(57)【要約】      （修正有）【課題】有意な分解を伴うことなく、室温で長期間保持可能な超音波イメージング剤として使用される脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを生成させるための、脂質配合物を提供する。【解決手段】プロピレングリコール中にＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥを含む非水性混合物と、パーフルオロカーボンガスとを含む組成物。ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ対プロピレングリコールの比が、約１：１００〜約１：６００の範囲が好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロピレングリコール中にＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥを含む非水性混合物と、
パーフルオロカーボンガスと
を含む組成物。
【請求項２】
ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ対プロピレングリコールの比が、約１：１００〜約１：６００の範囲内である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
プロピレングリコールおよびグリセロール中にＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥを含む非水性混合物と、
パーフルオロカーボンガスと
を含む組成物。
【請求項４】
ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ対プロピレングリコール対グリセロールの比が、約１：１００：１００〜約１：６００：７００の範囲内である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
グリセロール中にＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥを含む非水性混合物と、
パーフルオロカーボンガスと
を含む組成物。
【請求項６】
ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ対グリセロールの比が、約１：１００〜約１：７００である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記非水性混合物が、５ｗ／ｗ（重量／重量）％以下の水を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記非水性混合物が、１〜４ｗ／ｗ％の水を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記非水性混合物が、１ｗ／ｗ％以下の水を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
脂質の対イオンであるイオンを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
塩化ナトリウムを含まない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
塩化物イオンを含まない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
緩衝液をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
非リン酸緩衝液をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥの合計が、非水性混合物に対して約０．９〜約７．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥが、約１０：８２：８（モル％）の比で存在する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
室温で約３ヶ月間貯蔵した場合に５％以下の不純物を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
両方とも室温で貯蔵した場合にＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）よりも少ない不純物を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記パーフルオロカーボンガスが、パーフルオロプロパンガスである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
ＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥが、ＭＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥが、１０対８２対８（１０：８２：８）のモル％比で存在する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
バイアル中で提供される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
約３．８ｍｌまたはそれ以下の実体積を有するバイアル中で提供される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
Ｖ底バイアル中で提供される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
平底バイアル中で提供される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
丸底バイアル中で提供される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記バイアルが、ガラスバイアルである、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
シングルチャンバー容器中で提供される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
マルチプルチャンバー容器中で提供される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物を含む容器。
【請求項３１】
シングルチャンバー容器である、請求項３０に記載の容器。
【請求項３２】
第１および第２のチャンバーを含み、前記非水性混合物が、前記第１のチャンバーに存在し、かつ前記パーフルオロカーボンガスが、前記第２のチャンバーに存在する、請求項３０に記載の容器。
【請求項３３】
第１のチャンバーに請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物、および第２のチャンバーにプロピレングリコールまたはグリセロールまたはプロピレングリコールおよびグリセロールを含む容器。
【請求項３４】
第１のチャンバーに請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物、および第２のチャンバーに希釈水溶液を含む容器。
【請求項３５】
前記希釈水溶液が、生理食塩水溶液である、請求項３３に記載の容器。
【請求項３６】
前記希釈水溶液が、緩衝生理食塩水溶液である、請求項３３に記載の容器。
【請求項３７】
２ｍＬのＷｈｅａｔｏｎバイアル中の、請求項３、４または７〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記非水性混合物が、プロピレングリコールおよびグリセロールに対して１ｍＬあたり約３．７５ｍｇの脂質の脂質濃度を有する、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
固体形態のＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥの混合物と、
パーフルオロカーボンガスと
を含む組成物。
【請求項４０】
請求項３９に記載の組成物を含む容器。
【請求項４１】
シングルチャンバーを有する、請求項４０に記載の容器。
【請求項４２】
第１のチャンバーを有し、前記組成物が前記容器の前記第１のチャンバーに存在する、請求項４０に記載の容器。
【請求項４３】
２つのチャンバーを有し、第１のチャンバーが、固体形態のＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥを含み、かつ第２のチャンバーが、パーフルオロカーボンガスを含む、請求項４０に記載の容器。
【請求項４４】
２つのチャンバーを有し、第１のチャンバーが、固体形態のＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥと、前記パーフルオロカーボンガスとを含み、かつ第２のチャンバーが、（ａ）プロピレングリコール、（ｂ）プロピレングリコールおよびグリセロール、または（ｃ）グリセロールを含む、請求項４０に記載の容器。
【請求項４５】
３つのチャンバーを有し、第１のチャンバーが、固体形態のＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥを含み、第２のチャンバーが、前記パーフルオロカーボンガスを含み、かつ第３のチャンバーが、（ａ）プロピレングリコール、（ｂ）プロピレングリコールおよびグリセロール、または（ｃ）グリセロールを含む、請求項４０に記載の容器。
【請求項４６】
ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥの合計対プロピレングリコールの比が、約１：１００〜約１：６００の範囲内である、請求項４４または４５に記載の容器。
【請求項４７】
ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ対プロピレングリコール対グリセロールの比が、約１：１００：１００〜約１：６００：７００の範囲内である、請求項４４または４５に記載の容器。
【請求項４８】
ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥの合計対グリセロールの比が、約１：１００〜約１：７００である、請求項４４または４５に記載の容器。
【請求項４９】
希釈水溶液を含む追加のチャンバーを有する、請求項４２〜４８のいずれか一項に記載の容器。
【請求項５０】
プロピレングリコールとグリセロールとを含む非水性溶液中に、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥと、パーフルオロカーボンガスとを含む脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを含む組成物。
【請求項５１】
前記脂質カプセル化ガスマイクロスフェアが、約１．０ミクロン〜約２．０ミクロンの範囲の平均直径を有する、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記脂質カプセル化ガスマイクロスフェアが、約１．２ミクロン〜約２．０ミクロンの範囲の平均直径を有する、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５３】
前記脂質カプセル化ガスマイクロスフェアが、約１．４〜１．８ミクロンの平均直径を有する、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５４】
前記脂質カプセル化ガスマイクロスフェアが、１０８個／ｍＬ以上の濃度で前記組成物中に存在する、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５５】
５ｗ／ｗ％以下の水を含む、請求項５０〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５６】
１〜４ｗ／ｗ％の水を含む、請求項５０〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５７】
１ｗ／ｗ％以下の水を含む、請求項５０〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５８】
脂質の対イオンであるイオンを含む、請求項５０〜５７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５９】
塩化ナトリウムを含まない、請求項５０〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６０】
塩化物イオンを含まない、請求項５０〜５９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
緩衝液をさらに含む、請求項５０〜６０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６２】
酢酸緩衝液、安息香酸緩衝液、またはサリチル酸緩衝液をさらに含む、請求項５０〜６０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６３】
ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥの合計が、非水性溶液に対して１ｍｌあたり約０．９ｍｇ〜約４ｍｇの脂質の濃度で存在する、請求項５０〜６２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６４】
ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥが、約１０％：８２％：８％（モル％）の比で存在する、請求項５０〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記脂質カプセル化ガスマイクロスフェアが、パーフルオロカーボンガスを含む、請求項５０〜６４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６６】
前記脂質カプセル化ガスマイクロスフェアが、パーフルオロプロパンガスを含む、請求項５０〜６４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６７】
ＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥが、ＭＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥである、請求項５０〜６６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６８】
バイアル中の、請求項５０〜６７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６９】
約３．８ｍｌまたはそれ以下の実体積を有するバイアル中の、請求項５０〜６７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７０】
Ｖ底バイアル中の、請求項５０〜６７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７１】
平底バイアル中の、請求項５０〜６７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７２】
丸底バイアル中の、請求項５０〜６７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７３】
前記バイアルが、ガラスバイアルである、請求項６８〜７２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７４】
シングルチャンバー容器中の、請求項５０〜６７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７５】
マルチプルチャンバー容器中の、請求項５０〜６７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７６】
容器中に請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。
【請求項７７】
前記容器が、シングルチャンバー容器またはマルチチャンバー容器である、請求項７６に記載のキット。
【請求項７８】
第２の容器をさらに含む、請求項７６または７７に記載のキット。
【請求項７９】
前記第２の容器が、希釈水溶液を含む、請求項７８に記載のキット。
【請求項８０】
前記第２の容器が、プレ充填シリンジである、請求項７８または７９に記載のキット。
【請求項８１】
前記第２の容器が、プロピレングリコールを含む、請求項７８または７９に記載のキット。
【請求項８２】
前記第２の容器が、グリセロールを含む、請求項７８または７９に記載のキット。
【請求項８３】
希釈水溶液を含む第３の容器をさらに含む、請求項７７〜８２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８４】
前記マルチチャンバー容器が、請求項１に記載の組成物を含む第１のチャンバーと、グリセロールおよび／または希釈水溶液を含む第２のチャンバーとを含む、請求項７７に記載のキット。
【請求項８５】
前記マルチチャンバー容器が、請求項３に記載の組成物を含む第１のチャンバーと、希釈水溶液を含む第２のチャンバーとを含む、請求項７７に記載のキット。
【請求項８６】
前記マルチチャンバー容器が、請求項５に記載の組成物を含む第１のチャンバーと、プロピレングリコールおよび／または希釈水溶液を含む第２のチャンバーとを含む、請求項７７に記載のキット。
【請求項８７】
ＶＩＡＬＭＩＸ（登録商標）デバイスをさらに含む、請求項７６〜８６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８８】
請求項１に記載の組成物にグリセロールおよび／または希釈水溶液を添加する工程と、
次いで前記組成物を活性化して脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを形成する工程と
を含む、超音波コントラスト剤を形成する方法。
【請求項８９】
請求項３に記載の組成物を活性化して脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを形成する工程を含む、超音波コントラスト剤を形成する方法。
【請求項９０】
請求項３に記載の組成物に希釈水溶液を添加する工程と、
次いで前記組成物を活性化して脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを形成する工程と
を含む、超音波コントラスト剤を形成する方法。
【請求項９１】
請求項５に記載の組成物にプロピレングリコールおよび／または希釈水溶液を添加する工程と、
次いで前記組成物を活性化して脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを形成する工程と
を含む、超音波コントラスト剤を形成する方法。
【請求項９２】
前記組成物が、２０〜４５秒間にわたり活性化される、請求項８８〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記組成物が、６０〜１２０秒間にわたり活性化される、請求項８８〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
追加の希釈水溶液で前記脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを希釈する工程をさらに含む、請求項８８〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
コントラスト超音波イメージングを必要とする被験体に前記脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを投与する工程をさらに含む、請求項８８〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記組成物が、バイアル中にある、請求項８８〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記組成物が、シリンジ中にある、請求項８８〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記組成物が、シングルチャンバー容器中にある、請求項８８〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記組成物が、マルチチャンバー容器中にある、請求項８８〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国法典第３５編第１１９条第（ｅ）項の下、２０１４年１２月３１日出願の米国仮特許出願第６２／０９８，４５３号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本発明は、部分的には、超音波コントラスト剤を作製するための新しい改善された配合物および超音波コントラスト剤自体の調製物を提供する。かかる配合物は、その組成、その製造方法、およびその使用方法がそれほど複雑ではなく、驚くべきことに、長期間にわたり室温でより安定であることを含めて、超音波コントラスト剤の作製に使用される先行技術の配合物よりもロバストである。かかる配合物を用いれば、驚くべきことに、複雑な操作を行うことなく超音波コントラスト剤を作製することが可能である。
【０００３】
本明細書には、こうした新しい配合物、こうした新しい配合物を含むキット、超音波コントラスト剤を作製するためのこうした配合物の使用方法を含むこうした配合物の使用方法、および脂質カプセル化ガスマイクロスフェア自体の組成物または調製物が提供される。こうした新しい配合物は、より詳細に本明細書に記載される非水性混合物を含む。
【０００４】
一態様では、本明細書には、プロピレングリコールおよびグリセロール中のＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥの非水性混合物と、緩衝液とからなるか、またはそれらから本質的になる組成物が提供される。
【０００５】
他の態様では、本明細書には、プロピレングリコール中のＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥの非水性混合物と、緩衝液とからなるか、またはそれらから本質的になる組成物が提供される。
【０００６】
他の態様では、本明細書には、グリセロール中のＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥの非水性混合物と、緩衝液とからなるか、またはそれらから本質的になる組成物が提供される。
【０００７】
緩衝液は、限定されるものではないが、酢酸緩衝液（たとえば、酢酸ナトリウムと酢酸との組み合わせ）、安息香酸緩衝液（たとえば、安息香酸ナトリウムと安息香酸との組み合わせ）、またはサリチル酸緩衝液（たとえば、サリチル酸ナトリウムとサリチル酸との組み合わせ）でありうる。
【０００８】
以上の組成物は、任意選択的にパーフルオロカーボンガスと共に、さらには脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを生成するためにパーフルオロカーボンガスの存在下でかつ任意選択的に希釈水溶液の存在下でかかる組成物を活性化するための説明書を含めて、任意選択的に使用説明書と共に無菌容器内に提供しうる。活性化すべき組成物は、第２の相として希釈水溶液を含みうるため、活性化前は不均一でありうる。
【０００９】
他の態様では、本明細書には、プロピレングリコールおよびグリセロール中のＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥの非水性混合物と、パーフルオロカーボンガスとを含む組成物が提供される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対プロピレングリコール対グリセロールの重量対重量対重量（ｗ／ｗ／ｗ）比は、約１：５０：５０〜約１：１０００：１０００または約１：１００：１００〜約１：６００：７００の範囲内である。いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対プロピレングリコール対グリセロールのｗ／ｗ／ｗ比は、約１：１２０：１２０〜約１：４００：４００、約１：１２０：１２０〜約１：３００：３００、または約１：１２０：１２０〜約１：２５０：２５０である。いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対プロピレングリコール対グリセロールのｗ／ｗ／ｗ比は、約１：１００：１５０〜約１：１５０：２００である。いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対プロピレングリコール対グリセロールのｗ／ｗ／ｗ比は、約１：２５０：３００〜約１：３００：３５０である。いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対プロピレングリコール対グリセロールのｗ／ｗ／ｗ比は、約１：５００：６００〜約１：６００：７００である。いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対プロピレングリコール対グリセロールのｗ／ｗ／ｗ比は、約１：１３８：１６８または約１：２７６：３３６または約１：５５２：６７３である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対プロピレングリコール対グリセロールのｗ／ｗ／ｗ比は、約０．７５ｍｇ：１０３．５ｍｇ：１２６．２ｍｇである。いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対プロピレングリコール対グリセロールのｗ／ｗ／ｗ比は、約０．３７５ｍｇ：１０３．５ｍｇ：１２６．２ｍｇである。いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対プロピレングリコール対グリセロールのｗ／ｗ／ｗ比は、約０．１８７５ｍｇ：１０３．５ｍｇ：１２６．２ｍｇである。
【００１２】
他の態様では、本明細書には、プロピレングリコール中のＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥの非水性混合物と、パーフルオロカーボンガスとを含む組成物が提供される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対プロピレングリコールのｗ／ｗ比は、約１：１０〜約１：２０００または約１：１０〜約１：１５００または約１：１０〜約１：１０００または約１：２０〜約１：２０００または約１：５０〜約１：１０００または約１：５０〜約１：６００または約１：１００〜約１：６００の範囲内である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対プロピレングリコールのｗ／ｗ比は、約１：１００〜約１：２００または約１：１００〜約１：１５０である。いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対プロピレングリコールのｗ／ｗ比は、約１：２００〜約１：３５０または約１：２５０〜約１：３００である。いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対プロピレングリコールのｗ／ｗ比は、約１：５００〜約１：６００または約１：５２５〜約１：５７５である。いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対プロピレングリコールのｗ／ｗ比は、約１：１３８または約１：２７６または約１：５５２である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対プロピレングリコールのｗ／ｗ比は、約０．７５ｍｇ：１０３．５ｍｇまたは約０．３７５ｍｇ：１０３．５ｍｇまたは約０．１８７５ｍｇ：１０３．５ｍｇである。
【００１６】
他の態様では、本明細書には、グリセロール中のＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥの非水性混合物と、パーフルオロカーボンガスとを含む組成物が提供される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対グリセロールのｗ／ｗ比は、約１：１０〜約１：２０００または約１：１５〜約１：１５００または約１：５０〜約１：１０００または約１：５０〜約１：７０００または約１：１００〜約１：７００の範囲内である。いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対グリセロールのｗ／ｗ比は、約１：１００〜約１：２００または約１：１２５〜約１：１７５である。いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対グリセロールのｗ／ｗ比は、約１：２５０〜約１：４００にまたは約１：３００〜約１：３５０である。いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対グリセロールのｗ／ｗ比は、約１：５５０〜約１：７００または約１：６５０〜約１：７００である。いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対グリセロールのｗ／ｗ比は、約１：１６８または約１：３３６または約１：６７３である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ（合計）対グリセロールのｗ／ｗ比は、０．７５ｍｇ：１２６．２ｍｇまたは０．３７５ｍｇ：１２６．２ｍｇまたは０．１８７５ｍｇ：１２６．２ｍｇである。
【００１９】
他の態様では、本明細書には、以上の組成物のいずれかを含む容器が提供される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、容器はシングルチャンバー容器である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、容器は第１および第２のチャンバーを含み、第１のチャンバーには非水性混合物が存在し、かつ第２のチャンバーにはパーフルオロカーボンガスが存在する。
【００２２】
他の態様では、本明細書には、第１のチャンバーに以上の組成物のいずれか、および第２のチャンバーに希釈水溶液を含む容器が提供される。
【００２３】
他の態様では、本明細書には、以上の組成物のいずれかと希釈水溶液とを含む容器が提供され、第１のチャンバーには非水性混合物が提供され、第２のチャンバーにはパーフルオロカーボンガスが提供され、かつ第３のチャンバーには希釈水溶液が提供される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、希釈水溶液は生理食塩水溶液である。いくつかの実施形態では、希釈水溶液は水性緩衝溶液である。いくつかの実施形態では、希釈水溶液は緩衝生理食塩水溶液である。
【００２５】
他の態様では、本明細書には、固体形態のＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥの混合物と、パーフルオロカーボンガスとを含む組成物が提供される。固体形態のＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥの混合物は、ブレンド固体形態（たとえば、比較的均一な脂質混合物）でありうるか、または固体形態の各脂質の組み合わせでありうる（たとえば、均一な脂質混合物でありうるか、またはそうでないものでありうる）。他の態様では、本明細書には、以上の固体形態の組成物を含む容器が提供される。いくつかの実施形態では、容器は、シングルチャンバーを有する容器である。いくつかの実施形態では、容器は、２つのチャンバーを有する容器であり、第１のチャンバーは、固体形態のＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥを含み、かつ第２のチャンバーは、パーフルオロカーボンガスを含む。いくつかの実施形態では、容器は、２つのチャンバーを有する容器であり、第１のチャンバーは、固体形態のＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥと、パーフルオロカーボンガスとを含み、かつ第２のチャンバーは、（ａ）プロピレングリコール、（ｂ）プロピレングリコールおよびグリセロール、または（ｃ）グリセロールを含む。合わせた脂質対プロピレングリコールおよび／または合わせた脂質対グリセロールのｗ／ｗ／ｗ比は、以上に明記した通りでありうる。いくつかの実施形態では、容器は、３つのチャンバーを有する容器であり、第１のチャンバーは、固体形態のＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥを含み、第２のチャンバーは、パーフルオロカーボンガスを含み、かつ第３のチャンバーは、（ａ）プロピレングリコール、（ｂ）プロピレングリコールおよびグリセロール、または（ｃ）グリセロールを含む。いくつかの実施形態では、容器は、希釈水溶液を含む追加のチャンバーを有する容器である。
【００２６】
他の態様では、本明細書には、プロピレングリコールとグリセロールとを含む非水性溶液中にＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥと、パーフルオロカーボンガスとを含む脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを含む組成物が提供される。
【００２７】
他の態様では、本明細書には、プロピレングリコールを含む非水性溶液中にＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥを含む脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを含む組成物が提供される。
【００２８】
他の態様では、本明細書には、グリセロールを含む非水性溶液中にＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥと、パーフルオロカーボンガスとを含む脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを含む組成物が提供される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、脂質カプセル化ガスマイクロスフェアは、約１．０ミクロン〜約２．０ミクロンの範囲の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質カプセル化ガスマイクロスフェアは、約１．２ミクロン〜約２．０ミクロンの範囲の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質カプセル化ガスマイクロスフェアは、約１．４〜１．８ミクロンの平均直径を有する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、脂質カプセル化ガスマイクロスフェアは、１０８個／ｍＬ超の濃度で組成物中に存在する。
【００３１】
種々の実施形態は、以上の組成物に同様に当てはまる。これについて次に述べる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、非水性混合物は、重量基準（すなわち、脂質とプロピレングリコールおよび／またはグリセロールとの総重量に対する水の重量）で５％未満の水を含む。いくつかの実施形態では、非水性混合物は、重量基準で１〜４％の水を含む。いくつかの実施形態では、非水性混合物は、重量基準で１％未満の水を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、組成物は塩フリーである。すなわち、組成物中に脂質の対イオンを含みうるが、他のイオンを含まない。脂質の対イオンは、典型的にはナトリウムなどのカチオンである。そのため、いくつかの実施形態では、組成物はアニオンを含まない。いくつかの実施形態では、組成物は塩化ナトリウムを含まない。いくつかの実施形態では、組成物は塩化物イオンを含まない。
【００３４】
いくつかの実施形態では、組成物は緩衝液をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は非リン酸緩衝液をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、酢酸緩衝液、安息香酸緩衝液、またはサリチル酸緩衝液をさらに含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、組み合わされたＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥは、非水性混合物に対して１ｍｌあたり約０．９〜約８ｍｇの脂質、非水性混合物に対して１ｍｌあたり約０．９ｍｇ〜約７．５ｍｇの脂質、非水性混合物に対して１ｍｌあたり約２ｍｇ〜約７．５ｍｇの脂質、または非水性混合物に対して１ｍｌあたり約２ｍｇ〜約４ｍｇの脂質の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、組み合わされたＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥは、非水性混合物に対して１ｍｌあたり約１．８７５ｍｇ〜約３．７５ｍｇの脂質および非水性混合物に対して１ｍｌあたり約３．７５〜約７．５ｍｇの脂質を含めて、非水性混合物に対して１ｍｌあたり約０．９４ｍｇ〜約７．５ｍｇの脂質または非水性混合物に対して１ｍｌあたり約１．８７５ｍｇ〜約７．５ｍｇの脂質の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥは、約１０：８２：８（モル％）の比に存在する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、非水性混合物は、単独またはパーフルオロカーボンガスとの組み合わせで、室温で約３ヶ月間貯蔵した場合、５％未満の不純物を含む。いくつかの実施形態では、非水性混合物は、単独またはパーフルオロカーボンガスとの組み合わせで、両方とも室温で貯蔵した場合（すなわち、組成物およびＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）を室温で貯蔵した場合）、ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）よりも少ない不純物を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、パーフルオロカーボンガスはパーフルオロプロパンガスである。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥはＭＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥである。
【００３９】
いくつかの実施形態では、組成物は、バイアルに入れて提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、約３．８ｍｌ以下の実容積のバイアルに入れて提供される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、組成物は、Ｖ底バイアルに入れて提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、平底バイアルに入れて提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、丸底バイアルに入れて提供される。いくつかの実施形態では、バイアルは、ガラスバイアルである。いくつかの実施形態では、プロピレングリコールおよびグリセロール中で組み合わされたＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥの非水性混合物と、パーフルオロカーボンガスとを含む組成物は、約３．７５ｍｇ／ｍｌの脂質濃度で２ｍｌ  Ｎｉｐｒｏ（Ｗｈｅａｔｏｎ）バイアルに入れて提供される。いくつかの実施形態では、プロピレングリコールおよびグリセロール中で組み合わされたＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥの非水性混合物と、パーフルオロカーボンガスとを含む組成物は、約３．７５ｍｇ／ｍｌの脂質濃度で２ｍｌ  Ｓｃｈｏｔｔバイアルに入れて提供される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、組成物は、シングルチャンバー容器に入れて提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、マルチプルチャンバー容器に入れて提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、第１のチャンバーに入れて提供され、かつ希釈水溶液は、第２のチャンバーに入れて提供される。希釈水溶液は、生理食塩水溶液でありうるか、または生理食塩水フリーでありうる。希釈水溶液は、緩衝溶液でありうるか、または緩衝液フリーでありうる。希釈水溶液は、緩衝生理食塩水溶液でありうる。
【００４２】
他の態様では、本明細書には、容器内に以上の組成物のいずれかを含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、容器はシングルチャンバー容器である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、キットは第２の容器を含む。いくつかの実施形態では、第２の容器は希釈水溶液を含む。いくつかの実施形態では、第２の容器はプレ充填シリンジである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、容器はマルチチャンバー容器である。いくつかの実施形態では、第１の容器は、固体形態の脂質（すなわち、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ）を含み、かつ第２の容器は、プロピレングリコールまたはグリセロールまたはプロピレングリコールおよびグリセロールを含む。第３の容器は希釈水溶液を含みうる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、第１の容器はプロピレングリコール中に脂質を含み、かつ第２の容器はグリセロールまたは希釈水溶液を含む。代替的に、第２の容器はグリセロールを含み、かつ第３の容器は希釈水溶液を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、第１の容器はグリセロール中に脂質を含み、かつ第２の容器はプロピレングリコールまたは希釈水溶液を含む。代替的に、第２の容器はプロピレングリコールを含み、かつ第３の容器は希釈水溶液を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、第１の容器はプロピレングリコールおよびグリセロール中に脂質を含み、かつ第２の容器は希釈水溶液を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、キットは、活性化デバイス、たとえば、限定されるものではないがＶＩＡＬＭＩＸ（登録商標）デバイスをさらに含む。
【００４９】
非水性混合物のいくつか（すなわち、これらの修飾脂質配合物のいくつか）は、「活性化」として本明細書で参照されるプロセスにより合わせた溶液の均一度に関係なく非水性混合物として、または希釈水溶液の単純添加後に脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを生成するために使用しうることも本発明により見いだされた。これは驚くべきことであった。なぜなら、特定の市販コントラスト剤は、脂質を含むプレ配合単相混合物を過剰の水性溶液中で活性化することにより作製されるからである。水性溶液中に脂質をプレ配合しないでも、または水性溶液の不在下でも好適なサイズおよび数の脂質カプセル化マイクロスフェアを生成可能であることは、本発明の以前には知られていなかった。
【００５０】
そのため、他の態様では、本明細書には、パーフルオロカーボンガスの存在下でかつ希釈水溶液の存在下または不在下で以上の非水性混合物のいずれかを活性化して脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを形成する工程を含む、超音波コントラスト剤を形成する方法が提供される。
【００５１】
他の態様では、本明細書には、パーフルオロカーボンガスの存在下で以上の非水性混合物のいずれかと希釈水溶液とを合わせる工程と、合わせた物を活性化して脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを形成する工程とを含む、超音波コントラスト剤を形成する方法が提供される。希釈水溶液は、撹拌または他の改質（たとえば加熱など）を行ってまたは行わずに非水性混合物に添加しうると共に、かかる合わせた混合物は、単相混合物であるか（すなわち、脂質相および水性相が実質的にコミングルされており、および／または混合物が比較的均一に見える）または二相混合物であるか（すなわち、脂質相および水性相が実質的にコミングルされておらず、および／または混合物が比較的均一に見えない）にかかわらず、パーフルオロカーボンガスの存在下で活性化しうる。
【００５２】
他の態様では、本明細書には、以上の非水性混合物のいくつかとプロピレングリコール単独またはプロピレングリコールおよび希釈水溶液（同時にもしくは逐次的に）とを合わせる工程と、合わせた物をパーフルオロカーボンガスの存在下で活性化して脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを形成する工程とを含む、超音波コントラスト剤を形成する方法が提供される。
【００５３】
他の態様では、本明細書には、以上の非水性混合物のいくつかとグリセロール単独またはグリセロールおよび希釈水溶液（同時にもしくは逐次的に）とを合わせる工程と、合わせた物をパーフルオロカーボンガスの存在下で活性化して脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを形成する工程とを含む、超音波コントラスト剤を形成する方法が提供される。
【００５４】
非水性混合物は、室温であることができ、および／または使用前に室温で貯蔵したものでありうる。室温貯蔵は、何日間から何ヵ月間、何年間までの範囲でありうる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、活性化は２０〜４５秒間にわたり行われる。いくつかの実施形態では、活性化は６０〜１２０秒間にわたり行われる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本方法は、追加の希釈水溶液で脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを希釈する工程をさらに含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本方法は、コントラスト超音波イメージングを必要とする被験体に脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを投与する工程をさらに含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、組成物はバイアル中に存在する。いくつかの実施形態では、組成物はシリンジ中に存在する。いくつかの実施形態では、組成物はシングルチャンバー容器中に存在する。いくつかの実施形態では、組成物はマルチチャンバー容器中に存在する。
【００５９】
さらに他の態様では、本明細書には、本明細書に記載の組成物のいずれか１つ中の不純物のレベルを検出および／または測定する方法が提供される。かかる方法は、組成物の健全性の評価に特に有用であり、組成物が使用に好適であるかまたは廃棄すべきかを決定するために使用しうる。本方法は、本明細書に記載の組成物の新たに製造されたバッチで実施しうるか、またはその製造後のある期間にわたり輸送状態または貯蔵状態にあったバッチで実施しうる。
【００６０】
本方法は、サンプルの成分を検出および同定する工程を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、物理化学的性質、たとえば、限定されるものではないが電荷および親油性に基づいて、任意選択的に検出および同定前に成分を分離する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、分離は検出前に実施され、かつサンプルは分離前に生理食塩水で希釈される。いくつかの実施形態では、サンプルは均一溶液が得られるまで混合される。物理化学的性質に基づく分離技術は当技術分野で公知であり、限定されるものではないが逆相ＨＰＬＣなどのＨＰＬＣが挙げられる。次いで、不純物が検出され、かつ限定されるものではないが帯電エアロゾル検出（ＣＡＤ）などの技術を用いて任意選択的に測定される。他の実施形態では、分離後に蒸発光散乱検出（ＥＬＳＤ）を使用しうる。かかる検出の例は、より詳細に本明細書に記載されている。
【００６１】
本発明のこれらのおよび他の態様および実施形態については、より詳細に本明細書に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）と対比した脂質ブレンド／プロピレングリコール（ＬＢ／ＰＧ）配合物の安定性である。
【図２】ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）と対比した脂質ブレンド／プロピレングリコール／グリセロール（ＬＢ／ＰＧ／Ｇ）配合物の安定性である。
【図３】ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）と対比した脂質ブレンド／プロピレングリコール／グリセロール／緩衝液（ＬＢ／ＰＧ／ｇ／緩衝液）配合物の安定性である。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
超音波イメージング剤として使用される脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを生成させるための脂質配合物は、有意な分解を伴うことなく長期間にわたる室温を含めて室温で保持可能であることが本発明により見いだされた。これまで、前述の目的に使用される脂質配合物は、分解を回避するために４℃で貯蔵しなければならないと考えられていた。こうした修飾脂質配合物を室温で数ヶ月間にわたり貯蔵しても、生じる不純物は５％未満であり、現在市販されている超音波コントラスト剤を同一の期間にわたり室温で貯蔵した場合に存在するレベルよりも少ないことが本発明により見いだされた。
【００６４】
重要なこととして、脂質含有非水性混合物として参照されるこうした修飾脂質配合物を室温での長期貯蔵を含めて室温で貯蔵しても、現在市販されている超音波コントラスト剤に匹敵するサイズおよび量のマイクロスフェアを形態可能であることから実証されるように、超音波コントラスト剤として使用するためにマイクロスフェアを形成する能力に悪影響を及ぼさない。したがって、こうした修飾脂質配合物は、少なくともこうした安定性の向上の観点から特定の市販の脂質配合物よりもロバストである。
【００６５】
本明細書に記載の新しい脂質配合物は、少なくとも部分的には冷蔵を必要としないことが理由で、特定の既存の配合物よりも使用しやすい。これとは対照的に、特定の現在市販されている脂質配合物は、その貯蔵期間にわたり冷蔵しなければならないが、その後は室温で患者に投与される。すなわち、かかる配合物は、使用可能となる前に最初に約４℃からほぼ室温まで加温しなければならない。これとは対照的に、本明細書に提供される修飾脂質配合物は、室温に加温する待ち時間を必要とすることなく本質的に即使用可能である。このため、こうした修飾配合物は、より使用しやすいうえに、たとえば緊急時にただちに使用できる。
【００６６】
加えて、修飾脂質配合物は本質的によりロバストな性質を有するため、たとえば輸送時および貯蔵を含めて、使用前にその健全性が損なわれる可能性はより低い。現行では、市販の配合物のいくつかを室温で任意の有意な期間にわたり貯蔵した場合、かかる配合物は、問題がある品質を有するおそれがあるため、廃棄が必要となるおそれがある。新しい配合物を用いた場合、エンドユーザーは、配合物の履歴または処理に関心を払う必要がない。そのため、使いやすさの向上とは別に、健全性の問題に起因して廃棄される修飾脂質配合物の量はより少ないはずである。
【００６７】
こうした修飾脂質配合物は、超音波コントラスト剤としてまたはその中間体として使用することが意図される。このため、本明細書に記載されるように、ガスと共に提供された場合、希釈水溶液を併用してまたは併用せずに活性化して脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを形成しうる。さらに、希釈水溶液を使用した場合、かかる配合物は、非水性混合物と希釈水溶液とのプレ配合もプレ混合もなんら必要とすることなく希釈水溶液の単純添加後に活性化しうる。例として、希釈水溶液を添加すると不均一混合物または二相混合物を生じうると共に、この二相混合物は活性化しうる。特定の市販の超音波コントラスト剤は、水性マトリックス中に配合してプレ配合された比較的均一な脂質の単相混合物として提供され、この本質的に水性の配合物の形態で活性化される。これとは対照的に、本明細書に提供される修飾脂質配合物は、その非水性形態で活性化しうるか、または脂質と希釈水溶液とをプレ配合することも混合物が均一であることも必要とすることなく希釈水溶液の単純添加後に活性化しうる。すなわち、したがって、活性化時（ならびに輸送時および貯蔵時）、脂質配合物の体積をかなり小さくすることが可能であり、必要に応じて使用直前に希釈可能である。すなわち、希釈水溶液を添加することなく活性化可能であるため、また、配合物を使用しない場合には後で使用するために配合物を単に貯蔵することが可能であるため、配合物の健全性が損なわれる可能性もより低い。その代わりに、活性化するために非水性混合物と水性溶液とを組み合わさなければないない場合、このタイプの柔軟性はこの状況では損なわれて、配合物を廃棄しなければならないであろうことから、再び不要な廃棄物をもたらすであろう。
【００６８】
したがって、本発明は、部分的には、それ自体で超音波コントラスト剤として好適な脂質カプセル化ガスマイクロスフェアの作製に使用される脂質が、非水性混合物の形態で配合した場合、有意な分解を伴うことなく室温で長期間にわたり貯蔵可能であるという予想外の驚くべき知見に基づく。非水性混合物は、プロピレングリコール、またはグリセロール、またはプロピレングリコールとグリセロールとの混合物を含みうる。重要なこととして、本明細書に提供される脂質配合物は、特に両方ともマイクロスフェアの音響特性に影響を及ぼすマイクロスフェアの濃度およびサイズに関して、現在市販されている超音波コントラスト剤ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）により生成されるものと同等の脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを生成する。かかる脂質配合物は、長期貯蔵を含めて室温貯蔵に対してＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）よりもロバストでありかつその影響を受けにくい。
【００６９】
ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）は、最適状態に及ばない心エコー図を有する被験体で左心室腔を不透明化するためにおよび左心室の心内膜境界の描出を向上させるために使用することがＦＤＡにより認可されている超音波コントラスト剤である。ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）は、水性溶液中に１０：８２：８モル％の比でＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＭＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥを含む単相溶液と、パーフルオロプロパンガスを含むヘッドスペースとを含むバイアルで提供される。被験体への投与前、ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）は、機械的振盪により活性化される（以下では「活性化ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）」として参照される）。活性化の結果として、１．１〜３．３ミクロンの平均直径を有する十分な数の脂質カプセル化ガスマイクロスフェアが形成される。しかしながら、ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）は、使用直前まで冷蔵しなければならない。このため、特に貯蔵時に適切な冷蔵が欠如する状況では、その有用性は特に制限される。
【００７０】
本明細書には、特に、脂質カプセル化ガスマイクロスフェアの製造に使用するための組成物ならびに脂質カプセル化ガスマイクロスフェア自体の組成物および使用が提供される。本発明は、かかるマイクロスフェアの製造方法をさらに提供する。
【００７１】
貯蔵配合物
こうした新しい配合物は、１種以上の脂質と、プロピレングリコール（ＰＧ）、またはグリセロール（Ｇ）、またはプロピレングリコールおよびグリセロール（ＰＧ／Ｇ）との非水性混合物を含む。こうした配合物は、既存の超音波コントラスト剤配合物を用いてこれまで可能であったよりも長い期間にわたりより高い温度で有意な分解を伴うことなく貯蔵しうることが本発明により見いだされた。したがって、こうした組成物は、配合物が使用前にどのように取り扱われたかに関して特に関心を払うことなく広範にわたる状況で使用しうる。
【００７２】
こうした新しい配合物の安定性の向上は、実施例で実証される。実施例では、プロピレングリコール中またはプロピレングリコールおよびグリセロール中の脂質配合物は、室温で保持されたＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）配合物で観測されるよりも少ない分解を伴って３ヶ月間以上にわたり保持可能であることが示される。こうした配合物は、有意な分解を伴うことなく約３〜６ヵ月間にわたり貯蔵しうることが実施例により実証される。
【００７３】
プロピレングリコール、またはグリセロール、またはプロピレングリコールおよびグリセロール中の脂質の非水性混合物は、重量基準（すなわち、脂質とプロピレングリコールおよび／またはグリセロールとの総重量に対する水の重量）で５％以下の水を有する混合物であることが意図される。いくつかの場合、非水性混合物は、５％未満の水（ｗ／ｗ）、１〜４％の水（ｗ／ｗ）、１〜３％の水（ｗ／ｗ）、２〜３％の水（ｗ／ｗ）、または１〜２％の水（ｗ／ｗ）を含む。いくつかの場合、非水性混合物は１％未満の水（ｗ／ｗ）を含む。含水率は、製造の終了時（および長期貯蔵前）に測定しうるか、または長期貯蔵後を含めて貯蔵後および使用直前に測定しうる。
【００７４】
非水性混合物は塩フリーでもありうる。これは脂質の対イオン以外のいかなる塩も含有しないことが意図される。より具体的には、例として、ＤＰＰＡおよびＤＰＰＥなどの脂質は、典型的にはナトリウム塩として提供される。本明細書で用いられる場合、塩フリー非水性混合物は、かかる対イオン（たとえば、ＤＰＰＡおよび／またはＤＰＰＥが使用される場合にはナトリウムイオン）を含みうるが、他のイオンを含有しない。いくつかの場合、非水性混合物は塩化ナトリウムも塩化物イオンも含まない。
【００７５】
非水性混合物は緩衝液を含みうる。緩衝液は、酢酸緩衝液、安息香酸緩衝液、またはサリチル酸緩衝液でありうるが、これらに限定されるものではない。非リン酸緩衝液は、いくつかの場合、本明細書に提供される非水性混合物への溶解プロファイルに基づいて好ましい。いくつかの場合、リン酸緩衝液を使用しうる（たとえば、希釈水溶液の添加後またはそれと同時）。
【００７６】
いくつかの実施形態では、非水性混合物は、（ａ）１種以上の脂質と、（ｂ）プロピレングリコールまたはグリセロールまたはプロピレングリコール／グリセロールと、（ｃ）非リン酸緩衝液とを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。かかる非水性混合物は、パーフルオロカーボンガスなどのガスと共に提供しうるか、または単独で（すなわち、ガスの不在下で）提供しうる。かかる非水性混合物は、ガスを併用してまたは併用せずに単回使用量および／または単回使用容器で提供しうる。かかる容器は典型的には無菌であろう。
【００７７】
非リン酸緩衝液は、限定されるものではないが、酢酸緩衝液、安息香酸緩衝液、サリチル酸緩衝液、ジエタノールアミン緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、グルタミン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、グルタル酸緩衝液、アコニット緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、乳酸緩衝液、グリセリン酸緩衝液、グルコン酸緩衝液、およびトリス緩衝液でありうる。いくつかの場合、緩衝液はリン酸緩衝液である。各緩衝液タイプの緩衝液濃度の決定および最適化を行うことは、当業者の技能の範囲内である。
【００７８】
本明細書で用いられる室温とは、１８〜２５℃および２０〜２５℃およびそれらの間のすべての温度を含めて１５〜３０℃の温度を意味する。室温は、かかる温度に制御しうるが（たとえば、サーモスタットにより保持される）、そのように限定されるものではない。
【００７９】
脂質
こうした新しい配合物は、１種、典型的には２種以上の脂質を含む。本明細書で用いられる場合、「脂質」または「全脂質」または「合わせた脂質」とは、脂質の混合物を意味する。
【００８０】
脂質は、個別の固体状態（たとえば粉末）の形態で提供しうる。代替的に、脂質は脂質ブレンドとして提供しうる。脂質ブレンドの作製方法は、米国特許第８，０８４，０５６号明細書および公開ＰＣＴ出願の国際公開第９９／３６１０４号パンフレットに記載のものを含む。脂質ブレンドとは、本明細書で用いられる場合、ブレンドされて個別の粉末形態の脂質の単純混合により達成可能なものよりも均一な脂質混合物を生じた２種以上の脂質を意味することが意図される。脂質ブレンドは一般に粉末形態である。脂質ブレンドは、水性懸濁凍結乾燥プロセスまたは有機溶媒を用いた有機溶媒溶解沈殿プロセスにより作製しうる。水性懸濁凍結乾燥プロセスでは、所望の脂質は昇温で水中に懸濁され、次いで凍結乾燥により濃縮される。
【００８１】
有機溶媒溶解方法は以下の工程を含む。
【００８２】
（ａ）所望の脂質（たとえば、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＭＰＥＧ５０００  ＤＰＰＥ）と第１の非水性溶媒系とを接触させる工程。この系は、典型的には、溶媒の組み合わせ、たとえば、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、トルエン／ＭｅＯＨである。好ましくは、第１の非水性溶媒はトルエンとメタノールとの混合物である。完全溶解を達成するのに十分な温度に脂質溶液を加温することが望ましいこともある。かかる温度は、好ましくは約２５〜７５℃、より好ましくは約３５〜６５℃である。溶解後、非溶解異物は、熱時濾過により除去しうるか、または室温に冷却してから濾過しうる。公知の濾過方法を使用しうる（たとえば、重力濾過、真空濾過、または圧力濾過）。
【００８３】
（ｂ）次いで、溶液は厚いゲル／半固体に濃縮される。濃縮は、好ましくは真空蒸留により行われる。ロータリーエバポレーションなどの他の溶液濃縮方法を使用することも可能である。この工程の温度は、好ましくは約２０〜６０℃、より好ましくは３０〜５０℃である。
【００８４】
（ｃ）次いで、厚いゲル／半固体は第２の非水性溶媒中に分散される。混合物は、好ましくはで周囲温度近傍（たとえば１５〜３０℃）でスラリー化される。有用な第２の非水性溶媒は、濾過された溶液から脂質を沈殿させるものである。第２の非水性溶媒は、好ましくはメチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）である。他のエーテルおよびアルコールを使用しうる。
【００８５】
（ｄ）次いで、第２の非水性溶媒の添加時に生成された固体が捕集される。好ましくは、捕集された固体は、第２の非水性溶媒（たとえばＭＴＢＥ）の他の部分で洗浄される。捕集は、好ましくは周囲温度で真空濾過または遠心分離により行いうる。捕集後、約２０〜６０℃の温度で固体を真空乾燥させることが有利である。
【００８６】
脂質ブレンドの生成方法に関連する米国特許第８，０８４，０５６号明細書および公開ＰＣＴ出願の国際公開第９９／３６１０４号パンフレットの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８７】
有機溶媒溶解沈殿プロセスは、有機溶解方法を用いて得られる均一分布脂質固体を含めて米国特許第８，０８４，０５６号明細書および公開ＰＣＴ出願の国際公開第９９／３６１０４号パンフレットに概説されているいくつかの理由で、水性懸濁／凍結乾燥プロセスよりも好ましい。
【００８８】
代替的に、脂質は、非水性混合物を形成するためにプロピレングリコール、グリセロール、またはプロピレングリコール／グリセロール中に一緒にまたは個別に直接溶解される個別粉末として提供しうる。
【００８９】
本明細書で用いられる場合、脂質溶液は、脂質の混合物を含む溶液である。同様に、脂質配合物は、１種以上の脂質を含む配合物である。脂質は、陽イオン性、陰イオン性、または中性の脂質でありうる。脂質は、たとえば、脂肪酸、フッ素化脂質、中性脂肪、ホスファチド、油、フッ素化油、グリコ脂質、界面活性剤（界面活性剤およびフルオロ界面活性剤）、脂肪族アルコール、ワックス、テルペン、およびステロイドを含めて、天然、合成、または半合成のいずれかの起源でありうる。
【００９０】
脂質の少なくとも１つはリン脂質でありうるため、脂質ブレンドはリン脂質ブレンドとして参照しうる。リン脂質は、本明細書で用いられる場合、極性（親水性）リン酸ヘッド基を有する油性（疎水性）炭化水素鎖を含有する脂肪物質である。リン脂質は両親媒性である。それらは、自然に水性媒体中に境界および閉鎖ベシクルを形成する。
【００９１】
脂質は、好ましくはすべてリン脂質、好ましくは１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）である。ＤＰＰＡおよびＤＰＰＥは、モノナトリウム塩の形態で提供しうる。
【００９２】
いくつかの場合、脂質成分は、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境を含めて周囲環境とマイクロスフェアとの反応性を減少させて半減期を伸ばすように修飾しうる。キチン、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマーを有する脂質もこの目的に使用しうる。ＰＥＧにコンジュゲートされた脂質は、本明細書ではＰＥＧ化脂質として参照される。好ましくは、ＰＥＧ化脂質は、ＤＰＰＥ−ＰＥＧまたはＤＳＰＥ−ＰＥＧである。
【００９３】
ＰＥＧなどのポリマーへの脂質のコンジュゲーションは、さまざまな連結または結合、たとえば、限定されるものではないがアミド結合、カルバメート結合、アミン結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、チオアミド結合、およびジスルフィド（チオエステル）結合により達成しうる。
【００９４】
ＰＥＧの末端基は、限定されるものではないがヒドロキシ−ＰＥＧ（ＨＯ−ＰＥＧ）（またはその反応性誘導体）、カルボキシ−ＰＥＧ（ＣＯＯＨ−ＰＥＧ）、メトキシ−ＰＥＧ（ＭＰＥＧ）、もしくは他の低級アルキル基、たとえば、ｉｓｏ−プロポキシＰＥＧもしくはｔ−ブトキシＰＥＧ、アミノＰＥＧ（ＮＨ２ＰＥＧ）、またはチオール（ＳＨ−ＰＥＧ））でありうる。
【００９５】
ＰＥＧの分子量は、約１０００〜約７５００および約１０００〜約５０００を含めて約５００〜約１００００でさまざまでありうる。いくつかの重要な実施形態では、ＰＥＧの分子量は約５０００である。したがって、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００またはＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００は、約５０００の分子量を有するＰＥＧポリマーに結合されたＤＰＰＥまたはＤＳＰＥを意味する。
【００９６】
脂質溶液中の脂質の全量に対するＰＥＧ化脂質のパーセントは、モル基準で約２％〜約２０％である。種々の実施形態では、脂質の全量に対するＰＥＧ化脂質のパーセントは、５モルパーセント〜約１５モルパーセントである。
【００９７】
好ましくは、脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスファチジン酸のモノナトリウム塩（ＤＰＰＡ）、およびＮ−（ポリエチレングリコール５０００カルバモイル）−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミンのモノナトリウム塩（ＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ）である。ポリエチレングリコール５０００カルバモイルは、メトキシポリエチレングリコール５０００カルバモイルでありうる。いくつかの重要な実施形態では、脂質は、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥの１つ、２つ、または３つすべてでありうる。ＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥは、ＭＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥまたはＨＯ−ＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥでありうる。
【００９８】
Ｕｎｇｅｒらの米国特許第５，４６９，８５４号明細書に記載されるような多種多様な脂質を本プロセスで使用しうる。好適な脂質としては、たとえば、脂肪酸、リゾ脂質、フッ素化脂質、ホスホコリン、たとえば、血小板活性化因子（ＰＡＦ）関連のもの（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ．）、たとえば、１−アルキル−２−アセトイル−ｓｎ−グルセロ３−ホスホコリンおよび１−アルキル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グルセロ３−ホスホコリン、飽和および不飽和の両方の脂質のホスファチジルコリン、たとえば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファトジルコリン、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、およびジアラキドニルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン、たとえば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、たとえば、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴ脂質、たとえば、スフィンゴミエリン、グリコ脂質、たとえば、ガングリオシドＧＭ１およびＧＭ２、グルコ脂質、スルファチド、グリコスフィンゴ脂質、ホスファチジン酸、たとえば、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）およびジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、およびオレイン酸が挙げられる。
【００９９】
他の好適な脂質としては、ホスファチジルコリン、たとえば、ジオレシルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびジステアロイルホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、たとえば、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、およびＮ−スクシニル−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴ脂質、グリコ脂質、たとえば、ガングリオシドＧＭ１、グルコ脂質、スルファチド、グリコスフィンゴ脂質、ホスファチジン酸、たとえば、ジパルマトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、パルミチン脂肪酸、ステアリン脂肪酸、アラキドン脂肪酸、ラウリン脂肪酸、ミリスチン脂肪酸、ラウロレイン脂肪酸、抹香脂肪酸、ミリストレイン脂肪酸、パルミトレイン脂肪酸、ペトロセリン脂肪酸、オレイン脂肪酸、イソラウリン脂肪酸、イソミリスチン脂肪酸、イソパルミチン脂肪酸、イソステアリン脂肪酸、コレステロールおよびコレステロール誘導体、たとえば、コレステロールヘミスクシネート、コレステロールスルフェート、およびコレステリル−（４’−トリメチルアンモニオ）−ブタノエート、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸アルコール、ポリオキシエチレン脂肪酸アルコールエーテル、ポリオキシエチル化ソルビタン脂肪酸エステル、グリセロールポリエチレングリコールオキシステアレート、グリセロールポリエチレングリコールリシノレート、エトキシル化ダイズステロール、エトキシル化ヒマシ油、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン脂肪酸ポリマー、ポリオキシエチレン脂肪酸ステアレート、１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）−カルボニル）−メチルアミノ）−オクタデカン酸、Ｎ−［１２−（（（７’−ジエチルアミノ−クマリン−３−イル）−カルボニル）−メチル−アミノ）オクタデカノイル］−２−アミノ−パルミチン酸、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール、１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール、ならびに１−ヘキサデシル−２−パルミトイル−グリセロホスホエタノールアミンおよびパルミトイルホモシステイン、ラウリルトリメチルアンモニウムブロミド（ラウリル−＝ドデシル−）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（セトリル−＝ヘキサデシル−）、ミリスチルトリメチルアミニウムブロミド（ミリスチル−＝テトラデシル−）、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、たとえば、アルキルがＣ１２、Ｃ１４、またはＣ１６アルキルであるもの、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムブロミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムブロミド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムブロミド、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロリド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、セチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムブロミド、セチルピリジニウムクロリド、Ｎ−［１−２，３−ジオレオイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、および１，２−ジオレオイル−ｅ−（４’−トリメチルアンモニオ）−ブタノイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＯＴＢ）が挙げられる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＤＰＰＥを使用する場合、それらのモルパーセントは、約７７〜９０モル％ＤＰＰＣ、約５〜１５モル％ＤＰＰＡ、および約５〜１５モル％ＤＰＰＥ（ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００を含む）でありうる。各脂質の好ましい比としては、実施例の部に記載のもの、たとえば、６．０対５３．５対４０．５（ＤＰＰＡ：ＤＰＰＣ：ＭＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ）の重量％比または１０対８２対８（１０：８２：８）（ＤＰＰＡ：ＤＰＰＣ：ＭＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ）のモル％比が挙げられる。
【０１０１】
長期の室温貯蔵を意図した非水性混合物中の脂質濃度は、実施形態に依存して変化しうる。いくつかの場合、脂質濃度は、非水性混合物に対して約０．９ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｍＬおよび非水性混合物に対して約０．９ｍｇ〜約７．５ｍｇ／ｍＬを含めて、非水性混合物に対して約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ／ｍＬの範囲でありうる。いくつかの実施形態では、脂質濃度は、非水性混合物に対して１ｍｌあたり約１．８７５ｍｇ〜約７．５ｍｇの脂質または非水性混合物に対して１ｍｌあたり約３．７５ｍｇ〜約７．５ｍｇの脂質を含めて、非水性混合物に対して１ｍｌあたり約０．９４ｍｇ〜約７．５ｍｇの脂質の範囲でありうる。いくつかの場合、脂質濃度は、非水性混合物に対して約０．９４ｍｇ〜約１．８７５ｍｇ／ｍＬ、非水性混合物に対して約１．８７５ｍｇ〜約３．７５ｍｇ／ｍＬ、または非水性混合物に対して１ｍｌあたり約３．７５ｍｇ〜約７．５ｍｇの全脂質である。
【０１０２】
例として、脂質濃度は、プロピレングリコール／グリセロール（合計）に対して１ｍＬあたり約１ｍｇ〜約５ｍｇの脂質を含めて、プロピレングリコール／グリセロール（合計）に対して１ｍＬあたり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの脂質の範囲でありうる。いくつかの場合、脂質濃度は、プロピレングリコール／グリセロール（合計）に対して１ｍＬあたり約０．９４ｍｇ〜約３．７５ｍｇの脂質である。
【０１０３】
他の例として、脂質濃度は、プロピレングリコールに対して１ｍＬあたり約１ｍｇ〜約１０ｍｇの脂質またはプロピレングリコールに対して１ｍＬあたり約２ｍｇ〜約７．５ｍｇの脂質またはプロピレングリコールに対して１ｍｌあたり約３．７５ｍｇ〜約７．５ｍｇの脂質を含めて、プロピレングリコールに対して１ｍＬあたり約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇの脂質の範囲でありうる。いくつかの実施形態では、脂質濃度は、プロピレングリコールに対して１ｍＬあたり約３．７５ｍｇ〜約７．５ｍｇの脂質を含めて、プロピレングリコールに対して１ｍＬあたり約１．８７５ｍｇ〜約７．５ｍｇの脂質である。
【０１０４】
さらに他の例として、脂質濃度は、グリセロールに対して１ｍＬあたり約１ｍｇ〜約１０ｍｇの脂質またはグリセロールに対して１ｍＬあたり約２ｍｇ〜約７．５ｍｇの脂質またはグリセロールに対して１ｍＬあたり約３．７５ｍｇ〜約７．５ｍｇの脂質を含めて、グリセロールに対して１ｍＬあたり約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇの脂質の範囲でありうる。いくつかの場合、脂質濃度は、グリセロールに対して１ｍＬあたり約３．７５ｍｇ〜約７．５ｍｇの脂質を含めて、グリセロールに対して１ｍＬあたり約１．８７５ｍｇ〜約７．５ｍｇの脂質である。
【０１０５】
市販の超音波コントラスト剤脂質配合物と比較してより少量の脂質を用いても依然として超音波コントラスト剤として有用な脂質カプセル化ガスマイクロスフェアの組成物を生成できる能力は、単一バイアルから被験体に投与可能な脂質（および他の成分）の最大量を低減することにより被験体への偶発的過量投与の可能性が低減されるため、有益である。
【０１０６】
プロピレングリコールは室温で液体であり、２０℃で１．０３５ｇ／ｍｌの密度を有する。グリセロールは室温で液体であり、２０℃で１．２６ｇ／ｍｌの密度を有する。
【０１０７】
長期の室温貯蔵が可能な非水性混合物の全体積は、意図される最終使用に依存して変化しうる。例として、体積は、約０．０５〜約１０ｍＬ、または約０．１〜約１０ｍＬ、または約０．１〜約５ｍＬ、または約０．２５〜約５ｍＬ、または約０．５〜約１ｍＬ、または約０．１〜約１．０ｍＬの範囲でありうる。
【０１０８】
こうした非水性混合物は、典型的には、たとえば、以下に記載されるように活性化前および／または被験体への投与前に水性溶液で希釈されることを理解すべきである。全希釈は、約５倍〜約３０倍を含めて、約５倍、約１０倍、約２０倍、および約５０倍を含めて、約１倍〜約１００倍でありうる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、脂質とプロピレングリコールとグリセロールとを含む脂質配合物は、活性化前に約５倍に希釈しうる。いくつかの実施形態では、脂質とプロピレングリコールとを含む脂質配合物は、活性化前に約１０倍に希釈しうる。いくつかの実施形態では、脂質とグリセロールとを含む脂質配合物は、活性化前に約１０倍に希釈しうる。その後、希釈組成物は、約１０倍〜約５０倍を含めて、約１０倍を含めて、約１倍〜約５０倍にさらに希釈しうる。
【０１１０】
したがって、上述した脂質、プロピレングリコール、およびグリセロールの濃度は、希釈時に変化するであろう。たとえば、希釈が約１０倍の例では、最終配合物の脂質濃度は、約１０倍から以上に述べたものまで低減される。プロピレングリコールおよび／またはグリセロールの濃度でも類似の低下が起こるであろう。
【０１１１】
ガス
非水性混合物はガスと共に提供しうる。たとえば、非水性混合物は、ガスに接触した状態で提供しうるか、またはガスに接触せずにガスと同一の容器またはハウジング内に提供しうる（すなわち、非水性混合物およびガスは、互いから物理的に分離しうる）。
【０１１２】
こうした非水性混合物をパーフルオロカーボンガスなどのガスに接触した状態で長期にわたり室温で安定に貯蔵しうることは、これまで知られておらず、または予想されていなかった。こうした非水性混合物を活性化して脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを形成しうることも知られておらず、または予想されていなかった。こうした非水性混合物のいくつかを用いて臨床的に有用な程度に十分な数および十分なサイズ（たとえば直径で表される）のマイクロスフェアを形成しうることが本発明によりさらに見いだされた。
【０１１３】
ガスは、好ましくは、非水性混合物などの本明細書に提供される脂質配合物に実質的に不溶である。ガスは、六フッ化硫黄またはパーフルオロカーボンガスなどの非可溶性フッ素化ガスでありうる。パーフルオロカーボンガスの例としては、パーフルオロプロパン、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサンが挙げられる。本発明のマイクロスフェアで使用しうるガスの例は、米国特許第５，６５６，２１１号明細書に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。重要な実施形態では、ガスはパーフルオロプロパンである。
【０１１４】
ガスの例としては、限定されるものではないが、ヘキサフルオロアセトン、イソプロピルアセチレン、アレン、テトラフルオロアレン、三フッ化ホウ素、１，２−ブタジエン、１，３−ブタジエン、１，２，３−トリクロルブタジエン、２−フルオロ−１，３−ブタジエン、２−メチル−１，３ブタジエン、ヘキサフルオロ−１，３−ブタジエン、ブタジイン、１−フルオロブタン、２−メチルブタン、デカフルオロブタン（パーフルオロブタン）、デカフルオロイソブタン（パーフルオロイソブタン）、１−ブテン、２−ブテン、２−メチ−１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、パーフルオロ１−ブテン、パーフルオロ１−ブテン、パーフルオロ２−ブテン、４−フェニル−３−ブテン−２−オン、２−メチル−１−ブテン−３−イン、ブチルニトレート、１−ブチン、２−ブチン、２−クロロ−１，１，１，４，４，４−ヘキサフルオロ−ブチン、３−メチル−１−ブチン、パーフルオロ２−ブチン、２−ブロモ−ブチルアルデヒド、硫化カルボニル、クロトノニトリル、シクロブタン、メチルシクロブタン、オクタフルオロシクロブタン（パーフルオロシクロブタン）、パーフルオロイソブタン、３−クロロシクロペンテン、シクロプロパン、１，２−ジメチルシクロプロパン、１，１−ジメチルシクロプロパン、エチルシクロプロパン、メチルシクロプロパン、ジアセチレン、３−エチル−３−メチルジアジリジン、１，１，１−トリフルオロジアゾエタン、ジメチルアミン、ヘキサフルオロジメチルアミン、ジメチルエチルアミン、ビス−（ジメチルホスフィン）アミン、２，３−ジメチル−２−ノルボルナン、パーフルオロジメチルアミン、ジメチルオキソニウムクロリド、１，３−ジオキソラン−２−オン、１，１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，１−トリフルオロエタン、１，１，２，２−テトラフルオロエタン、１，１，２−トリクロロ−１，２，２−トリフルオロエタン、１，１−ジクロロエタン、１，１−ジクロロ−１，２，２，２−テトラフルオロエタン、１、２−ジフルオロエタン、１−クロロ−１，１，２，２，２−ペンタフルオロエタン、２−クロロ−１，１−ジフルオロエタン、１−クロロ−１，１，２，２−テトラフルオロ−エタン、２−クロロ−１，１−ジフルオロエタン、クロロエタン、クロロペンタフルオロエタン、ジクロロトリフルオロエタン、フルオロエタン、ニトロペンタフルオロエタン、ニトロソペンタフルオロ−エタン、パーフルオロエタン、パーフルオロエチルアミン、エチルビニールエーテル、１，１−ジクロロエチレン、１，１−ジクロロ−１，２−ジフルオロ−エチレン、１，２−ジフルオロエチレン、メタン、メタン−スルホニル−クロリ−デトリフルオロ、メタン−スルホニル−フルオリド−トリフルオロ、メタン−（ペンタフルオロチオ）トリフルオロ、メタン−ブロモ−ジフルオロ−ニトロソ、メタン−ブロモ−フルオロ、メタン−ブロモ−クロロ−フルオロ、メタン−ブロモ−トリフルオロ、メタン−クロロ−ジフルオロ−ニトロ、メタン−クロロ−ジニトロ、メタン−クロロ−フルオロ、メタン−クロロ−トリフルオロ、メタン−クロロ−ジフルオロ、メタン−ジブロモ−ジフルオロ、メタン−ジクロロ−ジフルオロ、メタン−ジクロロ−フルオロ、メタン−ジフルオロ、メタン−ジフルオロ−ヨード、メタン−ジシラノ、メタン−フルオロ、メタン−ヨードメタン−ヨード−トリフルオロ、メタン−ニトロ−トリフルオ、メタン−ニトロソ−トリオフルオロ、メタン−テトラフルオロ、メタン−トリクロロ−フルオロ、メタン−トリフルオロ、メタンスルフェニルクロリド−トリフルオロ、２−メチルブタン、メチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチルラクテート、メチルニトリット、メチルスルフィド、メチルビニルエーテル、ネオペンタン、窒素（Ｎ２）、亜酸化窒素、１，２，３−ノナデカントリカルボン酸−２−ヒドロキシクリメチルエステル、１−ノネン−３−イン、酸素（Ｏ２）、酸素１７（１７Ｏ２）、１，４−ペンタジエン、ｎ−ペンタン、ドデカフルオロペンタン（パーフルオロペンタン）、テトラデカフルオロヘキサン（パーフルオロヘキサン）、パーフルオロイソペンタン、パーフルオロネオペンタン、２−ペンタノン−４−アミノ−４−メチル、１−ペンテン、２−ペンテン｛シス｝、２−ペンテン｛トランス｝、１−ペンテン−３−ブロモ、１−ペンテン−パーフルオロ、フタル酸−テトラクロロ、ピペリジン−２，３，６−トリメチル、プロパン、プロパン−１，１，１，２，２，３−ヘキサフルオロ、プロパン−１，２−エポキシ、プロパン−２，２ジフルオロ、プロパン−２−アミノ、プロパン−２−クロロ、プロパン−ヘプタフルオロ−１−ニトロ、プロパン−ヘプタフルオロ−１−ニトロソ、パーフルオロプロパン、プロペン、プロピル−１，１，１，２，３，３−ヘキサフルオロ−２，３ジクロロ、プロピレン−１−クロロ、プロピレン−クロロ−｛トランス｝、プロピレン−２−クロロ、プロピレン−３−フルオロ、プロピレン−パーフルオロ、プロピン、プロピン−３，３，３−トリフルオロ、スチレン−３−フルオロ、六フッ化硫黄、硫黄（ジ）−デカフルオロ（Ｓ２Ｆ１０）、トルエン−２，４−ジアミノ、トリフルオロアセトニトリル、トリフルオロメチルペルオキシド、トリフルオロメチルスルフィド、六フッ化タングステン、ビニルアセチレン、ビニルエーテル、ネオン、ヘリウム、クリプトン、キセノン（特にルビジウム富化過分極キセノンガス）、二酸化炭素、ヘリウム、および空気が挙げられる。
【０１１５】
フッ素化ガス（すなわち、１つ以上のフッ素分子を含有するガス、たとえば、六フッ化硫黄）、フルオロカーボンガス（すなわち、フッ素化炭素またはガスであるフッ素化ガス）、およびパーフルオロカーボンガス（すなわち、完全フッ素化されたフルオロカーボンガス、たとえば、パーフルオロプロパンおよびパーフルオロブタン）が好ましい。
【０１１６】
パーフルオロカーボンガスなどのガスは、典型的には、生成時に空気が取り込まれるため、室温においてその通常の濃度未満で存在する。パーフルオロプロパンの濃度は、非水性混合物とガスヘッドスペースとを含むバイアル中に存在する場合、約１気圧の圧力で約６．５２ｍｇ／ｍＬであると予想される。他のガスの濃度は、当技術分野で公知のように、生成時に空気が取り込まれるため同様に希釈されるであろう。
【０１１７】
本明細書に提供される非水性混合物は、パーフルオロカーボンガスなどのガスに接触しているかそれから物理的に分離しているかにかかわらず、約４℃〜約４０℃、約４℃〜約３０℃、約４℃〜約２５℃、約１０℃〜約４０℃、約１５℃〜約４０℃、または約１５℃〜約３０℃の範囲内の温度で貯蔵しうることが本発明により企図される。
【０１１８】
本明細書に提供される非水性混合物は、パーフルオロカーボンガスなどのガスに接触しているかそれから物理的に分離しているかにかかわらず、約１ヶ月間〜約６ヶ月間、約１月間〜約１年間、または約１ヶ月間〜約２年間にわたり貯蔵しうることが本発明によりさらに企図される。そのため、本明細書に提供される非水性混合物は、パーフルオロカーボンガスなどのガスに接触しているかそれから物理的に分離しているかにかかわらず、たとえば、限定されるものではないが、約１５℃〜約３０℃の範囲内の温度で約１ヶ月間〜約２年間にわたり貯蔵しうる。
【０１１９】
容器およびチャンバーの構成
非水性混合物は、容器（またはハウジング）に入れて提供しうる。容器は、シングルチャンバー容器またはマルチチャンバー容器、たとえば、限定されるものではないが、デュアルチャンバー容器でありうる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、容器はバイアルである。バイアルは、限定されるものではないがガラスまたはプラスチックをはじめとする任意の材料で作製しうる。ガラスは、医薬グレードのガラスでありうる。容器は、ゴムストッパーなどのストッパーでシールしうる。いくつかの実施形態では、容器は０．５〜１０ｍＬ容器である。容器は、１〜５ｍＬ容器または１もしくは２ｍＬ容器でありうる。かかる体積は、典型的には、容器に入れられる液体体積（液体充填体積として参照される）を意味する。これは、液体充填体積よりも大きい容器の全内部体積とは対照的である。液体充填体積および内部体積の例は、次の通りである。すなわち、２．９ｍＬの内部体積を有するＳｃｈｏｔｔ２ｍＬ（液体充填体積）バイアル、４．５ｍＬの内部体積を有するＳｃｈｏｔｔ３ｍＬ（液体充填体積）バイアル、および１．２ｍＬの内部体積を有するＷｈｅａｔｏｎ１ｍＬの（液体充填体積）ｖバイアルである。
【０１２１】
本開示との関連で理解されるように、容器の内部体積は、非水性混合物とガスとで占められうる。好適な容器の例は、約３．７５ｍｌの実内部体積を有するＷｈｅａｔｏｎ２ｍｌガラスバイアル（たとえば、Ｎｉｐｒｏからカタログ番号２７０２、Ｂ３３ＢＡ、２ｃｃ、１３ｍｍ、タイプＩ、フリントチューブバイアルとして市販されている）である。好適なストッパーの例は、Ｗｅｓｔグレイブチルライオシリコナイズストッパー（カタログ番号Ｖ５０、４４１６／５０、１３ｍｍ）である。好適なシールの例は、Ｗｅｓｔフリップオフアルミニウムシール（カタログ番号３７６６、白色、１３ｍｍ）である。容器は、好ましくは、無菌であり、および／または公開ＰＣＴ出願の国際公開第９９／３６１０４号パンフレットに記載されるように脂質溶液および／またはガスを導入した後で滅菌される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、容器は、平底バイアルなどの平底容器である。好適なバイアルは、Ｗｈｅａｔｏｎバイアルを含めて平底ボロシリケートバイアルを含む。いくつかの実施形態では、容器は、非平底容器またはバイアルである。いくつかの実施形態では、容器は、Ｖ底バイアルなどのＶ底容器である。いくつかの実施形態では、容器は、丸底バイアルなどの丸底容器である。いくつかの実施形態では、容器は、その底部表面積（または底部表面直径）がその頂部（開口）表面積（または直径）よりも小さいかまたはそれらの間の任意の直径（たとえば本体直径）よりも小さい収束壁を有する。明確さを期して、Ｖ底の容器またはバイアルは、その底部表面積がその頂部または本体の表面積のいずれかよりも有意に小さい収束壁を有する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、容器はシリンジである。非水性混合物は、任意選択的にガスと物理的に接触した状態で、プレ充填シリンジに入れて提供しうる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、容器は、シングルチャンバー容器、たとえばバイアルである。かかるシングルチャンバーでは、非水性混合物およびガス（存在する場合）は、互いと物理的に接触した状態でありうる。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、容器は、２つ以上のチャンバーを含む。２つのチャンバーの内容物は、たとえば貯蔵時に互いに物理的に分離される。しかしながら、使用時、２つのチャンバーの内容物は合わせて混合される。そのため、容器は、第１および第２のチャンバーの内容物を物理的に分離するバリヤーをさらに含むが、最終的にはそれらの内容物を合わせるために「除去」可能である。本開示では、圧力、機械的突刺またはパンチ処理、溶解などを含めて、かかるバリヤーを除去可能な任意の手段が企図される。
【０１２６】
デュアルチャンバーシリンジまたはデュアルチャンバーチューブなどのデュアルチャンバーデバイスは、当技術分野で公知であり、市販されている。例としては、ＶｅｔｔｅｒデュアルチャンバーシリンジおよびＮｅｏＰａｋデュアルチャンバーチューブが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、１種以上の脂質と、プロピレングリコールまたはグリセロールまたはプロピレングリコール／グリセロールと、非リン酸緩衝液とからなるか、またはそれらから本質的になる非水性混合物は、シングルチャンバー容器などの容器に入れて提供される。かかる混合物は、パーフルオロカーボンガスなどのガスを併用してまたは併用せずに提供しうる。ガスと共に提供する場合、ガスは、以下に提供されるように非水性混合物と同一のチャンバーまたはマルチチャンバー容器の個別のチャンバーに存在しうる。
【０１２８】
容器は２つのチャンバーを有しうると共に、第１のチャンバーは、プロピレングリコールおよびグリセロール中またはプロピレングリコール中またはグリセロール中にＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、ＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥなどの脂質を含む非水性混合物を含み、かつ第２のチャンバーは、パーフルオロカーボンガスなどのガスを含む。非水性混合物は、非リン酸緩衝液などの緩衝液を含みうる。
【０１２９】
他の実施形態では、容器は２つのチャンバーを有しうると共に、第１のチャンバーは、
（ｉ）以下のもの、すなわち、
（ａ）ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、ＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥなどの脂質と、
（ｂ）プロピレングリコールおよびグリセロール、またはプロピレングリコール、またはグリセロールと
を含む非水性混合物と、
（ｉｉ）パーフルオロカーボンガスなどのガスと
を含み、かつ第２のチャンバーは希釈水溶液を含む。
【０１３０】
非水性混合物は、非リン酸緩衝液などの緩衝液を含みうる。代替的に、水性溶液は、リン酸緩衝液などの緩衝液を含みうえる。
【０１３１】
他の実施形態では、容器は２つのチャンバーを有しうると共に、第１のチャンバーは、
（ｉ）以下のもの、すなわち、
（ａ）ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、ＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥなどの脂質と、
（ｂ）プロピレングリコールおよびグリセロール、またはプロピレングリコール、またはグリセロールと
を含む非水性混合物
を含み、かつ第２のチャンバーは、
（ｉ）希釈水溶液と、
（ｉｉ）パーフルオロカーボンガスなどのガスと
を含む。
【０１３２】
他の実施形態では、容器は、少なくとも３つのチャンバーを有しうると共に、第１のチャンバーは、プロピレングリコール中またはグリセロール中またはプロピレングリコールおよびグリセロール中にＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥを含む非水性混合物を含み、第２のチャンバーは、パーフルオロカーボンガスなどのガスを含み、かつ第３のチャンバーは水性溶液を含む。
【０１３３】
他の実施形態では、容器は、脂質とプロピレングリコールとを含む非水性混合物を含む第１のチャンバーと、グリセロールを含む第２のチャンバーとを含みうる。他の実施形態では、容器は、脂質とグリセロールとを含む非水性混合物を含む第１のチャンバーと、プロピレングリコールを含む第２のチャンバーとを含みうる。
【０１３４】
希釈水溶液は、塩、たとえば、限定されるものではないが塩化ナトリウムを含みうるため、生理食塩水溶液と見なしうる。希釈水溶液は、リン酸緩衝液などの緩衝液を含みうるため、緩衝希釈水溶液と見なしうる。希釈水溶液は、緩衝生理食塩水溶液でありうる。非水性混合物は、本明細書に例示される非リン酸緩衝液などの緩衝液を含みうる。非水性混合物および希釈水溶液は両方とも緩衝液を含みうる。典型的な実施形態では、非水性混合物または希釈水溶液のいずれかは緩衝液を含むが、両方が含むことはない。理解されるように、緩衝液濃度は、使用される緩衝液のタイプに依存してさまざまであり、また当業者の技能の範囲内で決定されるであろう。非水性脂質配合物中の緩衝液濃度は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲でありうる。いくつかの場合、緩衝液濃度は、約５ｍＭを含めて、約１ｍＭ〜５０ｍＭ、または約１ｍＭ〜２０ｍＭ、または約１ｍＭ〜１０ｍＭ、または約１ｍＭ〜約５ｍＭでありうる。
【０１３５】
ヒト被験体を含めて典型的には被験体の静脈内に投与される最終配合物は、４〜８の範囲内または４．５〜７．５の範囲内のｐＨを有しうる。いくつかの場合、ｐＨは、約６〜約７．５の範囲内または６．２〜約６．８の範囲内でありうる。さらに他の場合、ｐＨは、約６．５（たとえば、６．５±０．５または±０．３）でありうる。いくつかの場合、ｐＨは、５〜６．５の範囲内または５．２〜６．３の範囲内または５．５〜６．１の範囲内または５．６〜６の範囲内または５．６５〜５．９５の範囲内でありうる。さらに他の場合、ｐＨは、約５．７〜約５．９の範囲内でありうる（たとえば、範囲の一端または両端の±０．１または±０．２または±０．３）。他の場合、ｐＨは、約５．８（たとえば、５．８±０．１５または５．８±０．１）でありうる。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、希釈水溶液は、グリセロールとリン酸緩衝液などの緩衝液と塩と水とを含む。かかる希釈水溶液は、グリセロールの欠如した非水性混合物と併用しうる。いくつかの実施形態では、脂質溶液は、８：１の重量比で生理食塩水（塩および水の組み合わせ）とグリセロールとをさらに含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、希釈水溶液は、プロピレングリコールとリン酸緩衝液などの緩衝液と塩と水とを含む。かかる希釈水溶液は、プロピレングリコールの欠如した非水性混合物と併用しうる。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、希釈水溶液は、リン酸緩衝液などの緩衝液と塩と水を含む。かかる希釈水溶液は、プロピレングリコールとグリセロールとの両方を含む非水性混合物と併用しうる。
【０１３９】
本明細書には、脂質とプロピレングリコールとの非水性混合物とガスとを容器に入れる工程を含む方法、脂質とグリセロールとの非水性混合物とガスとを容器に入れる工程を含む方法、および脂質とプロピレングリコールとグリセロールとの非水性混合物とガスとを容器に入れる工程を含む方法が提供される。こうした方法のいずれでも、ガスは、ヘッドスペースガスの交換により容器に入れうる。この目的に好適なガス交換器は、当技術分野で公知である。ガス交換デバイスの例は、凍結乾燥するチャンバーである。次いで、かかる容器は、２年間までまたは１〜１２ヶ月間にわたりまたは１〜３０日間にわたり、約１０〜約５０℃、１５〜約４０の℃、または約２０〜約３０℃で貯蔵しうる。他の態様では、容器は、任意選択的に以上の期間にわたり、以上の温度で貯蔵するための説明書と共に、または代替的に４℃でまたは冷蔵下で貯蔵するための説明書なしで提供しうる。
【０１４０】
本明細書には、プロピレングリコール中の脂質の非水性溶液とパーフルオロカーボンガスとを含む第１の組成物と、希釈水溶液を含む第２の組成物とを合わせる工程を含む方法、グリセロール中の脂質の非水性溶液とパーフルオロカーボンガスとを含む第１の組成物と、希釈水溶液を含む第２の組成物とを合わせる工程を含む方法、ならびにプロピレングリコールおよびグリセロール中の脂質の非水性溶液とパーフルオロカーボンガスとを含む第１の組成物と、希釈水溶液を含む第２の組成物とを合わせる工程を含む方法が提供される。
【０１４１】
第１および第２の組成物は、それぞれ容器の第１および第２のチャンバーに提供しうると共に、合わせる工程は、第１および第２のチャンバー間のシールを破壊する工程を含みうる。第１の組成物は、バイアルに入れて提供しうると共に、第２の組成物は、シリンジに入れて提供しうる。この場合、シリンジの内容物は、バイアルの内容物に添加される。代替的に、第２の組成物は、バイアルに入れて提供しうると共に、第１の組成物は、シリンジに入れて提供しうる。この場合、シリンジの内容物は、バイアルの内容物に添加される。
【０１４２】
以上の実施形態の組み合わせまたは変更形態はいずれも本開示により企図および包含され、かつ以上の例は、特に明示的な指定がない限り限定とみなすべきではないことを理解すべきである。
【０１４３】
以上の容器の実施形態はいずれも、追加のハウジングを併用してまたは併用せずに、４℃超の温度で（または冷蔵せずに）貯蔵するための説明書と共に、または貯蔵温度に関して記述のない説明書と共に提供しうる。本明細書に提供される配合物は４℃で貯蔵しうるが、この温度で貯蔵することは要件ではないことを理解すべきである。説明書は、何日間、何ヵ月間、さらには何年間にもわたる貯蔵などの長期貯蔵についてさらに説明しうると共に、長期貯蔵が室温またはほぼ室温（たとえば１８〜２５℃）で行われることをさらに説明しうる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、組成物はバイアルなどの容器中に存在し、かかる容器にはラベルが付される。容器は、その外表面の１つ以上に固定されたラベルを有しうる。かかるラベルは、目に見えると共に、さらなる補助またはデバイスを用いることなくエンドユーザーが読んで理解しうる紙ラベルまたは他のかかるラベルでありうる。代替的に、ラベルは、マシンまたはデバイスで可読なものでありうる。マシンまたはデバイスで可読なラベルの例としては、磁気ストライプ、チップ、バーコード（線状、マトリックス、および２Ｄのバーコードを含む）、無線周波数識別（ＲＦＩＤ）タグなどが挙げられる。線状バーコードなどのバーコードは、統一コード委員会（Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｃｏｄｅ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）規格または医療業界通信協議会（Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）規格に準拠するかまたはそれらを満たすものでありうる。一方、かかるラベルは、たとえば、磁気ストライプリーダー、チップリーダー、バーコードスキャナーまたはリーダー、ＲＦＩＤタグリーダーなどのデバイスから読み取りうる。認証および／または「トラックアンドトレース」の目的に使用されてきた実質上任意のラベリング技術を本明細書に提供される容器との関連で使用可能である。
【０１４５】
ラベルは、限定されるものではないが、容器中に含まれる組成物の供給元および／または生産者、たとえば、組成物の作製および／または組成物の成分の製造を行った会社または子会社の名称、組成物の作製日、組成物を作製した物理的場所、容器の輸送日、容器の処理、たとえば、遠隔地で貯蔵したかなど、かかる貯蔵の条件および期間、容器の配達日、配達手段、ＦＤＡにより指定された全国医薬品コード（ＮＤＣ）、容器の内容物、用量および使用方法、たとえば、投与経路などをはじめとするさまざまな情報を容器のエンドユーザーまたは中間取扱い業者に提供しうる。
【０１４６】
ラベルは、たとえば、容器およびその中に含まれる組成物の認証をはじめとする１つ以上の目的を果たしうる。認証とは、認可者に由来するものおよび認可者により作製されたものとして容器を同定またはマーキングする能力を意味し、それにより、エンドユーザーまたは他の者は、他の無認可者に由来する容器および組成物を同定しうる。ラベルはまた、容器をトラックアンドトレースするためにも使用しうる。この特徴を用いて、製造後から被験体への投与時点まで、容器およびその中に含まれる組成物を追跡することが可能である。これに関連して、その期間の容器の移動は、データベースに記憶しうると共に、任意選択的に、かかるデータベースは、組成物の健全性を確保するためにエンドユーザーがアクセス可能である。
【０１４７】
ラベルはまた、２つの異なるモードを用いて読み取られる情報を含有しうることを意図して、組み合わせラベルでありうる。たとえば、ラベルは、目視により明らかで理解可能な特定の情報（たとえば、生産者の名称を言葉で）および埋込みＲＦＩＤまたはバーコード埋込み情報などのマシン可読な他の情報を含有しうる。
【０１４８】
ラベルはまた、２つ以上の目的を果たしうることを意図して二重使用ラベルでありうる。たとえば、ラベルは、組成物を同定する情報ならびに製造業者および／または製造日を同定するさらなる情報を含有しうる。この情報は、同一の方式または異なる方式を用いて伝達しうる（たとえば、一方はＲＦＩＤラベルで提供しうると共に、他方はバーコードラベルで提供しうる）。
【０１４９】
ラベルは、ヒトが目視可能かつ理解可能な内容、たとえば、製造業者の名称などを提供しうる。代替的にまたは追加的に、ラベルは、情報を含有しうる、ヒトの眼で容易に目視可能であるが、参照しなければならないルックアップテーブルまたは他の形態のデータベースの不在下では意味のある情報を提供しない。かかる情報は、たとえば、アルファベット数字コードとして提供しうる。
【０１５０】
活性化
以上の組成物はいずれも、結果的に超音波コントラスト剤として使用可能な脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを形成するために使用しうる。本明細書で用いられる場合、脂質カプセル化ガスマイクロスフェアとは、主にガスでありかつ脂質シェルによりカプセル化される内部体積を有するスフェアのことである。脂質シェルは、ユニラメラ層またはマルチラメラ二層を含めて単層または二層として配置しうる。こうしたマイクロスフェアは、超音波コントラスト剤として有用である。
【０１５１】
マイクロスフェアは、活性化プロセスにより非水性混合物から生成される。活性化とは、本明細書にさらに詳細に記載されるように、脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを生成することを目的とする脂質溶液（たとえば非水性溶液）の激しい振盪を意味する。活性化は、典型的には、溶液に対して少なくとも１×１０７マイクロスフェア／ｍｌ、溶液に対して５×１０７マイクロスフェア／ｍｌ、または溶液に対して少なくとも７．５×１０７マイクロスフェア／ｍｌ、溶液に対して少なくとも１×１０８マイクロスフェア／ｍｌ、または溶液に対して約１×１０９マイクロスフェア／ｍｌを生成する。
【０１５２】
本開示では、本明細書に提供される特定の非水性混合物は、ガスの存在下で脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを形成するために使用可能であることが企図される。こうした非水性混合物を活性化しうることは予想外であった。
【０１５３】
活性化は、規定の期間にわたり振盪することを含めて激しい撹拌により実施しうる。以上に記載したように、活性化は、希釈水溶液の存在下または不在下で行いうる。活性化は、本明細書で用いられる場合、ガスがヘッドスペースから脂質溶液中に導入されるように脂質溶液を撹拌する運動として定義される。脂質溶液を撹拌してガスの導入をもたらす任意のタイプの運動を振盪に使用しうる。撹拌は、ある時間後にフォームの形成を可能にするのに十分な力でなければならない。好ましくは、撹拌は、フォームが短時間で、たとえば、３０分間以内、好ましくは２０分間以内、より好ましくは１０分間以内に形成されるのに十分な力である。いくつかの実施形態では、活性化は、５分間未満、４分間未満、３分間未満、２分間未満、約７５秒間、１分間未満、または約４５秒間で行いうる。撹拌は、マイクロエマルジョン化により、マイクロ流動化により、たとえば、渦撹拌により（たとえば、ボルテックスにより）、左右交互に、または上下運動により行いうる。さまざまなタイプの運動を組み合わせうる。撹拌は、脂質溶液を保持する容器を振盪することにより、または容器自体を振盪せずに容器内の脂質溶液を振盪することにより行いうる。さらに、振盪は、手作業でまたは機械により行いうる。使用しうるメカニカルシェーカーは、たとえば、シェーカーテーブル、たとえば、ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃｅｒｒｉｔｏｓ，  Ｃａｌｉｆ．）シェーカーテーブル、マイクロフリュイダイザー、Ｗｉｇ−Ｌ−Ｂｕｇ（商標）（Ｃｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｌｙｏｎｓ，Ｉｌｌ．）、およびメカニカルペイントミキサー、ＶＩＡＬＭＩＸ（登録商標）、または実施例１２に記載のデバイスのいずれかが挙げられる。激しい振盪とは、少なくとも約６０回の振盪運動／分として定義される。これはいくつかの場合に好ましい。少なくとも１０００回転／分のボルテックスは、激しい振盪の例であり、いくつかの場合により好ましい。１８００回転／分のボルテックスは、いくつかの場合により好ましい。
【０１５４】
ＶＩＡＬＭＩＸ（登録商標）は、米国特許第６，０３９，５５７号明細書に記載されている。バイアルなどの容器は、たとえば４５秒間を含めて以上に述べた時間の範囲でＶＩＡＬＭＩＸ（登録商標）を用いて十分に撹拌しうる。ＶＩＡＬＭＩＸ（登録商標）を用いた活性化は、３０秒間、４５秒間、６０秒間、７５秒間、９０秒間、１０５秒間、１２０秒間、またはそれよりも長い時間を含めて、１分間以下で行いうる。
【０１５５】
活性化法のさらなる例は、実施例１２に提供される。
【０１５６】
脂質とプロピレングリコールとグリセロールとを含む非水性混合物は、他の溶液を添加することなくガスの存在下で活性化しうる。代替的に、この混合物は、最初に希釈水溶液と合わせてからガスの存在下で活性化しうる。
【０１５７】
脂質とプロピレングリコールとを含む非水性混合物は、最初にグリセロールおよび任意選択的に希釈水溶液と合わせてからガスの存在下で活性化しうる。
【０１５８】
脂質とグリセロールとを含む非水性混合物は、最初にプロピレングリコールおよび任意選択的に希釈水溶液と合わせてからガスの存在下で活性化しうる。
【０１５９】
他の場合、固体形態の脂質は、脂質ブレンドであるか否かにかかわらず、プロピレングリコール単独、またはグリセロール単独、またはプロピレングリコールおよびグリセロール、またはプロピレングリコール、グリセロール、および希釈水溶液（したがって、塩と緩衝液とを含みうる）に溶解しうる。こうした混合物はいずれも活性化しうると共に、いくつかの場合、使用前に希釈水溶液でさらに希釈しうる。
【０１６０】
そのため、本明細書には、プロピレングリコールとグリセロールとを含む非水性混合物中のＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥと、パーフルオロカーボンガスとを含む脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを含む組成物、プロピレングリコールを含む非水性混合物中のＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥと、パーフルオロカーボンガスとを含む脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを含む組成物、およびグリセロールを含む非水性混合物中のＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥと、パーフルオロカーボンガスとを含む脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを含む組成物が提供される。
【０１６１】
本開示ではまた、限定されるものではないが緩衝生理食塩水溶液などの希釈水溶液の存在下でのマイクロスフェアの形成も企図される。希釈水溶液は、塩と緩衝液とプロピレングリコールとグリセロールと水とを含みうる。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、脂質カプセル化ガスマイクロスフェアを含む活性化組成物は、８：１：１の重量％比で生理食塩水とグリセロールとプロピレングリコールとを含みうる。
【０１６３】
形成後、マイクロスフェアは、希釈水溶液で希釈してから被験体に投与しうる。生理食塩水溶液は、典型的には、薬学的に許容可能であろう。また、保存剤を欠如しうる（本明細書では保存剤フリーとして参照される）。希釈水溶液は、生理食塩水溶液でありうる（すなわち、限定されるものではないが、塩化ナトリウムなどの塩を含有しうる）、および／または限定されるものではないがリン酸緩衝液などの緩衝液を含有しうる。脂質カプセル化ガスマイクロスフェアは、約５〜約５０倍または約３５〜約４５倍に希釈しうる。希釈された脂質カプセル化ガスマイクロスフェアは、超音波コントラストイメージングを必要とする被験体にボーラス注入または連続注入により投与しうる。
【０１６４】
マイクロスフェアは、ミクロン範囲の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、マイクロスフェアは、約１．０〜約２．０ミクロンまたは約１．２ミクロン〜約１．８ミクロンの範囲の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、マイクロスフェアは、約１．６ミクロンの平均直径を有する。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、マイクロスフェアの大多数は、約１．０〜約３．０ミクロンの範囲内、または約１．０〜約２．０ミクロン、または約１．２〜約２．０ミクロン、または約１．２〜約１．８ミクロンの範囲内の直径を有しうる。マイクロスフェアの大多数とは、組成物中の測定された脂質カプセル化ガスマイクロスフェアの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％を意味する。いくつかの実施形態では、組成物中の検出された脂質カプセル化ガスマイクロスフェアの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、以上の範囲のいずれかの直径を有する。
【０１６６】
平均直径とは、組成物中のすべて検出されたマイクロスフェアの平均直径を意味する。マイクロスフェア直径は、典型的には、当技術分野で公知の入手可能な機器、たとえば、限定されるものではないが、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＦＰＩＡ−３０００  Ｓｙｓｍｅｘ粒子サイザーを用いて測定される。当技術分野で理解されるように、かかる機器は、典型的には下限および上限の両方のカットオフサイズを有する。すなわち、こうしたカットオフ未満またはカットオフ超のマイクロスフェアは、それぞれカウントされないため（マイクロスフェアの濃度計算に含まれない）、それらの直径は測定されない（マイクロスフェアの平均直径を決定するうえで考慮されない）。実施例で使用した機器は、１．０ミクロンの下限カットオフおよび４０．０ミクロンの上限カットオフを有していた。カウントまたは検出されたマイクロスフェアの大多数は、１．０ミクロンの下側カットオフおよび４０．０ミクロンの上側カットオフを用いて、１．０〜２０．０ミクロンの範囲内の直径を有する。本開示では、マイクロスフェアサイズおよびマイクロスフェア直径という用語は、同義的に用いられることを理解すべきである。そのため、特に明記されていない限り、マイクロスフェアサイズはマイクロスフェア直径を意味する。
【０１６７】
活性化組成物を含む本明細書に提供される組成物は、安定化材料または安定化剤、粘度調整剤、等張化剤、コーティング剤、懸濁化剤などの他の成分をさらに含みうる。各クラスの作用剤の例は、当技術分野で公知であり、たとえば、米国特許第５，６５６，２１１号明細書、公開ＰＣＴ出願の国際公開第９９／３６１０４号パンフレット、および米国特許出願公開第２０１３／００２２５５０号明細書に提供される。
【０１６８】
活性化組成物を含む本明細書に提供される組成物は、限定されるものではないが、酢酸緩衝液、安息香酸緩衝液、サリチル酸緩衝液、および／またはリン酸緩衝液をはじめとする１種以上の緩衝液を含みうる。
【０１６９】
組成物のｐＨは、約６．２〜約６．８でありうる。いくつかの場合、ｐＨは、５〜６．５の範囲内または５．２〜６．３の範囲内または５．５〜６．１の範囲内または５．６〜６の範囲内または５．６５〜５．９５の範囲内でありうる。さらに他の場合、ｐＨは、約５．７〜約５．９の範囲内でありうる（たとえば、範囲の一端または両端の±０．１または±０．２または±０．３）。他の場合、ｐＨは、約５．８（たとえば、５．８±０．１５または５．８±０．１）でありうる。かかる範囲は、たとえば、水に希釈された酢酸緩衝配合物を用いて達成しうる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、各１ｍｌの最終組成物（希釈水溶液で非水性溶液を希釈した後）は、水中に０．７５ｍｇの脂質（０．０４５ｍｇのＤＰＰＡ、０．４０１ｍｇのＤＰＰＣ、および０．３０４ｍｇのＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００からなる）、１０３．５ｍｇのプロピレングリコール、１２６．２ｍｇのグリセロール、２．３４ｍｇの第一リン酸ナトリウム一水和物、２．１６ｍｇの二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、および４．８７ｍｇの塩化ナトリウムを含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、各１ｍｌの最終組成物は、水中に約０．４３ｍｇの脂質（０．０２２５ｍｇのＤＰＰＡ、０．２ｍｇのＤＰＰＣ、および０．１５２ｍｇのＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００からなる）、１０３．５ｍｇのプロピレングリコール、１２６．２ｍｇのグリセロール、２．３４ｍｇの第一リン酸ナトリウム一水和物、２．１６ｍｇの二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、および４．８７ｍｇの塩化ナトリウムを含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、各１ｍｌの最終組成物（生理食塩水で非水性溶液を希釈した後）は、水中に０．７５ｍｇの脂質（０．０４５ｍｇのＤＰＰＡ、０．４０１ｍｇのＤＰＰＣ、および０．３０４ｍｇのＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００からなる）、１０３．５ｍｇのプロピレングリコール、１２６．２ｍｇのグリセロール、０．０７４ｍｇの酢酸ナトリウム、０．００６ｍｇの酢酸、および７．２０ｍｇの塩化ナトリウムを含む。
【０１７３】
不純物および安定性
本発明は、非水性溶液などの脂質溶液中の不純物含有率を評価する方法をさらに提供する。かかる方法は、任意選択的にＨＰＬＣなどの１種以上の分離技術と組み合わせた帯電エアロゾル検出（ＣＡＤ）などのいくつかの分析方法のいずれかを用いて、不純物の存在に関して脂質溶液を分析する工程を含む。脂質溶液は、脂質とプロピレングリコールまたはグリセロールまたはプロピレングリコールおよびグリセロールとを含む非水性溶液でありうる。脂質溶液は、非リン酸緩衝液などの緩衝液をさらに含みうる。脂質溶液は、塩および／または水をさらに含みうる。閾値レベル超の不純物の存在は、脂質溶液が適正に貯蔵されなかったこと、その安定性が損なわれていること、およびそのために脂質溶液を被験体に投与せずに廃棄すべきであることを意味しうる。かかる方法は、品質管理の目的に使用しうる。
【０１７４】
実施例２は、非水性溶液中の不純物含有率の測定方法を提供する。不純物含有率は、投入（または理論もしくは公称）脂質量に対する％不純物として提供される。すなわち、不純物は、脂質の損失がないと仮定して存在する脂質の全量に対するパーセントで表される。
【０１７５】
修飾脂質配合物は、たとえば、約１ヶ月間、約２ヵ月間、約３ヵ月間、約６ヵ月間、またはそれよりも長い期間を含めて、約１年間または約２年間を含めて、ある期間にわたり室温で貯蔵した場合、１０％未満、５％未満、または２％未満の不純物を含みうる。
【０１７６】
重要なこととして、修飾脂質配合物は、配合物を両方とも室温で貯蔵した場合（すなわち、組成物およびＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）を室温で貯蔵した場合）、ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）よりも少ない不純物を含みうる。こうした不純物レベルの低下は、約１％、約２％、約３％、約４％、または約５％の差でありうる。
【０１７７】
使用および用途
本発明は、マイクロスフェアおよびマイクロスフェア組成物の使用方法を提供する。マイクロスフェアは、超音波コントラスト剤であることが意図され、ヒトまたは非ヒト被験体においてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用しうる。本発明の組成物は、診断もしくは治療の目的でまたは診断と治療とを組み合わせた目的で使用しうる。
【０１７８】
ヒト被験体に対して超音波コントラスト剤として使用する場合、組成物は、十分な数のマイクロスフェアを形成して、任意選択的により大きい体積に希釈して、１回以上のボーラス注射によりまたは連続注入により投与するために、本明細書で記載されるように活性化される。投与は、典型的には静脈内注射である。次いで、その後まもなくイメージングが実施される。イメージング用途では、心臓を対象としうるか、または超音波イメージングに対して感受性のある身体の他の領域を含みうる。イメージングは、心臓、血管、心血管系、および肝臓をはじめとする身体の１つ以上の器官または領域のイメージングでありうる。
【０１７９】
本発明の被験体としては、ヒトおよび動物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの場合にはヒトが好ましい。
【０１８０】
脂質組成は有効量で投与される。有効量は、意図されるｉｎ  ｖｉｖｏ反応および／または用途を促進または惹起する量であろう。超音波用途などのイメージング用途との関連では、有効量は、被験体または被験体の領域のイメージングを可能にする、脂質マイクロスフェアの量でありうる。
【実施例】
【０１８１】
実施例１．サンプル調製
市販のＦＤＡ認可超音波コントラスト剤ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（Ｌａｎｔｈｅｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ）を比較のために使用した。各バイアルは、次のもの、すなわち、注射用水中の１０３．５ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコールと１２６．２ｍｇ／ｍＬのグリセロールと２．３４ｍｇ／ｍＬの第一リン酸ナトリウム一水和物と２．１６ｍｇ／ｍＬの二塩基性リン酸ナトリウム七水和物と４．８７ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムとのマトリックス中に、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ、０．４０１ｍｇ／ｍＬ）と１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスファチジン酸（ＤＰＰＡ、０．０４５ｍｇ／ｍＬ）とＮ−（メトキシポリエチレングリコール５０００カルバモイル）−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ５０００  ＤＰＰＥ、０．３０４ｍｇ／ｍＬ）とを含有する。ｐＨは６．２〜６．８である。脂質溶液の公称充填体積は、３．８０ｍＬの近似体積を有する２ｃｃＷｈｅａｔｏｎガラスバイアル中の約１．７６ｍＬであり、そのため、パーフルオロプロパンガス（ＰＦＰ、６．５２ｍｇ／ｍＬ）を含有するヘッドスペースは、約２．０４ｍＬである。
【０１８２】
以下のように新しい配合物を調製した。
【０１８３】
ＤＰＰＣ、ＤＰＰＡ、およびＭＰＥＧ５００  ＤＰＰＥを含有する脂質ブレンド（ＬＢ）は、米国特許第８０８４０５６号明細書（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように調製し、本プロセスに使用しうる。ＬＢの配合物は、５５℃でプロピレングリコール（ＰＧ）媒体中または１：１ｖ／ｖプロピレングリコール／グリセロール（ＰＧ／Ｇ）媒体中またはグリセロール媒体中にＬＢ粉末を混合することにより調製した。いくつかの研究では、９０／１０、７５／２５、５０／５０、２５／７９、および１０／９０の塩対酸比で０．００５Ｍの酢酸緩衝液、安息香酸緩衝液、またはサリチル酸緩衝液を調製し、媒体に溶解させた。いくつかの場合、リン酸緩衝液を水性溶液中または生理食塩水溶液中に加えた。
【０１８４】
実施例２．脂質安定性
プロピレングリコール中の実施例１の新しい配合物脂質ブレンドサンプルを２ｃｃＷｈｅａｔｏｎガラスバイアルに入れ、ヘッドスペースをＰＦＰガスで置き換え、Ｗｅｓｔグレイブチルライオストッパーを挿入し、アルミニウムシールでバイアルをクリンプした。室温貯蔵に対応するように２５℃の環境チャンバー内にバイアルを貯蔵するか、または最終滅菌に対応するように乾燥オーブン内で１３０℃に加熱した。適切な時間点でサンプルバイアルを貯蔵域から取り出し、デクリンプし、生理食塩水をバイアルに添加し、均一溶液が確保されるように混合した。サンプルをＨＰＬＣバイアルに移して、逆相ＨＰＬＣ分離およびコロナ帯電エアロゾル検出（ＣＡＤ；ＨＰＬＣ  Ｗｉｔｈ  Ｃｈａｒｇｅｄ  Ａｅｒｏｓｏｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｌａｓｓｅｓ，Ｉ．Ｎ．Ａｃｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ｇａｍａｃｈｅ，Ｒ．ＭｃＣａｒｔｈｙ  ａｎｄ  Ｄ．Ａｓａ，ＥＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ；Ｊ．Ｗａｒａｓｋａ  ａｎｄ  Ｉ．Ｎ．Ａｃｗｏｒｔｈ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｊａｎｕａｒｙ  ２００８）により不純物を分析した。
【０１８５】
２５℃で３ヶ月間貯蔵したＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）バイアルの結果を比較のために提供する。分析では、Ｃ１８カラムと、水、メタノール、酢酸アンモニウム、およびトリエチルアミンを含有する移動相とを用いて、蒸発光散乱検出（ＥＬＳＤ）を備えたグラジエント逆相ＨＰＬＣを使用した。表１および２は、２５℃および１３０℃でバイアル中の全脂質内容物に対するパーセントとして全不純物を提供する。
【０１８６】
【表１】
2020172507.tif 000003
【０１８７】
【表２】
2020172507.tif 000004
【０１８８】
図１は、２〜８℃および２５℃でのＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）ならびに２５℃での７．５ｍｇ  ＬＢ／ｍＬ  ＰＧの全不純物レベルを時間の関数として例示している。２〜８℃で貯蔵したＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）中の全不純物レベルは、２５℃で貯蔵した７．５ｍｇ  ＬＢ／ｍＬ  ＰＧ配合物のものに類似していた。しかしながら、ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）を２５℃で貯蔵した場合、全不純物レベルは劇的に増加した。
【０１８９】
７．５ｍｇ  ＬＢ／ｍＬ  ＰＧ配合物は、より高い温度でＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）配合物よりもはるかにロバストであることがこれらのデータから実証される。この観測は予想外であった。
【０１９０】
実施例３．脂質ブレンド／プロピレングリコール／グリセロール（ＬＢ／ＰＧ／Ｇ）配合物の安定性
プロピレングリコール／グリセロール中の実施例１の新しい配合物脂質ブレンドサンプルを２ｃｃＷｈｅａｔｏｎガラスバイアルに入れ、ヘッドスペースをＰＦＰガスで置き換え、Ｗｅｓｔグレイブチルライオストッパーを挿入し、アルミニウムシールでバイアルをクリンプした。室温貯蔵に対応するように２５℃の環境チャンバー内にバイアルを貯蔵するか、または最終滅菌に対応するようにオーブン内で１３０℃に加熱した。２５℃で貯蔵したバイアルを準備し、実施例２に記載されるように分析した。１３０℃で加熱したバイアルを実施例２に記載されるように準備したが、実施例２でＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）に対して記載したＨＰＬＣ系を用いて分析した。表３および４は、２５℃および１３０℃でバイアル中の全脂質内容物に対するパーセントとして全不純物を提供する。実施例２に記載されるように分析したＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）の結果を比較のために提供する。
【０１９１】
【表３】
2020172507.tif 000005
【０１９２】
【表４】
2020172507.tif 000006
【０１９３】
図２は、２〜８℃および２５℃で貯蔵したＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）ならびに２５℃で貯蔵した３．７５ｍｇ  ＬＢ／ｍＬ  ＰＧ／Ｇの全不純物レベルを時間の関数として例示している。２〜８℃で貯蔵したＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）中の全不純物レベルは、２５℃で貯蔵した３．７５ｍｇ  ＬＢ／ｍＬ  ＰＧ／Ｇ配合物のものに類似していた。しかしながら、ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）を２５℃で貯蔵した場合、全不純物レベルは劇的に増加した。
【０１９４】
３．７５ｍｇ  ＬＢ／ｍＬ  ＰＧ／Ｇ配合物は、より高い温度でＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）配合物よりもはるかにロバストであることがこれらのデータから実証される。この観測は予想外であった。
【０１９５】
実施例４．緩衝脂質ブレンド／プロピレングリコール／グリセロール配合物の安定性
０．００５Ｍの酢酸（７５／２５酢酸ナトリウム／酢酸）緩衝液、安息香酸（７５／２５安息香酸ナトリウム／安息香酸）緩衝液、またはサリチル酸（９０／１０サリチル酸ナトリウム／サリチル酸）緩衝液を含有する１：１（ｖ：ｖ）プロピレングリコール／グリセロール中の実施例１の新しい配合物脂質ブレンドサンプルを２ｃｃＷｈｅａｔｏｎガラスバイアルに充填し、ヘッドスペースをＰＦＰガスで置き換え、Ｗｅｓｔグレイブチルライオストッパーを挿入し、アルミニウムシールでバイアルをクリンプした。２５℃でバイアルを貯蔵して準備し、実施例２に記載されるように分析した。実施例２に記載されるように分析したＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）の結果を比較のために提供する。２５℃でのバイアルで全脂質内容物に対するパーセントとして全不純物を表５に示す。
【０１９６】
図３は、時間の関数として全不純物レベルを例示している。しかしながら、ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）を２５℃で貯蔵した場合、全不純物レベルは劇的に増加した。３．７５ｍｇ緩衝ＬＢ／ｍＬ  ＰＧ／Ｇ配合物は、より高い温度でＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）配合物よりもはるかにロバストであることがこれらのデータから実証される。この観測は予想外であった。
【０１９７】
【表５】
2020172507.tif 000007
【０１９８】
実施例５．脂質ブレンドグリセロール配合物の安定性
グリセロール中の実施例１の新しい配合物脂質ブレンドサンプルを２ｃｃＨＰＬＣガラスバイアルに充填し、ヘッドスペースをＰＦＰガスで置き換え、セプタムを含有するスクリューキャップでバイアルをシールした。２５℃でバイアルを貯蔵して準備し、実施例２に記載されるように分析した。
【０１９９】
実施例２に記載されるように分析したＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）の結果を比較のために提供する。表６は、この実験の全不純物結果を提供する。７．５ｍｇ緩衝ＬＢ／ｍＬ  Ｇ配合物は、より高い温度でＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）配合物よりもはるかにロバストであることがこれらのデータから実証される。この観測は予想外であった。
【０２００】
【表６】
2020172507.tif 000008
【０２０１】
実施例６．脂質ブレンド粉末の安定性
ＰＴＦＥでライニングされたキャップを備えたアンバーボトルにＬＢ粉末を入れて２５℃で貯蔵した。メタノール（５０％）とプロピレングリコール（１０％）とグリセリン（１０％）と酢酸アンモニウム（３０％、５ｍＭ）との溶液でサンプルを調製した。溶液をＨＰＬＣバイアルに移して、Ｃ１８カラムと、水、メタノール、酢酸アンモニウム、およびトリエチルアミンを含有する移動相とを用いて、蒸発光散乱検出（ＥＬＳＤ）を備えたグラジエント逆相ＨＰＬＣで分析した。
【０２０２】
表７は、２５℃で貯蔵したＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）と比較した脂質ブレンド粉末の安定性データを示している。
【０２０３】
脂質ブレンド粉末は、より高い温度でＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）配合物よりもはるかにロバストであることがこれらのデータから実証される。
【０２０４】
【表７】
2020172507.tif 000009
【０２０５】
実施例７．ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）の活性化
ＶＩＡＬＭＩＸ（登録商標）を用いてＰＦＰ／脂質溶液の機械的振盪（米国特許第６，０３９，５５７号明細書（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、本プロセスで使用しうる）を行って、市販のＦＤＡ認可超音波コントラスト剤ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（Ｌａｎｔｈｅｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．）を活性形態にした（「活性化」）。この結果、脂質マイクロスフェア中にガスが取り込まれて活性生成物を生じる（ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）処方情報を参照されたい）。ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）の最適ＶＩＡＬＭＩＸ（登録商標）活性化によりガス充填マイクロスフェアが一貫して生成され、１および４０ミクロンの下側および上側カットオフを有する適切なシース溶液（表８参照）中に希釈すると粒子サイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ  ＦＰＩＡ−３０００  Ｓｙｓｍｅｘ）を用いて数およびサイズ分布を分析することが可能である。
【０２０６】
【表８】
2020172507.tif 000010
【０２０７】
Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｓｏｎｏｓ５５００臨床超音波イメージングシステムを用いて選択サンプルの音響減衰を測定した。１０ｍｌシリンジ中でサンプルを１：７．７（１．３ｍｌ＋８．７ｍｌ生理食塩水）に希釈した。このシリンジから２００マイクロリットルのサンプルを室温で２００ｍｌの０．９％生理食塩水の入ったビーカー中にピペット添加した。２ｃｍ撹拌子により溶液の均一性を維持し、ビーカーの上部で溶液中にちょうど進入しかつ撹拌子の上縁から８．９ｃｍ上の位置に超音波システムのｓ３トランスデューサーを配置した。次いで、５秒間の１２０Ｈｚ画像をディジタル方式で取得してディスクに書き込んだ。ＩＢＳモードでＵＳシステムを使用し、ＴＧＣをすべての深さで最小値に固定し、ＬＧＣを無効にした。最大よりも１８ｄＢ低くパワーを設定してメカニカルインデックス（ＭＩ）は０．２であった。受信利得を９０および圧縮を０に固定した。試験した各サンプルでサンプルの注入前（ブランク）および注入後にＵＳデータ取得を行った。ビーカー中へのサンプル導入の２０、６０、および１２０秒後に測定を行った。
【０２０８】
ＵＳシステムにより生成されたファイルを読んでＩＢＳモードでｄＢ単位の値を計算するフィリップス（Ｐｈｉｌｉｐｓ）ＱＬａｂを用いて画像解析を行った。対象の領域を撹拌子上に引き出し、全５秒間（約３６０ビデオフレーム）の取得にわたりｄＢ値を平均した。ブランクＲＯＩ値からサンプルＲＯＩ値（両方とのｄＢ単位）を減算することにより減衰測定値を取得した。これをＵＳトランスデューサーと撹拌子の上縁との間の距離の２倍で除算してｄＢ／ｃｍ単位で減衰を得た。ビーカーへの導入後の時間に対してサンプルの線形回帰を適用することにより最終値を得た。使用した値は、回帰直線とｙ軸との切片から導出した。
【０２０９】
【表９】
2020172507.tif 000011
【０２１０】
実施例８．非水性配合物の活性化
実施例１に記載の脂質ブレンドの新しい配合物を２ｃｃＷｈｅａｔｏｎガラスバイアルに秤取し、所要により希釈剤を添加し、ヘッドスペースをＰＦＰガスで置き換え、Ｗｅｓｔグレイブチルライオストッパーを挿入し、アルミニウムシールでバイアルをクリンプした。所要によりストッパーを介して希釈剤を注入し、ある時間にわたりＶＩＡＬＭＩＸ（登録商標）を用いてバイアルを機械的に振盪し、最適な生成物活性化をもたらした。マイクロスフェアの数および分布を決定し、実施例７に記載の方法によりいくつかの活性化配合物の超音波減衰を調べた。
【０２１１】
【表１０】
2020172507.tif 000012
【０２１２】
【表１１】
2020172507.tif 000013
【０２１３】
【表１２】
2020172507.tif 000014
【０２１４】
【表１３】
2020172507.tif 000015
【０２１５】
ａ）単に希釈剤を添加してＶＩＡＬＭＩＸ（登録商標）で振盪することにより、ＰＧ、ｂ）ＰＧ／Ｇ、ｃ）緩衝ＰＧ／Ｇ中に配合された脂質ブレンドを活性化すると、活性化ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（実施例７に示される）と均等な特性および音響減衰を有するマイクロスフェアを形成可能であることがこうした研究から実証される。希釈水溶液を用いてプレ配合する必要がなく、単純添加で十分であることがこのことから実証される。さらに、バイアルストッパーを介して注入することにより脂質配合物に希釈剤を添加可能である。加えて、希釈剤の添加前に振盪することにより、ＰＧ／Ｇ中の脂質ブレンドを活性化すると、活性化ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（実施例７に示される）と均等な特性および音響減衰を有するマイクロスフェアを形成可能である。こうした知見は驚くべきことである。
【０２１６】
実施例９．個別脂質または脂質ブレンドの活性化
０．０４５：０．４０１：０．３０４（ｗ：ｗ：ｗ）比（脂質ブレンドの比と同一）で個別リン脂質（ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣおよびＭＰＥＧ５０００  ＤＰＰＥ）をプロピレングリコール中に混合することにより配合物（個別脂質配合物）を調製した。得られた７．５ｍｇ／ｍＬの個別脂質プロピレングリコール配合物を希釈剤（ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）バイアル組成物に一致するようにグリセロール、リン酸緩衝液、および生理食塩水を含有する）に添加し、かつ混合して０．７５ｍｇ／ｍＬの最終全脂質濃度を得た。１．７ｍＬのアリコートを２ｃｃＷｈｅａｔｏｎガラスバイアルに添加し、ヘッドスペースをＰＦＰガスで置き換え、Ｗｅｓｔグレイブチルライオストッパーを挿入し、アルミニウムシールでバイアルをクリンプした。ＶＩＡＬＭＩＸ（登録商標）でバイアルを活性化し、Ｓｙｓｍｅｘ  ＦＰＩＡ３０００を用いてマイクロスフェア数および平均マイクロスフェアサイズを分析した。
【０２１７】
【表１４】
2020172507.tif 000016
【０２１８】
脂質ブレンドを調製することなくＰＧ中に個別脂質を混合することにより、活性化ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（実施例７と比較して）と均等な特性を有するマイクロスフェアを生成するように活性化可能な溶液を希釈剤との混合により形成しうる配合物を生成可能であることがこの研究から実証される。
【０２１９】
他の実験では、脂質ブレンドを２ｃｃＷｈｅａｔｏｎガラスバイアルに秤取し、マトリックス（ＰＧ／Ｇ／生理食塩水）をバイアルに添加し、ヘッドスペースをＰＦＰガスで置き換え、Ｗｅｓｔグレイブチルライオストッパーを挿入し、ＶＩＡＬＭＩＸ（登録商標）で２５℃において活性化し、アルミニウムシールでバイアルをクリンプし、Ｓｙｓｍｅｘ  ＦＰＩＡ３０００を用いてマイクロスフェア数および平均マイクロスフェアサイズを分析した。結果は表１５に示される。
【０２２０】
【表１５】
2020172507.tif 000017
【０２２１】
脂質ブレンド粉末をバイアルに秤取し、希釈剤を添加し、ヘッドスペースをＰＦＰで置き換え、バイアルを活性化して活性化ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（実施例７と比較して）と均等な特性を有するマイクロスフェアを生成可能であったことがこの研究から実証される。活性化させるために脂質をプレ配合する必要がなかったことがこのことから実証される。
【０２２２】
実施例１０．異なる脂質濃度の活性化
実施例１に記載の脂質ブレンドを用いて、プロピレングリコール（ＰＧ）または１：１ｖ／ｖプロピレングリコール／グリセロール（ＰＧ／Ｇ）のいずれかにさまざまな量のＬＢ粉末を混合することにより、さまざまな全脂質ブレンド濃度で配合物を作製した。各脂質配合物を２ｃｃＷｈｅａｔｏｎガラスバイアルに秤取し、所要により希釈剤を添加し、ヘッドスペースをＰＦＰガスで置き換え、Ｗｅｓｔグレイブチルライオストッパーを挿入し、アルミニウムシールでバイアルをクリンプした。ＶＩＡＬＭＩＸ（登録商標）を用いてバイアルを機械的に振盪して生成物を活性化し、所要により、針を備えたシリンジを用いてストッパーを介して希釈剤を添加した。実施例７に記載されるようにマイクロスフェアの数および分布を決定した。
【０２２３】
【表１６】
2020172507.tif 000018
【０２２４】
【表１７】
2020172507.tif 000019
【０２２５】
さまざまな脂質濃度を有する脂質ブレンド配合物は、活性化時、比例数のマイクロスフェア（所与の体積１ｍＬ当たり）を生成することがこうした研究から実証された。マイクロスフェアのサイズは、活性化ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）と均等であり、マイクロスフェアの数は、活性化ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）または均等な希釈形態に類似しているかまたはそれらよりも多い。ＰＧまたはＰＧ／Ｇ中の多種多様な脂質ブレンド濃度を用いて活性化ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）と均等な特性を有するマイクロスフェアを形成する能力は予想されなかった。希釈剤の添加前にＰＧ／Ｇ中の脂質ブレンドを活性化することによりこれを達成する能力は、さらに驚くべきことであった。
【０２２６】
実施例１１．容器
バイアル、シリンジ、および可撓性プラスチックチューブを含む種々の容器に新しい脂質配合物またはＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）を充填してから活性化した。すべての研究で、適切量の脂質配合物を容器に入れ、ヘッドスペースをＰＦＰと交換し、容器をシールし、および配合物を活性化した。
【０２２７】
【表１８】
2020172507.tif 000020
【０２２８】
【表１９】
2020172507.tif 000021
【０２２９】
【表２０】
2020172507.tif 000022
【０２３０】
【表２１】
2020172507.tif 000023
【０２３１】
【表２２】
2020172507.tif 000024
【０２３２】
【表２３】
2020172507.tif 000025
【０２３３】
【表２４】
2020172507.tif 000026
【０２３４】
バイアル、シリンジ、およびプラスチックチューブをはじめとするさまざまな容器でメカニカルシェーカーによる脂質ブレンドＰＧおよびＰＧ／Ｇ配合物の振盪プロセスを達成可能であり、かつ活性化ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）と均等な特性を有するマイクロスフェアを生成可能であることがこうした研究から実証された。驚くべきことに、機械的振盪は、容器および容器を作製する材料の寸法差を克服し、均等なサイズおよび数を生成するマイクロスフェアの形成を可能にした。希釈剤の添加前および添加後の両方でシリンジ内においてＰＧおよびＰＧ／Ｇ中のＬＢ配合物が活性化されることは刺激的な知見である。希釈剤と配合物とを分離してから活性化前または活性化後に機械的振盪により２つの成分を一緒にしうることに加えて、容易な生成物製造により室温で安定な配合物を達成可能な調製物を提供する新たな機会をもたらす。
【０２３５】
実施例１２．活性化方法
ＶＩＡＬＭＩＸ（登録商標）を使用する以外のいくつかの方法を用いてＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）を活性化する能力を実証する研究を行った。こうした方法は、表２５に報告された結果と共に以下に記載されている。
【０２３６】
Ａ．ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（１．５ｍＬ）を３ｍｌプラスチックシリンジに入れて三方ストップコックに接続した。同一サイズの個別シリンジにＰＦＰガスを充填し、ストップコックの他のポートに接続した。各シリンジのプランジャーを前後に交互に５０〜４００回押圧することによりＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）およびＰＦＰガスを混合した。マイクロバブル数およびバブル直径の測定からＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）の活性化が示唆される。
【０２３７】
Ｂ．ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（３．０ｍＬ）を１０ｍｌプラスチックシリンジに入れて三方ストップコックに接続した。同一サイズの個別シリンジにＰＦＰガスを充填し、ストップコックの他のポートに接続した。各シリンジのプランジャーを前後に交互に２００回押圧することによりＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）およびＰＦＰガスを混合した。マイクロバブル数およびバブル直径の測定からＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）の活性化が示唆される。
【０２３８】
Ｃ．脂質配合物（１．５ｍＬの０．０４５ｍｇ／ｍＬ  ＤＰＰＡ、０．７５ｍｇ／ｍＬ  ＤＰＰＣ、０ｍｇ／ｍＬ  ＭＰＥＧ５０００ＤＰＰＥ、４．８７ｍｇ  ＮａＣｌ／ｍＬ、１０３．５ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール、１２６．２ｍｇ／ｍＬグリセロール、２．３４ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、２．１６ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨＰＯ４７Ｈ２０）を３ｍｌプラスチックシリンジに入れて三方ストップコックに接続した。同一サイズの個別シリンジにＰＦＰガスを充填し、ストップコックの他のポートに接続した。各シリンジのプランジャーを前後に交互に１００回押圧することにより配合物およびＰＦＰガスを混合した。マイクロバブル数およびバブル直径の測定からこの脂質配合物の活性化が示唆される。
【０２３９】
Ｄ．修飾脂質配合物（１．５ｍＬの０．０４５ｍｇ／ｍＬ  ＤＰＰＡ、０．７５ｍｇ／ｍＬ  ＤＰＰＣ、０ｍｇ／ｍＬ  ＭＰＥＧ５０００ＤＰＰＥ、４．８７ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ、１０３．５ｍｇ／ｍＬ  プロピレングリコール、１２６．２ｍｇ／ｍＬ  グリセロール、２．３４ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、２．１６ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨＰＯ４７Ｈ２０）を３ｍｌプラスチックシリンジに入れて三方ストップコックに接続した。同一サイズの個別シリンジにＰＦＰガスを充填し、ストップコックの他のポートに接続した。脂質配合物充填シリンジとストップコックとの間に、７つの高性能Ｘグリッドスタティックミキサー（ＳｔａＭｉｘＣｏ、ＧＸＰ−９、４−ＰＡ６６、ブラック）を備えたプラスチックチューブを置いた。各シリンジのプランジャーを前後に交互に５０回押圧することにより配合物およびＰＦＰガスを混合した。マイクロバブル数およびバブル直径の測定からこの脂質配合物の活性化が示唆される。
【０２４０】
Ｅ．修飾脂質配合物（１．５ｍＬの０．０４５ｍｇ／ｍＬ  ＤＰＰＡ、０．７５ｍｇ／ｍＬ  ＤＰＰＣ、０ｍｇ／ｍＬ  ＭＰＥＧ５０００ＤＰＰＥ、４．８７ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ、１０３．５ｍｇ／ｍＬ  プロピレングリコール、１２６．２ｍｇ／ｍＬ  グリセロール、２．３４ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、２．１６ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨＰＯ４７Ｈ２０）を３ｍｌプラスチックシリンジに入れて２つの三方ストップコックに直列接続した。同一サイズの個別シリンジにＰＦＰガスを充填し、ストップコックの他のポートに接続した。各シリンジのプランジャーを前後に交互に１００回押圧することにより配合物およびＰＦＰガスを混合した。マイクロバブル数およびバブル直径の測定からこの脂質配合物の活性化が示唆される。
【０２４１】
Ｆ．修飾脂質配合物（１．５ｍＬの０．０４５ｍｇ／ｍＬ  ＤＰＰＡ、０．７５ｍｇ／ｍＬ  ＤＰＰＣ、０ｍｇ／ｍＬ  ＭＰＥＧ５０００ＤＰＰＥ、４．８７ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ、１０３．５ｍｇ／ｍＬ  プロピレングリコール、１２６．２ｍｇ／ｍＬ  グリセロール、２．３４ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、２．１６ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨＰＯ４７Ｈ２０）を３ｍｌプラスチックシリンジに入れて三方ストップコックに接続した。同一サイズの個別シリンジにＰＦＰガスを充填し、ストップコックの他のポートに接続した。脂質配合物充填シリンジとストップコックとの間に、８つの高性能Ｘグリッドスタティックミキサー（ＳｔａＭｉｘＣｏ、ＧＸＦ−１０−２−ＭＥ、オレンジ）を備えたプラスチックチューブを置いた。各シリンジのプランジャーを前後に交互に１００回押圧することにより配合物およびＰＦＰガスを混合した。マイクロバブル数およびバブル直径の測定からこの脂質配合物の活性化が示唆される。
【０２４２】
Ｇ．修飾脂質配合物（１．５ｍＬの０．０４５ｍｇ／ｍＬ  ＤＰＰＡ、０．４０１ｍｇ／ｍＬ  ＤＰＰＣ、０．３０４ｍｇ／ｍＬ  ＭＰＥＧ５０００ＤＰＰＥ、４．８７ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ、１５５．２５ｍｇ／ｍＬ  プロピレングリコール、３１．５５ｍｇ／ｍＬ  グリセロール、２．３４ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、２．１６ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨＰＯ４７Ｈ２０）を３ｍｌプラスチックシリンジに入れて三方ストップコックに接続した。同一サイズの個別シリンジにＰＦＰガスを充填し、ストップコックの他のポートに接続した。各シリンジのプランジャーを前後に交互に１００回押圧することにより配合物およびＰＦＰガスを混合した。マイクロバブル数およびバブル直径の測定からこの脂質配合物の活性化が示唆される。
【０２４３】
Ｈ．ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（１．５ｍＬ）＋３．５ｍＬの生理食塩水を５ｍｌプラスチックシリンジに入れて三方ストップコックに接続した。同一サイズの個別シリンジにＰＦＰガスを充填し、ストップコックの他のポートに接続した。各シリンジのプランジャーを前後に交互に１００回押圧することによりＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）、生理食塩水、およびＰＦＰガスを混合した。マイクロバブル数およびバブル直径の測定からＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）の活性化が示唆される。
【０２４４】
Ｉ．ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（１．５ｍＬ）を３ｍｌプラスチックシリンジに入れて三方ストップコックに接続した。同一サイズの個別シリンジにＰＦＰガスを充填し、ストップコックの他のポートに接続した。ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）充填シリンジとストップコックとの間に、プラスチックヘリカルミキサー（ＳｔａＭｉｘＣｏ、２．５”×３／１６”、２．５インチで１５ヘリカルターン）を備えたプラスチックチューブを置いた。各シリンジのプランジャーを前後に交互に５０回押圧することによりＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）およびＰＦＰガスを混合した。マイクロバブル数およびバブル直径の測定からＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）の活性化が示唆される。
【０２４５】
Ｊ．ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（３．０ｍＬ）を１０ｍｌプラスチックシリンジに入れて三方ストップコックに接続した。同一サイズの個別シリンジにＰＦＰガスを充填し、ストップコックの他のポートに接続した。ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）充填シリンジとストップコックとの間に、プラスチックヘリカルミキサー（ＳｔａＭｉｘＣｏ、２．５”×３／１６”、２．５インチで１５ヘリカルターン）を備えたプラスチックチューブを置いた。各シリンジのプランジャーを前後に交互に５０回押圧することによりＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）およびＰＦＰガスを混合した。マイクロバブル数およびバブル直径の測定からＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）の活性化が示唆される。
【０２４６】
Ｋ．ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（１．５ｍＬ）を３ｍｌプラスチックシリンジに入れて、プラスチックヘリカルミキサー（ＳｔａＭｉｘＣｏ、２．５”×３／１６”、２．５インチで１５ヘリカルターン）を備えたプラスチックチューブに直接接続した。同一サイズの個別シリンジにＰＦＰガスを充填し、プラスチックチューブの他端に接続した。各シリンジのプランジャーを前後に交互に２５回押圧することによりＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）およびＰＦＰガスを混合した。マイクロバブル数およびバブル直径の測定からＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）の活性化が示唆される。
【０２４７】
Ｌ．ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（１．５ｍＬ）を３ｍｌプラスチックシリンジに入れて、２０ｕ  ＱＭＡフィルター（Ｗａｔｅｒｓ）に直接接続した。同一サイズの個別シリンジにＰＦＰガスが充填し、フィルターの他端に接続した。各シリンジのプランジャーを前後に交互に５０回押圧することによりＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）およびＰＦＰガスを混合した。マイクロバブル数およびバブル直径の測定からＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）の活性化が示唆される。
【０２４８】
Ｍ．ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（１．５ｍＬ）を３ｍｌプラスチックシリンジに入れて、２０ｕ  ＱＭＡフィルター（Ｗａｔｅｒｓ）とプラスチックヘリカルミキサー（ＳｔａＭｉｘＣｏ、２．５”×３／１６”、２．５インチに１５ヘリカルターン）を備えたプラスチックチューブとに直接接続した。同一サイズの個別シリンジにＰＦＰガスが充填し、ミキサーの他端に接続した。各シリンジのプランジャーを前後に交互に５０回押圧することによりＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）およびＰＦＰガスを混合した。マイクロバブル数およびバブル直径の測定からＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）の活性化が示唆される。
【０２４９】
Ｎ．ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（０．６ｍＬ）を１ｍｌガラスシリンジに入れて、５ｕフィルターを含有する１．５インチ金属ホルダーに接続した。同一サイズの個別ガラスシリンジにＰＦＰガスを充填し、金属ホルダーの他端に接続した。この押出し装置は市販されている（ＬｉｐｏｓｏＦａｓｔ−Ｂａｓｉｃ，Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．）。各シリンジのプランジャーを前後に交互に２５回押圧することによりＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）およびＰＦＰガスを混合した。マイクロバブル数およびバブル直径の測定からＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）の活性化が示唆される。
【０２５０】
Ｏ．ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（０．６ｍＬ）を１ｍｌガラスシリンジに入れて、５ｕフィルターを含有する１．５インチ金属ホルダーに接続した。同一サイズの個別ガラスシリンジにＰＦＰガスを充填し、金属ホルダーの他端に接続した。この押出し装置は市販されている（ＬｉｐｏｓｏＦａｓｔ−Ｂａｓｉｃ，Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．）。各シリンジのプランジャーを前後に交互に１００回押圧することによりＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）およびＰＦＰガスを混合した。マイクロバブル数およびバブル直径の測定からＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）の活性化が示唆される。
【０２５１】
Ｐ．ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（０．６ｍＬ）を１ｍｌガラスシリンジに入れて、０．４または１．０ミクロンフィルターのいずれかを含有する１．５インチ金属ホルダーに接続した。同一サイズの個別ガラスシリンジにＰＦＰガスを充填し、金属ホルダーの他端に接続した。この押出し装置は市販されている（ＬｉｐｏｓｏＦａｓｔ−Ｂａｓｉｃ，Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．）。各シリンジのプランジャーを前後に交互に２５回押圧することによりＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）およびＰＦＰガスを混合した。マイクロバブル数およびバブル直径の測定からＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）の活性化が示唆される。
【０２５２】
Ｑ．ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（１．５ｍＬ）のバイアルを最高設定で５分間ボルテックスした。マイクロバブル数およびバブル直径の測定からＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）の活性化が示唆される。
【０２５３】
Ｒ．ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（１．５ｍＬ）のバイアルを２分間超音波処理した。しかしながら、溶液が乳白色であったため、マイクロバブル数およびバブル直径測定の試験は行わなかった。
【０２５４】
Ｓ．ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（１．５ｍＬ）のバイアルを高速ブレードホモジナイザーで５分間処理した。しかしながら、溶液が乳白色であったため、マイクロバブル数およびバブル直径測定の試験は行わなかった。
【０２５５】
Ｔ．ＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）（１．５ｍＬ）のバイアルを０．７５”×２．２５”×２３”の木材スティックの端に固定し、１５”離れた２つの木材ポスト間で１００ヒット／２７秒の割合で３００〜１５００回移動し、マイクロバブル数またはバブル直径測定の試験を行った。マイクロバブル数およびバブル直径の測定からＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）の活性化が示唆される。
【０２５６】
【表２５】
2020172507.tif 000027
【０２５７】
さまざまな活性化デバイスを用いてＤＥＦＩＮＩＴＹ（登録商標）またはその改変体の活性化を達成可能であることがこうした研究から実証された。
【０２５８】
特許および特許出願を含めて本明細書に挙げられた参照文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【図１】
2020172507.tif 000028
【図２】
2020172507.tif 000029
【図３】
2020172507.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月30日(2020.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載される通りの発明。
【外国語明細書】
2020172507000001.pdf