(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト乳癌のＣＮＳへの転移性播種の処置方法の提供。【解決手段】中枢神経系送達のため配合される少なくとも１つのＡＡＶベクターを含んでなる組成物が記述される。該組成物は、そのための発現制御配列に作動可能に連結されている脳への送達のための抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物をコードする配列を含有する少なくとも１つの発現カセットおよび製薬学的に許容できる担体を含んでなる。該抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物は、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する低下された親和性を有するか若しくは測定可能な親和性を有しないように改変されている免疫グロブリンでありうる。とりわけ脳の原発および／若しくは転移癌のための製薬学的組成物の製造におけるこれら構築物の使用方法および抗悪性腫瘍レジメンにおけるそれらの使用もまた提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢神経系送達のため配合される少なくとも１つのＡＡＶベクターを含んでなる組成物であって、前記組成物が、そのための発現制御配列に作動可能に連結されている脳への送達のための抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物をコードする配列を含有する少なくとも１つの発現カセットおよび製薬学的に許容できる担体を含んでなる、上記組成物。
【請求項２】
抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物が、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する低下された親和性を有するか若しくは測定可能な親和性を有しないように改変されている免疫グロブリンを含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物が、増大されたＡＤＣＣ活性を有するように改変されている免疫グロブリンを含んでなる、請求項１若しくは請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
免疫グロブリン構築物が、位置Ｙ４３６（配列番号２５のａａ４５９）、Ｓ２５４（配列番号２５のａａ２７７）、Ｉ２５３（配列番号２５のａａ２７６）および／若しくはＨ４３５（配列番号２５のａａ４５８）の１種若しくはそれ以上で改変されている、請求項２若しくは請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物が、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、イムノアドヘシン若しくは一本鎖可変フラグメント抗体から選択される、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項６】
免疫グロブリン構築物が原発若しくは転移ＣＮＳ癌に向けられる、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項７】
免疫グロブリンが、トラスツズマブ、２１２−Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブ若しくはペルツズマブよりなる群から選択される抗Ｈｅｒ２抗体である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
トラスツズマブの重鎖をコードする配列が、配列番号１のｎｔ６１−１４１０の核酸配列若しくはそれに最低９０％同一の配列を有する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
トラスツズマブの軽鎖をコードする配列が、配列番号１のｎｔ２０７０−２７１１に示される核酸配列若しくはそれに最低９０％同一の配列を有する、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも１つのＡＡＶベクターがＡＡＶ９、ＡＡＶ  ｒｈ１０若しくはＡＡＶ  ｈｕ３７キャプシドを有する、請求項１ないし９のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１１】
組成物が最低２種の異なる抗体発現カセットを含んでなるＡＡＶを含んでなる、請求項１ないし１０のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１２】
組成物が単一抗体発現カセットを含んでなる、請求項１ないし１０のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１３】
ＦｃＲｎについての破壊された結合を有する抗Ｈｅｒ２重鎖を含んでなる、ＡＡ９キャプシドを有しかつ抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ抗体若しくはその機能的フラグメントをコードする発現カセットをその中にパッケージングしているＡＡＶウイルスベクターを含んでなる組
成物。
【請求項１４】
脳中の腫瘍の増殖を遅らせる方法であって、前記方法が請求項１ないし１３のいずれか１つに記載の組成物をそれの必要な被験体に投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１５】
前記組成物がくも膜下腔内に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が血液脳関門の化学的若しくは物理的破壊の非存在下で投与される、請求項１４若しくは１５に記載の方法。
【請求項１７】
脳中の転移乳癌の処置方法であって、前記方法が請求項１ないし１３のいずれか１つに記載の組成物をそれの必要な被験体に投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１８】
前記組成物がくも膜下腔内に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が血液脳関門の化学的若しくは物理的破壊の非存在下で投与される、請求項１７若しくは１８に記載の方法。
【請求項２０】
生物学的製剤、小分子、抗悪性腫瘍薬、放射線および／若しくは化学療法剤と組合せの請求項１ないし１３のいずれかに記載の組成物を投与することを含んでなる抗悪性腫瘍レジメン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［電子的形態で提出された資料の引用することによる組み込み］
出願人は、電子的形態で提出される配列表資料を引用することにより本明細書に組み込む。本ファイルは「１４−７０２８ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と表示される。
【背景技術】
【０００２】
脳転移は、そのための処置の選択肢がほとんどなくかつ不十分である乳癌の普遍的かつ破壊的な続発症である。乳癌患者の６〜１６％が中枢神経系（ＣＮＳ）転移を発症する。これらの患者は診断の時から２０％の１年および１．３％の５年の生存率中央値を有する。非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４。脳転移の外科的切除はしばしば実現不可能であり、そして化学療法剤は血液脳関門（ＢＢＢ）によりＣＮＳからほとんど排除される［非特許文献５］。乳癌脳転移を処置するための代替療法が必要とされる。
【０００３】
ＨＥＲ２受容体チロシンキナーゼを過剰発現する乳癌はＣＮＳに転移する高い傾向を有し、そして全乳癌症例の２５〜３０％を構成する［非特許文献６］。トラスツズマブ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））はＨＥＲ２に向けられた第一選択の治療的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり；この抗体はＨＥＲ２陽性疾患を伴う患者の生存を有意に改善することが報告されている［非特許文献７；非特許文献８］。しかしながら、ｍＡｂはＢＢＢを横断しないため、トラスツズマブから利益を得る患者は、しばしばＣＮＳ疾患の同時の進行を経験する。［上に引用される非特許文献５］。トラスツズマブをＣＮＳ中に直接注入することは安全であることが判明しており、そして髄膜癌腫症を伴う患者へのトラスツズマブのくも膜下腔内投与は全生存を２から１３．５か月に増大させることが報告されている［非特許文献９］。軟膜癌腫症は無傷よりはむしろ障害された血液脳関門を伴う。非特許文献１０は、循環する微小気泡と組合せられた集束超音波バースト（ｆｏｃｕｓｅｄ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｂｕｒｓｔ）がトラスツズマブに対し血液脳関門および血液腫瘍関門の双方を一時的に透過性にし得ることを報告する。
【０００４】
現在の治療法は全身性疾患の改良された制御に至った一方、ヒト乳癌のＣＮＳへの転移性播種の処置は大きな治療上の課題である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ＤｉＳｔｅｆａｎｏ  Ａら、Ｃａｎｃｅｒ．１９７９；４４：１９１３−１９１８
【非特許文献２】Ｔａｋａｋｕｒａ  Ｋら、Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｏｋｙｏ：Ｉｇａｋｕ−Ｓｈｏｉｎ、１９８２
【非特許文献３】Ｈａｌｌ  ＷＡら、Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ．Ｍｅｄ  Ｏｎｃｏｌ．２０００  Ｎｏｖ；１７（４）：２７９−８６
【非特許文献４】Ｐｉｅｎｋｏｗｓｋｉ  Ｔ、Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ  ＣＣ．Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ＣＮＳ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１０  Ｍａｙ；２１（５）：９１７−２４
【非特許文献５】Ｎａｋａｙａｍａ  Ａら、Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＴＡＫ−２８５，ａｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ，Ｎｏｎ−Ｐｇｐ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  Ｒａｔ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｔｕｍｏｒｓ，ａｎｄ  ｉｎ  ａｎ  ＨＥＲ２−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂｒａｉｎ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｍｏｄｅｌ、Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１３  Ａｕｇ  １６；４（７）
【非特許文献６】Ｂｅｎｄｅｌｌ  ＪＣら、Ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｉｎ  ｗｏｍｅｎ  ｗｈｏ  ｒｅｃｅｉｖｅ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ．２００３  Ｊｕｎ  １５；９７（１２）：２９７２−７
【非特許文献７】Ｌｉｎ  ＮＵら、Ｂｒａｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ：ｔｈｅ  ＨＥＲ２  ｐａｒａｄｉｇｍ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７  Ｍａｒ  １５；１３（６）：１６４８−５５
【非特許文献８】Ｐａｌｍｉｅｒｉ  Ｄら、Ｈｅｒ−２  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７  Ｍａｙ  １；６７（９）：４１９０−８
【非特許文献９】Ｚａｇｏｕｒｉ  Ｆら、Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｎｉｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ＨＥＲ２−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｐｏｏｌｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ．２０１３  Ｍａｙ；１３９（１）：１３−２２
【非特許文献１０】Ｐａｒｋ，Ｅ−Ｊら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１６３（２０１２）、２７７−２８４
【発明の概要】
【０００６】
中枢神経系への送達のため配合されている少なくとも１つのＡＡＶベクターを含んでなる抗悪性腫瘍組成物が提供され、ここで前記組成物は、そのための発現制御配列に作動可能に連結されているＣＮＳへの送達のための抗悪性腫瘍免疫グロブリン産物をコードする配列を含有する最低１個の発現カセットおよび製薬学的に許容できる担体を含んでなる。一例において、該抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物は胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する低下された親和性を有するか若しくは測定可能な親和性を有しないように改変されている免疫グロブリンを含んでなる。適しては、本組成物は、脳中の腫瘍の増殖を遅らせることにおける使用ならびに／または腫瘍サイズを低下させるためおよび／若しくは被験体の無増悪生存を増大させるために有効である。
【０００７】
一局面において、本明細書で提供されるところの組成物は、ＡＡＶ９キャプシドを有し、かつ、ＦｃＲｎに対する破壊された結合を有する抗Ｈｅｒ２重鎖を含んでなる抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ抗体若しくはその機能的フラグメントをコードする発現カセットをその中にパッケージングさせている、ＡＡＶウイルスベクターを含んでなる。
【０００８】
別の局面において、本明細書に記述されるところの組成物を中枢神経系に例えばくも膜下腔内に投与することを必要とする、脳中の腫瘍の増殖を遅らせる方法が提供される。一局面において、該組成物は血液脳関門の化学的若しくは物理的破壊の非存在下で投与される。
【０００９】
なお別の局面において、本発明は、本明細書に記述されるところの組成物をそれの必要な被験体に投与することによる脳中の腫瘍の処置方法を提供する。
【００１０】
なお別の局面において、本発明は、抗体若しくは他の生物学的製剤、小分子抗悪性腫瘍薬、放射線および／または化学療法剤と組合せの本明細書に記述されるところの組成物を投与することを含んでなる、抗悪性腫瘍レジメンを提供する。
【００１１】
本発明のなお他の局面および利点は本発明の以下の詳細な記述から容易に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】配列の上の配列表の番号付け［配列番号２５］および配列の下の慣習的なＥｕ（ＩＭＧＴ）の番号付けを伴うトラスツズマブのポリペプチドの重鎖のアミノ酸配列を提供する。
【図２】１×１０11  ＧＣ  ＩＣＶのＡＡＶ９．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ若しくはＡＡＶ９．２０１ＩＡを予防的に与えられ、その後ベクター投与２１日後にＢＴ４７４−Ｍ１．ｆｆｌｕｃ腫瘍細胞を脳中に移植されたマウスの生存曲線を提供する。２０１ＩＡ群（偽似処置）の生存中央値は６６日であることが示される一方、ＡＡＶ９．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂで処置された群の生存中央値は９９日で、生存率の３３％増加である。
【００１３】
［発明の詳細な記述］
本明細書に記述される組成物およびレジメンは抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物の中枢神経系への送達に有用である。ＡＡＶ−Ｉｇを含んでなる本明細書に記述される組成物は、中枢神経系（ＣＮＳ）の癌（腫瘍）および具体的には脳中に位置するものに十分に適する。
【００１４】
本明細書で使用されるところの「ＣＮＳ腫瘍」という用語は、脳（頭蓋内）、髄膜（脳および脊髄を覆う結合組織層）若しくは脊髄中に位置しうる原発若しくは転移癌を包含する。原発ＣＮＳ癌の例は、とりわけ、神経膠腫（膠芽腫（多形神経膠芽腫としてもまた知られる）、星状細胞腫、乏突起神経膠腫および上衣腫ならびに混合膠腫を包含しうる）、髄膜腫、髄芽腫、神経腫、ならびに原発ＣＮＳリンパ腫（脳、脊髄若しくは髄膜中の）であり得る。転移癌の例は、別の組織若しくは器官例えば乳房、肺、リンパ腫、白血病、黒色腫（皮膚癌）、結腸、腎、前立腺から発するもの若しくは脳に転移する他の種類を包含する。
【００１５】
本明細書で使用されるところの「抗悪性腫瘍」免疫グロブリン構築物（本明細書で定義されるところの抗体若しくは抗体フラグメントを包含する）は、癌細胞若しくは充実性腫瘍上に位置する細胞表面抗原若しくは受容体に結合しかつ腫瘍若しくは非充実型腫瘍中の悪性細胞の増殖および拡散を阻害若しくは予防しそして場合によっては腫瘍のサイズを低下させる、ポリペプチドに基づく部分をコードする。抗悪性腫瘍免疫グロブリンポリペプチドは、多数の機序、例えば、増殖因子受容体を阻害すること、細胞周期を制御するシグナルを送達するための細胞膜抗原に架橋結合すること、血管新生を阻害すること、化学療法後のＤＮＡ修復を阻害すること、若しくはなお細胞死を誘発することにより腫瘍細胞増殖を阻害することにより、機能し得る。あるいは、それらは抗体依存性および補体媒介性細胞傷害のような宿主の免疫エフェクター機能を活性化することにより間接的に腫瘍増殖に影響し得る。一態様において、本明細書に記述される組成物およびレジメンの抗悪性腫瘍効果は、処置されない若しくは他のレジメンで処置される被験体に比較した腫瘍サイズの低減および／若しくは増大された無増悪生存率により評価し得る。
【００１６】
「免疫グロブリン」という用語は、抗体、その機能的フラグメントおよびイムノアドヘシンを包含するように本明細書で使用される。抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、細胞内抗体（「イントラボディ（ｉｎｔｒ
ａｏｂｏｄｉｅｓ）」、組換え抗体、多特異性抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2、Ｆ（
ａｂ）3、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）2のような抗体フラグメント、一本鎖可変フラグメント抗体（ｓｃＦｖ）、タンデム／ビスｓｃＦｖ、Ｆｃ、ｐＦｃ’、ｓｃＦｖＦｃ（若しくはｓｃＦｖ−Ｆｃ）、ジスルフィドＦｖ（ｄｓｆｖ）、ＢｉＴＥ抗体のような二特異性抗体（ｂｃ−ｓｃＦｖ）；ラクダ科動物の（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体、表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）抗体、ヒト化抗体、完全にヒトの抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ＮＡＮＯＢＯＲＹ（登録商標）としてもまた知られる）、キメラ抗体、最低１個のヒト定常領域を含んでなるキメラ抗体などを包含する多様な形態で存在しうる。「抗体フラグメント」は、その標的例えば腫瘍細胞に結合する免疫グロブリンの可変領域の少なくとも一部分を指す。
【００１７】
タンパク質若しくは核酸に関して使用される場合の「異種の」という用語は、該タンパク質若しくは核酸が、天然に相互に対し同一の関係で見出されない２種若しくはそれ以上の配列若しくは下位配列を含んでなることを示す。例えば、核酸は典型的に組換えで製造され、新たな機能的核酸を作成するように配置されている無関係の遺伝子からの２若しくはそれ以上の配列を有する。例えば、一態様において、核酸は異なる遺伝子からのコーディング配列の発現を指図するよう配置されている１遺伝子からのプロモーターを有する。従って、該コーディング配列に関して該プロモーターは異種である。
【００１８】
本明細書で使用されるところの「発現カセット」は、免疫グロブリン遺伝子（１個若しくは複数）（例えば、免疫グロブリン可変領域、免疫グロブリン定常領域、完全長軽鎖、完全長重鎖若しくは免疫グロブリン構築物の別のフラグメント）、プロモーターを含んでなりかつそのための他の制御配列を包含しうる核酸分子を指し、このカセットは、遺伝要素（例えばプラスミド）を介してパッケージング宿主細胞に送達されかつウイルスベクターのキャプシド（例えばウイルス粒子）中にパッケージングされることができる。典型的には、ウイルスベクターを生成するためのこうした発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルおよび本明細書に記述されるもののような他の発現制御配列により隣接されている本明細書に記述される免疫グロブリン配列を含有する。
【００１９】
上述されたところの「約」という用語は、数値を修飾するために使用される場合、別の方法で明記されない限り±１０％の変動を意味している。
【００２０】
本明細および請求の範囲を通じて使用されるところの「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語、ならびに変形のなかでも「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでなる（こと）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（こと）（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」を包含するその変形は、他の成分、要素、整数、段階などを包含する。「よりなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」若しくは「よりなる（こと）（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は他の成分、要素、整数、段階などを排除する。
【００２１】
ＡＡＶベクターからの発現のため、抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物についてのアミノ酸配列は、公表されているもの、商業的に入手可能であるもの、および本明細書に記述されるコーディング配列から選択される。本明細書に記述されるところの抗悪性腫瘍免疫グロブリンは、ＨＥＲ２のようなヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）を標的としうる。トラスツズマブの一例は組換えＩｇＧ１κ、すなわち細胞に基づくアッセイでヒト上皮成長因子受容体タンパク質の細胞外ドメインに高親和性（Ｋｄ＝５ｎＭ）を伴い選択的に結合するヒト化モノクローナル抗体である。商業的に入手可能な製品はＣＨＯ細胞培養物中で製造される。例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ０００７２を参照されたい。トラスツズマブ軽鎖１および２ならびに重鎖１および２のアミノ酸配列、ならびにトラスツズマブのＸ線構造の研究から得られる配列は、受託番号ＤＢ
０００７２でこのデータベース上で提供され、この配列は引用することにより本明細書に組み込まれる。２１２−Ｐｂ−ＴＣＭＣ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ［Ａｒｅｖａ  Ｍｅｄ、メリーランド州ベセスダ］もまた参照されたい。目的の別の抗体は、例えばペルツズマブ、すなわちヒト上皮成長因子受容体２タンパク質（ＨＥＲ２）の細胞外二量体化ドメイン（サブドメインＩＩ）を標的とする組換えヒト化モノクローナル抗体を包含する。それはそれぞれ４４８および２１４残基を有する２本の重鎖および２本の軽鎖よりなる。ＦＤＡ承認２０１２年６月８日。その重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、例えば、ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ０６３６６（異名は２Ｃ４、ＭＯＡＢ  ２Ｃ４、モノクローナル抗体２Ｃ４およびｒｈｕＭＡｂ−２Ｃ４を包含する）中のこのデータベース上に受託番号ＤＢ０６３６６で提供される。ＨＥＲ２に加え、他のＨＥＲ標的を選択しうる。
【００２２】
例えば、ＭＭ−１２１／ＳＡＲ２５６２１２は、ＨＥＲ３受容体を標的とし［Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ’ｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｂｉｏｌｏｇｙ］かつ非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌および卵巣癌の処置で有用であることが報告されている、完全にヒトのモノクローナル抗体である。ＳＡＲ２５６２１２はＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）受容体を標的とする治験用の完全にヒトのモノクローナル抗体である［Ｓａｎｏｆｉ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ］。別の抗Ｈｅｒ３／ＥＧＦＲ抗体はＲＧ７５９７［Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ］であり、頭頸部癌で有用であると記述されている。別の抗体マルゲツキシマブ（ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）（若しくはＭＧＡＨ２２）すなわちＨＥＲを標的とする次世代のＦｃ最適化されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）［ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ］もまた利用しうる。
【００２３】
あるいは、他のヒト上皮細胞表面マーカーおよび／または他の腫瘍受容体若しくは抗原を標的としうる。他の細胞表面マーカー標的の例は、例えば、５Ｔ４、ＣＡ−１２５、ＣＥＡ（例えばラベツズマブにより標的とされる）、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０（例えばリツキシマブにより標的とされる）、ＣＤ２２（例えばエプラツズマブ若しくはベルツズマブにより標的とされる）、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１（またインテグリンαvβ3）、ＣＤ１３３（例えば膠芽腫細胞）、ＣＴＬＡ−４（例えば、例えば神経芽腫の処置で使用されるイピリムマブ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体２（ＣＸＣＲ２）（脳中の多様な領域で発現される；例えば抗ＣＸＣＲ２（細胞外）抗体＃ＡＣＲ−０１２（Ａｌｏｍｅｎｅ  Ｌａｂｓ））；ＥｐＣＡＭ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）［例えば第ＷＯ２０１２０２０００６Ａ２号明細書を参照されたい、脳癌］、葉酸受容体α（例えば小児上衣脳腫瘍、頭頸部癌）、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）（抗ＦＧＦＲ１抗体を用いる癌の協議処理（ｄｉｓｃｕｓｉｏｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）について、ら、第ＷＯ２０１２１２５１２４Ａ１号明細書を参照されたい）、ＦＧＦＲ２（例えば、第ＷＯ２０１３０７６１８６Ａ号明細書および第ＷＯ２０１１１４３３１８Ａ２号明細書に記述される抗体を参照されたい）、ＦＧＦＲ３（例えば、第ＵＳ８１８７６０１号明細書および第ＷＯ２０１０１１１３６７Ａ１号明細書に記述される抗体を参照されたい）、ＦＧＦＲ４（例えば、第ＷＯ２０１２１３８９７５Ａ１号明細書に記述される抗ＦＧＦＲ４抗体を参照されたい）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（例えば第ＷＯ２０１０１１９９９１Ａ３号明細書中の抗体を参照されたい）、インテグリンα5β1、ＩＧＦ−１受容体、ガングリオシドＧＤ２（例えば第ＷＯ２０１１１６０１１９Ａ２号明細書に記述される抗体を参照されたい）、ガングリオシドＧＤ３、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）（とりわけ神経膠腫と関連しかつ抗体グレムバツムマブ（ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）（ＣＲ０１１）の標的、ムチン、ＭＵＣ１、ホスファチジルセリン（例えば、バビツキシマブ（ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）により標的とされる、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ］、前立腺癌細胞、ＰＤ−Ｌ１（例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８）、完全にヒトのｇＧ４、例えば転移黒色腫］、血小板由来増殖因子受容体α（ＰＤＧＦＲα）若しくはＣＤ１４０、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）、テネイシンＣ、
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）Ａ（例えばベバシズマブにより標的とされる）ならびにＶＥＧＦＲ２（例えばラムシルマブにより標的とされる）を包含する。他の抗体およびそれらの標的は、例えばモノクローナル抗体ＡＰＮ３０１（ｈｕ１４．１９−ＩＬ２）［小児における悪性黒色腫および神経芽腫、Ａｐｅｉｒｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、オーストリア・ウィーン］を包含する。例えば、転移乳癌を包含する充実性腫瘍の処置に有用であると記述されているモノクローナル抗体８Ｈ９もまた参照されたい。モノクローナル抗体８Ｈ９はＢ７Ｈ３抗原に対する特異性をもつマウスＩｇＧ１抗体である［Ｕｎｉｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ］。このマウス抗体はヒト化され得る。Ｂ７−Ｈ３および／若しくはＢ７−Ｈ４抗原を標的とするなお他の免疫グロブリン構築物を本発明で使用しうる。別の抗体はＳ５８（抗ＧＤ２、神経芽腫）である。ＣｏｔａｒａTM［Ｐｅｒｒｅｇｒｉｎｃｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ］は再発性膠芽腫の処置について記述されているモノクローナル抗体である。他の抗体は、例えばアバスチン、フィクラツズマブ（ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）、ｍｅｄｉ−５７５およびオララツマブ（ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）を包含しうる。なお他の免疫グロブリン構築物若しくはモノクローナル抗体を本発明での使用のため選択しうる。例えば、Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，２０１３  Ｒｅｐｏｒｔ、ｐｐ．１−８７、ＰｈＲＭＡ’ｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ＆Ｐｕｂｌｉｃ  Ａｆｆａｉｒｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔの刊行物。（２０２）８３５−３４６０（本明細書に引用することにより組み込まれる）を参照されたい。
【００２４】
標的および免疫グロブリンが一旦選択されれば、選択された免疫グロブリン（例えば重および／若しくは軽鎖（１種若しくは複数））のコーディング配列を得かつ／若しくは合成することができる。タンパク質、ペプチド若しくはポリペプチド（例えば免疫グロブリンのような）のシークエンシング方法は当業者に既知である。タンパク質の配列が一旦知られれば、アミノ酸配列を核酸コーディング配列に戻し翻訳する、ウェブに基づくおよび商業的に利用可能なコンピュータプログラムならびにサービスをベースとする会社（ｓｅｒｖｉｃｅ  ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐａｎｉｅｓ）が存在する。例えば、ＥＭＢＯＳＳによるｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／；Ｇｅｎｅ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｎｆｉｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｍｓ／ｓｍｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）；ＥｘＰａｓｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）を参照されたい。一態様において、ＲＮＡおよび／若しくはｃＤＮＡコーディング配列が、ヒト細胞中での最適の発現のために設計される。
【００２５】
コドン最適化されたコーディング領域は多様な異なる方法により設計し得る。この最適化は、オンラインで利用可能である方法（例えばＧｅｎｅＡｒｔ）、公表された方法、若しくはコドン最適化サービスを提供する会社例えばＤＮＡ２．０（カリフォルニア州メンローパーク）を使用して実施しうる。１つのコドンを最適化するアルゴリズムが、例えば米国国際特許公開第ＷＯ２０１５／０１２９２４号明細書（本明細書に引用することにより組み込まれる）に記述されている。例えば米国特許公開第２０１４／００３２１８６号明細書および米国特許公開第２００６／０１３６１８４号明細書もまた参照されたい。適しては、産物の読み取り枠（ＯＲＦ）の長さ全体が改変される。しかしながら、いくつかの態様において、ＯＲＦの１フラグメントのみを変えてもよい。これらの方法の１つを使用することにより、いずれか所定のポリペプチド配列に対する該頻度を適用し得、そして該ポリペプチドをコードするコドン最適化されたコーディング領域の核酸フラグメントを製造し得る。
【００２６】
多数の選択肢が、コドンに対する実際の変化を実施するため若しくは本明細書に記述されるとおり設計されたコドン最適化されたコーディング領域を合成するために利用可能で
ある。こうした改変若しくは合成は、当業者に公知の標準かつ慣例の分子生物学的操作を使用して実施し得る。１アプローチにおいて、長さ各８０〜９０ヌクレオチドのかつ所望の配列の長さにわたる一連の相補オリゴヌクレオチド対を標準的方法により合成する。アニーリングに際してそれらが付着端を含有する８０〜９０塩基対の二本鎖フラグメントを形成するようなこれらのオリゴヌクレオチド対を合成し、例えば、該対中の各オリゴヌクレオチドを、該対中の他のオリゴヌクレオチドに相補的である領域を超え３、４、５、６、７、８、９、１０若しくはそれ以上の塩基を伸長するように合成する。オリゴヌクレオチドの各対の一本鎖端を、オリゴヌクレオチドの別の対の一本鎖端とアニーリングするよう設計する。該オリゴヌクレオチド対をアニーリングさせ、そしてこれら二本鎖フラグメントのおよそ５ないし６個をその後、付着一本鎖端を介して一緒にアニーリングさせ、そしてその後それらを一緒に連結し、そして標準的細菌クローニングベクター、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッドから入手可能なＴＯＰＯ（登録商標）ベクター中にクローン化する。該構築物をその後標準的方法によりシークエンスする。一緒に連結された８０ないし９０塩基対フラグメントの５ないし６フラグメント、すなわち約５００塩基対のフラグメントよりなるこれら構築物のいくつかを製造し、その結果所望の配列全体が一連のプラスミド構築物中で表示される。これらプラスミドの挿入物をその後適切な制限酵素で切断し、そして一緒に連結して最終構築物を形成する。該最終構築物をその後標準的細菌クローニングベクターにクローン化しかつシークエンスする。付加的な方法は当業者に直ちに明らかであろう。加えて、遺伝子合成は容易に商業的に利用可能である。
【００２７】
本明細書に記述される免疫グロブリン遺伝子は、「野生型」すなわち公表された若しくは商業的に入手可能なまたは他の既知の定常免疫グロブリンドメインを発現するのに使用しうるか、あるいは免疫グロブリン上に存在するＦｃ結合部位に結合するための親和性を低下若しくは結合を除去するように操作し得る。それらが認識する抗体の種類に基づき分類されるいくつかの異なる種類のＦｃ受容体が存在する。本明細書で使用されるところの「ＦｃＲｎ」はＩｇＧを結合する胎児性Ｆｃ受容体を指す。それはＭＨＣクラスＩタンパク質に構造が類似である。ヒトにおいて、それはＦＣＧＲＴ遺伝子によりコードされる。該Ｆｃ受容体は、例えば血液脳関門の上皮細胞を包含する多用な細胞型上に位置する。本明細書で使用されるところの「ＦｃＲｎ結合ドメイン」という用語は、ＦｃＲｎに直接若しくは間接的に結合するタンパク質ドメインを指す。ＦｃＲｎは哺乳動物ＦｃＲｎでありうる。さらなる態様において、ＦｃＲｎはヒトＦｃＲｎである。ＦｃＲｎに直接結合するＦｃＲｎ結合ドメインは抗体Ｆｃ領域である。同時に、ヒトＦｃＲｎ結合活性を有するアルブミン若しくはＩｇＧのようなポリペプチドに結合することが可能な領域は、アルブミン、ＩｇＧ若しくはそのようなものを介してヒトＦｃＲｎに間接的に結合し得る。従って、こうしたヒトＦｃＲｎ結合領域はヒトＦｃＲｎ結合活性を有するポリペプチドに結合する領域でありうる。本明細書で使用されるところの「Ｆｃ領域」という用語は、ＦｃＲｎすなわち哺乳動物ＦｃＲｎ若しくはヒトＦｃＲｎに直接結合するＦｃＲｎ結合ドメインを指す。具体的には、Ｆｃ領域は抗体のＦｃ領域である。Ｆｃ領域は哺乳動物Ｆｃ領域若しくはより具体的にはヒトＦｃ領域でありうる。具体的には、Ｆｃ領域はヒト免疫グロブリンの第二および第三定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）内に位置しうる。さらに、Ｆｃ領域はＣＨ２およびＣＨ３のヒンジでありうる。一態様において、免疫グロブリン構築物はＩｇＧである。さらなる一態様において、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１のＦｃ領域である。他のＩｇアイソタイプを同様に使用し得る。
【００２８】
これら結合ドメインはＩｇＧ重鎖の定常領域（領域ＣＨ２およびＣＨ３）内に位置するため、トラスツズマブ中の改変のための本明細書に提供されるアミノ酸位置は、対応するアミノ酸番号を同定するために改変のため選択された別の免疫グロブリン重鎖とのアライメントを製造することにより容易に決定し得る。こうしたアライメントを製造するための方法およびコンピュータプログラムが当業者に利用可能かつ公知である。本出願で言及さ
れるアミノ酸位置は配列番号３および２５（重鎖）ならびに配列番号４（軽鎖）中で提供されるところのトラスツズマブの番号付けに基づく。置換は、（１文字記号により特定されるアミノ酸）−位置番号−（１文字記号により特定されるアミノ酸）としてもまた書くことができ、それにより第一のアミノ酸は置換されるアミノ酸でありかつ第二のアミノ酸は指定される位置の置換するアミノ酸である。本明細書で使用されるところの「置換」および「アミノ酸の置換」ならびに「アミノ酸置換」という用語は、アミノ酸配列中の１アミノ酸の別のものでの置換を指し、ここで後者は置き換えられるアミノ酸と異なる。アミノ酸の置換方法は当業者に公知であり、そして限定されるものでないが該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の突然変異を挙げることができる。ＩｇＧ中のアミノ酸置換の作成方法は、例えば、アミノ酸改変技術のその議論について引用することにより組み込まれる第ＷＯ２０１３／０４６７０４号明細書について記述されるとは言え、この文書は本明細書に記述されるところの結合親和性を低下若しくは除去することよりむしろＦｃＲｎ親和性を増大することを記述する。
【００２９】
上述される「アミノ酸置換」という用語およびその同義語は、１アミノ酸の別の置換するアミノ酸での置換による１アミノ酸配列の改変を包括することを意図している。該置換は保存的置換でありうる。２アミノ酸に関する保存的という用語は、該アミノ酸が当業者により認識される共通の特性を共有することを意味することを意図している。２アミノ酸に関する非保存的という用語は、当業者により認識される少なくとも１つの特性において差違を有するそのアミノ酸を意味することを意図している。例えば、こうした特性は、疎水性の非酸性側鎖を有するアミノ酸、疎水性側鎖（酸性若しくは非酸性とさらに識別されうる）を有するアミノ酸、脂肪族の疎水性側鎖を有するアミノ酸、芳香族の疎水性側鎖を有するアミノ酸、極性の中性側鎖をもつアミノ酸、荷電している側鎖をもつアミノ酸、荷電している酸性側鎖をもつアミノ酸、および荷電している塩基性側鎖をもつアミノ酸を包含しうる。天然に存在するおよび天然に存在しないアミノ酸双方が当該技術分野で既知であり、そして態様において置換するアミノ酸として使用されうる。従って、保存的アミノ酸置換は、疎水性側鎖を有する第一のアミノ酸を疎水性側鎖を有する異なるアミノ酸と交換することを必要とすることができ；一方、非保存的アミノ酸置換は、酸性の疎水性側鎖をもつ第一のアミノ酸を異なる側鎖例えば塩基性の疎水性側鎖若しくは親水性側鎖を有する異なるアミノ酸と交換することを必要としうる。なお他の保存的若しくは非保存的変化は当業者により決定され得る。
【００３０】
なお他の態様において、所定の１位置での置換は、本明細書で特定される目的を達成するために当業者に明らかであることができる１アミノ酸若しくはアミノ酸の一群の１つであることができる。
【００３１】
一態様において、本明細書で定義されるところの免疫グロブリン構築物は、免疫グロブリンＦｃ領域の保存される領域に位置する天然の配列が除去されて、ＦｃＲｎへの結合を排除しそして（ＣＮＳ領域から）血液脳関門を横断しかつ全身循環中へのタンパク質性免疫グロブリン構築物の移動を最小限にする若しくは排除するように操作される。一例において、これはＦｃＲｎ結合ドメインの１若しくはそれ以上のアミノ酸を変えることにより、例えば選択されるアミノ酸（１若しくは複数）のコドンの改変により、達成しうる。
【００３２】
例えば、免疫グロブリンは、位置Ｙ４３６（配列番号２５のａａ４５９）、Ｓ２５４（配列番号２５のａａ２７７）、Ｉ２５３（配列番号２５のａａ２７６）および／若しくはＨ４３５（配列番号２５のａａ４５８）のアミノ酸残基をコードするコドンの１個若しくはそれ以上において、別の適するアミノ酸例えばアラニン（Ａｌａ、Ａ）に改変しうる。しかしながら、例えばＴ２５０（配列番号２５のａａ２７３）、Ｍ２５２（配列番号２５のａａ２７５）、Ｓ２５４（配列番号２５のａａ２７７）、Ｔ２５６（配列番号２５のａａ２７９）、Ｐ２５７（配列番号２５のａａ２８０）、Ｐ２７１（配列番号２５のａａ２
９４）、Ｔ３０７（配列番号２５のａａ３３０）、Ｑ３１１（配列番号２５のａａ３３４）、Ｄ３７６（配列番号２５のａａ３９９）、Ｅ３８０（配列番号２５のａａ４０３）、Ｍ４２８（配列番号２５のａａ４５１）および／若しくはＮ４３４（配列番号２５のａａ４５７）、または相互との若しくは本明細書に記述される他の改変とのこれらの組合せ１種若しくはそれ以上のような、ＦｃＲｎに機能的に結合することに関与する他の位置を変異させうる。他の適する改変は、Ｉ２５３（配列番号２５のａａ２７６）、Ｓ２５４（配列番号２５のａａ２７７）、Ｋ２８８（配列番号２５のａａ３１１）、Ｖ３０５（配列番号２５のａａ３２８）、Ｑ３１１（配列番号２５のａａ３３４）、Ｄ３１２（配列番号２５のａａ３３５）、Ｋ３１７（配列番号３４０のａａ３４０）、Ｋ３６０（配列番号２５のａａ３８３）、Ｑ３６２（配列番号２５のａａ３８５）、Ｅ３８０（配列番号２５のａａ４０３）、Ｓ４１５（配列番号２５のａａ４３８）、Ｓ４２４（配列番号２５のａａ４４７）、Ｈ４３３（配列番号２５のａａ４５６）、Ｎ４３４（配列番号２５のａａ４５７）、Ｈ４３５（配列番号２５のａａ４５８）および／若しくはＹ４３６（配列番号２５のａａ４５９）、または２種若しくはそれ以上の組合せに配置しうる。上述されたとおり、他のＩｇＧ重鎖ＣＨ２およびＣＨ２中の対応する位置を選択しうる。本明細書の「１若しくはそれ以上」への言及は、例えば１、２、３、４、５、の個別の態様を包括することを意図している。付加的な態様において、「１若しくはそれ以上」という用語は、トラスツズマブ重鎖可変領域配列番号３、軽鎖可変領域配列番号４、重鎖配列番号２５若しくは本明細書で同定される別のアミノ酸配列に対する最低約８５％の同一性、最低９０％の同一性、最低約９５％の同一性若しくは最低約９９％の同一性を生じるとみられる、本明細書に記述されるポリペプチド中の多数の置換を包含する。
【００３３】
加えて、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および／若しくは抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を高める突然変異を、本明細書に記述されるトラスツズマブバリアントに組み込みうる。さらなる態様において、こうした突然変異は免疫細胞による腫瘍細胞の死滅を助長する。ＡＤＣＣ機能を高めるための適するアミノ酸改変の例は、例えば、とりわけ米国特許公開第２００８／０１１８５０１号明細書；Ａ  Ｎａｓｕｍｅら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ
Ｄｅｖｅｌ  Ｔｈｅｒ、２００９、３；７−１６、オンライン公開２００９年９月２１日。ＧＡ  Ｌａｚａｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、ｖｏｌ．１０３、ｎｏ．１１、ｐ．４００５−４０１０（Ｍａｒ  １４，２００６）；およびＧＬ  Ｍｏｏｒｅら、ＭＡｂｓ、２０１０  Ｍａｒ−Ａｐｒ；２（２）：１８１−１８９に記述されている。
【００３４】
変異体の位置を同定するために本明細書で使用される重鎖アミノ酸の番号付けはＥＵ番号付け体系［ＩＭＧＴ特有の番号付け、Ｅｄｅｌｍａｎ、Ｇ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ、６３、７８−８５（１９６９）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／−Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ］］に基づき、そしてＦｃＲｎ結合ドメイン、具体的にはＦｃ領域中の位置を指す。類似の様式で、置換は例えば「ＥＵ３８７Ｒ」若しくは「ＥＵ４４０Ｅ」として示され、ここで「ＥＵ」の後に示される数字はＥＵ番号付けに従った置換の位置を示し、そして数字の後の文字は１文字記号で示される置換されるアミノ酸である。他の番号付け体系は、例えばＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．、Ｔ．Ｔ．Ｗｕ、Ｈ．Ｍ．Ｐｅｒｒｙ、Ｋ．Ｓ．Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、Ｃ．Ｆｏｅｌｅｒ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｎｏ．９１−３２４２  Ｕ．Ｓ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ）を包含する。
【００３５】
一態様において、抗Ｈｅｒ２抗体は本明細書に記述されるところの組成物および方法のために選択される。一態様において、選択される抗体はトラスツズマブである。トラスツズマブのアミノ酸配列は、例えばＰ．Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  
Ｓｃｉ．、８９：４２８５−４２８９（Ｍａｙ  １９８２）に記述されている。トラスツズマブ重鎖のアミノ酸配列は図１に提供され、配列表［配列番号２５］およびＥＵ番号付け体系双方を示す。トラスツズマブ重鎖可変領域のアミノ配列は［配列番号３］に示され、また、トラスツズマブ軽鎖可変領域は付属として付けられる配列表［配列番号４］に提供される。トラスツズマブを発現するため、ヒトにおけるトラスツズマブポリペプチドの最適の発現のため選択されたコドンを含有する新規核酸分子が設計された。さらに、該新規核酸分子は、可変および定常領域から構成される重および軽鎖ポリペプチドの上流に融合されたＩＬ−２シグナルリーダーペプチドをコードするトラスツズマブの各重鎖および軽鎖にとって異種のリーダー配列を包含する。しかしながら、別の異種リーダー配列をＩＬ−２シグナル／リーダーペプチドの一方若しくは双方の代わりに使用しうる。シグナル／リーダーペプチドは、各重鎖および軽鎖免疫グロブリン構築物について同一若しくは異なることができる。これらは免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）中に天然に見出されるシグナル配列でありうるか、若しくは異種供給源からでありうる。こうした異種供給源は、とりわけ、サイトカイン（例えばＩＬ−２、ＩＬ１２、ＩＬ１８など）、インスリン、アルブミン、β−グルクロニダーゼ、アルカリプロテアーゼ若しくはフィブロネクチン分泌シグナルペプチドでありうる。プロモーター（１種若しくは複数）は、多様な供給源、例えばヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリモウイルス（ｐｏｌｙｍｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）若しくはグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ−１）潜伏関連プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックスメタロプロテインプロモーター（ＭＰＰ）およびニワトリβ−アクチンプロモーターから選択し得る。
【００３６】
本明細書に記述される発現カセットは、重および軽鎖のコーディング領域の間に配置される最低１個の配列内リボソーム進入部位すなわちＩＲＥＳを含有しうる。あるいは、重および軽鎖はフューリン２ａ自己切断ペプチドリンカーにより分離されうる［例えばＲａｄｃｌｉｆｆｅとＭｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４）、１１、１６７３−１６７４を参照されたい。該発現カセットは最低１個のエンハンサーすなわちＣＭＶエンハンサーを含有しうる。なお他のエンハンサーエレメントは、例えば、アポリポタンパク質エンハンサー、ゼブラフィッシュエンハンサー、ＧＦＡＰエンハンサーエレメント、および第ＷＯ２０１３／１５５５２２２号明細書に記述されるような脳特異的エンハンサー、ウッドチャック肝炎後転写後調節エレメント（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  ｐｏｓｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を包含しうる。加えて、若しくは、あるいは、他の、例えばハイブリッドヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）−前初期（ＩＥ）−ＰＤＧＲプロモーター若しくは他のプロモーター−エンハンサーエレメントを選択しうる。発現を高めるため、他のエレメントはイントロンであり得る（ｐｒｏｍｅｇａイントロン若しくはキメラニワトリグロビン−ヒト免疫グロブリンイントロンのような）。
【００３７】
本明細書に提供されるところの、配列番号１の操作された核酸分子の番号付けに関して、トラスツズマブの重鎖ポリペプチドをコードする核酸配列はリーダー配列（配列番号１の１−６０）を特徴とし、核酸６１ないし４２３は免疫グロブリン重鎖（ＨＣ）可変配列のコーディング領域であり、核酸４３９ないし７１４はＨＣ定常領域１のコーディング領域であり、核酸７１５ないし１４１０はＨＣ定常領域２および３のコーディング領域である。ＩＲＥＳは、トラスツズマブ重鎖とトラスツズマブ軽鎖コーディング配列のリーダー配列との間の配列番号１の核酸１４２２−２０１２に配置される。トラスツズマブ軽鎖可変配列の可変領域は配列番号１のヌクレオチド２０７０−２３９１であり；軽鎖定常領域は配列番号１の核酸２４０７ないし２７１１に配置される。
【００３８】
トラスツズマブ免疫グロブリンポリペプチド［例えば、重鎖、軽鎖若しくはそのフラグメントであって、そのフラグメントは、例えば、配列番号１の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および／若しくは３、定常領域（１、２若しくは３）、あるいは、配列番号１に対しそれに最低約８５％同一、最低約９０％、それに最低約９５％同一、若しくはそれに最低約９９％同一である配列を包含することができ、又は、免疫グロブリンポリペプチド（例えば重鎖、軽鎖、若しくは、いかなるＦｃＲＮ改変も伴わないトラスツズマブについて本明細書に提供されると同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびそのフラグメントをコードするそのフラグメント［例えば重鎖、軽鎖、若しくはそのフラグメント（例えば可変領域（例えば相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および／若しくは３を包含する）、定常領域（１、２若しくは３））］をコードするそのフラグメントをコードする核酸配列もまた本明細書に包括される。
【００３９】
２種若しくはそれ以上の核酸若しくはポリペプチド配列の文脈における「同一の」若しくは「同一性」パーセントという用語は、下述されるデフォルトのパラメータを用いるＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ  ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、または人的アライメントおよび目視点検（例えばＮＣＢＩウェブサイトなどを参照されたい）により評価されるところの、指定される一領域（例えば、比較窓若しくは指定される領域にわたる最大の対応について比較かつ整列される場合に本明細書に提供される改変されたＯＲＦのいずれか１種）にわたり同一であるかまたは同一であるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドの指定されるパーセンテージ（すなわち、約７０％同一性、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の同一性を有する、２種若しくはそれ以上の配列若しくは下位配列を指す。別の例として、ポリヌクレオチド配列はＧＣＧバージョン６．１中のプログラムＦａｓｔａを使用して比較し得る。Ｆａｓｔａはクエリおよび検索配列の間の最良の重複の領域のアライメントおよび配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、ＧＣＧバージョン６．１（引用することにより本明細書に組み込まれる）に提供されるところのそのデフォルトのパラメータ（６のワードサイズおよびスコアリングマトリックスについてのＮＯＰＡＭファクター）を用いてＦａｓｔａを使用して決定し得る。一般に、これらのプログラムはデフォルトの設定で使用されるとは言え、当業者はこれらの設定を必要とされるとおり変更し得る。あるいは、当業者は、少なくとも、参照されるアルゴリズムおよびプログラムにより提供されるもののような同一性若しくはアライメントの水準を提供する別のアルゴリズム若しくはコンピュータプログラムを利用し得る。この定義はまた配列の相補物も指すか若しくはそれにも適用され得る。該定義は、欠失および／若しくは付加を有する配列ならびに置換を有するものもまた包含する。下述されるとおり、好ましいアルゴリズムはギャップなどを説明し得る。好ましくは、同一性は、長さが最低約２５、５０、７５、１００、１５０、２００アミノ酸若しくはヌクレオチドである領域、およびしばしば長さが２２５、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００アミノ酸若しくはヌクレオチドである領域、またはアミノ酸若しくは核酸配列の完全長にわたり存在する。
【００４０】
典型的に、アライメントをあるアミノ酸配列に基づき製造する場合、該アライメントは参照ＡＡＶ配列に関してそのように同定される挿入および欠失を含有し、そして、該アミノ酸残基の番号付けは該アライメントについて提供される参照尺度に基づく。しかしながら、いずれの所定のＡＡＶ配列も参照尺度より少ないアミノ酸残基を有しうる。本発明において、親配列を議論する場合、「同一位置」若しくは「対応する位置」という用語は、整列される配列のための参照尺度に関して該配列のそれぞれ中の同一残基番号に配置されるアミノ酸を指す。しかしながら、アライメントから取り出される場合、タンパク質のそれぞれはこれらのアミノ酸を異なる残基番号に配置させていることができる。アライメントは多様な公的若しくは商業的に利用可能な多配列アライメントプログラムのいずれかを
使用して実施する。配列アライメントプログラム、例えば「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」および「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」プログラムがアミノ酸配列に利用可能である。一般に、これらのプログラムのいずれもデフォルトの設定で使用されるとは言え、当業者はこれらの設定を必要とされるとおり変更し得る。あるいは、当業者は、少なくとも、参照されるアルゴリズムおよびプログラムにより提供されるもののような同一性若しくはアライメントの水準を提供する別のアルゴリズム若しくはコンピュータプログラムを利用し得る。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、“Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”、２７（１３）：２６８２−２６９０（１９９９）を参照されたい。
【００４１】
別の態様において、ＦｃＲｎに対するその親和性を変えさせておりかつ有効な抗悪性腫瘍活性を保持する改変された抗Ｈｅｒ２抗体が提供される。１個若しくはそれ以上のアミノ酸改変を、ＦｃＲｎへの機能的結合を除去するように選択しうる。一態様において、該改変はＦｃＲｎに対するトラスツズマブ免疫グロブリンの結合親和性を天然のタンパク質の１０％未満に低下させる。適しては、これらの突然変異をもつ免疫グロブリンは全部の他のＦｃ受容体に実質的に正常に結合する。例えば、該免疫グロブリンは、位置Ｙ４３６、Ｓ２５４、Ｉ２５３および／若しくはＨ４３５の最低１つをアラニン若しくは他のアミノ酸に、または相互とのこれらの１種若しくはそれ以上、または本明細書に記述される改変の１種若しくはそれ以上との１、２種若しくはそれ以上の組合せを改変しうる。しかしながら、例えばＴ２５０（配列番号２５のａａ２７３）、Ｍ２５２（配列番号２５のａａ２７５）、Ｓ２５４（配列番号２５のａａ２７８）、Ｔ２５６（配列番号２５のａａ２８０）、Ｐ２５７（配列番号２５のａａ２８１）、Ｐ２７１（配列番号２５のａａ２９４）、Ｔ３０７（配列番号２５のａａ３３０）、Ｑ３１１（配列番号２５のａａ３３４）、Ｄ３７６（配列番号２５のａａ３９９）、Ｅ３８０（配列番号２５のａａ４０３）、Ｍ４２８（配列番号２５のａａ４５１）および／若しくはＮ４３４（配列番号２５のａａ４５７）、あるいは相互とのまたは本明細書に記述される他の改変とのこれらの組合せ１種若しくはそれ以上のような、ＦｃＲｎへの機能的結合に関与する他の位置を変異させうる。他の適する改変は、例えば所望の抗悪性腫瘍活性を保持する別のアミノ酸での置換により、Ｉ２５３（配列番号２５のａａ２７６）、Ｓ２５４（配列番号２５のａａ２７８）、Ｋ２８８（配列番号２５のａａ３１１）、Ｖ３０５（配列番号２５のａａ３２８）、Ｑ３１１（配列番号２５のａａ３３４）、Ｄ３１２（配列番号２５のａａ３３５）、Ｋ３１７（配列番号３４０のａａ３４０）、Ｋ３６０（配列番号２５のａａ３８３）、Ｑ３６２（配列番号２５のａａ３８５）、Ｅ３８０（配列番号２５のａａ４０３）、Ｓ４１５（配列番号２５のａａ４３８）、Ｓ４２４（配列番号２５のａａ４４７）、Ｈ４３３（配列番号２５のａａ４５６）、Ｎ４３４（配列番号２５のａａ４５７）、Ｈ４３５（配列番号２５のａａ４５８）および／若しくはＹ４３６（配列番号２５のａａ４５９）または２種若しくはそれ以上の組合せに配置されうる。なお他の突然変異を組み込みうる。例えば、ＫｕｏとＡｖｅｓｏｎ、ｍＡｂｓ、３：５、４２２−４３０（Ｓｅｐｔ／Ｏｃｔ  ２０１１）およびＳｈｉｅｌｄ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００１、２７６：６５９−６６０４を参照されたい。アミノ酸配列が一旦選択されれば、該核酸配列を設計し得、かつ／若しくは以前に記述された配列を上述されたとおり操作しうる。これら改変は、当業者に既知である部位特異的突然変異誘発若しくは他の遺伝子工学技術を使用して該核酸コーディング領域を操作することによりなされる。
【００４２】
類似の改変を、別の選択された抗ＨＥＲ２免疫グロブリン構築物、若しくは、あるいは、本明細書に記述されるところの別の抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物中に操作しうる。
【００４３】
一態様において、本明細書に記述される免疫グロブリン遺伝子は、その上に運搬される免疫グロブリン構築物配列を移入するＡＡＶベクターを生成するために有用な遺伝要素（
例えばプラスミド）中に操作される。選択されるベクターは、トランスフェクション、電気穿孔法、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を包含するいずれかの適する方法によりＡＡＶパッケージング細胞に送達しうる。安定なパッケージング細胞もまた作成し得る。こうした構築物を作成するのに使用される方法は核酸操作の当業者に既知であり、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術を包含する。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＧｒｅｅｎとＳａｍｂｒｏｏｋ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（２０１２）を参照されたい。
【００４４】
ＡＡＶベクター
本明細書に記述されるところのＡＡＶベクターは、そのそれぞれが抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物の重および／若しくは軽鎖ポリペプチドまたは他のポリペプチドの１種若しくはそれ以上をコードする１種若しくはそれ以上の核酸配列を含み得る。適しては、組成物はｉｎ  ｖｉｖｏで抗悪性腫瘍構築物を形成するポリペプチドの全部を含有する１種若しくはそれ以上のＡＡＶベクターを含有する。例えば、完全長抗体は４個のポリペプチドすなわち重（Ｈ）鎖ポリペプチドの２個の同一のコピーおよび軽（Ｌ）鎖ポリペプチドの２コピーよりなる。重鎖のそれぞれは１個のＮ末端可変（ＶＨ）領域および３個のＣ末端定常（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）領域を含有し、ならびに各軽鎖は１個のＮ末端可変（ＶＬ）領域および１個のＣ末端定常（ＣＬ）領域を含有する。軽および重鎖の各対の可変領域は抗体の抗原結合部位を形成する。この点に関して、本明細書に記述されるところのＡＡＶベクターは、免疫グロブリン構築物の２個の重鎖ポリペプチド（例えば定常、可変（ｃｏｎａｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ）および２個の軽鎖ポリペプチドをコードする単一核酸配列を含み得る。あるいは、ＡＡＶベクターは、最低１個の重鎖定常ポリペプチドおよび最低１個の重鎖可変ポリペプチドをコードする第一の発現カセット、ならびに免疫グロブリン構築物の双方の軽鎖ポリペプチドをコードする第二の発現カセットを含み得る。なお別の態様において、ＡＡＶベクターは、第一の重鎖ポリペプチドをコードする第一の発現カセット、第二の重鎖ポリペプチドをコードする第二の発現カセット、第一の軽鎖ポリペプチドをコードする第三の発現カセット、および第二の軽鎖ポリペプチドをコードする第四の発現カセットを含み得る。
【００４５】
典型的には、ＡＡＶベクターの発現カセットは、ＡＡＶ  ５’末端逆位配列（ＩＴＲ）、免疫グロブリン構築物コーディング配列およびいずれかの制御配列、ならびにＡＡＶ  ３’ＩＴＲを含んでなる。しかしながら、これらのエレメントの他の構成が適することができる。Ｄ配列および末端解離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）（ｔｒｓ）が欠失されている、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮されたバージョンが記述されている。他の態様において、完全長のＡＡＶ  ５’および３’ＩＴＲを使用する。
【００４６】
シュードタイピングされたＡＡＶが製造されるはずである場合、発現におけるＩＴＲはキャプシドのＡＡＶ供給源と異なる供給源から選択される。例えば、ＡＡＶ２  ＩＴＲを、ＣＮＳまたはＣＮＳ内の組織若しくは細胞を標的とするための特定の効率を有するＡＡＶキャプシドとの使用に選択しうる。一態様において、ＡＡＶ２からのＩＴＲ配列若しくはその欠失されたバージョン（ΔＩＴＲ）を、便宜上および規制当局による承認を促進するために使用する。しかしながら他のＡＡＶ供給源からのＩＴＲを選択しうる。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２からでありかつＡＡＶキャプシドが別のＡＡＶ供給源からである場合、生じるベクターはシュードタイピングされたと称することができる。しかしながらＡＡＶ
ＩＴＲの他の供給源を利用しうる。
【００４７】
「ｓｃ」という略称は自己相補性を指す。「自己相補性ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸
配列により運搬されるコーディング領域が分子内二本鎖ＤＮＡテンプレートを形成するよう設計されている構築物をゆだねる（ｒｅｆｅｒ）。感染に際して、第二の鎖の細胞媒介性合成を待機するよりことむしろ、ｓｃＡＡＶの２個の相補的半分が会合して、即座の複製および転写の準備ができている１個の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成することができる。例えばＤ  Ｍ  ＭｃＣａｒｔｙら、“Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、（Ａｕｇｕｓｔ  ２００１）、Ｖｏｌ  ８、Ｎｕｍｂｅｒ  １６、１２４８−１２５４ページを参照されたい。自己相補性ＡＡＶは、例えば米国特許第６，５９６，５３５号明細書；同第７，１２５，７１７号明細書；および同第７，４５６，６８３号明細書（それらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。
【００４８】
発現カセットは、典型的に、例えば選択された５’ＩＴＲ配列と免疫グロブリン構築物コーディング配列の間に配置される、発現制御配列の一部としてプロモーター配列を含有する。組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、調節可能なプロモーター［例えば第ＷＯ２０１１／１２６８０８号明細書および第ＷＯ２０１３／０４９４３号明細書を参照されたい］若しくは生理学的合図に応答性のプロモーターを、本明細書に記述されるベクター中で使用しうる利用しうる（ｍａｙ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｍａｙ  ｂｅ  ｕｔｉｌｉｚｅｄ）。プロモーターに加え、発現カセットおよび／若しくはベクターは、他の適切な転写開始、終止、エンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのような効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列：翻訳効率を高める配列（すなわちコザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；ならびに所望の場合はコードされる産物の分泌を高める配列を含有しうる。
【００４９】
これらの制御配列は免疫グロブリン構築物遺伝子配列に「作動可能に連結されて」いる。本明細書で使用されるところの「作動可能に連結されている」という用語は、目的の遺伝子と隣接している発現制御配列および目的の遺伝子を制御するためにトランスで若しくは離れて作用する発現制御配列の双方を指す。
【００５０】
一態様において、自己相補性ＡＡＶが提供される。このウイルスベクターはΔ５’  ＩＴＲおよびＡＡＶ  ３’  ＩＴＲを含有しうる。別の態様において、一本鎖ＡＡＶウイルスベクターが提供される。被験体への送達に適するＡＡＶウイルスベクターの生成および単離方法は当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第７７９０４４９号明細書；米国特許第７２８２１９９号明細書；第ＷＯ２００３／０４２３９７号明細書；第ＷＯ２００５／０３３３２１号明細書、第ＷＯ２００６／１１０６８９号明細書；および第ＵＳ７５８８７７２Ｂ２号明細書を参照されたい］。一系において、産生体細胞株を、ＩＴＲにより隣接されている導入遺伝子をコードする構築物ならびにｒｅｐおよびｃａｐをコードする構築物（１個若しくは複数）で一過性にトランスフェクトする。第二の系において、ｒｅｐおよびｃａｐを安定的に供給するパッケージング細胞株を、ＩＴＲにより隣接されている導入遺伝子をコードする構築物で一過性にトランスフェクトする。これらの系のそれぞれにおいて、ＡＡＶビリオンがヘルパーアデノウイルス若しくはヘルペスウイルスへの感染に応答して産生され、汚染するウイルスからの該ｒＡＡＶの分離を必要とする。より最近、ＡＡＶを回収するためにヘルパーウイルスへの感染を必要としない系が開発された。すなわち、必要とされるヘルパー機能（すなわちアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４若しくはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２およびＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）もまた該系によりトランスに供給される。これらのより新しい系において、ヘルパー機能は、必要とされるヘルパー機能をコードする構築物への細胞の一過性トランスフェクションにより供給し得るか、若しくは、細胞を、ヘルパー
機能をコードする遺伝子を安定に含有するように操作することができ、その発現を転写若しくは翻訳後レベルで制御し得る。なお別の系において、ＩＴＲおよびｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子により隣接されている導入遺伝子を、バキュロウイルスに基づくベクターへの感染により昆虫細胞中に導入する。これら産生系に関する総説については、全般として、例えばＺｈａｎｇら、２００９、“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｖｉｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０：９２２−９２９（その各内容はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。これらおよび他のＡＡＶ産生系の作成および使用方法は、以下の米国特許（その各内容はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）すなわち第５，１３９，９４１号明細書；第５，７４１，６８３号明細書；第６，０５７，１５２号明細書；第６，２０４，０５９号明細書；第６，２６８，２１３号明細書；第６，４９１，９０７号明細書；第６，６６０，５１４号明細書；第６，９５１，７５３号明細書；第７，０９４，６０４号明細書；第７，１７２，８９３号明細書；第７，２０１，８９８号明細書；第７，２２９，８２３号明細書；および第７，４３９，０６５号明細書にもまた記述されている。
【００５１】
パッケージングのための利用可能な空間は、単一発現カセット中に１個以上の転写ユニットを組合せてかように必要とされる制御配列の量を低減することにより保存しうる。例えば、単一プロモーターが、２若しくは３種またはそれ以上の遺伝子をコードする単一のｃＤＮＡ若しくはＲＮＡの発現を指図することができ、また、下流の遺伝子の翻訳がＩＲＥＳ配列により駆動される。別の例において、単一のプロモーターが、自己切断ペプチド（例えば２Ａ）および／若しくはプロテアーゼ認識部位（例えばフューリン）をコードする配列により相互から分離されている２若しくは３種またはそれ以上の遺伝子を単一読み取り枠（ＯＲＦ）中に含有するｃＤＮＡ若しくはＲＮＡの発現を指図しうる。該ＯＲＦは従って、翻訳の間若しくは後のいずれかに個別のタンパク質（例えば重鎖および軽鎖のような）に切断される単一のポリタンパク質をコードする。しかしながら、これらのＩＲＥＳおよびポリタンパク質系を使用してＡＡＶパッケージング空間を節約し得るとは言え、それらは同一のプロモーターにより駆動され得る成分の発現についてのみ使用し得ることが注目されるべきである。別の代替において、ＡＡＶの導入遺伝子容量は、アニーリングしてヘッドトゥテールコンカテマーを形成し得る２種のゲノムのＡＡＶ  ＩＴＲを提供することにより増大させ得る。
【００５２】
下の実施例において、乳癌のＣＮＳ転移を処置するためにＣＮＳ中で直接トラスツズマブを発現させるためのＡＡＶ９ベクターが記述される。ＡＡＶ９ベクターは例えば米国特許第７，９０６，１１１号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。しかしながら、ＡＡＶキャプシドおよび他のウイルスエレメントの他の供給源を、他の免疫グロブリン構築物および他のベクターエレメントでしうるように選択しうる。ＡＡＶベクターの生成方法は、例えば第ＷＯ２００３／０４２３９７号明細書；第ＷＯ２００５／０３３３２１号明細書、第ＷＯ２００６／１１０６８９号明細書；第ＵＳ７５８８７７２Ｂ２号明細書を包含する文献および特許文書に広範囲に記述されている。ＡＡＶキャプシドの供給源は、ＣＮＳ、ＣＮＳ内の特定の細胞、および／または特定の癌関連抗原若しくは受容体を標的とするＡＡＶから選択しうる。適するＡＡＶは、例えばＡＡＶ９［第ＵＳ７，９０６，１１１号明細書；第ＵＳ２０１１−０２３６３５３−Ａ１号明細書］、ｒｈ１０［第ＷＯ２００３／０４２３９７号明細書］および／若しくはｈｕ３７［例えば第ＵＳ７，９０６，１１１号明細書；第ＵＳ２０１１−０２３６３５３−Ａ１号明細書を参照されたい］を包含しうる。しかしながら、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８［米国特許第７７９０４４９号明細書；米国特許第７２８２１９９号明細書］および例えば、ここで欠落しているものとみなされる一語で記述されるもののような他者を包含する他のＡＡＶが、本明細書に記
述されるＡＡＶベクターを製造するために選択しうる。
【００５３】
用途およびレジメン
適するのは、本発明の組成物は、ＡＡＶベクターが、免疫グロブリン構築物、および選択された細胞中でその免疫グロブリンの発現を命令する制御配列をコードする核酸発現カセットを所持するように設計される。ＣＮＳ中への該ベクターの投与後に、ベクターは発現カセットをＣＮＳに送達し、そしてタンパク質性免疫グロブリン構築物をｉｎ  ｖｉｖｏで発現する。抗悪性腫瘍の方法における本明細書に記述される組成物の使用が、１種若しくはそれ以上の他の抗悪性腫瘍若しくは他の有効な剤の送達を場合によっては必要としうる抗悪性腫瘍レジメンでのこれらの組成物の使用がそうであるように、記述される。
【００５４】
上で述べられたとおり、組成物は、抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物をｉｎ  ｖｉｖｏで送達するための発現カセットを含有する、本明細書に記述されるところの単一の種類のＡＡＶベクターを含有しうる。あるいは、組成物は、そのそれぞれがその中に異なる発現カセットをパッケージングしている２種若しくはそれ以上の異なるＡＡＶベクターを含有しうる。例えば、該２種若しくはそれ以上の異なるＡＡＶは、ｉｎ  ｖｉｖｏで集成して単一の機能的免疫グロブリン構築物を形成する免疫グロブリンポリペプチドを発現する多様な発現カセットを有しうる。別の例において、２種若しくはそれ以上のＡＡＶは、異なる標的のための免疫グロブリンポリペプチドを発現する異なる発現カセットを有することができ、例えば、２者が２種の機能的免疫グロブリン構築物（例えば１種の抗Ｈｅｒ２免疫グロブリン構築物および第二の抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物）を提供する。なお別の代替において、該２種若しくはそれ以上の異なるＡＡＶは、同一標的に向けられる免疫グロブリン構築物を発現することができ、ここで該免疫グロブリン構築物の一方はＦｃＲｎ結合を除去するよう改変されており、かつその能力を保持する若しくはＦｃＲｎに結合する高められた能力を有する第二の免疫グロブリン構築物を発現することができる。こうした組成物は脳領域中の増大された保持を伴う抗体および免疫グロブリン構築物の全身送達のための抗体を同時に提供するのに有用でありうる。
【００５５】
場合によっては、本明細書に記述されるこれらの免疫グロブリン構築物の一方若しくは双方は高められたＡＤＣＣ活性を有する。本明細書に記述されるところのレジメンは、本明細書に記述される組合せの１種若しくはそれ以上に加え、抗悪性腫瘍生物学的製剤、抗悪性腫瘍小分子薬、化学療法剤、免疫増強剤、放射線、外科手術などの１種若しくはそれ以上とのさらなる組合せを含みうる。本明細書に記述されるところの生物学的製剤は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、核酸分子、ベクター（ウイルスベクターを包含する）などに基づく。
【００５６】
適しては、本明細書に記述される組成物は、注入、浸透圧ポンプ、くも膜下腔内カテーテルを介する被験体への送達、または別の装置若しくは経路による送達のための設計されている製薬学的に適する担体に懸濁された、抗悪性腫瘍有効量の１種若しくはそれ以上のＡＡＶを含んでなる。一例において、該組成物はくも膜下腔内送達のため配合される。本明細書で使用されるところのくも膜下腔内送達は脊柱管、より具体的にはくも膜下腔中への注入を包括する。しかしながら他の送達経路、および例えば頭蓋内、鼻内、大槽内、脳脊髄内液（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）送達、とりわけ適する直接若しくは全身経路すなわちオンマヤリザーバーを包含するＡＡＶ組成物のための製薬学的に許容できる担体を選択しうる。
【００５７】
該組成物は、約１×１０9ゲノムコピー（ＧＣ）ないし約５×１０13ＧＣ（体重が７０
ｋｇの平均的被験体を処置するため）の範囲にあるＡＡＶの量を含有するよう投薬量単位に配合し得る。一態様において、その中で約１５ｍＬ（若しくは未満）から約４０ｍＬまでのＣＳＦを取り出し、およびその中でベクターを該ＣＳＦと混合かつ／若しくは適合性
の担体に懸濁しそして被験体に送達する脊椎穿刺を実施する。一例において、ベクター濃度は約３×１０13ＧＣ、しかし約１×１０9ＧＣ、約５×１０9ＧＣ、約１×１０10ＧＣ、約５×１０10ＧＣ、約１×１０11ＧＣ、約５×１０11ＧＣ、約１×１０12ＧＣ、約５×１０12ＧＣ若しくは約１．０×１０13ＧＣのような他の量である。
【００５８】
好ましくは生理学的に適合性の担体に懸濁されているｒＡＡＶをヒト若しくはヒト以外の哺乳動物患者に投与しうる。適する担体は、移入ウイルスが指図される適応症を鑑み当業者により容易に選択されうる。例えば、１つの適する担体は、多様な緩衝溶液と配合されうる食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）を包含する。他の例示的担体は滅菌食塩水、乳糖、ショ糖、麦芽糖および水を包含する。担体の選択は本発明の制限でない。場合によっては、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体（１種若しくは複数）に加え、保存剤若しくは化学的安定化剤のような他の慣習的製薬学的成分を含有しうる。
【００５９】
一態様において、本明細書に記述される組成物は腫瘍の増殖を遅らせる方法で使用される。なお別の態様において、本明細書に記述される組成物は被験体における腫瘍サイズを低減するために有用である。さらなる一態様において、本明細書に記述される組成物は非充実性腫瘍癌（ｎｏｎ−ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃａｎｃｅｒ）中の癌細胞の数を低減することにおいて有用である。別の態様において、本明細書で提供されるところの組成物は、患者における全生存および／若しくは無増悪生存の増大方法で使用される。例えば、下の実施例のデータは、試験された期間にわたる単独治療としての脳中の転移乳癌の生存率の３３％増大を示す。しかしながら、生存率のなおより控えめな増大が望ましいとみられる。抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物は、処置されるべき腫瘍を視野に入れて選択される。例えば、脳中の転移乳癌の処置のため、本明細書に記述されるところの組換えＡＡＶ中に抗ＨＥＲ抗体のための発現カセットを操作しうる。場合によっては、本明細書に記述されるところのＡＡＶ組成物を、付加的な外因性の薬理学的若しくは化学的剤または血液脳関門の他の物理的破壊の非存在下で投与する。
【００６０】
併用療法において、本明細書に記述されるＡＡＶに送達される免疫グロブリン構築物を、別の剤での治療を開始する前、間若しくは後、ならびにそのいずれかの組合せ、すなわち抗悪性腫瘍療法を開始する前および間、前および後、間および後若しくは前、間および後に投与する。例えば、該ＡＡＶは、放射線治療を開始する前１と３０日の間、好ましくは３と２０日の間、より好ましくは５と１２日の間に投与し得る。本発明の別の態様において、化学療法は、ＡＡＶに媒介される免疫グロブリン（抗体）療法と同時に若しくはより好ましくはその後に投与する。なお他の態様において、本発明の組成物は他の生物製剤、例えば組換えモノクローナル抗体薬、抗体−薬物複合物などと組合せうる。さらに、上で論考されるような多様なＡＡＶに送達される免疫グロブリン構築物の組合せをこうしたレジメンで使用しうる。
【００６１】
いかなる適する方法若しくは経路も、本明細書に記述されるところのＡＡＶを含有する組成物を投与するために、ならびに場合によっては抗悪性腫瘍薬および／若しくは他の受容体のアンタゴニストを共投与するために使用し得る。本発明により利用される抗悪性腫瘍薬レジメンは、患者の腫瘍の状態の処置に最適に適すると考えられるいかなるレジメンも包含する。多様な悪性病変が、患者ごとに決定されることができる特異的抗腫瘍抗体および特異的抗悪性腫瘍薬の使用を必要とし得る。投与経路は、例えば全身、経口、静脈内、腹腔内、皮下若しくは筋肉内投与を包含する。投与されるアンタゴニストの用量は、例えばアンタゴニストの種類、処置されている種類および重症度腫瘍、ならびにアンタゴニストの投与経路を包含する多数の因子に依存する。
【００６２】
以下の実施例は本明細書に記述される本発明に対する具体的説明のみでありかつ制限でない。
【００６３】
［実施例］
【実施例１】
【００６４】
ＧＦＰのＡＡＶ９に媒介される送達のＣＮＳ発現
ＧＦＰおよびｍＡｂの双方が、５×１０12ゲノムコピー（ｇｃ）／ｋｇのＣＭＶ若しくはＣＢ７いずれかのプロモーター下にＧＦＰ導入遺伝子を含有するＡＡＶ９ベクターの大槽内注入後にカニクイザルのＣＮＳで発現されている。１４日後に、マカクを剖検しかつ組織学および生体分布研究を実施した。剖検後組織学的分析は、大脳、小脳、脈絡叢、髄膜および脊髄前角におけるＧＦＰの広範なＣＳＮ発現を示した。
【００６５】
加えて、ＣＢ７プロモーターの制御下に２０１抗ＳＩＶイムノアドヘシン（２０１ＩＡ）導入遺伝子を含有する３×１０12ｇｃ／ｋｇのＡＡＶ９ベクターを大槽内注入し、そしてＣＳＦを定期的間隔で採取してイムノアドヘシンの濃度を測定した。ＣＳＦ中で発現される２０１ＩＡの生じるレベルは約６００ｎｇ／ｍＬで頂点に達し、約２５０ｎｍ／ｍＬで安定状態に達し、そして注入後１９８日に安定した状態を保った。
【００６６】
Ａ．２０１ＩＡ発現構築物
アカゲザル抗ＳＩＶ  ｍａｃ２５１  ｇｐ１２０  ＩｇＧ−２０１（Ｇｌａｍａｎｎら
Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９８；７４（１５）：７１５８−７１６３．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７４．１５．７１５８−７１６３．２０００．更新。）イムノアドヘシン（２０１ＩＡ）のコドン最適化されたヌクレオチド配列を、ＡＡＶ発現構築物中にクローン化した。該構築物はＡＡＶ２末端逆位配列により隣接され、そしてＣＢ７プロモーター、キメライントロンおよびウサギグロビンポリアデニル化配列を含有した（ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．２０１ＩＡ．ｒＢＧ）。
【００６７】
Ｂ．ＦｃＲｎ結合を廃止するための２０１ＩＡのＩ２５３Ａ突然変異
２０１ＩＡ遺伝子に相補的しかし重鎖アミノ酸配列のＩ２５３Ａ［配列番号２４はこの突然変異をもつＣＨ２．ＣＨ３フラグメントを提供する］若しくはＨ４５３Ａ［配列番号２３はこの突然変異をもつＣＨ２．ＣＨ３フラグメントを提供する］（Ｋａｂａｔの番号付け）に対応する突然変異を含有する、ヌクレオチド配列長さ７６８ｂｐを、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から得た。該配列はｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．２０１ＩＡ．ｒＢＧ中のものに一致するＰｓｔ１およびＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位により隣接された。該変異された配列を、製造元により記述されるとおり、示される酵素（ＮＥＢ）を使用する制限消化および連結（ＴａＫａＲａ  Ｉｎｃ．）によりｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．２０１ＩＡ．ｒＢＧに別個にクローン化した。サンガーシークエンシング（ＧｅｎｅＷｉｚ）を使用して、ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．２０１ＩＡ．ｒＢＧ［配列番号５（配列番号６はコードされる２０１ＩＡ配列に対応する）］、ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．２０１ＩＡ（Ｉ２５３Ａ）．ｒＢＧ［配列番号７（配列番号８をコードする）］およびｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．２０１ＩＡ（Ｈ４３５Ａ）．ｒＢＧ［配列番号９（配列番号１０をコードする］の相補性を、所望の突然変異のいずれの側でも確認した。
【００６８】
Ｂ．ＨＥＫ２９３細胞中でのＩＡ発現およびプロテインＡによる精製
３×１０8ＨＥＫ２９３細胞（２９３細胞）を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／
ストレプトマイシンで補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＣｅｌｌＧｒｏ）（ＤＭＥＭ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ）中で１０スタックＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に播種し、そして３７℃  ５％ＣＯ2で４８時間
インキュベートした。ＴＥ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中の１ｍｇのｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．２０１ＩＡ．ｒＢＧ若しくはｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．２０１ＩＡ（Ｉ２５３Ａ）．ｒＢＧを４２ｍＬの室温の抗生物質および血清を含まないＤＭＥＭで希釈した。１ｍｇ／ｍ
ＬおよびｐＨ７．１の２ｍＬのＰＥＩ−Ｍａｘ  ４０ｋＤａ、直鎖状（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、４２ｍＬの室温の抗生物質および血清を含まないＤＭＥＭで別個に希釈した。希釈されたＤＮＡおよび希釈されたＰＥＩを組合せそして室温で１５分間インキュベートした。ＤＮＡ−ＰＥＩ混合物を１Ｌ最終容量の抗生物質および血清を含まないＤＭＥＭに添加した。２９３Ｔ細胞を無菌ＰＢＳで２回洗浄した。該ＤＮＡ−ＰＥＩ  ＤＭＥＭ混合物を添加し、そして細胞とともに３７℃  ５％ＣＯ2で７２時間インキュベートした
。上清を収集し、そして３０００×ｇで１０分間遠心分離して細胞破片をペレットにした。上清をその後、製造元の説明書に従ってＣｅｎｔｒｉｋｏｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ−７０遠心式フィルターユニット（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。２０１ＩＡ若しくは２０１ＩＡ（Ｉ２５３Ａ）をその後、プロテインＡ抗体精製キット（Ｓｉｇｍａ）を使用して精製し、そしてＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。精製されたＩＡをその後、グリセロールを使用して１ｍｇ／ｍＬに希釈しかつ−２０℃で保存した。
【００６９】
Ｃ．ＩＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット分析
ＮｕＰａｇｅ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥを製造元の説明書に従って実施した。簡潔には、１μｇの２０１ＩＡ、２０１ＩＡ（Ｉ２５３Ａ）若しくは２０１ＩＡ（Ｈ４５３Ａ）を２９３上清から精製したか、または、組織内で以前に精製された２０１ＩＡを、ＮｕＰａｇｅ試料緩衝液およびＮｕＰａｇｅ還元剤と混合しかつ７０℃で１０分間加熱した。プレキャストＮｕＰａｇｅ  ４−１２％ビス−トリス１ｍｍアクリルアミドゲルに試料およびＭａｇｉｃＭａｒｋ  ＸＰウエスタンタンパク質標準（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を負荷し、そして１×ＮｕＰａｇｅ
ＭＯＰＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液中２００Ｖで１時間泳動した。Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）ＴｕｒｂｏTM  １×転写装置（ＢｉｏＲａｄ）を使用してタンパク質をＬＦ  ＰＶＤＦメンブレンに転写した。イオンリザーバースタックを１×Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）ＴｕｒｂｏTM（ＴＢＴ）転写緩衝液で２〜３分間濡らした。プレカットＬＦ  ＰＶＤＦメンブレンを透明まで１００％エタノールに浸漬し、その後１×ＴＢＴ緩衝液に２〜３分間移した。転写スタックを組み立て、そして１．３Ａおよび２５Ｖで７分間泳動した。該ＬＦ  ＰＶＤＦメンブレンを、１×ＮＥＴ緩衝液＋２％ゼラチン（二重蒸留されたＨ２Ｏ中５０ｍＭトリスＨＣＬ、ｐＨ７、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２％ゼラチン）中で穏やかな振とうを伴い一夜ブロッキングした。ビオチンに結合されたヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を１×ＮＥＴ＋２％ゼラチンで希釈し、そしてメンブレンとともに室温でインキュベートし、１×ＮＥＴで洗浄し、１×ＮＥＴ＋２％ゼラチンで希釈されたストレプトアビジン−ワサビペルオキシダーゼ（Ａｂｃａｍ）とともにインキュベートし、そして１×ＮＥＴで洗浄した。ウエスタンブロットを、製造元のプロトコルに従いＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して検出した。画像は、高解像度化学発光自動設定を伴うＢｉｏＲａｄ
ＣｈｅｍｉＤｏｃTM  ＭＰ画像装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して撮影した。
【００７０】
Ｄ．２０１ＩＡ  ＥＬＩＳＡ
全部の手順は別の方法で示されない限り室温で実施した。プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を使用してＢｉｏＴｅｋ  ４０５ＴＳマイクロプレート洗浄装置で洗浄した。ＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈されたｍａｃ２５１  ｇｐ１２０（Ｉｍｍｕｎｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．）を、Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）９６ウェルＥａｓｙＷａｓｈTM  ＥＬＩＳＡアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上４℃で一夜インキュベートした。プレートがその後、２０１ＩＡ  ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋５％熱不活性化ウシ胎児血清＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ＋０．０７％Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロッキングされた。希釈された試料をプレートに添加しかつプレートを２倍に最低４回希釈し
た。プレートを３７℃で１ｈインキュベートし、そして２０１ＩＡ  ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液中で再度ブロッキングした。プレートをその後、ＰＢＳで希釈されたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ−ビオチン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）、その後ＰＢＳで希釈されたストレプトアビジン−ワサビペルオキシダーゼ（Ａｂｃａｍ）とともにインキュベートした。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を使用してプレートを発色させた。Ｈ2ＳＯ4で発色反応を停止した後に、プレートを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｅｖｉｃｅｓ）プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで読み取った。
【００７１】
２０１ＩＡ若しくは２０１ＩＡ（Ｉ２５３Ａ）の同等な性能、ならびにこれら実施例に記述されるところの２９３細胞から精製された２０１（Ｈ４５３）および組織内で製造された２０１ＩＡ標準タンパク質の性能を、２０１ＩＡ  ＥＬＩＳＡにより確認した。各ＩＡを５０ｎｇ／ｍＬに希釈しかつ上述されたとおりアッセイした。標準として使用された２０１ＩＡは後に続くとおり製造した。ＲＡＧ  ＫＯマウスに、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．２０１ＩＡベクターを３×１０11ＧＣ／マウスあたりで静脈内注入し、そして眼窩出血を週１回８週間収集し、マウスを心出血により殺した（ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）。一般に群あたり５マウスが存在する。全部の収集された血清を一緒にプールし、そして上述されたとおりＳＩＧＭＡからのプロテインＡアフィニティーカラムに負荷する。一般に、精製された２０１ＩＡを１ｍｇ／ｍｌに希釈し、そして最終グリセロールがより良好な保存のため約２０％になるようにグリセロールを添加する。
【００７２】
Ｅ．ＡＡＶ９ベクター製造
ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．２０１ＩＡ．ｒＢＧおよびｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．２０１ＩＡ（Ｉ２５３Ａ）．ｒＢＧを、Ｍ．Ｌｏｃｋら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１０  Ｏｃｔ；２１（１）；１２５９−１２７１、オンライン公開２０１０年９月２４日に以前に記述されたとおり、２９３細胞の三重トランスフェクションによりＡＡＶ９キャプシドにパッケージングしかつ精製した。
【００７３】
Ｆ．マウスの脳および血清中の２０１ＩＡおよび２０１ＩＡ（Ｉ２５３Ａ）の発現
全部の動物は、研究における動物の管理と使用についてのＮＩＨおよびＵＳＤＡのガイドラインに従って飼養した。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドの６〜８週齢雌性Ｒａｇ１−／−（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ  ＃００２２１６）、ＦｃＲｎ−／−  Ｒａｇ１−／−（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ  ＃０１７７００）若しくはヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウス（ｍＦｃＲｎ−／−  ｈＦｃＲｎ＋／＋、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ  ＃０１６９１９）を得、そしてペンシルバニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）で飼育した。
【００７４】
ベクター投与のため、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．２０１ＩＡ．ｒＢＧ若しくはＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．２０１ＩＡ（Ｉ２５３Ａ）．ｒＢＧを無菌ＰＢＳで希釈した。静脈内（ＩＶ）投与のため、ベクターを１００μＬあたり１×１０10若しくは１×１０11ゲノムコピー（ＧＣ）に希釈した。脳室内（ＩＣＶ）投与のため、ベクターを１０μＬあたり１×１０10ＧＣ若しくは１×１０11ＧＣに希釈した。ＩＶ注入は尾静脈注入により実施し、およびＩＣＶ注入は、麻酔のイソフルオラン誘導（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ）後に、以前に記述された（Ｇｌａｓｃｏｃｋら  Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．２０１１  Ｏｃｔ  ３；（５６））とおりフリーハンドで実施した。血液を、第３、７、１４、２１、２８、４２、５６日、および２０１ＩＡ（Ｉ２５３Ａ）について第６０日若しくは２０１ＩＡについて第７６日の最終時点に、Ｚ−ＧｅｌTMマイクロチューブ血清分離装置（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）中への後眼窩出血により採取した。血液を室温で２０分間インキュベートし、その後５０００×ｇで５分間遠心分離した。血清を−８０℃で保ち、そして血清２０１ＩＡ濃度を測定するためにＤ部で上述された２０１
ＩＡ  ＥＬＩＳＡで使用した。
【００７５】
剖検で、マウスを無菌ＰＢＳ中１００ｍｇ／ｋｇケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇキシラジンで麻酔の脊髄面（ｓｐｉｎａｌ  ｐｌａｎｅ  ｏｆ  ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ）まで深く麻酔した。胸腔を露出させた。２０ゲージＡｎｇｉｏｃａｔｈTM  ＡｕｔｏｇｕａｒｄTM  ＩＶカテーテル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を心の左室に挿入し、そして右房に剪刀で刻み目を付けた。ヘパリン（１０Ｕ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を含む５０ｍＬのＰＢＳを、３０ｍＬ携帯型シリンジを使用して該ＩＶカテーテルを通し左室中にゆっくりと投与した。右房を出る液体は灌流処置の終了時に澄明であった。脳、肝および脾を取り出しかつドライアイス上で直ちに凍結した。脳組織抽出液を、凍結されたマウス脳を四分すること（１／４あたり（ｐｅｒ  ｑｕａｒｔｅｒ）約１００ｍｇ脳）およびそれらを１ｍＬの組織溶解緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎTM−Ｘ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）に浸漬することにより製造した。試料を、ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒTM（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してステンレス鋼製ビーズを用い３０Ｈｚで２分間均質化し、―８０℃で一夜凍結し、室温水浴中で融解し、そして１０Ｋ×ｇで４℃で１０分間遠心分離した。個別のマウス脳の４区分のそれぞれからの上清を組合せた。穏やかなボルテックス撹拌後に脳抽出液を分注しそして使用まで−８０℃で凍結した。希釈された脳抽出液を上述された２０１ＩＡ  ＥＬＩＳＡで使用して、脳中の２０１ＩＡ発現を確認した。
【００７６】
各Ｉ２５３ＡおよびＨ４３５Ａ  ２０１ＩＡ変異体の血清発現は、双方の試験された用量（１×１０10ＧＣ／マウス若しくは１×１０11ＧＣ／マウス）のｉｖ若しくはｉｃｖ双方の投与後に野生型２０１ＩＡ（標準）より有意により低かった。ＩＣＶ投与（１×１０11ＧＣ／マウス）後に試験された脳抽出液は野生型（標準）のものを超えるレベルの脳中のＩ２５３Ａ変異体の発現を示した。Ｈ４３５Ａ（１×１０11ＧＣ／マウス）の発現が観察された。
【００７７】
Ｇ．カニクイザルのＣＳＦおよび血清中の２０１ＩＡおよび２０１ＩＡ（Ｉ２５３Ａ）の発現
３〜５ｋｇの間の体重である４匹の３〜４年齢雌性カニクイザルを、研究における動物の管理と使用についてのＮＩＨおよびＵＳＤＡのガイドラインに従って、ペンシルバニア大学で１２時間の明／暗周期でステンレス鋼製ケージングに収容した。動物を試験の開始前７週馴化させた。サルに霊長類飼料（Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｄｉｅｔ）５０４９（ＰＭＩ  Ｆｅｅｄｓ  Ｉｎｃ．）を与えた。水は自動給水装置から任意に与えた。
【００７８】
ベクター投与の日に、動物を、筋肉内に（ＩＭ）与えられるケタミン（１０〜１５ｍｇ／ｋｇ）およびでデクスメデトミジン（０．０５〜０．１０ｍｇ／ｋｇ）を使用して麻酔した。動物の重量を測定しかつバイタルサインを記録した。頭部および頸椎の背部の上の毛を剃った。皮膚をベタジンで無菌的に準備処置した。頸部を、顎先が胸部にほとんど触れていたように屈曲させた（動物の気道を閉塞しないよう注意を払った）。頭蓋の背部の後頭隆起および環椎（Ｃ１）の翼（ｗｉｎｇｓ）を触診し、そして脊髄針若しくは通常針（２０〜２４ゲージ）をそれらの間の中ほどに挿入した。骨が遭遇された場合は針を前方若しくは後方に向け直した。一旦くも膜下腔中で、ＣＳＦを、それが針のハブ中に込み上がった際に重力流を介してシリンジ若しくは他の無菌容器中に収集した（２ｍＬまで）。吸引を針に適用しなかった。２ｍＬまでのベクター溶液を、０．５ｍＬ／分でシリンジポンプを使用して若しくは人的にゆっくりの一定のペースで注入した。針を除去し、そして直接の圧を穿刺部位に適用した。２匹のサルがＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．２０１ＩＡ．ｒＢＧ．Ｎ４０１を受領しかつ２匹がＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．２０１ＩＡ（Ｉ２５３Ａ）．ｒＢＧを受領した。用量は体重１キログラムあたり１．００×１０12ＶＧであった。
【００７９】
少なくとも２週ごとに１度、動物をバイタルサイン、臨床病理学および免疫学について監視した。血液および腰椎ＣＳＦを処置後第８および１５日に、その後月１回収集した。血清およびＣＳＦはおよそ−６５ないし−８０℃で保存した。２０１ＩＡ発現を上で示されたところの２０１ＩＡ  ＥＬＩＳＡにより評価した。動物の血液化学および血液プロファイルの変化を契約施設Ａｎｔｅｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．により監視した。
【００８０】
サルはそれらの試験期間の終了時に安楽死されることができる。動物は最初にケタミン（１０〜１５ｍｇ／ｋｇ）およびデクスメデトミジン（０．０５〜０．１０ｍｇ／ｋｇ）ＩＭで鎮静される。それらはペントバルビタール（８０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）を使用して安楽死される。死亡は心拍および呼吸の非存在により確認する。動物は死亡を保証するため放血されてもまたよい。収集される組織は組織病理学のため１０％中性緩衝ホルマリン中に置かれることができる。ゲノムコピー分析のため、組織試料をドライアイス上で直ちに凍結しかつ＜−６０℃で維持することができる。試料は凍結切片作成のためにＯＣＴ包埋媒体中で直接凍結させることができる。スライドを、ペンシルバニア大学の遺伝子治療プログラム細胞・形態学中核施設（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ）により調製することができる。他の適切な染色を試験病理学者の判断で使用してもよい。
【実施例２】
【００８１】
トラスツズマブを発現するＡＡＶ９の製造
乳癌脳転移の十分に公表されたマウス異種移植モデルを使用して、ＣＮＳで発現されるトラスツズマブが生存を延長若しくは腫瘍量を軽減するかどうかを確認する［Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ａｒａｎｄａ  Ａら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｈｅｍｏｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ．２０１３；１４：８３０６−８３２７］。ＨＥＲ２陽性ヒトＢＴ４７４乳管癌細胞をルシフェラーゼでトランスフェクトし、そしてヌードマウスの脳実質に定位注入する。腫瘍サイズを発光強度により監視することができる。腫瘍が１０ｍｍ2に増殖する場合
に、マウスに、トラスツズマブ導入遺伝子を運搬する変動する濃度のＡＡＶ９ベクターを脳室内注入することができる。
【００８２】
該導入遺伝子は、トラスツズマブの軽および重可変鎖の公表された配列をコードする配列番号１に今や提供されるコドン最適化された核酸配列をＩｇＧ発現カセット中にクローン化することにより創成する。第ＷＯ２０１５／０１２９２４号明細書（本明細書に引用することにより組み込まれる）に記述される定常領域アミノ酸配列を使用し得る。例えば、トラスツズマブのマウスｍＡｂ前駆体のヒト化を記述するＣａｒｔｅｒ  Ｐら、Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｐ１８５ＨＥＲ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９２  Ｍａｙ  １５；８９（１０）：４２８５−９を参照されたい。これらのアミノ酸配列は、２０１３年に質量分析によりシークエンスされた臨床生成物のもの［Ｇａｈｏｕａｌ  Ｒら、Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉ−ｌｅｖｅｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｕｓｉｎｇ  ｓｈｅａｔｈｌｅｓｓ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ−ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．ＭＡｂｓ．２０１３  Ａｐｒ  ５；５（３）。［印刷に先立つ電子出版（Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）］に正確に一致する。ベクターの注入後、腫瘍サイズおよびマウス生存を３０日間監視することができる。剖検で、腫瘍の病理学的検査を実施することができ、そして脳抽出液のＥＬＩＳＡによるトラスツズマブ発現のレベルを測定することができる。本明細書に記述されるベクターおよび方法は、延長された生存、無増悪生存ならびに／または腫瘍量の軽減および／若しくは安定
化を提供するはずである。
【００８３】
Ａ．トラスツズマブ発現構築物
トラスツズマブの重および軽鎖のＷＨＯ公表されたヌクレオチド配列に一致する配列をＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から得た。軽鎖配列はＥｃｏＲＶおよびＢｓｉＷ１制限部位により隣接され、そして重鎖配列はＸｂａ１およびＳａｌ１制限部位により隣接され［該核酸配列は、トラスツズマブ重鎖可変（配列番号１２）、重鎖定常（配列番号１３）、軽鎖可変（配列番号１４）、κ鎖（配列番号１５）およびＡｍｐ−Ｒ（配列番号１６）をコードする配列番号１１に提供されている］、こうしてトラスツズマブ重および軽鎖を含有するプラスミドの配列を提供する。
【００８４】
重および軽鎖配列を、既知のクローン化技術を使用する制限消化（ＮＥＢ）および連結（ＴａＫａＲａ  Ｉｎｃ．）を使用してＡＡＶ発現構築物にクローン化した。該重および軽鎖配列はＦ２Ａ自己切断ペプチドにより相互から分離された。該構築物はＡＡＶ２末端逆位配列により隣接され、そしてＣＭＶ前初期プロモーター、キメライントロンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有し、ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＣＩ．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ．ＳＶ４０と呼ばれた［配列番号１７、トラスツズマブ重鎖可変、重鎖定常、軽鎖可変、κ鎖（それぞれ配列番号１８−２１）をコードする）］。
【００８５】
Ｂ．ＨＥＫ２９３細胞中のトラスツズマブ発現およびプロテインＡによる精製
３×１０8ＨＥＫ２９３細胞［ＡＴＣＣから得られた］を、１０スタックＣｅｌｌＳＴ
ＡＣＫ（登録商標）中でＤＭＥＭ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ中３７℃  ５％ＣＯ2で４８時間播
種した。１ｍｇのｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＣＩ．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ．ＳＶ４０（Ａ部に記述された）を４２ｍＬの室温の抗生物質および血清を含まないＤＭＥＭで希釈した。１ｍｇ／ｍＬかつｐＨ７．１の２ｍＬのＰＥＩ−Ｍａｘ  ４０ＫＤａ、直鎖状（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、４２ｍＬの室温の抗生物質および血清を含まないＤＭＥＭで別個に希釈した。希釈されたＤＮＡおよび希釈されたＰＥＩを組合せそして室温で１５分間インキュベートした。該ＤＮＡ−ＰＥＩ混合物を１Ｌの最終容量の抗生物質および血清を含まないＤＭＥＭに添加した。２９３細胞を無菌ＰＢＳで２回洗浄し、そして細胞をその後ＤＮＡ−ＰＥＩ  ＤＭＥＭ混合物とともに７２時間インキュベートした。上清を収集し、３０００×ｇで１０分間遠心分離して細胞破片をペレットにし、そして製造元の説明書に従い、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ−７０遠心式フィルターユニット（ＥＭＤ
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。トラスツズマブをその後、プロテインＡ抗体精製キット（Ｓｉｇｍａ）を使用して精製し、そしてＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。精製されたトラスツズマブを、グリセロールを使用して１ｍｇ／ｍＬに希釈しかつ−２０℃で保存した。
【００８６】
Ｃ．ＩＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット分析
ＮｕＰａｇｅ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥを製造元の説明書に従って実施した。簡潔には、本実施例のＢ部に記述されたとおり２９３上清から精製された１μｇのトラスツズマブ、若しくはＰＢＳに再懸濁されたトラスツズマブ臨床生成物（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ、ＨＵＰ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）を、ＮｕＰａｇｅ試料緩衝液およびＮｕＰａｇｅ還元剤と混合しかつ７０℃で１０分間加熱した。プレキャストＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４−１２％勾配ビス−トリス（中性のｐＨ）１ｍｍアクリルアミドゲルに試料およびＭａｇｉｃＭａｒｋTM  ＸＰウエスタンタンパク質標準（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を負荷し、そして１×ＮｕＰａｇｅ（登録商標）３−モルホリノプロパン−１−スルホン酸（ＭＯＰＳ）ＳＤＳ泳動緩衝液中２００Ｖで１時間泳動した。Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）ＴｕｒｂｏTM  １×転写システム（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、タンパク質を低蛍光（ＬＦ）フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンに転写した。イオンリザーバースタックを１×Ｔｒａｎｓ−Ｂ
ｌｏｔ（登録商標）ＴｕｒｂｏTM（ＴＢＴ）転写緩衝液で２〜３分間濡らした。プレカットＬＦ  ＰＶＤＦメンブレンを透明まで１００％エタノールに浸漬し、その後１×ＴＢＴ緩衝液に２〜３分間移した。転写スタックを組み立て、そして１．３Ａおよび２５Ｖで７分間泳動した。該ＬＦ  ＰＶＤＦメンブレンを、１×ＮＥＴ緩衝液＋２％ゼラチン（二重蒸留Ｈ2Ｏ中５０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭエチレンジ
アミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ｐＨ８、０．０５％ＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００（ＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００は親水性ポリエチレンオキシド鎖および芳香族炭化水素親油すなわち疎水性基を有する非イオン性界面活性剤であり）、２％ゼラチン）中で穏やかな振とうを伴い一夜ブロッキングした。ビオチンに結合されたヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を１×ＮＥＴ＋２％ゼラチンで希釈し、そしてメンブレンと室温でインキュベートし、１×ＮＥＴで洗浄し、１×ＮＥＴ＋２％ゼラチンで希釈されたストレプトアビジン−ワサビペルオキシダーゼ（Ａｂｃａｍ）とインキュベートし、そして１×ＮＥＴで洗浄した。ウエスタンブロットを、製造元のプロトコルに従いＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して検出した。画像は、高解像度化学発光自動設定を伴うＢｉｏＲａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃTM  ＭＰ画像システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して撮影した。
【００８７】
Ｄ．ベクター製造
ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＣＩ．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ．ＳＶ４０は２９３細胞の三重トランスフェクションによりＡＡＶ９キャプシドにパッケージングし、そして以前に記述された（Ｌｏｃｋら、２０１０、上で引用される）とおり精製した。
【００８８】
Ｅ．トラスツズマブＥＬＩＳＡ
トラスツズマブのミモトープのＥＬＩＳＡを、以前に記述された（Ｊｉａｎｇら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ｆｅｂ  １１；２８０（６）：４６５６−６２．電子出版（Ｅｐｕｂ）２００４年１１月９日）とおり開発した。全部の段階は別の方法で述べられない限り室温で実施した。プレートをＢｉｏＴｅｋ  ４０５ＴＳマイクロプレート洗浄装置で洗浄した。トラスツズマブが結合するＨＥＲ２のエピトープのペプチドミモトープＬＬＧＰＹＥＬＷＥＬＳＨ［配列番号２２］を該ミモトープから得、ＤＭＳＯに再懸濁しかつ−８０℃で保存した。Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）９６ウェルＥａｓｙＷａｓｈTM  ＥＬＩＳＡアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、１００ｍＭ重炭酸塩溶液（ｐＨ９．６）中１μｇ／ｍＬのＬＬＧＰＹＥＬＷＥＬＳＨ［配列番号２２］で被覆し、４℃で一夜インキュベートし、そしてトラスツズマブＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液（ＴＥＢ、ＰＢＳ＋５％ウシ血清アルブミン＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ＋０．０７％Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロッキングした。試料をＴＥＢで希釈しかつプレーティングし、ＴＥＢでＥＬＩＳＡプレートを２倍に希釈しかつインキュベートした。プレートをその後、ＴＥＢで希釈されたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ−ビオチン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）、次いでＴＥＢで希釈されたストレプトアビジン−ワサビペルオキシダーゼ（Ａｂｃａｍ）とインキュベートした。プレートをＴＭＢ基質で発色させ、２Ｎ  Ｈ2ＳＯ4で停止し、その後ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで読み取った。
【００８９】
Ｆ．マウスの脳および血清中の２０１ＩＡおよび２０１ＩＡ（Ｉ２５３Ａ）の発現
Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドの６〜８週齢雌性Ｒａｇ１−／−マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ  ＃００２２１６）を得かつペンシルバニア大学で飼育し、そして研究における動物の管理と使用についてのＮＩＨおよびＵＳＤＡのガイドラインに従って飼養した。
【００９０】
ベクター投与のため、ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＣＩ．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ．ＳＶ４０を
無菌ＰＢＳで希釈した。静脈内（ＩＶ）投与のため、ベクターを１００μＬあたり１×１０10若しくは１×１０11ＧＣに希釈した。脳室内（ＩＣＶ）投与のため、ベクターを１０μＬあたり１×１０10若しくは１×１０11ＧＣに希釈した。ＩＶ注入は尾静脈注入により実施し、およびＩＣＶ注入は以前に記述された（Ｇｌａｓｃｏｃｋら）とおり麻酔のイソフルオラン誘導後にフリーハンドで実施した。血液を、ベクター投与後第３、７、１４、２１、２８、４２、５６および６０日に、Ｚ−Ｇｅｌマイクロチューブ血清分離装置（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）中への後眼窩出血により採取した。血液を室温で２０分間インキュベートし、その後５０００×ｇで５分間遠心分離した。血清を−８０℃で保ち、そして血清トラスツズマブ濃度を測定するために上述されたトラスツズマブＥＬＩＳＡで使用した。
【００９１】
剖検で、マウスを無菌ＰＢＳ中１００ｍｇ／ｋｇケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇキシラジンで麻酔の脊髄面まで深く麻酔した。胸腔を露出させた。２０ゲージＡｎｇｉｏｃａｔｈTM  ＡｕｔｏｇｕａｒｄTM  ＩＶカテーテル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を心の左室に挿入し、そして右房に剪刀で刻み目を付けた。ヘパリン（１０Ｕ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を含む５０ｍＬのＰＢＳを、３０ｍＬ携帯型シリンジを使用して該ＩＶカテーテルを通し左室にゆっくりと投与した。右房を出る液体は灌流処置の終了時に澄明であった。脳、肝および脾を取り出しかつドライアイス上で直ちに凍結した。
【００９２】
脳組織抽出液を、凍結されたマウス脳を四分すること（１／４あたり約１００ｍｇ脳）およびそれらを１ｍＬの組織溶解緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）に浸漬することにより製造した。試料を、ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）上でステンレス鋼製ビーズを用い３０Ｈｚで２分間均質化し、−８０℃で一夜凍結し、室温水浴中で融解し、そして１０Ｋ×ｇで４℃で１０分間遠心分離した。単一マウス脳の４区分のそれぞれからの上清を組合せた。穏やかなボルテックス撹拌後に、脳抽出液を分注しそして使用まで−８０℃で凍結した。希釈された脳抽出液を上のトラスツズマブＥＬＩＳＡで使用して、脳トラスツズマブ濃度を測定した。
【００９３】
これらのデータは、実験の持続期間（６０日）の間の静脈内ベクター送達後のＲａｇ１−／−マウスの血清中の１０００μｇ／ｍＬ超の定常状態の発現レベルを示す。ＩＣＶベクター投与を受領するマウスについて、７５０μｇ／ｍＬ超の定常状態の発現レベルが実験の持続期間（６０日）の間観察される。これらの量は治療効果を提供することができるレベルの発現を示すと考えられる。
【００９４】
脳の研究は、１×１０10および１×１０11静脈内ベクターを受領するものについて、試験マウスにおける約１２００ないし約１８００μｇのトラスツズマブの間の濃度を示した。ｉｖ送達についてこれらの投薬量レベル間で何らかの有意差が存在するように思われなかった。同一用量で、より大きな変動が、ＩＣＶを介してこれらの濃度で送達されたベクターについて観察された。該濃度は約１０００μｇから約２５００μｇまで変動した。
【００９５】
Ｇ．ホタルルシフェラーゼを発現するＨＥＲ２＋  ＢＴ４７４−Ｍ１乳癌細胞株の生成
継代２７のＨＥＲ２＋ＢＴ４７４．Ｍ１ヒト乳管癌細胞はＬｏｕｉｓ  ＣｈｏｄｏｓｈとＪａｓｏｎ  Ｒｕｔｈから恵与された。［ＢＴ４７４．ＭＩ細胞はカリフォルニア太平洋医療センター（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）から得ることができるＢＴ４７４のサブクローンであり；Ｓｉ  Ｔｕｅｎ  Ｌｅｅ−Ｈｏｅｆｌｉｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｊｕｌｙ  １５、２００８  ６８；５８７８。］細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンで補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌｇｒｏ）（ＤＭＥＭ／Ｆ１２  ｃｏｍｐｌｅｔｅ）中、Ｔ７５組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で増殖させた。ＶＳＶＧ．ＨＩＶ．ＳＩＮ．ｃＰＰＴ．ＣＭＶ．ｆｆ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ．ＷＰＲＥレンチウイ
ルスベクターをＰｅｎｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅから得た［Ｅ．Ｃｏｐｒｉｎｉら、Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ａｕｇ  ２０１０、２（８）：１５７７−１５８８。］ＢＴＢ４７４−Ｍ１細胞が６０〜７０％コンフルエントになった場合に、培地を吸引し、細胞を無菌ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理しかつ計数した。２ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２  ｃｏｍｐｌｅｔｅ中の２．５×１０5細胞を６ウェル組織培養処理済みプレート（Ｆａｌｃｏｎ）のウェ
ルに添加し、そして３７℃  ５％ＣＯ2で一夜インキュベートした。ベクターを、抗生物
質および血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２で３．５×１０8ＶＧ／ｍＬに希釈し、そして
５回の２倍連続希釈を調製した。６種のベクター希釈の１ｍＬを、ＰＢＳ洗浄されたＢＴ４７４−Ｍ１細胞および１ｍＬの抗生物質および血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２を含有する６ウェルプレートの対応するウェルに添加した。プレートを３７℃  ５％ＣＯ2で４
８時間インキュベートした。培地を吸引しそしてＤＭＥＭ／Ｆ１２  ｃｏｍｐｌｅｔｅで置き換えた。細胞病理は顕微鏡検査により示されなかった。別の７２時間後に、最高濃度のベクターを受領した３ウェル中の細胞を無菌ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、混合し、そしてＴ７５フラスコ中、ＤＭＥＭ／Ｆ１２  ｃｏｍｐｌｅｔｅ中で培養した。３７℃  ５％ＣＯ2で７２時間後に、細胞をトリプシン処理しかつ２００μＬのＤＭＥＭ／Ｆ
１２  ｃｏｍｐｌｅｔｅあたり１細胞の濃度に希釈した。ウェルあたり２００μＬの細胞懸濁液を９６ウェル組織培養処理済みプレート（Ｆａｌｃｏｎ）にプレーティングし、そして３７℃  ５％ＣＯ2で６週間インキュベートした。培地を２週ごとに変えた。プレー
ティング２週後に、クローン細胞の単一コロニーを含むウェルが顕微鏡検査により示された。ウェルがクローン細胞の単一クラスターで７０％コンフルエントとなった場合に、１５クローンを、２４ウェルプレート中、その後６ウェルプレート、その後Ｔ２５組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の７０〜８０％コンフルエンシーへのさらなる増殖のため選択した。細胞の形態学を親ＢＴ４７４．Ｍ１細胞株と比較しそして同等であることが示された。
【００９６】
細胞のルシフェラーゼ活性を、製造元の説明書のＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）レポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。ＤＮＡはＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞から単離した。最高の発光を伴う５クローン中の細胞あたりのルシフェラーゼのコピー数を、プローブとしてレンチウイルスパッケージングシグナルを使用するＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により測定した［Ａ  Ｈａｃｈｉｙａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、Ａｐｒ  ２００７；１４（８）：６４８−６５６、電子出版２００７年２月１日（Ｅｐｕｂ
２００７  Ｆｅｂ１）］。異種移植実験のため選ばれたクローンを継代数５２まで増殖させ、そして５％ＤＭＳＯおよび２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で液体窒素中に凍結保存した。
【００９７】
Ｈ．Ｒａｇ１−／−マウスにおけるＨＥＲ２＋乳癌脳転移の異種移植モデル
本実施例のＧ部に記述されるとおり製造されたＢＴ４７４−Ｍ１．ｆｆｌｕｃ細胞を融解し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２  ｃｏｍｐｌｅｔｅで洗浄し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２  ｃｏｍｐｌｅｔｅ中３７℃  ５％ＣＯ2でＴ１７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で増殖させ、そして
腫瘍細胞移植の最低１週前に１回継代した。注入の日に、継代５３の細胞を７０％〜８０％コンフルエンシーでトリプシン処理し、そして血球計数器を使用して計数した。細胞を１０００×ｇで３分間遠心分離しそして無菌ＰＢＳで洗浄した。再度遠心分離した後に、細胞を１×１０5細胞／１μＬで無菌ＰＢＳに再懸濁しかつ注入まで氷上に保存した。腫
瘍細胞注入手順のため、マウスを無菌ＰＢＳ中１００ｍｇ／ｋｇケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇキシラジンの腹腔内（ＩＰ）注入により麻酔して麻酔の脊髄面を誘導した。眼軟膏をマウスの眼に適宜塗布した。毛を電気バリカンを使用してマウスの頭の頂上から剪断した。エストロゲンペレット（１．６ｍｇ、６０日放出）を、露出された皮膚を最初にポビドンヨードその後７０％エタノールで消毒することにより皮下に移植した。胸椎を覆う皮膚中の小型切開を作成し、そして皮膚および下にある筋膜を平滑に（ｂｌｕｎｔｌｙ）切
開した。エストロゲンペレットを皮下に移植し、そして切開を４．０  ｖｉｃｒｙｌで縫合した。次に、マウスをその後定位装置に固定した。頭蓋上の露出された皮膚をポビドンヨード次いで７０％エタノールで清浄にした。前後方切開およそ１ｃｍ長を、２２替刃メスで頭蓋の頂上の上に作成した。十字縫合を特定した。空気ドリルの位置を十字縫合に定めそして座標を書き留めた。ドリル点を十字縫合の−０．８ｍｍ前後方、＋２．２ｍｍ内外方向に動かし、そしてバーホールを脳実質が達せられるまで突き通した。ドリルを定位装置から取り外し、そして１０μＬハミルトンシリンジを１μＬの細胞懸濁液で負荷した。針の位置を装置上で定め、十字縫合にもたらし、そして上で示された座標に動かした。針をバーホール上の正確な位置決めに関して確認し、そして座標を、十字縫合の−４．０ｍｍ  ＤＶ、その後＋１．０ｍｍ貫入する前に相応して調節した。１μＬの細胞懸濁液を５分にわたり注入した。針を注入後５分間正しい位置に残し、その後ゆっくりと除去した。マウスを定位装置から取り外し、そして４．０  ｖｉｃｒｙｌを使用して頭蓋上の切開を縫合した。マウスを、３７℃に設定された加熱パッドの上のクリーンケージに入れた。麻酔から回復した後、マウスに、無菌ＰＢＳ中の０．３ｍｇ／ｋｇブプレノルフィンと一緒に無菌ＰＢＳ中の１００μＬの１５ｍｇ／ｋｇエンロフロキサシン（Ｂａｙｅｒ）を皮下に与えた。マウスは処置後２日間エンロフロキサシンを皮下に受領した。
【００９８】
腫瘍の増殖を、生物発光画像法（ＢＬＩ）を使用して３〜４日ごとに監視した。マウスに、最初に無菌ＰＢＳ中１５０ｍｇ／ｋｇルシフェリン、その後５分後にＰＢＳ中１００ｍｇ／ｋｇケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇキシラジンをＩＰ注入した。麻酔を投与した５〜１０分後に、マウスをＩＶＩＳ  Ｘｅｎｏｇｅｎ画像化装置を使用して画像検査した。生物発光を少なくとも５秒間測定した。発光する腫瘍に対応する関心領域（ＲＯＩ）を、ＲＯＩの周囲にゲートを描くことにより測定した。発光は光量子／秒で報告した。剖検で、マウスをＣＯ２への過剰曝露次いで頸部脱臼により安楽死させた。脳を取り出し、そしてホルマリン次いで７０％エタノール中で保存し、そして切片作成のためパラフィン中に包埋した。ヘマトキシリンおよびエオシンならびにルシフェリン免疫染色を実施した。肝および脾もまたベクターゲノムの体内分布分析のため剖検で採取した。
【００９９】
Ｉ．乳癌脳転移の異種移植モデルの予防的処置
６〜８週齢雌性Ｒａｇ１−／−マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ  ＃００２２１６）を、１×１０11ＶＧのＡＡＶ９．ＣＭＶ．ＣＩ．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ．ＳＶ４０（ｎ＝９）、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．２０１ＩＡ．ｒＢＧ（ｎ＝１０）若しくは処置なし（ｎ＝５）のＩＣＶ注入で、腫瘍移植２１日前に処置した。腫瘍を移植しかつ生物発光を上で示されたとおり測定した。血液をベクター注入後Ｄ２０、３６、６２および７２にマウスから後眼窩採取して、ＣＮＳトラスツズマブ発現の代理物として血清トラスツズマブを測定した。１×１０8光量子／秒の腫瘍ＢＬＩに達した後に、マウスを毎日監視し、そし
て嗜眠、背を丸めること（ｈｕｎｃｈｉｎｇ）、麻痺、神経学的欠陥若しくは痙攣を包含する神経学的障害若しくは重大な病的状態と定義される臨床エンドポイントで殺す。
【０１００】
図２は、１×１０11ＧＣ  ＩＣＶのＡＡＶ９．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ若しくはＡＡＶ９．２０１ＩＡを予防的に与えられ、その後ベクター投与２１日後にＢＴ４７４−Ｍ１．ｆｆｌｕｃ腫瘍細胞を脳中に移植されたマウスの生存曲線を提供する。この曲線は腫瘍移植後９９日の結果を反映する。２０１ＩＡ群（偽似処置）の生存中央値は６６日であることが示される一方、ＡＡＶ９．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂで処置された群の生存中央値は９９日すなわち生存率の３３％増加である。
【０１０１】
Ｒａｇ１−／−マウスにおいてｉｖおよびｉｃｖ送達されるところのＡＡＶ９．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの体内分布を評価した。ｉｖおよびｉｃｖ送達されるベクター双方について１×１０10ＧＣという用量で、比較的低レベルのベクターゲノムが肝若しくは脳いずれでも観察される。より高用量（１×１０11ＧＣ）で、有意により高レベルのベクターが
双方の送達方法について肝で見出される一方、脳中の有意により高レベルがｉｃｖ投与を受領する動物でのみ見出される。このベクターが組織非特異的プロモーターを含有したことは注目すべきである。安全性の懸念は、肝での発現を最小限にするために、脳の細胞および場合によっては他の神経細胞若しくは中枢神経系の細胞を特異的に標的とする組織特異的プロモーターの使用を介して低減させうる。あるいは、肝での発現は、他器官への乳癌転移を予防若しくは制御するためにトラスツズマブの全身送達に有益でありうる。
【０１０２】
Ｊ．ＮＳＧマウスを使用するＢＴ４７４−Ｍ１乳癌脳転移の研究に適する代替マウスモデル
６〜８週齢雌性ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ  ＃００５５５７）をペンシルバニア大学で飼育した。腫瘍を、腫瘍細胞の調製および注入技術に対する以下の変更を伴い上で示されたとおり移植した。腫瘍細胞は、５０％ＭａｔｒｉＧｅｌ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）／５０％無菌ＰＢＳに５μＬあたり１×１０5細胞で再懸濁した。注入
量を１μＬから５μＬに増大した。脳実質中で針の位置を定めた後に、注入を開始する前に５分が経過した。注入は１０分にわたりゆっくりと実施し、そしてシリンジを除去前に正しい位置に５分残した。マウスを監視し、そして生物発光を本文書の別の場所に示されるとおり測定した。該データは腫瘍細胞の脳中への成功裏の生着を示した。腫瘍増殖の速度を評価して、このモデルが脳への乳癌転移の研究に望ましいかどうかを決定することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０３】
以下の情報は数字見出し＜２２３＞にフリーテキストを含有する配列について提供される。
【０１０４】
【表１】
2020079293.tif 000002
【０１０５】
【表２】
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【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
【表４】
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【０１０８】
【表５】
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【０１０９】
【表６】
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【０１１０】
【表７】
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【０１１１】
【表８】
2020079293.tif 000009
【０１１２】
本出願は引用することによりここに組み込まれる配列および配列表を含有する。４月２５日、２０１４５出願の米国仮出願第６１／９８４，６４６号明細書、ならびに本出願に引用される全部の刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物若しくは特許出願が引用することにより組み込まれることを特別にかつ個別に示されたかのようにそっくりそのまま引用することによりここに組み込まれる。前述の発明は理解の明快さの目的上具体的説明および例としていくぶん詳細に記述されたとは言え、ある種の変更および改変が、付属として付けられる請求の範囲の技術思想若しくは範囲から離れることなくそれになされ得ることが、本発明の教示に照らして当業者に容易に明らかであろう。
【図１】
2020079293.tif 000010
【図２】
2020079293.tif 000011
【配列表】
2020079293000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月7日(2020.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に開示された発明の範囲内にある技術的主題。
【外国語明細書】
2020079293000001.pdf