(57)【要約】【課題】異なる電気活動特性を有する細胞集団同士の電気生理学的な相互作用を評価することができるインビトロで細胞を評価する方法を提供する。【解決手段】インビトロで細胞を評価する方法は、互いに離間して配置され、神経突起を介して互いに連結された複数の細胞集団において、少なくとも２つの細胞集団の電気活動をそれぞれ測定することを含み、電気活動を測定される前記少なくとも２つ細胞集団のうち少なくとも１つは、少なくとも１種の神経細胞を含む細胞集団であり、前記少なくとも２つの細胞集団は、電気活動が測定される時点において互いに異なる電気活動特性を示す。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで細胞を評価する方法であって、
互いに離間して配置され、神経突起を介して互いに連結された複数の細胞集団において、少なくとも２つの細胞集団の電気活動をそれぞれ測定することを含み、
電気活動を測定される前記少なくとも２つ細胞集団のうち少なくとも１つは、少なくとも１種の神経細胞を含む細胞集団であり、
前記少なくとも２つの細胞集団は、電気活動が測定される時点において互いに異なる電気活動特性を示す、評価方法。
【請求項２】
前記細胞集団は、電気活動が測定される時点において、電気活動特性として、発火頻度、発火振幅、発火パターン、バースト頻度、バースト振幅、バーストパターン、バースト周期性、振動周波数、振動振幅及び振動位相からなる群から選択される少なくとも１つが互いに異なる、請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
前記神経細胞は、幹細胞から分化誘導されたものである、請求項１又は２に記載の評価方法。
【請求項４】
前記複数の細胞集団は、全て幹細胞に由来するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項５】
前記幹細胞は、人工多能性幹細胞である、請求項３又は４に記載の評価方法。
【請求項６】
前記少なくとも２つの細胞集団は、全て神経細胞を含む細胞集団である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項７】
前記電気活動の測定は、電極を用いて行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項８】
前記少なくとも２つの細胞集団の少なくとも１つに任意の剤を添加することを更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項９】
前記電気活動の測定結果に基づいて、細胞集団に対する候補剤の作用を評価することを更に含む、請求項８に記載の評価方法。
【請求項１０】
前記神経突起を切断することを更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項１１】
インビトロで細胞を評価するために用いる細胞基板であって、
細胞の電気活動を検出する複数の電極を有する基板と、
異なる前記電極上に、平面視で互いに離間して配置された複数の細胞集団と、
を備え、
前記複数の細胞集団のうち少なくとも２つの細胞集団は、神経突起を介して互いに連結されており、
前記少なくとも２つの細胞集団のうち少なくとも１つの細胞集団は、少なくとも１種の神経細胞を含み、
前記少なくとも２つの細胞集団は、互いに異なる電気活動特性を示す、細胞基板。
【請求項１２】
細胞基板の製造方法であって、
複数の電極を有する基板の異なる前記電極上に、平面視で互いに離間するように、複数の細胞集団をそれぞれ配置すること、及び
前記複数の細胞集団のうち少なくとも２つの細胞集団の間を、神経突起を介して互いに連結させること、を含み、
前記少なくとも２つの細胞集団は、互いに異なる電気活動特性を示し、
前記少なくとも２つの細胞集団のうち、少なくとも１つの細胞集団は、少なくとも１種の神経細胞を含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビトロで細胞を評価する方法、細胞基板、及び細胞基板の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳は、複数種類の神経細胞が集団で領域を形成し、複雑に相互作用している構造を持つ生体組織である。脳の各領域において興奮性及び抑制性の神経細胞が適切なバランスで配置され、それらの接続構造であるシナプスを介して情報伝達を可能にする回路網が形成されることで、脳は機能する。神経伝達機序をインビトロで再現し、神経発達や神経疾患の研究及び薬物の作用を評価するスクリーニング等を可能にするために、神経細胞の培養物を用いて神経回路網を生成させ、細胞の電気的活動の変化を測定する手法が用いられることが既に知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
非特許文献１には、微小電極アレイ上の２つの区画に、胎児ラット由来の海馬から得られた初代細胞を播種し、それぞれの区画に播種された細胞集団の集団バースト及びネットワークバーストを観察したことが記載されている。
非特許文献２は、脳損傷を処置するための補綴具として脳組織内の信号伝達を代替するブリッジングシステムを提案するものである。その原理実証試験として、離れた領域に配置した神経細胞を含む２つの細胞集団を神経突起で接続した際に観察される同期発火を、神経接続を物理的に切断することで阻害したモデルにおいて、ブリッジングシステムにより再度同期が確認されたことが開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来の神経細胞の培養物では、多種類の細胞が空間的な配置の制御が行われずに混在した状態であるため、当該培養物中において神経回路網の接続もまたランダムに行われ、培養物中の異なる性質を有する神経細胞同士がどのようにお互いに影響しているかを評価することができない。
【０００５】
本発明は、異なる電気活動特性を有する細胞集団同士の電気生理学的な相互作用を評価することができるインビトロで細胞を評価する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
インビトロで細胞を評価する方法は、互いに離間して配置され、神経突起を介して互いに連結された複数の細胞集団において、少なくとも２つの細胞集団の電気活動をそれぞれ測定することを含み、電気活動を測定される前記少なくとも２つ細胞集団のうち少なくとも１つは、少なくとも１種の神経細胞を含む細胞集団であり、前記少なくとも２つの細胞集団は、電気活動が測定される時点において互いに異なる電気活動特性を示す。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、異なる電気活動特性を有する細胞集団同士を連結した簡易な脳回路モデルを用いて、細胞集団同士の電気生理学的な相互作用を評価することができる方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の第１実施形態に係る細胞基板を示す平面図である。
【図２】図１に示すＩＩ−ＩＩ線で切断した細胞基板を示す断面図である。
【図３】本発明の第２実施形態に係る細胞基板を示す平面図である。
【図４】実施例１における試験フローを示す図である。
【図５】実施例１における各細胞集団の発火パターンを示すラスタープロットである。
【図６】実施例１における神経突起を介した結合が形成された各細胞集団の発火パターンを示すラスタープロットである。
【図７】実施例１における神経突起を介した結合を切断した各細胞集団の発火パターンを示すラスタープロットである。
【図８】実施例２における神経突起を介した結合が形成された各細胞集団の発火パターンを示すラスタープロットである。
【図９】実施例２における神経突起を介した結合を切断した各細胞集団の発火パターンを示すラスタープロットである。
【図１０】実施例３における神経突起を介した結合が形成された各細胞集団の発火パターンを示すラスタープロットである。
【図１１】実施例３における神経突起を介した結合を切断した各細胞集団の発火パターンを示すラスタープロットである。
【図１２】実施例３における神経突起切断後の試験のフローを示す図である。
【図１３】実施例３における神経突起を介した結合を切断し、８日後に回路が再形成した様子を示す顕微鏡画像である。
【図１４】実施例３における神経突起を介した結合を切断し、培養３日後の各細胞集団の発火パターンを示すラスタープロットである。
【図１５】実施例３における神経突起を介した結合を切断し、培養８日後の各細胞集団の発火パターンを示すラスタープロットである。
【図１６】実施例４における各細胞集団の発火パターンを示すラスタープロットである。
【図１７】実施例４における神経突起を介した結合が形成された各細胞集団の発火パターンを示すラスタープロットである。
【図１８】実施例４における神経突起を介した結合が形成された各細胞集団の薬剤処理後の発火パターンを示すラスタープロットである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の一実施形態に係る評価方法、評価システム及び細胞基板の製造方法について、必要に応じて特定の実施形態及び図面を参照して説明する。かかる実施形態及び図面は、本発明の理解を容易にするための一例に過ぎず、本発明を限定するものではない。すなわち、以下に説明する部材の形状、寸法、配置等については、本発明の趣旨を逸脱することなく、変更、改良され得るとともに、本発明にはその等価物が含まれる。
また、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、重複する説明は適宜省略する。
【００１０】
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
【００１１】
＜評価方法＞
本発明の評価方法は、インビトロで細胞を評価する方法であり、互いに異なる電気活動特性を有し、神経突起により連結された少なくとも２以上の細胞集団の電気活動を測定することを含む方法である。本発明の評価方法によれば、異なる電気活動特性を有する細胞集団同士がどのように影響し合っているのか、或いは、外部からの刺激に対する感受性にどのような影響を及ぼすのか等、異なる電気活動特性を有する細胞集団同士の電気生理学的な相互作用を評価することができる。
【００１２】
本明細書において、「細胞集団」とは、２個以上の細胞を含む細胞の集まりであり、例えば、平面的に細胞同士が集まった状態のものであってもよく、３次元的に細胞同士が接着して構成された細胞塊であってもよい。また、単一種の細胞により形成されていてもよいし、複数種の細胞が含まれていてもよい。また、細胞集団は、集団として特定の電気活動特性を示す。
【００１３】
本明細書において、「電気活動特性」とは、細胞の活動に伴って示される電気化学的活動に関する性質を意味し、例えば細胞の自発発火の発火頻度、発火振幅、発火パターン、細胞集団の同期バーストのバースト頻度、バースト振幅、バーストパターン、バースト周期性、神経振動の振動周波数、振動振幅、振動位相、細胞内のナトリウムイオン、カルシウムイオン等のカチオン濃度及びその変化パターン等が挙げられる。ここでいう「発火」とは、１回の瞬間的な活動電位の変化を意味し、「バースト」とは、連続的な発火状態を意味し、単一の発火よりマクロで見た場合のパターンである。複数の細胞集団の自発発火が全体的に同期して起こることを同期バーストという。また、「神経振動」とは、バーストと非バーストの繰り返しパターンを意味する。電気活動特性は、単一の特性だけを観察してもよいが、近年では複数の特性（パラメータ）を同時に計測し、多変量解析等を用いて特徴づけを行うこともあり、このような複数の特性の組み合わせによる特徴も本発明の「電気活動特性」に包含される。測定の簡便さの点で、電極を用いて測定可能な電気化学的特性が好ましく、細胞の自発発火の発火頻度、発火振幅、発火パターン、細胞集団の同期バーストのバースト頻度、バースト振幅、バーストパターン、バースト周期性、神経振動の振動周波数、振動振幅及び振動位相からなる群から選択される少なくとも１つが異なる細胞集団を用いることが好ましい。ここでいう「バーストパターン」とは、バーストの波形パターン、「バースト周期性」とは、バーストの周期的規則性をそれぞれ意味する。
細胞又は細胞集団の電気活動特性は、公知の電気生理学的手法を用いて測定することができる。かかる電気生理学的手法としては、これに限定するものではないが、例えば多電極アレイ等の電極を用いて局所的な電場電位を測定する方法、パッチクランプ法等により直接的に活動電位を測定する方法、膜電位感受性色素等を用いて膜電位の変化を測定する方法、カルシウムイメージング法等のカチオン変動を測定する方法等が挙げられる。膜電位感受性色素としては、例えば、カルシウムキレーター及び蛍光団からなるカルシウム感受性色素、styryl系化合物、cyanine系及びoxonol系化合物、rhodamine誘導体等が挙げられる。また、「電気活動が測定される時点において互いに異なる電気活動特性を示す」とは、２以上の細胞集団において同一の手法により電気活動特性を計測した場合に、それぞれ異なる結果を示すことを意味する。典型的には、例えば２以上の細胞集団に含まれる細胞の種類がそれぞれ異なる、比率がそれぞれ異なる、などの場合に、細胞集団が互いに異なる電気活動特性を示すこと等が挙げられる。
【００１４】
本発明の評価方法は、上述のとおり細胞集団の電気活動を測定することを含んでいる。電気活動の測定は、少なくとも２つの細胞集団に対して行われ、例えば２つ、３つ、４つ５つ以上等の細胞集団に対して行ってもよい。これらの細胞集団は、平面視で互いに離間して配置されている。電気活動が測定される少なくとも２つの細胞集団は、神経突起（軸索）を介して互いに連結されている。ここでいう「神経突起を介して互いに連結されている」とは、ある細胞集団から別の細胞集団に対して、神経突起を介してシグナルが伝達されることを意味し、典型的には同期的な発火やバーストが観察される。電気活動が測定される細胞集団が３つ以上である場合、神経突起を介した連結は、ある細胞集団において生じたシグナルが、全ての細胞集団に伝達される限り特に制限されず、直列的な連結であっても並列的な連結であってもよい。例えば並列的に、それぞれの細胞集団が別個独立して互いに連結しあっていてもよく、全ての細胞集団が直列的に連結していてもよく、それらが混在していてもよい。
【００１５】
細胞集団の離間距離は、神経突起を介した連結が達成される限り特に限定されないが、１００μｍ以上が好ましい。離間距離が前記下限値以上であることで、細胞集団同士の各活動電位が混同せず、より精度が高く測定することができる。一方、距離の上限は、神経突起が伸長できる距離を考慮すると、例えば、３ｃｍ程度とすることができる。典型的には、１００μｍ以上１ｃｍ以下程度が好ましい。
【００１６】
本明細書において、「電気活動を測定する」とは、細胞活動に伴う上記の電気活動特性の経時的変化を測定することを意味する。少なくとも２以上の、神経突起を介して互いに連結された細胞集団の電気活動を測定することにより、それらの細胞集団がどのようにシグナルをやり取りしているのか、ひいてはそれぞれの細胞集団が組織的にどのように連携しているのか、等を評価することができる。電気活動の測定は、電気活動の評価が可能な程度の間、行われればよく、また複数回行われてもよい。本発明の一態様において、電気活動は、試験の間、継続的に測定される。
【００１７】
電気活動が測定される細胞集団のうち、少なくとも１つの細胞集団には、神経細胞が含まれている。神経細胞としては、例えば末梢神経と中枢神経に大別することもできる。末梢神経としては、例えば、感覚神経細胞、運動神経細胞、自律神経細胞が挙げられる。中枢神経としては、例えば、介在神経細胞、投射ニューロンが挙げられる。投射ニューロンとしては、例えば、皮質ニューロン、海馬ニューロン、扁桃体ニューロン等が挙げられる。また、中枢神経細胞は、興奮性ニューロンと抑制性ニューロンとに大別することもできる。中枢神経系で主に興奮性伝達を担うグルタミン酸作動性ニューロン、主に抑制性伝達を担うＧＡＢＡ（γ-aminobutyric acid）作動性ニューロン等が挙げられる。その他神経調節物質を放出するニューロンとして、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、ノルアドレナリン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、ヒスタミン作動性ニューロン等が挙げられる。
【００１８】
神経細胞が含まれる少なくとも１つの細胞集団以外の他の細胞集団には、前記神経細胞が含まれる少なくとも１つの細胞集団と神経突起を介して連結し、該少なくとも１つの細胞集団からの伝達シグナルを受信可能な細胞が含まれる。かかる伝達シグナルを受信可能な細胞としては、例えば神経細胞、筋細胞等が挙げられる。筋細胞としては、例えば、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。これら細胞を１種単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。前記他の細胞集団に含まれる伝達シグナルを受信可能な細胞としては、評価系全体でネットワークを構築できるという観点から、神経細胞であることが好ましい。すなわち、全ての細胞集団が神経突起を介して相互にシグナルをやり取り可能となることから、評価系の全ての細胞集団に神経細胞が含まれることが好ましい。
【００１９】
これらの細胞集団に含まれる細胞は、初代培養細胞であってもよく、継代培養細胞であってもよく、株化された細胞であってもよく、不死化細胞であってもよく、各種遺伝子編集を施した細胞であってもよい。また、所望の細胞を多く含む細胞集団を得やすいという観点から、幹細胞から分化誘導された細胞が好ましい。幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯血由来幹細胞、神経幹細胞等が挙げられる。人工多能性幹細胞としては、例えば、核移植胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。間葉系幹細胞としては、例えば、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞等が挙げられる。中でも、幹細胞としては、ｉＰＳ細胞が好ましい。ｉＰＳ細胞は健常者由来のものであってもよく、各種神経系の疾患を有する患者由来のものであってもよい。また、各種遺伝子編集が施されたものであってもよく、例えば、遺伝子編集を施し各種神経系の疾患の原因又はリスク因子となる遺伝子を持つものであってもよい。ｉＰＳ細胞が各種神経系の疾患を有する患者由来の細胞である場合には、当該神経系の疾患モデルを構築するために利用することができる。神経系の疾患としては、特別に限定されないが、例えば、神経変性疾患、自閉症、てんかん、注意欠陥−多動性障害（Attention-deficit hyperactivity disorder；ＡＤＨＤ）、統合失調症、双極性障害等が挙げられる。神経変性疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症等が挙げられる。
【００２０】
細胞の由来となる動物種としては、限定されるものではないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等が挙げられる。中でも、哺乳動物が好ましく、ヒトが特に好ましい。
【００２１】
細胞集団に含まれる細胞は、上述のとおり生体から採取されたものであってもよく、株化され培養されたものであってもよく、幹細胞から分化誘導されたものであってもよい。細胞集団としては、上記のとおり得られた細胞をそのまま用いてもよく、さらに他の細胞を混合して形成してもよい。所望の特性を有する細胞集団を得やすいという観点から、細胞集団は幹細胞に由来するもの、すなわち幹細胞を分化誘導して得られる細胞集団であることが好ましい。本実施形態の評価方法に用いる場合、所望の評価系を構築しやすいという観点から、全ての細胞集団が幹細胞に由来するものであることが好ましい。
【００２２】
電気活動が測定される少なくとも２つの細胞集団は、電気活動が測定される時点において、その電気活動特性が異なっている。すなわち、本来的に電気活動特性の異なる細胞集団であってもよく、もともと同一の電気活動活性を示す細胞集団であったものが、例えば電気活動特性に影響する剤（例えばＮＭＤＡ受容体阻害剤等）の添加や、別の細胞集団からの神経突起を介した連絡等により、電気活動特性が変化した結果、異なる電気活動特性を有するようになったものであってもよい。かかる電気活動特性の変化は、少なくとも２つの細胞集団の電気活動を測定する時点までに達成されていればよい。電気活動特性に影響する剤は、単一の化合物であっても複数の化合物の組み合わせであってもよい。
【００２３】
上述のとおり、従前は１つの細胞集団内におけるランダムな神経回路網の接続による同期バーストが観察できていたのみであり、神経細胞に作用する剤の正確な評価等はできなかった。すなわち、実際の脳組織内では、シグナル下流での電気活動の変化がシグナル上流に作用するフィードバック等、様々な神経回路が複雑に構築されているため、単純に１つの細胞集団における電気活動を確認しただけでは、細胞やそれに作用する剤の正確な評価は出来なかった。本実施形態の評価方法によれば、複数の異なる細胞集団による同期的効果やフィードバック効果等の影響も評価できるため、従来よりも正確に細胞やそれに作用する剤の評価が可能となる。
【００２４】
本発明の一態様において、電気活動の測定は電極を用いて行われる。電気活動を直接的に且つ簡便に計測可能であるため、電極を用いることが好ましい。かかる電極としては、例えば多点平面電極（ＭＥＡ）等の局所的な電場電位を測定することが可能な電極の他、微小ガラス電極等の細胞の活動電位を直接計測可能な電極も用いることができる。かかる電極を用いた態様については、具体例とともに細胞基板についての項目で詳述する。
【００２５】
本実施形態の評価方法は、評価系を構築した状態での同期バースト等を確認することにより、各細胞集団の性質や細胞集団同士の相関関係等を評価することができる。例えば神経突起を介して連結された、任意の細胞集団Ａ及びＢのバーストを観察した場合に、細胞集団Ａにおいて自発的なバースト以外に、細胞集団Ｂの自発的バーストと同期したバーストが確認できた場合、細胞集団Ａは細胞集団Ｂからの伝達シグナルを受信していると評価できる。またこの場合に、細胞集団Ｂにおいて細胞集団Ａの自発的バーストと同期したバーストが確認できない場合、細胞集団Ｂは細胞集団Ａの上流にある集団であり、フィードバック的な投射を受けていないと評価できる。
【００２６】
本発明の評価方法の好ましい一態様において、神経細胞に作用すると推測される剤（本開示において「候補剤」と称する）を、電気活動を計測される細胞集団に添加することを含む。候補剤が添加された結果、電気活動に何らかの変化が生じた場合、かかる候補剤は神経細胞に作用するものであると判断できる。このことにより、神経細胞に作用する候補剤を効率的に選抜することが可能となる。したがって本発明の一態様において、候補剤の細胞集団（又はそこに存在する神経細胞）に対する作用を評価することを含み、さらなる一態様において、かかる評価に基づいて効果的な候補剤をスクリーニングすることが包含される。すなわち、本発明には、本発明の評価方法を用いた候補剤のスクリーニング方法が包含される。なお、本発明の評価方法の詳細については、具体例とともに細胞基板の項目において詳述する。
【００２７】
本発明の一態様において、少なくとも２つの細胞集団において電気活動を測定した後、かかる細胞集団を連結する神経突起の少なくとも１つを切断することを含む。いったん神経突起が切断されると再連結は起こらないため、電気活動の測定は少なくとも１回必ず切断前に行われる。切断後に電気活動を測定した細胞集団における電気活動の変化を測定することにより、かかる神経突起を介した連絡がどのように集団に作用していたかを評価することができる。また、神経突起が切断された評価系において上記の候補剤の効果を確認することにより、外傷性脳損傷等のモデルとして候補剤の評価を行うことができる。
【００２８】
＜細胞基板＞
本発明の細胞基板は、特にインビトロで細胞を評価するために用いることができる。以下に、本発明の細胞基板について、実施形態の具体例を用いて詳述する。また、本実施形態の評価方法の詳細については、以下に示すインビトロで細胞を評価する系の使用方法において具体的に説明する。
【００２９】
［第１実施形態］
図１〜２は、本発明の第１実施形態に係る細胞基板を示す図である。図１は、本発明の第１実施形態に係る細胞基板１００を示す平面図である。図２は、図１に示すＩＩ−ＩＩ線で切断した細胞基板１００の断面図である。
【００３０】
細胞基板１００は、複数の検出部３を有する基板５と、異なる検出部上３に、平面視で互いに離間して配置された第１細胞集団１０及び第２細胞集団２０と、を備える。基板５上には、培地４が満たされている。第１細胞集団１０と第２細胞集団２０とは、異なる電気活動特性を示し、神経突起１ａを介して結合を形成している。本実施形態の評価方法では、上記構成を有する細胞基板を用いることで、異なる電気活動特性を有する細胞集団同士の電気生理学的な相互作用を評価することができる。
【００３１】
図２に示すように、第１細胞集団１０は、基板５に埋め込まれた検出部３ａ、３ｂ及び３ｃ上に配置されている。第１細胞集団１０は１以上の検出部３上に配置されていればよいが、２以上の検出部３上に配置されていることが好ましい。これにより、第１細胞集団１０に含まれる複数の細胞の活動電位変化により生じる電場電位をそれぞれの検出部３において検出することができ、得られた電場電位の平均値を算出することで、より精度の高い電場電位のデータを得ることができる。
【００３２】
（第１細胞集団）
第１細胞集団１０は、１細胞以上の神経細胞１を含む神経細胞集団である。第１細胞集団１０は、集団として特定の電気活動特性を示すものであれば、神経細胞１のみからなる細胞集団であってもよく、神経細胞１と該神経細胞１以外の細胞との混合細胞からなる細胞集団であってもよい。また、第１細胞集団１０が神経細胞１のみからなる細胞集団である場合に、１種の神経細胞１からなる細胞集団であってもよく、２種以上の神経細胞１の混合細胞からなる細胞集団であってもよい。
【００３３】
神経細胞集団中の神経細胞の含有量は、特に制限はないが、通常、神経細胞中の全細胞数に対して１％以上、５％以上が好ましく、２０％以上がより好ましく、４０％以上がさらに好ましく、８０％以上が特に好ましい。
【００３４】
神経細胞１としては、上述した神経細胞を用いることができる。
【００３５】
第１細胞集団１０に含まれる神経細胞１以外の細胞としては、例えば、グリア細胞等が挙げられる。グリア細胞は、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、上衣細胞、シュワン細胞等に大別される。
【００３６】
第１細胞集団１０に含まれる細胞の由来となる動物種としては、上述の動物種を用い得る。
【００３７】
（第２細胞集団）
第２細胞集団２０は、神経細胞１と電気信号を伝達し合う細胞２（以下、単に「細胞２」と称する場合がある）を１細胞以上含む細胞集団である。
第２細胞集団２０は、外部からの刺激に応答して、同期的な活動電位を示すものであれば、細胞２のみからなる細胞集団であってもよく、細胞２と該細胞２以外の細胞との混合細胞からなる細胞集団であってもよい。また、第２細胞集団２０が細胞２のみからなる細胞集団である場合に、１種の細胞２からなる細胞集団であってもよく、２種以上の細胞２の混合細胞からなる細胞集団であってもよい。
【００３８】
第２細胞集団中の細胞２の含有量は、特に制限はないが、通常、神経細胞中の全細胞数に対して１％以上、５％以上が好ましく、２０％以上がより好ましく、４０％以上がさらに好ましい。
【００３９】
細胞２としては、例えば、神経細胞、筋細胞等が挙げられる。筋細胞としては、例えば、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。これら細胞を１種単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００４０】
第２細胞集団２０に含まれる細胞２以外の細胞としては、例えば、上記グリア細胞の他、線維芽細胞、血管内皮細胞等の心臓及び筋組織に含まれる筋細胞以外の細胞等が挙げられる。
【００４１】
第２細胞集団２０に含まれる細胞は、上記第１細胞集団１０において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００４２】
第２細胞集団２０に含まれる細胞の由来となる動物種としては、上記第１細胞集団１０において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００４３】
（培地）
培地４としては、第１細胞集団１０及び第２細胞集団２０に含まれる細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地であればよく、細胞の種類により適宜選択することができる。例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）等の基礎培地に必要成分を添加したもの等が挙げられるが、これらに限定されない。神経細胞の培養において用いられる培地として市販されている培地を用いてもよく、かかる培地としては、例えば、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｐｌｕｓ（共にＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が挙げられる。
【００４４】
（検出部）
検出部３は、第１細胞集団１０及び第２細胞集団２０に含まれる各細胞の活動電位変化により生じる電場電位を検出するように構成されている。なお、ここでいう「検出する」には、電場電位の発生を検出することや、電場電位の変化の具体的な周波数、振幅及び位相を検出することが包含される。検出部３は、基板５内に検出部３の表面が露出し、各細胞集団と接するように埋め込まれていてもよく、基板５上に配置されていてもよい。
【００４５】
検出部３の数は、２個以上であればよく、例えば、４個、８個、１６個、３２個、６４個等とすることができる。
【００４６】
検出部３として具体的には、例えば、電極が挙げられる。検出部３が電極であることで、細胞集団が生じる電場電位の周波数、振幅及び位相の経時的な変化を検出することができる。
【００４７】
（基板）
基板５は、検出部３を有する。検出部３（特に電極）を有する基板５として具体的には、例えば、多点電極アレイ（Multi-Electrode Array；MEA）等が挙げられる。また、基板５は、第１細胞集団１０及び第２細胞集団２０を維持培養するために、培地４を保持できるように構成されていることが好ましく、例えば、ウェル内にＭＥＡが配置された培養容器等が挙げられる。培養容器の形状は１つのウェルを有するディッシュ型であってもよく、複数のウェルを有するマルチウェルプレート型であってもよい。
【００４８】
基板５は、細胞への毒性がなければどのような材料で構成されていてもよいが、弾性材料や、ガラス、セラミック、ステンレス鋼等の金属材料等が好ましい。弾性材料としては、例えば、シクロオレフィン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート等）、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート（ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等）、ポリビニル等の合成樹脂；ＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）等のシリコン系樹脂；ＥＰＤＭ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ Ｄｉｅｎｅ Ｍｏｎｏｍｅｒ）等の合成ゴム；天然ゴム等が挙げられる。
基板５には、これら材料を１種単独又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００４９】
［第２実施形態］
図３は、本発明の第２実施形態に係る細胞基板２００を示す平面図である。図３に示す細胞基板２００は、第１細胞集団及び第２細胞集団に加えて、第３細胞集団及び第４集団を含む４つの細胞集団を備える点で図１〜２に示す細胞基板１００と異なる。細胞基板２００では、４つの細胞集団を備えることで、より複雑な神経突起を介した結合を構築することができ、４つの細胞集団間での電気生理学的な相互作用を評価することができる。
【００５０】
（第３細胞集団及び第４細胞集団）
第３細胞集団３０及び第４細胞集団４０は、第１細胞集団１０及び第２細胞集団２０が配置された検出部３以外の検出部３上に、平面視で第１細胞集団１０及び第２細胞集団２０と離間して配置されている。
第３細胞集団３０及び第４細胞集団４０は、外部からの刺激に応答して、同期的な活動電位を示す細胞集団である。第３細胞集団３０及び第４細胞集団４０は、第１細胞集団１０又は第２細胞集団２０と同一の細胞からなる細胞集団であってもよく、第１細胞集団１０及び第２細胞集団２０のいずれとも異なる細胞からなる細胞集団であってもよい。第３細胞集団３０及び第４細胞集団４０は、第１細胞集団１０及び第２細胞集団２０のうち少なくともいずれか一方の細胞集団と神経突起を介した結合を形成することができ、図３に示すように、第１細胞集団１０と第３細胞集団３０とが神経突起１ａ及び２ｂを介した結合を形成しており、第２細胞集団２０と第４細胞集団４０とが神経突起２ａ及び２ｃを介した結合を形成していてもよい。また、第３細胞集団３０及び第４細胞集団４０が、神経突起２ｂ及び２ｃを介した結合を形成していてもよい。
【００５１】
第３細胞集団３０及び第４細胞集団４０に含まれる細胞としては、上記第１細胞集団１０及び上記第２細胞集団２０において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００５２】
細胞基板は、図１〜３に示すものに限定されず、本発明の効果を損なわない範囲内において、図１〜３に示すものの一部の構成が変更又は削除されたものや、これまでに説明したものにさらに他の構成が追加されたものであってもよい。
【００５３】
例えば、図１〜２に示す細胞基板１００において、第２細胞集団２０は、神経細胞１とは異なる種類の神経細胞を１細胞以上含む細胞集団であってもよい。第２細胞集団２０に含まれる神経細胞としては、上記第１細胞集団１０において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００５４】
例えば、図３に示す細胞基板２００において、細胞集団の数は４に限定されず、５以上の複数の細胞集団を備えていてもよい。
【００５５】
＜細胞基板の製造方法＞
細胞基板は、例えば、以下に示す方法により製造することができる。
まず、検出部（電極等）を有する基板上に、複数の細胞集団を配置する領域の間に仕切り部材を配置する。このとき、各細胞集団を基板上の一定の領域内に留めるために、各細胞集団をそれぞれ囲うように、枠部材を配置してもよい。仕切り部材及び枠部材を構成する材料としては、細胞への毒性がなければどのような材料で構成されていてもよく、基板５の材料として例示されたものと同様のものが挙げられる。また、細胞集団としては、上記において詳述された細胞集団を用いることができる。
【００５６】
次いで、当該仕切り部材を挟んで、複数の細胞集団が平面視で互いに離間するように配置する。或いは、枠部材がさらに配置された基板を用いる場合には、当該枠部材で囲われた領域内に各細胞集団がそれぞれ収まるように配置する。
【００５７】
細胞集団の配置方法としては、細胞集団を培地や緩衝液と混合した細胞懸濁液を調製し、当該細胞懸濁液を、マイクロピペッターを用いて播種する方法や、配置面積が１０ｍｍ２以下等の狭い領域である場合には、上記細胞懸濁液をインクジェットバイオプリンタを用いて播種する方法等が挙げられる。特に高精度のバイオプリンタを用いて播種する場合、仕切り部材等がなくても、狭い離間距離で、各細胞集団を離間して配置することが可能となるため好ましい。
【００５８】
各細胞集団を配置後、基板上に各細胞集団が接着するまで、培養する。培養条件としては、例えば、１０時間以上４８時間以下程度の一定期間、３７℃、５%ＣＯ２濃度等の通常の細胞培養条件下で培養することができる。また、培養時に使用する培地についても、細胞の種類に応じて適宜選択することができ、上記細胞基板において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００５９】
各細胞集団に含まれる細胞が基板上に接着したことを確認した後、前記仕切り部材（及び前記枠部材）を除去して、培養する。培養条件として、５日間以上６０日間以下程度、例えば、１８日間以上２８日間以下の一定期間、３７℃、５%ＣＯ２濃度等の通常の細胞培養条件下で培養することができる。上記一定期間培養することで、第１細胞集団１０と第２細胞集団２０との間に、神経突起を介した結合を形成させることができる。
【００６０】
細胞集団に含まれる細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である場合には、公知の方法を用いて、ｉＰＳ細胞を各種細胞に分化させた後、使用することができる。ｉＰＳ細胞から各種細胞への分化誘導には、市販の分化誘導キット、例えば、Ｅｌｉｘｉｒｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製の分化誘導キット（具体的には、ドーパミン作動性神経細胞、コリン作動性神経細胞、グルタミン酸作動性神経細胞及びセロトニン作動性神経細胞の混合培養物分化誘導キット；コリン作動性神経細胞分化誘導キット；ドーパミン作動性神経細胞分化誘導キット；ＧＡＢＡ作動性神経細胞分化誘導キット；骨格筋細胞分化誘導キット）等を用いることができる。また、市販のｉＰＳ細胞由来の分化誘導神経細胞を用いてもよい。
【００６１】
ｉＰＳ細胞から分化誘導された各種細胞は、細胞種に特異的なバイオマーカーを検出することで、所望の細胞に分化誘導されたことを確認することができる。例えば、成熟した神経細胞である場合には、例えば、Ｄｃｘ、ＭＡＰ−２、シナプシン１、ＴｕＪ１、ＮＳＥ、Ｍａｐ２ａ、Ｇａｐ４３、ＮＦ、ＣＤ２４、ＣＤＨ２／ＣＤ３２５、シナプトフィジン、及びＣＤ５６／ＮＣＡＭからなる群より選ばれる少なくとも１種のマーカーを発現していることに基づいて、成熟した神経細胞と同定することができる。
【００６２】
また、神経細胞は、軸索及び樹状突起を有する形態であることや、活動電位を発生することからも同定することができる。
【００６３】
特定の種類の神経細胞であることは、ドーパミン作動性ニューロン（ＴＨ、ＡａＤＣ、Ｄａｔ、Ｏｔｘ−２、ＦｏｘＡ２、ＬＭＸ１Ａ及びＶＭＡＴ２からなる群より選ばれる少なくとも１種のマーカー）、コリン作動性ニューロン（ＮＧＦ及びＣｈＡＴからなる群より選ばれる少なくとも１種のマーカー）、ＧＡＢＡ作動性ニューロン（ＧＡＤ６７及びｖＧＡＴからなる群より選ばれる少なくとも１種のマーカー）、グルタミン酸作動性ニューロン（ｖＧＬＵＴ１）、セロトニン作動性ニューロン、運動ニューロン（ＨＢ９、ＳＭＮ、ＣｈＡＴ及びＮＫＸ６からなる群より選ばれる少なくとも１種のマーカー）、感覚ニューロン（ＰＯＵ４Ｆ１及びペリフェリンからなる群より選ばれる少なくとも１種のマーカー）、アストロサイト（ＧＦＡＰ及びＴａｐａ１からなる群より選ばれる少なくとも１種のマーカー）、並びに、オリゴデンドロサイト（Ｏ１、Ｏ４、ＣＮＰアーゼ（ＣＮＰａｓｅ）、及びＭＢＰからなる群より選ばれる少なくとも１種のマーカー）に特徴的な表現型マーカーをそれらが発現しているか否かに基づいて同定することができる。
【００６４】
特定の神経伝達物質に対する感受性を有する神経細胞であることは、神経伝達物質の生合成、放出、及び再取り込みに関わる受容体及び酵素を有すること、並びにシナプス伝達に関連する脱分極及び再分極事象に関わるイオンチャネルを有することに基づいて同定することができる。シナプス形成は、シナプトフィジンの染色によって確認することができる。特定の神経伝達物質の受容性は、例えば、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、グルタミン酸、ドーパミン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、ノルアドレナリン、アセチルコリン、及びセロトニンの受容体を検出することによって確認することができる。
【００６５】
細胞基板に用いられる細胞集団の電気活動特性は、細胞集団に含まれる細胞の活動電位や細胞集団が呈する同期バースト等を、公知の電気生理学的手法を用いて測定することで確認することができる。具体的には、後述する実施例に示すように、ＭＥＡを備える基板上に第１細胞集団１０及び第２細胞集団２０をそれぞれ配置し、例えば、ＭＥＤ６４システム（株式会社ＳＣＲＥＥＮホールディングス製）、Ｍａｅｓｔｒｏ  ＭＥＡ（Ａｘｉｏｎ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社製）、ＭＥＡ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ製）等のＭＥＡシステムを用いて、活動電位を５分間程度測定することで確認することができる。
【００６６】
＜評価系を用いた評価方法＞
上記細胞基板は、インビトロで細胞を評価する系（以下、単に「評価系」と称する場合がある）として利用することもできる。
【００６７】
［使用方法］
本実施形態の評価系の使用方法について、以下に説明する。
例えば、本発明の第１実施形態に係る細胞基板１００を用いる場合には、第１細胞集団１０と前記第２細胞集団２０との活動電位を検出部３で検出し、検出部３から配線６ａ、６ｂ、６ｃ、７ａ、７ｂ及び７ｃを介して測定部（図示せず）に活動電位のデータを送信し、解析する。各細胞集団の活動電位の測定結果から、第１細胞集団１０及び第２細胞集団２０の活動電位の周期、振幅及び位相からなる群より選ばれる１つ以上が部分的に又は全体的に同期しているか否かを確認することで、第１細胞集団１０と第２細胞集団２０と間の電気生理学的な相互作用の有無を判断することができる。
【００６８】
例えば、後述する実施例に示すように、第１細胞集団１０及び第２細胞集団２０の活動電位の一部の発火パターンが同期した場合には、神経突起を介した結合により第１細胞集団１０と第２細胞集団２０と間の電気生理学的な相互作用があると判断することができる。
【００６９】
さらに、形成された結合を、医療用メス等を用いて人為的に切断し、切断後における第１細胞集団１０及び第２細胞集団２０の活動電位を測定することで、各細胞集団の電気活動を評価することもできる。
例えば、後述する実施例に示すように、切断後における第１細胞集団１０及び第２細胞集団２０の電気活動特性が、神経突起を介した結合の形成前と同様に、互いに異なる電気活動特性に戻った場合には、上記活動電位の一部の発火パターンの同期は、当該結合の形成に基づくものであると判断することができる。
【００７０】
例えば、本発明の第２実施形態に係る細胞基板２００を用いる場合には、第１細胞集団１０、第２細胞集団２０、第３細胞集団３０、及び第４細胞集団４０の活動電位を検出部３で検出し、検出部３から配線を介して測定部に活動電位のデータを送信し、解析する。これにより、複雑な細胞基板内において個々の細胞集団がいずれの細胞集団に影響を受ける又は及ぼすのか、或いは、影響を受けない又は及ぼさないのか、について判断することができる。
【００７１】
さらに、上記細胞基板１００を用いた場合と同様に、形成された結合のうち１以上の結合を切断し、切断後の各細胞集団の活動電位を測定することで、各細胞集団の電気活動を評価することもできる。このとき、各細胞集団間の結合を全て切断してもよく、所望の細胞集団間においてのみ部分的に結合を切断してもよく、所望の順番で細胞集団間の結合を順次切断してもよい。
【００７２】
本実施形態の評価方法及び評価系は、軸索誘導、神経変性障害、神経細胞の可塑性、神経細胞の学習及び記憶等の神経の発達や障害の細胞学的及び分子学的な基礎研究において非常に有用である。
【００７３】
また、本実施形態の評価方法及び評価系は、任意の化合物の評価に用いることもできる。具体的には、複数の細胞集団のうち１以上の細胞集団に任意の化合物を添加した後、各細胞集団の活動電位を測定する。これにより、任意の化合物の各細胞集団に対する影響、具体的には、任意の化合物の神経回路網の活性化能や同期発火を変化させる能力、化合物の毒性を評価することができる。また、当該評価に基づいて、任意の化合物が特定の疾患の治療に有用である可能性があるか否かについて判断することができる。
【００７４】
例えば、後述する実施例に示すように、神経突起を介した結合が形成された興奮性ニューロンを多く含む第１細胞集団及び抑制性ニューロンを多く含む第２細胞集団に、任意の化合物を曝露した場合に、第１細胞集団の活動電位の発火パターンが第２細胞集団に完全に同期した場合には、当該化合物が神経細胞の同期発火を抑制する能力を有するものであると判断することができる。また、当該判断に基づいて、上記化合物は、同期発火が過多である疾患（例えば、てんかん、自閉症、統合失調症等）の治療に有用な可能性があると判断することができる。このように、本実施形態の評価方法及び評価系は、化合物のスクリーニングに好適に用いられる。
【００７５】
例えば、本発明は、以下の態様を含む。
（１）  インビトロで細胞を評価する方法であって、互いに離間して配置され、神経突起を介して互いに連結された複数の細胞集団において、少なくとも２つの細胞集団の電気活動をそれぞれ測定することを含み、電気活動を測定される前記少なくとも２つ細胞集団のうち少なくとも１つは、少なくとも１種の神経細胞を含む細胞集団であり、前記少なくとも２つの細胞集団は、電気活動が測定される時点において互いに異なる電気活動特性を示す、評価方法。
（２）  前記細胞集団は、電気活動が測定される時点において、電気活動特性として、発火頻度、発火振幅、発火パターン、バースト頻度、バースト振幅、バーストパターン、バースト周期性、振動周波数、振動振幅及び振動位相からなる群から選択される少なくとも１つが互いに異なる、（１）に記載の評価方法。
（３）  前記神経細胞は、幹細胞から分化誘導されたものである、（１）又は（２）に記載の評価方法。
（４）  前記複数の細胞集団は、全て幹細胞に由来するものである、（１）〜（３）のいずれか一つに記載の評価方法。
（５）  前記幹細胞は、人工多能性幹細胞である、（３）又は（４）に記載の評価方法。（６）  前記少なくとも２つの細胞集団は、全て神経細胞を含む細胞集団である、（１）〜（５）のいずれか一つに記載の評価方法。
（７）  前記電気活動の測定は、電極を用いて行われる、（１）〜（６）のいずれか一つに記載の評価方法。
（８）  前記少なくとも２つの細胞集団の少なくとも１つに任意の剤を添加することを更に含む、（１）〜（７）のいずれか一つに記載の評価方法。
（９）  前記電気活動の測定結果に基づいて、細胞集団に対する候補剤の作用を評価することを更に含む、（８）に記載の評価方法。
（１０）  前記神経突起を切断することを更に含む、（１）〜（９）のいずれか一つに記載の評価方法。
（１１）  インビトロで細胞を評価するために用いる細胞基板であって、細胞の電気活動を検出する複数の電極を有する基板と、異なる前記電極上に、平面視で互いに離間して配置された複数の細胞集団と、を備え、前記複数の細胞集団のうち少なくとも２つの細胞集団は、神経突起を介して互いに連結されており、前記少なくとも２つの細胞集団のうち少なくとも１つの細胞集団は、少なくとも１種の神経細胞を含み、前記少なくとも２つの細胞集団は、互いに異なる電気活動特性を示す、細胞基板。
（１２）  細胞基板の製造方法であって、複数の電極を有する基板の異なる前記電極上に、平面視で互いに離間するように、複数の細胞集団をそれぞれ配置すること、及び前記複数の細胞集団のうち少なくとも２つの細胞集団の間を、神経突起を介して互いに連結させること、を含み、前記少なくとも２つの細胞集団は、互いに異なる電気活動特性を示し、前記少なくとも２つの細胞集団のうち、少なくとも１つの細胞集団は、少なくとも１種の神経細胞を含む、製造方法。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７７】
［実施例１］
（異なる電気活動特性を有する２つの細胞集団を含む細胞基板を用いたインビトロ評価系の構築）
１．細胞の準備
Elixirgen Scientific社が市販している２種類の凍結iPS細胞由来神経細胞（GABAergic Neurons from Healthy DonorとMixed Neurons from Healthy Donor）を培地に懸濁し、予め０．０５％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；シグマ製）及び８０μｇ／ｍＬのラミニン溶液（シグマ製）でコーティングしておいた多点電極アレイ（ＭＥＡ；株式会社ＳＣＲＥＥＮホールディングス）の電極を含む基板上に播種した。培養３週間目以降に回路網の形成により神経細胞の同期的な発火が誘発されることを確認した。興奮性の細胞をより多く含み、短い周期の同期的な発火を示すものを細胞集団Ａ、抑制性細胞を多く含み、長い周期の同期的な発火を示すものを細胞集団Ｂとした。
【００７８】
２．細胞の配置
図４は実施例１における試験のフローを示す図である。まず、細胞集団Ａ（１０）を含む領域と細胞集団Ｂ（２０）を含む領域とを区切るように、ジメチルポリシロキサン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｏｌｙｓｉｌｏｘａｎｅ；ＰＤＭＳ）からなる仕切り部材８ａ及び８ｂ、並びに枠部材９ａ及び９ｂを張り付けた基板５を準備した。次いで、当該基板５上に、「１．」で得られた電気生理学的な挙動が異なる細胞集団Ａ（１０）及び細胞集団Ｂ（２０）をそれぞれ含む２種類の細胞懸濁液を、これら細胞集団が混ざらないように、枠部材９ａ及び９ｂで囲われた各領域に播種した。領域の面積が１０ｍｍ２超と広い場合には、マイクロピペットを用いて各細胞懸濁液を播種した。面積が１０ｍｍ２以下と狭い場合には手技では困難なため、細胞吐出用のインクジェットバイオプリンタを用いて各細胞懸濁液を播種した。
【００７９】
細胞が基板５に接着したことを確認し、培養１日後にＰＤＭＳの仕切り部材８ａ及び８ｂ、並びに枠部材９ａ及び９ｂを剥がして除去して、培養を継続した。細胞集団Ａ（１０）及び細胞集団Ｂ（２０）に含まれる細胞体はそれぞれ領域内に留まったまま、神経突起を伸ばし１週間以上２週間以下の期間で互いの領域が接続された回路網が形成した。
【００８０】
３．活動電位の測定
細胞集団Ａ及び細胞集団Ｂが、神経突起を介して接続された状態（神経回路網が形成された状態）で４週間培養し、電極から検出できる活動電位をＭＥＤ６４システム（株式会社ＳＣＲＥＥＮホールディングス）で５分間測定した。電気波形の解析はMED64システムに付属のソフトウェアBurstScopeで行った。同期した発火パターンを可視化するラスタープロットを図６に示す。また、単独で基板に播種して培養した各細胞集団の発火パターンを可視化するラスタープロットを図５に示す。
【００８１】
図５及び図６から、細胞集団Ａ及び細胞集団Ｂのそれぞれに神経回路の成熟を示す同期した発火が誘発されているのが示された。更に、細胞集団Ａ及び細胞集団Ｂの間にも互いの発火が同期していることが示された。短い発火周期の細胞集団Ａの一部の発火が、細胞集団Ｂに影響されて、細胞集団Ｂの発火頻度の頂点に同期する傾向があり、それらの合間に細胞集団Ｂにはない短い周期の発火が追加発生する位相となった。
【００８２】
次いで、細胞集団Ａ及び細胞集団Ｂの間の同期が、伸長した神経突起の接続によるものであることを確認するために、マイクロマニピュレーターに取りつけたメス（フェザー安全剃刀株式会社）で神経突起を図４に示すように切断した。切断後、３０分間、ＣＯ２インキュベーターで培養し、安定させてから、活動電位の再測定を行った。結果を図７に示す。
【００８３】
図７から、切断後には細胞集団Ａ及び細胞集団Ｂの間は同期しなくなり、細胞集団Ａは短い発火周期、細胞集団Ｂは長い発火周期の規則的なパターンに戻ることが示された。
【００８４】
［実施例２］
（細胞基板を用いた薬剤の評価）
１．細胞基板の準備
実施例１と同様の方法を用いて、基板上に細胞集団Ａ及び細胞集団Ｂが互いに離間して配置された細胞基板を準備した。
【００８５】
２．薬剤処理
細胞集団Ａ及び細胞集団Ｂが、神経突起を介して接続された状態（神経回路網が形成された状態）で興奮性のＮＭＤＡ受容体を選択的に阻害するＤ−（−）−２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸（Ｄ−ＡＰ５）を、最終濃度１０μＭになるように培地に加えた。１０分間、３７℃のＣＯ２インキュベーターで静置した。
【００８６】
３．活動電位の測定
「２．」の薬剤処理後の各細胞集団について、電極から検出できる活動電位をＭＥＤ６４システムで５分間測定した。結果を図８に示す。
【００８７】
図８から、細胞集団Ａの発火パターンについて、短い周期の発火が消え、細胞集団Ｂと全く同じ周期とピークの形態で同期した発火パターンとなった。
【００８８】
次いで、細胞集団Ａ及び細胞集団Ｂの間の神経突起を図４に示すように切断した。切断後、１０分間ＣＯ２インキュベーターで培養し、安定させてから、活動電位の再測定を行った。結果を図９に示す。
【００８９】
図９から、細胞集団Ｂのパターンは変わらないが、細胞集団Ａの同期発火の周期が大幅に延長し、細胞集団Ａの方がＤ−ＡＰ５による神経伝達の阻害に敏感に反応することが分かった。この結果から、細胞集団Ａは、細胞集団Ｂの影響下にあるかないかで、薬物への反応性が大きく異なることが分かった。
以上のことから、異なる電気活動特性を有する２以上の細胞集団が同一基板に配置されている本評価方法を用いることで、複雑な薬物の作用を評価できることが示された。
【００９０】
［実施例３］
（細胞基板を用いた神経回路の切断後の回路修復の評価）
１．細胞基板の準備
細胞集団ＡはElixirgen Scientific社が市販している凍結iPS細胞由来神経細胞（Cholinergic Neurons from Healthy Donor）を用い、細胞集団Ｂは実施例１と同じもの（GABAergic Neurons from Healthy Donor）を用いる以外は、実施例１と同様の方法を用いて、基板上に細胞集団Ａ及び細胞集団Ｂが互いに離間して配置された細胞基板を準備した。
【００９１】
２．活動電位の測定
実施例１と同様の方法を用いて、培養６週目において、細胞集団Ａ及び細胞集団Ｂが、神経突起を介して接続された状態で、電極から検出できる活動電位を５分間測定した。同期した発火パターンを可視化するラスタープロットを図１０に示す。細胞集団Ｂが短い発火周期の細胞集団Ａの頂点に同期する傾向が得られた。
【００９２】
３．神経突起の切断
次いで、実施例１と同様の方法を用いて、細胞集団Ａ及び細胞集団Ｂの間の神経突起を切断した。切断後の翌日に測定した活動電位の結果を図１１に示す。切断後には細胞集団Ａ及び細胞集団Ｂの間は同期しなくなり、細胞集団Ａは短い発火周期、細胞集団Ｂは長い発火周期の規則的なパターンに戻ることが示された。
【００９３】
４．切断後の回路修復の評価
図１２に実施例３における神経突起切断後の試験のフローを示す。
細胞集団Ａ及び細胞集団Ｂの間の神経突起が切断された状態で３７℃のＣＯ２インキュベーターで静置し、培養を続けた。培養１日後、３日後、８日後で顕微鏡観察と活動電位の測定を行った。
【００９４】
図１３に神経突起を切断した直後の細胞基板を２００ｘ倍率の位相差顕微鏡で観察した画像と、その後８日間培養した後に観察した画像の比較を示す。培養８日後には神経突起の伸長と一部神経細胞の遊走により、切断部位が修復されていることが確認できた。
【００９５】
活動電位を培養３日後および８日後に測定した結果のラスタープロットをそれぞれ図１４および１５に示す。培養３日後では細胞集団Ａ及び細胞集団Ｂの間は同期しておらず、細胞集団Ａは短い発火周期、細胞集団Ｂは長い発火周期の規則的なパターンのままであるが、培養８日後には実施例１の初期回路形成時と同様に、短い発火周期の細胞集団Ａの一部の発火が、細胞集団Ｂに影響されて、細胞集団Ｂの発火頻度の頂点に同期する傾向があり、それらの合間に細胞集団Ｂにはない短い周期の発火が追加発生する位相となった。また、細胞集団Ｂも細胞集団Ａに影響され、短い周期の発火を追加発生し、それらの一部が細胞集団Ａの発火頻度の頂点に同期することが確認できた。
【００９６】
以上のことから、神経突起を切断した後に十分な期間培養することにより、異なる電気活動特性を有する細胞集団が双方に影響され、回路の再形成と共に発火周期を再度同期することが確認できた。
また、本評価方法を用いることで、突起切断による神経回路ダメージの修復が評価できることが示された。
【００９７】
［実施例４］
（抑制性のGABA作動性神経を有する細胞集団を含む細胞基板を用いたインビトロ評価系の構築および細胞基板を用いた薬剤の評価）
１．細胞基板の準備
細胞集団ＡはCellular Dynamics International社が市販している凍結iPS細胞由来神経細胞（iCell GABANeurons）を用い、細胞集団Ｂは実施例１と同じもの（GABAergic Neurons from Healthy Donor）を用いる以外は、実施例１と同様の方法を用いて、基板上に細胞集団Ａ及び細胞集団Ｂが互いに離間して配置された細胞基板を準備した。
【００９８】
２．活動電位の測定
実施例１と同様の方法を用いて、培養４週目において、細胞集団Ａ及び細胞集団Ｂが、神経突起を介して接続された状態で、電極から検出できる活動電位を５分間測定した。同期した発火パターンを可視化するラスタープロットを図１７に示す。また、単独で基板に播種して培養した各細胞集団の発火パターンを可視化するラスタープロットを図１６に示す。
【００９９】
図１６から、単独で培養した場合には、多くの抑制性細胞で構成された集団細胞Ａは、自発発火するが同期性が全くなく、細胞集団Ｂは実施例１と同様に神経回路の成熟を示す同期した発火が誘発されているのが示された。
【０１００】
図１７から、神経突起を介して接続された状態では、細胞集団Ａが細胞集団Ｂに影響されて、細胞集団Ｂの発火頻度の頂点に同期する傾向が得られた。
【０１０１】
３．薬剤処理
細胞集団Ａ及び細胞集団Ｂが、神経線維神経突起を介して接続された状態（神経回路網が形成された状態）で抑制性のＧＡＢＡＡ受容体を選択的に阻害するピクロトキシン（ＰＴＸ）を、最終濃度３０μＭになるように培地に加えた。１０分間、３７℃のＣＯ２インキュベーターで静置した。
【０１０２】
４．活動電位の測定
上記「３．」の薬剤処理後の各細胞集団について、電極から検出できる活動電位をＭＥＤ６４システムで５分間測定した。結果を図１８に示す。
【０１０３】
図１８から、細胞集団Ａと細胞集団Ｂは同期したまま、薬剤処理前とは著しく周期の短い同期発火パターンとなった。
【０１０４】
以上のことから、同一基板に配置されている２以上の細胞集団のうち、一つ以上の集団が抑制性の神経細胞で形成されている場合にも、神経突起を介して接続された集団の影響で同期した発火パターンを示し、薬剤を用いて抑制性の受容体に作用することで発火パターンを変動させられることが示された。
【符号の説明】
【０１０５】
１：神経細胞
１ａ、２ａ、２ｂ、２ｃ：神経突起
２：神経細胞と電気信号を伝達し合う細胞
３、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ：検出部（電極）
４：培地
５：基板（培養容器）
６ａ、６ｂ、６ｃ、７ａ、７ｂ、７ｃ：配線
８ａ、８ｂ：仕切り部材
９ａ、９ｂ：枠部材
１０：第１細胞集団（細胞集団Ａ）
２０：第２細胞集団（細胞集団Ｂ）
３０：第３細胞集団
４０：第４細胞集団
１００：細胞基板
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１０６】
【特許文献１】特表２０１７−５２８１２７号公報
【非特許文献】
【０１０７】
【非特許文献１】Bisio M. et al., “Emergence of Bursting Activity in Connected Neuronal Sub-Populations.”, PLoS ONE 9(9): e107400, 2014
【非特許文献２】Chiappalone M., “Progress in Neuroengineering for brain repair: from in vitro to in vivo studies and beyond.”, CNS Models and Translational Strategies, Invited lecture, at CHI’s 3rd WPC Europe, Lisbon (Portugal), November 27-30 2018.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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