(57)【要約】【課題】線維化α-SYNの神経細胞間伝播現象を抑制する機序によるパーキンソン病（PD）及びレビー小体（LBD）の疾患修飾療法を提供する。【解決手段】線維化α-SYNと特異的に結合する線維化α-SYN受容体タンパク質を含有する、パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維化α-SYNと特異的に結合する線維化α-SYN受容体タンパク質を含有する、パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤。
【請求項２】
前記線維化α-SYN受容体タンパク質が、以下の（i）〜（iv）のいずれかである請求項１に記載の治療剤。
（i）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質
（ii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９５％以上同一の配列を有するタンパク質
（iii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列に対して１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているタンパク質
（iv）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片
【請求項３】
以下の（i）〜（iv）のいずれかの線維化α-SYN受容体タンパク質を含有する、パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤。
（i）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質
（ii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９５％以上同一の配列を有するタンパク質
（iii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列に対して１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているタンパク質
（iv）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片
【請求項４】
配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質又はその断片に特異的に結合する抗体を含有する、パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤。
【請求項５】
線維化α-SYNと線維化α-SYN受容体タンパク質との特異的結合を阻害する物質を含有する、パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤。
【請求項６】
前記線維化α-SYN受容体タンパク質が、以下の（i）〜（iv）のいずれかである請求項５に記載の治療剤。
（i）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質
（ii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９５％以上同一の配列を有するタンパク質
（iii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列に対して１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているタンパク質
（iv）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片
【請求項７】
パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤のスクリーニング方法であって、
線維化α-SYNを、脳由来の膜タンパクライブラリーと接触させる工程と、
線維化α-SYNと特異的に結合するタンパク質を選択する工程と、
前記選択されたタンパク質のうち、細胞膜に局在し、細胞膜貫通ドメインを有し、細胞膜表面に発現する受容体タンパク質を、パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤の候補として選択する工程と
を含むスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤及びそのスクリーニング方法に関し、より詳細には、線維化マウスアルファシヌクレイン(alpha-synuclein, α-SYN)に結合する膜タンパク質の網羅的スクリーニング方法と、かかるスクリーニング方法により同定されたタンパク質を含有するパーキンソン病又はレビー小体病の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（Parkinson’s disease, PD）及びレビー小体病（Lewy body disease, LBD）は、線維化α-SYNを主要構成成分とする神経細胞内封入体であるレビー小体（Lewy body, LB）の出現と、脳幹に位置する青斑核・黒質などにおけるカテコラミン産生細胞の脱落を特徴とする神経変性疾患である。PD及びLBDにおける神経変性機構に関しては、ミスフォールドしたα-SYNの一形態である線維化α-SYNの毒性が繰り返し論じられてきた。さらに近年、線維化α-SYNが神経細胞間を伝播することで病期が進行する、いわゆるプリオノイド仮説が注目されている（図1）。この仮説ではα-SYN受容体の存在がα-SYNの取り込みを促進させると考えられているが、同仮説の背景にあるα-SYNの細胞間伝播機構のメカニズムに関してはいまだ不明な点が多い（非特許文献1）。2016年に神経・グリア細胞表面に局在し、α-SYN受容体として機能する可能性のある分子LAG3の存在が海外から報告されたが（非特許文献2）、哺乳動物の脳組織を出発材料とした線維化α-SYN受容体の網羅的探索はいまだ行われていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Tohoku J Exp Med 2017;242:63-76
【非特許文献２】Science 2016;353:aah3374
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
線維化α-SYNの神経細胞間伝播現象に直接関与する線維化α-SYN受容体タンパク質の網羅的探索（スクリーニング）及び同定が望まれているが、その探索には幾つかの障壁が存在する。例えば、線維化α-SYNは生体膜そのものと非特異的に結合しやすいという特徴を有しており、この問題を克服する上で既存の方法には限界があった。
【０００５】
本発明の課題は、特異性の高い線維化α-SYN受容体タンパク質のスクリーニングと、かかるスクリーニングにより同定された線維化α-SYN受容体タンパク質を有効成分として含有するパーキンソン病又はレビー小体病の治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、細胞外α-SYNが神経細胞へ取り込まれる際にα-SYN受容体として機能する膜タンパクの網羅的探索において、生体膜への結合などに由来する非特異的影響を低減し、より信頼性の高い手法を確立し、本発明を完成させるに到った。
【０００７】
本発明は以下の通りである。
項１．線維化α-SYNと特異的に結合する線維化α-SYN受容体タンパク質を含有する、パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤。
項２．前記線維化α-SYN受容体タンパク質が、以下の（i）〜（iv）のいずれかである項１に記載の治療剤。
（i）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質
（ii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９５％以上同一の配列を有するタンパク質
（iii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列に対して１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているタンパク質
（iv）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片
項３．以下の（i）〜（iv）のいずれかの線維化α-SYN受容体タンパク質を含有する、パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤。
（i）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質
（ii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９５％以上同一の配列を有するタンパク質
（iii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列に対して１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているタンパク質
（iv）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片
項４．配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質又はその断片に特異的に結合する抗体を含有する、パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤。
項５．線維化α-SYNと線維化α-SYN受容体タンパク質との特異的結合を阻害する物質を含有する、パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤。
項６．前記線維化α-SYN受容体タンパク質が、以下の（i）〜（iv）のいずれかである項５に記載の治療剤。
（i）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質
（ii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９５％以上同一の配列を有するタンパク質
（iii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列に対して１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているタンパク質
（iv）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片
項７．パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤のスクリーニング方法であって、
線維化α-SYNを、脳由来の膜タンパクライブラリーと接触させる工程と、
線維化α-SYNと特異的に結合するタンパク質を選択する工程と、
前記選択されたタンパク質のうち、細胞膜に局在し、細胞膜貫通ドメインを有し、細胞膜表面に発現する受容体タンパク質を、パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤の候補として選択する工程と
を含むスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、哺乳動物の脳組織における線維化α-SYN受容体候補タンパクの網羅的スクリーニング方法を提供することができる。さらに、神経細胞表面の線維化α-SYN受容体分子が同定されることで、細胞間伝播現象の一端が明らかにされるとともに、同分子をターゲットとした伝播阻害治療薬の開発が期待される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】α-SYN受容体を介した細胞間伝播現象（プリオノイド仮説）。
【図２】α-SYNの透過型電子顕微鏡像。（A）単量体α-SYN、（B）線維化α-SYN。
【図３】膜タンパク質ライブラリーの作成。
【図４】MEMBRANE PROTEIN LIBRARY（登録商標）上のα-SYN受容体候補タンパク質。
【図５】BLTOCHIP（登録商標）-MS法の解析手順。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明において扱われているα-SYNに関して概説する。α-SYNは、140アミノ酸残基より構成される神経系タンパクである（NCBI Reference Sequence: ヒト NP_000336, マウス NP_033247）。構造的には両親和性を有しα-らせん構造をとるアミノ末端、中央部の疎水性に富み線維化に関与するドメイン（non-amyloid-β componentと称される）、およびプロリンに富み陰性に荷電したカルボキシル末端の3個の機能的ドメインから構成される。α-SYNは主にシナプス前終末に存在し、シナプス可塑性をはじめとして複数の生理的機能が報告されている。α-SYN をコードするSNCA遺伝子変異（点変異、遺伝子重複）は家族性PDを発症させることが知られている。物理化学的ストレスや遺伝子変異により、α-SYNは重合・線維化物を形成し細胞毒性を発揮することが知られている。リコンビナントタンパクとして人工的に精製したα-SYNは、生体内と同様、主に単量体として存在するが、振盪を加えることで容易に凝集し、患者脳内のLBにて観察される線維化α-SYNと類似した構造に変化する（図2A,B）。本発明においては、この単量体及び線維化物の両形態のα-SYNをリガンドとして用いた。
【００１１】
次に、本発明者らが以前に開発した膜タンパク質ライブラリー（Membrane Protein Library（登録商標））に加えてマトリックス支援レーザー脱離イオン化法と飛行時間型質量分析法とを組み合わせて用いた解析法（MALDI-TOF-MS法）の流れを図解する。まず、マウス脳を懸濁し膜画分を抽出後に人工リポソームと混合・調整することでMEMBRANE PROTEIN LIBRARY（登録商標）を作成する（図3）。
【００１２】
理論上、膜タンパク一分子が配置するように限界希釈されたMEMBRANE PROTEIN LIBRARY（登録商標）に、リガンドとして単量体α-SYN又は線維化α-SYNを混合し、α-SYNと受容体候補タンパクとの結合を促す（図4）。なお、生理的に存在する単量体α- SYNをコントロールとして、毒性が確認された病的意義を持つ線維化α-SYNと特異的に結合するタンパク質を、α-SYN受容体候補タンパク質として選択する。
【００１３】
この後、発明者が以前に開発した測定板(BLOTCHIP（登録商標）)を用いたMALDI-TOF-MS法であるBLOTCHIP（登録商標）-MS法によりα-SYN受容体候補タンパク質の同定を行う（図5）。BLOTCHIP（登録商標）-MS法によるタンパク質の同定については再表2004/031759、特開2007-332120等を参照されたい。  さらに、上記の網羅的スクリーニングにより同定された線維化α-SYN受容体候補タンパクの発現を、培養細胞系において上昇又は抑制させることで、線維化α-SYNの取り込みに与える影響を評価した。併せて、共免疫沈降法により線維化α-SYN受容体候補タンパクと線維化α-SYNとの会合を検証した。網羅的スクリーニングと培養細胞系における検証実験により絞り込まれた膜タンパクを、真の線維化α-SYN受容体タンパクと判定した。本明細書において、線維化α-SYN受容体タンパク質とは、線維化α-SYNと特異的に結合する受容体タンパク質を指す。
【００１４】
よって、本発明は以下の技術を包含する。
【００１５】
本発明の第１の態様によれば、線維化α-SYNと特異的に結合する線維化α-SYN受容体タンパク質を含有する、パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤が提供される。線維化α-SYNと特異的に結合する線維化α-SYN受容体タンパク質は有効成分としてパーキンソン病又はレビー小体病の治療のために作用する。
【００１６】
上記線維化α-SYN受容体タンパク質は好ましくは、以下の（i）〜（iv）のいずれかである。
【００１７】
（i）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質
（ii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９５％以上同一の配列を有するタンパク質
（iii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列に対して１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているタンパク質
（iv）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片
配列番号１、２、３はそれぞれニューロトリミン（Neurotorimin, NTM）のヒト、マウス、及びアカゲザルの部分配列である。配列番号１のアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列の同一性は９８．１％であり、配列番号１のアミノ酸配列と配列番号３のアミノ酸配列の同一性は９７．６％である。
【００１８】
配列番号４、５、６はそれぞれコンタクチン関連タンパク質２（Contactin-associated protein-like 2, CONTNAP2）のヒト、マウス、及びアカゲザルの部分配列である。配列番号４のアミノ酸配列と配列番号５のアミノ酸配列の同一性は９３．８％であり、配列番号４のアミノ酸配列と配列番号６のアミノ酸配列の同一性は９８．６％である。
【００１９】
配列番号７、８、９はそれぞれ高移動度グループタンパク質（High mobility group protein B1, HMGB1）のヒト、マウス、及びアカゲザルの部分配列である。配列番号７のアミノ酸配列と配列番号８のアミノ酸配列の同一性は９９．１％であり、配列番号７のアミノ酸配列と配列番号９のアミノ酸配列の同一性は１００％である。
【００２０】
配列番号１０、１１、１２はそれぞれDIP2A タンパク質２ホモログA(Disco-interacting protein 2 homolog A, DIP2A)のヒト、マウス、及びアカゲザルの部分配列である。配列番号１０のアミノ酸配列と配列番号１１のアミノ酸配列の同一性は４５．０％であり、配列番号１０のアミノ酸配列と配列番号１２のアミノ酸配列の同一性は９８．１％である。
【００２１】
配列番号１３、１４、１５はそれぞれソルチリン（Sortilin）のヒト、マウス、及びアカゲザルの部分配列である。配列番号１３のアミノ酸配列と配列番号１４のアミノ酸配列の同一性は９０．１％であり、配列番号１３のアミノ酸配列と配列番号１５のアミノ酸配列の同一性は９８．９％である。
【００２２】
上記（ii）において、線維化α-SYN受容体タンパク質は好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９８％以上同一の配列を有するタンパク質であり、より好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９９％以上同一の配列を有するタンパク質である。
【００２３】
上記（iv）において、配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片は、パーキンソン病又はレビー小体病の治療効果を有する。配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片は、好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の連続する少なくとも５０個のアミノ酸配列を有する断片であり、より好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の連続する少なくとも１００個のアミノ酸配列を有する断片であり、さらにより好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の連続する１５０個のアミノ酸配列を有する断片である。
【００２４】
好ましい一つの実施形態では、上記線維化α-SYN受容体タンパク質は、配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００２５】
本発明の第２の態様によれば、以下の（i）〜（iv）のいずれかの線維化α-SYN受容体タンパク質を含有するパーキンソン病又はレビー小体病の治療剤が提供される。
【００２６】
（i）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質
（ii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９５％以上同一の配列を有するタンパク質
（iii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列に対して１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているタンパク質
（iv）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片
上記（ii）において、線維化α-SYN受容体タンパク質は好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９８％以上同一の配列を有するタンパク質であり、より好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９９％以上同一の配列を有するタンパク質である。
【００２７】
上記（iv）において、配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片は、パーキンソン病又はレビー小体病の治療効果を有する。配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片は、好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の連続する少なくとも５０個のアミノ酸配列を有する断片であり、より好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の連続する少なくとも１００個のアミノ酸配列を有する断片であり、さらにより好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の連続する１５０個のアミノ酸配列を有する断片である。
【００２８】
好ましい一つの実施形態では、上記パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤は、配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質を含有するパーキンソン病又はレビー小体病の治療剤である。
【００２９】
本発明の第３の態様によれば、配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質又はその断片に特異的に結合する抗体を含有するパーキンソン病又はレビー小体病の治療剤が提供される。抗体により特異的に結合されるアミノ酸配列の配列の長さは、配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の連続する少なくとも５個のアミノ酸であり、より好ましくは連続する少なくとも８個のアミノ酸である。
【００３０】
かかる抗体は免疫分野の周知技術により作製することができ、例えば、マウス等の動物に配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質を抗原として免疫することにより作製することもできるし、あるいは、ファージライブラリー等の抗体ライブラリーのスクリーニング等により作製することができる。
【００３１】
本発明の第４の態様によれば、線維化α-SYNと線維化α-SYN受容体タンパク質との特異的結合を阻害する物質を含有する、パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤が提供される。
【００３２】
好ましい一つの実施形態では、線維化α-SYN受容体タンパク質は、以下の（i）〜（iv）のいずれかのタンパク質である。
【００３３】
（i）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質
（ii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９５％以上同一の配列を有するタンパク質
（iii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列に対して１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているタンパク質
（iv）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片
上記（ii）において、線維化α-SYN受容体タンパク質は好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９８％以上同一の配列を有するタンパク質であり、より好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９９％以上同一の配列を有するタンパク質である。
【００３４】
上記（iv）において、配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片は、パーキンソン病又はレビー小体病の治療効果を有する。配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片は、好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の連続する少なくとも５０個のアミノ酸配列を有する断片であり、より好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の連続する少なくとも１００個のアミノ酸配列を有する断片であり、さらにより好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の連続する１５０個のアミノ酸配列を有する断片である。
【００３５】
好ましい別の実施形態では、線維化α-SYN受容体タンパク質は、配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００３６】
好ましい別の実施形態では、上記線維化α-SYN受容体タンパク質は、配列番号１、４、７、１０、及び１３のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００３７】
線維化α-SYNと線維化α-SYN受容体タンパク質との結合を抑制することは、線維化α-SYNの神経細胞間伝播を阻害し、脳内病理の進展抑制につながる。従って、線維化α-SYN受容体タンパク質のアミノ酸配列に対する特異的結合能をもつ化合物は、パーキンソン病又はレビー小体病の疾患修飾薬となる可能性があり、その例として受容体タンパクを認識する抗体、抗体断片、およびアプタマー等が挙げられる。特異抗体は、マウス等の宿主動物に候補タンパクを抗原として免疫することや、λファージ等の抗体ライブラリーのスクリーニング等により作製することが可能である。また、抗体断片としては、Fv、Fab、scFv等が挙げられる。アプタマーとは、特定の分子と特異的に結合する核酸分子やペプチド等である。核酸アプタマーは、Systematic evolution of ligands by exponential enrichment法等により選別することができる。ペプチドアプタマーは、酵母を用いたTwo-hybrid法等により選別可能である。
【００３８】
本発明の第５の態様によれば、線維化α-SYNと線維化α-SYN受容体タンパク質との特異的結合を阻害する物質を含有する、パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤が提供される。
【００３９】
好ましい一つの実施形態では、上記線維化α-SYN受容体タンパク質は以下の（i）〜（iv）のいずれかのタンパク質である。
【００４０】
（i）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質
（ii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９５％以上同一の配列を有するタンパク質
（iii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列に対して１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているタンパク質
（iv）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片
上記（ii）において、線維化α-SYN受容体タンパク質は好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９８％以上同一の配列を有するタンパク質であり、より好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９９％以上同一の配列を有するタンパク質である。
【００４１】
上記（iv）において、配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片は、パーキンソン病又はレビー小体病の治療効果を有する。配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片は、好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の連続する少なくとも５０個のアミノ酸配列を有する断片であり、より好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の連続する少なくとも１００個のアミノ酸配列を有する断片であり、さらにより好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の連続する１５０個のアミノ酸配列を有する断片である。
【００４２】
好ましい別の実施形態では、上記線維化α-SYN受容体タンパク質は、配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００４３】
線維化α-SYNと線維化α-SYN受容体タンパク質との特異的結合が阻害されているか否かは、線維化α-SYNと線維化α-SYN受容体タンパク質とを発現する培養細胞に、該阻害物質を投与することで確認することもできるし、線維化α-SYN又は線維化α-SYN受容体タンパク質のうちの一方を発現する培養細胞に、線維化α-SYN又は線維化α-SYN受容体タンパク質のうちの他方と、該阻害物質を投与することで確認することもできる。
【００４４】
本発明の第６の態様によれば、パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤のスクリーニング方法であって、線維化α-SYNを、脳由来の膜タンパクライブラリーと接触させる工程と、線維化α-SYNと特異的に結合するタンパク質を選択する工程と、該選択されたタンパク質のうち、細胞膜に局在し、細胞膜貫通ドメインを有し、細胞膜表面に発現する受容体タンパク質を、パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤の候補として選択する工程とを含むスクリーニング方法が提供される。
【００４５】
本発明の第７の態様によれば、脳におけるレビー小体又はα−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下及び非存在下で、線維化α-SYNと、線維化α-SYNに特異的に結合する線維化α-SYN受容体タンパク質とを接触させる工程と、前記被検物質の存在下及び非存在下における線維化α-SYNと線維化α-SYN受容体タンパク質との結合量を定量する工程と、前記被検物質の存在下における線維化α-SYNと線維化α-SYN受容体タンパク質との結合量が、前記被検物質の非存在下における線維化α-SYNと線維化α-SYN受容体タンパク質と比較して変化した場合に、前記被検物質をパーキンソン病又はレビー小体病の治療剤の治療剤であると判定する工程と、を含むスクリーニング方法が提供される。
【００４６】
上記の第６及び第７の態様において、好ましい一つの実施形態では、上記線維化α-SYN受容体タンパク質は以下の（i）〜（iv）のいずれかのタンパク質である。
【００４７】
（i）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質
（ii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９５％以上同一の配列を有するタンパク質
（iii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列に対して１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているタンパク質
（iv）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片
上記（ii）において、線維化α-SYN受容体タンパク質は好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９８％以上同一の配列を有するタンパク質であり、より好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９９％以上同一の配列を有するタンパク質である。
【００４８】
上記（iv）において、配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片は、パーキンソン病又はレビー小体病の治療効果を有する。配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片は、好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の連続する少なくとも５０個のアミノ酸配列を有する断片であり、より好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の連続する少なくとも１００個のアミノ酸配列を有する断片であり、さらにより好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の連続する１５０個のアミノ酸配列を有する断片である。
【００４９】
好ましい別の実施形態では、上記線維化α-SYN受容体タンパク質は、配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００５０】
上記の第１〜第７の態様において、線維化α-SYNは哺乳動物の線維化α-SYNであり、好ましくはマウス又はヒトの線維化α-SYNであり、より好ましくはヒト線維化α-SYNである。
【００５１】
上記第１〜７の態様において、パーキンソン病又はレビー小体病の治療剤は単剤であってもよいし、他の成分を含有する医薬組成物であってもよい。医薬組成物の場合、有効成分としての、線維化α-SYN受容体タンパク質、該線維化α-SYN受容体タンパク質に対する抗体、又は線維化α-SYNと、線維化α-SYN受容体タンパク質との特異的結合を阻害する物質を、適宜の薬学的に許容され得る担体である賦形剤（デンプン、乳糖、白糖、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等）、結合剤（デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等）、滑沢剤（ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等）、崩壊剤（カルボキシメチルセルロースカルシウム、タルク等）、希釈剤（注射用水、生理食塩水等）、添加剤（安定剤、保存剤、着色剤、香料、溶解補助剤、乳化剤、緩衝剤、等張化剤等）等と常法により混合し、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤などの固形剤又は注射剤などの液剤の形態で投与することができる。
【００５２】
本発明の第８の態様によれば、線維化α-SYNと特異的に結合する線維化α-SYN受容体タンパク質を、哺乳動物に投与する工程を含む、パーキンソン病又はレビー小体病の治療方法が提供される。
【００５３】
好ましい一つの実施形態では、上記線維化α-SYN受容体タンパク質は以下の（i）〜（iv）のいずれかのタンパク質である。
【００５４】
（i）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質
（ii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９５％以上同一の配列を有するタンパク質
（iii）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列に対して１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されているタンパク質
（iv）配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片
上記（ii）において、線維化α-SYN受容体タンパク質は好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９８％以上同一の配列を有するタンパク質であり、より好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列と９９％以上同一の配列を有するタンパク質である。
【００５５】
上記（iv）において、配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片は、パーキンソン病又はレビー小体病の治療効果を有する。配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の断片は、好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の連続する少なくとも５０個のアミノ酸配列を有する断片であり、より好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の連続する少なくとも１００個のアミノ酸配列を有する断片であり、さらにより好ましくは配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列の連続する１５０個のアミノ酸配列を有する断片である。
【００５６】
好ましい別の実施形態では、上記線維化α-SYN受容体タンパク質は、配列番号１〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００５７】
哺乳動物は特に限定されず、好ましくはヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ等が挙げられ、より好ましくはマウス、サル又はヒトであり、さらに好ましくはヒトである。
【実施例】
【００５８】
次に実施例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実験例１．線維化α-SYNと特異的に結合するマウス脳由来膜タンパクの網羅的スクリーニング
（１）MEMBRANE PROTEIN LIBRARY（登録商標）の調製（Sci Rep 2018;8:17865）
以下の方法によりマウス全脳から膜タンパクを可溶化・抽出した。マウス脳2 gをリン酸ナトリウムバッファー（10mM、pH 7.4）10 mLに入れて磨砕・懸濁した後、遠心分離（2,500 rpm）を5分間行った。回収した上清を40 %スクロース水溶液12 mLに重層し、遠心分離（95,000 rpm）を１時間行い、2層に分かれた液体の界面に存在する膜タンパクを含む溶液を回収した。抽出した膜タンパク50 mgに対して塩酸トリスバッファー（10 mM、pH 7.4）5mLを添加し、超音波処理（INSONATOR 201M、KUBOTA）を施した。また、リポソームを作成した。クロロホルム10 mLに精製卵黄レシチン1 g、コレステロール0.2 gを溶解し、室温で真空乾燥した。次に、トリス塩酸バッファー（10 mM、pH 7.4）10 mLを添加して再構成した後、激しく撹拌することでリポソーム懸濁液とした。
【００５９】
超音波処理後の膜タンパク質とリポソーム懸濁液とを混合し、膜融合させた後に、凍結融解と超音波処理を行い、膜タンパクが埋め込まれたリポソームを得た。最後に、ポアサイズ200nmのポリカーボネート膜（Nucleopore、Whatman）を通過させ、マウス全脳由来膜タンパクライブラリーとした。
【００６０】
（２）MEMBRANE PROTEIN LIBRARY（登録商標）を用いたα-SYN受容体候補タンパクのスクリーニング
NHS−セファロースに固定した単量体α-SYN（リガンド1）及び線維化α-SYN（リガンド2）を用いてMEMBRANE PROTEIN LIBRARY（登録商標）をスクリーニングすることで、これらリガンドと結合する膜タンパクの単離を試みた。具体的には、上述したリガンド1、又はリガンド2をMEMBRANE PROTEIN LIBRARY（登録商標）と反応させ、結合した膜タンパクをアフィニティー精製した。コントロール（対照）としては、NHS−セファロース単体を用いた。最後に、精製物をBLOTCIHP（登録商標）-MSにより解析した。
【００６１】
リガンド1又はリガンド2に結合する膜タンパク質3338個の中で、リガンド1/リガンド2結合比 > 1.2の条件を満たした候補タンパクは87個であった。さらに細胞膜への局在や、細胞膜貫通ドメインを有するなど細胞膜表面に発現し受容体タンパクとしての必要条件を満たしたものを取捨選択した結果、表1に示した5つが残った。これら5つの膜タンパクは、線維化α-SYNと特異的な結合を示す受容体候補分子となり得る。5つの膜タンパクのアミノ酸配列を解析したところ、配列番号２、５、８、１１、１４のアミノ酸配列を有していた。
【００６２】
【表１】
2020172452.tif 000002
【００６３】
上記のマウスの配列番号２、５、８、１１、１４のアミノ酸配列に対して相同なアミノ酸配列を公共のタンパク質配列データベースを用いてヒト及びアカゲザルで検索したところ、ヒトでは配列番号１、４、７、１０、１３のアミノ酸配列を有するタンパク質、アカゲザルでは配列番号３、６、９、１２、１５のアミノ酸配列を有するタンパク質が同定された。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明によれば、神経細胞間伝播現象を抑制する機序によるPD及びLBDの疾患修飾療法を提供することができる可能性がある。
【図１】
2020172452.tif 000003
【図２】
2020172452.tif 000004
【図３】
2020172452.tif 000005
【図４】
2020172452.tif 000006
【図５】
2020172452.tif 000007
【配列表】
2020172452000001.app