌移行、腸内毒素原性または腸疾患性感染性下痢、セリアック病、非熱帯性スプルー、ラクトース不耐症、食事曝露が粘膜絨毛の鈍麻および吸収不良を引き起こすその他の状態、萎縮性胃炎、骨粗しょう症、骨折、代謝性疾患、糖尿病、神経変性疾患、メラノーマならびに組織再生、組織修復または創傷治癒を必要とする状態からなる群から選択される、請求項１０に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項１２】
真核細胞においてＷｎｔシグナル伝達を増大するよう、別の細胞表面タンパク質とさらに特異的に結合し、その他の細胞表面タンパク質が、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５およびＬＧＲ６からなる群から選択される、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項１３】
薬学的に許容される担体中の、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項１４】
対象においてＷｎｔシグナル伝達の低減から利益を受ける疾患またはその他の適応症の治療において医薬として使用するための、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外ドメインと特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼが、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３からなる群から選択され、
（ｂ）抗体または抗原結合断片の、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外ドメインとの結合が、対象においてＲ−スポンジン刺激性Ｗｎｔシグナル伝達を遮断する、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
疾患またはその他の適応症が、がん、硬結性骨化症、特発性肺繊維症および心肥大からなる群から選択される、請求項１４に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項１６】
対象においてＷｎｔシグナル伝達の低減から利益を受ける疾患またはその他の適応症の治療において医薬として使用するための、薬学的に許容される担体中の膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの可溶性細胞外ドメインであって、
（ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼが、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３からなる群から選択され、
（ｂ）対象において、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの可溶性細胞外ドメインが、Ｒ−スポンジンと特異的に結合して、Ｒ−スポンジン刺激性Ｗｎｔシグナル伝達を遮断する、可溶性細胞外ドメイン。
【請求項１７】
疾患またはその他の適応症が、がん、硬結性骨化症、特発性肺繊維症および心肥大からなる群から選択される、請求項１６に記載の可溶性細胞外ドメイン。
【請求項１８】
ＩＩ型糖尿病の治療における医薬として使用するための、
（ａ）ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）阻害剤の対象への投与の前に、または
（ｂ）ＤＰＰ−４阻害剤の対象への投与と一緒に、または
（ｃ）ＤＰＰ−４阻害剤の対象への投与の前、次いで、ＤＰＰ−４阻害剤の対象への投与と一緒に
ＩＩ型糖尿病を有する対象に投与される、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項１９】
ＤＰＰ−４阻害剤がビルダグリプチン（Ｇａｌｖｕｓ（登録商標））である、請求項１８に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、受容体と結合するモノクローナル抗体、具体的には、ＺＮＲＦ３タンパク質と、またはＲＮＦ４３タンパク質と結合する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｗｎｔシグナル伝達経路は、細胞増殖および分化の調節にとって重要である真核細胞中のタンパク質のネットワークである。Logan CY and Nusse R, 「The Wnt signaling pathway in development and disease.」 Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 20:781-810 (2004);Nusse R., 「Wnt signaling in disease and in development.」 Cell Res. 15(1):28-32 (Jan. 2005);Clevers H, 「Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.」 Cell 127(3):469-80 (3 Nov. 2006)。Ｗｎｔシグナル伝達は、胚発生の間の細胞増殖および分化の調節に必須である。成人では、Ｗｎｔシグナル伝達は、組織ホメオスタシスを促進する。
【０００３】
Ｗｎｔシグナル伝達の調節不全は、多数のヒト疾患に関係している。Ｗｎｔ経路の異常な過剰活性化は、結腸直腸癌の腫瘍発生を引き起こすことに関与している可能性がある。
反対に、病理的に低いレベルのＷｎｔシグナル伝達は、骨粗しょう症、変形性関節症、多発性嚢胞腎疾患および神経変性疾患と関連していた。Ｗｎｔ経路の制御された活性化は、組織修復および創傷治癒などの再生プロセスを促進するとわかっている。Zhao J, Kim KA and Abo A, 「Tipping the balance: modulating the Wnt pathway for tissue repair.」, Trends Biotechnol. 27(3):131-6 (Mar. 2009)。
【０００４】
Ｗｎｔタンパク質は、細胞中のＷｎｔ経路を活性化する細胞表面受容体（「Ｗｎｔ受容体複合体」）と結合するタンパク質リガンドである。標準的および非標準両方のいくつかの種類のＷｎｔ経路が同定されている。
【０００５】
標準的Ｗｎｔ／β−カテニン経路を介したＷｎｔシグナル伝達は、転写補助因子タンパク質β−カテニンの細胞代謝回転を調節する。MacDonald BT, Tamai K and He X, 「Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases.」 Dev. Cell 17(1):9-26 (Jul. 2009)および「Evaluating and treating scleroderma」と題された米国特許出願２００９／０２２０４８８。Ｗｎｔリガンドの不在下で、β−カテニンは、多タンパク質「破壊複合体」によってリン酸化されたままであり、これが、細胞のプロテオソームにおいてβ−カテニンのポリユビキチン化およびβ−カテニンの分解を引き起こす。Ｗｎｔが、Ｗｎｔ受容体複合体と結合すると、β−カテニンは、「破壊複合体」の阻害によって安定化される。次いで、β−カテニンは、核に転位置する。核では、β−カテニンは、Ｗｎｔ標的遺伝子の転写を活性化し、したがって、細胞増殖および分化のための遺伝子発現プログラムを活性化する。
【０００６】
標準Ｗｎｔ／β−カテニン経路では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）タンパク質および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５／６（ＬＲＰ５／６）が、受容体複合体を形成する。Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質およびＬＲＰ５／６は、標準Ｗｎｔ／β−カテニン経路にとって重要である。
【０００７】
非標準では、β−カテニン独立経路、Ｗｎｔシグナル伝達が、細胞および組織運動を支配する、平面内細胞極性（ＰＣＰ）または組織極性シグナル伝達を調節する。Zallen JA, 「Planar polarity and tissue morphogenesis.」Cell 129(6):1051-63 (15 Jun. 2007); Simons M and Mlodzik M, 「Planar cell polarity signling: from fly development to human disease.」 Annu. Rev. Genet; 42:517-40 (2008);米国特許出願第２００９／０２２０４８８号。Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質は、非標準Ｗｎｔシグナル伝達における受容体であるが、ＬＲＰ５／６は、必須ではない。
【０００８】
Ｗｎｔシグナル伝達経路に関与している多数のタンパク質にもかかわらず、特に、Ｗｎｔ経路中のβ−カテニンの経路の上流の標的は、この経路では２、３種しか新薬の開発につながるような標的が同定されていない。Ｗｎｔシグナル伝達関連障害に対する治療を開発するには、Ｗｎｔシグナル伝達を増強する薬剤が必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、本発明者らの、細胞の表面上のＷｎｔ受容体複合体の量の活性な負の制御因子としての、２種の相同膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの同定から来ている。リガーゼは、Ｚｉｎｃ／ＲＩＮＧフィンガータンパク質３（ＺＮＲＦ３）およびＲｉｎｇフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３）である。発明者らは、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３は、Ｒ−スポンジン（ＲＳＰＯ）タンパク質の分子標的、Ｗｎｔシグナル伝達に対して細胞を強力に感作させる分泌タンパク質の群であると示している。本発明者らは、Ｒ−スポンジンは、ＺＮＲＦ３とロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体４（ＬＧＲ４）の間の相互作用を誘導し、ＺＮＲＦ３の阻害およびＷｎｔシグナル伝達の活性化につながることをさらに示す。
【００１０】
本発明は、真核細胞においてＷｎｔシグナル伝達を増大するための、真核細胞の表面上のＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３タンパク質の細胞外ドメインとの抗体結合によるＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３活性の調節を提供する。一実施形態では、本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達を増大する抗体をアンタゴナイズする抗ＺＮＲＦ３である。別の実施形態では、本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達を増大する抗体をアンタゴナイズする抗ＲＮＦ４３である。
【００１１】
本発明はまた、低いＷｎｔシグナル伝達を有する疾患および状態を治療するために本発明の抗体をアンタゴナイズすることの医学的使用を提供する。低いＷｎｔシグナル伝達と関連している疾患および状態の一部として、それだけには限らないが、粘膜炎短腸症候群(mucositis short bowel syndrome)、胃腸管粘膜における細菌移行、腸内毒素原性または腸疾患性感染性下痢、セリアック病、非熱帯性スプルー、ラクトース不耐症および食事曝露が粘膜絨毛の鈍麻および吸収不良を引き起こすその他の状態ならびに萎縮性胃炎およびＩＩ型糖尿病が挙げられる。また、骨粗しょう症、骨折、糖尿病などの代謝性疾患、神経変性疾患およびメラノーマも含まれる。さらに、本発明の抗体をアンタゴナイズすることを使用して、組織修復および創傷治癒などの組織再生のためにＷｎｔシグナル伝達を増進してもよい。
【００１２】
本発明はさらに、二重特異性抗体などの多重結合特異性を有する抗体を提供する。抗体の一部は、ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３の細胞外ドメインと結合する。抗体のその他の部分は、Ｒ−スポンジンの共受容体、例えば、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５（ＧＰＲ４９としても知られる）またはＬＧＲ６の細胞外ドメインと結合する。例えば、特定の実施形態では、本開示内容は、
（ｉ）抗体の一部が、ＺＮＲＦ３の細胞外ドメインと結合し、抗体のその他の部分が、Ｒ−スポンジンの共受容体の細胞外ドメインと結合する抗体、または
（ｉｉ）抗体の一部が、ＲＮＦ４３の細胞外ドメインと結合し、抗体のその他の部分が、Ｒ−スポンジンの共受容体の細胞外ドメインと結合する抗体
に関する。
【００１３】
本発明は、ＩＩ型糖尿病を治療するためのＤＰＰ−４阻害剤との併用療法としての本発明の抗体の使用を提供する。本発明の抗体は、インクレチンホルモンのレベルを高めるよう投与される。ＤＰＰ−４阻害剤は、有効性のためにインクレチンの内因性産生を必要とするので、本発明の抗体は、ビルダグリプチン（Ｇａｌｖｕｓ（登録商標））などのＤＰＰ−４阻害剤または別のＤＰＰ−４阻害剤との併用療法として投与され得る。併用療法は、ＤＰＰ−４阻害剤の投与前の、またはＤＰＰ−４阻害剤の投与を伴う本発明の抗体の投与であり得る。
【００１４】
本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達を増大するためにＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３活性を調節する必要のない有用性のために、それぞれ、ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３の外部領域と結合する抗ＺＮＲＦ３または抗ＲＮＦ４３抗体の使用を提供する。ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３外部領域に対する抗体を使用して、特定の種類の腫瘍、例えば、結腸腺癌においてなど、Ｗｎｔ経路過剰活性化の結果としてＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３が高度に発現される疾患を診断できる。ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３外部領域に対する抗体はまた、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）またはがん細胞特異的送達および死滅のためのその他の同様の方法において使用できる。
【００１５】
本発明は、ＺＮＲＦ３とのＲ−スポンジン結合を干渉するために、またＲ−スポンジン誘導性Ｗｎｔシグナル伝達を阻害するために使用できるＺＮＲＦ３外部領域に対する抗体を提供する。このような抗体を使用して、それだけには限らないが、がん、変形性関節症、硬結性骨化症、特発性肺繊維症および心肥大を含めた高いＷｎｔシグナル伝達と関連している状態を治療できる(to treated)。
【００１６】
本発明はまた、Ｗｎｔシグナル伝達の低減から利益を得る疾患またはその他の適応症の治療において使用するために、薬学的に許容される担体中の膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ（ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３）の可溶性細胞外ドメインを提供する。ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３の可溶性細胞外ドメインは、Ｒ−スポンジンと特異的に結合して、Ｒ−スポンジンによって刺激されるＷｎｔシグナル伝達を遮断する。このような抗体を使用して、それだけには限らないが、がん、変形性関節症、硬結性骨化症、特発性肺繊維症および心肥大を含めた高いＷｎｔシグナル伝達と関連している状態を治療できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３がＷｎｔ標的遺伝子であることを示す一連の棒グラフである。マウスＬ細胞を、Ｗｎｔ３Ａコンディショニング培地（ＣＭ）を用いて、または用いずに２４時間処理した。全ＲＮＡを抽出して、ＺＮＲＦ３、ＲＮＦ４３およびＧＵＳＢ  Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブを用いて逆転写ならびにｑＰＣＲ解析を実施した。ΔΔＣｔ法を使用して、ｍＲＮＡレベルを得、棒グラフ中に示されるレベルを、ＧＵＳＢ（β−グルクロニダーゼのヒト遺伝子）のｍＲＮＡレベルに対して、またＷｎｔ３Ａコンディショニング培地なしに対して標準化する。
【図２Ａ】結腸がんでは、ＺＮＲＦ３が上方制御されることを示す一連の棒グラフである。ＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡ  レベルは、４人の患者から得た結腸腺癌および隣接する正常組織においてであった。ｍＲＮＡレベルを測定し、図１に記載のとおり分析した。
【図２Ｂ】結腸がんでは、ＲＮＦ４３が上方制御されることを示す一連の棒グラフである。ＲＮＦ４３  ｍＲＮＡレベルは、４人の患者から得た結腸腺癌および隣接する正常組織においてであった。ｍＲＮＡレベルを測定し、図１に記載のとおり分析した。
【図３】ＳＷ４８０結腸がん細胞におけるβ−カテニン遺伝子（ＣＴＮＮＢ１）のｓｉＲＮＡ媒介性枯渇ならびに細胞株におけるＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３の相対ｍＲＮＡレベルに対する効果を示す一連の棒グラフである。すべてのｍＲＮＡレベルは、内部対照としてＧＵＳＢ（β−グルクロニダーゼのヒト遺伝子）を用いるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブベースの定量的ＲＴ−ＰＣＲによるΔΔＣｔ法を使用して測定した。エラーバーは、標準偏差（ｎ＝４）を表す。
【図４】ＺＮＲＦ３が、Ｗｎｔシグナル伝達を負に調節することを示す一連の棒グラフである。クローニングされたＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（登録商標）（ＳＴＦ）リポーターを有するＨＥＫ２９３細胞は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはｓｉＲＮＡ耐性（ｓｉＲ）のいずれかを安定に発現し、Ｃ末端血球凝集素（ＨＡ）タグを付けた野生型（ＷＴ）ＺＮＲＦ３またはＲＩＮＧドメインを欠くＺＮＲＦ３（ΔＲＩＮＧ）は、対照ｓｉＲＮＡ（ＰＧＬ２）またはＺＮＲＦ３  ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、示される場合には、３０％  Ｗｎｔ３Ａコンディショニング培地（ＣＭ）を添加した。トランスフェクションの３日後、Ｐｒｏｍｅｇａ製のＢｒｉｇｈｔＧｌｏ（登録商標）試薬を使用してルシフェラーゼ活性をアッセイした。
【図５】ＲＮＦ４３が、ＺＮＲＦ３の機能的同族体であることを示す一連の棒グラフである。棒グラフは、ＧＦＰまたは野生型（ＷＴ）ＲＮＦ４３またはＲＩＮＧドメインを欠くＲＮＦ４３（ΔＲＩＮＧ）のいずれかを安定に発現する、クローニングされたＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（登録商標）（ＳＴＦ）リポーターを有するＨＥＫ２９３細胞（すなわち、２９３−ＳＴＦ細胞）を、対照ｓｉＲＮＡ（ＰＧＬ２）またはＺＮＲＦ３  ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした結果を表す。トランスフェクションの３日後、ルシフェラーゼ活性を、Ｐｒｏｍｅｇａ製のＢｒｉｇｈｔＧｌｏ（登録商標）試薬を使用してアッセイし、ＧＦＰ＋ｐＧＬ２ｓｉ群に対して標準化した。
【図６】以下の細胞株および処理の示されたタンパク質の免疫ブロットを示す一連のポリアクリルアミドゲル切片である：対照ｐＧＬ２  ｓｉＲＮＡまたはＺＮＲＦ３  ｓｉＲＮＡのいずれかのトランスフェクション後の、空のベクター（ＥＶ）、ｓｉＲＮＡ耐性ＺＮＲＦ３またはＲＩＮＧドメインを欠くＺＮＲＦ３（ΔＲＩＮＧ）を安定に発現するＨＥＫ２９３−ＳＴＦ細胞のＷｎｔリポーターアッセイ。エラーバーは、標準偏差（ｎ＝４）を表す。示されたタンパク質は、リン酸化Ｄｖｌ２（上部のバンド）；ｐＬＲＰ６、リン酸化ＬＲＰ６である。ＬＲＰ６ブロット中の下部のバンドは、ＺＮＲＦ３によって影響を受けないタンパク質のＥＲ形態である。Ｄｖｌ２は、セグメント極性タンパク質ディシブルド同族体である。
【図７】Ｍｙｃ−ＦＺＤ８を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞のビオチン化後に、ニュートラアビジンビーズによってプルダウンされた総および細胞表面Ｍｙｃ−ＦＺＤ８（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ８）の免疫ブロットを示す一連のポリアクリルアミドゲル切片である。細胞は、対照ｐＧＬ２  ｓｉＲＮＡまたはＺＮＲＦ３  ｓｉＲＮＡのいずれかを用いてトランスフェクトした。ＴＣＬ、総細胞溶解物。
【図８】Ｗｎｔシグナル伝達を調節する、２種のＺＮＲＦ３  ｈＦａｂｓを同定する一連の棒グラフである。特に、棒グラフは、ＺＮＲＦ３抗体がＳＴＦ活性を増大することを示す。ＨＥＫ２９３−ＳＴＦ細胞を、５％  Ｗｎｔ３ａコンディショニング培地の不在下および存在下で、５０μｇ／ｍｌのＺＮＲＦ３抗体または対照抗体を用いて一晩処理し、ＳＴＦルシフェラーゼリポーターアッセイに付した。
【図９】Ｒ−スポンジン（ＲＳＰＯ）、ＬＧＲ４およびＺＮＲＦ３の免疫共沈降を示す一連のポリアクリルアミドゲル切片である。ＬＧＲ４−ＨＡおよびＭｙｃ−ＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧを同時発現するＨＥＫ２９３細胞を、ＲＳＰＯ１−ＧＦＰコンディショニング培地（ＣＭ）を用いて１時間処理し、細胞溶解物を抗Ｍｙｃ抗体を用いて免疫沈降させ、免疫沈降物を溶解し、抗ＨＡ、抗Ｍｙｃおよび抗ＧＦＰ抗体を用いてブロットした。この図は、ＲＳＰＯ１が、ＺＮＲＦ３とＬＧＲ４の間の相互作用を増大することを示す。
【図１０】過剰発現ＺＮＲＦ３  ＥＣＤ−ＴＭ（細胞内ドメイン末端切断型の大部分を有するＺＮＲＦ３突然変異体）が、ＲＳＰＯ１を特異的に阻害するが、Ｗｎｔ３ａ誘導性ＳＴＦ活性は阻害しないことを示す一連の棒グラフである。空のベクター（ＥＶ）またはＺＮＲＦ３  ＥＣＤ−ＴＭを安定に発現するＨＥＫ２９３−ＳＴＦ細胞を、Ｗｎｔ３ａまたはＲＳＰＯ１を用いてΔＣで一晩処理し、ＳＴＦルシフェラーゼリポーターアッセイに付した。
【図１１】ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（登録商標）（ＳＴＦ）リポーターアッセイにおけるＩｇＧ−Ａｂ１およびＩｇＧ−Ａｂ２の刺激効果を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、以下を提供する：第１に、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３は、細胞表面タンパク質であり、したがって、ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３との抗体結合後に新薬の開発につながるような可能性がある。第２に、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３は、β−カテニンおよびＷｎｔシグナル伝達経路の負の制御因子である。ｓｉＲＮＡの使用による、またはドミナントネガティブ突然変異体ＺＮＲＦ３タンパク質の発現によるＺＮＲＦ３の阻害は、Ｗｎｔシグナル伝達の増大を引き起こす。第３に、ＲＮＦ４３は、ＺＮＲＦ３の機能的同族体である。第４に、タンパク質の細胞外ドメインと結合するＺＮＲＦ３に対する抗体は、ｓｉＲＮＡの使用による、またはドミナントネガティブ突然変異体ＺＮＲＦ３タンパク質の発現によるＺＮＲＦ３の阻害の効果を摸倣し、したがって、Ｗｎｔシグナル伝達の増大を引き起こす。第５に、タンパク質の細胞外ドメインと結合する、ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３に対する種々の種類の抗体は、特定化された結合を有する抗体を製造する公知の方法によって製造され得る。第６に、ＺＮＲＦ３の阻害は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を増進し、インビボ(in vivo)でＷｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達を撹乱する。第７に、タンパク質の細胞外ドメインと結合するＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３に対する抗体の使用は、Ｗｎｔシグナル伝達を増大し、したがって、Ｗｎｔシグナル伝達の欠乏を治療することを、治療用抗体の公知の投与方法を使用して達成することができる。第８に、Ｒ−スポンジンは、ＺＮＲＦ３とＬＧＲ４間の会合を増大することによってＺＮＲＦ３を阻害することが、本発明者らによってわかったので、一方で、ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３のいずれかと、他方で、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５またはＬＧＲ６と結合する二重特異性抗体を使用して、Ｒ−スポンジンを摸倣し、真核細胞においてＷｎｔシグナル伝達を増大できる。第９に、膜Ｅ３ユビキチンリガーゼＺＮＲＦ３は、Ｒ−スポンジンの分子標的であることが、本発明者らによってわかったので、ＺＮＲＦ３と結合する抗体を使用して、真核細胞のＲ−スポンジンの活性を阻害できる。
【００１９】
ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３は、細胞表面タンパク質である。Ｚｉｎｃ／ＲＩＮＧフィンガータンパク質３（ＺＮＲＦ３、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｑ９ＵＬＴ６、配列番号１）およびＲｉｎｇフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｑ６８ＤＶ７、配列番号２）は、構造的に関連しているＲＩＮＧフィンガータンパク質である。
各タンパク質は、シグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ＲＩＮＧドメイン（非定型ジンクフィンガードメイン）を含有する。
【００２０】
【表１】
2020200332.tif 000002
【００２１】
抗ＺＮＲＦ３抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから市販されている。ＺＮＲＦ３（Ｐ−１５）（製品ｓｃ−８６９５８）は、ヒト起源のＺＮＲＦ３の内部領域（細胞外領域ではなく）内のペプチドマッピングに対して作製された親和性精製されたヤギポリクローナル抗体である。
【００２２】
ＺＮＲＦ３は、これまでに広範囲に特性決定されていないが、ＲＮＦ４３は、Ｓｕｇｉｕｒａらによって、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を有すると実証されている。Sugiura T, Yamaguchi A and Miyamoto K, 「A cancer-associated RING finger protein, RNF43, is an ubiquitin ligase that interacts with a nuclear protein, HAP95.」 Exp. Cell Res. 314(7):1519-28 (15 Apr. 2008)。ＲＮＦ４３はまた、「Genes and polypeptides relating to human colon cancers」と題された米国特許第７，４２５，６１２号に記載されている。
【００２３】
本発明者らは、３種の試験を実施して、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３は、細胞表面タンパク質であることを示した。
【００２４】
第１に、顕微鏡観察によって、ＺＮＲＦ３は、細胞表面膜に局在することが示された。
本発明者らは、一部のＨＥＫ２９３細胞を、ＺＮＲＦ３のＣ末端緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合物を安定に発現するよう、その他のＨＥＫ２９３細胞を、シグナルペプチドが欠失したＺＮＲＦ３−ＧＦＰを安定に発現するよう遺伝子改変した(genetically engineered)した。
【００２５】
本発明者らのトランスフェクションアッセイのために、本発明者らは、短い変異体（ＮＭ＿０３２１７３）と、合成された３００塩基対のＮ末端断片を融合することによって、全長ヒトＺＮＲＦ３  ｃＤＮＡ（ＮＭ＿００１２０６９９８）を作製した。本発明者らは、２段階ＰＣＲによってｓｉＲＮＡ耐性ＺＮＲＦ３  ｃＤＮＡを構築し、ＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧ（アミノ酸２９３〜３３４を失っている）およびＺＮＦ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）膜貫通（ＴＭ）（アミノ酸１〜２５６）を作製するための鋳型として使用した。ｃＤＮＡを、哺乳類発現ベクター中、ＣＭＶプロモーターの制御下にクローニングした。プラスミドを配列決定して、同一性および望ましくない突然変異がないことを確認した。
【００２６】
本発明者らは、標準プロトコルを使用するレトロウイルスまたはレンチウイルス感染によって、種々のコンストラクトを、ＨＥＫ２９３またはＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（登録商標）（ＳＴＦ）リポーターがクローニングされたＨＥＫ２９３細胞（すなわち、ＨＥＫ２９３−ＳＴＦ）細胞中に導入した。
【００２７】
本発明者らのアッセイのための細胞培養のために、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞または誘導体細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。
【００２８】
第２に、本発明者らのＨＥＫ２９３細胞および誘導体細胞株の共焦点顕微鏡解析によって、ＺＮＲＦ３−ＧＦＰが細胞膜上に局在化されるのに対し、シグナルペプチドが欠失したＺＮＲＦ３−ＧＦＰは、細胞質中に拡散的に局在化されることが示された。
【００２９】
第３に、本発明者らは、細胞表面タンパク質ビオチン化アッセイにおける本発明者らの顕微鏡結果を確認した。本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞を、全長ＺＮＲＦ３−ＨＡまたはシグナルペプチドが欠失したＺＮＲＦ３  ΔＳＰ−ＨＡのいずれかとともに、クローニングされたＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（登録商標）（ＳＴＦ）リポーターを用いてトランスフェクトした。
【００３０】
本発明者らの免疫ブロット法および免疫沈降アッセイのために、本発明者らは、以下の方法を使用した：総細胞溶解物を、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を補給した、ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、０．５％  デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を使用して細胞を溶解することにより調製し、続いて、１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。次いで、各溶解物から得た等量のタンパク質（２５〜５０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ブロッキングおよび示された一次抗体とともに４℃で一晩のインキュベーションのためにニトロセルロース膜にトランスファーした。ＨＲＰまたは赤外色素のいずれかとコンジュゲートしている二次抗体を、それぞれ、ＥＣＬフィルム法またはＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナーによるシグナル可視化のために使用した。免疫ブロッティングバンドの定量化は、ＡｌｐｈａＥａｓｅＦＣ（登録商標）ソフトウェアを用いる濃度測定解析によって実施した。免疫共沈降実験のために、細胞を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．８％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含有するバッファーに溶解した。清澄化した細胞溶解物を、示された抗体およびプロテインＧ−セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともに、４℃で一晩インキュベートした。ビーズを溶解バッファーを用いて４回洗浄し、結合しているタンパク質を、免疫ブロット法解析のためにＳＤＳサンプルバッファー中に溶出した。
【００３１】
トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の両セットをビオチン化し、市販されているＰｉｅｒｃｅ（登録商標）細胞表面タンパク質単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、製品番号８９８８１）の使用説明書に従って、ストレプトアビジン(strepavidin)アガロースによって親和性精製した。細胞溶解物（インプット）およびプルダウン溶出液の両方を、市販の抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ）を用いて免疫ブロッティングした。
【００３２】
本発明者らの結果は、シグナルペプチド欠損（ΔＳＰ）突然変異体タンパク質ではなく、ＺＮＲＦ３−ＨＡを、細胞表面タンパク質のビオチン化後のストレプトアビジンプルダウンで回収したということを示した。これらの免疫学的結果によって、ＺＮＲＦタンパク質上の細胞外領域の存在が確認された。
【００３３】
したがって、本発明者らの結果は、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３は、細胞表面上に局在するＥ３ユビキチンリガーゼであることを示す。ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３が、細胞表面上にあるので、その活性は、リガンド結合によって直接的に調節され得、したがって、新薬の開発につながるようなものであり得る。
【００３４】
ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３は、β−カテニンシグナル伝達標的ならびにβ−カテニンおよびＷｎｔシグナル伝達経路の負の制御因子である。総合すると、図１〜図５から得られる本発明者らの結果は、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達標的ならびにβ−カテニンおよびＷｎｔシグナル伝達経路の負の制御因子であることを示す。
【００３５】
第１に、ＺＮＦＲ３およびＲＮＦ４３の発現は、図１に示されるように、正常なＷｎｔシグナル伝達経路を有する細胞においてＷｎｔ３ａコンディショニング培地（ＣＭ）によって誘導される。
【００３６】
本発明者らのＰＣＲアッセイのために、処理細胞から全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉキット（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、Ｔａｑｍａｎ  逆転写試薬（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の使用説明書に従って用いて逆転写した。転写物レベルは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ配列検出システム（登録商標）を使用して評価した。リアルタイムＰＣＲは、０．６μｌの２０Ｘ  Ａｓｓａｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標）混合物（各プライマーについて１８μＭおよびＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブについて５μＭの予備混合濃度）、６μｌの２Ｘ  Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（登録商標）および５．４μｌの希釈ｃＤＮＡ鋳型からなる１２μｌの反応物中で実施した。利用した熱循環状態は、５０℃で２分、９５℃で１０分、続いて、９５℃で１５秒および６０℃で１分間の４０サイクルとした。
【００３７】
本発明者らは、標準化のためにハウスキーピング遺伝子、ＧＵＳＢを用い、比較ΔΔＣＴ法を使用して遺伝子発現解析を実施した。使用したＡｓｓａｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標）試薬は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【００３８】
マウスＬ細胞では、Ｗｎｔ３Ａ処理は、定量的ＰＣＲによって測定されるように、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３発現を、それぞれ、１２．９倍および２．２倍増大した。本発明者らの結果は、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達標的であることを示す。
【００３９】
第２に、ＺＮＦＲ３およびＲＮＦ４３の発現は、図２に示されるように、機能亢進性β−カテニンシグナル伝達を有する結腸直腸がんにおいて増大される。ＺＮＲＦ３発現（図２Ａ）およびＲＮＦ４３発現（図２Ｂ）は両方とも、定量的ＰＣＲ解析によって、上記の方法によって示されるように結腸腺癌細胞において上昇する。
【００４０】
結腸癌は、ＡＰＣタンパク質が末端切断型であるようなＡＰＣ（大腸腺腫症）遺伝子突然変異によって機能亢進されるＷｎｔシグナル伝達を有するとわかっている。ＡＰＣタンパク質は、β−カテニン「破壊複合体」の成分である。したがって、β−カテニンが安定化されるので、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３の発現は誘導される。
【００４１】
第３に、ＳＷ４８０結腸直腸がん細胞株におけるＺＮＲＦ３  ｍＲＮＡ発現は、図３に示されるように、β−カテニンのｓｉＲＮＡ媒介性枯渇の際に下方制御される。
【００４２】
第４に、ＺＮＲＦ３のｓｉＲＮＡノックダウンは、非がん細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を増大する。第５に、ＺＮＲＦ３のドミナントネガティブ突然変異体の発現は、Ｗｎｔシグナル伝達を同様に増大する。
【００４３】
本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞を使用して、ＺＮＲＦ３のｓｉＲＮＡノックダウンが、図４に示されるように、ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（登録商標）（ＳＴＦ）リポーター活性によって測定されるように、Ｗｎｔリポーター活性を大幅に増大することを見出した。空のベクター（ＥＶ）を安定に発現するＨＥＫ２９３−ＳＴＦ細胞、ｓｉＲＮＡ耐性野生型（ＷＴ）ＺＮＲＦ３またはＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧを、対照ｐＧＬ２  ｓｉＲＮＡまたはＺＮＲＦ３  ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、ＳＴＦ活性を測定した。本発明者らのアッセイのために、ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ（登録商標）またはＤｕａｌＧｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、製造業者の使用説明書に従って使用してＳＴＦルシフェラーゼアッセイを実施した。上記のように、ＳＴＦは、Ｗｎｔリポーターアッセイである。図４のアッセイにおいて使用したｓｉＲＮＡコンストラクトは、表２中に列挙されている。
【００４４】
【表２】
2020200332.tif 000003
【００４５】
図４に示されるように、ｓｉＲＮＡ耐性ＺＮＲＦ３の過剰発現は、ＺＮＲＦ３  ｓｉＲＮＡ誘導性ＳＴＦ活性化を無効にした。これらの結果は、ＺＮＲＦ３  ｓｉＲＮＡの効果が狙い通りであることを示す。
【００４６】
本発明者らは、さらに、図４に示されるように、ＲＩＮＧドメインを欠くＺＮＲＦ３突然変異体（ＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧ）の過剰発現が、ＳＴＦ活性を強力に増大することを見出した。ＲＩＮＧドメインを欠く（ΔＲ）ＺＮＲＦ３の過剰発現は、ＳＴＦリポーター活性自体を増大した。重要なことに、これらの効果はまた、外因性Ｗｎｔ３Ａコンディショニング培地添加がない場合にも観察された。
【００４７】
図４における本発明者らの結果を要約すると、ＳＴＦのＺＮＲＦ３  ｓｉＲＮＡ誘導性活性化は、ｓｉＲＮＡ耐性ＺＮＲＦ３によって阻害され、ＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧは、ＳＴＦを増大する。本発明者らの結果はまた、ＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧのドミナントネガティブ機能を示す。
【００４８】
第６に、図５の結果は、ＲＮＦ４３は、ＺＮＲＦ３の機能的同族体であり、したがって、β−カテニンおよびＷｎｔシグナル伝達経路の負のレギュレーターであるということを示す。上記のように、Ｅ３リガーゼＲＮＦ４３は、Ｅ３リガーゼＺＮＲＦ３と高い配列相同性を有する。図５中の結果は、ＲＨＦ４３の発現が、ＺＮＲＦ３  ｓｉＲＮＡの、ＳＴＦリポーター活性に対する効果をレスキューしたことを示す。図５のアッセイにおいて使用したｓｉＲＮＡコンストラクトは、表３に列挙されている。
【００４９】
【表３】
2020200332.tif 000004
【００５０】
野生型ＲＮＦ４３の過剰発現は、ＺＮＲＦ３  ｓｉＲＮＡ誘導性ＳＴＦ活性化を遮断したが、ＲＮＦ４３  ΔＲＩＮＧの過剰発現は、ＳＴＦを増大した。ＲＩＮＧドメインを欠くＲＮＦ４３（ΔＲ）はまた、ＺＮＲＦ３に対するドミナントネガティブ活性を示した。
【００５１】
第７に、ＩＷＰ−２は、Ｗｎｔ分泌を遮断する公知のヤマアラシ（Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ）阻害剤である。Chen B. et al.「Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer.」Nat. Chem. Biol. 5, 100-107 (2009)。本発明者らは、ＩＷＰ２が、外因性Ｗｎｔの不在下で、ＺＮＦＲ３  ｓｉＲＮＡまたはＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧ誘導性β−カテニン蓄積およびＳＴＦ活性化を完全に阻害することを見出した。本発明者らの結果は、ＺＮＲＦ３が、内因性Ｗｎｔタンパク質によって開始されるβ−カテニンシグナル伝達を抑制することを示す。したがって、本発明者らの結果は、ＺＮＲＦ３を、Ｗｎｔシグナル伝達のその他の負の制御因子と区別する。
【００５２】
第８に、生化学的アッセイは、ＺＮＲＦ３が、β−カテニンシグナル伝達を調節する分子機構を示した。空のベクター（ＥＶ）を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞、ｓｉＲＮＡ耐性野生型または突然変異体ＺＮＲＦ３を、対照ｐＧＬ２  ｓｉＲＮＡまたはＺＮＲＦ３  ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした。
【００５３】
本発明者らの免疫ブロットアッセイ結果は、図６に示されている。一次抗体の供給源は、抗ＬＲＰ６、抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＬＲＰ６（Ｓｅｒ１４９０）および抗Ｄｖｌ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＨＡ（Ｒｏｃｈｅ）および抗チューブリン（Ｓｉｇｍａ）である。
【００５４】
免疫ブロットアッセイは、ＺＮＲＦ３  ｓｉＲＮＡを用いる処理またはＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧの過剰発現が、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＬＲＰ６および総ＬＲＰ６のレベルを増大することを示した。図７、レーン１、レーン２およびレーン５を参照のこと。ＺＮＲＦ３  ｓｉＲＮＡの効果は、ｓｉＲＮＡ耐性ＺＮＲＦ３の発現によって遮断された。図７、レーン２およびレーン４を参照のこと。
【００５５】
ＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧのタンパク質発現レベルは、図７において野生型ＺＮＲＦ３と比較してかなり高く、Ｅ３ユビキチンリガーゼであるＺＮＲＦ３と一致し、自己ユビキチン化およびその後の分解に付される。
【００５６】
興味深いことに、ＺＮＲＦ３  ｓｉＲＮＡを用いる処理およびＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧの過剰発現は、セグメント極性タンパク質ディシブルド同族体Ｄｖｌ２リン酸化を増大した。図７、レーン１、レーン２およびレーン５を参照のこと。野生型ＺＮＲＦ３の過剰発現は、Ｄｖｌ２リン酸化を減少させた。図７、レーン１およびレーン３を参照のこと。ディシブルドリン酸化は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ活性化の直接読み取り値であり、ＬＲＰ６活性化に依存しない。MacDonald BT, Tamai K, and He X,「Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases.」 Dev. Cell 17, 9-26 (2009)。したがって、結果は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄの活性はまた、ＺＮＲＦ３によって影響を受けることを示す。
【００５７】
ＺＮＲＦ３阻害の際のＬＲＰ６細胞膜発現の増大は、空のベクター（ＥＶ）またはＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞との抗ＬＲＰ６抗体結合を使用するフローサイトメトリー解析を使用して確認した。
【００５８】
フローサイトメトリーのために、トリプシン不含細胞解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞を回収し、ＦＡＣＳバッファー（１％  ＢＳＡおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）に再懸濁した。ブロッキングした後、細胞を、抗ＬＲＰ６（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）とともに４℃で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファーで十分に洗浄した後、細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて染色し、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターを使用する多チャネル解析に付した。
【００５９】
第９に、本発明者らは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄのレベルまたは活性もまた、ＺＮＲＦ３によって影響を受けることを調べるためにアッセイを実施した。Ｎ末端にＭｙｃタグを付けたＦＺＤ８を作製するために、本発明者らは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ８（ＦＺＤ８）に、シグナルペプチドの直後にＮ末端トリプルＭｙｃエピトープを用いてタグが付けられている遺伝子コンストラクトを作製した。ＺＮＲＦ３に、シグナルペプチドの直後にトリプルＭｙｃエピトープまたはＣ末端血球凝集素（ＨＡ）エピトープを用いてタグを付けた。
【００６０】
Ｎ末端Ｍｙｃタグが付いているＦＺＤ８を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションによって構築した。この細胞株中Ｍｙｃ−ＦＺＤ８のほとんどは、細胞質内にあり、Ｍｙｃ−ＦＺＤ８のわずかな画分のみが、細胞膜に局在化される。
【００６１】
細胞表面タンパク質ビオチン化アッセイは、ＺＮＲＦ３  ｓｉＲＮＡは、総Ｍｙｃ−ＦＺＤ８のレベルに影響を及ぼさず、細胞膜上のＭｙｃ−ＦＺＤ８のレベルを強力に増大することを示した。図７参照のこと。一次抗体の供給源は、抗Ｍｙｃタグ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Technology)および抗チューブリン（Ｓｉｇｍａ）とした。
【００６２】
さらに、フローサイトメトリーによって示されるように、ＺＮＲＦ３  ｓｉＲＮＡおよびＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧが、Ｍｙｃ−ＦＺＤ８の膜レベルを増大したのに対し、野生型ＺＮＲＦ３は減少させた。汎Ｆｒｉｚｚｌｅｄ(pan-Frizzled)抗体を使用して、本発明者らは、内因性Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質の細胞表面レベルが、それぞれ、野生型ＺＮＲＦ３またはＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧの過剰発現の際に減少または増大することを見出した。
【００６３】
総合すると、これらの結果は、ＺＮＲＦ３が細胞膜でのＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰ６のレベルを調節することを示す。
【００６４】
要約すると、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達標的ならびにβ−カテニンおよびＷｎｔシグナル伝達経路の負の制御因子である。
【００６５】
ＺＮＲＦ３に対する抗体をアンタゴナイズすること。ＺＮＲＦ３が、細胞表面に局在化され、保存された細胞外ドメインを含有するので、本発明者らは、精製ＺＮＲＦ３細胞外ドメインおよび標準技術を使用してファージディスプレイベースの抗体パニングを実施して、ＺＮＲＦ３細胞外ドメインと結合し、ＺＮＲＦ３機能を調節する抗体を同定した。
【００６６】
ファージパニングのために、Ｆｃ−ＺＮＲＦ３  ＥＣＤ（細胞外ドメイン、配列番号１のアミノ酸５６〜２１９）タンパク質を使用した。Ｆｃ−ＺＮＲＦ３  ＥＣＤを使用するＥＬＩＳＡによって、断片抗原結合性（Ｆａｂ）クローンをスクリーニングし、ＺＮＲＦ３とのその結合を、ＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を使用するＦＡＣＳ解析によって確認した。
【００６７】
得られた抗体（ＦａｂクローンＡｂ１およびＡｂ２）のうち２種が、外因性Ｗｎｔ３ａ付加がなくともＳＴＦリポーターによって測定されるＷｎｔ刺激活性を示した。さらに、図８は、２種の抗体が、Ｗｎｔ３ａ誘導性ＳＴＦ活性を増進したことを示す。抗体の配列は、配列番号３および配列番号４に（Ａｂ１について）および配列番号５および配列番号６に（Ａｂ２について）規定されている。
【００６８】
【表４】
2020200332.tif 000005
【００６９】
さらに、２種の抗体は、ＬＲＰ６および膜Ｍｙｃ−ＦＺＤ８のレベルを若干増大させた。これらの結果は、ＺＮＲＦ３が、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰ６の膜レベルを減少させることによってＷｎｔシグナル伝達を阻害することをさらに示す。
【００７０】
本発明者らの結果は、２種の抗体が、ＺＮＲＦ３のｓｉＲＮＡノックダウンによって、またドミナントネガティブ突然変異の発現によって上記で示されるようなＺＮＲＦ３の阻害を摸倣することを示す。これらの抗ＺＮＲＦ３抗体は、その活性がＺＮＲＦ３  ｓｉＲＮＡと同様であるので、抗体をアンタゴナイズする。したがって、これらの抗ＺＮＲＦ３抗体は、Ｗｎｔシグナル伝達を増大する抗体をアンタゴナイズする。
【００７１】
さらに、本発明者らは、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓによって提供されたプロトコルに従って親和性成熟によってＡｂ２のＦａｂ変異体を選択した。http://issuu.com/abdserotec/docs/hucal-manual__2nd-ed_-highresで閲覧可能であるHuCAL（登録商標）Antibodies-Technical Manual（2nd Edition, 2010）を参照のこと。手短には、本発明者らは、軽鎖Ａｂ２をコードするプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼを用いて消化して、ＬＣＤＲ３をコードする配列を除去し、ＬＣＤＲ３領域をコードできる長さのランダム配列を有するポリヌクレオチドの形態のＬＣＤＲ３カセットを加え、次いで、プラスミドおよびＬＣＤＲ３カセットを再度ライゲーションして、Ａｂ２の軽鎖の変異体形態を発現できる発現ライブラリーを形成した。このライブラリーを使用して、ＺＮＲＦ３と結合したＡｂ２の変異体Ｆａｂ（変異体軽鎖および非変異体重鎖）を選択した。
【００７２】
同様に、本発明者らは、重鎖Ａｂ２をコードするプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼを用いて消化して、ＨＣＤＲ２をコードする配列を除去し、ＨＣＤＲ２領域をコードできる長さのランダム配列を有するポリヌクレオチドの形態のＨＣＤＲ２カセットを加え、次いで、プラスミドおよびＨＣＤＲ２カセットを再ライゲーションして、Ａｂ２の重鎖の変異体形態を発現できる発現ライブラリーを形成した。このライブラリーのために、使用したプラスミドは、Ａｂ２の変化していない重鎖のＨＣＤＲ１とは異なるＨＣＤＲ１カセットを有していた。このライブラリーを使用して、ＺＮＲＦ３と結合するＡｂ２の変異体Ｆａｂ（変異体軽鎖および非変異体重鎖）を選択した。
【００７３】
軽鎖の親和性成熟のために、ＬＣＤＲ３ドメインを修飾した。したがって、Ａｂ２の軽鎖のＬＣＤＲ３の配列（配列番号３９）は、１Ｆ２（３＿１Ｂ１）（配列番号９３）、２Ａ６（３＿４Ａ１０）（配列番号９９）、２Ｂ７（３＿４Ｇ１）（配列番号１０５）、２Ｂ８（４＿３Ｅ１０）（配列番号１１１）、２Ｃ９（４＿４Ｅ３）（配列番号１１７）、２Ｆ５（３＿４Ａ４）（配列番号１２３）および２Ｇ６（３＿４Ｄ９）（配列番号１２９）を含むＡｂ２の変異体の軽鎖のＬＣＤＲ３とは異なる。
【００７４】
重鎖の親和性成熟のために、ＨＣＤＲ２ドメインを修飾した。したがって、Ａｂ２の重鎖のＨＣＤＲ２の配列（配列番号４１）は、２Ｃ１（２＿３Ａ５）（配列番号１３７）、２Ｄ１（２＿３Ａ７）（配列番号１４３）および２Ｈ２（２＿３Ｈ８）（配列番号１４９）を含むＡｂ２の変異体の重鎖のＨＣＤＲ３とは異なる。
【００７５】
さらに、Ａｂ２の重鎖の配列ＨＣＲ１（配列番号４０）は、重鎖が、配列番号１３６、配列番号１４２および配列番号１４８を含むＡｂ２の重鎖から修飾されているＡｂ２の変異体の重鎖のＨＣＤＲ３とは異なる。
【００７６】
Ａｂ２の変異体の重鎖の一部は、重鎖が、ＩｇＧタンパク質の二量体の四次タンパク質構造と幾分か同様の方法で二量化するのを可能にするペプチドを含有する。http://issuu.com/abdserotec/docs/hucal-manual__2nd-ed_-highresで閲覧可能であるHuCAL（登録商標）Antibodies-Technical Manual(2nd Edition, 2010)を参照のこと。また、www.abdserotec.com/HuCALで、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓの一部門から入手可能な小論文「Choosing the Best HuCAL（登録商標） Antibodies Format」も参照のこと。
したがって、ペプチドを含有する重鎖は、本明細書において「Ｈｃｈ二量体」と呼ばれる。
【００７７】
Ａｂ２の変異体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、親のＡｂ２と同様にか、またはそれより良好に非精製溶解物中のＺＮＲＦ３と特異的に結合する。Ａｂ２変異体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列は、表５に示されている。
【００７８】
【表５−１】
2020200332.tif 000006
【表５−２】
2020200332.tif 000007
【表５−３】
2020200332.tif 000008
【表５−４】
2020200332.tif 000009
【００７９】
本発明者らは、抗ＺＮＲＦ３Ｆａｂ（Ａｂ１およびＡｂ２）をヒトＩｇＧ１  ＬＡＬＡ形式に変換した。変換は、１９  Ｂｌａｃｋｓｔｏｎｅ  Ｓｔｒｅｅｔ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ  ０２１３９にあるＧｅｎｅＷｉｚの商業的に利用可能なサービスを使用して実施した。
【００８０】
図１１の結果は、得られたＩｇＧ（ＩｇＧ−Ａｂ１およびＩｇＧ−Ａｂ２）は、ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（登録商標）（ＳＴＦ）リポーターアッセイによって示されるように、ＺＮＲＦ３アンタゴニスト活性を保持するということを示す。
【００８１】
表６は、ＩｇＧ−Ａｂ１（ｈ＿κ＿ＺＮＲＦ３＿Ａｂ１＿Ｌｃｈおよびｈ＿ＩｇＧ１ｆ＿ＬＡＬＡ＿ＺＮＲＦ３＿Ａｂ１＿Ｈｃｈ）およびＩｇＧ−Ａｂ２（ｈ＿κ＿ＺＮＲＦ３＿Ａｂ２＿Ｌｃｈおよびｈ＿ＩｇＧ１ｆ＿ＬＡＬＡ＿ＺＮＲＦ３＿Ａｂ２＿Ｈｃｈ）のヒト軽鎖およびヒト重鎖の配列を示す。
【００８２】
【表６】
2020200332.tif 000010
【００８３】
抗体製造法。ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３に対する種々の種類の抗体が、以下に記載されるような、特定化された結合を有する抗体を製造する公知の方法によって製造され得る。
【００８４】
定義。特に別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、免疫学の技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【００８５】
用語「抗体」とは、本明細書において、全抗体および任意の抗原結合断片（すなわち。
「抗原結合部分」）またはその一本鎖を含む。天然に存在する抗体は、普通、ジスルフィド結合によって相互接続された、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖を有する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域とともに散剤している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。
【００８６】
用語、抗体の「抗原結合部分」は、本明細書において、所与の抗原（例えば、ＺＮＲＦまたはＲＮＦ４３の細胞外領域）と特異的に結合する能力を保持する、無傷の抗体の１種または複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、無傷の抗体の断片によって実施され得る。用語、抗体の「抗原結合部分」内に包含される結合断片の例として、Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結している２つのＦａｂ断片を含む二価断片、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる(Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)。
【００８７】
Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、ＶＬおよびＶＨ領域対が、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる一価抗体およびその断片を形成する単一タンパク質鎖として製造されるのを可能にする人工ペプチドリンカーによって、組換え法を使用して連結され得る。例えば、Bird et al., Science 242:423-426 (1988)およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883 (1988)を参照のこと。このような一本鎖抗体は、抗体の１種または複数の「抗原結合部分」を含む。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して得られ、断片は、無傷の抗体と同一方法で有用性についてスクリーニングされる。
【００８８】
抗原結合部分はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ(maxibodies)、ミニボディ(minibodies)、細胞内抗体、ダイアボディ、トリアボディ(triabodies)、テトラボディ(tetrabodies)、ｖ−ＮＡＲおよびｂｉｓ−ｓｃＦｖ中に組み込まれ得る。例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23, 9, 1126-1136 (2005)参照のこと。抗体の抗原結合部分が、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づいて足場中にグラフトされ得る。フィブロネクチンポリペプチドモノボディを説明する米国特許第６，７０３，１９９号を参照のこと。
【００８９】
抗原結合部分は、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって、１対の抗原結合領域を形成する１対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む、一本鎖抗体およびその断片中に組み込まれ得る。Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)および米国特許第５，６４１，８７０号参照のこと。
【００９０】
用語「結合特異性」とは、本明細書において、個々の抗体結合部位の唯一の抗原決定基と反応する能力を指す。抗体の結合部位は、抗体またはその断片のＦａｂ部分中に位置し、重鎖および軽鎖の超可変領域から構築される。したがって、本発明は、抗体がＺＮＲＦ３の細胞外ドメインと「特異的に結合する」さまざまな抗体構造および抗体がＲＮＦ４３の細胞外ドメインと「特異的に結合する」さまざまな抗体構造を提供する。
【００９１】
用語「キメラ抗体」とは、（ａ）定常領域またはその一部が、抗原結合部位（可変領域）が、異なるまたは変更されたクラス、エフェクター機能および／もしくは種の定常領域またはキメラ抗体に新規特性を付与する完全に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物などと連結されるよう、変更され、置換され、交換されている、あるいは（ｂ）可変領域またはその一部が、異なるか、または変更された抗原特異性を有する可変領域で変更され、置き換えられ、交換されている、抗体またはその断片を意味する。
例えば、マウス抗体は、その定常領域を、ヒト免疫グロブリン由来の定常領域で置き換えることによって修飾され得る。ヒト定常領域での置き換えによって、キメラ抗体は、元のマウス抗体と比較して、ヒトにおいて低減した抗原性を有しながら、抗原の認識においてその特異性を保持し得る。
【００９２】
用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は、本明細書において、抗原特異性および結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。一般に、各軽鎖可変領域中に３種のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）および各重鎖可変領域中に３種のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）がある。
【００９３】
所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition (Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) (「カバット(Kabat)」番号付け法)によって、またはAl-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273,927-948 (1997)(「コチア(Chothia)」番号付け法)によって記載されるものを含めた、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定され得る。
【００９４】
所与のＣＤＲのアミノ酸配列境界の決定方法の一例が実施され得るので、表７は、Ａｂ１（配列番号３および４）およびＡｂ２（配列番号５および６）の軽鎖および重鎖のＣＤＲを提供する。本発明者らは、www.bioinf.org.uk/abs/でＤｒ．  Ａｎｄｒｅｗ  ＣＲ  Ｍａｒｔｉｎ'ｓ  Ｇｒｏｕｐ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｌｏｎｄｏｎによって提供されたものと同様のアラインメント法を使用して、Ａｂ１およびＡｂ２の軽鎖および重鎖のＣＤＲのカバット配列の最初の決定を行った（配列番号３１〜４２、「最初の」）。ＣＤＲのカバット配列の最初の決定を行うのに有用なその他の情報およびアラインメント法は、http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/でＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇによって、また、http://www.imgt.org/でＴＨＥ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）によって提供される。
【００９５】
表７はまた、カバットの番号付け法によって実施された、Ａｂ１およびＡｂ２の軽鎖および重鎖のＣＤＲの最新の決定（配列番号４３〜５４、「カバット」)を示す。表７は、コチア番号付け法によって実施された、Ａｂ１およびＡｂ２の軽鎖および重鎖のＣＤＲの最新の決定（配列番号５５〜６６、「コチア」)をさらに示す。
【００９６】
【表７−１】
2020200332.tif 000011
【表７−２】
2020200332.tif 000012
【００９７】
さらに、Ａｂ２のＦａｂ変異体のＣＤＲ配列（表５を参照のこと）を、「最初の」決定方法によってカバット配列を決定するための上記の方法を使用して算出した。表８は、軽鎖または重鎖中のＣＤＲ配列およびアミノ酸の位置を示す。
【００９８】
【表８−１】
2020200332.tif 000013
【表８−２】
2020200332.tif 000014
【００９９】
さらに、ＩｇＧ形式の抗ＺＮＲＦ３抗体のＣＤＲ領域を、「最初の」決定方法によってカバット配列を決定するための上記の方法を使用して算出した。表９は、軽鎖または重鎖中の配列およびアミノ酸の位置を示す。
【０１００】
【表９】
2020200332.tif 000015
【０１０１】
用語「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。
特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一または本質的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を、核酸が、アミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列を指す。ポリペプチド配列については、「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸の、化学的に同様のアミノ酸での置換をもたらす、ポリペプチド配列への個々の置換、欠失または付加を含む。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。このような保存的に修飾された変異体は、多型変異体に加えて、多型変異体を排除せず、本発明の種間相同体および対立遺伝子である。以下の８群は、互いの保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照のこと。いくつかの実施形態では、用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴に大幅に影響を与えないか、変更しないアミノ酸修飾を指すよう使用される。
【０１０２】
用語「交差遮断する(cross-block)」、「交差遮断された(cross-blocked)」および「交差遮断している(cross-blocking)」は、抗体またはその他の結合剤の、標準競合結合アッセイにおいてその他のリガンド（Ｒ−スポンジンなど）の結合を干渉する能力を意味するよう本明細書において同義的に使用される。抗体またはその他の結合剤が、別のリガンドの結合を干渉できる能力または程度は、したがって、本発明に従って交差遮断すると言われ得るかどうかは、標準競合結合アッセイを使用して決定され得る。１つの適したアッセイは、Ｂｉａｃｏｒｅ技術（例えば、表面プラズモン共鳴技術を使用して相互作用の程度を測定できるＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００（登録商標）機器（Ｂｉａｃｏｒｅ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を使用することによる）の使用を含む。交差遮断を測定するための別のアッセイは、ＥＬＩＳＡベースのアプローチを使用する。
【０１０３】
用語「エピトープ」とは、抗体と特異的に結合できるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、普通、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、普通、特定の三次元構造特徴ならびに特定の電荷特徴を有する。立体構造および非立体構造エピトープは、前者との結合が変性溶媒の存在下では失われるが、後者との結合は失われない点で区別される。本発明の抗体について、エピトープは、ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３の細胞外ドメインである場合も、細胞外ドメイン上にある場合もある。一実施形態では、エピトープは、脊椎動物ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３、例えば、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、マウスまたはヒトＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３の細胞外ドメイン上にある。より特定の実施形態では、エピトープは、ヒトまたはカニクイザルＺＮＲＦ３もしくはＲＮＦ４３、またはヒトおよびカニクイザル両方のＺＮＲＦ３もしくはＲＮＦ４３の細胞外ドメイン上にある。
【０１０４】
用語「遺伝子改変された(genetically engineered)」とは、組換えＤＮＡ技術の製造および使用ならびに組換えＤＮＡからのポリペプチドの発現によるヒト介入による生物における遺伝物質の構造の変更を指す。組換えＤＮＡの使用およびポリペプチドの発現のための技術は、当業者に公知である。本発明の遺伝子改変された抗体または抗体断片を製造するための技術は、本明細書に提供された参考文献に記載されている。例えば、Bird et al., Science 242:423-426 (1988)およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883 (1988)を参照のこと。また、例えば、Riechmann L et al., Nature 332:323-327 (1998);Jones P et al., Nature 321:522-525 (1986);Queen C et al., Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033 (1989); Winterの米国特許第５，２２５，５３９号およびQueen et al.の米国特許第５，５３０，１０１号、同５，５８５，０８９号、同５，６９３，７６２号および同６，１８０，３７０号も参照のこと。
【０１０５】
用語「ヒト抗体」は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方が、ヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体を含む。さらに、抗体が、定常領域を含有する場合には、定常領域も、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系列配列またはヒト生殖系列配列の突然変異型に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロ(in vitro)でランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボで体細胞突然変異によって導入される突然変異）。
【０１０６】
用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方が、ヒト配列に由来する可変領域を有する単一結合特異性を示す抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞と融合しているヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって製造される。
【０１０７】
「ヒト化」抗体は、ヒトにおいて、より少なく免疫原性でありながら、非ヒト抗体の反応性を保持する抗体である。これは、例えば、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持することおよび抗体の残りの部分をそのヒト対応物（すなわち、可変領域の定常領域ならびにフレームワーク部分）で置き換えることによって達成され得る。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, (1984);Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988);Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, (1988);Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991);およびPadlan, Molec. Immun., 31:169-217 (1994)を参照のこと。ヒト操作技術の別の例は、ＵＳ５，７６６，８８６に開示されたＸｏｍａ技術である。
【０１０８】
用語「単離抗体」とは、異なる抗原特異性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３と特異的に結合する単離抗体は、ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、対象のタンパク質と特異的に結合する単離抗体は、その他の抗原に対する交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、その他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【０１０９】
用語「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によって提供される抗体クラス（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４などのＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＧ）を指す。アイソタイプはまた、Ｆｃ機能を変更するよう、例えば、エフェクター機能またはＦｃ受容体との結合を増進または低減するよう修飾が行われている、これらのクラスの修飾された型を含む。
ＩｇＧ形式の抗ＺＮＲＦ３抗体の例のために、表６を参照のこと。
【０１１０】
用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、本明細書において、単一分子組成の抗体の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープについて単一結合特異性および親和性を示す。
【０１１１】
用語「ベクター」は、連結している別のポリヌクレオチドを輸送できるポリヌクレオチドを指すものとする。
【０１１２】
保存的修飾を有する抗体。特定の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域または両方を有し、これらのＣＤＲ配列のうち１種または複数が、本明細書に記載された抗体に基づいた特定のアミノ酸配列またはその保存的修飾を有し、抗体は、本発明の抗体の所望の機能特性を保持する。配列番号３〜６および本明細書に記載されたＣＤＲ配列、配列番号６７〜８６および本明細書に記載されたＣＤＲ配列および配列番号８７〜９０および本明細書に記載されたＣＤＲ配列を参照のこと。また、表７中の配列番号３１〜６６、表８中の配列番号９１〜１５０および表９中の配列番号１５１〜１６２も参照のこと。
【０１１３】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、免疫学的技術分野において当業者によって理解されるように、ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって配置された３つのＣＤＲ領域を有するポリペプチドであり得る。
【０１１４】
一実施形態では、本発明のこの抗体または抗原結合断片は、（ａ）配列番号３１；配列番号３７  配列番号４３；配列番号４９；配列番号５５；配列番号６１；配列番号９１；配列番号９７；配列番号１０３；配列番号１０９；配列番号１１５；配列番号１２１；配列番号１２７；配列番号１３３；配列番号１３９；配列番号１４５；配列番号１５１または配列番号１５７からなる群から選択されるペプチド配列を有する第１の領域から選択されるペプチド配列を有する第１の領域と、（ｂ）配列番号３２；配列番号３８；配列番号４４；配列番号５０；配列番号５６；配列番号６２；配列番号９２；配列番号９８；配列番号１０４；配列番号１１０；配列番号１１６；配列番号１２２；配列番号１２８；配列番号１３４；配列番号１４０；配列番号１４６；配列番号１５２；または配列番号１５８から選択されるペプチド配列を有する第２の領域と（ｃ）配列番号３３；配列番号３９；配列番号４５；配列番号５１；配列番号５７；配列番号６３；配列番号９３；配列番号９９；配列番号１０５；配列番号１１１；配列番号１１７；配列番号１２３；配列番号１２９；配列番号１３５；配列番号１４１；配列番号１４７；配列番号１５３；または配列番号１５９から選択されるペプチド配列を有する第３の領域を有する。特定の実施形態では、この抗体または抗原結合断片は、前文に記載されるように選択される３つのＣＤＲ領域の、ＣＤＲ領域のペプチド配列を有するポリペプチドのうち少なくとも１種とともに、１種または複数のポリペプチドを有する。より特定の実施形態では、このポリペプチドは、抗体の軽鎖または抗体断片である。
【０１１５】
別の実施形態では、本発明のこの抗体または抗原結合断片は、（ａ）配列番号３４；配列番号４０；配列番号４６；配列番号５２；配列番号５８；配列番号６４；配列番号９４；配列番号１００；配列番号１０６；配列番号１１２；配列番号１１８；配列番号１２４；配列番号１３０；配列番号１３６；配列番号１４２；配列番号１４８；配列番号１５４；または配列番号１６０から選択されるペプチド配列を有する第１の領域と、（ｂ）配列番号３５；配列番号４１；配列番号４７；配列番号５３；配列番号５９；配列番号６５；配列番号９５；配列番号１０１；配列番号１０７；配列番号１１３；配列番号１１９；配列番号１２５；配列番号１３１；配列番号１３７；配列番号１４３；配列番号１４９；配列番号１５５；または配列番号１６１から選択されるペプチド配列を有する第２の領域と、（ｃ）配列番号３６；配列番号４２；配列番号４８；配列番号５４；配列番号６０；配列番号６６；配列番号９６；配列番号１０２；配列番号１０８；配列番号１１４；配列番号１２０；配列番号１２６；配列番号１３２；配列番号１３８；配列番号１４４；配列番号１５０；配列番号１５６；または配列番号１６２から選択されるペプチド配列を有する第３の領域とを有する。特定の実施形態では、この抗体または抗原結合断片は、前文に記載されるように選択される３つのＣＤＲ領域の、ＣＤＲ領域のペプチド配列を有するポリペプチドのうち少なくとも１種とともに、１種または複数のポリペプチドを有する。より特定の実施形態では、このポリペプチドは、抗体の重鎖または抗体断片である。
【０１１６】
さらに別の実施形態では、本発明のこの抗体または抗原結合断片は、（ａ）配列番号３１および配列番号３７からなる群から選択されるペプチド配列を有する第１の領域と、（ｂ）配列番号３２および配列番号３８からなる群から選択されるペプチド配列を有する第２の領域と、（ｃ）配列番号３３および配列番号３９からなる群から選択されるペプチド配列を有する第３の領域とを有する。特定の実施形態では、この抗体または抗原結合断片は、前文に記載されるように選択される３つのＣＤＲ領域の、ＣＤＲ領域のペプチド配列を有するポリペプチドのうち少なくとも１種とともに、１種または複数のポリペプチドを有する。より特定の実施形態では、このポリペプチドは、抗体の軽鎖または抗体断片である。
【０１１７】
さらに別の実施形態では、本発明のこの抗体または抗原結合断片は、（ａ）配列番号３４および配列番号４０からなる群から選択されるペプチド配列を有する第１の領域と、（ｂ）配列番号３５および配列番号４１からなる群から選択されるペプチド配列を有する第２の領域と、（ｃ）配列番号３６および配列番号４２からなる群から選択されるペプチド配列を有する第３の領域とを有する。特定の実施形態では、この抗体または抗原結合断片は、前文に記載されるように選択される３つのＣＤＲ領域の、ＣＤＲ領域のペプチド配列を有するポリペプチドのうち少なくとも１種とともに、１種または複数のポリペプチドを有する。より特定の実施形態では、このポリペプチドは、抗体の重鎖または抗体断片である。
【０１１８】
ＣＤＲ領域の外側である本発明の抗体中のアミノ酸について、本発明の抗体の機能特性を変更することなく保存的アミノ酸置換が行われ得る。
【０１１９】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、本明細書に開示されるＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ２の変異体、ＩｇＧ−Ａｂ１またはＩｇＧ−Ａｂ２から選択される軽鎖または重鎖ポリペプチドと、高度のペプチド配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【０１２０】
一実施形態では、本発明のこの抗体または抗原結合断片は、配列番号３；配列番号５；配列番号６７；配列番号６９；配列番号７１；配列番号７３；配列番号７５；配列番号７７；配列番号７９；配列番号８１；配列番号８３；または配列番号８５から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、この抗体または抗原結合断片は、配列番号３；配列番号５；配列番号６７；配列番号６９；配列番号７１；配列番号７３；配列番号７５；配列番号７７；配列番号７９；配列番号８１；配列番号８３；または配列番号８５から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドのうち少なくとも１種を有する１種または複数のポリペプチドを有する。より特定の実施形態では、このポリペプチドは、抗体の軽鎖またはＦａｂの抗体断片である。
【０１２１】
別の実施形態では、本発明のこの抗体または抗原結合断片は、配列番号４；配列番号６；配列番号６８；配列番号７０；配列番号７２；配列番号７４；配列番号７６；配列番号７８；配列番号８０；配列番号８２；配列番号８４；配列番号８６；配列番号８８；または配列番号９０から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、この抗体または抗原結合断片は、配列番号４；配列番号６；配列番号６８；配列番号７０；配列番号７２；配列番号７４；配列番号７６；配列番号７８；配列番号８０；配列番号８２；配列番号８４；配列番号８６；配列番号８８；または配列番号９０から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドのうち少なくとも１種を有する１種または複数のポリペプチドを有する。より特定の実施形態では、このポリペプチドは、抗体の重鎖またはＦａｂの抗体断片である。
【０１２２】
一実施形態では、本発明のこの抗体または抗原結合断片は、配列番号８７または配列番号８９から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、この抗体または抗原結合断片は、配列番号８７または配列番号８９から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドのうち少なくとも１種を有する１種または複数のポリペプチドを有する。より特定の実施形態では、このポリペプチドは、抗体の軽鎖またはＩｇＧの抗体断片である。
【０１２３】
別の実施形態では、本発明のこの抗体または抗原結合断片は、配列番号８８または配列番号９０から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、この抗体または抗原結合断片は、配列番号８８および配列番号９０から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドのうち少なくとも１種を有する１種または複数のポリペプチドを有する。より特定の実施形態では、このポリペプチドは、抗体の重鎖またはＩｇＧの抗体断片である。
【０１２４】
同一エピトープと結合する抗体。本発明は、ＺＮＲＦ２３およびＲＮＦ４３と結合する抗体を提供する。したがって、さらなる抗体は、結合アッセイにおいて本発明の抗体と交差競合する（例えば、統計的に有意な方法で、結合を競合的に阻害する）その能力に基づいて同定され得る。本明細書において、抗体は、競合抗体が、１０６×ＫＤの競合抗体より高い競合抗体濃度の存在下で、本発明の抗体の結合を５０％超阻害する場合に、結合について「競合する」。
【０１２５】
遺伝子改変され、修飾された抗体。本発明の抗体は、修飾される抗体を操作するための出発材料として本明細書に示されるＶＨおよび／またはＶＬ配列のうち１種または複数を有する抗体を使用してさらに調製され得、修飾された抗体は、出発抗体から変更された特性を有し得る。実施され得る可変領域操作の１つの種類として、ＣＤＲグラフティングがある。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体−抗原相互作用に関与しているので、異なる特性を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列上にグラフトされた特定の天然に存在する抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然に存在する抗体の特性を摸倣する組換え抗体を発現させることが可能である。例えば、Riechmann L et al., Nature 332:323-327 (1998);Jones P et al., Nature 321:522-525 (1986); Queen C et al., Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033 (1989); Winterの米国特許第５，２２５，５３９号およびQueen et al.の米国特許第５，５３０，１０１号、同５，５８５，０８９号、同５，６９３，７６２号および同６，１８０，３７０号を参照のこと。このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベースまたは公開された参考文献から得られる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース中に見出すことができる。Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication No. 91-3242 (U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda MD, 1991); Tomlinson IM et al., J. fol. Biol. 227:776-798 (1992);およびCox JPL et al., Eur. J Immunol. 24:827-836 (1994)を参照のこと。
【０１２６】
抗原−結合ドメインを、代替フレームワークまたは足場中にグラフトすること。さまざまな抗体／免疫グロブリンフレームワークまたは足場は、得られるポリペプチドが、ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３と特異的に結合する少なくとも１種の結合領域を含む限り、使用され得る。このようなフレームワークまたは足場は、ヒト免疫グロブリンの５種の主なイディオタイプまたはその断片を含み、好ましくは、ヒト化態様を有するその他の動物種の免疫グロブリンを含む。ラクダ科動物において同定されたものなどの単一重鎖抗体は、これに関して特に注目される。
【０１２７】
一態様では、本発明は、本発明のＣＤＲがグラフトされ得る非免疫グロブリン足場を使用して非免疫グロブリンベースの抗体を作製することに関する。既知または将来の非免疫グロブリンフレームワークおよび足場が、それらが、標的タンパク質（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３）に特異的な結合領域を含む限り使用され得る。既知非免疫グロブリンフレームワークまたは足場として、それだけには限らないが、フィブロネクチン(CompoundTherapeutics, Inc., Waltham、MA)、アンキリン(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis， Ltd., Cambridge, MA, and Ablynx nv, Zwijnaarde, Belgium)、リポカリン(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、小モジュラー免疫医薬(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)、マキシボディ(Avidia, Inc., Mountain View, CA)、プロテインＡ(Affibody AG, Sweden)およびアフィリン(γ−クリスタリンまたはユビキチン)(Scil Proteins GmbH, Halle、Germany)が挙げられる。
【０１２８】
アビマー(Avimers)は、ＬＲＰ−１などのタンパク質を含有する天然Ａ−ドメインに由来する。これらのドメインは、元々、タンパク質−タンパク質相互作用のために使用され、ヒトでは、２５０種を超えるタンパク質が構造的にＡドメインに基づいている。アビマーは、アミノ酸リンカーによって（２−１０）連結しているいくつかの異なる「Ａ−ドメイン」モノマーからなる。例えば、米国特許出願第２００４／０１７５７５６号、同２００５／００５３９７３号、同２００５／００４８５１２号および同２００６／０００８８４４号に記載された方法論を使用して標的抗原と結合できるアビマーが作製され得る。
【０１２９】
アフィボディ(Affibody)親和性リガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのうち１種の足場に基づく３つのヘリックス束からなる小さい、単純なタンパク質である。プロテインＡは、細菌スタフィロコッカス・アウレウス(staphylococcus aureus)に由来する表面タンパク質である。この足場ドメインは、５８個のアミノ酸からなり、そのうち１３個が無作為化されて、多数のリガンド変異体を有するアフィボディライブラリーを作製する。例えば、米国特許第５，８３１，０１２号を参照のこと。抗体の通常の分子量は、約１５０ｋＤａであるのに対し、アフィボディ分子ミミック抗体は、約６ｋＤａの分子量を有する。
【０１３０】
ヒトまたはヒト化抗体。本発明は、ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３タンパク質（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３）と特異的に結合する完全ヒト抗体を提供する。キメラまたはヒト化抗体と比較して、本発明のヒトＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３結合性抗体は、ヒト対象に投与された場合に抗原性をさらに低減した。
【０１３１】
ヒトＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３結合性抗体は、当技術分野で公知の方法を使用して作製され得る。例えば、非ヒト抗体を、遺伝子改変されたヒト抗体に変換するために使用されるヒューマニアリング(humaneering)技術。米国特許公報第２００５／０００８６２５号には、非ヒト抗体のものに対して同じものを維持しながら、またはより良好な結合特徴をもたらしながら、非ヒト抗体可変領域を抗体中のヒト可変領域で置き換えるためのインビボ法が記載されている。さらに、ヒトＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３結合性抗体はまた、通常、ヒト抗体を製造する会社、例えば、ＫａｌｏＢｉｏｓ，  Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）から商業的に入手され得る。
【０１３２】
ラクダ科動物抗体。ラマ種（ラマ(Lama glama)、アルパカ(Vicugna pacos)およびビクーニャ(Vicugna vicugna)）などの新世界メンバー(new world members)を含めた、ラクダおよびヒトコブラクダ(フタコブラクダ(Camelus bactrianus)およびヒトコブラクダ(Camelus dromaderius)）ファミリーのメンバーから得られる抗体タンパク質は、大きさ、構造の複雑性およびヒト対象に対する抗原性に関して特性決定されている。哺乳類のこのファミリーから得られる特定のＩｇＧ抗体は、天然に見られるように、軽鎖を欠き、したがって、その他の動物から得られる抗体の２つの重鎖および２つの軽鎖を有する通常の４鎖の四次構造とは構造的に異なっている。１９９４年３月３日に公開された国際特許出願ＷＯ９４／０４６７８を参照のこと。ＶＨＨと同定された小さい単一可変ドメインであるラクダ科動物抗体の領域は、標的に対して高親和性を有する小タンパク質を生じるよう遺伝子工学によって得ることができ、「ラクダ科動物ナノボディ」として知られる低分子量抗体由来タンパク質をもたらす。１９９８年６月２日に発行された米国特許第５，７５９，８０８号を参照のこと。また、Stijlemans B et al., J Biol Chem 279: 1256-1261 (2004);Dumoulin M et al., Nature 424: 783-788 (2003);Pleschberger M et al. Bioconjugate Chem 14: 440-448 (2003);Cortez-Retamozo V et al., Int J cancer 89: 456-62 (2002);およびLauwereys M et al., EMBO J 17: 3512-3520 (1998)も参照のこと。ラクダ科動物抗体および抗体断片の操作されたライブラリーは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている。非ヒト起源のその他の抗体と同様に、ラクダ科動物抗体のアミノ酸配列は、ヒト配列とより密接に似ている配列を得るよう組換えによって変更され得る、すなわち、ナノボディは、「ヒト化」され得る。したがって、ヒトに対するラクダ科動物抗体の天然低抗原性は、さらに低減され得る。
【０１３３】
本発明の抗体を製造する方法。いくつかの実施形態では、哺乳類宿主細胞は、本発明の抗体を発現し、製造するために使用される。例えば、それらは、内在性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株または外因性発現ベクターを有する哺乳類細胞株のいずれかであり得る。これらは、任意の正常な致死または正常なまたは異常な不死動物またはヒト細胞を含む。例えば、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマを含めた、無傷の免疫グロブリンを分泌できるいくつかの適した宿主細胞株が開発されている。ポリペプチドを発現させるための哺乳類組織細胞培養の使用は、例えば、Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987)に全般的に論じられている。哺乳類宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーターおよびエンハンサーなどの発現制御配列を含み得る。例えば、Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68 (1986)を参照のこと、およびリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列などの必須プロセシング情報部位。これらの発現ベクターは、普通、哺乳類遺伝子に由来するか、または哺乳類ウイルスに由来するプロモーターを含有する。適したプロモーターは、構成、細胞種特異的、段階特異的および／または調節可能または制御可能であり得る。有用なプロモーターとして、それだけには限らないが、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ  ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト最初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーターおよび当技術分野で公知のプロモーター−エンハンサーの組み合わせが挙げられる。
【０１３４】
本発明のモノクローナル抗体の作製。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体法、例えば、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)の標準体細胞ハイブリダイゼーション技術を含めた種々の技術によって製造され得る。モノクローナル抗体を製造する多数の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発がん性形質転換が使用され得る。
【０１３５】
ハイブリドーマを調製するための動物システムは、マウスシステムである。マウスにおけるハイブリドーマ製造は、十分に確立された手順である。免疫処置プロトコルおよび融合のための免疫処置された脾細胞の単離のための技術は、当技術分野で公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順も公知である。
【０１３６】
本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製され得る。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、標準分子生物学技術を使用して、対象とするマウスハイブリドーマから得られ、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するよう操作され得る。例えば、キメラ抗体を作製するために、マウス可変領域を、当技術分野で公知の方法を使用してヒト定常領域と連結してもよい。例えば、Cabilly et al.の米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと。ヒト化抗体を作製するために、マウスＣＤＲ領域が、当技術分野で公知の方法を使用してヒトフレームワーク中に挿入され得る。例えば、Winterの米国特許第５，２２５，５３９号ならびにQueen et al.の米国特許第５，５３０，１０１号、同５，５８５，０８９号、同５，６９３，７６２号および同６，１８０，３７０号を参照のこと。
【０１３７】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３に対して向けられたこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウスシステムではなくヒト免疫システムの一部を保持する、トランスジェニックまたは染色体導入マウス（transchromosomic mice)を使用して作製され得る。これらのトランスジェニックおよび染色体導入マウスとして、本明細書において、それぞれ、ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと呼ばれ、まとめて本明細書において「ヒトＩｇマウス」と呼ばれるマウスが挙げられる。
【０１３８】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，  Ｉｎｃ．）は、再配列されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびк軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活化するターゲッティングされた突然変異と一緒に含有する。例えば、Lonberg, et al., Nature 368(6474): 856-859 (1994)を参照のこと。したがって、マウスは、免疫処置に応じてマウスＩｇＭまたはκの発現の低減を示し、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを生じる。Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101 (1994);Lonberg, N. and Huszar, D.、Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 (1995)およびHarding, F. and Lonberg, N., Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546 (1995)。ＨｕＭＡｂマウスの調製および使用ならびにこのようなマウスによって保持されるゲノム修飾は、Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20:6287-6295 (1992);Chen, J. et at., International Immunology 5: 647-656 (1993);Tuaillon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724 (1993); Choi et al., Nature Genetics 4:117-123 (1993); Chen, J. et al., EMBO J. 12: 821-830 (1993);Tuaillon et al., J. Immunol. 152:2912-2920 (1994);Taylor, L. et al.， International Immunology 579-591 (1994);およびFishwild, D. et al.， Nature Biotechnology 14: 845-851 (1996)にさらに記載されている。すべてLonbergおよびKayのさらなる米国特許第５，５４５，８０６号；同５，５６９，８２５号；同５，６２５，１２６号；同５，６３３，４２５号；同５，７８９，６５０号；同５，８７７，３９７号；同５，６６１，０１６号；同５，８１４，３１８号；同５，８７４，２９９号；および同５，７７０，４２９号; Surani et al.の米国特許第５，５４５，８０７号；すべてLonbergおよびKayのＰＣＴ公開番号ＷＯ９２１０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７１１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２；およびKorman et al.のＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／１４４２４も参照のこと。
【０１３９】
別の実施形態では、本発明のヒト抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を保持するマウスなどの、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を保持するマウスを使用して産生され得る。本明細書において「ＫＭマウス」と呼ばれるこのようなマウスは、Ishida et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に詳細に記載されている。
【０１４０】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスジェニック動物システムは、当技術分野で利用可能であり、本発明の抗体を産生させるために使用され得る。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と呼ばれる代替トランスジェニックシステムが使用され得る。このようなマウスは、例えば、Kucherlapati et al.の米国特許第５，９３９，５９８号；同６，０７５，１８１号；同６，１１４，５９８号；同６，１５０，５８４号および同６，１６２，９６３号に記載されている。
【０１４１】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替の染色体導入動物システムが、当技術分野では利用可能であり、本発明の抗体を産生させるために使用され得る。例えば、「ＴＣマウス」と呼ばれるヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両方を保持するマウスが使用され得、このようなマウスは、Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727 (2000)に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を保持するウシが、当技術分野で記載されており、本発明の抗体を産生させるために使用され得る。Kuroiwa et al., Nature Biotechnology 20:889-894 (2002)。
【０１４２】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためにファージディスプレイ法を使用して調製され得る。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法が、当技術分野では確立されており、または以下の実施例において記載されている。例えば、Ladner et al.の米国特許第５，２２３，４０９号；同５，４０３，４８４号；および同５，５７１，６９８号；Dower et al.の米国特許第５，４２７，９０８号および同５，５８０，７１７号；McCafferty et al.の米国特許第５，９６９，１０８号および同６，１７２，１９７号；ならびにGriffiths et al.の米国特許第５，８８５，７９３号；同６，５２１，４０４号；同６，５４４，７３１号；同６，５５５，３１３号；同６，５８２，９１５号および同６，５９３，０８１号を参照のこと。
【０１４３】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫処置の際にヒト抗体反応が生じ得るよう、ヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを使用して調製され得る。このようなマウスは、例えば、Wilson et al.の米国特許第５，４７６，９９６号および同５，６９８，７６７号に記載されている。
【０１４４】
フレームワークまたはＦｃ操作。本発明の操作された抗体として、例えば、抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾が行われたものが挙げられる。通常、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低減するために行われる。例えば、１つのアプローチは、１つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰突然変異」することである。より詳しくは、体細胞突然変異を受けた抗体は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列に対して比較することによって同定され得る。フレームワーク領域配列をその生殖系列立体配置に戻すために、例えば、位置指定突然変異誘発によって、体細胞突然変異が、生殖系列配列に「復帰突然変異」され得る。このような「復帰突然変異された」抗体もまた、本発明によって包含されるものとする。
【０１４５】
別の種類のフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内の、またはさらに１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の１個または複数の残基を突然変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって、抗体の潜在的な免疫原性を低減することを含む。このアプローチはまた、「脱免疫化」と呼ばれ、Carr et al.の米国特許公報第２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。
【０１４６】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われた修飾に加え、またはその代替として、本発明の抗体は、通常、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞性細胞毒性などの抗体の１つまたは複数の機能特性を変更するために、Ｆｃ領域内の修飾を含むよう操作され得る。さらに、本発明の抗体は、やはり、抗体の１つまたは複数の機能特性を変更するために、そのグリコシル化を変更するために、化学的に修飾され得る（例えば、１つまたは複数の化学的部分が、抗体と結合され得る）または修飾され得る。これらの実施形態の各々は、以下にさらに詳細に記載されている。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、カバットのＥＵ指数のものである。
【０１４７】
一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基数が変更される、例えば、増大されるか、低減されるよう修飾される。このアプローチは、Bodmer et al.の米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基数が、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリーを促進するために、または抗体の安定性を増大もしくは低減するために変更される。
【０１４８】
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域が、抗体の生物学的半減期を低減するために突然変異される。より詳しくは、１種または複数のアミノ酸突然変異が、抗体が、天然のＦｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合に対して、損なわれたブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を有するよう、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域中に導入される。このアプローチは、Ward et al.の米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載されている。
【０１４９】
別の実施形態では、抗体は、生物学的半減期を増大するために修飾される。種々のアプローチが可能である。例えば、Wardの米国特許第６，２７７，３７５号に記載されるように、以下の突然変異のうち１つまたは複数が、導入され得る：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４ＳおよびＴ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を増大するために、Presta et al.の米国特許第５，８６９，０４６号および同６，１２１，０２２号に記載されるように、抗体が、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取られるサルベージ受容体結合性エピトープを含有するよう、ＣＨ１またはＣＬ領域内で変更されてもよい。
【０１５０】
さらにその他の実施形態では、少なくとも１個のアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基と置き換え、抗体のエフェクター機能を変更することによって、Ｆｃ領域が変更される。
例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対して変更された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力は保持するよう、１個または複数のアミノ酸が異なるアミノ酸残基で置き換えられ得る。親和性が変更されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、両方ともWinter et al.による米国特許第５，６２４，８２１号および同５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載されている。
【０１５１】
別の実施形態では、抗体が、変更されたＣ１ｑ結合および／または低減されたか、もしくは無効にされた補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を有するよう、アミノ酸残基から選択される１種または複数のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基で置き換えられ得る。このアプローチは、Idusogie et al.の米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。
【０１５２】
別の実施形態では、１個または複数のアミノ酸残基が変更され、それによって、抗体の補体を固定する能力が変更される。このアプローチは、Bodmer et al.のＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１にさらに記載されている。
【０１５３】
さらに別の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体の、抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増大するよう、および／または、１個もしくは複数のアミノ酸を修飾することによってＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増大するよう修飾される。
このアプローチは、PrestaによるＰＣＴ公開ＷＯ００／４２０７２にさらに記載されている。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対する、ヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、結合が改善された変異体が記載されている。Shields RL et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)を参照のこと。
【０１５４】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化抗体が作製され得る(すなわち、抗体がグリコシル化を欠く)。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増大するよう変更され得る。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つまたは複数の部位を変更することによって達成され得る。例えば、１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらし、それによって、その部位でのグリコシル化を排除するために１つまたは複数のアミノ酸置換が行われ得る。このような非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増大し得る。このようなアプローチは、Co et al.の米国特許第５，７１４，３５０号および同６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されている。
【０１５５】
さらに、またはあるいは、低減した量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体または増大した二分性ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体などの、変更された種類のグリコシル化を有する抗体が作製され得る。このような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増大すると実証されている。このような炭水化物修飾は、例えば、変更されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることによって達成され得る。変更されたグリコシル化機構を有する細胞は、当技術分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それによって、変更されたグリコシル化を有する抗体を製造する宿主細胞として使用され得る。例えば、Hang et al.のEP1,176,195には、フコシルトランスフェラーゼをコードする、機能的に撹乱されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株が記載されており、その結果、このような細胞株において発現された抗体は、低フコシル化を示す。PrestaによるＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５には、フコースをＡｓｎ（２９７）連結炭水化物に結合し、また、その宿主細胞において発現された抗体の低フコシル化をもたらす能力が低下した、変異体ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞が記載されている。Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 277:26733-26740 (2002)も参照のこと。Umana et al.の国際特許出願ＷＯ９９／５４３４２には、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するよう操作された細胞株が記載されており、その結果、操作された細胞株において発現された抗体が、二分性ＧｌｃＮａｃ構造の増大を示し、これが抗体のＡＤＣＣ活性の増大をもたらす。Umana et al., Nat. Biotech. 17:176-180 (1999)も参照のこと。
【０１５６】
ＺＮＲＦ３の阻害は、インビボでＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を増進し、Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達を撹乱する。Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質は、Ｗｎｔ／β−カテニンおよびＷｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達の両方に必要であり、ＺＮＲＦ３の阻害は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質の膜レベルを高める。したがって、ＺＮＲＦ３の阻害は、Ｗｎｔ／β−カテニンおよびＷｎｔ／ＰＣＰグナル伝達の両方を促進すると予測される。本発明者らは、モデル生物においてこの仮説を調べた。
【０１５７】
第１に、ゼブラフィッシュ胚における野生型ＺＮＲＦ３ではないＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧの過剰発現は、前方神経(anterioneural)構造の喪失、最も顕著には失明をもたらした。前方神経外胚葉におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の抑制は、原腸陥入の間の初期神経パターン形成にとって重要な工程であり、β−カテニンシグナル伝達の異所性活性化は、前方神経構造の喪失をもたらす。
【０１５８】
ゼブラフィッシュは、標準法を使用して維持した。Nusslein-Volhard C and Dahm R Zebrafish. A practical approach. (Oxford University Press, UK, 2002)、Westerfield M The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). (University of Oregon Press, Eugene, OR, 1995)。
【０１５９】
インビトロ転写を実施して、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、鋳型としてヒトＺＮＲＦ３、ＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧを含有する直線化したプラスミドおよびＧＦＰコード配列を使用して、キャップドｍＲＮＡを合成した。ゼブラフィッシュのために、１〜２細胞段階で、２００ｐｇのＺＮＲＦ３  ＷＴ  ｍＲＮＡまたは４００ｐｇのＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧ  ｍＲＮＡを胚に注入した。
【０１６０】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために、示された段階の胚を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で一晩固定化した。ＤＩＧ標識したアンチセンスプローブを作製し、標準的プロトコルに従って使用した。Nusslein-Volhard C and Dahm R, Zebrafish. A practical approach.(Oxford University Press， UK， 2002)。
【０１６１】
細胞追跡による運動の解析を、Gerdes et al., Nature Genetics  39, 1350 (2007)によって先に記載されたように実施した。手短には、１ｎＬの１０，０００ＭＷ  デキストランコンジュゲートＡｌｅｘａ  ４８８系統トレーサー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、２５６細胞段階の細胞の真下の卵黄に注入した。背側領域中に蛍光クローンを有する胚を、胚の正中線への細胞運動について観察し、前後軸にそって拡大した。同一胚の３０％被包期、シールド期および７５％被包期で生存画像が撮れた。
【０１６２】
第２に、アフリカツメガエル胚におけるＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧの過剰発現は、軸複製および動物キャップにおけるβ−カテニン標的遺伝子の発現の増大につながった。
【０１６３】
アフリカツメガエル胚を使用する実験は、これまでに記載されるとおりとした。Goentoro L and Kirschner MW, 「Evidence that fold-change, and not absolute lebel, of beta-catenin dictates Wnt signaling.」 Mol. Cell 36, 872-884 (2009)。
【０１６４】
インビトロ転写を実施して、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、鋳型として、ヒトＺＮＲＦ３、ＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧを含有する直線化したプラスミドおよびＧＦＰコード配列を使用して、キャップドｍＲＮＡを合成した。
アフリカツメガエルのために、２００ｐｇのＺＮＲＦ３  ＷＴまたはＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧ  ｍＲＮＡのいずれか、ならびにＧＦＰ対照ｍＲＮＡを、周辺帯に、４細胞期胚中の２つの卵割球に注入した。
【０１６５】
アフリカツメガエルＺｎｒｆ３の発現パターンを分析するために、種々の段階で胚から全ＲＮＡを抽出した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用して、このｃＤＮＡで定量的ＰＣＲを実施した。使用したプライマーは、ZNRF3 5'-GATGGAGAGGAGCTGAGAGTCATTC-3'（フォワード）（配列番号１７）；5'-GATAACTCGCTGTTGCTGCTG-3'（リバース）（配列番号１８）；H4 histone 5'-CGGGATAACATTCAGGGTA-3'（フォワード）（配列番号１９）；5'-TCCATGGCGGTAACTGTC-3'（リバース）（配列番号２０）であった。サンプルを、内部対照としてのＨ４ヒストンに対して標準化した。アフリカツメガエル動物キャップを用いるＲＴ−ＰＣＲのために、ｍＲＮＡを２細胞期の両卵割球の動物極に注入した。動物キャップは、段階８．５で単離し、RT-PCRのために段階10.5まで培養した。使用したプライマーは、Ｓｈｉａｍｏｉｓ、5'-CTCCAGCCACCAGTACCAGATC-3'（フォワード）（配列番号２１）；5'-GGGGAGAGTGGAAAGTGGTTG-3'（リバース）（配列番号２２）；Xnr3、5'-TCCACTTGTGCAGTTCCACAG-3'（フォワード）（配列番号２３）；5-ATCTCTTCATGGTGCCTCAGG-3'（リバース）（配列番号２４）；およびElf1alpha、5-CAGATTGGTGCTGGATATGC-3'（フォワード）（配列番号２５）、5'-ACTGCCTTGATGACTCCTAG-3'（リバース）（配列番号２６）であった。
【０１６６】
ゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエルアッセイから得た本発明者らの結果をまとめると、本発明者らは、ＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧによる過剰のβ−カテニンシグナル伝達と関連している通常の表現型の誘導は、ＺＮＲＦ３が、インビボでＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を抑制することを示すことを見出した。正常な原腸陥入には、ＰＣＰシグナル伝達アウトプットの正確な調節が必要であり、増大したか、または低減したＰＣＰシグナル伝達のいずれかが、収斂伸長運動を撹乱する。興味深いことに、ゼブラフィッシュ胚における野生型ＺＮＲＦ３またはＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧの過剰発現は、ｍｙｏＤおよびｐｃｄｈ８に対するリボプローブを用いて染色することによって判断される、短い体軸および広い体節などの収斂伸長欠陥の表現型特徴をもたらした。野生型ＺＮＲＦ３の過剰発現は、軸の二分岐を頻繁に引き起こし、興味深いことに、ドミナントネガティブＦｒｉｚｚｌｅｄの過剰発現によって同一表現型も生じた。Nasevicius A. et al.「Evidence for a frizzled-mediated wnt pathway required for zebrafish dorsal mesoderm formation.」 Development 125, 4283-4292 (1998)。
【０１６７】
すべての観察された表現型が、収斂伸長欠陥と一致し、ＺＮＲＦ３の活性を混乱させることが、原腸陥入運動に影響を及ぼすことを示す。これは、蛍光系統追跡実験において確認される。対照胚では、細胞は、背側正中線上に収束する。対照的に、野生型ＺＮＲＦ３またはＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧのいずれかを過剰発現する細胞は、それらが正常に正中線に向かって収束しなかったので、欠陥のある背外側運動を示した。
【０１６８】
第３に、マウスにおけるＺＮＲＦ３の機能を研究するために、本発明者らは、Ｚｎｒｆ３ノックアウトマウスを構築し、ノックアウト突然変異をＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドに戻し交雑した。Ｚｎｒｆ３欠損胚は、誕生前後に死滅した。
【０１６９】
ターゲッティングベクターでは、ＲＩＮＧドメインをコードするエキソン７は、２つのｌｏｘＰ部位によって両側が隣接している。直線化したターゲッティングベクターを、１２９／ＳｖＪ  ＥＳ細胞にエレクトロポレーションし、Ｇ４１８耐性ＥＳクローンを最初にネステッドＰＣＲによってスクリーニングし、次いで、サザンブロット解析に付した。
ゲノムＤＮＡを、ＸｍｎＩまたはＢｇｌＩＩ制限酵素を用いて消化し、それぞれ、５’および３’相同領域の外側に位置するプローブとハイブリダイズした。ＥＳクローン５Ａ７を胚盤胞注入に使用し、キメラの雄を、Ｃ５７ＢＬ／６ＪバックグラウンドのＣＲＥデリーター（ｄｅｌｅｔｅｒ）マウスと交配した。エキソン７のｃｒｅ媒介性欠失を有するＦ１マウスを、ＰＣＲによって同定し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドでさらに戻し交雑し、その後、ヘテロ接合性マウスと交雑させて、ホモ接合性マウス/胚を得た。野生型、ヘテロ接合性およびホモ接合性マウスを、以下のプライマーを用いる「マルチプレックス」ＰＣＲによって同定した：ＮＥＯ（Ｔ、フォワード）5'-TATCATGGTCTGTATACCGGGATCG-3'（配列番号２７）；＃５２３（Ｅ、フォワード）：5'-CATACTTTGGGCTCATGAGCAAGC-3'（配列番号２８）；＃５２１（Ｅ、Ｔ、リバース）：5'-GCAGGTATACATTACCACACCC-3'（配列番号２９）。Ｚｎｒｆ３欠損マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドに交雑させた。Ｚｎｒｆ３−／−マウス胚および野生型同腹子対照を、ヘテロ接合性の親の定時交配によって作製した。示された胚段階で、妊娠した雌を屠殺し、４％パラホルムアルデヒド中、４℃で一晩固定化した後に、画像処理または組織学のために胚を切断して取り出した。胚の遺伝子型を、卵黄嚢から抽出したゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲ遺伝子型解析によって決定した。エタノールの勾配シリーズ(gradient serials)で脱水した後、水平切片法のために、胚を頂部にパラフィン包埋し、スライドをヘマトキシリンおよびエオシンによって染色した。Ｅ９．５マウス胚を用いる全載ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、Ｅｘｉｑｏｎ製の２５ｎＭ二重ＤＩＧ標識ロックド核酸（ＬＮＡ）プローブを使用する標準プロトコルに従って実施した。マウスＡｘｉｎ２プローブ配列：TCTCTAACATCCACTGCCAGA（配列番号３０）。
【０１７０】
Ｚｎｒｆ３ヌル胚のほとんどの注目すべき表現型は、レンズ形成を欠く。β−カテニン標的遺伝子Ａｘｉｎ２の発現は、Ｅ９．５  Ｚｎｒｆ３ヌル胚の眼領域において大幅に高められたので、この表現型は、レンズ発生の際の機能亢進性β−カテニンシグナル伝達による可能性が高い。
【０１７１】
表面外胚葉におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の抑制が、レンズ発生にとって重要であることが知られている。眼におけるβ−カテニンシグナル伝達の異所性活性化は、レンズ形成を遮断し、β−カテニンの眼特異的欠失が、異所性レントイド体の形成につながる。Smith AN, Miller LA, Song N, Taketo MM, and Lang RA, 「The duality of beta-catenin function: a requirement in lens morphogenesis and signaling suppression of lens fate in periocular ectoderm.」Dev. Biol. 285, 477-489 (2005); Kreslova J et al.「Abnormal lens morphogenesis and ectopic lens formation in the absence of beta-catenin function.」Genesis. 45, 157-168 (2007);Machon O et al.「Lens morphogenesis is dependent on Pax6-mediated inhibition of the canonical Wnt/beta-catenin signaling in the lens surface ectoderm.」Genesis. 48, 86-95 (2010).
【０１７２】
Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達は、神経板の折りたたみ狭小化の際の細胞運動にとって重要であり、Ｆｒｉｚｚｌｅｄおよびディシブルド欠損マウスは、神経管閉鎖欠損を示すと知られている。Wang Y, Guo N and Nathans J, The role of Frizzled3 and Frizzled6 in neural tube closure and in the planar polarity of inner-ear sensory hair cells. J. Neurosci. 26, 2147-2156 (2006); Yu H et al. 「Frizzled 1 and frizzled 2 genes function in palate, ventricular septum and neural tube closure: general implications for tissue fusion processes.」 Development 137, 3707-3717 (2010);Wang J et al.「Dishevelled genes mediate a conserved mammalian PCP pathway to regulate convergent extension during neurulation.」 Development 133, 1767-1778 (2006); Etheridge SL et al. 「Murine dishevelled 3 functions in redundant pathways with dishevelled1 and 2 in normal cardiac outflow tract, cochlea, and neural tube development.」 PLoS Genet. 4, e1000259 (2008)。興味深いことに、本発明者らのＺｎｒｆ３ヌル胚の約２０％が、神経管閉鎖欠損を示し、これは撹乱されたＷｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達に起因する可能性が高い。総合すると、これらの結果は、ＺＮＲＦ３は、インビボでＷｎｔ／β−カテニンおよびＷｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達の両方を調節すると示す。
【０１７３】
Ｒ−スポンジンは、ＺＮＲＦ３の阻害によって、Ｗｎｔシグナル伝達を増進する。以下にさらに記載されるように、Ｒ−スポンジンタンパク質（例えば、ＲＳＰＯ１〜ＲＳＰＯ４）は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達およびＷｎｔ／ＰＣＰを強力に増強し、したがって、生物学的および治療的重要性を有する分泌された分子のファミリーである。本発明者らは、ＺＮＲＦ３は、Ｒ−スポンジンの分子標的であることを発見した。本発明者らの結果は、ＺＮＲＦ３が、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰ６の代謝回転を促進することによってＷｎｔシグナル伝達を阻害することおよびこのＺＮＲＦ３活性がＲ−スポンジンによって阻害されることを示す。
【０１７４】
Ｒ−スポンジンは、Ｗｎｔ／β−カテニンおよびＷｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達を増進する。Ｆｒｉｚｚｌｅｄは、Ｗｎｔ／β−カテニンおよびＷｎｔ／ＰＣＰ経路によって共有されるので、Ｒ−スポンジンは、Ｄｖｌリン酸化を誘導し、本発明者らは、Ｒ−スポンジンが、Ｆｒｉｚｚｌｅｄの膜レベルを高めることによってＷｎｔシグナル伝達を増強するかどうかを調べた。実際、本発明者らは、Ｒ−スポンジン１（ＲＳＰＯ１）が、細胞表面タンパク質ビオチン化アッセイを使用することによって、またフローサイトメトリーアッセイにおいてＭｙｃ−ＦＺＤ８の膜レベルを増大することを見出した。本発明者らは、ＲＳＰＯ１が、汎Ｆｒｉｚｚｌｅｄ抗体を使用するフローサイトメトリーアッセイにおいて内因性Ｆｒｉｚｚｌｅｄの細胞表面レベルを増大することも見出した。
【０１７５】
ＺＮＲＦ３は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質の膜レベルを調節するので、本発明者らは、Ｒ−スポンジンが、ＺＮＲＦ３を阻害することによってＷｎｔシグナル伝達を増進するかどうかを調べた。本発明者らは、Ｒ−スポンジンが、Ｒ−スポンジンの細胞外ドメインと物理的に相互作用することを見出した。そうするために、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞を、Ｎ末端にＭｙｃタグが付いているＦＺＤ４（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４）、またはＺＮＲＦ３  ＥＣＤ−ＴＭまたはＺＮＲＦ３  Ｐ１０３Ａ  ＥＣＤ−ＴＭを用いて一過性にトランスフェクトし、次いで、これらの細胞を、ＲＳＰＯ１−ＧＦＰコンディショニング培地とともに１時間インキュベートした。本発明者らは、抗ＧＦＰおよび抗Ｍｙｃ抗体を使用する免疫蛍光を使用して、ＲＳＰＯ１−ＧＦＰの、細胞表面上に発現されたＭｙｃタグの付いたタンパク質との結合を決定した。この細胞ベースの結合アッセイを使用して、ＲＳＰＯ１−ＧＦＰは、ＺＮＲＦ３  ＥＣＤ−ＴＭと結合するが、ＺＮＲＦ３  Ｐ１０３Ａ  ＥＣＤ−ＴＭまたはＦＺＤ４とは結合しないと示された。したがって、本発明者らの結果は、Ｒ−スポンジンが、ＺＮＲＦ３の細胞外ドメインと特異的に相互作用することを示す。
【０１７６】
Ｒ−スポンジンはまた、ＬＧＲ４と結合すると知られているので、本発明者らは、Ｒ−スポンジンが、ＬＧＲ４およびＺＮＲＦ３と同時に相互作用して、ＺＮＲＦ３およびＲ−スポンジン間の相互作用を誘導するかどうかを調べた。これは、図９に示されている。ＨＥＫ２９３細胞は、ＬＧＲ４−ＨＡを同時発現し、Ｍｙｃ−ＺＮＲＦ３  ΔＲＩＮＧを、ＲＳＰＯ１−ＧＦＰコンディショニング培地（ＣＭ）を用いて１時間処理した。次いで、細胞溶解物を、抗Ｍｙｃ抗体を用いて免疫沈降させた。免疫沈降物を溶解し、抗ＨＡ、抗Ｍｙｃおよび抗ＧＦＰ抗体を用いてブロットした。図９は、ＲＳＰＯ１が  ＺＮＲＦ３とＬＧＲ４の間の相互作用を増大することを示す。
【０１７７】
Ｒ−スポンジンは、ＺＮＲＦ３との結合およびその活性の抑制によってＷｎｔシグナル伝達を増大するので、本発明者らは、ＺＮＲＦ３  ＥＣＤの過剰発現が、Ｒ−スポンジンと内因性ＺＮＲＦ３の間の相互作用を防ぎ、Ｒ−スポンジン媒介性シグナル伝達を阻害するかどうかを調べた。これは、図１０に示されている。空のベクターまたはＺＮＲＦ３  ＥＣＤ−ＴＭとともにＳＴＦルシフェラーゼリポーターを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、示された濃度および組み合わせの、Ｗｎｔ３ａコンディショニング培地またはＲＳＰＯ１  ΔＣコンディショニング培地で一晩処理した。次いで、細胞をルシフェラーゼリポーターアッセイに付した。図１０に示されるように、ＺＮＲＦ３  ＥＣＤ−ＴＭの過剰発現は、ＲＳＰＯ１を遮断したが、Ｗｎｔ３ａ誘導性ＳＴＦ活性化は遮断しなかった。
【０１７８】
したがって、本発明者らの結果は、ＺＮＲＦ３  ＥＣＤ−ＴＭの過剰発現が、ＨＥＫ２９３細胞において、Ｒ−スポンジンを阻害したが、Ｗｎｔ３ａ誘導性β−カテニン安定化は阻害しなかったことを示す。ＺＮＲＦ３  ＥＣＤ−ＴＭの過剰発現はまた、汎Ｆｒｉｚｚｌｅｄ抗体を使用するフローサイトメトリーアッセイにおいて、内因性ＦｒｉｚｚｌｅｄのＲＳＰＯ１誘導性膜蓄積も遮断した。まとめると、図９および図１０から得られる本発明者らの結果は、Ｒ−スポンジンが、ＺＮＲＦ３を阻害することおよびＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質の細胞表面レベルを増大することによって、Ｗｎｔシグナル伝達を増進することを示す。Ｒ−スポンジンは、ＺＮＲＦ３の細胞外ドメインと物理的に相互作用し、ＺＮＲＦ３とＬＧＲ４間の会合を誘導する。
【０１７９】
以下にさらに論じられるように、本発明者らの結果は、ＺＮＲＦ３（またはＲＮＦ４３）およびＬＧＲ４（またはＬＧＲ５またはＬＧＲ６）の両方と結合する二重特異性抗体は、Ｒ−スポンジン活性を摸倣し、Ｗｎｔシグナル伝達を増進することを示す。
【０１８０】
不十分なＷｎｔシグナル伝達に起因する疾患を治療するための本発明の抗体の投与および本発明の抗体を投与するための医薬製剤。本発明の抗体は、低いＷｎｔシグナル伝達を特徴とする疾患の治療にとって有用である。
【０１８１】
病理的に低いレベルのＷｎｔシグナル伝達は、骨粗しょう症、多発性嚢胞腎疾患および神経変性疾患と関連している。Ｗｎｔ経路の制御された活性化は、組織修復および創傷治癒などの再生プロセスを促進することが示されている。Zhao J, Kim KA, and Abo A, 「Tipping the balance: modulating the Wnt pathway for tissue repair.」Trends Biotechnol. 27(3):131-6(Mar. 2009)。Logan CY and Nusse R, 「The Wnt signaling pathway in development and disease.」 Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 20:781-810 (2004);Nusse R., 「Wnt signaling in disease and in development.」 Cell Res. 15(1):28-32 (Jan. 2005);Clevers H, 「Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.」 Cell 127(3):469-80 (3 Nov. 2006)も参照のこと。骨粗しょう症または粘膜炎におけるＷｎｔシグナル伝達の役割を示すために概念実証実験が行われている。さらに、Ｗｎｔシグナル伝達の増大は、糖尿病およびその他の代謝性疾患の治療にとって有益であり得るということが示唆されている。
【０１８２】
ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３の機能を阻害するためにＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３の細胞外ドメインと結合する抗体は、Ｗｎｔシグナル伝達に対して細胞を感作させ、したがって、疾患またはＷｎｔ刺激装置から利益を受けるその他の適応症のために使用され得る。
低いＷｎｔシグナル伝達と関連している疾患および状態の一部として、それだけには限らないが、粘膜炎短腸症候群、胃腸管粘膜における細菌移行、腸内毒素原性または腸疾患性感染性下痢、セリアック病、非熱帯性スプルー、ラクトース不耐症ならびに食事曝露が粘膜絨毛の鈍麻および吸収不良を引き起こすその他の状態、萎縮性胃炎および糖尿病が挙げられる。また、骨粗しょう症、骨折、糖尿病などの代謝性疾患、神経変性疾患およびメラノーマも含まれる。さらに、本発明の抗体をアンタゴナイズすることを使用して、組織修復および創傷治癒などの組織再生のためにWntシグナル伝達を増進してもよい。本発明の方法を使用して治療され得る、損傷を受けた組織の例として、それだけには限らないが、腸組織、心臓組織、肝臓組織、腎臓組織、骨格筋、脳組織、骨組織、結合組織および皮膚組織が挙げられる。
【０１８３】
米国特許出願２００９／０２２０４８８には、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性を治療的に調節するための、抗体（本発明の抗体ではない）、特に、Ｗｎｔシグナル伝達経路の分泌された成分と、またはＷｎｔシグナル伝達経路の成分の細胞外領域と結合する抗体の投与が記載されている。米国特許出願第２００９／０２２０４８８号には、例えば、Ｗｎｔと結合し、Ｗｎｔ活性を阻害し、例えば、細胞表面受容体、例えば、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体またはＬＲＰ５／６とのＷｎｔ結合を阻害する抗体が記載されている。特許出願に引用された別のクラスの抗体として、Ｗｎｔの細胞表面受容体の細胞外領域、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体もしくはＬＰＲ５／６などと結合して、Ｗｎｔの受容体との相互作用を低減または妨げるか、そうでなければ、受容体シグナル伝達を低減する抗体が挙げられる。本願によって記載される投与方法は、ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３の細胞外ドメインと結合する抗体に適用され得る。したがって、本発明の抗体を使用して、低いＷｎｔシグナル伝達を特徴とする疾患または状態を有する対象に投与できる。この投与によって、本発明の抗体は、対象を「治療」するために使用される。対象におけるＷｎｔシグナル伝達が増大されると、本発明の抗体の投与は、対象における疾患または状態を「回復させる」。
【０１８４】
粘膜炎は、がん治療の臨床合併症である。粘膜炎は、迅速に増殖する細胞に対する照射または化学療法の細胞傷害性効果によって引き起こされる。粘膜炎は、腸および経口粘膜に主に影響を及ぼす上皮損傷からなる。臨床徴候は、口腔の重篤な疼痛、悪心、下痢、栄養障害であり、重篤な場合には、敗血症および死亡がある。症状は、がん治療の用量制限につながり得ることが多い。固形腫瘍のための化学療法または放射線療法と関連している、口腔または胃腸粘膜炎のための現在利用可能な治療はない。
【０１８５】
口腔粘膜炎は、がん治療の一般的な、よくある衰弱性合併症である。頭頸部がんのための放射線療法を受けている患者の５０％および５−ＦＵを用いて治療される患者の１０〜１５％が、グレード３〜４の口腔粘膜炎になる。ＲＳＰＯ１は、動物モデルにおいて口腔粘膜炎を回復させるとわかっている。Zhao J et al., PNAS 106:2331 (2010)。
【０１８６】
短腸症候群（ＳＢＳ）は、小腸の広範なセグメントの機能的または解剖学的喪失に起因し、その結果、消化薬および吸収薬能が重篤に損なわれる。毎年、多数の人が、外傷、炎症性腸疾患、悪性、腸間膜虚血およびその他のものを含めた種々の障害のために小腸の長いセグメントの切除を受ける。放射線などの種々の非手術性手順が、機能性短腸症候群を引き起こし得る。短腸症候群のための現在の治療として、食事のアプローチ、総非経口栄養摂取量（ＴＰＮ）、腸移植および非移植腹部手術が挙げられる。これらの治療は、ＳＢＳ患者の改善された予後に寄与したが、それらは、低減した腸機能の根底にある問題を部分的に補正したにすぎない。現在の治療は、ＳＢＳ患者において残りの小腸の回復を加速できない。Seetharam and Rodrigues, 「Short bowel syndrome: a review of management of options」 The Saudi Journal of Gastroenterology 17, 229-235(2011)参照のこと。
【０１８７】
成体哺乳類の腸は、最も迅速に自己再生する組織の１つを構成し、腸管粘膜は、増殖性陰窩および分化した絨毛に折りたたまれた連続構造を含む。粘膜撹乱に応じて、宿主は、治癒反応を開始し、粘膜完全性の回復および粘膜構造の再生をもたらす。このプロセスは、腸幹細胞の増殖に重度に依存している。Neal et al., 「Intestinal stem cells and their roles during mucosal injury and repair.」 Journal of Surgical Research 167, 1-8 (2010);van der Flier and Clevers, 「Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.」 Annual Review of Physiology 71, 241-261 (2009)。
【０１８８】
したがって、腸幹細胞の活性を調節する因子は、宿主の、腸管内の障害に対して応答する能力において主要な役割を果たす。Ｗｎｔタンパク質は、腸幹細胞の増殖を支持する最も重要な増殖因子であるので、Ｗｎｔシグナル伝達を増強することは、腸管上皮の増殖を増大する。これは、小腸絨毛の数の増大および粘膜吸収性表面積の増大につながる。
【０１８９】
したがって、一実施形態では、本発明の抗体は、短腸症候群を有するヒトに投与される。抗体は、胃腸管粘膜吸収性表面積を増大する目的で投与される。本発明の抗体の投与は、偶発的な短腸症候群を有するヒトが、経腸栄養に適応する場合または流行性のＳＢＳを有するヒトが、経腸栄養から栄養素を吸収する場合またはヒトが体重を維持するのに毎日必要な、ヒトの総非経口栄養の量を低減させた場合に成功した予後を有する。
【０１９０】
細菌移行の防止。一実施形態では、本発明の抗体が、腸内細菌によって引き起こされる敗血症のリスクのあるヒトに投与される。抗体は、胃腸管粘膜完全性を増大する目的で、したがって、腸内細菌がヒトの血流中を通過するのを防ぐ目的で投与される。減少した胃腸管粘膜完全性（ヒト集団について正常である胃腸管粘膜完全性と比較して）は、危篤状態の患者において血流感染症および敗血症の主要な供給源となる。抗体の投与は、本発明の抗体が投与されていない患者においてよりも、集中治療室（ＩＣＵ）患者において菌血症および敗血症のより少ない症例しか観察されない場合に成功した予後を有する。
【０１９１】
腸内毒素原性または腸疾患性感染性下痢の間またはその後の回復の加速。感染性下痢は、主要な小児科の問題である。一実施形態では、本発明の抗体は、下痢の終了までの時間または正常な腸運動までの時間を短縮する目的で投与される。本発明の抗体は、経口または非経口再水和を含み、時には抗生物質を含む標準治療に加えて投与され得る。抗体の投与は、本発明の抗体が投与されていない小児科の患者と比較して、小児科の患者において、入院の減少、入院の短期化または脱水および電解質異常の合併症の発生率低下が観察される場合に成功した予後を有する。
【０１９２】
セリアック病、非熱帯性スプルー、ラクトース不耐症および食事曝露が粘膜絨毛の鈍麻および吸収不良を引き起こすその他の状態。一実施形態では、本発明の抗体は、粘膜吸収性表面積を増加することを目的として投与される。本発明の抗体は、主として、有害な食べ物を避けており、時には、栄養補助食品を避けている標準治療に加えて投与され得る。
本発明の抗体の投与は、セリアック病、非熱帯性スプルー、ラクトース不耐症またはその他の状態を有するヒトが、経腸栄養に適応する場合、または状態のいずれかを有するヒトが経腸栄養から栄養素を吸収する場合、またはヒトが体重を維持するのに毎日必要な、総非経口栄養の量を低減させた場合に成功した予後を有する。
【０１９３】
萎縮性胃炎、具体的には、環境性化生萎縮性胃炎と呼ばれる形態。萎縮性胃炎は、高齢の、ビタミンＢ１２注射を用いて現在治療されているものでは一般的な状態である。患者は、カルチノイド腫瘍および腺癌の増大したリスクを有する。抗体の投与は、カルチノイドの場合には、化成Ｇ細胞からのガストリン産生を低減することによる腫瘍発生率の低下が、医療専門家によって観察される場合に成功した予後を有する。抗体は、医療専門家がＷｎｔ経路の増大によって腫瘍が活性化されると決定した場合には、対象に投与されてはならない。
【０１９４】
２型糖尿病。一実施形態では、本発明の抗体は、インクレチンホルモン、例えば、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）および胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）のレベルを増大する目的で投与される。インクレチンは、食後ランゲルハンス島のβ細胞から放出されるインスリンの量の増大を引き起こす。インクレチンＧＬＰ−１およびＧＩＰは両方とも、酵素ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）によって迅速に不活化される。ＤＰＰ−４阻害剤はＤＰＰ−４による内因性インクレチンの不活性化を防ぐことによって、活性インクレチンレベルを高める。
【０１９５】
ＤＰＰ−４阻害剤の有効性は、ＩＩ型糖尿病を有する患者では減少すると思われる内因性活性インクレチンレベルに応じて変わる。Pratley RE and Gilbert M, Rev. Diabet. Stud. 5(2):73-94 (2008)を参照のこと。
【０１９６】
本発明の抗体の投与は、Ｗｎｔ経路を阻害し、これが、インクレチンを産生できる腸における細胞の増殖を引き起こすことによって腸内分泌細胞（例えば、Ｌ細胞およびＫ細胞）の数を増大させる。ＤＰＰ−４阻害剤は、有効性のためにインクレチンの内因性産生を必要とするので、本発明の抗体は、ＩＩ型糖尿病を有するヒトによって使用するために、ビルダグリプチン（Ｇａｌｖｕｓ（登録商標））、シタグリプチン（Ｊａｎｕｖｉａ（登録商標））、サクサグリプチン（Ｏｎｇｌｙｚａ（登録商標））、リナグリプチン（Ｔｒａｊｅｎｔａ（登録商標））、デュトグリプチン、ジェミグリプチン（ｇｅｍｉｇｌｉｐｔｉｎ）、アログリプチンまたは別のＤＰＰ−４阻害剤などのＤＰＰ−４阻害剤との、またはベルベリンなどのＤＰＰ−４阻害剤を含む化合物との併用療法として投与され得る。
【０１９７】
併用療法は、ＤＰＰ−４阻害剤の投与前の対象への本発明の抗体の投与であり得る。ＤＰＰ−４阻害剤の投与前の時間量は、対象の腸内分泌細胞が、インクレチンを産生するのに十分なほど増殖するようなものとなる。インクレチンの産生は、実験室法によって調べられ得る。
【０１９８】
併用療法は、代わりに、ＤＰＰ−４阻害剤の投与と一緒の対象への本発明の抗体の投与であり得、その結果、腸内分泌細胞の増殖およびＤＰＰ−４の阻害が一緒に起こる。用語「と一緒に」とは、対象が、ＤＰＰ−４阻害剤治療を受けている間に、本発明の抗体が、ＩＩ型糖尿病を有する対象に投与されることを意味する。本発明の抗体の投与は、ＤＰＰ−４阻害剤の投与と同時であっても、同時でなくてもよく、ＤＰＰ−４阻害剤との組合せにおいてであってもよい。ＧＬＰ−１などのインクレチンはまた、Ｌ細胞の増殖を引き起こすので(Grigoryan M et al., Endocrinology 153: 3076-3088 (2012)、インクレチンレベルの増大（ＤＰＰ−４阻害からの）が、腸上皮Ｌ細胞を上方制御し、上方制御されたＬ細胞（ＺＮＲＦ３拮抗作用からの）が、インクレチンレベルを上方制御するので、ＤＰＰ−４阻害剤を伴う本発明の抗体の投与は正のフィードバックループを増進し得る。
【０１９９】
ＤＰＰ−４阻害剤の投与の前またはＤＰＰ−４阻害剤との組合せにおける本発明の抗体の投与は、対象が、ＩＩ型糖尿病の良好な制御を有すると、ベースラインからのＨｇｂＡ１ｃ変化によって評価される場合に成功した予後を有する。ベースラインからのＨｇｂＡ１ｃ変化を評価する方法については、例えば、Vilsboll T et al., J Clin Endocrinol Metab 88:4897-4903 (2003)を参照のこと。
【０２００】
代謝性疾患。Ｗｎｔシグナル伝達の低減は、代謝性疾患と関連している。機能喪失型ＬＲＰ６Ｒ６１１Ｃ突然変異は、ヒトにおいて早期冠動脈疾患、メタボリックシンドロームおよび骨粗しょう症をもたらす。Main A et al., Science 315:1278 (2007).「LRP5 loss-of-function mutation is associated with osteoporosis, impaired glucose metabolism and hypercholesterolaemia in human」 Saarinnen et al., Clin Endocrinol 72:481 (2010)。ＬＲＰ５およびａｐｏＥの両方を欠くマウスにおける重篤な高コレステロール血症、脂肪耐性異常および進行したアテローム性動脈硬化症。Magoori K et al., JBC 11331 (2003)。ＬＲＰ５は、マウスにおける正常なコレステロール代謝およびグルコース誘導性インスリン分泌に必須である。Fujino et al., PNAS 100:229 (2003)。ＴＣＦ７Ｌ２変異体は、２型糖尿病のリスクを付与する。Grant SF et al., Nat Genet 38:320 (2006);Florez JC et al., N Engl J Med 355:241 (2006)。要約すると、Ｗｎｔシグナル伝達の増大は、代謝性疾患の治療にとって有益であり得るということがわかる。したがって、代謝性疾患を有する対象への本発明の抗体の投与は、対象の代謝性疾患を治療するのに有用である。
【０２０１】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、結腸および小腸の炎症状態の群である。主要な種類のＩＢＤとして、クローン病および潰瘍性大腸炎がある。ＲＳＰＯ１タンパク質は、動物モデルにおいて、炎症性腸疾患を回復させることがわかった。Zhao J et al., Gastroenterology 132:1331 (2007)。したがって、ＩＢＤを有する対象への本発明の抗体の投与は、対象のＩＢＤを治療するのに有用である。
【０２０２】
製剤。本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤された本発明の抗体または抗原結合断片を含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される担体は、組成物を増進または安定化するか、または組成物の調製を促進するよう使用され得る。薬学的に許容される担体として、生理学的に適合する、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。
【０２０３】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知のさまざまな方法によって投与され得る。投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて変わる。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下であるか、標的部位に近接して投与されることが好ましい。薬学的に許容される担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与に（例えば、注射または注入による)適したものでなくてはならない。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、二重特異性および多重特異性抗体またはその断片は、酸および化合物を不活化し得るその他の天然条件の作用から化合物を保護するための材料でコーティングされてもよい。
【０２０４】
組成物は滅菌され、流体でなければならない。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒径を維持することによって、または界面活性剤を使用することによって維持され得る。多くの場合には、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールなどの多価アルコールおよび塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長時間吸収は、組成物中に、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを含むことによってもたらされ得る。
【０２０５】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知の、日常的に実施される方法に従って調製され得る。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Mack Publishing Co., 20th ed., 2000);およびSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed.、(Marcel Dekker, Inc.、New York、1978)を参照のこと。医薬組成物は、ＧＭＰ条件下で製造されることが好ましい。通常、本発明の医薬組成物には、本発明の抗体の治療上有効な用量または有効用量が使用される。抗体は、当業者に公知の従来法によって薬学的に許容される剤形に製剤される。投与レジメンは、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するよう調整される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、いくつかに分割された用量が経時的に投与されてもよく、または用量は、治療状況の緊急事態によって示されるように、比例的に低減または増大されてもよい。投与の容易性および投与量の均一性のために、非経口組成物を投与単位形に製剤することは、特に有利である。本明細書において、投与単位形とは、治療される対象のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすと算出された所定の量の活性化合物を含有する。
【０２０６】
投与量。本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、対象に対して毒性でなく、特定の対象、組成物および投与様式に対して所望の治療反応を達成するために効果的である有効成分の量を得るために変わり得る。選択された投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用されている特定の化合物の排出速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用されるその他の薬物、化合物および／または材料、治療されている対象の年齢、性別、体重、状態、全身の健康および従前の病歴および同様の因子を含めたさまざまな薬物動態因子に応じて変わる。
【０２０７】
医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するのに必要なものよりも低いレベルで、医薬組成物中で使用される本発明の抗体の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増大することができる。一般に、本明細書に記載されたアレルギー性炎症障害の治療のための、本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、対象の生理学的状態、対象が、ヒトであるか、または動物であるか、投与されるその他の薬物適用および治療が予防的であるか、または治療的であるかを含めた多数の異なる因子に応じて変わる。治療投与量は、安全性および有効性を最適化するよう量が決められる必要がある。抗体を用いる全身投与には、投与量は、宿主の体重の、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常は、０．０１〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例示的治療レジメンは、２週間に１回または１ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回の全身投与を必要とする。抗体を用いる硝子体内投与には、投与量は、約０．０００１〜約１０ｍｇの範囲である。例示的治療レジメンは、２週間に１回または１ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回の全身投与を必要とする。
【０２０８】
抗体は、普通、複数回で投与される。単回投与量間の間隔は、週、月または年であり得る。間隔はまた、対象における本発明の抗体の血液レベルを測定することによって示されるような、不規則なものであってもよい。全身投与のいくつかの方法では、投与量は、１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法では、２５〜５００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するよう調整される。あるいは、抗体は、あまり頻繁ではない投与が必要とされる徐放製剤として投与され得る。投与量および頻度は、対象における抗体の半減期に応じて変わる。一般に、ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体のものよりも長い半減期を示す。投与の投与量および頻度は、治療が予防的であるか、または治療的であるかに応じて変わり得る。予防的適用では、比較的低投与量が、比較的頻繁でない間隔で長期間にわたって投与される。一部の対象は、その人生の残りの期間、治療を受け続ける。治療的適用では、疾患の進行が低減されるか、終結されるまで、好ましくは、対象が疾患の症状の部分的な回復または完全な回復を示すまで、比較的短い間隔での比較的高投与量が必要であることもある。その後、対象は、予防的レジメンを投与され得る。
【０２０９】
二重特異性抗体。ＺＮＲＦ３は、Ｒ−スポンジンの分子標的である。Ｒ−スポンジンは、ＺＮＲＦ３およびＬＧＲ４の両方と相互作用し、ＺＮＲＦ３の機能を阻害する。ＺＮＲＦ３およびＬＧＲ４の誘導された二量化は、Ｒ−スポンジンを摸倣し、ＺＮＲＦ３の機能を阻害すると予測される。したがって、本発明は、二重特異性または多重特異性抗体またはその抗原結合断片を提供する。抗体の一方の部分は、ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３の細胞外ドメインと結合する。抗体のもう一方の部分は、Ｒ−スポンジン共受容体ＬＧＲ４、ＬＧＲ５またはＬＧＲ６と結合する。このような抗体は、Ｒ−スポンジンを摸倣し、Ｗｎｔシグナル伝達を増進するはずである。
【０２１０】
本発明の抗体またはその抗原結合領域は、少なくとも２種の異なる結合部位または標的分子と結合する二重特異性抗体およびその断片を作製するよう、誘導体化され得るか、または別の機能的分子、例えば、別のペプチドもしくはタンパク質（例えば、別の抗体または受容体のリガンド）と連結され得る。本発明の抗体は、実際、３種以上の異なる結合部位および／または標的分子と結合する多重特異性分子を作製するよう、誘導体化され得るか、または２種以上のその他の機能的分子と連結され得る。このような多重特異性分子はまた、本明細書において、用語「二重特異性分子」に包含されるものとする。本発明の二重特異性分子を作製するために、本発明の抗体が、１種または複数のその他の結合分子、例えば、別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合ミメティックと機能的に連結されてもよく（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合による会合または別のものによって）、その結果、二重特異的分子が生じる。
【０２１１】
さらに、二重特異性抗体およびその断片が多重特異性である本発明については、抗体およびその断片は、第１および第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性をさらに含み得る。
【０２１２】
一実施形態では、本発明の二重特異性分子は、結合特異性として、少なくとも１種の抗体または例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖもしくは一本鎖Ｆｖを含めたその抗体断片を含む。抗体はまた、軽鎖または重鎖二量体または任意のその最小の断片、
例えば、Ｆｖまたは米国特許第４，９４６，７７８号に記載されるような一本鎖コンストラクトであり得る。
【０２１３】
ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが、短すぎて同一鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にできないリンカーによって接続された単一ポリペプチド鎖上に発現される、二価の、二重特異性分子である。ＶＨおよびＶＬドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対を形成し、それによって、２つの抗原結合部位が生じる。例えば、Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993);Poljak et al., Structure 2:1121-1123 (1994)を参照のこと。ダイアボディは、同一細胞内に、構造ＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡ（ＶＨ−ＶＬ立体配置）またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ（ＶＬ−ＶＨ立体配置）のいずれかを有する２種のポリペプチド鎖を発現させることによって製造され得る。それらのほとんどは、細菌においては可溶性形態で発現され得る。一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、２つのダイアボディ形成性ポリペプチド鎖を、およそ１５個のアミノ酸残基のリンカーを用いて接続することによって製造される。Holliger and Winter、Cancer Immunol. Immunother. 45(3-4):128-30 (1997);Wu et al., Immunotechnology 2(1):21-36 (1996)参照のこと。ｓｃＤｂは、細菌中で可溶性の、活性単量体形態で発現され得る。Holliger and Winter, Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30 (1997); Wu et al., Immunotechnology 2(1):21-36 (1996); Pluckthun and Pack, Immunotechnology 3(2): 83-105 (1997); Ridgway et al., Protein Eng. 9(7):617-21 (1996)参照のこと。ダイアボディは、「ジダイアボディ」を作製するためにＦｃと融合され得る。
Lu et al., J. Biol. Chem. 279(4):2856-65 (2004)参照のこと。
【０２１４】
本発明の二重特異性分子において使用され得るその他の抗体として、マウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体が挙げられる。
【０２１５】
本発明の二重特異性抗体は、当技術分野で公知の方法を使用して成分結合特異性をコンジュゲートすることによって調製され得る。例えば、二重特異性抗体の各結合特異性は、別個に作製され、次いで、互いにコンジュゲートされてもよい。結合特異性が、タンパク質またはペプチドである場合には、共有結合コンジュゲーションに種々のカップリングまたは架橋剤を使用してもよい。架橋剤の例として、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）が挙げられる。例えば、Karpovsky et al., J. Exp. Med. 160:1686 (1984); Liu, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648 (1985))参照のこと。その他の方法として、Paulus, Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132 (1985); Brennan et al., Science 229:81-83 (1985)およびGlennie et al., J. Immunol. 139: 2367-2375 (1987)に記載されたものが挙げられる。コンジュゲート剤として、ＳＡＴＡおよびｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、両方ともＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．  （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手可能がある。
【０２１６】
結合特異性が抗体である場合には、それらは２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によってコンジュゲートされ得る。特定の実施形態では、ヒンジ領域は、コンジュゲーションに先立って奇数のスルフヒドリル残基、例えば、１つを含有するよう修飾される。
【０２１７】
あるいは、両結合特異性が、同一ベクターにコードされ、発現され、同一宿主細胞にアセンブルされてもよい。この方法は、二重特異性分子が、ｍＡｂ  ×  ｍＡｂ、ｍＡｂ  ×  Ｆａｂ、Ｆａｂ  ×  Ｆ（ａｂ’）２またはリガンド  ×  Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子または２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。
二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子を調製する方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号；同５，４５５，０３０号；同４，８８１，１７５号；同５，１３２，４０５号；同５，０９１，５１３号；同５，４７６，７８６号；同５，０１３，６５３号；同５，２５８，４９８号；および同５，４８２，８５８号に記載されている。
【０２１８】
二重特異性分子の、その特定の標的との結合は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ解析、生物検定法（例えば、増殖阻害）またはウエスタンブロットアッセイによって確認され得る。これらのアッセイの各々は、一般に、注目する複合体に特異的な標識された試薬（例えば、抗体）を使用することによって、特に注目されるタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
【０２１９】
別の態様では、本発明は、少なくとも２つの同一または異なる、本発明の抗体の抗原結合部分を含む多価化合物を提供する。抗原結合部分は、タンパク質融合または共有結合もしくは非共有結合連結によって一緒に連結され得る。あるいは、二重特異性抗体およびその断片についての連結方法は記載されている。四価抗体およびその断片は、例えば、本発明の抗体の抗体を、本発明の抗体の定常領域と結合する抗体、例えば、Ｆｃまたはヒンジ領域と架橋することによって得ることができる。
【０２２０】
したがって、ＬＧＲ４／ＬＧＲ５／ＬＧＲ６およびＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３両方との二重特異性抗体（またはタンパク質キメラなどのその他の同様の物質）結合は、細胞をＷｎｔシグナル伝達に対して感作させ、Ｗｎｔ刺激物質から利益を受ける疾患またはその他の適応症のために使用され得る。このような適応症として、それだけには限らないが、粘膜炎短腸症候群、胃腸管粘膜における細菌移行、腸内毒素原性または腸疾患性感染性下痢、セリアック病、非熱帯性スプルー、ラクトース不耐症および食事曝露が粘膜絨毛の鈍麻および吸収不良を引き起こすその他の状態、萎縮性胃炎およびＩＩ型糖尿病が挙げられる。
また、骨粗しょう症、骨折、糖尿病などの代謝性疾患、神経変性疾患およびメラノーマも含まれる。
【０２２１】
例えば、特定の実施形態では、開示内容は、
（ｉ）抗体の一方の部分が、ＺＮＲＦ３の細胞外ドメインと結合し、抗体のもう一方の部分が、Ｒ−スポンジンの共受容体の細胞外ドメインと結合する抗体、または
（ｉｉ）抗体の一方の部分が、ＲＮＦ４３の細胞外ドメインと結合し、抗体のもう一方の部分が、Ｒ−スポンジンの共受容体の細胞外ドメインと結合する抗体
に関する。
【０２２２】
Ｒ−スポンジン。Ｒ−スポンジンタンパク質（ＲＳＰＯ１−４）は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達およびＷｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達を強力に増強する分泌された分子のファミリーである。Kazanskaya O et al. 「R-Spondin 2 is a secreted activator of Wnt/beta-catenin signaling and is required for Xenopus myogenesis.」 Dev.Cell 7, 525-534 (2004);Kim KA et al., 「Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epitheium.」 Science 309, 1256-1259 (2005); Kim KA, 「R-Spondin family members regulate the Wnt pathway by a common mechanism.」 Mol. Biol. Cell 19, 2588-2596 (2008); Ohkawara B， Glinka A, and Niehrs C, 「Rspo3 binds syndecan 4 and induces Wnt/PCP singnaling  via clathrin-mediated endocytosis to promote morphogenesis.」 Dev. Cell 20, 303-314 (2011); Kamata T et al., 「R-spondin, a novel gene with thrombospondin type 1 domain, was expressed in the dorsal neural tube and affected in Wnts mutants.」 Biochim. Biophys. Acta 1676, 51-62 (2004); Nam JS., Turcotte TJ, and Yoon JK, 「Dynamic expression of R-spondin family genes in mouse development.」Gene Expr. Patterns. 7, 306-312 (2007);Aoki M et al., 「R-spondin3 is required for mouse placental development.」 Dev. Biol. 301, 218-226 (2007);Blaydon DC et al., 「The gene encoding R-spondin 4 (RSPO4), a secreted protein implicated in Wnt signaling, is mutated in inherited anonychia.」 Nat. Genet. 38, 1245-1247 (2006);Kazanskaya O. et al. 「The Wnt signaling regulator R-spondin 3 promotes angioblast and vascular development.」 Development 135, 3655-3664 (2008);Parma P et al., 「R-spondin 1 is essential in sex determination, skin differentiation and malignancy.」 Nat. Genet. 38, 1304-1309 (2006)。Ｒ−スポンジンは、同時発現されるか、またはＷｎｔによって誘導され、組織パターン形成および分化に関与している。
【０２２３】
Ｒｓｐｏ１は、Ｌｇｒ５＋幹細胞のニッチを形成する、腸の陰窩のパネート細胞において発現される。ＲＳＰＯ１は、陰窩幹細胞の増殖を刺激し、マウスを化学療法誘導性粘膜炎から保護する。Zhao J et al.「R-spondin1 protects mice from chemotherapy or radiation-induced oral mucositis through the canonical Wnt/beta-catenin pathway.」 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 106, 2331-2336 (2009)。
【０２２４】
したがって、本発明は、Ｒ−スポンジンとＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３の間の相互作用を遮断する、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３の細胞外ドメインとの抗体結合を提供する。このような抗体は、薬学的に許容される担体において製剤化され得る。このような抗体は、Ｒ−スポンジン刺激性Ｗｎｔシグナル伝達を遮断し、Ｗｎｔ阻害剤から利益を受ける適応症に使用され得る。このような適応症として、それだけには限らないが、種々のがん、硬結性骨化症、特発性肺繊維症、心肥大が挙げられる。
【０２２５】
さらに、本発明は、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３の細胞外ドメインを提供する。これらの細胞外ドメインは、これらのタンパク質が、組織中を循環するＲ−スポンジンと結合して、Ｒ−スポンジンシグナル伝達を阻害するので、治療効果のために投与され得る。ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３の投与された細胞外ドメインは、偽受容体として作用する。このような投与されたタンパク質は、薬学的に許容される担体において製剤化され得る。このような投与されたタンパク質は、Ｒ−スポンジン刺激性Ｗｎｔシグナル伝達を遮断し、Ｗｎｔ阻害剤から利益を受ける適応症に使用され得る。このような適応症として、それだけには限らないが、種々のがん、硬結性骨化症、特発性肺繊維症、心肥大が挙げられる。
【０２２６】
本明細書に引用された特許および刊行物各々の内容は、参照によりその全文が組み込まれる。
【０２２７】
本明細書に提供された詳細な説明は、本発明を例示するためのものであって、その範囲を制限するものではない。本発明のその他の変形は、当業者には容易に明らかとなり、添付の特許請求の範囲によって包含される。
【図１】
2020200332.tif 000016
【図２Ａ】
2020200332.tif 000017
【図２Ｂ】
2020200332.tif 000018
【図３】
2020200332.tif 000019
【図４】
2020200332.tif 000020
【図５】
2020200332.tif 000021
【図６】
2020200332.tif 000022
【図７】
2020200332.tif 000023
【図８】
2020200332.tif 000024
【図９】
2020200332.tif 000025
【図１０】
2020200332.tif 000026
【図１１】
2020200332.tif 000027
【配列表】
2020200332000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月18日(2020.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２７】
本明細書に提供された詳細な説明は、本発明を例示するためのものであって、その範囲を制限するものではない。本発明のその他の変形は、当業者には容易に明らかとなり、添付の特許請求の範囲によって包含される。
［１]  膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外ドメインと特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３からなる群から選択され、
（ｂ）抗体の、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外ドメインとの結合が、真核細胞においてＷｎｔシグナル伝達を増大し、ここで、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼが、真核細胞の表面上にある、単離抗体またはその抗原結合断片。
［２]  増大したＷｎｔシグナル伝達が、インビトロアッセイにおいて検出することができる、項目１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
［３]  少なくとも１種の遺伝子改変されたポリペプチドを含む、項目１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
［４]  抗体または抗原結合断片のアミノ末端からカルボキシル末端に、３つの領域：
（ａ）配列番号３１；配列番号３７；配列番号４３；配列番号４９；配列番号５５；配列番号６１；配列番号９１；配列番号９７；配列番号１０３；配列番号１０９；配列番号１１５；配列番号１２１；配列番号１２７；配列番号１３３；配列番号１３９；配列番号１４５；配列番号１５１および配列番号１５７からなる群から選択されるペプチド配列を有する第１の領域と、
（ｂ）配列番号３２；配列番号３８；配列番号４４；配列番号５０；配列番号５６；配列番号６２；配列番号９２；配列番号９８；配列番号１０４；配列番号１１０；配列番号１１６；配列番号１２２；配列番号１２８；配列番号１３４；配列番号１４０；配列番号１４６；配列番号１５２；および配列番号１５８からなる群から選択されるペプチド配列を有する第２の領域と、
（ｃ）配列番号３３；配列番号３９；配列番号４５；配列番号５１；配列番号５７；配列番号６３；配列番号９３；配列番号９９；配列番号１０５；配列番号１１１；配列番号１１７；配列番号１２３；配列番号１２９；配列番号１３５；配列番号１４１；配列番号１４７；配列番号１５３；および配列番号１５９からなる群から選択されるペプチド配列を有する第３の領域と
を含む、項目１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
［５]  抗体または抗原結合断片のアミノ末端からカルボキシル末端に、３つの領域：
（ａ）配列番号３４；配列番号４０；配列番号４６；配列番号５２；配列番号５８；配列番号６４；配列番号９４；配列番号１００；配列番号１０６；配列番号１１２；配列番号１１８；配列番号１２４；配列番号１３０；配列番号１３６；配列番号１４２；配列番号１４８；配列番号１５４；および配列番号１６０からなる群から選択されるペプチド配列を有する第１の領域と、
（ｂ）配列番号３５；配列番号４１；配列番号４７；配列番号５３；配列番号５９；配列番号６５；配列番号９５；配列番号１０１；配列番号１０７；配列番号１１３；配列番号１１９；配列番号１２５；配列番号１３１；配列番号１３７；配列番号１４３；配列番号１４９；配列番号１５５；および配列番号１６１からなる群から選択されるペプチド配列を有する第２の領域と、
（ｃ）配列番号３６；配列番号４２；配列番号４８；配列番号５４；配列番号６０；配列番号６６；配列番号９６；配列番号１０２；配列番号１０８；配列番号１１４；配列番号１２０；配列番号１２６；配列番号１３２；配列番号１３８；配列番号１４４；配列番号１５０；配列番号１５６；および配列番号１６２からなる群から選択されるペプチド配列を有する第３の領域と
を含む、項目１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
［６]  （ａ）１種または複数のポリペプチドを含み、
（ｂ）少なくとも１種のポリペプチドが、抗体または抗原結合断片のアミノ末端からカルボキシル末端に、３つの領域：
（１）配列番号３１；配列番号３７；配列番号４３；配列番号４９；配列番号５５；配列番号６１；配列番号９１；配列番号９７；配列番号１０３；配列番号１０９；配列番号１１５；配列番号１２１；配列番号１２７；配列番号１３３；配列番号１３９；配列番号１４５；配列番号１５１および配列番号１５７からなる群から選択されるペプチド配列を有する第１の領域と、
（２）配列番号３２；配列番号３８；配列番号４４；配列番号５０；配列番号５６；配列番号６２；配列番号９２；配列番号９８；配列番号１０４；配列番号１１０；配列番号１１６；配列番号１２２；配列番号１２８；配列番号１３４；配列番号１４０；配列番号１４６；配列番号１５２；および配列番号１５８からなる群から選択されるペプチド配列を有する第２の領域と、
（３）配列番号３３；配列番号３９；配列番号４５；配列番号５１；配列番号５７；配列番号６３；配列番号９３；配列番号９９；配列番号１０５；配列番号１１１；配列番号１１７；配列番号１２３；配列番号１２９；配列番号１３５；配列番号１４１；配列番号１４７；配列番号１５３；および配列番号１５９からなる群から選択されるペプチド配列を有する第３の領域と
を含み、
（ｂ）少なくとも１種のポリペプチドが、抗体または抗原結合断片のアミノ末端からカルボキシル末端に、３つの領域：
（１）配列番号３４；配列番号４０；配列番号４６；配列番号５２；配列番号５８；配列番号６４；配列番号９４；配列番号１００；配列番号１０６；配列番号１１２；配列番号１１８；配列番号１２４；配列番号１３０；配列番号１３６；配列番号１４２；配列番号１４８；配列番号１５４；および配列番号１６０からなる群から選択されるペプチド配列を有する第１の領域と、
（２）配列番号３５；配列番号４１；配列番号４７；配列番号５３；配列番号５９；配列番号６５；配列番号９５；配列番号１０１；配列番号１０７；配列番号１１３；配列番号１１９；配列番号１２５；配列番号１３１；配列番号１３７；配列番号１４３；配列番号１４９；配列番号１５５；および配列番号１６１からなる群から選択されるペプチド配列を有する第２の領域と、
（３）配列番号３６；配列番号４２；配列番号４８；配列番号５４；配列番号６０；配列番号６６；配列番号９６；配列番号１０２；配列番号１０８；配列番号１１４；配列番号１２０；配列番号１２６；配列番号１３２；配列番号１３８；配列番号１４４；配列番号１５０；配列番号１５６；および配列番号１６２からなる群から選択されるペプチド配列を有する第３の領域と
を含む、項目１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
［７]  抗体または抗原結合断片のペプチド配列が、配列番号３；配列番号５；配列番号６７；配列番号６９；配列番号７１；配列番号７３；配列番号７５；配列番号７７；配列番号７９；配列番号８１；配列番号８３；配列番号８５；配列番号８７；および配列番号８９からなる群から選択される配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する、項目１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
［８]  抗体または抗原結合断片のペプチド配列が、配列番号４；配列番号６；配列番号６８；配列番号７０；配列番号７２；配列番号７４；配列番号７６；配列番号７８；配列番号８０；配列番号８２；配列番号８４；配列番号８６；配列番号８８；および配列番号９０からなる群から選択される配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する、項目１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
［９]  （ａ）１種または複数のポリペプチドを含み、
（ｂ）少なくとも１種のポリペプチドが、配列番号３；配列番号５；配列番号６７；配列番号６９；配列番号７１；配列番号７３；配列番号７５；配列番号７７；配列番号７９；配列番号８１；配列番号８３；配列番号８５；配列番号８７；および配列番号８９からなる群から選択される配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有し、
（ｂ）少なくとも１種のポリペプチドが、配列番号４；配列番号６；配列番号６８；配列番号７０；配列番号７２；配列番号７４；配列番号７６；配列番号７８；配列番号８０；配列番号８２；配列番号８４；配列番号８６；配列番号８８；および配列番号９０からなる群から選択される配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する、項目１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
［１０]  Ｗｎｔシグナル伝達の増大から利益を受ける疾患またはその他の適応症の治療において医薬として使用するための、項目１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
［１１]  Ｗｎｔシグナル伝達の増大から利益を受ける疾患またはその他の適応症が、粘膜炎短腸症候群、胃腸管粘膜における細菌移行、腸内毒素原性または腸疾患性感染性下痢、セリアック病、非熱帯性スプルー、ラクトース不耐症、食事曝露が粘膜絨毛の鈍麻および吸収不良を引き起こすその他の状態、萎縮性胃炎、骨粗しょう症、骨折、代謝性疾患、糖尿病、神経変性疾患、メラノーマならびに組織再生、組織修復または創傷治癒を必要とする状態からなる群から選択される、項目１０に記載の単離抗体または抗原結合断片。
［１２]  真核細胞においてＷｎｔシグナル伝達を増大するよう、別の細胞表面タンパク質とさらに特異的に結合し、その他の細胞表面タンパク質が、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５およびＬＧＲ６からなる群から選択される、項目１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
［１３]  薬学的に許容される担体中の、項目１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
［１４]  対象においてＷｎｔシグナル伝達の低減から利益を受ける疾患またはその他の適応症の治療において医薬として使用するための、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外ドメインと特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼが、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３からなる群から選択され、
（ｂ）抗体または抗原結合断片の、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外ドメインとの結合が、対象においてＲ−スポンジン刺激性Ｗｎｔシグナル伝達を遮断する、単離抗体またはその抗原結合断片。
［１５]  疾患またはその他の適応症が、がん、硬結性骨化症、特発性肺繊維症および心肥大からなる群から選択される、項目１４に記載の単離抗体または抗原結合断片。
［１６]  対象においてＷｎｔシグナル伝達の低減から利益を受ける疾患またはその他の適応症の治療において医薬として使用するための、薬学的に許容される担体中の膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの可溶性細胞外ドメインであって、
（ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼが、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３からなる群から選択され、
（ｂ）対象において、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの可溶性細胞外ドメインが、Ｒ−スポンジンと特異的に結合して、Ｒ−スポンジン刺激性Ｗｎｔシグナル伝達を遮断する、可溶性細胞外ドメイン。
［１７]  疾患またはその他の適応症が、がん、硬結性骨化症、特発性肺繊維症および心肥大からなる群から選択される、項目１６に記載の可溶性細胞外ドメイン。
［１８]  ＩＩ型糖尿病の治療における医薬として使用するための、
（ａ）ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）阻害剤の対象への投与の前に、または
（ｂ）ＤＰＰ−４阻害剤の対象への投与と一緒に、または
（ｃ）ＤＰＰ−４阻害剤の対象への投与の前、次いで、ＤＰＰ−４阻害剤の対象への投与と一緒に
ＩＩ型糖尿病を有する対象に投与される、項目１に記載の単離抗体または抗原結合断片。
［１９]  ＤＰＰ−４阻害剤がビルダグリプチン（Ｇａｌｖｕｓ（登録商標））である、項目１８に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外ドメインと特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３からなる群から選択され、
（ｂ）抗体の、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外ドメインとの結合が、真核細胞においてＷｎｔシグナル伝達を増大し、ここで、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼが、真核細胞の表面上にある、単離抗体またはその抗原結合断片。
【外国語明細書】
2020200332000001.pdf