(57)【要約】      （修正有）【課題】ＳＴＡＴ３特異的に高阻害活性を有する化合物を取得する。【解決手段】ＳＴＡＴ３における、Ｋ７０９、Ｉ７１１、Ｃ７１２、Ｖ７１３、Ｔ７１４、及びＰ７１５からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸と、同一ＳＴＡＴ３分子のＳＨ２ドメインに存在するアミノ酸との、相互作用を阻害することを指標として、ＳＴＡＴ３の活性化抑制化合物をスクリーニングする方法、並びに、ＳＴＡＴ３における、Ｋ７０９、Ｉ７１１、Ｃ７１２、Ｖ７１３、Ｔ７１４、及びＰ７１５からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸と、同一ＳＴＡＴ３分子のＳＨ２ドメインに存在するアミノ酸との、相互作用を阻害する化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＴＡＴ３における、Ｋ７０９、Ｉ７１１、Ｃ７１２、Ｖ７１３、Ｔ７１４、及びＰ７１５からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸と、同一ＳＴＡＴ３分子のＳＨ２ドメインに存在するアミノ酸との、相互作用を阻害する化合物。
【請求項２】
前記相互作用が、
Ｋ７０９とＲ６８８との相互作用、
Ｉ７１１とＭ６４８との相互作用、
Ｃ７１２とＹ６４０との相互作用、
Ｖ７１３とＹ６５７との相互作用、
Ｖ７１３とＭ６６０との相互作用、
Ｖ７１３とＬ６６６との相互作用、
Ｔ７１４とＹ６５７との相互作用、及び
Ｐ７１５とＭ６６０との相互作用
からなる群より選択される少なくとも１つの相互作用である、
請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
以下の（ｉ−１）、（ｉ−２）、（ｉｉ−１）、又は（ｉｉ−２）のポリペプチド。
（ｉ−１）配列番号１の６８９〜７７０番目のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｉ−２）（ｉ−１）のアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つＳＴＡＴ３の活性化抑制作用を有する、ポリペプチド。
（ｉｉ−１）配列番号２の６８９〜７２２番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｉｉ−２）（ｉｉ−１）のアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つＳＴＡＴ３の活性化抑制作用を有する、ポリペプチド。
【請求項４】
前記ＳＴＡＴ３の活性化抑制作用が、
ＳＴＡＴ３のＹ７０５のリン酸化の脱リン酸化促進作用、及び／又は
核内のＳＴＡＴ３の核外への移行促進作用
である、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の化合物あるいは請求項３又は４に記載のポリペプチドを含有するＳＴＡＴ３非活性化促進組成物。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の化合物あるいは請求項３又は４に記載のポリペプチドを含有する抗がん組成物。
【請求項７】
ＳＴＡＴ３における、Ｋ７０９、Ｉ７１１、Ｃ７１２、Ｖ７１３、Ｔ７１４、及びＰ７１５からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸と、同一ＳＴＡＴ３分子のＳＨ２ドメインに存在するアミノ酸との、相互作用を阻害することを指標として、ＳＴＡＴ３の活性化抑制化合物をスクリーニングする方法。
【請求項８】
前記相互作用が、
Ｋ７０９とＲ６８８との相互作用、
Ｉ７１１とＭ６４８との相互作用、
Ｃ７１２とＹ６４０との相互作用、
Ｖ７１３とＹ６５７との相互作用、
Ｖ７１３とＭ６６０との相互作用、
Ｖ７１３とＬ６６６との相互作用、
Ｔ７１４とＹ６５７との相互作用、及び
Ｐ７１５とＭ６６０との相互作用
からなる群より選択される少なくとも１つの相互作用である、
請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
ＳＴＡＴ３のＹ７０５のリン酸化の脱リン酸化促進作用、及び／又は
核内のＳＴＡＴ３の核外への移行促進作用
を指標として、
ＳＴＡＴ３の活性化抑制化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
核内のＳＴＡＴ３が被験化合物適用から１５分以内に核外へ移行されるかを指標として、ＳＴＡＴ３の活性化抑制化合物をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ＳＴＡＴ３非活性化促進化合物及びそのスクリーニング方法等に関する。なお、本明細書に記載される全ての文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）は、シグナル伝達と転写活性化を行うことで、分化や生存、増殖などを調節するタンパク質の一群、Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＳＴＡＴ）ファミリー分子の一つである。ＳＴＡＴファミリーの中でも、ＳＴＡＴ３はがん化との関係が特に注目されている。種々のひとがん細胞で恒常的に活性化されたＳＴＡＴ３がしばしば観察され、実際にＳＴＡＴ３ががん細胞の生存、増殖、転移に関する遺伝子発現を起こすことが知られている。また様々ながん細胞で、活性型のＳＴＡＴ３変異が報告されていることからも、がん発症にＳＴＡＴ３活性が重要な役割をもつことが示された。ＳＴＡＴ３を阻害することにより、がん細胞の生存や増殖や転移を抑制することができるとの報告も多数なされ、がんの成り立ちによってはＳＴＡＴ３阻害ががん治療として有用な治療手段になると考えられている。
【０００３】
ＳＴＡＴ３は非活性化状態時では細胞質にと核との間をシャトルしている。ＩＬ−６やオンコスタチンＭなどのサイトカインやＥＧＦ、ＰＤＧＦなどの増殖因子の刺激により活性化されたＪａｎｕｓキナーゼ（ＪＡＫ）や受容体キナーゼによって７０５番目のチロシンにリン酸化を受けると互いのＳＨ２ドメインが相手のリン酸化チロシンを認識することで安定化した２量体を形成し、核内移行後も安定な２量体として標的遺伝子を活性化する転写因子として働くことが知られている。この活性化経路はＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路と呼ばれている。
【０００４】
ＳＴＡＴ３阻害剤の開発には、チロシンリン酸化を受けた活性化ＳＴＡＴ３の安定な２量体（ダイマー）を形成の仕組みの理解が重要である。ＳＴＡＴ３のｐＹ７０５を含むチロシンリン酸化モチーフ（ＰＴＭ）が相手ＳＴＡＴ３のＳＨ２ドメイン（おおよそ、５８４番目から６８８番目のアミノ酸により構成されるドメイン）に互いに認識されることで２量体を形成する。これまで開発されてきた化合物は、リン酸化チロシンがＳＨ２ドメインに直接認識される部位に特異的に結合することで２量体形成を阻害するものがほとんどである。それらのうち一部はがん（例えば固形がん、血液がん等）治療のために有用であると期待されたが、今なお市場に出たものは存在しない。すなわち、未だＳＴＡＴ３特異的に高阻害活性を有する化合物は得られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１３−５１２２４８号公報
【特許文献２】特表２０１０−５３９０９７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｃｅｌｌｓ  １７，１３２−１４５，２０１２
【非特許文献２】Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９４，  １４５−１５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示は、ＳＴＡＴ３特異的に高阻害活性を有する化合物を取得するための研究に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ＳＴＡＴ３のｐＹ７０５（ｐはリン酸化、Ｙはアミノ酸一文字表記（すなわちチロシン）、７０５は７０５番目のアミノ酸であること、をそれぞれ示す。すなわち、当該記載は、アミノ酸配列７０５番目のチロシンがリン酸化されていることを示す。特に断らない限り、以下同じ。）を含むチロシンリン酸化モチーフ（ｐＹＬＫＴＫＦ）とＳＨ２とによるＳＴＡＴ３間の結合は、ＳＨ２内４個のアミノ酸とチロシンリン酸化部位との極性結合、ＳＨ２内のＷ６２３及びＶ６３７とＬ７０６との疎水性結合、Ｙ６４０とＦ７１０との結合等からなることが報告されている。
【０００９】
これらの複数部位での相互作用を特異的にブロックする阻害剤を取得し、がん等の病気の治療に用いようという試みがなされてきた。しかしながら、上述の通り、特異的かつ低濃度で効果を発揮する阻害剤治療薬の開発は成功していると言えない状況である。
【００１０】
なぜ、特異的かつ低濃度で効果を発揮する阻害剤を取得することが難しいのかを探るため、ＳＴＡＴ３タンパク間相互作用メカニズムを見直し、阻害剤の標的部位を新たに求めることを試みた。特に、ＩＬ−６刺激により活性化されたＳＴＡＴ３ダイマーのｐＹ７０５脱リン酸化と活性化後核内ＳＴＡＴ３の核外輸送という二つの非活性化指標がＳＴＡＴ３のＳｅｒ７２７リン酸化に依存して比較的早期に起こる点に着目し、どのように非活性化が起こるのかを明らかにすることを通じて、標的部位の同定を試みた。
【００１１】
今回構造解析と種々のＳＴＡＴ３変異体を用いた解析から、ＳＴＡＴ３の２量体形成には、ｐＹ７０５を含むリン酸化モチーフだけでなく、Ｌ７０６からＰ７１５のＣ末端テール部位（ＣＴＴ）が重要であり、Ｓｅｒ７２７リン酸化依存的な非活性化機序もこのＣＴＴの修飾によるものとの結果を得た。構造解析および変異体の機能解析の結果、ＣＴＴのうち遠位部のＫ７０９からＰ７１５が自らのＳＨ２部分に戻り、自らのＳＨ２ドメイン（特に当該ドメイン内のＢＧループと呼ばれる部位）と分子内結合（ＣＴＴ−ＳＨ２分子内結合）をすることが重要であることを見出した。またＣＴＴの近位部は２量体を構成する二つのモノマーのＣＴＴが交わる部位であり、二つのＣＴＴ間で相互作用している。ＣＴＴ遠位部と自らのＳＨ２との結合が強く起こると、ＣＴＴ間結合を介して相手のＣＴＴ近位部や相手のｐＹ７０５が自らのＳＨ２により近付くことになり、結果として安定なｐＹ７０５−ＳＨ２間結合が生じると考えられた。生理的なＳＴＡＴ３非活性化にはＳｅｒ７２７のリン酸化に依存してＣＴＴに何らかの修飾（Ｔ７１４やＴ７０８のリン酸化、Ｋ７０７やＫ７０９のアセチル化を想定）がもたらされる結果ＣＴＴ遠位部と自らのＳＨ２分子内結合がゆるむと考えられた。構造解析からこのＣＴＴ−ＳＨ２結合を強めると予測された変異体（Ｋ６５８ＹやＹ６４０Ｆなど）は実際に活性型ＳＴＡＴ３変異体となり、この結合を弱めると予測された変異体（Ｋ７０９ＥやＴ７１４Ａ変異体）は優性抑制型ＳＴＡＴ３変異体となることが確認された。活性型変異体は実際のがん患者さんに見られる変異であり、抑制型変異ＳＴＡＴ３は免疫不全発症の患者さんに見られたものである。さらに、今回見出したＣＴＴ−ＳＨ２内のＢＧループ分子内結合は、ＳＴＡＴ３分子にのみ存在し、他のＳＴＡＴファミリー分子には存在しないことから、このＣＴＴ−ＳＨ２分子内相互作用を特異的に阻害する化合物は、ＳＴＡＴ３ホモ２量体やＳＴＡＴ３−ＳＴＡＴ１ヘテロ２量体の非活性化を促進することが期待される。
【００１２】
なお、本明細書において、ＣＴＴとは、ＳＴＡＴ３のＹ７０５以降からＰ７１５までの領域（７０６番目から７１５番目までのアミノ酸配列）からなる領域のことを指す。
【００１３】
本開示は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
ＳＴＡＴ３における、Ｋ７０９、Ｉ７１１、Ｃ７１２、Ｖ７１３、Ｔ７１４、及びＰ７１５からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸と、同一ＳＴＡＴ３分子のＳＨ２ドメインに存在するアミノ酸との、相互作用を阻害する化合物。
項２．
前記相互作用が、
Ｋ７０９とＲ６８８との相互作用、
Ｉ７１１とＭ６４８との相互作用、
Ｃ７１２とＹ６４０との相互作用、
Ｖ７１３とＹ６５７との相互作用、
Ｖ７１３とＭ６６０との相互作用、
Ｖ７１３とＬ６６６との相互作用、
Ｔ７１４とＹ６５７との相互作用、及び
Ｐ７１５とＭ６６０との相互作用
からなる群より選択される少なくとも１つの相互作用である、
項１に記載の化合物。
項３．
以下の（ｉ−１）、（ｉ−２）、（ｉｉ−１）、又は（ｉｉ−２）のポリペプチド。
（ｉ−１）配列番号１の６８９〜７７０番目のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｉ−２）（ｉ−１）のアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つＳＴＡＴ３の活性化抑制作用を有する、ポリペプチド。
（ｉｉ−１）配列番号２の６８９〜７２２番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｉｉ−２）（ｉｉ−１）のアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つＳＴＡＴ３の活性化抑制作用を有する、ポリペプチド。
項４．
前記ＳＴＡＴ３の活性化抑制作用が、
ＳＴＡＴ３のＹ７０５のリン酸化の脱リン酸化促進作用、及び／又は
核内のＳＴＡＴ３の核外への移行促進作用
である、項３に記載のポリペプチド。
項５．
項１又は２に記載の化合物あるいは項３又は４に記載のポリペプチドを含有するＳＴＡＴ３非活性化促進組成物。
項６．
項１又は２に記載の化合物あるいは項３又は４に記載のポリペプチドを含有する抗がん組成物。
項７．
ＳＴＡＴ３における、Ｋ７０９、Ｉ７１１、Ｃ７１２、Ｖ７１３、Ｔ７１４、及びＰ７１５からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸と、同一ＳＴＡＴ３分子のＳＨ２ドメインに存在するアミノ酸との、相互作用を阻害することを指標として、ＳＴＡＴ３の活性化抑制化合物をスクリーニングする方法。
項８．
前記相互作用が、
Ｋ７０９とＲ６８８との相互作用、
Ｉ７１１とＭ６４８との相互作用、
Ｃ７１２とＹ６４０との相互作用、
Ｖ７１３とＹ６５７との相互作用、
Ｖ７１３とＭ６６０との相互作用、
Ｖ７１３とＬ６６６との相互作用、
Ｔ７１４とＹ６５７との相互作用、及び
Ｐ７１５とＭ６６０との相互作用
からなる群より選択される少なくとも１つの相互作用である、
項７に記載のスクリーニング方法。
項９．
ＳＴＡＴ３のＹ７０５のリン酸化の脱リン酸化促進作用、及び／又は
核内のＳＴＡＴ３の核外への移行促進作用
を指標として、
ＳＴＡＴ３の活性化抑制化合物をスクリーニングする方法。
項１０．
核内のＳＴＡＴ３が被験化合物適用から１５分以内に核外へ移行されるかを指標として、ＳＴＡＴ３の活性化抑制化合物をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【００１４】
ＳＴＡＴ３特異的に活性化抑制作用を有する化合物を取得するためのスクリーニング方法、及び当該化合物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＳＴＡＴα及びＳＴＡＴβのドメイン構造の説明図とＤＮＡ上の活性化ＳＴＡＴ３β二量体の結晶構造解析から得られた構造図を示す。
【図２】ＳＴＡＴ３をノックアウトしたＨｅｐＧ２細胞株ＳＫＯ細胞とＳＴＡＴ３とＴＣ４５とをダブルノックアウトした細胞（ＤＫＯ）において、野生型ＳＴＡＴ３またはＳＴＡＴ３  Ｓ７２７Ａ変異体を発現させ、ＩＬ−６刺激後のＳＴＡＴ３  ｐＹ７０５の変化とＳＴＡＴ３核内分布の変化を免疫組織染色法と共焦点顕微鏡にて検討した結果等を示す。ＳＴＡＴ３非活性化に伴うｐＹ７０５脱リン酸化と活性化後核外輸送は、ともにＳｅｒ７２７リン酸化により促進されることを示す。リン酸化を受けないＳ７２７Ａ変異体では刺激１８０分後から、一部の細胞で核外輸送が始まることがわかる。
【図３】ヒトのＳＴＡＴα（７７０アミノ酸長）及びＳＴＡＴβ（７２２アミノ酸長）の構造の概要を示す。（Ａ）ＳＴＡＴα及びＳＴＡＴβのＳＨ２ドメインＲ６８８からＳ７０１までの領域（６８９−７０１）は構造解析でも位置の定まらない領域であり、Ｙ７０５を含むペプチドとの間を連結している。Ｙ７０５に続くＬ７０６からＰ７１５までの領域は分子間、分子内相互作用に関わり、ｐＹ７０５−ＳＨ２相互作用の安定性に重要な働きを持つことを見出したことから特にＣ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔａｉｌ（ＣＴＴ）と呼ぶことにした。ＳＴＡＴ３αではその後５５アミノ酸が続き、転写活性を示すことから転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）という。このドメイン中には重要なＳｅｒ７２７を含んでいる。スプライシングの違いで生じるＳＴＡＴ３βはＣＴＴに続いて７アミノ酸が加わる。（Ｂ）ＳＴＡＴ３β二量体の結晶構造に基づき、ｐＹ７０５と相手のＳＨ２ドメイン間の結合面の構造を示す。Ｌ７０６からＰ７１５のペプチドＣ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔａｉｌ  （ＣＴＴ）は近位部でＣＴＴ−ＣＴＴの分子間結合（赤丸で示す２）があり、Ｋ７０９からＰ７１５までの遠位部ＣＴＴは自らのＳＨ２との間で分子内相互作用（赤丸で示す３）をする。図のα、β、γ、δ、は主な結合部位を示す。ＣＴＴの関わる２種のタンパク相互作用により、ｐＹ７０５とその近傍アミノ酸は相手分子のＳＨ２との距離が近くなることから、これら結合がｐＹ７０５−ＳＨ２結合（赤丸で示す１）を支えると考えられた。
【図４】ＳＴＡＴ３野生型（ＳＴＡＴ３  ＷＴ）、Ｒ６８との結合に必須なＫ７０９をグルタミン酸に置換したＫ７０９Ｅ変異体（Ｋ７０９Ｅ）、Ｙ６５７側鎖のＯＨ基と水素結合するＴ７１４をアラニンに置換したＴ７１４Ａ変異体（Ｔ７１４Ａ）をＨｅｐＧ２−ＳＫＯ細胞やＨｅｐＧ２−ＤＫＯ細胞に導入し、それぞれＩＬ−６刺激１５分、続いてキナーゼ活性を抑制する阻害剤Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（ＳＴ）を加えた。Ｙ７０５リン酸化及びＳＴＡＴ３をウェスタンブロットにより解析した（Ａ〜Ｃ）。ＨｅｐＧ２−ＤＫＯ細胞に導入したＳＴＡＴ３  Ｋ７０９ＥとＳＴＡＴ３Ｔ７１４Ａの核内分布の変化を示す（Ｄ、Ｅ）。活性化されたＳＴＡＴ３変異体は、速やかにチロシン脱リン酸化を受けるが、ＴＣ４５ノックアウト細胞においてもＳＴによりキナーゼが阻害された後速やかに脱リン酸化を受ける。この脱リン酸化は、活性を失ったＳＴＡＴ３が核から細胞質に輸送された後起こると考えられたが、実際に二つの変異体が速やかに核外輸送を受けることが、Ｄ、Ｅで示された。
【図５】ＨｅｐＧ２−ＳＫＯ細胞に、Ａ）Ｋ７０９Ｅ／Ｓ７２７Ａ、Ｔ７１４Ａ／Ｓ７２７Ａ変異体、Ｂ）ＣＴＴ−ＳＨ２との結合を高めると予測された変異体（Ｙ６４０ＦやＫ６５８Ｙ）、あるいはＣ）Ｐ７１５Ａ、Ｋ７０９Ｅ／Ｐ７１５Ａ変異体を発現させ、ＩＬ−６刺激後にＳＴを加え、ｐＹ７０５の脱リン酸化を検討した。ＣＴＴ−ＳＨ２間の結合が弱くなる変異体は活性化された後、速やかに非活性化が起こり、ｐＳ７２７作用も必要でないこと、逆にＣＴＴ−ＳＨ２結合が強くなると予測された変異体では、ＳＴ処理後も非活性化が起こりにくくなることを示している。Ｐ７１５Ａ変異体では、Ｓｅｒ７２７リン酸化依存的な非活性化促進作用がなくなることから、ｐＳ７２７作用にはＰｒｏ７１５が重要であることも示している。このＰ７１５Ａ変異は、構造上ＣＴＴ−ＳＨ２作用には影響を与えないと考えられたことから、ｐＳ７２７依存的な作用は、Ｐｒｏ７１５依存的なＣＴＴの修飾によるものと考えられた。
【図６】Ｙ６４０Ｆ変異やＫ６５８Ｙ変異はがん患者さんで見つかる変異であり、いずれもＣＴＴ−ＳＨ２作用を増強することがわかったが、それではＫ７０９ＥやＴ７１４Ａという変異を加えることでその持続的活性化が抑制されるか検討した。Ｋ７０９Ｅ変異は、Ｙ６４０Ｆ変異の効果を抑制する効果は小さく、Ｋ６５８Ｙ変異の効果を強く抑制した。一方、Ｔ７１４Ａは、Ｙ６４０Ｆ，  Ｋ６５８Ｙ変異のいずれの効果も中和した。このことは、ＣＴＴ−ＳＨ２作用を阻害剤で抑制する場合、どの部位を阻害するかを選ぶことで、活性型変異の効果抑制にふさわしい阻害剤が選択できる可能性を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本開示に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。本開示は、特定の化合物（好ましい代表例としては、特定のペプチドや、ペプチド構造に類似し分子間相互作用を特異的に抑制する化合物等が挙げられる）を含有するＳＴＡＴ３非活性化促進組成物、及び当該特定の化合物のスクリーニング方法等を好ましく包含するが、これらに限定されるわけではなく、本開示は本明細書の記載から当業者が認識できる全てを包含する。
【００１７】
ＳＴＡＴ３には、ＳＴＡＴ３α及びＳＴＡＴ３β等のスプライシングバリアントが存在するが、本明細書においてＳＴＡＴ３はいずれのバリアントも包含する。なお、ＳＴＡＴ３αは全長７７０アミノ酸、ＳＴＡＴ３βは全長７２２アミノ酸である。ヒトのＳＴＡＴ３α及びＳＴＡＴ３βのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び配列番号２として配列表に記載する。
なお、上記の通り、本明細書において、ＣＴＴとは、ＳＴＡＴ３αにもβにも共通するＹ７０５に続くＬ７０６からＰ７１５（ＬＫＴＫＦＩＣＶＴＰ）領域のことを指す。  
【００１８】
本開示に包含されるＳＴＡＴ３非活性化促進組成物が含有する特定の化合物は、ＳＴＡＴ３におけるＫ７０９、Ｉ７１１、Ｃ７１２、Ｖ７１３、Ｔ７１４、及びＰ７１５からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸と、同一ＳＴＡＴ３分子のＳＨ２ドメインに存在するアミノ酸との、相互作用を阻害する化合物である。当該ＳＨ２ドメインに存在するアミノ酸としては、Ｒ６８８、Ｍ６４８、Ｙ６４０、Ｙ６５７、Ｍ６６０、Ｌ６６６、Ｙ６５７、及びＭ６６０等が好ましく挙げられる。
【００１９】
当該相互作用としては、Ｋ７０９とＲ６８８との相互作用、Ｉ７１１とＭ６４８との相互作用、Ｃ７１２とＹ６４０との相互作用、Ｖ７１３とＹ６５７との相互作用、
Ｖ７１３とＭ６６０との相互作用、Ｖ７１３とＬ６６６との相互作用、Ｔ７１４とＹ６５７との相互作用、及びＰ７１５とＭ６６０との相互作用が好ましく挙げられる。前記特定の化合物としては、いずれかの相互作用の１つ又は２つ以上の組み合わせを阻害する化合物が好ましい。
【００２０】
なお、当該相互作用とは、例えば水素結合、イオン性相互作用、疎水的相互作用、芳香族相互作用等が好ましく挙げられ、中でも水素結合及びイオン性相互作用が好ましい。当該相互作用によって分子内結合が形成されるところ、相互作用の阻害とは具体的には当該分子内結合の破壊をいう。
【００２１】
また、上記相互作用が阻害されると、（Ｉ）Ｙ７０５のリン酸化の脱リン酸化が促進されるか、若しくは（ＩＩ）核内のＳＴＡＴ３が核外に出るまでの時間が短縮される（好ましく概ね１０〜１５分以内に核外に出る）か、又はこの（Ｉ）及び（ＩＩ）の両方が起こることにより、ＳＴＡＴ３の活性が抑制されることも今回見出された。このため、被検化合物が、当該相互作用を阻害するかを、当該（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）を指標として調べることができる。
【００２２】
当該被検化合物は特に制限されるものではなく、種々の低分子化合物及び高分子化合物等を用いることができる。高分子化合物としては、例えば核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ等）やタンパク質（例えば抗体又はその一部等）、ポリマー等の高分子化合物を例示することができる。
【００２３】
なお、本開示は、このような候補化合物から上記特定の化合物をスクリーニングする方法も包含する。このようなスクリーニング方法としては、前記相互作用の阻害を指標として、阻害する化合物を選択する方法が挙げられる。前記相互作用の阻害については、例えば（Ｉ）Ｙ７０５のリン酸化の脱リン酸化が促進されるか、若しくは（ＩＩ）核内のＳＴＡＴ３が核外に出るまでの時間が短縮される（好ましくは概ね１０〜１５分以内に核外に出る）か、又はこの（Ｉ）及び（ＩＩ）の両方が起こることを指標として行うことができる。
【００２４】
また、当該スクリーニング方法には、ｓｔａｔ３遺伝子ノックアウト細胞株を用いることもできる。当該ノックアウト細胞株において、例えば標識（好ましくは蛍光タグ、より好ましくは蛍光タンパク質）が付されたＳＴＡＴ３を発現させることにより、容易にＳＴＡＴ３の局在を観察することができる。標識として蛍光タンパク質を用いる場合、例えば、ＳＴＡＴ３のＣ末端またはＮ末端に付加することができ、ＳＴＡＴ３のＮ末端に付加することが好ましい。
【００２５】
（Ｉ）Ｙ７０５のリン酸化の脱リン酸化の促進は、より具体的には、細胞（好ましくはＨｅｐＧ２細胞）に被検化合物を適用し、適当な方法にて刺激（例えば、１５分間ＩＬ−６刺激）した後、新たなキナーゼによるリン酸化を抑制した条件下（例えばＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ等のキナーゼ阻害剤を用いることが出来る）、ＳＴＡＴ３  Ｙ７０５のリン酸化の変化をモニターすることで確認することができる。また、（ＩＩ）核内のＳＴＡＴ３が核外に出るまでの時間の短縮については、より具体的には、被検化合物を適用し、ＨｅｐＧ２細胞を適当な方法にて刺激（例えば、１５分間ＩＬ−６刺激）した後、新たなキナーゼによるリン酸化を抑制した条件下（例えばＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ等のキナーゼ阻害剤を用いることが出来る）、ＳＴＡＴ３の核外輸送がリン酸化非抑制条件下（例えばキナーゼ阻害剤非存在下）と比べて短時間（好ましくは２０〜３０分）のうちに核外に出るかで判断することができる。
【００２６】
当該特定の化合物として、特に好適なものとして、ＳＴＡＴ３のＣＴＴ部分の位置に入り込みＳＨ２部分とＣＴＴとの結合を阻害する分子、ポリペプチド又はペプチド模倣薬が挙げられる。当該分子、ポリペプチドやペプチド模倣薬は、ＳＴＡＴ３のＣＴＴと拮抗して、ＳＴＡＴ３のＣＴＴがＳＨ２ドメインと相互作用するのを阻害（拮抗阻害）すると考えられるからである。
【００２７】
このようなポリペプチドとしては、具体的には例えば以下の（ｉ−１）、（ｉ−２）、（ｉｉ−１）、又は（ｉｉ−２）のポリペプチドや、ＳＨ２部分への結合活性が高まった変異を含むペプチドが挙げられる。
【００２８】
（ｉ−１）配列番号１の６８９〜７７０番目のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｉ−２）（ｉ−１）のアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つＳＴＡＴ３の活性化抑制作用を有する、ポリペプチド。
（ｉｉ−１）配列番号２の６８９〜７２２番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｉｉ−２）（ｉｉ−１）のアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つＳＴＡＴ３の活性化抑制作用を有する、ポリペプチド。
【００２９】
なお、配列番号１はヒトのＳＴＡＴα（７７０アミノ酸長）のアミノ酸配列を、配列番号２は、ヒトのＳＴＡＴβ（７２２アミノ酸長）のアミノ酸配列を、それぞれ示す。
【００３０】
当該（ｉ−１）及び（ｉｉ−２）のポリペプチドにおいて、欠失、置換又は付加されたアミノ酸は、１〜２０（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０）個程度であることが好ましく、１〜１０個程度がより好ましく、１〜５個程度がより好ましい。また、上記の（Ｉ）及び（ＩＩ）の少なくとも一方が起こる場合に、ＳＴＡＴ３の活性化抑制作用を有すると判断する。
【００３１】
また、当該（ｉ−１）のポリペプチドは（ｉ）のポリペプチドと同一性（アイデンティティー）が８０％以上であることが好ましく、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％以上であることがより好ましく、１００％であることがさらに好ましい。また、当該（ｉｉ−１）のポリペプチドは（ｉｉ）のポリペプチドと同一性（アイデンティティー）が８０％以上であることが好ましく、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％以上であることがより好ましく、１００％であることがさらに好ましい。なお、当該同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて２配列を比較して得られる同一性である。
【００３２】
当該特定の化合物を含むＳＴＡＴ３非活性化促進組成物は、抗がん組成物として好ましく用いることができる。当該がんとしては、特に制限はされず、例えば固形がん及び血液がんのいずれにも用いることができる。
【００３３】
また、当該特定の化合物を含むＳＴＡＴ３非活性化促進組成物は、当該特定の化合物に加えて、例えば薬学的に許容される担体及び／又は添加剤等を含むことができる。例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶剤、甘味剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、界面活性剤、保湿剤、保存剤、ｐＨ調整剤、粘稠化剤等を挙げることができる。製剤形態も特に制限されず、常法により有効成分及びその他の成分を混合し、例えば錠剤、被覆錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゼリー剤、チュアブル剤、ソフト錠剤等の製剤に調製することができる。投与形態も特に制限はされず、例えば経口投与、経血管投与（特に経静脈等よ）等が好ましく挙げられる。公知の方法又は公知の方法から極めて容易に想到できる方法により、このような剤形へと調製することができる。
【００３４】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本発明は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。
【００３５】
また、上述した本発明の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本発明に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本発明には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
【００３７】
ＳＴＡＴ３はＩＬ−６などのサイトカイン刺激により活性化されたＪａｋキナーゼにより細胞質でＹ７０５にチロシンリン酸化を受ける。ＳＴＡＴ３にはＹ７０５に加えてＳ７２７（７２７番目のセリン）にも様々なセリン／スレオニンキナーゼによりリン酸化を受けることが報告されていた。さらに、Ｓ７２７リン酸化がＳＴＡＴ３活性の持続を抑制すること、その機序として、Ｓ７２７リン酸化依存的に、核内でチロシン脱リン酸化酵素ＴＣ４５によるＹ７０５チロシン脱リン酸化を促進することが報告されていた（Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｃｅｌｌｓ  １７，１３２−１４５，２０１２）。
【００３８】
そこで、ＳＴＡＴ３とＴＣ４５とをダブルノックアウト（ＤＫＯ）した細胞において、ＳＴＡＴ３を強制発現させ、その挙動を検討した。
【００３９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術にてＨｅｐＧ２細胞のｓｔａｔ３遺伝子ノックアウト細胞株ＨｅｐＧ２−ｓｔａｔ３−ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ  （ＳＴＡＴ３のシングルノックアウト：ＳＫＯ）を樹立した。さらにこのＳＫＯ細胞を用いてｔｃ４５遺伝子をノックアウトし、ｓｔａｔ３，  ｔｃ４５ダブルノックアウト細胞株ＨｅｐＧ２−ｓｔａｔ３−ｔｃ４５−ｄｏｕｂｌｅ−ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ  （ＳＴＡＴ３及びＴＣ４５のダブルノックアウト：ＤＫＯ）を樹立した  （図２Ａ）。これら細胞に野生型（ＷＴ）のＳＴＡＴ３又はＳＴＡＴ３  Ｓ７２７Ａ（７２７番目のセリンがアラニンに置換されたＳＴＡＴ３）を、レンチウイルスベクターを用いて導入し、ＨｅｐＧ２  親株に発現するＳＴＡＴ３量と比べて２〜３倍程度のＳＴＡＴ３を発現する細胞株を得た。ＩＬ−６で刺激したＳＫＯ又はＤＫＯで発現させた。ＩＬ−６の刺激により、ＳＴＡＴ３を活性化した。ＩＬ−６は培地に添加し、添加０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、又は１８０分後に細胞を回収した。そして、回収した細胞を用いて、ウェスタンブロットにより、ｐＹ７０５及びＳＴＡＴ３の発現量を検討した（図２Ｂ及び図２Ｅ）。さらに、これらのＳＫＯ及びＤＫＯを免疫染色し、２５細胞以上の細胞について、細胞全体で観察されるＳＴＡＴ３のシグナルに対する核内で観察されるＳＴＡＴ３のシグナルの比（すなわち、ＳＴＡＴ３の核内存在比）を算出し（図２Ｃ及び図２Ｆ）、統計処理した（図２Ｄ及び図２Ｇ）。これらの結果（特にＳｔａｔ３とＴＣ４５ダブルノックアウト（ＤＫＯ）条件下実験の結果）から、ＳＴＡＴ３はｐＹ７０５を維持したままＳＴＡＴ３の非活性化が起こり、Ｓ７２７リン酸化依存的に核外輸送が促進される（ＳＴＡＴ３の核内分布が減少する）ことが分かった。
【００４０】
以上のことから、ＳＴＡＴ３二量体の非活性化は、ｐＹ７０５の脱リン酸化とは独立に、Ｓ７２７リン酸化依存的に、起こることが考えられた。非活性化の開始機序を探るため、構造解析を試みた。既に報告されていたＳＴＡＴ３β二量体の結晶構造（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９４，  １４５−１５１）に基づいて、ＣＴＴにおけるアミノ酸とその他の部位とのアミノ酸との相互作用を解析した。当該解析には、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｄｔｉｏｎｓ  ｃａｌｃｕｌａｔｅｒ  （ＰＩＣ）（Ｔｉｎａ，  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３５，  Ｗ４７３−４７６）及びＭｕｔａＢｉｎｄ（Ｌｉ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４４，  Ｗ４９４−５０１）を用いた。その結果、ｐＹ７０５−ＳＨ２の結合をだけでなく、ＣＴＴ−ＣＴＴ間の分子間相互作用と同一分子内（すなわち、二量体の別々の分子間ではなく２量体を形成する１つの分子内）のＣＴＴとＳＨ２ドメインとの間で相互作用を示すアミノ酸対が見出された。当該アミノ酸対について、次の表に示す。ＣＴＴの関与する二つの相互作用がｐＹ７０５−ＳＨ２結合を支持する可能性が示唆された。
【００４１】
【表１】
2020172477.tif 000002
【００４２】
なお、当該表中の「ＮＺ」は側鎖のＮ（窒素原子）を、「ＳＧ」は側鎖のＳ（硫黄原子）を、「ＯＧ１」は側鎖のＯ（酸素原子）を、「Ｏ＊」は主鎖のＯ（酸素原子）を、「ＯＨ」は側鎖のヒドロキシ基を、それぞれ示す。
【００４３】
また、図１にＳＴＡＴ３の二量体の結晶構造、並びにＳＴＡＴα及びＳＴＡＴβの構造を示し、図３にＣＴＴとＳＨ２ドメインとの間で相互作用を詳細に解析した結果を示す。
【００４４】
当該結果から、ＣＴＴに含まれるアミノ酸のなかでも、Ｋ７０９、Ｉ７１１、Ｃ７１２、Ｖ７１３、Ｔ７１４、及びＰ７１５の各アミノ酸が、ＣＴＴとＳＨ２ドメインとの間で相互作用に重要であることが分かった。
【００４５】
これらの中の代表例として、Ｋ７０９及びＴ７１４を選択し、さらに検討を進めた。
【００４６】
具体的には、Ｋ７０９Ｅ（７０９番目のＫ（リジン）がＥ（グルタミン酸）に置換されている）又はＴ７１４Ａ（７１４番目のＴ（チロシン）がＡ（アラニン）に置換されている）変異を有するＳＴＡＴ３を、上記と同様にして、ＨｅｐＧ２−ＳＫＯ細胞とＨｅｐＧ２−ＤＫＯ細胞に発現させ、ＩＬ−６刺激を与えた後、Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（ＳＴ）にてキナーゼ活性を阻害し、時間経過によるＹ７０５リン酸化の変化をウェスタンブロットにより解析した。コントロールとしてＳＴＡＴ３  ＷＴも用いた。結果を図４に示す。ＳＴＡＴ３  Ｋ７０９ＥもＳＴＡＴ３  Ｔ７１４Ａ変異体もＩＬ−６刺激１５分後のｐＹ７０５レベルが低く、ＳＴ処理後には速やかにｐＹ７０５が低下した。この速やかなｐＹ７０５の低下は、核内でのｐＹ７０５脱リン酸化に働くＴＣ４５がないＤＫＯ細胞でも起こっており、ＳＴ処理後、速やかな核外輸送が起こると考えられた。ここには示さないが、Ｋ７０９Ｅ及びＴ７１４Ａ変異体では、非活性化が促進されＳＴＡＴ３の標的遺伝子であるｓｏｃｓ３の発現量も減少した。よってＳＴＡＴ３活性が低下しているといえることがわかった。従って、これらのアミノ酸は、ＳＴＡＴ３の活性維持に重要であること、及びその活性は、これらのアミノ酸が関与するＣＴＴとＳＨ２ドメインとの間での相互作用が失われることにより抑制されること、がわかった。
【００４７】
つまり、ＣＴＴ−ＳＨ２分子内結合が弱くなるとＳＴＡＴ３の活性化は起こるが、非活性化しやすくなることを示している。
【００４８】
ＨｅｐＧ２−ＳＫＯ細胞に、Ａ）Ｋ７０９Ｅ／Ｓ７２７Ａ、Ｔ７１４Ａ／Ｓ７２７Ａ変異体、Ｂ）ＣＴＴ−ＳＨ２との結合を高めると予測された変異体（Ｙ６４０ＦやＫ６５８Ｙ）、あるいはＣ）Ｐ７１５Ａ、Ｋ７０９Ｅ／Ｐ７１５Ａ変異体を発現させ、ＩＬ−６刺激後にＳＴを加え、ｐＹ７０５の脱リン酸化を検討した。ＣＴＴ−ＳＨ２間の結合が弱くなる変異体は活性化された後、速やかに非活性化が起こり、ｐＳ７２７作用も必要でないこと、逆にＣＴＴ−ＳＨ２結合が強くなると予測された変異体では、ＳＴ処理後も非活性化が起こりにくくなることを示している。Ｐ７１５Ａ変異体では、Ｓｅｒ７２７リン酸化依存的な非活性化促進作用がなくなることから、ｐＳ７２７作用にはＰｒｏ７１５が重要であることも示している。このＰ７１５Ａ変異は、構造上ＣＴＴ−ＳＨ２作用には影響を与えないと考えられたことから、ｐＳ７２７依存的な作用は、Ｐｒｏ７１５依存的なＣＴＴの修飾によるものと考えられた。（図５）
【００４９】
さらに、Ｋ７０９Ｅ変異体やＴ７１４Ａ変異体をＨｅｐＧ２−ＤＫＯに発現させ、ＩＬ−６の刺激（培地への添加）単独または刺激１５分後にスタウロスポリン（Ｊａｋをはじめとする多数のキナーゼ活性を抑制する阻害剤）を終濃度０．５μＭとなるよう培地へ添加し、時間を追って、ＳＴＡＴ３の細胞内局在の変化を検討した。いずれの変異体でもＩＬ−６刺激により核内に入ったＳＴＡＴ３は、さらなるキナーゼによる活性化を抑制すると１０分以内に核外輸送が起こった。
【００５０】
以上の結果から、ＣＴＴ−ＳＨ２分子内結合が阻害されると、（ＩＬ６等で刺激されて）Ｙ７０５のリン酸化は問題なく起こるが、速やかな非活性化が起こり、結果として脱リン酸化の促進、若しくは一旦活性化されたＳＴＡＴ３の核外輸送が起こる（概ね１０〜１５分以内に核外に出る）、又はこの両方が起こることにより、ＳＴＡＴ３の活性が抑制される蓋然性が高いことが分かった。また、ＳＴＡＴ３  Ｓｅｒ７２７リン酸化は、ＳＴＡＴ３の非活性化を促進する作用を示すが、Ｋ７０９ＥやＴ７１４Ａ変異体の非活性化促進機序は、Ｓｅｒ７２７リン酸化の作用を必要としなかった（図６Ａ）。
【００５１】
次にＣＴＴ−ＳＨ２相互作用を高めると考えられた二つの活性型変異を用いることで、ＣＴＴ−ＳＨ２結合の役割を検討した。Ｋ６５８Ｙ、Ｙ６４０Ｆという二つの変異は、構造解析の結果、異なる機序でＣＴＴ−ＳＨ２相互作用を強めると考えられた。Ｙ６５８となることでＣＴＴのＩ７１１とＶ７１３との間に新たな疎水結合が生じ、結果としてＣＴＴ部分がより強くＳＨ２に結合すると考えられ、Ｙ６４０Ｆ変異体では、Ｃ７１２とＹ６４０の間の水素結合がなくなるが、この結合は図３Ｂのδで示した結合であり、同図に示されたα、β、γの結合とは引っ張る方向が異なり、下、前方へ引っ張ることで、ＣＴＴをＳＨ２から離すように働いている。従って、Ｙ６４０Ｆという変異になり、Ｃ７１２とＹ６４０間の水素結合が無くなるとＣＴＴがよりＳＨ２側に結合すると予想された。実際、この二つの変異体をＨｅｐＧ２−ＳＫＯ細胞に発現させ、ＩＬ−６刺激後、ＳＴ処理を加え、ｐＹ７０５の変化を見た所、ｐＹ７０５の脱リン酸化が抑制され、持続的な活性を示した（図６Ｂ）。この結果は、ＣＴＴ−ＳＨ２相互作用の強さがＳＴＡＴ３安定性を決めていることを示しているが、Ｓｅｒ７２７リン酸化依存的な非活性化促進作用も無くなることから、Ｓｅｒ７２７リン酸化の作用が、このＣＴＴ−ＳＨ２相互作用の制御を介して働くことが推定された。そのような機序としては、Ｓｅｒ７２７リン酸化依存的にＣＴＴに含まれるアミノ酸の修飾（リン酸化、アセチル化など）がもっとも考えられた。プロリン７１５をアラニンに変異させるＰ７１５Ａ変異体は、Ｓｅｒ７２７リン酸化による非活性化促進活性を抑えたが、Ｋ７０９Ｅ変異体の非活性化には抑制効果を示さなかったことから、プロリン７１５が関わるＳｅｒ７２７リン酸化依存的な修飾、Ｔ７１４またはＴ７０８のリン酸化、Ｋ７０９、Ｋ７０７のアセチル化などが候補であるといえる。次にＫ６５８ＹやＹ６４０Ｆという活性型変異の活性を抑制するのに、ＣＴＴ−ＳＨ２間のどの部位で抑制が入るとそのようながんで見つかる活性型変異作用を抑制できるか検討するため、それぞれの変異にＫ７０９Ｅ変異またはＴ７１４Ａ変異を加えた。Ｙ６４０Ｆ変異による持続的活性は、Ｔ７１４Ａ変異を加えることで正常化し、Ｋ６５８Ｙ変異による持続的活性は、Ｋ７０９ＥでもＴ７１４Ａ変異でも正常化することができることを示した（図６）。これらの結果から、がんなどで見つかる活性型変異に対して、阻害部位の違いによる阻害物質の使い分けが有効な場合があると考えられた。
【図１】
2020172477.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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