(57)【要約】      （修正有）【課題】造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を必要とする患者におけるＨＳＣＴ後の生存率を改善するとともに、ＨＳＣＴの合併症である感染症を予防するための新規方法の提供。【解決手段】それを必要としている患者に対して、有効量のマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）ポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストを投与する工程を含む、顆粒球／単球前駆細胞（ＧＭＰ）を一過的に提供する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要としている患者において顆粒球／単球前駆細胞（ＧＭＰ）を一過的に提供する方法において使用するための、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）ポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニスト。
【請求項２】
それを必要としている患者における骨髄血球減少症及び関連する合併症の予防又は治療において使用するための、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニスト。
【請求項３】
Ｍ−ＣＳＦポリペプチドが、配列番号５を含むか若しくは配列番号５からなる配列、又は配列番号５の配列と少なくとも８０％同一である配列を有する、請求項１又は２に記載の通り使用するためのＭ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニスト。
【請求項４】
Ｍ−ＣＳＦ受容体のアゴニストが、インターロイキン−３４ポリペプチドである、請求項１又は２に記載の通り使用するためのＭ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニスト。
【請求項５】
それを必要としている患者が、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受ける患者である、請求項１〜４のいずれか一項記載の通り使用するためのＭ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニスト。
【請求項６】
骨髄血球減少症が、好中球減少症及び／又は単球減少症である、請求項２〜５のいずれか一項記載の通り使用するためのＭ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニスト。
【請求項７】
骨髄血球減少症が、骨髄破壊療法によって誘導される、請求項２〜６のいずれか一項記載の通り使用するためのＭ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニスト。
【請求項８】
合併症が、ウイルス、細菌、及び／又は真菌の感染症である、請求項１〜７のいずれか一項記載の通り使用するためのＭ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニスト。
【請求項９】
Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストの存在下でプライミングされる造血幹細胞移植片。
【請求項１０】
移植片が、動員末梢血サンプル又は骨髄（ＢＭ）又は臍帯血（ＵＣＢ）サンプルからなる群より選択される、請求項９記載の造血幹細胞移植片。
【請求項１１】
ＨＳＣＴを受ける患者における骨髄血球減少症及び関連する合併症の予防又は治療において使用するための、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストの存在下でプライミングされる造血幹細胞移植片。
【請求項１２】
ＨＳＣＴを受ける患者における骨髄血球減少症及び関連する合併症の予防又は治療において同時に及び／又は後で使用するための、（ｉ）造血幹細胞移植片と（ｉｉ）Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストとを含むキットオブパーツ組成物。
【請求項１３】
造血幹細胞移植片が、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストの存在下で、それを必要としている患者に移植する前にプライミングされる、請求項１２記載のキットオブパーツ組成物。
【請求項１４】
ＨＳＣＴを受ける患者の生存時間を改善する方法であって、ＨＳＣＴと同時に及び／又はＨＳＣＴの後に、処置に有効な量のＭ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストを該患者に投与する工程を含む方法。
【請求項１５】
ＨＳＣＴを受ける患者の生存時間を改善する方法であって、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストの存在下でプライミングされる、処置に有効な量の造血幹細胞移植片を該患者に投与する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍学、癌の処置、及び骨髄血球減少症によって引き起こされる免疫不全の分野に関する。より具体的には、本発明は、それを必要としている患者（例えば、造血幹細胞移植を受ける患者）における骨髄血球減少症及び関連する合併症（例えば、感染症）を予防又は治療するための、方法及びマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）ポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストを含む組成物に関する。
【０００２】
背景技術
造血幹細胞の注入からなる造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、白血病、リンパ腫、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄（ＢＭ）機能不全症候群、先天性免疫不全、酵素欠損症、及び異常血色素症を含む広範な疾患を治癒させることができる。
【０００３】
ＨＳＣＴの合併症の管理における著しい進歩にもかかわらず、感染症（前処置関連毒性（ＲＲＴ）及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に加えて）は、依然として、主に同種ＨＳＣＴ後の移植後罹患及び死亡の重大な原因である。感染合併症の管理における大きな進歩は、移植後の最初の１ヶ月間にみられる複雑な免疫の機能低下の機序及び所与の感染症に対する素因におけるその役割についての更なる理解によって、また、優れた設計の治験によってもたらされてきた。同種ＨＳＣＴ後の感染による死亡の割合は、過去２０年間にわたって減少してきたが、このリスクを更に低減し、そして、この高リスク集団に適合したより効率的な防止及び予防ストラテジーを実施するために為すべきことが未だ多く残されている。
【０００４】
更に、自己移植後は感染による死亡のリスクがはるかに低いが、手技のリスクは従来の化学療法のリスクよりも高いので、任意の移植プログラムにおいて予防措置を講じなければならない。
【０００５】
ＨＳＣＴレシピエントが最も感染しやすい病原体のスペクトルは、優勢な免疫欠如に対応する時系列に従う。ＨＳＣＴの最初の１ヶ月においては、好中球減少症が主な宿主防御欠如であるので、患者は、細菌、真菌、及びウイルスに感染しやすくなる。ＨＳＣＴ後は、コルチコステロイド及び他の免疫抑制剤のせいで食細胞の質的機能不全が持続する。この期間中の日和見性のウイルス、細菌、及び糸状菌による感染のリスクは、ＧＶＨＤの重篤度及び強力な免疫抑制療法の必要性に強く関連している。
【０００６】
したがって、感染の可能性を最小化するための新規アプローチが開発されてきた。例えば、ＨＳＣＴ後の好中球減少症の期間を短縮するので、顆粒球コロニー刺激因子［Ｇ−ＣＳＦ又はフィルグラスチム（filgastrim）］又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子［ＧＭ−ＣＳＦ又はサルグラモスチム］が用いられているが、これら成長因子が日和見疾患（細菌感染症又は真菌感染症を含む）の発病率を有効に低減し、それによって、死亡率を低下させるかどうかを示すデータは見つけられなかった。
【０００７】
したがって、ＨＳＣＴ後にこれら成長因子を日常的に使用することには議論の余地があるので、これらの使用を推奨することはできない。その結果、ＨＳＣＴ後の造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）レシピエントの生存率を改善するために、該レシピエントの中で感染症を有効に予防するのに有用な手段が依然として大いに必要とされている。
【０００８】
更に、感染症又は炎症等のストレス条件下では、身体は、攻撃感染に適合した新たな血液細胞を生成することが迅速に必要とされる。造血サイトカインは、分化系列が決定された前駆体の生存、増殖、及び分化に影響を与えることが知られている１、２が、長期造血幹細胞（ＨＳＣ）がサイトカインの直接分化系列特定効果の影響を受けて特定の種類の前駆体を生成しやすいかどうかについては議論されている。転写因子のバランスを遺伝学的に変化させると、サイトカインの指示に対するＨＳＣの感受性を高めることができるが３、ＨＳＣのコミットメントの開始は、一般的に、分化系列特異的転写因子等の細胞固有の制御因子における確率的変動によって誘発されると考えられており４、５、６、７、より後期の分化段階における子孫細胞の生存及び増殖はサイトカインが確保する８、９。
【０００９】
発明の概要
第１の態様では、本発明は、それを必要としている患者において顆粒球／単球前駆細胞（ＧＭＰ）を一過的に提供する方法において使用するための、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）ポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストに関する。
【００１０】
第２の態様では、本発明は、それを必要としている患者における骨髄血球減少症及び関連する合併症の予防又は治療において使用するための、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストに関する。
【００１１】
第３の態様では、本発明は、また、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストの存在下でプライミングされる造血幹細胞移植片に関する。
【００１２】
第４の態様では、本発明は、また、ＨＳＣＴを受ける患者における骨髄血球減少症及び関連する合併症の予防又は治療において使用するための、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストの存在下でプライミングされる造血幹細胞移植片に関する。
【００１３】
第５の態様では、本発明は、更に、ＨＳＣＴを受ける患者における骨髄血球減少症及び関連する合併症の予防又は治療において同時に及び／又は後で使用するための、（ｉ）造血幹細胞移植片と（ｉｉ）Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストとを含むキットオブパーツ組成物に関する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、更に、ＨＳＣＴを受ける患者の生存時間を改善する方法であって、ＨＳＣＴと同時に及び／又はＨＳＣＴの後に、処置に有効な量のＭ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストを該患者に投与する工程を含む方法に関する。
【００１５】
更なる態様では、本発明は、ＨＳＣＴを受ける患者の生存時間を改善する方法であって、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストの存在下でプライミングされる、処置に有効な量の造血幹細胞移植片を該患者に投与する工程を含む方法に関する。
【００１６】
発明を実施するための形態
本発明者らは、次に、感染症及び炎症中に放出される骨髄サイトカインであるマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）が、選択的な生存又は増殖とは関係なく、骨髄主要制御因子ＰＵ．１を直接誘導し、そして、ＨＳＣにおける骨髄細胞の運命の変化を指示することができることを示す。ビデオイメージング及び単一細胞遺伝子発現解析により、高度に精製されたＨＳＣを培養下のＭ−ＣＳＦで刺激すると、ＰＵ．１プロモーターが活性化され、そして、骨髄遺伝子サイン及び分化能を備えるＰＵ．１＋細胞の数が増加することが明らかになった。インビボでは、高全身濃度のＭ−ＣＳＦは、単一のＨＳＣにおいて内因性ＰＵ．１タンパク質のＭ−ＣＳＦ受容体依存性活性化を直接刺激し、そして、ＰＵ．１依存性骨髄分化嗜好を誘導した。
【００１７】
Ｍ−ＣＳＦのみが（ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦに比べて）、インビトロ及びインビボにおいてＨＳＣに対して直接作用して細胞同一性の変化を指示し、それによって、幹細胞の活性を損なわせることなく、顆粒球／単球前駆細胞（ＧＭＰ）を特異的かつ一過的に増加させ得ることが実際に示されている。この新たに同定されたＭ−ＣＳＦの特性は、骨髄血球減少症を回復させるため、具体的には、幹細胞移植後に感染から患者を保護し、それによって、ＨＳＣＴを受ける患者等のそれを必要としている患者における骨髄血球減少症（例えば、好中球減少症）及び関連する合併症、より具体的には、例えばＨＳＣＴ後のこれら日和見感染症と戦うための免疫系がレシピエントにおいてまだ再建されていない間に生じる細菌及び／又は真菌の感染症を予防又は治療するための主な関心対象である。
【００１８】
処置方法及び使用：
本発明は、それを必要としている患者（例えば、ＨＳＣＴを受ける患者）において顆粒球／単球前駆細胞（ＧＭＰ）を一過的に提供するために用いられる方法及び組成物（例えば、医薬組成物及びキットオブパーツ組成物）を提供する。また、本発明は、それを必要としている患者における骨髄血球減少症及び関連する合併症の予防又は治療に用いるための方法及び組成物を提供する。
【００１９】
第１の態様では、本発明は、それを必要としている患者において顆粒球／単球前駆細胞（ＧＭＰ）を一過的に提供する方法において使用するための、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）ポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストに関する。
【００２０】
本明細書で使用するとき、細胞に関する用語「一過的に提供する」とは、細胞の初期集団から特徴的な細胞型の数を一過的に（すなわち、限られた期間の間、好ましくは、ＨＳＣＴ後１ヶ月間）増加させることを指す。したがって、一過的に提供する対象細胞（すなわち、顆粒球／マクロファージ前駆細胞）は、細胞の初期集団（すなわち、ＨＳＣＴを受ける患者に投与されるＨＳＣ移植片）のインビボ分化によって生成される。更に、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニスト（例えば、ＩＬ−３４ポリペプチド）は、顆粒球／マクロファージ前駆細胞を特異的かつ一過的に提供し、そして、リンパ細胞（例えば、リンパ前駆細胞）を含む他の細胞は提供しないことに留意すべきである。したがって、ＨＳＣＴを受ける患者に投与されるＨＳＣの大部分からは、顆粒球／マクロファージ前駆細胞が特異的かつ一過的に生じたが、他の細胞型、特に、リンパ前駆細胞（ＧＶＨＤのリスクを有する）は生じなかった。実際、「移植片対宿主病」（「ＧＶＨ」又は「ＧＶＨＤ」とも呼ばれる）とは、異なるＭＨＣクラスのリンパ球が宿主に導入されたときに生じる細胞応答を指し、宿主に対するリンパ球の反応をもたらす。
【００２１】
本明細書で使用するとき、用語「顆粒球／マクロファージ前駆細胞」又は「ＧＭＰ」とは、共通の骨髄前駆細胞に由来する細胞を指し、そして、顆粒球及びマクロファージ細胞を生じさせる能力を特徴とするが、典型的に、骨髄分化系列の赤血球細胞又は巨核球は生じさせない。
【００２２】
第２の態様では、本発明は、それを必要としている患者における骨髄血球減少症及び関連する合併症の予防又は治療において使用するための、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストに関する。
【００２３】
本明細書で使用するとき、用語「マクロファージコロニー刺激因子ポリペプチド」又は「Ｍ−ＣＳＦポリペプチド」（「コロニー刺激因子１ポリペプチド」については、ＣＳＦ−１としても知られている）とは、マクロファージの産生、分化、及び機能を制御する任意のネイティブ又は変異体（ネイティブ又は合成）のサイトカインを指す。この用語は、天然のＭ−ＣＳＦ変異体及びその改変型を含む。したがって、ｍＲＮＡのオルタナティブスプライシングを通して産生される３つの異なる変異体Ｍ−ＣＳＦアイソフォームが記載されており、それぞれ、アクセッション番号UPI0000D61F83としてUniProt Uniparcデータベースに提供されている２５６アミノ酸のタンパク質を指すＭ−ＣＳＦ［アルファ］変異体、アクセッション番号NP_000748.3としてGenPeptデータベースに提供されている５５４アミノ酸のタンパク質を指し、そして、アクセッション番号NM_000757.5としてGenBank データベースに提供されている核酸配列によってコードされているＭ−ＣＳＦ［ベータ］変異体、及びアクセッション番号NP_757349.1としてGenPeptデータベースに提供されている４３８アミノ酸のタンパク質を指し、そして、アクセッション番号NM_172210.2としてGenBank データベースに提供されている核酸配列によってコードされているＭ−ＣＳＦ［ガンマ］変異体である。
【００２４】
１つの実施形態では、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドは、アクセッション番号UPI0000D61F83としてUniProt Uniparcデータベースに提供されている２５６アミノ酸のヒトアイソフォームＭ−ＣＳＦ［アルファ］であり、そして、以下に示す配列（配列番号１）を有するか又は配列番号１の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一である配列を有するポリペプチドである：
【００２５】
【化１】
2020172525.tif 000002
【００２６】
１つの実施形態では、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドは、アクセッション番号NP_000748.3としてGenBank データベースに提供されている５５４アミノ酸のヒトアイソフォームＭ−ＣＳＦ［ベータ］であり、そして、以下に示す配列（配列番号２）を有するか又は配列番号２の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一である配列を有するポリペプチドである：
【００２７】
【化２】
2020172525.tif 000003
【００２８】
１つの実施形態では、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドは、アクセッション番号NP_757349.1としてGenBankデータベースに提供されている４３８アミノ酸のヒトアイソフォームＭ−ＣＳＦ［ガンマ］であり、そして、以下に示す配列（配列番号３）を有するか又は配列番号３の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一である配列を有するポリペプチドである：
【００２９】
【化３】
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【００３０】
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」とは、天然で産生されようと合成で作製されようと、特定の長さを有しないペプチド結合によって結合されているアミノ酸残基のポリマーを指す。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質が、ポリペプチドの定義に含まれ、そして、これら用語は、特許請求の範囲に加えて明細書全体を通して互換的に用いられる。ポリペプチドという用語は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化等を含むがこれらに限定されない翻訳後修飾を除外するものではない。また、この用語は、天然のアミノ酸ポリマー及び非天然のアミノ酸ポリマーに加えて、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的化学模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００３１】
用語「Ｍ−ＣＳＦポリペプチド」は、本明細書では、天然のヒトポリペプチドＭ−ＣＳＦ及び該ポリペプチドの天然の対立遺伝子変異を含むと定義される。対立遺伝子変異は、ポリペプチド又はタンパク質におけるアミノ酸を変化させる場合もあり変化させない場合もある、種個体群における天然の塩基変化である。更に、本発明に係るＭ−ＣＳＦポリペプチドは、完全長Ｍ−ＣＳＦ及びその変異体を含むか又はからなるポリペプチドを包含するだけでなく、その断片が生物学的に活性である限り、該断片からなるポリペプチドも包含する。更に、この定義には、ポリペプチド又はそのＤＮＡ配列において誘導された改変を含有し得る、ポリペプチドＭ−ＣＳＦの組み換えバージョン及び合成バージョンも含まれる。したがって、用語Ｍ−ＣＳＦポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の配列によってコードされているＭ−ＣＳＦポリペプチドの機能的等価物を包含することを意図する。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「機能的等価物」とは、親ポリペプチドの生物活性及び特異性を保持している分子（例えば、組み換えポリペプチド）を指す。したがって、用語「Ｍ−ＣＳＦポリペプチドの機能的等価物」は、該機能的等価物が、以下に記載する通り、参照ポリペプチドの生物活性のうちの少なくとも１つ、好ましくは全てを示す限り、参照するポリペプチド（すなわち、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド）の変異体及び断片を含む。
【００３３】
ポリペプチドの「変異体」とは、ネイティブ配列のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物活性ポリペプチドを指す。このような変異体は、例えば、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端において１つ以上のアミノ酸残基が付加されているか又は欠失しているポリペプチドを含む。通常、変異体は、ネイティブ配列のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００３４】
本発明のクエリーアミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、対象ポリペプチド配列が、クエリーアミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり５アミノ酸以下の変化を含み得ることを除いて、対象ポリペプチドのアミノ酸配列がクエリー配列と同一であることを意図する。言い換えれば、クエリーアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象配列におけるアミノ酸残基の５％（１００個のうちの５個）以下が挿入されていてもよく、欠失していてもよく、又は別のアミノ酸に置換されていてよい。
【００３５】
本願の枠組みにおいて、同一性の割合は、グローバルアラインメントを用いて計算される（すなわち、２つの配列をその全長にわたって比較する）。２つ以上の配列の同一性及び相同性を比較する方法は、当技術分野において周知である。例えば、全長を考慮して２つの配列の最適なアラインメント（ギャップを含む）を見出すためにNeedleman-Wunschグローバルアラインメントアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453）を用いる「needle」プログラムを用いてよい。該needleプログラムは、例えば、ebi.ac.ukワールドワイドウェブサイトにおいて入手可能である。本発明に係る同一性の割合は、好ましくは、「Gap Open」パラメータが１０．０に等しく、「Gap Extend」が０．５に等しく、そして、Blosum62マトリックスを用いるEMBOSS::needle（グローバル）プログラムを用いて計算される。
【００３６】
参照配列と「少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である」アミノ酸配列からなるポリペプチドは、例えば、参照配列と比べて欠失、挿入、及び／又は置換等の突然変異を含み得る。参照配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、参照配列の対立遺伝子変異体に対応し得る。例えば、それは、参照配列と比べて置換のみを含んでよい。該置換は、好ましくは、以下の表に示す保存的置換に対応する。
【００３７】
【表１】
2020172525.tif 000005
【００３８】
ポリペプチド「断片」とは、本明細書で使用するとき、参照ポリペプチドよりも短い生物活性ポリペプチド（例えば、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドの断片）を指す。したがって、本発明に係るポリペプチドは、その断片が生物学的に活性である限り、Ｍ−ＣＳＦの断片を含むか又はからなるポリペプチドを包含する。
【００３９】
本発明の枠組み内において、生物活性断片は、例えば、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドの少なくとも１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、又は５５０個の保存的アミノ酸を含み得る。
【００４０】
上記の通り、３つのＭ−ＣＳＦアイソフォームは、完全長及び切断型の前駆体から合成される。Pixley et al. 2004 Trends Cell Biol. 2004 Nov;14(11):628-38に記載の通り、前駆体のＮ末端の１５０アミノ酸が同一であり、そして、インビトロ生物活性に十分であることに更に留意すべきである。実際に、Ｍ−ＣＳＦの３つ全ての成熟型のアミノ酸１〜１５０は、同一であり、そして、Ｍ−ＣＳＦの生物活性に必須の配列を含有していると考えられる。したがって、ＭＣＳＦ−ポリペプチドの生物活性断片は、少なくとも１５０アミノ酸を含むＮ末端断片である。
【００４１】
１つの実施形態では、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドは、マウスＭ−ＣＳＦの組み換え型１５６アミノ酸ポリペプチドであり、そして、以下に示す配列（配列番号４）を有する：
【００４２】
【化４】
2020172525.tif 000006
【００４３】
１つの特定の実施形態では、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドは、ヒトＭ−ＣＳＦの１５０アミノ酸ポリペプチドを含むか又はからなり、そして、以下に示す配列（配列番号５）を有する：
【００４４】
【化５】
2020172525.tif 000007
【００４５】
Ｍ−ＣＳＦ又はその断片の「生物活性」とは、（ｉ）造血幹細胞（ＨＳＣ）の骨髄分化を誘導する能力（より具体的には、実施例の項に記載する通りの骨髄単球分化；すなわち、ＨＳＣによるＧＭＰの産生増加を誘導する能力）；及び／又は（ｉｉ）（実施例の項に記載の通り）転写因子ＰＵ．１の発現を誘導する能力；及び／又は（ｉｉｉ）骨髄血球減少症及び関連する合併症（例えば、感染症）を治療若しくは予防する能力を意味する。
【００４６】
当業者は、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドの断片が生物学的に活性であるかどうかを容易に決定することができる。新たに生成されたポリペプチドが、ＨＳＣのインビトロ若しくはインビボにおける骨髄分化を誘導するかどうか及び／又は転写因子ＰＵ．１の発現を誘導するかどうかを確認するために、各ポリペプチドについてＦＡＣＳ分析、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析、又は単一細胞遺伝子発現プロファイリング（実施例の項を参照）を実施してよい。更に、新たに生成されたポリペプチドが、骨髄血球減少症及び関連する合併症（例えば、感染症）を治療又は予防するかどうかを確認するために、骨髄移植（ＢＭＴ）及び移植片対宿主病のマウスモデルを用いてよい。更に、（例えば、ＢＭＴ及びＧＶＨＤのマウスモデルを用いることによって）インビトロ又はインビボで実施される経時変化及び用量応答は、各ポリペプチドについて最適な条件を決定する。
【００４７】
本明細書で使用するとき、用語「Ｍ−ＣＳＦ受容体アゴニスト」とは、造血幹細胞及び造血前駆細胞上に存在するＭ−ＣＳＦ受容体（ヒトではＣＳＦ１Ｒ遺伝子によってコードされている細胞表面タンパク質である、ＣＤ１１５としても知られている）に結合することができ、そして、骨髄細胞、単球、マクロファージ、又は単核食細胞系の関連細胞（例えば、ミクログリア及びランゲルハンス細胞）の産生を刺激することができる任意の合成又は天然の化合物（例えば、ポリペプチド）を指す。１つの実施形態では、Ｍ−ＣＳＦ受容体リガンドは、ヒトポリペプチドである。
【００４８】
好ましい実施形態では、Ｍ−ＣＳＦ受容体のアゴニストは、ＩＬ３４ポリペプチドである。
【００４９】
本明細書で使用するとき、用語「インターロイキン−３４ポリペプチド」又は「ＩＬ−３４ポリペプチド」は、当技術分野において周知であり、そして、単球及びマクロファージの増殖、生存、及び分化を促進するサイトカインを指す。天然のヒトＩＬ−３４タンパク質は、アクセッション番号Q6ZMJ4としてUniProtデータベースに提供されている２４２アミノ酸のアミノ酸配列を有し、そして、以下に示す配列（配列番号６）を有するか又は配列番号６の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一である配列を有するポリペプチドである：
【００５０】
【化６】
2020172525.tif 000008
【００５１】
Ｍ−ＣＳＦポリペプチドについて既に記載した通り、ＩＬ−３４ポリペプチドという用語は、配列番号６によってコードされているＩＬ−３４ポリペプチドの機能的等価物を包含することを意図する。
【００５２】
１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、タグを含んでよい。タグは、ポリペプチドの精製に有用であり得るエピトープ含有配列である。タグは、免疫標識技術を用いる細胞又は組織サンプル内のポリペプチドの局在、イムノブロッティングによるポリペプチドの検出等のために、親和性クロマトグラフィー等の様々な技術によって取り付けられる。当技術分野において一般的に使用されているタグの例は、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグ、ＦＬＡＧ（商標）タグ、Ｓｔｒｅｐタグ（商標）、Ｖ５タグ、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ（典型的に、６個のヒスチジン残基からなる）等である。
【００５３】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、その安定性及び／又はそのバイオアベイラビリティ（biodisponibility）を改善する化学修飾を含んでよい。このような化学修飾は、インビボにおける酵素分解からのポリペプチドの保護が増大しており及び／又は膜バリアを横断する能力が高いポリペプチドを得、それによって、ポリペプチドの半減期を延長し、そして、生物活性を維持又は改善することを目的とする。当技術分野において公知の任意の化学修飾を、本発明に従って使用することができる。このような化学修飾としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
−  修飾及び／若しくは異常アミノ酸によるアミノ酸の置換（例えば、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、若しくはＯｒｎ等の異常アミノ酸によるアミノ酸の置換）；並びに／又は
−  ペプチドのＮ末端及び／若しくはＣ末端の修飾（例えば、Ｎ末端のアシル化（好ましくは、アセチル化）若しくは脱アミノ化又はＣ末端カルボキシル基のアミド若しくはアルコール基への修飾）；
−  ２個のアミノ酸間のアミド結合の修飾：２個のアミノ酸を結合させるアミド結合の窒素原子若しくはアルファ炭素のアシル化（好ましくは、アセチル化）若しくはアルキル化（好ましくは、メチル化）；
−  ２個のアミノ酸を結合させるアミド結合のアルファ炭素における修飾（例えば、２個のアミノ酸を結合させるアミド結合のアルファ炭素のアシル化（好ましくは、アセチル化）又はアルキル化（好ましくは、メチル化））；
−  キラリティの変化（例えば、１個以上の天然のアミノ酸（Ｌエナンチオマー）の対応するＤ−エナンチオマーによる置換）；
−  アミノ酸鎖の（Ｃ末端からＮ末端への）逆位と共に、１個以上の天然のアミノ酸（Ｌ−エナンチオマー）が対応するＤ−エナンチオマーで置換されているレトロインバージョン；
−  １個以上のアルファ炭素が窒素原子で置換されているアザペプチド；並びに／又は
−  １個以上のアミノ酸のアミノ基がα炭素ではなくβ炭素に結合しているベータペプチド。
【００５４】
薬物のバイアビリティーを改善するための別のストラテジーは、水溶性ポリマーの使用である。様々な水溶性ポリマーが、生体分布を変化させる、細胞取り込みモードを改善する、生理学的バリアの透過性を変化させる、及び身体からのクリアランス速度を改変することが示されている。標的化又は持続放出効果を達成するために、末端基として、骨格の一部として、又はポリマー鎖におけるペンダント基として薬物部分を含有する水溶性ポリマーが合成されている。
【００５５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、生体適合性が高く、そして、修飾が容易であることを鑑みて、薬物担体として広く用いられている。様々な薬物、タンパク質、及びリポソームへの結合が、滞留時間を改善し、そして、毒性を低下させることが示されている。ＰＥＧは、鎖の末端におけるヒドロキシル基を通して及び他の化学的方法を介して、活性剤に結合することができるが、ＰＥＧ自体は、１分子当たり最大２個の活性剤に限定される。異なるアプローチでは、ＰＥＧ及びアミノ酸のコポリマーが、ＰＥＧの生体適合性を保持しているが、１分子当たり多数の結合点が存在する（より大きな薬物負荷を提供する）という追加の利点を有し、そして、様々な用途に適するように合成的に設計できる新規生体材料として研究された。
【００５６】
当業者は、薬物を有効に修飾するためのＰＥＧ化技術を認識している。例えば、ＰＥＧ及び三官能性モノマー（例えば、リジン）の交互ポリマーからなる薬物送達ポリマーが、VectraMed（Plainsboro, N.J.）によって用いられている。ＰＥＧ鎖（典型的に、２０００ダルトン以下）は、安定なウレタン結合を通してリジンのａ−及びｅ−アミノ基に結合する。このようなコポリマーは、ポリマー鎖に沿って厳しく制御された所定の間隔で反応性ペンダント基（リジンのカルボン酸基）を提供すると同時に、ＰＥＧの望ましい特性を保持している。反応性ペンダント基は、誘導体化、架橋、又は他の分子とのコンジュゲーションに用いることができる。これらポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧセグメントの分子量、及び薬物とポリマーとの間の切断可能な結合を変化させることによって、安定な長時間循環するプロドラッグの作製において有用である。ＰＥＧセグメントの分子量は、薬物／連結基複合体のスペーシング、及びコンジュゲートの分子量当たりの薬物量に影響を与える（ＰＥＧセグメントが小さいほど、より大きな薬物負荷を与える）。一般に、ブロックコポリマーコンジュゲートの全体の分子量を増加させると、該コンジュゲートの循環半減期が長くなる。それにもかかわらず、コンジュゲートは、容易に分解可能でなければならないか又は許容限度の糸球体濾過率を下回る（例えば、６０kDa未満の）分子量を有していなければならない。
【００５７】
循環半減期及び生体分布の維持において重要なポリマー骨格に加えて、特定のトリガー、典型的には、標的組織における酵素活性によって骨格ポリマーから放出されるまで、リンカーを用いて処置剤をプロドラッグの形態で維持してもよい。例えば、この種の組織活性化薬物送達は、生体分布の特定の部位への送達が必要であり、そして、処置剤が病変の部位又はその近傍で放出される場合、特に有用である。活性化薬物送達において用いるための連結基ライブラリーは、当業者に公知であり、そして、酵素反応速度、活性酵素の保有率、及び選択された疾患特異的酵素の切断特異性に基づき得る。このようなリンカーは、処置用送達のために本明細書に記載するポリペプチドの修飾において用いることができる。
【００５８】
更に別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、異種ポリペプチド（すなわち、無関係なタンパク質、例えば、免疫グロブリンタンパク質に由来するポリペプチド）に融合し得る。
【００５９】
本明細書で使用するとき、用語「融合した」及び「融合」は、互換的に用いられる。これら用語は、化学的コンジュゲーション又は組み換え手段を含むいかなる手段によっても、２つ以上の要素又は成分を互いに結合させることを指す。「インフレーム融合」とは、元のＯＲＦの正確な翻訳リーディングフレームが維持されるように、２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を結合させて連続するより長いＯＲＦを形成することを指す。例えば、組み換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされているポリペプチドに対応する２つ以上のセグメント（セグメントは、通常このように結合されることはない）を含有する単一のタンパク質であってよい。したがって、リーディングフレームは、融合したセグメント全体を通して連続になっているが、セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的に又は空間的に離れている場合もある。
【００６０】
本明細書で使用するとき、用語「Ｍ−ＣＳＦ融合タンパク質」とは、異種ポリペプチドに融合したＭ−ＣＳＦポリペプチド又はその機能的等価物を含むポリペプチドを指す。Ｍ−ＣＳＦ融合タンパク質は、一般的に、（上記）Ｍ−ＣＳＦポリペプチドと共通する少なくとも１つの生物学的特性を共有する。
【００６１】
Ｍ−ＣＳＦ融合タンパク質の例は、Ｍ−ＣＳＦイムノアドヘシンである。
【００６２】
本明細書で使用するとき、用語「イムノアドヘシン」は、異種タンパク質（「アドへシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを組み合わせる抗体様分子を指す。構造的に、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（すなわち、「異種」である）所望の結合特異性を有するアミノ酸配列と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的に、受容体又はリガンドの結合部位を少なくとも含む連続するアミノ酸配列である。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭ等から得ることができる。
【００６３】
免疫グロブリン配列は、免疫グロブリン定常ドメイン（Ｆｃ領域）であることが好ましいが、必須ではない。イムノアドヘシンは、ヒト抗体の有用な化学的特性及び生物学的特性の多くを有し得る。イムノアドヘシンは、適切なヒト免疫グロブリンのヒンジ及び定常ドメイン（Ｆｃ）配列に結合している所望の特異性を有するヒトタンパク質配列から構築することができるので、全体にヒト成分を用いて対象となる結合特異性を達成することができる。このようなイムノアドヘシンは、患者に対して最低限の免疫原性しか有しないので、慢性的に又は繰り返し使用しても安全である。１つの実施形態では、Ｆｃ領域は、ネイティブ配列のＦｃ配列である。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、変異体のＦｃ配列である。更に別の実施形態では、Ｆｃ領域は、機能的Ｆｃ配列である。Ｍ−ＣＳＦイムノアドヘシンのＭ−ＣＳＦ配列部分及び免疫グロブリン配列部分は、最小のリンカーによって結合することができる。免疫グロブリン配列は、免疫グロブリン定常ドメインであることが好ましいが、必須ではない。本発明のキメラにおける免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭから得ることができるが、好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３から得ることができる。
【００６４】
本明細書で使用するとき、用語「Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列のＦｃ配列及び変異体のＦｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために用いられる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位におけるアミノ酸残基から又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端まで及ぶと定義される。
【００６５】
Ｍ−ＣＳＦ融合タンパク質の別の例は、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドと、Konterman et al. 2012 AlbudAb（商標）Technology Platform-Versatile Albumin Binding Domains for the Development of Therapeutics with Tunable Half-Livesに記載されているAlbudAb（商標）テクノロジープラットフォームによるヒト血清アルブミン結合ドメイン抗体（AlbudAbs）との融合である。
【００６６】
本発明のポリペプチドは、当業者に明らかである通り、任意の好適な手段によって生成され得る。本発明に従って使用するために十分な量のＭ−ＣＳＦポリペプチドを生成するために、本発明のポリペプチドを含有する組み換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって、発現を便利に達成することができる。好ましくは、ポリペプチドは、組み換え手段によって、コーディング核酸分子から発現させることによって生成される。様々な異なる宿主細胞においてポリペプチドをクローニング及び発現させるための系は、周知である。
【００６７】
組み換え型で発現させる場合、ポリペプチドは、好ましくは、宿主細胞においてコーディング核酸から発現させることによって生成される。具体的な系の個々の要件に応じて任意の宿主細胞を用いてよい。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳類細胞、植物細胞、酵母及びバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドを発現させるために当技術分野において利用可能な哺乳類細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、及びその他多くの細胞が挙げられる。また、容易に操作及び増殖させることができるので、細菌も組み換えタンパク質を生成するために好ましい宿主である。一般的な好ましい細菌宿主は、大腸菌（E coli）である。
【００６８】
更に、タンパク質系バイオ医薬品の大部分は、その処置用途に関連するタンパク質の特性に大きな影響を与え得る何らかの形態の翻訳後修飾を有していたことに留意すべきである。タンパク質のグリコシル化は、最も一般的な修飾である（ヒトタンパク質の約５０％がグリコシル化されている）。グリコシル化は、組成物内のタンパク質において様々なグリカン構造を作製することを通してタンパク質組成物に顕著な異種性を導入し得る。このようなグリカン構造は、糖タンパク質が小胞体（ＥＲ）及びゴルジ複合体を通過するときに、グリコシル化機構の多様な酵素の作用によって作製される（グリコシル化カスケード）。タンパク質のグリカン構造の性質は、タンパク質の折り畳み、安定性、寿命、輸送、薬力学、薬物動態、及び免疫原性に対して影響を有する。グリカン構造は、タンパク質の主な機能活性に対して大きな影響を有する。グリコシル化は、局所タンパク質構造に影響を及ぼし得、そして、ポリペプチド鎖の折り畳みを指示するのに役立ち得る。グリカン構造の１つの重要な種類は、いわゆるＮ−グリカンである。これは、発生期のポリペプチド鎖のコンセンサス配列ＮＸＳ／Ｔにおけるアスパラギン残基のアミノ（Ｎ）基とオリゴ糖との共有結合によって生成される。Ｎ−グリカンは、更に、タンパク質の選別又はその最終標的への方向づけ（directing）に関与し得：抗体のＮ−グリカンは、例えば、補体成分と相互作用し得る。また、Ｎ−グリカンは、例えば、その可溶性の強化、その表面における疎水性パッチの遮蔽、タンパク質分解からの保護、及び鎖内安定化相互作用の指示によって糖タンパク質を安定化させる機能を有する。グリコシル化は、例えば、ヒトにおいてタンパク質の半減期を制御し得、Ｎ−グリカンにおける末端シアル酸の存在が、血流中を循環しているタンパク質の半減期を延長し得る。
【００６９】
本明細書で使用するとき、用語「糖タンパク質」は、１つ以上のＮ−グリカンが結合している任意のタンパク質を指す。したがって、この用語は、当技術分野において一般的に糖タンパク質として認識されているタンパク質、及び１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位を含有するように遺伝子操作されているタンパク質の両方を指す。本明細書で使用するとき、用語「Ｎ−グリカン」及び「グリコフォーム」は、互換的に用いられ、そして、Ｎ結合型オリゴ糖、例えば、アスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によってポリペプチドのアスパラギン残基に結合しているものを指す。Ｎ結合型糖タンパク質は、タンパク質におけるアスパラギン残基のアミド窒素に結合しているＮ−アセチルグルコサミン残基を含有する。糖タンパク質にみられる主要糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）、及びシアル酸（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ））である。糖基のプロセシングは、ＥＲの内腔において翻訳と同時に生じ、そして、Ｎ結合型糖タンパク質についてはゴルジ装置において翻訳後も続く。
【００７０】
近年、多数の酵母、例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、及びサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が、このような系の利点を使用するが、グリコシル化に関する不利点をなくすために開発中である。幾つかの株は、タンパク質において規定のヒト様グリカン構造を生成するために遺伝的に開発中である。ヒト様Ｎ−グリカンを生成するために酵母を遺伝子操作する方法は、米国特許出願公開第２００４０２３００４２号、同第２００５０２０８６１７号、同第２００４０１７１８２６号、同第２００５０２０８６１７号、及び同第２００６０２８６６３７号に記載されている方法と共に、米国特許第７，０２９，８７２号及び同第７，４４９，３０８号に記載されている。これら方法は、酵母型Ｎ−グリカンの代わりに主にヒト様複合体又はハイブリッドＮ−グリカンを有する処置用糖タンパク質を生成することができる組み換え酵母を構築するために用いられている。既に記載した通り、ヒト様グリコシル化は、主に、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、フコース、及び／又はＮ−アセチルノイラミン酸を含有する「複雑な」Ｎ−グリカン構造を特徴とする。したがって、酵母の幾つかの株は、１つ以上のヒト様複合体又はヒト様ハイブリッドＮ−グリカン、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含む糖タンパク質を生成するように遺伝子操作されている。
【００７１】
本明細書で使用するとき、用語「骨髄血球減少症」とは、骨髄細胞の数が異常に少ないことを特徴とする血液病を指す。本明細書で使用するとき、この用語は、好中球減少症及び単球減少症を含み、そして、血小板減少症及び赤血球減少症は除く。
【００７２】
本明細書で使用するとき、用語「単球減少症」とは、単球の数が異常に少ないことを特徴とする血液病を指す。
【００７３】
本明細書で使用するとき、用語「好中球減少症」とは、好中球の数が異常に少ない、例えば、１５００個（好中球）/μL（血液）未満、好ましくは１０００個（好中球）/μL（血液）未満、最も好ましくは５００個（好中球）/μL（血液）未満であることを特徴とする血液病を指す。
【００７４】
本明細書で使用するとき、この用語は、慢性、周期性、及び急性の好中球減少症を含む。好中球減少症は、例えば、慢性特発性好中球減少症、先天性好中球減少症、又は続発性好中球減少症、例えば、感染誘導性好中球減少症、薬物誘導性好中球減少症、アルコール依存症誘導性好中球減少症、自己免疫性好中球減少症、ＡＩＤＳにおける慢性続発性好中球減少症、骨髄置換によって引き起こされる好中球減少症、細胞障害性化学療法によって引き起こされる好中球減少症、放射線療法によって引き起こされる好中球減少症、葉酸若しくはビタミンＢ１２欠乏によって引き起こされる好中球減少症、脾機能亢進症によって引き起こされる好中球減少症、又はＴγ−リンパ増殖性疾患によって引き起こされる好中球減少症に対応し得る。
【００７５】
「それを必要としている患者」とは、処置すべき骨髄血球減少症又は関連する合併症に罹患しているか又は罹患しやすい個体を意味する。本発明の枠組み内で処置される個体は、好ましくは、ヒトである。
【００７６】
１つの特定の実施形態では、それを必要としている患者は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受ける患者である。
【００７７】
本明細書で使用するとき、用語「造血幹細胞移植（又はＨＳＣＴ）を受ける患者」とは、ＨＳＣ移植片を移植しなければならないヒトを指す。典型的に、前記患者は、ＨＳＣＴによって治癒可能な疾病に冒されている。
【００７８】
１つの実施形態では、ＨＳＣＴを受ける患者は、白血病、リンパ腫、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄（ＢＭ）機能不全症候群、先天性免疫不全、酵素欠損症、及び異常血色素症からなる群より選択される疾患に冒されている。
【００７９】
本明細書で使用するとき、用語「造血幹細胞移植」又は「ＨＳＣＴ」とは、広範な血液病の処置の構成要素を指す。一般的に、自己移植及び同種移植の２種類のＨＳＣＴが存在する。
【００８０】
１つの実施形態では、ＨＳＣＴは、同種ＨＳＣＴである。本明細書で使用するとき、用語「同種」とは、遺伝的に近縁であるか又は遺伝的に近縁ではないが遺伝的に類似している同じ種のメンバーに由来するか、該メンバーを起源とするか、又は該メンバーであることを指す。「同種移植」とは、レシピエントがドナーと同じ種である場合の、ドナーからレシピエントへの細胞又は器官の移植を指す。同種移植は、典型的にレシピエントのＭＨＣに適合するドナーを用いて、ドナーの幹細胞を注入することを含む。しかし、適合非血縁ドナー（ＭＵＤ）移植は、より強い移植片対宿主反応にも関連しているので、死亡率がより高くなる。
【００８１】
別の実施形態では、ＨＳＣＴは、自己ＨＳＣＴである。本明細書で使用するとき、用語「自己」とは、同じ被験体若しくは患者に由来するか、又は該被験体若しくは患者を起源とすることを指す。「自己移植」とは、被験体自身の細胞又は器官を採取し、そして、再移植することを指す。自己移植は、骨髄破壊処置後にレシピエント自身の細胞を注入することを含む。自己細胞移植は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクを最小化するので、合併症が減少する。
【００８２】
本明細書で使用するとき、用語「骨髄破壊性」又は「骨髄破壊」とは、典型的に、細胞毒性剤又は放射線に曝露することによる、造血系の機能障害又は破壊を指す。骨髄破壊は、造血系を破壊する高用量の細胞毒性剤又は高線量の放射線全身照射によってもたらされる完全な骨髄破壊を包含する。また、非骨髄破壊条件（骨髄抑制処置）によって引き起こされる不完全に骨髄が破壊された状態も含む。したがって、非骨髄破壊条件は、被験体の造血系を完全には破壊しない処置である。
【００８３】
１つの実施形態では、骨髄血球減少症に関連する合併症は、ウイルス、細菌、及び／又は真菌の感染症である。
【００８４】
ウイルス感染症の非限定的な例としては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染症、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）感染症、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ６）感染症、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染症、呼吸器系ウイルス感染症（例えば、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス、ライノウイルス、及びインフルエンザウイルス）、及びアデノウイルス感染症が挙げられる。
【００８５】
細菌感染症の非限定的な例としては、グラム陰性細菌感染症、例えば、エシェリキア属（例えば、大腸菌（Escherichia coli））、サルモネラ属、シゲラ属、及び他の腸内細菌科、シュードモナス属（例えば、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa））、モラクセラ属、ヘリコバクター属、及びレジオネラ属の感染症が挙げられる。
【００８６】
真菌感染症の非限定的な例としては、アスペルギルス属感染症（例えば、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus））、カンジダ属感染症（例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）及びカンジダ・アルビカンス以外）、並びにトリコスポロン属、アルテルナリア属、フザリウム属、及びケカビ目の感染症を含む他の新興真菌感染症が挙げられる。
【００８７】
１つの特定の実施形態では、合併症は、ＨＳＣＴの０〜１００日後に発生する初期感染症である。
【００８８】
他の特定の実施形態では、合併症は、ＨＳＣＴの少なくとも１年後まで少なくとも１００日に発生する晩期感染症である。
【００８９】
本明細書で使用するとき、用語「予防」とは、このような用語が適用される疾患又は状態の発症を遅らせるか又は防ぐことを目的とする予防的方法又はプロセスを特徴付けることを意図する。
【００９０】
本明細書で使用するとき、用語「治療」とは、（１）このような用語が適用される疾患状態若しくは状態の症状の進行、増悪、若しくは悪化を減速させるか若しくは停止させる；（２）このような用語が適用される疾患状態若しくは状態の症状を軽減するか若しくは寛解させる；及び／又は（３）このような用語が適用される疾患状態若しくは状態を回復若しくは治癒させることを目的とする治療的方法又はプロセスを特徴付けることを意図する。
【００９１】
あるいは、本発明のポリペプチドをコードしている核酸（例えば、配列番号１〜配列番号５に示すＭ−ＣＳＦポリペプチド、又は配列番号６に示すＩＬ−３４ポリペプチド等）、又はこのような核酸を含むベクター、又はこのような発現ベクターを含む宿主細胞を、それを必要としている患者における骨髄血球減少症及び関連する合併症の予防又は治療において用いてよい。
【００９２】
したがって、本発明の別の態様は、それを必要としている患者における骨髄血球減少症及び関連する合併症の予防又は治療において使用するための、上記配列番号１〜配列番号６の任意の１つを含むアミノ酸配列をコードしている核酸に関する。
【００９３】
本発明の核酸は、例えば、単独で又は組み合わせて、任意の化学的、生物学的、遺伝学的、又は酵素的技術等であるがこれらに限定されるわけではない、当技術分野においてそれ自体公知の任意の技術によって生成され得る。
【００９４】
本発明の別の態様は、それを必要としている患者における骨髄血球減少症及び関連する合併症の予防又は治療において使用するための、上記配列番号１〜配列番号６の任意の１つを含むアミノ配列をコードしている核酸配列を含む発現ベクターである。
【００９５】
その最も広義の意味において、「ベクター」とは、核酸の細胞への移動を促進することができる任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクターの非存在下で生じる分解の程度に比べて少ない分解で核酸を細胞に輸送する。一般に、本発明において有用なベクターとしては、プラスミド、ファージミド、ウイルス、対象となる核酸配列の挿入又は組み込みによって操作されているウイルス又は細菌の起源に由来する他のビヒクルが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクターが好ましい種類のベクターであり、そして、以下のウイルス由来の核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない：レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、及びマウス肉腫ウイルス）；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ−４０タイプのウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；及びＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス）。命名されていないが、当技術分野において公知の他のベクターを容易に用いることができる。
【００９６】
好ましいウイルスベクターは、非必須遺伝子が対象となる遺伝子で置換されている非細胞変性真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスとしては、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）が挙げられ、該ウイルスの生活環は、ウイルスのゲノムＲＮＡがＤＮＡに逆転写され、続いて、宿主細胞のＤＮＡにプロウイルスが組み込まれることを含む。レトロウイルスは、ヒト遺伝子治療治験が承認されている。最も有用なのは、複製欠損性（すなわち、所望のタンパク質の合成を指示することはできるが、感染粒子を作製することはできない）レトロウイルスである。このような遺伝的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボにおいて遺伝子を高効率で形質導入するために一般的に使用される。複製欠損性レトロウイルスを生成するための標準的なプロトコール（プラスミドに外因性遺伝物質を組み込む工程と、パッケージング細胞株（cell lined）にプラスミドをトランスフェクトする工程と、パッケージング細胞株によって組み換えレトロウイルスを生成する工程と、組織培養培地からウイルス粒子を回収する工程と、標的細胞にウイルス粒子を感染させる工程とを含む）は、KRIEGLER（A Laboratory Manual," W.H. Freeman C.O., New York, 1990）及びMURRY（"Methods in Molecular Biology," vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991）に提供されている。
【００９７】
特定の用途に好ましいウイルスは、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスであり、これらは、遺伝子治療においてヒトに使用することが既に承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損性になるように改変することができ、そして、広範な細胞型及び種に感染することができる。更に、熱及び脂質溶媒安定性；造血細胞を含む多様な分化系列の細胞における形質導入頻度が高い；及び重複感染阻害の欠如ゆえに複数の一連の形質導入が可能である等の利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的にヒト細胞ＤＮＡに組み入れることができ、それによって、レトロウイルス感染に特徴的な挿入突然変異及び挿入遺伝子発現のばらつきの可能性を最小化することができる。更に、野性型アデノ随伴ウイルスは、選択圧の非存在下において組織培養で１００回超継代した後に感染し、このことは、アデノ随伴ウイルスのゲノムの組み込みが比較的安定な事象であることを示す。また、アデノ随伴ウイルスは、染色体外でも機能し得る。
【００９８】
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは、当技術分野において広範に記載されており、そして、当業者に周知である。例えば、SANBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照。ここ数年、プラスミドベクターは、インビボにおいて抗原をコードしている遺伝子を細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして用いられている。プラスミドベクターは、ウイルスベクターの多くと同じ安全性の問題を有していないので、このために特に有利である。しかし、宿主細胞に適合するプロモーターを有するこれらプラスミドは、プラスミド内の作動可能にコードされている遺伝子からペプチドを発現させることができる。幾つかの一般的に用いられているプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣｌ９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドは、当業者に周知である。更に、プラスミドは、ＤＮＡの特定の断片を除去したり付加したりするために、制限酵素及びライゲーション反応を用いて特別に設計することができる。プラスミドは、様々な非経口、粘膜、及び局所経路によって送達され得る。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、又は他の経路によって注射してよい。また、鼻腔内スプレー又はドロップ、肛門坐剤、及び経口によって投与してもよい。また、遺伝子銃を用いて表皮又は粘膜表面に投与してもよい。プラスミドは、水溶液で与えられるか、金粒子上で乾燥させるか、又はリポソーム、デンドリマー、及びマイクロカプセル化を含むがこれらに限定されない別のＤＮＡ送達系と共に与えられてよい。
【００９９】
本発明の別の態様は、骨髄血球減少症及び関連する合併症の予防又は治療において用いるための、上記発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【０１００】
本発明によれば、用いることができる宿主細胞の例は、ヒト単球（特に、処置される被験体から得られるもの）である。
【０１０１】
遺伝子を運ぶベクターを細胞に導入することができる手段としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、形質導入、若しくはＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション、リン酸カルシウムを用いるトランスフェクション、又は当業者に公知の他の手段が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
医薬組成物：
本発明は、また、それを必要としている患者において顆粒球／単球前駆細胞（ＧＭＰ）を一過的に提供する方法において使用するための、本明細書に定義するポリペプチド（又はそれをコードしている核酸、それを含む発現ベクター若しくは宿主細胞）と１つ以上の薬学的に許容し得る担体とを含むものに関する。
【０１０３】
本発明は、更に、それを必要としている患者において骨髄血球減少症及び関連する合併症の処置において使用するための、本明細書に定義するポリペプチド（又はそれをコードしている核酸、それを含む発現ベクター若しくは宿主細胞）と１つ以上の薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物に関する。
【０１０４】
本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、意図する目的を達成するのに有効な量のポリペプチドが含有されている全ての組成物を含む。更に、医薬組成物は、活性化合物を薬学的に用いることができる製剤に加工するのを容易にする賦形剤及び補助剤を含む、好適な生理学的に許容し得る担体を含有してよい。
【０１０５】
用語「生理学的に許容し得る担体」は、活性成分の生物活性の有効性に干渉せず、そして、投与される宿主に対して毒性ではない任意の担体を包含することを意味する。好適な生理学的に許容し得る担体は、当技術分野において周知であり、そして、例えば、この分野の標準的な参考書であるRemington's Pharmaceutical Sciences（Mack Publishing Company, Easton, USA, 1985）に記載されている。例えば、非経口投与については、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン、及びリンゲル液等のビヒクル中で、上記活性成分を注射用単位剤形に製剤化してよい。
【０１０６】
生理学的に許容し得る担体に加えて、本発明の医薬組成物は、安定剤、賦形剤、緩衝剤、及び保存剤等の添加剤を微量含んでいてもよい。本発明の医薬組成物は、更に、少なくとも１つの更なる化合物を含んでよい。
【０１０７】
１つの実施形態では、前記少なくとも１つの更なる化合物は、抗ウイルス化合物、抗真菌化合物、抗細菌化合物、サイトカイン、又は成長因子からなる群より選択される。
【０１０８】
抗ウイルス化合物は、患者が遭遇するウイルスに適したものであってよい。有用な抗ウイルス化合物としては、一例として、限定されるわけではないが、アシクロビル、シドホビル、ガンシクロビル、イドクスウリジン、ペンシクロビル、バルガンシクロビル、バラシクロビル、ビダラビン、アマンタジン、リマンタジン、ザナミビル、ホミビルセン、イミキモド、及びリバビリンが挙げられる。レトロウイルスに対する療法としては、特に、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（例えば、ジドブジン、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビン、ラミブジン（lamividudine））、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（例えば、ネビラピン、エファビレンツ、デラビルジン（delvirudine））、及びプロテアーゼ阻害剤（例えば、サクイナビル（saquinivir）、インジナビル、リトナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、及びロピナビル）が挙げられる。
【０１０９】
抗真菌化合物は、全身抗真菌剤であってよい。１つの有用なこの種の抗真菌化合物は、ポリエン・マクロライド系抗生物質のファミリー由来のアムホテリシンＢである。別の抗真菌化合物は、フッ素化ピリミジンであるフルシトシンである。真菌によるフルシトシンの脱アミノ化により、代謝拮抗物質及びＤＮＡ合成阻害剤である５−フルオロウラシルが生成される。フルシトシンは、典型的に、クリプトコッカスの感染及びカンジダ症（candiadosis）に用いられる。単独で用いられるが、フルシトシンは、一般的に、アムホテリシンＢと併用される。イミダゾール及びトリアゾールは、アゾール系抗真菌化合物の広い分類を表す。例示的なアゾール抗真菌剤としては、特に、ケトコナゾール（ketoconzaole）、イトラコナゾール（itracanazole）、フルコナゾール、エコナゾール、ボリコナゾール、及びテルコナゾール（tercanozole）が挙げられる。
【０１１０】
抗細菌化合物は、特定の細菌病原体に好適な抗生物質であってよい。これらは、広域スペクトル抗生物質、及びより標的の狭い抗細菌化合物の両方を含む。抗細菌化合物の様々な分類は、一例として、限定されるわけではないが、キノロン及びフルオロキノロン、［ベータ］−ラクタム抗生物質、アミノグリコシド、テトラサイクリン、マクロライド、及びこれらの様々な同種物である。例示的なキノロン化合物としては、シプロフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシン、ロメフロキサシン、及びモキシフロキサシン（moxifioxacin）が挙げられる。例示的な［ベータ］−ラクタム抗生物質としては、ペニシリン（例えば、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ）、アンピシリン、カルベニシリン、メチシリン、カルバペネム、及びセファロスポリン（例えば、セファロチン、セファマンドール、セファクロール、セフォニシド、セフォテタン、セフォタキシム（cefatoxime）、セフタジジム、セフチゾキシム、セフェピム）が挙げられる。例示的なアミノグリコシドとしては、ネオマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、及びネチルミシンが挙げられる。例示的なマクロライドとしては、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、及びアジスロマイシンが挙げられる。
【０１１１】
本発明のポリペプチドは、意図する目的を達成する任意の手段によって投与してよい。例えば、投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、脳内、くも膜下腔内、鼻腔内、経口、直腸内、経皮、頬側、局所、吸入、又は皮下使用を含むがこれらに限定されない多数の異なる経路によって行ってよい。非経口及び局所の経路が特に好ましい。
【０１１２】
投与される投与量は、個体の要求、所望の効果、及び選択される投与経路に依存する。投与される投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康、及び体重、併用処置、併用処置があるとすれば処置の頻度、並びに所望の効果の性質に依存することが理解される。各処置に必要な全用量は、複数回投与又は単回投与によって投与してよい。
【０１１３】
投与に用いられる用量は、様々なパラメータの関数として、特に、用いられる投与方式、関連する病変、又は望ましい処置期間の関数として適合させ得る。例えば、所望の処置効果を達成するのに必要な用量よりも低いレベルの用量の化合物で開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは、当技術分野の技術の範囲内である。しかし、ポリペプチドの日用量は、成人１人当たり１日当たり０．０１〜１，０００mgという広範囲にわたって変動し得る。好ましくは、組成物は、処置される被験体に対する投与量を症状で調整するために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０、及び５００mgの活性成分を含有する。医薬は、典型的に、約０．０１mg〜約５００mgの活性成分、好ましくは１mg〜約１００mgの活性成分を含有する。薬物の有効量は、通常、１日当たり０．００２mg／kg（体重）〜約２０mg／kg（体重）、特に、１日当たり約０．００１mg／kg（体重）〜１０mg／kg（体重）の投与量レベルで供給される。
【０１１４】
別の態様では、本発明は、それを必要としている患者にＧＭＰ細胞を一過的に提供する方法であって、処置に有効な量のＭ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストを該患者に投与する工程を含む方法に関する。
【０１１５】
更に別の態様では、本発明は、それを必要としている患者における骨髄血球減少症及び関連する合併症を予防又は治療する方法であって、処置に有効な量のＭ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストを該患者に投与する工程を含む方法に関する。
【０１１６】
「処置に有効な量」とは、処置すべき疾患を予防、治療、又は緩和することができるポリペプチドの濃度を達成するのに十分な量を意味する。このような濃度は、当業者であれば日常的に決定することができる。実際に投与されるポリペプチドの量は、典型的に、処置される状態、選択される投与経路、投与される実際の化合物、被験体の年齢、体重、及び応答、被験体の症状の重篤度等を含む関連する状況を鑑みて、医師又は獣医師によって決定される。また、投与量は投与されるポリペプチドの安定性に依存し得ることを当業者は理解する。
【０１１７】
特定の実施形態では、本発明は、ＨＳＣ移植を受ける患者にＧＭＰ細胞を一過的に提供する方法であって、ＨＳＣＴと同時に及び／又はＨＳＣＴの後に、処置に有効な量のＭ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストを該患者に投与する工程を含む方法に関する。
【０１１８】
更に別の態様では、本発明は、更に、ＨＳＣ移植を受ける患者における骨髄血球減少症及び関連する合併症を予防又は治療する方法であって、ＨＳＣＴと同時に及び／又はＨＳＣＴの後に、処置に有効な量のＭ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストを該患者に投与する工程を含む方法に関する。
【０１１９】
本明細書で使用するとき、用語「同時に」とは、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）と同日に、対象となるポリペプチドをレシピエント患者に投与することを意味する。
【０１２０】
本明細書で使用するとき、用語「後に」とは、ＨＳＣＴの後に、例えば、ＨＳＣＴの２、３、４、５、６、又は７日後に、対象となるポリペプチドをレシピエント患者に投与することを意味する。
【０１２１】
１つの実施形態では、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストによる処置は、２サイクル以上投与される、すなわち、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストの投与は、少なくとも１回繰り返される。
【０１２２】
例えば、具体的な患者の状態及び応答に応じて、２〜１０サイクル又は更にはそれ以上投与してよい。間隔、すなわち、次の２つの後続サイクルの開始間の時間は、典型的に数日間である。
【０１２３】
別の態様では、本発明は、更に、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストの存在下でプライミングされる造血幹細胞移植片に関する。
【０１２４】
Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストによるエクスビボ処置は、ＨＳＣＴを受ける患者における骨髄血球減少症及び関連する合併症を予防又は治療するために、骨髄破壊療法又は骨髄抑制細胞減少療法レジメン後の患者の骨髄レスキューを改善する。
【０１２５】
本明細書で使用するとき、用語「造血幹細胞移植片」とは、幹細胞移植を成功させるために最適な数の造血幹細胞／kg（患者）を指す。造血幹細胞移植片は、患者の年齢、重量、及び健康状態、適応症の性質及び重篤度の関数として広く変動し得る。ＨＳＣに好適な投与量範囲は、これら検討事項に従って変動する。
【０１２６】
造血幹細胞移植片として有用な造血幹細胞（ＨＳＣ）には、骨髄（ＢＭ）、末梢血、及び臍帯血という３つの主な起源がある。臍帯血（ＵＣＢ）は、血縁及び非血縁の同種造血幹細胞移植のための、他の造血前駆体源（例えば、骨髄及び動員末梢血）の実用的な代替源である。
【０１２７】
本明細書で使用するとき、用語「造血幹細胞」又は「ＨＳＣ」とは、最終的に、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、リンパ系樹状細胞、骨髄樹状細胞、顆粒球、マクロファージ、巨核球、及び赤血球細胞を含む造血系の全ての細胞型に分化し得る、クローン化可能な自己複製多能性細胞を指す。造血系の他の細胞と同様に、ＨＳＣは、典型的に、特徴的な細胞マーカーセットの存在によって定義される。ＨＳＣの同定に有用なマーカーの表現型は、当該技術分野において一般的に知られている。ヒトＨＳＣの場合、細胞マーカーの表現型は、好ましくは、ＣＤ３４＋ＣＤ９０（ＴｈｙＩ）＋Ｌｉｎ−を含む。ヒトＨＳＣは、更に、ＡＣ１３３陽性；ＣＤ３８陰性／低発現性；及び特定の分化系列マーカーＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ１４、ＣＤ１５、及びグルコホリンＡについて陰性であることを特徴とし得る。通常、本発明で用いられる細胞集団は、存在する細胞の少なくとも約５０％、より通常は、存在する細胞の少なくとも約７５％、好ましくは、存在する細胞の少なくとも約８５％が造血幹細胞の表現型を有し、存在する細胞の約９５％であってもよい。
【０１２８】
「マーカー表現型検査」とは、その表現型（例えば、分化状態及び／又は細胞型）を決定するために細胞上のマーカー又は抗原を同定することを指す。これは、細胞上に存在する抗原を認識する抗体を用いる免疫表現型検査によって行うことができる。抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよいが、一般的に、他の細胞マーカーとの交差反応性が最小になるように選択される。特定の細胞分化又は細胞表面マーカーは、該細胞が由来する動物種に特有であるが、他の細胞マーカーは、種間で共有されていることを理解すべきである。種間で等価な細胞型を定義するこれらマーカーは、種によって構造（例えば、アミノ酸配列）に差があっても、同じマーカーとして同定される。細胞マーカーとしては、特定の状況下では細胞分化（ＣＤ）マーカーとも呼ばれる細胞表面分子、及び遺伝子発現マーカーが挙げられる。遺伝子発現マーカーは、細胞型又は分化状態を示す発現遺伝子のセットである。１つには、遺伝子発現プロファイルは、細胞表面マーカーを反映するが、非細胞表面分子を含んでいる場合もある。
【０１２９】
１つの実施形態では、造血幹細胞移植片は、ドナー（同種又は自己移植片）から得られる動員末梢血サンプル若しくは骨髄（ＢＭ）、又は臍帯血（ＵＣＢ）サンプルからなる群より選択される。
【０１３０】
本明細書で使用するとき、用語「プライミングされた」移植片とは、幹細胞の活性を損なうことなく顆粒球／単球前駆細胞（ＧＭＰ）を特異的かつ一過的に増加させるために、活性化されているか又は特定の遺伝子を発現するように変化している移植片を指す。末梢血、骨髄、又は臍帯血から得られる造血前駆細胞移植片のプライミングは、更に、患者の感染症のリスクを低減することができる。
【０１３１】
プライミングは、上記Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストと共に、少なくとも１時間、好ましくは１時間〜２週間、１〜１０日間、５〜１０日間、又は５〜７日間細胞をインキュベートし、次いで、場合により、細胞からサイトカインを分離し、そして、プライミングされた細胞をレシピエント患者に注入することによって行うことができる。
【０１３２】
本発明のＭ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストは、少なくとも約１ng/mL、約１〜１０００ng/mL、約１０〜５００ng/mL、約２０〜２５０ng/mLの量でインキュベーションミックス中に存在し得る。
【０１３３】
別の態様では、本発明は、ＨＳＣＴを受ける患者における骨髄血球減少症及び関連する合併症の予防又は治療において使用するための、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストの存在下でプライミングされる造血幹細胞移植片に関する。
【０１３４】
本発明は、更に、ＨＳＣ移植を受ける患者における骨髄血球減少症及び関連する合併症を予防又は治療する方法であって、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストの存在下でプライミングされる、処置に有効な量の造血幹細胞移植片を該患者に投与する工程を含む方法に関する。
【０１３５】
キットオブパーツ組成物：
プライミングされているか又はプライミングされていない造血前駆細胞移植片と、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストとを１つの製剤中で合わせ、そして、同時に投与してもよい。しかし、別々の組成物を用いて別々に投与してもよい。更に、異なる時間に投与してもよいことに留意する。
【０１３６】
したがって、別の態様では、本発明は、ＨＳＣＴを受ける患者における骨髄血球減少症及び関連する合併症の予防又は治療において同時に及び／又は後で使用するための、（ｉ）造血幹細胞移植片と（ｉｉ）Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストとを含むキットオブパーツ組成物に関する。
【０１３７】
１つの実施形態では、キットは、抗ウイルス化合物、抗真菌化合物、抗細菌化合物、サイトカイン、又は成長因子からなる群より選択される少なくとも１つの更なる化合物を含んでもよい。
【０１３８】
有用な抗ウイルス化合物、抗真菌化合物、及び抗細菌化合物の例については、上に記載した。
【０１３９】
用語「キット」、「製品」、又は「複合製剤」とは、本明細書で使用するとき、上に定義した併用パートナーを独立に又は区別される量の併用パートナーを含む様々な固定の組み合わせを使用することによって、すなわち、同時に又は異なる時点で投与してよいという意味で、特に「キットオブパーツ」を定義する。次いで、キットオブパーツのパーツを、同時に又は経時的に交互に、すなわち、キットオブパーツの任意のパーツについて異なる時点で、そして、等しい又は異なる時間間隔で投与してよい。複合製剤で投与される併用パートナーの全量の比率は、変動し得る。併用パートナーは、同じ経路で又は異なる経路で投与してよい。投与が逐次である場合、第１のパートナーは、例えば、第２のパートナーの１、２、３、４、５、６、７日間前に投与してよい。
【０１４０】
別の態様では、本発明は、ＨＳＣＴを受ける患者の生存時間を改善する方法であって、ＨＳＣＴと同時に及び／又はＨＳＣＴの後に、処置に有効な量のＭ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストを該患者に投与する工程を含む方法に関する。
【０１４１】
本明細書で使用するとき、用語「生存」とは、患者が生き残っていることを指し、そして、全生存（ＯＳ）及び無進行生存（ＰＦＳ）を含む。
【０１４２】
本明細書で使用するとき、用語「全生存」とは、診断又は処置の時点から規定の期間（例えば、３ヶ月間、６ヶ月間、１年間等）生き残っている患者を指す。
【０１４３】
本明細書で使用するとき、用語「無進行生存」とは、疾患（例えば、移植された患者において発生する、制御されていないか又は処置不可能な日和見感染症等）が進行することなく生き残っている患者を指す。
【０１４４】
本明細書で使用するとき、用語「生存時間の改善」とは、処置されていない患者に対して（すなわち、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストで処置されていない患者に対して）、処置された患者における全生存又は無進行生存が増大することを意味する。
【０１４５】
集団の生存時間の改善は、任意の再現可能な手段によって測定することができる。好ましい態様では、集団の平均生存時間の改善は、例えば、ある集団について、活性化合物による処置の開始後の平均生存長さを計算することによって測定することができる。別の好ましい態様では、集団の平均生存時間の増大は、例えば、ある集団について、活性化合物による処置の第１のラウンドの完了後の平均生存長さを計算することによって測定することもできる。
【０１４６】
別の特定の態様では、本発明は、ＨＳＣＴを受ける患者の生存時間を改善する方法であって、（ｉ）ＨＳＣＴの前に、処置に有効な量のＭ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストを該患者に投与する第１の工程と、（ｉｉ）ＨＳＣＴと同時に及び／又はＨＳＣＴの後に、処置に有効な量のＭ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストを該患者に投与する第２の工程とを含む方法に関する。
【０１４７】
更なる態様では、本発明は、ＨＳＣＴを受ける患者の生存時間を改善する方法であって、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド又はＭ−ＣＳＦ受容体のアゴニストの存在下でプライミングされる、処置に有効な量の造血幹細胞移植片を該患者に投与する工程を含む方法に関する。
【０１４８】
以下の図面及び実施例によって本発明を更に説明する。しかし、これら実施例及び図面は、いかなる手段によっても、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】Ｍ−ＣＳＦは、ＨＳＣ中の骨髄主要制御因子ＰＵ．１を活性化する。ａ〜ｃ）対照（ＰＢＳ）又はＭ−ＣＳＦを注射した１６時間後における、ＰＵ．１−ＧＦＰレポーターマウスの代表的なＦＡＣＳプロファイル（ａ）、及びＨＳＣ（ｂ）又はＣＤ１５０ｈｉＨＳＣ（ｃ）におけるＧＦＰ発現の定量。＊＊＊ｐ＝０，００９；＊＊ｐ＝０，０３。ｄ）Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、又はＧ−ＣＳＦの存在下又は非存在下で１６時間培養した後の分取したＨＳＣにおける、ＧＡＰＤＨ発現（Ｒ．Ｕ．）に対して正規化したＰＵ．１発現の定量ＲＴ−ＰＣＲ解析。エラーバーは、デュープリケートの標準偏差を示す。
【図２】個々のＰＵ．１陰性ＨＳＣからのＰＵ．１＋細胞生成の連続ビデオ撮像。ａ）図２ｅで定量される細胞（ｎ＝３９）を代表する、Ｍ−ＣＳＦと共に１８時間培養した後のＰＵ．１−ＧＦＰレポーターマウス由来の３つの分取した個々のＧＦＰ陰性ＨＳＣの１２時間の観察時間にわたる１０分間隔（点）及び移動中央値（線）によるＧＦＰ蛍光強度。緑：ＧＦＰを活性化している細胞、黒：ＧＦＰ陰性のままの細胞。ｂ）異なる時点においてＰＵ．１の活性化を示す２つの代表的なＨＳＣ（細胞Ａ、Ｂ）を含む視野の、ａ）における記号によって示されている時間に撮影された静止画像。細胞Ｃは、示されている視野外に存在していた。ｃ）図２ｅで定量される細胞（ｎ＝３９）を代表する、ＰＵ．１が活性化していない（細胞Ｃ）又は活性化している（細胞Ａ、Ｄ）、Ｍ−ＣＳＦと共に培養した３つの代表的なＨＳＣの８時間にわたって４０分間隔で撮影した静止画像。ｄ）２４時間の観察期間後における、全細胞に対する百分率としての、Ｍ−ＣＳＦを含む（ｎ＝３９）又は含まない（ｎ＝４２）ＰＵ．１陰性ＨＳＣ（分化系列が決定された細胞）に由来するＰＵ．１＋細胞の定量。＊ｐ＜０．１。ｅ）２４時間の観察期間にわたる、ｄ）に示されている細胞のＰＵ．１陰性ＨＳＣにおけるＰＵ．１活性化のタイミング。
【図３】Ｍ−ＣＳＦはＰＵ．１を活性化し、そして、単一のＨＳＣにおける骨髄のアイデンティティを指示する。ａ）全細胞に対する百分率としての、骨髄遺伝子発現プロファイルを有する（青）又は他の分化系列遺伝子を発現している（白）個々のＰＵ．１＋細胞。＊＊＊ｐ＝０．００９（０ｈ）、及び０，００５（−Ｍ−ＣＳＦ）。ｂ）インビボにおいてＭ−ＣＳＦでプライミングされたＣＤ４５．２ ＰＵ．１−ＧＦＰマウスから分取したＰＵ．１−及びＰＵ．１＋ ＨＳＣを、亜致死的に放射線照射されたＣＤ４５．１レシピエントに移植し、そして、２週間後に脾臓内の子孫細胞を分析するための実験設計。ｃ、ｄ）インビボにおいてＭ−ＣＳＦで刺激する前又は刺激した後の、移植されたＰＵ．１−又はＰＵ．１＋ ＨＳＣに由来するドナーのＧＭＰ及びＭＥＰ前駆体の代表的なＦＡＣＳプロファイル（ｃ）及び比の定量（ｄ）。＊＊ｐ＝０．０５、＊＊＊ｐ＝０．０１、ｎ＝４、８、４。
【図４】Ｍ−ＣＳＦは、インビボにおいて単一のＨＳＣにて、可逆的なＰＵ．１依存性の骨髄分化の優位性を刺激する。ａ）インビボにおいてＭ−ＣＳＦでプライミングした又は対照のＨＳＣを移植した２週間後における、亜致死的に放射線照射されたレシピエントの脾臓におけるドナーのＧＭＰのＭＥＰ前駆体に対する比。実験設計は、図６に示す。＊＊＊ｐ＝０．００３、ｎ＝８，９。ｂ）ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞の血小板又はＣＤ１９＋リンパ腫細胞に対する比として表される、Ｍ−ＣＳＦでプライミングした又は対照のＨＳＣを移植した４週間後及び６週間後における、競合的に再構築されたマウスの血液に対するドナーの寄与。＊＊＊ｐ＝０．０１、ｎ＝１０、６、＊ｐ＝０．０７、ｎ＝６、４。ｃ）対照（ｆｌ／ｆｌ）又は欠失（Δ／Δ）ＰＵ．１対立遺伝子を有する対照又はＭ−ＣＳＦでプライミングしたＨＳＣを移植した２週間後における、亜致死的に放射線照射されたレシピエントの脾臓におけるＭａｃ＋骨髄細胞に対するドナーの寄与。＊＊ｐ＝０．０５、ｎ＝６、４、５。
【図５】Ｍ−ＣＳＦで誘導したＰＵ．１＋細胞の分化能。ａ）Ｍ−ＣＳＦと共に培養してＰＵ．１＋細胞を誘導する前及び後に分取したＣＤ４５．２ ＰＵ．１− ＨＳＣを亜致死的に放射線照射されたＣＤ４５．１レシピエントに移植し、そして、２週間後に脾臓内の子孫細胞を分析するための実験設計。ｂ、ｃ）Ｍ−ＣＳＦと共に培養する前に移植したＰＵ．１− ＨＳＣ又はＭ−ＣＳＦと共に培養後に移植したＰＵ．１＋細胞に由来するドナーのＧＭＰのＭＥＰ前駆体に対する比（ｂ）及び全ＧＭＰ（ｃ）の定量。＊＊ｐ＝０．０２、＊＊＊ｐ＝０．０７、ｎ＝６、７。
【図６】Ｍ−ＣＳＦでプライミングしたＨＳＣの分化能。ａ）インビボにおいてＭ−ＣＳＦでプライミングされたＣＤ４５．２ ＨＳＣを亜致死的に放射線照射されたＣＤ４５．１レシピエントに移植し、そして、２週間後に脾臓内で又は４週間後に血液中で子孫細胞を分析するための実験設計。ｂ）移植の２週間後の脾臓における対照（ＰＢＳ）又はＭ−ＣＳＦでプライミングされたＨＳＣに由来する全ドナー細胞におけるＧＭＰ及びＭＥＰ前駆体の百分率。＊ｐ＝０．１、＊＊ｐ＝０．０４、ｎ＝４、４。ｃ）移植の４週間後の血液中のドナーＣＤ１１ｂ＋ＳＳＣｌｏ単球のＣＤ１９＋Ｂ細胞に対する比率の定量。＊＊＊ｐ＝０．００９、ｎ＝８、４。
【図７−１】Ｍ−ＣＳＦでプライミングしたＨＳＣの競合移植。ａ）ＣＤ４５．２競合者ＨＳＣと共にアクチン−ＧＦＰ ＣＤ４５．２マウス由来のＦＡＣＳで分取し、インビボにおいてＭ−ＣＳＦでプライミングされたＨＳＣ（ＣＤ１５０＋ＣＤ３４−ＣＤ１３５−ＫＳＬ）を致死的に放射線照射されたＣＤ４５．１レシピエントに競合的に移植し、そして、血液細胞の分布を分析するための実験設計。ｂ）アクチン−ＧＦＰ＋ ＨＳＣに由来する血小板、リンパ腫、及び骨髄血液細胞を定量するためのゲーティングストラテジー。ｃ）Ｍａｃ＋骨髄、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ６１＋血小板（４、６、及び１４週間）及びＣＤ３ｅ Ｔ細胞（１４週間）中のＧＦＰ＋ドナー細胞の百分率として表され、そして、ＣＤ４５．２ドナー画分における全ＧＦＰの寄与に対して正規化した、Ｍ−ＣＳＦでプライミングした又は対照のＨＳＣを移植した４、６、及び１４週間後における、競合的に再構築されたマウスの血液に対するドナーの寄与。＊＊ｐ＝０．０３、ｎ＝６、４。
【図７−２】Ｍ−ＣＳＦでプライミングしたＨＳＣの競合移植。ａ）ＣＤ４５．２競合者ＨＳＣと共にアクチン−ＧＦＰ ＣＤ４５．２マウス由来のＦＡＣＳで分取し、インビボにおいてＭ−ＣＳＦでプライミングされたＨＳＣ（ＣＤ１５０＋ＣＤ３４−ＣＤ１３５−ＫＳＬ）を致死的に放射線照射されたＣＤ４５．１レシピエントに競合的に移植し、そして、血液細胞の分布を分析するための実験設計。ｂ）アクチン−ＧＦＰ＋ ＨＳＣに由来する血小板、リンパ腫、及び骨髄血液細胞を定量するためのゲーティングストラテジー。ｃ）Ｍａｃ＋骨髄、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ６１＋血小板（４、６、及び１４週間）及びＣＤ３ｅ Ｔ細胞（１４週間）中のＧＦＰ＋ドナー細胞の百分率として表され、そして、ＣＤ４５．２ドナー画分における全ＧＦＰの寄与に対して正規化した、Ｍ−ＣＳＦでプライミングした又は対照のＨＳＣを移植した４、６、及び１４週間後における、競合的に再構築されたマウスの血液に対するドナーの寄与。＊＊ｐ＝０．０３、ｎ＝６、４。
【図８】造血幹及び前駆細胞（ＨＳ／ＰＣ）移植後のＭＣＳＦ刺激は、緑膿菌感染を防ぐ（ｐ＜０．０１）。ａ）ｒｈＭＣＳＦ処理。ｂ）Ｂａｃ．ウイルスｍＭＣＳＦ処理。
【図９】ＨＳ／ＰＣ移植後のＭＣＳＦ刺激は、細菌組織負荷を低減した（＊＊＊ｐ＜０．０１）。
【図１０】ＨＳ／ＰＣ移植後のＭＣＳＦ刺激は、アスペルギルス・フミガーツス感染を防ぐ（ｐ＜０．０１）。ａ）ｒｈＭＣＳＦ処理。ｂ）Ｂａｃ．ウイルスｍＭＣＳＦ処理。
【０１５０】
実施例１：Ｍ−ＣＳＦは、単一の造血幹細胞において骨髄分化系列の運命を指示する。
材料及び方法
方法の概要：本質的に記載されている通り、フローサイトメトリー、骨髄移植、及びインビボにおけるＨＳＣの免疫蛍光を実施した３。BioMark HDシステム及び４８．４８ダイナミックアレイ（Fluidigm, CA, USA）を用いて単一細胞ナノ流体系リアルタイムＰＣＲを実施し、そして、ビデオ顕微鏡解析は、提案されている規格に従った２４。手順及び試薬の詳細については、補足方法に記載する。
【０１５１】
マウス：ＣＤ４５．１及びＣ５７Ｂｌ／６マウスは、Charles Riverから入手した。ＰＵ．１−ＧＦＰ３１Ｍ−ＣＳＦＲ−／−２７及びＰＵ．１ｆｌ／ｆｌ３２マウスについては記載されている。ｗｔ又はＭ−ＣＳＦＲ−／−胚２７及びＰＵ．１ｆｌ／ｆｌ又はＰＵ．１ｆｌ／ｆｌ：：ＭｘＣｒｅ骨髄に由来するＣＤ４５．２胎児肝臓を用いて上記の通り３再構築された年齢及び性別が適合しているＣＤ４５．１レシピエントを、再構築の８週間後以内にＣＤ１５０＋ＣＤ３４−ＫＳＬＦ ＨＳＣを単離するために用いた。インビボにおける注射については、１０μg/マウス Ｍ−ＣＳＦ、５mg/kg ＬＰＳ（０５５：Ｂ５大腸菌）、又は分取した細胞を、ＰＢＳ １００μＬ中で後眼窩洞に注射した。ＨＳＣ移植については、ＣＤ１５０＋ＣＤ３４−ＫＳＬＦ ＨＳＣ ４００個をＣＤ４５．２マウスから分取し、そして、Ｌｉｎ＋Ｓｃａ−ＣＤ４５．１担体細胞 １００．０００個と混合した後、亜致死的に放射線照射された（４，５Gy）ＣＤ４５．１レシピエントマウスに注射した。競合的移植については、ＣＤ１５０＋，ＣＤ３４−ＫＳＬＦ ＨＳＣ １３００個を、対照又はＭ−ＣＳＦ １０μgを注射した１６時間後にアクチン−ＧＦＰ ＣＤ４５．２マウス３３から単離し、同数のＣＤ４５．２競合者ＨＳＣと混合し、そして、Ｌｉｎ＋Ｓｃａ−ＲＣ溶解ＣＤ４５．１担体細胞 ３００．０００個と共に、亜致死的に放射線照射された（４．５Gy）ＣＤ４５．１レシピエントに注射した。ＧＦＰ＋ドナー細胞を少なくとも５％有するマウス由来の血液中で４及び６週間後に、血小板、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、及びＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞に対する寄与を分析した。ＰＵ．１欠失については、対照（ＰＢＳ）又はＭ−ＣＳＦ １０μgを注射する７及び９日間前に、ＰＵ．１ｆｌ／ｆｌ又はＰＵ．１ｆｌ／ｆｌ：：ＭｘＣｒｅで再構築されたマウスに、５μg/g ポリイノシン酸：ポリシチジル酸を腹腔内注射した。全てのマウス実験は、施設の指針に従って特定病原体除去条件下で実施した。
【０１５２】
ＦＡＣＳ分析：ＦＡＣＳ分取及び分析については、記載されている染色プロトコール３、並びに公開されている幹細胞及び前駆細胞の定義３４、FACSCanto、LSRII、及びFACS AriaIII機器、並びにＤＩＶＡ（商標）ソフトウェア（Becton-Dickinson）を用い、少なくとも２００の事象を用いて集団のみを分析した。ＨＳＣ分析については、抗ＣＤ３４−ＦＩＴＣ（クローンＲＡＭ３４、BD Biosciences）、抗ＣＤ１３５−ＰＥ（クローンＡ２Ｆ１０．１、BD Biosciences）、抗ＣＤ１５０−Ｐｅ−Ｃｙ７（クローンＴＣ１５−１２Ｆ１２．２、Biolegend）、抗ＣＤ１１７−ＡＰＣ−Ｈ７（クローン２Ｂ８、BD Biosciences）、抗Ｓｃａ−１−Ｐｅ−Ｃｙ５（クローンＤ７、Biolegend）、抗ＣＤ４８−ＡＰＣ（クローンＨＭ４８−１、Biolegend）抗体を用いた。これとは別に又は加えて、前駆体及び血液細胞分析については、抗ＣＤ３４ Ａｌｅｘａ ７００（クローンＲＡＭ３４、BD Biosciences）、抗ＣＤ１６／３２ ＰＥ（クローン２．４Ｇ２、BD biosciences）、抗ＣＤ１１ｂ ＰＥ−ＣＦ５９４（クローンＭ１／７０、BD biosciences）、抗ＣＤ１９ＰＥ−Ｃｙ７（クローン１Ｄ３、BD biosciences）、抗ＣＤ４５．２ ＡＰＣ（クローン１０４、BD biosciences）、及び抗ＣＤ４５．１ Pacific Blue（クローンＡ２０、BD biosciences）抗体を用いた。LIVE/DEAD Fixable Violet死細胞色素（Invitrogen）を生存マーカーとして用いた。
【０１５３】
分取したＨＳＣの脾臓内注射及び蛍光顕微鏡法：インビボにおけるＨＳＣの分析については、ＦＡＣＳ分取したＣＤ１５０＋ＣＤ３４−ＫＳＬＦ ＨＳＣ １５００〜７０００個を３７℃で１０分間、ＰＢＳ／０，５％ ＢＳＡ中３μM ＣＦＳＥ（Invitrogen）で染色し、ＰＢＳ／０，５％ ＢＳＡで３回洗浄し、そして、ＰＢＳ ３０μL（０．９％ ＤＭＳＯ中アイソタイプ対照若しくはＡＦＳ９８ α−Ｍ−ＣＳＦＲ抗体 １μg２６又は２μM ＧＷ２５８０、１０μM Ｌｙ２９４００、１０μM ＰＤ９８０５９、又は２μM ＳＵ６５６阻害剤を含有するか又はしない）中で麻酔マウスの脾臓に注射した。２４時間後、脾臓をＯＣＴ（Tissue-Tek, Sakura）に包埋し、そして、−８０℃で冷凍した。器官全体からクリオスタット切片（５μm）を調製し、乾燥させ、そして、４％ ＰＦＡ／ＰＢＳ中にて室温で１０分間固定し、そして、切片１０枚毎に更に加工した。ＰＢＳで洗浄した後、スライドを室温で１時間、ＰＢＳ／２％ ＢＳＡ／１％ ロバ血清／１％ ＦＣＳ／０．１％ サポニン中でブロッキングし、４℃で３６時間、抗ＰＵ．１ポリクローナル抗体（Santa Cruz）と共にＰＢＳ／０．０５％ サポニン（１：５０）中でインキュベートし、洗浄し、そして、二次Alexa 546ロバ抗ウサギ抗体（Molecular probes）と共にＰＢＳ／０．０５％ サポニン（１：５００）中でインキュベートした。全ての免疫蛍光サンプルをProLong Gold DAPI antifade（Molecular probes）で封入し、そして、Zeiss Axioplan 2でマルチ蛍光顕微鏡法によって解析した。全てのＣＦＳＥ＋細胞を、指定の通り３０個以上又は５０個以上の細胞のＰＵ．１発現について解析した。サンプルのアイデンティティを知らされていない第２の訓練された顕微鏡使用者によって、細胞数及び染色を検証した。Leica SP5Xで共焦点顕微鏡法によって高解像度写真を得た。
【０１５４】
ＨＳＣのインビトロにおける培養：ＣＤ１５０＋ＣＤ３４−ＫＳＬＦ ＨＳＣ又はＣＤ１５０＋ＣＤ３４−ＣＤ４８−ＫＳＬＦ ＨＳＣ（単一細胞）を、１００U/mL ペニシリン及び１００mg/mL ストレプトマイシン（いずれもInvitrogen）を添加した１０％ ＦＢＳを含むS-clone SF-03培地（Sanko Jyunyaku）に分取し、そして、コーティングされていないＵ字形９６ウェルプレート（Greiner）において、ＳＣＭ １００μL、２０ng/mL ｒＳＣＦ、５０ng/mL ｒＴＰＯ＋／−１００ng/mL ｒＭ−ＣＳＦ、又は１００ng/mL ｒＧＭ−ＣＳＦ又は１００ng/mL ｒＧ−ＣＳＦ中で培養した。全てのサイトカインは、マウスのものであり、PeproTechから入手した。細胞の生存は、AnnexinV及びヨウ化プロピジウムＦＡＣＳ染色３５によって解析した。
【０１５５】
定量リアルタイムＰＣＲ：全ＲＮＡを単離し、そして、μMACS One-step T7テンプレートキット（Miltenyi Biotec）で逆転写し、そして、製造業者の説明書に従って、TaqMan Universal PCR Master Mix及び7500 Fast Real Time PCR System配列検出システム（いずれもApplied Biosystem）を用いて定量リアルタイムＰＣＲによって分析した。
【０１５６】
単一細胞遺伝子発現プロファイリング：AriaIII分取機（Becton-Dickinson）におけるオートクローンモジュールを用いて、９６ウェルプレートにおけるCellsDirect Reaction Mix（Invitrogen）に直接単一細胞を分取した。Fluidigm Advanced Development Protocolに従って個々の細胞溶解、ｃＤＮＡ合成、及び増幅を実施し、そして、Dynamic Array IFCs（Biomark Fluidigm）を用いる単一細胞ミクロ流体系リアルタイムＰＣＲをFluidigm Inc.の熟練技術者によって実施した。予め増幅させた生成物（２２サイクル）を、Universal PCR Master Mixによる分析前に５倍希釈し、そして、BioMark System（Fluidigm）の９６．９６ダイナミックアレイにおいてTaqMan 遺伝子発現アッセイ（ＡＢＩ）を一覧にした。システムのソフトウェア（BioMark Real-time PCR Analysis; Fluidigm）からＣｔ値を計算し、そして、以下に概説する品質管理ルールのセットに従ってフィルターにかけた。
【０１５７】
遺伝子フィルター：
（ａ）対照を含む各遺伝子について、CtCall＝FAILED及びCtQuality<thresholdのデータを除去した。
（ｂ）対照を含む各遺伝子について、CtValues>=32.0を除去して、非常に低発現の遺伝子を取り除いた。
（ｃ）対照を含む各遺伝子について、デュープリケートでCtValues>=2.0の差を有する遺伝子を不一致とみなして除去した。
【０１５８】
サンプルフィルター：
（ａ）対照遺伝子（Ｇａｐｄｈ）が発現しなかったか又は遺伝子フィルター（ａ〜ｃ）に従って除去されていた場合、全サンプルを除去した。
（ｂ）その列の全ての遺伝子のＣｔ値の平均が２７．０以上である場合、そのサンプルの列全体を除去した。
【０１５９】
経時的撮影及び解析：可能な限り、ビデオ顕微鏡法のプロトコールは、提案されている指針に従った２４。詳細には、ｗｔＣ５７／Ｂｌ６由来のＦＡＣＳ分取したＣＤ１５０＋ＣＤ３４−ＫＳＬＦ ＨＣＳ又はＰＵ．１−ＧＦＰレポーターマウス３１骨髄由来のＧＦＰ陰性ＣＤ１５０＋ＣＤ３４−ＫＳＬＦ ＨＣＳを、１００U/mL ペニシリン及び１００mg/mL ストレプトマイシン、２０ng/mL ｒＳＣＦ、５０ng/mL ｒＴＰＯ＋／−１００ng/mL ｒＭ−ＣＳＦを添加したＳＣＭに懸濁させ、そして、Ibidi μ-slidesVI(0.4)（Biovalley SA, France）にプレーティングした。３７℃及び５％ＣＯ２でCell Observer system（Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany）を用いて経時的顕微鏡法を実施した。１０×（A-plan 10x/0.45 Ph1）又は４０×（Plan-Apochromat 40x/0.95 Korr M27）対物レンズを用いて、明視野及び蛍光（ＧＦＰフィルター：EX BP 470/40；３５０ms）において、２×２ビニングのCoolSNAPHQ2白黒カメラ（Photometrics）及び蛍光照明用のハロゲン化金属１２０Ｗ源を用いて、１０分間毎に画像を取得した。画像解析のために、各時点で４×４画像のマトリックスを取得した。AxioVisionソフトウェア（Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany）で画像を繋ぎ合わせ、そして、わずかなローリングボールによる背景の減算及び１画素ガウスぼかしを用いてFijiソフトウェア３６で処理した。明視野画像の背景の減算については、ｚ−照射の中央値を経時的スタックから差し引いた。ImageJ３７及びFiji３６ソフトウェアの基本コマンド及びマニュアルモードの特定の追跡プラグインMTrackJ３８を用いて単一細胞追跡を実施した。各細胞を明視野チャネルにおいて手動で一コマずつ追跡し、そして、２人の顕微鏡の専門家によって相互制御した。標準的ではない形態又は大きさの細胞は除いた。各細胞の周囲の所定の対象領域（ＲＯＩ）内の最高強度と最低強度との差として蛍光シグナルを測定した。細胞の特性及び挙動（細胞分裂、細胞死、位置、蛍光増加）を手動で文書化して、累積曲線を構築した。Ｒ３９及びExcel（Microsoft Corporation）ソフトウェアを用いて、データを管理し、そして、グラフィックを作成した。
【０１６０】
統計解析：直接サンプルを比較するための両側ノンパラメトリックマンホイットニー検定又は比率のためのピアソンカイ２検定によってＰ値を計算した（アルファ＝０，０５）。箱ひげ図（Whisker prots）は、中央値（線）、上位及び下位四分位点（箱）、及び極端な外れ値（点線のひげ）を示す。
【０１６１】
結果
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）等の系列特異的サイトカインは、生理学的ストレス又は感染症１０、１１の間に強く誘導され得、そして、分化系列の決定された前駆体からの成熟細胞の産生を増加させる１、２。しかし、一般的なモデルによれば、該サイトカインは、一般的に、造血幹細胞（ＨＳＣ）の分化決定に直接影響を与えるとは考えられない９、１２、１３。ＨＳＣの細胞運命の選択は、従来、確率モデルによって説明されている１４。この観点から考えると、競合する分化系列決定転写因子における転写ノイズ１５及びランダム変動が、分化系列の選択を開始させる交差拮抗スイッチを導く４、５、６、７が、一方、サイトカインは、得られる子孫細胞の生存及び増殖を刺激することによって該子孫細胞にしか作用しないと考えられる８、９。このような主要制御因子の重要な例は、骨髄単球性分化を誘導する転写因子ＰＵ．１である１６、１７。一般的に、外部シグナルがこのような固有の主要制御因子の初期活性化を駆動することができるかどうかは知られていない。転写因子ＭａｆＢが欠失しているＨＳＣは、Ｍ−ＣＳＦに応答するＰＵ．１の活性化に対する感受性が高まるので３、本発明者らは、高全身濃度のＭ−ＣＳＦがＰＵ．１を誘導し、そして、転写因子のバランスが事前に変化していないｗｔＨＳＣにおける骨髄単球運命を指示することができるかどうかについて調べた。
【０１６２】
本発明者らは、高全身濃度のＭ−ＣＳＦを刺激する細菌感染症の強力な模倣剤であるリポ多糖類（ＬＰＳ）１１が、ＰＵ．１−ＧＦＰレポーターマウスの長期ＨＳＣ（ＣＤ１１７＋ｓｃａ＋Ｌｉｎ−ＣＤ１３５−ＣＤ３４−ＣＤ１５０＋）におけるＧＦＰのアップレギュレーションを誘導することを観察した１８。ＨＳＣにおけるＭ−ＣＳＦ受容体（Ｍ−ＣＳＦＲ）の発現と一致して３、１９、組み換えＭ−ＣＳＦの直接静脈注射も、１６時間後にＨＳＣにおいてＰＵ．１活性化の著しい増大を誘導した（図１ａ、ｂ）。この処理は、Ｍ−ＣＳＦＲ又はＭａｆＢ発現に著しい変化は引き起こさなかったが、これは、高Ｍ−ＣＳＦＲ又は低ＭａｆＢレベルを有する骨髄プライミングされたＨＳＣの選択に相反するものである。また、Ｍ−ＣＳＦは、ＧＦＰ陽性又は陰性のＨＳＣにおいて骨髄分化系列バイアスを有することが報告されている２０、ＣＤ１５０ｈｉＨＳＣの比率の変化を誘導せず、そして、ＣＤ１５０ｈｉＨＳＣ（図１ｃ）において全ＨＳＣ（図１ａ、ｂ）と同程度ＰＵ．１を活性化した。最後に、培養したＣＤ１５０ｈｉＨＳＣは、Ｍ−ＣＳＦの存在下において増殖についても生存についても優位性は明らかにならなかった。以前から存在するＨＳＣ亜集団の選択的増幅又は生存に相反するこれらデータをまとめると、Ｍ−ＣＳＦは、ＨＳＣにおいてＰＵ．１発現を新たに誘導することができることが示された。
【０１６３】
図１ｄに示す通り、幹細胞に対するＭ−ＣＳＦの効果は、直接かつ特異的であったが、その理由は、ＦＡＣＳで精製されたＨＳＣが、Ｍ−ＣＳＦと共に１６時間培養した後にはＰＵ．１発現を増加させたが、感染中に放出され得るサイトカインであるＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦと共に培養した場合には増加させなかったためである２２。観察された遺伝子発現の変化は、ＰＵ．１＋細胞のＭ−ＣＳＦ依存性選択によって説明することはできず、その理由は、培養したＨＳＣのビデオ顕微鏡法ではＭ−ＣＳＦにおいて増殖についても生存についても優位性が示されず、そして、ＰＵ．１が細胞分裂の開始前に誘導されたためである。ビデオ撮影によってＰＵ．１−ＧＦＰマウス由来の分取した個々のＧＦＰ陰性ＨＳＣを連続観察したところ、Ｍ−ＣＳＦが以前はＰＵ．１陰性であった細胞でＰＵ．１発現を誘導することができることが確認された（図２ａ〜ｃ）。本発明者らは、理論的に以前は陰性であった細胞においてＰＵ．１が誘導され、そして、ＰＵ．１＋細胞の分裂し得るとき、１８時間及び４２時間の培養の間のＨＳＣの運命を記録した。２４時間の観察期間の最後には、対照条件下の２倍を上回るＰＵ．１＋細胞がＭ−ＣＳＦにおいて発生しており（図２ｄ）、そして、これら細胞の起源のバックトラッキングにより、全てのＰＵ．１＋細胞が以前はＰＵ．１陰性であった細胞に由来していたが、ＰＵ．１＋細胞の分裂により生じたものはなかったことが明らかになった。ＰＵ．１＋細胞が分裂しないことは、部分的にＧＦＰ励起の光毒性効果に起因している可能性があるが２３、２４、本発明者らは、ＰＵ．１＋細胞において観察された増加は、完全に、ＰＵ．１レポーターのＭ−ＣＳＦによって誘導される活性化に起因するものであると結論付けることができた。ＰＵ．１活性化のこれら決定事象は、Ｍ−ＣＳＦの存在下において全観察期間にわたり、８時間早く、そして、高い割合で生じた（図２ｅ）。この結果は、Ｍ−ＣＳＦが、単一の以前はＰＵ．１陰性であったＨＳＣにおけるＰＵ．１プロモーターの活性化を直接増加させることができることを示した。
【０１６４】
Ｍ−ＣＳＦによって誘導されるＰＵ．１の活性化が個々のＨＳＣの細胞アイデンティティを変化させるかどうかを更に調べるために、Fluidigm（商標）ダイナミックアレイにおけるナノ流体系リアルタイムＰＣＲによって単一細胞のｍＲＮＡ発現プロファイルを解析した。これら幹細胞のアイデンティティに一致して、新たに単離されたＨＳＣのほとんど全ては、幹細胞及び前駆細胞に関連する遺伝子を発現し、そして、約半分は、分化系列特異的遺伝子を全く発現していなかった（ｌｉｎ−）か又は複数（ｍｉｘ）発現していた。残りは、主に巨核球（Ｍｅｇ）、巨核球−赤血球（ＭｅｇＥ）、又は骨髄分化系列プライミングを示した。Ｍ−ＣＳＦなしで１６時間培養すると、Ｍｅｇ及びｌｉｎ−プロファイルを犠牲にして混合分化系列プロファイルを有する細胞の数が増加した。対照的に、Ｍ−ＣＳＦの存在下で培養すると、骨髄遺伝子発現サインを有する細胞の大きな増加が誘導された。ビデオ顕微鏡法の結果と一致して、骨髄遺伝子発現の増加は、ＰＵ．１＋細胞の数の倍加に関連していた。興味深いことに、この増加は、完全に、任意の他の分化系列からの遺伝子を発現しなかった骨髄サインを有するＰＵ．１＋細胞に起因していた。対照的に、非骨髄遺伝子も発現したＰＵ．１＋細胞の数は、およそ一定のままであった（図３ａ）。同時に、これは、Ｍ−ＣＳＦによって誘導されたＰＵ．１＋細胞が骨髄細胞アイデンティティであるとみなされていたことを示した。この遺伝子発現の変化がインビボにおける機能的骨髄分化系列選択を反映しているかどうかを評価するために、刺激されていないＰＵ．１−ＨＳＣとインビボにおいてＭ−ＣＳＦでプライミングした後のＰＵ．１−及びＰＵ．１＋のＨＳＣとの分化能を比較した（図３ｂ）。これら集団の移植の２週間後における脾臓の前駆体分析により、ＰＵ．１−ＨＳＣからよりもＰＵ．１＋ＨＳＣからの方が、発生する顆粒球／マクロファージ前駆体（ＧＭＰ）の巨核球／赤血球前駆体（ＭＥＰ）に対する比が高いことが明らかになった（図３ｃ、ｄ）。培養中にＭ−ＣＳＦで刺激したＰＵ．１−ＨＳＣに由来するＰＵ．１＋細胞の骨髄分化能においても同様の増加が観察された（図５ａ〜ｃ）。同時に、これらデータは、Ｍ−ＣＳＦによって誘導されたＰＵ．１により、単一ＨＳＣにおいて骨髄の細胞運命が変化したことを示した。
【０１６５】
Ｍ−ＣＳＦがインビボにおいて個々のＨＳＣの細胞運命の変化も誘導するかどうかを更に調べるために、適合幹細胞ニッチを有する髄外造血部位である３、２５脾臓にＣＦＳＥ標識ＨＳＣを移植し、そして、２４時間後の単一ＨＳＣにおいて免疫蛍光による外因性ＰＵ．１タンパク質の発現を解析した。ＨＳＣの大部分は、移植直後にはＰＵ．１陰性であったが、ＬＰＳに曝露された宿主の脾臓に移植した後には、ほぼ全てが活性化ＰＵ．１を有していた。この効果は、Ｍ−ＣＳＦ受容体に対するブロッキング抗体２６がＰＵ．１の活性化を強く阻害したので、Ｍ−ＣＳＦシグナル伝達に主に依存していた。更に、組み換えＭ−ＣＳＦの直接注射により、移植されたＨＳＣにおいてＰＵ．１が同様に強く誘導された。この効果は、完全に細胞自律的であると思われるが、その理由は、Ｍ−ＣＳＦ受容体欠失（Ｍ−ＣＳＦＲ−／−）２７ＨＳＣが、Ｍ−ＣＳＦ刺激されたレシピエントにおいて対照レシピエントよりも高いＰＵ．１の活性化を示さなかったためである。同様に、Ｍ−ＣＳＦＲの低分子阻害剤、又は受容体の下流のシグナル伝達を行うＰＩ３Ｋ、ＥＲＫ及びＳＲＣキナーゼ２８も、これら経路によるｐｕ．１遺伝子の転写活性化因子の刺激と一致して、ＰＵ．１の誘導を防いだ。更に、インビボにおいてＭ−ＣＳＦでプライミングされたＣＤ４５．２ ＨＳＣを亜致死的に放射線照射されたＣＤ４５．１レシピエントに移植したところ、２週間後の脾臓においてＧＭＰのＭＥＰ前駆体に対する比が増大し（図４ａ、図６ａ、ｂ）、そして、４週間後の末梢血において骨髄のリンパ細胞に対する比が増大する（図６ｃ）ことが明らかになった。競合移植アッセイにおいて、Ｍ−ＣＳＦでプライミングされたＨＳＣも、６週間後に再平衡化された血液中において、４週間の血小板及びリンパの寄与に比べて骨髄の優位性を示し、そして、長期の多分化系列寄与が損なれることはなかった（図４ｂ、図７）。最後に、このＭ−ＣＳＦでプライミングされたＨＳＣの骨髄分化優位性は、ＰＵ．１の欠失によって消滅させることができた（図４ｃ）。同時に、これら結果は、可逆的なＰＵ．１依存性の骨髄分化の優位性をもたらす、インビボにおける単一ＨＳＣの細胞アイデンティティの変化をＭ−ＣＳＦが直接指示することができることを示した。
【０１６６】
これら結果は、感染症の造血ストレス条件下において、高全身濃度のＭ−ＣＳＦが、ＨＳＣの骨髄遺伝子発現及び分化優位性を直接指示できることを示す。これは、サイトカインの作用及びＨＳＣがどのようにして分化を決定しているかについての現在の見解に異議を唱えるものである。サイトカインは、一般的に、系列決定された前駆体に対して作用すると考えられているが、本発明者らは、ここに、幹細胞がサイトカインによる分化系列指示の直接の標的であることを示す。ＨＳＣは、細菌２９又はウイルス感染症３０に特徴的なシグナルに応答して増殖するが、分化系列特異的遺伝子発現又は分化能は変化しないことが示されている。選択的サイトカイン作用の一般的なパラダイムと一致して、固有の幹細胞サブタイプが異なる刺激に応答して選択的優位性を有し得ることが提案されている２１。このような機序は、集団基準で指令機序と区別することが困難である。本発明者らは、誘導された分化系列特異性の変化を選択的機序と区別するために、細胞分裂の開始前に、時間窓において培養下及びインビボにて単一細胞分析の複数のアッセイを使用した。これらデータは、Ｍ−ＣＳＦが、選択的生存又は増殖とは独立に、プロモーター、メッセージ及びタンパク質レベルにおいて、骨髄主要制御因子ＰＵ．１の活性化によって幹細胞のアイデンティティを直接変化させ得ることを示す。造血幹細胞における遺伝子発現の多分化系列プライミングは、一般的に、初期細胞運命決定が、分化系列特異的転写因子のバランスにおける確率的変動によってのみ駆動されることを示すと解釈されている４、５、６、１２、１３。本発明者らによるデータは、次に、サイトカインが、ランダム選択を増幅させるだけでなく、ＰＵ．１等の分化系列特異性の重要な制御因子を直接活性化させて、造血幹細胞の分化系列運命を指示して、子孫の損傷に合わせた出力を誘導することができることを示す。Ｍ−ＣＳＦ処理は、幹細胞の活性を損なわせることなく骨髄子孫の産生を一過的に増加させることができるので、骨髄血球減少症を寛解させる、特に幹細胞移植後に感染症から患者を保護するために有用であり得る。
【０１６７】
実施例２及び３：ＭＣＳＦの機能的影響。
感染中のＭＳＣＦが媒介するＨＳＣの決定の機能的影響を調べるために、２つの別々の一連の実験を実施した。全ての実験において、レシピエントの致死的放射線照射後、ＨＳ／ＰＣ ２５００個にドナー由来のｃＫｉｔ-担体細胞 ２００，０００個を移植した。移植を受けていない未感染マウスは、放射線照射が致死的であることを示すための対照として機能した（黒の点線；図８Ａ、８Ｂ及び図１０Ａ、１０Ｂ；ｎ＝１２）。
【０１６８】
ＨＳ／ＰＣ移植を受けた未感染マウスは、有効な救命移植の対照として機能した（黒線；図８Ａ、８Ｂ及び図１０Ａ、１０Ｂ；ｎ＝８）。２つの他の群のマウスには、ＨＳ／ＰＣ移植日にＭＣＳＦ（ｒｈＭＣＳＦ又はバキュロウイルスによって産生されたｍＭＣＳＦ）又はＰＢＳを３回注射した。
【０１６９】
移植の１週間後、これらマウスを、致死量の細菌（緑膿菌）又は日和見真菌（アスペルギルス・フミガーツス）に曝露した。
【０１７０】
実施例２：ＨＳ／ＰＣ移植後のＭＣＳＦ刺激は、細菌感染を防ぐ。
材料及び方法
マウス：ＣＤ４５．１及びＣ５７Ｂｌ／６マウスは、Charles Riverから入手した。１０〜１４週齢の性別適合ＣＤ４５．２レシピエントを、６〜８週齢のＣＤ４５．１から単離した骨髄由来のＫＳＬ（ｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）＋、Ｓｃａ＋、Ｌｉｎ−）ＨＳ／ＰＣを用いて上記の通り３再構築した。インビボにおける注射については、指定の濃度のＭ−ＣＳＦ及び／又は分取した細胞を、ＰＢＳ １００〜２００μL中で後眼窩洞に注射した。ＨＳ／ＰＣ移植については、ＫＬＳ ＨＳ／ＰＣ ２５００個をＣＤ４５．１マウスから分取し、そして、ｃＫｉｔ−ＣＤ４５．２又はｃＫｉｔ−，Ｔｅｒｒ１１９＋担体細胞 ２００，０００個と混合した後、致死的に放射線照射された（１６０kV、２５mA、６．３１Gy）ＣＤ４５．２レシピエントマウスに注射した。放射線照射後、全てのマウスに、飲用水中において抗生物質を与えて、他の病原体による日和見感染の機会を低減した（全てのマウス実験は、施設の指針に従って特定病原体除去条件下で実施した）。
【０１７１】
造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳ／ＰＣ）並びにｃＫｉｔ−細胞の単離：ビオチン化ラット抗マウス分化系列抗体カクテルで染色し、次いで、ストレプトアビジン免疫磁気マイクロビーズ（Miltenyi Biotec）で染色することによって、全骨髄細胞を成熟細胞から欠失させた。分化系列陰性細胞をＨＳ／ＰＣマーカー；抗ＣＤ１１７−ＡＰＣ−Ｈ７（クローン２Ｂ８、BD Biosciences）、抗Ｓｃａ−１−ＰＥ−Ｃｙ５（クローンＤ７、Bio legend）、ストレプトアビジン−ＡＰＣ（eBioscience）、及び生存マーカーとしてのLIVE/DEAD Fixable Violet死細胞色素（Invitrogen）で染色した。FACSAriaIII機器を用いてＨＳ／ＰＣを分取した。ｃＫｉｔ−担体細胞を単離するために、ビオチン化抗マウスＣＤ１１７（クローン２Ｂ８、BioLegend）で染色し、次いで、ストレプトアビジン−免疫磁気マイクロビーズ（Miltenyi Biotec）で染色することによって全骨髄細胞を欠失させ、そして、オートマックを用いて陰性細胞を分取した。Ｔｅｒｒ１１９＋担体細胞については、ｃＫｉｔ−細胞をビオチン化抗Ｔｅｒ１１９と共にインキュベートし、次いで、抗ビオチンマイクロビーズと共にインキュベートし、そして、automacsを用いて陽性分取した。
【０１７２】
Ｍ−ＣＳＦ処理：各マウスにＭ−ＣＳＦ １０μgを３回注射した：ＨＳ／ＰＣ移植の１時間前；移植の６時間及び１８時間後。ヒトＭ−ＣＳＦ（ｒｈＭＣＳＦ、Chiron Corporation Inc., USA、現在Novartis AGの一部門）及びマウスＭ−ＣＳＦをバキュロウイルスで発現させ（Ｂａｃ．ウイルスｍＭＣＳＦ５６）、実験に用いた。
【０１７３】
緑膿菌の感染：他の文献に記載されている通り５３、５４、緑膿菌ＰＡ１４株に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をタグ付けした。ＧＦＰをタグ付けしたＰＡ１４株を３７℃で一晩、ＬＢ中で培養し、ＬＢで１：１００希釈し、そして、細菌の対数期（３〜４  ＯＤ６００nm）に達するまで３時間成長させた。ＰＢＳで希釈した５×１０３CFU/mL 細菌溶液 １００μLを感染実験に更に用いた。ＨＳ／ＰＣ移植の１週間後、滅菌ＰＢＳ １００μL中細菌 ５００コロニー形成単位（CFU）を腹腔内接種することによってマウスを曝露した。
【０１７４】
細菌組織負荷の定量：感染マウスを屠殺し；器官（脾臓、肺、肝臓、及び心臓）を摘出し、そして、計量した。組織１グラム当たりのCFUを決定するために、組織ホモジネートの連続希釈物をＰＢＳで調製し、そして、適切な抗生物質を添加したシュードモナス単離寒天（ＰＩＡ）（Difco laboratories）にプレーティングし、そして、３７℃で一晩インキュベートした。１６〜２４時間後にコロニーを計数した。
【０１７５】
結果
ＨＳ／ＰＣ移植後のＭＣＳＦ刺激は、緑膿菌感染から保護し、そして、細菌組織負荷を低減させた。
放射線照射及びＨＳ／ＰＣ移植後、８日目（Ｄ８）にマウスを緑膿菌に感染させた。ヒトＭＳＣＦで処理したマウスは、生存率（三角線；図８Ａ；ｎ＝１０）が未処理マウス（四角線）における１５．３％からＭＣＳＦ処理マウス（三角線、図８Ａ及びＢ；ｎ＝１３）では５０％に改善されることを示した。マウスＭＣＳＦで処理されたマウスは、更に、生存率が８７．５％に改善された（三角線；図８Ｂ；ｎ＝８）。
【０１７６】
更に、感染により死亡したマウスでは、Ｍ−ＣＳＦ処理したマウスにおいて死亡が遅れた（図８Ａ及びＢ）。
【０１７７】
細菌負荷の分析については、マウスを感染の１８時間後に屠殺し、脾臓、肺、肝臓、及び心臓から組織ホモジネートを調製し、そして、プレーティングしてCFUを決定した。未処理群の１３頭のマウスのうちの８〜１０頭は、ｒｈＭＣＳＦ処理群の１０頭のマウスのうちの２〜３頭と比べて瀕死の状態であった。この早い時点で、ｒｈＭＣＳＦ処理マウスは、未処理マウスに比べて細菌の組織負荷の著しい減少を示し（図９）、これは、生存率の増大が細菌負荷の減少に起因することを示唆する。
【０１７８】
実施例３：ＨＳ／ＰＣ移植後のＭＣＳＦ刺激は、真菌感染を防ぐ。
材料及び方法
マウス；造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳ／ＰＣ）並びにｃＫｉｔ−細胞の単離とＭ−ＣＳＦ処理：実施例２に上記した通り。
【０１７９】
アスペルギルス・フミガーツスの感染：アスペルギルス・フミガーツスＦＧＳＣ１１００は、Centre International de Ressources Microbiennes - Champignons Filamenteux（CIRM-CF, Marseille, France）から供与された。各実験について、２５℃で５日間、培養物を麦芽寒天培地（２％ 麦芽抽出物、２％Bacto-agar DIFCO）上で成長させた。Bitmansour et al. (2002)５５に従って、滅菌生理食塩水中で分生胞子懸濁液を調製した。ＨＳ／ＰＣ移植の１週間後、滅菌ＰＢＳ ２０〜４０μL中分生胞子 ２〜４×１０６個を鼻腔内接種することによってマウスを感染させた。
【０１８０】
感染した器官の真菌培養：器官（肺、肝臓、心臓、及び脾臓）を摘出し、計量し、そして、組織ホモジネートをＰＢＳ中で調製した。ホモジネートを連続希釈し、そして、各希釈物 ２００μLをSabouraud dextrose agar（DIFCO）にプレーティングした。プレートを２５℃でインキュベートし、そして、３〜５日間後に写真を撮影した。
【０１８１】
結果
ＨＳ／ＰＣ移植後のＭＣＳＦ刺激は、アスペルギルス・フミガーツス感染を防ぎ、そして、真菌組織負荷を低減させる。
放射線照射及びＨＳ／ＰＣ移植後、Ｄ８にマウスをアスペルギルス・フミガーツスに感染させた。ヒトＭＳＣＦで処理したマウスは、１０％の生存率しか示さなかった未処理マウス（四角線；図１０Ａ及びＢ；ｎ＝１０）と比べて、４０％の生存率（三角線；図１０Ａ；ｎ＝１０）を示した。興味深いことに、マウスＭＣＳＦで処理したマウスは、更に保護され、６０％の生存率を示した（三角線；図１０Ｂ；ｎ＝１０）。感染後６日間生存していた未処理群の１０頭のマウスのうちの１頭は、合計３５日間の観察期間中、依然として生存していた。
【０１８２】
更に、感染により死亡したマウスにおいて、未処理マウスのＤ９〜Ｄ１４からｒｈＭＣＳＦ処理群のＤ１０〜Ｄ１５に、死がわずかに遅れた。真菌負荷の分析については、マウスを感染の４８時間後に屠殺し、そして、肺、肝臓、及び心臓から組織ホモジネートを調製した。希釈したホモジネート（肺、肝臓、及び心臓の１／１０；心臓の１／１００）をSabouraud dextrose agarプレートにプレーティングして、真菌のコロニー成長を観察した。ｒｈＭＣＳＦ処理マウスは、未処理マウスと比べて、真菌コロニーの組織負荷の著しい減少を示した。真菌組織培養物を、９６時間を超えてインキュベートして、アスペルギルス・フミガーツスの典型的なコロニー形態を検証した。
【０１８３】
参考文献
本願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する分野の状況について記載している。これら参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月3日(2020.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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