(57)【要約】【課題】本発明の課題は、ＲＵＮＸ２機能低下疾患の治療薬を提供することである。【解決手段】サイトカラシンＤまたはラトランクリンＡなどのアクチン重合阻害剤、ブレビスタチンなどのミオシンII阻害剤、またはリモデリンなどのＮ-アセチルトランスフェラーゼ阻害剤を有効成分として含有する薬剤をＲＵＮＸ２機能低下疾患の治療薬とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクチン重合阻害剤、ミオシンII阻害剤、またはＮ-アセチルトランスフェラーゼ阻害
剤を有効成分として含有するＲＵＮＸ２機能低下疾患の治療薬。
【請求項２】
前記ＲＵＮＸ２機能低下疾患が、鎖骨頭蓋骨異形成症または骨粗鬆症である、請求項１に記載の治療薬。
【請求項３】
前記疾患を有する患者が、機能的なＲＵＮＸ２遺伝子および／またはＲＵＮＸ２タンパク質を有しない、請求項１または２に記載の治療薬。
【請求項４】
前記アクチン重合阻害剤が、サイトカラシンＤまたはラトランクリンＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項５】
前記ミオシンII阻害剤が、ブレビスタチンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項６】
前記Ｎ-アセチルトランスフェラーゼ阻害剤が、リモデリンである、請求項１〜３のい
ずれか１項に記載の治療薬。
【請求項７】
間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導するための分化誘導剤であって、アクチン重合阻害剤、ミオシンII阻害剤、またはＮ-アセチルトランスフェラーゼ阻害剤を有効成分として
含有する、分化誘導剤。
【請求項８】
in vitroで間葉系幹細胞が骨芽細胞への分化誘導をうける、請求項７に記載の分化誘導剤。
【請求項９】
前記間葉系幹細胞が、機能的なＲＵＮＸ２遺伝子および／またはＲＵＮＸ２タンパク質を有しない、請求項７または８に記載の分化誘導剤。
【請求項１０】
前記アクチン重合阻害剤が、サイトカラシンＤまたはラトランクリンＡである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の分化誘導剤。
【請求項１１】
前記ミオシンII阻害剤が、ブレビスタチンである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の分化誘導剤。
【請求項１２】
前記Ｎ-アセチルトランスフェラーゼ阻害剤が、リモデリンである、請求項７〜９のい
ずれか１項に記載の分化誘導剤。
【請求項１３】
in vitroにおける骨芽細胞分化誘導アッセイ系であって、
機能的なＲＵＮＸ２遺伝子および／またはＲＵＮＸ２タンパク質を有しない未分化な骨芽細胞を備えるアッセイ系。
【請求項１４】
前記未分化な骨芽細胞がカルバリア細胞である、請求項１３に記載のアッセイ系。
【請求項１５】
薬剤が骨芽細胞の分化を誘導するかどうかを調べる方法であって、
機能的なＲＵＮＸ２遺伝子および／またはＲＵＮＸ２タンパク質を有しない未分化な骨芽細胞に前記化合物を投与する工程と、
前記未分化な骨芽細胞が分化したかどうかを調べる工程と、
を含む方法。
【請求項１６】
前記未分化な骨芽細胞がカルバリア細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物がアクチン重合阻害剤である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＲＵＮＸ２機能低下疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、
機能的なＲＵＮＸ２遺伝子および／またはＲＵＮＸ２タンパク質を有しない未分化な骨芽細胞に１以上の化合物を投与する工程と、
前記未分化な骨芽細胞が分化したかどうかを調べる工程と、
前記未分化な骨芽細胞が分化した化合物を選択する工程と、
を含む方法。
【請求項１９】
前記未分化な骨芽細胞がカルバリア細胞である、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＵＮＸ２機能低下疾患の治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
鎖骨頭蓋骨異形成症（Cleidocranial dysplasia; CCD）は、鎖骨欠損または低形成、頭蓋縫合の骨化遅延、歯牙の萌出遅延などを主症状とする遺伝病である。原因遺伝子はＲＵＮＸ２遺伝子であることが明らかになっており、ヘテロ接合体で上記症状を表現型とし、ホモ接合体は致死になる（引用文献１及び２参照）。
【０００３】
ＲＵＮＸ２遺伝子は、転写因子をコードし、骨形成のマスター遺伝子であると考えられている（引用文献３及び４参照）。ＲＵＮＸ２はＳＰ７遺伝子の転写を活性化するが、その後にＲＵＮＸ２とＳＰ７は協調して骨芽細胞の分化に関わるターゲット遺伝子の転写を調節する（引用文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Nat Genet. 1997 Jul; vol.16 (No.3): pp.307-10.
【非特許文献２】Cell.1997 May 30;vol.89 (No.5): pp.773-9.
【非特許文献３】Int J Biol Macromol. 2015; vol.78: pp.202-8.
【非特許文献４】DNA Cell Biol. 2015 May; vol.34 (No.5): pp.305-15.
【非特許文献５】Connect Tissue Res. 2014 Aug; vol.55 Suppl.1: pp.83-7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＲＵＮＸ２機能低下疾患の治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ＲＵＮＸ２とＳＰ７は協調して骨芽細胞の分化に関わるターゲット遺伝子の転写を調節することから、従来、骨芽細胞の分化及び成熟には、この２つの遺伝子が共同で機能することが重要であると考えられてきた。しかしながら、本願発明者らは、骨芽細胞の分化におけるＲＵＮＸ２の機能を解析している間に、骨芽細胞の分化過程で、ＲＵＮＸ２が細胞の力学的ストレス耐性の獲得や遺伝子発現に適した核内環境の構築に重要な役割をしていることを示唆する結果を得た。すなわち、従来の仮説では、ＲＵＮＸ２欠損骨芽前駆細胞が成熟骨芽細胞に分化することは困難であると考えられるにもかかわらず、ＲＵＮＸ２欠損骨芽前駆細胞に対し、アクチン重合阻害剤、ミオシンII阻害剤、Ｎ-アセチルトランス
フェラーゼ阻害剤などの細胞骨格を調節する酵素の阻害剤を添加することにより、石灰化する成熟骨芽細胞に分化するという結果を得た。こうして、本願発明者らは、本発明を完成させた。
【０００７】
本発明の一実施態様は、アクチン重合阻害剤、ミオシンII阻害剤、またはＮ-アセチル
トランスフェラーゼ阻害剤を有効成分として含有するＲＵＮＸ２機能低下疾患の治療薬である。前記ＲＵＮＸ２機能低下疾患が、鎖骨頭蓋骨異形成症または骨粗鬆症であってもよい。前記疾患を有する患者が、機能的なＲＵＮＸ２遺伝子および／またはＲＵＮＸ２タンパク質を有しなくてもよい。前記アクチン重合阻害剤が、サイトカラシンＤまたはラトランクリンＡであってもよい。前記ミオシンII阻害剤が、ブレビスタチンであってもよい。前記Ｎ-アセチルトランスフェラーゼ阻害剤が、リモデリンであってもよい。
【０００８】
本発明の他の実施態様は、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導するための分化誘導剤であって、アクチン重合阻害剤を有効成分として含有する、分化誘導剤である。in vitroで間葉系幹細胞が骨芽細胞への分化誘導をうけてもよい。前記間葉系幹細胞が、機能的なＲＵＮＸ２遺伝子および／またはＲＵＮＸ２タンパク質を有しなくてもよい。前記アクチン重合阻害剤が、サイトカラシンＤまたはラトランクリンＡであってもよい。
【０００９】
本発明のさらなる実施態様は、骨芽細胞分化誘導アッセイ系であって、機能的なＲＵＮＸ２遺伝子および／またはＲＵＮＸ２タンパク質を有しない未分化な骨芽細胞を備えるアッセイ系である。前記未分化な骨芽細胞がカルバリア細胞であってもよい。
【００１０】
本発明のさらなる実施態様は、化合物が骨芽細胞の分化を誘導するかどうかを調べる方法であって、機能的なＲＵＮＸ２遺伝子および／またはＲＵＮＸ２タンパク質を有しない未分化な骨芽細胞に前記化合物を投与する工程と、前記未分化な骨芽細胞が分化したかどうかを調べる工程と、を含む方法である。前記未分化な骨芽細胞がカルバリア細胞であってもよい。前記化合物がアクチン重合阻害剤であってもよい。
【００１１】
本発明のさらなる実施態様は、ＲＵＮＸ２機能低下疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、機能的なＲＵＮＸ２遺伝子および／またはＲＵＮＸ２タンパク質を有しない未分化な骨芽細胞に１以上の化合物を投与する工程と、前記未分化な骨芽細胞が分化したかどうかを調べる工程と、前記未分化な骨芽細胞が分化した化合物を選択する工程と、を含む方法である。前記未分化な骨芽細胞がカルバリア細胞であってもよい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、ＲＵＮＸ２機能低下疾患の治療薬を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施例１において、培養したカルバリア細胞に、ノコダゾール、ブレビスタチン、サイトカラシンＤ、リモデリンを添加して、骨芽細胞分化を調べた結果を表す図である。
【図２】本発明の実施例２において、培養したカルバリア細胞に、アクチン重合阻害剤を添加し、各薬剤の最適濃度を調べた結果を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の目的、特徴、利点、およびそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態および具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１５】
＝＝分化誘導剤＝＝
本開示の分化誘導剤は、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導するための分化誘導剤であって、アクチン重合阻害剤を有効成分として含有する。ここで、分化誘導するとは、あらゆる条件で分化誘導しない間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることと、多少とも骨芽細胞に分化する間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を促進することを含む。
【００１６】
間葉系幹細胞の由来となる動物は特に限定されず、脊椎動物であることが好ましく、哺乳類であることがより好ましく、ラット、マウス、ブタ、ヒト、であることがさらに好ま
しい。
【００１７】
in vitroで間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導してもよく、in vivoで生体内の間葉系
幹細胞を骨芽細胞に分化誘導してもよい。
【００１８】
アクチン重合阻害剤は、アクチンの重合を阻害する機能を持つ薬剤であれば特に限定されず、サイトカラシンＤやラトランクリンＡ、のほか、サイトカラシンＢ、サイトカラシンＣ、サイトカラシンＥ、ラトランクリンＢが例示できる。
【００１９】
間葉系幹細胞におけるＲＵＮＸ２遺伝子の機能性および／またはＲＵＮＸ２タンパク質の量については特に限定されない。つまり、機能的なＲＵＮＸ２遺伝子が存在してもよく、すなわちＲＵＮＸ２遺伝子が野生型であっても、機能を持たない変異型と野生型のヘテロ接合でもよいが、機能的なＲＵＮＸ２遺伝子を有しない、すなわち機能を持たない変異型のホモ接合であることが好ましい。機能的なＲＵＮＸ２タンパク質の量についても特に限定されず、正常に骨芽細胞に分化する正常量であってもよく、正常には骨芽細胞に分化しない低下量であってもよいが、機能的なＲＵＮＸ２タンパク質を有しないことが好ましい。間葉系幹細胞において、機能的なＲＵＮＸ２タンパク質の量が低下する、あるいは無くなる原因は特に限定されず、例えば、間葉系幹細胞が機能を持たない変異型のヘテロ接合やホモ接合であってもよく、野生型の間葉系幹細胞に対して、アンチセンスＲＮＡやｓｉＲＮＡによって、機能的なＲＵＮＸ２タンパク質の発現を抑制してもよい。
【００２０】
従来、ＲＵＮＸ２遺伝子は骨芽細胞分化のマスター遺伝子と考えられていたため、機能的なＲＵＮＸ２タンパク質が低下した場合、骨芽細胞を正常に分化誘導するためには、ＲＵＮＸ２遺伝子発現を活性化したりすることで、機能的なＲＵＮＸ２タンパク質を正常レベルに戻す必要があった。また、機能的なＲＵＮＸ２遺伝子がない場合、表現型を正常に回復させるためには、機能的なＲＵＮＸ２遺伝子を導入する必要があった。しかしながら、本開示のように、機能的なＲＵＮＸ２タンパク質の代わりに化合物を使用することができるようになったため、機能的なＲＵＮＸ２タンパク質がない場合でも、骨芽細胞を正常に分化誘導させることができる。
【００２１】
＝＝ＲＵＮＸ２機能低下疾患の治療薬＝＝
上述のように、アクチン重合阻害剤は、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導する。従って、アクチン重合阻害剤は、ＲＵＮＸ２機能低下疾患の治療薬として有用である。治療対象は特に限定されず、脊椎動物であることが好ましく、哺乳類であることがより好ましく、イヌやネコなどのペット、ラットやマウスなどの実験動物、ブタやウシなどの家畜、またはヒト、であることがさらに好ましい。
【００２２】
ここで、ＲＵＮＸ２機能低下疾患は特に限定されないが、鎖骨頭蓋骨異形成症や骨粗鬆症が例示できる。
【００２３】
アクチン重合阻害剤は、アクチンの重合を阻害する機能を持つ薬剤であれば特に限定されず、サイトカラシンＤやラトランクリンＡが例示できる。
【００２４】
ＲＵＮＸ２機能低下疾患を有する患者において、ＲＵＮＸ２遺伝子の機能性および／またはＲＵＮＸ２タンパク質の量については特に限定されない。つまり、機能的なＲＵＮＸ２遺伝子が存在してもよく、すなわちＲＵＮＸ２遺伝子が野生型であっても、機能を持たない変異型と野生型のヘテロ接合でもよいが、機能的なＲＵＮＸ２遺伝子を有しない、すなわち機能を持たない変異型のホモ接合であることが好ましい。また、機能的なＲＵＮＸ２タンパク質の量についても特に限定されず、正常に骨芽細胞に分化する正常量であってもよく、正常には骨芽細胞に分化しない低下量であってもよいが、機能的なＲＵＮＸ２タ
ンパク質を有しないことが好ましい。体内で、機能的なＲＵＮＸ２タンパク質の量が低下する、あるいは無くなる原因は特に限定されず、例えば、患者が機能を持たない変異型と野生型のヘテロ接合体や変異型のホモ接合体であってもよい。
【００２５】
分化誘導剤と同様に、本開示の治療薬では、機能的なＲＵＮＸ２タンパク質の代わりに化合物を使用することができるようになったため、機能的なＲＵＮＸ２遺伝子がないＲＵＮＸ２機能低下疾患の患者をも治療することができる。
【００２６】
＝＝アッセイ系＝＝
本開示のアッセイ系は、骨芽細胞分化誘導アッセイ系であって、機能的なＲＵＮＸ２遺伝子および／またはＲＵＮＸ２タンパク質を有しない未分化な骨芽細胞を備える。このアッセイ系はin vivoの系であってもin vitroの系であってもよい。in vivoの系の場合、アッセイ系とする動物（ヒトを除く）は特に限定されないが、脊椎動物であることが好ましく、哺乳類であることがより好ましく、ラット、マウスであることがさらに好ましい。その動物は、自然突然変異によって機能的なＲＵＮＸ２遺伝子および／またはＲＵＮＸ２タンパク質を有しなくてもよく、人為的にノックアウト動物やノックダウン動物を作製し、それをアッセイ系としてもよい。in vitroの場合、未分化な骨芽細胞を含む培養細胞でも培養組織でも培養器官でもよい。未分化な骨芽細胞は特に限定されないが、カルバリア細胞や間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞由来未分化骨芽細胞が例示できる。
【００２７】
このアッセイ系は、後述するように、化合物が骨芽細胞の分化を誘導するかどうかを調べる方法や、ＲＵＮＸ２機能低下疾患の治療薬のスクリーニング方法に用いることができる。
【００２８】
＝＝化合物が骨芽細胞の分化を誘導するかどうかを調べる方法＝＝
本開示の方法は、化合物が骨芽細胞の分化を誘導するかどうかを調べる方法であって、上述のアッセイ系に化合物を投与する工程と、未分化な骨芽細胞が分化したかどうかを調べる工程と、を含む方法である。
【００２９】
化合物は特に限定されない。化合物を投与する方法も特に限定されないが、in vivoの
場合、経口投与または非経口投与のどちらでもよい。in vitroの場合、細胞を培養するための培地にあらかじめ加えてもよく、細胞を培養している培地に直接加えてもよい。
【００３０】
未分化な骨芽細胞が分化したかどうかも公知の方法に従えばよいが、in vivoの場合、
個体レベルでは、動物の表現型が正常になったことを調べてもよく、組織レベルでは、骨組織が分化していることを調べてもよく、細胞レベルでは、実際に骨芽細胞が分化していることを調べてもよい。in vitroの場合、例えば、von Kossa染色やアリザリンレッド染
色などを用いれば、骨特異的な石灰化を確認することができる。
【００３１】
この方法を用いることによって、後述するように、ＲＵＮＸ２機能低下疾患の治療薬のスクリーニングを行うことができる。
【００３２】
＝＝ＲＵＮＸ２機能低下疾患の治療薬のスクリーニング方法＝＝
本開示の方法は、ＲＵＮＸ２機能低下疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、機能的なＲＵＮＸ２遺伝子および／またはＲＵＮＸ２タンパク質を有しない未分化な骨芽細胞に１以上の化合物を投与する工程と、未分化な骨芽細胞が分化したかどうかを調べる工程と、未分化な骨芽細胞が分化した化合物を選択する工程と、を含む。
【００３３】
複数の化合物に対して、上述のようにして、骨芽細胞の分化を誘導するかどうかを調べ、未分化な骨芽細胞が分化した化合物を選択することにより、ＲＵＮＸ２機能低下疾患の
治療薬を効率良く得ることが可能になる。
【実施例】
【００３４】
【実施例１】
【００３５】
本実施例では、培養したカルバリア細胞に、ノコダゾール、ブレビスタチン、サイトカラシンＤ、リモデリンを添加し、骨芽細胞分化に与える影響を調べた。
【００３６】
胎生18.5日齢の野生型およびRunx2遺伝子ヘテロ欠損マウス、Runx2ホモ欠損マウスより頭蓋領域を摘出し、0.1%コラゲナーゼ、0.2%ディスパーゼを含むαMEM培地中にて震盪す
ることでカルバリア細胞を得た。採取したカルバリア細胞は10%ウシ血清、100 mg/Lアス
コルビン酸マグネシウム塩、3mg/mlβ-グリセロリン酸、100ng/ml BMP-2を含むαMEM培地を用いて骨芽細胞分化誘導を行なった。
【００３７】
その結果、図１に示すように、ブレビスタチンとリモデリンはRUNX2ヘテロ欠損細胞の
石灰化能を亢進した。またサイトカラシンＤはRUNX2ヘテロ欠損細胞の石灰化能亢進だけ
ではなく、石灰化能を全く持たないRUNX2ホモ欠損細胞においても石灰化能を回復させる
作用があった。
【００３８】
このように、アクチン重合阻害剤、ミオシンII阻害剤、またはＮ-アセチルトランスフ
ェラーゼ阻害剤は、ＲＵＮＸ２機能低下疾患の治療薬として有望である。」
【実施例２】
【００３９】
本実施例では、培養したカルバリア細胞に、アクチン重合阻害剤を添加し、各薬剤の最適濃度を調べた。
【００４０】
サイトカラシンＤ及びラトランクリンＡによるRUNX2ホモ欠損細胞の石灰化能回復に関
して、2種類の濃度でその作用の違いを検討した。
【００４１】
その結果、図２に示すように。サイトカラシンＤは０．２μMにおいて、ラトランクリ
ンＡは０．１μMにおいてその効果がもっとも強く現れた。
【図１】
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【図２】
2020200267.tif 000003