(57)【要約】      （修正有）【課題】気管支喘息等の閉塞性肺疾患のバイオマーカー及びその利用方法を提供する。【解決手段】被検体から採取された体液の細胞外小胞におけるタンパク質群より選択される少なくとも1種のタンパク質を検出する工程を含み、さらに、前記工程で検出されたタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が閉塞性肺疾患に罹患していると判定する工程を含む、検査方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
閉塞性肺疾患を検査する方法であって、
（1）被検体から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、及びタンパク質群（C）：
（A）Ig lambda-1 chain C region、Alpha-actinin-1、14-3-3 protein theta、H-2 class I histocompatibility antigen, K-B alpha chain、Vesicle-associated membrane protein 8、Alpha-2-macroglobulin、Thrombospondin-1、Zinc finger protein 536、Complement C1q subcomponent subunit B、Histone H3.3C、Clusterin、Condensin-2 complex subunit G2、Platelet glycoprotein 4、Serglycin、Pyridoxal phosphate phosphatase PHOSPHO2、Hyaluronan-binding protein 2、Integrin beta-2、Complement C1q subcomponent subunit A、Histone H1t、Myc target protein 1、Platelet-derived growth factor subunit B、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Ig kappa chain C region、Laminin subunit gamma-1、Hippocalcin-like protein 1、Src kinase-associated phosphoprotein 2、Collagen alpha-2(VI) chain、Proteoglycan 4、4F2 cell-surface antigen heavy chain、Immunoglobulin J chain、CD5 antigen-like、Histone H4、RNA-binding protein MEX3B、Histone H2B type 3-A、Plasma protease C1 inhibitor、Ig kappa chain V-II region 7S34.1、Serine protease inhibitor A3N、Ig kappa chain V-III region PC 2880/PC 1229、Platelet factor 4、Bridging integrator 2、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、Glycophorin-C、Alpha-2-antiplasmin、Versican core protein、Protein unc-13 homolog B、Calnexin、Ig kappa chain V-III region PC 7183、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Ig kappa chain V-III region PC 4050、Glucose-6-phosphate isomerase、Galectin-related protein、Lymphocyte antigen 6E、Amyloid beta A4 protein、Biglycan、Ig kappa chain V-III region PC 2154、Ig kappa chain V-V region HP 91A3、Complement C1r-A subcomponent、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1、Complement C1s-A subcomponent、Gamma-1-syntrophin、Hemopexin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Ras-related protein Rap-2c、Ig kappa chain V-V region L6、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein、Growth factor receptor-bound protein 2、Ig heavy chain V region 6.96、Keratin, type II cuticular Hb1、Early endosome antigen 1、TBC domain-containing protein kinase-like protein、Platelet glycoprotein VI、Catenin delta-1、60S acidic ribosomal protein P2、Glycophorin-A、BRCA1-A complex subunit RAP80、Laminin subunit alpha-2、Actin-related protein 2/3 complex subunit 5、Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1、RAC-gamma serine/threonine-protein kinase、Ig kappa chain V-II region MOPC 167、Programmed cell death protein 6、Cysteine-rich secretory protein 3、及びProtein FAM177A1からなるタンパク質群、
（B）Cytohesin-2、Erythrocyte band 7 integral membrane protein、Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Amyloid beta A4 protein、Gamma-1-syntrophin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Fermitin family homolog 3、Complement C1r-A subcomponent、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Biglycan、Collagen alpha-2(IV) chain、Complement C1q subcomponent subunit B、Complement C1q subcomponent subunit A、Hippocalcin-like protein 1、Laminin subunit alpha-5、Lymphocyte antigen 6E、Myc target protein 1、Interferon-induced transmembrane protein 2、Trem-like transcript 1 protein、Laminin subunit gamma-1、Bridging integrator 2、Serglycin、Plasma protease C1 inhibitor、Collagen alpha-2(VI) chain、Integrin beta-2、F-box only protein 40、Thrombospondin-1、Alpha-2-macroglobulin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10、Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 3、Collagen alpha-1(I) chain、Vesicle-associated membrane protein 8、CD81 antigen、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Actin-related protein 2/3 complex subunit 3、Platelet glycoprotein IX、Choline transporter-like protein 2、Syntaxin-4、Tetraspanin-9、Platelet factor 4、Integrin alpha-6、Beta-2-microglobulin、Transthyretin、Vesicle-associated membrane protein 3、Platelet glycoprotein Ib beta chain、4F2 cell-surface antigen heavy chain、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Integrin alpha-IIb、Collagen alpha-2(I) chain、Synaptosomal-associated protein 23、Alpha-1-antitrypsin 1-3、Mucin-13、Sodium-dependent serotonin transporter、Multimerin-1、Alpha-1-antitrypsin 1-4、Ras-related protein Rab-7a、Ras-related protein Rap-2b、Ubiquitin-60S ribosomal protein L40、Ig kappa chain V-V region L6、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta、Serine incorporator 3、H-2 class I histocompatibility antigen, Q10 alpha chain、Basigin、C4b-binding protein、Signaling lymphocytic activation molecule、Tropomyosin alpha-4 chain、Alpha-synuclein、及びCalcium-transporting ATPase type 2C member 1からなるタンパク質群、並びに
（C）Collagen alpha-1(XVIII) chain、Carboxypeptidase N subunit 2、Complement C1q subcomponent subunit C、Interferon-induced transmembrane protein 3、Fibulin-2、及びAdenylyl cyclase-associated protein 1からなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質を検出する工程を含む、検査方法。
【請求項２】
さらに、（2）前記工程（1）で検出されたタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が閉塞性肺疾患に罹患していると判定する工程を含む、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
前記工程（2）が、
（2a）前記タンパク質群（A）及び前記タンパク質群（C）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が気管支喘息に罹患していると判定する工程、
（2b）前記タンパク質群（B）及び前記タンパク質群（C）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が慢性閉塞性肺疾患に罹患していると判定する工程、
（2c）前記タンパク質群（A）から選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が慢性閉塞性肺疾患非合併型の気管支喘息に罹患していると判定する工程、
（2d）前記タンパク質群（B）から選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が気管支喘息非合併型の慢性閉塞性肺疾患に罹患していると判定する工程、並びに
（2e）前記タンパク質群（C）から選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が気管支喘息及び慢性閉塞性肺疾患の両方に罹患していると判定する工程
からなる群より選択される少なくとも1種の工程である、請求項２に記載の検査方法。
【請求項４】
前記カットオフ値が、閉塞性肺疾患に罹患していない被検体から採取された体液の細胞外小胞における対応タンパク質の量又は濃度の値の、2.5〜6倍の値である、請求項２又は３に記載の検査方法。
【請求項５】
前記体液が全血、血漿、及び血清からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１〜４のいずれかに記載の検査方法。
【請求項６】
前記タンパク質（A）群が（A1）14-3-3 protein theta、Thrombospondin-1、Platelet glycoprotein 4、Pyridoxal phosphate phosphatase PHOSPHO2、Integrin beta-2、Collagen alpha-2(VI) chain、Proteoglycan 4、Glycophorin-C、Versican core protein、Amyloid beta A4 protein、Ras-related protein Rap-2c、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、及びSerum amyloid A-2 proteinからなる群であり、且つ
前記タンパク質（B）群が（B1）Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Complement C1r-A subcomponent、Biglycan、Complement C1q subcomponent subunit B、Laminin subunit alpha-5、Interferon-induced transmembrane protein 2、Laminin subunit gamma-1、Serglycin、Thrombospondin-1、Alpha-2-macroglobulin、Collagen alpha-1(I) chain、Platelet factor 4、Vesicle-associated membrane protein 3、4F2 cell-surface antigen heavy chain、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Collagen alpha-2(I) chain、Multimerin-1、Ras-related protein Rab-7a、Serine incorporator 3、Basigin、及びC4b-binding proteinからなる群である、
請求項１〜５のいずれかに記載の検査方法。
【請求項７】
前記タンパク質（A1）群が（A2）Amyloid beta A4 protein、Ras-related protein Rap-2c、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、及びSerum amyloid A-2 proteinからなる群であり、且つ
前記タンパク質（B1）群が（B2）Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Complement C1r-A subcomponent、Biglycan、及びComplement C1q subcomponent subunit Bからなる群である、
請求項６に記載の検査方法。
【請求項８】
前記被検体がマウスである、請求項１〜７のいずれかに記載の検査方法。
【請求項９】
タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、及びタンパク質群（C）：
（A）Ig lambda-1 chain C region、Alpha-actinin-1、14-3-3 protein theta、H-2 class I histocompatibility antigen, K-B alpha chain、Vesicle-associated membrane protein 8、Alpha-2-macroglobulin、Thrombospondin-1、Zinc finger protein 536、Complement C1q subcomponent subunit B、Histone H3.3C、Clusterin、Condensin-2 complex subunit G2、Platelet glycoprotein 4、Serglycin、Pyridoxal phosphate phosphatase PHOSPHO2、Hyaluronan-binding protein 2、Integrin beta-2、Complement C1q subcomponent subunit A、Histone H1t、Myc target protein 1、Platelet-derived growth factor subunit B、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Ig kappa chain C region、Laminin subunit gamma-1、Hippocalcin-like protein 1、Src kinase-associated phosphoprotein 2、Collagen alpha-2(VI) chain、Proteoglycan 4、4F2 cell-surface antigen heavy chain、Immunoglobulin J chain、CD5 antigen-like、Histone H4、RNA-binding protein MEX3B、Histone H2B type 3-A、Plasma protease C1 inhibitor、Ig kappa chain V-II region 7S34.1、Serine protease inhibitor A3N、Ig kappa chain V-III region PC 2880/PC 1229、Platelet factor 4、Bridging integrator 2、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、Glycophorin-C、Alpha-2-antiplasmin、Versican core protein、Protein unc-13 homolog B、Calnexin、Ig kappa chain V-III region PC 7183、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Ig kappa chain V-III region PC 4050、Glucose-6-phosphate isomerase、Galectin-related protein、Lymphocyte antigen 6E、Amyloid beta A4 protein、Biglycan、Ig kappa chain V-III region PC 2154、Ig kappa chain V-V region HP 91A3、Complement C1r-A subcomponent、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1、Complement C1s-A subcomponent、Gamma-1-syntrophin、Hemopexin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Ras-related protein Rap-2c、Ig kappa chain V-V region L6、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein、Growth factor receptor-bound protein 2、Ig heavy chain V region 6.96、Keratin, type II cuticular Hb1、Early endosome antigen 1、TBC domain-containing protein kinase-like protein、Platelet glycoprotein VI、Catenin delta-1、60S acidic ribosomal protein P2、Glycophorin-A、BRCA1-A complex subunit RAP80、Laminin subunit alpha-2、Actin-related protein 2/3 complex subunit 5、Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1、RAC-gamma serine/threonine-protein kinase、Ig kappa chain V-II region MOPC 167、Programmed cell death protein 6、Cysteine-rich secretory protein 3、及びProtein FAM177A1からなるタンパク質群、
（B）Cytohesin-2、Erythrocyte band 7 integral membrane protein、Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Amyloid beta A4 protein、Gamma-1-syntrophin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Fermitin family homolog 3、Complement C1r-A subcomponent、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Biglycan、Collagen alpha-2(IV) chain、Complement C1q subcomponent subunit B、Complement C1q subcomponent subunit A、Hippocalcin-like protein 1、Laminin subunit alpha-5、Lymphocyte antigen 6E、Myc target protein 1、Interferon-induced transmembrane protein 2、Trem-like transcript 1 protein、Laminin subunit gamma-1、Bridging integrator 2、Serglycin、Plasma protease C1 inhibitor、Collagen alpha-2(VI) chain、Integrin beta-2、F-box only protein 40、Thrombospondin-1、Alpha-2-macroglobulin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10、Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 3、Collagen alpha-1(I) chain、Vesicle-associated membrane protein 8、CD81 antigen、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Actin-related protein 2/3 complex subunit 3、Platelet glycoprotein IX、Choline transporter-like protein 2、Syntaxin-4、Tetraspanin-9、Platelet factor 4、Integrin alpha-6、Beta-2-microglobulin、Transthyretin、Vesicle-associated membrane protein 3、Platelet glycoprotein Ib beta chain、4F2 cell-surface antigen heavy chain、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Integrin alpha-IIb、Collagen alpha-2(I) chain、Synaptosomal-associated protein 23、Alpha-1-antitrypsin 1-3、Mucin-13、Sodium-dependent serotonin transporter、Multimerin-1、Alpha-1-antitrypsin 1-4、Ras-related protein Rab-7a、Ras-related protein Rap-2b、Ubiquitin-60S ribosomal protein L40、Ig kappa chain V-V region L6、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta、Serine incorporator 3、H-2 class I histocompatibility antigen, Q10 alpha chain、Basigin、C4b-binding protein、Signaling lymphocytic activation molecule、Tropomyosin alpha-4 chain、Alpha-synuclein、及びCalcium-transporting ATPase type 2C member 1からなるタンパク質群、並びに
（C）Collagen alpha-1(XVIII) chain、Carboxypeptidase N subunit 2、Complement C1q subcomponent subunit C、Interferon-induced transmembrane protein 3、Fibulin-2、及びAdenylyl cyclase-associated protein 1からなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の検出剤を含む、閉塞性肺疾患の検査薬。
【請求項１０】
閉塞性肺疾患誘発処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、及びタンパク質群（C）：
（A）Ig lambda-1 chain C region、Alpha-actinin-1、14-3-3 protein theta、H-2 class I histocompatibility antigen, K-B alpha chain、Vesicle-associated membrane protein 8、Alpha-2-macroglobulin、Thrombospondin-1、Zinc finger protein 536、Complement C1q subcomponent subunit B、Histone H3.3C、Clusterin、Condensin-2 complex subunit G2、Platelet glycoprotein 4、Serglycin、Pyridoxal phosphate phosphatase PHOSPHO2、Hyaluronan-binding protein 2、Integrin beta-2、Complement C1q subcomponent subunit A、Histone H1t、Myc target protein 1、Platelet-derived growth factor subunit B、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Ig kappa chain C region、Laminin subunit gamma-1、Hippocalcin-like protein 1、Src kinase-associated phosphoprotein 2、Collagen alpha-2(VI) chain、Proteoglycan 4、4F2 cell-surface antigen heavy chain、Immunoglobulin J chain、CD5 antigen-like、Histone H4、RNA-binding protein MEX3B、Histone H2B type 3-A、Plasma protease C1 inhibitor、Ig kappa chain V-II region 7S34.1、Serine protease inhibitor A3N、Ig kappa chain V-III region PC 2880/PC 1229、Platelet factor 4、Bridging integrator 2、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、Glycophorin-C、Alpha-2-antiplasmin、Versican core protein、Protein unc-13 homolog B、Calnexin、Ig kappa chain V-III region PC 7183、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Ig kappa chain V-III region PC 4050、Glucose-6-phosphate isomerase、Galectin-related protein、Lymphocyte antigen 6E、Amyloid beta A4 protein、Biglycan、Ig kappa chain V-III region PC 2154、Ig kappa chain V-V region HP 91A3、Complement C1r-A subcomponent、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1、Complement C1s-A subcomponent、Gamma-1-syntrophin、Hemopexin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Ras-related protein Rap-2c、Ig kappa chain V-V region L6、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein、Growth factor receptor-bound protein 2、Ig heavy chain V region 6.96、Keratin, type II cuticular Hb1、Early endosome antigen 1、TBC domain-containing protein kinase-like protein、Platelet glycoprotein VI、Catenin delta-1、60S acidic ribosomal protein P2、Glycophorin-A、BRCA1-A complex subunit RAP80、Laminin subunit alpha-2、Actin-related protein 2/3 complex subunit 5、Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1、RAC-gamma serine/threonine-protein kinase、Ig kappa chain V-II region MOPC 167、Programmed cell death protein 6、Cysteine-rich secretory protein 3、及びProtein FAM177A1からなるタンパク質群、
（B）Cytohesin-2、Erythrocyte band 7 integral membrane protein、Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Amyloid beta A4 protein、Gamma-1-syntrophin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Fermitin family homolog 3、Complement C1r-A subcomponent、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Biglycan、Collagen alpha-2(IV) chain、Complement C1q subcomponent subunit B、Complement C1q subcomponent subunit A、Hippocalcin-like protein 1、Laminin subunit alpha-5、Lymphocyte antigen 6E、Myc target protein 1、Interferon-induced transmembrane protein 2、Trem-like transcript 1 protein、Laminin subunit gamma-1、Bridging integrator 2、Serglycin、Plasma protease C1 inhibitor、Collagen alpha-2(VI) chain、Integrin beta-2、F-box only protein 40、Thrombospondin-1、Alpha-2-macroglobulin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10、Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 3、Collagen alpha-1(I) chain、Vesicle-associated membrane protein 8、CD81 antigen、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Actin-related protein 2/3 complex subunit 3、Platelet glycoprotein IX、Choline transporter-like protein 2、Syntaxin-4、Tetraspanin-9、Platelet factor 4、Integrin alpha-6、Beta-2-microglobulin、Transthyretin、Vesicle-associated membrane protein 3、Platelet glycoprotein Ib beta chain、4F2 cell-surface antigen heavy chain、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Integrin alpha-IIb、Collagen alpha-2(I) chain、Synaptosomal-associated protein 23、Alpha-1-antitrypsin 1-3、Mucin-13、Sodium-dependent serotonin transporter、Multimerin-1、Alpha-1-antitrypsin 1-4、Ras-related protein Rab-7a、Ras-related protein Rap-2b、Ubiquitin-60S ribosomal protein L40、Ig kappa chain V-V region L6、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta、Serine incorporator 3、H-2 class I histocompatibility antigen, Q10 alpha chain、Basigin、C4b-binding protein、Signaling lymphocytic activation molecule、Tropomyosin alpha-4 chain、Alpha-synuclein、及びCalcium-transporting ATPase type 2C member 1からなるタンパク質群、並びに
（C）Collagen alpha-1(XVIII) chain、Carboxypeptidase N subunit 2、Complement C1q subcomponent subunit C、Interferon-induced transmembrane protein 3、Fibulin-2、及びAdenylyl cyclase-associated protein 1からなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、閉塞性肺疾患モデル動物のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記指標の値がカットオフ値以上である場合に、前記動物を閉塞性肺疾患モデル動物として選択する工程を含む、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、及びタンパク質群（C）：
（A）Ig lambda-1 chain C region、Alpha-actinin-1、14-3-3 protein theta、H-2 class I histocompatibility antigen, K-B alpha chain、Vesicle-associated membrane protein 8、Alpha-2-macroglobulin、Thrombospondin-1、Zinc finger protein 536、Complement C1q subcomponent subunit B、Histone H3.3C、Clusterin、Condensin-2 complex subunit G2、Platelet glycoprotein 4、Serglycin、Pyridoxal phosphate phosphatase PHOSPHO2、Hyaluronan-binding protein 2、Integrin beta-2、Complement C1q subcomponent subunit A、Histone H1t、Myc target protein 1、Platelet-derived growth factor subunit B、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Ig kappa chain C region、Laminin subunit gamma-1、Hippocalcin-like protein 1、Src kinase-associated phosphoprotein 2、Collagen alpha-2(VI) chain、Proteoglycan 4、4F2 cell-surface antigen heavy chain、Immunoglobulin J chain、CD5 antigen-like、Histone H4、RNA-binding protein MEX3B、Histone H2B type 3-A、Plasma protease C1 inhibitor、Ig kappa chain V-II region 7S34.1、Serine protease inhibitor A3N、Ig kappa chain V-III region PC 2880/PC 1229、Platelet factor 4、Bridging integrator 2、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、Glycophorin-C、Alpha-2-antiplasmin、Versican core protein、Protein unc-13 homolog B、Calnexin、Ig kappa chain V-III region PC 7183、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Ig kappa chain V-III region PC 4050、Glucose-6-phosphate isomerase、Galectin-related protein、Lymphocyte antigen 6E、Amyloid beta A4 protein、Biglycan、Ig kappa chain V-III region PC 2154、Ig kappa chain V-V region HP 91A3、Complement C1r-A subcomponent、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1、Complement C1s-A subcomponent、Gamma-1-syntrophin、Hemopexin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Ras-related protein Rap-2c、Ig kappa chain V-V region L6、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein、Growth factor receptor-bound protein 2、Ig heavy chain V region 6.96、Keratin, type II cuticular Hb1、Early endosome antigen 1、TBC domain-containing protein kinase-like protein、Platelet glycoprotein VI、Catenin delta-1、60S acidic ribosomal protein P2、Glycophorin-A、BRCA1-A complex subunit RAP80、Laminin subunit alpha-2、Actin-related protein 2/3 complex subunit 5、Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1、RAC-gamma serine/threonine-protein kinase、Ig kappa chain V-II region MOPC 167、Programmed cell death protein 6、Cysteine-rich secretory protein 3、及びProtein FAM177A1からなるタンパク質群、
（B）Cytohesin-2、Erythrocyte band 7 integral membrane protein、Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Amyloid beta A4 protein、Gamma-1-syntrophin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Fermitin family homolog 3、Complement C1r-A subcomponent、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Biglycan、Collagen alpha-2(IV) chain、Complement C1q subcomponent subunit B、Complement C1q subcomponent subunit A、Hippocalcin-like protein 1、Laminin subunit alpha-5、Lymphocyte antigen 6E、Myc target protein 1、Interferon-induced transmembrane protein 2、Trem-like transcript 1 protein、Laminin subunit gamma-1、Bridging integrator 2、Serglycin、Plasma protease C1 inhibitor、Collagen alpha-2(VI) chain、Integrin beta-2、F-box only protein 40、Thrombospondin-1、Alpha-2-macroglobulin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10、Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 3、Collagen alpha-1(I) chain、Vesicle-associated membrane protein 8、CD81 antigen、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Actin-related protein 2/3 complex subunit 3、Platelet glycoprotein IX、Choline transporter-like protein 2、Syntaxin-4、Tetraspanin-9、Platelet factor 4、Integrin alpha-6、Beta-2-microglobulin、Transthyretin、Vesicle-associated membrane protein 3、Platelet glycoprotein Ib beta chain、4F2 cell-surface antigen heavy chain、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Integrin alpha-IIb、Collagen alpha-2(I) chain、Synaptosomal-associated protein 23、Alpha-1-antitrypsin 1-3、Mucin-13、Sodium-dependent serotonin transporter、Multimerin-1、Alpha-1-antitrypsin 1-4、Ras-related protein Rab-7a、Ras-related protein Rap-2b、Ubiquitin-60S ribosomal protein L40、Ig kappa chain V-V region L6、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta、Serine incorporator 3、H-2 class I histocompatibility antigen, Q10 alpha chain、Basigin、C4b-binding protein、Signaling lymphocytic activation molecule、Tropomyosin alpha-4 chain、Alpha-synuclein、及びCalcium-transporting ATPase type 2C member 1からなるタンパク質群、並びに
（C）Collagen alpha-1(XVIII) chain、Carboxypeptidase N subunit 2、Complement C1q subcomponent subunit C、Interferon-induced transmembrane protein 3、Fibulin-2、及びAdenylyl cyclase-associated protein 1からなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の抑制剤を含有する、閉塞性肺疾患の予防又は治療剤。
【請求項１３】
被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、及びタンパク質群（C）：
（A）Ig lambda-1 chain C region、Alpha-actinin-1、14-3-3 protein theta、H-2 class I histocompatibility antigen, K-B alpha chain、Vesicle-associated membrane protein 8、Alpha-2-macroglobulin、Thrombospondin-1、Zinc finger protein 536、Complement C1q subcomponent subunit B、Histone H3.3C、Clusterin、Condensin-2 complex subunit G2、Platelet glycoprotein 4、Serglycin、Pyridoxal phosphate phosphatase PHOSPHO2、Hyaluronan-binding protein 2、Integrin beta-2、Complement C1q subcomponent subunit A、Histone H1t、Myc target protein 1、Platelet-derived growth factor subunit B、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Ig kappa chain C region、Laminin subunit gamma-1、Hippocalcin-like protein 1、Src kinase-associated phosphoprotein 2、Collagen alpha-2(VI) chain、Proteoglycan 4、4F2 cell-surface antigen heavy chain、Immunoglobulin J chain、CD5 antigen-like、Histone H4、RNA-binding protein MEX3B、Histone H2B type 3-A、Plasma protease C1 inhibitor、Ig kappa chain V-II region 7S34.1、Serine protease inhibitor A3N、Ig kappa chain V-III region PC 2880/PC 1229、Platelet factor 4、Bridging integrator 2、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、Glycophorin-C、Alpha-2-antiplasmin、Versican core protein、Protein unc-13 homolog B、Calnexin、Ig kappa chain V-III region PC 7183、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Ig kappa chain V-III region PC 4050、Glucose-6-phosphate isomerase、Galectin-related protein、Lymphocyte antigen 6E、Amyloid beta A4 protein、Biglycan、Ig kappa chain V-III region PC 2154、Ig kappa chain V-V region HP 91A3、Complement C1r-A subcomponent、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1、Complement C1s-A subcomponent、Gamma-1-syntrophin、Hemopexin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Ras-related protein Rap-2c、Ig kappa chain V-V region L6、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein、Growth factor receptor-bound protein 2、Ig heavy chain V region 6.96、Keratin, type II cuticular Hb1、Early endosome antigen 1、TBC domain-containing protein kinase-like protein、Platelet glycoprotein VI、Catenin delta-1、60S acidic ribosomal protein P2、Glycophorin-A、BRCA1-A complex subunit RAP80、Laminin subunit alpha-2、Actin-related protein 2/3 complex subunit 5、Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1、RAC-gamma serine/threonine-protein kinase、Ig kappa chain V-II region MOPC 167、Programmed cell death protein 6、Cysteine-rich secretory protein 3、及びProtein FAM177A1からなるタンパク質群、
（B）Cytohesin-2、Erythrocyte band 7 integral membrane protein、Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Amyloid beta A4 protein、Gamma-1-syntrophin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Fermitin family homolog 3、Complement C1r-A subcomponent、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Biglycan、Collagen alpha-2(IV) chain、Complement C1q subcomponent subunit B、Complement C1q subcomponent subunit A、Hippocalcin-like protein 1、Laminin subunit alpha-5、Lymphocyte antigen 6E、Myc target protein 1、Interferon-induced transmembrane protein 2、Trem-like transcript 1 protein、Laminin subunit gamma-1、Bridging integrator 2、Serglycin、Plasma protease C1 inhibitor、Collagen alpha-2(VI) chain、Integrin beta-2、F-box only protein 40、Thrombospondin-1、Alpha-2-macroglobulin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10、Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 3、Collagen alpha-1(I) chain、Vesicle-associated membrane protein 8、CD81 antigen、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Actin-related protein 2/3 complex subunit 3、Platelet glycoprotein IX、Choline transporter-like protein 2、Syntaxin-4、Tetraspanin-9、Platelet factor 4、Integrin alpha-6、Beta-2-microglobulin、Transthyretin、Vesicle-associated membrane protein 3、Platelet glycoprotein Ib beta chain、4F2 cell-surface antigen heavy chain、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Integrin alpha-IIb、Collagen alpha-2(I) chain、Synaptosomal-associated protein 23、Alpha-1-antitrypsin 1-3、Mucin-13、Sodium-dependent serotonin transporter、Multimerin-1、Alpha-1-antitrypsin 1-4、Ras-related protein Rab-7a、Ras-related protein Rap-2b、Ubiquitin-60S ribosomal protein L40、Ig kappa chain V-V region L6、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta、Serine incorporator 3、H-2 class I histocompatibility antigen, Q10 alpha chain、Basigin、C4b-binding protein、Signaling lymphocytic activation molecule、Tropomyosin alpha-4 chain、Alpha-synuclein、及びCalcium-transporting ATPase type 2C member 1からなるタンパク質群、並びに
（C）Collagen alpha-1(XVIII) chain、Carboxypeptidase N subunit 2、Complement C1q subcomponent subunit C、Interferon-induced transmembrane protein 3、Fibulin-2、及びAdenylyl cyclase-associated protein 1からなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法。
【請求項１４】
前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞における対応タンパク質の量又は濃度よりも低い場合に、前記被検物質を閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分として選択する工程を含む、請求項１３に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、及びタンパク質群（C）：
（A）Ig lambda-1 chain C region、Alpha-actinin-1、14-3-3 protein theta、H-2 class I histocompatibility antigen, K-B alpha chain、Vesicle-associated membrane protein 8、Alpha-2-macroglobulin、Thrombospondin-1、Zinc finger protein 536、Complement C1q subcomponent subunit B、Histone H3.3C、Clusterin、Condensin-2 complex subunit G2、Platelet glycoprotein 4、Serglycin、Pyridoxal phosphate phosphatase PHOSPHO2、Hyaluronan-binding protein 2、Integrin beta-2、Complement C1q subcomponent subunit A、Histone H1t、Myc target protein 1、Platelet-derived growth factor subunit B、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Ig kappa chain C region、Laminin subunit gamma-1、Hippocalcin-like protein 1、Src kinase-associated phosphoprotein 2、Collagen alpha-2(VI) chain、Proteoglycan 4、4F2 cell-surface antigen heavy chain、Immunoglobulin J chain、CD5 antigen-like、Histone H4、RNA-binding protein MEX3B、Histone H2B type 3-A、Plasma protease C1 inhibitor、Ig kappa chain V-II region 7S34.1、Serine protease inhibitor A3N、Ig kappa chain V-III region PC 2880/PC 1229、Platelet factor 4、Bridging integrator 2、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、Glycophorin-C、Alpha-2-antiplasmin、Versican core protein、Protein unc-13 homolog B、Calnexin、Ig kappa chain V-III region PC 7183、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Ig kappa chain V-III region PC 4050、Glucose-6-phosphate isomerase、Galectin-related protein、Lymphocyte antigen 6E、Amyloid beta A4 protein、Biglycan、Ig kappa chain V-III region PC 2154、Ig kappa chain V-V region HP 91A3、Complement C1r-A subcomponent、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1、Complement C1s-A subcomponent、Gamma-1-syntrophin、Hemopexin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Ras-related protein Rap-2c、Ig kappa chain V-V region L6、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein、Growth factor receptor-bound protein 2、Ig heavy chain V region 6.96、Keratin, type II cuticular Hb1、Early endosome antigen 1、TBC domain-containing protein kinase-like protein、Platelet glycoprotein VI、Catenin delta-1、60S acidic ribosomal protein P2、Glycophorin-A、BRCA1-A complex subunit RAP80、Laminin subunit alpha-2、Actin-related protein 2/3 complex subunit 5、Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1、RAC-gamma serine/threonine-protein kinase、Ig kappa chain V-II region MOPC 167、Programmed cell death protein 6、Cysteine-rich secretory protein 3、及びProtein FAM177A1からなるタンパク質群、
（B）Cytohesin-2、Erythrocyte band 7 integral membrane protein、Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Amyloid beta A4 protein、Gamma-1-syntrophin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Fermitin family homolog 3、Complement C1r-A subcomponent、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Biglycan、Collagen alpha-2(IV) chain、Complement C1q subcomponent subunit B、Complement C1q subcomponent subunit A、Hippocalcin-like protein 1、Laminin subunit alpha-5、Lymphocyte antigen 6E、Myc target protein 1、Interferon-induced transmembrane protein 2、Trem-like transcript 1 protein、Laminin subunit gamma-1、Bridging integrator 2、Serglycin、Plasma protease C1 inhibitor、Collagen alpha-2(VI) chain、Integrin beta-2、F-box only protein 40、Thrombospondin-1、Alpha-2-macroglobulin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10、Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 3、Collagen alpha-1(I) chain、Vesicle-associated membrane protein 8、CD81 antigen、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Actin-related protein 2/3 complex subunit 3、Platelet glycoprotein IX、Choline transporter-like protein 2、Syntaxin-4、Tetraspanin-9、Platelet factor 4、Integrin alpha-6、Beta-2-microglobulin、Transthyretin、Vesicle-associated membrane protein 3、Platelet glycoprotein Ib beta chain、4F2 cell-surface antigen heavy chain、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Integrin alpha-IIb、Collagen alpha-2(I) chain、Synaptosomal-associated protein 23、Alpha-1-antitrypsin 1-3、Mucin-13、Sodium-dependent serotonin transporter、Multimerin-1、Alpha-1-antitrypsin 1-4、Ras-related protein Rab-7a、Ras-related protein Rap-2b、Ubiquitin-60S ribosomal protein L40、Ig kappa chain V-V region L6、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta、Serine incorporator 3、H-2 class I histocompatibility antigen, Q10 alpha chain、Basigin、C4b-binding protein、Signaling lymphocytic activation molecule、Tropomyosin alpha-4 chain、Alpha-synuclein、及びCalcium-transporting ATPase type 2C member 1からなるタンパク質群、並びに
（C）Collagen alpha-1(XVIII) chain、Carboxypeptidase N subunit 2、Complement C1q subcomponent subunit C、Interferon-induced transmembrane protein 3、Fibulin-2、及びAdenylyl cyclase-associated protein 1からなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、閉塞性肺疾患の誘発性又は増悪性の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、閉塞性肺疾患バイオマーカー、その利用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
気管支喘息（BA）は患者数が3億人に及ぶと推測されており、その有病率の増加が社会的・経済的負担となっている。気管支喘息の本態は、慢性の気道炎症であるが、炎症を制御する鍵分子や気道リモデリングの解明は不十分である。一方、慢性閉塞性肺疾患（COPD）は、2020年には世界死因の第3位と推定されているものの、その診断は呼吸機能の評価のみに依存しているために、多くの患者は未診断のまま放置され、病態解明が不十分である。
【０００３】
気管支喘息、COPD等の閉塞性肺疾患は、個々の遺伝子やタンパク質の変異そのものが病態を形成するというよりも、それらが相互作用して形成された細胞分子ネットワークの調節不全が基礎となって発症すると考えられる。実際、気流閉塞と炎症を特徴とする喘息とCOPDには種々の表現型があり、このことがこれらの疾患の病態解明をより困難にしていると考えられる。さらに両疾患が混在するオーバーラップ症候群も高率に存在することから注目されているものの、鑑別方法や詳細な病態は不明である。
【０００４】
COPDは、世界に2億人の患者が推定され、日本では530万人、そのうち治療を受けている患者はわずか5%に過ぎない。一方、世界2億人の患者が推定されている喘息は、吸入ステロイドの普及により死亡者数は減少しているものの、罹患数は高齢化とともに増加し続けている。最近、COPDと喘息を合併するACOSは、予後不良であることやCOPD患者の20%とも推定されているため注目されている。さらに、喘息は種々の表現型（フェノタイプ）やエンドタイプが存在するため、個別化医療が求められている。このような現状のなかで、Th2 typeの炎症を誘導するIL-5, IL-13, IgEなどの分子を標的とした治療が次々に開発されてきた（日本ではIgEゾレアとIL-5R ABヌーカラが臨床応用）。海外でも次々にTh2タイプの炎症を標的とした治療が開発されているものの、ぺリオスチンを除くと治療選択や有効性を判断する指標（コンパニオンバイオマーカー）はほとんど開発されていないのが現状である。
【０００５】
もちろん、マウスにおける疾患活動性を示すバイオマーカーの開発も急務である。なぜなら、創薬の開発にあたる大手製薬企業において、喘息モデルの評価法は、マウス呼吸機能を一匹ずつ測定するという原始的方法に頼らざるを得ないため、ハイスループットスクリーニングが不可能である。
【０００６】
血清は、非侵襲的に繰り返し採取可能であるので理想的な検査試料と考えられるものの、そこに含まれる99%以上のタンパク質はバイオマーカーの観点から夾雑物とされる多量タンパク（アルブミン等）であるため、プロテオミクスの観点からは、検査資料としての有用性は低い。例えば、COPDと喘息を鑑別可能なバイオマーカーに関する最近の論文（非特許文献１）では、患者数十人の解析を試みるも、解析が2次元電気泳動法による古い質量分析(MS)技術によるものであっただけでなく、大量夾雑物を含む血清を用いたものであったため、見出されたバイオマーカーはプロトロンビンを含む血清夾雑物のみで、COPD特異的バイオマーカーとは言い難い。
【０００７】
細胞外小胞は、細胞から分泌される膜小胞であり、細胞内のタンパク質や遺伝情報（mRNA, microRNA等）を細胞外に運搬することにより、局所や全身における細胞間の情報伝達を担っている。近年、がんの検査試料として細胞外小胞が注目を集めているものの、呼吸器疾患、さらには気管支喘息等の閉塞性肺疾患の検査試料としての有用性については知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Am J Respir Crit Care Med. 2011 Jun 15;183(12):1633-43.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、気管支喘息等の閉塞性肺疾患のバイオマーカー及びその利用方法を提供することを課題とする。好ましくは、本発明は、気管支喘息と慢性閉塞性肺疾患（COPD）との鑑別やこれらの合併症の鑑別が可能なバイオマーカー及びその利用方法を提供することを課題とする。より好ましくは、閉塞性肺疾患の病態を反映するバイオマーカー及びその利用方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、被検体から採取された体液の細胞外小胞における特定のタンパク質群が、閉塞性肺疾患のバイオマーカーとして有用であることを見出した。さらに研究を進めた結果、これらのバイオマーカーにより、気管支喘息と慢性閉塞性肺疾患（COPD）との鑑別やこれらの合併症の鑑別も可能であることを見出した。また、一部のバイオマーカーは、閉塞性肺疾患の病態を反映することをも見出した。これらの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【００１１】
項１．  
閉塞性肺疾患を検査する方法であって、
（1）被検体から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、及びタンパク質群（C）：
（A）Ig lambda-1 chain C region、Alpha-actinin-1、14-3-3 protein theta、H-2 class I histocompatibility antigen, K-B alpha chain、Vesicle-associated membrane protein 8、Alpha-2-macroglobulin、Thrombospondin-1、Zinc finger protein 536、Complement C1q subcomponent subunit B、Histone H3.3C、Clusterin、Condensin-2 complex subunit G2、Platelet glycoprotein 4、Serglycin、Pyridoxal phosphate phosphatase PHOSPHO2、Hyaluronan-binding protein 2、Integrin beta-2、Complement C1q subcomponent subunit A、Histone H1t、Myc target protein 1、Platelet-derived growth factor subunit B、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Ig kappa chain C region、Laminin subunit gamma-1、Hippocalcin-like protein 1、Src kinase-associated phosphoprotein 2、Collagen alpha-2(VI) chain、Proteoglycan 4、4F2 cell-surface antigen heavy chain、Immunoglobulin J chain、CD5 antigen-like、Histone H4、RNA-binding protein MEX3B、Histone H2B type 3-A、Plasma protease C1 inhibitor、Ig kappa chain V-II region 7S34.1、Serine protease inhibitor A3N、Ig kappa chain V-III region PC 2880/PC 1229、Platelet factor 4、Bridging integrator 2、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、Glycophorin-C、Alpha-2-antiplasmin、Versican core protein、Protein unc-13 homolog B、Calnexin、Ig kappa chain V-III region PC 7183、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Ig kappa chain V-III region PC 4050、Glucose-6-phosphate isomerase、Galectin-related protein、Lymphocyte antigen 6E、Amyloid beta A4 protein、Biglycan、Ig kappa chain V-III region PC 2154、Ig kappa chain V-V region HP 91A3、Complement C1r-A subcomponent、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1、Complement C1s-A subcomponent、Gamma-1-syntrophin、Hemopexin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Ras-related protein Rap-2c、Ig kappa chain V-V region L6、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein、Growth factor receptor-bound protein 2、Ig heavy chain V region 6.96、Keratin, type II cuticular Hb1、Early endosome antigen 1、TBC domain-containing protein kinase-like protein、Platelet glycoprotein VI、Catenin delta-1、60S acidic ribosomal protein P2、Glycophorin-A、BRCA1-A complex subunit RAP80、Laminin subunit alpha-2、Actin-related protein 2/3 complex subunit 5、Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1、RAC-gamma serine/threonine-protein kinase、Ig kappa chain V-II region MOPC 167、Programmed cell death protein 6、Cysteine-rich secretory protein 3、及びProtein FAM177A1からなるタンパク質群、
（B）Cytohesin-2、Erythrocyte band 7 integral membrane protein、Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Amyloid beta A4 protein、Gamma-1-syntrophin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Fermitin family homolog 3、Complement C1r-A subcomponent、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Biglycan、Collagen alpha-2(IV) chain、Complement C1q subcomponent subunit B、Complement C1q subcomponent subunit A、Hippocalcin-like protein 1、Laminin subunit alpha-5、Lymphocyte antigen 6E、Myc target protein 1、Interferon-induced transmembrane protein 2、Trem-like transcript 1 protein、Laminin subunit gamma-1、Bridging integrator 2、Serglycin、Plasma protease C1 inhibitor、Collagen alpha-2(VI) chain、Integrin beta-2、F-box only protein 40、Thrombospondin-1、Alpha-2-macroglobulin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10、Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 3、Collagen alpha-1(I) chain、Vesicle-associated membrane protein 8、CD81 antigen、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Actin-related protein 2/3 complex subunit 3、Platelet glycoprotein IX、Choline transporter-like protein 2、Syntaxin-4、Tetraspanin-9、Platelet factor 4、Integrin alpha-6、Beta-2-microglobulin、Transthyretin、Vesicle-associated membrane protein 3、Platelet glycoprotein Ib beta chain、4F2 cell-surface antigen heavy chain、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Integrin alpha-IIb、Collagen alpha-2(I) chain、Synaptosomal-associated protein 23、Alpha-1-antitrypsin 1-3、Mucin-13、Sodium-dependent serotonin transporter、Multimerin-1、Alpha-1-antitrypsin 1-4、Ras-related protein Rab-7a、Ras-related protein Rap-2b、Ubiquitin-60S ribosomal protein L40、Ig kappa chain V-V region L6、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta、Serine incorporator 3、H-2 class I histocompatibility antigen, Q10 alpha chain、Basigin、C4b-binding protein、Signaling lymphocytic activation molecule、Tropomyosin alpha-4 chain、Alpha-synuclein、及びCalcium-transporting ATPase type 2C member 1からなるタンパク質群、並びに
（C）Collagen alpha-1(XVIII) chain、Carboxypeptidase N subunit 2、Complement C1q subcomponent subunit C、Interferon-induced transmembrane protein 3、Fibulin-2、及びAdenylyl cyclase-associated protein 1からなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質を検出する工程を含む、検査方法。
【００１２】
項２．  
さらに、（2）前記工程（1）で検出されたタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が閉塞性肺疾患に罹患していると判定する工程を含む、項１に記載の検査方法。
【００１３】
項３．  
前記工程（2）が、
（2a）前記タンパク質群（A）及び前記タンパク質群（C）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が気管支喘息に罹患していると判定する工程、
（2b）前記タンパク質群（B）及び前記タンパク質群（C）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が慢性閉塞性肺疾患に罹患していると判定する工程、
（2c）前記タンパク質群（A）から選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が慢性閉塞性肺疾患非合併型の気管支喘息に罹患していると判定する工程、
（2d）前記タンパク質群（B）から選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が気管支喘息非合併型の慢性閉塞性肺疾患に罹患していると判定する工程、並びに
（2e）前記タンパク質群（C）から選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が気管支喘息及び慢性閉塞性肺疾患の両方に罹患していると判定する工程
からなる群より選択される少なくとも1種の工程である、項２に記載の検査方法。
【００１４】
項４．  
前記カットオフ値が、閉塞性肺疾患に罹患していない被検体から採取された体液の細胞外小胞における対応タンパク質の量又は濃度の値の、2.5〜6倍の値である、項２又は３に記載の検査方法。
【００１５】
項５．  
前記体液が全血、血漿、及び血清からなる群より選択される少なくとも1種である、項１〜４のいずれかに記載の検査方法。
【００１６】
項６．  
前記タンパク質（A）群が（A1）14-3-3 protein theta、Thrombospondin-1、Platelet glycoprotein 4、Pyridoxal phosphate phosphatase PHOSPHO2、Integrin beta-2、Collagen alpha-2(VI) chain、Proteoglycan 4、Glycophorin-C、Versican core protein、Amyloid beta A4 protein、Ras-related protein Rap-2c、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、及びSerum amyloid A-2 proteinからなる群であり、且つ
前記タンパク質（B）群が（B1）Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Complement C1r-A subcomponent、Biglycan、Complement C1q subcomponent subunit B、Laminin subunit alpha-5、Interferon-induced transmembrane protein 2、Laminin subunit gamma-1、Serglycin、Thrombospondin-1、Alpha-2-macroglobulin、Collagen alpha-1(I) chain、Platelet factor 4、Vesicle-associated membrane protein 3、4F2 cell-surface antigen heavy chain、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Collagen alpha-2(I) chain、Multimerin-1、Ras-related protein Rab-7a、Serine incorporator 3、Basigin、及びC4b-binding proteinからなる群である、
項１〜５のいずれかに記載の検査方法。
【００１７】
項７．  
前記タンパク質（A1）群が（A2）Amyloid beta A4 protein、Ras-related protein Rap-2c、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、及びSerum amyloid A-2 proteinからなる群であり、且つ
前記タンパク質（B1）群が（B2）Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Complement C1r-A subcomponent、Biglycan、及びComplement C1q subcomponent subunit Bからなる群である、
項６に記載の検査方法。
【００１８】
項８．  
前記被検体がマウスである、項１〜７のいずれかに記載の検査方法。
【００１９】
項９．  
タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、及びタンパク質群（C）：
（A）Ig lambda-1 chain C region、Alpha-actinin-1、14-3-3 protein theta、H-2 class I histocompatibility antigen, K-B alpha chain、Vesicle-associated membrane protein 8、Alpha-2-macroglobulin、Thrombospondin-1、Zinc finger protein 536、Complement C1q subcomponent subunit B、Histone H3.3C、Clusterin、Condensin-2 complex subunit G2、Platelet glycoprotein 4、Serglycin、Pyridoxal phosphate phosphatase PHOSPHO2、Hyaluronan-binding protein 2、Integrin beta-2、Complement C1q subcomponent subunit A、Histone H1t、Myc target protein 1、Platelet-derived growth factor subunit B、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Ig kappa chain C region、Laminin subunit gamma-1、Hippocalcin-like protein 1、Src kinase-associated phosphoprotein 2、Collagen alpha-2(VI) chain、Proteoglycan 4、4F2 cell-surface antigen heavy chain、Immunoglobulin J chain、CD5 antigen-like、Histone H4、RNA-binding protein MEX3B、Histone H2B type 3-A、Plasma protease C1 inhibitor、Ig kappa chain V-II region 7S34.1、Serine protease inhibitor A3N、Ig kappa chain V-III region PC 2880/PC 1229、Platelet factor 4、Bridging integrator 2、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、Glycophorin-C、Alpha-2-antiplasmin、Versican core protein、Protein unc-13 homolog B、Calnexin、Ig kappa chain V-III region PC 7183、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Ig kappa chain V-III region PC 4050、Glucose-6-phosphate isomerase、Galectin-related protein、Lymphocyte antigen 6E、Amyloid beta A4 protein、Biglycan、Ig kappa chain V-III region PC 2154、Ig kappa chain V-V region HP 91A3、Complement C1r-A subcomponent、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1、Complement C1s-A subcomponent、Gamma-1-syntrophin、Hemopexin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Ras-related protein Rap-2c、Ig kappa chain V-V region L6、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein、Growth factor receptor-bound protein 2、Ig heavy chain V region 6.96、Keratin, type II cuticular Hb1、Early endosome antigen 1、TBC domain-containing protein kinase-like protein、Platelet glycoprotein VI、Catenin delta-1、60S acidic ribosomal protein P2、Glycophorin-A、BRCA1-A complex subunit RAP80、Laminin subunit alpha-2、Actin-related protein 2/3 complex subunit 5、Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1、RAC-gamma serine/threonine-protein kinase、Ig kappa chain V-II region MOPC 167、Programmed cell death protein 6、Cysteine-rich secretory protein 3、及びProtein FAM177A1からなるタンパク質群、
（B）Cytohesin-2、Erythrocyte band 7 integral membrane protein、Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Amyloid beta A4 protein、Gamma-1-syntrophin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Fermitin family homolog 3、Complement C1r-A subcomponent、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Biglycan、Collagen alpha-2(IV) chain、Complement C1q subcomponent subunit B、Complement C1q subcomponent subunit A、Hippocalcin-like protein 1、Laminin subunit alpha-5、Lymphocyte antigen 6E、Myc target protein 1、Interferon-induced transmembrane protein 2、Trem-like transcript 1 protein、Laminin subunit gamma-1、Bridging integrator 2、Serglycin、Plasma protease C1 inhibitor、Collagen alpha-2(VI) chain、Integrin beta-2、F-box only protein 40、Thrombospondin-1、Alpha-2-macroglobulin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10、Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 3、Collagen alpha-1(I) chain、Vesicle-associated membrane protein 8、CD81 antigen、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Actin-related protein 2/3 complex subunit 3、Platelet glycoprotein IX、Choline transporter-like protein 2、Syntaxin-4、Tetraspanin-9、Platelet factor 4、Integrin alpha-6、Beta-2-microglobulin、Transthyretin、Vesicle-associated membrane protein 3、Platelet glycoprotein Ib beta chain、4F2 cell-surface antigen heavy chain、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Integrin alpha-IIb、Collagen alpha-2(I) chain、Synaptosomal-associated protein 23、Alpha-1-antitrypsin 1-3、Mucin-13、Sodium-dependent serotonin transporter、Multimerin-1、Alpha-1-antitrypsin 1-4、Ras-related protein Rab-7a、Ras-related protein Rap-2b、Ubiquitin-60S ribosomal protein L40、Ig kappa chain V-V region L6、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta、Serine incorporator 3、H-2 class I histocompatibility antigen, Q10 alpha chain、Basigin、C4b-binding protein、Signaling lymphocytic activation molecule、Tropomyosin alpha-4 chain、Alpha-synuclein、及びCalcium-transporting ATPase type 2C member 1からなるタンパク質群、並びに
（C）Collagen alpha-1(XVIII) chain、Carboxypeptidase N subunit 2、Complement C1q subcomponent subunit C、Interferon-induced transmembrane protein 3、Fibulin-2、及びAdenylyl cyclase-associated protein 1からなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の検出剤を含む、閉塞性肺疾患の検査薬。
【００２０】
項１０．  
閉塞性肺疾患誘発処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、及びタンパク質群（C）：
（A）Ig lambda-1 chain C region、Alpha-actinin-1、14-3-3 protein theta、H-2 class I histocompatibility antigen, K-B alpha chain、Vesicle-associated membrane protein 8、Alpha-2-macroglobulin、Thrombospondin-1、Zinc finger protein 536、Complement C1q subcomponent subunit B、Histone H3.3C、Clusterin、Condensin-2 complex subunit G2、Platelet glycoprotein 4、Serglycin、Pyridoxal phosphate phosphatase PHOSPHO2、Hyaluronan-binding protein 2、Integrin beta-2、Complement C1q subcomponent subunit A、Histone H1t、Myc target protein 1、Platelet-derived growth factor subunit B、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Ig kappa chain C region、Laminin subunit gamma-1、Hippocalcin-like protein 1、Src kinase-associated phosphoprotein 2、Collagen alpha-2(VI) chain、Proteoglycan 4、4F2 cell-surface antigen heavy chain、Immunoglobulin J chain、CD5 antigen-like、Histone H4、RNA-binding protein MEX3B、Histone H2B type 3-A、Plasma protease C1 inhibitor、Ig kappa chain V-II region 7S34.1、Serine protease inhibitor A3N、Ig kappa chain V-III region PC 2880/PC 1229、Platelet factor 4、Bridging integrator 2、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、Glycophorin-C、Alpha-2-antiplasmin、Versican core protein、Protein unc-13 homolog B、Calnexin、Ig kappa chain V-III region PC 7183、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Ig kappa chain V-III region PC 4050、Glucose-6-phosphate isomerase、Galectin-related protein、Lymphocyte antigen 6E、Amyloid beta A4 protein、Biglycan、Ig kappa chain V-III region PC 2154、Ig kappa chain V-V region HP 91A3、Complement C1r-A subcomponent、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1、Complement C1s-A subcomponent、Gamma-1-syntrophin、Hemopexin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Ras-related protein Rap-2c、Ig kappa chain V-V region L6、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein、Growth factor receptor-bound protein 2、Ig heavy chain V region 6.96、Keratin, type II cuticular Hb1、Early endosome antigen 1、TBC domain-containing protein kinase-like protein、Platelet glycoprotein VI、Catenin delta-1、60S acidic ribosomal protein P2、Glycophorin-A、BRCA1-A complex subunit RAP80、Laminin subunit alpha-2、Actin-related protein 2/3 complex subunit 5、Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1、RAC-gamma serine/threonine-protein kinase、Ig kappa chain V-II region MOPC 167、Programmed cell death protein 6、Cysteine-rich secretory protein 3、及びProtein FAM177A1からなるタンパク質群、
（B）Cytohesin-2、Erythrocyte band 7 integral membrane protein、Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Amyloid beta A4 protein、Gamma-1-syntrophin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Fermitin family homolog 3、Complement C1r-A subcomponent、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Biglycan、Collagen alpha-2(IV) chain、Complement C1q subcomponent subunit B、Complement C1q subcomponent subunit A、Hippocalcin-like protein 1、Laminin subunit alpha-5、Lymphocyte antigen 6E、Myc target protein 1、Interferon-induced transmembrane protein 2、Trem-like transcript 1 protein、Laminin subunit gamma-1、Bridging integrator 2、Serglycin、Plasma protease C1 inhibitor、Collagen alpha-2(VI) chain、Integrin beta-2、F-box only protein 40、Thrombospondin-1、Alpha-2-macroglobulin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10、Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 3、Collagen alpha-1(I) chain、Vesicle-associated membrane protein 8、CD81 antigen、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Actin-related protein 2/3 complex subunit 3、Platelet glycoprotein IX、Choline transporter-like protein 2、Syntaxin-4、Tetraspanin-9、Platelet factor 4、Integrin alpha-6、Beta-2-microglobulin、Transthyretin、Vesicle-associated membrane protein 3、Platelet glycoprotein Ib beta chain、4F2 cell-surface antigen heavy chain、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Integrin alpha-IIb、Collagen alpha-2(I) chain、Synaptosomal-associated protein 23、Alpha-1-antitrypsin 1-3、Mucin-13、Sodium-dependent serotonin transporter、Multimerin-1、Alpha-1-antitrypsin 1-4、Ras-related protein Rab-7a、Ras-related protein Rap-2b、Ubiquitin-60S ribosomal protein L40、Ig kappa chain V-V region L6、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta、Serine incorporator 3、H-2 class I histocompatibility antigen, Q10 alpha chain、Basigin、C4b-binding protein、Signaling lymphocytic activation molecule、Tropomyosin alpha-4 chain、Alpha-synuclein、及びCalcium-transporting ATPase type 2C member 1からなるタンパク質群、並びに
（C）Collagen alpha-1(XVIII) chain、Carboxypeptidase N subunit 2、Complement C1q subcomponent subunit C、Interferon-induced transmembrane protein 3、Fibulin-2、及びAdenylyl cyclase-associated protein 1からなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、閉塞性肺疾患モデル動物のスクリーニング方法。
【００２１】
項１１．  
前記指標の値がカットオフ値以上である場合に、前記動物を閉塞性肺疾患モデル動物として選択する工程を含む、項１０に記載のスクリーニング方法。
【００２２】
項１２．  
タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、及びタンパク質群（C）：
（A）Ig lambda-1 chain C region、Alpha-actinin-1、14-3-3 protein theta、H-2 class I histocompatibility antigen, K-B alpha chain、Vesicle-associated membrane protein 8、Alpha-2-macroglobulin、Thrombospondin-1、Zinc finger protein 536、Complement C1q subcomponent subunit B、Histone H3.3C、Clusterin、Condensin-2 complex subunit G2、Platelet glycoprotein 4、Serglycin、Pyridoxal phosphate phosphatase PHOSPHO2、Hyaluronan-binding protein 2、Integrin beta-2、Complement C1q subcomponent subunit A、Histone H1t、Myc target protein 1、Platelet-derived growth factor subunit B、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Ig kappa chain C region、Laminin subunit gamma-1、Hippocalcin-like protein 1、Src kinase-associated phosphoprotein 2、Collagen alpha-2(VI) chain、Proteoglycan 4、4F2 cell-surface antigen heavy chain、Immunoglobulin J chain、CD5 antigen-like、Histone H4、RNA-binding protein MEX3B、Histone H2B type 3-A、Plasma protease C1 inhibitor、Ig kappa chain V-II region 7S34.1、Serine protease inhibitor A3N、Ig kappa chain V-III region PC 2880/PC 1229、Platelet factor 4、Bridging integrator 2、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、Glycophorin-C、Alpha-2-antiplasmin、Versican core protein、Protein unc-13 homolog B、Calnexin、Ig kappa chain V-III region PC 7183、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Ig kappa chain V-III region PC 4050、Glucose-6-phosphate isomerase、Galectin-related protein、Lymphocyte antigen 6E、Amyloid beta A4 protein、Biglycan、Ig kappa chain V-III region PC 2154、Ig kappa chain V-V region HP 91A3、Complement C1r-A subcomponent、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1、Complement C1s-A subcomponent、Gamma-1-syntrophin、Hemopexin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Ras-related protein Rap-2c、Ig kappa chain V-V region L6、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein、Growth factor receptor-bound protein 2、Ig heavy chain V region 6.96、Keratin, type II cuticular Hb1、Early endosome antigen 1、TBC domain-containing protein kinase-like protein、Platelet glycoprotein VI、Catenin delta-1、60S acidic ribosomal protein P2、Glycophorin-A、BRCA1-A complex subunit RAP80、Laminin subunit alpha-2、Actin-related protein 2/3 complex subunit 5、Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1、RAC-gamma serine/threonine-protein kinase、Ig kappa chain V-II region MOPC 167、Programmed cell death protein 6、Cysteine-rich secretory protein 3、及びProtein FAM177A1からなるタンパク質群、
（B）Cytohesin-2、Erythrocyte band 7 integral membrane protein、Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Amyloid beta A4 protein、Gamma-1-syntrophin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Fermitin family homolog 3、Complement C1r-A subcomponent、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Biglycan、Collagen alpha-2(IV) chain、Complement C1q subcomponent subunit B、Complement C1q subcomponent subunit A、Hippocalcin-like protein 1、Laminin subunit alpha-5、Lymphocyte antigen 6E、Myc target protein 1、Interferon-induced transmembrane protein 2、Trem-like transcript 1 protein、Laminin subunit gamma-1、Bridging integrator 2、Serglycin、Plasma protease C1 inhibitor、Collagen alpha-2(VI) chain、Integrin beta-2、F-box only protein 40、Thrombospondin-1、Alpha-2-macroglobulin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10、Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 3、Collagen alpha-1(I) chain、Vesicle-associated membrane protein 8、CD81 antigen、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Actin-related protein 2/3 complex subunit 3、Platelet glycoprotein IX、Choline transporter-like protein 2、Syntaxin-4、Tetraspanin-9、Platelet factor 4、Integrin alpha-6、Beta-2-microglobulin、Transthyretin、Vesicle-associated membrane protein 3、Platelet glycoprotein Ib beta chain、4F2 cell-surface antigen heavy chain、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Integrin alpha-IIb、Collagen alpha-2(I) chain、Synaptosomal-associated protein 23、Alpha-1-antitrypsin 1-3、Mucin-13、Sodium-dependent serotonin transporter、Multimerin-1、Alpha-1-antitrypsin 1-4、Ras-related protein Rab-7a、Ras-related protein Rap-2b、Ubiquitin-60S ribosomal protein L40、Ig kappa chain V-V region L6、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta、Serine incorporator 3、H-2 class I histocompatibility antigen, Q10 alpha chain、Basigin、C4b-binding protein、Signaling lymphocytic activation molecule、Tropomyosin alpha-4 chain、Alpha-synuclein、及びCalcium-transporting ATPase type 2C member 1からなるタンパク質群、並びに
（C）Collagen alpha-1(XVIII) chain、Carboxypeptidase N subunit 2、Complement C1q subcomponent subunit C、Interferon-induced transmembrane protein 3、Fibulin-2、及びAdenylyl cyclase-associated protein 1からなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の抑制剤を含有する、閉塞性肺疾患の予防又は治療剤。
【００２３】
項１３．  
被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、及びタンパク質群（C）：
（A）Ig lambda-1 chain C region、Alpha-actinin-1、14-3-3 protein theta、H-2 class I histocompatibility antigen, K-B alpha chain、Vesicle-associated membrane protein 8、Alpha-2-macroglobulin、Thrombospondin-1、Zinc finger protein 536、Complement C1q subcomponent subunit B、Histone H3.3C、Clusterin、Condensin-2 complex subunit G2、Platelet glycoprotein 4、Serglycin、Pyridoxal phosphate phosphatase PHOSPHO2、Hyaluronan-binding protein 2、Integrin beta-2、Complement C1q subcomponent subunit A、Histone H1t、Myc target protein 1、Platelet-derived growth factor subunit B、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Ig kappa chain C region、Laminin subunit gamma-1、Hippocalcin-like protein 1、Src kinase-associated phosphoprotein 2、Collagen alpha-2(VI) chain、Proteoglycan 4、4F2 cell-surface antigen heavy chain、Immunoglobulin J chain、CD5 antigen-like、Histone H4、RNA-binding protein MEX3B、Histone H2B type 3-A、Plasma protease C1 inhibitor、Ig kappa chain V-II region 7S34.1、Serine protease inhibitor A3N、Ig kappa chain V-III region PC 2880/PC 1229、Platelet factor 4、Bridging integrator 2、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、Glycophorin-C、Alpha-2-antiplasmin、Versican core protein、Protein unc-13 homolog B、Calnexin、Ig kappa chain V-III region PC 7183、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Ig kappa chain V-III region PC 4050、Glucose-6-phosphate isomerase、Galectin-related protein、Lymphocyte antigen 6E、Amyloid beta A4 protein、Biglycan、Ig kappa chain V-III region PC 2154、Ig kappa chain V-V region HP 91A3、Complement C1r-A subcomponent、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1、Complement C1s-A subcomponent、Gamma-1-syntrophin、Hemopexin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Ras-related protein Rap-2c、Ig kappa chain V-V region L6、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein、Growth factor receptor-bound protein 2、Ig heavy chain V region 6.96、Keratin, type II cuticular Hb1、Early endosome antigen 1、TBC domain-containing protein kinase-like protein、Platelet glycoprotein VI、Catenin delta-1、60S acidic ribosomal protein P2、Glycophorin-A、BRCA1-A complex subunit RAP80、Laminin subunit alpha-2、Actin-related protein 2/3 complex subunit 5、Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1、RAC-gamma serine/threonine-protein kinase、Ig kappa chain V-II region MOPC 167、Programmed cell death protein 6、Cysteine-rich secretory protein 3、及びProtein FAM177A1からなるタンパク質群、
（B）Cytohesin-2、Erythrocyte band 7 integral membrane protein、Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Amyloid beta A4 protein、Gamma-1-syntrophin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Fermitin family homolog 3、Complement C1r-A subcomponent、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Biglycan、Collagen alpha-2(IV) chain、Complement C1q subcomponent subunit B、Complement C1q subcomponent subunit A、Hippocalcin-like protein 1、Laminin subunit alpha-5、Lymphocyte antigen 6E、Myc target protein 1、Interferon-induced transmembrane protein 2、Trem-like transcript 1 protein、Laminin subunit gamma-1、Bridging integrator 2、Serglycin、Plasma protease C1 inhibitor、Collagen alpha-2(VI) chain、Integrin beta-2、F-box only protein 40、Thrombospondin-1、Alpha-2-macroglobulin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10、Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 3、Collagen alpha-1(I) chain、Vesicle-associated membrane protein 8、CD81 antigen、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Actin-related protein 2/3 complex subunit 3、Platelet glycoprotein IX、Choline transporter-like protein 2、Syntaxin-4、Tetraspanin-9、Platelet factor 4、Integrin alpha-6、Beta-2-microglobulin、Transthyretin、Vesicle-associated membrane protein 3、Platelet glycoprotein Ib beta chain、4F2 cell-surface antigen heavy chain、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Integrin alpha-IIb、Collagen alpha-2(I) chain、Synaptosomal-associated protein 23、Alpha-1-antitrypsin 1-3、Mucin-13、Sodium-dependent serotonin transporter、Multimerin-1、Alpha-1-antitrypsin 1-4、Ras-related protein Rab-7a、Ras-related protein Rap-2b、Ubiquitin-60S ribosomal protein L40、Ig kappa chain V-V region L6、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta、Serine incorporator 3、H-2 class I histocompatibility antigen, Q10 alpha chain、Basigin、C4b-binding protein、Signaling lymphocytic activation molecule、Tropomyosin alpha-4 chain、Alpha-synuclein、及びCalcium-transporting ATPase type 2C member 1からなるタンパク質群、並びに
（C）Collagen alpha-1(XVIII) chain、Carboxypeptidase N subunit 2、Complement C1q subcomponent subunit C、Interferon-induced transmembrane protein 3、Fibulin-2、及びAdenylyl cyclase-associated protein 1からなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法。
【００２４】
項１４．  
前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞における対応タンパク質の量又は濃度よりも低い場合に、前記被検物質を閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分として選択する工程を含む、項１３に記載のスクリーニング方法。
【００２５】
項１５．  
被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、及びタンパク質群（C）：
（A）Ig lambda-1 chain C region、Alpha-actinin-1、14-3-3 protein theta、H-2 class I histocompatibility antigen, K-B alpha chain、Vesicle-associated membrane protein 8、Alpha-2-macroglobulin、Thrombospondin-1、Zinc finger protein 536、Complement C1q subcomponent subunit B、Histone H3.3C、Clusterin、Condensin-2 complex subunit G2、Platelet glycoprotein 4、Serglycin、Pyridoxal phosphate phosphatase PHOSPHO2、Hyaluronan-binding protein 2、Integrin beta-2、Complement C1q subcomponent subunit A、Histone H1t、Myc target protein 1、Platelet-derived growth factor subunit B、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Ig kappa chain C region、Laminin subunit gamma-1、Hippocalcin-like protein 1、Src kinase-associated phosphoprotein 2、Collagen alpha-2(VI) chain、Proteoglycan 4、4F2 cell-surface antigen heavy chain、Immunoglobulin J chain、CD5 antigen-like、Histone H4、RNA-binding protein MEX3B、Histone H2B type 3-A、Plasma protease C1 inhibitor、Ig kappa chain V-II region 7S34.1、Serine protease inhibitor A3N、Ig kappa chain V-III region PC 2880/PC 1229、Platelet factor 4、Bridging integrator 2、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、Glycophorin-C、Alpha-2-antiplasmin、Versican core protein、Protein unc-13 homolog B、Calnexin、Ig kappa chain V-III region PC 7183、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Ig kappa chain V-III region PC 4050、Glucose-6-phosphate isomerase、Galectin-related protein、Lymphocyte antigen 6E、Amyloid beta A4 protein、Biglycan、Ig kappa chain V-III region PC 2154、Ig kappa chain V-V region HP 91A3、Complement C1r-A subcomponent、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1、Complement C1s-A subcomponent、Gamma-1-syntrophin、Hemopexin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Ras-related protein Rap-2c、Ig kappa chain V-V region L6、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein、Growth factor receptor-bound protein 2、Ig heavy chain V region 6.96、Keratin, type II cuticular Hb1、Early endosome antigen 1、TBC domain-containing protein kinase-like protein、Platelet glycoprotein VI、Catenin delta-1、60S acidic ribosomal protein P2、Glycophorin-A、BRCA1-A complex subunit RAP80、Laminin subunit alpha-2、Actin-related protein 2/3 complex subunit 5、Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1、RAC-gamma serine/threonine-protein kinase、Ig kappa chain V-II region MOPC 167、Programmed cell death protein 6、Cysteine-rich secretory protein 3、及びProtein FAM177A1からなるタンパク質群、
（B）Cytohesin-2、Erythrocyte band 7 integral membrane protein、Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Amyloid beta A4 protein、Gamma-1-syntrophin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Fermitin family homolog 3、Complement C1r-A subcomponent、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Biglycan、Collagen alpha-2(IV) chain、Complement C1q subcomponent subunit B、Complement C1q subcomponent subunit A、Hippocalcin-like protein 1、Laminin subunit alpha-5、Lymphocyte antigen 6E、Myc target protein 1、Interferon-induced transmembrane protein 2、Trem-like transcript 1 protein、Laminin subunit gamma-1、Bridging integrator 2、Serglycin、Plasma protease C1 inhibitor、Collagen alpha-2(VI) chain、Integrin beta-2、F-box only protein 40、Thrombospondin-1、Alpha-2-macroglobulin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10、Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 3、Collagen alpha-1(I) chain、Vesicle-associated membrane protein 8、CD81 antigen、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Actin-related protein 2/3 complex subunit 3、Platelet glycoprotein IX、Choline transporter-like protein 2、Syntaxin-4、Tetraspanin-9、Platelet factor 4、Integrin alpha-6、Beta-2-microglobulin、Transthyretin、Vesicle-associated membrane protein 3、Platelet glycoprotein Ib beta chain、4F2 cell-surface antigen heavy chain、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Integrin alpha-IIb、Collagen alpha-2(I) chain、Synaptosomal-associated protein 23、Alpha-1-antitrypsin 1-3、Mucin-13、Sodium-dependent serotonin transporter、Multimerin-1、Alpha-1-antitrypsin 1-4、Ras-related protein Rab-7a、Ras-related protein Rap-2b、Ubiquitin-60S ribosomal protein L40、Ig kappa chain V-V region L6、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta、Serine incorporator 3、H-2 class I histocompatibility antigen, Q10 alpha chain、Basigin、C4b-binding protein、Signaling lymphocytic activation molecule、Tropomyosin alpha-4 chain、Alpha-synuclein、及びCalcium-transporting ATPase type 2C member 1からなるタンパク質群、並びに
（C）Collagen alpha-1(XVIII) chain、Carboxypeptidase N subunit 2、Complement C1q subcomponent subunit C、Interferon-induced transmembrane protein 3、Fibulin-2、及びAdenylyl cyclase-associated protein 1からなるタンパク質群
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、閉塞性肺疾患の誘発性又は増悪性の評価方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、閉塞性肺疾患のバイオマーカーを提供することができる。該バイオマーカーを利用することにより、閉塞性肺疾患の検査、好酸球浸潤の程度の判定、閉塞性肺疾患モデル動物のスクリーニング等を、より簡便、より効率的、且つより低コストで行うことができる。また、該バイオマーカーを利用することにより、気管支喘息と慢性閉塞性肺疾患（COPD）との鑑別やこれらの合併症の鑑別も可能である。さらに、該バイオマーカーを利用することにより、閉塞性肺疾患の予防又は治療、閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング等も可能になり得る。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００２８】
1．閉塞性肺疾患の検査方法
本発明は、その一態様において、閉塞性肺疾患を検査する方法であって、
（1）被検体から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、及びタンパク質群（C）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質を検出する工程（工程1）を含む、検査方法（本明細書において、「本発明の肺閉塞性肺疾患検査方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００２９】
1-1．工程（1）
検査対象である「閉塞性肺疾患」は、特に制限されないが、具体的には、例えば気管支喘息、COPD、びまん性汎細気管支炎、閉塞性細気管支炎等が挙げられる。
【００３０】
被検体は、本発明の検査方法の対象生物であり、その生物種は特に制限されない。被検体の生物種としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられ、好ましくはマウスが挙げられる。
【００３１】
被検体の状態は、特に制限されない。被検体としては、例えば閉塞性肺疾患に罹患しているかどうか不明な検体、気管支喘息に罹患していると既に別の方法により判定されているが、COPDに罹患しているかどうか不明な検体、COPDに罹患していると既に別の方法により判定されているが、気管支喘息に罹患しているかどうか不明な検体、気管支喘息及びCOPDに罹患していると既に別の方法により判定されている検体、閉塞性肺疾患に罹患していないと既に別の方法により判定されている検体、閉塞性肺疾患の治療中の検体等が挙げられる。
【００３２】
体液は、特に制限されない。体液としては、例えば全血、血清、血漿、髄液、唾液、関節液、尿、組織液（気管支肺胞洗浄液を含む）、汗、涙、喀痰、鼻汁などが挙げられ、好ましくは全血、血清、血漿、髄液が挙げられ、より好ましくは全血、血清、血漿が挙げられる。体液は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００３３】
体液は、当業者に公知の方法で被検体から採取することができる。例えば、全血は、注射器などを用いた採血によって採取することができる。血清は、全血から血球及び特定の血液凝固因子を除去した部分であり、例えば、全血を凝固させた後の上澄みとして得ることができる。血漿は、全血から血球を除去した部分であり、例えば、全血を凝固させない条件下で遠心分離に供した際の上澄みとして得ることができる。
【００３４】
細胞外小胞は、細胞から分泌、放出等される膜小胞である限り特に制限されない。細胞外小胞は、通常は、細胞内のタンパク質や遺伝情報（mRNA, microRNA等）を細胞外に運搬することにより、局所や全身における細胞間の情報伝達を担っている膜小胞として定義される。細胞外小胞としては、例えばエクソソーム、微小小胞体、アポトーシス小体、エクトソーム、マイクロパーティクル、分泌マイクロベシクル等が挙げられる。
【００３５】
細胞外小胞は、体液から、公知の方法に従って又は準じて、精製、分離、濃縮等することができる。細胞外小胞を精製、分離、濃縮等する方法としては、例えば超遠心法（例えばペレットダウン法、スクロースクッション法、密度勾配遠心法等）、イムノアフィニティー担体を用いる方法、ゲルろ過法、フィールド・フロー分画法、FACS法等が挙げられる。また、細胞外小胞の精製、分離、濃縮等は、市販のキットを用いて行うことも可能である。これらの方法は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００３６】
工程（1）の検出対象は、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、及びタンパク質群（C）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質（本明細書において、これらをまとめて「対象タンパク質」と示すこともある。）である。
【００３７】
タンパク質群（A）は、（A）Ig lambda-1 chain C region、Alpha-actinin-1、14-3-3 protein theta、H-2 class I histocompatibility antigen, K-B alpha chain、Vesicle-associated membrane protein 8、Alpha-2-macroglobulin、Thrombospondin-1、Zinc finger protein 536、Complement C1q subcomponent subunit B、Histone H3.3C、Clusterin、Condensin-2 complex subunit G2、Platelet glycoprotein 4、Serglycin、Pyridoxal phosphate phosphatase PHOSPHO2、Hyaluronan-binding protein 2、Integrin beta-2、Complement C1q subcomponent subunit A、Histone H1t、Myc target protein 1、Platelet-derived growth factor subunit B、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Ig kappa chain C region、Laminin subunit gamma-1、Hippocalcin-like protein 1、Src kinase-associated phosphoprotein 2、Collagen alpha-2(VI) chain、Proteoglycan 4、4F2 cell-surface antigen heavy chain、Immunoglobulin J chain、CD5 antigen-like、Histone H4、RNA-binding protein MEX3B、Histone H2B type 3-A、Plasma protease C1 inhibitor、Ig kappa chain V-II region 7S34.1、Serine protease inhibitor A3N、Ig kappa chain V-III region PC 2880/PC 1229、Platelet factor 4、Bridging integrator 2、Oncoprotein-induced transcript 3 protein、Glycophorin-C、Alpha-2-antiplasmin、Versican core protein、Protein unc-13 homolog B、Calnexin、Ig kappa chain V-III region PC 7183、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Ig kappa chain V-III region PC 4050、Glucose-6-phosphate isomerase、Galectin-related protein、Lymphocyte antigen 6E、Amyloid beta A4 protein、Biglycan、Ig kappa chain V-III region PC 2154、Ig kappa chain V-V region HP 91A3、Complement C1r-A subcomponent、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1、Complement C1s-A subcomponent、Gamma-1-syntrophin、Hemopexin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Ras-related protein Rap-2c、Ig kappa chain V-V region L6、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein、Growth factor receptor-bound protein 2、Ig heavy chain V region 6.96、Keratin, type II cuticular Hb1、Early endosome antigen 1、TBC domain-containing protein kinase-like protein、Platelet glycoprotein VI、Catenin delta-1、60S acidic ribosomal protein P2、Glycophorin-A、BRCA1-A complex subunit RAP80、Laminin subunit alpha-2、Actin-related protein 2/3 complex subunit 5、Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1、RAC-gamma serine/threonine-protein kinase、Ig kappa chain V-II region MOPC 167、Programmed cell death protein 6、Cysteine-rich secretory protein 3、及びProtein FAM177A1からなるタンパク質群である。
【００３８】
タンパク質群（A）は、気管支喘息特異的なバイオマーカーであり、これを指標とすることにより慢性閉塞性肺疾患非合併型の気管支喘息を鑑別可能である。
【００３９】
タンパク質群（A）の中でも、病勢をより反映している（好酸球浸潤の程度との相関がより高い）という観点からは、好ましくは、14-3-3 protein theta、Thrombospondin-1、Platelet glycoprotein 4、Pyridoxal phosphate phosphatase PHOSPHO2、Integrin beta-2、Collagen alpha-2(VI) chain、Proteoglycan 4、Glycophorin-C、Versican core protein、Amyloid beta A4 protein、Ras-related protein Rap-2c、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein等が挙げられる。
【００４０】
タンパク質群（A）の中でも、正常検体に対する量比がより高い（コントロールの発現量が確認できない場合も包含する）という観点からは、好ましくはIg kappa chain V-V region MOPC 41、Ig kappa chain V-III region PC 4050、Glucose-6-phosphate isomerase、Galectin-related protein、Lymphocyte antigen 6E、Amyloid beta A4 protein、Biglycan、Ig kappa chain V-III region PC 2154、Ig kappa chain V-V region HP 91A3、Complement C1r-A subcomponent、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1、Complement C1s-A subcomponent、Gamma-1-syntrophin、Hemopexin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Ras-related protein Rap-2c、Ig kappa chain V-V region L6、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein、Growth factor receptor-bound protein 2、Ig heavy chain V region 6.96、Keratin, type II cuticular Hb1、Early endosome antigen 1、TBC domain-containing protein kinase-like protein、Platelet glycoprotein VI、Catenin delta-1、60S acidic ribosomal protein P2、Glycophorin-A、BRCA1-A complex subunit RAP80、Laminin subunit alpha-2、Actin-related protein 2/3 complex subunit 5、Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1、RAC-gamma serine/threonine-protein kinase、Ig kappa chain V-II region MOPC 167、Programmed cell death protein 6、Cysteine-rich secretory protein 3、Protein FAM177A1等が挙げられ、より好ましくはRas-related protein Rap-2c、Ig kappa chain V-V region L6、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein、Growth factor receptor-bound protein 2、Ig heavy chain V region 6.96、Keratin, type II cuticular Hb1、Early endosome antigen 1、TBC domain-containing protein kinase-like protein、Platelet glycoprotein VI、Catenin delta-1、60S acidic ribosomal protein P2、Glycophorin-A、BRCA1-A complex subunit RAP80、Laminin subunit alpha-2、Actin-related protein 2/3 complex subunit 5、Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1、RAC-gamma serine/threonine-protein kinase、Ig kappa chain V-II region MOPC 167、Programmed cell death protein 6、Cysteine-rich secretory protein 3、Protein FAM177A1等が挙げられ、さらに好ましくはSerum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein、Growth factor receptor-bound protein 2、Ig heavy chain V region 6.96、Keratin, type II cuticular Hb1、Early endosome antigen 1、TBC domain-containing protein kinase-like protein、Platelet glycoprotein VI、Catenin delta-1、60S acidic ribosomal protein P2、Glycophorin-A、BRCA1-A complex subunit RAP80、Laminin subunit alpha-2、Actin-related protein 2/3 complex subunit 5、Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1、RAC-gamma serine/threonine-protein kinase、Ig kappa chain V-II region MOPC 167、Programmed cell death protein 6、Cysteine-rich secretory protein 3、Protein FAM177A1等が挙げられる。
【００４１】
タンパク質群（A）の中でも、正常検体に対する量比がより高い（コントロールの発現量が確認できない場合は包含しない）という観点からは、好ましくはIg kappa chain V-V region MOPC 41、Ig kappa chain V-III region PC 4050、Glucose-6-phosphate isomerase、Galectin-related protein、Lymphocyte antigen 6E、Amyloid beta A4 protein、Biglycan、Ig kappa chain V-III region PC 2154、Ig kappa chain V-V region HP 91A3、Complement C1r-A subcomponent、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1、Complement C1s-A subcomponent、Gamma-1-syntrophin、Hemopexin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Ras-related protein Rap-2c、Ig kappa chain V-V region L6、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein等が挙げられ、より好ましくはRas-related protein Rap-2c、Ig kappa chain V-V region L6、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein等が挙げられ、さらに好ましくはSerum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein等が挙げられる。
【００４２】
タンパク質群（A）の中でも、病勢をより反映している（好酸球浸潤の程度との相関がより高い）という観点、及び正常検体に対する量比がより高いという観点からは、好ましくはAmyloid beta A4 protein、Ras-related protein Rap-2c、Decorin、Serum amyloid A-1 protein、Serum amyloid A-2 protein等が挙げられる。
【００４３】
タンパク質群（B）は、Cytohesin-2、Erythrocyte band 7 integral membrane protein、Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Amyloid beta A4 protein、Gamma-1-syntrophin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Fermitin family homolog 3、Complement C1r-A subcomponent、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Biglycan、Collagen alpha-2(IV) chain、Complement C1q subcomponent subunit B、Complement C1q subcomponent subunit A、Hippocalcin-like protein 1、Laminin subunit alpha-5、Lymphocyte antigen 6E、Myc target protein 1、Interferon-induced transmembrane protein 2、Trem-like transcript 1 protein、Laminin subunit gamma-1、Bridging integrator 2、Serglycin、Plasma protease C1 inhibitor、Collagen alpha-2(VI) chain、Integrin beta-2、F-box only protein 40、Thrombospondin-1、Alpha-2-macroglobulin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10、Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 3、Collagen alpha-1(I) chain、Vesicle-associated membrane protein 8、CD81 antigen、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Actin-related protein 2/3 complex subunit 3、Platelet glycoprotein IX、Choline transporter-like protein 2、Syntaxin-4、Tetraspanin-9、Platelet factor 4、Integrin alpha-6、Beta-2-microglobulin、Transthyretin、Vesicle-associated membrane protein 3、Platelet glycoprotein Ib beta chain、4F2 cell-surface antigen heavy chain、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Integrin alpha-IIb、Collagen alpha-2(I) chain、Synaptosomal-associated protein 23、Alpha-1-antitrypsin 1-3、Mucin-13、Sodium-dependent serotonin transporter、Multimerin-1、Alpha-1-antitrypsin 1-4、Ras-related protein Rab-7a、Ras-related protein Rap-2b、Ubiquitin-60S ribosomal protein L40、Ig kappa chain V-V region L6、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta、Serine incorporator 3、H-2 class I histocompatibility antigen, Q10 alpha chain、Basigin、C4b-binding protein、Signaling lymphocytic activation molecule、Tropomyosin alpha-4 chain、Alpha-synuclein、及びCalcium-transporting ATPase type 2C member 1からなるタンパク質群である。
【００４４】
タンパク質群（B）は、慢性閉塞性肺疾患特異的なバイオマーカーであり、これを指標とすることにより気管支喘息非合併型の慢性閉塞性肺疾患を鑑別可能である。
【００４５】
タンパク質群（B）の中でも、病勢をより反映している（平均肺胞径との相関がより高い）という観点からは、好ましくは、Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Complement C1r-A subcomponent、Biglycan、Complement C1q subcomponent subunit B、Laminin subunit alpha-5、Interferon-induced transmembrane protein 2、Laminin subunit gamma-1、Serglycin、Thrombospondin-1、Alpha-2-macroglobulin、Collagen alpha-1(I) chain、Platelet factor 4、Vesicle-associated membrane protein 3、4F2 cell-surface antigen heavy chain、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、Collagen alpha-2(I) chain、Multimerin-1、Ras-related protein Rab-7a、Serine incorporator 3、Basigin、C4b-binding protein等が挙げられる。
【００４６】
タンパク質群（B）の中でも、正常検体に対する量比がより高い（コントロールの発現量が確認できない場合も包含する）という観点からは、好ましくはCytohesin-2、Erythrocyte band 7 integral membrane protein、Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Amyloid beta A4 protein、Gamma-1-syntrophin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Fermitin family homolog 3、Complement C1r-A subcomponent、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Biglycan、Collagen alpha-2(IV) chain、Complement C1q subcomponent subunit B、Complement C1q subcomponent subunit A、Hippocalcin-like protein 1、Laminin subunit alpha-5、Lymphocyte antigen 6E、Myc target protein 1、Interferon-induced transmembrane protein 2、Trem-like transcript 1 protein、Laminin subunit gamma-1、Bridging integrator 2、Serglycin、Plasma protease C1 inhibitor、Collagen alpha-2(VI) chain、Integrin beta-2、F-box only protein 40、Thrombospondin-1、Alpha-2-macroglobulin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10、Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 3、Collagen alpha-1(I) chain、Vesicle-associated membrane protein 8、CD81 antigen、Alpha-1-antitrypsin 1-5、Alpha-synuclein、及びCalcium-transporting ATPase type 2C member 1等が挙げられ、より好ましくはCytohesin-2、Erythrocyte band 7 integral membrane protein、Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Amyloid beta A4 protein、Gamma-1-syntrophin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Fermitin family homolog 3、Complement C1r-A subcomponent、Alpha-synuclein、及びCalcium-transporting ATPase type 2C member 1等が挙げられ、さらに好ましくはCytohesin-2、Erythrocyte band 7 integral membrane protein、Alpha-2-antiplasmin、Alpha-synuclein、及びCalcium-transporting ATPase type 2C member 1等が挙げられる。
【００４７】
タンパク質群（B）の中でも、正常検体に対する量比がより高い（コントロールの発現量が確認できない場合は包含しない）という観点からは、好ましくはErythrocyte band 7 integral membrane protein、Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Amyloid beta A4 protein、Gamma-1-syntrophin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Fermitin family homolog 3、Complement C1r-A subcomponent、Ig kappa chain V-V region MOPC 41、Biglycan、Collagen alpha-2(IV) chain、Complement C1q subcomponent subunit B、Complement C1q subcomponent subunit A、Hippocalcin-like protein 1、Laminin subunit alpha-5、Lymphocyte antigen 6E、Myc target protein 1、Interferon-induced transmembrane protein 2、Trem-like transcript 1 protein、Laminin subunit gamma-1、Bridging integrator 2、Serglycin、Plasma protease C1 inhibitor、Collagen alpha-2(VI) chain、Integrin beta-2、F-box only protein 40、Thrombospondin-1、Alpha-2-macroglobulin、Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10、Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 3、Collagen alpha-1(I) chain、Vesicle-associated membrane protein 8、CD81 antigen、Alpha-1-antitrypsin 1-5等が挙げられ、より好ましくはErythrocyte band 7 integral membrane protein、Alpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Amyloid beta A4 protein、Gamma-1-syntrophin、Cytochrome c oxidase subunit 6B1、Fermitin family homolog 3、Complement C1r-A subcomponent等が挙げられ、さらに好ましくはErythrocyte band 7 integral membrane protein、Alpha-2-antiplasmin等が挙げられる。が挙げられる。
【００４８】
タンパク質群（B）の中でも、病勢をより反映している（平均肺胞径との相関がより高い）という観点、及び正常検体に対する量比がより高いという観点からは、好ましくはAlpha-2-antiplasmin、Complement C1s-A subcomponent、Complement C1r-A subcomponent、Biglycan、Complement C1q subcomponent subunit B等が挙げられる。
【００４９】
タンパク質群（C）は、Collagen alpha-1(XVIII) chain、Carboxypeptidase N subunit 2、Complement C1q subcomponent subunit C、Interferon-induced transmembrane protein 3、Fibulin-2、及びAdenylyl cyclase-associated protein 1からなるタンパク質群である。
【００５０】
タンパク質群（C）は、気管支喘息及び慢性閉塞性肺疾患の両方に特異的なバイオマーカーであり、これを指標とすることにより慢性閉塞性肺疾患合併型の気管支喘息（或いは気管支喘息合併型の慢性閉塞性肺疾患）を鑑別可能である。
【００５１】
タンパク質群（C）の中でも、好酸球浸潤の程度との相関がより高いという観点からは、好ましくは、Interferon-induced transmembrane protein 3、Collagen alpha-1(XVIII) chain、Fibulin-2、Adenylyl cyclase-associated protein 1等が挙げられ、平均肺胞径との相関がより高いという観点からは、好ましくは、Collagen alpha-1(XVIII) chain、Complement C1q subcomponent subunit C等が挙げられる。
【００５２】
タンパク質群（C）の中でも、正常検体に対する量比がより高い（コントロールの発現量が確認できない場合も包含する）という観点からは、好ましくはCollagen alpha-1(XVIII) chain、Carboxypeptidase N subunit 2、Complement C1q subcomponent subunit C、Fibulin-2、Adenylyl cyclase-associated protein 1等が挙げられる。
【００５３】
タンパク質群（C）の中でも、正常検体に対する量比がより高い（コントロールの発現量が確認できない場合も包含しない）という観点からは、好ましくはCollagen alpha-1(XVIII) chain、Carboxypeptidase N subunit 2、Complement C1q subcomponent subunit C等が挙げられる。
【００５４】
タンパク質群（A）〜（C）のタンパク質は、マウスの場合であれば、後述の実施例における表1〜4に示されるUniProtKBアクセッション番号によって特定されるタンパク質である。他の生物種の場合であれば、表1〜5に示されるUniProtKBアクセッション番号によって特定されるタンパク質のオーソログである。
【００５５】
工程（1）における対象タンパク質の数は、1種のみでもよいが、2種以上の組み合わせであってもよい。より多く（例えば2種、5種、10種、20種、40種、80種、120種以上）の検出対象を組み合わせることにより、閉塞性肺疾患の検査、気管支喘息と慢性閉塞性肺疾患との鑑別、これらの合併症の鑑別等を、より性格に行うことが可能になる。
【００５６】
検出は、通常は、対象タンパク質の量又は濃度を測定することによって行われる。「濃度」とは、絶対濃度に限らず、相対濃度や、単位体積辺りの重量や、絶対濃度を知るために測定した生データなどでもよい。
【００５７】
対象タンパク質を検出する方法としては、対象タンパク質の一部又は全部を特異的に検出できる方法であれば特に制限されない。検出方法としては、具体的には、例えば、対象タンパク質を構成するペプチドを検出する質量分析法、対象タンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法等を挙げることができる。なお、対象タンパク質のアミノ酸配列情報は、UniProtKBアクセッション番号を基に、EBI（http://www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhelp.html）のデータベースで検索することにより得ることができる。
【００５８】
免疫学的測定法としては、免疫組織化学染色法、ELISA法、EIA法、RIA法、ウェスタンブロッティング法等を好適に例示することができる。
【００５９】
質量分析法とは、ペプチド試料を、イオン源を用いて気体状のイオンとし（イオン化）、分析部において、真空中で運動させ電磁気力を用いて、あるいは飛行時間差によりイオン化したペプチド試料を質量電荷比に応じて分離し、検出できる質量分析計を用いた測定方法のことをいい、イオン源を用いてイオン化する方法としては、EI法、CI法、FD法、FAB法、MALDI法、ESI法などの方法を適宜選択することができ、また、分析部において、イオン化したペプチド試料を分離する方法としては、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（TOF）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などの分離方法を適宜選択することができる。また、2以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（MS／MS）やトリプル四重極型質量分析を利用することができる。また、サンプルがリン酸化したペプチドを含む試料の場合、質量分析計へのサンプル導入前に、サンプルを鉄イオン固定化アフィニティークロマトグラフィー（Fe-IMAC）を用いて濃縮することができる。また、液体クロマトグラフ（LC）やHPLCにより、対象タンパク質を構成するペプチドを分離・精製してサンプルとすることができる。また、検出部やデータ処理方法も適宜選択することができる。なお、質量分析法を用いて対象タンパク質を構成するペプチドを質量分析法で検出・定量する場合、かかるペプチドと同一のアミノ酸配列からなる、濃度が既知の安定同位体で標識したペプチドを内部標準とすることができる。かかる安定同位体標識ペプチドとしては、検出する対象タンパク質を構成するペプチドにおけるアミノ酸の1個以上が、15N，13C，18O，及び2Hのいずれか1以上を含む安定同位体標識ペプチドであれば、アミノ酸の種類、位置、数などは適宜選択することができ、かかる安定同位体標識ペプチドは、安定同位元素により標識されたアミノ酸を用いてF-moc法（Amblard., et al. Methods Mol Biol.298:3-24(2005)）等の適当な手段で化学合成することができるが、iTRAQ（登録商標）試薬、ICAT（登録商標）試薬、ICPL（登録商標）試薬、NBS（登録商標）試薬などの標識試薬を用いて作製することもできる。
【００６０】
工程（1）を含む本発明の検査方法によれば、閉塞性肺疾患の検出指標である対象タンパク質の量及び／又は濃度を提供することができ、これにより閉塞性肺疾患の検出などを補助することができる。また、工程（1）を含む本発明の検査方法によれば、検出指標である対象タンパク質の量及び／又は濃度を提供することができ、これにより好酸球浸潤の程度の評価を補助することもできる。好酸球浸潤は、気管支喘息の活動性（過敏性、可逆性等）、COPDの急性増悪等に関与するので、好酸球浸潤の評価は、急性憎悪の可能性の判断や、予後不良群の鑑別等に利用し得る。また、このように、好酸球浸潤は閉塞性疾患に関与する重要なファクターであるものの、それを評価する方法は。呼気NOの測定という煩雑な作業を要する方法以外は知られていなかった。本発明のバイオマーカーを用いれば、このような煩雑な作業を要せず、従来より簡便且つ効率的に好酸球浸潤を評価することができる。
【００６１】
工程（1）を含む本発明の検査方法による検査結果は、閉塞性肺疾患の病態解明、閉塞性疾患の予後予測（呼吸機能低下群、急性憎悪）、被検体の層別化、治療方法の選択（個別化医療、治療反応性）、閉塞性肺疾患（特に、気管支喘息）における難治化や、リモデリングの評価、閉塞性肺疾患の組織型や表現型等の鑑別等に利用し得る。
【００６２】
1-2．工程（2）
本発明の検査方法は、一態様として、さらに、
（2）前記工程（1）で検出されたタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が閉塞性肺疾患に罹患していると判定する工程（工程2）を含むことが好ましい。該工程2を含む本発明の検査方法によれば、閉塞性肺疾患を判定することが可能となる。
【００６３】
工程2は、より具体的には、例えば以下の（2a）〜（2e）に分けられる。
（2a）前記タンパク質群（A）及び前記タンパク質群（C）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が気管支喘息に罹患していると判定する工程、
（2b）前記タンパク質群（B）及び前記タンパク質群（C）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が慢性閉塞性肺疾患に罹患していると判定する工程、
（2c）前記タンパク質群（A）から選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が慢性閉塞性肺疾患非合併型の気管支喘息に罹患していると判定する工程、
（2d）前記タンパク質群（B）から選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が気管支喘息非合併型の慢性閉塞性肺疾患に罹患していると判定する工程、並びに
（2e）前記タンパク質群（C）から選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が気管支喘息及び慢性閉塞性肺疾患の両方に罹患していると判定する工程。
【００６４】
工程（2）は、より好ましくは上記工程2a〜2eからなる群より選択される少なくとも1種の工程である。
【００６５】
カットオフ値は、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などの観点から当業者が適宜設定することができ、例えば、閉塞性肺疾患に罹患していない被検体から採取された体液の細胞外小胞における対象タンパク質の量及び／又は濃度に基づいて、その都度定められた値、或いは予め定められた値とすることができる。カットオフ値は、例えば、閉塞性肺疾患に罹患していない被検体から採取された体液の細胞外小胞における対象タンパク質の量及び／又は濃度（被検体が複数の場合は、平均値、中央値など）の、例えば1〜10倍、好ましくは2〜8倍、より好ましくは2.5〜6倍の値とすることができる。
【００６６】
工程（2）のより好ましい態様においては、閉塞性肺疾患の病勢を反映しているバイオマーカーを用いることにより、前記工程（1）で検出されたタンパク質の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体がより病勢の強い閉塞性肺疾患に罹患していると判定することができる。この場合、カットオフ値を、例えば閉塞性肺疾患に罹患している被検体から採取された体液の細胞外小胞における対象タンパク質の量及び／又は濃度に基づいた値とすることにより、一定以上の病勢であるかどうかを評価できる。或いは、被検体が閉塞性肺疾患の治療中の検体である場合、カットオフ値を、例えば同一検体についての過去の試料における対象タンパク質の量及び／又は濃度に基づいた値とすることにより、治療効果を判定することができる。
【００６７】
さらに、工程（2）のより好ましい態様においては、好酸球浸潤の程度と相関しているバイオマーカーを用いることにより、前記工程（1）で検出されたタンパク質の量又は濃度を指標として、好酸球浸潤の程度を判定することができる。より具体的には、例えば、予め好酸球浸潤の程度（一定面積内の好酸球浸潤数）とバイオマーカーの量又は濃度との相関に基づいた検量線を作成し、測定されたバイオマーカーの量又は濃度と検量線から、好酸球浸潤の程度を判定することができる。
【００６８】
2．閉塞性肺疾患のより高い精度での診断
工程（2）を含む本発明の検査方法により、被検体が閉塞性肺疾患に罹患していると判定された場合、本発明の検査方法に、さらに閉塞性肺疾患の医師による診断を適用する工程を組み合わせることによって、より高い精度で閉塞性肺疾患を診断することができる。また、本発明の検査方法はより正確に閉塞性肺疾患を検出できるので、本発明の検査方法に上記工程を組み合わせることによって、より効率的且つより正確に「閉塞性肺疾患に罹患している」と診断できる。
【００６９】
3．閉塞性肺疾患の治療
工程（2）を含む本発明の検査方法により被検体が閉塞性肺疾患に罹患していると判定された場合は本発明の検査方法に対してさらに、或いは上記「2．閉塞性肺疾患のより高い精度での診断」に記載の様に閉塞性肺疾患に罹患していると診断された場合は本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対してさらに、（3）閉塞性肺疾患に罹患していると判定又は診断された被検体に対して、該疾患の治療を行う工程を行うことによって、被検体の該疾患を治療することが可能となる。また、本発明の検査方法はより正確に閉塞性肺疾患を検出できるので、本発明の検査方法に対して、或いは本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対して工程3を組み合わせることによって、閉塞性肺疾患に罹患している被検体をより効率的に、より確実に治療できる。
【００７０】
閉塞性肺疾患の治療方法は、特に制限されないが、代表的には投薬治療が挙げられる。投薬治療に用いる医薬としては、特に制限されないが、例えばスピリーバ、シーブリ、エンクラッセ、エクリラ、アトロベント、テルシガン等の抗コリン薬；  セレベント、オンブレス、オーキシス、サルタノール、メプチン等のβ2刺激薬；  ウルティブロ、アノーロ、スピオルト等の抗コリン薬・β2刺激薬配合剤；  キュバール、フルタイド、パルミコート、オルベスコ、アズマネックス等のステロイド薬；  アドエア、シムビコート、レルベア等のステロイド薬・β2刺激薬配合剤等が挙げられる。医薬は、1種、2種、又は3種以上を組み合わせて用いることができる。
【００７１】
4．閉塞性肺疾患の検査薬
本発明は、その一態様において、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、及びタンパク質群（C）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の検出剤を含む、閉塞性肺疾患の検査薬（本明細書において、「本発明の検査薬」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００７２】
タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、閉塞性肺疾患等については、上記「1．閉塞性肺疾患の検査方法」における定義と同様である。
【００７３】
検出剤は、対象タンパク質を特異的に検出できるものである限り特に制限されない。該検出剤としては、例えば対象タンパク質に対する抗体が挙げられる。検出剤は、標識されたものであってもよい。標識としては、例えば蛍光物質、発光物質、色素、酵素、金コロイド、放射性同位体などが挙げられる。また、検出剤（特に抗体）は、基材（例えばマイクロウェルプレート等のプラスチック基材）に吸着した状態であってもよい。
【００７４】
抗体は、対象タンパク質を選択的に（特異的に）認識するものであれば、特に限定されない。ここで、「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばウェスタンブロット法やELISA法において、対象タンパク質が特異的に検出できることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物が対象タンパク質に由来するものであると判断できるものであればよい。
【００７５】
抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。対象タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
【００７６】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology , Chapter 11.12〜11.13(2000)）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した対象タンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該対象タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した対象タンパク質、あるいは対象タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。
【００７７】
抗体の作製に免疫抗原として使用される対象タンパク質は、公知の遺伝子配列情報に基づいて、DNAクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。
【００７８】
具体的には、対象タンパク質をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。また対象タンパク質の部分ペプチドは、公知の遺伝子配列情報に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
【００７９】
また本発明の抗体は、対象タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体の製造のために用いられるオリゴ（ポリ）ペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、対象タンパク質と同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはこの免疫原特性を有し、且つ対象タンパク質のアミノ酸配列において少なくとも連続する8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるオリゴ（ポリ）ペプチドを例示することができる。
【００８０】
かかるオリゴ（ポリ）ペプチドに対する抗体の製造は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、BCG（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントが含まれる。
【００８１】
本発明の検査薬は、組成物の形態であってもよい。該組成物には、必要に応じて他の成分が含まれていてもよい。他の成分としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
【００８２】
本発明の検査薬は、キットの形態であってもよい。該キットには、上記検出剤或いはこれを含む上記組成物のほかに、被検体の体液の細胞外小胞における対象タンパク質の検出に使用し得るものを含んでいてもよい。このようなものの具体例としては、各種試薬（例えば二次抗体、緩衝液等）、器具（例えば細胞外小胞の精製、分離、濃縮用器具（例えばカラム等））等が挙げられる。
【００８３】
5．閉塞性肺疾患モデル動物のスクリーニング方法
本発明は、その一態様において、閉塞性肺疾患誘発処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、及びタンパク質群（C）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、閉塞性肺疾患モデル動物のスクリーニング方法（本明細書において、「本発明のモデル動物スクリーニング方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００８４】
体液、細胞外小胞、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、閉塞性肺疾患、対象タンパク質の量又は濃度の測定等については、上記「1．閉塞性肺疾患の検査方法」における定義と同様である。
【００８５】
動物は、スクリーニング対象動物であり、その生物種はヒト以外の動物である限り特に制限されない。該動物の生物種としては、例えばサル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられ、好ましくはマウスが挙げられる。
【００８６】
閉塞性肺疾患誘発処理は、閉塞性肺疾患を誘発できる処理である限り、特に制限されない。例えば気管支喘息を誘発させる場合であれば、例えばOVA（卵白アルブミン）；  、ダニ、花粉、昆虫等のアレルゲン等の誘発剤を投与（例えば経鼻投与、経口投与、吸入投与、経気管支投与、腹空内投与、静脈投与、経皮投与等、好適には腹空内投与と経鼻投与との組み合わせ）することによって、或いは遺伝子改変処理をすることによって、誘発処理が行われる。例えば慢性閉塞性肺疾患を誘発させる場合であれば、例えばエラスターゼ、喫煙暴露、タバコ抽出液、LPS+タバコ抽出液等の誘発剤を投与（例えば経鼻投与、経口投与、吸入投与、経気管支投与、腹空内投与、静脈投与、経皮投与等、好適には経鼻投与）することによって、或いは遺伝子改変処理をすることによって、誘発処理が行われる。
【００８７】
本発明のモデル動物スクリーニング方法は、より具体的には、上記指標の値がカットオフ値以上である場合に、前記動物を閉塞性肺疾患モデル動物（或いは閉塞性肺疾患モデル候補動物）として選択する工程を含む。
【００８８】
カットオフ値は、スクリーニングの精度などの観点から当業者が適宜設定することができ、例えば、閉塞性肺疾患誘発処理していない動物から採取された体液の細胞外小胞における対象タンパク質の量及び／又は濃度に基づいて、その都度定められた値、或いは予め定められた値とすることができる。カットオフ値は、例えば、閉塞性肺疾患誘発処理していない動物から採取された体液の細胞外小胞における対象タンパク質の量及び／又は濃度（被検体が複数の場合は、平均値、中央値など）の、例えば1〜10倍、好ましくは2〜8倍、より好ましくは2.5〜6倍の値とすることができる。
【００８９】
6．閉塞性肺疾患の予防又は治療剤
本発明は、その一態様において、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、及びタンパク質群（C）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の抑制剤を含有する、閉塞性肺疾患の予防又は治療剤（本明細書において、「本発明の剤」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００９０】
タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）等については、上記「1．閉塞性肺疾患の検査方法」における定義と同様である。
【００９１】
抑制剤としては、好ましくは対象タンパク質の発現抑制剤が挙げられる。
【００９２】
対象タンパク質の発現抑制剤としては、対象タンパク質、そのmRNAなどの発現量を抑制し得るものである限り特に制限されず、例えば対象タンパク質の遺伝子特異的small interfering RNA（siRNA）、対象タンパク質の遺伝子特異的microRNA（miRNA）、対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸、これらの発現ベクター；  対象タンパク質の遺伝子特異的リボザイム；  CRISPR/Casシステムによる対象タンパク質の遺伝子遺伝子編集剤などが挙げられる。
【００９３】
なお、発現抑制とは、対象タンパク質、そのmRNAなどの発現量を、例えば1/2、1/3、1/5、1/10、1/20、1/30、1/50、1/100、1/200、1/300、1/500、1/1000、1/10000以下に抑制することを意味し、これらの発現量を0とすることをも包含する。
【００９４】
対象タンパク質の遺伝子siRNAは、対象タンパク質をコードする遺伝子の発現を特異的に抑制する二本鎖RNA分子である限り特に制限されない。一実施形態において、siRNAは、例えば、18塩基以上、19塩基以上、20塩基以上、又は21塩基以上の長さであることが好ましい。また、siRNAは、例えば、25塩基以下、24塩基以下、23塩基以下、又は22塩基以下の長さであることが好ましい。ここに記載するsiRNAの長さの上限値及び下限値は任意に組み合わせることが想定される。例えば、下限が18塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が19塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が20塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が21塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さの組み合わせが想定される。
【００９５】
siRNAは、shRNA(small hairpin RNA)であっても良い。shRNAは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、shRNAは、ある領域の配列を配列aとし、配列aに対する相補鎖を配列bとすると、配列a、スペーサー、配列bの順になるようにこれらの配列が一本のRNA鎖に存在するようにし、全体で45〜60塩基の長さとなるように設計することができる。配列aは、標的となる対象タンパク質をコードする塩基配列の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されず、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列aの長さは19〜25塩基、好ましくは19〜21塩基である。
【００９６】
対象タンパク質の遺伝子特異的siRNAは、5’又は3’末端に、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、通常2〜4塩基程度である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いると核酸の安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９７】
siRNAは、3'末端に突出部配列（オーバーハング）を有していてもよく、具体的には、dTdT（dTはデオキシチミジンを表わす）を付加したものが挙げられる。また、末端付加がない平滑末端（ブラントエンド）であってもよい。siRNAは、センス鎖とアンチセンス鎖が異なる塩基数であってもよく、例えば、アンチセンス鎖が3'末端及び5'末端に突出部配列（オーバーハング）を有している「asymmetrical interfering RNA（aiRNA）」を挙げることができる。典型的なaiRNAは、アンチセンス鎖が21塩基からなり、センス鎖が15塩基からなり、アンチセンス鎖の両端で各々3塩基のオーバーハング構造をとる。
【００９８】
対象タンパク質の遺伝子特異的siRNAの標的配列の位置は特に制限されるわけではないが、一実施形態において、5’-UTR及び開始コドンから約50塩基まで、並びに3’-UTR以外の領域から標的配列を選択することが望ましい。選択された標的配列の候補群について、標的以外のmRNAにおいて16-17塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）などのホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認することが好ましい。特異性が確認された標的配列について、AA（もしくはNA）以降の19−21塩基にTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該19−21塩基に相補的な配列及びTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる2本鎖RNAをsiRNAとして設計してもよい。また、siRNAの前駆体であるshRNAは、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、5-25塩基程度）を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することにより設計することができる。
【００９９】
siRNA及び／又はshRNAの配列は、種々のwebサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、以下を挙げることができる。
Ambionが提供するsiRNA Target Finder（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）pSilencer（登録商標）Expression Vector用インサートデザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）RNAi Codexが提供するGeneSeer（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）。
【０１００】
siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるshRNAを合成し、これを、RNA切断タンパク質ダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。
【０１０１】
対象タンパク質の遺伝子特異的miRNAは、対象タンパク質をコードする遺伝子の翻訳を阻害する限り任意である。例えば、miRNAは、siRNAのように標的mRNAを切断するのではなく、標的の3’非翻訳領域（UTR）に対合してその翻訳を阻害してもよい。miRNAは、pri-miRNA（primary miRNA）、pre-miRNA（precursor miRNA）、及び成熟miRNAのいずれでもよい。miRNAの長さは特に制限されず、pri-miRNAの長さは通常数百〜数千塩基であり、pre-miRNAの長さは通常50〜80塩基であり、成熟miRNAの長さは通常18〜30塩基である。一実施形態において、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNAは、好ましくはpre-miRNA又は成熟miRNAであり、より好ましくは成熟miRNAである。このような対象タンパク質の遺伝子特異的miRNAは、公知の手法で合成してもよく、合成RNAを提供する会社から購入してもよい。
【０１０２】
対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸とは、対象タンパク質をコードする遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸であって、該mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、対象タンパク質合成を抑制する機能を有する核酸である。アンチセンス核酸はDNA、RNA、DNA/RNAキメラのいずれでもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性リボヌクレアーゼH（RNase H）に認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こす。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、対象タンパク質の遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。イントロン配列は、ゲノム配列と、対象タンパク質の遺伝子のcDNA塩基配列とをBLAST、FASTAなどのホモロジー検索プログラムを用いて比較することにより、決定することができる。
【０１０３】
対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果として対象タンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さは制限されない。対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸は、対象タンパク質をコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよい。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題などを考慮すれば、約10〜約40塩基、特に約15〜約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、これらに限定されるものではない。より具体的には、対象タンパク質の遺伝子の5’端ヘアピンループ、5’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’端パリンドローム領域又は3’端ヘアピンループなどをアンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されるものではない。
【０１０４】
対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸は、対象タンパク質の遺伝子のmRNAや初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン（antigene））であってもよい。
【０１０５】
上記した対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、及び対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、安定性（化学的及び／又は対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含んでもよい。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（phosphorothioate; PS)、メチルホスホネート（methylphosphonate）、ホスホロジチオネート（phosphorodithioate）などの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2’位の水酸基を、-OR（R=CH3（2’-O-Me）、CH2CH2OCH3（2’-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、又はCH2CH2CNなど）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などを施してもよい。また、siRNAやmiRNAを構成するヌクレオチド分子の一部は、天然型のDNAに置換されていてもよい。
【０１０６】
対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、及び対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸などは、対象タンパク質の遺伝子のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも公知の手法により、化学的に合成することができる。
【０１０７】
対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、又は対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸の発現ベクターについては、対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、又は対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸が発現可能な状態で組み込まれている限りにおいて特に限定されない。典型的には、該発現ベクターは、プロモーター配列、及び対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、又は対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸のコード配列（必要に応じて、さらに転写終結シグナル配列）を含むポリヌクレオチド、必要に応じて他の配列を含む。プロモーターは、特に制限されず、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーターなどのRNA polymerase II（polII）系プロモーター；  マウス及びヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどのRNA polymerase III（polIII）系プロモーターなどが挙げられ、これらの中でも、短いRNAの転写を正確に行うことができるという観点から、polIII系プロモーターが好ましい。他の配列としては、特に制限されず、発現ベクターが含み得る公知の配列を各種採用することができる。このような配列の一例としては、例えば複製起点、薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、薬剤耐性遺伝子の種類及びベクターの種類は上述のものを例示できる。
【０１０８】
対象タンパク質の遺伝子発現抑制剤の別の例としては、対象タンパク質の遺伝子特異的リボザイムなどが挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAを意味するが、本願では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する。リボザイム核酸として最も汎用性の高いものは、ウイロイドやウイルソイドなどの感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型などが知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイム核酸は、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないという利点を有する。対象タンパク質の遺伝子のmRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。
【０１０９】
本発明の剤の適用対象は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどの種々の哺乳類動物などが挙げられる。
【０１１０】
本発明の剤の形態は、特に限定されず、本発明の剤の用途に応じて、各用途において通常使用される形態をとることができる。
【０１１１】
形態としては、用途が医薬、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などである場合は、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）、点鼻剤、吸入剤、肛門坐剤、挿入剤、浣腸剤、ゼリー剤、注射剤、貼付剤、ローション剤、クリーム剤などの非経口摂取に適した製剤形態（非経口製剤形態）が挙げられる。
【０１１２】
形態としては、用途が食品組成物の場合は、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキーなどが挙げられる。
【０１１３】
形態としては、用途が口腔用組成物である場合は、例えば液体（溶液、乳液、懸濁液など）、半固体（ゲル、クリーム、ペーストなど）、固体（錠剤、粒子状剤、カプセル剤、フィルム剤、混練物、溶融固体、ロウ状固体、弾性固体など）などの任意の形態、より具体的には、歯磨剤（練歯磨、液体歯磨、液状歯磨、粉歯磨など）、洗口剤、塗布剤、貼付剤、口中清涼剤、食品（例えば、チューインガム、錠菓、キャンディ、グミ、フィルム、トローチなど）などが挙げられる。
【０１１４】
本発明の剤は、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば医薬、食品組成物、口腔用組成物、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などに配合され得る成分である限り特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤などが挙げられる。
【０１１５】
本発明の剤の対象タンパク質の抑制剤の含有量は、抑制剤の種類、用途、使用態様、適用対象、適用対象の状態などに左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001〜100重量％、好ましくは0.001〜50重量％とすることができる。
【０１１６】
本発明の組成物の適用（例えば、投与、摂取、接種など）量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分の重量として、一般に一日あたり0.1〜1000 mg/kg体重である。上記投与量は1日1回又は2〜3回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
【０１１７】
7．閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法
本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、及びタンパク質群（C）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法（本明細書において、「本発明の有効成分スクリーニング方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【０１１８】
体液、細胞外小胞、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、閉塞性肺疾患、対象タンパク質の量又は濃度の測定等については、上記「1．閉塞性肺疾患の検査方法」における定義と同様である。
【０１１９】
動物の生物種は特に制限されない。動物の生物種としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられ、好ましくはマウスが挙げられる。
【０１２０】
被検物質としては、天然に存在する化合物又は人工に作られた化合物を問わず広く使用することができる。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。化合物には、低分子化合物に限らず、タンパク質、核酸、多糖類等の高分子化合物も包含される。
【０１２１】
本発明の有効成分スクリーニング方法は、より具体的には、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞における対応タンパク質の量又は濃度（対照値）よりも低い場合に、前記被検物質を閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分（或いは、閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分の候補物質）として選択する工程を含む。
【０１２２】
対応タンパク質とは、指標としている対象タンパク質と同じタンパク質を意味する。
【０１２３】
「低い」とは、例えば指標の値が、対照値の1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100であることを意味する。
【０１２４】
8．閉塞性肺疾患の誘発性又は増悪性の評価方法
本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、及びタンパク質群（C）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、閉塞性肺疾患の誘発性又は増悪性の評価方法（本明細書において、「本発明の毒性評価方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【０１２５】
体液、細胞外小胞、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、閉塞性肺疾患、対象タンパク質の量又は濃度の測定、動物の生物種、被検物質等については、上記「1．閉塞性肺疾患の検査方法」及び「7．閉塞性肺疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法」における定義と同様である。
【０１２６】
本発明の毒性評価方法は、より具体的には、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞における対応タンパク質の量又は濃度（対照値）よりも高い場合に、前記被検物質を閉塞性肺疾患の誘発性又は増悪性があると判定する工程を含む。
【０１２７】
対応タンパク質とは、指標としている対象タンパク質と同じタンパク質を意味する。
【０１２８】
「高い」とは、例えば指標の値が、対照値の2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍であることを意味する。
【実施例】
【０１２９】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【０１３０】
試験例1．気管支喘息モデルマウスの血清の調製
マウスとして、11週齢のC57BL6/J雄マウスを用いた。OVA（Sigma, A5503, GradeV）20μg及びAlum（Thermo Imject Alum (#77161  Lot NB168145)）2mgをPBS 400μLに懸濁して、4％イソフルランで吸入麻酔したマウスに、腹空内投与した。初回投与から7日後に、再度、OVA（20μg）及びAlum（2mg）のPBS（400μL）懸濁液を腹空内投与した。初回投与から21、22及び23日後に、OVA（50μg）のPBS（50μL）懸濁液を経鼻投与した。初回投与から28日後に血清を回収した。病理評価を行い、気管支喘息状態にあるマウス（n＝8）の血清を、気管支喘息モデルマウスの血清として選別した。なお、病理評価においては、公知の方法に従って、気管支周囲の血管周辺領域における一定面積当たりの好酸球浸潤数を測定した。この好酸球浸潤数は喘息の活性化指標となる値である。
【０１３１】
試験例2．慢性閉塞性肺疾患（COPD）モデルマウスの血清の調製
マウスとして、11週齢のC57BL6/J雄マウスを用いた。4％イソフルランで吸入麻酔したマウスに、ブタエラスターゼ（Elastase Products Company社製）7.5 Uを含有する滅菌PBS 40μLを、2回に分けて、20μLずつ投与した。より具体的には、一回目に20μLを滴下して吸引させ、しばらく休ませてから再度滴下して吸引させた。投与から21日後に、血清を回収した。病理評価を行い、慢性閉塞性肺疾患の状態にあるマウス（n＝8）の血清を、慢性閉塞性肺疾患モデルマウスの血清として選別した。なお、病理評価においては、公知の方法に従って、平均肺胞径を測定した。この平均肺胞径はの指標となる値である。
【０１３２】
試験例3．細胞外小胞画分の調製
試験例1及び2で得られた血清、並びに正常マウス（11週齢のC57BL6/J雄マウス、n＝8）の血清から細胞外小胞画分を調製した。細胞外小胞画分の調製は、細胞外小胞精製カラム（EV-Second、ジーエルサイエンス社製）を用いて行った。
【０１３３】
試験例4．プロテオミクス解析（ノンラベル、LC-MS/MS）
細胞外小胞画分中のタンパク質の定量を、LC-MS/MS分析（ノンラベル法）により行った。具体的には以下のようにして行った。
【０１３４】
（サンプル調製）
細胞外小胞画分を、5mMのTCEPを用いて37℃で30分間還元し、25mMのヨードアセトアミドを用いて室温で45分間アルキル化した。その後、サンプルを50mM重炭酸アンモニウムで7倍希釈し、96ウェルフィルタープレートに入れ、5μLの固定化トリプシン（Thermo Fisher Scientific社製）と共に37℃で6時間振とうして、消化させた。トリプシン消化物を、Oasis HLB 96-well μElution Plate（Waters Corporation社製、米国）を用いて脱塩し、LC-MS/MS分析に供した。
【０１３５】
（LC／MS／MS分析）
乾燥したペプチドサンプルを、0.1％のトリフルオロ酢酸を含む、2％のアセトニトリル溶液に再懸濁し、Ultimate 3000 RSLC nano-flow HPLC system（DIONEX社製、米国）を備えるLTQ-Orbitrap-Velos mass spectrometer（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて分析した。75μm × 150 mm C18 tip-column（日京テクノス社製）において、溶媒A（0．1％のギ酸）および溶媒B（アセトニトリル中の0．1％ギ酸）を用い、流速250nL／分において、95分間で溶媒Bを6.4〜30％、その後10分間で溶媒Bを30〜95％とする多段階直線勾配で、サンプルを分離した。
【０１３６】
溶出したペプチドを、2000 Vのスプレー電圧でイオン化し、MSデータをデータ依存型フラグメント法で取得した。測定スキャン（survey scan）は、m／z 400〜1600、分解度60000、AGCターゲット値1.0×106イオンカウントで行った。各測定スキャンにおける上位20の強度の前駆イオンを、リニアイオントラップでAGCターゲット値5000イオンカウントのノーマルCIDスキャンモードを用いた低分解能MS/MS取得に供した。
【０１３７】
Proteome Discoverer 1.3 software（Thermo Fischer Scientific社製）を用いてSEQUESTデータベースサーチを行い、タンパク質の同定を試みた。MS/MSスペクトルをマウスタンパク質データベースUniProtに対して検索した。検索パラメーターは次のとおりである：Enzyme Name = Semitrypsin、Precursor Mass Tolerance = 3 ppm、Fragment Mass Tolerance = 0.8 Da、Dynamic Modification = Oxidation (Met)、Static Modification = Carbamidomethyl (Cys)。SEQUEST Decoy Database SearchにおけるPeptide Validator activityによるFDR（false discovery rate）が1％未満である場合に、そのペプチドと同定した。
【０１３８】
（Expressionistサーバーにおけるラベルフリー定量分析）
LC-MS/MSのデータセットを、Expressionist RefinerMS module（Genedata AG社製、スイス）にロードし、データ処理およびフリー定量分析を行った。RefinerMS softwareの全体的なワークフローを図2に示す。2D MSクロマトグラム面（x = m/z 、y =RT）上の10個のデータポイント毎にSpectrum Gridをセッティングした。次いで、第1および第2のChemical Noise Subtractionにおいて、RT = 2 scansおよびm/z = 6 pointsで、Structure Removalを順次行った。続いて、第3のChemical Noise Subtractionにおいて、RT Window = 500 scansおよびQuantile = 90%でStructure Removalを行った。第4のChemical Noise Subtractionにおいて、RT = 2 scansでStructure Removalを行った。その後、2000未満の強度のシグナルを、Intensity Thresholdingを用いて排除した。最後に、第5および第6のChemical Noise Subtractionにおいて、ぞれぞれRT = 2 scansおよびm/z = 5 pointsでStructure Removal行った。
【０１３９】
次いで、Chromatogram Gridをノイズ減算データ上の10スキャン毎にセットし、次のパラメーターを用いてChromatogram RT Alignmentを行った：m/z Window = 11 points、RT Window = 11 scans、Gap Penalty = 1、RT Search Interval = 2 minutes、Alignment Scheme = pairwise alignment based tree。
【０１４０】
続いて、一時的平均化クロマトグラムにおけるピークを、次のパラメーターを用いて、Summed Peak Detection Activityによって検出した：Summation Window = 20 scans、Overlap = 10、Minimum Peak Size = 6 scans、Maximum Merge Distance = 1 data points、Gap/Peak Ratio = 5、Method = curvature-based peak detection、Peak Refinement Threshold = 5、Consistency Filter Threshold = 1。最後に、Summed Isotope Clustering Activityを用いて、1つの分子に由来する同位体ピークを同位体クラスターにグループ化した。このときのパラメーターは次のとおりである：Minimum Charge = 1、Maximum Charge = 6、Maximum Missing Peaks = 0、First Allowed Gap Position = 10、Ionization =protonation、RT Tolerance = 0.1 minute、m/z Tolerance = 0.01 Da、Minimum Cluster Size Ratio = 0.5。
【０１４１】
（Expressionist Analystにおける統計学的解析）
組織線維化疾患モデルマウス群と正常マウス群とを比較し、t-検定により、2つの群間で有意に（P<0.05）離れた発現レベルを示す候補を抽出した。同様に、慢性閉塞性肺疾患モデルマウス群と正常マウス群とを比較し、t-検定により、2つの群間で有意に（P<0.05）離れた発現レベルを示す候補を抽出した。次に、バイオマーカー候補の最小の組合せを、Expressionist Analyst module （Genedata AG）におけるSupport Vector Machine-Recursive Feature Elimination（SVM-RFE）アルゴリズムまたはSVM-SVMアルゴリズムによって、取扱説明書に従い、見積もった。
【０１４２】
（結果）
各種タンパク質の定量データを得た。気管支喘息モデルマウスの細胞外小胞画分における量の平均値（気管支喘息群）が、正常マウスの細胞外小胞画分における量の平均値（コントロール群）の5倍以上であったタンパク質、及びコントロール群では発現を確認できないが気管支喘息群では発現が確認できたタンパク質、並びに慢性閉塞性肺疾患モデルマウスの細胞外小胞画分における量の平均値（COPD群）が、正常マウスの細胞外小胞画分における量の平均値（コントロール群）の3倍以上であったタンパク質、及びコントロール群では発現を確認できないがCOPD群では発現が確認できたタンパク質を、閉塞性肺疾患バイオマーカーとして一定程度の有効性があると判定し、選択した。さらに、各気管支喘息群モデルマウスにおける好酸球浸潤数とタンパク質量との相関、及び各慢性閉塞性肺疾患モデルマウスにおける平均肺胞径とタンパク質量との相関を解析し、相関係数（r値）を算出した。選択されたタンパク質、コントロール群に対する量比、及び相関係数を表１〜４に示す。
【０１４３】
【表１】
2020079707.tif 000002
【０１４４】
【表２】
2020079707.tif 000003
【０１４５】
【表３】
2020079707.tif 000004
【０１４６】
【表４】
2020079707.tif 000005
【０１４７】
表１〜４のタンパク質群の内、Collagen alpha-1(XVIII) chain、Carboxypeptidase N subunit 2、Complement C1q subcomponent subunit C、Interferon-induced transmembrane protein 3、Fibulin-2、及びAdenylyl cyclase-associated protein 1については、気管支喘息群及びCOPD群の両方において、コントロール群に比べて一定以上の量であったタンパク質である。