(57)【要約】【課題】酪酸菌を増殖させるプレバイオティクスを提供する。【解決手段】以下の食品素材群から選択される一種以上を含有する、酪酸菌用プレバイオティクス組成物。（食品素材：ごま、アーモンド、抹茶、プルーン、キウイ、ケール、アボカド、にんじん、純ココア、おから）【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の食品素材群から選択される一種以上を含有する、酪酸菌用プレバイオティクス組成物。
（食品素材：ごま、アーモンド、抹茶、プルーン、キウイ、ケール、アボカド、にんじん、純ココア、おから）
【請求項２】
前記食品素材を組成物全体の０．１質量％以上含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記酪酸菌が、フィーカリバクテリウム属細菌及び／又はゲンミゲル属細菌である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
飲食品である、請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
医薬品である、請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酪酸菌用プレバイオティクス組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、腸内細菌と健康との関連性に注目が集まり、世界中で研究が行われている。腸内環境改善に関連する用語として知られる「プロバイオティクス」は、一般に腸内フローラのバランスを改善することにより人に有益な作用をもたらす生きた微生物を指し、ビフィズス菌等が一般的に知られている。また、かかるプロバイオティクスが資化するものとして「プレバイオティクス」があり、これは、消化管上部で分解・吸収されず、大腸に共生する有益な細菌の選択的な栄養源となりそれらの増殖を促進し、大腸の腸内フローラ構成を健康的なバランスに改善し維持し、ヒトの健康の増進維持に役立つものを一般に意味する。
【０００３】
大腸に共生する有益な細菌のひとつとして、酪酸菌がある。酪酸は、腸内に存在する短鎖脂肪酸のひとつであり、大腸細胞にエネルギーを提供する主要な栄養素としてだけでなく、宿主の遺伝子発現、細胞分化、腸組織発生、免疫調節、酸化ストレス低下、及び下痢コントロールなど、腸内のみならず種々の機能を調節する細胞メディエーターである（非特許文献１）。
健康のために酪酸を体内に取り込むことは有用であるが、酪酸は非常に強い不快臭を放つため、食品や医薬品等の形態で摂取することは現実的ではない。また、腸内に生息する主な酪酸菌は、酸素感受性が極端に高いためにｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養が非常に困難で
あり、酪酸菌を製剤化して摂取することも難しい（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Cell. 2016 Jun 2;165(6):1332-1345
【非特許文献２】Best. Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2017 Dec;31(6):643-648.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
かかる状況に鑑み、本発明者らは腸内に生息する酪酸菌を増殖させることが健康の維持・向上のために有用であると考えた。したがって、本発明は、酪酸菌を増殖させるプレバイオティクスを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、特定の食品素材が、腸内で酪酸菌を著しく増殖させることができることを見出し、これを酪酸菌用のプレバイオティクスの有効成分とすることに想到し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の食品素材群から選択される一種以上を含有する、酪酸菌用プレバイオティクス組成物である。
（食品素材：ごま、アーモンド、抹茶、プルーン、キウイ、ケール、アボカド、にんじん、純ココア、おから）
好ましくは、前記酪酸菌は、フィーカリバクテリウム属細菌及び／又はゲンミゲル属細菌である。
好ましい態様において、本発明の組成物は食品素材を組成物全体の０．１質量％以上含
有する。
本発明の組成物は、好ましくは飲食品である。
また、本発明の組成物は、好ましくは医薬品である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、腸内で酪酸菌を効率的に増殖させることができるプレバイオティクスが提供される。酪酸菌が産生する酪酸は、細胞メディエーターとして機能し健康を維持向上させるため、本発明は産業上非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】試料を添加して腸内細菌を中和培養した後の、酪酸菌（フィーカリバクテリウム・プラスニッチ）の腸内細菌全体に占める割合を示すグラフ（ｎ＝６）。
【図２】試料を添加して腸内細菌を中和培養した後の酪酸濃度を示すグラフ（ｎ＝６）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
次に、本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。
【００１１】
本発明の組成物は、ごま、アーモンド、抹茶、プルーン、キウイ、ケール、アボカド、にんじん、純ココア、及びおからからなる食品素材群から選択される一種以上を含有する。これらのうち１種類でもよいし、２種以上を任意に組み合わせてもよい。
ごま、アーモンド、プルーン、キウイ、アボカドについては、通常は果実部をいう。ケールは、植物体全体でもよいが、葉部が好ましい。にんじんは、植物体全体でもよいが、根部が好ましい。おからは、大豆から豆乳を絞った後の残渣である。
【００１２】
前記食品素材は、生の態様、加熱された態様、凍結された態様のいずれでもよく限定されない。
また、前記食品素材は、その破砕物、抽出物、又は抽出物の画分、精製した画分、又はそれらの溶媒除去物であってもよい。
【００１３】
前記抽出物の場合、抽出の形態は有機溶媒及び／又は水性溶媒による抽出、超臨界抽出等とくに限定されない。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示することができる。
具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物を予め粉砕あるいは細切したもの１質量部に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却し後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。
【００１４】
本発明の組成物における前記食品素材の含有量は、組成物の態様により適宜設定すればよく、特に限定されないが、例えば、好ましくは固形物量として、組成物全体の０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上とするのがよい。含有量の上限は特に制限されないが、例えば組成物全体の５質量％以下、又は１００質量％以下であってよい。なお、これらの含有量は、本発明の組成物の製造時の値、流通時の値、及び摂取（投与）時の値を含む。
【００１５】
本発明の組成物は、酪酸菌用プレバイオティクスとして用いられる。すなわち、腸内の酪酸菌により資化されその増殖を促進させることができる。
【００１６】
なお、酪酸菌とは、酪酸を産生する細菌の総称である。本発明における酪酸菌は、特に限定されないが、例えばフィーカリバクテリウム属、コプロコッカス属、クロストリジウム属、ユーバクテリウム属、ゲンミゲル属等に属する細菌が挙げられ、より具体的にはヒト腸内に存在する、フィーカリバクテリウム・プラスニッチ、ゲンミゲル・フォルミシリス等が挙げられる。
【００１７】
なお、腸内で酪酸菌を増殖させることができること、すなわち酪酸菌により資化されることは、佐々木らの方法（Sasaki K. et al., PLoS ONE 12(7): e0180991）や、次の評価方法により確認することができる。
具体的には、試料を含有する培地中で腸内細菌を中和培養する培養工程、及び前記培養工程後の培地中の細菌叢の構成を解析する解析工程を含む方法により評価する。
被験試料（素材）がヒト小腸で通常吸収される糖類を含む場合は、前記培養工程の前に被験試料から分子量６６６．５８以下の糖類を除去する前処理工程を行うことが好ましい。前記前処理工程は、好ましくはエタノール沈殿により行われる。該前処理工程により被験試料（素材）からヒト小腸で通常吸収される糖類、すなわち分子量６６６．５８以下の糖類を予め除き、ヒト小腸で通常吸収されず大腸に到達する糖類を中和培養に供することにより、プレバイオティクスのヒト大腸での酪酸菌への影響を正確に感度よく評価することができる。なお、分子量６６６．５８以下の糖類としては、ニストース、ケストース、シュークロース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース等が挙げられる。
【００１８】
前記中和培養工程は、ｐＨ＞５．５、より好ましくは＞６．０の条件下で行われる。好ましくは、培養を通してｐＨが好ましくは５．５以下にならないように、より好ましくは６．０以下にならないように、炭酸ナトリウム等の適当な中和剤を間欠的に添加する等して制御される。また、中和培養に用いる培地は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース等の小腸で吸収される糖類を実質的に含有しない限りにおいて特に限定されず、例えば糖類を含有しないＹＣＦＡ培地が挙げられる。ここで、実質的に含有しないとは、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）である。
前記試料の培地への添加量としては、培養を妨げない限りにおいて任意に設定でき、例えば０．１〜５％（ｗ／ｖ）とすることができる。
中和培養は、通常は嫌気条件下で行われる。
また、培養時間は、好ましくは１２時間以上、より好ましくは２４時間以上とし、通常は９６時間以下、より好ましくは４８時間以下とする。
【００１９】
解析工程では、培養工程後の培地中の細菌叢の構成を解析する。例えば、シークエンス解析により腸内細菌を同定し、その存在量の割合を算出することにより解析を行う。ここで、培養前後で酪酸菌が増殖し、かつ酪酸菌の割合が通常は１５％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上に維持されている場合に、被験試料は酪酸菌の増殖を促進するプレバイオティクスであると判断される。
【００２０】
本発明の組成物は、体内の酪酸が増加することにより予防又は改善しうる疾患や病態、あるいは体内の酪酸が減少することに起因する疾患や病態の対象者に対して、有用となり得る。例えば、整腸用、免疫調節用、酸化ストレス低減用、又は下痢の予防・改善用、炎症性腸疾患用、大腸がんの予防用等とすることができる。
【００２１】
本発明の別の態様は、酪酸菌用プレバイオティクス組成物の製造における、前記食品素
材の使用である。
本発明の別の態様は、腸内での酪酸菌の増殖における、前記食品素材の使用である。
本発明の別の態様は、腸内で酪酸菌を増殖させるために用いられる、前記食品素材である。
前記食品素材を動物に投与することを含む、腸内で酪酸菌を増殖させ方法である。ここで、動物は、特に限定されないが、通常はヒトである。
【００２２】
本発明の組成物の摂取（投与）時期は、特に限定されず、投与対象の状態に応じて適宜選択することが可能である。
【００２３】
本発明の組成物の摂取（投与）量は、摂取（投与）対象の年齢、性別、状態、その他の条件等により適宜選択される。前述の食品素材の固形物量として、好ましくは０．１〜１０００ｍｇ／日、より好ましくは、１〜１００ｍｇ／日の範囲となる量を目安とするのがよい。
なお、摂取（投与）の量や期間にかかわらず、組成物は１日１回又は複数回に分けて投与することができる。
【００２４】
本発明の組成物の摂取（投与）経路は、経口又は非経口のいずれでもよいが、通常は経口である。また、非経口摂取（投与）としては、直腸投与等が挙げられる。
【００２５】
本発明の組成物は、前述の食品素材とともに、酪酸菌を含有する態様でもよい。また、本発明の組成物は、酪酸菌又は酪酸菌を含有する製剤と併用して摂取されてもよい。かかる態様により、腸内における酪酸菌増殖促進効果、及びそれによる酪酸増加効果がより期待できる。
なお、これらの態様の場合、酪酸菌は生菌であることが好ましい。
【００２６】
本発明の組成物を経口摂取される組成物とする場合は、飲食品の態様とすることが好ましい。
【００２７】
飲食品としては、前述の食品素材の効果を損なわず、経口摂取できるものであれば形態や性状は特に制限されず、前述の食品素材を含有させること以外は、通常飲食品に用いられる原料を用いて通常の方法によって製造することができる。
【００２８】
飲食品としては、液状、ペースト状、ゲル状固体、粉末等の形態を問わず、例えば、錠菓；流動食（経管摂取用栄養食）；パン、マカロニ、スパゲッティ、めん類、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等の小麦粉製品；即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品、その他の即席食品等の即席食品類；農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）等の農産加工品；水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等の水産加工品；畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等の畜産加工品；加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等の乳・乳製品；バター、マーガリン類、植物油等の油脂類；しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等の基礎調味料；調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等の複合調味料・食品類；素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等の冷凍食品；キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、ゼリー、その他の菓子などの菓子類；炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶
飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等の嗜好飲料類、ベビーフード、ふりかけ、お茶漬けのり等のその他の市販食品等；育児用調製粉乳；経腸栄養食；機能性食品（特定保健用食品、栄養機能食品）等が挙げられる。
【００２９】
また、飲食品の一態様として飼料とすることもできる。飼料としては、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。
飼料の形態としては特に制限されず、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、マイロ等の穀類；大豆油粕、ナタネ油粕、ヤシ油粕、アマニ油粕等の植物性油粕類；フスマ、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類；魚粉、脱脂粉乳、ホエイ、イエローグリース、タロー等の動物性飼料類；トルラ酵母、ビール酵母等の酵母類；第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油脂類；単体アミノ酸；糖類等を含有するものであってよい。
【００３０】
本発明の組成物が飲食品（飼料を含む）の態様である場合、酪酸菌用プレバイオティクスであることや腸内の酪酸菌を増殖させるという用途が表示された飲食品として提供・販売されることが可能である。
【００３１】
かかる「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、前記用途を想起・類推させうるような表現であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、全て本発明の「表示」行為に該当する。
また、「表示」は、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装に前記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為等が挙げられる。
【００３２】
一方、表示内容としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示等）であることが好ましい。また、そのような表示内容を、包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ等の販売現場における宣伝材、その他の書類等へ付することが好ましい。
【００３３】
また、「表示」には、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、医薬用部外品等としての表示も挙げられる。この中でも特に、消費者庁によって認可される表示、例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、若しくは機能性表示食品に係る制度、又はこれらに類似する制度にて認可される表示等が挙げられる。具体的には、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク減少表示、科学的根拠に基づいた機能性の表示等を挙げることができ、より具体的には、健康増進法に規定する特別用途表示の許可等に関する内閣府令（平成二十一年八月三十一年内閣府令第五十七号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）及びこれに類する表示が典型的な例である。
かかる表示としては、例えば、「酪酸菌を増やしたい方」、「フィーカリバクテリウム属細菌を増やしたい方」、「酪酸で整腸作用」等と表示することが挙げられる。
【００３４】
本発明の組成物は、医薬品の態様とすることもできる。
医薬品の投与経路は、経口又は非経口のいずれでもよいが経口が好ましい。また、非経口摂取（投与）としては、直腸投与等が挙げられる。
医薬品の形態としては、投与方法に応じて、適宜所望の剤形に製剤化することができる
。例えば、経口投与の場合、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等に製剤化することができる。また、非経口投与の場合、座剤、軟膏剤、注射剤等に製剤化することができる。
製剤化に際しては、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤等の成分を用いることができる。また、他の薬効成分や、公知の又は将来的に見出されるプレバイオティクスなどを併用することも可能である。
加えて、製剤化は剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。
【００３５】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられる。
【００３６】
結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マクロゴール等が挙げられる。
【００３７】
崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。
【００３８】
滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ピーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩類；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。
【００３９】
安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられる。
【００４０】
矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。
なお、経口投与用の液剤の場合に使用する担体としては、水等の溶剤等が挙げられる。
【００４１】
本発明の医薬品を摂取するタイミングは、例えば食前、食後、食間、就寝前など特に限定されない。
【実施例】
【００４２】
以下に実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４３】
＜試験例１＞ｉｎ ｖｉｔｒｏでの酪酸菌増殖確認試験
（１）被験試料の前処理
被験試料としては、ごま、アーモンド、抹茶、プルーン、キウイ、ケール、アボカド、にんじん、純ココア、おから、イヌリンを用い、以下のように調製した。
市販されている、ごま（９００ｇ）をミキサーで粉砕して鍋に入れ、材料が浸る程度の水を加えて沸騰状態で２時間加熱する。室温まで冷却した後、ガーゼを用いて濾過し、濾液を回収した。得られた液を遠心（１８００ｇ、１０分）し、上澄みを、ろ紙（２種）で濾した後、さらに濾過（１種）して抽出液を得た。この抽出液に対して公知のエタノール沈殿法を行い、得られた沈殿物を凍結乾燥して粉末（７０００ｍｇ）を得た。これを０．１％(w/v)になるようＭｉｌｌｉＱ水に溶解後、０．２２μｍフィルター（メルクミリポ
ア社製）を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
市販されている、アーモンド（５５０ｇ）をミキサーで粉砕して鍋に入れ、材料が浸る程度の水を加えて沸騰状態で２時間加熱する。室温まで冷却した後、ガーゼを用いて濾過し、濾液を回収した。得られた液を遠心（１８００ｇ、１０分）し、上澄みを、ろ紙（２種）で濾した後、さらに濾過（１種）して抽出液を得た。この抽出液に対して公知のエタノール沈殿法を行い、得られた沈殿物を凍結乾燥して粉末（２５００ｍｇ）を得た。これを０．１％(w/v)になるようＭｉｌｌｉＱ水に溶解後、０．２２μｍフィルター（メルク
ミリポア社製）を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
【００４４】
市販の抹茶（２５０ｇ）を２０００ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に溶解後、２時間煮沸した。その後約１５ｍＬずつ遠心チューブ（ＦＡＬＣＯＮ社３５２０７０）に分注し、３０ｍＬの９９．５％エタノール（Ｗａｋｏ社０５０−００４４６）を加え、混和した。その後×１，３００ｇで１０分間遠心、上清を除去し、次いで９９．５％エタノールを４５ｍＬ加え混和し、×１，３００ｇで10分間遠心した。再度上清を除去し、沈殿物を凍結乾燥させ合計１０ｇの粉末を得た。これを０．１％(w/v)になるようＭｉｌｌｉＱ水に溶解後、０
．２２μｍフィルター（メルクミリポア社製）を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
市販されている、プルーン（３７０ｇ）をミキサーで粉砕して鍋に入れ、材料が浸る程度の水を加えて沸騰状態で２時間加熱する。室温まで冷却した後、ガーゼを用いて濾過し、濾液を回収した。得られた液を遠心（１８００ｇ、１０分）し、上澄みを、ろ紙（２種）で濾した後、さらに濾過（１種）して抽出液を得た。この抽出液に対して公知のエタノール沈殿法を行い、得られた沈殿物を凍結乾燥して粉末（１２７０ｍｇ）を得た。これを０．１％(w/v)になるようＭｉｌｌｉＱ水に溶解後、０．２２μｍフィルター（メルクミ
リポア社製）を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
【００４５】
市販されている、キウイ（６００ｇ）をミキサーで粉砕して鍋に入れ、材料が浸る程度の水を加えて沸騰状態で２時間加熱する。室温まで冷却した後、ガーゼを用いて濾過し、濾液を回収した。得られた液を遠心（１８００ｇ、１０分）し、上澄みを、ろ紙（２種）で濾した後、さらに濾過（１種）して抽出液を得た。この抽出液に対して公知のエタノール沈殿法を行い、得られた沈殿物を凍結乾燥して粉末（２７３０ｍｇ）を得た。これを０．１％(w/v)になるようＭｉｌｌｉＱ水に溶解後、０．２２μｍフィルター（メルクミリ
ポア社製）を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
市販されている、ケール（４００ｇ）をミキサーで粉砕して鍋に入れ、材料が浸る程度の水を加えて沸騰状態で２時間加熱する。室温まで冷却した後、ガーゼを用いて濾過し、濾液を回収した。得られた液を遠心（１８００ｇ、１０分）し、上澄みを、ろ紙（２種）で濾した後、さらに濾過（１種）して抽出液を得た。この抽出液に対して公知のエタノール沈殿法を行い、得られた沈殿物を凍結乾燥して粉末（４１６０ｍｇ）を得た。これを０．１％(w/v)になるようＭｉｌｌｉＱ水に溶解後、０．２２μｍフィルター（メルクミリ
ポア社製）を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
【００４６】
市販されている、アボカド（４２０ｇ）をミキサーで粉砕して鍋に入れ、材料が浸る程度の水を加えて沸騰状態で２時間加熱する。室温まで冷却した後、ガーゼを用いて濾過し、濾液を回収した。得られた液を遠心（１８００ｇ、１０分）し、上澄みを、ろ紙（２種）で濾した後、さらに濾過（１種）して抽出液を得た。この抽出液に対して公知のエタノ
ール沈殿法を行い、得られた沈殿物を凍結乾燥して粉末（３２９０ｍｇ）を得た。これを０．１％(w/v)になるようＭｉｌｌｉＱ水に溶解後、０．２２μｍフィルター（メルクミ
リポア社製）を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
市販されている、にんじん（３４０ｇ）ミキサーで粉砕して鍋に入れ、材料が浸る程度の水を加えて沸騰状態で２時間加熱する。室温まで冷却した後、ガーゼを用いて濾過し、濾液を回収した。得られた液を遠心（１８００ｇ、１０分）し、上澄みを、ろ紙（２種）で濾した後、さらに濾過（１種）して抽出液を得た。この抽出液に対して公知のエタノール沈殿法を行い、得られた沈殿物を凍結乾燥して粉末（１７００ｍｇ）を得た。これを０．１％(w/v)になるようＭｉｌｌｉＱ水に溶解後、０．２２μｍフィルター（メルクミリ
ポア社製）を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
【００４７】
市販の純ココア（森永製菓社製）４００ｇを２０００ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に溶解後、２時間煮沸した。その後約１５ｍＬずつ遠心チューブ（ＦＡＬＣＯＮ社３５２０７０）に分注し、３０ｍＬの９９．５％エタノール（Ｗａｋｏ社０５０−００４４６）を加え、混和した。その後×１，３００ｇで１０分間遠心、上清を除去し、次いで９９．５％エタノールを４５ｍＬ加え混和し、×１，３００ｇで10分間遠心した。再度上清を除去し、沈殿物を凍結乾燥させ合計１４．３ｇの粉末を得た。これを０．１％(w/v)になるようＭｉｌ
ｌｉＱ水に溶解後、０．２２μｍフィルター（メルクミリポア社製）を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
市販のイヌリン（フジ日本精糖株式会社製）１０ｇを１００ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に溶解後、約１５ｍＬずつ遠心チューブ（ＦＡＬＣＯＮ社３５２０７０）に分注し、３０ｍＬの９９．５％エタノール（Ｗａｋｏ社０５０−００４４６）を加え、混和した。その後×１，３００ｇで１０分間遠心、上清を除去し、次いで９９．５％エタノールを４５ｍＬ加え混和し、×１，３００ｇで１０分間遠心した。再度上清を除去し、沈殿物を凍結乾燥させ合計８．７ｇの粉末を得た。これを０．１％(w/v)になるようＭｉｌｌｉＱ水に溶解後
、０．２２μｍフィルター（メルクミリポア社製）を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
【００４８】
（２）中和培養
糖を含有しないＹＣＦＡ培地を１００ｍＬ作成し、ｐＨコントロール可能な培養装置Ｂｉｏ Ｊｒ．８（株式会社バイオット社製ＢＪＲ−２５ＮＡ１Ｓ−８Ｍ）のベッセルに入
れ、（１）で前処理した各被験試料を１ｇ添加した。また、陰性対象として、被験試料を添加しない培地も用意した。各培地をベッセルごと、１１５℃２０分間のオートクレーブ処理にかけた。その後、無菌的にフィルター滅菌処理したビタミン液とシステイン液を添加し、被験試料の終濃度が１％（ｗ／ｖ）となる培養液を調製した。その後、窒素置換を一晩行うことで嫌気状態とし、生理食塩水で１０％（ｗ／ｖ）に予め調整しておいた糞便溶液１００μＬを添加し、ｐＨが６以下にならないよう１ＭのＮａ２ＣＯ３液でコントロールしながら２４時間３７℃で嫌気培養を行った。
なお、前記糞便は、通常の食餌を継続している健康なヒト（４０歳代男性１名、３０歳代男性２名、２０歳代男性２名、及び３０歳代女性１名）から提供されたものである。
陰性対照とした。
【００４９】
（３）腸内細菌の解析
前記（２）における２４時間培養後の培養液を１ｍＬ採取し、１５，０００ｇで１０分間遠心して沈殿を得た。前記沈殿を、４５０μＬの抽出液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣ
ｌ, ４ｍＭ ＥＤＴＡ, ｐＨ９．０）に懸濁した後、１０％ＳＤＳ溶液５０μＬ、０．１
ｍｍ径のガラスビーズ３００ｍｇ、５００μＬのＴＥ飽和フェノール（和光純薬）と混合し、ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ １００Ａ（フナコシ社製）にてパワーレベル５、３０秒の破砕処理を行った。次いで、１４，０００ｇで５分間遠心後４００μＬの上清を取り、２５０μＬのフェノール・クロロホルム溶液（和光純薬）を加えて混合し、１４，０００ｇで
５分間遠心後、２５０μＬの上清を取得した。さらに２−プロパノールを２５０μＬ加えて得た沈殿を２００μＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ８．０）で溶解し、鋳型ＤＮＡ溶液とした。
【００５０】
次に細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の第３〜４可変領域を増幅させるための１ｓｔプラ
イマーセット（配列番号１及び２）と、次世代シーケンサーMiseq （イルミナ社製）にて解析するために必要な２ｎｄプライマーセット（配列番号３及び４、なおｎは１度の解析で複数サンプルを処理するための任意の塩基配列（インデックス領域））を設計し、Life
Technologies社のオリゴプライマー作成サービスによりプライマーを合成した。
鋳型ＤＮＡ溶液および１ｓｔプライマーセットを含む総液量を２５μＬとした反応液をＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて調製した。Ｖｅｒｉｔｉ ２００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により、９４℃３分の後、９４℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃３０秒を２０回、７２℃１０分のＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動し、バンドパターンを確認した。続いて得られたＰＣＲ産物１μＬを鋳型とし、２ｎｄプライマーセットを用いて上述した条件と同様にＰＣＲを実施した。ただしＰＣＲのサイクル数は２０回ではなく１５回とした。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動し、バンドパターンを確認後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ９６ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて精製を行い、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて濃度を測定した。同濃度のＤＮＡ溶液を混合したものをＭｉｓｅｑ ｖ２ Ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（イルミナ社製）に供し、Ｍ
ｉｓｅｑにてシークエンス解析を実施した。
【００５１】
得られたペアエンド配列をＱＩＩＭＥ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）(http://qiime.org/)にて腸内細菌叢の構成を解析し、その中の最優勢酪酸菌（フィーカリ
バクテリウム・プラスニッチ）及び別の酪酸菌（ゲンミゲル・フォルミシリス）の腸内細菌全体に占める割合をそれぞれ算出し、全被験者の平均を求めた。
【００５２】
図１にフィーカリバクテリウム・プラスニッチの腸内細菌全体に占める割合を示す。本発明に係る食品素材の存在下では、既知の酪酸菌の増加が報告されているイヌリン存在下に比べて、酪酸菌が増殖したことが認められた。
【００５３】
（４）酪酸濃度の測定
前記（２）における２４時間培養後の培養上清を４０μＬ用いて、以下の測定を実施した。
サンプルのラベル化はラベル化試薬ＦＡキット（ＹＭＣ）を用いて行い、Ｎａｎｏ Ｆ
ｉｌｔｅｒ Ｐｌｕｎｇｅｒ ｗ（ＴＨＯＭＳＯＮ）を用いて濾過し、ＨＰＬＣ測定に供した。
酪酸の測定にはａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ（ｗａｔｅｒｓ）及びＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＦＡカラム（ＹＭＣ）を用いた。移動相Ａはメタノール、移動相Ｃは０．１％ トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液、移動相Ｄは０．１％ ＴＦＡを溶解したアセトニトリル液を用
いた。グラジエントプログラムは、（ｉ）０〜５分：移動相Ａ １６％、移動相Ｃ ７９％、移動相Ｄ ５％、（ｉｉ）５〜３０分：移動相Ａ １６％、移動相Ｃ ５４％、移動相Ｄ ３０％、（ｉｉｉ）３０〜３５分：移動相Ａ １６％、移動相Ｃ ７９％、移動相Ｄ ３０
％、（ｉｖ）３５〜４０分：移動相Ａ １６％、移動相Ｃ ７９％、移動相Ｄ ５％、（ｖ
）４０〜４５分：移動相Ａ １６％、移動相Ｃ ７９％、移動相Ｄ ５％と５段階でプログ
ラムした。流速は１．００ ｍＬ／ｍｉｎ、カラムオーブン温度は５０℃に設定した。蛍
光検出器を用いて吸光２３０ ｎｍで測定した。
【００５４】
図２に酪酸濃度の測定結果を示す。接種した糞便に比べて、キウイ、アーモンド、又は
おからを添加して中和培養した後の培養溶液では酪酸濃度の増加が認められた。
【図１】
2020156420.tif 000003
【図２】
2020156420.tif 000004
【配列表】
2020156420000001.app