(57)【要約】      （修正有）【課題】酵素調製物により基質を処理する方法、新規な酵素調製物、および酵素調製物を調製する方法の提供、また、ラクターゼの提供。【解決手段】ラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり４０単位未満のアリールスルファターゼ活性体を含む、細胞内産生ラクターゼであって、クロマトグラフィを用いてラクターゼからアリールスルファターゼを分離する工程を含む方法。また、基質を酵素調整物で処理する工程を含み、その酵素調製物がアリールスルファターゼを実施的に含有しない方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり４０単位未満のアリールスルファターゼ活性体を含むラクターゼ。
【請求項２】
ラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり３０単位未満のアリールスルファターゼ活性体、より好ましくはラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり２０単位未満のアリールスルファターゼ活性体、最も好ましくはラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり１０単位未満のアリールスルファターゼ活性体を含む請求項１に記載のラクターゼ。
【請求項３】
細胞内産生ラクターゼである請求項１または２に記載のラクターゼ。
【請求項４】
中性ラクターゼ、好ましくはＫ．ｌａｃｔｉｓラクターゼである請求項１〜３のいずれか一項に記載のラクターゼ。
【請求項５】
ｐＨ＝６〜ｐＨ＝８に最適ｐＨを有する請求項１〜４のいずれか一項に記載のラクターゼ。
【請求項６】
ラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり０．５ＲＦＵ／ｍｉｎ未満のプロテアーゼ活性体を有する請求項１〜５のいずれか一項に記載のラクターゼ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のラクターゼを含む組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のラクターゼまたは請求項７に記載の組成物を含む乳製品。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のラクターゼまたは請求項７に記載の組成物を、ラクトースを含む乳製品に添加する工程を含む、乳製品の製造方法。
【請求項１０】
アリールスルファターゼにより生成するオフフレーバーのない乳製品の製造方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載のラクターゼまたは請求項７に記載の組成物を使用する工程を含む方法。
【請求項１１】
ラクターゼ含有酵素調製物を精製する方法であって、クロマトグラフィを用いてラクターゼからアリールスルファターゼを分離する工程を含む方法。
【請求項１２】
酵素調製物で基質を処理する工程を含む方法であって、前記酵素調製物がアリールスルファターゼを実質的に含有しない方法。
【請求項１３】
前記酵素調製物が請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の酵素調製物である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項２３〜２５のいずれか一項または請求項３４もしくは３５に記載の方法により、酵素調製物を得る工程を含む請求項１０または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記基質がタンパク質性基質である請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記基質が、硫酸基で置換されたアルキルフェノールを含む請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記基質が、乳タンパク質、例えばカゼインおよび／または乳清タンパク質を含む請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記基質が、ミルク、醗酵乳製品、例えばヨーグルト、乳清、加水分解物および／または肉である請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記処理過程における基質中のアリールスルファターゼ濃度が、基質１リットル当たり５００＊１０Ｅ３アリールスルファターゼ単位以下、基質１リットル当たり好ましくは２５０＊１０Ｅ３アリールスルファターゼ単位以下、好ましくは１００＊１０Ｅ３アリールスルファターゼ単位以下、好ましくは５０＊１０Ｅ３アリールスルファターゼ単位以下、好ましくは２５＊１０Ｅ３アリールスルファターゼ単位以下である請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵素調製物が、ラクターゼ、プロテアーゼ、リパーゼまたはエステラーゼを含む、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
栄養食品（例えば、乳製品）を調製する方法である請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１０〜２１のいずれか一項に記載の方法により得られる製品。
【請求項２３】
酵素調製物を調製する方法であって、前記方法は、対象酵素およびアリールスルファターゼを含有する粗酵素調製物を精製する工程を含み、アリールスルファターゼが対象酵素から分離される方法。
【請求項２４】
前記精製により、アリールスルファターゼ活性体が、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、低減される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記精製が、クロマトグラフィにより、好ましくは１回のクロマトグラフ分離工程で行われる請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
アリールスルファターゼ欠損菌株である宿主細胞を製造する方法であって、アリールスルファターゼを産生する培養物を、その培養物の一部が変質してアリールスルファターゼ欠損宿主細胞を作り出すような条件に置く工程、およびその宿主細胞を分離する工程を含む方法。
【請求項２７】
突然変異誘発条件、好ましくは物理的または化学的突然変異誘発などのランダム突然変異誘発条件が使用される請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
遺伝子組換え操作技術、好ましくはワンステップの遺伝子破壊、マーカー挿入、部位特異的突然変異誘発、削除、ＲＮＡ干渉、アンチセンスＲＮＡが使用される請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）栄養培地中、ポリペプチドの発現を誘導する条件下で、アリールスルファターゼ欠損宿主細胞を培養する工程、
（ｂ）前記宿主細胞中で前記ポリペプチドを発現させる工程、および
（ｃ）必要に応じて、前記栄養培地または前記宿主細胞から前記ポリペプチドを回収する工程
を含む方法によりポリペプチドを製造する方法。
【請求項３０】
（ａ）ポリペプチドを発現する発現ベクターによりアリールスルファターゼ欠損宿主細胞を形質転換する工程、
（ｂ）栄養培地中、前記ポリペプチドの発現を誘導する条件下で、前記宿主細胞を培養する工程、
（ｃ）前記宿主細胞中で前記ポリペプチドを発現させる工程、および
（ｄ）必要に応じて、前記栄養培地または前記宿主細胞から前記ポリペプチドを回収する工程
を含む方法によりポリペプチドを製造する方法。
【請求項３１】
（ａ）アリールスルファターゼの産生を妨げる栄養培地中で、かつポリペプチドの発現を誘導する条件下で、宿主細胞を培養する工程、
（ｂ）前記宿主細胞中で前記ポリペプチドを発現させる工程、および
（ｃ）必要に応じて、前記栄養培地または前記宿主細胞から前記ポリペプチドを回収する工程
を含む方法によりポリペプチドを製造する方法。
【請求項３２】
（ａ）ポリペプチドを発現する発現ベクターにより宿主細胞を形質転換する工程、
（ｂ）アリールスルファターゼの産生を妨げる栄養培地中で、かつ前記ポリペプチドの発現を誘導する条件下で、前記宿主細胞を培養する工程、
（ｃ）前記宿主細胞中で前記ポリペプチドを発現させる工程、および
（ｄ）必要に応じて、前記栄養培地または前記宿主細胞から前記ポリペプチドを回収する工程
を含む方法によりポリペプチドを製造する方法。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが酵素である請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
酵素調製物を調製する方法であって、前記方法が、請求項３３に記載の方法によって酵素を調整する工程、および栄養培地または宿主細胞から酵素調製物を回収する工程を含む方法。
【請求項３５】
前記酵素が、ラクターゼ、プロテアーゼ、リパーゼまたはエステラーゼである請求項２３〜２５のいずれか一項または請求項３３もしくは３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項２３〜２５のいずれか一項または請求項３５に記載の方法により得られる酵素調製物。
【請求項３７】
前記酵素調製物が、ラクターゼ、プロテアーゼ、リパーゼおよび／またはエステラーゼを含む請求項１２〜３６のいずれか一項に記載の酵素調製物。
【請求項３８】
カルボキシペプチダーゼを含む酵素調製物であって、１ＣＰＧ当たり１００００単位未満のアリールスルファターゼ活性体を含む酵素調製物。
【請求項３９】
１ＣＰＧ当たり１０００単位未満、好ましくは１００単位未満、好ましくは５０単位未満、好ましくは１０単位未満のアリールスルファターゼ活性体を含む請求項３８に記載の酵素調製物。
【請求項４０】
プロリン特異性プロテアーゼを含む酵素調製物であって、１ＰＰＵ当たり３００＊１０Ｅ３単位未満のアリールスルファターゼ活性体を含む酵素調製物。
【請求項４１】
１ＰＰＵ当たり１００＊１０Ｅ３単位未満のアリールスルファターゼ活性体を含む請求項４０に記載の酵素調製物。
【請求項４２】
ラクターゼを含む酵素調製物であって、ラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり４０単位未満のアリールスルファターゼ活性体を含む酵素調製物。
【請求項４３】
ラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり３０単位未満のアリールスルファターゼ活性体、より好ましくはラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり２０単位未満のアリールスルファターゼ活性体、最も好ましくはラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり１０単位未満のアリールスルファターゼ活性体を含む請求項４２に記載の酵素調製物。
【請求項４４】
請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の酵素調製物の、乳製品を調製するための使用。
【請求項４５】
請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の酵素調製物の、オフフレーバーの生成を防止または減少させるための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素調製物により基質を処理する方法、新規な酵素調製物、および酵素調製物を調製する方法に関する。本発明は、また、ラクターゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
食品グレードの製品の化学的性質、生化学的性質または感覚刺激性を改善するために、酵素が広く使用されている。また、牛乳や他の動物由来の基質の加工において、酵素の使用によって最終製品に大きな価値を付与している。例としては、ミルクをラクトース不耐性の個体が受容できるようにするためにラクターゼとインキュベーションすること、カゼインおよび乳清タンパク質のアレルギー誘発性を抑制し泡立ち特性を改良するためにタンパク質分解性加水分解を行うこと、ベーキング性およびマヨネーズの安定性を改良するために、ホスホリパーゼＡ２を使用して卵のリン脂質を改質すること、肉および魚製品の硬さと弾力性を改良するためにトランスグルタミナーゼを使用すること、さらにはグルコースオキシダーゼの添加により卵製品または粉チーズから酸素を除去することが挙げられる。さらに、各種動物由来の食品のフレーバーを増進させるために、酵素処理が行われている。例えば、魚および肉製品のフレーバーの醸成を加速させるためにプロテアーゼが使用されている。さらに、チーズのフレーバー醸成を加速させることも、よく知られた対象である。ＥＭＣ（酵素変性チーズ）が、主として種々のリパーゼを使用する確立された製品であるのに対し、チーズの熟成期間中に生じる風味の微妙な変化を、微量のエキソプロテアーゼ、リパーゼまたはエステラーゼを加えることによって加速させることが、最近開発されている。
【０００３】
本発明は、また、ラクターゼに関する。ラクターゼ、すなわちβ−ガラクトシダーゼ（Ｅ．Ｃ：３．２．１．２３）は、ラクトース（二糖類）がその構成成分である単糖類のグルコースおよびガラクトースに加水分解するのを触媒する酵素である。ラクトースは乳製品に、より具体的には、ミルク、スキムミルク、クリームおよび他のミルク製品に含まれる。ラクトースは、人体（および他の哺乳動物）の腸壁で、天然に存在するラクターゼによって分解される。
【０００４】
ラクターゼが欠損する人々の大部分に、ラクトースにより引き起こされる栄養および機能上の問題があることはよく知られ、また記載もされている。そのような人々は、ラクトースを加水分解することができず、その場合、ラクトースは大腸に達し、そこで脱水症、カルシウム吸収の低下、下痢、鼓腸、おくびおよび腹痛、そして重症の場合には、水分の多い劇症の下痢をも引き起こす。
【０００５】
工業的に重要なラクターゼの用途の一つに、ラクトース不耐性の人々のためのラクトース加水分解ミルク製品の製造がある。そのような加水分解ミルク製品としては、殺菌ミルク、ＵＨＴミルクおよび、タンパク質加水分解などの中間処理工程を経るかまたは経ないで、元の成分の全部または一部から還元したミルクが挙げられる。ラクターゼによる処理は、ミルクの熱処理前に行ってもよいし、後に行ってもよい。ラクターゼによる処理は、ミルクに酵素を加えることによって行うことができる。ラクトースの溶解特性は、結晶化するほどのものであるため、生地が砂のようなザラザラしたものになりやすい。そうした望ましくない生地は、コンデンスミルク、濃縮ミルク、粉ミルク、冷凍乳、アイスクリームなどのいくつかの乳製品や、ミルクを高濃度で含有する菓子製品に見られる。ラクターゼによりラクトースの全部または一部を加水分解することにより、この問題を解消し、均一な生地の製品を提供することができ、その結果、顧客受容性を高めることができる。
【０００６】
ラクターゼの別の工業的用途は、ミルクまたはヨーグルトのようなラクトース含有製品の甘味を増大させることである。そのような製品のラクトースを加水分解すると、グルコースが生成され、その結果として甘味が増大する。ラクターゼの別の工業的用途は、パンなどの、乳製品成分を含むラクトース製品の加水分解である。ラクトースは、フレーバーの増進、湿分の保持、褐色の付与および焼き特性の改善のために、そうした製品に添加されている。加水分解したラクトースシロップは、例えば、パンの耳の発色促進、フレーバーおよび香りの改善、生地の改質、保存期間の延長、並びにパンの塊構造の強化に関して有望である。
【０００７】
ヨーグルトなどの醗酵乳製品において、ラクターゼによりラクトースの加水分解を行うと、甘味が増大する。しかしながら、醗酵処理の開始前にラクターゼを加えると、酸の生成速度が速まり、その結果、処理時間が短縮される。ミルク、または乳清などのミルク由来の製品をラクターゼで処理すれば、猫などのラクトース不耐性動物用の飼料およびペットフードの用途に適したものとすることができる。ラクトースの加水分解により、より濃縮度の高い乳清の製造が可能になり、同時に、ラクトース欠乏患者について先に記載したことと類似の、腸の問題を回避することができる。ラクトース加水分解乳清は、濃縮することにより固形分７０〜７５％を含有するシロップが製造され、アイスクリーム、パンおよび菓子製品の食品添加物として使用される。
【０００８】
ラクターゼは、微生物を含む、非常に広範囲の生物で報告されており、また、そうした生物から単離されている。ラクターゼは、多くの場合、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓやＢａｃｉｌｌｕｓのような微生物の細胞内成分である。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、特にＫ．ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓ、並びに、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｔｏｒｕｌａ属およびＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属の酵母などは、酵母酵素ラクターゼの一般的なソースであり、一方、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓまたはＢ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓは細菌ラクターゼのよく知られたソースである。Ｍａｘｉｌａｃｔ（登録商標）（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ由来。オランダ、デフルト（Ｄｅｆｌｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のＤＳＭ社製。）など、それらの生物に由来するラクターゼ調製物がいくつか商業的に入手可能である。これらラクターゼは全て、最適ｐＨがｐＨ＝６〜ｐＨ＝８であるため、所謂、中性ラクターゼである。生物の中には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒやＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのように、細胞外ラクターゼを産生するものがあり、米国特許第５，７３６，３７４号明細書には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅにより産生された、そのようなラクターゼの例が記載されている。最適ｐＨや最適温度などのラクターゼの酵素特性は種によって変化する。しかしながら、一般に、排出されたラクターゼは、最適ｐＨがｐＨ＝３．５〜ｐＨ＝５．０と低く、細胞内ラクターゼは、通常、ｐＨ＝６．０〜ｐＨ＝７．５の範囲というより高い最適ｐＨを示す。しかし、これらの一般則からの例外も見られる。中性ラクターゼを選択するか、または酸性ラクターゼを選択するかは、用途におけるｐＨプロファイルに依る。中性ｐＨの用途では、通常、中性ラクターゼが好ましい。そのような用途としては、ミルク、アイスクリーム、乳清、チーズ、ヨーグルト、粉ミルクなどが挙げられる。酸性ラクターゼは、酸性範囲の用途により適している。ラクターゼの適切な濃度は、ラクトースの初期濃度、必要とする加水分解の程度、ｐＨ、温度および加水分解時間に依存する。
【０００９】
食品の機能面および／または風味面での改良を目的としているものの、酵素処理は時として予期しない、かつ望ましくない副次的作用をもたらすことがある。望ましくない副次的作用の一例は、酵素処理の結果、オフフレーバーが発生することである。
【００１０】
メッタール（Ｍｅｔｔａｌｌ）ら、ジ・オーストラリアン・ジャーナル・オブ・デーリー・テクノロジー（Ｔｈｅ  Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、（１９９１年）、４６−４８頁には、ミルクをラクターゼで処理したときに発生するオフフレーバーの問題が記載されている。この刊行物によれば、高濃度のプロテアーゼがオフフレーバーの急激な増強の原因であるとみられる。したがって、オフフレーバー生成のリスクを低減するために、副次的なタンパク質の分解を最小にするよう、製造プロセスを最適化している。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ由来のラクターゼを精製する方法の一例が、国際公開第０２／０８１６７３号パンフレットに記載されている。
【００１１】
プロテアーゼ活性の低いラクターゼ調製物であってもなお、オフフレーバーを生成することがあることが判っている。酵母の細胞質由来の中性ラクターゼの場合、特にそうである。ラクターゼ調製物の使用に伴うオフフレーバーの生成は、ラクトース加水分解ＵＨＴミルクで特に問題となる。この場合使用されるラクターゼは、最適ｐＨがミルクに好ましいものであるという理由から、中性ラクターゼである。ＵＨＴミルクには、室温で数ヶ月という保存期間を確保するために高温の熱処理が施されている。冷蔵庫外で長期間保存すると、これらの製品はオフフレーバーを生成しやすい。たとえオフフレーバー生成速度が非常に遅かったとしても、数ヶ月の保存の後では、かなりのオフフレーバーが生成される。これはこの製品を消費しようとする魅力を消失させる。
【発明の概要】
【００１２】
意外にも、酵素調製物中に不純物として混入した副活性体のアリールスルファターゼの存在が、たとえ非常に低い濃度であっても、その調製物で基質を処理したとき、製品中のオフフレーバーが強く増強されることがあり、また、アリールスルファターゼ活性体が全くないかまたは少ない酵素調製物を使用すると、オフフレーバーの増強が強く抑制されることが判った。
【００１３】
したがって、本発明は、一つの態様では、アリールスルファターゼを実質的に含まない酵素調製物で基質を処理することを含む方法を提供するものである。
【００１４】
本発明は、また、別の態様では、アリールスルファターゼを実質的に含まない酵素調製物を提供するものである。
【００１５】
本発明は、また、特別の態様では、ラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり４０単位未満のアリールスルファターゼ活性体を含むラクターゼを提供するものである。
【００１６】
本発明のラクターゼ調製物は、食品および飼料製品において、オフフレーバー化合物を生成せずにラクトースを加水分解するのに有用である。
【００１７】
本発明者らは、意外にも、アリールスルファターゼが、オフフレーバー生成の原因として極めて重要な酵素活性体であることを見出した。本発明者らは、ＵＨＴミルクにアリールスルファターゼを加えることにより、この単一の酵素が、ラクターゼ処理ＵＨＴミルクでしばしば観測されるオフフレーバーを再現できるとの結論に至る確証的証拠を得た。
【００１８】
科学的理論に縛られずに言うならば、代謝抱合体、特に硫酸基で置換されたアルキルフェノールのアリールスルファターゼによる加水分解が、オフフレーバーを醸成する１つのメカニズムであると考えられる。したがって、本発明の酵素調製物は、硫酸基で置換されたアルキルフェノールを含有する基質の処理に対して、特に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＴＯＰＯベクターにおけるＫ．ｌａｃｔｉｓアリールスルファターゼ遺伝子の５’−フランクのクローニング。
【図２】ＴＯＰＯベクターにおけるＫ．ｌａｃｔｉｓアリールスルファターゼ遺伝子の３’−フランクのクローニング。
【図３】ＴＯＰＯベクターにおけるＳａｃｌｌサイト欠損Ｋ．ｌａｃｔｉｓアリールスルファターゼ遺伝子の３’−フランクのクローニング。
【図４】１つのプラスミドにおける５’−フランクとａｍｄＳ選択カセットとの結合。
【図５】１つのプラスミドにおける５’−フランク、３’−フランクおよびａｍｄＳ選択カセットの結合。
【図６】アリールスルファターゼノックアウト構築体の最終的な構築。
【図７】基質としてＤａｂｃｙｌ−Ｅｄａｎｓを使用したエンドプロテアーゼのプロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
一つの態様では、本発明は、ラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり４０単位未満のアリールスルファターゼ活性体を含むラクターゼを提供するものである。ラクターゼは、ラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり３０単位未満のアリールスルファターゼ活性体を含むことが好ましく、ラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり２０単位未満のアリールスルファターゼ活性体を含むことがより好ましく、ラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり１０単位未満のアリールスルファターゼ活性体を含むことが特に好ましい。アリールスルファターゼ単位は実施例２で定義され、ＮＬＵで表されるラクターゼ活性体に対して正規化されている。これもまた、実施例２で定義されている。
【００２１】
ラクターゼは、細胞内産生ラクターゼであってもよいし、または細胞外産生ラクターゼであってもよい。好ましい実施態様では、ラクターゼは細胞内産生ラクターゼである。
【００２２】
好ましい実施態様では、ラクターゼは中性ラクターゼである。この中性ラクターゼは、ｐＨ＝６〜ｐＨ＝８の最適ｐＨを有していてもよい。
【００２３】
中性ラクターゼ調製物は、通常、微生物の細胞質に由来する。それらの製造法としては、（大規模な）微生物の醗酵を行った後、ラクターゼを分離することが挙げられる。後者は、細胞質から酵素を放出させるために細胞壁の破壊を必要とする。細胞の溶解には、オクタノールなどの有機溶媒による細胞壁の透過化、超音波分解またはフレンチプレッシング（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓｉｎｇ）などの技術が使用される。プロテアーゼなどのラクターゼ以外の他の酵素も細胞質から同時に放出される。
【００２４】
好ましい実施態様では、ラクターゼは、ラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり０．５ＲＦＵ／ｍｉｎ未満のプロテアーゼ活性体を有する。
【００２５】
本発明により精製することができる細胞内ラクターゼは、微生物を含む、非常に広範囲の生物で報告されており、また、そうした生物から単離されている。ラクターゼは、多くの場合、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓやＢａｃｉｌｌｕｓのような微生物の細胞内成分である。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、特にＫ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ  ｍａｒｘｉｎｕｓおよびＫ．ｆｒａｇｉｌｉｓ、並びに、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｔｏｒｕｌａ属およびＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属の酵母などは、酵母酵素ラクターゼの一般的なソースであり、一方、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓまたはＢ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓは細菌ラクターゼのよく知られたソースである。Ｍａｘｉｌａｃｔ（登録商標）（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ由来、ＤＳＭ社製）など、それらの生物に由来するラクターゼ調製物がいくつか商業的に入手可能である。これらラクターゼは全て、最適ｐＨがｐＨ＝６〜ｐＨ＝８であるため、所謂、中性ラクターゼである。
【００２６】
細胞内ラクターゼは、様々な種で報告されており、そのうちのいくつかは、アミノ酸配列および／またはＤＮＡ配列が知られている。配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（米国メリーランド州、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡ））、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（英国、ヒンクストン（Ｈｉｎｘｔｏｎ，ＵＫ）のＥＭＢＬ−Ｂａｎｋ）、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）（日本国、三島（Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｊａｐａｎ））およびＳｗｉｓｓｐｒｏｔ（スイス（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））の配列データベースで公的に入手可能である。ラクターゼは、遺伝子および／またはタンパク質配列の相同性に基づき、ゲノムから同定することができる。細胞内酵素の粗調製物は、細胞の中央代謝に関与する酵素、例えば解糖に関与する酵素など、細胞の細胞質にのみ存在する酵素のいくつかが含まれるという特徴がある。
【００２７】
細胞外ラクターゼについても報告がされている。それらは、リーダー配列と呼ばれるペプチド配列を含有していることから、一般に、細胞外酵素であると見られている。このリーダー配列は、細胞外へ酵素を排出すべきであるという信号として、酵素を産生する細胞により、ある方法で認識される。分泌の間に、通常、リーダー配列は除去される。細胞外ラクターゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅなどの様々な種で報告がされている。細胞外酵素の粗調製物は、細胞内酵素を含まず、かつプロテアーゼのような典型的な細胞外酵素を含むという特徴がある。発見された細胞外酵素のタイプは、生物により異なり、その生物に特有なものである。醗酵または処理中に細胞が溶解するために、そのような細胞外酵素調製物中には、低濃度の細胞内酵素を見出すことができる。
【００２８】
ラクターゼ酵素は、このように、それらのアミノ酸配列を、他の既知のラクターゼのものと比較することによって、細胞外または細胞内ラクターゼとして分類することができる。原理的には、細胞内ラクターゼはリーダー配列を有することができる。これにより、ラクターゼは細胞から培地中へ排出されよう。このような酵素の粗調製物は、アミノ酸配列に基づき細胞内酵素として分類されたラクターゼが、典型的な細胞外酵素が存在し、かつ、典型的な細胞内酵素が存在しないかまたは低濃度で存在する中で、存在するという特徴を有するであろう。
【００２９】
本発明において使用される好ましい細胞内ラクターゼは：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／ＢＧＡＬ  ＫＬＵＬＡに記載のアミノ酸配列を有するＫ．ｌａｃｔｉｓラクターゼ、または、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのアミノ酸配列に対し、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の類似度のアミノ酸配列を有するラクターゼ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／Ｑ６ＱＴＦ４  ＫＬＵＭＡに記載のアミノ酸配列を有するＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓラクターゼ、または、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の類似度のアミノ酸配列を有するラクターゼ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ−ｓｒｖ／ｕｎｉＰｒｏｔＶｉｅｗ．ｄｏ？ｐｒｏｔｅｉｎＩｄ＝Ｏ３１３４１  ＢＡＣＣＩ＆ｐａｇｅｒ．ｏｆｆｓｅｔ＝０
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ−ｓｒｖ／ｕｎｉＰｒｏｔＶｉｅｗ．ｄｏ？ｐｒｏｔｅｉｎＩｄ＝Ｑ４５０９２  ＢＡＣＣＩ＆ｐａｇｅｒ．ｏｆｆｓｅｔ＝０
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ−ｓｒｖ／ｕｎｉＰｒｏｔＶｉｅｗ．ｄｏ？ｐｒｏｔｅｉｎＩｄ＝Ｑ４５０９３  ＢＡＣＣＩ＆ｐａｇｅｒ．ｏｆｆｓｅｔ＝０に記載のアミノ酸配列を有するＢ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓラクターゼ、または、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の類似度のアミノ酸配列を有するラクターゼである。
【００３０】
用語「相同性」または「パーセント類似度」は、ここでは同じ意味で使用される。ここでは、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント類似度を決定するために、最適比較を目的として配列を配置するものと定める（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列と最適配置をとるために、第１のアミノ酸または核酸配列にギャップを挿入することができる）。それから、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置で、アミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列内の位置が、第２の配列の対応する位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同じもので占められているならば、その分子はその位置で同一である。２つの配列のパーセント類似度は、両配列で共有する同一位置の数の関数である（すなわち、％類似度＝同一位置の数／位置の総数（すなわち、オーバーラップする位置）×１００）。２つの配列が同じ長さであることが好ましい。当業者であれば、２つの配列間の相同性を決定するために、いくつかの異なるコンピュータプログラムを入手できることを知っているであろう。例えば、配列を比較し、２つの配列のパーセント類似度を決定するには、数学アルゴリズムを使用して行うことができる。好ましい実施態様では、２つのアミノ酸配列のパーセント類似度は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）に組み込まれているニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）（ジャーナル・オブ・モリキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ）（４８）：４４４−４５３頁（１９７０年））のアルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、並びに、ギャップ重量１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ重量１、２、３、４、５または６を使用して決定される。当業者であれば、これら全ての異なるパラメータにより若干異なる結果が得られるものの、異なるアルゴリズムを使用したときの２つの配列の全体的なパーセント類似度は、あまり大きくは変わらないことを認識しているであろう。
【００３１】
細胞内ラクターゼの調製には、ラクターゼ酵素を放出させるために細胞を破壊する必要がある。同時に、他の細胞質酵素も放出される。ラクターゼの工業的調製物の品質は、ラクターゼ活性体に対する副活性体の割合によって決定される。プロテアーゼはミルクの凝固またはミルクにおけるオフフレーバーの生成といった用途上望ましくない副次的作用を引き起こすことが知られていることから、特に問題の大きい副酵素である。オフフレーバーの生成は、保存期間が長く、かつ室温で保存される製品にとって、特に重大な問題である。そのような製品の１つにＵＨＴミルクがあり、ラクトース加水分解ＵＨＴミルクでは、オフフレーバーの生成は周知の問題である。ＵＨＴミルクはオフフレーバーの生成に対して非常に敏感であり、ラクターゼ調製物がＵＨＴミルクでオフフレーバーを発生させないならば、他の用途でも通常はオフフレーバーを発生させないであろう。ミルク、特にＵＨＴミルクのオフフレーバー生成に関係する化合物は、タンパク質分解反応およびメイラード反応（バレロ（Ｖａｌｅｒｏ）ら、（２００１年）、フード・ケミストリー（Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．）、７２、５１−５８頁）の両方に関連している。ラクターゼ調製物中に副活性体として存在するプロテアーゼはいかなるものであっても、オフフレーバーの生成を加速する可能性がある。どの程度のプロテアーゼ濃度が必要であるかは明らかではないが、数ヶ月に及ぶ保存期間では、非常に低いタンパク質分解活性であっても重要である。ＵＨＴミルクはオフフレーバーの生成に対して非常に敏感であり、ラクターゼ調製物が、文献に記載されている（例えば、バレロ（Ｖａｌｅｒｏ）ら、（２００１年）、フード・ケミストリー（Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．）、７２、５１−５８頁に記載されている）ようなオフフレーバー以外のオフフレーバーをＵＨＴミルクで発生させないならば、他の用途でも通常はオフフレーバーを発生させないであろう。したがって、ＵＨＴ適用は、ラクターゼ調製物のオフフレーバー生成能に関して品質評価を行うには、優れた方法である。プロテアーゼは、少なくとも部分的には、オフフレーバー生成の原因であったため、ラクターゼ製品のプロテアーゼ濃度を低下させることに集中的に努力した。しかしながら、本発明者らは、プロテアーゼ濃度を低減しても、ＵＨＴミルクのオフフレーバーの生成を完全には抑えられないことを見出した。本発明者らは、意外にも、アリールスルファターゼが、オフフレーバー生成の原因として極めて重要な酵素活性体であることを見出した。本発明者らは、ＵＨＴミルクにアリールスルファターゼを加えることにより、この単一の酵素が、ラクターゼ処理ＵＨＴミルクでしばしば観測されるオフフレーバーを再現できるという確証的証拠を得た。
【００３２】
本発明においては、ラクターゼ酵素からアリールスルファターゼを除去するために、クロマトグラフ法を開示する。ラクターゼ酵素は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ由来のものであることが好ましい
【００３３】
本発明者らは、オフフレーバーを含有しないか、またはオフフレーバーを相当濃度含有している種々のＵＨＴミルクの試料について、詳細な感覚分析を実施した（実施例１）。これらの感覚分析を、試料の化学組成の詳細な分析と組み合わせた。数種類の化合物が、キーとなる芳香化合物として同定され、その大部分はＵＨＴミルクに関係するものとして、既に文献に記載されているものであった。意外にも、ｐ−クレゾールもまた、キーとなるオフフレーバー化合物であることが判った。この化合物は、これまでにはＵＨＴミルク中のオフフレーバー化合物の中に記載されていなかった（バレロ（Ｖａｌｅｒｏ）ら、（２００１年）フード・ケミストリー（Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．）、７２、５１−５８頁）。これは、アリールスルファターゼによって、ミルク中に極めて微量に存在するスルフェート抱合体から生成される（Ｖ．ロペス（Ｖ．Ｌｏｐｅｚ）、Ｒ．Ｃ．リンゼイ（Ｒ．Ｃ．Ｌｉｎｄｓａｙ）、ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（Ｊ  Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．）（１９３３年）、４１、４４６−４５４頁；Ｍ．キリック（Ｍ．Ｋｉｌｌｉｃ）およびＲ．Ｃ．リンゼイ（Ｒ．Ｃ．Ｌｉｎｄｓａｙ）、ジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス（Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ）（２００５年）８８、７−１２頁；Ｍ．キリック（Ｍ．Ｋｉｌｉｃ）およびＲ．Ｃ．リンゼイ（Ｒ．Ｃ．Ｌｉｎｄｓａｙ）、ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（Ｊ  Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．）（２００５年）５３、１７０７−１７１２頁）。本発明者らは、意外にも、アリールスルファターゼがラクターゼ調製物中の酵素活性体であり、オフフレーバー生成の原因であることを見出した。本発明者らはこのことを、ＵＨＴミルクにアリールスルファターゼを加えることによって確認し、この単一の酵素がラクターゼ処理ＵＨＴミルクでしばしば観測されるオフフレーバーを実際に再現できることを見出した。本発明者らは、その後、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ由来のラクターゼ酵素からアリールスルファターゼを除去するためのクロマトグラフ法を開発した。本発明者らは、アリールスルファターゼを除去すると、ＵＨＴミルク中のオフフレーバーの生成も抑えられることを見出した。これは味覚パネリストによる試験によって明らかとなったものである。最終ラクターゼ製品中におけるアリールスルファターゼの濃度は、＜２０アリールスルファターゼ単位であり、好ましくは＜１０アリールスルファターゼ単位、より好ましくは＜８のアリールスルファターゼ単位、最も好ましくは０アリールスルファターゼ単位である。アリールスルファターゼ単位は、実施例２で定義されており、ＮＬＵで表され、実施例２で同様に定義されているラクターゼ活性に対して正規化されている）。ラクターゼの精製方法がいくつか文献に記載されているが（例えば、国際公開第０２／０８１６７３号パンフレット）、これらの精製方法はアリールスルファターゼを除去するためのものではなかった。これらの結果は、ともにＫ．ｌａｃｔｉｓに由来するアリールスルファターゼとラクターゼの、イオン交換（Ｑ−セファロース）クロマトグラフィおよび疎水性相互作用（ブチル���セファロース）クロマトグラフィにおける溶出挙動が極めて類似していることを示している。したがって、文献に記載された従来の方法では、アリールスルファターゼを含有しないラクターゼ調製物を得ることは期待できない。
【００３４】
クロマトグラフィによりラクターゼ調製物中のアリールスルフェート濃度を低下させる以外にも、ラクターゼ調製物からアリールスルファターゼ活性体を低減または除去する方法がある。これらには次のものがある。１）成長培地へのスルフェートの添加。スルフェートはアリールスルファターゼの発現を抑制することが知られており（バイル（Ｂｅｉｌ）ら、（１９９５年）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２２９、３８５−３９４頁）、したがって培地へのスルフェートの添加によって、アリールスルファターゼ濃度が低下することが期待される；２）ランダム突然変異導入法、または、例えば当業者に知られている分子生物学的技術を使用した直接的アプローチによる、生物ゲノムからのアリールスルファターゼ産生遺伝子の除去または破壊；３）アリールスルファターゼ活性体の天然の低産生株または非産生株である菌株のスクリーニングおよび選択；４）酵素抑制剤の添加。例えば、ある分類のアリールスルファターゼは、リン酸イオンによって抑制されることが知られている。
【００３５】
スルフェート、グルクロニドおよびホスフェートなどの代謝抱合体は、牛乳などの様々な種からのミルクに含まれている（ロペス（Ｌｏｐｅｚ）ら（１９９３年）ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．）４１、４４６−４５４頁；キリック（Ｋｉｌｌｉｃ）ら（２００５年）ジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス（Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ）８８、７−１２頁）。哺乳動物では、代謝抱合体は解毒および異物の水への溶解性促進の手段として広く受け入れられている。抱合体は、肝臓および腎臓で最も効率的に生成され、血流中を循環した後、主として尿および胆汁中に排泄される。アルカリフェノールや他の各種化合物の抱合体は、牛、ヤギおよび羊などの乳中に見出されている（ロペス（Ｌｏｐｅｚ）ら（１９９３年）ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．）４１、４４６−４５４頁）。代謝抱合体の種類および多様性は非常に幅広く、チオフェノール、フェノール、ｏ−クレゾールおよびｐ−クレゾールの抱合体が挙げられる。抱合により、硫酸基、リン酸基またはグルクロニド基の付加が起こる。これらの基は、アリールスルファターゼ、ホスフェートおよびグルクロニダーゼのような酵素により、抱合体から放出され、これにより毒性化合物が放出される。いくつかのタイプの抱合体が牛、羊およびヤギの乳中に存在することが示されており、抱合体の相対量は調製物間で異なり、少なくとも部分的に種が関係している（ロペス（Ｌｏｐｅｚ）ら（１９９３年）ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．）４１、４４６−４５４頁）。牛乳では、スルフェート抱合体が最も多く含まれる抱合体であるが、羊の乳ではホスフェート抱合体がスルフェートより多いことが示されている（ロペス（Ｌｏｐｅｚ）ら（１９９３年）ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．）４１、４４６−４５４頁）。
【００３６】
本出願においては、ミルク中に存在する抱合体が中性ラクターゼ調製物における副活性体の基質であることが示される。これらの抱合体の濃度は、種の間で変化し（ロペス（Ｌｏｐｅｚ）ら（１９９３年）ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ）、４１、４４６−４５４頁）、また、種の中では時間とともに変化する（キリック（Ｋｉｌｉｃ）ら、（２００５年）ジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス（Ｊ  ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ）、８８、７−１２頁）ことが知られている。このことがラクターゼの調製条件に影響すると予想される。例えば、ホスフェート抱合体の非常に豊富な羊乳では、ラクターゼ調製物のホスフォターゼ濃度の許容度は、同じラクターゼ調製物をホスフェート抱合体濃度が非常に低い牛乳に使用する場合と比較すると、かなり低いと予想される。この点に関しては、細胞内ラクターゼ調製物と細胞外ラクターゼ調製物に差はない。
【００３７】
別の態様では、本発明は、基質を酵素調製物で処理する方法を提供する。酵素調製物はアリールスルファターゼを実質的に含まないことが好ましい。
【００３８】
ここでは、アリールスルファターゼを実質的に含まない酵素調製物に、アリールスルファターゼ活性体が存在しないか、または、存在しても十分に低濃度であるため、関連する製造プロセスで意図した酵素活性体を有効量加えたときにも、前記製造プロセスで、前述したような負の感覚刺激効果を伴う硫酸化アルキルフェノールの分解が観察されないような酵素調製物であればいかなるものも包含される。
【００３９】
ここでは、アリールスルファターゼを実質的に含まない酵素調製物に、アリールスルファターゼの活性を対象とする酵素の活性で除した比が所定の値未満である酵素調製物が包含される。好ましい比は、使用する酵素および用途により変化する場合がある。
【００４０】
アリールスルファターゼ活性体とは、ＥＣ３．１．６．１に記載されているような、フェノールスルフェートをフェノールとスルフェートの部分に分解することができる硫酸エステルヒドロラーゼ活性体をいう。アリールスルファターゼ単位は、本願の材料および方法の項（および実施例２）で定義されている。他の酵素の活性体についても、本願の材料および方法の項で定義されている。
【００４１】
本発明のさらに別の態様では、本発明は、カルボキシペプチダーゼを含む酵素調製物であって、アリールスルファターゼ活性体の含量が、１カルボキシペプチダーゼ単位（ＣＰＧ）当たり１００００単位（ＡＳＵ）未満である酵素調製物を提供する。酵素調製物は、アリールスルファターゼ活性体の含量が、カルボキシペプチターゼ（ＣＰＧ）１単位当たり５０００単位未満であることが好ましく、より好ましくは１０００単位未満であり、より好ましくは５００単位未満であり、より好ましくは１００単位未満であり、より好ましくは５０単位未満であり、より好ましくは１０単位未満である。
【００４２】
さらに別の態様では、本発明は、プロリン特異性プロテアーゼを含む酵素調製物であって、アリールスルファターゼ活性体の含量が、プロリンプロテアーゼ１単位（ＰＰＵ）当たり３００＊１０Ｅ３単位（ＡＳＵ）未満である酵素調製物を提供する。酵素調製物は、アリールスルファターゼ活性体の含量が、１プロテアーゼ単位（ＰＰＵ）当たり、１００＊１０Ｅ３単位未満であることが好ましく、５０＊１０Ｅ３単位未満であることが好ましく、１０＊０Ｅ３単位未満であることが好ましく、５０００単位未満であることが好ましい。
【００４３】
さらに別の態様では、本発明は、（中性）ラクターゼを含む酵素調製物であって、アリールスルファターゼ活性体の含量が、ラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり４０単位（ＡＳＵ）未満である酵素調製物を提供する。酵素調製物は、アリールスルファターゼ活性体の含量が、ラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり３０単位未満であることが好ましく、ラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり２０単位未満であることがより好ましく、ラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たり１０単位未満であることが特に好ましい。
【００４４】
さらに別の態様では、本発明は、（酸性）ラクターゼを含む酵素調製物であって、アリールスルファターゼ活性体の含量が、ラクターゼ活性体１ＡＬＵ当たり４００単位（ＡＳＵ）未満である酵素調製物を提供する。酵素調製物は、アリールスルファターゼ活性体の含量が１００単位（ＡＳＵ）未満であることが好ましく、ラクターゼ活性体１ＡＬＵ当たり３０単位であることが好ましく、ラクターゼ活性体１ＡＬＵ当たり２０単位未満であることがより好ましく、ラクターゼ活性体１ＡＬＵ当たり１０単位未満であることが特に好ましい。
【００４５】
さらに別の態様では、本発明は、アミノペプチダーゼを含む酵素調製物であって、アリールスルファターゼ活性体の含量が、１ＡＰＵ当たり１０００単位（ＡＳＵ）未満、好ましくは１ＡＰＵ当たり３００単位（ＡＳＵ）未満、好ましくは１ＡＰＵ当たり１００単位（ＡＳＵ）未満、好ましくは１ＡＰＵ当たり３０単位（ＡＳＵ）未満、好ましくは１ＡＰＵ当たり１０単位（ＡＳＵ）未満である酵素調製物を提供する。
【００４６】
さらに別の態様では、本発明は、エステラーゼおよび／またはリパーゼを含む酵素調製物であって、アリールスルファターゼ活性体の含量が、１ＢＧＥ当たり１０＊１０Ｅ６単位（ＡＳＵ）未満、好ましくは１ＢＧＥ当たり３＊１０Ｅ６単位（ＡＳＵ）未満、好ましくは１ＢＧＥ当たり１＊１０Ｅ６単位（ＡＳＵ）未満、好ましくは１ＢＧＥ当たり３００＊１０Ｅ３単位（ＡＳＵ）未満である酵素調製物を提供する。
【００４７】
アリールスルファターゼを実質的に含まない酵素調製物による基質の処理には、前記処理過程における基質中のアリールスルファターゼの濃度が所定の値未満である場合の基質処理も包含される。
【００４８】
さらに別の態様では、本発明は、酵素調製物による基質の処理方法であって、前記処理過程における基質中のアリールスルファターゼの濃度が、基質１リットル当たり５００＊１０Ｅ３アリールスルファターゼ単位以下、基質１リットル当たり好ましくは２５０＊１０Ｅ３アリールスルファターゼ単位以下、好ましくは１００＊１０Ｅ３アリールスルファターゼ単位以下、好ましくは５０＊１０Ｅ３アリールスルファターゼ単位以下、好ましくは２５＊１０Ｅ３アリールスルファターゼ単位以下である方法を提供する。アリールスルファターゼ濃度を上記値未満に維持することは、基質が乳、好ましくは牛乳であるとき、特に有利であることが判った。
【００４９】
アリールスルファターゼを実質的に含まない酵素調製物には、対象の酵素とアリールスルファターゼとを含有する粗酵素調製物を精製し、アリールスルファターゼを対象の酵素から分離することによって得られる酵素調製物も包含される。
【００５０】
したがって、本発明は、また、酵素調製物の調製方法であって、対象の酵素とアリールスルファターゼとを含有する粗酵素調製物を精製し、アリールスルファターゼを対象の酵素から分離することを含む方法を提供する。この方法は、精製された酵素調製物で基質を処理することを含むことが有利である。
【００５１】
精製工程は、アリールスルファターゼ活性体を対象の酵素活性体に対し相対的に低減させるという効果を有する。精製によりアリールスルファターゼ活性体が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％低減されることが好ましい。当業者であれば、このことが、（ａＡＳ，ｐｕｒ／ａｅｎｚ，ｐｕｒ）／（ａＡＳ，ｃｒｕｄｅ／ａｅｎｚ，ｃｒｕｄｅ）が好ましくは≦０．５であり、好ましくは≦０．２であり、好ましくは≦０．１であり、好ましくは≦０．０５であり、好ましくは≦０．０１であることを意味することを理解するであろう。ここで
ａＡＳ，ｐｕｒ＝精製酵素調製物中のアリールスルファターゼ活性体（単位／ｍｌ）
ａｅｎｚ，ｐｕｒ＝精製酵素調製物中の対象酵素活性体（単位／ｍｌ）
ａＡＳ，ｃｒｕｄｅ＝粗酵素調製物中のアリールスルファターゼ活性体（単位／ｍｌ）
ａｅｎｚ，ｃｒｕｄｅ＝粗酵素調製物中の対象酵素活性体（単位／ｍｌ）
【００５２】
精製は適切ならばいかなる方法で行ってもよい。好ましい実施態様では、精製はクロマトグラフィで行われる。クロマトグラフィを用いて酵素調製物を精製する方法、それ自体は、公知である。最も適切なクロマトグラフ分離法の選択は、存在する関連酵素および関連アリールスルファターゼ活性体の分子特性に依存する。関係する分子特性は、等電点、疎水性、分子表面の電荷分布、関連酵素の分子量および副活性や、その他のたんぱく質化学特性である。適切なクロマトグラフ分離法を選択するにあたって、これらの特性を使用する実践的背景は、エイ・オー・ザ・プロテイン・ピュアリフィケーション・ハンドブック（ａ．ｏ．ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）（ベルギー（Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ディーゲム（Ｄｉｅｇｅｍ）のＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（現在、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から出版）に見出すことができる。適切なクロマトグラフ分離法としては、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフ法、疎水性相互作用クロマトグラフィなどが挙げられる。本発明においては、イオン交換クロマトグラフィまたは疎水性相互作用クロマトグラフィが好ましい。
【００５３】
好ましい実施態様では、精製は１回のクロマトグラフ分離工程で行われる。酵素活性体を、汚染アリールスルファターゼ活性体から１回のクロマトグラフ工程で効率良く分離できるという事実は、本発明の方法を工業的に利用するうえで特に有利である。
【００５４】
酵素調製物は、適切なものであればいかなる酵素を含んでいてもよい。好ましい実施態様では、酵素（以下、対象酵素ともいう）は、ラクターゼ、プロテアーゼ、リパーゼまたはエステラーゼである。本発明で使用される酵素を以下に記載する。
【００５５】
国際的に認められている全ての酵素の分類および命名法の基本はＩＵＭＢにより提供されている。最新のＥＣ番号のＩＵＭＢテキストは、インターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｗ／ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／ＥＣ３／４／１１／で閲覧することができる。このシステムでは、酵素は単一反応を触媒するという事実のもとに定義されている。これは、複数の異なるタンパク質が全て同一の酵素として記載され、また、複数の反応を触媒するタンパク質が複数の酵素として扱われることを意味している。
【００５６】
このシステムでは、プロテアーゼは、エンド−およびエキソプロテアーゼにさらに分類される。さらに、所謂ジ−およびトリペプチジルペプチダーゼが存在する。エンドプロテアーゼは、内部ペプチド結合を加水分解する酵素であり、エキソプロテアーゼは、末端α−アミノ基に隣接するペプチド結合（「アミノペプチダーゼ」）、または、末端カルボキシル基と末端から２番目のアミノ酸とのペプチド結合（「カルボキシペプチダーゼ」）を加水分解する酵素である。エンドプロテアーゼは触媒機構に基づいてサブ−サブクラスに分類される。セリンエンドプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２１）、システインエンドプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２２）、アスパラギン酸エンドプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２３）、金属エンドプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２４）およびスレオニンエンドプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２５）のサブ−サブクラスがある。チモシン（ＥＣ  ３．４．２３．４）またはムコールペプシン（ＥＣ  ３．４．２３．２３）などの、一般にミルクを凝固させてチーズを製造するプロテアーゼは、いずれもアスパルギン酸エンドプロテアーゼのクラスに属する。
【００５７】
エキソプロテアーゼの中で、所謂アミノペプチダーゼ（ＥＣ  ３．４．１１）は、タンパク質およびペプチド基質から、単一のアミノ基末端アミノ酸を連続的に除去することができる。エキソプロテアーゼの中で、カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ  ３．４．１６、３．４．１７および３．４．１８）は、タンパク質およびペプチド基質から、単一のカルボキシル基末端アミノ酸を連続的に除去することができる。ジ−およびトリペプチジルペプチダーゼ（ＥＣ  ３．４．１３、３．４．１４および３．４．１５）は、ペプチドまたはタンパク質のアミノ基末端側またはカルボキシル基末端側からジペプチドまたはトリペプチドを切断除去していくことができる。
【００５８】
本発明の実施態様では、酵素は、アスパルギン酸エンドプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２３）を除いたプロテアーゼである。
【００５９】
タンパク質またはペプチドに作用し、かつ本願の範囲において特に関連する他の酵素は、オメガペプチダーゼ（ＥＣ  ３．４．１９）、およびアミノ酸の側鎖を転移させることができる酵素である。そのような転移反応を受ける基質は、フリーのアミノ酸であってもよく、あるいは、たんぱく質またはペプチドに結合したアミノ酸であってもよい。後者の酵素群の例としては、タンパク質結合グルタミンのガンマアミド基を選択的に加水分解することができる酵素、すなわち、ペプチド−グルタミナーゼ（ＥＣ  ３．５．１．４３および３．５．１．４４）がある。
【００６０】
さらに、トランスグルタミナーゼ（ＥＣ  ２．３．２．１３）およびタンパク質−リシン  ６−オキシダーゼ（ＥＣ  １．４．３．１３）などの、タンパク質またはペプチドを架橋することができる酵素も典型的な例である。
【００６１】
ラクターゼ（ＥＣ  ３．２．１．２３）、すなわちラクトースを分解することができる微生物ベータ−ガラクトシダーゼは、本願の範囲において特に関係するものである。
【００６２】
リパーゼおよびエステラーゼは、ＥＭＣ（酵素変性チーズ）の製造で通常使用されており、そして、チーズの熟成が加速されることにより増大する利益を享受できることから、本願の範囲において特に関係を有するものである。したがって、リパーゼおよびエステラーゼは、本発明の方法により精製されるべき最も重要な対象である。ＩＵＭＢシステムによれば、リパーゼおよびエステラーゼはカルボン酸エステルヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．１．１）に属する。エステラーゼは様々な基質に広く作用することができるのに対して、リパーゼ（ＥＣ  ３．１．１．３）はトリアシルグリセロールのみを分解する。トリアシルグリセロールから、フォルメート、アセテート、プロピオネートまたはブチレートを除去することができるリパーゼも、しばしば「エステラーゼ」と称される。本願では、「エステラーゼ」という用語は、トリアシルグリセロールから、そのような短鎖カルボン酸を効率的に除去することができる酵素をいう。リパーゼまたはエステラーゼなどの両親媒性酵素の回収は、必要に応じて、胆汁酸または他の食品グレードの乳化剤を使用することにより改善される。リパーゼおよびエステラーゼの活性を決定する方法は、材料および方法の項に示す。
【００６３】
工業的に利用可能な食品グレードの酵素調製物は、通常、哺乳動物の組織（例えば膵臓からトリプシン）、あるいは、植物質（例えばパパイヤフルーツからパパイン）から得られる。好ましい実施態様では、酵素は、微生物種、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種などの細菌、あるいは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓもしくはＰｉｃｈｉａなどの酵母、または糸状菌から得られる。食品グレードの酵素調製物を産生することで知られる糸状菌としては、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａおよびＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓが挙げられる。本発明の一実施態様では、酵素調製物は、糸状菌、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅにより製造されるか、またはそれらに由来するものである。ここでは、そのような酵素調製物は、Ａ．ｎｉｇｅｒまたはＡ．ｏｒｙｚａｅによって製造されたセルフクローン酵素調製物も包含する。
【００６４】
対象酵素は、醗酵培地中で対象プロテアーゼを産生、好ましくは分泌する菌類を使用して、微生物による醗酵プロセスにより製造されたものであってもよい。当該技術分野では、そのような醗酵プロセスは公知であり、例えば、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットを参照されたい。従来技術の方法においては、酵素は、これもまた当該技術分野で知られている方法で醗酵培地から回収することができる。第１工程として、産生生物の細胞を、遠心分離またはろ過により培養液から分離する。細胞を含まない培養液を、例えば限外ろ過により濃縮し、続いてクロマトグラフィにより精製する。菌類の株は、通常、複数のアリールスルファターゼ活性体を産生するので、これらのアリールスルファターゼ活性体から関連する酵素を、クロマトグラフィにより１工程で分離することは重要である。さらなる問題は、特定の微生物が分泌する、異なる種類の酵素活性体、すなわち、求める酵素活性体および各種アリールスルファターゼ活性体が、非常に近い等電点を有することである。所望の酵素活性体と汚染アリールスルファターゼ活性体とをクロマトグラフィで分離したなら、こうして得られた精製酵素調製物は安定化させてもよい。
【００６５】
酵素が微生物によって分泌されず細胞内に留まっている場合には、生産微生物をろ過または遠心分離によって回収し、その後、保持された細胞を溶解し、関連する酵素活性体を放出させる。さらにろ過または遠心分離工程を行って細胞の破片を除去した後、液体部分を濃縮し、分泌された酵素に関して上述したように、安定化させる。
【００６６】
精製した液体の酵素調製物は濃縮し、グリセロールまたは他のポリオールなどの公知の安定化剤と混合する。あるいは、公知の沈殿および／または蒸発工程の後、よく知られた（スプレー）乾燥技術により、濃縮した酵素溶液から固体調製物を得る。
【００６７】
本発明においては、基質を酵素調製物で処理してもよい。基質は、適切なものであればいかなる基質であってもよい。基質は、タンパク質性の基質であることが好ましい。タンパク質性の基質は、タンパク質を含むものであればいかなる基質であってもよい。好ましい実施態様では、基質は、乳タンパク質、例えばカゼインおよび／または乳清タンパク質を含む。好ましい基質の例としては、乳、乳から製造された製品、醗酵乳製品（例えば、ヨーグルト）、乳清および／または加水分解物が挙げられる。基質は、また、肉を含んでいてもよい。
【００６８】
加水分解物としては、タンパク質性基質タンパク質、好ましくは動物由来の基質タンパク質を酵素により加水分解することによって生成されるものであればいかなるものであってもよい。乳清タンパク質加水分解物、カゼイン加水分解物およびスキムミルク加水分解物が好ましい。
【００６９】
好ましい実施態様では、基質は硫酸基で置換されたアルキルフェノールを含有する。アルキルフェノールとは、少なくとも１個の芳香族プロトンがアルキル基によって置換されたフェノール類をいう。アルキル基の長さは変化してもよく、また、分岐または置換されていてもよい。好ましいアルキルフェノールは、メチルフェノールおよびエチルフェノールである。
【００７０】
硫酸化アルキルフェノールとは、ヒドロキシ基の位置で硫酸化によって抱合されているアルキルフェノールをいう。
【００７１】
アリールスルファターゼ（ＥＣ  ３．１．６．１）は、アルキルフェノールスルフェートをアルキルフェノールとスルフェート部分に分解することができる硫酸エステルヒドロラーゼである。
【００７２】
基質の処理には、基質を酵素調製物と接触させるプロセスが含まれる。この処理には、基質を酵素調製物の存在下にインキュベートするプロセスが含まれる。酵素調製物は適切な方法で基質に添加される。
【００７３】
方法は、製品、例えば栄養食品、好ましくは乳製品が製造される方法であればいかなるものであってもよい。ここでは、乳製品は、乳タンパク質、例えばカゼインおよび／または乳清タンパク質を含有する全ての組成物を包含する。例を挙げれば、乳、乳から作られる製品、醗酵乳製品（例えばヨーグルト）、コンデンスミルク、エバミルク、粉ミルク、冷凍乳、アイスクリーム、乳清、および／またはチーズがある。製品は加水分解物であってもよい。
【００７４】
酵素調製物は、あらゆる適切な製品、例えば栄養食品、好ましくは乳製品を調製するために使用することができる。
【００７５】
本発明は、また、オフフレーバーの発生を防止または低減するための、本発明の酵素調製物の使用に関する。
【００７６】
一態様では、本発明は、アリールスルファターゼ欠損株の宿主細胞を製造する方法であって、アリールスルファターゼを産生する培養物を、その培養物の一部が変質してアリールスルファターゼ欠損宿主細胞を作り出すような条件に置く工程、およびその宿主細胞を分離する工程を含む方法を提供する。
【００７７】
好ましい実施態様では、突然変異誘発条件、好ましくは物理的または化学的突然変異誘発などのランダム突然変異誘発条件が使用される。
【００７８】
好ましい実施態様では、遺伝子組換え操作技術、好ましくはワンステップの遺伝子破壊、マーカー挿入、部位特異的突然変異誘発、削除、ＲＮＡ干渉、アンチセンスＲＮＡの技術が使用される。
【００７９】
本発明は、さらに、
（ａ）栄養培地中、ポリペプチドの発現を誘導する条件下で、アリールスルファターゼ欠損宿主細胞を培養する工程、
（ｂ）前記宿主細胞中でポリペプチドを発現させる工程、および
（ｃ）必要に応じて、栄養培地または宿主細胞からポリペプチドを回収する工程
を含む方法により、ポリペプチドを製造する方法を提供する。
【００８０】
本発明は、さらに、
（ａ）ポリペプチドを発現する発現ベクターによりアリールスルファターゼ欠損宿主細胞を形質転換する工程、
（ｂ）栄養培地中、ポリペプチドの発現を誘導する条件下で、宿主細胞を培養する工程、
（ｃ）宿主細胞中でポリペプチドを発現させる工程、および
（ｄ）必要に応じて、栄養培地または宿主細胞からポリペプチドを回収する工程
を含む方法により、ポリペプチドを製造する方法を提供する。
【００８１】
本発明は、さらに、
（ａ）アリールスルファターゼの産生を妨げる栄養培地中で、かつポリペプチドの発現を誘導する条件下で、宿主細胞を培養する工程、
（ｂ）前記宿主細胞中でポリペプチドを発現させる工程、および
（ｃ）必要に応じて、栄養培地または宿主細胞からポリペプチドを回収する工程
を含む方法により、ポリペプチドを製造する方法を提供する。
【００８２】
本発明は、さらに、
（ａ）ポリペプチドを発現する発現ベクターにより宿主細胞を形質転換する工程、
（ｂ）アリールスルファターゼを産生させない栄養培地中で、かつポリペプチドの発現を誘導する条件下で、宿主細胞を培養する工程、
（ｃ）宿主細胞中でポリペプチドを発現させる工程、および
（ｄ）必要に応じて、栄養培地または宿主細胞からポリペプチドを回収する工程
を含む方法により、ポリペプチドを製造する方法を提供する。
【００８３】
好ましい実施態様では、ポリペプチドは酵素である。好ましい実施態様では、酵素調製物を調製する方法であって、ここで開示された方法により酵素を調製する工程、および栄養培地または宿主細胞から酵素調製物を回収する工程を含む方法が提供される。
【００８４】
以下で、さらに開示する。
【００８５】
［醗酵抑制］
好ましい実施態様では、酵素調製物は、アリールスルファターゼの産生が制限ないし抑制された増殖培地中で培養された工業的宿主菌株を使用して製造される。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａでは、単一の硫黄源としてスルフェートを過剰に含有する培地で培養すると、有意な濃度のアリールスルファターゼは検出されないが、単一の硫黄源としてエタンスルフォネートを使用すると、有意量のアリールスルファターゼ活性体が産生されることが報告されている（バイル（Ｂｅｉｌ）ら、（１９９５年）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２２９、３８５−３９４頁）。したがって、醗酵培地に過剰のスルフェートを使用することも、工業的により重要な微生物においてアリールスルファターゼ活性体の生産を抑制する効果があると考えられる。したがって、硫黄源としてスルフェートを過剰に含有する培地で酵素産生生物を増殖させると、アリールスルファターゼ活性体量の少ない、好ましい酵素生成物が生産される。培地中に過剰のスルフェートが存在するとは、ここでは、微生物の増殖が完了した後にも、有意な量の遊離スルフェートが培養液中に依然残っていることを意味する。本発明においては、増殖の全期間中、増殖培地中のスルフェートのモル量が他の硫黄含有物質のモル量よりも多い限り、スルフェートが増殖培地中の唯一の硫黄源である必要はない。さらに、アリールスルファターゼ活性体を抑制する好ましい硫黄源として、スルフェートに代えてシステインまたはチオシアネートを使用することもできる。さらに、醗酵が終わった後でも、培養液中のアリールスルファターゼ活性体の抑制が解除されるのを防止するために、洗浄、貯蔵、および他の下流の処理工程における全溶液中で、有意量のスルフェートまたは他の抑制性硫黄源を含有させることは適切である。
【００８６】
［古典的菌株の改良］
アリールスルファターゼ欠損菌株は、遺伝子組換え操作技術を使用する遺伝子工学によって、宿主を突然変異誘発にかけることによって、またはその両方によって、得ることができる。本発明の、アリールスルファターゼをコードする遺伝子の修飾ないし不活性化は、親細胞に突然変異誘発法を適用し、親細胞に比べてアリールスルファターゼ発現能の小さい突然変異細胞を選択することによって達成される。特異的またはランダムな突然変異誘発は、例えば、適切な物理的もしくは化学的な突然変異誘発剤の使用、適切なオリゴヌクレオチドの使用、またはＤＮＡ配列にＰＣＲ利用突然変異誘発法を適用することにより、生起させることができる。さらに、突然変異誘発は、これらの突然変異誘発剤を任意に組み合わせて使用することによって生起させてもよい。
【００８７】
本発明の目的に適した物理的もしくは化学的な突然変異誘発剤の例としては、ガンマ線または紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸およびヌクレオチド類似体が挙げられる。そのような誘発剤を使用する場合、突然変異誘発は、選択した突然変異誘発剤の存在下に、突然変異を誘発すべき親細胞を、適切な条件でインキュベートし、遺伝子の発現が抑えられた突然変異細胞を選択することによって、通常、行われる。あるいは、そのような菌株を、ハイブリダイゼーションまたは交配や、プロトプラスト融合または遺伝子多様性を誘起する他の古典的遺伝子技術などの遺伝子技術を使用して、分離してもよい。得られたアリールスルファターゼ欠損菌株は、その後、アリールスルファターゼの発現レベルをモニタリングすることによって選別される。場合により、アリールスルファターゼ欠損菌株は、その後、宿主細胞中で発現する、所定の対象遺伝子の発現レベルを測定することによって選別される。アリールスルファターゼ活性体が低減された菌株の選別は、培養液中、培養上清中、透過した細胞中、または細胞溶解物中のアリールスルファターゼ活性体を直接測定することによって行ってもよい。アリールスルファターゼ活性体の測定に関し、工業的産生菌株の細胞を、必要に応じて透過処理し、蛍光基質（４−メチルウンベリフェロン−スルフェート（ＭＵＳ）など）とともに、その基質が細胞に取り込まれるまでインキュベートし、蛍光の減少を測定することによってアリールスルファターゼ活性の低い細胞をスクリーニングすることが可能である。そのような測定は、個々の培養物について、既存の蛍光光度計を用いて直接行ってもよく、あるいは、好ましいものであるが、蛍光の弱い細胞を選別し、さらなる培養のために使用するという方法でフローサイトメトリーによって行ってもよい。そのような方法で使用する細胞は、蛍光基質と共にインキュベートされる前に、突然変異誘発が行われていてもよく、いなくてもよい。
【００８８】
あるいは、増殖培地中における唯一の硫黄源としてのアルキルエステルのスルフェートエステル（クレシルスルフェートまたはエタンスルフォネートなど）上では増殖することができない菌株を選択することによって、アリールスルファターゼ活性が低減された菌株を分離してもよい。
【００８９】
本発明に適した菌株、特に、多くの工業的酵母菌株のように、１倍性でなく２倍性や異数性であるか、または他の倍数性を有する工業的産生菌株、あるいは、糸状菌のようにアリールスルファターゼをコードする複数の遺伝子を含む工業的産生菌株を分離するには、古典的な遺伝子技術を数回用いる必要がある。
【００９０】
［ＤＮＡ組換え技術］
あるいは、アリールスルファターゼ活性体量を低減させた工業的産生菌株は、ＤＮＡ組換え技術を使用して作製してもよい。ワンステップ遺伝子破壊、マーカー挿入、部位特異的突然変異誘発、削除、ＲＮＡ干渉、アンチセンスＲＮＡ、その他の、遺伝子を不活性化または破壊するいくつかの技術が、当該技術分野では知られており、いずれも、アリールスルファターゼ活性体を低減させた工業的産生菌株を得ることを目的に、アリールスルファターゼ活性体の合成を低減、抑制または阻害するために使用することができる。アリールスルファターゼ産生遺伝子の発現を指令する制御配列を変更することによってアリールスルファターゼを不活性化することも、本発明の一部である。遺伝子破壊によってプロモーター活性を低下させることが、その一例である。
【００９１】
近代的な遺伝子修飾技術、好ましくはアリールスルファターゼ活性体をコードする遺伝子を阻害することにより、より好ましくはアリールスルファターゼ活性体をコードする遺伝子にマーカー遺伝子を挿入することにより、最も好ましくはゲノムからアリールスルファターゼのコード領域の一部または全部を除去することにより、組換えアリールスルファターゼ欠損菌株を得ることができる。そのような遺伝子の不活性化を実現する方法は、多くの種類の微生物について報告され、当業者に知られており（例えば欧州特許第３５７１２７号明細書を参照）、実施例８にも記載されている。これによって、突然変異細胞内のアリールスルファターゼの発現が低下または消失する。これらの技術を使用して改質する宿主菌株にもよるが、アリールスルファターゼコード配列の全てまたは大部分を除去するためには、この方法を何回か繰り返す必要がある。
【００９２】
アリールスルファターゼなどの宿主遺伝子の修飾ないし不活性化は、遺伝子のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を使用して、確立されたアンチセンス技術によって行われる。より具体的には、遺伝子の発現は、ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を導入することにより、低下または消失させることができる。それは、細胞内で転写され、細胞内で生成されたｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる。したがって、相補的なアンチセンスヌクレオチド配列がｍＲＮＡにハイブリダイズできる条件下では、翻訳されるタンパク質の量は減少するか皆無となる。アンチセンスＲＮＡの発現については、ンギアム（Ｎｇｉａｍ）ら（アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、６６：７７５−７８２頁、２０００年）およびツレナー（Ｚｒｅｎｎｅｒ）ら（プランタ（Ｐｌａｎｔａ）、１９０：２４７−２５２頁、１９９３年）に例示されている。
【００９３】
宿主遺伝子の修飾、ダウンレギュレーションまたは不活性化は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術によって行ってもよい（ＦＥＭＳマイクロバイオロジー・レターズ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｌｅｔｔ．）、２３７：３１７−３２４頁、２００４年）。より具体的には、糸状菌細胞による遺伝子の発現を、その発現に影響するヌクレオチド配列の同一のセンス部分およびアンチセンス部分を、互いの後ろにヌクレオチドスペーサを間に挟んでクローニングし、発現ベクターに挿入し、その発現ベクターを細胞に導入することによって、低下または消失させてもよい。その細胞では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が転写され、その後、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるより短いｓｉＲＮＡに加工される。ｄｓＲＮＡが転写された後、短い（２１〜２３）ヌクレオチドｓｉＲＮＡ断片が生成し、影響を受けるべきｍＲＮＡの標的分解が生起される。特定のｍＲＮＡが消失する程度は一定ではない。宿主遺伝子の修飾、ダウンレギュレーションまたは不活性化に、国際公開第２００５／０５６７２号パンフレットおよび国際公開第２００５／０２６３５６号パンフレットに記載されているＲＮＡ干渉技術を使用してもよい。
【００９４】
上記のいずれかの方法によって修飾ないし不活性化され、先に定義したのと同じ試験法を使用して測定したときと同一条件で培養した場合のアリールスルファターゼ活性体の産生量が親細胞より少ない、アリールスルファターゼ欠損菌株は、他のヌクレオチド配列を有していてもよい。
【００９５】
このような古典的遺伝子技術またはＤＮＡ組換え技術により分離または作成されたアリールスルファターゼ活性体を低減させた工業的産生菌株は、最終製品にオフフレーバーがないことが要求される関連の工業プロセスで使用することができる。これらの菌株は、工業的に関連する酵素の製造に使用されることが好ましい。これらの菌株は食品工業で使用される酵素の製造に使用されることが好ましく、これらの菌株は乳製品の加工に使用されることがよりいっそう好ましい。そのようなアリールスルファターゼ活性体を低減させた工業的産生菌株は、ラクターゼの製造に使用されることが特に好ましい。
【００９６】
［宿主菌株］
適切な工業的宿主菌株としては、好ましくは細菌などの原核微生物があり、より好ましくは真核生物、例えば、酵母、糸状菌などの菌類、または、植物細胞がある。Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌は、培地中にタンパク質を分泌することができるので、宿主として非常に適している。宿主として適した他の細菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に含まれるものである。対象酵素をコードするＤＮＡ配列の発現に好ましい酵母宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の中の１つである。酵母宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ  ｖａｒ．  ｌａｃｔｉｓとしても知られている）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ種、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ種、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ種およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ種からなる群より選択されることがより好ましい。
【００９７】
しかしながら、酵素の発現に特に好ましいのは、糸状菌宿主細胞である。好ましい糸状菌宿主細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｄｉｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ属、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ属、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ属、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属およびＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属からなる群より選択される。糸状菌宿主細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｙｚａｅ種、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ種もしくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ種のもの、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ群（レーパー（Ｒａｐｅｒ）およびフェネル（Ｆｅｎｎｅｌ）、ザ・ジーナス・アスペルギルス（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｕｓ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ザ・ウイリアムズ・アンド・ウィルキンス・カンパニー（Ｔｈｅ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、バルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、２９３−３４４頁、１９６５年で定義されている）のものより好ましい。このようなものとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍが挙げられ、また、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ種、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ種、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ａｌａｂａｍｅｎｓｅ種、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ種、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ種、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｐｈｉｌｕｍ種、Ｄｉｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｍ種およびＴｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ種のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
本発明の範囲に含まれる好ましい工業的産生菌株の例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種（特に、欧州特許出願公開第Ａ−１８４，４３８号明細書および欧州特許出願公開第Ａ−２８４，６０３号明細書に記載のもの）およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種などの菌類、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（特に、欧州特許出願公開第Ａ−１３４，０４８号明細書および欧州特許出願公開第Ａ−２５３，４５５号明細書に記載のもの）、特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種などの細菌、並びにＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種（特に、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓなどの欧州特許出願公開第Ａ−０９６，４３０号明細書に記載のもの、および欧州特許出願公開第Ａ−３０１，６７０号明細書に記載のもの）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓもしくはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどの酵母である。本発明は、最も好ましくは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓによる、アリールスルファターゼ活性体を含まないラクターゼの製造に関する。
【００９９】
所定のポリペプチドまたは酵素を工業的に製造するのに適したアリールスルファターゼ欠損菌株が分離されており、意外にも、このアリールスルファターゼ欠損菌株は、由来する野生型菌株と、培養条件が同じ場合に、少なくとも同量のポリペプチドまたは酵素を産生する。
【０１００】
本発明のアリールスルファターゼ欠損菌株は、検出可能な細胞内または細胞外アリールスルファターゼ活性体が、モデル反応で検出されるそれの５０％未満である菌株であることが好ましい（実施例２の実験情報を参照）。本発明のアリールスルファターゼ欠損菌株は、細胞内アリールスルファターゼ活性体が５０％未満である菌株であることがより好ましい。本発明のアリールスルファターゼ欠損菌株は、細胞内アリールスルファターゼ活性体が、由来する野生型菌株のモデル反応で検出される細胞内アリールスルファターゼ活性体の２５％未満である菌株であることがより好ましい。好ましくは１０％未満であり、より好ましくは５％未満であり、より好ましくは１％未満であり、アリールスルファターゼ欠損菌株中にアリールスルファターゼ活性体が検出されないことが特に好ましい。本願においては、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ培養物中で得られる野生型のアリールスルファターゼ濃度の参照として、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ培養物中で得られる野生型のポリペプチド濃度の参照として、およびＫ．ｌａｃｔｉｓ培養物中で得られる細胞内アリールスルファターゼ活性体濃度の参照として、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株ＣＢＳ２３５９を採用している。アリールスルファターゼ欠損Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株は、同一培養条件で、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株ＣＢＳ２３５９よりも、アリールスルファターゼ活性体の産生が少ない菌株であると定義される。アリールスルファターゼ欠損菌株は、細胞内アリールスルファターゼ活性体が、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株ＣＢＳ２３５９のモデル反応で検出されるそれの５０％未満であるＫ．ｌａｃｔｉｓ株であることが好ましい。本発明のアリールスルファターゼ欠損Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株は、細胞内アリールスルファターゼ活性体が、由来するＫ．ｌａｃｔｉｓ株ＣＢＳ２３５９のモデル反応で検出される細胞内アリールスルファターゼ活性体の２５％未満である菌株であることがより好ましい。好ましくは１０％未満であり、より好ましくは５％未満であり、より好ましくは１％未満であり、アリールスルファターゼ欠損Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株中にアリールスルファターゼ活性体が検出されないことが特に好ましい。本発明の好ましい実施態様では、本願の後段で定義する方法を使用して得られたアリールスルファターゼ欠損Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株を用いた。
【０１０１】
当業者には、非常に多くの種類のポリペプチド検出システムが知られている。検出システムには、ポリペプチドまたは酵素活性を検出できるあらゆる分析法が含まれる。例を挙げれば、これらの分析システムには、限定されるものではないが、比色分析、光度分析、蛍光分析、比濁分析、粘度測定、免疫学的分析、生物学的分析、クロマトグラフィおよび他の利用可能な分析法に基づく方法が含まれる。産生されたポリペプチドが酵素であるならば、産生された活性酵素の量は、モデル反応における活性の測定から決定される（実施例２を参照）。
【０１０２】
他の好ましい実施態様では、本発明のアリールスルファターゼ欠損菌株は、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現構築体により形質転換されると、少なくとも由来する野生型菌株が、アリールスルファターゼ欠損菌株と同じ発現構築体により形質転換されていて、同じ条件で培養された場合に産生する量のポリペプチドを産生するという点に特徴がある。本発明のアリールスルファターゼ欠損菌株は、由来する野生型菌株が、同じ培養条件で生産するのと同じかまたはそれより多くの量の所定のポリペプチドを生産する菌株であることが好ましい。アリールスルファターゼ欠損菌株は、培養条件が同じ場合に、所定のポリペプチドを由来する野生型菌株より多く生産することがより好ましい。
【０１０３】
［他の天然または非相同のポリペプチドおよび他の配列の製造］
さらに別の実施態様では、本発明は、宿主細胞中でヌクレオチド配列を転写する方法であって、その転写された配列が所望のポリペプチドをエンコードするか、または機能性核酸分子であり、
（ａ）栄養培地で、（ｉ）プロモーター、（ｉｖ）ポリペプチドをエンコードする下流のヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）翻訳停止信号、および（ｉｖ）転写停止信号を含む宿主細胞を培養する工程、
（ｂ）宿主細胞中でポリペプチドを発現させる工程、および
（ｃ）必要に応じて、栄養培地または宿主細胞からポリペプチドを回収する工程
を含む方法を提供する。
【０１０４】
製造されたポリペプチドは、プロテアーゼ分解に対して感受性があることがある。その場合には、プロテアーゼ欠損の突然変異宿主細胞が使用される。アリールスルファターゼ欠損菌株は、本発明の方法で生産されることが好ましい。アリールスルファターゼ欠損菌株は、当該技術分野で知られた方法で、所望のポリペプチドの産生に適した栄養培地で増殖または維持することができる。例えば、細胞は、固体基質に平板培養してもよく、フラスコ中で振盪培養してもよく、実験室または工業的規模の発酵槽で、適切な培地中で、かつ、ポリペプチドが発現および／または分離できる条件で、小規模または大規模発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式（ｆｅｄｂａｔｃｈ）または固形発酵など）で培養してもよい。培養は、炭素および窒素源と、無機塩とを含む適切な栄養培地で、当該技術分野で知られた方法を用いて行う（例えば、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）およびラシュアー（ＬａＳｕｒｅ）編、モア・ジーン・マニピュレーションズ・イン・ファンギ（Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ）、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州、１９９１年を参照）。適切な培地は供給業者から入手可能であり、あるいは、公開されている組成物（例えば、ジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログ）を使用して調製してもよい。ポリペプチドが栄養培地に分泌されるならば、ポリペプチドは栄養培地から直接回収することができる。ポリペプチドが分泌されなければ、細胞溶解物から回収することができる。
【０１０５】
得られたポリペプチドは、当該技術分野で知られた方法で分離することができる。例えば、ポリペプチドは、これらに限定されるものではないが、遠心分離、ろ過、抽出、スプレードライ、蒸発、または沈殿などの従来の方法により栄養培地から分離することができる。分離されたポリペプチドは、その後、これらに限定されるものではないが、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、アフィニティ、疎水性、クロマト分画、サイズ排除）、電気泳動（例えば、予備等電点電気泳動）、溶解度差（例えば、アセトンまたは硫酸アンモニウム沈殿）または抽出（例えば、カオトロープ、塩またはｐＨ）などの、当該技術分野で知られた様々な方法でさらに精製してもよい。例えば、ジャンソン（Ｊａｎｓｏｎ）およびライデン（Ｒｙｄｅｎ）編、プロテイン・ピュアリフィケーション（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＶＣＨ  パブリッシャーズ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８９年を参照されたい。
【０１０６】
ポリペプチドは、当該技術分野で知られたポリペプチドに特有の方法により検出することができる。これらの検出方法としては、特異抗体の使用、酵素生産物の生成、酵素基質の消滅またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ法が挙げられる。例えば、ポリペプチド活性の測定に、酵素アッセイが使用される。当該技術分野においては、酵素活性を測定する方法が、多くの酵素について知られている。
【０１０７】
ポリペプチドは、アリールスルファターゼ欠損菌株に対し、天然または非相同のいずれのポリペプチドであってもよい。「非相同ポリペプチド」という用語は、ここでは、野生型菌株から産生されたものでないポリペプチドと定義される。「ポリペプチド」という用語は、ここでは、特定の長さのエンコードされた生成物を意味するのではなく、したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を包含する。非相同ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列は、原核生物、真核生物または他のソースから得てもよく、また、合成遺伝子であってもよい。「から得る」という用語は、ここで所定のソースと共に使用されるときは、ポリペプチドが、そのソース、または、そのソースの遺伝子が挿入された細胞により産生されることを意味する。
【０１０８】
所望のポリペプチドは、抗体もしくはその抗原結合部、抗原、凝固因子、酵素、ペプチドホルモンもしくはその変形体、受容体もしくはそのリガンド結合部、調節タンパク質、構造タンパク質、レポーター、輸送タンパク、細胞内タンパク質、分泌過程に関与するタンパク質、折りたたみ過程に関与するタンパク質、シャペロン、ペプチド・アミノ酸トタンスポータ、グリコシル化因子、または転写因子であってよい。ポリペプチドは細胞外、培地へ分泌されてもよい。
【０１０９】
酵素は、特定のものに限定されるものではない。好ましい酵素は、本明細書の残りの部分および実施例で開示する。
【０１１０】
あるいは、ポリペプチドは、例えばシャペロン、プロテアーゼもしくは転写因子などの、細胞内タンパク質または酵素であってもよい。この例は、プント（Ｐｕｎｔ）ら（アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５０：４４７−４５４頁、１９９８年））により報告されている。これは、例えば、シャペロン、プロテアーゼまたは転写因子などのこのポリペプチドが、タンパク質生成の制限因子であると知られているならば、タンパク質生産体としての宿主細胞の効率を改善するために使用することができる。
【０１１１】
本発明の方法では、アリールスルファターゼ欠損菌株もまた、細胞に対して天然ポリペプチドを遺伝子組換えで製造するために使用することができる。天然ポリペプチドは、ポリペプチドの発現を促進し、信号配列を使用して対象とする天然ポリペプチドを細胞外に排出することを促進し、かつ、その細胞により通常生産されるポリペプチドをエンコードする遺伝子のコピー数を増加させるために、例えば、ポリペプチドをエンコードする遺伝子を、別のプロモーターの制御下に置くことによって、遺伝子組換え生産することができる。本発明は、そのような細胞に対して天然ポリペプチドの遺伝子組換え生産もまた、「非相同ポリペプチド」という用語の範囲内に、そのような発現のために、細胞に非内在性の遺伝子要素が使用されているか、または、糸状菌細胞では通常起こらない仕方で機能を発現するよう操作が加えられている、内在性の配列要素が使用されている限り、包含する。非相同ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を分離またはクローニングするために使用される技術は、当該技術分野では知られており、ゲノムＤＮＡからの分離、ｃＤＮＡからの調製またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１１２】
本発明の方法において、非相同ポリペプチドには、ポリペプチドまたはその断片のＮ−末端またはＣ−末端に別のポリペプチドが融合した、融合またはハイブリッドポリペプチドもまた含まれる。融合ポリペプチドは、あるポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列（またはその一部）を、別のポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列（またはその一部）に融合させることによって作られる。
【０１１３】
融合ポリペプチドを生産する技術は、当該技術分野では知られており、ポリペプチドをエンコードするコーディング配列を、それらがフレームに入り、かつ、融合ポリペプチドが同一のプロモーターおよびターミネータのコントロール下に入るように、ライゲートすることが挙げられる。ハイブリッドポリペプチドは、少なくとも２つの異なるポリペプチド（１つ以上は、突然変異菌類細胞に非相同である）から得られた部分的または完全なポリペプチド配列の組み合わせを含む。対象の非相同ポリペプチドをエンコードする、分離されたヌクレオチド配列は、ポリペプチドを発現させるために、様々の方法で操作することができる。発現は、ポリペプチドの生産に関与するいかなる工程も含むと理解され、これらに限定されるものでないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌が挙げられる。発現ベクターによっては、ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列の操作を、ベクターへの挿入前に行うことが望ましいかまたは必要である。クローニング法を利用してヌクレオチド配列を修飾する技術は、当該技術分野ではよく知られている。
【０１１４】
生産するポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列を、前記ＤＮＡ配列の高レベルの発現、好ましくは前記ポリペプチドの高レベルの分泌を確実にするために、適切なＤＮＡ調整領域へリンクさせる操作が可能である。生産するポリペプチドがアリールスルファターゼ欠損菌株に対して天然であるならば、その天然分泌信号を使用することが好ましい。あるいは、生産するポリペプチドがアリールスルファターゼ欠損菌株に対して天然でないならば、生産されるべき非相同遺伝子に融合したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ遺伝子などを含む融合構築体が作られることが好ましい。本発明の好ましい実施態様では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのアルファアミラーゼ遺伝子の調整領域が使用される。本発明のより好ましい実施態様では、Ａ．ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ遺伝子の調整領域が使用される。本発明のより好ましい実施態様では、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのラクターゼ遺伝子の調整領域が使用される。ＤＮＡ構築体は、選択可能なマーカーを含んでもよい。あるいは、選択可能なマーカーは第２のＤＮＡ構築体上に存在してもよい。例示するなら、これらのマーカーとしては、これらに限定されるものではないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ遺伝子）、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣまたはｐｙｒＧなどの栄養要求性マーカー遺伝子、および、例えばフレオマイシン、ハイグロマイシンＢまたはＧ４１８に対して抵抗性を示す抗生物質抵抗性遺伝子が挙げられる。マーカー遺伝子は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓからのアセトアミダーゼ遺伝子であることが好ましい。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓからのアセトアミダーゼ遺伝子は、ｇｐｄＡプロモーターに融合していることがより好ましい。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓからのアセトアミダーゼ遺伝子は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＤＨ１プロモーターに融合していることがより好ましい。
【０１１５】
ポリペプチドを高収率で生産するのに適しており、かつ、ポリペプチド生産体として工業装置で使用することができるアリールスルファターゼ欠損菌株を得る方法を開発した。ポリペプチドは、前記アリールスルファターゼ欠損菌株に対して、相同であっても非相同であってもよい。非相同なポリペプチドまたは酵素の場合、本発明が適用される野生型菌株は、本明細書で前述したように、そのようなポリペプチドまたは酵素をコードする遺伝子を発現するよう、前もって形質転換しておいてもよい。そのようなアリールスルファターゼ欠損菌株は、由来する野生型菌株が同一の培養条件で生産するのと少なくとも同量のポリペプチドを生産する。あるいは、アリールスルファターゼ欠損菌株は、本明細書で前述したように、形質転換の前に、そのようなポリペプチドまたは酵素をコードする遺伝子により構築される。
【０１１６】
本発明の実施態様では、その結果、食品工業で有用な酵素の生産に有用な親細胞の突然変異体である、アリールスルファターゼ表現型が低減された本発明の宿主細胞内で、ポリペプチドが生産される。その親細胞は、アリールスルファターゼをエンコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を含み、かつ、突然変異細胞は、同一条件下で培養したとき、親細胞より少ないアリールスルファターゼ活性体を生産する。
【０１１７】
本発明の１つの態様で開示された好ましい特徴は、本発明の他の態様にも適用される。
【実施例】
【０１１８】
以下の実施例を参照して本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１１９】
［材料および方法］
アリールスルファターゼ活性試験：ニトロフェニルスルフェート（Ｓｉｇｍａより入手）を基質として用いてアリールスルファターゼ活性を測定した。活性の測定に、０．５ｍｌの基質溶液（ｐＨ６．５の１００ｍＭＮａＰｉ緩衝液中に２０ｍＭのｐ−ニトロフェニルスルフェート）を、０．５ｍｌのアリールスルファターゼ活性体含有試料溶液と混合した。この溶液を３７℃で３時間、インキュベートした。その後、０．５ＭのＮａＯＨを１．５ｍｌ加えて反応を停止させた。試料溶液の代わりに水を加えたブランク試験と対比して、４１０ｎｍでのＯＤを測定した（光路長１ｃｍ）。参照として、ＮａＯＨによる反応停止後に酵素を加えた溶液を調製した。この参照溶液のＯＤ４１０を、酵素が３時間活性であった溶液について測定したＯＤ４１０から差し引いた。アリールスルファターゼ単位（ＡＳＵ）は、ＯＤ４１０＊１０Ｅ６／ｈｒの変化で表される。液体生成物では、アリールスルファターゼ活性は、生成物１ｍｌ当たりのＯＤ４１０＊１０Ｅ６／ｈｒの変化で表すことができる。固体生成物では、アリールスルファターゼ活性は、生成物１ｇ当たりのＯＤ４１０＊１０Ｅ６／ｈｒの変化で表すことができる。対象酵素の活性が分かっているときは、アリールスルファターゼ活性は、対象酵素の１活性単位当たりのＯＤ４１０＊１０Ｅ６／ｈｒの変化で表すこともできる。
【０１２０】
酸性ラクターゼ活性試験：酸性ラクターゼをｏ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｆｌｕｋａ  ７３６６０）と共に、ｐＨ４．５、３７℃で１５分間インキュベートし、ｏ−ニトロフェノールを発生させる。１０％炭酸ナトリウムを加えてインキュベーションを停止させる。発生したｏ−ニトロフェノールの消滅を、波長４２０ｎｍで測定し、酸性ラクターゼ活性を定量する。１酸性ラクターゼ単位（ＡＬＵ）は、試験条件下で、１分当たり１マイクロモルのｏ−ニトロフェノールを発生させる酵素の量である。
【０１２１】
プロリン特異性エンドプロテアーゼ活性試験：国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに記載されているようにして、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒからプロリン特異性エンドプロテアーゼを過剰に生産し、クロマトグラフィにより精製した。基質としてＣＢＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ、ブーベンドルフ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ）、スイス（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））を使用し、ｐＨ４．６のクエン酸塩／リン酸二ナトリウム緩衝液中、３７℃で、Ａ．ｎｉｇｅｒプロリン特異性エンドプロテアーゼ活性を試験した。反応生成物を、４０５ｎｍで分光光度法によりモニターした。４５０ｎｍにおける吸収が時間とともに増加することが、酵素活性の尺度である。
【０１２２】
中性近傍のｐＨを最適とするプロリン特異性エンドプロテアーゼの活性を、厳密に同じ条件下で決定するが、ここでは、酵素反応はｐＨ７．０で行う。
【０１２３】
ＤＰＰ  ＩＶなどのプロリン特異性ジペプチジルペプチダーゼの活性を、中性近傍のｐＨを最適とするプロリン特異性エンドプロテアーゼに特定の条件下で決定するが、ここではＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを基質として使用する。
【０１２４】
プロリンプロテアーゼ単位（ＰＰＵ）は、特定の条件下、０．３７ｍＭの基質濃度で、１分当たり１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリドを放出する酵素の量として定義される。
【０１２５】
カルボキシペプチダーゼ活性試験：Ａ．ｎｉｇｅｒ由来カルボキシペプチダーゼ、ＰｅｐＧ（「ＣＰＧ」；ダル・デーガン（Ｄａｌ  Ｄｅｇａｎ）ら、アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、５８、（１９９２年）２１４４−２１５２頁）の活性を、合成基質ＦＡ−Ｐｈｅ−Ａｌａ（Ｂａｃｈｅｍ、ブーベンドルフ、スイス）を基質として使用して決定した。この基質の酵素加水分解（１．５ｍＭのＦＡ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、ｐＨ４．５および３７℃で）により、３４０ｎｍの波長でモニターされる吸光度が減少する。１単位（ＣＰＧＵ）は、試験条件で、３４０ｎｍでの光密度を１分あたり１吸光度単位ずつ減少させるのに必要な酵素の量である。
【０１２６】
アミノペプチダーゼ活性試験
アミノペプチダーゼの活性を、合成基質Ｘ−ｐＮＡ（ここで、ｐＮＡはｐ−ニトロアニリドを表し、「Ｘ」はアミノ酸残基を表す）を使用して決定される。異なるアミノペプチダーゼは異なる選択性を有しうるため、アミノ酸残基「Ｘ」の種類は試験されるアミノペプチダーゼの開裂選択性に依存する。したがって「Ｘ」は特定のアミノペプチダーゼが最も高い選択性を示す残基である。多くのアミノペプチダーゼはＰｈｅに対して最も高い選択性を示すため、Ｐｈｅ−ｐＮＡは好ましい基質である。各種のＸ−ｐＮＡ基質をＢａｃｈｅｍ（ブーベンドルフ、スイス）から入手することができる。この基質の酵素加水分解（１．５ｍＭ、ｐＨ６．５および３７℃で）により、着色が進むが、これは波長４１０ｎｍでモニターされる。１単位（ＡＰＵ）は、試験条件で、４１０ｎｍでの光密度を１分当たり１吸光度単位ずつ増加させるのに必要な酵素の量である。
【０１２７】
エステラーゼ／リパーゼ活性試験：エステラーゼおよびリパーゼは、トリグリセロールからの遊離脂肪酸の放出を触媒する。本試験では、基質としてグリセロールトリブチレートを使用する。エステラーゼ／リパーゼの活性を決定するために、トリブチレートから放出された酪酸を、水酸化ナトリウムで７．５の一定ｐＨになるまで滴定する。したがって、ｐＨを一定に保つために、１単位時間当たり加えられる水酸化ナトリウムの量は、酵素試料のエステラーゼ活性に直接比例する。
【０１２８】
測定は、Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ  ｐＨ−ｓｔａｔ  ｕｎｉｔおよび以下の試薬を使用して行われる。
【０１２９】
アラビアゴム溶液：１Ｌ容積のフラスコ中で、約８００ｍＬの脱ミネラル水に、１００ｇのアラビアゴム（Ｓｉｇｍａ）および５００ｍｇのＴｈｙｍｏｌ（ＩＣＮ））を、穏やかに攪拌しながら連続して溶解させる。水と混合物で１リットル調製する。４０００ｒｐｍで１５分間、溶液を遠心分離する。得られたアラビアゴム溶液は２ヶ月間冷蔵庫の中で保存できるが、使用の少なくとも１日前には調製しなければならない。
【０１３０】
水酸化ナトリウム０．０２ｍｏｌ／ｌ：０．０１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨを含むアンプルの内容物を、５００ｍＬ容積のフラスコへ、水と共に定量的に移す。水と混合物とで容器体積とする。
【０１３１】
ＳＤＳ／ＢＳＡ溶液：穏やかに攪拌しながら、１ｇのＳＤＳ（メルク（Ｍｅｒｃｋ））および１ｇのＢＳＡ（フラクションＶ、Ｓｉｇｍａ）を約４０ｍＬの水に溶解する。泡の生成を避ける。ＳＤＳおよびＢＳＡを完全に溶解した後、水で体積を１リットルにする。新鮮な調製溶液のみを使用する。
【０１３２】
基質エマルジョン：５０ｇのグリセロールトリブチレートを秤量して６００ｍＬのガラスビーカーに入れ、３００ｍＬのアラビアゴム溶液を加える。Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘの最大速度で５分間攪拌してエマルジョンを調製する。０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨでｐＨを７．５に調節する。
【０１３３】
特別の酵素試料のエステラーゼ／リパーゼ活性を試験するには、酵素試料約１ｇを秤量し、ＳＤＳ／ＢＳＡ溶液に溶解させる。この試料溶液は、約０．２〜０．８ＮＢＧＥ／ｍｌ（後述）に等価な最終酵素量を含有するようにしなければならない。測定開始まで、試料溶液を氷の上で保管する。
【０１３４】
その後、加熱した反応器に、次の溶液：２０ｍＬの基質エマルジョン、５．０ｍＬの水（４０℃に予備加熱）を移し、１５分間予備加熱し、その後、５．０ｍＬの対照試料または試料溶液を加えることによって測定を開始し、Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ  ｐＨ−ｓｔａｔ  ｕｎｉｔのＶＩＴ９０エステラーゼプログラムをスタートさせることによって測定を行う。
【０１３５】
エステラーゼ／リパーゼ単位（ＮＢＧＥ）は、以下の手順で、温度４０℃、ｐＨ７．５において、グリセロールトリブチレートから１分当たり１μｍｏｌの遊離脂肪酸を放出する酵素量として定義される。
【０１３６】
［実施例］
［実施例１］
［ＵＨＴ−ミルクのオフフレーバー化合物の同定］
無菌状態で、Ｍａｘｉｌａｃｔ  ＬＧ５０００（ＤＳＭ、オランダ）を、セミスキムＵＨＴ−ミルク（Ｆｒｉｅｓｃｈｅ  Ｖｌａｇ、オランダ）に加え、１リットル当たり１０，０００および４０，０００ＮＬＵの濃度とし、室温で４日間インキュベートした。参照実験では、Ｍａｘｉｌａｃｔを加えなかった。味覚パネリストによる試料評価の前に、セミスキムミルク１リットル当たり４０，０００ＮＬＵを加え、室温で１８時間インキュベートすることにより、新鮮なラクターゼ加水分解ミルク試料を調製した。試料の分析は、ＮＩＺＯ  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（オランダ）にて、ＮＩＺＯ  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの通常の方法であり、かつ感覚分析および化学分析を含むＳＯＩＲ法を使用して実施した。感覚分析は調製した試料に対して直接に実施し、各ミルク試料の一定量を、後の化学分析のために、小分けにして−２５℃で凍結した。
【０１３７】
感覚分析は、９人の訓練されたパネリストによって行われた。参照試料は、調理済みと評価され、その他の試料は標準的でないＵＨＴミルクとして分類された。オフフレーバーを表現する主な属性は、化学オフフレーバー、薬剤オフフレーバー、尿／不潔オフフレーバーおよび馬小屋／肥料オフフレーバーであった。
【０１３８】
揮発性化合物を、室温付近の温度で同時高真空蒸留により分離し、水分の多い試料抽出物を得た。揮発性化合物は、その後、動的ヘッドスペース法を使用して、水分が多い抽出物から分離し、吸着剤で捕集した。分離した化合物は、熱脱着を利用してガスクロマトグラフに注入し、ＧＣ−カラム上で分離した。ＧＣ−流出物が、２人の訓練を受けた評価者（ＧＣ−スニフ）によって評価され、臭いの用語で表現された（臭度測定）。動的ヘッドスペース法サンプリングの間に、２つの異なるパージ時間（３０分および２４時間）を設けることによって、高濃度および低濃度のＧＣ−スニフ分析を２回行った。その後、臭度分析の間に、ラクターゼ処理ＵＨＴ試料のオフフレーバー特性に対応すると示唆されたピーク（化合物）を、質量分析によって同定した。オフフレーバーの原因を説明する対象の化合物は、１）エステル（エチルブタノエート）；２）硫黄化合物（ジメチルスルフィド、ジメチルトリスルフィドおよびベンゾチアゾール）；３）硫黄エステル（メチルチオアセテート、メチルチオブチレート）；４）１−オクテン−３−オール；５）２−ノネナール；６）β−ダマセノン；７）ボルネオールおよび８）ｐ−クレゾールと同定された。ｐ−クレゾールは、ミルク中の抱合体由来のものであろう。最も不快感を与える感覚属性である「薬剤オフフレーバー」に関連する唯一の化合物はｐ−クレゾールである。試料に標準量のｐ−クレゾールを加え、ＧＣ−分析によって、試料中のｐ−クレゾール濃度を測定した。ＵＨＴ−ミルク試料（４日間のインキュベーション）中のｐ−クレゾールの濃度は、１リットル当たり１２μｇと推定された。これは、空気および水のそれぞれのフレーバー閾値である１ｐｐｂおよび２ｐｐｂを明らかに超えている（ハ（Ｈａ）ら、（１９９１年）、ジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス（Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ）７４、３２６７−３２７４頁）。それは、また、牛乳中に普通に見られるｐ−クレゾールの濃度範囲である。この結果は、ミルクで組換え実験を行って確認し、ｐ−クレゾールがラクターゼ処理ＵＨＴ−ミルクの薬剤オフフレーバーの原因物質であることを確認した。
【０１３９】
［実施例２］
［アリールスルファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性の測定］
基質としてｐ−ニトロフェニルスルフェート（Ｓｉｇｍａから入手）を使用して、アリールスルファターゼ活性を測定した。活性の測定に、０．５ｍｌの基質溶液（ｐＨ６．５、１００ｍＭのＮａＰｉ緩衝液中に２０ｍＭのｐ−ニトロフェニルスルフェート）を、０．５ｍｌのアリールスルファターゼ活性体含有試料溶液と混合した。この溶液を３７℃で３時間、インキュベートした。その後、１．５ｍｌの０．５ＭＮａＯＨを加えて反応を停止させた。試料溶液の代わりに水を加えたブランク試験と対比して、４１０ｎｍのＯＤを測定した（光路長１ｃｍ）。参照として、ＮａＯＨによる反応停止後に酵素を加えた溶液を調製した。この参照溶液のＯＤ４１０を、酵素が３時間活性であった溶液について測定したＯＤ４１０から差し引いた。アリールスルファターゼ活性は、１ＮＬＵ当たりのＯＤ４１０＊１０Ｅ６／ｈｒの変化で表される。試料溶液のラクターゼ活性（ＮＬＵ）を下記のように測定した。
【０１４０】
ＦＣＣ（第４版、１９９６年７月、８０１−８０２頁：ラクターゼ（ニュートラル）β−ガラクトシダーゼ・アクティビティ（Ｌａｃｔａｓｅ  （ｎｅｕｔｒａｌ）  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｚｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ））に記載の手順に従い、基質としてｏ−ニトリフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を使用し、中性ラクターゼ単位（ＮＬＵ）としてラクターゼ活性を測定した。
【０１４１】
［実施例３］
［ＵＨＴ−ミルクへのアリールスルファターゼの添加］
商業的に入手できるアリールスルファターゼ（Ｓｉｇｍａ、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、タイプＶＩ；４．９ｍｇタンパク質／ｍｌ；３．９アリールスルファターゼ単位（Ｓｉｇｍａの定義による）／ｍｇタンパク質）を使用してミルクのオフフレーバー試験を行った。試験では、１ｍｌの酵素溶液と共に、５０ｍｌのＵＨＴミルク（Ｃａｍｐｉｎａ、オランダ）を３０℃でインキュベートした。試料の臭いを嗅いで、オフフレーバーの進行を追った。ラクターゼと共にインキュベートしたＵＨＴ−ミルクで、実施例１でも記載した典型的なオフフレーバー臭が、２時間のインキュベーション後に明確に感知された。インキュベーション１７時間後には、臭いはより強くなった。アリールスルファターゼがラクターゼと類似のオフフレーバーを発生させたことは明らかであった。実施例１に記載した知見に基づけば、このことは、ミルク中のｐ−クレシルスルフェート抱合体からのｐ−クレゾールの放出で説明することができる。アリールスルファターゼの代わりに、酸性ホスファターゼ（小麦の胚芽、Ｓｉｇｍａ、４０ｍｌのミルク中にＳｉｇｍａによる定義で６ホスファターゼ単位）またはグルクロニダーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来、Ｓｉｇｍａ、４０ｍｌのミルク中にＳｉｇｍａによる定義で６３５０グルクロニダーゼ単位）を加えた試験も実施した。これらのインキュベーションでは、典型的なオフフレーバーは生じなかった。このことは、牛乳のオフフレーバー生成には、スルフェート抱合体が最も重要な抱合体であることを示唆している。これは、文献にある知見と一致する（Ｌｏｐｅｚら（１９３３年）ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．）４１、４４６−４５４頁）。この結果は、グルクロニダーゼまたは酸性ホスファターゼにより発生する他のオフフレーバー化合物の存在を完全に排除するものではないが、これらの化合物がフレーバー閾値より高いレベルに達しないことは明らかである。
【０１４２】
［実施例４］
［ＵＨＴ−ミルクのオフフレーバー試験：手順］
２０，０００ＮＬＵ／Ｌミルクと共に、セミスキムＵＨＴミルク（Ｃａｍｐｉｎａ、オランダ）を、３０℃で４８時間インキュベートした。細菌の感染を避けるために無菌状態で殺菌フィルタを通してラクターゼを加えた。４８時間後、訓練された味覚パネリストによりミルクを試験し、ラクターゼを加えなかった以外は同じ条件でインキュベートしたミルク溶液と比較した。テイスティングの少し前に、５０００ＮＬＵ／Ｌミルクを加え、３０℃で２時間インキュベートして、参照溶液を調製した。この甘いミルクが、参照溶液として味覚パネリストに使用された。オフフレーバーは、パネリストにより次のように採点される：ブランクのミルクは「−」とした。感知されるが軽度のオフフレーバーを含む軽度オフフレーバー製品は「＋」が与えられ、より強いオフフレーバーを含む製品は「＋＋」または「＋＋＋」で表される。「＋＋＋」の表示は、非常に不快と感じる高レベルのオフフレーバーを示す。オフフレーバーを特徴付けるために使用される用語は、実施例１に記載したものと同じである。
【０１４３】
［実施例５］
［Ｋ  ｌａｃｔｉｓラクターゼの精製：アリールスルファターゼ活性体の除去］
Ｍａｘｉｌａｃｔ  ＬＸ５０００（ＤＳＭ、オランダ）、すなわち、商業的に入手可能なＫ．ｌａｃｔｉｓラクターゼを、水で１０倍に希釈し、５５ｍＭのＫＰｉ（ｐＨ７．０）中で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用した。ラクターゼ活性体がカラムの溶出液中で検出されるまで、充填を継続した。その後、カラム容積の４倍量の５５ｍＭのＫＰｉ（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄し、続いて、０．１６ＭのＮａＣｌを含有する６５ｍＭのＫＰｉ（ｐＨ７．０）でラクターゼを溶出させた。画分を集めラクターゼ活性を測定した。ラクターゼ含有画分をプールし、１ＭのＮａＳＯ４を含有する５５ｍＭのＫＰｉ（ｐＨ７．０）中で平衡化したｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に充填した。ラクターゼ活性体がカラムの溶出液中に検出されるまで、１ＭのＮａＳＯ４（ｐＨ７．０）が存在するカラムへ、ラクターゼを充填した。カラム容積の４倍量の、１ＭのＮａＳＯ４を含有する５５ｍＭのＫＰｉ（ｐＨ７．０）で、カラムを洗浄した。カラム容積の１５倍量の、１ＭのＮａＳＯ４を含有する５５ｍＭのＫＰｉ（ｐＨ７．０）から５５ｍＭのＫＰｉ（ｐＨ７．０）へと直線的勾配を有する液を使用して、ラクターゼを溶出させた。溶出液のプロファイルを、ＵＶ−検出（２８０ｎｍ）によりモニターした。画分を集め、ラクターゼ活性を試験した。ラクターゼ含有画分を、ラクターゼのピーク（ＯＤ２８０ｎｍ）が最大ピーク値の５０％に減少した後に集められた画分は除いてプールした。これらの画分を除くことは、ラクターゼ調製物のアリールスルファターゼによる汚染を防止する上で重要である。ラクターゼの溶出は、アリールスルファターゼの溶出と部分的にオーバーラップする。生成物を濃縮し、１０ｋｄａｌｔｏｎのフィルタ上の限外ろ過により脱塩し、５０重量％になるまでグリセロールを添加して保存した。
【０１４４】
［実施例６］
［精製したラクターゼ中のプロテアーゼ水準］
一般式Ｇｌｕ（ＥＤＡＮＳ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘｘｘ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ＤＡＢＣＹＬ）（Ｘｘｘ：２０個の天然アミノ酸のいずれか）で示される一連の基質を使用して、プロテアーゼ活性を測定した。基質は、ＰＥＰＳＣＡＮ（Ｌｅｌｙｓｔａｄ、オランダ）から入手したものであり、内部でクエンチされた蛍光基質である。そのようなペプチド基質が開裂すると、蛍光信号を発する。したがって、蛍光の出現は、エンドプロテアーゼ活性体の存在を示す。１００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｂｉｓ（ｐＨ６．７）中に５０μＭの基質を含有する溶液２００μｌに５０μｌの酵素溶液を加えることによって、９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、エンドプロテアーゼ活性を測定した。反応混合物を、ＴＥＣＡＮ  Ｇｅｎｉｕｓマイクロタイタープレートリーダー中で、Ｍａｇｅｌｌａｎ４ソフトウェアを使用して、４０℃で１０分間インキュベートした。蛍光の発生を時間的に追跡した（励起フィルタ：３４０ｎｍ、蛍光フィルタ：４９２ｎｍ）。蛍光曲線の傾きにより、プロテアーゼ活性を定量化し、ＲＦＵ／分／ＮＬＵとして表した（ＲＦＵ：相対蛍光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｕｎｉｔ）、Ｇｅｎｉｕｓ製装置により与えられる）。酵素試料のＮＬＵ単位は実施例２のようにして測定される。図７は、ＬＸ５０００をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで精製すると、プロテアーゼ活性が飛躍的に低下することを示している。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ後にプールした画分（実施例４）は、出発物質（ＬＸ５０００）と比較すると、少なくとも５〜１０倍低いプロテアーゼ活性を有する。使用した各基質でＲＦＵ／分／ＮＬＵが＜０．５であるラクターゼ試料（図１を参照）は、低水準のプロテアーゼ活性を有する調製物であると定義される。
【０１４５】
［実施例７］
［非精製ラクターゼと精製ラクターゼとの比較］
数種のラクターゼ調製物を、実施例４に記載のオフフレーバー試験に供した。ラクターゼ調製物は、アリールスルファターゼ含量が異なった。各調製物について、少なくとも２つの試料を使用した。個々の試料はアリールスルファターゼ活性が異なる。活性の範囲を表１の右欄に示す。オフフレーバー試験の結果を表１に示す。明らかに、アリールスルファターゼ活性レベルとオフフレーバーの生成には相関がある。低レベルのアリールスルファターゼ（１９以下、表１を参照）はオフフレーバーを生成しないが、レベルが高くなるとオフフレーバーの生成が強くなる。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ後のラクターゼ調製物は、プロテアーゼレベルは低いものの、依然としてオフフレーバーが生成されていることも明らかである（実施例５を参照）。
【０１４６】
【表１】
2020089365.tif 000002
【０１４７】
［実施例８］
［アリールスルファターゼ活性体を含有する、異なる市販の酵素調製物］
異なるソースから製造され、かつ異なる加工経路で回収された各種酵素製品を収集し、材料と方法の項で規定した試験法を用いて、アリールスルファターゼ活性を分析した。得られた結果から（表２を参照）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍなどの各種微生物から得られる酵素調製物は、アリールスルファターゼ活性体による重大な汚染を受けるおそれがあることが明らかである。
【０１４８】
これらの酵素調製物は、本発明の方法により有利に精製することができる。
【０１４９】
【表２】
2020089365.tif 000003
【０１５０】
［実施例９］
［イオン交換クロマトグラフィを用いる、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来プロリン特異性プロテアーゼからのアリールスルファターゼ活性体のクロマトグラフィによる除去］
Ａ．ｎｉｇｅｒにより分泌されたプロリン特異性エンドプロテアーゼから、アリールスルファターゼ副活性体を除去するために（国際公開第０２／０４６３８１号パンフレット）、多くのクロマトグラフ用樹脂をスクリーニングした。Ａ．ｎｉｇｅｒにより分泌された、プロテアーゼと主分泌アリールスルファターゼ活性体との等電点の差が、約０．５ｐＨ単位であると判ったことから、大規模な工業的条件下であってさえも、２つの活性体の許容可能な分離を行うクロマトグラフィによる分離を検証することは極めて厳しい。
【０１５１】
結局、カチオン交換体のＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦと、疎水性相互作用（ＨＩＣ）樹脂のｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ）が、その後の試験のために選択された。両樹脂を、Ｔｒｉｃｏｒｎ  ５／１００カラム（ＣＶ＝２．２ｍｌ）中で、ＵＮＩＣＯＲＮ  ３．２０によりコントロールされたＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００と、ＵＮＩＣＯＲＮ  ３．２１によりコントロールされたＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒとを使用し、ＦＲＡＣ−９５０画分回収装置と組み合わせて、試験した。溶出後、得られた全ての画分について、材料と方法の項で規定した方法を用いて、プロリン特異性エンドプロテアーゼ活性およびアリールスルファターゼ活性を試験した。
【０１５２】
【表３】
2020089365.tif 000004
【０１５３】
発色性ペプチドＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ、ブーベンドルフ、スイス）に対してプロリン特異性活性を示す画分をプールした後、粗酵素調製物とクロマトグラフィ精製酵素組成物のアリールスルファターゼ活性を比較した。全く同じプロリン特異性活性（９ＰＰＵ／ｍｌ）を示す調製物が、アリールスルファターゼ活性では、粗調製物の３８００＊１０Ｅ３単位／ｍｌから、クロマトグラフィ精製調製物の３０＊１０Ｅ３単位／ｍｌ未満へと低下することが明らかとなった。
【０１５４】
［実施例１０］
［疎水性相互作用クロマトグラフィを用いる、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来プロリン特異性プロテアーゼからのアリールスルファターゼ活性体のクロマトグラフィによる除去］
次の条件で、ＨＩＣクロマトグラフィを実施した。出発物質として、１０ＰＰＵ／ｍｌの活性を有する、Ａ．ｎｉｇｅｒ由来プロリン特異性エンドプロテアーゼのダイアフィルタ濾液を使用した。このダイアフィルタ濾液を、２ＭのＮａ２ＳＯ４を含有する２０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ４．２、Ｇ＝１２１ｍＳ／ｃｍ）で２倍に希釈した後、ろ過（０．２μｍ）により無菌とし、その後、カラムに充填した。
【０１５５】
【表４】
2020089365.tif 000005
【０１５６】
酵素をカラムに充填した後、かなりのテーリングを示すために、ベースラインにまで戻る分離を行うには、長い洗浄操作が必要である。最後に、緩衝液Ｂにより、プロリン特異性エンドプロテアーゼがカラムから溶出された。プロリン特異性タンパク質分解活性体を含有する画分をプールした。希釈されているが、この精製した物質は、元のタンパク質分解活性体に戻って計算すれば、非常に低いアリールスルファターゼ活性を示しており、プロリン特異性細胞内タンパク質分解活性体およびアリールスルファターゼ活性体が、この疎水性相互作用クロマトグラフィの手順を使用することによって、効率的に分離されたことが実証された。ここで、また、全く同じプロリン特異性活性（９ＰＰＵ／ｍｌ）を示す調製物が、アリールスルファターゼ活性では、粗調製物の３８００＊１０Ｅ３単位／ｍｌから、クロマトグラフィ精製調製物の３０＊１０Ｅ３単位／ｍｌ未満へと低下することが明らかとなった。
【０１５７】
［実施例１１］
［Ａ．ｎｉｇｅｒ由来の精製プロリン特異性エンドプロテアーゼは、異臭のないカゼイン加水分解物を生成する］
クロマトグラフィにより精製されたプロリン特異性エンドプロテアーゼの特性を試験するために、クロマトグラフィにより精製したものと、クロマトグラフィにより精製しなかったものを使用して、全く同じ手順で、２つのカゼイン加水分解物を調製した。
【０１５８】
１００ｇ／Ｌのカゼイン酸ナトリウム（Ｍｕｒｒａｙ  Ｇｏｌｄｂｅｒｎ、ニュージーランド（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ））および水を含有する溶液へ、スブチリシン（Ｐｒｏｔｅｘ  Ｌ；２５ミリリットル／グラム−タンパク質）を加え、６０℃で４時間、ｐＨはそのままでインキュベートした。生成した沈殿物を、攪拌しながらゆっくりと溶解した。最後に、沈殿物を僅かに含む透明な溶液を得た。その後、溶液のｐＨを４．５に調節し、液体を同じ容積に分割した。これらの分割体の１つに、カゼイン加水分解物１グラム当たり１ＰＰＵの粗Ａ．ｎｉｇｅｒプロリルエンドペプチダーゼを、他の分割体に、１ＰＰＵのクロマトグラフィにより精製したＡ．ｎｉｇｅｒプロリルエンドペプチダーゼを加えた。５５℃で９時間継続してインキュベートした後、両溶液に対し、１０ｋＤａの限外ろ過を行った。さらに熱による不活性化工程（５秒、１２０℃）を行い、冷却時間を置いた後、両液体の味と匂いを、乳加水分解物のオフフレーバーおよび異臭を感知し、ランク付けする訓練を受けた５人のパネリストにより評価した。パネリストらは、全員が、粗プロリン特異性エンドプロテアーゼで調製された加水分解物には、クロマトグラフィにより精製したプロリン特異性エンドプロテアーゼで調製された加水分解物には見られない、特徴的な「家畜小屋」のような臭いおよびフレーバーがあったと結論した。
【０１５９】
【表５】
2020089365.tif 000006
【０１６０】
［実施例１２］
［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来カルボキシペプチダーゼからのアリールスルファターゼ活性体のクロマトグラフィによる除去］
カルボキシペプチダーゼの等電点（ｉ．ｅ．ｐ．４．５）と、Ａ．ｎｉｇｅｒからの主な分泌アリールスルファターゼの等電点（ｉ．ｅ．ｐ．５．０および５．４）とは互いに近いため、２つの酵素のクロマトグラフィによる分離は、極めて困難であることが判明した。しかしながら、以下の方法によって、アリールスルファターゼを含まない純粋なカルボキシペプチダーゼを得ることができた。最も重要なことは、この方法が比較的単純であって、工業規模で実施できることである。
【０１６１】
再度、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ樹脂を使用した。次の条件でクロマトグラフィを行った。
【０１６２】
【表６】
2020089365.tif 000007
【０１６３】
粗製酵素をカラムに充填した後、緩衝液Ａでカラムを洗浄し、非結合／弱い結合の汚染物を除去した。最後に、緩衝液Ｂにより、カルボキシペプチダーゼを溶出させる。発色性ペプチドＦＡ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、ブーベンドルフ、スイス）の加水分解活性体を含有するピークを回収した。ほぼ同等のカルボキシペプチダーゼ活性体を含むカルボキシペプチダーゼ調製物（２０６０ＣＰＧ／ｇ；活性測定のための材料および方法を参照）が、アリールスルファターゼ活性では、粗酵素中の初期の３１２００＊１０Ｅ３単位／ｍｌから、精製調製物中の１０＊１０Ｅ３単位／ｍｌへと減少している。
【０１６４】
［実施例１３］
［Ａ．ｎｉｇｅｒ由来の精製カルボキシペプチダーゼは、オフフレーバーを発生させることなく、ゴーダ（Ｇｏｕｄａ）チーズの熟成を加速する。］
乳は規格化されておらず、ＮＩＺＯのものを集めた。ゴーダチーズはＮＩＺＯの方法により製造した。簡単に言えば、開始剤を添加の後、１５〜２０分間攪拌する。その後、レンネットを加え、３分間攪拌し、固まらせる（約４５〜５０分）。次第に増大するダイアルを使用して凝固物をカットする。これには１０分を要し、最終スピードは８．５となる。ブレードを回転させ、スピード１１でさらに１０分攪拌する。タンク中に１２０Ｌが残るように排出する。スピード１６で攪拌しながら、３６Ｌ（残りの体積の３０％）の水を５５℃で加えて、タンク内の最終温度を３５．５〜３５．７℃にする。スピード１６で６０分間攪拌する。カードを集め、１５分間静置する。モールド（重し）上でカードを分割し、満たしたモールドを３０分間静置する。０．７ｂａｒで３０分間プレスし（最初のプレスの後、チーズコードを加える）、１．２ｂａｒで３０分間、その後、１．７ｂａｒで３０分間プレスする。各プレス後、カードをひっくり返す。プレス後、圧力を開放し、モールド中でチーズを静置させる（塩水室中、１３℃で終夜）。モールドからチーズを取り出し、３０分間塩水に沈め、均一な塩水処理となるよう、２回ひっくり返す。１３℃、８８％の湿度で熟成させる。この方法では、タンパク質に対する脂肪の比を１．０５に標準化している（カゼインに対する脂肪の比の約０．８５と同等）。殺菌処理後、２００Ｌのチーズタンクに、ポンプでミルクを加えた。Ｄｅｌｖｏ（登録商標）−ＴＥＣ  ＵＸ２１Ａ（１．５Ｕ；ＤＳＭ  Ｆｏｏｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ、Ｄｅｌｆｔ、オランダ）を微生物開始剤として使用し、Ｍａｘｉｒｅｎ（登録商標）６００（５５ＩＭＣＵ／Ｌミルク；ＤＳＭ  Ｆｏｏｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ、Ｄｅｌｆｔ、オランダ）をレンネットとして使用した。チーズを２６時間塩水処理し、１３℃、８８％ＲＨで熟成させた。精製および非精製ＰｅｐＧを、２００ＣＰＧＵ／リットルミルクの濃度で、レンネットと共に加えた。
【０１６５】
６週間および２４週間の熟成の後、各チーズタンクからのチーズの代表サンプルについて、内部のパネリストが等級付けを行った。この委員会はラウンド・ザ・プレース方式、すなわち、等級付け委員に、試行の詳細について情報が与えられ、その後、彼らが見出したこと（後に、要約される）について議論するという方式で行われた。
【０１６６】
【表７】
2020089365.tif 000008
【０１６７】
【表８】
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【０１６８】
精製および非精製ともに、ＰｅｐＧに添加により明らかな影響が見られた。非精製が使用されたチーズで、苦味感とバランスの悪さが報告され、これにより、ＰｅｐＧは精製すべきであるとの結論が導き出される。
【０１６９】
［実施例１４〜１５］
以下に記載した実施例では、文献（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（２０００年）「モリキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、および、イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら（編）（１９９０年）「ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ））に記載されているような、核酸の単離および精製、核酸の電気泳動、酵素による核酸の修飾、開裂および／または増幅、Ｅ．ｃｏｌｉなどの形質転換といった標準的な分子クローニング技術が実施された。
【０１７０】
［実施例１４］
［Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのアリールスルファターゼノックアウト株の構築］
［Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの染色体ＤＮＡの単離：］
１００ｍｌのＹＥＰＤ（１％酵母抽出物；１％バクトペプトン（Ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ）；２％グルコース）の振盪フラスコに、単一コロニーのＫ．ｌａｃｔｉｓＣＢＳ２３５９を植え付け、２８０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２４時間培養した。計数チャンバーを用いて細胞の数を数え、４．１＊１０８の細胞に対応する培養物の量を使用した。染色体ＤＮＡの抽出を、Ｑ−ＢＩＯｇｅｎｅから供給されたＦａｓｔ  ＤＮＡ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ＃  ６５４０−６００）を使用して行った。イーストプロトコルを使用し、スピード設定６．０で４０秒間のＦａｓｔｐｒｅｐ  ＦＰ１２０ホモジナイザー（ＢＩＯ１０１、Ｓａｖａｎｔ）を使用する一段ホモジナイズステップを使用した。その後、氷上で試料を冷却し、その後、同じ条件で再度ホモジナイズした。
【０１７１】
Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ１０００分光光度計を使用して、抽出したゲノムＤＮＡの純度および収量を測定した。抽出物の濃度が１１４ナノグラム／マイクロリットルであることが分かった。Ａ２６０／Ａ２８０およびＡ２６０／Ａ２３０の比は、それぞれ１．５７および０．７７であることが分かった。
【０１７２】
［５’および３’アリールスルファターゼフランクのＰＣＲ増幅：］
［５’フランクアリールスルファターゼプライマー：］
【化１】
2020089365.tif 000010
【０１７３】
［３’フランクアリールスルファターゼ：］
【化２】
2020089365.tif 000011
【０１７４】
［３’フランクＳａｃＩＩ−アリールスルファターゼ：］
【化３】
2020089365.tif 000012
【０１７５】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、Ｅｓｐｏｏ  フィンランド（Ｆｉｎｌａｎｄ））を使用して、アリールスルファターゼフランクを増幅した。供給者の指示に従い、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で、Ｋ．ｌａｃｔｉｓＣＢＳ２３５９ゲノムＤＮＡを１００倍に希釈し、テンプレートとして５μｇを、５０μｌＰＣＲ混合物中で使用した。以下のプログラムを使用するＨｙｂａｉｄ  ＭＢＳ  ０．２Ｇ  ＰＣＲブロック：
【０１７６】
【表９】
2020089365.tif 000013
【０１７７】
【表１０】
2020089365.tif 000014
【０１７８】
【表１１】
2020089365.tif 000015
【０１７９】
［アリールスルファターゼノックアウトベクターの構築：］
Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｐａｒｔ．ｎｏ．４５−０２４５）を使用して、供給者の指示に従い、得られた５’−、３’−および３’ＳａｃＩＩ−アリールスルファターゼフランクＰＣＲフラグメントを、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。ＴＯＰＯクローニング反応を、供給者の指示に従って、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｃｈｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｐａｒｔ．ｎｏ．４４−０３０１）へとトランスフォームした。５’ＴＯＰＯ、３’ＴＯＰＯおよび３’ＳａｃＩＩ−ＴＯＰＯに対してそれぞれ、ＭｕｎＩ、ＳａｃＩＩ、ＸｃｍＩおよびＤｒａＩ；ＭｕｎＩ、ＳａｃＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶ；ＭｕｎＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶおよびＳａｃＩＩを使用して、制限パターン解析に基づき正しいクローンを選別した。
【０１８０】
ａｍｄＳカセットをｐＫＬＡＣ１ベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）から分離した。ｐＫＬＡＣ１プラスミドを、ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｄａｍ−Ｉｄｃｍ−Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）；Ｃａｔ．Ｎｏ  Ｃ２９２５Ｈ）へトランスフォームし、メチル化されていないプラスミドを分離した。
【０１８１】
ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｄｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＡ０２００）を使用して、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む終夜のＬＢＣ培養物から、５’ＴＯＰＯ、３’ＴＯＰＯ、３’ＳａｃＩＩ−ＴＯＰＯおよびｐＫＬＡＣ１ベクターのプラスミドＤＮＡバッチを、大量に分離した。
【０１８２】
ｐＫＬＡＣ１ベクターをＳａｌＩおよびＸｂａＩで消化させ、５’ＴＯＰＯベクターをＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化させた。Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＥｘｔｒａｃｔＩＩ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｙ  Ｎａｇｅｌ）を使用し、供給者の指示に従って、消化物を精製した。
【０１８３】
ＳａｌＩ／ＸｂａＩ消化ａｍｄＳカセットを、Ｑｕｉｃｋ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ２２００Ｓ）を使用し、供給者の指示に従って、ＸｂａＩ／ＸｈｏＩ消化５’ＴＯＰＯベクターへライゲートした。ライゲーション混合物を、供給者の指示に従い、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｐａｒｔ．ｎｏ．４４−０３０１）へトランスフォームした。ＭｕｎＩ、ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩを使用して、制限パターン解析に基づき正しいクローンを選別した。以上により次のベクター：５’ａｍｄＳＴＯＰＯベクター（図１）を得た。
【０１８４】
ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｄｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＡ０２００）を使用し、供給者の指示に従い、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む、終夜のＬＢＣ培養物から、５’ａｍｄＳ  ＴＯＰＯプラスミドバッチを、大量に分離した。５’ａｍｄＳ  ＴＯＰＯベクターをＭｕｎＩおよびＡｓｃＩで消化させ、３’ＳａｃＩＩ−ＴＯＰＯベクターをＭｕｎＩおよびＥｃｏＲＩで消化させた。
【０１８５】
ＭｕｎＩ／ＥｃｏＲＩ  ３’ＳａｃＩＩ−ＴＯＰＯフラグメントを分離し、ゲル抽出により精製した。ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｐａｒｔ．ｎｏ．Ｓ３３１０２）を含むＴＡＥ緩衝液中、１％アガロース上で、供給者の指示に従って電気泳動を行った。ダークリーダートランスイルミネータ（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＲ−４５Ｍ）を使用して、フラグメントを可視化し、ゲルから切り取り、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＥｘｔｒａｃｔＩＩ  ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｙ  Ｎａｇｅｌ；Ｃａｔ．Ｎｏ．７４０  ６０９．２５０）を使用し、供給者のゲル抽出プロトコルに従って、アガロースから抽出した。
【０１８６】
５’ａｍｄＳ  ＴＯＰＯベクターをＭｕｎＩおよびＡｓｃＩで消化させ、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＥｘｔｒａｃｔＩＩ  ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｙ  Ｎａｇｅｌ）を使用し、供給者のＰＣＲ精製プロトコルに従って精製した。その後、Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ；Ｃａｔ．Ｎｏ．１  ７５８  ２５０）を使用し、供給者の指示に従って、ＭｕｎＩ／ＡｓｃＩ消化５’ａｍｄＳ  ＴＯＰＯベクターを脱リン酸化した。
【０１８７】
ＭｕｎＩ／ＥｃｏＲＩ３’ＳａｃＩＩ−  ＴＯＰＯフラグメントを、Ｑｕｉｃｋ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ２２００Ｓ）を使用し、供給者の指示に従って、脱リン酸化されたＭｕｎＩ／ＡｓｃＩ消化５’ａｍｄＳ  ＴＯＰＯベクターへライゲートした。ライゲーション混合物を、ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｄａｍ−Ｉｄｃｍ−Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ  Ｃ２９２５Ｈ）へ、供給者の指示に従い、トランスフォームした。ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶを使用して、制限パターン解析に基づき正しいクローンを選別した。以上により、次のベクター：５’ａｍｄＳ  ３’ＳａｃＩＩ−  ＴＯＰＯベクターを得た。
【０１８８】
ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｄｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＡ０２００）を使用し、供給者の指示に従い、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む終夜のＬＢＣ培養物から、５’ａｍｄＳ  ３’ＳａｃＩＩ−  ＴＯＰＯベクターのバッチを、大量に分離した。
【０１８９】
５’ａｍｄＳ  ３’ＳａｃＩＩ−ベクターをＸｂａＩで消化させた。３’ＴＯＰＯベクターをＸｂａＩおよびＳｐｅＩで消化させた。Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＥｘｔｒａｃｔＩＩ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｙ  Ｎａｇｅｌ）を使用し、供給者の指示に従って、消化物を精製した。ＸｂａＩ／ＳｐｅＩ３’ＴＯＰＯフラグメントを、上述のようにして、ゲル抽出により分離した。Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｒｏｃｈｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１  ７５８  ２５０）を使用し、供給者の指示に従って、ＸｂａＩ消化５’ａｍｄＳ  ３’ＳａｃＩＩ−ベクターを脱リン酸化した。ＸｂａＩ／ＳｐｅＩ３’フラグメントを、Ｑｕｉｃｋ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ２２００Ｓ）を使用し、供給者の指示に従って、脱リン酸化されたＸｂａＩ消化５’ａｍｄＳ  ３’ＳａｃＩＩ−ベクターへライゲートした。ライゲーション混合物を、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｃｈｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｐａｒｔ．ｎｏ．４４−０３０１）へトランスフォームした。ＭｆｅＩ、ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｃＩを使用して、制限パターン解析に基づき正しいクローンを選別した。以上により、最終のＫ．ｌａｃｔｉｓアリールスルファターゼノックアウトベクターを得た（図３）。
【０１９０】
ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｄｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＡ０２００）を使用し、供給者の指示に従い、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む終夜のＬＢＣ培養物から、アリールスルファターゼノックアウトベクターのバッチを、大量に分離した。Ｋ．ｌａｃｔｉｓアリールスルファターゼノックアウトベクターはＳａｃＩＩで消化させて、ＴＯＰＯベクター部のないリニアなノックアウトカセットを得た。Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＥｘｔｒａｃｔＩＩ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｙ  Ｎａｇｅｌ）を使用し、供給者の指示に従って、消化物を精製した。
【０１９１】
［アリールスルファターゼノックアウトベクターによるＫ．ｌａｃｔｉｓＣＢＳ２３５９の形質転換］
１００ｍｌのＫ．ｌａｃｔｉｓＣＢＳ２３５９のＹＥＰＤ培養物を、３０℃、２８０ｒｐｍで振盪しながら２４時間、インキュベートした。この培養物を、同じ条件でＯＤ６１０が０．５〜０．８に達するまで培養した１００ｍｌのＹＥＰＤ培養物に植え付けるために使用した。
【０１９２】
細胞を、１５５９ｇ、４℃で５分間の遠心分離により回収した。５０ｍｌの無菌エレクトロポレーション緩衝液（ＥＢ）（ｐＨ７．５の１０ｍＭのＴｒｉｓ、９．２％（ｗ／ｖ）のサッカロース、１ｍＭのＭｇＣｌ２、４℃で）で細胞ペレットを洗浄する。細胞ペレットを、室温で、２５ｍＭのＤＴＴおよび２０ｍＭ、ｐＨ８．０のＨＥＰＥＳ緩衝液を含む５０ｍｌＹＥＰＤに再懸濁させた。細胞を、振盪せずに３０℃で３０分間インキュベートした。細胞を、１５５９ｇ、４℃で、５分間の遠心分離により回収し、氷温度のＥＢ１０ｍｌで洗浄した。細胞を、１５５９ｇ、４℃で、５分間の遠心分離で、再度ペレット化し、０．１ｍｌの氷温度のＥＢに再度懸濁させた。細胞懸濁液を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに４０マイクロリットルずつ分配した。１つの細胞アリコートに０．２〜１．０マイクログラム（１〜５マイクロリットル）のリニアなノックアウト構築体を加え、ピペット操作で混合し、１５分間、氷上でインキュベートした。細胞−ＤＮＡ混合物を、ギャップサイズ２ｍｍの、冷却したエレクトロポレーションキュベット（ＢＴＸ；Ｐａｒｔ．Ｎｏ．４５−０１２５）に加えた。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、Ｍｏｄｅｌ  Ｎｏ．１６５２０７７）およびＰｕｌｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ；Ｍｏｄｅｌ  Ｎｏ．１６５２０９８）からなるＢｉｏＲａｄエレクトロポレータ上で、次の設定：１０００Ｖ、４００オームおよび２５μＦにより、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション終了後、直ちに１ｍｌのＹＥＰＤを加え、１２ｍｌの無菌試験管に細胞を移し、３０℃の振盪インキュベータ中で、２時間、インキュベートした。細胞を、１５５９ｇで５分間遠心分離してペレット化し、生理食塩水（０．８５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）中で洗浄した。細胞を再びペレット化し、１ｍｌの生理食塩水中に再懸濁させた。２５μｌ、５０μｌおよび１００μｌのアリコートを選択性ａｍｄＳ寒天板（１．２５％（ｗ／ｖ）の寒天、１．１７％（ｗ／ｖ）の酵母カーボンベース（Ｙｅａｓｔ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｂａｓｅ）、３０ｍＭのｐＨ６．８リン酸緩衝液および５ｍＭのアセトアミド）上で平板培養した。寒天板は３０℃で２日間、引き続き、室温で２日間、インキュベートした。
【０１９３】
単一のコロニーが出現するよう、コロニーを選択し、それをＹＥＰＤ寒天板上でストリーキングすることによって精製し、そして３０℃で２４時間インキュベーションした。オリゴヌクレオチドが、ａｍｄＳカセットに対し、ノックアウト構築体組み込みの下流側でターゲットにするコロニーＰＣＲを用いて、これらの単一コロニーの、ノックアウト構築体の標的組換えについてテストした。コロニー物質を、２０ｍＭのＮａＯＨ、０．２％（ｗ／ｖ）中に懸濁させ、９８℃で５時間インキュベートした。細胞懸濁液を水で２倍に希釈し、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、Ｅｓｐｏｏ、フィンランド；製品コードＦ−５３０Ｓ）を使用する、２５マイクロリットルＰＣＲ反応のテンプレートとして、供給者の指示に従って、２．５マイクロリットルを直接使用した。
【０１９４】
【化４】
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【０１９５】
【表１２】
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【０１９６】
ＰＣＲは１％アガロースゲル上で分析し、明確な増幅バンドを示す標的転換体を選択した。アリールスルファターゼノックアウト株を、２３５９ΔＡＲＹ１−１０と命名し、次回の使用まで保管した。
【０１９７】
［実施例１５］
［２３５９ΔＡＲＹ中のアリールスルファターゼ活性体の検出］
マザー菌株ＣＢＳ２５３９および菌株２３５９ΔＡＲＹの両者を振盪フラスコ内、１００ｍｌＹＥＰ＋２％ガラクトース中において、３０℃で３日間、培養した。バイオマスを、１５５９ｇ、４℃で５分間遠心分離して回収した。バイオマスを、氷温度の水で２回洗浄し、培地成分を除去した。酵母バイオマスを、Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｙ−ＰＥＲ）を使用し、製造業者（Ｐｉｅｒｃｅ）の指示通りに処理し、アリールスルファターゼのような細胞内酵素を抽出した。アリールスルファターゼ活性体を抽出するのに、ガラスビーズによる機械的剪断、または、例えばＺｙｍｏｌｙａｓｅ（ＧｌｏｖｅｒおよびＨａｍｅｓ、ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ２−ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５年を参照）で細胞壁を溶解する酵素処理などの、他の酵母菌溶解方法が使用できることは、当業者には明らかである。
【０１９８】
実施例２に記載した方法を使用して、抽出物中のアリールスルファターゼを測定した。この実験から、マザー菌株はかなりの量のアリールスルファターゼ活性体を含んでいるが、２３５９ΔＡＲＹ株には、そのような活性体は検出されないことが明らかになった。実施例２に従って、この抽出物のβ−ガラクトシダーゼ（ラクターゼ）活性体を測定すると、野生型菌株ＣＢＳ２３５９と突然変異菌株２３５９ΔＡＲＹとで、検出されるラクターゼ活性体に差はなく、突然変異菌株がアリールスルファターゼ活性体を特異的に妨害することを示している。
【０１９９】
突然変異菌株は、工業的規模で、アリールスルファターゼ活性体を実質的に含まないラクターゼ調製物を製造するために使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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