(57)【要約】      （修正有）【課題】グルタル酸大量生産用再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株及びこれを用いたグルタル酸大量生産方法を提供する。【解決手段】５−アミノバレラートアミノトランスフェラーゼ、グルタレートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、リシン−２−モノオキシゲナーゼ、デルタ−アミノバレルアミダーゼ、及びＨ３０またはＨ３６プロモーターをコーディングするヌクレオチド序列を含む発現ベクターに形質転換されたグルタル酸生産用再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株を開示する。前記再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株を使用してグルタル酸を生産する場合、生産量が優れるだけでなく、副産物無しでグルタル酸のみ選択的に生産することが可能で分離精製が要求されなくて経済的であるので、再組合菌株からグルタル酸を生産することに有用である。【選択図】図１
2020028292.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−アミノバレラートアミノトランスフェラーゼ（5-aminovalerate aminotransferase；ＤａｖＴ）酵素、グルタレートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（glutarate semialdehyde dehydrogenase；ＤａｖＤ）酵素、リシン−２−モノオキシゲナーゼ（lysine 2-monooxygenase；ＤａｖＢ）酵素、デルタ−アミノバレルアミダーゼ（deltaaminovaleramidase；ＤａｖＡ）酵素、及びＨ３０またはＨ３６プロモーター（promoter）をコーディングするヌクレオチド序列を含む発現ベクターに形質転換されたグルタル酸（glutaric acid）生産用再組合コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）菌株。
【請求項２】
前記５−アミノバレラートアミノトランスフェラーゼ酵素（ＤａｖＴ）をコーディングするヌクレオチド序列は序列番号１または２と表示されることを特徴とする、請求項１に記載のグルタル酸生産用再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株。
【請求項３】
前記グルタレートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＤａｖＤ）をコーディングするヌクレオチド序列は序列番号３または４と表示されることを特徴とする、請求項１に記載のグルタル酸生産用再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株。
【請求項４】
前記リシン−２−モノオキシゲナーゼ酵素（ＤａｖＢ）をコーディングするヌクレオチド序列は序列番号５または６と表示されることを特徴とする、請求項１に記載のグルタル酸生産用再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株。
【請求項５】
前記デルタ−アミノバレルアミダーゼ酵素（ＤａｖＡ）をコーディングするヌクレオチド序列は序列番号７または８と表示されることを特徴とする、請求項１に記載のグルタル酸生産用再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株。
【請求項６】
前記発現ベクターはヒスチジン−タグ（polyhistidine-tag、Ｈｉｓ−ｔａｇ）をコーディングするヌクレオチド序列を追加で含むことを特徴とする、請求項１乃至５のうち、いずれか一項に記載のグルタル酸生産用再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株。
【請求項７】
前記ヒスチジン−タグをコーディングするヌクレオチド序列は５−アミノバレラートアミノトランスフェラーゼ酵素（ＤａｖＴ）またはリシン−２−モノオキシゲナーゼ酵素（ＤａｖＢ）をコーディングするヌクレオチド序列の５’−末端に位置することを特徴とする、請求項６に記載のグルタル酸生産用再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株。
【請求項８】
前記ヒスチジン−タグをコーディングするヌクレオチド序列はリシン−２−モノオキシゲナーゼ酵素（ＤａｖＢ）をコーディングするヌクレオチド序列の５’−末端に位置することを特徴とする、請求項７に記載のグルタル酸生産用再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株。
【請求項９】
（１工程）請求項１乃至５、請求項７及び８のうちのいずれか一項の再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株をグルコースが含まれた培地で培養してグルタル酸を生産するステップ；及び
（２工程）前記１工程の培養液からグルタル酸を収得するステップ；
を含む再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株からグルタル酸を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルタル酸生産用再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株及びこれを用いたグルタル酸生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
全世界的な石油需給不安と石油資源枯渇、地球温暖化に対する危機意識のため、最近、産業バイオ技術を用いてバイオマスから由来した代替生産方法や代替化合物を生産するための全人類的な努力がバイオエネルギー、バイオプラスチック、バイオ化合物などの多様な分野で可視化されている。
【０００３】
バイオマスを活用して生産されるバイオプラスチック市場の場合、２００２年Natureworks社により商業化されたポリ乳酸（Poly Lactic acid）が年１４万トン規模で生産されて、最近、市場が急速に拡大されている。ＰＨＡ系バイオプラスチックであるポリ−（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシバレレート｛poly-(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalarate)}（P（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ））もMetabolixとＡＤＭの合併会社であるTellesにより５万トン規模の工場が２０１０年完工して製品が市販されている。また、デュポン社が生産しているバイオマス基盤の１，３−プロパンジオールを用いてＰＴＴ高分子製品が現在商用化されている。その他にもコハク酸基盤のＰＢＳなども活発に開発されている。
【０００４】
ナイロン５５とナイロン４５の製造時に使われるＣ５のグルタル酸（glutaric acid）は主に化学的方法により生産するが、バイオマスを基盤に製造することも可能であり、微生物で自然的に生産されるグルタル酸はシュードモナスプチダ（Pseudomonas putida）菌株でＬ−リシンの異化作用経路のうち、中間体として生成されることが報告されたことがある。
【０００５】
シュードモナスプチダ菌株でＬ−リシン（L-lysine）はリシン−２−モノオキシゲナーゼ（lysine 2-monooxygenase；ＤａｖＢ）酵素により５−アミノバレルアミド（5-aminovaleramide）に転換され、前記５−アミノバレルアミドはデルタ−アミノバレルアミダーゼ（delta-aminovaleramidase；ＤａｖＡ）酵素により５−アミノバレル酸（5-aminovaleric acid、５−ＡＶＡ）に転換され、前記５−アミノバレル酸は５−アミノバレラートアミノトランスフェラーゼ（5-aminovalerate aminotransferase；ＤａｖＴ）酵素によりグルタレートセミアルデヒド（glutarate semialdehyde）に転換され、前記グルタレートセミアルデヒドはグルタレートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（glutarate semialdehyde dehydrogenase；ＤａｖＤ）酵素によりグルタル酸（glutaric acid）に転換される。しかしながら、シュードモナスプチダ菌株では前記過程により生産されたグルタル酸をアセチル−ＣｏＡ（acetyl-CoA）に変換する過程をさらに含む。
【０００６】
再組合菌株を用いてグルタル酸を生産する従来の先行技術として、韓国登録特許第１０−１２７１１６０号及び先行論文［Park, S. J. et al., Metab Eng., 42-47, 2013］には再組合大腸菌菌株からグルタル酸を製造する方法が開示されており、韓国公開特許第１０−２０１４−０１３２０９３号及び先行論文［Shin, J. H. et al., Microb Cell Fact., 15(1), 174, 2016］には再組合コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）菌株からグルタル酸を製造する方法が開示されたことがある。
【０００７】
しかしながら、本発明の場合、ＤａｖＴ、ＤａｖＤ、ＤａｖＢ、及びＤａｖＡ酵素序列を含む再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株に関するものであって、前記ＤａｖＴ、ＤａｖＤ、ＤａｖＢ、及びＤａｖＡ酵素の最適化されたコドンを含むことも可能であり、特定酵素序列のＬ−末端にヒスティディン−タグを含むことも可能な再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株に関するものである。前記再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株を使用する場合、副産物無しでグルタル酸が大量に生産（最大２４．５ｇ／Ｌのグルタル酸生産）されることを確認することができた。
【０００８】
一方、前記先行文献である韓国登録特許第１０−１２７１１６０号及び先行論文［Park, S. J. et al., Metab Eng., 42-47, 2013］はｄａｖＢ、ｄａｖＡ、ｄａｖＴ、及びｄａｖＤ序列を含む再組合大腸菌菌株や、またはｄａｖＢ、ｄａｖＡ、ｇａｂＴ、及びｇａｂＤ序列を含む再組合大腸菌菌株を用いてグルタル酸を生産したものであって、本発明とは使用した微生物菌株が相異し、長時間培養してもグルタル酸の生産率（０．５〜２ｇ／Ｌ以下に生産）が低いことを確認することができた。
【０００９】
また、前記先行文献である韓国公開特許第１０−２０１４−０１３２０９３号及び先行論文［Shin, J. H. et al., Microb Cell Fact., 15(1), 174, 2016］はｄａｖＢ、ｄａｖＡ、ｇａｂＴ、及びｇａｂＤ序列を含む再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株、またはｄａｖＢ及びｄａｖＡ（または、ｄａｖＡ序列のＮ−末端にヒスチジン−タグを含み）序列を含む再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株を用いてグルタル酸を生産したものであって、本発明とは再組合菌株に含まれた酵素が相異し、特に長時間流加培養を行う場合、５−アミノバレル酸の主生産物と単に副産物としてグルタル酸が生産されることと知られていた。
【００１０】
したがって、本発明のようにグルタル酸の生産量が優れるだけでなく、副産物無しでグルタル酸のみ選択的に生産することが可能であるので、別途の分離精製過程が要求されないので経済的な再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株を開示した以前の報告は未だない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２０１４−０１３２０９３号、コリネバクテリウム属菌株を用いたグルコースからグルタル酸の製造方法、２０１４年１１月１７日、公開。
【特許文献２】韓国登録特許第１０−１７６６９６４号、Ｌ−リシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びこれを用いたＬ−リシン生産方法、２０１７年０８月０３日、登録。
【特許文献３】韓国登録特許第１０−１２７１１６０号、再組合微生物を用いたグルタル酸の製造方法、２０１３年０５月２９日、登録。
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Park, S. J. et al., Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of 5-aminovalerate and glutarate as C5 platform chemicals, Metab Eng., 42-47, 2013. 。
【非特許文献２】Shin, J. H. et al., Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for enhanced production of 5-aminovaleric acid, Microb Cell Fact., 15(1), 174, 2016。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、グルタル酸大量生産用再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株及びこれを用いたグルタル酸大量生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は５−アミノバレラートアミノトランスフェラーゼ（5-aminovalerate aminotransferase；ＤａｖＴ）酵素、グルタレートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（glutarate semialdehyde dehydrogenase；ＤａｖＤ）酵素、リシン−２−モノオキシゲナーゼ（lysine 2-monooxygenase；ＤａｖＢ）酵素、デルタ−アミノバレルアミダーゼ（deltaaminovaleramidase；ＤａｖＡ）酵素、及びＨ３０またはＨ３６プロモーター（promoter）をコーディングするヌクレオチド序列を含む発現ベクターに形質転換されたグルタル酸（glutaric acid）生産用再組合コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）菌株に関するものである。
【００１５】
前記５−アミノバレラートアミノトランスフェラーゼ酵素（ＤａｖＴ）をコーディングするヌクレオチド序列は序列番号１または２と表示され、前記グルタレートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＤａｖＤ）をコーディングするヌクレオチド序列は序列番号３または４と表示され、前記リシン−２−モノオキシゲナーゼ酵素（ＤａｖＢ）をコーディングするヌクレオチド序列は序列番号５または６と表示され、前記デルタ−アミノバレルアミダーゼ酵素（ＤａｖＡ）をコーディングするヌクレオチド序列は序列番号７または８と表示されることを特徴とする。
【００１６】
また、前記発現ベクターはヒスチジン−タグ（polyhistidine-tag、Ｈｉｓ−ｔａｇ）をコーディングするヌクレオチド序列を追加で含み、前記ヒスチジン−タグは６個以上のヒスチジン（histidine）残基（residue）で構成されたアミノ酸モチーフであって、本発明では６個のヒスチジン−タグを使用する。好ましくは前記ヒスチジン−タグをコーディングするヌクレオチド序列は５−アミノバレラートアミノトランスフェラーゼ酵素（ＤａｖＴ）またはリシン−２−モノオキシゲナーゼ酵素（ＤａｖＢ）をコーディングするヌクレオチド序列の５’−末端に位置し、より好ましくは前記ヒスチジン−タグをコーディングするヌクレオチド序列はリシン−２−モノオキシゲナーゼ酵素（ＤａｖＢ）をコーディングするヌクレオチド序列の５’−末端に位置する。
【００１７】
本発明で最も好ましい再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株は、序列番号１の序列を有する５−アミノバレラートアミノトランスフェラーゼ酵素（ＤａｖＴ）、序列番号３の序列を有するグルタレートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（ＤａｖＤ）、序列番号５の序列を有するリシン−２−モノオキシゲナーゼ酵素（ＤａｖＢ）、及び序列番号７の序列を有するデルタ−アミノバレルアミダーゼ酵素（ＤａｖＡ）をコーディングするヌクレオチド序列を含み、序列番号５の序列を有するリシン−２−モノオキシゲナーゼ酵素（ＤａｖＢ）をコーディングするヌクレオチド序列の５’−末端にヒスチジン−タグを含む発現ベクターに形質転換された再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株である。
【００１８】
前記プロモーターは転写を始めることに必要とする序列であって、ｐＬプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔａｃプロモーター、合成プロモーターなどを使用することが一般的であるが、最適の発現強さを示すために、好ましくは合成プロモーターであるＨ３０またはＨ３６プロモーターを使用する。
【００１９】
前記菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムの他にもコリネバクテリウムジプテリエ（Corynebacterium diptheriae）、コリネバクテリウムグラヌロサム（Corynebacterium granulosum）、溶血性コリネバクテリウム（Corynebacterium haemolyticum）、コリネバクテリウムミヌチシマム（Corynebacterium minutissimum）、化膿性コリネバクテリウム（Corynebacterium pyogenes）、潰瘍性コリネバクテリウム（Corynebacterium ulcerans）などのグルコースからＬ−リシンを生産することができるコリネバクテリウム属菌株であれば、特別に制限されずに使用することが可能であるが、好ましくはコリネバクテリウムグルタミカム菌株を使用する。
【００２０】
前記用語“発現ベクター”とは、適当な宿主細胞で目的蛋白質または目的ＲＮＡを発現することができるベクターであって、遺伝子挿入物（前記ポリヌクレオチド）が発現されるように作動可能に連結された必須な調節要素を含む遺伝子作製物を意味する。発現ベクターは、一旦、宿主細胞内にあれば宿主染色体ＤＮＡに関わらず複製することができ、挿入された外来ＤＮＡが発現できる。プラスミドが現在ベクターの最も通常的に使われる形態であるので、本発明の明細書で“プラスミド（plasmid）”及び“ベクター（vector）”は時に相互交換的に使われる。
【００２１】
前記ベクターは、プラスミドベクター、コズミドベクター、バクテリオファージベクター、及びウイルスベクターなどを含むが、これに制限されない。適合した発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーのような発現調節エレメントの他にも膜標的化または分泌のためのシグナル序列またはリーダー序列を含み、目的によって多様に製造できる。ベクターのプロモーターは構成的または誘導性でありうる。また、発現ベクターはベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合、複製起源を含むことができる。
【００２２】
前記用語“形質転換”はＤＮＡを宿主に導入してＤＮＡが染色体外因子として、または染色体統合完成により複製可能になることを意味する。本発明に従う形質転換に使われることができる宿主細胞は、元核または真核細胞全てを含むことができ、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率の高い宿主が使われることができる。例えば、エスケリキア、シュードモナス、バシラス、ストレプトマイセス、真菌、酵母のような周知の真核及び元核宿主、スポドプナテフルギペルダ（ＳＦ９）のような昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０などの動物細胞などが使われることができ、これに制限されるのではない。
【００２３】
形質転換はポリヌクレオチドを導入するどんな方法も含まれて、当分野で公知されたように、宿主細胞によって適合した標準技術を選択して遂行することができる。このような方法には電気衝撃遺伝子伝達法（electroporation）、原形質融合、燐酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈澱、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈澱、シリコンカーバイド繊維を用いた撹拌、アグロバクテリア−媒介形質転換、ＰＥＧ（polyethylene glycol）、デキストランサルフェート、リポフェクタミン、粒子衝撃法（particle bombardment）などが含まれるが、これに制限されない。
【００２４】
また、本発明は、
（１工程）前記発現ベクターに形質転換された再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株をグルコースが含まれた培地で培養してグルタル酸を生産するステップ；及び
（２工程）前記１工程の培養液からグルタル酸を収得するステップ；を含む再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株を用いたグルタル酸生産方法に関するものである。
【００２５】
前記用語“培養”は微生物を適当に人工的に調節した環境条件で生育させることを意味し、灰分培養（batch culture）、流加培養（fed batch culture）などが含まれるが、特別にこれに制限されるのではない。
【００２６】
培養条件は特別にこれに制限されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、燐酸または硫酸）を使用して適正ｐＨ（ｐＨ５乃至９、好ましくはｐＨ６乃至８、最も好ましくはｐＨ６．８）を調節することができ、酸素または酸素−含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持することができる。また、培養温度は２０乃至４５℃、好ましくは２５乃至４０℃を維持することができ、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡生成を抑制することができ、１０乃至１６０時間の間培養することが好ましい。
【００２７】
培養に使われる培地は適切な方式により特定の菌株の要件を満たさなければならず、コリネバクテリウムグルタミカム菌株に対する培養培地は公知されている（例えば、Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981）。使われることができる糖原には、グルコース、スクロース、ラクトース、フラクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナツ油などのオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、アセト酸のような有機酸が含まれる。これら物質は個別的に、または混合物として使われることができる。使われることができる窒素原にはペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆ミール、及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び窒酸アンモニウムが含まれることができる。窒素原も個別的にまたは混合物として使用することができる。使われることができるリンの原料には、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム−含有塩が含まれることができる。また、培養培地は成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有することができる。
【００２８】
また、前記物質に加えて、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が使われることができる。また、培養培地に適切な前駆体が使われることができる。前記の原料は培養過程で培養物に適切な方式により灰分式または連続式により添加できる。
【００２９】
前記培養物からグルタル酸を回収するステップは、当業界に公知された方法により遂行されることができ、遠心分離、濾過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈澱、結晶化、電氣泳動、分別溶解（例えば、アンモニウムサルフェート沈澱）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疏水性、及びサイズ排除）などの方法を使用することができる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明は、グルタル酸生産用再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株及びこれを用いたグルタル酸生産方法に関するものである。前記再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株を使用してグルタル酸を生産する場合、生産量が優れるだけでなく、副産物無しでグルタル酸のみ選択的に生産することが可能であるので、分離精製が要求されなくて経済的であるので、再組合菌株からグルタル酸を生産することに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の実施例１１−１の再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株を２．５Ｌ醗酵器で灰分培養し、これから生産されたグルタル酸を時間によって確認した結果である。
【図２】本発明の実施例１１−１の再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株を５Ｌ醗酵器で流加培養し、これから生産されたグルタル酸を時間によって確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。しかしながら、本発明はここで説明される実施例に限定されず、他の形態に具体化されることもできる。むしろ、ここで紹介される内容が徹底し完全になり、当業者に本発明の思想を十分に伝達するために提供するものである。
【００３３】
＜実施例１．再組合コリネバクテリウムグルタミカム発現ベクター及び菌株構築＞
本発明では再組合菌株からグルタル酸を生産するためにコリネバクテリウムグルタミカム（KCTC 1857, Korean Collection for Type Cultures, South Korea）菌株を用いて、リシン−２−モノオキシゲナーゼ（ＤａｖＢ）酵素、デルタ−アミノバレルアミダーゼ（ＤａｖＡ）酵素、５−アミノバレラートアミノトランスフェラーゼ（ＤａｖＴ）酵素、グルタレートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＤａｖＤ）酵素、Ｈ３０またはＨ３６プロモーター（promoter）、及びヒスチジン−タグ（Ｈｉｓ６−ｔａｇ）序列を含んだ再組合コリネバクテリウムグルタミカム発現ベクターを構築した。この際、前記ｄａｖＴ、ｄａｖＤ、ｄａｖＢ、ｄａｖＡ遺伝子は以下の表１のプライマーを使用してシュードモナスプチダから得た。
【００３４】
また、グルタル酸生産において前記シュードモナスプチダ由来ｄａｖＴ、ｄａｖＤ遺伝子と同一に５−アミノバレル酸をグルタル酸に転換させることに使われるコリネバクテリウムグルタミカム由来酵素遺伝子であるｇａｂＴ、ｇａｂＤ遺伝子を使用してグルタル酸生産効率を比較した。
【００３５】
【表１】
2020028292.tif 000003
【００３６】
発現ベクターを構築するための具体的な方法として、先行文献［Joo, J. C. et al., Bioresour Technol., 245(Pt B), 1692-1700, 2017］を参考にして作ったｐＣＥＳ２０８Ｈ３０ＤａｖＢＡ及びｐＣＥＳ２０８Ｈ３６ＤａｖＢＡのプラスミドをＢａｍＨＩの制限酵素に切断し、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩの制限酵素に切断されたコリネバクテリウムグルタミカム由来ｇａｂＤ遺伝子を挿入して、ｐＣＥＳ２０８Ｈ３０ＧａｂＤＤａｖＢＡ及びｐＣＥＳ２０８Ｈ３６ＧａｂＤＤａｖＢＡを構築した。前記駆逐されたｐＣＥＳ２０８Ｈ３０ＧａｂＤＤａｖＢＡ及びｐＣＥＳ２０８Ｈ３６ＧａｂＤＤａｖＢＡのプラスミドをＢａｍＨＩの制限酵素に切断し、ＢｇｌＩＩの制限酵素に切断されたコリネバクテリウムグルタミカム由来ｇａｂＴ遺伝子を挿入してｐＣＥＳ２０８Ｈ３０ＧａｂＴＤＤａｖＢＡ及びｐＣＥＳ２０８Ｈ３６ＧａｂＴＤＤａｖＢＡを構築した。
【００３７】
以後、同一な方法によりｐＣＥＳ２０８Ｈ３０ＤａｖＢＡ及びｐＣＥＳ２０８Ｈ３６ＤａｖＢＡのプラスミドをＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩに切断されたシュードモナスプチダ由来ｄａｖＤ遺伝子を挿入した後、ＢｇｌＩＩに切断されたシュードモナスプチダ由来ｄａｖＴ遺伝子を挿入してｐＣＥＳ２０８Ｈ３０ＤａｖＴＤＢＡ及びｐＣＥＳ２０８Ｈ３６ＤａｖＴＤＢＡを構築した。
【００３８】
また、序列番号２、４、６、及び８に記載したコドン最適化されたｄａｖＴ、ｄａｖＤ、ｄａｖＢ、及びｄａｖＡ遺伝子（バイオニア、合成依頼）、ｄａｖＴまたはｄａｖＢ序列の５’−末端にＨｉｓ６−ｔａｇ序列が含まれた遺伝子を前記と同一な方法によりプラスミドに挿入して以下の表２の発現ベクターを得た。
【００３９】
以後、前記発現ベクターをコリネバクテリウムグルタミカム菌株に形質転換して以下の表２の実施例１乃至１２及び比較例１乃至２の菌株を確保した。
【００４０】
【表２】
2020028292.tif 000004
2020028292.tif 000005
2020028292.tif 000006
【００４１】
＜実験例１．再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株からグルタル酸の生産確認＞
前記実施例１乃至１２及び比較例１乃至２の再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株を２ｍｌのＲＧ培地（１０ｇ／Ｌグルコース、４０ｇ／Ｌ脳心臓浸出液（brain heart infusion）、１０ｇ／Ｌ肉抽出物（beef extract）、及び３０ｇ／Ｌ of Ｄ−ソルビトール）が含まれた１４ｍｌの丸いチューブ（round bottom tube）に接種し、３０℃及び２５０ｒｐｍの条件でオーバーナイト（overnight）で培養した。
【００４２】
次に、２５０ｍｌフラスコ（baffled flask）に２０ｍｌのＣＧ５０培地及び前記オーバーナイトで培養した培養液を入れて、３０℃及び２５０ｒｐｍの条件で１２０時間の間培養した。この際、前記ＣＧ５０培地は１リットル基準５０ｇグルコース、３０ｇ酵母抽出物（yeast extract）、３０ｇ  （ＮＨ４）２ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ  ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ  ＦeＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｍｇビオチン（biotin）及び０．３ｍｇサイアミン−塩酸塩（thiamine-HCl）が含まれて、追加で２０ｍｇ／Ｌのカナマイシン（kanamycin）を加えた。
【００４３】
また、本発明の実施例１１−１の場合、灰分培養及び流加培養を実施した。まず灰分培養は２．５Ｌ  ｊａｒ醗酵器（BioCNS、Korea）に前記培養液と５００ｍｌのＣＧ１００培地を入れて、３０℃及び６００ｒｐｍの条件で培養した。前記ＣＧ１００培地は１リットル基準１００ｇグルコース、３０ｇ酵母抽出物、３０ｇ  （ＮＨ４）２ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ  ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ  ＦeＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｍｇビオチン、及び０．３ｍｇサイアミン−塩酸塩が含まれて、追加で２０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを加えた。培養する間ｐＨを６．９に維持するために２８％（ｖ／ｖ）ＮＨ４ＯＨを使用し、気泡が形成されることを防止するためにアンチフォーム２０４（Antifoam 204, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）を周期的に加えた。細胞成長（cell growth）は６００ｎｍで吸光度（ＯＤ６００）を測定した。
【００４４】
次に、流加培養は５０ｍｌのＣＧ５０培地及び再組合コリネバクテリウムグルタミカム培養液を入れて、３０℃及び２５０ｒｐｍの条件で６時間の間培養した。以後、５Ｌ  ｊａｒ醗酵器（Biostat B plus controllerが装着、Satorius 5L jar fermenter）に前記培養液を入れて、３０℃及び１０００ｒｐｍの条件で培養した。初期培養は前記灰分培養時に使用したＣＧ１００培地２Ｌを使用し、グルコースの濃度は流入溶液（feeding solution；６７０ｇ／Ｌグルコース、２７０ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び０．５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を使用して１０−４０ｇ／Ｌになるように維持し、２０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを加えた。培養する間ｐＨを６．９に維持するために２８％（ｖ／ｖ）ＮＨ４ＯＨを使用し、気泡が形成されることを防止するためにアンチフォーム２０４を周期的に加えた。細胞成長は６００ｎｍで吸光度（ＯＤ６００）を測定した。
【００４５】
前記２５０ｍｌフラスコで培養した実施例１乃至１２及び比較例１乃至２の培養液を用いて残っているグルコース及び再組合コリネバクテリウムグルタミカムから生産されたグルタル酸を測定するために、以下の表３の条件でＨＰＬＣを遂行し、その結果を表４に示した。
【００４６】
また、表３のＨＰＬＣ条件で実施例１１−１の灰分培養または流加培養の結果を確認し、これを図１及び２に示した。
【００４７】
【表３】
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【００４８】
【表４】
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【００４９】
表４を見ると、実施例１乃至１２の再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株を用いた場合、グルタル酸が０．５〜３．０ｇ／Ｌに生産されることを確認することができた。特に、実施例１１−１及び１１−２のようにｄａｖＢ序列のＮ−末端位置にヒスチジン−タグ序列を含む菌株の場合、グルタル酸の生産量が２．０〜３．０ｇ／Ｌと表れて、従来に報告された再組合コリネバクテリウムグルタミカム菌株である比較例１乃至２に比べてグルタル酸生産量が顕著に優れることが分かった。
【００５０】
また、前記結果に基づいて実施例１１−１を用いてグルタル酸を大量生産した図１及び２を見ると、グルタル酸が最大２４．５ｇ／Ｌまで生産されて副産物がほとんどない、かつ大量のグルタル酸が生産できることを確認することができた。
【００５１】
一方、比較例１乃至２のグルタル酸生産量は０．２ｇ／Ｌ以下に表れて、非常に低い効率でグルタル酸が生成されることを確認することができた。これは、比較例１−１及び１−２のように５−アミノバレル酸をグルタル酸に転換させるコリネバクテリウムグルタミカム内の自体酵素であるＧａｂＴ及びＧａｂＤにより十分に転換されないということを確認することができ、比較例２−１及び２−２のように５−アミノバレル酸をグルタル酸に転換させるコリネバクテリウムグルタミカム内の自体酵素であるＧａｂＴ及びＧａｂＤを過発現させたにもかかわらず、十分に転換されないことを確認した。これを通じて該当酵素はグルタル酸生合成の中間体である５−アミノバレル酸をグルタル酸に転換させる適切な酵素でないと判明されており、本発明で導入したＤａｖＴ及びＤａｖＤ酵素がグルタル酸をより効率よく生産する酵素であることを明らかにすることができた。
【００５２】
したがって、先行文献のように生産効率の低い大腸菌の代わりに、グルタル酸前駆体であるＬ−リシンを過量に生産するコリネバクテリウムグルタミカム菌株を使用し、シュードモナスプチダ由来ｄａｖＴ、ｄａｖＤ、ｄａｖＢ、及びｄａｖＡの遺伝子を全て含み、特にＮ−末端位置にヒスチジン−タグ序列を含むことが副産物がなくて分離精製が要求されないで経済的であるので、グルタル酸のみ選択的に大量生産できる方法であることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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