(57)【要約】【課題】乳以外の安価な発酵原料により、容易な方法で、菌体外多糖の産生量を増加させることができる、菌体外多糖の産生方法を提供する。【解決手段】玄米を重量精米歩合８０％以上で精米したときに得られた米糠を米麹または糖化酵素で糖化させてなる培地に、菌体外多糖産生能を有する乳酸菌を植菌して発酵させ、菌体外多糖を産生させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
玄米を重量精米歩合８０％以上で精米したときに得られた米糠を米麹または糖化酵素で糖化させてなる培地に、菌体外多糖産生能を有する乳酸菌を植菌して発酵させ、菌体外多糖を産生させることを特徴とする菌体外多糖の産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、菌体外多糖産生能を有する乳酸菌による、菌体外多糖の産生量を増加させるための、菌体外多糖の産生方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
菌体外多糖（Exopolysaccharide：ＥＰＳ）とは、微生物によって環境へと分泌され、かつ、糖残基を含む高分子量の重合体のことをいう。そして、菌体外多糖は、主に多糖類（菌体外多糖）とタンパク質からなり、その他に、ＤＮＡや脂質等の巨大分子も含む。
なかでも、乳酸菌により分泌され産生された菌体外多糖は、生理作用（整腸作用、免疫賦活作用、ストレス由来の皮膚血流低下改善作用や皮膚機能改善作用、血中ＨＤＬコレステロールの割合を増やす働き等）が高く、健康面においても、より優れた効果を発揮することから、近年において注目されている。
【０００３】
乳酸菌により菌体外多糖を産生させるには、菌体外多糖産生能を有する乳酸菌による、乳酸発酵を行う必要がある。そして、より多くの菌体外多糖を産生させるには、上記乳酸発酵の温度や時間を調整するか、特殊な発酵調整剤を用いる等して、発酵を制御する必要がある（例えば、特許文献１〜３等参照）。
また、乳酸菌に対し、パルス電界処理を行うことで、多くの菌体外多糖を産生させる方法も検討されている（特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第６３９２６６８号公報
【特許文献２】特許第６２０９３７１号公報
【特許文献３】特開平８−１９１６８６号公報
【特許文献４】特開２０１７−２１６９２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、乳酸菌の菌種や菌株によって適切な発酵温度や発酵時間は異なるため、一律に多くの菌体外多糖を産生させることができるよう制御するのは難しい。
また、上記のような特殊な発酵調整剤の使用は、コスト増大の要因となるおそれがあり、さらに、上記のような特殊な発酵調整剤が、食用に適さない、呈味性を損なう等の問題がある場合、上記発酵調整剤の使用が難しくなるといった懸念もある。
また、上記のように、乳酸菌に対しパルス電界処理を行うことで、多くの菌体外多糖を産生させる方法では、パルス電界処理に要するコストや、パルス電界処理用の設備にかかるコストが、問題となるおそれがある。
【０００６】
また、乳酸菌により菌体外多糖を産生させる手法において、従来においては、その殆どが牛乳等の乳を発酵原料としている。そのため、乳以外の安価な発酵原料により、菌体外多糖を効率的に産生させる手法が、従来から求められている。
【０００７】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、乳以外の安価な発酵原料により、容易な方法で、菌体外多糖の産生量を増加させることができる、菌体外多糖の産生方法の提供をその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意研究を重ねた。その研究の過程で、乳以外の安価な発酵原料として、米糠を、米麹または糖化酵素で糖化させたものを用いることを想起した。そして、上記のような糖化が行われた培地に、菌体外多糖産生能を有する乳酸菌を植菌して発酵させたところ、菌体外多糖の産生量を顕著に増加させることができることを見いだし、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち、本発明は、上記の目的を達成するために、以下の［１］を、その要旨とする。
［１］玄米を重量精米歩合８０％以上で精米したときに得られた米糠を米麹または糖化酵素で糖化させてなる培地に、菌体外多糖産生能を有する乳酸菌を植菌して発酵させ、菌体外多糖を産生させることを特徴とする菌体外多糖の産生方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の菌体外多糖の産生方法は、乳以外の安価な発酵原料により、容易な方法で、菌体外多糖の産生量を増加させることができる。
そして、本発明の菌体外多糖の産生方法に使用される米糠は、糖化によって自然な甘みを呈するようになり、さらに菌体外多糖によって米糠特有の糠臭さやえぐみが緩和されることから、本発明の産生方法により得られた菌体外多糖は、米糠の分離工程を経なくとも、呈味性に優れたものとなる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
つぎに、本発明を実施するための形態について説明する。ただし、本発明は、この実施の形態に限られるものではない。
【００１２】
先にも述べたように、本発明の菌体外多糖の産生方法は、米糠を、米麹または糖化酵素で糖化させて得られた培地に、菌体外多糖産生能を有する乳酸菌を植菌して発酵させることにより行われる。なかでも、上記の、米糠の糖化を、米麹により行うことが、より菌体外多糖の産生量増大につながる等の観点から好ましい。
【００１３】
上記米糠とは、玄米粒の外側の部分をいい、本発明において、上記米糠としては、菌体外多糖の産生量を増加させる観点から、玄米をおよそ重量精米歩合８０％以上で精米したときに得られた米糠が用いられる。そして、上記米糠として、重量精米歩合８０％以上で精米したときに得られた米糠のみを用いることが、好ましい。なお、菌体外多糖の産生量をより増加させるには、上記重量精米歩合がより大きくなるよう精米したときに得られた米糠（より玄米粒の外側の部分）を用いることが好ましい。しかしながら、玄米粒の外側の部分は、米糠特有の糠臭さやえぐみが強く、最終製品にまで支障をきたすことから、この問題の解決と、菌体外多糖の産生量増加のバランスの観点から、玄米を重量精米歩合８０〜９０％で精米したときに得られた米糠が、より好ましく用いられる。
ここで、重量精米歩合とは、以下の式（１）により求められた値である。また、下記の「白米」とは、上記精米後の玄米を意味する。
重量精米歩合（％）＝（白米重量／玄米重量）×１００  ……（１）
なお、一般的には、玄米を、およそ重量精米歩合９０％以上で精米したときに得られた米糠が「赤糠」と呼ばれ、およそ重量精米歩合８０％以上９０％未満で精米したときに得られた米糠が「中白糠」と呼ばれ、およそ重量精米歩合８０％未満で精米したときに得られた米糠が「白糠」と呼ばれる。
なお、米粉の使用は、本発明の菌体外多糖の産生方法において好ましい結果が得られないことから、本発明において、米粉を使用しないことが望ましい。
【００１４】
上記の、米糠の糖化に際し、上記米糠は、通常、水を加えて、吸水ないし希釈させたものが用いられる。このとき、上記米糠１重量部に対し、水の添加量は、２重量部以上であることが好ましい。なお、菌体外多糖の産生量増加の観点から、上記水の添加量の上限は、上記米糠１重量部に対し、１００重量部以下であることが好ましい。
また、上記のように水を加えた後、米麹または糖化酵素で糖化させる前に、７０〜１００℃（好ましくは８０〜１００℃）で、５〜６０分間（好ましくは１０〜３０分間）の条件で加熱し、米糠に含まれるでんぷんのα化を行うことが望ましい。
【００１５】
そして、上記の、米麹による米糠の糖化は、４０〜７０℃（好ましくは５０〜６５℃）で、０．５〜２４時間（好ましくは５〜２０時間）の条件で行われる。
なお、上記米麹としては、例えば、甘酒用の米麹、酒造用の米麹等があげられる。そして、これらの米麹は、単独でもしくは二種以上併せて用いられる。
【００１６】
また、上記の、糖化酵素による米糠の糖化は、４０〜８０℃（好ましくは５０〜７０℃）で、０．５〜２４時間（好ましくは３〜２０時間）の条件で行われる。
なお、上記糖化酵素としては、例えば、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、β−アミラーゼ等があげられる。そして、これらの糖化酵素は、単独でもしくは二種以上併せて用いられる。
【００１７】
そして、上記のように、米麹または糖化酵素で糖化させて得られた培地に、菌体外多糖産生能を有する乳酸菌の植菌を行う。
なお、上記乳酸菌の植菌は、米糠を、米麹または糖化酵素で糖化させた後、米麹や糖化酵素を失活させてから行うことが、より高品質の菌体外多糖を得る観点から好ましい。上記米麹や糖化酵素の失活は、通常、８０〜１００℃で１０〜６０分間の加熱により行われる。
なお、上記培地に対し、乳酸菌の植菌前あるいは乳酸菌による乳酸発酵後に、遠心分離またはろ過により、酸敗・有毒化の要因となる油脂成分を分離・除去することが、より高品質の菌体外多糖を得る観点から好ましい。
【００１８】
上記の、菌体外多糖産生能を有する乳酸菌とは、乳酸発酵に際し菌体外多糖（Exopolysaccharide：ＥＰＳ）の産生能を有する乳酸菌のことをいう。このような乳酸菌として、本発明においては、菌体外多糖産生能を有する、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス、ストレプトコッカス  サーモフィラス、ラクトバチルス  デルブリュッキー  サブスピーシーズ  ブルガリカス等が好ましく用いられる。なお、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス等に属する乳酸菌であっても、菌体外多糖を産生しない菌株のものは、本発明で使用することはできない。
そして、上記のように菌体外多糖を産生する乳酸菌は、例えば、特定生息域での微生物の採取や、いわゆるスクリーニングによる選別作業等により得ることができる。なお、上記乳酸菌の併用は、その発酵の際の至適条件が重複する場合であれば可能である。
【００１９】
特に、上記乳酸菌として、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス  ＦＣ（Lactococcus lactis subsp.cremoris FC,FERM P-20185）、ストレプトコッカス  サーモフィラス  Ｔ３８（Streptococcus thermophiles T38）を用いることが、菌体外多糖の産生量をより増加させる観点から好ましく、より好ましくは、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス  ＦＣである。
なお、上記のラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス  ＦＣは、本出願人が寄託し、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（現在の、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター  特許生物寄託センター）に受託された菌株であり、菌体外多糖を産生する特徴がある。またラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス  ＦＣは、１０℃以上で増殖する特性を有し、２５〜３０℃を至適温度としており、さらに、培地上に、白〜乳白状の粘稠性を有するコロニーを形成し、例えば、ＢＣＰ培地上に、２５℃×２日培養すると、直径０．５〜１．０ｍｍの円形（半球状）コロニーとなる。また、培養条件や生理的状態によるコロニー形態の変化はない。
【００２０】
また、上記のようにして米糠を米麹または糖化酵素で糖化させて得られた培地への、上記乳酸菌の植菌は、例えば、その菌体が凍結乾燥され粉末状となったものである場合、活性化させたもの（スターター）とし、上記培地に添加することが好ましい。上記スターターは、例えば、グルコースを加えた水に乳酸菌粉末を添加し、２０〜４５℃（好ましくは２５〜４０℃）で６〜４８時間（好ましくは７〜１０時間）活性化させることにより得られる。そして、このようにして得られたスターターは、その生菌数が１０7ｃｆｕ／ｇ以上のものが好ましく用いられ、その添加量は、上記培地１００重量部に対し、好ましくは０．１〜１０重量部の範囲であり、より好ましくは１〜５重量部の範囲である。
なお、本明細書において、生菌数の測定は、ＢＣＰ培地（ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（栄研化学社製））に試験試料を添加、混釈し、各乳酸菌の至適温度に応じて２５℃または３７℃で４８時間培養した後、コロニー数を計数することにより行われる。
【００２１】
そして、上記スターターに使用された乳酸菌が、例えば、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス  ＦＣである場合、その至適温度が２５℃前後であるため、上記植菌後の乳酸発酵は、２４〜２６℃で３〜２４時間の条件で行うことが好ましい。このように、使用する乳酸菌の種類によって、その至適温度に合った条件で乳酸発酵を行う必要がある。
【００２２】
なお、上記乳酸発酵前の培地のＢｒｉｘ値（糖度）は１〜４０であることが好ましく、より好ましくは１〜３０の範囲である。本明細書において、Ｂｒｉｘ値は、糖度屈折計により測定される。
また、上記乳酸発酵前の培地のｐＨは５．５〜７．５であることが好ましく、上記乳酸発酵後の培地のｐＨは３．５〜５．５であることが好ましい。
また、上記乳酸発酵後の培地における乳酸菌の生菌数は１０7〜１０9ｃｆｕ／ｇであることが好ましい。
【００２３】
そして、上記乳酸発酵により菌体外多糖が産生されたことは、例えば、次のようにして確認することができる。
第一の方法としては、上記乳酸発酵を行う前の、米麹または糖化酵素で糖化された培地の多糖量と、上記乳酸発酵後の培地の多糖量を比較する方法がある。そして、その増加した多糖量が、おおよそ上記乳酸発酵により産生された菌体外多糖の量と認めることができる。
なお、上記培地の多糖量の測定は、例えば、上記培地からタンパク等の夾雑物を取り除いた精製物に対し、フェノール硫酸法を用いて、その多糖画分を比色法で定量することにより行われる。
【００２４】
また、培地の多糖量の測定が困難な場合、第二の方法として、上記乳酸発酵を行う前の、米麹または糖化酵素で糖化された培地の粘度と、上記乳酸発酵後の培地の粘度を比較する方法がある。すなわち、上記乳酸発酵により得られる菌体外多糖は、一般に、粘性が高いことから、上記乳酸発酵後の培地の粘度のほうが明らかに増大していた場合、上記乳酸発酵により菌体外多糖の産生量が増大したものと認めることができる。
【００２５】
そして、目的とする菌体外多糖は、上記乳酸発酵後の培地から、遠心分離、ろ過、精製等の手法により、米糠由来成分や菌体等を除去することにより、抽出することができる。
なお、上記のような手法により菌体外多糖の抽出を行うことなく、上記乳酸発酵後の培地ごと、菌体外多糖の産生量が増大した組成物として提供することも可能である。すなわち、上記組成物は、米糠の糖化によって自然な甘みを呈しており、さらに菌体外多糖によって米糠特有の糠臭さやえぐみが抑えられていることから、上記のような工程を経なくとも、呈味性に優れているからである。
【００２６】
そして、上記菌体外多糖（上記菌体外多糖を含有する組成物も含む）は、そのまま飲食品とする他、必要に応じ、粉末化、錠剤化、カプセル化等して、サプリメント、医薬品、食品添加剤等として、利用することも可能である。
【実施例】
【００２７】
つぎに実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。また、以下の記述で「％」とあるのは、特に断りのない限り重量基準である。
【００２８】
・まず、実施例に先立ち、下記に示す三種のスターター（ＦＣ、Ｔ３８、Ｃ４）を調製した。なお、下記のスターターに使用の乳酸菌は、出願人により管理している菌株である。
【００２９】
［スターター（ＦＣ）］
菌体外多糖産生能を有する乳酸菌である、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス  ＦＣ（FERM P-20185）を、グルコース１．０％加えた水１００ｍｌに添加し、２５℃環境下で８時間発酵を行い、上記乳酸菌を１０7ｃｆｕ／ｇ含有するスターターを調製した。
【００３０】
［スターター（Ｔ３８）］
菌体外多糖産生能を有する乳酸菌である、ストレプトコッカス  サーモフィラス  Ｔ３８を、グルコース１．０％加えた水１００ｍｌに添加し、３７℃環境下で６時間発酵を行い、上記乳酸菌を１０7ｃｆｕ／ｇ含有するスターターを調製した。
【００３１】
［スターター（Ｃ４）］
菌体外多糖産生能を示さない乳酸菌である、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス  Ｃ４を、グルコース１．０％加えた水１００ｍｌに添加し、２５℃環境下で８時間発酵を行い、上記乳酸菌を１０7ｃｆｕ／ｇ含有するスターターを調製した。
【００３２】
・つぎに、下記に示す米糠および米粉を準備した。
【００３３】
［白糠］
玄米を重量精米歩合７２％未満で精米したときに得られた米糠
【００３４】
［中白糠］
玄米を重量精米歩合８２％以上８８％未満で精米したときに得られた米糠
【００３５】
［赤糠］
玄米を重量精米歩合９０％以上で精米したときに得られた米糠
【００３６】
［米粉］
精米後の米を粉末にした米粉（半鐘屋社製、「半鐘屋の米粉」）
【００３７】
・また、下記に示す米麹および糖化酵素を準備した。
【００３８】
［米麹］
マルコメ社製、「プラス糀  米こうじ」
【００３９】
［α−アミラーゼ］
ヤクルト薬品工業社製、「ユニアーゼＢＭ−８」
【００４０】
［グルコアミラーゼ］
ヤクルト薬品工業社製、「ユニアーゼ３０」
【００４１】
〔実施例１〜４、比較例１〜５〕
後記の表２に示す組合せで、米糠あるいは米粉を原料とする培地を調製し、上記培地に対し、後記の表２に示す組合せで、米麹あるいは糖化酵素を加えることにより糖化を行った。そして、上記糖化後の培地を、８５℃で３０分間加熱して失活させた後、後記の表１に示す組合せで、培地に各スターターを加え、乳酸発酵を行った。
ここで、上記培地の調製は、原料（米糠あるいは米粉）１００重量部に対し、水を５００重量部加え、その後、撹拌しながら８５℃で１０分間加熱して行った。
また、上記培地の米麹による糖化は、培地に使用された上記原料１００重量部に対し、米麹を５０重量部加えた後、撹拌しながら５５℃で１５時間加熱することにより行った。
また、上記培地の糖化酵素による糖化は、培地に使用された上記原料１００重量部に対し、α−アミラーゼ０．０５重量部を加え、撹拌しながら８５℃で３０分間加熱し、その後、上記培地を冷却してグルコアミラーゼ０．１重量部を加え、撹拌しながら５５℃で１５時間加熱することにより行った。
また、上記糖化後の培地にスターターを加えた後の乳酸発酵は、スターター（ＦＣ）およびスターター（Ｃ４）を使用した場合では、２５℃で８時間保持した状態で行い、スターター（Ｔ３８）を使用した場合では、３７℃で６時間保持した状態で行った。なお、いずれのスターターも、培地に使用された上記原料１００重量部に対し、３重量部の割合で加えた。
【００４２】
このようにして得られた乳酸発酵物に対し、下記の基準に従い、各特性の評価を行った。そして、これらの結果を後記の表２に併せて示した。
なお、後記の表２に、上記乳酸発酵前の培地のＢｒｉｘ値（糖度）、上記乳酸発酵前の培地のｐＨ（発酵前）、上記乳酸発酵後の培地のｐＨ（発酵後）、上記乳酸発酵後の培地における乳酸菌の生菌数（乳酸菌数）も、併せて示した。
【００４３】
〔多糖量増加〕
上記乳酸発酵の前と後の培地の多糖量をそれぞれ測定した。すなわち、各培地からタンパク除去を行い、多糖画分を回収した後、精製を行い、多糖の定量を行うことにより、上記多糖量の測定を行った。
なお、上記「タンパク除去」工程は、各培地１００ｇに対し、２０体積％のトリクロロ酢酸を同量添加して懸濁させ、その懸濁物を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）して上清を回収した後、上記上清に対し、再度、上記と同条件で遠心分離することにより行った。
また、上記「多糖画分の回収」工程は、上記「タンパク除去」工程を経た上清に対し、１．５倍量の４℃エタノールを添加して混和し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０分間）して上清を捨てることにより、行った。
また、上記「精製」工程は、上記「多糖画分の回収」工程を経て得た多糖画分に対し、４℃の６０体積％エタノール水溶液を添加して混和し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０分間）して上清を捨てる、といった作業を２回繰り返すことにより行った。
また、上記「多糖の定量」は、上記「精製」工程を経て回収した多糖画分を、フェノール硫酸法を用いて、比色法で定量することにより行った。
そして、上記乳酸発酵前の培地の多糖量に対し、上記乳酸発酵後の培地の多糖量の差が１０（ｍｇ／１００ｍｇ）以上であり、乳酸発酵後の多糖量増加が顕著に認められたものを「○」と評価し、上記乳酸発酵後の培地の多糖量の差が１０（ｍｇ／１００ｍｇ）未満であり、乳酸発酵後の多糖量増加が殆ど認められなかったものを「×」と評価した。なお、多糖量の測定を行わなかったものは「−」とした。
【００４４】
〔粘性増加〕
上記乳酸発酵前の培地（１０℃）をスプーンで５回かき混ぜたときの粘性（とろみ）と比較したときの、上記乳酸発酵後の培地（１０℃）をスプーンで５回かき混ぜたときの粘性（とろみ）を、訓練された嗜好性官能評価パネラー１４名によって評価した。評価方法は、下記の表１に基づき４段階評価（乳酸発酵前の培地と同等の粘性を示すものを「×」と評価）し、全パネラーの評価の平均をとることにより、粘性増加の度合をみた。
【００４５】
【表１】
2020156341.tif 000002
【００４６】
【表２】
2020156341.tif 000003
【００４７】
上記表２の結果から、実施例の乳酸発酵物は、乳酸発酵前に比べて粘度の増加が認められ、特に、実施例１では、多糖量の上昇度合が著しいことが確認された。また、実施例２，３，４では、乳酸発酵後の粘性の上昇度合が著しかったことから、実施例２，３，４でも、菌体外多糖が増産されていると認められる。
【００４８】
これに対し、菌体外多糖産生能を示さない乳酸菌による乳酸発酵を行った比較例１の乳酸発酵物、および、米粉を原料とした比較例２，３の乳酸発酵物は、乳酸発酵前に比べ、乳酸発酵後の多糖量の上昇は殆どみられず、乳酸発酵後の粘性の上昇も殆どみられなかった。また、白糠を原料とした比較例４，５の乳酸発酵物も、乳酸発酵前に比べ、乳酸発酵後の粘性の上昇が殆どみられなかったことから、乳酸発酵後の多糖量の上昇がないとみなされる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の菌体外多糖の産生方法は、従来の手法に比べ、容易な方法で、菌体外多糖の産生量を増加させることができる。また、従来の手法では、その殆どが牛乳等の乳を発酵原料としているが、本発明によって、乳以外の安価な発酵原料による菌体外多糖の産生方法を提供することができるため、様々なメリットがある。例えば、本発明によって得られた菌体外多糖を、発酵物から殆どあるいは全く抽出しないまま摂取した場合であっても、そもそも原材料に乳を含んでいないことから、乳アレルギーや、乳特有の風味が苦手な人にとってメリットがあり、また、コスト面でもメリットがある。
そして、上記のようにして得られた菌体外多糖（上記菌体外多糖を含有する組成物も含む）は、そのまま飲食品とする他、必要に応じ、粉末化、錠剤化、カプセル化等して、サプリメント、医薬品、食品添加剤等として、利用することも可能である。