(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞集団を調製するための改善された培養培地、その組成物、並びにそのような培地及び組成物を用いる方法を提供する。【解決手段】（ａ）約１%〜約２０%の多糖；及び（ｂ）化学的に定義された細胞培養培地を含む、培養培地。前記多糖がデキストランである。また、細胞集団、特に、造血系幹細胞を含む細胞の集団を操作するための改善された方法に関する。【選択図】図２
2020089373.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)約1%〜約20%の多糖;及び
(b)化学的に定義された細胞培養培地
を含む、培養培地。
【請求項２】
前記多糖がデキストランである、請求項1記載の培養培地。
【請求項３】
前記多糖が:デキストラン-1、デキストラン-10、デキストラン-20、デキストラン-30、
及びデキストラン-40からなる群より選択されるデキストランである、請求項1記載の培養
培地。
【請求項４】
前記多糖が、デキストラン-40である、請求項1記載の培養培地。
【請求項５】
前記多糖が、ヒドロキシエチルスターチ(HES)である、請求項1記載の培養培地。
【請求項６】
前記多糖が:ヘタスターチ、ヘキサスターチ、ペンタスターチ、及びテトラスターチか
らなる群より選択されるHESである、請求項1記載の培養培地。
【請求項７】
前記多糖がヘタスターチである、請求項1記載の培養培地。
【請求項８】
約1%〜約5%の多糖を含む、請求項1から7のいずれか一項記載の培養培地。
【請求項９】
約6%の多糖を含む、請求項1から7のいずれか一項記載の培養培地。
【請求項１０】
約7%の多糖を含む、請求項1から7のいずれか一項記載の培養培地。
【請求項１１】
約8%の多糖を含む、請求項1から7のいずれか一項記載の培養培地。
【請求項１２】
約9%の多糖を含む、請求項1から7のいずれか一項記載の培養培地。
【請求項１３】
約10%の多糖を含む、請求項1から7のいずれか一項記載の培養培地。
【請求項１４】
約1%〜約5%のHSAを含む、請求項1から13のいずれか一項記載の培養培地。
【請求項１５】
約2%のHSAを含む、請求項14記載の培養培地。
【請求項１６】
約3%のHSAを含む、請求項14記載の培養培地。
【請求項１７】
約4%のHSAを含む、請求項14記載の培養培地。
【請求項１８】
約5%のHSAを含む、請求項14記載の培養培地。
【請求項１９】
前記化学的に定義された細胞培養培地が:StemSpan-ACF、StemSpan-H3000、StemSpan-SF
EM、Stemline II、StemPro 34、StemXVivo、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ダルベ
ッコ改変イーグル培地(DMEM)、ロズウェルパーク記念研究所培地(RPMI)1640培地、マッコ
イ5A培地、最小必須培地α培地(α-MEM)、基礎培地イーグル(BME)、フィッシャー培地、
培地199、F-12K栄養混合物培地(Kaighn改変、F-12K)、及びX-vivo 20からなる群より選択
される、請求項1から18のいずれか一項記載の培養培地。
【請求項２０】
前記化学的に定義された細胞培養培地が:StemSpan-ACF、StemSpan-H3000、及びStemSpa
n-SFEMからなる群より選択される、請求項1から19のいずれか一項記載の培養培地。
【請求項２１】
前記化学的に定義された細胞培養培地がStemSpanである、請求項1から20のいずれか一
項記載の培養培地。
【請求項２２】
さらに1つ以上の増殖因子又はサイトカインを含む、請求項1から21のいずれか一項記載
の培養培地。
【請求項２３】
前記化学的に定義された培養培地が: flt3-リガンド(FLT3);トロンボポイエチン(TPO)
、幹細胞因子(SCF)、上皮細胞増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β
)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、インターロイキン-3(IL3)、インターロイキン-6(I
L6)、及びインターロイキン-9(IL9)からなる群より選択される1つ以上の増殖因子又はサ
イトカインを含む、請求項1から21のいずれか一項記載の培養培地。
【請求項２４】
cAMPアナログ又はエンハンサー、Gα-s活性化因子、及びプロスタグランジン経路アゴ
ニストからなる群より選択される作用剤をさらに含む、請求項1から23のいずれか一項記
載の培養培地。
【請求項２５】
前記プロスタグランジン経路アゴニストが選択的にPGE2 EP2又はPGE2 EP4受容体に結合
する、請求項24記載の培養培地。
【請求項２６】
前記プロスタグランジン経路アゴニストが、PGE2、又はPGE2アナログ又は誘導体を含む
、請求項24記載の培養培地。
【請求項２７】
前記プロスタグランジン経路アゴニストが:PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-メチルPGE2
、20-エチルPGE2、及び8-イソ-16-シクロヘキシル-テトラノルPGE2からなる群より選択さ
れる、請求項24記載の培養培地。
【請求項２８】
前記プロスタグランジン経路アゴニストが、16,16-dmPGE2を含む、請求項24記載の培養
培地。
【請求項２９】
(a)細胞の集団;
(b)約1%〜約20%の多糖;及び
(c)化学的に定義された細胞培養培地
を含む、組成物。
【請求項３０】
前記細胞の集団が: 骨髄細胞(BMC)、臍帯血細胞(UCBC)、胎盤血細胞、動員末梢血細胞(
mPBC)、造血幹細胞(HSC)、造血前駆細胞(HPC)、及びCD34+細胞からなる群より選択される
、請求項29記載の組成物。
【請求項３１】
前記細胞の集団が:骨髄、臍帯血、胎盤血、又は動員末梢血からなる群より選択される
、請求項29記載の組成物。
【請求項３２】
前記細胞の集団が: 造血幹細胞(HSC)、造血前駆細胞(HPC)、及びCD34+細胞のうちの少
なくとも1つを含む、請求項29記載の組成物。
【請求項３３】
前記細胞の集団が、CD34+細胞の精製された集団を含む、請求項29から32のいずれか記
載の組成物。
【請求項３４】
前記多糖がデキストランである、請求項29から32のいずれか記載の組成物。
【請求項３５】
前記多糖が:デキストラン-1、デキストラン-10、デキストラン-20、デキストラン-30、
及びデキストラン-40からなる群より選択されるデキストランである、請求項29から32の
いずれか記載の組成物。
【請求項３６】
前記多糖がデキストラン-40である、請求項29から32のいずれか記載の組成物。
【請求項３７】
前記多糖がHESである、請求項29から32のいずれか記載の組成物。
【請求項３８】
前記多糖が:ヘタスターチ、ヘキサスターチ、ペンタスターチ、及びテトラスターチか
らなる群より選択されるHESである、請求項29から32のいずれか記載の組成物。
【請求項３９】
前記多糖がヘタスターチである、請求項29から32のいずれか記載の組成物。
【請求項４０】
約1%〜約5%の多糖を含む、請求項29から39のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４１】
約6%の多糖を含む、請求項29から39のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４２】
約7%の多糖を含む、請求項29から39のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４３】
約8%の多糖を含む、請求項29から39のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４４】
約9%の多糖を含む、請求項29から39のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４５】
約10%の多糖を含む、請求項29から39のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４６】
約1%〜約5%のHSAを含む、請求項29から45のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４７】
約2%のHSAを含む、請求項29から45のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４８】
約3%のHSAを含む、請求項29から45のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４９】
約4%のHSAを含む、請求項29から45のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５０】
約5%のHSAを含む、請求項29から45のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５１】
前記化学的に定義された細胞培養培地が:StemSpan-ACF、StemSpan-H3000、StemSpan-SF
EM、Stemline II、StemPro 34、StemXVivo、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ダルベ
ッコ改変イーグル培地(DMEM)、ロズウェルパーク記念研究所培地1640培地、マッコイ5A培
地、最小必須培地α培地(α-MEM)、基礎培地イーグル(BME)、フィッシャー培地、培地199
、F-12K栄養混合物培地(Kaighn改変、F-12K)、及びX-vivo 20からなる群より選択される
、請求項29から50のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５２】
前記化学的に定義された細胞培養培地が:StemSpan-ACF、StemSpan-H3000、及びStemSpa
n-SFEMからなる群より選択される、請求項29から51のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５３】
前記化学的に定義された細胞培養培地がStemSpanである、請求項29から52のいずれか一
項記載の組成物。
【請求項５４】
1つ以上の増殖因子又はサイトカインをさらに含む、請求項29から53のいずれか一項記
載の組成物。
【請求項５５】
前記化学的に定義された培養培地が: flt3-リガンド(FLT3);トロンボポイエチン(TPO)
、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン-3(IL3)、インターロイキン-6(IL6)、及びインタ
ーロイキン-6(IL9)からなる群より選択される1つ以上の増殖因子又はサイトカインを含む
、請求項29から53のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５６】
cAMPアナログ又はエンハンサー、Gα-s活性化因子、及びプロスタグランジン経路アゴ
ニストからなる群より選択される作用剤をさらに含む、請求項29から55のいずれか一項記
載の組成物。
【請求項５７】
前記プロスタグランジン経路アゴニストが選択的にPGE2 EP2又はPGE2 EP4受容体に結合
する、請求項56記載の組成物。
【請求項５８】
前記プロスタグランジン経路アゴニストが、PGE2、又はPGE2アナログ又は誘導体を含む
、請求項56記載の組成物。
【請求項５９】
前記プロスタグランジン経路アゴニストが:PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-メチルPGE2
、20-エチルPGE2、及び8-イソ-16-シクロヘキシル-テトラノルPGE2からなる群より選択さ
れる、請求項56記載の組成物。
【請求項６０】
前記プロスタグランジン経路アゴニストが、16,16-dmPGE2を含む、請求項56記載の組成
物。
【請求項６１】
細胞集団を調製する方法であって、前記細胞集団と請求項1から28記載の培養培地のい
ずれか1つとを接触させることを包含する、前記方法。
【請求項６２】
前記細胞集団が造血細胞集団を含む、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
前記造血細胞集団が: 骨髄細胞(BMC)、臍帯血細胞(UCBC)、胎盤血細胞、動員末梢血細
胞(mPBC)、造血幹細胞(HSC)、造血前駆細胞(HPC)、及びCD34+細胞からなる群より選択さ
れる、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
前記造血細胞集団が:骨髄、臍帯血、胎盤血、又は動員末梢血からなる群より選択され
る、請求項62記載の方法。
【請求項６５】
前記造血細胞集団が: 造血幹細胞(HSC)、造血前駆細胞(HPC)、及びCD34+細胞のうちの
少なくとも1つを含む、請求項62記載の方法。
【請求項６６】
前記造血細胞集団が、CD34+細胞の精製された集団である、請求項62記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞集団が、凍結保存された細胞を含み、かつ接触させることが、前記培養培地中
で前記凍結保存された細胞を解凍することを包含する、請求項61から66のいずれか一項記
載の方法。
【請求項６８】
前記細胞集団が、前記細胞の集団を前記培養培地とを接触させる前に解凍された凍結保
存された細胞を含む、請求項61から66のいずれか一項記載の方法。
【請求項６９】
前記細胞集団が、約20℃〜約37℃の温度で解凍される、請求項67又は68記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞集団が、約25℃、約30℃、又は約37℃の温度で解凍される、請求項67又は請求
項68記載の方法。
【請求項７１】
前記接触させた細胞集団の細胞溶解が、対照の培養培地と接触させた対照の細胞集団の
細胞溶解と比較して、約10%、約20%、約30%、約40%又は約50%低下する、請求項61から70
のいずれか一項記載の方法。
【請求項７２】
前記接触させた細胞集団の細胞溶解が、対照培養培地と接触させた対照の細胞集団の細
胞溶解と比較して、約2倍、3倍、又は5倍低下する、請求項61から70のいずれか一項記載
の方法。
【請求項７３】
前記接触させた造血細胞集団からのTNCの回収が、対照の培養培地と接触させた対照の
造血細胞集団からのTNCの回収と比較して、約10%、約20%、約30%、又は約50%増大する、
請求項62から70のいずれか一項記載の方法。
【請求項７４】
前記接触させた造血細胞集団からのTNCの回収が、対照の培養培地と接触させた対照の
造血細胞集団からのTNCの回収と比較して、約2倍、約3倍、又は約5倍増大する、請求項62
から70のいずれか一項記載の方法。
【請求項７５】
前記接触させたCD34+細胞の生存度が、対照の培養培地と接触させた対照の細胞集団のC
D34+細胞生存度と比較して、約10%、約20%、約30%、約40%又は約50%増大する、請求項66
記載の方法。
【請求項７６】
前記接触させたCD34+細胞の生存度が、対照の培養培地と接触させた対照の細胞集団のC
D34+細胞生存度と比較して、約2倍、約3倍、又は約5倍増大する、請求項66記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞集団が、生体外で調節される、請求項61から76のいずれか一項記載の方法。
【請求項７８】
前記調節が、前記細胞集団と:cAMPアナログ又はエンハンサー、Gα-s活性化因子、及び
プロスタグランジン経路アゴニストからなる群より選択される少なくとも1つの作用剤と
を接触させることを含む、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
前記プロスタグランジン経路アゴニストが選択的にPGE2 EP2又はPGE2 EP4受容体に結合
する、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
前記プロスタグランジン経路アゴニストが、PGE2、又はPGE2アナログ又は誘導体を含む
、請求項78記載の方法。
【請求項８１】
前記プロスタグランジン経路アゴニストが:PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-メチルPGE2
、20-エチルPGE2、及び8-イソ-16-シクロヘキシル-テトラノルPGE2からなる群より選択さ
れる、請求項78記載の方法。
【請求項８２】
前記プロスタグランジン経路アゴニストが、16,16-dmPGE2を含む、請求項78記載の方法
。
【請求項８３】
前記細胞集団を、前記少なくとも1つの作用剤と約1時間〜約4時間接触させる、請求項7
8から82のいずれか一項記載の方法。
【請求項８４】
前記細胞集団が、前記少なくとも1つの作用剤と約1時間又は約2時間接触させる、請求
項78から82のいずれか一項記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞集団を、前記少なくとも1つの作用剤と約25℃〜約37℃の温度で接触させる、
請求項78から82のいずれか一項記載の方法。
【請求項８６】
前記細胞集団を、前記少なくとも1つの作用剤と約30℃又は約37℃の温度で接触させる
、請求項78から82のいずれか一項記載の方法。
【請求項８７】
前記細胞集団が、造血細胞を含み、かつ接触させることが、前記造血細胞と10μMの16,
16-dmPGE2とを約37℃で、約2時間接触させることを包含する、請求項78から82のいずれか
一項記載の方法。
【請求項８８】
前記細胞集団の生着、再構成、ホーミング及び/又は増殖が、インビボにおいて、調節
されていない細胞集団と比較して、増大する、請求項77から87のいずれか一項記載の方法
。
【請求項８９】
CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及びULBP2からなる群よ
り選択される少なくとも2つの遺伝子の発現が、対照の調節されていない細胞集団におけ
る少なくとも2つの遺伝子の発現と比較して、前記細胞集団中で約20倍増大する、請求項7
7から87のいずれか一項記載の方法。
【請求項９０】
CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及びULBP2からなる群よ
り選択される少なくとも5つの遺伝子の発現が、対照の調節されていない細胞集団におけ
る少なくとも5つの遺伝子の発現と比較して、前記細胞集団中で約10倍、約3倍、又は約2
倍増大する、請求項77から87のいずれか一項記載の方法。
【請求項９１】
遺伝子CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HAS1、CXCL2、CXCL3、及びCXCR4の発現
が、対照の調節されていない細胞集団における遺伝子の発現と比較して、前記細胞集団中
で約3倍又は約2倍増大する、請求項77から87のいずれか一項記載の方法。
【請求項９２】
前記細胞集団が、対象に投与される、請求項61から91のいずれか一項記載の方法。
【請求項９３】
前記細胞集団が、前記対象に対して同種異系である、請求項92記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞集団が、前記対象に対して自系である、請求項92記載の方法。
【請求項９５】
前記対象が:虚血、非悪性血液障害、免疫不全、重症複合免疫不全(SCID)、リンパ球減
少症、血小板減少症、好中球減少症、貧血、ファンコニー貧血、重症再生不良性貧血、先
天性異常血色素症、鎌状赤血球病、β-地中海貧血、鎌状赤血球病、ウィスコット・オル
ドリッチ症候群、代謝性蓄積疾患、ハーラー病、ハンター病、マンノシドーシス、癌、血
液悪性腫瘍、急性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、
非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、非血液癌、乳癌、卵巣癌、脳癌
、前立腺癌、肺癌、結腸癌、皮膚癌、肝臓癌、及び膵臓癌からなる群より選択される疾患
、障害、又は状態を有する、請求項92記載の方法。
【請求項９６】
約25℃〜約37℃の温度で約1〜約24時間の間、プロスタグランジン経路を調節する少な
くとも1つの作用剤とサンプルとを接触させることによって調節される解凍された全臍帯
血サンプル中で少なくとも70%のTNCを維持する、請求項1から21のいずれか一項記載の培
養培地。
【請求項９７】
前記解凍された全臍帯血サンプル中で少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%
、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%のTNCを維持する、請求項96記載の培
養培地。
【請求項９８】
前記少なくとも1つの作用剤が:cAMPアナログ又はエンハンサー、Gα-s活性化因子、及
びプロスタグランジン経路アゴニストからなる群より選択される、請求項96又は請求項97
記載の培養培地。
【請求項９９】
前記少なくとも1つの作用剤が選択的にPGE2 EP2又はPGE2 EP4受容体に結合する、請求
項96又は請求項97記載の培養培地。
【請求項１００】
前記少なくとも1つの作用剤が、PGE2、又はPGE2アナログ又は誘導体を含む、請求項96
又は請求項97記載の培養培地。
【請求項１０１】
前記少なくとも1つの作用剤が:PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-メチルPGE2、20-エチル
PGE2、及び8-イソ-16-シクロヘキシル-テトラノルPGE2からなる群より選択される、請求
項96又は請求項97記載の培養培地。
【請求項１０２】
前記少なくとも1つの作用剤が、16,16-dmPGE2を含む、請求項96又は請求項97記載の培
養培地。
【請求項１０３】
前記サンプルを、前記少なくとも1つの作用剤と、約1時間〜約4時間の間接触させる、
請求項96又は請求項97記載の培養培地。
【請求項１０４】
前記サンプルを、前記少なくとも1つの作用剤と、約1時間又は約2時間の間接触させる
、請求項96又は請求項97記載の培養培地。
【請求項１０５】
前記サンプルを、前記少なくとも1つの作用剤と約25℃〜約37℃の温度で接触させる、
請求項96又は請求項97記載の培養培地。
【請求項１０６】
前記サンプルを、前記少なくとも1つの作用剤と約30℃又は約37℃の温度で接触させる
、請求項96又は請求項97記載の培養培地。
【請求項１０７】
前記サンプルを、10μMの16,16-dmPGE2と約37℃で、約2時間接触させる、請求項96又は
請求項97記載の培養培地。
【請求項１０８】
CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及びULBP2からなる群よ
り選択される少なくとも2つの遺伝子の発現が、対照の全臍帯血サンプル中の少なくとも2
つの遺伝子の発現と比較して、前記接触させたサンプル中で約20倍増大する、請求項96か
ら107のいずれか一項記載の培養培地。
【請求項１０９】
CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及びULBP2からなる群よ
り選択される少なくとも5つの遺伝子の発現が、対照の全臍帯血サンプル中の少なくとも5
つの遺伝子の発現と比較して、前記接触させたサンプル中で約10倍、約3倍、又は約2倍増
大する、請求項96から107のいずれか一項記載の培養培地。
【請求項１１０】
前記遺伝子CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及びULBP2の
発現が、対照の全臍帯血サンプル中の遺伝子の発現と比較して、前記接触させたサンプル
中で約10倍、約5倍、約3倍、又は約2倍増大する、請求項96から107のいずれか一項記載の
培養培地。
【請求項１１１】
前記全臍帯血サンプルが、約25℃〜約37℃の温度で約1〜約24時間の間、プロスタグラ
ンジン経路を調節する少なくとも1つの作用剤とサンプルとを接触させることによって、
培養培地中で調節され、ここで、該サンプルは、少なくとも70%のTNCを含み、かつ濃縮に
は供されない、請求項1から21のいずれか一項記載の培養培地と接触させた全臍帯血サン
プル。
【請求項１１２】
前記TNCが少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくと
も95%又は少なくとも99%である、請求項111記載の全臍帯血サンプル。
【請求項１１３】
前記少なくとも1つの作用剤が:cAMPアナログ又はエンハンサー、Gα-s活性化因子、及
びプロスタグランジン経路アゴニストからなる群より選択される、請求項111又は請求項1
12記載の全臍帯血サンプル。
【請求項１１４】
前記少なくとも1つの作用剤が選択的にPGE2 EP2又はPGE2 EP4受容体に結合する、請求
項111又は請求項112記載の臍帯血サンプル。
【請求項１１５】
前記少なくとも1つの作用剤がPGE2、又はPGE2アナログ又は誘導体を含む、請求項111又
は請求項112記載の全臍帯血サンプル。
【請求項１１６】
前記少なくとも1つの作用剤が:PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-メチルPGE2、20-エチル
PGE2、及び8-イソ-16-シクロヘキシル-テトラノルPGE2からなる群より選択される、請求
項111又は請求項112記載の全臍帯血サンプル。
【請求項１１７】
前記少なくとも1つの作用剤が、16,16-dmPGE2を含む、請求項111又は請求項112記載の
全臍帯血サンプル。
【請求項１１８】
前記全臍帯血サンプルを、前記少なくとも1つの作用剤と約1時間〜約4時間接触させる
、請求項111又は請求項112記載の全臍帯血サンプル。
【請求項１１９】
前記全臍帯血サンプルを、前記少なくとも1つの作用剤と、約1時間又は約2時間接触さ
せる、請求項111又は請求項112記載の全臍帯血サンプル。
【請求項１２０】
前記全臍帯血サンプルを、前記少なくとも1つの作用剤と、約25℃〜約37℃の温度で接
触させる、請求項111又は請求項112記載の全臍帯血サンプル。
【請求項１２１】
前記全臍帯血サンプルを、前記少なくとも1つの作用剤と、約30℃又は約37℃の温度で
接触させる、請求項111又は請求項112記載の全臍帯血サンプル。
【請求項１２２】
前記全臍帯血サンプルを、10μMの16,16-dmPGE2と、約37℃で、約2時間接触させる、請
求項111又は請求項112記載の全臍帯血サンプル。
【請求項１２３】
CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及びULBP2からなる群よ
り選択される少なくとも2つの遺伝子の発現が、対照の全臍帯血サンプル中の少なくとも2
つの遺伝子の発現と比較して、前記接触させたサンプル中で約20倍増大する、請求項111
から122のいずれか一項記載の全臍帯血サンプル。
【請求項１２４】
CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及びULBP2からなる群よ
り選択される少なくとも5つの遺伝子の発現が、対照の全臍帯血サンプル中の少なくとも5
つの遺伝子の発現と比較して、前記接触させたサンプル中で約10倍、約3倍又は約2倍増大
する、請求項111から122のいずれか一項記載の全臍帯血サンプル。
【請求項１２５】
前記遺伝子CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及びULBP2の
発現が、対照の全臍帯血サンプル中の遺伝子の発現と比較して、前記接触させたサンプル
中で約10倍、約5倍、約3倍又は約2倍増大する、請求項111から122のいずれか一項記載の
全臍帯血サンプル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の相互参照)
本出願は、米国特許法第119条(e)のもとで、その全体が引用により組み込まれている、
2013年3月15日出願の米国仮特許出願第61/792,818号の利益を主張する。
【０００２】
(背景)
(技術分野)
本発明は、一般に細胞集団、特に造血幹細胞を含む細胞の集団を操作するための改善さ
れた培養培地、その組成物、並びにそのような培地及び組成物を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
(関連技術の説明)
幹細胞は、多くの臨床適用及び研究の適用に有用性を有する。例えば、幹細胞及びそれ
らの分化した子孫は、細胞アッセイ、薬物スクリーニング及び毒性アッセイで用いられ得
る。幹細胞はまた、損傷した組織の処置のための再生医療などの細胞ベースの治療に有用
性を示す。探求されている再生医療の一態様は、癌及び変性障害の拡大している列挙を処
置するための造血幹細胞移植の使用である。National Marrow Donor Program(登録商標)(
NMDP)によれば、推定45,000〜50,000個の造血細胞移植(骨髄、末梢血幹細胞(PBSC)、又は
臍帯血移植)が、生命を脅かす悪性及び非悪性の疾患を有する患者を処置するために毎年
世界中で行われている(Blume KG, Forman SJ, Appelbaum FR,編集、「トーマスの造血細
胞移植(Thomas' Hematopoietic Cell Transplantation)」、第3版、Malden, Mass:Blackw
ell;2004:9-15の中の、Horowitz MM.ら、「造血細胞移植の使用及び増殖(Uses and Growt
h of Hematopoietic Cell Transplantation)」)。さらに、約4,800例の患者が、NMDPを通
じて無関係のドナー又は臍帯血単位を用いて毎年移植されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これらの適用の全てに関して、再生可能な幹細胞培養法は、それらを用いるべき目的に
関して適切な質の十分な細胞数を提供する必要がある。しかし、現行の技術では、ある程
度の細胞死が生じ得る過程である、凍結保存、解凍、再懸濁、増殖、培養、及び細胞集団
の維持などの、細胞プロセシング活動を受ける細胞の生物学的活性を保存し得る細胞培養
培地がない。したがって、当該分野では、研究及び治療の目的のために細胞の集団をプロ
セシングするため、維持するため、操作するため、及び増殖させるために効率的な細胞培
養培地が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
(概要)
本発明は一般には、細胞集団を調製するための改善された培養培地、その組成物、並び
にそのような培地及び組成物を用いる方法を提供する。
【０００６】
種々の実施態様では、(a)約1%〜約20%の多糖;及び(b)化学的に定義された細胞培養培地
を含む培養培地が提供される。
【０００７】
特定の実施態様では、多糖はデキストランである。
【０００８】
一実施態様では、多糖は:デキストラン-1、デキストラン-10、デキストラン-20、デキ
ストラン-30、及びデキストラン-40からなる群より選択されるデキストランである。
【０００９】
特定の実施態様では、多糖は、デキストラン-40である。
【００１０】
追加の実施態様では、多糖は、ヒドロキシエチルスターチ(HES)である。
【００１１】
特定の実施態様では、多糖は:ヘタスターチ、ヘキサスターチ、ペンタスターチ、及び
テトラスターチからなる郡より選択されるHESである。
【００１２】
一実施態様では、多糖はヘタスターチである。
【００１３】
別の実施態様では、培地は、約1%〜約5%の多糖を含む。
【００１４】
さらに別の実施態様では、培地は、約6%の多糖を含む。
【００１５】
1つの特定の実施態様では、培地は、約7%の多糖を含む。
【００１６】
1つの特定の実施態様では、培地は、約8%の多糖を含む。
【００１７】
1つの追加の実施態様では、培地は、約9%の多糖を含む。
【００１８】
1つのさらなる実施態様では、培地は、約10%の多糖を含む。
【００１９】
特定の実施態様では、培地は、約1%〜約5%のHSAを含む。
【００２０】
さらなる実施態様では、培地は、約2%のHSAを含む。
【００２１】
別の実施態様では、培地は、約3%のHSAを含む。
【００２２】
さらなる実施態様では、培地は、約4%のHSAを含む。
【００２３】
一実施態様では、培地は、約5%のHSAを含む。
【００２４】
さらなる実施態様では、ここでは、化学的に定義された細胞培養培地は:StemSpan-ACF
、StemSpan-H3000、StemSpan-SFEM、Stemline II、StemPro 34、StemXVivo、イスコフ改
変ダルベッコ培地(Iscove's modified Dulbecco's medium)(IMDM)、ダルベッコ改変イー
グル培地(Dulbecco's modified Eagle medium)(DMEM)、ロズウェルパーク記念研究所培地
(Roswell Park Memorial Institute medium)(RPMI)1640培地、マッコイ5A培地、最小必須
培地α培地(minimum essential medium alpha medium)(α-MEM)、基礎培地イーグル(basa
l medium Eagle)(BME)、フィッシャー培地、培地199、F-12K栄養混合物培地(Kaighn改変
、F-12K)、及びX-vivo 20からなる群より選択される。
【００２５】
特定の実施態様では、化学的に定義された細胞培養培地は:StemSpan-ACF、StemSpan-H3
000、及びStemSpan-SFEMからなる群より選択される。
【００２６】
特定の実施態様では、化学的に定義された細胞培養培地はStemSpanである。
【００２７】
別の特定の実施態様では、培養培地は、さらに1つ以上の増殖因子又はサイトカインを
含む。
【００２８】
1つの特定の実施態様では、化学的に定義された培養培地は:flt3-リガンド(FLT3);トロ
ンボポイエチン(TPO)、幹細胞因子(SCF)、上皮細胞増殖因子(EGF)、トランスフォーミン
グ増殖因子-β(TGF-β)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、インターロイキン-3(IL3)、
インターロイキン-6(IL6)、及びインターロイキン-9(IL9)からなる群より選択される1つ
以上の増殖因子又はサイトカインを含む。
【００２９】
一実施態様では、培養培地は:cAMPアナログ又はエンハンサー、Gα-s活性化因子、及び
プロスタグランジン経路アゴニストからなる群より選択される作用剤をさらに含む。
【００３０】
特定の実施態様では、プロスタグランジン経路アゴニストは選択的にPGE2 EP2又はPGE2
EP4受容体に結合する。
【００３１】
さらなる実施態様では、プロスタグランジン経路アゴニストは、PGE2、又はPGE2アナロ
グ又は誘導体を含む。
【００３２】
さらなる実施態様では、プロスタグランジン経路アゴニストは:PGE2、16,16-dmPGE2、1
5(S)-15-メチルPGE2、20-エチルPGE2、及び8-イソ-16-シクロヘキシル-テトラノルPGE2か
らなる群より選択される。
【００３３】
さらなる特定の実施態様では、プロスタグランジン経路アゴニストは、16,16-dmPGE2を
含む。
【００３４】
種々の実施態様では、(a)細胞の集団;(b)約1%〜約20%の多糖;及び(c)化学的に定義され
た細胞培養培地を含む組成物が提供される。
【００３５】
一実施態様では、細胞の集団は:骨髄細胞(BMC)、臍帯血細胞(UCBC)、胎盤血細胞、動員
末梢血細胞(mPBC)、造血幹細胞(HSC)、造血前駆細胞(HPC)、及びCD34+細胞からなる群よ
り選択される。
【００３６】
特定の実施態様では、細胞の集団は:骨髄、臍帯血、胎盤血、又は動員末梢血からなる
群より選択される。
【００３７】
別の特定の実施態様では、細胞の集団は:造血幹細胞(HSC)、造血前駆細胞(HPC)、及びC
D34+細胞のうちの少なくとも1つを含む。
【００３８】
特定の実施態様では、細胞の集団は、CD34+細胞の精製された集団を含む。
【００３９】
追加の実施態様では、多糖はデキストランである。
【００４０】
別の実施態様では、多糖は:デキストラン-1、デキストラン-10、デキストラン-20、デ
キストラン-30、及びデキストラン-40からなる群より選択されるデキストランである。
【００４１】
一実施態様では、多糖はデキストラン-40である。
【００４２】
特定の実施態様では、多糖はHESである。
【００４３】
さらなる実施態様では、多糖は:ヘタスターチ、ヘキサスターチ、ペンタスターチ、及
びテトラスターチからなる群より選択されるHESである。
【００４４】
特定の実施態様では、多糖はヘタスターチである。
【００４５】
さらなる実施態様では、組成物は約1%〜約5%の多糖を含む。
【００４６】
別の実施態様では、組成物は約6%の多糖を含む。
【００４７】
さらなる特定の実施態様では、組成物は約7%の多糖を含む。
【００４８】
一実施態様では、組成物は約8%の多糖を含む。
【００４９】
特定の実施態様では、組成物は、約9%の多糖を含む。
【００５０】
ある特定の実施態様では、組成物は約10%の多糖を含む。
【００５１】
さらなる特定の実施態様では、組成物は約1%〜約5%のHSAを含む。
【００５２】
さらなる特定の実施態様では、組成物は約2%のHSAを含む。
【００５３】
別の特定の実施態様では、組成物は約3%のHSAを含む。
【００５４】
1つの特定の実施態様では、組成物は約4%のHSAを含む。
【００５５】
一実施態様では、組成物は約5%のHSAを含む。
【００５６】
さらなる実施態様では、化学的に定義された細胞培養培地は:StemSpan-ACF、StemSpan-
H3000、StemSpan-SFEM、Stemline II、StemPro 34、StemXVivo、イスコフ改変ダルベッコ
培地(IMDM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、ロズウェルパーク記念研究所培地(RPM
I)1640培地、マッコイ5A培地、最小必須培地α培地(α-MEM)、基礎培地イーグル(BME)、
フィッシャー培地、培地199、F-12K栄養混合物培地(Kaighn改変、F-12K)、及びX-vivo 20
からなる群より選択される。
【００５７】
一実施態様では、化学的に定義された細胞培養培地は:StemSpan-ACF、StemSpan-H3000
、及びStemSpan-SFEMからなる群より選択される。
【００５８】
別の実施態様では、化学的に定義された細胞培養培地はStemSpanである。
【００５９】
さらに別の実施態様では、組成物は、1つ以上の増殖因子又はサイトカインをさらに含
む。
【００６０】
特定の実施態様では、化学的に定義された培養培地は:flt3-リガンド(FLT3);トロンボ
ポイエチン(TPO)、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン-3(IL3)、インターロイキン-6(IL
6)、及びインターロイキン-6(IL9)からなる群より選択される1つ以上の増殖因子又はサイ
トカインを含む。
【００６１】
特定の実施態様では、組成物は:cAMPアナログ又はエンハンサー、Gα-s活性化因子、及
びプロスタグランジン経路アゴニストからなる群より選択される作用剤をさらに含む。
【００６２】
さらなる実施態様では、プロスタグランジン経路アゴニストは選択的にPGE2 EP2又はPG
E2 EP4受容体に結合する。
【００６３】
特定の実施態様では、プロスタグランジン経路アゴニストは、PGE2、又はPGE2アナログ
又は誘導体を含む。
【００６４】
さらなる実施態様では、プロスタグランジン経路アゴニストは:PGE2、16,16-dmPGE2、1
5(S)-15-メチルPGE2、20-エチルPGE2、及び8-イソ-16-シクロヘキシル-テトラノルPGE2か
らなる群より選択される。
【００６５】
一実施態様では、プロスタグランジン経路アゴニストは、16,16-dmPGE2を含む。
【００６６】
種々の実施態様では、細胞集団を調製する方法であって、細胞集団と前述の実施態様の
いずれか1つによる培地とを接触させることを包含する、前記方法が提供される。
【００６７】
一実施態様では、細胞集団は造血細胞集団を含む。
【００６８】
別の実施態様では、造血細胞集団は:骨髄細胞(BMC)、臍帯血細胞(UCBC)、胎盤血細胞、
動員末梢血細胞(mPBC)、造血幹細胞(HSC)、造血前駆細胞(HPC)、及びCD34+細胞からなる
群より選択される。
【００６９】
さらなる実施態様では、造血細胞集団は:骨髄、臍帯血、胎盤血、又は動員末梢血から
なる群より選択される。
【００７０】
別の実施態様では、造血細胞集団は:造血幹細胞(HSC)、造血前駆細胞(HPC)、及びCD34+
細胞のうちの少なくとも1つを含む。
【００７１】
特定の実施態様では、造血細胞集団は、CD34+細胞の精製された集団である。
【００７２】
別の実施態様では、細胞集団は、凍結保存された細胞を含み、かつ接触させることは、
培養培地中で凍結保存された細胞を解凍することを包含する。
【００７３】
一実施態様では、細胞集団は、細胞の集団と培養培地とを接触させる前に解凍された凍
結保存された細胞を含む。
【００７４】
さらなる実施態様では、細胞集団は、約20℃〜約37℃の温度で解凍される。
【００７５】
別の実施態様では、細胞集団は、約25℃、約30℃、又は約37℃の温度で解凍される。
【００７６】
別の実施態様では、接触させた細胞集団の細胞溶解は、対照の培養培地と接触させた対
照の細胞集団の細胞溶解と比較して、約10%、約20%、約30%、約40%又は約50%低下する。
【００７７】
さらなる実施態様では、接触させた細胞集団の細胞溶解は、対照培養培地と接触させた
対照細胞集団の細胞溶解と比較して、約2倍、3倍、又は5倍低下する。
【００７８】
別の実施態様では、接触させた造血細胞集団からのTNCの回収は、対照の培養培地と接
触させた対照造血細胞集団からのTNCの回収と比較して、約10%、約20%、約30%、又は約50
%増大する。
【００７９】
別の実施態様では、接触させた造血細胞集団からのTNCの回収は、対照の培養培地と接
触させた対照造血細胞集団からのTNCの回収と比較して、約2倍、約3倍、又は約5倍増大す
る。
【００８０】
特定の実施態様では、接触させたCD34+細胞の生存度は、対照の培養培地と接触させた
対照細胞集団のCD34+細胞生存度と比較して、約10%、約20%、約30%、約40%又は約50%増大
する。
【００８１】
別の実施態様では、接触させたCD34+細胞の生存度は、対照の培養培地と接触させた対
照細胞集団のCD34+細胞生存度と比較して、約2倍、約3倍、又は約5倍増大する。
【００８２】
別の実施態様では、細胞集団は、生体外で調節される。
【００８３】
特定の実施態様では、調節は、細胞集団と:cAMPアナログ又はエンハンサー、Gα-s活性
化因子、及びプロスタグランジン経路アゴニストからなる群より選択される少なくとも1
つの作用剤とを接触させることを包含する。
【００８４】
一実施態様では、プロスタグランジン経路アゴニストは選択的にPGE2 EP2又はPGE2 EP4
受容体に結合する。
【００８５】
別の実施態様では、プロスタグランジン経路アゴニストは、PGE2、又はPGE2アナログ又
は誘導体を含む。
【００８６】
別の実施態様では、プロスタグランジン経路アゴニストは:PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)
-15-メチルPGE2、20-エチルPGE2、及び8-イソ-16-シクロヘキシル-テトラノルPGE2からな
る群より選択される。
【００８７】
別の実施態様では、プロスタグランジン経路アゴニストは、16,16-dmPGE2を含む。
【００８８】
特定の実施態様では、細胞集団を、少なくとも1つの作用剤と約1時間〜約4時間接触さ
せる。
【００８９】
別の実施態様では、細胞集団を、少なくとも1つの作用剤と約1時間又は約2時間接触さ
せる。
【００９０】
別の実施態様では、細胞集団を、少なくとも1つの作用剤と約25℃〜約37℃の温度で接
触させる。
【００９１】
別の実施態様では、細胞集団を、少なくとも1つの作用剤と約30℃又は約37℃の温度で
接触させる。
【００９２】
別の実施態様では、細胞集団は、造血細胞を含み、かつ接触させることは、造血細胞と
10μMの16,16-dmPGE2とを約37℃で、約2時間接触させることを含む。
【００９３】
特定の実施態様では、細胞集団の生着、再構成、ホーミング及び/又は増殖は、インビ
ボにおいて、調節されていない細胞集団と比較して、増大する。
【００９４】
別の実施態様では:CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及び
ULBP2からなる群より選択される少なくとも2つの遺伝子の発現は、対照の調節されていな
い細胞集団における少なくとも2つの遺伝子の発現と比較して、細胞集団中で約20倍増大
する。
【００９５】
一実施態様では、CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及びU
LBP2からなる群より選択される少なくとも5つの遺伝子の発現は、対照の調節されていな
い細胞集団における少なくとも5つの遺伝子の発現と比較して、細胞集団中で約10倍、約3
倍、又は約2倍増大する。
【００９６】
別の実施態様では、遺伝子CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HAS1、CXCL2、CXCL
3、及びCXCR4の発現は、対照の調節されていない細胞集団における遺伝子の発現と比較し
て、細胞集団中で約3倍又は約2倍増大する。
【００９７】
一実施態様では、細胞集団は、対象に投与される。
【００９８】
さらなる実施態様では、細胞集団は、対象に対して同種異系である。
【００９９】
別の実施態様では、細胞集団は、対象に対して自系である。
【０１００】
特定の実施態様では、対象は:虚血、非悪性血液障害、免疫不全、重症複合免疫不全(SC
ID)、リンパ球減少症、血小板減少症、好中球減少症、貧血、ファンコニー貧血、重症再
生不良性貧血、先天性異常血色素症、鎌状赤血球病、β-地中海貧血、鎌状赤血球病、ウ
ィスコット・オルドリッチ症候群、代謝性蓄積疾患、ハーラー病、ハンター病、マンノシ
ドーシス、癌、血液悪性腫瘍、急性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、ホ
ジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、非血液癌、乳
癌、卵巣癌、脳癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、皮膚癌、肝臓癌、及び膵臓癌からなる群よ
り選択される疾患、障害、又は状態を有する。
【０１０１】
種々の実施態様では、約25℃〜約37℃の温度で約1〜約24時間の間、プロスタグランジ
ン経路を調節する少なくとも1つの作用剤とサンプルとを接触させることによって調節さ
れる解凍された全臍帯血サンプル中で少なくとも70%のTNCを維持する、前述の実施態様の
うちのいずれか1つに記載の培養培地が提供される。
【０１０２】
特定の実施態様では、培養培地は、解凍された全臍帯血サンプル中で少なくとも75%、
少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%のTNCを維持する。
【０１０３】
特定のさらなる実施態様では、少なくとも1つの作用剤は:cAMPアナログ又はエンハンサ
ー、Gα-s活性化因子、及びプロスタグランジン経路アゴニストからなる群より選択され
る。
【０１０４】
1つの特定の実施態様では、少なくとも1つの作用剤は選択的にPGE2 EP2又はPGE2 EP4受
容体に結合する。
【０１０５】
特定の実施態様では、少なくとも1つの作用剤は、PGE2、又はPGE2アナログ又は誘導体
を含む。
【０１０６】
一実施態様では、少なくとも1つの作用剤は:PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-メチルPGE
2、20-エチルPGE2、及び8-イソ-16-シクロヘキシル-テトラノルPGE2からなる群より選択
される。
【０１０７】
さらなる実施態様では、少なくとも1つの作用剤は、16,16-dmPGE2を含む。
【０１０８】
追加の実施態様では、サンプルを、少なくとも1つの作用剤と、約1時間〜約4時間の間
接触させる。
【０１０９】
特定の実施態様では、サンプルを、少なくとも1つの作用剤と、約1時間又は約2時間の
間接触させる。
【０１１０】
一実施態様では、サンプルを、少なくとも1つの作用剤と約25℃〜約37℃の温度で接触
させる。
【０１１１】
一つの特定の実施態様では、全臍帯血サンプルを、少なくとも1つの作用剤と約30℃又
は約37℃の温度で接触させる。
【０１１２】
別の実施態様では、サンプルを、10μMの16,16-dmPGE2と約37℃で、約2時間接触させる
。
【０１１３】
特定の実施態様では:CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及
びULBP2からなる群より選択される少なくとも2つの遺伝子の発現は、対照の全臍帯血サン
プル中の少なくとも2つの遺伝子の発現と比較して、接触させたサンプル中で約20倍増大
する。
【０１１４】
1つの特定の実施態様では:CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL
3、及びULBP2からなる群より選択される少なくとも5つの遺伝子の発現は、対照の全臍帯
血サンプル中の少なくとも5つの遺伝子の発現と比較して、接触させたサンプル中で約10
倍、約3倍、又は約2倍増大する。
【０１１５】
さらなる特定の実施態様では:遺伝子CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CX
CL2、CXCL3、及びULBP2の発現は、対照の全臍帯血サンプル中の遺伝子の発現と比較して
、接触させたサンプル中で約10倍、約5倍、約3倍、又は約2倍増大する。
【０１１６】
種々の実施態様では、前述の実施態様のいずれか1つによる培養培地と接触させた全臍
帯血サンプルであって、約25℃〜約37℃の温度で約1〜約24時間の間、プロスタグランジ
ン経路を調節する少なくとも1つの作用剤とサンプルとを接触させることによって、培養
培地中で調節され、ここでこのサンプルは、少なくとも70%のTNCを含み、かつ濃縮には供
されない、臍帯血サンプルが提供される。
【０１１７】
特定の実施態様では、TNCは少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくと
も90%、少なくとも95%又は少なくとも99%である。
【０１１８】
さらなる実施態様では、少なくとも1つの作用剤は:cAMPアナログ又はエンハンサー、G
α-s活性化因子、及びプロスタグランジン経路アゴニストからなる群より選択される。
【０１１９】
一実施態様では、少なくとも1つの作用剤は選択的にPGE2 EP2又はPGE2 EP4受容体に結
合する。
【０１２０】
特定の実施態様では、少なくとも1つの作用剤はPGE2、又はPGE2アナログ又は誘導体を
含む。
【０１２１】
特定の実施態様では、少なくとも1つの作用剤は:PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-メチ
ルPGE2、20-エチルPGE2、及び8-イソ-16-シクロヘキシル-テトラノルPGE2からなる群より
選択される。
【０１２２】
別の実施態様では、少なくとも1つの作用剤は、16,16-dmPGE2を含む。
【０１２３】
追加の実施態様では、全臍帯血サンプルを、少なくとも1つの作用剤と約1時間〜約4時
間接触させる。
【０１２４】
さらなる実施態様では、全臍帯血サンプルを、少なくとも1つの作用剤と、約1時間又は
約2時間接触させる。
【０１２５】
別の特定の実施態様では、全臍帯血サンプルを、少なくとも1つの作用剤と、約25℃〜
約37℃の温度で接触させる。
【０１２６】
一実施態様では、全臍帯血サンプルを、少なくとも1つの作用剤と、約30℃又は約37℃
の温度で接触させる。
【０１２７】
一実施態様では、全臍帯血サンプルを、10μMの16,16-dmPGE2と、約37℃で、約2時間で
接触させる。
【０１２８】
追加の実施態様では:CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及
びULBP2からなる群より選択される少なくとも2つの遺伝子の発現は、対照の全臍帯血サン
プル中の少なくとも2つの遺伝子の発現と比較して、接触させたサンプル中で約20倍増大
する。
【０１２９】
特定の実施態様では:CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及
びULBP2からなる群より選択される少なくとも5つの遺伝子の発現は、対照の全臍帯血サン
プル中の少なくとも5つの遺伝子の発現と比較して、接触させたサンプル中で約10倍、約3
倍又は約2倍増大する。
【０１３０】
さらなる実施態様では、遺伝子CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、
CXCL3、及びULBP2の発現は、対照の全臍帯血サンプル中の遺伝子の発現と比較して、接触
させたサンプル中で約10倍、約5倍、約3倍又は約2倍増大する。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
(図面の簡単な説明)
【図１Ａ】解凍後、洗浄後、37℃で1時間のインキュベーション後、及び37℃で2時間のインキュベーション後の、StemSpan-ACF単独と比較した、StemSpan-ACFと8%のデキストラン-40中でインキュベートしたサンプル中の生きているCD34+細胞の数を示す。
【図１Ｂ】解凍後、洗浄後、37℃で1時間のインキュベーション後、及び37℃で2時間のインキュベーション後の、StemSpan単独と比較した、StemSpan-ACFと8%のデキストラン中でインキュベートしたサンプル中のCD45+細胞画分中のインタクトな顆粒球の百分率を示す。
【図２】解凍後、洗浄後、及び37℃で2時間のインキュベーション後の、10μMのdmPGE2で処置して、StemSpan-ACF、StemSpan-ACF+2.1%のHSA、StemSpan+4.2%のHSA、IMDM+4.2%のHSA、又はStemSpan-ACFと8%デキストラン-40との中でプロセシングされた、臍帯血単位についてTNCのカウントを示す。
【図３】10μMのdmPGE2とともに2時間37℃でインキュベーションした後の増大したCXCR4発現を示すCD34+細胞のパーセントを示す。サンプルは、StemSpan-ACF、StemSpan-ACF+5%デキストラン-40、又はStemSpan+10%デキストラン-40で処理した。
【発明を実施するための形態】
【０１３２】
(詳細な説明)
(A.概説)
本発明は、細胞の集団をプロセシング及び調節するための改善された細胞培養培地、特
に造血幹細胞の組成物を提供する。本発明はまた、移植療法のための造血細胞組成物を調
製するなどの、インビトロ及びインビボの研究及び再生幹細胞療法を含む、種々の用途の
ための細胞を調製する方法を提供する。いかなる特定の理論にも束縛されることは望まな
いが、培養培地は、解凍された細胞集団の調製の間、及び細胞のその後の生体外の操作の
間を含む、細胞処理の間に、細胞生存度を改善し、かつ細胞集団(例えば、顆粒球を含む
白血球)中の種々の細胞種の細胞溶解を低下させることが考えられる。細胞培養培地は、
アポトーシス細胞の膜を安定化することによって細胞溶解を低下させ得る。
【０１３３】
細胞の安定性増大及び細胞溶解の低下の結果として、細胞プロセシングの間に全有核細
胞カウント(total nucleated cell count)(TNC)の回復で得られた増大(細胞溶解に起因す
る細胞内成分の放出を妨げることによる)に加えて、細胞培養培地は、細胞生成物内の「
クランピング」を生じ得る血球生成物中の細胞片の蓄積を妨げる。血球生成物中のクラン
ピングは、細胞のさらなる細胞プロセシング操作を妨害し得、また細胞の調節を含む細胞
過程を阻害し得る。したがって、プロセシング及び調節の間、アポトーシス及び細胞(例
えば、顆粒球を含む白血球)の溶解を阻害することによって、本発明の培養培地は、細胞
集団のプロセシング、調節及び/又は増殖の間にTNCの回復を改善する。この培養培地はさ
らに、遺伝子及び/又はタンパク質発現中の変化によって実証され得るように(ここでは、
このような調節は、他の細胞培養又は注入媒体中で損なわれるか、又は減退され得る)、
低分子による細胞の活性化を含む、細胞の調節を可能にする。
【０１３４】
この培養培地は、細胞集団、特に、造血幹細胞を含む細胞の集団を、分離すること、凍
結保存すること、解凍すること、再懸濁すること、調節すること、増殖させること、又は
維持することを含む、全ての細胞プロセシング工程で用いられ得る。この培養培地は、全
臍帯血、及び動員末梢血を含む全血球生成物をプロセシング及び操作して、細胞集団中の
、例えば、顆粒球及び単球の細胞溶解を妨げ、それによってプロセシングの間、これらの
血液生成物中のクランピングの出現を低減することに特に有用であり得る。
【０１３５】
本発明はまた、移植療法のための造血細胞の改善された供給源を提供する高い生物学的
活性を有する造血幹細胞を含む組成物を提供する。改善された細胞組成物は、増大した治
療特性を有し、これによって、生着の増大、造血性再構成の増大、骨髄に対するホーミン
グの増大、及び増殖の増大がインビボで生じる。したがって、本明細書で企図される改善
された方法及び組成物によって、臍帯血移植における部分的又は単一の臍帯血単位の使用
が可能になる場合がある。
【０１３６】
種々の実施態様では、移植療法のための造血細胞を含む細胞の集団を調製する方法が提
供される。この改良法は、造血細胞の調節及び富化を可能にし、それによって生着の成功
及び造血再構成の確率を増大する、造血細胞集団を安定化する新規な培養培地の使用を含
む。
【０１３７】
本発明の実施は、特段反対のことが示されない限り、例示の目的で多くが下に記載され
る、当該分野の技術の範囲内の化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組み換
えDNA技術、遺伝学、免疫学及び細胞生物学の従来の方法を使用する。このような技術は
、文献中に詳細に説明される。例えば、Sambrookらの成書、「分子クローニング:実験室
マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」(第3版、2001);Sambrookらの成
書、「分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」
(第2版、1989);Maniatisらの成書、「分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cl
oning:A Laboratory Manual)」(1982);Ausubelらの成書、「分子生物学における現代のプ
ロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」(John Wiley and Sons, 2008年
7月更新);「分子生物学における短いプロトコール:分子生物学における現代のプロトコー
ル由来の方法の大要(Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods 
from Current Protocols in Molecular Biology)」,Greene Pub.Associates and Wiley-I
nterscience;Glover,「DNAクローニング:実践的アプローチ(DNA Cloning:A Practical Ap
proach)」,第I巻&II巻(IRL Press, Oxford, 1985);Anand,「複合ゲノムの解析技術(Techn
iques for the Analysis of Complex Genomes)」,(Academic Press, New York, 1992);「
転写と翻訳(Transcription and Translation)」(B.Hames & S.Higgins,編,1984);Perbal
の成書、「分子クローニングのための実践的ガイド(A Practical Guide to Molecular Cl
oning)」(1984);並びにHarlow及びLaneの成書、「抗体(Antibodies)」,(Cold Spring Har
bor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,1998)を参照のこと。
【０１３８】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が引用により本明
細書中に組み込まれている。
【０１３９】
(B.定義)
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、
本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書
に記載の方法及び材料と類似した、又はそれと等しい任意の方法及び材料を本発明の実施
又は試験において用いてもよいが、組成物、方法及び材料の好ましい実施態様が本明細書
に記載されている。本発明の目的に関して、以下の用語が下で定義されている。
【０１４０】
冠詞「a(ある、1つの)」、「an(ある、1つの)」、及び「the(その、この)」は、本明細
書では、その冠詞の文法上の目的語の1つ、又は2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)を指
して用いられる。例として、「1つのエレメント(an element)」とは、1つのエレメント又
は2つ以上のエレメントを意味する。
【０１４１】
本明細書において用いる場合、「約」又は「およそ」という用語は、参照の数量、レベ
ル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量又は長さに対して30%、25%、20%、2
5%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%又は1%程度まで変動する数量、レベル、値、
数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量又は長さを指す。特定の実施態様では、「約
」又は「およそ」という用語は、数値の前にある場合、その値プラス又はマイナス15%、1
0%、5%、又は1%の範囲を示す。
【０１４２】
「少なくとも〜」という用語は、いくつかの実施態様では「少なくとも約〜」という用
語と置き換えられてもよいことが理解される。
【０１４３】
「含む、包含する(comprise)」、「含む、包含する(comprises)」及び「含んでいる、
包含している(comprising)」という単語は、本明細書全体を通して、文脈上異なる解釈を
要する場合を除き、明記されている工程若しくはエレメント、又は工程若しくはエレメン
トの群を包含するが、任意の他の工程若しくはエレメント、又は工程若しくはエレメント
の群を排除するものではないことを意味することが理解されるであろう。「〜からなる(c
onsisting of〜)」とは、「〜からなる(consisting of〜)」という句に続くいかなるもの
も包含することを意味し、それに限定される。したがって、「〜からなる(consisting of
〜)」という句は、列挙されているエレメントが必要又は必須であること、及び他のエレ
メントは存在しない場合があることを示す。「〜から本質的になる(consisting essentia
lly of〜)」とは、この句の後に列挙されている任意のエレメントを包含することを意味
し、列挙されているエレメントに関して本開示に明記されている活動又は作用に干渉も寄
与もしない他のエレメントに限定される。したがって、「〜から本質的になる(〜consist
ing essentially of)」という句は、列挙されているエレメントが必要又は必須であるが
、他のエレメントでは任意のものはなく、列挙されているエレメントの活性又は作用にそ
れらが影響を及ぼすか否かに応じて、存在してもよいし、又は存在しなくてもよいことと
を示す。
【０１４４】
本明細書全体を通して「一実施態様」、「ある実施態様」、「特定の実施態様」、「関
連する実施態様」、「ある特定の実施態様」、「追加の実施態様」又は「さらなる実施態
様」又はそれらの組合せへの言及は、その実施態様に関連して記載されている特定の特徴
、構造又は特性が本発明の少なくとも1つの実施態様に包含されることを意味する。した
がって、本明細書全体を通した種々の箇所における上記の句の出現は、必ずしも全てが同
じ実施態様について言及しているのではない。さらに、特定の特徴、構造、又は特性を任
意の適切な様式で1つ以上の実施態様で組み合わせてもよい。
【０１４５】
特定の実施態様では、「再懸濁」又は「希釈」という用語は、本明細書で企図される培
養培地中に解凍された細胞を移すことを指す。この解凍された細胞は、同じ容積の培養培
地へ、又はより大量の容積へ移されてもよい。この解凍された細胞は、本明細書で企図さ
れる培養培地中へ、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10倍又はそれを超えて希釈されても
よい。
【０１４６】
「生体外(ex vivo)」という用語は、一般に、生物体から取り出す活動、例えば、好ま
しくは天然の条件の変更は最小にして、生物体外の人工的な環境における生組織中で又は
その上で行われた実験又は測定を指す。特定の実施態様では、「生体外」手順とは、生物
体から採取されて、実験装置中で、通常は滅菌条件下で、一般には数時間、又は最大約24
時間まで、ただし状況に応じて48時間又は72時間までを含めた時間にわたって、培養又は
調節された生細胞又は組織を包含する。特定の実施態様では、このような組織又は細胞は
、収集されて凍結されてもよく、後に生体外処理のために解凍されてもよい。生細胞又は
生組織を用いる、数日よりも長く続く組織培養実験又は手順は、一般には、「インビトロ
」とみなされるが、特定の実施態様では、この用語は、生体外と互換的に用いてもよい。
【０１４７】
「生体外における投与」、「生体外における処理、処置」又は「生体外における調節」
という記述は、一般に、1つ以上の臓器、細胞、又は組織を、生きているか又は最近死亡
した対象から得、必要に応じて、精製/富化し、処理又は手順にさらす医学的手技(例えば
、細胞を本発明の組成物又は作用剤と一緒にインキュベートして、造血幹細胞又は造血前
駆細胞などの特定の細胞の増殖を増強することを含む生体外投与工程)に関する。生体外
において処理した細胞を、ドナー又は別の生きている対象に投与してもよい。
【０１４８】
そのような生体外における治療適用はまた、治療能力を有する細胞を生きている対象に
1回以上投与することによるなどの、任意のインビボにおける処理又は手技の工程も含ん
でよい。これらの実施態様については、当該分野において周知の技術に従い、本明細書の
他の箇所に記載されている局所投与及び全身投与の両方が企図される。対象に投与される
治療用細胞の量は、対象の特性、例えば、全体的な健康、年齢、性別、体重、及び薬物に
対する耐容性、並びに薬物及び/又は細胞移植に対する反応の程度、重症度、及び種類な
どに依存する。
【０１４９】
「インビボ」という用語は、一般に、細胞の生着、再構成、細胞のホーミング、細胞の
自己再生、及び細胞の増殖などの生体内で起こる活性を指す。一実施態様では、「インビ
ボにおける増大」という用語は、細胞集団がインビボにおいて数を増加させる能力を指す
。特定の実施態様では、インビボにおける増大とは、幹細胞の自己再生及び/又は増殖を
包含する。
【０１５０】
本明細書において用いる場合、「生着」という用語は、細胞を組織又は損傷部位などの
ある場所に組み込んで、その細胞が、その組織又はそのような部位で常在細胞となる過程
を指す。細胞は、例えば骨髄に、又は傷害を受けた部位若しくは虚血組織などの別の場所
に生着してもよい。
【０１５１】
特定の実施態様では、「生着」という用語は、造血細胞が骨髄に位置して、そこで常在
細胞となる過程を指す。特定の実施態様では、生着は実質的に、細胞増殖及び再構成とは
独立している。「生着の増大」とは、対照のサンプルのような別のサンプル中で生着する
細胞の数に対して、あるサンプル中ではより多くの細胞が生着する場合に生じる。いくつ
かの実施態様では、生着の増大は、処理していないサンプル又は対照のサンプル中での細
胞数と比較して、細胞の処理されたサンプル中でより多くの細胞が生着する場合に生じる
。
【０１５２】
「生着能力」とは、造血細胞が生着する能力を指し、例えば、細胞が生着の増大の能力
を有することを示す、遺伝子発現によって評価され得る。
【０１５３】
本明細書において用いる場合、「再構成」という用語は、1個以上の生着された造血細
胞が、より多くの前駆体及びより多くの分化した造血細胞種を生じることによって、対象
の造血系を再複製又は再生する能力を指す。特定の実施態様では、再構成とは、造血系を
再配置する、生着された造血幹細胞及び/又は前駆細胞の過程を指す。長期再構成は生着
を必要とする。「造血再構成の増大」は、特定の造血系列を単に部分的に又は優先的に再
構成し得る、処理されたサンプル対処理されてないサンプルのような、異なるサンプル中
の細胞と比較してあるサンプル中の細胞でより多くの造血系が再構成される場合に生じる
。「再構成能力」とは、例えば、造血細胞が造血系を再構成する能力を指し、細胞が再構
成の増大の能力を有することを示す遺伝子発現によって評価され得る。
【０１５４】
「ホーミング」とは、HSPCが特定の領域又は組織に局在化する、すなわち、そこに移動
する能力を指す。ホーミングとは、投与したHSPCが骨髄、又は傷害を受けた部位若しくは
虚血組織などの別の場所に局在化することを包含し得る。「ホーミングの増大」は、より
多くの細胞が、未処理サンプルと比較して処理サンプルで見られる遊走のような、異なる
サンプル中の標的組織に遊走する細胞の数と比較して、サンプル中の標的組織へ遊走する
場合に起こる。造血細胞が標的組織に遊走する能力である「ホーミング能力」は、例えば
、細胞がホーミングの増大の能力を有することを示す遺伝子発現によって評価され得る。
【０１５５】
本明細書において用いる場合、「増殖」という用語は、対称分裂又は非対称分裂のいず
れかの細胞分裂の、細胞分裂における増大を指す。特定の実施態様では、「増殖」とは、
幹細胞及び/又は前駆体の対称又は非対称分裂を指す。「増殖の増大」は、未処理サンプ
ル中の細胞と比較して、処理サンプル中の細胞の数の増大がある場合に生じる。「増殖能
力」とは、細胞が増殖の増大という能力を有することを示す造血細胞の遺伝子発現の特徴
を指す。
【０１５６】
本明細書において用いる場合、「処置、処理(treatment)」、「処置すること、処理す
ること(treating)」などの用語は、限定するものではないが、疾患の症状の改善又は排除
を実現することを含めた、所望の薬理的効果及び/又は生理的効果を得ることを指す。効
果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防するという点で予防的であってよく、
かつ/又は、症状の改善若しくは排除を実現する、或いは疾患及び/若しくは疾患に起因す
る有害な影響の部分的若しくは完全な治癒をもたらすという点で治療的であり得る。「処
置、処理(treatment)」とは、本明細書において用いる場合、哺乳動物、特にヒトにおけ
る疾患の任意の治療を包含し、かつ:(a)疾患の素因があり得るが、今のところはまだそれ
を有すると診断されていない対象においてその疾患が生じることを予防すること;(b)疾患
を阻害すること、すなわち、その発生を阻止すること;(c)疾患を軽減すること、例えば、
疾患の退縮を引き起こすこと、例えば、疾患の症状を完全に又は部分的に排除すること;
及び(d)個体を疾患前の状態に回復させること、例えば、造血系を再構成することを包含
する。
【０１５７】
「増強する(enhance)」又は「促進する(promote)」又は「増加させる(increase)」又は
「活性化する(activate)」とは、一般に、作用剤又は組成物が、細胞において、ビヒクル
又は対照分子/組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、大きな生理学
的応答(すなわち、下流の効果)、例えば、造血幹細胞及び造血前駆細胞の生着又は再構成
の増大、及びインビボにおける幹細胞の増殖の増大を生じさせる、又は引き起こす能力を
指す。測定可能な生理学的応答としては、当該分野における理解及び本明細書における記
載から明らかなものの中でも、造血幹細胞及び造血前駆細胞の生着、再構成、生存能力、
ホーミング、自己再生、及び/又は増殖の増大が挙げられる。一実施態様では、測定可能
な生理学的応答としては、参照サンプル(例えば、対照又は未処理の細胞)中の遺伝子の発
現と比較して、造血細胞の治療能力についてのマーカーである複数の遺伝子の発現の増大
が挙げられる。「増大した、増加した(increased)」又は「向上された、強化された、増
強された(enhanced)」量とは、通常は、「統計的に有意な」量であり、かつビヒクル(作
用剤が存在しない)又は対照組成物によって生じる応答の1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍
、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍又はそれ超(例えば、500倍、
1000倍)(その間に入る1を超える全ての整数及び小数点、例えば、1.5、1.6、1.7、1.8な
どを含む)の増大を包含し得る。
【０１５８】
「低減する、減少する(decrease)」又は「低下する、低減する(lower)」又は「減る(le
ssen)」又は「減少する、低下する(reduce)」又は「軽減する(abate)」とは、一般に、作
用剤又は組成物が、細胞において、ビヒクル又は対照分子/組成物のいずれかによって引
き起こされる応答と比較して、少ない生理学的応答(すなわち、下流の効果)、例えば、遺
伝子発現の低下を生じさせる、又は引き起こす能力を指す。一実施態様では、減少は、通
常は細胞の生存能力の低下と関連する、遺伝子発現の低下又は細胞シグナル伝達の減少で
あってもよい。「減少した(decrease)」又は「低下した(reduced)」量とは、一般には、
「統計的に有意な」量であって、かつビヒクル(作用剤が存在しない)又は対照の組成物に
よって生じる応答の1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍以上(例
えば、500倍、1000倍)(その間に入る1を超える全ての整数及び小数点、例えば、1.5、1.6
、1.7、1.8などを含む)の減少を包含し得る。
【０１５９】
「維持する(maintain)」又は「保存する(preserve)」又は「維持(maintenance)」又は
「変化なし(no change)」又は「実質的な変化なし(no substantial change)」、「実質的
な増大なし(no substantial increase)」又は「実質的な減少なし(no substantial decre
ase)」とは、一般に、作用剤が、ビヒクル又は対照の分子/組成物のいずれかによって引
き起こされる応答(参照応答)と比較して、細胞において、匹敵する生理学的応答(すなわ
ち、下流の効果)を生じさせるか、又は引き起こす能力を指す。匹敵する応答とは、参照
応答と有意に異ならないか、又は測定可能には異ならない応答である。
【０１６０】
細胞の「治療能力」とは、細胞の治療の量であって、対象に投与された場合に治療有益
性を提供する細胞の能力を指す。特定の実施態様では、細胞の治療能力は、細胞の治療能
力を示す、複数の遺伝子の発現の増大によって、及び/又は特定の遺伝子発現特徴の存在
によって、測定、定量、決定、特定又は確証され得る。一実施態様では、治療能力とは、
細胞が特定の組織、臓器又は損傷部位へホーミングして生着する能力を指す。ある特定の
実施態様では、治療能力とは、細胞が対象の造血系を再構成する能力を指す。ある特定の
実施態様では、治療能力とは、対象に一旦投与されれば細胞がインビボで自己再生を受け
る能力を指す。特定の実施態様では、「治療用細胞」、「治療能力を有する細胞」、及び
「治療能力を有している細胞」という用語は、互換的に用いられる。
【０１６１】
特定の実施態様では、複数の遺伝子及び/又は特定の遺伝子発現特徴の発現が増大して
いる細胞は、「十分な治療能力」を有する。細胞の治療能力は、対象に投与された場合、
それらが生着する能力、細胞系列を再構成する能力、及び/又は増殖する能力を有する場
合に十分である。
【０１６２】
特定の実施態様では、治療能力を有する細胞は、固有の又は実質的に固有の遺伝子及び
/又はタンパク質の発現を含む。固有の又は実質的に固有の発現を含んでいる細胞は、治
療能力を有するとみなされる。特定の実施態様では、「複数の遺伝子の発現」という句は
、遺伝子の発現、mRNAの発現を指す。他の実施態様では、「複数の遺伝子の発現」という
句は、タンパク質発現のレベルを指す。
【０１６３】
「複数」の遺伝子とは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、
38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、
58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、
78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、
98、99、100、200、300、400、500又はそれ以上の遺伝子であって、任意の間に入る数の
遺伝子を含む遺伝子を指す。
【０１６４】
本明細書において用いる場合、「遺伝子発現プロフィール(プロファイル)」、「遺伝子
発現特徴(シグネチャー)」、「遺伝子発現パネル」、「遺伝子パネル」又は「遺伝子特徴
(シグネチャー)」という用語は、同じサンプル、すなわち、細胞の集団について測定され
た複数の(すなわち2つ以上の)遺伝子の発現のレベルを指す。遺伝子発現特徴は、治療用
細胞又は治療能力を有する細胞を、当該分野において現存する細胞及び/又は対照、ビヒ
クル、又は未処理細胞と区別するために役立つ、一群の遺伝子「特徴遺伝子」又は「複数
の遺伝子」が同定されるように定義してもよい。
【０１６５】
「特徴遺伝子」とは、本明細書において用いる場合、一群の特徴遺伝子又は複数の遺伝
子中の任意の遺伝子を意味する。明確にするために、特徴遺伝子は、ハウスキーピング遺
伝子は含まない。
【０１６６】
「遺伝子発現」とは、本明細書において用いる場合、幹細胞及び前駆細胞、又は幹細胞
若しくは前駆細胞を含む細胞の集団などの生物学的サンプル中の遺伝子の相対的な発現レ
ベル及び/又は発現パターンを指す。特定の実施態様では、幹細胞又は前駆細胞は造血幹
細胞及び造血前駆細胞である。
【０１６７】
「遺伝子改変(遺伝子組み換え)(genetic modification)」とは、例えば、ウイルス若し
くはプラスミドベクター中へポリヌクレオチド配列を挿入することによる、又は相同組み
換え若しくは非相同末端結合による細胞のゲノムの一時的又は持続的な改変を指す。
【０１６８】
本明細書において用いる場合、「遺伝子治療、遺伝子療法(gene therapy)」という用語
は、遺伝子及び/又は遺伝子の発現を修復、訂正、又は改変する、細胞中へのポリヌクレ
オチドの導入を指す。特定の実施態様では、遺伝子治療は、ゲノムを改変し、及び他の実
施態様では、遺伝子治療はエピソーム性である。
【０１６９】
本明細書において用いる場合、「発現を検出すること」、「発現を決定すること」及び
「発現を測定すること」という句は、遺伝子のRNA転写物又はその発現産物の数量又は存
在を決定することを指す。遺伝子の発現、すなわち遺伝子発現プロファイリングを検出す
るための方法としては、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法、
ポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法、免疫組織化学的方法、及びプロテオミクスに
基づく方法が挙げられる。この方法では、一般に、目的の遺伝子の発現産物(例えば、mRN
A)を検出する。いくつかの実施態様では、逆転写PCR(RT-PCR)などのPCRに基づく方法(Wei
sら、TIG 8巻:263〜64頁、1992年)、及びマイクロアレイなどのアレイに基づく方法(Sche
naら、Science 270巻:467〜70頁、1995年)が用いられる。
【０１７０】
RNA抽出のための一般的方法は、当該分野で周知であり、かつAusubelら編、Current Pr
otocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, New York 1987〜1999年を含めた分
子生物学の標準の教本に開示されている。具体的には、RNA単離は、Qiagen(Valencia、Ca
lif. (カリフォルニア)州)などの商業的な製造業者からの精製キット、緩衝液セット及び
プロテアーゼを製造業者の指示に従って用いて行ってもよい。例えば、Qiagen RNeasyミ
ニカラムを用いて、培養物中の細胞から全RNAを単離してもよい。単離されたRNAは、これ
だけに限定されないが、PCR分析及びプローブアレイを含めたハイブリダイゼーション又
は増殖アッセイにおいて用いてもよい。RNAレベルを検出するための1つの方法は、単離さ
れたRNAを、検出しようとする遺伝子によりコードされるmRNAとハイブリダイズし得る核
酸分子(プローブ)と接触させることを包含する。核酸プローブは、例えば、全長のcDNA、
又はその一部、例えば、少なくとも7、15、30、60、100、250、又は500ヌクレオチドの長
さであり、ストリンジェントな条件下で本発明の内因性遺伝子、又は任意の誘導体DNA若
しくはRNAと特異的にハイブリダイズするために十分なオリゴヌクレオチドなどであって
よい。mRNAとプローブがハイブリダイズすることにより、問題の内因性遺伝子が発現され
ていることが示される。
【０１７１】
サンプル中の遺伝子発現のレベルを決定するための代替の方法は、例えば、RT-PCR(米
国特許第4,683,202号)、リガーゼ連鎖反応(Barany、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88巻:189〜
93頁、1991年)、自家持続配列複製法(Guatelliら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87巻:1874〜
78頁、1990年)、転写増殖系(Kwohら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86巻:1173〜77頁、1989年
)、Q-ベータレプリカーゼ(Lizardiら、Bio/Technology 6巻:1197頁、1988年)、ローリン
グサークル複製(米国特許第5,854,033号)、又は任意の他の核酸の増殖方法による、核酸
増殖のプロセス、その後、増殖された分子を当業者に周知の技術を用いて検出することを
包含する。
【０１７２】
多数の異なるPCR又はqPCRのプロトコールが当該分野で公知であり、かつ本明細書の下
に例示されており、かつ治療能力を決定するために、本明細書で企図される細胞能力アッ
セイを用いる使用について直接適用又は適合され得る。いくつかの状況下では、定量的PC
R(qPCR)(リアルタイムPCRとも称される)では、定量的測定だけでなく、時間及びコンタミ
ネーションの低減ももたらされるので、好ましい。いくつかの場合には、完全な遺伝子発
現プロファイリング技術の利用可能性は、新鮮な凍結組織及び特殊化された実験室設備が
必要なことに起因して限られており、それにより、そのような技術を臨床実践場面におい
て慣用的に用いることは難しくなる。本明細書で用いられる場合、「定量的PCR(又は「リ
アルタイムqPCR」)」とは、反応産物を繰り返しサンプリングする必要なしに行われる場
合、PCR増殖の進行の直接モニタリングを指す。定量的PCRでは、反応産物が生成され、シ
グナルがバックグラウンドレベルを超えた後だが、反応はプラトーに到達する前に追跡さ
れる場合、シグナル伝達機構(例えば、蛍光)によって反応産物をモニターし得る。蛍光の
検出可能な又は「閾値」レベルを実現するために必要なサイクル数は、PCRプロセスの開
始時の増殖可能な標的の濃度に直接応じて変動し、これにより、シグナル強度を測定する
ことによってサンプル中の標的核酸の量の測定をリアルタイムで得ることが可能になる。
【０１７３】
C.培養培地
種々の実施態様では、血球生成物を含む、細胞組成物の操作のための改善された培養培
地が企図される。この培養培地は、血球生成物プロセシングの間の有核細胞の回収を増大
することによって、血球生成物中の総有核細胞(TNC)カウントを増大する。いかなる特定
の理論に限定されることなく、本発明の培養培地は、有核細胞の溶解を低下させることに
よって血球生成物のTNCを増大し、それによって、本発明の培地を用いて製造された血球
生成物中の非有核細胞に対する有核細胞の比を増大する。改善された培養培地はまた、プ
ロセシングの間(凍結保存、解凍、再懸濁、培養、又は操作の間を含む)の血球生成物(1つ
以上の作用剤によってインビトロ又は生体外で解凍、及び/又は調節又は増殖させた血球
生成物中を含む)の細胞生存度を改善する。この細胞培養培地はまた、アポトーシス細胞
の膜を安定化することによって、血球生成物の安定性を増大し、それによって細胞溶解を
低下させ、細胞破片の凝集を妨げ、細胞過程を阻害し得る細胞内成分の放出を予防する。
この細胞培養培地はまた、本明細書で開示されているような1つ以上の調節剤により細胞
の生体外調節の有効性を改善する。一実施態様では、細胞培養培地は、多糖が補充されて
いる幹細胞を培養するために用いられるストック細胞培養培地を含む。いくつかの実施態
様では、細胞培養培地は、化学的に定義されたストック基礎培地、例えば、幹細胞の維持
、増殖及び/又は分化を支持するために適切な任意の定義された基礎培地、例えば、多糖
が補充されている、従来のヒト胚性幹細胞培地を含む。特定の実施態様では、培養培地は
、多糖類、ヒト血清アルブミン(HSA)、及び化学的に定義された培地を含む。
【０１７４】
いくつかの実施態様では、この培養培地は、凍結、解凍、再懸濁、プロセシング又は精
製、1つ以上の作用剤による調節、又は造血細胞、例えば、HSPCの増殖のうちの1つ以上に
適切である。特定の実施態様では、培養培地は、解凍、再懸濁、プロセシング又は精製、
調節、増殖及び対象に対する造血細胞の投与に適切である。さらなる実施態様では、この
培養培地は、造血細胞の解凍、再懸濁、プロセシング又は精製、調整、及び増殖に適切で
あり、かつ造血細胞は引き続き、対象への投与のために医薬として許容し得る細胞培養培
地で洗浄される。
【０１７５】
1.多糖
一実施態様では、細胞培養培地又は組成物は、1つ以上の低分子量多糖類を含む。「多
糖」とは、単糖類から構成される長鎖の糖類の任意の大きい分類を指す。この鎖は、未分
岐でも、分岐でもよく、単糖類は、1、2又は時にはより多くの種類であり得るので、多糖
類は種々の方法で分類され得る。特定の実施態様では、細胞培養培地及び組成物は、約1%
〜約20%の多糖、約1%〜約15%の多糖、約1%〜約10%の多糖、又は約5%〜約10%の多糖を含む
。特定の実施態様では、培養培地及び組成物は、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少な
くとも約4%、少なくとも約5%、少なくとも約6%、少なくとも約7%、少なくとも約8%、少な
くとも約9%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約13%、
少なくとも約14%少なくとも約15%、少なくとも約16%、少なくとも約17%、少なくとも約18
%、少なくとも約19%、又は少なくとも約20%の多糖を含んでもよい。
【０１７６】
いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、細胞培養培地中の多糖含量を増
大することは、解凍された後の細胞の膜を安定化し、アポトーシス細胞での細胞溶解を妨
げ、それによって血球生成物のTNCカウント及び造血幹細胞前駆細胞(hematopoietic stem
and progenitor cell)(HSPC)生存度を増大することが考えられる。特定の好ましい実施
態様では、培養培地又は組成物は、デキストラン及びデンプンからなる群より選択される
多糖を含む。
【０１７７】
a.デキストラン
種々の実施態様では、細胞培養培地又は組成物は、1つ以上の低分子量デキストランを
含む。デキストランは、デキストラン生体高分子の骨格単位に連結された側鎖1-3を有す
るα-D-1,6-グルコース-連結グルカンから構成される多糖類である。分岐の程度はおよそ
5%である。分枝はほぼ1-2グルコース単位長である。デキストランは、リゥコノストック-
メゼンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)B512Fによってスクロース含有培地の発酵
から得ることができる。デキストランは等張性であって、かつ室温で保管できる。
【０１７８】
低分子量デキストランの例示的な例としては、約1000Da(デキストラン-1)、約10,000Da
(デキストラン-10)、約20,000Da(デキストラン-20)、約30,000Da(デキストラン-30)、約4
0,000Da(デキストラン-40)、又は約50,000Da(デキストラン-50)の分子量を有するデキス
トランが挙げられる。
【０１７９】
特定の実施態様では、細胞培養培地又は組成物は、少なくとも1.0%、少なくとも2.0%、
少なくとも3.0%、少なくとも4.0%、少なくとも5.0%、少なくとも6.0%、少なくとも7.0%、
少なくとも8.0%、少なくとも9.0%、少なくとも10.0%、少なくとも11.0%、少なくとも12.0
%、少なくとも13.0%、少なくとも14.0%、少なくとも15.0%、少なくとも16.0%、少なくと
も17.0%、少なくとも18.0%、少なくとも19.0%、又は少なくとも20.0%のデキストランを含
む。特定の実施態様では、細胞培養培地又は組成物は、約1%〜約20%のデキストラン、約2
.5%〜約15%のデキストラン、約5%〜約12.5%のデキストラン、又は約5%〜約10%のデキスト
ランを含む。一実施態様では、デキストランは、デキストラン-1、デキストラン-10、デ
キストラン-20、デキストラン-30、デキストラン-40、又はデキストラン-50のうちの1つ
以上である。ある特定の実施態様では、このデキストランはデキストラン-40である。
【０１８０】
b.ヒドロキシエチルスターチ(HES)
種々の実施態様では、細胞培養培地又は組成物は、1つ以上の低分子量デンプンを含む
。「デンプン」とは、植物中の炭水化物の主要な貯蔵形態である白色の無味無臭の顆粒又
は粉末の複合糖質(C6H10O5)xである多糖を指す。特定の実施態様では、細胞培養培地は、
ヒドロキシエチルスターチ(HES)を含む。
【０１８１】
HESは、トウモロコシ又はソルガムのいずれかのろう様種からできているポリマー分子
の母体名であって、主にアミロペクチン(98%)から構成される。これは、アルカリ触媒の
存在下で、エチレンオキシドとアミロペクチンとの間の反応によって形成された、グリコ
ーゲンによく似ている高度に分岐した多糖である。分子量及びモル置換は、グルコース分
子上のC2、C3及びC6位でヒドロキシエチル基によるヒドロキシル基の置換の程度によって
調節され得る。C6に対するC2位の置換(C2:C6比)が大きいほど、半減期が大きい。
【０１８２】
数平均分子量(Mn)は、溶液中のポリマーの分子量の算術平均である。重量平均分子量(M
w)は、各々の数の分子の数の合計を全分子の総数で割ったものである。この重量は、溶液
中により大きいポリマーが存在する場合、一般にはより大きい。異なるHES生成物の分類
は、Mwと置換の程度との比を含む。
【０１８３】
HES生成物の例示的な実施例としては、限定するものではないが、ヘタスターチ(0.7度
の置換)、ヘキサスターチ(0.6度の置換)、ペンタスターチ(0.5度の置換)、及びテトラス
ターチ(0.4度の置換)が挙げられる。
【０１８４】
特定の実施態様では、細胞培養培地又は組成物は、約1.0%、少なくとも2.0%、少なくと
も3.0%、少なくとも4.0%、少なくとも5.0%、少なくとも6.0%、少なくとも7.0%、少なくと
も8.0%、少なくとも9.0%、少なくとも10.0%、少なくとも11.0%、少なくとも12.0%、少な
くとも13.0%、少なくとも14.0%、少なくとも15.0%、少なくとも16.0%、少なくとも17.0%
、少なくとも18.0%、少なくとも19.0%、又は少なくとも20.0%のHESを含む。特定の実施態
様では、HESは:ヘタスターチ、ヘキサスターチ、ペンタスターチ、及びテトラスターチか
らなる群より選択される。特定の培地処方物では、細胞培養培地は:ヘタスターチ、ヘキ
サスターチ、ペンタスターチ、及びテトラスターチからなる群より選択される1つ以上の
デンプンを含む。一実施態様では、細胞培養培地又は組成物は、約2.5%〜約12.5%のHES、
約2.5%〜約10%のHES、約5%〜約12.5%のHES、又は約5%〜約10%のHESを含む。
【０１８５】
1つの特定の実施態様では、細胞培養培地は、デキストラン及びHESの両方を、1.0%、少
なくとも2.0%、少なくとも3.0%、少なくとも4.0%、少なくとも5.0%、少なくとも6.0%、少
なくとも7.0%、少なくとも8.0%、少なくとも9.0%、少なくとも10.0%、少なくとも11.0%、
少なくとも12.0%、少なくとも13.0%、少なくとも14.0%、少なくとも15.0%、少なくとも16
.0%、少なくとも17.0%、少なくとも18.0%、少なくとも19.0%、又は少なくとも20.0%の総
デンプン濃度で含む。
【０１８６】
2.ヒト血清アルブミン(HSA)
ヒト血清アルブミン(HSA)は、66,437Daの分子量(アミノ酸組成に基づく)を有するヒト
血漿中の最も豊富なタンパク質である。市販の調製物は、種々の程度の翻訳後修飾及び遺
伝子改変を含み、分子量構成は主に66,437〜66,600Daの範囲である。
【０１８７】
種々の実施態様では、細胞培養培地又は組成物は、HSAを含む。特定の実施態様では、
細胞培養培地又は組成物は、約1.0%、約1.25%、約1.5%、約1.75%、約2.0%、約2.25%、約2
.5%、約2.75%、約3.0%、約3.25%、約3.5%、約3.75%、約4.0%、約4.25%、約4.5%、約4.75%
、約5.0%、約5.25%、約5.5%、約5.75%、約6.0%、約6.25%、約6.5%、約6.75%、約7.0%、約
7.25%、又は約7.5%のHSAを含む。
【０１８８】
別の実施態様では、細胞培養培地又は組成物は、約2.0%〜約7.5%、約2.5%〜約6%、又は
約4.0%〜約6%、又は約4%〜約5%のHSAを含む。
【０１８９】
3.化学的に定義された細胞培養培地
「化学的に定義された培地」とは、化学的成分の全てが公知である、ヒト又は動物の細
胞のインビトロ又は生体外の細胞培養に適切な増殖培地を指す。特定の実施態様では、化
学的に定義された培地とは、動物由来の成分を全く含まず、かつウシ胎仔血清、ウシ血清
アルブミン又はヒト血清アルブミンのいずれも含まない。なぜならこれらの生成物は、ウ
シ又はヒトの供給源由来であり、かつアルブミン及び脂質の複合混合物を含むからである
。しかし、特定の実施態様では、組成物は、化学的に定義された培地及び前述の種類の血
清又は追加の作用剤、例えば、サイトカイン、増殖因子、プロスタグランジン経路アゴニ
スト、及びグルココルチコイドのうちの1つ以上を含んでもよい。
【０１９０】
培養及び増殖及び/又はヒト造血細胞の維持のための規定のかつヒト化された培地は通
常は、塩類、ビタミン類、グルコースの供給源、ミネラル類及びアミノ酸類を含む。特定
の実施態様では、この定義された培地は、ヒト血清又は血清代替物が補充されてもよい。
血清代替物は、その目的のための市販の製品であってもよいし、又は血清アルブミンなど
のタンパク質、ビタミン類、塩類、ミネラル類、トランスフェリン又はトランスフェリン
代替物、及びインスリン又はインスリン代替物の処方された混合物であってもよい。この
血清代替物成分はまた、セレニウムが補充されてもよい。一実施態様では、培養培地は、
ヒト血清アルブミン、ビタミン類、抗酸化物質類、微量ミネラル類、特定の脂質、及びク
ローニングされた増殖因子が補充されている定義された培地を含む。
【０１９１】
特定の実施態様では、定義された培地とはまた、医薬として許容し得る細胞培養培地で
もある。このような組成物は、ヒト対象への投与に適切である。一般的に言って、本発明
の造血細胞の維持、増殖及び/又は健康を支持する任意の培地が、薬学的な細胞培養培地
としての使用に適切である。特定の実施態様では、医薬として許容し得る細胞培養培地は
、無血清培地又は化学的に定義された培地である。
【０１９２】
医薬として許容し得る細胞培養培地の1つの例示的な実施例としては、無水塩化カルシ
ウムCaCl3(158.695mg/L);硫酸銅CuSO4 5H2O(0.000654mg/L);硝酸第二鉄Fe(NO3)9H2O(0.07
51mg/L);硫酸第二鉄FeSO47H2O(0.0209mg/L);塩化カリウムKCl(306.969mg/L);塩化マグネ
シウムMgCl2(14.418mg/L);硫酸マグネシウムMgSO4(63.237mg/L);塩化ナトリウムNaCl(502
1.73mg/L);炭酸水素ナトリウムNaHCO4(1100mg/L);第一リン酸ナトリウムNaH2PO4H2O(93.9
64mg/L);第二リン酸ナトリウムNa2HPO4 7H2O(35.753mg/L);硫酸亜鉛ZnSO4 7H2O(0.217mg/
L);D-グルコース(デキストロース)(3836.3mg/L);フェノールレッド(8.127mg/L);HEPES(30
99.505mg/L);ヒポキサンチンNa(1.203mg/L);リノール酸(0.0211mg/L);DL-68-チオクト酸(
0.0528mg/L);プトレシンナトリウム2HCl(0.0407mg/L);プトレシン8亜セレン酸ナトリウム
(2.5×10-6mg/L);ピルビン酸ナトリウム(40.1885mg/L);アラニン(3.24mg/L);アルギニンH
Cl(116.255mg/L);アスパラギン(4.19mg/L);アスパラギン酸(3.347mg/L);システインH2O(9
.445mg/L);システイン2HCl(15.752mg/L);グルタミン酸(3.7グルタミン(293.55mg/L);グリ
シン(24.439mg/L);ヒスチジンHCl H2O(36.847mg/L);イソロイシン(79.921mg/L);ロイシン
(82.227mg/L);リジンHCl(118.937mg/L);メチオニン(23.679mg/L);フェニルアラニン(50.8
61mg/L);プロリン(12.564mg/L);セリン(34.214mg/L);トレオニン(74.408mg/L);トリプト
ファン(12.54mg/L);チロシン2Na+2H2O(64.086mg/L);バリン(73.606mg/L);ビオチン(0.001
76mg/L);D-パントテン酸カルシウム(3.127mg/L);塩化コリン(6.52mg/L);葉酸(3.334mg/L)
;i-イノシトール(9.904mg/L);ナイアシンアミド(3.079mg/L);ピリドキシンHCl(3.022mg/L
);リボフラビン(0.31mg/L);チアミンHCl(3.092mg/L);チミジン(0.183mg/L);及びビタミン
B12(0.512mg/L)が挙げられる。
【０１９３】
特定の実施態様での使用に適切な化学的に定義された細胞培養培地の例示的な例として
は、限定するものではないが、StemSpan-ACF、StemSpan-H3000、StemSpan-SFEM、Stemlin
e II、StemPro 34、StemXVivo、イスコフ改変ダルベッコ培地(Iscove's modified Dulbec
co's medium)(IMDM)、ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle medium)
(DMEM)、ロズウェルパーク記念研究所培地(RPMI) 1640培地、マッコイ5A培地、最小必須
培地α培地(minimum essential medium alpha medium)(α-MEM)、基礎培地イーグル(basa
l medium Eagle)(BME)、フィッシャー培地、培地199、F-12K栄養混合物培地(Kaighn改変
、F-12K)、及びX-vivo 20が挙げられる。
【０１９４】
サイトカイン及び/又は造血細胞増殖因子の例示的な例としては、限定するものではな
いが、flt3-リガンド(FLT3)、トロンボポイエチン(TPO)、幹細胞因子(SCF)、上皮細胞増
殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)、塩基性線維芽細胞増殖因子(b
FGF)、インターロイキン-3(IL3)、インターロイキン-6(IL6)、及びインターロイキン-9(I
L9)が挙げられる。
【０１９５】
D.組成物
種々の実施態様では、血球生成物、又は部分的に単離されるか若しくは精製された造血
細胞、及び血球生成物の操作のための改善された培養培地を含む組成物が企図される。組
成物の細胞は、細胞生存度が増大しており、かつ凍結/解凍の処理、及び1つ以上の作用剤
によるインビトロで又は生体外の調整又は増殖に耐え得る。この組成物はまた、安定性の
増大したアポトーシス細胞を含み、それによって細胞溶解を低下させ、細胞破片凝集を妨
げ、かつその後の細胞過程を阻害し得る細胞内成分の放出を防止する。
【０１９６】
特定の実施態様では、組成物は、血球生成物、又は単離された若しくは精製された造血
細胞の集団を含む。いくつかの実施態様では、この組成物は、凍結、解凍、再懸濁、プロ
セシング又は精製、1つ以上の作用剤での調整、又は増殖のうちの1つ以上に適切である。
特定の実施態様では、この組成物は、解凍、再懸濁、プロセシング又は精製、調整、増殖
及び対象への投与に適切である。さらなる実施態様では、この組成物は解凍、再懸濁、プ
ロセシング又は精製、調整、及び増殖に適切であり、かつ対象への投与のための医薬とし
て許容し得る細胞培養培地で洗浄される。
【０１９７】
特定の実施態様では、組成物は、血球生成物又はHLA型である造血細胞の集団を含み、
かつ移植について特定の患者に適合されてもよいし、又は部分的に適合されてもよい。
【０１９８】
最低限、造血細胞集団のHLA分類は、例えば、低い分解/分割の抗原レベルで6つのHLA遺
伝子座、HLA-A、-B、及び-DRについて行う。
【０１９９】
種々の実施態様では、血球生成物又は造血細胞の集団は、ハプロタイプの造血幹細胞又
は前駆細胞を含む。いくつかの実施態様では、治療組成物を含んでいる細胞の集団は、HL
A-A、HLA-B、HLA-C、及びHLA-DRB1に基づいてHLA分類される。特定の実施態様では、細胞
の集団は、HLA-DRB3/4/5、HLA-DQB1、及びDPB1からなる群に基づいてHLA分類される。い
くつかの実施態様では、治療組成物を含んでいる細胞の集団は、特定のヒト患者と適合さ
れる。いくつかの実施態様では、HLAハプロタイプの細胞の集団は、特定のヒト対象と6つ
のうち4つのHLAマッチを有する。HLA適合は、対立遺伝子又は抗原、及びそれらの組合せ
に基づいてもよい。いくつかの実施態様では、HLAハプロタイプの細胞の集団は、特定の
ヒト対象(治療組成物が投与される対象など)との部分的なミスマッチである。
【０２００】
1.血球生成物
特定の実施態様では、組成物は、血球生成物又はその一部を含んでもよい。適切な血球
生成物は、血液バンクから得てもよいし、又はドナー若しくは患者から直接得てもよい。
特定の実施態様では、ある組成物は、血球生成物の1つ以上の単位を含む。血球生成物の
適切な供給源としては、限定するものではないが、骨髄、臍帯、臍帯血、胎盤血、胎盤、
胎児血液、胎児肝臓、胎児脾臓、ウォートン・ジェリー(Wharton's jelly)、及び動員末
梢血が挙げられる。
【０２０１】
一実施態様では、血球生成物は臍帯血である。本明細書において用いる場合、「臍帯血
(cord blood)」、「全臍帯血(whole cord blood)」、「全臍帯血(whole umbilical cord 
blood)」、又は「臍帯血(umbilical cord blood)」という用語は、一般に、臍帯が早期に
クランプされない場合、新生児循環に戻る、新生児由来の比較的少量の血液(最大約180mL
まで)に関する。臍帯血は、HSPCが豊富であり、かつ当該分野で公知の技術によって回収
されて、後の使用のために保管される(例えば、このような方法論についての引用により
本明細書に組み込まれている、米国特許第7,147,626号及び同第7,131,958号を参照のこと
)。一実施態様では、全臍帯血は、赤血球及び/又は血漿を含まない。
【０２０２】
特定の実施態様では、血球生成物は、治療適用における使用のために十分な量の造血細
胞を必要とする。血球生成物中の造血細胞の量を増大することは、対象中で造血幹細胞前
駆細胞(hematopoietic stem and progenitor cell)を動員する工程を包含し得る。特定の
実施態様における使用を意図する血球生成物中の十分な量の造血幹細胞前駆細胞(hematop
oietic stem and progenitor cell)は、少なくとも約1×103個のHSPC、少なくとも約1×1
04個のHSPC、少なくとも約1×105個のHSPC、少なくとも約1×106個のHSPC、少なくとも約
1×107個のHSPC、少なくとも約1×108個のHSPC、少なくとも約1×109個のHSPC、少なくと
も約1×1010個のHSPC、少なくとも約1×1011個のHSPC、少なくとも約1×1012個のHSPC、
少なくとも約1×1013個のHSPC、少なくとも約1×1014個のHSPC、又は少なくとも約1×101
5個のHSPCを含む。
【０２０３】
「造血幹細胞動員」とは、骨髄又は造血幹細胞前駆細胞(hematopoietic stem and prog
enitor cell)を含んでいる別の組織から、幹細胞移植の前の、白血球除去療法の目的のた
めの末梢血循環への幹細胞の放出を指す。ドナーから回収した幹細胞の数を増大すること
によって、治療適用について利用可能な幹細胞の数が有意に改善され得る。造血性増殖因
子、例えば、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)又は化学療法剤は、動員を刺激するために
用いられる場合が多い。市販の幹細胞動員薬が存在し、かつ対象への移植のために十分な
量の造血幹細胞前駆細胞(hematopoietic stem and progenitor cell)を動員するためにG-
CSFと組み合わされて用いられ得る。例えば、G-CSF及びMozobil(商標)(Genzyme Corporat
ion)をドナーに投与して、移植に十分な数の造血細胞を回収してもよい。造血幹細胞前駆
細胞(hematopoietic stem and progenitor cell)を動員する他の方法は当業者に明白であ
ろう。
【０２０４】
2.造血細胞
種々の実施態様では、本明細書で意図する組成物は、造血細胞を含んでいる精製された
又は単離された細胞の集団を含む。本明細書において用いる場合、「単離された」という
用語は、その元の環境から取り出されている物質を指す。例えば、「単離された細胞の集
団」、「単離された細胞の供給源」、又は「単離されたHSPC」などは、本明細書において
用いる場合、1つ以上の細胞が、インビトロ又は生体外においてそれらの天然の細胞の環
境から、及び組織又は臓器の他の構成成分との結合から分離されていること、すなわち、
インビボで物質と有意に結合されていないことを指す。特定の実施態様では、組成物は、
造血幹細胞又は前駆細胞の集団を含む。
【０２０５】
特別な実施態様では、組成物は、自系/自家(「自己」)であるか、又は非自系(「非自己
」、例えば、同種異系、同系又は異種)細胞である細胞を含む。「自系」とは、本明細書
において用いる場合、同じ対象由来の細胞を指す。「同種異系」とは、本明細書において
用いる場合、比較する細胞とは遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。「同系」とは、本明
細書において用いる場合、比較する細胞と遺伝的に同一である、異なる対象の細胞を指す
。「異種」とは、本明細書において用いる場合、比較する細胞とは異なる種の細胞を指す
。好ましい実施態様では、本発明の細胞は同種異系のものである。
【０２０６】
種々の実施態様では、幹細胞の使用は、それらが、インビボで特定の生物学的ニッチに
投与された場合、適切な細胞種に分化する能力を有するので、好ましい。「幹細胞」とい
う用語は、(1)長期にわたって自己再生できるか、又は元の細胞と同一のコピーを少なく
とも1つ生成することができる、(2)単一細胞レベルで、複数の、またいくつかの例では唯
一の特殊化した細胞型に分化することができる、及び(3)インビボで組織の機能的再生を
することができる、未分化細胞である細胞を指す。本明細書において用いる場合、「前駆
体」又は「前駆細胞」という用語は、自己再生する能力及びより成熟した細胞に分化する
能力を有する細胞を指す。前駆細胞は、多能性幹細胞及び多分化能細胞と比較して能力が
低い。
【０２０７】
本明細書において用いる場合、「造血幹細胞造血前駆細胞(hematopoietic stem and pr
ogenitor cell)」又は「HSPC」という用語は、抗原マーカーであるCD34(CD34+)が存在す
ることによって特定され、したがって、CD34+細胞として特徴付けられる細胞、及びこの
ような細胞の集団を指す。特定の実施態様では、「HSPC」という用語は、抗原性マーカー
CD34の存在(CD34+)及び系列(Lin)マーカーがないことによって特定され、したがって、CD
34+/Lin(-)細胞として特徴付けられる細胞、並びにそのような細胞の集団を指す。CD34+
及び/又はLin(-)細胞を含んでいる細胞の集団はまた、造血前駆細胞も含むことが認識さ
れる。一実施態様では、組成物は、単離されたCD34+細胞の集団を含む。
【０２０８】
造血幹細胞は、骨髄細胞系列(例えば、単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、
好酸球、赤血球、巨核球/血小板、樹状細胞)、及びリンパ球系(例えば、T細胞、B細胞、N
K細胞)、並びに当該分野で公知のその他の血球を含む、生物体の全種類の血球を生じさせ
る、多分化能幹細胞である(Fei,R.ら、米国特許第5,635,387号;McGlaveら、米国特許第5,
460,964号;Simmons,P.ら、米国特許第5,677,136号;Tsukamotoら、米国特許第5,750,397号
;Schwartzら、米国特許第5,759,793号;DiGuistoら、米国特許第5,681,599号;Tsukamotoら
、米国特許第5,716,827号を参照のこと)。造血前駆細胞(HSC)は、生物体の寿命にわたっ
て成熟血球の全レパートリーが生じ得る方向付けられた造血前駆細胞(HPC)を生じさせる
。
【０２０９】
本明細書において用いる場合、「顆粒球」という用語は、白血球であって、それらの細
胞質中での顆粒の存在によって特徴付けられる白血球のカテゴリーを指す。顆粒球は、通
常3つのセグメントに分かれる、可変形状の核のために、多形核白血球(PMN又はPML)と呼
ばれる場合が多い。最も豊富な種類の顆粒級は、好中球顆粒球であるが、「顆粒球」とい
う用語は、好中球顆粒球、好酸球顆粒球、及び好塩基球顆粒球を包含する。
【０２１０】
特定の実施態様では、HPSCは、高度に精製されたHSPC集団(均質集団)として提供されて
も、又は0.01%〜約100%のHSPC(異質集団)を含む組成物として提供されてもよい。造血幹
細胞前駆細胞(hematopoietic stem and progenitor cell)を含んでいる細胞の集団として
は、骨髄細胞、臍帯血細胞、胎盤血細胞、動員末梢血細胞、造血幹細胞、又は造血前駆細
胞が挙げられる。特定の実施態様では、造血細胞の集団中のHSPCの数は、上記で考察され
るとおり、ドナー中の幹細胞及び前駆細胞を動員することによって増大され得る。
【０２１１】
一実施態様では、組成物は、HSPCの量を、部分的又は単一の臍帯血中に含むか、又は少
なくとも0.1×105細胞/体重1kg、少なくとも0.5×105細胞/体重1kg、少なくとも1×105細
胞/体重1kg、少なくとも5×105細胞/体重1kg、少なくとも10×105細胞/体重1kg、少なく
とも0.5×106細胞/体重1kg、少なくとも0.75×106細胞/体重1kg、少なくとも1×106細胞/
体重1kg、少なくとも1.25×106細胞/体重1kg、少なくとも1.5×106細胞/体重1kg、少なく
とも1.75×106細胞/体重1kg、少なくとも2×106細胞/体重1kg、少なくとも2.5×106細胞/
体重1kg、少なくとも3×106細胞/体重1kg、少なくとも4×106細胞/体重1kg、少なくとも5
×106細胞/体重1kg、少なくとも10×106細胞/体重1kg、少なくとも15×106細胞/体重1kg
、少なくとも20×106細胞/体重1kg、少なくとも25×106細胞/体重1kg、又は少なくとも30
×106細胞/体重1kgである。
【０２１２】
特定の実施態様では、組成物は、約1×103個のHSPC、少なくとも約1×104個のHSPC、少
なくとも約1×105個のHSPC、少なくとも約1×106個のHSPC、少なくとも約1×107個のHSPC
、少なくとも約1×108個のHSPC、少なくとも約1×109個のHSPC、少なくとも約1×1010個
のHSPC、少なくとも約1×1011個のHSPC、少なくとも約1×1012個のHSPC、少なくとも約1
×1013個のHSPC、少なくとも約1×1014個のHSPC、又は少なくとも約1×1015個のHSPCを含
む。一実施態様では、HSPCはCD34+である。
【０２１３】
特定の実施態様では、組成物は、約95%〜約100%のHSPCである細胞集団を含む。いくつ
かの実施態様では、この細胞の集団は、約0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%
、又は30%未満のHSPCを含む。細胞の集団はいくつかの実施態様では、約0.1%、0.5%、1%
、2%、5%、10%、15%、20%、25%、又は30%未満のHSPCを含む。他の実施態様では、この細
胞の集団は、約0.1%〜約1%、約1%〜約3%、約3%〜約5%、約10%〜約15%、約15%〜20%、約20
%〜25%、約25%〜30%、約30%〜35%、約35%〜40%、約40%〜45%、約45%〜50%、約60%〜70%、
約70%〜80%、約80%〜90%、約90%〜95%、又は約95%〜約100%のHSPCである。
【０２１４】
特定の実施態様では、この細胞の集団は、約0.1%〜約1%、約1%〜約3%、約3%〜約5%、約
10%〜約15%、約15%〜20%、約20%〜25%、約25%〜30%、約30%〜35%、約35%〜40%、約40%〜4
5%、約45%〜50%、約60%〜70%、約70%〜80%、約80%〜90%、約90%〜95%、又は約95%〜約100
%のHSPCである。
【０２１５】
種々の実施態様では、この細胞は、遺伝子改変された細胞ではない。他の実施態様では
、細胞は、例えば、タンパク質をコードする遺伝子配列を含むレトロウイルスベクター又
はレンチウイルスベクターなどのポリヌクレオチドの導入などによって遺伝子改変されて
いる。いくつかの実施態様では、細胞は、遺伝的欠損を補正するために遺伝子改変されて
おり、他の実施態様では、細胞は、野性型又は変異体タンパク質の産生を増大又は低下さ
せるように遺伝子改変されている。細胞中のタンパク質の発現を増大するために用いられ
るポリヌクレオチドは、細胞中で適切な発現を指向するためのポリヌクレオチド配列、及
びポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。細胞中のタンパク質
の発現を低下させるために用いられるポリヌクレオチドは、分解のための野性型ポリペプ
チド配列をコードするポリヌクレオチドを標的するポリヌクレオチド配列を含んでもよい
。
【０２１６】
3.増強された造血細胞
特定の実施態様では、組成物は、ヒト造血幹細胞前駆細胞(hematopoietic stem and pr
ogenitor cell)を含み、ここで、幹細胞は、生体外で、細胞の治療特性を増大し得る1つ
以上の作用剤と接触させた。一実施態様では、ヒト造血幹細胞前駆細胞(hematopoietic s
tem and progenitor cell)は、生体外で、細胞内のCXCR4遺伝子発現を増大する1つ以上の
作用剤と接触させた。1つの好ましい実施態様では、CXCR4の遺伝子発現は、接触させてい
ない造血幹細胞前駆細胞(hematopoietic stem and progenitor cell)又はビヒクル対照で
処理された細胞と比較して、処理されたヒト造血幹細胞中で、少なくとも約2、3、4、5、
10、15、20、又は30倍増大する。「増強された造血幹細胞前駆細胞(hematopoietic stem 
and progenitor cell)」又は「増強されたHSPC」とは、対照、ビヒクル又は未処理の細胞
と比較して、少なくとも約2、3、4、5、10、15、20、又は30倍、細胞中でCXCR4遺伝子発
現を増大する、1つ以上の作用剤を用いて生体外で処理されたHSPCを指す。
【０２１７】
本明細書において用いる場合、「接触させていない」、「未処理の」、又は「対照」の
細胞とは、対照の作用剤以外の作用剤で処理されていない、例えば、培養も、接触も又は
インキュベートもされていない細胞である。DMSO(対照の作用剤)と接触させるか、又は別
のビヒクル(10%のデキストラン、5%HSA、及び0.9%生理食塩水)と接触させた血球生成物又
は造血細胞が対照の細胞である。
【０２１８】
本発明のHSPCは、高レベルのCXCR4発現を示す遺伝子発現プロフィールによって特定さ
れ、かつ特徴付けられる。HSPCはまた、CXCR4遺伝子発現の増大、及びCXCR4ポリペプチド
の細胞表面発現の増大に基づいても特徴付けられ得る。特定の実施態様では、本発明のHS
PC中のCXCR4遺伝子発現は、接触させていない細胞中のCXCR4の発現と比較して、少なくと
も2、3、4、5、10、15、20、又は30倍増大する。特定の実施態様では、本発明のHSPC中の
CXCR4遺伝子発現は、接触させていない細胞中のCXCR4の発現と比較して、少なくとも30、
35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、又は100倍増大する。
【０２１９】
特定の実施態様では、HSPC中のCXCR4遺伝子発現は、未処理のHSPCと比較して、約30〜
約80倍増大する。さらなる実施態様では、HSPC中のCXCR4遺伝子発現は、未処理のHSPCと
比較して、約40〜約80倍、約50〜約80倍、約60〜約80倍、又は約50〜約70倍増大する。
【０２２０】
処理されたHSPC又はそのアリコートのCXCR4遺伝子発現又は遺伝子発現特徴は、細胞を1
つ以上の作用剤で処理した後に決定され得る。例えば、HSPCは、1つ以上の作用剤で、生
体外で処理され、作用剤を除去するために洗浄され、細胞のさらなるインキュベーション
なしで細胞の一部から遺伝子発現が分析され得る。
【０２２１】
特定の実施態様における使用のための遺伝子、例えば、「特徴(シグナチャー)遺伝子」
の例示的な群としては限定するものではないが、以下が挙げられる:YRPWモチーフ1と関連
するヘアリー/エンハンサー-オブ-スプリット(HEY1)、UL16結合タンパク質2(ULBP2)、ヒ
アルロナンシンターゼ1(HAS1)、GTP-結合タンパク質GEM(GEM)、レニン(REN)、コラーゲン
、I型、α1(COL1A1)、シクロオキシゲナーゼ2(COX-2)、アンジオポイエチン1(ANGPT1)、
ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド6(CXCL6)、プロミニン1(PROM1)、骨形成タンパク質4
(BMP4)、アンジオポイエチン2(ANGPT2)、κBキナーゼβ阻害薬(IKBKB)、血小板/内皮細胞
接着分子1(PECAM1)、免疫グロブリン様及びEGF様ドメイン1を有するチロシンキナーゼ(TI
E1)、アンフィレグリン(AREG)、カスパーゼ3(CASP3)、ジャグド(jagged)1(JAG1)、アリー
ル炭化水素受容体核輸送体(ARNT)、cAMP-反応因子モジュレーター(CREM)、結合組織増殖
因子(CTGF)、CD40リガンド(CD40L)、BCL2関連Xタンパク質(BAX)、肝細胞増殖因子(HGF)、
スーパーオキシドディスムターゼ2(SOD2)、血小板由来増殖因子B(PDGFB)、トロンボスポ
ンジン1(THBS1)、二重特異性タンパク質ホスファターゼ4(DUSP4)、システインリッチタン
パク質61(CYR61)、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド1(CXCL1)、内皮チロシンキナーゼ
(TEK)、CASP8及びFADD様アポトーシス調節因子(CFLAR)、インスリン増殖因子2(IGF2)、ケ
モカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4(CXCR4)、マトリックスメタロプロテアーゼ2(MMP2)、線
維芽細胞増殖因子2(FGF2)、プロスタグランジン-エンドペルオキシドシンターゼ2(PTGS2)
、RAS関連C3ボツリヌス基質2(RAC2)、血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)、核受容体サブ
ファミリー4、A群、メンバー2(NR4A2)、核受容体サブファミリー4、A群、メンバー3(NR4A
3)、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)、トランスフォーミング増殖因子β1(TGFB1)、マトリ
ックスメタロプロテアーゼ9(MMP9)、CD40抗原(CD40)、CD44抗原(CD44)、高移動度群ボッ
クス1(HMGB1)、窒素酸化物シンターゼ3(NOS3)、キナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)、イン
テグリンβ1(ITGB1)、カテニン(カドヘリン関連タンパク質)、β1(CTNNB1)、コロニー刺
激因子3(CSF3)、インターロイキン8(IL8)、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ
受容体(PLAUR)、B細胞CLL/リンパ腫2(BCL2)、骨形成タンパク質2(BMP2)、コロニー刺激因
子1(CSF1)、v-aktマウス胸腺腫ウイルス発現遺伝子相同体1(AKT1)、血管内皮細胞増殖因
子A(VEGFA)、細胞間接着分子1(ICAM1)、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド3(CXCL3)、
カスパーゼ8(CASP8)、CD34抗原(CD34)、インターロイキン1A(IL1A)、CD47抗原(CD47)、ケ
モカイン(C-Cモチーフ)リガンド7(CCL7)、低酸素誘導性因子1A(HIF1A)、EDN1(エンドセリ
ン1)、スフィンゴシン-1-ホスフェート受容体1(S1PR1)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体
1(CCR1)、SMADファミリーメンバー4(SMAD4)、fms関連チロシンキナーゼ1(FLT1)、CD151抗
原(CD151)、胎盤増殖因子(PGF)、B細胞中のκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核
因子1(NFKB1)、SMADファミリーメンバー2(SMAD2)、CXCケモカイン受容体7(CXCR7)、トラ
ンスフォーミング増殖因子β3(TGFB3)、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド5(CXCL5)、
サイクリンD1(CCND1)、ヘパリン-結合EGF様増殖因子(HBEGF)、核受容体サブファミリー3
、C群、メンバー1(NR3C1)、腫瘍壊死因子(TNF)、インテグリンαL(ITGAL)、CXCケモカイ
ン受容体2(CXCR2)、転写のシグナル伝達物質及び活性化因子1(STAT1)、インテグリンα4(
ITGA4)、白血病阻害性因子(LIF)、RAS p21タンパク質活性化因子1(RASA1)、カドヘリン5(
CDH5)、エフリンB2(EFNB2)、Gプロテインシグナル伝達の調節因子16(RGS16)、ケモカイン
(C-X-Cモチーフ)リガンド2(CXCL2)、インテグリンα5(ITGA5)、ケモカイン(C-X-Cモチー
フ)リガンド12(CXCL12)、メタロプロテイナーゼの組織インヒビター1(TIMP1)、Fos関連抗
原2(FOSL2)、インテグリンβ2(ITGB2)、及びメタロプロテイナーゼの組織インヒビター2(
TIMP2)。
【０２２２】
特定の実施態様における使用に適切な特徴遺伝子の別の例示的な群としては、限定する
ものではないが:YRPWモチーフ1と関連するヘアリー/エンハンサー-オブ-スプリット(HEY1
)、GTP-結合タンパク質GEM(GEM)、二重特異性タンパク質ホスファターゼ4(DUSP4)、アン
フィレグリン(AREG)、核受容体関連1ンパク質(NR4A2)、レニン(REN)、cAMP-反応因子モジ
ュレーター(CREM)、コラーゲン、I型、α1(COL1A1)、Fos関連抗原2(FOSL2)、及びUL16結
合タンパク質2(ULBP2)が挙げられる。
【０２２３】
特定の実施態様における使用に適切な特徴遺伝子の別の例示的な群としては、限定する
ものではないが:ヒアルロナンシンターゼ1(HAS1)、GTP-結合タンパク質GEM(GEM)、二重特
異性タンパク質ホスファターゼ4(DUSP4)、アンフィレグリン(AREG)、核受容体関連1タン
パク質(NR4A2)、レニン(REN)、cAMP-反応因子モジュレーター(CREM)、コラーゲン、I型、
α1(COL1A1)、Fos関連抗原2(FOSL2)、及びCXCケモカイン受容体4(CXCR4)が挙げられる。
【０２２４】
特徴遺伝子の遺伝子のさらなる例示的な群としては、限定するものではないが:CREM、G
EM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及びULBP2が挙げられる。
【０２２５】
1つ以上の作用剤と接触され、かつ増強された治療特性を有しているヒトHSPCはさらに
、細胞内cAMPシグナル伝達のレベルの増大(例えば、CREBリン酸化反応、又は生化学的ア
ッセイによって決定される);遺伝子発現アッセイ、例えば、マイクロアレイで決定される
、PGE2R2/R4細胞シグナル伝達経路で示される遺伝子(例えば、CREM)、並びに幹細胞及び
前駆細胞のホーミング及び生着を増大する遺伝子(例えば、CXCR4)の上方制御を示す遺伝
子発現特徴;細胞生存度アッセイ、例えば、7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)染色で決
定して、幹細胞及び前駆細胞の生存度において測定可能な低下がないこと;並びに/又は、
例えば、インビトロのコロニー形成単位(CFU-C)アッセイで決定して、幹細胞が自己再生
する能力の増大を含む。
【０２２６】
E.作用剤(Agent)
種々の実施態様では、組成物は、血球生成物又は造血幹細胞若しくは前駆細胞(細胞の1
つ以上の治療特性を増強する1つ以上の作用剤と接触させるか、又はそれで処理した)を含
む。任意の特定の理論に束縛されることは望まないが、移植のための造血細胞を調製する
ための本明細書のいずれかで開示さている組成物及び方法は、造血細胞の短時間処理をさ
らに含むことが考えられる。多糖、及び場合によりHSAを含んでいる培地中で凍結される
か、解凍されるか、再構成されるか又は再懸濁された造血細胞は、それら細胞を1つ以上
の作用剤で処理して、移植前にそれらの治療特性を増大することが可能であるように、細
胞生存度を安定化する。
【０２２７】
一実施態様では、凍結保存された細胞集団は、本明細書で企図される培地中で解凍され
、再懸濁され、それによってこの造血細胞集団は、作用剤と細胞とを接触させること、又
は一緒に培養することによって調節される。この細胞は、多糖を含んでいる本発明の細胞
培養培地中で解凍されても、再懸濁されても、又は調節されてもよい。本明細書において
用いる場合、「作用剤(agent)」とは、1つ以上の遺伝子の遺伝子発現を増大し得る化合物
又は分子であって、その作用剤で処理された造血細胞の治療特性の増大を示したものを指
す。特別な作用剤としては、例えば、プロスタグランジン経路を刺激し得る化合物、例え
ば、cAMPアナログ又はエンハンサー、Gα-s活性化因子、及びプロスタグランジン経路ア
ゴニストが挙げられる。造血細胞は、特定の実施態様では、細胞とプロスタグランジン経
路を刺激する1つ以上の作用剤とを接触させる前、及び/又は後、又はそれに加えて、或い
は、造血細胞とプロスタグランジン経路を刺激する1つ以上の作用剤とを接触させる代わ
りに、1つ以上のサイトカイン、増殖因子、及び/又はグルココルチコイドで処理しても、
培養しても、又は接触させてもよい。
【０２２８】
造血細胞は、細胞の治療特性を増大するために十分な条件下で処理されてもよい。本明
細書において用いる場合、「十分な条件」、又は「十分な条件下」という用語は、1つ以
上の作用剤を用いて造血細胞を処理して、細胞の治療特性の増大を示す1つ以上の遺伝子
の遺伝子発現を増大するための条件を指す。条件としては限定するものではないが、細胞
の供給源、細胞を処理するために用いられる作用剤、及び作用剤の濃度、細胞がその作用
剤に曝される時間、並びに処理の温度が挙げられる。本明細書で企図される1つ以上の作
用剤との接触によって増大する治療特性としては、限定するものではないが、生着、再構
成、ホーミング、生存、及び増殖が挙げられる。
【０２２９】
特定の実施態様では、組成物は、1つ以上の作用剤を、各々の最終濃度が約1μM〜約100
μMで含む。特定の実施態様では、組成物は、1つ以上の作用剤を、各々の最終濃度が約1
×10-14M〜約1×10-3M、約1×10-13M〜約1×10-4M、約1×10-12M〜約1×10-5M、約1×10-
11M〜約1×10-4M、約1×10-11M〜約1×10-5M、約1×10-10M〜約1×10-4M、約1×10-10M〜
約1×10-5M、約1×10-9M〜約1×10-4M、約1×10-9M〜約1×10-5M、約1×10-8M〜約1×10-
4M、約1×10-7M〜約1×10-4M、約1×10-6M〜約1×10-4Mで、又は任意の介在する範囲の最
終濃度で含む。
【０２３０】
別の特定の実施態様では、組成物は、1つ以上の作用剤を用いて、各々の最終濃度が約1
×10-14M、約1×10-13M、約1×10-12M、約1×10-10M、約1×10-9M、約1×10-8M、約1×10
-7M〜約1×10-6M、約1×10-5M、約1×10-4M、約1×10-3Mで、又は任意の介在する最終濃
度で処理されている血球生成物又は造血細胞を含む。1つ以上の作用剤を含む処理では、
その作用剤は、互いに異なる濃度であっても、又は同じ濃度であってもよい。
【０２３１】
特定の実施態様では、組成物は、間欠的に、偶発的に、又は連続して、1つ以上の作用
剤と、同じ容器内で接触させる(例えば、一定期間の間、細胞の集団と1つの薬物とを接触
させること、培養培地を交換すること及び/又は細胞の集団を洗浄すること、次いで同じ
所定の期間、又は異なる所定の期間にわたって、同じ又は異なる組合せの薬剤によって、
そのサイクルを繰り返すこと)造血細胞を含む。
【０２３２】
1.プロスタグランジン経路アゴニスト
本明細書において用いる場合、「プロスタグランジン経路アゴニスト」という用語は、
プロスタグランジン細胞シグナル伝達経路を刺激する作用剤を指し、この作用剤としては
、細胞中で、PGE2R2及び/又はPGE2R4細胞シグナル伝達経路を刺激する作用剤、並びにCXC
R4遺伝子発現を増大する作用剤が挙げられる。本発明の細胞の調製における使用に適切な
プロスタグランジン経路アゴニストの実例としては、限定するものではないが、PGE2、dm
PGE2、15(S)-15-メチルPGE2、20-エチルPGE2、8-イソ-16-シクロヘキシル-テトラノルPGE
2、及びPGE2アナログが挙げられる。特定の実施態様では、PGE2R2及びPGE2R4アゴニスト
並びにそれらのアナログが特に興味深いものであり、いくつかの実施態様では、その作用
剤は、優先的にPGE2 EP2又はPGE2 EP4受容体に結合し、かつ活性化する。
【０２３３】
本明細書において用いる場合「プロスタグランジンE2」又は「PGE2」という用語は、限
定するものではないが、任意の天然に存在するか又は化学的に合成されたPGE2分子、並び
にその「アナログ」を包含する。本明細書において用いる場合、「アナログ」という用語
は別の化学物質と類似の化学的分子に関し、例えば、PGE2は、構造及び機能として、単一
のエレメント又は基だけ構造的に異なる場合が多いが、親の化合物と同じ機能を保持して
いる場合、2つ以上の基(例えば、2、3、又は4つの基)の改変によって異なってもよい。こ
のような改変は、当業者には慣用的であり、これには、例えば、追加又は置換された化学
部分、例えば、エステル又は酸のアミド、保護基、例えば、ベンジル基(アルコール又は
チオールの)、及びtert-ブトキシルカルボニル基(アミンの)が挙げられる。また、アルキ
ル側鎖、例えば、アルキル置換(例えば、メチル、ジメチル、エチル、など)に対する修飾
、飽和又は不飽和の側鎖のレベルに対する修飾、及び置換されたフェニル及びフェノキシ
などの修飾された基の付加も挙げられる。アナログとしてはまた、コンジュゲート、例え
ば、ビオチン又はアビジン部分、酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼなどが挙げ
られ、これは、放射性標識部分、生物発光部分、化学発光部分、又は蛍光部分を含む。ま
た、本明細書に記載される作用剤に部分を追加して、それらの薬物動態学的特性を変更し
てもよく、例えば、他の所望の特性のうちでも、インビトロ若しくは生体外における半減
期を増大しても、又はそれらの細胞浸透特性を増大してもよい。また、薬剤の多数の所望
の質(例えば、溶解度、バイオアベイラビリティ、製造など)を高めることが公知のプロド
ラッグも含まれる(例えば、このようなアゴニストの開示については、引用により組み込
まれている、例示的なEPアゴニストプロドラッグについてのWO/2006/047476を参照のこと
)。
【０２３４】
PGE2「アナログ」の実例としては、限定するものではないが、16,16-ジメチルPGE2(「d
mPGE2」)、16,16-ジメチルPGE2 p-(p-アセトアミドベンズアミド)フェニルエステル、11-
デオキシ-16,16-ジメチルPGE2、9-デオキシ-9-メチレン-16,16-ジメチルPGE2、9-デオキ
シ-9-メチレンPGE2、9-ケトフルプロステノール、5-トランスPGE2、17-フェニル-ω-トリ
ノルPGE2、PGE2セリノールアミド、PGE2メチルエステル、16-フェニルテトラノルPGE2、1
5(S)-15-メチルPGE2、15(R)-15-メチルPGE2、8-イソ-15-ケトPGE2、8-イソPGE2イソプロ
ピルエステル、8-イソ-16-シクロヘキシル-テトラノルPGE2、20-ヒドロキシPGE2、20-エ
チルPGE2、11-デオキシPGE1、ノクロプロスト、スルプロストン、ブタプロスト、15-ケト
PGE2、及び19(R)ヒドロキシPGE2が挙げられる。また、9位置で、ハロゲンで置換されてい
るPGE2と同様の構造を有するPGアナログ又は誘導体(例えば、その全体が引用により本明
細書中に組み込まれているWO2001/12596を参照のこと)、並びに2-デカルボキシ-2-ホスフ
ィニコプロスタグランジン誘導体、例えば、その全体が引用により本明細書中に組み込ま
れている米国特許仮出願第2006/0247214号に記載されるもの)も挙げられる。
【０２３５】
PGE2R2(EP2)及びPGE2R4(EP4)細胞シグナル伝達経路の刺激/活性化は、細胞の生着を増
大し、細胞生存度を維持し、かつホーミング及び増殖を増大する、HSPC中の生理学的応答
を強調すると考えられる。したがって、一実施態様では、PGE2R2及びPGE2R4受容体に結合
して刺激する「非PGE2-ベースのリガンド」(すなわち、PGE2R2/PGE2R4アゴニスト)が、本
発明の方法における使用について企図される。
【０２３６】
非-PGE2-ベースのEP2受容体アゴニストの実例としては、CAY10399、ONO_8815Ly、ONO-A
E1-259、CP-533,536、並びにWO 2007/071456に開示されているカルバゾール及びフルオレ
ンが挙げられる。
【０２３７】
非PGE2ベースのEP4アゴニストの実例としては、ONO-4819、APS-999 Na、AH23848、ONO-
AE1-329、並びにWO/2000/038663;米国特許第6,747,037;及び米国特許第6,610,719に開示
されている他の非PGE2ベースのEP4アゴニストが挙げられる。
【０２３８】
PGE2 EP4受容体に選択的な作用剤は、PGE2 EP4受容体に優先的に結合して、活性化する
。このような作用剤は、任意の他の3つのEP受容体、すなわち、EP1、EP2及びEP3について
よりもEP4受容体に高い親和性を有する。PGE EP4受容体に選択的に結合する作用剤として
は、限定するものではないが: 5-[(1E,3R)-4,4-ジフルオロ-3-ヒドロキシ-4-フェニル-1-
ブテン-1-イル]-1-[6-(2H-テトラゾール-5R-イル)ヘキシル]-2-ピロリジノン;2-[3-[(1R,
2S,3R)-3-ヒドロキシ-2-[(E,3S)-3-ヒドロキシ-5-[2-(メトキシメチル)フェニル]ペンタ-
1-エニル]-5-オキソシクロペンチル]スルファニルプロピルスルファニル]酢酸;メチル4-[
2-[(1R,2R,3R)-3-ヒドロキシ-2-[(E,3S)-3-ヒドロキシ-4-[3-(メトキシメチル)フェニル]
ブタ-1-エニル]-5-オキソシクロペンチル]エチルスルファニル]ブタノエート;16-(3-メト
キシメチル)フェニル-ro-テトラノル-5-チアPGE;5-{3-[(2S)-2-{(3R)-3-ヒドロキシ-4-[3
-(トリフルオロメチル)フェニル]ブチル}-5-オキソピロリジン-1-イル]プロピル]チオフ
ェン-2-カルボキシレート;[4'-[3-ブチル-5-オキソ-1-(2-トリフルオロメチル-フェニル)
-1,5-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾール-4-イルメチル]-ビフェニル-2-スルホン酸(3-メチル
-チオフェン-2-カルボニル)-アミド];及び((Z)-7-{(1R,4S,5R)-5-[(E)-5-(3-クロロ-ベン
ゾ[b]チオフェン-2-イル)-3-ヒドロキシ-ペンタ-1-エニル]-4-ヒドロキシ-3,3-ジメチル-
2-オキソ-シクロペンチル}-ヘプタ-5-エン酸)、及び任意のそれらの作用剤の医薬として
許容し得る塩からなる群より選択される作用剤が挙げられる。
【０２３９】
特定の実施態様では、プロスタグランジン経路アゴニストは、PGE2、dmPGE2、15(S)-15
-メチルPGE2、20-エチルPGE2、又は8-イソ-16-シクロヘキシル-テトラノルPGE2である。
【０２４０】
2. cAMPエンハンサー
「サイクリックAMP(cAMP)エンハンサー」とは、作用剤なし、又は対照の分子/組成物と
比較した場合、細胞中でより大量のcAMP、細胞中でより大量のcAMP活性、又はcAMP関連シ
グナル伝達経路の任意の他の関連の成分、又はcAMPシグナル伝達経路の測定可能な下流の
生理学的応答若しくは効果を生じさせるか、又は引き起こす分子を指す。
【０２４１】
cAMPエンハンサーの実例としては、限定するものではないが、ホルボールエステル、フ
ォルスコリン、スクラレリン、8-ブロモ-cAMP、コレラ毒素(CTx)、アミノフィリン、2,4
ジニトロフェノール(DNP)、ノルエピネフリン、エピネフリン、イソプロテレノール、イ
ソブチルメチルキサンチン(IBMX)、カフェイン、テオフィリン(ジメチルキサンチン)、ド
ーパミン、ロリプラム、イロプロスト、プロスタグランジンE1、プロスタグランジンE2、
脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド(PACAP)、及び血管作動性腸管ポリペ
プチド(VIP)が当該分野で公知のもののうちでも挙げられる。cAMPエンハンサーの他の例
としては、とりわけ、cAMP及びcAMPのアナログ、例えば、sp-5,6-DCl-BIMPS(BIMPS)及び
ジブチリルcAMP(dbcAMP)が挙げられる。
【０２４２】
3. Gα-s活性化因子
「Gα-s活性化因子又は活性化剤」又は「Gプロテインα-s活性化剤又は活性化剤」とし
ては、刺激性Gプロテイン(「Gα-s」)又はGα-sの改変体のαサブユニットを活性化し得
る任意の分子が挙げられる。
【０２４３】
Gα-s活性化因子の実例としては、PGE2並びにそれらのアゴニスト及び誘導体、並びに
コレラ毒素が挙げられる。
【０２４４】
4.グルココルチコイド
本発明の方法における使用に適したグルココルチコイド及びグルココルチコイド受容体
アゴニストの実例としては、限定するものではないが、メドリソン、アルクロメタゾン、
アルクロメタゾンジプロピオネート、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベクロメタゾンジ
プロピオネート、ベタメタゾン、ベタメタゾンベンゾエート、ベタメタゾンバレレート、
ブデソニド、シクレソニド、クロベタゾール、クロベタゾールブチレート、クロベタゾー
ルプロピオネート、クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチゾール、
コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコルト、デソニド、デソキシメタゾン、デスオキ
シコルトン、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフロラゾンジアセ
テート、ジフルコルトロン、ジフルコルトロンバレレート、ジフルオロコルトロン、ジフ
ルプレドネート、フルクロロロン、フルクロロロンアセトニド、フルドロキシコルチド、
フルメタゾン、フルメタゾン、フルメタゾンピバレート、フルニソリド、フルニソリド半
水和物、フルオシノロン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルチン
、フルオコリチンブチル、フルオコルトロン、フルオロコルチゾン、フルオロメトロン、
フルペロロン、フルプレドニデン、フルプレドニデンアセテート、フルプレドニゾロン、
フルチカゾン、フルチカゾンプロピオネート、ホルモコルタール、ハルシノニド、ハロメ
タゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンアセテート、ヒドロコルチゾンアセポネー
ト、ヒドロコルチゾンブテプレート、ヒドロコルチゾンブチレート、ロテプレドノール、
メプレドニゾン、6a-メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾ
ロンアセテート、メチルプレドニゾロンアセポネート、モメタゾン、モメタゾンフロエー
ト、モメタゾンフロエート一水和物、パラメタゾン、プレドニカルバート、プレドニゾロ
ン、プレドニゾン、プレドニリデン、リメキソロン、チキソコルトール、トリアムシノロ
ン、トリアムシノロンアセトニド及びウロベタゾール、並びにそれらの組合せが挙げられ
る。
【０２４５】
特定の実施態様では、このグルココルチコイドは、メドリゾン、ヒドロコルチゾン、ト
リアムシノロン、アルクロメタゾン、又はデキサメタゾンを含む。さらに具体的な実施態
様では、グルココルチコイドはメドリゾンである。
【０２４６】
F.造血細胞調製方法
本明細書で企図される方法は、移植のための血球生成物及び/又は造血細胞の改善され
た調製を提供する。本発明の培養培地はまた、インビトロ及びインビボの研究などの使用
のために細胞を調製するのに用途を見出し得る。本発明のいくつかの態様では、細胞は、
新鮮な又は凍結した細胞(例えば造血細胞)の集団と、本発明の培地とを接触させることに
よって、本明細書に開示されている使用のために調製される。このような接触としては、
限定するものではないが、細胞プロセシング活動、例えば、細胞を洗浄すること、凍結保
存された細胞を解凍すること、細胞を生体外で1つ以上の調節剤(modulating agent)(例え
ばプロスタグランジン経路アゴニスト)で調節すること、培養物中で細胞を維持する又は
増殖させること、細胞を単離すること、又は細胞分化を誘導することが挙げられる。
【０２４７】
特定の実施態様では、この方法は、血球生成物又は造血細胞の凍結保存及び解凍のいず
れか又は両方、並びに本明細書で企図される培養培地中に解凍された細胞を移すことを包
含する。別の実施態様では、凍結保存された造血幹細胞は、本発明の培地中で解凍される
。さらに別の実施態様では、造血細胞は、細胞の凍結保存の前に本発明の培養培地と接触
させる。造血細胞は、以前に凍結保存されたか、又は凍結保存されていない(新鮮な)血球
生成物の凍結保存の前、又は解凍の後のいずれに、単離されても、調節されても、及び/
又は増殖させてもよい。いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、培養培地
は、新鮮又は凍結した血球生成物を、再懸濁、プロセシング、単離、調節、洗浄及び/又
は増殖させることに有用であると考えられる。一実施態様では、培養培地は、細胞生存度
を改善し、細胞溶解を低下させ、かつ新鮮な血球生成物の生物学的活性及び治療特性を増
大する。したがって、凍結保存された又は解凍された細胞又は新鮮な細胞は、本明細書で
企図される培養培地中でさらに単離されても、調節されても、又は増殖させてもよい。
【０２４８】
一実施態様では、移植用の造血細胞集団を安定化する方法が提供される。ある特定の実
施態様では、この方法は、凍結保存された血球生成物又は造血細胞の集団を解凍すること
、及び本明細書で企図される培養培地中に移すことを包含する。別の実施態様では、造血
細胞の集団を移すことは、省略され、細胞は本発明の培地中で直接解凍される。安定化さ
れた細胞集団は、対照の溶液(例えば、10%のデキストラン、5%HSA、及び0.9%のNaCl、又
は定義された培養培地単独)に移された解凍された対照の細胞集団と比較して、細胞溶解
が低下し、及びCD34+細胞生存度が増大している。
【０２４９】
ある特定の実施態様では、移植用の細胞の集団中で造血細胞溶解を低下させる方法が提
供される。ある特定の実施態様では、この方法は、凍結保存された血球生成物又は造血細
胞の集団を解凍すること、及び本明細書で企図される培養培地中に移すことを包含する。
いくつかの実施態様では、このような方法は、本発明の培地に血球生成物又は造血細胞の
集団を移すことを省き、代わりに、保存された血球生成物又は造血細胞を直接本発明の培
地中で解凍することを包含する。これらの実施態様では、溶解は、対照の溶液に移された
、解凍された対照の細胞集団と比較して、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約2倍、
約3倍、又は約5倍低下する。
【０２５０】
一実施態様では、移植用の細胞の集団中で造血細胞生存度を増大する方法が提供される
。ある特定の実施態様では、この方法は、凍結保存された血球生成物又は造血細胞の集団
を解凍すること、及び本明細書において企図される培養培地中にそれを移すことを包含す
る。或いは、凍結保存された血球生成物又は造血細胞の集団は、本発明の培地中で直接解
凍されてもよい。これらの実施態様では、CD34+細胞生存度は、対照溶液に移された、解
凍された対照の細胞集団と比較して、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約2倍、約3
倍、又は約5倍増大する。
【０２５１】
ある特定の実施態様では、細胞のあるサンプルからの総有核細胞(total nucleated cel
l)(TNC)の回収を増大する方法が提供される。本明細書において用いる場合、「総有核細
胞カウントを増大する(increasing total nucleated cell count)、又は「TNC回収を増大
する」という言及は、対照の培地を用いる有核細胞の回収に対して、本発明の培地を用い
て回収された有核細胞の数の任意の測定可能な増大を意味するものとする。例えば、本発
明の培地によって、対照の培地を用いてサンプルから回収された非有核細胞に対するTNC
の比と比較して、サンプル由来の非有核細胞に対するTNCの比が高い回収が可能になるTNC
の増大が観察される。
【０２５２】
ある特定の実施態様では、この方法は、凍結保存された血球生成物又は造血細胞の集団
を解凍すること、及び本明細書において企図される培養培地に移すことを包含する。或い
は、この方法は、凍結保存された血球生成物又は造血細胞の集団を本発明の培地中に移す
ことを省いてもよく、代わりに凍結保存された血球生成物又は造血細胞の集団を直接本発
明の培地中で解凍してもよい。これらの実施態様では、TNCは、対照の溶液に移された、
解凍された対照の細胞集団と比較して、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約2倍、約
3倍、又は約5倍増大する。
【０２５３】
1.凍結保存
一実施態様では、血球生成物又は造血細胞の集団は、1つ以上のバッグ(又はユニット)
中で分裂されて凍結されてもよい。別の実施態様では、2つ以上の細胞集団がプールされ
て、別のアリコートに分けられ、そして各々のアリコートが凍結され得る。本明細書にお
いて用いる場合、「凍結した/凍結する」及び「凍結保存された/凍結保存する」という用
語は、互換的に用いられる。特定の実施態様では、凍結保存は、細胞を生存可能な形態で
凍結する公知の方法を包含する。凍結保存は、細胞膜に対する浸透圧効果、細胞の脱水、
溶質濃度、及び氷晶形成によって細胞損傷を生じさせる。氷が細胞の外側で形成されるの
で、利用可能な水は、溶液から取り除かれて、細胞から引き出され、これによって浸透圧
脱水及び溶質濃度の上昇が生じ、これが最終的に細胞を破壊し得る。考察については、Ma
zur,P.,1977,Cryobiology 14:251〜272を参照のこと。
【０２５４】
これらの損傷効果は、凍結保存剤、例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)、グリセロー
ル、ポリビニルピロリジン、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、i-エリトリ
トール、D-リビトール、D-マンニトール、D-ソルビトール、i-イノシトール、D-ラクトー
ス、塩化コリン、アミノ酸類、メタノール、アセトアミド、グリセロールモノアセテート
、及び無機塩類の使用、(b)凍結速度の制御、並びに(c)分解反応を最小限にするのに十分
低い温度での貯蔵によって低減され得る。
【０２５５】
ある好ましい実施態様では、低濃度では細胞に非毒性である液体、DMSOを用いる。低分
子で、DMSOは細胞に自由に細胞に浸透し、水と組み合わさって、その凍結性を改変し、氷
の形成による損傷を防ぐことによって、細胞内オルガネラを保護する。血漿(例えば、20
〜25%の濃度まで)又は血漿代用剤(Plasmalyte)の添加によって、DMSOの防御効果が増強さ
れ得る。DMSOの添加後、細胞は、凍結するまで0℃で保持されなければならない。なぜな
ら、約1%のDMSO濃度は、4℃超の温度では毒性であるからである。
【０２５６】
制御された緩徐な冷却速度を用いて、凍結誘導された細胞損傷を低減することができる
。異なる凍結保存剤は、異なる最適冷却速度を有する。その冷却手順は、例えば、プログ
ラム可能な凍結装置又はメタノール浴手順の使用によって行ってもよい。
【０２５７】
完全に凍結した後、血球生成物又は造血細胞を、長期極低温保管容器にすばやく移して
もよい。一実施態様では、サンプルは、液体窒素(-196℃)又はその蒸気(-165℃)中で極低
温で保管してもよい。このような保管は、極めて低い真空であり、かつ内部が超絶縁であ
る大型のThermos容器に似ており、その結果熱の漏出及び窒素の損失が絶対最小に保持さ
れている、極めて有効な液体窒素冷蔵庫の可用性によってかなり容易になる。適切なラッ
キングシステムは市販されており、個々の標品の分類、貯蔵及び検索に用いられ得る。
【０２５８】
2.解凍
種々の実施態様では、本明細書で企図される組成物及び方法は、事前に凍結された血球
生成物及び造血細胞の解凍に多数の利点を提供する。本発明の種々の態様によれば、事前
に凍結された血球生成物及び造血細胞を、血球生成物及び造血細胞の解凍の前、間、又は
後に本発明の培地と接触してもよい。いかなる特定の理論にも束縛されることは望まない
が、本発明の培地中で、凍結された血球生成物及び造血細胞を解凍すること、又は解凍さ
れた細胞を本発明の培地中に移すことは、総有核細胞(TNC)カウント及び造血細胞生存度
を増大し、細胞のその後のプロセシング、調節、及び/又は増殖を可能にすると考えられ
る。さらに、本発明の培地中で血球生成物を解凍すること、又は解凍された細胞を本発明
の培地中に移すことは、アポトーシス細胞の膜を安定化し、それによって細胞溶解を低下
させ、細胞破片凝集を妨げ、細胞過程を阻害し得る細胞内成分の放出を妨げると考えられ
る。したがって、本発明の培地中で血球生成物を解凍すること、又は解凍された細胞を本
発明の培地中に移すことは、移植療法のための高品質の造血細胞の集団を提供する。
【０２５９】
一実施態様では、DMSO又は他の凍結保存剤を含んでいる凍結保存された細胞の集団を解
凍して、本明細書で企図される培養培地中で、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7
倍、約8倍、約9倍、約10倍又はそれを超えて希釈し、移植用の細胞を調製するその後の工
程に用いる。次いで、この希釈された細胞組成物を、本明細書で企図される培養培地中で
洗浄して再懸濁してもよいし、又は移植のための細胞を調製するその後の工程で用いても
よい。ある特定の実施態様では、次にその解凍された細胞をさらに、処理しても、調節し
ても、又は増殖させてもよい。ある特定の実施態様では、その解凍された細胞を、その必
要があるヒト対象に直接注入してもよい。
【０２６０】
一実施態様では、移植のための凍結保存された血球生成物を調製する方法が提供される
。特定の実施態様では、この方法は、凍結保存された血球生成物又は造血細胞の集団、例
えば、造血幹細胞前駆細胞(hematopoietic stem and progenitor cell)を、本発明の培地
中で解凍することを包含する。他の実施態様では、解凍された細胞を、本明細書で企図さ
れる培養培地に移し、場合により、直ちに、又はプロセシング、調節若しくは増殖の1回
以上の工程の後のいずれかで、対象への注入のために調製する。
【０２６１】
ある特定の実施態様では、血球生成物又は造血細胞は、約20℃〜約37℃、約25℃〜約37
℃、約30℃〜約37℃、又は約35℃〜約37℃の温度で解凍される。ある特定の実施態様では
、この血球生成物又は造血細胞は、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、
約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、
約36℃、又は約37℃の温度で解凍される。
【０２６２】
3.造血細胞のプロセシング
種々の実施態様では、本明細書で企図される方法は、移植用の血球生成物及び/又は造
血細胞の改善された調製を提供し、この方法は、血球生成物又は細胞をプロセシングする
工程を包含する。本明細書において用いる場合、「プロセシング」という用語は、血球生
成物を洗浄、精製、そうでなければ操作する工程を指す。
【０２６３】
血球生成物は、他の単離、凍結、解凍、再懸濁、調節、及び増殖の工程の間に何度も洗
浄してもよい。例えば、血球生成物は、血球生成物を操作するか又は取り扱う各々の工程
の間に1、2、3、4、5又はそれを超える回数洗浄してもよい。血球生成物を洗浄するため
の例示的な洗浄溶液としては、生理食塩液、リンゲル液、低分子量デキストラン、及びHS
A(0.9%のNaClに含まれる)が挙げられる。特定の実施態様では、血球生成物はまた、化学
的に定義された培地で1回以上洗浄してもよい。さらに、血球生成物は、本明細書で企図
される本発明の培地中で洗浄してもよいと考えられる。
【０２６４】
他の実施態様では、血球生成物をプロセシングして、生成物の一部を除去して、下流の
操作を改善してもよい。例えば、全臍帯血、胎盤血、又は動員末梢血をプロセシングして
、赤血球及び血漿を除去してもよい。特定の実施態様では、赤血球を取り除いて、ドナー
とレシピエントとの間の血液型不適合反応を最小限にする。
【０２６５】
一実施態様では、この血球生成物又は造血細胞を、細胞集団が約75%、約80%、約85%、
約90%、約95%、又は約100%の造血細胞又はCD34+細胞であるように、プロセシングする。
いくつかの実施態様では、細胞の集団は、約0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%、15%、20%、2
5%、又は30%未満の造血細胞又はCD34+細胞である。
【０２６６】
特定の実施態様では、プロセシングされた細胞の集団は、造血幹細胞又は前駆細胞又は
CD34+細胞の集団を含み、間葉系幹細胞及び/又は内皮前駆細胞を実質的に含まない。特定
の実施態様では、細胞の集団は、造血幹細胞又は前駆細胞又はCD34+細胞、約30%、25%、2
0%、15%、10%又は5%未満の間葉系幹細胞、及び約30%、25%、20%、15%、10%又は5%未満の
内皮前駆細胞を含む。
【０２６７】
細胞の集団は、当該分野で公知の方法を用いて、例えば、免疫磁性選択技術、蛍光活性
化セルソーティング、又はそれらの組合せを用いて、間葉系幹細胞及び/又は内皮前駆細
胞を代わりに欠いてもよく、CD34+細胞は、本明細書で開示されており、本発明における
使用に適切な多数の細胞供給源から精製してもよい。
【０２６８】
4.造血細胞の調節
種々の実施態様では、本明細書において企図される培養培地の使用によって、血球生成
物を操作する既存の方法を上回る特定の利点が提供される。細胞生存度の増大に加えて、
培養培地では、操作された細胞が生物学的活性及び治療特性を保持又は増大することが可
能になる。本明細書において企図される培養培地中で培養される全臍帯血などの生成物は
、遺伝子発現の変化を含み、これには、本明細書において企図される培養培地の非存在下
で処理された同じ生成物中で正常には低いか又は存在しない、治療用遺伝子発現特徴を代
表する遺伝子発現の増大を含む。例えば、本明細書のいずれかに記載されるような1つ以
上の作用剤(例えば、プロスタグランジン経路アゴニスト)で処理された全臍帯血は、本明
細書のいずれかに記載されるような、対照の溶液中で操作される全臍帯血と比較して、細
胞が治療特性を有していることを示す特徴遺伝子の遺伝子発現の増大を示す。したがって
、細胞(例えば造血細胞)及び血液生成物は、細胞及び血液生成物が、本明細書に開示され
ている1つ以上の作用剤で処理される前、間及び/又は後に本発明の培地と接触させてもよ
い。
【０２６９】
一実施態様では、組成物は、接触させていない細胞と比較して、接触させた細胞中で少
なくとも約2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、又は80倍、CXCR4遺伝子発現
を増大するのに十分な条件下でCXCR4遺伝子発現を増大し得る1つ以上の作用剤を用いて生
体外で処理された血球生成物又は造血細胞を含む。特定の実施態様では、この造血細胞は
、凍結された血球生成物又は造血細胞を解凍した後、1つ以上の作用剤と接触させる。別
の実施態様では、造血細胞は、本明細書において企図される培養培地中で、凍結保存され
;解凍され、再懸濁され、及び/又は精製され、本明細書において企図される培養培地中で
、細胞を1つ以上の作用剤と接触させることによって、調節されるか及び/又は増殖させる
。
【０２７０】
特定の実施態様では、HSPCは、接触させていない細胞と比較して、接触させた細胞にお
いて、少なくとも約2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、又は80倍、CXCR4遺
伝子発現を増大するのに有効な量及び十分な時間(すなわち、十分な条件下で)1つ以上の
作用剤で処理される。
【０２７１】
特定の実施態様では、十分な温度条件としては、限定するものではないが、約22℃、23
℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃
、37℃、38℃、及び39℃の温度を含む、約22℃〜約39℃の温度範囲(ほぼ室温〜ほぼ体温)
の温度範囲などの、生理学的に関連する温度での1つ以上の作用剤との血球生成物又は造
血細胞のインキュベーションが挙げられる。ある特定の実施態様では、十分な温度条件は
、約35℃〜39℃である。一実施態様では、この十分な温度条件は、約37℃である。
【０２７２】
ある特定の実施態様では、ある作用剤の十分な濃度は、約10nM〜約100μM、約100nM、
約500nM、約1μM、約10μM、約20μM、約30μM、約40μM、約50μM、約60μM、約70μM、
約80μM、約90μM、約100μM、約110μM、又は約120μMの最終濃度、又はその作用剤の任
意の他の介在する濃度(例えば、0.1μM、1μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM)で
ある。ある特定の実施態様では、各々の作用剤の十分な濃度は、約10μM〜約25μMの最終
濃度である。一実施態様では、ある作用剤の十分な濃度は約10μMの最終濃度である。
【０２７３】
さらなる実施態様では、血球生成物又は造血細胞の集団を、1つ以上の作用剤を用いて
処理するために十分な時間は、約60分〜約24時間、約60分〜約12時間、約60分〜約6時間
、約2時間〜約6時間、約2時間〜約4時間のインキュベーション期間であり、これには、限
定するものではないが、約60分、約70分、約80分、約90分、約100分、約110分、約2時間
、約2.5時間、約3時間、約3.5時間又は約4時間又は任意の他の介在する期間の処理を包含
する。ある特定の実施態様では、十分なインキュベーション期間は、約2時間〜約4時間で
ある。一実施態様では、HSPCを処理するために十分なインキュベーション期間は約4時間
である。
【０２７４】
種々の実施態様では、CXCR4遺伝子発現を、接触させていない細胞と比べて、接触させ
た細胞中で少なくとも約2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、又は80倍増大す
るための十分な条件は、HSPCを生体外で、約22℃〜約39℃の温度範囲で;約10μM〜約25μ
Mのプロスタグランジン経路アゴニスト、及び約10μM〜約25μMのグルココルチコイドの
最終濃度で処理すること;並びにこの作用剤を用いる、約1時間〜約4時間、約2時間〜約3
時間、約2時間〜約4時間、又は約3時間〜約4時間のインキュベーションを含む。
【０２７５】
特定の実施態様では、CXCR4遺伝子発現を、接触させていない細胞と比べて、接触させ
た細胞中で少なくとも約2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、又は80倍増大す
るための十分な条件は、HSPCを生体外で、約22℃〜約39℃の温度範囲で;約10μM〜約25μ
MのPGE2又はdmPGE2、及び約10μM〜約25μMのグルココルチコイドの最終濃度で処理する
こと;並びにこの作用剤を用いる、約1時間〜約4時間、約2時間〜約3時間、約2時間〜約4
時間、又は約3時間〜約4時間のインキュベーションを含む。
【０２７６】
種々の実施態様では、CXCR4遺伝子発現を、接触させていない細胞と比べて、接触させ
た細胞中で少なくとも約2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、又は80倍増大す
るための十分な条件は、HSPCを生体外で、約37℃の温度範囲で;約10μMの16,16-dmPGE2の
最終濃度で、約2時間の間処理することを包含する。
【０２７７】
特定の実施態様では、本明細書で企図される方法は、血球生成物又は造血細胞を調節し
て、遺伝子発現特徴又はパネル中で2つ以上の遺伝子の遺伝子発現を増大することを包含
する。
【０２７８】
適切な遺伝子発現パネルの1つの実例としては、HEY1、COX2、ULBP2、HAS1、GEM1、REN
、COL1A1、ANGPT1、CXCL6、PROM1、BMP4、ANGPT2、IKBKB、PECAM1、TIE1、AREG、CASP3、
JAG1、ARNT、CREM、CTGF、CD40L、BAX、HGF、SOD2、PDGFB、THBS1、DUSP4、CYR61、CXCL1
、TEK、CFLAR、IGF2、CXCR4、MMP2、FGF2、PTGS2、RAC2、PDGFR、NR4A2、NR4A3、TERT、T
GFB1、MMP9、CD40、CD44、HMGB1、NOS3、KDR、ITGB1、CTNNB1、CSF3、IL8、PLAUR、BCL2
、BMP2、CSF1、AKT1、VEGFA、ICAM1、CXCL3、CASP8、CD34、IL1A、CD47、CCL7、HIF1A、E
DN1、S1PR1、CCR1、SMAD4、FLT1、CD151、PGF、NFKB1、SMAD2、CXCR7、TGFB3、CXCL5、CC
ND1、HBEGF、NR3C1、TNF、ITGAL、CXCR2、STAT1、ITGA4、LIF、RASA1、CDH5、EFNB2、RGS
16、CXCL2、ITGA5、CXCL12、TIMP1、FOSL2、ITGB2、及びTIMP2が挙げられる。
【０２７９】
別の実施態様では、血球生成物又は造血細胞の集団を、調節して:CREM、GEM、NR4A2、N
R4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及びULBP2からなる群より選択される複数の特
徴遺伝子の遺伝子発現を増大する。この調節された細胞は、対照又は未処理細胞中の発現
レベルと比較して、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10の特徴遺伝子の発現の増大を有し得
る。
【０２８０】
特定の実施態様では、血球生成物又は造血細胞の集団は、少なくとも2つの遺伝子、少
なくとも5つの遺伝子、少なくとも10個の遺伝子、少なくとも25個の遺伝子、少なくとも5
0個の遺伝子、若しくは少なくとも100個以上の遺伝子、又は任意の介在する数の特徴遺伝
子の遺伝子発現を増大するように調節される。好ましい実施態様では、血球生成物又は造
血細胞の集団は、約2〜約25個の遺伝子、約2〜約10個の遺伝子、又は約5〜約10個の遺伝
子、又は任意の間に入る範囲のそれらの遺伝子の遺伝子発現を増大するように調節される
。
【０２８１】
特定の実施態様では、血球生成物又は造血細胞の集団は、少なくとも2、3、4、又は5個
の特徴遺伝子の発現が、細胞の対照の集団中の遺伝子の発現と比較して、約80倍、約70倍
、約60倍、約50倍、約40倍、約30倍、約20倍、約10倍、約5倍、約3倍、又は約2倍増大す
る場合、十分に調節されているとみなされる。追加の実施態様では、血球生成物又は造血
細胞の集団は、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、又は90個の特徴遺伝子、又
は任意の間に入る数のそれらの遺伝子の発現が、対照の集団の細胞における遺伝子の発現
と比較して、約80倍、約70倍、約60倍、約50倍、約40倍、約30倍、約20倍、約10倍、約5
倍、約3倍、又は約2倍増大する場合に有意に調節される。
【０２８２】
種々の実施態様では、調節された造血細胞は、治療特性が増大しており、これには、生
着の増大、生着能力の増大、造血再構成の増大、造血再構成能力の増大、ホーミングの増
大、ホーミング能力の増大、増殖の増大及び増殖能力の増大が挙げられる。特定の実施態
様では、これらの増大した治療特性は、対照又はビヒクル組成物(10%のデキストラン、5%
のHSA、0.9%のNaCl又は定義された培養培地単独)と接触させた血球生成物又は造血細胞と
比較して増大する。
【０２８３】
5.造血細胞の増殖
一実施態様では、組成物は、造血幹細胞前駆細胞(hematopoietic stem and progenitor
cell)を増殖させるために1つ以上の作用剤を用いて生体外で処理された血球生成物又は
造血細胞を含む細胞の集団を含む。ある特定の実施態様では、細胞を、移植の手順の前、
間及び/又は後などの、生体外の処理の間に、造血幹細胞前駆細胞(hematopoietic stem a
nd progenitor cell)の成長及び増殖を促進する1つ以上の作用剤と接触させる(例えば、
その全体が引用により本明細書中に組み込まれているWO2008/073748を参照のこと)。同様
に、また本明細書に提供される方法によれば、造血細胞移植の前の、プロスタグランジン
経路アゴニスト又はそのアナログの存在下でのHSPCの生体外の増殖は、移植後の造血機能
及び免疫機能の生着及び再構成を改善し得る(例えば、その全体が引用により本明細書中
に組み込まれている、Lordら、Cell Cycle 6:3054〜7,2007を参照のこと)。
【０２８４】
したがって、特定の実施態様では、本明細書で企図される移植用の細胞を調製する方法
は、造血幹細胞(hematopoietic stem cell)(HSC)成長又は増殖、並びに他の幹細胞様細胞
(例えば、多分化能細胞、多能性細胞、など)の成長又は増殖を刺激することを含み、この
方法には血球生成物又は造血細胞集団を本明細書において企図される培養培地に移すこと
、この細胞を1つ以上のプロスタグランジン経路アゴニストと接触させること、及びこの
細胞をHSPCの成長又は増殖を刺激するのに十分な時間インキュベートすること、並びにそ
れによってHPSCの成長又は増殖を刺激することを包含する。
【０２８５】
G.処置の方法又は治療方法
本明細書で企図される細胞を調製する組成物及び方法は、種々の臨床設定で有用であり
、これには、細胞移植、血液疾患、疾患及び状態の処置、虚血の処置及び遺伝子療法が挙
げられる。特定の実施態様では、血球生成物又は造血細胞を含んでいる組成物は、それを
必要とする対象において細胞移植片の生着、再構成、ホーミング、及び増殖を増大するの
に有用である。
【０２８６】
「それを必要とする対象」としては、限定するものではないが、造血系の生着、再構成
、ホーミング、増殖、又は遺伝子療法の必要な対象が挙げられる。含まれるのは、本明細
書のいずれかに考察されるような種々の種類の白血病、貧血、リンパ腫、骨髄腫、免疫不
全障害、及び固形腫瘍を有するか、又は有すると診断された対象である。「対象」として
はまた、悪性疾患のための処置又は遺伝子療法の構成要素の経過の間などの、幹細胞移植
又は骨髄移植の候補であるヒトが挙げられる。特定の実施態様では、対象は、細胞ベース
の遺伝子療法として、遺伝子組み換えされたHSPCを投与される。対象としてはまた、同種
移植術のために幹細胞又は骨髄を提供する個体又は動物も挙げられる。特定の実施態様で
は、対象は、骨髄機能廃絶の照射療法又は化学療法を受けていた場合もあるし、又は骨髄
機能廃絶をもたらす急性照射若しくは化学的傷害を受けていた場合もある。特定の実施態
様では、対象は、種々の癌療法の間など、照射療法又は化学療法を受けていた場合もある
。典型的な対象としては、ある作用剤、又は幹細胞若しくは骨髄移植で調節され得る1つ
以上の生理学的活性が異常な量(「正常」又は「健常な」対象よりも低いか又は高い量)を
示す動物が挙げられる。
【０２８７】
造血系の生着又は再構成の必要な対象としては、癌のための化学療法又は放射線療法を
受けている対象、及び非悪性の血液障害、特に免疫不全(例えば、とりわけ、SCID、ファ
ンコーニ貧血、重症再生不良性貧血、又は先天性異常ヘモグロビン症、又は代謝蓄積症、
例えば、ハーラー(Hurler)病、ハンター病、マンノシドーシス)又は癌、特に、血液悪性
腫瘍、例えば、急性白血病、慢性白血病(骨髄球性又はリンパ系)、リンパ腫(ホジキン又
は非ホジキン)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、又は非血液癌、例えば、固形腫瘍(例
としては、乳癌、卵巣癌、脳癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、皮膚癌、肝臓癌、又は膵臓癌
など)に罹患している(例えば、罹っている)対象が挙げられる。
【０２８８】
対象としてはまた、再生不良性貧血、免疫障害(重症複合免疫不全症候群又は紅斑性狼
瘡)、骨髄異形成、地中海貧血、鎌状赤血球病又はウィスコット・オルドリッチ症候群に
罹患している対象が挙げられる。いくつかの実施態様では、対象は、別の一次的な処置、
例えば、放射線療法、化学療法、又はジドブジン(zidovadine)、クロラムフェニコール(c
hloramphenical)若しくはガンシクロビル(gangciclovir)のような骨髄抑制薬物での処置
の望ましくない副作用又は合併症の結果である障害に罹患する。このような障害としては
、好中球減少症、貧血、血小板減少症、及び免疫機能不全が挙げられる。
【０２８９】
他の対象は、骨髄の幹細胞又は前駆細胞に対して傷害を引き起こす感染(例えば、ウイ
ルス感染、細菌感染又は真菌感染)によって生じる障害を有し得る。
【０２９０】
さらに、以下の状態に罹患している対象も、本発明の細胞ベースの組成物を用いる処置
から利益を受ける場合がある:リンパ球減少症、リンパ漏、リンパ鬱滞、赤血球減少症、
赤血球変性障害、赤芽球減少症、白赤芽球症、;赤血球崩壊、地中海貧血症(サラセミア)
、骨髄線維症、血小板減少症、播種性血管内凝固症候群(disseminated intravascular co
agulation)(DIC)、免疫(自己免疫)血小板減少性紫斑病(immune (autoimmune) thrombocyt
openic purpura)(ITP)、HIV誘発性ITP、骨髄異形成;血小板傷害性疾患、血小板増加症、
先天性好中球減少症(例えば、コストマン(Kostmann)症候群及びシュワッハマン・ダイア
モンド(Schwachman-Diamond)症候群)、新生物関連好中球減少症、小児及び成人の周期性
好中球減少症;感染後好中球減少症;骨髄異形成症候群;化学療法及び放射線療法に関連す
る好中球減少症;慢性肉芽腫性疾患;ムコ多糖症;ダイアモンド・ブラックファン;鎌状赤血
球病;重症型β-地中海貧血(サラセミア);ゴーシェ病;クラッベ病;異染性白質ジストロフ
ィー;テイサックス病;ニーマン・ピック病;糖タンパク質分解反応異常症(例えば、フコシ
ドーシス,a-マンノシドーシス);並びにMPS-III(サンフィリポ)。
【０２９１】
ある特定の実施態様では、対象は、骨髄を提供した骨髄ドナーであるか、骨髄をまだ提
供していない骨髄ドナーであるか、骨髄ドナー移植レシピエントであるか、環境ストレス
下の造血前駆細胞を有するか、貧血を有するか、正常な対象と比較して免疫細胞機能のレ
ベルが低下しているか、又は免疫系欠損を有する。
【０２９２】
ある特定の実施態様では、対象は、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、
慢性骨髄性白血病(chronic myeloid leukemia)、慢性骨髄性白血病(chronic myelogenous
leukemia)、慢性顆粒球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性非リンパ芽球性白血病
、又は前白血病を有する。
【０２９３】
対象としてはまた、虚血の組織又は組織虚血に関連する1つ以上の症状、例としては、
限定するものではないが、臓器機能の損傷又は喪失(限定するものではないが、脳、腎臓
又は心機能の障害又は喪失を含む)、筋けいれん、跛行、知覚麻痺、チクチク感(tingling
)、脱力感、疼痛、創傷治癒の低下、炎症、皮膚変色、及び壊疽の処置を必要とする対象
が挙げられる。本明細書において用いる場合、「虚血」、「虚血性状態」、又は「虚血性
事象」という用語は、血管系の任意の狭窄、損傷又は障害によって生じる任意の細胞、組
織、臓器又は身体部分に対する血液供給における任意の低下又は停止を意味する。虚血は
時には、血管狭窄又は血栓症又は塞栓症から生じる。虚血により、直接的な虚血傷害、酸
素(低酸素症、無酸素症)、グルコース、及び栄養分の供給の減少によって引き起こされる
細胞死に起因する組織損傷が生じ得る。「低酸素症」又は「低酸素状態」とは、細胞、臓
器又は組織が不十分な酸素の供給を受けている状態を意図している。「無酸素症」とは、
臓器又は組織に酸素が実質的に完全に存在しないことを指し、それが持続する場合には、
細胞、臓器又は組織が死に至る可能性がある。
【０２９４】
特定の実施態様では、対象は、例えば、異常ヘモグロビン症など、遺伝子治療を必要と
している。本明細書において用いる場合、「異常ヘモグロビン症」又は「異常血色素症状
態」という用語は、血液中に異常なヘモグロビン分子が存在することに関与する任意の障
害を包含する。異常ヘモグロビン症の例としては、これだけに限定されないが、ヘモグロ
ビンC症、ヘモグロビン鎌状赤血球症(sickle cell disease)(SCD)、鎌状赤血球貧血、及
び地中海貧血(サラセミア)が挙げられる。また血液中に異常なヘモグロビンの組合せが存
在する異常ヘモグロビン症(例えば、鎌状赤血球/Hb-C症)も包含される。
【０２９５】
「鎌状赤血球貧血」又は「鎌状赤血球症」という用語は、本明細書では、赤血球の鎌状
化に起因する、任意の症候性の貧血性の状態を包含すると定義される。鎌状赤血球症の徴
候としては:貧血;疼痛;及び/又は臓器機能障害、例えば、腎不全、網膜症、急性胸部症候
群、虚血、持続勃起症及び卒中が挙げられる。本明細書において用いる場合、「鎌状赤血
球症」という用語は、特に、HbSにおける鎌状赤血球置換に関してホモ接合体である対象
における、鎌状赤血球貧血に伴う種々の臨床的問題を指す。本明細書において用いる場合
、「地中海貧血(サラセミア)」という用語は、ヘモグロビンの合成に影響を及ぼす変異に
起因して起こる遺伝性貧血を包含する。したがって、この用語は、重症の又はβサラセミ
ア、重症型サラセミア、中間型サラセミア、ヘモグロビンH症のようなαサラセミアなど
の地中海貧血症の状態によって生じる任意の症候性貧血を包含する。
【０２９６】
一実施態様では、細胞ベースの治療の方法は、それを必要とする対象に対して、本明細
書で企図される培養培地中に解凍され移された血球生成物又は造血細胞の集団を投与する
ことを含み、ここでは場合により、この細胞はプロセシングされるか、調節されるか、又
はこのような培地中で増殖させる。種々の実施態様では、細胞は、造血細胞、例えば、細
胞の1つ以上の治療特性を増大するように1つ以上の作用剤で場合により処理された、造血
幹細胞又は前駆細胞(例えば、臍帯血又は動員末梢血から単離された)などである。ある特
定の実施態様では、その細胞は、プロスタグランジン経路アゴニスト、例えば、16,16-dm
PGE2を用いて、場合により10μMの濃度で、約2時間、37℃で処理される。
【０２９７】
対象に対する本明細書で調製された細胞のある「量」の投与とは、限定するものではな
いが、対象の処置を含む、所望の治療的又は予防的結果を達成するために「有効な量」の
投与を指す。したがって、本明細書における目的のための細胞の「治療有効量」とは、当
該分野で公知の検討によって決定され、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重、並びに個
体において所望の応答を誘発する細胞の能力などの要因に従って変化し得る。「治療有効
量」という用語は、対象(例えば、患者)を「処置する」ために有効である量を包含する。
治療有効量とはまた、細胞のなんらかの毒性の影響又は有害な影響よりも治療的に有益な
影響が上回る量でもある。
【０２９８】
「予防上有効な量」とは、所望の予防的な結果を実現するために有効な治療能力を有し
ている細胞の量を指す。必然ではないが一般的には、予防的な用量は、疾患の初期段階よ
り前、又はその時点で対象に用いられるので、予防上有効な量は、治療有効量よりも少な
い。
【０２９９】
本明細書で記載される方法で用いられる細胞の集団を投与するために適切な方法として
は、限定するものではないが、静脈内投与及び動脈内投与などの血管内投与の方法を含め
た非経口投与が挙げられる。本発明の細胞を投与するための追加的な例示的な方法として
は、筋肉内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関
節内、被膜下、くも膜下、脊髄内及び胸骨内の注射及び注入が挙げられる。
【０３００】
種々の実施態様では、対象に投与される血球生成物又は造血細胞は、細胞の異種の集団
、例としては、全骨髄、臍帯血、動員末梢血、造血幹細胞、造血前駆細胞、及び造血幹細
胞前駆細胞(hematopoietic stem and progenitor cell)の子孫、例としては、顆粒球(例
えば、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球)、赤血球(例えば、網状
赤血球、赤血球)、血小板(例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板)、及び単球(例
えば、単球、マクロファージ)である。
【０３０１】
ここで、本発明の特定の実施態様を以下の実施例によりさらに完全に説明する。しかし
、本発明は、多くの異なる形態で具現化され得、本明細書に示される実施態様に限定され
ると解釈されるべきではない;そうではなく、これらの実施態様は、本開示が網羅的であ
り、かつ完全であり、かつ本発明の範囲を当業者に詳細に伝達するように提供される。
【実施例】
【０３０２】
(実施例1)
StemSpan-ACF +デキストラン-40は、生きているCD34+細胞の損失を最小限にし、全臍帯
血の短時間インキュベーションの間のTNC回収を改善する
短時間インキュベーションの間の臍帯血のCD34の数え上げ
臍帯血単位は、カロリナス臍帯血バンク(Carolinas Cord Blood Bank)(CBB)から入手し
た。これらの臍帯血単位からのサンプルは、StemSpan-ACF(Stem Cell Technologies, Van
couver, BC, Canada)又はStemSpan-ACF(8%のデキストラン-40(Sigma-Aldrich, St Louis,
MO(ミズーリ)州)を含有)中で、37℃で解凍した。各々のサンプルを、400×gで10分間遠
心分離して、各々のサンプルを最初に解凍したのと同じ培地中に再懸濁した。両方のサン
プルを37℃で2時間インキュベートした。100μLのサンプルを、プロセシング及びインキ
ュベーション全体にわたって両方の条件から採取した。BD幹細胞数え上げキット(BD Stem
Cell Enumeration Kit)(BD Biosciences, San Jose, CA(カリフォルニア)州)の臍帯血単
位用の標準的な溶解なし、洗浄なしのプロトコールを用いて、CD34-PE、CD45-FITC、及び
7AADについて細胞を染色した。そのサンプルを、BD FACSCanto II(BD Biosciences, San 
Jose, CA(カリフォルニア)州)で分析して、ISHAGEゲートストラテジーを用いてゲーティ
ングした。顆粒球の百分率は、特徴的な高い側方散乱及び低いCD45表面発現を有する顆粒
球集団の周囲でゲートセットを用いて推定した。
【０３０３】
(結果)
StemSpan-ACF単独と比較して、StemSpan-ACFと8%のデキストラン-40との中で、37℃で1
時間インキュベートし、2時間のインキュベーション後(インキュベーション後)のサンプ
ル中でより多数の生存CD34+細胞が認められた(図1a)。インキュベーション後、生存CD34+
細胞の数は、StemSpan中でデキストラン-40と共にインキュベートされたサンプルと比較
して、StemSpan-ACF中でインキュベートしたサンプル中では36%少なかった。
【０３０４】
CD45+細胞画分中のインタクトな顆粒球の百分率は、StemSpan-ACFと8%のデキストラン
中でインキュベートすると、StemSpan単独中でインキュベートした場合と比べ、37℃で1
時間及び2時間のインキュベーション後(インキュベーション後)のサンプル中で約20%増大
した(図1b)。この結果によって、インキュベーションの間に溶解された顆粒球の画分がよ
り小さいことが示された。
【０３０５】
(実施例2)
StemSpan-ACF+デキストラン-40は、dmPGE2で処理された全臍帯血中でTNCの損失を低下
させる。
(dmPGE2による全臍帯血単位の生体外調節)
臍帯血単位は、Carolinas CBBから入手して、液体窒素(LN2)蒸気相中に保管した。臍帯
血単位を、凍結保存の前にRBC-低下及び血漿-低下し、25mLの容積で保管した。臍帯血単
位を、水浴中で37℃で解凍し、その容積を、StemSpan-ACF、StemSpan-ACF +2.1%のHSA、S
temSpan + 4.2%のHSA, IMDM + 4.2%のHSA、又はStemSpan-ACFと8%のデキストラン-40中で
45mLにした。Sepax 2細胞プロセシングシステム(Biosafe, Geneva, Switzerland)を用い
て、同じ培地を用いて臍帯血単位を洗浄し、ここでは臍帯血単位を最初に解凍した。洗浄
した臍帯血単位の総容積は、95mLであった。dmPGE2を臍帯血単位に対して、最終濃度10uM
まで添加した。臍帯血単位を、Plasmatherm装置(Barkey, Leopoldshoehe, Germany)の中
に、2時間37℃で一定にパドル混合しながら入れた。総有核細胞(total nucleated cell)(
TNC)カウントを、解凍、洗浄及びインキュベーション工程の後に、Sysmex KX-21N(Sysmex
America, Inc, Lincolnshire, IL(イリノイ)州)を用いて決定した。
【０３０６】
(結果)
StemSpan-ACF又はIMDM中でプロセシングされた臍帯血単位についてのTNCカウントでは
、StemSpan-ACFと8%のデキストラン-40との中でのTNCの8.0%の損失と比較して、解凍から
インキュベーション後まで65.4%の平均のTNC損失が生じた(図2)。これらの単位の間の1つ
の観察可能な相違は、デキストラン-40なしの培地中での細胞破片クランピングであった
。TNCのほとんどの損失は、インキュベーションの間に生じたが、ある程度の損失はまた
、臍帯血単位の洗浄の間にも生じた。
【０３０７】
(実施例3)
dmPGE2で処理された全臍帯血は、StemSpan-ACF +デキストラン-40中で生物学的活性を
維持する。
StemSpan-ACFに対するデキストラン-40の添加は、生物学的活性を阻害しない。
臍帯血単核球細胞(All Cells, Emeryville, CA(カリフォルニア)州)を、37℃の水浴中
で解凍して、10%のウシ胎仔血清及び5uLのDNase(Life Technologies, Grand Island, NY(
ニューヨーク)州)を含む事前に温められた10mLのIMDMで直ちに希釈した。この細胞を、3
方向に分割して、300×gで10分間遠心分離した。細胞を、StemSpan-ACF(培地1)、StemSpa
n-ACFと5%のデキストラン-40(培地2)、又はStemSpan-ACFと10%のデキストラン-40(培地3)
の中に再懸濁した。培地1由来のサブセット1×106細胞を、4℃で保持して、直ちに、BD B
iosciencesのLineage Mix-FITC、CXCR4-PE、CD34-APC、及びCD45-V450抗体を用いて染色
した。3つの全ての培地条件を、ビヒクル処理コホート及び10μMのdmPGE2処理コホートに
分けて、37℃で2時間インキュベートした。その細胞を同じ培地で洗浄して、37℃でさら
に1時間インキュベートした。各々のコホートを、上に示したのと同じ抗体を用いて染色
した。Lin-CD45lowCD34+7AAD-細胞内のCXCR4表面タンパク質のレベルを解析した。
【０３０８】
結果
10μMのdmPGE2で2時間37℃でインキュベーションした後、CXCR4遺伝子発現の増大が観
察され、dmPGE2なしでのさらに1時間のインキュベーション後、CXCR4表面タンパク質が増
大した。StemSpan-ACFに対する5%又は10%のデキストラン-40の添加により、CXCR4表面タ
ンパク質発現のレベルの増大によって証明されるとおり、dmPGE2に対するCD34+細胞の応
答は低下しなかった(図3)。
【０３０９】
上記の種々の実施態様を組み合わせて、さらなる実施態様を提供してもよい。本明細書
に引用されるか、及び/又は出願データシートに列挙される、米国特許、米国特許出願公
開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許刊行物の全ては、その全体が引用
により本明細書中に組み込まれている。本実施態様の態様は、種々の特許、出願及び刊行
物の概念を使用してさらなる実施態様を得るために必要である場合、改変されてもよい。
【０３１０】
これら及び他の変更を行って、上記の詳細な説明に照らして具現化してもよい。一般に
は、以下の特許請求の範囲では、用いられる用語は、本明細書及び特許請求の範囲で開示
さている特定の実施態様に対してその特許請求の範囲を限定すると解釈されるべきではな
いが、このような特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲に沿った全ての可能
な実施態様を包含すると解釈されるべきである。したがって、この特許請求の範囲は、本
開示によって限定されることはない。
【図１Ａ】
2020089373.tif 000003
【図１Ｂ】
2020089373.tif 000004
【図２】
2020089373.tif 000005
【図３】
2020089373.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月4日(2020.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に実質的に記載された、新規な物、方法及び製造方法。
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月4日(2020.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１０】
これら及び他の変更を行って、上記の詳細な説明に照らして具現化してもよい。一般に
は、以下の特許請求の範囲では、用いられる用語は、本明細書及び特許請求の範囲で開示
さている特定の実施態様に対してその特許請求の範囲を限定すると解釈されるべきではな
いが、このような特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲に沿った全ての可能
な実施態様を包含すると解釈されるべきである。したがって、この特許請求の範囲は、本
開示によって限定されることはない。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
(a)約1%〜約20%の多糖;及び
(b)化学的に定義された細胞培養培地
を含む、培養培地。
（構成２）
前記多糖がデキストランである、構成1記載の培養培地。
（構成３）
前記多糖が:デキストラン-1、デキストラン-10、デキストラン-20、デキストラン-30、
及びデキストラン-40からなる群より選択されるデキストランである、構成1記載の培養培
地。
（構成４）
前記多糖が、デキストラン-40である、構成1記載の培養培地。
（構成５）
前記多糖が、ヒドロキシエチルスターチ(HES)である、構成1記載の培養培地。
（構成６）
前記多糖が:ヘタスターチ、ヘキサスターチ、ペンタスターチ、及びテトラスターチか
らなる群より選択されるHESである、構成1記載の培養培地。
（構成７）
前記多糖がヘタスターチである、構成1記載の培養培地。
（構成８）
約1%〜約5%の多糖を含む、構成1から7のいずれか一項記載の培養培地。
（構成９）
約6%の多糖を含む、構成1から7のいずれか一項記載の培養培地。
（構成１０）
約7%の多糖を含む、構成1から7のいずれか一項記載の培養培地。
（構成１１）
約8%の多糖を含む、構成1から7のいずれか一項記載の培養培地。
（構成１２）
約9%の多糖を含む、構成1から7のいずれか一項記載の培養培地。
（構成１３）
約10%の多糖を含む、構成1から7のいずれか一項記載の培養培地。
（構成１４）
約1%〜約5%のHSAを含む、構成1から13のいずれか一項記載の培養培地。
（構成１５）
約2%のHSAを含む、構成14記載の培養培地。
（構成１６）
約3%のHSAを含む、構成14記載の培養培地。
（構成１７）
約4%のHSAを含む、構成14記載の培養培地。
（構成１８）
約5%のHSAを含む、構成14記載の培養培地。
（構成１９）
前記化学的に定義された細胞培養培地が:StemSpan-ACF、StemSpan-H3000、StemSpan-SF
EM、Stemline II、StemPro 34、StemXVivo、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ダルベ
ッコ改変イーグル培地(DMEM)、ロズウェルパーク記念研究所培地(RPMI)1640培地、マッコ
イ5A培地、最小必須培地α培地(α-MEM)、基礎培地イーグル(BME)、フィッシャー培地、
培地199、F-12K栄養混合物培地(Kaighn改変、F-12K)、及びX-vivo 20からなる群より選択
される、構成1から18のいずれか一項記載の培養培地。
（構成２０）
前記化学的に定義された細胞培養培地が:StemSpan-ACF、StemSpan-H3000、及びStemSpa
n-SFEMからなる群より選択される、構成1から19のいずれか一項記載の培養培地。
（構成２１）
前記化学的に定義された細胞培養培地がStemSpanである、構成1から20のいずれか一項
記載の培養培地。
（構成２２）
さらに1つ以上の増殖因子又はサイトカインを含む、構成1から21のいずれか一項記載の
培養培地。
（構成２３）
前記化学的に定義された培養培地が: flt3-リガンド(FLT3);トロンボポイエチン(TPO)
、幹細胞因子(SCF)、上皮細胞増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β
)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、インターロイキン-3(IL3)、インターロイキン-6(I
L6)、及びインターロイキン-9(IL9)からなる群より選択される1つ以上の増殖因子又はサ
イトカインを含む、構成1から21のいずれか一項記載の培養培地。
（構成２４）
cAMPアナログ又はエンハンサー、Gα-s活性化因子、及びプロスタグランジン経路アゴ
ニストからなる群より選択される作用剤をさらに含む、構成1から23のいずれか一項記載
の培養培地。
（構成２５）
前記プロスタグランジン経路アゴニストが選択的にPGE2 EP2又はPGE2 EP4受容体に結合
する、構成24記載の培養培地。
（構成２６）
前記プロスタグランジン経路アゴニストが、PGE2、又はPGE2アナログ又は誘導体を含む
、構成24記載の培養培地。
（構成２７）
前記プロスタグランジン経路アゴニストが:PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-メチルPGE2
、20-エチルPGE2、及び8-イソ-16-シクロヘキシル-テトラノルPGE2からなる群より選択さ
れる、構成24記載の培養培地。
（構成２８）
前記プロスタグランジン経路アゴニストが、16,16-dmPGE2を含む、構成24記載の培養培
地。
（構成２９）
(a)細胞の集団;
(b)約1%〜約20%の多糖;及び
(c)化学的に定義された細胞培養培地
を含む、組成物。
（構成３０）
前記細胞の集団が: 骨髄細胞(BMC)、臍帯血細胞(UCBC)、胎盤血細胞、動員末梢血細胞(
mPBC)、造血幹細胞(HSC)、造血前駆細胞(HPC)、及びCD34+細胞からなる群より選択される
、構成29記載の組成物。
（構成３１）
前記細胞の集団が:骨髄、臍帯血、胎盤血、又は動員末梢血からなる群より選択される
、構成29記載の組成物。
（構成３２）
前記細胞の集団が: 造血幹細胞(HSC)、造血前駆細胞(HPC)、及びCD34+細胞のうちの少
なくとも1つを含む、構成29記載の組成物。
（構成３３）
前記細胞の集団が、CD34+細胞の精製された集団を含む、構成29から32のいずれか記載
の組成物。
（構成３４）
前記多糖がデキストランである、構成29から32のいずれか記載の組成物。
（構成３５）
前記多糖が:デキストラン-1、デキストラン-10、デキストラン-20、デキストラン-30、
及びデキストラン-40からなる群より選択されるデキストランである、構成29から32のい
ずれか記載の組成物。
（構成３６）
前記多糖がデキストラン-40である、構成29から32のいずれか記載の組成物。
（構成３７）
前記多糖がHESである、構成29から32のいずれか記載の組成物。
（構成３８）
前記多糖が:ヘタスターチ、ヘキサスターチ、ペンタスターチ、及びテトラスターチか
らなる群より選択されるHESである、構成29から32のいずれか記載の組成物。
（構成３９）
前記多糖がヘタスターチである、構成29から32のいずれか記載の組成物。
（構成４０）
約1%〜約5%の多糖を含む、構成29から39のいずれか一項記載の組成物。
（構成４１）
約6%の多糖を含む、構成29から39のいずれか一項記載の組成物。
（構成４２）
約7%の多糖を含む、構成29から39のいずれか一項記載の組成物。
（構成４３）
約8%の多糖を含む、構成29から39のいずれか一項記載の組成物。
（構成４４）
約9%の多糖を含む、構成29から39のいずれか一項記載の組成物。
（構成４５）
約10%の多糖を含む、構成29から39のいずれか一項記載の組成物。
（構成４６）
約1%〜約5%のHSAを含む、構成29から45のいずれか一項記載の組成物。
（構成４７）
約2%のHSAを含む、構成29から45のいずれか一項記載の組成物。
（構成４８）
約3%のHSAを含む、構成29から45のいずれか一項記載の組成物。
（構成４９）
約4%のHSAを含む、構成29から45のいずれか一項記載の組成物。
（構成５０）
約5%のHSAを含む、構成29から45のいずれか一項記載の組成物。
（構成５１）
前記化学的に定義された細胞培養培地が:StemSpan-ACF、StemSpan-H3000、StemSpan-SF
EM、Stemline II、StemPro 34、StemXVivo、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ダルベ
ッコ改変イーグル培地(DMEM)、ロズウェルパーク記念研究所培地1640培地、マッコイ5A培
地、最小必須培地α培地(α-MEM)、基礎培地イーグル(BME)、フィッシャー培地、培地199
、F-12K栄養混合物培地(Kaighn改変、F-12K)、及びX-vivo 20からなる群より選択される
、構成29から50のいずれか一項記載の組成物。
（構成５２）
前記化学的に定義された細胞培養培地が:StemSpan-ACF、StemSpan-H3000、及びStemSpa
n-SFEMからなる群より選択される、構成29から51のいずれか一項記載の組成物。
（構成５３）
前記化学的に定義された細胞培養培地がStemSpanである、構成29から52のいずれか一項
記載の組成物。
（構成５４）
1つ以上の増殖因子又はサイトカインをさらに含む、構成29から53のいずれか一項記載
の組成物。
（構成５５）
前記化学的に定義された培養培地が: flt3-リガンド(FLT3);トロンボポイエチン(TPO)
、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン-3(IL3)、インターロイキン-6(IL6)、及びインタ
ーロイキン-6(IL9)からなる群より選択される1つ以上の増殖因子又はサイトカインを含む
、構成29から53のいずれか一項記載の組成物。
（構成５６）
cAMPアナログ又はエンハンサー、Gα-s活性化因子、及びプロスタグランジン経路アゴ
ニストからなる群より選択される作用剤をさらに含む、構成29から55のいずれか一項記載
の組成物。
（構成５７）
前記プロスタグランジン経路アゴニストが選択的にPGE2 EP2又はPGE2 EP4受容体に結合
する、構成56記載の組成物。
（構成５８）
前記プロスタグランジン経路アゴニストが、PGE2、又はPGE2アナログ又は誘導体を含む
、構成56記載の組成物。
（構成５９）
前記プロスタグランジン経路アゴニストが:PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-メチルPGE2
、20-エチルPGE2、及び8-イソ-16-シクロヘキシル-テトラノルPGE2からなる群より選択さ
れる、構成56記載の組成物。
（構成６０）
前記プロスタグランジン経路アゴニストが、16,16-dmPGE2を含む、構成56記載の組成物
。
（構成６１）
細胞集団を調製する方法であって、前記細胞集団と構成1から28記載の培養培地のいず
れか1つとを接触させることを包含する、前記方法。
（構成６２）
前記細胞集団が造血細胞集団を含む、構成61記載の方法。
（構成６３）
前記造血細胞集団が: 骨髄細胞(BMC)、臍帯血細胞(UCBC)、胎盤血細胞、動員末梢血細
胞(mPBC)、造血幹細胞(HSC)、造血前駆細胞(HPC)、及びCD34+細胞からなる群より選択さ
れる、構成62記載の方法。
（構成６４）
前記造血細胞集団が:骨髄、臍帯血、胎盤血、又は動員末梢血からなる群より選択され
る、構成62記載の方法。
（構成６５）
前記造血細胞集団が: 造血幹細胞(HSC)、造血前駆細胞(HPC)、及びCD34+細胞のうちの
少なくとも1つを含む、構成62記載の方法。
（構成６６）
前記造血細胞集団が、CD34+細胞の精製された集団である、構成62記載の方法。
（構成６７）
前記細胞集団が、凍結保存された細胞を含み、かつ接触させることが、前記培養培地中
で前記凍結保存された細胞を解凍することを包含する、構成61から66のいずれか一項記載
の方法。
（構成６８）
前記細胞集団が、前記細胞の集団を前記培養培地とを接触させる前に解凍された凍結保
存された細胞を含む、構成61から66のいずれか一項記載の方法。
（構成６９）
前記細胞集団が、約20℃〜約37℃の温度で解凍される、構成67又は68記載の方法。
（構成７０）
前記細胞集団が、約25℃、約30℃、又は約37℃の温度で解凍される、構成67又は構成68
記載の方法。
（構成７１）
前記接触させた細胞集団の細胞溶解が、対照の培養培地と接触させた対照の細胞集団の
細胞溶解と比較して、約10%、約20%、約30%、約40%又は約50%低下する、構成61から70の
いずれか一項記載の方法。
（構成７２）
前記接触させた細胞集団の細胞溶解が、対照培養培地と接触させた対照の細胞集団の細
胞溶解と比較して、約2倍、3倍、又は5倍低下する、構成61から70のいずれか一項記載の
方法。
（構成７３）
前記接触させた造血細胞集団からのTNCの回収が、対照の培養培地と接触させた対照の
造血細胞集団からのTNCの回収と比較して、約10%、約20%、約30%、又は約50%増大する、
構成62から70のいずれか一項記載の方法。
（構成７４）
前記接触させた造血細胞集団からのTNCの回収が、対照の培養培地と接触させた対照の
造血細胞集団からのTNCの回収と比較して、約2倍、約3倍、又は約5倍増大する、構成62か
ら70のいずれか一項記載の方法。
（構成７５）
前記接触させたCD34+細胞の生存度が、対照の培養培地と接触させた対照の細胞集団のC
D34+細胞生存度と比較して、約10%、約20%、約30%、約40%又は約50%増大する、構成66記
載の方法。
（構成７６）
前記接触させたCD34+細胞の生存度が、対照の培養培地と接触させた対照の細胞集団のC
D34+細胞生存度と比較して、約2倍、約3倍、又は約5倍増大する、構成66記載の方法。
（構成７７）
前記細胞集団が、生体外で調節される、構成61から76のいずれか一項記載の方法。
（構成７８）
前記調節が、前記細胞集団と:cAMPアナログ又はエンハンサー、Gα-s活性化因子、及び
プロスタグランジン経路アゴニストからなる群より選択される少なくとも1つの作用剤と
を接触させることを含む、構成77記載の方法。
（構成７９）
前記プロスタグランジン経路アゴニストが選択的にPGE2 EP2又はPGE2 EP4受容体に結合
する、構成78記載の方法。
（構成８０）
前記プロスタグランジン経路アゴニストが、PGE2、又はPGE2アナログ又は誘導体を含む
、構成78記載の方法。
（構成８１）
前記プロスタグランジン経路アゴニストが:PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-メチルPGE2
、20-エチルPGE2、及び8-イソ-16-シクロヘキシル-テトラノルPGE2からなる群より選択さ
れる、構成78記載の方法。
（構成８２）
前記プロスタグランジン経路アゴニストが、16,16-dmPGE2を含む、構成78記載の方法。
（構成８３）
前記細胞集団を、前記少なくとも1つの作用剤と約1時間〜約4時間接触させる、構成78
から82のいずれか一項記載の方法。
（構成８４）
前記細胞集団が、前記少なくとも1つの作用剤と約1時間又は約2時間接触させる、構成7
8から82のいずれか一項記載の方法。
（構成８５）
前記細胞集団を、前記少なくとも1つの作用剤と約25℃〜約37℃の温度で接触させる、
構成78から82のいずれか一項記載の方法。
（構成８６）
前記細胞集団を、前記少なくとも1つの作用剤と約30℃又は約37℃の温度で接触させる
、構成78から82のいずれか一項記載の方法。
（構成８７）
前記細胞集団が、造血細胞を含み、かつ接触させることが、前記造血細胞と10μMの16,
16-dmPGE2とを約37℃で、約2時間接触させることを包含する、構成78から82のいずれか一
項記載の方法。
（構成８８）
前記細胞集団の生着、再構成、ホーミング及び/又は増殖が、インビボにおいて、調節
されていない細胞集団と比較して、増大する、構成77から87のいずれか一項記載の方法。
（構成８９）
CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及びULBP2からなる群よ
り選択される少なくとも2つの遺伝子の発現が、対照の調節されていない細胞集団におけ
る少なくとも2つの遺伝子の発現と比較して、前記細胞集団中で約20倍増大する、構成77
から87のいずれか一項記載の方法。
（構成９０）
CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及びULBP2からなる群よ
り選択される少なくとも5つの遺伝子の発現が、対照の調節されていない細胞集団におけ
る少なくとも5つの遺伝子の発現と比較して、前記細胞集団中で約10倍、約3倍、又は約2
倍増大する、構成77から87のいずれか一項記載の方法。
（構成９１）
遺伝子CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HAS1、CXCL2、CXCL3、及びCXCR4の発現
が、対照の調節されていない細胞集団における遺伝子の発現と比較して、前記細胞集団中
で約3倍又は約2倍増大する、構成77から87のいずれか一項記載の方法。
（構成９２）
前記細胞集団が、対象に投与される、構成61から91のいずれか一項記載の方法。
（構成９３）
前記細胞集団が、前記対象に対して同種異系である、構成92記載の方法。
（構成９４）
前記細胞集団が、前記対象に対して自系である、構成92記載の方法。
（構成９５）
前記対象が:虚血、非悪性血液障害、免疫不全、重症複合免疫不全(SCID)、リンパ球減
少症、血小板減少症、好中球減少症、貧血、ファンコニー貧血、重症再生不良性貧血、先
天性異常血色素症、鎌状赤血球病、β-地中海貧血、鎌状赤血球病、ウィスコット・オル
ドリッチ症候群、代謝性蓄積疾患、ハーラー病、ハンター病、マンノシドーシス、癌、血
液悪性腫瘍、急性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、
非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、非血液癌、乳癌、卵巣癌、脳癌
、前立腺癌、肺癌、結腸癌、皮膚癌、肝臓癌、及び膵臓癌からなる群より選択される疾患
、障害、又は状態を有する、構成92記載の方法。
（構成９６）
約25℃〜約37℃の温度で約1〜約24時間の間、プロスタグランジン経路を調節する少な
くとも1つの作用剤とサンプルとを接触させることによって調節される解凍された全臍帯
血サンプル中で少なくとも70%のTNCを維持する、構成1から21のいずれか一項記載の培養
培地。
（構成９７）
前記解凍された全臍帯血サンプル中で少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%
、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%のTNCを維持する、構成96記載の培養
培地。
（構成９８）
前記少なくとも1つの作用剤が:cAMPアナログ又はエンハンサー、Gα-s活性化因子、及
びプロスタグランジン経路アゴニストからなる群より選択される、構成96又は構成97記載
の培養培地。
（構成９９）
前記少なくとも1つの作用剤が選択的にPGE2 EP2又はPGE2 EP4受容体に結合する、構成9
6又は構成97記載の培養培地。
（構成１００）
前記少なくとも1つの作用剤が、PGE2、又はPGE2アナログ又は誘導体を含む、構成96又
は構成97記載の培養培地。
（構成１０１）
前記少なくとも1つの作用剤が:PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-メチルPGE2、20-エチル
PGE2、及び8-イソ-16-シクロヘキシル-テトラノルPGE2からなる群より選択される、構成9
6又は構成97記載の培養培地。
（構成１０２）
前記少なくとも1つの作用剤が、16,16-dmPGE2を含む、構成96又は構成97記載の培養培
地。
（構成１０３）
前記サンプルを、前記少なくとも1つの作用剤と、約1時間〜約4時間の間接触させる、
構成96又は構成97記載の培養培地。
（構成１０４）
前記サンプルを、前記少なくとも1つの作用剤と、約1時間又は約2時間の間接触させる
、構成96又は構成97記載の培養培地。
（構成１０５）
前記サンプルを、前記少なくとも1つの作用剤と約25℃〜約37℃の温度で接触させる、
構成96又は構成97記載の培養培地。
（構成１０６）
前記サンプルを、前記少なくとも1つの作用剤と約30℃又は約37℃の温度で接触させる
、構成96又は構成97記載の培養培地。
（構成１０７）
前記サンプルを、10μMの16,16-dmPGE2と約37℃で、約2時間接触させる、構成96又は構
成97記載の培養培地。
（構成１０８）
CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及びULBP2からなる群よ
り選択される少なくとも2つの遺伝子の発現が、対照の全臍帯血サンプル中の少なくとも2
つの遺伝子の発現と比較して、前記接触させたサンプル中で約20倍増大する、構成96から
107のいずれか一項記載の培養培地。
（構成１０９）
CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及びULBP2からなる群よ
り選択される少なくとも5つの遺伝子の発現が、対照の全臍帯血サンプル中の少なくとも5
つの遺伝子の発現と比較して、前記接触させたサンプル中で約10倍、約3倍、又は約2倍増
大する、構成96から107のいずれか一項記載の培養培地。
（構成１１０）
前記遺伝子CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及びULBP2の
発現が、対照の全臍帯血サンプル中の遺伝子の発現と比較して、前記接触させたサンプル
中で約10倍、約5倍、約3倍、又は約2倍増大する、構成96から107のいずれか一項記載の培
養培地。
（構成１１１）
前記全臍帯血サンプルが、約25℃〜約37℃の温度で約1〜約24時間の間、プロスタグラ
ンジン経路を調節する少なくとも1つの作用剤とサンプルとを接触させることによって、
培養培地中で調節され、ここで、該サンプルは、少なくとも70%のTNCを含み、かつ濃縮に
は供されない、構成1から21のいずれか一項記載の培養培地と接触させた全臍帯血サンプ
ル。
（構成１１２）
前記TNCが少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくと
も95%又は少なくとも99%である、構成111記載の全臍帯血サンプル。
（構成１１３）
前記少なくとも1つの作用剤が:cAMPアナログ又はエンハンサー、Gα-s活性化因子、及
びプロスタグランジン経路アゴニストからなる群より選択される、構成111又は構成112記
載の全臍帯血サンプル。
（構成１１４）
前記少なくとも1つの作用剤が選択的にPGE2 EP2又はPGE2 EP4受容体に結合する、構成1
11又は構成112記載の臍帯血サンプル。
（構成１１５）
前記少なくとも1つの作用剤がPGE2、又はPGE2アナログ又は誘導体を含む、構成111又は
構成112記載の全臍帯血サンプル。
（構成１１６）
前記少なくとも1つの作用剤が:PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-メチルPGE2、20-エチル
PGE2、及び8-イソ-16-シクロヘキシル-テトラノルPGE2からなる群より選択される、構成1
11又は構成112記載の全臍帯血サンプル。
（構成１１７）
前記少なくとも1つの作用剤が、16,16-dmPGE2を含む、構成111又は構成112記載の全臍
帯血サンプル。
（構成１１８）
前記全臍帯血サンプルを、前記少なくとも1つの作用剤と約1時間〜約4時間接触させる
、構成111又は構成112記載の全臍帯血サンプル。
（構成１１９）
前記全臍帯血サンプルを、前記少なくとも1つの作用剤と、約1時間又は約2時間接触さ
せる、構成111又は構成112記載の全臍帯血サンプル。
（構成１２０）
前記全臍帯血サンプルを、前記少なくとも1つの作用剤と、約25℃〜約37℃の温度で接
触させる、構成111又は構成112記載の全臍帯血サンプル。
（構成１２１）
前記全臍帯血サンプルを、前記少なくとも1つの作用剤と、約30℃又は約37℃の温度で
接触させる、構成111又は構成112記載の全臍帯血サンプル。
（構成１２２）
前記全臍帯血サンプルを、10μMの16,16-dmPGE2と、約37℃で、約2時間接触させる、構
成111又は構成112記載の全臍帯血サンプル。
（構成１２３）
CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及びULBP2からなる群よ
り選択される少なくとも2つの遺伝子の発現が、対照の全臍帯血サンプル中の少なくとも2
つの遺伝子の発現と比較して、前記接触させたサンプル中で約20倍増大する、構成111か
ら122のいずれか一項記載の全臍帯血サンプル。
（構成１２４）
CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及びULBP2からなる群よ
り選択される少なくとも5つの遺伝子の発現が、対照の全臍帯血サンプル中の少なくとも5
つの遺伝子の発現と比較して、前記接触させたサンプル中で約10倍、約3倍又は約2倍増大
する、構成111から122のいずれか一項記載の全臍帯血サンプル。
（構成１２５）
前記遺伝子CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3、及びULBP2の
発現が、対照の全臍帯血サンプル中の遺伝子の発現と比較して、前記接触させたサンプル
中で約10倍、約5倍、約3倍又は約2倍増大する、構成111から122のいずれか一項記載の全
臍帯血サンプル。
【外国語明細書】
2020089373000001.pdf