(57)【要約】      （修正有）【課題】組換え植物細胞において、長鎖多価不飽和脂肪酸、特にドコサヘキサエン酸を合成する方法の提供。【解決手段】エステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに、任意にステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）の１またはそれ以上を含み、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、約７％から２０％である、抽出植物脂質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸
（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサ
ヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに、任意にステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエ
ン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ
）の１またはそれ以上を含み、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベ
ルは、約７％から２０％である、抽出植物脂質。
【請求項２】
以下の特徴：
ｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは、約２％から
１８％の間、または約２％から１６％の間、または約２％から１５％の間である、
ｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）の
レベルは、６％未満、または３％未満、または２％未満、または１％未満である、
ｌｘｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルは、
約１％から約３０％の間、約３％から約３０％の間、または約６％から約３０％の間、ま
たは１％から約２０％の間、または約３０％から約６０％の間、または約４５％から約６
０％、または約３０％である、
ｌｘｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸（ＬＡ）の
レベルは、約４％から約３５％の間、または約４％から約２０％の間、または約４％から
１７％の間である、
ｌｘｉｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸（ＡＬＡ）
のレベルは、約４％から約４０％の間、約７％から約４０％の間、または約１０％から約
３５％の間、または約２０％から約３５％の間、または約４％から１６％の間、または約
２％から１６％の間である、
ｌｘｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記γ‐リノレン酸（ＧＬＡ）の
レベルは、４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、０．０５
％から７％の間、０．０５％から４％の間、または０．０５％から約３％の間、または０
．０５％から約２％の間である、
ｌｘｘｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ステアリドン酸（ＳＤＡ）
のレベルは、約７％未満、約６％未満、約４％未満、約３％未満、約０．０５％から約７
％の間、約０．０５％から約６％の間、約０．０５％から約４％の間、約０．０５％から
約３％の間、または０．０５％から約２％の間である、
ｌｘｘｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサテトラエン酸（
ＥＴＡ）のレベルは、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約１％未満、約０．５％未
満、約０．０５％から約６％の間、約０．０５％から約５％の間、約０．０５％から約４
％の間、約０．０５％から約３％の間、または約０．０５％から約２％の間である、
ｌｘｘｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸（
ＥＴｒＡ）のレベルは、４％未満、約２％未満、約１％未満、０．０５％から４％の間、
０．０５％から３％の間、または０．０５％から約２％の間、または０．０５％から約１
％の間である、
ｌｘｘｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサペンタエン酸（
ＥＰＡ）のレベルは、４％未満、約３％未満、約２％未満、０．０５％から１０％の間、
０．０５％から５％の間、または０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２
％の間である、
ｌｘｘｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ドコサぺンタエン酸（ＤＰ
Ａ）のレベルは、４％未満、約３％未満、約２％未満、０．０５％から８％の間、０．０
５％から５％の間、または０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間
である、
ｌｘｘｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、約８
％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％
、約１７％、約１８％、約８％から２０％の間、約１０％から２０％の間、約１１％から
２０％の間、約１０％から約１６％の間、または約１４％から２０％の間である、
ｌｘｘｖｉｉ）前記脂質は、その脂肪酸含有量にω６‐ドコサぺンタエン酸（２２：５
Δ４，７，１０，１３，１６）を含む、
ｌｘｘｖｉｉｉ）前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ω６‐ドコサぺンタエン酸（２２
：５Δ４，７，１０，１３，１６）を実質的に含まない、
ｌｘｘｉｘ）前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ＳＤＡ、ＥＰＡ、およびＥＴＡを実質
的に含まない、
ｌｘｘｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、約４
％から約２５％の間、または約４％から約２０％の間、約６％から約２０％の間、約４％
から約６０％の間、約３０％から約６０％の間、または約４５％から約６０％の間である
、
ｌｘｘｘｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベル
は、約４％から約３５％の間、または約８％から約２５％の間、または８％から約２２％
の間である、
ｌｘｘｘｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベ
ルは、約２０％から約７５％の間、または約５０％から約７５％の間、または約６０％か
ら約７５％の間である、
ｌｘｘｘｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸のレベルは
、約３５％から約５０％の間、約２０％から約３５％の間、約６％から２０％の間、２０
％未満、約１６％未満、約１０％未満、約１％から約１６％の間、約２％から約１０％の
間、または約４％から約１０％の間である、
ｌｘｘｘｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸のレベルは、
約１０％未満、約８％未満、約６％未満、４％未満、約１％から約２０％の間、約１％か
ら約１０％の間、約０．５％から約８％の間、または約０．５％から４％の間である、
ｌｘｘｘｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸のレベルは、３
６％から約６５％の間、４０％から約６０％の間、約２０％から約３５％の間、約１０％
から約２０％の間、約２５％、約３０％、約３５％、または約４０％である、
ｌｘｘｘｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω３脂肪酸のレベルは、
９％から約３３％の間、約１０％から約２０％の間、約２０％から約３０％の間、約１２
％から約２５％の間、約１３％、約１５％、約１７％、または約２０％である、
ｌｘｘｘｖｉｉ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω６脂肪酸：総ω３脂
肪酸の比は、約１．０から約３．０の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．５
の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５
未満、約１．０、約０．１、または約０．２である、
ｌｘｘｘｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω６脂肪酸：新ω３
脂肪酸の比は、約１．０から約３．０の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．
５の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１
５未満、約０．１、約０．２、または約１．０である、
ｌｘｘｘｉｘ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０
％、少なくとも約８０％、約６０％から約９８％の間、約７０％から約９５％の間、また
は約７５％から約９０％の間の、Δ１２‐デサチュラーゼによる、オレイン酸のＬＡへの
転換の効率に基づく、
ｘｃ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少な
くとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約３０％から約７０％の間
、約３５％から約６０％の間、または約５０％から約７０％の間の、Δ６‐デサチュラー
ゼによる、ＡＬＡのＳＤＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｃｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、
少なくとも約７５％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約８８％の間、または約
７５％から約８５％の間の、Δ６‐エロンガーゼによる、ＳＤＡのＥＴＡ酸への転換の効
率に基づく、
ｘｃｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、
少なくとも約７５％、約６０％から約９９％の間、約７０％から約９９％の間、または約
７５％から約９８％の間の、Δ５‐デサチュラーゼによる、ＥＴＡのＥＰＡへの転換の効
率に基づく、
ｘｃｉｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％
、少なくとも約９０％、約５０％から約９５％の間、または約８５％から約９５％の間の
、Δ５‐エロンガーゼによる、ＥＰＡのＤＰＡへの転換の効率に基づく、
ｘｃｉｖ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、
少なくとも約９３％、約５０％から約９５％の間、約８０％から約９５％の間、または約
８５％から約９５％の間の、Δ４‐デサチュラーゼによる、ＤＰＡのＤＨＡへの転換の効
率に基づく、
ｘｃｖ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少
なくとも約２０％、約１０％から約５０％の間、約１０％から約３０％の間、または約１
０％から約２５％の間の、オレイン酸のＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｃｖｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、
少なくとも約２２％、少なくとも約２５％、約１５％から約５０％の間、約２０％から約
４０％の間、または約２０％から約３０％の間の、ＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく
、
ｘｃｖｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％
、少なくとも約２４％、約１７％から約５５％の間、約２２％から約３５％の間、または
約２４％から約３５％の間のＡＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｃｖｉｉｉ）前記抽出脂質における前記総脂肪酸は、Ｃ２０：１を１％未満有する、
ｘｃｉｘ）前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は、少なくとも約
７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、約７０％から約
９９％の間、または約９０％から約９９％の間であり、
ｃ）前記脂質は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含む、
ｃｉ）前記脂質は、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、または約０．００１％か
ら約５％の間の、遊離（非エステル化）脂肪酸および／もしくはリン脂質を含む、または
、これらを実質的に含まない、
ｃｉｉ）ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＨＡの少なくとも７０％または少なくとも
８０％が、前記ＴＡＧのｓｎ‐１またはｓｎ‐３の位置にある、
ｃｉｉｉ）前記脂質において最も豊富なＤＨＡ含有ＴＡＧの種は、ＤＨＡ／１８：３／
１８：３（ＴＡＧ５８：１２）である、
ｃｉｖ）前記脂質は、トリ‐ＤＨＡ  ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む、の１もしく
はそれ以上、または全てを有する請求項１の脂質。
【請求項３】
オイルの形態であって、該オイルの重量の少なくとも約９０％、または少なくとも約９
５％、少なくとも約９８％、または約９５％から約９８％の間が前記脂質である、請求項
１または請求項２の脂質。
【請求項４】
１またはそれ以上のステロールをさらに含む、請求項１から３のいずれか１つの脂質。
【請求項５】
オイルの形態であって、約１０ｍｇのステロール／ｇのオイル未満、約７ｍｇのステロ
ール／ｇのオイル未満、約１．５ｍｇから約１０ｍｇの間のステロール／ｇのオイル、ま
たは約１．５ｍｇから約７ｍｇの間のステロール／ｇのオイルを含む請求項４の脂質。
【請求項６】
カンペステロール／２４‐メチルコレステロール、Δ５‐スチグマステロール、エブリ
コール、β‐シトステロール／２４‐エチルコレステロール、Δ５‐アベナステロール／
イソフコステロール、Δ７‐スチグマステロール／スティグマスト‐７‐エン‐３β‐オ
ールおよび、Δ７‐アベナステロールの１もしくはそれ以上、または全てを含む請求項４
または請求項５の脂質。
【請求項７】
約０．５ｍｇのコレステロール／ｇのオイル未満、約０．２５ｍｇのコレステロール／
ｇのオイル未満、約０ｍｇから約０．５ｍｇの間のコレステロール／ｇのオイル、もしく
は約０ｍｇから約０．２５ｍｇの間のコレステロール／ｇのオイルを含む、またはコレス
テロールを実質的に含まない、請求項４から６のいずれか１つの脂質。
【請求項８】
前記脂質はオイルであり、好ましくは、油料種子由来のオイルである、請求項１から７
のいずれか１つの脂質。
【請求項９】
前記脂質は、アブラナ属種オイル、ワタオイル、アマオイル、ヒマワリ属種オイル、ベ
ニバナオイル、ダイズオイル、トウモロコシオイル、シロイヌナズナオイル、モロコシオ
イル、ソルガムブルガレオイル、エンバクオイル、トリフォリウム属種オイル、エラエイ
スグイネエヌシスオイル、ベンサミアナタバコオイル、オオムギオイル、ルピナスアング
スティフォリウスオイル、イネオイル、アフリカイネオイル、カメリナサティバオイル、
クランベアビシニカオイル、ミスカンサスｘギガンティウスオイル、またはススキオイル
である、請求項８の脂質。
【請求項１０】
ｉ）脂質を含む植物部分を得ることであって、前記脂質はエステル化形態で脂肪酸を含
み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）およびγ‐リノレン酸
（ＧＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ステアリド
ン酸（ＳＤＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）
、並びに任意にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）
の１またはそれ以上を含み、前記植物部分における抽出可能な脂質の前記総脂肪酸含有量
における前記ＤＨＡのレベルは、約７％から２０％である工程、
ｉｉ）前記植物部分から脂質を抽出することであって、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含
有量における前記ＤＨＡのレベルは、約７％から２０％である工程、
を含む、抽出植物脂質を産生するためのプロセス。
【請求項１１】
前記抽出脂質は、請求項２から９に定義される１またはそれ以上の特徴を有する、請求
項１０のプロセス。
【請求項１２】
前記植物部分が、種子、好ましくは油料種子である、請求項１０または請求項１１のプ
ロセス。
【請求項１３】
前記種子が、アブラナ属種子、ワタ、アマ、ヒマワリ属種、ベニバナ、ダイズ、トウモ
ロコシ、シロイヌナズナ、モロコシ、ソルガムブルガレ、エンバク、トリフォリウム属種
、エラエイスグイネエヌシス、ベンサミアナタバコ、オオムギ、ルピナスアングスティフ
ォリウス、イネ、アフリカイネ、カメリナサティバ、またはクランベアビシニカ、好まし
くは、セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバの種子である、請
求項１２のプロセス。
【請求項１４】
種子１グラム当たり、少なくとも約１８ｍｇ、少なくとも約２２ｍｇ、少なくとも約２
６ｍｇ、約１８ｍｇから約１００ｍｇの間、約２２ｍｇから約７０ｍｇの間、または約２
４ｍｇから約５０ｍｇの間のＤＨＡを、前記種子が含む、請求項１２または請求項１３の
プロセス。
【請求項１５】
前記植物部分は、以下のセットの酵素：
ｉ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デ
サチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４
‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ
４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラー
ゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロ
ンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デ
サチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４
‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ
４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、または
ｖｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュ
ラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐
エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
の１つをコードし、
各ポリヌクレオチドが、前記植物部分の細胞において、前記ポリヌクレオチドの発現を
方向づけることが可能である、１またはそれ以上のプロモーターに操作可能に結合される
、外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１０から１４のいずれか１つのプロセス。
【請求項１６】
前記植物部分が、以下の特徴：
ｉ）前記Δ１２‐デサチュラーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少な
くとも約８０％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約９０％の間、または約７５
％から約８５％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞におけるオレイン酸をリノ
ール酸に転換する、
ｉｉ）前記ω３‐デサチュラーゼが、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少な
くとも約８５％、約６５％から約９５％の間、約７５％から約９１％の間、または約８０
％から約９１％の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ω６脂肪酸をω３脂
肪酸に転換する、
ｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少
なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約３０％から約７０％の
間、約３５％から約６０％の間、または約５０％から約７０％の間の効率で、１またはそ
れ以上の植物の細胞において、ＡＬＡをＳＤＡに転換する、
ｉｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、約５％未満、約２．５％未満、約１％未満、約０
．１％から約５％の間、約０．５％から約２．５％の間、または約０．５％から約１％の
間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、リノール酸をγ‐リノレン酸に転
換する、
ｖ）前記Δ６‐エロンガーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくと
も約７５％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約８０％の間、または約７５％か
ら約８０％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＳＤＡをＥＴＡに転
換する、
ｖｉ）前記Δ５‐デサチュラーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少な
くとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、約６０％から約９５％の間
、約７０％から約９５％の間、または約７５％から約９５％の間の効率で、１またはそれ
以上の植物の細胞において、ＥＴＡをＥＰＡに転換する、
ｖｉｉ）前記Δ５‐エロンガーゼが、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少な
くとも約９０％の間、約５０％から約９０％の間、または約８５％から約９５％の間の効
率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＥＰＡをＤＰＡに転換する、
ｖｉｉｉ）前記Δ４‐デサチュラーゼが、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、
少なくとも約９３％、約５０％から約９５％の間、約８０％から約９５％の間、または約
８５％から約９５％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＤＰＡをＤ
ＨＡに転換する、
ｉｘ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞における、ＤＨＡへのオレイン酸の転換
の効率が、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、約１０％か
ら約５０％の間、約１０％から約３０％の間、または約１０％から約２５％の間である、
ｘ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞における、ＤＨＡへのＬＡの転換の効率が
、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、少なくとも約２５％
、約１５％から約５０％の間、約２０％から約４０％の間、または約２０％から約３０％
の間である、
ｘｉ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞における、ＤＨＡへのＡＬＡの転換の効
率が、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少なくとも約２４％、約１７％から約
５５％の間、約２２％から約３５％の間、または約２４％から約３５％の間である、
ｘｉｉ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞が、前記外因性ポリヌクレオチドを欠
いている対応する細胞よりも、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、約１５％から
約３０％の間、または約２２．５％から約２７．５％の間で多いω３脂肪酸を含む、
ｘｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、、リノール酸（ＬＡ）に対してα‐リノレン
酸（ＡＬＡ）を優先的に不飽和化する、
ｘｉｖ）前記Δ６‐エロンガーゼは、また、Δ９‐エロンガーゼ活性を有する、
ｘｖ）前記Δ１２‐デサチュラーゼは、また、Δ１５‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｖｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、また、Δ８‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｖｉｉ）前記Δ８‐デサチュラーゼは、また、Δ６‐デサチュラーゼ活性を有する、
またはΔ６‐デサチュラーゼ活性を有していない、
ｘｖｉｉｉ）前記Δ１５‐デサチュラーゼは、また、ＧＬＡでω３‐デサチュラーゼ活
性を有し、
ｘｉｘ）前記ω３‐デサチュラーゼは、また、ＬＡでΔ１５‐デサチュラーゼ活性を有
する、
ｘｘ）前記ω３‐デサチュラーゼは、両方のＬＡおよび／またはＧＬＡを不飽和化する
、
ｘｘｉ）前記ω３‐デサチュラーゼは、、ＬＡに対してＧＬＡを優先的に不飽和化する
、
ｘｘｉｉ）前記植物部分における前記ＤＨＡのレベルは、少なくとも約１０％、少なく
とも約１５％、少なくとも約２０％、約１０％から約５０％の間、約１５％から約３０％
の間、または約２０％から約２５％の間の、前記植物部分におけるオレイン酸のＤＨＡへ
の転換の効率に基づく、
ｘｘｉｉｉ）前記植物部分における前記ＤＨＡのレベルは、少なくとも約１５％、少な
くとも約２０％、少なくとも約２２％、約１５％から約６０％の間、約２０％から約４０
％の間、または約２２％から約３０％の間の、前記植物部分におけるＬＡのＤＨＡへの転
換の効率に基づく、
ｘｘｉｖ）前記植物部分における前記ＤＨＡのレベルは、少なくとも約１７％、少なく
とも約２２％、少なくとも約２４％、約１７％から約６５％の間、約２２％から約３５％
の間、または約２４％から約３５％の間の、前記植物部分におけるＡＬＡのＤＨＡへの転
換の効率に基づく、
ｘｘｘ）１もしくはそれ以上のまたは全ての前記デサチュラーゼが、対応するアシル‐
ＰＣ基質よりもアシル‐ＣｏＡ基質で、より高い活性を有する、
ｘｘｘｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としての、ＬＡよりもＡＬＡで、
より高いΔ６‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｘｘｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ‐２位置に
結合するＡＬＡよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、より高いΔ６‐デサチュ
ラーゼ活性を有する、
ｘｘｘｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、基質としてのＡＬＡで、ＬＡと比較して
、少なくとも約２倍高いΔ６‐デサチュラーゼ活性、少なくとも３倍高い活性、少なくと
も４倍高い活性、または少なくとも５倍高い活性を有する、
ｘｘｘｉｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ‐２位置に
結合するＡＬＡよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、より高い活性を有する、
ｘｘｘｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ‐２位置に結
合するＡＬＡよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、少なくとも約５倍高いΔ６
‐デサチュラーゼ活性または少なくとも１０倍高い活性を有する、
ｘｘｘｖｉ）前記デサチュラーゼは、フロントエンドのデサチュラーゼである、
ｘｘｘｖｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、ＥＴＡで、検出可能なΔ５‐デサチュラ
ーゼ活性を有していない、
の１もしくはそれ以上、または全てを有する請求項１５のプロセス。
【請求項１７】
前記植物部分が、以下の特徴：
ｉ）前記Δ１２‐デサチュラーゼが、配列番号１０で規定される配列を有するアミノ酸
、その生物学的に活性な断片、または配列番号１０と少なくとも５０％同一であるアミノ
酸配列を含む、
ｉｉ）前記ω３‐デサチュラーゼが、配列番号１２で規定される配列を有するアミノ酸
、その生物学的に活性な断片、または配列番号１２と少なくとも５０％同一であるアミノ
酸配列を含む、
ｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、配列番号１６で規定される配列を有するアミノ
酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号１６と少なくとも５０％同一であるアミ
ノ酸配列を含む、
ｉｖ）前記Δ６‐エロンガーゼが、配列番号２５で規定される配列を有するアミノ酸、
配列番号２６のようなその生物学的に活性な断片、または配列番号２５および／または配
列番号２６と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、
ｖ）前記Δ５‐デサチュラーゼが、配列番号３０で規定される配列を有するアミノ酸、
その生物学的に活性な断片、または配列番号３０と少なくとも５０％同一であるアミノ酸
配列を含む、
ｖｉ）前記Δ５‐エロンガーゼが、配列番号３７で規定される配列を有するアミノ酸、
その生物学的に活性な断片、または配列番号３７と少なくとも５０％同一であるアミノ酸
配列を含む、
ｖｉｉ）前記Δ４‐デサチュラーゼが、配列番号４１で規定される配列を有するアミノ
酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号４１と少なくとも５０％同一であるアミ
ノ酸配列を含む、
の１もしくはそれ以上、または全てを有する、請求項１５または請求項１６のプロセス
。
【請求項１８】
前記植物部分が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、モノ
アシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）、グリセロール‐３‐ホスフ
ェートアシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、１‐アシル‐グリセロール‐３‐ホスフ
ェートアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）好ましくはＣ２２多価不飽和脂肪族アシ
ル‐ＣｏＡ基質を使用し得るＬＰＡＡＴ、アシル‐ＣｏＡ：リソホスファチジルコリンア
シルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、ホスホリパ
ーゼＣ（ＰＬＣ）、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、ＣＤＰ‐コリンジアシルグリセロール
コリンホスフォトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）、ホスファチジル（ｐｈｏｓｈａｔｉｄｙ
ｌ）コリンジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）、ホスファチジ
ルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスフォトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）、アシ
ル‐ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）、または２つもしくはそれ以上のこれらの組み合わせを
コードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１５から１７のいずれか１つの
プロセス。
【請求項１９】
前記植物部分が、ＦＡＥ１、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＬＰＣＡＴ
、ＰＬＡ２、ＰＬＣ、ＰＬＤ、ＣＰＴ、ＰＤＡＴ、ＦＡＴＢのようなチオエステラーゼ、
またはΔ１２‐デサチュラーゼ、または２つもしくはそれ以上のこれらの組み合わせから
選択される、前記植物部分の細胞における内因性酵素の産生および／または活性を下方制
御する、導入された突然変異または外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１０か
ら１８のいずれか１つのプロセス。
【請求項２０】
少なくとも１つまたは全ての前記プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求
項１５から１９のいずれか１つのプロセス。
【請求項２１】
少なくとも１つまたは全ての前記プロモーターが、オイル生合成もしくはオレオシンの
ような蓄積遺伝子から、またはコンリニンのような種子貯蔵タンパク質遺伝子から得られ
た、請求項２０のプロセス。
【請求項２２】
前記Δ４‐デサチュラーゼおよび前記Δ５‐エロンガーゼをコードする、外因性ポリヌ
クレオチドの発現を方向づける前記プロモーターが、前記植物部分の種子の発生以前、ま
たはピークの発現に達する以前において、ポリヌクレオチドの発現を開始し、前記プロモ
ーターが前記Δ１２‐デサチュラーゼおよび前記ω３‐デサチュラーゼをコードする前記
外因性ポリヌクレオチドの発現を方向づける、請求項１５から２１のいずれか１つのプロ
セス。
【請求項２３】
前記外因性ポリヌクレオチドは、前記植物部分の細胞のゲノムに組込まれるＤＮＡ分子
、好ましくはＴ‐ＤＮＡ分子において共有結合で結合され、好ましくは前記植物部分の前
記細胞の前記ゲノムに組込まれるこのようなＤＮＡ分子の数は、１、２もしくは３以下で
あり、または２もしくは３である、請求項１５から２２のいずれか１つのプロセス。
【請求項２４】
前記植物は、同じまたは異なるアミノ酸配列を有するΔ６‐デサチュラーゼをそれぞれ
コードする少なくとも２つの異なる外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項２３のプロセ
ス。
【請求項２５】
前記外因性ポリヌクレオチドを含む前記植物部分の総オイル含有量は、前記外因性ポリ
ヌクレオチドを欠く対応する植物部分の総オイル含有量の少なくとも約４０％、または少
なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または約５
０％から約８０％の間である、請求項１５から２４のいずれか１つのプロセス。
【請求項２６】
前記脂質は、オイル、好ましくは油料種子由来の種子オイルの形態であり、前記脂質の
重量の少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または約
９５％から約９８％の間がトリアシルグリセロールである、請求項１０から２５のいずれ
か１つのプロセス。
【請求項２７】
前記総脂肪酸含有量のパーセンテージとしての前記ＤＨＡのレベルを増加させるために
前記脂質を処理することをさらに含む、請求項１０から２６のいずれか１つのプロセス。
【請求項２８】
前記処理がエステル交換反応である、請求項２７のプロセス。
【請求項２９】
請求項１０から２８のいずれか１つのプロセスを用いて産生された、脂質または該脂質
を含むオイル。
【請求項３０】
単一のＤＮＡ分子に全て共有結合で結合される、第１の遺伝子、第２の遺伝子、第３の
遺伝子、第４の遺伝子、第５の遺伝子、および第６の遺伝子の順で含む、キメラ遺伝子コ
ンストラクトであって、
第１、第２、および第３の遺伝子が第１の遺伝子クラスターとしてともに結合され、第
４、第５、および第６の遺伝子が第２の遺伝子クラスターとしてともに結合され、
各遺伝子は、各プロモーターが前記コード領域および転写ターミネーターおよび／また
はポリアデニル化領域が操作可能に結合されるように、プロモーター、コード領域、およ
び転写ターミネーター、および／またはポリアデニル化領域を含み、
各プロモーターが、前記ＤＮＡ分子が３、４、５、または６つの異なるプロモーターを
含むように、独立して他のプロモーターと同じまたは異なり、１もしくはそれ以上のまた
は全ての前記プロモーターが、それが操作可能に結合されるコード領域に対して異種性で
あり、
前記第１の遺伝子の転写の方向が、前記第３の遺伝子から離れており、前記第３の遺伝
子の転写の方向と反対であり、
前記第４の遺伝子の転写の方向が、前記第６の遺伝子から離れており、前記第６の遺伝
子の転写の方向と反対であり、
前記第２の遺伝子の転写の方向が、前記第１の遺伝子または前記第３の遺伝子と同じで
あり、
前記第５の遺伝子の転写の方向が、前記第４の遺伝子または前記第６の遺伝子と同じで
あり、
前記第２の遺伝子の前記転写ターミネーターおよび／またはポリアデニル化領域が、約
０．２から約３．０キロベースの間の第１のスペーサー領域により、より近いいずれかの
、前記第１または第３の遺伝子の前記プロモーターから間隔を置き、
約１．０から約１０．０キロベースの間の第２のスペーサー領域により前記第１の遺伝
子クラスターが第２の遺伝子クラスターから間隔を置き、および
前記第５の遺伝子の前記転写ターミネーターおよび／またはポリアデニル化領域が、約
０．２から約３．０キロベースの間の第３のスペーサー領域により、より近いいずれかの
、第４または第６の遺伝子の前記プロモーターから間隔を置く、キメラ遺伝子コンストラ
クト。
【請求項３１】
前記ＤＮＡ分子が、約１．０から約１０．０キロベースの間のスペーサー領域により、
より近いいずれかの、前記第１の遺伝子クラスターまたは前記第２の遺伝子クラスターか
ら間隔を置く第７の遺伝子を含む、請求項３０の遺伝子コンストラクト。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ分子が、２つまたはそれ以上の異なる転写ターミネーターおよび／またはポ
リアデニル化領域を含む、請求項３０または請求項３１の遺伝子コンストラクト。
【請求項３３】
少なくとも１つの前記スペーサー領域がマトリックス結合領域（ＭＡＲ）を含む、請求
項３０から３２のいずれか１つの遺伝子コンストラクト。
【請求項３４】
前記ＤＮＡ分子が、前記遺伝子に隣接する左右境界領域を含み、かつＴ‐ＤＮＡ分子で
ある、請求項３０から３３のいずれか１つの遺伝子コンストラクト。
【請求項３５】
アグロバクテリウム細胞である、または植物細胞のゲノムに組み込まれる、請求項３０
から３４のいずれか１つの遺伝子コンストラクト。
【請求項３６】
少なくとも１つの前記遺伝子が、脂肪酸デサチュラーゼまたは脂肪酸エロンガーゼをコ
ードする、請求項３０から３５のいずれか１つの遺伝子コンストラクト。
【請求項３７】
請求項１５に定義される酵素のセットをコードする遺伝子、および／または請求項１６
または１７に定義される酵素をコードする１またはそれ以上の遺伝子を含む、請求項３６
の遺伝子コンストラクト。
【請求項３８】
ｉ）配列番号１から９、１１、１４、１８、２２、２３、２８、３４、３５、３９、ま
たは４５のいずれかから選択されるヌクレオチドの配列、および／または
ｉｉ）配列番号１から９、１１、１４、１８、２２、２３、２８、３４、３５、３９、
または４５に示される１またはそれ以上の配列と、少なくとも９５％同一または９９％同
一であるヌクレオチドの配列、
を含む、単離および／または外因性ポリヌクレオチド。
【請求項３９】
請求項３８のポリヌクレオチドおよび／または請求項３０から３７のいずれか１つの前
記遺伝子コンストラクトを含む、ベクターまたは遺伝子コンストラクト。
【請求項４０】
配列番号１１、１４、１８、２２、２３、２８、３４、３５、３９、もしくは４５のい
ずれか１つから選択される前記ヌクレオチドの配列、または配列番号１１、１４、１８、
２２、２３、２８、３４、３５、３９、もしくは４５で示される１もしくはそれ以上の前
記配列と少なくとも９５％同一もしくは９９％同一である前記ヌクレオチドの配列は、プ
ロモーターに操作可能に結合される、請求項３９のベクターまたは遺伝子コンストラクト
。
【請求項４１】
以下のセットの酵素：
ｉ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デ
サチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４
‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ
４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラー
ゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロ
ンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デ
サチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４
‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ
４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、または
ｖｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュ
ラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐
エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
の１つをコードする、外因性ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、
各ポリヌクレオチドは、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけるこ
とができるように、１またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合される、宿主細胞
。
【請求項４２】
請求項１から９のいずれか１つに定義される脂質を含み、または１もしくはそれ以上の
または全ての前記デサチュラーゼもしくはエロンガーゼは、請求項１６または請求項１７
に定義される１またはそれ以上の特徴を有する、請求項４１の細胞。
【請求項４３】
ｉ）配列番号１０に規定される配列を有するアミノ酸を含むΔ１２‐デサチュラーゼを
コードする第１の外因性ポリヌクレオチド、その生物学的に活性な断片、または配列番号
１０と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列と、
ｉｉ）配列番号１２に規定される配列を有するアミノ酸を含むω３‐デサチュラーゼを
コードする第２の外因性ポリヌクレオチド、その生物学的に活性な断片、または配列番号
１２と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列とを含み、
各ポリヌクレオチドが、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけるこ
とができる１またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合される、宿主細胞。
【請求項４４】
１またはそれ以上の請求項３８の前記ポリヌクレオチド、請求項３０から３７のいずれ
か１つの前記遺伝子コンストラクト、または請求項３９もしくは請求項４０の前記ベクタ
ーもしくは遺伝子コンストラクトを含む宿主細胞。
【請求項４５】
植物における、植物部分におけるものである、および／または成熟した植物種子の細胞
である、請求項４１から４４のいずれか１つの細胞。
【請求項４６】
前記植物または植物種子は、それぞれ油料種子植物または油料種子である、請求項４５
の細胞。
【請求項４７】
請求項４１から４６のいずれか１つの細胞を含む、トランスジェニック非ヒト生物。
【請求項４８】
トランスジェニック植物である、請求項４７のトランスジェニック非ヒト生物。
【請求項４９】
ａ）その種子における脂質であって、該脂質がエステル化形態における脂肪酸を含み、
および
ｂ）以下のセットの酵素：
ｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、真菌のω３‐デサチュラーゼ、および／または真菌のΔ
１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュ
ラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、または
ｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、真菌のω３‐デサチュラーゼ、および／もしくは真菌
のΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサ
チュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、の１つをコードする外因
性ポリヌクレオチドを含み、
各ポリヌクレオチドは、前記植物の種子を発生する場合に、前記ポリヌクレオチドの発
現を方向づけることができるように１またはそれ以上の種子特異的プロモーターを操作可
能に結合され、
前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）およびγ‐リノレン酸
（ＧＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ステアリド
ン酸（ＳＤＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、
ならびに任意にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および／またはエイコサテトラエン酸（
ＥＴＡ）を含み、
前記脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは約７％から２０％である
、油料種子植物。
【請求項５０】
前記植物は、キャノーラ、ダイズ、カメリナサティバ、またはシロイヌナズナ植物であ
る、請求項４９の植物。
【請求項５１】
１またはそれ以上の前記デサチュラーゼは、アシル‐ＣｏＡ基質を使用することができ
る、請求項４９または請求項５０の植物。
【請求項５２】
１またはそれ以上の前記Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチ
ュラーゼ、およびΔ８‐デサチュラーゼは、もし存在する場合には、アシル‐ＣｏＡ基質
を用いることができ、好ましくは、ｉ）Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、
およびΔ４‐デサチュラーゼ、またはｉｉ）Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラー
ゼ、およびΔ８‐デサチュラーゼのそれぞれは、アシル‐ＣｏＡ基質を用いることができ
る、請求項５１の植物。
【請求項５３】
前記植物の成熟した、収穫された種子は、１グラムの種子あたり少なくとも約２８ｍｇ
、好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約３２ｍｇ、１グラムの種子あたり少なく
とも約３６ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは１グラム
の種子あたり少なくとも約４４ｍｇ、または１グラムの種子あたり少なくとも約４８ｍｇ
のＤＨＡ含有量を有する、請求項４９から５２のいずれか１つの植物。
【請求項５４】
ＤＨＡを含む種子を産生することができるセイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、また
はカメリナサティバ植物であって、
前記植物の成熟した、収穫された種子は、１グラムの種子あたり少なくとも約２８ｍｇ
、好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約３２ｍｇ、１グラムの種子あたり少なく
とも約３６ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは１グラム
の種子あたり少なくとも約４４ｍｇ、または１グラムの種子あたり少なくとも約４８ｍｇ
のＤＨＡ含有量を有する植物。
【請求項５５】
前記外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項４９から５４のいずれか１つの植物の植物
細胞。
【請求項５６】
以下の特徴：
ｉ）請求項４８から５４のいずれか１つの植物由来である、
ｉｉ）請求項１から９のいずれか１つに定義される脂質を含む、
ｉｉｉ）請求項１０から２８のいずれか１つのプロセスで使用され得る、
ｉｖ）請求項３０から３７のいずれか１つの遺伝子コンストラクトを含む、または
ｖ）請求項１４、４１、または４８から５２のいずれか１つに定義される外因性ポリヌ
クレオチドのセットを含む、
の１またはそれ以上を有する植物部分、好ましくは種子。
【請求項５７】
ＤＨＡおよび重量で約４％から約１５％の間の水分含有量を含む、成熟した、収穫され
たセイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバ種子であって、
前記種子の前記ＤＨＡの含有量は、１グラムの種子あたり少なくとも約２８ｍｇ、好ま
しくは１グラムの種子あたり少なくとも約３２ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約
３６ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは１グラムの種子
あたり少なくとも約４４ｍｇ、または１グラムの種子あたり少なくとも約４８ｍｇである
、種子。
【請求項５８】
請求項１から９のいずれか１つに定義される、１もしくはそれ以上のまたは全ての特徴
を含む、抽出脂質を産生するために使用され得る、請求項４１から４６、もしくは５５の
いずれか１つの前記細胞、請求項４７もしくは請求項４８の前記トランスジェニック生物
、請求項４９から５３のいずれか１つの前記油料種子植物、請求項５４の前記セイヨウア
ブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、請求項４９もしくは請求項
５６の前記植物部分、または請求項５７の前記種子。
【請求項５９】
請求項４１から４５のいずれか１つの細胞を産生する方法であって、
ａ）前記細胞、好ましくは、ＬＣ‐ＰＵＦＡを合成することができない細胞に、請求項
３０から３７のいずれか１つの前記遺伝子コンストラクト、請求項３８の前記単離および
／または外因性ポリヌクレオチド、請求項３９または請求項４０の前記ベクターまたは遺
伝子コンストラクト、請求項１４、４１から４３、または４８から５２のいずれか１つに
定義される１またはそれ以上の外因性ポリヌクレオチドの組み合わせを導入することと、
ｂ）任意に、前記遺伝子またはポリヌクレオチドを前記細胞内に発現することと、
ｃ）任意に、前記細胞の前記脂肪酸組成を分析することと、
ｄ）任意に、前記遺伝子またはポリヌクレオチドを発現する細胞を選択することと、を
含む方法。
【請求項６０】
前記細胞における脂質が、１またはそれ以上の請求項１から９に定義される特徴を有す
る、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記遺伝子コンストラクト、前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチド、前記
ベクター、前記遺伝子コンストラクト、または外因性ポリヌクレオチドの組み合わせは、
前記細胞の前記ゲノムに安定して組込まれる、請求項５９または請求項６０に記載の方法
。
【請求項６２】
前記細胞は植物細胞であり、前記方法は、工程ａ）の前記細胞から形質転換植物を再生
する工程をさらに含む、請求項５９から６１のいずれか１つの方法。
【請求項６３】
前記遺伝子および／または外因性ポリヌクレオチドは、一過性で前記細胞内に発現され
る、請求項６２の方法。
【請求項６４】
請求項５９から６３のいずれか１つの方法を用いて産生される細胞。
【請求項６５】
種子を産生する方法であって、
ａ）好ましくは少なくとも１０００のこのような植物の個体群の一部としてのフィール
ドで、またはスタンダードな栽植密度で栽植される少なくとも１ヘクタールのエリアで、
請求項４８から５４のいずれか１つの植物、または請求項１０から２８、５６、もしくは
５７のいずれか１つに定義される部分を産生する植物を成長させることと、
ｂ）前記植物の１つまたは複数から種子を収穫することと、
ｃ）任意に、前記種子から脂質を抽出して、好ましくは、少なくとも６０ｋｇＤＨＡ／
ヘクタールの総ＤＨＡ収率を有するオイルを産生することと、
を含む、方法。
【請求項６６】
以下の特徴：
ｉ）前記オイルが請求項２、または４から７のいずれか１つに定義される、
ｉｉ）前記植物部分または種子が、請求項１４、１６から１９、２１から２８のいずれ
か１つのプロセスで使用され得る、
ｉｉｉ）前記外因性ポリヌクレオチドが、請求項３０から３５のいずれか１つの遺伝子
コンストラクトに含まれる、
ｉｖ）前記外因性ポリヌクレオチドは、請求項３８の外因性ポリヌクレオチドを含む、
ｖ）前記植物細胞は、請求項４３の細胞である、
ｖｉ）前記種子は、請求項６５の方法で産生された、
の１またはそれ以上を有する、請求項４８から５７のいずれか１つの前記植物、植物細胞
、植物部分、または種子。
【請求項６７】
１もしくはそれ以上の脂肪酸デサチュラーゼおよび／もしくは脂肪酸エロンガーゼ、ま
たは１もしくはそれ以上の脂肪酸デサチュラーゼ、並びに１もしくはそれ以上の脂肪酸エ
ロンガーゼを産生する方法であって、
請求項３６または請求項３７の前記遺伝子コンストラクト、請求項３８の前記単離およ
び／または外因性ポリヌクレオチド、請求項３９または請求項４０の前記ベクターまたは
遺伝子コンストラクト、１またはそれ以上の請求項１４、４１から４３、または４８から
５２のいずれか１つで定義される外因性ポリヌクレオチドの組み合わせを、細胞でまたは
細胞フリーの発現システムで発現することを含む方法。
【請求項６８】
請求項１０から２８のいずれか１つの前記プロセス、請求項４１から４６、もしくは５
５のいずれか１つの前記細胞、請求項４７もしくは４８の前記トランスジェニック生物、
請求項４９から５３のいずれか１つの前記油料種子植物、請求項５４の前記セイヨウアブ
ラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、請求項４９もしくは請求項５
６の前記植物部分、請求項５７の前記種子、または請求項６６の前記植物、植物細胞、植
物部分、もしくは種子を用いて、産生されまたは得られる脂質またはオイル。
【請求項６９】
油料種子のオイルの抽出により得られる、請求項２９または請求項６８の脂質またはオ
イル。
【請求項７０】
キャノーラオイル（セイヨウアブラナ、ブラッシカ・ラパ亜種）、マスタードオイル（
セイヨウカラシナ）、他のアブラナオイル、ヒマワリ油（ヒマワリ）、亜麻仁油（アマ）
、ダイズオイル（ダイズ）、ベニバナオイル（ベニバナ）、コーンオイル（トウモロコシ
）、タバコオイル（タバコ）、ピーナッツオイル（ピーナッツ）、パームオイル、綿実油
（ワタ）、ココナッツオイル（ココヤシ）、アボカドオイル（アボカド）、オリーブオイ
ル（オリーブ）、カシューオイル（カシューナッツ）、マカダミアオイル（マカダミア）
、アーモンドオイル（アーモンド）、またはシロイヌナズナ種子オイル（シロイヌナズナ
）である、請求項２９、６８、または６９の脂質またはオイル。
【請求項７１】
請求項１０から２８のいずれか１つの前記プロセス、請求項４１から４６、もしくは５
５のいずれか１つの前記細胞、請求項４７もしくは４８の前記トランスジェニック生物、
請求項４９から５３のいずれか１つの前記油料種子植物、請求項５４の前記セイヨウアブ
ラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、請求項４９もしくは請求項５
６の前記植物部分、請求項５７の前記種子、または請求項６６の前記植物、植物細胞、植
物部分、もしくは種子を用いて、産生されまたは得られる脂肪酸。
【請求項７２】
請求項５６、５７、または６６のいずれか１つの種子から得られる種子ミール。
【請求項７３】
１またはそれ以上の、請求項２９、もしくは５９から５１のいずれか１つの前記脂質も
しくはオイル、請求項６２の前記脂肪酸、請求項３０から３７のいずれか１つの前記遺伝
子コンストラクト、請求項３８の前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチド、請
求項３９もしくは請求項４０の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、請求項４１
から４６、もしくは５５のいずれか１つの前記細胞、請求項４７もしくは請求項４８の前
記トランスジェニック生物、請求項４９から５３のいずれか１つの前記油料種子植物、請
求項５４の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、
請求項４９もしくは請求項５６の前記植物部分、請求項５７の前記種子、請求項６６の前
記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、または請求項７２の前記種子ミールを含む
組成物。
【請求項７４】
１またはそれ以上の、請求項１から９、２９、もしくは５９のいずれか１つの前記脂質
もしくはオイル、請求項６２の前記脂肪酸、請求項３０から３７のいずれか１つの前記遺
伝子コンストラクト、請求項３８の前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチド、
請求項３９もしくは請求項４０の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、請求項４
１から４６、もしくは５５のいずれか１つの前記細胞、請求項４７もしくは請求項４８の
前記トランスジェニック生物、請求項４９から５３のいずれか１つの前記油料種子植物、
請求項５４の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物
、請求項４９もしくは請求項５６の前記植物部分、請求項５７の前記種子、請求項６６の
前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、請求項７２の前記種子ミール、または請
求項７３の組成物を含む家畜飼料、化粧品、または化学物質。
【請求項７５】
家畜飼料を産生する方法であって、
１またはそれ以上の、請求項１から９、２９、もしくは５９のいずれか１つの前記脂質
もしくはオイル、請求項６２の前記脂肪酸、請求項３０から３７のいずれか１つの前記遺
伝子コンストラクト、請求項３８の前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチド、
請求項３９もしくは請求項４０の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、請求項４
１から４６、もしくは５５のいずれか１つの前記細胞、請求項４７もしくは請求項４８の
前記トランスジェニック生物、請求項４９から５３のいずれか１つの前記油料種子植物、
請求項５４の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物
、請求項４９もしくは請求項５６の前記植物部分、請求項５７の前記種子、請求項６６の
前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、請求項７２の前記種子ミール、または請
求項７３の前記組成物を、少なくとも１つの他の食品原料成分と混合することを含む、方
法。
【請求項７６】
ＰＵＦＡから利益を得る、症状を治療または防止する方法であって、
対象に、１またはそれ以上の、請求項１から９、２９、もしくは５９のいずれか１つの
前記脂質もしくはオイル、請求項６２の前記脂肪酸、請求項３０から３７のいずれか１つ
の前記遺伝子コンストラクト、請求項３８の前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレ
オチド、請求項３９もしくは請求項４０の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、
請求項４１から４６、もしくは５５のいずれか１つの前記細胞、請求項４７もしくは請求
項４８の前記トランスジェニック生物、請求項４９から５３のいずれか１つの前記油料種
子植物、請求項５４の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサテ
ィバ植物、請求項４９もしくは請求項５６の前記植物部分、請求項５７の前記種子、請求
項６６の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、請求項７２の前記種子ミール、
請求項７３の前記組成物、または請求項７４の前記家畜飼料、を投与することを含む、方
法。
【請求項７７】
前記症状は、心不整脈、血管形成、炎症、喘息、乾せん、骨粗鬆症、腎結石、ＡＩＤＳ
、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、統合失調症、癌、胎児性アルコール症候群
、注意欠陥多動性障害、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、単極性うつ病、攻撃的な敵
意（aggressive hostility）、副腎白質ジストロフィー（adrenoleukodystophy）、冠動
脈心疾患、高血圧、糖尿病、肥満、アルツハイマー病、慢性閉塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎
、血管形成後の再狭窄、湿疹、血圧上昇、血小板凝集、消化管出血、子宮内膜症、月経前
症候群、筋痛性脳脊髄炎、ウイルス感染後の慢性疲労、または眼性疾患である、請求項７
６の方法。
【請求項７８】
ＰＵＦＡから利益を得る、症状を治療または防止するための薬剤の製造のために、１ま
たはそれ以上の、請求項１から９、２９、もしくは５９のいずれか１つの前記脂質もしく
はオイル、請求項６２の前記脂肪酸、請求項３０から３７のいずれか１つの前記遺伝子コ
ンストラクト、請求項３８の前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチド、請求項
３９もしくは請求項４０の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、請求項４１から
４６、もしくは５５のいずれか１つの前記細胞、請求項４７もしくは請求項４８の前記ト
ランスジェニック生物、請求項４９から５３のいずれか１つの前記油料種子植物、請求項
５４の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、請求
項４９もしくは請求項５６の前記植物部分、請求項５７の前記種子、請求項６６の前記植
物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、請求項７２の前記種子ミール、請求項７３の前
記組成物、または請求項７４の前記家畜飼料、の使用。
【請求項７９】
請求項５６、５７、または６６のいずれか１つの種子を得ることと、金銭的利益のため
に得られた前記種子を取引することとを含む、種子を取引する方法。
【請求項８０】
前記種子を得ることは、請求項４８から５４、または６６のいずれか１つの前記植物を
栽培すること、および／または前記植物から前記種子を収穫することを含む、請求項７９
の方法。
【請求項８１】
前記種子を得ることは、コンテナに前記種子を配置すること、および／または前記種子
を保存することをさらに含む、請求項８０の方法。
【請求項８２】
前記種子を得ることは、前記種子を異なる場所に運ぶことをさらに含む、請求項７９か
ら８１のいずれか１つの請求項の方法。
【請求項８３】
前記取引することは、コンピュータのような電子的手段を用いて行われる、請求項７９
から８２のいずれか１つの請求項の方法。
【請求項８４】
ａ）請求項５６、５７、または６６のいずれか１つに定義された種子を含む植物の地上
部分を刈り取り、並べ、および／または収穫することと、
ｂ）前記植物部分の残りから前記種子を分離するために、前記植物の前記一部を脱穀し
、および／または選り分けることと、
ｃ）工程ｂ）で分離された前記種子をふるいにかけおよび／またはソートすること、お
よび容器内に前記ふるいにかけられたおよび／またはソートされた種子をロードすること
により、種子の入った容器を産生することを含む、種子の入った容器を産生するプロセス
。
【請求項８５】
多価不飽和脂肪酸のエチルエステルを産生するためのプロセスであって、
抽出植物脂質におけるトリアシルグリセロールをエステル交換することを含み、前記抽
出植物脂質は、エステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸
、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、
およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに任意に１またはそれ以上のステアリドン酸
（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、および
エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前
記ＤＨＡのレベルが約７％から２０％であり、これにより前記エチルエステルを産生する
、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え植物細胞において、長鎖多価不飽和脂肪酸、特にドコサヘキサエン酸
を合成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オメガ３長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ‐ＰＵＦＡ）は、ヒトおよび動物の健康のために
重要な化合物として現在広く認識されている。これらの脂肪酸は、食事供給源から、また
はその両方がヒトの食事において必須脂肪酸であるとされる、リノール酸（ＬＡ，１８：
２ω６）もしくはα‐リノレン酸（ＡＬＡ，１８：３ω３）の脂肪酸の転換により得られ
るかもしれない。ヒトおよび多くの他の脊椎動物が植物源から得られたＬＡまたはＡＬＡ
をＣ２２に転換することができ、一方、それらは非常に低い割合でこの転換を行う。さら
に、最も現代的な社会では、理想であるとされるω６：ω３脂肪酸について４：１の比ま
たはそれ以下の代わりに、少なくとも９０％の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）がω６脂肪
酸である、アンバランスな食事をしている（非特許文献１）。ヒトについてのエイコサペ
ンタエン酸（ＥＰＡ，２０：５ω３）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ，２２：６ω３
）のようなＬＣ‐ＰＵＦＡの即時の食事供給源は、大部分は魚および魚油である。健康の
専門家は、よって、ヒトの食事に、有意なレベルのＬＣ‐ＰＵＦＡを含む魚を規則的に含
めることを薦めている。ますます、魚由来のＬＣ‐ＰＵＦＡオイルは、食品生産物、例え
ば、調整粉乳に組み込まれている。しかしながら、グローバルなおよび国際的な水産業の
低下に起因し、これらの有益な健康増進オイルの代替的なソースが必要とされる。
【０００３】
動物と対照的に、顕花植物は、１８の炭素よりも長い鎖の長さを有する多価不飽和脂肪
酸を合成する性能を欠く。特に、他の被子植物とともに作物および園芸作物は、ＡＬＡ由
来であるＥＰＡ、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ，２２：５ω３）、およびＤＨＡのような
より長い鎖のω３脂肪酸を合成するために必要とされる酵素を有していない。植物のバイ
オテクノロジーにおける重要なゴールは、よって、実質的な量のＬＣ‐ＰＵＦＡを産生し
、これによりこれらの化合物の代替的なソースを提供する作物植物のエンジニアリングで
ある。
【０００４】
ＬＣ‐ＰＵＦＡ生合成経路
微細藻類、蘚類、および真菌類のような、生物におけるＬＣ‐ＰＵＦＡの生合成は、通
常、一連の酸素依存的な不飽和化および鎖延長反応として生じる（図１）。これらの生物
において、ＥＰＡを産生する最も一般的な経路は、Δ６‐不飽和化、Δ６‐伸長およびΔ
５‐不飽和化（Δ６‐不飽和化経路と呼ばれる）を含み、一方、より一般的ではない経路
は、Δ９‐伸長、Δ８‐不飽和化、およびΔ５‐不飽和化（Δ９‐不飽和化経路とよばれ
る）を使用する。これらの連続的な不飽和化および鎖延長反応は、図１の左上に模式的に
示されるω６脂肪酸基質ＬＡ（ω６）または図１の右下に示されるＥＰＡにたどり着くω
３基質ＡＬＡ（ω３）のいずれかにより開始し得る。最初のΔ６‐不飽和化がω６基質Ｌ
Ａで行われる場合、一連の３つの酵素のＬＣ‐ＰＵＦＡ産生物は、ω６脂肪酸ＡＲＡであ
ろう。ＬＣ‐ＰＵＦＡ合成生物は、アラキドン酸（ＡＲＡ，２０：４ω６）のＥＰＡへの
転換について、図１にΔ１７‐デサチュラーゼ工程として示されるように、ω３‐デサチ
ュラーゼを用いて、ω６脂肪酸をω３脂肪酸に転換することとしてもよい。ω３‐デサチ
ュラーゼファミリーのいくつかのメンバーは、ＬＡからＡＲＡの範囲の種々の基質で作用
し得る。植物のω３‐デサチュラーゼはＬＡのＡＬＡへのΔ１５‐不飽和化を特異的に触
媒することが多く、一方、真菌および酵母のω３‐デサチュラーゼは、ＡＲＡのＥＰＡへ
のΔ１７‐不飽和化に特異的であることとしてもよい（非特許文献２、非特許文献３）。
いくつかの報告は、多種多様なω６基質をそれらの対応するω３産生品に転換し得る非特
異的なω３‐デサチュラーゼが存在することを示唆する（非特許文献４）。
【０００５】
これらの生物におけるＥＰＡのＤＨＡへの変換は、ＤＰＡを産生するためにＥＰＡのΔ
５‐伸長により生じ、その後、ＤＨＡを産生するためのΔ４‐不飽和化に続く（図１）。
対照的に、哺乳類は、Δ４‐デサチュラーゼとは独立した、３つの別個の反応により、Ｄ
ＰＡをＤＨＡに転換する、いわゆる「シュプレッヒャー（Sprecher）」経路を使用する（
非特許文献５）。
【０００６】
植物、蘚類、微細藻類、およびカエノラブディティスエレガンス（Caenorhabditis ele
gans）のような下等動物に概してみられるフロントエンドのデサチュラーゼは、ホスファ
チジルコリン（ＰＣ）基質のｓｎ‐２位置にエステル化された脂肪酸基質を主に受容する
。これらのデサチュラーゼは、よって、アシル‐ＰＣ、脂質‐結合フロントエンドデサチ
ュラーゼとして知られる（非特許文献６）。対照的に、高等動物のフロントエンドデサチ
ュラーゼは、概して、脂肪酸基質がＰＣよりもむしろＣｏＡに結合するアシル‐ＣｏＡ基
質を受容する（非特許文献７）。いくつかの微細藻類デサチュラーゼおよび１つの植物デ
サチュラーゼは、ＣｏＡへとエステル化される脂肪酸基質を使用することが知られる（表
２）。
【０００７】
各ＰＵＦＡ鎖延長反応は、多成分性のタンパク質複合体により触媒される４つの工程か
らなり、まず、縮合反応が、マロニル‐ＣｏＡから脂肪酸に２Ｃユニットの追加をもたら
し、β‐ケトアシル中間物の形成をもたらす。次に、これがＮＡＤＰＨにより還元され、
その後エノイル中間物を産生するための脱水へと続いた。この中間物は、最後に、伸長さ
れた脂肪酸を産生するために２回目の還元がなされた。概して、これらの４つの反応の濃
縮工程は基質特異的であり、一方、他の工程はそうではないことが考えられる。実施にお
いては、このことは、天然の植物の伸長機構は、ＰＵＦＡに特異的な濃縮酵素（概して「
エロンガーゼ（elongase）」と呼ばれる）が導入されることを提供するＰＵＦＡを伸長す
ることができるが、非天然ＰＵＦＡ基質を伸長することにおける、天然の植物伸長機構の
効率は、低いかもしれないことを意味する。２００７年に、酵母の伸長サイクルデヒドラ
ターゼの同定および特徴づけが公開された（非特許文献８）。
【０００８】
植物、蘚類、および微細藻類におけるＰＵＦＡ不飽和化は、アシル‐ＰＣプールにおけ
る脂肪酸基質に対して主に天然に生じ、一方、伸長は、アシル‐ＣｏＡプールにおける基
質に対して生じる。アシル‐ＰＣ分子からＣｏＡ担体への脂肪酸の転移は、ホスホリパー
ゼ（ＰＬＡ）により行われ、一方、アシル‐ＣｏＡ脂肪酸からＰＣ担体への転移は、リゾ
ホスファチジル‐コリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）により行われる（図２
１）（非特許文献９）。
【０００９】
ＬＣ‐ＰＵＦＡの工学的産生
ほとんどのＬＣ‐ＰＵＦＡ代謝工学は、有酸素性のΔ６‐不飽和化／伸長経路を用いて
行われてきた。タバコにおけるγ‐リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３ω６）の生合成が、シ
アノバクテリウムシネコシスティス由来のΔ６‐デサチュラーゼを用いて、１９９６年に
最初に報告された（非特許文献１０）。より近年では、ＧＬＡがベニバナ（種子オイルに
おける７３％ＧＬＡ；非特許文献１１）およびダイズ（２８％ＧＬＡ；非特許文献１２）
のような作物植物において産生された。ＥＰＡおよびＤＨＡのようなＬＣ‐ＰＵＦＡの産
生は、増加した数の不飽和化および関連する伸長工程に起因する、より複雑な工学を伴う
。陸上植物におけるＥＰＡの産生は、イソクリシスガルバナ（Isochrysis galbana）由来
のΔ９‐エロンガーゼ、ユーグレナグラシリス由来のΔ８‐デサチュラーゼ、およびモル
ティエレラアルピナ由来のΔ５‐デサチュラーゼをコードする遺伝子をアラビドプシスに
導入し、３％までのＥＰＡを産生した非特許文献１３により最初に報告された。この研究
は、ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）由来のΔ６‐デサチュラーゼおよびΔ
６‐エロンガーゼ、並びにフェオダクチラム（Phaeodactylum tricornutum）由来のΔ５
‐デサチュラーゼをコードする遺伝子を用いる亜麻の種子において、０．８％までのＥＰ
Ａの産生を報告した非特許文献１４により続けられた。
【００１０】
ＤＨＡ産生の最初の報告、および報告された最も高いレベルのＶＬＣ‐ＰＵＦＡ産生を
示すのが、種子ではなく、魚類の内臓真菌症菌（Saprolegnia diclina）のΔ６‐デサチ
ュラーゼ、モルティエレラアルピナのΔ６‐デサチュラーゼ、モルティエレラアルピナの
Δ５‐デサチュラーゼ、魚類の内臓真菌症菌のΔ４‐デサチュラーゼ、魚類の内臓真菌症
菌のΔ１７‐デサチュラーゼ、モルティエレラアルピナのΔ６‐エロンガーゼおよびパブ
ロバルセリ（Pavlova lutheri）のΔ５‐エロンガーゼをコードする遺伝子を導入するこ
とにより、ダイズ胚における３％ＤＨＡの産生が記載される、特許文献１であった。また
、ＤＨＡをも産生する胚における最大のＥＰＡのレベルは、ＥＰＡのＤＨＡへの転換の効
率が乏しいことを示す、１９．６％であった（特許文献２）。この発見は、非特許文献１
５により公開されたものと同様であり、ＥＰＡからＤＨＡへの流動は低く、ゼブラフィッ
シュΔ５／６‐デサチュラーゼ、カエノラブディティスエレガンス（Caenorhabditis ele
gans）Δ６‐エロンガーゼ、並びにパブロバサリナ（Pavlova salina）Δ５‐エロンガー
ゼおよびΔ４‐デサチュラーゼを用いるアラビドプシスにおいて３％ＥＰＡおよび０．５
％ＤＨＡの産生であった。また、２００５年には、Wu et al.が、ピティウムイレギュラ
レ（Pythium irregulare）のΔ６‐デサチュラーゼ、スラウストキトリッド（Thraustoch
ytrid）のΔ５‐デサチュラーゼ、ヒメツリガネゴケのΔ６‐エロンガーゼ、キンセンカ
（Calendula officianalis）のΔ１２‐デサチュラーゼ、スラウストキトリッドのΔ５‐
エロンガーゼ、フィトフトラインフェスタンス（Phytophthora infestans）のΔ１７‐デ
サチュラーゼ、ニジマス（Oncorhyncus mykiss）のＬＣ‐ＰＵＦＡエロンガーゼ、スラウ
ストキトリッドのΔ４‐デサチュラーゼ、およびスラウストキトリッドＬＰＣＡＴを用い
て、セイヨウカラシナにおける２５％ＡＲＡ、１５％ＥＰＡ、および１．５％ＤＨＡの産
生を公開した（非特許文献１６）。ω３ＬＣ‐ＰＵＦＡを合成する油料種子作物を産生す
るための試みの概要は、非特許文献１７および非特許文献１８で提供される。非特許文献
１８により示されるように、トランスジェニック植物においてＤＨＡの産生について示す
ための得られた結果は、魚油においてみられるレベルに近いものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第０４／０１７４６７号
【特許文献２】国際公開第２００４／０７１４６７号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Trautwein, 2001
【非特許文献２】Pereira et al., 2004a
【非特許文献３】Zank et al., 2005
【非特許文献４】Zhang et al., 2008
【非特許文献５】Sprecher et al., 1995
【非特許文献６】Domergue et al. , 2003
【非特許文献７】Domergue et al., 2005
【非特許文献８】Denic and Weissman, 2007
【非特許文献９】Singh et al. , 2005
【非特許文献１０】Reddy and Thomas, 1996
【非特許文献１１】Knauf et al., 2006
【非特許文献１２】Sato et al., 2004
【非特許文献１３】Qi et al. (2004)
【非特許文献１４】Abbadi et al. (2004)
【非特許文献１５】Robert et al. (2005)
【非特許文献１６】Wu et al., 2005
【非特許文献１７】Venegas-Caleron et al. (2010)
【非特許文献１８】Ruiz-Lopez et al. (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、遺伝子組換え細胞におけるＬＣ‐ＰＵＦＡの、特に、油料種子植物の種子にお
けるＤＨＡのより効率的な産生の必要性が残る。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、高いレベルのＤＨＡを有する脂質を産生するために特定された方法および
植物を有する。
【００１５】
第１の態様において、本発明は、エステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイ
ン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）
を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに、任意にステアリドン
酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およ
びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）の１またはそれ以上を含み、前記抽出脂質の総脂肪酸
含有量における前記ＤＨＡのレベルは、約７％から２０％である、抽出植物脂質を提供す
る。
【００１６】
一実施形態においては、前記抽出脂質は、以下の特徴：
ｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルは、約２％
から１８％の間、または約２％から１６％の間、または約２％から１５％の間であり、
ｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）の
レベルは、約６％未満、または約３％未満、または約２％未満、または約１％未満である
、
ｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルは、約１
％から約３０％の間、約３％から約３０％の間、約６％から約３０％の間、１％から約２
０％の間、約３０％から約６０％の間、約４５％から約６０％、または約３０％である、
ｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸（ＬＡ）のレベルは
、約４％から約３５％の間、約４％から約２０％の間、または約４％から１７％の間であ
る、
ｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸（ＡＬＡ）のレベ
ルは、約４％から約４０％の間、約７％から約４０％の間、約１０％から約３５％の間、
約２０％から約３５％の間、約４％から１６％の間、または約２％から１６％の間である
、
ｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記γ‐リノレン酸（ＧＬＡ）のレ
ベルは、４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、０．０５％
から約７％の間、０．０５％から約４％の間、０．０５％から約３％の間、または０．０
５％から約２％の間である、
ｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ステアリドン酸（ＳＤＡ）の
レベルは、約７％未満、約６％未満、約４％未満、約３％未満、約０．０５％から約７％
の間、約０．０５％から約６％の間、約０．０５％から約４％の間、約０．０５％から約
３％の間、または０．０５％から約２％の間である、
ｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサテトラエン酸（Ｅ
ＴＡ）のレベルは、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約１％未満、約０．５％未満
、約０．０５％から約６％の間、約０．０５％から約５％の間、約０．０５％から約４％
の間、約０．０５％から約３％の間、または約０．０５％から約２％の間である、
ｉｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ
）のレベルは、約４％未満、約２％未満、約１％未満、約０．０５％から約４％の間、約
０．０５％から約３％の間、または約０．０５％から約２％の間、または約０．０５％か
ら約１％の間である、
ｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）
のレベルは、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約０．０５％から約１０％の間、約
０．０５％から約５％の間、約０．０５％から約３％の間、または約０．０５％から約２
％の間である、
ｘｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）
のレベルは、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約０．０５％から約８％の間、約０
．０５％から約５％の間、または約０．０５％から約３％の間、または約０．０５％から
約２％の間である、
ｘｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、約８％、
約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約
１７％、約１８％、約８％から２０％の間、約１０％から２０％の間、約１１％から２０
％の間、約１０％から約１６％の間、または約１４％から２０％の間である、
ｘｉｉｉ）前記脂質は、その脂肪酸含有量にω６‐ドコサぺンタエン酸（２２：５Δ４
，７，１０，１３，１６）を含む、
ｘｉｖ）前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ω６‐ドコサぺンタエン酸（２２：５Δ４
，７，１０，１３，１６）を実質的に含まない、
ｘｖ）前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ＳＤＡ、ＥＰＡ、およびＥＴＡを実質的に含
まない、
ｘｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、約４％
から約２５％の間、約４％から約２０％の間、約６％から約２０％の間、約４％から約６
０％の間、約３０％から約６０％の間、または約４５％から約６０％の間である、
ｘｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベルは
、約４％から約３５％の間、約８％から約２５％の間、または８％から約２２％の間であ
る、
ｘｖｉｉｉ）記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベルは
、約２０％から約７５％の間、約５０％から約７５％の間、または約６０％から約７５％
の間である、
ｘｉｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸のレベルは、約３５
％から約５０％の間、約２０％から約３５％の間、約６％から約２０％の間、約２０％未
満、約１６％未満、約１０％未満、約１％から約１６％の間、約２％から約１０％の間、
または約４％から約１０％の間である、
ｘｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸のレベルは、約１０％
未満、約８％未満、約６％未満、４％未満、約１％から約２０％の間、約１％から約１０
％の間、約０．５％から約８％の間、または約０．５％から４％の間である、
ｘｘｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸のレベルは、３６％
から約６５％の間、約４０％から約６０％の間、約２０％から約３５％の間、約１０％か
ら約２０％の間、約２５％、約３０％、約３５％、または約４０％である、
ｘｘｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω３脂肪酸のレベルは、約９
％から約３３％の間、約１０％から約２０％の間、約２０％から約３０％の間、約１２％
から約２５％の間、約１３％、約１５％、約１７％、または約２０％である、
ｘｘｉｉｉ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸
の比は、約１．０から約３．０の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．５の間
、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満
、約１．０、約０．１、または約０．２である、
ｘｘｉｖ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の
比は、約１．０から約３．０の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．５の間、
約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満、
約０．１、約０．２、または約１．０である、
ｘｘｖ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少
なくとも約８０％、約６０％から約９８％の間、約７０％から約９５％の間、または約７
５％から約９０％の間の、Δ１２‐デサチュラーゼによる、オレイン酸のＬＡへの転換の
効率に基づく、
ｘｘｖｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、
少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約３０％から約７０％
の間、約３５％から約６０％の間、または約５０％から約７０％の間の、Δ６‐デサチュ
ラーゼによる、ＡＬＡのＳＤＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｖｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％
、少なくとも約７５％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約８８％の間、または
約７５％から約８５％の間の、Δ６‐エロンガーゼによる、ＳＤＡのＥＴＡ酸への転換の
効率に基づく、
ｘｘｖｉｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０
％、少なくとも約７５％、約６０％から約９９％の間、約７０％から約９９％の間、また
は約７５％から約９８％の間の、Δ５‐デサチュラーゼによる、ＥＴＡのＥＰＡへの転換
の効率に基づく、
ｘｘｉｘ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、
少なくとも約９０％、約５０％から約９５％の間、または約８５％から約９５％の間の、
Δ５‐エロンガーゼによる、ＥＰＡのＤＰＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｘ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少
なくとも約９３％、約５０％から約９５％の間、約８０％から約９５％の間、または約８
５％から約９５％の間の、Δ４‐デサチュラーゼによる、ＤＰＡのＤＨＡへの転換の効率
に基づく、
ｘｘｘｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、
少なくとも約２０％、約１０％から約５０％の間、約１０％から約３０％の間、または約
１０％から約２５％の間の、オレイン酸のＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｘｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％
、少なくとも約２２％、少なくとも約２５％、約１５％から約５０％の間、約２０％から
約４０％の間、または約２０％から約３０％の間の、ＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づ
く、
ｘｘｘｉｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１７％、少なくとも約２２
％、少なくとも約２４％、約１７％から約５５％の間、約２２％から約３５％の間、また
は約２４％から約３５％の間のＡＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｘｉｖ）前記抽出脂質における前記総脂肪酸は、Ｃ２０：１を１％未満有する、
ｘｘｘｖ）前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は、少なくとも約
７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、約７０％から約
９９％の間、または約９０％から約９９％の間であり、
ｘｘｘｖｉ）前記脂質は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含む、
ｘｘｘｖｉｉ）前記脂質は、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、または約０．０
０１％から約５％の間の、遊離（非エステル化）脂肪酸および／もしくはリン脂質を含み
、または、これらを実質的に含まない、
ｘｘｘｖｉｉｉ）ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＨＡの少なくとも７０％または少
なくとも８０％が、前記ＴＡＧのｓｎ‐１またはｓｎ‐３の位置にある、
ｘｘｘｉｘ）前記脂質において最も豊富なＤＨＡ含有ＴＡＧの種は、ＤＨＡ／１８：３
／１８：３（ＴＡＧ５８：１２）である、
ｘｌ）前記脂質は、トリ‐ＤＨＡ  ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む、
の１もしくはそれ以上、または全てを有する。
【００１７】
別の実施形態では、前記抽出脂質は、オイルの形態であって、該オイルの重量の少なく
とも約９０％、または少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または約９５％から約
９８％の間が前記脂質である。
【００１８】
好ましい実施形態では、前記脂質またはオイル、好ましくは、種子オイルは、以下の特
徴を有する：前記脂質またはオイルにおける前記総脂肪酸含有量において、前記ＤＨＡの
レベルは約７％から２０％の間であり、前記パルミチン酸のレベルは約２％から約１６％
の間であり、前記ミリスチン酸のレベルは６％未満であり、前記オレイン酸のレベルは約
１％から約３０％の間であり、前記ＬＡのレベルは約４％から約３５％の間であり、ＡＬ
Ａが存在し、ＧＬＡが存在し、前記ＳＤＡのレベルは約０．０５％から約７％の間であり
、前記ＥＴＡのレベルは約４％未満であり、前記ＥＰＡのレベルは約０．０５％から約１
０％の間であり、前記ＤＰＡのレベルは約０．０５％から約８％の間であり、前記抽出脂
質の前記総脂肪酸含有量における前記総飽和脂肪酸のレベルは約４％から約２５％の間で
あり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総一価不飽和脂肪酸のレベルは約
４％から約３５％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総多価不
飽和脂肪酸のレベルは約２０％から約７５％の間であり、前記抽出脂質の前記脂肪酸含有
量における、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、約０．０５から約３．０の間であり、
前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は約０．０
３から約３．０の間、好ましくは約０．５０未満であり、前記脂質の前記脂肪酸組成は、
少なくとも約６０％のΔ１２‐デサチュラーゼによるオレイン酸のＬＡへの転換の効率、
少なくとも約６０％のΔ６‐エロンガーゼによるＳＤＡのＥＴＡ酸への転換の効率、約５
０％から約９５％の間のΔ５‐エロンガーゼによるＥＰＡのＤＰＡへの転換の効率、約５
０％から約９５％の間Δ４‐デサチュラーゼによるＤＰＡのＤＨＡへの転換の効率、少な
くとも約１０％のオレイン酸のＤＨＡへの転換の効率に基づき、および前記脂質の前記ト
リアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は少なくとも約７０％であり、並びに、任意に、
前記脂質は、コレステロールを実質的に含まないおよび／または前記脂質がトリ‐ＤＨＡ
ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む。
【００１９】
より好ましい実施形態では、前記脂質またはオイル、好ましくは、種子オイルは、以下
の特徴を有する：前記脂質における前記総脂肪酸含有量において、前記ＤＨＡのレベルは
約７％から２０％の間であり、前記パルミチン酸のレベルは約２％から約１６％の間であ
り、前記ミリスチン酸のレベルは２％未満であり、前記オレイン酸のレベルは約１％から
約３０％の間であり、前記ＬＡのレベルは約４％から約３５％の間であり、前記ＡＬＡの
レベルは約７％から約４０％の間であり、前記ＧＬＡのレベルは約４％未満であり、前記
ＳＤＡのレベルは約０．０５％から約７％の間であり、前記ＥＴＡのレベルは約４％未満
であり、前記ＥＴｒＡのレベルは約０．０５％から約４％の間であり、前記ＥＰＡのレベ
ルは約０．０５％から約１０％の間であり、前記ＤＰＡのレベルは約０．０５％から約８
％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総飽和脂肪酸のレベルは
約４％から約２５％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総一価
不飽和脂肪酸のレベルは約４％から約３５％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含
有量における前記総多価不飽和脂肪酸のレベルは約２０％から約７５％の間であり、前記
抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω６脂肪酸のレベルは０．５％から約１０
％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸のレベルは３６
％から約７５％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω３脂肪
酸のレベルは約９％から約３３％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけ
る、ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、約０．０５から約３．０の間であり、前記抽出脂
質の前記脂肪酸含有量における、新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は約０．０３から約３
．０の間であり、前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約６０％のΔ１２‐デサチュ
ラーゼによるオレイン酸のＬＡへの転換の効率、少なくとも約６０％のΔ６‐エロンガー
ゼによるＳＤＡのＥＴＡ酸への転換の効率、少なくとも約６０％のΔ５‐デサチュラーゼ
によるＥＴＡのＥＰＡへの転換の効率、約５０％から約９５％の間のΔ５‐エロンガーゼ
によるＥＰＡのＤＰＡへの転換の効率、約５０％から約９５％の間Δ４‐デサチュラーゼ
によるＤＰＡのＤＨＡへの転換の効率、少なくとも約１０％のオレイン酸のＤＨＡへの転
換の効率、少なくとも約１５％のＬＡのＤＨＡへの転換の効率、少なくとも約１７％のＡ
ＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づき、並びに、前記抽出脂質における前記脂肪酸含有量
が１％未満のＣ２０：１であり、前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有
量は少なくとも約７０％であり、前記脂質はコレステロールを実質的に含まず、および前
記脂質はトリ‐ＤＨＡ  ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む。好ましくは、前記脂質もし
くはオイルはキャノーラオイルであり、および／または前記植物または植物部分から抽出
された後に、エステル交換反応プロセスにより処理されない。好ましい実施形態において
、前記脂質またはキャノーラオイルは、メチルまたはエチルエステルのようなアルキルエ
ステルへと前記オイルにおける前記脂肪酸を転換するためにその後に処理されることとし
てもよい。さらなる処理が、ＤＨＡについての前記脂質またはオイルを濃縮するために適
用されることとしてもよい。
【００２０】
一実施形態では、前記脂質またはオイル、好ましくは種子オイルは、以下の特徴を有す
る：前記脂質の前記総脂肪酸含有量において、前記ＤＨＡのレベルは約７％から２０％の
間であり、前記パルミチン酸のレベルは約２％から約１６％の間であり、前記ミリスチン
酸のレベルは２％未満であり、前記オレイン酸のレベルは約３０％から約６０％の間、好
ましくは約４５％から約６０％の間であり、前記ＬＡのレベルは約４％から約２０％の間
であり、前記ＡＬＡのレベルは約２％から約１６％の間であり、前記ＧＬＡのレベルは約
３％未満であり、前記ＳＤＡのレベルは約３％未満であり、前記ＥＴＡのレベルは約４％
未満であり、前記ＥＴｒＡのレベルは約２％未満であり、前記ＥＰＡのレベルは約４％未
満であり、前記ＤＰＡのレベルは約４％未満であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量
における前記総飽和脂肪酸のレベルは約４％から約２５％の間であり、前記抽出脂質の前
記総脂肪酸含有量における前記総一価不飽和脂肪酸のレベルは約３０％から約６０％の間
、または約４０％から約６０％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における
前記総多価不飽和脂肪酸のレベルは約２０％から約７５％の間であり、前記抽出脂質の前
記総脂肪酸含有量における前記新ω６脂肪酸のレベルは約０．５％から約１０％の間であ
り、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸のレベルは約１０％から約
２０％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω３脂肪酸のレベ
ルは約９％から約２０％の間であり、前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω６
脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、約０．０５から約３．０の間、好ましくは約０．５０未満
であり、前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は
約０．０３から約３．０の間であり、前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）
含有量は少なくとも約７０％であり、前記脂質はコレステロールを実質的に含まず、およ
び前記脂質はトリ‐ＤＨＡ  ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む。好ましくは、前記脂質
またはオイルは、ＳＤＡ、ＥＰＡ、およびＥＴＡを実質的に含まず、および／またはキャ
ノーラオイルであり、および／または前記植物または植物部分から抽出された後に、エス
テル交換反応プロセスにより処理されない。特定の実施形態では、前記脂質またはキャノ
ーラオイルは、メチルまたはエチルエステルのようなアルキルエステルへと前記オイルに
おける前記脂肪酸を転換するためにその後に処理されることとしてもよい。さらなる処理
が、ＤＨＡについての前記脂質またはオイルを濃縮するために適用されることとしてもよ
い。
【００２１】
さらに好ましい実施形態では、前記脂質またはオイル、好ましくは種子オイルは、以下
の特徴を有する：前記脂質またはオイルの前記総脂肪酸含有量において、前記ＤＨＡのレ
ベルは約７％から２０％の間であり、前記パルミチン酸のレベルは約２％から約１６％の
間であり、前記ミリスチン酸のレベルは６％未満であり、前記オレイン酸のレベルは約１
％から約３０％の間であり、前記ＬＡのレベルは約４％から約３５％の間であり、ＡＬＡ
が存在し、ＧＬＡが存在し、前記ＳＤＡのレベルは約０．０５％から約７％の間であり、
前記ＥＴＡのレベルは約６％未満であり、前記ＥＰＡのレベルは約０．０５％から約１０
％の間であり、前記ＤＰＡのレベルは約０．０５％から約８％の間である。
【００２２】
さらなる実施形態では、前記抽出脂質は、１またはそれ以上のステロール、好ましくは
植物ステロールをさらに含む。
【００２３】
別の実施形態では、前記抽出脂質はオイルの形態であって、約１０ｍｇのステロール／
ｇのオイル未満、約７ｍｇのステロール／ｇのオイル未満、約１．５ｍｇから約１０ｍｇ
の間のステロール／ｇのオイル、または約１．５ｍｇから約７ｍｇの間のステロール／ｇ
のオイルを含む。
【００２４】
前記抽出脂質内にあり得るステロールの例は、カンペステロール／２４‐メチルコレス
テロール、Δ５‐スチグマステロール、エブリコール（eburicol）、β‐シトステロール
／２４‐エチルコレステロール、Δ５‐アベナステロール（avenasterol）／イソフコス
テロール、Δ７‐スチグマステロール／スティグマスト（stigmast）‐７‐エン‐３β‐
オール、およびΔ７‐アベナステロールの１もしくはそれ以上、または全てを含むが、必
ずしもこれらに限定されない。
【００２５】
一実施形態では、前記植物種は、キャノーラのような、表２６に挙げられたものであり
、前記ステロールのレベルは、その特定の植物種について表２６で挙げられたものとほぼ
同じである。
【００２６】
一実施形態では、前記抽出脂質は、約０．５ｍｇのコレステロール／ｇのオイル未満、
約０．２５ｍｇのコレステロール／ｇのオイル未満、約０ｍｇから約０．５ｍｇの間のコ
レステロール／ｇのオイル、もしくは約０ｍｇから約０．２５ｍｇの間のコレステロール
／ｇのオイルを含む、またはコレステロールを実質的に含まない。
【００２７】
さらなる実施形態では、前記脂質はオイルであり、好ましくは、油料種子由来のオイル
である。このようなオイルの例は、キャノーラオイルのようなアブラナ属種オイル、ワタ
オイル、アマオイル、ヒマワリ属種オイル、ベニバナオイル、ダイズオイル、トウモロコ
シオイル、シロイヌナズナオイル、モロコシオイル、ソルガムブルガレ（Sorghum vulgar
e）オイル、エンバクオイル、トリフォリウム属種オイル、エラエイスグイネエヌシス（E
laesis guineenis）オイル、ベンサミアナタバコオイル、オオムギオイル、ルピナスアン
グスティフォリウス（Lupinus angustifolius）オイル、イネオイル、アフリカイネオイ
ル、カメリナサティバ（Camelina sativa）オイル、クランベアビシニカ（Crambe abyssi
nica）オイル、ミスカンサスｘギガンティウスオイル（Miscanthus x giganteus）、また
はススキオイルを含むが、これらに限定されない。
【００２８】
エステル化形態で脂肪酸を含む、抽出植物脂質、好ましくは抽出されたキャノーラ種子
オイルもまた提供され、前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）
を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエ
ン酸（ＤＨＡ）、並びに任意に１またはそれ以上のステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサ
ペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸
（ＥＴＡ）を含み、前記脂質の前記総脂肪酸含有量において、脂質は以下の特徴を有する
：
ｉ）前記ＤＨＡのレベルが、約３％、約４％、約５％、約６％、または約７％であり、
ｉｉ）前記パルミチン酸のレベルが、約２％から約１６％の間であり、
ｉｉｉ）前記ミリスチン酸のレベルが、約２％未満であり、
ｉｖ）前記オレイン酸のレベルが、約３０％から約６０％の間、好ましくは約４５％か
ら約６０％の間であり、
ｖ）前記ＬＡのレベルが、約４％から約２０％の間であり、
ｖｉ）前記ＡＬＡのレベルが、約２％から約１６％の間であり、
ｖｉｉ）前記ＧＬＡのレベルが、約４％未満であり、
ｖｉｉｉ）前記ＳＤＡのレベルが、約６％未満、または約４％未満であり、
ｉｘ）前記ＥＴＡのレベルが、約６％未満、または約４％未満であり、
ｘ）前記ＥＴｒＡのレベルが、約１％未満であり、
ｘｉ）前記ＥＰＡのレベルが、約１０％未満であり、および／または前記ＥＰＡのレベ
ルが、前記ＤＨＡのレベルの０．５から２．０倍であり、
ｘｉｉ）前記ＤＰＡのレベルが、約４％未満であり、
ｘｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総飽和脂肪酸のレベルが、
約４％から約２５％の間であり、
ｘｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総一価不飽和脂肪酸のレベル
が、約３０％から約７０％の間であり、
ｘｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総多価不飽和脂肪酸のレベルが
、約１５％から約７５％の間、好ましくは約１５％から約３０％の間であり、
ｘｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω６脂肪酸のレベルが、約
０．５％から約１０％の間であり、
ｘｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総ω３脂肪酸のレベルが、
約１０％から約２０％の間であり、
ｘｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω３脂肪酸のレベルが
、約３％から約２０％の間であり、
ｘｉｘ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は
、約０．０５から約３．０の間、好ましくは約０．５０未満であり、
ｘｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は
、約０．０３から約３．０の間であり、
ｘｘｉ）前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は、少なくとも約７
０％であり、および
ｘｘｉｉ）前記脂質は、コレステロールを実質的に含まない。一実施形態では、前記脂
質は、トリ‐ＤＨＡ  ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む。より好ましくは、前記脂質は
、ＳＤＡおよびＥＴＡを実質的に含まず、および／または前記植物または植物部分から抽
出された後に、エステル交換反応プロセスにより処理されない。
【００２９】
別の態様では、エステル化形態で脂肪酸を含む、抽出植物脂質が提供され、前記脂肪酸
は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸
（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに１またはそ
れ以上のステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエ
ン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、（ｉ）前記抽出脂質の
前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルが７％から２０％の間であり、（ｉｉ）
前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルが２％から１６％
の間であり、（ｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（
Ｃ１４：０）のレベルが６％未満であり、（ｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量に
おける前記オレイン酸のレベルが、１％から３０％の間、好ましくは３０％から６０％の
間であり、（ｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸（ＬＡ）の
レベルが４％から３５％の間であり、（ｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけ
るαリノレン酸（ＡＬＡ）のレベルが４％から４０％の間であり、（ｖｉｉ）前記抽出脂
質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）のレベルが４％未
満であり、（ｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総飽和脂肪酸の
レベルが４％から２５％の間であり、（ｉｘ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における
総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比が、１．０から３．０の間、または０．１から１の間で
あり、（ｘ）前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は少なくとも７０
％であり、および（ｘｉ）ＴＡＧの形態においてエステル化されたＤＨＡの少なくとも７
０％が、前記ＴＡＧのｓｎ‐１またはｓｎ‐３位置にある。一実施形態では、１もしくは
それ以上のまたは全ての以下の特徴を有する：
ｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルが約２％か
ら約１５％の間である、
ｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）の
レベルが１％未満である、
ｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルが、約３
％から約３０％の間、約６％から約３０％の間、１％から約２０％の間、約４５％から約
６０％の間、または約３０％である、
ｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸（ＬＡ）のレベルが
、約４％から約２０％の間、または約４％から１７％の間である、
ｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸（ＡＬＡ）のレベ
ルが、約７％から約４０％の間、約１０％から約３５％の間、約２０％から約３５％の間
、または約４％から約１６％の間である、
ｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記γ‐リノレン酸（ＧＬＡ）のレ
ベルが、４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、０．０５％
から７％の間、０．０５％から４％の間、または０．０５％から約３％の間、または０．
０５％から約２％の間である、
ｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ステアリドン酸（ＳＤＡ）の
レベルが、約４％未満、約３％未満、約０．０５％から約７％の間、約０．０５％から約
４％の間、約０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間である、
ｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサテトラエン酸（Ｅ
ＴＡ）のレベルが、約４％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．０５％から約５％
の間、約０．０５％から約４％の間、約０．０５％から約３％の間、または約０．０５％
から約２％の間である、
ｉｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ
）のレベルが、約２％未満、約１％未満、０．０５％から４％の間、０．０５％から３％
の間、または０．０５％から約２％の間、または０．０５％から約１％の間である、
ｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）
のレベルが、４％未満、約３％未満、約２％未満、０．０５％から１０％の間、０．０５
％から５％の間、または０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間で
ある、
ｘｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）
のレベルが、４％未満、約３％未満、約２％未満、０．０５％から８％の間、０．０５％
から５％の間、または０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間であ
る、
ｘｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルが、約８％、
約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約
１７％、約１８％，約８％から２０％の間、約１０％から２０％の間、約１１％から２０
％の間、約１０％から約１６％の間、または約１４％から２０％の間である、
ｘｉｉｉ）前記脂質は、その脂肪酸含有量にω６‐ドコサぺンタエン酸（２２：５Δ４
，７，１０，１３，１６）を含む、
ｘｉｖ）前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ω６‐ドコサぺンタエン酸（２２：５Δ４
，７，１０，１３，１６）を実質的に含まない、
ｘｖ）前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ＳＤＡ、ＥＰＡ、およびＥＴＡを実質的に含
まない、
ｘｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、約４％
から約２０％の間、または約６％から約２０％の間である、
ｘｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベルは
、約４％から約３５％の間、約８％から約２５％の間、または８％から約２２％の間であ
る、
ｘｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベル
は、約２０％から約７５％の間、約５０％から約７５％の間、または約６０％から約７５
％の間である、
ｘｉｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸のレベルは、約３５
％から約５０％の間、約２０％から約３５％の間、約６％から２０％の間、２０％未満、
約１６％未満、約１０％未満、約１％から約１６％の間、約２％から約１０％の間、また
は約４％から約１０％の間である、
ｘｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸のレベルは、約１０％
未満、約８％未満、約６％未満、４％未満、約１％から約２０％の間、約１％から約１０
％の間、約０．５％から約８％の間、または約０．５％から４％の間である、
ｘｘｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸のレベルは、３６％
から約６５％の間、４０％から約６０％の間、約２０％から約３５％の間、約１０％から
約２０％の間、約２５％、約３０％、約３５％、または約４０％である、
ｘｘｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω３脂肪酸のレベルは、９％
から約３３％の間、約１０％から約２０％の間、約２０％から約３０％の間、約１２％か
ら約２５％の間、約１３％、約１５％、約１７％、または約２０％である、
ｘｘｉｉｉ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸
の比は、約０．１から約０．５の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満
、約０．２０未満、約０．１５未満、約１．０、約０．１、または約０．２である、
ｘｘｉｖ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の
比は、約１．０から約３．０の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．５の間、
約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満、
約０．１、約０．２、または約１．０である、
ｘｘｖ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少
なくとも約２０％、約１０％から約５０％の間、約１０％から約３０％の間、または約１
０％から約２５％の間の、オレイン酸のＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｖｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、
少なくとも約２２％、少なくとも約２５％、約１５％から約５０％の間、約２０％から約
４０％の間、または約２０％から約３０％の間の、ＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく
、
ｘｘｖｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％
、少なくとも約２４％、約１７％から約５５％の間、約２２％から約３５％の間、または
約２４％から約３５％の間のＡＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｖｉｉｉ）前記抽出脂質における前記総脂肪酸は、Ｃ２０：１を１％未満有する、
ｘｘｉｘ）前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は、少なくとも約
８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、約７０％から約９９％の間、または約
９０％から約９９％の間である、
ｘｘｘ）前記脂質は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含む、
ｘｘｘｉ）前記脂質は、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．００１％から
約５％の間の、遊離（非エステル化）脂肪酸および／もしくはリン脂質を含み、または、
これらを実質的に含まない、
ｘｘｘｉｉ）ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＨＡの少なくとも８０％が、ＴＡＧの
ｓｎ‐１またはｓｎ‐３の位置にある、
ｘｘｘｉｉｉ）前記脂質において最も豊富なＤＨＡ含有ＴＡＧの種は、ＤＨＡ／１８：
３／１８：３（ＴＡＧ５８：１２）である、および
ｘｘｘｉｖ）前記脂質は、トリ‐ＤＨＡ  ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む。
【００３０】
特に上記態様に関し、一実施形態では、
ｉ）前記脂質がオイルの形態であり、該オイルが、カンペステロール、Δ５‐スチグマ
ステロール、エブリコール、β‐シトステロール、Δ５‐アベナステロール、Δ７‐スチ
グマステロールおよび、Δ７‐アベナステロールの１もしくはそれ以上のまたは全てのよ
うな、１もしくはそれ以上のステロールを含み、および、任意に、前記オイルは１０ｍｇ
未満のステロール／ｇのオイルを含む、および／もしくは前記オイルはコレステロールを
実質的に含まず、並びに／または、
ｉｉ）前記脂質は、油料種子がアブラナ属種子の油料種子またはキャノーラ種子である
ような、油料種子由来のオイルの形態である。
【００３１】
別の態様では、本発明は、
ｉ）脂質を含む植物部分を得ることであって、前記脂質はエステル化形態で脂肪酸を含
み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α
‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並び
に、任意にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、ドコサぺンタ
エン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）の１またはそれ以上を含み、
前記植物部分における前記抽出可能な脂質の総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベル
は、約７％から２０％である工程、
ｉｉ）前記植物部分から脂質を抽出することであって、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含
有量における前記ＤＨＡのレベルは、約７％から２０％である工程、を含む、抽出植物脂
質を産生するためのプロセスを提供する。
【００３２】
好ましい実施形態では、前記抽出脂質は、上記に定義される１またはそれ以上の特徴を
有する。
【００３３】
一実施形態では、前記植物部分は、種子、好ましくは油料種子である。このような種子
の例は、アブラナ属種子、ワタ、アマ、ヒマワリ属種、ベニバナ、ダイズ、トウモロコシ
、シロイヌナズナ（アラビドプシスタリアナ）、モロコシ、ソルガムブルガレ、エンバク
、トリフォリウム属種、エラエイスグイネエヌシス、ベンサミアナタバコ、オオムギ、ル
ピナスアングスティフォリウス、イネ、アフリカイネ、カメリナサティバ、またはクラン
ベアビシニカ、好ましくは、セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサテ
ィバ（Ｃ．サティバ）種子を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
別の実施形態では、前記種子は、種子１グラム当たり、少なくとも約１８ｍｇ、少なく
とも約２２ｍｇ、少なくとも約２６ｍｇ、約１８ｍｇから約１００ｍｇの間、約２２ｍｇ
から約７０ｍｇの間、または約２４ｍｇから約５０ｍｇのＤＨＡを含む。
【００３５】
さらなる実施形態では、前記植物部分は、以下のセットの酵素：
ｉ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デ
サチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４
‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ
４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラー
ゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロ
ンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デ
サチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４
‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ
４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、または
ｖｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュ
ラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐
エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
の１つをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、
各ポリヌクレオチドが、前記植物部分の細胞において、前記ポリヌクレオチドの発現を
方向づけることが可能である、１またはそれ以上のプロモーターに操作可能に結合される
。
【００３６】
さらに、さらなる実施形態では、前記植物部分は、以下の特徴：
ｉ）前記Δ１２‐デサチュラーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少な
くとも約８０％、約６０％から約９８％の間、約７０％から約９５％の間、または約７５
％から約９０％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞におけるオレイン酸をリノ
ール酸に転換する、
ｉｉ）前記ω３‐デサチュラーゼが、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少な
くとも約８５％、約６５％から約９５％の間、約７５％から約９５％の間、または約８０
％から約９５％の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ω６脂肪酸をω３脂
肪酸に転換する、
ｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少
なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約３０％から約７０％の
間、約３５％から約６０％の間、または約５０％から約７０％の間の効率で、１またはそ
れ以上の植物の細胞において、ＡＬＡをＳＤＡに転換する、
ｉｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、約５％未満、約２．５％未満、約１％未満、約０
．１％から約５％の間、約０．５％から約２．５％の間、または約０．５％から約１％の
間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、リノール酸をγ‐リノレン酸に転
換する、
ｖ）前記Δ６‐エロンガーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくと
も約７５％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約８８％の間、または約７５％か
ら約８５％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＳＤＡをＥＴＡに転
換する、
ｖｉ）前記Δ５‐デサチュラーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少な
くとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、約６０％から約９９％の間
、約７０％から約９９％の間、または約７５％から約９８％の間の効率で、１またはそれ
以上の植物の細胞において、ＥＴＡをＥＰＡに転換する、
ｖｉｉ）前記Δ５‐エロンガーゼが、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少な
くとも約９０％の間、約５０％から約９５％の間、または約８５％から約９５％の間の効
率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＥＰＡをＤＰＡに転換する、
ｖｉｉｉ）前記Δ４‐デサチュラーゼが、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、
少なくとも約９３％、約５０％から約９５％の間、約８０％から約９５％の間、または約
８５％から約９５％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＤＰＡをＤ
ＨＡに転換する、
ｉｘ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞における、ＤＨＡへのオレイン酸の転換
の効率が、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、約１０％か
ら約５０％の間、約１０％から約３０％の間、または約１０％から約２５％の間である、
ｘ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞における、ＤＨＡへのＬＡの転換の効率が
、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、少なくとも約２５％
、約１５％から約５０％の間、約２０％から約４０％の間、または約２０％から約３０％
の間である、
ｘｉ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞における、ＤＨＡへのＡＬＡの転換の効
率が、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少なくとも約２４％、約１７％から約
５５％の間、約２２％から約３５％の間、または約２４％から約３５％の間である、
ｘｉｉ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞が、前記外因性ポリヌクレオチドを欠
いている対応する細胞よりも、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、約１５％から
約３０％の間、または約２２．５％から約２７．５％の間で多いω３脂肪酸を含む、
ｘｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、、リノール酸（ＬＡ）に対してα‐リノレン
酸（ＡＬＡ）を優先的に不飽和化する、
ｘｉｖ）前記Δ６‐エロンガーゼは、また、Δ９‐エロンガーゼ活性を有する、
ｘｖ）前記Δ１２‐デサチュラーゼは、また、Δ１５‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｖｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、また、Δ８‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｖｉｉ）前記Δ８‐デサチュラーゼは、また、Δ６‐デサチュラーゼ活性を有し、ま
たはΔ６‐デサチュラーゼ活性を有していない、
ｘｖｉｉｉ）前記Δ１５‐デサチュラーゼは、また、ＧＬＡでω３‐デサチュラーゼ活
性を有する、
ｘｉｘ）前記ω３‐デサチュラーゼは、また、ＬＡでΔ１５‐デサチュラーゼ活性を有
する、
ｘｘ）前記ω３‐デサチュラーゼは、両方のＬＡおよび／またはＧＬＡを不飽和化する
、
ｘｘｉ）前記ω３‐デサチュラーゼは、、ＬＡに対してＧＬＡを優先的に不飽和化する
、
ｘｘｉｉ）前記植物部分における前記ＤＨＡのレベルは、少なくとも約１０％、少なく
とも約１５％、少なくとも約２０％、約１０％から約５０％の間、約１５％から約３０％
の間、または約２０％から約２５％の間の、前記植物部分におけるオレイン酸のＤＨＡへ
の転換の効率に基づく、
ｘｘｉｉｉ）前記植物部分における前記ＤＨＡのレベルは、少なくとも約１５％、少な
くとも約２０％、少なくとも約２２％、約１５％から約６０％の間、約２０％から約４０
％の間、または約２２％から約３０％の間の、前記植物部分におけるＬＡのＤＨＡへの転
換の効率に基づく、
ｘｘｉｖ）前記植物部分における前記ＤＨＡのレベルは、少なくとも約１７％、少なく
とも約２２％、少なくとも約２４％、約１７％から約６５％の間、約２２％から約３５％
の間、または約２４％から約３５％の間の、前記植物部分におけるＡＬＡのＤＨＡへの転
換の効率に基づく、
ｘｘｘ）１もしくはそれ以上のまたは全ての前記デサチュラーゼが、対応するアシル‐
ＰＣ基質よりもアシル‐ＣｏＡ基質で、より高い活性を有する、
ｘｘｘｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としての、ＬＡよりもＡＬＡで、
より高いΔ６‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｘｘｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としてのＰＣのｓｎ‐２位置に
結合するＡＬＡよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、より高いΔ６‐デサチュ
ラーゼ活性を有する、
ｘｘｘｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、基質としてのＡＬＡで、ＬＡと比較して
、少なくとも約２倍高いΔ６‐デサチュラーゼ活性、少なくとも３倍高い活性、少なくと
も４倍高い活性、または少なくとも５倍高い活性を有する、
ｘｘｘｉｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ‐２位置に
結合するＡＬＡよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、より高い活性を有する、
ｘｘｘｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ‐２位置に結
合するＡＬＡよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、少なくとも約５倍高いΔ６
‐デサチュラーゼ活性または少なくとも１０倍高い活性を有する、
ｘｘｘｖｉ）前記デサチュラーゼは、フロントエンドのデサチュラーゼである、
ｘｘｘｖｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、ＥＴＡで、検出可能なΔ５‐デサチュラ
ーゼ活性を有していない、
の１もしくはそれ以上、または全てを有する。
【００３７】
さらに、さらなる実施形態では、前記植物部分が、１もしくはそれ以上のまたは全ての
以下の特徴：
ｉ）前記Δ１２‐デサチュラーゼが、配列番号１０で規定される配列を有するアミノ酸
、その生物学的に活性な断片、または配列番号１０と少なくとも５０％同一であるアミノ
酸配列を含む、
ｉｉ）前記ω３‐デサチュラーゼが、配列番号１２で規定される配列を有するアミノ酸
、その生物学的に活性な断片、または配列番号１２と少なくとも５０％同一であるアミノ
酸配列を含む、
ｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、配列番号１６で規定される配列を有するアミノ
酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号１６と少なくとも５０％同一であるアミ
ノ酸配列を含む、
ｉｖ）前記Δ６‐エロンガーゼが、配列番号２５で規定される配列を有するアミノ酸、
配列番号２６のようなその生物学的に活性な断片、または配列番号２５および／または配
列番号２６と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、
ｖ）前記Δ５‐デサチュラーゼが、配列番号３０で規定される配列を有するアミノ酸、
その生物学的に活性な断片、または配列番号３０と少なくとも５０％同一であるアミノ酸
配列を含む、
ｖｉ）前記Δ５‐エロンガーゼが、配列番号３７で規定される配列を有するアミノ酸、
その生物学的に活性な断片、または配列番号３７と少なくとも５０％同一であるアミノ酸
配列を含む、
ｖｉｉ）前記Δ４‐デサチュラーゼが、配列番号４１で規定される配列を有するアミノ
酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号４１と少なくとも５０％同一であるアミ
ノ酸配列を含む、
の１もしくはそれ以上、または全てを有する。
【００３８】
一実施形態では、前記植物部分が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（
ＤＧＡＴ）、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）、グリセロ
ール‐３‐ホスフェートアシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、１‐アシル−グリセロ
ール‐３‐ホスフェートアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、好ましくはＣ２２多
価不飽和脂肪族アシル‐ＣｏＡ基質を使用し得るＬＰＡＡＴ、アシル‐ＣｏＡ：リソホス
ファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬ
Ａ２）、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、ＣＤＰ‐コリンジ
アシルグリセロールコリンホスフォトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）、ホスファチジルコリ
ン（phoshatidylcholine）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）
、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスフォトランスフェラーゼ（Ｐ
ＤＣＴ）、アシル‐ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）、または２つもしくはそれ以上のこれら
の組み合わせをコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。
【００３９】
別の実施形態では、前記植物部分が、ＦＡＥ１、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、ＬＰ
ＡＡＴ、ＬＰＣＡＴ、ＰＬＡ２、ＰＬＣ、ＰＬＤ、ＣＰＴ、ＰＤＡＴ、ＦＡＴＢのような
チオエステラーゼ、またはΔ１２‐デサチュラーゼ、または２つもしくはそれ以上のこれ
らの組み合わせから選択される、前記植物部分の細胞における内因性酵素の産生および／
または活性を下方制御する、導入された突然変異または外因性ポリヌクレオチドをさらに
含む。
【００４０】
さらなる実施形態では、少なくとも１つまたは全ての前記プロモーターが種子特異的プ
ロモーターである。一実施形態では、少なくとも１つまたは全ての前記プロモーターが、
オイル生合成もしくはオレオシンのような蓄積遺伝子から、またはコンリニン（conlinin
）のような種子貯蔵タンパク質遺伝子から得られている。
【００４１】
別の実施形態では、前記Δ４‐デサチュラーゼおよび前記Δ５‐エロンガーゼをコード
する、外因性ポリヌクレオチドの発現を方向づける前記プロモーターが、前記植物部分の
種子の発生以前、またはピークの発現に達する以前において、ポリヌクレオチドの発現を
開始し、前記プロモーターが前記Δ１２‐デサチュラーゼおよび前記ω３‐デサチュラー
ゼをコードする前記外因性ポリヌクレオチドの発現を方向づける。
【００４２】
さらなる実施形態では、前記外因性ポリヌクレオチドは、前記植物部分の細胞のゲノム
に組込まれるＤＮＡ分子、好ましくはＴ‐ＤＮＡ分子において共有結合で結合され、好ま
しくは前記植物部分の前記細胞の前記ゲノムに組込まれるこのようなＤＮＡ分子の数は、
１、２もしくは３以下であり、または２もしくは３である。
【００４３】
さらに別の実施形態では、前記植物は、同じまたは異なるアミノ酸配列を有するΔ６‐
デサチュラーゼをそれぞれコードする少なくとも２つの異なる外因性ポリヌクレオチドを
含む。
【００４４】
さらなる実施形態では、前記外因性ポリヌクレオチドを含む前記植物部分の総オイル含
有量は、前記外因性ポリヌクレオチドを欠く対応する植物部分の総オイル含有量の少なく
とも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくと
も約７０％、または約５０％から約８０％の間である。これらの実施形態において、最大
の前記オイル含有量は、対応する野生型の植物部分の前記オイル含有量の約１００％であ
ることとしてもよい。
【００４５】
別の実施形態では、前記脂質は、オイル、好ましくは、油料種子由来の種子オイルの形
態であり、前記脂質の重量の少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、少なくと
も約９８％、または約９５％から約９８％の間がトリアシルグリセロールである。
【００４６】
さらなる実施形態では、前記プロセスは、前記総脂肪酸含有量のパーセンテージとして
の前記ＤＨＡのレベルを増加させるために前記脂質を処理することをさらに含む。例えば
、前記処理がエステル交換反応である。例えば、キャノーラオイルのような前記脂質が、
前記オイルにおける前記脂肪酸を、メチルまたはエチルエステルのようなアルキルエステ
ルに転換するために処理されることとしてもよく、その後、前記ＤＨＡについての前記脂
質またはオイルを濃縮するために分画することとしてもよい。
【００４７】
ｉ）脂質を含む、植物部分、好ましくは、キャノーラ種子を得ることであって、前記脂
質はエステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール
酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコ
サヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに任意に１またはそれ以上のエイコサペンタエン酸（Ｅ
ＰＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテ
トラエン酸（ＥＴＡ）を含み、前記植物部分における抽出可能な脂質の前記総脂肪酸含有
量における前記ＤＨＡのレベルは、約３％、約４％、約５％、約６％、または約７％であ
る工程、および
ｉｉ）前記植物部分から脂質を抽出する工程、
を含む、抽出植物脂質を産生するためのプロセスがさらに提供され、
前記抽出脂質は、前記脂質の前記総脂肪酸含有量において、以下の特徴を有する：
ｉ）前記ＤＨＡのレベルは約３％、約４％、約５％、約６％、または約７％であり、
ｉｉ）前記パルミチン酸のレベルは約２％から約１６％の間であり、
ｉｉｉ）前記ミリスチン酸のレベルは２％未満であり、
ｉｖ）前記オレイン酸のレベルは約３０％から約６０％の間、好ましくは約４５％から
約６０％の間であり、
ｖ）前記ＬＡのレベルは約４％から約２０％の間であり、
ｖｉ）前記ＡＬＡのレベルは約２％から約１６％の間であり、
ｖｉｉ）前記ＧＬＡのレベルは約４％未満であり、
ｖｉｉｉ）前記ＳＤＡのレベルは、約６％未満、または約４％未満であり、
ｉｘ）前記ＥＴＡのレベルは、約６％未満、または約４％未満であり、
ｘ）前記ＥＴｒＡのレベルは約１％未満であり、
ｘｉ）前記ＥＰＡのレベルは約１０％未満であり、および／または前記ＥＰＡのレベル
は前記ＤＨＡのレベルの０．５から２．０倍であり、
ｘｉｉ）前記ＤＰＡのレベルは約４％未満であり、
ｘｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総飽和脂肪酸のレベルは約
４％から約２５％の間であり、
ｘｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総一価不飽和脂肪酸のレベル
は約３０％から約７０％の間であり、
ｘｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総多価不飽和脂肪酸のレベルは
約１５％から約７５％の間、好ましくは、約１５％から約３０％の間であり、
ｘｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω６脂肪酸のレベルは約０
．５％から約１０％の間であり、
ｘｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸のレベルは約１０
％から約２０％の間であり、
ｘｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω３脂肪酸のレベルは
約３％から約２０％の間であり、
ｘｉｘ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比
は、約０．０５から約３．０の間、好ましくは約０．５０未満であり、
ｘｘ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は
約０．０３から約３．０の間であり、
ｘｘｉ）前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は少なくとも約７０
％であり、および
ｘｘｉｉ）前記脂質はコレステロールを実質的に含まない。一実施形態では、前記脂質
はトリ‐ＤＨＡ  ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む。より好ましくは、前記脂質は、Ｓ
ＤＡおよびＥＴＡを実質的に含まず、および／または前記植物または植物部分から抽出さ
れた後に、エステル交換反応プロセスにより処理されない。
【００４８】
ｉ）脂質を含む植物部分を得ることであって、前記脂質はエステル化形態で脂肪酸を含
み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α
‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並び
に、１またはそれ以上のステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、
ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、（ｉ）
前記抽出脂質の総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、７％から２０％の間であ
り、（ｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルが、
２％から１６％の間であり、（ｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記
ミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは、６％未満であり、（ｉｖ）前記抽出脂質の前記
総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルは、１％から３０％の間または３０％か
ら６０％の間であり、（ｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸
（ＬＡ）のレベルは、４％から３５％の間であり、（ｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸
含有量における前記α‐リノレン酸（ＡＬＡ）のレベルは、４％から４０％の間であり、
（ｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸（ＥＴｒ
Ａ）のレベルは、４％未満であり、（ｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量にお
ける総飽和脂肪酸のレベルは、４％から２５％の間であり、（ｉｘ）前記抽出脂質の前記
脂肪酸含有量における、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、１．０から３．０の間、ま
たは０．１から１の間であり、（ｘ）前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）
含有量は、少なくとも７０％であり、および（ｘｉ）ＴＡＧの形態でエステル化されたＤ
ＨＡの少なくとも７０％が、ＴＡＧのｓｎ‐１またはｓｎ‐３の位置にある工程、
％、および、
ｉｉ）前記植物部分から脂質を抽出することであって、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含
有量における前記ＤＨＡのレベルは、約７％から２０％である工程、
を含む、抽出植物脂質を産生するためのプロセスもまた提供される。
【００４９】
本発明のプロセスを用いて産生される、脂質または該脂質を含むオイルもまた提供され
る。
【００５０】
別の態様では、本発明は、多価不飽和脂肪酸のエチルエステルを産生するためのプロセ
スを提供し、該プロセスは、抽出植物脂質におけるトリアシルグリセロールをエステル交
換することを含み、前記抽出植物脂質は、エステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、
オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（Ａ
ＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに任意に１または
それ以上のステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタ
エン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、前記抽出脂質の前記
総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルが約７％から２０％であり、これにより前記
エチルエステルを産生する。
【００５１】
好ましい実施形態では、前記抽出脂質は、１またはそれ以上の上記の特徴を有する。
【００５２】
別の態様では、本発明は、多価不飽和脂肪酸のエチルエステルを産生するためのプロセ
スを提供し、該プロセスは、抽出植物脂質におけるトリアシルグリセロールをエステル交
換することを含み、前記抽出植物脂質は、トリアシルグリセロールの形態でエステル化さ
れた脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含む
ω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（
ＤＨＡ）、並びに１またはそれ以上のステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸
（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を
含み、（ｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、約３％
、約４％、約５％、約６％、または７％から２０％の間であり、（ｉｉ）前記抽出脂質の
前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルが、２％から１６％の間であり、
（ｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）
のレベルは、６％未満であり、（ｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記
オレイン酸のレベルは、１％から３０％の間または３０％から６０％の間であり、（ｖ）
前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸（ＬＡ）のレベルは、４％か
ら３５％の間であり、（ｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノ
レン酸（ＡＬＡ）のレベルは、４％から４０％の間であり、（ｖｉｉ）前記抽出脂質の前
記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）のレベルは、４％未満で
あり、（ｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは
、４％から２５％の間であり、（ｉｘ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω
６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、１．０から３．０の間、または０．１から１の間であり
、（ｘ）前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は、少なくとも７０％
であり、および（ｘｉ）ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＨＡの少なくとも７０％が、
ＴＡＧのｓｎ‐１またはｓｎ‐３の位置にあり、これにより前記エチルエステルを産生す
る。一実施形態では、前記抽出植物脂質は、以下の特徴：
ｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルが２％から
１５％の間である、
ｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）の
レベルが１％未満である、
ｘｘｘｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルが、約
３％から約３０％の間、約６％から約３０％の間、１％から約２０％の間、約４５％から
約６０％の間、または約３０％である、
ｘｘｘｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸（ＬＡ）のレ
ベルが、約４％から約２０％の間、または約４％から１７％である、
ｘｘｘｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸（ＡＬ
Ａ）のレベルが、約７％から約４０％の間、約１０％から約３５％の間、約２０％から約
３５％の間、または４％から１６％の間である、
ｘｘｘｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記γ‐リノレン酸（Ｇ
ＬＡ）のレベルが、４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、
０．０５％から７％の間、０．０５％から４％の間、または０．０５％から約３％の間、
または０．０５％から約２％の間である、
ｘｘｘｉｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ステアリドン酸（ＳＤＡ
）のレベルが、約４％未満、約３％未満、約０．０５％から約７％の間、約０．０５％か
ら約４％の間、約０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間である、
ｘｌ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ
）のレベルが、約４％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．０５％から約５％の間
、約０．０５％から約４％の間、約０．０５％から約３％の間、または約０．０５％から
約２％の間である、
ｘｌｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸（ＥＴｒ
Ａ）のレベルが、約２％未満、約１％未満、０．０５％から４％の間、０．０５％から３
％の間、または０．０５％から約２％の間、または０．０５％から約１％の間である、
ｘｌｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサペンタエン酸（Ｅ
ＰＡ）のレベルが、４％未満、約３％未満、約２％未満、０．０５％から１０％の間、０
．０５％から５％の間、または０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％
の間である、
ｘｌｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ドコサぺンタエン酸（Ｄ
ＰＡ）のレベルが、４％未満、約３％未満、約２％未満、０．０５％から８％の間、０．
０５％から５％の間、または０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の
間である、
ｘｌｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルが、約８％
、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、
約１７％、約１８％、約８％から２０％の間、約１０％から２０％の間、約１１％から２
０％の間、約１０％から約１６％の間、または約１４％から２０％の間である、
ｘｌｖ）前記脂質は、その脂肪酸含有量にω６‐ドコサぺンタエン酸（２２：５Δ４，
７，１０，１３，１６）を含む、
ｘｌｖｉ）前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ω６‐ドコサぺンタエン酸（２２：５Δ
４，７，１０，１３，１６）を実質的に含まない、
ｘｌｖｉｉ）前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ＳＤＡ、ＥＰＡ、およびＥＴＡを実質
的に含まない、
ｘｌｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、
約４％から約２０％の間、または約６％から約２０％の間である、
ｘｌｉｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベルは
、約４％から約３５％の間、約８％から約２５％の間、または８％から約２２％の間であ
る、
ｌ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベルは、約２
０％から約７５％の間、約５０％から約７５％の間、または約６０％から約７５％の間で
ある、
ｌｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸のレベルは、約３５％
から約５０％の間、約２０％から約３５％の間、約６％から２０％の間、２０％未満、約
１６％未満、約１０％未満、約１％から約１６％の間、約２％から約１０％の間、または
約４％から約１０％の間である、
ｌｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸のレベルは、約１０
％未満、約８％未満、約６％未満、４％未満、約１％から約２０％の間、約１％から約１
０％の間、約０．５％から約８％の間、または約０．５％から４％の間である、
ｌｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸のレベルは、３６
％から約６５％の間、４０％から約６０％の間、約２０％から約３５％の間、約１０％か
ら約２０％の間、約２５％、約３０％、約３５％、または約４０％である、
ｌｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω３脂肪酸のレベルは、９％か
ら約３３％の間、約１０％から約２０％の間、約２０％から約３０％の間、約１２％から
約２５％の間、約１３％、約１５％、約１７％、または約２０％である、
ｌｖ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は
、約０．１から約０．５の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０
．２０未満、約０．１５未満、約１．０、約０．１、または約０．２である、
ｌｖｉ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比
は、約１．０から約３．０の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．５の間、約
０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満、約
０．１、約０．２、または約１．０である、
ｌｖｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、
少なくとも約２０％、約１０％から約５０％の間、約１０％から約３０％の間、または約
１０％から約２５％の間の、オレイン酸のＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｌｖｉｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％
、少なくとも約２２％、少なくとも約２５％、約１５％から約５０％の間、約２０％から
約４０％の間、または約２０％から約３０％の間の、ＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づ
く、
ｌｉｘ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少
なくとも約２４％、約１７％から約５５％の間、約２２％から約３５％の間、または約２
４％から約３５％の間のＡＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｌｘ）前記抽出脂質における前記総脂肪酸は、Ｃ２０：１を１％未満有する、
ｌｘｉ）前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は、少なくとも約８
０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、約７０％から約９９％の間、または約９
０％から約９９％の間である、
ｌｘｉｉ）前記脂質は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含む、
ｌｘｉｉｉ）前記脂質は、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、または約０．００
１％から約５％の間の、遊離（非エステル化）脂肪酸および／もしくはリン脂質を含む、
または、これらを実質的に含まない、
ｌｘｉｖ）ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＨＡの少なくとも８０％が、前記ＴＡＧ
のｓｎ‐１またはｓｎ‐３の位置にある、
ｌｘｖ）前記脂質において最も豊富なＤＨＡ含有ＴＡＧの種は、ＤＨＡ／１８：３／１
８：３（ＴＡＧ５８：１２）である、および
ｌｘｖｉ）前記脂質は、トリ‐ＤＨＡ  ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む、
の１もしくはそれ以上、または全てを有する。
【００５３】
特に上記態様に関し、一実施形態では、以下の事項：
ｉ）前記脂質はオイルの形態であり、前記オイルは、カンペステロール、Δ５‐スチグ
マステロール、エブリコール、β‐シトステロール、Δ５‐アベナステロール、Δ７‐ス
チグマステロールおよび、Δ７‐アベナステロールの１もしくはそれ以上のまたは全ての
ような、１もしくはそれ以上のステロールを含み、並びに、任意に、前記オイルは約１０
ｍｇ未満のステロール／ｇのオイルを含む、および／もしくは前記オイルはコレステロー
ルを実質的に含まない、
ｉｉ）前記脂質は、油料種子がアブラナ属種子の油料種子またはキャノーラ種子のよう
な、油料種子由来のオイルの形態である、
ｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、約３％、
約４％、約５％、約６％、または７％から２０％である、
の１もしくはそれ以上、または全てが適用される。
【００５４】
さらなる態様では、本発明は、単一のＤＮＡ分子上で、全て共有結合で結合される、第
１の遺伝子、第２の遺伝子、第３の遺伝子、第４の遺伝子、第５の遺伝子、および第６の
遺伝子の順で含む、キメラ遺伝子構築物（コンストラクト）を提供し、第１、第２、およ
び第３の遺伝子が第１の遺伝子クラスターとしてともに結合され、第４、第５、および第
６の遺伝子が第２の遺伝子クラスターとしてともに結合され、
各遺伝子は、各プロモーターが前記コード領域および転写ターミネーターおよび／また
はポリアデニル化領域が操作可能に結合されるように、プロモーター、コード領域、およ
び転写ターミネーター、および／またはポリアデニル化領域を含み、
各プロモーターが、前記ＤＮＡ分子が３、４、５、または６つの異なるプロモーターを
含むように、独立して他のプロモーターと同じまたは異なり、
１もしくはそれ以上のまたは全ての前記プロモーターが、それが操作可能に結合される
コード領域に対して異種性であり、
前記第１の遺伝子の転写の方向が、前記第３の遺伝子から離れており、前記第３の遺伝
子の転写の方向と反対であり、
前記第４の遺伝子の転写の方向が、前記第６の遺伝子から離れており、前記第６の遺伝
子の転写の方向と反対であり、
前記第２の遺伝子の転写の方向が、前記第１の遺伝子または前記第３の遺伝子と同じで
あり、
前記第５の遺伝子の転写の方向が、前記第４の遺伝子または前記第６の遺伝子と同じで
あり、
前記第２の遺伝子の前記転写ターミネーターおよび／またはポリアデニル化領域が、約
０．２から約３．０キロベースの間の第１のスペーサー領域により、より近いいずれかの
、前記第１または第３の遺伝子の前記プロモーターから間隔を置き、
約１．０から約１０．０キロベースの間の第２のスペーサー領域により前記第１の遺伝
子クラスターが第２の遺伝子クラスターから間隔を置き、および
前記第５の遺伝子の前記転写ターミネーターおよび／またはポリアデニル化領域が、約
０．２から約３．０キロベースの間の第３のスペーサー領域により、より近いいずれかの
、第４または第６の遺伝子の前記プロモーターから間隔を置く。
【００５５】
一実施形態では、前記ＤＮＡ分子が、約１．０から約１０．０キロベースの間のスペー
サー領域により、より近いいずれかの、前記第１の遺伝子クラスターまたは前記第２の遺
伝子クラスターから間隔を置く第７の遺伝子を含む。
【００５６】
別の実施形態では、前記ＤＮＡ分子が、２つまたはそれ以上の異なる転写ターミネータ
ーおよび／またはポリアデニル化領域を含む。
【００５７】
さらに、さらなる実施形態では、少なくとも１つの前記スペーサー領域がマトリックス
結合領域（ＭＡＲ）を含む。
【００５８】
さらなる実施形態では、前記ＤＮＡ分子が、前記遺伝子に隣接する左右境界領域を含み
、かつＴ‐ＤＮＡ分子である。
【００５９】
別の実施形態では、前記遺伝子コンストラクトが、アグロバクテリウム細胞におけるも
のである、または植物細胞のゲノムに組み込まれる。
【００６０】
好ましい実施形態では、少なくとも１つの前記遺伝子が、脂肪酸デサチュラーゼまたは
脂肪酸エロンガーゼをコードする。
【００６１】
別の実施形態では、前記遺伝子コンストラクトは、本明細書に定義される酵素のセット
をコードする遺伝子、および／または本明細書に定義される酵素をコードする１またはそ
れ以上の遺伝子を含む。
【００６２】
さらなる態様では、本発明は、
ｉ）配列番号１から９、１１、１４、１８、２２、２３、２８、３４、３５、３９、ま
たは４５のいずれかから選択されるヌクレオチドの配列、および／または
ｉｉ）配列番号１から９、１１、１４、１８、２２、２３、２８、３４、３５、３９、
または４５に示される１またはそれ以上の配列と、少なくとも９５％同一または９９％同
一であるヌクレオチドの配列、
を含む、単離および／または外因性ポリヌクレオチドを提供する。
【００６３】
特定の好ましい実施形態では、前記単離および／または外因性ポリヌクレオチドは、
ｉ）配列番号２のヌクレオチドの配列、および／または
ｉｉ）配列番号２に示される配列と、少なくとも９５％同一または９９％同一であるヌ
クレオチドの配列、
を含む。
【００６４】
別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよび／または本発明の前記遺伝
子コンストラクトを含む、ベクターまたは遺伝子コンストラクトを提供する。
【００６５】
一実施形態では、配列番号１１、１４、１８、２２、２３、２８、３４、３５、３９、
もしくは４５のいずれか１つから選択される前記ヌクレオチドの配列、または配列番号１
１、１４、１８、２２、２３、２８、３４、３５、３９、もしくは４５で示される１もし
くはそれ以上の前記配列と少なくとも９５％同一もしくは９９％同一である前記ヌクレオ
チドの配列は、プロモーターに操作可能に結合される。
【００６６】
さらなる態様では、本発明は、以下のセットの酵素：
ｉ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デ
サチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４
‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ
４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラー
ゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロ
ンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デ
サチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４
‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ
４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、または
ｖｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュ
ラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９−
エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
の１つをコードする、外因性ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、
各ポリヌクレオチドは、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけるこ
とができるように、１またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合される。
【００６７】
一実施形態では、前記細胞が、上記に定義される脂質を含み、または１もしくはそれ以
上のまたは全ての前記デサチュラーゼもしくはエロンガーゼは、上記に定義される１また
はそれ以上の特徴を有する。
【００６８】
別の態様では、本発明は、
ｉ）配列番号１０に規定される配列を有するアミノ酸を含むΔ１２‐デサチュラーゼを
コードする第１の外因性ポリヌクレオチド、その生物学的に活性な断片、または配列番号
１０と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列と、
ｉｉ）配列番号１２に規定される配列を有するアミノ酸を含むω３‐デサチュラーゼを
コードする第２の外因性ポリヌクレオチド、その生物学的に活性な断片、または配列番号
１２と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列とを含む、宿主細胞を提供し、
各ポリヌクレオチドが、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけるこ
とができる１またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合される。
【００６９】
さらなる態様では、本発明は、１またはそれ以上の、本発明の前記ポリヌクレオチド、
本発明の前記遺伝子コンストラクト、または本発明の前記ベクターもしくは遺伝子コンス
トラクトを含む、宿主細胞を提供する。
【００７０】
一実施形態では、前記細胞は、植物における、植物部分におけるものであり、および／
または成熟した植物種子の細胞である。
【００７１】
一実施形態では、前記植物または植物種子は、それぞれ油料種子植物または油料種子で
ある。
【００７２】
本発明の細胞を含むトランスジェニック非ヒト生物もまた提供される。
【００７３】
好ましくは、前記トランスジェニック非ヒト生物は、トランスジェニック植物であり、
好ましくは、油料種子植物またはシロイヌナズナである。一実施形態では、前記植物は、
アブラナ属植物、好ましくは、セイヨウアブラナもしくはセイヨウカラシナ、またはシロ
イヌナズナ以外の他の植物である。
【００７４】
別の態様では、本発明は、
ａ）その種子における脂質であって、該脂質はエステル化形態における脂肪酸を含み、
および
ｂ）以下のセットの酵素：
ｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、真菌のω３‐デサチュラーゼ、および／もしくは真菌の
Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチ
ュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、または
ｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、真菌のω３‐デサチュラーゼ、および／もしくは真菌
のΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサ
チュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
の１つをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、油料種子植物を提供し、各ポリヌ
クレオチドは、前記植物の種子を発生する場合に、前記ポリヌクレオチドの発現を方向づ
けることができるように１またはそれ以上の種子特異的プロモーターを操作可能に結合さ
れ、前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）およびγ‐リノレン
酸（ＧＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ステアリ
ドン酸（ＳＤＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）
、ならびに任意にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および／またはエイコサテトラエン酸
（ＥＴＡ）を含み、前記脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは約７％
から２０％である。
【００７５】
油料種子植物の例は、アブラナ属種子、ワタ、アマ、ヒマワリ属種、ベニバナ、ダイズ
、トウモロコシ、シロイヌナズナ、モロコシ、ソルガムブルガレ、エンバク、トリフォリ
ウム属種、エラエイスグイネエヌシス、ベンサミアナタバコ、オオムギ、ルピナスアング
スティフォリウス、イネ、アフリカイネ、カメリナサティバ、またはクランベアビシニカ
を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、前記油料種子植物は、キャノーラ、
ダイズ、カメリナサティバ、または シロイヌナズナ植物である。代替的な実施形態では
、前記油料種子植物は、シロイヌナズナ以外である。
【００７６】
一実施形態では、１またはそれ以上の前記デサチュラーゼは、アシル‐ＣｏＡ基質を使
用することができる。好ましい実施形態では、１またはそれ以上の前記Δ６‐デサチュラ
ーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、およびΔ８‐デサチュラーゼは、
もし存在する場合には、アシル‐ＣｏＡ基質を用いることができ、好ましくは、ｉ）Δ６
‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、およびΔ４‐デサチュラーゼ、またはｉｉ）
Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、およびΔ８‐デサチュラーゼのそれぞれ
は、アシル‐ＣｏＡ基質を用いることができる。一実施形態では、Δ１２‐デサチュラー
ゼおよび／またはω３‐デサチュラーゼは、アシル‐ＣｏＡ基質を用いることができる。
アシル‐ＣｏＡ基質は、好ましくは、ＡＬＡ‐ＣｏＡ、ＥＴＡ‐ＣｏＡ、ＤＰＡ‐ＣｏＡ
、ＥＴｒＡ‐ＣｏＡ、ＬＡ‐ＣｏＡ、ＧＬＡ‐ＣｏＡ、またはＡＲＡ‐ＣｏＡである。
【００７７】
一実施形態では、前記植物の成熟した、収穫された種子は、１グラムの種子あたり少な
くとも約２８ｍｇ、好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約３２ｍｇ、１グラムの
種子あたり少なくとも約３６ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約４０ｍｇ、より好
ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約４４ｍｇ、または１グラムの種子あたり少な
くとも約４８ｍｇのＤＨＡ含有量を有する。最大のＤＨＡ含有量は、１グラムの種子あた
り約８０から約１００ｍｇ、または１グラムの種子あたり約８０ｍｇもしくは約１００ｍ
ｇであることとしてもよい。
【００７８】
さらなる態様では、本発明は、ＤＨＡを含む種子を産生することができるセイヨウアブ
ラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバ植物を提供し、前記植物の成熟した、
収穫された種子は、１グラムの種子あたり少なくとも約２８ｍｇ、好ましくは１グラムの
種子あたり少なくとも約３２ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約３６ｍｇ、１グラ
ムの種子あたり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも
約４４ｍｇ、または１グラムの種子あたり少なくとも約４８ｍｇのＤＨＡ含有量を有する
。最大のＤＨＡ含有量は、１グラムの種子あたり約８０から約１００ｍｇ、または１グラ
ムの種子あたり約８０ｍｇもしくは約１００ｍｇであることとしてもよい。
【００７９】
別の態様では、本発明は、前記外因性ポリヌクレオチドを含む、本発明の植物の植物細
胞を提供する。
【００８０】
植物部分、好ましくは種子もまた提供され、以下の特徴、
ｉ）本発明の植物由来である、
ｉｉ）本明細書で定義される脂質を含む、
ｉｉｉ）本発明のプロセスで使用され得る、
ｉｖ）本発明の遺伝子コンストラクトを含む、または
ｖ）本明細書で定義される外因性ポリヌクレオチドのセットを含む、
の１またはそれ以上を有する。
【００８１】
さらに別の態様では、本発明は、ＤＨＡおよび重量で約４％から約１５％の間の水分含
有量を含む、成熟した、収穫されたセイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリ
ナサティバ種子を提供し、前記種子の前記ＤＨＡの含有量は、１グラムの種子あたり少な
くとも約２８ｍｇ、好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約３２ｍｇ、１グラムの
種子あたり少なくとも約３６ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約４０ｍｇ、より好
ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約４４ｍｇ、または１グラムの種子あたり少な
くとも約４８ｍｇである。最大のＤＨＡ含有量は、１グラムの種子あたり約８０から約１
００ｍｇ、または１グラムの種子あたり約８０ｍｇもしくは約１００ｍｇであることとし
てもよい。
【００８２】
一実施形態では、本発明の前記細胞、本発明の前記トランスジェニック生物、本発明の
前記油料種子植物、本発明の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリ
ナサティバ植物、本発明の前記植物部分、または本発明の前記種子であって、本明細書で
定義される１もしくはそれ以上のまたは全ての特徴を含む抽出脂質を産生するために使用
され得るものがある。
【００８３】
さらにさらなる態様では、本発明は、本発明の細胞を産生する方法を提供し、該方法は
、
ａ）前記細胞、好ましくは、ＬＣ‐ＰＵＦＡを合成することができない細胞に、本発明
の前記遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および／または外因性ポリヌクレオチド
、本発明の前記ベクターまたは遺伝子コンストラクト、本明細書に定義される１またはそ
れ以上の外因性ポリヌクレオチドの組み合わせを導入することと、
ｂ）任意に、前記遺伝子またはポリヌクレオチドを前記細胞内に発現することと、
ｃ）任意に、前記細胞の前記脂肪酸組成を分析することと、
ｄ）任意に、前記遺伝子またはポリヌクレオチドを発現する細胞を選択することと、
を含む。
【００８４】
一実施形態では、前記細胞における前記脂質が、１またはそれ以上の本明細書に定義さ
れる特徴を有する。
【００８５】
別の実施形態では、前記遺伝子コンストラクト、前記単離および／もしくは外因性ポリ
ヌクレオチド、前記ベクター、前記遺伝子コンストラクト、または外因性ポリヌクレオチ
ドの組み合わせは、前記細胞の前記ゲノムに安定して組込まれる。
【００８６】
さらなる実施形態では、前記細胞は植物細胞であり、前記方法は工程ａ）の前記細胞か
ら形質転換植物を再生する工程をさらに含む。
【００８７】
別の実施形態では、前記遺伝子および／または外因性ポリヌクレオチドは、一過性で前
記細胞内に発現される。
【００８８】
本発明の方法を用いて産生される細胞もまた提供される。
【００８９】
別の態様では、本発明は、種子を産生する方法を提供し、該方法は、
ａ）好ましくは少なくとも１０００のこのような植物の個体群の一部としてのフィール
ドで、またはスタンダードな栽植密度で栽植される少なくとも１ヘクタールのエリアで、
本明細書の植物、または本明細書に定義される部分を産生する植物を成長させることと、
ｂ）前記植物の１つまたは複数から種子を収穫することと、
ｃ）任意に、前記種子から脂質を抽出して、好ましくは、少なくとも６０ｋｇＤＨＡ／
ヘクタールの総ＤＨＡ収率を有するオイルを産生することと、
を含む。
【００９０】
一実施形態では、本発明の他の前記植物、植物細胞、植物部分、または種子は、以下の
特徴：
ｉ）前記オイルが本明細書に定義される、
ｉｉ）前記植物部分または種子が、本発明のプロセスで使用されることができる、
ｉｉｉ）前記外因性ポリヌクレオチドが、本発明の遺伝子コンストラクトに含まれる、
ｉｖ）前記外因性ポリヌクレオチドは、本発明の外因性ポリヌクレオチドを含む、
ｖ）前記植物細胞は、本発明の細胞である、
ｖｉ）前記種子は、本発明の方法で産生される、
の１またはそれ以上を有する。
【００９１】
別の態様では、本発明は、１もしくはそれ以上の脂肪酸デサチュラーゼおよび／もしく
は脂肪酸エロンガーゼ、または１もしくはそれ以上の脂肪酸デサチュラーゼ、並びに１も
しくはそれ以上の脂肪酸エロンガーゼを産生する方法を提供し、該方法は、本発明の前記
遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および／または外因性ポリヌクレオチド、本発
明の前記ベクターまたは遺伝子コンストラクト、本明細書で定義される１またはそれ以上
の外因性ポリヌクレオチドの組み合わせを、好ましくは、前記フィールドで油料種子植物
に発生する油料種子において、細胞でまたは細胞フリーの発現システムで発現することを
含む。
【００９２】
さらなる態様では、本発明は、本発明の前記プロセス、本発明の前記細胞、本発明の前
記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本発明の前記セイヨウアブラナ
、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発明の前記植物部分、本発明の
前記種子、または本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子を用いて、産生
されまたは得られる脂質またはオイルを提供する。
【００９３】
一実施形態では、前記脂質またはオイルは、油料種子由来のオイルの抽出により得られ
る。油料種子由来のオイルの例は、キャノーラオイル（セイヨウアブラナ、ブラッシカ・
ラパ亜種）、マスタードオイル（セイヨウカラシナ）、他のアブラナオイル、ヒマワリ油
（ヒマワリ）、亜麻仁油（アマ）、ダイズオイル（ダイズ）、ベニバナオイル（ベニバナ
）、コーンオイル（トウモロコシ）、タバコオイル（タバコ）、ピーナッツオイル（ピー
ナッツ）、パームオイル、綿実油（ワタ）、ココナッツオイル（ココヤシ）、アボカドオ
イル（アボカド）、オリーブオイル（オリーブ）、カシューオイル（カシューナッツ）、
マカダミアオイル（マカダミア）、アーモンドオイル（アーモンド）、またはシロイヌナ
ズナ種子オイル（シロイヌナズナ）を含むが、これらに限定されない。
【００９４】
さらなる態様では、本発明は、本発明の前記プロセス、本発明の前記細胞、本発明の前
記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本発明の前記セイヨウアブラナ
、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発明の前記植物部分、本発明の
前記種子、または本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子を用いて、産生
されまたは得られる脂肪酸を提供する。好ましくは、前記脂肪酸はＤＨＡである。前記脂
肪酸は、本明細書に記載される脂肪酸組成を有する脂肪酸の混合物であることとしてもよ
い。一実施形態では、前記脂肪酸は非エステル化である。
【００９５】
本発明の種子から得られる種子ミールもまた提供される。好ましい種子ミールは、セイ
ヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、カメリナサティバ、またはダイズの種子ミールを含む
が、これらに限定されない。一実施形態では、前記種子ミールは、本明細書に定義される
外因性ポリヌクレオチドおよび／または遺伝子コンストラクトを含む。
【００９６】
別の態様では、本発明は、１またはそれ以上の、本発明の前記脂質もしくはオイル、本
発明の前記脂肪酸、本発明の前記遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および／もし
くは外因性ポリヌクレオチド、本発明の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、本
発明の前記細胞、本発明の前記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本
発明の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発
明の前記植物部分、本発明の前記種子、本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしく
は種子、または本発明の前記種子ミールを含む組成物を提供する。実施形態では、前記組
成物は、薬学的、食品、もしくは農業的使用に適する担体、種子処理化合物、肥料、他の
食品もしくは配合原料、または添加されたタンパク質もしくはビタミンを含む。
【００９７】
１またはそれ以上の、本発明の前記脂質もしくはオイル、本発明の前記脂肪酸、本発明
の前記遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチ
ド、本発明の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、本発明の前記細胞、本発明の
前記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本発明の前記セイヨウアブラ
ナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発明の前記植物部分、本発明
の前記種子、本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、本発明の前記種子
ミール、または本発明の組成物を含む、家畜飼料、化粧品、または化学物質もまた提供さ
れる。
【００９８】
別の態様では、本発明は、家畜飼料を産生する方法を提供し、該方法は、１またはそれ
以上の、本発明の前記脂質もしくはオイル、本発明の前記脂肪酸、本発明の前記遺伝子コ
ンストラクト、本発明の前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチド、本発明の前
記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、本発明に係る前記細胞、本発明の前記トラン
スジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本発明の前記セイヨウアブラナ、セイヨ
ウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発明の前記植物部分、本発明の前記種子
、本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、本発明の前記種子ミール、ま
たは本発明の前記組成物を、少なくとも１つの他の食品原料成分と混合することを含む。
【００９９】
別の態様では、本発明は、ＰＵＦＡから利益を得る、症状を治療または防止する方法を
提供し、該方法は、対象に、１またはそれ以上の、本発明の前記脂質もしくはオイル、本
発明の前記脂肪酸、本発明の前記遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および／もし
くは外因性ポリヌクレオチド、本発明の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、本
発明の前記細胞、本発明の前記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本
発明の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発
明の前記植物部分、本発明の前記種子、本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしく
は種子、本発明の前記種子ミール、本発明の前記組成物、または本発明の前記家畜飼料、
を投与することを含む。
【０１００】
ＰＵＦＡから利益を得る症状の例は、心不整脈、血管形成、炎症、喘息、乾せん、骨粗
鬆症、腎結石、ＡＩＤＳ、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、統合失調症、癌、
胎児性アルコール症候群、注意欠陥多動性障害、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、単
極性うつ病、攻撃的な敵意（aggressive hostility）、副腎白質ジストロフィー（adreno
leukodystophy）、冠動脈心疾患、高血圧、糖尿病、肥満、アルツハイマー病、慢性閉塞
性肺疾患、潰瘍性大腸炎、血管形成後の再狭窄、湿疹、血圧上昇、血小板凝集、消化管出
血、子宮内膜症、月経前症候群、筋痛性脳脊髄炎、ウイルス感染後の慢性疲労、または眼
性疾患を含むが、これらに限定されない。
【０１０１】
ＰＵＦＡから利益を得る、症状を治療または防止するための薬剤の製造のために、１ま
たはそれ以上の、本発明の前記脂質もしくはオイル、本発明の前記脂肪酸、本発明のいず
れか１つの前記遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および／もしくは外因性ポリヌ
クレオチド、本発明の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、本発明の前記細胞、
本発明の前記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本発明の前記セイヨ
ウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発明の前記植物部分
、本発明の前記種子、本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、本発明の
前記種子ミール、本発明の前記組成物、または本発明の前記家畜飼料、の使用もまた提供
される。前記薬剤の前記産生は、本明細書に記載される状態の治療のために、薬学的に受
容可能な担体と、本発明のオイルを混合することを含むこととしてもよい。前記方法は、
まず、前記ＤＨＡのレベルを増加させるために、前記オイルを精製することおよび／また
はエステル交換反応および／または前記オイルの分画を含むこととしてもよい。特定の実
施形態において、前記方法は、前記オイルにおける前記脂肪酸を、メチルまたはエチルエ
ステルのようなアルキルエステルに転換するために、キャノーラオイルのような前記オイ
ルまたは脂質を処理することを含む。さらに、分画または蒸留のような処理が、前記ＤＨ
Ａについての前記オイルまたは脂質を濃縮するために適用されることとしてもよい。好ま
しい実施形態では、前記薬剤はＤＨＡのエチルエステルを含む。さらにより好ましい実施
形態では、前記薬剤における前記ＤＨＡのエチルエステルのレベルは、３０％から５０％
の間である。例えば、前記薬剤における前記総脂肪酸含有量の３０％から５０％の間で、
前記薬剤はＥＰＡのエチルエステルをさらに含むこととしてもよい。このような薬剤は、
本明細書に記載されるような医学的状態を治療するために、ヒトまたは動物の対象に投与
するのに適する。
【０１０２】
別の態様では、本発明は、本発明の種子を得ることと、金銭的利益のために得られた前
記種子を取引することとを含む、種子を取引する方法を提供する。
【０１０３】
一実施形態では、前記種子を得ることは、本発明の前記植物を栽培すること、および／
または前記植物から前記種子を収穫することを含む。
【０１０４】
別の実施形態では、前記種子を得ることは、コンテナに前記種子を配置すること、およ
び／または前記種子を保存することをさらに含む。
【０１０５】
さらなる実施形態では、前記種子を得ることは、前記種子を異なる場所に運ぶことをさ
らに含む。
【０１０６】
さらに別の実施形態では、前記方法は、前記種子が取引された後に、前記種子を異なる
場所に運ぶことをさらに含む。
【０１０７】
さらなる実施形態では、前記取引することは、コンピュータのような電子的手段を用い
て行われる。
【０１０８】
さらに別の態様では、本発明は、
ａ）本発明の種子を含む植物の地上部分を刈り取り、並べ、および／または収穫するこ
とと、
ｂ）前記植物部分の残りから前記種子を分離するために、前記植物の前記一部を脱穀し
、および／または選り分けることと、
ｃ）工程ｂ）で分離された前記種子をふるいにかけおよび／またはソートすること、お
よび容器内に前記ふるいにかけられたおよび／またはソートされた種子をロードすること
により、種子の入った容器を産生することと、
を含む、種子の入った容器を産生するプロセスを提供する。
【０１０９】
前記脂質もしくオイル、好ましくは種子オイルに関連するまたは有用な、一実施形態で
は、本発明は、表１６の種子１４のような、実施例のセクションにおいて表で提供される
ものについての脂肪のレベルを有する。
【０１１０】
あらゆる本明細書の実施形態は、別途に特に記載されない限り、あらゆる他の実施形態
に必要な変更を加えて適用すると解釈されるべきである。
【０１１１】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態による範囲に限定されず、これらは例
示のみの目的を意図とされる。機能的に均等な産生物、組成物、および方法は、あきらか
に、本明細書に記載されるように、本発明の範囲内である。
【０１１２】
本明細書を通じて、特定の別途の記載または文脈上別途の必要性がない限り、単一の工
程、組成物の材料、工程の群、組成物の材料の群への参照は、１つおよび複数（つまり、
１またはそれ以上の）のこれらの工程、組成物の材料、工程の群、組成物の材料の群を包
含すると解釈されるべきである。
【０１１３】
本発明は、以下の非限定的な実施例によりおよび添付の図面に対する参照により、ここ
に記載される。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】好気性ＤＨＡ生合成経路である。
【図２】ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７の左境界と右境界との間のＴ−ＤＮＡ挿入領域のマップ。ＲＢは右境界を示す；ＬＢ、左境界；ＴＥＲ、転写ターミネーター／ポリアデニル化領域；ＰＲＯ、プロモーター；コード領域は矢印の上に記され、プロモーターおよびターミネーターは矢印の下に記される。Ｍｉｃｐｕ−Δ６Ｄ、ミクロモナス・プシラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｓｉｌｌａ）Δ６デサチュラーゼ；Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅ、ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ  ｃｏｒｄａｔａ）Δ６エロンガーゼ；Ｐａｖｓａ−Ａ５Ｄ、パブロバ・サリナΔ５デサチュラーゼ；Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄ、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ω３デサチュラーゼ；Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄ、Ｐ．サリナΔ４デサチュラーゼ；Ｌａｃｋｌ−Δ１２Ｄ、ラカンセア・クルイベリ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）Δ１２デサチュラーゼ；Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅ、ピラミモナス・コルダタΔ５エロンガーゼ。ＮＯＳはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ノパリンシンターゼ転写ターミネーター／ポリアデニル化領域；ＦＰ１、セイヨウアブラナ切断ナピンプロモーター；ＦＡＥ１、シロイヌナズナＦＡＥ１プロモーター；レクチン、グリシン・マックスレクチン転写ターミネーター／ポリアデニル化領域；Ｃｎｌ１およびＣｎｌ２はリヌム・ウシタティスシムムコンリニン（ｃｏｎｌｉｎｉｎ）１またはコンリニン２プロモーターまたはターミネーターを意味する。ＭＡＲはニコチアナ・タバカムのＲｂ７マトリックス付着領域である。
【図３】ｐＪＰ３４０４の左境界と右境界との間のＴ−ＤＮＡ挿入領域のマップ。標識は図２の通りである。
【図４】ｐＪＰ３３６７の左境界と右境界との間の挿入領域のマップ。標識は図２の通りである。
【図５】Ｔ２およびＴ３世代の複数の独立トランスジェニックシロイヌナズナ種子脂質の総脂肪酸のパーセンテージとしてのＤＨＡ量である。角括弧がついたＴ２事象はＴ３に持ち込まれた。コロンビアおよびｆａｄ２変異体Ａ．タリアナバックグラウンドの双方からの事象が示される。
【図６】トランスジェニックシロイヌナズナ種子の脂質の総脂肪酸含有量のパーセンテージとしての、油含有量（ｗ／ｗ）対ＤＨＡ含有量である。
【図７】ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７を使って形質転換したＢ．ナプス胚のＴ−ＤＮＡの他の導入遺伝子と比較して、低発現のΔ６デサチュラーゼを示す代表的なＲＴ−ＰＣＲゲルである。レーンは左からＲＴ−ＰＣＲ産物を示す：１、ＤＮＡサイズマーカー；レーン２、Δ１２デサチュラーゼ；レーン３、ω３デサチュラーゼ；レーン４、Δ６デサチュラーゼ（低発現）；レーン５、Δ６エロンガーゼ；レーン６、Δ５デサチュラーゼ；レーン７、Δ５エロンガーゼ；レーン８、Δ４デサチュラーゼ。
【図８】オレイン酸のパーセンテージに対してプロットされたＡＬＡのパーセンテージであり、それぞれトランスジェニック３５Ｓ：ＬＥＣ２セイヨウアブラナ体細胞胚から得た脂質中の総脂肪酸のパーセンテージとして示す。
【図９】ＮＭＲによる、Ａ）マグロ油およびＢ）トランスジェニックＤＨＡアラビドプシス種子油に対する位置分布の分析である。ＤＨＡアルファと示されるピークは、ＴＡＧのｓｎ−１およびｓｎ−３位置に存在するＤＨＡの量を示す（位置的な優先がない場合は、これは総ＤＨＡの６６％に等しい）一方で、ＤＨＡベータと示されるピークは、ＴＡＧのｓｎ−２位置に存在するＤＨＡの量を示す（優先がない場合は、これはＤＨＡの３３％に等しい）。
【図１０】トランスジェニックＡ．タリアナの発育中の（灰色）および成熟した（黒色）種子における主要なＤＨＡ含有トリアシルグリセロール種のＬＣ−ＭＳ分析である。ＤＨＡに続く数字は、炭素原子の総数および他の２つの脂肪酸の二重結合の総数を意味する。したがって、ＤＨＡ／３４：１は、ＴＡＧ５６：７などとも呼ばれ得る。
【図１１】ｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢＧＢＥＣ＿ササゲ＿ＥＰＡ＿挿入断片の左境界と右境界との間のＴ−ＤＮＡ挿入領域のマップである。標識は図２の通りである；ＳＳＵ、シロイヌナズナＲｕｂｉｓｃｏ小サブユニットプロモーター。
【図１２】候補Δ１２デサチュラーゼがその中にクローニングされるＮｏｔＩ制限部位を示すバイナリーベクターｐＪＰ３３６４のマップである。
【図１３】ＳｉｇｍａＰｌｏｔを使用して生成したボックスプロットであり、ｐＦＮ０４５−ｐＦＮ０５０で形質転換したアラビドプシスＴ２種子群の種子脂質の脂肪酸２０：４ω６（ＡＲＡ）のパーセンテージを示す。ゼロに一番近い各枠の境界は、２５パーセンタイルを示し、各枠の中の線は中央値を示し、ゼロから一番遠い各枠の境界は、７５パーセンタイルを意味する。各枠の上下に示される誤差バーは、９０および１０パーセンタイルを示す。
【図１４】ｐＦＮ０４５−ｐＦＮ０５０で形質転換したアラビドプシスＴ２種子の種子脂質の総脂肪酸含有量のパーセンテージとして、ＡＲＡの平均量を示す。
【図１５】ｐＦＮ０４５−ｐＦＮ０５０で形質転換したアラビドプシスＴ２種子群の種子脂質の脂肪酸２０：２ω６（ＥＤＡ）のパーセンテージを示すボックスプロットである。ボックスプロットの値は図１３で記載された通りに示される。
【図１６】ｐＦＮ０４５−ｐＦＮ０５０で形質転換したアラビドプシスＴ４種子群の種子脂質のＡＲＡのパーセンテージを示すボックスプロットである。ボックスプロットの値は図１３で記載された通りに示される。
【図１７】ｐＦＮ０４５−ｐＦＮ０５０で形質転換したアラビドプシスＴ４種子群の種子脂質の総脂肪酸含有量のパーセンテージとして、ＡＲＡの平均量を示す。
【図１８】ｐＦＮ０４５−ｐＦＮ０５０で形質転換したアラビドプシスＴ４種子群の種子脂質のＥＤＡのパーセンテージを示すボックスプロットである。ボックスプロットの値は図１３で記載された通りに示される。
【図１９】（Ａ）環および側鎖ナンバリングを伴った、基本的な植物ステロール構造である。（Ｂ）いくつかの植物ステロールの化学構造である。
【図２０】公知のＬＰＡＡＴの系統樹である。
【図２１】ＰＣ、ＣｏＡプールおよびＴＡＧプールの間で脂肪酸を搬送する様々なアシル交換酵素である。出典はＳｉｎｇｈら（２００５）からである。
【発明を実施するための形態】
【０１１５】
配列表のカギ
配列番号１‐ｐＪＰ３４１６‐ＧＡ７ヌクレオチド配列。
配列番号２‐ｐＧＡ７‐ｍｏｄ＿Ｂヌクレオチド配列。
配列番号３‐ｐＧＡ７‐ｍｏｄ＿Ｃヌクレオチド配列。
配列番号４‐ｐＧＡ７‐ｍｏｄ＿Ｄヌクレオチド配列。
配列番号５‐ｐＧＡ７‐ｍｏｄ＿Ｅヌクレオチド配列。
配列番号６‐ｐＧＡ７‐ｍｏｄ＿Ｆヌクレオチド配列。
配列番号７‐ｐＧＡ７‐ｍｏｄ＿Ｇヌクレオチド配列。
配列番号８‐ｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢＧＢＥＣ＿Ｃｏｗｐｅａ＿ＥＰＡ＿インサートヌ
クレオチド配列。
配列番号９‐植物におけるラカンセア・クルイベリ（Lachancea kluyveri）Δ１２デサ
チュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号１０‐ラカンセア・クルイベリΔ１２‐デサチュラーゼ。
配列番号１１‐植物におけるピキア・パストリスω３デサチュラーゼの発現についての
コドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号１２‐ピキア・パストリスω３デサチュラーゼ。
配列番号１３‐ミクロモナス・プシラΔ６‐デサチュラーゼをコードするオープンリー
ディングフレーム。
配列番号１４‐植物におけるミクロモナス・プシラΔ６‐デサチュラーゼの発現につい
てのコドン最適化オープンリーディングフレーム（バージョン１）。
配列番号１５‐植物におけるミクロモナス・プシラΔ６‐デサチュラーゼの発現につい
てのコドン最適化オープンリーディングフレーム（バージョン２）。
配列番号１６‐ミクロモナス・プシラΔ６‐デサチュラーゼ。
配列番号１７‐オストレオコッカスルシマリヌスΔ６‐デサチュラーゼをコードするオ
ープンリーディングフレーム。
配列番号１８‐植物におけるオストレオコッカスルシマリヌスΔ６‐デサチュラーゼの
発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号１９‐オストレオコッカスルシマリヌスΔ６‐デサチュラーゼ。
配列番号２０‐オストレオコッカスタウリΔ６‐デサチュラーゼ。
配列番号２１‐ピラミモナス・コルダタΔ６‐デサチュラーゼをコードするオープンリ
ーディングフレーム。
配列番号２２‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ６‐エロンガーゼの発現につい
てのコドン最適化オープンリーディングフレーム（３’末端で切断され、機能的なエロン
ガーゼをコードする）（バージョン１）。
配列番号２３‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ６‐エロンガーゼの発現につい
てのコドン最適化オープンリーディングフレーム（３’末端で切断され、機能的なエロン
ガーゼをコードする）（バージョン２）。
配列番号２４‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ６‐エロンガーゼの発現につい
てのコドン最適化オープンリーディングフレーム（３’末端で切断され、機能的なエロン
ガーゼをコードする）（バージョン３）。
配列番号２５‐ピラミモナス・コルダタΔ６‐エロンガーゼ。
配列番号２６‐切断されたピラミモナス・コルダタΔ６‐エロンガーゼ。
配列番号２７‐パブロバサリナΔ５‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディン
グフレーム。
配列番号２８‐植物におけるパブロバサリナΔ５‐デサチュラーゼの発現についてのコ
ドン最適化オープンリーディングフレーム（バージョン１）。
配列番号２９‐植物におけるパブロバサリナΔ５‐デサチュラーゼの発現についてのコ
ドン最適化オープンリーディングフレーム（バージョン２）。
配列番号３０‐パブロバサリナΔ５‐デサチュラーゼ。
配列番号３１‐ピラミモナス・コルダタΔ５‐デサチュラーゼをコードするオープンリ
ーディングフレーム。
配列番号３２‐ピラミモナス・コルダタΔ５‐デサチュラーゼ。
配列番号３３‐ピラミモナス・コルダタΔ５‐エロンガーゼをコードするオープンリー
ディングフレーム。
配列番号３４‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ５‐エロンガーゼの発現につい
てのコドン最適化オープンリーディングフレーム（バージョン１）。
配列番号３５‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ５‐エロンガーゼの発現につい
てのコドン最適化オープンリーディングフレーム（バージョン２）。
配列番号３６‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ５‐エロンガーゼの発現につい
てのコドン最適化オープンリーディングフレーム（バージョン３）。
配列番号３７‐ピラミモナス・コルダタΔ５‐エロンガーゼ。
配列番号３８‐パブロバサリナΔ４‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディン
グフレーム。
配列番号３９‐植物におけるパブロバサリナΔ４‐デサチュラーゼの発現についてのコ
ドン最適化オープンリーディングフレーム（バージョン１）。
配列番号４０‐植物におけるパブロバサリナΔ４‐デサチュラーゼの発現についてのコ
ドン最適化オープンリーディングフレーム（バージョン２）。
配列番号４１‐パブロバサリナΔ４‐デサチュラーゼ。
配列番号４２‐イソクリシスガルバナΔ９‐エロンガーゼをコードするオープンリーデ
ィングフレーム。
配列番号４３‐イソクリシスガルバナΔ９‐エロンガーゼ。
配列番号４４‐エミリアニアハクスレイＣＣＭＰ１５１６Δ９‐エロンガーゼをコード
するオープンリーディングフレーム。
配列番号４５‐植物におけるエミリアニアハクスレイΔ９‐エロンガーゼの発現につい
てのコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号４６‐エミリアニアハクスレイＣＣＭＰ１５１６Δ９‐エロンガーゼ。
配列番号４７‐パブロバピンギスΔ９‐エロンガーゼをコードするオープンリーディン
グフレーム。
配列番号４８‐パブロバピンギスΔ９‐エロンガーゼ。
配列番号４９‐パブロバサリナΔ９‐エロンガーゼをコードするオープンリーディング
フレーム。
配列番号５０‐パブロバサリナΔ９‐エロンガーゼ。
配列番号５１‐パブロバサリナΔ８‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディン
グフレーム。
配列番号５２‐パブロバサリナΔ８‐デサチュラーゼ。
配列番号５３‐Ｐ１９ウイルスサプレッサー。
配列番号５４‐Ｖ２ウイルスサプレッサー。
配列番号５５‐Ｐ３８ウイルスサプレッサー。
配列番号５６‐Ｐｅ‐Ｐ０ウイルスサプレッサー。
配列番号５７‐ＲＰＶ‐Ｐ０ウイルスサプレッサー。
配列番号５８‐Ｐ１９ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレー
ム。
配列番号５９‐Ｖ２ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム
。
配列番号６０‐Ｐ３８ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレー
ム。
配列番号６１‐Ｐｅ‐Ｐ０ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフ
レーム。
配列番号６２‐ＲＰＶ‐Ｐ０ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディング
フレーム。
配列番号６３‐シロイヌナズナＬＰＡＡＴ２。
配列番号６４‐リムナンテスアルバＬＰＡＡＴ。
配列番号６５‐サッカロマイセスセレビシエＬＰＡＡＴ。
配列番号６６‐ミクロモナス・プシラＬＰＡＡＴ。
配列番号６７‐モルティエレラアルピナＬＰＡＡＴ。
配列番号６８‐セイヨウアブラナ（Braccisa napus）ＬＰＡＡＴ。
配列番号６９‐セイヨウアブラナＬＰＡＡＴ。
配列番号７０‐フィトフトラインフェスタンスω３デサチュラーゼ。
配列番号７１‐タラッシオシラシュードナナω３デサチュラーゼ。
配列番号７２‐ピティウムイレギュラレω３デサチュラーゼ。
【０１１６】
一般的な技術および定義
別途具体的に定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語
は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、脂肪酸合成、トランスジェニック植物、タ
ンパク質化学、および生化学における）により一般的に理解されるのと同じ意味を有する
と解釈されるべきである。
【０１１７】
別途示されない限り、本発明で利用される、遺伝子組換えタンパク、細胞培養、および
免疫学的技術は、当業者によく知られる標準的な手順である。このような技術は、J. Per
bal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Samb
rook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laborat
ory Press (1989), T.A. Brown (エディター), Essential Molecular Biology: A Practi
cal Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (エ
ディター), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995および
1996), F.M. Ausubel et al. (エディター), Current Protocols in Molecular Biology,
Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 現在までの全てのアップデー
トを含む), Ed Harlow and David Lane (エディター), Antibodies: A Laboratory Manua
l, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988),および J.E. Coligan et al. (エディター
), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (現在までの全てのアップデ
ートを含む)のようなソースにおける文献を通じて記載され、および説明される。
【０１１８】
用語「および／または」、例えば、「Ｘおよび／またはＹ」は、「ＸおよびＹ」または
「ＸまたはＹ」のいずれかを意味することが理解されるべきであり、両方の意味について
、または一方の意味について、明示的なサポートを提供すると解釈されるべきである。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、逆の記載がない限り、所定の値の＋／−１
０％、より好ましくは＋／−５％、より好ましくは＋／−１％を指す。
【０１２０】
本明細書を通じて、用語「含む（include）」または「含む（includes）」もしくは「
含んでいる（including）」のようなバリエーションは、１つの記載された要素、整数、
もしくは工程、または群の要素、整数、もしくは工程を含むが、あらゆる他の要素、整数
、もしくは工程、または群の要素、整数、もしくは工程を排除しないことを暗示すること
が理解されるであろう。
【０１２１】
選択された定義
本明細書で使用される場合、用語「抽出植物脂質」および「単離植物脂質」は、植物ま
たは種子のようなその植物部分を、例えば、破砕することにより、抽出形態である脂質組
成物を指す。抽出脂質は、例えば、植物の種子を破砕することにより得られる比較的天然
の組成物、または全てではなくても、ほとんどの１もしくはそれ以上のもしくはそれぞれ
の、植物性物質由来の水、核酸、タンパク質、および炭水化物が取り除かれた、より精製
された組成物、であり得る。精製方法の例が、以下に記載される。一実施形態では、抽出
または単離植物の脂質は、組成物の重量により、少なくとも約６０％、少なくとも約７０
％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％（ｗ／ｗ）脂
質を含む。脂質は、室温で固体または液体であることとしてもよく、液体である場合に、
オイルであることが考えられる。一実施形態では、本発明の抽出脂質は、別のソースによ
り産生されないＤＨＡのような別の脂質（例えば、魚油由来のＤＨＡ）とブレンドされて
いない。一実施形態では、抽出後に、１もしくはそれ以上のまたは全ての、ＤＨＡに対す
るオレイン酸、ＤＨＡに対するパルミチン酸、ＤＨＡに対するリノール酸、および総ω６
脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、無傷の種子または細胞における比と比較される場合に、有
意に変化していない（例えば、１０％または５％以下の変化）。別の実施形態では、抽出
植物脂質は、無傷の種子または細胞における比と比較される場合に、１もしくはそれ以上
のまたは全ての、ＤＨＡに対するオレイン酸、ＤＨＡに対するパルミチン酸、ＤＨＡに対
するリノール酸、および総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比を変化させるかもしれない、水
素化または分画法のような手順にさらされていない。本発明の抽出植物脂質がオイルにお
いて含まれる場合、オイルは、ステロールのような、非脂肪酸分子をさらに含むこととし
てもよい。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、用語「抽出植物オイル」および「単離植物オイル」は、抽
出植物脂質または単離植物脂質を含み、室温で液体である、物質または組成物を指す。オ
イルは、植物または種子のようなその一部から得られる。抽出または単離オイルは、例え
ば、植物の種子を破砕することにより得られる比較的天然の組成物、または全てではなく
ても、ほとんどの１もしくはそれ以上のもしくはそれぞれの、植物性物質由来の水、核酸
、タンパク質、および炭水化物が取り除かれた、より精製された組成物、であり得る。組
成物は、脂質または非脂質である他の成分を含むこととしてもよい。一実施形態では、オ
イル組成物は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なく
とも約９０％、または少なくとも約９５％（ｗ／ｗ）抽出植物脂質を含む。一実施形態で
は、本発明の抽出されたオイルは、別のソース（例えば、魚油由来のＤＨＡ）により産生
されていないＤＨＡのような別のオイルによりブレンドされていない。一実施形態では、
抽出後に、１もしくはそれ以上のまたは全ての、ＤＨＡに対するオレイン酸、ＤＨＡに対
するパルミチン酸、ＤＨＡに対するリノール酸、および総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比
は、無傷の種子または細胞における比と比較される場合に、有意に変化していない（例え
ば、１０％または５％以下の変化）。別の実施形態では、抽出植物オイルは、無傷の種子
または細胞における比と比較される場合に、１もしくはそれ以上のまたは全ての、ＤＨＡ
に対するオレイン酸、ＤＨＡに対するパルミチン酸、ＤＨＡに対するリノール酸、および
総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比を変化させるかもしれない、水素化または分画法のよう
な手順にさらされていない。本発明の抽出植物オイルは、ステロールのような非脂肪酸分
子を含むこととしてもよい。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「オイル」は、主に脂質を含み、常温で液体である組成物
である。例えば、本発明のオイルは、好ましくは、重量により、少なくとも７５％、少な
くとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％の脂質を含む。典型的には、
精製されたオイルは、オイルにおける脂質の重量による少なくとも９０％トリアシルグリ
セロール（ＴＡＧ）を含む。ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、
リン脂質、およびステロールのようなオイルの微量な成分は、本明細書に記載されるよう
に存在することとしてもよい。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、用語「脂肪酸」は、飽和または不飽和の長い脂肪族末端を
有することが多い、カルボン酸（または、有機酸）を指す。典型的に、脂肪酸は、少なく
とも８炭素原子の長さ、より好ましくは少なくとも１２炭素の長さの炭素‐炭素結合鎖を
有する。最も天然に発生する脂肪酸は、それらの生合成が２つの炭素原子を有するアセテ
ートを伴うため、同じ数の炭素原子を有する。脂肪酸は、遊離状態（非エステル化）にお
けるもの、またはトリグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、アシル
‐ＣｏＡ（チオ‐エステル）結合、もしくは他の結合形態の一部ような、エステル化形態
におけるものであることとしてもよい。脂肪酸は、ホスファチジルコリン、ホスファチジ
ルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチ
ジルイノシトール、またはジホスファチジルグリセロール形態のような、リン脂質として
のエステル化であることとしてもよい。
【０１２５】
「飽和脂肪酸」は、あらゆる二重結合、または鎖に沿う他の官能基を含まない。用語「
飽和」は、水素を指し、全ての炭素（カルボン酸［‐ＣＯＯＨ］基から離れてている）が
、できるだけ多くの水素を含む。つまり、オメガ（ω）端部は３つの水素（ＣＨ３‐）を
含み、鎖内の各炭素は２つの水素（‐ＣＨ２‐）を含む。
【０１２６】
「不飽和脂肪酸」は、各アルケンが、二重に結合された「‐ＣＨ＝ＣＨ‐」部分（つま
り、別の炭素に対して二重に結合された炭素）により、鎖の一重に結合された「‐ＣＨ２
‐ＣＨ２‐」部分を置換し、１またはそれ以上のアルケン官能基が鎖に沿って存在するこ
とを除いて、飽和脂肪酸に対して類似の形態である。二重結合の両側に結合された鎖にお
ける２つの隣の炭素原子は、シスまたはトランス構造で生じ得る。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、用語「一価不飽和脂肪酸」は、その炭素鎖において少なく
とも１２の炭素原子および鎖におけるただ１つのアルケン基（炭素‐炭素二重結合）を含
む、脂肪酸を指す。本明細書で使用される場合、用語「多価不飽和脂肪酸」または「ＰＵ
ＦＡ」は、その炭素鎖において少なくとも１２の炭素原子および少なくとも２つのアルケ
ン基（炭素‐炭素二重結合）を含む、脂肪酸を指す。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、用語「長鎖多価不飽和脂肪酸」および「ＬＣ‐ＰＵＦＡ」
は、その炭素鎖において少なくとも２０の炭素原子および少なくとも２つの炭素‐炭素二
重結合を含む、脂肪酸を指し、よって、ＶＬＣ‐ＰＵＦＡを含む。本明細書で使用される
場合、用語「非常に長い長鎖多価不飽和脂肪酸」および「ＶＬＣ‐ＰＵＦＡ」は、その炭
素鎖において少なくとも２２の炭素原子および少なくとも３つの炭素‐炭素二重結合を含
む、脂肪酸を指す。脂肪酸の炭素鎖における炭素原子の数は、通常、分岐していない炭素
鎖を指す。炭素鎖が分岐されている場合、炭素原子の数は、側鎖におけるものを除外する
。一実施形態において、長鎖多価不飽和脂肪酸は、ω３脂肪酸であり、つまり、脂肪酸の
メチル端部から３番目の炭素‐炭素結合において、不飽和化（炭素‐炭素二重結合）を有
する。別の実施形態では、長鎖多価不飽和脂肪酸は、ω６脂肪酸であり、つまり、脂肪酸
のメチル端部から６番目の炭素‐炭素結合において、不飽和化（炭素‐炭素二重結合）を
有する。さらなる実施形態では、長鎖多価不飽和脂肪酸は、アラキドン酸（ＡＲＡ、２０
：４Δ５、８、１１、１４；ω６）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ、２０：４Δ８、１
１、１４、１７、ω３）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５Δ５、８、１１、１
４、１７；ω３）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ、２２：５Δ７、１０、１３、１６、１
９、ω３）、またはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ，２２：６Δ４、７、１０、１３、１６
、１９、ω３）からなる群から選択される。また、ＬＣ‐ＰＵＦＡは、ジホモ‐γ‐リノ
ール酸（ＤＧＬＡ）またはエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ、２０：３Δ１１、１４、１７
、ω３）であることとしてもよい。本発明により産生されるＬＣ‐ＰＵＦＡは、上記のあ
らゆるまたは全ての混合物であることとしてもよく、他のＬＣ‐ＰＵＦＡまたはこれらの
ＬＣ‐ＰＵＦＡのあらゆる誘導体を含むこととしてもよいことは、容易に明らかになるで
あろう。好ましい実施形態では、ω３脂肪酸は、少なくともＤＨＡ、好ましくは、ＤＰＡ
およびＤＨＡ、またはＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡである。
【０１２９】
さらに、本明細書で使用される場合、用語「長鎖多価不飽和脂肪酸」および「非常に長
い長鎖多価不飽和脂肪酸」は、遊離状態（非エステル化）における、または、トリグリセ
リド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、アシル‐ＣｏＡ結合、もしくは他の
結合形態の一部のようなエステル化形態におけるである脂肪酸を指す。脂肪酸は、ホスフ
ァチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホ
スファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、またはジホスファチジルグリ
セロール形態のような、リン脂質としてエステル化されることとしてもよい。よって、Ｌ
Ｃ‐ＰＵＦＡは、細胞の脂質、または細胞、組織、または生物から抽出された脂質もしく
は精製されたオイルにおける混合物の形態で存在することとしてもよい。好ましい実施形
態においては、本発明は、少なくとも７５％または少なくとも８５％のトリアシルグリセ
ロールを含み、ＬＣ‐ＰＵＦＡを含む少なくとも前記のトリアシルグリセロールを有する
、言及したもののような他の形態の脂質として残りが存在する、オイルを提供する。後に
、オイルは、さらに精製され、または、例えば、遊離脂肪酸を放出するために強塩基での
加水分解により、もしくは蒸留等により処理されることとしてもよい。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「総ω６脂肪酸」または「総ω６脂肪酸含有量」等は、そ
の内容が測定される場合に、総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表される、抽出脂質
、オイル、遺伝子組換え（recombinanat）細胞、植物部分、または種子におけるエステル
化および非エステル化ω６脂肪酸の全ての合計を指す。これらのω６脂肪酸は、（もし存
在する場合には）ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、およびω６‐ＤＰＡを含み
、あらゆるω３脂肪酸および一価不飽和脂肪酸を除外する。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「新ω６脂肪酸」または「新ω６脂肪酸含有量」等は、そ
の内容が測定される場合に、総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表される、抽出脂質
、オイル、遺伝子組換え細胞、植物部分、または種子における、ＬＡを除く、エステル化
および非エステル化ω６脂肪酸の全ての合計を指す。これらの新ω６脂肪酸は、細胞内に
導入される遺伝子コンストラクト（外因性ポリヌクレオチド）の発現による本発明の細胞
、植物、植物部分、および種子で産生される脂肪酸であり、（もし存在する場合には）Ｇ
ＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡおよびω６‐ＤＰＡを含むが、ＬＡおよびあらゆるω３
脂肪酸および一価不飽和脂肪酸を除外する。例示的な総ω６脂肪酸含有量および新ω６脂
肪酸含有量は、実施例１に記載されるように、ＦＡＭＥへのサンプルにおける脂肪酸の転
換およびＧＣによる分析により測定される。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「総ω３脂肪酸」または「総ω３脂肪酸含有量」等は、そ
の内容が測定される場合に、総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表される、抽出脂質
、オイル、遺伝子組換え細胞、植物部分、または種子におけるエステル化および非エステ
ル化ω３脂肪酸の全ての合計を指す。これらのω３脂肪酸は、（もし存在する場合には）
ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡを含み、あらゆるω
６脂肪酸および一価不飽和脂肪酸を除外する。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「新ω３脂肪酸」または「新ω３脂肪酸含有量」等は、そ
の内容が測定される場合に、総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表される、抽出脂質
、オイル、遺伝子組換え細胞、植物部分、または種子における、ＡＬＡを除く、エステル
化および非エステル化ω３脂肪酸の全ての合計を指す。これらの新ω３脂肪酸は、細胞内
に導入される遺伝子コンストラクト（外因性ポリヌクレオチド）の発現による本発明の細
胞、植物、植物部分、および種子で産生される脂肪酸であり、（もし存在する場合には）
ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡを含むが、ＡＬＡおよびあら
ゆるω６脂肪酸および一価不飽和脂肪酸を除外する。例示的な総ω３脂肪酸含有量および
新ω３脂肪酸含有量は、実施例１に記載されるように、ＦＡＭＥへのサンプルにおける脂
肪酸の転換およびＧＣによる分析により測定される。
【０１３４】
本発明で使用される、デサチュラーゼ、エロンガーゼ、およびアシルトランスフェラー
ゼタンパク質、並びにそれらをコードする遺伝子は、あらゆる当該技術分野で知られるも
の、または相同体、またはこれらの誘導体である。このような遺伝子およびコードされる
タンパク質サイズの例は、表１に挙げられる。ＬＣ‐ＰＵＦＡ生合成に関与することが示
されたデサチュラーゼ酵素は全て、いわゆる「フロントエンド」のデサチュラーゼの群に
属する。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、用語「フロントエンドのデサチュラーゼ」は、３つの高度
に保存されたヒスチジンボックスを含む、典型的な脂肪酸デサチュラーゼドメインに沿っ
て、Ｎ末端シトクロムｂ５ドメインの存在により構造的に特徴づけられる、脂質のアシル
鎖の既存の不飽和部分とカルボキシル基との間の二重結合を導入するクラスの酵素のメン
バーを指す（Napier et al., 1997）。
【０１３６】
本発明における使用に関するあらゆるエロンガーゼまたはデサチュラーゼの活性は、例
えば、酵母細胞、植物細胞のような細胞における、または好ましくは体性の胚もしくはト
ランスジェニック植物における酵素をコードする遺伝子を発現することにより、および細
胞、胚、もしくは植物が、酵素が発現されない比較可能な細胞、胚、もしくは植物と比較
してＬＣ‐ＰＵＦＡを産生する性能を増加させたかどうかを測定することにより試験され
ることとしてもよい。
【０１３７】
一実施形態において、本発明における使用のための１またはそれ以上のデサチュラーゼ
および／またはエロンガーゼは、微細藻類から精製され得、つまり、微細藻類から精製さ
れ得るポリペプチドと同じアミノ酸配列である。
【０１３８】
一定の酵素が、本明細書に「二機能性」として具体的に記載されるが、このような用語
がないことが、特定の酵素が具体的に定義される以外の活性を有しないことを暗示する必
要はない。
【０１３９】
デサチュラーゼ
本明細書で使用される場合、用語「デサチュラーゼ」は、例えば、アシル‐ＣｏＡエス
テルのような、典型的にはエステル化形態におけるものである、脂肪酸基質のアシル基内
に炭素‐炭素二重結合を導入することが可能な酵素を指す。アシル基は、ホスファチジル
コリン（ＰＣ）のようなリン脂質に対して、またはアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）に対
して、または、好ましい実施形態ではＣｏＡに対して、エステル化されることとしてもよ
い。よって、デサチュラーゼは、概して、３つのグループにカテゴライズされることとし
てもよい。一実施形態では、デサチュラーゼは、フロントエンドのデサチュラーゼである
。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「Δ４‐デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシル
末端から４番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応
を行うタンパク質を指す。「Δ４‐デサチュラーゼ」は、ＤＰＡをＤＨＡに転換すること
が少なくとも可能である。ＤＰＡからＤＨＡを産生するための不飽和化工程は、哺乳類以
外の生物におけるΔ４‐デサチュラーゼにより触媒され、この酵素をコードする遺伝子は
、淡水性の原生生物種ユーグレナグラシリスおよび海洋種スラウストキトリウム（Thraus
tochytrium）種から単離された(Qiu et al., 2001; Meyer et al., 2003)。一実施形態に
おいて、Δ４‐デサチュラーゼは、配列番号４１に規定される配列を有するアミノ酸、も
しくはスラウストキトリウム種Δ４‐デサチュラーゼ、その生物学的に活性な断片、また
は配列番号４１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１４１】
ＬＣ‐ＰＵＦＡ生合成に関連するクローン化遺伝子
【表１】
2020172643.tif 000002
2020172643.tif 000003
2020172643.tif 000004
2020172643.tif 000005
2020172643.tif 000006
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「Δ５‐デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシル
末端から５番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応
を行うタンパク質を指す。Δ５‐デサチュラーゼの例は、Ruiz-Lopez et al. (2012)およ
びPetrie et al. (2010a)および本明細書の表１に挙げられる。一実施形態において、Δ
５‐デサチュラーゼは、配列番号３０に規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的
に活性な断片、または配列番号３０と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、Δ５‐デサチュラーゼは、配列番号３２に規定される配列を有するア
ミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号３２と少なくとも５３％同一である
アミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ５‐デサチュラーゼは、スラウストキトリウ
ム種またはエミリアニアハクスレイ由来である。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「Δ６‐デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシル
末端から６番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応
を行うタンパク質を指す。Δ６‐デサチュラーゼの例は、Ruiz-Lopez et al. (2012)およ
びPetrie et al. (2010a)および本明細書の表１に挙げられる。好ましいΔ６‐デサチュ
ラーゼは、ミクロモナス・プシラ、ピティウムイレギュラレ、またはオストレオコッカス
タウリ由来である。
【０１４４】
一実施形態では、Δ６‐デサチュラーゼは、少なくとも２つの、好ましくは全ての３つ
の、および好ましくは植物細胞において、以下の事項：ｉ）脂肪酸基質としてのリノール
酸（ＬＡ、１８：２Δ９、１２、ω６）よりも高いα‐リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３Δ
９、１２、１５、ω３）でのΔ６‐デサチュラーゼ活性；ｉｉ）脂肪酸基質としてのＰＣ
のＳｎ‐２位置に結合するＡＬＡよりも高い脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡでのΔ６
‐デサチュラーゼ活性；およびｉｉｉ）ＥＴｒＡでのΔ８‐デサチュラーゼ活性、を有す
ることによりさらに特徴づけられる。このようなΔ６‐デサチュラーゼの例は、表２に提
供される。
【０１４５】
一実施形態では、Δ６‐デサチュラーゼは、ω３基質で、対応するω６基質よりも高い
活性を有し、植物細胞のような遺伝子組換え細胞における外因性ポリヌクレオチドから発
現される場合には、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましく
は少なくとも５０％、または、酵母細胞で発現される場合には、少なくとも３５％、の効
率で、オクタデカテトラエン酸（ステアリドン酸、ＳＤＡ、１８：４Δ６、９、１２、１
５、ω３）を産生するために、ＡＬＡで活性を有する。一実施形態において、Δ６‐デサ
チュラーゼは、より高い活性、例えば、脂肪酸基質としてのＡＬＡでＬＡよりも少なくと
も約２倍高いΔ６‐デサチュラーゼ活性を有する。別の実施形態では、Δ６‐デサチュラ
ーゼは、より高い活性、例えば、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、脂肪酸基質とし
てのＰＣのＳｎ‐２位置に結合するＡＬＡよりも、少なくとも５倍のΔ６‐デサチュラー
ゼ活性または少なくとも１０倍高い活性を有する。さらなる実施形態では、Δ６‐デサチ
ュラーゼは、脂肪酸基質ＡＬＡ‐ＣｏＡおよびＰＣのＳｎ‐２位置に結合するＡＬＡの両
方で活性を有する。
【０１４６】
アシル‐ＣｏＡ基質で活性を有することが実証されたデサチュラーゼ
【表２】
2020172643.tif 000007
【０１４７】
一実施形態において、Δ６‐デサチュラーゼは、ＥＴＡで検出可能なΔ５‐デサチュラ
ーゼ活性を有しない。別の実施形態では、Δ６‐デサチュラーゼは、配列番号１６、配列
番号１９、もしくは配列番号２０で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活
性な断片、または配列番号１６、配列番号１９、もしくは配列番号２０と少なくとも７７
％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ６‐デサチュラーゼは、配列番
号１９もしくは配列番号２０で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な
断片、または配列番号１９もしくは配列番号２０の１つもしくは両方と少なくとも６７％
同一であるアミノ酸配列を含む。また、Δ６‐デサチュラーゼは、Δ８‐デサチュラーゼ
活性を有することとしてもよい。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「Δ８‐デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシル
末端から８番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応
を行うタンパク質を指す。Δ８‐デサチュラーゼは、ＥＴｒＡをＥＴＡに転換することが
少なくとも可能である。Δ８‐デサチュラーゼの例は、表１に挙げられる。一実施形態に
おいて、Δ８‐デサチュラーゼは、配列番号５２に規定される配列を有するアミノ酸、そ
の生物学的に活性な断片、または配列番号５２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配
列を含む。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「ω３‐デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のメチル末端か
ら３番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行う
タンパク質を指す。よって、ω３‐デサチュラーゼは、ＬＡをＡＬＡにおよびＧＬＡをＳ
ＤＡに（全てＣ１８脂肪酸）、またはＤＧＬＡをＥＴＡにおよび／もしくはＡＲＡをＥＰ
Ａに（Ｃ２０脂肪酸）転換することとしてもよい。いくつかのω３‐デサチュラーゼ（グ
ループＩ）は、植物およびラン藻のω３‐デサチュラーゼのような、Ｃ１８基質でのみ活
性を有する。このようなω３‐デサチュラーゼは、Δ１５‐デサチュラーゼでもある。他
のω３‐デサチュラーゼは、Ｃ２０基質で活性を有し、Ｃ１８基質で活性を有さず（グル
ープＩＩ）またはいくつかの活性を有する（グループＩＩＩ）。このようなω３‐デサチ
ュラーゼは、Δ１７‐デサチュラーゼでもある。好ましいω３‐デサチュラーゼは、ピキ
ア・パストリスω３‐デサチュラーゼ（配列番号１２）のような、ＬＡをＡＬＡに、ＧＬ
ＡをＳＤＡに、ＤＧＬＡをＥＴＡに、およびＡＲＡをＥＰＡに転換するグループＩＩＩタ
イプである。ω３‐デサチュラーゼの例は、Pereira et al. (2004a)（魚類の内臓真菌症
菌（Saprolegnia diclina）ω３‐デサチュラーゼ、グループＩＩ）、Horiguchi et al. 
(1998)、Berberich et al. (1998)、およびSpychalla et al. (1997)（線虫ω３‐デサチ
ュラーゼ、グループＩＩＩ）により記載されるものを含む。好ましい実施形態では、ω３
‐デサチュラーゼは、真菌のω３‐デサチュラーゼである。本明細書で使用される場合、
「真菌のω３‐デサチュラーゼ」は、卵菌ソースを含む真菌ソース由来、またはアミノ酸
配列がこれらに対して少なくとも９５％同一であるこれらの変異体である、ω３‐デサチ
ュラーゼを指す。多数のω３‐デサチュラーゼをコードする遺伝子は、例えば、フィトフ
トラインフェスタンス（受入番号ＣＡＪ３０８７０、国際公開第２００５０８３０５３号
；配列番号７０）、魚類の内臓真菌症菌（受入番号ＡＡＲ２０４４４，Pereira et al., 
2004a ＆米国特許第７２１１６５６号）、ピティウムイレギュラレ（国際公開第２００８
０２２９６３号，グループＩＩ；配列番号７２）、モルティエレラアルピナ（Sakuradani
et al., 2005；受入番号ＢＡＤ９１４９５；国際公開第２００６０１９１９２号）、タ
ラッシオシラシュードナナ（Armbrust et al., 2004;受入番号ＸＰ＿００２２９１０５７
；国際公開第２００５０１２３１６号、配列番号７１）、ラカンセア・クルイベリ（サッ
カロマイセスクルイベリ（Saccharomyces kluyveri）としても知られる；Oura et al., 2
004；受入番号ＡＢ１１８６６３）由来の真菌ソースから単離された。Xue et al. (2012)
は、Ｃ２０基質について好ましい、ω６脂肪酸基質を対応するω３脂肪酸に効率的に転換
することができた、つまり、それらはΔ１５‐デサチュラーゼ活性よりも強いΔ１７‐デ
サチュラーゼ活性を有した、卵菌ピティウムアファニデルマツム（Pythium aphanidermat
um）、フィトフトラソジャエ（Phytophthora sojae）、およびフィトフトララモラム（Ph
ytophthora ramorum）由来のω３‐デサチュラーゼを記載する。これらの酵素は、Δ１２
‐デサチュラーゼ活性を欠くが、基質としてのアシル‐ＣｏＡおよびリン脂質フラクショ
ンの両方における脂肪酸を使用することができた。
【０１５０】
より好ましい実施形態では、真菌ω３‐デサチュラーゼは、ピキア・パストリス（コマ
ガタエラパストリス（Komagataella pastoris）としても知られる）ω３‐デサチュラー
ゼ／Δ１５‐デサチュラーゼ（Zhang et al., 2008;受入番号ＥＦ１１６８８４；配列番
号１２）、またはこれらと少なくとも９５％同一であるポリペプチドである。
【０１５１】
一実施形態では、ω３‐デサチュラーゼは、少なくとも、ＡＲＡをＥＰＡに、ＤＧＬＡ
をＥＴＡに、ＧＬＡをＳＤＡに、のうち１つを、ＡＲＡをＥＰＡにおよびＤＧＬＡをＥＴ
Ａに、の両方を、ＡＲＡをＥＰＡにおよびＧＬＡをＳＤＡに、の両方を、またはこれら３
つの全てを転換することができる。
【０１５２】
一実施形態において、ω３‐デサチュラーゼは、少なくとも３つの炭素‐炭素二重結合
、好ましくはＡＲＡを有する、Ｃ２０脂肪酸で、Δ１７‐デサチュラーゼ活性を有する。
別の実施形態では、ω３‐デサチュラーゼは、３つの炭素‐炭素二重結合、好ましくはＧ
ＬＡを有するＣ１８脂肪酸で、Δ１５‐デサチュラーゼ活性を有する。好ましくは、両方
の活性が存在する。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「Δ１２‐デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシ
ル末端から１２番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ
反応を行うタンパク質を指す。Δ１２‐デサチュラーゼは、典型的には、オレオイル-ホ
スファチジルコリンまたはオレオイル‐ＣｏＡのいずれかを、リノレオイル−ホスファチ
ジルコリン（１８：１‐ＰＣ）またはリノレオイル‐ＣｏＡ（１８：ｌ‐ＣｏＡ）にそれ
ぞれ転換する。基質に結合されたＰＣを用いるサブクラスは、リン脂質依存性のΔ１２‐
デサチュラーゼを、後者のサブクラス（sublclass）はアシル−ＣｏＡ依存性のΔ１２‐
デサチュラーゼを指す。植物および真菌Δ１２‐デサチュラーゼは、概して前者のサブク
ラスであるのに対して、動物のΔ１２‐デサチュラーゼ、例えば、Zhou et al. (2008)に
よる昆虫からクローン化された遺伝子によりコードされるΔ１２‐デサチュラーゼは後者
のサブクラスである。多くの他のΔ１２‐デサチュラーゼ配列は、配列のデータベースを
サーチすることにより容易に同定され得る。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「Δ１５‐デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシ
ル末端から１５番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ
反応を行うタンパク質を指す。Δ１５‐デサチュラーゼをコードする多数の遺伝子は、植
物および真菌の種からクローン化された。例えば、米国特許第５９５２５４４号は、植物
Δ１５‐デサチュラーゼ（ＦＡＤ３）をコードする核酸を記載する。これらの酵素は、植
物Δ１５‐デサチュラーゼの特性であったアミノ酸モチーフを含む。国際公開第２００１
１４５３８号は、ダイズＦＡＤ３をコードする遺伝子を記載する。多くの他のΔ１５‐デ
サチュラーゼ配列は、配列データベースをサーチすることにより、容易に同定され得る。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、「Δ１７‐デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシ
ル末端から１７番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ
反応を行うタンパク質を指す。Δ１７‐デサチュラーゼは、もしそれがω３結合で不飽和
化を導入するためにＣ２０基質で作用する場合には、ω３‐デサチュラーゼであるとも考
えられる。
【０１５６】
好ましい実施形態では、Δ１２‐デサチュラーゼおよび／またはΔ１５‐デサチュラー
ゼは、真菌Δ１２‐デサチュラーゼまたは真菌Δ１５‐デサチュラーゼである。本明細書
で使用される場合、「真菌Δ１２‐デサチュラーゼ」または「真菌のΔ１５‐デサチュラ
ーゼ」は、卵菌ソースを含む真菌ソース、または、アミノ酸配列がこれらに対して少なく
とも９５％同一である、これらの変異体由来である、Δ１２‐デサチュラーゼまたはΔ１
５‐デサチュラーゼを指す。多数のデサチュラーゼをコードする遺伝子は、真菌のソース
から単離された。米国特許第７２１１６５６号は、魚類の内臓真菌症菌由来のΔ１２デサ
チュラーゼを記載する。国際公開第２００９０１６２０２号は、Helobdella robusta、オ
オキツネタケ（Laccaria bicolor）、ナスビカサガイ（Lottia gigantea）、ミクロコレ
スクソノプラステス（Microcoleus chthonoplastes）、モノシガブレビコリス（Monosiga
brevicollis）、マイコスファエレラフィジエンシス（Mycosphaerella fijiensis）、コ
ムギ葉枯病菌（Mycospaerella graminicola）、Naegleria gruben、ネクトリアヘマトコ
ッカ（Nectria haematococca）、ネマトステラベクテンシス（Nematostella vectensis）
、フィコマイセスブレイクスリーアヌス（Phycomyces blakesleeanus）、トリコデルマレ
シイ（Trichoderma resii）、ヒメツリガネゴケ、ポスティアプラセンタ（Postia placen
ta）、イヌカタヒバ（Selaginella moellendorffii）、およびミクロドキウムニバレ（Mi
crodochium nivale）由来の真菌のデサチュラーゼを記載する。国際公開第２００５／０
１２３１６号は、タラッシオシラシュードナナおよび他の真菌類由来のΔ１２‐デサチュ
ラーゼを記載する。国際公開第２００３／０９９２１６号は、アカパンカビ、アスペルギ
ルスニデュランス、灰色かび病菌およびモルティエレラアルピナから単離された真菌のΔ
１２‐デサチュラーゼおよびΔ１５‐デサチュラーゼをコードする遺伝子を記載する。国
際公開第２００７１３３４２５号は、サッカロマイセスクルイベリ、モルティエレラアル
ピナ、アスペルギルスニデュランス、アカパンカビ、フザリウムグラミニアラム（Fusari
um graminearum）、フザリウムモニリフォルメ（Fusarium moniliforme）、およびマグネ
ポルテグリセア（Magnaporthe grisea）から単離される真菌のΔ１５デサチュラーゼを記
載する。好ましいΔ１２デサチュラーゼは、フィトフトラソジャエ由来である（Ruiz-Lop
ez et al., 2012）。
【０１５７】
真菌のΔ１２‐デサチュラーゼおよび真菌のΔ１５‐デサチュラーゼの別個のサブクラ
スが、二機能性の真菌のΔ１２／Δ１５‐デサチュラーゼである。これらをコードする遺
伝子は、フザリウムモリノフォルメ（Fusarium monoliforme）(受入番号ＤＱ２７２５１
６、Damude et al., 2006)、アカントアメーバカステラーニ（Acanthamoeba castellanii
）(受入番号ＥＦ０１７６５６、Sayanova et al., 2006)、パーキンサスマリヌス（Perki
nsus marinus）(国際公開第２００７０４２５１０号)、麦角病菌（Claviceps purpurea）
(受入番号ＥＦ５３６８９８、Meesapyodsuk et al., 2007)、およびネナガヒトヨタケ（C
oprinus cinereus）(受入番号ＡＦ２６９２６６、Zhang et al., 2007)からクローン化さ
れた。
【０１５８】
別の実施形態では、ω３‐デサチュラーゼが、アシル‐ＣｏＡ基質で、対応するアシル
‐ＰＣ基質と少なくとも同じ活性、好ましくはより高い活性を有する。本明細書で使用さ
れる場合、「対応するアシル‐ＰＣ基質」は、脂肪酸がアシル‐ＣｏＡ基質におけるもの
と同じ脂肪酸である、ホスファチジルコリン（ＰＣ）のｓｎ‐２位置でエステル化された
脂肪酸を指す。例えば、アシル‐ＣｏＡ基質はＡＲＡ‐ＣｏＡであることとしてもよく、
対応するアシル‐ＰＣ基質はｓｎ‐２ＡＲＡ−ＰＣであることとしてもよい。一実施形態
では、活性は少なくとも２倍以上高い。好ましくは、ω３‐デサチュラーゼは、アシル‐
ＣｏＡ基質とその対応するアシル‐ＰＣ基質の両方で少なくとも同じ活性を有し、Ｃ１８
およびＣ２０基質の両方で活性を有する。このようなω３‐デサチュラーゼの例は、上記
に挙げられたクローン化された真菌デサチュラーゼ間で知られる。
【０１５９】
さらなる実施形態では、ω３‐デサチュラーゼは、配列番号１２に規定される配列を有
するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号１２と少なくとも６０％同じ
である、好ましくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％配列番号１２と同じで
あるアミノ酸配列を含む。
【０１６０】
さらに、さらなる実施形態では、本発明における使用のためのデサチュラーゼは、アシ
ル‐ＣｏＡ基質で、対応するアシル‐ＰＣ基質よりも高い活性を有する。別の実施形態で
は、本発明における使用のためのデサチュラーゼは、アシル‐ＰＣ基質で、対応するアシ
ル‐ＣｏＡ基質よりも高い活性を有するが、両方の基質でいくつかの活性を有する。上記
に概説したように、「対応するアシル‐ＰＣ基質」は、脂肪酸がアシル‐ＣｏＡ基質にお
けるものと同じ脂肪酸である、ホスファチジルコリン（ＰＣ）のｓｎ‐２位置でエステル
化された脂肪酸を指す。一実施形態では、より高い活性は少なくとも２倍以上高い。一実
施形態では、デサチュラーゼは、Δ５もしくはΔ６‐デサチュラーゼ、またはω３‐デサ
チュラーゼであって、その例が提供されるが、表２に挙げられたものに限定されない。ど
の基質でデサチュラーゼが作用するのかを、すわなち、アシル‐ＣｏＡまたはアシル‐Ｐ
Ｃ基質で、試験するために、分析が、Domergue et al. (2003)および(2005)に記載される
ように、酵母細胞で行われ得る。また、デサチュラーゼについてのアシル‐ＣｏＡ基質性
能が、エロンガーゼの場合に推論され得、デサチュラーゼ（desturase）とともに発現さ
れる場合、エロンガーゼがデサチュラーゼの産生物の伸長を触媒する、少なくとも約９０
％の植物細胞における酵素的な転換効率を有する。これに基づき、ＧＡ７コンストラクト
（実施例２および３）およびその変異体（実施例５）から発現されるΔ５‐デサチュラー
ゼおよびΔ４‐デサチュラーゼが、それらの個々のアシル‐ＣｏＡ基質、ＥＴＡ‐ＣｏＡ
、およびＤＰＡ‐ＣｏＡを不飽和化することを可能にする。
【０１６１】
エロンガーゼ
生化学的証拠が、脂肪酸伸長が４つの工程：濃縮、還元、脱水、および第２の還元から
なることを示唆する。本発明の内容において、「エロンガーゼ」は、適切な生理的条件下
で、伸長複合体の他のメンバーの存在下で凝縮工程を触媒するポリペプチドを指す。伸長
タンパク質複合体の凝縮成分（「エロンガーゼ」）のみの細胞における異種性または相同
性発現が、個々のアシル鎖の伸長のために必要とされることが示された。よって、導入さ
れたエロンガーゼが、成功的なアシル伸長を行うためのトランスジェニック宿主からの還
元および脱水作業を成功的に採用することができる。鎖の長さに対する鎖延長反応の特異
性または脂肪酸基質の不飽和化の程度が、凝縮成分に存在することが考えられる。また、
この成分は、鎖延長反応において律速であることが考えられる。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「Δ５‐エロンガーゼ」は、ＥＰＡをＤＰＡに転換するこ
とが少なくとも可能である。Δ５‐エロンガーゼの例は、国際公開第２００５／１０３２
５３号に開示されるものを含む。一実施形態において、Δ５‐エロンガーゼは、少なくと
も６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、または
最も好ましくは８０％もしくは９０％の効率でＤＰＡを産生するために、ＥＰＡで活性を
有する。さらなる実施形態では、Δ５‐エロンガーゼは、配列番号３７に規定されるアミ
ノ酸配列、その生物学的に活性な断片、または配列番号３７と少なくとも４７％同一であ
るアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、Δ６‐エロンガーゼは、オストレオコッ
カスタウリまたはオストレオコッカスルシマリヌス由来である（米国出願公開第２０１０
／０８８７７６号）。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、「Δ６‐エロンガーゼ」は、ＳＤＡをＥＴＡに少なくとも
転換することができる。Δ６‐エロンガーゼの例は、表１に挙げられるものを含む。一実
施形態において、エロンガーゼは、配列番号２５に規定される配列を有するアミノ酸、そ
の生物学的に活性な断片（例えば、配列番号２６に規定されるフラグメント）、または配
列番号２５もしくは配列番号２６の１つもしくは両方と少なくとも５５％同一であるアミ
ノ酸配列を含む。一実施形態では、Δ６‐エロンガーゼは、ヒメツリガネゴケ（Zank et 
al., 2002;受入番号ＡＦ４２８２４３）またはタラシオシラシュードナナ（Tlialassiosi
ra pseudonana）（Ruiz-Lopez et al., 2012）由来である。
【０１６４】
本明細書で使用される場合、「Δ９‐エロンガーゼ」は、ＡＬＡをＥＴｒＡに少なくと
も転換することができる。Δ９‐エロンガーゼの例は、表１にあげられるものを含む。一
実施形態において、Δ９‐エロンガーゼは、配列番号４３に規定される配列を有するアミ
ノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号４３と少なくとも８０％同一であるア
ミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ９‐エロンガーゼは、配列番号４６に規定され
る配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号４６と少なくとも
８１％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ９‐エロンガーゼは、配列
番号４８に規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番
号４８と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ９‐エ
ロンガーゼは、配列番号５０に規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な
断片、または配列番号５０と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる
実施形態では、Δ９‐エロンガーゼは、ω６基質で対応するω３基質よりも高い活性を有
し、またはその逆である。
【０１６５】
本明細書で使用される場合、用語「ω６基質で対応するω３基質よりも高い活性を有す
る」は、ω３デサチュラーゼの作用により異なる基質での酵素の相対的な活性を指す。好
ましくは、ω６基質はＬＡであり、ω３基質はＡＬＡである。
【０１６６】
Δ６‐エロンガーゼおよびΔ９‐エロンガーゼ活性を有するエロンガーゼは、（ｉ）Ｓ
ＤＡをＥＴＡに転換すること、および（ｉｉ）ＡＬＡをＥＴｒＡに変換することが少なく
とも可能であり、Δ９‐エロンガーゼ活性よりも高いΔ６‐エロンガーゼ活性を有する。
一実施形態において、エロンガーゼは、ＥＴＡを産生するために、ＳＤＡで、少なくとも
５０％、より好ましくは少なくとも６０％の転換の効率、および／またはＥＴｒＡを産生
するために、ＡＬＡで、少なくとも６％もしくはより好ましくは少なくとも９％の転換の
効率を有する。別の実施形態では、エロンガーゼは、Δ９‐エロンガーゼ活性よりも少な
くとも約６．５倍高いΔ６‐エロンガーゼ活性を有する。さらなる実施形態では、エロン
ガーゼは、検出可能なΔ５‐エロンガーゼ活性を有していない。
【０１６７】
他の酵素
本明細書で使用される場合、用語「１‐アシル‐グリセロール‐３‐ホスフェートアシ
ルトランスフェラーゼ」（ＬＰＡＡＴ）は、リゾホスファチジン酸‐アシルトランスフェ
ラーゼまたはアシルＣｏＡ‐リゾホスファチジン酸‐アシルトランスフェラーゼともよば
れ、ホスファチド酸（ＰＡ）を形成するためにｓｎ‐２位置でｓｎ‐ｌ‐アシル‐グリセ
ロール‐３‐ホスフェート（ｓｎ‐１  Ｇ‐３‐Ｐ）をアシル化するタンパク質を指す。
よって、用語「１‐アシル‐グリセロール‐３‐ホスフェートアシルトランスフェラーゼ
活性」は、ＰＡ（ＥＣ  ２．３．１．５１）を産生するための、ｓｎ‐２位置での（ｓｎ
‐１  Ｇ‐３‐Ｐ）のアシル化を指す。好ましいＬＰＡＡＴは、ＬＰＡのｓｎ‐２位置に
多価不飽和Ｃ２２アシル基を転移するために、基質として多価不飽和Ｃ２２アシル‐Ｃｏ
Ａを使用し得るものであり、ＰＡを形成する。このようなＬＰＡＡＴは、実施例１３に例
示され、そこに記載されるように試験され得る。一実施形態では、本発明のために有用な
ＬＰＡＡＴは、配列番号６３から６９のいずれか１つに規定される配列を有するアミノ酸
、その生物学的に活性な断片、または１もしくはそれ以上の配列番号６３から６９のいず
れか１つと少なくとも４０％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本
発明について有用なＬＰＡＡＴは、配列番号６４、６５、および６７のいずれか１つに規
定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または１もしくはそれ以上
の配列番号６４、６５、および６７のいずれか１つと少なくとも４０％同一であるアミノ
酸配列を含む。
【０１６８】
本明細書で使用される場合、用語「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」
（ＥＣ２．３．１．２０；ＤＧＡＴ）は、トリアシルグリセロールを産生するために、ア
シル‐ＣｏＡからジアシルグリセロール基質へと脂肪族アシル基を転移するタンパク質を
指す。よって、「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性」は、トリアシル
グリセロールを産生するための、ジアシルグリセロールへのアシル‐ＣｏＡの転移を指す
。ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、およびＤＧＡＴ３として言及される３つの既知のタイプのＤ
ＧＡＴがある。ＤＧＡＴ１ポリペプチドは、典型的には、１０の膜貫通ドメインを有し、
ＤＧＡＴ２は、典型的には、２の膜貫通ドメインを有し、一方、ＤＧＡＴ３は、典型的に
は可溶性である。ＤＧＡＴ１ポリペプチドの例は、アスペルギルスフミガーツス(受入番
号ＸＰ＿７５５１７２）、シロイヌナズナ（ＣＡＢ４４７７４）、トウゴマ（ＡＡＲ１１
４７９）、オオアブラギリ（ＡＢＣ９４４７２）、ベルノニアガラメンシス（ＡＢＶ２１
９４５、ＡＢＶ２１９４６）、ニシキギ（ＡＡＶ３１０８３）、カエノラブディティスエ
レガンス（Caenorhabditis elegans）（ＡＡＦ８２４１０）、ドブネズミ（Rattus norve
gicus）（ＮＰ＿４４５８８９）、ホモサピエンス（ＮＰ＿０３６２１１）由来のＤＧＡ
Ｔ１遺伝子によりコードされるポリペプチド、並びにその変異体および／または突然変異
体を含む。ＤＧＡＴ２ポリペプチドの例は、シロイヌナズナ （受入番号ＮＰ＿５６６９
５２）、トウゴマ（ＡＡＹ１６３２４）、オオアブラギリ（ＡＢＣ９４４７４）、モルテ
ィエレララマニアナ（ＡＡＫ８４１７９）、ホモサピエンス（Ｑ９６ＰＤ７、Ｑ５８ＨＴ
５）、ウシ（Bos taurus）（Ｑ７０ＶＤ８）、ハツカネズミ（Mus musculus）（ＡＡ８４
１７５）、ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５由来のＤＧＡＴ２遺伝子によりコードされるポ
リペプチド、並びにその変異体および／または突然変異体を含む。ＤＧＡＴ３ポリペプチ
ドの例は、ピーナッツ（peanut）(ピーナッツ（Arachis hypogaea）, Saha, et al., 200
6)由来のＤＧＡＴ３遺伝子によりコードされるポリペプチド、並びにその変異体および／
または突然変異体を含む。
【０１６９】
ポリペプチド／ペプチド
ポリペプチドの内容における用語「遺伝子組換え」は、それが天然に産生される場合の
その自然の状態と比較して、変化した量または変化した率で、細胞によりまたは細胞フリ
ーの発現システムにより産生される場合のポリペプチドを指す。一実施形態において、細
胞は、ポリペプチドを天然で産生しない細胞である。しかしながら、細胞は、産生される
ポリペプチドの変化した量を生じさせる非内因性遺伝子含む細胞であることとしてもよい
。本発明の遺伝子組換えポリペプチドは、それが産生される、細胞、組織、器官、もしく
は生物、または細胞フリー発現システムにおけるポリペプチド、つまり、それが産生され
たトランスジェニック（遺伝子組換え）細胞の他の成分から分離または精製されていない
ポリペプチド、および、その後、少なくともいくつかの他の成分から精製されるこのよう
な細胞または細胞フリーのシステムにおいて産生されるポリペプチドを含む。
【０１７０】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、概して、互換的に使用される。
【０１７１】
ポリペプチドまたはポリペプチドのクラスは、基準のアミノ酸配列に対してそのアミノ
酸配列の同一性の程度（％同一性）により、または１つの基準のアミノ酸配列に対して、
別に対するよりもより高い％同一性を有することにより、定義されることとしてもよい。
基準のアミノ酸配列に対するポリペプチドの％同一性は、典型的には、ギャップクリエー
ションペナルティ（gap creation penalty）＝５、および、ギャップエクステンションペ
ナルティ（gap extension penalty）＝０．３のパラメーターによってＧＡＰ分析（Needl
eman and Wunsch, 1970；ＧＣＧプログラム）により測定される。問い合わせ配列は、少
なくとも１５アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１５アミノ酸の領域にわ
たる２つの配列に照準を合わせる。より好ましくは、問い合わせ配列は、少なくとも５０
アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも５０アミノ酸の領域にわたる２つの配
列に照準を合わせる。より好ましくは、問い合わせ配列は、少なくとも１００アミノ酸の
長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１００アミノ酸の領域にわたる２つの配列に照準
を合わせる。さらにより好ましくは、問い合わせ配列は、少なくとも２５０アミノ酸の長
さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも２５０アミノ酸の領域にわたる２つの配列に照準を
合わせる。さらにより好ましくは、ＧＡＰ分析は、それらの全体の長さにわたる２つの配
列に照準を合わせる。ポリペプチドまたはポリペプチドのクラスは、基準ポリペプチドと
同じ酵素活性もしくは異なる活性を有し、またはその活性を欠くこととしてもよい。好ま
しくは、ポリペプチドが、基準ポリペプチドの活性の少なくとも１０％、少なくとも５０
％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の酵素的な活性を有する。
【０１７２】
本明細書で使用される場合、「生物活性」フラグメントは、例えば、デサチュラーゼお
よび／またはエロンガーゼ活性、または他の酵素活性を有するような、全長基準ポリペプ
チドの定義された活性を維持する、本明細書に定義されるポリペプチドの一部である。本
明細書で使用される生物学的に活性な断片は、全長ポリペプチドを除外する。生物学的に
活性な断片は、それらが定義された活性を維持する限り、あらゆるサイズ部分であり得る
。好ましくは、生物学的に活性な断片は、全長タンパク質の少なくとも１０％、少なくと
も５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の活性を維持する。
【０１７３】
定義されたポリペプチドまたは酵素に関し、本明細書で提供されるものよりもより高い
％同一性の形態が、好ましい実施形態を包含することが理解されるであろう。よって、適
用できる場合、最小の％同一性の形態に照らして、ポリペプチド／酵素は、関連して挙げ
られる配列番号と、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましく
は少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも７６
％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましく
は少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２
％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましく
は少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７
％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましく
は少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なく
とも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９
．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、
より好ましくは少なくとも９９．８％、およびさらにより好ましくは少なくとも９９．９
％同一であるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【０１７４】
本明細書で定義されるポリペプチドのアミノ酸配列変異体／突然変異体は、本明細書に
定義される核酸に適切なヌクレオチドの変更を導入することにより、または所望のポリペ
プチドのインビトロ合成により調製され得る。このような変異体/突然変異体は、例えば
、アミノ酸内に、残基の欠失、挿入、または置換を含む。欠失、挿入、および置換の組み
合わせは、最終的なペプチド産生物が所望の酵素活性を有することを提供する、最終的な
コンストラクトに達するために作成され得る。
【０１７５】
突然変異体（変更された）ペプチドは、あらゆる公知技術を用いて調製され得る。例え
ば、本明細書に定義されるポリヌクレオチドは、Harayama (1998)により広く記載される
ように、インビトロで突然変異誘発またはＤＮＡシャッフリング技術に供され得る。突然
変異／変更ＤＮＡ由来の産生物は、例えば、それらがデサチュラーゼまたはエロンガーゼ
活性を有する場合に、測定を行うための、本明細書に記載される技術を用いて容易にスク
リーニングされ得る。
【０１７６】
アミノ酸配列の突然変異体をデザインする際、突然変異点の場所および突然変異の性質
が、変更される特徴（複数を含む）に依存するであろう。突然変異の場所は、例えば、（
１）まず保守的なアミノ酸の選択により、その後の達成された結果による革新的な選択に
より置換し、（２）標的残基を欠失させ、または（３）位置される場所に隣り合う他の残
基を挿入することにより、個々にまたは連続して変更され得る。
【０１７７】
アミノ酸配列は、概して約１から１５の残基の範囲、より好ましくは約１から１０残基
および典型的には約１から５の連続する残基を欠失する。
【０１７８】
置換突然変異体は、除去されるポリペプチド分子における少なくとも１つのアミノ酸残
基およびその場所に挿入される異なる残基を有する。置換突然変異誘発の最も高い関心の
場所は、天然に生じるデサチュラーゼまたはエロンガーゼの中で保存されない場所を含む
。これらの場所は、好ましくは、酵素活性を維持するために、比較的保守的な態様で置換
される。このような保守的な置換は、「例示的な置換」の項目のもとに、表３で示される
。
【０１７９】
好ましい実施形態では、突然変異体／変異体ポリペプチドは、天然に生じるポリペプチ
ドと比較される場合に、唯一、または、１もしくは２もしくは３もしくは４以下の保守的
なアミノ酸変更を有する。保守的なアミノ酸の変更の詳細は、表３に提供される。当業者
が認識しているように、このような微小な変更は、遺伝子組換え細胞で発現される場合に
、ポリペプチドの活性を変更しないことが合理的に予測され得る。
【０１８０】
ポリペプチドは、当該技術分野で知られる方法に従って、天然のポリペプチドまたは遺
伝子組換えポリペプチドの産生および回収を含む、種々の方法で産生され得る。一実施形
態において、遺伝子組換えポリペプチドは、本明細書で定義される宿主細胞のような、ポ
リペプチドを産生するために有効な条件下でポリペプチドの発現を可能にする細胞を培養
することにより産生される。ポリペプチドを産生するためにより好ましい細胞は、植物に
おける細胞、特に、植物における種子である。
【０１８１】
ポリヌクレオチド
また、本発明は、例えば、遺伝子、単離ポリヌクレオチド、Ｔ‐ＤＮＡ分子のようなキ
メラ遺伝子構築物、またはキメラＤＮＡであることとしてもよい、ポリヌクレオチドを提
供しおよび／または使用する。本明細書に定義される特定の活性を行うための、ゲノムま
たは合成の起源、二本鎖または一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり、炭水化物、脂質、タ
ンパク質、または他の材料との組み合わされることとしてもよい。用語「ポリヌクレオチ
ド」は、本明細書で、用語「核酸分子」と互換的に使用される。「単離ポリヌクレオチド
」で、天然のソースから得られる場合に、その天然状態で関連しもしくは結合されるポリ
ヌクレオチド配列、または非天然で生じるポリヌクレオチドで、ポリヌクレオチド配列か
ら分離された、ポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、天
然に関連する、他の成分から、少なくとも６０％フリー、より好ましくは少なくとも７５
％フリー、およびより好ましくは少なくとも９０％フリーである。
【０１８２】
例示的な置換
【表３】
2020172643.tif 000008
【０１８３】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、非天然起源である。非天然源のポリヌ
クレオチドの例は、（本明細書に記載される方法を用いることによるような）突然変異さ
れたもの、およびタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが、（本明細書
に記載されるコンストラクトにおけるような）天然に関連していないプロモーターに操作
可能に結合されるポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
【０１８４】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」はその広い内容で解釈され、構造遺伝子の
、転写領域および翻訳される場合にはタンパク質コード領域を含み、遺伝子の発現を伴う
、両端に少なくとも約２ｋｂの距離でコード領域と５’および３’の端部の両方で隣り合
って配置される配列を含むデオキシリボヌクレオチド配列を含む。この点については、遺
伝子は、遺伝子が「キメラ遺伝子」を指す場合における、異種性の制御シグナル、または
所与の遺伝子と天然に関連する、プロモーター、エンハンサー、ターミネーション、およ
び／またはポリアデニル化シグナルのような制御シグナルを含む。タンパク質コード領域
の５’に配置され、およびｍＲＮＡに存在する配列は、５’の非翻訳配列を指す。タンパ
ク質コード領域の下流または３’に配置され、およびｍＲＮＡに存在する配列は、３’の
非翻訳配列を指す。用語「遺伝子」は、ｃＤＮＡおよび遺伝子のゲノムの形態の両方を包
含する。ゲノムの形態または遺伝子のクローンは、「イントロン」、または「介在領域」
、または「介在配列」とよばれる非コード配列により中断されるコード領域を含む。イン
トロンは、核のＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）内に転写される遺伝子のセグメントである。イント
ロンは、エンハンサーのような調節エレメントを含むこととしてもよい。イントロンは、
核または転写一次産物から取り除かれまたは「切り出され」、よって、イントロンはメッ
センジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物に存在しない。ｍＲＮＡは、新生のポリペプチドに
おける配列またはアミノ酸の順序を特定するための翻訳中に機能する。用語「遺伝子」は
、本明細書に記載される本発明のタンパク質の全部または一部および上記のいずれか１つ
に対する相補的なヌクレオチド配列をコードする、合成または融合分子を含む。
【０１８５】
本明細書で使用される場合、「キメラＤＮＡ」または「キメラ遺伝子構築物（コンスト
ラクト）」は、その天然の位置において天然のＤＮＡ分子ではないあらゆるＤＮＡ分子を
指し、また、本明細書で「ＤＮＡコンストラクト」を指す。典型的には、キメラＤＮＡま
たはキメラ遺伝子は、調節および転写され、または天然でともに操作可能に結合されたこ
とがみられない、つまり、互いに対して異種性である、タンパク質コード配列を含む。よ
って、キメラＤＮＡまたはキメラ遺伝子は、異なるソース由来である調節配列およびコー
ド配列、または同じソース由来である調節配列およびコード配列を含むが、天然でみられ
るものと異なる態様で配列されることとしてもよい。
【０１８６】
用語「内因性」は、例えば、研究下の植物と同じ発生上のステージでの非変更植物に通
常存在しまたは産生される物質を指すために、本明細書で使用される。「内因性遺伝子」
は、生物のゲノムにおけるその天然の場所での天然の遺伝子を指す。本明細書で使用され
る場合、「遺伝子組換え核酸分子」、「遺伝子組換えポリヌクレオチド」、またはこれら
のバリエーションは、遺伝子組換えＤＮＡ技術により構成または変更された核酸分子を指
す。用語「外来性ポリヌクレオチド」または「外因性ポリヌクレオチド」または「異種性
ポリヌクレオチド」等は、実験的操作により、細胞のゲノム内に導入されたあらゆる核酸
を指す。外来性または外因性遺伝子は、非天然生物内に挿入される遺伝子、天然の宿主内
で新しい場所に導入される天然の遺伝子、またはキメラ遺伝子であることとしてもよい。
「導入遺伝子」は、変換手順により、ゲノム内に導入された遺伝子である。用語「遺伝的
に変更された」、「トランスジェニック」、およびそのバリエーションは、変換または形
質導入により細胞内に遺伝子を導入すること、細胞における遺伝子を突然変異すること、
およびこれらの作用がなされる細胞もしくは生物またはこれらの後代における遺伝子の調
節の変更または調節することを含む。本明細書で使用される「ゲノム領域」は、導入遺伝
子、または導入遺伝子の群（本明細書ではクラスターとしても言及される）が、細胞また
はこれらの子孫内に導入された、ゲノム内の位置を指す。このような領域は、本明細書に
記載される方法によるような、人の干渉により組み込まれたヌクレオチドのみを含む。
【０１８７】
ポリヌクレオチドの内容における用語「外因性」は、その天然の状態と比較して変化し
た量における、細胞に存在する場合のポリヌクレオチドを指す。一実施形態において、細
胞は、ポリヌクレオチドを天然で含まない細胞である。しかしながら、細胞は、コードさ
れたポリペプチドの変化した産生の量をもたらす、非内因性ポリヌクレオチドを含む細胞
であることとしてもよい。本発明の外因性ポリヌクレオチドは、トランスジェニック（遺
伝子組換え）細胞、または存在する場合には、細胞フリーの発現システムの他の成分から
分離されていないポリヌクレオチド、および少なくともいくつかの他の成分からその後精
製されるこのような細胞または細胞フリーの発現システムで産生されるポリヌクレオチド
を含む。外因性ポリヌクレオチド（核酸）は、天然に存在するヌクレオチドの連続的な伸
展であり得、またはシングルポリヌクレオチドを形成するために結合される異なるソース
（天然由来および／または合成）由来の２つまたはそれ以上の連続的なヌクレオチドの伸
展を含む。典型的には、このようなキメラポリヌクレオチドは、関心細胞におけるオープ
ンリーディングフレームの転写を駆動するのに適するプロモーターに操作可能に結合する
、本発明のポリペプチドをコードする少なくともオープンリーディングフレームを含む。
【０１８８】
本明細書で使用される場合、用語「異なる外因性ポリヌクレオチド」またはそのバリエ
ーションは、各ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、少なくとも１つ、好ましくはそ
れ以上のヌクレオチドにより異なることを意味する。ポリヌクレオチドは、細胞内のタン
パク質へと翻訳されるまたはされないこととしてもよい、ＲＮＡをコードする。実施例で
は、各ポリヌクレオチドは、異なる活性でタンパク質をコードすることが好ましい。別の
実施例では、各外因性ポリヌクレオチドは、他の外因性ポリヌクレオチドと９５％未満、
９０％未満、または８０％未満同一である。好ましくは、外因性ポリヌクレオチドは、機
能的なタンパク質／酵素をコードする。さらに、異なる外因性ポリヌクレオチドは非重複
であり、各ポリヌクレオチドは、例えば、別の外因性ポリヌクレオチドと重複しない染色
体外の転移核酸の別個の領域であることが好ましい。最小限で、各外因性ポリヌクレオチ
ドは、転写開始および停止部位、並びに、指定されたプロモーターを有する。個々の外因
性ポリヌクレオチドは、イントロンを含むこととしてもよく、または含まないこととして
もよい。
【０１８９】
定義されたポリヌクレオチドに関し、上記に提供されるよりも高い数値の％同一性は、
好ましい実施形態に包含されることが理解されるであろう。よって、適用可能である場合
には、最小の同一性％の数値に照らして、ポリヌクレオチドは、関連して挙げられる配列
番号の少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも
７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ま
しくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも
９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ま
しくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも
９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ま
しくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なく
とも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９
．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、
より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、およびさ
らにより好ましくは少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むことが
好ましい。
【０１９０】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに
対し、厳しい条件下で、選択的にハイブリダイズすることとしてもよい。本明細書で使用
される場合、厳しい条件は、（１）ホルムアミドのような変性剤、例えば、０．１％（ｗ
／ｖ）ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、７５
０ｍＭ  ＮａＣｌでｐＨ６．５とした５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、７５ｍＭクエ
ン酸ナトリウム入りの５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを４２℃でハイブリダイゼーション
中に採用する、または（２）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、
０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１
％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト液、超音波処理されたサーモンスパムのＤＮＡ
（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを０．２×ＳＳＣお
よび０．１％ＳＤＳにおいて４２℃で採用する、および／または（３）洗浄のための低イ
オン強度および高温、例えば、０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリ
ウム／０．１％ＳＤＳを５０℃で採用するものである。
【０１９１】
本発明のポリヌクレオチドは、天然に生じる分子と比較される場合に、ヌクレオチド残
基の欠失、挿入または置換である、１またはそれ以上の突然変異を有することとしてもよ
い。基準配列に対して突然変異を有するポリヌクレオチドは、天然起源（すなわち、天然
のソースからの単離）または合成（例えば、上記のような核酸で部位特異的突然変異誘発
またはＤＮＡシャッフリングを行うことによる）のいずれかであり得る。よって、本発明
のポリヌクレオチドは、天然起源または遺伝子組換え由来のいずれかであり得ることは明
らかである。好ましいポリヌクレオチドは、公知技術で知られるような、植物細胞におけ
る翻訳のためにコドン最適化されるコード領域を有するものである。
【０１９２】
組み換えベクター
本発明の一実施形態には、組み換えベクターが含まれ、これは、宿主細胞にポリヌクレ
オチド分子を導入するのが可能ないずれかのベクターに挿入された、本明細書で定義され
る少なくとも１つのポリヌクレオチド分子を含む。組み換えベクターには発現ベクターが
含まれる。組み換えベクターは、異種性ポリヌクレオチド配列、つまり、本明細書で定義
されるポリヌクレオチド分子に、自然には隣接して見つからず、好ましくは、該ポリヌク
レオチド分子（複数可）が由来した種以外の種由来であるヌクレオチド配列を含む。ベク
ターはＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得、一般的にプラスミドである。プラスミド
ベクターには通常、１つ以上のＴ−ＤＮＡ領域を含む、たとえばｐＵＣ由来ベクター、ｐ
ＳＫ由来ベクター、ｐＧＥＭ由来ベクター、ｐＳＰ由来ベクター、ｐＢＳ由来ベクターま
たは好ましくはバイナリーベクターといった、原核細胞における発現カセットの容易な選
択、増幅および形質転換を提供する追加の核酸配列を含む。追加の核酸配列には、ベクタ
ーの自律複製を提供する複製開始点、好ましくは抗生物質または除草剤耐性をコードする
選択マーカー遺伝子、核酸構築物にコードされる核酸配列または遺伝子を挿入するための
複数の部位を提供する特有のマルチプルクローニング部位、および、原核および真核（特
に植物）細胞の形質転換を強化する配列が含まれる。組み換えベクターには、本明細書で
定義されるポリヌクレオチドを２つ以上、たとえば、３、４、５または６つの本明細書で
定義されるポリヌクレオチドを組み合わせて含み得、好ましくは、それぞれのポリヌクレ
オチドが、対象細胞で動作可能な発現制御配列に操作可能に結合している本発明のキメラ
遺伝子構築物を含み得る。本明細書で定義される２つ以上のポリヌクレオチド、たとえば
、３、４、５または６つのポリヌクレオチドは、好ましくは単一組み換えベクターと共有
結合し、好ましくは単一Ｔ−ＤＮＡ分子内で共有結合し、これは、次いで、単一分子とし
て細胞に導入され、本発明に従った組み換え細胞を形成し得、好ましくは、たとえばトラ
ンスジェニック植物の組み換え細胞のゲノムに組み込まれ得る。したがって、そのように
結合したポリヌクレオチドは組み換え細胞または植物の子孫内に単一遺伝子座として一緒
に受け継がれる。組み換えベクターまたは植物は、たとえば、各組み換えベクターが３、
４、５または６つのポリヌクレオチドを含む、それぞれが複数のポリヌクレオチドを含む
そのような組み換えベクターを２つ以上含み得る。
【０１９３】
本明細書で使用される「操作可能に結合」は、２つ以上の核酸（たとえば、ＤＮＡ）断
片間の機能的な関係性を指す。通常、転写調整要素(プロモーター)の転写された配列に対
する機能的な関係性を指す。たとえば、プロモーターが適切な細胞でコード配列の転写を
刺激または調節する場合、プロモーターは本明細書で定義されるポリヌクレオチドといっ
たコード配列に操作可能に結合している。一般的に、転写配列に操作可能に結合するプロ
モーター転写調節要素は、転写配列に物理的に近接しており、すなわち、これらはシス作
用性である。しかし、エンハンサーといったいくつかの転写調節要素は、それらが強化す
る転写対象であるコード領域に物理的に近接または隣接して位置する必要はない。
【０１９４】
複数のプロモーターが存在する場合、各プロモーターは独立して同一または異なってい
てよい。
【０１９５】
キメラＤＮＡまたは遺伝子構築物といった組み換え分子はまた、（ａ）発現された本明
細書で定義するポリペプチドが、ポリペプチドを生産する細胞から分泌されるのを可能に
するシグナルペプチド配列をコードする、または、たとえば細胞の小胞体（ＥＲ）内での
ポリペプチドの保持もしくはプラスチドへの送達といった、発現ポリペプチドの局在化を
提供する、１つ以上の分泌シグナルを含み、ならびに／または（ｂ）融合タンパク質とし
て核酸分子の発現を導く融合配列を含む。適切なシグナル断片の例には、本明細書で定義
されるポリペプチドの分泌または局在化を指示することが可能な、任意のシグナル断片が
含まれる。組み換え分子はまた、本明細書で定義される核酸分子の核酸配列を囲む、およ
び／または、本明細書で定義される核酸分子の核酸配列内に、介在および／または非翻訳
配列を含み得る。
【０１９６】
形質転換体の同定を助長するために、核酸構築物は、好ましくは、外来性または外因性
ポリヌクレオチドとして、または、外来性または外因性ポリヌクレオチドに加えて、選択
またはスクリーンマーカー遺伝子を含む。「マーカー遺伝子」は、マーカー遺伝子を発現
する細胞に特有の表現型を分け与え、したがってそのような形質転換細胞がマーカーを有
さない細胞から区別されることを可能にする遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子は、
選択剤（たとえば、除草剤、抗生物質、放射、熱または非形質転換細胞を傷つける他の処
理）に対する耐性に基づいて「選択」できる特色を提供する。スクリーンマーカー遺伝子
（またはレポーター遺伝子）は、観察または試験を通して、すなわち、「スクリーニング
」する（たとえば、非形質転換細胞には存在しないβ−グルクロニダーゼ、ルシフェラー
ゼ、ＧＦＰまたは他の酵素活性）ことで、同定できる特色を提供する。マーカー遺伝子お
よび対象のヌクレオチド配列は結合していなくてもよい。植物細胞といった、選択した細
胞と組み合わせて機能的である（すなわち、選択的である）限り、マーカーの実際の選択
は重要ではない。
【０１９７】
細菌選択マーカーの例には、アンピシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール
またはテトラサイクリン耐性、好ましくはカナマイシン耐性といった抗生物質耐性を与え
るマーカーが挙げられる。植物形質転換体の選択のための例示的選択マーカーには、ハイ
グロマイシンＢ耐性をコードするｈｙｇ遺伝子；カナマイシン、パロモマイシン、Ｇ４１
８への耐性を与えるネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子；た
とえば欧州特許第２５６２２３号に記載されるような除草剤由来のグルタチオンへの耐性
を与えるラット肝臓のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子；たとえば国際公開
第８７／０５３２７号に記載されるようなホスフィノトリシンといったグルタミンシンテ
ターゼインヒビターへの耐性を過剰発現の際に与えるグルタミンシンテターゼ遺伝子、た
とえば欧州特許第２７５９５７号に記載されるような選択剤ホスフィノトリシンへの耐性
を与えるストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒ
ｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、たとえばＨ
ｉｎｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）が説明するようなＮ−ホスホノメチルグリシン
への耐性を与える５−エノールシキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコー
ドする遺伝子、たとえば国際公開第９１／０２０７１号に記載されるビアラホスに対する
耐性を与えるｂａｒ遺伝子；ブロモキシニルへの耐性を与える臭鼻菌由来のｂｘｎといっ
たニトリラーゼ遺伝子（Ｓｔａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８）；メトトレキセーへ
の耐性を与えるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（Ｔｈｉｌｌｅｔ  ｅｔ  
ａｌ．、１９８８年）；イミダゾリノン、スルホニルウレアもしくは他のＡＬＳ阻害化学
物質への耐性を与える突然変異体アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）（欧州特許第１
５４，２０４号）；５−メチルトリプトファンへの耐性を与える突然変異したアントラニ
ル酸シンターゼ遺伝子；または除草剤への耐性を与えるダラポンデハロゲナーゼ遺伝子が
含まれるが、これらに限定されない。
【０１９８】
好ましいスクリーンマーカーには、様々な色素生産性基質が知られるβ−グルクロニダ
ーゼ（ＧＵＳ）酵素をコードするｕｉｄＡ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子（Ｎｉｅｄ
ｚ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５）またはその誘導体；生物発光検知を可能にするルシフェラ
ーゼ（ｌｕｃ）遺伝子（Ｏｗ  ｅｔ  ａｌ．、１９８６）、および、当該技術分野で知ら
れる他のものが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「レポーター
分子」は、タンパク質産物への参照によってプロモーターの決定を助長する分析的に同定
可能なシグナルをその化学的性質で提供る分子を意味する。
【０１９９】
好ましくは、核酸構築物は植物細胞といった細胞のゲノム内に安定に取り込まれる。し
たがって、核酸は、分子がゲノム、好ましくはＴ−ＤＮＡ分子の右および左境界配列に取
り込まれることを可能にする適切な成分を含み得、または、構築物は、細胞の染色体に組
み込まれ得る適切なベクター内に配置される。
【０２００】
発現
本明細書で使用される発現ベクターは、宿主細胞を形質転換する、および、１つ以上の
特定のポリヌクレオチド分子（複数可）の発現をもたらすことが可能なＤＮＡベクターで
ある。本発明の好ましい発現ベクターは、酵母菌および／または植物細胞の遺伝子発現を
指示できる。本発明に有益な発現ベクターには、転写制御配列、翻訳制御配列、複製開始
点といった調整配列および組み換え細胞に適合し、本発明のポリヌクレオチド分子の発現
を制御する他の調整配列が含まれる。特に、本発明に有益なポリヌクレオチドまたはベク
ターには、転写制御配列が含まれる。転写制御配列は、転写の開始、伸長および終結を制
御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーターおよびエンハンサー配列と
いった、転写開始を制御するものである。適切な転写制御配列には、本発明の組み換え細
胞の少なくとも１つで機能し得る、いずれかの転写制御配列が含まれる。使用される調整
配列の選択は、植物といった標的有機生物および／または対象の標的器官または組織によ
る。そのような調整配列は、植物または植物ウイルスといった任意の真核生物から得られ
得、または、化学的に合成され得る。そのような様々な転写制御配列が、当業者には公知
である。特に好ましい転写制御配列は、植物またはその部分の使用によって、恒常的、ま
たは発生段階および／もしくは組織特異的のいずれかで植物の転写を指示することにおい
て活性を有するプロモーターである。
【０２０１】
植物細胞の安定形質移入またはトランスジェニック植物の確立に適切な複数のベクター
が、たとえば、Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９８５，ｓｕｐｐ．１９８７；Ｗｅｉｓｓｂａ
ｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、アカデミック・プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１
９８９；ならびにＧｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ、クルーヴァー・アカデミック・パブリッシャーズ社（Ｋｌｕ
ｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、１９９０で説明されている。通常
、植物発現ベクターには、たとえば、５’および３’調整配列の転写制御下の、１つ以上
のクローニングされた植物遺伝子および優勢な選択マーカーが含まれる。そのような植物
発現ベクターには、プロモーター調整領域（たとえば、誘導性もしくは恒常的、環境的も
しくは発達的に調整される、または、細胞もしくは組織特異的発現を制御する調節領域）
、転写開始開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位
、および／またはポリアデニル化シグナルも含まれ得る。
【０２０２】
植物細胞で活性を有する複数の恒常的プロモーターが説明されている。植物における恒
常的発現に適切なプロモーターには、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ
プロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）３５Ｓ、サトウキビ桿状型ウイ
ルス（ｓｕｇａｒｃａｎｅ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ  ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ツユ
クサ黄色斑葉ウイルス（ｃｏｍｅｌｌｉｎａ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｔｔｌｅ）、リブロー
ス−１，５−ビス−リン酸カブロキシラーゼの小サブユニット由来の光誘導性プロモータ
ー、イネ細胞質トリオースリン酸イソメラーゼ（ｒｉｃｅ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｔｒｉ
ｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）プロモーター、アラビドプシスのアデ
ニンホスホリポシルトランスフェラーゼプロモーター、イネアクチン１遺伝子プロモータ
ー、マンノピンシンターゼプロモーターおよびオクトピンシンターゼプロモーター、Ａｄ
ｈプロモーター、スクロースシンターゼプロモーター、Ｒ遺伝子複合プロモーターならび
にクロロフィルα／β結合タンパク質遺伝子プロモーターが含まれるが、これらに限定さ
れない。
【０２０３】
葉、種子、根または茎といった植物の供給源組織での発現のために、本発明で使用され
るプロモーターはこれらの特定の組織で比較的高発現を有することが好ましい。この目的
のために、組織または細胞特異的または強化性発現を伴う遺伝子のための複数のプロモー
ターから選択され得る。文献で報告されているそのようなプロモーターの例には、エンド
ウ由来の葉緑体グルタミンシンテターゼＧＳ２プロモーター、コムギ由来の葉緑体フルク
トース−１，６−ビホスファターゼプロモーター、ジャガイモ由来の核光合成ＳＴ−ＬＳ
１プロモーター、シロイヌナズナ由来のセリン／トレオニンキナーゼプロモーターおよび
グルコアミラーゼ（ＣＨＳ）プロモーターが含まれる。リブロース−１，５−ビスリン酸
カブロキシラーゼプロモーターおよびＣａｂプロモーターも、光合成的に活発である組織
で活性を有すると報告されている。
【０２０４】
環境的、ホルモン的、化学的および／または発達的シグナルに反応して調節される様々
な植物遺伝子プロモーターはまた、植物細胞での遺伝子発現のためにも使用され得、これ
には、（１）熱、（２）光（たとえば、エンドウＲｂｃＳ−３Ａプロモーター、トウモロ
コシＲｂｃＳプロモーター）；（３）アブシジン酸といったホルモン、（４）傷をつける
こと（たとえば、ＷｕｎＩ）；または（５）メチルジャスモン酸、サリチル酸、ステロイ
ドホルモン、アルコール、Ｓａｆｅｎｅｒｓ（国際公開第９７／０６２６９号）といった
化学物質によって調製されるプロモーターを含み、また（６）器官特異的プロモーターを
利用するのも有益であり得る。
【０２０５】
本明細書で使用される「植物種子特異的プロモーター」またはその変化形は、他の植物
組織と比較した際、植物の発育中の種子での遺伝子転写を優先的に指示するプロモーター
を指す。ある実施形態では、種子特異的プロモーターは、植物の葉および／または茎と比
べて、植物の発育中の種子で少なくとも５倍強大に発現され、好ましくは、他の植物組織
と比較して発育中の種子の胚でより強大に発現される。好ましくは、プロモーターは発育
中の種子の対象遺伝子の発現を指示するのみであり、および／または、葉といった植物の
他の部分の対象遺伝子の発現はノーザンブロット分析および／またはＲＴ−ＰＣＲでは検
知不可能である。通常プロモーターは、種子の成長および発育の間に、特に種子での貯蔵
化合物の合成および蓄積の段階の間に、遺伝子の発現を促進する。そのようなプロモータ
ーは植物貯蔵器官全体または種皮もしくは子葉（複数可）といったその一部分のみで遺伝
子発現を促進し得、好ましくは、胚、双子葉類植物の種子または単子葉類植物の種子の胚
乳もしくはアリューロン層で遺伝子発現を促進し得る。
【０２０６】
種子特異的発現のために好まれるプロモーターには、ｉ）デサチュラーゼおよびエロン
ガーゼといった、種子での脂肪酸生合成および蓄積に関わる酵素をコードする遺伝子のプ
ロモーター、ｉｉ）種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、およびｉｉ
ｉ）種子での炭水化物生合成および蓄積に関わる酵素をコードする遺伝子のプロモーター
が含まれる。適切な種子特異的プロモーターは、アブラナナピン遺伝子プロモーター（米
国第５，６０８，１５２号）、ビキア・ファバ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ）ＵＳＰプロモー
ター（Ｂａｕｍｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１）、アラビドプシスオレオシンプロモ
ーター（国際公開第９８／４５４６１号）、ファセオルス・ヴルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌ
ｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）ファゼオリンプロモーター（米国第５，５０４，２００号）、
ブラシカＢｃｅ４プロモーター（国際公開第９１／１３９８０号）またはビキア・ファバ
由来のレグミンＬｅＢ４プロモーター（Ｂａｕｍｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２）お
よびトウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、イネなどといった単子葉植物での種子
特異的発現を導くプロモーターである。注目すべき、適切なプロモーターは、オオムギｌ
ｐｔ２またはｌｐｔ１遺伝子プロモーター（国際公開第９５／１５３８９号および国際公
開第９５／２３２３０号）または国際公開第９９／１６８９０号に記載されるプロモータ
ー（オオムギホルデイン遺伝子、イネグルテリン遺伝子、イネオリジン遺伝子、イネプロ
ラミン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子、コムギグルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン
遺伝子、カラスムギグルテリン遺伝子、ソルガムカシリン遺伝子、ライムギセカリン遺伝
子のプロモーター）である。他のプロモーターには、Ｂｒｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９
８）、Ｐｏｔｅｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）、米国第２００７０１９２９０２号お
よび米国２００３０１５９１７３号によって説明されるものが含まれる。ある実施形態で
は、種子特異的プロモーターが、胚、子葉（複数可）または胚乳といった種子の定義した
部分で優先的に発現される。そのような特異的プロモーターの例には、ＦＰ１プロモータ
ー（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６）、エンドウレグミンプロモーター
（Ｐｅｒｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）、マメフィトヘマグルチニンプロモーター（
Ｐｅｒｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）、アマ２Ｓ貯蔵タンパク質をコードする遺伝子
のためのコンリニン１およびコンリニン２プロモーター（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２
０１０）、シロイヌナズナ由来のＦＡＥ１遺伝子のプロモーター、セイヨウアブラナのグ
ロブリン様タンパク質遺伝子のＢｎＧＬＰプロモーター、リヌム・ウシタティスシムム由
来のペルオキシレドキシン遺伝子のＬＰＸＲプロモーターが含まれるがこれらに限定され
ない。
【０２０７】
５’非翻訳リーダー配列は、本発明のポリヌクレオチドの異種性遺伝子配列を発現する
よう選択されたプロモーター由来であり得、または、好ましくは生産される酵素のコード
領域に関して異種性であり、および、所望される場合はｍＲＮＡの翻訳を増大するように
特定的に改変され得る。導入遺伝子の発現を最適化するレビューに関しては、Ｋｏｚｉｅ
ｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）を参照されたい。５’非翻訳領域は、適切な真核生物遺伝
子、植物遺伝子（コムギおよびトウモロコシクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子リ
ーダー）または合成遺伝子配列由来の植物ウイルスＲＮＡ（とりわけタバコモザイクウイ
ルス、タバコエッチウイルス、トウモロコシ萎縮モザイクウイルス、アルファルファモザ
イクウイルス）からも取得され得る。本発明は、非翻訳領域が、プロモーター配列に付随
する５’非翻訳配列由来である構築物には制限されない。リーダー配列は、無関係のプロ
モーターまたはコード配列由来でもあり得る。本発明の文脈で役立つリーダー配列は、ト
ウモロコシＨｓｐ７０リーダー（米国５，３６２，８６５号および米国５，８５９，３４
７号）およびＴＭＶオメガ成分を含む。
【０２０８】
転写の終結は、対象のポリヌクレオチドにキメラベクター内で操作可能に結合した３’
非翻訳ＤＮＡ配列によって達成される。組み換えＤＮＡ分子の３’非翻訳領域は、アデニ
レートヌクレオチドのＲＮＡの３’末端への添加を引き起こすように植物で機能するポリ
アデニル化シグナルを含む。３’非翻訳領域は、植物細胞で発現される様々な遺伝子から
取得され得る。一般的に、この能力において、ノパリンシンターゼ３’非翻訳領域、エン
ドウ小サブユニットＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子の３’非翻訳領域、ダイズ７Ｓ種子貯蔵タンパ
ク質遺伝子またはアマコンリニン遺伝子の３’非翻訳領域が使用される。アグロバクテリ
ウム腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニレートシグナルを含む３’転写、非
翻訳領域も適切である。
【０２０９】
組み換えＤＮＡ技術を用いて、たとえば宿主細胞内でのポリヌクレオチド分子のコピー
数、これらポリヌクレオチド分子が転写される効率、結果として得られる転写物が翻訳さ
れる効率、および翻訳後修飾の効率を操作することで、形質転換ポリヌクレオチド分子の
発現を向上し得る。本明細書で定義されるポリヌクレオチド分子の発現を増大するのに役
立つ組み換え技術には、ポリヌクレオチド分子の1つ以上の宿主細胞染色体への組み込み
、ｍＲＮＡへの安定配列の添加、転写制御シグナル（たとえば、プロモーター、オペレー
ター、エンハンサー）の置換または修飾、翻訳制御シグナル（たとえば、リボゾーム結合
部位、シャイン・ダルガノ配列）の置換または修飾、宿主細胞のコドン使用頻度に対応す
るようにポリヌクレオチド分子を修飾すること、および転写物を不安定化する配列の欠失
が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１０】
組み換え細胞
本発明はまた、本明細書で定義されるポリヌクレオチド、キメラ遺伝子構築物または組
み換えベクターといった1つ以上の組み換え分子で形質転換した宿主細胞である、組み換
え細胞、好ましくは組み換え植物細胞も提供する。組み換え細胞は、２または３つの組み
換えベクター、または組み換えベクターおよび1つ以上の追加ポリヌクレオチドもしくは
キメラＤＮＡといった、その任意の組み合わせを含み得る。本発明の適切な細胞には、た
とえば本明細書に記載されるポリペプチドまたは酵素をコードする分子といった、本発明
のポリヌクレオチド、キメラＤＮＡまたは組み換えベクターで形質転換され得る任意の細
胞が含まれる。細胞は好ましくは、それによってＬＣ−ＰＵＦＡを生産するために使用さ
れることができる細胞である。組み換え細胞は培養中の細胞、インビトロの細胞であり得
、または、たとえば植物といった有機生物内にあり得、もしくは、たとえば種子もしくは
葉といった器官内にあり得る。好ましくは細胞は、植物または植物部分内にあり、さらに
好ましくは植物の種子内にある。
【０２１１】
ポリヌクレオチド（複数可）が導入される宿主細胞は、非形質転換細胞または少なくと
も１つの核酸分子ですでに形質転換された細胞のいずれかであり得る。そのような核酸分
子は、ＬＣ−ＰＵＦＡ合成に関係し得、または無関係であり得る。本発明の宿主細胞は、
本明細書で定義されるタンパク質を内因的に（すなわち、自然に）生産することができる
か、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドで形質転換された後にのみ、そのような
タンパク質を生産することができるかのいずれかであり得、前者の場合、そこから生じる
組み換え細胞は、ポリペプチドを生産する強化した能力を有する。ある実施形態では、発
明の組み換え細胞は、長鎖多価不飽和脂肪酸を合成する強化した能力を有する。本明細書
で使用される語句「長鎖多価不飽和脂肪酸を合成する強化された能力を伴う細胞」は、本
発明の組み換え細胞を本発明のポリヌクレオチド（複数可）を欠如する宿主細胞と比較し
、組み換え細胞が、天然の細胞よりも多くの長鎖多価不飽和脂肪酸脂肪酸を生産している
、または、天然の細胞よりも大きい濃度のＤＨＡといったＬＣ−ＰＵＦＡ（他の脂肪酸と
比べて）を生産している状態である、相対的な語句である。たとえば別の脂肪酸、脂質、
デンプンといった炭水化物、ＲＮＡ分子、ポリペプチド、医薬品または他の生成物といっ
た、別の生成物を合成する強化した能力を伴う細胞は、対応する意味を有する。
【０２１２】
本発明の宿主細胞は、本明細書に記載されるタンパク質を少なくとも１つ生産すること
のできる任意の細胞であり得、細菌、真菌（酵母菌を含む）、寄生虫、節足動物、動物お
よび植物細胞を含み得る。細胞は原核生物または真核生物の細胞であり得る。好まれる宿
主細胞は、酵母菌および植物細胞である。好ましい実施形態では、植物細胞は種子細胞で
あり、特に種子の子葉または胚乳内の細胞である。一実施形態では、細胞は動物細胞また
は藻細胞である。植物細胞は、たとえば非ヒト動物細胞、非ヒト脊椎動物細胞、非ヒト哺
乳動物細胞といった任意の種類の動物の細胞であり得、または、魚類、甲殻類、無脊椎動
物、昆虫などといった水生動物の細胞であり得る。細胞は発酵プロセスに適した有機生物
の細胞であり得る。本明細書で使用される「発酵プロセス」という語句は、任意の発酵プ
ロセスまたは発酵工程を含む任意のプロセスを指す。微生物の発酵の例としては、酵母菌
といった真菌生物が含まれる。本明細書で使用される「酵母菌」には、サッカロマイセス
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）菌種、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・カールベルゲンシス、カン
ジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）菌種、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）菌種、
ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）菌種、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）菌種、トリコデルマ（
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌種、リポミセス（ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）菌種、リポマイセス
・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙ）およびヤロウイア・リポリティカ
（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が含まれる。好ましい酵母菌には、サッカ
ロマイセス菌種の株、およびとりわけ、サッカロマイセス・セレビシエが含まれる。
【０２１３】
トランスジェニック植物
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを１つ以上含むトランスジェニック植物とい
った、本発明の細胞を含む植物も提供する。本明細書で名詞として使用される「植物」と
いう語句は、全体の植物を指すが、形容詞として使用される場合は、たとえば植物器官（
たとえば、葉、茎、根、花）、単細胞（たとえば、花粉）、種子、植物細胞などといった
、植物に存在する、植物から得られる、植物由来の、または植物に関係する任意の物質を
指す。「植物部分」という語句は、その植物部分が本発明に従った脂質を合成する限り、
たとえば葉または茎といった植物構造、根、花器官または構造、花粉、種子、胚、胚乳、
胚盤または種皮といった種子部分、たとえば維管束組織といった組織、細胞および同植物
の子孫を含む、植物ＤＮＡを含む全植物部分を指す。
【０２１４】
「トランスジェニック植物」「遺伝子改変植物」またはその変化形は、同一の種、変種
または品種の野生型植物には見つからない遺伝子構築物（「導入遺伝子」）を含む植物を
指す。本発明の文脈で定義されるトランスジェニック植物には、所望する植物または植物
器官に本明細書で定義する脂質または少なくとも１つのポリペプチドの生産を引き起こす
組み換え技術を用いて遺伝子的に改変した植物およびそれらの子孫が含まれる。トランス
ジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物部分は対応した意味を有する。本明細
書で言及される「導入遺伝子」は、バイオテクノロジーの分野での通常の意味を有し、組
み換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術によって生産した、または変化させた遺伝子配列、および
、本発明の細胞、好ましくは植物細胞に導入された遺伝子配列を含む。導入遺伝子には、
導入遺伝子が導入された植物細胞と同一の種、変種もしくは品種であり得る、もしくは、
異なる種、変種もしくは品種であり得る植物由来の遺伝子配列、または、植物細胞以外の
細胞由来の遺伝子配列が含まれ得る。一般的に、導入遺伝子は、たとえば形質転換といっ
たヒトの操作によって植物といった細胞内に導入されるが、当業者が理解する通り、いか
なる方法を用いてもよい。
【０２１５】
「種子」および「穀粒」は、本明細書で同じ意味で使用される。「穀粒」は、収穫され
た穀粒といった成熟穀粒または植物上にまだあるが収穫される準備ができている穀粒を指
すが、文脈によっては吸水または発芽後の穀粒も指し得る。成熟した穀粒または種子は一
般的に、約１８〜２０％未満の含水量を有する。本明細書で使用される「発育中の種子」
は、通常受精または開花後の植物の生殖構造に見つかる成熟前の種子を指すが、植物から
単離された、成熟前のそのような種子も指し得る。
【０２１６】
本明細書で使用される「植物部分を得る」または「種子を得る」という語句は、それぞ
れ植物部分または種子を得る任意の方法を指し、野外または温室もしくは成長室といった
容器の植物から植物部分または種子を回収すること、または、植物部分または種子の供給
元からの購入もしくは受け取りを含む。種子は、植え付けに適切であり得、すなわち、発
芽して後代植物を生産でき、または、もう発芽できないように処理されており、たとえば
、食物もしくは飼料の適用または本発明の脂質の抽出に役立つ、粉砕、研磨または製粉し
た種子である。
【０２１７】
本明細書で使用される「植物貯蔵器官」という語句は、たとえばタンパク質、炭水化物
、脂肪酸および／または油の形態での貯蔵エネルギーに特化した植物の一部分を指す。植
物貯蔵器官の例としては、種子、果実、塊根および塊茎が挙げられる。本発明の好ましい
植物貯蔵器官は種子である。
【０２１８】
本明細書で使用される「表現型的に正常」という語句は、非改変植物または植物器官と
比較した際に、著しく低下した成長および生殖能力を有さない、本発明の遺伝子改変植物
または植物器官、特に種子、塊茎または果実といった貯蔵器官を指す。ある実施形態では
、表現型的に正常な遺伝子改変植物または植物器官は、植物貯蔵器官特異的プロモーター
に操作可能に結合したサイレンシング抑制因子をコードする外因性ポリヌクレオチドを含
み、前記ポリヌクレオチドを含まない同質遺伝子植物または器官と実質的に同じである成
長または生殖能力を有する。好ましくは、バイオマス、成長速度、発芽速度、貯蔵器官サ
イズ、種子サイズおよび／または生産される生存種子の数は、同一条件下で成長した前記
外因性ポリヌクレオチドを有さない植物の９０％未満である。この語句は、野生型植物と
は違い得るが、たとえば実生葉のバレリーナ表現型といった、商業上の目的のための植物
の有用性をもたらさない植物の特色は包含しない。
【０２１９】
本発明の実践における使用によって提供される、または本発明の実践における使用が企
図される植物には、単子葉類および双子葉類の双方が含まれる。好ましい実施形態では、
本発明の植物は、農作物（たとえば、穀類および豆類、トウモロコシ、コムギ、ジャガイ
モ、タピオカ、イネ、ソルガム、雑穀、キャッサバ、オオムギもしくはエンドウ）または
他のマメ科植物である。植物を、食用根、塊茎、葉、茎、花または果実の生産のために成
長させ得る。植物は、野菜または観賞植物であり得る。本発明の植物は：トウモロコシ（
ゼア・メイズ）、キャノーラ（セイヨウアブラナ、ブラッシカ・ラパ種）、カラシナ（セ
イヨウカラシナ）、アマ（リヌム・ウシタティスシムム）、アルファルファ（メディカゴ
・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ））、イネ（オリザ・サティバ）、ライム
ギ（セカレ・セレアレ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒａｌｅ））、ソルガム（ソルガム・ビカラ
ー、ソルガム・ヴルガレ）、ヒマワリ（ヘリアンタス・アヌス）、コムギ（トリチウム・
アエスチブム（Ｔｒｉｔｉｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ））、ダイズ（グリシン・マックス）
、タバコ（ニコチアナ・タバカム）、ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕ
ｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））、ピーナッツ（アラキス・ヒポゲア）、ワタ（ゴシピウム・
ヒルスツム）、サツマイモ（ロプモエア・バタツス（Ｌｏｐｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）
）、キャッサバ（マニホト・エスクレンタ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ））、
コーヒー（コフェア（Ｃｏｆｅａ）種）、ココナッツ（ココヤシ）、パイナップル（アナ
ナ・コモスス（Ａｎａｎａ  ｃｏｍｏｓｕｓ））、柑橘類樹木（シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ
）種）、ココア（テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ））、茶（カメ
リア・セネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｅｎｅｎｓｉｓ））、バナナ（ムサ（Ｍｕｓａ
）種）、アボカド（ペルセア・アメリカナ）、イチジク（フィクス・カシカ（Ｆｉｃｕｓ
ｃａｓｉｃａ））、グアバ（プシディウム・グアジャバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａ
ｖａ））、マンゴー（マンギフェラ・インディカ（Ｍａｎｇｉｆｅｒ  ｉｎｄｉｃａ））
、オリーブ（オレア・エウロパエア）、パパイア（カリカ・パパヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａ
ｐａｙａ））、カシュー（アナカルジウム・オクシデンタレ）、マカダミア（マカダミア
・インテルグリフォリア）、アーモンド（プルヌス・アミグダルス）、テンサイ（ベタ・
ブルガリス（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））、オートムギまたはオオムギであり得る。
【０２２０】
好ましい実施形態では、植物は被子植物である。
【０２２１】
ある実施形態では、植物は油料種子植物であり、好ましくは油料種子農作物である。本
明細書で使用される「油料種子植物」は、植物の種子の油の商業的生産のために使用され
る植物種である。油料種子植物は、アブラナ（たとえばキャノーラ）、トウモロコシ、ヒ
マワリ、ダイズ、ソルガム、アマ（アマニ）またはテンサイであり得る。さらに、油料種
子植物は、他のブラシカ属、綿、ピーナッツ、ポピー、カラシナ、トウゴマ、ゴマ、ベニ
バナまたはナッツ生産植物であり得る。植物は、オリーブ、アブラヤシまたはココナッツ
といったその果実内で多量の油を生産する。本発明が適用され得る園芸植物は、レタス、
エンダイブまたはキャベツ、ブロッコリーまたはカリフラワーを含むブラシカ属の野菜で
ある。本発明は、タバコ、ウリ、ニンジン、イチゴ、トマトまたコショウにも適用され得
る。
【０２２２】
さらに好ましい実施形態では、本発明のトランスジェニック植物を生産するために使用
される非トランスジェニック植物は、特に種子内に、ｉ）２０％未満、１０％未満または
５％未満の１８：２脂肪酸および／またはｉｉ）１０％未満または５％未満の１８：３脂
肪酸を有する油を生産する。
【０２２３】
好ましい実施形態では、トランスジェニック植物は、その子孫が所望する表現型に関し
て分離しないように、導入されたそれぞれおよび全ての遺伝子（導入遺伝子）に対してホ
モ接合である。トランスジェニック植物は、導入された導入遺伝子（複数可）に対してヘ
テロ接合でもあり得、好ましくは、たとえばハイブリッド種子から成長したＦ１種子にお
いて、導入遺伝子と均一にヘテロ接合であり得る。そのような植物は当該技術分野では良
く知られる雑種強勢といった利点を提供し得る。
【０２２４】
関連がある場合、トランスジェニック植物は、限定しないが、Δ６デサチュラーゼ、Δ
９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ６エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、ω３デ
サチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼ、ジアシルグリセロールアシルト
ランスフェラーゼ、ＬＰＡＡＴ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼおよび／
またはΔ１２デサチュラーゼといったＬＣ−ＰＵＦＡの生産に関わる酵素をコードする追
加の導入遺伝子も含み得る。これらの活性を１つ以上伴うそのような酵素の例は、当該技
術分野では知られており、本明細書に記載されるものが含まれる。特定の例では、トラン
スジェニック植物は；
ａ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼ
およびΔ６エロンガーゼ、
ｂ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼ
およびΔ９エロンガーゼ、
ｃ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼ
、Δ６エロンガーゼおよびΔ１５デサチュラーゼ、
ｄ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼ
、Δ９エロンガーゼおよびΔ１５デサチュラーゼ
ｅ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼ
、Δ６エロンガーゼおよびΔ１７デサチュラーゼ、または、
ｆ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼ
、Δ９エロンガーゼおよびΔ１７デサチュラーゼ、をコードする外因性ポリヌクレオチド
を少なくとも含む。
【０２２５】
ある実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ピシウム・イレグラレΔ６デサチュラ
ーゼ、スラウストキトリドΔ５デサチュラーゼまたはエミリアナ・ハックスレイ（Ｅｍｉ
ｌｉａｎａ  ｈｕｘｌｅｙｉ）Δ５デサチュラーゼ、フィスコミトレラ・パテンスΔ６エ
ロンガーゼ、スラウストキトリドΔ５エロンガーゼまたはオストレオコッカス・タウリ（
Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ）Δ５エロンガーゼ、フィトフトラ・インフェス
タンスω３デサチュラーゼまたはピシウム・イレグラレω３デサチュラーゼおよびスラウ
ストキトリドΔ４デサチュラーゼである一連のポリペプチドをコードする。
【０２２６】
ある実施形態では、本発明の植物は、好ましくは少なくとも１，０００または１，００
０，０００個の実質的に同じ植物群として野外で成長し、または、少なくとも１ヘクター
ルの面積内で成長する。植え付け密度は、植物種、植物変種、気候、土壌条件、肥料の割
合および当該技術分野で知られる他の要因によって異なる。たとえば、キャノーラは通常
１ヘクタールあたり１２０〜１５０万の植物の植え付け密度で成長する。植物は当該技術
分野で知られる通りに収穫され、これには植物の一刈り、地干し刈りおよび／または刈り
取り、次いで、植物材料を脱穀および／または吹き分けて、しばしばもみ殻の形態である
植物部分の残りの部分から種子を分離することが含まれ得る。または、種子は野外で単一
のプロセス、すなわちコンバイニングによって収穫され得る。
【０２２７】
植物の形質転換
トランスジェニック植物を、Ａ．Ｓｌａｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌ
ａｎｔｓ、オックスフォード大学出版局（２００３）およびＰ．Ｃｈｒｉｓｔｏｕおよび
Ｈ．Ｋｌｅｅ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ジ
ョン・ワイリー＆サンズ社（２００４）で広く説明されるものといった、当該技術では公
知の技術を用いて生産できる。
【０２２８】
本明細書で使用される語句「安定に形質転換する」、「安定に形質転換した」という語
句およびそれの変化形は、外因性核酸分子の存在を積極的に選択する必要なく、外因性核
酸分子が細胞分裂の間に後代細胞へ移されるように、外因性核酸分子を細胞のゲノムに組
み込むことを指す。安定的形質転換体またはその子孫は、染色体ＤＮＡ上のサザンブロッ
トまたはゲノムＤＮＡのインサイツハイブリダイゼーションといった、当該技術分野では
公知の任意の方法によって選択され得る。
【０２２９】
アングロバクテリウム媒介性導入は、植物細胞へ遺伝子を導入するのに広く適用可能な
システムであり、なぜなら、全体の植物組織もしくは植物器官または組織培養の外植片の
細胞に、植物細胞ゲノムのＤＮＡの一過性発現または安定的組み込みのいずれかで、ＤＮ
Ａを導入することができるからである。ＤＮＡを植物細胞に導入する、アグロバクテリウ
ム媒介性植物組み込みベクターの使用は、当該技術分野では良く知られており（たとえば
、米国第５１７７０１０号、米国第５１０４３１０号、米国第５００４８６３号または米
国第５１５９１３５号を参照）、ＤＮＡを植物細胞に導入できるアグロバクテリウムまた
は他の細菌を用いたフローラルディップ方法が含まれる。導入されるＤＮＡの領域は境界
配列によって定義され、介在ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）が通常植物ゲノムに挿入される。さら
に、Ｔ−ＤＮＡの組み込みは、ほとんど再配列をもたらさない比較的正確なプロセスであ
る。アグロバクテリウム媒介性形質転換が効率的であるこれらの植物変種において、トラ
ンスジェニックの容易な、および、定義された性質のために、最善の方法である。好まし
いアグロバクテリウム形質転換ベクターは、大腸菌ならびにアグロバクテリウムでの複製
が可能であり、説明される好都合な操作を可能にする（Ｋｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎ：
Ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｇｅｎｔｓ、ＨｏｈｎおよびＳｃｈｅｌ
ｌ編集、シュプリンガー・フェアラーク社（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニュー
ヨーク、ｐｐ．１７９−２０３（１９８５）。
【０２３０】
使用され得る加速方法には、たとえば、微粒子銃などが含まれる。植物細胞に形質転換
する核酸分子を送達するための方法の一例が、微粒子銃である。この方法は、Ｙａｎｇ  
ｅｔ  ａｌ．、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆ
ｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、オックスフォード大学出版局、英国、オックスフォ
ード（１９９４）によって評論されている。核酸で覆われ、推進力によって細胞内に送達
され得る非生物粒子（微粒子）である。例示的な粒子には、タングステン、金、プラチナ
などから成るものが含まれる。微粒子銃の特徴的な利点は、それが再現可能的に単子葉類
を形質転換する効果的な方法であることに加え、プロトプラストの単離またはアグロバク
テリウム感染の感受性のいずれも必要でないことである。
【０２３１】
別の代替実施形態では、プラスチドは安定に形質転換され得る。より高等の植物におけ
るプラスチド形質転換に関して開示される方法には、選択マーカーを含むＤＮＡのパーテ
ィクル・ガン・デリバリーおよび相同組み換えを通してＤＮＡをプラスミドゲノムに標的
すること（米国第５，４５１，５１３号、米国第５，５４５，８１８号、米国第５，８７
７，４０２号、米国第５，９３２４７９号および国際公開第９９／０５２６５号）が含ま
れる。
【０２３２】
細胞形質転換の他の方法も用い得、これらには、花粉への直接ＤＮＡ導入、植物の生殖
器官へのＤＮＡの直接注入、または、未成熟胚の細胞へのＤＮＡの直接注入に続く乾燥し
た胚の再水和による、ＤＮＡの植物への導入が含まれるがこれらに限定はされない。
【０２３３】
単一の植物プロトプラスト形質転換体または様々な形質転換外植片からの植物の再生、
発育および栽培は当該技術分野では良く知られている（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ
．、Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ
、アカデミック・プレス社、カリフォルニア、サンディエゴ（１９８８）。この再生およ
び成長プロセスには通常、これらの個別化した細胞を、根付いた小植物の段階の一般的な
胚発育の段階を通して培養し、形質転換細胞を選択する工程が含まれる。トランスジェニ
ック胚および種子は同様に再生される。その後、得られる根付いたトランスジェニック芽
を、土壌といった適切な植物成長培地に播く。
【０２３４】
外来性、外因性遺伝子を含む植物の発育または再生は当該技術分野で良く知られている
。好ましくは、再生される植物は自家受粉してホモ接合トランスジェニック植物を提供す
る。そうでなければ、再生した植物から得られる花粉を、作物栽培学的に重要な系統の、
種子から成長した植物に交雑させる。逆に、これらの重要な系統の植物の花粉を用いて、
再生植物を受粉させる。当業者には良く知られている方法を用いて、所望する外因性核酸
を含む本発明の導入遺伝子植物を栽培する。
【０２３５】
トランスジェニック細胞および植物の導入遺伝子の存在を確認するために、当業者には
公知の方法を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅またはサザンブロット分析を実
施し得る。導入遺伝子の発現産物は、産物の性質によって様々な方法のいずれかで検知さ
れ得、ウェスタンブロットおよび酵素アッセイを含む。トランスジェニック植物が一度得
られたら、それらは成長して所望する表現型を有する植物組織または部分を生産し得る。
植物組織または植物部分を、収穫および／または種子を回収し得る。種子は、所望する特
徴を有する組織または部分を有する追加の植物を成長させるための供給源として役立ち得
る。
【０２３６】
アグロバクテリウムまたは他の形質転換方法を用いて形成したトランスジェニック植物
は通常、１つの染色体上に単一遺伝子座を含む。そのようなトランスジェニック植物を、
添加した遺伝子（複数可）に対してヘミ接合であると呼び得る。さらに好ましいのは、添
加した遺伝子（複数可）に対してホモ接合であるトランスジェニック植物であり；すなわ
ち、染色体ペアの各染色体上の同一座に１つの遺伝子である、２つの添加遺伝子を含むト
ランスジェニック植物である。ホモ接合トランスジェニック植物は、ヘミ接合トランスジ
ェニック植物を自家受精させ、生産された種子のいくつかを発芽させ、得られた植物を対
象遺伝子に関して分析することで、得ることができる。
【０２３７】
独立して分離する２つの外因性遺伝子または座を含む、２つの異なるトランスジェニッ
ク植物も交雑（交配）して双方の遺伝子または座のセットを含む子孫を生産し得るという
ことも理解される。適切なＦ１子孫の自家受粉は、双方の外来性遺伝子または座に対して
ホモ接合な植物を生産し得る。親植物とのもどし交雑および非トランスジェニック植物と
の外交配も、栄養繁殖と同様に、企図される。異なる特質および作物に一般的に使用され
る他の交雑方法の記述がＦｅｈｒ、Ｉｎ：Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  
Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｗｉｌｃｏｘ  Ｊ．編集、米国農学会（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ）、ウィスコンシン、マディ
ソン（１９８７）に見られる。
【０２３８】
外因性ＲＮＡ量および安定発現の強化
サイレンシング抑制因子
ある実施形態では、本発明の細胞、植物または植物部分は、サイレンシング抑制因子タ
ンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。
【０２３９】
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、細胞およびウイルスｍＲＮＡの双方を分
解のためにターゲットし得る、ヌクレオチド配列特異的防御メカニズムである。ＰＴＧＳ
は、外来性（異種性）または内因性ＤＮＡで安定にまたは一過性に形質転換した植物また
は真菌で起こり、導入した核酸との配列相同性を有するＲＮＡ分子の蓄積の低下につなが
る。
【０２４０】
サイレンシング抑制因子と対象の導入遺伝子との同時発現が、導入遺伝子から転写され
た細胞内に存在するＲＮＡの量を増大することが広く企図されている。このことがインビ
トロの細胞に関して正しいと証明されている一方で、多くの全植物同時発現実験では顕著
な副作用が観察されている。さらに具体的には、Ｍａｌｌｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００
２）、Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４
）、Ｄｕｎｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６
）、Ｌｅｗｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）およびＭｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８
）が説明する通り、サイレンシング抑制因子を発現する植物は、一般的に恒常的プロモー
ター下では、それらが商業上の生産には有効ではない程度まで、しばしば表現型的に異常
である。
【０２４１】
最近、植物またはその部分の種子へのサイレンシング抑制因子の発現を制限することで
、ＲＮＡ分子量が増大し得、および／またはＲＮＡ分子量が多くの世代にわたって安定化
し得ることが発見されている（国際公開第２０１０／０５７２４６号）。本明細書で使用
される「サイレンシング抑制因子タンパク質」、つまりＳＳＰは、特に初めに形質転換し
た植物から繰り返された世代にわたって、植物細胞の異なる導入遺伝子からの発現産物の
量を強化する植物細胞で発現され得る任意のポリペプチドである。ある実施形態では、Ｓ
ＳＰはウイルス性サイレンシング抑制因子またはその変異体である。多くの数のウイルス
性サイレンシング抑制因子が当該技術分野で知られており、Ｐ１９、Ｖ２、Ｐ３８、Ｐｅ
−ＰｏおよびＲＰＶ−Ｐ０を含むがこれらに限定しない。ある実施形態では、ウイルス性
サイレンシング抑制因子は、配列番号５３から５７のいずれか１つで提供される配列、そ
の生物学的に活性な断片、または、配列番号５３から５７のうち１つ以上に少なくとも５
０％相同であり、サイレンシング抑制因子としての活性を有するアミノ酸配列を有するア
ミノ酸を含む。
【０２４２】
本明細書で使用される「発現を安定する」、「安定に発現された」「安定な発現」およ
びそれらの変化形は、繰り返される世代、たとえば少なくとも３、少なくとも５または少
なくとも１０の世代にわたって、サイレンシング抑制因子をコードする外因性ポリヌクレ
オチドを欠如する同質遺伝子植物と比較した際に、ＲＮＡ分子の量が後代植物において実
質的に同じまたはより高いことを指す。しかし、この語句（複数可）は、繰り返される世
代にわたって、以前の世代と比較してＲＮＡ分子量の多少の損失、たとえば１世代あたり
少なくとも１０％の損失がある可能性を排除しない。
【０２４３】
抑制因子は任意の供給源から選択され得る、たとえば、植物、ウイルス、哺乳動物など
である。抑制因子が得られるウイルスおよびそれぞれの特定ウイルスからの抑制因子に関
するタンパク質（たとえばＢ２、Ｐ１４など）またはコード領域指定の一覧表に関しては
国際公開第２０１０／０５７２４６号を参照されたい。抑制因子の複数のコピーが使用さ
れ得る。異なる抑制因子が一緒に使用され得る（たとえば、タンデムで）。
【０２４４】
ＲＮＡ分子
植物種子に発現されることが望ましいＲＮＡ分子は実質的にどれもサイレンシング抑制
因子と同時発現され得る。コードされたポリペプチドは、油、デンプン、炭水化物、栄養
素などの代謝に関連し得、または、タンパク質、ペプチド、脂肪酸、脂質、ろう、油、デ
ンプン、砂糖、炭水化物、風味、匂い、毒素、カロテノイド、ホルモン、ポリマー、フラ
ボノイド、貯蔵タンパク質、フェノール酸、アルカロイド、リグニン、タンニン酸、セル
ロース、糖タンパク質、糖脂質などの合成、好ましくはＴＡＧの生合成または構築に関与
し得る。
【０２４５】
特定の実施例では、作製した植物は、たとえば、キャノーラまたはヒマワリであるブラ
シカ属、ベニバナ、アマ、綿、ダイズ、カメリナまたはトウモロコシといった植物での油
生産のための酵素の量を増大した。
【０２４６】
生産されるＬＣ−ＰＵＦＡの量
組み換え細胞または種子といった植物部分で生産されるＬＣ−ＰＵＦＡまたはＬＣ−Ｐ
ＵＦＡ（複数）の組み合わせの量は重要である。量は、特定のＬＣ−ＰＵＦＡ、または、
たとえば、ω３ＬＣ−ＰＵＦＡもしくはω６ＬＣ−ＰＵＦＡもしくはＶＬＣ−ＰＵＦＡと
いった関連ＬＣ−ＰＵＦＡのグループ、または、当該技術分野で知られる方法によって決
定され得る他のものである脂肪酸の合計の組成（パーセントで）として表され得る。量は
、ＬＣ−ＰＵＦＡ含有量としても表され得、たとえば、組み換え細胞を含む材料の乾燥重
量におけるＬＣ−ＰＵＦＡのパーセンテージ、たとえば、ＬＣ−ＰＵＦＡである種子の重
量のパーセンテージである。油料種子で生産されるＬＣ−ＰＵＦＡは、ＬＣ−ＰＵＦＡ含
有量の面で見れば、油生産のためには育てられない野菜または穀物においてよりも著しく
高い可能性があることがわかるが、双方は類似したＬＣ−ＰＵＦＡ組成を有し得、双方は
ヒトまたは動物の消費のためのＬＣ−ＰＵＦＡの供給源として使用され得る。
【０２４７】
ＬＣ−ＰＵＦＡ量は当該技術分野で知られる任意の方法で測定され得る。好ましい方法
では、総脂質を細胞、組織または有機生物から抽出し、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）
による分析の前に脂肪酸をメチルエステルに変換する。そのような技術は実施例１にて説
明される。クロマトグラムでのピーク位置を使用して、それぞれの特定の脂肪酸を同定し
得、各ピーク下の面積を積分して量を測定する。別で指示されない限り、本明細書で使用
される、試料中の特定の脂肪酸のパーセンテージは、クロマトグラムでの脂肪酸の合計面
積のパーセンテージとして、その脂肪酸のピーク下の面積として決定される。これは、実
質的に重量パーセンテージ（ｗ／ｗ）に対応する。脂肪酸の同一性をＧＣ−ＭＳで確認し
得る。総脂肪酸を、当該技術分野で知られる技術で分離し、ＴＡＧ分画といった分画を精
製し得る。たとえば、薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を分析的規模で実施し、特にＴ
ＡＧの脂肪酸組成を決定するために、ＤＡＧ、アシル−ＣｏＡまたはリン脂質といった他
の脂質分画からＴＡＧを分離し得る。
【０２４８】
一実施形態では、抽出した脂質の脂肪酸のＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計
量は、細胞の総脂肪酸の約７％と約２５％との間である。さらなる実施形態では、細胞の
総脂肪酸は、１%未満のＣ２０：１を有する。好ましい実施形態では、細胞の抽出可能Ｔ
ＡＧは、本明細書で言及される量で脂肪酸を含む。本明細書に記載される脂質を定義する
特色の可能な組み合わせもそれぞれ包含される。
【０２４９】
組み換え細胞、植物または種子といった植物部分でのＬＣ−ＰＵＦＡの生産量は、本明
細書で「転換効率」または「酵素的効率」とも呼ばれる、特定の基質脂肪酸から１つ以上
の産物脂肪酸への転換パーセンテージとしても表され得る。このパラメーターは、細胞、
植物、植物部分または種子から抽出される脂質における脂肪酸組成に基づいており、すな
わち、１つ以上の基質脂肪酸（それから生じる他の脂肪酸全てを含む）として形成された
ＬＣ−ＰＵＦＡ（それから生じる他のＬＣ−ＰＵＦＡを含む）の量である。転換パーセン
テージの一般式は：１００×（産物ＬＣ−ＰＵＦＡをおよびそれから生じる全ての産物の
パーセンテージの合計）／（基質脂肪酸およびそれから生じる全ての産物のパーセンテー
ジの合計）である。たとえばＤＨＡに関しては、これはＤＨＡの量（脂質の総脂肪酸含有
量におけるパーセンテージとして）の、基質脂肪酸（たとえば、ＯＡ、ＬＡ、ＡＬＡ、Ｓ
ＤＡ、ＥＴＡまたはＥＰＡ）およびその基質から生じたＤＨＡ以外の全ての産物の量に対
する比として表され得る。転換パーセンテージまたは転換の効率は、経路での単一の酵素
的工程、または、経路の一部分もしくは全体に関して表され得る。
【０２５０】
特定の転換効率が、次の式に従って本明細書で算出される：
１．ＯＡからＤＨＡ＝１００×（％ＤＨＡ）／（ＯＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ
、ＥＤＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）
。
２．ＬＡからＤＨＡ＝１００×（％ＤＨＡ）／（  ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、Ｅ
ＤＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）。
３．ＡＬＡからＤＨＡ＝１００×（％ＤＨＡ）／  ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、
ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）。
４．ＥＰＡからＤＨＡ＝１００×（％ＤＨＡ）／（ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％
）。
５．ＤＰＡからＤＨＡ（Δ４デサチュラーゼ効率）＝１００×（％ＤＨＡ）／（ＤＰＡお
よびＤＨＡの合計％）。
６．Δ１２デサチュラーゼ効率＝１００×（ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、
ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）／（ＯＡ、
ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ
、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）。
７．ω３デサチュラーゼ効率＝１００×（ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、
ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）／（ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ、
ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）。
８．ＯＡからＡＬＡ＝１００×（ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡお
よびＤＨＡの合計％）／（ＯＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ、Ｓ
ＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）。
９．Δ６デサチュラーゼ効率（ω３基質ＡＬＡ上）＝１００×（ＳＤＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ
、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）／（％ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、Ｄ
ＰＡおよびＤＨＡ）。
１０．Δ６エロンガーゼ効率（ω３基質ＳＤＡ上）＝１００×（ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ
およびＤＨＡの合計％）／（ＳＤＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）。
１１．Δ５デサチュラーゼ効率（ω３基質ＥＴＡ上）＝１００×（ＥＰＡ、ＤＰＡおよび
ＤＨＡの合計％）／（ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）。
１２．Δ５エロンガーゼ効率（ω３基質ＥＰＡ上）＝１００×（ＤＰＡおよびＤＨＡの合
計％）／（ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）。
【０２５１】
本発明の脂質、好ましくは種子油の脂肪酸組成を、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸または
新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸のいずれかに関する、総脂肪酸含有量のω６脂肪酸：ω３脂
肪酸の比によっても特徴づける。総ω６脂肪酸、総ω３脂肪酸、新ω６脂肪酸および新ω
３脂肪酸という語句は、本明細書で定義される意味を有する。本明細書で例証する方法で
、細胞、植物、植物部分または種子から抽出された脂質での脂肪酸組成から比を算出する
。脂質においてω６脂肪酸よりもω３脂肪酸の量を多く有することが望まれ、したがって
、１．０未満のω６：ω３比が好まれる。０．０の比は、定義されるω６脂肪酸の完全な
不在を示し；０．０３の比が実施例６に記載される通り、達成された。そのような低い比
は、ω３デサチュラーゼ、特に、本明細書で例示されるピキア・パストリスω３デサチュ
ラーゼといった真菌ω３デサチュラーゼと、ω３基質に好みを示すΔ６デサチュラーゼと
の併合使用を通して達成され得る。
【０２５２】
種子の重量あたりのＬＣ−ＰＵＦＡの収率も、種子中の総油含有量および油中の％ＤＨ
Ａに基づいて算出され得る。たとえば、キャノーラ種子の油含有量が約４０％（ｗ／ｗ）
で、油の総脂肪酸含有量の約１２％がＤＨＡである場合、種子のＤＨＡ含有量は、約４．
８％または種子１グラムあたり約４８ｍｇである。実施例２で説明する通り、約９％のＤ
ＨＡを有し、キャノーラよりも低い油含有量を有するアラビドプシス種子のＤＨＡ含有量
は、１ｇ種子あたり約２５ｍｇであった。約７％のＤＨＡ含有量では、キャノーラ種子ま
たはカメリナ・サティバ種子は種子１グラムあたり約２８ｍｇのＤＨＡ含有量を有する。
したがって、本発明は１グラム種子あたり約２８ｍｇのＤＨＡを少なくとも含む、セイヨ
ウアブラナ、セイヨウカラシナおよびカメリナ・サティバ植物ならびにそれらから得られ
る種子を提供する。種子は、ドライダウンした後の収穫した成熟種子の標準通りの含水量
を有する（４〜１５％水分）。本発明はまた、種子を得ることおよびその種子から油を抽
出することを含む、油を得るためのプロセス、ならびに、その油の使用、ならびに、本発
明に従う植物から種子を収穫することを含む、種子を得る方法も提供する。
【０２５３】
１ヘクタールあたりに生産されるＤＨＡ量も、１ヘクタールあたりの種子収率が分かっ
ていれば、算出可能であり、または、推定可能である。たとえば、オーストラリアのキャ
ノーラは通常、１ヘクタールあたり約２．５トンの種子をもたらし、これは、４０％の油
含有量では約１０００ｋｇの油をもたらす。総油中１２％のＤＨＡでは、これは、１ヘク
タールあたり約１２０ｋｇのＤＨＡを提供する。油含有量が５０％減った場合でも、１ヘ
クタールあたり約６０ｋｇのＤＨＡを提供する。
【０２５４】
現在までの証拠によって、酵母菌または植物に異種性で発現されるいくつかのデサチュ
ラーゼは、いくつかのエロンガーゼとの組み合わせで比較的低い活性を有することが提唱
されている。ＬＣ−ＰＵＦＡ合成における基質として脂肪酸のアシル−ＣｏＡ形態を使用
する能力を有するデサチュラーゼを提供することで、これを緩和し得、これは、組み換え
細胞、特に植物細胞で、好都合であると考えられる。効率的なＤＨＡ合成に特に好都合な
組み合わせは、たとえばピキア・パストリスω３デサチュラーゼ（配列番号１２）といっ
た真菌ω３デサチュラーゼと、たとえば、ミクロモナス・プシラΔ６デサチュラーゼ（配
列番号１３）または少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性を有するその変異形といった
、ω３アシル基質に対して好みを有するΔ６デサチュラーゼとの組み合わせである。
【０２５５】
本明細書で使用される「実質的に含まない」という語句は、その組成物が（たとえば脂
質または油）が、定義される成分をほとんど（たとえば、約０．５％未満、約０．２５％
未満、約０．１％未満もしくは約０．０１％未満）または一切含まないことを意味する。
ある実施形態では、「実質的に含まない」は、その成分が、通例の分析的技術を用いて検
知不能であること意味し、たとえば、特定の脂肪酸（ω６ドコサペンタエン酸といった）
は実施例１で説明されるガスクロマトグラフィーを用いて検知され得ない。
【０２５６】
油の生産
当該技術分野で日常的に実施される技術を用いて、本発明の細胞、植物、種子などによっ
て生産される油を抽出、プロセスおよび分析し得る。通常、植物種子を、調理、プレスお
よび抽出して、粗油を生産し、これを次いで、脱ガム、精製、脱色、脱臭する。一般的に
、種子を粉砕する技術は当該技術分野では公知である。たとえば、油料種子に水をスプレ
ーして含水量をたとえば８．５％まで上げることで油料種子を和らげ得、隙間設定が０．
２３から０．２７ｍｍの滑らかなローラーを用いてフレーク状にし得る。種子の種類によ
っては、粉砕前に水を加えない可能性がある。熱の適用は酵素を非活性化させ、細胞破裂
を助長し、油の液滴を合体させ、タンパク質粒子を凝集し、これらはすべて抽出プロセス
を助長する。
【０２５７】
ある実施形態では、種子油の大部分は、スクリュープレスを経る経路によって放出され
る。スクリュープレスから排除されたケイクを次いで、たとえばヘキサンと一緒に、熱ト
レーシングカラムを用いて溶媒抽出する。または、プレス操作によって生産された粗油を
、溝付きのワイヤー排水蓋を有する沈殿タンクを通過させ、プレス操作の間に油と一緒に
現れた固体を除き得る。精製油をプレートおよびフレームフィルターを通過させて、いず
れの残存している固体微粒子を除去し得る。望ましい場合は、抽出プロセスから回収され
る油を精製油と一緒にまとめて、混合粗油を生産し得る。
【０２５８】
溶媒を一度粗油から取り除くと、プレスおよび抽出した部分をまとめ、通常の油プロセ
シング手順に供する。本明細書で使用される「精製」という語句は、本発明の脂質または
油との関連で使用される際は、抽出した脂質または油が、脂質／油成分の純度を高める１
つ以上のプロセシング工程に供せられることを通常意味する。たとえば精製工程には、抽
出した油を：脱ガム、脱臭、脱色、乾燥および／または分画化することから成る群のうち
１つ以上または全てが含まれ得る。しかし、本明細書で使用される「精製」という語句に
は、総脂肪酸含有量のパーセンテージとしてのＤＨＡ含有量を増大するための、エステル
交換反応プロセスまたは本発明の脂質または油の脂肪酸組成を変化する他のプロセスは含
まれない。つまり、精製脂質または油の脂肪酸組成は、実質的に非精製脂質または油の脂
肪酸組成と実質的に同じである。
【０２５９】
脱ガム
脱ガムは、油の精製において初期の工程であり、その第１の目的は抽出した総脂質のう
ちおよそ１〜２％で存在し得るリン脂質の大部分を油から取り除くことである。通常リン
酸を含む約２％の水を７０〜８０℃で粗油に添加すると、微量金属および色素を伴う、大
部分のリン脂質の分離につながる。取り除かれた難溶性物質は、主にリン脂質およびトリ
アシルグリセロールの混合物であり、レシチンとしても知られる。濃縮したリン酸を粗種
子油に添加することで脱ガムを実施し、非水和性ホスファチドを水和性形態に変換し得、
および、存在する少量の金属をキレート化し得る。遠心分離によって、ガムを種子油から
分離する。
【０２６０】
アルカリ精製
アルカリ精製は、粗油を処理するための精製プロセスの１つであり、時折中和とも呼ば
れる。アルカリ精製は、通常脱ガムに続き、脱色の前に行われる。脱ガムに続いて、種子
油を十分な量のアルカリ溶液の添加によって処理し、全ての脂肪酸およびリン酸を滴定し
、こうして形成されたセッケンを取り除く。適切なアルカリ性材料には、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシ
ウムおよび水酸化アンモニアが含まれる。このプロセスは通常室温で実行され、遊離脂肪
酸分画を取り除く。セッケンを遠心分離またはセッケンのための溶媒への抽出によって取
り除いて、中和した油を水で洗う。必要であれば、油中の任意の余分なアルカリを、塩酸
または硫酸といった適切な酸で中和し得る。
【０２６１】
脱色
脱色は、窒素もしくは蒸気と、または、真空で作用させることで、漂白土（０．２〜２
．０％）の存在下および酸素の不在下で、油を９０〜１２０℃で１０〜３０分間加熱する
精製プロセスである。油プロセシングにおけるこの工程は、所望しない色素（カロテノイ
ド、クロロフィル、ゴシポールなど）を取り除くように設計され、該プロセスはまた、酸
化産物、微量金属、硫黄化合物および微量のセッケンも取り除く。
【０２６２】
脱臭
脱臭は、高温度（２００〜２６０℃）および低圧（０．１〜１ｍｍＨｇ）での油および
脂肪の処理である。これは通常、蒸気を、種子油１００ｍｌあたり、約０．１ｍｌ／分の
速度で種子油に導入することで達成される。３０分のスパージング後、種子油を真空下で
放冷する。通常、種子油をガラス容器に移し、冷蔵下で保管する前に、アルゴンで洗い流
す。この処理によって、種子油の色が改善され、任意の残存している遊離脂肪酸、モノア
シルグリセロールおよび酸化産物を含む、揮発性物質または臭気化合物の大部分が取り除
かれる。
【０２６３】
脱ろう
脱ろうは、周囲以下の温度での結晶化によって、油および脂肪を固体（ステアリン）お
よび液体（オレイン）分画に分離するために、油の商業上の生産において時折使用される
プロセスである。これは本来、固体フリー生成物を生産するために綿実油に適用された。
通常は油の飽和脂肪酸含有量を低下するために使用される。
【０２６４】
エステル交換反応
エステル交換反応は、初めに脂肪酸をＴＡＧから自由脂肪酸または脂肪酸エステルのい
ずれか、通常は脂肪酸メチルエステルまたはエチルエステルとして放出することで、脂肪
酸をＴＡＧ内または間で交換する、または、その脂肪酸を別のアルコールに移してエステ
ルを形成するプロセスである。分画化プロセスと組み合わせる場合、エステル交換反応を
用いて脂質の脂肪酸組成を改変し得る（Ｍａｒａｎｇｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５）
。セステル交換は、化学的（たとえば、強酸または塩基触媒性）または酵素的方法のいず
れかを用い得、後者はＴＡＧ上の脂肪酸に関して位置特異的（ｓｎ−１／３またはｓｎ−
２特異的）であり得るリパーゼを用い、または、他よりもいくつかの脂肪酸に対して好み
を有する（Ｓｐｅｒａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）。油中のＬＣ−ＰＵＦＡの濃度
を増大するための脂肪酸分画化は、たとえば、冷凍結晶化、尿素を用いた複合体形成、分
子蒸留、超臨界流体抽出および銀イオン錯体形成といった、当該技術で公知の方法のいず
れかによって達成され得る。尿素との複合体結成はその油中の飽和および一価不飽和脂肪
酸の量を減らす際の単純性および効率性のために好ましい方法である（Ｇａｍｅｚ  ｅｔ
ａｌ．、２００３）。始めに、酸または塩基触媒性反応条件下での加水分解によって、
油のＴＡＧを、しばしば脂肪酸エステルの形態であるそれらを構成する脂肪酸に分け、そ
れによって、過剰なアルコールが用いられ、形成されたアルキルエステルおよび、さらに
形成されたグリセロールの分離を可能にする、１ｍｏｌのＴＡＧが少なくとも３ｍｏｌの
アルコール（たとえば、エチルエステルにはエタノール、メチルエステルにはメタノール
）と反応し、または、リパーゼによって、油のＴＡＧを、しばしば脂肪酸エステルの形態
であるそれらを構成する脂肪酸に分ける。その処理によって脂肪酸組成が通常は改変した
、これらの遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを次いで、複合体形成のための尿素のエタノ
ール溶液と混合する。飽和および一価不飽和脂肪酸は容易に尿素と複合体形成し、冷却の
際に結晶化し、続いて濾過によって取り除かれ得る。非尿素と複合した分画はこうしてＬ
Ｃ−ＰＵＦＡに富んでいる。
【０２６５】
家畜飼料
本発明には、家畜飼料として使用され得る組成物を含む。本発明のために、「家畜飼料
」には、体内に取り込まれた際に（ａ）組織に栄養分を与え、もしくは組織を築く、また
はエネルギーを供給するために役立つ；および／または（ｂ）十分な栄養状態または代謝
機能を維持、再建または支持する、ヒトまたは動物の消費のための任意の食物または調製
物が含まれる。本発明の家畜飼料には、たとえば、本発明の調製粉乳および種子ミールと
いった、乳児および／または小さな子供にとって栄養のある組成物が含まれる。
【０２６６】
本発明の家畜飼料は、たとえば、本発明の細胞、本発明の植物、本発明の植物部分、本
発明の種子、本発明の抽出物、本発明の方法の生成物、本発明の発酵プロセスの産物、ま
たは適切な担体（複数可）を伴う組成物を含む。「担体」という語句は、その広義で使用
され、栄養価を含み得るまたは含み得ない任意の成分を包含する。当業者には理解される
通り、担体は、家畜飼料を消費する有機生物に有害な影響を有さないような、家畜飼料で
の使用に適している（または十分低い濃度で使用される）必要がある。
【０２６７】
本発明の家畜飼料は、本明細書で開示される方法、細胞または植物の使用で直接もしく
は間接的に生産される油、脂肪酸エステルもしくは脂肪酸を含む。組成物は、固体または
液体の形態のいずれかであり得る。さらに、組成物には、食用多量養素、タンパク質、炭
水化物、ビタミンおよび／またはミネラルが、特定の使用に望ましい量で含まれ得る。こ
れら成分の量は、組成物が、正常な個体への使用を意図されているのか、または代謝疾患
などを患う個体など、特化したニーズを有する個体への使用を意図されているのかによっ
て、異なるであろう。
【０２６８】
栄養価を伴う適切な担体の例には、食用脂、炭水化物およびタンパク質といった多量養
素が含まれるが、これらに限定されない。そのような食用脂の例には、ココナッツ油、ル
リジサ油、真菌油、黒潮（ｂｌａｃｋ  ｃｕｒｒｅｎｔ）油、ダイズ油ならびにモノおよ
びジグリセリドが含まれるが、これらに限定されない。そのような炭水化物の例には：グ
ルコース、食用ラクトースおよび加水分解デンプンが含まれる（がこれらに限定されない
）。さらに、本発明の栄養組成物で使用され得るタンパク質の例には、ダイズタンパク質
、電気透析乳漿、電気透析脱脂乳、牛乳の乳漿またはこれらタンパク質の加水分解物が含
まれる（が、これらに限定されない）。
【０２６９】
ビタミンおよびミネラルに関しては、次に挙げるものが本発明の家畜飼料組成物に添加
され得る：カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、クロリド、マグネシウム、マンガ
ン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素およびビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、ＣおよびＢ群。他のその
ようなビタミンおよびミネラルも添加され得る。
【０２７０】
本発明の家畜飼料組成物で使用される成分は、半精製または精製由来であり得る。半精
製または精製とは、天然材料の精製または新規合成によって調製された物質を指す。
【０２７１】
また、本発明の家畜飼料組成を、食事の補充が必要でない場合でも、食物に添加しても
よい。たとえば、組成物をいかなる種類の植物にも添加してよく、それには：マーガリン
、改変バター、チーズ、牛乳、ヨーグルト、チョコレート、キャンディ、スナック食品、
サラダ油、調理油、調理脂、肉、魚および飲み物が含まれる（がこれらに限定されない）
。
【０２７２】
サッカロマイセス属の種は、ビールの醸造およびワイン作りの双方で使用され、また、
特にパンを焼く際に作用剤としても使用される。たとえばヤロウイア種を含む油性酵母菌
といった他の酵母菌もＬＣ−ＰＵＦＡ生産に役立つ。酵母菌は、養殖漁業といった動物試
料での添加剤としても使用され得る。本明細書で説明されるようにＬＣ−ＰＵＦＡを合成
するよう適合された、遺伝子操作した酵母菌株が提供され得ることは明らかになるであろ
う。これら酵母菌株またはそれらで生産されるＬＣ−ＰＵＦＡを、次いで、食料品ならび
にワインおよびビール作りで使用し、強化した脂肪酸含有量を有する製品を提供し得る。
【０２７３】
さらに、本発明に従って生産された脂肪酸または形質転換して対象遺伝子を含むおよび
発現する宿主細胞を、動物の栄養補助食品としても使用し、動物の組織、卵または牛乳の
脂肪酸組成を、ヒトまたは動物の消費により望ましいものに変え得る。そのような動物の
例には、ヒツジ、ウシ、ウマ、ニワトリといった家禽類などが含まれる。
【０２７４】
さらに、本発明の家畜飼料を養殖漁業で用いて、ヒトまたは動物の消費用の、魚、また
は、たとえばエビといった甲殻類の脂肪酸量を増大し得る。好ましい魚はサケである。
【０２７５】
本発明の好ましい家畜飼料は、ヒトまたは他の動物用の食物または試料として直接使用
され得る、植物、種子ならびに葉および茎といった他の植物部分である。たとえば、動物
は野外で成長したそのような植物を直接食べ得、または、制御した餌やりの中で測定され
た量を与えられ得る。本発明には、そのような植物および植物部分を、ヒトおよび他の動
物のＬＣ−ＰＵＦＡ量を増大するための摂食としての使用が含まれる。
【０２７６】
組成物
また、本発明には、本発明の方法を用いて生産される１つ以上の脂肪酸および／または
結果として得られる油を含む組成物、具体的には医薬組成物も包含される。
【０２７７】
医薬組成物は、リン酸緩衝生理食塩水、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤
または水／油乳濁液といった乳濁液のような、標準的で、良く知られる、非毒性の薬剤的
に許容される担体、補助剤または媒体と組み合わせた、１つ以上の脂肪酸および／または
油を含み得る。組成物は液体または固体のいずれかの形態であり得る。たとえば、組成物
は、錠剤、カプセル、経口摂取可能液体または粉末、注射可能または局所軟膏またはクリ
ームの形態であり得る。たとえば、分散液の場合は必要な粒径の維持、および、界面活性
剤の使用によって、適切な流動性が維持され得る。たとえば、糖、塩化ナトリウムなどの
等張剤を含むことも望まれ得る。そのような不活性希釈剤に加え、組成物はまた、湿潤剤
、乳濁および懸濁剤、甘味料、風味料および芳香剤といった補助剤も含み得る。
【０２７８】
懸濁物は、活性化合物に加え、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチ
レンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒ
ドロキシド、ベントナイト、寒天、ならびにトラガントまたはこれら物質の混合物といっ
た懸濁剤を含み得る。
【０２７９】
当該技術分野では良く知られている技術を用いて、錠剤およびカプセルといった固体剤
形を調製し得る。たとえば、本発明にしたがって生産した脂肪酸を、アカシア、コーンス
ターチまたはゼラチンといった結合剤、ジャガイモデンプンまたはアルギン酸といった崩
壊剤、およびステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムといった潤滑剤と組み合わせ
て、ラクトース、スクロースおよびコーンスターチといった従来の錠剤ベースで錠剤化し
得る。これら賦形剤を抗酸化剤および関連脂肪酸と一緒にゼラチンカプセルに組み込むこ
とで、カプセルを調製し得る。
【０２８０】
静脈内投与に関して、本発明従って生産された脂肪酸またはその誘導体を、市販製剤に
組み込んでもよい。
【０２８１】
特定の脂肪酸の一般的な投与量は、０．１ｍｇから２０ｇを、１日あたり１から５回の
摂取（１日最大１００ｇまで）であり、好ましくは、１日約１０ｍｇから約１、２、５ま
たは１０ｇの範囲である（１または複数の服用）。当該技術分野で知られる通り、最小限
である、約３００ｍｇ／日の脂肪酸、特にＬＣ−ＰＵＦＡ、が望ましい。しかし、任意の
量の脂肪酸も対象には有益であることが理解されるであろう。
【０２８２】
本発明の医薬組成物の可能性のある投与経路には、たとえば、経腸（たとえば経口およ
び経直腸）および非経口が含まれる。たとえば、液体調製物は経口または経直腸投与され
得る。さらに、均質な混合物を水に完全に分散させ、生理学的に許容される希釈剤、保存
剤、緩衝剤または噴霧剤と滅菌条件下で混合し、スプレーまたは吸入剤を形成し得る。
【０２８３】
患者に投与される組成物の投与量は、当業者の一人によって決定され得、患者の体重、
患者の年齢、患者の全体的な健康状態、患者の過去の経歴、患者の免疫状態などといった
様々な要因次第である。
【０２８４】
さらに、本発明の組成物を美容上の目的で使用し得る。混合物が形成されるように本発
明の組成物を既存の美容組成物に添加し得、また、本発明に従って生産された脂肪酸を、
美容組成物における唯一の「活性」成分として使用し得る。
【実施例】
【０２８５】
実施例１.材料および方法
一過性発現系での植物細胞の遺伝子発現
外因性遺伝子構築物を、基本的にＶｏｉｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）およびＷ
ｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）が説明する通りに、一過性発現系で植物細胞に発現さ
せた。ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターといった強度の恒常的プロモーターから発現される
コード領域を含むプラスミドを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導
入した。国際公開第２０１０／０５７２４６号に記載される通り、ｐ１９ウイルス性サイ
レンシング抑制因子発現のためのキメラ遺伝子３５Ｓ：ｐ１９を別でＡＧＬ１内に導入し
た。組み換えアグロバクテリウム細胞を、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌ
リファンピシンを添加したＬＢブロス内で、２８℃で静止期まで成長させた。次いで、１
０ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ５．７、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１００μΜアセトシリンゴン
を含む浸潤緩衝液内でＯＤ６００＝１．０まで再懸濁する前に、室温で１５分間、５００
０ｇでの遠心分離によって細菌をペレット状にした。次いで、３５Ｓ：ｐ１９および対象
の試験キメラ構築物（複数可）を含む同じ体積のアグロバクテリウム培養物を、葉の組織
への浸潤に先立って混合する前に、細胞を振動させながら２８℃で３時間インキュベート
した。一般的に、浸潤後、葉のディスクを脂肪酸のＧＣ分析のために取り出して凍結乾燥
させる前に、植物をさらに５日間成長させた。
【０２８６】
内部標準として量が既知であるヘキサデカン酸と一緒に、８０℃で２時間、メタノール
／ＨＣｌ／ジクロロメタン（１０／１／１  ｖ／ｖ）溶液中試料をインキュベートするこ
とで、凍結乾燥試料における全ての葉脂質の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を作製し
た。ＦＡＭＥをヘキサン／ＤＣＭで抽出し、ヘキサン中、小体積まで濃縮し、ＧＣに注入
した。脂質分画に存在する各および総脂肪酸の量を内部標準の既知の量をもとに定量化し
た。
【０２８７】
脂肪酸のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析
３０ｍのＳＧＥ−ＢＰＸ７０カラム（７０％シアノプロピルポリシルフェニレン−シロ
キサン、０．２５ｍｍの内部直径、０．２５ｍｍのフィルムの厚さ）、ＦＩＤ、分割／非
分割注入器ならびにアジレント・テクノロジー社７６９３シリーズ自動回収装置および注
入器を備えたアジレント・テクノロジー社７８９０Ａ  ＧＣ（米国、カリフォルニア州、
パロアルト）を用いたガスクロマトグラフィーによって、ＦＡＭＥを分析した。ヘリウム
をキャリアガスとして用いた。１５０℃のオーブン温度で試料を分割モード（５０：１比
）で注入した。注入後、オーブン温度を１５０℃で１分間維持し、次いで、１分あたり３
℃ずつ２１０℃まで上げ、再度１分あたり５０℃ずつ２４０℃まで上げ、最終的に、２４
０℃で１．４分間維持した。アジレント・テクノロジー社ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフト
ウェア（Ｒｅｖ  Ｂ．０４．０３（１６）、米国、カリフォルニア州、パロアルト）で、
既知の量である外部標準ＧＬＣ−４１１（Ｎｕｃｈｅｃｋ）およびＣ１７：０−ＭＥ内部
標準の反応をもとにピークを定量化した。
【０２８８】
脂質の液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）分析
内部定量化標準として既知の量のｔｒｉ−Ｃ１７：０−ＴＡＧを添加した後、開花から
１２日後（ｄａｆ）の、凍結乾燥した発育中の種子および成熟した種子から全ての脂質を
抽出した。５ｍｇの乾燥材料あたりで、抽出した脂質をブタノール：エタノール（１：１
ｖ／ｖ）中１０ｍＭのブチル化ヒドロキシトルエン１ｍＬに溶解し、アジレント社１２
００シリーズＬＣおよび６４１０ｂエレクトロスプレーイオン化３連４重極ＬＣ−ＭＳを
用いて分析した。０．２ｍＬ／分のフロー速度でバイナリ勾配を操作するＡｓｃｅｎｔｉ
ｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＲＰ−Ａｍｉｄｅカラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、２．７μｍ、Ｓ
ｕｐｅｌｃｏ）を用いて、脂質をクロマトグラフィーによって分離した。移動相は：Ａ．
Ｈ２Ｏ：メタノール：テトラヒドロフラン（５０：２０：３０  ｖ／ｖ／ｖ）中１０ｍＭ
の蟻酸アンモニウム；Ｂ．Ｈ２Ｏ：メタノール：テトラヒドロフラン（５：２０：７５、
ｖ／ｖ／ｖ）中１０ｍＭの蟻酸アンモニウムであった。マルチプルリアクションモニタリ
ング（ＭＲＭ）リストは、３０Ｖの衝突エネルギーおよび６０Ｖのフラグメンターを用い
て、次の主要な脂肪酸をもとにした：１６：０、１８：０、１８：１、１８：２、１８：
３、１８：４、２０：１、２０：２、２０：３、２０：４、２０：５、２２：４、２２：
５、２２：６。アンモニア化合プリカーサーイオンおよび２２：６のニュートラルロスに
よるプロダクトイオンをもとに、各ＭＲＭ  ＴＡＧを同定した。１０μΜのトリステアリ
ン外部標準を用いてＴＡＧを定量化した。
【０２８９】
種子脂肪酸プロフィールおよび油含有量の測定
種子油含有量を測定する予定であった場合、種子を２４時間デシケーター内で乾燥させ
、およそ４ｍｇの種子を、テフロン加工のねじ口を含む２ｍｌのガラス小瓶に移した。０
．１ｍｌトルエン中に溶解した０．０５ｍｇトリヘプタデカノインを内部標準として小瓶
に添加した。
【０２９０】
０．７ｍｌの１ＮメタノールＨＣｌ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を、種子材料を含む小瓶に添加
することで、種子ＦＡＭＥを調製し、簡単に撹拌し、８０℃で２時間インキュベートした
。室温まで下げた後、０．３ｍｌの０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）および０．１ｍｌヘキサ
ンを小瓶に添加し、１０分間、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  Ｖｉｂｒａｍａｘ１１０でよく混合し
た。ＦＡＭＥを０．３ｍｌのガラス製インサートに集め、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ
）を伴うＧＣで、前記した通りに分析した。
【０２９１】
市販の標準ＧＬＣ−４１１（ニューチェック・プレップ社（ＮＵ−ＣＨＥＫ  ＰＲＥＰ
，ＩＮＣ．，）、米国）に存在する同じＦＡＭＥの既知の量のピーク面積反応をもとに、
各ＦＡＭＥのピーク面積をまず校正した。ＧＬＣ−４１１は、Ｃ８：０からＣ２２：６に
及ぶ、同量の３１個の脂肪酸（重量％）を含む。標準に存在しなかった脂肪酸の場合、発
明者らは最も類似したＦＡＭＥのピーク面積反応を取り出した。たとえば、１６：ｌｄ９
のＦＡＭＥのピーク面積反応を１６：ｌｄ７に関して使用し、Ｃ２２：６のＦＡＭＥ反応
をＣ２２：５に関して使用した。校正した面積を用いて、内部標準質量との比較によって
、試料中の各ＦＡＭＥの質量を算出した。油はＴＡＧの形態で主に保存され、その重量を
、ＦＡＭＥ重量をもとに算出した。各ＦＡＭＥＳのモルを算出し、ＦＡＭＥの合計モルを
３で割ることで、グリセロールの合計モルを算出した。４１および１５がそれぞれグリセ
ロール部分およびメチル基の分子量である、重量％油＝１００×（（４１×合計モルＦＡ
ＭＥ／３）＋（合計ｇＦＡＭＥ−（１５×合計モルＦＡＭＥ）））／ｇ種子という関係を
用いて、グリセロールおよび脂肪アシル部分の合計としてＴＡＧを算出した。
【０２９２】
油試料のステロール含有量の分析
およそ１０ｍｇの油の試料を、内部標準として添加した一定分量のＣ２４：０モノオー
ルと一緒に、８０％ＭｅＯＨ中４ｍＬの５％ＫＯＨを用い、テフロン加工のねじ口のガラ
ス管内で８０℃にて２時間加熱し、けん化した。反応混合物を冷やした後、２ｍＬのＭｉ
ｌｌｉ−Ｑ水を添加し、振動および撹拌することで、ステロールを２ｍＬのヘキサン：ジ
クロロメタン（４：１  ｖ／ｖ）に抽出した。混合物を遠心分離し、ステロール抽出物を
取り除き、２ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で洗浄した。振動および遠心分離のあと、ステロー
ル抽出物を次いで除去した。窒素ガスの流れを利用して抽出物を蒸発させ、２００ｍＬの
ＢＳＴＦＡを用い、および８０℃で２時間加熱して、ステロールをシリル化した。
【０２９３】
ステロールのＧＣ／ＧＣ−ＭＳ分析のために、ステロール−ＯＴＭＳｉ誘導体を４０℃
のヒートブロック上の窒素ガスの流れ下で乾燥し、次いで、ＧＣ／ＧＣ−ＭＳ分析の直前
にクロロホルムまたはヘキサンに再溶解した。ステロール−ＯＴＭＳ誘導体を、Ｓｕｐｅ
ｒｌｃｏ  Ｅｑｕｉｔｙ（商標）−１溶融石英キャピラリーカラム（１５ｍ×０．１ｍｍ
内部直径、０．１μｍのフィルムの厚さ）、ＦＩＤ、分割／非分割注入器ならびにアジレ
ント・テクノロジー社７６８３Ｂシリーズ自動回収装置および注入器が取り付けられたア
ジレント・テクノロジー社６８９０Ａ  ＧＣ（米国、カリフォルニア州、パロアルト）を
用いたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析した。ヘリウムをキャリアガスとし
て使用した。１２０℃のオープン温度で、非分割モードで試料を注入した。注入後、オー
ブン温度を１分あたり１０℃ずつ２７０℃まで上げ、最終的に１分あたり５℃ずつ３００
℃まで上げた。アジレント・テクノロジー社ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（米国
、カリフォルニア州、パロアルト）でピークを定量化した。ＧＣ結果は各成分の面積の±
５％のエラーに影響される。
【０２９４】
ＧＣ−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）の分析をＦｉｎｎｉｇａｎ  Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ  
ＧＣＱ  ＧＣ−ＭＳおよびＦｉｎｎｉｇａｎ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ  ＧＣ−ＭＳ上で実施した；双方のシステムにカラム上注入器およびＴ
ｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ  Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（米国、テキサス州、オースティ
ン）を取り付けた。各ＧＣに、上記したものと類似した極性のキャピラリーカラムを取り
付けた。質量スペクトルデータを用いて、保持時間データを、信憑性のある実験室標準に
関して得られた保持時間データと比較することで、それぞれの成分を同定した。試料バッ
チと同時に、完全な手続き上のブランク分析を実施した。
【０２９５】
ＲＴ−ＰＣＲ条件
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅は、一般的に、製造業者の説明にしたがって１０ｐ
ｍｏｌのフォワードプライマーおよび３０ｐｍｏｌのリバースプライマー、２．５ｍＭの
最終濃度までのＭｇＳＣ４、緩衝液を伴う４００ｎｇの全ＲＮＡならびにヌクレオチド成
分を用いた、体積２５μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ
−ＰＣＲシステム（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して実行された
。典型的な温度レジームは：逆転写が起こるために３０分間４５℃で１サイクル；次いで
、２分間９４℃で１サイクル、引き続き、３０秒間９４℃、３０秒間５２℃、１分間７０
℃の４０サイクル；次いで、反応混合物を５℃に冷やす前に２分間７２℃の１サイクルで
あった。
【０２９６】
３５Ｓ−ＬＥＣ２での誘導によるＢ.ナプス体細胞胚の作製
【０２９７】
Ｂ.ナプス（ｃｖ．Ｏｓｃａｒ）種子を、（Ａｔｔｉｌａ  Ｋｅｒｅｓｚｔ  ｅｔ  ａ
ｌ．、２００７）が説明する通り、塩素ガスを用いて滅菌した。滅菌した種子を、ｐＨ５
．８に調節した０．８％寒天を伴う１／２強度のＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳ
ｋｏｏｇ、１９６２）上で発芽させ、６〜７日間、２４℃にて、１８／６時間（明／暗）
の光周期を伴う蛍光灯（５０μΕ／ｍ２ｓ）下で成長させた。２〜４ｍｍの柄の長さであ
る子葉柄（Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎａｒｙ  ｐｅｔｉｏｌｅｓ）をこれら実生から無菌的に単
離し、外植片として使用した。１つは種子特異的バイナリーベクターを保有し、２つ目は
３５Ｓ−ＬＥＣ２構築物を伴う、形質転換したＡ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１の培養物
を新しいプレートの単一コロニーから接種し、適切な抗生物質を伴う１０ｍＬのＬＢ培地
内で成長させ、２８℃で、１５０ｒｐｍの撹拌を伴いながら一晩成長させた。細菌細胞を
５分間の４０００ｒｐｍの遠心分離で回収し、２％スクロースを含むＭＳ培地で洗浄し、
１０ｍＬの同じ培地内に再懸濁し、１００μＭまでアセトシリンゴンを添加した後、４時
間、必要に応じて選択のための抗生物質と成長させた。植物組織への添加の２時間前に、
スペルミジンを１．５ｍＭの最終濃度まで添加し、細菌の最終密度を新しい培地でＯＤ６
００ｎｍ＝０．４まで調節した。１つは種子特異的構築物を保有し、もう一方は３５Ｓ−
ＡｔＬＥＣ２を保有する、２つの細菌培養物を、１：１から１：１．５比で混合した。
【０２９８】
新たに単離したＢ.ナプス子葉柄を、２０ｍＬのＡ．ツメファシエンス培養物で６分間
感染させた。子葉柄を滅菌フィルター紙上にブロットして余分なＡ．ツメファシエンスを
除去し、次いで、同時培養培地（１ｍｇ／ＬのＴＤＺ、０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、Ｌ−シ
ステイン（５０ｍｇ／Ｌ）を添加した１００μΜアセトシリンゴン、アスコルビン酸（１
５ｍｇ／Ｌ）およびＭＥＳ（２５０ｍｇ／１）を有するＭＳ培地）に移した。プレートを
微小孔テープで密封し、２４℃で４８時間、暗所でインキュベートした。同時培養した外
植片を事前選択培地（１ｍｇ／ＬのＴＤＺ、０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、３ｍｇ／ＬのＡｇ
ＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌセフォタキシムおよび５０ｍｇ／Ｌチメンチンを含むＭＳ）に移
し、４〜５日間、２４℃で、１６時間／８時間の光周期を伴って培養した。種子特異的ベ
クター上の選択マーカー遺伝子にしたがって、外植片を次いで選択培地（１ｍｇ／ＬのＴ
ＤＺ、０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌセフォタキシ
ムおよび５０ｍｇ／Ｌチメンチンを含むＭＳ）に移し、２〜３週間、２４℃で、１６時間
／８時間の光周期を伴って培養した。緑色の胚形成カルスを伴う外植片をホルモンフリー
ＭＳ培地（３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌセフォタキシム、５０ｍｇ／Ｌチメ
ンチンおよび選択剤を伴うＭＳ）に移し、もう２〜３週間培養した。選択培地上で生き残
った外植片から単離した魚雷または子葉期の胚を、ＧＣを使って、それらの全ての脂質の
脂肪酸組成に関して分析した。
【０２９９】
実施例２．シロイヌナズナ種子のトランスジェニックＤＨＡ経路の安定な発現
【０３００】
バイナリーベクターの作製
バイナリーベクターｐＪＰ３４１６−ＧＡ７およびｐＪＰ３４０４はそれぞれ、５つの
デサチュラーゼおよび２つのエロンガーゼをコードする７つの異種性脂肪酸生合成遺伝子
、ならびに、各ベクターに存在するＴ−ＤＮＡの左境界と右境界の反復の間に植物選択マ
ーカーを含んでいた（図２および３）。配列番号１は、右境界から左境界の配列のｐＪＰ
３４１６−ＧＡ７のＴ−ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列を提供する。双方の遺伝子構築物
は、ラカンセア・クルイベリΔ１２−デサチュラーゼ（配列番号１のヌクレオチド１４１
４３〜１６６４８を含む）、ピキア・パストリスω３デサチュラーゼ（配列番号１のヌク
レオチド７６５４〜１０１５６を含む）、ミクロモナス・プシラΔ６デサチュラーゼ（配
列番号１のヌクレオチド２２６〜２３０９を含む）、パブロバ・サリナΔ５およびΔ４デ
サチュラーゼ（それぞれ配列番号１のヌクレオチド４５２４〜６４８５および１０１５７
〜１４１４２を含む）およびピラミモナス・コルダタΔ６およびΔ５エロンガーゼ（それ
ぞれ配列番号１のヌクレオチド２３１０〜４５２３および１７８２５〜１９９６７を含む
）をコードする、植物コドン最適化遺伝子を含んでいた。配列番号１に対して、バイナリ
ーベクターｐＪＰ３４１６−ＧＡ７のＴ−ＤＮＡ（方向：右境界から左境界の配列）領域
の特定の領域は次の通りである：
ヌクレオチド１〜１６３：右境界；４８０〜２２６、アグロバクテリウム・ツメファシエ
ンスノパリンシンターゼターミネーター（ＴＥＲ＿ＮＯＳ）；１８８３〜４８９、ミクロ
モナス・プシラΔ６デサチュラーゼ；２３０９〜１９５２、セイヨウアブラナ切断ナピン
プロモーター（ＰＲＯ＿ＦＰｌ）；２３１０〜３２４３、シロイヌナズナＦＡＥ１プロモ
ーター（ＰＲＯ＿ＦＡＥ１）；３３１２〜４１８１、ピラミモナス・コルダタΔ６エロン
ガーゼ；４１９０〜４５２３、グリシンマックスレクチンターミネーター（ＴＥＲ＿レク
チン）；４５２４〜４８８１、ＰＲＯ＿ＦＰｌ；４９５０〜６２３０：パブロバ・サリナ
Δ５デサチュラーゼ；６２３１〜６４８５：ＴＥＲ＿ＮＯＳ；７６５３〜６４８６、ニコ
チアナ・タバカムＲｂ７マトリックス付着領域（ＭＡＲ）；８３８７〜７６５４、リヌム
・ウシタティスシムムコンリニン１ターミネーター（ＴＥＲ＿Ｃｎｌ１）；９６３８〜８
３８８、ピキア・パストリスω３デサチュラーゼ；１０１５６〜９７０７、リヌム・ウシ
タティスシムムコンリニン１プロモーター（ＰＲＯ＿Ｃｎｌ１）；１０１５７〜１２１８
９、リヌム・ウシタティスシムムコンリニン１プロモーター；１２２５８〜１３６０４、
パブロバ・サリナΔ４デサチュラーゼ；１３６０５〜１４１４２、リヌム・ウシタティス
シムムコンリニン２ターミネーター；１４１４３〜１４５９２、ＰＲＯ＿Ｃｎｌ１；１４
６６１〜１５９１４、ラカンセア・クルイベリΔ１２デサチュラーゼ；１５９１５〜１６
６４８、ＴＥＲ＿Ｃｎｌ１；１７８１６〜１６６４９、ＭＡＲ；１７８２５〜１８７５８
、ＰＲＯ＿ＦＡＥ１；１８８２７〜１９６３３、ピラミモナス・コルダタΔ５エロンガー
ゼ；１９６３４〜１９９６７、ＴＥＲ＿レクチン；１９９９０〜２０５２７、複製エンハ
ンサー領域を伴うカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター；２０５３７〜２１
０８８、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネスホスフィノトリシン−Ｎ−アセチルト
ランスフェラーゼ；２１０９７〜２１３４９、ＴＥＲ＿ＮＯＳ；２１３６７〜２１５２７
、左境界。
【０３０１】
構築物の７つのコード領域は、それぞれ、種子特異的プロモーターの制御下にあり、３
つの異なるプロモーター、すなわち、切断セイヨウアブラナナピンプロモーター（ｐＢｎ
ＦＰ１）、シロイヌナズナＦＡＥ１プロモーター（ｐＡｔＦＡＥ１）およびリヌム・ウシ
タティスシムムコンリニン１プロモーター（ｐＬｕＣｎｌ１）が使用された。７つの脂肪
酸生合成遺伝子は、一緒に、１８：１Δ９（オレイン酸）から２２：６Δ４、７、１０、
１３、１６、１９（ＤＨＡ）に変換するよう設計された全体のＤＨＡ合成経路をコードし
ていた。双方のバイナリーベクターは、複製エンハンサー領域を伴うカリフラワーモザイ
クウイルス（ＣａＭＶ）３５ＳプロモーターおよびＡ．ツメファシエンスｎｏｓ３’ポリ
アデニル化領域−転写ターミネーターに操作可能に結合した領域をコードするＢＡＲ植物
選択マーカーを含んでいた。植物選択マーカーはＴ−ＤＮＡ領域の左境界に隣接して配置
され、したがって、植物細胞へのＴ−ＤＮＡ導入の方向に関して、Ｔ−ＤＮＡ上で遠位に
位置した。これは、選択マーカー遺伝子を含まない可能性が高いＴ−ＤＮＡの部分的導入
が選択されない可能性を増大した。ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７およびｐＪＰ３４０４はそれ
ぞれアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎ
ｅｓ）由来のＲｉＡ４複製開始点を含んだ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、１９９７）。
【０３０２】
配列番号１のヌクレオチド２２６〜１９９７５に対応するＤＮＡ領域（ＧＡ７領域）を
合成し、この領域をＰｓｐＯＭＩ部位の受容バイナリーベクターｐＪＰ３４１６に挿入す
ることで、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７を作製した。ＧＡ７上の各脂肪酸生合成遺伝子は、プ
ロモーターと翻訳開始ＡＴＧとの間に、各コード領域と操作可能に結合して遺伝子から生
成されるｍＲＮＡの翻訳効率を最大化するタバコモザイクウイルス５’非翻訳領域（５’
ＵＴＲ）配列を含んでいた。ＧＡ７構築物はまた、Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）
が説明する通り、２つのニコチアナ・タバカムＲｂ７マトリックス付着領域（ＭＡＲ）配
列を含んでいた。核付着領域と時折呼ばれるＭＡＲ配列は、インビトロで核マトリックス
に特異的に結合すると知られており、インビボでクロマチンの核マトリックスへの結合を
媒介し得る。ＭＡＲは、トランスジェニックサイレンシングを緩和するように機能すると
考えられている。ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７において、トランスジェニック発現カセットを
遮断するＤＮＡスペーサーとして作用するために、ＭＡＲも、Ｔ−ＤＮＡ領域内に挿入お
よび配置される。ＧＡ７領域の挿入前のｐＪＰ３４１６ベクターは、境界間に植物選択マ
ーカーカセットしか含んでいなかった。
【０３０３】
種子内のＳＤＡ生産のための遺伝子を含んだバイナリーベクターｐＪＰ３３６７に遺伝
子カセットが添加される、制限酵素をもとにした順次挿入によって、遺伝子構築物ｐＪＰ
３４０４を作製した。この構築物は、双方ともＢ.ナプス切断ナピンプロモーター（ＦＰ
１）によって発現されるＬ．クルイベリΔ１２デサチュラーゼおよびＰ．パストリス（Ｐ
．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ω３デサチュラーゼ、ならびに、Ａ．タリアナＦＡＥ１プロモータ
ーに発現されるＭ．プシラΔ６デサチュラーゼを含んでいた（図４）。はじめに、Ａ．タ
リアナＦＡＤ２イントロンをＥｃｏＲＩ部位に隣接させ、ｐＪＰ３３６７ＭｆｅＩ部位に
クローニングしてｐＪＰ３３９５を作製した。それぞれＦＡＥ１およびＦＰ１プロモータ
ーによって促進されるＰ．コルダタΔ６およびΔ５エロンガーゼカセットを含む断片を、
ｐＪＰ３３９５のＫａｓＩ部位にクローニングして、ｐＪＰ３３９８を作製した。次いで
、ｐＪＰ３３９８のＲＫ２複製開始点をＲｉＡ４複製開始点で置き換えることで、ｐＪＰ
３３９９を作製した。それぞれＦＰ１およびＦＡＥ１プロモーターによって促進されるＰ
．サリナΔ５およびΔ４デサチュラーゼカセットを含むＳｂｆＩ隣接断片をｐＪＰ３３９
９のＳｂｆＩ部位にクローニングすることで、最終バイナリーベクター、ｐＪＰ３４０４
を作製した。
【０３０４】
Ａ．タリアナ（シロイヌナズナ）形質転換および脂肪酸組成の分析
キメラベクターをＡ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入し、形質転換したアグロバク
テリウムの培養物からの細胞を用いて、形質転換のためにフローラルディップ方法を利用
してＡ．タリアナ（シロイヌナズナ）（生態型コロンビアおよびｆａｄ２変異体）植物を
処理した（ＣｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔ、１９９８）。成熟後、処理した植物からのＴ１
種子を回収しＢＡＲ選択マーカー遺伝子を含む植物の選択のためにＰＰＴを含むＭＳプレ
ート上に播いた。生き残った、健康なＴ１実生を土壌に移した。植物が成熟まで成長し、
自家受精が可能にした後、これら植物からのＴ２種子を回収し、それらの種子脂質の脂肪
酸組成を実施例１で記載する通りにＧＣ分析によって分析した。
【０３０５】
ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７をコロンビア遺伝的背景へ使用した１３個の形質転換体および
ｆａｄ２変異体を使用した６個の形質転換体に関して、種子脂質のＤＨＡ量のデータが図
５に示される（Ｔ２と標識されたレーン）。ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７構築物は、総脂肪酸
含有量のパーセンテージとして表されるＤＨＡ量の、ｐＪＰ３４０４構築物よりも平均的
に少しだけ高い生産につながった。表４は、最も高いＤＨＡ量を伴うＴ２系統からの総種
子脂質の脂肪酸組成を示す。同一種子のオレイン酸からのＤＨＡの生産における各酵素的
工程に関して算出された転換効率が表５に示される。転換効率は、（％産物×１００）／
（％残存基質＋％産物）で算出され、したがってパーセンテージで表される。
【０３０６】
ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７  Ｔ２形質転換系統で生産されたＤＨＡの最も高く観察された
量は６．２％であり、さらに、０．５％ＥＰＡおよび０．２％ＤＰＡ（系統＃１４）を伴
った。これらのＴ２種子は、導入遺伝子に対して依然と分離しており、すなわち、均一し
てホモ接合ではなかった。独立トランスジェニック種子の総種子脂質のプロフィール（表
４）のまとめたデータが表６に示される。これらの種子の導入遺伝子の結果生産されたω
３脂肪酸の量（コロンビア背景で内因的に生産されたＡＬＡの量を除外した全ての新ω３
脂肪酸）が１０．７％である一方で、ω６脂肪酸の量（１８：２Δ９、１２を除外した全
ての新ω６脂肪酸）は１．５％であった。これは、新ω３脂肪酸：新ω６脂肪酸の極端に
有利な比、すなわち、７．３：１を意味する。
【０３０７】
ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７で形質転換した選択系統、すなわち、コロンビア背景の７、１
０、１４、２２および３４と指定された系統ならびにｆａｄ２変異体背景の１８、２１お
よび２５と指定された系統のＴ２種子を、インビトロのトランスジェニック実生の選択の
ためにＰＰＴを含むＭＳ培地上に播いた。各系統に対して２０個のＰＰＴ耐性実生が土壌
に移され、自家受精後成熟するまで成長させた。これらの植物は、選択マーカー遺伝子、
および、したがって、植物ゲノムの少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ挿入物にとって、ホモ接
合である傾向が非常に高かった。これら植物のＴ３種子を回収し、それらの種子油の脂肪
酸組成を、ＧＣによって分析した。データは表７に表される。この分析によって、ｐＪＰ
３４１６−ＧＡ７構築物は、ホモ接合植物のＴ３種子で、分離するＴ２種子よりも高い量
のω３ＬＣ−ＰＵＦＡ  ＤＨＡを生産することが明らかになった。最大約１３．９％のＤ
ＨＡがコロンビア背景で２２．２と指定されたＴ３のｐＪＰ３４１６−ＧＡ７形質転換系
統で観察され、これは、ヘミ接合Ｔ２種子における約５．５％から増加し、種子脂質含有
量における総脂肪酸のパーセンテージとして、約２４．３％の新ω３脂肪酸の合計量を伴
った。新ω６脂肪酸は、総脂肪酸の１．１％の量であり、新ω３脂肪酸：新ω６脂肪酸の
大変有利な比、すなわち約２２：１を意味する。同様に、ｆａｄ２変異体背景での形質転
換は、種子脂質含有量における総脂肪酸のパーセンテージとして、１１．５％のＤＨＡを
含む、２０．６％の新ω３脂肪酸の合計をもたらした。
【０３０８】
【表４】
2020172643.tif 000009
【０３０９】
【表５】
2020172643.tif 000010
【０３１０】
【表６】
2020172643.tif 000011
【０３１１】
【表７】
2020172643.tif 000012
【０３１２】
オレイン酸からのＤＨＡの生産のための経路における各酵素工程の酵素的転換効率が、
より高いＤＨＡ量を有するＴ３種子に関して表８に示される。系統２２．２の種子におけ
るΔ１２デサチュラーゼ転換効率は８１．６％で、ω３デサチュラーゼ効率は８９．１％
であり、双方とも著しく高く、これらの真菌（酵母菌）酵素は発育中の種子で良く機能で
きたことを示す。ＤＨＡ経路における他の外因性酵素の活性はω３基質に対して同様に高
く、Δ６デサチュラーゼは４２．２％効率、Δ６エロンガーゼは７６．８％、Δ５デサチ
ュラーゼは９５．０％、Δ５エロンガーゼは８８．７％およびΔ４デサチュラーゼは９３
．３％効率で作用した。ω６基質ＬＡ上のΔ６デサチュラーゼ活性はもっと低く、Δ６デ
サチュラーゼはＬＡ上でたった０．７％の転換効率で作用した。ＧＬＡはたった０．４％
の量で存在し、最も高いＤＨＡ含有量を伴うＴ３種子で検知された２０：２ω６を除いて
、唯一の新ω６産物であった。独立トランスジェニック種子の総種子脂質プロフィール（
表７）のまとめたデータが表９で示される。最も高いＤＨＡ量を有する系統に関するこの
データは、総ω６  ＦＡ（ＬＡを含む）の総ω３  ＦＡ（ＡＬＡを含む）に対する０．１
０の比を含んだ。この系統の脂質における、新ω６  ＦＡ（ＬＡを含まない）の新ω３  
ＦＡ（ＡＬＡを含まない）に対する比は、０．０５であった。総多価不飽和脂肪酸量は、
これらの系統で５０％超であり、少なくとも４つの系統で６０％超であった。全体的な転
換効率は次のように算出された：ＯＡからＥＰＡ＝２１．８％、ＯＡからＤＨＡ＝１８．
０％、ＬＡからＥＰＡ＝２６．９％、ＬＡからＤＨＡ＝２２．２％、ＡＬＡからＥＰＡ＝
３０．１％、ＡＬＡからＤＨＡ＝２４．９％。
【０３１３】
【表８】
2020172643.tif 000013
【０３１４】
【表９】
2020172643.tif 000014
【０３１５】
Ｔ２系統２２の子孫である、コロンビア背景のｐＪＰ３４１６−ＧＡ７系統２２．２か
らのＴ３種子を土壌に直接播き、得られたＴ３植物の成熟種子の脂肪酸組成をＧＣで分析
した。これらの種子の平均ＤＨＡ量は、種子脂質の総脂肪酸のパーセンテージとして、１
３．３％±１．６（ｎ＝１０）であった。表６で示される通り（右側の柱）、最も高い量
のＤＨＡを有する系統は、種子脂質の総脂肪酸において１５．１％のＤＨＡを含んでいた
。酵素的転換効率が、オレイン酸からのＤＨＡ生産の各工程に関して、表８に示される。
【０３１６】
最も高いＤＨＡ量を伴う系統の総ω６  ＦＡ（ＬＡを含む）のω３  ＦＡ（ＡＬＡを含
む）に対する比は、０．１０２であった。最も高いＤＨＡ量を有する系統での新ω６  Ｆ
Ａ（ＬＡを含まない）の新ω３  ＦＡ（ＡＬＡを含まない）に対する比は、０．０５３で
あった。総飽和脂肪酸の量は約１７．８％であり、一価不飽和脂肪酸の量は約１８．１％
であった。総ω６脂肪酸の量は約５．７％であり、ω３脂肪酸の量は約５５．９％であっ
た。全体的な転換効率は次のように算出された：ＯＡからＥＰＡ＝２４．５％、ＯＡから
ＤＨＡ＝２０．１％、ＬＡからＥＰＡ＝２９．９％、ＬＡからＤＨＡ＝２４．５％、ＡＬ
ＡからＥＰＡ＝３２．９％、ＡＬＡからＤＨＡ＝２７．０％。総オメガ３脂肪酸は総脂肪
酸の５５．９％まで蓄積することが発見された一方で、オメガ６脂肪酸は総プロフィール
の５．７％であった。
【０３１７】
サザンブロットハイブリダイゼーション分析を実施した。結果は、高蓄積ＤＨＡ系統は
ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７構築物のＴ−ＤＮＡの単一または重複コピーのいずれかであった
が、トランスジェニック系統コロンビア＃２２は例外で、これは、アラビドプシス植物の
ゲノムに３つのＴ−ＤＮＡ挿入を有した。Ｔ５世代種子もまた分析し、総種子脂質におい
て最大１３．６％のＤＨＡを有することが分かった。ＧＡ７構築物は、ＤＨＡ生産能力の
観点からは、複数の世代を超えて安定であることが分かった。
【０３１８】
トランスジェニックＡ．タリアナ（シロイヌナズナ）ＤＨＡ系統の油含有量の測定
様々な量のＤＨＡを有するトランスジェニックＡ．タリアナ種子の油含有量を実施例１
で説明した通りＧＣで測定した。データは図６に示され、油含有量（種子の重量％油）を
ＤＨＡ含有量（総脂肪酸のパーセンテージとして）に対してグラフ化している。種子１グ
ラムあたり最大２６．５ｍｇのＤＨＡが観察された（表１０）。トランスジェニックアラ
ビドプシスの油含有量は、ＤＨＡ含有量と負で相関していることが分かった。種子の重量
あたりのＤＨＡ量は、約１４％ＤＨＡを有する種子と比較して、約９％のＤＨＡ量を有す
る形質転換種子でより高かった。これがアラビドプシス以外の種子にもあてはまるかどう
かはまだ測定されていない。
【０３１９】
【表１０】
2020172643.tif 000015
【０３２０】
実施例３．カメリナサティバ種子のトランスジェニックＤＨＡ経路の安定な発現
上記のバイナリーベクターｐＪＰ３４１６−ＧＡ７を、Ａ．ツメファシエンス株ＡＧＬ
１に導入し、形質転換したアグロバクテリウムの培養物からの細胞を用いて、形質転換の
ためにフローラルディップ方法を用いてＣ．サティバ（カメリナサティバ）顕花植物を処
理した（ＬｕおよびＫａｎｇ、２００８）。植物の成長および成熟後、処理した植物のＴ
１種子を回収し、土壌に播き、得られた植物を除草剤ＢＡＳＴＡで噴霧することで処理し
、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７のＴ−ＤＮＡ上に存在するｂａｒ選択マーカー遺伝子のトラン
スジェニックであり、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７のＴ−ＤＮＡ上に存在するｂａｒ選択マー
カー遺伝子を発現していた植物を選択した。除草剤に耐性を持ち、生き残ったＴ１植物を
、自家受精させた後に成熟するまで成長させ、得られたＴ２種子を回収した。５つのトラ
ンスジェニック植物が得られ、そのうち３つのみが全体のＴ−ＤＮＡを含んでいた。
【０３２１】
全体のＴ−ＤＮＡを含んだ３つの植物のそれぞれからのおおよそ２０の種子のプールか
ら脂質を抽出した。プール化した試料のうち２つは、大変低い、ほとんど検知できない量
のＤＨＡを含んでいたが、３つ目のプールは約４．７％のＤＨＡを含んでいた（表１２）
。したがって、この植物の１０個の各Ｔ２種子から脂質を抽出し、脂肪酸組成をＧＣで分
析した。この形質転換系統の各種子の脂肪酸組成データも表１１に示される。総種子脂質
プロフィール（表１１）をまとめたデータは表１２に示される。
【０３２２】
【表１１】
2020172643.tif 000016
【０３２３】
【表１２】
2020172643.tif 000017
2020172643.tif 000018
【０３２４】
ＤＨＡは、１０個のそれぞれの種子のうち６つに存在した。他の４つの種子はＤＨＡを
有さず、親植物のＴ−ＤＮＡ挿入のヘミ接合性をもとに、Ｔ−ＤＮＡを有さなかった無効
分離体であると推定された。最も高い量のＤＨＡを有する単一種子から抽出された脂質は
９．０％のＤＨＡを有し、一方で、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計パーセンテージは
１１．４％であった。形質転換の結果この種子で生産された新ω３脂肪酸（ＳＤＡ、ＥＴ
ｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ）の合計パーセンテージは１９．３％であり、一
方で、新ω６脂肪酸（ＧＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡおよびいずれかのω６伸長産物
）の対応する合計は、２．２％であり、ＧＬＡおよびＥＤＡのみが新ω６脂肪酸として検
知された。総ω６ＦＡ（ＬＡを含む）のω３ＦＡ（ＡＬＡを含む）に対する比は、０．４
４だと分かった。最も高いＤＨＡ量を有する種子の新ω６ＦＡ（ＬＡを含まない）の新ω
３ＦＡ（ＡＬＡを含まない）に対する比は、０．１２であった。総飽和脂肪酸の量は約１
７．８％であり、一価不飽和脂肪酸の量は約１５．５％であった。総ω６脂肪酸の量は、
約２０．４％であり、ω３脂肪酸の量は約４６％であった。全体の転換効率は次のように
算出された：ＯＡからＥＰＡ＝１５．６％、ＯＡからＤＨＡ＝１２．３％、ＬＡからＥＰ
Ａ＝１７．２％、ＬＡからＤＨＡ＝１３．６％、ＡＬＡからＥＰＡ＝２４．８％、ＡＬＡ
からＤＨＡ＝１９．６％。
【０３２５】
この系統のホモ接合種子を、Ｔ４世代で得た。Ｔ４世代全体で観察された平均７．３％
のＤＨＡを有するＦＤ５−４６−１８−１１０事象で、最大１０．３％のＤＨＡが生産さ
れた。
【０３２６】
複数の温室でホモ接合種子を植え付け、全体で６００超の個々の植物を作製した。ソッ
クスレー、アセトンおよびヘキサン抽出を含む様々な方法を使用して、種子から油を抽出
している。
【０３２７】
上記の通り得られた、独立して形質転換した系統のＣ．サティバの数が低かったので、
Ｃ．サティバをｐＪＰ３４１６−ＧＡ７で形質転換するさらなる実験を実施する。発明者
らは、種子油中の総脂肪酸のパーセンテージで１０％超のＤＨＡ量が、さらに形質転換さ
れた系統およびで達成され、Ｔ−ＤＮＡに対してホモ接合である植物は２０％のＤＨＡま
で達成される推測する。２０個のＣ．サティバＧＡ７＿ｍｏｄＨ事象を作製し、種子のＤ
ＨＡ含有量を分析している。３つのＧＡ７＿ｍｏｄＢ事象作製し、事象ＣＭＤ１７．１か
らのＴ１種子の分析は、９．８％のプール化種子ＤＨＡ含有量を明らかにした。最も高い
単一種子ＤＨＡ値は１３．５％であることがわかった。
【０３２８】
実施例４．セイヨウアブラナ種子のトランスジェニックＤＨＡ経路の安定な発現
単一ベクターを用いたＢ.ナプス（セイヨウアブラナ）形質転換および脂肪酸組成の分析
バイナリーベクターｐＪＰ３４１６−ＧＡ７を使用して、形質転換セイヨウアブラナ植
物およびその植物からの種子を作製した。標準的なエレクトロポレーション手法を介して
、上記のベクターｐＪＰ３４１６−ＧＡ７をアグロバクテリウム・ツメファシエンス株Ａ
ＧＬ１に導入した。トランスジェニックアグロバクテリウム細胞の培養物を、１５０ｒｐ
ｍでの振動を伴って、２８℃のＬＢ培地で一晩成長させた。細菌細胞を５分間の４０００
ｒｐｍでの遠心分離によって回収し、Ｗｉｎａｎｓ  ＡＢ培地（Ｗｉｎａｎｓ、１９８８
）で洗浄し、１０ｍＬのＷｉｎａｎｓ  ＡＢ培地（ｐＨ５．２）に再懸濁し、カナマイシ
ン（５０ｍｇ／Ｌ）、リファンピシン（２５ｍｇ／Ｌ）および１００μΜアセトシリンゴ
ンの存在下で一晩成長を続けた。ブラシカ細胞の感染の２時間前に、スペルミジン（１２
０ｍｇ／Ｌ）を添加し、細菌の最終密度を新しいＡＢ培地で０．３〜０．４のＯＤ６００
ｎｍまで調節した。１／２ＭＳ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、１９６２）で成
長した８日目のセイヨウアブラナ実生から新たに単離した子葉柄または１ｍｇ／Ｌのチジ
アズロン（ＴＤＺ）および０．１ｍｇ／Ｌのα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を伴うＭＳ培
地上で３〜４日で事前に条件を整えた胚軸断片を、１０ｍＬのアグロバクテリウム培養物
で５分間感染した。アグロバクテリウムで感染した外植片を次いで滅菌フィルター紙にブ
ロットして余分なアグロバクテリウムを除去し、異なる抗酸化剤（Ｌ−システイン５０ｍ
ｇ／Ｌおよびアスコルビン１５ｍｇ／Ｌ）を添加した、または添加していない、同時培養
培地（１ｍｇ／ＬのＴＤＺ、０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡおよび１００μΜアセトシリンゴン
を伴うＭＳ培地）に移した。全プレートをパラフィルムで密封し、２３〜２４℃の暗所で
４８時間インキュベートした。
【０３２９】
処理した外植片を次いで、５００ｍｇ／Ｌセフォタキシムおよび５０ｍｇ／Ｌチメンチ
ンを含む滅菌蒸留水で１０分間洗浄し、滅菌蒸留水で１０分間すすぎ、滅菌フィルター紙
上にブロットして乾燥し、事前選択培地（１ｍｇ／ＬのＴＤＺ、０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ
、２０ｍｇ／Ｌの硫酸アデニン（ＡＤＳ）、１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／
Ｌのセフォタキシムおよび５０ｍｇ／Ｌチメンチンを含むＭＳ）に移し、１６時間／８時
間の光周期で、５日間２４℃で培養した。次いで、形質転換細胞の選択のための作用剤と
して１．５ｍｇ／Ｌのグルフォシネートアンモニウムを伴う選択培地（１ｍｇ／ＬのＴＤ
Ｚ、０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、２０ｍｇ／ＬのＡＤＳ、１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２
５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムおよび５０ｍｇ／Ｌのチメンチンを含むＭＳ）にそれらを
移し、同じ培地上で、隔週で継代培養しながら、１６時間／８時間の光周期で、２４℃に
て４週間培養した。緑色のカルスを伴う外植片を発芽開始培地（１ｍｇ／Ｌのキネチン、
２０ｍｇ／ＬのＡＤＳ、１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム
、５０ｍｇ／Ｌのチメンチンおよび１．５ｍｇ／Ｌのグルフォシネートアンモニウムを含
むＭＳ）に移し、もう２〜３週間培養した。耐性外植片から生まれた芽を芽伸長培地（０
．１ｍｇ／Ｌのジベレリン酸、２０ｍｇ／ＬのＡＤＳ、１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２
５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムおよび１．５ｍｇ／Ｌのグルフォシネートアンモニウムを
含むＭＳ培地）に移し、もう２週間培養した。２〜３ｃｍの長さの健康的な芽を選択し、
発根培地（１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、２０ｍｇ／ＬのＡＤＳ、１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３お
よび２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを含む１／２ＭＳ）に移し、２〜３週間培養した。
根を伴う良く確立された芽を、実生成長ミックスを含むポットに移し、２週間成長キャビ
ネットで成長させ、引き続き、温室に移した。この方法で、ＧＡ７構築物で形質転換した
およそ４０（Ｔ０）の植物を得た。
【０３３０】
植物を、自家受精させた後、成熟するまで成長させた。形質転換した植物から得た種子
を、実施例１に記載される通り、それらの種子油の脂肪酸組成に関して分析した。最も高
いＤＨＡ量を有する形質転換系統に関するデータが表１３で示される。平均的なＤＨＡ量
は、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７のＴ−ＤＮＡで形質転換したＢ.ナプス種子の種子油におい
て、同じ構築物で形質転換したＡ．タリアナ種子（実施例２）またはカメリナ種子（実施
例３）よりも、著しく低かった。およそ４０の系統の中で最も高い量のＤＨＡは１．５２
％であり、トランスジェニック系統の大部分は検知可能なＤＨＡを有した。これらの種子
のなかに、総脂肪酸の約３５％である相当な蓄積のＡＬＡがあり、これはＳＤＡまたは経
路で続く産物に効率的に変換されていなかったことが留意された。
【０３３１】
Ｔ１事象、ＣＴ１２５−２からの単一Ｂ.ナプス種子の脂肪酸プロフィール分析を実施
して、トランスジェニック種子で生産されたＤＨＡの量をより良く測定した。種子は、０
％（無効種子）と８．５％の間のＤＨＡを含むことがわかった（表１３）。
【０３３２】
ＤＨＡ生産を示す、植物系統ＣＴ１１６ならびに他のトランスジェニック系統由来の種
子をいくつか播いて、後代植物を作製した。ＧＡ７構築物が、同一構築物を有するトラン
スジェニックＡ．タリアナおよびＣ．サティバと比較して、なぜＤＨＡ生産に関して不十
分に作用し、および、ｐＪＰ３１１５およびｐＪＰ３１１６上の遺伝子の組み合わせと比
較してなぜ不十分に作用したのかを決定するために、これら植物の発育中の胚から単離し
た総ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを実施した（下）。一段階ＲＴ−ＰＣＲキット（インビ
トロゲン社）および各導入遺伝子を標的する遺伝子特異的プライマーを用いて、ＲＴ−Ｐ
ＣＲを総ＲＮＡに対して行った。これによって、ＧＡ７構築物の各遺伝子は、形質転換種
子の大部分で不十分に発現したΔ６デサチュラーゼを除いて、Ｂ.ナプス形質転換体で良
好に発現することが確認された。この構築物からの他の遺伝子は、Ｂ.ナプスおよびＡ．
タリアナ種子の双方で良く機能し、たとえば、Δ１２およびΔ１５デサチュラーゼはオレ
イン酸量を減らす一方で種子のＬＡおよびＡＬＡの増加した量を生産するように機能した
。代表的なＲＴ−ＰＣＲゲルは、図７に示され、これは、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７の他の
導入遺伝子と比較して、Δ６デサチュラーゼの低発現を明らかに示す。
【０３３３】
導入遺伝子とホモ接合であるトランスジェニック植物および種子を、最も高いＤＨＡを
有する系統の後代を植え付けることで、作製する。
【０３３４】
【表１３】
2020172643.tif 000019
【０３３５】
２つのベクターを用いたＢ.ナプス形質転換および脂肪酸組成の分析
Ｂ.ナプスの別の実験において、および、導入遺伝子を導入するための代替形式として
、国際公開第２０１０／０５７２４６号に記載されるバイナリーベクターｐＪＰ３１１５
およびｐＪＰ３１１６を使用して、形質転換Ｂ.ナプス植物を別々に作製し、形質転換種
子をその植物から得た。ｐＪＰ３１１５上のＴ−ＤＮＡは、クレピス・パレスチナ（Ｃｒ
ｅｐｉｓ  ｐａｌｅｓｔｉｎａ）Δ１２デサチュラーゼ、ミクロモナス・プシラΔ６デサ
チュラーゼ、ピラミモナス・コルダタΔ６エロンガーゼおよびパブロバ・サリナΔ５デサ
チュラーゼをコードするキメラ遺伝子を含み、ｐＪＰ３１１６上のＴ−ＤＮＡはペルリア
・フルテスケンス（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）Δ１５デサチュラーゼ、ピ
ラミモナス・コルダタΔ５エロンガーゼおよびパブロバ・サリナΔ４デサチュラーゼを含
んでいた。２つのＴ−ＤＮＡは、一緒に存在し、発育中の種子に発現された場合、内因的
に生産されたオレイン酸からＤＨＡを生産するための７遺伝子経路を形成した。これらの
ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１に、標準的なエレクトロポ
レーション手法で導入し、形質転換した細胞を独立して使用し、上記の方法を用いてＢ.
ナプスを形質転換し、安定的に形質転換したＴ０植物を作製した。２９のｐＪＰ３１１５
および１９のｐＪＰ３１１６形質転換体を得て、これらの植物を成熟するまで成長させ、
自家受精の後に得られた種子を、それらの種子油の脂肪酸組成に関して分析した。ｐＪＰ
３１１５のＴ−ＤＮＡでの形質転換は、内因的に生産されたＡＬＡからのＥＰＡ生産につ
ながると予測された一方で、ｐＪＰ３１１６のＴ−ＤＮＡでの形質転換はＬＡからのＡＬ
Ａ生産増大につながると予測された。これらの表現型を示す植物を複数同定した。事象の
大部分は、低量のＥＰＡ生産を伴うΔ１２不飽和化のために、低下したＯＡ／増大したＬ
Ａ表現型を示した。最大２．６％のＥＰＡがｐＪＰ３１１１５トランスジェニック種子プ
ールで観察された。同様に、ｐＪＰ３１１６事象の大部分はΔ１５デサチュラーゼ活性の
ために増大したＡＬＡ表現型を有することが分かった。最大１８．５％のＡＬＡがｐＪＰ
３１１６のＴ−ＤＮＡで形質転換したプール種子で発見された。
【０３３６】
最も高い量のＥＰＡおよびＡＬＡを有する系統のＴ１植物を交雑させ、２４個の回収し
た事象の後代種子（Ｆ１）のＤＨＡ含有量を分析した。ＤＨＡは、これらの事象のうち１
７個で発見され、最大１．９％のＤＨＡがこれらの事象のプール種子で発見された。単一
種子分析を実施して、ＤＨＡ生産の範囲を決定し、そのデータが表１４に示される。広い
範囲のＤＨＡ量が交雑子孫で観察され、おそらく、親植物でのＴ−ＤＮＡのヘミ接合性質
のためであり、その結果、いくつかの種子は双方のＴ−ＤＮＡを受け取らなかった。最大
６．７％のＤＨＡが全種子脂質で観察された。
【０３３７】
【表１４】
2020172643.tif 000020
【０３３８】
【表１５】
2020172643.tif 000021
2020172643.tif 000022
【０３３９】
全脂質プロフィール（表１４）をまとめたデータが表１５に示される。表１５のデータ
によると、最も高い量のＤＨＡを有する種子での全ω６ＦＡ（ＬＡを含む）のω３ＦＡ（
ＡＬＡを含む）に対する比は、３．３４であった。新ω６ＦＡ（ＬＡを含まない）の新ω
３ＦＡ（ＡＬＡを含まない）に対する比は１．３９であった。総飽和脂肪酸の量は、約１
３．７％であり、一価不飽和脂肪酸の量は約２１．８％であった。総ω６脂肪酸の量は４
６．４％であり、ω３脂肪酸の量は約１４．８％であった。全体の転換効率は次のように
算出された：ＯＡからＥＰＡ＝１２．８％、ＯＡからＤＨＡ＝８．５％、ＬＡからＥＰＡ
＝１５．７％、ＬＡからＤＨＡ＝１０．４％、ＡＬＡからＥＰＡ＝７２．１％、ＡＬＡか
らＤＨＡ＝４７．９％。ｐＪＰ３１１５およびｐＪＰ３１１６の組み合わせでの本実験で
観察されたω６脂肪酸からω３脂肪酸の転換の効率の低下は、ＡＬＡからＤＨＡの転換の
ための遺伝子と組み合わせた場合、真菌Δ１５／ω３デサチュラーゼと比較して、植物Δ
１５デサチュラーゼの効率がより低い（実施例２および３）ためであると考えられた。
【０３４０】
導入された導入遺伝子の全てにホモ接合であるＤＨＡ含有系統の子孫を分析のために作
製する。
【０３４１】
実施例５．植物種子における、ＤＨＡ経路をコードするＴ−ＤＮＡの改変
Ｂ.ナプスでのＤＨＡ生産量を実施例４に記載される量を超えて改善するために、バイ
ナリーベクターｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＡ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢ
、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＣ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＤ、ｐＪＰ３４
１６−ＧＡ７−ｍｏｄＥおよびｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＦを次のように作製した
。これらのバイナリーベクターは、実施例２に記載されたｐＪＰ３４１６−ＧＡ７構築物
の変異形であり、特にΔ６デサチュラーゼおよびΔ６エロンガーゼ機能を改善することで
、植物種子でのＤＨＡの合成をさらに増大するように設計した。Δ５エロンガーゼと比べ
て比較的低い伸長効率のために、ＧＡ７構築物で形質転換したある種子では、ＳＤＡが蓄
積されるのが観察されていたので、他の改変の中で、２つのエロンガーゼ遺伝子配置をＴ
−ＤＮＡで交換した。
【０３４２】
まず始めに新しいＰ．コルダタΔ６エロンガーゼカセットをｐＪＰ３４１６−ＧＡ７の
ＳｂｆＩ部位間にクローニングし、Ｐ．コルダタΔ５エロンガーゼカセットと取り換える
ことで、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７における２つのエロンガーゼコード配列を、Ｔ−ＤＮＡ
上でのそれらの配置を交換し、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＡを得た。Ｍ．プシラΔ
６デサチュラーゼを促進するＦＰ１プロモーターをコンリニンＣｎｌ２プロモーター（ｐ
ＬｕＣｎｌ２）と交換することで、この構築物をさらに改変し、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７
−ｍｏｄＢを得た。Δ６デサチュラーゼ発現を増大、それによって酵素効率を増大させる
試みの中でこの改変を行った。Ｃｎｌ２プロモーターは、切断ナピンプロモーターよりも
より高い導入遺伝子の発現をＢ.ナプスにもたらし得ると考えられた。少し異なるコドン
使用頻度を伴う第２のＭ．プシラΔ６デサチュラーゼカセット（配列番号１５）を添加す
ることにより、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＣを作製し、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−
ｍｏｄＢの右境界のちょうど内側のＰｍｅＩ部位に挿入したＦＰ１プロモーターで促進し
た。Δ６デサチュラーゼ発現量を増大し、複数のプロモーターの使用によってΔ６デサチ
ュラーゼの発現のための種子発育間の期間を延ばすために、第２のΔ６デサチュラーゼカ
セットを双方のｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢおよびｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏ
ｄＦに添加した。２つの核配列で異なるコドン使用頻度を使用して、同一Ｔ−ＤＮＡ内で
の類似したコード領域の同時抑制の恐れのない、同一タンパク質配列の翻訳につながった
。ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＤおよびｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＥは、配列
番号１のヌクレオチド１６６４９〜１７８１６に対応する３番目のＭＡＲ配列がＰｍｅＩ
部位にてそれぞれｐＪＰ３４１６−ＧＡ７およびｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢに添
加された類似変異形であった。天然Δ６デサチュラーゼヌクレオチド配列を含む第２のＭ
．プシラΔ６デサチュラーゼカセットを添加することで、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏ
ｄＦを作製し、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢの右境界のＰｍｅＩ部位にあるＦＰ１
プロモーターで促進した。ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＧを、まず始めにＡｓｃＩ−
ＰａｃＩ部位での制限クローニングによってＭ．プシラΔ６デサチュラーゼカセットをＣ
ｎｌ２：Ｐ．コルダタΔ５エロンガーゼカセットで置き換えることで作製した。次いで、
ＳｂｆＩ部位での制限クローニングによって本来のＦＡＥ１：Ｐ．コルダタΔ５エロンガ
ーゼカセットをＦＡＥ１：Ｍ．プシラΔ６デサチュラーゼカセットで交換することで、ｐ
ＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＧを作製した。これらの遺伝子構築物のそれぞれのＴ−Ｄ
ＮＡのヌクレオチド配列は、次のように示される：ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢ（
配列番号２）、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＣ（配列番号３）、ｐＪＰ３４１６−Ｇ
Ａ７−ｍｏｄＤ（配列番号４）、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＥ（配列番号５）、ｐ
ＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＦ（配列番号６）およびｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄ
Ｇ（配列番号７）。
【０３４３】
バイナリーベクターｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍ
ｏｄＣ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＤ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＥ、ｐＪ
Ｐ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＦおよびｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＧを使用して形質
転換したブラシカ体細胞胚ならびにセイヨウアブラナ、カメリナ・サティバおよびシロイ
ヌナズナ植物および後代種子を作製する。ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢに関するデ
ータが次の実施例で示される。
【０３４４】
８個のトランスジェニックｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢ  Ａ．タリアナ事象およ
び１５個のトランスジェニックｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＧ  Ａ．タリアナ事象を
作製した。プール化したｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢ種子において３．４％と７．
２％との間のＤＨＡが観察され、プール化したＴ２  ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＧ
種子において０．６と４．１％との間のＤＨＡが観察された。最も高いｐＪＰ３４１６−
ＧＡ７−ｍｏｄＢ事象のいくつかを選択培地上に播き、生き残った実生を次の世代まで持
って行った。種子のＤＨＡ含有量が分析されている。プール化したＴ１種子は導入遺伝子
に対して分離している群を示し、いずれかの無効分離体を含んでいたので、後代植物のホ
モ接合種子は種々油中最大２０％の総脂肪酸含有量である増大した量のＤＨＡを有するで
あろうと予測される。他の改変構築物を使ってＡ．タリアナを形質転換した。ほんの少数
の形質転換系統しか得られなかったが、どれもｍｏｄＢ構築物よりも高い量のＤＨＡをも
たらさなかった。
【０３４５】
また、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢ構築物を使用し、品種ＯｓｃａｒおよびＮＸ
００５と呼ばれる育種系統の形質転換Ｂ.ナプス植物を作製した。Ｏｓｃａｒ形質転換に
関しては１０個の独立形質転換植物（Ｔ０）を、ＮＸ００５に関しては２０個の独立系統
をこれまでに得た。種子（Ｔ１種子）をこれらのトランスジェニック系統から回収した。
種子のプールを、種子油中ＤＨＡ量に関して試験し、最も高い量を示した２つの系統を選
択し、これらを系統ＣＴ１３２．５（品種Ｏｓｃａｒで）およびＣＴ１３３．１５（ＮＸ
００５で）と名付けた。ＣＴ１３２．５から２０個の種子およびＣＴ１３３．１５から１
１個の種子を水に浸し、２日後、各種子それぞれの子葉半分から油を抽出した。胚軸を伴
うもう片方の子葉を培地上で維持および培養し、特定の後代系統を維持した。油中脂肪酸
組成を決定した；ＣＴ１３２．５に関するデータが表１６に示される。分析した２０の種
子のうちの１０個におけるＤＨＡ量は、ＧＣ分析で測定された総脂肪酸含有量の７〜２０
％の範囲にあった。他の種子は７％未満のＤＨＡを有し、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏ
ｄＢ由来のＴ−ＤＮＡの部分（不完全）コピーを含み得た。トランスジェニック系統は遺
伝子的に結合していない複数の導入遺伝子挿入を含んでいるように見えた。トランスジェ
ニック系統ＣＴ１３３．１５の種子は、０〜５％の範囲のＤＨＡ量を示した。ＤＨＡを有
さない種子は無効分離体になる可能性が高かった。これらのデータによって、ｍｏｄＢ構
築物はキャノーラ種のＤＨＡ生産に関して良好に働くことが確認された。
【０３４６】
また、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢおよびｐＪＰ３４１６−０Ａ７−ｍｏｄＦ構
築物を使って形質転換したカメリナ・サティバ植物を作製した。少なくとも２４個の独立
形質転換植物（Ｔ０）を得、後代分析によってさらに細かく調査した。種子（Ｔ１種子）
をこれらのトランスジェニック系統から回収した。種子のプールを種子油中ＤＨＡ量に関
して試験し、最も高いＤＨＡ量（６％と９％との間）を示す６個の系統を選択した。各系
統からの２０個のＴ１種子のＤＨＡ量を分析し、多くの種子はＧＣ分析で測定された総脂
肪酸含有量の６〜１４％の範囲でＤＨＡを示した。油中脂肪酸組成を決定した；複数のト
ランスジェニック種子に関するデータが表１７に示される。これらのデータによって、ｍ
ｏｄＢおよびｍｏｄＦ構築物は双方ともカメリナ属でのＤＨＡ生産に関して良好に働くこ
とが確認された。
【０３４７】
【表１６】
2020172643.tif 000023
2020172643.tif 000024
2020172643.tif 000025
【０３４８】
【表１７】
2020172643.tif 000026
【０３４９】
発明者らは、概して、ＤＨＡ経路の律速酵素活性の効率は、単一コピーＴ−ＤＮＡ形質
転換体に比べて複数コピーＴ−ＤＮＡ形質転換体においてより活発であり得、また、経路
で制限している可能性がある酵素をコードする複数の遺伝子をＴ−ＤＮＡに挿入すること
で増大し得ることを企図した。複数コピー形質転換体の可能性のある重要性の証拠はＧＡ
７構築物で形質転換したアラビドプシス種子（実施例２）に見られ、ここでは、最も多収
性であるＤＨＡ事象は、宿主ゲノムに挿入された３つのＴ−ＤＮＡを有した。複数の遺伝
子は同一であり得、または、好ましくは、同一のポリペプチドをコードする異なる変異形
であり、または、重複した発現パターンを有する異なるプロモーターの制御下にある。た
とえば、増加した発現は、同一タンパク質が生産される場合でも、複数のΔ６デサチュラ
ーゼコード領域の発現によって達成され得る。ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＦおよび
ｐＪＰ３４１６−０Ａ７−ｍｏｄＣでは、たとえば、Ｍ．プシラΔ６デサチュラーゼの２
つのバージョンが存在し、異なるプロモーターによって発現された。コード配列は異なる
コドン使用頻度を有し、したがって、異なるヌクレオチド配列を有して、可能性のあるサ
イレンシングまたは同時抑制効果を軽減したが、同一タンパク質の生産につながった。
【０３５０】
実施例６．体細胞胚の種子特異的構築物の活性
種子特異的プロモーターの制御下である種子中の遺伝子構築物の発現を予測する迅速ア
ッセイシステムを作るために、体細胞胚システムをセイヨウアブラナに準備した。これに
は、体細胞胚形成の開始に関わるＬＥＣ２転写因子を発現するベクターが使用された。実
演として、バイナリーベクター３５Ｓ：ＬＥＣ２およびｐＪＰ１０７（Ｐｅｔｒｉｅ  ｅ
ｔ  ａｌ．、２０１０ａおよびｂ）をアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１
に標準的なエレクトロポレーションを介して導入し、そのアグロバクテリウム形質転換体
を使用して同時培養によってセイヨウアブラナを同時形質転換した。ｐＪＰ１０７のＴ−
ＤＮＡ領域はイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）Δ９エ
ロンガーゼ、Ｐ．サリナΔ８デサチュラーゼおよびＰ．サリナΔ５デサチュラーゼをコー
ドする遺伝子を含んでおり、各遺伝子は種子特異的プロモーターによって発現された。対
照形質転換には３５Ｓ：ＬＥＣ２ベクターが単独で用いられた。３５Ｓ：ＬＥＣ２発現は
、実施例１に記載される形質転換Ｂ.ナプスカルス組織に直接由来する組織培養物での体
細胞胚の形成につながった。
【０３５１】
脂肪酸分析によって、構築物ｐＪＰ１０７のＴ−ＤＮＡ上の種子特異的遺伝子は、同時
形質転換ＬＥＣ２遺伝子の存在下でトランスジェニック体細胞胚に発現され、機能してＬ
ＡからＡＲＡ（２０：４Δ５、８、１１、１４）およびＡＬＡからＥＰＡ（２０：５Δ５
、８、１１、１４、１７）を生産することが示された。３つの同時形質移転間体細胞胚に
関するデータが表１８に示され、それぞれの脂肪酸組成を、ｐＪＰ１０７のＴ−ＤＮＡの
遺伝子を導入し、ｐＪＰ１０７のＴ−ＤＮＡを発現したセイヨウアブラナ種子の種子油の
脂肪酸組成と比較した（Ｐｅｔｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０ａおよびｂ）。安定的に
形質転換した種子プロフィールと比較した場合、ＡＲＡならびに中間脂肪酸ＥＤＡ（２０
：２ω６）およびＤＧＬＡ（２０：３ω６）の類似した総パーセンテージおよび転換効率
が体細胞胚組織で観察された。安定なＴ２トランスジェニック種子および体細胞胚の脂肪
酸組成において類似した結果が観察された：ω６脂肪酸はそれぞれ２６．６％および２５
．６％（平均）の量である一方で、ＡＲＡ量はそれぞれ９．７％および１０．６％（平均
）であることが分かった。
【０３５２】
３５Ｓ：ＬＥＣ２を単独で導入し、体細胞胚を時間経過で分析した場合、脂肪酸プロフ
ィールは、逆相関して減少する１８：３Δ９、１２、１５および増加する１８：１Δ９を
伴う、さらに胚様であるプロフィールに変化することが発見された（図８）。これらの結
果によって、体細胞胚は確実に性質上種子のようになっており、ｐＪＰ１０７のＴ−ＤＮ
Ａの上の遺伝子は発現されたことが示された。これは、体細胞胚システムが、トランスジ
ェニック植物およびそれからの成熟種子を作製する全プロセスを必要とせずに、Ｂ.ナプ
スのトランスジェニック種子特異的構築物の迅速な性質決定を可能にすることを示した。
【０３５３】
【表１８】
2020172643.tif 000027
【０３５４】
体細胞胚を作製するための同一のシステムを用いて、セイヨウアブラナ細胞を別々でｐ
ＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢおよびｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＤで形質転換し
た。ｍｏｄＢからは１８個、ｍｏｄＤからは２４個である、４２個の胚を得た。全ての脂
質を胚から抽出し、脂肪酸組成を分析した。胚は、０％と最大１６．９％との間のＤＨＡ
を含んでいた（表１９）。０％のＤＨＡの結果は、部分的Ｔ−ＤＮＡのみの組込みまたは
ゲノムの転写的に不活動な領域への挿入のためであると推定された。総ω３ＦＡ（ＡＬＡ
を含む）の総ω６ＦＡ（ＬＡを含む）に対する比は胚＃２７０に関しては２．３、胚＃２
８４に関しては１１．９６であることが分かった。総ω６ＦＡ（ＬＡを含む）の総ω３Ｆ
Ａ（ＡＬＡを含む）に対する比は＃２８４に関して０．０８であった。新ω６ＦＡ（ＬＡ
を含まない）の新ω３ＦＡ（ＡＬＡを含まない）に対する比は、＃２８４に関しては０．
０３であった。全体の転換効率は次のように算出された：（胚＃２７０、＃２８４に関し
て）ＯＡからＥＰＡ＝１４．０％、２９．８％；ＯＡからＤＨＡ＝９．７％、２４．２％
；ＬＡからＥＰＡ＝１５．４％、３０．７％；ＬＡからＤＨＡ＝１０．７％、２５．０％
；ＡＬＡからＥＰＡ＝２２．１％、３３．３％；ＡＬＡからＤＨＡ＝１５．３％、２７．
０％。これらの効率は、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢベクターがＢ.ナプス細胞で
良好に機能できることを示したＴ３  ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７アラビドプシス系統に関し
て観察されたものに類似しており、または、＃２８４の場合は、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７
−ｍｏｄＢベクターがＢ.ナプス細胞で良く機能できることが示されたＴ３  ｐＪＰ３４
１６−ＧＡ７アラビドプシス系統に関して観察されたものよりも大きかった。ＳＤＡ量は
３．０％未満であり、Δ６エロンガーゼはＧＡ７構築物よりもさらに良好に作用していた
ことを示す。＃２８４で達成されたそれぞれの酵素効率は次の通りであった：Δｌ２デサ
チュラーゼ、９７．４％；ω３−デサチュラーゼ、９２．３％；Δ６デサチュラーゼ、３
８．２％；Δ６エロンガーゼ、８８．２％；Δ５デサチュラーゼ、９８．８％；Δ５エロ
ンガーゼ、９４．１％；およびΔ４デサチュラーゼ、８６．３％。総飽和脂肪酸は２１．
２％であり、総一価不飽和脂肪酸は１０．２％であり、総多価不飽和脂肪酸は６８．６％
であった。
【０３５５】
発明者らは、下に記載されるさらなるデータを除いて、これまでＢ.ナプス細胞で達成
されたなかで、これは一番高い量のＤＨＡであったと考える。これによって、ｐＪＰ３４
１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢにおける改変は、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７と比較して、Δ６デサ
チュラーゼ遺伝子の発現量を増大するのに効果的であることも実証された。上記のバイナ
リーベクターｐＪＰ３４１６−ＧＡ７、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＡ、ｐＪＰ３４
１６−ＧＡ７−ｍｏｄＣ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＤ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７
−ｍｏｄＥおよびｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＦを３５Ｓ：ＬＥＣ２と同時形質転換
し、形質転換Ｂ.ナプス体細胞胚を作製する。ｍｏｄＤ胚では最大７．０％のＤＨＡ、ｍ
ｏｄＥ胚では９．９％のＤＨＡ、ｍｏｄＦ胚では８．３％のＤＨＡ、少数のｍｏｄＧ胚で
は３．６％のＤＨＡが観察された。
【０３５６】
【表１９】
2020172643.tif 000028
【０３５７】
実施例７．ＤＨＡを生産するトランスジェニックＡ．タリアナ種子のＴＡＧの分析
形質転換Ａ．タリアナ種子のＴＡＧ上のＤＨＡの位置分布をＮＭＲで決定した。およそ
２００ｍｇの種子から、初めにそれらをヘキサン下でつぶし、つぶした種子を、１０ｍＬ
ヘキサンを含むガラス管に移すことで、全ての脂質を抽出した。管をおよそ５５℃の水浴
内で温め、次いで撹拌および遠心分離した。ヘキサン溶液を除去し、その手順をさらに４
×１０ｍＬで繰り返した。抽出物を１つにまとめ、ロータリーエバポレーションによって
濃縮し、ヘキサン中２０ｍＬの７％ジエチルエーテルを用いた短いシリカカラムを通過さ
せることで、抽出脂質内のＴＡＧを極性脂質から精製した。精製ＴＡＧ上のアシル基の位
置分布を以前に説明された通り量的に決定した（Ｐｅｔｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０
ａおよびｂ）。
【０３５８】
分析によって、総種子油中のＤＨＡのほとんどはＴＡＧのｓｎ−１／３位置に位置し、
ｓｎ−２位置にはほとんど発見されないことが示された（図９）。これは、５０％のＡＲ
Ａ（２０：４Δ５、８、１１、１４）がトランスジェニックキャノーラ油のｓｎ−２位置
に位置する一方で、３３％のみが無作為な分布であると予測されることを示したＡＲＡ生
産種子のＴＡＧとは対照的である（Ｐｅｔｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）。
【０３５９】
ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７またはｐＪＰ３１１５およびｐＪＰ３１１６の組み合わせで形
質転換したＢ.ナプス種子のＴＡＧにおけるＤＨＡの位置分布は基本的に同じ方法で決定
される。
【０３６０】
また、トランスジェニックＡ．タリアナ種子の全ての脂質を３連４重極ＬＣ−ＭＳによ
って分析し、主要なＤＨＡ含有トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）種を決定した（図１０
）。最も多くＤＨＡを含むＴＡＧ種は、ＤＨＡ−１８：３−１８：３（ＴＡＧ５８：１２
；位置分布を説明しない命名法）であり、２番目に多いのはＤＨＡ−１８：３−１８：２
（ＴＡＧ５８：１１）であることが分かった。低いが検知可能な量ではあるが、Ｔｒｉ−
ＤＨＡ  ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）が総種子油に観察された。他の主要なＤＨＡ含有Ｔ
ＡＧ種には、ＤＨＡ−３４：３（ＴＡＧ５６：９）、ＤＨＡ−３６：３（ＴＡＧ５８：９
）、ＤＨＡ−３６：４（ＴＡＧ５８：１０）、ＤＨＡ−３６：７（ＴＡＧ５８：１３）お
よびＤＨＡ−３８：４（ＴＡＧ６０：１０）が含まれていた。２つの主要なＤＨＡ含有Ｔ
ＡＧの同一性は、Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳによってさらに確認された。
【０３６１】
実施例８．Ｂ．ナプス種子でのＤＨＡ生産の予測
ＧＡ７遺伝子構築物を用いた、１５％量でのアラビドプシス種子のＤＨＡの効率的な生
産を実施例２で実証した。セイヨウアブラナ種子における同じ構築物は、主にこの種のＧ
Ａ７のΔ６でサンチュラーゼ遺伝子の不十分な発現のために、形質転換体の多く（全てで
はない）で約１．５％のＤＨＡしか生産しなかった（実施例４）。ＧＡ７構築物の改変は
Δ６デサチュラーゼ遺伝子発現問題を克服するであろうという認識に基づいて（実施例５
を参照、実施例６で実証された）、計算を実施し、ＪＰ３４１６−ＧＡ７の変異形から遺
伝子を発現すし、ここで、各導入遺伝子をコードした酵素が、ＧＡ７構築物を有するＡ．
タリアナで観察されたのと同じくらい効率的に作用していたＢ.ナプストランスジェニッ
ク種子の、あり得る脂肪酸プロフィールを決定した。３つの計算に対して予測される脂肪
酸組成（＃１、＃２、＃３）が表２０に示される。これは、５９％オレイン酸、２０％Ｌ
Ａおよび８％ＡＬＡを含んでいたＢ.ナプスに関する野生型（非形質転換）脂肪酸組成に
基づいた。表の下半分に示される３つの予測された部分的脂肪酸プロフィールは、表の上
半分で示される各酵素的工程の転換効率に基づいた。予測＃２では、７５％効率のΔ１２
不飽和化、７５％のΔ１５不飽和化、３５％のΔ６不飽和化、８０％のΔ６伸長化、９０
％のΔ５不飽和化、９０％のΔ５伸長化および９０％のΔ４不飽和化の組み合わせが、一
般的なキャノーラトランスジェニック種子でのおよそ１０％のＤＨＡの生産につながるで
あろう。これらの効率は全て、アラビドプシスで見られるそれぞれの効率より低いまたは
ほぼ同じであったため、予測＃２は控えめな推定を意味した。＃３に列挙される転換効率
は、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７で形質転換したＡ．タリアナで見られる効率的な転換に基づ
いた概算である。ＤＨＡは、Ｂ.ナプスで生産される種子油の総脂肪酸含有量の約１５％
で生産されると予測され、Ａ．タリアナで観察された最も効率的な生産量を反映した結果
であった。ホモ接合状態での複数のＴ−ＤＮＡの挿入は、Ｂ.ナプスでＤＨＡ量を２０％
まで増やすと期待される。
【０３６２】
【表２０】
2020172643.tif 000029
【０３６３】
実施例９．トランスジェニックＥＰＡ経路の植物葉での安定な発現
バイナリーベクター構築
葉組織でのＥＰＡの合成のための植物へのＴ−ＤＮＡ導入のために、バイナリーベクタ
ーｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢＧＢＥＣ＿ササゲ＿ＥＰＡ＿挿入断片（配列番号８）を設計し
た。このバイナリーベクターは、酵素：Ｍ．プシラΔ６デサチュラーゼ（配列番号１６）
、Ｐ．コルダタΔ６エロンガーゼ（配列番号：２５）およびＰ．サリナΔ５デサチュラー
ゼ（配列番号３０）をコードするキメラ遺伝子を含んでおり、それぞれは、ＣａＭＶ３５
ＳおよびＡ．タリアナＲｕｂｉｓｃｏ小サブユニット（ＳＳＵ）プロモーターの制御下で
あった（図９）。配列番号２の領域１９９〜１０８７８を合成し、これをＢｓｉＷＩおよ
びＫａｓＩ部位で受容バイナリーベクターｐＯＲＥ０４（Ｃｏｕｔｕ  ｅｔ  ａｌ．、１
９９７）内にクローニングすることで、バイナリーベクターを作製した。３つの脂肪酸生
合成遺伝子は、ＡＬＡ、１８：３Δ９、１２、１５からＥＰＡ、２０：５Δ５、８、１１
、１４、１７に変換するのに必要な酵素をコードした。
【０３６４】
Ｎ．ベンサミアナ（ベンサミアナタバコ）葉細胞でのＥＰＡ構築物の一過性発現
構築物が正しく、葉組織で効率的に遺伝子を発現することを試験するために、キメラベ
クターｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢＧＢＥＣ＿ササゲ＿ＥＰＡ＿挿入断片をＡ．ツメファシエ
ンス株ＡＧＬ１に導入した。キメラベクター３５Ｓ：ｐ１９もＡ．ツメファシエンス株Ａ
ＧＬ１に実施例１で説明された通り導入した。これらの培養物からの細胞を、２４℃の成
長室でベンサミアナタバコ植物の葉組織内に浸潤させた。同じ葉の両面に位置する比較中
の試料に、複数の直接比較物を湿潤させた。実験は３通りで実施された。浸潤に続いて、
実施例１に説明されるＧＣによる脂肪酸プロフィール分析のために葉ディスクを取り出す
前に、植物をさらに５日間成長させた。ＧＣ分析によって、ＥＰＡベクターはベンサミア
ナタバコ葉で機能してＥＰＡを生産し（表２１）、最も高い量のＥＰＡは総葉脂質の１０
．７％であったことが明らかになった。
【０３６５】
ニコチアナ・タバカムの安定的形質転換
キメラベクターｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢＧＢＥＣ＿ササゲ＿ＥＰＡ＿挿入断片を使って
、ニコチアナ・タバカムを安定に形質転換した。ベクターをＡ．ツメファシエンス株ＡＧ
Ｌ１に標準的なエレクトロポレーション手法を介して導入した。形質転換した細胞を、カ
ナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびリファンピシン（２５ｍｇ／Ｌ）を添加した固相ＬＢ
培地で成長させ、２８℃で２日間インキュベートした。単一のコロニーを用いて新しい培
養を開始した。４８時間の活発な培養に続いて、細胞を２，０００ｘ  ｇでの遠心分離に
よって回収し、上澄みを除去した。細胞を５０％ＬＢおよび５０％ＭＳ培地をＯＤ６００
＝０．５の密度で含む新しい溶液に再懸濁した。
【０３６６】
【表２１】
2020172643.tif 000030
【０３６７】
インビトロで成長させたＮ．タバカム品種Ｗ３８の葉試料を鋭いメスで切除し、サイズ
約０．５〜１ｃｍ２の正方形の断片に切り、一方でＡ．ツメファシエンス溶液に浸した。
Ａ．ツメファシエンスに浸した、傷をつけたＮ．タバカム葉断片を、滅菌フィルター紙上
にブロットして乾燥し、および添加物なしのＭＳプレートに移動する前に、室温で１０分
間放置させた。２４℃での２日間の同時培養期間に続いて、外植片を滅菌の液体ＭＳ培地
で３回洗浄し、次いで滅菌フィルター紙でブロットして乾燥し、１．０ｍｇ／Ｌベンジル
アミノプリン（ＢＡＰ）、０．２５ｍｇ／Ｌインドール酢酸（ＩＡＡ）、５０ｍｇ／Ｌカ
ナマイシンおよび２５０ｍｇ／Ｌセフォタキシムを添加した選択ＭＳ寒天上に置いた。プ
レートを２４℃で２週間インキュベートし、形質転換Ｎ．タバカム葉断片を発芽させた。
【０３６８】
インビトロで根のついたトランスジェニック植物を作るために、健康な若芽を切断し、
２５μｇ／ＬのＩＡＡ、５０ｍｇ／Ｌノカナマイシンおよび２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキ
シムを添加したＭＳ寒天培地を含む２００ｍＬの組織培養ポットに移した。トランスジェ
ニック芽を室温で根付かせ成熟するまで成長させた後、土壌に移した。十分大きな葉ディ
スクを２１個の成熟トランスジェニック植物から取り、実施例１に記載される通りに脂肪
酸プロフィールを分析した。全てのトランスジェニック試料がＥＰＡを含むことが分かり
（表２１）、ヘミ接合の１次形質転換体で最も高い量のＥＰＡは総葉脂質の１２．１％で
あることが分かった。葉試料は、それらの脂質の中に少量（０．５％未満）のＤＰＡも含
み、これは、Δ６エロンガーゼの低量のΔ５伸長活性によるＥＰＡの伸長に起因した。総
ω３ＦＡ（ＡＬＡを含む）のω６ＦＡ（ＬＡを含む）に対する比は、２．７であることが
分かった。全体的な転換効率は次のように算出された：ＯＡからＥＰＡ＝１８．４％、Ｌ
ＡからＥＰＡ＝１８．９％、ＡＬＡからＥＰＡ＝２５．９％。１２．１％のＥＰＡの生産
は、特にその事象がヘミ接合の１次転換体であったため、注目すべきである。特にＡＬＡ
からＥＰＡへの効率は、安定種子形質転換体で観察されたものに近い。構築物がΔ１２ま
たはΔ１５デサチュラーゼを含んでおらず、ＯＡおよびＬＡからＡＬＡへの転換を増大し
たのは注目に値する。増加した効率はこれらの活性の加算で予測される。
【０３６９】
ヘミ接合形質転換体の種子は回収され、ホモ接合植物を作製するために植え付けされて
いる。
【０３７０】
上部ＥＰＡ系統にセットされた種子は正常に見え、系統＃１０および＃１７からの種子
は良く発芽し、Ｔ２世代を確立した。ＥＰＡの無効（ＥＰＡ無し）系統に対する比は、事
象＃２８が単一遺伝子座であることを示し、したがってこの系統のＴ３世代も確立した。
Ｔ３群の脂肪酸プロフィール分析は、導入遺伝子が、無効事象は一切見つからず、安定し
た量のＥＰＡを伴ったホモ接合であったことを示した。全体のＴ３群の総葉脂質における
ＥＰＡの平均量は、９．４％±０．３（表２２）であることが分かった。
【０３７１】
【表２２】
2020172643.tif 000031
【０３７２】
ホモ接合Ｔ３Ｎ．タバカム植物の葉試料をさらに生化学分析に供した。全ての脂質を凍
結乾燥した葉材料から抽出し、薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分画化した。
ＥＰＡはＮ．タバカムＴＡＧに最大３０．１％で、ならびに、極性脂質に６．３％で存在
したことが分かった（表２３）。トランスジェニック経路によって生産されるＥＰＡが、
ＴＡＧ、ＭＧＤＧ、ＤＧＤＧ、ＳＱＤＧ、ＰＧ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＩおよびＰＳを含む評価
された総脂質分画に存在したことに留意するのは興味深い。総脂質プールは、低量の新規
中間体またはω６ＬＣ−ＰＵＦＡ脂肪酸を、新規ω３のω６脂肪酸に対するＴＡＧ比が１
０：１の状態で含んでいた。
【０３７３】
ササゲの安定的形質転換
キメラベクターｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢ  ＧＢＥＣ−ササゲ−ＥＰＡ−挿入断片をササ
ゲ（ビグナ・ウンギクラタ）に次の通りに形質転換した。成熟した乾燥種子が好ましい出
発材料であるが、種子が最大新鮮重量である未熟なさやから回収した種子を使用してもよ
い。乾燥種子を手で脱穀し、種子の皮が破けるのを避け、したがって、微生物との混入を
低減する。
【０３７４】
乾燥種子または未熟なさやを７０％エタノールに２分間浸し、次いで、２０％の市販の
漂白剤（８．４ｇ／Ｌの次亜塩素ナトリウム最終濃度）で３０分間処理する。種子を次い
で滅菌水で複数回洗浄する。未熟な種子をさやから無菌的に取り除き、一方で成熟種子を
一晩水に浸した。２つの異なる外植片を、複数の芽作製のために使用し得、すなわち、胚
軸および子葉そのもの、好ましくは二分した胚軸が付着した子葉である。芽および根端を
、子葉節、すなわち、軸の子葉への付着点に傷をつける前に、軸から取り除く。１９個の
品種および系統の初期比較から、ササゲのほとんどの系統は形質転換され得ることが現在
明確であり、唯一の注意は異なる組織培養条件が各系統のために最適化される必要がある
ということである。
【０３７５】
【表２３】
2020172643.tif 000032
【０３７６】
選択マーカー遺伝子、ｂａｒまたはＮｐｔＩＩが形質転換のために使用され得る。アグ
ロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１はササゲ形質転換に好ましい株である。ｐ
ＯＲＥ０４＋１１ＡＢＧＢＥＣ−ササゲ−ＥＰＡ−挿入断片ベクターを含むアグロバクテ
リウムを１８０ｒｐｍの振とう器で２８℃にて一晩培養し、懸濁物を８０００ｇで１０分
間遠心分離にかけ、培地１（１０分の１に希釈し、３０ｇ／ｌのスクロース、加圧滅菌の
前にｐＨ５．６に調節し、フィルターを滅菌したＭＳ−ビタミンを添加した２０ｍＭの２
−ＭＥＳ、１００ｍｇ／ｌのミオイノシトール、１．７ｍｇ／ｌのＢＡＰ、０．２５ｍｇ
／ｌのＧＡ３、０．２ｍＭのアセトシリンゴン、２５０ｍｇ／ｌの
1423706895449_1
、１５０ｍｇ／ｌのジチオスレイトールおよび０．４ｇ／ｌのＬ−システインを含むＭＳ
塩基性培地）に再懸濁する。メスで分裂領域に傷をつけてから、外植片を振らずに細菌懸
濁物に１時間浸す。処理した外植片を次いで滅菌フィルター紙上にブロットし、フィルタ
ー紙をかけた固定培地２（０．８％寒天を含む培地１）に移す。同時培養の４日後、発芽
および形質転換した芽の選択のために、外植片を培地３（１００ｍｇ／ｌのミオイノシト
ール、１５０ｍｇ／ｌのチメンチン、３０ｇ／Ｌのスクロース、３ｍＭのＭＥＳ、１．７
ｍｇ／ＬのＢＡＰ、５ｍｇ／ＬのＰＰＴまたは２５〜５０ｍｇ／Ｌのジェネテシンまたは
１５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、０．８ｇ／Ｌの寒天を添加し、ｐＨ５．６に調節した全
強度ＭＳ培地）に移す。２週間後、初めの芽が見られる。子葉を子葉節領域から取り除き
、培養物を新しい培地３に移す。死組織および瀕死の組織の除去に続いて、２週間ごとに
培養物を新しい培地３に移す。初めの４つの継代培養物はカナマイシン選択上にあり、続
いてジェネテシンおよびカナマイシンと交互にする。６継代培養後、生き残った若芽を、
芽伸長のために、培地４（ＢＡＰを含まないが０．５ｍｇ／ｌのＧＡ３、５０ｍｇ／ｌの
アスパラギン、０．１ｍｇ／ｌの３−インドール酢酸（ＩＡＡ）、１５０ｍｇ／ｌのチメ
ンチンおよびＰＰＴ（１０ｍｇ／１）、ジェネテシン（５０ｍｇ／Ｌ）またはカナマイシ
ン（１５０ｍｇ／Ｌ）のいずれかを添加した培地３）に移す。それぞれの芽が１ｃｍの長
さを超えるまで芽を２週間ごとに継代培養する。選択下でのさらなる成長のために、より
大きなこれらの芽をペトリ皿から培養瓶（高さ８０ｍｍ）に移す。
【０３７７】
再生した芽の大部分はインビトロで根を下ろし得、根を下ろした植物を土壌に移し、周
囲室温条件に移す前に１４〜２１日間高湿度室で根付かせた。
【０３７８】
ササゲへの遺伝子移転を高めるために、同時培養培地にチオール化合物を添加した。Ｌ
−システイン、ジチオスレイトールおよびチオ硫酸ナトリウムの添加によって傷をつけた
組織の褐色化を緩和する。
【０３７９】
大量のササゲ外植片を単純化したプロトコルで処理してもよい。簡潔に、該プロトコル
は次の工程から成る：滅菌化成熟種子を一晩水に浸す、その結果、その種子を縦に二分化
することで外植片を導く、割れた胚軸（芽および根尖部は取り除かれている）は子葉にま
だ付着している、分裂領域を局所的に傷つけることで補助されるアグロバクテリウム株Ａ
ＧＬ１との感染、チオール化合物を含む培地上で２５℃にて光をうけて４日間にわたる同
時培養、選択剤を含む培地上での発芽および芽の伸長、芽はインビトロで根付き、開花お
よび結実のために室温条件へ移す、推定トランスジェニック植物のＰＣＲまたは酵素分析
、ならびに、ＰＣＲまたは酵素活性による次世代子孫のスクリーニング。
【０３８０】
トランスジェニックＴ０植物の子孫は、表現型では正常である。導入遺伝子を子孫に伝
え、ホモ接合Ｔ２植物を、それらのＴ３子孫を酵素活性に関してまたはＰＣＲによってス
クリーニングすることで同定する。
【０３８１】
この形質転換システムを用いて１０００の外植片あたり約１０個のトランスジェニック
植物を作製し、これは、他のマメ科植物の形質転換頻度に類似している。形質転換される
品種または系統によって、このプロトコルは、外植片調製からＴ１種子回収まで、５〜８
か月を必要とする。
【０３８２】
形質転換システムを使ってｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢＧＢＥＣ−ササゲ−ＥＰＡ−挿入断
片バイナリーベクターを再生、形質転換ササゲ植物に導入する。
【０３８３】
ｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢＧＢＥＣ−ササゲ−ＥＰＡ−挿入断片バイナリーベクターに対
し、Δ５エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼをコードする遺伝子を加える修飾を行い
、生産したＥＰＡをＤＨＡにさらに変換する能力を与える遺伝子構築物を提供する。栄養
組織でのＤＨＡの生産のために、構築物を植物へ形質転換する。
【０３８４】
化学的選択を生き延びた少数の事象にＥＰＡが存在することが分かった。最も高い系統
は、総葉脂質中７．１％±０．２のＥＰＡ含んでいた。形質転換の速度は、６つの系統の
みトランスジェニックが確認されたササゲに関して普段経験されるよりも低かった。何が
この結果をもたらしたのかは今のところはまだ分からないが、普段の大きさよりも大きい
トランスジェニック事象が、不完全なＴ−ＤＮＡ領域を含んでいたことに留意するのは興
味深い。大きな構築物のサイズが効率の低下に寄与した可能性がある。３つの各トランス
ジェニック酵素の見かけの転換効率も算出した（表２２）。天然ＡＬＡの初期Δ６不飽和
化後のＥＰＡへの良好な転換を伴い、結果は全３つの種においておおむね類似した。特定
のΔ５エロンガーゼの不在にもかかわらず、ＥＰＡからＤＰＡへのΔ５伸長が多少あった
ことが留意された。Ｐ．コルダタΔ６エロンガーゼは以前、低量のΔ９エロンガーゼ活性
（すなわち、１８：３Δ９、１２、１５から２０：３Δ１１、１４、１７への転換）を有
すると示されてきたが、酵母菌アッセイではΔ５エロンガーゼ活性は一切検知されなかっ
た。
【０３８５】
実施例１０．Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の差異の試験
バイナリーベクター作製
一連のキメラΔ１２デサチュラーゼ遺伝子を試験および比較する試みとして、複数のバ
イナリーベクターを作り、これらを使用してＡ．タリアナおよびＢ.ナプスを形質転換し
た。バイナリーベクターｐＪＰ３３６５、ｐＪＰ３３６６、ｐＪＰ３３６７、ｐＪＰ３３
６８およびｐＪＰ３３６９はそれぞれ、Ｐ．パストリスω３デサチュラーゼ（配列番号１
２）およびＭ．プシラΔ６デサチュラーゼ（配列番号１６）酵素、および一連のΔ１２デ
サチュラーゼの１つを含んでいた。Δ１２デサチュラーゼはクリプトコッカス・ネオフォ
ルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）（ｐＪＰ３３６５において
受託番号ＸＰ＿５７０２２６）由来であり、遺伝子活性を増大する試みとしてＬ１５１Ｍ
突然異変（ｐＪＰ３３６６において）、ラカンセア・クルイベリ（ｐＪＰ３３６７におい
て配列番号１０）、シネコシスティスＰＣＣ６８０３（ｐＪＰ３３６８において受託番号
ＢＡＡ１８１６９）およびクレピス・パラエスチナ（Ｃｒｅｐｉｓ  ｐａｌａｅｓｔｉｎ
ａ）（ｐＪＰ３３６９において受託番号ＣＡＡ７６１５７、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９
９８）を含んだクリプトコッカス・ネオフォルマンスΔ１２デサチュラーゼのバージョン
である。クレピスデサチュラーゼはこの一連の中で唯一の植物デサチュラーゼであり；他
は真菌酵素であった。野生型であったクレピス・パレスチナΔ１２デサチュラーゼを除い
た、各Δ１２デサチュラーゼのための植物コドン最適化タンパク質コード領域を、ＦＰ１
プロモーターに操作可能に結合して各デサチュラーゼの種子特異的発現を提供する配向で
、ベクターｐＪＰ３３６４のＮｏｔＩ部位に挿入することで、ベクターを作った（図１２
参照）。ベクターｐＪＰ３３６４は、それぞれが種子特異的プロモーターの制御下にある
Ｐ．パストリスω３デサチュラーゼおよびＭ．プシラΔ６デサチュラーゼをコードするキ
メラ遺伝子をすでに含んでいた（図１２）。３つの脂肪酸生合成酵素、すなわちΔ１２デ
サチュラーゼ、ω３デサチュラーゼおよびΔ６デサチュラーゼの組み合わせを、オレイン
酸（１８：１Δ９）からＳＤＡ（１８：４Δ６、９、１２、１５）に変換する経路を構築
するよう設計した。したがって、アッセイを実行し、形質転換種子のＳＤＡ生産量を測定
した。
【０３８６】
Ａ．タリアナおよびＢ.ナプス形質転換および分析
キメラバイナリーベクターをＡ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入し、形質転換した
アグロバクテリウムの培養物からの細胞を用いて、形質転換のためにフローラルディップ
方法を利用してｆａｄ２変異体Ａ．タリアナ植物を形質転換した（ＣｌｏｕｇｈおよびＢ
ｅｎｔ、１９９８）。成熟後、処理した植物のＴ１種子を回収し、各キメラベクターのＴ
−ＤＮＡ上に存在するＮｐｔＩＩ選択マーカー遺伝子を有する小植物の選択のために、カ
ナマイシンを含むＭＳプレート上にプレート化した。生き残ったＴ１実生を土壌に移した
。植物を自家受精させ、成熟するまで成長させた後、これらの植物からのＴ２種子を回収
し、種子脂質の脂肪酸組成をＧＣによって分析した。
【０３８７】
キメラベクターｐＪＰ３３６７も使用して、実施例４に記載される方法でＢ.ナプスを
形質転換し、１２個のトランスジェニック事象を作製した。ＳＤＡは、植物のプール化し
た種子のうち０．６％から２．２％の範囲で見つかり、最も高いＳＤＡトランスジェニッ
ク植物を有するトランスジェニック植物から、９個の別個の種子を脂肪酸組成に関して分
析した。そのような分析の脂肪酸組成データは表２４に示される。
【０３８８】
データによって、双方のＡ．タリアナおよびＢ.ナプスにおけるＴ−ＤＮＡのそれぞれ
から発現されるΔ１２デサチュラーゼ活性は、予想に反して低く、ＧＡ７構築物の同じ発
現カセットで見られた７０〜８０％（実施例２および３）ではなく約２０％の酵素転換効
率をもたらしたことが示された。これらのベクターからのΔ１２デサチュラーゼ遺伝子の
比較的不十分な発現の理由は不明であるが、全体の構築物での遺伝子の位置に関連し得る
。
【０３８９】
対照的に、ＲＴ−ＰＣＲ発現分析は、Ｔ−ＤＮＡ上のＰ．パストリスω３デサチュラー
ゼおよびＭ．プシラΔ６デサチュラーゼ遺伝子は形質転換種子で比較的良好に発現された
ことを示した。表２４には、形質転換種子のΔ６デサチュラーゼ転換効率が含まれ、これ
は、あるＢ.ナプス形質転換系統では約１１％〜約２５％の範囲であった。これは、ＧＡ
７構築物で形質転換したＢ.ナプス種子で見られた約７％のΔ６デサチュラーゼの転換効
率よりも著しく高かった（実施例４）。
【０３９０】
【表２４】
2020172643.tif 000033
【０３９１】
したがって、ｐＪＰ３３６７のＴ−ＤＮＡによってもたらされたより高いΔ６デサチュ
ラーゼ転換効率を活用するために、このＴ−ＤＮＡで形質転換されたＢ.ナプス植物をｐ
ＪＰ３４１６−ＧＡ７のＴ−ＤＮＡで形質転換した植物（実施例４）と交雑させ、双方の
Ｔ−ＤＮＡを保有する後代植物および種子を作製した。Ｆ１種子から抽出された油の脂肪
酸組成を、ＤＨＡ含有量および他の脂肪酸含有量に関してＧＣで分析する。増加したＤＨ
Ａ量が、Δ６デサチュラーゼの増加した発現の結果として観察される。双方のＴ−ＤＮＡ
にとってホモ接合である植物を作製し、該植物はより高い量のＤＨＡを生産するはずであ
る。
【０３９２】
実施例１１．サイレンシング抑制因子タンパク質を用いることによる、脂肪酸の蓄積の増
大
バイナリーベクターの構築
国際公開第２０１０／０５７２４６号で、植物の種子における導入遺伝子発現を増大させ
るためのサイレンシング抑制因子タンパク質（ＳＳＰ）の使用が説明される。そのような
タンパク質が、複数の世代にわたって
1423706895449_2
のＬＣ−ＰＵＦＡの生産を強化および安定させ得ることを実証するために、複数のＳＳＰ
、すなわち、Ｖ２（受託番号ＧＵ１７８８２０．１）、ｐ１９（受託番号ＡＪ２８８９４
３．１）、ｐ３８（受託番号ＤＱ２８６８６９．１）およびＰ０ＰＥ（受託番号Ｌ０４５
７３．１）を試験のために選択した。ｐ１９は、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢ
ＳＶ）由来の抑制因子タンパク質であり、これは、２１個のヌクレオチドの長さのｓｉＲ
ＮＡが相同ＲＮＡのアルゴノート誘導切断を誘導する前に、２１個のヌクレオチドの長さ
のｓｉＲＮＡに結合する（Ｖｏｉｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。トマト黄化葉巻
ウイルス（ＴＹＬＣＶ）由来の抑制因子タンパク質であるＶ２は、ｓｓＲＮＡ基質から二
本鎖ＲＮＡ中間体を生成するのに必要であると考えられるタンパク質である（Ｂｅｃｌｉ
ｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）、植物タンパク質ＳＧＳ３に結合し（Ｇｌｉｃｋ  ｅｔ  
ａｌ．、２００８）、または、５’オーバーハングを有するｄｓＲＮＡ構造に結合する（
Ｆｕｋｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．、２００９）。ｐ３８は、ダイサーまたはアルゴノート
タンパク質に結合することによって植物サイレンシングメカニズムに干渉する、ターニッ
プクリンクルウィルス（ＴＣＶ）由来の抑制因子タンパク質である（Ａｚｅｖｅｄｏ  ｅ
ｔ  ａｌ．、２０１０）。ポレロウイルス由来の、Ｐ０ＰＥおよびＲＰＶ−Ｐ０といった
Ｐ０タンパク質は、強化した分解のためにアルゴノートタンパク質を標的とする（Ｂａｕ
ｍｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００７；Ｂｏｒｔｏｌａｍｉｏｌ  ｅｔ  ａｌ．、２
００７、Ｆｕｓａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）。したがって、ＬＡ（１８：１Δ９、
１２）からＡＲＡ（２０：４Δ５、８、１１、１４）への生産のための一連の脂肪酸生合
成遺伝子と組み合わせて、植物種子でのこれらＳＳＰの発現のために、遺伝子構築物を次
のように調製した。
【０３９３】
イソクリシス・ガルバナΔ９エロンガーゼおよびパブロバ・サリナΔ８およびΔ５デサ
チュラーゼをコードする脂肪酸生合成遺伝子および細菌選択マーカーを、９５６０ｂｐ断
片を生じるＰｍｅｉおよびＡｖｒＩＩでの消化によって、ｐＪＰ３０１０の単一ＤＮＡ断
片上で得た。この断片上のΔ９エロンガーゼコード領域をＡ．タリアナＦＡＥ１プロモー
ター（ｐＡｔＦＡＥ１）およびコンリニン転写終結／ポリアデニル化領域（ＬｕＣｎｌ２
−３’）に結合させた。デサチュラーゼコード領域をそれぞれ切断ナピンＦＰ１プロモー
ター（ｐＢｎＦＰ１）およびｎｏｓ３’転写終結／ポリアデニル化領域に結合させた。こ
の断片上の３つの脂肪酸生合成遺伝子をｐＪＰ１０７と同じ方法で方向付けおよびスペー
ス配置し（Ｐｅｔｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）、ｐＪＰ１０７と同じタンパク質を
コードさせた。ＤＮＡ断片はまた、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするｐＣＷ１
４１（国際公報第２０１０／０５７２４６号を参照）のｐＦＰ１：ＧＦｉＰ：ｎｏｓ３’
遺伝子を含んでいた。このスクリーニング可能なマーカー遺伝子を、視覚的な種子特異的
マーカーとして使用し、単純および非破壊的な同定が可能になり、それによって、その遺
伝子を含み発現するトランスジェニック種子の選択が可能になった。
【０３９４】
それぞれが異なるＳＳＰ遺伝子を含む一連の５つのベクター（国際公報第２０１０／０
５７２４６号）のそれぞれのＰｍｅＩ−ＡｖｒＩＩ部位にＰｍｅＩ−ＡｖｒＩＩ断片を挿
入し、ｐＦＮ０４５、ｐＦＮ０４６、ｐＦＮ０４７、ｐＦＮ０４８およびｐＦＮ０４９と
指定した遺伝子構築物をもたらした。これらは、ＳＳＰのＰ０ＰＥ、ｐ３８、ｐ１９、３
５Ｓ：Ｖ２およびＶ２をそれぞれコードする遺伝子を含む。各ＳＳＰ遺伝子は、Ｖ２コー
ド領域が恒常的ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下である構築物ｐＦＮ０４８を除いて
、ＦＰ１プロモーターおよびｏｃｓ３’転写終結／ポリアデニル化領域の制御下にあった
。各例のＳＳＰ遺伝子は構築物のＴ−ＤＮＡ領域内にあり、Ｔ−ＤＮＡの右境界（ＲＢ）
に隣接した。ｐＦＮ０４５をＡｈｄＩおよびＮｈｅＩで消化し、続いてＤＮＡリガーゼで
再環状化してＦＰ１：Ｐ０ＰＥ遺伝子を欠失することによって、いずれのＳＳＰコード配
列も欠如した第６の構築物、ｐＦＮ０５０を作った。６つの各構築物は、Ｔ−ＤＮＡ内お
よびＴ−ＤＮＡの左境界に隣接したＮｐｔＩＩ選択マーカー遺伝子を含んだ。構築物は全
てアグロバクテリウムのプラスミドの維持のためのＲＫ２複製開始点を有した。
【０３９５】
ＳＳＰと組み合わせたＡＲＡ発現ベクターとのＡ．タリアナの形質転換
その種子脂質において高いリノール酸量を有するｆａｄ２／ｆａｅ１二重変異体である
、アラビドプシスの遺伝子型ＭＣ４９を形質転換するために、フローラルディップ方法に
よって（ＣｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔ、１９９８）、６つの各構築体ｐＦＮ０４５〜ｐＦ
Ｎ０５０で個別に形質転換したＡ．ツメファシエンス株ＧＶ３１０１で、植物を処理した
。処理した植物を成熟するまで成長させ、それらから回収したＴ１種子を、カナマイシン
を含むＭＳ培地上にプレートし、形質転換したＴ１種子を選択した。種子のＧＦＰ発現の
スクリーニングも、形質転換Ｔ１種子のための視覚的なマーカーとして使用した。ＭＳ／
Ｋａｎプレート上に生き残った、または、ＧＦＰ陽性種子から得た実生を土壌に移し、Ｔ
２種子のために成熟まで成長させた。得られた形質転換植物の数は、ｐＦＮ０４５、ｐＦ
Ｎ０４６、ｐＦＮ０４７、ｐＦＮ０４８、ｐＦＮ０４９およびｐＦＮ０５０との形質転換
でそれぞれ５、１４、３２、８、２３および２４であった。この段階で、ｐＦＮ０４６に
ｐ３８をコードする遺伝子は機能的ではないことが分かり、したがって、ベクターｐＦＮ
０４６で形質転換した植物を追加対照、すなわち、ｐＦＮ０５０と基本的に同じであると
見なした。
【０３９６】
ＦＡＭＥ調製およびＧＣ分析による種子脂質の脂肪酸組成決定のために、各形質転換植
物から約１００個のプール化したＴ２種子を取り出した。各トランスジェニック系統から
の６つのＴ２実生も成長させ、Ｔ３種子を作製した。
【０３９７】
Ｔ２種子から抽出した全ての脂質における脂肪酸組成を、ＧＣを用いて決定した。分析
によって、ある範囲のＡＲＡならびにＴ２群の中間体ＥＤＡ（２０：２ω６）およびＤＧ
ＬＡ（２０：３ω６）の量が示された。ＡＲＡに関するデータが図１３および１４に示さ
れる。
【０３９８】
図１３は、Ｔ２種子の群の脂質におけるＡＲＡ量のボックスプロット分析を示す。ＡＲ
Ａ生合成遺伝子に加えてＦＰ１：ｐ１９および３５Ｓ：Ｖ２遺伝子を含む種子群のＡＲＡ
の中央（５０パーセンタイル）値は、ＳＳＰ遺伝子を含まないｐＦＰ０５０の欠陥ＦＰ１
：ｐ３８遺伝子または対照Ｔ−ＤＮＡ含む種子よりも、著しく高かった。ｐ１９およびＶ
２をコードする遺伝子で形質転換した種子に関する平均ＡＲＡ量は、ｐ３８遺伝子で形質
転換した種子またはＳＳＰを持たない種子に関してよりも多かった（図１４）。１つのＦ
Ｐ１：ｐ１９およぶ２つのＦＰ１：Ｖ２系統は、約１９％、２０％および２３％のＡＲＡ
をそれぞれ示した。これらは異常値であり、したがって、ボックスプロット分析の計算に
は含まれなかった。遺伝子ＦＰ１：Ｐ０ＰＥおよび３５Ｓ：Ｖ２を含むＴ−ＤＮＡで形質
転換した植物は、他の構築物と比べてより少ない数で生き残った；これらの遺伝子はＭＣ
４９背景では植物の健康に有害であり得ると考えられる。
【０３９９】
構築物の中でＡＲＡ量が著しく異なるだけでなく、ＬＡからＡＲＡの経路の第１の中間
体、すなわちＥＤＡ（２０：２ω６）の種子脂質における量もＶ２またはｐ１９を発現す
る系統において、ＳＳＰを欠如するまたはｐ３８構築物を含む種子よりも低く観察された
（図１５）。Ｔ３種子では、ｐ１９を発現する構築物を含む１つの群は種子脂質中の総脂
肪酸のパーセンテージとしての３８％のＡＲＡを示した。
【０４００】
ある範囲のトランスジェニックＴ３系統をＴ４世代まで進ませた。Ｖ２を発現するＴ４
種子のＡＲＡの量は、前の世代に比べて同じであるか、または、それらのＴ３親に比べて
増加した量を確実に示すかのいずれかであった（図１６）。ｐ１９を発現する系統は、さ
らにばらつきのあるＡＲＡ量を示した。ＡＲＡ量はいくつかの系統では低下した一方で、
他ではＴ３親と比較して同じまたは増加していた。対照的に、欠陥ｐ３８遺伝子を含む、
または、ＳＳＰを欠如する系統は、一般的にＡＲＡの量の低下および中間体の量の増加を
示した（図１８）。これらの系統のいくつかでは、ＡＲＡは約１％まで低下し、ＥＤＡの
量は約２０％まで増加した。Ｔ４種子のＡＲＡの平均量は、ｐ３８を発現する、または、
ＳＳＰを欠如する系統と比べて、ｐ１９およびＶ２を発現する系統に関してより高かった
（図１７）。
【０４０１】
この実験によって、ＬＣ−ＰＵＦＡ生合成経路のための遺伝子をさらに一緒に伴うトラ
ンスジェニック植物の種子におけるＳＳＰの発現は、子孫の第１世代にて所望する脂肪酸
の生産量を増加しただけでなく、子孫の第３または第４世代といった後代の世代での脂肪
酸生産量を安定させた。増加した脂肪酸生産は、生合成経路での中間脂肪酸の量の低下を
伴った。種子特異的プロモーターから発現されるＳＳＰのｐ１９およびＶ２が好ましかっ
た。ｐ３８  ＳＳＰを発現するように設計された構築物は欠陥であり、この構築物では有
効なデータは一切得られなかった。他のウイルス由来のＶ２  ＳＳＰおよびそのホモログ
は、特に好ましいと考えられ、なぜなら、これらは生合成経路遺伝子の最大発現および発
育中の種子の同一細胞内での他の遺伝子の同時サイレンシングを可能にするからである。
【０４０２】
実施例１２．油中のステロール含有量および組成のアッセイ
オーストラリアの商業的供給源から購入した１２個の植物油試料の植物ステロールを、
実施例１に記載される通り、ＧＣおよびＧＣ−ＭＳ分析によってＯ−トリメチルシリルエ
ーテル（ＯＴＭＳｉ−エーテル）として特徴づけた。保持データ、質量スペクトルの解釈
ならびに文献および実験室標準質量スペクトルとの比較によってステロールを同定した。
ステロールを、５β（Ｈ）−コラン−２４−オール内部標準の使用によって定量化した。
基本的な植物ステロール構造および同定ステロールのいくつかの化学構造が図１９および
表２５に示される。
【０４０３】
分析した植物油は：ゴマ（セサマム・インディカム（Ｓｅｓａｍｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ
））、オリーブ（オレア・エウロパエア）、ヒマワリ（ヘリアンサス・アヌス）、トウゴ
マ（リシヌス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ））、キャノーラ（セイヨ
ウアブラナ）、ベニバナ（カーサマス・ティンクトリアス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎ
ｃｔｏｒｉｕｓ））、ピーナッツ（アラキス・ヒポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇ
ａｅａ））、アマ（リヌム・ウシタティスシムム）およびダイズ（グリシン・マックス）
由来である。全油試料のうち、主要な植物ステロールは相対存在量が多い順で：β−シト
ステロール（総ステロール含有量の２８〜５５％に及ぶ）、Δ５−アベナステロール（イ
ソフコステロール）（３〜２４％）、カンペステロール（２〜３３％）、Δ５−スチグマ
ステロール（０．７〜１８％）、Δ７−スチグマステロール（１〜１８％）およびΔ７−
アベナステロール（０．１〜５％）であった。他のマイナーな複数のステロールを同定し
、それらは：コレステロール、ブラシカステロール、カリナステロール、カンペスタノー
ルおよびエブリコールであった。４つのＣ２９：２および２つのＣ３０：２ステロールも
検知されたが、これらのマイナーな成分の同定を完成するには研究がさらに必要である。
加えて、油のいくつかには他の同定されなかったステロールが複数存在したが、それらの
大変低い存在量のために、質量スペクトルはそれらの構造の同定が可能になるほど十分強
くなかった。
【０４０４】
油のｍｇ／ｇとして表されるステロール含有量は、多い量の順で：キャノーラ油（６．
８ｍｇ／ｇ）、ゴマ油（５．８ｍｇ／ｇ）、アマ油（４．８〜５．２ｍｇ／ｇ）、ヒマワ
リ油（３．７〜４．１ｍｇ／ｇ）、ピーナッツ油（３．２ｍｇ／ｇ）、ベニバナ油（３．
０ｍｇ／ｇ）、ダイズ油（３．０ｍｇ／ｇ）、オリーブ油（２．４ｍｇ／ｇ）、トウゴマ
油（１．９ｍｇ／ｇ）であった。％ステロール組成および総ステロール含有量が表２６に
示される。
【０４０５】
【表２５】
2020172643.tif 000034
【０４０６】
全種子油試料の中で、主要な植物ステロールは一般的にβ−シトステロール（総ステロ
ール含有量の３０〜５７％に及ぶ）であった。他の主要なステロールの割合では、油間で
大きな幅があった：カンペステロール（２〜１７％）、Δ５−スチグマステロール（０．
７〜１８％）、Δ５−アベナステロール（４〜２３％）、Δ７−スチグマステロール（１
〜１８％）。異なる種の油は異なるステロールプロフィールを有し、いくつかは大変特徴
的なプロフィールを有していた。キャノーラ油の場合、キャノーラ油は一番大きな割合の
カンペステロール（３３．６％）を有し、一方で、他の種の試料は一般的により低い量を
有し、たとえば、ピーナッツ油では最大１７％であった。ベニバナ油は比較的大きな割合
のΔ７−スチグマステロール（１８％）を有する一方で、このステロールは通常他の種の
油では低く、ヒマワリ油では最大９％である。ステロールプロフィールは各種に対して特
有であるので、したがって、ステロールプロフィールを使用して特定の野菜または植物油
の同定を助け、および、純種性および他の油との不純物混和を確認し得る。
【０４０７】
表２６．アッセイした植物油のステロール含有量および組成
【０４０８】
【表２６】
2020172643.tif 000035
2020172643.tif 000036
【０４０９】
ヒマワリおよびベニバナそれぞれの２つの試料を比較し、各場合で、１つは種の冷圧に
よって作製し、精製しておらず、一方で、他方は冷圧せず、精製した。いくつか違いが観
察されたものの、２つの油の源は類似したステロール組成および総ステロール含有量を有
し、処理および生産はこれら２つのパラメーターには効果をほとんど有さなかったことを
示している。試料間のステロール含有量は３倍ばらつき、１．９ｍｇ／ｇから６．８ｍｇ
／ｇに及んだ。キャノーラ油は一番高いステロール含有量を有し、トウゴマ油は一番少な
いステロール含有量を有した。
【０４１０】
実施例１３．ｓｎ−２ＴＡＧ位置でのＤＨＡの蓄積の増加
本発明者らは、ＴＡＧのｓｎ−２位置でのＤＨＡ蓄積は、１−アシル−グリセロール−
３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をＧＡ７構築物またはその変異形に
よって提供されるようなＤＨＡ生合成経路と一緒に同時発現することで増加し得ることを
考察した。好ましいＬＰＡＡＴは、多価不飽和Ｃ２２脂肪アシル−ＣｏＡに基質として作
用するものであり、内因性ＬＰＡＡＴに比べ、ＰＡを形成するＬＰＡのｓｎ−２位置での
多価不飽和Ｃ２２鎖の挿入の増加につながる。細胞質ＬＰＡＡＴ酵素はしばしば、特にそ
の種がＴＡＧにて異常な脂肪酸を合成および蓄積する場合、様々な基質の好みを示す。リ
ムナンテス・ダグラシー（Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）由来のＬＰＡＡ
Ｔ２は、ＰＡ合成のためにエルコイル−ＣｏＡ（Ｃ２２：１−ＣｏＡ）を基質として用い
ることが示され、これは、Ｃ２２基質を使用し得ない同じ種由来のＬＰＡＡＴ１とは対照
的であった（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）。
【０４１１】
公知のＬＰＡＡＴを企図し、試験のために複数を選択し、ｓｎ−２位置でＤＨＡの取り
込みを増加することが期待されないものがいくつか対照として含まれた。公知のＬＰＡＡ
Ｔには：シロイヌナズナＬＰＡＡＴ２：（配列番号６３、受託番号ＡＢＧ４８３９２、Ｋ
ｉｍ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）、リムナンテス・アルバＬＰＡＡＴ（配列番号６４、受
託番号ＡＡＣ４９１８５、Ｌａｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５）、サッカロマイセ
ス・セレビシエＳｌｃｌｐ（配列番号６５、受託番号ＮＰ０１０２３１、Ｚｏｕ  ｅｔ  
ａｌ．、１９９７）、モルティエレラ・アルピナＬＰＡＡＴ１（配列番号６７、受託番号
ＡＥＤ３３３０５；米国特許第７８７９５９１号）およびＢ.ナプスＬＰＡＡＴ（配列番
号６８および配列番号６９、それぞれ受託番号ＡＤＣ９７４７９およびＡＤＣ９７４７８
）が含まれた。これらを選択してＬＰＡＡＴ酵素の３つのグループを包含した：１）異常
な長鎖多価不飽和脂肪酸に対して通常低活性を有する対照植物種子ＬＰＡＡＴ（アラビド
プシスおよびブラシカＬＰＡＡＴを含む）、２．基質としてＣ２２アシル−ＣｏＡ、この
場合エルカ酸Ｃ２２：１を用いることでＣ２２脂肪酸に作用することが以前に実証された
ＬＰＡＡＴ（リムナンテスおよびサッカロマイセスＬＰＡＡＴを含む）、３．ＥＰＡおよ
びＤＨＡといった長鎖多価不飽和脂肪酸を基質として使用できる可能性が高いと発明者ら
が考えるＬＰＡＡＴ（モルティエレラＬＰＡＡＴを含む）。
【０４１２】
アラビドプシスＬＰＡＡＴ２（ＬＰＡＴ２とも呼ばれる）はＣ１６およびＣ１８基質に
対して活性を有することが示される、小胞体に局在した酵素であるが、Ｃ２０またはＣ２
２基質に対する活性は試験されなかった（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。リムナン
テス・アルバＬＰＡＡＴ２は、Ｃ２２：１アシル鎖をＰＡのｓｎ−２位置に挿入すること
が実証されたが、ＤＨＡを基質として使用する能力は試験されなかった（Ｌａｓｓｎｅｒ
ｅｔ  ａｌ．、１９９５）。選択されたＳ．セレビシエＬＰＡＡＴ  Ｓｌｃｌｐは、１
８：１−ＣｏＡに加えて２２：１−ＣｏＡを基質として使用して活性を有することが示さ
れ、鎖長に関する幅広い基質特異性を示唆する（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）。再
び、ＤＨＡ−ＣｏＡおよび他のＬＣ−ＰＵＦＡは基質として試験されなかった。モルティ
エレラＬＰＡＡＴは、トランスジェニックヤロウイア・リポリティカのＥＰＡおよびＤＨ
Ａ脂肪酸基質に対して活性を有することが以前に示された（米国７８７９５９１）。
【０４１３】
発明者らは、さらなるＬＰＡＡＴを同定した。ミクロモナス・プシラは、この種のＴＡ
Ｇ上のＤＨＡの分布は確認されていないが、その油中にＤＨＡを生産および蓄積する微細
藻類である。アラビドプシスＬＰＡＡＴ２をＢＬＡＳＴ問い合わせ配列として使用してミ
クロモナス・プシラゲノム配列を調査することで、ミクロモナス・プシラＬＰＡＡＴ（配
列番号６６、受託番号ＸＰ＿００２５０１９９７）を同定した。候補配列が複数生じ、配
列ＸＰ＿００２５０１９９７を、Ｃ２２  ＬＣ−ＰＵＦＡに対する活性を伴う可能性の高
いＬＰＡＡＴ酵素として試験するために合成した。リシヌス・コムニスＬＰＡＡＴをトウ
ゴマゲノム配列の推定ＬＰＡＡＴとして注釈した（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）
。トウゴマゲノム由来の４つの候補ＬＰＡＡＴを合成し、浸潤したＮ．ベンサミアナ葉組
織の粗葉可溶化物で試験した。ここに記載される候補配列はＬＰＡＡＴ活性を示した。
【０４１４】
複数の候補ＬＰＡＡＴを、系統樹上に公知のＬＰＡＡＴと一緒に配列した（図２０）。
推定ミクロモナスＬＰＡＡＴは推定Ｃ２２  ＬＰＡＡＴとクラスター化しなかったが、分
岐配列であったことが留意された。
【０４１５】
様々なＬＰＡＡＴの、基質としてＤＨＡ−ＣｏＡを使用する能力の初期試験として、キ
メラ遺伝子構築物を、Ｎ．ベンサミアナ葉における外因性ＬＰＡＡＴの恒常的発現のため
に作製し、それぞれは次の通りに、３５Ｓプロモーターの制御下にある：３５Ｓ：Ａｒａ
ｔｈ−ＬＰＡＡＴ２（アラビドプシスＥＲ  ＬＰＡＡＴ）；３５Ｓ：Ｒｉｃｃｏ−ＬＰＡ
ＡＴ２；３５Ｓ：Ｌｉｍａｌ−ＬＰＡＡＴ（リムナンテス・アルバＬＰＡＡＴ）；３５Ｓ
：Ｓａｃｃｅ−Ｓｌｃｌｐ（Ｓ．セレビシエＬＰＡＡＴ）；３５Ｓ：Ｍｉｃｐｕ−ＬＰＡ
ＡＴ（ミクロモナス・プシラＬＰＡＡＴ）；３５Ｓ：Ｍｏｒａｌ−ＬＰＡＡＴ１（モルテ
ィエレラ・アルピナＬＰＡＡＴ）。外因性ＬＰＡＡＴを欠如する３５Ｓ：ｐ１９構築物を
対照として実験で用いる。これら構築物をそれぞれ、実施例１で記載される通りにアグロ
バクテリウム経由でＮ．ベンサミアナ葉に導入し、浸潤から５日後、処理した葉の区域を
切断し、すりつぶして葉可溶化物を作る。各可溶化物には、ＬＰＡを合成するための外因
性ＬＰＡＡＴならびに内因性酵素が含まれる。１４Ｃで標識したＯＡ、ＬＡまたはＡＬＡ
（Ｃ１８基質）、ＡＲＡ（Ｃ２０基質）およびＤＨＡ（Ｃ２２）を可溶化物に別々に添加
することで、インビトロの反応を３通りで準備する。反応を２５℃でインキュベートし、
１４Ｃで標識した脂肪酸のＰＡへの取り込みの量をＴＬＣで測定する。ＡＲＡおよびＣ１
８脂肪酸と比較して、各ＬＰＡＡＴのＤＨＡを用いる能力を算出する。メドウフォーム、
モルティエレラおよびサッカロマイセスＬＰＡＡＴは、ＤＨＡ基質に活性を有することが
発見され、放射標識したＰＡはこれらに関しては現れたが、他のＬＰＡＡＴに関しては現
れなかった。全ＬＰＡＡＴは、類似したオレイン酸供給によって活性であると確認された
。
【０４１６】
種子のＬＰＡＡＴ活性を試験するために、タンパク質コード配列またはＬＰＡＡＴを複
数コンリニン（ｐＬｕＣｎｌ１）プロモーターの制御下でバイナリーベクターに挿入する
。次いで、キメラ遺伝子、Ｃｎｌ１：Ａｒａｔｈ−ＬＰＡＡＴ（陰性対照）、Ｃｎｌ１：
Ｌｉｍａｌ−ＬＰＡＡＴ、Ｃｎｌ：Ｓａｃｃｅ−ＳｌｃｌｐおよびＣｎｌ１：Ｍｏｒａｌ
−ＬＰＡＡＴをそれぞれ含む、結果として得られた遺伝子構築物を用いてＢ.ナプスおよ
びＡ．タリアナ植物を形質転換し、種子特異的な方法でＬＰＡＡＴを発現する安定した形
質転換体を作製する。Ｃｎｌ１：ＬＰＡＡＴ構築物を有する形質転換植物を、種子でＤＨ
Ａを生産するＧＡ７構築物またはその変異形を発現する植物（実施例５）と交雑し、ＴＡ
Ｇのｓｎ−２位置でのＤＨＡの取り込みの増加につながる。また、構築物を用いて、ＧＡ
７構築物およびその変異形をすでに含むＢ．ナプス、Ｃ．サティバおよびＡ．タリアナ植
物（実施例２から５）を形質転換して親およびＬＰＡＡＴ遺伝子構築物の双方を保有する
子孫を作製する。ＴＡＧのｓｎ−２位置でのＤＨＡの取り込みの増加は、ＬＰＡＡＴコー
ド導入遺伝子を欠如する植物での取り込みに相対的であると予想される。油含有量も種子
で改善され、特に、より多い量のＤＨＡを生産する種子に関して改善され、実施例２で説
明されるアラビドプシス種子で見られる傾向を相殺する。
【０４１７】
広義的に説明される本発明品の趣旨または範囲から逸脱することなく、数多くの変化お
よび／または修正が特定の実施形態で示される本発明品になされ得ることが、当業者には
理解されるだろう。したがって、本実施形態は全ての点において例示的であり制限的では
ないと見なされる。
【０４１８】
本出願は、２０１２年６月１５日に出願された米国第６１／６６０，３９２号、２０１
２年６月２２日に出願された米国第ＵＳ６１／６６３，３４４号、２０１２年９月６日に
出願された米国第６１／６９７，６７６号、２０１３年３月１４日に出願された米国第６
１／７８２，６８０号からの優先権を主張し、それぞれの全体の内容が参照により本明細
書に組み込まれる。
【０４１９】
本明細書で考察および／または参照された出版物はすべてその全体が本明細書に組み込
まれる。
【０４２０】
本出願は、２０１２年６月１５日に出願された米国第６１／６６０，３９２号、２０１
２年６月２２日に出願された米国第６１／６６３，３４４号および２０１２年９月６日に
出願された米国第６１／６９７，６７６号を、参照により本明細書に組み込む。
【０４２１】
本明細書に含まれる文書、法令、材料、デバイス、品物などの考察はいずれも、本発明
の文脈を提供する目的のためのみである。これらの事柄のいずれかまたは全てが先行技術
の基盤の一部を形成する、または、本出願の各請求項の優先日以前に存在した通り、本発
明に関連した当該分野では共通の常識であったということが承認としては見なされない。
【０４２２】
参照
Abbadi et al. (2004) Plant Cell 16: 2734-2748.
Abbott et al. (1998) Science 282:2012-2018.
Abdullah et al. (1986) Biotech. 4:1087.
Agaba et al. (2004) Marine Biotechnol. (NY) 6:251-261.
Alvarez et al. (2000) Theor Appl Genet 100:319-327.
Armbrust et al. (2004) Science 306:79-86.
Attila Kereszt et al. (2007) Nature Protocols 2:948 - 952.
Baumberger et al. (2007) Curr. Biol. 17:1609-1614.
Baumlein et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225:459-467.
Baumlein et al. (1992) Plant J. 2:233-239.
Beaudoin et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6421-6426.
Beclin et al. (2002) Curr. Biol. 12:684-688.
1423706895449_3.et
al. (1998) Plant Mol. Biol. 36:297-306.
Bortolamiol et al. (2007) Curr. Biol. 17:1615-1621.
Broun et al. (1998) Plant J. 13:201-210.
Brown et al. (2002) Biochem J. 364:795-805.
Chapman et al. (2004) Gen. Dev. 18:1179-1186.
Chen et al. (2004) The Plant Cell 16:1302-1313.
Cheng et al. (1996) Plant Cell Rep. 15:653-657.
Cheng et al. (2010) Transgenic Res 19: 221-229.
Chikwamba et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:11127-11132.
Cho et al. (1999a) J. Biol. Chem. 274:471-477.
Cho et al. (1999b) J. Biol. Chem. 274:37335-37339.
Clough and Bent (1998) Plant J. 16:735-43.
Coutu et al. (2007) Transgenic Res. 16: 771-781.
Damude et al. (2006). Proc Natl Acad Sci USA 103: 9446-9451.
Denic and Weissman (2007) Cell 130:663-677.
Domergue et al (2002) Eur. J. Biochem. 269:4105-4113.
Domergue et al. (2002) Eur. J. Biochem. 269:4105-4113.
Domergue et al. (2003) J. Biol. Chem. 278: 35115-35126.
Domergue et al. (2005) Biochem. J.1389: 483-490.
Dunoyer et al. (2004) The Plant Cell 16:1235-1250.
Ellerstrom et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:1019-1027.
Fujimura et al. (1985) Plant Tissue Culture Lett. 2:74.
Fukunaga (2009) EMBO J. 28:545-55.
Gamez et al. (2003) Food Res International 36: 721-727.
Garcia-Maroto et al. (2002) Lipids 37:417-426.
Girke et al. (1998) Plant J. 15:39-48.
Glick et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 105-157-161.
Grant et al. (1995) Plant Cell Rep. 15:254-258.
Hall et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9320-9324
Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286:950-952.
Hamilton et al. (1997) Gene 200:107-16.
Harayama (1998). Trends Biotechnol. 16: 76-82.
Hastings et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:14304-14309.
Hinchee et al. (1988) Biotechnology 6:915-922.
Hoffmann et al. (2008) J Biol. Chem. 283:22352-22362.
Hong et al. (2002a) Lipids 37:863-868.
Horiguchi et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39:540-544.
Horvath et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:1914-1919.
Huang et al. (1999) Lipids 34:649-659.
Inagaki et al. (2002) Biosci. Biotechnol. Biochem. 66:613-621.
Johansen and Carrington (2001) Plant Physiol. 126-930-938.
Kajikawa et al. (2004) Plant Mol. Biol. 54:335-52.
Kajikawa et al. (2006) FEBS Lett 580:149-154.
Kim et al. (2005) Plant Cell. 2005 1073-89.
Knutzon et al. (1998) J. Biol Chem. 273:29360-6.
Koziel et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:393-405.
Lassner (1995) Plant Physiol. 109:1389-94.
Leonard et al. (2000) Biochem. J. 347:719-724.
Leonard et al. (2000b) Biochem. J. 350:765-770.
Leonard et al. (2002) Lipids 37:733-740.
Lewsey et al. (2007) Plant J. 50:240-252.
Lo et al. (2003) Genome Res. 13:455-466.
Lu and Kang (2008) Plant Cell Rep. 27:273-8.
Mallory et al. (2002) Nat. Biotech. 20:622-625.
Marangoni et al. (1995) Trends in Food Sci. Technol. 6: 329-335.
Meesapyodsuk et al. (2007) J Biol Chem 282: 20191-20199.
Meng et al. (2008) J. Gen. Virol. 89:2349-2358.
Meyer et al. (2003) Biochem. 42:9779-9788.
Meyer et al. (2004) Lipid Res 45:1899-1909.
Michaelson et al. (1998a) J. Biol. Chem. 273:19055-19059.
Michaelson et al. (1998b) FEBS Lett. 439:215-218.
Murashige and Skoog (1962) Physiologia Plantarum 15:473-497.
Napier et al. (1998) Biochem. J. 330:611-614.
Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453.
Niedz et al. (1995) Plant Cell Reports 14:403.
Ow et al. (1986) Science 234:856-859.
Parker-Barnes et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:8284-8289.
Pereira et al. (2004a) Biochem. J. 378:665-671.
Pereira et al. (2004b) Biochem. J. 384:357-366.
Perrin et al. (2000) Mol Breed 6:345-352.
Petrie et al. (2010a) Metab. Eng. 12:233-240.
Petrie et al. (2010b) Plant Methods 11:6:8.
Petrie et al. (2012) Transgenic Res. 21:139-147.
Potenza et al. (2004) In Vitro Cell Dev Biol - Plant 40:1-22.
Prasher et al (1985) Biochem. Biophys. Res. Commun. 127:31-36.
Qi et al. (2002) FEBS Lett. 510:159-165.
Qi et al. (2004) Nat. Biotech. 22: 739-745.
Qiu et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:31561-31566.
Reddy and Thomas (1996) Nat. Biotech. 14:639-642.
Reddy et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:293-300.
Robert et al. (2005) Func. Plant Biol. 32:473-479.
Robert et al. (2009) Marine Biotech 11:410-418.
Ruiz-Lopez et al. (2012) Transgenic Res. 21:139-147.
Saha et al. (2006) Plant Physiol. 141:1533-1543.
Saito et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267:1813-1818.
Sakuradani et al. (1999) Gene 238:445-453.
Sato et al. (2004) Crop Sci. 44: 646-652.
Sakuradani et al. (2005) Appl. Microbiol. Biotechnol. 66:648-654.
Sayanova et al. (2006) J Biol Chem 281: 36533-36541.
Sayanova et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4211-4216.
Sayanova et al. (2003) FEBS Lett. 542:100-104.
Sayanova et al. (2006) Planta 224:1269-1277.
Sayanova et al. (2007) Plant Physiol 144:455-467.
Singh et al. (2005) Curr. Opin. in Plant Biol. 8:197-203.
Speranza et al. (2012) Process Biochemistry (In Press).
Sperling et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267:3801-3811.
Sperling et al. (2001) Arch. Biochm. Biophys. 388:293-8.
Sprecher et al. (1995) J. Lipid Res. 36:2471-2477.
Spychalla et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:1142-1147.
Stalker et al. (1998) J. Biol. Chem. 263:6310-6314.
Thillet et al. (1988) J. Biol. Chem 263:12500-12508.
Tonon et al. (2003) FEBS Lett. 553:440-444.
Toriyama et al. (1986) Theor. Appl. Genet. 205:34.
Trautwein (2001) European J. Lipid Sci. and Tech. 103:45-55.
Tvrdik (2000) J. Cell Biol. 149:707-718.
Venegas-Caleron et al. (2010) Frog. Lipid Res. 49:108-119.
Voinnet et al. (2003) Plant J. 33:949-956.
Wallis and Browse (1999) Arch. Biochem. Biophys. 365:307-316.
Watts and Browse (1999b) Arch. Biochem. Biophys. 362:175-182.
Weiss et al. (2003) Int. J. Med. Microbiol. 293:95:106.
Whitney et al. (2003) Planta 217:983-992.
Winans (1988) J. Bacteriol. 170:4047-54.
Wood (2009) Plant Biotechnol J. 7:914-24.
Wu et al. (2005) Nat. Biotech. 23:1013-1017.
Yang et al. (2003) Planta 216:597-603.
Zank et al. (2002) Plant J. 31:255-268.
Zank et al. (2005) WO 2005/012316
Zhang et al. (2004) FEBS Lett. 556:81-85.
Zhang et al. (2006) 20:3255-3268.
Zhang et al. (2007a) FEBS Letters 581: 315-319.
Zhang et al. (2008) Yeast 25: 21-27.
Zhou et al. (2007) Phytochem. 68:785-796.
Zhou et al. (2008) Insect Mol Biol 17: 667-676.
Zou et al. (1997) Plant Cell. 9:909-23.
【図１】
2020172643.tif 000037
【図２】
2020172643.tif 000038
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月26日(2020.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２２】
参照Abbadi et al. (2004) Plant Cell 16: 2734-2748.Abbott et al. (1998) Science 282:2012-2018.Abdullah et al. (1986) Biotech. 4:1087.Agaba et al. (2004) Marine Biotechnol. (NY) 6:251-261.Alvarez et al. (2000) Theor Appl Genet 100:319-327.Armbrust et al. (2004) Science 306:79-86.Attila Kereszt et al. (2007) Nature Protocols 2:948 - 952.Baumberger et al. (2007) Curr. Biol. 17:1609-1614.Baumlein et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225:459-467.Baumlein et al. (1992) Plant J. 2:233-239.Beaudoin et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6421-6426.Beclin et al. (2002) Curr. Biol. 12:684-688.1423706895449_3.et al. (1998) Plant Mol. Biol. 36:297-306.Bortolamiol et al. (2007) Curr. Biol. 17:1615-1621.Broun et al. (1998) Plant J. 13:201-210.Brown et al. (2002) Biochem J. 364:795-805.Chapman et al. (2004) Gen. Dev. 18:1179-1186.Chen et al. (2004) The Plant Cell 16:1302-1313.Cheng et al. (1996) Plant Cell Rep. 15:653-657.Cheng et al. (2010) Transgenic Res 19: 221-229.Chikwamba et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:11127-11132.Cho et al. (1999a) J. Biol. Chem. 274:471-477.Cho et al. (1999b) J. Biol. Chem. 274:37335-37339.Clough and Bent (1998) Plant J. 16:735-43.Coutu et al. (2007) Transgenic Res. 16: 771-781.Damude et al. (2006). Proc Natl Acad Sci USA 103: 9446-9451.Denic and Weissman (2007) Cell 130:663-677.Domergue et al (2002) Eur. J. Biochem. 269:4105-4113.Domergue et al. (2002) Eur. J. Biochem. 269:4105-4113.Domergue et al. (2003) J. Biol. Chem. 278: 35115-35126.Domergue et al. (2005) Biochem. J.1389: 483-490.Dunoyer et al. (2004) The Plant Cell 16:1235-1250.Ellerstrom et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:1019-1027.Fujimura et al. (1985) Plant Tissue Culture Lett. 2:74.Fukunaga (2009) EMBO J. 28:545-55.Gamez et al. (2003) Food Res International 36: 721-727.Garcia-Maroto et al. (2002) Lipids 37:417-426.Girke et al. (1998) Plant J. 15:39-48.Glick et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 105-157-161.Grant et al. (1995) Plant Cell Rep. 15:254-258.Hall et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9320-9324Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286:950-952.Hamilton et al. (1997) Gene 200:107-16.Harayama (1998). Trends Biotechnol. 16: 76-82.Hastings et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:14304-14309.Hinchee et al. (1988) Biotechnology 6:915-922.Hoffmann et al. (2008) J Biol. Chem. 283:22352-22362.Hong et al. (2002a) Lipids 37:863-868.Horiguchi et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39:540-544.Horvath et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:1914-1919.Huang et al. (1999) Lipids 34:649-659.Inagaki et al. (2002) Biosci. Biotechnol. Biochem. 66:613-621.Johansen and Carrington (2001) Plant Physiol. 126-930-938.Kajikawa et al. (2004) Plant Mol. Biol. 54:335-52.Kajikawa et al. (2006) FEBS Lett 580:149-154.Kim et al. (2005) Plant Cell. 2005 1073-89.Knutzon et al. (1998) J. Biol Chem. 273:29360-6.Koziel et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:393-405.Lassner (1995) Plant Physiol. 109:1389-94.Leonard et al. (2000) Biochem. J. 347:719-724.Leonard et al. (2000b) Biochem. J. 350:765-770.Leonard et al. (2002) Lipids 37:733-740.Lewsey et al. (2007) Plant J. 50:240-252.Lo et al. (2003) Genome Res. 13:455-466.Lu and Kang (2008) Plant Cell Rep. 27:273-8.Mallory et al. (2002) Nat. Biotech. 20:622-625.Marangoni et al. (1995) Trends in Food Sci. Technol. 6: 329-335.Meesapyodsuk et al. (2007) J Biol Chem 282: 20191-20199.Meng et al. (2008) J. Gen. Virol. 89:2349-2358.Meyer et al. (2003) Biochem. 42:9779-9788.Meyer et al. (2004) Lipid Res 45:1899-1909.Michaelson et al. (1998a) J. Biol. Chem. 273:19055-19059.Michaelson et al. (1998b) FEBS Lett. 439:215-218.Murashige and Skoog (1962) Physiologia Plantarum 15:473-497.Napier et al. (1998) Biochem. J. 330:611-614.Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453.Niedz et al. (1995) Plant Cell Reports 14:403.Ow et al. (1986) Science 234:856-859.Parker-Barnes et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:8284-8289.Pereira et al. (2004a) Biochem. J. 378:665-671.Pereira et al. (2004b) Biochem. J. 384:357-366.Perrin et al. (2000) Mol Breed 6:345-352.Petrie et al. (2010a) Metab. Eng. 12:233-240.Petrie et al. (2010b) Plant Methods 11:6:8.Petrie et al. (2012) Transgenic Res. 21:139-147.Potenza et al. (2004) In Vitro Cell Dev Biol - Plant 40:1-22.Prasher et al (1985) Biochem. Biophys. Res. Commun. 127:31-36.Qi et al. (2002) FEBS Lett. 510:159-165.Qi et al. (2004) Nat. Biotech. 22: 739-745.Qiu et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:31561-31566.Reddy and Thomas (1996) Nat. Biotech. 14:639-642.Reddy et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:293-300.Robert et al. (2005) Func. Plant Biol. 32:473-479.Robert et al. (2009) Marine Biotech 11:410-418.Ruiz-Lopez et al. (2012) Transgenic Res. 21:139-147.Saha et al. (2006) Plant Physiol. 141:1533-1543.Saito et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267:1813-1818.Sakuradani et al. (1999) Gene 238:445-453.Sato et al. (2004) Crop Sci. 44: 646-652.Sakuradani et al. (2005) Appl. Microbiol. Biotechnol. 66:648-654.Sayanova et al. (2006) J Biol Chem 281: 36533-36541.Sayanova et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4211-4216.Sayanova et al. (2003) FEBS Lett. 542:100-104.Sayanova et al. (2006) Planta 224:1269-1277.Sayanova et al. (2007) Plant Physiol 144:455-467.Singh et al. (2005) Curr. Opin. in Plant Biol. 8:197-203.Speranza et al. (2012) Process Biochemistry (In Press).Sperling et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267:3801-3811.Sperling et al. (2001) Arch. Biochm. Biophys. 388:293-8.Sprecher et al. (1995) J. Lipid Res. 36:2471-2477.Spychalla et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:1142-1147.Stalker et al. (1998) J. Biol. Chem. 263:6310-6314.Thillet et al. (1988) J. Biol. Chem 263:12500-12508.Tonon et al. (2003) FEBS Lett. 553:440-444.Toriyama et al. (1986) Theor. Appl. Genet. 205:34.Trautwein (2001) European J. Lipid Sci. and Tech. 103:45-55.Tvrdik (2000) J. Cell Biol. 149:707-718.Venegas-Caleron et al. (2010) Frog. Lipid Res. 49:108-119.Voinnet et al. (2003) Plant J. 33:949-956.Wallis and Browse (1999) Arch. Biochem. Biophys. 365:307-316.Watts and Browse (1999b) Arch. Biochem. Biophys. 362:175-182.Weiss et al. (2003) Int. J. Med. Microbiol. 293:95:106.Whitney et al. (2003) Planta 217:983-992.Winans (1988) J. Bacteriol. 170:4047-54.Wood (2009) Plant Biotechnol J. 7:914-24.Wu et al. (2005) Nat. Biotech. 23:1013-1017.Yang et al. (2003) Planta 216:597-603.Zank et al. (2002) Plant J. 31:255-268.Zank et al. (2005) WO 2005/012316Zhang et al. (2004) FEBS Lett. 556:81-85.Zhang et al. (2006) 20:3255-3268.Zhang et al. (2007a) FEBS Letters 581: 315-319.Zhang et al. (2008) Yeast 25: 21-27.Zhou et al. (2007) Phytochem. 68:785-796.Zhou et al. (2008) Insect Mol Biol 17: 667-676.Zou et al. (1997) Plant Cell. 9:909-23.
本発明は、以下の態様を含む。
［１］
エステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに、任意にステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）の１またはそれ以上を含み、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、約７％から２０％である、抽出植物脂質。
［２］
以下の特徴：
ｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは、約２％から１８％の間、または約２％から１６％の間、または約２％から１５％の間である、
ｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは、６％未満、または３％未満、または２％未満、または１％未満である、
ｌｘｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルは、約１％から約３０％の間、約３％から約３０％の間、または約６％から約３０％の間、または１％から約２０％の間、または約３０％から約６０％の間、または約４５％から約６０％、または約３０％である、
ｌｘｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸（ＬＡ）のレベルは、約４％から約３５％の間、または約４％から約２０％の間、または約４％から１７％の間である、
ｌｘｉｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸（ＡＬＡ）のレベルは、約４％から約４０％の間、約７％から約４０％の間、または約１０％から約３５％の間、または約２０％から約３５％の間、または約４％から１６％の間、または約２％から１６％の間である、
ｌｘｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記γ‐リノレン酸（ＧＬＡ）のレベルは、４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、０．０５％から７％の間、０．０５％から４％の間、または０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間である、
ｌｘｘｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ステアリドン酸（ＳＤＡ）のレベルは、約７％未満、約６％未満、約４％未満、約３％未満、約０．０５％から約７％の間、約０．０５％から約６％の間、約０．０５％から約４％の間、約０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間である、
ｌｘｘｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のレベルは、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．０５％から約６％の間、約０．０５％から約５％の間、約０．０５％から約４％の間、約０．０５％から約３％の間、または約０．０５％から約２％の間である、
ｌｘｘｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）のレベルは、４％未満、約２％未満、約１％未満、０．０５％から４％の間、０．０５％から３％の間、または０．０５％から約２％の間、または０．０５％から約１％の間である、
ｌｘｘｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）のレベルは、４％未満、約３％未満、約２％未満、０．０５％から１０％の間、０．０５％から５％の間、または０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間である、
ｌｘｘｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）のレベルは、４％未満、約３％未満、約２％未満、０．０５％から８％の間、０．０５％から５％の間、または０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間である、
ｌｘｘｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約８％から２０％の間、約１０％から２０％の間、約１１％から２０％の間、約１０％から約１６％の間、または約１４％から２０％の間である、
ｌｘｘｖｉｉ）前記脂質は、その脂肪酸含有量にω６‐ドコサぺンタエン酸（２２：５Δ４，７，１０，１３，１６）を含む、
ｌｘｘｖｉｉｉ）前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ω６‐ドコサぺンタエン酸（２２：５Δ４，７，１０，１３，１６）を実質的に含まない、
ｌｘｘｉｘ）前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ＳＤＡ、ＥＰＡ、およびＥＴＡを実質的に含まない、
ｌｘｘｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、約４％から約２５％の間、または約４％から約２０％の間、約６％から約２０％の間、約４％から約６０％の間、約３０％から約６０％の間、または約４５％から約６０％の間である、
ｌｘｘｘｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベルは、約４％から約３５％の間、または約８％から約２５％の間、または８％から約２２％の間である、
ｌｘｘｘｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベルは、約２０％から約７５％の間、または約５０％から約７５％の間、または約６０％から約７５％の間である、
ｌｘｘｘｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸のレベルは、約３５％から約５０％の間、約２０％から約３５％の間、約６％から２０％の間、２０％未満、約１６％未満、約１０％未満、約１％から約１６％の間、約２％から約１０％の間、または約４％から約１０％の間である、
ｌｘｘｘｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸のレベルは、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、４％未満、約１％から約２０％の間、約１％から約１０％の間、約０．５％から約８％の間、または約０．５％から４％の間である、
ｌｘｘｘｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸のレベルは、３６％から約６５％の間、４０％から約６０％の間、約２０％から約３５％の間、約１０％から約２０％の間、約２５％、約３０％、約３５％、または約４０％である、
ｌｘｘｘｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω３脂肪酸のレベルは、９％から約３３％の間、約１０％から約２０％の間、約２０％から約３０％の間、約１２％から約２５％の間、約１３％、約１５％、約１７％、または約２０％である、
ｌｘｘｘｖｉｉ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、約１．０から約３．０の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．５の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満、約１．０、約０．１、または約０．２である、
ｌｘｘｘｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は、約１．０から約３．０の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．５の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満、約０．１、約０．２、または約１．０である、
ｌｘｘｘｉｘ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、約６０％から約９８％の間、約７０％から約９５％の間、または約７５％から約９０％の間の、Δ１２‐デサチュラーゼによる、オレイン酸のＬＡへの転換の効率に基づく、
ｘｃ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約３０％から約７０％の間、約３５％から約６０％の間、または約５０％から約７０％の間の、Δ６‐デサチュラーゼによる、ＡＬＡのＳＤＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｃｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約８８％の間、または約７５％から約８５％の間の、Δ６‐エロンガーゼによる、ＳＤＡのＥＴＡ酸への転換の効率に基づく、
ｘｃｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、約６０％から約９９％の間、約７０％から約９９％の間、または約７５％から約９８％の間の、Δ５‐デサチュラーゼによる、ＥＴＡのＥＰＡへの転換の効率に基づく、
ｘｃｉｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、約５０％から約９５％の間、または約８５％から約９５％の間の、Δ５‐エロンガーゼによる、ＥＰＡのＤＰＡへの転換の効率に基づく、
ｘｃｉｖ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、約５０％から約９５％の間、約８０％から約９５％の間、または約８５％から約９５％の間の、Δ４‐デサチュラーゼによる、ＤＰＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｃｖ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、約１０％から約５０％の間、約１０％から約３０％の間、または約１０％から約２５％の間の、オレイン酸のＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｃｖｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、少なくとも約２５％、約１５％から約５０％の間、約２０％から約４０％の間、または約２０％から約３０％の間の、ＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｃｖｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少なくとも約２４％、約１７％から約５５％の間、約２２％から約３５％の間、または約２４％から約３５％の間のＡＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｃｖｉｉｉ）前記抽出脂質における前記総脂肪酸は、Ｃ２０：１を１％未満有する、
ｘｃｉｘ）前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、約７０％から約９９％の間、または約９０％から約９９％の間であり、
ｃ）前記脂質は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含む、
ｃｉ）前記脂質は、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、または約０．００１％から約５％の間の、遊離（非エステル化）脂肪酸および／もしくはリン脂質を含む、または、これらを実質的に含まない、
ｃｉｉ）ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＨＡの少なくとも７０％または少なくとも８０％が、前記ＴＡＧのｓｎ‐１またはｓｎ‐３の位置にある、
ｃｉｉｉ）前記脂質において最も豊富なＤＨＡ含有ＴＡＧの種は、ＤＨＡ／１８：３／１８：３（ＴＡＧ５８：１２）である、
ｃｉｖ）前記脂質は、トリ‐ＤＨＡ  ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む、の１もしくはそれ以上、または全てを有する［１］の脂質。
［３］
オイルの形態であって、該オイルの重量の少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または約９５％から約９８％の間が前記脂質である、［１］または［２］の脂質。
［４］
１またはそれ以上のステロールをさらに含む、［１］から［３］のいずれか１つの脂質。
［５］
オイルの形態であって、約１０ｍｇのステロール／ｇのオイル未満、約７ｍｇのステロール／ｇのオイル未満、約１．５ｍｇから約１０ｍｇの間のステロール／ｇのオイル、または約１．５ｍｇから約７ｍｇの間のステロール／ｇのオイルを含む［４］の脂質。
［６］
カンペステロール／２４‐メチルコレステロール、Δ５‐スチグマステロール、エブリコール、β‐シトステロール／２４‐エチルコレステロール、Δ５‐アベナステロール／イソフコステロール、Δ７‐スチグマステロール／スティグマスト‐７‐エン‐３β‐オールおよび、Δ７‐アベナステロールの１もしくはそれ以上、または全てを含む［４］または［５］の脂質。
［７］
約０．５ｍｇのコレステロール／ｇのオイル未満、約０．２５ｍｇのコレステロール／ｇのオイル未満、約０ｍｇから約０．５ｍｇの間のコレステロール／ｇのオイル、もしくは約０ｍｇから約０．２５ｍｇの間のコレステロール／ｇのオイルを含む、またはコレステロールを実質的に含まない、［４］から［６］のいずれか１つの脂質。
［８］
前記脂質はオイルであり、好ましくは、油料種子由来のオイルである、［１］から［７］のいずれか１つの脂質。
［９］
前記脂質は、アブラナ属種オイル、ワタオイル、アマオイル、ヒマワリ属種オイル、ベニバナオイル、ダイズオイル、トウモロコシオイル、シロイヌナズナオイル、モロコシオイル、ソルガムブルガレオイル、エンバクオイル、トリフォリウム属種オイル、エラエイスグイネエヌシスオイル、ベンサミアナタバコオイル、オオムギオイル、ルピナスアングスティフォリウスオイル、イネオイル、アフリカイネオイル、カメリナサティバオイル、クランベアビシニカオイル、ミスカンサスｘギガンティウスオイル、またはススキオイルである、［８］の脂質。
［１０］
ｉ）脂質を含む植物部分を得ることであって、前記脂質はエステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）およびγ‐リノレン酸（ＧＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに任意にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）の１またはそれ以上を含み、前記植物部分における抽出可能な脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、約７％から２０％である工程、
ｉｉ）前記植物部分から脂質を抽出することであって、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、約７％から２０％である工程、を含む、抽出植物脂質を産生するためのプロセス。
［１１］
前記抽出脂質は、［２］から［９］に定義される１またはそれ以上の特徴を有する、［１０］のプロセス。
［１２］
前記植物部分が、種子、好ましくは油料種子である、［１０］または［１１］のプロセス。
［１３］
前記種子が、アブラナ属種子、ワタ、アマ、ヒマワリ属種、ベニバナ、ダイズ、トウモロコシ、シロイヌナズナ、モロコシ、ソルガムブルガレ、エンバク、トリフォリウム属種、エラエイスグイネエヌシス、ベンサミアナタバコ、オオムギ、ルピナスアングスティフォリウス、イネ、アフリカイネ、カメリナサティバ、またはクランベアビシニカ、好ましくは、セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバの種子である、［１２］のプロセス。
［１４］
種子１グラム当たり、少なくとも約１８ｍｇ、少なくとも約２２ｍｇ、少なくとも約２６ｍｇ、約１８ｍｇから約１００ｍｇの間、約２２ｍｇから約７０ｍｇの間、または約２４ｍｇから約５０ｍｇの間のＤＨＡを、前記種子が含む、［１２］または［１３］のプロセス。
［１５］
前記植物部分は、以下のセットの酵素：
ｉ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、または
ｖｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
の１つをコードし、
各ポリヌクレオチドが、前記植物部分の細胞において、前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることが可能である、１またはそれ以上のプロモーターに操作可能に結合される、外因性ポリヌクレオチドを含む、［１０］から［１４］のいずれか１つのプロセス。
［１６］
前記植物部分が、以下の特徴：
ｉ）前記Δ１２‐デサチュラーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約９０％の間、または約７５％から約８５％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞におけるオレイン酸をリノール酸に転換する、
ｉｉ）前記ω３‐デサチュラーゼが、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、約６５％から約９５％の間、約７５％から約９１％の間、または約８０％から約９１％の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ω６脂肪酸をω３脂肪酸に転換する、
ｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約３０％から約７０％の間、約３５％から約６０％の間、または約５０％から約７０％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＡＬＡをＳＤＡに転換する、
ｉｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、約５％未満、約２．５％未満、約１％未満、約０．１％から約５％の間、約０．５％から約２．５％の間、または約０．５％から約１％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、リノール酸をγ‐リノレン酸に転換する、
ｖ）前記Δ６‐エロンガーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約８０％の間、または約７５％から約８０％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＳＤＡをＥＴＡに転換する、
ｖｉ）前記Δ５‐デサチュラーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約９５％の間、または約７５％から約９５％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＥＴＡをＥＰＡに転換する、
ｖｉｉ）前記Δ５‐エロンガーゼが、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％の間、約５０％から約９０％の間、または約８５％から約９５％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＥＰＡをＤＰＡに転換する、
ｖｉｉｉ）前記Δ４‐デサチュラーゼが、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、約５０％から約９５％の間、約８０％から約９５％の間、または約８５％から約９５％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＤＰＡをＤＨＡに転換する、
ｉｘ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞における、ＤＨＡへのオレイン酸の転換の効率が、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、約１０％から約５０％の間、約１０％から約３０％の間、または約１０％から約２５％の間である、
ｘ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞における、ＤＨＡへのＬＡの転換の効率が、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、少なくとも約２５％、約１５％から約５０％の間、約２０％から約４０％の間、または約２０％から約３０％の間である、
ｘｉ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞における、ＤＨＡへのＡＬＡの転換の効率が、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少なくとも約２４％、約１７％から約５５％の間、約２２％から約３５％の間、または約２４％から約３５％の間である、
ｘｉｉ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞が、前記外因性ポリヌクレオチドを欠いている対応する細胞よりも、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、約１５％から約３０％の間、または約２２．５％から約２７．５％の間で多いω３脂肪酸を含む、
ｘｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、、リノール酸（ＬＡ）に対してα‐リノレン酸（ＡＬＡ）を優先的に不飽和化する、
ｘｉｖ）前記Δ６‐エロンガーゼは、また、Δ９‐エロンガーゼ活性を有する、
ｘｖ）前記Δ１２‐デサチュラーゼは、また、Δ１５‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｖｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、また、Δ８‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｖｉｉ）前記Δ８‐デサチュラーゼは、また、Δ６‐デサチュラーゼ活性を有する、またはΔ６‐デサチュラーゼ活性を有していない、
ｘｖｉｉｉ）前記Δ１５‐デサチュラーゼは、また、ＧＬＡでω３‐デサチュラーゼ活性を有し、
ｘｉｘ）前記ω３‐デサチュラーゼは、また、ＬＡでΔ１５‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｘ）前記ω３‐デサチュラーゼは、両方のＬＡおよび／またはＧＬＡを不飽和化する、
ｘｘｉ）前記ω３‐デサチュラーゼは、、ＬＡに対してＧＬＡを優先的に不飽和化する、
ｘｘｉｉ）前記植物部分における前記ＤＨＡのレベルは、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、約１０％から約５０％の間、約１５％から約３０％の間、または約２０％から約２５％の間の、前記植物部分におけるオレイン酸のＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｉｉｉ）前記植物部分における前記ＤＨＡのレベルは、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、約１５％から約６０％の間、約２０％から約４０％の間、または約２２％から約３０％の間の、前記植物部分におけるＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｉｖ）前記植物部分における前記ＤＨＡのレベルは、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少なくとも約２４％、約１７％から約６５％の間、約２２％から約３５％の間、または約２４％から約３５％の間の、前記植物部分におけるＡＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｘ）１もしくはそれ以上のまたは全ての前記デサチュラーゼが、対応するアシル‐ＰＣ基質よりもアシル‐ＣｏＡ基質で、より高い活性を有する、
ｘｘｘｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としての、ＬＡよりもＡＬＡで、より高いΔ６‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｘｘｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ‐２位置に結合するＡＬＡよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、より高いΔ６‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｘｘｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、基質としてのＡＬＡで、ＬＡと比較して、少なくとも約２倍高いΔ６‐デサチュラーゼ活性、少なくとも３倍高い活性、少なくとも４倍高い活性、または少なくとも５倍高い活性を有する、
ｘｘｘｉｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ‐２位置に結合するＡＬＡよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、より高い活性を有する、
ｘｘｘｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ‐２位置に結合するＡＬＡよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、少なくとも約５倍高いΔ６‐デサチュラーゼ活性または少なくとも１０倍高い活性を有する、
ｘｘｘｖｉ）前記デサチュラーゼは、フロントエンドのデサチュラーゼである、
ｘｘｘｖｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、ＥＴＡで、検出可能なΔ５‐デサチュラーゼ活性を有していない、
の１もしくはそれ以上、または全てを有する［１５］のプロセス。
［１７］
前記植物部分が、以下の特徴：
ｉ）前記Δ１２‐デサチュラーゼが、配列番号１０で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号１０と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、
ｉｉ）前記ω３‐デサチュラーゼが、配列番号１２で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号１２と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、
ｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、配列番号１６で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号１６と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、
ｉｖ）前記Δ６‐エロンガーゼが、配列番号２５で規定される配列を有するアミノ酸、配列番号２６のようなその生物学的に活性な断片、または配列番号２５および／または配列番号２６と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、
ｖ）前記Δ５‐デサチュラーゼが、配列番号３０で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号３０と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、
ｖｉ）前記Δ５‐エロンガーゼが、配列番号３７で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号３７と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、
ｖｉｉ）前記Δ４‐デサチュラーゼが、配列番号４１で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号４１と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、
の１もしくはそれ以上、または全てを有する、［１５］または［１６］のプロセス。
［１８］
前記植物部分が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）、グリセロール‐３‐ホスフェートアシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、１‐アシル‐グリセロール‐３‐ホスフェートアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）好ましくはＣ２２多価不飽和脂肪族アシル‐ＣｏＡ基質を使用し得るＬＰＡＡＴ、アシル‐ＣｏＡ：リソホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、ＣＤＰ‐コリンジアシルグリセロールコリンホスフォトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）、ホスファチジル（ｐｈｏｓｈａｔｉｄｙｌ）コリンジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスフォトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）、アシル‐ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）、または２つもしくはそれ以上のこれらの組み合わせをコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、［１５］から［１７］のいずれか１つのプロセス。
［１９］
前記植物部分が、ＦＡＥ１、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＬＰＣＡＴ、ＰＬＡ２、ＰＬＣ、ＰＬＤ、ＣＰＴ、ＰＤＡＴ、ＦＡＴＢのようなチオエステラーゼ、またはΔ１２‐デサチュラーゼ、または２つもしくはそれ以上のこれらの組み合わせから選択される、前記植物部分の細胞における内因性酵素の産生および／または活性を下方制御する、導入された突然変異または外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、［１０］から［１８］のいずれか１つのプロセス。
［２０］
少なくとも１つまたは全ての前記プロモーターが種子特異的プロモーターである、［１５］から［１９］のいずれか１つのプロセス。
［２１］
少なくとも１つまたは全ての前記プロモーターが、オイル生合成もしくはオレオシンのような蓄積遺伝子から、またはコンリニンのような種子貯蔵タンパク質遺伝子から得られた、［２０］のプロセス。
［２２］
前記Δ４‐デサチュラーゼおよび前記Δ５‐エロンガーゼをコードする、外因性ポリヌクレオチドの発現を方向づける前記プロモーターが、前記植物部分の種子の発生以前、またはピークの発現に達する以前において、ポリヌクレオチドの発現を開始し、前記プロモーターが前記Δ１２‐デサチュラーゼおよび前記ω３‐デサチュラーゼをコードする前記外因性ポリヌクレオチドの発現を方向づける、［１５］から［２１］のいずれか１つのプロセス。
［２３］
前記外因性ポリヌクレオチドは、前記植物部分の細胞のゲノムに組込まれるＤＮＡ分子、好ましくはＴ‐ＤＮＡ分子において共有結合で結合され、好ましくは前記植物部分の前記細胞の前記ゲノムに組込まれるこのようなＤＮＡ分子の数は、１、２もしくは３以下であり、または２もしくは３である、［１５］から［２２］のいずれか１つのプロセス。
［２４］
前記植物は、同じまたは異なるアミノ酸配列を有するΔ６‐デサチュラーゼをそれぞれコードする少なくとも２つの異なる外因性ポリヌクレオチドを含む、［２３］のプロセス。
［２５］
前記外因性ポリヌクレオチドを含む前記植物部分の総オイル含有量は、前記外因性ポリヌクレオチドを欠く対応する植物部分の総オイル含有量の少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または約５０％から約８０％の間である、［１５］から［２４］のいずれか１つのプロセス。
［２６］
前記脂質は、オイル、好ましくは油料種子由来の種子オイルの形態であり、前記脂質の重量の少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または約９５％から約９８％の間がトリアシルグリセロールである、［１０］から［２５］のいずれか１つのプロセス。
［２７］
前記総脂肪酸含有量のパーセンテージとしての前記ＤＨＡのレベルを増加させるために前記脂質を処理することをさらに含む、［１０］から［２６］のいずれか１つのプロセス。
［２８］
前記処理がエステル交換反応である、［２７］のプロセス。
［２９］
［１０］から［２８］のいずれか１つのプロセスを用いて産生された、脂質または該脂質を含むオイル。
［３０］
単一のＤＮＡ分子に全て共有結合で結合される、第１の遺伝子、第２の遺伝子、第３の遺伝子、第４の遺伝子、第５の遺伝子、および第６の遺伝子の順で含む、キメラ遺伝子コンストラクトであって、
第１、第２、および第３の遺伝子が第１の遺伝子クラスターとしてともに結合され、第４、第５、および第６の遺伝子が第２の遺伝子クラスターとしてともに結合され、
各遺伝子は、各プロモーターが前記コード領域および転写ターミネーターおよび／またはポリアデニル化領域が操作可能に結合されるように、プロモーター、コード領域、および転写ターミネーター、および／またはポリアデニル化領域を含み、
各プロモーターが、前記ＤＮＡ分子が３、４、５、または６つの異なるプロモーターを含むように、独立して他のプロモーターと同じまたは異なり、１もしくはそれ以上のまたは全ての前記プロモーターが、それが操作可能に結合されるコード領域に対して異種性であり、
前記第１の遺伝子の転写の方向が、前記第３の遺伝子から離れており、前記第３の遺伝子の転写の方向と反対であり、
前記第４の遺伝子の転写の方向が、前記第６の遺伝子から離れており、前記第６の遺伝子の転写の方向と反対であり、
前記第２の遺伝子の転写の方向が、前記第１の遺伝子または前記第３の遺伝子と同じであり、
前記第５の遺伝子の転写の方向が、前記第４の遺伝子または前記第６の遺伝子と同じであり、
前記第２の遺伝子の前記転写ターミネーターおよび／またはポリアデニル化領域が、約０．２から約３．０キロベースの間の第１のスペーサー領域により、より近いいずれかの、前記第１または第３の遺伝子の前記プロモーターから間隔を置き、
約１．０から約１０．０キロベースの間の第２のスペーサー領域により前記第１の遺伝子クラスターが第２の遺伝子クラスターから間隔を置き、および
前記第５の遺伝子の前記転写ターミネーターおよび／またはポリアデニル化領域が、約０．２から約３．０キロベースの間の第３のスペーサー領域により、より近いいずれかの、第４または第６の遺伝子の前記プロモーターから間隔を置く、キメラ遺伝子コンストラクト。
［３１］
前記ＤＮＡ分子が、約１．０から約１０．０キロベースの間のスペーサー領域により、より近いいずれかの、前記第１の遺伝子クラスターまたは前記第２の遺伝子クラスターから間隔を置く第７の遺伝子を含む、［３０］の遺伝子コンストラクト。
［３２］
前記ＤＮＡ分子が、２つまたはそれ以上の異なる転写ターミネーターおよび／またはポリアデニル化領域を含む、［３０］または［３１］の遺伝子コンストラクト。
［３３］
少なくとも１つの前記スペーサー領域がマトリックス結合領域（ＭＡＲ）を含む、［３０］から［３２］のいずれか１つの遺伝子コンストラクト。
［３４］
前記ＤＮＡ分子が、前記遺伝子に隣接する左右境界領域を含み、かつＴ‐ＤＮＡ分子である、［３０］から［３３］のいずれか１つの遺伝子コンストラクト。
［３５］
アグロバクテリウム細胞である、または植物細胞のゲノムに組み込まれる、［３０］から［３４］のいずれか１つの遺伝子コンストラクト。
［３６］
少なくとも１つの前記遺伝子が、脂肪酸デサチュラーゼまたは脂肪酸エロンガーゼをコードする、［３０］から［３５］のいずれか１つの遺伝子コンストラクト。
［３７］
［１５］に定義される酵素のセットをコードする遺伝子、および／または［１６］または［１７］に定義される酵素をコードする１またはそれ以上の遺伝子を含む、［３６］の遺伝子コンストラクト。
［３８］
ｉ）配列番号１から９、１１、１４、１８、２２、２３、２８、３４、３５、３９、または４５のいずれかから選択されるヌクレオチドの配列、および／または
ｉｉ）配列番号１から９、１１、１４、１８、２２、２３、２８、３４、３５、３９、または４５に示される１またはそれ以上の配列と、少なくとも９５％同一または９９％同一であるヌクレオチドの配列、
を含む、単離および／または外因性ポリヌクレオチド。
［３９］
［３８］のポリヌクレオチドおよび／または［３０］から［３７］のいずれか１つの前記遺伝子コンストラクトを含む、ベクターまたは遺伝子コンストラクト。
［４０］
配列番号１１、１４、１８、２２、２３、２８、３４、３５、３９、もしくは４５のいずれか１つから選択される前記ヌクレオチドの配列、または配列番号１１、１４、１８、２２、２３、２８、３４、３５、３９、もしくは４５で示される１もしくはそれ以上の前記配列と少なくとも９５％同一もしくは９９％同一である前記ヌクレオチドの配列は、プロモーターに操作可能に結合される、［３９］のベクターまたは遺伝子コンストラクト。
［４１］
以下のセットの酵素：
ｉ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、または
ｖｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
の１つをコードする、外因性ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、
各ポリヌクレオチドは、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができるように、１またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合される、宿主細胞。
［４２］
［１］から［９］のいずれか１つに定義される脂質を含み、または１もしくはそれ以上のまたは全ての前記デサチュラーゼもしくはエロンガーゼは、［１６］または［１７］に定義される１またはそれ以上の特徴を有する、［４１］の細胞。
［４３］
ｉ）配列番号１０に規定される配列を有するアミノ酸を含むΔ１２‐デサチュラーゼをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、その生物学的に活性な断片、または配列番号１０と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列と、
ｉｉ）配列番号１２に規定される配列を有するアミノ酸を含むω３‐デサチュラーゼをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、その生物学的に活性な断片、または配列番号１２と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列とを含み、
各ポリヌクレオチドが、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができる１またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合される、宿主細胞。
［４４］
１またはそれ以上の［３８］の前記ポリヌクレオチド、［３０］から［３７］のいずれか１つの前記遺伝子コンストラクト、または［３９］もしくは［４０］の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクトを含む宿主細胞。
［４５］
植物における、植物部分におけるものである、および／または成熟した植物種子の細胞である、［４１］から［４４］のいずれか１つの細胞。
［４６］
前記植物または植物種子は、それぞれ油料種子植物または油料種子である、［４５］の細胞。
［４７］
［４１］から［４６］のいずれか１つの細胞を含む、トランスジェニック非ヒト生物。
［４８］
トランスジェニック植物である、［４７］のトランスジェニック非ヒト生物。
［４９］
ａ）その種子における脂質であって、該脂質がエステル化形態における脂肪酸を含み、および
ｂ）以下のセットの酵素：
ｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、真菌のω３‐デサチュラーゼ、および／または真菌のΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、または
ｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、真菌のω３‐デサチュラーゼ、および／もしくは真菌のΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、の１つをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、
各ポリヌクレオチドは、前記植物の種子を発生する場合に、前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができるように１またはそれ以上の種子特異的プロモーターを操作可能に結合され、
前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）およびγ‐リノレン酸（ＧＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ならびに任意にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および／またはエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、
前記脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは約７％から２０％である、油料種子植物。
［５０］
前記植物は、キャノーラ、ダイズ、カメリナサティバ、またはシロイヌナズナ植物である、［４９］の植物。
［５１］
１またはそれ以上の前記デサチュラーゼは、アシル‐ＣｏＡ基質を使用することができる、［４９］または［５０］の植物。
［５２］
１またはそれ以上の前記Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、およびΔ８‐デサチュラーゼは、もし存在する場合には、アシル‐ＣｏＡ基質を用いることができ、好ましくは、ｉ）Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、およびΔ４‐デサチュラーゼ、またはｉｉ）Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、およびΔ８‐デサチュラーゼのそれぞれは、アシル‐ＣｏＡ基質を用いることができる、［５１］の植物。
［５３］
前記植物の成熟した、収穫された種子は、１グラムの種子あたり少なくとも約２８ｍｇ、好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約３２ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約３６ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約４４ｍｇ、または１グラムの種子あたり少なくとも約４８ｍｇのＤＨＡ含有量を有する、［４９］から［５２］のいずれか１つの植物。
［５４］
ＤＨＡを含む種子を産生することができるセイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバ植物であって、
前記植物の成熟した、収穫された種子は、１グラムの種子あたり少なくとも約２８ｍｇ、好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約３２ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約３６ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約４４ｍｇ、または１グラムの種子あたり少なくとも約４８ｍｇのＤＨＡ含有量を有する植物。
［５５］
前記外因性ポリヌクレオチドを含む、［４９］から［５４］のいずれか１つの植物の植物細胞。
［５６］
以下の特徴：
ｉ）［４８］から［５４］のいずれか１つの植物由来である、
ｉｉ）［１］から［９］のいずれか１つに定義される脂質を含む、
ｉｉｉ）［１０］から［２８］のいずれか１つのプロセスで使用され得る、
ｉｖ）［３０］から［３７］のいずれか１つの遺伝子コンストラクトを含む、または
ｖ）［１４］、［４１］、または［４８］から［５２］のいずれか１つに定義される外因性ポリヌクレオチドのセットを含む、
の１またはそれ以上を有する植物部分、好ましくは種子。
［５７］
ＤＨＡおよび重量で約４％から約１５％の間の水分含有量を含む、成熟した、収穫されたセイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバ種子であって、
前記種子の前記ＤＨＡの含有量は、１グラムの種子あたり少なくとも約２８ｍｇ、好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約３２ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約３６ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約４４ｍｇ、または１グラムの種子あたり少なくとも約４８ｍｇである、種子。
［５８］
［１］から［９］のいずれか１つに定義される、１もしくはそれ以上のまたは全ての特徴を含む、抽出脂質を産生するために使用され得る、［４１］から［４６］、もしくは［５５］のいずれか１つの前記細胞、［４７］もしくは［４８］の前記トランスジェニック生物、［４９］から［５３］のいずれか１つの前記油料種子植物、［５４］の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、［４９］もしくは［５６］の前記植物部分、または［５７］の前記種子。
［５９］
［４１］から［４５］のいずれか１つの細胞を産生する方法であって、
ａ）前記細胞、好ましくは、ＬＣ‐ＰＵＦＡを合成することができない細胞に、［３０］から［３７］のいずれか１つの前記遺伝子コンストラクト、［３８］の前記単離および／または外因性ポリヌクレオチド、［３９］または［４０］の前記ベクターまたは遺伝子コンストラクト、［１４］、［４１］から［４３］、または［４８］から［５２］のいずれか１つに定義される１またはそれ以上の外因性ポリヌクレオチドの組み合わせを導入することと、
ｂ）任意に、前記遺伝子またはポリヌクレオチドを前記細胞内に発現することと、
ｃ）任意に、前記細胞の前記脂肪酸組成を分析することと、
ｄ）任意に、前記遺伝子またはポリヌクレオチドを発現する細胞を選択することと、を含む方法。
［６０］
前記細胞における脂質が、１またはそれ以上の［１］から［９］に定義される特徴を有する、［５９］に記載の方法。
［６１］
前記遺伝子コンストラクト、前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記遺伝子コンストラクト、または外因性ポリヌクレオチドの組み合わせは、前記細胞の前記ゲノムに安定して組込まれる、［５９］または［６０］に記載の方法。
［６２］
前記細胞は植物細胞であり、前記方法は、工程ａ）の前記細胞から形質転換植物を再生する工程をさらに含む、［５９］から［６１］のいずれか１つの方法。
［６３］
前記遺伝子および／または外因性ポリヌクレオチドは、一過性で前記細胞内に発現される、［６２］の方法。
［６４］
［５９］から［６３］のいずれか１つの方法を用いて産生される細胞。
［６５］
種子を産生する方法であって、
ａ）好ましくは少なくとも１０００のこのような植物の個体群の一部としてのフィールドで、またはスタンダードな栽植密度で栽植される少なくとも１ヘクタールのエリアで、［４８］から［５４］のいずれか１つの植物、または［１０］から［２８］、［５６］、もしくは［５７］のいずれか１つに定義される部分を産生する植物を成長させることと、
ｂ）前記植物の１つまたは複数から種子を収穫することと、
ｃ）任意に、前記種子から脂質を抽出して、好ましくは、少なくとも６０ｋｇＤＨＡ／ヘクタールの総ＤＨＡ収率を有するオイルを産生することと、
を含む、方法。
［６６］
以下の特徴：
ｉ）前記オイルが［２］、または［４］から［７］のいずれか１つに定義される、
ｉｉ）前記植物部分または種子が、［１４］、［１６］から［１９］、［２１］から［２８］のいずれか１つのプロセスで使用され得る、
ｉｉｉ）前記外因性ポリヌクレオチドが、［３０］から［３５］のいずれか１つの遺伝子コンストラクトに含まれる、
ｉｖ）前記外因性ポリヌクレオチドは、［３８］の外因性ポリヌクレオチドを含む、
ｖ）前記植物細胞は、［４３］の細胞である、
ｖｉ）前記種子は、［６５］の方法で産生された、の１またはそれ以上を有する、［４８］から［５７］のいずれか１つの前記植物、植物細胞、植物部分、または種子。
［６７］
１もしくはそれ以上の脂肪酸デサチュラーゼおよび／もしくは脂肪酸エロンガーゼ、または１もしくはそれ以上の脂肪酸デサチュラーゼ、並びに１もしくはそれ以上の脂肪酸エロンガーゼを産生する方法であって、
［３６］または［３７］の前記遺伝子コンストラクト、［３８］の前記単離および／または外因性ポリヌクレオチド、［３９］または［４０］の前記ベクターまたは遺伝子コンストラクト、１またはそれ以上の［１４］、［４１］から［４３］、または［４８］から［５２］のいずれか１つで定義される外因性ポリヌクレオチドの組み合わせを、細胞でまたは細胞フリーの発現システムで発現することを含む方法。
［６８］
［１０］から［２８］のいずれか１つの前記プロセス、［４１］から［４６］、もしくは［５５］のいずれか１つの前記細胞、［４７］もしくは［４８］の前記トランスジェニック生物、［４９］から［５３］のいずれか１つの前記油料種子植物、［５４］の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、［４９］もしくは［５６］の前記植物部分、［５７］の前記種子、または［６６］の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子を用いて、産生されまたは得られる脂質またはオイル。
［６９］
油料種子のオイルの抽出により得られる、［２９］または［６８］の脂質またはオイル。
［７０］
キャノーラオイル（セイヨウアブラナ、ブラッシカ・ラパ亜種）、マスタードオイル（セイヨウカラシナ）、他のアブラナオイル、ヒマワリ油（ヒマワリ）、亜麻仁油（アマ）、ダイズオイル（ダイズ）、ベニバナオイル（ベニバナ）、コーンオイル（トウモロコシ）、タバコオイル（タバコ）、ピーナッツオイル（ピーナッツ）、パームオイル、綿実油（ワタ）、ココナッツオイル（ココヤシ）、アボカドオイル（アボカド）、オリーブオイル（オリーブ）、カシューオイル（カシューナッツ）、マカダミアオイル（マカダミア）、アーモンドオイル（アーモンド）、またはシロイヌナズナ種子オイル（シロイヌナズナ）である、［２９］、［６８］、または［６９］の脂質またはオイル。
［７１］
［１０］から［２８］のいずれか１つの前記プロセス、［４１］から［４６］、もしくは［５５］のいずれか１つの前記細胞、［４７］もしくは［４８］の前記トランスジェニック生物、［４９］から［５３］のいずれか１つの前記油料種子植物、［５４］の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、［４９］もしくは［５６］の前記植物部分、［５７］の前記種子、または［６６］の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子を用いて、産生されまたは得られる脂肪酸。
［７２］
［５６］、［５７］、または［６６］のいずれか１つの種子から得られる種子ミール。
［７３］
１またはそれ以上の、［２９］、もしくは［５９］から［５１］のいずれか１つの前記脂質もしくはオイル、［６２］の前記脂肪酸、［３０］から［３７］のいずれか１つの前記遺伝子コンストラクト、［３８］の前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチド、［３９］もしくは［４０］の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、［４１］から［４６］、もしくは［５５］のいずれか１つの前記細胞、［４７］もしくは［４８］の前記トランスジェニック生物、［４９］から［５３］のいずれか１つの前記油料種子植物、［５４］の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、［４９］もしくは［５６］の前記植物部分、［５７］の前記種子、［６６］の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、または［７２］の前記種子ミールを含む組成物。
［７４］
１またはそれ以上の、［１］から［９］、［２９］、もしくは［５９］のいずれか１つの前記脂質もしくはオイル、［６２］の前記脂肪酸、［３０］から［３７］のいずれか１つの前記遺伝子コンストラクト、［３８］の前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチド、［３９］もしくは［４０］の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、［４１］から４６］、もしくは［５５］のいずれか１つの前記細胞、［４７］もしくは［４８］の前記トランスジェニック生物、［４９］から［５３］のいずれか１つの前記油料種子植物、［５４］の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、［４９］もしくは［５６］の前記植物部分、［５７］の前記種子、［６６］の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、［７２］の前記種子ミール、または［７３］の組成物を含む家畜飼料、化粧品、または化学物質。
［７５］
家畜飼料を産生する方法であって、
１またはそれ以上の、［１］から［９］、［２９］、もしくは［５９］のいずれか１つの前記脂質もしくはオイル、［６２］の前記脂肪酸、［３０］から［３７］のいずれか１つの前記遺伝子コンストラクト、［３８］の前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチド、［３９］もしくは［４０］の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、［４１］から［４６］、もしくは５５］のいずれか１つの前記細胞、［４７］もしくは［４８］の前記トランスジェニック生物、［４９］から［５３］のいずれか１つの前記油料種子植物、［５４］の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、［４９］もしくは［５６］の前記植物部分、［５７］の前記種子、［６６］の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、［７２］の前記種子ミール、または［７３］の前記組成物を、少なくとも１つの他の食品原料成分と混合することを含む、方法。
［７６］
ＰＵＦＡから利益を得る、症状を治療または防止する方法であって、
対象に、１またはそれ以上の、［１］から［９］、［２９］、もしくは［５９］のいずれか１つの前記脂質もしくはオイル、［６２］の前記脂肪酸、［３０］から［３７］のいずれか１つの前記遺伝子コンストラクト、［３８］の前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチド、［３９］もしくは［４０］の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、［４１］から［４６］、もしくは［５５］のいずれか１つの前記細胞、［４７］もしくは［４８］の前記トランスジェニック生物、［４９］から［５３］のいずれか１つの前記油料種子植物、［５４］の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、［４９］もしくは［５６］の前記植物部分、［５７］の前記種子、［６６］の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、［７２］の前記種子ミール、［７３］の前記組成物、または［７４］の前記家畜飼料、を投与することを含む、方法。
［７７］
前記症状は、心不整脈、血管形成、炎症、喘息、乾せん、骨粗鬆症、腎結石、ＡＩＤＳ、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、統合失調症、癌、胎児性アルコール症候群、注意欠陥多動性障害、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、単極性うつ病、攻撃的な敵意（aggressive hostility）、副腎白質ジストロフィー（adrenoleukodystophy）、冠動脈心疾患、高血圧、糖尿病、肥満、アルツハイマー病、慢性閉塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎、血管形成後の再狭窄、湿疹、血圧上昇、血小板凝集、消化管出血、子宮内膜症、月経前症候群、筋痛性脳脊髄炎、ウイルス感染後の慢性疲労、または眼性疾患である、［７６］の方法。
［７８］
ＰＵＦＡから利益を得る、症状を治療または防止するための薬剤の製造のために、１またはそれ以上の、［１］から［９］、［２９］、もしくは［５９］のいずれか１つの前記脂質もしくはオイル、［６２］の前記脂肪酸、［３０］から［３７］のいずれか１つの前記遺伝子コンストラクト、［３８］の前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチド、［３９］もしくは［４０］の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、［４１］から［４６］、もしくは５５のいずれか１つの前記細胞、［４７］もしくは［４８］の前記トランスジェニック生物、［４９］から［５３］のいずれか１つの前記油料種子植物、［５４］の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、［４９］もしくは［５６］の前記植物部分、［５７］の前記種子、［６６］の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、［７２］の前記種子ミール、［７３］の前記組成物、または［７４］の前記家畜飼料、の使用。
［７９］
［５６］、［５７］、または［６６］のいずれか１つの種子を得ることと、金銭的利益のために得られた前記種子を取引することとを含む、種子を取引する方法。
［８０］
前記種子を得ることは、［４８］から［５４］、または［６６］のいずれか１つの前記植物を栽培すること、および／または前記植物から前記種子を収穫することを含む、［７９］の方法。
［８１］
前記種子を得ることは、コンテナに前記種子を配置すること、および／または前記種子を保存することをさらに含む、［８０］の方法。
［８２］
前記種子を得ることは、前記種子を異なる場所に運ぶことをさらに含む、［７９］から［８１］のいずれか１つの方法。
［８３］
前記取引することは、コンピュータのような電子的手段を用いて行われる、［７９］から［８２］のいずれか１つの方法。
［８４］
ａ）［５６］、［５７］、または［６６］のいずれか１つに定義された種子を含む植物の地上部分を刈り取り、並べ、および／または収穫することと、
ｂ）前記植物部分の残りから前記種子を分離するために、前記植物の前記一部を脱穀し、および／または選り分けることと、
ｃ）工程ｂ）で分離された前記種子をふるいにかけおよび／またはソートすること、および容器内に前記ふるいにかけられたおよび／またはソートされた種子をロードすることにより、種子の入った容器を産生することを含む、種子の入った容器を産生するプロセス。
［８５］
多価不飽和脂肪酸のエチルエステルを産生するためのプロセスであって、
抽出植物脂質におけるトリアシルグリセロールをエステル交換することを含み、前記抽出植物脂質は、エステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに任意に１またはそれ以上のステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルが約７％から２０％であり、これにより前記エチルエステルを産生する、プロセス。
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月18日(2020.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抽出された植物オイルを産生するためのプロセスであって、
Ａ）オイルを含むセイヨウアブラナまたはシロイヌナズナの種子を得る工程であって、
前記オイルが
（ａ）オレイン酸を含む総一価不飽和脂肪酸含有量、
（ｂ）パルミチン酸、および存在する場合、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）を含む総飽和脂肪酸含有量、
（ｃ）リノール酸（ＬＡ）およびγ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ならびに存在する場合、アラキドン酸（ＡＲＡ）を含む総ω６脂肪酸含有量、
（ｄ）α−リノレン酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含む総ω３脂肪酸含有量、
を含む総脂肪酸含有量を含み、
（ｉ）ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡ、ならびに所望によりＡＲＡ、がそれぞれ総脂肪酸含有量におけるレベルで存在し、各レベルが総脂肪酸含有量のパーセンテージとして示され、それにより前記オイル中のＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡのレベルの合計が、総脂肪酸含有量の７重量％と２５重量％との間であり、
（ｉｉ）ＤＨＡがトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化されており、ＴＡＧの形態でエステル化されているＤＨＡの少なくとも７０重量％が、ＴＡＧのｓｎ−１またはｓｎ−３の位置でエステル化されており、
（ｉｉｉ）パルミチン酸が、前記オイルにおいて、総脂肪酸含有量の２重量％から１６重量％の間のレベルで存在し、
（ｉｖ）オレイン酸が、前記オイルにおいて、総脂肪酸含有量の１重量％から６０重量％の間のレベルで存在し、
（ｖ）ＬＡが、前記オイルにおいて、総脂肪酸含有量の４重量％から３５重量％の間のレベルで存在し、
（ｖｉ）ＧＬＡが、前記オイルにおいて、総脂肪酸含有量の４重量％未満のレベルで存在し、
（ｖｉｉ）前記オイルの総飽和脂肪酸含有量が、総脂肪酸含有量の４重量％から２５重量％の間であり、
（ｖｉｉｉ）前記オイルの総ω６脂肪酸含有量の総ω３脂肪酸含有量に対する比が０．１から３．０の間であり、
（ｉｘ）ミリスチン酸が、存在する場合、総脂肪酸含有量の１重量％未満のレベルで存在し、
（ｘ）エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）が、存在する場合、総脂肪酸含有量の４重量％未満のレベルで存在する、工程と、
Ｂ）植物部分からオイルを抽出する工程とを含む、プロセス。
【請求項２】
γ‐リノレン酸（ＧＬＡ）が、前記オイルにおいて、総脂肪酸含有量の２重量%未満のレベルで存在する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
オレイン酸が、前記オイルにおいて、総脂肪酸含有量の３重量％から３０重量％の間または２７重量％から３０重量％の間のレベルで存在する、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
総ω３脂肪酸含有量中に新ω３脂肪酸を含み、総ω６脂肪酸含有量中に新ω６脂肪酸を含み、前記オイル中の前記新ω６脂肪酸の前記新ω３脂肪酸に対する比が０．１から１の間である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＨＡの少なくとも８０重量％が、前記ＴＡＧのｓｎ‐１またはｓｎ‐３の位置にある、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
ＳＤＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡがそれぞれ総脂肪酸含有量におけるレベルで存在し、各レベルが総脂肪酸含有量のパーセンテージとして示され、それによりＳＤＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡのパーセンテージの合計によって除したＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡのパーセンテージの合計がパーセンテージで表すと少なくとも７５重量％である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡがそれぞれ総脂肪酸含有量におけるレベルで存在し、各レベルが総脂肪酸含有量のパーセンテージで示され、それによりＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡのパーセンテージの合計によって除したＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡのパーセンテージの合計がパーセンテージで表すと７０重量％から９８重量％の間である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
ＤＨＡが、総脂肪酸含有量の２．７重量％〜３．３重量％のレベルで前記オイル中に存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項９】
ＤＨＡが、総脂肪酸含有量の７重量％から２０重量％の間のレベルで前記オイル中に存在する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記オイルを処理して、ＤＨＡのレベルを前記総脂肪酸含有量のパーセンテージとして増加することをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記処理がエステル交換反応を含む、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
多価不飽和脂肪酸のエチルエステルを産生するためのプロセスであって、前記方法がセイヨウアブラナまたはシロイヌナズナの種子から抽出されたオイル中のトリアシルグリセロールにおける脂肪酸のエステル交換することを含み、
前記抽出されたオイルが
（ａ）オレイン酸を含む総一価不飽和脂肪酸含有量、
（ｂ）パルミチン酸、および存在する場合、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）を含む総飽和脂肪酸含有量、
（ｃ）リノール酸（ＬＡ）およびγ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ならびに存在する場合、アラキドン酸（ＡＲＡ）を含む総ω６脂肪酸含有量、
（ｄ）α−リノレン酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含む総ω３脂肪酸含有量、
を含む総脂肪酸含有量を含み、
（ｉ）ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡ、ならびに所望によりＡＲＡ、がそれぞれ総脂肪酸含有量におけるレベルで存在し、各レベルが総脂肪酸含有量のパーセンテージとして示され、それにより前記抽出されたオイル中のＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡのレベルの合計が、総脂肪酸含有量の７重量％と２５重量％との間であり、
（ｉｉ）ＤＨＡがトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化されており、ＴＡＧの形態でエステル化されているＤＨＡの少なくとも７０重量％が、ＴＡＧのｓｎ−１またはｓｎ−３の位置でエステル化されており、
（ｉｉｉ）パルミチン酸が、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の２重量％から１６重量％の間のレベルで存在し、
（ｉｖ）オレイン酸が、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の１重量％から６０重量％の間のレベルで存在し、
（ｖ）ＬＡが、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の４重量％から３５重量％の間のレベルで存在し、
（ｖｉ）ＧＬＡが、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の４重量％未満のレベルで存在し、
（ｖｉｉ）前記抽出されたオイルの総飽和脂肪酸含有量が、総脂肪酸含有量の４重量％から２５重量％の間であり、
（ｖｉｉｉ）前記抽出されたオイルの総ω６脂肪酸含有量の総ω３脂肪酸含有量に対する比が０．１から３．０の間であり、
（ｉｘ）ミリスチン酸が、存在する場合、総脂肪酸含有量の１重量％未満のレベルで存在し、
（ｘ）エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）が、存在する場合、総脂肪酸含有量の４重量％未満のレベルで存在し、
それにより、前記エチルエステルを産生する、プロセス。
【請求項１３】
セイヨウアブラナまたはシロイヌナズナの種子から抽出されたオイルを含む組成物であって、前記オイルが
（ａ）オレイン酸を含む総一価不飽和脂肪酸含有量、
（ｂ）パルミチン酸、および存在する場合、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）を含む総飽和脂肪酸含有量、
（ｃ）リノール酸（ＬＡ）およびγ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ならびに存在する場合、アラキドン酸（ＡＲＡ）を含む総ω６脂肪酸含有量、
（ｄ）α−リノレン酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含む総ω３脂肪酸含有量、
を含む総脂肪酸含有量を含み、
（ｉ）ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡ、ならびに所望によりＡＲＡ、がそれぞれ総脂肪酸含有量におけるレベルで存在し、各レベルが総脂肪酸含有量のパーセンテージとして示され、それにより前記抽出されたオイル中のＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡのレベルの合計が、総脂肪酸含有量の７重量％と２５重量％との間であり、
（ｉｉ）ＤＨＡがトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化されており、ＴＡＧの形態でエステル化されているＤＨＡの少なくとも７０重量％が、ＴＡＧのｓｎ−１またはｓｎ−３の位置でエステル化されており、
（ｉｉｉ）パルミチン酸が、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の２重量％から１６重量％の間のレベルで存在し、
（ｉｖ）オレイン酸が、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の１重量％から６０重量％の間のレベルで存在し、
（ｖ）ＬＡが、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の４重量％から３５重量％の間のレベルで存在し、
（ｖｉ）ＧＬＡが、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の４重量％未満のレベルで存在し、
（ｖｉｉ）前記抽出されたオイルの総飽和脂肪酸含有量が、総脂肪酸含有量の４重量％から２５重量％の間であり、
（ｖｉｉｉ）前記抽出されたオイルの総ω６脂肪酸含有量の総ω３脂肪酸含有量に対する比が０．１から３．０の間であり、
（ｉｘ）ミリスチン酸が、存在する場合、総脂肪酸含有量の１重量％未満のレベルで存在し、
（ｘ）エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）が、存在する場合、総脂肪酸含有量の４重量％未満のレベルで存在する、組成物。
【請求項１４】
セイヨウアブラナまたはシロイヌナズナの種子から抽出されたオイルを含む食料品、化粧品または化学物質であって、前記オイルが
（ａ）オレイン酸を含む総一価不飽和脂肪酸含有量、
（ｂ）パルミチン酸、および存在する場合、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）を含む総飽和脂肪酸含有量、
（ｃ）リノール酸（ＬＡ）およびγ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ならびに存在する場合、アラキドン酸（ＡＲＡ）を含む総ω６脂肪酸含有量、
（ｄ）α−リノレン酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含む総ω３脂肪酸含有量、
を含む総脂肪酸含有量を含み、
（ｉ）ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡ、ならびに所望によりＡＲＡ、がそれぞれ総脂肪酸含有量におけるレベルで存在し、各レベルが総脂肪酸含有量のパーセンテージとして示され、それにより前記抽出されたオイル中のＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡのレベルの合計が、総脂肪酸含有量の７重量％と２５重量％との間であり、
（ｉｉ）ＤＨＡがトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化されており、ＴＡＧの形態でエステル化されているＤＨＡの少なくとも７０重量％が、ＴＡＧのｓｎ−１またはｓｎ−３の位置でエステル化されており、
（ｉｉｉ）パルミチン酸が、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の２重量％から１６重量％の間のレベルで存在し、
（ｉｖ）オレイン酸が、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の１重量％から６０重量％の間のレベルで存在し、
（ｖ）ＬＡが、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の４重量％から３５重量％の間のレベルで存在し、
（ｖｉ）ＧＬＡが、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の４重量％未満のレベルで存在し、
（ｖｉｉ）前記抽出されたオイルの総飽和脂肪酸含有量が、総脂肪酸含有量の４重量％から２５重量％の間であり、
（ｖｉｉｉ）前記抽出されたオイルの総ω６脂肪酸含有量の総ω３脂肪酸含有量に対する比が０．１から３．０の間であり、
（ｉｘ）ミリスチン酸が、存在する場合、総脂肪酸含有量の１重量％未満のレベルで存在し、
（ｘ）エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）が、存在する場合、総脂肪酸含有量の４重量％未満のレベルで存在する、食料品、化粧品または化学物質。
【請求項１５】
食料品を産生する方法であって、前記方法が抽出されたオイルを少なくとも１つの他の食品原料成分と混合することを含み、前記抽出されたオイルがセイヨウアブラナまたはシロイヌナズナの種子由来のものであり、前記オイルが
（ａ）オレイン酸を含む総一価不飽和脂肪酸含有量、
（ｂ）パルミチン酸、および存在する場合、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）を含む総飽和脂肪酸含有量、
（ｃ）リノール酸（ＬＡ）およびγ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ならびに存在する場合、アラキドン酸（ＡＲＡ）を含む総ω６脂肪酸含有量、
（ｄ）α−リノレン酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含む総ω３脂肪酸含有量、
を含む総脂肪酸含有量を含み、
（ｉ）ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡ、ならびに所望によりＡＲＡ、がそれぞれ総脂肪酸含有量におけるレベルで存在し、各レベルが総脂肪酸含有量のパーセンテージとして示され、それにより前記抽出されたオイル中のＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡのレベルの合計が、総脂肪酸含有量の７重量％と２５重量％との間であり、
（ｉｉ）ＤＨＡがトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化されており、ＴＡＧの形態でエステル化されているＤＨＡの少なくとも７０重量％が、ＴＡＧのｓｎ−１またはｓｎ−３の位置でエステル化されており、
（ｉｉｉ）パルミチン酸が、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の２重量％から１６重量％の間のレベルで存在し、
（ｉｖ）オレイン酸が、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の１重量％から６０重量％の間のレベルで存在し、
（ｖ）ＬＡが、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の４重量％から３５重量％の間のレベルで存在し、
（ｖｉ）ＧＬＡが、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の４重量％未満のレベルで存在し、
（ｖｉｉ）前記抽出されたオイルの総飽和脂肪酸含有量が、総脂肪酸含有量の４重量％から２５重量％の間であり、
（ｖｉｉｉ）前記抽出されたオイルの総ω６脂肪酸含有量の総ω３脂肪酸含有量に対する比が０．１から３．０の間であり、
（ｉｘ）ミリスチン酸が、存在する場合、総脂肪酸含有量の１重量％未満のレベルで存在し、
（ｘ）エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）が、存在する場合、総脂肪酸含有量の４重量％未満のレベルで存在する、方法。
【請求項１６】
多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）から利益を得る、症状を治療または防止するするための医薬の製造のためのオイルの使用であって、前記オイルがセイヨウアブラナまたはシロイヌナズナの種子から抽出されたものであり、前記オイルが
（ａ）オレイン酸を含む総一価不飽和脂肪酸含有量、
（ｂ）パルミチン酸、および存在する場合、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）を含む総飽和脂肪酸含有量、
（ｃ）リノール酸（ＬＡ）およびγ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ならびに存在する場合、アラキドン酸（ＡＲＡ）を含む総ω６脂肪酸含有量、
（ｄ）α−リノレン酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含む総ω３脂肪酸含有量、
を含む総脂肪酸含有量を含み、
（ｉ）ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡ、ならびに所望によりＡＲＡ、がそれぞれ総脂肪酸含有量におけるレベルで存在し、各レベルが総脂肪酸含有量のパーセンテージとして示され、それにより前記抽出されたオイル中のＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡのレベルの合計が、総脂肪酸含有量の７重量％と２５重量％との間であり、
（ｉｉ）ＤＨＡがトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化されており、ＴＡＧの形態でエステル化されているＤＨＡの少なくとも７０重量％が、ＴＡＧのｓｎ−１またはｓｎ−３の位置でエステル化されており、
（ｉｉｉ）パルミチン酸が、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の２重量％から１６重量％の間のレベルで存在し、
（ｉｖ）オレイン酸が、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の１重量％から６０重量％の間のレベルで存在し、
（ｖ）ＬＡが、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の４重量％から３５重量％の間のレベルで存在し、
（ｖｉ）ＧＬＡが、前記抽出されたオイルにおいて、総脂肪酸含有量の４重量％未満のレベルで存在し、
（ｖｉｉ）前記抽出されたオイルの総飽和脂肪酸含有量が、総脂肪酸含有量の４重量％から２５重量％の間であり、
（ｖｉｉｉ）前記抽出されたオイルの総ω６脂肪酸含有量の総ω３脂肪酸含有量に対する比が０．１から３．０の間であり、
（ｉｘ）ミリスチン酸が、存在する場合、総脂肪酸含有量の１重量％未満のレベルで存在し、
（ｘ）エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）が、存在する場合、総脂肪酸含有量の４重量％未満のレベルで存在する、使用。
【請求項１７】
以下のセットの酵素：
ｉ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、または
ｖｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、  の１つをコードする、外因性ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、
各ポリヌクレオチドは、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができるように、１またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合される、宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１７に記載の細胞を含む、トランスジェニック非ヒト生物、好ましくはトランスジェニック植物。
【請求項１９】
ａ）その種子における脂質であって、該脂質がエステル化形態における脂肪酸を含み、および
ｂ）以下のセットの酵素：
ｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、真菌のω３‐デサチュラーゼ、および／または真菌のΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、または
ｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、真菌のω３‐デサチュラーゼ、および／もしくは真菌のΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、の１つをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、  各ポリヌクレオチドは、前記植物の種子を発生する場合に、前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができるように１またはそれ以上の種子特異的プロモーターを操作可能に結合され、
前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）およびγ‐リノレン酸（ＧＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ならびに任意にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および／またはエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、
前記脂質の前記総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは２％から１６％の間であり、前記脂質の前記総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは１％未満である、油料種子植物。
【請求項２０】
ＤＨＡを含む種子を産生することができるセイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバ植物であって、
前記植物の成熟した、収穫された種子は、１グラムの種子あたり少なくとも約２８ｍｇ、好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約３２ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約３６ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約４４ｍｇ、または１グラムの種子あたり少なくとも約４８ｍｇのＤＨＡ含有量を有する植物。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のプロセスで使用され得るオイルを含む、植物部分、好ましくは種子。
【請求項２２】
ＤＨＡおよび重量で約４％から約１５％の間の水分含有量を含む、成熟した、収穫されたセイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバ種子であって、
前記種子の前記ＤＨＡの含有量は、１グラムの種子あたり少なくとも約２８ｍｇ、好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約３２ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約３６ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約４４ｍｇ、または１グラムの種子あたり少なくとも約４８ｍｇである、種子。
【請求項２３】
種子を産生する方法であって、
ａ）好ましくは少なくとも１０００のこのような植物の個体群の一部としてのフィールドで、またはスタンダードな栽植密度で栽植される少なくとも１ヘクタールのエリアで、請求項１９の植物、または請求項２１に定義される部分を産生する植物を成長させることと、
ｂ）前記植物の１つまたは複数から種子を収穫することと、
ｃ）任意に、前記種子からオイルを抽出して、好ましくは、少なくとも６０ｋｇＤＨＡ／ヘクタールの総ＤＨＡ収率を有するオイルを産生することと、
を含む、方法。
【外国語明細書】
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