(57)【要約】【課題】ナトリウム濃度センサーＮａｘチャンネル及び／又は酸感受性イオンチャンネルＡＳＩＣ１の発現や機能を阻害する剤、それを用いた食塩の過剰摂取や体液のナトリウム濃度上昇にともなう血圧上昇を抑制できる食塩感受性高血圧症の予防及び／又は治療用医薬、並びにこれらの剤及び医薬のスクリーニング方法、比較・評価法を提供する。【解決手段】等張ナトリウム濃度を超えるナトリウム濃度下で、終板脈管器官細胞に被検物質を接触させ、接触前のＮａ＋流入速度に対して当該細胞内へのＮａ＋流入速度が有意に減少すること特徴とするＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法、並びにＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能阻害剤及び食塩感受性高血圧の予防及び／又は治療用医薬を用いる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法であって、等張ナトリウム濃度を超えるナトリウム濃度下で、終板脈管器官細胞、あるいはＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１を発現する細胞に被検物質を接触させ、接触前の細胞内Ｎａ＋流入速度に対して当該細胞内へのＮａ＋流入速度が有意に減少すること特徴とするＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
食塩感受性高血圧症の予防及び／又は治療用医薬のスクリーニング方法であって、等張ナトリウム濃度を超えるナトリウム濃度下で、終板脈管器官細胞に被検物質を接触させ、当該細胞内へのＮａ＋流入速度が有意に減少することを特徴とする食塩感受性高血圧症の予防及び／又は治療用医薬のスクリーニング方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のスクリーニング方法において、等張ナトリウム濃度を超えるナトリウム濃度下で、終板脈管器官細胞に被検物質を接触させ、接触の有無において乳酸塩量、細胞外Ｈ＋濃度またはｐＨに有意な差があることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項４】
Ｎａｘチャンネルと蛍光タンパク質の融合タンパク質、もしくはＡＳＩＣ１と蛍光タンパク質の融合タンパク質を発現させた培養細胞に、被検物質を接触させ、接触の有無において前記培養細胞に由来する蛍光量に有意な差があることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項５】
Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で存在する非ヒト動物に、被検物質を投与し、当該非ヒト動物におけるＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の活性を比較・評価することを特徴とするＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で存在する非ヒト動物に、被検物質を投与し、当該非ヒト動物におけるＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の活性を比較・評価することを特徴とするＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法であって、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の活性の比較・評価が、前記非ヒト動物の血圧である、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で存在する非ヒト動物に、被検物質を投与し、当該非ヒト動物におけるＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の活性を比較・評価することを特徴とするＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法であって、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の活性の比較・評価が、前記非ヒト動物の血液とＣＳＦのＮａ＋濃度に依存する前記非ヒト動物の血圧による食塩感受性高血圧症の程度の比較・評価である、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
非ヒト動物がマウスである、請求項５〜７のいずれか記載のＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項１、３、４，５、６、７又は８に記載のＮａｘチャンネルの脳内Ｎａ＋濃度センサーの発現または機能及び／又はＮａｘチャンネルのシグナルを受け取るＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法によって得られるＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能阻害剤。
【請求項１０】
請求項２、３、４、７又は８に記載のＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法によって得られるＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１からのシグナル伝達を阻害する物質を有効成分とする食塩感受性高血圧の予防及び／又は治療用医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナトリウム濃度センサーＮａｘチャンネル及び／又は酸感受性イオンチャンネルＡＳＩＣ１の発現や機能を阻害する剤、それを用いた食塩の過剰摂取や体液のナトリウム濃度上昇にともなう血圧上昇を抑制できる食塩感受性高血圧症の予防及び／又は治療用医薬、並びにこれらの剤及び医薬のスクリーニング方法、比較・評価法に関する。
【０００２】
脳内の終板脈管器官（ＯＶＬＴ）に発現するナトリウム濃度センサーＮａｘチャンネル、および酸感受性イオンチャンネルＡＳＩＣ１の発現や機能を阻害することで、食塩の過剰摂取や体液のナトリウム濃度上昇にともなう血圧上昇を抑制できることを見出した。ＮａｘやＡＳＩＣ１の機能阻害を標的とすることで、食塩感受性高血圧の治療が可能になる。
【０００３】
厚生労働省の平成２６年度患者調査によると、我が国で最も患者数の多い疾患は高血圧症であり、患者数約１，０００万人、年間医療費１兆８，０００億円にものぼる国民病である。そして、高血圧患者の半数は、食塩の過剰摂取により血圧が高くなっている、いわゆる食塩感受性高血圧であると推定されている。
【０００４】
本発明は、脳内の終板脈管器官（ＯＶＬＴ）に発現するＮａｘチャンネル、および酸感受性イオンチャンネルＡＳＩＣ１を選択的に阻害することが、食塩感受性高血圧の治療に有効であることを示すものである。これまで、ＮａｘとＡＳＩＣ１が血圧制御に関与することは知られていなかった。本発明者らは、Ｎａｘ遺伝子欠損マウスや、ＯＶＬＴでＡＳＩＣ１の機能や発現を抑制したマウスは、食塩感受性の血圧上昇を起こさないことを見出し、ＮａｘおよびＡＳＩＣ１の機能阻害を標的とした新規の高血圧治療法の発明を完成した。
【背景技術】
【０００５】
高血圧の予防や改善の観点から、食塩摂取量の目標は一日当たり５ｇ未満である（世界保健機関、２０１２年)。しかし、平成２９年度国民健康・栄養調査によると、我が国の食塩摂取量の平均は目標をはるかに超える９．９ｇであった。加えて、現代のライフスタイルでは、外食や加工済み食品由来の食塩摂取が多く、摂取量をコントロールするのは非常に困難である。従って、食塩による血圧上昇のメカニズムそのものを標的とした治療が必要と考えられる。
【０００６】
近年では、食塩の過剰摂取による血圧上昇は、交感神経系の活性化による血管収縮によるものであると考えられている（非特許文献６５参照）。その機序として、食塩の過剰摂取により体液（血液や脳脊髄液）のナトリウム（Ｎａ＋）濃度が上昇すると、脳内でそれが感知され、その情報を受けて交感神経の制御中枢が活性化する、というモデルが多くの実験により裏付けられてきている。このことから、脳内でＮａ＋濃度を感知するシステムを阻害することが、食塩感受性高血圧の新たな治療法になりうると考えられるが、肝心の脳内Ｎａ＋濃度センサーの分子実体は不明であった。
【０００７】
以上の通り、中枢神経系を標的とした高血圧治療薬は開発されておらず、この開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Mente, A., O'Donnell, M.J., Rangarajan, S., McQueen, M.J., Poirier, P., Wielgosz, A., Morrison, H., Li, W., Wang, X., Di, C., et al. (2014). Association of urinary sodium and potassium excretion with blood pressure. N Engl J Med. 371, 601.611.
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、ナトリウム濃度センサーＮａｘチャンネル及び／又は酸感受性イオンチャンネルＡＳＩＣ１の発現や機能を阻害する剤、それを用いた食塩の過剰摂取や体液のナトリウム濃度上昇にともなう血圧上昇を抑制できる食塩感受性高血圧症の予防及び／又は治療用医薬、並びにこれらの剤及び医薬のスクリーニング方法、比較・評価法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、従来の課題を解決すべく鋭意検討した結果、脳内の終板脈管器官に発現するナトリウム濃度センサーＮａｘチャンネル、および酸感受性イオンチャンネルＡＳＩＣ１の発現や機能を阻害することで、食塩の過剰摂取や体液のナトリウム濃度上昇にともなう血圧上昇を抑制できることを見出した。
すなわち、ＮａｘやＡＳＩＣ１の機能阻害を標的とすることで、食塩感受性高血圧の予防及び／又は治療が可能になることを見出し、ついに、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
ここで、終板脈管器官は以下「ＯＶＬＴ」と略すことがあり、ＯＶＬＴに発現するナトリウム濃度センサーＮａｘチャンネルは以下「Ｎａｘ」又は「Ｎａｘチャンネル」と略すことがあり、酸感受性イオンチャンネルＡＳＩＣ１は以下「ＡＳＩＣ１」と略すことがある。
【００１２】
本発明は、交感神経の活性化を介した血圧上昇を担う、脳内Ｎａ＋濃度センサーの分子実体であるＮａｘチャンネル、およびＮａｘのシグナルを受け取る分子であるＡＳＩＣ１の機能阻害が、食塩感受性高血圧の新たな治療法となることを示すものである。Ｎａｘは細胞外Ｎａ＋濃度依存的に開口するナトリウムチャンネルであり（非特許文献２１参照）、その発現は脳内のＯＶＬＴなど、ごく限られた部位で認められる（非特許文献１７参照）。ＯＶＬＴは血液−脳関門を欠損しているとともに、脳室に面した位置にあるという特徴を持つため、体液のＮａ＋濃度を感知するのに適した脳内器官である。ＯＶＬＴにおいて、ＮａｘとＡＳＩＣ１は以下のような仕組みで血圧の制御に関与している。
【００１３】
食塩の過剰摂取により体液のＮａ＋濃度が上昇すると、ＯＶＬＴのグリア細胞 （アストロサイトおよび上衣細胞）に発現するＮａｘが活性化し、グリア細胞の糖取り込みと嫌気的解糖が亢進する。解糖により産生された乳酸は、乳酸／Ｈ＋共輸送体によって細胞外へと放出され、細胞外Ｈ＋濃度の上昇（ｐＨの低下）を引き起こす。その結果、ＯＶＬＴのニューロンに発現しているＡＳＩＣ１が活性化し、神経活動が亢進する。ＡＳＩＣ１を発現するＯＶＬＴニューロンは、交感神経活動の活性化を担っており、このニューロンが活性化することで血圧が上昇する。
【００１４】
本発明者らが調べた結果、体液中のナトリウム濃度がわずか５％上昇しただけで血圧は有意に上昇し、その大部分はＮａｘ依存的であった。このことから、Ｎａｘによる血圧上昇は、体液のナトリウム濃度上昇に鋭敏に反応するシステムであると考えられ、実際の食塩感受性高血圧患者でも活性化している可能性が高い。加えて、上記の標的分子は血液-脳関門の無いＯＶＬＴに存在するため、創薬候補化合物を探索する際に、血液−脳関門を通過できるものに限定しなくてよいという利点がある。さらにＮａｘは、生体内で発現している組織が限られているとともに、Ｎａｘ遺伝子欠損マウスには見かけ上の異常はなく、正常に生育する。また、ＡＳＩＣ１遺伝子欠損マウスについても、現時点で深刻な異常は報告されていない（非特許文献６６参照）。このことから、ＮａｘやＡＳＩＣ１機能阻害により副作用が起こるリスクは非常に小さいと推察される。
【００１５】
本発明は、脳内の終板脈管器官（ＯＶＬＴ）に発現するＮａｘチャンネル、および酸感受性イオンチャンネルＡＳＩＣ１を選択的に阻害することが、食塩感受性高血圧の治療に有効であることを示すものである。これまで、ＮａｘとＡＳＩＣ１が血圧制御に関与することは知られていなかった。本発明者らは、Ｎａｘ遺伝子欠損マウスや、ＯＶＬＴでＡＳＩＣ１の機能や発現を抑制したマウスは、食塩感受性の血圧上昇を起こさないことを見出し、ＮａｘおよびＡＳＩＣ１の機能阻害を標的とした新規の高血圧治療法に係る発明、すなわち、ナトリウム濃度センサーＮａｘチャンネルおよび酸感受性イオンチャンネルＡＳＩＣ１の発現や機能を阻害する剤、それを用いた食塩の過剰摂取や体液のナトリウム濃度上昇にともなう血圧上昇を抑制できる食塩感受性高血圧の予防及び／又は治療用医薬、並びにこれらの剤及び医薬のスクリーニング方法に係る発明を完成した。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
上記したように、終板脈管器官（ＯＶＬＴ）において、ナトリウム濃度センサーＮａｘチャンネルと酸感受性イオンチャンネルＡＳＩＣ１は以下のような仕組みで血圧の制御に関与している。
１）食塩の過剰摂取により体液のＮａ＋濃度が上昇する。
２）ＯＶＬＴのグリア細胞（アストロサイトおよび上衣細胞）に発現するＮａｘが活性化し、グリア細胞の糖取り込みと嫌気的解糖が亢進する。
３）解糖により産生された乳酸は、乳酸／Ｈ＋共輸送体によって細胞外へと放出され、細胞外Ｈ＋濃度の上昇（ｐＨの低下）を引き起こす。
４）ＯＶＬＴのニューロンに発現しているＡＳＩＣ１が活性化し、神経活動が亢進する。
５）ＡＳＩＣ１を発現するＯＶＬＴニューロンは、交感神経活動の活性化を担っており、このニューロンが活性化することで血圧が上昇する。
【００１８】
図８に示すように、上記の血圧の制御について食塩の過剰摂取より血圧上昇シグナル発生に至るまでの仕組みにより説明される。その中で、医薬のスクリーニング方法の標的（ターゲット）としては、図８の創薬標的１および創薬標的２として示すように、グリア細胞（アストロサイトおよび上衣細胞）に発現するＮａｘとＯＶＬＴのニューロンに発現するＡＳＩＣ１のいずれか、あるいは両方の発現またはその機能を阻害する剤が創薬標的となる。
【００１９】
また一方で、グリア細胞（アストロサイトおよび上衣細胞）に発現するＮａｘとＯＶＬＴのニューロンに発現するＡＳＩＣ１のいずれか、あるいは両方の発現を阻害あるいは阻止することが医薬に結び付くことに基づく、いわゆる核酸医薬としてのスクリーニング方法についても本発明の範囲内にある。
【００２０】
以上の通り本発明は、上記の血圧制御の仕組みなどから、食塩感受性高血圧症の予防及び／又は治療用医薬に結びつくスクリーニング方法を完成した発明に係る。
【００２１】
本発明は、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法であって、等張ナトリウム濃度を超えるナトリウム濃度下で、終板脈管器官細胞、あるいはＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１を発現する細胞に被検物質を接触させ、接触前の細胞内Ｎａ＋流入速度に対して、接触後の当該細胞へのＮａ＋流入速度が有意に減少することを特徴とするＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法に係る。
【００２２】
等張ナトリウム濃度とは生体中の生理的溶液による浸透圧と実質的に等しい浸透圧を示すナトリウム濃度を言い、高張ナトリウム濃度とは等張ナトリウム濃度を超える浸透圧を示すナトリウム濃度を言う。
【００２３】
例えば後述する図１Ａ、図１Ｂに示すように食塩の過剰摂取前後における血液や脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるＮａ＋の変化があり、図３Ｃ等に示すように高張ナトリウム濃度として１６０ｍＭＮａ＋、等張ナトリウム濃度として１４５ｍＭＮａ＋が実施されている。このように、高張ナトリウム濃度は等張ナトリウム濃度を超える浸透圧を示すナトリウム濃度であればよく、さらに具体的には、１４８ｍＭＮａ＋（等張ナトリウム濃度１４５ｍＭＮａ＋の２％増）〜２９０ｍＭＮａ＋（等張ナトリウム濃度１４５ｍＭＮａ＋の１００％増）の範囲であればよく、特に１５０ｍＭＮａ＋（同３．５％増）〜１７４ｍＭＮａ＋（同２０％増）を挙げることができる。
【００２４】
Ｎａ＋濃度は例えば後記する実施例にも記載のように、血液分析計ｉ−ＳＴＡＴなどの装置を用いて測定される数値による。あるいはＮａ＋の量あるいは濃度に応じて色調、色相が変化する色素等を使い、連続的あるいは不連続的にその数値を追跡することによってもよい。
【００２５】
例えばＮａ＋インジケーターとして蛍光を利用する場合、ＳＢＦＩ（励起波長３４０／３８０ｎｍ、発光波長５０５ｎｍ、Ｋｄ＝４ｍＭ）やAsante NaTRIUM Green（励起波長４８８−５１７ｎｍ、発光波長５４０ｎｍ、Ｋｄ＝２０ｍＭ）などのＮａ指示薬を用いることが挙げられる。これによりＮａ＋濃度を連続的あるいは不連続的に追跡、モニターあるいは定量することができる。また蛍光以外にも、インジケーターを選定することで、光吸収、燐光など、公知の測定方法を用いることができる。
【００２６】
Ｎａ＋流入速度に有意な差がないとは、被検物質を接触させる前のＮａ＋流入速度と被検物質を接触させた後のＮａ＋濃度とで、統計的に有意な差がないことを言い、例えば各々のデータ数値の標準偏差を基にｐ＜０.０５、ｐ＜０.０１又はｐ＜０００１であることを言う。
【００２７】
Ｎａ＋流入速度が有意に減少するとは、Ｎａ＋流入量を連続的あるいは不連続的に追跡、モニターあるいは定量し、流入の速度が有意に低下していることが認められることをいう。この場合、連続的に追跡、モニターあるいは定量している場合には、速度に応じた変化量となる傾きが有意に減ずることをいう。不連続的に追跡、モニターあるいは定量している場合には、所定時間あるいは間隔ごとのＮａ＋流入量を外挿した変化速度が有意に減ずることをいう。
【００２８】
本発明は、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法であって、等張ナトリウム濃度を超えるナトリウム濃度下で、終板脈管器官細胞に被検物質を接触させ、グリア細胞の糖取り込み能と嫌気的解糖の結果としての乳酸の産生を測定する、スクリーニング方法に係る。
【００２９】
さらに乳酸が産生される場合に乳酸／Ｈ＋共輸送体によって細胞外へと放出され、細胞外Ｈ＋濃度の上昇、またはｐＨの低下を測定する、スクリーニング方法に係る。
【００３０】
これらのスクリーニング方法において、産生乳酸の測定、細胞外Ｈ＋濃度の上昇、またはｐＨの低下については、有効な被検物質を接触させた場合にはこれらはＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害することから、上記のＮａ＋流入速度に有意な差がないと同様に、被検物質を接触させる前の産生乳酸の測定、細胞外Ｈ＋濃度またはｐＨの測定値と被検物質を接触させた後のこれらの測定値とで、統計的に有意な差がないことを言い、例えば各々のデータ数値の標準偏差を基にｐ＜０.０５、ｐ＜０.０１又はｐ＜０００１であることを言う。
【００３１】
さらに産生乳酸の量、細胞外Ｈ＋濃度あるいは量やｐＨ値が有意に変動する場合、産生乳酸の量、細胞外Ｈ＋濃度あるいは量やｐＨを連続的あるいは不連続的に追跡、モニターあるいは定量し、その量の変化が有意に変動していることが認められることをいう。この場合、連続的に追跡、モニターあるいは定量している場合には、速度に応じた変化量となる傾きが有意に減ずるあるいは増加することをいう。不連続的に追跡、モニターあるいは定量している場合には、所定時間あるいは間隔ごとの産生乳酸の量、細胞外Ｈ＋濃度あるいは量やｐＨを外挿した変化量が有意に変動することをいう。
【００３２】
さらに上記のような統計的に有意差があるか否かの定性的な評価方法のみならず、その数値によっては、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質である被験物質の阻害の程度を定量値として評価することもできる。
【００３３】
後述する図１Ａ、図１Ｂなどに示すように高塩濃度の摂取前後における血中又は脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＮａ＋濃度として等張ナトリウム濃度１４５ｍＭＮａ＋を超える、例えば１５３ｍＭＮａ＋（等張ナトリウム濃度１４５ｍＭＮａ＋の５％増）〜１６０ｍＭＮａ＋（同１０％増）程度を挙げることができる。
【００３４】
後述する図４Ｅ、図４Ｆ、図４Ｇなどに示すように細胞外Ｈ＋濃度の変化としてｐＨを測定することで、定量的に評価することができる。さらに具体的には、測定当初のｐＨより酸性側（Ｈ＋濃度増側）になるか否かを測定する。ｐＨが０．２〜２．０酸性側へ移動することを確認すればよい。
【００３５】
また細胞外Ｈ＋濃度の変化としてのｐＨの測定については、ｐＨにより色調あるいは吸収、蛍光波長等が変化する色素等を用いることで、光学的に追跡、モニターあるいは定量ができ、評価することができる。
【００３６】
例えば、ＢＣＥＣＦ（pKa=6.98）のような指示薬や、FFN102，FFN202のようなpH応答性蛍光偽神経伝達物質（pH-responsive fluorescent false neurotransmitter,FFN）を用いることが挙げられる。これによりH＋濃度あるいはpHを色素が発する蛍光等により光学的に連続的あるいは不連続的に追跡、モニターあるいは定量することができる。また蛍光以外にも、インジケーターを選定することで、光吸収、燐光など、公知の測定方法を用いることができる。
【００３７】
またスクリーニング方法として、非ヒト動物などを使用する場合には、被験物質投与と共に高張Ｎａも投与して、結果として血圧上昇が測定できるかを測定することもできる。血圧の測定は、被験物質の効能の有無を見る定性的な評価だけでなく、血圧を定量的に評価し、被験物質の効能の強さあるいは効力の強さを見ることもできる。
【００３８】
例えば後述する図７Ａ、図７Ｂなどに示すように動脈血の血圧の変化量として、高張Ｎａ液注入前後の差として、１ｍｍＨｇ〜２０ｍｍＨｇ、さらに２ｍｍＨｇ〜１５ｍｍＨｇ、特に４ｍｍＨｇ〜１０ｍｍＨｇの範囲となるかを確認すればよい。
【００３９】
産生乳酸の測定、細胞外Ｈ＋濃度またはｐＨの測定において、測定に必要な添加物等は適宜加えることができる。
【００４０】
本発明に係るスクリーニング方法に用いられる細胞、組織、器官、非ヒト動物は目的に応じ、本発明に開示する範囲に応じて選択すればよい。細胞としても１細胞であっても、複数の細胞や、細胞の塊としたものであってもよい。
【００４１】
＜Naxの発現あるいは機能を阻害する医薬品候補物質のスクリーニングに用いられる細胞＞
本発明のスクリーニング方法に用いられる細胞としては、動物細胞に対して、NaxをコードするcDNA（SCN7AのcDNA）を発現させることでスクリーニングに用いる細胞を作製することができる。
【００４２】
使用される細胞の種類については特に限定されることはなく、例えばラット由来のC6グリオブラストーマ細胞やマウス神経芽細胞Neuro-2Aを用いて作製することができる。
【００４３】
Naxをコードする遺伝子を発現させる方法についても限定されることはなく、例えばプラスミドDNAベクターやウイルスベクターを用いて発現させる方法を挙げることができる。
【００４４】
本発明に係るスクリーニング方法に用いるためには、Naxの発現量など、細胞の性質が揃っていることでデータの信頼性あるいは安定性が良くなるため好ましい。このため細胞をクローン化し、Naxの機能評価に使えるクローンを選別してから使用することが好ましい。
【００４５】
例えばドキシサイクリン（Dox）などの薬剤の存在下ではNaxが発現せず、Naxを発現させるための培地から前記Doxを除くことで初めてNaxが発現するようにした細胞を用いることができる。このようにした細胞は、Naxの機能が維持されているため、本発明のスクリーニング方法に用いることができる。
【００４６】
以下に、例として上記の細胞の作製方法を、図を用いて記載する。
・最初に、図９Ａに示すように、テトラサイクリン応答因子（TRE）のDNA配列に続けて、NaxをコードするcDNAをつないだ遺伝子配列を作製する。
・次いで、この遺伝子配列を組み込んだプラスミドベクターと、抗生物質のネオマイシン耐性の遺伝子を有するプラスミドベクターを同時に細胞に導入する。
・上記のプラスミドベクターが同時に導入された細胞をネオマイシンで処理し、生存すれば、遺伝子導入が成功している、とするものである。
・さらに、生存した細胞に対し、アデノウイルスベクターを用いてTetリプレッサータンパク（tTA）遺伝子を導入する。
【００４７】
Tetリプレッサータンパク（tTA）は、TREに結合することでTREの下流につないだNaxなどの遺伝子（図９ＢではNax）の発現を誘導する機能がある。このためドキシサイクリン（Dox）の存在下では、図９Ｂに示すように、tTAがTREに結合できなくなり、Naxが発現しない。これに対しDoxを培地から抜くと、Naxが発現するようになり、Naxの機能を評価できる細胞として使用できるようになる（例えば非特許文献３０、非特許文献４７参照）。
【００４８】
＜ASIC1の発現あるいは機能を阻害する医薬品候補物質のスクリーニングに用いる細胞＞
本発明のスクリーニング方法に用いられる細胞としては、動物細胞に対して、ヒトのASIC1aをコードするcDNA（ACCN2 variant1のcDNA）を発現させることでスクリーニングに用いる細胞を作製することができる。
【００４９】
使用される細胞の種類については特に限定されることはなく、例えば内因性にASICを発現していないCOS-7細胞などがよく用いて作製することができる。
【００５０】
ASICをコードする遺伝子を発現させる方法についても限定されることはなく、例えばプラスミドDNAベクターやウイルスベクターを用いて発現させる方法を挙げることができる。この場合も、上記のNaxの場合と同様に、クローン化するというステップを踏んでから使用することができる。
【００５１】
本発明に係るスクリーニング方法に用いられる器材としては公知の器材を適宜本発明の目的に応じて使用することができる。その内でも、スクリーニングに用いる材料、被験物質を加えてスクリーニングを行なう容器として、例えば市販の２４ウエルマイクロタイタープレート、９６ウエルマイクロタイタープレート、３８４ウエルマイクロタイタープレートあるいはこれらよりも多くのウエル数のマイクロタイタープレートであれば一度に大量の被験物質のスクリーニングを行うことができる。
【００５２】
また複数細胞、組織、器官を用いてスクリーニングを行う場合には、滅菌処理されたマイクロタイタープレートを用い、また複数細胞、組織、器官の大きさによっては、組織培養ができるようなシャーレタイプや、少ないウエル数のマイクロタイタープレートを用いて行なうことでよい。
【００５３】
等張ナトリウム濃度とは生体中の生理的溶液による浸透圧と実質的に等しい浸透圧を示すナトリウム濃度を言い、高張ナトリウム濃度とは等張ナトリウム濃度を超える浸透圧を示すナトリウム濃度を言う。
【００５４】
＜Naxの発現あるいは機能を阻害する医薬品候補物質のスクリーニング＞
本発明のスクリーニング方法は、細胞外液（培養液）のＮａ＋濃度を人為的に変えたときの、細胞内のＮａ＋濃度の変化を測定することで実施することができる。
【００５５】
すなわち、Ｎａｘが発現した細胞では、細胞外液（培養液）のＮａ＋濃度を人為的に高くすると、細胞内のＮａ＋濃度が上昇する。このため、Ｎａｘが発現した細胞内のＮａ＋濃度上昇速度が低下あるいは停止、消失させることのできる物質を医薬品候補物質とすることができる。
【００５６】
医薬品候補物質を、スクリーニングを行なう系に加えるタイミングは特に限定されない。タイミングとしては、例えば細胞外液（培養液）のＮａ＋濃度を、等張ナトリウム濃度を超えるナトリウム濃度となるように加えるなどの人為的に高くする前であってもよく、あるいは細胞外液（培養液）のＮａ＋濃度を人為的に高くした後でもよい。
【００５７】
細胞内のＮａ＋濃度を測定するためには、Ｎａ＋と結合したときには、上記したように蛍光強度が変化する化合物を細胞に取り込ませ、蛍光強度の変化を指標にして測定することができる。例えば前記したナトリウムインジケーターであるSBFIを用いて評価することができる。
【００５８】
細胞外液（培養液）のＮａ＋濃度を、等張ナトリウム濃度を超えるナトリウム濃度となるように加えるなどの人為的に高くしたときに、細胞外液（培養液）の乳酸濃度、Ｈ＋濃度、ｐＨなどを指標として、これらが変化するかを評価してスクリーニングすることもできる。
＜ASIC1aの発現あるいは機能を阻害する候補物質のスクリーニング＞
本発明のスクリーニング方法は、細胞外液（培養液）のＨ＋濃度を人為的に変えたときの、細胞内Ｎａ＋あるいはＣａ２＋濃度の変化を測定することで実施することができる。
【００５９】
すなわち、ASIC1aが発現した細胞では、細胞外液（培養液）のＨ＋濃度を人為的に高くすると、細胞内のＮａ＋およびＣａ２＋濃度が上昇する。このため、ASIC1aが発現した細胞内のＮａ＋あるいはＣａ２＋濃度上昇を軽減あるいは消失させることのできる物質を医薬品候補物質とすることができる。
【００６０】
細胞内のＣａ２＋濃度を測定するためには、Ｃａ２＋と結合したときには、上記したように蛍光強度が変化する化合物を細胞に取り込ませ、蛍光強度の変化を指標にして測定することができる。例えばカルシウム蛍光プローブである化合物として、1-[2-Amino-5-(2,7-difluoro-6-acetoxymethoxy-3-oxo-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid, tetra(acetoxymethyl) ester（Fluo-4、CAS番号；273221-67-3）など様々な化合物を用いて評価することができる。
【００６１】
あるいは、Ｃａ２＋と結合したときに蛍光強度が変化する蛍光タンパク質を細胞に発現させることでも測定できる。この場合、蛍光タンパクの蛍光強度の変化を指標にして測定することができる。
【００６２】
蛍光タンパクとしては、GCaMP6などが使用できる。この場合は、GCaMP6をコードするcDNAをプラスミドDNAベクターやウイルスベクターを用いて発現させることができる。
【００６３】
上記の細胞内のＮａ＋濃度、Ｃａ２＋濃度は、測定により定量的または半定量的に測定でき、その結果として得られた数値あるいは相対的な数値から、ＮａｘやＡＳＩＣ１の発現あるいは機能を阻害する医薬品候補物質の作用の程度を把握することができる。このため、医薬品候補物質が複数あればその作用の順位付けも可能である。
【００６４】
以上の通り、本発明に係るスクリーニング方法は図８に示すように、ＮａｘとＡＳＩＣ１が高血圧に関与するという知見を基にしてなされた発明である。このため、本発明の課題である食塩の過剰摂取や体液のナトリウム濃度上昇にともなう血圧上昇を抑制できる食塩感受性高血圧症の予防及び／又は治療用医薬を提供する目的で本発明のスクリーニング方法を実施することが有益であることが初めて理解されるものである。
【００６５】
本発明は、等張ナトリウム濃度を超えるナトリウム濃度下で、終板脈管器官細胞に被検物質を接触させ、接触の有無において乳酸塩量、細胞外Ｈ＋濃度またはｐＨに有意な差があることを特徴とするスクリーニング方法に係る。
【００６６】
具体的に、図１０に示すスクリーニング方法により医薬品対象物質を実施することができる。すなわち、終板脈管器官からの単離組織・細胞又はグリア細胞由来の培養細胞についてＮａｘが発現されたものを用い、例えば、等張Ｎａ濃度の培地（図８におけるＡ）、高Ｎａ濃度の培地（図８におけるＢ）および高Ｎａ濃度の培地と医薬品候補化合物の組み合わせ（図８におけるＣ）により培地中の乳酸濃度のレベルを測定する。
【００６７】
その結果、高Ｎａ濃度により乳酸濃度の抑えられた候補化合物が医薬品候補となる。乳酸濃度が抑えられたか否かは、図８において、ＡとＣとの乳酸濃度もしくは量を比較し、有意な差の有無を確認する。またＢについては必要に応じて行ない、スクリーニングがうまく進行しているかを確認する対照として行なうとよい。
【００６８】
上記のスクリーニング方法はグリア細胞などの嫌気的糖代謝が盛んな細胞を使う場合に好ましく用いられ得る。また材料としては、動物から終板脈管器官の組織を単離したものや、グリア細胞由来の培養細胞（C6グリオブラストーマ細胞）などにＮａｘ遺伝子を導入したもの使用するとよい。
【００６９】
また本発明は、食塩感受性高血圧症の予防及び／又は治療用医薬のスクリーニング方法であって、等張ナトリウム濃度を超えるナトリウム濃度下で、終板脈管器官細胞、あるいはＮａｘを発現する細胞に被検物質を接触させ、当該細胞内へのＮａ＋流入速度に有意な差が生じることを特徴とする食塩感受性高血圧症の予防及び／又は治療用医薬のスクリーニング方法に係る。
【００７０】
また本発明は、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上に存在する非ヒト動物に、被検物質を投与し、当該非ヒト動物におけるＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の活性を比較・評価することを特徴とするＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法に係る。
【００７１】
本発明は、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上に存在する非ヒト動物に、被検物質を投与し、当該非ヒト動物におけるＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の活性を比較・評価することを特徴とするＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法であって、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の活性の比較・評価が、前記非ヒト動物の血圧である、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法に係る。
【００７２】
本発明は、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上に存在する非ヒト動物に、被検物質を投与し、当該非ヒト動物におけるＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の活性を比較・評価することを特徴とするＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法であって、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の活性の比較・評価が、前記非ヒト動物の血液とＣＳＦのＮａ＋濃度に依存する前記非ヒト動物の血圧による食塩感受性高血圧症の程度の比較・評価である、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法に係る。
【００７３】
本発明は、非ヒト動物がマウスである、上記のＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法に係る。
【００７４】
本発明は、上記のＮａｘチャンネルの脳内Ｎａ＋濃度センサーの発現または機能及び／又はＮａｘチャンネルのシグナルを受け取るＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法によって得られるＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能阻害剤に係る。
【００７５】
本発明は、上記の脳内Ｎａ＋濃度センサーとしてのＮａｘチャンネルの発現または機能及び／又はＮａｘチャンネルのシグナルを受け取るＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法によって得られるＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質を有効成分とする食塩感受性高血圧の予防及び／又は治療用医薬に係る。
【００７６】
＜Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１からのシグナル伝達の阻害剤と、食塩感受性高血圧の予防及び／又は治療用医薬＞
本発明は、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１からのシグナル伝達の阻害剤であり、この剤はＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１からのシグナル伝達を阻害する物質を有効成分とする食塩感受性高血圧の予防及び／又は治療用医薬に用いることができる。
【００７７】
本発明の医薬の有効成分は、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１からのシグナル伝達を阻害する物質であればどのような物質でもよく、特に限定されない。Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１からのシグナル伝達を阻害する物質としては、例えば、抗Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１抗体、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１と結合するペプチド、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１と結合する化学物質などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの抗体、ペプチド又は化学物質は、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１と結合することにより、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の機能を阻害することができる抗体、ペプチド又は化学物質であることが好ましい。Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１からのシグナル伝達を阻害することができる抗体、ペプチド又は化学物質は、食塩感受性高血圧症の病態形成を抑制することができる。
【００７８】
Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１からのシグナル伝達を阻害することができる抗体として公知の抗体は、本発明の医薬の有効成分として好適に用いることができる。
【００７９】
抗Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１抗体は、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１、またはそのフラグメントを抗原として作製することができる。抗原に用いるＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１は、どのような動物由来のＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１でもよいが、哺乳動物のＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１であることが好ましく、ヒトのＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１であることがより好ましい。抗原に用いるＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１またはそのフラグメントは、それぞれを発現する細胞の培養上清や細胞抽出物から公知の方法（例えば、アフィニティーカラム）で精製する方法などを用いることができる。
【００８０】
本発明の医薬の有効成分として用いる抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等）でもよい。抗体は医薬として用いる場合にはヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体が好ましいまたスクリーニング方法又は活性の比較・評価法に用いる場合にはヒトまたはヒト以外の動物由来の抗体であってよい。
【００８１】
Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１からのシグナル伝達を阻害することができるペプチドとして、ＡＳＩＣ１の阻害剤である、ＰｃＴｘ１の誘導体や、これらの物質の薬学的に許容されるその塩を含む。公知のペプチドは、本発明の医薬の有効成分として好適に用いることができる。
【００８２】
本発明の医薬の有効成分として用いるペプチドは、公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法）または液相合成法により作製することができる。また、ペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを導入した形質転換体を用いて作製することができるなど、公知の方法を用いることができる。
【００８３】
Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１からのシグナル伝達を阻害することができる化学物質として、Ｎａチャンネルの阻害剤であるフグ毒、又はＡＳＩＣ１の阻害剤であるベンザミルの誘導体や、これらの物質の薬学的に許容されるその塩を含む。また、ＯＶＬＴにおける細胞外ｐＨの低下を抑制する化学物質を含む。さらに薬学的に許容されるその塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等の塩基付加塩や酸付加塩が挙げられる。さらに本発明においては、投与後に、生体中で（ｉｎ  ｖｉｖｏ）何らかの化学的又は生理的プロセスによって薬物を放出する薬物前駆体である化合物、すなわち「プロドラッグ」をも包含しうる。
【００８４】
さらにＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１からのシグナル伝達を阻害することができるものとして、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１を発現する遺伝子に作用し、その発現を阻害するＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸断片を用いることもできる。これらはＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の機能を発現する遺伝子に相補的配列、転写、翻訳を阻害する配列など、機能として発現を阻止できるものであれば特に制限はない。そのスクリーニング方法はＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現量を測定することでよい。
【００８５】
例えば後述するＡＳＩＣ１のａｍｉＲＮＡ（配列番号３、配列番号４）のようにＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の一部配列であって、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の機能、作用を阻害できる配列であれば、核酸医薬として食塩感受性高血圧症の予防及び／又は治療用医薬となりえ、候補医薬となる。これらの核酸はＡＡＶベクター等によりインビボノックダウンの手法により非ヒト動物に導入してその効能を評価することができる。
【００８６】
なお、本発明に係る食塩感受性高血圧症の予防及び／又は治療用医薬は、図Ｓ１Ｄ、図Ｓ１Ｅにもその一例が示されるように、各代謝レベルを示す生化学的な数値において、野生型とＮａｘチャンネルのノックダウン動物とで有意差がないことから、副作用は認められないものと推察される。
【００８７】
本発明に係るスクリーニング方法としては、グリア細胞（アストロサイトおよび上衣細胞）に発現するＮａｘとＯＶＬＴのニューロンに発現するＡＳＩＣ１のいずれか、あるいは両方の発現を阻害あるいは阻止することが医薬に結び付くことに基づく、いわゆる核酸医薬としてのスクリーニング方法も対象とする。
【００８８】
本発明は、ＮａｘチャンネルもしくはＡＳＩＣ１を発現させた培養細胞に、蛍光タンパク質を組み込み、かつ被検物質を接触させ、接触の有無において前記培養細胞に由来する蛍光量に有意な差がある、スクリーニング方法に係る。
【００８９】
いわゆる核酸医薬としては、ＮａｘあるいはASIC1a等のASIC1の全配列の一部を配列として持つものあるいはそれを基に作成される類似配列体を対象とする。さらにその配列としては、ヒトＮａｘあるいはASIC1の配列とすることが好ましい。
【００９０】
これらの配列あるいは候補配列としては、Ｎａｘの発現を阻害する効果があると予想される配列、およびASIC1a等のASIC1の発現を阻害する効果があると予想される配列を、コンピュータ等を用いて検索して複数ピックアップするという手法にて行なうことができる。さらにこの手法と同様ないかなる公知手法であってもよい。
【００９１】
具体的には、例えばASIC1aについて例示できる。
5'-TTTAGCCAAGTCTCCAAGAAT-3'      （配列番号５）
5'-TTAGCCAAGTCTCCAAGAATG-3'      （配列番号６）
5'-AGGTATGAGATACCAGACACA-3'      （配列番号７）
5'-ACCCTTCAACATGCGTGAGTT-3'      （配列番号８）
5'-GGGCAATGGGCTGGAAATCAT-3'      （配列番号９）
5'-ACTGACGAGACGTCCTTCGAA-3'      （配列番号１０）
5'-TCCTTCGAAGCAGGCATCAAA-3'      （配列番号１１）
5'-GGACTCGGATTTGGATTTCTT-3'      （配列番号１２）
5'-CGGATTTGGATTTCTTCGACT-3'      （配列番号１３）
5'-TACAAGGAGTGTGCAGATCCT-3'      （配列番号１４）
【００９２】
なお、上記配列番号５〜配列番号１４は考えられる配列に過ぎず、前記した通り、ＮａｘあるいはASIC1a等のASIC1の全配列の一部を配列として持つものあるいはそれを基に作成される類似配列であってもよい。従って上記配列番号５〜配列番号１４以外にも候補配列は考えられることは言うまでもなく、本発明はこれらの配列を示すことで何ら制限を受けることはない。
【００９３】
上記の通り、いわゆる核酸医薬のスクリーニング方法については、核酸医薬としてその多くは医薬品とする候補の対象遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解して、タンパク質に翻訳させないことで、医薬品としての効果を発揮するものをいう。その態様としては、一般に知られている通り、アンチセンス型、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、アプタマー型、ＣｐＧオリゴ型などが挙げられ、それぞれにおうじて一本鎖、２本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡが用いられる。
【００９４】
本発明において、後記する図５Ｅおよび図５Ｆに示すように、ASIC1のマイクロRNA(miRNA)を用いてASIC1のタンパク質が減ったことを確認した後、血圧に対する効果があるかを評価している。図５ＥではASIC1に対するマイクロRNAと偽薬（LacZ遺伝子に対するマイクロRNA）を局所注入し、ASIC1の発現（赤で表示）が減ったことを確認している。図５ＦではASIC1に対するマイクロRNAを注入したマウスで血圧を抑えたことを示している。
【００９５】
このことから、いわゆる核酸医薬のスクリーニング方法については、対象遺伝子（ＮａｘあるいはASIC1）の発現が抑制されたかどうかを指標に行なうことが好ましく、本発明のスクリーニング方法において用いられる細胞としては培養細胞を用いることが好ましい。
【００９６】
また核酸医薬のスクリーニング方法において評価される指標としてはメッセンジャーRNA量や発現するタンパク質量を直接定量する方法が挙げられる。
【００９７】
以下の図１１に示す方法により遺体的に説明する。
・プラスミドベクターやウイルスベクターを用いて、培養細胞にＮａｘあるいはASIC1を発現させる。
・このとき、ＮａｘあるいはASIC1に、GFPやmCherryなどの蛍光タンパク質を結合させておく。すなわちFused-geneの形で発現ベクターをデザインする。
・こうすることで、蛍光の強さがＮａｘあるいはASIC1タンパクの発現量として評価できる。
・その後、核酸医薬の候補となる物質を培地に添加し、一定時間後に蛍光が減ったかどうかを評価する。
・蛍光が変わらない場合は効果がなく、蛍光が減衰あるいは抑制されることでＡＳＩＣ１の発現抑制効果があることが分かる。
以上の処方により、核酸医薬の候補となる物質をスクリーニングすることができる。この方法はメッセンジャーRNA量やタンパク質量を直接定量するよりも簡便な方法として期待できる。
【００９８】
本発明の医薬は、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１からのシグナル伝達を阻害する物質を有効成分とし、常套手段に従って製剤化することができる。製剤可能方法は公知の手法を適宜適用すればよい。
【００９９】
＜スクリーニング方法＞
本発明は、食塩感受性高血圧症治療薬のスクリーニング方法に係る。本発明のスクリーニング方法は、終板脈管器官（ＯＶＬＴ）に発現するＮａｘチャンネル及び／又は酸感受性イオンチャンネルＡＳＩＣ１を用いることを特徴とする。本発明のスクリーニング方法に用いるＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１は、どのような動物由来のＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１でもよいが、哺乳動物のＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１であることが好ましく、ヒトのＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１であることがより好ましい。Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１またはこれらのフラグメントは、公知の方法をで作製することができる。
【０１００】
本発明のスクリーニング方法において用いる被験物質は、特に限定されないが、例えば、核酸、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等を好ましく用いることができる。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。これら被験物質は塩を形成していてもよい。被験物質の塩としては、生理学的に許容される酸や塩基との塩が用いられる。
【０１０１】
本発明のスクリーニング方法により、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１からのシグナル伝達を阻害する物質を選択することが好ましい。Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１からのシグナル伝達を阻害すれば、食塩感受性高血圧症の病態形成を抑制することができ、食塩感受性高血圧症を予防および／または治療することができる。
【０１０２】
本発明のスクリーニング方法により、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１からのシグナル伝達を阻害する物質を選択する場合、例えば、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と、野生型の非ヒト動物とに、被検物質を投与する工程と、これら非ヒト動物におけるＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の活性を比較・評価する工程とを含む方法を好適に用いることができる。
【０１０３】
被験物質と投与しない対照群における機能の発現量と比較して、被験物質を投与した場合に活性が低下していれば、当該被験物質を食塩感受性高血圧症治療薬候補物質として選択すれることができる。対照群の活性と比較して、統計学的に有意に阻害活性を有する被験物質を選択することが好ましい。
【０１０４】
本発明のスクリーニング方法により、ＮａｘチャンネルからのシグナルをＡＳＩＣ１が受け取るという相互作用を阻害する物質を選択することが好ましい。この相互作用を阻害すれば、食塩感受性高血圧症の病態形成を抑制することができ、食塩感受性高血圧症を予防および／または治療することができる。
【０１０５】
本発明のスクリーニング方法により、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１からのシグナル伝達を阻害する物質を選択する場合、例えば、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と、野生型の非ヒト動物とに、被検物質を投与する工程と、これら非ヒト動物におけるＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の活性を比較・評価する工程と、被験物質を投与しない場合の活性レベルと比較して、活性レベルを低下させる、すなわちＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の機能を阻害する活性が高い被験物質を選択する工程を含む方法を好適に用いることができる。
【０１０６】
Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の機能を阻害する活性を確認する方法は特に限定されず、公知の方法を適宜選択して使用することができる。例えば、血液およびＣＳＦ［Ｎａ＋］の定量、血圧（ＢＰ）の測定、免疫組織化学、光遺伝学実験による測定、ＯＶＬＴスライスにおけるインビトロ電気生理学による測定、グルコースイメージング、乳酸塩濃度の測定、画像解析などを好適に用いることができる。
【０１０７】
被験物質を投与しない対照群におけるＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の機能を阻害する活性のレベルと比較して、被験物質を投与した場合にＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の機能を阻害する活性のレベルが有意に変動していれば、当該被験物質を目的物質として選択すれることができる。対照群の結合レベルと比較して、統計学的に有意に活性のレベルを変動させる被験物質を選択することが好ましく、活性のレベルを定量化し、判断する基準数値を設定して被験物質を選択することがより好ましい。
【０１０８】
本発明には、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１からのシグナル伝達を阻害する物質の有効量を投与する工程を包含することを特徴とする食塩感受性高血圧症の予防および／または治療のための医薬の使用が含まれる。
【０１０９】
本明細書において「薬学的に許容されるその塩」としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等の塩基付加塩や酸付加塩が挙げられる。さらに本発明においては、投与後に、生体中で（ｉｎ  ｖｉｖｏ）何らかの化学的又は生理的プロセスによって薬物を放出する薬物前駆体である化合物、すなわち「プロドラッグ」をも包含しうる。
【発明の効果】
【０１１０】
脳内の終板脈管器官（ＯＶＬＴ）に発現するＮａｘチャンネル、および酸感受性イオンチャンネルＡＳＩＣ１の発現や機能を阻害することで、食塩の過剰摂取や体液のＮａ＋濃度上昇にともなう血圧上昇を抑制できることを見出した。食塩感受性高血圧において、体液中のＮａ＋濃度の上昇が何らかの機構で感知されて、血圧上昇を起こしていることは以前から示唆されていたが、Ｎａ＋濃度感知機構の分子実体は不明であった。ＮａｘやＡＳＩＣ１の機能を阻害する化合物を探索することすることで、新規の作用機序を持つ血圧改善薬を開発することが可能となり、食塩感受性高血圧の治療につながる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１Ａ】食塩の過剰摂取前（対照）および食塩の過剰摂取後（ＨＳ）において、血液中のＮａ＋濃度を示す。
【図１Ｂ】食塩の過剰摂取前（対照）および食塩の過剰摂取後（ＨＳ）において、脳脊髄液（ＣＳＦ、以下「脳脊髄液」を「ＣＳＦ」と略すことがある）を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、対照およびＨＳ摂取マウスにおけるＭＢＰ（平均動脈血圧、以下「平均動脈血圧」を「ＭＢＰ」と略すことがある）の概日変化を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、対照およびＨＳ摂取マウスにおける２４時間にわたる平均ＭＢＰを示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、腹腔内（ｉ．ｐ．、以下「腹腔内」を「ｉ．ｐ．」と略すことがある）注射後のＭＢＰの変化を示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、自由に動く条件下での、高張性（４５０ｍＭ［Ｎａ＋］、左）および等張性（１４５ｍＭ［Ｎａ＋］、右）Ｎａ溶液の脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．、以下「脳室内」を「ｉ．ｃ．ｖ．」と略すことがある）注入に応答するＭＢＰの変化を示す。
【図１Ｇ】図１Ｇは、ＣＳＤで前処置したマウスにおける高張Ｎａ溶液の脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）注入に応答したＭＢＰの変化を示す。
【図１Ｈ】図１Ｈは、ＭＢＰにおけるＣＳＤ感受性成分（左）およびＮａｘ依存成分（右）のプロファイルを示す。
【図１Ｉ】図１Ｉは、マウスをマニング化合物で前処理したときの高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答するＭＢＰの変化を示す。
【図１Ｊ】図１Ｊは、マウスをＭＣおよびＣＳＤで前処理したときの高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答するＭＢＰの変化を示す。
【図１Ｋ】図１Ｋは、マウスを麻酔下、ＭＣで前処理したときの高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答するＭＢＰの変化を示す。
【図１Ｌ】図１Ｌ（左）は、高張Ｎａ溶液の脳室内注入の直前（０分）および１０分後の腰部ＳＮＡの代表的な生の記録を示し、図１Ｌ（右）は、高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答した腰部ＳＮＡの変化を示す。
【図２Ａ】図２Ａ上は、逆行性トレーサーＣＴｂ−４８８のＰＶＮへの注入およびＳＦＯ（→ＰＶＮ）およびＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの逆行性ラベリングを示す模式図であり、図２Ａ下は、Ｎａｘ（赤色で示す）およびＣＴｂ−４８８（緑色で示す）シグナルを感知したことを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂ左は、ＨＳ摂取前（対照）またはＨＳ摂取後（ＨＳ）のＳＦＯにおけるＦｏｓ（赤色で示す）およびＣＴｂ−４８８（緑色で示す）シグナルを示し、図２Ｂ右は、ＣＴｂ−４８８陽性（ＣＴｂ＋）細胞におけるＦｏｓ陽性（Ｆｏｓ＋）細胞の割合のサマリーである。
【図２Ｃ】図２Ｃ左は、ＨＳ摂取前（対照）またはＨＳ摂取後（ＨＳ）のＯＶＬＴ（Ｃ）におけるＦｏｓ（赤色で示す）およびＣＴｂ−４８８（緑色で示す）シグナルを示し、図２Ｃ右は、ＣＴｂ−４８８陽性（ＣＴｂ＋）細胞におけるＦｏｓ陽性（Ｆｏｓ＋）細胞の割合のサマリーである。
【図２Ｄ】図２Ｄ左は、Ｖｇｌｕｔ２−ＣｒｅマウスのＰＶＮへのＨｉＲｅｔ−ＤＩＯ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰの注入を示す模式図であり、図２Ｄ右は、ＯＶＬＴでのＥＹＦＰ発現を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、麻酔下で異なる周波数でＯＶＬＴの光学的刺激（青色の期間）に応答するＭＢＰの代表的な変化を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆ左は、ＣＳＤ前処理の有無により、５Ｈｚでの光刺激に応答するＭＢＰの代表的な変化を示し、図２Ｆ右は、ＭＢＰの変化のサマリーである。
【図２Ｇ】図２Ｇ左は、野生型（ＷＴ）またはＶｇｌｕｔ２−ＣｒｅマウスのＰＶＮへのＨｉＲｅｔ−ＤＩＯ−ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰの注入を示す模式図であり、図２Ｇ右は、Ｖｇｌｕｔ２−ＣｒｅマウスのＯＶＬＴにおけるＥＹＦＰ発現を示す。
【図２Ｈ】図２Ｈ左は、光学刺激をオン（Ｏｐｔ ＯＮ）またはオフ（Ｏｐｔ Ｏｆｆ）した高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答するＭＢＰの変化を示し、図２Ｈ右は、ＭＢＰの変化のサマリーである。
【図３Ａ】図３Ａは、電気生理学的実験の概略図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＣＴｂ−５５５標識ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの発火活性におけるＣＨＣＡを用いた高張［Ｎａ＋］（１６０ｍＭ）の効果を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃ左は、解離したＯＶＬＴ細胞によるグルコース（２−ＮＢＤＧ）の取り込みのイメージング分析を示し、図３Ｃ右は、ＧＦＡＰおよびＮａｘ（ＧＦＡＰ＋、Ｎａｘ＋）およびどちらも発現しない細胞（ＧＦＡＰ−、Ｎａｘ−）を発現する細胞によるグルコース取り込みの概要である。
【図３Ｄ】図３Ｄ左は、野生型（ＷＴ）およびＮａｘ−ＫＯマウスから解離したＯＶＬＴ細胞のグルコースイメージング（２−ＮＢＤＧ）を示し、図３Ｄ右は、グルコース摂取の概要である。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＯＶＬＴ組織における乳酸塩放出を示す。
【図３Ｆ】図３Ｆ左、下は、星状細胞および上衣細胞を切除する戦略を示す模式図であり、図３Ｆ右は、ＯＶＬＴ組織からの乳酸の放出を示す。
【図３Ｇ】図３Ｇは、ＯＶＬＴ組織からの乳酸塩放出に対するα−ＣＨＣＡ（５ｍＭ）の影響を示す。
【図３Ｈ】図３Ｈは、麻酔下での高張Ｎａ溶液（４５０ｍＭ）の脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）．注入に応答するＭＢＰを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの発火活性に対する１ｍＭ乳酸塩の効果を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、５ｍＭ乳酸塩がＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの発火活性に及ぼす効果を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、低ｐＨ溶液がＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの発火活性に及ぼす効果を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄ左は、ＯＶＬＴの位置とイメージングの場所を示す模式図（右側のパネルのボックス）を示し、図４Ｄ右は、野生型（ＷＴ）およびＮａｘ−ＫＯマウスからのＯＶＬＴスライスの細胞間空間におけるｐＨを示す代表的な疑似カラー画像（本明細書では白黒画像）である。
【図４Ｅ】図４Ｅは、四角で示した撮像領域のｐＨ変化の時間経過を示す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、軽度の酸性化に応答したＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの発火活性に対する乳酸塩の効果を示す。
【図４Ｇ】図４Ｇは、ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの発火活性に及ぼす低ｐＨおよび高浸透圧の効果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ビヒクル、ベンザミルを、麻酔下でＯＶＬＴに注射した後の高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答するＭＢＰの変化を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＰｃＴｘ１またはＡＰＥＴｘ２を、麻酔下でＯＶＬＴに注射した後の高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答するＭＢＰの変化を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、図５Ａおよび図５ＢにおけるＭＢＰの変化のまとめを示す。
【図５Ｄ】図５Ｄ上、左は、ＣＴｂ−４８８を用いてＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンを感知する戦略の概略図であり、図５Ｄ上、右、下は、ＯＶＬＴのＡＳＩＣ１（赤色で示す）とＣＴｂ−４８８（緑色で示す）信号である。
【図５Ｅ】図５Ｅ左は、野生型（ＷＴ）マウスのＯＶＬＴにＬａｃＺまたはＡＳＩＣ１のＥｍＧＦＰおよび人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）を運ぶＡＡＶウイルスベクターの注入を示す概略図であり、図５Ｅ右は、ＯＶＬＴにおけるＥｍＧＦＰおよびＡＳＩＣ１の免疫蛍光を示す。
【図５Ｆ】図５Ｆは、高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答したＭＢＰの変化を示す。
【図５Ｇ】図５Ｇは、シナプス伝達の遮断下でのＣＴｂ−５５５標識ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの発火活性に対するベンザミルによる高張［Ｎａ＋］の効果を示す。
【図５Ｈ】図５Ｈは、シナプス伝達の遮断下でのＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの発火活性に対するＰｃＴｘ１の高張［Ｎａ＋］の効果を示す。
【図５Ｉ】図５Ｉは、麻酔下でのＡＳＬ１活性化因子、ＭｉｔＴｘ（０．１又は１μＭ）のＯＶＬＴへの連続注入に応答するＭＢＰの変化を示す。
【図５Ｊ】図５Ｊは、麻酔下でのＡＳＬ１活性化因子、ＭｉｔＴｘ（０．１又は１μＭ）のＯＶＬＴへの連続注入に応答するＭＢＰの変化を示す。
【図５Ｋ】図５Ｋは、図５Ｉおよび図５ＪにおけるＭＢＰの変化のサマリーを示す。
【図６Ａ】図６Ａ左、上は、ＣＴＶ−４８８のＲＶＬＭへの注入およびＰＶＮ（→ＲＶＬＭ）ニューロンの逆行性ラベリングを示し、図６Ａ右は、ＣＴｂ−４８８陽性（ＣＴｂ＋）細胞におけるＦｏｓ陽性（Ｆｏｓ＋）細胞の割合のサマリーである。
【図６Ｂ】図６Ｂ上は、ＲＶＬＭを示す冠状脳切片の模式図であり、図６Ｂ下、右は、ＴＨ＋細胞におけるＦｏｓ陽性（Ｆｏｓ＋）細胞の割合のサマリーである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、塩誘発血圧（ＢＰ）上昇の中心的メカニズムを示す。
【図Ｓ１Ａ】図Ｓ１Ａは、収縮期血圧（ＳＢＰ、上）、拡張期血圧（ＢＰ）（ＤＢＰ、中）および平均動脈血圧（ＭＢＰ、下）の概日変化を示す。
【図Ｓ１Ｂ】図Ｓ１Ｂ左は、コントロールおよびＨＳ摂取マウスの運動活性の概日変化を示し、図Ｓ１Ｂ右は、２４時間にわたる全運動活動を示す。
【図Ｓ１Ｃ】図Ｓ１Ｃは、実験手順の模式図である。
【図Ｓ１Ｄ】図Ｓ１Ｄは、対照（−１日目）条件下の野生型（ＷＴ）およびＮａｘ−ＫＯマウスの塩および水代謝を示す。
【図Ｓ１Ｅ】図Ｓ１Ｅは、ＨＳ摂取（７日目）（図Ｓ１Ｅ）条件下の野生型（ＷＴ）およびＮａｘ−ＫＯマウスの塩および水代謝を示す。
【図Ｓ２Ａ】図Ｓ２Ａは、ＤＯＣＡ塩処理の０日目および２０日目の血液を示す。
【図Ｓ２Ｂ】図Ｓ２Ｂは、ＤＯＣＡ塩処理の０日目および２０日目のＣＳＦ Ｎａ＋濃度を示す。
【図Ｓ２Ｃ】図Ｓ２Ｃは、２０日間のＤＯＣＡ塩治療前後の血圧（ＢＰ）の変化を示す。
【図Ｓ２Ｄ】図Ｓ２Ｄは、非処理（対照）およびＤＯＣＡ塩（ＤＯＣＡ）野生型（ＷＴ）およびＮａｘ−ＫＯマウスにおけるＣＳＤ注射によって誘導された血圧（ＢＰ）の変化を示す。
【図Ｓ２Ｅ】図Ｓ２Ｅは、等張性および高張性生理食塩水の腹腔内の前および後の野生型（ＷＴ）およびＮａｘ−ＫＯマウスにおける血液およびＣＳＦ［Ｎａ＋］を示す。
【図Ｓ２Ｆ】図Ｓ２Ｆは、麻酔下での等張および高張食塩水の腹腔内注入に応じたＭＢＰの変化を示す。
【図Ｓ２Ｇ】図Ｓ２Ｇは、ＣＳＤで前処理したマウスにおける高張食塩水の腹腔内（ｉ．ｐ．）注入に応じたＭＢＰの変化を示す。
【図Ｓ２Ｈ】図Ｓ２Ｈは、図Ｓ２Ｆおよび図Ｓ２Ｇにおける腹腔内注入の開始後３０分のＭＢＰの変化のサマリーを示す。
【図Ｓ３Ａ】図Ｓ３Ａは、冠状脳切片を示す。局所破壊の代表的な成功例を示す。
【図Ｓ３Ｂ】図Ｓ３Ｂは、麻酔下の野生型（ＷＴ）マウスにおける高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答するＭＢＰの変化を示す。
【図Ｓ３Ｃ】図Ｓ３Ｃ左は、Ｖｇｌｕｔ２−ｉｒｅｓ−ＣｒｅまたはＶｇａｔ−ｉｒｅｓ−ＣｒｅマウスのＰＶＮへのＨｉＲｅｔ−ＤＩＯ−ＣｈＲ２―ＥＹＦＰの注入を示す模式図であり、図Ｓ３Ｃ中は、ＯＶＬＴにおけるＥＹＦＰ発現を示し、図Ｓ３Ｃ右は、ＯＶＬＴ中のＥＹＦＰ陽性細胞数を示す。
【図Ｓ４】図Ｓ４左は、ＡＡＶ−ＥｍＧＦＰ−ＬａｃＺ ａｍｉＲＮＡを第３脳室（３Ｖ）またはＯＶＬＴに注入する模式図である。
【図Ｓ５Ａ】図Ｓ５Ａ上は、ＰＶＮへのＣＴｂ−４８８の注入および正中視索前核（ＭｎＰＯ）の逆行性標識を示す模式図であり、図Ｓ５Ａ下は、少数のＣＴｂ−４８８陽性ニューロンがＭｎＰＯ中に検出されたことを示す。ｄＭｎＰＯ、背面ＭｎＰＯ；ｖＭｎＰＯ、腹側ＭｎＰＯ；ａｃａ、前交連。
【図Ｓ５Ｂ】図Ｓ５Ｂは、ｄＭｎＰＯのＡＳＩＣ１（赤色で示す）とＣＴｂ−４８８（緑色で示す）信号を示す。
【図Ｓ５Ｃ】図Ｓ５Ｃは、野生型（ＷＴ）およびＮａｘ−ＫＯマウスのＯＶＬＴおよびｄＭｎＰＯにおけるＮａｘシグナルの検出を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、野生型マウスのＯＶＬＴへ、ＡＳＩＣ１ａの選択的阻害剤Ｐｓａｌｍｏｔｏｘｉｎ−１の局所的注入をおこなった結果を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、野生型マウスのＯＶＬＴで、人工マイクロＲＮＡを用いたＡＳＩＣ１の局所的ノックダウンをおこなった結果を示す。
【図８】食塩の過剰摂取より血圧上昇シグナル発生に至るまでの仕組みを示す図である。
【図９Ａ】テトラサイクリン応答因子（TRE）のDNA配列に続けて、NaxをコードするcDNAをつないだ遺伝子配列を作製する配列構造を示す図である。
【図９Ｂ】ドキシサイクリン（Dox）の存在下でtTAがTREに結合できなくなりNaxが発現せず、Doxを培地から抜くとＮａｘが発現するようになることを示す図である。
【図１０】終板脈管器官からの単離組織・細胞を例とした。
【図１１】核酸医薬のスクリーニング方法において、ＮａｘあるいはASIC1タンパク質の発現量として簡便に評価する方法示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１１２】
＜はじめに＞
Ｎａｘ−ＫＯ（「Ｎａｘノックアウト」のことであって、以下、本明細書においては単に「Ｎａｘ−ＫＯ」ということがある）マウスは、塩負荷によって誘発される塩感受性高血圧を示さない。ＯＶＬＴ中のＮａｘ陽性グリア細胞は、体液中のＮａ＋増加によって活性化される。活性化されたグリア細胞は、ＡＳＩＣ１ａ陽性ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンを活性化するためにＨ＋放出を促進する。ニューロンは、ＲＶＬＭを介して交感神経媒介性高血圧を誘発する。
【０１１３】
野村（Nomura）らの報告において、ＮａＣｌ誘発性の交感神経活性化を介した血圧上昇の神経機構を報告している。ＯＶＬＴ（organum vasculosum lamina terminalis）におけるＮａｘによるＮａ＋の感知、およびその後のＮａｘ陽性グリア細胞から放出されたＨ＋によるＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンにおけるＡＳＩＣ１ａ活性化は、このプロセスにおける主要なステップである。
【０１１４】
過度の食塩摂取による体液中のナトリウム濃度［Ｎａ＋］の増加は、交感神経活動（ＳＮＡ、以下「ＳＮＡ」と略すことがある）を高めることによって血圧（ＢＰ）を上昇させる。しかし、増加した［Ｎａ＋］に関する情報がＳＮＡに翻訳されるメカニズムはまだ解明されていない。
【０１１５】
本発明者らは、野生型マウスとは対照的に、血圧（ＢＰ）増加をもたらす交感神経活性化が、高塩濃度摂取またはＮａｘノックアウトマウスにおける高張性ＮａＣｌ溶液の腹腔内/脳室内注入によって誘発されなかったことを明らかにした。
【０１１６】
本発明者らは、体液中の［Ｎａ＋］の増加を検出するセンサーとして、ＯＶＬＴの特定の神経膠細胞（グリア細胞）に発現するＮａｘチャンネルを同定し、心室核（ＰＶＮ、以下「ＰＶＮ」と略すことがある）に突出するＯＶＬＴニューロンが酸感知Ｎａｘ陽性グリア細胞から放出されたＨ＋イオンによるイオンチャンネル１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）現在の結果は、塩誘発血圧（ＢＰ）上昇に関与する神経原性機構についての洞察を提供する。
【０１１７】
＜前書き＞
ＮａＣｌ摂取量と血圧（ＢＰ）との間に正の相関関係が確立されている（非特許文献１参照）。時間制御サンプリングを用いた実験的および臨床的研究は、血漿中のナトリウム濃度［Ｎａ＋］および脳脊髄液（ＣＳＦ）を増加させることを示している（非特許文献２及び非特許文献３参照）。
【０１１８】
実験動物を用いたこれまでの研究は、高張ＮａＣｌ溶液の腹腔内（ｉ．ｐ．、以下「ｉ．ｐ．」と略すことがある）および静脈内（ｉ．ｖ．、以下「ｉ．ｖ．」と略すことがある）投与が血圧（ＢＰ）を急激に上昇させることを明らかにした（非特許文献４及び非特許文献５参照）。血漿中の上昇［ＮａＣｌ］は血管内液量の増加を誘導し（非特許文献６参照）、脳下垂体から血液中へのバソプレシン分泌を誘発することが示唆されている（非特許文献７参照）。バソプレッシンは、血管平滑筋細胞で発現されるＶ１ａ受容体を活性化することによって血管収縮を誘導する（非特許文献７参照）。
【０１１９】
これらのメカニズムに加えて、血漿およびＣＳＦ ［ＮａＣｌ］の上昇は、交感神経活動（ＳＮＡ）を高め、血圧（ＢＰ）の増加をもたらす（非特許文献３参照）。
【０１２０】
動物実験は、ＳＮＡの遮断が、高い塩摂取または体液中の［Ｎａ＋］増加によって誘発される血圧（ＢＰ）上昇を強く減弱させることを実証した（非特許文献８および非特許文献９参照）。腹腔内高張ＮａＣｌ溶液の注射は、ヒト対象においてＳＮＡを増強した（非特許文献１０参照）。さらに、高張ＮａＣｌの腹腔内または脳室内注入は、血圧（ＢＰ）を増加させ、ＳＮＡを変化させた（非特許文献１１および非特許文献８参照。これらの知見は、［Ｎａ＋］（および／または［Ｃｌ−］）のいくつかのモニタリング機構が脳内に存在することを示唆している。近年、ＯＶＬＴが脳内の［Ｎａ＋］上昇のセンシング部位として提案されている（非特許文献１２および非特許文献１３参照）。しかし［Ｎａ＋］センシングが交感神経媒介性の血圧（ＢＰ）上昇を誘発する原因となる分子メカニズムはまだ解明されていない。
【０１２１】
ＯＶＬＴおよび脳弓下器官（ＳＦＯ、以下「脳弓下器官」を「ＳＦＯ」と称することがある）は、血液-脳関門（ＢＢＢ、以下「血液-脳関門」を「ＢＢＢ」と称することがある）がない感覚性脳室周囲器官（ｓＣＶＯｓ、以下「感覚性脳室周囲器官」を「ｓＣＶＯｓ」と称することがある）を含む（非特許文献１４参照）。ＯＶＬＴおよびＳＦＯの有窓性毛細血管は、脳内の血漿と細胞外液との間の［Ｎａ＋］平衡を促進する。これらの２つの座位は第３脳室に面しており、ＣＳＦの［Ｎａ＋］のモニタリングにも適している。
【０１２２】
以前の研究は、ＳＮＡおよび血圧（ＢＰ）（非特許文献１２参照）のコントロールにおけるＯＶＬＴの不可欠な役割を示唆している：ＯＶＬＴを包含する第３脳室前壁（ＡＶ３Ｖ）の破壊は、中枢性高ナトリウム血症に対するＳＮＡおよび血圧（ＢＰ）応答を損なうことが判明した。ＯＶＬＴは、視床下部の室傍核（ＰＶＮ）への神経結合を有する（非特許文献１４参照）。
【０１２３】
さらに、心血管系を調節するための交感神経出力は、ＰＶＮの小細胞性領域に存在するニューロンによって制御されており、このニューロンは孤束核（ＮＴＳ、以下「ＮＴＳ」と略すことがある）や吻側延髄腹外側野（ＲＶＬＭ、以下「ＲＶＬＭ」と略すことがある）などの下部脳幹、および脊髄に投射している（非特許文献１５参照）。
【０１２４】
Ｎａｘチャンネルは、機能解明の進んだ脳の［Ｎａ＋］センサーであり、生理学的範囲内の血液およびＣＳＦの［Ｎａ＋］の増加をモニターする（非特許文献２１および非特許文献２２参照）。Ｎａｘは、ＯＶＬＴおよびＳＦＯにおける特殊グリア細胞（星状膠細胞および上衣細胞）のラメラプロセスで発現され、これらのグリアプロセスはニューロンの細胞を包む（非特許文献１６参照）。
【０１２５】
本発明者らはこれまで、Ｎａｘシグナルが塩分と水分の摂取量の制御に関与していることを実証した。Ｓｃｎ７ａノックアウト（Ｎａｘ−ＫＯ）マウスは、脱水条件下でさえ、塩の摂取を停止しなかった（非特許文献１７参照）。本発明者らはまた、ＳＦＯが、塩分摂取行動を制御するためにＮａｘによって体液中の［Ｎａ＋］を検出するための主要な部位であることを示した（非特許文献１８および非特許文献１９参照）。本発明者らの最近の知見は、ｓＣＶＯｓのＮａｘシグナルが飲水行動にも関与していることを示唆している（非特許文献２０参照）。しかしながら、血圧（ＢＰ）制御におけるＮａｘの可能な役割はまだ解明されていない。
【０１２６】
本明細書に示すように、体液中の［Ｎａ＋］上昇に応答して、野生型（ＷＴ、以下「ＷＴ」と略すことがある）およびＮａｘ−ＫＯマウスにおける血圧（ＢＰ）およびＳＮＡの変化を調べた。ＯＶＬＴにおけるＮａｘ活性化は、ＳＮＡおよび血圧（ＢＰ）応答にとって決定的に重要であることが明らかになった。
【０１２７】
ＰＶＮに投射するＯＶＬＴニューロン（ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロン）はＮａｘシグナルによって活性化され、光遺伝学技術（optogenetic techniques）によるＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの特異的刺激は血圧（ＢＰ）上昇を再現した。Ｎａｘ陽性グリア細胞からの［Ｎａ＋］依存性Ｈ＋放出は、ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンにおける酸感受性イオンチャネル１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）の活性化を誘導した。
【０１２８】
＜結果＞
以下の説明において、「図１」とは「図１Ａ〜図１Ｌ」のいずれかあるいは全体を意味することがあり、他の図についても同様である。
【０１２９】
Ｎａｘは交感神経活性化を介して塩誘発血圧（ＢＰ）上昇を仲介する：慢性高塩摂取について
本発明者らは、多くのグループが以前からラットやマウスで使用している手法である、２％ＮａＣｌを用いた強制的な食塩過剰摂取（ＨＳ摂取、以下「ＨＳ摂取」と略すことがある）の効果を野生型（ＷＴ）とＮａｘ−ＫＯマウスで比較した（非特許文献２３、非特許文献９及び非特許文献２４参照）。
【０１３０】
すなわち、飲料水を２％ＮａＣｌ（ＨＳ摂取）に置き換えることによって血圧（ＢＰ）上昇を誘導した。７日間のＨＳ摂取後、血液およびＣＳＦ中の［Ｎａ＋］レベルは両方の遺伝子型において同様に約１４５ｍＭから約１６０ｍＭまで増加した（図１Ａ及び１Ｂ）。ＨＳ摂取した野生型（ＷＴ）マウスは、日内リズムの変化なしに平均動脈血圧（ＭＢＰ、以下「ＭＢＰ」と略すことがある）の有意な上昇を示した（図１Ｃ）。しかし、ＨＳ摂取に起因するＭＢＰの上昇は、Ｎａｘ−ＫＯマウスでは観察されなかった（図１Ｃ）。ＭＢＰレベルは、ＨＳ摂取のない対照条件の場合と一日を通して同様であった。したがって、ＨＳ摂取した野生型（ＷＴ）マウスの２４時間平均のＭＢＰは、ＨＳ摂取したＮａｘ−ＫＯマウスよりも有意に高かった（約７ｍｍＨｇ）（図１Ｄ）。ＨＳ摂取は２つのマウス系統の毎日の運動活動に影響を及ぼさず、基礎血圧（ＢＰ）と水／Ｎａバランスは類似していることに注意することが重要である（図Ｓ１Ａ、Ｅ）。
【０１３１】
２つの遺伝子型の間のＭＢＰで観察された差異に対するＳＮＡの寄与を評価するために、クロリソンダミン（ＣＳＤ、以下「クロリソンダミン」を「ＣＳＤ」と略すことがある）による自律神経節の急性遮断が及ぼす影響を調べた。ＨＳ摂取のないマウスでは、ＣＳＤの腹腔内注入は、両方の遺伝子型においてＭＢＰを約２８ｍｍＨｇ低下させた（図１Ｅ）。ＨＳ摂取した野生型（ＷＴ）マウスは、ＣＳＤによってＭＢＰ（約４１ｍｍＨｇ）の大きな減少を示した。対照的に、ＨＳ摂取されたＮａｘ−ＫＯマウスにおけるＭＢＰの減少は、対照状態（図１Ｅ）と同じレベル（約２８ｍｍＨｇ）で著しく小さくなった。
【０１３２】
慢性食塩誘発性高血圧症の他の一般的な動物モデルであるデオキシコルチコステロンアセテート＋食塩（ＤＯＣＡ−ｓａｌｔ）高血圧モデル（図Ｓ２Ａ、Ｄ）、においても、血中およびＣＳＦ ［Ｎａ＋］の増加および塩保持によって誘発される血圧（ＢＰ）およびＳＮＡ上昇のためのＮａｘの必要性が観察された（非特許文献２５参照）。
【０１３３】
Ｎａｘは、交感神経活性化を介して塩誘導血圧（ＢＰ）上昇を媒介する：高張食塩水の腹腔内注入
体液中の［Ｎａ＋］を急激に上昇させる方法として、高張食塩水（３Ｍ ＮａＣｌ、１０μＬ／２０ｇ体重/分、１０分間）の腹腔内注入の効果を調べた。血液およびＣＳＦ中の［Ｎａ＋］レベルは、両方の遺伝子型で高張食塩水の腹腔内注入し、注入開始後１５分〜３０以内にプラトー（飽和）したように見える（それぞれ１６５及び１６０ｍＭ、図Ｓ２Ｅ）。野生型（ＷＴ）マウスでは、付随するＭＢＰの増加が観察され、高張食塩水の腹腔内注入の開始の３０分後に約１５ｍｍＨｇに達した（図Ｓ２Ｆ及びＳ２Ｈ）。しかし、Ｎａｘ−ＫＯマウスのＭＢＰはいずれの時点でも応答を示さなかった（図Ｓ２Ｆ及びＳ２Ｈ）。等張性生理食塩水（１４５ｍＭ ＮａＣｌ）の腹腔内注入は、野生型（ＷＴ）またはＮａｘ−ＫＯマウスにおいてＭＢＰに影響を及ぼさなかった。ＣＳＤを用いた交感神経遮断は、野生型（ＷＴ）におけるＭＢＰ応答を無効にし、Ｎａｘ−ＫＯマウスでは効果は観察されなかった（図Ｓ２Ｇ及びＳ２Ｈ）。結果的に２つの遺伝子型間の差異は消失し、体液中の［Ｎａ＋］増加によって誘導される交感神経媒介性血圧（ＢＰ）上昇に対するＮａｘの寄与を示した。
【０１３４】
Ｎａｘは、交感神経活性化を通じて塩誘発血圧（ＢＰ）上昇を媒介する：高張Ｎａ溶液の脳室内注入
本発明者らは、高張Ｎａ溶液の脳室内注入を用いて脳室から脳Ｎａｘを直接刺激しようと試みた。４５０ｍＭ ［Ｎａ＋］（０．４μＬ／分で１０分）を含む人工ＣＳＦ注入はまた、１０分後に約１６０ｍＭまでＣＳＦ ［Ｎａ＋］を増加させた（表Ｓ１）。高浸透圧Ｎａ溶液の注入は、注入後３〜５分からＭＢＰを上昇させ、両方の遺伝子型で７〜１０分以内にプラトーに到達した。しかし、この増加の大きさは、野生型（ＷＴ）マウスよりもＮａｘ−ＫＯマウスにおいて顕著に小さかった（約６ｍｍＨｇ対約１５ｍｍＨｇ：図１Ｆ、左）。コントロールとして、等張Ｎａ溶液の脳室内注入は、野生型（ＷＴ）またはＮａｘ−ＫＯマウスにおいてＭＢＰを変化させなかった（図１Ｆ、右）。ＣＳＤを用いた交感神経遮断は、野生型（ＷＴ）ではＭＢＰ応答を顕著に低下させたが、Ｎａｘ−ＫＯマウスでは減少させなかった。結果的に、２つの遺伝子型の差異をなくした（図１Ｇ）。図１Ｆ、左および図１Ｇに示すデータ間の差異から計算したＣＳＤ感受性成分のプロフィール（図１Ｈ、左）は、交感神経媒介性の血圧（ＢＰ）上昇がＮａｘ−ＫＯマウスには存在しないことを示した。さらに、図１Ｆの２つの遺伝子型間の差から計算されたＮａｘ依存性成分（図１Ｈ、右）のプロファイルは、野生型（ＷＴ）におけるＣＳＤ感受性成分のプロファイルとほぼ一致していた（図１Ｈ、左）。このことはＮａｘが交感神経媒介性血圧（ＢＰ）上昇を駆動することを再び示唆している。
【０１３５】
次に本発明者らは、バソプレッシン受容体１ａの阻害剤であるマニング化合物（ＭＣ）の効果を試験した。なぜなら、高張Ｎａ溶液の脳室内注入は、ＭＢＰの増加に寄与することが示された（非特許文献２６参照）からである。ＭＣで前処置した野生型（ＷＴ）マウスでは、ＭＢＰは脳室内注入の５分後から徐々に増加した。約８ｍｍＨｇでプラトーに到達した（図１Ｉ）。他方、ＭＢＰ上昇は、同じ処理をしたＮａｘ−ＫＯマウスでは完全に消失し、これは、Ｎａｘ−ＫＯマウスにおけるＭＢＰ上昇がバソプレシン単独によって引き起こされたことを示している。追加のＣＳＤ処理は、ＭＣ−前処理野生型（ＷＴ）マウスにおけるＭＢＰ応答を完全になくし、Ｎａｘ−ＫＯマウスでは効果は観察されなかった（図１Ｊ）。これらの結果は、Ｎａｘシグナルが交感神経媒介性血圧（ＢＰ）上昇のみに使用されることを示している。ＭＢＰ上昇におけるＳＮＡ非依存性成分は、バソプレッシン依存性であると判定された：ＭＢＰ上昇におけるこの成分は、２つの遺伝子型間で類似していた（図１Ｇ）。本発明者らの以前の研究（非特許文献２７参照）では、Ｎａｘ−ＫＯマウスの脱水に対するバソプレシンの応答が正常であったことに注意することが重要である。
【０１３６】
ＭＣ−前処理（バソプレシンがブロックされた）野生型（ＷＴ）マウス（図１Ｉ）における血圧（ＢＰ）応答は、ＣＳＤ感受性（交感神経媒介性）成分およびＮａｘ依存性成分のプロファイルとほぼ一致した（図１Ｈ）。この結果は、ＭＣ−前処理条件下での血圧（ＢＰ）上昇がＮａｘ依存性（交感神経媒介性）成分に完全に対応することを示している。したがって、本発明者らは、以後、高張Ｎａ溶液の脳室内注入の前にＭＣでマウスを前処理した。ＳＮＡ増加を確認するために、本発明者らは麻酔下で腰部交感神経線維のＳＮＡを直接測定した。高張Ｎａ溶液の脳室内注入は、麻酔したマウスにおいてＭＢＰを上昇させた（図１Ｋ）。高張Ｎａ溶液の脳室内注入の後、腰部ＳＮＡは野生型（ＷＴ）において増加したが、Ｎａｘ−ＫＯマウスでは増加しなかった（図１Ｌ、左）。腰部ＳＮＡの変化の時間経過（図１Ｌ、右）は、ＭＢＰにおけるＣＳＤ感受性成分のパターンと類似していた（図１Ｈ、左）。まとめると、これらの結果は、ＮａｘシグナルがＳＮＡの増加を介して［Ｎａ＋］依存性血圧（ＢＰ）上昇を媒介することを明確に示している。
【０１３７】
ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンは、塩誘導血圧（ＢＰ）上昇を媒介する
ＳＦＯおよびＯＶＬＴは視床下部のＰＶＮへの神経経路を有し、ＰＶＮにはＳＮＡを制御するためのニューロンが存在する（非特許文献１５参照）。ＣＴｂ−４８８による逆行標識によって、ＳＦＯおよびＯＶＬＴにおいてＰＶＮに突出するニューロンが検出された（図２Ａ）。以下、それぞれをＳＦＯ（→ＰＶＮ）ニューロンおよびＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンと呼ぶ。ＣＴｂ−４８８陽性のＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンは、脳実質までグリアプロセスを伸ばすＮａｘ陽性グリア細胞にしっかりと包埋された（図２Ａ）。局所破壊実験は、ＳＦＯではなくＯＶＬＴが、血圧（ＢＰ）制御のためのＮａｘによるＣＳＦの［Ｎａ＋］感知において役割を果たすことを示したが（図Ｓ３ＡおよびＳ３Ｂ）、これは以前の所見と一致する（（非特許文献２８参照）。ＳＦＯ（→ＰＶＮ）およびＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンは両方とも、ＨＳ摂取によって活性化された（図２Ｂ及び２Ｃ）。しかしながら、２つの遺伝子型の間の神経活動（Ｆｏｓ発現）の差異はＳＦＯではなく、ＯＶＬＴにおいてのみ観察され、ＯＶＬＴの血圧（ＢＰ）の［Ｎａ＋］依存性制御への寄与を示唆した（図２Ｂ及び２Ｃ）。
【０１３８】
ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンが血圧（ＢＰ）上昇を実際に駆動するかどうかを調べるために、本発明者らは、青色光感受性陽イオンチャンネルであるチャネルロドプシン２（ＣｈＲ２、以下「ＣｈＲ２」と略すことがある）を用いて、光遺伝学実験を行った。
【０１３９】
本発明者らは、ｄｏｕｂｌｅ−ｌｏｘＰ−ｆｌａｎｋｅｄ  ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ（ＤＩＯ）−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰの配列を有する高頻度逆行性遺伝子導入レンチウイルスベクター（ＨｉＲｅｔ）（非特許文献２９参照）を、小胞性グルタミン酸トランスポーター２（Ｖｇｌｕｔ２、以下「Ｖｇｌｕｔ２」と略すことがある）−Ｃｒｅマウス又は小胞ＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）トランスポーター（Ｖｇａｔ）−ＣｒｅマウスのＰＶＮに、注射した（図Ｓ３Ｃ、左）。多くのＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンはＶｇａｔ陽性ではなく、Ｖｇｌｕｔ２陽性であったので（図Ｓ３Ｃ）、Ｖｇｌｕｔ２−Ｃｒｅマウスをその後の光遺伝学実験に用いた。ＥＹＦＰで標識された細胞、すなわちＰＶＮに投射するＶｇｌｕｔ２陽性ニューロンは、主にＯＶＬＴ内に存在するようであった（図２Ｄ）。
【０１４０】
５及び２０Ｈｚでの青色パルスレーザーを用いた刺激は、刺激頻度依存的に（約１５及び約３０ｍｍＨｇ）、ＭＢＰを急速に上昇させた（図２Ｅ）。５Ｈｚの刺激では、ＭＢＰの上昇は、高張Ｎａ溶液の脳室内注入により起こる血圧上昇と似ている。５ＨｚでのＯＶＬＴの光刺激は、すぐにＭＢＰを増加させ、この上昇は刺激されている間維持された。しかし、レーザーを切ったとき、ＭＢＰは１分以内にベースラインレベルに戻った（図２Ｆ、左）。予想通り、光刺激で観察されたＭＢＰの増加は、ＣＳＤ（図２Ｆ、右）による前処置によって完全に消滅し、ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの活性化が交感神経活性化を介して血圧（ＢＰ）上昇を実際に駆動することを示している。
【０１４１】
また、光活性化クロライドポンプ（第３世代の高度好塩菌由来ハロロドプシン（Natronomonas halorhodopsin））、ｅＮｐＨＲ３．０；（非特許文献２９参照）を用いたＶｇｌｕｔ２陽性ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの光遺伝学的阻害の効果を調べるために、ＨｉＲｅｔ−ＤＩＯ２４２  ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰをＶｇｌｕｔ２−ＣｒｅマウスのＰＶＮに注入した（図２Ｇ）。光照射をおこなうと、予想通りに、 高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答したＭＢＰ上昇が抑制された（図２Ｈ）。ｅＮｐＨＲ３．０の発現自体は、高張Ｎａ溶液の脳室内注入に対する血圧（ＢＰ）応答に影響しなかった。（図２Ｈ、Ｏｐｔ ＯＦＦ群）。
【０１４２】
Ｈ＋はＮａｘ陽性グリア細胞から［Ｎａ＋］依存的に放出され、ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンを活性化する
ＮａｘシグナルによるＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの活性化メカニズムを解明するために、急性脳スライスを用いて発火特性を調べた（図３Ａ）。シナプス伝達の阻害剤の存在下で、セルアタッチ法のパッチクランプ実験を行った。等張Ｎａ溶液（［Ｎａ＋］=１４５ｍＭ）では、両方の遺伝子型のＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンは約１Ｈｚで連続発火活性を示した（図３Ｂ）。灌流液を高張Ｎａ溶液（［Ｎａ＋］=１６０ｍＭ）に変更すると、野生型（ＷＴ）脳スライスにおけるＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの発火頻度は約３Ｈｚに上昇したが、Ｎａｘ−ＫＯスライスでは上昇しなかった ３Ｂ）。
【０１４３】
本発明者らは以前、ＳＦＯのＮａｘ陽性グリア細胞において細胞外［Ｎａ＋］の増加によるＮａｘの活性化が嫌気的解糖を刺激し、結果的にモノカルボン酸トランスポーター（ＭＣＴｓ）を介した乳酸塩の放出を引き起こすことを示した（非特許文献３０参照）。乳酸塩は、隣接する抑制性ニューロンのエネルギー基質として機能し、そのニューロンの発火頻度を上昇させることで、塩分摂取行動を制御するニューロンを抑制していた（非特許文献１９及び非特許文献３０参照）。Ｎａｘおよびグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の二重免疫染色は、ＯＶＬＴ中のＮａｘ陽性細胞がグリア細胞であることを再び証明した（図３Ｃ）。ＯＶＬＴの細胞を高張Ｎａ溶液中にインビトロでインキュベーションすると、Ｎａｘ陽性細胞によるグルコース取り込みを顕著に増強した（図３Ｃ及び３Ｄ）。一貫して、ＯＶＬＴ組織を高張Ｎａ溶液中でインキュベーションはすると、野生型（ＷＴ）マウスのＯＶＬＴからの乳酸放出が顕著に高まったが、Ｎａｘ−ＫＯマウスではそうではなかった（図３Ｅ）。
【０１４４】
細胞傷害性ジフテリア毒素Ａフラグメント（ｄｔＡ）によるＧＦＡＰ陽性細胞の選択的除去（図３Ｆ）、およびα-シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（α−ＣＨＣＡ）による乳酸トランスポーター（モノカルボン酸トランスポーター；ＭＣＴ）の阻害（図３Ｇ）は両方とも、ＯＶＬＴからの乳酸塩放出を有意に減少させた。α−ＣＨＣＡによるＭＣＴの阻害と一致して、高張ＮａによるＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの活性化は、α−ＣＨＣＡによって消失した（図３Ｂ）。高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答する交感神経媒介性のＭＢＰ上昇は、ＯＶＬＴへのα−ＣＨＣＡの持続的注入によって一貫して消失した（図３Ｈ）。しかし、高張Ｎａによって活性化されたＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンは、生理的なｐＨ（ｐＨ７．４）の乳酸溶液（１ｍＭ及び５ｍＭ）によって活性化されないことがわかった（図４Ａ及び４Ｂ）。
【０１４５】
ＭＣＴは乳酸塩／Ｈ＋共輸送体であるので、高張Ｎａ溶液による刺激はまた、Ｎａｘ陽性細胞からのＨ＋放出を刺激し得る。次に、Ｈ＋が神経伝達物質として機能してＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンを活性化するかどうかを電気生理学的に調べた。ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンは乳酸塩を含まない酸性溶液（ｐＨ６．８）で活性化されたため（図４Ｃ）、Ｎａｘ陽性グリア細胞から放出されたＨ＋がＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンを活性化することを示している。野生型（ＷＴ）マウス由来のＯＶＬＴ切片においては、細胞間スペースのｐＨの低下が検出されたが、Ｎａｘ−ＫＯマウス由来のものでは検出されなかった（図４Ｄ及び４Ｅ）。野生型（ＷＴ）切片におけるこのＨ＋放出は、α−ＣＨＣＡによって予想通りにブロックされた（図４Ｄ及び４Ｅ）。生理的ｐＨ（ｐＨ７．４）では乳酸塩単独でＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンを活性化することはなかったが、軽度の酸性化（ｐＨ７．０）によって誘発されたＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの活性化は、乳酸によって増強された（図４Ａ及び４Ｂ）。さらに、ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンは、１６０ｍＭ［Ｎａ＋］溶液と等張である３０ｍＭのマンニトール溶液によって活性化されなかった（図４Ｇ）。これらの結果は、浸透圧の上昇ではなく［Ｎａ＋］の上昇が、Ｎａｘ陽性グリア細胞からのＨ＋放出を刺激し、ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの活性化を導くことを示した。
【０１４６】
ＡＳＩＣ１ａは、ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンのＮａｘ依存性活性化を仲介する
以前の研究では、塩誘発血圧（ＢＰ）上昇が上皮性ナトリウムチャネル／ｄｅｇｅｎｅｒｉｎ（ＥＮａＣ／ＤＥＧ）スーパーファミリーの広範な阻害剤であるベンザミルの脳室内注入により遮断されたことを報告した（非特許文献３１参照）。ベンザミルのＯＶＬＴへの事前注入は、野生型（ＷＴ）マウスにおける高張性Ｎａ溶液の脳室内注入に起因する交感神経的に媒介されるＭＢＰ上昇を一貫して完全になくしたが、Ｎａｘ−ＫＯマウスでは何の効果も観察されなかった（図５Ａ及び５Ｃ）。従って本発明者らは、ＥＮａＣ／ＤＥＧスーパーファミリー（非特許文献３２参照）においてベンザミルに感受性のあるＨ＋依存性サブグループである酸感受性イオンチャンネル（ＡＳＩＣ）が血圧（ＢＰ）の［Ｎａ＋］依存性上昇に関与していると推測した。
【０１４７】
ＡＳＩＣ１ａの特異的阻害剤であるサルモトキシン−１（ｐｓａｌｍｏｔｏｘｉｎ−１（ＰｃＴｘ１））でＯＶＬＴを前処理により、野生型（ＷＴ）マウスにおけるＣＳＦ［Ｎａ＋］の増加によって誘発されるＭＢＰ上昇が消失した（非特許文献５６参照）。ＡＳＩＣ３の特異的阻害剤であるＡＰＥＴｘ２はそうしなかった（図５Ｂ及び５Ｃ）（非特許文献５５参照）。ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンにおけるＡＳＩＣ１の発現は、免疫蛍光染色によって確認した（図５Ｄ；パネルｉ）。注目すべきことに、ＣＴｂ−４８８で逆行的標識されたニューロンは、ＯＶＬＴ周辺の領域でも検出されたが、それらはＡＳＩＣ１発現に関して陰性であった（図５Ｄ；パネルｉｉ）。
【０１４８】
次いで、ＡＳＩＣ１またはＬａｃＺ（対照として）を標的とする人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）の配列を組み込んだアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いて、ＯＶＬＴにおけるＡＳＩＣ１のノックダウンを行った。 エメラルドグリーン蛍光タンパク質（ＥｍＧＦＰ）の免疫蛍光シグナルによってＡＡＶ感染細胞を視覚化した（図５Ｅ及びＳ４）。本発明者らは、血圧（ＢＰ）応答の低下が、ＡＳＩＣ１ ａｍｉＲＮＡによるＯＶＬＴにおけるＡＳＩＣ１免疫反応性の低下に関連することを見出した（図５Ｆ）。これらの結果は、ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンのＨ＋依存性活性化におけるＡＳＩＣ１ａの関与を示した。急性脳スライスを用いた電気生理学的実験はさらに、本発明者らの結論を支持した：細胞外［Ｎａ＋］の増加に応答するＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの活性化は、ベンザミルおよびＰｃＴｘ１によって消失した（図５Ｇ及び５Ｈ）。
【０１４９】
インビボ実験において、ＡＳＩＣ１活性化因子であるＭｉｔＴｘの効果を試験した。ＯＶＬＴへの０．１μＭ及び１．０μＭのＭｉｔＴｘの連続注入は、両遺伝子型におけるＭＢＰ上昇を用量依存的に誘導した（図５Ｉ及び５Ｋ）（非特許文献３３参照）。ＡＳＩＣ２及びＡＳＩＣ３は、０．１μＭのＭｉｔＴｘによって活性化されなかったことに注意することが重要である（非特許文献３３参照）。予想通り、ＭｉｔＴｘの効果は、ＣＳＤによる神経節遮断によって消失した（図５Ｊ及び５Ｋ）。
【０１５０】
Ｎａｘシグナルは、ＰＶＮ−ＲＶＬＭ経路を介して血圧（ＢＰ）を上昇させる
ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの活性化によって引き起こされるＳＮＡの増加は、ＰＶＮ−ＲＶＬＭ経路を介して媒介されることが示唆されている（非特許文献１５参照）。この見解の通り、ＲＶＬＭに投射するＰＶＮニューロン［ＰＶＮ（→ＲＶＬＭ）ニューロン］は、ＨＳ摂取によって野生型（ＷＴ）では活性化されたが、Ｎａｘ−ＫＯマウスでは活性化されなかった（図６Ａ）。 さらに、チロシン水酸化酵素（ＴＨ）を発現するＲＶＬＭニューロンは、ＨＳ摂取により野生型（ＷＴ）では活性化されたが、Ｎａｘ−ＫＯマウスでは活性化されなかった（図６Ｂ）。ＴＨ陽性ＲＶＬＭニューロンは、脊髄の交感神経節前ニューロンを制御することが知られている（非特許文献３４参照）。従って、ＮａｘシグナルはＯＶＬＴ−ＰＶＮ−ＲＶＬＭ神経経路を介して伝達され、ＳＮＡを活性化し、結果として血圧（ＢＰ）を上昇させた（図６Ｃ）。
【０１５１】
＜討論＞
本明細書では、異なる塩負荷実験（ＨＳ摂取、ＤＯＣＡ−ｓａｌｔプロトコール、および高張食塩水の腹腔内注入）のすべてにおいて、マウスの血液およびＣＳＦにおいて［Ｎａ＋］を増加させることを示した（図１及び図２）。血液とＣＳＦの［Ｎａ＋］は、これらプロトコールを適用した動物において強く関連していた。体液（血液およびＣＳＦ）中の［Ｎａ＋］（７．１０ｍＭ）の急性および慢性の増加は、交感神経系を活性化し、血圧（ＢＰ）を１０〜１５ｍｍＨｇ上昇させた（図１及び図２）。
【０１５２】
遺伝的に高血圧のラット（Ｄａｈｌ塩感受性ラットおよび自然発症高血圧ラット）において、ＨＳ摂取は血圧（ＢＰ）上昇に先行してＣＳＦの［Ｎａ＋］レベルを上昇させた（非特許文献３５および非特許文献３６参照）。最近の研究によると、離乳直後から慢性塩分摂取をおこなった動物は、ＣＳＦ［Ｎａ＋］レベルの特異的な上昇と、血圧（ＢＰ）上昇を示した（非特許文献３７参照）。塩感受性高血圧の原因となる中心的メカニズムを解明するために、本発明者らはその後、ＣＳＦ［Ｎａ＋］を急激かつ選択的に増加させる高張Ｎａ溶液の脳室内注入を採用した。
【０１５３】
本発明者らは、Ｎａｘ−ＫＯマウスが体液中の［Ｎａ＋］増加に応答して交感神経媒介性血圧（ＢＰ）上昇を起こさないことを示した。本発明者らの詳細な研究は、ＯＶＬＴにおいてＮａｘによって感知された体液中の［Ｎａ＋］上昇に関する情報が、交感神経媒介性血圧（ＢＰ）上昇に関与することを明らかにした。ＯＶＬＴでは、細胞外［Ｎａ＋］の上昇がＮａｘを活性化し、結果として、ＭＣＴを介したＮａｘ陽性グリア細胞からのＨ＋および乳酸の放出を刺激する。
【０１５４】
放出されたＨ＋は、ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンのＡＳＩＣ１ａを通してこのニューロンを活性化させた。 Ｖｇｌｕｔ２陽性ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンはＰＶＮ（→ＲＶＬＭ）ニューロンを活性化してＳＮＡを増加させ、血圧（BP）上昇をもたらす。これらの分子および細胞プロセスは、血液およびＣＳＦの［Ｎａ＋］増加に応答して血圧（ＢＰ）上昇に関与する神経原性機構の第１段階である。ＯＶＬＴは正常なＢＢＢを欠いており、第３脳室に面しているので、ＯＶＬＴのグリア細胞（上衣細胞および星状膠細胞）に存在するＮａｘによってＣＳＦおよび血液の［Ｎａ＋］増加が両方とも感知されると考えられる（図６Ｃ）。脳室内注入によってＣＳＦ中で［Ｎａ＋］が選択的に増加すると、観察されたＮａｘ依存性血圧（ＢＰ）上昇は約８ｍｍＨｇであった（図１Ｈ）。この値は、他のプロトコル（図１Ａ〜１Ｅ、およびＳ２）を用いて血液およびＣＳＦの［Ｎａ＋］増加によって誘導された対応する値（約１２ｍｍＨｇ）よりも小さいため、ＯＶＬＴのＮａｘがこれらの２つの［Ｎａ＋］を感知すると考えられる（図６Ｃ）。
【０１５５】
細胞外［Ｎａ＋］増加によってＯＶＬＴのＮａｘが活性化すると、ＳＦＯ（非特許文献３０参照）の場合と同様に、Ｎａｘ陽性細胞からのＭＣＴを介したＨ＋イオンと乳酸塩の放出が起こった（図３Ｅ〜３Ｇ、４Ｄ、及び４Ｅ）。脱水条件下において乳酸塩は、［Ｎａ＋］の増加に応答してＮａｘ−陽性グリア細胞からグリオトランスミッターとして分泌され、ＳＦＯ中の抑制性ニューロンを活性化していた。（非特許文献３０参照）。
【０１５６】
乳酸塩はＳＦＯ中のＧＡＢＡ作動性ニューロンにおいてエネルギー源として用いられ、代謝を活性化してＡＴＰの産生を誘導した。結果として生じる［ＡＴＰ］の増加は、ＡＴＰ感受性Ｋ＋チャネルを阻害し、抑制性ニューロンを活性化することで塩摂取を抑制することが示唆されている（非特許文献３０参照）。
【０１５７】
対照的に、Ｈ＋は、ＯＶＬＴにおける特定のＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンを刺激するシグナル伝達物質であった（図４Ａ〜４Ｃ）。ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンは、Ｈ＋によるＡＳＩＣ１ａの活性化を介して神経活動が亢進し、ＮａｘシグナルをＲＶＬＭニューロンに伝達してＳＮＡを活性化し、血圧（ＢＰ）上昇を導いた。
【０１５８】
最近の研究では、高張ＮａＣｌのＯＶＬＴへの直接注入はＳＮＡを増加させることが、また、ソルビトールを用いた浸透圧の上昇はＳＮＡを増加させないことが示された（非特許文献１３参照）。同じグループは、細胞外［Ｎａ＋］濃度が生理学的範囲（２．５〜１０ｍＭ）で増加したときに、いくつかのＯＶＬＴニューロンが神経伝達を介さずに活性化されたことを示した（非特許文献１２参照）。
【０１５９】
Ｎａｘは細胞外［Ｎａ＋］の小さな増加を感知するため、Ｎａｘは脳内［Ｎａ＋］センサーの基準を満たすと考えられている（非特許文献２１及び非特許文献２２参照）。
【０１６０】
まとめると、これらの知見は、ＯＶＬＴにおいてＮａｘによって感知された体液中の［Ｎａ＋］増加に関する情報が血圧（ＢＰ）制御に使用されるという本発明者らの見解を支持するものである。
【０１６１】
ＡＳＩＣを含むＥＮａＣ／ＤＥＧスーパーファミリーの広範な阻害剤であるベンザミル（ｂｅｎｚａｍｉｌ）は塩誘導血圧（ＢＰ）上昇を弱める効果を持つことが、以前に報告されていた（非特許文献３１参照）。ベンザミルはＥＮａＣに対して最も強い親和性を有する（非特許文献３９参照）。
【０１６２】
本発明者らは、ベンザミルおよびＰｃＴｘ１の両方がＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの活性を一貫して阻害することを確認した（図５Ｇ及び５Ｈ）。本明細書では、ＯＶＬＴのＡＳＩＣ１ａが交感神経媒介性血圧（ＢＰ）上昇の制御に関与していることを示した。
【０１６３】
しかしながら、ＥＮａＣが他の脳領域の塩感受性高血圧に関与する可能性を排除するものではないことに留意することが重要である。例えば、塩感受性高血圧を発症するＮｅｄｄ４−２遺伝子欠損マウスは、脈絡叢およびいくつかの脳領域におけるＥＮａＣの発現レベルの増加を示した［ＰＶＮおよび視索上核（ＳＯＮ、以下「ＳＯＮ」と略すことがある）では増加したが、ＳＦＯやＯＶＬＴでは増加は報告されていない］（非特許文献４０参照）。
【０１６４】
ＡＳＩＣ１ａは、ＡＳＩＣ１遺伝子の選択的スプライシングされた転写物の１つから産生され、ＡＳＩＣ１ｂまたは他のＡＳＩＣメンバーよりも高いＨ＋感受性を示す（非特許文献３２参照）。従って、ＡＳＩＣ１ａ単独で、細胞外ｐＨが７．０まで軽度に低下したことを感知し、ニューロンの興奮を駆動することができる（非特許文献４１参照）。
【０１６５】
さらに、ＡＳＩＣ１ａがＨ＋−に応答して引き起こす電流は、乳酸塩およびアラキドン酸（ＡＡ）を含むいくつかのモジュレーターによって増強されることが知られている（非特許文献４２および非特許文献６３参照）。予想通り、乳酸塩はＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンのＨ＋誘導性活性化を増強した（図４Ｆ）。
【０１６６】
また、Ｎａｘシグナルは、ＡＡカスケードの活性化を介して、ＯＶＬＴにおいてエポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）の産生を導く可能性がある（非特許文献２０参照）。高浸透圧マンニトール溶液による処理はｐＨ感受性ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロン（図４Ｇ）を活性化しなかったので、浸透圧の変化（高張Ｎａ溶液によって誘導される）はＡＳＩＣ１ａ陽性ＯＶＬＴニューロンを活性化しないようである。
【０１６７】
ＰＶＮは、バソプレッシンを分泌する大細胞性ニューロンと、交感神経制御を媒介する小細胞性ニューロンを有する（非特許文献４３および非特許文献４４参照）。光遺伝学技術によるＶｇｌｕｔ２陽性ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの活性化およびＡＳＩＣ１活性化因子であるＭｉｔＴｘのＯＶＬＴへの直接的注入による血圧（ＢＰ）上昇は、ＳＮＡの遮断によって完全に消滅した（図２Ｆ及び５Ｋ）。Ｎａｘシグナルによって活性化されるＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンは、ＰＶＮ中の小細胞ニューロンを選択的に刺激していると考えられる。
【０１６８】
一方、血圧（ＢＰ）上昇におけるバソプレッシン依存性成分は、野生型（ＷＴ）およびＮａｘ−ＫＯマウス間で類似していた（図１Ｇ）。これは、脱水条件下で、Ｎａｘ−ＫＯマウスが正常なバソプレシン放出を示したという以前の所見と一致する（非特許文献２７参照）。ＯＶＬＴの浸透圧感受性ニューロンは、バソプレッシン分泌を制御するために、ＳＯＮおよびＰＶＮの大細胞ニューロンへの接続を有すると仮定されている（非特許文献４５参照）。これらの知見は、浸透圧依存性（またはＮａｘ非依存性、しかし［Ｎａ＋］依存性）ＯＶＬＴニューロンが、バソプレシン分泌の制御に関与することを示している。
【０１６９】
本発明者らの結果は、ＳＦＯが［Ｎａ＋］依存性ＳＮＡ対照（図２Ｂ及びＳ３Ｂ）の主要センシング（感知）部位ではないことを明確に示した。しかし、ＳＦＯにおけるグルタミン酸神経細胞の光発生活性化は、血圧（ＢＰ）を上昇させると報告されている（非特許文献４６参照）。ＳＦＯの局所破壊は、血液由来のアンジオテンシンＩＩによって誘発される交感神経媒介性血圧（ＢＰ）上昇を弱めることが示されている（非特許文献６４参照）。従って、血中アンジオテンシンＩＩを感知することにより、ＳＦＯはＳＮＡおよび血圧（ＢＰ）の制御に関与するようである。
【０１７０】
最近の研究はまた、正中視索前核（ＭｎＰＯ）におけるアデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド１（Ａｄｃｙａｐ１）−陽性ニューロンが、高張食塩水の腹腔内注射により活性化され、血圧（ＢＰ）上昇を引き起こすことを報告した（非特許文献４６参照）。ＭｎＰＯは、ＡＶ３Ｖ領域内のＯＶＬＴに対して背側に位置し、ＯＶＬＴから神経入力を受け取る。少数のＭｎＰＯ（→ＰＶＮ）ニューロンがＭｎＰＯに見出され（図５Ａ）、ＡＳＩＣ１の発現がこれらのニューロンのいくつかで検出された（図５Ｂ）。
【０１７１】
しかし、以前に報告したように、ＮａｘはＭｎＰＯには存在しなかった（図５Ｃ）（非特許文献１７および非特許文献４７参照）。ＭｎＰＯは正常なＢＢＢを有し、ＭｎＰＯが位置するＯＶＬＴの背側の領域への高張ＮａＣｌ溶液の直接注入は血圧（ＢＰ）に影響しなかった（非特許文献１２参照）。これらの知見は、ＭｎＰＯが［Ｎａ＋］の一次感知部位ではないことを強く示唆している。しかし、ＯＶＬＴで感知されたＮａｘシグナルの一部がＭｎＰＯ（→ＰＶＮ）ニューロンを介して中継される可能性を排除することはできない。
【０１７２】
疫学的および介入的研究からの豊富な証拠は、塩分感受性と呼ばれる塩摂取量の変化に対するヒトの血圧（ＢＰ）反応の異質性を確立している（非特許文献４８参照）。食塩感受性は、ほとんどが過剰の塩を排出する腎臓の能力に関連しているが、これは免疫応答を含む多くのメカニズムによって実際に影響を受ける（非特許文献４９参照）。従って、ヒトの塩感受性高血圧症は、塩と様々な因子の組み合わせによって誘発される複雑な形質として認識される必要がある（非特許文献５０および非特許文献５１参照）。
【０１７３】
初期の理論は、単純にナトリウムと水分保持の増加による血液量の増大を中心にしていました。しかし、目下（現在）の結果は、血液中の［Ｎａ＋］およびＣＳＦが約１６０ｍＭまで増加した場合でさえ、脳［Ｎａ＋］センサー欠損Ｎａｘ−ＫＯマウスが交感神経媒介性血圧（ＢＰ）上昇を示さなかったことを明らかに示した。本発明者らの結果は、新しい神経治療標的を提供し、ヒトにおける塩感受性表現型を治療する将来の可能性を促進する可能性がある。
【実施例】
【０１７４】
以下実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
以下の実施例において、用いた試薬に関する説明、及び用いた手法を以下に示す。
【０１７５】
＜試薬＞
実験で使用した薬物の中で、二塩化クロロ二ナトリウム（ＣＳＤ）、キヌレン酸、ビククリンおよびテトロドトキシン（ＴＴＸ：フグ毒）はトクリス（Ｔｏｃｒｉｓ）から得た。サイアルモトキシチン−１（ｐｓａｌｍｏｔｏｘｉｎ−１）、ＡＰＥＴｘ２、およびＭｉｔＴｘは、Alomone Labから得た。コレラ毒素サブユニットｂ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲートおよび５５５コンジュゲート（ＣＴｂ−４８８及びＣＴｂ−５５５）および２−（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１,３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−（２−ＮＢＤＧ）はサーモフィッシャーサイエンティフィック製であった。β-メルカプト-β、β-シクロペンタメチレンプロピオニル１、Ｏ−ｍｅ−Ｔｙｒ２、Ａｒｇ８］−バソプレシン（マニング化合物、ＭＣ）、タモキシフェン、およびα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（α−ＣＨＣＡ）を含む他の全ての試薬は、 シグマ−アルドリッチから入手した。
【０１７６】
＜組換えウイルスベクター＞
狂犬病ウイルス糖タンパク質を有する偽型レンチウイルスベクターである血清型５およびＤＪ型組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）および高効率逆行性遺伝子導入レンチウイルス（ＨｉＲｅｔ）（非特許文献２９参照）をマウスの脳への遺伝子導入に使用した（＞１．０×１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ）。マウス脳内への注入手順等については後述する。
【０１７７】
ＨｉＲｅｔ−ＭＳＣＶ−ＤＩＯ−ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）―ＥＹＦＰ−ＷＰＲＥおよびＨｉＲｅｔ−ＭＳＣＶ−ＤＩＯｅＮｐＨＲ３．０―ＥＹＦＰ−ＷＰＲＥを使用して、ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）又はｅＮｐＨＲ３．０のＣｒｅ依存性発現を光生成実験に誘導した。）ＨｉＲｅｔ−ＭＳＣＶ−ＤＩＯ−ｅＮｐＨＲ３．０―ＥＹＦＰ−ＷＰＲＥを構築するために、ｐＡＡＶ−Ｅｆ１−ＤＩＯ−ｅＮｐＨＲ３．０―ＥＹＦＰを使用した：後者はKarl Deisserothからの提供物であった（Addgeneプラスミド＃２６９６６）。
【０１７８】
ＡＡＶ−Ｅｆ１−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＥＸ−ｄｔＡ（ＡＡＶ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤＩＯ−ｄｔＡ）ベクター（非特許文献６２参照）をＡＡＶ５コートタンパク質でセロタイプし、ノースカロライナ大学のウイルスベクターコアによりパッケージングした（６×１０１２ウイルス粒子／ｍｌ）。アストロサイトの欠失にはＡＡＶ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤＩＯ−ｄｔＡを用いた（下記参照）。
【０１７９】
インビボノックダウン実験のために、人工マイクロＲＮＡ（ＡＡＶ−Ｅｆ１−ＥｍＧＦＰ−ＷＰＲＥ−ＬａｃＺ ａｍｉＲＮＡおよびＡＡＶ−Ｅｆ１−ＥｍＧＦＰ−ＷＰＲＥ−ＡＳＩＣ１ａｍｉＲＮＡ）を担持するＡＡＶベクターを使用した。以下のオリゴヌクレオチドＤＮＡ対をアニーリングし、ｐｃＤＮＡ６．２−ＧＷ／ＥｍＧＦＰ−ｍｉＲベクター（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）にクローン化して、ａｍｉＲＮＡ構築物を調製した。
【０１８０】
ＬａｃＺａｍｉＲＮＡ（対照として）
5'-TGCTGAAATCGCTGATTTGTGTAGTCGTTTTGGCCACTGACTGACGACTACA CATCAGCGATTT-3'      （配列番号１）
および
5'-CCTGAAATCGCTGATGTGTAGTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGACTACACAAATCAGCGATTTC-3'      （配列番号２）
Ａｓｉｃ１ａｍｉＲＮＡ
5'-TGCTGAGGTAAAGTCCTCAAACGTGCGTTTGGCCACTGACTGACGCACGTT TGGACTTTACCT-3'      （配列番号３）
および
5'-CCTGAGGTAAAGTCCAAACGTGCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGCACGTTTGAGGACTTTACCTC-3'      （配列番号４）
【０１８１】
次いで、３コピーのａｍｉＲＮＡを製造業者のプロトコールに従ってタンデムにコンジュゲートした。ｐＡＡＶ−ＥＦ１ａ−ＥｍＧＦＰ−ＷＰＲＥ中のＷＰＲＥの下流にａｍｉＲＮＡフラグメントをサブクローニングした。
【０１８２】
＜血液およびＣＳＦ［Ｎａ＋］の定量＞
血液［Ｎａ＋］を測定するために、断頭によりマウスを殺し、血液サンプルを収集した。サンプリング直後に血液分析計（ｉ−ＳＴＡＴ、Abbott）およびｉ−ＳＴＡＴ６＋カートリッジ（Abbott）を用いて血液［Ｎａ＋］を測定した。ＣＳＦ［Ｎａ＋］の測定では、小規模の改変で以前に記載されたように、大槽からＣＳＦを回収した（非特許文献６０参照）。マウスをイソフルランで麻酔し、定位フレーム（Narishige）に入れた。大槽を露出させた後、毛細管作用によりＣＳＦを集めるために空のガラス針（先端直径約０．５ｍｍ）を挿入した。採取直後に、Fingraph（大塚製薬）でＣＳＦ［Ｎａ＋］を評価した。
【０１８３】
＜血圧（ＢＰ）の測定＞
意識のある自由に動くマウスの遠隔測定システム（Dataquest ART、Data Science International）を用いて血圧（ＢＰ）を測定した。遠隔測定プローブ（ＨＤ−Ｘ１１、データサイエンスインターナショナル）のセンサーチップを、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内に麻酔下で左頚動脈に入れ、実験開始の１週間前に注射した。記録後、ＭＢＰデータは１分間の平均で得られ、２４時間の概日変化を分析した場合（図１Ｃ及びＳ１Ａ）、ＭＢＰデータは１時間にわたって平均化された。
【０１８４】
麻酔したマウスにおける血圧（ＢＰ）の測定において、Ｍｉｌｌａｒカテーテル（モデルＳＰＲ−６７１、Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を、ウレタン（１．０〜１．３ｇ／ｋｇ体重、腹腔内）を用いた麻酔下で左頚動脈に入れた。直腸温度は、温度計を備えた加熱パッドを用いて３７．０〜３７．５℃に維持した。手術終了から１時間安定させた後、記録を開始した。血圧（ＢＰ）データは、データ記録ユニット（ＰｏｗｅｒＬａｂ２６Ｔ、ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて０．１ｋＨｚで収集し、ＬａｂＣｈａｒｔソフトウェア（AD Instruments）を用いて分析した。記録後、ＭＢＰ生データは１分間に平均化した。光発生実験の場合、ＭＢＰデータは１秒間に平均化した。
【０１８５】
意識のあるマウスにおける自律神経系の血圧（ＢＰ）への寄与を、テレメトリプローブを移植したマウスにＣＳＤ（１０ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内）を注射して評価した（図１Ｅ）。ＣＳＤは、ニコチン性アセチルコリン受容体を阻害することにより、交感神経節を含む自律神経節におけるシナプス伝達を急激に遮断し、従って、すぐに（５分以内に）ＣＳＤを腹腔内注入すると、大きな血圧（ＢＰ）減少が起こる。本発明者らは、安定したＭＢＰを確認した後にＣＳＤを腹腔内注入する。実験後、ＭＢＰのベースラインからナディールへの変化を計算した。ベースラインＭＢＰは、ＣＳＤの腹腔内注射の直前の５分間のＭＢＰを平均して計算した。ナディールＭＢＰは、最低値を示した２分の間にＭＢＰを平均することによって評価した。 実験は１０：００〜１３：００の間に実施された。
【０１８６】
図Ｓ２Ｃ及びＳ２Ｄの実験では、血圧（ＢＰ）を測定するために非侵襲的な尾部カフシステム（ＢＰ−９８Ａ；Softron Co.Ltd.、Tokyo、Japan）を使用した。簡単に述べると、マウスをホルダーに入れて運動を防止し、３７℃で加温した。テールカフを尾の根元に置き、収縮期血圧を１０〜１５回測定し平均した。一連の測定は１０分以内に終了した。実際のデータ収集に先立ち、すべてのマウスを７回以上の測定（１セット／日）を行うことにより測定に順応させた。 マウスがホルダーに入ってくると、完全に順応したと判断された。概日リズムの影響を最小限に抑えるため、１０時から１２時の間に血圧（ＢＰ）測定を実施した。
【０１８７】
＜歩行活動の測定＞
遠隔測定プローブ（ＨＤ−Ｘ１１、データサイエンスインターナショナル）を備えた遠隔測定システム（Dataquest ART、Data Science  International）を使用して、意識的に自由に動くマウスの歩行活動を測定した。実験手順は、上述の血圧（ＢＰ）測定と同じであった。記録後、活性カウントを１時間ごとに合計した。
【０１８８】
＜塩および水の代謝の分析＞
塩および水の代謝を評価するために、マウスを代謝ケージ（Columbus Instruments）中に維持した。 飲用量（水または２％ＮａＣｌ）および２４時間の食物消費を測定し、２４時間尿サンプルを採取した。２４時間尿中Ｎａ＋排泄量を算出するために、尿中Ｎａ＋濃度をｉ−ＳＴＡＴ ６＋カートリッジを備えたｉ−ＳＴＡＴ分析器を用いて測定した。必要であれば、尿を脱イオン水で希釈した。
【０１８９】
＜腹腔内注入＞
マイクロシリンジポンプ（Ｍｉｃｒｏ４、World Precision Instruments）に接続された２７Ｇ針を用いて、等張食塩水（１４５ｍＭ ＮａＣｌ）および高張食塩水（３Ｍ ＮａＣｌ）の腹腔内注入を行った。１０μＬ／２０ｇ体重/分の速度で１０分間注入を行った。注入の１時間前に、針の先端を腹腔内に挿入した。場合によっては、実験の１時間前に、ＣＳＤ（神経節遮断薬、２０ｍｇ／ｋｇ体重）での腹腔内前処置を行った。
【０１９０】
＜脳外科手術＞
外科手術は以前に記載されているように（非特許文献１８及び非特許文献１９参照）、少し修正して実施した。マウスをペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内）で麻酔し、定位フレーム（Narishige）に入れた。小さな切開部を介して頭蓋骨を露出させた後、カニューレ埋め込み、注射、または病巣のために小さな穴を穿孔した。
【０１９１】
脳室内注入のための２６−Ｇガイドカニューレを移植するために、ガイドカニューレ（Ｃ３１５Ｇ、Plastics One Inc.または手作りガイドカニューレ）を側脳室に定位的に配置した（後方０．５ｍｍ、側方１．０ ｍｍ；深度２．０ ｍｍ；ブレグマに対して）。ガイドカニューレは、２つの固定ネジと歯科用セメントで頭蓋骨に固定した。
【０１９２】
１．０μｇ／μＬのＣＴｂ−４８８又はＣＴｂ−５５５を含有するＰＢＳを充填したガラス針を、ＲＶＬＭ（後方６．８ｍｍ、側方１．１ｍｍ、深度５．９ ｍｍ；ブレグマに対して）または両側ＰＶＮ（後方０．８ｍｍ、両側方０．２ ｍｍ、深度５．０ ｍｍ；ブレグマに対して）に配置した。マイクロシリンジポンプ（Ｍｉｃｒｏ４、World Precision Instruments）を用いて１００ｎＬ／分の速度でＲＶＬＭに5分間、ＰＶＮに２分間、５０ｎＬ／分で注入を行った。手術完了後、動物を７日間以上回復させてから使用した。
【０１９３】
ウイルス注入のために使用した手順は、上記の逆行性トレーサーの注入手順と同様であった。ウイルスを両側ＰＶＮまたはＯＶＬＴに１００ｎＬ／分の速度でそれぞれ１．０μＬ又は０．２５μＬ注入した。ウイルス注射後４週間以上、動物を実験に使用した。ウイルス注射後２週間以上経過した２０Ｇガイドカニューレ（Ｃ３１１Ｇ；Plastics One）を、光発生実験のためのマウスに移植した。ガイドカニューレの先端は、（前方０．７ｍｍ、側方＋／−０．０ｍｍ、深度４．５ｍｍ；ブレグマに対して）の直上に設定した。
【０１９４】
電気破壊を誘発するために、タングステン単極電極（８０〜１００ｋΩの抵抗とチップ直径約５μｍ；ユニークメディカル）をＳＦＯ（後方０．６ｍｍ、側方＋／−０．０ｍｍ、深度２．５ｍｍ；ブレグマに対して）又は、ＯＶＬＴ（前方０．７ｍｍ、側方＋／−０．０ｍｍ、深度５．０ｍｍ；ブレグマに対して）に挿入した。電流源（５３５００、Ugo Basile）から正の電流（０．５ｍＡ）を２０秒間流した。手術の完了後、動物を７日間以上回復させ、脳室内注入のためのガイドカニューレを埋め込んだ。次いで、（上記のように）脳室内注入を行った。 実験が完了した後、２倍の対物レンズを備えた顕微鏡（Ｂｉｏｚｅｒｏ、Keyence）下で破壊部位を検証するために、脳を１００μｍの厚さに切断した。
【０１９５】
＜脳室内注入＞
シリンジポンプ（ＥＳＰ−６４； Eicom）に接続された３３−Ｇ内部カニューレ（Plastics One）を用いて、０．４μＬ／分の速度で１０分間脳室内注入した。１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグルコースおよび５ｍＭのＮａＯＨ（ＨＣｌによりｐＨ７．４に調整）を含む等張Ｎａ溶液（１４５ｍＭ ［Ｎａ＋］）として、適切な容量のＮａＣｌを等張Ｎａ溶液に添加することにより、高張Ｎａ溶液（３００，４５０、および９００ｍＭ ［Ｎａ＋］）を調製した。場合によっては、脳室内注入の１時間前に、ＭＣ（バソプレシン受容体１ａの特異的アンタゴニスト、３ｍｇ／ｋｇ体重）および／またはＣＳＤ（神経節遮断薬、２０ｍｇ／ｋｇ体重）による腹腔内前処置を行った。
【０１９６】
＜ＳＮＡの記録＞
腰椎ＳＮＡは、以前に記載されたように（非特許文献５３参照）、軽微な変更を加えて測定した。マウスをウレタン（１．０〜１．３ｇ／ｋｇ体重、腹腔内）で麻酔し、直腸温度を、温度計を備えた加熱パッドを用いて３７．０〜３７．５℃に維持した。左腰部交感神経線維を後腹膜アプローチにより露出させ、一対の白金電極（Unique Medical）を神経線維に付着させた。脱水を避けるために、電極および神経線維をシリコンゲル（ＫＷＩＫ−ＣＡＳＴ、World Precision Instruments）で固定した。ＰｏｗｅｒＬａｂ２６Ｔを用いて４ｋＨｚで増幅器（ＤＡＭ−８０、World Precision Instruments）で１０，０００倍に増幅した神経信号を記録した。１時間以上安定させた後、脳室内注入を開始した。脳室内注入の１時間前にＭＣを注射した（３ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内）。輸液。実験の終了後、動物を過剰の麻酔薬で安楽死させた。記録した神経信号を、それぞれ１００及び１０００Ｈｚの低および高周波カットオフでソフトウェア（Ｃｈａｒｔ、AD Instruments）で濾過した。腰椎ＳＮＡの変化の分析では、記録された神経信号を１分間隔で整流して合計し、死後値をバックグラウンドノイズとして差し引いた。脳室内注入の開始直前の神経活動を１００％と設定し、百分率の変化を１００％から腰部ＳＮＡの％変化として示した。
【０１９７】
＜免疫組織化学＞
最初にＰＢＳで、次に２０％中和されたホルマリンで、深部麻酔下、マウスを経心灌流した。脳を慎重に取り出し、さらに４℃で４８時間固定した。脳をマイクロスライサー（ＶＴ１０００Ｓ、Leica Microsystems）またはクライオスタット（ｃｍ３０５０Ｓ、Leica Microsystems）で５０μｍの厚さで冠状に切断した。クライオスタットを用いた切開に関して、脳に漸増スクロースシリーズを浸潤させ、次いでＯＣＴ化合物（Sakura、Tokyo、Japan）に包埋した。
【０１９８】
ＰＢＳ中５％正常ロバ血清および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するブロッキング緩衝液で室温で１時間ブロッキングした後、脳切片を一次抗体と共に４℃で２日間インキュベートし、次いでＰＢＳで２回洗浄した。切片を二次抗体と４℃で１日間反応させた。抗Ｎａｘ（１：２０００）（非特許文献４７参照）、抗ＧＦＰ（１：１，０００，０４４０４−８４、ナカライテスク）、抗ＡＳＩＣ１（１：２００、ＡＳＣ−０１４、Alomone Lab）、抗−１１５４ｃ−Ｆｏｓ（１：５００、ｓｃ−５２Ｇ、Santa Cruz Biotechnology）および抗ＴＨ（１：５，０００、ＡＢ１５２、Millipore）脳切片をスライドに載せ、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡またはＬｅｉｃａ ＨｙＤハイブリッド検出器を備えたＬｅｉｃａＴＣＳ ＳＰ８共焦点顕微鏡でｚスタック画像を捕捉した。抗Ｎａｘ抗体の特異性は、我々の以前の研究に記載されているＮａｘ−ＫＯマウスを用いて検証した（非特許文献４７参照）。抗ＡＳＩＣ１抗体の特異性を、ノックダウン実験を用いて確認した（図５Ｅ）。
【０１９９】
＜光発生実験＞
インビボ光照射に関して、青色光レーザー（４４５ｎｍ、１，０００ｍＷ、ＣＷ；ＫａＬａｓｅｒ）または黄色光レーザー（５７７ｎｍ、３０００ｍＷ、ＣＷ； Ｇｅｎｅｓｉｓ Ｔａｉｐａｎ５７７、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）に接続されたプラスチック光ファイバーを介して、送られた。ＣｈＲ２の光刺激を達成するために、１Ｈｚと２０Ｈｚの間の周波数のパルス青色光レーザーを使用した。ｅＮｐＨＲ３．０による光学阻害については、黄色レーザー光による連続照射を行った。ファイバの先端で測定したところ、レーザ出力は５〜１０ｍＷ／ｍｍ２に維持された。ＯＶＬＴにおける光の光学パワーは、
http://web.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/
のサイトにあるオンライン脳組織光伝達計算機を使用して計算した。本発明者らの実験では、光ファイバー先端から標的組織までの距離を５００μｍに設定し、期待される光学パワーは１．２０〜３．６４ｍＷ／ｍｍ２であった。
【０２００】
＜ＯＶＬＴスライスにおけるインビトロ電気生理学＞
インビトロ電気生理学的実験は、わずかな変更を加え、以前に報告された方法にて行われた（非特許文献２２参照）。ＣＴｂ−５５５は、記録の少なくとも１週間前にＰＶＮに左右両側に注入した。脳をすばやく取り出し、１００％Ｏ２で５〜１０分間バブリングしたスクロースリンガー溶液に浸漬した。スクロースリンガー溶液の組成は、２６０ｍＭ スクロース、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＳＯ４、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコースおよび５ｍＭ ＮａＯＨ（ＨＣｌでｐＨ７．４に調整）であり、氷冷したものを使用した。マイクロスライサー（Ｐｒｏ ７、Dosaka EM）を用いてスライスを３５０μｍの厚さに切断し、次いで室温で１００％Ｏ２を吹き込んだ改変リンガー溶液で１時間以上プレインキュベートした。次いで、スライスを直立顕微鏡（ＢＸ６１ＷＩ、オリンパス）上の記録チャンバーに取り付け、１００％Ｏ２を吹き込んだ改変リンガー溶液を連続的に灌流した。ＮａＣｌ又はＨＣｌを添加して、改変リンガー溶液中の［Ｎａ＋］またはｐＨを変化させた。すべての記録溶液は、キヌレン酸（１ｍＭ）およびビククリン（３０μＭ）を含有した。発火頻度の分析においては、ＣＴｂ−５５５標識ニューロンにセルアタッチ法を用いた。全ての記録は３３〜３６℃で行った。ホウケイ酸ガラス細管から調製したパッチピペットにピペット溶液を満たした。ピペット溶液の組成は、１４０ｍＭ Ｋグルコン酸、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ Ｎａ２ＡＴＰ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．１ｍＭ スペルミン（ＨＣｌでｐＨ７．４に調整）である。リンガー溶液中の電極の抵抗は３．７ＭΩであった。ＡｘＰａｔｃｈ ２００Ｂパッチクランプ増幅器（Axon Instruments）をソフトウェアｐＣＬＡＭＰと共に使用してデータを取得し、ソフトウェアＣｌａｍｐｆｉｔ（Axon Instruments）で分析した。
【０２０１】
＜解離したＯＶＬＴ細胞のグルコースイメージング＞
以前に記載されたように、細胞の解離およびグルコースイメージングが行われた（非特許文献３０参照）。簡潔には、野生型（ＷＴ）およびＮａｘ−ＫＯマウスをジエチルエーテルで深く麻酔し、断頭した。その後、ＯＶＬＴを脳から摘出した。細胞を単離し、Ｃｅｌｌ−ｔａｋ（BD Biosciences）でコーティングしたガラス底の皿（Matsunami Glass）上にプレーティングし、５％ＣＯ２で３７℃、３時間ガス処理した湿度制御インキュベーター中の１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中でインキュベートした。次に、細胞を５００μＭの２−ＮＢＤＧとともに３７℃で１０分間インキュベートした。２−ＮＢＤＧを１６０ｍＭ［Ｎａ＋］溶液に３７℃でアプライした後、細胞の蛍光強度は時間の経過と共に少なくとも３０分まで徐々に増加した。次いで、細胞を１４５ｍＭ［Ｎａ＋］溶液で５回洗浄した。バリア（波長５３６＋／−４０ｎｍ、ＧＦＰ−３０３５Ｂ、Semrock、Rochester、NY）および励起フィルタ（波長４８８＋／−１０ｎｍ、Ｃ７７７３、浜松フォトニクス（株））を有する蛍光顕微鏡（ＩＸ７１、Olympus）を用いて評価した。
【０２０２】
＜ＯＶＬＴにおけるグリア細胞の標的切除＞
ＡＡＶ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤＩＯ−ｄｔＡを上記のようにｈＧＦＡＰ−ＣｒｅＥＲＴ２または野生型（ＷＴ）マウスのＯＶＬＴに注射した。 ＡＡＶ注射の３週間後、マウスに１日２回タモキシフェン（１００ｍｇ／ｋｇｂｗ、腹腔内）を５日間投与して、Ｃｒｅ組換えによりＡＡＶのｌｏｘＰ部位を切除した。タモキシフェンを最終濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるようにヒマワリ油に３７℃で溶解させた後、フィルター滅菌し、暗所にて４℃で最大７日間保存した。タモキシフェン治療の完了後１週間、乳酸塩測定および免疫組織化学のために脳を使用した。 同じ処理を受けた野生型（ＷＴ）マウスと比較して、ｈＧＦＡＰ−ＣｒｅＥＲＴ２マウスのＯＶＬＴにおいて、９０％を超えるＮａｘ陽性細胞が結果的に排除された。
【０２０３】
＜乳酸塩濃度の測定＞
脳から解剖したＯＶＬＴ（各１５匹のマウス）を５つの部分に分け、１μＭのＴＴＸを含有する０．５ｍｌの改変リンガー溶液中、３７℃で２４時間インキュベートした。ＯＶＬＴを含有する溶液を９，２００×ｇで５分間遠心分離し、上清を測定に使用した。上清の乳酸塩濃度をｉ−ＳＴＡＴにより測定した。
【０２０４】
＜ＯＶＬＴ組織における細胞外ｐＨの画像解析＞
ＯＶＬＴを含有する急性脳スライスを上記のように調製した。スライスを直ちに１００％Ｏ２を吹き込んだインキュベーション溶液に入れ、２５℃で１０〜３０分間インキュベートした。溶液は、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのグルコース及び５ｍＭのＮａＯＨ（ＨＣｌでｐＨ７．４に調整）を含有する。この溶液を、２’，７’−ビス−（２-カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン（ＢＣＥＣＦ酸、Thermo Fisher；２００μＭ）、膜不透過性ｐＨ依存性蛍光色素を含む他の溶液に変更して、３７℃で２０分間インキュベートした。インキュベーション中、直立顕微鏡に取り付けられたディスク共焦点ユニット（ＤＳＵシステム、オリンパス）で蛍光画像を撮影した。蛍光比は、ＬＥＤ光源（Ｌｉｇｈｔ Ｅｎｇｉｎｅ ＳＰＥＣＴＲＡＸ、Lumencor）を用いて４３８及び５１２ｎｍの励起波長でモニターした。細胞外［Ｎａ＋］を変化させるために、高張Ｎａを含むイメージング溶液をイメージングチャンバにゆっくりと加えた。
【０２０５】
＜ＯＶＬＴへの薬剤の直接注入＞
血圧（ＢＰ）記録中のＯＶＬＴへの薬物注入に関して、上記のように、Ｍｉｌｌａｒカテーテルの移植後、マウスを定位フレームに置いた。ＯＶＬＴ注射および脳室内注入を行なうと（図３Ｈ、５Ａ及び５Ｂ）、上述のように、脳室内注入のためのガイドカニューレを、最初に植え付けた。次いで、小さな孔を穿孔し、薬物を含有する改変リンガー溶液で満たされたガラス針を、ＯＶＬＴ（前側＋０．７ｍｍ；側方＋／−０．０ｍｍ；腹側、５．０ｍｍ；ブレグマに対して）に配置した。ベンザミル、ＰｃＴｘ１及びＡＰＥＴｘ２の注射は、Ｍｉｃｒｏ４を用いた脳室内の開始の約３０分前に１００ｎＬ／分の速度で５分間の注入を開始した。α−ＣＨＣＡの場合、脳室内注入の開始の１５分前に連続注入を開始した。注入は最初の５分間、注入速度を１００ｎＬ／分に設定し、その後、脳室内注入の最後まで１０ｎＬ／分で続けた。ＭｉｔＴｘの注射は、脳室内注入なしで１００ｎＬ／分の速度で５分間実施した。
【０２０６】
薬物注入の位置を確認するために、蛍光ラテックスビーズ（ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ、Thermo Fisher Scientific）を実験の最後に注入した。脳を１００μｍの厚さに切断し、ビーズの蛍光を２×対物レンズを有するＢｉｏｚｅｒｏを用いて評価した。
【０２０７】
＜数量化と統計分析＞
データの正規性は、最初にＳｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ試験によって試験された。 正規性が否定されなかった場合、データは平均＋／−標準偏差（ＳＥＭ）を用いて集約された。１つまたは２つの要因の影響を、一方向または２方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて試験した。反復測定（ＲＭ）ＡＮＯＶＡを使用して、Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ−Ｇｅｉｓｓｅｒの自由度の補正を用いて、すべての反復測定を分析した。正規性が否定されたとき、ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ ＡＮＯＶＡが用いられ、四分位範囲（ＩＱＲ）の中央値が示された。
【０２０８】
ペアワイズの比較は、ペアまたはペアなしスチューデントｔ検定、またはノンパラメトリックのマンホイットニーＵ検定またはウィルコクソン（Wilcoxon）の署名順位テストに基づいている。これらは、ＡＮＯＶＡにおける特定の（大域的）試験が有意であった場合の事後的な探索的分析としても適用された。 全ての試験は両面試験であった。各実験の統計分析の詳細を表Ｓ２に示す。すべての統計分析は、Ｏｒｉｇｉｎ  Ｐｒｏ  ２０１７ソフトウェア（OriginLab Corporation）を用いて行った。すべての実験においてＰ＜０．０５が有意であると考えられた。
【０２０９】
２４時間のＭＢＰ変化（図１Ｃ）では、双方向ＲＭ ＡＮＯＶＡが群と時間との間に有意な相互作用を検出した（ｐ＝０．００６）。この相互作用は、ＨＳ／野生型（ＷＴ）群における差異的なＭＢＰプロフィールのために考えられた。しかし、相互作用は質的ではなく定量的であった。次に、明暗の全期間、つまり２４時間のＭＢＰ（図１Ｄ）の全期間にわたるサマリーＭＢＰ値に基づく分析を採用した。
【０２１０】
＜実験モデルおよびサブジェクト詳細＞
動物実験プロトコールは全て、国立自然科学研究所の動物実験および使用委員会（承認番号１４Ａ１４９，１５Ａ１６４，１６Ａ２５および１７Ａ００６）によってレビューおよび承認された。ホモ接合型Ｓｃｎ７ａノックアウトＮａｘ−ＫＯ；（非特許文献１７参照）、ヘテロ接合型Ｓｌｃ１７ａ６−ｉｒｅｓ−Ｃｒｅ（Ｖｇｌｕｔ２−Ｃｒｅ）（非特許文献６１参照）、ヘテロ接合型Ｓｌｃ３２ａ１−ｉｒｅｓ−Ｃｒｅ（Ｖｇａｔ−Ｃｒｅ）（非特許文献６１参照）（Jackson Labs株＃016962）およびヘテロ接合型ｈＧＦＡＰ−ＣｒｅＥＲＴ２（非特許文献５７参照）８〜２０週齢までのマウスを使用した。これらの研究で使用された全てのマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド上にあった。 マウスを１２時間の明暗サイクル（午前８時に点灯）で温度制御された室内に維持し、食物および純水に自由に接近させた。
【０２１１】
以下、図面による結果により本発明を説明する。
【０２１２】
例１
図１Ａ〜図Ｌにおいて、高塩摂取は、体液中の［Ｎａ＋］の増加を誘発し、野生型（ＷＴ）における交感神経媒介性血圧（ＢＰ）上昇を駆動するが、Ｎａｘ−ＫＯマウスでは上昇しない。
【０２１３】
Ｎａｘ遺伝子欠損マウスに食塩を過剰摂取させても、交感神経を介した血圧上昇を起こさない
通常状態 (対照群)または食塩を過剰摂取した状態 (食塩群)の野生型マウスとＮａｘ遺伝子欠損（Ｎａｘ−ＫＯ）マウスを比較した。食塩群のマウスは、飲み水を２％食塩水に交換して７日間飼育したのち、実験に使用した。
【０２１４】
Ｎａｘ遺伝子欠損マウスは、脳脊髄液のＮａ＋濃度上昇に応答した交感神経性の血圧上昇を起こさない
野生型マウスとＮａｘ遺伝子欠損（Ｎａｘ−ＫＯ）マウスに対し、高張Ｎａ液（Ｎａ＋濃度：４５０ｍＭ）の脳室内注入をおこない、血圧と交感神経活動の変化を比較した。脳室内注入実験は、抗利尿ホルモンの受容体阻害剤を腹腔内に投与したのちにおこなった。
【０２１５】
図１Ａ及び図１Ｂでは、高塩濃度摂取前（対照、図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」と表示）および高塩濃度摂取後（ＨＳ、図中、「ＨＳ」と表示）において、血液中のＮａ＋濃度（［Ｎａ＋］と表示する）およびＣＳＦ（図１Ｂ）を示す。図１Ａではｎ＝６、図１Ｂではｎ＝５のマウスを用いた。
図１Ａにおける血液中および図１Ｂにおける脳脊髄液中のＮａ＋濃度は、食塩の過剰摂取により両遺伝子型のマウスで同様に上昇した。
【０２１６】
図１Ｃは、対照およびＨＳ摂取マウスにおけるＭＢＰの概日変化を示す。図中、それぞれ、ｎ＝７である。図中、対照野生型（ＷＴ）対ＨＳ−摂取野生型（ＷＴ）について、*ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１であり、ＨＳ摂取野生型（ＷＴ）対ＨＳ摂取Ｎａｘ−ＫＯについて、♯ｐ＜０．０５、♯♯ｐ＜０．０１、♯♯♯ｐ＜０．００１である。
【０２１７】
図１Ｄは、対照およびＨＳ摂取マウスにおける２４時間にわたる平均ＭＢＰを示す。図中、それぞれ、ｎ＝９である。
マウスの動脈血圧を持続的に測定し、２４時間の平均値を算出した。野生型マウスでは、食塩の過剰摂取により血圧が上昇した。Ｎａｘ−ＫＯマウスでは、食塩を過剰摂取させても有意な血圧の上昇は認められなかった。
【０２１８】
図１Ｅは、腹腔内注射後のＭＢＰの変化を示す。図中、クロルイソンダミン（chlorisondamine、「ＣＳＤ」と略し、神経節遮断薬であり、１０ｍｇ／ｋｇ体重投与される）は、ＭＢＰに対する自律神経系の寄与を示している。図中、それぞれ、ｎ＝５である。
交感神経活動の指標として、交感神経活動の阻害による動脈血圧の低下量を測定した。交感神経活動の阻害は、クロリソンダミンの腹腔内投与（１０ｍｇ／ｋｇ体重）によりおこなった。野生型マウスでは、対照群と比較して食塩群の血圧低下量が有意に大きかったため、交感神経活動の活性化が示された。Ｎａｘ−ＫＯマウスでは、食塩を過剰摂取しても交感神経活動は活性化しなかった。
データは平均値＋／−標準偏差（ＳＥＭ）で表示している。双方向（Two-way） ANOVAで検定をおこなったのち、スチューデント（Student’s）ｔ検定で事後比較をおこなった。ｎｓ有意差なし、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【０２１９】
図１Ｆは、自由に動く条件下での、高張性（４５０ｍＭ［Ｎａ＋］、左）および等張性（１４５ｍＭ［Ｎａ＋］、右）Ｎａ溶液の脳室内注入に応答するＭＢＰの変化を示す。注入は、水平バーによって示される時間の間に行った。図中、それぞれ、ｎ＝５であり、縦軸（Ｙ軸はＭＢＰの変化を示し、単位はｍｍＨｇ）は０分の値をゼロに設定した。
【０２２０】
図１Ｇは、ＣＳＤ（２０ｍｇ／ｋｇ体重）で前処置したマウスにおける高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答したＭＢＰの変化を示す。図中、それぞれ、ｎ＝５である。
【０２２１】
図１Ｈは、ＭＢＰにおけるＣＳＤ感受性成分（左）およびＮａｘ依存成分（右）のプロファイルを示す。
これらは、図１Ｇおよび図１Ｆにおいて、左のＣＳＤを用いたＭＢＰデータと、図１Ｆ、左の２つの遺伝子型間のＭＢＰデータの適合曲線の差から得られた。
データを適合（フィット）させるために、次の式が使用された：
ＭＢＰ＝ＰＭａｘ／（１＋ｅｘｐ（（ｔ１／２−ｔ）／ａ））
ここで、ｔ＝時間である。
ＰＭａｘ＝１４．２０ｍｍＨｇ（ＣＳＤ無しの野生型（ＷＴ））および６．００ｍｍＨｇ（ＣＳＤなしのＮａｘ−ＫＯ）および４．２０ｍｍＨｇ（ＣＳＤありの野生型（ＷＴ））および５．８０ｍｍＨｇ（ＣＳＤありのＮａｘ−ＫＯ）である。
ｔ１／２＝３．８０分（ＣＳＤ有りおよび無しの野生型（ＷＴ））および４．５０分（ＣＳＤ有および無しのＮａｘ−ＫＯ）である。
ａ＝０．５５分である。
【０２２２】
図１Ｉは、マウスをマニング化合物（ＭＣ、３ｍｇ／ｋｇ体重）で前処理したときの高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答するＭＢＰの変化を示す。図中、それぞれ、ｎ＝５である。
野生型マウスでは、高張Ｎａ液の脳室注入にともなって血圧が上昇した。Ｎａｘ−ＫＯマウスでは、高張Ｎａ液を脳室注入しても有意な血圧の上昇は認められなかった。
【０２２３】
図１Ｊは、マウスをＭＣ（３ｍｇ／ｋｇ体重）およびＣＳＤ（２０ｍｇ／ｋｇ体重）で前処理したときの高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答するＭＢＰの変化を示す。図中、それぞれ、ｎ＝５である。
交感神経阻害剤 (クロリソンダミン、２０ｍｇ／ｋｇ体重)を腹腔内投与したのち、高張Ｎａ液の脳室注入をおこなった。野生型、Ｎａｘ−ＫＯともに血圧の上昇は起こらなかった。
【０２２４】
図１Ｋは、マウスを麻酔下、ＭＣ（３ｍｇ／ｋｇ体重）で前処理したときの高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答するＭＢＰの変化を示す。図中、それぞれ、ｎ＝６である。
【０２２５】
図１Ｌ（左）は、高張Ｎａ溶液の脳室内注入の直前（０分）および１０分後の腰部ＳＮＡの代表的な生の記録を示す。図中、スケールバーは０．１秒を示す。
図１Ｌ（右）は、高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答した腰部ＳＮＡの変化を示す。図中、それぞれ、ｎ＝６である。
図において、０分の値を１００％に設定した。
野生型マウスでは、高張Ｎａ液の脳室注入にともなって交感神経活動が亢進した。Ｎａｘ−ＫＯマウスでは、高張Ｎａ液を脳室注入しても交感神経活動の亢進は認められなかった。
データは平均値＋／−標準偏差（ＳＥＭ）で表示している。双方向（Two-way） repeated measure ANOVAで検定をおこなったのち、スチューデント（Student’s）検定で事後比較をおこなった。「ｎｓ」は「有意差なし」を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【０２２６】
図１Ｇ、図１Ｉ、図１Ｊ、図１Ｋ及び図１Ｌにおいて、ＣＳＤおよびＭＣは脳室内注入の１時間前に腹腔内注射した。
データは平均値＋／−標準偏差（ＳＥＭ）として表す。「ｎｓ」は「有意差なし」を示し、特に指定のない限り、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１とした。
図１Ｆ、図１Ｇ、図１Ｉ、図１Ｊ、図１Ｋ及び図１Ｌにおいて、各時点での遺伝子型間では＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。各実験の統計解析の詳細を表Ｓ２に示す。図Ｓ１及びＳ２ならびに表Ｓ１も参照のこと。
【０２２７】
例２
図２Ａ〜図２Ｈにおいて、ＯＶＬＴ−ＰＶＮ神経回路は、体液中の［Ｎａ＋］の増加によって活性化され、交感神経媒介性血圧（ＢＰ）上昇を引き起こす。
【０２２８】
図２Ａ上は、逆行性トレーサーＣＴｂ−４８８のＰＶＮへの注入およびＳＦＯ（→ＰＶＮ）およびＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの逆行性ラベリングを示す模式図である。図２Ａ下は、Ｎａｘ（赤色で示す）およびＣＴｂ−４８８（緑色で示す）シグナルを感知したことを示す。矢頭は、Ｎａｘ陽性細胞に囲まれたＣＴｂ陽性細胞を示す。図に示すスケールバーは５０μｍである。
【０２２９】
図２Ｂ左は、ＨＳ摂取前（対照）またはＨＳ摂取後（ＨＳ）のＳＦＯにおけるＦｏｓ（赤色で示す）およびＣＴｂ−４８８（緑色で示す）シグナルを示す。矢印はＦｏｓ／ＣＴｂ−４８８二重陽性細胞を示す。図に示すスケールバーは５０μｍである。図２Ｂ右は、ＣＴｂ−４８８陽性（ＣＴｂ＋）細胞におけるＦｏｓ陽性（Ｆｏｓ＋）細胞の割合のサマリーである。図中、それぞれ、ｎ＝６である。サマリーデータは四分位範囲の中央値として表される。
【０２３０】
図２Ｃ左は、ＨＳ摂取前（対照）またはＨＳ摂取後（ＨＳ）のＯＶＬＴ（Ｃ）におけるＦｏｓ（赤色で示す）およびＣＴｂ−４８８（緑色で示す）シグナルを示す。矢印はＦｏｓ／ＣＴｂ−４８８二重陽性細胞を示す。図に示すスケールバーは５０μｍである。図２Ｃ右は、ＣＴｂ−４８８陽性（ＣＴｂ＋）細胞におけるＦｏｓ陽性（Ｆｏｓ＋）細胞の割合のサマリーである。図中、それぞれ、ｎ＝６である。サマリーデータは四分位範囲の中央値として表される。
【０２３１】
図２Ｄ左は、Ｖｇｌｕｔ２−ＣｒｅマウスのＰＶＮへのＨｉＲｅｔ−ＤＩＯ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰの注入を示す模式図。図２Ｄ右は、ＯＶＬＴでのＥＹＦＰ発現を示す。図に示すスケールバーは５０μｍである。
【０２３２】
図２Ｅは、麻酔下で異なる周波数でＯＶＬＴの光学的刺激（青色の期間）に応答するＭＢＰの代表的な変化を示す。光学的刺激の開始前の平均ＭＢＰ値（−１〜０分）は、縦軸にゼロに設定した。
【０２３３】
図２Ｆ左は、ＣＳＤ前処理（２０ｍｇ／ｋｇ体重）の有無により、５Ｈｚでの光刺激に応答するＭＢＰの代表的な変化を示す。ＣＳＤは光刺激の１時間前に腹腔内注入した。図２Ｆ右は、ＭＢＰの変化のサマリーである（０〜１０分の平均）。図中、それぞれ、ｎ＝４である。
【０２３４】
図２Ｇ左は、野生型（ＷＴ）またはＶｇｌｕｔ２−ＣｒｅマウスのＰＶＮへのＨｉＲｅｔ−ＤＩＯ−ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰの注入を示す模式図である。図２Ｇ右は、Ｖｇｌｕｔ２−ＣｒｅマウスのＯＶＬＴにおけるＥＹＦＰ発現を示す。図に示すスケールバーは５０μｍである。
【０２３５】
図２Ｈ左は、光学刺激をオン（Ｏｐｔ ＯＮ）またはオフ（Ｏｐｔ Ｏｆｆ）した高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答するＭＢＰの変化を示す。注入は、水平バーによって示される時間の間に行った。黄色の影で示される時間の間、光刺激を行った。Ｏｐｔ ＯＦＦ群のマウスは、脳室内注入の３０分前に１０分間光刺激を受けた。十分なＥＹＦＰ陽性細胞がＯＶＬＴ（＞３５０細胞／ｍｍ２）で検出されたＶｇｌｕｔ２−Ｃｒｅマウスを使用した。
*ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（野生型（ＷＴ）Ｏｐｔ ＯＮとＶｇｌｕｔ２−ＣｒｅＯｐｔＯＮ）；♯ｐ＜０．０５、♯♯ｐ＜０．０１、♯♯♯ｐ＜０．００１（Ｖｇｌｕｔ２−Ｃｒｅ Ｏｐｔ ＯＦＦとＶｇｌｕｔ２−Ｃｒｅ Ｏｐｔ ＯＮ）である。図２Ｈ右は、ＭＢＰの変化のサマリーである（平均７〜１０分）。Ｏｐｔ ＯＮ条件は黄色示されるようであった。図中、それぞれ、ｎ＝７である。
【０２３６】
データは、特に明記しない限り、平均＋／−標準偏差（ＳＥＭ）として表す。「ｎｓ」は「有意差なし」を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１とした。各実験の統計解析の詳細を表Ｓ２に示す。図Ｓ３も参照のこと。
【０２３７】
例３
図３Ａ〜図３Ｈにおいて、ＯＶＬＴ中のＮａｘ陽性グリア細胞は、細胞外［Ｎａ＋］の増加に応答して、ＭＣＴ、乳酸／Ｈ＋共輸送体を介して乳酸を放出する。
【０２３８】
図３Ａは、電気生理学的実験の概略図である。ＣＴｂ−５５５を、記録の少なくとも１週間前にＰＶＮに左右に注入した。ＯＶＬＴ中のＣＴｂ−５５５標識ニューロンの発火頻度をセルアタッチ法で測定した。
【０２３９】
図３Ｂは、ＣＴｂ−５５５標識ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの発火活性におけるＣＨＣＡを用いた高張［Ｎａ＋］（１６０ｍＭ）の効果を示す。脳スライスを用いた全ての電気生理学的実験において、細胞外溶液は、シナプス伝達を遮断するために、キヌレン酸（１ｍＭ）およびビククリン（３０μＭ）を含有させた。α−ＣＨＣＡ（５ｍＭ）を、水平バーによって示される時間の間、灌流液に添加した。代表的な発火活動（図３Ｂの左、上）、時間経過（図３Ｂの左、下）、サマリーデータ（図３Ｂの右）が示されている。サマリーデータは、４〜５分、１４〜１５分及び２４〜２５分に得られたものである。図中、それぞれ、ｎ＝６である。遺伝子型間で、♯♯♯ｐ＜０．００１であった。
【０２４０】
図３Ｃ左は、解離したＯＶＬＴ細胞によるグルコース（２−ＮＢＤＧ）の取り込みのイメージング分析を示す。野生型（ＷＴ）マウスから単離したＯＶＬＴから解離した細胞を１４５又は１６０ｍＭ［Ｎａ＋］溶液中の２−ＮＢＤＧを用いたグルコース取り込みのイメージング分析に供した。画像化後、細胞を抗ＧＦＡＰおよび抗Ｎａｘ抗体で免疫染色した。ＤＩＣ、微分干渉コントラスト画像を示す。図に示すスケールバーは２５μｍである。図３Ｃ右は、ＧＦＡＰおよびＮａｘ（ＧＦＡＰ ＋、Ｎａｘ＋）およびどちらも発現しない細胞（ＧＦＡＰ−、Ｎａｘ−）を発現する細胞によるグルコース取り込みの概要である。１６０ｍＭ［Ｎａ＋］溶液中のグルコース取り込みは、１４５ｍＭ［Ｎａ＋］状態に対する相対値によって示された。それぞれ３匹のマウスからのｎ＝２０細胞を用いた。
【０２４１】
図３Ｄ左は、野生型（ＷＴ）およびＮａｘ−ＫＯマウスから解離したＯＶＬＴ細胞のグルコースイメージング（２−ＮＢＤＧ）を示す。図に示すスケールバーは２５μｍである。図３Ｄ右は、グルコース摂取の概要である。それぞれ３匹のマウスからのｎ＝２０細胞を用いた。
【０２４２】
図３Ｅは、ＯＶＬＴ組織における乳酸塩放出を示す。野生型（ＷＴ）およびＮａｘ−ＫＯマウスから単離したＯＶＬＴ組織を、１４５又は１６０ｍＭ［Ｎａ＋］溶液中で２４時間インキュベートした。溶液中の得られた乳酸塩濃度をｉ−ＳＴＡＴにより測定した。それぞれ１５匹のマウスからのｎ＝５であった。
【０２４３】
図３Ｆ左、下は、アストロサイトおよび上衣細胞を切除する戦略を示す模式図である。Ｃｒｅ依存性ジフテリア毒素Ａ断片（ｄｔＡ）（ＡＡＶ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤＩＯ−ｄｔＡ）を発現する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をＧＦＡＰ８０６ ＣｒｅＥＲＴ２マウスのＯＶＬＴに注入した。
図３Ｆ左、下：ウイルス注射およびタモキシフェン処理を受けたマウスの冠状脳切片におけるｍＣｈｅｒｒｙおよびＮａｘシグナルの検出を示す。ウイルス感染はｍＣｈｅｒｒｙ蛍光によって確認された。Ｎａｘ陽性細胞の大部分は、ＧＦＡＰ−ＣｒｅＥＲＴ２マウスのＯＶＬＴから欠失した。図３Ｆ右は、ＯＶＬＴ組織からの乳酸の放出を示す。それぞれ１５匹のマウスからのｎ＝５であった。
【０２４４】
図３Ｇは、ＯＶＬＴ組織からの乳酸塩放出に対するα−ＣＨＣＡ（５ｍＭ）の影響を示す。それぞれ１５匹のマウスからのｎ＝５であった。図３Ｈは、麻酔下での高張Ｎａ溶液（４５０ｍＭ）の脳室内注入に応答するＭＢＰを示す。ビヒクルまたはα−ＣＨＣＡ（１０ｍＭ）のＯＶＬＴ注射を、脳室内注入の開始の１５分前に開始した。水平バーによって示される時間の間、脳室内注入を行った。図中、それぞれ、ｎ＝４である。群間では*ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１であった。
【０２４５】
サマリーデータは平均＋／−標準偏差（ＳＥＭ）として表す。「ｎｓ」は「有意差なし」を示す。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１とした。各実験の統計解析の詳細を表Ｓ２に示す。図Ｓ３も参照のこと。
【０２４６】
例４
図４Ａ〜図４Ｇにおいて、血圧（ＢＰ）上昇につながるＯＶＬＴ−ＰＶＮ神経回路の塩誘発活性化には、グリア細胞からのＮａｘ依存性Ｈ＋放出が必須である。
【０２４７】
図４Ａは、ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの発火活性に対する１ｍＭ乳酸塩の効果を示す。灌流液を、１４５ｍＭ［Ｎａ＋］を含む改変リンゲル液から、１６０ｍＭ［Ｎａ＋］または１ｍＭ乳酸塩（ｐＨ７．４）を含むものに変更した。代表的な発火活性（図４Ａ上）、時間経過（図４Ａ下、左）、サマリーデータ（図４Ａ下、右）が示される。サマリーデータは、４〜５分、９〜１０分、１４〜１５分、および１９〜２０分に得られたものである。図中、それぞれ、ｎ＝６である。
【０２４８】
図４Ｂは、５ｍＭ乳酸塩がＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの発火活性に及ぼす効果を示す。灌流液を、改変リンゲル溶液から、記録開始５分後に５ｍＭの乳酸を含む溶液に変更した。代表的な発火活性（図４Ｂ上）、代表的な時間経過（図４Ｂ下、左）、サマリーデータ（図４Ｂ下、右）が示される。サマリーデータは、４〜５分および１４〜１５分に得られたものである。図中、それぞれ、ｎ＝６である。
【０２４９】
図４Ｃは、低ｐＨ溶液がＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの発火活性に及ぼす効果を示す。灌流液を、水平バーによって示される時間の間、低ｐＨ溶液（ｐＨ６．８）に変更した。代表的な発射活動（図４Ｃ上）、時間経過（図４Ｃ下、左）、サマリーデータ（図４Ｃ下、右）が示される。サマリーデータは、４〜５分および１４〜１５分に得られたデータであり、四分位範囲の中央値として表される。図中、それぞれ、ｎ＝６である。
【０２５０】
図４Ｄは、ＯＶＬＴ組織の細胞間空間におけるｐＨのイメージング分析を示す。
図４Ｄ左は、ＯＶＬＴの位置とイメージングの場所を示す模式図（右側のパネルのボックス）を示す。図４Ｄ右は、野生型（ＷＴ）およびＮａｘ−ＫＯマウスからのＯＶＬＴスライスの細胞間空間におけるｐＨを示す代表的な疑似カラー画像（本明細書では白黒画像）である。切片をビヒクルまたはα−ＣＨＣＡ（５ｍＭ）で前処理した。図に示すスケールバーは２０μｍである。
【０２５１】
図４Ｅは、四角で示した撮像領域のｐＨ変化の時間経過を示す。高張Ｎａ溶液（１６０ｍＭ）を、水平バーによって示される時間の間に適用した。３つのＯＶＬＴからそれぞれｎ＝１０ポイントで示す。野生型（ＷＴ）ビークル対Ｎａｘ−ＫＯビヒクルについて＊＊＊ｐ＜０．００１であり、野生型（ＷＴ）ビヒクル対野生型（ＷＴ）−ＣＨＣＡについて、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１であった。
【０２５２】
図４Ｆは、軽度の酸性化に応答したＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの発火活性に対する乳酸塩の効果を示す。灌流液を改変リンゲル液（［Ｎａ＋］＝１４５ｍＭ、ｐＨ７．４）から、高Ｎａ溶液（１６０ｍＭ、ｐＨ７．４）、低ｐＨ溶液（［Ｎａ＋］＝１４５ｍＭ、ｐＨ７．０）、次いで低ｐＨ乳酸塩（３ｍＭ、ｐＨ７．０）を含む溶液へ変更した。代表的な発火活性（図４Ｆ左、上）、時間経過（図４Ｆ左、下）、サマリーデータ（図４Ｆ右）を示す。サマリーデータは、４〜５分、９〜１０分、１４〜１５分、１９〜２０分、および２４〜２５分に得られたものである。乳酸塩による増強はｐＨ６．８で非常に小さいため、ｐＨ６．８の代わりにｐＨ７．０を使用した（データは示していない）。図中、それぞれ、ｎ＝６である。
【０２５３】
図４Ｇは、ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの発火活性に及ぼす低ｐＨおよび高浸透圧の効果を示す。灌流液を改変リンゲル液（ｐＨ７．４）から低ｐＨ溶液（ｐＨ６．８）または３０ｍＭマンニトール（ｐＨ７．４）を含む溶液に変更した。代表的な発射活動（図４Ｇ左、上）、時間経過（図４Ｇ左、下）、サマリーデータ（図４Ｇ右）を示す。サマリーデータは、４〜５分、９〜１０分、１４〜１５分、および１９〜２０分に得られたものである。図中、それぞれ、ｎ＝６である。
【０２５４】
サマリーデータは、別段の指定がない限り、平均＋／−標準偏差（ＳＥＭ）として表す。「ｎｓ」は「有意差なし」を示す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１とした。各実験の統計解析の詳細を表Ｓ２に示す。
【０２５５】
例５
図５Ａ〜図５Ｋにおいて、ＡＳＩＣ１ａは、ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの活性化を媒介し、血圧（ＢＰ）の上昇をもたらす。
【０２５６】
図５Ａおよび図５Ｂは、ビヒクル、ベンザミル（１ｍＭ；図５Ａ）、ＰｃＴｘ１（１μＭ；図５Ｂ）、またはＡＰＥＴｘ２（２００μＭ；図５Ｂ）を、麻酔下でＯＶＬＴに注射した後の高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答するＭＢＰの変化を示す。水平バーによって示される時間の間、脳室内注入を行った。ＯＶＬＴ注射は、脳室内注入開始の約３０分前に開始し、５分間継続した。図５Ｂの野生型（ＷＴ）マウスのビヒクルデータを図５Ａから再現した。図５Ａでは、ビヒクルとベンザミルとの間で＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１であった。図５Ｂでは、ビヒクルと比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１であった。図中、それぞれ、ｎ＝５である。
【０２５７】
図５Ｃは、図５Ａおよび図５ＢにおけるＭＢＰの変化のまとめを示す（脳室内輸液中は７〜１０分の平均）。図中、それぞれ、ｎ＝５である。
【０２５８】
図５Ｄ上、左は、ＣＴｂ−４８８を用いてＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンを感知する戦略の概略図である。図５Ｄ上、右、下は、ＯＶＬＴのＡＳＩＣ１（赤色で示す）とＣＴｂ−４８８（緑色で示す）信号である。図中の矢印は、ＡＳＩＣ１／ＣＴｂ二重陽性細胞を示す。図に示すスケールバーは５０μｍである。
【０２５９】
図５Ｅ左は、野生型（ＷＴ）マウスのＯＶＬＴにＬａｃＺまたはＡＳＩＣ１のＥｍＧＦＰおよび人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）を運ぶＡＡＶウイルスベクターの注入を示す概略図である。図５Ｅ右は、ＯＶＬＴにおけるＥｍＧＦＰおよびＡＳＩＣ１の免疫蛍光を示す。
【０２６０】
図５Ｆは、高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答したＭＢＰの変化を示す。注入は、水平バーによって示される時間の間に行った。図中、それぞれ、ｎ＝５である。群間では＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１であった。
【０２６１】
図５Ｇは、シナプス伝達の遮断下でのＣＴｂ−５５５標識ＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの発火活性に対するベンザミルによる高張［Ｎａ＋］の効果を示す。ＣＴｂ−５５５注入は、図５ＤのＣＴｂ−４８８注入について記載したように行った。ベンザミル（１ｍＭ）を、記録開始１５分後に灌流液に添加した。代表的な発火活性（図５Ｇ上）、時間経過（図５Ｇ下、左）、サマリーデータ（図５Ｇ下、右）を示す。サマリーデータは、４〜５分、９〜１０分、１９〜２０分、および２４〜２５分に得られたものである。図中、それぞれ、ｎ＝６である。
【０２６２】
図５Ｈは、シナプス伝達の遮断下でのＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンの発火活性に対するＰｃＴｘ１の高張［Ｎａ＋］の効果を示す。記録開始１５分後に灌流液にＰｃＴｘ１（３０ｎＭ）を加えた。代表的な発火活性（図５Ｈ上）、時間経過（図５Ｈ下、左）、サマリーデータ（図５Ｈ下、右）を示す。サマリーデータは、４〜５分、９〜１０分、１９〜２０分、および２４〜２５分に得られたものである。図中、それぞれ、ｎ＝６である。
【０２６３】
図５Ｉおよび図５Ｊは、麻酔下でのＡＳＬ１活性化因子、ＭｉｔＴｘ（０．１又は１μＭ）のＯＶＬＴへの連続注入に応答するＭＢＰの変化を示す。図５Ｉにおいて、ＣＳＤ（２０ｍｇ／ｋｇ体重）がＯＶＬＴ注射の１時間前に腹腔内注射された。ＯＶＬＴ注射は、水平バーによって示された時間の間に行った。図中、それぞれ、ｎ＝６である。
【０２６４】
図５Ｋは、図５Ｉおよび図５ＪにおけるＭＢＰ（ＯＶＬＴ注射中の平均４〜５分）の変化のサマリーを示す。「ｎｓ」は、遺伝子型間に有意差はないことを示し、＊＊ｐ＜０．０１はビヒクルとは有意に異なることを示す。図中、それぞれ、ｎ＝６である。
【０２６５】
サマリーデータは平均＋／−標準偏差（ＳＥＭ）として表す。「ｎｓ」は「有意差なし」を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１とした。各実験の統計解析の詳細を表Ｓ２に示す。図Ｓ４及びＳ５も参照されたい。
【０２６６】
例６
図６Ａ〜図６Ｃにおいて、Ｎａｘシグナルは、ＳＮＡを活性化するために、ＯＶＬＴ−ＰＶＮ−ＲＶＬＭ神経経路を介して伝達される。
【０２６７】
図６Ａ左、上は、ＣＴＶ−４８８のＲＶＬＭへの注入およびＰＶＮ（→ＲＶＬＭ）ニューロンの逆行性ラベリングを示す。図６Ａ左、下は、ＰＶＮ領域の略図である。図６Ａ左下は、ＰＶ摂取前（コントロール）またはＨＳ摂取後（ＨＳ）に、ＰＶＮ中のＦｏｓ（赤色で示す）およびＣＴｂ−４８８（緑色で示す）シグナルである。図中の矢印は、Ｆｏｓ／ＣＴｂ二重陽性細胞を示す。図６Ａ右は、ＣＴｂ−４８８陽性（ＣＴｂ＋）細胞におけるＦｏｓ陽性（Ｆｏｓ＋）細胞の割合のサマリーである。図中、それぞれ、ｎ＝５である。図に示すスケールバーは５０μｍである。
【０２６８】
図６Ｂ上は、ＲＶＬＭを示す冠状脳切片の模式図である。ＲＶＬＭの正方形は、チロシンヒドロキシラーゼ陽性（ＴＨ＋）ニューロンを有する領域を示す。図６Ｂ左下は、ＨＳ摂取前（コントロール）またはＨＳ摂取後（ＨＳ）に、Ｆｏｓ（赤色で示す）およびＴＨ（緑色で示す）の検出を示す。図中の矢印は、Ｆｏｓ／ＴＨ二重陽性細胞を示す。図６Ｂ下、右は、ＴＨ＋細胞におけるＦｏｓ陽性（Ｆｏｓ＋）細胞の割合のサマリーである。図中、それぞれ、ｎ＝５である。図に示すスケールバーは５０μｍである。
【０２６９】
図６Ｃは、塩誘発血圧（ＢＰ）上昇の中心的メカニズムを示す。血液およびＣＳＦ［Ｎａ＋］の増加は、ＯＶＬＴにおいてＮａｘを活性化し、ＭＣＴを介してＮａｘ発現上衣細胞から乳酸（Ｌａｃ−）およびＨ＋放出を誘導する。得られた細胞外酸性化（Ｈ＋）は、ＡＳＩＣ１ａ活性化を介してＯＶＬＴ（→ＰＶＮ）ニューロンを刺激する。ＯＶＬＴ−ＰＶＮ−ＲＶＬＭ神経経路が活性化され、ＳＮＡの増加により血圧（ＢＰ）が上昇する。
【０２７０】
サマリーデータは四分位範囲の中央値として表す。「ｎｓ」は「有意差なし」を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１とした。各実験の統計解析の詳細を表Ｓ２に示す。
【０２７１】
例Ｓ１
本発明者らは、Ｎａｘ−ＫＯマウスが、正常な条件下で毎日の収縮期、拡張期および平均動脈血圧（ＭＢＰ）における典型的なパターンを示したことを確認した（図Ｓ１Ａ）。ＭＢＰは以前に報告されたように２つのピークを有する日周パターンを示した（非特許文献５２参照）。ＨＳ摂取の場合、飲料水を、２％ＮａＣｌを含む生理食塩水で７日間置き換えた。塩摂取量とＮａ排泄量は、ＨＳ摂取の前と後７日間の２つの遺伝子型間で類似していた（図Ｓ１Ｃ〜Ｓ１Ｅ）。
【０２７２】
デオキシコルチコステロンアセテート＋塩（ＤＯＣＡ塩）高血圧モデルを作製するために、イソフルラン吸入によりマウスを麻酔し、次いで５０ｍｇのＤＯＣＡペレット（２１日放出；Innovative Research of America）を皮下に移植するか、擬似手術を行なった。擬似手術を受けたマウスは、食物および純水に自由に接近して維持された（対照群）。ＤＯＣＡを移植したマウスを０．９％のＮａＣｌを含む食物および生理食塩水に２０日間自由に接近させて維持した（ＤＯＣＡ塩群）。
【０２７３】
＜補足情報＞
中枢Ｎａｘによって感知される体液中の［Ｎａ＋］増加は、ＡＳＩＣ１ａのＨ＋依存性活性化を介して交感神経的に誘導される血圧上昇を誘導する。
【０２７４】
図Ｓ１Ａ〜図Ｓ１Ｅにおいて、Ｎａｘ−ＫＯマウスの運動活性およびナトリウム代謝は、ＨＳ摂取中は正常である。これらは図１および以下の方法に関連する。
【０２７５】
図Ｓ１Ａは、収縮期血圧（ＳＢＰ、上）、拡張期血圧（ＢＰ）（ＤＢＰ、中）および平均動脈血圧（ＭＢＰ、下）の概日変化を示す。それぞれのパラメータは、遠隔測定法により自由に動く条件下で２日間連続して記録した。生データを１時間にわたって平均し、２日間の値を平均した。図中、それぞれ、ｎ＝１０のマウスを用いた。
【０２７６】
図Ｓ１Ｂ左は、コントロールおよびＨＳ摂取マウスの運動活性の概日変化を示す。活動（活性）は遠隔測定法によって自由に動く条件下で記録された。活動カウントは１時間間隔で合計された。図Ｓ１Ｂ右は、２４時間にわたる全運動活動を示す。図中、それぞれ、ｎ＝７のマウスを用いた。図Ｓ１Ａおよび図Ｓ１Ｂのサマリーデータは平均＋／−標準偏差（ＳＥＭ）として表される。「ｎｓ」は、「重要ではない」ことを示す。
【０２７７】
図Ｓ１Ｃは、実験手順の模式図である。マウスを代謝ケージに３日間（−４日目〜−２日目）慣らし、正常な食事と水で飼育した。−１日目に、飲水量、摂食量、尿量を測定した（対照条件とした）。次いで、ＨＳ摂取を７日間強制するために、飲料水を２％ＮａＣｌ溶液と交換した。７日目に、２％ＮａＣｌ溶液の飲用量、摂食量および尿容量を測定した（ＨＳ摂取状態）。体液摂取量は主に食物摂取量と関連があり、野生型（ＷＴ）とＮａｘ−ＫＯマウス（非特許文献１７参照）の間では類似していた。
【０２７８】
図Ｓ１Ｄおよび図Ｓ１Ｅは、対照（−１日目）（図Ｓ１Ｄ）およびＨＳ摂取（７日目）（図Ｓ１Ｅ）条件下の野生型（ＷＴ）およびＮａｘ−ＫＯマウスの塩および水代謝を示す。毎日の水分摂取量、総Ｎａ摂取量、尿容量、尿中［Ｎａ＋］、尿中Ｎａ排泄量、Ｎａバランス、水収支が表示される。図Ｓ１Ｅでは、摂取量の代わりに２％ＮａＣｌ溶液の摂取量が示されている。図Ｓ１Ｄの対照マウスによる総Ｎａ摂取量を、マウス（食餌１００ｇ中のＮａ ０．４１ｇ）によって消費された食物量のＮａ含量から計算した。図Ｓ１ＥにおけるＨＳ摂取マウスによる総摂取量は、食物から採取したＮａと２％ＮａＣｌ溶液の合計であった。尿中Ｎａ排泄量は、尿量および尿［Ｎａ＋］から算出した。Ｎａバランスは、全Ｎａ摂取量（ｍｍｏｌ／日）から尿Ｎａ排泄量（ミリモル／日）を差し引いて算出した。図Ｓ１Ｄにおける対照マウスの水収支は、摂取量（ｍＬ／日）から尿量（ｍＬ／日）を差し引くことによって計算した。図Ｓ１ＥにおけるＨＳ摂取マウスの水収支は、２％ＮａＣｌ溶液（ｍＬ／日）の摂取量から尿量（ｍＬ／日）を差し引いて計算した。サマリーデータは四分位範囲の中央値として表される。図中、それぞれ、ｎ＝５のマウスを用いた。「ｎｓ」は「有意差なし」を示す。各実験の統計解析の詳細を表Ｓ２に示す。
【０２７９】
例Ｓ２
図Ｓ２Ａ〜図Ｓ２Ｈにおいて、体液中の［Ｎａ＋］の慢性的かつ急激な増加は共に、野生型（ＷＴ）における交感神経媒介性血圧（ＢＰ）上昇を駆動するが、Ｎａｘ−ＫＯマウスでは上昇しない。図１に関連する。
【０２８０】
図Ｓ２Ａおよび図Ｓ２Ｂは、ＤＯＣＡ塩処理の０日目および２０日目の血液（図Ｓ２Ａ）およびＣＳＦ Ｎａ＋濃度（図Ｓ２Ｂ）を示す。図中、それぞれ、ｎ＝５である。
【０２８１】
図Ｓ２Ｃは、２０日間のＤＯＣＡ塩治療前後の血圧（ＢＰ）の変化を示す。テールカフ法を用いて毎日の血圧（ＢＰ）を測定した。０日目の測定後、ＤＯＣＡペレットを皮下に移植し、飲料水を０．９％ＮａＣｌで置換した。図中、それぞれ、ｎ＝１１である。
【０２８２】
図Ｓ２Ｄは、非処理（対照）およびＤＯＣＡ塩（ＤＯＣＡ）野生型（ＷＴ）およびＮａｘ−ＫＯマウスにおけるＣＳＤ注射によって誘導された血圧（ＢＰ）の変化を示す。ビヒクル（１９日目）またはクロルイソンダミン（ＣＳＤ、２０日目）は、血圧（ＢＰ）測定の１時間前に腹腔内注入し、ビヒクル処置とＣＳＤ処置との間の血圧（ＢＰ）の差異を示した。図中、それぞれ、ｎ＝８である。
【０２８３】
図Ｓ２Ｅは、等張性（１４５ｍＭ ［Ｎａ＋］）および高張性（３Ｍ［Ｎａ＋］）生理食塩水の腹腔内投与の前および後の野生型（ＷＴ）およびＮａｘ−ＫＯマウスにおける血液およびＣＳＦ［Ｎａ＋］を示す。図中、それぞれ、ｎ＝４である。注入は、水平バーによって示される時間の間、行った。
【０２８４】
図Ｓ２Ｆは、麻酔下での等張および高張食塩水の腹腔内注入に応じたＭＢＰの変化を示す。図中、それぞれ、ｎ＝５である。縦軸は０分の値をゼロに設定した。等張性と高張性の間で、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１であった。
【０２８５】
図Ｓ２Ｇは、ＣＳＤ（２０ｍｇ／ｋｇ体重）で前処理したマウスにおける高張食塩水の腹腔内注入に応じたＭＢＰの変化を示す。図中、それぞれ、ｎ＝５である。
【０２８６】
図Ｓ２Ｈは、図Ｓ２Ｆおよび図Ｓ２Ｇにおける腹腔内注入の開始後３０分のＭＢＰの変化のサマリーを示す。図中、それぞれ、ｎ＝５である。
【０２８７】
データは平均＋／−標準偏差（ＳＥＭ）として表す。「ｎｓ」は「有意差なし」を示す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１とした。各実験の統計解析の詳細を表Ｓ２に示す。
【０２８８】
例Ｓ３
図Ｓ３Ａ〜図Ｓ３Ｃにおいて、ＯＶＬＴは、ＣＳＦ ［Ｎａ＋］増加によって誘発される交感神経媒介性の血圧（ＢＰ）上昇に必須であり、ＰＶＮに突出するＶｇｌｕｔ２陽性ニューロンを保持する。これらは図２に関連する。
【０２８９】
ＯＶＬＴを選択的に破壊されたマウスは、脳脊髄液のＮａ＋濃度上昇に応答した交感神経性の血圧上昇を起こさない
Ｎａｘの発現部位であるＳＦＯあるいはＯＶＬＴを局所的に破壊したマウスを作製した。破壊後、高張Ｎａ液（Ｎａ＋濃度：４５０ｍＭ）の脳室内注入をおこない、血圧の変化を比較した。
【０２９０】
図Ｓ３Ａは、冠状脳切片を示す。局所破壊の代表的な成功例を示す。
右のパネルは、ＳＦＯまたはＯＶＬＴを局所破壊したマウスの脳切片を示す。コントロールパネルの矢頭は、ＳＦＯまたはＯＶＬＴを示す。図中のスケールバーは２５０μｍである。
【０２９１】
図Ｓ３Ｂは、麻酔下の野生型（ＷＴ）マウスにおける高張Ｎａ溶液の脳室内注入に応答するＭＢＰの変化を示す。対照は、別の脳領域の局所的な電気的破壊を受けた。注入は、水平バーによって示される時間の間行った。図中、それぞれ、ｎ＝６である。対照と比較して、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１であった。
【０２９２】
対象群とＳＦＯ破壊群では、高張Ｎａ液の脳室注入にともなって血圧が同様に上昇した。ＯＶＬＴを破壊したマウスでは、高張Ｎａ液を脳室注入したときの血圧上昇が抑制されていた。
データは平均値＋／−標準偏差（ＳＥＭ）で表示している。双方向（Two-way） repeated measure ANOVAで検定をおこなったのち、スチューデント（Student’s）ｔ検定で事後比較をおこなった。ｎｓ有意差なし、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【０２９３】
図Ｓ３Ｃ左は、Ｖｇｌｕｔ２−ｉｒｅｓ−ＣｒｅまたはＶｇａｔ−ｉｒｅｓ−ＣｒｅマウスのＰＶＮへのＨｉＲｅｔ−ＤＩＯ−ＣｈＲ２―ＥＹＦＰの注入を示す模式図である。図Ｓ３Ｃ中は、ＯＶＬＴにおけるＥＹＦＰ発現を示す。図中のスケールバーは５０μｍである。図Ｓ３Ｃ右は、ＯＶＬＴ中のＥＹＦＰ陽性細胞数を示す。図中、それぞれ、ｎ＝５である。＊＊＊ｐ＜０．００１であった。
【０２９４】
サマリーデータは平均値＋／−標準偏差（ＳＥＭ）として表される。各実験の統計解析の詳細を表Ｓ２に示す。
【０２９５】
例Ｓ４
図Ｓ４において、ＯＶＬＴから心室へのウイルス漏出は有効であることを示す。図５に関連する。
【０２９６】
図Ｓ４左は、ＡＡＶ−ＥｍＧＦＰ−ＬａｃＺ ａｍｉＲＮＡを第３脳室（３Ｖ）またはＯＶＬＴに注入する模式図である。合計５０または２５０ｎＬのＡＡＶウイルスを３ＶまたはＯＶＬＴにそれぞれ注入した。図Ｓ４右は、ＯＶＬＴおよび第４脳室（４Ｖ）のＥｍＧＦＰシグナルを示す。矢頭はＥｍＧＦＰ陽性細胞を示す。ウイルス注入が成功した場合（左欄）、４Ｖを囲むＯＶＬＴ（矢頭）または脳室周囲組織の最下部領域（矢印）には感染がなかった。一方、ウイルス漏出が ３Ｖが発生し、４Ｖ領域への感染も観察された（右の列）。図中のスケールバーは５０μｍである。
【０２９７】
例Ｓ５
図Ｓ５Ａ〜図Ｓ５Ｃにおいて、ＭｎＰＯは、ＰＶＮに突出するニューロンを保持するが、Ｎａｘ発現に関しては陰性である。図５に関連する。
【０２９８】
図Ｓ５Ａ上は、ＰＶＮへのＣＴｂ−４８８の注入および前核核（ＭｎＰＯ）の逆行性標識を示す模式図である。図Ｓ５Ａ下は、少数のＣＴｂ−４８８陽性ニューロンがＭｎＰＯ中に検出されたことを示す。ｄＭｎＰＯ；背側ＭｎＰＯ、ｖＭｎＰＯ；腹側ＭｎＰＯ、ａｃａ；前交連（anterior commissure）。
【０２９９】
図Ｓ５Ｂは、ｄＭｎＰＯのＡＳＩＣ１（赤色で示す）とＣＴｂ−４８８（緑色で示す）信号を示す。矢頭は、ＡＳＩＣ１／ＣＴｂ二重陽性細胞を示す。図中のスケールバーは５０μｍである。
【０３００】
図Ｓ５Ｃは、野生型（ＷＴ）およびＮａｘ−ＫＯマウスのＯＶＬＴおよびｄＭｎＰＯにおけるＮａｘシグナルの検出を示す。図中のスケールバーは５０μｍである。
【０３０１】
例７
図７Ａ〜図７Ｂでは、ＯＶＬＴにおいてＡＳＩＣ１の機能や発現を抑制すると、脳脊髄液のＮａ＋濃度上昇に応答した交感神経性の血圧上昇が抑制される。
【０３０２】
図７Ａでは、野生型マウスのＯＶＬＴへ、ＡＳＩＣ１ａの選択的阻害剤Ｐｓａｌｍｏｔｏｘｉｎ−１の局所的注入をおこなった。その後、高張Ｎａ液の脳室注入をおこない、血圧を測定した。溶媒のみの注入をおこなった対照群では、高張Ｎａ液の脳室注入にともなって血圧が上昇した。ＡＳＩＣ１ａ阻害剤を注入したマウスでは、高張Ｎａ液を脳室注入したときの血圧上昇が抑制されていた。各群ｎ＝５匹。
【０３０３】
図７Ｂでは、野生型マウスのＯＶＬＴで、人工マイクロＲＮＡを用いたＡＳＩＣ１の局所的ノックダウンをおこなった。人工マイクロＲＮＡの導入にはアデノ随伴ウイルスを用いた。その後、高張Ｎａ液の脳室注入をおこない、血圧を測定した。対照群として大腸菌ＬａｃＺ遺伝子を標的とする人工マイクロＲＮＡを導入したマウスでは、高張Ｎａ液の脳室注入にともなって血圧が上昇した。ＡＳＩＣ１のノックダウンをおこなったマウスでは、高張Ｎａ液を脳室注入したときの血圧上昇が抑制されていた。各群ｎ＝６匹。
【０３０４】
データは平均値＋／−標準偏差（ＳＥＭ）で表示している。双方向（Two-way） repeated measure ANOVAで検定をおこなったのち、スチューデント（Student’s）ｔ検定で事後比較をおこなった。ｎｓ有意差なし、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【０３０５】
【表１】
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【０３０６】
脳室内等張性（１４５ｍＭ ［Ｎａ＋］）または様々な高張性（３００，４５０、または９００ｍＭ ［Ｎａ＋］）Ｎａ溶液の脳室内注入を行った。１０分間脳室内注入した後、ＣＳＦを大槽から集めた。表中、それぞれ、ｎ＝５のマウスを用いた。各実験の統計解析の詳細を表Ｓ２に示す。
【０３０７】
【表２】
2020089350.tif 000003
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【０３０８】
【表３】
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【０３０９】
【表４】
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【０３１０】
【表５】
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【０３１１】
【表６】
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【０３１２】
【表７】
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【０３１３】
【表８】
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【０３１４】
【表９】
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【０３１５】
【表１０】
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【０３１６】
【表１１】
2020089350.tif 000023
【０３１７】
以上の通り、本発明の実施例から次のように纏めることもできる。
（１）構成及び説明
Ｎａｘ遺伝子欠損マウスでは、食塩の過剰摂取や、体液のＮａ＋濃度上昇に応答した血圧上昇が消失していた。Ｎａｘの発現部位であるＯＶＬＴを選択破壊すると、体液のNa+濃度上昇に応答した血圧上昇が消失した。Ｎａｘシグナルの受容分子である酸感受性イオンチャンネルＡＳＩＣ1の発現や機能をＯＶＬＴで抑制すると、体液のＮａ＋濃度上昇に応答した血圧上昇が消失した。
【０３１８】
（２）具体的作用
ＮａｘおよびＡＳＩＣ1の発現や機能を阻害することで、食塩の過剰摂取や体液のＮａ＋濃度上昇にともなう血圧上昇を抑制できることを見出した。ＮａｘやＡＳＩＣ1の機能を阻害する化合物をターゲットとしたスクリーニングをおこなうことで、新規の血圧改善薬の開発に利用することができる。
【０３１９】
（３）実施例に基づく特有の効果
中枢神経系を標的とした高血圧治療薬は開発されていない。本発明を利用して開発される血圧改善薬は、これまでにない新規の作用機序を持つため、既存薬との併用により相加効果／相乗効果を発揮できる可能性がある。さらに、Ｎａｘ遺伝子欠損マウスには見かけ上の異常はなく、正常に生育する。ＡＳＩＣ１遺伝子欠損マウスについても、深刻な異常は報告されていない。このことから、副作用リスクの少ない治療法が開発できると考えられる。
【図１Ａ】
2020089350.tif 000024
【図１Ｂ】
2020089350.tif 000025
【図１Ｃ】
2020089350.tif 000026
【図１Ｄ】
2020089350.tif 000027
【図１Ｅ】
2020089350.tif 000028
【図１Ｆ】
2020089350.tif 000029
【図１Ｇ】
2020089350.tif 000030
【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
2020089350.tif 000032
【図１Ｊ】
2020089350.tif 000033
【図１Ｋ】
2020089350.tif 000034
【図１Ｌ】
2020089350.tif 000035
【図２Ａ】
2020089350.tif 000036
【図２Ｂ】
2020089350.tif 000037
【図２Ｃ】
2020089350.tif 000038
【図２Ｄ】
2020089350.tif 000039
【図２Ｅ】
2020089350.tif 000040
【図２Ｆ】
2020089350.tif 000041
【図２Ｇ】
2020089350.tif 000042
【図２Ｈ】
2020089350.tif 000043
【図３Ａ】
2020089350.tif 000044
【図３Ｂ】
2020089350.tif 000045
【図３Ｃ】
2020089350.tif 000046
【図３Ｄ】
2020089350.tif 000047
【図３Ｅ】
2020089350.tif 000048
【図３Ｆ】
2020089350.tif 000049
【図３Ｇ】
2020089350.tif 000050
【図３Ｈ】
2020089350.tif 000051
【図４Ａ】
2020089350.tif 000052
【図４Ｂ】
2020089350.tif 000053
【図４Ｃ】
2020089350.tif 000054
【図４Ｄ】
2020089350.tif 000055
【図４Ｅ】
2020089350.tif 000056
【図４Ｆ】
2020089350.tif 000057
【図４Ｇ】
2020089350.tif 000058
【図５Ａ】
2020089350.tif 000059
【図５Ｂ】
2020089350.tif 000060
【図５Ｃ】
2020089350.tif 000061
【図５Ｄ】
2020089350.tif 000062
【図５Ｅ】
2020089350.tif 000063
【図５Ｆ】
2020089350.tif 000064
【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
2020089350.tif 000069
【図６Ａ】
2020089350.tif 000070
【図６Ｂ】
2020089350.tif 000071
【図６Ｃ】
2020089350.tif 000072
【図Ｓ１Ａ】
2020089350.tif 000073
【図Ｓ１Ｂ】
2020089350.tif 000074
【図Ｓ１Ｃ】
2020089350.tif 000075
【図Ｓ１Ｄ】
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【図Ｓ１Ｅ】
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【図Ｓ２Ａ】
2020089350.tif 000078
【図Ｓ２Ｂ】
2020089350.tif 000079
【図Ｓ２Ｃ】
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【図Ｓ２Ｄ】
2020089350.tif 000081
【図Ｓ２Ｅ】
2020089350.tif 000082
【図Ｓ２Ｆ】
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【図Ｓ２Ｇ】
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【図Ｓ２Ｈ】
2020089350.tif 000085
【図Ｓ３Ａ】
2020089350.tif 000086
【図Ｓ３Ｂ】
2020089350.tif 000087
【図Ｓ３Ｃ】
2020089350.tif 000088
【図Ｓ４】
2020089350.tif 000089
【図Ｓ５Ａ】
2020089350.tif 000090
【図Ｓ５Ｂ】
2020089350.tif 000091
【図Ｓ５Ｃ】
2020089350.tif 000092
【図７Ａ】
2020089350.tif 000093
【図７Ｂ】
2020089350.tif 000094
【図８】
2020089350.tif 000095
【図９Ａ】
2020089350.tif 000096
【図９Ｂ】
2020089350.tif 000097
【図１０】
2020089350.tif 000098
【図１１】
2020089350.tif 000099
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年9月6日(2019.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法であって、等張ナトリウム濃度を超えるナトリウム濃度下で、終板脈管器官細胞に被検物質を接触させ、接触前の細胞内Ｎａ＋流入速度に対して当該細胞内へのＮａ＋流入速度が有意に減少すること特徴とするＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法であって、等張ナトリウム濃度を超えるナトリウム濃度下で、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１を発現する細胞に被検物質を接触させ、接触前の細胞内Ｎａ＋流入速度に対して当該細胞内へのＮａ＋流入速度が有意に減少すること特徴とするＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法であって、
Ｎａｘチャンネルを発現する細胞が、クローン化されており、動物細胞に対してＮａｘをコードするｃＤＮＡをプラスミドベクター又はウイルスベクターを用いて発現させた細胞であり、
ＡＳＩＣ１を発現する細胞が、クローン化されており、動物細胞に対してASIC1をコードするｃＤＮＡをプラスミドベクター又はウイルスベクターを用いて発現させた細胞である、方法。
【請求項３】
食塩感受性高血圧症の予防及び／又は治療用医薬のスクリーニング方法であって、等張ナトリウム濃度を超えるナトリウム濃度下で、終板脈管器官細胞に被検物質を接触させ、当該細胞内へのＮａ＋流入速度が有意に減少することを特徴とする食塩感受性高血圧症の予防及び／又は治療用医薬のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求項１または請求項３に記載のスクリーニング方法において、等張ナトリウム濃度を超えるナトリウム濃度下で、終板脈管器官細胞に被検物質を接触させ、接触の有無において乳酸塩量、細胞外Ｈ＋濃度またはｐＨに有意な差があることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項５】
蛍光タンパク質を結合させたＮａｘもしくはＡＳＩＣ１を発現するベクターを用いて、培養細胞にＮａｘチャンネルと蛍光タンパク質の融合タンパク質もしくはＡＳＩＣ１と蛍光タンパク質の融合タンパク質を発現させた培養細胞に、被検物質として核酸を接触させ、接触の有無において前記培養細胞に由来する蛍光量に有意な差があるスクリーニング方法であって、
培養細胞は次の１）および２）の工程を経て得られる細胞であり、
１）プラスミドベクター又はウイルスベクターを用いて培養細胞にＮａｘあるいはＡＳＩＣ１を発現させる、
２）発現させるＮａｘあるいはＡＳＩＣ１に、融合遺伝子（Ｆｕｓｅｄ−ｇｅｎｅ）の形で発現ベクターをデザインして蛍光タンパク質を結合させる、
前記培養細胞において、前記ＮａｘチャンネルもしくはＡＳＩＣ１と蛍光タンパク質の融合タンパク質の発現量を蛍光の強さとして評価する方法であり、
前記披検物質を、前記培養細胞を含む培地に添加し、添加しない場合に対して有意に蛍光量が減少することで評価する、方法。
【請求項６】
蛍光タンパク質を結合させたＮａｘもしくはＡＳＩＣ１を発現するベクターを用いて、培養細胞にＮａｘチャンネルと蛍光タンパク質の融合タンパク質もしくはＡＳＩＣ１と蛍光タンパク質の融合タンパク質を発現させた培養細胞に、被検物質としてペプチドを接触させ、接触の有無において前記培養細胞に由来する蛍光量に有意な差があるスクリーニング方法であって、
培養細胞は次の１）および２）の工程を経て得られる細胞であり、
１）プラスミドベクター又はウイルスベクターを用いて培養細胞にＮａｘあるいはＡＳＩＣ１を発現させる、
２）発現させるＮａｘあるいはＡＳＩＣ１に、融合遺伝子（Ｆｕｓｅｄ−ｇｅｎｅ）の形で発現ベクターをデザインして蛍光タンパク質を結合させる、
前記培養細胞において、前記ＮａｘチャンネルもしくはＡＳＩＣ１と蛍光タンパク質の融合タンパク質の発現量を蛍光の強さとして評価する方法であり、
前記披検物質を、前記培養細胞を含む培地に添加し、添加しない場合に対して有意に蛍光量が減少することで評価する、方法。
【請求項７】
Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で存在する非ヒト動物に、被検物質を投与し、当該非ヒト動物におけるＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の活性を比較・評価することを特徴とするＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法であって、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の活性の比較・評価が、前記非ヒト動物の血液と脳脊髄液のＮａ＋濃度に依存する前記非ヒト動物の血圧による食塩感受性高血圧症の程度の比較・評価である、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
非ヒト動物がマウスである、請求項７に記載のＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法。
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月5日(2020.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
食塩感受性高血圧症の予防及び／又は治療用医薬のスクリーニング方法であって、等張ナトリウム濃度を超えるナトリウム濃度下で、終板脈管器官細胞に被検物質を接触させ、当該細胞内へのＮａ＋流入速度が有意に減少することを特徴とする食塩感受性高血圧症の予防及び／又は治療用医薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で存在する非ヒト動物に、被検物質を投与し、当該非ヒト動物におけるＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の活性を比較・評価することを特徴とするＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法であって、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の活性の比較・評価が、前記非ヒト動物の血液と脳脊髄液のＮａ＋濃度に依存する前記非ヒト動物の血圧による食塩感受性高血圧症の程度の比較・評価である、Ｎａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
非ヒト動物がマウスである、請求項２に記載のＮａｘチャンネル及び／又はＡＳＩＣ１の発現または機能を阻害する物質のスクリーニング方法。