(57)【要約】      （修正有）【課題】イン・ビボ型バイオセンサのプローブにおいて、酵素およびレドックスメディエータの外部への流出を防止して、耐久性を向上させる。【解決手段】バイオセンサプローブのセンシング部分を構成するベースとなる絶縁性基板の表面の一部に所定形状の凹部領域を設け、その凹部領域内に検知層を形成する。【選択図】図１２
2020156910.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオセンサ用のプローブであって、
絶縁性基板と、
前記絶縁性基板の少なくとも一部に形成された導電性薄膜と、
導電性薄膜上の一部に規定された作用電極と、
前記作用電極が規定された導電性薄膜以外の導電性薄膜上の一部に規定された対極と、
前記作用電極または対極が規定された導電性薄膜以外の導電性薄膜上の一部に形成された参照電極と、
前記作用電極上に形成された検知層と、
前記作用電極、前記検知層、前記参照電極、および前記対極を被覆する生体性適合保護膜と、を備え、
前記作用電極が規定された絶縁性基板の少なくとも一部に凹部領域が形成され、前記凹部領域の内底面上に前記導電性薄膜および検知層が形成されているプローブ。
【請求項２】
前記凹部領域の内底面は、その外周部が中央領域よりも下方に窪んでいる、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記凹部領域の開口部周囲に沿って上方に突堤部が形成されている、請求項１または２に記載のプローブ。
【請求項４】
前記検知層は、少なくともレドックスメディエータおよび検体応答性酵素を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項５】
前記検知層は、レドックスメディエータを含むメディエータ層および検体応答性酵素を含む酵素層から構成される多層膜である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項６】
バイオセンサ用のプローブの製造方法であって、
プローブのベースとなる絶縁性基板の一部に凹部領域を形成する工程；
前記絶縁性基板の少なくとも一部に導電性薄膜を形成する工程；
前記凹部領域の内底面に形成された導電性薄膜上に検知層を形成する工程； 
前記絶縁性基板に形成された、異なる導電性薄膜上に、参照電極および対極を、それぞれ、形成する工程；ならびに、
前記参照電極、前記対極および前記検知層を生体性適合保護膜で被覆する工程
を含む、プローブの製造方法。
【請求項７】
前記凹部領域が、プレス加工、エッチング加工、レーザー加工、研削加工よりなる群から選択される方法を用いて形成される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記凹部領域が、加熱プレス加工によって形成される、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、例えば、液体試料の被検体に含まれる特定物質の濃度を計測するバイオセンサを構成するプローブおよびその製造方法に関する。より詳しくは、本開示により、体内に挿入されるバイオセンサプローブに形成された検知層に含まれる酵素やメディエータの漏出または変質を防止することによって、バイオセンサの耐久性を向上したバイオセンサプローブおよびその製造方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサとは、生体の有する分子認識能を利用あるいは模倣して物質を計測するシステムであり、例えば、酵素−基質、抗原−抗体、ホルモン−レセプターなどの組合せのうち一方を検体（測定対象物質）とし、他方を受容体として検体とその受容体との間の分子認識反応によって発生する化学的な変化をトランスデューサーで電気信号に変換し、得られた電気信号の強さに応じて検体の量を測定する測定装置である。
【０００３】
バイオセンサに用いる生体分子として、上記以外にも遺伝子、糖鎖、脂質、ペプチド、細胞、組織なども含まれる。なかでも、酵素を用いたバイオセンサは盛んに開発が行われており、その代表例が、自己血糖測定に用いられるグルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOx）やグルコース脱水素酵素 (Glucose dehydrogenase; GDH)などを用いた電気化学式グルコースセンサである。
【０００４】
自己血糖測定に用いられる電気化学式グルコースセンサは、概略、その表面に電極が形成された絶縁基板の上に、スペーサーを介してカバーが配置されている構成である。前記電極上には検体応答性酵素、レドックスメディエータ（電子伝達体）等を含む試薬が配置されており、この部分が分析部となる。この分析部には、血液を導入するための流路の一端が連通しており、前記流路の他端は外部に向かって開口しており、ここが血液供給口となる。このようなセンサを用いた血糖値の測定は、例えば、次のようにして行われる。すなわち、まず、前記センサを専用の測定装置（メータ）にセットする。そして、指先等をランセットで傷つけて出血させ、これに前記センサの血液供給口を接触させる。血液は、毛細管現象によりセンサの流路に吸い込まれ、これを通って分析部に導入され、ここで、前記試薬と接触する。そして、検体応答性酵素E（例えば、GOx、GDH）は、血液中のグルコースと特異的に反応することでグルコースを酸化する。レドックスメディエータMは、酸化によって発生した電子を受容する。電子を受容して還元されたレドックスメディエータMは、電極で電気化学的に酸化される。還元体レドックスメディエータMの酸化によって得られる電流値や電荷量などの大きさから、血液中のグルコース濃度、すなわち血糖値が簡便に検出される。
【０００５】
このような電気化学式血糖センサは、糖尿病治療における血糖値管理に重要な役割を果たし、糖尿病患者は血糖値に基づく適切なインスリン投与や食事制限を行うことができる。しかしながら、一日に何度も血糖値を測定しなければならず、その都度血液採取をすることは患者に苦痛を強いることとなるので、生活の質（Quality of Life; QOL）を維持することが困難であった。
【０００６】
すでに埋め込み型電気化学式グルコースセンサが開発されている。このような埋め込み型電気化学式グルコースセンサ1の本体10を生体2に貼り付けてプローブ11を生体内に挿入して継続的に血糖値の測定を行う（図１および２）。これにより、その都度血液採取することなく、長時間にわたり血糖値を測定することができる。
【０００７】
厚生労働省は、「平成9年遠隔診療通知（平成9年12月24日付け健政発第1075号厚生省健康政策局長通知）」を行い、遠隔診療の基本的考え方や医師法第20条等との関係から留意すべき事項を示した。その後、情報通信機器の開発・普及の状況を踏まえ、２０１５年８月１０日付けで情報通信機器を用いた診療（いわゆる「遠隔診療」）について各都道府県知事に向けて事務連絡を行った。２０１５年通知により、遠隔診療は事実上解禁され、２０１６年には情報通信機器3（スマートフォン）と専用アプリケーションを用いて、バイオセンサ1と無線データ通信する遠隔診療ツールが世の中に出回り始めた（図３）。さらに、２０１７年７月１４日付けで、遠隔診療の取扱いについて、再度周知、明確化する趣旨で通知（医政発0714第4号）が行われた。２０１５年通知によれば、遠隔診療は、当事者が医師および患者本人であることが確認できる限り、テレビ電話や、電子メール、ソーシャルネットワーキングサービス等の情報通信機器を組み合わせた遠隔診療についても、直接の対面診療に代替し得る程度の患者の心身の状況に関する有用な情報が得られる場合には、直ちに医師法第20条等に抵触するものではない、とした。この２０１７年通知によって、情報通信機器を利用した遠隔診療がさらに発展するであろう。したがって、埋め込み型センサの需要はますます高まることが期待される。
【０００８】
従来のイン・ビボ型（埋め込み型）のバイオセンサの構成として、主面を有するベース基板と、前記ベース基板の主面上に形成され、作用極と対極とを有する電極層と、被検体と反応する試薬層と、前記試薬層を含む、被検体と試薬が反応する空間を覆う生体性適合膜と、を備えたものであった（特許文献１）。また、イン・ビトロ型のバイオセンサでは、絶縁性の基板の表面に、少なくとも測定電極と対電極を形成し、その上に少なくとも一部を覆うように試薬層を形成し、試薬層の厚さを調整するための絶縁部を設け、試薬層を形成するための絶縁部が、凹部を形成したバイオセンサもある（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第８３２６３９３号明細書
【特許文献２】特開２０００−２２１１５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記従来のイン・ビボの埋め込み型センサは、そのプローブを長時間体内に挿入するので、構成要素である検体応答性酵素やレドックスメディエータが流出する機会が増大する。検体応答性酵素やレドックスメディエータがセンサ外部に流出すれば、センサ感度が劣化するのみならず、生体に対して害を与えることとなる。また、検体応答性酵素やレドックスメディエータが外部に流出すれば、センサの耐久性も低下する。したがって、検体応答性酵素やレドックスメディエータの流出を防止する対策が非常に重要である。
【００１１】
従来のイン・ビボの埋め込み型のバイオセンサでは、ベースとなる絶縁性基板上に電極層を形成し、その上に検知層を形成し、その試薬層を生体性適合の保護膜で覆って、検体応答性酵素やレドックスメディエータなどの試薬が外部に流出することを防止しているが、絶縁性基板上に形成した検知層に対して、保護膜の膜厚が薄くなる部分が生じ、試薬が膜の外部に漏れ出す場合があり、その結果、バイオセンサの測定の耐久性が低下してしまうのであった。
【００１２】
したがって、本開示では、バイオセンサの測定の耐久性を向上するために、ベース基板上に形成した検知層に対して、保護膜の膜厚が薄くなる部分が存在しないバイオセンサプローブおよびその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この課題を解決するために、本開示では、イン・ビボ型（埋め込み型）のバイオセンサにおいて、バイオセンサプローブのセンシング部分を構成するベースとなる絶縁性基板の表面の一部に凹部領域を設け、その凹部領域内に検知層を形成する。
【００１４】
より具体的には、本開示は、バイオセンサ用のプローブであって、絶縁性基板と、前記絶縁性基板の表面に形成された導電性薄膜と、導電性薄膜上の一部分に形成された作用電極と、前記絶縁性基板の作用電極以外の導電性薄膜上に形成された参照電極及び対極と、前記作用電極上に形成された検知層と、前記作用電極、前記参照電極、前記対極および前記検知層を被覆する生体性適合保護膜と、を備え、前記作用電極が形成された絶縁性基板の少なくとも一部に凹部領域が形成され、前記凹部上に前記導電性薄膜および検知層が形成されたプローブを提供する。
【００１５】
本開示のひとつの態様は、前記凹部領域の内底面は、その外周部が中央領域よりも下方に窪んでいることを特徴とする。
この窪みの形状は、限定されないが、検体応答性酵素やレドックスメディエータなどの試薬の水溶液の溶媒に対して毛細管現象が生じる程度に細い切り込み状であることが望ましく、開口から下方に向かって狭くなっていく。
前記凹部領域の深さは、その内底面において、外周部から下記する窪みを除いた領域、すなわち、凹部領域の内壁面から中央に向かって水平方向で３０μｍ以上離れた領域（以下、「底部領域」という。）の絶縁性基板の表面からの平均深さとして、５〜１００μｍであり、好ましくは１０〜４０μｍであり、より好ましくは１５〜３５μｍである。
窪みの開口の幅は、プローブの幅より小さければよく、好ましくは５０〜３００μｍであり、より好ましくは１００〜２５０μｍであり、より好ましくは１５０〜２５０μｍである。
窪みの深さは、平均底部領域面から２．５〜３０μｍであり、好ましくは５〜２０μｍであり、より好ましくは５〜１５μｍである。ここで、「平均底部領域面」とは、底部領域の絶縁性基板の上表面からの平均深さに位置し、絶縁性基板の上表面に対して水平な仮想的な面を意味する。
【００１６】
本開示のもう一つの態様は、前記凹部領域の開口部周囲に沿って上方に突堤部が形成されていることを特徴とする。
突堤部の内壁面は、凹部領域の垂直軸に対して凹部領域の内方に傾いていなければよく、前記垂直軸に対して水平または凹部領域の外方に傾いていている。すなわち、突堤部の内壁面が示す凹部領域の垂直軸に対する傾きは、外方に０〜４５°であり、好ましくは３〜３０°であり、より好ましくは５〜１５°、最も好ましくは６〜１０°である。
突堤部下部が、検知層、保護膜を形成する際に突堤部が破損されない程度の厚みを有していればよく、突堤部の外壁の傾きは、当該厚みに依存して適宜定まる。
絶縁性基板の上表面から突堤部の上端までの高さは５〜９０μｍであり、好ましくは１０〜５０μｍであり、より好ましくは１５〜３０μｍである。
【００１７】
凹部領域の寸法や角度は、上面図において長手方向および横手方向のそれぞれを略４等分する３つの線分を接触式表面形状測定装置（Dektak XT）や形状解析レーザー顕微鏡（ＶＫ−Ｘ１５０）で走査して得られたプロファイルから算出した平均値である。
【００１８】
本開示によるイン・ビボ型バイオセンサ用のプローブの製造方法は、
プローブのベースとなる絶縁性基板の表側の一部に凹部領域を形成する工程、
前記絶縁性基板の表側および凹部領域の全面、ならびに裏面に導電性薄膜を形成する工程、
前記凹部領域の内底面上の導電性薄膜上に検知層を形成する工程；ならびに、
前記作用電極、前記参照電極、前記対極および前記検知層を生体性適合保護膜で被覆する工程
を含む。
【００１９】
絶縁性基板の表側の一部に凹部領域を形成する工程において、絶縁性基板に凹部領域を形成できる方法であれば、プレス加工、エッチング加工、レーザー加工、研削加工などのいずれの方法も用いることができる。本開示によるプローブにおいて、所望する形状の凹部領域を形成する方法としては、金型を用いたプレス加工が好ましく、加熱プレス加工がより好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本開示によれば、絶縁性基板の表側の一部に形成した凹部領域内に検知層を形成したので、検知層上の保護膜の膜厚を十分に厚く形成することが可能となり、その結果、試薬の外部への漏出や保護膜内の試薬の変質を防ぐことができる。これにより、バイオセンサの測定の耐久性を向上することができた。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】埋め込み型バイオセンサが生体（人体）に取り付けられた状態を示す概略図。
【図２】生体（人体）に取り付けられた状態の埋め込み型バイオセンサを示す断面図。
【図３】スマートフォンと測定データを無線通信する埋め込み型バイオセンサの概略図。
【図４】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。
【図５】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。
【図６】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。
【図７】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。
【図８】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブ表側の上面図。
【図９】図８におけるA-A’切断線での断面図。
【図１０】図９におけるB-B’切断線での断面図。
【図１１】図９におけるC-C’切断線での断面図。
【図１２】本開示によるひとつの実施形態の製造工程毎のプローブ先端の短手方向の断面図。
【図１３】本開示によるひとつの実施形態の製造工程において、絶縁性基板（ＰＥＴ基板）上に、金型を使用する加熱プレス加工により形成した凹部領域を示す図：（ａ）上方から観察した顕微鏡像、（ｂ）凹部領域の短手方向に縦に切断した時の切断部端面を観察した顕微鏡像、（ｃ）凹部領域の長手方向プロファイルおよび（ｄ）凹部領域の短手方向のプロファイル。
【図１４】本開示による別の実施形態の製造工程において、絶縁性基板（ＰＥＴ基板）上に、レーザー加工により形成した凹部領域を示す図：（ａ）上方から観察した顕微鏡像、（ｂ）凹部領域の短手方向に縦に切断した時の切断部端面を観察した顕微鏡像、（ｃ）凹部領域の長手方向プロファイルおよび（ｄ）凹部領域の短手方向のプロファイル。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
１．埋め込み型バイオセンサのプローブの製造方法
本開示のひとつの実施形態の埋め込み型バイオセンサ1のプローブ11の製造方法を説明する。以下に示す構造および製造方法は、本開示のひとつの具体例であり、本開示の特徴を有する所望の凹部領域が形成されていれば、下記した構成に限定されるものではない。
【００２３】
（１）絶縁性基板の準備
埋め込み型バイオセンサ1は本体10とプローブ11を含み、プローブ11は、概略、生体内に挿入するセンシング部分およびバイオセンサ本体10の内部回路と電気的接続するための端子部分からなる鍵形状である。センシング部分は体内に挿入できるように細く形成され、端子部分はバイオセンサ本体10に挿入して電気的接続を形成するように一定の大きさを有する。したがって、まず、鍵形状の絶縁性基板111を準備する（図４ａ）。上段には表側から見た上面図を示し、下段には裏側から見た上面図を示す（以下、同様）。この絶縁性基板111は、生体内に挿入するプローブとして使用できる材料および厚さであれば、特に限定されることなく、例えば、約200 μm厚のポリエチレンテレフタレート (PET)を用いることができる。
鍵形状の絶縁性基板111は、材料を裁断することによって準備するが、裁断する方法は、特に限定されず、レーザーカット、ピナクルダイを用いたダイカットなどの分野公知の方法で裁断することができる。
【００２４】
（２）凹部領域の形成
次に、絶縁性基板111のセンシング部分の先端の表側の表面に、長手方向に沿って凹部領域112を形成する（図４ｂ）。
凹部領域の形成方法として、プレス加工、エッチング加工、レーザー加工、研削加工などのいずれの方法を用いることができる。
特に、金型を用いたプレス加工が好ましく、加熱プレス加工がより好ましい。加熱プレス加工の場合、加熱温度は、プレス加工する対象の素材に応じて異なるが、１００〜２５０℃の温度範囲が好ましく、押圧力は、プレス加工する素材や面積に応じて異なるが、１個のプローブを作製する際、５０〜２５０Ｎが好ましい。さらには、素材としてポリエチレンテレフタレート (PET)を使用する場合、１３０〜２００℃の温度範囲が好ましく、押圧力は、プレス加工する面積に応じて、７０〜２００Ｎが好ましい。
【００２５】
（３）導電性薄膜の形成
絶縁性基板111の両面に、炭素または金、銀、白金もしくはパラジウムなどの金属よりなる群から選択される導電性金属材料をスパッタ法、蒸着法、イオンプレーティングなどにより堆積することによって導電性薄膜113を形成する（図５ｃ）。これにより、絶縁性基板111の表側の表面において、凹部領域の側面および内底面から凹部領域が形成されていない領域にわたって連続的に導電性薄膜が形成され、同様に、絶縁性基板111の裏側の表面の全面にも連続的に導電性薄膜が形成される。導電性薄膜の好ましい厚さは、10 nm〜数百nmである。
【００２６】
（４）電極リードの形成
絶縁性基板111の表側に形成した導電性薄膜113にレーザー描写することによって絶縁性基板111の表面に達する深さの溝114を形成して、作用電極リード113aと参照電極リード113bに分離して電気的絶縁する（図５ｄ）。
【００２７】
（５）絶縁膜の形成
絶縁性基板111の表側に、作用電極115および参照電極116ならびに本体10と電気接続するための作用電極用端子115aおよび参照電極用端子116aとして用いる領域を除いた部分に、スパッタ法、スクリーン印刷法などにより、開口を有する絶縁膜117aを形成し、絶縁性基板111の裏側に、対極118および本体10と電気接続するための対極用端子118aとして用いる領域を除いた部分に、スパッタ法、スクリーン印刷法などにより、開口を有する絶縁膜117bを形成する（図６ｅ）。絶縁膜の好ましい厚さは、5〜40 μmである。
【００２８】
（６）参照電極の形成
絶縁性基板111の表側に形成した絶縁膜117aの参照電極用の開口にAg/AgClをスクリーン印刷法、ディスペンサ法およびインクジェット法などにより堆積させて、参照電極116を形成する（図６ｆ）。参照電極の好ましい厚さは、5〜40 μmである。
【００２９】
（７）検知層の形成
凹部領域112の作用電極115の上に、レドックスメディエータの水溶液および検体応答性酵素の水溶液を混合させ、その混合水溶液を塗布乾燥して、少なくとも、レドックスメディエータおよび検体応答性酵素を含む検知層119を形成する（図７ｇ）。また、検知層の導電性を向上させるために、レドックスメディエータおよび検体応答性酵素の混合水溶液の前に、炭素粒子懸濁液などの導電性粒子を先に塗布乾燥してもよい。本開示において、「検体応答性酵素」とは、検体の酸化または還元を特異的に触媒することのできる生化学物質を意味する。バイオセンサの検出目的に使用できれば、いかなる生化学物質でもよい。例えば、グルコースを検体とする場合、適した検体応答性酵素は、グルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOx）やグルコース脱水酵素 (Glucose dehydrogenase; GDH)などである。「レドックスメディエータ」とは、電子伝達を仲介する酸化還元物質を意味し、バイオセンサにおいて、検体（アナライト）の酸化還元反応によって生じる電子の伝達を担う。例えば、フェナジン誘導体などが含まれるが、これに限定されず、バイオセンサの検出目的に使用できれば、いかなる酸化還元物質でもよい。
【００３０】
また、以下にレドックスメディエータの合成の一例を示す。
［合成例：カルボキシル基を有するフェナジン誘導体の合成］
1-メトキシフェナジンにN-アルキル化剤を作用して、例えば、5-(4-カルボキシブチル)-1-メトキシフェナジニウム硝酸塩を合成する。さらに、末端カルボキシル基にN-ヒドロキシスクシンイミドを付加してカルボキシル基の反応性が向上した、5-{[(2,5-ジオキソピリジン-1-イル)オキシ]-5-オキソペンチル}-1-メトキシフェナジニウム硝酸塩を合成する。対応するN-アルキル化剤を選択して、所望のN-アルキルカルボキシフェナジニウム塩を合成することができる。
【００３１】
【化１】
2020156910.tif 000003
【００３２】
合成例で得られた、5-{[(2,5-ジオキソピリジン-1-イル)オキシ]-5-オキソペンチル}-1-メトキシフェナジニウム硝酸塩（Ph-C5-Su）：
【００３３】
【化２】
2020156910.tif 000004
を0.6 mg計り取り、100 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸 (MES)緩衝液（pH 6.0）120 μLに溶解した。別途、ポリ（L-リジン）塩酸塩（株式会社ペプチド研究所 Code 3075; M.W.>12000, 透析によるカットオフ）を5 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH 6.0）1 mLに溶解した。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、ポリ（L-リジン）塩酸塩にフェナジンが共有結合した高分子量ポリマー（PLL-C5-Ph_1）を得た。
得られたPLL-C5-Ph_1の溶液は、マイクロプレート (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN)およびプレートリーダー (TECAN infinite M200 PRO)により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を約11に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
【００３４】
本開示において、検知層は、少なくともレドックスメディエータおよび検体応答性酵素を含み、レドックスメディエータの水溶液および検体応答性酵素の水溶液を順次塗布乾燥して、レドックスメディエータを含むメディエータ層および検体応答性酵素を含む酵素層から構成される多層膜であってもよい。
また、検知層の好ましい厚さは、1〜80 μmである。
【００３５】
水溶液や懸濁液を平面基板上に塗布し乾燥した場合、コーヒーステイン現象によって、含有成分の濃度が、外周部において高く、中央部において低くなり、その結果、塗布膜の外周部が高くなり、中央部において低くなることが知られている。すなわち、凹部領域の内底面が平坦であると、レドックスメディエータの水溶液および検体応答性酵素の水溶液を塗布し乾燥してメディエータ層や酵素層を形成すれば、各層の濃度や厚みが中央から外周部に向かって大きく変化する。その結果、構造的に不安定であり、検知層の場所によって試薬の濃度変化が生じて、検知感度も低下する。
しかしながら、本開示による凹部領域の内底面は、上記したように、その外周部が中央領域よりも下方に窪んでいて、この窪みの形状は、水のような溶媒に対して毛細管現象が生じる程に細い切り込み状であるので、コーヒーステイン現象によって層厚が厚くなりがちな外周部において、水溶液が窪み内に引き込まれ、厚みが相殺されるので、結果として検知層の厚みが、ほぼ平坦となる。
【００３６】
（８）保護膜の形成
センシング部分を、センサ保護用の生体適合性樹脂を含む溶液に浸漬して、センシング部分の両面、側面および端面に保護膜120を形成する（図７ｈ）。保護膜120は、作用電極用端子115a、参照電極用端子116aおよび対極用端子118aを被覆することなく、少なくとも、作用電極115、参照電極116、対極118および検知層119を被覆し、生体内に挿入される長さ以上に形成する。保護膜の好ましい厚さは、5〜200 μmである。
【００３７】
センサ保護用の生体適合性樹脂として、限定されないが、ポリ（4-ビニルピリジン）を用いることができ、ポリ（4-ビニルピリジン）はポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE)などの架橋剤により架橋されていてもよく、例えば、ポリ(tert-ブチルメタクリレート)-b-ポリ(4-ビニルピリジン)、ポリスチレン-co-4-ビニルピリジン-co-オリゴ[プロピレングリコールメチルエーテル]メタクリレートなどが挙げられる。
【００３８】
２．埋め込み型バイオセンサのプローブの内部構造
本開示のひとつの実施形態の埋め込み型バイオセンサ1のプローブ11のプローブの内部構造をさらに説明する。
【００３９】
図８に、センシング部分に保護膜まで形成された状態のプローブ11の表側から見た上面図を示す。図８のA-A’切断線での断面図を図９に示す。絶縁性基板111の両側に導電性薄膜113が形成されている。表側の導電性薄膜113では、溝114によって作用電極リード113aと参照電極リード113bの２つのリードに分離され、電気的に絶縁されている。作用電極リード113aの一部が作用電極115として機能する。センシング部分の先端または先端付近には、凹部領域112が形成され、その側面および内底面まで連続的に導電性薄膜113が形成され、したがって、凹部領域112の内底面が作用電極115として機能することとなる。この作用電極115上に検知層119が形成されている。検知層119は図９では、一層で示されているが、作用電極上にメディエータ層119aを形成し、その上にレドックスメディエータ層119bを形成して二層構造とすることができ、実施形態に依存して、その他の構成も許容される。
また、絶縁膜117aの開口部分に参照電極116が形成されて、参照電極リード113bと電気的に接続している。裏側の導電性薄膜113は対極リード113cとなり、その一部が対極118として機能する。
なお、図９において、プローブ内部の基本的構造を説明する趣旨から、凹部領域の形状は簡便に描写している。
【００４０】
図９のB-B’切断線での断面図を図１０に示す。絶縁性基板111の表側に作用電極115が形成され、その上に検知層119が形成され、裏側に対極118が形成されている。さらに、センシング部分の周囲全体が本開示の保護膜120で被覆されていることが分かる。
なお、図１０において、プローブ内部の基本的構造を説明する趣旨から、凹部領域の形状は簡便に描写している。
【００４１】
図９のC-C’切断面での断面図を図１１に示す。絶縁性基板111の表側に、溝114で電気的に分離された作用電極リード113aと参照電極リード113bとが形成され、その上に絶縁膜117aが形成されている。絶縁膜117aの開口部に参照電極116が形成されている。基板111の裏側に対極リード113cが形成され、その上に絶縁膜117bが形成されている。さらに、センシング部分の周囲全体が本開示の保護膜120で被覆されていることが分かる。また、参照電極116は、ここでは表側に配置したが、裏側に配置してもよい。
【実施例】
【００４２】
［実施例１］
＜プローブの作製＞
（１）絶縁性基板の準備
ポリエチレンテレフタレート (PET)シート（東レ株式会社製ルミラーR E20 #188; 189 μm厚）を使用した。
（２）凹部領域の形成
図４ｂに示す絶縁性基板111のセンシング部分の先端の表側の表面にあたる部分の長手方向に沿って、上面図において略長方形の凹部領域112を形成した。
この実施例においては、加熱プレス加工により、凹部領域を形成した。横２５００μｍ×幅２００μｍ×高さ１０００μｍ程度の凸部を有した金型を有するプレスを約２００℃に加熱し、約１２５Ｎ／１プローブの圧力で絶縁性基板１１１の表面に対して、垂直上方から押し当てた。その結果、図１２ｂに示すように、絶縁性基板１１１に、凹部領域が形成された。前記凹部領域を上方から観察した顕微鏡像を図１３ａに示し、凹部領域の短手方向に縦に切断した時の切断部端面を観察した顕微鏡像を図１３ｂに示す。また、前記凹部領域の長手方向に走査して計測したプロファイルを図１３ｃに示し、前記凹部領域の短手方向に走査して計測したプロファイルを図１３ｄに示す。横軸／縦軸ともにμｍ単位で表示されている。
【００４３】
上記の観察から、凹部領域の長手方向の長さが約２３００μｍ、幅が１７０μｍの開口を有する凹部領域が形成されていることが確認された。
より詳細には、図１３ｃおよびｄから理解されるように、縦断面図において、内底面の周辺領域が中央領域と比較して窪んでいる。窪みの先端は細い切り込み状であり、検体応答性酵素やレドックスメディエータなどの試薬の水溶液に対して毛細管現象が生じるような形状を形成することができた。前記凹部領域の深さは、その内底面において、凹部領域の内壁面から中央に向かって水平方向で３０μｍ以上離れた領域（底部領域）の絶縁性基板の上表面からの平均深さとして、約４０μｍであることが確認された。また、窪みの開口部の幅が約２０μｍであり、窪みの深さは、平均底部領域面からの深さとして、約６〜１５μｍであった。
【００４４】
また、上記の観察から、凹部領域の開口部周囲に沿って上方に突出する突堤部が形成されていることが確認された。
より詳細には、図１３ｃのプロファイルから理解されるように、縦断面図において、突堤部の内壁面は、凹部領域の垂直軸に対して外方に約８°傾いていた。絶縁性基板の上表面から突堤部の上端までの高さは約２０μｍであった。なお、突堤部下部の厚みは約１０μｍであり、突堤部下部の厚みと上端までの高さから、突堤部外壁の傾きは、凹部領域の垂直軸に対して内方に約１０°であった。
【００４５】
（３）導電性薄膜の形成
図５ｃおよび図１２ｃに示すように、前記絶縁性基板の両面に、スパッタ法により金を堆積することによって、導電性薄膜（厚さ30 nm）を形成した。その結果、図１３ａに示すように、前記凹部領域を上面から観察した顕微鏡象から、絶縁性基板１１１の上表面、形成された凹部領域の内壁および内底面を含めて全体に導電性薄膜が形成されたことが確認された。
【００４６】
（４）電極リードの形成
図５ｄに示すように、絶縁性基板の表側に形成した導電性薄膜にレーザー描写することによって絶縁性基板の表面に達する深さの溝を形成して、作用電極リードと参照電極リードに分離して電気的分離した。
【００４７】
（５）絶縁膜の形成
図６ｅに示すように、絶縁性基板の表側に、作用電極および参照電極ならびに、埋め込み型バイオセンサの本体と電気接続するための作用電極用端子および参照電極用端子として用いる領域を除いた部分に開口を有する絶縁膜をスクリーン印刷法により形成し、絶縁性基板の裏側に、対極および本体と電気接続するための対極用端子として用いる領域を除いた部分に開口を有する絶縁膜（厚さ１０から２０ μm）をスクリーン印刷法により形成した。
【００４８】
（６）参照電極の形成
図６ｆに示すように、絶縁性基板の表側に形成した絶縁膜の参照電極用の開口にAg/AgClをスクリーン印刷法により堆積させて、参照電極（厚さ１０から１５ μm）を形成した。
【００４９】
図では、基板上での各構成の位置関係が明確になるように、鍵形状に裁断した基板に対して種々の構成を図示しているが、実際のプローブ作製に際しては、ここまでの工程を行ってから、加工された基板を鍵形状に裁断した。
【００５０】
図９におけるB-B’切断線での断面図に相当する、より具体的な絶縁性基板の縦断面図を図１２ａに示す（以下、同様）。この実施例において、ＰＥＴシートの裁断は、ピナクルダイを用いるダイカット（以下、「ピナクルカット」と称する。）により行った。
【００５１】
（７）検知層の形成
図７ｇおよび図１２ｄに示すように、絶縁性基板の表側に形成した絶縁膜の開口部から露出した導電性薄膜を作用電極とし、その上に、炭素粒子懸濁液として、ケッチェンブラックEC600JD（ライオン・スペシャリティ・ケミカルズ株式会社）をテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（和光純薬株式会社）0.2%水溶液で2mg/mlになるように懸濁させた溶液を0.18μlをインクジェット装置（Labojet3000:マイクロジェット社製）塗布し乾燥させた。その後、レドックスメディエータである合成したPLL-Phと、検体応答性酵素であるグルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-依存性）（BBI international GDH GLD1）と、グルタルアルデヒド溶液（和光純薬工業株式会社）の混合水溶液を0.12μlを同様にインクジェット装置により塗布し乾燥して二層構造の検知層を形成した。
【００５２】
（８）保護膜の形成
図７ｈおよび図１２ｅに示すように、センシング部分を、架橋剤および保護膜用ポリマーを含むエタノール溶液に浸漬して、センシング部分の両面、側面および端面に保護膜（厚さ5-40 μm）を形成した。
より具体的には、ポリ(tert-ブチルメタクリレート)-b-ポリ(4-ビニルピリジン)（株式会社ゼネラルサイエンスコーポレーション）を１０％（重量/体積）になるようにエタノールに溶解させた溶液と、ポリスチレン-co-4-ビニルピリジン-co-オリゴ[プロピレングリコールメチルエーテル]メタクリレート),ランダム（株式会社ゼネラルサイエンスコーポレーション）を１０％（重量/体積）になるようにエタノールに溶解させた溶液と、ポリ(エチレングリコール)ジグリシジルエーテルに溶解させた溶液と、緩衝液として、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸を200 mMとエタノールを調製し、保護膜溶液に上記で作製したプローブを浸漬し、10分乾燥後に再度浸漬を15回繰返し、２４時間分以上乾燥をすることによって、架橋した保護膜を形成し、プローブAを得た。
【００５３】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブAを３極式のポテンショスタット（ビー・エー・エス株式会社）に取り付け、37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中にプローブを設置した。このPBS溶液に500秒ごとにグルコースを50、150、300、500 mg/dLずつ添加して、継続的に電流応答値（nA）を測定した。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。
【００５４】
［耐久性］
プローブAを37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中で保管した。保管１日目、４日目、７日目および１４日目に、プローブAを３極式のポテンショスタット（ビー・エー・エス株式会社）に取り付けて、37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中にプローブを設置した。このPBS溶液に500秒ごとにグルコースを50、150、300、500 mg/dLずつ添加して、継続的に電流応答値（nA）を測定した。１日目のグルコース濃度500 mg/dLでの電流応答値を100%として、各濃度での応答率 (%)を算出した。結果を表１にまとめた。
【００５５】
［比較例１］
実施例１において、絶縁性基板に凹部領域を形成しない以外は、実施例１と同様にして、プローブBを得た。
実施例１と同様にして、プローブBの耐久性を測定し、算出した結果を表１にまとめた。
【００５６】
【表１】
2020156910.tif 000005
【００５７】
プローブ先端付近に凹部領域を形成し、その中に作用電極を形成したプローブＡは、生理食塩水中での保管後１４日目まで、応答性が低下しなかったが、凹部領域を形成しない従来のプローブＢは、生理食塩水中での保管日数が経過するにつれ、応答性が低下していった。
したがって、本開示のように所定の形状の凹部領域内に検知層を形成するので、検知層に含まれる成分が保護膜内で移動して、プローブ外部に漏出することが抑制され、その結果、バイオセンサの測定の耐久性が向上されたことが実証できた。
【００５８】
凹部領域内に検知層が、ほぼ平坦の厚みで設けられ、検知層表面からの保護膜の膜厚は十分に確保することができるので、検知層に含まれる試薬がプローブ外部に漏出することが防止される。さらに、凹部領域の開口部周囲に沿って上方に突出する突堤部が形成されているので、検知層に含まれた試薬が絶縁性基板の上表面の高さまで達したとしても、水平方向に拡散することが防止される。
【００５９】
［実施例２］
実施例１において、凹部領域の形成を、加熱プレス加工からレーザー加工に変更した以外は、実施例１と同様の条件で、プローブＣを得た。以下、実施例１と異なる点についてのみ、説明する。
【００６０】
（２）凹部領域の形成
図４ｂに示すように、絶縁性基板111のセンシング部分の先端の表側の表面に、長手方向に沿って、上面図において略長方形の凹部領域112を形成した。
この実施例においては、レーザー加工により、凹部領域を形成した。その結果、図１２ｂに示すように、絶縁性基板１１１に、凹部領域が形成された。また、前記凹部領域を上方から観察した顕微鏡像を図１４ａに示し、凹部領域の短手方向に縦に切断した時の切断部端面を観察した顕微鏡像を図１４ｂに示す。また、前記凹部領域の長手方向に走査して計測したプロファイルを図１４ｃに示し、前記凹部領域の短手方向に走査して計測したプロファイルを図１４ｄに示す。横軸／縦軸ともにμｍ単位で表示されている。
【００６１】
上記の観察から、凹部領域の長手方向の長さが約２２００μｍ、幅が３００μｍの開口を有する凹部領域が形成されていることが確認された。
より詳細には、図１４ｃおよびｄのプロファイルから理解されるように、縦断面図において、内底面が非常に粗く、所望の形状を得ることができなかった。
【００６２】
また、上記の観察から、凹部領域の開口部周囲に沿って上方に突出する突堤部が形成されていることが確認された。
より詳細には、図１４ｄのプロファイルから理解されるように、縦断面図において、突堤部の内壁面は、凹部領域の垂直軸に対して外方に約８°傾いていた。絶縁性基板の上表面から突堤部の上端までの高さは約２０μｍであった。なお、突堤部下部の厚みは約１５μｍであり、突堤部下部の厚みと上端までの高さから、突堤部外壁の傾きは、凹部領域の垂直軸に対して内方に約１０°であった。
【００６３】
この実施例においては、所望の形状の内底面を得ることができなかったが、所望の突堤部が形成できたことから、レーザーの種類や出力制御を適切に行えば、所定の形状の凹部領域を形成することは可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本開示の少なくとも検体応答性酵素およびレドックスメディエータを含む検知層および前記検知層上に形成した保護膜を備えた膜構造体は、埋め込み型バイオセンサのプローブに有用である。
【符号の説明】
【００６５】
1    埋め込み型バイオセンサ
10   本体
11   プローブ
111  絶縁性基板
112  凹部領域
113  導電性薄膜
113a 作用電極リード
113b 参照電極リード
113c 対極リード
114  溝
115  作用電極
116  参照電極
117  絶縁膜
118  対極
119  検知層
120  保護膜
2    生体
3    情報通信機器
【図１】
2020156910.tif 000006
【図２】
2020156910.tif 000007
【図３】
2020156910.tif 000008
【図４】
2020156910.tif 000009
【図５】
2020156910.tif 000010
【図６】
2020156910.tif 000011
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020156910.tif 000015
【図１１】
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【図１２】
2020156910.tif 000017
【図１３】
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【図１４】
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