(57)【要約】      （修正有）【課題】効率よく合理的にシトルリンを産生でき、もって様々な飲食品に応用できるシトルリン含有組成物の製造方法の提供。【解決手段】シトルリン産生能を有する微生物を乳化剤を含むアルギニン添加培地で培養する工程を含む、シトルリン含有組成物の製造方法。該方法により製造されたシトルリン含有組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトルリン産生能を有する微生物を、乳化剤を含むアルギニン添加培地で培養する工程を含むシトルリン含有組成物の製造方法。  
【請求項２】
乳化剤が、脂肪酸エステルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
乳化剤が、脂肪酸としてラウリン酸を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
乳化剤が、ラウリン酸ペンタグリセリド、ラウリン酸デカグリセリンおよびラウリン酸ショ糖エステルからなる群から選択される、請求項１〜３いずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
微生物が、乳酸菌、ビフィズス菌またはプロピオン酸菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法により製造された、シトルリン含有組成物。
【請求項７】
請求項６に記載のシトルリン含有組成物を含有する飲食品。
【請求項８】
ヨーグルトである、請求項７に記載の飲食品。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の製造方法によって製造されたシトルリン含有組成物からシトルリンを精製することを含む、シトルリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シトルリンを含む組成物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シトルリンは遊離アミノ酸としてスイカの実から発見され、現在では哺乳類を含む動植物に幅広く存在することが知られている。日本においては２００７年から食品としての使用が認められており、例えばサプリメントとして補給した場合、動脈硬化の予防、勃起機能の改善、記憶能力の増強や運動機能の向上など様々な有益な効果を有することが報告されている。
【０００３】
現在、シトルリンは主として微生物による発酵法により製造されているところ（引用文献1、２）、飲食品または食品素材としては極めて高価であり、さらに、その機能を発揮させるために必要な摂取量は比較的に多量（例えば、数百ｍｇ）である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１１１５９７号
【特許文献２】国際公開第２０１５／１１１５９８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、シトルリンのもつ有用性に着目し、これを飲食品または食品素材に応用することにより機能性食品などを提供できるとの観点から、シトルリン含有組成物の製造方法について検討した。すなわち本発明の課題は、効率よくシトルリン含有組成物を製造でき、乳製品などの飲食品に応用できる方法を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねる中で、シトルリン産生能を有する微生物を、乳化剤を含む培地で培養することにより効率よくシトルリンが産生されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、以下のシトルリン含有組成物の製造方法、および該製造方法で製造された組成物に関する。
［１］  シトルリン産生能を有する微生物を、乳化剤を含むアルギニン添加培地で培養する工程を含むシトルリン含有組成物の製造方法。   
［２］  乳化剤が、脂肪酸エステルである、前記［１］に記載の方法。
［３］  乳化剤が、脂肪酸としてラウリン酸を含む、前記［１］または［２］に記載の方法。
［４］  乳化剤が、ラウリン酸ペンタグリセリド、ラウリン酸デカグリセリンおよびラウリン酸ショ糖エステルからなる群から選択される、前記［１］〜［３］いずれかに記載の方法。
［５］  微生物が、乳酸菌、ビフィズス菌またはプロピオン酸菌である、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］  前記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法により製造された、シトルリン含有組成物。
［７］  前記［６］に記載のシトルリン含有組成物を含有する飲食品。
［８］  ヨーグルトである、前記［７］に記載の飲食品。
［９］  前記［１］〜［８］に記載の製造方法によって製造されたシトルリン含有組成物からシトルリンを精製することを含む、シトルリンの製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の製造方法によれば、シトルリン産生能を有する微生物を使用して、シトルリンを高濃度で含むシトルリン含有組成物が短時間で得られる。また本発明に係るシトルリン含有組成物は、食品に使用できる乳化剤を用いた場合は、それ自体を食品として利用したり、食品素材として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、アルギニンおよびシトルリンのクロマトグラフィーのピークを示す。
【図２】図２は、各種の乳化剤を添加して培養した際のシトルリン濃度の推移を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明に係る方法に使用するシトルリン産生能を有する微生物はシトルリンを産生するものであれば特に限定されないが、アルギニンをシトルリンに変換する代謝能を有するものが好ましい。好ましくはシトルリン産生能を有する乳酸菌、ビフィズス菌またはプロピオン酸菌であり、より好ましくはシトルリン産生能を有する乳酸菌である。
【００１１】
本発明のシトルリン産生能を有する乳酸菌は、好ましくは、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、エンテロコッカス・フェーカリス（Enterococcus faecalis）、オエノコッカス・オエニ（Oenococcus oeni）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）、ラクトバチルス・アミロボラスLactobacillus amylovorus、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis) 、およびラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)からなる群から選択される１種または２種以上であり、より好ましくは、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・ファーメンタム、およびラクトバチルス・ブフネリからなる群から選択される１種または２種以上であり、さらに好ましくは、ラクトコッカス・ラクティスである。
【００１２】
本発明に係る方法において、微生物の培養は、好気条件下、および嫌気条件下のいずれの条件で行ってもよい。培養には、増殖培養や発酵などが含まれ、増殖培養には誘導期や対数増殖期のものに限定されず、定常期や死滅期の増殖期のものも含まれる。また培養は、必ずしも微生物の生育に至適な条件で行なわれる必要はなく、微生物の増殖が阻害されたり、微生物の一部が死滅するような温度条件やｐＨ条件で行なってもよい。
【００１３】
本発明に係る方法において、アルギニン添加培地は、アルギニンを添加した微生物用培地や、アルギニンを含有する微生物用培地に限定されず、乳酸菌の培養において生育環境を提供する任意の媒体を含み、例えば、発酵乳の製造に使用するアルギニンを含有する原料乳や、アルギニンを含有する発酵乳などであってよい。
【００１４】
本発明に係る方法において、乳化剤は市販の乳化剤であれば特に限定されないが、好ましくは食品に添加し得る観点から、例えばグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなどの脂肪酸エステルであり、特に好ましくは脂肪酸としてラウリン酸を含む、ラウリン酸ペンタグリセリド、ラウリン酸デカグリセリンおよびラウリン酸ショ糖エステルである。
【００１５】
乳化剤は、最終濃度で０．００１重量％以上、好ましくは０．０１重量％〜２０重量％、例えば０．１〜１０重量％、０．０５〜１０重量％、より好ましくは０．１〜０．５重量％となるように培地に添加してよい。
【００１６】
本発明に係る方法において、乳化剤は、培養開始前にアルギニン添加培地に添加してもよく、培養開始後の対数増殖期や定常期など任意のタイミングでアルギニン添加培地に添加することが好ましい。
【００１７】
本発明に係る方法において、乳化剤の存在下で３０分以上、典型的には１〜１００時間、好ましくは３〜６０時間培養することにより、シトルリンの収率を高めることができる。
【００１８】
本発明に係る方法において、培養温度は、乳酸菌の培養が可能な温度範囲であればよく、例えば１０℃〜６０℃であり、好ましくは２０℃〜６０℃であり、さらに好ましくは３０℃〜６０℃であり、特に好ましくは３５℃〜５５℃である。アルギニン代謝能を有する微生物は、アルギニンをシトルリンに変換する酵素のアルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）と、シトルリンからオルニチンに変換する酵素のオルニチンカーボミルトランスフェラーゼ（ＯＴＣ）を有しているところ、ＡＤＩの発現および/または活性を高めることでアルギニンからシトルリンへの変換を亢進させ、および/またはＯＴＣの発現および/または活性を低めることでシトルリンからオルニチンへの変換を抑制するなどして、ＡＤＩの発現および/または活性をＯＴＣに比して優位にすることで、シトルリンの収量を高めることができる。したがって、本発明の一態様において、培養温度は、ＡＤＩの発現および/または活性を優位にすべく、通常の微生物培養よりも高い培養温度で培養することが好ましく、例えば４０℃〜６０℃、好ましくは４２℃〜４７℃、より好ましくは４４℃〜４６℃である。
【００１９】
また本発明の別の態様によれば、通常の微生物培養温度または微生物に応じた至適成育温度で培養した後に、アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）の発現および/または活性をＯＴＣに比して優位にすべく、任意のタイミングで、培養温度を連続的にまたは段階的に変化させることができ好ましくは乳化剤を添加した後に４５℃以上、好ましくは５０℃以上、さらに好ましくは４５〜５５℃以上、特に好ましくは５５℃で培養することである。
【００２０】
本発明に係るシトルリン含有組成物は、例えば、シトルリンを含有する乳酸菌培養液などとして得ることができ、ヨーグルトやチーズ、菓子、清涼飲料水、乳酸菌飲料、乳飲料などの飲食品、食品組成物、飲料組成物、サプリメント、医薬品、流動食、口腔化粧料などの各種製品の原料や、シトルリンを富化するための添加物として用いることができる。また、本発明に係るシトルリン含有組成物は、かかる組成物自体を、例えば、シトルリンを含有するヨーグルトまたはチーズなどの飲食品、食品組成物、飲料組成物、サプリメント、医薬品、口腔化粧料などとして用いることができる。さらに本発明は、一態様において、例えば、シトルリンを含有する乳酸菌培養液などをさらに精製して、シトルリンを得ることもできる。
【００２１】
本発明に係る方法において、シトルリン含有組成物からシトルリンを精製する方法としては、通常知られている精製方法を採用することができ、たとえば、イオン交換、ゲルろ過、逆相等の各種クロマトグラフィー、塩析、晶析、溶媒沈殿などの方法が挙げられる。
【００２２】
以下、実施例に基づいて、本発明を具体的に説明する。なお、この実施例は、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００２３】
［例１］
表１に記載した組成の培地を調合し、８０℃で１０分間保持して殺菌し、かかる培地にラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）MEP201805株を接種し、培養中に培地のｐＨが６．０を維持する様に中和剤を逐次添加し、３４℃で５時間培養した。次いで、この培地に１０％（ｗ／ｗ）の濃度で調整したラウリン酸ペンタグリセリド（Ａ−１２１Ｅ、太陽化学株式会社製）、ラウリン酸デカグリセリン（Ｌ−１０Ｄ、三菱ケミカルフーズ株式会社製）、ラウリン酸ショ糖エステル（Ｌ−１６９５、三菱ケミカルフーズ株式会社製）の乳化剤水溶液を培地に３％（ｗ／ｗ）で添加し、５５℃に昇温し、昇温完了後５時間培養した。培養後１、３、５時間の経過時点でサンプルを採取し、下記の方法にしたがって、それぞれのサンプルに含まれるシトルリンの濃度を測定した。
【００２４】
【表１】
2020028253.tif 000002
【００２５】
シトルリンの濃度の測定は下記の条件にて高速液体クロマトグラフィー（HPLC: Agilent Technology 1200series G1314Dを用いて行った。カラムは住化分析センター社製 SUMICHIRAL OA-5000を使用した。移動相は１．０ｖ／ｖ％のイソプロパノール水溶液に対し、２ｍＭの濃度で硫酸銅（II）五水和物を溶解したものを使用した。移動相の流量は１ｍＬ／ｍｉｎとし、サンプルの注入量は１０μＬとした。カラム温度は４０℃とした。１サンプル当たりの分析時間は１５分とした。検出方法は２５４ｎｍ  ＵＶ光の吸光度とした。この方法で得られるクロマトチャートと、それぞれのピークに対応する物質を図１に示す。
【００２６】
図２に培地に乳化剤を添加した後のシトルリン濃度推移を示す。乳化剤を添加しない対照試験（無添加）に比べ、乳化剤を添加した試験（A-121E、L-10D、L-169D）ではＣｉｔ濃度の上昇が見られ、シトルリン製造の効率化が可能となった。なおＡ−１２１Ｅはラウリン酸ペンタグリセリド、Ｌ−１０Ｄはラウリン酸ペンタグリセリド、Ｌ−１６９Ｄはラウリン酸ショ糖エステルをそれぞれ示す。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明は、シトルリン含有組成物の製造方法および該方法により製造されたシトルリン含有組成物を提供する。
【図１】
2020028253.tif 000003
【図２】
2020028253.tif 000004