(57)【要約】      （修正有）【課題】調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のサプレッサー機能を強化して、自己タンパク質に対する炎症応答を減少させたり、該Ｔｒｅｇの機能を阻止すること、又はＴｒｅｇを所望の標的に対する炎症性免疫応答が可能なエフェクターＴ細胞へと再プログラム化することによって、癌、炎症性疾患等を治療する医薬組成物の提供。【解決手段】−１００ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する、ポリスチレン粒子、ダイヤモンド粒子、ラクチド−グリコリド共重合体、ポリ乳酸重合体、乳酸−グリコール酸共重合体等の負に荷電した粒子、及び担体を含み、前記粒子が、結合したペプチド又は抗原性部分を含まない、医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において単球及び／又は好中球アポトーシスを誘導する方法であって、前記対象に、負に荷電した粒子と、担体とを含む薬学的組成物を投与することを含み、前記粒子が、結合したペプチド又は抗原性部分を含まない、方法。
【請求項２】
前記負に荷電した粒子が、ポリスチレン粒子、ダイヤモンド粒子、ＰＬＵＲＩＯＮＩＣＳ安定化ポリプロピレン硫化物粒子、又は乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粒子がポリスチレン粒子である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記粒子がダイヤモンド粒子である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記粒子がＰＬＧＡ粒子である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記粒子がカルボキシル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記粒子が、約−１００ｍＶ未満のゼータ電位を有する、請求項１及び６に記載の方法。
【請求項８】
前記粒子が、−７５ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記粒子が、−５０ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記粒子が、−５０ｍＶ〜−４０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、炎症性免疫応答を寛解させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
炎症性単球、顆粒球、又は抑制性好中球の炎症性病巣への浸潤が、減少させられる及び／又は阻害される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．１μｍ〜約１０μｍである、請求項１及び６に記載の方法。
【請求項１４】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．３μｍ〜約５μｍである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍ〜約３μｍである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍ〜約１μｍである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が自己免疫障害を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記自己免疫障害が、多発性硬化症、強皮症、１型糖尿病、リウマチ性関節炎、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、レイノー症候群、シェーグレン症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性心筋炎、炎症性腸疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、セリアック病、潰瘍性大腸炎、及びクローン病からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が移植レシピエントである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が、虚血性再灌流損傷、アテローム性動脈硬化症を有するか、又は心筋梗塞を患ったことがある、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象が乾癬又は皮膚炎を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象がアレルギー性障害を患う、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記アレルギー性障害が、湿疹、喘息、アレルギー性鼻炎、又は皮膚過敏症である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象が細菌又はウイルス感染を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ウイルス感染が、ヘルペスウイルス感染、肝炎ウイルス感染、西ナイルウイルス感染、フラビウイルス、インフルエンザ感染、ライノウイルス感染、パピローマウイルス感染、又はパラインフルエンザウイルス感染である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ウイルス感染が、前記対象の中枢神経系に感染する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ウイルス感染が、ウイルス性脳炎又はウイルス性髄膜炎を引き起こす、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細菌感染が、前記対象の中枢神経系に感染する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記細菌感染が、敗血症細菌性脳炎又は細菌性髄膜炎を引き起こす、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象が、手術を受けたか、又はこれから受ける、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記負に荷電した粒子が、手術前に対象に投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記負に荷電した粒子が、手術中に対象に投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記負に荷電した粒子が、手術後に対象に投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記対象が、身体的外傷又は損傷を経験した、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物が、経口、経鼻、静脈内、筋肉内、経眼、経皮、又は皮下投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
炎症性障害を持つ対象における炎症環境から炎症誘発性メディエータを除去するための方法であって、負に荷電した粒子と、担体とを含む薬学的組成物を前記対象に投与することを含み、前記粒子が、結合したペプチド又は抗原性部分を含まない、方法。
【請求項３９】
前記対象中で産生された前記炎症誘発性メディエータが、前記負に荷電した粒子に結合する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記負に荷電した粒子が、ポリスチレン粒子、ダイヤモンド粒子、ＰＬＵＲＩＯＮＩＣＳ安定化ポリプロピレン硫化物粒子、又は乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）粒子である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記粒子がポリスチレン粒子である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記粒子がダイヤモンド粒子である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記粒子がＰＬＧＡ粒子である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記粒子がカルボキシル化されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記粒子が、約−１００ｍＶ未満のゼータ電位を有する、請求項３８又は４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記粒子が、−７５ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記粒子が、−５０ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記粒子が、−５０ｍＶ〜−４０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記組成物が、炎症性免疫応答を寛解させる、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
炎症性単球、単球由来抑制細胞、及び／又は抑制性好中球の炎症性病巣への浸潤が、減少させられる及び／又は阻害される、請求項３８に記載の方法。
【請求項５１】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．３８μｍ〜約１０μｍである、請求項１及び４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．３μｍ〜約５μｍである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍ〜約３μｍである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍ〜約１μｍである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記対象が自己免疫障害を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項５７】
前記自己免疫障害が、多発性硬化症、強皮症、１型糖尿病、リウマチ性関節炎、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、レイノー症候群、シェーグレン症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性心筋炎、炎症性腸疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、セリアック病、潰瘍性大腸炎、及びクローン病からなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記対象が移植レシピエントである、請求項３８に記載の方法。
【請求項６０】
前記対象が、虚血性再灌流損傷、アテローム性動脈硬化症を有するか、又は心筋梗塞を患ったことがある、請求項３８に記載の方法。
【請求項６１】
前記対象が乾癬又は皮膚炎を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項６２】
前記対象がアレルギー性障害を患う、請求項３８に記載の方法。
【請求項６３】
前記アレルギー性障害が、湿疹、喘息、アレルギー性鼻炎、又は皮膚過敏症である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記対象が細菌又はウイルス感染を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項６５】
前記ウイルス感染が、ヘルペスウイルス感染、肝炎ウイルス感染、西ナイルウイルス感染、フラビウイルス、インフルエンザ感染、ライノウイルス感染、パピローマウイルス感染、又はパラインフルエンザウイルス感染である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ウイルス感染が、前記対象の中枢神経系に感染する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ウイルス感染が、ウイルス性脳炎又はウイルス性髄膜炎を引き起こす、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記細菌感染が、前記対象の中枢神経系に感染する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記細菌感染が、敗血症細菌性脳炎又は細菌性髄膜炎を引き起こす、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記対象が、手術を受けたか、又はこれから受ける、請求項３８に記載の方法。
【請求項７１】
前記負に荷電した粒子が、手術前に前記対象に投与される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記負に荷電した粒子が、手術中に前記対象に投与される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記負に荷電した粒子が、手術後に前記対象に投与される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記対象が、身体的外傷又は損傷を経験した、請求項３８に記載の方法。
【請求項７５】
前記組成物が、経口、経鼻、静脈内、筋肉内、経眼、経皮、又は皮下投与される、請求項３８に記載の方法。
【請求項７６】
対象において抗原特異的寛容を誘導する方法であって、中に１つ又は２つ以上の抗原が埋め込まれた負に荷電した粒子と、担体とを含む薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項７７】
前記負に荷電した粒子が、ポリスチレン粒子、ダイヤモンド粒子、ＰＬＵＲＩＯＮＩＣＳ安定化ポリプロピレン硫化物粒子、又は乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）粒子である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記粒子がポリスチレン粒子である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記粒子がダイヤモンド粒子である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記粒子がＰＬＧＡ粒子である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
前記粒子がカルボキシル化されている、請求項７６に記載の方法。
【請求項８２】
前記粒子が、約−１００ｍＶ未満のゼータ電位を有する、請求項７６又は８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記粒子が、−７５ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記粒子が、−５０ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記粒子が、−５０ｍＶ〜−４０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記組成物が、炎症性免疫応答を寛解させる、請求項７６に記載の方法。
【請求項８７】
炎症性単球、顆粒球、及び／又は抑制性好中球の炎症性病巣への浸潤が、減少させられる及び／又は阻害される、請求項７６に記載の方法。
【請求項８８】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．１μｍ〜約１０μｍである、請求項７６又は８１に記載の方法。
【請求項８９】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．３μｍ〜約５μｍである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍ〜約３μｍである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍ〜約１μｍである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記対象が自己免疫障害を有する、請求項７６に記載の方法。
【請求項９４】
前記自己免疫障害が、多発性硬化症、強皮症、１型糖尿病、リウマチ性関節炎、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、レイノー症候群、シェーグレン症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性心筋炎、炎症性腸疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、セリアック病、潰瘍性大腸炎、及びクローン病からなる群から選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記対象が移植レシピエントである、請求項７６に記載の方法。
【請求項９７】
前記対象が、虚血性再灌流損傷、アテローム性動脈硬化症を有するか、又は心筋梗塞を患ったことがある、請求項７６に記載の方法。
【請求項９８】
前記対象が乾癬又は皮膚炎を有する、請求項７６に記載の方法。
【請求項９９】
前記対象がアレルギー性障害を患う、請求項７６に記載の方法。
【請求項１００】
前記アレルギー性障害が、湿疹、喘息、アレルギー性鼻炎、又は皮膚過敏症である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記対象が細菌又はウイルス感染を有する、請求項７６に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ウイルス感染が、ヘルペスウイルス感染、肝炎ウイルス感染、西ナイルウイルス感染、フラビウイルス、インフルエンザ感染、ライノウイルス感染、パピローマウイルス感染、又はパラインフルエンザウイルス感染である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ウイルス感染が、前記対象の中枢神経系に感染する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ウイルス感染が、ウイルス性脳炎又はウイルス性髄膜炎を引き起こす、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記細菌感染が、前記対象の中枢神経系に感染する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０６】
前記細菌感染が、敗血症細菌性脳炎又は細菌性髄膜炎を引き起こす、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記対象が、手術を受けたか、又はこれから受ける、請求項７６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記負に荷電した粒子が、手術前に前記対象に投与される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記負に荷電した粒子が、手術中に前記対象に投与される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１０】
前記負に荷電した粒子が、手術後に前記対象に投与される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１１】
前記対象が、身体的外傷又は損傷を経験した、請求項７６に記載の方法。
【請求項１１２】
前記組成物が、経口、経鼻、静脈内、筋肉内、経眼、経皮、又は皮下投与される、請求項７６に記載の方法。
【請求項１１３】
前記組成物が、前記対象において心筋梗塞後の炎症性傷害からの保護を提供する、請求項２２、６０、又は９７に記載の方法。
【請求項１１４】
前記組成物が、前記対象において再灌流後の炎症性傷害からの保護を提供する、請求項２２、６０、又は９７に記載の方法。
【請求項１１５】
傷害組織の再生を増加させることを、それを必要とする患者において行う方法であって、負に荷電した粒子と、担体とを含む薬学的組成物を投与することを含み、前記粒子が、結合したペプチド又は抗原性部分を含まない、方法。
【請求項１１６】
上皮細胞再生が大腸炎患者において増加させられる、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
再ミエリン化が多発性硬化症患者において増加させられる、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１８】
対象において単球、顆粒球、及び／又は好中球アポトーシスを誘導する方法であって、負に荷電した粒子を含む薬学的組成物を前記対象に投与することを含み、前記粒子が、アレルギー、自己免疫疾患、及び／又は炎症性疾患若しくは障害と関連付けられる１つ又は２つ以上のエピトープを含む抗原と、担体とを含む、方法。
【請求項１１９】
負に荷電した粒子を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、前記対象において抗原特異的寛容を誘導する方法であって、前記粒子が、アレルギー、自己免疫疾患、及び／又は炎症性疾患若しくは障害と関連付けられる１つ又は２つ以上のエピトープを含む抗原と、担体とを含む、方法。
【請求項１２０】
前記１つ又は２つ以上のエピトープが、表１又は２に記載されるものから選択される、請求項１１８又は１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記負に荷電した粒子が、ポリスチレン粒子、ダイヤモンド粒子、ＰＬＵＲＩＯＮＩＣＳ安定化ポリプロピレン硫化物粒子、又は乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）粒子である、請求項１１８又は１１９に記載の方法。
【請求項１２２】
前記粒子がカルボキシル化されている、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記粒子が、約−１００ｍＶ未満のゼータ電位を有する、請求項１１８又は１１９に記載の方法。
【請求項１２４】
前記粒子が、−７５ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記粒子が、−５０ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記粒子が、−５０ｍＶ〜−４０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記組成物が、炎症性免疫応答を寛解させる、請求項１１８又は１１９に記載の方法。
【請求項１２８】
炎症性単球及び／又は抑制性好中球の炎症性病巣への浸潤が、減少させられる及び／又は阻害される、請求項１１８又は１１９に記載の方法。
【請求項１２９】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．１μｍ〜約１０μｍである、請求項１１８又は１１９に記載の方法。
【請求項１３０】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．３μｍ〜約５μｍである、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍ〜約３μｍである、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍ〜約１μｍである、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍである、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記対象が自己免疫障害を有する、請求項１１８又は１１９に記載の方法。
【請求項１３５】
前記自己免疫障害が、多発性硬化症、強皮症、１型糖尿病、リウマチ性関節炎、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、レイノー症候群、シェーグレン症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性心筋炎、炎症性腸疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、セリアック病、潰瘍性大腸炎、及びクローン病からなる群から選択される、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記抗原が、ミエリン塩基性タンパク質の１つ又は２つ以上のエピトープを含む、請求項１１８又は１１９に記載の組成物。
【請求項１３７】
前記抗原が、配列番号４９７５又は配列番号４９７６の１つ又は２つ以上のエピトープを含む、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１３８】
前記抗原が、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の１つ又は２つ以上のエピトープを含む、請求項１１８又は１１９に記載の組成物。
【請求項１３９】
前記抗原が、配列番号１又は配列番号４９７８のうちの１つ又は２つ以上である。
【請求項１４０】
前記抗原が、インスリンの１つ又は２つ以上のエピトープを含む、請求項１１８又は１１９に記載の組成物。
【請求項１４１】
前記抗原が、配列番号４９８１の１つ又は２つ以上のエピトープを含む、請求項１４０に記載の組成物。
【請求項１４２】
前記抗原が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）の１つ又は２つ以上のエピトープを含む、請求項１１８又は１１９に記載の組成物。
【請求項１４３】
前記抗原が、配列番号４９８２の１つ又は２つ以上のエピトープを含む、請求項１４２に記載の組成物。
【請求項１４４】
前記抗原が、プロテオリピドタンパク質の１つ又は２つ以上のエピトープを含む、請求項１１８又は１１９に記載の組成物。
【請求項１４５】
前記抗原が、配列番号４９７７の１つ又は２つ以上のエピトープを含む、請求項１４４に記載の組成物。
【請求項１４６】
前記抗原が、グリアデンの１つ又は２つ以上のエピトープを含む、請求項１１８又は１１９に記載の組成物。
【請求項１４７】
前記抗原が、配列番号４９８３〜４９８５又は５１３６〜５１４０の１つ又は２つ以上のエピトープを含む、請求項１４７に記載の組成物。
【請求項１４８】
前記抗原が、アクアポリンの１つ又は２つ以上のエピトープを含む、請求項１１８又は１１９に記載の組成物。
【請求項１４９】
前記抗原が、配列番号４９７９の１つ又は２つ以上のエピトープを含む、請求項１４９に記載の組成物。
【請求項１５０】
前記抗原が、ミエリン関連糖タンパク質の１つ又は２つ以上のエピトープを含む、請求項１１８又は１１９に記載の組成物。
【請求項１５１】
前記抗原が、配列番号４９８０の１つ又は２つ以上のエピトープを含む、請求項１５０に記載の組成物。
【請求項１５２】
前記抗原が、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖の１つ又は２つ以上のエピトープを含む、請求項１１８又は１１９に記載の組成物。
【請求項１５３】
前記抗原が、配列番号５０１７の１つ又は２つ以上のエピトープを含む、請求項１５２に記載の組成物。
【請求項１５４】
対象において調節性Ｔ細胞を誘導する方法であって、負に荷電した粒子と、担体とを含む薬学的組成物を前記対象に投与することを含み、前記負に荷電した粒子が、結合したペプチド又は抗原性部分を含まない、方法。
【請求項１５５】
前記調節性Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞が、ＣＤ２５＋及び／又はＦｏｘＰ３＋である、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
前記調節性Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋である、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５８】
前記負に荷電した粒子が、ポリスチレン粒子、ダイヤモンド粒子、ＰＬＵＲＩＯＮＩＣＳ安定化ポリプロピレン硫化物粒子、又は乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）粒子である、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５９】
前記粒子がポリスチレン粒子である、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
前記粒子がダイヤモンド粒子である、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６１】
前記粒子がＰＬＧＡ粒子である、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６２】
前記粒子がカルボキシル化されている、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１６３】
前記粒子が、約−１００ｍＶ未満のゼータ電位を有する、請求項１５４又は１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記粒子が、−７５ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記粒子が、−５０ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記粒子が、−５０ｍＶ〜−４０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．１μｍ〜約１０μｍである、請求項１５４又は１６２に記載の方法。
【請求項１６８】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．３μｍ〜約５μｍである、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍ〜約３μｍである、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍ〜約１μｍである、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍである、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記対象が自己免疫障害を有する、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１７３】
前記自己免疫障害が、多発性硬化症、強皮症、１型糖尿病、リウマチ性関節炎、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、レイノー症候群、シェーグレン症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性心筋炎、炎症性腸疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、セリアック病、潰瘍性大腸炎、及びクローン病からなる群から選択される、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
前記対象が移植レシピエントである、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１７６】
前記対象が、虚血性再灌流損傷、アテローム性動脈硬化症を有するか、又は心筋梗塞を患ったことがある、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１７７】
前記対象が乾癬又は皮膚炎を有する、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１７８】
前記対象がアレルギー性障害を患う、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１７９】
前記アレルギー性障害が、湿疹、喘息、アレルギー性鼻炎、又は皮膚過敏症である、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
前記対象が細菌又はウイルス感染を有する、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１８１】
前記ウイルス感染が、ヘルペスウイルス感染、肝炎ウイルス感染、西ナイルウイルス感染、フラビウイルス、インフルエンザ感染、ライノウイルス感染、パピローマウイルス感染、又はパラインフルエンザウイルス感染である、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
前記ウイルス感染が、前記対象の中枢神経系に感染する、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
前記ウイルス感染が、ウイルス性脳炎又はウイルス性髄膜炎を引き起こす、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
前記細菌感染が、前記対象の中枢神経系に感染する、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８５】
前記細菌感染が、敗血症細菌性脳炎又は細菌性髄膜炎を引き起こす、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
前記対象が、手術を受けたか、又はこれから受ける、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１８７】
前記負に荷電した粒子が、手術前に前記対象に投与される、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１８８】
前記負に荷電した粒子が、手術中に前記対象に投与される、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１８９】
前記負に荷電した粒子が、手術後に前記対象に投与される、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１９０】
前記対象が、身体的外傷又は損傷を経験した、請求項１５４に記載の方法。
【請求項２００】
前記組成物が、経口、経鼻、静脈内、筋肉内、経眼、経皮、又は皮下投与される、請求項１５４に記載の方法。
【請求項２０１】
炎症性障害を持つ対象中の血清又は血漿から調節タンパク質を濃縮するための方法であって、負に荷電した粒子と、担体とを含む薬学的組成物を前記対象に投与することを含み、前記粒子が、結合したペプチド又は抗原性部分を含まない、方法。
【請求項２０２】
前記対象中で産生された前記調節タンパク質が、前記負に荷電した粒子に結合する、請求項３８に記載の方法。
【請求項２０３】
前記負に荷電した粒子が、ポリスチレン粒子、ダイヤモンド粒子、ＰＬＵＲＩＯＮＩＣＳ安定化ポリプロピレン硫化物粒子、又は乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）粒子である、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０４】
前記粒子がポリスチレン粒子である、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０５】
前記粒子がダイヤモンド粒子である、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０６】
前記粒子がＰＬＧＡ粒子である、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０７】
前記粒子がカルボキシル化される、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０８】
前記粒子が、約−１００ｍＶ未満のゼータ電位を有する、請求項２０１又は２０７に記載の方法。
【請求項２０９】
前記粒子が、−７５ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項２０８に記載の方法。
【請求項２１０】
前記粒子が、−５０ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１１】
前記粒子が、−５０ｍＶ〜−４０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１２】
前記組成物が、炎症性免疫応答を寛解させる、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２１３】
炎症性単球、単球由来抑制細胞、及び／又は抑制性好中球の炎症性病巣への浸潤が、減少させられる及び／又は阻害される、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２１４】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．２０１μｍ〜約１０μｍである、請求項２０１及び２０７に記載の方法。
【請求項２１５】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．３μｍ〜約５μｍである、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２１６】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍ〜約３μｍである、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２１７】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍ〜約１μｍである、請求項２１６に記載の方法。
【請求項２１８】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍである、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２１９】
前記対象が自己免疫障害を有する、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２２０】
前記自己免疫障害が、多発性硬化症、強皮症、１型糖尿病、リウマチ性関節炎、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、レイノー症候群、シェーグレン症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性心筋炎、炎症性腸疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、セリアック病、潰瘍性大腸炎、及びクローン病からなる群から選択される、請求項２１９に記載の方法。
【請求項２２１】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項２２０に記載の方法。
【請求項２２２】
前記対象が移植レシピエントである、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２２３】
前記対象が、虚血性再灌流損傷、アテローム性動脈硬化症を有するか、又は心筋梗塞を患ったことがある、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２２４】
前記対象が乾癬又は皮膚炎を有する、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２２５】
前記対象がアレルギー性障害を患う、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２２６】
前記アレルギー性障害が、湿疹、喘息、アレルギー性鼻炎、又は皮膚過敏症である、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２２７】
前記対象が細菌又はウイルス感染を有する、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２２８】
前記ウイルス感染が、ヘルペスウイルス感染、肝炎ウイルス感染、西ナイルウイルス感染、フラビウイルス、インフルエンザ感染、ライノウイルス感染、パピローマウイルス感染、又はパラインフルエンザウイルス感染である、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２２９】
前記ウイルス感染が、前記対象の中枢神経系に感染する、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３０】
前記ウイルス感染が、ウイルス性脳炎又はウイルス性髄膜炎を引き起こす、請求項２２９に記載の方法。
【請求項２３１】
前記細菌感染が、前記対象の中枢神経系に感染する、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３２】
前記細菌感染が、敗血症細菌性脳炎又は細菌性髄膜炎を引き起こす、請求項６８に記載の方法。
【請求項２３３】
前記対象が、手術を受けたか、又はこれから受ける、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２３４】
前記負に荷電した粒子が、手術前に前記対象に投与される、請求項２３３に記載の方法。
【請求項２３５】
前記負に荷電した粒子が、手術中に前記対象に投与される、請求項２３３に記載の方法。
【請求項２３６】
前記負に荷電した粒子が、手術後に前記対象に投与される、請求項２３３に記載の方法。
【請求項２３７】
前記対象が、身体的外傷又は損傷を経験した、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２３８】
前記組成物が、経口、経鼻、静脈内、筋肉内、経眼、経皮、又は皮下投与される、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２３９】
対象における炎症状態を診断するための方法であって、
（ａ）前記対象から血液を取り出すことと、
（ｂ）前記血液を分離させて、血清及び／又は血漿を単離することと、
（ｃ）前記血清及び／又は血漿を、負に荷電した粒子と共に一定期間インキュベートすることと、
（ｄ）前記負に荷電した粒子に結合したタンパク質を単離又は精製することと、
（ｅ）（ｄ）において前記負に荷電した粒子から精製した前記タンパク質が、表６に列挙するタンパク質のうちの１つ又は２つ以上を含むときに、対象が炎症状態を経ていると決定することと、を含む、方法。
【請求項２４０】
対象における炎症状態を診断するための方法であって、
（ａ）前記対象に、負に荷電した粒子を含む組成物を静脈内投与することであって、前記負に荷電した粒子が、結合したペプチド又は抗原性部分を含まない、投与することと、
（ｂ）工程（ａ）において投与した前記負に荷電した粒子を、前記対象の前記血液から取り出すことと、
（ｃ）前記負に荷電した粒子に結合したタンパク質を単離又は精製することと、
（ｄ）（ｃ）において前記負に荷電した粒子から精製した前記タンパク質が、表６に列挙するタンパク質のうちの１つ又は２つ以上を含むときに、対象が炎症状態を経ていると決定することと、を含む、方法。
【請求項２４１】
（ｃ）において前記負に荷電した粒子から精製した前記タンパク質が、表６に列挙するタンパク質のうちの２個以上を含む、請求項２３９又は２４０に記載の方法。
【請求項２４２】
（ｃ）において前記負に荷電した粒子から精製した前記タンパク質が、表６に列挙するタンパク質のうちの３個以上を含む、請求項２３９又は２４０に記載の方法。
【請求項２４３】
（ｃ）において前記負に荷電した粒子から精製した前記タンパク質が、表６に列挙するタンパク質のうちの４個以上を含む、請求項２３９又は２４０に記載の方法。
【請求項２４４】
（ｃ）において前記負に荷電した粒子から精製した前記タンパク質が、表６に列挙するタンパク質のうちの５個以上を含む、請求項２３９又は２４０に記載の方法。
【請求項２４５】
（ｃ）において前記負に荷電した粒子から精製した前記タンパク質が、表６に列挙するタンパク質のうちの１０個以上を含む、請求項２３９又は２４０に記載の方法。
【請求項２４６】
前記負に荷電した粒子が、ポリスチレン粒子、ダイヤモンド粒子、ＰＬＵＲＩＯＮＩＣＳ安定化ポリプロピレン硫化物粒子、又は乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）粒子である、請求項２３９又は２４０に記載の方法。
【請求項２４７】
前記粒子がポリスチレン粒子である、請求項２４６に記載の方法。
【請求項２４８】
前記粒子がダイヤモンド粒子である、請求項２４６に記載の方法。
【請求項２４９】
前記粒子がＰＬＧＡ粒子である、請求項２４６に記載の方法。
【請求項２５０】
前記粒子がカルボキシル化されている、請求項２３９又は２４０に記載の方法。
【請求項２５１】
前記粒子が、約−１００ｍＶ未満のゼータ電位を有する、請求項２５０に記載の方法。
【請求項２５２】
前記粒子が、−７５ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項２５１に記載の方法。
【請求項２５３】
前記粒子が、−５０ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項２５２に記載の方法。
【請求項２５４】
前記粒子が、−５０ｍＶ〜−４０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項２５３に記載の方法。
【請求項２５５】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．１μｍ〜約１０μｍである、請求項２３９又は２４０に記載の方法。
【請求項２５６】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．３μｍ〜約５μｍである、請求項２５５に記載の方法。
【請求項２５７】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍ〜約３μｍである、請求項２５６に記載の方法。
【請求項２５８】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍ〜約１μｍである、請求項２５７に記載の方法。
【請求項２５９】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．５μｍである、請求項２５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年３月１３日出願の米国仮出願第６１／７７９，１８２号、２０１３年７月１１日出願の同第６１／８４４，９６１号、２０１３年８月１３日出願の同第６１／８６５，３９２号、及び２０１３年１０月４日出願の同第６１／８７７，２１２号への優先権を主張し、これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（電子的に提出されたテキストファイルの説明）
同封の電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＣＯＵＲ−００１＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１４年３月１３日、ファイルサイズ１．２メガバイト）。
【背景技術】
【０００３】
炎症性疾患及び障害は、異常あるいは無秩序な炎症応答が疾患の病因又は重症度に寄与する状態である。例としては、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、セリアック病、及び糖尿病などの自己免疫疾患、結核、並びに西ナイルウイルス脳炎を含む種々の形態の髄膜炎及び脳炎、そして心筋梗塞及び移植再灌流損傷などの虚血性再灌流疾患が挙げられる。加えて、手術、損傷、又は他の組織外傷後に観察される炎症の増加は、患者の回復に悪影響を及ぼし得る。
【０００４】
これらの疾患又は障害の多くは、組織損傷又は他の傷害の部位における多核／単核細胞浸潤を特徴とする。これらの浸潤において観察された単核細胞の例としては、リンパ球、特にＴリンパ球、並びに単球、マクロファージ、樹状細胞、ミクログリア細胞、及び他のものなどの、単核食細胞系（ＭＰＳ細胞）の細胞が挙げられる。
【０００５】
単核細胞浸潤において観察される細胞の多くは、これらの異常炎症応答に関与することが疑われる。例えば、多発性硬化症などの疾患では、ＣＤ４＋  Ｔ細胞が病的免疫応答において中心的役割を果たすことが知られている。Ｔ細胞活性化の早期の時点では、樹状細胞及び他のＭＰＳ細胞が、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性化の原因であり得る。ＭＰＳ細胞も食作用を通して炎症に寄与するが、少なくとも一部の炎症性疾患では、このような細胞がＣＤ４＋  Ｔ細胞の不在下でそれが可能であるのかは明らかではない。
【０００６】
末梢血単球は、発現に従って１つ若しくは２つ以上の群に分類され得るか、又はある特定の細胞表面分子のものではない。具体的には、ヒト「常在単球」又は「成熟単球」は、ＣＤ１４ｌｏＣＤ１６＋表現型（マウスの対応部分はＣＸ３ＣＲ１ｈｉＣＣＲ２−Ｇｒ１−である）を有すると理解されている。細胞の別の群「炎症性単球」又は「未熟単球」は、ＣＤ１４＋ＣＤ１６−表現型（マウスの対応部分は（ＣＸ３ＣＲ１ｌｏＣＣＲ２＋Ｇｒ１＋である）を有すると理解されている。（Ｇｅｉｓｓｍａｎｎ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９：７１〜８２）
【０００７】
炎症性単球は、広範な免疫介在性疾患及び障害に関与することが見出されている。炎症組織に進入すると、ＬＹ６Ｃｈｉ炎症性単球は、やがては組織傷害、瘢痕化、及び更には死亡に至る多数の炎症誘発性サイトカイン、プロテアーゼ、及び一酸化窒素を含む他のメディエータを分泌し得る、組織マクロファージ又は樹状細胞（ＤＣ）へと分化する。（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０５：２３１９〜２３３７、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１１  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８６：５０８〜５１５、Ｓｃｈｉｏｐｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１２  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ２２３：２９１〜２９８、Ｓｗｉｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２０：２６２７〜２６３４、Ｓｗｉｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，２００９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５：６１２〜６１６、Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍ．Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ、Ｎａｈｒｅｎｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２１：２４３７〜２４４５）。炎症性単球の阻害は、病変を減少させるだけではなく、ある特定の炎症状態においては修復機序の早期開始も可能にし得る。現在に至るまで、これらの転帰を変更する、炎症性単球を特異的に標的化するための安全かつ有効な療法は存在しない。医師らは、炎症性単球応答の成分を短期間中和する、広域作用性ステロイド、非ステロイド系抗炎症剤、又は抗体に頼っている。
【０００８】
大部分の疾患状態における炎症性単球及び多形核細胞の役割、血流中のへのそれらの治療的到達性、及び粒子と相互作用するそれらの本質的傾向を考慮すると、粒子ベースの治療薬が、抗体又は小分子と比べて、これらの細胞を特異的に標的化することにより良く対応している可能性がある。現在に至るまで、この領域における研究は、予防接種を目的とした癌治療薬又は抗原性物質の送達の強化を可能にするための、ナノ粒子又は微粒子と共役した遅延放出性小分子治療薬の製剤化に集中した（Ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：１３３〜１４９）。しかしながら、薬学的有効成分を担持しない粒子それ自体のインビボにおける免疫調節資質は、大抵の場合に見落とされてきた。
【０００９】
自然の白血球クリアランス、及びアポトーシスを誘導する能力は、依然として、炎症由来のマクロファージ及び樹状細胞を含む特定の細胞サブセットと関連付けられる病変を減少させることを目的とする療法の主要目的であり続ける。驚くべきことに、ポリスチレン、ナノダイヤモンド、又は生分解性乳酸−グリコール酸共重合体由来の免疫修飾粒子（ＩＭＰ）は、注入時に、コラーゲン構造を持つマクロファージ受容体（ＭＡＲＣＯ）を通して炎症性単球によって吸収され、それらがカスパーゼ３介在性アポトーシスを受ける脾臓における単球の遊走及び分画を引き起こすことが見出された。おそらくより驚くべきことに、炎症の急性モデルにおける免疫修飾粒子（ＩＭＰ）の標的化した投与は、炎症の原発部位での炎症性単球の蓄積を減少させただけではなく、全モデルにおいて病変及び疾患重症度を減少させた。ＩＭＰは、炎症性単球によって引き起こされる又は増強される疾患に対する、汎用性があり容易に変換可能な治療選択肢である。ＩＭＰは、新規かつ安全な炎症性単球特異的療法を代表する。
【００１０】
調節性Ｔ細胞（又はＴｒｅｇ）は、末梢における自己免疫及び一般的炎症を制御することにおいて重要な免疫調節細胞型である。Ｔｒｅｇは、通常ＣＤ２５を構造的に発現するＣＤ４陽性細胞である。したがって、Ｔｒｅｇは、多くの場合にＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔ細胞である。これらの調節性Ｔ細胞は、感染性疾患、自己免疫、妊娠、及び腫瘍を含むがこれらに限定されない様々な炎症状態におけるＴ細胞介在性免疫の強力なサプレッサーである。インビボにおいて、少数のＴｒｅｇは、多数の活性化されたエフェクターＴ細胞を制御することができる。単離したばかりのＴｒｅｇは最小限の構成的エフェクター機能を呈するが、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）をインビトロにおいてライゲーションすること又はマウスをインビボにおいて高用量の自己抗原で予備免疫することは、Ｔｒｅｇのサプレッサー機能を刺激する。Ｔ細胞のサプレッサー機能を強化するためのＴＣＲライゲーションに対する要件は、大部分のＴ細胞が構成的に発現される自己抗原を認識すると考えられることから、逆説的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
Ｔｒｅｇのサプレッサー機能を強化して、自己タンパク質に対する炎症応答を減少させることが、自己免疫疾患などの炎症状況において望ましい。逆に、例えば免疫応答を腫瘍に適用しようとする場合、Ｔｒｅｇの機能を阻止すること、又はＴｒｅｇを、所望の標的に対する炎症性免疫応答が可能なエフェクターＴ細胞へと再プログラム化することのいずれかによって、Ｔｒｅｇ機能をオフにすることが望ましいことがある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明には、修飾された粒子単独、つまり、ペプチドに結合していない粒子が、必要な患者において炎症性免疫応答を寛解させることに有効であるという驚くべき発見が関与する。驚くべきことに、炎症性免疫応答を減退させ、炎症性疾患を治療するために必要なのは、負に荷電した粒子の投与だけであり、それをペプチドに結合させる必要はない。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、負に荷電した粒子及び担体を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、対象において単球、顆粒球、及び／又は好中球アポトーシスを誘導する方法を提供する。更なる実施形態では、負に荷電した粒子は、結合したペプチド又は抗原性部分を含まない。一部の実施形態では、負に荷電した粒子はポリスチレン粒子である。他の実施形態では、負に荷電した粒子はダイヤモンド粒子である。また他の実施形態では、負に荷電した粒子は、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）粒子である。一部の実施形態では、粒子は、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）安定化ポリプロピレン硫化物粒子である。また他の実施形態では、負に荷電した粒子はカルボキシル化される。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、負に荷電した粒子及び担体を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、対象における抗炎症性ＣＤ１０３＋樹状細胞及び調節性Ｔ細胞の誘導及び増殖方法を提供する。更なる実施形態では、負に荷電した粒子は、結合したペプチド又は抗原性部分を含まない。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、負に荷電した粒子及び担体を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、炎症性障害を持つ対象中の炎症環境から炎症誘発性メディエータを除去するための方法を提供する。更なる実施形態では、負に荷電した粒子は、結合したペプチド又は抗原性部分を含まない。一部の実施形態では、負に荷電した粒子はポリスチレン粒子である。他の実施形態では、負に荷電した粒子はダイヤモンド粒子である。また他の実施形態では、負に荷電した粒子は、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）粒子である。一部の実施形態では、粒子は、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）安定化ポリプロピレン硫化物粒子である。更なる実施形態では、負に荷電した粒子はカルボキシル化される。更なる実施形態では、負に荷電した粒子は、対象中で産生される炎症誘発性ポリペプチドに結合する。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、負に荷電した粒子及び担体を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、炎症性障害を持つ対象中の炎症環境からの調節タンパク質を濃縮し提示するための方法を提供する。更なる実施形態では、負に荷電した粒子は、結合したペプチド又は抗原性部分を含まない。一部の実施形態では、負に荷電した粒子はポリスチレン粒子である。他の実施形態では、負に荷電した粒子はダイヤモンド粒子である。また他の実施形態では、負に荷電した粒子は、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）粒子である。一部の実施形態では、粒子は、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）安定化ポリプロピレン硫化物粒子である。更なる実施形態では、負に荷電した粒子はカルボキシル化される。更なる実施形態では、負に荷電した粒子は、対象中で産生される調節タンパク質に結合する。
【００１７】
また更なる実施形態では、本発明は、負に荷電した粒子が濃縮調節タンパク質を濃縮し提示して、対象における炎症性免疫応答を寛解させるように、調節タンパク質を事前に吸収させた負に荷電した粒子を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、対象において病変状態の及び／又は不必要な炎症性免疫応答を制御するための方法を提供する。更なる実施形態では、負に荷電した粒子は、結合したペプチド又は抗原性部分を含まない。一部の実施形態では、負に荷電した粒子はポリスチレン粒子である。他の実施形態では、負に荷電した粒子はダイヤモンド粒子である。また他の実施形態では、負に荷電した粒子は、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）粒子である。一部の実施形態では、粒子は、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）安定化ポリプロピレン硫化物粒子である。更なる実施形態では、負に荷電した粒子はカルボキシル化される。
【００１８】
一実施形態では、中に１つ又は２つ以上の抗原が埋め込まれた負に荷電した粒子と、担体とを含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、対象において抗原特異的寛容を誘導する方法を提供する。更なる実施形態では、負に荷電した粒子は、結合したペプチド又は抗原性部分を含まない。一部の実施形態では、負に荷電した粒子はポリスチレン粒子である。他の実施形態では、負に荷電した粒子はダイヤモンド粒子である。また他の実施形態では、負に荷電した粒子は、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）粒子である。一部の実施形態では、粒子は、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）安定化ポリプロピレン硫化物粒子である。更なる実施形態では、負に荷電した粒子はカルボキシル化される。更なる実施形態では、負に荷電した粒子は、対象中で産生される炎症誘発性ポリペプチドに結合する。
【００１９】
一実施形態では、粒子は、１つ又は２つ以上のエピトープを含む抗原に結合する。更なる実施形態では、エピトープは、アレルギー、自己免疫疾患、又は炎症性疾患若しくは障害と関連付けられる。一実施形態では、エピトープは、１型糖尿病、多発性硬化症、セリアック病、又はクローン病若しくは大腸炎、例えば潰瘍性大腸炎を含む、炎症性腸疾患と関連付けられる。一実施形態では、エピトープは、表１又は２に記載するエピトープである。一実施形態では、粒子は、１つの疾患及び／又は障害と関連付けられる１つのエピトープのみを含む抗原に結合させられる。更なる実施形態では、抗原は、同じ疾患及び／又は障害と関連付けられる２つ以上のエピトープを含む。更なる実施形態では、抗原は、異なる疾患及び／又は障害と関連付けられる２つ以上のエピトープを含む。
【００２０】
一実施形態では、負に荷電した粒子は、約−１００ｍＶ未満のゼータ電位を有する。別の実施形態では、負に荷電した粒子は、約−５０ｍＶ未満のゼータ電位を有する。一実施形態では、負に荷電した粒子は、−１００ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する。一部の実施形態では、−７５ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を持つ負に荷電した粒子は、カルボキシル化される。別の実施形態では、負に荷電した粒子は、−６０ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する。別の実施形態では、負に荷電した粒子は、−５０ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する。特定の実施形態では、負に荷電した粒子は、−５０ｍＶ〜−４０ｍＶのゼータ電位を有する。別の実施形態では、負に荷電した粒子は、−１００ｍＶ〜−５０ｍＶのゼータ電位を有する。一実施形態では、負に荷電した粒子は、−７５ｍＶ〜−５０ｍＶのゼータ電位を有する。
【００２１】
一実施形態では、本発明の薬学的製剤は、炎症性単球の炎症性病巣への浸潤を減少させる及び／又は阻害する。別の実施形態では、本発明の薬学的製剤は炎症性免疫応答を寛解させる。
【００２２】
一実施形態では、本発明の薬学的製剤は調節性Ｔ細胞の数を増加させる。別の実施形態では、本発明の薬学的製剤は炎症性免疫応答を寛解させる。
【００２３】
一実施形態では、本発明の薬学的製剤は、約０．１μｍ〜約１０μｍの平均粒径を持つ負に荷電した粒子を含む。別の実施形態では、負に荷電した粒子は、約０．２μｍ〜約２．μｍの平均粒径を有する。更なる実施形態では、負に荷電した粒子は、約０．３μｍ〜約５μｍの平均粒径を有する。なお更なる実施形態では、負に荷電した粒子は、約０．５μｍ〜約３μｍの平均粒径を有する。また更なる実施形態では、負に荷電した粒子は、約０．５μｍの平均粒径を有する。
【００２４】
一実施形態では、対象は、手術を受けたか、又はこれから受ける。更なる実施形態では、負に荷電した粒子は、手術前に対象に投与される。なお更なる実施形態では、負に荷電した粒子は、手術中に対象に投与される。なお更なる実施形態では、負に荷電した粒子は、手術後に対象に投与される。別の実施形態では、対象は移植レシピエントである。
【００２５】
更なる実施形態では、対象は、直近に身体的外傷を経験している。更なる実施形態では、対象は、直近に損傷を経験している。なお更なる実施形態では、損傷はスポーツ損傷である。更なる実施形態では、損傷は震盪である。
【００２６】
一実施形態では、対象は、自己免疫障害を有する。更なる実施形態では、自己免疫障害は、多発性硬化症、強皮症、１型糖尿病、リウマチ性関節炎、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、レイノー症候群、シェーグレン症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性心筋炎、炎症性腸疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、セリアック病、潰瘍性大腸炎、又はクローン病である。特定の実施形態では、自己免疫疾患は多発性硬化症である。更なる実施形態では、自己免疫疾患はセリアック病である。更なる実施形態では、自己免疫疾患は１型糖尿病である。更なる実施形態では、自己免疫疾患は、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患である。
【００２７】
一実施形態では、対象はアレルギー性障害を有する。更なる実施形態では、アレルギー性障害は、湿疹、喘息、アレルギー性鼻炎、又は皮膚過敏症である。別の実施形態では、対象は移植レシピエントである。
【００２８】
一実施形態では、対象は、虚血性再灌流損傷、アテローム性動脈硬化症を有するか、又は心筋梗塞を患ったことがある。別の実施形態では、対象は乾癬又は皮膚炎を有する。
【００２９】
一実施形態では、対象はウイルス感染を有する。更なる実施形態では、ウイルス感染は、ヘルペスウイルス感染、肝炎ウイルス感染、西ナイルウイルス感染、フラビウイルス、インフルエンザ感染、ライノウイルス感染、パピローマウイルス感染、又はパラインフルエンザウイルス感染である。更なる実施形態では、ウイルス感染は、該対象の中枢神経系に感染する。また更なる実施形態では、ウイルス感染は、ウイルス性脳炎又はウイルス性髄膜炎を引き起こす。
【００３０】
一実施形態では、対象は細菌感染を有する。更なる実施形態では、細菌感染は、該対象の中枢神経系に感染する。また更なる実施形態では、細菌感染は、敗血症細菌性脳炎又は細菌性髄膜炎を引き起こす。
【００３１】
更なる実施形態では、本発明の粒子の投与は、対象において好中球及び他の顆粒球を引き起こす可能性のある病変の蓄積を予防する。更なる実施形態では、対象は癌を有する。
【００３２】
一実施形態では、本発明の粒子の投与は、対象において傷害組織の再生を増加させる。一実施形態では、本発明の粒子の投与は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）又は外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）を持つ対象における傷害組織の再生を増加させる。更なる実施形態では、粒子の投与は、上皮細胞の再生を増加させる。なお更なる実施形態では、粒子の投与は、ニューロンの再ミエリン化を増加させる。別の実施形態では、対象は自己免疫疾患を有する。なお別の実施形態では、対象は、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、及び／又はクローン病を有する。なお別の実施形態では、対象は多発性硬化症を有する。一実施形態では、負に荷電した粒子の投与は、対象において抗原特異的寛容を誘導する。一実施形態では、抗原特異的寛容を誘導する粒子は、アレルギー、自己免疫疾患、及び／又は炎症性疾患と関連付けられる１つ又は２つ以上のエピトープを含む。一実施形態では、エピトープは、表１又は２に記載するものから選択される。一実施形態では、負に荷電した粒子は、ポリスチレン粒子、ダイヤモンド粒子、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）安定化ポリプロピレン硫化物粒子、又は乳酸−グリコール酸共重合体粒子である。一実施形態では、粒子はカルボキシル化される。一実施形態では、粒子は、約−１００ｍＶ未満のゼータ電位を有する。一実施形態では、粒子は、約−７５ｍＶ〜０ｍＶ、例えば、−５０ｍＶ〜０ｍＶ、又は−１００ｍＶ〜−５０ｍＶ、又は−７５ｍＶ〜−５０ｍＶ、又は−５０ｍＶ〜−４０ｍＶのゼータ電位を有する。一実施形態では、粒子は、約０．１μｍ〜約１０μｍ、例えば、約０．２μｍ〜約２μｍ、又は約０．３μｍ〜約５μｍ、又は０．５μｍ〜約３μｍ、又は約０．５μｍ〜約１μｍの平均粒径を有する。
【００３３】
一実施形態では、対象は自己免疫疾患を有する。一実施形態では、自己免疫疾患は、多発性硬化症、強皮症、１型糖尿病、リウマチ性関節炎、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、レイノー症候群、シェーグレン症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性心筋炎、炎症性腸疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、セリアック病、潰瘍性大腸炎、又はクローン病である。一実施形態では、粒子は、１つ又は２つ以上のミエリン塩基性タンパク質エピトープを含む。一実施形態では、ミエリン塩基性タンパク質エピトープは、配列番号４９７５又は配列番号４９７６のうちの１つ又は２つ以上である。一実施形態では、粒子は、１つ又は２つ以上のミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質エピトープを含む。一実施形態では、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質エピトープは、配列番号１又は配列番号４９７８のうちの１つ又は２つ以上である。一実施形態では、粒子は、１つ又は２つ以上のインスリンエピトープを含有する。一実施形態では、１つ又は２つ以上のインスリンエピトープは、配列番号４９８１である。一実施形態では、粒子は、１つ又は２つ以上のグルタミン酸デカルボキシラーゼエピトープを含む。一実施形態では、グルタミン酸デカルボキシラーゼエピトープは、配列番号４９８２である。一実施形態では、粒子は、１つ又は２つ以上のプロテオリピドタンパク質エピトープを含有する。一実施形態では、プロテオリピドタンパク質エピトープは、配列番号４９７７である。一実施形態では、粒子は、１つ又は２つ以上のグリアデン（gliaden）エピトープを含む。一実施形態では、グリアデンエピトープは、配列番号４９８３〜４９８５を含む。
【００３４】
一実施形態では、本方法は、負に荷電した粒子を任意の好適な手段によって投与することを含む。一実施形態では、本組成物は、経口、経鼻、静脈内、筋肉内、経眼、経皮、又は皮下投与される。特定の実施形態では、カルボキシル化された粒子は、経鼻投与される。また別の実施形態では、負に荷電した粒子は、静脈内投与される。また別の実施形態では、負に荷電した粒子は、皮下投与される。
【００３５】
一実施形態では、本方法は、対象中の炎症状態を診断する方法を含む。特定の実施形態では、本方法は、対象から血液を取り出し、その血液又はそれに由来する血清／血漿を負に荷電した粒子と共にインキュベートし、表６に列挙するタンパク質の存否を決定することを含み、表６の１つ又は２つ以上のタンパク質の存在は、炎症性免疫応答を示す。別の実施形態では、本方法は、負に荷電した粒子を含む薬学的組成物を対象の血液循環中に注射し、続いて粒子を血液循環から取り出し、対象から取り出した粒子の表面における表６に列挙するタンパク質の存否を決定することを含み、表６の１つ又は２つ以上のタンパク質の存在は、炎症性免疫応答を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】（Ａ〜Ｇ）は、ＰＳ−ＩＭＰによるＷＮＶ感染マウスの処置が疾患病変を寛解させる能力を示す。５％以上の体重減少時におけるＰＳ−ＩＭＰによるＷＮＶ感染マウスの処置は、さもなければ感染により死亡したはずのマウスの６０％の生存をもたらした（ａ）。この作用は、ポリスチレン中性粒子（ＰＳＮＰ）で処置したマウスにおいて有意に減退し、ビヒクル対照においては不在であった（ａ）。免疫付与後７日目のＷＮＶ感染マウスの脳への炎症性単球由来マクロファージの浸潤は、ポリスチレン免疫修飾粒子（ＰＳ−ＩＭＰ）で処置したマウスにおいて有意に減少し、ＮＰで処置したマウスではより少ない程度に減少した（ｂ）。乳酸−グリコール酸共重合体免疫修飾粒子（ＰＬＧＡ−ＩＭＰ）又はナノダイヤモンド（ＮＤ）−ＩＭＰによるＷＮＶ感染動物の処置は、さもなければ感染により死亡したはずのマウスの約６０％の生存をもたらした（ｃ）。ポリスチレン系のポリスチレン正荷電粒子（ＰＳ−ＰＰ）によるＷＮＶ感染マウスの処置が、免疫付与後７日目の脳への炎症性単球マクロファージ浸潤を減少させず（ｄ）、あるいは生存も向上させなかった（ｅ）ため、ＩＭＰの負電荷はこの作用に不可欠である。ＷＮＶ感染マウスの生存を促進するのに最適なＰＳ−ＩＭＰの用量は、約４×１０９個の粒子に相当する０．３５５ｍｇであると決定した（ｆ、ｇ）。生存データは、１群当たり１０〜２０匹のマウスによる３つの別個の実験を代表する。マンテル・ヘンツェルログランク検定を使用して統計分析を実施した。フローサイトメトリーデータは、平均値±標準偏差であり、１群当たり４〜５匹のマウスによる３つの別個の実験を代表する。一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキー・クレーマー事後検定を使用して統計分析を実施した。ＰＳ−ＩＭＰ及びＮＰ群とビヒクル対照群との比較において、Ｐ値０．０５以下（＊）、Ｐ値０．０１以下（＊＊）、Ｐ値０．００１以下（＊＊＊）。ＰＳ−ＩＭＰ群とＮＰ群との比較において、Ｐ値０．０５以下（＃）、Ｐ値０．０１以下（＃＃）、Ｐ値０．００１以下（＃＃＃）。
【図２】（Ａ〜Ｇ）は、ＰＳ−ＩＭＰで処置したときの脾臓へのＩＭの方向転換を示す。静脈内注射から２４時間後、ＦＩＴＣ−ＰＳ−ＩＭＰは、肺、脾臓、及び肝臓に局在し、少数が、脳、腎臓、又は胸腺で観察される（ａ）。脾臓では、ＦＩＴＣ−ＰＳ−ＩＭＰは、擬似感染動物におけるほぼ同数のＬｙ６Ｃｈｉ  ΦＩＭ、Ｂ２２０＋  Ｂ細胞、ＣＤ３＋  Ｔ細胞、及びＮＫ１．１＋  ＮＫ細胞と関連付けられた（ｂ、ｃ）。ＷＮＶ感染動物では、ＦＩＴＣ−ＰＳ−ＩＭＰは、主にＬｙ６Ｃｈｉ  ΦＩＭに局在した（ｂ、ｃ）。（ｄ）脾臓を、免疫付与後７日目にフローサイトメトリーに対して処理し、生細胞（Ｒ１）をゲーティングした。この集団から、ＣＤ４５＋白血球を選択し（Ｒ２）、ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇ−単球をゲーティングしてＬｙ６Ｇ＋好中球の少数の集団を除外した（Ｒ３、ｄ）。ＦＩＴＣ−ＰＳ−ＩＭＰは、擬似感染動物におけるＬｙ６Ｃｌｏ単球とは対照的に、ＷＮＶ感染動物におけるＬｙ６Ｃｈｉ  ΦＩＭと関連付けられることを見出した（ｅ）。ＰＳ−ＩＭＰの注入、及び程度は小さいにせよＮＰの注入は、ＷＮＶ感染動物の免疫付与後７日目の脾臓におけるＬｙ６Ｃｈｉ  ΦＩＭの蓄積（ｆ）、及び血中のこれらの細胞数の有意な減少（ｇ）をもたらした。免疫組織化学データは、１群当たり３匹のマウスによる３つの別個の実験を代表する。スライドをＤＡＰＩ（青色）で対比染色して、細胞核を特定した。フローサイトメトリーデータは、平均値±標準偏差であり、１群当たり４〜５匹のマウスによる３つの別個の実験を代表する。一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキー・クレーマー事後検定を使用して統計分析を実施した。ＰＳ−ＩＭＰ及びＮＰとビヒクル対照群との比較において、Ｐ値０．０５以下（＊）、Ｐ値０．０１以下（＊＊）、Ｐ値０．００１以下（＊＊＊）。ＰＳ−ＩＭＰ群とＮＰ群との比較において、Ｐ値０．０５以下（＃）、Ｐ値０．０１以下（＃＃）、Ｐ値０．００１以下（＃＃＃）。
【図３】（Ａ〜Ｆ）は、ＰＳ−ＩＭＰ処置が、ＷＮＶ感染マウスのＣＮＳへの炎症性単球のホーミングを減少させることを示す。Ｌｙ６Ｃｈｉ／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ−／Ｌｙ６Ｇ−  ΦＩＭを、免疫付与後６日目の擬似感染ドナー及びＷＮＶ感染ドナーの骨髄から単離し、ＰＫＨ２６によって標識し、免疫付与後６日目の適合レシピエントに注射し、その直後にビヒクル、ＮＰ、又はＰＳ−ＩＭＰを別個に注射した（ａ）。脳（ｂ）及び脾臓（ｃ）を、免疫付与後７日目にフローサイトメトリーに対して処理し、ＣＤ４５ｈｉ／ＣＤ１１ｂ＋マクロファージをゲーティングした（Ｒ１）。ＰＳ−ＩＭＰは、養子導入したＰＫＨ２６＋／Ｌｙ６Ｃｈｉ骨髄由来のΦＩＭの脳（ｂ、ｄ）への浸潤を有意に減少させ、このことは、脾臓（ｃ、ｅ）におけるＰＫＨ２６＋細胞の蓄積と相関する。養子導入したΦＩＭの７０％超が、脾臓におけるＦＩＴＣ−ＰＳ−ＩＭＰ（すなわち、ＰＫＨ２６＋／ＦＩＴＣ＋細胞、ｇ、Ｒ１）を取り込み、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ１０３（ｇ、Ｒ２）を発現する細胞に分化したことを見出した。５％の体重減少時における脾摘マウスへのＰＳ−ＩＭＰ注入（ｆ）は、脳への単球輸送の減少に失敗し、ＰＳ−ＩＭＰ−及びビヒクル処置動物は、フローサイトメトリーによって決定したところ、ほぼ同数の単球を有した（ｆ）。フローサイトメトリーデータは、平均値±標準偏差であり、１群当たり４〜５匹のマウスによる３つの別個の実験を代表する。一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキー・クレーマー事後検定を使用して統計分析を実施した。ＰＳ−ＩＭＰ及びＮＰとビヒクル対照群との比較において、Ｐ値０．０５以下（＊）、Ｐ値０．０１以下（＊＊）、Ｐ値０．００１以下（＊＊＊）。ＰＳ−ＩＭＰ群とＮＰ群との比較において、Ｐ値０．０５以下（＃）、Ｐ値０．０１以下（＃＃）、Ｐ値０．００１以下（＃＃＃）。
【図４】（Ａ〜Ｉ）は、炎症性単球がＩＭＰ活性に不可欠なＭＡＲＣＯを発現することを示す。ＰＳ−ＩＭＰを、チオグリコール酸塩によって炎症を起こした腹膜への単球の遊走を阻害するその能力について試験した（レジメンはａに示す）。ＷＴ及びＭＡＲＣＯ−／−マウスは、腹膜から単離したＬｙ６Ｃｈｉ／ＣＤ１１ｂ＋単球（ΦＩＭ）の数によって決定したところ、チオグリコール酸塩注射と同様に応答した（ｂ、ｅ）。ＰＳ−ＩＭＰ処置（ａに示す通り）は、チオグリコール酸塩を注射したＷＴ動物において、４８時間で腹腔へのΦＩＭ浸潤を有意に減少させたが、ＭＡＲＣＯ−／−マウスの腹腔から単離したΦＩＭは減少させなかった（ｂ、ｅ）。ＦＩＴＣ−ＰＳ−ＩＭＰ（緑色）は、脾臓の辺縁帯におけるＭＡＲＣＯ＋（赤色蛍光）細胞と関連付けられることを見出した（ｃ）。ＷＮＶ感染は、ΦＩＭ上のＭＡＲＣＯ発現を上方調節する（ｄ）。チオグリコール酸塩を注射したＷＴマウスにおいては、ＰＳ−ＩＭＰ処置は、ＭＡＲＣＯ−／−動物中では観察されなかった脾臓におけるΦＩＭの数の有意な増加と関連付けられた（ｂ、ｅ）。ＭＡＲＣＯ−／−動物と比較して有意に数の多いＰＳ−ＩＭＰ＋Ｌｙ６Ｃｈｉ  ΦＩＭが、チオグリコール酸塩を注射したＷＴマウスの脾臓から単離された（ｆ）。チオグリコール酸塩誘導性ＷＴマウスへのＰＳ−ＩＭＰの注入は、アポトーシスマーカーであるアネキシンＶ（ｇ、ｈ）及びカスパーゼ−３（ｉ）を発現したＬｙ６Ｃｈｉ  ΦＩＭの数の有意な増加をもたらした。これは、ＭＡＲＣＯ−／−動物中では観察されなかった。フローサイトメトリーデータは、平均値±標準偏差であり、１群当たり４〜５匹のマウスによる３つの別個の実験を代表する。一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキー・クレーマー事後検定を使用して統計分析を実施した。ＷＴ  ＰＳ−ＩＭＰ群と全ての他の群との比較において、Ｐ値０．０５以下（＊）、Ｐ値０．０１以下（＊＊）、Ｐ値０．００１以下（＊＊＊）。
【図５】（Ａ〜Ｓ）は、ＰＳ−ＩＭＰが、ＥＡＥ、心筋炎症、及び炎症性腸疾患における疾患病変及び炎症性単球の浸潤を寛解させることを示す。ＰＬＰ１３９〜１５１で免疫付与したＳＪＬマウスにおけるＥＡＥ（ａ）又は最初の再発（ｂ）の発症時に開始するＰＬＧＡ−ＩＭＰ注入は、平均臨床スコアを有意に減少させた。免疫付与後７日目から７日間、ＰＬＧＡ−ＩＭＰ又はビヒクルのいずれかで処置したマウスからの脊髄へのフローサイトメトリーは、減少したＣＤ４５＋  ＣＤ１１ｂ＋  ＣＤ１１ｃ＋  Ｌｙ６Ｃｈｉ細胞によって決定したところ、有意に少ない炎症を有した（ｃ）。これは脊髄への単球流入を減少させ、このことは、脾臓におけるＣＤ４５＋  ＣＤ１１ｂ＋  Ｌｙ６Ｃ＋単球の増加と相関する（ｄ）。炎症の別モデルとして、ＰＬＧＡ−ＩＭＰ（ｈに示すように注入した）を永久的左前下行枝閉塞モデル中でも試験した。（ｈ）に示す通りの３日間のＰＬＧＡ−ＩＭＰ注入は、ビヒクル処置対照と比較して、材料及び方法に記載するＨ＆Ｅ組織学検査及び画像分析によって決定したところ、梗塞サイズの減少をもたらした（ｉ、ｊ）。加えて、減少した閉塞サイズは、ビヒクル処置対照と比較したＰＬＧＡ−ＩＭＰ処置マウスにおけるより少数のＣＤ６８＋マクロファージと相関した（ｋ、ｌ、赤色蛍光）。炎症の別モデルでは、動脈を４５分間結紮し、その後血流を戻した。（ｍ）で示すように、マウスを６日間ＰＬＧＡ−ＩＭＰで処置した。１日目及び５日目で、血清クレアチニンクリアランスは、ビヒクル処置対照と比較して、ＩＭＰで処置した動物において有意に大きかった（ｎ）。このことは、ＩＭＰで処置した動物における尿細管萎縮の減少と相関した（ｏ）。炎症の別モデルとして、（ｐ）に示すＰＳ−ＩＭＰ又はビヒクルのための注入レジメンを用いて、ＰＳ−ＩＭＰ療法をＤＳＳ誘導性大腸炎モデルにおいて試験すると、これは、ＤＳＳ誘導性大腸炎の全体的な臨床重症度を減少させた（ｑ）。減少した臨床スコアは、単球（すなわち、非多形核球）形態を持つ減少した数のＧｒ−１＋細胞と相関した（ｒ、ｓ）。ＥＡＥ平均臨床スコアデータは、１群当たり１０〜２０匹のマウスによる３つの別個の実験を代表する。フローサイトメトリーデータは、平均値±標準偏差であり、１群当たり４〜５匹のマウスによる３つの別個の実験を代表する。心筋梗塞データは、１群当たり少なくとも３匹のマウスによる２つの実験の代表である。腎臓虚血再灌流データは、１群当たり少なくとも４〜５匹のマウスによる２つの実験の代表である。ＤＳＳ大腸炎データは、１群当たり少なくとも３匹のマウスによる少なくとも３つの実験の代表である。画像分析を、材料及び方法に記載する通りに行った。不対で両側のスチューデントのＴ検定を使用して、統計分析を実施した。ＰＳ−ＩＭＰとビヒクル対照群との比較において、Ｐ値０．０５以下（＊）、Ｐ値０．０１以下（＊＊）、Ｐ値０．００１以下（＊＊＊）。事後的ボンフェローニの補正を用いた二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）の使用による比較のための統計分析（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０ソフトウェア）。＊ｐ値０．０５未満、＊＊ｐ値０．０１未満、＊＊＊ｐ値０．００１未満。擬似についてはｎ＝５、１日目については１群当たりｎ＝７、対照群に対する５日目についてはｎ＝４〜５（３匹の動物が３〜４日目で死亡したため）。尿細管スコアデータが含まれるように４．３日目あたりでは１つの試料のみ採集し、５日目陰性ビーズについてはｎ＝７であった。
【図６】（Ａ〜Ｐ）は、ＩＭＰ処置が、ＷＮＶ感染脳における炎症性サイトカインレベルを有意に減少させることを示す。擬似感染及びＷＮＶ感染マウスを、免疫付与後６日目にＰＳ−ＩＭＰで処置し、免疫付与後７日目に脳を単離及び均質化した。多重ＥＬＩＳＡを使用してサイトカイン及びケモカインレベルを分析した。ＩＭＰで処置したＷＮＶ感染動物の脳において、対照と比較して有意に減少したレベルのＣＣＬ２（ａ）、ＩＦＮ−γ（ｂ）、ＩＬ−６（ｃ）、ＴＮＦ（ｄ）、ＩＬ−１０（ｅ）、ＩＬ−４（ｆ）、ＣＣＬ３（ｇ）、ＩＬ−１２（ｈ）、ＧＭ−ＣＳＦ（ｋ）、ＩＬ−１α（ｌ）、ＩＬ−９（ｎ）、ＩＬ−１β（ｏ）、及びＩＬ−２（ｐ）が観察された。ＩＬ−３（ｈ）、ＣＣＬ５（ｊ）、及びＩＬ−１５（ｍ）のレベルは、ＩＭＰ処置によって有意に減少はしなかった。
【図７】（Ａ〜Ｆ）は、少数のＩＭＰがＷＮＶ感染脳中で見出され、ＩＭＰが腹膜炎における炎症性単球の減少に非常に有効であることを示す。鮮やかな青色のＮＰ又はＰＳ−ＩＭＰは、免疫付与後６日目の注射後の免疫組織化学検査によって、免疫付与後７日目のＷＮＶ感染脳中で検出できなかった（ａ）。同様に、ＦＩＴＣ−ＮＰ又はＰＳ−ＩＭＰも、フローサイトメトリーによってＷＮＶ感染脳中で検出できなかった（ｂ）。ＰＳ−ＩＭＰを、（ｃ）に示すように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるチオグリコール酸塩腹膜炎のモデル中で試験した。チオグリコール酸塩注入から２４時間後のＰＳ−ＩＭＰ注入は、腹膜から単離されたＬｙ６ＣｈｉＣＤ１１ｂ＋（Ｒ３）単球の数を減少させた（ｃ、ｄ）。この作用は、脾摘マウスにおいては無効にされた（ｅ）。粒子の免疫組織化学検査及びフローサイトメトリーデータは、１群当たり少なくとも３匹のマウスによる３つの別個の実験を代表する。スライドをＤＡＰＩ（青色）で対比染色して、細胞核を特定した。チオグリコール酸塩データは、１群当たり５匹のマウスによる少なくとも３つの実験の代表である。フローサイトメトリーデータは、平均値±標準偏差であり、１群当たり４〜５匹のマウスによる３つの別個の実験を代表する。
【図８】（Ａ〜Ｇ）は、ＩＭＰが、ＥＡＥ、心筋梗塞、及びＤＳＳ誘導性大腸炎における上皮の修復中に脾臓でのΦＩＭの蓄積を促進することを示す。ＣＤ４５＋  ＣＤ１１ｂ＋単球由来細胞の有意に減少した浸潤が、ＰＬＧＡ−ＩＭＰ注入後に１４日目のＥＡＥ脳中で観察された（ａ）。脳における単球由来細胞の減少は、ビヒクル処置対照と比較したＰＬＧＡ−ＩＭＰ処置動物の脾臓におけるΦＩＭの有意な蓄積に対応した（ｂ）。心筋梗塞後、ビヒクル処置対照と比較して、脾臓におけるΦＩＭの有意な蓄積がＰＬＧＡ−ＩＭＰ処置動物中で観察された（ｃ、ｄ）。ＤＳＳチャレンジ９日目の横行結腸のＫｉ６７＋免疫組織化学染色（ｆ）は、Ｈ２Ｏ対照群と比較して、上皮における特徴的なＫｉ６７＋染色を見せ、ＤＳＳチャレンジ動物中では染色は比較的弱かった（ｆ）。より少ない腺窩降下物が、ＰＳ−ＩＭＰで処置したＤＳＳチャレンジ動物中で観察された（ｆ）。また更に、これらの動物中では、Ｋｉ６７＋染色が固有層においてより頻繁かつ強烈であった。ＤＳＳ誘導性大腸炎ビヒクル対ＰＳ−ＩＭＰを比較する画像分析（ｇ）は、観察されたＫｉ６７の差異が統計的に有意であったことを示した。ＥＡＥデータは、平均値±標準偏差であり、１群当たり４〜５匹のマウスによる３つの別個の実験を代表する。心筋梗塞データは、１群当たり少なくとも３匹のマウスによる２つの実験の代表である。ＤＳＳ大腸炎データは、１群当たり少なくとも３匹のマウスによる少なくとも３つの実験の代表である。画像分析を、材料及び方法に記載する通りに行った。不対で両側のスチューデントのＴ検定を使用して、統計分析を実施した。ＰＳ−ＩＭＰとビヒクル対照群との比較において、Ｐ値０．０５以下（＊）、Ｐ値０．０１以下（＊＊）、Ｐ値０．００１以下（＊＊＊）。
【図９】オプソニン化ＩＭＰが、脳へのマクロファージの遊走を阻害する能力を減少させたことを示す。７日目の血漿を、擬似又はＷＮＶ感染動物から採取し、ＰＳ−ＩＭＰと共にインキュベートした。これらの「オプソニン化」粒子又は未オプソニン化（未処理ビーズ）粒子を、免疫付与後６日目でＷＮＶ感染マウスに再注入した。７日目に、脳をフローサイトメトリーによって炎症性単球の流入について検査した。未処理ＩＭＰ（正常ＩＭＰ）は脳への単球流入の減少をもたらしたが、擬似血漿でコーティングしたＩＭＰは、単球の遊走を阻害する能力は有しなかった。目的とするＷＮＶ血清でコーティングしたＩＭＰは、コーティングしていないＩＭＰと比べて単球を阻害する能力は弱かったが、それでもある程度遊走を減少させることはできた。
【図１０】ＰＬＧＡ−ＩＭＰが、炎症性単球と好中球との両方においてＴＧモデル中でアポトーシスを誘導することを示す。チオグリコール酸塩誘導性ＷＴマウスへのＰＬＧＡ−ＩＭＰの注入は、アポトーシスマーカーであるアネキシンＶ及びカスパーゼ−３を発現したＬｙ６Ｃｈｉ  ΦＩＭ及びＬｙ６Ｇ＋好中球の数の有意な増加をもたらした。これは、擬似処置動物においては観察されなかった。フローサイトメトリーデータは、平均値±標準偏差であり、１群当たり４〜５匹のマウスによる３つの別個の実験を代表する。一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキー・クレーマー事後検定を使用して統計分析を実施した。ＷＴ  ＰＳ−ＩＭＰ群と全ての他の群との比較において、Ｐ値０．０５以下（＊）、Ｐ値０．０１以下（＊＊）、Ｐ値０．００１以下（＊＊＊）。
【図１１】（Ａ及びＢ）は、アポトーシスが、ＰＬＧＡ又はＰＳ  ＩＭＰ注入後２時間以内で検出可能であることを示す。注射から２時間後、ＰＳ−ＩＭＰは、擬似及びＴＧ腹膜炎を誘導したマウスの脾臓におけるＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ−単球に局在した。ＰＳ−ＩＭＰの取り込みは酵素カスパーゼ−３の活性と関連付けられ、これは、アポトーシスを示す（ａ）。単球の数の増加は、ＰＳ−ＩＭＰで処置したＴＧ腹膜炎を誘導したマウスにおけるカスパーゼ−３活性に対して陽性であった（ｂ）。
【図１２】ＰＬＧＡ−ＩＭＰが、心筋梗塞モデルにおいて炎症性傷害から保護することを示す。４日間のＰＬＧＡ−ＩＭＰ注入は、ビヒクル処置対照と比較して、Ｈ＆Ｅ組織学検査及び画像分析によって決定したところ、梗塞サイズの減少をもたらした。加えて、減少した閉塞サイズは、ビヒクル処置対照と比較したＰＬＧＡ−ＩＭＰ処置マウスにおけるより少数のＣＤ６８＋マクロファージ、及び脾臓におけるＬｙ６Ｃｈｉ細胞の増加と相関した。
【図１３】ＰＬＧＡ−ＩＭＰ注入が、心筋虚血（ＬＡＤ閉塞）再灌流モデルにおいて炎症性傷害から保護することを示す。冠動脈を閉塞させ、３０分後に血流を戻した。マウスを４日間ＰＬＧＡ−ＩＭＰで処置した。ＰＬＧＡ−ＩＭＰによる処置は、ＰＢＳ対照動物と比較して、梗塞瘢痕サイズ及び収縮期の駆出率を有意に減少させた。
【図１４】（Ａ）は、  ラクチド−グリコリド共重合体（ＰＬＧ）粒子の顕微鏡写真を示す。Ｂ及びＣは、ＰＬＧ−ＰＥＭＡ粒子の平均粒径（ｎｍ）及びζ電位（ｍＶ）を含む、動的光散乱分析による表面機能化ラクチド−グリコリド共重合体粒子の特徴化を示す。表面機能化ラクチド−グリコリド共重合体粒子を、１８．２ＭΩの水中で毎秒２．５×１０５計数の計数速度でＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）において分析した。表面機能化ラクチド−グリコリド共重合体粒子の集団は、バッチ当たり５〜１５％異なったが、概して、５６７ｎｍのＺ平均粒径、６７０ｎｍのピーク粒径、及び０．２０９の多分散性指数を有した。
【図１５】（Ａ）は、ＰＬＧＡ−ＩＭＰ注入が、ＥＡＥにおいて炎症性傷害から保護することを示す。処置中止時には無病期間があるが、時間と共に疾患は再発する。（Ｂ）ＰＬＧＡ−ＩＭＰ注入（しかしビヒクル対照ではない）は、抗炎症性タンパク質様ＰＤ−１を発現する調節性Ｔ細胞の増殖及び誘導をもたらす。（Ｃ）これらのＴｒｅｇは、ＩＭＰ処置中に最も豊富であり、処置中止後に時間と共に衰える。
【図１６】（Ａ）炎症性障害を持つ対象の血液からの病原性タンパク質及び細胞残屑の除去、並びに（Ｂ）炎症性障害を持つ対象の血流からの調節タンパク質の濃縮及び提示を示す。
【図１７】対象が炎症プロセスを受けているか否かを決定するために、負に荷電した粒子が対象の血清からタンパク質の存否を決定することができるという概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明者らは、驚くべきことに、ある特定の粒径及びゼータ電位のポリスチレン、ＰＬＧＡ、又はダイヤモンド粒子などの負に荷電した粒子が対象に投与されると、炎症性免疫応答が寛解することを見出した。加えて、本発明者らはまた、驚くべきことに、これらの同じ負に荷電した粒子が、対象に投与されるときに、対象において単球及び／又は好中球アポトーシス、並びに向上したクリアランスを誘導することも見出した。これらの同じ負に荷電した粒子が、対象に投与されるときに、寛容原性樹状細胞、サプレッサー細胞、及び調節性Ｔ細胞を誘導することもまた驚くに値した。これらの負に荷電した粒子は、炎症環境から炎症誘発性メディエータを除去することも見出された。同様に、負に荷電した粒子はまた、調節性メディエータを濃縮及び提示して、調節性Ｔ細胞応答を更に誘導するか、あるいは炎症性免疫応答を寛解させる。負に荷電した粒子は、したがって、自己免疫疾患などの過剰な炎症性免疫応答を特徴とするあらゆる疾患又は状態の治療において、並びに細菌及びウイルス感染の治療において、有用であり得る。最後に、１つ又は２つ以上の抗原が埋め込まれた粒子は、対象において抗原特異的寛容を誘導する。
【００３８】
本明細書で使用する「粒子」は、あらゆる物質の組織に由来しない微小な組成物を指し、それは球体又は球体様の実体又はビーズであってもよい。「粒子」という用語及び「ビーズ」という用語は、互換的に使用され得る。加えて、「粒子」という用語は、ビーズ及び球体を包含するように使用されてもよい。
【００３９】
「カルボキシル化された粒子」又は「カルボキシル化されたビーズ」又は「カルボキシル化された球体」は、その表面にカルボキシル基を含有するように修飾されたあらゆる粒子を含む。一部の実施形態では、カルボキシル基の付加は、例えば、ＭＡＲＣＯなどのスカベンジャー受容体との相互作用を通して、血液循環からの粒子の食細胞／単球取り込みを強化する。カルボキシル化は、エチレン−無水マレイン酸共重合体（ＰＥＭＡ）を含むがこれらに限定されない、カルボキシル基を付加するいずれの化合物を使用しても達成することができる。
【００４０】
「負に荷電した粒子」又は「負に荷電したビーズ」又は「負に荷電した球体」は、負電荷を本質的に保有するか、負電荷を有するように修飾されたいかなる粒子も含む。一部の実施形態では、粒子は、粒子のカルボキシル化によって、負電荷を有するように作製される。
【００４１】
本明細書で使用する「抗原性部分」は、宿主の免疫系によって認識される任意の部分、例えばペプチドを指す。抗原性部分の例としては、自己抗原及び／又は細菌若しくはウイルスタンパク質、ペプチド、又は成分が挙げられるが、これらに限定されない。理論に束縛されることなく、負に荷電したビーズそれ自体は免疫系によって認識され得るが、それに結合するだけの負に荷電したビーズは、本発明の目的では「抗原性部分」とはみなされない。
【００４２】
本明細書で使用する「裸ビーズ」又は「裸粒子」又は「裸球体」は、カルボキシル化されていないか、あるいは修飾されていないビーズ、粒子、又は球体を指す。
【００４３】
本明細書で使用する「炎症誘発性メディエータ」又は「炎症誘発性ポリペプチド」は、対象において炎症を誘導、維持、又は延長するポリペプチド又はその断片を指す。炎症誘発性メディエータの例としては、サイトカイン及びケモカインが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
本明細書で使用する「炎症環境」又は「炎症病巣」は、対象における炎症又は炎症誘発性メディエータの増加した濃度の部位を指す。炎症環境は、全体としての対象の循環を包含してもよい。例えば、対象が全身性炎症性障害を患う場合、炎症性メディエータは、対象の循環全体で見出され得る。故に、これらの実施形態では、炎症環境は、目立たない領域内に封じられない。
【００４５】
「調節性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」又は「サプレッサーＴ細胞」は、Ｔ細胞免疫応答を調節することができるＴ細胞を意味する。例えば、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞応答のエフェクター機能を阻害することができるＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞であり得る。
【００４６】
粒子は、いかなる形状又は配座を有してもよい。しかしながら、一部の実施形態では、インビボにおいて凝集する可能性の低い粒子を使用することが好ましい。これらの実施形態内の粒子の例は、球形状を有するものである。
【００４７】
各粒子が均一な粒径である必要はないが、粒子は概して、抗原提示細胞又は他のＭＰＳ細胞において食作用を引き起こすのに十分な粒径でなければならない。粒子は、溶解性を強化し、インビボにおける凝集に起因する起こり得る合併症を回避し、飲作用を促進するために、微視的又はナノスケールの粒径であることが好ましい。粒径は、間質腔からリンパ球成熟の領域への取り込みのための因子であり得る。約０．１μｍ〜約１０μｍの平均粒径を有する粒子は、食作用を引き起こすことができる。故に、一実施形態では、粒子は、これらの範囲内の粒径を有する。別の実施形態では、粒子は、約０．２μｍ〜約２μｍの平均粒径を有する。別の実施形態では、粒子は、約０．３μｍ〜約５μｍの平均粒径を有する。また別の実施形態では、粒子は、約０．５μｍ〜約３μｍの平均粒径を有する。更なる実施形態では、粒子は、約０．１μｍ、又は約０．２μｍ、又は約０．３μｍ、又は約０．４μｍ、又は約０．５μｍ、又は約１．０μｍ、又は約１．５μｍ、又は約２．０μｍ、又は約２．５μｍ、又は約３．０μｍ、又は約３．５μｍ、又は約４．０μｍ、又は約４．５μｍ、又は約５．０μｍの平均粒径を有する。特定の実施形態では、粒子は、約０．５μｍの粒径を有する。組成物中の粒子は、均一な粒径である必要はない。例として、薬学的製剤は複数の粒子を含有してもよく、その一部は約０．５μｍであり、他の粒子は約１．０μｍである。これら所与の範囲内である粒径のいずれの混合物も有用となるであろう。
【００４８】
一部の実施形態では、粒子は非金属である。これらの実施形態では、粒子は重合体から形成され得る。好ましい実施形態では、粒子は、個体中で生分解性である。この実施形態では、粒子は、個体中で粒子が蓄積することなく、複数回の投薬にわたって個体中で提供することができる。好適な粒子の例としては、ポリスチレン粒子、ＰＬＧＡ粒子、ＰＬＵＲＩＯＮＩＣＳ安定化ポリプロピレン硫化物粒子、及びダイヤモンド粒子が挙げられる。
【００４９】
粒子表面は、非特異的又は不必要な生物相互作用を最小限にする物質からなることが好ましい。粒子表面と間質との間の相互作用は、リンパ取り込みに関与する因子であり得る。粒子表面は、物質でコーティングされて、非特異的相互作用を防止し得るか又は減少させ得る。ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）などのその共重合体（ポリ（エチレングリコール）−ｂｌ−ポリ（プロピレングリコール）−ｂｌ−ポリ（エチレングリコール））の共重合体を含む）といった親水性層で粒子をコーティングすることによる立体安定化は、皮下注射後のリンパ取り込みの向上によって示されるように、間質のタンパク質との非特異的相互作用を減少させ得る。これらの因子の全ては、リンパ取り込みの観点から粒子の物理的特性の重要性を示す。生分解性重合体を使用して、重合体及び／又は粒子及び／又は層の全て又は一部を作製し得る。生分解性重合体は、例えば、官能基が溶液中の水と反応した結果によって分解を受け得る。本明細書で使用する「分解」という用語は、分子量の減少又は疎水性基の親水性基への変換のいずれかによって可溶性となることを指す。エステル基を持つ重合体、例えば、ポリラクチド及びポリグリコリドは概して、自然加水分解に付される。
【００５０】
本発明の粒子はまた、更なる成分を含有してもよい。例えば、担体は、担体に組み込まれるか又は共役される造影剤を有してもよい。現在市販されている、造影剤を有する担体ナノスフェアは、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ｓｉｇｈｔナノスフェアである。量子ドット（ＱＤ）として知られる無機の量子閉じ込め発光性ナノ結晶は、ＦＲＥＴ用途において理想的なドナーとして現れた。その高量子収率及び同調可能なサイズ依存性ストークスシフトは、異なるサイズが、単一の紫外線波長で励起されるときに青から赤外までを発することを可能にする。（Ｂｒｕｃｈｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８１，２０１３、Ｎｉｅｍｅｙｅｒ，Ｃ．Ｍ  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００３，４２，５７９６、Ｗａｇｇｏｎｅｒ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９５，２４６，３６２、Ｂｒｕｓ，Ｌ．Ｅ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９９３，７９，５５６６）。デンドリマーとして知られる重合体のクラスに基づく有機／無機ハイブリッド量子ドットなどの量子ドットは、生物学的標識化、撮像、及び光学バイオセンシングシステムにおいて使用され得る。（Ｌｅｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２１，１２８８６）。無機量子ドットの伝統的な合成とは異なり、これらのハイブリッド量子ドットナノ粒子の合成は、高温、又は毒性の高い不安定な試薬を必要としない。（Ｅｔｉｅｎｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．８７，１８１９１３，２００５）。
【００５１】
粒子は、広範な物質から形成され得る。粒子は、生体利用に好適な物質からなることが好ましい。例えば、粒子は、ガラス、シリカ、ヒドロキシカルボン酸のポリエステル、ジカルボン酸のポリ無水物、又はヒドロキシカルボン酸及びジカルボン酸の共重合体からなってもよい。より一般的には、担体粒子は、直鎖若しくは分枝鎖、置換若しくは非置換、飽和若しくは不飽和、線形若しくは架橋された、アルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、アラルケニル、ヘテロアリール、若しくはアルコキシヒドロキシ酸のポリエステル、又は直鎖若しくは分枝鎖、置換若しくは非置換、飽和若しくは不飽和、線形若しくは架橋された、アルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、アラルケニル、ヘテロアリール、若しくはアルコキシジカルボン酸のポリ無水物からなり得る。加えて、担体粒子は、量子ドットポリスチレン粒子などの量子ドットであるか、又は量子ドットからなることができる（Ｊｏｕｍａａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２２：１８１０〜６）。エステル及び無水物結合の混合物（例えば、グリコール酸及びセバシン酸の共重合体）を含む担体粒子も用いることができる。例えば、担体粒子は、ポリグリコール酸重合体（ＰＧＡ）、ポリ乳酸重合体（ＰＬＡ）、ポリセバシン酸重合体（ＰＳＡ）、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、［ｒｈｏ］乳酸−セバシン酸共重合体（[rho］oly(lactic-co-sebacic)ａｃｉｄ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）（ＰＬＳＡ）、グリコール酸−セバシン酸共重合体（ＰＧＳＡ）、ポリプロピレン硫化物重合体、ポリ（カプロラクトン）、キトサンなどを含む物質を含んでもよい。本発明において有用な他の生体適合性、生分解性重合体としては、カプロラクトン、炭酸塩、アミド類、アミノ酸、オルトエステル、アセタール、シアノアクリレート、及び分解性ウレタンの重合体又は共重合体、並びに直鎖若しくは分枝鎖、置換若しくは非置換、アルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アルケニル、又は芳香族ヒドロキシ若しくはジカルボン酸を持つこれらの共重合体が挙げられる。加えて、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシン及びシステイン、又はこれらの鏡像異性体などの、反応性側鎖基を持つ生物学的に重要なアミノ酸が、前述の物質のうちのいずれかを持つ共重合体に含まれて、抗原ペプチド及びタンパク質、又は共役部分に共役するための反応基を提供し得る。本発明に好適な生分解性物質としては、ダイヤモンド、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ポリプロピレン硫化物重合体、及びＰＬＧＡ重合体が挙げられる。生体適合性であるが非生分解性の物質も、本発明の担体粒子に使用し得る。例えば、アクリル酸塩、エチレン酢酸ビニル、アシル置換酢酸セルロース、非分解性ウレタン、スチレン、塩化ビニル、フッ化ビニル、ビニルイミダゾール、クロロスルホン化オレフィン、エチレンオキシド、ビニルアルコール、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）（ＤｕＰｏｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．）、及びナイロンの非生分解性重合体を用いてもよい。
【００５２】
一実施形態では、免疫修飾粒子と接触する緩衝溶液は、塩基性ｐＨを有し得る。塩基性溶液に好適な塩基性ｐＨとしては、７．１、７．５、８．０、８．５、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、及び１３．５が挙げられる。緩衝溶液はまた、任意の好適な塩基及びその複合体で作製され得る。本発明の一部の実施形態では、緩衝溶液は、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、重炭酸リチウム、カリウム二水素リン酸塩、リン酸二水素ナトリウム、又はリン酸二水素リチウム、及びこれらの複合体を含むが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明の一実施形態では、免疫修飾粒子は、共重合体を含有する。これらの共重合体は、異なるモル比を有してもよい。本免疫修飾粒子の好適な共重合体の比率は、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８１：１９、８２：１８、８３：１７、８４：１６、８５：１５、８６：１４、８７：１３、８８：１２、８９：１１、９０：１０、９１：９、９２：８、９３：７、９４：６、９５：５、９６：４、９７：３、９８：２、９９：１、又は１００：０であり得る。別の実施形態では、共重合体は、周期的、統計的、線状、分枝（星型、ブラシ型、又は櫛型共重合体）共重合体であってもよい。一部の実施形態では、共重合体の比率は、ポリスチレン：ポリ（カルボン酸ビニル）／８０：２０、ポリスチレン：ポリ（カルボン酸ビニル）／９０：１０、ポリ（カルボン酸ビニル）：ポリスチレン／８０：２０、ポリ（カルボン酸ビニル）：ポリスチレン／９０：１０、ポリ乳酸：ポリグリコール酸／５０：５０、ポリ乳酸：ポリグリコール酸／８０：２０、又はポリ乳酸：ポリグリコール酸／９０：１０であってもよいが、これらに限定されない。
【００５４】
本発明の粒子は、当技術分野で既知の任意の手段によって製造することができる。粒子を製造する例示的な方法としては、マイクロエマルション重合法、界面重合法、沈殿重合法、エマルション蒸発法、エマルション拡散法、溶媒置換法、及び塩析法が挙げられるが、これらに限定されない（Ａｓｔｅｔｅ  ａｎｄ  Ｓａｂｌｉｏｖ，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｎ．，１７：２４７〜２８９（２００６））。ＰＬＧＡ粒子の製造プロセスの操作によって、粒子特性（例えば、粒径、粒径分布、ゼータ電位、形態、疎水性／親水性、ポリペプチドの閉じ込めなど）を制御することができる。粒径は、ＰＬＧＡの濃度、粒子の製造に使用される溶媒、有機相の性質、製造に使用される界面活性剤、連続相及び不連続相の粘度、使用される溶液の性質、使用される水の温度、超音波処理、蒸発速度、添加剤、剪断応力、滅菌、及び任意の封入された抗原又はポリペプチドの性質を含むがこれらに限定されない数々の要因に影響される。
【００５５】
粒径は、重合体濃度に影響を受け、より大きい粒子は、より高い重合体濃度から形成される。例えば、１％から４％（ｗ／ｖ）へのＰＬＧＡ濃度の増加は、溶媒プロピレンカーボネートを使用する場合、平均粒径を約２０５ｎｍから約２９０ｎｍへと増加させ得る。あるいは、酢酸エチル及び５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７中では、１％から５％（ｗ／ｖ）へのＰＬＧＡ濃度の増加は、平均粒径を１２０ｎｍから２３０ｎｍへと増加させる。
【００５６】
連続及び不連続相の粘度も、より小さい粒子の形成において要となる工程である拡散プロセスに影響を与える重要なパラメータである。粒径は分散相の粘度の増加と共に増加し、一方で、粒径はより粘度の高い連続相と共に減少する。概して、有機溶媒対水性溶媒の相比率が低いほど、粒径は小さくなる。
【００５７】
ホモジナイザー速度及び撹拌も粒径に影響を与え、概して、より早い速度及び撹拌が粒径の減少をもたらすが、速度及び撹拌の更なる増加が粒径を減少させなくなる時点が存在する。単に速く掻き混ぜる場合と比較して、エマルションが高圧ホモジナイザーによって均質化される場合には、粒径の減少に好ましい影響がある。例えば、５％のＰＶＡにおける２０％の相分配で、掻き混ぜによる平均粒径は２８８ｎｍであり、均質化（３０ＭＰａ（３００バール）の高圧）による平均粒径は２３１ｎｍである。
【００５８】
粒子の重要な粒径減少は、溶媒の拡散を向上させるために添加する水の温度を変化させることによって達成される。平均粒径は、水温の増加と共に減少する。
【００５９】
粒子中に封入されるポリペプチドの性質も粒径に影響を与える。概して、疎水性ポリペプチドの封入は、より親水性であるポリペプチドの封入と比較して、より小さい粒子の形成につながる。二重エマルションプロセスでは、より親水性であるポリペプチドの閉じ込めは、高分子量のＰＬＧＡと高い内部相粘度を引き起こす高分子量の第１の界面活性剤とを使用することによって向上する。溶媒、重合体、及びポリペプチド間の相互作用は、粒子へのポリペプチドを粒子に組み込むことの効率性に影響を与える。
【００６０】
ＰＬＧＡ分子量は最終平均粒径に影響する。概して、分子量が大きいほど、平均粒径は大きくなる。例えば、ＰＬＧＡの組成及び分子量が変化するとき（例えば、５０：５０のＰＬＧＡについては１２から４８ｋＤａへ、２５のＰＬＧＡについては１２から９８ｋＤａへ）、平均粒径は変化する（それぞれ、約１０２ｎｍ〜１５４ｎｍ、約１３２ｎｍ〜１５２ｎｍ）。粒子が同じ分子量である場合であっても、その組成は平均粒径に影響し得、例えば、５０：５０の比率を持つ粒子は、概して、７５：２５の比率を持つ粒子よりも小さい粒子を形成する。重合体の末端基も、粒径に影響を与える。例えば、酸性ＰＬＧＡ末端基についての平均粒径が２４０ｎｍ（ＰＩ＝０．２２５）であるのと比較して、エステル末端基で調製した粒子は、７４０ｎｍ（ＰＩ＝０．３９４）の平均粒径を持つ粒子を形成する。
【００６１】
使用される溶媒も粒径に影響を与え、溶液の表面張力を減少させる溶媒はまた、粒径も減少させる。
【００６２】
有機溶媒は真空蒸発によって除去されて、重合体及びポリペプチドの傷害を回避し、かつ最終粒径の減少を促進する。有機溶媒の真空下の蒸発は、より小さい粒子の形成に効果的である。例えば、真空蒸発は、通常の速度の蒸発下でもたらされる平均粒径よりも約３０％小さい平均粒径をもたらす。
【００６３】
超音波処理波長の振幅も粒子の特徴に影響を与える。更なる液滴径の変化のない安定したミニエマルションを形成するためには、波長の振幅は６００〜８００ｓの超音波処理で２０％超であるべきである。しかしながら、超音波処理の主な欠点は、形成されたエマルションの単分散の欠如である。
【００６４】
本発明の粒子の産生に使用し得る有機相としては、酢酸エチル、メチルエチルケトン、プロピレンカーボネート、及びベンジルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。使用し得る連続相としては、界面活性剤のポロキサマー１８８が挙げられるが、これに限定されない。
【００６５】
種々の界面活性剤を、本発明の粒子の製造に使用することができる。界面活性剤は、陰イオン性、陽イオン性、又は非イオン性であることができる。ポロキサマー及びポロアキサミン（poloaxamine）族の界面活性剤が粒子合成において一般的に使用される。使用し得る界面活性剤としては、ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ−８０、ゼラチン、デキストラン、プルロニックＬ−６３、ＰＶＡ、メチルセルロース、レシチン、及びＤＭＡＢが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、生分解性かつ生体適合性である界面活性剤は、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ（Ｄ−α−トコフェリルポリエチレングリコール１０００コハク酸塩）が挙げられるが、これに限定されない。ある特定の実施形態では、２つの界面活性剤が必要とされる（例えば、二重エマルション蒸発法において）。これらの２つの界面活性剤は、第１のエマルションのための疎水性界面活性剤と、第２のエマルションのための疎水性界面活性剤とを含むことができる。
【００６６】
本発明の粒子の産生に使用し得る溶媒としては、アセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、クロロホルム、及びクロリネート（chlorinate）族のメンバーである塩化メチルが挙げられるが、これらに限定されない。有機溶媒の選択には、重合体は本溶媒中で可溶性でなければならないということと、溶媒は水相と完全に非混和性でなければならないということとの２つの選択基準が求められる。
【００６７】
本発明の粒子の産生に使用し得る塩としては、塩化マグネシウム六水和物が挙げられるが、これに限定されない。
【００６８】
一般的な塩析剤としては、電解質（例えば、塩化ナトリウム、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム）、又は非電解質（例えば、スクロース）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
本発明の粒子の安定性及び粒径は、脂肪酸又は炭素の短鎖を含むがこれらに限定されない化合物の付加によって向上し得る。ラウリン酸のより長い炭素鎖の付加は、粒子の特徴の向上と関連付けられる。また更に、疎水性添加剤の付加は、粒径、粒子へのポリペプチドの組み込み、及び放出プロファイルを向上させることができる。粒子の調製は、凍結乾燥によって安定化することができる。トレハロースなどの抗凍結剤の付加により、凍結乾燥時の粒子の凝集を減少させることができる。
【００７０】
現在市販されている好適なビーズとしては、ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）などのポリスチレンビーズが挙げられる。
【００７１】
物理的特性も、未熟リンパ球を有する領域における取り込み及び保持後のナノ粒子の有用性に関係する。これらは、剛性又は弾力性などの機械的特性を含む。一部の実施形態は、最近開発され、全身（だが標的化又は免疫ではない）送達を特徴とするＰＰＳ−ＰＥＧ系においてのように、ＰＥＧにおいてのように、ゴム状コア、例えば、親水性被覆層といった被覆層を持つポリ（プロピレンスルフィド）（ＰＰＳ）に基づく。ゴム状コアは、ポリスチレン又は金属ナノ粒子系においてのように、実質的に剛性であるコアとは対照的である。ゴム状という用語は天然又は合成ゴム以外のある特定の弾性物質を指し、これは重合体分野の当業者にはよく知られている用語である。例えば、架橋されたＰＰＳを使用して、疎水性ゴム状コアを形成させることができる。ＰＰＳは、酸化条件下で分解して、疎水性ゴムから親水性の水溶性重合体へと移行しながら、ポリスルホキシド、及び最終的にポリスルホンとなる。他の硫化物重合体を使用に採用してもよく、硫化物重合体という用語は、単量体の主鎖に硫黄を持つ重合体を指す。使用し得る他のゴム状重合体は、約３７℃未満の水和状態下ガラス転移温度を持つポリエステルである。疎水性コアは、被覆層がコアから離れて立体的に膨張する傾向を持つように、コアと被覆層とが混ざらない傾向にあるため、親水性被覆層と共に有利に使用することができる。コアは、その上に層を有する粒子を指す。層は、コアの少なくとも一部分を覆う物質を指す。層は、吸収されるか、又は共有結合され得る。粒子又はコアは、固体又は中空であってもよい。より高い負荷の疎水性薬物がゴム状の疎水性コアを持つ粒子によって担持され得ることから、ゴム状の疎水性コアは、結晶又はガラス状（ポリスチレンの場合のように）コアなどの剛性疎水性コアよりも有利である。
【００７２】
別の物理的特性は、表面の親水性である。親水性物質は、架橋されていないとき、１リットル当たり少なくとも１グラムの水中での溶解度を有し得る。親水性重合体を持つ粒子の立体安定化は、非特異的相互作用を減少させることによって間質からの取り込みを向上させ得るが、粒子の増加した隠密性質も、未熟リンパ球を有する領域における食細胞による内在化を減少させ得る。これらの競合する特徴の均衡を保つという課題は克服したが、なお本出願は、リンパ節におけるＤＣ及び他のＡＰＣへの有効なリンパ送達のためのナノ粒子の創出を実証する。一部の実施形態は、親水性成分、例えば、親水性物質の層を含む。好適な親水性物質の例は、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレンオキシド、ポリサッカライド、ポリアクリル酸、及びポリエーテルのうちの１つ又は２つ以上である。層中の重合体の分子量は、インビボにおける有用な程度の立体障害を提供するように、例えば、約１，０００〜約１００，０００又は更にそれ以上に調整することができ、当業者であれば、全ての範囲及び明確に記述される範囲内の値、例えば１０，０００〜５０，０００が企図されることを即座に理解するであろう。
【００７３】
粒子の組成物は粒子が体内で存続する時間に影響し、寛容は急速な粒子の取り込み及びクリアランス／分解を必要とすることを見出した。５０：５０を超えるラクチド：グリコリドの比は分解速度を遅延させるため、本発明の粒子は、約５０：５０以下のラクチド：グリコリド比を有する。一実施形態では、本発明の粒子は、約５０：５０のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比を有する。
【００７４】
粒子は、更なる反応のための官能基を組み込み得る。更なる反応のための官能基としては、求電子剤又は求核剤が挙げられ、これらは他の分子との反応に簡便である。求核剤の例は、第１級アミン、チオール、及びヒドロキシルである。求電子剤の例は、スクシンイミジルエステル、アルデヒド、イソシアネート、及びマレイミドである。
【００７５】
本発明の負に荷電した粒子などのコロイド治療薬の効能は、粒子のインビボにおける分布に密接に関係する。コロイド系の分布は、ゼータ電位を決定することによって予測することができる。ゼータ電位は、分散媒と分散した粒子に結合する流体の固定層との間の電位差の測定であり、分散液中の隣接する同様に荷電した粒子間の反発の程度を示す。高いゼータ電位は、コロイド製剤の安定性及び良好な分散を予測する。好ましい実施形態では、本発明の薬学的製剤のゼータ電位は、インビボにおける製剤の良好な分散を予測する。
【００７６】
本発明の粒子は、特定のゼータ電位を保有することができる。ある特定の実施形態では、ゼータ電位は負である。一実施形態では、ゼータ電位は約−１００ｍＶ未満である。一実施形態では、ゼータ電位は約−５０ｍＶである。ある特定の実施形態では、粒子は、−１００ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を保有する。更なる実施形態では、粒子は、−７５ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を保有する。更なる実施形態では、粒子は、−６０ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を保有する。更なる実施形態では、粒子は、−５０ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を保有する。また更なる実施形態では、粒子は、−４０ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を保有する。更なる実施形態では、粒子は、−３０ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を保有する。更なる実施形態では、粒子は、−２０ｍＶ〜＋０ｍＶのゼータ電位を保有する。更なる実施形態では、粒子は、−１０ｍＶ〜−０ｍＶのゼータ電位を保有する。更なる実施形態では、粒子は、−１００ｍＶ〜−５０ｍＶのゼータ電位を保有する。更なる実施形態では、粒子は、−７５ｍＶ〜−５０ｍＶのゼータ電位を保有する。更なる実施形態では、粒子は、−５０ｍＶ〜−４０ｍＶのゼータ電位を保有する。
【００７７】
本発明の粒子は、炎症性免疫応答を減退させることを、それを必要とする対象において行うために、及び細菌又はウイルス感染を治療することを、それを必要とする対象において行うために有効ないかなる用量でも付与することができる。ある特定の実施形態では、約１０２〜約１０２０個の粒子が個体に提供される。更なる実施形態では、約１０３〜約１０１５個の粒子が提供される。なお更なる実施形態では、約１０６〜約１０１２個の粒子が提供される。また更なる実施形態では、約１０８〜約１０１０個の粒子が提供される。好ましい実施形態では、好ましい用量は１ｍｌ当たり０．１％の固体である。したがって、０．５μｍのビーズについては、好ましい用量は約４×１０９個のビーズであり、０．０５ｍのビーズについては、好ましい用量は約４×１０１２個のビーズであり、３μｍのビーズについては、好ましい用量は２×１０７個のビーズである。しかしながら、治療される特定の状態を治療することにおいて有効であるあらゆる用量が、本発明に包含される。
【００７８】
本発明は、自己免疫疾患、移植拒絶反応、炎症性疾患及び／又は障害、虚血再灌流、卒中、心筋梗塞、並びにアレルギー反応などの免疫関係障害の治療に有用である。合成の生体適合性粒子系を置換して免疫寛容を誘導することは、製造の容易さ、治療薬の広い可用性につながり、試料間の均一性を増加させ、可能性のある治療部位の数を増加させ、かつ担体細胞に対するアレルギー反応の可能性を劇的に減少させ得る。
【００７９】
本明細書で使用する「免疫応答」という用語は、Ｔ細胞介在性及び／又はＢ細胞介在性免疫応答を含む。例示的な免疫応答は、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生及び細胞傷害性を含む。加えて、免疫応答という用語は、Ｔ細胞活性化、例えば抗体産生（液性応答）、及びサイトカイン応答性細胞、例えばマクロファージの活性化によって間接的に影響される免疫応答を含む。免疫応答に関与する免疫細胞としては、Ｂ細胞及びＴ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔｈ１、及びＴｈ２細胞）などのリンパ球；抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球、ランゲルハンス細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞、及びケラチン生成細胞、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞、オリゴデンドロサイトなどのノンプロフェッショナル細胞）；ナチュラルキラー細胞；マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球、及び顆粒球などの骨髄細胞が挙げられる。一部の実施形態では、本発明の修飾された粒子は、炎症の部位への炎症性細胞の輸送を減少させるのに有効である。
【００８０】
本明細書で使用する「炎症性単球」という用語は、ＣＤ１４／ＣＤ１６及びＣＣＲ２の任意の組み合わせを発現している任意の骨髄細胞を指す。本明細書で使用する「抑制性好中球」という用語は、単球由来のサプレッサー細胞及び／又は好中球を包含する。
【００８１】
本明細書で使用する「アネルギー」、「寛容」、又は「抗原特異的寛容」という用語は、Ｔ細胞受容体介在性刺激へのＴ細胞の非感受性を指す。このような非感受性は、概して抗原特異的であり、抗原性ペプチドへの曝露が停止した後に存続する。例えば、Ｔ細胞におけるアネルギーは、サイトカイン産生、例えばＩＬ−２の欠如を特徴とする。Ｔ細胞アネルギーは、Ｔ細胞が抗原に曝露され、第２のシグナル（共刺激シグナル）の不在下で第１のシグナル（Ｔ細胞受容体又はＣＤ−３介在性シグナル）を受信するときに発生する。これらの条件下で、同じ抗原への細胞の再曝露が（再曝露が副刺激分子の存在下で発生するとしても）、サイトカインの産生の失敗、及びその後の増殖の失敗をもたらす。故に、サイトカインの産生の失敗は、増殖を防止する。アネルギー性Ｔ細胞は、しかしながら、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）と共に培養する場合、増殖することができる。例えば、Ｔ細胞アネルギーはまた、指標細胞系を使用してＥＬＩＳＡ又は増殖アッセイによって測定されるように、Ｔリンパ球によるＩＬ−２産生の欠如によって観察され得る。あるいは、レポーター遺伝子構造物を使用することができる。例えば、アネルギー性Ｔ細胞は、５’ＩＬ−２遺伝子エンハンサーの制御下にある異種プロモーターによって、又はエンハンサー内で見出され得るＡＰＩ配列のマルチマーによって誘導されるＤＬ−２遺伝子転写の開始に失敗する（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９２  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５７：１１３４）。
【００８２】
本明細書で使用する「免疫寛容」という用語は、ａ）減少したレベルの特異的免疫応答（少なくとも一部分では、抗原特異的エフェクターＴリンパ球、Ｂリンパ球、抗体、又はそれらの等価物によって媒介されると考えられる）、ｂ）特異的免疫応答の開始若しくは進行、又はｃ）特異的免疫応答の開始若しくは進行の減少した危険性の場合、治療されていない対象と比較した治療された対象の一部に行う方法を指す。「特異的」免疫寛容は、免疫寛容が他のものと比較してある特定の抗原に対して選択的に引き起こされるときに発生する。「非特異的」免疫寛容は、免疫寛容が、炎症性免疫応答をもたらす抗原に対して無差別に引き起こされるときに発生する。「準特異的」免疫寛容は、免疫寛容が、半差別的に、病原性免疫応答をもたらす抗原に対しては引き起こされ、防御免疫応答をもたらす他のものに対しては引き起こされないときに発生する。
【００８３】
寛容活性に対する代用物は、標的部位において適切なサイトカインの産生を刺激する粒子の能力である。標的部位でＴサプレッサー細胞によって放出される免疫調節性サイトカインは、ＴＧＦ−βであると考えられている（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２１，１９９２）。寛容の間に産生され得る他の因子は、サイトカインＩＬ４及びＩＬ−１０、並びにメディエータＰＧＥである。対照的に、活発な免疫破壊を受けている組織中のリンパ球は、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、及びＩＦＮγなどのサイトカインを分泌する。よって、修飾された粒子の効能は、適切な型のサイトカインを刺激するその能力を測定することによって評価することができる。
【００８４】
このことを考慮すると、修飾された粒子、有効な粘膜結合成分、有効な組み合わせ、又は粘膜投与の有効な様式及びスケジュールの迅速なスクリーニング試験を、動物モデル系を使用して実施することができる。動物は、試験粒子組成物を用いて粘膜表面で治療され、ある時期に、疾患を引き起こす抗原又は病原体の投与によるチャレンジを受ける。脾臓細胞を単離し、約５０μｇ／ｍＬの濃度にある、疾患を引き起こす抗原又は病原菌由来の抗原の存在下で、インビトロにおいて培養する。培地へのサイトカインの分泌は、標準的なイムノアッセイによって定量化することができる。
【００８５】
細胞の活性を抑制する粒子の能力は、修飾された粒子で免疫付与した動物から単離した細胞を使用して、又は疾患を引き起こす抗原若しくはウイルス抗原標的抗原に応答性である細胞系を創出することによって、決定することができる（Ｂｅｎ−Ｎｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１９５，１９８１）。この実験の一変形形態では、サプレッサー細胞集団に軽度に放射線照射して（約１０００〜１２５０ラド）増殖を防止し、サプレッサーをキラー細胞を用いて共培養し、その後、トリチウム化チミジンの組み込み（又はＭＴＴ）を使用してキラー細胞の増殖活性を定量化する。別の変形形態では、ポリカーボネート膜によって分離させた相互の１ｍｍ以内で集団が共インキュベートするのを可能にするｄｕａｌ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍａｓｓ．）の上部及び下部レベルにおいて、サプレッサー細胞集団及びキラー細胞集団を培養する（国際公開第ＷＯ  ９３／１６７２４号）。このアプローチでは、キラー細胞の増殖活性は別個に測定することができるため、サプレッサー細胞集団の照射は不要である。
【００８６】
特定の疾患に対する組成物の有効性及び投与様式はまた、対応する動物疾患モデルにおいて詳述され得る。疾患の総体症状を減退又は遅延させるための治療の能力は、用いるモデルに適切なように、疾患の循環生化学的及び免疫学的特質、罹患組織の免疫組織学、並びに肉眼的な臨床的特徴のレベルでモニタリングする。試験に使用し得る動物モデルの非限定的な例を、以下の節に含める。
【００８７】
本発明は、ＴＨｌ応答、ＴＨ２応答、ＴＨ１７応答、又はこれらの応答の組み合わせを調節することによる寛容の調節を企図する。ＴＨｌ応答の調節は、例えばインターフェロンガンマの発現を変化させることを含む。ＴＨ２応答の調節は、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１３の任意の組み合わせの発現を変化させることを含む。典型的には、ＴＨ２応答の増加（減少）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、又はＩＬ−１３のうちの少なくとも１つの発現の増加（減少）を含むことになり、より典型的には、ＴＨ２応答の増加（減少）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、又はＥＬ−１３のうちの少なくとも２つの発現の増加を含むことになり、最も典型的には、ＴＨ２応答の増加（減少）は、ＤＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、又はＩＬ−１３のうちの少なくとも３つの増加を含むことになるが、ＴＨ２応答の増加（減少）が、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１３のうちの全ての発現の増加（減少）を含むことになるのが理想的である。ＴＨ１７の調節は、例えば、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、及びＩＬ２３の発現を変化させることを含み、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、及びＩＬ−２２のレベルに影響する。
【００８８】
自己抗原及び自己免疫疾患への寛容は、胸腺における自己反応性Ｔ細胞の陰性選択、及び、胸腺での削除を逃れ末梢において見出される自己反応性Ｔ細胞についての末梢寛容の機構を含む、種々の機構によって達成される。末梢Ｔ細胞寛容をもたらす機構の例としては、自己抗原の「無知」、自己抗原に対するアネルギー又は非応答、サイトカイン免疫偏向、及び自己反応性Ｔ細胞の活性化誘発性細胞死が挙げられる。加えて、調節性Ｔ細胞は、末梢寛容の介在に関与することが示されている。例えば、Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１１〜１９、Ｓｈｅｖａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１８２：５８〜６７を参照されたい。一部の状況では、自己抗原への末梢寛容が失われ（又は破壊され）、自己免疫応答が続いて起きる。例えば、ＥＡＥについての動物モデルにおいて、ＴＬＲ先天性免疫受容体を通した抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化は、自己寛容を破壊し、ＥＡＥの誘導をもたらすことを示した（Ｗａｌｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３：９９０〜９９７）。ある特定の実施形態では、本発明の粒子は、Ｔｒｅｇの頻度及び／又はエフェクター機能を増加させることによって、寛容又は一般的な免疫調節を誘導することができる。本発明の粒子によって概して上方調節されるＴｒｅｇは、転写レプレッサー因子フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）も発現するＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇである。しかしながら、本発明の粒子によって上方調節されるＴｒｅｇはまた、ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ又はサプレッサー細胞でもあってもよい。
【００８９】
したがって、一部の実施形態では、本発明は、抗原の提示を増加させ、同時に、ＴＬＲ７／８、ＴＬＲ９、及び／又はＴＬＲ７／８／９依存性の細胞刺激を抑制するか又は減少させるための方法を提供する。本明細書に記載するように、特定の修飾された粒子の投与は、ＤＣ又はＡＰＣによる抗原提示をもたらし、同時に、免疫賦活性ポリヌクレオチドと関連付けられる、ＴＬＲ  ７／８、ＴＬＲ９、及び／又はＴＬＲ７／８／９依存性細胞応答を抑制する。このような抑制は、１つ又は２つ以上のＴＬＲ関連サイトカインの減少したレベルを含み得る。
【００９０】
本発明の別の態様では、負に荷電した粒子は、図１６Ａに示すように、炎症応答を持つ対象の血液からの炎症誘発性メディエータ、病原性タンパク質、及び細胞残屑を拭い去るためのシンクとして働く。あるいは、又は加えて、本発明の負に荷電した粒子は、図１６Ｂに示すように、炎症応答を持つ対象の血液中の調節タンパク質に結合することによって調節タンパク質を濃縮し、これらの調節タンパク質をその同種受容体に提示して、免疫応答を更に寛解させ得る。以下でより詳細に考察するように、本発明者らは、少なくとも１５個の血清タンパク質が、無処置の対象又は免疫応答が進行中でない対象には結合が見出されない、活発な炎症性免疫応答を持つ対象において負に荷電した粒子に結合していることが見出されたことを発見した。これは、粒子が炎症誘発性シンク又は免疫調節物質のコンセントレーター／プレゼンターとして働くことができる上記の方法においてだけではなく、診断方法との関連においても有用である。具体的には、負に荷電した本発明の粒子は、質量分析法及び他のプロテオーム方法などの他の方法が失敗した場合に、血液試料の広範な診断方法において使用し得る。驚くべきことに、炎症性血漿又は血清を本明細書に記載の負に荷電した粒子と共にインキュベートしたとき、これは、非炎症性又は恒常性状態下の血清／血漿中では見出されなかったタンパク質の結合及びその後の精製をもたらしたことを見出した。
【００９１】
本発明の別の態様では、抗原を含む粒子を提供する。表面に抗原を担持するナノ粒子を使用して、Ｔ細胞寛容を誘導することに成功した（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０：１２１７〜１２２３）。ペプチドに結合した粒子による寛容は、Ｔ細胞アネルギーの誘導と調節性Ｔ細胞の活性との両方に依存し、Ｔ細胞寛容を誘導することによって自己免疫障害を治療するための代替的方法を示し得る。このＴ細胞寛容は、生分解性（ＰＬＧ）粒子に結合したペプチドを使用するときに観察された。
【００９２】
一実施形態では、本発明の粒子は、アレルギー、自己免疫疾患、及び／又は炎症性疾患若しくは障害と関連付けられる１つ若しくは２つ以上のエピトープを含む抗原に結合する。抗原は、エピトープの１つ又は２つ以上の複製を含み得る。一実施形態では、抗原は、１つの疾患又は障害と関連付けられる単一のエピトープを含む。更なる実施形態では、抗原は、同じ疾患又は障害と関連付けられる２つ以上のエピトープを含む。なお更なる実施形態では、抗原は、異なる疾患又は障害と関連付けられる２つ以上のエピトープを含む。更なる実施形態では、抗原は、１つ又は２つ以上のアレルギーと関連付けられる１つ又は２つ以上のエピトープを含む。更なる実施形態では、抗原は、多発性硬化症、１型糖尿病、セリアック病、及び／又はクローン病若しくは潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患と関連付けられる１つ又は２つ以上のエピトープを含む。
【００９３】
一実施形態では、エピトープは、ミエリン塩基性タンパク質（例えば、配列番号４９７５及び４９７６）、プロテオリピドタンパク質（例えば、配列番号４９７７）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（例えば、配列番号１及び４９７８）、アクアポリン（例えば、配列番号４９７９）、ミエリン関連糖タンパク質（例えば、配列番号４９８０）、インスリン（例えば、配列番号４９８１）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（例えば、配列番号４９８２）、グリアジン（例えば、配列番号４９８３〜４９８５又は５１３６〜５１４０）、若しくはＩＶ型コラーゲンのα３鎖（例えば、配列番号５０１７）、又はその断片、相同体、若しくはアイソフォームからのものである。更なる実施形態では、エピトープは、グリアジン及び／又はグルテニンからのものを含む、グルテンからのものである。一実施形態では、エピトープは、その全体があらゆる目的で本明細書に組み込まれる米国特許第８，４７６，２２８号に記載されるものなどの、インスリン相同体からのものである。一実施形態では、グリアデンは、米国出願第２０１１０２９３６４４号中の配列番号１３、１４、１６、３２０、若しくは３２１、又はＳｏｌｌｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６５：４５５〜４６０に記載されるものであり、これらの両方はその全体があらゆる目的で本明細書に組み込まれる。
【００９４】
本発明が企図する、種々の自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患若しくは障害と関連付けられるエピトープの更なる非限定的な例を、表１及び２に記載する。
【００９５】
【表１】
2020172501.tif 000002
【００９６】
全てのエピトープが直鎖状エピトープというわけではなく、エピトープは、不連続の立体構造エピトープであることもできる。自己免疫疾患又は炎症性疾患及び／若しくは障害と関連付けられる多数の不連続エピトープが既知である。不連続エピトープの非限定的な例を表２に記載する。
【００９７】
【表２−１】
2020172501.tif 000003
【００９８】
【表２−２】
2020172501.tif 000004
【００９９】
本発明の別の態様では、抗原を封入する粒子を提供する。粒子の内部に抗原を封入する粒子を使用して、対象においてＴ細胞寛容を誘導することができる。本発明の粒子内に封入され得る抗原の例としては、ウイルス抗原及び細菌抗原などの外来性抗原、内在性抗原、自己抗原、腫瘍抗原、並びに／又は天然抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
単球及びマクロファージは、主に、食作用、炎症性サイトカインの放出、活性酸素種、及び後天性免疫系を通して、炎症の発症及び消散において中心的役割を果たす（Ａｕｆｆｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：６６９〜６９２）。典型的に、単球は、アポトーシスを受ける前に、非常に短い時間血流中で循環するが、刺激性シグナルは、アポトーシス経路を阻害することによって単球の生存を誘発し、故に炎症応答の維持に寄与し得る。抗アポトーシスタンパク質は、カスパーゼを阻害すること又はアポトーシスプログラムの活性化によって作用する。とりわけ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）／Ａｋｔ、ＥＲＫ、Ｆａｓ、ＴＮＦ、熱ショックタンパク質、及び抗アポトーシス性分子は、単球の寿命を決定することにおいて重要な役割を果たす。炎症応答中、単球及びマクロファージなどの炎症性細胞は、炎症の部位に補充される。この補充は感染の有効な制御及びクリアランスに必須であるが、補充単球はまた、炎症性疾患及び変性疾患の発病に寄与する。単球の蓄積は有害であり得、アテローム性動脈硬化症、関節炎、及び多発性硬化症などの疾患を悪化させ得る。炎症の消散は、炎症病巣への炎症性細胞の減少及び／又は阻害、並びに既に存在する炎症性細胞のアポトーシスを必要とする。アポトーシス性カスパーゼは、多様な生物学的機能を用いてタンパク質を分解することで細胞をタンパク質分解的に解体することによって基本的な役割を果たす。例えば、カスパーゼ−３の活性化は、ＣＤ１４＋単球アポトーシスに必須である（Ｆａｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１７５５〜１７６２）。
【０１０１】
本発明の負に荷電した粒子（ときに本明細書では「免疫修飾粒子」又は「ＩＭＰ」として言及する）は、炎症病巣への炎症性単球の移行を特異的に阻害する。炎症性単球は、コラーゲンに依存する様式を持つマクロファージ受容体（ＭＡＲＣＯ）中にＩＭＰを取り込み、脾臓に遊走し、ここで、カスパーゼ３介在性細胞死を受ける。ＩＭＰ療法は、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）脳炎、腹膜炎、実験的自己免疫性脳脊髄炎、心筋梗塞後の心機能、腎臓再灌流損傷、及び大腸炎に良い影響を与えることが示されている。ＩＭＰは、ＭＡＲＣＯ依存性様式で炎症性単球を阻害するための代替的及び極めて特異的なツールを提供する。天然の白血球クリアランス経路を生かすことで、ＩＭＰは、新規かつ安全な炎症性単球特異的療法を示す。
【０１０２】
一態様では、本発明の方法は、対象において、単球、顆粒球、及び／又は好中球中でアポトーシスを誘導して、炎症応答の重症度又は期間を減少させることを含む。一実施形態では、負に荷電した本発明の粒子を投与することは、単球、顆粒球、及び／又は好中球アポトーシス並びにクリアランスを誘導することで、炎症の消散を補助する。
【０１０３】
一態様では、本発明の方法は、細胞によって産生される炎症性分子及びポリペプチドに結合することで、それらがその活性を発揮するのを防止する、「分子シンク」として使用することを企図する。炎症が起こるときには、サイトカイン及びケモカインなどの炎症誘発性メディエータが、マクロファージ及び単球などの細胞によって周囲の炎症誘発性環境中に放出される。炎症誘発性メディエータの例としては、インターロイキン、ＴＮＦ族のメンバー、インターフェロン、及びコロニー刺激因子が挙げられるが、これらに限定されない。これらのメディエータは、炎症応答を増強することで炎症性病変を悪化させる。本明細書に記載のように、本発明の粒子は、炎症性免疫応答を受けている動物の血清中で炎症性メディエータに結合する。本発明の粒子が結合する炎症性メディエータとしては、熱ショックタンパク質ベータ−１、タンパク質Ｓ１００−Ａ７、タンパク質Ｓ１００−Ａ８、タンパク質Ｓ１００−Ａ９、脂肪酸結合タンパク質、アネキシンＡ１、及びユビキチン交差反応性タンパク質前駆体が挙げられるが、これらに限定されない。コーティングしていない本発明の粒子の動物への投与は、炎症病巣に存在する炎症性単球の減少、炎症症状の減少、及び感染動物の生存の増加をもたらす。
【０１０４】
上で考察したように、本発明は、免疫介在性障害の治療に有用な生物学的特性を有する新規化合物を提供する。
【０１０５】
したがって、本発明の別の態様では、粒子を含み、かつ薬学的に許容される担体を任意選択的に含む、薬学的組成物を提供する。ある特定の実施形態では、これらの組成物は、１つ又は２つ以上の追加の治療薬を任意選択的に更に含む。別の実施形態では、本発明の粒子は、抗原を封入し得るか、又は抗原を埋め込まれてもよい。あるいは、本発明の粒子は、１つ又は２つ以上の他の治療薬の投与と組み合わせて、それを必要とする患者に投与してもよい。例えば、本発明の化合物との共同投与、又は薬学的組成物中への本発明の化合物の含有のための追加の治療薬は、承認された抗炎症薬であってもよく、あるいは、無制御の炎症性免疫応答又は細菌若しくはウイルス感染を特徴とするいずれかの障害の治療のために最終的に承認を得る、食品医薬品局で承認を受けている最中の多数の薬剤のうちのいずれか１つであってもよい。本発明の修飾された粒子のある特定のものは、治療のために遊離型で、又は適切な場合にはその薬学的に許容される誘導体として、存在することができる。
【０１０６】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を追加で含み、この担体としては、本明細書で使用する場合、所望の特定の剤形に適したように、ありとあらゆる溶媒、希釈剤、又は他の液体ビヒクル、分散若しくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤若しくは乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑沢剤などが挙げられる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）は、薬学的組成物の製剤化に使用される種々の担体、及びその調製のための既知の技法を開示する。望ましくない生物学的影響をもたらすこと、あるいは薬学的組成物の任意の他の成分（複数可）と有害な様式で相互作用することによってなど、いずれの従来の担体媒体もが本発明の化合物と不適合である限りにおいて、その使用は本発明の範囲内であると企図される。薬学的に許容される担体として働き得る物質の一部の例としては、ラクトース、グルコース、及びスクロースなどの糖類；コーンスターチ及びジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；滑石；ココアバター及び坐薬ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、胡麻油、オリーブ油、トウモロコシ油、及び大豆油などの油類；プロピレングリコールなどのグリコール類；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール、並びにリン酸緩衝溶液が挙げられるがこれらに限定されず、かつラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの他の無毒の相溶性滑沢剤、併せて着色剤、解除剤、コーティング剤、甘味、香味、及び芳香剤、防腐剤、並びに抗酸化剤も、製剤化担当者の判断に従って、組成中に存在し得る。
【０１０７】
経口投与のための液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、及びエリキシルが挙げられるが、これらに限定されない。活性化合物に加えて、液体剤形は、例えば水又は他の溶媒などの当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類（具体的には、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及び胡麻油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステルなどの、可溶化剤及び乳化剤、並びにこれらの混合物を含有してもよい。不活性希釈剤に加えて、経口用組成物はまた、湿潤剤、乳化及び懸濁剤、甘味剤、香味剤、及び芳香剤などのアジュバントを含むことができる。
【０１０８】
注射可能な調剤、例えば、滅菌の注射可能な水性又は油性懸濁液は、好適な分散又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して、既知の技術に従って製剤化し得る。滅菌の注射可能な調剤はまた、無毒の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌の注射可能な溶液、懸濁液、又はエマルション、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液としてあってもよい。用いることができる許容可能なビヒクル及び溶媒には、水、リンガー溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、及び等張食塩水がある。加えて、滅菌凝固油が、溶媒又は懸濁媒体として従来的に用いられる。この目的では、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含むいかなる無菌性凝固油も用いることができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が、注射可能物質の調製に使用される。
【０１０９】
注射可能な製剤は、例えば、細菌保持フィルタを通した濾過によって、又は使用前に滅菌水若しくは他の注射可能な滅菌媒体中に溶解若しくは分散させ得る滅菌固体組成物の形態にある滅菌剤を組み込むことにより、滅菌することができる。
【０１１０】
薬物の効果を延長するために、皮下又は筋肉注射からの薬物の吸収を遅延させることが望ましい場合が多い。これは、液体懸濁液、又は難水溶性の結晶質若しくは非晶質物質の使用によって達成し得る。そして薬物の吸収の速度はその溶解速度に依存し、この溶解速度は、今度は結晶サイズ及び結晶形に依存し得る。あるいは、非経口的に投与された薬物形態の遅延吸収は、薬物を油性ビヒクル中に溶解させるか又は懸濁することによって達成される。注射可能なデポー剤形は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性重合体中の薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって作製される。薬物の重合体に対する比率、及び用いる特定の重合体の性質に応じて、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性重合体の例としては、（ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。注射可能なデポー製剤はまた、体組織と互換性のあるリポソーム又はマイクロエマルション中に薬物を封入することによっても調製される。ある特定の実施形態では、薬物及び治療薬は、対象への投与のために本発明の粒子中にカプセル化してもよい。
【０１１１】
経口投与のための固形剤形としては、カプセル錠、錠剤、丸薬、粉末剤、及び顆粒剤が挙げられる。このような固形剤形において、この修飾された粒子は、少なくとも１つのクエン酸ナトリウム又はリン酸ニカルシウムなどの不活性な薬学的に許容される賦形剤若しくは担体、並びに／又はａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及びケイ酸などの充填剤又は増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、及びアカシアなどの結合剤、ｃ）グリセロールなどの保湿剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、ｅ）パラフィンなどの溶液緩和剤、ｆ）第４級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ｇ）例えば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレートなどの湿潤剤、ｈ）カオリン及びベントナイト粘土などの吸収剤、並びにｉ）滑石、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びこれらの混合物などの滑沢剤と混合する。カプセル錠、錠剤、及び丸薬の場合には、剤形はまた、緩衝剤を含んでもよい。
【０１１２】
類似の型の固形組成物も、ラクトース又は乳糖及び超高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、軟及び硬ゼラチンカプセルにおける充填剤として用いてもよい。錠剤、糖衣錠、カプセル錠、丸薬、及び顆粒剤の固形剤形は、腸溶コーティング及び薬学的製剤化分野で公知の他のコーティングなどのコーティング及びシェルを用いて調製することができる。これらは、不透明化剤を任意選択で含有してもよく、これらが、任意選択で遅延した様式で、腸管のある特定の部分においてのみ又はそこで優先的に、活性成分（複数可）を放出するような組成物であることもできる。使用し得る埋め込み組成物の例としては、重合物質及びワックスが挙げられる。類似の型の固形組成物も、ラクトース又は乳糖及び超高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、軟及び硬ゼラチンカプセルにおける充填剤として用いてもよい。
【０１１３】
修飾された粒子も、上記のような１つ又は２つ以上の賦形剤を用いたマイクロカプセル化形態にあることができる。錠剤、糖衣錠、カプセル錠、丸薬、及び顆粒剤の固形剤形は、腸溶コーティング、放出制御コーティング、及び薬学的製剤化分野で公知の他のコーティングなどのコーティング及びシェルを用いて調製することができる。このような固形剤形において、活性化合物は、スクロース、ラクトース、及びデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合してもよい。このような剤形はまた、通常の慣行のように、不活性希釈剤以外の追加的な物質、例えば、ステアリン酸マグネシウム及び微結晶性セルロースなどの錠剤化滑沢剤及び他の錠剤化助剤を含んでもよい。カプセル錠、錠剤、及び丸薬の場合には、剤形はまた、緩衝剤を含んでもよい。これらは、不透明化剤を任意選択で含有してもよく、これらが、任意選択で遅延した様式で、腸管のある特定の部分においてのみ又はそこで優先的に、修飾された粒子を放出するような組成物であることもできる。使用し得る埋め込み組成物の例としては、重合物質及びワックスが挙げられる。
【０１１４】
本発明は、本発明の修飾された粒子の薬学的に許容される局所製剤を包含する。本明細書で使用する「薬学的に許容される局所製剤」という用語は、表皮への製剤の適用による、本発明の修飾された粒子の皮膚内投与に対して薬学的に許容されるいずれの製剤も意味する。本発明のある特定の実施形態では、局所製剤は担体系を含む。薬学的に有効な担体としては、溶剤（例えば、アルコール、多価アルコール、水）、クリーム剤、ローション剤、軟膏、油剤、硬膏、リポソーム剤、粉末剤、エマルション、マイクロエマルション、及び緩衝溶液（例えば、低張又は緩衝食塩水）、又は医薬品を局所投与するための当技術分野で既知の任意の他の担体が挙げられるが、これらに限定されない。当技術分野で既知の担体のより完全な一覧は、当技術分野における基準である参照文献、例えば、共にＭａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．から出版されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８０、及び１７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５によって提供され、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の他の実施形態では、本発明の局所製剤は、賦形剤を含んでもよい。当技術分野で既知の任意の薬学的に許容される賦形剤を使用して、本発明の薬学的に許容される局所製剤を調製し得る。本発明の局所製剤に含めることができる賦形剤の例としては、防腐剤、抗酸化剤、保湿剤、軟化剤、緩衝剤、可溶化剤、他の浸透剤、皮膚保護剤、界面活性剤、及び噴射剤、並びに／又はこの修飾された粒子と組み合わせて使用される追加的な治療薬が挙げられるが、これらに限定されない。好適な防腐剤としては、アルコール、第４級アミン、有機酸、パラベン、及びフェノールが挙げられるが、これらに限定されない。好適な抗酸化剤としては、アスコルビン酸及びそのエステル、亜硫酸水素ナトリウム、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、トコフェノール、並びにＥＤＴＡ及びクエン酸のようなキレート剤が挙げられるが、これらに限定されない。好適な保湿剤としては、グリセリン、ソルビトール、ポリエチレングリコール、尿素、及びプロピレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。本発明との使用に好適な緩衝剤としては、クエン酸、塩酸、及び乳酸緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。好適な可溶化剤としては、第４級アンモニウムクロリド、シクロデキストリン、安息香酸ベンジル、レシチン、及びポリソルベートが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の局所製剤において使用し得る好適な皮膚保護剤としては、ビタミンＥ油、アラトイン、ジメチコーン、グリセリン、ペトロラタム、及び酸化亜鉛が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、本発明の薬学的に許容される局所製剤は、少なくとも本発明の修飾された粒子と浸透促進剤とを含む。局所製剤の選択は、治療される状態、本発明の化合物及び存在する他の賦形剤の物理化学的特徴、製剤中でのこれらの安定性、利用可能な製造設備、並びに費用上の制約を含むいくつかの要因に依存することになる。本明細書で使用する「浸透促進剤」という用語は、全身性吸収をほとんど又は全く行わずに、薬理学的に活性な化合物を、角質層を通して表皮又は真皮へと輸送することが可能な薬剤を意味する。多種多様な化合物が、皮膚を通した薬物の浸透速度を促進することにおけるその有効性について評価されている。例えば、種々の皮膚浸透促進剤の使用及び試験を調査している、Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ，Ｍａｉｂａｃｈ  Ｈ．Ｉ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｈ．Ｅ．（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９９５）、並びにＢｕｙｕｋｔｉｍｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅａｎｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｔｏｐｉｃａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｏｓｈ  Ｔ．Ｋ．，Ｐｆｉｓｔｅｒ  Ｗ．Ｒ．，Ｙｕｍ  Ｓ．Ｉ．（Ｅｄｓ．），Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，Ｉｌｌ．（１９９７）を参照されたい。ある特定の例示的な実施形態では、本発明と共に使用するための浸透剤としては、トリグリセリド（例えば、大豆油）、アロエ組成物（例えば、アロエベラゲル）、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、オクトリフェニルポリエチレングリコール（octolyphenylpolyethylene glycol）、オレイン酸、ポリエチレングリコール４００、プロピレングリコール、Ｎ−デシルメチルスルホキシド、脂肪酸エステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピル、ラウリン酸メチル、グリセロールモノオレエート、及びプロピレングリコールモノオレエート）、及びＮ−メチルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、本組成物は、軟膏、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、粉末剤、溶剤、噴霧剤、吸入剤、又はパッチ剤の形態にあってもよい。ある特定の例示的な実施形態では、本発明に従う組成物の製剤はクリームであり、これは更に、飽和又は不飽和脂肪酸、例えば、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、パルミトオレイン酸、セチル又はオレイルアルコールを含んでもよく、ステアリン酸が特に好ましい。本発明のクリーム剤は、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリオキシ−４０−ステアラートも含み得る。ある特定の実施形態では、活性成分は、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体及び任意の必要な防腐剤又は必要に応じて緩衝剤と混合する。眼用製剤、点耳剤、及び点眼剤も、本発明の範囲内にあるものと企図される。加えて、本発明は、化合物の体内への制御送達を提供する付加的利点を有する経皮パッチ剤の使用を企図する。このような剤形は、化合物を適切な媒体に溶解又は分散させることによって作製される。上述のように、浸透促進剤は、皮膚を通した化合物の流量を増加させるためにも使用することができる。速度は、速度制御膜を提供するか、あるいは化合物を重合体マトリックス又はゲルに分散させることによって制御することができる。
【０１１７】
修飾された粒子は、エアロゾルによって投与することができる。これは、修飾された粒子を含有する水性エアロゾル、リポソーム調剤、又は固形粒子を調製することによって達成される。非水性（例えば、フルオロカーボン噴射剤）懸濁剤を使用し得る。
【０１１８】
通常は、水性エアロゾルは、従来の薬学的に許容される担体及び安定剤と共に薬剤の水溶液又は懸濁液を製剤化することによって作製される。担体及び安定剤は特定の化合物の要件によって異なるが、典型的には、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎｓ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）、又はポリエチレングリコール）、血清アルブミンのような無害のタンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシンなどのアミノ酸、緩衝液、塩、糖類、又は糖アルコールが挙げられる。エアロゾルは概して等張液から調製される。
【０１１９】
本発明の修飾された粒子及び薬学的組成物は、併用療法において製剤化し用いることができ、これはつまり、化合物及び薬学的組成物が、１つ若しくは２つ以上の他の所望される治療薬若しくは医療処置と共に製剤化するか、又はそれらと同時に、それらの前若しくは後に、投与することができるということも理解されるであろう。併用レジメンにおいて用いる療法（治療薬又は処置）の特定の組み合わせは、所望の治療薬及び／又は処置と達成が所望される治療効果との適合性を考慮に入れることになる。用いる療法は、同じ障害に対して所望の効果を達成し得る（例えば、本発明の化合物は、別の抗炎症剤と同時に投与し得る）か、又はこれらの療法は、異なる効果（例えば、任意の副作用の制御）を達成してもよい。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、本発明の修飾された粒子を含有する薬学的組成物（例えば、抗炎症性及び／又は緩和的）は、１つ又は２つ以上の追加的な治療的活性成分を更に含む。本発明の目的では、「緩和的」という用語は、疾患の症状及び／又は治療レジメンの副作用の軽減に集中するが、治癒的ではない治療を指す。例えば、緩和的治療は、鎮痛剤、抗悪心薬（antinausea）、及び吐気止め薬（anti-sickness drug）を包含する。
【０１２１】
本発明は、個体、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおいて免疫応答を調節する方法を提供し、本方法は、本明細書に記載の修飾された粒子を個体に投与することを含む。本発明によって提供される免疫調節の方法は、免疫賦活性ポリペプチド又はウイルス若しくは細菌成分によって刺激される免疫応答を含むがこれに限定されない、先天性免疫応答又は適応免疫応答を抑制及び／又は阻害するものを含む。
【０１２２】
修飾された粒子は、免疫応答を調節するのに十分な量で投与される。本明細書に記載のように、免疫応答の調節は、液性及び／又は細胞性であってもよく、当技術分野における標準的な技法を使用して、及び本明細書に記載のように、測定される。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、個体は、アレルギー性疾患又は状態、アレルギー、及び喘息などの不必要な免疫活性化と関連付けられる障害を患う。アレルギー性疾患又は喘息を有する個体とは、既存のアレルギー性疾患又は喘息の認識可能な症状を持つ個体である。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、個体は、自己免疫疾患及び炎症性疾患などの不必要な免疫活性化と関連付けられる障害を患う。自己免疫疾患又は炎症性疾患を有する個体とは、既存の自己免疫疾患又は炎症性疾患の認識可能な症状を持つ個体である。
【０１２５】
自己免疫疾患は、臓器特異性及び全身性という２つの広義のカテゴリーに分類することができる。自己免疫疾患としては、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型真性糖尿病、２型真性糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、早発閉経などの免疫介在性不妊症、強皮症、シェーグレン病、白斑、脱毛症（禿げ）、多腺性不全、グレーブス病、甲状腺機能低下症、多発性筋炎、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、セリアック病、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と関連付けられるものを含む自己免疫性肝炎、下垂体機能低下症、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、心筋炎、アジソン病、自己免疫性皮膚疾患、ブドウ膜炎、悪性貧血、並びに副甲状腺機能低下症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
自己免疫疾患としてはまた、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、橋本病甲状腺炎、１型及び２型自己免疫性多腺性症候群、腫瘍随伴性天疱瘡、ブルス類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、線状ＩｇＡ病、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、妊娠性類天疱瘡、瘢痕性類天疱瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、幼少期の慢性水疱性疾患、溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、自己免疫性好中球減少症、重症筋無力症、イートン・ランバート筋無力症症候群、スティフマン症候群、急性散在性脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、伝導障害を伴う多巣性運動ニューロパチー、単クローン性免疫グロブリン血症を伴う慢性神経障害、オプソノクローヌス・ミオクローヌス症候群、小脳変性症、脳脊髄炎、網膜症、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、グルテン過敏性腸疾患、強直性脊椎炎、反応性関節炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、混合性結合組織疾患、ベチェット病、乾癬、結節性多発動脈炎、アレルギー性血管炎性肉芽腫症（チャーグ・ストラウス症候群）、多発性血管炎重複症候群、過敏性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、側頭動脈炎、高安動脈炎、川崎病、中枢神経系孤立性血管炎、閉塞性血栓性血管炎、サルコイドーシス、糸球体腎炎、及び寒冷症が挙げられるが、これらに限定されない。これらの状態は医学の分野で周知であり、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４ｔｈ  ｅｄ．，Ｆａｕｃｉ  Ａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，１９９８中で説明される。
【０１２７】
本発明の粒子で治療される対象はヒトであることが好ましいが、粒子は非ヒト動物種の治療に有用である。本発明の粒子で治療され得る非ヒト動物種としては、イヌ、ネコ、ニワトリ、ガチョウ、アヒル、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、非ヒト霊長類、サル、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、及びウマが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
自己免疫疾患の研究のための動物モデルは、当技術分野で既知である。例えば、ヒトの自己免疫疾患に最も類似しているように思われる動物モデルとしては、特定の疾患の高い発症率を自然発現する動物系統が挙げられる。このようなモデルの例としては、１型糖尿病と同様の疾患を発症する非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス、並びにニュージーランドハイブリッド、ＭＲＬ−Ｆａｓｌｐｒ、及びＢＸＳＢマウスなどのループス様疾患にかかりやすい動物が挙げられるが、これらに限定されない。自己免疫疾患を誘導した動物モデルとしては、多発性硬化症に対するモデルである実験的自己免疫性脳脊随炎（ＥＡＥ）、リウマチ性関節炎に対するモデルであるコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）、及びブドウ膜炎に対するモデルである実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）が挙げられるが、これらに限定されない。自己免疫疾患のための動物モデルはまた、遺伝子操作によって創出し、例えば、炎症性腸疾患に対するＩＬ−２／ＩＬ−１０ノックアウトマウス、ＳＬＥに対するＦａｓ又はＦａｓリガンドノックアウトマウス、及びリウマチ性関節炎に対するＩＬ−Ｉ受容体アンタゴニストノックアウトマウスを含む。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、個体は細菌又はウイルス感染を患う。細菌又はウイルス感染を有する個体とは、既存の細菌又はウイルス感染の認識可能な症状を持つ個体である。
【０１３０】
本発明の修飾された粒子で治療可能なウイルス感染の非限定的な一覧は、ヘルペスウイルス感染、肝炎ウイルス感染、西ナイルウイルス感染、フラビウイルス感染、インフルエンザウイルス感染、ライノウイルス感染、パピローマウイルス感染、パロミクソウイルス感染、パラインフルエンザウイルス感染、及びレトロウイルス感染を含む。好ましいウイルスは、対象の中枢神経系に感染するウイルスである。最も好ましいウイルスは、脳炎又は髄膜炎を引き起こすウイルスである。
【０１３１】
本発明の修飾された粒子で治療可能な細菌感染の非限定的な一覧は、ブドウ球菌感染、連鎖球菌感染、抗酸菌感染、バシラス感染、サルモネラ菌感染、ビブリオ感染、スピロヘータ感染、及びナイセリア感染を含む。対象の中枢神経系に感染する細菌が好ましい。脳炎又は髄膜炎を引き起こす細菌が最も好ましい。
【０１３２】
一部の実施形態では、本発明は、疾患の発症前に本発明の組成物を使用することに関する。他の実施形態では、本発明は、進行中の疾患を阻害するために本発明の組成物を使用することに関する。一部の実施形態では、本発明は、対象において疾患を寛解させることに関する。対象において疾患を寛解させることとは、対象において疾患を治療、予防、又は抑制することを含む。
【０１３３】
一部の実施形態では、本発明は、疾患の再発を予防することに関する。例えば、不必要な免疫応答は、ペプチドの１つの領域（抗原決定基など）で発生し得る。不必要な免疫応答と関連付けられる疾患の再発は、ペプチドの異なる領域で免疫応答攻撃を有することによって発生し得る。本発明の負に荷電した粒子は、結合したペプチド又は抗原部分を含まないため、粒子は複数のエピトープに対して効果的となる。ＭＳ及び他のＴｈＩ／１７介在性自己免疫疾患を含む一部の免疫応答障害におけるＴ細胞応答は動的であり、再発寛解型疾患及び／又は慢性進行性疾患の経過中に進化し得る。Ｔ細胞レパートリーの動的性質は、疾患が進行するにつれて標的が変化し得るため、ある特定の疾患の治療に対する影響を有する。これまでは、疾患の進行を予測するためには、応答パターンの事前の知識が必要とされた。本発明は、動的に変化する疾患の作用である「エピトープ伝播」の機能を予防することができる組成物を提供する。再発に対する既知のモデルは、多発性硬化症（ＭＳ）に対するモデルのように、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）に対する免疫反応である。初期の免疫応答は、ＰＬＰ１３９−１５に対する応答によって発生し得る。後続の疾患の発症は、ＰＬＰ［ｐｉ］ｓ−ｉβｉに対する再発免疫応答によって発生し得る。
【０１３４】
本発明のある特定の実施形態は、不必要な過敏症に関係する病変状態の治療に関する。過敏症は、１型、２型、３型、及び４型のうちのいずれかであり得る。即時型（１型）過敏症。投与の頻度は、典型的にはアレルゲン曝露のタイミングに対応することになる。好適な動物モデルは、当技術分野で既知である（例えば、Ｇｕｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１４６：３６９，１９９２，Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９，２０５５，１９９６、及び国際公開第ＷＯ  ９６／３５４１８号）。
【０１３５】
本発明の他の実施形態は、移植に関する。これは、ドナー個体からレシピエント個体への組織試料又は移植片の移動を指し、組織によって提供される生理学的機能を復元するために組織を必要とするヒトレシピエントに対して頻繁に行われる。移植される組織としては、腎臓、肝臓、心臓、肺などの全臓器；皮膚移植片及び眼の角膜などの臓器構成要素；並びに骨髄細胞、及び骨髄又は循環血液から選択し増殖させた細胞の培養物などの細胞浮遊液、並びに全血輸血が挙げられる（しかしこれらに限定されない）。
【０１３６】
いかなる移植の重度の起こり得る合併症も、宿主レシピエントと移植された組織との間の抗原性の差異の結果として起きる。差異の性質及び程度に応じて、宿主による移植片の、又は移植片による宿主の、又は両方の免疫学的攻撃が発生し得る危険性があり得る。危険性の程度は、同様の表現型を持つ同様に治療された対象の集団における応答パターンをたどり、広く受け入れられている臨床手順に従って種々の考えられる要因を相互に関連付けることによって決定する。免疫学的攻撃は、既存の免疫応答（事前に形成された抗体など）、又は移植時の前後に始動される免疫応答（ＴＨ細胞の生成など）の結果であり得る。抗体、ＴＨ細胞、又はＴｃ細胞は、相互、並びに種々のエフェクター分子及び細胞との任意の組み合わせで関与し得る。しかしながら、免疫応答に関与する抗原は概して知られていないため、抗原特異的療法の設計又は抗原特異的寛容の誘導に困難をもたらしている。本発明の修飾された粒子は、臓器の拒絶反応を予防するのに特に有用であり、これは、粒子が寛容の誘導に有効であるために、又は炎症性免疫応答を寛解させるために、結合したペプチド又は抗原が修飾された粒子に共役される必要がないことによる。
【０１３７】
本発明のある特定の実施形態は、レシピエントによる組織移植片の拒絶反応をもたらす宿主対移植片病の危険性を減少させることに関する。治療は、超急性、急性、又は慢性拒絶反応の影響を予防するか、又は減少させるために行い得る。治療は、移植片を導入するときに寛容が整っているように、移植の十分はるか前に優先的に開始するが、それが可能でない場合には、治療は、移植と同時か、又は移植の後に開始することができる。開始の時に関わらず、治療は概して、少なくとも移植後最初の月の間、一定間隔で継続することになる。移植片の十分な順応が起こる場合にはフォローアップの投薬は不要であり得るが、移植片の拒絶反応又は炎症の兆候が何かある場合には、再開することができる。もちろん、本発明の寛容化手順は、免疫抑制の他の形態と組み合わせて、更に低いレベルの危険性を達成してもよい。
【０１３８】
本発明のある特定の実施形態は、手術に対する応答として誘導される炎症応答を減少させるか、あるいは寛解させることに関する。本発明の一実施形態では、免疫修飾粒子は手術前に投与する。本発明の更なる実施形態では、免疫修飾粒子は、手術と並行して、又は手術中に投与する。本発明のなお更なる実施形態では、免疫修飾粒子は手術後に投与する。
【０１３９】
本発明の粒子はまた、膿瘍又は膿胸を治療するために使用して、細菌又は寄生生物などの病原体への曝露後に対象において産生される炎症応答を減少させ得る。本発明の一実施形態では、免疫修飾粒子は、当技術分野で既知の抗細菌及び／又は抗寄生生物治療と共に投与する。
【０１４０】
本発明の粒子はまた、スポーツ損傷、創傷、脊髄損傷、脳損傷、及び／又は軟部組織損傷を含むがこれらに限定されない身体的外傷又は損傷に対する応答として誘導される炎症応答を減少させ得るか、あるいは寛解させ得る。本発明の一実施形態では、免疫修飾粒子は、対象が外傷又は損傷を経た後に投与する。
【０１４１】
本発明の粒子はまた、癌細胞の発現及び／又は増殖と関連付けられる炎症応答を減少させるために使用してもよい。治療可能であり得る癌としては、中枢神経系癌、基底細胞癌腫、癌性脳腫瘍、バーキットリンパ腫、リンパ腫、子宮頸癌、卵巣癌、精巣癌、肝臓癌、非小細胞及び小細胞肺癌、黒色腫、膀胱癌、乳癌、結腸及び直腸癌、子宮内膜癌、腎臓（腎細胞）癌、白血病、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、並びに甲状腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、本発明の粒子の皮下注射は、抑制性好中球又は単球由来サプレッサー細胞の蓄積を防止することで、癌患者において腫瘍特異的免疫応答を強化又は促進する。
【０１４２】
本発明の粒子は、傷害を受けた組織の再生にも有用である。一実施形態では、患者への粒子の投与は、消化管中の傷害を受けた上皮細胞の再生を増加させる。更なる実施形態では、患者は、潰瘍性大腸炎、クローン病、又は炎症性腸疾患を患う。別の実施形態では、患者への本発明の粒子の投与は、ニューロンの再ミエリン化を増加させる。更なる実施形態では、患者は多発性硬化症を患う。
【実施例】
【０１４３】
以下の実施例を本発明の利点及び特徴を更に例解するために提供するが、本開示の範囲を制限することは意図しない。
【０１４４】
材料及び方法
マウス
ＷＮＶ及びＩＢＤ研究のために、生後８週の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスをＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＷＡ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手した。全手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｙｄｎｅｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの許可を得て行った。ＥＡＥ研究のために、生後８週の雌のＳＪＬ／ＪマウスをＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）から入手した。チオグリコール酸塩研究のために、生後８週の雌のＢａｌｂ／ｃをＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＭＤ，ＵＳＡ）から入手した。Ｂａｌｂ／ｃバックグラウンドのＭＡＲＣＯ−／−動物は、Ｌｅｓｔｅｒ  Ｋｏｂｚｉｋ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）の厚意により提供された。心臓炎症研究のために、生後１２週の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＭＥ，ＵＳＡ）から購入した。全手順は、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの許可を得て行った。全動物は、飼料及び水を適宜与えた、特定病原体のない状態で飼育した。
【０１４５】
ＷＮＶ感染
ＷＮＶ（Ｓａｒａｆｅｎｄ）を新生孔マウスの脳から得、インビトロの細胞培養で増殖させた（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０５：２３１９〜２３３７，２００８）。ＷＮＶ感染をＣ５７ＢＬ／６動物中で実施した（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０５：２３１９〜２３３７，２００８）。マウスを、１０μＬの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）中の６×１０４又は６×１０３のＰＦＵ  ＷＮＶに鼻腔内感染させた。滅菌ＰＢＳのみを使用して２４回の擬似感染を実施した。感染させた後、マウスの体重を毎日測定した。
【０１４６】
チオグリコール酸塩誘導性腹膜炎
腹膜炎の感染を、滅菌水（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）中で調製した１ｍｌの４％（ｗ／ｖ）のチオグリコール酸塩ブロスの腹腔内注射で行った。氷冷した０．０５ｍＭのＥＤＴＡ  ＰＢＳ溶液を使用した腹膜内灌流（洗浄）によって、白血球を定められた時点で単離した。
【０１４７】
ＥＡＥ誘導
ＰＬＰ１３９−１５１（ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ）ペプチド誘導性ＥＡＥを、ＳＪＬ／Ｊマウス中で誘導した（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８７：２４０５〜２４１７，２０１１）。個々の動物を毎日観察し、臨床スコアを、以下の通りの０〜５の尺度で盲検様式において評定した。０＝異常なし、１＝軟弱な尾又は後肢の脱力、２＝軟弱な尾及び後肢の脱力、３＝後肢の麻痺、４＝後肢の麻痺及び前肢の脱力、５＝瀕死。これらのデータを平均臨床スコアとして報告する。麻痺した動物は飼料及び水により容易にアクセスできるようにした。
【０１４８】
心筋梗塞（Cardiac infarction）
心筋梗塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）をＣ５７ＢＬ／６マウス中で実施した。左前下行枝を手術によって回復不能に閉塞させた（Ｙｅａｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０１４９】
腎臓虚血再灌流の誘導
腎動脈を４５分間結紮し、その後解放して腎臓の完全な再灌流を可能にした。
【０１５０】
炎症性腸疾患の誘導
ＩＢＤのＤＳＳ誘導性大腸炎モデルを誘導した（Ｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．８９：８５３〜８６０，２０１１）。水道水に溶解させた２．５％  ｗ／ｖ  ２５のＤデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ、ＭＷ  ３６，０００〜４４，０００Ｄ、ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ａｕｓｔｒａｌａｓｉａ）を９日間連続で適宜投与した４１。この期間中、対照群は水道水のみを受けた。体重及び臨床評定を毎日測定した。体重減少の百分率を次のように計算した。（（０日目〜９日目）の平均体重／０日目の体重）×１００。体重測定後、可動性及び歩行、発声、集団交流、並びに毛繕いを含む臨床パラメータについてマウスを検査した。各パラメータを０〜２の値で採点し、ここでは、総計値０〜１が正常、２〜４が軽度、５〜７が中等度、８〜１０が重度を表す４１。便評定を可能であれば毎日測定した。便の稠度、血便、及び直腸出血についてスコアをつけた。０〜６の総計値は便スコアを反映し、ここでは、０の値は正常な外観の便を表し、６の値は重度の下痢、直腸出血、及び便中の血液の存在を表す。
【０１５１】
粒子の静脈内送達
ＦＩＴＣ又はＢｒｉｇｈｔ  Ｂｌｕｅ（ＢＢ）Ｆｌｏｕｒｅｓｂｒｉｔｅプレーン及びカルボキシル化ポリスチレン粒子（粒径０．５μｍ）をＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰＡ，ＵＳＡ）から入手した。ＦＩＴＣ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）と、ＦＩＴＣポリスチレンのプレーン、カルボキシル化、及びアミノ化粒子（粒径５００ｎｍ）とをＰｈｏｓｐｈｏｒｅｘ（ＭＡ，ＵＳＡ）から得た。カルボキシル化した５００ｎｍのナノダイヤモンドをＭａｃｑｕａｒｉｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ又はＳｙｄｎｅｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で生成した。粒子を滅菌ＰＢＳ中で指示濃度まで希釈して、指示通りに２００μＬを静脈内注射した。ビヒクル対照動物は、２００μＬの滅菌ＰＢＳのみを受けた。組織を規定の時点で採取し、フローサイトメトリー、組織学検査、又は免疫組織化学検査のために処理した。骨髄由来のＬｙ６Ｃｈｉ炎症性単球の単離及び選別をＧｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８に記載のように行い、単離した細胞はＰＫＨ２６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、２．０×１０６の細胞は免疫付与後６日目に擬似及びＷＮＶ感染レシピエントに静脈内注射した。特異的粒子特性を表３に定義する。
【０１５２】
フローサイトメトリー
マウスに麻酔し、５０ｍＬの滅菌ＰＢＳを用いて灌流した。脾臓、脳、骨髄、血液、及び腹水を単離し、処理して単個細胞浮遊液にした（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０５：２３１９〜２３３７，２００８）。細胞を抗ＣＤ１６／３２と共にインキュベートし、トリパンブルー色素排除法を使用して生細胞を計数すると、常に９５％超の生存性を示した。その後、細胞を、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｃ、Ｌｙ６Ｇ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１０３、ＥＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対する蛍光標識した抗体と共にインキュベートした。細胞表面分子の発現を、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用して、ＦＡＣＳ  ＬＳＲ−ＩＩ上で測定した。生存集団を前方及び側方散乱によってゲーティングし、その後前方ゲーティングによって決定された蛍光集団を特定した。得たＦＡＣＳデータファイルを、フローサイトメトリープログラムＦｌｏｗ  Ｊｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．ＯＲ，ＵＳＡ）を使用して分析した。目的とする細胞集団の定量を、分析でのフローサイトメトリーの百分率及び各臓器からの絶対細胞数に基づいて計算した。
【０１５３】
養子移入
免疫付与後６日目にＷＮＶ感染動物の骨髄を処理して単個細胞浮遊液にし、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｃ、及びＬｙ６Ｇに対する蛍光標識した抗体と共にインキュベートした。ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｃｈｉ、Ｌｙ６Ｇ−単球を、９８％超の純度を達成するように設定した厳密度で、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ上で選別した。その後、細胞を、製造業者の説明書に従って、蛍光性膜染料ＰＫＨ２６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて標識した。整合した擬似感染及びＷＮＶ感染レシピエントに、免疫付与後６日目に、２００μＬのＰＢＳ中で送達した、２．０×１０６で選別したＬｙ６Ｃｈｉ単球を静脈内注射した。上記のように、脳及び脾臓を、免疫付与後７日目にレシピエントから単離した。（移入後２４ｈ）、フローサイトメトリーのために処理した。
【０１５４】
組織学検査及び免疫組織化学検査
マウスに麻酔し、５０ｍＬの滅菌ＰＢＳを用いて灌流した。処理してパラフィンにした心臓（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  １０３：１０９１９〜１０３０，２００７）を除いて、全臓器を単離し、Ｏｐｔｉｍｕｍ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＯＣＴ、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）中で急速凍結させた。８ミクロンの組織切片をクリオスタットミクロトーム上で切り取り、一晩空気乾燥させ、その後必要になるまで−８０℃で保管した。凍結させた切片を解凍し、組織学検査（標準的なヘマトキシリン及びエオシン染色）又は免疫組織化学検査を行った（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０５：２３１９〜２３３７，２００８）。ＭＡＲＣＯ、ＳＩＧＮ−Ｒ１、及びＳＩＧＬＥＣ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）、ＣＤ６８（Ａｂｃａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）及びＫｉ６７（Ａｂｃａｍ）に対する抗体を指示通りに使用した。ＤＰ−７０カメラ及びＤＰマネージャ２．２．１ソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ−５１顕微鏡上で画像を取得した。
【０１５５】
組織学検査及び免疫組織化学検査
マウスに麻酔し、５０ｍＬの滅菌ＰＢＳを用いて灌流した。処理してパラフィンにした心臓（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  １０３：１０９１９〜１０３０，２００７）を除いて、全臓器を単離し、Ｏｐｔｉｍｕｍ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＯＣＴ、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）中で急速凍結させた。８ミクロンの組織切片をクリオスタットミクロトーム上で切り取り、一晩空気乾燥させ、その後必要になるまで−８０℃で保管した。凍結させた切片を解凍し、組織学検査（標準的なヘマトキシリン及びエオシン染色）又は免疫組織化学検査を行った（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０５：２３１９〜２３３７，２００８）。ＭＡＲＣＯ、ＳＩＧＮ−Ｒ１、及びＳＩＧＬＥＣ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）、ＣＤ６８（Ａｂｃａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）及びＫｉ６７（Ａｂｃａｍ）に対する抗体を指示通りに使用した。ＤＰ−７０カメラ及びＤＰマネージャ２．２．１ソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ−５１顕微鏡上で画像を取得した。
【０１５６】
多重ＥＬＩＳＡ
多重プレート（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｐｌａｔｅ）ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｓｙｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、製造業者の説明書に従って、Ｑｕａｎｓｙｓ  Ｑ−ｐｌｅｘ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｓｃｒｅｅｎ  ＩＲ  １６−ｐｌｅｘを使用して行った。プレートを、Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＩＲ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で可視化した。Ｑｕａｎｓｙｓ  Ｑ−ｖｉｅｗソフトウェア（Ｑｕａｎｓｙｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して画像を分析した。
【０１５７】
【表３】
2020172501.tif 000005
【０１５８】
統計
グラフを作成し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＳＤＧ，ＵＳＡ）において統計的分析を行った。２つの試料を比較するために、不対で両側のスチューデントのＴ検定を実施した。３つ以上の試料を比較するために、テューキー・クレーマー事後検定を用いて一元配置ＡＮＯＶＡを行った。生存データについては、マンテル・ヘンツェルログランク検定を実施した。これらの検定では、０．０５以下のＰ値（＊）は有意であり、０．０１以下のＰ値（＊＊）は非常に有意であると見なした。
【０１５９】
（実施例１）
オプソニン化ＩＭＰは、脳へのマクロファージの遊走を阻害する能力の減少を有した。
７日目の血漿を、擬似又はＷＮＶ感染動物から採取し、ＰＳ−ＩＭＰと共にインキュベートした。これらの「オプソニン化」粒子又は未オプソニン化（未処理ビーズ）粒子を、免疫付与後６日目でＷＮＶ感染マウスに再注入した。７日目に、脳をフローサイトメトリーによって炎症性単球の流入について検査した。未処理ＩＭＰ（正常ＩＭＰ）は脳への単球流入の減少をもたらしたが、擬似血漿でコーティングしたＩＭＰは、単球遊走を阻害する能力は有しなかった（図９）。ＷＮＶ血清でコーティングしたＩＭＰは、コーティングしていないＩＭＰと比べて単球を阻害する能力は弱かったが、それでもある程度遊走を減少させることはできた。
【０１６０】
（実施例２）
免疫修飾粒子は、炎症性単球の遊走を減少させ、ＷＮＶの生存を減少させる
急性及び多くの慢性炎症性疾患の特徴は、炎症領域への単球の流入である。これまで、発明者らは、ＷＮＶの脳感染と関連付けられる病的状態は、脳への炎症性単球輸送の直接的結果であることを示してきた（Ｇｅｔｔｓ，２００８、Ｇｅｔｔｓ，２００７、Ｔｅｒｒｙ，２０１２、Ｇｅｔｔｓ，２０１２）。このモデルでは、５％以上の体重減少は、脳へのΦＩＭ輸送、故に致死性と相関するバイオマーカーである（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ）。感染動物のうちの少なくとも５０％が体重減少を始め、その１００％が、典型的に、最初の体重減少の７２時間以内に感染により死亡することになる（図１Ａ）。体重が減少しない動物は、脳炎のいずれの他の症状も示さないが、それでも終生の殺菌免疫能を発現する（図１Ａ）。単球輸送をモニタリングするため、最初の体重減少時（６日目）に、ポリスチレン中性粒子（ＰＳ−ＮＰ）の代わりに、カルボキシル化した負に荷電したポリスチレン粒子（ＰＳ−ＩＭＰ）を非意図的に注入した。驚くべきことに、注入は、臨床的ＷＮＶ中枢神経系（ＣＮＳ）感染と一様に関連付けられる、荒れた毛皮、倦怠、及び痙攣などの症状をほぼ即座に減少させた。この減少は、局所的炎症誘発性サイトカイン及びケモカインの減少と相関した（図６）。また更に、最大５日間のＰＳ−ＩＭＰの毎日の注入は、さもなければ感染により死亡したはずのマウスの６０％の生存をもたらした（図１Ａ）。これらのマウスにおいては、体重は典型的に安定し、５〜６日以内に対照レベルに戻った（図示せず）。ＰＳ−ＮＰ又はビヒクルで処置したマウスは継続した体重減少を示し、生存は１０％以下であった。また更に、ＷＮＶ又は擬似感染動物からの血清を用いた、注入前のＩＭＰの事前オプソニン化は、疾患の転帰に影響を与えなかった（図示せず）。ＷＮＶ脳炎における発明者らの以前の観察と一貫して（Ｇｅｔｔｓ，２００８、Ｇｅｔｔｓ，２００７、Ｔｅｒｒｙ，２０１２、Ｇｅｔｔｓ，２０１２）、生存は、リン酸緩衝生理食塩水（ビヒクル）で処置した、又はＰＳ−ＮＰで処置した対照動物と比較して、ＰＳ−ＩＭＰで処置したマウスの脳におけるΦＩＭ由来マクロファージの有意な減少と相関した（図１Ｂ、図７）。
【０１６１】
（実施例３）
免疫修飾粒子は負に荷電する必要がある
他のカルボキシル化粒子、具体的にはＮＤ  ＩＭＰ、及びＰＬＧＡ−ＩＭＰによるＷＮＶ感染動物の処置は、ＰＳ−ＩＭＰで処置した動物中で見られた生存統計と同様の生存統計をもたらし（図１Ｃ）、このことは、粒子コアが、処置効果に貢献する特性とは無関係であることを示す。初期のパイロット研究では、ゼータ電位が−５０ｍＶ未満のカルボキシル化ＰＳ−ＩＭＰを使用した（表３）。故に、ゼータ電位が−５０ｍＶ、約−０．５（中性、ポリスチレン中性粒子、ＰＳ−ＮＰ）、又は＋４０ｍＶ（アミノ化粒子、ポリスチレン正荷電粒子、ＰＳ−ＰＰ）であるＰＳ粒子を比較した。ＰＳ−ＩＭＰ（−５０ｍＶ）は、脳への炎症性単球輸送の減少について最も大きな影響を示した（図１Ｄ）。対照的に、ＰＰは、ＩＭ由来マクロファージの浸潤（図１Ｄ）も生存（図１Ｅ）も減少させなかった。ＷＮＶ脳炎を持つマウスにおける５００ｎｍのＰＳ−ＩＭＰについての用量反応は、最も効果的な用量が、マウス１匹当たり約４×１０９ＩＭＰ粒子、又は０．３５５ｍｇの粒子であることを示した（図１Ｆ〜Ｇ）。
【０１６２】
（実施例４）
ＰＳ−ＩＭＰ処置は、脾臓への炎症性マクロファージの方向転換をもたらす
注入後、ＰＳ−ＩＭＰは、肺、脾臓、及び肝臓に大部分が局在し（図２Ａ）、脳及び胸腺にはＦＩＴＣ＋粒子はなく（図７Ａ及びＢ）、末梢リンパ節では見出されなかった（データ図示せず）。フローサイトメトリーによって、炎症性単球、ＢＢ２０＋  Ｂ細胞、ＣＤ３＋  Ｔ細胞、及びＮＫ１．１細胞間でのＩＭＰの比較的均等な分布が明らかとなったが（図２Ｂ及びＣ）、感染マウス中では、炎症性単球は、脾臓において、いずれの他の細胞型よりも有意に多いＩＭＰを吸収することが見出された（図２Ｂ及びＣ）。循環内では、擬似感染マウスにおけるＩＭＰを含有する単球の表現型はＬｙ６Ｃ陰性であり、一方でＩＭＰは、感染動物においてＬｙ６Ｃ陽性単球に主に局在した（図２Ｄ及びＥ）。また更に、ＦＩＴＣ−ＰＳ−ＩＭＰで処置したＷＮＶ感染マウスからの脾臓は、ＮＰで処置したもの又はビヒクル対照よりも有意に多い炎症性単球を有し（図２Ｆ、図９）、このことは、これらのマウスにおける末梢血中で循環する炎症性単球の減少と密接に対応する（図２Ｇ）。
【０１６３】
ＷＮＶ脳炎における病的状態は炎症性単球によって引き起こされることがこれまでに示されている（Ｔｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。これらのこれまでの発見をここで得たデータと組み合わせると、ＩＭＰが、炎症性単球に結合し、炎症を起こしている脳へのその遊走を無効にし、代わりにそれらを脾臓へと迂回させることによって、その処置活性を媒介するとの仮説を立てた。これを確認するために、Ｌｙ６Ｃｈｉ単球を免疫付与後６日目のＷＮＶ感染マウスの骨髄から選別し、ＰＫＨ２６で標識し、免疫付与後６日目の擬似又はＷＮＶ感染レシピエントに静脈注射で移入した（図３Ａ）。この直後に、ＰＳ−ＩＭＰ、ＮＰ、又はビヒクルのみを注射した。ＰＫＨ２６で標識したＬｙ６Ｃｈｉ炎症性単球をＷＮＶ感染脳に輸送してマクロファージに分化させ、末梢免疫細胞は擬似感染脳中では観察されなかった（図３Ｂ、データ図示せず）。Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０５：２３１９〜２３３７，２００８）に記載されるように、ＰＳ−ＩＭＰ処置は、ＷＮＶ感染脳への宿主の炎症性単球浸潤を減少させ（図３Ｂ）、有意に少ない養子移入したＰＫＨ２６＋細胞が脳中に遊走した（図３Ｂ及び３Ｄ）。ＰＫＨ２６で標識した細胞の脾臓への移動（図３Ｃ及び３Ｅ）が擬似及びＷＮＶ感染マウス中で観察されたが、ＰＳ−ＩＭＰ処置は、ＷＮＶ感染マウスの脾臓における有意に多いＬｙ６Ｃｈｉ単球の蓄積をもたらした（図３Ｅ）。ＩＭＰ処置の効能における脾臓の重要性を脾摘マウス中で確認した。ＩＭＰ注入は、脾摘したビヒクルで処置したＷＮＶ感染対照マウスと比較して、ＷＮＶ感染脾摘マウスの脳への炎症性単球の移行を減少させることに失敗した（図３Ｆ）。脾臓は、ある特定の炎症状態下で脾臓から補充され得る、ＣＤ１１ｂ＋／Ｌｙ６Ｃｈｉ／ＣＤ１１ｃ−として特定される単球のリザーバを宿すことが最近になって示された（Ｓｗｉｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５：６１２〜６１６、２００９、Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０９：１２３〜１３７，２０１２、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２５：３６４〜３７４，２０１２）。ＩＭＰ注入が脾臓単球のこのプールを強化したとの仮説を立てた。しかしながら、ＩＭＰを取り込み脾臓に遊走した養子移入した単球のうちの７０％超が、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ１０３を発現し（図３Ｅ及び３Ｇ）、このことは、この仮説の可能性を下げた。総合すると、これらのデータは、注入したＩＭＰが炎症性単球によって吸収され、それが脾臓に迂回させられて、炎症部位への遊走に対して血中の炎症性単球数の減少をもたらすことを示唆する。
【０１６４】
（実施例５）
ＩＭＰは炎症を起こしている腹膜への炎症性単球の遊走を阻害する
単球がＷＮＶ脳炎中に観察される免疫病変の重要なメディエータであることは明らかであるが、感染は、他の細胞サブセットを含む複雑に入り組んだ免疫応答をもたらす。炎症中の炎症性単球へのＩＭＰの特異性に対処するため、滅菌マクロファージ介在性腹膜炎症のモデルを使用した。チオグリコール酸塩で炎症を起こさせた腹膜への白血球の遊走は、型通りのパターンに従い、最初の４〜１８時間以内に好中球が誘発され、続いて約１２時間以降にΦＩＭ由来マクロファージがＣＣＲ２に依存して蓄積した（Ｔｓｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＰＳ−ＩＭＰ（図７Ｄ−Ｅ、図４Ａ−Ｂ）又はＰＬＧＡ−ＩＭＰ（図示せず）のいずれかの注入は、チオグリコール酸塩の腹腔内注射から２４時間後、脾摘マウスにおいて無効にされた炎症部位への炎症性単球輸送を有意に減少させた（図７Ｆ）。このデータは併せて、主にマクロファージ介在性の炎症モデルにおけるＩＭＰの抗炎症性質、及びＩＭＰの効能のための脾臓の重要性も共に強調する。
【０１６５】
（実施例６）
炎症性単球は、ＩＭＰ活性に不可欠なＭＡＲＣＯを発現する
ＩＭＰなどの粒子は、スカベンジャー受容体経路を通して吸収される（Ｋａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。負に荷電した粒子及びポリスチレンの結合に特異的に関与する１つの要となるスカベンジャー受容体がＭＡＲＣＯである（Ｃｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｋａｎｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，２００７）。脾臓において、ＰＳ−ＩＭＰは、静脈内注入後のアポトーシス性細胞取り込みについてこれまでに記載したものと同様に、辺縁帯においてＭＡＲＣＯを発現する細胞集団と共局在化した（Ｇｅｔｔｓ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｇｅｔｔｓ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２）（図４Ｃ）。ＭＡＲＣＯは、擬似感染動物ではなくＷＮＶ感染動物の脾臓から単離したＬｙ６ｃｈｉ／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ−  ΦＩＭを上方調節されていることも分かった（図４Ｄ）。ＭＡＲＣＯの役割に更に対処するために、チオグリコール酸塩を使用してＭＡＲＣＯ欠乏（ＭＡＲＣＯ−／−）動物中で腹膜炎症を誘導した。同様の数の腹膜単球を、チオグリコール酸塩の投与から４８時間後にＷＴ及びＭＡＲＣＯ−／−マウスから単離した（図４Ｂ、４Ｅ）。しかしながら、ＰＳ−ＩＭＰ処置が腹膜におけるＬｙ６Ｃｈｉ／ＣＤ１１ｂ＋  ΦＩＭの数の減少をもたらしたＷＴマウスとは異なり、ＰＳ−ＩＭＰ処置の注入は、ＭＡＲＣＯ−／−動物から単離した腹膜Ｌｙ６Ｃｈｉ／ＣＤ１１ｂマクロファージの数を減少させず（図４Ｂ、４Ｄ）、このことは、ＩＭＰの取り込み及び効能におけるＭＡＲＣＯの役割を直接的に指摘する。加えて、ＭＡＲＣＯは、シリカ粒子を貧食したマクロファージ中でのアポトーシス誘導においても直接的な役割を担うことが示されている（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。興味深いことに、ＩＭＰは、ＰＳ−ＩＭＰ（図４Ｇ〜Ｉ、図１１Ｂ）又はＰＬＧＡ−ＩＭＰ（図示せず）の注入から２時間後に、ＷＴマウスの脾臓において、アネキシンＶ及びカスパーゼ−３陽性炎症性単球の数を有意に増加させたが、ＭＡＲＣＯ−／−マウスにおいては増加させなかった。アポトーシスは、好中球と炎症性単球との両方において誘導され、ＩＭＰ注入後２時間の間検出可能である（図１０）。マウスにＰＳ−ＩＭＰ又はＰＢＳを注射し、２時間後に屠殺した。脾臓を取り出し、処理して単個細胞浮遊液にし、抗ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｇ、定着性生死判別染料（Ｆｉｘａｂｌｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ）ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。アポトーシス細胞を、ＣａｓｐＧＬＯＷ（商標）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｃａｓｐａｓｅ−３  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して検出した。チオグリコール酸塩誘導性ＷＴマウスへのＰＬＧＡ−ＩＭＰの注入は、アポトーシスマーカーであるアネキシンＶ及びカスパーゼ−３を発現したＬｙ６Ｃｈｉ  ΦＩＭ及びＬｙ６Ｇ＋好中球の数の有意な増加をもたらした。これは、擬似処置動物においては観察されなかった。注射から２時間後（図１１）、ＰＳ−ＩＭＰは、擬似及びＴＧ腹膜炎を誘導したマウスの脾臓におけるＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ−単球に局在した。ＰＳ−ＩＭＰの取り込みは酵素カスパーゼ−３の活性と関連付けられ、これは、アポトーシスを示す（ａ）。単球の数の増加は、��Ｓ−ＩＭＰで処置したＴＧ腹膜炎を誘導したマウスにおけるカスパーゼ−３活性に対して陽性であった（ｂ）。
【０１６６】
壊死細胞はわずかしかなく（５％未満）、このことは、細胞死がＩＭＰの分解と関連付けられないことを示す。
【０１６７】
総合すると、データは、ＩＭＰがＭＡＲＣＯスカベンジャー受容体を通して吸収される可能性が高く、このことが、下流信号伝達７経路を媒介し得、その結果、脾臓における炎症性単球の遊走、蓄積、及び後続のアポトーシスが起きることを示唆する。
【０１６８】
（実施例７）
ＩＭＰ療法はＥＡＥにおいて炎症性単球を阻害する
ＩＭＰの処置的資質を更に理解するために、ある数の無関係の炎症性疾患モデルを検査した。まず、ＣＮＳ炎症の別の非感染性モデル、つまり実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を試験した。ＥＡＥにおいて、循環するＬｙ６Ｃｈｉ炎症性単球はマクロファージとミクログリアとに分化し、ＥＡＥにおいて、これらの同じ細胞は、Ｔ細胞活性化及びエピトープ伝播を促進するＣＤ１１ｃ＋  ＤＣに主に分化する（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０５：２３１９〜２３３７，２００７、Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１３：３１９０〜３１９７，２００９、Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ）。疾患の発症時の７日間にわたる生分解性ＰＬＧＡ−ＩＭＰの毎日の静脈内注入が、処置中に疾患を寛解させると共に、処置中止後１４日間の症状の欠如によって決定した長期的な利益と関連付けられた（図５Ａ）。より重要なことに、原疾患中のＩＭＰ処置の毎日の注入は、処置期間中の疾患スコアの減少及び再発始動の阻害をもたらした（図５Ｂ）。発症時に処置した動物における疾患スコアの減少は、フローサイトメトリーによって決定したところ、脊髄における炎症の減少と相関し（図５Ｃ、Ｄ、及び図８Ａ）、最も目立った減少は、炎症性単球由来ＤＣコンパートメント内で観察された（図５Ｃ及びＤ、並びに図８Ａ）。ＷＮＶ脳炎又は腹膜炎を患う動物における観察と同様に、ＥＡＥ  ＣＮＳにおける炎症性単球の減少は、脾臓におけるＬｙ６Ｃを発現している単球の有意な蓄積と相関した（図５Ｄ及び図８Ｂ）。
【０１６９】
（実施例８）
ＩＭＰ療法は虚血再灌流によって引き起こされた傷害を減少させる。
炎症性単球は、アテローム性動脈硬化症及び心筋梗塞を含む心疾患の病理に関与し、不良転帰と相関してきた（Ｓｗｉｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５：６１２〜６１６，０２００９、Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０９：１２３〜１３７，２０１２、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２５：３６４〜３７４，２０１２、Ｂａｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：１７２〜１８０，２００７）。永久的左前下行枝閉塞モデル（Ｙｅａｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ）を使用して、３日間のＰＬＧＡ−ＩＭＰ処置の影響（図５Ｈ）を決定した。ビヒクル処置動物では、閉塞は、左室壁の最大４０％が関与する心筋への強力な単球浸潤をもたらした（図５Ｉ及びＪ）。ＩＭＰ処置は、炎症性病巣のサイズを有意に減少させ、全体的な心臓炎症を１５〜２０％減少させた（図５ｉ、ｊ）。また更に、梗塞領域内のＣＤ６８＋マクロファージ数の有意な減少が観察され、ＩＭＰ処置は、ビヒクル処置対照と比べて１ｍｍ２当たりのＣＤ６８＋細胞の数の３０％の減少をもたらした（図５Ｋ、Ｌ）。重要なことに、ここでも、この減少は脾臓におけるＬｙ６Ｃｈｉ炎症性単球の数の有意な減少と相関する（図８Ｄ及びＥ）。再灌流損傷モデルにおけるＩＭＰ療法の資質に更に対処するために、腎動脈を４５分間結紮してその後血流を戻すことによって、ＩＭＰを齧歯動物中で試験した。ＩＭＰ処置は、結紮後１２時間で開始した。際立って、血清クレアチニンクリアランスは、１日目及び５日目で、ビヒクル処置対照と比較して、ＩＭＰで処置した動物において有意に大きく（ｎ）、このことは、これらの時点での処置した動物における尿細管萎縮スコアの減少と相関した（ｏ）。全体として、移植における生着不全及び心筋梗塞後の長期的転帰が、それぞれ、炎症及び梗塞の程度と直接的に相関することが確立されている（Ｎａｈｒｅｎｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２１：２４３７〜２４４５，２０１０、Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０９：１２３〜１３７，２０１２、Ｎａｈｒｅｎｄｏｒｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０４：３０３７〜３０４７，２００７）。ここでのデータは、ＩＭＰが炎症を減少させるだけでなく、より重要なことに、増加した臓器機能とも関連することの強力な裏付けを示す。
【０１７０】
（実施例９）
ＩＭＰ療法は、炎症性腸疾患の症状を寛解させる
腸は、脳、腹膜、又は心臓とは異なり、固有の臓器系を表す。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）における単球の重要性は、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導性大腸炎モデルを使用して、ケモカインＧＭ  ＣＳＦ及びＬｙ６Ｃｈｉ炎症性単球がＩＢＤの発病に関与するとして（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１８：１２２０〜１２２９，２００８）、１８：１２２０〜１２２９，２００８）。炎症を起こしている結腸へのＬｙ６Ｃｈｉ炎症性単球の輸送の減少は、疾患重症度を減少させると提案される。このため、ＤＳＳ誘導性大腸炎を持つ動物におけるＩＭＰ処置（図５Ｐ）を調査した。大腸炎症状は、ビヒクル対照と比較して、ＰＳ−ＩＭＰで処置した動物において有意に減退した（図５Ｇ）。また更に、免疫組織化学検査によって決定したところ、炎症を起こしている結腸への単球形態を持つＧＲ１＋細胞の数が減少した（図５Ｒ−Ｓ）。これは、ＰＳ−ＩＭＰで処置した動物において、上皮分裂と相関し、増殖マーカーＫｉ６７で標識した上皮細胞の数を有意に増加させた（図８Ｆ−Ｇ）。上皮増殖はＤＳＳチャレンジ後の腸の回復と関連付けられ、ＩＭＰの注入は明らかにＤＳＳ介在性傷害の早期の修復を可能にする。
【０１７１】
（実施例１０）
ＩＭＰ療法は、心筋梗塞モデルにおいて炎症性傷害から保護する。
永久的左前下行枝閉塞モデル（Ｙｅａｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ）を使用して、４日間の裸のＰＬＧＡ−ＩＭＰ処置の影響（図９）を決定した。ビヒクル処置動物では、閉塞は炎症の増加をもたらした。ＩＭＰ処置は、炎症性病巣のサイズを有意に減少させ、全体的な心臓炎症を減少させた。また更に、梗塞領域内のＣＤ６８＋マクロファージ数の有意な減少が観察され、ＩＭＰ処置は、ビヒクル処置対照と比べて１ｍｍ２当たりのＣＤ６８＋細胞の数の減少をもたらした。重要なことに、脾臓におけるＬｙ６Ｃｈｉ炎症性単球の数の有意な減少と相関したこの減少領域。
【０１７２】
心筋虚血（ＬＡＤ閉塞）再灌流モデルにおけるＩＭＰ療法の資質に更に対処するために、左前下行枝を梗塞させ、次いで３０分後に解放することによって、ＩＭＰを齧歯動物中で試験した。ＩＭＰ処置は、結紮後２４時間で開始し、４日間継続した。図１０に示すように、ＩＲ後２８日目で、処置動物における梗塞瘢痕サイズは、ＰＢＳ処置動物と比較して４５％減少した。加えて、ＰＬＧ−ＩＭＰ処置動物における収縮期の駆出率は、対照動物と比較して２１％増加した。
【０１７３】
前出の実施例におけるこれらのデータは、炎症部位への炎症性単球輸送を減少させるために、多種多様な感染性炎症性障害及び非感染性炎症性障害においてＩＭＰをうまく利用できることを示す。これは、臨床的疾患症状の有意な減少をもたらし、また、さもなければ炎症性単球が生成する炎症誘発性環境によって阻害され得る修復機構の始動を可能にし得る。
【０１７４】
（実施例１１）
負に荷電した免疫修飾粒子（ＩＭＰ）の調製
Ｄ２Ｏ中のポリ（エチレン−無水マレイン酸）（ＰＥＭＡ）の溶液（４ｍＬ、１％  ｗ／ｖ）に、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧ）の溶液（２ｍＬ、２０％  ｗ／ｖ）を滴加した。ＶＣ  ３０  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒを使用して、混合物を３０秒間１６ワットで氷上で超音波分解させた。得られた均質化した粗物質を、その後、Ｄ２Ｏの溶液（０．５％  ｗ／ｖのＰＥＭＡを含有する２００ｍＬ）中に注ぎ入れた。Ｂｅｌｌｃｏ  Ｇｌａｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｌｓｔｉｒ  Ｍｕｌｔｉ−ｓｔｉｒ  ９電磁撹拌機を使用して、３．５の速度設定で、均質化したスラリーを一晩撹拌させた（１０Ｗで１０秒間、１６Ｗで１０秒間、１６Ｗで３０秒間）。
【０１７５】
結果
３時間の撹拌の後、粒径分析を、使い捨てのポリスチレンキュベット中で動的光散乱を使用して行った。
ａ．１０Ｗ、１０秒−Ｚ平均＝４９９．９ｎｍ−ＰｄＩ＝０．２３、ピーク＝６３４．５ｎｍ
ｂ．１６Ｗ、１０秒−Ｚ平均＝５２８．９ｎｍ−ＰｄＩ＝０．２２７、ピーク＝６５７．５ｎｍ
ｃ．１６Ｗ、３０秒−Ｚ平均＝４７１．６ｎｍ−ＰｄＩ＝０．２２８、ピーク＝５８０．５ｎｍ
ｄ．１６Ｗ、６０秒−Ｚ平均＝４９１．１ｎｍ−ＰｄＩ＝０．２７５、ピーク＝６００．８ｎｍ
【０１７６】
反応が完了した後、得られた粗懸濁液を次いで精製した。
【０１７７】
精製
新たなＤ２Ｏ及び１０倍重炭酸ナトリウム緩衝液を一晩かけて４℃に冷却した。４０μｍのセルストレーナーを使用して、３６ｍＬの粒子懸濁液を、各バッチから、４ｍＬの冷却した１０倍重炭酸ナトリウム緩衝液を含む適切にラベル付けした５０ｍＬの遠心分離管中に濾過した。各ビーカーからは約６個のこのような管が得られた。全ての管を、４℃で７０００ｇで約１５分間遠心分離させ、上清を吸引した。上述の手順を使用して懸濁液の調製を繰り返し、できるだけ多くの粒子ペレットを１ｍＬの冷却したＤ２Ｏ中に懸濁した。
【０１７８】
４ｍＬの冷却した１０倍重炭酸ナトリウム緩衝液を入れた新たな管に再懸濁した粒子を移した。（工程１）
【０１７９】
全粒子ペレットの再懸濁が成功するまで粒子の再懸濁を繰り返した。（工程２）
【０１８０】
６個の遠心分離管を１つの遠心分離管（５０ｍＬ管）にまとめ、４０ｍＬの冷却したＤ２Ｏになるまで管に残りの容積を充填した（洗浄１）。
【０１８１】
管を、４℃で７０００ｇで約２０分間遠心分離させ、上清を吸引した。
【０１８２】
工程１及び２、並びに得られた粒子の洗浄１を、各回、少なくとも更に２回、繰り返した。最後に、次いで得られた粒子ペレットを液体窒素中での瞬間冷凍に付し、多岐管中で凍結乾燥させて負のＩＭＰを得た。
【０１８３】
図１４は、動的光散乱分析による、表面機能化ラクチド−グリコリド共重合体粒子の特徴化を示す。表面機能化ラクチド−グリコリド共重合体粒子を、１８．２ＭΩの水中で毎秒２．５×１０５計数の計数速度でＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）において分析した。表面機能化ラクチド−グリコリド共重合体粒子の集団は、５６７ｎｍのＺ平均粒径、６７０ｎｍのピーク粒径、及び０．２０９の多分散性指数を有した。
【０１８４】
表４は、表面機能化ＰＬＧ−ＰＥＭＡ粒子についての測定値を示す。各バッチはわずかに異なるため、表中のデータは代表としてのものである。しかし、表中の数字は、粒子のいくつかのバッチの組み合わせに基づく。二重エマルション粒子についての測定値は、表３中の測定値と同様である。
【０１８５】
【表４】
2020172501.tif 000006
【０１８６】
（実施例１２）
ＩＭＰは調節性Ｔ細胞を誘導する
これまでに、ＭＳモデル、実験的自己免疫性脳脊髄炎におけるＩＭＰ注入が疾患を阻害し得ることを示した。このモデルでは、０日目で、マウスに、完全フロイントアジュバント及びミエリン抗原、プロテオリピドタンパク質１３９〜１５８で免疫付与する。疾患症状を毎日モニタリングし、疾患の発症が明白であるときに、１０日間のＩＭＰ処置を実施する。この実施例では、疾患の発症時から１０日間にわたる生分解性ＰＬＧＡ−ＩＭＰの毎日の静脈内注入が、処置中に疾患を寛解させると共に、症状を欠いた１４日間の処置後期間と関連付けられた（図１５Ａ）。発症時に処置した動物における疾患スコアの減少は、処置中のＣ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ＴＩＭ３＋調節性Ｔ細胞の数の増加と相関した（図１５Ｂ及びＣ）。２０日目（処置開始後１０日目）で、これらのＴｒｅｇは、陰性の副刺激分子ＰＤ−１を発現する（図１５Ｂ）。投薬中止から１０日目に、Ｔｒｅｇの数が基準値まで減退したことが見出され、このことは、疾患の再発と相関した（図１５Ａ）。
【０１８７】
（実施例１３）
ＩＭＰは、無処置の血液と比較して、炎症血液において独特のタンパク質に結合する
マウス血漿を、西ナイル又は擬似（非感染）マウスからヘパリン化管中に心穿刺によって採集した。その後、当技術分野で公知の標準的な方法によって、血漿を他の血液成分（例えば、白血球及び赤血球）から分離した。その後、血漿を、３×１０８の免疫修飾ナノ粒子と共に室温で３０分間インキュベートした。３０分後、粒子を洗浄し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離させ、各レーンから１２個の均等なゲルスライスを切り出した。スライスをトリプシン消化に付し、得られたペプチド混合物を、タンデム質量分析と組み合わせた逆相液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって分析した。タンパク質をＧｅＬＣ−ＭＳ分析に付した。端的に言えば、タンパク質をジチオスレイトール及びヨードアセトアミドの存在下で還元し、アルキル化した。バンドを真空遠心分離によって乾燥させ、２４０ｎｇのトリプシンと共に１時間４℃でインキュベートした。余剰なトリプシンを除去し、３７℃で一晩のインキュベートのために５０ｍＭの重炭酸アンモニウムで代置した。質量分光分析の前に、Ｒ２樹脂（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ  ＭＡ）を含む既製マイクロカラムの使用によって、ペプチドを濃縮し脱塩した。溶出したペプチドを０．１％のギ酸中で再可溶化し、逆相ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに付した。約４１，０００個のＭＳ／ＭＳスペクトルを反復ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験から生成した。タンデム質量スペクトルを抽出し、荷電状態をＭａｓｃｏｔ中で解析及び脱アイソトープし、Ｍａｓｃｏｔ及びＸ！Ｔａｎｄｅｍを使用して分析した。有意とする閾値を０．０５未満のｐ値に設定して、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベース中に含まれるムースムスクルス（マウス）要素に対してデータを検索した。検索は、１５ｐｐｍの断片イオン質量耐性及び０．２Ｄａの親イオン耐性で実施した。メチオニンスルホキシド、カルボアミドメチルシステイン（ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、並びに脱アミド化アスパラギン及びグルタミンを、変数変更として指定した。スカフォールドを使用して複数のＭＳ／ＭＳ実験を統合し、ペプチド及びタンパク質同定に基づいてＭＳ／ＭＳを検証した。ペプチドは、Ｍａｓｃｏｔのイオンスコアが、二重、三重、及び四重に荷電したペプチドについて、それぞれ、３０、４０、及び４０を超過した場合にのみ考慮した。Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ同定は、２．０を超える−Ｌｏｇ（期待スコア）スコアを必要とした。タンパク質同定は、最低２個のペプチドが上記の基準に適合すると同定された場合に受け入れた。５個のタンパク質が、１個のペプチドが適合しただけであったにも関わらず同定と見なされた。この場合は、ペプチドを複数の根拠について配列決定し、単個のペプチドによって得られた配列包括度は５％超であった。
【０１８８】
これらの研究の結果によって、無処置の血清と共にインキュベートした粒子に結合した以下のタンパク質が特定された。
【０１８９】
【表５−１】
2020172501.tif 000007
【０１９０】
【表５−２】
2020172501.tif 000008
【０１９１】
しかし興味深いことに、これらの方法は、非炎症条件又は無処置条件下ではＩＭＰへの結合が見られない、炎症条件下でＩＭＰに結合する１５個の固有のタンパク質を特定した。これらのタンパク質を表６に列挙する。
【０１９２】
【表６】
2020172501.tif 000009
【０１９３】
これらの結果は、本発明の粒子が、炎症性メディエータ、病原性タンパク質、及び／又は細胞残屑、例えば、例えば、Ｓ１００タンパク質及び／又は脂肪酸結合タンパク質などを拭い去るためのシンクとして作用すること（図１６Ａ）と、同時にアネキシン１などの調節タンパク質を濃縮すること（図１６Ｂ）との両方において有用であることを示す。
【０１９４】
加えて、これらの結果は、対象における炎症性免疫応答の存在を決定／診断するために、血清をインビトロかインビボかのいずれかでＩＭＰと共にインキュベートし、続いて液体クロマトグラフィー、質量分析、ＨＰＬＣ、又は免疫沈降によってタンパク質をＩＭＰから精製するという本明細書に記載の診断方法において有用である（図１７）。
【０１９５】
本発明の特定の実施形態を説明し例解してきたが、このような実施形態は、本発明の例解のみであると見なされ、添付の特許請求の範囲に従って解釈されるほど本発明を限定するべきではない。
【０１９６】
本明細書で引用される全ての特許、出願、及び他の参考文献は、その全体が参照によって組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月1日(2020.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−１００ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する、ラクチド−グリコリド共重合体（ＰＬＧ）、ポリ乳酸重合体（ＰＬＡ）、ポリスチレン粒子、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）粒子及びダイヤモンド粒子からなる群から選択される負に荷電した粒子、及び担体を含む、癌、脳損傷、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、震盪、膿胸、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、軟部組織損傷、創傷、脊髄損傷、又は神経変性を治療するための医薬組成物であって、前記粒子が、結合したペプチド又は抗原性部分を含まない、医薬組成物。
【請求項２】
前記粒子がカルボキシル化されている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記粒子が、−７５ｍＶ〜−５０ｍＶ、又は−５０ｍＶ〜−４０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記粒子のポリ乳酸：ポリグリコール酸比が、５０：５０である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記負に荷電した粒子の粒径が、約０．１μｍ〜約１０μｍ、約０．３μｍ〜約５μｍ、０．５μｍ〜約３μｍ、又は約０．５μｍである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記癌が、脳癌、黒色腫、基底細胞癌腫、乳癌、前立腺癌、肺癌、子宮頸癌、中枢神経系癌、肝臓癌、結腸及び直腸癌、膵臓癌、子宮内膜癌、卵巣癌、膀胱癌、甲状腺癌、腎臓癌、精巣癌、白血病、及びリンパ腫からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記粒子が、静脈内、経口、経鼻、筋肉内、経眼、経皮、又は皮下で投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記組成物の使用が、前記癌の１以上の症状を改善し、場合により、前記癌の１以上の症状が、対象の腫瘍サイズ、腫瘍の発現、及び前記腫瘍における炎症性細胞のレベルからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記組成物の使用が、前記腫瘍での単球、マクロファージ、顆粒球及び／又は好中球の数を減少させる、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記組成物の使用が、単球及び／又は好中球のアポトーシスを誘導する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、白血病及び／又はリンパ腫を有する対象に使用するためのものであり、場合により、前記組成物の投与前に、前記対象が、骨髄移植、又は骨髄から増殖させた細胞の培養物の移植を受けている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、前記移植の結果として移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を有する対象に使用するためのものである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、ＧｖＨＤの１以上の症状を軽減する、請求項１２に記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
2020172501000001.pdf