(57)【要約】【課題】長期間保存したときに向上した安定性を有する、ルシフェラーゼを用いる光生成のためにＤ−ルシフェリン及びＬ−ルシフェリンの混合物を含有する方法、キット及び組成物を提供する。【解決手段】Ｄ−ルシフェリン及びＬ−ルシフェリンの混合物を使用し、サンプル中のＡＴＰまたはルシフェラーゼの存在または量を検出することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェラーゼ、Ｌ−ルシフェリン及びＤ−ルシフェリンを含む組成物であって、本質的にＡＴＰを含まず、Ｄ−ルシフェリン対Ｌ−ルシフェリンの比率が、１以上４未満：１である、組成物。
【請求項２】
Ｄ−ルシフェリン対Ｌ−ルシフェリンの前記比率が、２以上４未満：１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物における前記Ｌ−ルシフェリンの濃度が、少なくとも１００μＭである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも５〜９未満のｐＨを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ルシフェラーゼが、甲虫ルシフェラーゼである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記Ｄ−ルシフェリンが、Ｄ−５’フルオロルシフェリンであり、前記Ｌ−ルシフェリンが、Ｌ−５’フルオロルシフェリンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
バッファー、タンパク質安定化剤、マグネシウムイオン、金属キレート化剤、洗剤、消泡剤、無機ホスフェート、ピロホスフェート、ＡＭＰ、補酵素Ａ、還元剤若しくはこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの追加の成分を更に含むか、又は硫酸マグネシウム及びトランス−１，２−シクロヘキサンジアミンテトラ酢酸（ＣＤＴＡ）を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ洗剤、Ｍａｚｕ消泡剤、硫酸マグネシウム、補酵素Ａ、ピロホスフェート、ＤＴＴ、スルファイト、チオサルフェート、フッ化ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、リン酸カリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びＡＭＰから選択される少なくとも１つの追加の成分を更に含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記追加の成分のうちの少なくとも２つ、又は前記追加の成分のうちの少なくとも３つ若しくは少なくとも４つ若しくは少なくとも５つを含む、請求項７又は８に記載の組成物。
【請求項１０】
マグネシウムイオン、クエン酸バッファー、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、リン酸カリウム及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、並びに、（ｉ）ＭＥＳバッファー、フッ化ナトリウム及びピロホスフェート又は（ｉｉ）ＨＥＰＥＳバッファー及びＡＭＰのいずれかを更に含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
実質的にＬ−ルシフェリンを有さない組成物と比較して、０℃〜３５℃の温度で貯蔵したとき、増大した貯蔵寿命及び／又は安定性を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年２月２２日に出願された米国仮出願第６１／７６７，８７５号、２０１３年３月１４日に出願された米国仮出願第６１／７８３，７２６号に対する優先権を主張し、両方とも、全体的に本明細書に参考として組み込まれる。
【０００２】
本開示は、酵素及び代謝物をアッセイするのに有用な組成物、方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
ルシフェリンは、ラセミ化合物であり、溶液中で、Ｄ−ルシフェリンからＬ−ルシフェリンへと、またはＬ−ルシフェリンからＤ−ルシフェリンへとラセミ化する。Ｄ−ルシフェリンは、酵素ルシフェラーゼによって光を発生する基質として利用することができ、一方、Ｌ−ルシフェリンは、主に阻害性であり、発光を減少させる。貯蔵中のＤ−ルシフェリンからＬ−ルシフェリンへのゆっくりとしたラセミ化は、Ｄ−ルシフェリン基質の利用可能性の変動及び低下や、Ｌ−ルシフェリンの阻害効果に起因して、ルシフェラーゼの活性を活用するアッセイで問題を生じる。
【発明の概要】
【０００４】
特定の実施形態では、ルシフェラーゼ、Ｌ−ルシフェリン及びＤ−ルシフェリンを含み、本質的にＡＴＰを含まない組成物が提供される。特定の実施形態では、ＡＴＰ、Ｌ−ルシフェリン及びＤ−ルシフェリンを含み、本質的にルシフェラーゼを含まない組成物が提供される。
【０００５】
ある実施形態では、Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン及びＡＴＰを含む組成物が提供される。
【０００６】
特定の実施形態では、ルシフェラーゼ、Ｌ−ルシフェリン、Ｄ−ルシフェリン及びＡＴＰを含み、Ｌ−ルシフェリンの濃度が、Ｄ−ルシフェリンの濃度を超える組成物が提供される。
【０００７】
ある実施形態では、ルシフェラーゼ、Ｌ−ルシフェリン及びＤ−ルシフェリンを含む組成物を含み、この組成物が、本質的にＡＴＰを含まず、容器に封入されているキットが提供される。キットは、少なくとも１つのさらなる成分、例えば、１つ以上の洗剤、例えば、ドデシルトリアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、リン酸カリウム、消泡剤、バッファー、塩及びキレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含んでいてもよい。
【０００８】
ある実施形態では、Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン及びＡＴＰを含み、Ｌ−ルシフェリンの濃度が、Ｄ−ルシフェリンの濃度を超える組成物を含むキットが提供される。キットは、少なくとも１つのさらなる成分、例えば、１つ以上の洗剤、例えば、ドデシルトリアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、リン酸カリウム、消泡剤、バッファー、塩及びキレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含んでいてもよい。
【０００９】
ある実施形態では、Ｌ−ルシフェリン、Ｄ−ルシフェリン及びＡＴＰを含む組成物を含み、この組成物が、本質的にルシフェラーゼを含まず、容器に封入されたキットが提供される。キットは、少なくとも１つのさらなる成分、例えば、バッファー、二価のカチオンキレート化剤、マグネシウム塩、イオン性または非イオン性の洗剤、チオール含有化合物、例えば、補酵素ＡまたはＤＴＴ、１つ以上の硫黄含有還元剤またはこれらの組み合わせを含んでいてもよい。
【００１０】
ある実施形態では、ルシフェラーゼ、Ｌ−ルシフェリン及びＤ−ルシフェリンを含む組成物とサンプルとを接触させることと、生成した光を検出及び／または測定し、サンプル中のＡＴＰの存在または量を決定することとを含む、サンプル中のＡＴＰの存在または量を決定するための方法が提供される。
【００１１】
ある実施形態では、Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン及びＡＴＰを含む組成物と、ルシフェラーゼを発現する細胞を含有していてもよいサンプルとを接触させる、サンプル中のルシフェラーゼの存在または量を決定するための方法、キットまたは組成物が提供される。次いで、生成した光を検出及び／または測定し、サンプル中のルシフェラーゼの存在または量を決定する。ルシフェラーゼを発現する細胞を含有するサンプルは、溶解した細胞、未精製細胞抽出物または清澄化した細胞抽出物であってもよい。
【００１２】
ある実施形態では、細胞中でルシフェラーゼが発現し、この細胞を、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンの比率が約５：９５〜約７５：２５でＬ−ルシフェリン及びＤ−ルシフェリンを含む混合物と接触させる、ルシフェラーゼを発現する細胞からルシフェラーゼ活性を検出するための方法が提供される。ある実施形態では、この混合物は、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンの比率が少なくとも約５：９５〜約５５：４５、または少なくとも約５：９５〜約５０：５０でＬ−ルシフェリン及びＤ−ルシフェリンを含む。次いで、生成した光を検出及び／または測定し、細胞中のルシフェラーゼの存在または量を決定する。
【００１３】
ある実施形態では、細胞またはサンプルを、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンの比率が少なくとも約０．５：１〜約２：１でＬ−ルシフェリン及びＤ−ルシフェリンと、ルシフェラーゼとを含む混合物と接触させる、細胞または他のサンプル中のヌクレオシドホスフェート、例えば、ＡＴＰまたはＡＴＰ源を検出または定量するための方法が提供される。次いで、生成した光を検出及び／または測定し、細胞中のヌクレオシドホスフェートの存在または量を決定する。
【００１４】
ある実施形態では、ルシフェラーゼ反応を行うための方法が提供される。Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンを含む混合物を約０℃〜約３５℃の温度で所定期間貯蔵する。この混合物をルシフェラーゼ活性アッセイで使用する場合、光の出力（すなわち、発光）が測定される。この混合物を、ルシフェラーゼを含有するか、またはルシフェラーゼを発現するサンプルまたはサンプルの一部、ＡＴＰまたはＡＴＰ源と接触させ、反応アッセイを作成する。次いで、反応アッセイ中に生成した光を検出する。所定期間貯蔵した混合物を含有する反応アッセイは、特定の実施形態では、貯蔵期間開始時（時間ｔ＝０）に混合物を含有する相当するアッセイの光の出力の少なくとも約５０％または少なくとも約９０％の光の出力を生成する。特定の実施形態では、貯蔵期間は、少なくとも約３０分、少なくとも約１時間、少なくとも約４時間またはそれ以上であってもよい。
【００１５】
ある実施形態では、ルシフェラーゼ反応のための成分を配合するための方法が提供される。Ｄ−ルシフェリンとＬ−ルシフェリンを合わせて混合物を作成し、これを、約０℃〜約３５℃の温度で所定期間、例えば、約１時間、２時間、３時間または４時間、または１週間または２週間貯蔵する。ルシフェラーゼ活性アッセイで使用されるとき、この混合物によって光の出力（すなわち、発光）が生成し、この期間の後に生成した光の出力は、この期間の開始時の光の出力の少なくとも約５０％または少なくとも約９０％である。
【００１６】
本開示は、ルシフェラーゼ、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンを含む組成物に関する。この組成物は、本質的にＡＴＰを含まない。この組成物は、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンの比率が、少なくとも約０．５：１〜約２：１であってもよい。この組成物は、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンの比率が、少なくとも約５：９５〜約５５：４５であってもよい。この組成物は、ｐＨが少なくとも約５であり、約９未満であってもよい。ルシフェラーゼは、甲虫ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼまたはクリックビートルルシフェラーゼであってもよい。Ｄ−ルシフェリンは、Ｄ−５’フルオロルシフェリンであってもよく、Ｌ−ルシフェリンは、Ｌ−５’フルオロルシフェリンである。この組成物は、さらに、バッファー、タンパク質安定化剤、マグネシウムイオン、金属キレート化剤、洗剤、消泡剤、無機ホスフェート、ピロホスフェート、ＡＭＰ、補酵素Ａ、還元剤、またはこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのさらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、硫酸マグネシウム及びｔｒａｎｓ−１，２−シクロヘキサンジアミンテトラ酢酸（ＣＤＴＡ）を含んでいてもよい。この組成物は、さらに、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ洗剤、Ｍａｚｕ消泡剤、硫酸マグネシウム、ＡＴＰ、補酵素Ａ、ピロホスフェート、ＤＴＴ、スルファイト及びチオサルフェートから選択される少なくとも１つのさらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、さらに、フッ化ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、ピロホスフェート、リン酸カリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びＡＭＰから選択される少なくとも１つの成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも２つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも３つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも４つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも５つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、さらに、マグネシウムイオン、クエン酸バッファー、ＭＥＳバッファー、フッ化ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、ピロホスフェート、リン酸カリウム及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含んでいてもよい。この組成物は、クエン酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、マグネシウムイオン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、リン酸カリウム、消泡剤、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン及びＡＭＰを含んでいてもよい。この組成物は、Ｌ−ルシフェリンを含まない組成物と比較して、約０℃〜約３５℃の温度で貯蔵したとき、向上した貯蔵寿命及び／または安定性を有するだろう。
【００１７】
本開示は、Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン及びＡＴＰを含む組成物に関する。この組成物は、本質的にルシフェラーゼを含まない。この組成物は、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンの比率が、少なくとも約０．５：１〜約２：１であってもよい。この組成物は、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンの比率が、少なくとも約５：９５〜約５５：４５であってもよい。この組成物は、ｐＨが少なくとも約５であり、約９未満であってもよい。このルシフェラーゼは、甲虫ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼまたはクリックビートルルシフェラーゼであってもよい。Ｄ−ルシフェリンは、Ｄ−５’フルオロルシフェリンであってもよく、Ｌ−ルシフェリンは、Ｌ−５’フルオロルシフェリンである。この組成物は、さらに、バッファー、タンパク質安定化剤、マグネシウムイオン、金属キレート化剤、洗剤、消泡剤、無機ホスフェート、ピロホスフェート、ＡＭＰ、補酵素Ａ、還元剤、またはこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのさらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、硫酸マグネシウム及びｔｒａｎｓ−１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）を含んでいてもよい。この組成物は、さらに、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ洗剤、Ｍａｚｕ消泡剤、硫酸マグネシウム、ＡＴＰ、補酵素Ａ、ピロホスフェート、ＤＴＴ、スルファイト及びチオサルフェートから選択される少なくとも１つのさらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、さらに、フッ化ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、ピロホスフェート、リン酸カリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びＡＭＰから選択される少なくとも１つの成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも２つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも３つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも４つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも５つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、さらに、マグネシウムイオン、クエン酸バッファー、ＭＥＳバッファー、フッ化ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、ピロホスフェート、リン酸カリウム及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含んでいてもよい。この組成物は、クエン酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、マグネシウムイオン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、リン酸カリウム、消泡剤、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン及びＡＭＰを含んでいてもよい。この組成物は、Ｌ−ルシフェリンを含まない組成物と比較して、約０℃〜約３５℃の温度で貯蔵したとき、向上した貯蔵寿命及び／または安定性を有するだろう。
【００１８】
本開示は、Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン及びＡＴＰを含み、Ｌ−ルシフェリンの濃度が、Ｄ−ルシフェリンの濃度を超える組成物に関する。この組成物は、ｐＨが少なくとも約５であり、約９未満であってもよい。ルシフェラーゼは、甲虫ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼまたはクリックビートルルシフェラーゼであってもよい。Ｄ−ルシフェリンは、Ｄ−５’フルオロルシフェリンであってもよく、Ｌ−ルシフェリンは、Ｌ−５’フルオロルシフェリンである。この組成物は、さらに、バッファー、タンパク質安定化剤、マグネシウムイオン、金属キレート化剤、洗剤、消泡剤、無機ホスフェート、ピロホスフェート、ＡＭＰ、補酵素Ａ、還元剤、またはこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのさらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、硫酸マグネシウム及びｔｒａｎｓ−１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）を含んでいてもよい。この組成物は、さらに、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ洗剤、Ｍａｚｕ消泡剤、硫酸マグネシウム、ＡＴＰ、補酵素Ａ、ピロホスフェート、ＤＴＴ、スルファイト及びチオサルフェートから選択される少なくとも１つのさらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、さらに、フッ化ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、ピロホスフェート、リン酸カリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びＡＭＰから選択される少なくとも１つの成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも２つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも３つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも４つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも５つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、マグネシウムイオン、クエン酸バッファー、ＭＥＳバッファー、フッ化ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、ピロホスフェート、リン酸カリウム及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含んでいてもよい。この組成物は、クエン酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、マグネシウムイオン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、リン酸カリウム、消泡剤、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン及びＡＭＰを含んでいてもよい。この組成物は、Ｌ−ルシフェリンを含まない組成物と比較して、約０℃〜約３５℃の温度で貯蔵したとき、向上した貯蔵寿命及び／または安定性を有するだろう。
【００１９】
本開示は、向上した貯蔵寿命及び／または安定性を有する組成物に関する。この組成物は、ルシフェラーゼ、Ｌ−ルシフェリン及びＤ−ルシフェリンを含んでいてもよく、この組成物は、本質的にＡＴＰを含まない。ルシフェラーゼは、甲虫ルシフェラーゼであってもよい。甲虫ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼまたはクリックビートルルシフェラーゼであってもよい。この組成物は、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンの比率が、少なくとも約０．５：１〜約２：１であってもよい。この組成物は、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンの比率が、少なくとも約５：９５〜約５５：４５であってもよい。この反応混合物は、Ｌ−ルシフェリンを含まない組成物と比較して、約０℃〜約３５℃の温度で貯蔵したとき、向上した貯蔵寿命及び／または安定性を生じさせるだろう。この組成物は、ｐＨが少なくとも約５であり、約９未満であってもよい。Ｄ−ルシフェリンは、Ｄ−５’フルオロルシフェリンであってもよく、Ｌ−ルシフェリンは、Ｌ−５’フルオロルシフェリンである。この組成物は、さらに、バッファー、タンパク質安定化剤、マグネシウムイオン、金属キレート化剤、洗剤、消泡剤、無機ホスフェート、ピロホスフェート、ＡＭＰ、補酵素Ａ、還元剤、またはこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのさらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、硫酸マグネシウム及びｔｒａｎｓ−１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）を含んでいてもよい。この組成物は、さらに、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ洗剤、Ｍａｚｕ消泡剤、硫酸マグネシウム、ＡＴＰ、補酵素Ａ、ピロホスフェート、ＤＴＴ、スルファイト及びチオサルフェートから選択される少なくとも１つのさらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、さらに、フッ化ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、ピロホスフェート、リン酸カリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びＡＭＰから選択される少なくとも１つの成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも２つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも３つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも４つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも５つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、マグネシウムイオン、クエン酸バッファー、ＭＥＳバッファー、フッ化ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、ピロホスフェート、リン酸カリウム及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含んでいてもよい。この組成物は、クエン酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、マグネシウムイオン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、リン酸カリウム、消泡剤、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン及びＡＭＰを含んでいてもよい。
【００２０】
本開示は、向上した貯蔵寿命及び／または安定性を有する組成物に関する。この組成物は、Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン及びＡＴＰを含み、この組成物は、本質的にルシフェラーゼを含む。この組成物は、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンの比率が、少なくとも約０．５：１〜約２：１であってもよい。この組成物は、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンの比率が、少なくとも約５：９５〜約５５：４５であってもよい。この反応混合物は、Ｌ−ルシフェリンを含まない組成物と比較して、約０℃〜約３５℃の温度で貯蔵したとき、向上した貯蔵寿命及び／または安定性を有するだろう。この組成物は、ｐＨが少なくとも約５であり、約９未満であってもよい。Ｄ−ルシフェリンは、Ｄ−５’フルオロルシフェリンであってもよく、Ｌ−ルシフェリンは、Ｌ−５’フルオロルシフェリンである。この組成物は、さらに、バッファー、タンパク質安定化剤、マグネシウムイオン、金属キレート化剤、洗剤、消泡剤、無機ホスフェート、ピロホスフェート、ＡＭＰ、補酵素Ａ、還元剤、またはこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのさらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、硫酸マグネシウム及びｔｒａｎｓ−１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）を含んでいてもよい。この組成物は、さらに、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ洗剤、Ｍａｚｕ消泡剤、硫酸マグネシウム、ＡＴＰ、補酵素Ａ、ピロホスフェート、ＤＴＴ、スルファイト及びチオサルフェートから選択される少なくとも１つのさらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、さらに、フッ化ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、ピロホスフェート、リン酸カリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びＡＭＰから選択される少なくとも１つの成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも２つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも３つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも４つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも５つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、マグネシウムイオン、クエン酸バッファー、ＭＥＳバッファー、フッ化ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、ピロホスフェート、リン酸カリウム及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含んでいてもよい。この組成物は、クエン酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、マグネシウムイオン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、リン酸カリウム、消泡剤、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン及びＡＭＰを含んでいてもよい。
【００２１】
本開示は、向上した貯蔵寿命及び／または安定性を有する組成物に関する。この組成物は、Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン及びＡＴＰを含み、Ｌ−ルシフェリンの濃度が、Ｄ−ルシフェリンの濃度を超える。この反応混合物は、Ｌ−ルシフェリンを含まない組成物と比較して、約０℃〜約３５℃の温度で貯蔵したとき、向上した貯蔵寿命及び／または安定性を有するだろう。この組成物は、ｐＨが少なくとも約５であり、約９未満であってもよい。Ｄ−ルシフェリンは、Ｄ−５’フルオロルシフェリンであってもよく、Ｌ−ルシフェリンは、Ｌ−５’フルオロルシフェリンである。この組成物は、さらに、バッファー、タンパク質安定化剤、マグネシウムイオン、金属キレート化剤、洗剤、消泡剤、無機ホスフェート、ピロホスフェート、ＡＭＰ、補酵素Ａ、還元剤、またはこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのさらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、硫酸マグネシウム及びｔｒａｎｓ−１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）を含んでいてもよい。この組成物は、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ洗剤、Ｍａｚｕ消泡剤、硫酸マグネシウム、ＡＴＰ、補酵素Ａ、ピロホスフェート、ＤＴＴ、スルファイト及びチオサルフェートから選択される少なくとも１つのさらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、さらに、フッ化ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、ピロホスフェート、リン酸カリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びＡＭＰから選択される少なくとも１つの成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも２つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも３つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも４つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、少なくとも５つの前記さらなる成分を含んでいてもよい。この組成物は、マグネシウムイオン、クエン酸バッファー、ＭＥＳバッファー、フッ化ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、ピロホスフェート、リン酸カリウム及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含んでいてもよい。この組成物は、クエン酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、マグネシウムイオン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、リン酸カリウム、消泡剤、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン及びＡＭＰを含んでいてもよい。
【００２２】
本開示は、少なくとも１つの容器に封入された、上に記載したような組成物を含むキットに関する。
【００２３】
本開示は、第１の容器に封入された、上に記載したような組成物と、クエン酸バッファー、ＭＥＳバッファー、フッ化ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、ピロホスフェート、リン酸カリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びＡＭＰから選択される少なくとも１つの成分を含む第２の容器とを備える、キットに関する。この組成物は、Ｌ−ルシフェリンを含まない組成物と比較して、約０℃〜約３５℃の温度で貯蔵したとき、向上した貯蔵寿命及び／または安定性を有するだろう。
【００２４】
本開示は、上に記載したような組成物とサンプルとを接触させることと、生成した光を検出することによってサンプル中のＡＴＰの存在または量を決定することとを含む、サンプル中のＡＴＰの存在または量を決定するための方法に関する。サンプルは、無傷の細胞を含んでいてもよい。サンプルは、未精製細胞溶解物または清澄化した細胞溶解物を含んでいてもよい。細胞は、原核細胞または真核細胞であってもよい。サンプルは、ＡＴＰを生成するかまたはＡＴＰを使用する精製された酵素を含んでいてもよい。組成物は、Ｌ−ルシフェリンを含まない組成物と比較して、約０℃〜約３５℃の温度で貯蔵したときに比較される、向上した貯蔵寿命及び／または安定性を有するだろう。
【００２５】
本開示は、ルシフェラーゼを発現する細胞においてルシフェラーゼ活性を検出するための方法であって、この方法は、細胞内でルシフェラーゼを発現することと；ルシフェラーゼ、細胞、またはこれらの組み合わせと、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンの比率が（ｉ）少なくとも約５：９５〜約７５：２５、（ｉｉ）少なくとも約５：９５〜約５０：５０、（ｉｉｉ）約５：９５〜約２５：７５、または（ｉｖ）少なくとも約５：９５〜約２０：８０で、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンを含む混合物とを接触させることと；発光を検出することを含む、方法に関する。細胞を溶解してもよく、ルシフェラーゼを含む溶解した細胞を前記混合物と接触させてもよい。溶解した細胞を清澄化し、ルシフェラーゼを含む清澄化した細胞抽出物を作成してもよく、清澄化した細胞抽出物を前記混合物と接触させる。細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞であってもよい。混合物は、発光シグナルの半減期を長くするだろう。細胞は、ルシフェラーゼコード配列で一時的にトランスフェクトされてもよい。混合物は、ｐＨが少なくとも約６．５から約７．８未満、またはｐＨが少なくとも約６．６から少なくとも約６．８であってもよい。Ｄ−ルシフェリンは、Ｄ−５’フルオロルシフェリンであってもよく、Ｌ−ルシフェリンは、Ｌ−５’フルオロルシフェリンである。この組成物は、Ｌ−ルシフェリンを含まない組成物と比較して、約０℃〜約３５℃の温度で貯蔵したとき、向上した貯蔵寿命及び／または安定性を有するだろう。混合物は、ｐＨが約５〜約９であってもよい。
【００２６】
本開示は、ルシフェラーゼ反応を行うための方法に関する。この方法は、（ａ）Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンを含む組成物を約０℃〜約３５℃の温度で少なくとも約４時間の期間貯蔵し、貯蔵した混合物は、ルシフェラーゼ及びＡＴＰを含むアッセイにおいてサンプルと合わせたとき、光の出力を生成することができ、この期間の後の光の出力が、この期間の開始時の光の出力の少なくとも約５０％であることと；（ｂ）工程（ａ）の後、貯蔵した混合物と（ｉ）前記サンプル、（ｉｉ）ＡＴＰまたはＡＴＰ源、ルシフェラーゼ、またはこれらの組み合わせを合わせて反応アッセイを作成することと、生成した光を検出することとを含む。この期間は、少なくとも約１２時間であってもよく、この温度は、約０℃〜約６℃または約２０℃〜約３５℃である。サンプルは、ルシフェラーゼを含んでいてもよく、混合物は、ＡＴＰを含む。サンプルは、ＡＴＰを含んでいてもよく、混合物は、ルシフェラーゼを含む。この期間の後の光の出力は、この期間の開始時の光の出力の少なくとも約７５％であってもよい。混合物は、本質的にＡＴＰまたはルシフェラーゼを含まなくてもよい。この温度は、約２０℃〜約３５℃であってもよい。この温度は、約０℃〜約６℃であってもよく、この期間は、少なくとも約２週間である。この期間は、少なくとも約１２週間であってもよい。この期間は、少なくとも約２６週間であってもよい。この期間の後の光の出力が、この期間の開始時の光の出力の少なくとも約９０％であってもよい。この期間の後の光の出力が、この期間の開始時の光の出力の少なくとも約５０％であってもよい。この方法は、工程（ｂ）の後に、貯蔵した混合物と（ｉ）ルシフェラーゼ、（ｉｉ）ＡＴＰまたはＡＴＰ源、または（ｉｉｉ）これらの組み合わせを合わせ、第２の混合物を作成することと、第２の混合物中で生成した光を検出することとをさらに含んでいてもよい。混合物は、ｐＨが約５〜約９であってもよい。混合物は、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンの比率が、少なくとも約５：９５〜約７５：２５であってもよい。
【００２７】
本開示は、ルシフェラーゼ反応のための成分を配合するための方法に関する。この方法は、（ａ）Ｄ−ルシフェリン及びＬ−ルシフェリンを合わせて混合物を作成することと；（ｂ）約０℃〜約３５℃の温度で少なくとも約２日間の期間、混合物を貯蔵することとを含む。この混合物は、ルシフェラーゼを含むアッセイにおいてサンプルと合わせると光の出力を生成することができ、この期間の後の光の出力は、この期間の開始時の光の出力の少なくとも約５０％である。この混合物は、本質的にＡＴＰまたはルシフェラーゼを含まなくてもよい。この温度は、約２０℃〜約３５℃であってもよい。この温度は、約０℃〜約６℃であってもよく、この期間は、少なくとも約２週間である。この期間は、少なくとも約１２週間であってもよい。この期間は、少なくとも約２６週間であってもよい。この期間の後の光の出力は、この期間の開始時の光の出力の少なくとも約９０％であってもよい。この期間の後の光の出力は、この期間の開始時の光の出力の少なくとも約５０％であってもよい。この方法は、工程（ｂ）の後に、貯蔵した混合物と（ｉ）ルシフェラーゼ、（ｉｉ）ＡＴＰまたはＡＴＰ源、または（ｉｉｉ）これらの組み合わせを合わせ、第２の混合物を作成することと、第２の混合物中で生成した光を検出することとをさらに含んでいてもよい。混合物は、ｐＨが約５〜約９であってもよい。混合物は、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンの比率が、少なくとも約５：９５〜約７５：２５であってもよい。
【００２８】
本開示は、発光シグナルの半減期を長くするための方法に関する。この方法は、（ａ）ルシフェラーゼを含むサンプルと、Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン及びＡＴＰを含む混合物とを接触させ、反応アッセイを作成することと；（ｂ）発光を検出することとを含み、Ｄ−ルシフェリンを含み、Ｌ−ルシフェリンを実質的に含まない相当する反応アッセイと比較して、発光シグナルの半減期が長い。発光シグナルの半減期は、少なくとも約２５％長くなってもよい。発光シグナルの半減期は、少なくとも約５倍長くなってもよい。サンプルは、ルシフェラーゼを発現する細胞を含んでいてもよい。細胞を溶解し、サンプルは、ルシフェラーゼを含む溶解した細胞を含んでいてもよい。サンプルは、ルシフェラーゼを含む清澄化した細胞抽出物を含んでいてもよい。細胞は、原核細胞または真核細胞であってもよい。Ｄ−ルシフェリンは、Ｄ−５’フルオロルシフェリンであってもよく、Ｌ−ルシフェリンは、Ｌ−５’フルオロルシフェリンであり、相当する反応アッセイは、Ｄ−５’フルオロルシフェリンを含み、Ｌ−５’フルオロルシフェリンを実質的に含まない。
【００２９】
本開示は、ルシフェラーゼ反応を行うための方法に関する。この方法は、（ａ）組成物と、サンプル及びＡＴＰまたはＡＴＰ源、ルシフェラーゼ、またはこれらの組み合わせとを合わせて反応アッセイを作成し、前記組成物がＬ−ルシフェリン及びＤ−ルシフェリンを含むことと；（ｂ）生成した光を検出することとを含み、前記組成物を約０℃〜約３５℃の温度で少なくとも約４時間貯蔵したとき、Ｌ−ルシフェリンを含まない組成物と比較して、前記組成物が、向上した安定性を有する。貯蔵した組成物は、ルシフェラーゼ及びＡＴＰを含むアッセイにおいてサンプルと合わせたとき、光の出力を生成することができ、この期間の後の光の出力が、この期間の開始時の光の出力の少なくとも約５０％である。向上した安定性は、向上した貯蔵寿命及び／または向上したシグナル安定性を含んでいてもよい。この期間は、少なくとも約１２時間であってもよく、この温度は、約０℃〜約６℃または約２０℃〜約３５℃である。サンプルは、ルシフェラーゼを含んでいてもよく、組成物は、ＡＴＰを含んでいてもよい。サンプルは、ＡＴＰを含んでいてもよく、組成物は、ルシフェラーゼを含む。この期間の後の光の出力が、この期間の開始時の光の出力の少なくとも約７５％であってもよい。組成物は、本質的にＡＴＰまたはルシフェラーゼを含まなくてもよい。この温度は、約２０℃〜約３５℃であってもよい。この温度は、約０℃〜約６℃であってもよく、この期間は、少なくとも約２週間である。この期間は、少なくとも約１２週間であってもよい。この期間は、少なくとも約２６週間であってもよい。この期間の後の光の出力は、この期間の開始時の光の出力の少なくとも約９０％であってもよい。この期間の後の光の出力は、この期間の開始時の光の出力の少なくとも約５０％であってもよい。この方法は、工程（ｂ）の後に、前記組成物と（ｉ）ルシフェラーゼ、（ｉｉ）ＡＴＰまたはＡＴＰ源、または（ｉｉｉ）これらの組み合わせを合わせて混合物を作成することと、この混合物中で生成した光を検出することとをさらに含んでいてもよい。組成物は、ｐＨが約５〜約９であってもよい。組成物は、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンの比率が、少なくとも約５：９５〜約７５：２５であってもよい。
【００３０】
本開示は、ルシフェラーゼ反応のための成分を配合するための方法であって、この方法が、Ｄ−ルシフェリンとＬ−ルシフェリンを合わせて組成物を作成することを含み、前記組成物を約０℃〜約３５℃の温度で少なくとも約４時間貯蔵したとき、Ｌ−ルシフェリンを含まない組成物と比較して、前記組成物が、向上した安定性を有し、貯蔵した組成物は、ルシフェラーゼ及びＡＴＰを含むアッセイにおいてサンプルと合わせたとき、光の出力を生成することができ、この期間の後の光の出力が、この期間の開始時の光の出力の少なくとも約５０％である方法に関する。向上した安定性は、向上した貯蔵寿命及び／または向上したシグナル安定性を含んでいてもよい。組成物は、本質的にＡＴＰまたはルシフェラーゼを含んでいなくてもよい。この温度は、約２０℃〜約３５℃であってもよい。この温度は、約０℃〜約６℃であってもよく、この期間は、少なくとも約２週間である。この期間は、少なくとも約１２週間であってもよい。この期間は、少なくとも約２６週間であってもよい。この期間の後の光の出力は、この期間の開始時の光の出力の少なくとも約９０％であってもよい。この期間の後の光の出力は、この期間の開始時の光の出力の少なくとも約５０％であってもよい。この方法は、工程（ｂ）の後に、組成物と（ｉ）ルシフェラーゼ、（ｉｉ）ＡＴＰまたはＡＴＰ源、または（ｉｉｉ）これらの組み合わせを合わせて混合物を作成することと、この混合物中で生成した光を検出することとをさらに含んでいてもよい。組成物は、ｐＨが約５〜約９であってもよい。組成物は、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンの比率が、少なくとも約５：９５〜約７５：２５であってもよい。
【００３１】
本発明の他の態様は、詳細な記載及び添付の図面を考慮することによって明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、異なる温度で異なる時間、ルシフェリン混合物を貯蔵した後、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンを含有するアッセイから検出される発光を示すグラフである。
【図２】図２は、種々の時間ルシフェリンを貯蔵した後、Ｄ−ルシフェリンを含有するアッセイ、またはＤ−ルシフェリンとＬ−ルシフェリンの両方を含有するアッセイから検出される発光を示すグラフである。
【図３】図３は、種々の時間ルシフェリンを貯蔵した後、Ｄ−ルシフェリンを含有するアッセイ、またはＤ−ルシフェリンとＬ−ルシフェリンの両方を含有するアッセイから検出される発光を示すグラフである。
【図４】図４は、ルシフェラーゼレポーターアッセイ試薬における異なるＤ−／Ｌ−ルシフェリン（５’−フルオロルシフェリン）比率が、発光（４Ａ）及びシグナル半減期（４Ｂ）に与える影響を示すグラフを示す。
【図５】図５は、異なるＤ−／Ｌ−ルシフェリン（５’−フルオロルシフェリン）比率が、ルシフェラーゼレポーターアッセイ試薬の安定性に与える影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
貯蔵中の液体配合物におけるＤ−ルシフェリンからＬ−ルシフェリンへのラセミ化によって、ルシフェリンのＤ−エナンチオマー及びＬ−エナンチオマーの混合物が生じ、その中で、Ｄ−ルシフェリンは、ルシフェラーゼ酵素によって光を発生する基質として利用することができる。ルシフェラーゼのために利用可能なＤ−ルシフェリンの量が予測できないことは、ルシフェラーゼ活性を測定することに依存するアッセイ、例えば、サンプル中の代謝物（例えば、ＡＴＰ）の量を測定するアッセイでは問題である。アッセイ中のＬ−ルシフェリンの存在も、ルシフェラーゼ酵素の阻害剤として作用するため、問題であろう。
【００３４】
ある実施形態では、混合物で提供されるＤ−ルシフェリンとＬ−ルシフェリンの両方を含む組成物が開示される。ある実施形態では、この組成物をルシフェラーゼとともに使用し、ＡＴＰを利用する酵素（例えば、キナーゼ）の活性を測定することができ、ＡＴＰの量または濃度を測定することができ、ＡＴＰの中間産物を介し、サンプル中の特定の代謝物を測定することができ、所定期間にわたって安定な測定を提供することができ、またはこれらの組み合わせを得ることができる。ある実施形態では、組成物を使用し、細胞によって発現するルシフェラーゼの量を検出または測定することができる。驚くべきことに、Ｄ−ルシフェリンとＬ−ルシフェリンの両方を含む組成物は、実質的に純粋なＤ−ルシフェリンを含有する組成物、またはＤ−ルシフェリンを含み、Ｌ−ルシフェリンを実質的に含まない組成物、例えば、痕跡量のＬ−ルシフェリンを含む組成物よりも優れた安定性を示し、アッセイ性能の低下は最低限である。例えば、優れた安定性は、Ｌ−ルシフェリンが、存在するルシフェリン全体の少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％または少なくとも約７５％またはそれ以上存在するとき、またはＬ−ルシフェリンの量が、存在するＤ−ルシフェリンの量を超えるときに生じるだろう。ＡＴＰの中間産物を介して測定可能な代謝物としては、限定されないが、ヌクレオシドジホスフェート、例えば、アデノシンジホスフェート（ＡＤＰ）、グアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）、ウリジンジホスフェート（ＵＤＰ）、及びアデノシンモノホスフェート（ＡＭＰ）が挙げられる。特定の実施形態では、Ｄ−ルシフェリンとＬ−ルシフェリンの混合物を含む組成物は、場合によりルシフェラーゼを含み、場合により、ＡＴＰ、他のヌクレオシドトリホスフェート、ヌクレオシドジホスフェート、ヌクレオシドモノホスフェートまたはこれらの組み合わせを実質的に含まなくてもよい。他の実施形態では、Ｄ−ルシフェリンとＬ−ルシフェリンの混合物を含む組成物、例えば、Ｌ−ルシフェリンの濃度がＤ−ルシフェリンの濃度を超える混合物は、場合により、ＡＴＰを含んでいてもよい。
【００３５】
Ｄ−ルシフェリンとしては、化合物（Ｄ−（−）−２−（６’−ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−チアゾリン−４−カルボン酸）が挙げられ、Ｌ−ルシフェリンとしては、化合物（Ｌ−（−）−２−（６’−ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−チアゾリン−４−カルボン酸）及びこれらの塩形態が挙げられる。本明細書で使用する場合、Ｄ−異性体形態またはＬ−異性体形態のいずれかによらず、ルシフェリンは、塩形態、例えば、カリウム塩、ナトリウム塩、または他のアルカリ塩またはアルカリ土類塩、遊離酸及びルシフェリン誘導体及びこれらの塩形態、例えば、クロロルシフェリン及びフルオロルシフェリン、例えば、５’−フルオロルシフェリン、７’−フルオロルシフェリン及び５’−クロロルシフェリン及び７’−クロロルシフェリン、及び米国出願公開第２００９−００７５３０９号（開示内容全体が本明細書に参考として組み込まれる）に開示されるその他のものが挙げられる。
【００３６】
Ｄ−ルシフェリン及びＬ−ルシフェリン（Ｄ−ルシフェリン：Ｌ−ルシフェリン）は、少なくとも約０．２５：１、少なくとも約０．３：１、少なくとも約０．４：１、少なくとも約０．５：１、少なくとも約０．６：１、少なくとも約０．７：１、少なくとも約０．８：１、少なくとも約０．９：１、少なくとも約１：１及び約４未満：１、約３．７５未満：１、約３．５未満：１、約３．２５未満：１、約３未満：１、約２．７５未満：１、約２．５未満：１、約２．２５未満：１、約２未満：１、約１．９未満：１、約１．８未満：１、約１．７未満：１、約１．６未満：１、約１．５未満：１、約１．４未満：１、約１．３未満：１、約１．２５未満：１、約１．２未満：１または約１．１未満：１の比率で存在していてもよい。
【００３７】
Ｌ−ルシフェリン及びＤ−ルシフェリン（Ｌ−ルシフェリン：Ｄ−ルシフェリン）は、少なくとも約０．１：９９．９、少なくとも約１：９９、少なくとも約２：９８、少なくとも約３：９７、少なくとも約４：９６、少なくとも約５：９５、少なくとも約１０：９０、少なくとも約１５：８５、少なくとも約２０：８０、少なくとも約２５：７５、少なくとも約３０：７０、少なくとも約３５：６５、少なくとも約４０：６０、少なくとも約４５：５５、少なくとも約４９：５１、または少なくとも約５０：５０及び約９９未満：０．１、約９９未満：１、約９８未満：２、約９７未満：３、約９６未満：４、約９５未満：５、約９０未満：１０、約８５未満：１５、約８０未満：２０、約７５未満：２５、約７０未満：３０、約６５未満：３５、約６０未満：４０、約５５未満：４５、約５１未満：４９、または約５０未満：５０の比率で存在していてもよい。
【００３８】
Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン及び場合によりルシフェラーゼを含む混合物は、ヌクレオシドトリホスフェート、ヌクレオシドジホスフェートまたはこれらの任意の組み合わせを実質的に含まなくてもよく、または任意の量のヌクレオシドトリホスフェート、ヌクレオシドジホスフェートまたはこれらの任意の組み合わせを除外してもよい。例えば、Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン及び場合によりルシフェラーゼを含む混合物は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ｍ５ＵＴＰ、ＵＴＰまたはこれらの組み合わせを実質的に含まなくてもよく、または任意の量のＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ｍ５ＵＴＰ、ＵＴＰまたはこれらの組み合わせを除外してもよい。Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン及び場合によりルシフェラーゼを含む混合物は、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ＣＤＰ、ｍ５ＵＤＰ、ＵＤＰまたはこれらの組み合わせを実質的に含まなくてもよく、または任意の量のＡＤＰ、ＧＤＰ、ＣＤＰ、ｍ５ＵＤＰ、ＵＤＰまたはこれらの組み合わせを除外してもよい。Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン及び場合によりルシフェラーゼを含む混合物は、約５０μＭ未満のＡＴＰ、約１０μＭ未満のＡＴＰ、約５μＭ未満のＡＴＰ、約１μＭ未満のＡＴＰ、約０．５μＭ未満のＡＴＰ、約０．１μＭ未満のＡＴＰ、約０．０５μＭのＡＴＰ、約０．０１μＭ未満のＡＴＰ、約０．００５μＭ未満のＡＴＰ、または約０．００１μＭ未満のＡＴＰ、または約０．０００１μＭ未満のＡＴＰまたは本明細書に記載する他のヌクレオシドトリホスフェートを含んでいてもよい。
【００３９】
ある実施形態では、Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン及び場合によりルシフェラーゼを含む混合物は、少なくとも０．００５μＭのＡＴＰ、少なくとも約０．０１のＡＴＰ、少なくとも約０．０５μＭのＡＴＰ、少なくとも約０．１μＭのＡＴＰ、少なくとも約０．５μＭのＡＴＰ、少なくとも約１μＭのＡＴＰ、少なくとも約５μＭのＡＴＰ、少なくとも約１０μＭμＭのＡＴＰ、少なくとも約５０μＭのＡＴＰ及び約１０ｍＭ未満のＡＴＰ、約５ｍＭ未満のＡＴＰ、約４ｍＭ未満のＡＴＰ、約３ｍＭ未満のＡＴＰ、約２ｍＭ未満のＡＴＰ、約１ｍＭ未満のＡＴＰ、約０．５ｍＭ未満のＡＴＰを含んでいてもよい。例えば、このような混合物は、Ｌ−ルシフェリン：Ｄ−ルシフェリンの比率が、１より大きい：１、１．１より大きい：１、１．２より大きい：１、１．３より大きい：１、１．４より大きい：１、１．５より大きい：１、１．６より大きい：１、１．７より大きい：１、１．８より大きい：１、１．９より大きい：１、２より大きい：１、２．２５より大きい：１、２．５より大きい：１、２．７５より大きい：１、または３より大きい：１であってもよい。
【００４０】
Ｄ−ルシフェリンとＬ−ルシフェリンを含む混合物は、場合により、任意の量のヌクレオシドトリホスフェート（例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ）、ヌクレオシドジホスフェート（例えば、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ＣＤＰ）またはこれらの任意の組み合わせを実質的に含んでいてもよい。
【００４１】
Ｄ−ルシフェリンとＬ−ルシフェリンを含む混合物は、長期間にわたって安定なままであり、安定性は、この混合物をルシフェラーゼ活性アッセイに使用したときの光の出力によって測定される。向上した安定性は、向上した貯蔵寿命／安定性及び／または向上したシグナル安定性であってもよい。２２℃で８時間後または４℃で４日後に約１０％の活性の消失を示し得る従来の配合物とは対照的に、本発明の配合物は、向上した安定性、すなわち、向上した貯蔵寿命／安定性を示す。例えば、約４℃の温度（例えば、約１℃〜約６℃）または約２０℃〜２５℃または約２０℃〜約３５℃、例えば、約２２℃（例えば、約２０℃〜約２５℃、約２０℃〜約３５℃、約２２℃〜約３５℃、約２２℃〜約３０℃、約２５℃〜約３５℃、または約２５℃〜約３０℃）で貯蔵したとき、少なくとも約８時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約１ヶ月間、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約４ヶ月間、少なくとも約５ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約９ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２年間、少なくとも約３年間、少なくとも約４年間またはそれより長い貯蔵期間の後、元々の活性の少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が検出される（元々の活性は、所与の一連の条件で、Ｔ＝０でのルシフェラーゼ活性アッセイで測定され、その後の活性は、後の時間点で、実質的に同じ条件で測定される）。例えば、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンの約５０：５０の混合物を用いる本明細書に記載する方法、組成物及びキットは、約２０℃〜約２５℃、約２０℃〜約３５℃、約２２℃〜約３５℃、約２２℃〜約３０℃、約２５℃〜約３５℃、または約２５℃〜約３０℃の温度で少なくとも約２ヶ月間インキュベートした後、元々の活性の少なくとも約５０％が残っているだろう。
【００４２】
ルシフェラーゼ活性アッセイは、例えば、使用する酵素に最適なｐＨのバッファー中、ルシフェラーゼ、ルシフェリン（例えば、１ｍＭ）、ＡＴＰ（例えば、３ｍＭ）、ＭｇＳＯ4（例えば、１５ｍＭ）を含む。使用するルシフェラーゼの活性を最適化または安定化するために、他の任意要素の成分が存在していてもよい。ルシフェラーゼ活性アッセイの例は、実施例において本明細書に記載される。ある実施形態では、ルシフェラーゼを精製してもよく、または、サンプル（例えば、レポーター遺伝子）中で発現してもよい。
【００４３】
Ｄ−ルシフェリンとＬ−ルシフェリンの混合物を含むキット、方法及び組成物が本明細書で提供される。このキット、方法及び組成物は、１つ以上のルシフェラーゼを含んでいてもよく、またはこのキット、方法及び組成物を使用し、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用い、トランスフェクトされた原核細胞またはトランスフェクトされた真核細胞中、ルシフェラーゼをアッセイしてもよい。細胞は、例えば、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．など、哺乳動物細胞、例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、例えば、類人猿及びヒトの細胞、哺乳動物細胞株、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＶ−１、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ及びＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、植物細胞（双子葉植物または単子葉植物）または真菌細胞、例えば、酵母、例えば、Ｐｉｃｈｉａ、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓであってもよい。
【００４４】
基質としてルシフェリンを利用するルシフェラーゼとしては、甲虫ルシフェラーゼ、例えば、一般的なホタル（Ｌａｍｐｙｒｉｄａｅ科）のルシフェラーゼが挙げられる。甲虫ルシフェラーゼは、多くは、文献ではホタルルシフェラーゼと呼ばれる。しかし、ホタルルシフェラーゼは、実際に、甲虫ルシフェラーゼ綱のサブグループである。甲虫ルシフェラーゼは、クリックビートルルシフェラーゼ、例えば、Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ由来のルシフェラーゼも含む。甲虫ルシフェラーゼは、甲虫自身のランタンまたは当該技術分野で知られているタンパク質発現から精製されてもよい。
【００４５】
甲虫ルシフェラーゼ、特に、北アメリカのホタルＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓまたはＰｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａに由来するホタルルシフェラーゼは、当該技術分野でよく知られている。Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ（ＬｕｃＰｐｙ）は、遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質によって計算される場合、約５５０のアミノ酸（６１ｋＤａ）からなる。Ｐｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａホタルルシフェラーゼ（ＬｕｃＰｐｅ２）は、５４５アミノ酸残基からなる（ＧｅｎＢａｎｋ  ２１９０５３４；Ｙｅら、１９９７）。ＬｕｃＰｐｅ２から誘導される変異ルシフェラーゼ（例えば、熱に安定及び／または化学物質に安定）は、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ７８（７８−０Ｂ１０としても知られる）、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ９０（９０−１Ｂ５としても知られる）、ＬｕｃＰｐｅ２ｍｌ３３（１３３−１Ｂ２としても知られる）及びＬｕｃＰｐｅ２ｍｌ４６（１４６−１Ｈ２としても知られる）を含んでいてもよい。しかし、本明細書に記載する限定事項を満たす任意のルシフェラーゼを、本発明の組成物、方法及びキットに使用してもよい。熱に安定及び／または化学物質に安定なルシフェラーゼ（例えば、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ７８、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ９０、ＬｕｃＰｐｅ２ｍｌ３３及びＬｕｃＰｐｅ２ｍｌ４６）を誘導する方法は、ＰＣＴ／ＵＳ９９／３０９２５号に開示される。
【００４６】
単離及び／または精製されたルシフェラーゼを使用してもよい。ルシフェラーゼの天然環境の汚染要素は、典型的には、ルシフェラーゼアッセイを妨害する物質であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質系物質または非タンパク質系物質を含んでいてもよい。純度を確認するための一技術は、クマシーブルーまたは銀染色を用い、非還元条件または還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を適用することである。
【００４７】
本発明の組成物、キット及び方法で有用なルシフェラーゼとしては、安定なシグナルを生成するもの、及び／または熱に安定及び／または化学物質に安定なものが挙げられ、すなわち、ルシフェラーゼ反応が開始したときの発光と比較して、３０分あたりの発光の消失が５０％未満であると定義される、ルシフェラーゼ反応において向上した発光持続期間が得られるか、またはもっと高い温度でもっと大きな酵素安定性を有する。例示的なルシフェラーゼは、米国特許第６，１３２，９８３号；第６，１７１，８０８号；第６，２６５，１７７号；第６，６０２，６７７号；第７，２４１，５８４号；第７，９０６，２９８号；及び第８，０３０，０１７号；及び米国特許出願第２００３−００６８８０１号、第２００６−０１８３２１２号、第２００９−０１３７０１９号、第２０１１−０１７７５４０号及び第２０１２−０００９６４７号に開示され、それぞれの開示内容は、全体的に本明細書に参考として組み込まれる。
【００４８】
本発明の組成物、キット及び方法におけるルシフェラーゼとしては、「閃光」シグナルを生成し、光の出力の半減期が約３０分未満、約２５分未満、約２０分未満、約１５分未満、約１０分未満、約５分未満、約４分未満、約３分未満、約２分未満、または約１分未満のルシフェラーゼも挙げられる。
【００４９】
ルシフェラーゼとしては、５０℃で少なくとも２時間、または５０℃で少なくとも５時間の上昇した熱安定性を示すものが挙げられる。熱に安定なルシフェラーゼとしては、適切な水溶液に溶解するとき、半減期が約５０℃で約２時間より長く、５０℃で約５時間より長く、５０℃で約１０時間より長く、約６０℃で約５時間より長く、約６０℃で約１０時間より長く、約６０℃で約２４時間より長く、約２２℃で約３ヶ月より長く、または２２℃で約６ヶ月より長い安定性を有するものが挙げられる。
【００５０】
特定の実施形態では、本明細書に記載するようなＬ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンのラセミ混合物を含む反応混合物中に存在するルシフェラーゼの量を増やし、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンのラセミ混合物を含まない同様の反応混合物と実質的に同等の光の出力を得てもよい。例えば、ルシフェラーゼの量を、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンのラセミ混合物を含まない同様の反応混合物中のルシフェラーゼの量の少なくとも約１２０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％（２倍）、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％（５倍）、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも約８００％、少なくとも約９００％、または少なくとも約１０００％（１０倍）まで増やし、実質的に同等の光の出力を達成してもよい。
【００５１】
特定の実施形態では、本明細書に記載する組成物、方法及びキットは、ルシフェラーゼ反応中に生成した発光シグナルの半減期が長くなり、すなわち、シグナル安定性が向上する。Ｄ−ルシフェリンとＬ−ルシフェリンの混合物を含む本明細書に記載する組成物、方法及びキットは、発光シグナル（ルシフェラーゼ反応中に生成する光）の半減期を、純粋なＤ−ルシフェリンを含むか、またはＤ−ルシフェリンを含み、実質的にＬ−ルシフェリンを含まない、例えば、痕跡量のＬ−ルシフェリンを含むルシフェラーゼ反応から生成する発光シグナルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、または少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、または少なくとも約５００％長くしてもよい。ある実施形態では、実質的に純粋なＤ−ルシフェリンを含むか、またはＤ−ルシフェリンを含み、Ｌ−ルシフェリンを実質的に含まない、例えば、痕跡量のＬ−ルシフェリンを含むルシフェラーゼ反応から生成する発光シグナルと比較して、発光シグナルの半減期の少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１５倍、または少なくとも約２０倍の向上が達成される。
【００５２】
光の出力は、相対的光量単位（ＲＬＵ）で測定することができる。ある実施形態では、発光反応の初期の光の出力は、Ｄ−ルシフェリンとＬ−ルシフェリンの混合物を使用するときより低い。例えば、初期の光の出力は、実質的に純粋なＤ−ルシフェリンを含むか、またはＤ−ルシフェリンを含み、Ｌ−ルシフェリンを実質的に含まない、例えば、痕跡量のＬ−ルシフェリンを含む発光反応と比較して、初期の光の出力の約９５％未満、約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満であってもよい。ある実施形態では、もっと低い初期の光の出力は、本明細書で記載されるように、発光反応の半減期の向上を伴う。
【００５３】
本明細書に記載するキット、方法及び組成物において、ルシフェラーゼは、Ｌ−ルシフェリンとＤ−ルシフェリンを含有する溶液（例えば、水溶液）で与えられてもよく、または、例えば、Ｄ−ルシフェリン及びＬ−ルシフェリンとは別個の容器中、脱水した形態または乾燥した形態で与えられてもよく、使用前に可溶化する。ある実施形態では、ルシフェラーゼは、可溶化した形態のＤ−ルシフェリン及びＬ−ルシフェリンとは別個の容器中に与えられる。ルシフェリンの量は、Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリンまたはＤ−ルシフェリンとＬ−ルシフェリンのいずれかによらず、本明細書に記載される組成物、キット及び方法において、少なくとも約１ｎＭ、少なくとも約５ｎＭ、少なくとも約１０ｎＭ、少なくとも約５０ｎＭ、少なくとも約１００ｎＭ、少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約２５μＭ、少なくとも約５０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約２５０μＭ、少なくとも約０．５ｍＭ、少なくとも約１ｍＭ及び約５０ｍＭ未満、約４０ｍＭ未満、約３０ｍＭ未満、約３０ｍＭ未満、約１０ｍＭ未満、約５ｍＭ未満、約４ｍＭ未満、約３ｍＭ未満、または約２ｍＭ未満であってもよい。
【００５４】
本明細書に記載するキット、組成物及び方法は、本明細書に記載するＤ−ルシフェリンとＬ−ルシフェリンの混合物に加え、１つ以上のさらなる成分、例えば、ルシフェラーゼ；バッファー、例えば、クエン酸またはクエン酸バッファー、ＭＥＳ、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、またはＨＥＰＥＳ；無機ホスフェート、例えば、ピロホスフェートまたはリン酸カリウムの形態で；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ、ＣＤＴＡまたは１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸；塩、例えば、フッ化ナトリウム、硫酸マグネシウム；界面活性剤または洗剤、例えば、ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）（例えば、非イオン性ノニルフェノールエトキシレート）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）またはＴＨＥＳＩＴ（登録商標）（ヒドロキシポリエトキシドデカン）；消泡剤、例えば、ＩＮＤＵＳＴＲＯＬ（登録商標）ＤＦ２０４（有機消泡剤）またはＭＡＺＵ（登録商標）ＤＦ（シリコーン消泡剤）；タンパク質安定化剤、例えば、ゼラチン、ＰＲＩＯＮＥＸ（登録商標）１０％（ゼラチン、Ａ型）またはアルブミン（例えば、ＢＳＡ、ＨＳＡ）またはグリセロール；アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）またはアデノシンモノホスフェート（ＡＭＰ）を含んでいてもよい。他の成分としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピリジン、クラウンエーテル、またはシクロデキストリンが挙げられるだろう。さらなる成分としては、例えば、チオール化合物、例えば、補酵素Ａ、還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、または還元剤として作用する硫黄含有化合物、例えば、スルファイト、チオサルフェートのうち、１つ以上が挙げられるだろう。
【００５５】
キット、組成物及び方法に含まれ得る洗剤としては、カチオン性、アニオン性、非イオン性または両性イオン性の洗剤が挙げられる。洗剤は、例えば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）洗剤（ポリグリコールエーテル（非イオン性））、Ｂｒｉｊ  ３５（登録商標）洗剤（ポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル）、Ｂｒｉｊ  ５８（登録商標）洗剤（ポリオキシエチレン２０セチルエーテル（ＨＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）20Ｃ16Ｈ33））、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）洗剤（４−（１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール（ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ6Ｈ4−−（ＯＣＨ2ＣＨ2）xＯＨ、ｘ＝９−１０））、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−３０５（登録商標）洗剤（４）−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１（登録商標）洗剤（ポリオキシエチレン−９，１０分枝鎖ノニルフェニルエーテル）、ＣＨＡＰＳ（登録商標）洗剤（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、Ｃｈａｐｓｏ（登録商標）洗剤（３−（［３−コラミドプロピル］ジメチルアンモニオ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）、Ｂｉｇｃｈａｐ（登録商標）洗剤（Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド）、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）洗剤（ポリエチレングリコール４００ドデシルエーテル（ＨＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n（ＣＨ2）11ＣＨ3））、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ６４（登録商標）洗剤（ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（プロピレングリコール）−ブロック−ポリ（エチレングリコール））、Ｒｈｏｄａｓｕｒｆ  ８７０（登録商標）洗剤（ポリエトキシル化（２０）オレイルアルコール）、Ｃｈｅｍａｌ  ＬＡ−９（登録商標）洗剤（ポリオキシエチレン９ラウリルアルコール）、Ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ４６５（登録商標）洗剤（２，４，７，９−テトラメチル−５−デセイン−４，７−ジオールエトキシレート１０）、デオキシコレート、ＣＴＡ  ３、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃ０８（登録商標）洗剤（Ｃ８＝オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド）、またはＰｉｅｒｃｅ  Ｃ１０（登録商標）洗剤（ｎ−デシル−.β.−Ｄ−マルトシド（Ｃ１０アルキル側鎖））を含んでいてもよい。
【００５６】
本明細書に記載する方法、キット及び組成物、またはＤ−ルシフェリン及びＬ−ルシフェリンを利用する本明細書に記載するアッセイに使用されるＤ−ルシフェリンとＬ−ルシフェリンを含有する混合物は、ｐＨが、少なくとも約５、少なくとも約５．１、少なくとも約５．２、少なくとも約５．３、少なくとも約５．４、少なくとも約５．５、少なくとも約５．６、少なくとも約５．７、少なくとも約５．８、少なくとも約５．９、少なくとも約６、少なくとも約６．１、少なくとも約６．２、少なくとも約６．３、少なくとも約６．４、少なくとも約６．５、少なくとも約６．６、少なくとも約６．７、少なくとも約６．８、少なくとも約６．９、少なくとも約７、少なくとも約７．１、少なくとも約７．２、少なくとも約７．３、少なくとも約７．４、少なくとも約７．５、少なくとも約７．６、少なくとも約７．７、少なくとも約７．８、少なくとも約７．９、少なくとも約８、少なくとも約８．１、少なくとも約８．２、少なくとも約８．３、少なくとも約８．４、または少なくとも約８．５、約９未満、約８．９未満、約８．８未満、約８．７未満、約８．６未満、約８．５未満、約８．４未満、約８．３未満、約８．２未満、約８．１未満、約８未満、約７．９未満、約７．８未満、約７．７未満、約７．６未満、約７．５未満、約７．４未満、約７．３未満、約７．２未満、約７．１未満、約７未満、約６．９未満、約６．８未満、約６．７未満、約６．６未満、または約６．５未満であってもよい。ｐＨは、迅速な速度での明るい発光を促進する環境（例えば、約８〜９のｐＨ）、またはもっと持続的な発光を与えるもっと遅い速度の発光を促進する環境（例えば、約７．５未満または約７未満のｐＨ）を与えるように、混合物組成物またはアッセイ中で維持されていてもよい。
【００５７】
所定期間貯蔵される前に、本明細書に記載する任意の比率でＤ−ルシフェリンとＬ−ルシフェリンを合わせてもよい。本明細書に開示されるキットまたは組成物のルシフェラーゼ、ＡＴＰ、または任意の他の成分を、場合により、貯蔵前にＤ−ルシフェリンとＬ−ルシフェリンの混合物と合わせてもよい。混合物を、少なくとも約−８５℃、少なくとも約−８０℃、少なくとも約−７５℃、少なくとも約−５０℃、少なくとも約−４０℃、少なくとも約−３０℃、少なくとも約−２５℃、少なくとも約−２０℃、少なくとも約０℃、少なくとも約１℃、少なくとも約２℃、少なくとも約３℃または少なくとも約４℃、約４５℃未満、約４０℃未満、約３８℃未満、約３５℃未満、約３０℃未満、約２５℃未満、約２２℃未満、約２１℃未満、約２０℃未満、約１５℃未満、約１０℃未満、約８℃未満、または約６℃未満の温度で所定期間貯蔵してもよい。貯蔵のための所定期間は、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１日間、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約４週間、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約４ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、または少なくとも約１２ヶ月間であってもよい。貯蔵期間後に残っているＤ−ルシフェリンの量は、貯蔵前の混合物中のＤ−ルシフェリンの初期の量の少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５４％、少なくとも約５３％、少なくとも約５２％、または少なくとも約５１％であってもよい。貯蔵期間後に残っているＤ−ルシフェリンの量は、例えば、配合物が、貯蔵前に、Ｄ−ルシフェリンより多くのＬ−ルシフェリンを含む場合、貯蔵前の混合物中のＤ−ルシフェリンの初期の量の少なくとも約１０１％、少なくとも約１０５％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１１５％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約１０００％であってもよい。
【００５８】
本明細書に開示する組成物及びキットを使用し、光を生成するルシフェラーゼ−ルシフェリン反応によってサンプル中のＡＴＰの存在または量をアッセイしてもよい。ＡＴＰは、ＡＴＰを利用する反応（例えば、キナーゼ反応）の後のサンプル中に存在していてもよく、サンプル中のＡＴＰの量及び生成した光は、ＡＴＰを利用する酵素の活性の量と逆比例する。サンプルは、無傷の細胞を含有していてもよく、未精製細胞溶解物または清澄化した細胞溶解物を含有していてもよく、またはＡＴＰを生成するか、またはＡＴＰを使用する精製された酵素を含んでいてもよい。細胞は、原核細胞または真核細胞であってもよい。
【００５９】
本明細書に開示する組成物及びキットを使用し、サンプル中のルシフェラーゼの存在または量をアッセイしてもよい。ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ遺伝子、例えば、レポーター遺伝子のトランスフェクション（例えば、一時的または安定なトランスフェクション）後のサンプルに存在していてもよい。サンプルは、無傷の細胞、未精製細胞溶解物または清澄化した細胞溶解物を含有していてもよく、または、例えば、全動物イメージングのために全動物を含んでいてもよい。ルシフェラーゼは、細胞を含まない抽出物（例えば、ウサギ網状赤血球溶解物または小麦胚芽翻訳系）におけるルシフェラーゼコード配列の発現後のサンプル中に存在していてもよい。細胞は、原核細胞または真核細胞であってもよい。
【００６０】
本発明は、その適用において、本記載に記載されるか、または以下の図面に示される成分の構築及び配置の詳細に限定されないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、種々の様式で実施することができるか、または行うことができる。
【００６１】
本明細書で引用される任意の数値範囲は、下限値から上限値までのすべての値を含むことが理解されるべきである。例えば、ある濃度範囲が１％〜５０％と述べられている場合、例えば、２％〜４０％、１０％〜３０％、または１％〜３％などの値が、本明細書に明示的に挙げられていることを意図する。本明細書に引用される任意の数値範囲が、少なくともその下限値から、上限値がないすべての値、及び下限値がなく、その上限値までのすべての値を含むことも理解されるべきである。これらは、具体的に意図される単なる例であり、その最小値と、挙げられている最大値自体を含め、その間の数値範囲のあらゆる可能な組み合わせが、本出願に明示的に述べられていると考えられる。
【００６２】
本発明が、その適用において、本記載に記載される成分の構築及び配置の詳細に限定されないことも理解されるべきである。また、本明細書に使用される用語及び専門用語は、記載の目的のためであり、限定するとみなすべきではないことを理解すべきである。本発明を記述する観点で、「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」及び同様の指示語の使用は、本明細書に特に指示がなく、内容と明確に矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を包含すると解釈すべきである。「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、特記しない限り、非限定の用語として解釈すべきである（すなわち、「限定されないが、〜を含む」を意味する）。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書に特に指示がなく、内容と明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書に引用される特許明細書、特許及び文献は、具体的に、かつ完全に、全体的に参考として組み込まれる。矛盾する解釈が可能である場合、本開示に従う。
【００６３】
本明細書に提供される任意の実施例または例示的な言語及びすべての実施例または例示的な言語の使用（例えば、「例えば」）は、単に、本開示の態様及び実施形態を示すことを意図しており、特許請求の範囲を限定しない。
【実施例】
【００６４】
（実施例１：促進された安定性）
５ｍＭのＬ−ルシフェリンをＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｕｌｔｒａ−Ｇｌｏルシフェラーゼ及び５ｍＭのＤ−ルシフェリンを含有するＡＴＰ検出試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に溶解した。小分けし、種々の時間、種々の温度に放置し、次いで、−８０℃で貯蔵した。すべてのサンプルを同時に室温まで解凍し、次いで、１μＭのＡＴＰ水溶液と１：１で混合した。１０分後にＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＲＬＵ）を測定した。結果を図１に示す。
【００６５】
もっと高温での崩壊速度から、アレニウス式を使用し、もっと低い温度での崩壊速度を計算した。２２℃で、性能の１０％消失が８．６日目に起こると計算された。４℃で、それぞれ４．２ヶ月及び２年で１０％及び５０％の消失が計算された。−２０℃で、２０年で１０％の消失が計算された。
【００６６】
（実施例２：２２℃でのリアルタイム安定性。）
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏに５ｍＭのＬ−ルシフェリンを含むもの及び含まないものの小分け分を種々の時間、２２℃で放置し、次いで、−８０℃で貯蔵した。すべてのサンプルを同時に室温まで解凍し、次いで、１μＭのＡＴＰ水溶液と１：１で混合した。１０分後にＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＲＬＵ）を測定した。結果を図２に示す。
【００６７】
２２℃で、それぞれ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏで、Ｌ−ルシフェリンを含むもの及び含まないものについて、約１２時間または約２週間で、性能の１０％の消失が起こった。
【００６８】
（実施例３−ルシフェリン及び５’−フルオロルシフェリンの比較）
５ｍＭのＬ−異性体ルシフェリンまたはフルオロルシフェリンを、５ｍＭのそれぞれのＤ−異性体を含有する試薬（５００ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６、４００ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＣＤＴＡ、２０ｍＭのＭｇＳＯ４、２ｍＭのＮａＦ、１５μＭのテトラナトリウムピロホスフェート、２％のＴｈｅｓｉｔ、１％のＤＴＡＢ、０．２％のＭａｚｕ及び０．２１ｍｇ／ｍｌのＵｌｔｒａ−Ｇｌｏ）に溶解した。次いで、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏを含むそれぞれの試薬を、２μＭのＡＴＰ水溶液と１：１で混合し、長期間にわたって発光（ＲＬＵ）を測定した。結果を表１に示す。
【００６９】
表１
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【００７０】
Ｄ−異性体を比較するとき、光の出力において中程度の差しか存在しないが、５’−フルオロルシフェリンの異性体混合物は、ほぼ同じシグナル半減期を有するルシフェリンよりもかなり明るい。
【００７１】
（実施例４。天然のホタルルシフェラーゼを含有する試薬の向上した安定性）
１ｍＭのＬ−ルシフェリンを、１ｍＭのＤ−ルシフェリン及び１３．５４μｇ／ｍｌの天然ホタルルシフェラーゼ（ＱｕａｎｔｉＬｕｍ（登録商標）組み換えルシフェラーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を含有する試薬（５０ｍＭの酢酸Ｍｇ、２５ｍＭのトリスアセテート、ｐＨ７．７５、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．００２％のアジド、０．５ｍＭのＤＴＴ、１．３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）に溶解した。小分け分を種々の時間、２２℃で放置し、次いで、−８０℃で貯蔵した。すべてのサンプルを同時に室温まで解凍し、次いで、注入によって２０μＭのＡＴＰ水溶液と１：１で混合した。１０秒の崩壊後、発光（ＲＬＵ）を測定し、１０秒間積分した。結果を図３に示す。
【００７２】
２２℃で、Ｌ−異性体のルシフェリンを含む試薬、または含まない試薬を用い、それぞれ約５時間及び約５０時間で性能の１０％消失が起こった。
【００７３】
（実施例５。ルシフェラーゼレポーターアッセイ試薬中の異なるＤ−／Ｌ−ルシフェリンの比率が、発光及びシグナル半減期に与える影響）
ホタルルシフェラーゼ（ＣＭＶ−Ｆｌｕｃ）を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、１００μｌの完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋１×ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸））中、２．５×ｌ０5細胞／ｍｌで白色９６ウェルプレートに置いた。次いで、この細胞を３７℃、５％  ＣＯ2で一晩インキュベートした。一晩インキュベーションした後、このプレートを２２℃で平衡状態にした。１００：０；９５：５；９０：１０；８５：１５；８０：２０；または７５：２５のＤ−／Ｌ−５’−フルオロルシフェリンの１ｍＭのルシフェリンを含むホタルルシフェラーゼレポーターアッセイ試薬１００μｌを上述の細胞に加え（ｎ＝３）、３分間混合しつつインキュベーションした。ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ＋を用い、２２℃で発光を３分ごとに５時間測定した。
【００７４】
図４は、異なるＤ−／Ｌ−ルシフェリンの比率が、初期の発光（ＲＬＵ）（Ａ）及びシグナル半減期（Ｂ）に与える影響を示す。この発光を指数関数型崩壊にフィッティングすることによって、シグナル半減期を計算した。
【００７５】
（実施例６。異なるＤ−／Ｌ−ルシフェリンの比率が、ルシフェラーゼレポーターアッセイ試薬の安定性に与える影響）
種々の比率のＤ−／Ｌ−５’−フルオロルシフェリン（１００：０；９０：１０；８０：２０；７０：３０；６０：４０；及び５０：５０）を含むホタルルシフェラーゼレポーターアッセイ試薬を作成した。それぞれの試薬を１８０μｌの小分けに分注し、２２℃の水中、種々の時間（０日間、１日間、２日間、３日間、４日間または５日間）インキュベーションした。それぞれの期間の後、それぞれの比率を有する試薬の小分け分を−８０℃で凍結した。この期間が終わった後、すべての小分け分を解凍し、ピペットで上下させることにより混合し、９６ウェルプレートの３連のウェルに５０μｌを移し、次いで、２２℃で平衡状態にした。精製したホタルルシフェラーゼ（ＱｕａｎｔｉＬｕｍ）を、０．１％のＰｒｉｏｎｅｘを追加したＤＭＥＭで０．６９μｇ／ｍｌになるように希釈し、５０μｌをそれぞれのウェルに加え、３分間混合した。ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ＋ルミノメータで発光を読み取った。
【００７６】
図５は、Ｄ−／Ｌ−５’フルオロルシフェリンの比率が５０：５０に近づくにつれて、ルシフェラーゼレポーターアッセイ試薬の向上した室温安定性を示す。
【００７７】
本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔１〕ルシフェラーゼ、Ｌ−ルシフェリン及びＤ−ルシフェリンを含み、本質的にＡＴＰを含まない、組成物。
〔２〕Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン及びＡＴＰを含み、本質的にルシフェラーゼを含まない、組成物
〔３〕Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン及びＡＴＰを含む組成物であって、前記Ｌ−ルシフェリンの濃度が、前記Ｄ−ルシフェリンの濃度を超える、組成物。
〔４〕Ｌ−ルシフェリン対Ｄ−ルシフェリンの比率が、少なくとも約０．５：１〜約２：１である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の組成物。
〔５〕Ｌ−ルシフェリン対Ｄ−ルシフェリンの比率が、少なくとも約５：９５〜約５５：４５である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の組成物。
〔６〕約５以上約９未満のｐＨを有する、前記〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔７〕前記ルシフェラーゼが、甲虫ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼである、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔８〕前記Ｄ−ルシフェリンが、Ｄ−５’フルオロルシフェリンであり、前記Ｌ−ルシフェリンが、Ｌ−５’フルオロルシフェリンである、前記〔１〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔９〕バッファー、タンパク質安定化剤、マグネシウムイオン、金属キレート化剤、洗剤、消泡剤、無機ホスフェート、ピロホスフェート、ＡＭＰ、補酵素Ａ、還元剤、又はこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの更なる成分を更に含む、前記〔１〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔１０〕硫酸マグネシウム及びｔｒａｎｓ−１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）を含む、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１１〕１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ洗剤、Ｍａｚｕ消泡剤、硫酸マグネシウム、ＡＴＰ、補酵素Ａ、ピロホスフェート、ＤＴＴ、スルファイト及びチオサルフェートから選択される少なくとも１つの更なる成分を更に含む、前記〔１〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔１２〕フッ化ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、ピロホスフェート、リン酸カリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びＡＭＰから選択される少なくとも１つの成分を更に含む、前記〔１〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔１３〕少なくとも２つの前記更なる成分を含む、前記〔９〕、〔１１〕又は〔１２〕に記載の組成物。
〔１４〕少なくとも３つの前記更なる成分を含む、前記〔９〕、〔１１〕又は〔１２〕に記載の組成物。
〔１５〕少なくとも４つの前記更なる成分を含む、前記〔９〕、〔１１〕又は〔１２〕に記載の組成物。
〔１６〕少なくとも５つの前記更なる成分を含む、前記〔９〕、〔１１〕又は〔１２〕に記載の組成物。
〔１７〕マグネシウムイオン、クエン酸バッファー、ＭＥＳバッファー、フッ化ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、ピロホスフェート、リン酸カリウム及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を更に含む、前記〔１〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔１８〕クエン酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、マグネシウムイオン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、リン酸カリウム、消泡剤、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン及びＡＭＰを含む、前記〔１〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔１９〕前記甲虫ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼ又はクリックビートルルシフェラーゼである、前記〔７〕に記載の組成物。
〔２０〕実質的にＬ−ルシフェリンを有さない組成物と比較して、約０℃〜約３５℃の温度で貯蔵したとき、増大した貯蔵寿命及び／又は安定性を有する、前記〔１〕〜〔１９〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔２１〕増大した貯蔵寿命及び／又は安定性を有する組成物であって、ルシフェラーゼ、Ｌ−ルシフェリン及びＤ−ルシフェリンを含み、本質的にＡＴＰを含まない、前記組成物。
〔２２〕前記ルシフェラーゼが甲虫ルシフェラーゼである、前記〔２１〕に記載の組成物。
〔２３〕前記甲虫ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼ又はクリックビートルルシフェラーゼである、前記〔２１〕又は〔２２〕に記載の組成物。
〔２４〕増大した貯蔵寿命及び／又は安定性を有する組成物であって、Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン及びＡＴＰを含み、本質的にルシフェラーゼを含まない、前記組成物。
〔２５〕Ｌ−ルシフェリン対Ｄ−ルシフェリンの比率が、少なくとも約０．５：１〜約２：１である、前記〔２１〕〜〔２４〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔２６〕Ｌ−ルシフェリン対Ｄ−ルシフェリンの比率が、少なくとも約５：９５〜約５５：４５である、前記〔２１〕〜〔２４〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔２７〕増大した貯蔵寿命及び／又は安定性を有する組成物であって、前記組成物が、Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン及びＡＴＰを含み、Ｌ−ルシフェリンの濃度が、Ｄ−ルシフェリンの濃度を超える、前記組成物。
〔２８〕反応混合物が、実質的にＬ−ルシフェリンを有さない組成物と比較して、約０℃〜約３５℃の温度で貯蔵したとき、増大した貯蔵寿命を有する及び／又は安定性が生じる、前記〔２１〕〜〔２７〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔２９〕約５以上約９未満のｐＨを有する、前記〔２１〕〜〔２８〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔３０〕前記Ｄ−ルシフェリンが、Ｄ−５’フルオロルシフェリンであり、前記Ｌ−ルシフェリンが、Ｌ−５’フルオロルシフェリンである、前記〔２１〕〜〔２９〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔３１〕バッファー、タンパク質安定化剤、マグネシウムイオン、金属キレート化剤、洗剤、消泡剤、無機ホスフェート、ピロホスフェート、ＡＭＰ、補酵素Ａ、還元剤、又はこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの更なる成分を更に含む、前記〔２１〕〜〔３０〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔３２〕硫酸マグネシウム及びｔｒａｎｓ−１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）を含む、前記〔３１〕に記載の組成物。
〔３３〕１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ洗剤、Ｍａｚｕ消泡剤、硫酸マグネシウム、ＡＴＰ、補酵素Ａ、ピロホスフェート、ＤＴＴ、スルファイト及びチオサルフェートから選択される少なくとも１つの更なる成分を更に含む、前記〔２１〕〜〔３２〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔３４〕フッ化ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、ピロホスフェート、リン酸カリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びＡＭＰから選択される少なくとも１つの成分を更に含む、前記〔２１〕〜〔３３〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔３５〕少なくとも２つの前記更なる成分を含む、前記〔３１〕、〔３３〕又は〔３４〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔３６〕少なくとも３つの前記更なる成分を含む、前記〔３１〕、〔３３〕又は〔３４〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔３７〕少なくとも４つの前記更なる成分を含む、前記〔３１〕、〔３３〕又は〔３４〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔３８〕少なくとも５つの前記更なる成分を含む、前記〔３１〕、〔３３〕又は〔３４〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔３９〕マグネシウムイオン、クエン酸バッファー、ＭＥＳバッファー、フッ化ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、ピロホスフェート、リン酸カリウム及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を更に含む、前記〔２１〕〜〔３０〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔４０〕クエン酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、マグネシウムイオン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、リン酸カリウム、消泡剤、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン及びＡＭＰを含む、前記〔２１〕〜〔３０〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔４１〕少なくとも１つの容器に封入された前記〔１〕〜〔４０〕のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。
〔４２〕第１の容器に封入された前記〔１〕〜〔８〕及び〔１９〕〜〔３０〕のいずれか一項に記載の組成物と、クエン酸バッファー、ＭＥＳバッファー、フッ化ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、ヒドロキシポリエトキシドデカン、消泡剤、ピロホスフェート、リン酸カリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びＡＭＰから選択される少なくとも１つの成分を含む第２の容器とを備える、キット。
〔４３〕実質的にＬ−ルシフェリンを有さない組成物と比較して、前記組成物が、約０℃〜約３５℃の温度で貯蔵したとき、増大した貯蔵寿命及び／又は安定性を有する、前記〔４１〕又は〔４２〕に記載のキット。
〔４４〕前記〔１〕、〔４〕〜〔１７〕、〔１９〕〜２３、２５、２６及び２８〜３９のいずれか一項に記載の組成物とサンプルとを接触させる工程と、生成される発光を検出することによってサンプル中のＡＴＰの存在又は量を決定する工程とを含む、サンプル中のＡＴＰの存在又は量を決定するための方法。
〔４５〕前記サンプルが無傷の細胞を含む、前記〔４４〕に記載の方法。
〔４６〕前記サンプルが、未精製細胞溶解物又は清澄化した細胞溶解物を含む、前記〔４４〕に記載の方法。
〔４７〕前記細胞が、原核細胞又は真核細胞である、前記〔４５〕又は〔４６〕に記載の方法。
〔４８〕前記サンプルが、ＡＴＰを生成するか又はＡＴＰを使用する精製された酵素を含む、前記〔４４〕〜〔４７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４９〕前記組成物が、実質的にＬ−ルシフェリンを有さない組成物と比較して、約０℃〜約３５℃の温度で貯蔵したときに比較される、増大した貯蔵寿命及び／又は安定性を有する、前記〔４４〕〜〔４８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５０〕ルシフェラーゼを発現する細胞においてルシフェラーゼ活性を検出するための方法であって、前記細胞内でルシフェラーゼを発現する工程と、前記ルシフェラーゼ、前記細胞、又はこれらの組み合わせと混合物とを接触させる工程であって、前記混合物が、（ｉ）少なくとも約５：９５〜約７５：２５、（ｉｉ）少なくとも約５：９５〜約５０：５０、（ｉｉｉ）約５：９５〜約２５：７５、又は（ｉｖ）少なくとも約５：９５〜約２０：８０のＬ−ルシフェリン対Ｄ−ルシフェリンの比率で、Ｌ−ルシフェリン及びＤ−ルシフェリンを含む工程と、発光を検出する工程とを含む、方法。
〔５１〕前記細胞を溶解し、前記ルシフェラーゼを含む溶解した細胞を前記混合物と接触させる、前記〔５０〕に記載の方法。
〔５２〕前記溶解した細胞を清澄化し、前記ルシフェラーゼを含む清澄化した細胞抽出物を形成し、前記清澄化した細胞抽出物を前記混合物と接触させる、前記〔５１〕に記載の方法。
〔５３〕前記細胞が、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞である、前記〔５０〕〜〔５２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５４〕前記混合物が、発光シグナルの半減期を増大させる、前記〔５０〕〜〔５３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５５〕前記細胞が、ルシフェラーゼコード配列で一時的にトランスフェクトされる、前記〔５０〕〜〔５４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５６〕前記混合物が、少なくとも約６．５から約７．８未満のｐＨ、又は少なくとも約６．６から少なくとも約６．８のｐＨを有する、前記〔５０〕〜〔５５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５７〕前記Ｄ−ルシフェリンが、Ｄ−５’フルオロルシフェリンであり、前記Ｌ−ルシフェリンが、Ｌ−５’フルオロルシフェリンである、前記〔５０〕〜〔５６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５８〕前記組成物が、実質的にＬ−ルシフェリンを有さない組成物と比較して、約０℃〜約３５℃の温度で貯蔵したとき、増大した貯蔵寿命及び／又は安定性を有する、前記〔５０〕〜〔５７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５９〕ルシフェラーゼ反応を行うための方法であって、以下の工程、
（ａ）Ｌ−ルシフェリン及びＤ−ルシフェリンを含む混合物を約０℃〜約３５℃の温度で少なくとも約４時間の期間貯蔵する工程であって、前記貯蔵された混合物が、ルシフェラーゼ及びＡＴＰを含むアッセイ中、サンプルと合わせると、光の出力を生成することができ、且つ、前記期間の後の光の出力が、前記期間の開始時の光の出力の少なくとも約５０％である工程と、
（ｂ）工程（ａ）の後、前記貯蔵された混合物を、（ｉ）サンプル及び（ｉｉ）ＡＴＰ又はＡＴＰ源、ルシフェラーゼ、又はこれらの組み合わせと合わせ、反応アッセイを形成し、生成される発光を検出する工程と、
を含む、方法。
〔６０〕前記期間が、少なくとも約１２時間であり、前記温度が、約０℃〜約６℃又は約２０℃〜約３５℃である、前記〔５９〕に記載の方法。
〔６１〕前記サンプルがルシフェラーゼを含み、前記混合物がＡＴＰを含む、前記〔５９〕又は〔６０〕に記載の方法。
〔６２〕前記サンプルがＡＴＰを含み、前記混合物がルシフェラーゼを含む、前記〔５９〕又は〔６０〕に記載の方法。
〔６３〕前記期間の後の光の出力が、前記期間の開始時の光の出力の少なくとも約７５％である、前記〔５９〕〜〔６２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６４〕ルシフェラーゼ反応のための成分を配合するための方法であって、以下の工程、
（ａ）Ｄ−ルシフェリン及びＬ−ルシフェリンを合わせて混合物を形成する工程と、
（ｂ）約０℃〜約３５℃の温度で少なくとも約２日間の期間、前記混合物を貯蔵する工程と、
を含み、前記混合物が、ルシフェラーゼを含むアッセイにおいてサンプルと合わせると光の出力を生成することができ、前記期間の後の光の出力が、前記期間の開始時の光の出力の少なくとも約５０％である、前記方法。
〔６５〕前記混合物が、ＡＴＰ又はルシフェラーゼを本質的に含まない、前記〔５９〕〜〔６４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６６〕前記温度が、約２０℃〜約３５℃である、前記〔５９〕〜〔６５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６７〕前記温度が約０℃〜約６℃であり、前記期間が少なくとも約２週間である、前記〔５９〕〜〔６６〕に記載の方法。
〔６８〕前記期間が、少なくとも約１２週間である、前記〔５９〕〜〔６７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６９〕前記期間が、少なくとも約２６週間である、前記〔５９〕〜〔６８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７０〕前記期間の後の光の出力が、前記期間の開始時の光の出力の少なくとも約９０％である、前記〔５９〕〜〔６９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７１〕前記期間の後の光の出力が、前記期間の開始時の光の出力の少なくとも約５０％である、前記〔５９〕〜〔７０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７２〕工程（ｂ）の後に、前記貯蔵された混合物と（ｉ）ルシフェラーゼ、（ｉｉ）ＡＴＰ又はＡＴＰ源、又は（ｉｉｉ）これらの組み合わせを合わせ、第２の混合物を形成する工程と、前記第２の混合物中で生成される発光を検出する工程とを更に含む、前記〔６４〕〜〔７１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７３〕前記混合物が、約５〜約９のｐＨを有する、前記〔５０〕〜〔５５〕又は〔５７〕〜〔７２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７４〕前記混合物は、Ｌ−ルシフェリン対Ｄ−ルシフェリンの比率が、少なくとも約５：９５〜約７５：２５である、前記〔５９〕〜〔７３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７５〕発光シグナルの半減期を増大するための方法であって、以下の工程、
（ａ）ルシフェラーゼを含むサンプルと、Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン及びＡＴＰを含む混合物とを接触させて、反応アッセイを形成する工程と、
（ｂ）発光を検出する工程と、
を含み、Ｄ−ルシフェリンを含み、Ｌ−ルシフェリンを実質的に含まない相当する反応アッセイと比較して、前記発光シグナルの半減期が増大する、前記方法。
〔７６〕前記発光シグナルの半減期が、少なくとも約２５％増大する、前記〔７５〕に記載の方法。
〔７７〕前記発光シグナルの半減期が、少なくとも約５倍増大する、前記〔７５〕に記載の方法。
〔７８〕前記サンプルが、前記ルシフェラーゼを発現する細胞を含む、前記〔７５〕〜〔７７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７９〕前記細胞が溶解され、サンプルが前記ルシフェラーゼを含む前記溶解した細胞を含む、前記〔７８〕に記載の方法。
〔８０〕サンプルが、前記ルシフェラーゼを含む清澄化した細胞抽出物を含む、前記〔７５〕〜〔７７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８１〕前記細胞が、原核細胞又は真核細胞である、前記〔７８〕〜〔８０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８２〕前記Ｄ−ルシフェリンが、Ｄ−５’フルオロルシフェリンであり、前記Ｌ−ルシフェリンが、Ｌ−５’フルオロルシフェリンであり、前記相当する反応アッセイが、Ｄ−５’フルオロルシフェリンを含み、Ｌ−５’フルオロルシフェリンを実質的に含まない、前記〔７５〕〜〔８１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８３〕ルシフェラーゼ反応を行うための方法であって、以下の工程、
（ａ）組成物と、サンプル及びＡＴＰ又はＡＴＰ源、ルシフェラーゼ、又はこれらの組み合わせとを合わせて反応アッセイを形成する工程であって、前記組成物がＬ−ルシフェリン及びＤ−ルシフェリンを含む工程と、
（ｂ）生成される発光を検出する工程と、
を含み、前記組成物を約０℃〜約３５℃の温度で少なくとも約４時間の期間貯蔵したとき、実質的にＬ−ルシフェリンを有さない組成物と比較して、前記組成物が、増大した安定性を有し、貯蔵された組成物が、ルシフェラーゼ及びＡＴＰを含むアッセイにおいてサンプルと合わせたとき、光の出力を生成することができ、前記期間の後の光の出力が、前記期間の開始時の光の出力の少なくとも約５０％である、前記方法。
〔８４〕増大した安定性が、増大した貯蔵寿命及び／又は増大したシグナル安定性を含む、前記〔８３〕に記載の方法。
〔８５〕前記期間が少なくとも約１２時間であり、前記温度が約０℃〜約６℃又は約２０℃〜約３５℃である、前記〔８３〕又は〔８４〕に記載の方法。
〔８６〕前記サンプルがルシフェラーゼを含み、前記組成物がＡＴＰを含む、前記〔８３〕〜〔８５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８７〕前記サンプルがＡＴＰを含み、前記組成物がルシフェラーゼを含む、前記〔８３〕〜〔８５〕に記載の方法。
〔８８〕前記期間の後の光の出力が、前記期間の開始時の光の出力の少なくとも約７５％である、前記〔８３〕〜〔８７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８９〕ルシフェラーゼ反応のための成分を配合するための方法であって、Ｄ−ルシフェリンとＬ−ルシフェリンを合わせて組成物を形成する工程を含み、前記組成物を約０℃〜約３５℃の温度で少なくとも約４時間の期間貯蔵したとき、実質的にＬ−ルシフェリンを有さない組成物と比較して、前記組成物が、増大した安定性を有し、前記貯蔵された組成物が、ルシフェラーゼ及びＡＴＰを含むアッセイにおいて前記サンプルと合わせたとき、光の出力を生成することができ、前記期間の後の光の出力が、前記期間の開始時の光の出力の少なくとも約５０％である、前記方法。
〔９０〕増大した安定性が、増大した貯蔵寿命及び／又は増大したシグナル安定性を含む、前記〔８９〕に記載の方法。
〔９１〕前記組成物が、ＡＴＰ又はルシフェラーゼを本質的に含まない、前記〔８３〕〜〔９０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９２〕前記温度が、約２０℃〜約３５℃である、前記〔８３〕〜〔９１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９３〕前記温度が約０℃〜約６℃であり、前記期間が少なくとも約２週間である、前記〔８３〕〜〔９２〕に記載の方法。
〔９４〕前記期間が、少なくとも約１２週間である、前記〔８３〕〜〔９３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９５〕前記期間が、少なくとも約２６週間である、前記〔８３〕〜〔９４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９６〕前記期間の後の光の出力が、前記期間の開始時の光の出力の少なくとも約９０％である、前記〔８３〕〜〔９５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９７〕前記期間の後の光の出力が、前記期間の開始時の光の出力の少なくとも約５０％である、前記〔８３〕〜〔９６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９８〕工程（ｂ）の後に、前記組成物と（ｉ）ルシフェラーゼ、（ｉｉ）ＡＴＰ又はＡＴＰ源、又は（ｉｉｉ）これらの組み合わせを合わせて混合物を形成する工程と、前記混合物において生成される発光を検出する工程とを更に含む、前記〔８３〕〜〔９７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９９〕前記組成物が、約５〜約９のｐＨを有する、前記〔８３〕〜〔９８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１００〕前記組成物は、Ｌ−ルシフェリン対Ｄ−ルシフェリンの比率が、少なくとも約５：９５〜約７５：２５である、前記〔８３〕〜〔９９〕のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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