(57)【要約】【課題】ヒト外挿性の高い評価を可能にする脳血管モデルを提供すること。【解決手段】解繊された細胞外マトリックス成分と、脳毛細血管内皮細胞、周皮細胞、及び星状膠細胞を含む細胞とを含み、前記細胞の少なくとも一部が前記解繊された細胞外マトリックス成分に接着している三次元組織体からなる、脳血管モデル。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
解繊された細胞外マトリックス成分と、脳毛細血管内皮細胞、周皮細胞、及び星状膠細胞を含む細胞とを含み、前記細胞の少なくとも一部が前記解繊された細胞外マトリックス成分に接着している三次元組織体からなる、脳血管モデル。
【請求項２】
前記解繊された細胞外マトリックス成分が、解繊されたコラーゲン成分である、請求項１に記載の脳血管モデル。
【請求項３】
前記三次元組織体がフィブリンを更に含む、請求項１又は２に記載の脳血管モデル。
【請求項４】
水性媒体中において、解繊された細胞外マトリックス成分と、脳毛細血管内皮細胞、周皮細胞、及び星状膠細胞を含む細胞と、を接触させる接触工程、並びに、
前記解繊された細胞外マトリックス成分が接触した前記細胞を培養する培養工程を備える、脳血管モデルの製造方法。
【請求項５】
前記解繊された細胞外マトリックス成分が、解繊されたコラーゲン成分である、請求項４に記載の脳血管モデルの製造方法。
【請求項６】
前記接触工程が、フィブリン存在下で行われる、請求項４又は５に記載の脳血管モデルの製造方法。
【請求項７】
ウェルが少なくとも一つ設けられたプレートと、前記ウェル内に配置され、自己組織化により形成された脳血管モデルと、を含む、デバイス。
【請求項８】
前記脳血管モデルが、解繊された細胞外マトリックス成分と、脳毛細血管内皮細胞、周皮細胞、及び星状膠細胞を含む細胞とを含み、前記細胞の少なくとも一部が前記解繊された細胞外マトリックス成分に接着している三次元組織体からなる、請求項７に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳血管モデル及びデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液脳関門（ＢＢＢ）は、血液と中枢神経系との物質交換を制限するバリア機構である。脳血管は、周皮細胞（ペリサイト：ＢＰＣ）と、星状膠細胞（アストロサイト：ＡＳＴＲ）で裏打ちされた脳毛細血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）からなる複雑なチューブ形態であり、この強固なバリア機構（ＢＢＢ）により、物質の流入はトランスポーターによる輸送に限定される。中枢神経系の創薬では、候補化合物がＢＢＢを通過して脳へ到達する必要があるが、ヒトにおける脳内移行性を予測するモデルは存在せず、これが中枢神経薬の開発を他の疾患領域と比べて格段に困難にしている大きな原因となっている。脳内移行性を予測するモデルについてはこれまでにも種々の報告がなされている（例えば、非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｍａｒｃｏ  Ｃａｍｐｉｓｉ，ｅｔ  ａｌ．，“３Ｄ  ｓｅｌｆ−ｏｒｇａｎｉｚｅｄ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，  ｐｅｒｉｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ”Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１８，１８０，１１７−１２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
非臨床探索段階でヒト外挿性の高い評価が可能になる等の観点から、脳血管ネットワークを生体外でモデル化した三次元組織体の構築が望まれている。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ヒト外挿性の高い評価を可能にする脳血管モデルを提供することを目的とする。本発明はまた、脳血管モデルを用いたデバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、以下に示す発明によって、上記課題が解決できることを見出した。
［１］解繊された細胞外マトリックス成分と、脳毛細血管内皮細胞、周皮細胞、及び星状膠細胞を含む細胞とを含み、前記細胞の少なくとも一部が前記解繊された細胞外マトリックス成分に接着している三次元組織体からなる、脳血管モデル。
［２］前記解繊された細胞外マトリックス成分が、解繊されたコラーゲン成分である、［１］に記載の脳血管モデル。
［３］前記三次元組織体がフィブリンを更に含む、［１］又は［２］に記載の脳血管モデル。
［４］水性媒体中において、解繊された細胞外マトリックス成分と、脳毛細血管内皮細胞、周皮細胞、及び星状膠細胞を含む細胞と、を接触させる接触工程、並びに、前記解繊された細胞外マトリックス成分が接触した前記細胞を培養する培養工程を備える、脳血管モデルの製造方法。
［５］前記解繊された細胞外マトリックス成分が、解繊されたコラーゲン成分である、［４］に記載の脳血管モデルの製造方法。
［６］前記接触工程が、フィブリン存在下で行われる、［４］又は［５］に記載の脳血管モデルの製造方法。
［７］ウェルが少なくとも一つ設けられたプレートと、前記ウェル内に配置され、自己組織化により形成された脳血管モデルと、を含む、デバイス。
［８］前記脳血管モデルが、解繊された細胞外マトリックス成分と、脳毛細血管内皮細胞、周皮細胞、及び星状膠細胞を含む細胞とを含み、前記細胞の少なくとも一部が前記解繊された細胞外マトリックス成分に接着している三次元組織体からなる、［７］に記載のデバイス。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ヒト外挿性の高い評価を可能にする脳血管モデルを提供することが可能となる。本発明の脳血管モデルは、ヒトＢＭＥＣ、ＢＰＣ及びＡＳＴＲで構成され、チューブ構造を有し、トランポーターの発現が確認され、スループットが高く、灌流培養が可能である。本発明によれば、脳血管モデルを用いたデバイスを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ヒト株化細胞を用いて作製した脳血管モデルのＣＤ３１染色による観察結果を示す顕微鏡写真である。
【図２】三次元組織体の凍結切片のＣＤ３１染色による蛍光観察結果を示す写真である。
【図３】免疫染色による脳血管モデルのタンパク質発現の確認結果を示す図である。
【図４】ウエスタンブロットによる脳血管モデルのタンパク質発現の確認結果を示す図である。
【図５】ｉＰＳ細胞由来ｉＢＭＥＣを用いて作製した脳血管モデルのＣＤ３１染色による観察結果を示す顕微鏡写真である。
【図６】下部に開口を有する脳血管モデルを示す模式図である。
【図７】下部に開口を有する脳血管モデルのＣＤ３１染色による観察結果を示す顕微鏡写真である。
【図８】下部に開口を有する脳血管モデルの観察結果を示す写真である。
【図９】ＦＤ−２０００ｋＤａの添加による脳血管モデルの効果の確認結果を示す図である。
【図１０】解繊されたコラーゲン成分の分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１０】
＜脳血管モデル＞
一実施形態に係る脳血管モデルは、解繊された細胞外マトリックス成分と、脳毛細血管内皮細胞、周皮細胞、及び星状膠細胞を含む細胞とを含み、細胞の少なくとも一部が解繊された細胞外マトリックス成分に接着している三次元組織体からなる。当該脳血管モデルは、ヒト血液脳関門をより生体に近い状態で再現した評価モデルであるため、中枢神経薬の脳内移行性等を高精度に予測することが可能となる。
【００１１】
「脳血管モデル」とは、生体外で構築された組織モデルであって、脳血管の構造の少なくとも一部を再現したものを意味し、少なくとも脳毛細血管内皮細胞、周皮細胞、及び星状膠細胞を含む。脳血管モデルは、脳毛細血管内皮細胞、周皮細胞、及び星状膠細胞による強固なタイトジャンクション（バリア機能）を有している。脳血管モデルは、血液脳関門（ＢＢＢ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏでモデル化したものである。
【００１２】
［三次元組織体］
「三次元組織体」とは、細胞が三次元的に配置されている細胞の集合体であって、細胞培養によって人工的に作られる集合体を意味する。三次元組織体において、細胞は、細胞外マトリックス等の足場材を介して三次元的に配置されていてよい。三次元組織体の形状には特に制限はなく、例えば、シート状、球体状、楕円体状、直方体状等が挙げられる。ここで、生体組織は、構成が三次元組織体より複雑である。そのため、三次元組織体と生体組織とは容易に区別可能である。
【００１３】
（細胞）
一実施形態において、三次元組織体は、細胞として、脳毛細血管内皮細胞、周皮細胞、及び星状膠細胞を含む。細胞の由来となる動物種としては、ヒト、ブタ、ウシ、マウス等が挙げられる。上述した細胞としては、例えば、ヒト株化細胞を用いてもよく、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞由来の細胞を用いてもよい。細胞は、例えば、理研セルバンク、タカラバイオなどにより入手したものを用いることができる。ｉＰＳ細胞は、自作して用いてもよい。
【００１４】
三次元組織体において、脳毛細血管内皮細胞、周皮細胞、及び星状膠細胞の細胞数比（脳毛細血管内皮細胞：周皮細胞：星状膠細胞）は、９９：０．５：０．５〜０．５：４９．７５：４９．７５であってよく、５０：２５：２５〜２５：３７．５：３７．５であってよい。
【００１５】
三次元組織体は、脳毛細血管内皮細胞、周皮細胞、及び星状膠細胞以外の細胞（他の細胞）を１種又は２種以上含んでいてもよい。
【００１６】
細胞の含有率は、三次元組織体の全質量を基準として、例えば、０．０１質量％以上、０．１質量％以上、０．５質量％以上、１質量％以上、又は２５質量％以上であってよく、９９質量％以上、又は７５質量％以下であってよい。細胞の含有率は、三次元組織体の全質量を基準として、例えば、０．０１〜９９質量％であってよく、０．１〜９９質量％であってよく、１〜９９質量％であってよく、２５質量％〜７５質量％であってよい。
【００１７】
（解繊された細胞外マトリックス成分）
一実施形態において、三次元組織体は解繊された細胞外マトリックス成分（解繊細胞外マトリックス成分）を含む。三次元組織体が解繊細胞外マトリックス成分を含むことで、チューブ構造の脳血管モデルの作製がより一層容易になる。
【００１８】
細胞外マトリックス成分は、複数の細胞外マトリックス分子によって形成されている、細胞外マトリックス分子の集合体である。細胞外マトリックス分子とは、生物において細胞の外に存在する物質を意味する。細胞外マトリックス分子としては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の物質を用いることができる。細胞外マトリックス分子として、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、及びプロテオグリカン等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、これらを１種単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。なお、細胞外マトリックス分子は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、上述の細胞外マトリックス分子の改変体及びバリアントであってもよい。
【００１９】
コラーゲンとしては、例えば、線維性コラーゲン及び非線維性コラーゲンが挙げられる。線維性コラーゲンとは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲンを意味し、具体的には、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン等が挙げられる。非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。
【００２０】
プロテオグリカンとして、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
細胞外マトリックス成分は、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてよく、コラーゲンを含むことが好ましい。コラーゲンは好ましくは繊維性コラーゲンであり、より好ましくはＩ型コラーゲンである。線維性コラーゲンは、市販されているコラーゲンを用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体が挙げられる。
【００２２】
細胞外マトリックス成分は、動物由来の細胞外マトリックス成分であってよい。細胞外マトリックス成分の由来となる動物種として、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、一種類の動物に由来する成分を用いてもよいし、複数種の動物に由来する成分を併用して用いてもよい。細胞外マトリックス成分の由来となる動物種は、三次元組織化する細胞の由来と同じであっても異なっていてもよい。
【００２３】
解繊細胞外マトリックス成分は、上述の細胞外マトリックス成分を物理的な力の印加により解繊した成分である。解繊は、通常、細胞外マトリックス分子の結合を切断しない条件で実施される。細胞外マトリックス成分を解繊する方法としては、特に制限されない。例えば、超音波式ホモジナイザー、撹拌式ホモジナイザー、及び高圧式ホモジナイザー等の物理的な力の印加によって細胞外マトリックス成分を解繊してもよい。撹拌式ホモジナイザーを用いる場合、細胞外マトリックス成分をそのままホモジナイズしてもよいし、生理食塩水等の水性媒体中でホモジナイズしてもよい。また、ホモジナイズする時間、回数等を調整することでミリメートルサイズ、ナノメートルサイズの解繊細胞外マトリックス成分を得ることも可能である。解繊細胞外マトリックス成分は、凍結融解を繰り返すことで解繊することにより得ることもできる。
【００２４】
解繊細胞外マトリックス成分は、解繊されたコラーゲン成分（解繊コラーゲン成分）を含むことが好ましい。解繊されたコラーゲン成分は、コラーゲンに由来する三重らせん構造が維持されている。
【００２５】
解繊細胞外マトリックス成分の形状としては、例えば、繊維状が挙げられる。繊維状とは、糸状の細胞外マトリックス成分で構成される形状、又は糸状の細胞外マトリックス成分が架橋して構成される形状を意味する。
【００２６】
解繊細胞外マトリックス成分の平均長は、例えば、１ｎｍ以上、５ｎｍ以上、又は１０ｎｍ以上であってよく、１ｍｍ以下であってよい。一実施形態において、解繊細胞外マトリックス成分の平均長は、例えば、１０ｎｍ〜１ｍｍであってよく、厚い組織が形成しやすくなる観点から、２２μｍ〜４００μｍであってよく、１００μｍ〜４００μｍであってよい。他の実施形態において、解繊細胞外マトリックス成分の平均長は、組織形成が安定しやすくなる観点から、１００μｍ以下であってよく、５０μｍ以下であってよく、３０μｍ以下であってよく、１５μｍ以下であってよく、１０μｍ以下であってよく、１μｍ以下であってよい。解繊細胞外マトリックス成分全体のうち、大部分の解繊細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であってよい。具体的には、解繊細胞外マトリックス成分全体のうち９９％の解繊細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であってよい。解繊細胞外マトリックス成分は、平均長が上記範囲内である解繊コラーゲン成分であることが好ましい。
【００２７】
解繊細胞外マトリックス成分の平均径は、１０ｎｍ〜１００μｍであってよく、４μｍ〜３０μｍであってよく、２０μｍ〜３０μｍであってよい。解繊細胞外マトリックス成分は、平均径が上記範囲内である解繊コラーゲン成分であってよい。
【００２８】
上述の平均長及び平均径の範囲は、組織形成の観点から至適化されたものであるため、解繊細胞外マトリックス成分を水性媒体に懸濁し組織形成する段階で上記の平均長又は平均径の範囲内に収まっていることが望ましい。
【００２９】
解繊細胞外マトリックス成分の平均長及び平均径は、光学顕微鏡によって個々の解繊細胞外マトリックス成分を測定し、画像解析することによって求めることが可能である。なお、本明細書において、「平均長」は、測定した試料の長手方向の長さの平均値を意味し、「平均径」は、測定した試料の長手方向に直交する方向の長さの平均値を意味する。
【００３０】
三次元組織体における細胞外マトリックス含有量は、三次元組織体（乾燥重量）を基準として０．０１〜９９質量％であってよく、１０〜９０質量％であってよく、１０〜８０質量％であってよく、１０〜７０質量％であってよく、１０〜６０質量％であってよく、１〜５０質量％であってよく、１０〜５０質量％であってよく、１０〜３０質量％であってよく、２０〜３０質量％であってよい。三次元組織体における細胞外マトリックス含有量は、三次元組織体を構成する細胞外マトリックスの総含有量を意味する。三次元組織体を構成する細胞外マトリックスの総含有量は、三次元組織体を構成する細胞が産生する細胞外マトリックス（内因性細胞外マトリックス）と、上述した解繊された細胞外マトリックス成分等に由来する外因性細胞外マトリックスの合計含有量である。
【００３１】
三次元組織体における細胞外マトリックス含有量は、例えば、得られた三次元組織体の体積、及び脱細胞化した三次元組織体の質量から算出することが可能である。また、三次元組織体における細胞外マトリックス含有量は、例えば、ＥＬＩＳＡ等の抗原抗体反応を利用した方法又はＱｕｉｃｋＺｙｍｅ等の化学的検出方法により測定することもできる。
【００３２】
三次元組織体におけるコラーゲン含有量が上記範囲内であってよい。三次元組織体におけるコラーゲン含有量を測定する方法としては、例えば、以下のようなヒドロキシプロリンを定量する方法が挙げられる。三次元組織体を溶解した溶解液に、塩酸（ＨＣｌ）を混合し、高温で所定の時間インキュベートした後に室温に戻し、遠心分離した上澄みを所定の濃度に希釈することでサンプルを調製する。ヒドロキシプロリンスタンダード溶液をサンプルと同様に処理した後、段階的に希釈してスタンダードを調製する。サンプル及びスタンダードのそれぞれに対してヒドロキシプロリンアッセイバッファ及び検出試薬で所定の処理をし、５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン量を算出する。なお、三次元組織体を、高濃度の塩酸に直接懸濁して溶解した溶解液を遠心分離して上澄みを回収し、コラーゲン定量に用いてもよい。また、溶解させる三次元組織体は、培養液から回収したままの状態であってもよいし、回収後に乾燥処理を行い、液体成分を除去した状態で溶解させてもよい。但し、培養液から回収したままの状態の三次元組織体を溶解してコラーゲン定量を行う場合、三次元組織体が吸収している培地成分、及び実験手技の問題による培地の残りの影響で、三次元組織体重量の計測値がばらつくことが予想されるため、組織体の重量及び単位重量あたりに占めるコラーゲン量を安定して計測する観点からは、乾燥後の重量を基準とすることが好ましい。
【００３３】
コラーゲン含有量を測定する方法として、より具体的には、例えば、以下のような方法が挙げられる。
【００３４】
（サンプルの調製）
凍結乾燥処理を行った三次元組織体の全量を６ｍｏｌ／ｌ  ＨＣｌと混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間以上インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、サンプル溶液の上澄みを回収する。後述する測定において結果が検量線の範囲内に収まるように６ｍｏｌ／ｌ  ＨＣｌで適宜希釈した後、２００μＬを１００μＬの超純水で希釈することでサンプルを調製する。サンプルは３５μＬ用いる。
【００３５】
（スタンダードの調製）
スクリューキャップチューブに１２５μＬのスタンダード溶液（１２００μｇ／ｍＬ  ｉｎ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）と、１２５μＬの１２ｍｏｌ／ｌ  ＨＣｌを加え混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、上澄みを超純水で希釈して３００μｇ／ｍＬのＳ１を作製し、Ｓ１を段階的に希釈してＳ２（２００μｇ／ｍＬ）、Ｓ３（１００μｇ／ｍＬ）、Ｓ４（５０μｇ／ｍＬ）、Ｓ５（２５μｇ／ｍＬ）、Ｓ６（１２．５μｇ／ｍＬ）、Ｓ７（６．２５μｇ／ｍＬ）を作製する。４ｍｏｌ／ｌ  ＨＣｌ９０μＬのみのＳ８（０μｇ／ｍＬ）も準備する。
【００３６】
（アッセイ）
３５μＬのスタンダード及びサンプルをそれぞれプレート（ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｓｓａｙキット付属、ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に加える。７５μＬのアッセイバッファ（上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、２０分シェイキングしながら室温でインキュベートする。シールをはがし、７５μＬのｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  （ｒｅａｇｅｎｔ  Ａ：Ｂ＝３０μＬ：４５μＬ、上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、シェイキングで溶液を混合し、６０℃で６０分インキュベートする。氷上で十分に冷まし、シールをはがして５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン量を算出する。
【００３７】
また、三次元組織体中に占めるコラーゲンを、その面積比又は体積比によって規定してもよい。「面積比又は体積比によって規定する」とは、例えば三次元組織体中のコラーゲンを既知の染色手法（例えば、抗コラーゲン抗体を用いた免疫染色、又はマッソントリクローム染色）等で他の組織構成物と区別可能な状態にした上で、肉眼観察、各種顕微鏡及び画像解析ソフト等を用いて、三次元組織体全体に占めるコラーゲンの存在領域の比率を算出することを意味する。面積比で規定する場合、三次元組織体中の如何なる断面もしくは表面によって面積比を規定するかは限定されない。
【００３８】
例えば、三次元組織体中のコラーゲンを面積比によって規定する場合、その面積の割合は、上記三次元組織体の全体の面積を基準として０．０１〜９９％であってよく、１〜９９％であってよく、５〜９０％であってよく、７〜９０％であってよく、２０〜９０％であってよく、５０〜９０％であってよい。「三次元組織体におけるコラーゲン」については、上述したとおりである。三次元組織体を構成するコラーゲンの面積の割合は、内因性コラーゲン及び外因性コラーゲンを合わせた面積の割合を意味する。上記コラーゲンの面積の割合は、例えば、得られた三次元組織体をマッソントリクロームで染色し、三次元組織体の略中心部を通る断面の全体の面積に対する、青く染色したコラーゲンの面積の割合として算出することが可能である。
【００３９】
［他の成分］
一実施形態において、三次元組織体は、解繊された細胞外マトリックス成分及び細胞以外の他の成分を含んでいてよい。他の成分としては、例えば、上述した細胞外マトリックス成分であってよい。他の成分としては、例えば、フィブリン、ラミニン、コンドロイチン硫酸、ＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、テネイシン、マトリゲル等が挙げられる。他の成分は、フィブリン及びラミニンからなる群より選択される少なくとも１種の成分であってよい。他の成分は、ネットワーク形成がより一層優れたものとなる観点から、フィブリンであってよい。
【００４０】
他の成分としてフィブリンを用いる場合、三次元組織体におけるフィブリン含有量は、例えば、三次元組織体の全質量（乾燥質量）を基準として、０．１〜９９質量％であってよく、１〜５０質量％であってよく、３〜２０質量％であってよく、５〜１０質量％であってよい。三次元組織体におけるフィブリン含有量は、重量測定、吸光度測定、ＥＬＩＳＡ法等により測定することができる。
【００４１】
［三次元組織体の形状等］
三次元組織体の厚さは、１０μｍ以上であってよく、１００μｍ以上であってよく、１０００μｍ以上であってよい。このような三次元組織体は、生体組織により近い構造であり、実験動物の代替品等として好適なものとなる。厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、１０ｍｍ以下であってよく、３ｍｍ以下であってよく、２ｍｍ以下であってよく、１．５ｍｍ以下であってよく、１ｍｍ以下であってよい。
【００４２】
ここで、「三次元組織体の厚さ」とは三次元組織体がシート状、又は直方体状である場合、主面に垂直な方向における両端の距離を意味する。上記主面に凹凸がある場合、厚さは上記主面の最も薄い部分における距離を意味する。また、三次元組織体が球体状である場合、その直径を意味する。さらにまた、三次元組織体が楕円体状である場合、その短径を意味する。三次元組織体が略球体状又は略楕円体状であって表面に凹凸がある場合、厚さは、三次元組織体の重心を通る直線と上記表面とが交差する２点間の距離であって最短の距離を意味する。
【００４３】
三次元組織体は、トリプシンの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でトリプシン処理を行った後の残存率が７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後において酵素による分解が起きにくく、安定である。上記残存率は、例えば、トリプシン処理の前後における三次元組織体の質量から算出できる。
【００４４】
三次元組織体は、コラゲナーゼの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でコラゲナーゼ処理を行った後の残存率が７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後における酵素による分解が起きにくく、安定である。
【００４５】
＜脳血管モデルの製造方法＞
一実施形態に係る脳血管モデルの製造方法は、水性媒体中において、解繊された細胞外マトリックス成分と、脳毛細血管内皮細胞、周皮細胞、及び星状膠細胞を含む細胞と、を接触させる接触工程、並びに、解繊された細胞外マトリックス成分が接触した細胞を培養する培養工程を備える。
【００４６】
「水性媒体」とは、水を必須構成成分とする液体を意味する。水性媒体としては、外因性コラーゲン及び細胞が安定に存在できるものであれば、特に制限はない。例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の生理食塩水、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、血管内皮細胞専用培地（ＥＧＭ２）等の液体培地が挙げられる。液体培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。細胞に対する負荷を軽減する観点から、水性媒体は液体培地であることが好ましい。
【００４７】
［接触工程］
水性媒体中において、解繊された細胞外マトリックス成分と、細胞とを接触させる方法としては、特に制限はない。例えば、細胞を含む培養液に、解繊された細胞外マトリックス成分の分散液を加える方法、解繊された細胞外マトリックス成分の培地分散液に細胞を加える方法、又は予め用意した水性媒体に、解繊された細胞外マトリックス成分及び細胞をそれぞれ加える方法が挙げられる。
【００４８】
解繊細胞外マトリックス成分は、上記例示した細胞外マトリックス成分を解繊して得られるものであってよい。解繊細胞外マトリックス成分は、解繊コラーゲン成分を含んでいてよい。
【００４９】
接触工程における水性媒体中の解繊細胞外マトリックス成分の濃度は、目的とする三次元組織体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、接触工程における水性媒体中の解繊細胞外マトリックス成分の濃度は、０．１〜９０質量％であってもよいし、１〜３０質量％であってもよい。
【００５０】
接触工程における解繊細胞外マトリックス成分の使用量は、例えば、１．０×１０５〜１０．０×１０５ｃｅｌｌｓ（細胞数）の細胞に対して、０．１ｍｇ以上であってよく、０．５ｍｇ以上であってよく、１．０ｍｇ以上であってよく、２．０ｍｇ以上であってよく、３．０ｍｇ以上であってよく、１００ｍｇ以下であってよく、５０ｍｇ以下であってよい。解繊細胞外マトリックス成分は、２．０×１０５〜８．０×１０５ｃｅｌｌｓ、３．０×１０５〜６．０×１０５ｃｅｌｌｓ、又は５×１０５ｃｅｌｌｓの細胞に対して、上記範囲となるように添加してもよい。
【００５１】
接触工程における解繊細胞外マトリックス成分と、細胞との質量比（解繊細胞外マトリックス成分：細胞）は、１０００：１〜１：１であってよく、９００：１〜９：１であってよく、５００：１〜１０：１であってよい。
【００５２】
接触工程における、脳毛細血管内皮細胞、周皮細胞、及び星状膠細胞の細胞数比（脳毛細血管内皮細胞：周皮細胞：星状膠細胞）は、９９：０．５：０．５〜０．５：４９．７５：４９．７５であってよく、５０：２５：２５〜２５：３７．５：３７．５であってよい。
【００５３】
接触工程又は培養工程の間に、水性媒体中における解繊細胞外マトリックス成分と細胞とを共に沈降させる工程（沈降工程）を更に含んでもよい。このような工程を行うことで、三次元組織体における解繊細胞外マトリックス成分及び細胞の分布が、より均一になる。具体的な方法としては、特に制限はないが、例えば、解繊細胞外マトリックス成分と、細胞とを含有する培養液を遠心操作する方法が挙げられる。
【００５４】
接触工程は、解繊された細胞外マトリックス成分及び細胞以外の他の成分の存在下で行われてもよい。他の成分としては、例えば、上述した成分であってよい。他の成分は、ネットワーク形成がより一層優れたものとなる観点から、フィブリンであってよい。
【００５５】
接触工程がフィブリン存在下で行われる場合、例えば、接触工程は、フィブリン及び水性媒体を含む水溶液中で、解繊された細胞外マトリックス成分と、細胞とを接触させる工程であってよい。接触工程におけるフィブリンの使用量は、ネットワーク形成を基準として適宜設定することができる。接触工程におけるフィブリンは、例えば、フィブリン及び水性媒体を含む水溶液を１００質量％としたときに、１質量％以上又は５質量％以上となるように用いてよく、例えば、９９質量％以下又は９０質量％以下となるように用いてよい。
【００５６】
［培養工程］
解繊細胞外マトリックス成分が接触した細胞を培養する方法は、特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培養方法で行うことができる。例えば、培養温度は２０℃〜４０℃であってもよく、３０℃〜３７℃であってもよい。培地のｐＨは、６〜８であってもよく、７．２〜７．４であってもよい。培養時間は、１日〜２週間であってもよく、１週間〜２週間であってもよい。
【００５７】
培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。
【００５８】
培養工程における培地中の細胞密度は、目的とする三次元組織体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、培養工程における培地中の細胞密度は、１〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌであってもよいし、１０３〜１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌであってもよい。また、培養工程における培地中の細胞密度は、接触工程における水性媒体中の細胞密度と同じであってもよい。
【００５９】
＜脳血管モデルの形成剤＞
本実施形態に係る脳血管モデルの形成剤は、解繊細胞外マトリックス成分を含む。解繊細胞外マトリックス成分の平均長及び平均径はそれぞれ上述した範囲内であってよい。解繊細胞外マトリックス成分全体のうち９５％の長さが上述した範囲内であってよく、解繊細胞外マトリックス成分全体のうち９９％の長さが上述した範囲内であってよい。解繊細胞外マトリックス成分全体のうち９５％の直径が上述した範囲内にあってよく、解繊細胞外マトリックス成分全体のうち９９％の直径が上述した範囲内にあってよい。
【００６０】
「脳血管モデルの形成剤」とは、脳血管モデルを製造するための試薬を意味する。脳血管モデルの形成剤は、粉末の状態であってもよいし、水性媒体に解繊細胞外マトリックス成分が分散した分散液の状態であってもよい。解繊細胞外マトリックス成分の製造方法及び上記形成剤の使用方法としては、上記脳血管モデルの製造方法において示されている方法と同様の方法が挙げられる。
【００６１】
＜デバイス＞
一実施形態に係るデバイスは、ウェルが少なくとも一つ設けられたプレートと、ウェル内に配置され、自己組織化により形成された脳血管モデルと、を含む。
【００６２】
本実施形態に係るデバイスは、ウェル内で脳血管チューブネットワークが再現されたものであるため、被検体が血液脳関門（ＢＢＢ）機能に与える影響を調べる評価用デバイスとして好適に用いることができる。
【００６３】
「自己組織化」とは、構成要素自身の相互作用によって、自然に組織が形成される現象をいう。自己組織化により形成された脳血管モデルは、特に制限されないが、例えば、解繊された細胞外マトリックス成分と、脳毛細血管内皮細胞、周皮細胞、及び星状膠細胞を含む細胞と、必要に応じて、上述した他の成分と、を培養することによって、形成させることができる。自己組織化により形成された脳血管モデルは、例えば、解繊された細胞外マトリックス成分と、脳毛細血管内皮細胞、周皮細胞、及び星状膠細胞を含む細胞とを含み、細胞の少なくとも一部が解繊された細胞外マトリックス成分に接着している三次元組織体からなるものであってよい。
【００６４】
ウェルは、自己組織化により形成された脳血管モデルを配置することができる形状、容積、材質等を有していればよい。ウェルの形状は、例えば、平底、丸底、Ｕ底、Ｖ底等の凹部が挙げられる。ウェルの数は、例えば、２以上、５以上、又は５０以上であってよく、１００以下であってよい。ウェルが少なくとも一つ設けられたプレートとしては、例えば、マルチウェルプレートを用いることができる。マルチウェルプレートとしては、市販品を用いることができる。例えば、ウェル数６、１２、２４、４８、又は９６のマルチウェルプレートを用いることができる。ウェル及びプレートの材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ふっ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレートなどが挙げられる。ウェル及びプレートの色としては、例えば、透明、半透明、着色、完全遮光などが挙げられる。
【００６５】
自己組織化により形成された脳血管モデルは、マイクロ流体チップの流路内の少なくとも一部に配置することもできる。例えば、マイクロ流体チップの流路内の少なくとも一部に脳血管モデルを収容するための収容室を設け、該収容室内に脳血管モデルを配置してもよい。脳血管モデルをマイクロ流体チップの流路内の少なくとも一部に配置することによって、灌流培養と薬物の周囲への移行を評価することができる。
【００６６】
また、マイクロ流体チップの脳血管モデルが配置された流路と同一流路内（例えば、脳血管モデルより上流側）に、他の生体組織モデル（例えば、小腸モデル、肝臓モデル、腎臓モデル）を配置することもできる。他の生体組織モデルは、脳血管モデルが配置された流路と同一流路内に、複数配置してもよい。他の生体組織モデルは、生体組織モデルを収容するために設けられた流路内の収容室内に配置されていてよい。例えば、マイクロ流体チップの流路において、小腸モデル、肝臓モデル又は腎臓モデルと、脳血管モデルと、を上流側からこの順に配置してもよい。例えば、マイクロ流体チップの流路において、小腸モデルと、肝臓及び／又は腎臓モデルと、脳血管モデルと、を上流側からこの順に配置してもよい。脳血管モデルと、他の生体組織モデルとを同じ流路内に配置することによって、各生体組織における代謝物の血液脳関門機能障害、脳移行性、中枢毒性発現を評価することが可能となる。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６８】
＜試験例１：Ｉ型コラーゲンを用いた解繊されたコラーゲン（ＣＭＦ）の製造＞
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体５０ｍｇを超純水５ｍＬに懸濁してから、ホモジナイザーにより２分間ホモジナイズした。これによって、解繊されたコラーゲン（ＣＭＦ）を含む分散液を得た。ＣＭＦを含む分散液をＦＤＵ−２２００型（東京理化器械製）により３日間凍結乾燥し、水分を除去した。これによって、乾燥体として、ＣＭＦを得た。得られたＣＭＦの直径は、２０〜３０μｍであり、平均長（長さ）は１００〜２００μｍであった。ＣＭＦの直径及び長さは電子顕微鏡によって個々のＣＭＦを解析することで求めた。
【００６９】
＜試験例２：三次元組織体の製造１＞
血清を含む培地（ＤＭＥＭ）に濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＣＭＦを分散させ、ＣＭＦを含む培地分散液を準備した。
【００７０】
ＣＭＦを含む培地分散液と、フィブリン、ヒト株化細胞であるｃｉＢＭＥＣ、ｃｉＢＰＣ、ｃｉＡＳＴＲを含む細胞と、培地と、をシャーレに添加して、これらの成分同士を接触させた。得られた混合液中の細胞を沈殿培養により７日間培養した。
【００７１】
培養後に得られた三次元組織体に対して、ａｎｔｉ−ＣＤ３１抗体（ＤＡＫＯ社製、Ｍ０８２３）とＡｌｅｘａ６４７標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ａ−２１２３５）を用いた蛍光免疫染色を行い、三次元組織体を蛍光標識した。蛍光標識された三次元組織体を、共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ１ (横河電機製)で観察した。その結果を図１に示す。
【００７２】
図１に示すとおり、ＣＭＦを用いた三次元組織体の形成により、脳血管チューブネットワークが形成されていることを確認した。
【００７３】
図２は、作製した三次元組織体の凍結切片の切断面を示す蛍光免疫染色写真である。免疫染色は、ＣＤ３１染色により行った。図２に示すようにＣＭＦを用いて作製した三次元組織体は、穴を有していた。ＣＭＦを用いて作製した三次元組織体からなる脳血管モデルがチューブ構造を有していることを確認した。
【００７４】
＜試験例３：ＢＢＢタンパク質発現の確認＞
試験例２に記載の方法によって作製した三次元組織体において発現しているタンパク質を免疫染色により確認した。本試験は、次の条件で実施した。結果を図３に示す。三次元組織体を種々の一次抗体溶液に一晩浸漬し、ＰＢＳに数回浸すことで洗浄した。その後、種々の二次抗体に数時間浸漬し、ＰＢＳを用いて洗浄した。
【００７５】
図３に示すとおり、免疫染色により、ＣＭＦを用いて作製した三次元組織体において、トランスポーター、タイトジャンクション及び細胞マーカーの発現が確認された。
【００７６】
試験例２に記載の方法によって作製した三次元組織体において発現しているタンパク質をウエスタンブロッティング（ＷＢ）により確認した。本試験は、次の条件で実施した。結果を図４に示す。標本をＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５Ｘ  ＰＴＲ（ａｂ１９３９７２０）により溶解し、蛋白濃度を測定した。その後、２ＸのＳａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２％ＳＤＳ，１０％ｇｌｙｃｅｒｉｎ，０．０１２５％ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ，ｐＨ６．８）用いて分散した。得られたサンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離しＰＶＤＦメンブレンにトランスファーした。メンブレンをオーバーナイト４℃でブロッキング後、目的蛋白質特異的一次抗体を反応させ、洗浄後、ＨＲＰ標識した二次抗体を反応させ、化学発光法により目的蛋白のバンドを検出した。
【００７７】
図４に示すとおり、ウエスタンブロッティングにより、ＣＭＦを用いて作製した三次元組織体において、トランスポーター、タイトジャンクション及び細胞マーカーの発現が確認された。
【００７８】
免疫染色及びウエスタンブロッティングにより、タンパク質発現レベルで、脳血管ネットワークの基本性能を確認した。
【００７９】
＜試験例４：三次元組織体の製造１＞
血清を含む培地（ＤＭＥＭ）に濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＣＭＦを分散させ、ＣＭＦを含む培地分散液を準備した。
【００８０】
ＣＭＦを含む培地分散液、フィブリン、ｉＰＳ細胞由来のｉＢＭＥＣ、ｃｉＢＰＣ、ｃｉＡＳＴＲを含む細胞、及び培地をシャーレに添加して、これらの成分同士を接触させた。得られた混合液中の細胞を沈殿培養により７日間培養した。
【００８１】
培養後に得られた三次元組織体に対して、ａｎｔｉ−ＣＤ３１抗体（ＤＡＫＯ社製、Ｍ０８２３）とＡｌｅｘａ６４７標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ａ−２１２３５）を用いた蛍光免疫染色を行い、三次元組織体を蛍光標識した。蛍光標識された三次元組織体を、共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ１(横河電機製)で観察した。その結果を図５に示す。
【００８２】
図５に示すとおり、ｉＰＳ細胞由来のｉＢＭＥＣを用いた場合であっても、ＣＭＦを用いた三次元組織体の形成により、脳血管チューブネットワークが形成されていることを確認した。
【００８３】
＜試験例５：脳血管開口モデルの作製＞
図６は、脳血管モデルの一態様を示す模式図である。図６に示す脳血管モデルは、下部に開口を有している。図６に示すような下部に開口を有する脳血管モデルは、次の方法により作製した。脳血管内皮細胞をセルカルチャーインサートに接着させ、その上にＣＭＦを用いて、上述した方法と同様の方法で、三次元組織体を作製し、数日間培養した。
【００８４】
作製した脳血管モデルを、開口を有する側（図６中の矢印で示す向き）から観察した結果を図７（Ａ）に示す。図７（Ｂ）は、図７（Ａ）中の破線円内の領域を示す。図７（Ａ）の矢印で示されるように作製した脳血管モデルは、図７（Ａ）中矢印で示すように下部に開口を複数有していた。
【００８５】
＜試験例６：ＦＤ−２０００ｋＤａの添加による脳血管モデルの開口構造の確認＞
フルオレセインイソチオシアネート標識デキストランである、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ２０００ｋ（約３０ｎｍ、ＦＤ−２０００ｋＤａ）（東京化成工業株式会社製）の添加による脳血管モデルの開口構造の確認を実施した。脳血管モデルは、試験例５に記載の方法で作製した脳血管モデルを用いた。結果を図８〜９に示す。ＦＤ−２０００ｋＤａをフェノールレッド不含培地に溶解し、ＣＤ３１抗体で免疫染色した脳血管モデルが入ったセルカルチャーインサートの外側に添加した。約９時間後に共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。図８は、下部に開口を有する脳血管モデルのＣＤ３１染色による観察結果を示す。
【００８６】
図９は、ＣＤ３１陽性の脳血管モデルの開口内部における、フルオレセインイソチオシアネート標識デキストラン（ＦＤ−２０００ｋＤａ）の挙動の観察結果を示す。図９（Ａ）〜（Ｇ）における正方形状の枠内は、三次元組織体が形成されたセルカルチャーインサートのウェルの底面（三次元組織体の下方の面）を基準（０μｍ、図９（Ｂ））として、鉛直上方に１５．６μｍ（図９（Ｂ））、３１．３μｍ（図９（Ｃ））、４６．９μｍ（図９（Ｄ））、６２．５μｍ（図９（Ｅ））、９３．８μｍ（図９（Ｆ））又は１２５μｍ（図９（Ｇ））に位置する三次元組織体の横断面を示す。図９中の白色で表される領域は、フルオレセインイソチオシアネート標識デキストラン（ＦＤ−２０００ｋＤａ）が存在することを示し、図９中の薄く着色している領域は、ＣＤ３１陽性である領域を示す。
【００８７】
図８〜９に示すとおり、ＣＤ３１陽性の脳血管モデルの開口内部に、フルオレセインイソチオシアネート標識デキストラン（ＦＤ−２０００ｋＤａ）が内在していることが示唆された。
【００８８】
＜試験例７：解繊されたコラーゲン成分（ＣＭＦ）の分析＞
解繊されたコラーゲン成分（ＣＭＦ）について、円偏光二色性スペクトル及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。結果を図１０に示す。図１０に示すとおり、解繊されたコラーゲン成分（ＣＭＦ）が３重らせん構造及び分子量を維持していることが確認された。
【図１】
2020156421.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2020156421.tif 000009
【図９】
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【図１０】
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