(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトや哺乳動物の初期胚を効率よく発生させる胚培養培地の提供。【解決手段】本発明は、ヒトを含む哺乳動物の胚を培養する胚培養培地、及び培養方法であり、培地にピルビン酸と、ジメチルαケトグルタル酸とを含むことを特徴とする。ピルビン酸の添加量が０．０１ｍＭ以上０．２ｍＭ以下であることが好ましく、０．０２ｍＭ以上０．２ｍＭ以下であることが特に好ましい。【選択図】図１
2020028248.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを含む哺乳動物の胚を培養する胚培養培地であって、
ピルビン酸と、ジメチルαケトグルタル酸とを含む胚培養培地。
【請求項２】
ピルビン酸の添加量が０．０１ｍＭ以上０．２ｍＭ以下である請求項１に記載の胚培養培地。
【請求項３】
ピルビン酸の添加量が０．０２ｍＭ以上０．２ｍＭ以下である請求項１に記載の胚培養培地。
【請求項４】
ヒトを含む哺乳動物用の胚を培養する胚培養方法であって、
ピルビン酸と、ジメチルαケトグルタル酸とを添加した培地を用いて胚の培養を行う胚培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、胚培養培地、及び胚培養方法に関し、特に、ピルビン酸を含む胚培養培地、及び胚培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生殖医療や再生医療の進歩に伴い、体外培養による胚の発生を母体内での胚の発生に近似させるための研究が広く行なわれ、新たな培養方法が各種報告されている。
【０００３】
例えば、非特許文献１では、ＫＳＯＭａａ培地にヒト血清アルブミンを添加することが、マウス１細胞期胚の胚盤胞への発生率、及び該胚盤胞の着床率・産仔率の向上に有効であることが報告されている。
【０００４】
また、非特許文献２では、マウス初期胚の体外発生は、ピルビン酸に依存すること、また、培地にピルビン酸を添加しない場合には、細胞膜の透過性を付与したジメチルαケトグルタル酸により補完できることが報告されている。
【０００５】
このジメチルαケトグルタル酸については、ヒストン脱メチル化酵素やＴＥＴ（ｔｅｎ‐ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）タンパク質が酵素活性を発揮する上で不可欠であること（非特許文献３）、マウスの胚性幹細胞（ＥＳ）細胞の培地に４ｍＭを添加すると、ヒストンとＤＮＡの脱メチル化が促進されて自己複製が促進される一方で分化が抑制されること（非特許文献４、非特許文献５）、ミトコンドリア代謝とエピジェネティックの制御を介してヒト多能性幹細胞の分化が促進されること（非特許文献６）等が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】小田佳奈子，初期胚の体外培養がマウス固体発生に及ぼす影響，新潟大学博士論文（2014年）
【非特許文献２】Nagaraj R,et al.,Cell,168,210-223,2017
【非特許文献３】Kaelin WG Jr, McKnight SL. Influence of metabolism on epigenetics and disease.Cell. 2013 Mar 28;153(1):56-69.
【非特許文献４】Carey et al.,Nature,2015
【非特許文献５】Moussaieff A et al.,Cell Metab.,2015
【非特許文献６】TeSlaa et al.,Cell Metab.,2016
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところが、本発明者が実施したＩＣＲ系マウスについての実験によれば、後述するように、ＦＩ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｘ  Ｃ３ＨＥ）系マウスに係る非特許文献２の報告とは異なり、ピルビン酸不添加のＫＳＯＭ培地では、ジメチルαケトグルタル酸を添加しても１細胞期胚から胚盤胞への発生が見られないという結果が得られ、ジメチルαケトグルタル酸を培地に添加しても、初期胚の発生に有効でない場合の有ることが明らかになった。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、胚の発生に対し、より有効にジメチルαケトグルタル酸が作用して、効率よく胚を発生させることが可能な胚培養培地、及び胚培養方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するためになされた発明は、ヒトを含む哺乳動物の胚を培養する胚培養培地であって、ピルビン酸と、ジメチルαケトグルタル酸とを含む胚培養培地である。
【０００９】
本発明の胚培養培地は、ピルビン酸の添加量が０．０１ｍＭ以上０．２ｍＭ以下であることが好ましく、０．０２ｍＭ以上０．２ｍＭ以下であることが、特に好ましい。こうすることで、胚をより効率よく発生させることができる。胚培養培地に、ジメチルαケトグルタル酸の存在下で、０．０１ｍＭ以上のピルビン酸を添加することで、効率よく胚の胚盤胞への発生を行うことができ、０．０２ｍＭ以上のピルビン酸を添加することで、さらに効率よく胚の胚盤胞への発生を行うことができる。
【００１０】
また、本発明は、ヒトを含む哺乳動物用の胚を培養する胚培養方法であって、ピルビン酸と、ジメチルαケトグルタル酸とを添加した培地を用いて胚の培養を行う胚培養方法を含む。
【発明の効果】
【００１１】
このように、本発明の胚培養培地、及び胚培養方法では、ピルビン酸と、ジメチルαケトグルタル酸の両方を添加することで、より効率的に、胚を発生させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ピルビン酸の濃度と、ジメチルαケトグルタル酸（ｄｍ−αＫＧ）の有無がマウス１細胞期胚の胚盤胞への発生へ及ぼす影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の一の実施形態について詳述する。ただし、本発明は、以下の実施形態に限られるものではない。また、以下の説明において、ピルビン酸を添加した培地、添加しない培地を、それぞれ＋Ｐ培地、−Ｐ培地ともいうものとする。
【００１４】
本実施形態に係る胚培養培地は、基礎培地に、ピルビン酸とジメチルαケトグルタル酸（ｄｍ−αＫＧ）が主に添加される他、着床前胚の体外培養で発生を支持する支持物質（以下、「支持物質」という）が添加されている。
ここで、「基礎培地」とは、ピルビン酸の添加の有無にかかわらず、ｄｍ−αＫＧを含まない全ての培地をいい、それだけで哺乳動物の胚を培養可能なものも、培養できないものも含むものとする。
【００１５】
「哺乳動物」は、特に限定するものではないが、ヒト、マウス、ウシ、ウサギ、アカゲザル、ブタ、又はラット等が例示される。
【００１６】
基礎培地として用いられる培地としては、一般に着床前胚の体外発生培地として用いられている培地が好ましいが、特に限定されず、それ以外の培地を用いてもよい。
着床前胚の体外発生培地としては、マウス着床前胚の体外発生培地、ラット・ウサギ・ハムスター着床前胚の体外発生培地、ウシ・ブタ着床前胚の体外発生培地、又はヒト着床前胚の体外発生培地が挙げられる。
【００１７】
マウス着床前胚の体外培養培地としては、例えば、ＫＭＯＳ培地，ＫＭＯＳａａ培地（ＫＳＯＭ培地にアミノ酸溶液を添加したもの），Ｍ１６培地，Ｍ１２培地，ＣＺＢ培地，ＭＴＦ培地，ＢＷＷ培地，Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ培地，ＢＭＯＣ−ＩＩＩ培地が挙げられ、ＫＭＯＳ培地，ＫＭＯＳａａ培地が好ましい。
尚、ＫＳＯＭ培地は、一般にＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含むが、非生理物質であるため、省略してもよい。
【００１８】
ラット・ウサギ・ハムスター着床前胚の体外培養培地としては、例えば、ＨＥＣＭ１培地、ＨＥＣＭ３培地，Ｒ１ＥＣＭ培地，ｍＫＲＢ培地，Ｋａｎｅ’ｓ培地が挙げられる。
【００１９】
ウシ・ブタ着床前胚の体外培養培地としては、例えば、ｍＳＯＦ培地，ｍＳＯＦａａ培地，ＣＲ１ａａ培地，ＢＥＣＭ培地，ＰＺＭ培地（ＰＺＭ５培地）が挙げられ、ＣＲ１ａａ培地が好ましい。
【００２０】
ヒト着床前胚の体外培養培地としては、例えば、ＨＴＦ培地、ＱＡ  Ｃｌｅａｖａｇｅ培地，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ培地，ＱＡ  Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ培地，オンリーワン培地（株式会社日本医化器械製作所製），Ｅａｒｌｙ ｃｕｌｔｕｒｅ培地（株式会社日本医化器械製作所製）、ｇｌｏＢａｌ培地（ｌｉｆｅ  ｇｌｏｂａｌ社製）が挙げられる。
【００２１】
胚培養培地に対するピルビン酸の添加濃度は、特に限定されないが、０．０１ｍＭ以上０．２ｍＭ以下が好ましい。こうすることで、ピルビン酸による胚の発生効率の上昇をさらに向上させることができる。
また、当該ピルビン酸の添加濃度は、０．０２ｍＭ以上０．２ｍＭ以下であることが特に好ましい。こうすることで、ピルビン酸が０．０２ｍＭ未満の場合に比べて、より一層、胚の発生効率を向上できる。
【００２２】
胚培養培地に対するｄｍ−αＫＧの添加濃度は、特に限定されないが、８ｍＭ未満が好ましい。当該濃度が８ｍＭ以上であると、胚の発生効率を低下させる虞がある。
【００２３】
支持物質としては、例えば、組換えヒト血清アルブミン，ＰＶＡ（ポリビニルアルコール），ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン），脱イオン化ウシ血清アルブミン（ｄＢＳＡ），ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ（ウシ胎仔血清））が挙げられ、脱イオン化ウシ血清アルブミン，ＦＣＳが好ましい。
【実施例】
【００２４】
次に、本発明の実施例に係る培地を用いた実験を通じて本発明をさらに詳述する。ただし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００２５】
［マウス胚の培養実験］
マウス１細胞期胚の発生に及ぼすジメチルαケトグルタル酸（ｄｍ−αＫＧ）の効果を明らかにすべく、下記の実施例、比較例に示した培地を用いて、下記の要領で培養実験を行った。
（実施例１）
０．６％脱イオン化ウシ血清アルブミン（ｄＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加したＫＳＯＭ（ＥＤＴＡ不含、ピルビン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）不含）−Ｐ培地に、０．０１ｍＭピルビン酸を添加して＋Ｐ培地とし、さらに、ｄｍ−αＫＧ（東京化成工業社製）を１ｍＭ添加して、実施例１とした。尚、実施例１、及び後述する実施例２、３においては、当該−Ｐ培地が基礎培地となる。
【００２６】
（実施例２）
ピルビン酸を０．０２ｍＭとした他は、実施例１と同様にして培地を作成し、実施例２とした。
【００２７】
（実施例３）
ピルビン酸を０．２ｍＭとした他は、実施例１と同様にして培地を作成し、実施例３とした。
【００２８】
（比較例１）
ｄｍ−αＫＧ無添加の−Ｐ培地を比較例１とした。
【００２９】
（比較例２）
ｄｍ−αＫＧを１ｍＭ添加した−Ｐ培地を比較例２とした。
【００３０】
（比較例３〜比較例５）
ｄｍ−αＫＧ無添加で、ピルビン酸を０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ，０．２ｍＭを添加した（＋Ｐ）培地をそれぞれ比較例３、比較例４、比較例５とした。
【００３１】
＜実験１＞
・方法
実施例１〜実施例３、及び比較例１〜比較例５の培地を用い、ＩＣＲ系マウス（Ｋｗｌ：ＩＣＲ、紀和実験動物研究所製）から採取した１細胞期胚を３７℃、５％体積ＣＯ2の空気中で培養し、２細胞期胚、４細胞期胚への発生数と９６時間後における胚盤胞発生数を計数し、供試胚数に対する発生率を求めた。
【００３２】
・結果
実験１の結果を表１、及び図１に示す。
【表１】
2020028248.tif 000003
【００３３】
ＩＣＲ系マウス胚を用いた当該実験においても、ＦＩ系マウスを用いた上記非特許文献２の報告と同様に、ｄｍ−αＫＧ無添加の−Ｐ培地（比較例１）では、ほとんどの胚が２細胞期で発生を停止し、胚盤胞へは全く発生しなかった。
また、ｄｍ−αＫＧ無添加の＋Ｐ培地（０．０１ｍＭ〜０．２ｍＭのピルビン酸を添加、比較例３〜比較例５）では、１細胞期胚を有意の割合で胚盤胞へ発生させることができた。その割合は、ピルビン酸濃度の上昇につれて増加し、０．２ｍＭのピルビン酸を添加した比較例５で最も高い割合（７８．５％）を示した。比較例５の割合は、非特許文献２における割合と同様であった。
ところが、１ｍＭのｄｍ−αＫＧを添加した−Ｐ培地（比較例２）では、ＦＩ系マウス胚を用いた非特許文献２の報告とは異なり、胚盤胞への発生は全く改善されず、ｄｍ−αＫＧがピルビン酸の効果を補完しない場合の有ることが明らかとなった。
【００３４】
一方で、１ｍＭのｄｍ−αＫＧを添加した＋Ｐ培地（実施例１〜実例例３）では、１細胞期胚から胚盤胞への発生率が、ｄｍ−αＫＧ無添加の＋Ｐ培地（比較例３〜比較例５）と比べても、有意に高くなった（図１の実線と破線による折線参照）。
以上の結果から、ｄｍ−αＫＧは、ピルビン酸の存在下において発生培地に添加することで、胚の発生効率を大きく上昇させることが明らかになった。ピルビン酸とは異なる作用機構によって、マウス初期胚の胚盤胞への発生を相乗的に促進すると推測される。
【００３５】
また、図１に実線の折線で示すように、＋Ｐ培地においては、ピルビン酸を０．０２ｍＭ以上添加すると、１細胞期胚の胚盤胞への発生率が、急に上昇することが明らかになった。
【００３６】
［マウス産仔の発生実験］
マウスの産仔発生に及ぼすｄｍ−αＫＧの効果を明らかにすべく、上記の実施例、比較例に示した培地を用いて、下記の要領で実験２を行った。
【００３７】
＜実験２＞
・方法
実験１において、実施例１の培地（＋Ｐ培地、ｄｍ−αＫＧ１ｍＭ添加）、比較例５（＋Ｐ培地、ｄｍ−αＫＧ無添加）の培地により発生した胚盤胞と、交配後４日目のマウス子宮から採取した胚盤胞（Ｉｎ  ｖｉｖｏ区）を偽妊娠２．５日目のマウスの子宮内に非外科的方法により移植し、妊娠１９．５日目の着床率と産仔率を求めた。
【００３８】
・結果
実験２により得られた結果を表２に示す。
【表２】
2020028248.tif 000004
【００３９】
実施例１の培地（＋Ｐ培地、ｄｍ−αＫＧ添加）で発生した胚盤胞の移植による着床率、及び産仔への発生率は、表２に示すように、比較例５の培地（＋Ｐ培地、ｄｍ−αＫＧ無添加）の胚盤胞に比べていずれも高く、さらに、その値は、Ｉｎ  ｖｉｖｏ区胚盤胞に類似した値であった。
従って、ｄｍ−αＫＧは、体外培養で発生する胚盤胞への産仔への発生能を生体の卵管内で発生した胚の能力まで高める効果を有することが示唆される。
【００４０】
以上、実験１、実験２の結果から、ｄｍ−αＫＧのマウス初期胚に及ぼす効果については、これまで−Ｐ培地での発生停止を解除して＋Ｐ培地での胚盤胞発生率まで発生を高める効果の有ることが唯一報告されている（非特許文献２）が、＋Ｐ培地においてもｄｍ−αＫＧは、初期胚の胚盤胞、及び産仔への発生を促進する効果の有ることを初めて示すことができた。
【００４１】
また、ｄｍ−αＫＧを添加した＋Ｐ培地初期胚を培養することによって、卵管、及び子宮内で発生する胚に類似した発生の（胚質）を有する胚盤胞を高率に産生できることが示唆される。
【００４２】
［ウシ胚の培養実験］
次に、ウシ体外受精胚の発生に及ぼすｄｍ−αＫＧの効果を明らかにすべく、下記の実施例、比較例に示した培地を用いて、下記の要領で実験３を行った。
【００４３】
（実施例４）
５体積％のＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ、ウシ胎仔血清, ＧＩＢＣＯ（登録商標））と０．２ｍＭのピルビン酸とを添加したＣＲ１ａａ培地に、さらに、４ｍＭのｄｍ−αＫＧを添加して形成した培地を実施例４とした。
【００４４】
（比較例６）
５体積％のＦＣＳを添加したＣＲ１ａａ培地を比較例６とした。
【００４５】
（比較例７、比較例８）
５体積％のＦＣＳを添加したＣＲ１ａａ培地に、１ｍＭ、４ｍＭのｄｍ−αＫＧを添加し、それぞれ比較例７、及び比較例８の培地とした。
【００４６】
（比較例９）
５体積％のＦＣＳ、及び０．２ｍＭのピルビン酸を添加したＣＲ１ａａ培地を比較例９の培地とした。
【００４７】
（比較例１０）
５体積％のＦＣＳと０．２ｍＭのピルビン酸とを添加したＣＲ１ａａ培地に、さらに、８ｍＭのｄｍ−αＫＧを添加して形成した培地を比較例１０とした。
【００４８】
＜実験３＞
・方法
屠体ウシ卵巣の直径２〜６ｍｍの卵胞から吸引採取した卵子卵丘細胞複合体を成熟培地（１０体積％ＦＣＳ、及び０．０２ＡＵ  ＦＳＨ（前葉性卵胞刺激ホルモン、共立製薬社製）を添加したＭ１９９培地、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製)にて２２時間、５体積％ＣＯ2の空気中、３８．５℃の条件下で体外成熟させた。
尚、ここで「成熟」とは、卵母細胞を受精可能な減数分裂第２分裂中期まで進行させることをいう。
【００４９】
一方で、京都大学で液体窒素中に凍結保存されているウシ精子の入ったストローを３５℃の温湯中で融解し、保温したＩＶＦ１００溶液（株式会社機能性ペプチド研究所製）で融解した精子を洗浄処理した。次に、精子濃度を１×１０7個／ｍｌとなるようにＩＶＦ１００溶液で調整した。この精子液５０μｌに等量のＩＶＦ１００溶液を加えて最終精子濃度が５×１０6個／ｍｌとなるように調整し、この１００μｌの精子液のドロップ中に、上述の体外成熟させた卵子卵丘細胞複合体を移し（この操作を「媒精」という）、体外受精を行った。体外受精開始後約６時間で受精が完了した。
体外受精胚は、９６ｗｅｌｌプレート（住友ベークライト株式会社製２００μｌ／ｗｅｌｌ、Ｕ底、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標））の各ｗｅｌｌに満たした２００μｌの体外培養液（胚培養培地）中で、５体積％ＣＯ2、５体積％Ｏ2、９０体積％Ｎ2、３８．５℃の低酸素条件下で体外培養を行った。媒精開始時を０日目とし、２日目に卵割率そして８日目に胚盤胞への発生率を算出した。
以下、実験３を胚培養培地に対するピルビン酸の添加の有無により下記の２つの実験に分けて説明する。
【００５０】
・実験３−１
ピルビン酸無添加の胚培養培地におけるｄｍ−αＫＧ濃度の胚培養に及ぼす効果を比較例６〜比較例８の培地を用いて調べた。ただし、比較例６〜比較例８の培地には、ＦＣＳに由来する微量（０．０１〜０．０３ｍＭ）のピルビン酸が含まれている。
【００５１】
・実験３−２
ピルビン酸（０．２ｍＭ）を含む胚培養培地におけるｄｍ−αＫＧの胚培養に及ぼす効果を実施例４、比較例９、及び比較例１０を用いて調べた。
【００５２】
・結果
実験３（３−１，３−２）により得られた結果を表３に示す。
【表３】
2020028248.tif 000005
【００５３】
・実験３−１の結果
比較例６〜比較例８の卵割率（体外受精による供試卵数に対する卵割胚の割合）は、７８〜８０％であり、各比較例間でｄｍ−αＫＧの濃度が異なることによる有意差はなかった。また、当該供試卵から胚盤胞への発生率は、ｄｍ−αＫＧ無添加区の比較例６では、８．４％であり、殆どの胚は、８〜１６細胞期で発生を停止した。しかし、ｄｍ−αＫＧを１ｍＭ、あるいは４ｍＭを加えた比較例７、８の場合、それぞれの胚盤胞の発生率は２５．１％、２９．２％と有意に上昇した。
【００５４】
・実験３−２の結果
卵割率は、実験３−１の結果と同様の値であった。胚盤胞への発生率は、ｄｍ−αＫＧ無添加区（比較例９）では、３７．８％であったのに対し、４ｍＭのｄｍ−αＫＧを加えた実施例４では、５６．５％と有意に上昇した。しかし、ｄｍ−αＫＧを８ｍＭ加えた比較例１０では、３７．８％と、実施例４に比べて有意に低下した。
以上の結果から、マウス体外受精胚と同様に、ウシ体外受精胚においても、ピルビン酸の存在下においてｄｍ−αＫＧは、胚盤胞への発生を促進することが明らかとなった。
【００５５】
以上、本発明の胚培養培地は、上記の実施形態に限られず、例えば、ピルビン酸の添加濃度は、０．０１ｍＭ未満であってもよいし、０．２ｍＭを越えてもよい。ｄｍ−αＫＧの添加濃度は、８ｍＭ以上であってもよい。
【図１】
2020028248.tif 000006