(57)【要約】【課題】本発明の課題は、腫瘍などの標的部位に集積する間は血中での薬物の放出が抑制され、かつ標的部位に十分に集積した後に速やかに薬物が血中から除去されるリポソーム及びリポソーム組成物を提供することである。【解決手段】本発明によれば、親水性高分子が結合したリン脂質、ｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つリン脂質、及びｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質を少なくとも含むリポソームであって、上記の親水性高分子が結合したリン脂質の平均炭素鎖長が、上記のｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質の平均炭素鎖長よりも短い、上記リポソームが提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性高分子が結合したリン脂質、ｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つリン脂質、及びｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質を少なくとも含むリポソームであって、前記の親水性高分子が結合したリン脂質の平均炭素鎖長が、前記のｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質の平均炭素鎖長よりも短い、前記リポソームであって、
親水性高分子が結合したリン脂質が、重量平均分子量５０００のポリエチレングルコールが結合したジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン及び重量平均分子量２０００のポリエチレングルコールが結合したジミリストイルホスファチジルエタノールアミンからなる群より選択される一種以上であり、
ｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つリン脂質が、ジステアロイルホスファチジン酸であり、
ｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質が、水素添加大豆ホスファチジルコリンであり、
リポソーム膜を構成する脂質全体に対する前記のｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つリン脂質の含有率が２〜５モル％である、リポソーム。
【請求項２】
リポソーム膜を構成する脂質全体に対する前記の親水性高分子が結合したリン脂質の含有率が１〜２０モル％であり、リポソーム膜を構成する脂質全体に対する前記のｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質の含有率が３０〜８０モル％である、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
前記した、親水性高分子が結合したリン脂質、ｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つリン脂質、及びｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質以外に、さらに別の脂質を一種以上含む、請求項１又は２に記載のリポソーム。
【請求項４】
前記さらに別の脂質が、コレステロールである、請求項３に記載のリポソーム。
【請求項５】
リポソームを分散する媒体中に分散している、請求項１から４の何れか一項に記載のリポソーム。
【請求項６】
請求項１から５の何れか一項に記載のリポソームと、前記リポソームに内包された薬物とを含む、リポソーム組成物。
【請求項７】
前記薬物の分配係数ＬｏｇＤが１以下である、請求項６に記載のリポソーム組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソーム及びリポソーム組成物に関する。本発明は、抗がん剤などの医薬品として適切な血中動態を有するリポソーム及びリポソーム組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソーム（脂質小胞体ともいう）は、バリア能、化合物保持能、生体適合性、粒径設定の自由度、易分解性、表面修飾性等の特徴を生かして、免疫センサー、人工赤血球、薬物送達システムのキャリヤーなど多様な応用が検討されてきた。薬物送達システムのキャリヤーの用途において、リポソームは、水溶性化合物、脂溶性低分子、高分子と幅広い物質を内包することができる。
【０００３】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に代表される親水性ポリマーで表面が修飾されたリポソームは、細網内皮系の捕捉から逃れることができ、血中滞留性が高くなる。その結果、約４００ｎｍ以下のサイズの場合は、ＥＰＲ（Enhanced Permeability and Retention：透過性・滞留性亢進）効果により、腫瘍や炎症箇所への高い集積性が発揮される。ＥＰＲ効果とは、腫瘍や炎症などの病変部位において血管内皮細胞間にギャップがあり、正常組織に対してリポソームが集積し易くなる現象（Enhanced Permeability）、及び病変部位においてリンパ系の発達が未熟なため、集積したリポソームが排斥されず病変部位への集積がさらに進行する現象（Enhanced Retention）を意味する（非特許文献１）。
【０００４】
ＥＰＲ効果を利用して、親水性ポリマーで表面修飾して血中滞留を延長したリポソーム製剤を、腫瘍疾患に適用した場合には、薬物がリポソームに内包されているため循環器系などへの薬物の曝露を低減しながら、腫瘍へのリポソームの集積を高めることにより薬物の曝露を強化し、治療指数を向上することが期待できる。上記の原理によりドキシル（登録商標）は腫瘍集積による薬効と心毒性の低減を達成し、ドキソルビシンを内包した市販薬として広く使用されている。
【０００５】
ＥＰＲ効果を利用したリポソーム組成物として、特許文献１には、小胞形成脂質と、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーから選択される親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成脂質１〜２０モル％とから成るリポソームであって、腫瘍中への溢出に充分なサイズを有するリポソーム、及びリポソームに取り込まれた形態の腫瘍結像剤又は抗腫瘍剤を含む、リポソーム組成物が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第２８８９５４９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Cancer Research, (1986), 46, p.6387-6392
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一方で、ＥＰＲ効果により、正常組織にリポソームの集積を増強し、重篤な副作用を引き起こす場合がある。即ち、ドキシル（登録商標）の投与治療においては、手足又はベルトを装着した腰周りなど日常的な刺激が生じている箇所において、手足症候群と呼ばれる紅斑、色素沈着及び水泡が現れ強い痛みを伴う副作用が発生し、治療を中止せざる得ない場合がある（Arch Dermatol. 2000; (136), p.1475-1780）。この原因は、皮膚の炎症部にＥＰＲ効果によってリポソームが集積するためだと考えられている。
【０００９】
一方、ドキシル（登録商標）と同様に、ドキソルビシンを内包したリポソーム製剤であるが、放出が速く血中滞留が短い市販のドキソルビシン内包リポソームMyocet（登録商標）では、上記の副作用は発生しない。従って、上記の手足症候群の副作用は、ドキシル（登録商標）の長すぎる血中滞留が悪影響を及ぼしているためであると考えられる。
【００１０】
本発明は、腫瘍などの標的部位に集積する間は血中での薬物の放出が抑制され、かつ標的部位に十分に集積した後に速やかに薬物が血中から除去されるリポソーム及びリポソーム組成物を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、リポソームを構成する脂質成分の構成の適正化を図ることにより上記課題を解決したリポソーム及びリポソーム組成物を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明によれば、以下の発明が提供される。
【００１２】
［１］  親水性高分子が結合したリン脂質、ｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つリン脂質、及びｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質を少なくとも含むリポソームであって、上記の親水性高分子が結合したリン脂質の平均炭素鎖長が、上記のｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質の平均炭素鎖長よりも短い、上記リポソーム。
［２］  上記親水性高分子が、ポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類、ポリプロピレングリコール類、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン及び合成ポリアミノ酸からなる群から選択される一種以上である、［１］に記載のリポソーム。
［３］  上記親水性高分子の重量平均分子量が５００〜１０，０００である、［１］又は［２］に記載のリポソーム。
［４］  上記の親水性高分子が結合したリン脂質が、ｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つ、［１］から［３］の何れか一に記載のリポソーム。
［５］  上記の親水性高分子が結合したリン脂質が、親水性高分子が結合したジアシルホスファチジルエタノールアミン、又は親水性高分子が結合したジアシルグリセロールである、［１］から［４］の何れか一に記載のリポソーム。
【００１３】
［６］  上記のｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つリン脂質が、ホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルイノシトールからなる群から選択される一種以上である、［１］から［５］の何れか一に記載のリポソーム。
［７］  上記のｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、及びカルジオリピンからなる群から選択される一種以上である、［１］から［６］の何れか一に記載のリポソーム。
［８］  上記のｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質の平均炭素鎖長が１４〜２４である、［１］から［７］の何れか一に記載のリポソーム。
［９］  上記の親水性高分子が結合したリン脂質が、ポリエチレングリコールが結合したジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、又はポリエチレングリコールが結合したジミリストイルホスファチジルエタノールアミンであり、上記のｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質が、水素添加大豆ホスファチジルコリンである、［１］から［８］の何れか一に記載のリポソーム。
［１０］  リポソーム膜を構成する脂質全体に対する上記の親水性高分子が結合したリン脂質の含有率が１〜２０モル％であり、リポソーム膜を構成する脂質全体に対する上記のｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つリン脂質の含有率が１〜２０モル％であり、リポソーム膜を構成する脂質全体に対する上記のｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質の含有率が３０〜８０モル％である、［１］から［９］の何れか一に記載のリポソーム。
【００１４】
［１１］  上記した、親水性高分子が結合したリン脂質、ｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つリン脂質、及びｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質以外に、さらに別の脂質を一種以上含む、［１］から［１０］の何れか一に記載のリポソーム。
［１２］  上記さらに別の脂質が、コレステロールである、［１］から［１１］の何れか一に記載のリポソーム。
［１３］  リポソームを分散する媒体中に分散している、［１］から［１２］の何れか一に記載のリポソーム。
［１４］  ［１］から［１３］の何れか一に記載のリポソームと、上記リポソームに内包された薬物とを含む、リポソーム組成物。
［１５］  上記薬物の分配係数ＬｏｇＤが１以下である、［１４］に記載のリポソーム組成物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、腫瘍などの標的部位に集積する間は血中での薬物の放出が抑制され、かつ標的部位に十分に集積した後に速やかに薬物が血中から除去されるリポソーム及びリポソーム組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ドキソルビシン溶液、並びに実施例１、実施例２、比較例１及び比較例３のリポソーム組成物についての血中動態の評価の結果を示す。
【図２】図２は、ドキソルビシン溶液、並びに実施例２、比較例１及び比較例３のリポソーム組成物についての血中動態の評価の結果を示す。
【図３】図３は、比較例１及び比較例２のリポソーム組成物について血中動態の評価の結果を示す。
【図４】図４は、比較例１及び比較例４のリポソーム組成物についての血中動態の評価の結果を示す。
【図５】図５は、実施例１及び比較例１のリポソーム組成物、ドキソルビシン溶液、並びに溶媒参照についての薬効試験の結果を示す。
【図６】図６は、比較例１及び比較例２のリポソーム組成物、並びに溶媒参照についての薬効試験の結果を示す。
【図７】図７は、比較例１及び比較例４のリポソーム組成物、並びに溶媒参照についての薬効試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本明細書において組成物中の各成分の量は、リポソーム又は組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、リポソーム又は組成物中に存在する上記の複数の物質の合計量を意味する。
【００１８】
「放出」とは、リポソームに封入された薬物が、リポソームを構成する脂質膜を通過して、リポソームの外部へ出ることを意味する。
「血中滞留性」とは、リポソーム（又はリポソーム組成物）を投与した対象において、リポソームに封入された状態の薬物が血液中に存在する性質（状態）を意味する。
「リポソームの平均粒子径」とは、リポソームの体積平均粒子径を意味する。リポソームの平均粒子径は動的光散乱法を用いて測定する。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、濃厚系粒子アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子社製）、ナノトラックＵＰＡ（日機装社製）及びナノサイザー（マルバーン社製）等が挙げられる。
【００１９】
「対象」とは、その予防若しくは治療を必要とするヒト、マウス、サル、家畜等の哺乳動物であり、好ましくは、その予防若しくは治療を必要とするヒトである。
「腫瘍」（本発明では、「がん（癌）」と同義で用いる）とは、具体的には食道癌、胃癌（胃腺癌を含む）、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、腎細胞癌、喉頭癌、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌（子宮体癌を含む）、卵巣癌、尿路上皮癌、頭頚部扁平上皮癌、カポジ肉腫、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫などの固形腫瘍、また白血病などの液性腫瘍が挙げられる。腫瘍が発生する部位は、腫瘍の細胞、組織、器官又は臓器及びそれらの内部などである。
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、親水性高分子が結合したリン脂質、ｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つリン脂質、及びｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質を少なくとも含むリポソームであって、親水性高分子が結合したリン脂質の平均炭素鎖長が、ｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質の平均炭素鎖長よりも短い、リポソームに関する。
【００２１】
親水性高分子が結合したリン脂質から形成したリポソームは、高い血中滞留性を示し、ＥＰＲ効果により腫瘍などの患部への高い集積が可能である。しかし、上記リポソームには、新たな副作用として手足症候群を引き起こし、投薬の継続が困難になる場合があった。手足症候群は、リポソームの血中滞留時間が長すぎると、リポソームに内包される薬物によって皮膚の炎症を起こし、次回の投与においてＥＰＲ効果によってリポソームが集積することにより発生するものと考えられている。本発明においては、親水性高分子が結合したリン脂質及びｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つリン脂質に加えて、ｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質を用いてリポソームを形成し、さらに、親水性高分子が結合したリン脂質の平均炭素鎖長が、ｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質の平均炭素鎖長よりも短いものとすることによって、腫瘍への集積に十分な期間だけ血中に滞留しつつ、かつ皮膚に炎症を生じさせないという、優れた体内動態を達成できることを見出した。特に、親水性高分子が結合したリン脂質及びｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つリン脂質と、ｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質とを組み合わせるという特徴、並びに親水性高分子が結合したリン脂質の平均炭素鎖長がｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質の平均炭素鎖長よりも短いという特徴によって、上記した優れた体内動態を達成できることは全く予想外であった。また、本発明のリポソームは上記した優れた体内動態を示すことにより、十分な薬効を発揮すると同時に、副作用が低減されている。上記した優れた血中動態を達成できるメカニズムとしては、以下の通り推定されるが、本発明は下記メカニズムにより限定されるものではない。
【００２２】
親水性高分子が結合したリン脂質の平均炭素鎖長が、ｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質の平均炭素鎖長よりも短い場合、親水性高分子が結合したリン脂質は、リポソームを構成する脂質二重層から脱落しやすくなる。その結果、腫瘍に集積するのに充分な一定時間までは、血中を滞留し、かつ、皮膚への集積が進む前に血中からのリポソーム粒子の排斥が亢進することで、皮膚の炎症を抑えることができる。ただし、親水性高分子が脱落した後のリポソーム粒子表面に帯びる負電荷の量が少ない場合は、特定の臓器への集積を亢進する場合があると考えられ、様々な毒性を引き起こすことがある。
また、ｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つリン脂質の存在により、親水性高分子が結合したリン脂質が脱落したリポソームの電荷が負の電荷を帯びるようにすることで、毒性を低減することができる。
本発明の構成とすることにより、全く予想外の薬効の発現と副作用の低減が実現されたと推定できる。
【００２３】
［リポソーム］
リポソームとは、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、その閉鎖小胞の空間内に水相（内水相）を有する。内水相には、水等が含まれる。リポソームは通常、閉鎖小胞外の水溶液（外水相）に分散した状態で存在する。リポソームはシングルラメラ（単層ラメラ又はユニラメラとも呼ばれ、二重層膜が一重の構造である。）であっても、多層ラメラ（マルチラメラとも呼ばれ、タマネギ状の形状の多数の二重層膜の構造である。個々の層は水様の層で仕切られている。）であってもよいが、本発明では、医薬用途での安全性及び安定性の観点から、シングルラメラのリポソームであることが好ましい。
【００２４】
リポソームは、薬物を内包することのできるリポソームであれば、その形態は特に限定されない。「内包」とは、リポソームに対して薬物が内水相に含まれる形態をとることを意味する。例えば、膜で形成された閉鎖空間内に薬物を封入する形態、膜自体に内包する形態などが挙げられ、これらの組合せでもよい。
【００２５】
リポソームの平均粒子径は特に限定されないが、１０〜２００ｎｍであり、好ましくは１５〜１５０ｎｍ、より好ましくは２０〜１２０ｎｍである。
【００２６】
リポソームの脂質二重層を構成する成分（膜成分）は、脂質から選ぶことができる。脂質として、水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒に溶解するものを任意に使用することができる。本発明においては、脂質として、具体的には、親水性高分子が結合したリン脂質、ｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つリン脂質、及びｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質を使用する。なお、本発明において、「リン脂質」とはリン脂質に修飾を加えたリン脂質誘導体も包含する。
【００２７】
親水性高分子が結合したリン脂質における親水性高分子としては、特に限定されないがポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類、ポリプロピレングリコール類、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン及び合成ポリアミノ酸などが挙げられる。上記の親水性高分子は、それぞれ単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。これらの中でも、製剤の血中滞留性の観点から、ポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類及びポリプロピレングリコール類が好ましく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリセリン（ＰＧ）及びポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）がより好ましい。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は汎用であり、血中滞留性を向上させる効果があるため、最も好ましい。
【００２８】
ＰＥＧの重量平均分子量は、特に限定されない。ＰＥＧの重量平均分子量は、好ましくは５００〜１０，０００であり、より好ましくは１，０００〜７，０００、さらに好ましくは２，０００〜５，０００である。
【００２９】
親水性高分子が結合したリン脂質としては、ｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つことが好ましい。
親水性高分子が連結したリン脂質としては、ジアシルホファチジルエタノールアミンに親水性高分子を連結させ負電荷を持つリン脂質、及びジアシルグリセロールに親水性高分子を連結させ電荷を有さないリン脂質などが挙げられ、ポリエチレングリコールが結合したジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、又はポリエチレングリコールが結合したジミリストイルホスファチジルエタノールアミンが好ましい。
上記の中でも、重量平均分子量５０００のＰＥＧが結合したジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００）及び重量平均分子量２０００のＰＥＧが結合したジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ-ＰＥＧ２０００）が特に好ましい。
【００３０】
ｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つリン脂質とは、ｐＨ６〜８の領域でプロトンが乖離する酸性基を有する脂質を意味する。ｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つリン脂質としては、特に限定されないが、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ホスファチジルセリン及びホスファチジルイノシトール等が挙げられる。
【００３１】
ｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質とは、ｐＨ６〜８の領域でプロトンが乖離する酸性基又はプロトン化される塩基性基を持たない脂質を意味する。ｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質（電荷を持たないリン脂質）としては、特に限定されないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、並びにこれらを水素添加したもの（例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ））等が挙げられ、水素添加大豆ホスファチジルコリンが好ましい。
【００３２】
ｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質の平均炭素鎖長は特に限定されないが、好ましくは１４〜２４であり、より好ましくは１４〜２０であり、さらに好ましくは１６〜１８である。
平均炭素鎖長は、ｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質として使用する各リン脂質（１種又は２種以上）の炭素鎖長の値と、各リン脂質の含有率（ｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質の全質量に対する各リン脂質の質量の割合）とから求めることができる。
【００３３】
本発明の好ましい態様の具体例としては、親水性高分子が結合したリン脂質が、ポリエチレングリコールが結合したジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、又はポリエチレングリコールが結合したジミリストイルホスファチジルエタノールアミンであり、ｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質が、水素添加大豆ホスファチジルコリンである場合を挙げることができる。
【００３４】
リポソーム膜を構成する脂質全体に対する、親水性高分子が結合したリン脂質の含有率は、好ましくは１〜２０モル％であり、より好ましくは２〜１５モル％であり、さらに好ましくは２〜１０モル％であり、特に好ましくは３〜１０モル％である。
リポソーム膜を構成する脂質全体に対する、ｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つリン脂質の含有率は、好ましくは１〜２０モル％であり、より好ましくは２〜１５モル％であり、さらに好ましくは２〜１０モル％であり、特に好ましくは３〜１０モル％である。
リポソーム膜を構成する脂質全体に対する、ｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質の含有率は、好ましくは３０〜８０モル％であり、より好ましくは３５〜７０モル％であり、さらに好ましくは４０〜６０モル％である。
【００３５】
本発明のリポソームは、親水性高分子が結合したリン脂質、ｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つリン脂質、及びｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質以外に、さらに別の脂質を一種以上含んでいてもよい。
上記したさらに別の脂質としては、リン脂質以外の脂質を挙げることができる。リン脂質以外の脂質としては、リン酸を含まない脂質が挙げられ、特に限定されないがリン酸部分をその分子内に有しないグリセロ脂質、リン酸部分をその分子内に有しないスフィンゴ脂質等が挙げられる。なお、本発明において、「リン脂質以外の脂質」とはリン脂質以外の脂質に修飾を加えたリン脂質以外の脂質の誘導体も包含する。
【００３６】
リン脂質以外の脂質が塩基性官能基を含む場合、例えば、脂質に塩基性官能基を有する化合物が結合した物質である場合、脂質はカチオン化脂質と呼ばれる。カチオン化脂質は、例えば、リポソームの膜を修飾することが可能となり、標的部位である細胞との接着性等を高めることができる。
【００３７】
上記したさらに別の脂質は、コレステロール類でもよい。コレステロール類としては、シクロペンタヒドロフェナントレンを基本骨格とし、その一部あるいはすべての炭素が水素化されているコレステロール及びその誘導体を挙げることができる。例えば、コレステロールが挙げられる。リポソームの平均粒子径を１００ｎｍ以下に微細化していくと脂質膜の曲率が高くなる。リポソームにおいて配列した膜のひずみも大きくなるため、水溶性薬物は更に漏出しやすくなる。漏出性を抑制する手段として、脂質による膜のひずみを埋める（膜安定化効果）ために、コレステロール等を添加することが有効である。
【００３８】
リポソームにおいて、コレステロール類の添加は、リポソームの膜のすきまを埋めること等により、リポソームの膜の流動性を下げることが期待される。本発明のリポソームがコレステロール類を含む場合、リポソームを構成する脂質の合計量に対するコレステロール類の含有量は特に限定されないが、好ましくは１０〜７０モル％であり、より好ましくは２０〜６０モル％であり、さらに好ましくは３０〜５０モル％である。
【００３９】
リポソームには、上記の成分の他に、血中滞留性の改善のために親水性高分子等、膜構造の安定剤として脂肪酸、ジアセチルホスフェート等、抗酸化剤としてα−トコフェロール等を加えてもよい。本発明では、医薬用途において静脈注射用途での使用が認められていない分散助剤などの添加剤、例えば、界面活性剤等を用いないことが好ましい。
【００４０】
本発明のリポソームは、リポソームを分散する媒体中に分散している状態で提供することができる。上記媒体は、リポソームを分散できる媒体であれば特に限定されないが、好ましくは水性媒体である。上記の水性媒体は、外水相とも称し、本明細書中において後記する。
【００４１】
［リポソーム組成物］
（薬物）
本発明のリポソームに薬物を含めることにより、リポソーム組成物を提供することができる。薬物としては、リポソームに内包することのできる薬物であればよく、具体的には、酵素、タンパク質、ペプチド、核酸（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ(small interfering ＲＮＡ)、ｍｉＲＮＡ（microＲＮＡ））、低分子化合物、糖類（オリゴ糖及び多糖）、高分子化合物、抗腫瘍剤、抗菌剤、造影剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、保湿剤、育毛剤等の生理活性又は薬理学的活性を有する水溶性の物質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。リポソームを薬物送達システムのキャリヤーとして用いる場合、安定性の観点から、低分子化合物であることが好ましい。本発明のリポソーム組成物は、医薬組成物、化粧品組成物、食品組成物などとして提供することができるが、特に限定されない。医薬組成物の具体例としては、抗腫瘍剤などを挙げることができるが、特に限定されない。
【００４２】
薬物としては、水溶性薬物でも非水溶性薬物でもよく、特に限定されない。
薬物としては、好ましく、脂溶性が低い薬物を使用することができる。脂溶性が所定値より高い薬物は、リポソーム膜を形成する脂質に溶解し、引き続き外水相に分配することで、内水相からの漏出が生じ易い。したがって脂溶性が所定値以下の薬物を使用することにより、薬物を安定にリポソーム内水相に保持し易くなく。脂溶性の尺度としては分配係数ＬｏｇＤを用いることができる。
【００４３】
本発明でのＬｏｇＤは、薬物を内包する内水相のｐＨに調整した水と１−オクタノールとの分配係数を示す。ＬｏｇＤは、まず、緩衝液によりｐＨが調整された水相に薬物を溶解させ、同量の１−オクタノールを加えて充分に混合させ、水相及び１−オクタノール相のそれぞれの濃度を、液体クロマトグラフィー等の装置を用いて定量する。そして、１−オクタノール相での濃度を水相での濃度で割り、対数を取ることで算出される。
【００４４】
内水相のｐＨにおけるＬｏｇＤが１以下の薬物を使用する場合、上記薬物は、好適にリポソームに内包することができる。内水相として、通常設定することができるｐＨは、脂質の分解抑制の観点から３〜１１であり、その範囲でＬｏｇＤが１以下を示すことができる化合物としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、シタラビン及びペメトレキセドなどが挙げられ、一例としてはドキソルビシンが挙げられる。
【００４５】
薬物は、塩の形態として使用してもよい。
薬物の塩としては、通常知られているアミノ基などの塩基性基、ヒドロキシル基及びカルボキシル基などの酸性基における塩を挙げることができる。
【００４６】
塩基性基における塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸及び硫酸などの鉱酸との塩；ギ酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、アスパラギン酸、トリクロロ酢酸及びトリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸との塩；ならびにメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸及びナフタレンスルホン酸などのスルホン酸との塩が挙げられる。
【００４７】
酸性基における塩としては、例えば、ナトリウム及びカリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウム及びマグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アンモニウム塩；ならびにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、１−エフェナミン及びＮ、Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩などが挙げられる。
【００４８】
リポソーム組成物における薬物の含有量は特に限定されないが、リポソーム組成物に対して０．１〜２．０ｍｇ／ｍｌであることが好ましく、０．２〜１．０ｍｇ／ｍｌであることがより好ましい。
【００４９】
（その他の添加剤等）
本発明のリポソーム組成物には、適宜、水性溶媒、添加剤等を加えてもよい。リポソーム組成物は、投与経路に関連して、医薬的に許容される等張化剤、安定化剤、酸化防止剤、及びｐＨ調整剤の少なくとも一種を含んでもよい。
【００５０】
等張化剤としては、特に限定されないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムのような無機塩類、グリセロール、マンニトール、ソルビトールのようなポリオール類、グルコース、フルクトース、ラクトース、又はスクロースのような糖類が挙げられる。
【００５１】
安定化剤としては、特に限定されないが、例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、又はスクロースのような糖類が挙げられる。
【００５２】
酸化防止剤としては、特に限定されないが、例えば、アスコルビン酸、尿酸、トコフェロール同族体（例えば、ビタミンＥ、トコフェロールα、β、γ、δの４つの異性体）システイン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等が挙げられる。安定化剤及び酸化防止剤は、それぞれ単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。
【００５３】
ｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、クエン酸、酢酸、トリエタノールアミン、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ニ水素カリウムなどが挙げられる。
【００５４】
本発明のリポソーム組成物は、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、塩化ナトリウム、糖類、生体内分解性ポリマー、無血清培地、医薬添加物として許容される添加物を含有してもよい。
【００５５】
特に、本発明では、リポソーム組成物に、硫酸アンモニウム、Ｌ−ヒスチジン、精製白糖、水酸化ナトリウム、塩酸などを含有することが好ましい。
【００５６】
リポソーム組成物を充填する容器は、特に限定されないが、酸素透過性が低い材質であることが好ましい。例えば、プラスチック容器、ガラス容器、アルミニウム箔、アルミ蒸着フィルム、酸化アルミ蒸着フィルム、酸化珪素蒸着フィルム、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリ塩化ビニリデン等をガスバリア層として有するラミネートフィルムによるバック等が挙げられ、必要に応じて、着色ガラス、アルミニウム箔やアルミ蒸着フィルム等を使用したバック等を採用することで遮光することもできる。
【００５７】
リポソーム組成物を充填する容器において、容器内の空間部に存在する酸素による酸化を防ぐために、容器空間部及び薬液中のガスを窒素などの不活性ガスで置換することが好ましい。例えば、注射液を窒素バブリングし、容器への充填を窒素雰囲気下行うことが挙げられる。
【００５８】
リポソーム組成物の投与方法は、非経口的投与が好ましい。例えば、点滴などの静脈内注射（静注）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、眼内注射、髄腔内注射を選択することができる。リポソーム組成物の具体的な投与方法としては、シリンジ、点滴による投与が挙げられる。
【００５９】
リポソーム組成物に含まれる薬物の投与量は、通常、一日につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれるが、特に限定されるものではない。
【００６０】
［リポソーム及びリポソーム組成物の製造方法］
本発明のリポソーム及びリポソーム組成物の製造方法は特に限定されないが、例えば、有機溶媒に溶解した脂質を乳化してリポソームを形成する乳化工程、及び乳化工程で得られたリポソームに水溶性薬物を内包させる薬物ローディング工程によって、本発明のリポソーム及びリポソーム組成物を製造することができる。リポソーム及びリポソーム組成物の製造方法は、必要に応じて、乳化工程で用いた有機溶媒を蒸発させる蒸発工程等、他の工程を含んでもよい。
【００６１】
有機溶媒に溶解した脂質を乳化してリポソームを形成する乳化工程においては、乾燥固化工程を経ずに、有機溶媒に溶解した脂質を乳化することでリポソームを形成してもよい。乳化工程は、特に限定されないが、好ましくは高せん断をかけ、有機溶媒を含む乳化工程で微粒子化する工程である。必要に応じて、乳化工程で用いた有機溶媒を蒸発させる（脱溶媒する）ことでリポソームを形成することができる。
【００６２】
（乳化工程）
乳化工程では、脂質が有機溶媒に溶解している油相と、水相とを混合して脂質を含む水溶液を攪拌して乳化する。脂質が有機溶媒に溶解している油相及び水相を混合し撹拌し、乳化することで、油相及び水相が水中油型（Ｏ／Ｗ型）に乳化した乳化液が調製される。混合後、油相由来の有機溶媒の一部又は全部を後述する蒸発工程によって除去することにより、リポソームが形成される。又は、油相中の有機溶媒の一部又は全部が撹拌・乳化の過程で蒸発して、リポソームが形成される。
【００６３】
撹拌する方法としては、粒子微細化のために、超音波又は機械的せん断力が用いられる。また、粒子径の均一化のためには、一定の孔径のフィルターを通すエクストルーダー処理又はマイクロフルイザイザー処理を行うことができる。エクストルーダー等を用いれば、副次的に形成された多胞リポソームをばらして単胞リポソームにすることができる。本発明では、薬物をローディングしない状態のリポソームを、エクストリュージョン処理せずに次の工程に用いることが、製造工程の簡略化の観点から好ましい。
【００６４】
本発明では、撹拌の速度及び時間を任意に選択することで、調製するリポソームの平均粒子径を制御することができる。安全性及び安定性を有するリポソームを得る観点において、脂質を含む水溶液に周速２０ｍ／ｓｅｃ以上のせん断を与えることが好ましい。せん断としては、限定されないが、具体的には、周速２０ｍ／ｓｅｃ以上３５ｍ／ｓｅｃ以下のせん断を与えることが好ましく、周速２３ｍ／ｓｅｃ以上３０ｍ／ｓｅｃ以下のせん断を与えることがより好ましい。
【００６５】
（油相）
油相として用いられる有機溶媒として、水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒を用いる。本発明では、有機溶媒として、クロロホルム、塩化メチレン、ヘキサン、又はシクロヘキサンといった有機溶媒を実質的に用いないことが好ましく、これらの有機溶媒をまったく用いないことがより好ましい。
【００６６】
水溶性有機溶媒は、特に限定されないが、水と任意に混じりあう性質をもつ有機溶媒であることが好ましい。水溶性有機溶媒は、具体的には、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールなどのアルコール類、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール類などが挙げられる。これらのなかでも、アルコール類が好ましい。アルコールは、エタノール、メタノール、２−プロパノール、及びｔｅｒｔ−ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、エタノール、２−プロパノール、ｔｅｒｔ−ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることがより好ましく、エタノールであることがさらに好ましい。
【００６７】
エステル系有機溶媒は、特に限定されないが、有機酸及びアルコールの反応から得られるエステルであることが好ましい。エステル系有機溶媒は、具体的には、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、及びプロピオン酸メチルから選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、プロピオン酸メチルがより好ましく、酢酸エチルがさらに好ましい。
【００６８】
水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合比率は、特に限定されないが質量比で、９０：１０〜３０：７０、好ましくは８０：２０〜４０：６０、より好ましくは８０：２０〜７０：３０であればよい。水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒は、さらに水又は緩衝液など下記に述べる水性溶媒を含んでいてもよい。水性溶媒は、例えば１〜３０質量％の範囲で加えられていてもよい。混合溶媒のｐＨは、特に限定されないが、３〜１０程度の範囲が好ましく、４〜９程度であることがより好ましい。エステル系有機溶媒にはこれら溶媒に可溶な各種薬物などの生理活性物質などを含んでいてもよい。
【００６９】
水溶性有機溶媒としてエタノールを用い、エステル系有機溶媒として酢酸エチルを用いる場合、エタノールと酢酸エチルの混合比率は、特に限定されないが質量比で、８０：２０〜７０：３０であることが好ましい。
【００７０】
脂質の濃度は、特に限定されず、適宜調整することが可能であるが、水溶性有機溶媒とエステル系有機溶媒の混合液を溶媒とする溶液として、２０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、好ましくは３０ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌであればよい。
【００７１】
（水相）
水相とは、外水相及び内水相を意味する。
本発明における外水相とは、リポソームを分散する水溶液を意味する。たとえば注射剤の場合においては、バイアル瓶やプレフィルドシリンジ包装されて保管されたリポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。また、添付された分散用液やその他溶解液により投与時に用時分散した液についても同様に、リポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。
本発明における内水相とは、脂質二重膜を隔てた閉鎖小胞内の水相を意味する。
【００７２】
リポソームを製造する際に、リポソームを分散する水溶液（外水相）としては、水（蒸留水、注射用水等）、生理食塩水、各種緩衝液、糖類の水溶液及びこれらの混合物（水性溶媒）が好ましく用いられる。緩衝液としては、有機系、無機系に限定されることはないが、体液に近い水素イオン濃度付近に緩衝作用を有する緩衝液が好適に用いられ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グッドバッファーなどがあげられる。水相のｐＨは特に限定されないが、５〜９、好ましくは７〜８であればよい。例えば、リン酸緩衝液（例えば、ｐＨ＝７．４）を用いることが好ましい。リポソームの内水相は、リポソームを製造する際に、リポソームを分散する水溶液であってもよいし、新たに添加される、水、生理食塩水、各種緩衝液、糖類の水溶液及びこれらの混合物をあってもよい。外水相又は内水相として用いる水は、不純物（埃、化学物質等）を含まないことが好ましい。
【００７３】
生理食塩水とは、人体と等張になるように調整された無機塩溶液を意味し、さらに緩衝機能を持っていてもよい。生理食塩水としては、塩化ナトリウムを０．９ｗ／ｖ％含有する食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳともいう）及びトリス緩衝生理食塩水などが挙げられる。
【００７４】
（蒸発工程）
本発明では、必要に応じて蒸発工程を設けてもよい。蒸発工程では、乳化工程で得られたリポソームを含む水溶液から有機溶媒を蒸発させる。本発明において、蒸発工程とは、油相由来の有機溶媒の一部又は全部を蒸発工程として強制的に除去する工程、及び油相中の有機溶媒の一部又は全部が撹拌・乳化の過程で自然に蒸発する工程の少なくとも一つを含む。
【００７５】
蒸発工程における有機溶媒を蒸発させる方法は、特に限定されないが、例えば、有機溶媒を加熱することにより蒸発させる工程、乳化後に静置又は緩やかな撹拌を継続する工程、及び真空脱気を行う工程の少なくとも一つを行えばよい。
【００７６】
本発明では、有機溶媒を蒸発させる工程において、リポソームを含む水溶液に含まれる有機溶媒の濃度を、有機溶媒を蒸発させる工程の開始後から３０分間以内に、１５質量％以下にすることが好ましい。
【００７７】
リポソームを製造する際の液温は、適宜調整することが可能であるが、油相と水相との混合時の液温を使用する脂質の相転移温度以上とすることが好ましく、例えば、相転移温度が３５℃以上６０℃以下の脂質を使用する場合、４０℃以上７０℃以下とすることが好ましい。
【００７８】
乳化工程を経て調製されたリポソームを含む水溶液は、リポソームに含まれなかった成分の除去、又は濃度や浸透圧の調整のために、遠心分離、限外ろ過、透析、ゲルろ過、凍結乾燥等の方法で後処理をしてもよい。
【００７９】
得られたリポソームは、透析法、濾過法、エクストリュージョン処理等を用いて粒径を均一にしてもよい。リポソームの製造においては、薬物をローディングしない状態の空のリポソームを、エクストリュージョン処理をせずに調製することが好ましい。また、リポソーム内に内包された薬物と内包されない薬物とを分離するには、遠心分離法、透析法、ゲル濾過法等が利用できる。
エクストリュージョン処理とは、細孔を有するフィルターにリポソームを通過させることで、物理的なせん断力を施し、微粒化する工程を意味する。
【００８０】
（薬物ローディング工程）
薬物ローディング工程では、リポソームに薬物を封入させる。
薬物を水性媒体に溶解して薬物溶液を調製し、この薬物溶液と薬物未封入リポソームとを混合し、薬物ローディング液とする。次いで、透析液（適当な濃度のスクロース／ヒスチジン水溶液など）を用いて透析を行うことにより、薬物ローディング液の外水相に存在する未封入の薬物と溶質を除去し、透析液で外水相を置換することにより、リポソームに薬物を封入したリポソーム組成物を製造することができる。
【００８１】
（無菌ろ過）
上記により得られるリポソームを含む水溶液をリポソーム組成物とするためには、無菌ろ過を行うことが好ましい。ろ過の方法としては、中空糸膜、逆浸透膜、メンブレンフィルター等を用いて、リポソームを含む水溶液から不要な物を除去することができる。本発明では、特に限定されないが、滅菌できる孔径をもつフィルター（好ましくは０．２μｍのろ過滅菌フィルター）によってろ過することが好ましい。通常、ろ過工程において、ろ過滅菌フィルターへのリポソームが吸着又は凝集が発生することがある。
【００８２】
リポソームの変形による平均粒子径への影響を防ぐために、無菌ろ過工程及び後述する無菌充填工程は、リポソームを構成する脂質の相転移温度以下で行うことが好ましい。例えば、脂質の相転移温度が５０℃付近である場合、０〜４０℃程度が好ましく、より具体的には５〜３０℃程度で製造されることが好ましい。
【００８３】
（無菌充填）
無菌ろ過の後に得られたリポソームを含む水溶液は、医療用途として無菌充填することが好ましい。無菌充填の方法は公知のものが適用できる。容器に無菌的に充填することで医療用として好適なリポソーム組成物が調製できる。
【００８４】
［腫瘍体積］
本発明では、腫瘍体積を測定するために、モデルとなる動物（好ましくはマウスもしくはラット）に対して腫瘍を移植できる。本発明のリポソーム又はリポソーム組成物を哺乳動物等の対象に投与する場合、腫瘍の体積の増殖抑制という効果が観測できる。腫瘍の体積の増殖抑制は、使用される薬物、リポソームを構成する脂質等の組合せ、及び有効量に依存する。腫瘍体積の増殖抑制とは、腫瘍成長を抑制し得るか、腫瘍静止を達成し得るか、及び実質的若しくは完全な腫瘍退縮の少なくとも一つを意味する。
【００８５】
哺乳動物の対象の中の腫瘍体積は、任意の当分野で認められている方法を用いて測定できる。例えば、ノギスの測定を用いて、式：（ａ×ｂ２）×０．５（式中、“ａ”は最大直径であって、“ｂ”は短径の長さである）を用いて腫瘍体積を評価できる。また、ヒトでは、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）走査、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）走査のような画像診断などの手法により腫瘍体積を測定することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明のリポソーム及びリポソーム組成物は、適度な血中滞留性を示し、高い治療指数（薬効／毒性）を示すことができる。本発明のリポソーム及びリポソーム組成物によれば、薬効を低下させず副作用を低減することができる。本発明のリポソーム及びリポソーム組成物は、医薬品、化粧品、食品などに適用可能である。例えば、本発明のリポソーム及びリポソーム組成物は、抗がん剤を内包することができ、抗がん剤として利用することができる。
【実施例】
【００８７】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかし、本発明は実施例に何ら限定されるものではない。
溶媒組成における混合比は容量比を意味する。例えば、「エタノール／酢酸エチル＝７５／２５」は、容量比で７５％エタノール／２５％酢酸エチルを意味する。
また、１ｍｏｌ／ｍ３＝１０−３ｍｏｌ／Ｌ＝１ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００８８】
実施例においては以下の試薬を使用した。
重量平均分子量２０００のＰＥＧが結合したジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ-ＰＥＧ２０００）：SUNBRIGHT PM-020CN（日油株式会社製）
重量平均分子量５０００のＰＥＧが結合したジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００）：SUNBRIGHT PP-050CN（日油株式会社製）
重量平均分子量２０００のＰＥＧが結合したジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ-ＰＥＧ２０００）：SUNBRIGHT DSPE-020CN（日油株式会社製）
ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）：COATSOME MA-8080LS（日油株式会社製）
水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）：COATSOME NC21E（日油株式会社製）
コレステロール（Ｃｈｏｌ）：Cholesterol HP（Dishman株式会社製）
ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）：COATSOME MC-4040（日油株式会社製）
ドキソルビシン塩酸塩：ドキソルビシン塩酸塩（日本マイクロバイオファーマ株式会社製）
【００８９】
なお、ＤＭＰＥの平均炭素鎖長は１４であり、ＤＰＰＥの平均炭素鎖長は１６であり、ＤＳＰＥの平均炭素鎖長は１８である。ＨＳＰＣの平均炭素鎖長は、１６より大きく１８未満である。
【００９０】
実施例１
ａ）油相の調製
ＤＭＰＥ-ＰＥＧ２０００（成分Ａ：親水性高分子が結合したリン脂質）、ＤＳＰＡ（成分Ｂ：ｐＨ６〜８の領域で負電荷を持つリン脂質）、ＨＳＰＣ（成分Ｃ：ｐＨ６〜８の領域で電気的に中性であるリン脂質）及びコレステロール（Ｃｈｏｌ）を５／５／５０／４０のモル比となるように混合し、油相中に含まれる上記脂質混合物の濃度が５１ｍｇ／ｍｌとなるように、有機溶媒（エタノール／酢酸エチル＝７５／２５）４０５ｍｌを加えて７０℃に加温して脂質を溶解し油相とした。
【００９１】
ｂ）水相の調製
２６．７ｇの硫酸アンモニウムを日局注射用水１０８０ｍｌに溶解し水相とした。
【００９２】
ｃ）薬物未内包リポソームの調製
水相を７０℃に加温し、油相を添加した後、回転かき混ぜ式乳化機にて、周速３０ｍ／ｓ、１９０００ｒｐｍで３０分間混合した。その後、相転位温度以上に加温しながら窒素を送気することで有機溶媒と水とを蒸発させ、約１０００ｍＬ蒸発濃縮した。４１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを透析液として、外水相を透析置換し、さらに４１０ｍｍｏｌ／Ｌ透析液を用いて脂質混合物が３２ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、薬物未内包リポソームを得た。
【００９３】
ｄ）薬物内包リポソームの調製
薬物ローディング
１）薬物ローディング液の調製
ドキソルビシン塩酸塩（日本マイクロバイオファーマ株式会社製）４ｍｇ/ｍＬ溶液を塩化ナトリウム水溶液に加えて溶解させ、薬物溶液とした。つづいて、薬物溶液と薬物未封入リポソーム体積比１：１で混合した。５７℃で６０分間加熱し、薬物ローディング液とした。
【００９４】
透析によるリポソーム組成物の完成
透析液として２７５ｍｍｏｌ／Ｌスクロース／１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジン水溶液を調製した。この透析液を用いて室温にて透析を行い、薬物ローディング液の外水相に存在する未封入のゲムシタビン塩酸塩と各溶質を除去し、透析液で外水相を置換し、ドキソルビシンを封入したリポソーム組成物を完成した。
【００９５】
実施例２
ａ）油相の調製におけるＤＭＰＥ-ＰＥＧ２０００（成分Ａ）を、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００（成分Ａ）に変更した以外は実施例１同様にして、ドキソルビシンを内包したリポソーム組成物を得た。
【００９６】
比較例１
ａ）油相の調製におけるＤＭＰＥ-ＰＥＧ２０００（成分Ａ）及びＤＳＰＡ（成分Ｂ）を添加せず、ＨＳＰＣ（成分Ｃ）、コレステロール、ＤＳＰＥ-ＰＥＧ２０００を５５／４０／５のモル比となるように混合した以外は実施例１と同様にして、ドキソルビシンを内包したリポソーム組成物を得た。
【００９７】
比較例２
ＨＳＰＣ（成分Ｃ）、コレステロール、ＤＳＰＥ-ＰＥＧ２０００を５９／４０／１のモル比となるように混合した以外は比較例１と同様にして、ドキソルビシンを内包したリポソーム組成物を得た。
【００９８】
比較例３
ＨＳＰＣ（成分Ｃ）、コレステロール、ＤＳＰＥ-ＰＥＧ２０００に加え、ＤＭＰＣを４１／４０／５／１４のモル比となるように混合した以外は比較例１と同様にして、ドキソルビシンを内包したリポソーム組成物を得た。
【００９９】
比較例４
ａ）油相の調製におけるＤＳＰＡ（成分Ｂ）を添加せず、ＤＭＰＥ-ＰＥＧ２０００（成分Ａ）、ＨＳＰＣ（成分Ｃ）、コレステロールを５／５５／４０のモル比となるように混合した以外は実施例１と同様にして、ドキソルビシンを内包したリポソーム組成物を得た。
【０１００】
＜平均粒子径の測定＞
平均粒子径は、試料を超純水で１０倍体積に希釈し、Ｆ−ＰＡＲ（大塚電子社製)を用い、動的光散乱法で体積平均粒子径を測定した。結果を表１に示す。
【０１０１】
【表１】
2020079303.tif 000002
【０１０２】
＜血中動態の評価１＞
６週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに飽食条件下で、ドキソルビシン塩酸塩の９．４質量％スクロース水溶液（ドキソルビシン溶液とも称する）（０．９ｍｇ／ｍｌ）、あるいは実施例１、実施例２、比較例１又は比較例３のリポソーム組成物を薬物量として９ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した。ドキソルビシン溶液は投与後５分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、実施例１、実施例２、比較例１及び比較例３のリポソームは投与後５分、１時間、３時間又は４時間、８時間で採血し、遠心分離を施し血漿中のドキソルビシン濃度を定量した。結果を図１に示す。また、実施例１を除く上記血漿サンプルを限外ろ過し、リポソームから放出された血漿中のドキソルビシン濃度を定量した。結果を図２に示す。
【０１０３】
図１の結果より、ドキソルビシンに対し大幅に血中滞留が長くなっているが、比較例１に対して実施例１、実施例２及び比較例３は血中からの薬物消失が速いリポソーム組成物であることが分かる。図２の結果より、投与初期のリポソームからの血中への漏出が、実施例２、比較例１で抑制できているのに対し、比較例３は投与初期にドキソルビシンのリポソームから血中への漏出量が多いことが分かる。
【０１０４】
＜血中動態の評価２＞
６週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに飽食条件下で比較例１、比較例２のリポソーム組成物を、薬物量として４ｍｇ／ｋｇ静脈注射により投与した。投与後５分、４時間、２４時間、７２時間で採血し、遠心分離を施し血漿中のドキソルビシン濃度を定量した。結果を図３に示す。
この結果より、比較例１に対して比較例２は血中からの薬物消失が速いリポソーム組成物であることが分かる。
【０１０５】
＜血中動態の評価３＞
６週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに飽食条件下で比較例１、比較例４のリポソーム組成物を、薬物量として４ｍｇ／ｋｇ静脈注射により投与した。投与後５分、４時間、２４時間、７２時間で採血し、遠心分離を施し血漿中のドキソルビシン濃度を定量した。結果を図４に示す。
この結果より、比較例１に対して比較例４は血中からの薬物消失が速いリポソーム組成物であることが分かる。
【０１０６】
＜薬効試験１＞
ヒト結腸線癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞をＢＡＬＢ/Ｃヌードマウスの皮下に移植し皮下腫瘍を形成させた。移植後１１日目からドキソルビシン塩酸塩の９．４質量％スクロース水溶液（０．４ｍｇ／ｍｌ）、実施例１及び比較例１のリポソーム組成物（４ｍｇ／ｋｇ／週）並びに溶媒参照（９．４質量％スクロース水溶液）を投与開始した。リポソーム組成物及び溶媒参照を静脈投与して、１週間１回を１クール、合計３クール実施した。腫瘍体積をノギスで測定し、皮下腫瘍の抑制効果について評価した。結果を図５に示す。
この結果より、実施例１と比較例１のリポソーム組成物は、ドキソルビシン塩酸塩を投与した場合に比べ同等の高い薬効を示すことが分かる。
【０１０７】
＜薬効試験２＞
ヒト結腸線癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞をＢＡＬＢ/Ｃヌードマウスの皮下に移植し皮下腫瘍を形成させた。移植後１１日目から比較例１及び比較例２のリポソーム組成物（４ｍｇ／ｋｇ／週）並びに溶媒参照（９．４質量％スクロース水溶液）を投与開始した。リポソーム組成物及び溶媒参照を静脈投与して、１週間１回を１クール、合計３クール実施した。腫瘍体積をノギスで測定し、皮下腫瘍の抑制効果について評価した。結果を図６に示す。
この結果より、比較例２のリポソーム組成物は、比較例１を投与した場合に比べ薬効が減弱することが分かる。
【０１０８】
＜薬効試験３＞
ヒト結腸線癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞をＢＡＬＢ/Ｃヌードマウスの皮下に移植し皮下腫瘍を形成させた。移植後１４日目から比較例１及び比較例４のリポソーム組成物（４ｍｇ／ｋｇ／週）並びに溶媒参照（９．４質量％スクロース水溶液）を投与開始した。リポソーム組成物及び溶媒参照を静脈投与して、１週間１回を１クール、合計３クール実施した。腫瘍体積をノギスで測定し、皮下腫瘍の抑制効果について評価した。結果を図７に示す。
この結果より、比較例１と比較例４のリポソーム組成物は、ドキソルビシン塩酸塩を投与した場合に比べ同等の高い薬効を示すことが分かる。
【０１０９】
＜毒性試験＞
ＢＡＬＢ/Ｃ雌マウスに薬物として投与量９ｍｇ／ｋｇ、週２回６回投与を、実施例１、実施例２、比較例１、比較例２、比較例３、比較例４のリポソーム組成物、並びに溶媒参照（９，４質量％スクロース水溶液）について実施した。手足症候群を評価することを目的に、一般状態観察を実施した。生存状態のマウスについて足の腫れを観察し、腫れの有無を評価した。また、最終投与１週間後に剖検し、皮膚の赤色化の程度を評価した。結果を表２に示す。
【０１１０】
【表２】
2020079303.tif 000003
【０１１１】
＊  足の腫れの発生率（％）＝（四肢の内指１本でも腫れが認められた個体数）／（群全体の個体数）×１００
【０１１２】
＊＊  皮膚赤色化の発生率（％）＝（各スコアの個体数）／（群全体の個体数）×１００
−    直径１ｍｍ以下の赤色点０〜２個又は微細赤色点複数
＋    直径１ｍｍ以上の赤色点１〜２個かつ微細赤色点複数、又は直径５ｍｍ以上の赤色斑
２＋  直径１ｍｍ以上の赤色点３個以上  又は  直径１０ｍｍ以上の赤色斑
３＋  直径１ｍｍ以上赤色点複数  かつ  直径５ｍｍ以上の赤色斑複数
【０１１３】
この結果より、実施例１、実施例２及び比較例２は手足症候群が比較例１に対し低減されていることが分かる。比較例３は、評価中に一般状態の悪化・動物の死亡が認められ、毒性が強い結果となった。比較例４に関しては一部動物の死亡が認められ、手足症候群も憎悪する結果となった。
【０１１４】
＜試験結果まとめ＞
以上試験結果を表３にまとめた。本発明の実施例１、実施例２が強い腫瘍抑制効果を示し、さらに手足症候群を低減し、マウスへの致死的な変化が認められない高い治療指数を持つリポソーム製剤を提供できることが分かった。
比較例２はＰＥＧ修飾量を低減することで、比較例１が示す長すぎる血中滞留性を低減させ、手足症候群を低減するが、投与直後からリポソーム粒子が血中から消失するため腫瘍へ充分な集積がなされず薬効が減じると推定された。
【０１１５】
比較例３は、ＨＳＰＣよりアルキル鎖長が短く融点の低いＤＭＰＣをリポソーム膜に用いることでリポソーム膜の物質透過性を亢進させ、投与直後の漏出性が高くなった。これにより全身臓器へのドキソルビシンの曝露量を増加させ、毒性を憎悪すると推定された。
比較例４はＨＳＰＣより平均アルキル鎖が短いＤＭＰＥ-ＰＥＧ２０００でリポソーム表面をＰＥＧ修飾させた。投与直後はリポソーム粒子の消失もドキソルビシンの放出も比較例１同等に充分に抑制され心毒性を抑えつつも腫瘍への高い集積を達成し、比較例１同等の薬効を示した。この脂質は、血中投与後一定時間経過後にＰＥＧ脂質が脱離し、血中滞留が短くなり、またＰＥＧ脂質が持っていた負電荷も同時に消失し特定の臓器への移行が促進され、手足症候群が悪化したと推定される。
【０１１６】
実施例１及び実施例２は、投与直後はリポソーム粒子の消失もドキソルビシンの放出も比較例１同等に充分に抑制され心毒性を抑えつつも腫瘍への高い集積を達成し、一定の時間経過後に、ＰＥＧ脂質がリポソーム粒子から脱離し、皮膚への集積を抑制し、さらにＰＥＧ脂質が持っていた負電荷の消失も、脱離しない負電荷脂質が持つ電荷により補填され、特定の臓器への移行を抑制し手足症候群を低減できたと推定された。
【０１１７】
【表３】
2020079303.tif 000004
【０１１８】
＊  薬効  Ｔ／Ｃ（％）＝（薬物投与群の試験終了日の腫瘍体積）／（溶媒参照群の試験終了日の腫瘍体積）×１００
＊＊  足の腫れの発生率（％）＝（四肢の内指１本でも腫れが認められた個体数）／（群全体の個体数）×１００
【図１】
2020079303.tif 000005
【図２】
2020079303.tif 000006
【図３】
2020079303.tif 000007
【図４】
2020079303.tif 000008
【図５】
2020079303.tif 000009
【図６】
2020079303.tif 000010
【図７】
2020079303.tif 000011