(57)【要約】【課題】無オリゴペプチド細胞培地を提供すること。【解決手段】本発明は、ポリアミンを少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ含む無オリゴペプチド細胞培地およびポリアミンを少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ含む無オリゴペプチド細胞培地で細胞を培養する方法に関する。本発明は、また、ポリアミンを少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ含む培地で少なくとも１つのタンパク質を発現させる方法およびポリアミンを少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ含む培地で少なくとも１つのウイルスを生成する方法に関する。さらに、本発明による無オリゴペプチド培地は、着実な細胞増殖および所望の産物、特に、組換えタンパク質および／またはウイルス等の標的タンパク質の収率の上昇を可能にし、どのようなタンパク質加水分解物の品質またはロット差異にも依存しない。ポリアミンの特異的濃度による細胞培地の特異的補充は、細胞増殖、細胞の特異的生産性、および最終的な細胞密度を増加させるように作用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書の一部に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ポリアミンを少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ含む無オリゴペプチド細胞培地およびポリアミンを少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ含む前述の無オリゴペプチド細胞培地で細胞を培養する方法に関する。本発明は、また、ポリアミンを少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ含む培地で少なくとも１つのタンパク質を発現させる方法およびポリアミンを少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ含む培地で少なくとも１つのウイルスを生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞、詳細には真核細胞、より具体的には哺乳類細胞の培養に関して、細胞の効率的な増殖および生物学的産物（特に、例えば組換えタンパク質、抗体、ウイルス、ウイルス抗原、およびウイルス様粒子等の生物製剤）の生成に必要とされる栄養物質を備えている特別な培地を使用する必要性が常に存在する。前述の生物学的産物の効率的な生成に関して、最大限の産物収率を得るために、最適な細胞密度ならびにタンパク質発現それ自体の増加を達成することが重要である。
【０００３】
細胞培地製剤は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、いくつかの動物性タンパク質、および／またはウシ由来のタンパク質加水分解物、ならびに植物性または酵母由来のタンパク質加水分解物等の不明確な成分を含む様々な添加物が補充されてきた。
【０００４】
一般に、例えば、アルビミン、トランスフェリン、もしくはインスリン等の血清または血清由来物質は、細胞培養およびそこから得られる生物学的産物を混入し得る不必要な薬剤を含むこともある。さらに、ヒト血清由来の添加物は、血清を介して感染し得る肝炎ウイルスおよびＨＩＶを含むすべての既知のウイルスについてテストされる必要がある。さらに、ウシ血清よびそれに由来する産物は、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）汚染のリスクを有する。さらに、血清由来のすべての産物は、未知の物質によって汚染され得る。細胞培養でヒトまたは動物供給源由来の血清またはタンパク質添加物を使用するとき、詳細には、ヒト投与のための薬物またはワクチンの製造において細胞が使用される場合、多数の問題（例えば、異なるバッチの組成物における品質の差異、およびマイコプラズマ、ウイルス、またはＢＳＥの汚染のリスク等）がある。
【０００５】
従って、血清または他の動物性タンパク質化合物を必要としない効率的な宿主系および培養条件を提供する数多くの試みがなされてきた。
【０００６】
そのような無血清培地は、植物性または酵母由来の抽出タンパク質を基にして開発されてきた。例えば、大豆加水分解物は、発酵プロセスに有用であることが知られており、多数の偏好性生物、酵母、および真菌類の増殖を増進させることが可能である。特許文献１は、大豆ミールのパパイン消化が糖質および窒素の供給源であり、成分の多くは、組織培養で使用され得ることを記述している。非特許文献１は、定義された大豆および小麦の加水分解ペプチド画分の増殖および生産性の促進効果を記述している。
【０００７】
特許文献２は、脊椎動物細胞の増殖およびウイルス生成プロセスのための合成基礎培地および抽出酵母から構成される無血清培地を開示している。米ペプチドおよび抽出酵母を含む基本細胞培地およびその酵素消化、および／または動物細胞の増殖のための植物脂質から構成される培地製剤が、特許文献３に開示されている。組換え細胞の培養のための精製大豆加水分解物を含む培地は、特許文献４に開示されている。特許文献５は、大豆加水分解物および抽出酵母を含むが、増殖因子等の組換え型動物たんぱく質の存在も必要とする培地を開示している。
【０００８】
欧州特許第Ａ−０４８１７９１号は、操作されたＣＨＯ細胞を培養するための生化学的に定義された培地を記述し、その培地は、動物供給源から単離されたタンパク質、脂質、および糖質を含まず、さらに組換えインスリンまたはインスリン類似体、１％〜０．０２５％重量のパパイン消化大豆ペプトンおよびプトレシンを含む。国際公開第９８／０８９３４号は、加水分解大豆ペプチド（１〜１０００ｍｇ／Ｌ）、０．０１〜１ｍｇ／Ｌのプトレシン、および様々な動物由来成分（アルブミン、フェチュイン、種々のホルモン、および他のタンパク質を含む）を含む無血清真核細胞培養を記述している。これと関連して、プトレシンも、０．０８ｍｇ／Ｌの濃度でＤＭＥＭ／ハムＦ１２等の標準的な培地に含まれることが周知であることに注目すべきである。
【０００９】
しかしながら、植物および／または酵母の加水分解物は、オリゴペプチドならびに他の未知の成分および混入物の不明確な混合物である。さらに、市販されている加水分解物のロットの品質は、極めて異なる。結果的に、使用される加水分解物のロット数に応じて（「ロット間の差異」）、組換えタンパク質またはウイルス産物の生成における大きな差異（３倍までの差異）がある。この欠点は、細胞の増殖ならびに各細胞のタンパク質発現に影響を及ぼす。
【００１０】
要約すれば、当技術分野で周知の培地は、動物性、植物性、または酵母由来のタンパク質もしくは抽出ペプチドで補充される、または例えば、インスリン、インスリン様増殖因子、もしくは他の増殖因子等の組換え型タンパク質で補充される。
【００１１】
従って、上述の問題を克服するためには、動物、植物、および真菌のタンパク質および／またはオリゴペプチドを含まない細胞培地が必要である。さらに、発現される組換えタンパク質または他の任意の発現産物の収率を上昇させる必要性、およびヒトにおいて医薬品またはワクチンとして使用される等の生物学的産物の生成のために最適な細胞培地を提供する必要性が現在存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第９６／２６２６６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９６／１５２３１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９８／１５６１４号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０１／２３５２７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第００／０３０００号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｆｒａｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  （２０００）１６，６８８−６９２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、無オリゴペプチド細胞培地を提供することである。本発明のさらなる目的は、前述の培地で細胞を培養する方法ならびに組換えタンパク質を効率的に発現させる方法、および／またはウイルスを効率的に生成する方法を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、動物性、植物性、および／または酵母由来の加水分解物を排除すること、ならびに添加補助タンパク質またはオリゴペプチドを少しも含まない培地を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の要旨
驚くべきことに、細胞培地にポリアミンを少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ添加すると、細胞増殖が促進されることだけでなく、細胞ごとのタンパク質および／またはウイルス発現が上昇することにより有利な効果がもたらされる。前述の予想外の有利な効果は、無オリゴペプチド培地でも達成され得る。
【００１７】
さらに、本発明による無オリゴペプチド培地は、着実な細胞増殖および所望の産物、特に、組換えタンパク質および／またはウイルス等の標的タンパク質の収率の上昇を可能にし、どのようなタンパク質加水分解物の品質またはロット差異にも依存しない。ポリアミンの特異的濃度による細胞培地の特異的補充は、細胞増殖、細胞の特異的生産性、および最終的な細胞密度を増加させるように作用する。
【００１８】
従って、本発明による培地は、当技術分野で周知の培地と比較して、組換えタンパク質発現、ウイルス生成、および細胞増殖速度に関してより有利である。さらに、本発明による無オリゴペプチド培地は、細胞培地へのタンパク質加水分解物の添加を不必要にする。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
無オリゴペプチド細胞培地であって、ポリアミンを少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ含む、無オリゴペプチド細胞培地。
（項目２）
上記ポリアミンが、カダベリン、プトレシン、スペルミジン、スペルミン、アグマチン、オルニチン、およびその組み合わせからなる群から選択される、項目１に記載の無オリゴペプチド細胞培地。
（項目３）
上記ポリアミンが、合成的に生成される、項目１に記載の無オリゴペプチド細胞培地。（項目４）
上記ポリアミンが、約０．５〜約３０ｍｇ／Ｌの範囲の濃度で培地に存在する、項目１に記載の無オリゴペプチド細胞培地。
（項目５）
上記培地が、２０以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない、項目１に記載の無オリゴペプチド細胞培地。
（項目６）
上記培地が、３以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まず、場合によりグルタチオンを含む、項目１に記載の無オリゴペプチド細胞培地。
（項目７）
上記培地が、２以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まず、場合によりグルタチオンおよび／またはグルタミンの少なくとも１つの安定な形態を含む、項目１に記載の無オリゴペプチド細胞培地。
（項目８）
上記培地が、化学的に定義されている、項目１に記載の無オリゴペプチド細胞培地。
（項目９）
細胞を培養する方法であって、
（ａ）項目１に記載の無オリゴペプチドを準備するステップと、
（ｂ）培地で細胞を増殖させ、細胞培養を形成させるステップと、
を含む方法。
（項目１０）
上記細胞が、哺乳類細胞、昆虫細胞、トリ細胞、細菌細胞、および酵母細胞からなる群から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
少なくとも１つのタンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）細胞の培養を準備するステップと、
（ｂ）少なくとも１つのタンパク質をコードする配列を含む少なくとも１つの核酸配列を上記細胞に導入するステップと、
（ｃ）上記核酸配列を有する上記細胞を選択するステップと、
（ｄ）ポリアミンを少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ含む培地中の上記細胞で上記タンパク質を発現させるステップと
を含む方法。
（項目１２）
上記培地が、項目１に記載の無オリゴペプチド培地である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記タンパク質が、凝固因子ＶＩＩ、凝固因子ＶＩＩＩ、凝固因子ＩＸ、ｖＷＦ、ＡＤＡＭＴＳ１３、およびフューリンからなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
上記細胞が、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、またはＢＨＫ細胞である、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
上記細胞とタンパク質の組み合わせが、ＣＨＯ細胞／凝固因子ＶＩＩＩ、ＣＨＯ細胞／凝固因子ＶＩＩ、ＣＨＯ細胞／ＡＤＡＭＴＳ１３、ＣＨＯ細胞／フューリン、２９３細胞／凝固因子ＩＸからなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
少なくとも１つのウイルスを生成する方法であって、
（ａ）細胞の培養を準備するステップと、
（ｂ）上記細胞を少なくとも１つのウイルスに感染させるステップと、
（ｃ）上記ウイルスに感染した細胞を選択するステップと、
（ｄ）ポリアミンを少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ含む培地中の上記細胞で少なくとも１つのウイルスを増殖させるステップと
を含む方法。
（項目１７）
上記培地が、項目１に記載の無オリゴペプチド培地である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
上記ウイルスが、ポックスウイルス、コロナウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、レトロウイスル、トガウイルス、フラビウイルス、エンテロウイルス、ピコルナウイルス、アレナウイルス、ヘルペスウイルス、およびアデノウイルスからなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
上記ウイルスが、ワクシニアウイルス、ＳＡＲＳウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、レンチウイルス、ロスリバーウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、ＦＳＭＥウイルス、およびＡ型肝炎ウイルスからなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
上記細胞が、ベロ細胞またはニワトリ胚細胞である、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
上記細胞とウイルスの組み合わせが、ベロ細胞／弱毒化ワクシニア、ベロ細胞／ワクシニア、ベロ細胞／Ａ型肝炎ウイルス、ベロ細胞／インフルエンザウイルス、ベロ細胞／ウエストナイルウイルス、ベロ細胞／ＳＡＲＳウイルス、ベロ細胞／黄熱病ウイルス、ニワトリ胚細胞／ＦＳＭＥウイルス、およびニワトリ胚細胞／改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）からなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、培養期間（［日数］で表す）にわたるＢＡＶ培地で培養したＧＤ８／６細胞のＦＶＩＩＩ−ＣｏＡ容積測定生産性（［１日毎のリッターあたりのユニット数］で表す）に関する２．０ｍｇ／Ｌプトレシン  ２ＨＣｌの添加の効果を表すグラフである。矢印＝１１日目：プトレシン  ２ＨＣｌ（２ｍｇ／Ｌ）の添加。
【図２】図２は、容積測定生産性および細胞特異的生産性（ＱＰは［１日毎のリッターあたりのユニット数］で表す；ｑｐは［１日毎の１０Ｅ０６細胞あたりのｍＵ］で表す）および特異的増殖速度μ（ＢＡＶ培地で培養されたＧＤ８／６細胞の１日毎の特異的増殖速度を［ｄ−１］で表す）に関するＦｅ（ＩＩ）およびＣｕ（ＩＩ）を用いる付加的な補充と場合により組み合せたプトレシン添加の効果を比較する表である。
【図３】図３は、ＢＡＶ培地で培養したＧＤ８／６細胞の特異的増殖速度（絶対的μ、相対的μ）および細胞特異的生産性（絶対的ｑｐは、１日毎の１０Ｅ０６細胞あたりｍＵで表す；相対的ｑｐは、％で表す）に関するプトレシンおよび／またはオルニチンの効果を比較する表である。
【図４】図４は、ＢＡＶ培地で培養したＧＤ８／６細胞の特異的増殖速度（絶対的μ、相対的μ）および細胞特異的生産性（絶対的ｑｐ、相対的ｑｐ）に関するプトレシンおよびスペルミンの効果を比較する表である。
【図５】図５は、ＢＡＶ培地で培養したＧＤ８／６細胞の特異的増殖速度（絶対的μ、相対的μ）および細胞特異的生産性（絶対的ｑｐ、相対的ｑｐ）に関するプトレシンおよびエタノールアミンの効果を比較する表である。
【図６】図６は、平均ＭＶＡウイルス力価（［ＴＣＩＤ  ５０／ｍＬ×１０８］で表す）に関する３．６ｍｇ／Ｌのプトレシン  ２ＨＣｌ添加の効果を表すグラフである。−：プトレシン添加なし、Ｐｕｔｒ：３．６ｍｇ／Ｌのプトレシン  ２ＨＣｌ添加。
【図７】図７は、平均ＭＶＡウイルス力価（［ＴＣＩＤ  ５ｏ／ｍｌ×１０８で表す］）に関する様々な濃度のプトレシン  ２ＨＣｌ（［ｍｇ／Ｌ］で表す）の添加の効果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明の１つの態様は、ポリアミンを少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ含む無オリゴペプチド細胞培地に関する。
【００２１】
別に述べない限り、本文書全体を通して示される濃度値は、成分の遊離塩基形態を呼ぶ。
【００２２】
用語「ポリアミン」は、芳香族またはカチオン性アミノ酸由来の有機ポリカチオンである生体ポリアミン基のいずれかを呼ぶ。ポリアミンは、炭素、窒素、および水素で構成され、かつ２つ以上のアミノ基を含む。ポリアミンは、１つまたは複数の正電荷および疎水性骨格を有する。該用語は、例えば、カダベリン、プトレシン、スペルミジン、スペルミン、アグマチン、オルニチン、およびその組み合わせからなる群から選択される分子を包含する。発明の１つの実施形態では、無オリゴペプチド培地は、オルニチン、もしくはプトレシン、もしくはスペルミン、もしくはその組み合わせを含む。
【００２３】
本発明による無オリゴペプチド細胞培地の別の実施例では、ポリアミンはタンパク質加水分解物以外の供給源に由来する。１つの実施形態では、ポリアミンは、合成的に生成される。
【００２４】
本発明の１つの実施形態では、ポリアミン濃度は少なくとも約０．５ｍｇ／Ｌであり、別の実施形態では少なくとも約１ｍｇ／Ｌ、さらなる実施形態では少なくとも約２ｍｇ／Ｌ、さらに別の実施形態では少なくとも５ｍｇ／Ｌ、さらに別の実施形態では少なくとも８ｍｇ／Ｌ、およびさらなる実施形態では少なくとも１０ｍｇ／Ｌである。
【００２５】
本発明の１つの実施形態では、培地中のポリアミン濃度は約０．５ｍｇ／Ｌ〜約３０ｍｇ／Ｌの範囲であり、別の実施形態では約０．５ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌ、さらなる実施形態では約１．０ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌ、さらなる実施形態では約２，０ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌ、さらなる実施形態では約２ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌ、別の実施形態では約２ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／Ｌ、およびさらなる実施形態では約２ｍｇ／Ｌ〜約５ｍｇ／Ｌの範囲である。
【００２６】
前述の濃度は、純粋なポリアミンのそれぞれの濃度である。ポリアミン誘導体またはポリアミン含有化合物が使用される場合、ポリアミン基の濃度は、前述の指定範囲内である。例えば、２ｍｇ／Ｌのプトレシン  ２ＨＣｌは、前述の約１．０９５ｍｇ／Ｌのプトレシン濃度（２ＨＣｌなしの）に相当する。
【００２７】
本発明による用語「無オリゴペプチド細胞培地」は、例えばタンパク質加水分解物由来のオリゴペプチド等のオリゴペプチドを含まない無タンパク質培地を呼ぶ。１つの実施形態では、培地は、２０以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。本発明の１つの実施形態では、培地は、１５以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。本発明の別の実施形態では、培地は、１０以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。１つの実施形態では、培地は、７以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まず、別の実施形態では５以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まず、さらに別の実施形態では３以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。本発明のさらなる実施形態によれば、培地は，２以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。
【００２８】
本発明による培地は、グルタチオンおよび／または少なくとも１つのグルタチオンの安定な形態（例えば、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン等）を場合により含み得る。本明細書で使用されるように用語「グルタチオン」は、アミノ酸のグルタミン酸、システイン、およびグリシン（グルタチオンの酸化型、すなわちグルタチオンジスルフィド（酸化される過程でシステインスルフヒドリル側鎖の間のジスルフィド結合によって形成されるグルタチオン二量体）を含む）から構成されるトリペプチドを表す。
【００２９】
本発明の実施形態では、無オリゴペプチド細胞培地は、３以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まないが、場合によりグルタチオンを含み得る。
【００３０】
別の実施形態では、無オリゴペプチド細胞培地は、２以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まないが、グルタチオンおよび／またはグルタミンの少なくとも１つの安定な形態を場合により含み得る。
【００３１】
本発明による培地で回避される典型的なタンパク質および／またはオリゴペプチドは、例えば、アルブミン、トランスフェリン、インスリン、もしくは他の増殖因子ならびにその組換え型、または植物性もしくは酵母の加水分解物由来のオリゴペプチドもしくはその限外濾過形態等の血清および血清由来物質で発見されるものである。
【００３２】
本発明による無オリゴペプチド培地は、一般に当業者には周知のＤＭＥＭ、ハムＦ１２、培地１９９、マッコイ、またはＲＰＭＩ等の任意の基礎培地に基づくことが可能である。基礎培地は、アミノ酸、ビタミン、有機および無機塩類、ならびに糖質の供給源を含むいくつかの成分を含むことが可能であり、各成分は、細胞の培養を補助する量で存在し、その量は、一般に当業者には周知である。培地は、例えば、炭酸水素ナトリウム、坑酸化剤、機械的ストレスに対抗する安定剤、またはプロテアーゼ阻害剤のような緩衝物質等の補助物質を含み得る。必要に応じて、共重合体および／またはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコール（例えば、プルロニックＦ６８（登録商標）、ＳＥＲＶＡ社）の混合物等の非イオン性界面活性剤が添加され得る。
【００３３】
本発明による培地の実施形態では、ポリアミンは、ＤＮＡおよびＲＮＡの合成、および／または細胞増殖、および／または細胞分化、および／または膜安定化、および／または坑酸化ＤＮＡの保護を制御する。
【００３４】
１つの実施形態では、無オリゴペプチド細胞培地への少なくとも０．５ｍｇ／Ｌのポリアミンの添加は、培養細胞中のタンパク質および／またはウイルスの発現を増加させる。別の実施形態では、培養細胞中のタンパク質発現またはウイルス力価は、無オリゴペプチド細胞培地に少なくとも０．５ｍｇ／Ｌのポリアミンを添加することによって少なくとも５０％増加し得る。さらに別の実施形態では、前述の増加は、少なくとも６０％である。さらに別の実施形態では、細胞特異的生産性は、無オリゴペプチド細胞培地に少なくとも０．５ｍｇ／Ｌのポリアミンを添加することによって少なくとも２倍増加し、別の実施形態では、細胞特異的生産性は、少なくとも３倍増加する。さらに別の実施形態では、少なくとも０．５ｍｇ／Ｌのポリアミンの添加は、タンパク質発現および／またはウイルス力価を少なくとも４００％まで増加し、さらなる実施形態では、少なくとも５００％まで、別の実施形態では少なくとも６００％まで、さらなる実施形態では７００％まで増加という結果になる。
【００３５】
１つの実施形態では、培養細胞の特異的増殖速度は、無オリゴペプチド細胞培地に少なくとも０．５ｍｇ／Ｌのポリアミンを添加することによって増加し得る。さらなる実施形態では、前述の特異的増殖速度は、１０％増加し得る。さらに別の実施形態では、前述の特異的増殖速度は、２０％増加し得る。さらに別の実施形態では、前述の特異的増殖速度は、５０％増加し得る。さらなる実施形態では、前述の特異的増殖速度は、７０％増加し得る。別の実施形態では、前述の特異的増殖速度は、８０％増加し得る。さらに別の実施形態では、前述の特異的増殖速度は、９０％増加し得る。さらに別の実施形態では、前述の特異的増殖速度は、１００％増加し得る。
【００３６】
本発明のさらなる実施形態では、培地は、化学的に定義される。本明細書で使用されるように用語「化学的に定義される」とは、例えば、抽出動物成分、器官、腺、植物、または酵母等のいかなる不明確な補充も含まれないことを意味する。従って、化学的に定義される培地の各成分は、正確に定義される。
【００３７】
本発明は、さらに、以下のステップを含む細胞を培養するための方法に関する：
（ａ）本発明により無オリゴペプチド細胞培地を準備するステップ、および
（ｂ）細胞培養を形成するために培地で細胞を増殖させるステップ。
【００３８】
本発明は、いかなる細胞型にも限定されない。細胞型の例は、哺乳類細胞、昆虫細胞、トリ細胞、細菌細胞、および酵母細胞を含む。細胞は、例えば、組換え遺伝子発現のためにベクターを導入した幹細胞もしくは組換え細胞、またはウイルス産物を生成するためにウイルスをトランスフェクトされた細胞であり得る。細胞は、また、例えば、組換え形質転換を行わずに目的のタンパク質を産生する細胞（例えば、抗体産生Ｂ細胞）であり得、例えば、エブスタインバーウイルス感染等のウイルス感染によって不死化状態に形質転換され得る。細胞は、また、例えば、一次細胞（例えば、ニワトリ胚細胞）または一次細胞系であり得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス生成で使用される細胞は有用である。有用な細胞の具体的な例は、ＢＳＣ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、ベロ（ＶＥＲＯ）細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ−１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ−ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＳ−１細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、およびニワトリ胚細胞を含む。
【００３９】
本発明により使用される細胞は、例えば、バッチ培養、フィードバッチ培養、灌流培養、およびケモスタット培養からなる群から選択される方法によって培養され得る。これらすべての培養は、通常、当技術分野では周知である。
【００４０】
本発明は、さらに、例えば、異種もしくは自己タンパク質、または組換えタンパク質等の少なくとも１つのタンパク質を発現させるために以下のステップを含む方法に関する：ａ）細胞の培養液を準備するステップ、
ｂ）少なくとも１つのタンパク質をコードする配列を含む少なくとも１つの核酸を細胞に導入するステップ、
ｃ）核酸配列を有する細胞を選択するステップ、および
ｄ）ポリアミンを少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ含む培地中の細胞でタンパク質を発現させるステップ。
【００４１】
本発明の１つの実施形態では、ステップｄ）の培地は、本発明による無オリゴペプチド培地である。本発明のさらなる実施形態では、ステップａ）の培養細胞は、本発明による無オリゴペプチド細胞培地で増殖されたものである。別の実施形態では、ａ）からｄ）までのステップは、本発明による無オリゴペプチド細胞培地で実行される。
【００４２】
少なくとも１つのタンパク質をコードする配列を含む核酸配列は、ベクターであり得る。ベクターは、ウイルスによって送達されることが可能であり、あるいはプラスミドであり得る。タンパク質をコードする核酸配列は、特異的遺伝子またはその生物学的機能部分であり得る。１つの実施形態では、タンパク質は、因子ＶＩＩＩ等の血液凝固因子の少なくとも生物学的活性部分もしくはエリスロポエチン等の赤血球および血管形成の産生に関与するタンパク質の少なくとも生物学的活性部分、またはモノクローナル抗体である。
【００４３】
ある実施形態では、核酸配列は、凝固因子ＶＩＩ、凝固因子ＶＩＩＩ、凝固因子ＩＸ、ｖＷＦ、ＡＤＡＭＴＳ１３、およびフューリンからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする配列を含む。
【００４４】
本発明のある実施形態では、核酸は、さらに、プロモーター配列、エンハンサー、ＴＡＴＡボックス、転写開始部位、ポリリンカー、制限部位、ポリＡ配列、タンパク質のプロセシング配列、選択マーカー等、通常、当業者には周知であるタンパク質の制御発現に適する他の配列を含む。
【００４５】
本発明の１つの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、およびＢＨＫ細胞からなる群から選択される。
【００４６】
本発明の別の実施形態によれば、以下の細胞系は、それぞれの産物の発現のために組換えベクターを導入し得る：組換え凝固因子（例えば、因子ＶＩＩおよび／または因子ＶＩＩＩ）、および／またはモノクローナル抗体の産生のためのＣＨＯ細胞、組換えエリスロポエチン、形質転換エプスタインバーウイルスの産生のためのＢＨＫ細胞、ヒト抗体の産生のための免疫化ヒトＢ細胞。有用な細胞／タンパク質の組み合わせは、例えば、ＣＨＯ細胞／凝固因子ＶＩＩＩ、ＣＨＯ細胞／凝固因子ＶＩＩ、ＣＨＯ細胞／ＡＤＡＭＴＳ１３、ＣＨＯ細胞／フューリン、および２９３細胞／凝固因子ＩＸである。
【００４７】
本発明のさらなる実施形態では、本発明の培地で培養されない細胞によるタンパク質の発現と比較すると、本発明による培地で培養される細胞による少なくとも１つのタンパク質の発現は、増加する。別の実施形態では、前述の発現は、少なくとも１０％増加し、さらなる実施形態では少なくとも５０％増加する。
【００４８】
本発明は、さらに、少なくとも１つのウイルスもしくは１つのウイルスの少なくとも一部を生成するための方法に関し、以下のステップを含む：
ａ）細胞の培養液を準備するステップ、
ｂ）細胞を少なくとも１つのウイルスに感染させるステップ、
ｃ）ウイルスに感染した細胞を選択するステップ、および
ｄ）ポリアミンを少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ含む培地中の細胞で少なくとも１つのウイルスを増殖させるステップ。
【００４９】
本発明の１つの実施形態では、ステップｄ）の培地は、本発明による無オリゴペプチド培地である。本発明のさらなる実施形態では、ステップａ）の培養細胞は、本発明による無オリゴペプチド細胞培地で増殖されたものである。別の実施形態では、ａ）からｄ）までのステップは、本発明による無オリゴペプチド細胞培地で実行される。
【００５０】
本発明による方法で使用されるウイルスは、例えばポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルスもしくは弱毒化ワクシニアウイルス）；コロナウイルス（例えばＳＡＲＳウイルス）；オルソミクソウイルス（例えば、Ａ型もしくはＢ型インフルエンザ）；パラミクソウイルス；レトロウイスル（例えば、レンチウイルス）；トガウイルス（例えば、ロスリバーウイルス）；フラビウイルス（例えば、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、もしくはＦＳＭＥウイルス（すなわち、ダニ媒介性脳炎ウイルス））；エンテロウイルス（例えば、Ａ型肝炎）；ピコルナウイルス；アレナウイルス；ヘルペスウイルス；もしくはアデノウイルス等の任意のウイルスであり得る。本発明の１つの実施形態では、ウイルスは、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）である。ウイルスは、それぞれのウイルス生成のために本発明によって増殖し得る。
【００５１】
ウイルスは、野生型ウイルス、弱毒化ウイルス、リアソータントウイルス、もしくは組換えウイルス、またはその組み合わせ（例えば、弱毒化と組換え）であり得る。さらに、細胞をウイルスに感染させるために使用される実際のウイルス粒子の代わりに、感染性核酸クローンが使用され得る。スプリットウイルス粒子も使用され得る。
【００５２】
ウイルスを生成する方法は、ウイルス、ウイルス抗原、またはウイルス様粒子を含む免疫原性組成物を生成するために使用され得る。
【００５３】
本発明によってウイルスを生成するための方法で使用される細胞は、哺乳類細胞、昆虫細胞、トリ細胞、細菌細胞、および酵母細胞からなる群から選択され得る。１つの実施形態では、本発明によってウイルスを生成するための方法で使用される細胞は、ベロ細胞およびニワトリ胚細胞からなる群から選択される。
【００５４】
ウイルスもしくはウイルスの一部を生成するために細胞とウイルスの有用な組み合わせは、例えば、ベロ細胞／弱毒化ワクシニア、ベロ細胞／ワクシニア、ベロ細胞／Ａ型肝炎ウイルス、ベロ細胞／インフルエンザウイルス、ベロ細胞／ウエストナイルウイルス、ベロ細胞／ＳＡＲＳウイルス、ベロ細胞／黄熱病ウイルス、およびニワトリ胚細胞／ＦＳＭＥウイルスがある。本発明の１つの実施形態では、細胞／ウイルスの組み合わせは、ニワトリ胚細胞／改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）である。
【００５５】
有用な培養方法は、バッチ培養、フィードバッチ培養、灌流培養、およびケモスタット培養を含む。
【００５６】
ここで本発明は、以下の実施例でさらに例証されるが、それに限定されるものではない。
【実施例】
【００５７】
実施例１：ＢＡＶ培地の調製
無オリゴペプチド培地（ＢＡＶ培地）を、無機塩類、アミノ酸、ビタミン、および他の成分を含むＤＭＥＭ／ハムＦ１２（１：１）基礎培地（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）３２５００粉末）で調製した。また、Ｌ−グルタミン（６００ｍｇ／Ｌ）、アスコルビン酸（２０μＭ）、エタノールアミン（２５μＭ）、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＳＥＲＶＡ社）（０．２５ｇ／Ｌ）、亜セレン酸ナトリウム（５０ｎＭ）を加えた。さらに、必須アミノ酸を細胞培地に補充した：Ｌ−アスパラギン  Ｈ２Ｏ  ２０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン  ＨＣｌ  Ｈ２Ｏ  １５  ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン  ２ＨＣｌ  ２０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン  ３５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン
２０  ｍｇ／Ｌ。
【００５８】
実施例２：細胞数の決定
浮遊細胞または固定化細胞からの細胞数を、Ｓｃｈａｒｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  ｉｎ  ＬａｂｏｒＰｒａｘｉｓ  １０：１０９６−１１０３（１９８８）によって記述されるＣＡＳＹ（登録商標）セルカウンターで、あるいはクエン酸抽出と核の蛍光染色に続きＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社、デンマーク（ＤＫ））でのいずれかで数えて決定した。特異的増殖速度（μ）を、ある一定の時間間隔（ｔ）にわたる細胞密度（Ｘｔ）の増加および／または浮遊細胞のケモスタット培養の定常状態の希釈率（Ｄ）から算出する：
μ＝Ｄ＋Ｉｎ（Ｘｔ／Ｘ０）／ｔ。
【００５９】
実施例３：ＦＶＩＩＩ活性の決定
因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）（図１〜５を参照）の活性を色素生産性アッセイ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ社、スウェーデン）によって測定した。
【００６０】
実施例４：容積測定（ＱＰ）および細胞特異的生産性（ｑｐ）の算出
容積測定生産性（ＱＰ）を、生成システムで１日毎リアクター容積のリッターあたりでもたらされる活性ユニットの量（Ｕ／Ｌ／ｄ）から算出する。
【００６１】
細胞特異的生産性（ｑｐ）を、１日毎細胞数あたりで生成されるタンパク質の特定の量（Ｕもしくはμｇ）として定義する。
【００６２】
実施例５：大規模な細胞培養の条件
組換え哺乳類細胞（例えば、ＧＤ８／６細胞等の因子ＶＩＩＩを安定に発現するＣＨＯ細胞）の細胞培養を、１０Ｌのバイオリアクターでケモスタット培養の懸濁液で増殖させた。３７℃、酸素飽和度２０％、およびｐＨ７．０〜７．１の培養条件を一定に保った。ＢＡＶ培地の一定フィードによって培養液を供給した。
【００６３】
実施例６：ＦＶＩＩＩ発現へのポリアミン添加の効果
実施例５に記述するように、１１日間ＢＡＶ培地を一定にフィードすることで、１０Ｌバイオリアクター中のケモスタット培養でＧＤ８／６細胞を増殖させ、生産性が１００Ｕ／Ｌ／日を下まわる結果となった。プトレシン  ２ＨＣｌ（２ｍｇ／Ｌ）を添加することによって容積測定ＦＶＩＩＩ発現が８００％増加した（図１を参照）。従って、ＧＤ８／６細胞系の細胞特異的発現の駆動因子としてプトレシンを明確に特定することができた。
【００６４】
実施例７：ＦＶＩＩＩ発現へのポリアミンならびにＦｅ（ＩＩ）およびＣｕ（ＩＩ）の添加の効果
実施例５に記述するようにＧＤ８／６細胞を、１０Ｌバイオリアクター中のケモスタット培養で増殖させ、低い細胞特異的生産性および特異的増殖速度と共に平均生産性が２７１Ｕ／Ｌ／日という結果になった。プトレシン  ２ＨＣｌ（２ｍｇ／Ｌ）を添加することによって、ＦＶＩＩＩの発現は、主に増加した細胞特異的生産性のため、８７０Ｕ／Ｌ／日まで増加した。Ｆｅ（ＩＩ）およびＣｕ（ＩＩ）をそのままの濃度、さもなければ大豆加水分解物に通常含まれる濃度で追加補充することにより、特異的増殖速度の約０．６０ｄ−１増加につながり、１７００ｍＵ／１０Ｅ０６細胞／日を超える細胞特異的生産性の増加を達成し得た。これらの条件下で、２６８５Ｕ／Ｌ／日を超える容積測定生産性に達した。さらに、細胞密度の増加は、容積測定生産性が３０００Ｕ／Ｌ／日を超える結果となった。同等の発酵条件下の培地を含む大豆加水分解物の最大の容積測定生産性は、２０００〜２５００Ｕ／Ｌ／日であり、プトレシンと付加的な２つの金属イオンだけを含む化学的に定義された培地が、以前にこのプロセスで調べた培地形態（図２を参照）を含む大豆加水分解物よりも優れていることを示した。
【００６５】
実施例８：小規模の細胞培養の条件
浮遊培養でＧＤ８／６細胞を用いる小規模実験を、温度３７℃で、ｐＨおよびｐＯ２を制御せずにバッチリフィードモードで２００ｍｌ作業容量のテクネ社製スピナーフラスコで行った。上記に定義されるように、培養にＢＡＶ培地を供給し、さらにプトレシン  ２ＨＣｌ、オルニチン  ＨＣｌ、スペルミン  ４ＨＣｌ、もしくはエタノールアミン、またはその組み合わせを０〜１８ｍｇ／Ｌの範囲で（ＨＣｌなしの生体アミン０〜１０ｍｇ／Ｌと同等である（図３〜５を参照））を補充した。
【００６６】
実施例９：ＦＶＩＩＩ発現へのいくつかのポリアミンおよびポリアミンの組み合わせでの添加の効果
実施例８に記述するように、ＢＡＶ培地を用いる培養からのＧＤ８／６細胞を遠心分離させて、２００ｍｌ作業容量のテクネ社製スピナーフラスコに移し、図３、４、および５に示すようにエタノールアミン、プトレシン、オルニチン、および／またはスペルミンを補充した、定義される培地で約１−２Ｅ０６細胞／ｍｌの細胞密度でインキュベートした。生体アミンの経路でプトレシンの前駆体であるオルニチンは、濃度依存的方法でプトレシンを部分的に置換することができた。プトレシン  ２ＨＣｌを含む培地に様々な濃度でオルニチンを添加すると、特異的なＦＶＩＩＩ生産性および増殖速度がさらに増加するという結果がもたらされた（図３を参照）。しかしながら、本発明によるポリアミンではないエタノールアミンは、調査した任意の濃度でもプトレシンを置換できなく、またはプトレシンを含む培地でエタノールアミン濃度を増加させても容積測定生産性もしくは特異的増殖速度の有意な増加をもたらさなかった（図５を参照）。さらに、同様の条件下の実験で、生体アミン経路の別の中間体であるスペルミンも、濃度依存的方法でプトレシンを置換できることを示した（図４を参照）。
【００６７】
実施例１０：ＭＶＡウイルス生成へのポリアミン添加の効果
ニワトリ胚の初代細胞培養を、無ペプチド培地（ＦＭ−培地）を用いて３．６ｍｇ／Ｌのプトレシン  ２ＨＣｌの有、無でテクネスピナーフラスコ（作業容積２００ｍｌ）で培養した。
【００６８】
ＦＭ培地を、無機塩類、アミノ酸、ビタミン、および他の成分を含むＭ１９９基礎培地（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、３１１５０粉末）で調製した。また、ＮａＨＣＯ３（４．４ｇ／Ｌまで）、ゲンタマイシン  ＳＯ４（５０μｇ／Ｌ）、およびネオマイシン  ＳＯ４（５０μｇ／Ｌ）を加えた。
【００６９】
細胞培養をＭＶＡウイルスに感染させ、ＴＣＩＤ５０アッセイで上清をウイルス力価に関して解析した。プトレシンを添加することによって平均ウイルス力価（各ｎ＝１６試料）を約５０％増加させることができた（図６を参照）。
【００７０】
実施例１１：ＭＶＡウイルス生成へのポリアミンの複数用量による添加の効果
ニワトリ胚の初代細胞培養を、無ペプチド培地（ＣＥＭ−培地）を用いて３．６および９ｍｇ／Ｌのプトレシン  ２ＨＣｌの有、無でテクネスピナーフラスコ（作業容積２００ｍｌ）で培養した。
【００７１】
ＣＥＭ培地を、無機塩類、アミノ酸、ビタミン、および他の成分を含むＤＭＥＭ／ハムＦ１２（１：１）の基礎培地（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、３２５００粉末）で調製した。また、ＮａＨＣＯ３（２ｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン（６００ｍｇ／Ｌ）、アスコルビン酸（２０μＭ）、エタノールアミン（２５μＭ）、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＳＥＲＶＡ社）（０．２５ｇ／Ｌ）、亜セレン酸ナトリウム（５０ｎＭ）、ＦｅＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ（６００μｇ／Ｌ）、ゲンタマイシン  ＳＯ４（５０μｇ／Ｌ）、およびネオマイシン  ＳＯ４（５０μｇ／Ｌ）を加えた。さらに、必須アミノ酸を細胞培地に補充した：Ｌ−アスパラギン  Ｈ２Ｏ  ２０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン  ＨＣｌ  Ｈ２Ｏ  １５  ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン  ２ＨＣｌ  ２０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン  ３５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン  ２０  ｍｇ／Ｌ。
【００７２】
細胞培養をＭＶＡウイルスに感染させ、ＴＣＩＤ５０アッセイで上清をウイルス力価に関して解析した。９ｍｇ／Ｌのプトレシンを添加することによって平均ウイルス力価（各ｎ＝４試料）を約６０％増加させることができた（図７を参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2020028307.tif 000007
【図７】
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【外国語明細書】
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