(57)【要約】【課題】免疫学の分野、より具体的には、ナチュラルキラーT(NKT)細胞を含む、CD1d拘束性T細胞の活性化等のCD1d介在性の生物学的機能を改変する抗体を含む、ヒトCD1dに結合する単一ドメイン抗体、及びCD1d発現細胞の機能の調節の分野に関する。例えば、CD1dに結合する単一ドメイン抗体を少なくとも1つ含む化合物、単一ドメイン抗体を少なくとも1つ含むそのような化合物の使用及びそのような化合物を含む(医薬)組成物を提供する【解決手段】本発明は、化合物、特に、非古典的なMHCタンパク質CD1dに特異的に結合し、CD1d介在性の生物学的機能を調節するポリペプチドに関する。本発明は、特に、そのような化合物及びポリペプチドであって、少なくとも1つの単一ドメイン抗体を含むか又はそれから成り、少なくとも1つの単一ドメイン抗体が特異的にCD1dに結合する、化合物及びポリペプチドに関する。そのような化合物、ポリペプチド及び/又は単一ドメイン抗体を使用する方法及び用途も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者に化合物を投与する工程を含む癌を治療するための方法であって、前記化合物が、ヒトCD1dに結合して、CD1d拘束性T細胞の活性化を誘導することができる抗体を含む、方法。
【請求項２】
前記化合物が、インバリアントナチュラルキラーT細胞を活性化することができる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が、インバリアントナチュラルキラーT細胞の糖脂質誘導性活性化を刺激することができる、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、インバリアントナチュラルキラーT細胞のアルファ-ガラクトシルセラミド誘導性活性化を刺激することができる、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が、単一ドメイン抗体を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が、単一ドメイン抗体を含み、並びに、前記単一ドメイン抗体が、相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3を含み、前記CDR1が、配列番号33に記載のアミノ酸配列を含み、前記CDR2が、配列番号54に記載のアミノ酸配列を含み、及び、前記CDR3が、配列番号75に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物が、請求項12に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が、さらなる単一ドメイン抗体を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物が、二重特異性又は多重特異性化合物である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が、他の抗体に連結される、請求項1に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、免疫学の分野、より具体的には、ナチュラルキラーT(NKT)細胞を含む、CD1d拘束性T細胞の活性化等のCD1d介在性の生物学的機能を改変する抗体を含む、ヒトCD1dに結合する単一ドメイン抗体、及びCD1d発現細胞の機能の調節の分野に関する。例えば、CD1dに結合する単一ドメイン抗体を少なくとも1つ含む化合物、単一ドメイン抗体を少なくとも1つ含むそのような化合物の使用及びそのような化合物を含む(医薬)組成物が提供される。
【背景技術】
【０００２】
CD1dは、抗原提示細胞(APC)を含む多様なヒト細胞の表面上に発現される(CD1a、CD1b、CD1c、CD1d及びCD1eを含む)糖タンパク質のCD1(表面抗原分類1)ファミリーのメンバーである。ヒトにおいて、CD1dは、R3G1としても知られるCD1Dによりコードされる。CD1dを提示するAPCとしては、ランゲルハンス細胞、(活性化)B細胞、(例えば、リンパ節における)樹状細胞、及び(活性化)血中単球が挙げられる。CD1dは、多様な他の種類の細胞、例えば、肝臓、膵臓、皮膚、腎臓、子宮、結膜、精巣上体、胸腺及び扁桃によっても発現される(例えば、Canchisら、(1992) Immunology 80:561〜565頁を参照されたい)。
【０００３】
CD1dによって活性化/刺激される細胞としては、ナチュラルキラーT細胞(NKT細胞)が挙げられる。NKT細胞は、T細胞及びナチュラルキラー細胞両方の性質を共有する、不均一なT細胞群である。NKT細胞は、アルファ/ベータT細胞受容体(TCR)並びに典型的にNKT細胞と関連する様々な分子マーカーを発現するT細胞のサブセットである。
【０００４】
タイプ1又はインバリアントNKT細胞は、最もよく知られたNKT細胞群であり、通常のαβT細胞とは、それらのT細胞受容体の多様性がはるかに制限されている(「インバリアント」)点で異なる。これらのインバリアントな及び他のCD1d拘束性のT細胞(タイプ2NKT)を含むNKT細胞は、APC上に存在するCD1d分子によって提示される(自己の又は外来の)脂質及び糖脂質を認識する。(脂質を提示する)CD1dとTCRの相互作用は、インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子アルファ、並びにIL-4、IL-5及びIL-13のようなインターロイキン等の、Th1-又はTh2-様サイトカインを含むサイトカインの放出をトリガーする。
【０００５】
様々な脂質が、ミコール酸、ジアシルグリセロール及びスフィンゴリピドを含むCD1d分子を結合することが示された。アルファ-ガラクトシルセラミド、KRN7000は、インビトロ及びインビボのNKT細胞の活性化において最もよく研究された脂質結合性CD1dのリガンドである。他のリガンドは、イソグロボトリヘキソシルセラミド、(微生物由来)グリクロノシルセラミド、アルファ-C-ガラクトシルセラミド、スレイトールセラミド並びにリソホスファチジルコリン及びリソスフィンゴミエリンのような様々な(ヒト及び非ヒト)糖脂質を含む(例えば、Foxら(2009)PLOS Biology 7: 10e1000228を参照されたい)。
【０００６】
自己免疫、アレルギー性、抗微生物及び抗腫瘍免疫反応の調節におけるNKT細胞の重要な役割が、今や実証されている(van der Vlietら、(2004) Clinical Immunology 112(1): 8〜23頁)。生理学的に、NKT細胞は、抗腫瘍、自己免疫及び抗病原体反応を含む免疫反応を、状況次第で複数の骨髄腫細胞における細胞死の誘導を含む様々なメカニズムによって増強又は阻害することができる(Yueら、(2010) The Journal of Immunology 184: 268〜276頁)。NKT細胞が関与しうる状態としては、重症筋無力症、乾癬、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、大腸炎、自己免疫性肝炎、アテローム性動脈硬化及び喘息を含む自己免疫又は炎症疾患が挙げられる。サイトカイン放出に加えて、パーフォリン放出及びグランザイム放出のような細胞溶解並びに細胞死をもたらすNKT細胞エフェクター機能は、例えば癌における、NKT細胞が関わる状態にも関連しうる。したがって、CD1d介在性作用の調節は、潜在的な治療効果を有する。
【０００７】
インビトロ及びインビボの両方において、できるだけ特異的にCD1dと結合及び/又は相互作用しうる、すなわち、CD1ファミリーの他のファミリメンバーには最小限に結合するか又は結合しない化合物が継続的に必要とされている。特に、NKT細胞の活性化等の、しかしそれに限定されないCD1dが関与する生物学的機能を結びつける及び/又は調節(活性化又は阻害)する化合物が必要とされている。そのような化合物は、例えば、CD1d介在性機能が役目を果たす多様な疾患において利益を示しうる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第04/037999号
【特許文献２】国際公開第00/46383号
【特許文献３】国際公開第01/09300号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Canchisら、(1992) Immunology 80:561〜565頁
【非特許文献２】Foxら(2009)PLOS Biology 7: 10e1000228
【非特許文献３】van der Vlietら、(2004) Clinical Immunology 112(1): 8〜23頁
【非特許文献４】Yueら、(2010) The Journal of Immunology 184: 268〜276頁
【非特許文献５】GUIDE TO HUGE COMPUTERS、Martin J. Bishop編、Academic Press、San Diego、1994年
【非特許文献６】Carillo, H.,及びLipton, D.、SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073頁
【非特許文献７】Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387頁
【非特許文献８】Atschul, S. F.ら、J. Molec. Biol. (1990) 215:403頁
【非特許文献９】Yueら、(2010) J Immunol. 184(1):268〜76頁
【非特許文献１０】Yueら、(2005) Proc Natl Acad Sci U S A. 102(33):11811〜6頁
【非特許文献１１】Tengら、(2009) J Immunol. 182(6):3366〜71頁
【非特許文献１２】Tengら、(2009) J Immunol. 183(3):1911〜20頁
【非特許文献１３】Terabeら、(2014) Cancer Immunol Immunother. 63(3): 199〜213頁
【非特許文献１４】Schneidersら、(2011) Clin Immunol.140(2):130〜41頁
【非特許文献１５】Stirnemann Kら、J Clin Invest、2008年3月;118(3):994〜1005頁
【非特許文献１６】Blood. 2009年3月、12;113(11):2498〜507頁
【非特許文献１７】Roovers RCら、Cancer Immunol Immunother. 2007年;56:303〜17頁
【非特許文献１８】Hoogenboom HRら、Nucleic Acids Res 1991年;19:4133〜4137頁
【非特許文献１９】Lameris R.ら、Methods Mol Biol, 2014年; 1139: 155〜65頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、単一ドメイン抗体を少なくとも1つ含む化合物を提供する。単一ドメイン抗体は、ヒトCD1dに結合する。ヒトCD1dに結合する単一ドメイン抗体は、本明細書に開示されたアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3領域、並びにその保存的配列バリアントを含む。
【００１１】
好ましくは、単一ドメイン抗体は、例えば、表１に示される、本明細書に開示された組み合わせのCDR1、CDR2、及びCDR3領域を有する。
【００１２】
更により好ましくは、単一ドメイン抗体は、配列番号1〜配列番号21の群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００１３】
本発明による化合物は、ヒトCD1dに結合する単一ドメイン抗体が該化合物に含まれる限り、任意の種類の化合物、例えば、複合体であってよい。好ましくは、化合物はポリペプチドである。ある一定の実施形態では、化合物は、ヒトCD1dに結合する単一ドメイン抗体のみから成るものでもよい。他の実施形態では、化合物は、ヒトCD1dに結合する単一ドメイン抗体及び標識から成る。更なる実施形態では、化合物は、薬学的活性剤及び/又は他の抗体に連結された、ヒトCD1dに結合する単一ドメイン抗体を含んでもよい。
【００１４】
医学的処置における及び/又は診断薬としての、本発明による化合物の使用も提供される。
【００１５】
本明細書に開示された化合物を含む医薬組成物及びヌクレオチド配列及び本発明による化合物をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】選択された個々のナノボディのCD1d特異性。アイソタイプ対照mAb(IgG2b)、抗CD1d51.1mAb、R2陰性対照VHH及び個々のCD1dに特異的なVHHの結合を検出するために、フローサイトメトリーが使用された。データは、CD1a、CD1b、CD1c及びCD1d形質導入腫瘍細胞株への結合を実証する(n=3)。
【図２】CD1d特異的ナノボディによるmoDCの成熟及びサイトカイン産生の誘導。未成熟moDCが、CD1d特異的ナノボディとともに培養された。24時間後、サイトカイン産生の検出(ELISA)のために、上清が採取された。72時間後、フローサイトメトリーを使用して、成熟マーカーCD83の細胞表面発現についてmoDCが分析された。NC=陰性対照、PC=陽性対照、IgG2b=アイソタイプ対照mAb、51.1=抗CD1d51.1mAb、LPS=リポポリサッカライド、LPS-PMB=リポポリサッカライドとポリミキシンB。データは、平均+SEMを表す。n=3。
【図３】α-GalCer誘導性iNKT細胞活性化の阻害。CD1d形質導入HeLa細胞を、ビヒクル対照(veh)又はα-GalCer(他のすべての条件)で一夜、パルスした。洗浄後、ビヒクル又はα-GalCerでパルスしたHela-CD1dを、IgG2bアイソタイプ対照mAb、抗CD1d51.1mAb、陰性対照VHH R2又は抗CD1d中和VHH(VHH 24(18-29c))とともに2時間培養し、その後、iNKT細胞を添加した。24時間後、フローサイトメトリーを使用して、iNKT細胞の活性化(CD25発現)を決定した。データは、3つの実験の平均+SEMを示す。抗CD1d VHHによるiNKT細胞活性化の優れた中和。
【図４】iNKT細胞活性化の誘導。CD1d形質導入C1R細胞を、示したとおりにビヒクル対照(veh)又はα-GalCerで一夜、パルスした。洗浄後、ビヒクル又はα-GalCerでパルスしたC1R-CD1dを、特異的な抗CD1d VHHの有り又は無しで2時間培養し、その後、iNKT細胞を添加した。24時間後、フローサイトメトリーを使用して、iNKT細胞の活性化(CD25発現)を決定した。代表的なフローサイトメトリーのドットプロットは、α-GalCerによるiNKT細胞の活性化を実証するが、抗CD1d VHH(VHH 12(18-14b))との共培養後にはより顕著であった。データは、複数のCD1d発現腫瘍細胞株による複数の実験を代表するものである。
【図５】抗CD1dナノボディによるアネキシンV結合の誘導。C1R細胞、CD1d形質導入C1R細胞(左パネル)並びにMM.1s細胞及びCD1d形質導入MM.1s細胞(右パネル)を、IgG2bアイソタイプ対照mAb、抗CD1d51.1mAb、陰性対照VHH R2又はCD1d特異的VHH(VHH19(19-23G))とともに、24時間培養した。次いで、初期アポトーシスを示唆する、アネキシンVを結合する標的細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって決定した。データは、3つの実験の平均+SEMを示す。
【図６】プレート結合β2m-ヒトCD1d(±ビヒクル、α-GalCer及び/又は抗CD1d VHH)を使用する、iNKT細胞活性化の誘導。(ビヒクル対照又はα-GalCerを負荷した)β2m-hCD1dに融合した抗EGFR VHHから成る二重特異性構築物で、96ウエルプレートをコーティングした。コーティングしたプレートを、抗CD1d VHH(VHH12)の存在下又は非存在下で、2時間培養し、その後、iNKT細胞を添加した。24時間後、フローサイトメトリーを使用してiNKT細胞の活性化(CD25発現)を決定した。α-GalCerを負荷したβ2m-hCD1dによるわずかなiNKT細胞の活性化、しかし、抗CD1d VHH(VHH12(18-14b))とのα-GalCerを負荷したβ2m-hCD1dの共培養後のロバストな活性化を実証する、代表的なフローサイトメトリーのドットプロット。
【図７】CD1d-α-GalCer介在性のiNKT細胞活性化の用量依存的阻害。ビヒクル対照(ビヒクル)若しくはα-GalCer(他のすべての条件)及び培地(ビヒクル及びα-GC)、抗CD1d mAb 51.1(10μg/ml)、対照VHH(500nM)又は抗CD1d VHH(VHH24;500nM)でパルスした、CD1d形質導入HeLa細胞とiNKTの24時間の共培養後に、iNKTのCD25発現、IFN-γ及びTNF-α産生を決定した。グラフ表示は、iNKT細胞におけるCD25発現を示す(a)。IFN-γ及びTNF-α産生に対する、抗CD1d VHH(●記号)の濃度依存性の効果及び対照の非阻害性であるが、CD1d特異的なVHH(黒三角▲記号)。◆は、ビヒクル負荷した対照条件を示す(b)。平均+SD、n=3、*p<0.05、**p<0.01、****p<0.0001。試験したVHHは、VHH24である。
【図８】抗CD1d VHH12による用量依存的なiNKT細胞活性化。CCRF-CEM(T-ALL、CD1d陽性;n=4)及びCD1d形質導入MM.1s(多発性骨髄腫;n=3)細胞を、ビヒクル対照又はαGCでパルスし、抗CD1d VHH及び対照とともにインキュベートし、iNKTとともに24時間、共培養し、その後、iNKTのCD25発現を決定した。*p<0.05,**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001(図4に対して)。
【図９】iNKT細胞脱顆粒の誘導(左)及びCD1d+腫瘍細胞株に対する細胞傷害性(右)。CCRF-CEM細胞(CD1d陽性)を、ビヒクル対照又はαGCでパルスし、抗CD1d VHH及び対照とともにインキュベートし、iNKTとともに示された時間(6、12又は18時間)共培養(1:2のE:T比)し、フローサイトメトリーのためにCD107a(t=4時間)又はアネキシンV及び7-AADで染色した。N=5;*p<0.05;***p<0.001。示される抗CD1d VHHは、VHH12である。
【図１０】CD1d+初代多発性骨髄腫細胞に対するiNKT細胞の細胞傷害性の誘導。融解したMM患者からの初代骨髄サンプルを、ビヒクル対照若しくはαGCでパルスするか又は抗CD1d VHH及び対照とともにインキュベートし、次いで、示された時間(8及び16時間)、iNKTとともに共培養し、その後、生存MM細胞のパーセンテージを決定した。示される抗CD1d VHHは、VHH12である。
【図１１】抗CD1d VHH12による、iNKT細胞サイトカイン産生の誘導。サイトカイン産生の検出のために、Hela-CD1d細胞を、ビヒクル対照、OCH(アルファ-ガラクトシルセラミド(アルファ-GC)のスフィンゴシン切断型類似体;iNKT細胞においてTh2-サイトカイン産生を誘導することが報告された糖脂質)又はαGCでパルスし、抗CD1d VHH及び対照とともにインキュベートし、iNKTとともに24時間、共培養し、その後、(Cytometric Bead Assay; CBAにより)上清を分析した。N=4;*p<0.05;****p<0.0001
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
以下の説明及び例において、多数の用語が使用される。そのような用語に与えられる範囲を含め、明細書及び特許請求の範囲を明確かつ矛盾なく理解するために、以下の定義が提供される。本明細書中で別段の定めのない限り、使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。すべての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献の開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１８】
本発明の方法において使用される従来技術を実行する方法は、当業者に明白である。分子生物学、生化学、計算化学、細胞培養、組換えDNA、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、シーケンシング及び関連分野における従来技術の実践は、本分野の当業者に周知であり、ハンドブックにおいて論じられている。
【００１９】
本文書及びその特許請求の範囲において、動詞「含む」及びその活用形は、その非制限的な意味で使用されて、この用語に続く項目が含まれるが、具体的に述べられない項目も除外されないことを意味する。これは、動詞「から本質的に成る」並びに「から成る」を包含する。
【００２０】
本明細書中で使用される単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」は、文脈が明らかに別段の規定をしない限り、複数の指示物を含む。例えば、「1つの(a)」化合物を使用するための方法は、複数のこの化合物(例えば、数十、数百、数千、数万、数十万、数百万又はそれを超える分子)を使用することを含む。
【００２１】
用語「アラインすること」及び「アラインメント」により、短い又は長いひと続きの同一又は類似のアミノ酸の存在に基づく、2つ以上の分子/化合物のアミノ酸配列の比較が意味される。以下に更に説明されるように、アミノ酸配列のアラインメントのための数種の方法が本分野で知られている。
【００２２】
「配列同一性」は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、最上位のマッチが得られるように配列がアラインされる。「同一性」自体は、本分野において承認されている意味を有し、公開された技術を使用して計算可能である。2つの配列間の同一性又は類似性を決定するために一般に使用される方法は、GUIDE TO HUGE COMPUTERS、Martin J. Bishop編、Academic Press、San Diego、1994年及びCarillo, H.,及びLipton, D.、SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073頁に開示されたものを含むが、それに限定されない。同一性及び類似性を決定するための方法は、コンピュータプログラムにコード化されうる。2つの配列間の同一性及び類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法は、GCSプログラムパッケージ(Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387頁)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul, S. F.ら、J. Molec. Biol. (1990) 215:403頁)を含むが、それに限定されない。本明細書に開示された配列同一性は、本質的に以下のパラグラフに概説されるように、類似するアミノ酸のパーセンテージ(参照配列中のアミノ酸の総数で参照配列に類似するアミノ酸の数を割ったもの)を計算することによって決定される。
【００２３】
例示として、配列番号1の参照アミノ酸配列に対して、少なくとも、例えば70%の「配列同一性」を有するアミノ酸配列によって、ポリペプチド配列が配列番号1の参照アミノ酸の10アミノ酸毎に3以下のアミノ酸の変更を含みうる以外は、アミノ酸配列が参照配列と同一であることが意図される。したがって、参照アミノ酸配列に対するアミノ酸配列の同一性のパーセンテージは、参照アミノ酸配列の全長にわたって計算される。言い換えれば、参照アミノ酸配列に対して少なくとも70%同一を含むアミノ酸配列を得るためには、参照配列中の30%以下のアミノ酸残基が欠失若しくは別のアミノ酸で置換されるか、又は参照配列中の全アミノ酸残基の30%以下の数のアミノ酸が、参照配列中に挿入されてよい。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ若しくはカルボキシ末端位置において、或いは参照配列中の残基の中で個々に又は参照配列内の1つ若しくは複数の隣接した群の中に散在するそれら末端位置の間の任意の場所で起こってよい。
【００２４】
用語「アミノ酸配列」又は「タンパク質」又は「ペプチド」は、特定の作用様式、サイズ、3次元構造又は起源に関係なく、アミノ酸の鎖から成る分子を指す。よって、その「断片」又は「部分」はなお、「アミノ酸配列」又は「タンパク質」又は「ペプチド」と呼ばれうる。「単離されたアミノ酸配列」は、特別な配列を有し、もはやその元の自然の環境、例えば、インビトロ又は組換え細菌若しくはヒト宿主細胞中にないアミノ酸鎖を指すために使用される。
【００２５】
各イムノグロブリン分子は、可変ドメインを有する。イムノグロブリン分子の可変ドメインは、超可変(HV)及びフレームワーク(FR)領域に更に分割される。HV領域は、所与の位置におけるもっとも一般的なアミノ酸に対して、その位置に異なるアミノ酸を高い比率で有する。超可変領域は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる。イムノグロブリン分子は、3つの相補性決定領域(CDR1、CDR2、及びCDR3)を有する。はるかに可変性の低いアミノ酸配列を含む4つのフレームワーク領域が、CDR領域を分離している。CDR領域は、CD1dのような抗原に直接結合することができる。
【００２６】
説明
本発明は、一般に、ヒトCD1dに結合する単一ドメイン抗体を含む化合物に関する。本発明者らは、ヒトCD1dに結合する単一ドメイン抗体及びその抗原結合部分を見出した。
【００２７】
第1の態様では、ヒトCD1dに結合する単一ドメイン抗体を少なくとも1つ含む化合物が提供され、単一ドメイン抗体が、相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3を含み、CDR1が、配列番号22と少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、CDR2が、配列番号43と少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２８】
以前に開示されたとおり、CD1d(Entrez Gene ID 912; NCBI参照配列: NP_001757; Balkら、(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:252〜256頁)は、慢性リンパ球性白血病患者におけるB細胞、肝細胞、樹状細胞及び腫瘍細胞を含む様々な細胞において発現され、本明細書に開示された単一ドメイン抗体は、例えば、CD1dへの結合のためであるが、これらの細胞のいずれかにおけるCD1dに限定されないCD1dへの結合のため、或いはCD1dを発現する他の細胞におけるCD1dへの結合のため、或いは細胞に結合しないCD1d分子及び何にも結合しないか又は例えば、担体、ポリマー若しくは他のタンパク質に連結若しくは会合されるCD1d分子への結合のために使用可能である。
【００２９】
ヒトCD1dに結合する単一ドメイン抗体を含む化合物は、CD1dに結合する単一ドメイン抗体を含む限り、いかなる種類の化合物又は複合体であってもよい。好ましくは、本発明による化合物は、ヒトCD1dに結合する単一ドメイン抗体の存在のため、ヒトCD1dに結合することができる。
【００３０】
本発明による化合物は、更に、他の官能基又は非官能基を含んでよい。例えば、本発明の単一ドメイン抗体は、ナノ粒子、リポソーム、ウイルス、標識、別の抗体若しくはタンパク質構造体(例えば、受容体)に連結されてよく、又は抗原、ペプチド、薬物、マーカー若しくは核酸に融合されてもよい。例えば、化合物は、CD1d発現細胞の単離を可能とする磁性ビーズを含んでもよい。
【００３１】
CD1d単一ドメイン抗体は、抗体のカルボキシル若しくはアミノ末端を介して連結でき、又はカルボキシル若しくはアミノ末端以外の部位で連結することもできる。CD1d単一ドメイン抗体への付着は、直接的なもの、すなわち、いかなる中間配列もないもの、又はリンカーアミノ酸配列、リンカー分子若しくは化学結合によるものであってもよい。例えば、カップリングは、物理的及び/又は化学的なタイプのものであってよい。
【００３２】
一実施形態では、化合物は、二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。一実施形態では、化合物は、二価抗体又は多価抗体である。二価性又は多価性は、大きな親和性によって抗体が多量体抗原に結合することを可能とし;二重特異性又は多重特異性は、2つの抗原の架橋を可能とする。
【００３３】
化合物は、ヒトCD1dに結合する単一ドメイン抗体を少なくとも1つ含み、単一ドメイン抗体が、相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3を含み、CDR1が、配列番号22と少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、CDR2が、配列番号43と少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３４】
単一ドメイン抗体(Nanobodyと、開発者であるAblynx社によって、又はVHHとも呼ばれる、sdAb)は、当業者に周知である。単一ドメイン抗体は、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体である。よって、単一ドメイン抗体は、単一の相補性決定領域(CDR)1(CDR1)、単一のCDR2及び単一のCDR3を含む。単一ドメイン抗体の例は、重鎖抗体(heavy chain only antibody)、天然に軽鎖を含まない抗体、従来の抗体由来の単一ドメイン抗体及び改変抗体である。
【００３５】
単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ及びウシを含む任意の種に由来してよい。例えば、天然のVHH分子は、ラクダ科、例えば、ラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びグアナコにおいて産生された抗体に由来しうる。
【００３６】
全抗体のように、単一ドメイン抗体は、特定の抗原に選択的に結合することができる。単一ドメイン抗体は、CDR1、CDR2、及びCDR3を有するイムノグロブリン鎖の可変ドメイン並びにフレームワーク領域のみを含有してもよい。わずか約12〜15kDaの分子量により、ナノボディは、2つの重鎖及び2つの軽鎖から成る一般的な抗体(150〜160kDa)よりもかなり小さい。
【００３７】
CDR1、CDR2、及びCDR3配列は、種の間で交換されうる。例えば、ラマイムノグロブリン分子からCDR配列が選択され、ヒトイムノグロブリン分子のCDR配列と交換されて、ラマCDR配列に由来する特異性を有するヒトイムノグロブリン分子を得ることができる。ヒト配列が、元のラマフレームワーク配列に比べてヒトに対して免疫原性が低い可能性があるため、これは有利でありうる。そのようなCDR配列の交換は、ヒト化として知られる。
【００３８】
したがって、本発明によるイムノグロブリン分子は、ヒト由来のイムノグロブリン配列又はラマ由来のイムノグロブリン配列を含んでよく、ヒトCD1dの結合を提供するために、CDR1、CDR2、及びCDR3配列が本発明によるCDR配列と交換される。言い換えれば、本発明による化合物は、本明細書に開示されたCDRを含むヒト化単一ドメイン抗体を含みうる。例えば、単一ドメイン抗体は、ヒトフレームワーク配列及び本明細書に開示されたCDR領域を有しうる。
【００３９】
本発明による化合物に含まれる単一ドメイン抗体は、相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3を含み、CDR1が、配列番号22と少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、CDR2が、配列番号43と少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００４０】
配列番号22の配列は、本明細書中の表１において17-1Eと表示される単一ドメイン抗体のCDR1の配列に相当する。本発明の目的のために、単一ドメイン抗体17-1Eは、VHH番号1とも呼ばれうる。単一ドメイン抗体17-1Eの配列は、配列番号1として示され、表１において示されるCDR1、CDR2、及びCDR3の配列に加えてフレームワーク配列も含む。
【００４１】
配列番号43の配列は、本明細書中の表１において17-1Eと表示される単一ドメイン抗体のCDR2の配列に相当する。
【００４２】
本明細書に記載された、例えば、表１に列挙されたすべての単一ドメイン抗体に関して、CDR1の前の領域はフレームワーク領域(FW)1と呼ばれ、CDR1とCDR2の間の領域はFW2と呼ばれ、CDR2とCDR3の間の領域はFW3と呼ばれ、CDR3の後の領域はFW4と呼ばれうる。各個別のフレームワーク領域FW1、FW2、FW3及びFW4は、CDR1、CDR2、及びCDR3並びに全単一ドメイン抗体の配列に基づいて容易に確立可能であり、したがって、そのようなものとして開示される。
【００４３】
驚くべきことに、多様な単一ドメイン抗体のCDR1及びCDR2に関して高いアミノ酸配列同一性を有する様々な単一ドメイン抗体が得られうることが見出された。見出された単一ドメイン抗体のCDR1、CDR2、及びCDR3配列が、表１に列挙される。例えば、表１において19-23Gと表示される単一ドメイン抗体は、VHH番号19を有し、配列番号37に相当する配列を有するCDR1、配列番号58に相当する配列を有するCDR2及び配列番号79に相当する配列を有するCDR3の組み合わせを有する。このVHHのフレームワーク領域を含む配列全体は、配列番号16である。
【００４４】
しかしながら、本発明によれば、単一ドメイン抗体は、CDR1が配列番号22と少なくとも60%の配列同一性を示し、CDR2が配列番号43と少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む限り、CDR1、CDR2、及びCDR3の任意の組み合わせを含んでよい。例えば、単一ドメイン抗体が、第1のVHH(例えば、VHH番号10)の表１に示されるCDR1及び第2のVHH(例えば、VHH番号20)の表１に示されるCDR2を含むことも企図される。
【００４５】
言い換えれば、ヒトCD1dに結合する単一ドメイン抗体を少なくとも1つ含む本発明による化合物であって、単一ドメイン抗体のCDR1が、配列番号22と少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、単一ドメイン抗体のCDR2が、配列番号43と少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、化合物を、当業者が本開示に基づいて過度の負担なく提供できることが理解される。例えば、表１に示される多様なCDR1及びCDR2に基づいて。
【００４６】
好ましい実施形態では、CDR1は、その全長にわたって、配列番号22と少なくとも60%の配列同一性を示す。好ましい実施形態では、CDR2は、その全長にわたって、配列番号43と少なくとも60%の配列同一性を示す。好ましくは、CDR1は、その全長にわたって、配列番号22と少なくとも60%の配列同一性を示し、CDR2は、その全長にわたって、配列番号43と少なくとも60%の配列同一性を示す。好ましくは、CDR1及び/又はCDR2は、それぞれ、配列番号22及び/又は配列番号43と少なくとも65%、70%、75%、80%、90%、95%、97%、99%の同一性を示す。
【００４７】
ヒトCD1dに結合する単一ドメイン抗体を少なくとも1つ含む化合物であって、単一ドメイン抗体が、相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3を含み、CDR1が、配列番号22と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、CDR2が、配列番号43と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、CDR3が、配列番号64と少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;又は、CDR1が、配列番号33及び配列番号42から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み、CDR2が、配列番号54及び配列番号63から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み、CDR3が、配列番号75及び配列番号84から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、化合物も提供される。
【００４８】
提供される、本発明による化合物に含まれうる単一ドメイン抗体のうちに、CDR1については配列番号22と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を、CDR2については配列番号43と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を、CDR3については配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を提示する群が存在することが見出された。これらの単一ドメイン抗体は、各相補性決定領域に関して高度の同一性を共有する。好ましい実施形態では、CDR1は、その全長にわたって、配列番号22と少なくとも90%の配列同一性を示す。好ましい実施形態では、CDR2は、その全長にわたって、配列番号43と少なくとも80%の配列同一性を示す。好ましい実施形態では、CDR3は、その全長にわたって、配列番号64と少なくとも70%の配列同一性を示す。好ましくは、CDR1は、その全長にわたって、配列番号22と少なくとも90%の配列同一性を示し、CDR2は、その全長にわたって、配列番号43と少なくとも80%の配列同一性を示し、CDR3は、その全長にわたって、配列番号64と少なくとも70%の配列同一性を示す。好ましくは、CDR1は、配列番号22と少なくとも90%、92%、95%、97%、99%の同一性を示し、CDR2は、配列番号43と少なくとも80%、82%、85%、90%、92%、95%、97%、99%の同一性を示し、CDR3は、配列番号64と少なくとも70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、90%、92%、95%、97%、99%の同一性を示す。
【００４９】
本発明によれば、好ましい実施形態では、単一ドメイン抗体は、CDR1が、配列番号22と少なくとも90%の配列同一性を示し、CDR2が、配列番号43と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、CDR3が、配列番号64と少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む限り、CDR1、CDR2、及びCDR3の任意の組み合わせを含んでよい。例えば、単一ドメイン抗体が、第1のVHHの表１に示されるCDR1(例えば、VHH番号10;配列番号31)及び第2のVHHの表１に示されるCDR2(例えば、VHH番号20;配列番号59)及び第1若しくは第2のVHH又は第3のVHHの表１に示されるCDR3(例えば、VHH番号21;配列番号81)を含むことも企図される。
【００５０】
言い換えれば、好ましい実施形態では、当業者が、様々なCDR1、CDR2、及びCDR3を組み合わせることによって、ヒトCD1dに結合する単一ドメイン抗体を少なくとも1つ含む本発明による化合物であって、単一ドメイン抗体のCDR1が、配列番号22と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、単一ドメイン抗体のCDR2が、配列番号43と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、単一ドメイン抗体のCDR3が、配列番号64と少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、化合物を、本開示に基づいて過度の負担なく提供できることが理解される。例えば、表１に示される多様なCDR1、CDR2、及びCDR3に基づいて。
【００５１】
別の好ましい実施形態では、ヒトCD1dに結合する単一ドメイン抗体を少なくとも1つ含む化合物であって、単一ドメイン抗体が、相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3を含み、CDR1が、配列番号33及び配列番号42から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み、CDR2が、配列番号54及び配列番号63から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み、CDR3が、配列番号75及び配列番号84から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、化合物が提供される。
【００５２】
好ましくは、本明細書に開示されたヒトCD1dに結合する単一ドメイン抗体を少なくとも1つ含む化合物であって、単一ドメイン抗体が、表１に組み合わせて列挙された相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3、又はその保存的配列バリアントを有する、化合物が提供される。
【００５３】
当業者が、本明細書に開示された多様なCDR1、CDR2、CDR3、並びに(単一ドメイン抗体の多様なフレームワーク配列及び完全長配列を含む)提供された他の配列に基づいて多様な単一ドメイン抗体を提供できることは理解されるであろうが、単一ドメイン抗体は、表１に組み合わせて列挙されたCDR1、CDR2、及びCDR3並びにその保存的配列バリアントを有することが好ましい。言い換えれば、本発明による化合物は、単一ドメイン抗体を含み、好ましくは、CDR1及びCDR2及びCDR3が、表１に示されるのと全く同一のVHHのものである。例えば、単一ドメイン抗体は、表１に示されるのと同じVHHのもの、例えば、VHH1、VHH2、VHH3…VHH14、VHH18、VHH19…VHH24のCDR1、CDR2、及びCDR3を有する。特に、組み合わせて示される(すなわち、同じVHHからの)CDR1、CDR2、及びCDR3は、有益なCD1d結合を示すことが見出された。当業者に理解されるとおり、表１に開示されたCDR1、CDR2、及びCDR3の組み合わせの保存的配列バリアントも含まれる。
【００５４】
実際に、2つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を決定すること又は単一ドメイン抗体中のCDR1、CDR2、及びCDR3の組み合わせを確立することにおいて、当業者は、所謂「保存的」アミノ酸置換を考慮し、これは、一般に、アミノ酸残基が、化学構造が類似し、ポリペプチドの機能、活性又は他の生物学的性質に影響が少ないか又は本質的に影響しない別のアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換として説明されうる。そのような保存的アミノ酸置換は、例えば、国際公開第04/037999号、国際公開第00/46383号、国際公開第01/09300号及び国際公開第04/037999号から、本分野において周知である。保存的置換は、以下の群(a)〜(e)内の1つのアミノ酸残基:(a)小さな脂肪族の非極性又はわずかに極性の残基:Ala、Ser、Thr、Pro及びGly;(b)極性の陰性荷電した残基及びそれらの(非荷電)アミド:Asp、Asn、Glu及びGln;(c)極性の陽性荷電した残基:His、Arg及びLys;(d)大きな脂肪族の非極性残基:Met、Leu、Ile、Val及びCys;並びに(e)芳香族残基:Phe、Tyr及びTrpが、同じ群(a)〜(e)内の別のアミノ酸残基によって置換されることが好ましい。
【００５５】
保存的置換の好ましい例は以下のとおりである:AlaをGLyに若しくはSerに;ArgをLysに;AsnをGlnに若しくはHisに;AspをGluに;CysをSerに;GlnをAsnに;GluをAspに;GlyをAlaに若しくはProに;HisをAsnに若しくはGlnに;IleをLeuに若しくはValに;LeuをIleに若しくはValに;LysをArgに、Glnに若しくはGluに;MetをLeuに、Tyrに若しくはIleに;PheをMetに、Leuに若しくはTyrに;SerをThrに;ThrをSerに;TrpをTyrに;TyrをTrpに;及び/又はPheをValに、Ileに若しくはLeuに。
【００５６】
好ましくは、単一ドメイン抗体は、その保存的配列バリアントを含む、表１中に組み合わせて列挙された相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3を有する。より好ましくは、単一ドメイン抗体は、表１に組み合わせて列挙された相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3を有する。
【００５７】
本明細書中、上で開示された化合物であって、配列番号1〜配列番号21から成る群から選択されるアミノ酸配列又はその保存的配列バリアントを含む化合物も提供される。
【００５８】
言い換えれば、本発明による化合物中に含まれる単一ドメイン抗体は、配列番号1〜配列番号21、又は上で説明した、その保存的配列バリアントから成る群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれから成ることが好ましい。これらの配列1〜22は、フレームワーク領域を含む、表１に組み合わせて示されるCDR1、CDR2、及びCDR3を含む単一ドメイン抗体を表す。これらの単一ドメイン抗体及び本明細書に開示された実施例に詳述されるそれらのCD1d結合特性。配列番号1は、表１に示されるVHH番号1と一致し;配列番号2は、VHH番号2と一致し;配列番号3は、VHH番号3と一致し;配列番号4は、VHH番号4と一致し;配列番号5は、VHH番号5と一致し;配列番号6は、VHH番号6と一致し;配列番号7は、VHH番号7と一致し;配列番号8は、VHH番号8と一致し;配列番号9は、VHH番号9と一致し;配列番号10は、VHH番号10と一致し;配列番号11は、VHH番号11と一致し;配列番号12は、VHH番号12と一致し;配列番号13は、VHH番号13と一致し;配列番号14は、VHH番号14と一致し;配列番号15は、VHH番号18と一致し;配列番号16は、VHH番号19と一致し;配列番号17は、VHH番号20と一致し;配列番号18は、VHH番号21と一致し;配列番号19は、VHH番号22と一致し;配列番号20は、VHH番号23と一致し;配列番号21は、VHH番号24と一致する。
【００５９】
本発明による化合物に含まれ、その全長にわたって、配列番号1〜21(及び該当する場合には、本明細書に開示されたすべての配列)から成る群から選択される配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する、単一ドメイン抗体も提供される。
【００６０】
本発明による化合物は、CD1dに結合する単一ドメイン抗体を含む任意の種類の化合物であってよいが、好ましい実施形態では、化合物は、薬学的活性剤又は標識又はマーカーがそこに付着するポリペプチドである。例えば、CD1d結合性単一ドメイン抗体を含むポリペプチドは、CD1d発現細胞に送達されることが好ましい薬学的活性剤に連結されうる。別の例としては、CD1d結合性単一ドメイン抗体及び抗原を含む、本発明による化合物が挙げられる。そのような化合物は、例えば、樹状細胞に基づくワクチンにおいて用途を見出しうる。活性剤は、本発明による化合物、好ましくは本発明によるポリペプチドに連結されて、その送達部位における作用剤の放出を可能としうる。別の例は、本発明による化合物、例えば、本発明によるポリペプチドが、標識を含むものである。標識は、例えば、蛍光又は放射性標識の形態であってよいが、それに限定されない。本発明による化合物の存在又は局在化を検出することを可能とする任意の種類の標識が、本発明の関連において好適に使用されうる。別の実施形態では、化合物はポリペプチドである。
【００６１】
しかしながら、更に、本発明の別の好ましい実施形態では、先の請求項のいずれかに記載の化合物であって、化合物が更なる単一ドメイン抗体を含み、化合物が標識を含み、化合物に薬学的活性剤が連結されており、単一ドメイン抗体がヒト化され、化合物が二重特異性若しくは多重特異性化合物(二重特異性若しくは多重特異性は、2つの抗原の架橋を可能としうる)であり、化合物が二価若しくは多価化合物(二価性若しくは多価性は、大きな親和性によって抗体が多量体抗原に結合することを可能としうる)であり、化合物が、抗原、ペプチド若しくはヌクレオチド配列に融合され、化合物がリポソーム、ウイルスであり、及び/又は化合物がナノ粒子である、化合物が提供される。
【００６２】
本明細書に開示された化合物であって、単一ドメイン抗体がヒトCD1dに結合するが、ヒトCD1a、ヒトCD1b及び/又はヒトCD1cには結合しない、化合物も提供される。言い換えれば、意図される特別な用途のうちで、本発明の化合物は、ヒトCD1a、ヒトCD1b及び/又はヒトCD1cでなく、ヒトCD1dに特異的に結合する単一ドメイン抗体を含む。本発明による好ましい化合物は、ヒトCD1dに結合し、ヒトCD1a、ヒトCD1b及び/又はヒトCD1cには結合しない。配列番号1〜21によって表される単一ドメイン抗体は、ヒトCD1dと特異的に結合する単一ドメイン抗体の例である。当業者は、実施例により証明できるとおり、単一ドメイン抗体がヒトCD1dに特異的であるかを、どのように過度の負担なく決定するかを知っている。
【００６３】
本明細書中で述べるとおり、驚くべきことに、CDR1、CDR2及び/又はCDR3配列に関して、その間で高いアミノ酸同一性を共有するCD1d結合性単一ドメイン抗体を含む化合物が提供可能であることが見出された。更に、実施例から証明できるとおり、様々な機能的特徴及び特性を有する、本明細書に記載の単一ドメイン抗体を含む化合物が提供可能であることが見出された。したがって、本明細書において教示される化合物であって、化合物が、樹状細胞、好ましくは単球由来の樹状細胞の成熟を誘導することができ、好ましくは、単一ドメイン抗体が、VHH2若しくはVHH5に関して表１に組み合わせて列挙された相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3、又はその保存的配列バリアントを有するか、又は単一ドメイン抗体が、VHH2若しくはVHH5又はその保存的配列バリアントであり;及び/又は化合物が、糖脂質、例えば、アルファ-ガラクトシルセラミド誘導性の、インバリアントナチュラルキラーT細胞のようなCD1d拘束性T細胞の活性化を阻害することができ、好ましくは、単一ドメイン抗体が、VHH5若しくはVHH24に関して表１に組み合わせて列挙された相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3、又はその保存的配列バリアントを有するか、又は単一ドメイン抗体が、VHH5若しくはVHH24又はその保存的配列バリアントであり;及び/又は化合物が、インバリアントナチュラルキラーT細胞のようなCD1d拘束性T細胞の活性化を誘導することができ、及び/又は糖脂質(例えば、アルファ-ガラクトシルセラミド)誘導性の、インバリアントナチュラルキラーT細胞のようなCD1d拘束性T細胞の活性化を刺激することができ、好ましくは、単一ドメイン抗体が、VHH12に関して表１に組み合わせて列挙された相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3、又はその保存的配列バリアントを有するか、又は単一ドメイン抗体が、VHH12又はその保存的配列バリアントであり;及び/又は化合物が、アネキシンV結合(例えば、そのような化合物と接触した細胞へのアネキシンVの結合;アネキシンV結合は、初期(早期)アポトーシスのマーカーである)及び/又はCD1d発現細胞、好ましくはCD1d発現性腫瘍のアポトーシスを誘導することができ、好ましくは、単一ドメイン抗体が、VHH3、VHH6、VHH8若しくはVHH19に関して表１に組み合わせて列挙された相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3、又はその保存的配列バリアントを有するか、又は単一ドメイン抗体が、VHH3、VHH6、VHH8若しくはVHH19又はその保存的配列バリアントである、化合物も提供される。
【００６４】
表１に示されるCDRを含む単一ドメイン抗体VHH2及びVHH5は、樹状細胞の、好ましくは単球由来の樹状細胞の成熟(実施例を参照されたい)、並びにIL-12に代表されるサイトカイン産生を誘導することに関する活性を示すことが見出された。そのような単一ドメイン抗体を含む化合物は、インビトロ又はインビボでの樹状細胞の成熟及びサイトカイン、例えば、IL-12の産生を、例えば、癌、マラリア及びHIVの処置において及び/又は抗微生物若しくは抗ウイルス剤として誘導することにおいて有用である。更に、樹状細胞におけるCD1d-トリガリングは、本明細書において論じるように、ワクチン接種アプローチにおいて有用でありうる(例えば、Yueら、(2010) J Immunol. 184(1):268〜76頁; Yueら、(2005) Proc Natl Acad Sci U S A. 102(33):11811〜6頁; Tengら、(2009) J Immunol. 182(6):3366〜71頁;又はTengら、(2009) J Immunol. 183(3):1911〜20頁を参照されたい)。
【００６５】
更に、インバリアントナチュラルキラーT細胞のような、糖脂質、すなわち、CD1dによって結合/提示されうるすべての糖脂質、例えば、アルファ-ガラクトシルセラミド誘導性のCD1d拘束性T細胞の活性化を阻害することができる本発明による化合物であって、好ましくは、単一ドメイン抗体が、VHH5又はVHH24に関して表１に組み合わせて列挙された相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3、又はその保存的配列バリアントを有する、化合物が提供可能であることが見出された(実施例を参照されたい)。そのような単一ドメイン抗体を含む化合物は、糖脂質(例えば、アルファ-ガラクトシルセラミド)誘導性の(インバリアントナチュラルキラーT細胞を含む)CD1d拘束性T細胞の活性化をインビトロ又はインビボの両方において阻害すること、例えば、iNKT(インバリアントナチュラルキラーT細胞)細胞又は他のCD1d拘束性T細胞サブセットを研究すること及び/又は慢性の過剰刺激からレスキューすること(rescue-ing)において有用である(例えば、Terabeら、(2014) Cancer Immunol Immunother. 63(3): 199〜213頁を参照されたい)。
【００６６】
更に、本発明による化合物であって、インバリアントナチュラルキラーT細胞を含むCD1d拘束性T細胞の活性化を誘導すること及び/又は糖脂質(例えば、アルファ-ガラクトシルセラミド)誘導性の、インバリアントナチュラルキラーT細胞を含むCD1d拘束性T細胞の活性化を刺激することができ、好ましくは、単一ドメイン抗体が、VHH12に関して表１に組み合わせて列挙された相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3、又はその保存的配列バリアントを有する、化合物が提供される。そのような単一ドメイン抗体を含む化合物は、外から加えられた糖脂質の非存在下で、インバリアントナチュラルキラーT細胞の活性化を誘導すること及び/又は(アルファ-ガラクトシルセラミドを含む)糖脂質誘導性のインバリアントナチュラルキラーT細胞の活性化をインビトロ又はインビボの両方で、例えば、癌の処置において刺激することにおいて有用である。iNKT細胞は、(1)腫瘍細胞の直接的溶解により又は(2)(例えば、DCとの相互作用の後に)NK細胞、細胞傷害性T細胞のような二次免疫エフェクターをトリガーして抗腫瘍効果を発揮する、IFN-γのような免疫調節性サイトカインの産生により、腫瘍細胞傷害性を発揮しうる。これは例えばSchneidersら、(2011) Clin Immunol.140(2):130〜41頁で検討されている。
【００６７】
加えて、本発明による化合物であって、CD1dを標的とする構築物に結合して、腫瘍部位におけるiNKT細胞を標的とすること及びiNKT細胞の標的活性化を可能とし、好ましくは、単一ドメイン抗体が、VHH12に関して表１に組み合わせて列挙された相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3、又はその保存的配列バリアントを有し、好ましくは、単一ドメイン抗体が、VHH12である、化合物が提供される。これは、有用であり、Stirnemann Kら、J Clin Invest、2008年3月;118(3):994〜1005頁によって提案されたアプローチの上に構築される。
【００６８】
初期アポトーシスを示唆する、アネキシンV結合の増加を誘導すること及び/又はCD1d発現細胞、好ましくはCD1d発現性腫瘍におけるアポトーシスを誘導することができる化合物であって、好ましくは、単一ドメイン抗体が、VHH3、VHH6、VHH8又はVHH19に関して表１に組み合わせて列挙された相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3、又はその保存的配列バリアントを有する、化合物も提供される。そのような単一ドメイン抗体を含む化合物は、アネキシンV結合の増加及び/又はCD1d発現細胞におけるアポトーシスをインビトロ又はインビボの両方において、例えば、癌の処置において誘導することにおいて有用である。これは、例えば、細胞死をもたらしうる、CD1d+悪性腫瘍、例えば、多発性骨髄腫において有用である(Blood. 2009年3月、12;113(11):2498〜507頁)。
【００６９】
上記の様々な機能性を有する単一ドメイン抗体を含む、そのような化合物の、例えば、そのような機能性が有益である状態の処置における使用も提供される。
【００７０】
更なる好ましい実施形態では、本明細書に記載の化合物であって、化合物が、単一ドメイン抗体であって、好ましくは化合物が、表１に組み合わせて列挙された相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3、又はその保存的配列バリアントを有する単一ドメイン抗体であるか、又は単一ドメイン抗体が、配列番号1〜配列番号21から成る群から選択されるアミノ酸配列又はその保存的配列バリアントを有する、化合物が提供される。
【００７１】
抗体、好ましくは、ヒトCD1dに結合する単一ドメイン抗体を含む化合物であって、抗体、好ましくは単一ドメイン抗体が、相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3を含み、CDR1、CDR2、及びCDR3が、表１に示されるVHH番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、18、19、20、21、22、23又は24について示すCDR1、CDR2、及びCDR3それぞれのアミノ酸配列に対して、少なくとも80%、90%、95%又は100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、化合物も提供される。好ましくは、抗体、好ましくは単一ドメイン抗体を含む化合物は、表１に示されるVHH番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、18、19、20、21、22、23又は24について示すCDR1、CDR2、及びCDR3それぞれのアミノ酸配列に対して、少なくとも80%、90%、95%又は100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列又はその保存的配列バリアントを有する。好ましくは、化合物は、抗体、好ましくは一本鎖抗体である。表１に示される特定の抗体、又はそこに組み合わせて示される(すなわち、VHH番号毎の)CDR1、CDR2、CDR3を含む抗体のそれぞれは、実施例及び明細書において示される驚くべき非自明の特性を有する。本明細書に開示された、CDR1、CDR2及び/若しくはCDR3、抗体、単一ドメイン抗体をコードする核酸、そのような核酸を含むベクター又は本発明による化合物も提供される。
【００７２】
当業者に理解されるとおり、本明細書に記載の化合物は、インビトロ及びインビボの両方における研究ツールとして、診断ツールとして、(CD1dを発現する)標的部位への、例えば、薬物の送達のための手段としての、インビトロ及びインビボの両方において(例えば、化合物が二重特異性又は多重特異性である場合)2つ以上の異なる受容体、分子及び/又は抗原を標的とすることにおける、等の多種多様な用途を有しうる。好ましくは、本明細書に記載の化合物は、医学的処置における使用、又は診断薬としてのインビボでの使用のためのものである。本明細書に開示された化合物から利益を受けうる状態としては、癌、HIV、マラリア、喘息、アレルギー、自己免疫疾患、炎症性腸疾患及び移植片対宿主病(GVHD)が挙げられるが、それに限定されない。したがって、別の実施形態では、本発明による化合物を含む、例えば、本明細書に記載の単一ドメイン抗体を含む医薬組成物が提供される。当業者に理解されるとおり、医薬組成物は、本明細書に開示された化合物に加えて、別の化合物、例えば、他の薬学的活性成分及び/又は賦形剤を含んでよい。
【００７３】
本明細書に記載の化合物の使用であって、化合物が、インビトロで使用されるか又は化合物が、例えば、患者から得られたサンプルにおけるCD1d発現を検出するため及び/又はCD1dを発現する細胞を検出するためのインビトロの診断方法において使用される、化合物の使用も提供される。
【００７４】
本発明の別の態様によれば、本明細書に記載の化合物をコードするヌクレオチド配列が提供される。この実施形態では、本発明による化合物はポリペプチドであり、例えば、化合物は、単一ドメイン抗体、例えば、配列番号1〜21から成る群から選択される配列、及びその保存的配列バリアントを含む単一ドメイン抗体である。
【００７５】
本明細書に開示された配列は、アミノ酸配列に関する。したがって、アミノ酸配列をヌクレオチド配列に変換するためには、コドン表を使用することだけが必要であるため、当業者は、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を提供することが十分に可能である。
【００７６】
そのようなヌクレオチド配列は、プロモーター配列、ポリAシグナル等にそれを作動可能に連結して、それによって抗体が発現されうる遺伝子構築物を提供するために使用されうる。ヌクレオチド配列を含むそのような遺伝子構築物は、宿主細胞中に含まれてよい。本発明によるヌクレオチド配列を含むそのような宿主細胞又は非ヒト生物も提供される。
【００７７】
好ましい実施形態では、本明細書に開示されたヌクレオチド配列であって、配列番号22〜配列番号42から成る群から選択されるアミノ酸配列若しくはその保存的配列バリアント及び/又は配列番号43〜配列番号63から成る群から選択されるアミノ酸配列若しくはその保存的配列バリアント及び/又は配列番号64〜配列番号84から成る群から選択されるアミノ酸配列若しくはその保存的配列バリアントを含む化合物をコードするヌクレオチド配列が提供される。
【００７８】
本明細書に開示された化合物を調製するための方法であって、本発明による核酸を含む宿主細胞に、化合物を発現させる工程;及び化合物を得る工程を含む、方法も提供される。当業者は発現及び取得のための方法を容易に知る。
【００７９】
最後に、CDR1及び/又はCDR2及び/又はCDR3、好ましくは、CDR1及びCDR2、より好ましくは、CDR1、CDR2、及びCDR3を含む抗体であって、CDR1が、配列番号22〜配列番号42又はその保存的配列バリアントから成る群から選択されるアミノ酸配列を有し、CDR2が、配列番号43〜配列番号63又はその保存的配列バリアントから成る群から選択されるアミノ酸配列を有し、CDR3が、配列番号64〜配列番号84又はその保存的配列バリアントから成る群から選択されるアミノ酸配列を有する、抗体も提供される。好ましくは、相補性決定領域CDR1、CDR2、及びCDR3は、表１に示されるVHH番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、18、19、20、21、22、23又は24について示すCDR1、CDR2、及びCDR3それぞれのアミノ酸配列に対して、少なくとも80%、90%、95%又は100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００８０】
抗体は、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、四本鎖抗体(4-chain antibody)又は任意の他のイムノグロブリン分子を含む、任意のタイプの抗体であってよい。抗体は、他の官能基又は非官能基に連結されてよく、例えば、抗体は、二重特異性若しくは多重特異性抗体、及び/又は二価若しくは多価抗体であってよく、例えば、本明細書中、上で開示されたナノ粒子、薬物、ペプチド、核酸等に融合される標識を含んでよい。抗体は、(ヒト)患者の処置において、例えば、癌の処置において使用されうる又はヒトCD1d及び/若しくはヒトCD1dを発現する細胞を結合し、検出するために使用されうる。
【００８１】
配列表に提供された配列番号22〜84が表１に示される配列と異なる場合、表１に示される配列が優先する。
【００８２】
【表１】
2020172550.tif 000002
【００８３】
【表２】
2020172550.tif 000003
【実施例】
【００８４】
免疫化
記述されたとおりに(Roovers RCら、Cancer Immunol Immunother. 2007年;56:303〜17頁)、2頭の個々のラマ(ラマ(Lama glama))を免疫化した。手短に言えば、108個の安定なCD1d導入C1R細胞を、0、14、28及び35日目にs.c.注射した。ファージディスプレイライブラリの構築のために、43日目に150mlの血液を収集した。
【００８５】
CD1d特異的VHHの選択
ファージディスプレイライブラリの構築のために、収集した150mlの血液サンプルから末梢血リンパ球(PBL)を単離した。単離したリンパ球から、cDNAを調製し、重鎖抗体の可変ドメインをコードする遺伝子を増幅するための鋳型として使用した。PCR断片を、pUR8100ファージミドベクターにライゲーションし、E.コリ(E.coli)細胞を形質転換した。この方法で、2つのVHHライブラリーを得て、引き続いて、これをファージで発現させ、選択のために使用した。この目的のために、両ライブラリーからのファージを、CD1d形質導入HeLa細胞とともに4℃で2時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、100mM HClにより4℃で7分、結合したファージを溶出した。次いで、除去したファージをTris-HClで中和し、続いて、E.コリに感染させた。次いで、野生型C1R細胞を使用して4℃で1時間、選択したファージを2回対抗選択し、その後、未結合ファージを、CD1d形質導入C1R細胞とともに1時間、インキュベートした。次いで、結合したファージを溶出し、上記のとおりにE.コリに感染させた。2%グルコース/アンピシリンを含有する寒天プレートに細菌を播種して、VHH DNAをコードする細菌の単一コロニーを形成させた。個々のコロニーからのVHH DNAを、Sfi1/BstEll消化酵素により消化し、Sfi1/BstEllクローニングを可能とするためのHC-Vカセットの付加並びにgenlll配列のC末端myc-及び6x HIS-タグの除去により、pHen1の派生体、プラスミドpMEK219(Hoogenboom HRら、Nucleic Acids Res 1991年;19:4133〜4137頁)にクローニングした。pMEK219-VHHでE.コリTG1細菌を形質転換した。
【００８６】
0.1%グルコース及び100μg/mlアンピリシンを加えた2xTY培地に接種するために、一夜培養物を使用した。OD600に達したら、IPTGを最終濃度1mMで添加した。2〜5時間、タンパク質産生させた。200〜220rpmで激しく振盪しながら、すべての培養の増殖を37℃で実行した。4℃で15分間、培養をスピンすることによってタンパク質産生を停止させた。細菌ペレットをPBSに再懸濁し、-80℃で少なくとも1時間凍結した。細菌懸濁液を融解し、4℃で1時間、わずかに振盪し、4500rpmで30分間スピンした。フローサイトメトリーを使用してCD1d形質導入C1R細胞への結合を確認するために、上清を使用した。
【００８７】
選択したVHHのCD1d特異性
CD1d特異的結合の確認を、C1R及びCD1a、CD1b、CD1c又はCD1dのいずれかを発現するK562細胞を使用するフローサイトメトリーによって評価した。96ウエルプレート中で染色を実行し、FACSバッファー中、4℃で30分間、すべてのインキュベーションを実行した。CD1dの結合の一次スクリーニングのために、抗CD1d VHHを含有する25μlの上清とともに細胞をインキュベートした。洗浄後、最終希釈度1:500の抗mycタグ抗体クローン4A6(Merck Millipore社, MA, USA)とともに細胞をインキュベートし、洗浄し、最終希釈度1:200のヤギ抗マウスF(ab)2 APC(Beckman Coulter社, Fullerton, CA, USA)とともにインキュベートした。最後の洗浄工程後、フローサイトメトリー(FACSFortessa, BD Biosciences社)によって細胞へのVHH結合を評価した。特異的結合を示すVHHを選択した。陽性対照として、抗CD1d 51.1 mAb(eBiosciences社, New Jersey, USA)を使用し、陰性対照として、アゾ染料RR6に特異的なナノボディを使用した。選択した抗CD1d VHHのCD1dへの結合を、精製(以下を参照されたい)及び抗CD1d VHHのシーケンシング後に確認した。これらの実験のために、抗CD1d VHH及び対照を、5μg/mlの濃度で試験した。代表的なデータを図1に示す。
【００８８】
フィンガープリント分析及びシーケンシング
構造的に異なるCD1d特異的なVHHを選択するために、選択されたVHHからのDNAを、コロニーPCRによって増幅し、Hinf1で消化し、引き続いて、2%アガロースゲルにかけた。消化パターンに基づいて、様々なファミリーが選択されうる。次いで、特有のクローンを確認するために個々のファミリーをシーケンシングした(BaseClear B.V.社, Leiden, The Netherlands)。
【００８９】
VHHの産生及び精製
特有の抗CD1d VHHを含有する上清を記載したとおりに生成した。引き続いて、精製のために、洗浄したTalon樹脂(Clontech社, Mountain View、CA、USA)とともにこれらの上清を室温で1時間インキュベートした。Talon樹脂を、PBSで3回、15mM  イミダゾール/PBS、pH7で1回洗浄し、150mM  イミダゾール/PBS、pH7で溶出した。溶出画分をPBSに対して24時間、2回透析した。精製したVHHの濃度をNanodrop(Thermo Fisher Scientific社, Wilmington, DE, USA)における測定によって決定し、クマシー染色したタンパク質ゲルによって純度を確認した。
【００９０】
抗CD1d介在性のmoDC成熟
未成熟の単球由来の樹状細胞(moDC)を記載されたとおりに生成した(Lameris R.ら、Methods Mol Biol, 2014年; 1139: 155〜65頁)。moDCを完全培地(HEPES、10% FCS、0.05mM  ベータ-メルカプトエタノール(β-ME)、100IU/mLのペニシリンナトリウム、100μg/mLの硫酸ストレプトマイシン及び2.0mMのl-グルタミンを含有するRPMI-1640)中、48ウエルプレートにおいて6*104細胞/ウエルの濃度で、5ng/mlのrhIL-4、500U/mlのrhGM-CSF、1000U/mlのrhINF-γ、25μg/mlのポリミキシンB及び500nMの抗-CD1d VHH又は陰性対照VHHの存在下で培養した。LPS(200ng/ml)を陽性対照として使用した。24時間後、(ELISAを使用する)IL-12及びIL-10産生の分析(示さない)のために、上清を採取した。72時間後、細胞を採取し、フローサイトメトリー(FACS Fortessa, BD Biosciences社)を使用してmoDC成熟マーカー(PE標識抗CD86(示さない)、APC標識抗CD83、BD Biosciences社)の発現について分析した。代表的なデータを図2に示す。
【００９１】
抗CD1d VHHによるαGalCer誘導性iNKT活性化の阻害
iNKT細胞を、記載されたとおりに(Lameris R.ら、Methods Mol Biol 2014年; 1139: 155〜65頁)生成した。5*104個のCD1d形質導入HeLa細胞を、96ウエルプレートにおいて、10% FCS、0.05mM  β-ME、100IU/mLのペニシリンナトリウム、100  μg/mLの硫酸ストレプトマイシン、2.0mMのl-グルタミン及び400ng/mlのα-GalCerを含有するDMEM中、37℃で一夜、培養した。次いで、HeLa細胞を洗浄し、500nMの抗CD1d VHH(又は陰性対照VHH)とともに2時間、37℃でインキュベートし、その後、5*104個の休止(25%未満のCD25発現)iNKTを添加した。24時間後、(ELISAを使用する)IFN-γ及びIL-4の検出のために上清を採取した一方、iNKT細胞を採取し、FACSバッファーに再懸濁し、(iNKT細胞における活性化マーカーCD25の発現により評価した(FACS Fortessa, BD Biosciences社))iNKT細胞の活性化の誘導(又は阻害)を検出するためにフローサイトメトリーにより分析した。少なくともVHH24による代表的な結果については、図3及び図7を参照されたい。
【００９２】
抗CD1d VHHによるiNKT細胞活性化の誘導
iNKT細胞を、記載されたとおりに(Lameris R.ら、Methods Mol Biol 2014年; 1139: 155〜65頁)生成した。5*104個のCD1d形質導入HeLa細胞、CD1d形質導入C1R細胞及びCD1d形質導入MM.1s細胞を、37℃において96ウエルプレート中、100ng/mlのα-GalCer又はビヒクル対照の存在下又は非存在下、10% FCS、0.05mM  β-ME、100IU/mLのペニシリンナトリウム、100μg/mLの硫酸ストレプトマイシン、2.0mMのl-グルタミンを含有するDMEM中で一夜、培養した。次いで、α-GalCer又はビヒクル対照を負荷したCD1d形質導入細胞を洗浄し、500nMの抗CD1d VHH(又は陰性対照VHH)とともに2時間、37℃でインキュベートし、その後、5*104個の休止(25%未満のCD25発現) iNKTを添加した。24時間後、(ELISAを使用する)IFN-γ及びIL-4の検出のために上清を採取した一方、iNKT細胞を採取し、FACSバッファーに再懸濁し、(iNKT細胞における活性化マーカーCD25の発現により評価した(FACS Fortessa, BD Biosciences社))iNKT細胞の活性化の誘導を検出するためにフローサイトメトリーにより分析した。VHH12に関するデータを示す代表的な結果については、図4及び図8(濃度依存性)を参照されたい。
【００９３】
抗CD1d VHHによって誘導したアネキシンV結合の分析
CD1d-C1R及びCD1d-MM.1s(並びに陰性対照としての形質導入しないC1R及びMM.1s細胞株)を、37℃で48ウエルプレート中、1ウエルあたり1*105個の細胞で培養し、500nMの抗CD1d VHH、陰性対照VHH又は(陽性対照としての)抗CD1d51.1mAbとともにインキュベートした。24時間後、製造者のプロトコル(VPS Diagnostics社、Hoeven, the Netherlands)に従ってアネキシンV及びヨウ化プロピジウム(PI)によって細胞を染色し、フローサイトメトリー(FACS Fortessa, BD Biosciences社)により分析した。実験結果を図5に示す。
【００９４】
プレート結合CD1d及び抗CD1d VHHによるiNKT細胞活性化の誘導
iNKT細胞を、記載されたとおりに(Lameris R.ら、Methods Mol Biol 2014年; 1139: 155〜65頁)生成した。α-GalCer(1mM)又はビヒクル対照(100%DMSO)を、80℃で2分間加熱し、5分間超音波処理し、引き続いて、滅菌した温かい(37℃)0.1%トライトン（登録商標）-Xで100μMの濃度に希釈した。次に、6μMのβ2m-ヒトCD1dに融合した抗EGFR VHHから成る二重特異性構築物を、1:1の割合で添加した。α-GalCer及びβ2m-CD1d-抗EGFR構築物の最終濃度は、それぞれ、50μM及び3μMであった。ビヒクル及びα-GalCerを、振盪しながら、室温で一夜インキュベートした。96ウエルプレートを抗flag mAb(Sigma社、クローンM2;1:1000)でコーティングし、4℃で一夜インキュベートした。翌日、抗flagコーティングしたプレートを、PBSで2回洗浄し、PBSで希釈したα-GalCer又はビヒクルを負荷した構築物(構築物濃度0.5μM)とともに、振盪しながら室温で2時間インキュベートした。PBSで洗浄後、コーティングしたプレートを、250nMの抗CD1d VHHとともに37℃で2時間インキュベートし、その後、1*105個の休止(25%未満のCD25発現)iNKT細胞を添加した。24時間後、iNKT細胞を採取し、FACSバッファーに再懸濁し、(iNKT細胞における活性化マーカーCD25の発現により評価した(FACS Fortessa, BD Biosciences社))iNKT細胞の活性化の誘導を評価するためにフローサイトメトリーにより分析した。結果を図6に表す。
【００９５】
VHH12
上で示すデータに加えて、VHH12を使用して追加実験を行った。実験の結果を図9、図10及び図11に示す。図9は、iNKT細胞脱顆粒の誘導(左)及びCD1d+腫瘍細胞株に対する細胞傷害性(右)を示す。図10は、CD1d+初代多発性骨髄腫細胞に対するiNKT細胞の細胞傷害性の誘導を示す。図11は、抗CD1d VHH12によるiNKT細胞サイトカイン産生の誘導を示す。サイトカイン産生の検出のために、HeLa-CD1d細胞を、ビヒクル対照、OCH(アルファ-ガラクトシルセラミド(アルファ-GC)のスフィンゴシン切断型誘導体;iNKT細胞においてTh2-サイトカイン産生を誘導することが報告された糖脂質)又はαGCでパルスし、抗CD1d VHH及び対照とともにインキュベートし、iNKTとともに24時間共培養し、その後、(Cytometric Bead Assay;CBAにより)上清を分析した。N=4; *p<0,05; ****p<0,0001。示す抗CD1d VHHは、VHH12である。
【００９６】
結果
多様な実験の代表的な結果を図面及び付随する説明文に示し;追加実験データを本発明の関連において上で論じた。
【図１】
2020172550.tif 000004
【図２】
2020172550.tif 000005
【図３】
2020172550.tif 000006
【図４】
2020172550.tif 000007
【図５】
2020172550.tif 000008
【図６】
2020172550.tif 000009
【図７】
2020172550.tif 000010
【図８】
2020172550.tif 000011
【図９】
2020172550.tif 000012
【図１０】
2020172550.tif 000013
【図１１】
2020172550.tif 000014
【配列表】
2020172550000001.app
【外国語明細書】
2020172550000001.pdf