(57)【要約】      （修正有）【課題】網膜疾患を治療する方法の提供。【解決手段】活性血漿カリクレイン（たとえばヒト血漿カリクレイン）に特異的に結合する１つまたは複数の抗体を含む組成物の有効量を、その必要がある対象に投与することを含む方法。前記網膜疾患が、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、ぶどう膜炎、眼内炎、またはポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）からなる群から選択される。前記抗体は、ヒトのプレカリクレインに結合せず、ヒトのＰＫａｌの触媒ドメインに特異的に結合する。前記組成物が、硝子体内注射を介して投与される方法。【選択図】図１Ａ
2020079246.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の網膜疾患を治療する方法であって、
活性血漿カリクレイン（ＰＫａｌ）に特異的に結合する抗体を含む組成物の有効量を、その必要がある対象に投与すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記網膜疾患が、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、ぶどう膜炎、眼内炎、またはポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記網膜疾患が、糖尿病黄斑浮腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が、ヒトのプレカリクレインに結合しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、ヒトのＰＫａｌの触媒ドメインに特異的に結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、ヒトの活性ＰＫａｌの１つまたは複数のアミノ酸残基と相互作用し、かつ、ヒトのＰＫａｌの活性を少なくとも５０％阻害し、前記アミノ酸残基が、Ｖ４１０、Ｌ４１２、Ｔ４１３、Ａ４１４、Ｑ４１５、Ｒ４１６、Ｌ４１８、Ｃ４１９、Ｈ４３４、Ｃ４３５、Ｆ４３６、Ｄ４３７、Ｇ４３８、Ｌ４３９、Ｗ４４５、Ｙ４７５、Ｋ４７６、Ｖ４７７、Ｓ４７８、Ｅ４７９、Ｇ４８０、Ｄ４８３、Ｆ５２４、Ｅ５２７、Ｋ５２８、Ｙ５５２、Ｄ５５４、Ｙ５５５、Ａ５６４、Ｄ５７２、Ａ５７３、Ｃ５７４、Ｋ５７５、Ｇ５７６、Ｓ５７８、Ｔ５９６、Ｓ５９７、Ｗ５９８、Ｇ５９９、Ｅ６００、Ｇ６０１、Ｃ６０２、Ａ６０３、Ｒ６０４、Ｑ６０７、Ｐ６０８、Ｇ６０９、Ｖ６１０、およびＹ６１１からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、前記ヒトの活性ＰＫａｌのエピトープに結合し、前記エピトープが、
（ｉ）Ｖ４１０−Ｃ４１９、
（ｉｉ）Ｈ４３４−Ｌ４３９、
（ｉｉｉ）Ｙ４７５−Ｇ４８０、
（ｉｖ）Ｆ５２４−Ｋ５２８、
（ｖ）Ｙ５５２−Ｙ５５５、
（ｖｉ）Ｄ５７２−Ｓ５７８、
（ｖｉｉ）Ｔ５９６−Ｒ６０４、および
（ｖｉｉｉ）Ｑ６０７−Ｙ６１１
からなる群から選択されるセグメントを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、活性ＰＫａｌの活性を少なくとも８０％阻害する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が、約１ｎＭ未満の見かけ上のＫｉ（Ｋｉ，ａｐｐ）を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が、約０．１ｎＭ未満のＫｉ，ａｐｐを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が、約０．０５ｎＭ未満のＫｉ，ａｐｐを有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が、１０−６Ｍ未満の活性ＰＫａｌに関する結合親和性（ＫＤ）を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が、Ｒ５５１、Ｑ５５３、Ｙ５５５、Ｔ５５８、およびＲ５６０の位置で１つまたは複数の変異を含む活性ＰＫａｌの変異体と比較して、優先的に前記活性ＰＫａｌに結合する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が、相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、および相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域を含み、前記ＨＣ  ＣＤＲ３が、モチーフ
Ｘ９９Ｒ１００Ｘ１０１Ｇ１０２Ｘ１０３Ｐ１０４Ｒ１０５Ｘ１０６Ｘ１０７Ｘ１０８Ｘ１０９Ｘ１１０Ｘ１１１
を含み、ここで、
Ｘ９９がＲまたはＱであり、
Ｘ１０１がＴ、Ｉ、Ｒ、Ｓ、またはＰであり、
Ｘ１０３がＶ、Ｉ、またはＬであり、
Ｘ１０６がＲまたはＷであり、
Ｘ１０７がＤまたはＮであり、
Ｘ１０８がＡ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、またはＶであり、
Ｘ１０９がＦまたはＬであり、
Ｘ１１０がＤ、Ｅ、またはＮであり、および
Ｘ１１１が、Ｉ、Ｎ、Ｍ、またはＳである、
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｘ９９がＱであり、かつＸ１０１がＩ、Ｒ、Ｓ、またはＰである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｘ１０６がＷであり、かつＸ１１１がＮ、Ｍ、またはＳである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｘ１０１がＩであり、Ｘ１０８がＥであり、かつＸ１０３がＩまたはＬである、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
Ｘ１０１がＩであり、かつＸ１０３がＩまたはＬである、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
Ｘ１０３がＩまたはＬであり、かつＸ１１０がＤ、Ｅ、またはＮである、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記重鎖可変領域が、ＨＣ  ＣＤＲ１にＨ３１を含む、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記重鎖可変領域が、フレームワーク領域１（ＦＲ１）にＦ２７、Ｆ２９、またはその両方を含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体が、相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）、および相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域をさらに含む、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＬＣ  ＣＤＲ２が、Ｋ５０、Ｌ５４、Ｅ５５、Ｓ５６、またはその組み合わせを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記軽鎖可変領域が、フレームワーク領域３（ＦＲ３）にＧ５７をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記軽鎖可変が、フレームワーク領域２（ＦＲ２）にＮ４５を含む、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体が、ＤＸ−２９３０の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、およびＨＣ  ＣＤＲ３、ならびにＤＸ−２９３０の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が、ＤＸ−２９３０のＨＣ可変ドメインとＤＸ−２９３０のＬＣ可変ドメインとを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が、完全長の抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体がＦａｂである、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物が、硝子体内注射を介して投与される、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体がＤＸ−２９３０と同一のエピトープに結合し、またはＤＸ−２９３０と活性ＰＫａｌに関して競合する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載の重鎖可変領域とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載の軽鎖可変領域とを含むＦａｂである、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
網膜疾患の治療に使用するための医薬組成物であって、活性血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）に特異的に結合する抗体と薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項３５】
前記網膜疾患が、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、ぶどう膜炎、眼内炎、またはポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）である、請求項３４に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項３６】
網膜疾患の治療に使用するための薬剤の製造における、活性血漿カリクレイン（ＰＫａｌ）に特異的に結合する抗体の使用。
【請求項３７】
前記網膜疾患が、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、ぶどう膜炎、眼内炎、またはポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）である、請求項３６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１４年３月２７日に出願の米国特許仮出願番号第６１／９７１，１７０号の利益を主張するものであり、この文献全体は本明細書中参照として援用されている。
【背景技術】
【０００２】
網膜疾患は、中心視を提供する網膜領域に影響を及ぼす。多くの網膜疾患は共通の症状を共有するが、それぞれは固有の特徴を有する。
【０００３】
糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）は、糖尿病患者で起こる網膜血管の漏出により引き起こされる黄斑の腫脹である。ＤＭＥは、糖尿病性網膜症の人々における失明の主な原因である。糖尿病の人々が、その生涯のうちでＤＭＥを発症するリスクは１０％である。ＤＭＥは、２０年超にわたり糖尿病を患っている人では最大３０％に罹患する。治療しないままである場合、ＤＭＥは、中度〜重度の失明をもたらし得る。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、糖尿病黄斑浮腫および網膜疾患の動物モデルを、ＤＸ−２９４４、すなわち活性ＰＫａｌに結合するＦａｂ抗体で治療できることを示す試験に部分的に基づくものである。
【０００５】
本開示の一部の態様は、対象における、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞症、ぶどう膜炎、眼内炎、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、または黄斑浮腫を呈する他のいずれかの網膜疾患などの網膜疾患を治療する方法であって、その必要がある対象に活性血漿カリクレイン（Ｐｋａｌ）に特異的に結合する抗体を含む組成物の有効量を投与する（たとえば硝子体内注射、眼内注射、または皮下注射を介して投与する）ことを含む、方法に関する。
【０００６】
一部の実施形態では、抗体は、ヒトのプレカリクレインに結合しない。一部の実施形態では、抗体は、ヒトのＰＫａｌの触媒ドメインに特異的に結合する。一部の実施形態では、抗体は、ヒトの活性ＰＫａｌの１つまたは複数のアミノ酸残基と相互作用し、ヒトのＰＫａｌの活性を少なくとも５０％阻害する。１つまたは複数のアミノ酸残基は、Ｖ４１０、Ｌ４１２、Ｔ４１３、Ａ４１４、Ｑ４１５、Ｒ４１６、Ｌ４１８、Ｃ４１９、Ｈ４３４、Ｃ４３５、Ｆ４３６、Ｄ４３７、Ｇ４３８、Ｌ４３９、Ｗ４４５、Ｙ４７５、Ｋ４７６、Ｖ４７７、Ｓ４７８、Ｅ４７９、Ｇ４８０、Ｄ４８３、Ｆ５２４、Ｅ５２７、Ｋ５２８、Ｙ５５２、Ｄ５５４、Ｙ５５５、Ａ５６４、Ｄ５７２、Ａ５７３、Ｃ５７４、Ｋ５７５、Ｇ５７６、Ｓ５７８、Ｔ５９６、Ｓ５９７、Ｗ５９８、Ｇ５９９、Ｅ６００、Ｇ６０１、Ｃ６０２、Ａ６０３、Ｒ６０４、Ｑ６０７、Ｐ６０８、Ｇ６０９、Ｖ６１０、およびＹ６１１のうちの１つまたは複数であり得る。一部の実施形態では、抗体は、Ｖ４１０−Ｃ４１９、Ｈ４３４−Ｌ４３９、Ｙ４７５−Ｇ４８０、Ｆ５２４−Ｋ５２８、Ｙ５５２−Ｙ５５５、Ｄ５７２−Ｓ５７８、Ｔ５９６−Ｒ６０４、またはＱ６０７−Ｙ６１１のセグメントを含むエピトープに結合する。
【０００７】
一部の実施形態では、抗体は、活性ＰＫａｌの活性を少なくとも８０％阻害する。一部の実施形態では、抗体は、約１ｎＭ未満の見かけ上のＫｉ（Ｋｉ，ａｐｐ）を有する。一部の実施形態では、抗体は、約０．１ｎＭ未満のＫｉ，ａｐｐを有する。一部の実施形態では、抗体は、約０．０５ｎＭ未満のＫｉ，ａｐｐを有する。一部の実施形態では、抗体は、１０−６Ｍ未満の、活性ＰＫａｌの結合親和性（ＫＤ）を有する。一部の実施形態では、抗体は、Ｒ５５１、Ｑ５５３、Ｙ５５５、Ｔ５５８、およびＲ５６０の位置で１つまたは複数の変異を含む活性ＰＫａｌの変異体と比較して、優先的に活性ＰＫａｌに結合する。
【０００８】
一部の実施形態では、抗体は、相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、および相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域を含み、ここでは、ＨＣ  ＣＤＲ３はモチーフＸ９９Ｒ１００Ｘ１０１Ｇ１０２Ｘ１０３Ｐ１０４Ｒ１０５Ｘ１０６Ｘ１０７Ｘ１０８Ｘ１０９Ｘ１１０Ｘ１１１を含み、ここでＸ９９はＲまたはＱであり；Ｘ１０１はＴ、Ｉ、Ｒ、Ｓ、またはＰであり；Ｘ１０３はＶ、Ｉ、またはＬであり；Ｘ１０６はＲまたはＷであり；Ｘ１０７はＤまたはＮであり；Ｘ１０８はＡ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、またはＶであり；Ｘ１０９はＦまたはＬであり；Ｘ１１０はＤ、Ｅ、またはＮであり、およびＸ１１１はＩ、Ｎ、Ｍ、またはＳ（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１５）である。一部の実施形態では、Ｘ９９はＱであり、かつＸ１０１はＩ、Ｒ、Ｓ、またはＰである。一部の実施形態では、Ｘ１０６はＷであり、かつＸ１１１はＮ、Ｍ、またはＳである。一部の実施形態では、Ｘ１０１はＩであり、Ｘ１０８はＥであり、かつＸ１０３はＩまたはＬである。一部の実施形態では、Ｘ１０１はＩであり、かつＸ１０３はＩまたはＬである。一部の実施形態では、Ｘ１０３はＩまたはＬであり、かつＸ１１０はＤ、Ｅ、またはＮである。一部の実施形態では、重鎖可変領域はＨＣ  ＣＤＲ１にＨ３１を含む。一部の実施形態では、重鎖可変領域は、フレームワーク領域１（ＦＲ１）にＦ２７、Ｆ２９、またはその両方を含む。
【０００９】
一部の実施形態では、抗体は、相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）、および相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域をさらに含む。一部の実施形態では、ＬＣ  ＣＤＲ２は、Ｋ５０、Ｌ５４、Ｅ５５、Ｓ５６、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、フレームワーク領域３（ＦＲ３）にＧ５７をさらに含む。一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、フレームワーク領域２（ＦＲ２）にＮ４５またはＫ４５を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、抗体は、ＤＸ−２９４４と同じエピトープに結合するか、または活性ＰＫａｌへの結合に関してＤＸ−２９４４と競合する。このような抗体は、ＤＸ−２９３０の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、およびＨＣ  ＣＤＲ３、ならびにＤＸ−２９３０の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３を含み得る。一部の実施形態では、抗体は、ＤＸ−２９３０のＨＣ可変ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびＤＸ−２９３０のＬＣ可変ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を含む。一例では、抗体はＤＸ−２９４４である。
【００１１】
本明細書中記載される方法のいずれかでは、抗体は、完全長の抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。一部の実施形態では、抗体はＦａｂである。一部の実施形態では、抗体は、ヒトの抗体またはヒト化抗体である。
【００１２】
また、（ｉ）網膜疾患（たとえばＤＭＥ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、ぶどう膜炎、眼内炎、またはＰＣＶ）の治療に使用するための医薬組成物であって、活性ＰＫａｌに結合する１つまたは複数の抗体（たとえば本明細書中に記載される抗体）と薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物、ならびに（ｉｉ）網膜疾患の治療に使用する薬剤の製造のための、当該組成物または抗体の使用は、本開示の範囲内にある。
【００１３】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細を、以下の説明に記載する。本発明の他の特徴または利点は、以下の図面およびいくつかの実施形態の詳細な説明から、同様に添付の特許請求の範囲から明らかである。
【００１４】
以下の図面は、本明細書の一部を形成しており、本開示の特定の態様をさらに例証するよう含まれており、本明細書中に提示される特定の実施形態の詳細な説明と併用してこれれら図面の１つまたは複数を参照することにより、本開示の特定の態様を良好に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】抗ＶＥＧＦ抗体の眼内注射で治療した動物のフルオレセイン眼底血管造影シグナルの低下を示す（ｎ＝５、ｔ検定によりｐ＜０．０５）。
【図１Ｂ】ＤＸ−２９４４で治療した動物のシグナルの同様の低下を示す（ビヒクル群ではｎ＝３、試験対象群ではｎ＝４、ｔ検定によりｐ＜０．０５）。
【図２Ａ】ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットのレーザー誘発ＣＮＶ後のＮａＣｌのビヒクルで治療した眼の例示的な写真を示す。
【図２Ｂ】ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットのレーザー誘発ＣＮＶ後のＤＸ―２９４４で治療した眼の例示的な写真を示す。
【図３】親抗体Ｍ０１６２−Ａ０４の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（ＤＸ２９３０はこの親抗体由来である）、ならびに記載される対応する生殖系列のＶＨおよびＶＬ遺伝子とのそのアライメントを示す。生殖系列配列と比較したＭ０１６２−Ａ０４における変異を示す（太字）。図３の配列は、上から下の順で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６〜１８（軽鎖Ｖ遺伝子）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９〜２１に対応する。
【図４】ヒトの血漿カリクレインの触媒ドメインのアミノ酸配列を示す（完全長のヒトのＰＫａｌの残基３９１〜６３８）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）。太字および下線が引かれた残基は、以下の実施例２で考察される結晶構造により同定されたＤＸ２９３０のＦａｂフラグメントとの相互作用に関与する残基を指す。
【図５】Ｘ１３５−Ａ０１およびＸ１３５−Ａ０３（図５Ａ）、Ｍ１６２−Ａ０４およびＸ１３３−Ｂ０２（図５Ｂ）、Ｘ１３３−Ｄ０６およびＸ１３３−Ｆ１０（図５Ｃ）、ならびにＸ１３３−Ｇ０５およびＭ１９９−Ａ０８（図５Ｄ）を含む、ヒトのＰＫａｌに対する、Ｍ０１６２−Ａ０４由来の多くの抗体変異体の見かけ上のＫｉ（Ｋｉ，ａｐｐ）を示す一連のグラフである。
【図６】野生型のＰＫａｌおよび多くのＰＫａｌ変異体に対する変異体Ｘ１１５−Ｆ０２（以下の表２参照）の見かけ上のＫｉ（Ｋｉ，ａｐｐ）を示す一連のグラフである。
【図７Ａ】ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）細胞で産生される、多くのＰＫａｌ変異体のアミノ酸配列（触媒ドメイン）を示す。この配列は、上から下の順に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３〜２７に対応する。
【図７Ｂ】ピキア細胞で産生される、多くのＰＫａｌ変異体のアミノ酸配列（触媒ドメイン）を示す。この配列は、上から下の順に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３〜２７に対応する。
【図８】１５日目のｂｒｏｗｎ  ＮｏｒｗａｙラットにおけるレーザーＣＮＶに及ぼす、抗ＶＥＧＦ陽性対照と比較したＤＸ−２９４４の効果を示す。抗ＶＥＧＦ抗体の眼内注射で治療した動物で観察されたフルオレセイン眼底血管造影シグナルの低下は、ＤＸ−２９４４で治療した動物で観察されたシグナルの低下と同程度であった（ｎ＝７、ｔ検定によりｐ＜０．０５）。
【図９】２２日目のｂｒｏｗｎ  ＮｏｒｗａｙラットにおけるレーザーＣＮＶに及ぼす、抗ＶＥＧＦ陽性対照と比較したＤＸ−２９４４の効果を示す。抗ＶＥＧＦ抗体の眼内注射で治療した動物で観察されたフルオレセイン眼底血管造影シグナルの低下は、ＤＸ―２９４４で治療した動物で観察されたシグナルの低下と同程度であった（ｎ＝７、ｔ検定によりｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
何百万人もの人々が、眼後部内部を覆う繊細な組織層の損傷により脳へ光信号を送る能力が低下する網膜疾患のために様々な程度の失明に罹っている。網膜疾患は、遺伝子および年齢に関連する要因ならびに糖尿病などの他の疾患を含む様々な要因により引き起こされ得る。糖尿病性網膜症は、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病のいずれかの糖尿病を有する人に起こる病態である。糖尿病性網膜症は、高血糖により誘導される網膜の微小脈管構造への損傷の結果と考えられている。この損傷により、網膜の血管がより透過性となる。一部の例では、損傷した血管は、黄斑上に体液、タンパク質、および／または脂質を漏出し、黄斑の腫脹および肥厚を引き起こす。黄斑の腫脹および肥厚は、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）と呼ばれる。ＤＭＥの症状として、霧視、視覚のゆがみ、および視野の斑点（時に「飛蚊症」と呼ばれる）が挙げられる。
【００１７】
ＤＭＥの標準的な治療は、レーザー凝固である。この治療は、周辺視力および／または夜間視力の部分的な喪失を含む望ましくない副作用を有する。
【００１８】
本開示は、活性血漿カリクレイン（ＰＫａｌ）に結合する抗体がＤＭＥ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、ぶどう膜炎、眼内炎、またはＰＣＶなどの網膜疾患の動物モデルに治療上有効であることを示す試験に、部分的に基づくものである。よって、一部の態様では、本開示は、活性ＰＫａｌ（たとえばヒトの活性ＰＫａｌ）に結合できる抗体を使用して、ＤＭＥ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、ぶどう膜炎、眼内炎、またはＰＣＶなどの網膜疾患の治療のための組成物および方法に関する。
【００１９】
活性ＰＫａｌに結合する抗体
本開示は、活性ＰＫａｌ、たとえばＰＫａｌの触媒ドメインに特異的に結合する単離抗体を提供する。一部の実施形態では、本明細書中記載される抗体は、プレカリクレイン（たとえばヒトのプレカリクレイン）に結合しない。
【００２０】
血漿カリクレインは、接触相のセリンプロテアーゼ構成要素である（Ｓａｉｎｚ  Ｉ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ９８，  ７７−８３，  ２００７）。接触相は、異物もしくは陰性荷電表面に曝露されると、またはプロリルカルボキシペプチダーゼによって内皮細胞表面上で、第ＸＩＩａ因子により活性化される（Ｓａｉｎｚ  Ｉ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ９８，  ７７−８３，  ２００７）。血漿カリクレインの活性化は、第ＸＩＩ因子のフィードバック活性化を介して内因性の凝固を増幅し、炎症誘発性ノナペプチドであるブラジキニンの産生を介して炎症を亢進する。この循環における主要なキニノゲナーゼとして、血漿カリクレインは、脈管でのブラジキニン産生の主な原因である。
【００２１】
例示的な血漿カリクレイン配列は、ヒト、マウス、もしくはラットの血漿カリクレインアミノ酸配列、これら配列のうち１つと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列、または、それらのフラグメント、たとえば以下に提供される配列のフラグメントを含むことができる。
【００２２】
成熟したヒト血漿カリクレインの例示的な配列を、以下に示す（たとえば本明細書中参照として援用されるＴａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ．  Ｊ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２８０（４９）：  ４１０７７−４１０８９参照。この文献は本明細書中参照として援用される）。この例示的な配列は、同種の産物の産生を促進するために１つの変異（Ｓ４８４、太字）を含む。
【化１】
2020079246.tif 000003
【００２３】
第ＸＩＩａ因子は、単一の部位（Ａｒｇ３７１−Ｉｌｅ３７２の間、上記の配列中「／」により表されている切断部位）でポリペプチド配列を切断することによりプレカリクレインを活性化して、次に、２つのジスルフィド結合したポリペプチド：約５２ｋＤａの重鎖および約３４ｋＤａの触媒ドメインからなる、活性血漿カリクレインを生成する［Ｃｏｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍａｉｅｒ，  （１９９７）  “Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ：  Ａ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  Ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ，  Ｐｒｏｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ，  Ａｎｔｉａｄｈｅｓｉｖｅ，  ａｎｄ  Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ”  Ｂｌｏｏｄ，  ９０，  ３８１９−３８４３］。
【００２４】
例示的なヒト、マウス、およびラットのプレカリクレインのアミノ酸配列（シグナルペプチドを含む）を以下に示す。プレカリクレインの配列は、活性血漿カリクレイン（ＰＫａｌ）の１つのポリペプチド鎖が１つの位置（「／」により表されている）で切断されて２つの鎖を生成することを除き、血漿カリクレインと同一である。以下に提供される配列は、シグナル配列を含む完全な配列である。発現する細胞から分泌される際に、シグナル配列が除去されると予測される。
【化２】
2020079246.tif 000004
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【００２５】
抗体は、本明細書中に記載される方法、たとえば網膜疾患を治療する方法に使用され得る。本明細書中で使用される用語「単離抗体」は、天然に会合した分子、すなわち抗体を含む調製物の乾燥重量の最大２０％を構成する天然に会合した分子を実質的に含まない抗体を指す。純度は、たとえばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびＨＰＬＣといった何等かの適切な方法により測定することができる。一部の例では、本明細書中開示される抗体は、活性ＰＫａｌまたはそのエピトープに特異的に結合する。
【００２６】
標的またはエピトープに「特異的に結合する」（本明細書中互換可能に使用される）抗体は、この分野でよく知られた用語であり、このような特異的な結合を決定する方法もまた、当該分野でよく知られている。ある分子が、代替的な標的と反応するよりも特定の標的抗原と、より頻繁に、より迅速に、より長い期間、かつ／またはより高い親和性で反応または会合する場合に、この分子は「特異的結合」を示すと言われる。ある抗体が、他の物質に結合するよりも、高い親和性、結合活性で、より迅速に、かつ／またはより長い期間結合する場合、抗体は標的抗原に「特異的に結合する」。たとえば、ヒトの活性ＰＫａｌまたはそのエピトープに特異的に（または優先的に）結合する抗体は、他の抗原または同一の抗原の他のエピトープに結合するよりも、高い親和性、結合活性で、より容易に、かつ／またはより長い期間、この標的抗原に結合する抗体である。また、たとえば、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体は、第２の標的抗原に特異的または優先的に結合してもよく、または結合しなくてもよいことが、この定義を読むことによって理解される。同様に、「特異的結合」、または「優先的結合」は、必ずしも排他的結合を（含むことができるが）必要とするものではない。一般的に、必ずしも必要ではないが、結合という言及は、優先的な結合を意味する。
【００２７】
抗体（互換可能に複数形で使用される）は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合できる免疫グロブリン分子である。本明細書中使用されるように、用語「抗体」は、無傷の（すなわち完全長の）ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含むだけでなく、その抗原結合フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ジアボディ、線状抗体、一本鎖抗体、多重特異性抗体（たとえば二重特異性抗体）、ならびに抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体、および共有結合で修飾した抗体を含む、必要とされる特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他のいずれかの改変した立体配置をも含む。抗体は、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭなどのいずれかのクラス（またはそのサブクラス）の抗体を含むが、抗体は、いずれかの特定のクラスである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを、異なるクラスに割り当てることができる。５つの主要な免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、ミュー、と呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置はよく知られている。
【００２８】
また、本明細書中に記載される抗体は、ＰＫａｌの活性を阻害し得る。一部の例では、本明細書中に記載される抗体は、少なくとも５０％、たとえば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上、ＰＫａｌの活性を阻害することができる。阻害定数（Ｋｉ）は、阻害剤の効力の測定値を提供し、酵素活性を半減させるために必要な阻害剤の濃度であり、酵素または基質の濃度に依存するものではない、抗ＰＫａｌ抗体の阻害活性は、以下の実施例３に記載される方法などの定例的な方法により決定することができる。
【００２９】
一部の例では、抗ＰＫａｌ抗体の阻害活性は、見かけ上のＫｉ（Ｋｉ，ａｐｐ）値により決定される。反応（たとえば酵素活性）の程度に及ぼす抗体の異なる濃度の阻害作用を測定することと、阻害剤の濃度の関数としての擬一次速度定数の変化をモリソン式（式１）に適合させることとにより、異なる基質濃度で得た抗体のＫｉ，ａｐｐ値により、見かけ上のＫｉ値の推定値が得られる。競合的阻害剤の場合、Ｋｉは、Ｋｉ，ａｐｐ対基質濃度のプロットの線形回帰解析から抽出したｙ切片から得られる。
【数１】
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【００３０】
一部の例では、本明細書中記載される抗ＰＫａｌ抗体は、１ｎＭ未満、たとえば０．５ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０１ｎＭ、またはそれより低いＫｉ，ａｐｐ値を有する。抗体のＫｉ，ａｐｐ値は、当該分野で知られた方法および本明細書中に記載される方法（実施例２）に従って推定することができる。
【００３１】
本明細書中記載される抗体は、マウス、ラット、ヒト、または他のいずれかを起源とすることができる（キメラ抗体またはヒト化抗体を含む）。一部の例では、抗体は、免疫学的に不活性である定常領域などの改変した定常領域を含み、たとえば、補体を媒介した溶解を引き金とせず、または抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激するものではない。ＡＤＣＣ活性は、米国特許第５，５００，３６２号に開示される方法を使用して評価することができる。他の実施形態では、定常領域は、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （１９９９）  ２９：２６１３−２６２４；国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１号；および／または英国特許出願番号第９８０９９５１．８号に記載されるように改変されている。
【００３２】
本明細書中に記載される抗体のいずれかは、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得る。「モノクローナル抗体」は、均一な抗体集団を指し、「ポリクローナル抗体」は、不均一な抗体集団を指す。これら２つの用語は、抗体の供給源または抗体を作製する方法を限定するものではない。
【００３３】
一例では、本明細書中記載される方法で使用される抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒトの免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む、特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその抗原結合フラグメントである非ヒト（たとえばマウスの）抗体の形態を指す。たいていの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒトの種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基により置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）は、対応する非ヒト残基により置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体または移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されないが、抗体の性能をさらに改良かつ最適化するために含まれる残基を含み得る。一般的に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、かつＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒトの免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲ領域である、少なくとも１つ、典型的に２つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。また、ヒト化抗体は、最適には、典型的にヒト免疫グロブリンの、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。抗体は、国際公開公報第９９／５８５７２号に記載されるように改変されたＦｃ領域を有し得る。ヒト化抗体の他の形態は、本来の抗体に関して変化している１つまたは複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つのＣＤＲ）を有しており、これらはまた、本来の抗体由来の１つまたは複数のＣＤＲに「由来する」１つまたは複数のＣＤＲとも呼ばれる。ヒト化抗体はまた、親和性成熟を伴い得る。
【００３４】
別の例では、本明細書中に記載される抗体は、ヒト抗体由来の重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含み得るキメラ抗体である。キメラ抗体は、第１の種由来の可変領域または可変領域の一部と、第２の種由来の定常領域とを有する抗体を指す。典型的に、これらのキメラ抗体では、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、１つの種の哺乳類（たとえばマウス、ウサギ、およびラットなどの非ヒトの哺乳類）由来の抗体の可変領域を模倣するが、定常部分はヒトなどの別の哺乳類に由来する抗体の配列と相同である。一部の実施形態では、アミノ酸の改変は、可変領域および／または定常領域で行うことができる。
【００３５】
一部の実施形態では、本明細書中に記載される抗ＰＫａｌ抗体は、ＰＫａｌまたはその触媒ドメインに対して適切な結合親和性を有する。本明細書中使用されるように、「結合親和性」は、見かけ上の結合定数またはＫＡを指す。ＫＡは、解離定数（ＫＤ）の逆数である。本明細書中記載される抗体は、少なくとも１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０Ｍ、またはそれより低い結合親和性（ＫＤ）を有し得る。結合親和性の増加は、ＫＤの減少に対応する。第２の標的と比較して第１の標的に対する抗体の親和性結合が高いことは、第２の標的の結合に関するＫＡ（または数値ＫＤ）よりも第１の標的の結合に関するＫＡが高いこと（またはより小さい数値のＫＤ）により示すことができる。このような場合、抗体は、第２の標的（たとえば第２の立体構造の同じタンパク質またはその模倣体、または第２のタンパク質）と比較して、第１の標的（たとえば第１の立体構造のタンパク質またはその模倣体）に関して特異性を有する。結合親和性の差異（たとえば特異性または他の比較に関する差異）は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７．５、５０、７０、８０、９１、１００、５００、１０００、１０，０００または１０５倍であり得る。
【００３６】
結合親和性は、平衡透析、平衡結合、ゲルろ過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または分光法（たとえば蛍光アッセイを使用する）を含む様々な方法により決定することができる。結合親和性を評価する例示的な条件は、ＨＢＳ―Ｐ緩衝剤（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）中である。これらの技術を使用して、標的タンパク質濃度の関数として結合した結合タンパク質濃度を測定できる。結合した結合タンパク質の濃度（［Ｂｏｕｎｄ］）は、以下の式
（数２）
［Ｂｏｕｎｄ］＝［Ｎ］［Ｆｒｅｅ］／（Ｋｄ＋［Ｆｒｅｅ］）
により、遊離の標的タンパク質濃度（［Ｆｒｅｅ］）および標的上の結合タンパク質の結合部位の濃度に関連しており、式中の（Ｎ）は、標的分子あたりの結合部位の数である。
【００３７】
しかしながら、ＫＡを正確に決定することは必ずしも必要ではなく、その理由は、場合によってたとえばＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ解析などの方法を使用して決定した親和性の定量的測定値がＫＡに比例するため、この測定値を得ることで十分であり、よってたとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイなどの機能的アッセイでの活性により、親和性の定量的測定値を得るために、または親和性の推定値を得るために、より高い親和性がたとえば２倍高いかどうかを決定することなどの比較に用いることができる。
【００３８】
一部の実施形態では、抗ＰＫａｌ抗体は、ＤＸ−２９３０の重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは重鎖および軽鎖可変領域を含む。ＤＸ−２９３０の完全長の重鎖および軽鎖の配列を以下に示す。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの配列もまた、以下に示す。ＤＸ−２９３０のＣＤＲの配列を、表１に示す。
【化３】
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【表１】
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【００３９】
一部の実施形態では、抗ＰＫａｌ抗体は、ＤＸ−２９３０の同じＣＤＲまたは重鎖および軽鎖可変領域を含むＦａｂである。たとえば、以下の実施例１に記載されるＤＸ−２９４４は、ＤＸ−２９３０のＦａｂ部分である。
【００４０】
ＤＸ−２９３０は、親クローンＭ０１６２−Ａ０４に由来する完全にヒトのＩｇＧである。Ｍ０１６２−Ａ０４のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を、図３に示す。対応する生殖系列ＶＨ遺伝子（ＶＨ３＿３−２３）およびＶＬ遺伝子（ＶＫ１＿Ｌ１２）とのアライメントもまた、図３に示す。Ｍ０１６２−Ａ０４のＨＣ  ＣＤＲ３と比較して、ＤＸ−２９３０のＨＣ  ＣＤＲ３は、Ｔ１０１Ｉ、Ｉ１０３Ｖ、およびＡ１０８Ｅの変異を含む（以下の表３参照、ＤＸ−２９３０のＨＣ  ＣＤＲ３は、Ｍ０１９９−Ａ０８と同一である）。本開示において、Ｃｈｏｔｈｉａのナンバリングスキームを使用する。
ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／
【００４１】
以下の表２は、ＤＸ−２９３０、その親抗体Ｍ０１６２−Ａ０４、およびその変異体の構造情報を提供する。
【表２】
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【００４２】
ヒト血漿カリクレインにおける特異的残基を標的とする抗体
一部の実施形態では、活性ＰＫａｌに特異的に結合する抗体は、Ｖ４１０、Ｌ４１２、Ｔ４１３、Ａ４１４、Ｑ４１５、Ｒ４１６、Ｌ４１８、Ｃ４１９、Ｈ４３４、Ｃ４３５、Ｆ４３６、Ｄ４３７、Ｇ４３８、Ｌ４３９、Ｗ４４５、Ｙ４７５、Ｋ４７６、Ｖ４７７、Ｓ４７８、Ｅ４７９、Ｇ４８０、Ｄ４８３、Ｆ５２４、Ｅ５２７、Ｋ５２８、Ｙ５５２、Ｄ５５４、Ｙ５５５、Ａ５６４、Ｄ５７２、Ａ５７３、Ｃ５７４、Ｋ５７５、Ｇ５７６、Ｓ５７８、Ｔ５９６、Ｓ５９７、Ｗ５９８、Ｇ５９９、Ｅ６００、Ｇ６０１、Ｃ６０２、Ａ６０３、Ｒ６０４、Ｑ６０７、Ｐ６０８、Ｇ６０９、Ｖ６１０、および／またはＹ６１１を含む、ヒトのＰＫａｌの触媒ドメインにおける、１つまたは複数の残基（たとえば少なくとも３、５、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５個）と相互作用する（完全長のプレカリクレインアミノ酸配列に基づく数）。これら残基の位置を、図４に示す（太字および下線）。これらの残基は、以下の実施例２に記載される結晶構造に従って、ＤＸ−２９３０の１つまたは複数の残基と相互作用すると同定されている。
【００４３】
相互作用は、２つの結合パートナーにより形成された複合体における２つの残基間の距離が、所定の値よりも小さく、たとえば＜６Å、＜４Å、または＜２Åであることを意味する。たとえば、１つの結合パートナーにおいて相互作用する残基は、複合体化した構造上の他の結合パートナーの残基からの少なくとも１つの原子の所定の閾値内（たとえば＜６Å、＜４Å、または＜２Å）に少なくとも１つの原子を有し得る。相互作用は、実際の結合を必要とするものではない。相互作用する残基は、抗体の認識に関与すると示唆されている。
【００４４】
一部の実施形態では、本明細書中に記載される抗体は、上記に列挙した１つまたは複数の残基を含むエピトープでヒト活性ＰＫａｌに結合する。「エピトープ」は、Ｆａｂまたは完全長の抗体などの抗体が結合する標的化合物上の部位を指す。エピトープは、直線状であり得て、典型的に長さがアミノ酸６〜１５個である。あるいは、エピトープは、立体構造的であり得る。
【００４５】
一部の例では、本明細書中に記載される活性ＰＫａｌに特異的に結合する抗体は、以下のセグメント：Ｖ４１０−Ｃ４１９、Ｈ４３４−Ｌ４３９、Ｙ４７５−Ｇ４８０、Ｆ５２４−Ｋ５２８、Ｙ５５２−Ｙ５５５、Ｄ５７２−Ｓ５７８、Ｔ５９６−Ｒ６０４、またはＱ６０７−Ｙ６１１を含むエピトープに結合する。一部の例では、抗体（たとえば非ＤＸ−２９３０抗体）は、ＤＸ−２９３０と同じエピトープに結合するか、または活性ＰＫａｌへの結合に関してＤＸ−２９３０と競合する。
【００４６】
一部の例では、本明細書中に記載される抗ＰＫａｌ抗体は、Ｒ５５１、Ｑ５５３、Ｙ５５５、Ｔ５５８、およびＲ５６０のうちの１つまたは複数で変異を含む変異体、たとえば実施例４に記載の変異体２と比較して、野生型のＰＫａに優先的に結合する。このような抗体は、変異体と比較してより高い親和性で野生型のＰＫａｌに結合し得る（たとえば少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍以上）。あるいはまたはさらに、抗体は、変異体と比較して、野生型ＰＫａｌに対してより高い阻害活性を示す（たとえば少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍以上）。
【００４７】
他の例では、本明細書中に記載される抗ＰＫａｌ抗体は、野生型の活性ＰＫａｌおよびその機能的変異体に結合する。本抗体は、不活性な変異体との結合と比較して、活性ＰＫａｌに優先的に結合することができる。抗体は、プレカリクレインと比較して活性ＰＫａｌに優先的に結合することができる。
【００４８】
特異的なモチーフおよび／または残基を有する抗血漿カリクレイン抗体
一部の実施形態では、本明細書中に記載される抗ＰＫａｌ抗体は、ＶＨおよびＶＬを含み、そのそれぞれが、フレームワーク領域に隣接した３つのＣＤＲを含む（ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４；図３参照）。重鎖のＣＤＲ３は、モチーフ：Ｘ９９Ｒ１００Ｘ１０１Ｇ１０２Ｘ１０３Ｐ１０４Ｒ１０５Ｘ１０６Ｘ１０７Ｘ１０８Ｘ１０９Ｘ１１０Ｘ１１１であって、Ｘ９９がＲまたはＱであり、Ｘ１０１がＴ、Ｉ、Ｒ、Ｓ、またはＰであり、Ｘ１０３がＶ、Ｉ、またはＬであり、Ｘ１０６がＲまたはＷであり、Ｘ１０７がＤまたはＮであり、Ｘ１０８がＡ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、またはＶであり、Ｘ１０９がＦまたはＬであり、Ｘ１１０がＤ、Ｅ、またはＮであり、およびＸ１１１がＩ、Ｎ、Ｍ、またはＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）である、モチーフを含むことができる。一部の例では、Ｘ９９がＱであり、かつＸ１０１がＩ、Ｒ、Ｓ、またはＰである。あるいはまたはさらに、Ｘ１０６がＷであり、かつＸ１１１がＮ、Ｍ、またはＳである。他の例では、Ｘ１０１がＩであり、Ｘ１０８がＥであり、かつＸ１０３がＩまたはＬであり；またはＸ１０１がＩであり、かつＸ１０３がＩまたはＬである。さらなる他の例では、Ｘ１０３がＩまたはＬであり、かつＸ１１０がＤ、Ｅ、またはＮである。
【００４９】
さらに、このような抗ＰＫａｌ抗体は、本明細書中考察した結晶構造に基づき、ヒトのＰＫａｌの触媒ドメインとの相互作用に関与すると同定されている１つまたは複数の他の残基を含むことができる。これらの残基は、ＶＨまたはＶＬ鎖に位置することができる。例として、ＶＨのＦＲ１のＥ１、Ｖ２、Ｆ２７、Ｔ２８、Ｆ２９、およびＳ３０、ＨＣ  ＣＤＲ１のＨ３１；ＬＣ  ＣＤＲ１のＳ３１およびＷ３２、ＶＬ鎖のＦＲ１のＹ４９、ＬＣ  ＣＤＲ２のＫ５０、Ｔ５３、Ｌ５４、およびＥ５５、およびＳ５６、ならびにＶＬ鎖のＦＲ３のＧ５７およびＶ５８が挙げられる。
【００５０】
上述した抗ＰＫａｌ抗体は、フレームワークとして何等かの生殖系列の重鎖および軽鎖のＶ遺伝子を使用することができる。重鎖Ｖ遺伝子として、限定するものではないが、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ１−４５、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ１−５８、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ２−５、ＩＧＨＶ２−２６、ＩＧＨＶ２−７０、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−１３、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−４３、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−６４、ＩＧＨＶ３−６６、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ４−４、ＩＧＨＶ４−２８、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ４−６１、ＩＧＨＶ４−Ｂ、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ６−１、およびＩＧＨＶ７−４−１が挙げられる。
【００５１】
一部の例では、抗体は、κ軽鎖を使用する。軽鎖のＶＫ遺伝子として、限定するものではないが、ＩＧＫＶ１−０５、ＩＧＫＶ１−０６、ＩＧＫＶ１−０８、ＩＧＫＶ１−０９、ＩＧＫＶ１−１２、ＩＧＫＶ１−１３、ＩＧＫＶ１−１６、ＩＧＫＶ１−１７、ＩＧＫＶ１−２７、ＩＧＫＶ１−３３、ＩＧＫＶ１−３７、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ１Ｄ−１６、ＩＧＫＶ１Ｄ−１７、ＩＧＫＶ１Ｄ−４３、ＩＧＫＶ１Ｄ−８、ＩＧＫＶ２−２４、ＩＧＫＶ２−２８、ＩＧＫＶ２−２９、ＩＧＫＶ２−３０、ＩＧＫＶ２−４０、ＩＧＫＶ２Ｄ−２６、ＩＧＫＶ２Ｄ−２９、ＩＧＫＶ２Ｄ−３０、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＫＶ３Ｄ−０７、ＩＧＫＶ３Ｄ−１１、ＩＧＫＶ３Ｄ−２０、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＫＶ５−２、ＩＧＫＶ６−２１、およびＩＧＫＶ６Ｄ−４１のＶ遺伝子が挙げられる。他の例では、抗体はたとえばＩＧＬＶ１−ＩＧＬＶ１０のいずれかの、λ軽鎖を使用する。
【００５２】
また抗体は、いずれかの生殖系列重鎖Ｊセグメント（たとえば重鎖ＩＧＪＨ１−ＩＧＪＨ６）および軽鎖Ｊセグメント（たとえばＩＧＪＫ１、ＩＧＪＫ２、ＩＧＪＫ３、ＩＧＪＫ４、またはＩＧＪＫ５）を使用することもでき、これらのセグメントはＣ末端、Ｎ末端、またはその両方で欠失などの変異を受けることができる。
【００５３】
生殖系列抗体の遺伝子／セグメントの配列は、当該分野でよく知られている。たとえばｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ／ｖｂｓｔａｔ．ｐｈｐを参照されたい。
【００５４】
一部の例では、本明細書中記載される抗ＰＫａｌ抗体は、重鎖および／または軽鎖のフレームワークとしてＶＨ３＿３−２３および／またはＶＫ１＿Ｌ１２を使用する。これは、Ｍ０１６２−Ａ０４の対応するＣＤＲ領域と比較して、たとえば最大５、４、３、２、または１つのアミノ酸残基の変異を含むＭ０１６２−Ａ０４（図３）と実施的に類似のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、および／またはＨＣ  ＣＤＲ３、ならびにＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、および／またはＬＣ  ＣＤＲ３を含み得る。
【００５５】
他の例では、抗ＰＫａｌ抗体は、Ｍ０１６２−Ａ０４の対応するＶＨＣＤＲと少なくとも７５％（たとえば８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％）同一のＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ鎖、ならびにＭ０１６２−Ａ０４の対応するＶＬ  ＣＤＲと少なくとも７５％（たとえば８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％）同一のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ鎖を含む。
【００５６】
あるいは、抗ＰＫａｌ抗体は、Ｍ０１６２−Ａ０４のＶＨ鎖（成熟もしくは前駆体）と少なくとも７５％（たとえば８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％）同一のＶＨ鎖、および／またはＭ０１６２−Ａ０４のＶＬ鎖（成熟もしくは前駆体）と少なくとも７５％（たとえば８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％）同一のＶＬ鎖を含む。
【００５７】
２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７、  １９９３で改変されたｆ  Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８、  １９９０のアルゴリズムを使用して決定される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０，  １９９０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質の検索は、対象のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行うことができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１７）：３３８９−３４０２，  １９９７に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（たとえばＸＢＬＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを使用することができる。
【００５８】
一部の例では、たとえば、残基が結晶構造に基づきＰＫａｌとの相互作用に関与する可能性がないと決定された位置で、保存的変異をＭ０１６２−Ａ０４のＣＤＲに導入することができる。本明細書中で使用されるように、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸の置換を行うタンパク質の相対的な電荷または大きさの特徴を変えることのないアミノ酸置換を指す。変異体は、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９，またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，    Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋといった方法を編纂した参照文献で見出されるように、当業者に知られたポリペプチド配列を変化させる方法に従って調製することができる。アミノ酸の保存的置換は、以下の群：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄの中のアミノ酸の間で行われる置換を含む。
【００５９】
糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）を治療する抗ＰＫａｌ抗体の使用
本開示の態様は、たとえばＤＭＥ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、ぶどう膜炎、眼内炎、またはＰＣＶといった網膜疾患を有する、有する疑いのある、または有するリスクのある対象の治療に関する。一部の実施形態では、このような対象を治療する方法であって、本明細書中に記載される活性ＰＫａｌに特異的に結合する抗体の有効量を含む組成物を適切な経路を介して上記対象に投与する、方法が提供される。
【００６０】
本明細書中に開示される方法を行うために、本明細書中に記載される組成物（たとえば医薬組成物）の有効量を、静脈内投与（たとえばボーラスとして、または一定期間にわたる持続点滴による）、眼内注射、硝子体内注射、または皮下注射などの適切な経路を介して治療の必要がある対象（たとえばヒト）に投与することができる。本組成物は、ヒトの活性ＰＫａｌに結合する１つまたは複数の抗体を含み得る。あるいは、本組成物は、適切なプロモーターに操作可能に結合し得る、抗ＰＫａｌ抗体をコードする核酸を含み得る。このような核酸は、発現ベクターであり得る。
【００６１】
本明細書中に記載される組成物および方法により治療される対象は、哺乳類、より好ましくはヒト、たとえば糖尿病を有するヒトであり得る。哺乳類として、限定するものではないが、家畜、競技用動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、およびラットが挙げられる。治療を必要とするヒトの対象は、ＤＭＥ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、ぶどう膜炎、眼内炎、またはＰＣＶを含む網膜疾患を有する、リスクがある、有する疑いのあるヒト患者であり得る。加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、眼の黄斑の劣化または崩壊である。黄斑変性を伴う対象は、かすみ目（ｂｌｕｒｒｉｎｅｓｓ）、中心視における暗い領域またはゆがみ、および任意に中心視の永続的な喪失などの症状を有し得る。網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）は、網膜から血液を運びだす小さな静脈の遮断である。多くの場合、動脈硬化（アテローム性動脈硬化症）および血餅の形成により引き起こされる。糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）は、真性糖尿病における黄斑内の血管からの体液の漏出による網膜層の腫脹、血管新生、血管の漏出、および網膜の肥厚を特徴とする糖尿病性網膜症の増殖型である。ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）は、脈絡膜脈管構造の疾患である。これは多くの民族の男女の両方で存在し、色素上皮の漿液性剥離および滲出性の変化を特徴とし、一般的に網膜下線維症が起こり得る。ぶどう膜炎は、眼の中央の層であるぶどう膜の腫脹および刺激である。ぶどう膜は、網膜に血液供給の大部分を提供する。これは、関節リウマチまたは強直性脊椎炎を含む自己免疫障害により引き起こされる場合がある。またぶどう膜炎は、感染症または毒素への曝露により引き起こされる場合もある。多くの場合、原因は不明である。眼内炎は、通常、感染症により引き起こされる眼内腔（すなわち眼房水および／または硝子体）の炎症性の病態である。
【００６２】
このような網膜疾患を有する対象は、たとえば視力検査、眼圧測定、光干渉断層撮影、カラーステレオ眼底撮影法、フルオレセイン眼底血管造影図、またはそれらの組み合わせといった、定例的な医療検査により同定することができる。網膜疾患を有する疑いのある対象は、たとえば霧視、乱視、また視野におけるスポットといった疾患の１つまたは複数の症状を示し得る。網膜疾患のリスクがある対象は、１つまたは複数のリスク因子を有する対象であり得る。たとえば、ＤＭＥのリスクのある対象は以下のリスク因子：高血圧、体液貯留、低アルブミン血症、または高脂血症のうちの１つまたは複数を有し得る。ＲＶＯに関連するリスク因子には、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、高血圧（高血圧症）、および緑内障、黄斑浮腫、または硝子体出血などの他の眼の病態が挙げられる。
【００６３】
一部の実施形態では、ＤＭＥの別の治療と併用して、本明細書中に記載される抗体で対象を治療することができる。ＤＭＥの治療の非限定的な例として、レーザー光凝固、ステロイド、ＶＥＧＦ経路標的化剤（たとえばＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（ラニビズマブ）もしくはＥｙｌｅａ（登録商標）（アフリベルセプト））、および／または抗ＰＤＧＦ剤が挙げられる。
【００６４】
本明細書中使用される「有効量」は、単独でまたは１つもしくは複数の他の活性薬剤と併用して、対象に治療上の効果を与えるために必要な各活性薬剤の量を指す。有効量は、当業者に認識されているように、治療される特定の病態、病態の重症度、年齢、身体状態、体格、性別、および体重を含む個々の患者のパラメータ、治療期間、併用療法の性質（存在する場合）、特定の投与経路、および医療従事者の知識および見解内の同様の要因に依存して変動する。これらの要因は、当業者に良く知られており、単なる定例的な実験を用いて行うことができる。一般的に、個々の成分の最高用量またはその組み合わせを使用すること、すなわち、健全な医療従事者の判断により安全な最高用量を使用することが好ましい。しかしながら、医療上の理由、心理的な理由、または実質的な他のいずれかの理由のため、患者がそれよりも低い用量または認容量を要求できることは当業者に理解されるであろう。
【００６５】
半減期などの経験的考慮は、一般的に、用量の決定に寄与する。たとえば、ヒト化抗体または完全にヒトの抗体などのヒトの免疫系と適合できる抗体を、抗体の半減期を長くし、抗体が宿主の免疫系により攻撃されないようにするために使用してもよい。投与回数は、治療過程のあいだで決定して調節してもよく、一般的に、必ずしも必要ではないが、ＤＭＥの治療および／または抑制および／または改善および／または遅延に基づくものである。あるいは、抗ＰＫａｌの持続的な徐放製剤が適切である場合もある。持続的放出を達成するための様々な製剤およびデバイスは、当該分野で知られている。
【００６６】
一例では、本明細書中に記載される抗ＰＫａｌ抗体の用量は、抗体の１つまたは複数の投与を受けている個体で経験的に決定され得る。個体は、漸増用量の抗体を投与される。抗体の効能を評価するために、網膜疾患の指標を追跡する。
【００６７】
一般的に、本明細書中記載される抗体のいずれかの投与では、初回候補用量は約２ｍｇ／ｋｇであり得る。本開示の目的のため、典型的な一日量は、上述の要因に基づき、おおよそ、０．１μｇ／ｋｇ〜３μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇ〜３００μｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、〜３０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上のいずれかの範囲であり得る。数日間またはそれ以上にわたって反復投与する場合、病態に応じて、ＤＭＥまたはその症状を軽減するために、症状の望ましい抑制が起こるまで、または十分な治療レベルが達成されるまで、治療を継続する。例示的な投与計画は、約２ｍｇ／ｋｇの初回用量、次に、約１ｍｇ／ｋｇの維持用量の抗体を１週間、次に約１ｍｇ／ｋｇの維持用量を隔週で投与することを含む。しかしながら、医師が達成を望む薬物動態の減衰パターンに応じて、他の投与計画が有益であり得る。たとえば、１週間に１〜４回の投与が考えられる。一部の実施形態では、約３μｇ／ｍｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ（約３μｇ／ｍｇ、約１０μｇ／ｍｇ、約３０μｇ／ｍｇ、約１００μｇ／ｍｇ、約３００μｇ／ｍｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、および約２ｍｇ／ｋｇなどの）の範囲の用量が使用され得る。一部の実施形態では、投与回数は、１週間に１回、２週間ごと、４週間ごと、５週間ごと、６週間ごと、７週間ごと、８週間ごと、９週間ごと、もしくは１０週間ごと；または１か月に１回、２ヶ月ごと、もしくは３か月ごと、またはそれ以上である。この治療の進捗は、従来の技術およびアッセイにより容易にモニタリングされる。投与計画（使用される抗体を含む）は、経時的に変動し得る。
【００６８】
一部の実施形態では、正常な体重の成年患者では、約０．３〜５．００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量を投与してもよい。特定の投与計画、すなわち、用量、タイミング、および反復は、特定の個体、その個体の病歴、ならびに、個々の薬剤の特性（薬剤の半減期、および当該分野でよく知られている他の考察など）に依存する。
【００６９】
本開示の目的のため、抗ＰＫａｌ抗体の適切な用量は、使用される特定の抗体（またはその組成物）、網膜疾患（たとえばＤＭＥ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、ぶどう膜炎、眼内炎、またはＰＣＶ）のタイプおよび重症度、抗体が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、従来の治療、患者の病歴および抗体への応答、ならびに主治医の裁量に依存する。典型的に、臨床医は、望ましい結果を達成する用量に達するまで、抗ＰＫａｌ抗体を投与する。抗ＰＫａｌ抗体の投与は、たとえば、レシピエントの生理的状態、投与の目的が治療または予防かどうか、および当業者に知られている他の要因に応じて、連続的または間欠的であり得る。抗ＰＫａｌ抗体の投与は、あらかじめ選択された期間にわたり本質的に連続的であり得るか、または、たとえば網膜疾患を発症する前、最中、または後のいずれかで、間隔をあけた一連の用量であり得る。
【００７０】
本明細書中使用されるように、用語「治療している」は、網膜疾患、網膜疾患の症状、または疾患に対する素因を治療、治癒、緩和、軽減、変質、救済、回復、改善、または影響を与える目的で、ＤＭＥ、網膜疾患（たとえばＤＭＥ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、ぶどう膜炎、眼内炎、またはＰＣＶ）、または網膜疾患に対する素因を有する対象への、１つまたは複数の活性薬剤を含む組成物の適用または投与を指す。
【００７１】
ＤＭＥ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、ぶどう膜炎、眼内炎、またはＰＣＶなどの網膜疾患を緩和することは、疾患の発症または進行を遅延させること、または疾患の重症度を低減することを含む。疾患を緩和することは、必ずしも治療的結果を必要とするものではない。本明細書中使用される、網膜疾患の発症を「遅延させること」は、疾患の進行を延ばす、妨害する、遅らせる、阻止する、安定化する、および／または延期することを意味する。この遅延は、疾患の病歴および／または治療される個体に応じた様々な期間の遅延であり得る。疾患の発症を「遅延」もしくは緩和する、または疾患の発病を遅延する方法は、本方法を使用しない場合と比較して、所定の時間枠で疾患の１つまたは複数の症状を発症する可能性を低下させ、かつ／または所定の時間枠で症状の程度を低減する方法である。このような比較は、典型的に、統計学的に有意な結果を得るために十分数の対象を使用した臨床試験に基づく。
【００７２】
疾患の「発症」または「進行」は、疾患の初回症状発現および／または確実な進行を意味する。疾患の発症は、当該分野でよく知られている標準的な臨床技術を使用することにより、検出可能であり、かつ評価することができる。しかしながら、発症は、検出できない可能性のある進行をも指す。本開示の目的のため、発症または進行は、症状の生物学的経過を指す。「発症」は、発生、再発、および発病（ｏｎｓｅｔ）を含む。本明細書中使用される網膜疾患の「発病」または「発生」は、最初の発病および／または再発を含む。
【００７３】
一部の実施形態では、本明細書中記載される抗ＰＫａｌ抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで活性ＰＫａｌの活性を少なくとも２０％（たとえば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上）阻害するために十分な量で、その必要のある対象に投与される。他の実施形態では、抗体は、ＰＫａｌのレベルを少なくとも２０％（たとえば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上）低下させるのに有効な量で投与される。
【００７４】
医療の分野の当業者に知られている従来の方法を使用して、治療すべき疾患のタイプ、または疾患部位に応じて、対象に医薬組成物を投与することができる。また、たとえば経口投与、非経口投与、吸入スプレー、局所投与、直腸投与、経鼻投与、頬側投与、経膣投与、またはインプラントリザーバーといった他の従来の経路を介して、本組成物を投与することもできる。本明細書中使用される用語「非経口」は、硝子体内、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、および頭蓋内の注射または点滴の技術を含む。さらに、１、３、または６ヶ月のデポー注射可能または生物分解性の物質および方法を使用するなどの、注射可能なデポー投与経路を介して対象に投与することができる。一部の実施形態では、本明細書中に記載される組成物は、治療が必要な患者の眼に投与される。一例では、局所的に投与される。別の例では、眼内または硝子体内に注射される。
【００７５】
注射可能な組成物は、植物油、ジメチルアクトアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｔａｍｉｄｅ）、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、およびポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）などの様々な担体を含み得る。静脈内注射では、水に可溶な抗体を、滴注法により投与でき、これにより、抗体および生理的に許容可能な賦形剤を含む医薬製剤が点滴される。生理的に許容可能な賦形剤は、たとえば５％デキストロース、０．９％の生理食塩水、リンガー液、または他の適切な賦形剤を含み得る。たとえば抗体の適切な可溶性の塩型の滅菌製剤といった筋肉内調製物を、注射用水、０．９％の生理食塩水、または５％のグルコース溶液などの薬学的賦形剤に溶解して投与することができる。
【００７６】
一実施形態では、抗ＰＫａｌ抗体を、部位特異的な送達技術または標的化局所送達技術を介して投与する。部位特異的な送達技術または標的化局所送達技術の例として、抗ＰＫａｌ抗体の様々な埋め込みデポー供給源、または注入カテーテル、留置カテーテル、もしくはニードルカテーテルなどの局所送達カテーテル、人工血管、外膜ラップ（ａｄｖｅｎｔｉｔｉａｌ  ｗｒａｐ）、シャント、およびステント、または他の埋め込み可能デバイス、部位特異的担体、直接注射、または直接適用が挙げられる。たとえば、国際特許公開公報第００／５３２１１号または米国特許第５，９８１，５６８号を参照されたい。
【００７７】
また、アンチセンスポリヌクレオチド、発現ベクター、またはサブゲノムポリヌクレオチドを含む治療用組成物の標的化送達を使用することもできる。受容体媒介型ＤＮＡ送達技術は、たとえばＦｉｎｄｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （１９９３）  １１：２０２；  Ｃｈｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  （Ｊ．  Ａ．  Ｗｏｌｆｆ，  ｅｄ．）  （１９９４）；  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （１９８８）  ２６３：６２１；  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （１９９４）  ２６９：５４２；  Ｚｅｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９９０）  ８７：３６５５；  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （１９９１）  ２６６：３３８に記載されている。
【００７８】
ポリヌクレオチド（たとえは本明細書中に記載される抗ＰＫａｌ抗体をコードするポリヌクレオチド）を含む治療用組成物は、遺伝子療法プロトコルの局所投与のため、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与される。一部の実施形態では、約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇ、またはそれ以上のＤＮＡの濃度範囲を、遺伝子治療プロトコルにおいて使用することもできる。
【００７９】
本明細書中に記載される抗ＰＫａｌ抗体は、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達することができる。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス由来または非ウイルス由来であり得る（一般的にＪｏｌｌｙ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  （１９９４）  １：５１；  Ｋｉｍｕｒａ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  （１９９４）  ５：８４５；  Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  （１９９５）  １：１８５；  ａｎｄ  Ｋａｐｌｉｔｔ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （１９９４）  ６：１４８を参照されたい）。このようなコード配列の発現を、内在性の哺乳類または異種性のプロモーターおよび／またはエンハーサーを使用して誘導することができる。コード配列の発現は、構成的または調節的のいずれかであり得る。
【００８０】
所望の細胞における所望のポリヌクレオチドの送達および発現のためのウイルスベースのベクターは、当該分野でよく知られている。例示的なウイルスベースのビヒクルとして、限定するものではないが、組み換えレトロウイルス（たとえば国際特許公開公報第９０／０７９３６号；第９４／０３６２２号；第９３／２５６９８号；第９３／２５２３４号；第９３／１１２３０号；第９３／１０２１８号；第９１／０２８０５号；米国特許第５，２１９，７４０号および第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；ならびに欧州特許第０  ３４５  ２４２号参照）、アルファウイルスベースのベクター（たとえばシンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（たとえば国際特許公開公報第９４／１２６４９号、第９３／０３７６９号；第９３／１９１９１号；第９４／２８９３８号；第９５／１１９８４号および第９５／００６５５号）が挙げられる。また、Ｃｕｒｉｅｌ，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  （１９９２）  ３：１４７に記載される死滅アデノウイルスに結合したＤＮＡの投与を使用することもできる。
【００８１】
非ウイルス送達ビヒクルおよび方法もまた使用することができ、これは、限定するものではないが、死滅アデノウイルスのみに結合または結合していないポリカチオン性縮合ＤＮＡ（たとえばＣｕｒｉｅｌ，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  （１９９２）  ３：１４７参照）；リガンド結合型ＤＮＡ（たとえばＷｕ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （１９８９）  ２６４：１６９８５参照）、真核細胞送達ビヒクル細胞（たとえば米国特許第５，８１４，４８２号；国際特許公開公報第９５／０７９９４号；第９６／１７０７２号；第９５／３０７６３号；および第９７／４２３３８号参照）、ならびに核酸の電荷の中和または細胞膜との融合を含む。ネイキッドＤＮＡもまた使用することができる。例示的なネイキッドＤＮＡ導入方法は、国際特許公開公報第９０／１１０９２号および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用できるリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、国際特許公開公報第９５／１３７９６号、国際特許公開公報第９４／２３６９７号、国際特許公開公報第９１／１４４４５号、および欧州特許第０５２４９６８号に記載されている。さらなる手法は、Ｐｈｉｌｉｐ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９４）  １４：２４１１，  ａｎｄ  ｉｎ  Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （１９９４）  ９１：１５８１に記載されている。
【００８２】
本明細書中に記載される方法で使用される、特定の投与計画、すなわち用量、タイミング、および反復は、特定の対象、および対象の病歴に依存する。一部の実施形態では、１つより多くの抗ＰＫａｌ抗体、または抗ＰＫａｌ抗体と別の適切な治療剤との組み合わせを、治療の必要がある対象に投与してもよい。アンタゴニストは、同じタイプであり得るか、または互いに異なり得る。また、抗ＰＫａｌ抗体は、薬剤の有効性を亢進かつ／または補完するように作用する他の薬剤と併用して使用することができる。
【００８３】
網膜疾患の治療の効力は、当該分野によく知られた方法により、たとえばフルオレセイン眼底血管造影により評価することができる。
【００８４】
抗体の調製
本明細書中に記載されるＰＫａｌに結合できる抗体は、当該分野で知られたいずれかの方法により作製することができる。たとえば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  （１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００８５】
一部の実施形態では、標的抗原（たとえばヒトのＰＫａｌまたはその触媒ドメイン）に特異的な抗体は、従来のハイブリドーマの技術により作製することができる。任意にＫＬＨなどの担体タンパク質に結合した完全長の標的抗原またはそのフラグメントを、この抗原に結合した抗体を作製するために宿主動物を免疫するために使用することができる。宿主動物の免疫の経路およびスケジュールは、一般的に、本明細書中にさらに記載される抗体の刺激および生成の確立された従来技術を踏まえたものである。マウスの抗体、ヒト化抗体、およびヒトの抗体の生成のための一般的な技術は、当該分野で知られており、本明細書中記載されている。ヒトを含むいずれかの哺乳類の対象またはヒト由来の抗体産生細胞を、ヒトを含む哺乳類のハイブリドーマ細胞株を産生する基礎として役立つよう操作することができることが企図される。典型的に、宿主動物に、本明細書中に記載されるものを含む、ある量の免疫原を、腹腔内、筋肉内、経口、皮下、足底内、かつ／または皮内に接種する。
【００８６】
ハイブリドーマは、Ｋｏｈｌｅｒ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｃ．  （１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７またはＢｕｃｋ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，  １８：３７７−３８１  （１９８２）による改変版の一般的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を使用して、リンパ球および不死化骨髄腫細胞から調製することができる。限定するものではないが、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３およびＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．，  ＵＳＡ由来のものを含む、入手可能な骨髄腫細胞株を、ハイブリダイゼーションに使用してもよい。一般的に、この技術は、ポリエチレングリコールなどの融合物質、または当業者に良く知られている電気的な手段を使用して、骨髄腫細胞とリンパ球細胞とを融合することを含む。融合後、細胞を、融合培地から分離して、ヒポキサンチン‐アミノプテリン‐チミジン（ＨＡＴ）培地などの選択的増殖培地で増殖させ、ハイブリダイズされていない親細胞を除去する。血清を補充したまたは補充していない、本明細書中に記載される任意の培地を、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために使用することができる。細胞融合技術の別の代替物として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を、本明細書中に記載される抗ＰＫａｌモノクローナル抗体を生成するために使用してもよい。ハイブリドーマを増殖させて、必要に応じてサブクローニングし、その上清を、従来のイムノアッセイの手法（たとえばラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、または蛍光イムノアッセイ）により抗免疫原活性に関してアッセイする。
【００８７】
抗体の供給源として使用することができるハイブリドーマは、ＰＫａｌ活性に干渉できるモノクローナル抗体を産生する親ハイブリドーマのすべての誘導体、子孫細胞を含む。このような抗体を産生するハイブリドーマは、既知の手法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させることができる。必要に応じて、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過などの従来の免疫グロブリン精製手法により、モノクローナル抗体を、培養培地または体液から単離することができる。望ましくない活性がもし存在する場合、たとえば、固相に結合した免疫原から作製された吸着剤の上に調製物を流すこと、および免疫原から望ましい抗体を溶出または放出することにより、除去することができる。たとえば、二官能性物質または誘導体化剤、たとえばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介した）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ、またはＲおよびＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを使用して、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤といった、免疫化される種に免疫原性であるタンパク質をコンジュゲートさせた標的抗原または標的アミノ酸配列を含むフラグメントを用いた宿主動物の免疫により、抗体（たとえばモノクローナル抗体）集団を生成することができる。
【００８８】
必要に応じて、対象の（たとえばハイブリドーマにより産生される）抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）をシークエンシングしてもよく、次にポリヌクレオチド配列を、発現または増殖のために、ベクターにクローニングしてもよい。対象の抗体をコードする配列は、宿主細胞においてベクター中で維持してもよく、次に宿主細胞を増殖させて、将来の使用のために凍結することができる。あるいは、抗体を「ヒト化」するため、または抗体の親和性（親和性の成熟化）もしくは他の特徴を改善するために、ポリヌクレオチド配列を遺伝的操作に使用してもよい。たとえば、抗体を臨床試験およびヒトの治療に使用する場合、免疫応答を回避するため、定常領域を、ヒトの定常領域により類似するように操作してもよい。標的抗原に対するより高い親和性を得るためおよびＰＫａｌ活性の阻害の効能をより高めるために、抗体配列を遺伝的に操作することが望ましい場合があり得る。１つまたは複数のポリヌクレオチドの変化を抗体に対して行うことができ、それでもなお標的抗原に対するその結合特異性を維持することができることは、当業者に明らかである。
【００８９】
他の実施形態では、完全にヒトの抗体は、特異的なヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するよう操作されている市販のマウスを使用することにより、得ることができる。より望ましい（たとえば完全にヒトの抗体）またはより強力な免疫応答を産生するよう設計されているトランスジェニック動物もまた、ヒト化抗体またはヒト抗体の作製に使用することができる。このような技術の例として、Ａｍｇｅｎ，  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フリーモント）製のＸｅｎｏｍｏｕｓｅＲＴＭならびにＭｅｄａｒｅｘ，  Ｉｎｃ．（ニュージャージー州プリンストン）製のＨｕＭＡｂ−ＭｏｕｓｅＲＴＭおよびＴＣ  ＭｏｕｓｅＲＴＭがある。別の代替物では、抗体は、ファージディスプレイまたは酵母の技術により組み換えを使用して作製され得る。たとえば、米国特許第５，５６５，３３２号；第５，５８０，７１７号；第５，７３３，７４３号；および第６，２６５，１５０号；ならびにＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２：４３３−４５５，  ａｎｄを参照されたい。あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３）を使用して、非免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメインの遺伝子レパートリーから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト抗体または抗体フラグメントを生成することができる。
【００９０】
無傷の抗体（完全長の抗体）の抗原結合フラグメントは、定例的な方法を介して調製することができる。たとえばＦ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体分子のペプシン消化により生成することができ、Ｆａｂフラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより作製することができる。
【００９１】
ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ、および二重特異性抗体などの遺伝子操作された抗体は、たとえば従来の組み換え技術を介して作製することができる。一例では、標的抗原に特異的なモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手法を使用することにより（たとえばモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、容易に単離し、シークエンシングすることができる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離した後、ＤＮＡを１つまたは複数の発現ベクターに入れてもよく、次にベクターを、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない、大腸菌細胞、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組み換え宿主細胞においてモノクローナル抗体を合成させる。たとえば、国際特許公開公報第８７／０４４６２号を参照されたい。次にたとえば、相同なマウスの配列の代わりに、ヒトの重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列を置換することにより（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８１：６８５１，）、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてもしくは一部を免疫グロブリンのコード配列に共有結合させることにより、ＤＮＡを改変することができる。このようにして、標的抗原の結合特異性を有する「キメラ」抗体または「ハイブリッド」抗体などの遺伝子操作された抗体を調製することができる。
【００９２】
また、Ｆａｂを生成する技術も、当該分野で知られている（たとえば本明細書中参照として援用されている国際特許公開公報第１９９３００６２１７号および同２００５０３８０３１号を参照）。様々な宿主‐発現ベクター系を利用して、Ｆａｂを組み換えにより発現させることができる。このような宿主‐発現ベクター系は、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされると本明細書中に記載されるＦａｂを発現し得る細胞を表す。これらの例として、限定するものではないが、本明細書中に記載されるＦａｂ抗体をコードするコード配列を含む、組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物（たとえば大腸菌および枯草菌）；本明細書中に記載されるＦａｂ抗体をコードする配列を含む組み換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（たとえばサッカロミケス  ピキア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｉｃｈｉａ））；本明細書中に記載されるＦａｂ抗体をコードする配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（たとえばバキュロウイルス（ｂａｃｌｏｖｉｒｕｓ））を感染させた昆虫細胞系；は本明細書中に記載されるＦａｂ抗体をコードする配列を含む、組み換えウイルス発現ベクター（たとえばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を用いて感染させた、また組み換えプラスミド発現ベクター（たとえばＴｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；または本明細書中に記載されるＦａｂ抗体をコードする組み換え発現構築物を有する哺乳類細胞系（たとえばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、３Ｔ３細胞、リンパ系細胞（ｌｙｍｐｈｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ））が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書中に記載されるＦａｂは、大腸菌において組み換え技術を用いて発現させる。一旦Ｆａｂが組み換え技術で発現された後に、ポリペプチドまたは抗体の精製に関して当該分野で知られたいずれかの方法により、たとえばクロマトグラフィー（たとえばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、またはサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心、溶解度の差異、またはポリペプチドもしくは抗体の精製に関する他の標準的な技術により、Ｆａｂを精製してもよい。
【００９３】
「キメラ抗体」の生成のために開発された技術もまた、当該分野でよく知られている。たとえばＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１，  ６８５１；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，  ６０４；  ａｎｄ  Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２を参照されたい。
【００９４】
ヒト化抗体を構築する方法もまた、当該分野でよく知られている。たとえば、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８６：１００２９−１００３３  （１９８９）を参照されたい。一例では、親の非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬの可変領域に、当該分野で知られた方法に従って３次元分子モデリング解析を行う。次に、正確なＣＤＲ構造の形成に重要であると予測されたフレームワークアミノ酸残基を、同じ分子モデリング解析を使用して同定する。並行して、親の非ヒト抗体の配列と相同であるアミノ酸配列を有するヒトのＶＨおよびＶＬ鎖を、検索クエリとして親のＶＨおよびＶＬ配列を使用して、いずれかの抗体遺伝子データベースから同定する。次に、ヒトのＶＨおよびＶＬアクセプター遺伝子を選択する。
【００９５】
選択したヒトのアクセプター遺伝子の中のＣＤＲ領域を、親の非ヒト抗体またはその機能的変異体由来のＣＤＲ領域と置換することができる。必要に応じて、ＣＤＲ領域との相互作用に重要であると予測される親鎖のフレームワーク領域内の残基（上記を参照）を使用して、ヒトのアクセプター遺伝子における対応する残基と置換することができる。
【００９６】
一本鎖抗体は、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を連結させることにより、組み換え技術を介して調製することができる。好ましくは、可動性リンカーを、２つの可変領域の間に組み込む。あるいは、一本鎖抗体を生成するために記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号および第４，７０４，６９２号）を、ファージまたは酵母のｓｃＦｖライブラリーを生成するよう適合させることができ、ＰＫａｌに特異的なｓｃＦｖクローンを、定例的な手法に従ってライブラリーから同定することができる。陽性のクローンを、ＰＫａｌ活性を阻害するクローンを同定するためにさらなるスクリーニングに供することができる。
【００９７】
当該分野で知られており、本明細書中に記載された方法に従って得た抗体は、当該分野でよく知られた方法を使用して特徴付けすることができる。たとえば１つの方法として、抗原が結合するエピトープを同定すること、または「エピトープマッピング」がある。抗体‐抗原複合体の結晶構造を解析すること、競合アッセイ、遺伝子フラグメント発現アッセイ、および合成ペプチドベースアッセイを含む、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングおよび特徴付けするための当該分野で既知の方法が多く存在しており、たとえばＣｈａｐｔｅｒ  １１  ｏｆ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９９９に記載されている。さらなる例として、エピトープマッピングを使用して、抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープは、直線状のエピトープ、すなわち、一続きのアミノ酸に含まれるエピトープであり得るか、または一続きの配列（一次構造の直線状の配列）に必ずしも含まれるとは限らないアミノ酸の３次元相互作用により形成される立体構造的なエピトープであり得る。様々な長さのペプチド（たとえば、少なくとも長さがアミノ酸４〜６個）を、単離または合成（たとえば組み換え技術を用いて）することができ、抗体との結合アッセイに使用することができる。別の例では、抗体が結合するエピトープは、標的抗原の配列に由来する重複するペプチドを使用し、抗体による結合を決定することにより、系統的なスクリーニングにおいて決定できる。遺伝子フラグメント発現アッセイに従って、標的抗原をコードするオープンリーディングフレームを、無作為に、または特異的な遺伝的構成により断片化し、発現された抗原フラグメントと試験される抗体との反応性を決定する。遺伝子フラグメントは、たとえば、ＰＣＲにより生成され、次に放射活性アミノ酸の存在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写してタンパク質に翻訳してもよい。次に、放射活性標識した抗原フラグメントに対する抗体の結合を、免疫沈降およびゲル電気泳動により決定する。また、特定のエピトープは、ファージ粒子の表面上に提示されるランダムペプチド配列の大きなライブラリー（ファージライブラリー）を使用することにより同定することもできる。あるいは、重複するペプチドフラグメントの定義されたライブラリーを、単純な結合アッセイにおいて試験抗体との結合に関して試験することができる。さらなる例として、抗原結合ドメインの変異導入法、ドメイン交換実験、およびアラニン系統的変異導入法を行って、エピトープの結合性にとって要求される、十分な、および／または必要な残基を同定することができる。たとえば、ドメイン交換実験は、ＰＫａｌポリペプチドの様々なフラグメントが、近縁であるが抗原性が異なるタンパク質（ニューロトロフィンタンパク質ファミリーの別のメンバーなど）に由来する配列と置換（交換）されている標的抗原の変異体を使用して、行うことができる。変異体ＰＫａｌ（たとえば以下の実施例２に記載される変異体）に対する抗体の結合を評価することにより、抗体の結合に対する特定の抗原フラグメントの重要性を評価することができる。
【００９８】
あるいは、ある抗体が、他の抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、同じ抗原に結合することがわかっている他の抗体を使用して、競合アッセイを行うことができる。競合アッセイは、当業者に良く知られている。
【００９９】
当該分野で知られているいずれかの適切な方法、たとえば本明細書中に記載されるエピトープマッピング方法を、抗ＰＫａｌ抗体が、本明細書中に記載されるＰＫａｌにおける１つまたは複数の特異的残基／セグメントに結合するかどうかを決定するために適用することができる。さらに、ＰＫａｌ中のそれらの定義された残基の１つまたは複数と抗体の相互作用は、定例的な技術により決定することができる。たとえば、結晶構造を、実施例１に開示される方法に従って決定することができ、これにより、ＰＫａｌ中の残基と抗体中の１つまたは複数の残基との間の距離を決定することができる。このような距離に基づき、ＰＫａｌ中の特定の残基が、抗体中の１つまたは複数の残基と相互作用するかどうかを決定することができる。さらに、競合アッセイおよび標的変異原性アッセイなどの適切な方法を適用して、変異体ＰＫａｌなどの別の標的と比較して、ＰＫａｌに対する候補抗ＰＫａｌ抗体の優先的結合を決定することができる。
【０１００】
医薬組成物
上述の抗ＰＫａｌ抗体のうちの１つまたは複数を、ＤＭＥの緩和に使用するための医薬組成物を形成するため、緩衝剤を含む薬学的に許容可能な担体（賦形剤）と混合することができる。「許容可能な」は、担体が組成物の活性成分に適合することができ（および好ましくは活性成分を安定化させることができ）なければならず、処置される対象に有害であってはならないことを意味する。薬学的に許容可能な賦形剤（担体）は、緩衝剤を含み、当該分野でよく知られている。たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．  （２０００）  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｅｄ．  Ｋ．  Ｅ．  Ｈｏｏｖｅｒ．を参照されたい。一例では、本明細書中に記載される医薬組成物は、活性ＰＫａｌの異なるエピトープ／残基を認識する１つより多くの抗ＰＫａｌ抗体を含む。
【０１０１】
本方法で使用される医薬組成物は、凍結乾燥した製剤または水溶液の剤形で、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤を含むことができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．  （２０００）  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｅｄ．  Ｋ．  Ｅ．  Ｈｏｏｖｅｒ）。許容可能な担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量および濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０個未満の残基）のポリペプチド：血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストランを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；金属錯体（たとえばＺｎ‐タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコールなどの非イオン性界面活性剤を含み得る。薬学的に許容可能な賦形剤を、本明細書中でさらに記載する。
【０１０２】
一部の例では、本明細書中に記載される医薬組成物は、抗ＰＫａｌ抗体を含むリポソームを含み、これは、Ｅｐｓｔｅｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：３６８８  （１９８５）；  Ｈｗａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４０３０  （１９８０）；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号に記載される方法などの当該分野で知られた方法により調製することができる。循環時間が改良されたリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有益なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法により、作製することができる。リポソームを、規定の孔サイズのフィルターを介して押し出すことにより、所望の直径のリポソームが得られる。
【０１０３】
また、抗ＰＫａｌ抗体は、たとえばコアセルベーション技術または界面重合によりそれぞれ調製したマイクロカプセル、たとえばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンのマイクロカプセル、およびポリ（メタクリル酸メチル）のマイクロカプセルに、コロイド状の薬剤送達システム（たとえばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）、またはマクロエマルションに、封入することができる。このような技術は当該分野で知られており、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  （２０００）を参照されたい。
【０１０４】
他の例では、本明細書中に記載される医薬組成物を、徐放の形態で製剤化することができる。徐放調製物の適切な例として、本抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透過性のマトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形品、たとえばフィルムまたはマイクロカプセルの形状である。徐放マトリックスの例として、ポリエステル、ハイドロゲル（たとえばポリ（２‐ヒドロキシエチル‐メタクリラート）、またはポリ（ビニルアルコール（ｖ  ｎｙｌａｌｃｏｈｏｌ））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸と７  エチル‐Ｌ‐グルタメートのコポリマー、非分解性のエチレン‐ビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）などの分解性の乳酸‐グリコール酸のコポリマー（乳酸‐グリコール酸のコポリマーおよび酢酸リュープロリドから構成される注射可能のマイクロスフィア）、しょ糖酢酸イソ酪酸エステル、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０１０５】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与に使用される医薬組成物は、無菌性でなければならない。これは、たとえば滅菌濾過膜を介したろ過により、容易に達成される。治療用抗体組成物は、一般的に、たとえば、皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有する静脈内投与溶液のバッグまたはバイアルといった滅菌性のアクセスポートを有するコンテナに入れられている。
【０１０６】
本明細書中に記載される医薬組成物は、経口投与、非経口投与、もしくは直腸投与、または吸入もしくは吹送法による投与のための錠剤、丸剤、カプセル、散剤、顆粒剤、液剤、または懸濁剤、または坐剤などの単位投与剤形であり得る。錠剤などの固体組成物を調製するために、主要な活性成分を、薬学的担体、たとえばコーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガムなどの従来の錠剤化成分、および他の薬学的な希釈剤、たとえば水と混合して、本発明の化合物またはその非毒性の薬学的に許容可能な塩の均質な混合物を含む固体の予備製剤組成物を形成することができる。これら予備製剤の組成物を均質と呼ぶ場合、組成物が錠剤、丸剤、およびカプセルなどの等しく有効な単位剤形に容易に細分され得るように、活性成分が組成物全体に均一に分散していることを意味する。次に、固体の予備製剤組成物を、本発明の活性成分を０．１〜約５００ｍｇ含む上述のタイプの単位剤形に細分化する。新規組成物の錠剤または丸剤は、長期間作用する利点を有する剤形を提供するために、コーティングすることができ、またはそうでなければ調合することができる。たとえば錠剤または丸剤は、内部投与成分と外部投与成分を含むことができ、後者は、前者を覆う外皮の形態である。胃での分解に抵抗するよう作用し、かつ内部成分を無傷のまま十二指腸へと通過させるか、または放出を遅らせる腸溶層により、この２つの成分を分離することができる。様々な材料をこのような腸溶層またはコーティングに使用することができ、このような材料として、多くのポリマー酸、ならびにセラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースなどの材料とポリマー酸との混合物が挙げられる。
【０１０７】
適切な表面活性剤として、特に、ポリオキシエチレンソルビタン（たとえばＴｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０、または８５）、および他のソルビタン（たとえばＳｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０、または８５）などの非イオン性の薬剤が挙げられる。表面活性剤を含む組成物は、０．０５〜５％の表面活性剤を含むことが都合よく、界面活性剤は０．１〜２．５％のあいだであり得る。必要に応じて、他の成分、たとえばマンニトールまたは他の薬学的に許容可能なビヒクルを添加してもよいと認識される。
【０１０８】
適切な乳剤を、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）などの市販の脂肪乳剤を使用して調製してもよい。活性成分を、あらかじめ混合した乳剤組成物に溶解してもよく、またはあるいは油（たとえばダイズ油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油、またはアーモンド油）、およびリン脂質（たとえば卵のリン脂質、ダイズのリン脂質、またはダイズのレシチン）と混合して形成された乳剤、および水に溶解してもよい。乳剤の浸透圧を調節するために、他の成分、たとえばグリセロールまたはグルコースを添加してもよいと認識される。適切な乳剤は、典型的に最大２０％、たとえば５〜２０％の油を含む。脂肪乳剤は、０．１〜１．０ｉｍ、特に０．１〜０．５ｉｍの脂肪の液滴を含み、５．５〜８．０の範囲のｐＨを有する。
【０１０９】
乳剤は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）またはその成分（ダイズ油、卵のリン脂質、グリセロール、および水）と抗ＰＫａｌ抗体を混合することにより調製された組成物であり得る。
【０１１０】
吸入または吹送法用の医薬組成物として、薬学的に許容可能な水性溶媒もしくは有機溶媒の液剤および懸濁剤、またはそれらの混合物、および散剤が挙げられる。液体または固体の組成物は、上述の適切な薬学的に許容可能な賦形剤を含んでもよい。一部の実施形態では、組成物は、局所作用または全身性の作用のために、経口経路または経鼻呼吸経路により投与される。
【０１１１】
好ましくは滅菌性の薬学的に許容可能な溶媒中の組成物を、気体を使用して噴霧してもよい。噴霧した溶液をネブライザーデバイスから直接吸い込んでもよく、またはネブライザーデバイスを、フェイスマスク、テント、または間欠的陽圧呼吸機器に取り付けてもよい。液剤、懸濁剤、または散剤の組成物は、好ましくは、適切な方法で製剤を送達するデバイスから経口的または経鼻的に投与され得る。
【０１１２】
網膜疾患の治療に使用するためのキット
また、本開示は、ＤＭＥ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、ぶどう膜炎、眼内炎、またはＰＣＶなどの網膜疾患の治療に使用するためのキットをも提供する。このようなキットは、たとえば本明細書中に記載されるいずれか、たとえばＤＸ−２９３０といった抗ＰＫａｌ抗体を含む１つまたは複数の容器を含むことができる。
【０１１３】
一部の実施形態では、キットは、本明細書中に記載される方法のいずれかに従って使用するための説明書を含み得る。含まれる説明書は、網膜疾患を治療、発病を遅延、または緩和するための抗ＰＫａｌ抗体の投与の説明を含み得る。キットは、個体が網膜疾患を有するか、または有するリスクがあるかどうかの同定に基づき治療に適した個体を選択する説明をさらに含み得る。さらなる他の実施形態では、説明書は、標的疾患のリスクがある個体に抗体を投与する説明を含む。
【０１１４】
抗ＰＫａｌ抗体の使用に関連する説明書は、一般的に、意図する治療のための用量、投与スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位剤形、バルク包装（たとえば複数の用量パッケージ）またはサブユニットの用量であってもよい。本発明のキットに供給される説明書は、典型的にラベルまたはパッケージインサート（たとえばキットに含まれる紙シート）に書かれた説明書であるが、機械可読の説明書（たとえば磁性記憶ディスクまたは光学記憶ディスク上で伝達される説明書）もまた許容可能である。
【０１１５】
本開示のキットは、適切に包装されている。適切な包装として、限定するものではないが、バイアル、ビン、ジャー、可撓性包装（たとえば封入されたマイラーまたはプラスチックのバッグ）などが挙げられる。また、シリンジなどの特定の機器またはミニポンプなどの点滴の機器と共に使用するための包装も企図される。キットは、滅菌性のアクセスポートを有してもよい（たとえば容器は、皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈内投与溶液のバッグまたはバイアルであってもよい）。本組成物中の少なくとも１つの活性成分は、本明細書中に記載される抗ＰＫａｌ抗体である。
【０１１６】
一般的な技術
本発明の実務は、特段他の記載がない限り、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を用いており、これらは従来技術の範囲内にある。このような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｍ．  Ｊ．  Ｇａｉｔ，  ｅｄ．，  １９８４）；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ  （Ｊ．  Ｅ．  Ｃｅｌｌｉｓ，  ｅｄ．，  １９９８）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ｅｄ．，  １９８７）；  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （Ｊ．  Ｐ．  Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｅ．  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  １９９８）  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  （Ａ．  Ｄｏｙｌｅ，  Ｊ．  Ｂ．  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｇ．  Ｎｅｗｅｌｌ，  ｅｄｓ．，  １９９３−８）  Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｄ．  Ｍ．  Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  ｅｄｓ．）；  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  （Ｊ．  Ｍ．  Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｐ．  Ｃａｌｏｓ，  ｅｄｓ．，  １９８７）；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９８７）；  ＰＣＲ：  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，  （Ｍｕｌｌｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９９４）；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｊ．  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９９１）；  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  １９９９）；  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｃ．  Ａ．  Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｔｒａｖｅｒｓ，  １９９７）；  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （Ｐ．  Ｆｉｎｃｈ，  １９９７）；  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｄ．  Ｃａｔｔｙ．，  ｅｄ．，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８８−１９８９）；  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｐ．  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｄｅａｎ，  ｅｄｓ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００）；  Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  （Ｅ．  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｌａｎｅ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９９）；  Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （Ｍ．  Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｄ．  Ｃａｐｒａ，  ｅｄｓ．，  Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  １９９５）などの文献に十分に説明されている。
【０１１７】
さらに苦心することなく、当業者は、上記の記載に基づき、本発明を最も完全な程度で利用することができると考えられる。よって、以下の特定の実施形態は、単なる例示であり、本開示の残りをいかなるようにも限定しないと解釈すべきである。本明細書中に記載されるすべての刊行物は、本明細書中で参照される目的または主題のために、参照として本明細書中に援用されている。
【０１１８】
実施例
実施例１：レーザー誘発脈絡膜血管新生（レーザＣＮＶ）疾患モデルにおけるＤＸ−２９４４の効果
ＤＸ―２９４４は、大腸菌発現系から発現させて精製したＤＸ−２９３０の組み換えＦａｂ型である。レーザーＣＮＶモデルは、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞症、および黄斑浮腫などのヒトの網膜疾患に関連する合併症に関する確立されたげっ歯類モデルである。この試験のために使用した実験計画を、以下に概説する。
実験計画
１日目：眼あたり３つの病変を作製するために両側のレーザー処置
３日目：試験薬剤、ビヒクル、または陽性対照（抗ＶＥＧＦ  Ａｂ）の両側の硝子体内注射
２２日目：ｉｎ  ｖｉｖｏでのフルオレセイン眼底血管造影
図１Ａ〜１Ｂおよび図２Ａ〜２Ｂにおける結果は、ＤＸ−２９４４が、観察されたＣＮＶを、陽性対照（抗ＶＥＧＦ抗体）とほぼ同程度に低減させることを示す。抗ＶＥＧＦ処置群のフルオレセイン眼底血管造影シグナルの平均値は７０２３蛍光単位であったが、これは、ＤＸ−２９４４処置群で観察された７０７１蛍光単位と類似する。
【０１１９】
実施例２：ＤＸ−２９３０−ＰＫａｌ複合体の結晶構造に基づくヒトの血漿カリクレインの触媒ドメインにおける重要な残基の同定
Ｈｉｓ−タグと融合した、ヒト血漿カリクレインの触媒ドメインを、昆虫細胞で発現させ、まずニッケル親和性カラムにより精製した。トリプシン消化を介して、Ｈｉｓ−タグを血漿カリクレインから除去し、遊離した血漿カリクレインを、ベンズアミジン親和性カラム、次にＳＥＣカラムにより精製した、精製した生成物をＰＡＧＥゲル上で試験した。この結果は、ヒトの血漿カリクレインの触媒ドメインが適切に発現されて精製されたことを示した。
【０１２０】
ＤＸ−２９３０を、定例の組み換え技術を介して調製し、精製した。ＤＸ−２９３０の組み換えＦａｂフラグメントを、定例の方法を介して生成し、精製した。
【０１２１】
抗体‐ＰＫａｌ複合体を形成できる適切な条件下で、ＤＸ−２９３０のＦａｂフラグメントおよびヒトの血漿カリクレインの触媒ドメインを様々な濃度で混合した。これにより、形成される複合体を、複合体における抗体‐ＰＫａｌの比率を決定するため、ＨＰＬＣを使用して試験した。これに応じて、１：１の複合体を形成するために適した抗体およびＰＫａｌの両方の濃度を同定した。
【０１２２】
抗体‐ＰＫａｌ複合体を、結晶化を可能にする様々な条件で保存した。結晶化した複合体に関して回折解析を行った。回折統計値に基づき、結晶構造（２．１Åおよび２．４Å）を決定した。
【０１２３】
結晶構造により、ＤＸ−２９３０との相互作用に関与するヒトＰＫａｌの触媒ドメインの残基を同定した。これらの残基を、図４に示し（太字および下線）、これは、ヒトのＰＫａｌの触媒ドメインのアミノ酸配列（ヒトのＰＫａｌの３９１〜６３８番目の残基）を提供する。
【０１２４】
さらに、結晶構造に基づき、重鎖可変領域におけるＥ１、Ｖ２、Ｆ２７、Ｔ２８、Ｆ２９、Ｓ３０、Ｈ３１、Ｒ１００、Ｉ１０１、Ｇ１０２、Ｖ１０３、Ｐ１０４、Ｒ１０５、Ｒ１０６、Ｄ１０７、Ｇ１０７、Ｋ１０８、およびＤ１１１、ならびに軽鎖可変領域におけるＳ３１、Ｗ３２、Ｙ４９、Ｋ５０、Ｔ５３、Ｌ５４、Ｅ５５、Ｓ５６、Ｇ５７、およびＶ５８を含む、ＰＫａｌと相互作用するＤＸ−２９３０の残基をも同定した。
【０１２５】
これらの残基は、ＤＸ−２９３０のＨＣ  ＣＤＲ３が、ＰＫａｌと相互作用する主な領域であり、ＨＣ  ＣＤＲ１およびＦＲ１における数個の残基もまた、ＰＫａｌとの相互作用に寄与することを示す。軽鎖では、ＬＣ  ＣＤＲ２領域が、相互作用に寄与することが見出された。
【０１２６】
さらに、この結果は、ＨＣ  ＣＤＲ３領域における特定の位置での変異が許容され得ることをも示す。たとえば、１０３番目の位置は、ＶまたはＩなどの小さな疎水性残基を必要とする。別の例として、Ｒ１０６を、Ｗと置換してもよく、Ｅ１０８をＳまたはＤと置換してもよく、それでもＰＫａｌの結合活性に実質的に影響を与えない。同様に、Ｄ１１０を、Ｅと置換してもよい。
【０１２７】
実施例３：親和性成熟化の結果は、結晶構造に由来する構造情報と一致する。
抗体Ｍ０１６２−Ａ０４の重鎖可変領域、特にＨＣ  ＣＤＲ３領域を、親和性成熟に供した。ＨＣ  ＣＤＲ３領域における１つまたは複数の位置でアミノ酸変異を有する様々な変異体を作製し、そのＫｉ，ａｐｐを、定例的な方法に従って決定した。
【０１２８】
簡潔に述べると、様々な濃度のＰＫａｌおよびＦａｂを共に、３０℃で１時間インキュベートする。次に、基質ペプチド（ＰＫａｌにより切断可能）を、このＰＫａｌ−Ｆａｂ混合物に添加する。次に、基質ペプチドの切断／タンパク質分解の比率を測定し、Ｆａｂの濃度に対してプロットする。次にこのプロットをＭｏｒｒｉｓｏｎ式に適合させ、Ｋｉ，ａｐｐ値を計算する。これにより得られた結果を、図５Ａ〜５Ｄおよび以下の表３に示す。
【表３】
2020079246.tif 000014
【０１２９】
親和性成熟の結果は、ＨＣ  ＣＤＲ３領域内の特定の位置の変異が、親のＭ０１６２−Ａ０４クローンと比較して、高い親和性／阻害性の抗ＰＫａｌ抗体をもたらすことを示す。これらの結果は、上記の実施例２に提供される構造情報と一致する。クローンＭ０１９９−Ａ０８のＨＣ  ＣＤＲ３領域は、ＤＸ−２９３０のＨＣ  ＣＤＲ３領域と同一であることに留意されたい。
【０１３０】
実施例４  抗体の阻害活性に及ぼす血漿カリクレインの変異の影響
様々なＰＫａｌ変異体に対する変異体Ｘ１１５−Ｆ０２の阻害活性を調べた。
【０１３１】
Ｘ１１５−Ｆ０２は、ＤＸ−２９３０に存在しないＣ末端のリジン残基を含み、ＣＨＯ細胞ではなくてＨＥＫ２９３Ｔで発現されることを除き、ＤＸ−２９３０と同じであるＩｇＧである（上記表２）。Ｘ１１５−Ｆ０２の結合特異性および親和性は、ＤＸ−２９３０と同じである。
【０１３２】
この試験で使用される血漿カリクレインの野生型および４つの変異体（図７Ａ〜７Ｂ）は、ピキア・パストリス（ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から発現され、精製された組み換え触媒ドメインである。変異体１は、活性部位のＳ３サブサイトにおいて以下の変異：Ｓ４７８Ａ、Ｎ４８１Ａ、Ｓ５０６Ａ、Ｙ５０７Ａ（完全長のアミノ酸配列に基づく数）を含む。変異体２は、活性部位のＳ１’サブサイトにおいて以下の変異：Ｒ５５１Ａ、Ｑ５５３Ａ、Ｙ５５５Ａ、Ｔ５５８Ａ、Ｒ５６０Ａを含む。変異体４は、活性部位から遠位である以下の変異：Ｎ３９６Ａ、Ｓ３９８Ａ、Ｗ３９９Ａを含む。変異体３は不活性であることがわかり、よって活性アッセイにおいて試験しなかった。変異体３は、活性部位のＳ１’サブサイトにおいて以下の変異：Ｄ５７２Ａ、Ｋ５７５Ａ、Ｄ５７７Ａを含む。
【０１３３】
野生型ＰＫａｌおよび変異体に対するＸ１１５―Ｆ０２の阻害活性を、上記の実施例３に記載される方法を使用して行い、Ｋｉ，ａｐｐ値を決定した。図６に示されるように、変異体１および４における変異は、血漿カリクレインのＸ１１５−Ｆ０２の阻害の効力に有意に影響を与えなかった。驚くべきことに、変異体２における変異は、効力をおよそ６５倍低減させた。これらの結果は、残基Ｒ５５１Ａ、Ｑ５５３Ａ、Ｙ５５５Ａ、Ｔ５５８Ａ、Ｒ５６０Ａおよびその隣接残基が、Ｘ１１５−Ｆ０２（ＤＸ−２９３０）の阻害活性に重要であり得ることを示す。
【０１３４】
実施例５：レーザー誘発脈絡膜血管新生（レーザーＣＮＶ）疾患モデルにおけるＤＸ−２９４４の効果‐試験３
本明細書中に記載されるＤＸ−２９４４を、大腸菌発現系から発現させて精製した。この試験で使用したレーザーＣＮＶモデルは、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞症、および黄斑浮腫などのヒトの網膜疾患に関連する合併症の、確立されたげっ歯類モデルである。行われた実験計画を以下に概説する。
実験計画：ラットにおけるレーザー誘発脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）
１日目：眼あたり３つの病変を生成するために両側のレーザー処置
３日目：試験薬剤、ビヒクル、および陽性対照の両側の硝子体内注射
１０日目：試験薬剤、ビヒクル、および陽性対照の両側の硝子体内注射
１５日目：ｉｎ  ｖｉｖｏでのフルオレセイン眼底血管造影
２２日目：ｉｎ  ｖｉｖｏでのフルオレセイン眼底血管造影
【０１３５】
図８で示される結果は、ＤＸ―２９４４が、試験の１５日目に観察されたＣＮＶを、陽性対照（抗ＶＥＧＦ抗体）とほぼ同程度に低減したことを示す。抗ＶＥＧＦ処置群での、フルオレセイン眼底血管造影シグナルの平均値は、４６２７蛍光単位であり、これはＤＸ−２９４４処置群で観察される４９１７蛍光単位と類似した。図９に示される結果は、ＤＸ−２９４４が、試験の２２日目に、観察されたＣＮＶを陽性対照とほぼ同程度に低減させたことを示す。抗ＶＥＧＦ処置群のフルオレセイン眼底血管造影シグナルの平均値は４５５１蛍光単位であり、これはＤＸ−２９４４処置群で観察される５０１１蛍光単位と類似した。
【０１３６】
これらの結果は、ＤＸ−２９４４が動物モデルにおいてＣＮＶを低減するために有効であることを示しており、この抗体が加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞症、および黄斑浮腫などのヒトの網膜疾患の治療に有効であることを示している。
【０１３７】
他の実施形態
本明細書に開示される特徴のすべては、何等かの組み合わせで組み合わせてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同じ、均等、または類似の目的を果たす代替的な特徴と置換してもよい。よって、特段他の記載が明確に記載されていない限り、開示される特徴は、それぞれ、一般的な一連の均等なまたは類似の特徴の単なる一例である。
【０１３８】
上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な用途および条件に適合させるために本発明の様々な変更および修正を行うことができる。よって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
【０１３９】
均等物
いくつかの発明の実施形態が本明細書中に記載され、例示されているが、当業者は、本明細書中に記載される機能を実施するための、および／もしくは本明細書中に記載される結果および／または利点の１つまたは複数を得るための、様々な他の手段および／または構造を容易に想定するものであり、このような変更および／または修正は、それぞれ、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲内にあるとされる。より一般的には、当業者は、本明細書中に記載されるすべてのパラメータ、次元、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、次元、材料および／または構成が、本発明の技術が使用される特定の用途に依存することを容易に理解するものである。当業者は、単なる定例的な実験を使用して、本明細書中に記載される特定の発明の実施形態の多くの均等物を認識し、または確認することができる。よって、上記の実施形態が、単なる例として提示されており、添付される特許請求の範囲およびその均等物の中で、発明の実施形態を、具体的に記載され、主張されるものとは異なるように実施してもよいと理解される。本開示の発明の実施形態は、本明細書中に記載されるそれぞれ個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法を目的としている。さらに、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合に、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の２つ以上の任意の組み合わせが、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【０１４０】
本明細書中で定義され使用されるすべての定義は、辞書での定義、参照として援用されている文書での定義、および／または定義される文言の通常の意味を支配すると理解すべきである。
【０１４１】
本明細書および特許請求の範囲において、本明細書中使用される不定形「ａ」および「ａｎ」は、特段他の記載が明確に記載されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解すべきである。
【０１４２】
本明細書および特許請求の範囲において、本明細書中使用される文言「および／または」は、組み合わせた要素の「いずれかまたは両方」、すなわち組み合わせて存在する場合もあれば、別々に存在する場合もある要素を意味すると理解される。「および／または」と共に列挙される複数の要素は、同じように、すなわち、組み合わせられる要素の「１つまたは複数」であると解釈すべきである。これらの具体的に同定された要素に関連するか関連しないかに関わらず、「および／または」の節により具体的に同定された要素以外の他の要素が任意に存在してもよい。よって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」という言及は、「含む」などの制限のない言語と共に使用される場合、一実施形態では、Ａのみ（任意にＢ以外の要素を含む）を指し、別の実施形態では、Ｂのみ（任意にＡ以外の要素を含む）を指し、さらなる別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（任意に他の要素を含む）を指す。
【０１４３】
本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、「または」は、上記で定義される「および／または」と同じ意味を有すると理解すべきである。たとえば、ある列挙で項目を分ける場合、「または」または「および／または」は、包括的、すなわち多くの要素または要素の列挙のうちの少なくとも1つを含むが、同様に１つより多くを含み、任意で、列挙されていない追加的な項目をも含むと解釈されるべきである。用語が「〜のうちの１つのみ」、または「〜のうち正確に１つ」、または特許請求の範囲で使用される「〜からなる」などの反対の意味を明確に表す用語のみが、多くの要素または要素の列挙のうちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般的に、本明細書中で使用される用語「または」は、「いずれか」、「〜のうちの１つ」、「〜のうちの１つのみ」、または「〜のうちの正確に１つ」などの排他的な文言が先行する場合に限って、排他的な代替物を示すと解釈される（すなわち「１つまたはその他であるが、両方ではない」）。
特許請求の範囲で使用する場合「〜から本質的になる」は、特許法の分野で使用される通常の意味を有する。
【０１４４】
本明細書および特許請求の範囲において、１つまたは複数の要素の列挙に関して「少なくとも１つ」の文言は、要素の列挙における要素の１つまたは複数から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素の列挙において具体的に列挙されるそれぞれのおよびあらゆる要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含むものではなく、この要素の列挙における要素のいかなる組み合わせも除外するものではないと理解すべきである。また、この定義は、具体的に同定されたこれら要素に関連するか関連しないかに関わらず、「少なくとも１つ」の文言が表す要素の列挙において具体的に同定された要素以外の要素が存在し得ることを許容する。よって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または同等に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または同等に、「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つ、または任意に１つより多くのＡを含むがＢは存在しない（および任意にＢ以外の要素を含む）ことを指し、別の実施形態では、少なくとも１つ、任意に１つより多くのＢを含むがＡは存在しない（および任意にＡ以外の要素を含む）ことを指し、さらなる別の実施形態では、少なくとも１つ、任意に１つより多くのＡと、少なくとも１つの、任意に１つより多くのＢとを含む（および任意に他の要素を含む）ことを指す。
【０１４５】
また、他の記載が明確に記載されない限り、１つより多くのステップまたは作用を含む本明細書中に請求される任意の方法において、方法のステップまたは作用の順序は、方法のステップまたは作用が列挙される順序に必ずしも限定されないと理解すべきである。
【０１４６】
特許請求の範囲、および上記の明細書では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「担持する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ（含む）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「〜から構成される」などのすべての移行句は、制限がないと理解され、すなわち、含むがそれらに限定されないことを意味する。「〜からなる」または「〜から本質的になる」の移行句のみが、それぞれ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ２１１１．０３に記載されるように、閉鎖的または半閉鎖的な移行句である。
【図１Ａ】
2020079246.tif 000015
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
2020079246.tif 000026
【図７Ｂ】
2020079246.tif 000027
【図８】
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【図９】
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【配列表】
2020079246000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月25日(2020.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の網膜疾患を治療する方法であって、
活性血漿カリクレイン（ＰＫａｌ）に特異的に結合する抗体を含む組成物の有効量を、その必要がある対象に投与すること
を含む、方法。