(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞（例えば髄核幹／前駆細胞）を含む細胞集団から、用途に応じた所定の形質を有する細胞（例えばＩＩ型コラーゲン陽性髄核細胞）を豊富に含む細胞集団を、効率的に調製するための手段を提供すること。【解決手段】（１）消化処理されていない組織中に存在する状態で、（２）少なくとも１種の、増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤が添加された培地中で、（３）細胞の付着性を高める処理がなされた培養表面を有する培養容器で、または（４）細胞外マトリックス分解剤が添加された培地中で、球状コロニーの形成を抑制しながら、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｉｅ２（tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain-2）の発現が陽性である幹細胞および／または前駆細胞（以下「Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞」と呼ぶ。）を含む細胞集団の培養方法であって、
消化処理されていない組織中に存在する状態で、当該Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する方法（以下「第１培養方法」と呼ぶ。）であり、
細胞集団中の前記Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を増幅する際に行われるものである、第１培養方法。
【請求項２】
前記Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞が、椎間板の髄核組織に由来するＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞である、請求項１に記載の第１培養方法。
【請求項３】
前記消化処理されていない組織が椎間板の髄核組織である、請求項１または２に記載の第１培養方法。
【請求項４】
前記消化処理されていない組織が、凍結保存された組織を解凍した組織である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の第１培養方法。
【請求項５】
凍結保存が、Ｔｉｅ２が活性化および／または発現された状態を維持する、あるいは前記細胞集団中のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞の減少を抑制するために行われるものである、請求項４に記載の第１培養方法。
【請求項６】
Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の培養方法であって、
少なくとも１種の、増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤が添加された培地中で、当該Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する方法（以下「第２培養方法」と呼ぶ。）であり、
細胞集団中の前記Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を増幅する際に行われるものである、第２培養方法。
【請求項７】
前記Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞が、椎間板の髄核組織に由来するＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞である、請求項６に記載の第２培養方法。
【請求項８】
前記増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤が、植物由来抽出物である、請求項６または７に記載の第２培養方法。
【請求項９】
前記植物が、ニッケイ（Cinnamomum）属の植物である、請求項８に記載の第２培養方法。
【請求項１０】
細胞の付着性を高める処理がなされた培養表面を有する培養容器で行われる、請求項６〜９のいずれか一項に記載の第２培養方法。
【請求項１１】
前記細胞の付着性を高める処理が、細胞外マトリックスまたはその他の生体関連分子を含有するコーティング剤を塗布する処理である、請求項１０に記載の第２培養方法。
【請求項１２】
前記コーティング剤として、ゼラチンを用いる、請求項１１に記載の第２培養方法。
【請求項１３】
Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の調製方法であって、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の第１培養方法および／または請求項６〜１２のいずれか一項に記載の第２培養方法を実施する工程を含む、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞のＴｉｅ２の発現を増強するとともに、細胞集団中のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を増幅するための培養段階（以下「増幅培養段階」と呼ぶ。）
を含む、調製方法。
【請求項１４】
前記増幅培養段階において実施する工程が、前記第１培養方法および前記第２培養方法を同時に実施する工程である、請求項１３に記載の調製方法。
【請求項１５】
前記増幅培養段階が、Ｔｉｅ２発現増強剤としてＴｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子のみが添加された培地中でＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する工程をさらに含む、請求項１３または１４に記載の調製方法。
【請求項１６】
前記増幅培養段階の後に、
Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を目的細胞へと分化誘導するための培養段階（以下「分化培養段階」と呼ぶ。）
をさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項１７】
前記分化培養段階が、
細胞の付着性を高める処理がなされた培養表面を有する培養容器で、当該Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する方法（以下「第３培養方法」と呼ぶ。）、および／または
細胞外マトリックス分解剤が添加された培地中で、球状コロニーの形成を抑制しながら、当該Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する方法（以下「第４培養方法」と呼ぶ。）
を実施する工程を含む、請求項１６に記載の調製方法。
【請求項１８】
前記第３培養方法における細胞の付着性を高める処理が、細胞外マトリックスまたはその他の生体関連分子を含有するコーティング剤を塗布する処理である、請求項１７に記載の調製方法。
【請求項１９】
前記細胞外マトリックスまたはその他の生体関連分子が、IV型コラーゲン、フィブロネクチンおよびポリリジンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１８に記載の調製方法。
【請求項２０】
前記第４培養方法における細胞外マトリックス分解剤が、少なくともII型コラーゲンに対する分解活性を有するプロテアーゼを含む、請求項１７に記載の調製方法。
【請求項２１】
前記分化培養段階において実施する工程が、前記第３培養方法および前記第４培養方法を同時に実施する工程である、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項２２】
前記目的細胞が、少なくともII型コラーゲンを発現する細胞である、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項２３】
前記少なくともII型コラーゲンを発現する細胞が髄核細胞である、請求項２２に記載の調製方法。
【請求項２４】
前記分化培養段階によって、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞も残存している細胞集団を得る、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項２５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の培養方法によって得られた細胞集団。
【請求項２６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の培養方法における培地と、当該培養方法に供される、培養されているまたは得られた細胞集団とを含有する培養物。
【請求項２７】
請求項１３〜２４のいずれか一項に記載の調製方法における、増幅培養段階および／または分化培養段階によって得られた細胞集団。
【請求項２８】
請求項１３〜２４のいずれか一項に記載の調製方法における、増幅培養段階用培地または分化培養段階用培地と、各々、当該増幅培養段階または分化培養段階に供される、培養されているまたは得られた細胞集団とを含有する培養物。
【請求項２９】
請求項２５または２７に記載の細胞集団を含有する、細胞治療用組成物。
【請求項３０】
椎間板の障害、変性またはヘルニアが症状として表れる疾患に対する治療または予防用である、請求項２９に記載の細胞治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞表面マーカーＴｉｅ２（tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain-2）の発現が陽性である幹細胞および／または前駆細胞（本明細書において「Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞」と呼ぶ。）を含む細胞集団の培養方法に関する。より詳しくは、本発明は、細胞集団中のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞（例えば髄核幹／前駆細胞）を増幅する工程や、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞から所定の形質を有する細胞（例えばII型コラーゲン発現髄核細胞）へと分化誘導する工程において利用することのできる、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腰痛は有訴者率で２位に入り、成人人口の２／３が一度は経験するありふれた疾患であり、労働障害や医療経済における社会問題の一因となっている。腰痛の原因の２０％とも言われる椎間板障害は、椎間板ヘルニア、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、すべり症などを誘引しうる重大な問題であるが、椎間板組織の不可逆的変化であり、病理学的には椎間板変性と呼ばれる病態である。椎間板はドーナツ型をした軟骨性の臓器であり、中心部の髄核（Nucleus Pulposus; NP）と周りを何周にも取り巻く線維性軟骨である線維輪（Annulus Fibrosus; AF）、そして隣接椎骨とを上下で連結する終板軟骨（Cartilaginous Endplate; EP）とで形成されている。ゼラチン状のＮＰは無血管臓器であり、ＮＰに含まれている脊索由来の髄核細胞から分泌される、大型のプロテオグリカンとコラーゲンで構成される細胞外基質（Extracellular Matrix; ECM）を多く含有する。ヒトを含む脊椎動物の一部において、脊索由来髄核細胞が一生の早い時期に消失することが報告されており、その消失の後、起源は未だ確定していないが形態学的には軟骨細胞に類似した軟骨様細胞が髄核を形成する。このような細胞形質の転換はＥＣＭ組成に影響を与え、含水量の低下、線維化といった椎間板の加齢や変性を招き、最終的に腰痛や腰椎変性疾患に大きく関わると考えられている。なお、マウス、ラット、ウサギ、ブタなどの多くの動物種は脊索由来髄核細胞を終生保持し、椎間板変性は殆ど認められないことから、脊索由来髄核細胞および他の髄核細胞の制御機構がヒトとは異なっているものと考えられる。
【０００３】
椎間板変性の予防方法または治療方法の一例として、同種椎間板細胞製剤、すなわち椎間板組織に投与するための同種髄核細胞、ＥＣＭ等を含有する細胞製剤の研究開発が進められている。そのような細胞製剤の製造のためには、ある程度まとまった量の同種髄核細胞が必要となる。例えば、椎間板ヘルニアの患者の手術により切除される椎間板髄核組織を髄核細胞の供給源として利用することができるが、そのようにして採取できる髄核組織量、すなわちそこに含まれる髄核細胞数は少ない。かといって、髄核細胞数を確保するために複数の椎間板ヘルニア患者（ドナー）に由来する髄核細胞を混合して用いることは、ウイルス感染症のリスクを完全に否定することはできないため避けることが望ましい。それゆえ、単一のドナー由来の少量の椎間板組織（髄核、線維輪等）に含まれている、成熟した髄核細胞への分化誘導が可能な稀少な幹細胞または前駆細胞を培養し、治療のために十分な数の髄核細胞を含む細胞集団を調製することが重要となる。
【０００４】
特許文献１には、髄核細胞（椎間板髄核に由来する細胞集団）を「細胞付着に干渉する条件下」で培養する（好ましくは無血清培地中で培養する）ことにより、その細胞集団に含まれている幹細胞および前駆細胞によって構成される「円板球」（discosphere）を作製することが開示されている。すなわち特許文献１には、髄核細胞を「細胞付着に干渉する条件下」で培地中で成長させるステップと、（ｂ）円板幹細胞（disc stem cell）、円板前駆細胞（disc progenitor cell）またはそれらの組み合わせについて濃縮するステップと、（ｃ）髄核細胞を含む円板球を産出し、それにより円板幹細胞集団を産出するステップとを含む「円板幹細胞集団を産出する方法」が記載されている（請求項３等）。なお、前記「円板球」については、円板幹細胞、円板前駆細胞またはそれらの組み合わせを含むインビトロの浮遊性球構造体（free floating circular-spherical structure）である、単一の円板幹細胞がそれ自身のクローン及び前駆細胞を生じさせる細胞の球である、円−球（circular-spherical）構造で配置された浮遊性の髄核幹細胞および髄核前駆細胞を含む、円板球を含む髄核細胞は互いに付着している、などと説明されている（段落００２４、００３９）。特許文献１にはさらに、「細胞付着に干渉する条件下」で培養された、円板幹細胞、円板前駆細胞またはそれらの組み合わせについて濃縮された「単離された円板幹細胞集団」（請求項１等）；髄核細胞から濃縮された円板幹細胞、円板前駆細胞、またはその混合物を含み、インビトロの浮遊性球構造体である「単離された円板球」（請求項１０等）；円板スキャフォールドと、円板幹細胞、円板前駆細胞またはそれらの組み合わせについて濃縮された髄核細胞を含む円板球とを含む「人工円板代替装置」（請求項１１等）；髄核細胞から濃縮された円板幹細胞、円板前駆細胞またはそれらの混合物を含む円板球を円板スキャフォールド内で成長させることを含む、円板人工代替装置を作製する方法（請求項１２等）；所定の低密度でプレーティングされた髄核細胞を「細胞付着に干渉する条件下」で培養するステップと、円板幹細胞、円板前駆細胞またはその混合物を含むインビトロの浮遊性球構造体を選択し、それにより濃縮された細胞集団を産出するステップを含む「濃縮された細胞集団を産出する方法」（請求項１７等）；円板幹細胞、円板前駆細胞またはそれらの組み合わせを含む円板球を１つもしくは複数の解離された円板球細胞へと解離するステップと、前記１つもしくは複数の解離された円板球細胞を、細胞付着に干渉し、所定の添加物（例えばＦＧＦ２、ＥＧＦ）を含む培地中で培養するステップとを含む「濃縮された円板幹細胞、円板前駆細胞またはその組み合わせの集団を拡大させる方法」（請求項１８等）なども記載されている。なお、特許文献１における「円板」は、原語「disc」の直訳であるが、「椎間板」の意味であると考えられる。
【０００５】
特許文献１では、椎間板髄核組織に由来する、円板幹細胞、円板前駆細胞、円板細胞等を含む不均質な細胞集団（髄核由来細胞集団）を培養するための培養容器または培地に関する事項について、次のようなことが言える。
【０００６】
特許文献１には、「細胞付着に干渉する条件下」での培養として、細胞付着に干渉する物質（メチルセルロース）を含む無血清培地中に低細胞密度でプレーティングして培養する、または超低付着プレートにおいて培養することにより、髄核由来細胞集団（そこに含まれている幹細胞等）から浮遊性球構造体である円板球を形成させる実施形態が開示されている（段落０１５６、実施例１：段落０１７０〜０１８１参照、請求項３、１７等の発明に対応）。しかしながら特許文献１には、細胞外マトリックスを分解する物質（例えばコラゲナーゼ）を含む培地中で、または細胞付着性の培養表面上で、髄核由来細胞集団（そこに含まれている幹細胞等）を培養し、円板球を形成させることなく、円板幹細胞を増殖させたり分化誘導分したりすることについて、記載も示唆もされていない。
【０００７】
特許文献１には、濃縮された円板幹細胞等を含む細胞集団を拡大する方法として、まずコラゲナーゼが補充された培地におけるインキュベーションによって円板球（浮遊性球構造体）を１つ若しくは複数の円板幹細胞へと解離し、その後、解離した細胞をメチルセルロース含有培地中に再プレーティングするという実施形態が開示されている（段落０１５７、実施例２：段落０１８２〜０１８４参照、請求項１８等の発明に対応）。しかしながら、当該実施形態におけるコラゲナーゼが補充された培地における培養は、一旦形成された円板球を個々の円板幹細胞等に解離するための一時的な処理に過ぎず、円板幹細胞等を分化誘導するための処理ではなく、解離した円板幹細胞等は再び「細胞付着に干渉する条件下」（メチルセルロース含有培地等）で培養される。円板球を形成していない状態の（形成する前の）円板幹細胞等を用いてコラゲナーゼが補充された培地における培養を開始し、その円板幹細胞等を拡大（増殖）させたり分化誘導したりすることや、円板幹細胞等を互いに解離させた後も引き続きコラゲナーゼが補充された培地での培養を継続し、浮遊性球構造体である円板球が形成されない状態を保持したまま、円板幹細胞等を拡大（増殖）すると共に分化させることについて、特許文献１には記載も示唆もされていない。
【０００８】
なお、特許文献１には、「細胞の成熟を阻害する化合物」（例えばＦＧＦ）または「細胞の幼若性を維持する化合物」（例えばＴＧＦ−βスーパーファミリメンバーや、ＢＭＰ、ＩＬ−６、ＬＩＦ等）を含む無血清培地中で円板幹細胞を成長させることについて記載されているが（段落００３５〜００３７）、Ｔｉｅ２の活性化を促進する物質を添加した培地中で円板幹細胞を培養することについては記載されていない。
【０００９】
また、特許文献１には、髄核由来細胞集団を得るための髄核組織の調製方法については、髄核（外科的に取得されたヒト円板材料、または生検標本）を断片化し、コラゲナーゼＩＩ、クロストリジウムコラゲナーゼなどを用いて処理することで、髄核組織を断片化し、個々の細胞を解離させる（単一細胞懸濁液とする）という、一般的な手法のみが記載されている（段落００２６、００２９、００３０、実施例１：段落０１７１〜０１７４等）。
【００１０】
一方、特許文献２および非特許文献１には、椎間板組織（髄核）に含まれている細胞のうち、細胞表面マーカーとしてＴｉｅ２および／またはＧＤ２が陽性である細胞が、髄核細胞の幹細胞または前駆細胞というべき細胞であること、特にＴｉｅ２およびＧＤ２の両方が陽性である細胞（活性状態にある髄核幹細胞）が、球状コロニーを形成し、一連の分化カスケードを経て最終的に成熟した髄核細胞への分化能を有する（他にも脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞および神経細胞への分化能も有する）こと、さらに髄核幹／前駆細胞を椎間板（髄核）に移植することによって、組織中でII型コラーゲン等の細胞外マトリックスを産生させることができ、椎間板組織を維持または再構築や、椎間板変性症の予防または治療ができる可能性があることなどが記載されている。
【００１１】
より具体的な実施形態として、特許文献２および非特許文献１には、椎間板組織（髄核）に含まれていた細胞集団をメチルセルロース培地にて浮遊培養することにより（付着型コロニーと共に）球状コロニーが形成されたこと、そのような球状コロニーは上述したＴｉｅ２陽性（かつＧＤ２陽性）細胞から導出されること、球状コロニー（その一部の細胞）ではII型コラーゲンおよびプロテオグリカンが発現していることなどが記載されている（例えば、特許文献２の実施例、段落００６７、００７０等参照）。しかしながら、特許文献２および非特許文献１にも、細胞外マトリックスを分解する物質（例えばコラゲナーゼ）を含む培地中で、または細胞付着性の培養表面上で（メチルセルロースが添加されてない培地を用いて）、球状コロニーを形成させることなく、髄核幹／前駆細胞（Ｔｉｅ２および／またはＧＤ２陽性細胞）を増殖させたり分化誘導したりすることについて、記載も示唆もされていない。
【００１２】
特許文献２および非特許文献１にも、椎間板髄核組織に由来する細胞集団の調製方法としては、組織をはさみなどで小片化した後、タンパク質消化酵素（トリプルエクスプレス、コラゲナーゼＰ）で消化するという、一般的な手法のみが記載されている（実施例：段落００４８）。
【００１３】
なお、特許文献２および非特許文献１には、Ｔｉｅ２陽性髄核細胞（椎間板髄核幹／前駆細胞）を維持するためには、Ｔｉｅ２（受容体）とＡｎｇ−１（アンジオポエチン−１、リガンド）との間のシグナル伝達機構が必要であり、Ａｎｇ−１の存在化で培養する（Ａｎｇ−１を強制発現させたＡＨＥＳＳ５と共培養する）ことによりＴｉｅ２陽性細胞を増幅できること、したがってＡｎｇ−１は髄核細胞の分化ヒエラルキーを制御するニッチ因子と考えられること、などが記載されてきる（実施例：段落００４９、００６９、００７５等）。
【００１４】
ところで、Ｔｉｅ２は血管内皮細胞にも発現しており、Ｔｉｅ２を活性化することにより、血管の成熟化、正常化または安定化がもたらされること、例えば腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病網膜症、高脂血症、高血圧などで観察される無秩序な血管の増幅（血管新生）を抑制したり、しわを防止、改善したりできることなどが知られている。そのような作用を有するＴｉｅ２活性化剤としては、例えば、ニッケイ（Cinnamomum）属植物由来の抽出物（いわゆるシナモンパウダー、特許文献３）、オリーブ果実エキス（特許文献４）、その他にもキラヤ、黄杞、銀杏、牡蠣、ウコン、菊、ナツメ、クコ、カミツレ、ブッチャーブルーム、サンザシ、スターフルーツ、ゲットウ、ハス、ルイボス、インディアンデーツ、カリン、シジュウムグァバ、ヒハツ、シベリアニンジン、マンゴージンジャー、高麗ニンジン、アキグミ、オカヒジキ、ハリギリ、リョウブ、ヤブカンゾウ、ハスイモ、ミツバウツギ、クサギ、ムベ、サンショウソウ、コナラ、クヌギ、アキノノゲシ、スイショウガキ、オオバコ、ノビル、ヤマモモ、ニッケイ、ソウカクシ、オウセイ、ギョクチク、カロニンハゲキテなど（特許文献４：背景技術参照）、様々な植物由来抽出物が提案されている。
【００１５】
特許文献３では、「Ｔｉｅ２活性化剤」に関する試験（実施例）として、ケイヒ熱水抽出物を添加した培地中で「Ｔｉｅ２を強制発現した血球系Ｂａｆ３細胞」または「正常ヒトさい帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）」を培養した場合、それらの細胞で発現したＴｉｅ２タンパク質はリン酸化されたものがコントロールに比べて多いことを、ウェスタンブロッティング法により確認している（段落００２４〜００２７、図１〜３等）。
【００１６】
しかしながら、特許文献３、特許文献４等には、椎間板から得られる髄核由来細胞集団（そこに含まれるＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞）の培養においてＴｉｅ２活性化剤を利用することや、それによりどのような作用効果がもたらされるかについては記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特許第５５０９０７３号公報（ＷＯ２００９／００９０２０対応）
【特許文献２】特許第５８６３６３９号公報（ＷＯ２０１１／１２２６０１対応）
【特許文献３】ＷＯ２００９／１２３２１１
【特許文献４】ＷＯ２０１６／０６０２４９
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Sakai D et al., Nat Commun. 2012;3:1264
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
前述したように、椎間板変性症等の予防または治療用の同種椎間板細胞製剤を製造するためには、II型コラーゲン、プロテオグリカン等の細胞外マトリックスを産生する機能的な髄核細胞が、ある程度まとまった量で必要となる。そのためには、例えば椎間板ヘルニア患者の患部から切除された椎間板組織（髄核等）に含まれている、髄核細胞の幹細胞および／または前駆細胞であると考えられているＴｉｅ２陽性細胞を効率的に増殖および分化させて、機能的な髄核細胞を多量に産生する必要がある。特に、椎間板変性症等の患者に細胞製剤を投与したときの治療効果を高めるためには、椎間板に含まれるＴｉｅ２陽性細胞（髄核幹／前駆細胞）を培養して分化誘導する際に、単に髄核細胞に分化させるのではなく、II型コラーゲン等の細胞外マトリックスの産生量の多い機能的な髄核細胞に、なるべく効率的に分化させることが重要である。それとともに、上記のように分化誘導する前にあらかじめ、組織から得られる細胞集団中のＴｉｅ２陽性細胞（髄核幹／前駆細胞）を効率的に増幅しておくことも、最終的に得られる機能的な髄核細胞の数を増やすために重要である。つまり、一定数のＴｉｅ２陽性細胞（髄核幹／前駆細胞）を含む細胞集団から、効率的な増幅および分化誘導によって、最終的に調製され投与される細胞集団中の機能的な髄核細胞を豊富なものとするための、実用的な手段が求められている。
【００２０】
また、前掲特許文献１および２に記載されているような従来技術の典型的な実施形態においては、椎間板組織に含まれている髄核幹／前駆細胞を含む細胞集団を、メチルセルロースが添加された培地中で培養することによって、球状コロニー（円板球、スフェロイド）を形成させた後、髄核細胞に分化させていた。しかしながら、メチルセルロースは粘稠性が高い物質であるため、それが添加されている培地から生成した細胞集団（そこに含まれる有用な機能性髄核細胞）を無駄なく回収することは困難または多大な労力が必要であり、細胞製剤の効率的な生産の足かせとなっていた。
【００２１】
本発明は、Ｔｉｅ２の発現が陽性である幹細胞および／または前駆細胞を含む細胞集団（例えば椎間板由来の髄核幹／前駆細胞を含む細胞集団）から、用途に応じた所定の形質を有する細胞（例えばII型コラーゲン等の細胞外マトリックスを産生する機能的な髄核細胞）を豊富に含む細胞集団を、効率的に調製するための手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは、椎間板髄核組織に含まれているＴｉｅ２陽性細胞（髄核幹／前駆細胞）を含む細胞集団を培養する際の、培養に供する細胞集団の状態や培養条件に注目して研究を進めた結果、上記の課題の解決に寄与しうる複数の特長的な技術的事項を見出した。また、それらの技術的特徴を備えた培養方法は、あるものは髄核幹／前駆細胞を増幅することを主な目的とする段階（増幅培養段階）の培養工程において、あるものは髄核幹／前駆細胞から機能的な髄核細胞へ分化誘導することを主な目的とする段階（分化培養段階）の培養工程において、組み合わせて順次または同時に利用できること、特にそのような培養方法を「融合」するようにして同時的に実施する培養工程とすることにより、発明の作用効果が相乗的に奏されることを見出した。
【００２３】
すなわち、本発明は一側面において、椎間板組織に含まれているＴｉｅ２陽性細胞（髄核幹／前駆細胞）に代表される、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の培養方法として、組み合わせ（好ましくは融合）が可能な、下記第１〜第４の培養方法を提供する。
【００２４】
本発明によるＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の「第１培養方法」は、消化処理されていない組織中に存在する状態で、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する方法である。
【００２５】
従来は、椎間板髄核組織に含まれる細胞集団を培養しようとする場合、採取された椎間板の髄核組織を細切した後、まずコラゲナーゼ等のタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）によって当該組織を消化する処理（消化処理）を行い、当該処理によって髄核組織から分離した細胞集団を回収して培養を始めることが一般的であった。しかしながら本発明者らは、髄核組織を細切した後、消化処理は行わず、その細切した髄核組織を培養液中に浮遊させて、細胞集団を組織中に留めたまま一定期間培養した場合、従来の消化処理を行った場合に比べて、細胞集団中のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞（髄核幹／前駆細胞）の比率が向上すること、また個々の細胞におけるＴｉｅ２の発現も増強されることを見出した。このような作用効果は、髄核組織の消化処理を行わないことで、髄核幹／前駆細胞にとって好ましい、すなわち、アンジオポエチン−１（Ａｎｇ−１）、ＶＥＧＦ−Ａ等の増殖因子が存在し、Ｔｉｅ２陽性細胞を維持している組織中の微小環境（ニッチ）が壊されていないこと（Ａｎｇ−１等がないとＴｉｅ２陽性細胞はやがてアポトーシスに向かう）、そのようなニッチ中に保持された状態の髄核幹／前駆細胞を含む細胞集団を用いて培養を開始することにより、Ｔｉｅ２の活性が維持されている（ニッチから細胞を単離してしまう従来の方法よりＴｉｅ２の発現が増強されている）髄核幹／前駆細胞は速やかに増殖を開始できるため、培養後に得られる細胞集団において上記のような陽性率の向上や発現量の増加がもたらされることを反映しているものと考えられる。
【００２６】
しかも、髄核組織から細胞集団を分離して回収するという作業を行わないことにより、髄核組織中に含まれている貴重なＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を無駄なく利用することができる。例えば、椎間板ヘルニア患者から摘出されるヘルニア部分に含まれる髄核組織量は１〜２ｇ程度であり、その髄核組織１ｇあたりに含まれるＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞は（患者の年齢等によっても変動するが、例えば）５万個程度である。さい帯血１ｃｃに含まれる白血球数は１０６個オーダーであり、がん組織１ｇに含まれるがん細胞数は１０８個オーダーであることなどと比較すると、髄核組織中のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞がいかに貴重なものかが分かる。そのようなＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞が、髄核組織から細胞集団を分離して回収するという作業を経ることによって失われてしまうことを防げる上に、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞の増幅培養にとって好ましいことになるのは、極めて有益である。
【００２７】
本発明によるＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の「第２培養方法」は、少なくとも１種の、増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤が添加された培地中で、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する方法である。
【００２８】
Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞は元来、Ｔｉｅ２（受容体チロシンキナーゼ）のリガンドであるアンジオポエチン−１（Ａｎｇ−１）が結合することによって、Ｔｉｅ２の活性化（リン酸化）が亢進することは知られており、Ａｎｇ−１を添加した培地中でＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を培養する（Ｔｉｅ２の発現を増強する）方法は従来技術（先行技術文献等）によって公知となっている。また、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）も同様に、Ｔｉｅ２の発現を増強する作用を有する増殖因子として知られており、ＦＧＦ２を添加した培地中でＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を培養する方法も公知となっている。
【００２９】
しかしながら本発明者らは、Ａｎｇ−１、ＦＧＦ２等の増殖因子とは異なる種類のＴｉｅ２発現増強剤、例えばシナモンパウダーの抽出液のような植物由来抽出物であるＴｉｅ２発現増強剤を、これまで報告のなかった髄核組織に由来するＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の培養に利用した場合、特に植物由来抽出物であるＴｉｅ２発現増強剤をＦＧＦ２等の増殖因子と併用した場合、培養によって得られる細胞集団中のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞（髄核幹／前駆細胞）の比率が向上するなどの効果があることを見出した。
【００３０】
本発明者らはさらに、上記の「第１培養方法」および「第２培養方法」を組み合わせること（特に融合すること）によって相乗効果的に、髄核組織中のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞（髄核幹／前駆細胞）を含む細胞集団から、当該幹／前駆細胞の細胞数または比率の高い細胞集団が得られることも見出した。
【００３１】
一方、本発明によるＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の「第３培養方法」は、細胞の付着性を高める処理がなされた培養表面を有する培養容器で、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する方法である。
【００３２】
従来は、他の多くの幹／前駆細胞と同様に、椎間板髄核組織に由来するＴｉｅ２陽性細胞（髄核幹／前駆細胞）を含む細胞集団も、前掲特許文献１に記載されているように「細胞付着に干渉する条件下」で、すなわち低付着性の培養容器を用いたり、メチルセルロース培地を用いたりすることで、浮遊性の球状コロニーを形成させるようにして培養されていた。しかしながら本発明者らは、髄核幹／前駆細胞、好ましくは前述したような第１培養方法および／または第２培養方法によってＴｉｅ２の発現が増強されている髄核幹／前駆細胞を含む細胞集団は、「細胞付着に干渉する条件下」ではなく、それとは逆に「細胞の付着性を高める処理（細胞付着性処理）がなされた培養表面を有する培養容器」、例えばポリリジンを含むコーティング剤が塗布されている培養容器を用いる二次元培養的な環境下で（メチルセルロース等を用いずに）、髄核幹／前駆細胞は球状コロニーを形成させることなく、その培養表面に付着させて培養できることを見出した。
【００３３】
このような第３培養方法を分化培養段階の工程において実施することにより、培養表面の処理がなされていない培養容器（または逆に細胞の付着性を阻害する処理（低付着性処理）がなされた培養容器）を用いる場合と比べて、髄核幹／前駆細胞から機能的な髄核細胞（Ｃｏｌ２陽性細胞等）への分化効率を向上させることができ、細胞集団中のＣｏｌ２陽性細胞の数または比率が高い細胞集団を調製することができる。
【００３４】
なお、第３培養方法は、前述した第２培養方法と融合した方法として、増幅培養段階の培養工程において実施することもできる。すなわち、細胞付着処理がなされた培養容器およびＴｉｅ２活性化剤が添加された培地においてＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を培養すれば、二次元培養的な環境下で（メチルセルロース等を用いずに）Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を増幅することができる。
【００３５】
本発明によるＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の「第４培養方法」は、細胞外マトリックス分解剤が添加された培地中で、球状コロニーの形成を抑制しながら、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する方法である。
【００３６】
従来、コラゲナーゼまたはその他のプロテアーゼのように、細胞外マトリックス（コラーゲン、プロテオグリカン等）を分解する作用を有する物質は、第１培養方法との関係で前述したように、採取された組織から細胞を分離するために用いること、あるいは幹／前駆細胞によって形成された球状コロニーを一度解離して、培地を交換し、再度球状コロニーを形成させるような培養方法において一時的に用いることが通常であった。
【００３７】
しかしながら本発明者らは、コラゲナーゼ等の細胞外マトリックスを分解する作用を有する物質（細胞外マトリックス分解剤）を、全く異なる目的において（用途のために）利用できることを見出した。すなわち、本発明者らは、髄核細胞への分化能を有する髄核幹／前駆細胞のようなＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞、好ましくは前述したような第１培養方法および／または第２培養方法によってＴｉｅ２の発現が増強されているＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞であれば、驚くべきことに細胞外マトリックス分解剤を添加した培地中であっても、つまり細胞外マトリックスによってＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞同士が結合している球状コロニーが形成できない状況下であっても、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を培養できること、好ましくは増殖させながらII型コラーゲン、プロテオグリカン等の細胞外マトリックスの発現が陽性である細胞に分化誘導できることを見出した。
【００３８】
本発明者らはさらに、上記の「第３培養方法」および「第４培養方法」を組み合わせることによって、好ましくは培地中の細胞外マトリックス分解剤の種類および濃度と培養容器表面のコーティング剤の種類とを適切に組み合わせた上で融合することによって、相乗効果的に、髄核幹／前駆細胞から、II型コラーゲン（Ｃｏｌ２）陽性細胞のような機能的髄核細胞への分化の効率を著しく向上させることができ、Ｃｏｌ２陽性細胞等の数または比率が従来よりも著しく高い細胞集団を調製することができることも見出した。
【００３９】
しかも、第３培養方法および／または第４培養方法を用いることにより、Ｃｏｌ２陽性細胞等の数または比率が一定水準に達した段階において、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞も完全にはなくなっておらず、一定水準の数または比率を留めた細胞集団が得られることも、本発明者らは見出した。そのような細胞集団は、一定水準の数または比率のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含むことで、投与したときの椎間板髄核に対する治療効果等がより優れたものとなる有用性を有する。
【００４０】
上記の各培養方法に基づき、本発明者らは、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞（髄核幹／前駆細胞等）を含む細胞集団から、当該Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞から分化した目的細胞（Ｃｏｌ２陽性髄核細胞等）を含む細胞集団への調製方法を構築した。この細胞集団の調製方法は、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞のＴｉｅ２の発現を増強しながら増殖させることで、細胞集団中のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を増幅するための培養段階（増幅培養段階）、およびＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を目的細胞へと分化誘導するための培養段階（分化培養段階）の少なくとも一方、好ましくは両方を含む。増幅培養段階は、上記の第１培養方法および第２培養方法の少なくとも一方、好ましくは両方（これらが融合した方法であってもよい。）を実施する工程を含む。分化培養段階は、上記の第３培養方法および第４培養方法の少なくとも一方、好ましくは両方（これらが融合した方法であってもよい。）を実施する工程を含む。第１培養方法および第２培養方法の両方を（好ましくは融合した方法として）実施する工程を含む増幅培養段階、ならびに第３培養方法および第４培養方法の両方を（好ましくは融合した方法として）実施する工程を含む分化培養段階を備えた細胞集団の調製方法は、本発明における特に優れた実施形態であり、従来公知の調製方法に比べて、所定の機能性を有する目的細胞の数または比率が飛躍的に向上した細胞集団を調製することができる。従来の調製方法は、あるものは、細胞集団全体の細胞数または髄核細胞の細胞数は一定の水準を満たすが、その中でＣｏｌ２の発現が陽性であるなど機能性を有する髄核細胞はそれほど多くない、別のものは、細胞集団中のＣｏｌ２陽性細胞の比率や個々の細胞の発現量は一定の水準を満たすが、Ｃｏｌ２陽性細胞の絶対的な数が足りない（一人のドナーから採取できる髄核組織から増やせるＣｏｌ２陽性細胞の数に限界がある）、というようであった。髄核に関する細胞集団について、Ｃｏｌ２陽性細胞の数と発現量（発現の強さ）を両立することは上記のように困難であったが、本発明の調製方法はその両立に成功した、これまでに提案されていない画期的な調製方法といえる。
【００４１】
別の見方をすれば、従来は（Ｔｉｅ２陽性）幹／前駆細胞が足場非依存的な増殖能を有し、球状コロニーを形成することができる性質を利用するために、また当該幹／前駆細胞から分化した細胞を培養表面（足場）上で培養することにより所望の機能性を失ってしまうことを避けるために、採取した組織に含まれている細胞集団を、メチルセルロース培地中または低付着性の培養表面上で培養しながら、当該幹／前駆細胞から所定の機能性を有する目的細胞へと分化させる方法が採用されていた。本発明者らは、上記の各培養方法（特に第３培養方法および第４培養方法）により、粘稠性が高く細胞の回収を困難なものとするメチルセルロースを用いることなく、また細胞が培養表面に付着することを許容する環境下で、（Ｔｉｅ２陽性）幹／前駆細胞の増殖および当該幹／前駆細胞から所定の機能性を有する目的細胞へ分化の効率性を著しく高め、産生された細胞集団を培地中から容易かつ無駄なく回収できる、画期的な方法を見出したと言える。
【００４２】
上記の培養方法および調製方法に関連して、特に第１培養方法および増幅培養工程に関連して、本発明者らは、消化処理されていない組織中に存在する状態で、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を凍結保存することにより、Ｔｉｅ２が活性化および／または発現された状態を維持する、あるいは細胞集団中のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞の減少を抑制することのできる、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の好ましい保存方法を見出した。従来は、採取された椎間板髄核組織に含まれるＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団について、比較的時間のかかるコラゲナーゼ等を用いた消化処理により当該組織から分離した後に、細胞集団のみを凍結保存することは行われていた。しかしながら、採取された椎間板髄核組織を直ちに凍結保存することによって、作業工程上の利便性が向上すると共に、（特に若年者のドナーから採取された）組織中の良好なニッチが保たれた状態のまま細胞集団を維持することができる。そのような凍結保存された組織を解凍した後は、前述した第１培養方法により、解凍された組織を培地に入れて細胞集団を培養し、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を効率的に増幅することができる。
【００４３】
上述した技術思想を、詳細は後述する（好ましい）実施形態と組み合わせて具体化すれば、本発明は例えば、少なくとも下記の事項を包含する発明として表現することができる。
【００４４】
［１］
Ｔｉｅ２（tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain-2）の発現が陽性である幹細胞および／または前駆細胞（以下「Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞」と呼ぶ。）を含む細胞集団の培養方法であって、
消化処理されていない組織中に存在する状態で、当該Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する方法（以下「第１培養方法」と呼ぶ。）。
［２］
前記Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞が、椎間板の髄核組織に由来するＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞である、項１に記載の第１培養方法。
［３］
前記消化処理されていない組織が椎間板の髄核組織である、項１または２に記載の第１培養方法。
［４］
前記消化処理されていない組織が、凍結保存された組織を解凍した組織である、項１〜３のいずれか一項に記載の第１培養方法。
［５］
細胞集団中の前記Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を増幅する際に行われる、項１〜４のいずれか一項に記載の第１培養方法。
【００４５】
［６］
Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の培養方法であって、
少なくとも１種の、増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤が添加された培地中で、当該Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する方法（以下「第２培養方法」と呼ぶ。）。
［７］
前記増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤が、植物由来抽出物である、項６に記載の第２培養方法。
［８］
前記植物が、ニッケイ（Cinnamomum）属の植物である、項７に記載の第２培養方法。
［９］
細胞集団中の前記Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を増幅する際に行われる、項６〜８のいずれか一項に記載の第２培養方法。
【００４６】
［１０］
Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の培養方法であって、
細胞の付着性を高める処理がなされた培養表面を有する培養容器で、当該Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する方法（以下「第３培養方法」と呼ぶ。）。
［１１］
前記Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞が、Ｔｉｅ２発現増強処理がなされているものである、項１０に記載の第３培養方法。
［１２］
前記細胞の付着性を高める処理が、細胞外マトリックスまたはその他の生体関連分子を含有するコーティング剤を塗布する処理である、項１０または１１に記載の第３培養方法。
［１３］
細胞集団中の前記Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を目的細胞に分化させる際に行われる、項１０〜１２のいずれか一項に記載の第３培養方法。
［１４］
前記細胞外マトリックスまたはその他の生体関連分子として、IV型コラーゲン、フィブロネクチンおよびポリリジンからなる群より選択される少なくとも１種を用いる、項１２または１３に記載の第３培養方法。
［１５］
細胞集団中の前記Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を増幅する際に行われる、項１０〜１４のいずれか一項に記載の第３培養方法。
［１６］
前記細胞外マトリックスとして、ゼラチンを用いる、項１２〜１５のいずれか一項に記載の第３培養方法。
【００４７】
［１７］
Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の培養方法であって、
細胞外マトリックス分解剤が添加された培地中で、球状コロニーの形成を抑制しながら、当該Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する方法（以下「第４培養方法」と呼ぶ。）。
［１８］
前記Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞が、Ｔｉｅ２発現増強処理がなされているものである、項１７に記載の第４培養方法。
［１９］
前記細胞外マトリックス分解剤が、少なくともII型コラーゲンに対する分解活性を有するプロテアーゼを含む、項１７または１８に記載の第４培養方法。
［２０］
細胞集団中の前記Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を目的細胞に分化させる際に行われる、項１７〜１９のいずれか一項に記載の第４培養方法。
【００４８】
［２１］
Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の調製方法であって、
項５に記載の第１培養方法および／または項９に記載の第２培養方法を実施する工程を含む、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞のＴｉｅ２の発現を増強するとともに、細胞集団中のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を増幅するための培養段階（以下「増幅培養段階」と呼ぶ。）
を含む、調製方法。
［２２］
前記増幅培養段階において実施する工程が、前記第１培養方法および前記第２培養方法を同時に実施する工程である、項２１に記載の調製方法。
［２３］
前記増幅培養段階が、Ｔｉｅ２発現増強剤としてＴｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子のみが添加された培地中でＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する工程をさらに含む、項２１または２２に記載の調製方法。
【００４９】
［２４］
Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団から、当該Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞から分化した目的細胞を含む細胞集団の調製方法であって、
項１３もしくは１４に記載の第３培養方法および／または項２０に記載の第４培養方法を実施する工程を含む、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を目的細胞へと分化誘導するための培養段階（以下「分化培養段階」と呼ぶ。）
を含む、調製方法。
［２５］
前記分化培養段階において実施する工程が、前記第３培養方法および前記第４培養方法を同時に実施する工程である、項２４に記載の調製方法。
［２６］
前記目的細胞が、少なくともII型コラーゲンを発現する細胞である、項２４または２５に記載の調製方法。
［２７］
前記少なくともII型コラーゲンを発現する細胞が髄核細胞である、項２６に記載の調製方法。
［２８］
前記分化培養段階によって、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞も残存している細胞集団を得る、項２４〜２７のいずれか一項に記載の調製方法。
［２９］
Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団から、当該Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞から分化した目的細胞を含む細胞集団への調製方法であって、
項２１〜２３のいずれか一項に記載の増幅培養段階、および
項２４〜２８のいずれか一項に記載の分化培養段階
を含む、調製方法。
【００５０】
［３０］
項１〜２０のいずれか一項に記載の培養方法によって得られた細胞集団。
［３１］
項１〜２０のいずれか一項に記載の培養方法における培地と、当該培養方法に供される、培養されているまたは得られた細胞集団とを含有する培養物。
［３２］
項２１〜２９のいずれか一項に記載の調製方法における、増幅培養段階または分化培養段階によって得られた細胞集団。
［３３］
項２１〜２９のいずれか一項に記載の調製方法における、増幅培養段階用培地または分化培養段階用培地と、当該増幅培養段階または分化培養段階に供される、培養されているまたは得られた細胞集団とを含有する培養物。
【００５１】
［３４］
項３０または３２に記載の細胞集団を含有する、細胞治療用組成物。
［３５］
椎間板の障害、変性またはヘルニアが症状として表れる疾患に対する治療または予防用である、項３４に記載の細胞治療用組成物。
【００５２】
［３６］
Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の保存方法であって、
消化処理されていない組織中に存在する状態で、当該Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を凍結保存することにより、Ｔｉｅ２が活性化および／または発現された状態を維持する、あるいは当該細胞集団中のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞の減少を抑制する、保存方法。
【発明の効果】
【００５３】
本発明のＴｉｅ２陽性幹／前駆細部の培養方法により、好ましくはＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を増幅することを主目的とする増幅培養工程と、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細部から所定の形質を有する成熟細胞へと分化誘導することを主目的とする分化培養工程を含む培養方法により、目的細胞を豊富に含む細胞集団を調製することができる。そのような本発明の培養方法に基づいて得られた細胞集団を利用することにより、所定の疾患の治療または予防のために効果的な細胞製剤を効率的に製造することが可能となる。
【００５４】
また、本発明では、前掲特許文献１および２などに記載されている従来技術で用いられている、メチルセルロースのように粘稠性の高い成分を培地に添加する必要がないので、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞またはそれから分化誘導された目的細胞を含む細胞集団を、培地から無駄なく回収することが可能となる。
【００５５】
本発明の代表的な実施形態によれば、椎間板ヘルニア患者の手術により少量しか採取することのできない椎間板（髄核）を用いて、そこに含まれているＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞（髄核幹細胞等）を効率的に増殖および分化させることにより、移植したときに高い治療効果が期待できる、II型コラーゲン等の細胞外マトリックスの産生能の高い機能的な髄核細胞を豊富に含む（また多少のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞も残存している）細胞集団を、簡単に、再現性よく、大量に得ることができる。従来は、そのような好適な細胞集団の作製は不可能であったが、本発明により可能となるため、細胞集団（を含有する細胞製剤）の投与による椎間板の再生療法が飛躍的に行いやすくなり、産業化が現実的なものとなる。
【００５６】
なお、本発明の第４培養方法の作用効果が奏される理由については、例えば図１に示すような原理が働いているためと予想される。但し、この予想は本発明の理解を補助するためのものであって、本発明を不必要に束縛するものではない。仮に図１に示すものとは異なる原理や作用機序に基づいて本発明の作用効果の一部または全部が奏されていることが事後的に判明したとしても、現実に確認することのできる本発明の作用効果やそのための本発明の構成要件が、以下の図１に基づく説明によって否定されるものではない。
【００５７】
図１［Ａ］は、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞（例えば髄核幹／前駆細胞）を含む細胞集団を、二次元培養（単層静置培養）により増殖および分化させる場合の、培養細胞の様子を表す。培養容器（フラスコ等）の培養表面は、あらかじめ細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含むコーティング剤を塗布するなど、細胞が付着できるような表面処理がなされている場合がある。幹／前駆細胞は培養容器の培養表面に付着し、その培養面上で伸展、増殖しながら分化する。このような二次元培養では、培養面上に塗布されていたＥＣＭまたは培養細胞から分泌されたＥＣＭと、培養細胞表面に発現している結合タンパク質（インテグリン等）との相互作用により、やがてＥＣＭの産生および分泌を停止する細胞内シグナル伝達が発生する。例えば、髄核由来細胞集団を二次元培養する場合は、当該細胞集団にもともと含まれている成熟髄核細胞と共に、当該細胞集団に含まれている髄核幹／前駆細胞が増殖しながら分化して生成した成熟髄核細胞から、II型コラーゲン、プロテオグリカン等のＥＣＭが盛んに分泌される。しかしながら、培養期間の経過と共に、やがて上述したような細胞内シグナル伝達によりII型コラーゲン等の産生および分泌が停止し（代わってI型コラーゲンの産生および分泌が増加し）、線維芽細胞様の表現型を示すようになるなど、成熟髄核細胞の脱分化が引き起こされる。したがって、一般的な二次元培養では、細胞集団中の細胞数を増加させことと、特定の形質を保持した（脱分化していない）細胞の割合を高めることの両立は難しいと考えられる。なお、本発明の第３培養方法においては、好ましくはＴｉｅ２の発現が増強されているＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を用いることによって、二次元培養でもII型コラーゲン等を発現する髄核細胞を一定の割合で含む細胞集団を比較的容易に調製することが可能となっている。
【００５８】
図１［Ｂ］および［Ｃ］は、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞（例えば髄核幹／前駆細胞）を含む細胞集団を、メチルセルロース含有培地（細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解剤は添加されていない）または低吸着性培養容器を用いた培養により増殖および分化させる場合の、培養細胞の様子を表す。前記図１［Ａ］の二次元培養と異なり、図１［Ｂ］に示すような培養では、培養容器の培養表面上のＥＣＭ等と培養細胞との相互作用は起きず、その相互作用によるＥＣＭの産生および分泌を停止する細胞内シグナル伝達も発生しない。したがって、培養の初期においては、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞はＥＣＭを産生および分泌しながら増殖し、やがて球状コロニーを形成する。しかしながら、形成された球状コロニーにおいて、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞またはそれらから分化した細胞（例えば髄核細胞）同士は互いに、分泌されたＥＣＭを介して接触することになる。そのため、図１［Ｃ］に示すように、培養期間の経過と共に、ＥＣＭと培養細胞との相互作用が起こるようになり、その相互作用によってＥＣＭ産生停止シグナルが発生し、図１［Ａ］と同様の脱分化が引き起こされる。したがって、図１［Ｂ］および［Ｃ］に示すような培養方法では、球状コロニーとして回収される細胞集団において、所定のＥＣＭ（例えばII型コラーゲン）の発現が陽性である細胞の比率を一定水準以上に高めることは困難である。
【００５９】
図１［Ｄ］は、本発明の第４培養方法に従って、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解剤が添加された培地（メチルセルロース等は含有していない）を用いた培養により増殖および分化させる場合の、Ｔｉｅ２陽性培養細胞の様子を表す。このような培養方法においても、図１［Ｂ］と同様に、幹／前駆細胞またはそれらから分化した細胞同士からＥＣＭは分泌される。しかしながら、培地に添加されているＥＣＭ分解剤により、細胞外に分泌されたＥＣＭは絶えず分解されるので、球状コロニーは形成されず、低吸着性の培養容器を用いなくても培養表面に細胞は付着しない。また、本発明の第３・第４培養方法において、図１［Ａ］の二次元培養と同様に、培養容器の培養表面にあらかじめＥＣＭを含むコーティング剤が塗布されていたとしても、その培養表面への細胞の付着は弱いものに留まる。したがって、ＥＣＭと培養細胞との相互作用に起因するＥＣＭ産生停止シグナルは抑制され、図１［Ａ］や図１［Ｂ］および［Ｃ］のときのような脱分化は起こりにくくなるため、所定のＥＣＭ（例えばII型コラーゲン）の発現が陽性である細胞の比率が従来技術より向上した細胞集団を調製できるようになる。
【００６０】
なお、培地中のＥＣＭ分解剤によって細胞外に分泌されたＥＣＭは分解されるが、細胞内のＥＣＭは分解されず蓄積が進む。そのため、本発明の第４培養方法を分化培養段階の工程において実施した後、得られた細胞集団を培地中から回収して細胞製剤を製造すれば、その細胞製剤が投与された組織において、細胞内に蓄積されていたＥＣＭは速やかに細胞外へ分泌されて細胞集団の生存に適した環境を創出することができ、その後の投与された細胞からのＥＣＭの産生および分泌（すなわち細胞製剤による治療効果）を促進できるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、通常の二次元培養（単層静置培養）、従来の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解剤を含まない培地を用いた浮遊培養、および本発明の第４培養方法による、ＥＣＭ分解剤を含む培地を用いた浮遊培養のそれぞれにおける、ＥＣＭの産生または分解と培養細胞との相互作用を模式的に表した図と、それぞれの培養細胞の写真を示している。Ａ（通常の二次元培養）：付着分子を介して髄核（ＮＰ）細胞が培養フラスコの培養面に付着することで、ＥＣＭ産生停止シグナルが伝達される。Ｂ（低吸着性フラスコ、メチルセルロース培地等による浮遊培養）：フラスコ培養面接触がなく、ＥＣＭ産生停止シグナルは伝達されない（×印おび点線の矢印）。Ｃ（培地中に酵素なし）：自ら産生したＥＣＭが培養面と同等の作用を示し（矢印）、ＥＣＭ産生停止シグナルが細胞内へと伝達される。Ｄ（培地中に酵素あり）：自ら産生した細胞外ＥＣＭが分解されＥＣＭ産生停止シグナルは細胞内へ伝達されないが（×印おび点線の矢印）、ＥＣＭの細胞内への蓄積は起きている。
【図２】図２は、試験例１（増幅培養段階：第１培養工程）における、Ｔｉｅ２陽性率の結果を表すグラフである。
【図３】図３は、試験例１（増幅培養段階：第１培養工程）における、Ｔｉｅ２平均発光強度（ＭＦＩ）の結果を表すグラフである。
【図４】図４は、試験例２（増幅培養段階（２段階）：第１・第２培養工程＋追加工程）における、Ｔｉｅ２陽性率の結果を表すグラフである。
【図５】図５は、試験例２（増幅培養段階（２段階）：第１・第２培養工程＋追加工程）における、髄核組織１ｇあたりから産生されるＴｉｅ２陽性細胞数の結果を表すグラフである。
【図６】図６は、試験例３（増幅培養段階（２段階）：第１・第２培養工程＋追加工程→分化培養段階：第３培養工程）における、II型コラーゲン（Ｃｏｌ２）陽性率の結果を表すグラフである。
【図７】図７は、試験例３（増幅培養段階（２段階）：第１・第２培養工程＋追加工程→分化培養段階：第３培養工程）における、髄核組織１ｇあたりから産生されるII型コラーゲン（Ｃｏｌ２）陽性細胞数の結果を表すグラフである。
【図８】図８は、試験例４（増幅培養段階（２段階）：第１・第２培養工程＋追加工程→分化培養段階：第３・第４培養工程）における、プロテオグリカン（ＰＧ）陽性率の結果を表すグラフである。
【図９】図９は、試験例４（増幅培養段階（２段階）：第１・第２培養工程＋追加工程→分化培養段階：第３・第４培養工程）における、II型コラーゲン（Ｃｏｌ２）陽性率の結果を表すグラフである。
【図１０】図１０は、試験例５（増幅培養段階（２段階）：第１・第２培養工程＋追加工程→分化培養段階：第３・第４培養工程  その２）における、プロテオグリカン（ＰＧ）およびII型コラーゲン（Ｃｏｌ２）それぞれの陽性率の結果を表すグラフである。ＧＥＬ：ゼラチン、Ｃｏｌ１：I型コラーゲン、Ｃｏｌ４：IV型コラーゲン、ＦＮ：フィブロネクチン、ＰＬＬ：ポリ−Ｌ−リジン（図１１も同様）。
【図１１】図１１は、試験例６（増幅培養段階（２段階）：第１・第２培養工程＋追加工程→分化培養段階：第３・第４培養工程  その３）における、プロテオグリカン（ＰＧ）およびII型コラーゲン（Ｃｏｌ２）それぞれの陽性率の結果を表すグラフである。
【図１２】図１２は、試験例５−１２における細胞集団の光学顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
−用語−
「幹細胞」は、自己複製能および分化能（全能性（totipotent）、多能性（pluripotent）、複能性（multipotent）または単能性（unipotent））を有する細胞を指す用語である。「前駆細胞」は、最終的にはすべて終末分化した細胞になるため厳密な意味での自己複製能を有さないが、比較的活発に増殖しながら所定の細胞へと分化してゆく分化能を有する細胞を指す用語である。当業者によって一般的に「幹細胞」または「前駆細胞」を含む名称で理解されている（特定されている）細胞は、本明細書における「幹細胞」または「前駆細胞」に該当する。
【００６３】
本明細書において、「幹細胞および／または前駆細胞」は、幹細胞、前駆細胞またはその両方を包含する表記であり、「幹／前駆細胞」と表記することもある。また、本明細書において、幹細胞および／または前駆細胞を含む細胞集団を「幹／前駆細胞集団」と表記し、幹細胞および／または前駆細胞から分化し成熟した細胞（終末分化細胞）を含む細胞集団を「成熟細胞集団」と表記することがある。
【００６４】
「幹細胞」および「前駆細胞」は、一般的には、１種または２種以上の特定の遺伝子（マーカー遺伝子、細胞マーカー）の発現が陽性または陰性であることをもって、他の細胞と区別することができる。すなわち、前述したような自己複製能および／または分化能を有する「幹細胞」および「前駆細胞」は、それぞれ特定のマーカー遺伝子の発現が陽性または陰性である細胞を指す用語として定義することもできる。
【００６５】
マーカー遺伝子（細胞マーカー）の発現が「陽性」であるか「陰性」であるかは、一般的な手法にしたがって、その遺伝子（ゲノム）から転写されるｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の発現量を定量的または定性的に測定し、その発現量が一定水準以上である（または一定水準を超える）場合に陽性、一定水準以下である（または一定水準に満たない）場合に陰性、と判定することができる。タンパク質の発現量は、例えば、フローサイトメトリー、免疫染色、ＥＬＩＳＡといった、当該タンパク質に特異的な抗体および標識剤などを用いた免疫学的アッセイにより、定量的または定性的に測定することができる。なお、Ｔｉｅ２タンパク質は細胞表面に発現するタンパク質のであり、Ｃｏｌ２は細胞内部に発現するタンパク質であり、それぞれ細胞表面および細胞内部に存在するタンパク質を検出する手法（免疫蛍光染色法等）として適切なものを用いればよい。ｍＲＮＡの発現量は、例えばＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、バイオチップといった、当該ｍＲＮＡに特異的な（相補的な）核酸および標識剤や核酸増幅方法（手段）などを用いたアッセイにより、定量的または定性的に測定することができる。細胞集団中の、所定のマーカー遺伝子（細胞マーカー）の発現が陽性または陰性である細胞の比率（陽性率または陰性率）は、細胞集団中の全細胞の数と、上記のような方法により陽性または陰性であると判定された細胞の数をそれぞれ、上記のような各種の方法により、例えばフローサイトメトリーにおける計測により、算出することができる。
【００６６】
本明細書において、「Ｔｉｅ２の発現が陽性である幹細胞および／または前駆細胞」すなわち「Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞」は、細胞マーカーの一つとして知られているＴｉｅ２（tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain-2）の発現が、例えばフローサイトメトリーによりタンパク質としての発現が、陽性であると判定される、幹細胞および／または前駆細胞としての形質を備える細胞を指す。本発明における代表的なＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞は、「椎間板の髄核組織に由来する」Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞、すなわち椎間板の髄核中に存在する（髄核から採取可能な）Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞またはそのＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を継代して得られるＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞であり、以下に述べる「髄核幹／前駆細胞」に相当する細胞である。
【００６７】
本明細書において、「目的細胞」は、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞から所定の分化誘導によって得られる、用途に応じた機能性を有する細胞、より具体的には、所定の遺伝子（細胞マーカー）の発現が、例えばフローサイトメトリーによりタンパク質としての発現が、陽性または陰性であると判定される細胞を指す。本発明における代表的な目的細胞は、以下に述べる「髄核細胞」のうち、Ｃｏｌ２、アグリカン等の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の遺伝子の発現が陽性であるものである。
【００６８】
本発明において「髄核細胞」は、椎間板（髄核）中の細胞集団の多数を占める、成熟して終末分化に達した細胞、またはそれと同等の形質を有する培養細胞を指す。髄核細胞は、具体的には、マーカー遺伝子として、Ｔｉｅ２およびＧＤ２が陰性である（さらに通常はＣＤ２４が陽性である）、また細胞外マトリックスのうち少なくともII型コラーゲンが陽性である（さらに通常はプロテオグリカン（アグリカン）も陽性である）細胞として定義することができる。例えば、フローサイトメトリーにより、タンパク質（細胞マーカー）として、Ｔｉｅ２およびＧＤ２が陰性（かつＣＤ２４が陽性）であり、II型コラーゲンが陽性（かつアグリカンも陽性）であると判定される細胞は、本発明における髄核細胞に該当する。なお、II型コラーゲン、アグリカン等の細胞外マトリックスについては、それらのタンパク質の産生量をフローサイトメトリーにより測定すると共に、それらのｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲ等により測定してもよい。
【００６９】
本発明において「髄核幹／前駆細胞」は、椎間板の髄核組織中の細胞集団の一部を占める、少なくとも髄核細胞への分化能を有する前駆細胞（髄核前駆細胞）および当該前駆細胞への分化能と自己複製能とを有する幹細胞（髄核幹細胞）、またはそれと同等の形質を有する培養細胞をまとめて指す。髄核幹／前駆細胞は、具体的には、マーカー遺伝子として、Ｔｉｅ２および／またはＧＤ２が陽性である細胞として定義することができる。例えば、フローサイトメトリーにより、タンパク質（細胞マーカー）として、Ｔｉｅ２が陽性かつＧＤ２が陰性、Ｔｉｅ２が陽性かつＧＤ２が陽性、またはＴｉｅ２が陰性かつＧＤ２が陽性、のいずれかであると判定される細胞は、本発明における髄核幹／前駆細胞に該当する。
【００７０】
なお、前掲特許文献２では、髄核由来細胞の細胞マーカーとしてＴｉｅ２およびＧＤ２の発現状態に基づき、Ｔｉｅ２が陽性である細胞を「椎間板髄核幹細胞」（このうち、ＧＤ２が陰性である細胞は休眠状態にあるもの、ＧＤ２が陽性である細胞は活性状態であるもの）、Ｔｉｅ２が陰性かつＧＤ２が陽性である細胞を「椎間板前駆細胞」、Ｔｉｅ２が陰性かつＧＤ２が陰性である細胞を「分化を終えた、成熟した椎間板髄核細胞」に分類している（段落００２４、００２５、００３２）。また、特許文献２では、髄核細胞の分化ヒエラルキーにおいて現れる細胞について、（i）Ｔｉｅ２陽性かつＧＤ２陰性（さらにＣＤ２４陰性、ＣＤ４４陽性／陰性、ＣＤ２７１陽性、Ｆｌｔ１陽性）である細胞、（ii）Ｔｉｅ２陽性かつＧＤ２陽性（さらにＣＤ２４陰性、ＣＤ４４陽性、ＣＤ２７１陽性、Ｆｌｔ１陽性）である細胞、（iii）Ｔｉｅ２陰性かつＧＤ２陽性（さらにＣＤ２４陰性、ＣＤ４４陽性、ＣＤ２７１陽性／陰性、Ｆｌｔ１陽性／陰性）である細胞、（iv）Ｔｉｅ２陰性かつＧＤ２陽性（さらにＣＤ２４陽性、ＣＤ４４陽性、ＣＤ２７１陰性、Ｆｌｔ１陰性）である細胞、（v）Ｔｉｅ２陰性かつＧＤ２陰性（さらにＣＤ２４陽性、ＣＤ４４陽性、ＣＤ２７１陰性、Ｆｌｔ１陰性）である細胞、に分類しており、上記（i）〜（iii）に対して「椎間板髄核幹／前駆細胞」（NP stem/progenitor cells）、上記（iii）〜（v）に対して「髄核コミット細胞」（NP committed cells）という表記を用いている（図７−２参照）。表記の仕方は相違しているが、特許文献２の「椎間板髄核幹細胞」および「椎間板髄核前駆細胞」、すなわち上記（i）〜（iV）の細胞が本発明における「髄核幹／前駆細胞」に相当し、特許文献２の「分化を終えた、成熟した椎間板髄核細胞」、すなわち上記（v）の細胞が本発明における「髄核成熟細胞」に相当する。必要に応じて、本発明における細胞を、特許文献２に記載された定義（特に、ＣＤ２４など、Ｔｉｅ２およびＧＤ２以外の１種または２種以上の細胞マーカーについての陽性か陰性かの定義）に従う細胞に置き換えることが可能である。
【００７１】
本発明において「球状コロニー」は、幹細胞および／または前駆細胞を含み、さらにそれらから分化した細胞を含んでいてもよい、球状の細胞集合体である。「球状コロニー」は、当業者から一般的に「スフェアー」、「スフェロイド」などと呼ばれることもある物体であり、前掲特許文献２における「円板球」（discosphere）または「浮遊性球構造体」（free floating circular-spherical structure）も「球状コロニー」に相当する物体である。
【００７２】
本発明において「Ｔｉｅ２の発現が増強されている」（Ｔｉｅ２発現増強）とは、個々の幹／前駆細胞において、Ｔｉｅ２遺伝子の発現が増強されている、すなわち通常よりも発現が亢進し、ｍＲＮＡまたはタンパク質としての発現量が増加していることをいう。通常であればＴｉｅ２遺伝子の発現がほとんど消失してしまうような条件下であっても、発現が消失せず一定水準の発現量を保つこと、つまりＴｉｅ２の発現が維持されることも、「Ｔｉｅ２の発現が増強されている」ことに該当する。また、個々の幹／前駆細胞においてそのようにＴｉｅ２の発現が増強された結果、細胞集団中における、Ｔｉｅ２のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が陽性であると判定される細胞数が増加すること、すなわち細胞集団中のＴｉｅ２陽性細胞の比率が通常よりも高くなることも、「Ｔｉｅ２発現増強」の表れであると解することができる。
【００７３】
より具体的には、例えば、あらかじめＴｉｅ２発現増強処理を施した細胞集団（Ｔｉｅ２発現増強処理群）と施していない細胞集団（コントロール群）に対して、細胞表面のＴｉｅ２タンパク質を蛍光標識する処理を施し、フローサイトメトリーでの測定により、コントロール群に比べてＴｉｅ２発現増強処理群の方が、所定の水準より蛍光強度が高く発現が陽性であると判定される細胞の比率が高い、および／または細胞１個あたりの平均蛍光強度が高い場合は、Ｔｉｅ２発現増強処理群の細胞集団（に含まれるＴｉｅ２発現細胞）は、Ｔｉｅ２の発現が増強されている（換言すれば、Ｔｉｅ２発現増強処理は所定の役割を果たしている）といえる。さらに、形態学的な観察においては、Ｔｉｅ２の発現が増強されている細胞は紡錘形をしている（そうでない細胞は球形に近い）ことを持って区別することもできる。
【００７４】
本発明において、上記のような「Ｔｉｅ２発現増強」の作用効果を奏する剤を本発明では「Ｔｉｅ２発現増強剤」と呼ぶ。なお、一部の増殖因子（ＦＧＦ２等）は、Ｔｉｅ２発現増強作用を有し、「Ｔｉｅ２発現増強剤」の一種に該当するともいえるので、そのような増殖因子を除く場合は「増殖因子以外のＴｉｅ２活性化発現増強剤」と呼ぶ。
【００７５】
本発明において、第１培養方法および／または第２培養方法を実施することは、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団に対して「Ｔｉｅ２発現増強処理」を施すことに該当する。
【００７６】
−培養方法−
本発明による、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の第１〜第４培養方法は次の通りである：
第１培養方法：消化処理されていない組織中に存在する状態で、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する方法；
第２培養方法：少なくとも１種の、増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤が添加された培地中で、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する方法；
第３培養方法：細胞の付着性を高める処理がなされた培養表面を有する培養容器で、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する方法；
第４培養方法：細胞外マトリックス分解剤が添加された培地中で、球状コロニーの形成を抑制しながら、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する方法。
【００７７】
本発明の第１〜第４培養方法は、単独で実施してもよいし、複数を組み合わせて、順次または同時に実施してもよい。第１〜第４培養方法から選ばれる複数の培養方法を組み合わせて同時に実施するとは、その選ばれた培養方法を融合すること、つまりその選ばれた培養方法に係る技術的事項を全て満たす培養方法を実施することを意味する。例えば、第１培養方法および第２培養方法は、組み合わせて順次または同時に（融合して）実施することができる（これらを融合した方法を「第１・第２培養方法」と称することがある。）。第３培養方法および第４培養方法も、組み合わせて順次または同時に（融合して）実施することができる（これらを融合した方法を「第３・第４培養方法」と称することがある。）。
【００７８】
本発明の第１〜第４培養方法を実施する目的は特に限定されるものではない。第１〜第４培養方法はそれぞれ、本発明の増幅培養段階（に相当する段階）、分化培養段階（に相当する段階）、その他の段階のいずれにおいて実施することも可能である。
【００７９】
本明細書中、第１〜第４培養方法に関する記載（さらにそれらを実施する第１〜第４培養工程）は、特段の断り書きがない場合、それぞれを単独の方法（工程）として実施する場合だけでなく、他の方法（工程）と融合した方法（工程）として実施する場合の記載として、適宜読み替えることができる。
【００８０】
本発明の第４培養方法の適用対象とする細胞集団に含まれるＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞、および当該幹／前駆細胞から分化した細胞は、細胞外マトリックス分解剤を含有しない通常の培地中では、細胞外に分泌された細胞外マトリックスにより互いに結合して球状コロニー（スフェロイド）を形成する細胞であり、本発明に従って培地に細胞外マトリックス分解剤を添加した場合は、球状コロニー（スフェロイド）の形成が抑止されるという作用効果が奏される細胞であればよく、細胞の種類は特に限定されるものではない。
【００８１】
本発明の代表的な実施形態において、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞から分化した細胞は、一般的な細胞よりも多くの細胞外マトリックスを産生し分泌する細胞、例えば椎間板髄核組織において細胞外マトリックスを産生し分泌する役目を担っている、髄核細胞である。成熟した髄核細胞は、細胞外マトリックスとして、少なくともII型コラーゲンを発現し、その他にもプロテオグリカン（アグリカン）などの細胞外マトリックスを発現する。本発明の好ましい実施形態では、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞から、II型コラーゲン、プロテオグリカン（アグリカン）等の細胞外マトリックスを発現する細胞、特にII型コラーゲンの、ｍＲＮＡとしてだけではなく、タンパク質としての発現量（産生量）に優れた、機能的な髄核細胞を分化させるようにする。
【００８２】
−調製方法（培養工程）−
本発明による、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団から、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞から分化した目的細胞を含む細胞集団への調製方法は、次のような増幅培養段階および／または分化培養段階、好ましくは増幅培養段階および分化培養段階の両方を（増幅培養段階が先、分化培養段階が後の順番で）含む：
増幅培養段階：Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞のＴｉｅ２の発現を増強するとともに、細胞集団中のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を増幅するための培養段階；
分化培養段階：Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を目的細胞へと分化誘導するための培養段階。
【００８３】
・増幅培養段階に関する工程
本発明の好ましい実施形態において、第１培養方法および第２培養方法は、増幅培養段階の工程において実施される。第１培養方法および第２培養方法は、いずれか一方のみを実施してもよいし、両方を実施してもよい。第１培養方法および第２培養方法の両方を実施する場合、増幅培養段階において、第１培養方法を実施する工程（本明細書において「第１培養工程」と称する。）および第２培養方法を実施する工程（本明細書において「第２培養工程」と称する。）は、順次行われる別個の工程としてもよいし（第１培養工程が先、第２培養工程が後になる。）、２つの培養方法が同時に行われる（それらが融合した第１・第２培養方法を実施する）単一の工程（本明細書において「第１・第２培養工程」と称する。）とする、つまりＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を、消化処理されていない組織中に存在する状態で、かつＴｉｅ２発現増強剤が添加された培地中で培養する工程としてもよい。
【００８４】
「増幅培養段階の工程」は、所定の条件に従った培養により、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を増幅することを主な目的とし、そのための作用効果が（他の作用効果よりも相対的に強く）奏される工程を意味する。つまり、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞の細胞数および／または比率が、培養前細胞集団よりも培養後細胞集団の方が高くなっていれば、その培養工程は「増幅培養段階の工程」ということができ、その限度内でＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞から他の細胞（目的細胞）への分化が起きることは許容される。
【００８５】
本発明では、個々のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞（例えば髄核幹／前駆細胞）におけるＴｉｅ２の発現を増強する（Ｔｉｅ２が発現した状態を維持することを含む。）とともに、細胞集団に含まれるＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞の細胞数および／または比率を向上させるなどの作用効果を相乗効果的に増強できることから、増幅培養段階の工程として第１・第２培養方法を実施する（つまり第１・第２培養工程を実施する）ことが特に好ましい。
【００８６】
・分化培養段階に関する工程
本発明の好ましい実施形態において、第３培養方法および第４培養方法は、分化培養段階の工程において実施される。第３培養方法および第４培養方法は、いずれか一方のみを実施してもよいし、両方を実施してもよい。第３培養方法および第４培養方法の両方を実施する場合、分化培養段階において、第３培養方法を実施する工程（本明細書において「第３培養工程」と称する。）および第４培養工程を実施する工程（本明細書において「第４培養工程」と称する。）は、順次行われる別個の工程としてもよいし、２つの培養方法が同時に行われる（それらが融合した第３・第４培養方法を実施する）単一の工程（本明細書において「第３第４培養工程」と称する。）とする、つまりＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を、細胞の付着性を高める処理がなされた培養表面を有する培養容器で、かつ細胞外マトリックス分解剤が添加された培地中で、球状コロニーの形成を抑制しながら培養する工程としてもよい。
【００８７】
「分化培養段階の工程」は、所定の条件に従った培養により、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を所定の細胞に分化させることを主な目的とし、そのための作用効果が（他の作用効果よりも相対的に強く）奏される工程を意味する。つまり、目的細胞の細胞数および／または比率が、培養前細胞集団よりも培養後細胞集団の方が高くなっていれば、その培養工程は「分化培養段階の工程」ということができる。
【００８８】
なお、前述したように、特許文献１に記載されている、球状コロニー（スフェロイド、円板球、浮遊性球構造体）を解離させるためにコラゲナーゼが添加された培地中で一時的に処理する工程は、上記のように規定された本発明の第４培養方法または分化培養段階の工程としての第４培養工程には該当しない。また、採取された組織中に含まれている細胞集団を単離するためにコラゲナーゼ等で処理する方法（工程）や、一般的な二次元培養において増殖した細胞を継代培養するためにトリプシンで処理して培養表面から細胞を解離させる方法（工程）も、上記のように規定された本発明の第４培養方法または分化培養段階の工程としての第４培養工程には該当しない。
【００８９】
本発明では、細胞集団に含まれるＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞（例えば髄核幹／前駆細胞）から分化した所定の機能性を有する細胞（例えばＣｏｌ２陽性髄核細胞）の細胞数および／または比率を向上させる一方、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞の細胞数および／または比率も一定水準を保つなどの作用効果を相乗効果的に増強できることから、分化培養段階の工程として第３・第４培養方法を実施する（つまり第３・第４培養工程を実施する）ことが特に好ましい。
【００９０】
増幅培養段階は、必要に応じて、Ｔｉｅ陽性幹／前駆細胞を増幅するという当該工程の目的に合致した、第１培養工程および／または第２培養工程以外の工程をさらに含んでいてもよい。そのような工程としては、例えば、Ｔｉｅ２発現増強剤としてＴｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子のみが添加された培地中でＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する工程（本明細書において「追加増幅培養工程」と称する。）が挙げられる。追加増幅培養工程におけるＴｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子としては、例えば、ＦＧＦおよび／またはＥＧＦが挙げられる。追加増幅培養工程は、第１培養工程および／または第２培養工程、特に第１培養工程または第１・第２培養工程の後で行うことが好ましい。また追加増幅工程においては、第１培養方法を実施しないこと、すなわちＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団は、消化処理されていない組織中に存在する状態ではなく、消化処理により細胞から分離された状態とすることが適切である。第１培養工程または第１・第２培養工程において実施される本発明の第１培養方法では、消化処理されていない組織中に存在する状態でＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養するが、ある程度の水準に達すると、組織中に存在していることの影響によると考えられるが、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞の増幅が抑えられる（培養期間を延ばしてもＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞が増幅されなくなる）ようになる。そこで、第１培養工程または第１・第２培養工程の後に、組織を消化処理し、分離した細胞集団を回収して、追加増幅工程を行うことにより、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞をより一層増幅することができる。
【００９１】
＜細胞集団＞
本発明の各培養方法または各培養工程に供されるＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団（本明細書において「培養前細胞集団」と総称する。）において、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞と、それ以外の細胞（Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞から分化した細胞等）それぞれの比率および／または数は基本的に任意であり、またＴｉｅ２陽性幹細胞と、Ｔｉｅ２陽性前駆細胞の比率も基本的に任意である。培養前細胞集団の組成は、発明の実施形態に応じて、各培養方法または各培養工程における作用効果などを考慮しながら、適宜調節することができる。
【００９２】
培養前細胞集団は、第１培養方法または第１培養工程に供される場合を除いて、常法に従って調製または準備することができる。例えば、体内から採取された椎間板髄核組織に含まれている細胞集団を培養前細胞集団として用いる場合は、まずはさみ等の器具を使って髄核組織を適切なサイズに細切し（例：数ミリメートル角程度のミンチにした後）、続いてコラゲナーゼ等のタンパク質分解酵素で処理して細胞を分散させ、必要に応じて濾過、遠心分離、洗浄等の処理を行うことで、髄核組織に含まれていた細胞集団を単離し回収することができる。このようにして得られる細胞集団を、第１培養方法または第１培養工程以外の培養前細胞集団として利用することができる。
【００９３】
一方で、本発明の第１培養方法または第１培養工程では、上記のような手順のうち、髄核組織を細切する段階で留め（タンパク質分解酵素による処理は行わず）、その細切した髄核組織に含まれた状態の細胞集団を、培養前細胞集団として利用する。
【００９４】
上記のように調製された、組織から分離された細胞集団、または組織中に含まれた状態の細胞集団（細胞集団を含んだ状態の組織）は、次の培養方法または培養工程に供されるまで、常法に従って凍結保存することができる。凍結保存された細胞集団または組織は、次の培養方法または培養工程を始める際に、常法に従って解凍をすることができる。凍結保存および解凍の際には、細胞集団または組織にとって好ましい処理を組み合わせてもよい。例えば、凍結保存の際に凍結保護剤（ＤＭＳＯ等）を添加してもよく、その場合は解凍の際に適切な条件で凍結保護剤を除去すればよい。
【００９５】
本発明の各培養方法または各培養工程により得られるＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団（本明細書において「培養後細胞集団」と総称する。）において、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞と、それ以外の細胞（Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞から分化した細胞等）ぞれぞれの比率および／または数は基本的に任意であり、またＴｉｅ２陽性幹細胞と、Ｔｉｅ２陽性前駆細胞の比率も基本的に任意である。培養後細胞集団の組成は、発明の実施形態に応じて、各培養方法または各培養工程によって得られる細胞集団の用途などを考慮しながら、適宜調節することができる。
【００９６】
培養後細胞集団は、常法に従って培地中から回収し、次の培養方法または培養工程に供する、あるいは細胞製剤の調製などその他の方法または工程に供することができる。
【００９７】
本発明の各培養方法または各培養工程の途中のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団（本明細書において「培養中細胞集団」と総称する。）において、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞と、それ以外の細胞（Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞から分化した細胞等）の割合は基本的に任意であり、またＴｉｅ２陽性幹細胞と、Ｔｉｅ２陽性前駆細胞の割合も基本的に任意である。培養中細胞集団の組成は、培養前細胞集団から培養後細胞集団へ移行する途中の組成であり、例えば培養中細胞集団のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞の比率（本明細書において「Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞率」と称する。）は、通常は、培養前細胞集団のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞率と培養後細胞集団のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞率によって挟まれる範囲に含まれる数値であるが、一時的に当該範囲から外れる数値となることも許容される。培養中細胞集団の組成は、発明の実施形態に応じて、また各培養方法または各培養工程における日数や継代の回数などによって変動する。
【００９８】
上記の各細胞集団が由来する「ヒトまたはその他の動物」（ドナー）は、本発明のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞の培養方法によって最終的に得られる細胞集団の用途、または当該方法に含まれる各培養方法または各培養工程によって得られる細胞集団の用途などを考慮して選択することができる。本発明の典型的な実施形態において、所定の疾患、症状等の予防用または治療用の細胞製剤を製造するための細胞集団を調製する場合は、「ヒトまたはその他の動物」は、その細胞製剤の投与対象（レシピエント）と同種の生物であり、好ましくはヒトである。
【００９９】
・増幅培養段階に関する細胞集団
本発明において、第１培養方法および／または第２培養方法に供される細胞集団、あるいは増幅培養段階における第１培養工程および／または第２培養工程に供される細胞集団（本明細書において「増幅培養前細胞集団」と総称する。）は、典型的には、ヒトまたはその他の動物の体内から採取された組織（椎間板）に含まれている細胞集団（初代培養細胞集団）またはその初代培養細胞集団を継代して得られた細胞集団（継代培養細胞集団）である。
【０１００】
増幅培養前細胞集団として、ヒトから採取された椎間板に含まれている細胞集団を用いる場合、一般的にＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞率が高く、ニッチが良好である傾向にある、１０歳代または２０歳代のヒトから採取された椎間板に含まれている細胞集団であることが好ましい。また、増幅培養前細胞集団は、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞率がなるべく高い、例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上である細胞集団であることが好ましい。
【０１０１】
なお、増幅培養前細胞集団は、実施形態によっては、ヒトまたはその他の動物の体内から採取された組織中に含まれている細胞集団ではない細胞集団、例えば、ヒトまたはその他の動物の細胞を用いて作製したｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞のような万能性または多能性を有する細胞を分化誘導することによって得られたＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団であってもよい。
【０１０２】
本発明において、第１培養方法および／または第２培養方法によって得られる細胞集団、あるいは増幅培養段階における第１培養工程および／または第２培養工程によって得られる細胞集団（本明細書において「増幅培養後細胞集団」と総称する。）の用途は特に限定されるものではなく、得られる細胞集団の組成等は用途に応じて適宜調節することができる。
【０１０３】
本発明の典型的な実施形態において、増幅培養後細胞集団は、第３培養方法および／または第４培養方法に供される細胞集団、あるいは分化培養段階における第３培養工程および／または第４培養工程に供される細胞集団として利用される。このような実施形態（用途）における増幅培養後細胞集団は、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞の比率および／または細胞数がなるべく高いことが好ましい。増幅培養後細胞集団におけるＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞率は、増幅培養前細胞集団やそれが由来する髄核組織の個体差などによって変動するため一概に言えるものではないが、例えば５％以上、好ましくは７％以上、９％以上、１１％以上、１３％以上、１５％以上である。増幅培養後細胞集団におけるＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞数は、増幅培養前細胞集団やそれが由来する髄核組織の個体差などによって変動するため一概に言えるものではないが、増幅培養前細胞集団における細胞数と比較して、例えば５倍以上、好ましくは１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、２５倍以上、３０倍以上である。
【０１０４】
・分化培養段階に関する細胞集団
本発明において、第３培養方法および／または第４培養方法に供される細胞集団、あるいは分化培養段階における第３培養工程および／または第４培養工程に供される細胞集団（本明細書において「分化培養前細胞集団」と称する。）は、あらかじめＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞が富化された細胞集団であることが好ましい。分化培養段階前細胞集団におけるＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞率は、増幅培養前もしくは増幅培養後細胞集団やそれが由来する髄核組織の個体差などによって変動するため一概に言えるものではないが、例えば５％以上、好ましくは７％以上、９％以上、１１％以上、１３％以上、１５％以上である。
【０１０５】
本発明の典型的な実施形態において、分化培養前細胞集団は、本発明の増幅培養段階によって得られた細胞集団（増幅培養後細胞集団）、例えば、増幅されたＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を、分化培養段階の実施形態（培養容器の種類やサイズ等）に応じて適当な細胞数となるよう分割した細胞集団である。本発明の増幅培養段階によって得られた細胞集団は、前述したような比率および／または細胞数のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む上、そのＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞のＴｉｅ２の発現が増強されている（Ｔｉｅ２の発現が維持されている）ため、分化培養段階における作用効果が増強されるという観点からも、分化培養前細胞集団として好ましい。
【０１０６】
なお、分化培養前細胞集団は、実施形態によっては、本発明の増幅培養段階（第１培養工程および／または第２培養工程）によって得られたものではない細胞集団、例えば、ヒトまたはその他の動物の体内から採取された組織中に含まれている細胞集団や、ヒトまたはその他の動物の細胞を用いて作製したｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞のような万能性または多能性を有する細胞を分化誘導することによって（Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を経て）得られた目的細胞を含む細胞集団であってもよい。
【０１０７】
本発明において、第３培養方法および／または第４培養方法によって得られる細胞集団、あるいは分化培養段階における第３培養工程および／または第４培養工程によって得られる細胞集団（本明細書において「分化培養後細胞集団」と総称する。）の用途は特に限定されるものではなく、得られる細胞集団の組成等は用途に応じて適宜調節することができる。例えば、移植用の細胞製剤を製造するために使用される細胞集団については、移植による治療または予防効果を奏する上で有用な機能性を有する目的細胞（例えばIIコラーゲンを産生する髄核細胞：Ｃｏｌ２陽性髄核細胞）をなるべく多く含むと同時に、そのような目的細胞の産生能が残されているＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞（例えば髄核幹／前駆細胞）も多少含む細胞集団であることが好ましい。
【０１０８】
分化培養後細胞集団におけるＣｏｌ２陽性（髄核）細胞率は、分化培養前細胞集団やそれが由来する髄核組織の個体差などによって変動するため一概に言えるものではないが、例えば５％以上、好ましくは１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上である。
【０１０９】
分化培養後細胞集団におけるＴｉｅ２陽性（髄核）幹／前駆細胞率は、分化培養前細胞集団やそれが由来する髄核組織の個体差などによって変動するため一概に言えるものではないが、例えば１％以上、好ましくは２％以上、４％以上、６％以上、８％以上、１０％以上である。
【０１１０】
なお、分化培養工程においても細胞集団に含まれる細胞数は通常増加する。分化培養後細胞集団における細胞数（Ｃｏｌ２陽性細胞、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞等のそれぞれ）は、分化培養前細胞集団やそれが由来する髄核組織の個体差などによって変動するため一概に言えるものではないが、分化培養前細胞集団における細胞数と比較して、例えば２倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、５０倍以上、１００倍以上である。
【０１１１】
＜培地＞
本発明の各培養方法または各培養工程で用いる培地は、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞およびそれから分化する細胞の培養に適したものであればよく、培養方法または培養工程の目的なども考慮しながら、適切な基礎培地および添加成分を選択することができる。添加成分は、培養方法がＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を増幅する際に行われるもの、つまり培養工程が増幅培養段階のものであれば、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞の増幅培養に適した添加成分、培養方法がＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を分化誘導する際に行われるもの、つまり培養工程が分化培養段階のものであれば、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞から目的細胞への分化誘導に適したものが選択される。
【０１１２】
なお、本発明の第３培養方法および第４培養方法では、またそれらの方法を実施する工程を含む第３培養工程および第４培養工程では、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞およびそれから分化した細胞が培養容器の培養表面に付着しないようにする成分、例えばメチルセルロースを培地に添加する必要はない。つまり、本発明の本発明の第３培養方法および第４培養方法、またそれらの方法を実施する工程を含む第３培養工程および第４培養工程の培地は通常、メチルセルロース等の、培養容器の培養表面への細胞付着を防止するための成分を含有しない。
【０１１３】
本発明の代表的な実施形態において、髄核幹／前駆細胞およびそれから分化した髄核細胞を培養する場合、増幅培養段階および分化培養段階の各工程用の培地はそれぞれ、例えば次のような基礎培地、添加成分、増殖因子、その他の成分を、それぞれ適量用いることにより調製することができる。
【０１１４】
基礎培地としては、例えば、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、グルコース添加なしまたはあり）、αＭＥＭ（イーグル最小必須培地α改変型）、Ｈａｍ’ｓＦ−１０培地、Ｈａｍ’ｓＦ−１２培地、あるいはこれらの混合物が挙げられる。
【０１１５】
増幅培養用または分化培養用の添加成分としては、例えば、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、Ｌ−アスコルビン酸（Ｌ−アスコルビン酸リン酸マグネシウム塩等として）、亜セレン酸（インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム（ITS：Insulin-Transferrin-Selenium）等として）および２−メルカプトエタノールが挙げられる。必要に応じてさらに、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、その他の成分を培地に添加してもよい。
【０１１６】
増殖因子としては、例えば、ＦＧＦ（fibroblast growth factor：線維芽細胞成長因子）、ＥＧＦ（Epidermal Growth Factor：上皮成長因子）、Ａｎｇ−１（アンジオポエチン−１）が挙げられる。本発明の一実施形態において、培地に添加する増殖因子は、少なくともＦＧＦを用いることが好ましく、ＦＧＦおよびＥＧＦの両方を用いることがより好ましく、必要に応じてそれらにＡｎｇ−１を追加して用いることも好ましい。
【０１１７】
ＦＧＦとしては、例えばｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor：塩基性線維芽細胞成長因子。ＦＧＦ−２と呼ばれることもある。）を用いることができる。培地中のＦＧＦの濃度は、通常１〜５０ｎｇ／ｍＬの範囲、好ましくは５〜１５ｎｇ／ｍＬの範囲、例えば約１０ｎｇ／ｍＬとすることができる。
【０１１８】
Ａｎｇ−１は、無血清培地において添加することが好ましい。また、Ａｎｇ−１としては水に可溶化したもの（ソリュブルＡｎｇ−１、リコンビナントＡｎｇ−１）が好ましい。培地中のＡｎｇ−１（好ましくはソリュブルＡｎｇ−１）の濃度は、通常１００〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲、例えば約５００ｎｇ／ｍＬとすることができる。
【０１１９】
なお、上記のＦＧＦ、ＥＧＦ、Ａｎｇ−１等の増殖因子は「Ｔｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子」であり、広義の「Ｔｉｅ２発現増強剤」に該当すると解することもできるが、本発明おけるこれらの増殖因子の取扱い方については本明細書中に別途記載する。
【０１２０】
＜Ｔｉｅ２発現増強剤＞
本発明の第２培養方法では、Ｔｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子以外の少なくとも１種の「Ｔｉｅ２発現増強剤」を培地に添加する。特に、第２培養方法を増幅培養段階の工程において実施する際に、Ｔｉｅ２発現増強剤の添加は、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞の幼若性を保持しながら細胞数を増加させる作用効果、さらには増幅培養段階で得られる細胞集団を分化培養工程に供したときに、分化培養工程後に得られる細胞集団の細胞増加率やＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞および機能性目的細胞の比率などを向上させる作用効果などを有する。Ｔｉｅ２発現増強剤は、いずれか１種を用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、上記のようなＴｉｅ２活性作用が認められる量で培地に添加すればよい。
【０１２１】
「Ｔｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子」としては、例えば、アンジオポエチン−１（Ａｎｇ−１）、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）などが挙げられる。本発明の第２培養方法では、そのような「Ｔｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子」以外の少なくとも１種の「Ｔｉｅ２発現増強剤」を用いるが、必要に応じて、Ｔｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子も組み合わせて用いることもできる。特に、第２培養方法を増幅培養段階の工程において実施する場合は、Ｔｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子と、それ以外のＴｉｅ２発現増強剤、例えば以下に説明するような動植物由来抽出物、好ましくは植物由来抽出物とを併用することにより、相乗効果を奏することが可能である。なお、増幅培養段階の工程として、少なくとも増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤を用いることを必須とする（任意成分として、そこにＴｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子を併用してもよい。）工程以外に別途、Ｔｉｅ２発現増強剤として実質的にＴｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子のみを用いた（増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤を実質的に用いない）工程を行ってもよい。
【０１２２】
増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤としては、従来技術において「Ｔｉｅ２活性化剤」として知られている様々な動植物由来抽出物を用いることができる。そのような動植物由来抽出物としては、例えば、アキグミ、アキノノゲシ、インディアンデーツ、ウコン、黄杞、オウセイ、オオバコ、オカヒジキ、オリーブ果実、牡蠣、カミツレ、カリン、カロニンハゲキテ、菊、ギョクチク、キラヤ、銀杏、クサギ、クコ、クヌギ、ゲットウ、高麗ニンジン、コナラ、サンザシ、サンショウソウ、シジュウムグァバ、シベリアニンジン、スイショウガキ、スターフルーツ、ソウカクシ、ナツメ、ニッケイ、ノビル、ハス、ハスイモ、ハリギリ、ヒハツ、ブッチャーブルーム、マンゴージンジャー、ミツバウツギ、ムベ、ヤブカンゾウ、ヤマモモ、リョウブ、ルイボスなどの抽出物が挙げられる。各抽出物についてＴｉｅ２発現増強作用が認められる使用量や、各抽出物を調製するために適切な動植物の部位（材料）および抽出方法も、当業者が適宜設定することができる。
【０１２３】
産業的な観点からは、Ａｎｇ−１、ＦＧＦ２などの増殖因子よりも安価であり、好ましくはそれらの増殖因子よりもＴｉｅ２発現増強作用に優れ、さらに好ましくはそれらの増殖因子と併用したときに相乗効果を奏する、上記の動植物由来抽出物から選択される１種または２種以上、好ましくは上記の植物由来抽出物から選択される１種または２種以上を、本発明の第２培養工程においてＴｉｅ２発現増強剤として用いることが有利である。
【０１２４】
・ニッケイ属植物由来抽出物
本発明の好ましい一実施形態において、Ｔｉｅ２発現増強剤として、ニッケイ属植物由来抽出物を用いることができる。ニッケイ属（Cinnamomum）には、ケイ（Cinnamomumcassia Blume）、クスノキ（C.camphora）、マルバニッケイ（C.daphnoides）、シバニッケイ（C.doederleinii）、ヤブニッケイ（C.japonicum）、オガサワラヤブニッケイ（C.pseudo-pedunculatum）、ニッケイ（C.sieboldii）、シバヤブニッケイセイロンニッケイ（C.verum）、シナモン（C.zeylanicum）など、３００以上の種が含まれる。例えば、ケイの若枝であるケイシ（桂枝）または樹皮であるケイヒ（桂皮）、あるいはそれらを粉末状に加工したシナモンパウダーとして製造販売されている製品の抽出物を、本発明におけるニッケイ属植物由来抽出物として用いることができる。
【０１２５】
ニッケイ属植物由来抽出物は常法により得ることができ、例えば原料となる植物体（例：シナモンパウダー）を抽出溶媒とともに常温または加熱して浸漬または加熱還流した後、上澄みを回収することにより、または濾液を濾過し、必要に応じて濃縮することにより、調製することができる。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒、例えば、水性溶媒、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、あるいは有機溶媒、例えばエタノール、プロピレングリコール、1,3ーブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、合水アルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン等を、それぞれ単独あるいは組み合わせて用いることができる。好ましくは、溶媒として水が用いられる。上記溶媒で抽出して得られた抽出物は、そのまま抽出液の形態で用いてもよいが、利便性の面から、乾燥または凍結乾燥等により固形化（粉体化）して保存し、使用時に必要に応じて適切な溶媒により希釈または再溶解（再分散）して、さらに必要に応じて濾過等の処理をして、用いることができる。ニッケイ属植物由来抽出物は、必要に応じて、イオン交換樹脂（例えば、アンバーライトXAD-2のようなポーラスポリマー）を用いた吸着法などにより、不純物を除去したもの（精製物）であってもよい。
【０１２６】
培地中のニッケイ属植物由来抽出物の濃度は、用いる当該抽出物の性状に応じて、またＴｉｅ２発現増強剤としての作用効果の程度などを考慮しながら、適宜調節することができる。例えば、ニッケイ属植物由来抽出物として、シナモンパウダー１ｍｇを生理食塩水１ｍＬで抽出して得られる抽出液を用いる場合、当該抽出液を培地に対して１〜５０ｖ／ｖ％程度、例えば約２０ｖ／ｖ％の量で添加することができる。抽出および添加の実施形態を変更する場合も、Ｔｉｅ２発現増強剤としての有効成分が上記の抽出および添加の実施形態と同程度になるようにすることができる。
【０１２７】
＜細胞外マトリックス分解剤（ＥＣＭ分解剤）＞
本発明の第４培養方法では、球状コロニーの形成を抑止しながらＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を分化させるために、培地に「細胞外マトリックス分解剤（ＥＣＭ分解剤）」を添加する。
【０１２８】
一般的に、幹／前駆細胞またはそれから分化した細胞から分泌される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）としては、例えばコラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリリン、ヒアルロン酸などが挙げられる。コラーゲンには、I型、II型、III型、IV型、IX型（ａ2）、その他の型のコラーゲンが包含される。プロテオグリカンには、アグリカン、バーシカン、パーマカン（以上、コアタンパク質のサイズや糖鎖の本数に基づく分類）や、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン（以上、コアタンパク質に結合しているグリコサミノグリカンに基づく分類）などが包含される。
【０１２９】
したがって、本発明におけるＥＣＭ分解剤としては、第４培養方法の実施形態、すなわち培養されるＴｉｅ２幹／前駆細胞またはそれから分化した細胞から分泌されるＥＣＭに対応して、上に例示したようなＥＣＭを分解する活性を有し、球状コロニーの形成を抑止することのできる物質（剤）を用いればよい。ＥＣＭ分解剤は、いずれか１種類を用いても、２種類以上を併用してもよい。
【０１３０】
典型的なＥＣＭ分解剤としては、ＥＣＭを構成しているタンパク質部分を分解する活性を有するプロテアーゼ、例えば、コラーゲンに対する分解活性を有するプロテアーゼであるコラゲナーゼが挙げられる。コラゲナーゼには、高分子量のコラーゲンに対して高い活性を示すクラスIコラゲナーゼと、低分子量のコラーゲン断片に対して高い活性を示すクラスIIコラゲナーゼがある。また、脊椎動物由来のコラゲナーゼは、天然の三重らせん領域（非常に限られたα鎖上）においてコラーゲンを切断する一方、細菌由来のコラゲナーゼはほとんど全ての型（Type）のコラーゲンに作用し、三重らせん領域内の複数の箇所でコラーゲンを切断することができる。細菌の培養上清から濃縮して得られるコラゲナーゼ製剤には、コラゲナーゼ（コラゲナーゼI、コラゲナーゼII）に加えて、コラゲナーゼ以外のプロテアーゼ（中性プロテアーゼ、クロストリパイン、トリプシン、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ等）や、非タンパク質分解酵素が含まれており、精製等により特定の成分を除外した製剤も製造されている。本発明では、公知の様々なコラゲナーゼ（製剤）、プロテアーゼなどから適切なものを選択し、ＥＣＭ分解剤として利用することができる。
【０１３１】
本発明の第４培養方法の代表的な実施形態において、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞は髄核幹／前駆細胞であり、Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞からの分化誘導により生成する細胞（目的細胞）は髄核細胞である。髄核細胞は、ＥＣＭとして、II型コラーゲン、IX型コラーゲン、XI型コラーゲン、プロテオグリカンなどを発現する。したがって、この実施形態におけるＥＣＭ分解剤としては、それらのＥＣＭに対する分解活性を有するもの、例えばII型コラーゲン等に対する分解活性を有するコラゲナーゼ（またはそれを含有する製剤）を選択すればよい。そのようなコラゲナーゼ（製剤）としては、例えば、「コラゲナーゼＰ」（ロシュ社、Clostridium histolyticum由来）、「リベラーゼ」（ロシュ社、コラゲナーゼIおよびIIならびに中性プロテアーゼの混合物）などが挙げられる。
【０１３２】
なお、ＥＣＭ分解剤としては、ＥＣＭに含まれるタンパク質に対する特異的な分解活性を有するが細胞毒性は低い、プロテアーゼのような酵素（タンパク質）が代表的であるが、本発明の作用効果を奏することができる、ＥＣＭに対する一定水準以上の分解活性と、一定水準以下の細胞毒性を有する、酵素（タンパク質）以外の物質、例えば低分子化合物も、ＥＣＭ分解剤として用いることができる可能性がある。
【０１３３】
培地中のＥＣＭ分解剤の濃度は、Ｔｉｅ２幹／前駆細胞を含む細胞集団から球状コロニーが形成されることを抑止できる濃度であればよく、用いるＥＣＭ分解剤の種類に応じて、また第４培養方法が分化培養段階における工程で実施される（第４培養工程として行われる）場合は、目的細胞の増加率や所定の遺伝子（マーカー遺伝子）の発現量または陽性率に及ぼす作用などを考慮しながら、適宜調節することができる。例えば、ＥＣＭ分解剤の濃度が高すぎると、上記の作用による有利な効果が十分に認められない（逆に不利な効果となる）場合があるので、ＥＣＭ分解剤の種類に応じた所定の範囲内でその濃度を調節することが好ましい。
【０１３４】
本発明において、第３培養方法と第４培養方法を融合した方法（第３・第４培養方法）または第３培養工程と第４培養工程を融合した工程（第３・第４培養工程）では、培地中のＥＣＭ分解剤の種類および濃度と、培養表面のコーティング剤の種類の組み合わせによって、目的細胞の増加率や所定の遺伝子（マーカー遺伝子）の発現量または陽性率などに対する作用効果が変動する場合がある。当業者であれば、どのような観点からの作用効果を期待するかに応じて、分化誘導前細胞集団の性状やその他の実施形態も考慮しながら、予備的な試験などを通じて、本発明を実施する上で適切な上記の各条件を設定することができる。
【０１３５】
上述したように、培地中のＥＣＭ分解剤の濃度は一概に決定されるものではなく、培養表面のコーティング剤の種類との組み合わせにもよるが、例えば、０．００２５〜５．０重量％、０．００５〜２．０重量％、０．０１〜１．０重量％などの範囲内で調節することができる。本発明の一実施形態において、ＥＣＭ分解剤として「コラゲナーゼＰ」を用いる場合、その培地中の濃度は、０．００５〜０．０５重量％、０．０１２５％〜０．０２５重量％などの範囲内で調節する、例えば約０．０１２５％重量％とすることができる。本発明の一実施形態において、ＥＣＭ分解剤として「リベラーゼ」を用いる場合、その培地中の濃度は、０．２５％〜２．０重量％、０．５〜１．０重量％などの範囲内で調節する、例えば約１．０重量％とすることができる。
【０１３６】
＜培養期間、その他の条件＞
本発明の各培養方法および各培養工程の期間およびその他の条件（例えばｐＨ、ＣＯ２濃度、Ｏ２濃度など）は基本的に、その培養工程（が含まれる培養段階）の目的に応じて、所望の細胞組成（種類および数・比率）を有する細胞集団が得られるよう、適宜調節することができる。ｐＨは、弱アルカリ性（例えば、約７．１５）とすることができる。ＣＯ２濃度は、例えば約５％とすることができる。Ｏ２濃度は、５％以下（例えば約２％）とすることができる。各培養方法および各培養工程（段階）の期間中は必要に応じて適宜、所定の日数毎に培地を新鮮なものに交換したり、所定の日数の経過後に成分を追加するまたは成分の濃度やｐＨを増加もしくは減少させるなどして培地を変化させたり、雰囲気変化させたりしてもよい。
【０１３７】
本発明の増幅培養段階における、第１培養工程、第２培養工程、またはそれらが融合した第１・第２培養工程の期間はそれぞれ、通常１〜３週間程度、例えば約２週間である。また、本発明の増幅培養段階が任意で含むことができるその他の工程の期間も同程度であり、例えばＦＧＦ添加培地を用いる培養工程の期間は約１週間である。所望の増幅培養後細胞集団が得られた時点で、増幅培養段階を終了すればよい。
【０１３８】
本発明の分化培養段階における、第３培養工程、第４培養工程、またはそれらが融合した第３・第４培養工程の期間はそれぞれ、通常１〜３週間程度、例えば約１０日である。また、本発明の増殖培養段階が任意で含むことができるその他の工程の期間も同程度であり、例えばＦＧＦ添加培地を用いる培養工程の期間は約１週間（約７日）である。また、本発明の分化培養段階が任意で含むことができるその他の工程の期間も同程度である。所望の分化培養後細胞集団が得られた時点で、分化培養段階を終了すればよい。
【０１３９】
＜培養容器＞
本発明の各培養方法および各培養工程で用いる培養容器、培養装置等は基本的に、その培養方法および培養工程（が含まれる培養段階）の目的に応じて、所望の細胞組成（種類および数・比率）を有する細胞集団が得られるよう、適宜選択することができる。
【０１４０】
培養容器は、フラスコ、ディッシュ、プレート、バッグなど、一般的な形状を有するものを用いることができ、細胞を収容できるウェルが形成されているものであってもよい。培養容器は、ガラス、プラスチック、樹脂など、一般的な材質で作製されているものを用いることができる。培養容器の表面（培養表面）は、無処理であってもよいし、細胞の付着性に関係する処理またはその他の処理がなされていてもよい。培養容器のサイズ（面積、容積）、また培養容器がウェルを備えているものであればそのウェルのサイズ（口径、深さ）および数なども、適宜選択することができる。必要に応じて、培養容器を振盪または回転させ、培地を撹拌しながら細胞集団を培養してもよい。
【０１４１】
本発明の第３培養方法（工程）および第４培養方法（工程）では、培養容器および培養装置は二次元培養（平面培養）に準じた実施形態とすることができる。また、本発明の第１培養方法（工程）は、細胞集団が組織中に存在した状態で培養する点で三次元的な培養とも言え、細胞集団を含んだ状態の組織（細片）は培養液中に浮遊した状態に置かれる。本発明の第２培養方法（工程）は、単独で実施する場合は三次元培養に準じた実施形態とすることもできるが、第１培養方法（工程）と融合して第１・第２培養方法（工程）として実施する場合、上記の第１培養方法（工程）と同様に培養液中に浮遊した状態に置かれる。これらの方法（工程）においては、第３培養方法（工程）のように細胞の付着性を高める表面処理がなされた培養容器を用いてもよいが、表面処理がなされていない通常の培養容器を用いても問題ない。
【０１４２】
＜細胞付着処理＞
本発明の第３培養方法（工程）では、細胞の付着性を高める表面処理（本明細書において「細胞付着処理」と呼ぶことがある。）がなされた培養容器を用いる。細胞付着処理の典型例としては、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）またはその他の生体関連物質を含有するコーティング剤を培養表面に塗布する処理が挙げられる。また、細胞付着性の低い素材、例えば疎水性が強いポリスチレンで成形された培養容器に対して、プラズマ処理により親水性に改質することも、細胞付着処理の例として挙げられる。
【０１４３】
細胞付着処理用のコーティング剤が含有するＥＣＭとしては、公知の様々なＥＣＭ、例えば、コラーゲン（I型、II型、IV型など）またはその熱処理物であるゼラチン、コンドロイチン硫酸Ａ、フィブロネクチン、ゼラチン、ラミニン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、プロテオグリカン（アグリカン、ヘパリン硫酸プロテオグリカンなど）が挙げられる。また、ＥＣＭ以外の生体関連物質としては、ポリリジン（ポリ−Ｌ−リジンまたはポリ−Ｄ−リジン）等のポリアミノ酸が挙げられる。その他の細胞付着処理用のコーティング剤としては、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡ（ポリ乳酸・グリコール酸共重合体）、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリホスファゼン、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリスルホン、ポリ−メチルメタクリラート、ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリラート、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドンポリオルニチン等が挙げられる。細胞付着処理用のコーティング剤は、上記の物質のいずれか１種類を含有するものであってもよし、２種類以上を含有するものであってもよい。
【０１４４】
ここで、第３・第４培養方法（工程）では、前述したように、細胞付着処理用のコーティング剤の種類と、培地に添加されるＥＣＭ分解剤の種類および濃度の組み合わせによって、本発明の作用効果（細胞集団の細胞増加率、目的細胞の比率など）が変動する場合がある。その一因として、細胞付着処理用のコーティング剤が含有するＥＣＭまたはその他の生体関連物質が、培地に添加されたＥＣＭ分解剤による分解活性の影響を受ける可能性が考えられる。しかしながら、本発明の作用効果が一定程度奏される（完全に阻害されない）範囲であれば、そのような影響の可能性のある細胞付着処理用のコーティング剤とＥＣＭ分解剤とを組み合わせて用いる実施形態も許容される。例えば、ＥＣＭ分解剤としてII型コラーゲンの分解活性を有するコラゲナーゼ（製剤）を所定の濃度で培地に添加する場合、細胞付着処理用のコーティング剤としては、そのＥＣＭ分解剤の種類および濃度による影響を受けにくいもの、または目的細胞（例えばＣｏｌ２陽性細胞）への分化誘導が一定水準で達成されるもの、例えばコラーゲンでないポリリジン（ポリ−Ｌ−リジンまたはポリ−Ｄ−リジン）またはフィブロネクチン、あるいはIV型コラーゲンを含有するものが好ましい。
【０１４５】
本発明の第３培養方法は、増幅培養段階において実施することも可能である。例えば、増幅培養段階との関係で前述した、Ｔｉｅ２発現増強剤としてＴｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子のみが添加された培地中でＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する工程（追加増幅培養工程）において、第３培養方法を実施することが可能である。このような実施形態における、細胞付着処理用のコーティング剤が含有するＥＣＭとしては、例えばゼラチンが好ましい。
【０１４６】
−細胞治療用組成物−
本発明の細胞治療用組成物は、上述したような本発明の培養方法または調製方法によって得られた細胞集団を含有し、必要に応じてその他の製薬学的に許容される成分を含有することができる。
【０１４７】
本発明の代表的な実施形態において、細胞治療用組成物は、髄核幹／前駆細胞から分化したＣｏｌ２陽性髄核細胞を含む（好ましくはＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞も含む）細胞治療用組成物である。当該実施形態における細胞治療用組成物の適用対象、つまり当該組成物を投与することにより予防または治療することのできる疾患としては、椎間板（髄核）の障害、変性、ヘルニア等が症状として表れる疾患、例えば、腰部または頚椎の椎間板症、椎間板ヘルニア、頚椎症性脊髄症、神経根症、脊椎分離症・すべり症、腰部脊柱管狭窄症、腰椎変性すべり症、腰椎変性側弯症が挙げられる。
【０１４８】
本発明の細胞治療用組成物の剤型は、細胞集団を標的とする部位（例えば椎間板の髄核）に移植または送達できるものであればよいが、例えば注射剤、好ましくは椎間板（髄核）またはその近傍への局所投与用の注射剤、あるいはターゲティングが可能である血管投与用注射剤とすることができる。
【０１４９】
製薬学的に許容される成分としては、例えば注射剤として調製する場合の注射用水もしくは生理食塩水、細胞集団用の培養液、その他の適切な溶媒・分散媒、その他の添加剤等が挙げられる。
【０１５０】
本発明の細胞治療用組成物は、所望の治療または予防効果を奏するために有効な量で投与すればよい。そのような有効量は、細胞治療用組成物の成分、剤形や、投与対象、投与経路、その他の実施形態などを勘案しながら、１回あたりの投与量、投与回数および投与間隔（一定期間内の投与回数）などによって適宜調整することができる。本発明の細胞治療用組成物は、ヒトおよびヒト以外の脊椎動物に対して実施することができる。
【０１５１】
−保存方法−
本発明のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の保存方法は、消化処理されていない組織中に存在する状態で、当該Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を凍結保存することにより、Ｔｉｅ２が活性化および／または発現された状態を維持する、あるいは細胞集団中のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞の減少を抑制するものである。
【０１５２】
本発明の保存方法に関する技術的事項は、第１培養方法との関係で前述したものと同様の技術的事項を適用することができる。Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含んだ状態の消化処理されていない組織に対する、凍結保存の手順や必要に応じて用いられる凍結保護剤などは、消化処理により組織から分離された従来のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団に対するものと、基本的に同様のものを適用することができる。
【実施例】
【０１５３】
本実施例の「増幅培養段階」の各工程における培地（以下の実施例において「増幅培養段階用培地」と呼ぶ。）として、ＤＭＥＭ（no Glucose、ｗａｋｏ）６０ｍＬおよびＭＥＭα（ナカライテスク）４０ｍＬの混合培地に、使用直前にＦＢＳ２０％を添加し、さらに実施例中の各表に示す追加成分を添加した（＋）または添加しなかった（−）ものを調製して使用した。
【０１５４】
本実施例の「分化培養段階」の各工程における培地（以下の実施例において「分化培養段階用培地」と呼ぶ。）として、ＤＭＥＭ（no Glucose、ｗａｋｏ）６０ｍＬおよびＦ１０（ｇｉｂｃｏ）４０ｍＬの混合培地に、２−メルカプトエタノール１μＬ、亜セレン酸（０．０１％）６μＬ、アスコルビン酸（５ｍｇ／ｍＬ）１．５ｍＬおよび３０％ＢＳＡ５ｍＬを添加し、さらに使用直前にＦＢＳ３０％を添加し、実施例中の各表に示す追加成分を添加した（＋）または添加しなかった（−）ものを調製して使用した。
【０１５５】
［試験例１］増幅培養段階：第１培養工程（ＷＴＣ法）
【表１】
2020156461.tif 000002
【０１５６】
椎間板ヘルニア患者（３２歳女性、２８歳女性および２０歳男性）の患部から切除した椎間板の髄核組織を、ハサミ等を用いて数ミリ角の大きさに細切した。細胞集団を含んだままの細切した髄核組織０．１〜０．５ｇを、増幅培養段階用培地への追加成分について表１に示す通りに調製した培地３ｍＬに浮遊させた後、６穴培養皿（培養表面は無処理）の１穴へ注入し、７日間培養した（ＷＴＣ法）。対照として、細切した髄核組織をそのまま培養するのではなく、常法に従ってコラゲナーゼで消化処理して、単離された細胞集団を回収し、それ以外はＷＴＣ法と同様にして、細胞集団を培養した（二次元培養法）。
【０１５７】
培養後、細胞集団を回収し、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）法により、細胞表面のＴｉｅ２の発現が陽性である細胞の細胞数および蛍光強度を測定し、細胞集団全体の細胞数に対する比率（Ｔｉｅ２陽性率）および平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出した。ＦＭＣ法では、抗ヒトＴｉｅ２抗体と蛍光色素アロフィコシアニンの複合体である蛍光標識剤（Ｒ＆Ｄ社、Anti-Tie-2, Human, Mouse-Mono(87315), Allophicocyanin、カタログ番号ＦＡＢ３１３１Ａ）を用いた。
【０１５８】
結果を図２および図３に示す。例えば試験例１−１および１−３を比較すると、どちらの結果においても試験例１−１の方が有意に高く（図２：ｐ＜０．０５、図３：ｐ＜０．０１、どちらもｔ検定）、ＷＴＣ法によるＴｉｅ２発現増強効果が認められた。
【０１５９】
［試験例２］増幅培養段階（２段階）：第１・第２培養工程＋追加工程
【表２】
2020156461.tif 000003
【０１６０】
市販のシナモン粉末１ｍｇを生理食塩水１ｍＬに懸濁し、３７℃で一晩抽出を行い、得られた抽出液（シナモン抽出液）を本試験で用いた。
【０１６１】
椎間板の髄核組織を採取した椎間板ヘルニア患者が１６歳女性、２８歳女性および３８歳女性であること、増幅培養段階の１段階目として、増幅培養段階用培地への追加成分について表２に示す通りに調製した培地を用いたこと、また培養期間を１４日間としたこと以外は、［試験例１］（試験例１−１および１−２）と同様の培養工程を行った。
【０１６２】
１段階目の培養工程後、ロシュ社製「コラゲナーゼ−Ｐ」（最終濃度０．０２５％）を培地に添加し、髄核組織を分散させた。髄核組織から分離した細胞集団を回収し、２０％ＦＢＳ添加ＭＥＭαに１．０×１０４／３ｍＬの密度で浮遊させた後、６穴培養皿（培養表面は無処理）の１穴へ注入し、１０ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦを添加した後、さらに７日間（合計２１日間）培養した。
【０１６３】
培養後、細胞集団を回収し、［試験例１］と同様のＦＣＭ法により、それぞれ細胞表面のＴｉｅ２の発現が陽性である細胞の、比率および組織１ｇに由来する細胞数を測定した。結果を図４および図５に示す。
【０１６４】
［試験例３］増幅培養段階（２段階）：第１・第２培養工程＋追加工程→分化培養段階：第３培養工程
【表３】
2020156461.tif 000004
【０１６５】
椎間板の髄核組織を採取した椎間板ヘルニア患者が１６歳女性、３０歳男性および３０歳女性になったこと以外は、前記試験例２と同様の手順で、合計２１日間の２段階の増幅培養段階の工程を行った。培養後の細胞集団を回収し、分化培養段階の工程として、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）でコーティングされた培養皿上（試験３−１）またはコーティングされていない培養皿上（試験例３−２）で１４日間、単層培養を行った。
【０１６６】
培養後、細胞集団を回収し、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）法により、細胞内のII型コラーゲン（Ｃｏｌ２）の発現が陽性である細胞の細胞数を測定し、細胞集団全体の細胞数に対する比率（Ｃｏｌ２陽性率）を算出した。細胞集団はあらかじめ、膜透過処理試薬「ＩｎｔｒａＰｒｅｐ」（ベックマンコールター社）で処理し、細胞内のＣｏｌ２を蛍光標識できるようにした。Ｃｏｌ２に対する蛍光標識法としては、１次抗体としてマウス抗ヒトＣｏｌ２抗体（協和ファーマケミカル株式会社（旧第一ファインケミカル株式会社、Anti-hCL(II) (purified IgG)、カタログ番号Ｆ−５７）を、２次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と蛍光色素ＦＩＴＣの複合体（ＢＤ社、Goat Anti-Mouse Ig FITC、カタログ番号３４９０３１）を用いた。結果を図６に示す。また、１ｇの髄核組織由来細胞を全て試験例２に従って増幅培養し、その後試験例３に従って分化培養したと仮定した場合の、Ｃｏｌ２陽性細胞数を算定した。結果を図７に示す。第３培養工程を適用した場合（試験３−１）、適用しなかった場合（試験３−２）に比べてＣｏｌ２陽性細胞数は約３倍に増加した。
【０１６７】
なお、ＦＣＭ法により、細胞内のプロテオグリカン（ＰＧ）の発現が陽性である細胞の細胞数も測定し、細胞集団全体の細胞数に対する比率（ＰＧ陽性率）を算出した。ＰＧに対する蛍光標識法としては、１次抗体としてマウス抗ヒトＰＧ抗体（EMD milliporee、Anti-Cartilage Proteoglycan Antibody, adult, clone EFG-4、カタログ番号ＭＡＢ２０１５）を、２次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と蛍光色素ＦＩＴＣの複合体（ＢＤ社、、Goat Anti-Mouse Ig FITC、カタログ番号３４９０３１）を用いた。結果は、第３培養工程（ＰＬＬコーティング）の適用の有無にかかわらず、ＰＧ陽性率は共に１００％近く、有意差は認められなかった（図示せず）。プロテオグリカンと異なり、II型コラーゲンを発現している機能的な髄核細胞は、従来の方法では最終的な細胞集団中の細胞数を増加させることが困難であったが、本発明の第１・第２培養工程および第３培養行程を組み合わせることによりそれが可能となり、培養方法としての優位性が示された。
【０１６８】
［試験例４］増幅培養段階（２段階）：第１・第２培養工程＋追加工程→分化培養段階：第３・第４培養工程
【表４】
2020156461.tif 000005
【０１６９】
前記試験例２と同様の手順で、合計２１日間の２段階の増幅培養段階の工程を行った。培養後の細胞集団を回収し、分化培養段階の工程として、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）でコーティングされた試験管内で、分化培養段階用培地に表４に示す通りの追加成分を適用した培地を用いて１４日間、培養を行った。
【０１７０】
培養後、細胞集団を回収し、［試験例３］と同様にしてＰＧ陽性率を算出した。結果を図８に示す。２種類のコラゲナーゼのどちらを培地に添加した場合も、コラゲナーゼを添加しなかった場合に比べて、ＰＧ陽性率は有意に増加した。
【０１７１】
試験例４−１〜４−３のそれぞれについて、さらに６サンプルずつ調製し（椎間板の髄核組織を採取した椎間板ヘルニア患者は、３２歳女性、２８歳女性、２０歳男性、１６歳女性、２８歳女性および３８歳女性）、［試験例３］と同様にしてＣｏｌ２陽性率を算出した。結果を図９に示す。サンプルによる差（椎間板髄核組織を採取した個人差）があったが、６サンプル中４サンプルにおいて、２種類のコラゲナーゼのうちのどちらかは、またはどちらとも、培地に添加した場合に、コラゲナーゼを添加しなかった場合に比べて、Ｃｏｌ２陽性率の向上が認められた。
【０１７２】
［試験例５］増幅培養段階（２段階）：第１・第２培養工程＋追加工程→分化培養段階：第３・第４培養工程  その２
【表５】
2020156461.tif 000006
【０１７３】
分化培養段階について、培養容器のコーティング剤および培地への追加成分（コラゲナーゼＰ）を表５に示すように変更したこと以外は前記試験例４と同様の手順で、増幅培養段階および分化培養段階の工程を行い、ＰＧ陽性率およびＣｏｌ２陽性率を測定した。結果を図１０に示す。例えば、培地に「コラゲナーゼＰ」を添加する場合は、濃度にもよるが、コーティング剤としてＣｏｌ４（IV型コラーゲン）、ＦＮ（フィブロネクチン）またはＰＬＬ（ポリ−Ｌ−リジン）を含むコーティング剤、特にＰＬＬを含むコーティング剤を用いることが、Ｃｏｌ２陽性率の向上にとって好ましいことが認められた。
【０１７４】
［試験例６］増幅培養段階（２段階）：第１・第２培養工程＋追加工程→分化培養段階：第３・第４培養工程  その３
【表６】
2020156461.tif 000007
【０１７５】
分化培養段階について、培養容器のコーティング剤および培地への追加成分（リベラーゼ）を表６に示すように変更したこと以外は前記試験例４と同様の手順で、増幅培養段階および分化培養段階の工程を行い、ＰＧ陽性率およびＣｏｌ２陽性率を測定した。結果を図１１に示す。例えば、培地に「リベラーゼ」を添加する場合は、濃度にもよるが、コーティング剤としてＣｏｌ４（IV型コラーゲン）またはＰＬＬ（ポリ−Ｌ−リジン）を含むコーティング剤を用いることが、Ｃｏｌ２陽性率の向上にとって好ましいことが認められた。
【図１】
2020156461.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2020156461.tif 000012
【図６】
2020156461.tif 000013
【図７】
2020156461.tif 000014
【図８】
2020156461.tif 000015
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月9日(2019.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
椎間板の髄核組織に由来する、Ｔｉｅ２（tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain-2）の発現が陽性である幹細胞および／または前駆細胞（以下「髄核由来Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞」と呼ぶ。）を含む細胞集団を、
少なくとも１種のＴｉｅ２発現増強作用を有する動植物由来抽出物が添加された培地中で、髄核組織のニッチ中に保持された状態において培養することにより、
髄核由来Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を増幅する培養方法（以下「第１・第２Ａ培養方法」と呼ぶ。）。
【請求項２】
前記第１・第２Ａ培養方法における動植物由来抽出物が、ニッケイ（Cinnamomum）属の植物由来の抽出物である、請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記第１・第２Ａ培養方法における培養が、細胞外マトリックスおよび／またはポリアミノ酸を含有するコーティング剤が塗布された培養表面を有する培養容器で行われる、請求項１または２に記載の培養方法。
【請求項４】
前記第１・第２Ａ培養方法における前記髄核組織を解凍した組織とすることにより、Ｔｉｅ２が活性化および／または発現された状態を維持する、あるいは前記細胞集団中のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞の減少を抑制する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項５】
前記第１・第２Ａ培養方法における培養期間が１週間以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項６】
前記髄核由来Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する際に、
髄核組織のニッチ中に保持された状態で、アスコルビン酸を含有しない培地中で培養する（培養時間が２４時間以下の場合を除く）、培養方法（以下「第１Ａ培養方法」と呼ぶ。）。
【請求項７】
前記第１Ａ培養方法における髄核組織を解凍した組織とすることにより、Ｔｉｅ２が活性化および／または発現された状態を維持する、あるいは前記細胞集団中のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞の減少を抑制する、請求項６に記載の培養方法。
【請求項８】
前記第１Ａ培養方法における培養期間が１週間以上である、請求項６または７に記載の培養方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の第１・第２Ａ培養方法または請求項６〜８のいずれか一項に記載の第１Ａ培養方法を実施する工程を含む、髄核由来Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞のＴｉｅ２の発現を増強するとともに、細胞集団中の髄核由来Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を増幅するための培養段階（以下「増幅培養段階Ａ」と呼ぶ。）
を含む、髄核由来Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の調製方法。
【請求項１０】
前記増幅培養段階Ａにおいて実施する工程が、前記第１Ａ培養方法と、少なくとも１種の、Ｔｉｅ２発現増強作用を有する動植物由来抽出物が添加された培地中で、髄核由来Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する方法（以下「第２Ａ培養方法」と呼ぶ。）とを同時に実施する工程、または
前記第１Ａ培養方法を実施する工程および前記第２Ａ培養方法を実施する工程を含む、請求項９に記載の調製方法。
【請求項１１】
前記増幅培養段階Ａがさらに、前記Ｔｉｅ２発現増強作用を有する動植物由来抽出物は添加されず、ＦＧＦ（繊維芽細胞成長因子）、ＥＧＦ（上皮成長因子）およびＡｎｇ−１（アンジオポエチン−１）からなる群より選ばれる少なくとも１種が添加された培地中でＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む、請求項９または１０に記載の調製方法。
【請求項１２】
前記第２Ａ培養方法における動植物由来抽出物が、ニッケイ（Cinnamomum）属の植物由来の抽出物である、請求項１０または１１に記載の調製方法。
【請求項１３】
前記第２Ａ培養方法における培養が、細胞外マトリックスおよび／またはポリアミノ酸を含有するコーティング剤が塗布された培養表面を有する培養容器で行われる、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項１４】
前記増幅培養段階Ａの後に、
前記髄核由来Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を少なくともII型コラーゲンを発現する髄核細胞へと分化誘導するための培養段階（以下「分化培養段階Ａ」と呼ぶ。）
をさらに含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項１５】
請求項９〜１３のいずれか一項に記載の調製方法における、増幅培養段階Ａによって得られたＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞の比率が５％以上である細胞集団。
【請求項１６】
請求項９〜１３のいずれか一項に記載の調製方法における、増幅培養段階Ａ用培地と、当該増幅培養段階Ａに供される、培養されているまたは得られた細胞集団とを含有する培養物。
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月28日(2020.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
椎間板の髄核組織に由来する、Ｔｉｅ２（tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain-2）の発現が陽性である幹細胞および／または前駆細胞（以下「髄核由来Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞」と呼ぶ。）を含む細胞集団を、
ニッケイ（Cinnamomum）属の植物由来の抽出物および／またはオリーブ果実の抽出物が添加された培地中で、髄核組織のニッチ中に保持された状態において培養することにより、
髄核由来Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を増幅する培養方法（以下「第１・第２Ａ培養方法」と呼ぶ。）。
【請求項２】
前記第１・第２Ａ培養方法における培養が、細胞外マトリックスおよび／またはポリアミノ酸を含有するコーティング剤が塗布された培養表面を有する培養容器で行われる、請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記第１・第２Ａ培養方法における前記髄核組織を解凍した組織とすることにより、Ｔｉｅ２が活性化および／または発現された状態を維持する、あるいは前記細胞集団中のＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞の減少を抑制する、請求項１または２に記載の培養方法。
【請求項４】
前記第１・第２Ａ培養方法における培養期間が１週間以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の第１・第２Ａ培養方法を実施する工程を含む、髄核由来Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞のＴｉｅ２の発現を増強するとともに、細胞集団中の髄核由来Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を増幅するための培養段階（以下「増幅培養段階Ａ」と呼ぶ。）
を含む、髄核由来Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団の調製方法。
【請求項６】
前記増幅培養段階Ａがさらに、前記ニッケイ（Cinnamomum）属の植物由来の抽出物またはオリーブ果実の抽出物は添加されず、ＦＧＦ（繊維芽細胞成長因子）、ＥＧＦ（上皮成長因子）およびＡｎｇ−１（アンジオポエチン−１）からなる群より選ばれる少なくとも１種が添加された培地中でＴｉｅ２陽性幹／前駆細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む、請求項５に記載の調製方法。
【請求項７】
前記増幅培養段階Ａの後に、
前記髄核由来Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞を少なくともII型コラーゲンを発現する髄核細胞へと分化誘導するための培養段階
をさらに含む、請求項５または６に記載の調製方法。