(57)【要約】      （修正有）【課題】可動要素挿入物（ＭＥＩ）で関連付けられた細胞増殖を同定する方法の提供。【解決手段】可動要素挿入物（ＭＥＩ）の挿入部およびその隣接するゲノム配列を使用する方法であって、細胞増殖に対するマーカーとして、薬剤に対する標的として、組織フィンガープリンティング法のためのマーカーとして、および、関連する方法および組成物において、ＭＥＩを使用する方法。細胞増殖事象、癌、および老化における可動要素の悪影響の検出、処置および継続中のモニタリングを行う、さらにこれらの症状に対処するための処置レジメンの成功例の選択、使用、およびモニタリングを行う方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖とタグ付された可動要素挿入物（ＭＥＩ）を同定する方法であって、 該方法は、
第１の核酸サンプルにおいて第１のＭＥＩ挿入部位で定量的にＭＥＩレベルを測定する工程；
第２の核酸サンプルにおいて第１のＭＥＩ挿入部位で定量的にＭＥＩレベルを測定する工程；および
第１の核酸サンプルにおける第１のＭＥＩ挿入部位のＭＥＩレベルが、第２の核酸サンプルにおける第１のＭＥＩ挿入部位のＭＥＩレベルと実質的に異なる場合に、細胞増殖にタグ付けされたＭＥＩをタグ付ＭＥＩとして第１のＭＥＩ挿入部位を同定する工程、 
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第１の核酸サンプルおよび前記第２の核酸サンプルは、実質的に同様の量の核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対照核酸は、第１の核酸サンプルおよび第２の核酸サンプル中に実質的に同様の量で存在する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第１のＭＥＩ挿入部位に隣接している配列を同定する工程を含む、請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
第１のＭＥＩ挿入部位に隣接している配列の欠損に対処する際の有効性と関連づけられた処置を選択する工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第１の核酸サンプルおよび第２の核酸サンプルは、第１の時点および第２の時点で共通の個体から取得される、請求項１−５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の時点および第２の時点は、前記個体に投与される処置によって離される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記処置は癌治療を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の時点および第２の時点は少なくとも６か月離される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の時点および第２の時点は少なくとも１年離される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の時点および第２の時点は少なくとも２年離される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の時点および第２の時点は少なくとも５年離される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の核酸サンプルおよび前記第２の核酸サンプルは、血液から抽出される、請求項１−１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の核酸サンプルおよび前記第２の核酸サンプルは、循環する遊離核酸を含む、請求項１−１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の核酸サンプルおよび前記第２の核酸サンプルは、循環する遊離ゲノムＤＮＡを含む、請求項１−１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
第１の核酸サンプルは第１の位置で個体から取得され、第２の核酸サンプルは第２の位置で個体から取得される、請求項１−５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
第１の位置は第１の癌組織を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
第２の位置は健常組織を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
第２の位置は第２の癌組織を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
第２の癌組織および第１の癌組織は共通の癌に由来する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第１の核酸サンプル中の第１のＭＥＩ挿入部位の前記ＭＥＩレベルおよび第２の核酸サンプル中の第１のＭＥＩ挿入部位の前記ＭＥＩレベルを開示するレポートを生成する工程を含む、請求項１−２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記レポートは前記個体に提供される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記レポートは健康管理の専門家に提供される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記レポートは秘密に製作される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
可動要素挿入物（ＭＥＩ）をモニタリングするレジメンであって、該レジメンは、
複数のＭＥＩ挿入境界を含む個体からゲノム配列情報を取得する工程；
発癌遺伝子に隣接している境界を同定するために複数のＭＥＩ挿入境界を調査する工程；
および発癌遺伝子に隣接しているＭＥＩ境界の量的存在率を経過観察する工程、
を含むことを特徴とするレジメン。
【請求項２６】
発癌遺伝子に隣接しているＭＥＩ境界の量的存在率を経過観察する前記工程は、
第１の時点で第１の血液サンプルを取得する工程、
第１の時点で第１の血液サンプル中のＭＥＩ境界の量的存在率を決定する工程、
第２の時点で第２の血液サンプルを取得する工程、および
第２の時点で第２の血液サンプル中のＭＥＩ境界の量的存在率を決定する工程、
を含む、請求項２５に記載のレジメン。
【請求項２７】
発癌遺伝子に隣接しているＭＥＩ境界の量的存在率を経過観察する前記工程は、
第１の時点で第１の組織サンプルを取得する工程、
第１の時点で第１の組織サンプル中のＭＥＩ境界の量的存在率を決定する工程、
第２の時点で第２の組織サンプルを取得する工程、および
第２の時点で第２の組織サンプル中のＭＥＩ境界の量的存在率を決定する工程、
を含む、請求項２５に記載のレジメン。
【請求項２８】
前記第１の組織サンプルおよび前記第２の組織サンプルは腫瘍組織を含む、請求項２７に記載のレジメン。
【請求項２９】
発癌遺伝子の欠損に関連する癌に対処するための処置を選択する工程を含む、請求項２５−２８のいずれか１項に記載のレジメン。
【請求項３０】
ＭＥＩ挿入部位の量的存在率が、前記サンプル中において、第１の時点から第２の時点への閾値を越えて増加した場合に、発癌遺伝子の欠損に関連する癌に対処するための処置を施す工程を含む、請求項２９に記載のレジメン。
【請求項３１】
閾値は１０％の増加である、請求項３０に記載のレジメン。
【請求項３２】
閾値は２０％の増加である、請求項３０に記載のレジメン。
【請求項３３】
閾値は３０％の増加である、請求項３０に記載のレジメン。
【請求項３４】
閾値は５０％の増加である、請求項３０に記載のレジメン。
【請求項３５】
第１の時点の前に、発癌遺伝子の欠損に関連する癌に対処するための処置の第１の投与量を投与する工程、および、ＭＥＩ挿入部位の量的存在率が、サンプルにおいて、第１の時点から第２の時点への閾値よりも低く減少しない場合に、投与量を増加させる工程を含む、請求項２９に記載のレジメン。
【請求項３６】
閾値は第１の時点の量の９０％である、請求項３５に記載のレジメン。
【請求項３７】
閾値は第１の時点の量の８０％である、請求項３５に記載のレジメン。
【請求項３８】
閾値は第１の時点の量の７０％である、請求項３５に記載のレジメン。
【請求項３９】
閾値は第１の時点の量の６０％である、請求項３５に記載のレジメン。
【請求項４０】
閾値は第１の時点の量の５０％である、請求項３５に記載のレジメン。
【請求項４１】
閾値は第１の時点の量の１０％である、請求項３５に記載のレジメン。
【請求項４２】
処置は化学療法を含む、請求項２８−３４のいずれか１項に記載のレジメン。
【請求項４３】
処置は放射線療法を含む、請求項２８−３４のいずれか１項に記載のレジメン。
【請求項４４】
処置は、ＭＥＩ挿入に隣接している配列の欠損を標的とする薬剤を含む、請求項２８−３４のいずれか１項に記載のレジメン。
【請求項４５】
処置は、ＭＥＩ挿入部位に隣接している配列によってエンコードされたタンパク質が関与する経路の誤調節を標的とする薬剤を含む、請求項２８−３４のいずれか１項に記載のレジメン。
【請求項４６】
処置は、特異的にＭＥＩ挿入接合部に結合する核酸を含む、請求項２８−３４のいずれか１項に記載のレジメン。
【請求項４７】
核酸はｐｉＲＮＡを含む、請求項４２に記載のレジメン。
【請求項４８】
核酸はｓｉＲＮＡを含む、請求項４２に記載のレジメン。
【請求項４９】
核酸はＣＲＩＳＰＲ核酸を含む、請求項４２に記載のレジメン。
【請求項５０】
核酸は、ＭＥＩ挿入境界のメチル化を導く、請求項４２に記載のレジメン。
【請求項５１】
癌組織のインビボでの可視化のための組成物であって、該組成物は、検出要素に結合された発癌遺伝子に隣接しているＭＥＩ境界に及ぶ核酸プローブを含むことを特徴とする組成物。
【請求項５２】
検出要素は蛍光体を含む、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
検出要素は光励起性成分を含む、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５４】
プローブは細胞膜を通過する、請求項５１‐５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５５】
プロ‐ブは細胞核膜を通過する、請求項５１‐５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５６】
プローブ螢光は、発癌遺伝子に隣接しているＭＥＩ境界を含む標的核酸配列へのプローブ結合に依存する、請求項５１‐５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記プローブは携帯型の蛍光体励起装置によって視覚化される、請求項５１‐５６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５８】
ゲノム老化をモニタリングするための方法であって、該方法は、
第１の期間で第１の核酸サンプル中のＭＥＩ挿入部位の数を定量的に測定する工程；
第１の期間で第１の核酸サンプル中のＭＥＩ挿入部位の数を定量的に測定する工程；
および、ＭＥＩ挿入境界の増加をゲノム老化の増加と相関させる工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５９】
ＭＥＩ挿入部位の数の１０％の増加はゲノムの老化を示す、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ＭＥＩ挿入部位の数の２０％の増加はゲノムの老化を示す、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
ＭＥＩ挿入部位の数の３０％の増加はゲノムの老化を示す、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
ＭＥＩ挿入部位の数の５０％の増加はゲノムの老化を示す、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
ゲノム老化が示された場合に、老化防止レジメンを推奨する工程を含む、請求項５８‐６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
老化防止レジメンはカロリー制限を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
老化防止レジメンはＮＳＡＩＤの投与を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
老化防止レジメンはＤＮＡメチラーゼの投与を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
老化防止レジメンは逆転写酵素阻害剤の投与を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
老化防止レジメンはレトロウイルス阻害剤の投与を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
老化防止レジメンはＨＩＶ阻害剤の投与を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
老化防止レジメンはＡＺＴの投与を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
老化防止レジメンはＨＢＶ阻害剤の投与を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７２】
老化防止レジメンはリバビリンの投与を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７３】
老化防止レジメンはトランスポサーゼ阻害剤の投与を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７４】
第１の核酸サンプルおよび第２の核酸サンプルを比較する方法であって、該方法は、
前記第１の核酸サンプルの複数のＭＥＩ境界に対する可動要素挿入物（ＭＥＩ）の境界配列を取得する工程；
前記第２の核酸サンプル中の前記複数のＭＥＩ境界の存在を分析する工程；
および、前記第２の核酸サンプルが、前記第１の核酸サンプル中に存在するＭＥＩ境界配列を欠いている場合に、前記第１の核酸サンプルと異なるものとして前記第２の核酸サンプルを同定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項７５】
前記第２の核酸サンプルが、前記第１の核酸サンプル中には存在しないＭＥＩ境界配列を含む場合に、前記第１の核酸サンプルと異なるものとして前記第２の核酸サンプルを同定する工程を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記第１の核酸サンプルの複数のＭＥＩ境界に対する可動要素挿入物（ＭＥＩ）の境界配列を取得する工程は、前記第１の核酸サンプルの全ゲノム配列決定を実行する工程を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記第１の核酸サンプルの複数のＭＥＩ境界に対する可動要素挿入物（ＭＥＩ）の境界配列を取得する工程は、前記第１の核酸サンプルの前記複数のＭＥＩ境界の標的とされた配列決定を実行する工程を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記第２の核酸サンプル中の前記複数のＭＥＩ境界の存在を分析する工程は、前記第２の核酸サンプルの全ゲノム配列決定を実行する工程を含む、請求項７４‐７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記第２の核酸サンプル中の前記複数のＭＥＩ境界の存在を分析する工程は、前記第２の核酸サンプルの前記複数のＭＥＩ境界の標的とされた配列決定を実行する工程を含む、請求項７４‐７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記第２の核酸サンプルの前記複数のＭＥＩ境界の標的とされた配列決定を実行する工程は、前記第１の核酸サンプルの各ＭＥＩ挿入部位を特異的に増殖させるプライマを含むプライマのパネルに、前記第２の核酸サンプルを接触させる工程を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記第２の核酸サンプルの前記複数のＭＥＩ境界の標的とされた配列決定を実行する工程は、前記第１の核酸サンプルの各ＭＥＩ挿入部位に対し特異的にアニールするプローブを含むプローブのパネルに、前記第２の核酸サンプルを接触させる工程を含む、請求項７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
プローブのパネルは、基質に結合されたプローブが基質に結合されていないプローブに対し差分的に視覚化可能であるように蛍光体へ結合された、少なくとも１つのプローブを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記第２のサンプルが法医学のサンプルを含む、請求項７４−８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記第２のサンプルが植物サンプルを含む、請求項７４−８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記植物サンプルは植物収穫物サンプルである、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記第２のサンプルは生物学的に危険な物質を含む、請求項７４−８２に記載の方法。
【請求項８７】
老化関連のゲノムの劣化の遅延に使用される組成物であって、該組成物は、可動要素挿入物を阻害する薬剤を含むことを特徴とする組成物。
【請求項８８】
前記組成物は逆転写酵素阻害剤を含む、請求項８７に記載の組成物。
【請求項８９】
前記組成剤はレトロウイルス阻害剤を含む、請求項８７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１４年２月２７日に出願された米国仮出願第６１／９４５，７９１号の利益を主張し、その全体が参照によって本明細書に組込まれる。
【０００２】
参照による組込み
この明細書において言及された全ての出版物、特許、および特許出願は、あたかも、個々の出版物、特許または特許出願それぞれが、参照によってその全体が組み入れられると特異的かつ個別的に表示されたのと同程度に、参照によって本出願に組込まれる。
【発明の概要】
【０００３】
いくつかの実施形態は、細胞増殖にタグ付けされた可動要素挿入物（ＭＥＩ）を同定する方法に関し、該方法は、第１の核酸サンプルにおいて第１のＭＥＩ挿入部位で定量的にＭＥＩレベルを測定する工程、第２の核酸サンプルにおいて第１のＭＥＩ挿入部位で定量的にＭＥＩレベルを測定する工程、および、第１の核酸サンプル中の第１のＭＥＩ挿入部位でのＭＥＩレベルが、第２の核酸サンプル中の第１のＭＥＩ挿入部位でのＭＥＩレベルと実質的に異なる場合に、細胞増殖とタグ付けされたタグ付きＭＥＩとして、第１のＭＥＩ挿入部位を同定する工程、を含む。方法のいくつかの様相において、第１核酸サンプルおよび第２の核酸サンプルは、実質的に同様の量の核酸を含む。方法のいくつかの様相において、対照核酸は、第１核酸サンプルおよび第２の核酸サンプル中に、実質的に同量で存在する。方法のいくつかの様相は、第１のＭＥＩ挿入部位に隣接する配列を識別する工程を含む。方法のいくつかの様相は、第１のＭＥＩ挿入部位に隣接する配列中の欠損に対処する際の有効性に関連する処置を選択する工程を含む。方法のいくつかの様相において、第１の核酸サンプルおよび第２の核酸サンプルは、第１の時点および第２の時点で共通の個体から取得される。方法のいくつかの様相において、第１の時点および第２の時点は、個人投与される処置によって離される。方法のいくつかの様相において、処置は癌治療を含む。方法のいくつかの様相において、第１の時点および第２の時点は少なくとも６か月間離される。方法のいくつかの様相において、第１の時点および第２の時点は少なくとも１年間離される。方法のいくつかの様相において、第１の時点および第２の時点は少なくとも２年間離される。方法のいくつかの様相において、第１の時点および第２の時点は少なくとも５年間離される。方法のいくつかの様相において、第１の核酸サンプルおよび第２の核酸サンプルは、血液から抽出される。方法のいくつかの様相において、第１の核酸サンプルおよび第２の核酸サンプルは、循環する遊離核酸を含む。方法のいくつかの様相において、第１の核酸サンプルおよび第２の核酸サンプルは、循環する遊離ゲノムＤＮＡを含む。方法のいくつかの様相において、第１の核酸サンプルは第１の位置で個体から取得され、第２の核酸サンプルは第２の位置で個体から取得される。方法のいくつかの様相において、第１の位置は第１の癌組織を含む。方法のいくつかの様相において、第２の位置は健常組織を含む。方法のいくつかの様相において、第２の位置は第２の癌組織を含む。方法のいくつかの様相において、第２の癌組織および第１の癌組織は、共通の癌に由来する。方法のいくつかの様相は、第１の核酸サンプル中の第１のＭＥＩ挿入部位でのＭＥＩレベル、および第２の核酸サンプル中の第１のＭＥＩ挿入部位のＭＥＩレベルを示すレポートを生成する工程を含む。方法のいくつかの様相において、レポートは個体に提供される。方法のいくつかの様相において、レポートは健康管理の専門家に提供される。方法のいくつかの様相において、レポートは秘密に製作される。
【０００４】
いくつかの実施形態は、可動要素挿入物（ＭＥＩ）をモニタリングするレジメンに関し、該レジメンは、複数のＭＥＩ挿入境界を含むゲノム配列情報を個体から取得する工程、発癌遺伝子に隣接する境界を同定するために複数のＭＥＩ挿入境界を調査する工程、および発癌遺伝子に隣接しているＭＥＩ境界の量的存在率を経過観察する工程、を含む。方法のいくつかの様相において、発癌遺伝子に隣接しているＭＥＩ境界の量的存在量の経過観察は、第１の時点で第１の血液サンプルを取得する工程、第１の時点で第１の血液サンプル中のＭＥＩ境界の量的存在量を決定する工程、第２の時点で第２の血液サンプルを取得する工程、および、第２の時点で第２の血液サンプル中のＭＥＩ境界の存在量を決定する工程、を含む。方法のいくつかの様相において、発癌遺伝子に隣接しているＭＥＩ境界の量的存在量の経過観察は、第１の時点で第１の組織サンプルを取得する工程、第１の時点で第１の組織サンプル中のＭＥＩ境界の量的存在量を決定する工程、第２の時点で第２の組織サンプルを取得する工程、および第２の時点で第２の組織サンプル中のＭＥＩ境界の量的存在量を決定する工程、を含む。方法のいくつかの様相において、第１の組織サンプルおよび第２の組織サンプルは腫瘍組織を含む。方法のいくつかの様相は、発癌遺伝子中の欠損と関係する癌に対処するための処置を選択する工程を含む。方法のいくつかの様相は、ＭＥＩ挿入部位の量的存在量がサンプル中で第１の時点から第２の時点への閾値を超えて増加する場合に、発癌遺伝子の欠損と関係する癌に対処するための処置を実施する工程を含む。方法のいくつかの様相において、閾値は１０％の増加である。方法のいくつかの様相において、閾値は２０％の増加である。方法のいくつかの様相において、閾値は３０％の増加である。方法のいくつかの様相において、閾値は５０％の増加である。方法のいくつかの様相は、第１の時点に先立って発癌遺伝子の欠損と関係する癌に対処するための処置の第１の投与量を投与する工程、およびＭＥＩ挿入部位の量的存在量がサンプル中において第１の時点から第２の時点への閾値より下に減少しない場合に、投与量を増加させる工程、を含む。方法のいくつかの様相において、閾値は第１の時点の量の９０％である。方法のいくつかの様相において、閾値は第１の時点の量の８０％である。方法のいくつかの様相において、閾値は第１の時点の量の７０％である。方法のいくつかの様相において、閾値は第１の時点の量の６０％である。方法のいくつかの様相において、閾値は第１の時点の量の５０％である。方法のいくつかの様相において、閾値は第１の時点の量の１０％である。方法のいくつかの様相において、処置は化学療法を含む。方法のいくつかの様相において、処置は放射線療法を含む。方法のいくつかの様相において、治療は、ＭＥＩ挿入に隣接している配列の欠損を標的とする薬剤を含む。方法のいくつかの様相において、処置は、ＭＥＩ挿入部位に隣接している配列によってエンコードされたタンパク質が関与する経路の誤調節を標的とする薬剤を含む。方法のいくつかの様相において、治療は、ＭＥＩ挿入接合部に特異的に結合する核酸を含む。方法のいくつかの様相において、核酸はｐｉＲＮＡを含む。方法のいくつかの様相において、核酸はｓｉＲＮＡを含む。方法のいくつかの様相において、核酸はＣＲＩＳＰＲ核酸を含む。方法のいくつかの様相において、核酸は、ＭＥＩ挿入境界のメチル化を導く。
【０００５】
いくつかの実施形態は、発癌遺伝子に隣接するＭＥＩ境界におよび、検出要素と結合された核酸プローブを含む、癌組織のインビボの可視化用組成物に関連する。組成物のいくつかの様相において、検出要素は蛍光体を含む。組成物のいくつかの様相において、検出要素は光励起性成分を含む。組成物のいくつかの様相において、プローブは細胞膜を通過する。組成物のいくつかの様相において、プローブは細胞核膜を通過する。組成物のいくつかの様相において、プローブ螢光は、発癌遺伝子に隣接しているＭＥＩ境界を含む標的核酸配列に対するプローブ結合に依存する。組成物のいくつかの様相において、プローブは携帯型の蛍光体励起装置によって視覚化される。
【０００６】
いくつかの実施形態は、ゲノムの老化をモニタリングする方法に関連し、該方法は、第１の期間で第１の核酸サンプル中のＭＥＩ挿入部位の数を定量的に測定する工程、第１の期間で第１の核酸サンプル中のＭＥＩ挿入部位の数を定量的に測定する工程、および、ＭＥＩ挿入境界の増加をゲノムの老化の増加と相関させる工程を含む。方法のいくつかの様相において、ＭＥＩ挿入部位の数の１０％の増加は、ゲノムの老化を示す。方法のいくつかの様相において、ＭＥＩ挿入部位の数の２０％の増加は、ゲノムの老化を示す。方法のいくつかの様相において、ＭＥＩ挿入部位の数の３０％の増加は、ゲノムの老化を示す。方法のいくつかの様相において、ＭＥＩ挿入部位の数の５０％の増加は、ゲノムの老化を示す。方法のいくつかの様相は、ゲノムの老化が示される場合に、老化防止レジメンを推奨する工程を含む。方法のいくつかの様相において、老化防止レジメンはカロリー制限を含む。方法のいくつかの様相において、老化防止レジメンは、ＮＴＨＥの投与を含む。方法のいくつかの様相において、老化防止レジメンは、ＤＮＡメチラーゼの投与を含む。方法のいくつかの様相において、老化防止レジメンは、小さな調節ｅＲＮＡの投与を含む。方法のいくつかの様相において、老化防止レジメンは、逆転写酵素阻害剤の投与を含む。方法のいくつかの様相において、老化防止レジメンは、レトロウイルス阻害剤の投与を含む。方法のいくつかの様相において、老化防止レジメンは、ＨＩＶ阻害剤の投与を含む。方法のいくつかの様相において、老化防止レジメンは、ＡＺＴの投与を含む。方法のいくつかの様相において、老化防止レジメンは、ＨＢＶ阻害剤の投与を含む。方法のいくつかの様相において、老化防止レジメンは、リバビリンの投与を含む。方法のいくつかの様相において、老化防止レジメンは、トランスポサーゼ阻害剤の投与を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態は、第１の核酸サンプルおよび第２の核酸サンプルを比較する方法に関し、第１の核酸サンプルの複数のＭＥＩ境界に対する可動要素挿入物（ＭＥＩ）の境界配列を取得する工程、第２の核酸サンプル中の複数のＭＥＩ境界の存在を分析する工程、および、第２の核酸サンプルが第１の核酸サンプル中に存在するＭＥＩ境界配列を欠く場合に、第１の核酸サンプルと異なるものとして第２の核酸サンプルを同定する工程、を含む。方法のいくつかの様相は、第２の核酸サンプルが第１の核酸サンプル中に存在しないＭＥＩ境界配列を含んでいる場合に、第１の核酸サンプルと異なるものとして第２の核酸サンプルを同定する工程を含む。方法のいくつかの様相において、第１の核酸サンプルの複数のＭＥＩ境界に対する可動要素挿入物（ＭＥＩ）の境界配列を取得する工程は、第１の核酸サンプルの全ゲノム配列決定を行なう工程を含む。方法のいくつかの様相において、第１の核酸サンプルの複数のＭＥＩ境界に対する可動要素挿入物（ＭＥＩ）の境界配列を取得する工程は、第１の核酸サンプルの複数のＭＥＩ境界の標的とされる配列決定を行なう工程を含む。方法のいくつかの様相において、第２の核酸サンプル中の複数のＭＥＩ境界の存在を分析する工程は、第２の核酸サンプルの全ゲノム配列決定を行なう工程を含む。方法のいくつかの様相において、第２の核酸サンプル中の複数のＭＥＩ境界の存在を分析する工程は、第２の核酸サンプルの複数のＭＥＩ境界の標的とされた配列決定とを実行する工程を含む。方法のいくつかの様相において、第２の核酸サンプルの複数のＭＥＩ境界の標的とされた配列決定を実行する工程は、第１の核酸サンプルの各ＭＥＩ挿入部位を特異的に増殖させるプライマーを含むプライマーのパネルを、第２の核酸サンプルと接触させる工程を含む。方法のいくつかの様相において、第２の核酸サンプルの複数のＭＥＩ境界の標的とされた配列決定を実行する工程は、第１の核酸サンプルの各ＭＥＩ挿入部位に対し特異的にアニールするプローブを含むプローブのパネルを、第２の核酸サンプルと接触させる工程を含む。方法のいくつかの様相において、プローブのパネルは、基質に結合されたプローブが、基質に結合されないプローブに比べて差分的に視覚化できるように、蛍光体への少なくとも１つに結合されたプローブを含む。方法のいくつかの様相において、第２のサンプルは法医学サンプルを含む。方法のいくつかの様相において、第２のサンプルは植物サンプルを含む。方法のいくつかの様相において、植物サンプルは植物収穫物サンプルである。方法のいくつかの様相において、第２のサンプルは生物学上危険な物質を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態は、可動要素挿入阻害剤を含む、老化に関連したゲノム劣化の遅延化に使用される組成物に関する。組成物のいくつかの様相において、組成は逆転写酵素阻害剤を含む。組成物のいくつかの様相において、組成はレトロウイルス阻害剤を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本発明の新しい特徴は、添付された特許請求の範囲において詳細に述べられる。本発明の特徴および利点に関する十分な理解は、本発明の原理が利用される例示の実施形態を記述する下記の詳細説明と、添付の図面とを参照することにより得ることができる。
【００１０】
【図１】複合変移体を調査および／または検出するための標的配列決定の使用を図示する。
【００１１】
【図２】挿入事象の確認および／または定量のための、冗長性および標識の使用を表示する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
転位因子と呼ばれる可動要素挿入物（ＭＥＩ）はヒトゲノムの３分の２を構成する。古代のＭＥＩ活性の結果として進化した、何百ものヒト遺伝子がある。いくつかのＭＥＩは、現代のＡＬＵ配列を含み、ヒトゲノムにおいてまだ活性を有する。ニューロン細胞は高いＭＥＩ活性を有し、ウイルスＭＥＩの影響は、ゲノム上の癌において広範囲に役割を有する。ＭＥＩは、バイアス無しに、ゲノムのタンパク質のコード領域および非コード領域の両方で、確率的に生じる。それらはヒト宿主転写および細胞活動に影響し、したがって、宿主遺伝子の機能を妨害するときに高度に有害である。強いネガティブセレクションが、これら有害事象の生殖系列移行に対して生じる。ＭＥＩは癌および他の遺伝障害に関連しているが、体細胞性ＭＥＩの程度および範囲は、十分に研究されてなく、文献化もされていない。新しいＤＮＡ塩基配列決定テクノロジーは、例えば、サンプル調製および分析の方法が、疾患中の活性ＭＥＩの影響を定量するために必要な感度を欠いているために、この影響を説明するために苦慮する。偏った増殖のせいで、多くのそのような方法は、ＭＥＩの活性を誤って表示する。ＭＥＩの正確な検出のための方法は、体細胞性ＭＥＩによって影響される重要遺伝子（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｇｅｎｅ）を決定できること、および、疾患の進行にしたがって、それらの活性を定量できることが必要である。重要遺伝子の機能の妨害を検出し定量する非侵入性試験は、細胞健康状態の汎用試験であり、成人発病性疾患のほぼ全領域に関係している。
【００１３】
可動性のＤＮＡ要素は、進化および遺伝性疾患における病での主要な推進力である。可動要素は、ヒトゲノムのほぼ３分の２を含む。ＭＥＩの主要なタイプは、限定的ではなく、Ａｌｕ、ＬＩＮＥ、ＳＶＡ、タイプＩのレトロトランスポゾン、ＥＲＶ（内在性レトロウイルス）を含み、これらは総体として、モビローム（Ｍｏｂｉｌｏｍｅ）と呼ばれる。
【００１４】
次世代の配列決定テクノロジーは、ヒトゲノム中のＭＥＩの分布率に関する理解を増大させた。Ａｌｕ、ＳＩＮＥおよびＳＶＡ要素は、今日、ヒトゲノムにおいて活性を有する。ＭＥＩの特定のファミリーは、それらの挿入部位において共通配列特徴を有し、合成オリゴヌクレオチドが、これらの挿入事象の診断用配列を取り調べるために生産されることを可能にする。１０００のゲノムプロジェクトの公的にアクセス可能なデータ内での、遺伝ＭＥＩおよびそれらの集団的頻度の分析は、研究個体群で発見されたＭＥＩのほぼ全てが、希少であると考えられ、発生頻度は１０％未満であることを示している。ほとんどの遺伝ＭＥＩはタンパク質をコードせず、このことは、ＭＥＩは遺伝子機能が高度に破壊されており、したがって、自然淘汰的に削除されたことを示している。特に、体細胞性ＭＥＩは、組織特異性である。例えば、ＡｌｕとＳＶＡのＭＥＩとは、特に上皮癌における、共通の腫瘍特定事象であるが、血液または脳の癌において発見される可能性はない。これは、ＭＥＩ活性に対する環境効果を示している。ＭＥＩのストレス誘発性活性のさらなる証拠は、多くの転位因子が、熱ショックＴＦ結合部位に類似するプロモーター配列を有しているという事実からもたらされる。ＭＥＩの活性化とメチル化の減少との間には相関があり、これは、ＭＥＩ活性の制御機構として提案されてきた。体細胞性ＭＥＩ活性は、胚発生、腫瘍細胞株およびニューロン始原細胞においてが高いが、正常な体細胞組織中のＭＥＩ活性についてほとんど知られていない。
【００１５】
ＨｅＬａ細胞株は、何十年にもわたる癌研究の重要部であり、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子の上流にＨＰＶ挿入部位を有しており、それは、不特定の細胞分裂の原因であるかもしれない。
【００１６】
ＭＥＩは、ヒト遺伝子における、オープンリーディングフレームの破壊、または、代替スプライス部位、代替プロモーター部位または代替ｐｏｌｙＡシグナル信号の提供によって、ヒト転写を変更することができる。２００１年のヒトゲノムのドラフトによって、ヒトゲノムが、特に＞１００，０００の翻訳タンパク質と比較して、ざっと２０，０００の遺伝子しかコードしていないことに、多くの人が驚いた。最新の理解は、新しいスプライス部位（例えばＬ１、Ａｌｕ）を導入することによって、ＭＥＩを、この現象に関連づけている。ほとんどのＡｌｕ由来の遺伝子は代替的にスプライスされ、多くの代替的スプライシングは組織特異的である。大多数のヒト遺伝子は、代替的スプライス部位を利用し、遺伝子の代替的末端のＭＥＩ処理により影響を受ける。例えば、ＡＴＲＮ遺伝子は、イントロンにおいてＬ１要素を有する。代替的にスプライスされた遺伝子は、Ａｔｔｒａｃｔｉｎの可溶性形態をエンコードし、これは、炎症反応の一部である。この選択形態は、色素沈着とエネルギー代謝のレセプターとして働く。１２０を超えるレトロトランスポゾン配列が、機能的ヒト遺伝子へ進化した。新規の生殖細胞系ＭＥＩ突然変異の推定発生率は、Ａｌｕ、Ｌ１およびＳＶＡ要素それぞれに対し、２０回中１回、１００回中１回、１０００回中１回の範囲である。ＤＮＡメチル化は、宿主防御機構であることが示され、メチルトランスフェラーゼ欠乏マウスは、結果的に致命的になる、高い染色体不安定性を示す。小型ＲＮＡは、ＭＥＩの活性および効果の調節機構でもある。これら小型ＲＮＡも、ｐｉＲＮＡとｓｉＲＮＡのクラスを含み、ＭＥＩに由来する。転写へのＭＥＩの影響は、代替的スプライシング、代替的プロモーターまたは代替的ｐｏｌｙＡ部位を通じて、単一座で起こり得る。広域レベルでは、転写ネットワークはＭＥＩプロモーター活性によって制御される。胚性幹細胞は、遺伝子ネットワークのリンクを示す。ＥＳ細胞は、メチル化によって制御される遺伝子発現のネットワークを開始する、内因性レトロウイルスの長いタンデム反復のネットワークを示す。多能性状態において、ＥＲＶはメチル化によって抑制される。哺乳類の妊娠経路は、ＭＥＩ活性を通じて進化した。この遺伝子ネットワークは、プロゲステロン反応におけるＭＥＲ２０要素によって活性化される。例えば、プロラクチンプロモーターは、ＭＥＲ３９可動要素に由来する。胎児―母間交換用のＳｙｎｃｔｉｎ遺伝子も、ＥＲＶ遺伝子に由来する。ＥＲＶは、約３００から約１２００のヌクレオチドのＬＴＲの側方に位置する。多くのＭＥＩのサイズは、より多くの共通要素に対し、例えば約２００ｂｐから約１０ｋｂまで範囲とすることができる。
【００１７】
ＭＥ走査は、ヒトゲノムにおいて最も活性的な共通ＭＥＩである、ＡｌｕＹｂ８／９要素からの遺伝ＭＥＩを同定することができる、しかしながら、その方法は、本来定量的ではない。アフリカ対ヨーロッパの個体群を見るときに、これらＡｌｕ要素は、ＳＮＰの多様性特徴を模倣する。Ａｌｕコピーは、ヒトゲノムにおけるコード遺伝子を、大幅に数で圧倒し、および、体細胞性ＭＥＩ事象は、ＭＥＩ活性の脱抑制が腫瘍および老化細胞で生じるにしたがい、生殖細胞系事象を大幅に数で圧倒すると推測された。これらの要素の存在率および反復性は、その時の広範なゲノム調査に、問題を提起する。シーケンス深度が大きいほど、ＭＥＩを検出する感度は高くなるが、偽陽性は、ライブラリ準備工程の間に、キメラ分子の生成から発生する可能性があり、ある要素は、ＰＣＲのような工程におけるバイアスによって、過剰出現を生じる可能性がある。
【００１８】
前記実施例は、遺伝ＭＥＩの効果、それらの破壊効果、および、ネガティブセレクションを示すが、体細胞性ＭＥＩの分布率について多くが学習された。ＭＥＩのモザイク遺伝子は、ニューロン細胞において豊富である。ニューロンは、異数性とレトロトランスポジションのレベルを上昇させ、これが、ヒト脳内の機能的多様性に寄与している可能性がある。
【００１９】
体細胞組織中のＭＥＩの活性化が、老化に効果があることを示唆する証拠がある。通常の老化において、体細胞性ＭＥＩ転写は活性化を始める。これらの要素の活性レトロトランスポジションが、マウス中の進行した老化で生じ、これは、細胞老化の機能として上昇したゲノム不安定性に対応する。ＭＥＩの位置および存在率は、老化速度を制御すること、および複合ＤＮＡ構造体を維持することの無能力化が、組織の機能不全や器官の最終的な死滅の原因となる。これらの転位事象は、炎症のような、複数のストレス関連要因によって加速され得る。レトロトランスポジションは、ある場合、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の感染に使用される医薬品のような、逆転写酵素の阻害を通じて媒介される。マウスにおける自然発生の癌は、ＭＥＩ活性を増加させる。
【００２０】
癌はゲノムの疾患と考えられるので、癌は、体細胞性ＭＥＩ研究の最も普及している領域であり、必ずそのようで有り続けるであろう。ＨＢＶ組込み事象の影響と、肝細胞癌（ＨＣＣ）におけるそれらの役割とは、広範囲の全ゲノム配列（ＷＧＳ）を使用して分析することができる。技術的見地から、増加したシーケンス深度は、シーケンス深度に比例した挿入事象の数を用いて確認された、より多くの体細胞性挿入事象をもたらす。肝細胞癌（ＨＣＣ）腫瘍中のクローン性増殖は、同じ個体からの正常サンプルと比較して、同じ事象のより高い頻度をもたらす。平均して、ＤＮＡ由来の腫瘍において、ウイルスゲノムの２つのコピーは、宿主ヒトゲノムの各１つのコピーについて見つけることができる。直接的遺伝子破壊、ウイルスプロモータ駆動性ヒト遺伝子転写、ウイルス‐ヒト転写溶融、およびＤＮＡコピー数変移を含む、破壊的事象は、挿入部位の近くで発見される。挿入事象の確率的モデルに対する裏付けが存在し、これは、挿入がほぼランダムであり、恐らくクロマチンに巻きつけられないＤＮＡのアクセス可能性が唯一影響することを示唆する。従来のＰＣＲ系アプローチは、増殖バイアスにより、ある種の挿入事象の分布率をしばしば過大評価する。組込みは、腫瘍および正常肝臓組織の全体にわたり広範囲であるが、機能的影響が腫瘍細胞に制限され、存在率がこれらの細胞のクローン性増殖の結果である発癌遺伝子およびがん抑制遺伝子における挿入事象の明瞭なパターンが、腫瘍内に存在する。挿入「末端」は、ＨＢＶゲノムの明瞭な領域にマッピングされ、これは、挿入部位の検出目的に使用することができる。例えば重複配列要素であるＤＲ１とＤＲ２部位は、ＨＢＶの線状ウイルスにおけるＨＢｘ遺伝子の末端で発見される。確率的モデルは、転写からの融合生成物が、ゲノムのいかなる場所にもマッピングすることができること、したがって、挿入ポイントにおいて、ウイルスからの共通部位と、ヒトゲノムからのバイアスがない部位が存在することを示す。
【００２１】
ほとんどのＨＢＶ挿入部位は再発性ではないが、クローン性増殖を起こす腫瘍における主要挿入部位の存在率が著しく増加する。腫瘍中のほとんどの事象は、タンパク質をコードする遺伝子の近くで生じ、このことは、クロマチン中ではなく暴露されたＤＮＡが、それを挿入に対しアクセス可能性にすることを示唆している。腫瘍内においてプロモーターとエキソンへ向かう挿入事象に対する肯定的選択が存在する。ほとんどの挿入は、中立的であり、腫瘍遺伝子センサスデータベースにおける遺伝子内へ挿入されないように見える。腫瘍中の組込み部位の数は、結果物、または、生存のような他の医学的指標に対応し得る。例えば、＞３の挿入事象を有する腫瘍は、生存に対し、非常に大きな負の効果を与え得る。
【００２２】
様々な癌タイプの腫瘍からのＲＮＡ−Ｓｅｑデータは、宿主／ウイルス融合、特に公知の発癌性ウイルスを研究するために使用することができる。例えば、ＮＧＳ  ＲＮＡ−Ｓｅｑリードは、子宮頸癌、肝臓癌およびバーケットリンパ腫に対するそれらの影響を見るために、ＨＰＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＥＢＶおよびＨＨＶの共通ウイルス株にマッピングすることができる。新規の組立てを使用して、新しいＨＰＶ株を有するネガティブな子宮頸癌腫瘍を再分析することができる。ＰＣＲ分析は、ＨＰＶ組込みの存在率を誤表示する可能性がある。ＨＰＶの陽性の組込みは、腫瘍タイプや含まれていた組織にかかわらず、腫瘍クラスタリングを示すことができる。ウイルスＭＥＩは、ウイルス性発癌遺伝子の発現、または発癌遺伝子または腫瘍抑制因子の活性を感化させるための組込みによって、細胞形質転換を引き起こし得る。
【００２３】
ＭＥＩ検出およびその診断の含意の臨床的有用性については、目標とされた戦略は使用されなければならない。ＭＥＩは、モザイクであり、ＭＥＩのストレス誘発性活性またはウイルス誘発性ＭＥＩ活性のような、環境要因のある種の形態によって引き起こされる。ＭＥＩは、ゲノムの機能領域で発見された場合の大きな悪影響と同様、進化に劇的な影響を及ぼしたことが示された。遺伝パターンはＳＮＰのパターンをモデル化し、体細胞性ＭＥＩに対する影響は、ちょうど解明され始めたばかりの謎である。挿入部位を観察するとともに、すべての組織タイプ中のそれらの存在率を定量する能力は、おそらくは血液、または、細胞を含まない血中ＤＮＡを代用物として使用して、細胞健康を決定するための有用なツールである。診断目的と、小型ＲＮＡによる特定の個体に対する合理的な治療的介入、メチル化、または逆転写酵素の阻害と、の両方のために、これらの活性化された可動性または侵入性のゲノム要素の標的が使用され得る。個体中のこれらの要素、特に個体の疾患に対する影響を理解することは、新しい治療および診断のオプションを可能にする。例えば、癌を引き起こすＭＥＩの事象は、発癌遺伝子または腫瘍抑制因子を攪乱する。生きている組織内の様々な手段を通じて活性化された蛍光プローブは、それらの細胞を外科手術中に抽出するために標的にするのに使用される。プローブは、可動要素と、このプローブが攪乱するヒト宿主遺伝子配列との接合部におよび、有効性を特定の接合事象のみに結びつけることによって、外科手術から抽出するためのマーカーまたはビーコンを提供する。
【００２４】
ＭＥＩは、おそらく起原がヒト以外であり、時間をかけて進化し、あるいはウイルス感染によって導入される。それらの主な目的は、ウイルスの観点から見ると、生存である。感染、炎症、アルコールのような毒性、物理的圧力、潰瘍などによって誘発される細胞のストレスはすべて、細胞の生存に影響し、したがって、ＭＥＩの活性が増大する。活性化したＭＥＩの脱調節は、単に偶然によって生じる可能性がある。次いで、活性化したＭＥＩは、染色体を再配列するか、または細胞性転写を変化させる。これらの効果は、適度かもしれないし、破滅的であるかもしれない。１個の細胞が脱抑制されると、その結果、クローン的に膨張する。活性ＭＥＩによって破壊された遺伝子が、膨張速度を決定する。細胞増殖遺伝子または調節遺伝子が破壊されると、それらが分裂する細胞の速度が増大し、腫瘍成長を引き起こす。反対に、癌非関連遺伝子は、攪乱され、重大な細胞機構の活性化／脱活性化を起こし得る（例えばアポトーシス、壊死、増殖、細胞分裂）。例えば、アポトーシス経路が不活性である場合、細胞は分裂し続けて器官内での拡散を増加させ続け、器官機能にネガティブな影響を与え始める可能性がある。結局これは、機能低下に通じるであろう。攪乱される遺伝子は、挿入事象の数と同様に、細胞健康または疾患進行の診断の両方の指標として機能することができるであろう。いくつかの場合において、これらの細胞のうちの一部は死滅するかもしれず、また、これらの細胞からのＤＮＡは、細胞を含まない血中ＤＮＡとして見出し得る。これらの希少事象を検出するのに十分な感受性を有し、これらの希少事象を定量するのに十分な精度を有するテクノロジーを用いて、これらの細胞を含まない分子の増加をモニタリングする工程は、分子医学の主要部になるであろう。若年時の基準線で開始する事象の数と、それらによって攪乱される遺伝子の数との両方は、すべてのヒト器官の細胞機能をカタログ化し、それらの寿命全体にわたり個体の細胞健康をモニタリングすることを可能にするであろう。これらの診断テストは、ＭＥＩ攪乱によって影響を受けたほぼすべての成人発病性の疾患および障害の早期発見および予防に通じ得るであろう。脳内における増大した体細胞性活性は、癌、アルツハイマー病やパーキンソン病のような神経変性障害、または自閉症のような他の障害に通じ得るであろう。ＭＥＩは、体細胞性活性と同様に、遺伝的構成要素の両方を含んでいる。これらの関係は、これらの障害の多くの欠けている遺伝力、および、これらの要素の活性化が誘発されたストレスまたは環境について説明し得るであろう。これは、これら複合体障害に対するエレガントな説明となる可能性がある。
【００２５】
ＭＥＩは、我々のＤＮＡにおける、本当に個々のゲノムの唯一のマーカーを表わす。ほとんど同一のＤＮＡを有する双子に対し、今日のシーケンサーを使用して絶対差を検出することは、エラー率により不可能である。反対に、ＭＥＩスペクトルを調査することは、２つの類似ではなく同一のゲノム（例えば双子）の間の、疾病を引き起こす、遺伝的差異を決定し得るであろう。さらに、ＭＥＩの本当に固有の遺伝子構造は、唯一の本当に固有の身元確認の法医学的マーカーを構成する。最も単純な実施例は、密接に関連する個体または双子の例である。ＭＥＩは、従来のＳＮＰ試験またはマイクロサテライトマーカーとの組合せで、最も酷似したゲノム配列さえ明確に除外することができた。
【００２６】
個人のゲノム上で生成される配列情報の量の増加、および、その情報の公的な共有に対する意欲の増大により、ゲノム同一性の偽造に対する可能性は、確かに現実的である。ＰＣＲ分析用プライマーに対するより高い結合性を有する合成ＤＮＡ配列は、いくつかの場合において、パブリックドメイン、研究分野を通じて、または、遺伝子実験会社のサイバーセキュリティの不足を通じても、アクセスされた個体配列データから生成される。これらの非常に効果的なＤＮＡ配列を有する個体の血液のドーピングは、おそらく個体の健康に影響を及ぼさず、仮にそうだとしても、個体はその危険を受け止める覚悟があるかもしれない。血液がＤＮＡ鑑定のために採取されるときに、これらのより有効な分子は、個体の同一性を混同するか、または完全に遮蔽するかもしれず、あるいは、サンプルを別の個体として表示さえし得る。ＭＥＩ、特に体細胞性ものとして最新の活性を有するものは、いくつかの場合において、ゲノム中のこれら体細胞性事象の位置とともに、複合的バックグラウンドでのそのような事象の量との両方を理由として、ゲノム的身元確認として使用される完全に固有の身元確認戦略を示すであろう。
【００２７】
これらの法医学の目的を、農業におけるＧＭＯ収穫物の検出にも使用し得るであろう。ＧＭＯ農場からの種子は、容易に近隣の農場へ広げることができるであろう。多くの農業会社が、それらの知的財産の不必要な移転の範囲を決定するために、近隣の農場におけるこれらの転位された要素を検出する。きわめて感度が高いこれらの診断マーカーを定量する方法は、それら生産物に紛れ込んだ有機体の比率を検出し定量する能力を実現するであろう。ＰＣＲ方法および他のバイアスをかけた戦略は、このレベルの感度を提示しない。
【００２８】
ＭＥＩは、化粧品産業にも同様に、大きな影響を及ぼすかもしれない。ＭＥＩ活性化が細胞老化に関連しているので、それは、皺または脱毛の原因を研究し決定するための独特な方法を示す。ＭＥＩは遺伝され、体細胞的に活性化され、または、ウイルス誘発され得る。すべては、ゲノムおよびその機能の破壊に帰着する。攪乱される遺伝子の決定は、それらの活性を縮小または除去するための治療および化粧的関与に対する新しい標的を表わす。ＭＥＩ活性の速度およびレベルのモニターは、カロリー制限のような自然な手段、または薬理学的関与の増加された投与量を通じて、関与のシグナルとなり得る。
【００２９】
細胞健康をモニタリングする試験は、若年時のＭＥＩ活性の基準線から始めて、本明細書に開示されるように、すべての個体に対する頻度試験オプションである。
【００３０】
本明細書での全体にわたって、開示は、理解を容易にするため、セクションに分けられる。これらの分割は、理解を容易にするためと理解されるべきであり、明細書のいくつかのセクションの互いに対する適用可能性を制限する必要はない。従って、明細書の任意の１つのセクション中の開示は、いくつかの場合において、そのセクションだけでなく、他のセクションに関連し、いくつかの場合において全体的な開示に関連する。
【００３１】
体細胞のＭＥＩ検出および定量化のための方法
ＭＥＩ検出のための現在の全ゲノム方法は、全ゲノム配列決定およびバイオインフォマティクス解析を含む。ＭＥＩ事象は、配列の一部がヒトの基準ゲノムにマッピングし、他の部分が適切にマッピングしない、「分割リード（ｓｐｌｉｔ−ｒｅａｄｓ）」を引き起こす。メイトペアリードまたはペアエンドリード（Ｍａｔｅ  ｐａｉｒｓ  ｏｒ  ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄ  ｒｅａｄｓ）は、ＤＮＡ分子のマッピングされていないまたはリンクされた一部の位置を固定するための、１つのリードのすべてまたは一部を使用する能力を提供している。超並列配列決定（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、冗長な質問（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）およびより大きなサンプリングを介する信頼度の増加を可能にする。しかしながら、その増加したサンプリングには、劇的なコストの増加が伴う。より深い配列決定深度は、ＭＥＩ検出に関する感度に比例する。全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）の手法は、不要なデータおよび倫理的考察と同様にコストの増加に関する問題をもたらしているが、いくつかの場合においてサンプル全体にわたるＭＥＩ挿入部位の偏りのない検出という利点を有する。いくつかの場合では、これらの方法は、中性のＭＥＩと疾患を引き起こすＭＥＩとの間の差を判定するのに重要である、いくつかのＭＥＩ事象を定量化する能力を阻害するであろう配列特異的な増幅バイアスを導入する。
【００３２】
ＭＥＩのためのいくつかの以前の目的の方法には、一般に、半特異的なＰＣＲの変異体を伴う。これらの方法は、以前に議論したように、いくつかの場合において配列特異的なバイアスが原因で定量的ではなく、配列増幅効率が原因で他の方法よりもいくつかのＭＥＩ位置の数を劇的に過剰に示している（ｏｖｅｒ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ）。体細胞のＭＥＩ事象が、中性であり、それ故、確率的に（ランダムに）表わされるかどうか、あるいは癌でのようにクローン的に広がったかどうかを判定する方法はない。さらに、ＭＥＩの挿入末端に対する遺伝子座特異的プライマーの設計の柔軟性が限定される。配列が、増幅を引き起こさないまたは効率的増幅をほとんど引き起こさないほど十分に変異させられるかまたは異なる場合、特異的事象の数の定量化は不可能である。したがって、配列結果が元の核酸サンプル中の鋳型の量を定量的に反映することを確かなものとするために、これらの方法を使用するときには注意を払わなければならない。
【００３３】
いくつかの適切な標的とした体細胞のＭＥＩ検出法は、ＭＥＩの挿入末端がしばしば反復性であるかまたは変更されるために、冗長性を提供することができる。活性な（Ａｃｔｉｖｅ）体細胞のＭＥＩは，現代的であり、古代の不活性なＭＥＩと比較してそれほど切断されないが、診断配列の点から変異させ得るかまたは最小限にされ得る。したがって、複数の冗長な遺伝子座特異的なプライマーは、ＴＳＲなどのＭＥＩの挿入末端あるいはＨＢＶの場合のＨｂｘ遺伝子の近くのＤＲ１／２診断領域に対して設計される。ＭＥＩ事象の複数の独立したサンプリングが、事象の内部確証およびより高い感度および特異性を可能にするため、これらの複数の異なる出発点も、ＭＥＩの確証を可能にする。さらに、天然の標識、または代替的な３’末端は、ＮＧＳライブラリ分子のために生成されるべきである。冗長なプライマー部位およびＮＧＳライブラリ分子の代替的な３’末端による天然の標識の組み合わせは、ＤＮＡ鋳型の独立したサンプリングを示し、これは、あらゆる局所的な挿入事象が、増幅工程の間にクローン化人工物（ｃｌｏｎａｌ  ａｒｔｉｆａｃｔｓ）の除去を介して確証および定量化することができることを保証している。さらに、キメラ分子が、これらの準備工程の間に生成され得、その結果、偽陽性となり得るため、そのような方法は、準備プロセスにおけるフラグメンテーションおよび連結を回避する必要がある。
【００３４】
他の定量化方法は、本明細書で熟考され、ＭＥＩ部位に関して本明細書に開示される方法は、いかなる単一の定量化方法によっても制限されない。様々な方法が、代替方法、各々が示す強調する課題および利点、および各手法が本明細書に開示される方法に適用可能とするための留意点として本明細書に示される。
【００３５】
本明細書における本開示の様々な実施形態は、１つ以上のＭＥＩ事象のその挿入物に隣接するゲノム配列に関連した定量化を含む。定量化は、多くの手法によって達成される。時にＭＥＩおよびその挿入物に隣接するゲノム配列とも呼ばれる、ＭＥＩは、最初に、非標的手法で全ゲノム配列決定によって、または特異的または半特異的なＰＣＲによって、あるいは当該技術分野で既知の他の手法によって特定される。挿入物に隣接する配列を決定するための当該技術分野で既知のＴＡＩＬ−ＰＣＲまたは他の手法が、いくつかの実施形態において使用される。多くの実施形態では、全ゲノム配列決定または他の非標的手法は、挿入物に隣接する境界に対する最初のＭＥＩマッピングに好ましい。フォローアップアッセイにおいて、全ゲノム手法が、いくつかの実施形態において使用され、一方で、特異的なＭＥＩおよび挿が隣接した配列に対する標的アッセイは、代替的なフォローアップアッセイまたは全ゲノムアッセイと組み合わせて使用される。
【００３６】
核酸サンプル中のＭＥＩ挿入物に隣接する配列接合の存在量の定量化は、多くの代替的または調整的な手法によって達成される。特異的なＭＥＩ挿入境界は、与えられたＭＥＩおよびその挿入物に隣接する配列に及ぶ、リードの数、特有のリードの数、または個別に導き出したリードの数を、以下のいずれか１つまたはそれ以上と比較することによって定量化される：サンプル中の核酸の量；核酸サンプル中の既知の単一コピー配列にマッピングする、リードの数、または特有のリードの数、あるいは個別に導き出したリードの数、別々のＭＥＩおよびその挿入物に隣接する配列にマッピングする、リードの数、または特有のリードの数、あるいは個別に導き出したリードの数；あるいは異なる時点で同じＭＥＩおよびその挿入物に隣接する配列にマッピングする、リードの数、または特有のリードの数、あるいは個別に導き出したリードの数。いくつかの場合では、特異的なＭＥＩ挿入部位は、入力核酸の合計量に対するその挿入部位に及ぶ、個別のリードの数を測定することによって定量化される。いくつかの場合では、特異的なＭＥＩ挿入部位は、核酸サンプルの既知の特有の遺伝子座にマッピングする個別のリードの数に対するその挿入部位に及ぶ、個別のリードの数を測定することによって定量化される。いくつかの場合では、特異的なＭＥＩ挿入部位は、既知のコピー数のマルチコピーの遺伝子座にマッピングする個別のリードの数に対するその挿入部位に及ぶ、個別のリードの数を測定することによって定量化される。いくつかの場合では、特異的なＭＥＩ挿入部位は、第２時点のサンプルからその挿入部位に及ぶ個別のリードの数に対する第１時点のサンプルからのその挿入部位に及ぶ個別のリードの数を測定することによって定量化される。定量化できる蛍光レベルを有する蛍光プローブへのハイブリダイゼーションによる定量化などの、代替的な定量化方法は、組み合わせてまたは代替方法として熟考される。
【００３７】
図２は、ＭＥＩ挿入部位の定量化に使用するための複数の個別のリードの例を示す。各リードは、ＭＥＩおよび挿入物に隣接する配列を含み、５’末端、３’末端および挿入長の特有の組み合わせを有する。したがって、各リードは、特定され得、クローン的に増幅されたＰＣＲ産物ではなくむしろ、ＭＥＩおよび挿入物に隣接する配列の個別の表示となり得る。
【００３８】
設計
ＭＥＩの各ファミリーは、ＭＥＩの挿入末端で同様の配列を有している。例えば、Ａｌｕｓでは、反復配列の側方に位置する７ｂｐの診断配列が存在し得る。末端の長さは、変わり得るおよび／またはいくつかの反復配列を有し得る。ＡＬＵ配列には、ｐｏｌｙＡ配列の伸長部分（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ  ｏｆ）も存在し得る。ｐｏｌｙＡ配列は、部分的に標的とされ得る。ＤＲ１およびＤＲ２などの、配列相同性を有する直列反復領域も、標的とされ得る。より長いリード長（例えば、ＭｉＳｅｑ  ２ｘ３５０リード）、ペアエンド配列決定のためのより長い挿入物（例えば５００ｂｐの挿入物）およびｄｄＮＴＰ取り込みによる制御可能なフラグメント長を使用して、複数のプライマーは、可動要素のＤＲ１およびＤＲ２の領域の各鎖に設計され得る。例えば、可動要素（例えば、Ａｌｕｓ、ＬＩＮＥ、ＳＶＡ、ウイルスＭＥＩなど）の各末端で１ｋｂの領域を標的とするために、複数の重複しないプライマーは、最末端（末端反復の近く）からより複雑な配列を介してより高い特異性を提供するように設計され得る。いくつかの場合では、少なくとも約３つのプライマーは、ＭＥＩの各隣接要素に使用され得る。ＰＣＲとは異なり、鎖置換ポリメラーゼを用いる線形プライマー伸長により、複数のプライミング部位は、互いに干渉しない。要素の各ファミリーは、生成される合成配列を介する配列決定によって要素タイプをすぐに識別するのに十分な配列の不一致を有し得る。各要素ファミリー内の複数のプライマーは、自己組織化のために一緒に識別され、ビニングされ（ｂｉｎｎｅｄ）得る。いくつかの場合では、リードは、重要遺伝子に対する妨害があるかどうか判断するのに十分な確実性を有してマッピングされ得る。その後、同じＭＥＩのための複数のプライマーは、キメラ分子から生成された非ＭＥＩ配列を単に比較することによって、同じＭＥＩ破壊事象の個別の確証として使用され得る。複数のプライミング事象（例えば、ＭＥＩ当たり約３乃至約１０）とともに、単一プライマーの各々は、ゲノムの複数のコピーから同じ事象の複数のコピーを生成する。天然の標識および３’合成標識は、鋳型の個別のサンプリングを判定し、事象をさらに確証するために使用され得る。興味深いことに、事象の相対的な時期（ａｇｅ）を判定するために、同じ方法が使用され得る。より古いＭＥＩ事象は、ＭＥＩ配列自体内の切断された末端または突然変異を有する傾向があり、これらの事象は、典型的に、カット・アンド・ペーストまたはコピー・アンド・ペーストの作業に必要とされる挿入配列を欠くために、不活性なものとして示される。
【００３９】
本開示はまた、遺伝病においてＭＥＩを検出するための方法を提供する。全長ＭＥＩの存在下では、ＭＥＩが体細胞性であるかまたはまだ活性であるかをさらに判定するために、データの他のソースが使用され得る。一般に、切断事象は、不活性なＭＥＩを示し得、これは、遺伝され、大多数の分子において発見される傾向にある。他方では、（細胞老化の指標であり得る）新しい体細胞のＭＥＩ活性は、分子のほんの数パーセントで見られ、これは、極端な配列深度が必要とされる理由である。逆算によって、体細胞の活性の割合は、２５の細胞分裂においておよそ１である。ヘテロ接合集団（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）において、これは、与えられた組織または生検から５０のＤＮＡ分子において約１に翻訳する。５０事象における１事象について、各個々の事象に対して３つのリードを用いて、１５０ｘの配列決定深度が必要とされる。潜在的に高い異質性およびこれらの多くがシングルトン事象（ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｖｅｎｔｓ）であるという事実を考慮して、平均で少なくとも１０００倍の適用範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）が、腫瘍を分析するために提供されることが可能であり、もしかすると、Ａｌｕｓなどの古いＭＥＩに対する内因性の活性を分析するための適用範囲よりさらに高いかもしれない（例えば、約１００万倍の適用範囲）。
【００４０】
データの他のソースは、それらが撹乱する遺伝子からのものであるが、事象の数からのものでもあり、これは、事象がクローン的に増幅される場合である。例えば、ＨＰＶまたはＨＢＶなどのウイルスは、それら自体をゲノムの多くの領域にランダムに挿入する。それは、各個々の事象にわたる一様なレベルの標準化された適用範囲につながる確率的事象である。事象が、細胞増殖遺伝子（例えば、発癌遺伝子または腫瘍抑制因子）に衝突する場合、これらの細胞タイプのクローン性増殖が観察され得る。そのため、特異的なＭＥＩ事象の数は、バックグラウンドのシングルトン（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ）またはダブルトンの（ｄｏｕｂｌｅｔｏｎ）体細胞事象の数と比較したときに、疾患の診断の指標として作用する。単細胞の研究については、同じ細胞における複数の事象が、腫瘍中で示されたような結果の指標となり得る。異質な腫瘍を検査することによっても、その各々が感染したが非腫瘍の細胞の集まりを有するため、別のレベルのデータが提供され得る。腫瘍を引き起こす事象に対するバックグラウンド事象の比率は、事象の各々にわたる配列決定深度の適用範囲を平均化することによって計算され得る。例えば、３倍以上の増加は、腫瘍を引き起こす事象対良性事象のカットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）になるだろう。これは、処置の間の血液中の特異的な腫瘍に対するモニタリングする標的として、または疾患進行を判定するために使用され得るか、あるいは腫瘍の除去が完了したことを確かなものとするために手術中の摘出のための（事象に及ぶ）プローブとして使用される。例えば、肝細胞におけるＨＢＶ感染の場合には、線状ウイルス中のＨｂｘ遺伝子近くのＤＲ１またはＤＲ２の領域の挿入末端を標的とする３つの異なるプライマーが、ＨＢＶ配列に対する特異的なプライマーを用いてリードのすべてを識別するために使用され得る。ゲノム中の与えられた位置からデータを生成した３つのプライマーの各々からの平均の適用範囲深さを計算し、与えられた事象の平均深さを他のランダムな挿入事象の平均深さと比較することによって、より高い平均の適用範囲事象が、クローン性増殖につながり得る主要な挿入部位として強調され得る。いくつかの例では、与えられた事象の平均深さは、他のランダムな挿入事象の平均深さの約１．２倍、約１．４倍、約１．６倍、約１．８倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、または約１００倍であり得る。３つの異なるプライマーは、より効率的な配列（例えば、より低いＧＣ含量領域）から増幅人工物を除去するために使用され得る。天然およびランダムな合成標識は、いずれか１つの事象のクローン増幅を除去するために使用され得る。要するに、各事象を確証し、定量化するための情報の複数のソースがあり得る。
【００４１】
本開示は、各々がＭＥＩ事象を表わす分子のライブラリを含む組成物を提供することができる。ライブラリは、多重フォーマットで存在し得る。
【００４２】
本開示は、生殖細胞系中の世代に渡されるすべての既知の癌を引き起こすウイルスおよび／またはすべての既知の活性なＡＬＵおよびＭＥＩに対して試験する方法をさらに提供することができる。該方法は、癌遺伝子破壊、細胞老化、各々の組織特異的なＭＥＩ事象（例えば、老化脳におけるアルツハイマー病）における重要遺伝子の破壊、および／または細胞の健康および老化に関する試験などの用途に使用され得る。
【００４３】
本開示は、既知の挿入部位配列からゲノム中の未知の配列を生成する方法を提供する。未知の配列は、遺伝子の破壊を判定するために使用され得る。リードからの合成プライマー配列は、配列決定されるＭＥＩタイプを決定するために使用され得、ゲノム配列は、破壊された遺伝子を識別するために使用され得、および天然および合成の標識は、各事象の定量を決定するために使用され得る。したがって、全体的な活性（事象の総数）と同様に事象の位置および数量はすべて、成人発症の疾患および細胞の健康における診断上または予後の判定に重要であり得る。
【００４４】
挿入の領域に対するプライマー設計が、ＭＥＩの５’または３’挿入部位で既知の診断配列において生じる。２０、５０、１００の塩基対のウィンドウに分割されて、特有のまたはいくらか特有のプライマー配列は、ＴＭ、縮重位置（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）および反復位置を考慮に入れて設計される。プライマー設計は、挿入末端から開始する複数のプライマーが設計されるという点で冗長である。すべての既知のＭＥＩウイルスおよび内因性のＭＥＩ配列に対して設計された単一のプライマーライブラリが、開発され、合成され、等モル比でプールされる。
【００４５】
プライマーは、使用されている配列決定プラットフォームのアダプター補体（ａｄａｐｔｅｒ  ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）に対応する５’末端で分子「尾部（ｔａｉｌ）」を含む。随意の分子バーコードが、いくつかの場合においてサンプル多重のための合成工程に含まれる。
【００４６】
プライマー伸長が、一様温度で鎖置換ポリメラーゼの使用によって、または熱的に安定なポリメラーゼの使用およびプライマー伸長反応の循環によって生じる。ポリメラーゼは、修飾塩基または水酸基を欠く３’末端を有する塩基を組み込みながら伸長する能力を有さなければならない。
【００４７】
天然のｄＮＴＰとビオチン化したｄｄＮＴＰの組み合わせが、反応混合物において使用される。天然のｄＮＴＰに対するｄｄＮＴＰの比率は、伸張分子のフラグメント長を決定する。例えば、ｄｄＮＴＰの１％の画分を使用することで、任意の与えられた塩基で末端分子を組み込む１／１００の可能性がもたらされる。典型的な結果は、１％のｄｄＮＴＰ比率が、およそ５００ｂｐのフラグメントピーク（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｐｅａｋｓ）をもたらすことを示す。これは恐らく天然のＮＴＰ対変更されたＮＴＰの取り込みの効率性の差が原因である。
【００４８】
結果として生じる分子は、５’末端での合成配列および３’末端での患者由来の配列から成るキメラ分子である。分子は、末端の、ビオチン化したヌクレオチドで終端する。
【００４９】
分子は、親和性反応のゲノムバックグラウンド（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）の使用によって精製される。ストレプトアビジンをコーティングした磁気ビーズが、この工程に使用される。４つのビオチン化した分子は、ストレプトアビジン分子につきビーズ上に結合し、残りのｄｄＮＴＰ、ｄＮＴＰおよび未使用のプライマーが除去される。
【００５０】
第２プライマー伸長反応が、３’末端での８のヌクレオチドおよびシーケンサープラットフォーム（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）に対応するＢアダプター補体から成るランダムなプライマーの使用によって生じる。ランダムなプライミングが、分子にわたって生じるが、鎖置換ポリメラーゼの使用によって、最も遠位のランダムプライマーおよびその伸長した産物のみが、ストレプトアビジンビーズに水素結合したままとなる。Ｂ反応からのコピーされた分子は、Ａプライマー全体を通って元の鎖上に流れ（ｒｕｎ）、５’Ｂアダプター、８ｂｐの合成ランダム配列、ＭＥＩ挿入物のヒト宿主のゲノム配列部位、ＭＥＩ遺伝子座特異的なプライマーの合成配列、および３末端でのＡアダプター補体を有する一本鎖分子をもたらす。これらの分子は、ストレプトアビジン結合した分子から変性され、全長シークエンサーアダプター、およびサンプル多重が必要とされる場合に、随意の外部バーコードを組み込むためにＰＣＲ増幅される。
【００５１】
このキメラリードの構造（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｒｅａｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）およびその特徴は、データ分析に多くの利点を有する。プライマーの合成遺伝子座特異的な配列は、どのＭＥＩがリードにおいて標的とされるかを判定するために使用される。同じＭＥＩ種に対して異なる伸長開始点を結果的にもたらす冗長なプライマー部位は、挿入事象の内部確証として使用され得る。これはまた、それほど効率的でないまたは不適切に設計された遺伝子座特異的なプライマーに関する脱落（ｄｒｏｐ  ｏｕｔ  ｆｏｒ）を回避する。遺伝子座特異的なプライマーは、ウイルスＭＥＩに加えて、Ａｌｕｓ、ＬＩＮＥを含む、すべての既知のＭＥＩのために使用され得る。既知のウイルスの全領域が、低い（ｂｅｉｎｇ  ｌｏｗ）同じサンプル中の複数のウイルスの可能性を有して単一のライブラリにおいて設計されるだろう。ウイルスプライマーの多くが、任意の与えられたサンプル中でデータを生成しない傾向にある。
【００５２】
３’フラグメンテーションおよび変更された３’配列は、内部の分子標識または天然のバーコードとして作用する。２つのリードは、異なる天然の標識（３’配列）を有する場合、確実に鋳型ＤＮＡから独立したリードとなり得、クローンのエラーにはならない。
【００５３】
Ｂアダプター反応からの合成配列のランダムな８ｂｐも、確率的な標識として作用することができる。ランダムな３’配列とランダムな８量体からの確率的な標識の組み合わせは、リードが、独立しており、クローン的に増幅されないことをさらに保証するために併用して使用され得る。
【００５４】
データ分析中に、与えられたＭＥＩからのリードは、最初にアダプター配列を切り取られる（ｔｒｉｍｍｅｄ  ｏｆ）。シーケンサー・ラン（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｒｕｎ）が多重バーコードを付けたサンプルを含んだ場合、分子バーコードが識別される。合成遺伝子座特異的なプライマーに対応する最初の５−２５の塩基は、標的とされているＭＥＩ事象を判定するために識別される。その後、塩基は、マッピングおよびアセンブリに対するリードから切り取られる。残りの配列は、ヒトの基準ゲノムに対してマッピングされ、重複するリードにわたって組み立てられ、ヒトゲノム中の挿入位置に関する証拠を提供する。二重のリードは、それらの３’末端および確率的な標識に基づいて除去される。ペアエンドリードに関して、第２リードは、挿入部位に対する重複するリードを提供するために縮小されている挿入物サイズで個々にマッピングされない場合に補充される。ＭｉＳｅｑシステムを使用して、３００ｂｐの挿入物サイズ（ＩＬＭＮクラスター生成に好ましい）で、約４００−５００ｂｐの累積的な配列が、位置的マッピングのために生成される。クローンのリードがすべて除去された後、事象の位置および数は、各位置に対して定量化される。
【００５５】
したがって、本明細書には、可動要素挿入（ＭＥＩ）の挿入部位配列および可動要素活性に関する、方法、組成および使用の方法が開示され、例えば、それらはヒトの健康に関する。ヒトの可動要素は、ＤＮＡトランスポゾンまたはレトロトランスポゾンとして分類され得る。ＤＮＡトランスポゾンは、カット・アンド・ペースト機構によって移動する。レトロトランスポゾンは、レトロトランスポジションと呼ばれるプロセスである、ＲＮＡ中間体を介するコピー・アンド・ペースト機構によって動く。
【００５６】
ヒトの疾患に関係する可動要素が、当該技術分野で知られている。典型的な可動要素は、限定することなく、Ｌ１、Ａｌｕ、ＳＩＮＥ−Ｒ／ＶＮＴＲ／Ａｌｕ（ＳＶＡ）、プロセス偽遺伝子、およびヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）を含む。タンパク質をコード化する遺伝子座の５’に位置するレトロトランスポジションは、代替的なプロモーターとして頻繁に機能する。例えば、キャップ分析遺伝子発現（ｃａｐ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）およびピロシーケンスによって評価されるように、遺伝子の３’ＵＴＲ（非翻訳領域）に位置するレトロトランスポゾンは、それぞれの遺伝子の発現を縮小する強い証拠を示す。レトロトランスポゾンの低メチル化は、レトロトランスポゾン自体の転写または近くの遺伝子の転写のいずれかに影響を与えると知られている。例えば、ＭＥＴ（肝細胞増殖因子受容体）の発癌遺伝子に関係するＬ１中のプロモーターのメチル化の増加は、腫瘍を有する膀胱の尿路上皮内の代替的なＭＥＴ転写を引き起こすと知られている。
【００５７】
同様に、多くのヒトレトロウイルスは、「可動要素」を構成し、ヒトゲノム配列に対するその影響のために本明細書で熟考される。多くのヒトレトロウイルスが、当該技術分野で知られている。レトロウイルスは、以下の２つの形態で存在すると知られている：それらの染色体ＤＮＡ中の正常な遺伝要素（内在性レトロウイルス）として、およびヒトからヒトに伝搬される、水平伝搬された感染性ＲＮＡを含有するウイルス（外在性レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ、ヒトＴ細胞白血球ウイルス、ＨＴＬＶ）として。ヒトレトロウイルス挿入によるＤＮＡへの異常な変化は、疾患の発症に関係していると知られている。ヒトＤＮＡに挿入する典型的なヒトレトロウイルスは、限定することなく、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、およびＨＳＲＶを含む。
【００５８】
本明細書には、細胞増殖にタグ付けされた可動要素挿入物（ＭＥＩ）を同定する方法が開示される。いくつかの場合では、これらの方法は、第１核酸サンプル中の第１ＭＥＩ挿入部位でＭＥＩレベルを定量的に測定する工程；第２核酸サンプル中の第１ＭＥＩ挿入部位でＭＥＩレベルを定量的に測定する工程；および第１核酸サンプル中の第１ＭＥＩ挿入部位でのＭＥＩレベルが、第２核酸サンプル中の第１ＭＥＩ挿入部位でのＭＥＩレベルと実質的に異なる場合に、第１ＭＥＩ挿入部位を細胞増殖にタグ付けされたＭＥＩとして同定する工程、を含む。
【００５９】
いくつかの場合では、サンプル核酸量は標準化され、一方、代替的な場合では、核酸量は、例えば、半数体ゲノムにつき単一のコピーで存在すると健康な個体において知られている核酸の１つまたは複数の核酸のレベルを測定することによって標準化される。いくつかの場合では、サンプルにいる場合、「実質的な差（ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」は、核酸存在量または核酸相対的存在量、あるいは標準化された核酸存在量が、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、または５０％以上異なるサンプルのときに生じる。いくつかの場合では、「実質的な差」は、５％の差を指す。いくつかの場合では、「実質的な差」は、１０％の差を指す。いくつかの場合では、「実質的な差」は、１５％の差を指す。いくつかの場合では、「実質的な差」は、２０％の差を指す。いくつかの場合では、「実質的な差」は、２５％の差を指す。いくつかの場合では、「実質的な差」は、３０％の差を指す。いくつかの場合では、「実質的な差」は、３５％の差を指す。いくつかの場合では、「実質的な差」は、４０％の差を指す。いくつかの場合では、「実質的な差」は、４５％の差を指す。いくつかの場合では、「実質的な差」は、５０％の差を指す。いくつかの場合では、「実質的な差」は、５０％以上の差を指す。
【００６０】
ＭＥＩ挿入部位に隣接している配列が、いくつかの場合において決定される。例えば、ＭＥＩ挿入物が、他のＭＥＩに対してまたは以前の時点にわたる１つの時点で過剰増殖に関係している場合、ＭＥＩ挿入部位に隣接している配列は、いくつかの場合において処置を選択するために使用される。
【００６１】
例えば、ＭＥＩが隣接した配列が、既知の発癌遺伝子に相当する場合、その発癌遺伝子に関係する癌の対処に関連する処置が、そのＭＥＩの過剰増殖を一時的にまたは空間的に実証する個人に施されるように選択される。
【００６２】
癌の発症に関係する多くの遺伝子が、当該技術分野で知られている。これらの遺伝子は、限定することなく、癌促進因子（ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｉｖｅｒｓ）、発癌遺伝子、腫瘍抑制因子および腫瘍感受性遺伝子を含む、様々な名称で知られている。これらの遺伝子の異常なＤＮＡ変化は、癌進行の一因となると知られている。改変したときに癌の促進に関係する典型的な遺伝子は、限定することなく、ａｂｌ１、ａｃｖｒ１ｂ、ａｆ４／ｈｒｘ、ａｋｔ１、ａｋｔ−２、ａｌｋ、ａｌｋ／ｎｐｍ、ａｍｌ１、ａｍｌ１／ｍｔｇ８、ａｐｃ、ａｒ、ａｒｉｄ１ａ、ａｒｉｄ１ｂ、ａｒｉｄ２、ａｓｘｌ１、ａｔｍ、ａｔｒｘ、ａｘｉｎ１、ａｘｌ、ｂ２ｍ、ｂａｐ１、ｂｃｌ２、ｂｌｃ−３、ｂｃｌ−６、ｂｃｏｒ、ｂｃｒ／ａｂｌ、ｂｒａｆ、ｂｒｃａ１、ｂｒｃａ２、ｃａｒｄ１１、ｃａｓｐ８、ｃ−ｍｙｃ、ｃｂｌ、ｃｄｃ７３、ｃｄｈ１、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｅｂｐａ、ｃｉｃ、ｃｒｅｂｂｐ、ｃｒｌｆ２、ｃｓｆ１ｒ、ｃｔｎｎｂ１、ｃｙｌｄ、ｄａｘｘ、ｄｂｌ、ｄｅｌ／ｃａｎ、ｄｎｍｔ１、ｄｎｍｔ３ａ、ｅ２ａ／ｐｂｘ１、ｅｇｆｒ、ｅｎｌ／ｈｒｘ、ｅｐ３００、ｅｒｂＢ、ｅｒｂＢ−２、ｅｒｇ／ＴＬＳ、ｅｔｓ−１、ｅｗｓ／ｆｌｉ−、ｅｚｈ２、ｆａｍ１２３ｂ、ｆｂｘｗ７、ｆｇｆｒ２、ｆｇｆｒ３、ｆｌｔ３、ｆｍｓ、ｆｏｓ、ｆｏｘｌ２、ｆｐｓ、ｆｕｂｐ１、ｇａｔａ１、ｇａｔａ２、ｇａｔａ３、ｇｌｉ、ｇｎａ１１、ｇｎａｑ、ｇｎａｓ、ｇｓｐ、ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｈ３ｆ３ａ、ｈｉｓｔ１ｈ３ｂ、ｈｎｆ１ａ、ｈｒａｓ、ｈｏｘ１１、ｈｓｔ、ｉｄｈ１、ｉｄｈ２、ｉｌ−２、ｉｎｔ−２、ｊａｋ１、ｊａｋ２、ｊａｋ３、ｊｕｎ、ｋｉｔ、ｋｓ３、Ｋ−ｓａｍ、ｋｄｍ５ｃ、ｋｄｍ６ａ、ｋｉｔ、ｋｌｆ４、ｋｒａｓ、ｌｂｃ、ｌｃｋ、ｌｍｏ１、ｌｍｏ２、ｌ−ｍｙｃ、ｌｙｌ−１、ｌｙｔ−１０Ｃ  ａｌｐｈａ−１、ｍａ、ｍｄｍ−２、ｍｏｓ、ｍａｐ２ｋ１、ｍａｐ３ｋ１、ｍｅｄ１２、ｍｅｎ１、ｍｅｔ、ｍｌｈ１、ｍｌｌ２、ｍｌｌ３、ｍｐｌ、ｍｓｈ２、ｍｓｈ６、ｍｙｄ８８、ｍｙｂ、ｍｙｈ１１／ｃｂｆｂ、ｎｃｏｒ１、ｎｅｕ、ｎ−ｍｙｃ、ｎｆ１、ｎｆ２、ｎｆｅ２ｌ２、ｎｏｔｃｈ１、ｎｏｔｃｈ２、ｎｐｍ１、ｎｒａｓ、ｏｓｔ、ｐａｘ５、ｐｂｘ１／ｅ２ａ、ｐｂｒｍ１、ｐｄｇｆｒａ、ｐｈｆ６、ｐｉｋ３ｃａ、ｐｉｋ３ｒ１、ｐｉｍ−１、ｐｒａｄ−１、ｐｐｐ２ｒ１ａ、ｐｒｄｍ１、ｐｔｃｈ１、ｐｔｅｎ、ｐｔｐｎ１１、ｒａｆ、ｒａｒ／ｐｍｌ、ｒａｓＨ、ｒａｓＮ、ｒｂ１、ｒｅｌ／ｎｒｇ、ｒｅｔ、ｒｈｏｍ１、ｒｅｈｏｍ２、ｒｏｓ、ｒｎｆ４３、ｒｕｎｘ１、ｓｋｉ、ｓｉｓ、ｓｅｔ／ｃａｎ、ｓｒｃｒｅｔ、ｓｅｔｄ２、ｓｅｔｂｐ１、ｓｆ３ｂ１、ｓｍａｄ２、ｓｍａｄ４、ｓｍａｒｃａ４、ｓｍａｒｃｂ１、ｓｍｏ、ｓｏｃｓ１、ｓｏｘ９、ｓｐｏｐ、ｓｒｓｆ２、ｓｔａｇ２、ｓｔｋ１１、ｔａｌ１、ｔａｌ２、ｔａｎ−１、ｔｉａｍ１、ｔｓｃ２、ｔｒｋ、ｔｅｔ２、ｔｎｆａｉｐ３、ｔｒａｆ７、ｔｐ５３、ｔｓｃ１、ｔｓｈｒ、ｕ２ａｆ１、ｖｈｌ、およびｗｔ１を含む。このリスト中の遺伝子にマッピングするＭＥＩ挿入物に隣接する配列は、例えば、いくつかの場合において、前記遺伝子にまたは前記遺伝子の遺伝子産物��関与するシグナル経路に関係する処置が、処置レジメンへの組み込みのための選択れるべきであることを示唆している。
【００６３】
同様に、多くのゲノム再編成が、癌に関係するものとして識別される。癌における遺伝子再構成が、主として、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）から生じることは当該技術分野で既知である。遺伝子再構成につながる典型的な機構は、限定することなく、合成依存性末端結合（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ）（ＳＤＥＪ）、切断融合架橋環による姉妹染色分体融合が引き起こした遺伝子増幅、Ｖ（Ｄ）Ｊ  組み換え−活性化（ＲＡＧ）タンパク質媒介性の転座、および活性化誘導シチジン脱アミノ酵素（ＡＩＤ）クラススイッチ組換えを含む。
【００６４】
典型的な遺伝子再構成は、限定することなく、ＡＣＳＬ３／ＥＴＶ１、ＡＣＴＢ／ＧＬＩ１、ＡＦＦ３／ＢＣＬ２、ＡＧＴＲＡＰ／ＢＲＡＦ、ＡＨＲＲ／ＮＣＯＡ２、ＡＫＡＰ９／ＢＲＡＦ、ＡＬＫ／ＰＴＰＮ３、ＡＮＫＲＤ２８／ＮＵＰ９８、ＡＲＨＧＡＰ６／ＰＲＣＣ、ＡＳＰＳＣＲ１／ＴＦＥ３、ＡＴＩＣ／ＡＬＫ、ＢＡＣＨ２／ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ１１Ｂ／ＴＣＲ、ＢＣＬ２／Ｉｇ、ＢＣＯＲ／ＲＡＲＡ、ＢＣＲ／ＡＢＬ１、ＢＣＲ／ＦＧＦＲ１、ＢＣＲ／ＪＡＫ２、ＢＣＲ／ＰＤＧＦＲＡ、ＢＩＲＣ３／ＭＡＬＴ１、ＢＲＤ３／Ｃ１５ｏｒｆ５５、ＢＲＷＤ３／ＡＲＨＧＡＰ２、ＢＲＷＤ３／ＡＲＨＧＡＰ２０、Ｃ１１ｏｒｆ９５／ＭＫＬ２、Ｃ１５ｏｒｆ２１／ＥＴＶ１、Ｃ１５ｏｒｆ５５／ＢＲＤ４、Ｃ６ｏｒｆ２０４／ＰＤＧＦＲＢ、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４／ＷＤＲ４３、ＣＡＮＴ１／ＥＴＶ４、ＣＡＰＲＩＮ１／ＰＤＧＦＲＢ、ＣＡＲＳ／ＡＬＫ、ＣＢＦＢ／ＭＹＨ１１、ＣＣＤＣ６／ＰＤＧＦＲＢ、ＣＣＤＣ６／ＲＥＴ、ＣＣＤＣ８８Ｃ／ＰＤＧＦＲＢ、ＣＣＮＤ１／ＦＳＴＬ３、ＣＤ４４／ＳＬＣ１Ａ２、ＣＤ７４／ＲＯＳ１、ＣＤＨ１１／ＵＳＰ６、ＣＤＫ５ＲＡＰ２／ＰＤＧＦＲＡ、ＣＤＫ６／ＭＬＬ、ＣＥＰ１１０／ＦＧＦＲ１、ＣＨＣＨＤ７／ＰＬＡＧ１、ＣＨＩＣ２／ＥＴＶ６、ＣＩＣ／ＤＵＸ４、ＣＬＴＣ／ＡＬＫ、ＣＬＴＣ／ＴＦＥ３、ＣＮＢＰ／ＵＳＰ６、ＣＮＴＲＬ／ＫＩＴ、ＣＯＬ１Ａ１／ＰＤＧＦＢ、ＣＯＬ１Ａ１／ＵＳＰ６、ＣＯＬ１Ａ２／ＰＬＡＧ１、ＣＯＬ６Ａ３／ＣＳＦ１、ＣＲＥＢ３Ｌ２／ＰＰＡＲＧ、ＣＲＴＣ１／ＭＡＭＬ２、ＤＧＫＢ／ＭＩＰＯＬ１、ＥＭＬ１／ＡＢＬ１、ＥＭＬ４／ＡＬＫ、ＥＰＣ１／ＰＨＦ１、ＥＲＣ１／ＰＤＧＦＲＢ、ＥＳＲＰ１／ＲＡＦ１、ＥＴＶ６／ＡＢＬ１、ＥＴＶ６／ＡＢＬ２、ＥＴＶ６／ＡＣＳＬ６、ＥＴＶ６／ＡＲＮＴ、ＥＴＶ６／ＢＡＺ２Ａ、ＥＴＶ６／ＣＤＸ２、ＥＴＶ６／ＦＧＦＲ３、ＥＴＶ６／ＦＬＴ３、ＥＴＶ６／ＧＯＴ１、ＥＴＶ６／ＩＴＰＲ２、ＥＴＶ６／ＪＡＫ２、ＥＴＶ６／ＬＹＮ、ＥＴＶ６／ＭＤＳ２、ＥＴＶ６／ＭＥＣＯＭ、ＥＴＶ６／ＮＫＡＩＮ２、ＥＴＶ６／ＮＴＲＫ３、ＥＴＶ６／ＰＤＧＦＲＡ、ＥＴＶ６／ＰＤＧＦＲＢ、ＥＴＶ６／ＰＥＲ１、ＥＴＶ６／ＰＲＤＭ１６、ＥＴＶ６／ＲＵＮＸ１、ＥＴＶ６／ＳＹＫ、ＥＷＳＲ１／ＡＴＦ１、ＥＷＳＲ１／ＣＲＥＢ１、ＥＷＳＲ１／ＤＤＩＴ３、ＥＷＳＲ１／ＥＲＧ、ＥＷＳＲ１／ＥＴＶ１、ＥＷＳＲ１／ＥＴＶ４、ＥＷＳＲ１／ＦＥＶ、ＥＷＳＲ１／ＦＬＩ１、ＥＷＳＲ１／ＮＦＡＴＣ２、ＥＷＳＲ１／ＮＲ４Ａ３、ＥＷＳＲ１／ＰＡＴＺ１、ＥＷＳＲ１／ＰＢＸ１、ＥＷＳＲ１／ＰＯＵ５Ｆ１、ＥＷＳＲ１／ＳＭＡＲＣＡ５、ＥＷＳＲ１／ＳＰ３、ＥＷＳＲ１／ＷＴ１、ＥＷＳＲ１／ＺＮＦ４４４、ＥＸＯＣ２／ＩＧＨ、ＦＣＨＳＤ１／ＢＲＡＦ、ＦＧＦＲ１ＯＰ／ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ／ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ２／ＦＧＦＲ１、ＦＩＰ１Ｌ１／ＰＤＧＦＲＡ、ＦＩＰ１Ｌ１／ＲＡＲＡ、ＦＯＸＯ１／ＰＡＸ３、ＦＯＸＰ１／ＡＢＬ１、ＦＵＳ／ＡＴＦ１、ＦＵＳ／ＣＲＥＢ３Ｌ１、ＦＵＳ／ＣＲＥＢ３Ｌ２、ＦＵＳ／ＤＤＩＴ３、ＦＵＳ／ＥＲＧ、ＦＵＳ／ＦＥＶ、ＦＺＤ６／ＳＤＣ２、ＧＡＰＤＨ／ＢＣＬ６、ＧＩＴ２／ＰＤＧＦＲＢ、ＧＯＬＧＡ４／ＰＤＧＦＲＢ、ＧＯＬＧＡ５／ＲＥＴ、ＧＯＰＣ／ＲＯＳ１、ＨＡＳ２／ＰＬＡＧ１、ＨＥＬＩＯＳ／ＢＣＬ１１Ｂ、ＥＲＶＫ−１７／ＥＴＶ１、ＨＩＰ１／ＰＤＧＦＲＢ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｉ／ＢＣＬ６、ＨＭＧＡ１／ＬＡＭＡ４、ＨＭＧＡ２／ＣＣＮＢ１ＩＰ１、ＨＭＧＡ２／ＣＯＧ５、ＨＭＧＡ２／ＣＯＸ６Ｃ、ＨＭＧＡ２／ＦＨＩＴ、ＨＭＧＡ２／ＬＰＰ、ＨＭＧＡ２／ＮＦＩＢ、ＨＭＧＡ２／ＲＡＤ５１Ｌ１、ＨＭＧＡ２／ＷＩＦ１、ＨＭＧＮ２Ｐ４６／ＥＴＶ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１／ＥＴＶ１、ＨＯＯＫ３／ＲＥＴ、ＨＰＲ／ＭＲＰＳ１０、ＨＳＰ９０ＡＡ１／ＢＣＬ６、ＨＳＰ９０ＡＢ１／ＢＣＬ６、ＩＫＺＦ１／ＢＣＬ６、ＩＬ２／ＤＥＸＩ、ＩＬ２／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＩＬ２１Ｒ／ＢＣＬ６、ＩＮＰＰ５Ｄ／ＡＢＬ１、ＩＴＫ／ＳＹＫ、Ｉｇ／ＢＣＬ１１Ｂ、Ｉｇ／ＢＣＬ３、Ｉｇ／ＢＣＬ６、Ｉｇ／ＢＣＬ７Ａ、Ｉｇ／ＣＣＮＤ１、Ｉｇ／ＣＣＮＤ３、Ｉｇ／ＣＤＫＮ２Ａ、Ｉｇ／ＦＣＧＲ２Ｂ、Ｉｇ／ＦＣＲＬ４、Ｉｇ／ＦＯＸＰ１、Ｉｇ／ＩＬ３、Ｉｇ／ＫＤＳＲ、Ｉｇ／ＬＨＸ４、Ｉｇ／ＬＨＸ４、Ｉｇ／ＭＵＣ１、Ｉｇ／ＭＹＣ、Ｉｇ／ＰＡＦＡＨ１Ｂ２、Ｉｇ／ＷＨＳＣ１、Ｉｇ／ＷＷＯＸ、ＪＡＺＦ１／ＰＨＦ１、ＪＡＺＦ１／ＳＵＺ１２、ＫＩＡＡ１５４９／ＢＲＡＦ、ＫＩＦ５Ｂ／ＡＬＫ、ＫＩＦ５Ｂ／ＰＤＧＦＲＡ、ＫＩＦ５Ｂ／ＲＥＴ、ＫＬＫ２／ＥＴＶ４、ＫＴＮ１／ＲＥＴ、ＬＣＫ／ＴＣＲ、ＬＣＰ１／ＢＣＬ６、ＬＥＯ１／ＳＬＣ１２Ａ１、ＬＩＦＲ／ＰＬＡＧ１、ＬＲＲＦＩＰ１／ＦＧＦＲ１、ＬＹＬ１／ＴＣＲ、ＭＡＬＡＴ１／ＡＣＡＴ２、ＭＡＬＡＴ１／ＴＦＥＢ、ＭＡＬＴ１／ＭＡＰ４、ＭＥＦ２Ｄ／ＤＡＺＡＰ１、ＭＩＲ１４２／ＭＹＣ、ＭＬＬ／ＡＢＩ１、ＭＬＬ／ＡＢＩ２、ＭＬＬ／ＡＣＡＣＡ、ＭＬＬ／ＡＦＦ１、ＭＬＬ／ＡＦＦ３、ＭＬＬ／ＡＦＦ４、ＭＬＬ／ＡＲＨＧＡＰ２６、ＭＬＬ／ＡＲＨＧＥＦ１２、ＭＬＬ／ＣＡＳＣ５、ＭＬＬ／ＣＡＳＰ８ＡＰ２、ＭＬＬ／ＣＢＬ、ＭＬＬ／ＣＲＥＢＢＰ、ＭＬＬ／ＤＡＢ２ＩＰ、ＭＬＬ／ＥＥＦＳＥＣ、ＭＬＬ／ＥＬＬ、ＭＬＬ／ＥＰ３００、ＭＬＬ／ＥＰＳ１５、ＭＬＬ／ＦＬＮＡ、ＭＬＬ／ＦＯＸＯ３、ＭＬＬ／ＧＡＳ７、ＭＬＬ／ＧＭＰＳ、ＭＬＬ／ＧＰＨＮ、ＭＬＬ／ＫＩＡＡ０２８４、ＭＬＬ／ＫＩＡＡ１５２４、ＭＬＬ／ＬＡＳＰ１、ＭＬＬ／ＬＰＰ、ＭＬＬ／ＭＡＭＬ２、ＭＬＬ／ＭＡＰＲＥ１、ＭＬＬ／ＭＬＬＴ１、ＭＬＬ／ＭＬＬＴ１０、ＭＬＬ／ＭＬＬＴ１１、ＭＬＬ／ＭＬＬＴ３、ＭＬＬ／ＭＬＬＴ４、ＭＬＬ／ＭＬＬＴ６、ＭＬＬ／ＭＹＯ１Ｆ、ＭＬＬ／ＮＣＫＩＰＳＤ、ＭＬＬ／ＮＥＢＬ、ＭＬＬ／ＰＩＣＡＬＭ、ＭＬＬ／ＰＤＳ５Ａ、ＭＬＬ／ＳＡＣＭ１Ｌ、ＭＬＬ／ＳＥＰＴ１１、ＭＬＬ／ＳＥＰＴ２、ＭＬＬ／ＳＥＰＴ５、ＭＬＬ／ＳＥＰＴ６、ＭＬＬ／ＳＥＰＴ９、ＭＬＬ／ＳＨ３ＧＬ１、ＭＬＬ／ＳＯＲＢＳ２、ＭＬＬ／ＴＥＴ１、ＭＬＬ／ＺＦＹＶＥ１９、ＭＮ１／ＥＴＶ６、ＭＳＩ２／ＨＯＸＡ９、ＭＳＮ／ＡＬＫ、ＭＹＢ／ＧＡＴＡ１、ＭＹＢ／ＮＦＩＢ、ＭＹＣ／Ｉｇ、ＭＹＣ／ＺＢＴＢ５、ＭＹＨ９／ＡＬＫ、ＭＹＯ１８Ａ／ＦＧＦＲ１、ＭＹＳＴ３／ＡＳＸＬ２、ＭＹＳＴ３／ＣＲＥＢＢＰ、ＭＹＳＴ３／ＮＣＯＡ２、ＭＹＳＴ３／ＮＣＯＡ３、ＭＹＳＴ４／ＣＲＥＢＢＰ、ＮＡＶ２／ＴＣＦ７Ｌ１、ＮＣＯＡ４／ＲＥＴ、ＮＤＥ１／ＰＤＧＦＲＢ、ＮＤＲＧ１／ＥＲＧ、ＮＤＲＧ１／ＥＲＧ、ＮＦＫＢ２／ＩＮＡ、ＮＦＫＢ２／ＴＢＸＡＳ１、ＮＩＮ／ＰＤＧＦＲＢ、ＮＯＮＯ／ＴＦＥ３、ＮＯＴＣＨ１／ＴＣＲ、ＮＰＭ１／ＡＬＫ、ＮＰＭ１／ＭＬＦ１、ＮＰＭ１／ＲＡＲＡ、ＮＳＤ１／ＡＮＫＲＤ２８、ＮＵＭＡ１／ＲＡＲＡ、ＮＵＰ２１４／ＡＢＬ１、ＮＵＰ２１４／ＤＥＫ、ＮＵＰ９８／ＡＤＤ３、ＮＵＰ９８／ＣＣＤＣ２８Ａ、ＮＵＰ９８／ＤＤＸ１０、ＮＵＰ９８／ＨＨＥＸ、ＮＵＰ９８／ＨＭＧＢ３、ＮＵＰ９８／ＨＯＸＡ１１、ＮＵＰ９８／ＨＯＸＡ１３、ＮＵＰ９８／ＨＯＸＡ９、ＮＵＰ９８／ＨＯＸＣ１１、ＮＵＰ９８／ＨＯＸＣ１３、ＮＵＰ９８／ＨＯＸＤ１１、ＮＵＰ９８／ＨＯＸＤ１３、ＮＵＰ９８／ＩＱＣＧ、ＮＵＰ９８／ＫＤＭ５Ａ、ＮＵＰ９８／ＬＮＰ１、ＮＵＰ９８／ＭＬＬ、ＮＵＰ９８／ＮＳＤ１、ＮＵＰ９８／ＰＲＲＸ１、ＮＵＰ９８／ＰＲＲＸ２、ＮＵＰ９８／ＰＳＩＰ１、ＮＵＰ９８／ＲＡＰ１ＧＤＳ１、ＮＵＰ９８／ＳＥＴＢＰ１、ＮＵＰ９８／ＴＯＰ１、ＮＵＰ９８／ＷＨＳＣ１Ｌ１、ＯＭＤ／ＵＳＰ６、Ｐ２ＲＹ８／ＣＲＬＦ２、ＰＡＸ３／ＮＣＯＡ１、ＰＡＸ３／ＮＣＯＡ２、ＰＡＸ５／ＡＵＴＳ２、ＰＡＸ５／ＢＲＤ１、ＰＡＸ５／Ｃ２０ｏｒｆ１１２、ＰＡＸ５／ＤＡＣＨ１、ＰＡＸ５／ＥＬＮ、ＰＡＸ５／ＥＴＶ６、ＰＡＸ５／ＦＯＸＰ１、ＰＡＸ５／ＨＩＰＫ１、ＰＡＸ５／ＪＡＫ２、ＰＡＸ５／ＰＭＬ、ＰＡＸ５／ＰＯＭ１２１、ＰＡＸ５／ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＰＡＸ５／ＺＮＦ５２１、ＰＡＸ８／ＰＰＡＲＧ、ＰＣＭ１／ＪＡＫ２、ＰＣＭ１／ＲＥＴ、ＰＤＥ４ＤＩＰ／ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＸ５／ＬＰＬ、ＰＩＣＡＬＭ／ＭＬＬＴ１０、ＰＩＭ１／ＢＣＬ６、ＰＭＬ／ＲＡＲＡ、ＰＯＵ２ＡＦ１／ＢＣＬ６、ＰＰＰ２Ｒ２Ａ／ＣＨＥＫ２、ＰＲＫＡＲ１Ａ／ＲＡＲＡ、ＰＲＫＡＲ１Ａ／ＲＥＴ、ＰＲＫＧ２／ＰＤＧＦＲＢ、ＰＶＲＬ２／ＴＣＲ、ＲＡＢＥＰ１／ＰＤＧＦＲＢ、ＲＡＮＢＰ１７／ＴＣＲ、ＲＡＮＢＰ２／ＡＬＫ、ＲＢＭ１５／ＭＫＬ１、ＲＢＭ６／ＣＳＦ１Ｒ、ＲＣＳＤ１／ＡＢＬ１、ＲＮＦ２１３／ＡＬＫ、ＲＰＮ１／ＭＥＣＯＭ、ＲＵＮＸ１／ＡＦＦ３、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＲＵＮＸ１／ＣＬＣＡ２、ＲＵＮＸ１／ＬＰＸＮ、ＲＵＮＸ１／ＭＡＣＲＯＤ１、ＲＵＮＸ１／ＲＵＮＸ１Ｔ１、ＲＵＮＸ１／ＳＨ３Ｄ１９、ＲＵＮＸ１／ＴＲＰＳ１、ＲＵＮＸ１／ＵＳＰ４２、ＲＵＮＸ１／ＹＴＨＤＦ２、ＲＵＮＸ１／ＺＮＦ６８７、ＲＹＫ／ＡＴＰ５Ｏ、ＳＥＣ３１Ａ／ＡＬＫ、ＳＥＣ３１Ａ／ＪＡＫ２、ＳＥＮＰ６／ＮＫＡＩＮ２、ＳＥＴ／ＮＵＰ２１４、ＳＦＰＱ／ＡＢＬ１、ＳＦＰＱ／ＴＦＥ３、ＳＦＲＳ３／ＢＣＬ６、ＳＬＣ３４Ａ２／ＲＯＳ１、ＳＬＣ４５Ａ３／ＢＲＡＦ、ＳＬＣ４５Ａ３／ＥＬＫ４、ＳＬＣ４５Ａ３／ＥＲＧ、ＳＬＣ４５Ａ３／ＥＴＶ１、ＳＬＣ４５Ａ３／ＦＬＩ１、ＳＮＸ２／ＡＢＬ１、ＳＰＥＣＣ１／ＰＤＧＦＲＢ、ＳＰＴＢＮ１／ＦＬＴ３、ＳＱＳＴＭ１／ＡＬＫ、ＳＲＧＡＰ３／ＲＡＦ１、ＳＳ１８／ＳＳＸ１、ＳＳ１８／ＳＳＸ２、ＳＳ１８／ＳＳＸ４、ＳＳ１８Ｌ１／ＳＳＸ１、ＳＳＢＰ２／ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ５Ｂ／ＲＡＲＡ、ＳＴＲＮ／ＰＤＧＦＲＡ、ＴＡＦ１５／ＮＲ４Ａ３、ＴＡＦ１５／ＺＮＦ３８４、ＴＡＬ１／ＲＨＯＡ、ＴＡＬ１／ＴＣＲ、ＴＣＥＡ１／ＰＬＡＧ１、ＴＣＦ１２／ＮＲ４Ａ３、ＴＣＦ３／ＨＬＦ、ＴＣＦ３／ＮＯＰ２、ＴＣＦ３／ＰＢＸ１、ＴＣＦ３／ＴＦＰＴ、ＴＣＦ３／ＺＮＦ３８４、ＴＣＲ／ＬＭＯ１、ＴＣＲ／ＬＭＯ２、ＴＣＲ／ＭＴＣＰ１ＮＢ、ＴＦＧ／ＡＬＫ、ＴＦＧ／ＮＲ４Ａ３、ＴＦＧ／ＮＴＲＫ１、ＴＦＲＣ／ＢＣＬ６、ＴＨＲＡＰ３／ＵＳＰ６、ＴＬＸ１／ＴＣＲ、ＴＭＰＲＳＳ２／ＥＲＧ、ＴＭＰＲＳＳ２／ＥＲＧ、ＴＭＰＲＳＳ２／ＥＴＶ１、ＴＭＰＲＳＳ２／ＥＴＶ４、ＴＭＰＲＳＳ２／ＥＴＶ５、ＴＰ５３ＢＰ１／ＰＤＧＦＲＢ、ＴＰＭ３／ＰＤＧＦＲＢ、ＴＰＭ４／ＡＬＫ、ＴＰＲ／ＮＴＲＫ１、ＴＲＩＭ２４／ＦＧＦＲ１、ＴＲＩＭ２７／ＲＥＴ、ＴＲＩＭ３３／ＲＥＴ、ＴＲＩＰ１１／ＰＤＧＦＲＢ、ＶＴＩ１Ａ／ＴＣＦ７Ｌ２、ＷＤＲ４８／ＰＤＧＦＲＢ、ＷＷＴＲ１／ＣＡＭＴＡ１、ＺＢＴＢ１６／ＲＡＲＡ、ＺＭＩＺ１／ＡＢＬ１、ＺＭＹＭ２／ＦＧＦＲ１、ＲＵＮＸ１／ＫＩＡＡ１５４９Ｌ、ＹＡＰ１／ＴＦＥ３、ＧＴＦ２Ｉ／ＮＣＯＡ２、ＥＷＳ／ＦＬＩ１、ＳＬＣ４４Ａ１／ＰＲＫＣＡ、ＮＡＢ２／ＳＴＡＴ６、ＣＵＸ１／ＡＧＲ３、ＦＧＦＲ３／ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＦＧＦＲ３／ＴＡＣＣ３、ＦＧＦＲ３／ＴＡＣＣ３、およびＮＡＢＰ１／ＲＡＲＡ、を含む。したがって、癌遺伝子再配列に関係する遺伝子に相当するＭＥＩ挿入物に隣接する配列は、再配列に関係する処置が、個体に対する処置レジメンに効果的となることを暗示している。
【００６５】
いくつかの場合では、ゲノム分析から得られた情報に基づいて、抗癌剤が投与される。化学療法の抗癌剤の例としては、ベンダムスチン、クロラムブチル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、プレドニムスチン、トロホスファミドのような、ナイトロジェンマスタード；ブスルファン、マンノスルファン、トレオスルファンのような、スルホン酸アルキル；カルボコン、チオテパ、トリアジクオンのような、エチレンイミン；カルムスチン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、セムスチン、ストレプトゾシンのような、ニトロソ尿素；エトグルシドのような、エポキシド；ダカルバジン、ミトブロニトール、ピポブロマン、テモゾロミドのような、他のアルキル化剤；メトトレザト、ペメトレキセド（ｐｅｒｍｅｔｒｅｘｅｄ）、プララトレキサート、ラルチトレキセドのような、葉酸アナログ；クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ネララビン、チオグアニンのような、プリンアナログ；アザシチジン、カペシタビン、カルモフール、シタラビン、デシタビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、テガフールのような、ピリミジンアナログ；ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビノレルビンのような、ビンカアルカロイド；エトポシド、テニポシドのような、ポドフィロトキシン誘導体；デメコルチンのような、コルヒチン誘導体；ドセタセル、パクリタキセル、パクリタキセルポリグルメクスのような、タキサン；トラベクテジンのような、他の植物アルカロイドおよび天然物；ダクチノマイシンのような、アクチノマイシン；アクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ピラルビシン、バルルビシン、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｎｃｉｎ）のような、アントラサイクリン（Ａｎｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ）；ブレオマイシン、イクサベピロン、マイトマイシン、プリカマイシンのような、他の細胞毒性抗生物質；カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチンのような、白金化合物；プロカルバジンのような、メチルヒドラジン；アミノレブリン酸、エファプロキシラル、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウム、テモポルフィンのような、感作物質；ダサチニブ、エルロチニブ、エベロリムス、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、パゾパニブ（ｐａｚｏｎａｎｉｂ）、ソラフェニブ、スニチニブ、テムシロリムスのような、プロテインキナーゼ阻害剤；アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン（ａｍｚａｃｒｉｎｅ）、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ベキサロテン、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エストラムスチン、ヒドロキシカルバミド、イリノテカン、ロニダミン、マソプロコール、ミルテホシン（ｍｉｌｔｅｆｏｓｅｉｎ）、ミトグアゾン、ミトタン、オブリメルセン、ペグアスパルガーゼ、ペントスタチン、ロミデプシン、シチマジーンセラデノベック、チアゾフリン、トポテカン、トレチノイン、ボリノスタットのような、他の抗腫瘍薬；ジエチルスチルベノール（ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｎｏｌ）、エチニルエストラジオール、ホスフェストロール、リン酸ポリエストラジオールのような、エストロゲン；ゲストノロン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロールのような、プロゲストゲン；ブセレリン、ゴセレリン、リュープロレリン、トリプトレリンのような、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログ；フルベストラント、タモキシフェン、トレミフェンのような、抗エストロゲン；ビカルタミド、フルタミド、ニルタミドのような、抗アンドロゲン；アミノグルテチミド、アナストロゾール、エキセメスタン、ホルメスタン、レトロゾール、ボロゾールのような、酵素阻害剤；アバレリックス、デガレリクスのような、他のホルモン拮抗薬；ヒスタミン二塩酸塩、ミファムルチド、ピドチモド、プレリキサホル、ロキニメックス、チモペンチンのような、免疫賦活薬；エベロリムス、グスペリムス、レフルノミド、ミコフェノール酸、シロリムスのような、免疫抑制薬；シクロスポリン、タクロリムスのような、カルシニューリン阻害剤；アザチオプリン、レナリドマイド、メトトレザト、サリドマイドのような、他の免疫抑制薬；およびヨーベングアン（ｉｏｂｅｎｇｕａｎｅ）のような放射性医薬品が挙げられる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、抗癌剤は、毒素、例えば、ジフテリア毒素である。特定の実施形態では、生体適合性ヒドロゲルポリマーを形成するために、生体適合性ヒドロゲルポリマーには、治療上有効な量の１つ以上の毒素が充填される。毒素の例としては、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、細胞溶解素、溶血素（例えば、α溶血毒またはＳｔａｐｈｙｌｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのα溶血素）、コレラ毒素、百日咳毒素、志賀毒素のような、エキソトキシン；大腸菌からの耐熱性エンテロトキシン；クラーレ；αコブラトキシン；ベロ毒素−１；およびＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからのアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）毒素、が挙げられる。
【００６７】
いくつかの場合では、処置は、ＭＥＩ挿入物に隣接する連続した配列を含む核酸配列の分解を特異的に標的とする組成物の投与を含む。
【００６８】
上に議論されるように、遺伝子または遺伝子産物、あるいはＭＥＩ挿入物に隣接する配列によって標識化される遺伝子産物に関連する経路に関係する処置を選択するためにＭＥＩ境界を使用することに加えて、ＭＥＩ挿入境界配列は、いくつかの場合において、ＭＥＩおよび挿入物に隣接する配列に及ぶ配列を直接標的とする、核酸を標的とする医薬品の開発に使用される。ＭＥＩおよび挿入物に隣接する境界配列に及ぶ核酸配列を含む多くの組成物が、本明細書で熟考される。いくつかの場合では、そのような組成物の共通の態様は、それらがＭＥＩ末端（ｅｄｇｅ）配列および挿入物に隣接するゲノム配列の両方に及ぶ配列に特異的であり、ＭＥＩ配列あるいは挿入物に隣接する配列のいずれかを分離して標的とするのには十分に長くない、核酸要素を含むということである。
【００６９】
すなわち、ここの多くのケースにおいて企図され開示された組成物は、挿入物に隣接する配列が無い状態ではＭＥＩに結合せず、隣接したＭＥＩがない状態では挿入物に隣接する配列に結合しない；むしろ、本明細書に開示された組成物は、ＭＥＩおよび隣接したゲノムの配列の両方を含む配列に特異的に結合する核酸成分を含む。したがって、そのような組成物を用いる処置上、例えば実質的に過剰であるとして本明細書で開示された時間か空間の分析で同定したものなどの、本明細書で開示されているようなＭＥＩ挿入物に隣接する配列に対応する核酸だけが、組成物によって標的とされ、一方、挿入物に隣接する配列を含むがＭＥＩ配列を含まない他のＭＥＩおよび挿入されていない対立遺伝子は組成物によって結合されない。一部の場合においては、組成物の核酸構成要素は３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０を超える塩基のＭＥＩ配列、および３、４、５、６、７、８、９、１０または１０を超える挿入物に隣接する配列塩基を含み、それにより、組成物とＭＥＩの間のみ、または組成物および挿入物に隣接する配列の間のみの結合エネルギーでは、結合を安全にするには不十分である。
【００７０】
本明細書に開示されるような組成物は、例えば、ＭＥＩおよび挿入物に隣接する配列を含む標的配列のエンドヌクレアーゼ的切断を導く部分と組み合わせて、前述した特性を有するガイド核酸を含む。
【００７１】
一部の実施形態において、ガイド核酸分子はガイドＲＮＡ分子である。場合によっては、ガイドＲＮＡ分子または他のガイド核酸分子は、例えばＣａｓ９タンパク質などエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質の補充により、それが結合したＤＮＡ分子の内部ヌクレオチド鎖切断を導く。とりわけジンクフィンガー・ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、エフェクター・ヌクレアーゼおよびＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｃｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ／ＣａｓベースのＲＮＡにガイドされたＤＮＡヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）のような転写活性因子は、本明細書に開示されているいくつかの実施形態と互換性を有する。
【００７２】
ガイドＲＮＡ分子または他のガイド核酸分子は、配列決定から取り除かれることになっている標的配列（標的配列領域内の非標的配列）と塩基対を為す配列を含む。いくつかの実施形態では、塩基対合は完全であるが、その一方でいくつかの実施形態では、塩基対合は部分的か、非標的配列と対になる塩基と対になっていない塩基を含む。
【００７３】
ガイドＲＮＡ分子または他のガイド核酸分子は、「ヘアピン」構造を形成する領域または複数の領域を含む場合がある。そのような領域または複数の領域は、パリンドローム配列を部分的にまたは完全に含み、その領域の５’および３’の末端は互いにハイブリタイズし、二本鎖「ステム」（ｓｔｅｍ）構造を形成する場合があり、これはいくつかの実施形態では、二本鎖ループ中の一本鎖の各々を互いにつなぎとめる非回帰性のループにキャップされる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ分子または他のガイド核酸分子は、ｔｒａｃｒＲＮＡステムループ（ｓｔｅｍ  ｌｏｏｐ）などのステムループを含む。ｔｒａｃｒＲＮＡステムループなどのステムループはＣａｓ９ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどの核酸エンドヌクレアーゼと複合体を形成する、または結合する場合がある。代替的に、ステムループはＣａｓ９以外のエンドヌクレアーゼ、または、例えば塩基切除酵素、メチルトランスフェラーゼ、または１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ酵素に干渉する他の核酸を修飾する活性がある酵素などの、エンドヌクレアーゼ以外の核酸修飾酵素と複合体を形成し得る。
【００７５】
ｔｒａｃｒＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ／エンドヌクレアーゼ系は、細胞が既知の配列であるウイルスにより繰り返される感染に対する耐性を獲得することによって、ユーバクテリアおよび古細菌の原核生物中の適応性のある免疫系であるとして確認された。例として、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ  Ｅ，  Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  Ｋ，  Ｓｈａｒｍａ  ＣＭ，  Ｇｏｎｚａｌｅｓ  Ｋ，  （２０１１）  “ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｆａｃｔｏｒ  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ”Ｎａｔｕｒｅ  ４７１  （７３４０）：６０２−７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９８８６．ＰＭＣ  ３０７０２３９．ＰＭＩＤ  ２１４５５１７４；Ｔｅｒｎｓ  ＭＰ，  Ｔｅｒｎｓ  ＲＭ  （２０１１）  “ＣＲＩＳＰＲ−ｂａｓｅｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ”  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １４  （３）：３２１−７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｉｂ．２０１１．０３．００５．ＰＭＣ  ３１１９７４７．ＰＭＩＤ  ２１５３１６０７；Ｊｉｎｅｋ  Ｍ，  Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  Ｋ，  Ｆｏｎｆａｒａ  Ｉ，  Ｈａｕｅｒ  Ｍ，  Ｄｏｕｄｎａ  ＪＡ，  Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ  Ｅ  （２０１２）  “Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｄｕａｌ−ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７  （６０９６）：８１６−２１．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２２５８２９．ＰＭＩＤ  ２２７４５２４９；ａｎｄ  Ｂｒｏｕｎｓ  ＳＪ  （２０１２）  “Ａ  Ｓｗｉｓｓ  ａｒｍｙ  ｋｎｉｆｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７  （６０９６）：８０８−９．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２２７２５３．ＰＭＩＤ  ２２９０４００２．を参照。この系は真核細胞中の標的遺伝子突然変異誘発を導くのに適している。例えば、Ｗｅｎｚｈｉ  Ｊｉａｎｇ，  Ｈｕａｎｂｉｎ  Ｚｈｏｕ，  Ｈｏｎｇｈａｏ  Ｂｉ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｆｒｏｍｍ，  Ｂｉｎｇ  Ｙａｎｇ，  ａｎｄ  Ｄｏｎａｌｄ  Ｐ．  Ｗｅｅｋｓ  （２０１３）  “Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，  ｔｏｂａｃｃｏ，  ｓｏｒｇｈｕｍ  ａｎｄ  ｒｉｃｅ”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｎｏｖ  ２０１３  ；４１（２０）：ｅ１８８，  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ａｕｇ  ３１，  ２０１３．  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ７８０、およびその中にある参考文献を参照。
【００７６】
本明細書で企図されるように、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼなどのＤＮＡエンドヌクレアーゼに配列特異性を提供するためにいくつかの実施形態でガイドＲＮＡ分子または他のガイド核酸分子を使用する。これらの実施形態では、ガイドＲＮＡ分子または他のガイド核酸分子は、例えばＣａｓ９（いくつかの実施形態では代替物または付加物として他のエンドヌクレアーゼを考慮する）などのエンドヌクレアーゼに結合する、またはエンドヌクレアーゼによって結合されるヘアピン構造を含み、さらにガイドＲＮＡ分子または他のガイド核酸分子は、配列決定ライブラリまたは配列決定反応から取り除かれることになっている配列に結合するまたは特異的に結合する、または排他的に結合する認識配列を含む。ガイドＲＮＡ分子または他のガイド核酸分子中の認識配列の長さは、配列除去工程で望ましい特異性の程度に応じて変わることがある。上に議論されたように、核酸特異性は、ＲＮＡ分子または他のガイド核酸分子がＭＥＩ挿入物に隣接する配列結合に特異的に結合するが、ＭＥＩにも挿入物に隣接する配列単独にも結合しないという必要条件により多くの場合指定されている。サンプル中に頻繁に生じる配列、または差次的に豊富な配列（ＡＴに富んだゲノムサンプル中のＡＴの存在量、またはＧＣに富んだゲノムサンプル中のＧＣの存在量）を含む短い認識配列は、おそらく多くの部位を同定し、したがって、エンドヌクレアーゼ活性、基部切除、メチル化、または少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ活性に干渉する他の活性などの頻繁な核酸修飾を導く。サンプル中に稀に生じる配列、または比率的に少ない塩基の組み合わせ（ＡＴに富んだゲノムサンプル中のＧＣの存在量、またはＧＣに富んだゲノムサンプル中のＡＴの存在量）を含む長い認識配列は、おそらく少ない部位を同定し、したがって、エンドヌクレアーゼ活性、基部切除、メチル化、または少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ活性に干渉する他の活性などの稀に生じる核酸修飾を導く。従って、本明細書に開示されるように、いくつかの実施形態では、単一のＭＥＩ挿入物に隣接する配列を特異的に標的とするために、認識配列の長さに対する修飾を介して配列反応からの配列移動の頻度を調整する場合がある。
【００７７】
ガイドＲＮＡ分子または他のガイド核酸分子は本明細書における開示と一致する多くの方法を通じて合成され得る。多量のガイドＲＮＡ分子または他のガイド核酸分子を製造するために標準の合成技術を使用する場合がある。二本鎖ＤＮＡ分子はＲＮＡ分子、または他のガイド核酸分子部位特異的結合配列、Ｃａｓ９タンパク質およびＴ７プロモーター部位に対応したガイドＲＮＡ分子または他のガイド核酸分子を含む。いくつかの場合において、二本鎖ＤＮＡ分子は約１００ｂｐ未満の長さになり得る。Ｃａｓ９タンパク質のための標的ＲＮＡ配列およびガイドＲＮＡ配列を含むことが可能である一本鎖ＲＮＡ分子を生成するために、Ｔ７ポリメラーゼを使用することが出来る。
【００７８】
本明細書に開示される組成物は、挿入物に隣接する配列内の遺伝子の発現抑制を導く前述のようなＭＥＩ挿入物に隣接する配列の結合特性を有するガイド核酸を含み、その結果、短縮されているか、そうでなければ変異させられている遺伝子産物の対立遺伝子、挿入物に隣接する配列、例えば腫瘍形成性の遺伝子産物、細胞周期調節、細胞増殖調節または細胞分裂調節の欠損を引き起こす遺伝子産物が、ガイド核酸による結合の後に発現停止される。場合によっては、ガイド核酸がｓｉＲＮＡ部分、ｐｉＲＮＡ部分または遺伝子産物の遺伝子発現抑制（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）、転写の調節または転写後の調節に関与する他の核酸部分を含む。
【００７９】
ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡは遺伝子抑制に関連する小型ＲＮＡ分子である。有機体の中へのｄｓＲＮＡの導入は、遺伝子発現の特異的な干渉を引き起こす場合がある。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として既知であるこの現象は、植物、無脊椎動物および哺乳動物の細胞における細胞機構による分解のためのｍＲＮＡの特異的な標的化に起因する。当該技術分野で既知である代表的なＲＮＡｉ技術は、限定されないが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｐｉＲＮＡを含む。ＲＮＡｉ機構類の構成要素は、標的遺伝子（ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのいずれか）、Ｄｉｃｅｒ、タンパク質Ａｒｇｏｎａｕｔｅファミリー（特にＡｇｏ−２）、Ｄｒｏｓｈａ、ＲＩＳＣ、ＴＲＢＰおよびＰＡＣＴを標的とするｄｓＲＮＡを含む。小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は通常、標的ｍＲＮＡの相補的結合に依存する配列に特異的な方法によってＲＮＡｉを活性化して、ｍＲＮＡの分解に至る２ｎｔ３’末端オーバーハングを備えたｄｓＲＮＡとして認識される。ｓｈＲＮＡは通常ｓｉＲＮＡに処理され、さらに標的ｍＲＮＡの相補的結合に依存する配列に特異的なやり方でｍＲＮＡの分解をもたらすループ構造を含む短いヘアピンのＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）として認識される。Ｄｒｏｓｈａは通常、核の中のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡｓおよびｓｈＲＮＡｓを処理するＲＮａｓｅＩＩＩ酵素として認識される。Ｄｉｃｅｒは通常、ｄｓＲＮＡｓを２０−２５ｂｐ  ｓｉＲＮＡに処理して、３’末端で２ｎｔオーバーハングを残すＲＮａｓｅＩＩＩ酵素として認識される。Ｄｉｃｅｒ１がｍｉＲＮＡ処理にとって重要である一方、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＤｉｃｅｒ２は長いｄｓＲＮＡｓを開裂する。ＲＩＳＣは通常Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質および関連するｓｉＲＮＡから成る、最小のＲＮＡ誘導型抑制複合体（ＲＩＳＣ）として認識される。それはまた、ＰＡＣＴ、ＴＲＢＰおよびＤｉｃｅｒを含む場合がある。ＲＩＳＣの正確な組成物は依然として記載されたことがないということに留意すべきである。ＴＲＢＰは通常ＤｉｃｅｒによるｄｓＲＮＡ開裂のために必要であり、ＲＩＳＣに至る通路として認識される。タンパク質Ｒ（ＰＫＲ）−活性化タンパク質（ＰＡＣＴ）は一般にｄｓＲＮＡ分裂のためのＤｉｃｅｒおよびＴＲＢＰに関連付けられるものとして認識される。単鎖のｓｉＲＮＡと共に、タンパク質のａｒｇｏｎａｕｔｅファミリーは集合してＲＩＳＣを形成し、ｍｉＲＮＡｓとｓｉＲＮＡｓを含む２１−３５ｎｔＲＮＡ、およびその関連する標的ｍＲＮＡを結合し、その後にエンドヌクレアーゼの機能を介してそれらを開裂する。
【００８０】
しばしば短い干渉ＲＮＡまたは抑制ＲＮＡとして知られている小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、二本鎖ＲＮＡ分子の種類であり、一般的に２０−２５の長さである塩基対である。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路においてもっとも重要なものであり、それは相補的なヌクレオチド配列を備えた特異的な遺伝子の発現に干渉する。ｓｉＲＮＡは、転写の後にｍＲＮＡを分解させることにより機能し、結果として翻訳を生じさせない。ｓｉＲＮＡは、さらにＲＮＡｉ関連の経路で、例えば、抗ウイルス性メカニズムとして、またはゲノムの染色質構造を形作る際に作用する。
【００８１】
ｓｉＲＮＡｓまたはｓｈＲＮＡｓのどちらかを選ぶ場合、考慮するべき重要な要素は処置の長さである。ｓｉＲＮＡｓは細胞で一時的に発現する一方、ｓｈＲＮＡｓはウイルスを媒介とした形質導入によって安定して統合可能である。ｓｉＲＮＡ設計のためのガイドラインは次のものを含む：（１）非特異的な抑制を避けるために１９−２９ｎｔの間のｓｉＲＮＡ配列を一般に推奨する（２）標的とする部位はＡＡジヌクレオチドを含む、および（３）３’ｄＵｄＵまたはｄＴｄＴジヌクレオチドオーバーハングを有するｓｉＲＮＡｓは有効性を増強する。一般に、ｓｉＲＮＡ配列には３５から５５％の間のＧ／Ｃ含有量がなければならない。
【００８２】
異なる細胞型は核酸の導入に対して異なる感受性を有するので、ＲＮＡｉの送達のためのプロトコルは細胞型に依存する。トランスフェクション、エレクトロポレーションおよび特定のウイルスの伝達方法は一時的である。
【００８３】
最も一般的な核酸送達方法には、トランスフェクションとエレクトロポレーションがある。トランスフェクションは、細胞膜を通過することを可能にする担体分子を有する核酸の複合体の形成と関係する。トランスフェクション方法は脂質トランスフェクションを含み、脂質トランスフェクションでは、正電荷を持つ頭部基を有する長い疎水性の鎖があるカチオン性脂質は負電荷をもつｓｉＲＮＡと相互に作用し、脂質二重層によってそれを囲み、それはその後細胞によって取り込まれる；カチオン性ポリマーに基づいたナノ粒子は、毒性を縮小しつつ効率を高め、さらに修飾されたｓｉＲＮＡｓの送達を可能にする；脂質または細胞を貫通するペプチド（ＣＰＰ）接合は、疎水性の部位（例えばコレステロール）またはカチオンのＣＣＰ（例えばｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎまたはｐｅｎｔａｔｒａｔｉｎ）によって標的細胞への送達を促進するｓｉＲＮＡの接合と関係する。
【００８４】
エレクトロポレーション方法において、負電荷を持つ頭部基を有するリン脂質分子から構成される細胞膜に電界を加える。電気的パルスはリン脂質を新しく順応させ、細胞膜で孔を生成し、ｓｉＲＮＡｓの侵入を可能にする。一般にトランスフェクトが困難な細胞にエレクトロポレーションを使用する。しかしながら、各細胞または組織のタイプのために特定の設定（電圧、パルスの数およびパルスの長さ）を最適化しなければならない。
【００８５】
ＲＮＡｉ介入は、癌、神経系疾患、ウイルス感染症、黄斑変性、糖尿病性網膜症およびＣ型肝炎、その他の障害を標的とした治癒的価値を持つ事が知られている。
【００８６】
トランスポゾンを抑制することはトランスポゾンを標的とする転写の遺伝子抑制の形式である。転写の遺伝子抑制は、ＤＮＡのその領域の転写を防ぐヒストン修飾の生成物である。トランスポゾンを転写によって抑制することはゲノムの維持に重大である。トランスポゾンの「ジャンプ」はゲノムの不安定性を引き起こし、非常に有害な突然変異を引き起こす場合がある。転位因子挿入は、血友病、重症複合免疫不全および癌に対する素因を含む多くの疾病に関連付けられてきた。したがって、トランスポゾンを抑制することはトランスポゾン変異が進行し、かつ次世代に継代される事を止めるために生殖細胞系列において極めて重大である。
【００８７】
最大の種類の小型ＲＮＡである、Ｐｉｗｉと相互に作用するＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）は、２６から３１ヌクレオチドの間の長さであり、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質ファミリー（遺伝子抑制タンパク質）からのｐｉｗｉタンパク質との相互作用によって機能する。ＰＩＷＩタンパク質に結合したｐｉＲＮＡｓは、トランスポゾンを発現停止させるために転写後の転写破壊を用いることが当該技術分野で知られている。ほとんどのｐｉＲＮＡｓは、発現停止したトランスポゾンから転写されたｍＲＮＡにアンチセンスであり、一般的にＰｉｗｉとオーベルジーヌ（Ａｕｂ）のタンパク質と関連する一方で、有意鎖のｐｉＲＮＡｓは代わりにＡｒｇｏｎａｕｔｅ  ３（Ａｇｏ３）と関連する傾向がある。「ピンポン」増幅と呼ばれるサイクルは、センスおよびアンチセンスｐｉＲＮＡｓの間で進行し、成熟したｐｉＲＮＡｓを生み出すために広範囲なトリミングおよび処理を含む。この工程は生殖細胞系列中のほとんどのｐｉＲＮＡｓの生成の原因であり、さらに生殖細胞系列の発達におけるｐｉＲＮＡｓの起源について説明する事が可能である。Ｐｉｗｉ−ｐｉＲＮＡ複合体は、ＣｐＧメチル化をトランスポゾン領域の上流または内部で増大させることにより、および／またはトランスポゾン領域周辺の染色質修飾により、または直接トランスポゾンの転写を分解することにより、トランスポゾン発現を抑制する。
【００８８】
代替的にまたは組み合わせで、処置は、場合によっては、細胞増殖、細胞周期または細胞増殖経路の誤調節に関連する癌の対処に関連して選択され、これに対してＭＥＩと関連する遺伝子が関与するメンバーをコード化する。例えば、ＴＳＣ２遺伝子座などＴＯＲ（ラパマイシンシグナル伝達の標的）の陰性の調節因子の中のＭＥＩは、成長調節阻害剤による処置を示唆する一方で、網膜芽細胞腫腫瘍抑圧遺伝子Ｒｂをコード化する遺伝子座のＭＥＩは、細胞周期進行に関連する処置を示唆する。
【００８９】
場合によっては、個体の中の位置、または個体の中の共通のサンプルソースからの時間にわたってＭＥＩレベルが比較される。
【００９０】
場合によっては、血液は、単独で、または代替的なモニタリング手法と組み合わせて、ＭＥＩレベルの進行中の一時的なモニタリングで使用される遊離した循環核酸などの分析用の核酸のソースとして使用される。代替的にまたは組み合わせで、いくつかの実施形態では、循環遊離ＤＮＡまたは他のソースからの他のＤＮＡが使用される。
【００９１】
遊離ヌクレインを抽出する方法が当該技術分野で既知である。核酸が細胞の内部にある場合、抽出のための手順は一般に、細胞溶解（化学的、物理的方法−サンプルの混合、粉砕、または超音波処理により、通常は達成される）、細胞溶解においても機能する洗浄剤または界面活性剤を加えることによる膜脂質の除去、プロテアーゼを加えることによる随意のタンパク質の除去、さらにＲＮａｓｅを加えることによる、随意のＲＮＡの除去（ＤＮＡが望ましい標的である時に行われる）を含む。ＤＮＡを精製する方法は、当該技術分野で既知である。典型的なＤＮＡ精製法は、限定されないが、エタノール沈澱、フェノール−クロロホルム抽出、およびミニカラム精製を含む。氷冷エタノールまたはイソプロパノールを使用して、エタノール沈澱を行うことが可能である。ＤＮＡがこれらのアルコールにおいて不溶性であるので、それは遠心分離上にペレット剤を与えることで、凝集する。通常は酢酸ナトリウムを加えることにより、イオン強度の増加によりＤＮＡの沈澱反応が向上する。フェノール・クロロホルム抽出は、サンプル中のタンパク質を変性させる。サンプルの遠心分離の後に、変性タンパク質は有機相の中にとどまり、その一方で核酸を含んでいる水相は溶液からフェノール残留物を取り除くクロロホルムと混じり合う。ミニカラム精製において、核酸は、緩衝液のｐＨおよび塩含有量に依存する固体相（シリカまたは他のもの）に結合し、その後に溶出される。
【００９２】
抽出のための核酸を循環させる典型的な形式は、限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオソーム（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ）、ミトコンドリア、単鎖、後成的に修飾されたもの、二重鎖構造、円形、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体、特異的なＤＮＡ塩基配列を含む人工か人造のＤＮＡ、例えば相補的ＤＮＡのようなＲＮＡサンプルから逆転写されたＤＮＡ、および、それらの組み合わせを含む。核酸の抽出のための典型的な生物学的なソースは、限定されないが、全血、漿液、血漿、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、髄液、洗浄液（例えば、気管支肺胞、胃、腹膜、送管、耳、関節鏡）生検サンプル、尿、糞便、たん、唾液、鼻、粘液、前立腺流体、精液、リンパ液、胆汁、涙、汗、母乳、乳汁、胚細胞および胎児の細胞を含む。生体サンプルは核酸を含んでいるあらゆる組織または流体であり得る。典型的な生体サンプルは、限定されないが、パラフィン、埋め込まれた組織、冷凍の組織、外科的な細針吸引、皮膚の細胞、筋肉、肺、頭部および頚部、食道、腎臓、膵臓、口、咽喉、咽頭、喉頭、食道、顔（ｆａｃｉａ）、脳、前立腺、胸、子宮内膜、小腸、血球、肝臓、精巣、子房、子宮、頸部、結腸、胃、脾臓、リンパ節、骨髄または腎臓を含む。流体サンプルは気管支毛、気管支洗浄液、気管支洗浄物、末梢血リンパ球、リンパ液、腹水、漿液、胸水、唾液、脳脊髄液、涙液、食道の洗浄液、および膀胱洗浄液と尿などの便通または尿の標本を含む。
【００９３】
上に議論される、または当該技術分野で既知である核酸サンプルソースは一時的な単一または複数の間隔で得られ、およびＭＥＩ挿入の境界量の量的事前評価のために核酸が得られる。時間点は、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、１年、２年、３年、４年、５年、１０年または１０年以上など、日、週、月または年によって分けられる。
【００９４】
いくつかの場合に、時間点は、腫瘍または他のガン組織の切除、あるいは腫瘍またはガン組織の除去を目的とした化学療法または放射線療法など処置の実行など、処置レジメンの部分的または完全な実行によって分けられる。いくつかの場合に、上に開示されるような処置レジメンおよび組成物は、処置レジメンの一時的な分析に使用するために企図される。
【００９５】
したがって、例えば、ＭＥＩのレベルの減少が効果を示し、ＭＥＩの相対的なレベルで上昇率の減少が効果を示し、または、安定したレベルのＭＥＩ挿入境界の相対量の安定化が効果を示す介入の効果をモニタリングするため、過剰増殖性の細胞に関連したＭＥＩのためのＭＥＩレベルの定量化が用いられる。
【００９６】
サンプルの時間的分離よりも空間の分離が本明細書に企図される。したがって、場合によっては、腫瘍または癌活性に表現型的に関連しない第１の領域、あるいは組織からサンプルを採取し、癌の活性または前癌性の活性の疑いをかけられたか、腫瘍または癌であると観察された別の領域または組織から第２のサンプルを採取した。
【００９７】
場合によっては、腫瘍の増殖、成長、細胞分裂、または転移に関連する細胞が、良性の、休止した、または老化した腫瘍組織に関係している細胞から分離されるように、休止した、および、有糸分裂が活性なまたは増殖的に活性な領域などの癌または腫瘍の内部の複数の領域からサンプルを採取した。
【００９８】
場合によっては、例えば、内部と端の細胞集団を別個に抽出するように腫瘍組織を空間的に区別する。代替的にまたは組み合わせで、表面の特性またはバイオマーカーで腫瘍細胞を分類する。
【００９９】
細胞分類のためのいくつかの方法が当該技術分野で知られている。典型的な種類の細胞分類は、限定されないが、蛍光性の活性化された細胞分類（ＦＡＣＳ）、磁気細胞選択および単細胞分類を含む。単細胞分類は、細胞内と細胞外の特性に基づいた細胞の異種混合の混合物を分類する方法を提供する。ＦＡＣＳは、細胞の異種混合物を分類するために、形態学を含まない細胞内と細胞外の特性の定量的測定を提供するためにフローサイトメトリーを利用する。磁気細胞分類は、細胞外の特性、典型的には細胞表面タンパク質（すなわち抗原）に基づいた細胞の異種混合の混合物を濃縮する方法を提供する。磁気活性化された細胞分類（ＭＡＣＳ）は、標識化細胞が磁気カラムを通過するカラムベースの分離技術である。ＳＥＰシステムは、磁界の内部で標識化細胞のチューブを配置するカラムを用いない細胞分離技術を提供する。陰性として選択された細胞が液体の懸濁液にある間、陽性として選択された細胞をチューブで保持する。細胞分類の方法は、細胞を分類するために癌バイオマーカーに特異的に結合する薬剤（例えば抗体）を分類する工程を含む。
【０１００】
典型的な癌バイオマーカーは、限定されないが、ＣＣＲ１０、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤ２４、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ３２、ＣＤ４６、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５１、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６３、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ９１、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１０２、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０８、ＣＤ１１１、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３６、ＣＤ１４１、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５１、ＣＤ１５５、ＣＤ１５７、ＣＤ１６４、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７７、ＣＤ１８６、ＣＤ１９６、ＣＤ２２１、ＣＤ２３０、ＣＤ２３４、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２６２、ＣＤ２６５、ＣＤ２７３、ＣＤ２７５、ＣＤ２９５、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３２４、ＣＤ３４０、ＢＭＰＲ−１Ｂ、カドヘリン−１１、ｃ−Ｍｅｔ、クラウディン−３（ＤＬＬ−１）、ＤＬＬ−３、Ｅｐｈ−Ｂ２、Ｅｐｈ−Ｂ４、ＦＯＬＲ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−３、Ｇｌｕｔ−１、Ｇｌｕｔ−２、Ｇｌｙｐｉｃａｎ  ５、ＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＥＲ３、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−２０Ｒａ、ｊａｇｇｅｄ−２、インテグリン−ａ８、インテグリンａ９ｂ１、インテグリンｂ５、ＬＡＧ−３、ロイコトリエン−Ｂ４Ｒ、Ｌｏｘ−１、ＬＤＬ−Ｒ、ＭＣＳＰ、量体、ネクチン−４、ノッチ２、ＮＰＣ、ＰＤ−Ｌ２、プレキシン−Ｂ１、セマフォリン４Ｂ、ソマトスタチン−Ｒ２、ＴＲＯＰ−２、ＵＬＢＰ２、インテグリンａＶｂ９およびＶＥＧＦＲ２を含む。単細胞の分類およびＦＡＣＳの場合には、バイオマーカーが細胞内または細胞外であり得る。
【０１０１】
第２のサンプルにおいて差次的に過剰なＭＥＩ挿入接合を同定するためにサンプルに渡ってＭＥＩレベルを比較する。本明細書で議論されるように、差次的に豊富なＭＥＩ挿入結合は、場合によっては、他のサンプルではなく１つのサンプル中で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７０％、１００％、２ｘ、２．５ｘ、３ｘ、３．５ｘ、４ｘ、５ｘ、または５ｘを超えて豊富である。
【０１０２】
上に議論されるような処置選択を導くために推定上健常でない組織に差次的に存在すると同定されたＭＥＩ挿入物境界が使用される。相対的なレベルの減少、または相対的なレベルの安定化、または相対的なレベルの増加率の減少が、処置効果を示す疾病進行または処置効果をモニタリングするために、推定上健常でない組織に差次的に存在すると同定されたＭＥＩ挿入物境界が使用される。
【０１０３】
場合によっては、腫瘍または癌または、健常であると推定される組織に由来する、サンプル中のＭＥＩ挿入部位の相対的存在量の増加は、サンプルが由来する組織が、潜在的に、前癌性か癌であるリスクを示すように、同定された腫瘍または癌の部位を超える癌細胞または前癌細胞の拡張をモニタリングするために、過剰増殖性の細胞活性に関係するＭＥＩ挿入物に隣接する配列を用いる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＭＥＩの定量的配列分析の結果を詳述する報告書が提供される。その報告書は、例えば、経時的な、処置レジメンに関連する、または１つの組織または領域が別の組織に対する相対的な形式で、ＭＥＩ相対存在量レベルに関連する情報を含む。いくつかの場合に、報告書は、ＭＥＩ挿入部位、または過剰増殖性の細胞に関連した部位に隣接している配列の同一性により通知される処置の推奨を伴う。様々な実施形態において、そのような処置推奨は、化学療法、放射線療法、組織切除またはそれらの組み合わせを伴う。場合によっては、処置は、ＭＥＩ挿入部位に関連する崩壊した遺伝子の生成物を標的とし、一方、ある実施形態では、処置は崩壊した遺伝子の生成物が関与する経路の一部の誤調節を標的とする。例えば、ＭＥＩ挿入によって示されるように陰性の調節遺伝子が崩壊すれば、処置は、ＭＥＩ挿入物の崩壊の結果としてアップレギュレートすると予想される、下流のシグナル伝達構成要素を標的とする場合がある。
【０１０５】
場合によっては、個人にその報告書を提供する一方、場合によっては、医療専門家に報告書を提供している。場合によっては、報告書は秘密裏に提供され、その結果公に提供されず、サンプルを提供する個人または個人と関連する医療従事者にのみ秘密裏に提供され、あるいは秘密裏に医療専門家に提供される。
【０１０６】
多くの方法はＭＥＩ挿入物に隣接する配列の定量化のために利用可能である。全体のゲノム配列決定を通じてＭＥＩ配列など反復の要素をどのように定量的に分析するかの概念の例は、以下の通りである。
【０１０７】
場合によっては、サンプル中の核酸配列存在量として本明細書で得られた配列情報を使用する。本明細書に開示されるように、または当該技術分野で既知であるように、ライブラリを生成し配列する。固有のタグ付けされた読み取りだけを含むように複製の読み取りを除外する。ゲノムの配列に、独自に読み取られた配列をマッピングする。標的部位にマッピングする独自なライブラリ配列の読み取りの数を数えて、それを用いてサンプルでその配列の存在量を表わす。いくつかの実施形態では、固有のタグ付けされた配列はサンプル配列の単一の部位に対する各マップを読み取る。場合によっては、固有のタグ付けされた配列の読み取りは、トランスポゾン挿入部位または反復の要素を有する部位などのゲノムの全体の複数の部位へマッピングされる。従って、場合によっては、トランスクリプトーム「遺伝子座」または転写物にマッピングされるライブラリ分子の数は、ライブラリが生成されるサンプル中の転写物の蓄積のレベルに相当する。反復性の要素にマッピングされるライブラリ分子の数は、ゲノムの一定の独自な領域へマッピングされるライブラリ分子の数に対する、サンプル中の反復性の要素の相対存在量を示す。所定のＭＥＩ挿入接合にマッピングされる配列読み取りを使用して、所定のサンプル中の挿入接合を定量化する。したがって、ＭＥＩ挿入境界におよぶ読み取りの数の比較によって、当業者は、例えばサンプルの健常な半数性のゲノム中の単一のコピーであると知られている配列などサンプル中の他の配列に関連するその挿入境界を定量化する。
【０１０８】
したがって、ライブラリ中の核酸分子配列の発生頻度がライブラリを生成するサンプル中の核酸分子配列の存在量に対応するので、サンプル中の核酸分子配列の相対存在量を定量化することは、独自にタグ付けされたライブラリフラグメントを含む配列ライブラリを生成すること、およびライブラリ上の核酸分子配列のマッピングすることによって達成される。いくつかの場合、ライブラリ中の核酸分子配列の出現頻度は、ライブラリ中の第２の核酸分子配列の出現頻度に関連して評価され、前記第２の核酸配列は、トランスクリプトーム中の既知の数量の遺伝子座または転写物、あるいはゲノムサンプルのゲノム当たりの既知のコピー数に対応する。
【０１０９】
核酸サンプル中の核酸配列定量化のためのより詳細なプロトコルを以下に提供する。しかしながら、本明細書に開示された方法は、核酸サンプル中の核酸配列定量化のどんな単一の方法にも制限されていないことを強調する。
【０１１０】
ゲノム中のあらゆる可能な位置から次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ライブラリを生成することは、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）鋳型を、ｇＤＮＡの側方に位置するプラットフォーム特異的な配列決定アダプターを有する適切なサイズのライブラリ分子に変換するための、偏りがない手法を必要とする。以下の図式：５’−ａｄａｐｔｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＮＮＮＮＮＮＮＮ−３’によって例証されるように、配列決定アダプター尾部を備えたランダムのプライマーを使用して実行し得る。
【０１１１】
一定のゲノムのための偏りを最小化するために、所望のゲノム中の可変含有量を説明するためにセミランダム（ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ）の様式でプライマーの「ランダム」部分を合成してもよい。一定のゲノム（例えばヒトゲノム）を１００ｂｐウィンドウの可変のＧＣ含有量に分解することが可能である。理想的には、プライマーは、１％から１００％ＧＣまでのゲノム中のＧＣ含有量のウィンドウに対して命じられた代表的な「ランダム性」を含めるために合成され、各ＧＣ％でゲノムの含有量に対して相対的な比率で合成され、蓄積されることになる。
【０１１２】
ランダムのプライミングにより、ゲノムの各塩基は、シーケンサーの読み取りの開始位置として表され得る。ゲノム中のあらゆる塩基で各ライブラリ分子を終了するために、ランダムのプライマーからの重合を終了させる、ランダムな／偏りのない手法が必要である。これを行うために、４つの天然のヌクレオチドの各々の固定比率から３’−ＯＨ群が欠けているジデオキシドヌクレオチドの固定比率を含むｄｄＮＴＰｓのカクテルを使用してもよい。ｄｄＮＴＰ対ｄＮＴＰの比率は、所定の任意の塩基位置での終了の可能性を決定することが可能である。例えば、１％のｄｄＮＴＰカクテル（９９％のｄＮＴＰ）は、ランダムのプライマーから伸長する分子の９９％が最初の塩基を過ぎて重合する見込みを与えることになる。この同じ実施例は、５０ｂｐのＮ５０（分子の５０％はＮ塩基より長くなる）を与える。相対的なｄｄＮＴＰ割合が減少するにつれ、Ｎ５０挿入物のサイズは増大する。したがって、ある条件の下で、０．８のｄｄＮＴＰ％は６２．５の挿入物の中央値サイズ（Ｎ５０）、および１９８．５のアダプターとランダムのプライマーを含む完全長のライブラリ分子の比較可能なＮ５０をもたらし、０．４のｄｄＮＴＰ％は１２５の挿入物の中央値サイズ（Ｎ５０）、および２６１のアダプターとランダムのプライマーを含む短縮していないライブラリ分子のうちの比較可能なＮ５０をもたらし、０．２のｄｄＮＴＰ％は挿入物の中央値サイズ（Ｎ５０）、および３８６のアダプターとランダムのプライマーを含む短縮していないライブラリ分子のうちの比較可能なＮ５０をもたらし、０．１のｄｄＮＴＰ％は、５００の挿入物の中央値サイズ、および６３６のアダプターとランダムのプライマーを含む短縮していないライブラリ分子の比較可能なＮ５０をもたらし、０．０５のｄｄＮＴＰ％は１０００の挿入物の中央値サイズ、および１１３６のアダプターとランダムのプライマーを含む短縮していないライブラリ分子の比較可能なＮ５０をもたらす。ＡＴまたはＧＣの区間など複雑さの低い領域については、そのゲノムの位置のｄｄＮＴＰの有効な濃度は半分に減少することになり、１％のｄｄＮＴＰカクテルを有するこのような複雑さの低い遺伝子座の中で生じるプライマー伸長反応のための１００ヌクレオチドのＮ５０を与える。（８つのヌクレオチドすべての間でポリメラーゼ取り込みの効率差の説明となるものではない）。
【０１１３】
反応中のｄｄＮＴＰ％を調節することで、重合された分子の範囲および多様性を調節することができる。フラグメントの長さおよびアデニン・チロシン・バイアスに対するｄｄＮＴＰ濃度の影響を図１１に示す。収率に対するｄｄＮＴＰ濃度の影響を図１２に示す。０．４％のｄｄＮＴＰでは、３００−１０００ｂｐ（モル）からのモル濃度は２７．５である；０．２％のｄｄＮＴＰでは、３００−１０００ｂｐ（モル）からのモル濃度は１６．１である；０．１％のｄｄＮＴＰでは、３００−１０００ｂｐ（モル）からのモル濃度は５．８である；および、０．０５％のｄｄＮＴＰでは、３００−１０００ｂｐ（モル）からのモル濃度は４．９である。図１３は、サイズによって選択された分子のための読み取り位置を示す。
【０１１４】
追加の段階は、ｇＤＮＡ鋳型、ならびにプライマーおよび超過ＮＴＰなどランダムの超過反応物からアダプター標識を付けた分子を単離することであり得る。これはビオチン化されたｄｄＮＴＰｓの使用を通じて行うことが可能である。この単離を達成するためにストレプロアビジンでコーティングされた磁気ビーズが使用され得る。
【０１１５】
ｄｄＮＴＰ／ビオチン取り込みと同様に鎖置換の能力を持っている酵素にポリメラーゼの選択を制限することができる。ＳＥＱＵＥＮＡＳＥおよびＴＨＥＲＭＯＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）は２つのそのような酵素である。低い入力量がサンプル資源の不足または強制的な希釈により必要な場合、ｄｄＮＴＰｓを組み込む能力が欠けた高進行性のポリメラーゼであるＳＥＱＵＥＮＡＳＥおよびＰｈｉ２９などの、酵素カクテルの使用を通じて収率を改良するために反応を最適化してもよい。Ｐｈｉ２９酵素は反応中のＳＥＱＵＥＮＡＳＥにより処理するための鋳型量を増大するだろう。反応の期間の最適化により鋳型の収率および多様性も増加させる場合がある。
【０１１６】
そのような順番に配列を行った反応の生成物は、以下の図式：５’−ＡＤＡＰＴＥＲ−ＮＮＮＮＮＮＮＮ−ＧＥＮＯＭＩＣ  ＩＮＳＥＲＴ−ｄｄＮＴＰ／ｂｉｏｔｉｎのように表わされる。
【０１１７】
現在市販されているシーケンサーは、ｇＤＮＡ挿入物が２つのアダプター配列の側方に位置する事を必要とする。第２のランダムのプライミング反応を通じて第２のアダプターを加えてもよい。磁気ビーズから分離した生成物は、次の図式：５・ｆ−Ａｄａｐｔｅｒ２−ＮＮＮＮＮＮＮＮ−３’によって実証されるように、別のアダプターを備えたランダムのプライマーを使用して、第２のランダムのプライミング反応のための鋳型として使用可能である。移動させられた生成物を、別のアダプターを備えたランダムのプライマーを使用する第２のランダムのプライミング反応のための鋳型として使用することが可能である。
【０１１８】
第２のアダプター追加のための酵素は、ｄｄＮＴＰを組込む能力を必要としない場合がある。鎖置換は要求され得る。許容可能な酵素はＳＥＱＵＥＮＡＳＥ、ＴＨＥＲＭＯＳＥＱＵＥＮＡＳＥ、Ｐｈｉ２９、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む。プライマーのランダムの部分はビーズ境界鋳型に結合し、鋳型分子の末端まで伸長することが可能である。鋳型の３’末端へ最も接近して結合するプライマーは、下流で結合したプライマーを移動させることが可能であり、それによって第１と第２のアダプターとともに、単一のビーズが結合した鋳型の単一のコピーを生成する。このコピーは磁気ビーズに水素結合した状態で存続可能である。ビーズ洗浄によって超過プライマー、ＮＴＰ、酵素および移動させた生成物を除去することが可能である。結果として生じる生成物は熱変性して（この鋳型をビーズから解放して）、アダプターに相補的なプライマーを用いたＰＣＲを介して配列されるか、増幅することが可能である。これによって作成された生成物は、３’から５’の配向に描かれる以下の図式：３’−ａｄａｐｔｅｒ１−ＮＮＮＮＮＮＮＮ−ｇＤＮＡｉｎｓｅｒｔ−ＮＮＮＮＮＮＮＮ−ａｄａｐｔｅｒ２−５’に示される。
【０１１９】
ＮＧＳ配列決定における決定的な誤差モードはライブラリ調製における誤差のクローン増幅である。ＰＣＲを用いないプロトコルについては、これは大した問題ではないが、どんな低い入力プロトコルも、増幅がシーケンサー上でロードするのに十分なライブラリを得ることを要求する。増幅プロセスで導入された誤差は、シーケンサー中で現われることがある。こうした誤差の標準的な減少は分析から重複を取り除くことである。しかしながら、十分な配列決定能力がサンプルに与えられると、重複の読み取り（同じ開始および終了位置で読み取る）が自然に生じることがある。したがって、こうした読み取りを取り除くと、分析の適用範囲と正確さを損なうことになる。分析の際に合成のランダムなプライマーを使用することで、クローンの人工産物対低頻度の突然変異の正確な測定が可能となる。ＰＣＲ複製は両端部に同じランダムなプライマー配列を有することもあり、一方で、ディープ配列決定の適用範囲による複製は様々なランダムなプライマー配列を有することもある。合成配列が常に各読み取りの同じ位置にあるため、この情報は容易に分析で得ることができる。
【０１２０】
合成化学（ＱｉａｇｅｎおよびＩＯＮ  Ｔｏｒｒｅｎｔなど）による無限の配列決定では、ホモポリマーの長い区間の配列を決定することは難しい。これは、本明細書に記載されたホモポリマー全域で各塩基での終結により達成された複雑なライブラリ生成によって緩和されることがある。
【０１２１】
これに応じて、上記の開示と一致して、第１の鎖のオリゴヌクレオチドライブラリが生成される。ランダムなライブラリを生成するために、最初の回の合成オリゴの母集団が合成される。第１の鎖のオリゴヌクレオチドは各々、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０量体、あるいはそれ以上のオリゴマーといったランダムなオリゴマー配列の５’の位置にある配列アダプターを含み、その後に鋳型の一定方向への伸長が生じる３’ＯＨが続く。場合によっては、配列アダプターは可変の識別子配列（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むように構成される。代替的な場合において、配列アダプターは不変である。配列アダプターは、場合によっては、増幅による標準的なプライマーにより指示された配列付加を介するなどして、Ａアダプターのような配列決定アダプターの後の追加のためのプライマー結合部位として使用される。
【０１２２】
場合によっては、オリゴヌクレオチドの母集団は、与えられたランダムなオリゴマー塩基配列（ランダムな５、６、７、８、９、あるいは１０量体など）のあらゆる起こり得る組み合わせが第１の鎖のオリゴヌクレオチド母集団で表わされるように、合成される。他の場合では、とりわけ長いランダムオリゴマーが選択されるとき（小さなオリゴマーの場合でも往々にしてあるが）、与えられたランダムなオリゴマー塩基配列のあらゆる起こり得る組み合わせ未満しか存在しない。
【０１２３】
場合によっては、ランダムなオリゴマーの塩基は、均等な割合で核酸塩基の偏りのないランダムな分布を表す。ある場合には、各塩基は、所定の位置で、あるいはランダムなオリゴマー母集団中で凝集して等しく生じる可能性がある。しかしながら、他の場合では、アニーリングとその後の第１の鎖の合成の効率を上げるために、母集団は、特定の塩基または塩基対を表す偏りのあるものを有する、ランダムなオリゴマー（ランダムな８量体など）に対する偏りを含むように合成される。例えば、ヒトゲノムは真のランダムな塩基存在量から予想されるような５０％のＧＣ組成物ではなく、約４０％のＧＣ割合を有すること分かる。例えば、図１０を参照。場合によっては、ランダムなオリゴマー分布は、第１の鎖の合成ライブラリ中のランダムなオリゴマー配列（８量体の配列など）の全体的な分布が、標的ゲノム、標的遺伝子座、標的遺伝子ファミリー、標的ゲノム要素（例えば、エキソン、イントロン、またはプロモーター配列など）の平均のような偏った標的平均の分布を、あるいはいくつかの実施形態ではヒトゲノム全体と一致させるために反映するように、偏りを持たせる。
【０１２４】
第１の鎖のオリゴライブラリ、または第１の鎖のオリゴヌクレオチドライブラリの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または１０％未満を表すオリゴヌクレオチドライブラリのサブセットを、デオキシリボ核酸またはリボ核酸のような核酸を含むサンプルに接触させる。ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸は広範囲の量で提供されてもよい。場合によっては、ゲノムＤＮＡサンプルは、１ｎｇ、２ｎｇ、３ｎｇ、４ｎｇ、５ｎｇ、６ｎｇ、７ｎｇ、８ｎｇ、９ｎｇ、１０ｎｇ、１１ｎｇ、１２ｎｇ、１３ｎｇ、１４ｎｇ、１５ｎｇ、１６ｎｇ、１７ｎｇ、１８ｎｇ、１９ｎｇ、２０ｎｇ、２１ｎｇ、２２ｎｇ、２３ｎｇ、２４ｎｇ、２５ｎｇ、２６ｎｇ、２７ｎｇ、２８ｎｇ、２９ｎｇ、３０ｎｇ、３１ｎｇ、３２ｎｇ、３３ｎｇ、３４ｎｇ、３５ｎｇ、３６ｎｇ、３７ｎｇ、３８ｎｇ、３９ｎｇ、４０ｎｇ、４１ｎｇ、４２ｎｇ、４３ｎｇ、４４ｎｇ、４５ｎｇ、４６ｎｇ、４７ｎｇ、４８ｎｇ、４９ｎｇ、５０ｎｇ、５１ｎｇ、５２ｎｇ、５３ｎｇ、５４ｎｇ、５５ｎｇ、５６ｎｇ、５７ｎｇ、５８ｎｇ、５９ｎｇ、６０ｎｇ、６１ｎｇ、６２ｎｇ、６３ｎｇ、６４ｎｇ、６５ｎｇ、６６ｎｇ、６７ｎｇ、６８ｎｇ、６９ｎｇ、７０ｎｇ、７１ｎｇ、７２ｎｇ、７３ｎｇ、７４ｎｇ、７５ｎｇ、７６ｎｇ、７７ｎｇ、７８ｎｇ、７９ｎｇ、８０ｎｇ、８１ｎｇ、８２ｎｇ、８３ｎｇ、８４ｎｇ、８５ｎｇ、８６ｎｇ、８７ｎｇ、８８ｎｇ、８９ｎｇ、９０ｎｇ、９１ｎｇ、９２ｎｇ、９３ｎｇ、９４ｎｇ、９５ｎｇ、９６ｎｇ、９７ｎｇ、９８ｎｇ、９９ｎｇ、または１００ｎｇ、あるいは上記の一覧によって定義される範囲外の値などの量またはそのおよその量で提供される。以下に見られるように、下流の熱サイクルの数は、開始鋳型の量が増加するにつれて減少する。場合によっては、ＲＮＡサンプルは、わずか１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００の細胞、または１００を超える細胞の細胞集団から抽出されたＲＮＡから提供される。
【０１２５】
さらに、ＤＮＡポリメラーゼ活性と一致する試薬を含むポリメラーゼ緩衝液が混合物に加えられる。多くのポリメラーゼは本明細書の開示に一致している。場合によっては、典型的なポリメラーゼは、鎖置換活性、ｄｄＮＴＰ取り込み活性を所有し、ビオチン標識ｄｄＮＴＰなどのビオチン標識ヌクレオチドを取り込むことができる。典型的なポリメラーゼはＳｅｑｕｅｎａｓｅであり、その一方で、典型的な逆転写酵素はＨＩＶ逆転写酵素である。
【０１２６】
さらに、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰを含む母集団、および場合によってはｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、およびｄｄＧＴＰのようなｄｄＮＴＰの母集団を含むヌクレオチドの母集団が混合物に加えられる。場合によっては、ｄｄＡＴＰ単独、ｄｄＴＴＰ単独、ｄｄＣＴＰ単独、およびｄｄＧＴＰ単独などの単一の種のｄｄＮＴＰだけが、ｄＮＴＰの母集団に加えられる。場合によっては、ｄｄＡＴＰとｄｄＴＴＰ、またはｄｄＣＴＰとｄｄＧＴＰなどのｄｄＮＴＰ対が加えられる。
【０１２７】
場合によっては、組成物に加えられたｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、およびｄｄＧＴＰなどのｄｄＮＴＰの母集団は、ビオチンでタグ付けしたｄｄＡＴＰ、ビオチンでタグ付けしたｄｄＴＴＰ、ビオチンでタグ付けしたｄｄＣＴＰ、およびビオチンでタグ付けしたｄｄＧＴＰなどの少なくとも１つのビオチンでタグ付けしたｄｄＮＴＰを含む。
【０１２８】
ｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ比率の範囲は本明細書の開示に一致している。９９．９％／０．１％、９９．５％／０．５％、９９％／１％、９８％／２％の比率および代替的な比率は、本明細書の開示と一致している。場合によっては、９９％のデオキシＮＴＰ対１％のジデオキシＮＴＰの相対的な比率が選択される。
【０１２９】
混合物は、場合によっては、９５°Ｃ、９６°Ｃ、９７°Ｃ、９８°Ｃ、または９９°Ｃなどの融解温度以上で、あるいはそれ以上の高温で加熱することにより、変性する。多くの場合、１００°Ｃよりも下の変性温度が典型的である。
【０１３０】
その後、混合物を、例えば、３０秒、１分、２分、または２分を超えて氷上で、あるいは、３０秒、１分、２分、または２分を超えて４°Ｃで、あるいは第１鎖合成オリゴヌクレオチドとゲノムＤＮＡサンプルまたはＲＮＡサンプルなどの核酸サンプルとの間の逆相補的塩基対合を可能にするのに十分な代替的冷却温度で冷やす。場合によっては、第１鎖合成オリゴヌクレオチドの一部またはすべては、そのランダムなオリゴ（ランダム８量体など）と、互いに結合するゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、またはＲＮＡ配列などの核酸サンプルとの間の完全な逆相補性を実証する。場合によっては、いくつかのオリゴヌクレオチドは、オリゴのランダムなオリゴマー（ランダム８量体など）に不完全に逆相補的であるゲノム領域に結合する。完全な逆相補性との塩基対合の失敗は、場合によっては、ランダムなライブラリ調製プロセスの後の工程には有害ではない。
【０１３１】
ポリメラーゼは代替的な実施形態における任意の変性工程の前または後に加えられる。混合物は、最適なポリメラーゼ活性などのポリメラーゼ活性と一致する温度に加熱され（例えば、２０°Ｃ、２１°Ｃ、２２°Ｃ、２３°Ｃ、２４°Ｃ、２５°Ｃ、２６°Ｃ、２７°Ｃ、２８°Ｃ、２９°Ｃ、３０°Ｃ、３１°Ｃ、３２°Ｃ、３３°Ｃ、３４°Ｃ、３５°Ｃ、３６°Ｃ、３７°Ｃ、３８°Ｃ、３９°Ｃ、４０°Ｃ、４１°Ｃ、４２°Ｃ、または、場合によっては、より大きな数、またはこの範囲内の数未満で）、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５分、または４５分を超える時間などの、第１の鎖のライブラリを合成するのに十分な期間、培養される。場合によっては、反応は１０分ごとなどの培養中の時点で撹拌される。
【０１３２】
伸長は第１の鎖の合成オリゴヌクレオチドの３’ＯＨから進行して、その結果として、各アニールされたオリゴの３’末端で取り込まれている各アニールされたオリゴのアニーリング部位の鋳型に対して逆相補的な配列がもたらされる。伸長はビオチン標識ｄｄＮＴＰ分子が取り込まれるまで続き、その時点で伸長は終了する。ｄＮＴＰとビオチン−ｄｄＮＴＰが９９％／１％の比率で提供される場合、伸長が生じる第１の鎖のオリゴの５０％は、ビオチン−ｄｄＮＴＰ分子の取り込みの前の５０を超える塩基の伸長を実証するものである。他のパラメータが同時に変えられない複数の場合では、ｄｄＮＴＰの割合が減少し、伸長生成物の少なくとも５０％の長さを表わすＮ５０が増加する。
【０１３３】
培養期間の終了時、反応は例えば５分間９８°Ｃでの熱失活によって止められる。代替的に、不活性化は、別の温度で、あるいはキレート剤またはｄＮＴＰａｓｅの追加によって達成されてもよい。
【０１３４】
上に言及されるように、場合によっては、取り込まれたｄｄＮＴＰはビオチンタグなどによりタグ付けされる。ジニトロフェニルなどのビオチンの代替物が場合によっては企図される。ｄｄＮＴＰに結合されるとともに少なくとも１つの核酸ポリメラーゼによって発生期の核酸分子に取り込まれることができる任意の親和性タグも本明細書の開示と一致している。同様に、例えば、ｄｄＮＴＰ結合部分によって核酸分子のｄｄＮＴＰ末端に送達可能な任意の親和性タグも本明細書の開示に一致している。場合によっては、親和性タグはビオチン−ｄｄＮＴＰである。
【０１３５】
場合によっては、タグ結合剤は、タグビオチンの場合はアビジンまたはストレプトアビジンなどの本明細書で提供されるようなタグ付けされた第１の鎖核酸分子と結合するように提供される。特定の場合では、ストレプトアビジンは、ストレプトアビジンと任意の結合パートナーが磁気スタンド上などの磁場に配置することで単離可能となるように、磁気ビーズと結合させる。
【０１３６】
タグ付けされた第１の鎖のライブラリは、ビオチンでタグ付けしたｄｄＮＴＰ核酸末端に対して、タグ結合剤、例えば、ストレプトアビジンを使用して単離される。場合によっては、ビーズ／サンプル混合物は２２Ｃで培養され、３０分間にわたって１０分のインターバルで撹拌される。その後、混合物を磁気スタンド上に置き、ビーズを固定して、上澄みを取り除く。チューブを撹拌し、磁気スタンド上に置く。ビーズを２００ｕＬのＴＥ緩衝液で３回洗浄する。代替的なタグ結合剤の組み合わせと代替的なプロトコルは、本明細書の開示に一致している。
【０１３７】
場合によっては、第１の鎖分子は、例えば、ゲル電気泳動のようなサイズ選択と、その後の所望のサイズの核酸の精製によって、タグ付けとは無関係に精製される。場合によっては、１０−１００、１０−１５０、１０−２００、１−３００、１０−３５０、１０−４００、１０−５００、１０−６００、１０−７００、１０−８００、１０−９００、または１０−１０００の塩基のサイズ範囲のフラグメントが単離される。
【０１３８】
上記のように精製される第１の鎖ライブラリ鋳型は反応緩衝液へ再導入される。例えば、鋳型は場合によってはその精製タグから分離され、ストレプトアビジンタグから溶出され、ｄＮＴＰを含む核酸合成緩衝液中に再懸濁される。場合によっては、鋳型はその精製タグに付いたままであり、洗浄され、反応緩衝液中に再懸濁される。ＮａＯＨ洗浄剤は、場合によっては、キャリーオーバー配列（ｃａｒｒｙｏｖｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ））を取り除き、かつ第１の鎖のライブラリ生成物の自己折り畳みを減らすために、以下の第１の鎖のライブラリ生成に含まれる。
【０１３９】
ライブラリの第２の鎖分子は以下のように合成される。第２のプローブライブラリが追加され、これは第２の鎖のプライマーの母集団を含む。場合によっては、各第２の鎖プライマーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０量体などのランダムなオリゴマー配列、あるいは、それよりも大きなオリゴマー（例えば、８量体）を含み、その後、鋳型の一定方向への伸長が生じる３’ＯＨを含む。場合によっては、配列アダプターは可変の識別子配列（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むように構成される。代替的な場合において、配列アダプターは不変である。配列アダプターは、場合によっては、増幅による標準的なプライマーにより指示された配列付加を介するなどして、Ｂアダプターのような配列決定アダプターの後の追加のためのプライマー結合部位として使用される。
【０１４０】
場合によっては、オリゴヌクレオチドの母集団は、与えられたランダムなオリゴマー塩基配列（ランダムな８量体など）のあらゆる起こり得る組み合わせが第２の鎖のオリゴヌクレオチド母集団で表わされるように、合成される。他の場合では、とりわけ長いランダムオリゴマーが選択されるとき（小さなオリゴマーの場合でも往々にしてあるが）、与えられたランダムなオリゴマー塩基配列のあらゆる起こり得る組み合わせ未満しか存在しない。
【０１４１】
場合によっては、ランダムなオリゴマーの塩基は、均等な割合での核酸塩基の偏りのないランダムな分布を表す。ある場合には、各塩基は、所定の位置で、あるいはランダムなオリゴマー母集団中で凝集して等しく生じる可能性がある。しかしながら、他の場合では、アニーリングとその後の第２の鎖の合成の効率を改善するために、母集団は特定の塩基または塩基対を表す偏りのあるものを有する、ランダムなオリゴマー（ランダムな８量体など）に対する偏りを含むように合成される。例えば、ヒトゲノムは真のランダムな塩基存在量から予想されるような５０％のＧＣ組成物ではなく、約４０％のＧＣ割合を有すること分かる。例えば、図１０を参照。場合によっては、ランダムなオリゴマー分布は、第２の鎖の合成ライブラリ中のランダムなオリゴマー配列（８量体の配列など）の全体的な分布が、標的ゲノム、標的遺伝子座、標的遺伝子ファミリー、標的ゲノム要素（例えば、エキソン、イントロン、またはプロモーター配列など）の平均のような偏った標的平均の分布を、あるいはいくつかの実施形態ではヒトゲノム全体と一致させるために反映するように、偏りを持たせる。
【０１４２】
混合物を３分間９８°Ｃに加熱する。混合物を２分間氷の上で冷やして、第２の鎖の合成オリゴヌクレオチドと第１の鎖のライブラリとの間の逆相帆的な塩基対合を可能にする。複数のオリゴヌクレオチドは、そのランダムな８量体と各々が結合する第１の鎖の配列との間で完全な逆相補性を実証することが分かっている。複数のオリゴヌクレオチドは、オリゴのランダムな８量体に不完全に逆相補的であるゲノム領域に結合することも観察されている。完全な逆相補性との塩基対合の失敗は、ランダムなライブラリ調製プロセスの後の工程には有害ではない。
【０１４３】
組成物を室温まで加熱して３０分間継続する。少量の入力ＤＮＡを含むサンプルについては、この時限を延長することができる。
【０１４４】
第１の鎖の合成オリゴヌクレオチドの３’ＯＨからの伸長が観察され、その結果として、各アニールされたオリゴの３’末端で取り込まれている各アニールされたオリゴのアニーリング部位の鋳型に対して逆相補的な配列がもたらされる。伸長は、第１の鎖の鋳型の５’末端に到達するまで継続する。第１の鎖の鋳型の３’末端から離れてアニーリングされる第２の鎖のオリゴは、その３’末端から伸長するが、第１の鎖の鋳型の３’末端に向かってさらにアニーリングされるオリゴにより準備刺激された伸長反応によって第１の鎖から移動する。
【０１４５】
これに応じて、二本鎖ライブラリ分子は以下の２つの特徴的な鎖を含んで合成される：１）５’末端から、Ａアダプター、ランダム８量体配列、および約１−１００のヌクレオチド上の標的配列を有し、ビオチンでタグ付けしたｄｄＮＴＰで終了する第１の鎖、ならびに、２）５’末端から、Ｂアダプター、第２のランダム８量体配列、サンプルに由来する標的配列、第１の鎖のランダムな８量体に逆相補的な第１のランダムな８量体、および、第１のＡアダプターに逆相補的な配列を有する第２の鎖。
【０１４６】
場合によっては、磁気ストレプトアビジンビーズを用いて、ビオチンでタグ付けした二本鎖ライブラリ分子を分離する。磁気ストレプトアビジンビーズは、例えば、結合緩衝液中で提供され、混合され、磁気スタンド上に置かれる。その後、結合緩衝液は、２５ｕＬ、５０ｕＬ、７５ｕＬ、１００ｕＬ、１２５ｕＬ、１５０ｕＬ、１７５ｕＬ、２００ｕＬ、２２５ｕＬ、２５０ｕＬ、２７５ｕＬ、３００ｕＬ、３５０ｕＬ、４００ｕＬ、４５０ｕＬ、または５００ｕＬの容量に交換されてもよく、プロセスは繰り返される。その後、上澄みを取り除き、ビーズを５ｕＬ、１０ｕＬ、１２ｕＬ、１４ｕＬ、１６ｕＬ、１８ｕＬ、２０ｕＬ、２２ｕＬ、２４ｕＬ、２６ｕＬ、２８ｕＬ、３０ｕＬ、３１ｕＬ、３２ｕＬ、３３ｕＬ、３４ｕＬ、３５ｕＬ、３６ｕＬ、３７ｕＬ、３８ｕＬ、３９ｕＬ、４０ｕＬ、４１ｕＬ、４２ｕＬ、４３ｕＬ、４４ｕＬ、４５ｕＬ、４６ｕＬ、４７ｕＬ、４８ｕＬ、４９ｕＬ  ５０ｕＬ、５２ｕＬ  ５４ｕＬ、５６ｕＬ、５８ｕＬ、または６０ｕＬの結合緩衝液に再懸濁してもよい。
【０１４７】
場合によっては、その後、ビオチンでタグ付けした二本鎖ライブラリ分子を再懸濁されたビーズに加える。場合によっては、ビーズ／サンプル混合物を２２Ｃで培養され、３０分間にわたって１０分のインターバルで撹拌する。その後、混合物を磁気スタンド上に置き、ビーズを固定して、上澄みを取り除く。チューブを撹拌し、磁気スタンド上に置く。ビーズを２００ｕＬのＴＥ緩衝液で３回洗浄する。場合によっては、これにより、２つの特徴的な鎖を含むストレプトアビジンにより精製された二本鎖ライブラリ分子の母集団が生じる：１）５’末端から、Ａアダプター、ランダムオリゴマー（８量体など）配列、および約１−１００のヌクレオチド上の標的配列を有し、ビオチンでタグ付けしたｄｄＮＴＰで終了する第１の鎖、ならびに、２）５’末端から、Ｂアダプター、第２のランダムオリゴマー（８量体など）配列、サンプルに由来する標的配列、第１の鎖のランダムオリゴマー（８量体など）に逆相補的な第１のランダムオリゴマー（８量体など）配列、および、第１のＡアダプターに逆相補的な配列を有する第２の鎖。代替的なタグ結合剤の組み合わせと代替的なプロトコルは、本明細書の開示に一致している。
【０１４８】
二本鎖ライブラリ分子の母集団に結合した磁気ストレプトアビジンは、その後、例えば、ヌクレアーゼを含まない水の量で再懸濁される。この量は、１０ｕＬ、１２ｕＬ、１４ｕＬ、１６ｕＬ、１８ｕＬ、２０ｕＬ、２２ｕＬ、２４ｕＬ、２６ｕＬ、２８ｕＬ、３０ｕＬ、３２ｕＬ、３４ｕＬ、３６ｕＬ、３７ｕＬ、３８ｕＬ、３９ｕＬ、４０ｕＬ、４１ｕＬ、４２ｕＬ、４３ｕＬ、４４ｕＬ、４５ｕＬ、４６ｕＬ、４７ｕＬ、４８ｕＬ、５０ｕＬ、５２ｕＬ、５４ｕＬ、５６ｕＬ、５８ｕＬ、または６０ｕＬのヌクレアーゼを含まない水であってもよい。アダプターＡプライマーの量とアダプターＢプライマーの量は、再懸濁されたビーズに加えられる。アダプターＡプライマーの量とアダプターＢプライマーの量は、同じであっても、異なってよい。アダプターＡプライマーの量とアダプターＢプライマーの量は、独立して、１ｕＬ、２ｕＬ、３ｕＬ、４ｕＬ、５ｕＬ、６ｕＬ、７ｕＬ、８ｕＬ、９ｕＬ、または１０ｕＬであってもよい。場合によっては、アダプターＡプライマーは、プライマーの３’末端で二本鎖鋳型の第１のアダプターと同一の配列を含み、本明細書に記載されるような合成反応による配列決定に必要な配列をさらに含む。他の場合では、アダプターＡプライマーは、プライマーの３’末端で二本鎖鋳型の第１のアダプターの配列を含む、１つの塩基対ミスマッチ、２つの塩基対ミスマッチ、３つの塩基対ミスマッチ、４つの塩基対ミスマッチ、５つの塩基対ミスマッチ、６つの塩基対ミスマッチ、７つの塩基対ミスマッチ、８つの塩基対ミスマッチ、９つの塩基対ミスマッチ、または１０の塩基対ミスマッチを有する。場合によっては、アダプターＢプライマーは、プライマーの３’末端で二本鎖鋳型の第２の鎖の第２のアダプターと同一の配列を含み、本明細書に記載されるような合成反応による配列決定に必要な配列をさらに含む。他の場合では、アダプターＢプライマーは、プライマーの３’末端で二本鎖鋳型の第２の鎖の第２のアダプターの配列を含む、１つの塩基対ミスマッチ、２つの塩基対ミスマッチ、３つの塩基対ミスマッチ、４つの塩基対ミスマッチ、５つの塩基対ミスマッチ、６つの塩基対ミスマッチ、７つの塩基対ミスマッチ、８つの塩基対ミスマッチ、９つの塩基対ミスマッチ、または１０の塩基対ミスマッチを有する。
【０１４９】
２ｘＰＣＲマスターミックスは、ビーズとプライマーの混合物に、１０ｕＬ、１５ｕＬ、２０ｕＬ、２５ｕＬ、３０ｕＬ、３５ｕＬ、４０ｕＬ、４５ｕＬ、５０ｕＬ、５５ｕＬ、６０ｕＬ、６５ｕＬ、７０ｕＬ、７５ｕＬ、８０ｕＬ、８５ｕＬ、９０ｕＬ、９５ｕＬ、または１００ｕＬの量で加えられる。場合によっては、この混合物は以下のように熱サイクル：約２分間約９８°Ｃ；その後の、約９８°Ｃで約２０秒間、約６０°Ｃで約３０秒間、および、約７２°Ｃで約３０秒間の約６回のサイクルに晒され；上記の約６回のサイクル後、反応は約５分間約７２°Ｃで維持され、その後、４°Ｃで保存される。熱サイクル条件の最適化は、鋳型入力を低くしてサンプル用のＰＣＲサイクルの数を増加させるなどして、本開示によって予見される。場合によっては、増幅はＰＣＲなしで行われる。一例において、鋳型核酸は完全長の配列決定アダプターを含むプライマーと共に使用され、第１の鎖の合成と第２の鎖の合成はその後のサイズ選択により行われる。これは二量化を回避するためのヘアピンの使用を必要とすることもあれば、必要としないこともある。
【０１５０】
場合によっては、それによって生じる配列決定ライブラリは以下の特性を有することが確認されている。それぞれの二本鎖分子は、順に、合成による配列決定に十分なアダプターＡ配列、最初のランダムなオリゴマー配列（８量体など）、未知の長さであるが１−１００の範囲の塩基の可能性が高い標的部位、第２のランダムオリゴマー（８量体）配列、および本明細書で開示されるような合成による配列決定に十分なＢアダプター配列を含む。
【０１５１】
場合によっては、ライブラリ構成要素は以下の特性を有することが確認されている。各分子は、ライブラリの他の分子の第１の分子タグ（８量体など）とは無関係の第１の分子タグ（８量体など）を含む。各分子は元々のサンプル配列に対応する標的配列を含む。標的配列の出発点、標的配列の長さ、およびそれぞれの所定の分子の標的配列の終点は、ライブライ内のそれぞれの他の分子の出発点、長さ、および終点とは無関係である。各分子は、ライブラリの他の分子の第２の分子タグ（８量体など）とは無関係の第２の分子タグ（８量体）を含む。
【０１５２】
場合によっては、ライブラリは凝集して以下の特性を有すると観察される。実質的にすべてのサンプル配列が複数の重複分子によってライブラリ内で表される。熱サイクルによるＡとＢのアダプターの最終的な追加の前の、実質的にすべてのライブラリ分子（まれな事象を除く）は特有のものであり、その第１の分子タグ（８量体など）配列、標的配列の出発点、標的配列、標的配列の長さ、標的配列の終点、および第２の分子タグ（８量体など）配列に関して、互いに異なる。
【０１５３】
本明細書で生成されるような配列ライブラリは、そのＡアダプターとＢアダプターと適合する合成により配列に晒され、配列結果が評価される。独立して、元々のサンプルの第２のアリコートは、タグ付けしていない鋳型の実質的なＰＣＲベースの増幅を含む標準的なＰＣＲベースのライブラリタグ付けを用いて、配列決定のために調製される。ライブラリは配列決定され、結果が比較される。
【０１５４】
ＭＥＩに対応する配列は従来の配列ライブラリ配列決定結果で同定されることが確認されている。ＭＥモノマー単位は複数の挿入物に隣接する境界配列に隣接していることが確認されており、このことはそれがサンプル中の複数のコピー中に存在することを示唆している。
【０１５５】
配列の読み取りが５’タグ、３’タグ、ならびに、各ライブラリ・メンバーの中のサンプル配列の固有の出発点、終点、および長さにより固有にタグ付けされるため、配列の読み取りは固有のライブラリ分子に対応する群へ容易に分類される。配列読み取りの数よりもむしろ配列読み取りの母集団で表される固有のライブラリ分子の数を数えることによって、当業者は、配列決定に晒す核酸サンプル中に所定のＭＥＩ挿入物に隣接する配列を有する分子の絶対数または相対数の定量的測定値を得ることができる。
【０１５６】
代替的な定量化手法を利用することができ、本明細書に開示される方法は定量化の一つの方法には限定されない。例えば、定量ＰＣＲは、場合によっては、サンプルまたは複数のサンプル中のＭＥＩ挿入物に隣接する配列レベルを決定するために使用される。
【０１５７】
一般に、定量ＰＣＲは、特定の波長の光のビームを各サンプルに照射し、励起したフルオロフォアによって放たれた螢光を検知する能力を備えたサーマルサイクラーにおいて実行される。サーマルサイクラーはサンプルを急速に加熱および冷却することもでき、それによって、核酸とＤＮＡポリメラーゼの物理化学的性質を利用する。ＰＣＲプロセスは２５−４０回繰り返される一連の温度変化からなる。こうしたサイクルは通常３つの段階からなる：１番目の段階は、約９５°Ｃで、二本鎖核酸の融解を可能にし；２番目の段階は、約５０−６０°Ｃの温度で、プライマーのＤＮＡ鋳型との結合を可能にし；３番目の段階は、６８−７２°Ｃの間で、ＤＮＡポリメラーゼによって実行される重合を促す。フラグメントの大きさが小さいため、最後の工程はこのタイプのＰＣＲでは通常省略される。なぜなら酵素はアライメント段階と変性段階の変化のあいだにその数を増加させることができるからである。加えて、複数のサーマルサイクラーは、非特異的な染料が使用されるときにプライマーの２量体の存在によって引き起こされるノイズを減らすために、例えば、８０°Ｃの温度で、各サイクルに対してわずか数秒だけ続く別の短い温度相を加える。各サイクルに使用される温度とタイミングは、以下のような多種多様なパラメータに依存する：ＤＮＡを合成するために用いられる酵素、反応における二価イオンとｄＮＴＰの濃度、およびプライマーの結合温度。
【０１５８】
定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の場合、ＤＮＡ結合染料は、ＰＣＲ中の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡに結合して、染料の蛍光発光を引き起こす。ＰＣＲの間のＤＮＡ生成物の増加は蛍光強度の増大をもたらし、各サイクルで測定され、したがってＤＮＡ濃度の定量化を可能にする。定量ＰＣＲはプローブ配列を含むＤＮＡのみを検知するために蛍光性のリポータープローブをさらに含むこともあり、これは特異性を増加させ、非特異的なＤＮＡ増幅のある状態でも定量化を可能にする。
【０１５９】
ｑＰＣＲを使用する定量化の方法は相対的な定量化と絶対的な定量化を含む。絶対的な定量化は、検量線を使用するＤＮＡ基準と比較して、標的ＤＮＡ分子の正確な数を与えるものである。相対的な定量化は、標的遺伝子の発現の倍数差を決定するために、内部基準遺伝子に基づく。定量化は、相補的ＤＮＡ（ｍＲＮＡの逆転写によって生成されるｃＤＮＡ）として解釈されるｍＲＮＡの発現レベルの変化として表現される。
【０１６０】
終点ＰＣＲ（従来のＰＣＲ）とは異なり、リアルタイムＰＣＲにより、螢光を測定することで増幅プロセスの任意の時点で所望の生成物の定量化が可能となる。定量ＰＣＲによるＤＮＡ定量化の一般に使用される方法は、対数目盛上のサイクル数に対する螢光のプロットに依存する。ＤＮＡベースの螢光の検出用の閾値はバックグラウンドよりも若干上に設定される。螢光が閾値を越えるサイクル数は閾値サイクル（Ｃｔ）または定量化サイクル（Ｃｑ）と呼ばれる。
【０１６１】
市販の定量ＰＣＲ組成物、キット、および方法は利用可能であり、これらの使用はＭＥＩ挿入物の隣接する配列定量化に関連して本明細書で開示されるいくつかの方法と一致している。
【０１６２】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、一般的な体細胞ゲノムの健康を経時的にモニタリングすることに関する。一般的なゲノムの健康は、本明細書に開示されるように、場合によっては挿入部位とは無関係に、独立したＭＥＩ事象の存在率によって反映されるような体細胞ゲノムの「健康」状態に関する。したがって、場合によっては、方法はＭＥＩ事象の総数を時間的または空間的に分析することに関する。場合によっては、各挿入の事象が関連する挿入部位の遺伝子に有害な危険を伝えるため、ＭＥＩ事象の数の増大は「総ゲノムの健康」の減少を示唆する。ＭＥＩ事象の総数は、場合によっては、癌、老化、細胞活性の喪失、または細胞活性の減少のリスクに相関する。
【０１６３】
総ＭＥＩ事象は、例えば、本明細書または他のところに開示されるような定量的な全体のゲノム配列決定を用いて決定される。代替的に、または組み合わせて、個々の可動要素は、最大で既知の可動要素の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または約１００％、または１００％を含む複数の可動要素が最初の時点または最初の組織中でその存在量に応じて定量化されるように、例えば、当該技術分野で知られているように、Ｑ−ＰＣＲ、または蛍光インサイツ−ハイブリダイゼーション手法を用いて、単一の可動要素に特異的なプライマー、プローブ、またはプライマーとプローブを用いて、あるいは、プライマー、プローブ、またはプライマーとプローブのパネルを用いて分析される。
【０１６４】
とりわけサンプルが組織から、または青年期または成人早期などのゲノムの健康が高いと予想される最初の時期に得られる場合、この定量化は場合によってはゲノムの健康の基準線として使用される。
【０１６５】
第２のサンプルは、最初の時点後の１年未満、１年、２年、３年、４年、５年、１０年、または１０年を超える時点などの第２の時点で得られる。総ＭＥＩレベルが測定され、最初の時点のレベル、または一般に患者のゲノムの健康に客観的に関連しているレベルと比較される。
【０１６６】
ＭＥＩ事象の総数が、第１のまたは以前のサンプルよりもむしろ第２のサンプル中で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７０％、１００％、２ｘ、２．５ｘ、３ｘ、３．５ｘ、４ｘ、５ｘ、または５ｘを超えて豊富に増える場合、サンプル中の核酸は「老化している（ｓｅｎｓｃｅｎｔ）」か、ゲノムの健全状態が悪いと判断される。多くの処置選択肢は健全状態の悪いゲノム中に体細胞核酸サンプルを有すると測定された個体に利用可能である。場合によっては、カロリー制限が選択される。場合によっては、ＮＳＡＩＤＳが処置レジメンの一部として推奨される。ＮＳＡＩＤＳの一部のリストは以下を含む：アスピリン、セレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）、ジクロフェナク（Ｃａｍｂｉａ、Ｃａｔａｆｌａｍ、Ｖｏｌｔａｒｅｎ−ＸＲ、Ｚｉｐｓｏｒ、Ｚｏｒｖｏｌｅｘ）、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン（Ｍｏｔｒｉｎ、Ａｄｖｉｌ）、インドメタシン（Ｉｎｄｏｃｉｎ）、ケトプロフェン、ケトロラク、ナブメトン、ナプロキセン（Ａｌｅｖｅ、Ａｎａｐｒｏｘ、Ｎａｐｒｅｌａｎ、Ｎａｐｒｏｓｙｎ）、オキサプロジン（Ｄａｙｐｒｏ）、ピロキシカム（フェルデン）、サルサレート、スリンダク、およびトルメチン。他のＮＳＡＩＤＳが企図され、本明細書の開示に一致している。
【０１６７】
可動要素活性は場合によっては、レトロトランスポザーゼ（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）活性と抑圧的なゲノムメチル化の欠損に関連している。したがって、場合によっては、処置レジメンは逆転写酵素阻害薬の投与を含む。場合によっては、処置は、レトロトランスポザーゼ阻害剤の投与を含む。場合によっては、処置は、レトロウイルスの阻害剤の投与を含む。処置方法はゲノムの分析から得られた情報に基づいて施されてもよい。遺伝的異常のための処置レジメンは当該技術分野で知られている。レトロウイルス疾患を処置するために投与される典型的な阻害剤は、限定されないが、ヌクレオシドアナログ、プロテアーゼ阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、ヌクレオチド遅延型転写酵素阻害剤（ＮｔＲＴＩｓ）、混合阻害剤または侵入阻害剤、およびインテグラーゼ阻害剤を含む。典型的なＮＲＴＩとしては、ジドブジン（レトロビル）、ラミブジン（エピビル）、ジダノシン（ヴァイデックス）、ザルシタビン（ハイビッド）、スタブジン（ゼリット）、およびアバカビル（ザイアジェン）が挙げられる。典型的なプロテアーゼインヒビターとしては、サキナビル（インビラーゼ）、リトナビル（ノービア）、インジナビル（クリキシバン）、ネルフィナビル（ビラセプト）、アンプレナビル（Ａｇｅｎｅｒａｓｅ）、ロピナビル、アタザナビル（Ｒｅｙａｔａｚ）、およびチプラナビル（Ａｐｔｉｖｕｓ）が挙げられる。典型的な非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）としては、ネビラピン（ビラミューン）、デラビルジン（レスクリプター）、エファビレンツ（Ｓｕｓｔｉｖａ）、およびエトラビリン（Ｉｎｔｅｌｅｎｃｅ）が挙げられる。典型的なＮｔＲＴＩｓとしてはテノホビル（Ｖｉｒｅａｄ）が挙げられる。典型的な混合阻害剤または侵入阻害剤はマラビロクとエンフビルチドを含む。典型的なインテグラーゼ阻害剤はラルテグラビル（Ｉｓｅｎｔｒｅｓｓ）を含んでいる。代替的に、または上記の列挙した処置の任意の組み合わせと組み合わせて、メチルトランスフェラーゼまたはＤＮＡメチル化促進組成物は個体に投与される。ＨＢＶを処置するための典型的な阻害剤としては、限定されないが、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）、ＰＥＧ−ＩＦＮ−α、エンテカビル、およびテノホビルが挙げられる。
【０１６８】
いくつかの場合、処置は、ＭＥＩ存在量の増加に対するその効果について経時的にモニタリングされる。例えば、第３のサンプルは、本明細書に開示される処置レジメンなどの処置レジメンの開始後の時点で得られ、例えば、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月の時点、最初の時点の１年未満の後、１、２、３、４、５、１０年後、または１０年よりも後に得られる。総ＭＥＩレベルが測定され、初期の時点のレベル、または通常は患者のゲノム健常と客観的に関連するレベル、または処置レジメンの開始前に判定されたレベルと比較され、或いは、以前のＭＥＩ存在量の測定値と比較される。予めの挿入のレベルのＭＥＩの凝集量の安定性以下のＭＥＩ存在量の増加率の減少を結果としてもたらす処置レジメンは、持続され、場合によっては、層ＭＥＩレベルの進行中のモニタリングを伴う。合計の総ＭＥＩレベルの増加に影響を与えない処置レジメンが交換され、補足され、或いは、投薬レジメンは、ＭＥＩレベルの増加がおそらく正に影響を受けるように修飾または増大される。
【０１６９】
いくつかの場合、このアッセイは、経時的に特異的な増加を実証する特異的なＭＥＩ挿入物に隣接する部位のモニタリングと、或いは、本明細書に列挙される発癌遺伝子などの既知のまたは疑われた発癌遺伝子、または本明細書に列挙されるゲノム再編成などの発癌遺伝子活性に関連したゲノム再編成を含む事象を識別するためにＭＥＩに隣接する境界のモニタリングと、或いはその両方と組み合わせて実行され、その結果、現在または将来の癌または腫瘍活性に関連していると特に疑われているＭＥＩ挿入事象は、例えば本明細書に開示される組成物と方法を使用して、早期に識別され、対処される。
【０１７０】
細胞の健常のために、試験は若年齢で行われ、挿入事象の無細胞ＤＮＡについて血液においてモニタリングされる。同じ挿入事象の増加は、この事象のクローン拡張を表わし、定量化され得、疾患進行に関連し得る。試験は、細胞健常または疾患の進行を判定するために、ＭＥＩ挿入物のための組織特異的試験と、エキソームまたは全ゲノム配列決定を含む生殖細胞変異体分析と、またはメチル化或いは定量ＲＮＡ分析と組み合わせて使用されてもよい。
【０１７１】
加えて、本明細書に開示のいくつかの実施形態は、癌または腫瘍細胞の集まりにおけるものなどの過剰増殖に関連する、ＭＥＩ挿入物に関係した境界などの、ＭＥＩ挿入物境界を持つ組織の可視化に関係する。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドプローブが使用され、それは、ＭＥＩ挿入物に隣接する連続配列を含む核酸配列へ特異的にアニールするヌクレオチド配列を含み、その結果、アニール後、プローブは、例えば癌または腫瘍組織の成功的な切除のために分析を行う医師に検出可能となる。
【０１７２】
ＭＥＩ挿入物境界配列は、ＭＥＩと挿入物に隣接する配列に及ぶ配列を直接可視化する、核酸を標的とするプローブを成長させるためにいくつかの場合に使用される。ＭＥＩと挿入隣接境界に及ぶ核酸配列を含む多くの組成物が、本明細書で考慮される。いくつかの場合、そのような組成物の通常の態様は、ＭＥＩ末端配列と挿入物隣接するゲノム配列の両方に及ぶ配列に特異的であり、且つ分離時にＭＥＩ配列または挿入物に隣接する配列の何れかを標的とするほど十分に長くない、核酸成分を含むということである。
【０１７３】
即ち、本明細書の多くの場合において考慮され且つ開示された組成物は、挿入物に隣接する配列の不在下でＭＥＩに結合せず、隣接するＭＥＩの不在下で挿入物に隣接する配列に結合しない。むしろ、本明細書に開示された組成物は、ＭＥＩおよび隣接するゲノム配列の両方を含む配列に特異的に結合する核酸成分を含む。故に、そのような組成物による処置後、例えば上記に開示されるように時間的または空間的なアッセイにおいて実質的に過剰に表わされると本明細書に開示されるように識別されたものなど、ＭＥＩ挿入物に隣接する配列に対応する核酸のみが、組成物により可視化され、一方で他のＭＥＩ、および挿入物に隣接する配列を含むがＭＥＩ配列を含まない未挿入の対立遺伝子は、組成物により結合されない。いくつかの場合に、組成物の核酸成分は、ＭＥＩ配列の３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０より多くの塩基、並びに挿入物に隣接する配列の３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０より多くの塩基を含み、それにより、組成物とＭＥＩ単独との間、または組成物と挿入物に隣接する配列単独との間の結合エネルギーは、結合を確実にするには不十分である。
【０１７４】
また、いくつかの実施形態において核酸に、蛍光団または他の視認可能な部分が結合される。いくつかの場合、核酸が基質に結合される場合に限り、その部分が可視化される。例えば、プローブは、いくつかの場合に蛍光団および消光剤（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含み、その結果、標的ＭＥＩ挿入物に隣接する部位への結合が存在しない状態で、消光部分は蛍光団を妨げるが、標的ＭＥＩ挿入部位への結合が存在する状態で、消光剤は、蛍光団が励起剤による励起後に発光することができるように蛍光団から立体的に取り除かれる。
【０１７５】
プローブはいくつかの場合、癌組織の完全切除を分析するために使用される。組織は切除され、プローブに接触させられる。癌組織は、例えば蛍光団の励起スペクトルと適合可能な電磁エネルギーの波長に供された後、切除された組織における蛍光の存在により確認される。非癌組織は、蛍光団の励起スペクトルと適合可能な電磁エネルギーの波長に供された後、蛍光の不在により識別される。多くの励起装置は、手術室環境において容易に使用される携帯型の励起装置などとして、当該技術分野で既知である。
【０１７６】
蛍光団および他の色素の化学的に反応性の誘導体が標識化分子のレポーターとして使用され得ることは、当該技術分野で既知である。制限のない典型的なＤＮＡ結合レポーターは：ＳｅＴａｕ−３８０−ＮＨＳ、ヒドロキシクマリン、アミノクマリン、メトキシクマリン、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ、ＳｅＴａｕ−４０５−ＮＨＳ、ＳｅＴａｕ−４０５−マレイミド、Ｌｕｃｉｆｅｒ  ｙｅｌｌｏｗ、ＳｅＴａｕ−４２５−ＮＨＳ、ＮＢＤ、Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）、Ｓｅｔａ−ＰｅｒＣＰ−６８０、ＰＥ−Ｃｙ５接合体、ＰＥ−Ｃｙ７接合体、Ｒｅｄ  ６１３、ＰｅｒＣＰ、ＴｒｕＲｅｄ、ＦｌｕｏｒＸ、フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｓｅｔａ−５５５−ＮＨＳ、Ｓｅｔａ−５５５−アジド、Ｓｅｔａ−５５５−ＤＢＣＯ、Ｓｅｔａ−Ｒ−ＰＥ−６７０、Ｃｙ３Ｂ、Ｓｅｔａ−５８０−ＮＨＳ、Ｃｙ３．５、ＳｅＴａｕ−６４７−ＮＨＳ、Ｃｙ５、Ｓｅｔａ−ＡＰＣ−７８０、Ｃｙ５．５、Ｓｅｔａ−６８０−ＮＨＳ、Ｃｙ７、ＴＲＩＴＣ、Ｘ−ローダミン、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）、ＡＰＣ−Ｃｙ７接合体、およびＳｅｔａ−７８０−ＮＨＳを含む。
【０１７７】
蛍光団と他のレポーターは、ＤＮＡを結合するプローブに結合するために使用され得る。そのようなプローブは、定量ＰＣＲの特異性を増加させるように設計されると、当該技術分野で知られている。例えば、ＴａｑＭａｎプローブの原則は、相補的な標的配列および蛍光団に基づく検出に対するハイブリダイゼーション中に二重標識プローブを開裂するために、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性に依存する。結果として生じる蛍光シグナルは、ＰＣＲの指数段階中に生成物の蓄積の定量的測定を可能にする。
【０１７８】
ＴａｑＭａｎプローブは、オリゴヌクレオチドプローブの５’−末端に共有結合される蛍光団、および３’−末端の消光物質（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）から成る。異なる化学的性質を持つ付加的なプローブは当該技術分野で既知であり、限定されないが、６−カルボキシフルオレセインまたはテトラクロロフルオレセイン、および消光物質（例えば、テトラメチルローダミン）を含む。消光物質分子は、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）を介してサーモサイクラーの光源により励起された時に、蛍光団により発光された蛍光を消す。蛍光団と消光物質が近接している限り、消光は蛍光シグナルを阻害する。
【０１７９】
いくつかの場合、プローブは、組織核ＤＮＡへのアクセスが促進されるように、細胞膜、核膜、または細胞膜と隔膜の両方にわたるプローブの転位を配向する部分を含む。
【０１８０】
加えて、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、ＭＥＩ挿入物に隣接する配列の特性を第２のサンプルまたは既知の参照特性と比較することにより、ヒトサンプル、他の動物サンプル、植物サンプル、またはバイオハザードサンプルなどの生物サンプルの識別に関係する。特性が判定されるサンプルは、例えば全ゲノム配列決定または他の適切な方法によりＭＥＩ挿入物に隣接する配列の判定のプロセスに供され、その個々のＭＥＩ挿入物に隣接する特性が判定される。いくつかの場合、プライマーパネル、プローブパネル、またはプライマーパネルとプローブパネルは、サンプルのＭＥＩ挿入物に隣接する配列の特性が全ゲノム配列決定に依存することなく他のサンプルにおいて検出されるように、成長される。
【０１８１】
未知の起源からのサンプルが得られ、ＭＥＩ挿入物に隣接する特性が成長されたサンプルとして同じ種および表現型の中から得られる。いくつかの場合、サンプルは遺伝子組み換え作物などの作物のものであり、作物の生殖系列の起原に関していくつかの疑問が存在する。同じ種の、且つ同じトランスジェニック耐性を持つ市販の遺伝子導入植物の特性が得られ、未知の起源のサンプルのＭＥＩ挿入に隣接する特性と比較される。サンプルおよび参照のＭＥＩ挿入物に隣接する配列を比較することにより、サンプルと参照が最近の共通の保存物（ｃｏｍｍｏｎ  ｓｔｏｃｋ）に由来するかどうかが判定される。
【０１８２】
代替的な実施形態において、ＭＥＩ挿入物に隣接する特性は、例えば、炭疽、エルシニア・ペストリス、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、または他の武器化自在な（ｗｅａｐｏｎｉｚａｂｌｅ）生体物質などのバイオハザード材料といった、法医学的サンプルの起源を判定するために使用される。
【０１８３】
いくつか実施形態において、第１または参照の核酸サンプルとは異なるものとしての第２の核酸サンプルの識別は、前記第２の核酸サンプルが第１の核酸サンプルに存在するＭＥＩ境界配列を欠いているかどうかを判定することを含む。
【０１８４】
いくつか実施形態において、前記第１の核酸サンプルとは異なるものとしての前記第２の核酸サンプルの識別は、前記第２の核酸サンプルが前記第１の核酸サンプルに存在しないＭＥＩ境界配列を含むかどうかを判定することを含む。
【０１８５】
境界配列は、代替的な実施形態において、標的とされた配列により、または全ゲノム配列決定により、或いはその両方により判定される。いくつかの場合、サンプルは、上記で議論されたプローブなどのプローブ、またはプローブのパネルと接触させられ、そしてサンプルの識別は、プローブ分子との接触後、プローブ励起時のサンプルの蛍光を個々に、連続して、または組み合わせて評価することにより、いくつかの場合において達成される。
【０１８６】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され且つ記載されている一方で、このような実施形態が、ほんの一例として提供されることは当業者に明白であろう。多数の変形、変化、および置換は、本発明から逸脱することなく、当業者によって現在想到される。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内の方法および構成は、それによって包含されることが、意図される。
【実施例】
【０１８７】
＜実施例１：時間的なＭＥＩのモニタリング＞
個体の核酸サンプルを全ゲノムの定量的配列決定にさらす。ＭＥＩ挿入部位は、２つの半数体ゲノムのコピーにつき１回の頻度で生じると識別され、それは、ＭＥＩ挿入物を生成する事象が、個体の体細胞ではなく個体の先祖生殖系列において恐らく生じたことを示す。
【０１８８】
ＭＥＩ挿入部位は、２つの半数体ゲノムのコピーにつき１回未満の頻度で生じると識別され、それは、個体の体細胞全てではないがいくつかにおいて事象が生じたことを示す。ＭＥＩ挿入部位を試験し、いくつかのＭＥＩ挿入部位が、機能の損失が細胞周期調節、細胞増殖調節、または細胞分裂調節における欠点に関連付けられた遺伝子を恐らく妨害していたことを判定する。
【０１８９】
ＭＥＩ挿入部位の存在量を経時的にモニタリングする。２年後、実施例１の個体の核酸サンプルを、個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析する。
【０１９０】
ＭＥＩ挿入部位を識別する。第１のＭＥＩ挿入部位が、以前の全ゲノム配列決定の過程（ｅｆｆｏｒｔ）において観察された頻度に匹敵する頻度で生じることを観察する。ＭＥＩ挿入物境界は、それ自体、細胞周期調節、細胞増殖調節、または細胞分裂調節の欠点に関連付けられないと結論付けられる。
【０１９１】
第２のＭＥＩ挿入部位が、以前の全ゲノム配列決定の過程において観察された頻度より１０倍高い頻度で生じることを観察する。ＭＥＩ挿入物境界は、それ自体、細胞周期調節、細胞増殖調節、または細胞分裂調節の欠点に関連すると結論付けられる。癌または調節下にある細胞増殖の欠点を探すために、個体を更なる観察にさらして、腫瘍または他の細胞の欠点がＭＥＩ挿入物境界に対応するかどうか判定するために観察からＤＮＡを得ることができる。
【０１９２】
推定上の癌組織を識別する。推定上の癌組織の核酸サンプルを全ゲノムの定量的配列決定にさらす。第２のＭＥＩ挿入部位の発生は、本来の全ゲノムのＭＥＩ調査における頻度の１００倍である頻度で生じると見出される。
【０１９３】
＜実施例２：時間的なＭＥＩのモニタリング＞
実施例１の個体の核酸サンプルを、個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析し、相対的且つ絶対的なＭＥＩ挿入部位の頻度を判定する。
【０１９４】
推定上の癌腫瘍組織を個体から切除する。手順に従い、実施例１の個体の第２の核酸サンプルを、個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析し、相対的且つ絶対的なＭＥＩ挿入部位の頻度を判定する。第２のＭＥＩ挿入部位の頻度は、本来の全ゲノムＭＥＩ調査における頻度に戻ったことが観察される。
【０１９５】
＜実施例３：時間的なＭＥＩのモニタリング＞
実施例１と２の個体の核酸サンプルを、推定上の癌腫瘍組織の切除の２年後に個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析し、相対的且つ絶対的なＭＥＩ挿入部位の頻度を判定する。第２のＭＥＩ挿入部位の頻度は、本来の全ゲノムＭＥＩ調査における頻度に留まることが観察される。
【０１９６】
実施例１と２の個体の核酸サンプルを、推定上の癌腫瘍組織の切除の４年後に個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析し、相対的且つ絶対的なＭＥＩ挿入部位の頻度を判定する。第２のＭＥＩ挿入部位の頻度は、本来の全ゲノムＭＥＩ調査における頻度の５倍であることが観察される。
【０１９７】
癌または調節下にある細胞増殖の欠点を探すために、個体を更なる観察にさらして、腫瘍または他の細胞の欠点がＭＥＩ挿入物境界に対応するかどうか判定するために観察からＤＮＡを得ることができる。
【０１９８】
推定上の癌組織を識別する。推定上の癌組織の核酸サンプルを全ゲノムの定量的配列決定にさらす。第２のＭＥＩ挿入部位の発生は、本来の全ゲノムのＭＥＩ調査における頻度の１００倍である頻度で生じると見出される。
【０１９９】
推定上の癌腫瘍組織を個体から切除する。手順に従い、第の核酸サンプルを個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析し、相対的且つ絶対的なＭＥＩ挿入部位の頻度を判定する。第２のＭＥＩ挿入部位の頻度は、本来の全ゲノムＭＥＩ調査における頻度に戻ったことが観察される。
【０２００】
＜実施例４．空間的なＭＥＩのモニタリング＞
腫瘍に悩む個体の表現型的に健常な組織の第１の核酸サンプルを、全ゲノムの定量的配列決定にさらす。ＭＥＩ挿入部位は、２つの半数体ゲノムのコピーにつき１回未満の頻度で生じると識別され、それは、個体の体細胞全てではないがいくつかにおいて事象が生じたことを示す。ＭＥＩ挿入部位を試験し、いくつかのＭＥＩ挿入部位が、機能の損失が細胞周期調節、細胞増殖調節、または細胞分裂調節における欠点に関連付けられた遺伝子を妨害していたことを判定する。
【０２０１】
腫瘍に悩む個体の腫瘍組織の第２の核酸サンプルを、全ゲノムの定量的配列決定にさらす。ＭＥＩ挿入部位は、２つの半数体ゲノムのコピーにつき１回未満の頻度で生じると識別され、それは、個体の腫瘍細胞全てではないがいくつかにおいて事象が生じたことを示す。ＭＥＩ挿入部位を試験し、いくつかのＭＥＩ挿入部位が、機能の損失が細胞周期調節、細胞増殖調節、または細胞分裂調節における欠点に関連付けられた遺伝子を妨害していたことを判定する。
【０２０２】
挿入部位の相対的且つ絶対的な存在量を試験する。いくつかのＭＥＩ挿入部位は、個々の表現型的に健常なものに由来する核酸サンプルに見出されたものに匹敵する、相対的且つ絶対的な頻度で生じることが観察される。このような部位は、細胞周期調節、細胞増殖調節、または細胞分裂調節の欠点に関係しないことが結論付けられる。
【０２０３】
腫瘍組織核酸サンプルに特有のＭＥＩ部位を識別する。いくつかの腫瘍特異的ＭＥＩ挿入部位は、腫瘍組織核酸サンプルにおいて低存在量で生じる。このようなＭＥＩ挿入は腫瘍活性に関連していないことが結論付けられる。
【０２０４】
いくつかのＭＥＩ挿入部位が、腫瘍組織核酸サンプル全体にわたり見出される。このようなＭＥＩ挿入部位は、細胞周期調節、細胞増殖調節、または細胞分裂調節の欠点の兆候に必須であることが結論付けられる。しかし、非腫瘍核酸サンプルにおけるそれらの比較的大量の存在は、腫瘍活性に関連する細胞周期調節、細胞増殖調節、または細胞分裂調節の欠点の存在を自身で示さないということを示す。
【０２０５】
いくつかのＭＥＩ挿入部位は、腫瘍組織核酸サンプル全体にわたって非常に高い頻度で見出され、非腫瘍核酸サンプルにおいては非常に低い頻度で見出される。このようなＭＥＩ挿入部位は、腫瘍活性に関連した細胞周期調節、細胞増殖調節、または細胞分裂調節の欠点の兆候を示すことが結論付けられる。
【０２０６】
＜実施例５．特異的なＭＥＩ挿入物境界の標的化＞
実施例２−３のＭＥＩ挿入物境界を、医薬介入のソースとして使用する。ＭＥＩ挿入物配列と挿入物に隣接するゲノム配列とを含む核酸分子を成長させる。この分子を、ＣＲＩＳＰＲ核酸標的化複合体に包装し、該ＣＲＩＳＰＲ核酸標的化複合体は、ＭＥＩ挿入物配列および挿入に隣接するゲノムの配列に隣接する核酸を開裂するためにエンドヌクレアーゼを特異的に配向し、且つ他のＭＥＩ挿入部位を開裂しないものである。
【０２０７】
＜実施例６．推定上の癌組織に関連付けられる、ＭＥＩ挿入物境界を持つ細胞を枯渇させる治療的介入＞
実施例１と２の個体の核酸サンプルを、推定上の癌腫瘍組織の切除の２年後に個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析し、相対的且つ絶対的なＭＥＩ挿入部位の頻度を判定する。第２のＭＥＩ挿入部位の頻度は、本来の全ゲノムＭＥＩ調査における頻度に留まることが観察される。
【０２０８】
実施例１と２の個体の核酸サンプルを、推定上の癌腫瘍組織の切除の４年後に個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析し、相対的且つ絶対的なＭＥＩ挿入部位の頻度を判定する。第２のＭＥＩ挿入部位の頻度は、本来の全ゲノムＭＥＩ調査における頻度の５倍であることが観察される。
【０２０９】
癌または調節下にある細胞増殖の欠点を探すために、個体を更なる観察にさらして、腫瘍または他の細胞の欠点がＭＥＩ挿入物境界に対応するかどうか判定するために観察からＤＮＡを得ることができる。
【０２１０】
推定上の癌組織を識別する。推定上の癌組織の核酸サンプルを全ゲノムの定量的配列決定にさらす。第２のＭＥＩ挿入部位の発生は、本来の全ゲノムのＭＥＩ調査における頻度の１００倍である頻度で生じると見出される。
【０２１１】
実施例５のＭＥＩ挿入物境界の標的化薬物を含む処置レジメンにより個体を処置する。推定上の癌組織は、特異的な細胞死を受けると観察される。
【０２１２】
手順に従い、核酸サンプルを個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析し、相対的且つ絶対的なＭＥＩ挿入部位の頻度を判定する。第２のＭＥＩ挿入部位の頻度は、本来の全ゲノムＭＥＩ調査における頻度に戻ったことが観察される。
【０２１３】
＜実施例７．推定上の癌組織に関連付けられる、ＭＥＩ挿入物境界を持つ細胞を枯渇させる治療的介入＞
実施例１と２の個体の核酸サンプルを、推定上の癌腫瘍組織の切除の２年後に個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析し、相対的且つ絶対的なＭＥＩ挿入部位の頻度を判定する。第２のＭＥＩ挿入部位の頻度は、本来の全ゲノムＭＥＩ調査における頻度に留まることが観察される。
【０２１４】
実施例１と２の個体の核酸サンプルを、推定上の癌腫瘍組織の切除の４年後に個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析し、相対的且つ絶対的なＭＥＩ挿入部位の頻度を判定する。第２のＭＥＩ挿入部位の頻度は、本来の全ゲノムＭＥＩ調査における頻度の５倍であることが観察される。
【０２１５】
癌または調節下にある細胞増殖の欠点を探すために、個体を更なる観察にさらして、腫瘍または他の細胞の欠点がＭＥＩ挿入物境界に対応するかどうか判定するために観察からＤＮＡを得ることができる。
【０２１６】
推定上の癌組織を識別しない。
【０２１７】
実施例５の医薬を標的とするＭＥＩ挿入物境界を含む処置レジメンにより個体を処置する。
【０２１８】
手順に従い、核酸サンプルを個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析し、相対的且つ絶対的なＭＥＩ挿入部位の頻度を判定する。第２のＭＥＩ挿入部位の頻度は、本来の全ゲノムＭＥＩ調査における頻度に戻ったことが観察される。
【０２１９】
＜実施例８．年齢に特異的なゲノムの老化現象のモニタリング＞
個体の核酸サンプルを全ゲノムの定量的配列決定にさらす。ＭＥＩ挿入部位は、２つの半数体ゲノムのコピーにつき１回の頻度で生じると識別され、それは、ＭＥＩ挿入物を生成する事象が、個体の体細胞ではなく個体の先祖生殖系列において恐らく生じたことを示す。
【０２２０】
ＭＥＩ挿入部位は、２つの半数体ゲノムのコピーにつき１回未満の頻度で生じると識別され、それは、個体の体細胞全てではないがいくつかにおいて事象が生じたことを示す。ＭＥＩ挿入部位を試験し、いくつかのＭＥＩ挿入部位が、機能の損失が細胞周期調節、細胞増殖調節、または細胞分裂調節における欠点に関連付けられた遺伝子を妨害していたことを判定する。
【０２２１】
ＭＥＩ挿入部位の存在量を経時的にモニタリングする。５年後、個体の核酸サンプルを個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析する。
【０２２２】
ＭＥＩ挿入部位は、初期の全ゲノムの定量的配列決定に従い観察されるものに匹敵する相対的頻度および相対存在量で生じると観察される。
【０２２３】
１０年後、個体の核酸サンプルを個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析する。
【０２２４】
ＭＥＩ挿入部位は、初期の全ゲノムの定量的配列決定に従い観察されるものに匹敵する相対存在量で生じると観察される。しかし、新規のＭＥＩ挿入事象が生じて、挿入部位の総数を２倍に上昇させたと観察される。
【０２２５】
カロリー制限を含む老化防止レジメンを推奨する。
【０２２６】
１５年後、個体の核酸サンプルを個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析する。
【０２２７】
ＭＥＩ挿入部位は、１０年で観察されるものに匹敵する相対存在量で生じると観察され、それは、ＭＥＩ挿入部位の頻度の増加が継続しなかったことを示す。
【０２２８】
＜実施例９．年齢に特異的なゲノムの老化現象のモニタリング＞
個体の核酸サンプルを全ゲノムの定量的配列決定にさらす。ＭＥＩ挿入部位は、２つの半数体ゲノムのコピーにつき１回の頻度で生じると識別され、それは、ＭＥＩ挿入物を生成する事象が、個体の体細胞ではなく個体の先祖生殖系列において恐らく生じたことを示す。
【０２２９】
ＭＥＩ挿入部位は、２つの半数体ゲノムのコピーにつき１回未満の頻度で生じると識別され、それは、個体の体細胞全てではないがいくつかにおいて事象が生じたことを示す。ＭＥＩ挿入部位を試験し、いくつかのＭＥＩ挿入部位が、機能の損失が細胞周期調節、細胞増殖調節、または細胞分裂調節における欠点に関連付けられた遺伝子を妨害していたことを判定する。
【０２３０】
ＭＥＩ挿入部位の存在量を経時的にモニタリングする。５年後、個体の核酸サンプルを個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析する。
【０２３１】
ＭＥＩ挿入部位は、初期の全ゲノムの定量的配列決定に従い観察されるものに匹敵する相対的頻度および相対存在量で生じると観察される。
【０２３２】
１０年後、個体の核酸サンプルを個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析する。
【０２３３】
ＭＥＩ挿入部位は、初期の全ゲノムの定量的配列決定に従い観察されるものに匹敵する相対存在量で生じると観察される。しかし、新規のＭＥＩ挿入事象が生じて、挿入部位の総数を２倍に上昇させたと観察される。
【０２３４】
逆転写酵素阻害剤による処置を含む老化防止レジメンが続く。
【０２３５】
１５年後、個体の核酸サンプルを個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析する。
【０２３６】
ＭＥＩ挿入部位は、１０年で観察されるものに匹敵する相対存在量で生じると観察され、それは、ＭＥＩ挿入部位の頻度の増加が継続しなかったことを示す。
【０２３７】
＜実施例１０．年齢に特異的なゲノムの老化現象のモニタリング＞
個体の核酸サンプルを全ゲノムの定量的配列決定にさらす。ＭＥＩ挿入部位は、２つの半数体ゲノムのコピーにつき１回の頻度で生じると識別され、それは、ＭＥＩ挿入物を生成する事象が、個体の体細胞ではなく個体の先祖生殖系列において恐らく生じたことを示す。
【０２３８】
ＭＥＩ挿入部位は、２つの半数体ゲノムのコピーにつき１回未満の頻度で生じると識別され、それは、個体の体細胞全てではないがいくつかにおいて事象が生じたことを示す。ＭＥＩ挿入部位を試験し、いくつかのＭＥＩ挿入部位が、機能の損失が細胞周期調節、細胞増殖調節、または細胞分裂調節における欠点に関連付けられた遺伝子を妨害していたことを判定する。
【０２３９】
ＭＥＩ挿入部位の存在量を経時的にモニタリングする。５年後、個体の核酸サンプルを個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析する。
【０２４０】
ＭＥＩ挿入部位は、初期の全ゲノムの定量的配列決定に従い観察されるものに匹敵する相対的頻度および相対存在量で生じると観察される。
【０２４１】
１０年後、個体の核酸サンプルを個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析する。
【０２４２】
ＭＥＩ挿入部位は、初期の全ゲノムの定量的配列決定に従い観察されるものに匹敵する相対存在量で生じると観察される。しかし、新規のＭＥＩ挿入事象が生じて、挿入部位の総数を２倍に上昇させたと観察される。
【０２４３】
レトロウイルス阻害剤による処置を含む老化防止レジメンが続く。
【０２４４】
１５年後、個体の核酸サンプルを個体の血液から得る。個体の血液の核酸を分析する。
【０２４５】
ＭＥＩ挿入部位は、１０年で観察されるものに匹敵する相対存在量で生じると観察され、それは、ＭＥＩ挿入部位の頻度の増加が継続しなかったことを示す。
【図１】
2020156491.tif 000003
【図２】
2020156491.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月19日(2020.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可動要素挿入物（ＭＥＩ）で関連付けられた細胞増殖を同定する方法であって、該方法は、
第１の核酸サンプルにおいて第１のＭＥＩ挿入部位で定量的にＭＥＩ頻度を測定する工程；
第２の核酸サンプルにおいて第１のＭＥＩ挿入部位で定量的にＭＥＩ頻度を測定する工程；および
第１の核酸サンプルにおける第１のＭＥＩ挿入部位のＭＥＩ頻度が、第２の核酸サンプルにおける第１のＭＥＩ挿入部位のＭＥＩ頻度と実質的に異なる場合に、過剰増殖性の細胞活性に関連付けられるとして第１のＭＥＩ挿入部位を同定する工程、
を含み、前記定量的にＭＥＩ頻度を測定する工程は、全ゲノム配列決定を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第１の核酸サンプルおよび前記第２の核酸サンプルは、実質的に同様の量の核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対照核酸は、前記第１の核酸サンプルおよび前記第２の核酸サンプル中に実質的に同様の量で存在する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第１のＭＥＩ挿入部位に隣接している配列を同定する工程を含む、請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の核酸サンプルおよび前記第２の核酸サンプルは、各々が単一の細胞から得られる、請求項１−４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の核酸サンプルおよび前記第２の核酸サンプルは、第１の時点および第２の時点で共通の個体から取得される、請求項１−５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の時点および第２の時点は少なくとも６か月離される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の核酸サンプルおよび前記第２の核酸サンプルは、血液から抽出される、請求項１−７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の核酸サンプルおよび前記第２の核酸サンプルは、循環する遊離核酸を含む、請求項１−８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の核酸サンプルおよび前記第２の核酸サンプルは、循環する遊離ゲノムＤＮＡを含む、請求項１−９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第１の核酸サンプルは第１の位置で個体から取得され、第２の核酸サンプルは第２の位置で個体から取得される、請求項１−５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
第１の位置は第１の癌組織を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第２の位置は健常組織を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
第２の位置は第２の癌組織を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
可動要素挿入物（ＭＥＩ）をモニタリングする方法であって、該方法は、
複数のＭＥＩ挿入境界を含む個体からゲノム配列情報を取得する工程；
複数のＭＥＩ挿入境界間の発癌遺伝子に隣接しているＭＥＩ挿入境界を同定するために複数のＭＥＩ挿入境界を調査する工程；
および発癌遺伝子に隣接しているＭＥＩ挿入境界の量的存在率を経過観察する工程、
を含み、
ここで、前記個体からゲノム配列情報を取得する工程は、ゲノムセグメントを増幅することを伴わず、前記ゲノムセグメントは、複数のＭＥＩ挿入境界を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項１６】
発癌遺伝子に隣接しているＭＥＩ挿入境界の量的存在率を経過観察する前記工程は、
第１の時点で第１の血液サンプルを取得する工程、
第１の時点で第１の血液サンプル中のＭＥＩ境界の量的存在率を決定する工程、
第２の時点で第２の血液サンプルを取得する工程、および
第２の時点で第２の血液サンプル中のＭＥＩ境界の量的存在率を決定する工程、
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
発癌遺伝子に隣接しているＭＥＩ挿入境界の量的存在率を経過観察する前記工程は、
第１の時点で第１の組織サンプルを取得する工程、
第１の時点で第１の組織サンプル中のＭＥＩ境界の量的存在率を決定する工程、
第２の時点で第２の組織サンプルを取得する工程、および
第２の時点で第２の組織サンプル中のＭＥＩ境界の量的存在率を決定する工程、
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の組織サンプルおよび前記第２の組織サンプルは腫瘍組織を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ゲノム配列情報が単一の細胞から得られる、請求項１５−１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
第１の核酸サンプルおよび第２の核酸サンプルを比較する方法であって、該方法は、
前記第１の核酸サンプルの複数の可動要素挿入物（ＭＥＩ）境界に対するＭＥＩ境界配列を取得する工程；
前記第２の核酸サンプル中の前記複数のＭＥＩ境界の存在を分析する工程；
および、前記第２の核酸サンプルが、前記第１の核酸サンプル中に存在する、挿入配列を含むＭＥＩ境界配列を欠いている場合に、前記第１の核酸サンプルと異なるものとして前記第２の核酸サンプルを同定する工程、
を含み、
ここで、前記個体からゲノム配列情報を取得する工程は、ゲノムセグメントを増幅することを伴わず、前記ゲノムセグメントは、複数のＭＥＩ挿入境界を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記第２の核酸サンプルが、前記第１の核酸サンプル中には存在しない、挿入配列を含むＭＥＩ境界配列を含む場合に、前記第１の核酸サンプルと異なるものとして前記第２の核酸サンプルを同定する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の核酸サンプルの複数の可動要素挿入物（ＭＥＩ）境界に対するＭＥＩ境界配列を取得する工程は、前記第１の核酸サンプルの全ゲノム配列決定を実行する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の核酸サンプルの複数の可動要素挿入物（ＭＥＩ）境界に対するＭＥＩ境界配列を取得する工程は、前記第１の核酸サンプルの前記複数のＭＥＩ境界の標的とされた配列決定を実行する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２の核酸サンプル中の前記複数のＭＥＩ境界の存在を分析する工程は、前記第２の核酸サンプルの全ゲノム配列決定を実行する工程を含む、請求項２０−２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２の核酸サンプル中の前記複数のＭＥＩ境界の存在を分析する工程は、前記第２の核酸サンプルの前記複数のＭＥＩ境界の標的とされた配列決定を実行する工程を含む、請求項２０−２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２の核酸サンプルの前記複数のＭＥＩ境界の標的とされた配列決定を実行する工程は、前記第１の核酸サンプルの各ＭＥＩ挿入部位を特異的に増殖させるプライマーを含むプライマーのパネルに、前記第２の核酸サンプルを接触させる工程を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２の核酸サンプルの前記複数のＭＥＩ境界の標的とされた配列決定を実行する工程は、前記第１の核酸サンプルの各ＭＥＩ挿入部位に対し特異的にアニールするプローブを含むプローブのパネルに、前記第２の核酸サンプルを接触させる工程を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
プローブのパネルは、基質に結合されたプローブが基質に結合されていないプローブに対し差分的に視覚化可能であるように蛍光体へ結合された、少なくとも１つのプローブを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の核酸サンプルおよび前記第２の核酸サンプルは、各々が単一の細胞から得られる、請求項２０−２８のいずれか１項に記載の方法。
【外国語明細書】
2020156491000001.pdf