(57)【要約】      （修正有）【課題】顕微鏡による細胞の識別作業が不要であり、量産性に優れ、高純度の多能性幹細胞の懸濁液を製造可能な、細胞懸濁液の製造方法の提供。【解決手段】以下の工程を経る、未分化の多能性幹細胞を含む細胞懸濁液の製造方法。（１）液体培地中で多能性幹細胞を培養基材に接着させ、培養する工程。（２）下記［ａ］〜［ｃ］の複数の組合せからなる工程、又は下記［ｃ］工程によって、分化細胞１の少なくとも一部を基材に接着させたまま、（１）工程で培養した未分化の多能性幹細胞を基材から剥離する工程。［ａ］多能性幹細胞に細胞間結合乖離液を接触させ、細胞間結合を乖離させる工程。［ｂ］未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する外部応力を加える工程。［ｃ］培養基材が温度応答性を有するものであり、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する温度及び時間で基材を冷却する工程。【選択図】図１
2020028287.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（２）の工程を経ることを特徴とする、未分化の多能性幹細胞を含む細胞懸濁液の製造方法。
（１）液体培地中で多能性幹細胞を培養基材に接着させ、培養する工程。
（２）下記［ａ］〜［ｃ］の複数の組合せからなる工程、又は下記［ｃ］工程によって、分化細胞の少なくとも一部を基材に接着させたまま、（１）工程で培養した未分化の多能性幹細胞を基材から剥離する工程。
［ａ］多能性幹細胞に細胞間結合乖離液を接触させ、細胞間結合を乖離させる工程。
［ｂ］未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する外部応力を加える工程。
［ｃ］培養基材が温度応答性を有するものであり、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する温度及び時間で基材を冷却する工程。
ここで、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する［ｂ］工程の外部応力及び［ｃ］工程の温度及び時間は、複数の剥離条件で（２）工程を行い、製造された細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率をフローサイトメーターにより測定し、未分化率が最も高い条件を選択するか、又は培養基材上の細胞を位相差顕微鏡により（２）工程の前後で観察し、未分化の多能性幹細胞が選択的に基材から剥離する条件を選択することにより決定される。
【請求項２】
前記［ａ］工程が、キレート剤を含有する細胞間結合乖離液を１秒〜３０分間接触させる工程、又はトリプシンを含有する細胞間結合乖離液を１秒〜１０分間接触させる工程であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞懸濁液の製造方法。
【請求項３】
前記［ｂ］工程が、０．１〜１０ｍＬ／ｓの流量で対流を与える工程であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞懸濁液の製造方法。
【請求項４】
前記［ｃ］工程が、０〜３０℃の温度で１秒〜６０分間冷却する工程であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞懸濁液の製造方法。
【請求項５】
前記［ｃ］工程の培養基材が、層厚×温度応答性成分の含有割合の積が５〜１００ｎｍである高分子による層を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞懸濁液の製造方法。
【請求項６】
前記［ｃ］工程の培養基材が、温度応答性成分の含有割有が７５ｗｔ％以上であるブロック共重合体であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞懸濁液の製造方法。
【請求項７】
前記［ｂ］及び［ｃ］工程において、多能性幹細胞を液体培地存在下で剥離することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞懸濁液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡による細胞の識別作業が不要であり、量産性に優れ、高純度の多能性幹細胞の懸濁液を製造可能な、細胞懸濁液の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞は、生体の様々な組織に分化する能力（分化万能性）を持つ細胞であり、再生医療分野における細胞ソースとして、大きな注目が寄せられている。多能性幹細胞を再生医療に応用するには、まず必要な数の多能性幹細胞を未分化状態で増殖させた後に、多能性幹細胞を液体に懸濁させた細胞懸濁液として回収することが必須である。
【０００３】
従来、高純度の多能性幹細胞の細胞懸濁液を作製する際には、次のような工程が必要であった。まず、分化した細胞（純度の低い細胞）を取り除くために、顕微鏡で観察して細胞を識別し、分化した細胞が存在する領域に印を付け、印を付けた領域をセルスクレーパーと呼ばれる棒状の器具を使用して擦ることにより、分化した細胞のみを基材から剥離させ、取り除く。次に、セルスクレーパーで基材全体を擦ることにより、基材上の全ての細胞を剥離させ、回収する。しかしながら、このような従来の多能性幹細胞の細胞懸濁液の作製方法では、基材上の一部の領域から手作業で分化した細胞を取り除くため、分化した細胞の除去に多大な時間を要し、量産性に乏しいという問題があった。また、分化した細胞を除去する際、除外する必要のない未分化の細胞までもが除外されるか、細胞を傷つける原因となっていた。さらには、未分化の細胞を回収する際にも、基材全体をセルスクレーパーで擦る必要があることから、大面積の基材を用いて大量の細胞懸濁液を作製するのは困難であった。
【０００４】
分化した細胞を選択的に除去する別の方法として、特許文献１では、培養容器の外部から高周波振動を加えることにより、培養容器内部の接着面から領域選択的に細胞を剥離させる方法が開示されている。しかしながら、特許文献１の方法では、一部の領域から選択的に細胞を剥離させるものであり、顕微鏡で細胞を観察して識別する作業が必要であり、細胞懸濁液の量産性を高めるものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１４／０１７４８１公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、顕微鏡による細胞の識別作業が不要であり、量産性に優れ、高純度の多能性幹細胞の懸濁液を製造可能な、細胞懸濁液の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、以上の点を鑑み、鋭意研究を重ねた結果、分化した細胞を取り除くことなく、未分化の細胞のみを選択的に剥離させる工程を有する細胞懸濁液の製造方法が上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、以下の［１］乃至［７］に存する。
［１］以下の（１）〜（２）の工程を経ることを特徴とする、未分化の多能性幹細胞を含む細胞懸濁液の製造方法。
（１）液体培地中で多能性幹細胞を培養基材に接着させ、培養する工程。
（２）下記［ａ］〜［ｃ］の複数の組合せからなる工程又は下記［ｃ］工程によって、分化細胞の少なくとも一部を基材に接着させたまま、（１）工程で培養した未分化の多能性幹細胞を基材から剥離する工程。
【０００９】
［ａ］多能性幹細胞に細胞間結合乖離液を接触させ、細胞間結合を乖離させる工程。
【００１０】
［ｂ］未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する外部応力を加える工程。
【００１１】
［ｃ］培養基材が温度応答性を有するものであり、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する温度及び時間で基材を冷却する工程。
【００１２】
ここで、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する［ｂ］工程の外部応力及び［ｃ］工程の温度及び時間は、複数の剥離条件で（２）工程を行い、製造された細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率をフローサイトメーターにより測定し、未分化率が最も高い条件を選択するか、又は培養基材上の細胞を位相差顕微鏡により（２）工程の前後で観察し、未分化の多能性幹細胞が選択的に基材から剥離する条件を選択することにより決定される。
［２］  前記［ａ］工程が、キレート剤を含有する細胞間結合乖離液を１秒〜３０分間接触させる工程、又はトリプシンを含有する細胞間結合乖離液を１秒〜１０分間接触させる工程であることを特徴とする、［１］に記載の細胞懸濁液の製造方法。
［３］  前記［ｂ］工程が、０．１〜１０ｍＬ／ｓの流量で対流を与える工程であることを特徴とする、［１］又は［２］に記載の細胞懸濁液の製造方法。
［４］  前記［ｃ］工程が、０〜３０℃の温度で１秒〜６０分間冷却する工程であることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞懸濁液の製造方法。
［５］  前記［ｃ］工程の培養基材が、層厚×温度応答性成分の含有割合の積が５〜１００ｎｍである高分子による層を有することを特徴とする、［１］〜［４］のいずれかに記載の細胞懸濁液の製造方法。
［６］  前記［ｃ］工程の培養基材が、温度応答性成分の含有割有が７５ｗｔ％以上であるブロック共重合体であることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞懸濁液の製造方法。
［７］  前記［ｂ］及び［ｃ］工程において、多能性幹細胞を液体培地存在下で剥離することを特徴とする、［１］〜［６］のいずれかに記載の細胞懸濁液の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、顕微鏡による細胞の選別作業が不要であり、量産性に優れ、高純度の多能性幹細胞の懸濁液を製造可能な、細胞懸濁液の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１の剥離操作前の基材表面の位相差顕微鏡像。
【図２】実施例１のキレート剤処理後の基材表面の位相差顕微鏡像。
【図３】実施例１の冷却剥離後の基材表面の位相差顕微鏡像。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための形態（以下、単に「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。以下の本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。
【００１６】
本明細書において、「温度応答性高分子」とは、温度変化によって親水性／疎水性の程度が変化する高分子を示す。また、水分子の存在下で高分子の温度を低温から高温へ昇温していく場合に、ある温度を境に高分子の親水性／疎水性の程度がより疎水性に変化し、水溶性から水不溶性に変化する温度応答性高分子が存在し、この境界温度を「下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ；Ｌｏｗｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）」という。一般に、温度応答性高分子がＬＣＳＴ未満の温度において水に溶解する場合、ＬＣＳＴ以上の温度では水に不溶となる。温度応答性高分子が水不溶性である場合には、ＬＣＳＴを有しないが、温度変化によって親水性／疎水性の程度が変化する応答温度を有する。
【００１７】
また、本明細書において、細胞懸濁液に含まれる細胞の「未分化率」とは、細胞懸濁液に含まれる細胞の内、どの程度の細胞が未分化の多能性幹細胞であるかの割合を示す。未分化率が高い場合、細胞懸濁液に含まれる多能性幹細胞の純度が高いことを意味し、好ましいものである。なお、細胞懸濁液の未分化率は、細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化マーカーを蛍光染色し、染色された細胞の割合をフローサイトメーターにより算出することで求めることができる。
【００１８】
本発明において、多能性幹細胞の種類は特に限定されるものではないが、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）を用いることができ、特に好ましくはｉＰＳ細胞である。また、多能性幹細胞の由来動物は特に限定されるものではないが、例えば、哺乳動物由来であることができる。哺乳動物の例には、げっ歯類（マウス、ラット等）、霊長類（サル、ヒト等）が含まれ、また実験動物であってもよく、コンパニオンアニマルであってもよい。本発明において、好ましくは霊長類由来であり、特に好ましくはヒト由来である。
【００１９】
本発明において「分化細胞」とは、多能性幹細胞が分化することで多能性幹細胞以外の細胞へと変化した細胞を示す。
【００２０】
本発明の細胞懸濁液の製造方法は、以下の（１）〜（２）の工程を経ることを特徴とする、未分化の多能性幹細胞を含む細胞懸濁液の製造方法。
（１）液体培地中で多能性幹細胞を培養基材に接着させ、培養する工程。
（２）下記［ａ］〜［ｃ］の複数の組合せからなる工程又は下記［ｃ］工程によって、分化細胞の少なくとも一部を基材に接着させたまま、（１）工程で培養した未分化の多能性幹細胞を基材から剥離する工程。
【００２１】
［ａ］多能性幹細胞に細胞間結合乖離液を接触させ、細胞間結合を乖離させる工程。
【００２２】
［ｂ］未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する外部応力を加える工程。
【００２３】
［ｃ］培養基材が温度応答性を有するものであり、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する温度及び時間で基材を冷却する工程。
【００２４】
ここで、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する［ｂ］工程の外部応力及び［ｃ］工程の温度及び時間は、複数の剥離条件で（２）工程を行い、製造された細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率をフローサイトメーターにより測定し、未分化率が最も高い条件を選択するか、又は培養基材上の細胞を位相差顕微鏡により（２）工程の前後で観察し、未分化の多能性幹細胞が選択的に基材から剥離する条件を選択することにより決定される。
【００２５】
本発明の（１）工程では、液体培地中で多能性幹細胞を培養基材に接着させ、培養する。多能性幹細胞を培養基材上で培養する方法としては、特に限定はないが、フィーダーフリー培養が好ましい。フィーダーフリーで培養を行う際、未分化性を維持させるのに有効な条件で培養することが好ましく、例えば、適切な液体培地の存在下で培養を行うことなどが挙げられる。多能性幹細胞の未分化性を維持させるのに有効な培地としては、例えば、多能性幹細胞の未分化性を維持するための因子として知られている、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、アスコルビン酸、炭酸水素ナトリウム、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、ＣＣＬ２、アクチビン、２−メルカプトメタノールのうち１つ以上を添加した培地を好適に用いることができる。多能性幹細胞の未分化性を維持するのに特に好適であることから、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、アスコルビン酸、炭酸水素ナトリウム、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）を含有する培地を用いることがさらに好ましく、塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地を用いることが最も好ましい。
【００２６】
前記塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地の種類に特に制限はないが、例えば、市販品としては、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ製）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ製）、Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ製）、Ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０３（味の素（株）製）、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ製）、ＴｅＳＲ−Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ製）、ＲｅｐｒｏＮａｉｖｅ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＸＦ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＦＦ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＦＦ２（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（バイオロジカルインタストリーズ社製）、ｉＳＴＥＭ（タカラバイオ（株）製）、ＧＳ２−Ｍ（タカラバイオ（株）製）、ｈＰＳＣ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ＤＸＦ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（株）製）等を挙げることができる。多能性幹細胞の未分化状態を維持するのに好適であることから、Ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）又はＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０３（味の素（株）製）が好ましく、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）又はＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０３（味の素（株）製）がさらに好ましく、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）が特に好ましい。
【００２７】
前記（１）工程で用いる培地としてはまた、多能性幹細胞の生存を維持するのに好適であることから、前記塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地にさらにＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤を添加した培地を用いることが好ましい。特にヒトの多能性幹細胞を用いる場合であって、ヒトの多能性幹細胞の細胞密度が低い状態において、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤が添加されていると、ヒトの多能性幹細胞の生存維持に効果的な場合がある。Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤としては、例えば、（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−Ｎ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）−４−（１−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ（和光純薬工業（株）製Ｙ−２７６３２）、１−（５−Ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（和光純薬工業（株）製ＨＡ１０７７）を用いることができる。培地に添加されるＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤の濃度としては、ヒトの多能性幹細胞の生存維持に有効な範囲であってヒトの多能性幹細胞の未分化状態に影響を与えない範囲であり、好ましくは１μＭ〜５０μＭであり、より好ましくは３μＭ〜２０μＭであり、さらに好ましくは５μＭ〜１５μＭであり、最も好ましくは８μＭ〜１２μＭである。
【００２８】
前記（１）工程で多能性幹細胞を基材上で培養する際の、多能性幹細胞の播種方法に特に制限はないが、例えば、前記基材に細胞懸濁液を注入することで行うことが出来る。播種の際の細胞密度は特に制限はないが、細胞を維持することができ、かつ増殖させることができるように、１．０×１０２〜１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましく、５．０×１０２〜５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がさらに好ましく、１．０×１０３〜２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が特に好ましく、１．２×１０３〜１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が最も好ましい。
【００２９】
前記（１）工程で多能性幹細胞を基材上で培養する際の、培養温度に特に制限はないが、細胞の増殖能や生理活性，機能維持に好適であることから、３０〜４２℃が好ましく、３２〜４０℃がさらに好ましく、３６〜３８℃が特に好ましく、３７℃が最も好ましい。
【００３０】
また、培養を開始して２２〜２６時間後に、最初の培地交換を行うことが好ましい。その４８〜７２時間後に２度目の培地交換を行い、その後、２４〜４８時間毎に培地交換を行うことが好ましい。この間、多能性幹細胞は増殖し、コロニーと呼ばれる細胞塊を形成する。コロニーの大きさが１ｍｍ前後になるまで培養を継続させ、その後、（２）工程に移行する。
【００３１】
前記（２）工程では、前記［ａ］〜［ｃ］の複数の組合せからなる工程、又は前記［ｃ］工程のみによって、分化細胞の少なくとも一部を基材に接着させたまま、（１）工程で培養した未分化の多能性幹細胞を基材から剥離する。［ａ］〜［ｃ］の組み合わせとしては、［ａ］と［ｂ］の組み合わせ、［ａ］と［ｃ］の組み合わせ、［ｂ］と［ｃ］の組み合わせ、［ａ］〜［ｃ］全ての組み合わせを挙げることができ、細胞懸濁液の量産性を高めるのに好適であることから、［ａ］と［ｂ］の組み合わせ、［ａ］と［ｃ］の組み合わせ、［ｂ］と［ｃ］の組み合わせ、又は［ｃ］のみが好ましい。また、未分化率を高めるのに好適であることから、［ａ］と［ｃ］の組み合わせ、又は［ｂ］と［ｃ］の組み合わせ、［ｃ］のみがさらに好ましく、［ａ］と［ｃ］の組み合わせ、［ｃ］のみが特に好ましい。さらに、作製される細胞懸濁液が未分化維持培養又はスフェロイド形成に用いるために好適な状態となることから、［ａ］と［ｃ］の組み合わせが最も好ましい。分化細胞を基材に接着させたまま未分化の多能性幹細胞を基材から剥離することによって、細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率を高めることができる。また、細胞を選別する工程が不要であることから、大面積の培養基材を使用した場合に、細胞懸濁液の量産性を高めることができる。分化細胞を含めて全ての細胞を基材から剥離する場合、細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率を高めることができない。また、分化細胞を含めて全ての細胞を基材から剥離する場合、細胞を選別する工程が必要であることから、大面積の培養基材を使用した場合に、細胞懸濁液の量産性を低下させる原因となる。
【００３２】
前記［ｂ］及び［ｃ］工程において、細胞へのダメージを低減し、多能性幹細胞の生存率を高め、また、分化多能性を維持するために好適であることから、多能性幹細胞を液体培地存在下で剥離することが好ましい。
【００３３】
本発明の細胞懸濁液の製造方法は、セルスクレーピングを行わないことが好ましい。セルスクレーピングを行わないことによって、大面積の培養基材を使用した場合に細胞の剥離に要する時間を短縮することができ、細胞懸濁液の量産性を高めることができる。また、セルスクレーピングを行わないことにより、未分化の多能性幹細胞を選択的に剥離することができ、細胞懸濁液の純度を高めることができる。ここで、本発明において「セルスクレーピング」とは、セルスクレーパーを用いて基材表面を擦ることにより細胞を基材から剥離する操作を示す。
【００３４】
前記［ａ］工程では、多能性幹細胞に細胞間結合乖離液を接触させ、細胞間結合を乖離させる。多能性幹細胞はコロニーの状態で増殖するため、細胞同士で結合を形成して互いに接着し合い、基材から剥離しにくい状態を形成しやすい。一方、分化細胞の多くはコロニーを形成しないことから、細胞間結合の乖離は基材からの剥離性にあまり影響しない。このために、細胞間結合を乖離させることにより、未分化の多能性幹細胞を優先して基材から剥離しやすく、細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率を高めることができる。
【００３５】
前記細胞間結合乖離液としては、例えば、トリプシンを含有する液体を好適に用いることができる。ここで、本発明において「トリプシン」とは、膵臓から分泌されるタンパク質分解酵素の「ＥＣ．３．４．２１．４」、又は該タンパク質分解酵素と同等の特性を有する分解酵素を示す。市販品としては例えば、Ｔｒｙｐｓｉｎ（商標）、ＴｒｙｐＬＥ（商標）ＳＥＬＥＣＴ、ＴｒｙｐＬＥ（商標）ＥＸＰＲＥＳ（いずれもサーモフィッシャー社製）等を挙げることができる。基材上で培養された多能性幹細胞と、トリプシンを含有する細胞間結合乖離液を接触させる時間としては、未分化の多能性幹細胞のみに選択的にトリプシンの作用を及ぼすのに好適であることから、１秒〜１０分間が好ましく、３０秒〜５分間がさらに好ましく、１分〜４分間が特に好ましく、１分〜２分間が最も好ましい。また、接触させる際の細胞間結合乖離液の温度としては、トリプシンを活性化させるのに好適であることから、１０〜４０℃が好ましく、２０〜４０℃がさらに好ましく、３０〜４０℃が特に好ましく、３７℃が最も好ましい。
【００３６】
前記細胞間結合乖離液としてはまた、キレート剤を含有するものも好適に用いることができる。この場合、キレート剤のみを含有するものであってもよいし、キレート剤と前述のトリプシンを共に含有するものであってもよい。前記キレート剤としては、キレート剤であること以外に特に限定はないが、例えば、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ニトリロトリ酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸、トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸、１，３−プロパンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、１，３−ジアミノ−２−プロパノール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸、Ｎ，Ｎ−ジ（２−ヒドロキシエチル）グリシン、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ジカルボキシメチルグルタミン酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、イミノ二酢酸、エチドロン酸、クエン酸、ムギネ酸、ビピリジン、ポルフィリン、フェナントロリン、ポルフィリン、クラウンエーテル、サイクレン、１８−クラウン−６、デフェロキサミン、ドータオクトレオテート、ニコチアナミン、ジメルカプロール、シデロホア等を挙げることができる。細胞を単一細胞又は数個〜数十個の細胞の凝集塊とするのに好適であり、また、細胞の生存率及び選択剥離の選択制を高めるのに好適であることから、１〜４価の金属イオンとキレートを形成するキレート剤が好ましく、２価の金属イオンとキレートを形成するキレート剤がさらに好ましく、カルシウムイオンとキレートを形成するキレート剤が特に好ましく、エチレンジアミン四酢酸が最も好ましい。基材上で培養された多能性幹細胞と、キレート剤を含有する細胞間結合乖離液を接触させる時間としては、トリプシンを含有しない細胞間結合乖離液である場合、未分化の多能性幹細胞のみに選択的に細胞剥離作用を及ぼすのに好適であることから、１秒〜３０分間が好ましく、３０秒〜２０分間がさらに好ましく、１分〜１０分間が特に好ましく、２分〜１０分間が最も好ましい。
【００３７】
前記［ｂ］工程では、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する外部応力を加える。未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する外部応力を加えることにより、細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率を高めることができる。また、細胞懸濁液の量産性を高めるのに好適であることから、外部応力は培養環境の特定の領域に作用させるものではなく、培養環境の全体に均一に作用させることが好ましい。
【００３８】
前記外部応力を加える工程としては特に限定はないが、培養液に対流を生じさせる工程、基材に振動を加える工程、基材が多孔質基材であり、培養面の裏面に圧力を加える工程のいずれか、又はこれらの複数の組み合わせであることが好ましい。
【００３９】
前記培養液に対流を生じさせる工程としては、使用する基材によって細胞の基材への接着強度が変化するため、最適な流量又は流速は基材の種類によって変化するが、例えば基材がポリスチレン基材の場合、流量として０．１〜１０ｍＬ／ｓが好ましく、０．２〜８ｍＬ／ｓがさらに好ましく、０．４〜６ｍＬ／ｓが特に好ましく、０．６〜４ｍＬ／ｓが最も好ましい。また、基材がポリスチレン基材以外の場合にも、複数の流量又は流速条件で細胞懸濁液を作製し、細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率を比較することによって、最適な流速を決定することができる。また、培養基材上の細胞を位相差顕微鏡により（２）工程の前後で観察し、未分化の多能性幹細胞が選択的に基材から剥離する条件を選択することができる。
【００４０】
前記培養液へ対流を生じさせる方法としては特に限定はないが、例えば、培養液をピペッティングすることや、ポンプ又は撹拌翼を用いることにより機械的に培養液内部に強制対流を発生させる方法を挙げることができる。ここで、本発明において「ピペッティング」とは、ピペットマン等の器具を用いて培養液の吸引及び吐出を繰り返すことにより、培養環境に対流を生じさせる操作を示す。
【００４１】
前記振動を基材に加える工程としては、使用する基材によって細胞の基材への接着強度が変化するため、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する振動は、基材の種類によって変化するが、基材がポリスチレンの非多孔質基材の場合、５０〜１００ｄＢが好ましく、５０〜９０ｄＢがさらに好ましく、５０〜８０ｄＢが特に好ましく、５０〜７０ｄＢが最も好ましい。また、基材がポリスチレン以外の場合は、前述の流量の場合と同様に、複数の振動条件で細胞懸濁液を作製することによって、最適な振動を決定することができる。また、培養基材上の細胞を位相差顕微鏡により（２）工程の前後で観察し、未分化の多能性幹細胞が選択的に基材から剥離する条件を選択することができる。
【００４２】
基材に振動を加える方法としては、特に限定はないが、タッピングや、定常波発生装置等の振動発生装置を基材に接触させる方法、基材に超音波を当てる方法等を挙げることができる。ここで、本発明において「タッピング」とは、培養容器を叩く等により培養環境に振動を与える操作を示す。
【００４３】
前記圧力を培養面の裏面に加える工程としては、使用する基材によって細胞の基材への接着強度が変化するため、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する圧力は、基材の種類によって変化するが、基材がポリエチレンテレフタレートの多孔質基材の場合、０．００１〜１ＭＰａが好ましく、０．００５〜０．５ＭＰａがさらに好ましく、０．０１〜０．２ＭＰａが特に好ましく、０．０２〜０．１ＭＰａが最も好ましい。また、基材がポリエチレンテレフタレート以外の多孔質基材の場合は、前述の流量の場合と同様に、複数の圧力条件で細胞懸濁液を作製することによって、最適な圧力を決定することができる。また、培養基材上の細胞を位相差顕微鏡により（２）工程の前後で観察し、未分化の多能性幹細胞が選択的に基材から剥離する条件を選択することができる。
【００４４】
培養面の裏面に圧力を加える方法としては、特に限定はないが、多能性幹細胞の存在する面とは逆側の面に、ポンプ等により圧力を加える方法等を挙げることができる。
【００４５】
前記［ｃ］工程は、培養基材が温度応答性を有するものであり、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する温度及び時間で基材を冷却する。
【００４６】
使用する基材によって細胞の基材への接着強度が変化するため、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する冷却温度及び冷却時間は、基材の種類によって変化するが、層厚×温度応答性成分の含有割合の積が３０ｎｍの温度応答性高分子による層を有する基材の場合、０〜３０℃の温度で１秒〜６０分間冷却することが好ましく、２〜２５℃の温度で１秒〜６０分間冷却することがさらに好ましく、２〜２０℃の温度で１秒〜６０分間冷却することが特に好ましく、２〜１０℃の温度で１秒〜６０分間冷却することが最も好ましい。また、層厚×温度応答性成分の含有割合の積が３０ｎｍの温度応答性高分子による層を有する基材以外の場合は、前述の流量の場合と同様に、複数の冷却条件で細胞懸濁液を作製することによって、最適な冷却温度及び冷却時間を決定することができる。また、培養基材上の細胞を位相差顕微鏡により（２）工程の前後で観察し、未分化の多能性幹細胞が選択的に基材から剥離する条件を選択することができる。より低温で長時間冷却するほど細胞が基材から剥離しやすくなることから、細胞の剥離量が少ない場合には低温で長時間の冷却、細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率が低い場合には温度を上げるか短時間の冷却とすることが好ましい。ここで、本発明において温度応答性高分子による層の「層厚」とは、温度応答性高分子による層の最も基材側の界面から最も表面側の界面までの基材面外方向の長さを示し、層厚が１０ｎｍを超える範囲ではミクロトームにより作製した培養基材の超薄切片を用いて断面像を透過型電子顕微鏡によって測定し、無作為に選んだ１０点の該距離を測定し、平均することで算出することができる。また、層厚が１０ｎｍ以下の範囲ではエリプソメーターを用いて測定することができる。また、本発明において「温度応答性成分の含有割合」とは、温度応答性高分子に含まれる温度応答性の単量体単位の重量割合を示す。
【００４７】
また、［ｃ］工程の前に［ａ］工程を設ける場合、使用する基材の種類だけでなく、［ａ］工程の条件によっても最適な［ｃ］工程の条件も変化する。層厚×温度応答性成分の含有割合の積が３０ｎｍの温度応答性高分子による層を有する基材の場合、［ａ］工程でトリプシンを含有する細胞間結合乖離液を接触させる時間としては１分〜４分間、キレート剤のみを含有する細胞間結合乖離液を接触させる時間としては２分〜１０分間が好ましい。
【００４８】
前記温度応答性を有する基材としては、応答温度が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性高分子による層を表面に有する基材を挙げることができ、剥離後の多能性幹細胞の生存率を高めるのに好適であることから、ＬＣＳＴが０℃〜５０℃の範囲にあることが好ましく、５℃〜３５℃がさらに好ましく、１０℃〜２５℃が特に好ましく、１５℃〜２５℃が最も好ましい。
【００４９】
前記温度応答性高分子を構成する単量体単位としては特に制限はないが、例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物；Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等のＮ  アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体；Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等のＮ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体；１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−  ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等の環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体；メチルビニルエーテル等のビニルエーテルを挙げることができ、ＬＣＳＴを０〜５０℃とするのに好適であることから、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミドが好ましく、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドがさらに好ましく、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが特に好ましい。
【００５０】
前記温度応答性高分子による層の層厚×温度応答性成分の含有割合の積としては、基材から多くの未分化の多能性幹細胞を剥離回収するのに好適であることから、５ｎｍ以上が好ましく、１０ｎｍ以上がさらに好ましく、２０ｎｍ以上が特に好ましく、３０ｎｍ以上が最も好ましい。また、未分化の多能性幹細胞のみを選択的に剥離し、分化細胞を剥離せず基材に残すことで細胞懸濁液の純度を高めるのに好適であることから、１０００ｎｍ以下が好ましく、１００ｎｍ以下がさらに好ましく、５０ｎｍ以下が特に好ましく、２５ｎｍ以下が最も好ましい。
【００５１】
前記温度応答性高分子の単量体単位とその他の単量体単位との共重合体を用いる方法においては、共重合体を強固に基材に固定化させるのに好適であることから、少なくとも水に不溶の高分子の単量体単位を含むことが好ましい。また、温度応答性高分子の応答温度の制御に好適であることから、共重合体の構造としてはブロック共重合体であることが好ましい。
【００５２】
前記水に不溶の高分子の単量体単位としては特に制限はないが、例えば、スチレン、２−ヒドロキシフェニルアクリレート、２−ヒドロキシフェニルメタクリレート、３−ヒドロキシフェニルアクリレート、３−ヒドロキシフェニルメタクリレート、４−ヒドロキシフェニルアクリレート、４−ヒドロキシフェニルメタクリレート、Ｎ−（２−ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ−（２−ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、ｎ−ブチルアクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、イソブチルアクリレート、イソブチルメタクリレート、ｔ−ブチルアクリレート、ｔ−ブチルメタクリレート、ｎ−ヘキシルアクリレート、ｎ−ヘキシルメタクリレート、ｎ−オクチルアクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、ｎ−デシルアクリレート、ｎ−デシルメタクリレート、ｎ−ドデシルアクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−テトラデシルアクリレート、ｎ−テトラデシルメタクリレートを挙げることができる。
【００５３】
前記共重合体における温度応答性成分の含有割合は、未分化の多能性幹細胞を選択的に剥離するのに好適であることから、５０ｗｔ％以上が好ましく、７０ｗｔ％以上がさらに好ましく、８０ｗｔ％以上が特に好ましく、９０ｗｔ％以上が最も好ましい。また、共重合体を基材へ強固に固定化するのに好適であることから、温度応答性高分子の構成単位比率が９５ｗｔ％以下であることが好ましく、９０ｗｔ％以下であることがさらに好ましく、８５ｗｔ％以下であることが特に好ましく、８０ｗｔ％以下であることが最も好ましい。
【００５４】
前記温度応答性高分子の分子量としては特に制限はないが、温度応答性高分子による層の強度を高めるのに好適であることから、数平均分子量で１０００〜１００万であることが好ましく、２０００〜５０万であることがさらに好ましく、５０００〜３０万であることが特に好ましく、１万〜２０万であることが最も好ましい。
【００５５】
本発明の基材表面に温度応答性高分子による層を形成させる方法としては、基材に温度応答性高分子を、（１）化学的な結合によって被覆させ層を形成させる方法、（２）物理的な相互作用によって被覆させ層を形成させる方法、を単独または併用して行うことができる。すなわち、（１）化学的な結合による方法としては、紫外線照射、電子線照射、ガンマ線照射、プラズマ処理、コロナ処理等を用いることができる。さらに、温度応答性高分子と基材が適当な反応性官能基を有する場合は、ラジカル反応、アニオン反応、カチオン反応等の一般に用いられる有機反応を利用することができる。（２）物理的な相互作用による方法としては、温度応答性高分子との相溶性が良く、塗工性のよいマトリックスを媒体とし、塗布、はけ塗り、ディップコーティング、スピンコーティング、バーコーディング、流し塗り、スプレー塗装、ロール塗装、エアーナイフコーティング、ブレードコーティング、グラビアコーティング、マイクログラビアコーティング、スロットダイコーティングなど通常知られている各種の方法を用いることが可能である。
【００５６】
基材の形状としては特に制限はなく、板、フィルムのような平面形状であってもよいし、ファイバー、多孔質粒子、多孔質膜、中空糸であってもよい。また、一般に細胞培養等に用いられる容器（ペトリ皿等の細胞培養皿、フラスコ、プレート等）であっても差し支えない。培養操作の容易性から、板、フィルムのような平面形状、又は平膜の多孔質膜であることが好ましい。
【００５７】
本発明において、多能性幹細胞の剥離性を高めるのに好適であることから、基材が多孔質基材であり、多孔質基材の孔径が培養する多能性幹細胞よりも小さなものであることが好ましい。基材が多孔質基材であることにより、多能性幹細胞の剥離性を高めることができる。また、多孔質基材の孔径が多能性幹細胞よりも小さなものであることにより、多能性幹細胞接着性及び増殖性を高めることができる。さらに、基材が多孔質基材であることにより、培養中に細胞へ栄養が行き渡りやすく、継代培養において多能性幹細胞の未分化維持率を高めることができる。また、多能性幹細胞接着性及び増殖性を高めるのに好適であることから、前記孔径が８μｍ以下であることがさらに好ましく、３μｍ以下であることが特に好ましく、１μｍ以下であることが最も好ましい。さらに、多能性幹細胞の剥離性を高めるのに好適であることから、前記細孔径が０．０１μｍ以上であることが好ましく、０．０５μｍ以上であることがさらに好ましく、０．１μｍ以上であることが特に好ましく、０．２μｍ以上であることが最も好ましい。ここで、本発明において多孔質基材の「孔径」とは、多孔質基材が有する細孔の、多孔質基材の面内方向に沿った直径の平均値を示し、多孔質基材のレーザー顕微鏡像や走査型電子顕微鏡像、透過型電子顕微鏡像において２０点以上の細孔について該直径を測定し、平均値を求めることによって算出することができる。
【００５８】
本発明において、多能性幹細胞の増殖性及び剥離性を高めるのに好適であることから、多孔質基材の細孔の孔密度が、１０〜１０１０個／ｃｍ２であることが好ましく、１０３〜１０９個／ｃｍ２がさらに好ましく、１０５〜１０９個／ｃｍ２が特に好ましく、１０５〜１０７個／ｃｍ２が最も好ましい。また、多孔質基材の透明性を高め、顕微鏡による細胞の観察を容易とするのに好適であることから、多孔質基材の細孔の細孔密度が、１０７個／ｃｍ２以下であることが好ましく、１０６個／ｃｍ２以下であることがさらに好ましく、１０５個／ｃｍ２以下であることが特に好ましく、１０４個／ｃｍ２以下であることが最も好ましい。ここで、本発明において多孔質基材の細孔の「孔密度」とは、多孔質基材の基材面積当たりに存在する細孔の数を示し、多孔質基材のレーザー顕微鏡像や走査型電子顕微鏡像、透過型電子顕微鏡像において、多孔質基材の細孔の孔径の２００倍以上の長さを一辺とする正方形の領域において細孔の数を求めることで算出することができる。なお、本発明において多孔質基材の「基材面積」とは、多孔質基材に細孔が存在しないと仮定した場合の、多孔質基材の一主面の表面積を示す。
【００５９】
本発明において、多能性幹細胞の剥離性を高めるのに好適であることから、多孔質基材の空隙率が０．０１〜３０％であることが好ましく、０．０１〜２０％がさらに好ましく、０．０１〜５％が特に好ましく、０．０１〜１．５％が最も好ましい。ここで、本発明において多孔質基材の「空隙率」とは、多孔質基材の表面の一主面について、細孔部分の合計面積を基材面積で割った値で、面積割合で基材面にどの程度の空隙が存在するのかを示し、多孔質基材のレーザー顕微鏡像や走査型電子顕微鏡像、透過型電子顕微鏡像において、多孔質基材の細孔の孔径の２００倍以上の長さを一辺とする正方形の領域を観察することによって測定することができる。
【００６０】
前記空隙率としてはまた、位相差顕微鏡による多能性幹細胞の観察を可能とするのに好適であることから、１０％以下が好ましく、７％以下がさらに好ましく、４％以下が特に好ましく、２％以下が最も好ましい。
【００６１】
さらに、前記空隙率としては、培地中に含まれる成分を迅速に透過させ、細胞へ万遍なく栄養を行き渡らせるのに好適であることから、空隙率が０．１％以上であることが好ましく、１％以上がさらに好ましく、５％以上が特に好ましく、１０％以上が最も好ましい。
【００６２】
本発明の細胞懸濁液の製造方法により製造される細胞懸濁液は、多能性幹細胞の未分化維持培養又は分化誘導用のスフェロイドの作製に用いるのに好適であることから、細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上がさらに好ましく、９０％以上が特に好ましく、９５％以上が最も好ましい。未分化率は未分化マーカーを染色してフローサイトメーターにより測定することができる。
【００６３】
本発明の細胞懸濁液の製造方法により製造される細胞懸濁液の細胞回収率は、細胞懸濁液の量産性を高めるのに好適であることから、２０％以上が好ましく、４０％以上がさらに好ましく、６０％以上が特に好ましく、８０％以上が最も好ましい。ここで、細胞回収率とは、本発明の（２）工程で剥離した細胞／培養した全細胞の割合を示す。
【実施例】
【００６４】
以下、本発明を実施するための形態を挙げて本発明について詳細に説明するが、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。また本発明の要旨の範囲内で適宜に変更して実施することができる。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。
＜重合体の組成＞
核磁気共鳴測定装置（日本電子（株）製、商品名ＪＮＭ−ＧＳＸ４００）を用いたプロトン核磁気共鳴分光（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル分析、又は核磁気共鳴測定装置（ブルカージャパン（株）製、商品名ＡＶＡＮＣＥＩＩＩＨＤ５００）を用いたカーボン核磁気共鳴分光（１３Ｃ−ＮＭＲ）スペクトル分析より求めた。
＜重合体の分子量、分子量分布＞
重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。ＧＰＣ装置は東ソー（株）製  ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣを用い、カラムは東ソー（株）製  ＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＡＷＭ−Ｈを２本用い、カラム温度を４０℃に設定し、溶離液は１０ｍＭトリフルオロ酢酸ナトリウムを含む１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロー２−イソプロパノールまたは１０ｍＭ臭化リチウムを含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いて測定した。測定試料は１．０ｍｇ／ｍＬで調製して測定した。分子量の検量線は、分子量既知のポリメタクリル酸メチル（ポリマーラボラトリーズ製）を用いた。
［実施例１］
基材としてポリスチレンディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）に温度応答性高分子による層が形成されたものを用い、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を１３００個／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を０．２ｍＬ／ｃｍ２加えた。また、細胞播種から２４時間後までは、前記培地にＹ−２７６３２（和光純薬工業（株）製）（濃度１０μＭ）とｉＭａｔｒｉｘ−５１１溶液（（株）ニッピ製）（２．５μＬ／ｍＬ）を添加した培地を使用して培養した。
【００６５】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、細胞はコロニー状で基材に存在していることを確認した。
【００６６】
培地を除去してリン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水にエチレンジアミン四酢酸を５×１０−３ｍｏｌ／Ｌの濃度となるように加えた細胞間結合乖離液をディッシュ内に加え、２５℃で２分間処理した。細胞間結合乖離液を除去してＹ−２７６３２を添加した培地をディッシュ内に加えた後、１５℃で１０分間冷却を行うことで細胞を剥離させた。未分化の細胞が選択的に剥離する様子が観察され（図１〜３）、細胞懸濁液として回収できた。
【００６７】
なお、温度応答性高分子の合成及びコーティングは以下の方法で行った。
【００６８】
試験管に、４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．４０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート７．１１ｇ（５０ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン５０ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール２５０ｍＬに注ぎ、析出した黄色油状物質を回収して減圧乾燥し、ｎ−ブチルメタクリレート重合体を得た。
【００６９】
試験管に、前記ｎ−ブチルメタクリレート重合体０．９ｇ（０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド８．１４ｇ（７２ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１５ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で１７時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をアセトンで希釈し、ヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した淡黄色固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体を得た。
【００７０】
ポリスチレンディッシュ上にＮ−イソプロピルアクリルアミドとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体の０．６ｗｔ％エタノール溶液を２０００ｒｐｍでスピンコートし、温度応答性高分子を被覆した。
【００７１】
温度応答性高分子の応答温度は３２℃、構成単位比率はｎ−ブチルメタクリレート４ｗｔ％、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド９６ｗｔ％、分子量はＭｎ７万であった。ポリスチレンディッシュ上への温度応答性高分子の被覆の層厚は３０ｎｍであった。
［実施例２］
実施例１においてリン酸緩衝生理食塩水での洗浄及び細胞間結合乖離液をディッシュ内に加える操作を行わず、また、１５℃で１０分間冷却を行った後に基材を２０回タッピングして振動を与える操作を行い、その他は実施例１と同様にして細胞懸濁液を作製した。未分化の細胞が選択的に剥離し、細胞懸濁液として回収できた。
［実施例３］
基材として温度応答性高分子による層を形成していないポリスチレンディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）を用い、１５℃で１０分間冷却する操作を行わず、代わりに約１．２ｍＬ／ｓの流量となるようピペッティング操作を２０回行うことで対流を与え、その他は実施例１と同様にして細胞懸濁液を作製した。未分化の細胞が選択的に剥離し、細胞懸濁液として回収できた。
［実施例４］
基材として温度応答性高分子による層を形成していないポリスチレンディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）を用い、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と、分化細胞としてヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株由来中胚葉細胞との共培養を以下の方法で行った。
【００７２】
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を２６０個／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で４日間培養した。培地はＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を０．２ｍＬ／ｃｍ２加えた。また、細胞播種から２４時間後までは、前記培地にＹ−２７６３２（和光純薬工業（株）製）（濃度１０μＭ）とｉＭａｔｒｉｘ−５１１溶液（（株）ニッピ製）（２．５μＬ／ｍＬ）を添加した培地を使用して培養した。培養４日間培養した時点でヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株由来中胚葉細胞を２２２０個／ｃｍ２の密度で播種し、さらに３日間共培養した。
【００７３】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、細胞はコロニー状で基材に存在していることを確認した。また、コロニーの周囲に中胚葉細胞が存在していることを確認した。
【００７４】
培地を除去後、リン酸緩衝生理食塩水に０．５×ＴｒｙｐＬＥ  ＳＥＬＥＣＴ、エチレンジアミン四酢酸を５×１０−３ｍｏｌ／Ｌの濃度となるように加えた細胞間結合乖離液をディッシュ内に加え、２５℃で２分間処理した。細胞間結合乖離液を除去してＹ−２７６３２を添加した１５℃の培地をディッシュ内に加えて室温で５分間冷却した後、約１．２ｍＬ／ｓの流量となるようピペッティング操作を２０回行うことで対流を与え、細胞を剥離させ、細胞懸濁液を回収した。また、剥離しなかった細胞は基材表面をセルスクレーパーで擦ることにより全ての細胞を剥離し、別の容器に回収して細胞数を計測した。細胞回収率として、「細胞懸濁液に含まれる細胞数／培養した全細胞数」の割合を求めた。ここで、培養した全細胞は、細胞懸濁液に含まれる細胞数とセルスクレーパーで剥離した細胞数の合計を示す。
【００７５】
冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９９．５％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は３３．８％であった。
［実施例５］
実施例１と同様の温度応答性高分子を以下の方法で被覆した基材を用い、実施例４と同様にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養及び細胞懸濁液の作製を行った。
【００７６】
ポリスチレンディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）上にＮ−イソプロピルアクリルアミドとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体の０．２ｗｔ％エタノール溶液を２０００ｒｐｍでスピンコートし、温度応答性高分子を被覆した。
【００７７】
冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９９．７％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は４８．２％であった。
［実施例６］
実施例１と同様の温度応答性高分子を以下の方法で被覆した基材を用い、実施例４と同様にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養及び細胞懸濁液の作製を行った。
【００７８】
ポリスチレンディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）上にＮ−イソプロピルアクリルアミドとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体の０．４ｗｔ％エタノール溶液を２０００ｒｐｍでスピンコートし、温度応答性高分子を被覆した。
【００７９】
冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９９．２％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は５２．０％であった。
［実施例７］
実施例１と同様の基材を用い、実施例４と同様にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養及び細胞懸濁液の作製を行った。
【００８０】
冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９８．２％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は７８．９％であった。
［実施例８］
実施例１と同様の温度応答性高分子を以下の方法で被覆した基材を用い、実施例４と同様にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養及び細胞懸濁液の作製を行った。
【００８１】
ポリスチレンディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）上にＮ−イソプロピルアクリルアミドとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体の０．８ｗｔ％エタノール溶液を２０００ｒｐｍでスピンコートし、温度応答性高分子を被覆した。
【００８２】
冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９８．７％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は８５．２％であった。
［実施例９］
以下の温度応答性高分子を用い、その他は実施例７と同様にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養及び細胞懸濁液の作製を行った。
【００８３】
試験管に、４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．４０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート７．１１ｇ（５０ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン５０ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール２５０ｍＬに注ぎ、析出した黄色油状物質を回収して減圧乾燥し、ｎ−ブチルメタクリレート重合体を得た。
【００８４】
試験管に、前記ｎ−ブチルメタクリレート重合体０．９ｇ（０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド２．６５ｇ（２３ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１５ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で１７時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をアセトンで希釈し、ヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥した。また、アセトンに再度溶解させ、純水５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体を得た。
【００８５】
冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９９．４％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は７２．７％であった。
［実施例１０］
以下の温度応答性高分子を用い、その他は実施例７と同様にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養及び細胞懸濁液の作製を行った。
【００８６】
試験管に、４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．４０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート７．１１ｇ（５０ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン５０ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール２５０ｍＬに注ぎ、析出した黄色油状物質を回収して減圧乾燥し、ｎ−ブチルメタクリレート重合体を得た。
【００８７】
試験管に、前記ｎ−ブチルメタクリレート重合体０．９ｇ（０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド０．８３ｇ（７．３ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１５ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で１７時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をアセトンで希釈し、ヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥した。また、アセトンに再度溶解させ、純水５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体を得た。
【００８８】
冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９９．７％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は６３．５％であった。
［実施例１１］
以下の温度応答性高分子を用い、その他は実施例７と同様にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養及び細胞懸濁液の作製を行った。
【００８９】
試験管に、４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．４０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート７．１１ｇ（５０ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン５０ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール２５０ｍＬに注ぎ、析出した黄色油状物質を回収して減圧乾燥し、ｎ−ブチルメタクリレート重合体を得た。
【００９０】
試験管に、前記ｎ−ブチルメタクリレート重合体０．９ｇ（０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド０．２６ｇ（２．４ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１５ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で１７時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をアセトンで希釈し、ヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥した。また、アセトンに再度溶解させ、純水５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体を得た。
【００９１】
冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９８．９％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は５５．０％であった。
［実施例１２］
実施例４と同様の方法でヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養を行った。培養後、培地の除去を行わず、そのまま室温で１５分間冷却し、ピペッティングを２０回行うことにより細胞懸濁液を作製した。また、剥離しなかった細胞は基材表面をセルスクレーパーで擦ることにより全ての細胞を剥離し、細胞回収率を求めた。
【００９２】
冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９４．５％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は２３．２％であった。
［実施例１３］
実施例７と同様の方法でヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養を行った。培養後、培地の除去や細胞間結合乖離液での処理を行わず、そのまま室温で１５分間冷却し、ピペッティング操作を２０回行うことにより細胞懸濁液を作製した。また、実施例４と同様にして細胞回収率を求めた。
【００９３】
冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９６．５％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は６８．５％であった。
［実施例１４］
実施例９と同様の方法でヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養を行った。培養後、培地の除去や細胞間結合乖離液での処理を行わず、そのまま室温で１５分間冷却し、ピペッティング操作を２０回行うことにより細胞懸濁液を作製した。また、実施例４と同様にして細胞回収率を求めた。
【００９４】
冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９８．２％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は６１．９％であった。
［実施例１５］
実施例１０と同様の方法でヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養を行った。培養後、培地の除去や細胞間結合乖離液での処理を行わず、そのまま室温で１５分間冷却し、ピペッティング操作を２０回行うことにより細胞懸濁液を作製した。また、実施例４と同様にして細胞回収率を求めた。
【００９５】
冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９７．８％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は４４．１％であった。
［実施例１６］
実施例１１と同様の方法でヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養を行った。培養後、培地の除去や細胞間結合乖離液での処理を行わず、そのまま室温で１５分間冷却し、ピペッティング操作を２０回行うことにより細胞懸濁液を作製した。また、実施例４と同様にして細胞回収率を求めた。
【００９６】
冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９６．６％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は２１．７％であった。
【００９７】
【表１】
2020028287.tif 000003
【００９８】
［比較例１］
基材としてポリスチレンディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）を用い、実施例１と同様にして多能性幹細胞を培養した後、リン酸緩衝生理食塩水にエチレンジアミン四酢酸を５×１０−３ｍｏｌ／Ｌの濃度となるように加えた細胞間結合乖離液をディッシュ内に加え、２５℃で２分間処理し、基材表面をセルスクレーパーで擦って細胞懸濁液を作製した。全ての細胞が剥離した。
［比較例２］
実施例１において１５℃で１０分間冷却を行わず、その他は実施例１と同様に行った。細胞は剥離せず、細胞懸濁液は得られなかった。
［比較例３］
実施例２において１５℃で１０分間冷却及び基材を２０回叩いて振動を与える操作を行わず、その他は実施例２と同様に行った。細胞は剥離せず、細胞懸濁液は得られなかった。
［比較例４］
実施例３において約１．２ｍＬ／ｓの流速となるようピペッティング操作を２０回行うことで対流を与える操作を行わず、その他は実施例３と同様に行った。細胞は剥離せず、細胞懸濁液は得られなかった。
［比較例５］
実施例４と同様にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養を行った後、細胞間結合乖離液による処理を実施例４と同様に行い、また基材表面をセルスクレーパーで擦って全ての細胞を剥離して細胞懸濁液を作製した。
【００９９】
回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は８２．２％であり、分化細胞が多く含まれるものであった。
［比較例６］
実施例４と同様にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養を行った後、細胞間結合乖離液による処理は行わず、また基材表面をセルスクレーパーで擦って全ての細胞を剥離して細胞懸濁液を作製した。
【０１００】
回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は８２．２％であり、分化細胞が多く含まれるものであった。
【０１０１】
【表２】
2020028287.tif 000004
【符号の説明】
【０１０２】
１  分化細胞
【図１】
2020028287.tif 000005
【図２】
2020028287.tif 000006
【図３】
2020028287.tif 000007