(57)【要約】【課題】  簡単な構造を有し、かつ簡単な操作で、効率よく細胞懸濁液を希釈することができる手段を提供すること。【解決手段】  本発明は、細胞懸濁液を希釈するためのデバイスであって、第一流路、第二流路、および第一流路と第二流路とを連通する連通路を含み、一方の流路を流れる希釈液が、連通路を通して、他方の流路を流れる細胞懸濁液に添加されるように構成されている、前記デバイスに関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞懸濁液を希釈するためのデバイスであって、
第一流路、第二流路、および第一流路と第二流路とを連通する連通路を含み、
一方の流路を流れる希釈液が、連通路を通して、他方の流路を流れる細胞懸濁液に添加されるように構成されている、前記デバイス。
【請求項２】
１以上の連通路が、流路方向に沿って配置されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
添加速度が、流路方向に向けて徐々に大きくなるように構成されている、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
連通路の断面積が、流路方向に向けて徐々に大きくなるように構成されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５】
一方の流路から他方の流路に向けて下り勾配ができるように構成されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６】
勾配が、流路方向に向けて徐々に大きくなるように構成されている、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
希釈液の注入速度が、希釈時の最大浸透圧負荷が４０〜２５０ｍＯｓｍ／秒となるように構成される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８】
第一流路および第二流路が螺旋状に配置されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９】
第一流路および第二流路が互いに隣接し、連通路が両流路を隔てる壁部に設けられている、請求項１〜８いずれか一項に記載のデバイス
【請求項１０】
デバイスが、密閉空間を構成する容器部をさらに含み、細胞懸濁液が容器部の下段側で希釈され、容器部の上段側に希釈された細胞懸濁液が溜まるように構成されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１１】
細胞懸濁液の希釈方法であって、一方の流路を流れる希釈液を、連通路を通して、他方の流路を流れる細胞懸濁液に添加する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞懸濁液を希釈するためのデバイスおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の利用が試みられている（非特許文献１）。
【０００３】
このような試みの一環として、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成したシート状細胞培養物が開発されてきた（例えば、特許文献１〜３参照）
【０００４】
再生医療に基づく新たな治療方法の確立とともに、自家細胞を凍結させて保存し、人工組織やシート状細胞培養物などの三次元構造体を形成したり、直接細胞を移植したりする際に、かかる凍結保存細胞を融解して自家細胞を回収し、それを用いて治療を行う機会が近年増加してきている。
【０００５】
この方法でシート状細胞培養物を形成する場合、通常よりも多くの細胞を必要とするため、多くの生細胞を回収するべく、細胞を凍結および／または融解する際に、細胞に物理化学的ダメージを極力与えない工夫がされている。
【０００６】
この状況の中で、本発明者らは、希釈液を注入する動作部、および動作部の希釈液注入速度を制御する演算制御部を含む、凍結保存細胞融解システムを提案した（特許文献４）。かかるシステムで希釈液注入速度を制御することで、急激な浸透圧変化によって死に至る細胞数を減少させ、それにより回収可能な生細胞数を向上させることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００７−５２８７５５号公報
【特許文献２】特開２０１０−８１８２９号公報
【特許文献３】特開２０１０−２２６９９１号公報
【特許文献４】特開２０１５−１８１４３３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Haraguchi et al., Stem Cells Transl Med. 2012;1(2):136-41
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のようなシステムは、動作部や制御部を実現するための構造が複雑で、製造コストが高く、操作が複雑であった。また、希釈工程における細胞懸濁液中の希釈液の分布にバラツキが生じることがあった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明はこのような点を考慮してなされたものであり、簡単な構造を有し、かつ簡単な操作で、効率よく細胞懸濁液を希釈することができる、手段を提供することにある。
【００１１】
すなわち本発明は、以下に関する。
［１］細胞懸濁液を希釈するためのデバイスであって、第一流路、第二流路、および第一流路と第二流路とを連通する連通路を含み、一方の流路を流れる希釈液が、連通路を通して、他方の流路を流れる細胞懸濁液に添加されるように構成されている、前記デバイス。
［２］１以上の連通路が、流路方向に沿って配置されている、［１］に記載のデバイス。
［３］添加速度が、流路方向に向けて徐々に大きくなるように構成されている、［１］または［２］に記載のデバイス。
［４］連通路の断面積が、流路方向に向けて徐々に大きくなるように構成されている、［１］〜［３］のいずれか一つに記載のデバイス。
［５］一方の流路から他方の流路に向けて下り勾配ができるように構成されている、［１］〜［４］のいずれか一つに記載のデバイス。
［６］勾配が、流路方向に向けて徐々に大きくなるように構成されている、［５］に記載のデバイス。
【００１２】
［７］希釈液の注入速度が、希釈時の最大浸透圧負荷が４０〜２５０ｍＯｓｍ／秒となるように構成される、［１］〜［６］のいずれか一つに記載のデバイス。
［８］第一流路および第二流路が螺旋状に配置されている、［１］〜［７］のいずれか一つに記載のデバイス。
［９］第一流路および第二流路が互いに隣接し、連通路が両流路を隔てる壁部に設けられている、［１］〜［８］のいずれか一つに記載のデバイス
［１０］デバイスが、密閉空間を構成する容器部をさらに含み、細胞懸濁液が容器部の下段側で希釈され、容器部の上段側に希釈された細胞懸濁液が溜まるように構成されている、［１］〜［９］のいずれか一つに記載のデバイス。
［１１］細胞懸濁液の希釈方法であって、一方の流路を流れる希釈液を、連通路を通して、他方の流路を流れる細胞懸濁液に添加する、前記方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、簡単な構造を有するため、製造コストを低く抑えることができ、かつ簡単な操作で、効率よく細胞懸濁液を希釈することができるため、作業者の手技に依存することなく、作業レベルを均一化することができる。
【００１４】
また、本発明によれば、凍結、融解を経ても高いバイアビリティを保ったまま細胞を回収できるため、とくに融解後に増殖培養を経ずに使用する場合であっても、十分な生細胞数を確保することが可能となる。
【００１５】
さらに、本発明によれば、細胞懸濁液を移動させながら希釈液を添加することができ、細胞懸濁液中の希釈液の分布のバラツキを抑えることができるため、生細胞の生存率が向上する。そして、細胞懸濁液と希釈液とを流路に対して間断なく流すことで、大量の細胞懸濁液を効率よく一度に希釈することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の第１実施形態に係るデバイスの概念図である。
【図２】図２は、本発明の第２実施形態に係るデバイスの概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、１つの側面において、細胞懸濁液を希釈するためのデバイスであって、第一流路、第二流路、および第一流路と第二流路とを連通する連通路を含み、一方の流路を流れる希釈液が、連通路を通して、他方の流路を流れる細胞懸濁液に添加されるように構成されている、前記デバイスに関する。
本発明は、１つの側面において、細胞懸濁液の希釈方法であって、一方の流路を流れる希釈液を、連通路を通して、他方の流路を流れる細胞懸濁液に添加する、前記方法に関する。本発明の一態様において、細胞懸濁液は、凍結保存細胞を融解して得られたものである。
【００１８】
本発明において、「凍結保存細胞」とは、通常は凍結保存された細胞そのものを意味するが、凍結保存された細胞の１つの凍結保存単位を意味することもある。この場合、凍結保存単位とは、例えば１つのチューブなど、１群として一緒に凍結保存される細胞群を意味する。したがってこの場合、「凍結保存細胞」を融解した場合、凍結されていた「細胞懸濁液」が得られることとなる。
【００１９】
本発明において、「希釈時の浸透圧負荷」とは、希釈液を加えたことによって変化する浸透圧の単位時間当たりの変化率を意味する。浸透圧負荷は、希釈液の添加速度（単位時間当たりの添加量）や、希釈液と希釈対象の液（例えば融解した細胞懸濁液など）との浸透圧の差などの因子により変化する。「最大浸透圧負荷」とは、希釈開始から希釈終了までの間に、希釈液の添加により変化する浸透圧負荷のうち、最大の数値を意味する。
【００２０】
本発明は、凍結保存細胞を融解して得られた細胞懸濁液を希釈し、その希釈時の浸透圧変化を十分緩慢にすることを特徴とするものである。通常凍結保存細胞を融解して生細胞を回収する際、融解した細胞懸濁液中にある細胞毒性成分の影響を低減させるためなどの目的で、融解した細胞懸濁液に培養培地などを加えて希釈する。本発明者らは、かかる希釈の工程において急激に希釈すると、懸濁液の浸透圧の急激な変化により細胞に与えられるダメージにより、生細胞の生存率が低下してしまうことを見出した。
【００２１】
希釈時の浸透圧変化が十分緩慢であれば、細胞に与えられるダメージが低減され、生細胞の回収量が増大する。浸透圧変化を緩慢にする方法は、例えば希釈液を添加する速度を遅くする、細胞懸濁液と浸透圧差の少ない希釈液を用いるなど、当該技術分野において知られたあらゆる方法を用いてよいが、例えば細胞毒性を有する希釈液を用いないなど、浸透圧負荷以外のダメージを与えないことが好ましい。
【００２２】
本発明において用い得る希釈液は特に限定されないが、細胞に物理化学的ダメージを与えないものが好ましい。希釈液の例としては、これに限定するものではないが、例えばＤＭＥＭ培地などの液体培地、ハンクス平衡塩溶液、ＰＢＳなどの緩衝液、生理食塩水などの等張液、蒸留水などが挙げられる。また、これらにさらにアルブミンなど他の成分が添加されていてもよい。
【００２３】
本明細書においては、単位Ｏｓｍは浸透圧の単位として用いており、１Ｏｓｍは１ｍｏｌ／Ｌの理想溶液の有する浸透圧と等価な浸透圧を意味するものである。また、希釈時の浸透圧負荷は、室温条件下における１秒あたりの浸透圧の変化（単位：Ｏｓｍ／秒）として表しているが、浸透圧変化の大きさを表現できる単位であればどんな単位を用いてもよく、これに限定するものではないが、例えば希釈液の添加速度、体積または重量の増加速度などが挙げられる。
【００２４】
浸透圧負荷は、浸透圧変化をリアルタイムで計測してもよいし、ある２つの時点での浸透圧を求め、その間の単位時間当たりの平均変化として求めてもよい。ある時間幅において一定の速度で希釈液を添加している場合、同一の希釈液を添加している限りにおいては、一般的に、希釈液添加開始時点での浸透圧負荷がその時間幅における浸透圧負荷の最大値となり、希釈液の添加量が増大するにつれて浸透圧負荷は減少していくと考えられる。したがって、ある態様において、一定の速度で同一の希釈液を添加している場合、希釈液添加開始時の浸透圧およびその単位時間後（例えば本発明の上記例においては１秒後）の浸透圧を求め、両時点での浸透圧の差分をその希釈における最大浸透圧負荷とみなす。
【００２５】
本発明は、一方の流路を流れる希釈液が、連通路を通して、他方の流路を流れる細胞懸濁液に添加されるようにすることで、細胞懸濁液を流路の始端から終端に向けて移動させながら（流しながら）、希釈液を添加することができる。したがって、本発明を利用して、希釈液を添加する場合、細胞懸濁液中の希釈液の分布にバラツキが生じにくい。そして、細胞懸濁液の流路の始端側での浸透圧負荷が、浸透圧負荷の最大値となり、流路を終端側に向けて進むにつれて、添加される希釈液の添加量が増大し、浸透圧負荷は緩やかに減少していくと考えられる。
【００２６】
本方法に用いることができる細胞の例としては、限定されずに、接着細胞（付着性細胞）を含む。接着細胞は、例えば、接着性の体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。体細胞は、幹細胞、特にｉＰＳ細胞から分化させたものであってもよい。シート状細胞培養物を形成し得る細胞の非限定例としては、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。本明細書においては、単層の細胞培養物を形成するもの、例えば、筋芽細胞または心筋細胞などが好ましく、とくに好ましくは骨格筋芽細胞またはｉＰＳ細胞由来の心筋細胞である。
【００２７】
上述のとおり、融解により得られた細胞懸濁液は細胞毒性成分（例えばＤＭＳＯなど）を含み得るため、希釈することで該細胞毒性成分の影響を低減することができる。本発明は、この希釈の際に浸透圧変化を十分緩慢にする、すなわち浸透圧負荷を十分小さくすることにより、融解細胞の生存率を増大させることに特徴を有するものである。
【００２８】
本発明において、「十分緩慢な浸透圧変化」の閾値は、用いる細胞、融解の条件、温度などにより変化し得る。例えば通常の凍結保存液（例えば１０％程度のＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ培地など）および通常の希釈液（例えば市販のＤＭＥＭ培地など）を用いる場合、ある態様において最大浸透圧負荷は約２５０ｍＯｓｍ／秒以下であり、約２２０ｍＯｓｍ／秒であることが好ましい。より好ましくは約１００ｍＯｓｍ／秒以下であり、さらに好ましくは約５０ｍＯｓｍ／秒以下である。
【００２９】
また、希釈に時間をかけすぎると、例えば細胞懸濁液中の細胞毒性成分の影響で、浸透圧負荷以外の理由によるダメージが細胞に与えられてしまう場合があるため、この観点からは速やかに希釈されることが好ましい。本発明の方法においては、最大浸透圧負荷の下限値は特に設定されなくてもよいが、通常の凍結保存液（例えば１０％程度のＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ培地など）および通常の希釈液（例えば市販のＤＭＥＭ培地など）を用いる場合であれば、約２ｍＯｓｍ／秒以上が好ましく、約２０ｍＯｓｍ／秒以上がより好ましく、約４０ｍＯｓｍ／秒以上がさらに好ましい。
【００３０】
したがって本発明の方法の好ましい一態様において、最大浸透圧負荷は、２ｍＯｓｍ／秒〜２５０ｍＯｓｍ／秒であり、より好ましくは２ｍＯｓｍ／秒〜２２０ｍＯｓｍ／秒であり、さらに好ましくは２０ｍＯｓｍ／秒〜１００ｍＯｓｍ／秒であり、回収可能な生細胞量の観点から、最も好ましくは４０ｍＯｓｍ／秒〜５０ｍＯｓｍ／秒である。
【００３１】
上述のとおり、本発明の方法において、融解した細胞懸濁液に最初に添加される希釈液が最大浸透圧負荷に最も影響しやすい。したがって、本発明の一態様において、最大浸透圧負荷は、希釈開始から３倍に希釈されるまでの間の最大浸透圧負荷であり、別の一態様においては、２倍に希釈されるまでの間の最大浸透圧負荷である。
【００３２】
本発明の好ましい一態様において、希釈は浸透圧を計測して最大浸透圧負荷を調節しながら行われる。浸透圧の計測は常時継続的に行われてもよいし、例えば１秒ごと、１０秒ごと、３０秒ごと、１分ごとなど、特定の時間間隔で行われてもよい。浸透圧の計測方法は、当該技術分野において知られたあらゆる方法を用いることができ、これに限定するものではないが、例えばオスモメーターなどを用いて計測することができる。
【００３３】
以下、本発明を、図面を参照しつつ、好適な実施形態に基づき、詳細に説明する。なお、図中の各部材の大きさは説明のために適宜強調されており、実際の比率、大きさを示すものではない。
【００３４】
＜第１実施形態＞
まず、本発明の第１実施形態に係るデバイスについて説明する。図１は、本発明の第１実施形態に係るデバイスの概念図である。図２は、本発明の第１実施形態に係るデバイスの変形例を示す概念図である。
【００３５】
図１Ａ〜図１Ｆに示されるように、デバイスは、第一流路１、第二流路２、および第一流路１と第二流路２とを連通する連通路３を含む。図中、上側は、第一流路１、第二流路２および連通路３の配置を示す上面図、下側は、上面図におけるＸ−Ｘ’断面図を示す。デバイスを使用する場合は、例えば、第一流路１の始端（注入口４）から細胞懸濁液を、第二流路２の始端（注入口５）から希釈液を注入し、希釈液を連通路３を通して細胞懸濁液に添加することで、細胞懸濁液を希釈し、希釈された細胞懸濁液を流路の終端側で回収することができる。細胞は、対数増殖期の細胞を用いるのが、生細胞回収量の観点から好ましい。
【００３６】
細胞懸濁液は、第一流路１内を進みながら、連通路３を通った希釈液により希釈されるため、細胞懸濁液中の希釈液の分布にバラツキが生じにくい。すなわち、遠沈管などに収容された細胞懸濁液に希釈液を滴下（添加）する場合、細胞懸濁液の上側と下側とで希釈液の分布にバラツキが生じやすいが、本発明においては、細胞懸濁液を移動させながら希釈液を添加するため、希釈液の分布にバラツキが生じにくい。
【００３７】
また、本発明においては、細胞懸濁液と希釈液とを流路に対して間断なく（連続的に）流すことができるため、大量の細胞懸濁液を効率よく一度に希釈することができる。すなわち、遠沈管などに収容した細胞懸濁液に希釈液を滴下（添加）する場合は、遠沈管の容積分だけの細胞懸濁液しか希釈されない。また、大量に希釈する場合は、複数の遠沈管を使用して、それぞれに希釈液を添加するなど効率が悪い。また、容積の大きな遠沈管を使用する場合は、細胞懸濁液の上側と下側とで希釈液の分布にバラツキが生じやすい。
【００３８】
図１Ａに示されるように、連通路３は、第一流路１と第二流路２とをバイパスするための流路であり、他の流路と区別するために連通路と呼ぶ。連通路３は、第一流路１と第二流路２との間に少なくとも１つ配置されていればよい。上記のように、最大浸透圧負荷は、希釈液の添加速度（単位時間当たりの添加量）に関連し、添加速度は連通路３の断面積に関連する。したがって、連通路３の断面積は、十分緩慢な浸透圧変化が起こるように設定することが好ましい。
【００３９】
細胞懸濁液の希釈は、一方の流路（第二流路２）を流れる希釈液が、他方の流路（第一流路１）を流れる細胞懸濁液に流れ込む（添加される）ことで起こるように構成することができる。これと逆の流れが起こると、連通路３を通過した細胞懸濁液が、希釈液の流れに巻き込まれ、急激な浸透圧変化が起こる。また、希釈が他方の流路だけで起こるようにすることで、希釈作業終了後に残留している細胞を、他方の流路に流体（例えば、ガス、希釈液など）を流し込むだけで回収することができる。したがって、流路や連通路の内表面に、細胞非接着処理を施してもよい。
【００４０】
液の流れ込みを生じさせる手段としては、第二流路２への希釈液の注入圧力を、第一流路１への細胞懸濁液の注入圧力より高くして、圧力差を生じさせることが挙げられる。圧力差を流速差に置き換えて実現することもできる。この場合、第一流路１、第二流路２、および／または連通路３を筒状の閉鎖空間として構成することで、空間内において流体圧力の伝搬が起こりやすいようにすることもできる。
【００４１】
また、別の手段として、第二流路２の終端側が閉塞されるように構成することが挙げられる。この場合、２つの流路への注入圧力（または、流速）が同じでも、第二流路２側の内部圧力が高まるため、終端側が開放されている第一流路１側との間に圧力差が生じる。さらに、別の手段として、一方の流路から他方の流路に向けて下り勾配ができるように構成することが挙げられる。これは、例えば、第二流路２と第一流路１の間に高低差をつける、連通路３に第二流路２から第一流路１にかけて下りの傾斜をつけるなどして実現することができる。
【００４２】
図１Ｂに示されるように、連通路３は、流路方向（液が流れる方向）に沿って離散的に複数配置することもできる。この場合、細胞懸濁液は、第一流路１を始端から終端側に向けて進みながら、複数の連通路３を通った希釈液により希釈される。すなわち、第一流路１内を進む細胞懸濁液は、1つ目の連通路３を通った希釈液で希釈され、この希釈された細胞懸濁液は、次の２つ目の連通路３を通った希釈液でさらに希釈される。したがって、細胞懸濁液の単位体積当たりの希釈液量を徐々に増大させ、浸透圧負荷を緩やかに減少させることができる。複数の連通路３同士の距離は、自由に設定することができる。
【００４３】
上記のように、浸透圧変化を緩慢にする手段としては、希釈液を添加する速度を遅くする方法を用いることができるが、添加速度が遅い場合は、細胞懸濁液を十分に希釈するのに時間がかかる。しかしながら、希釈が進むにつれて、希釈液の細胞懸濁液に占める割合は増大するため、希釈液をより多く添加しても細胞懸濁液の急激な希釈は起こりにくいと言える。したがって、本発明においては、希釈液の添加速度が、希釈が進むにつれて、すなわち、流路方向に向けて徐々に大きくなるように構成することで、希釈工程にかかる時間を大幅に短縮することができる。
【００４４】
図１Ｃに示されるように、連通路３は、流路方向に沿って離散的に複数配置した上で、連通路３の断面積が、流路方向に向けて徐々に大きくなるようにすることができる。これにより、希釈液の添加速度が、流路方向に向けて徐々に大きくなるようにすることができる。また、図１Ｄに示されるように、複数配置された連通路３の離間距離が、流路方向に向けて徐々に小さくなるように構成することもできる。すなわち、図１Ｃ、図１Ｄに示されるように、連通路３の断面積（流路方向単位長さ当たりの断面積）が、流路方向に向けて徐々に大きくなるように構成することができる。
【００４５】
図１Ｅに示されるように、連通路３は、第一流路１と第二流路２との間に流路方向に渡って配置することもできる。そして、図１Ｅに示されるように、連通路３の単位長さ当たりの断面積が、流路方向に向けて徐々に大きくなるように構成することもできる。このように、図１Ｃ〜図１Ｅは、希釈液の添加速度を徐々に大きくする手段の一例であるが、別の例として、第二流路２から第一流路１への勾配が、流路方向に向けて徐々に大きくなるように構成することもできる。これは、例えば、流路間の高低差を流路方向に向けて徐々に大きくする、連通路３の勾配を流路方向に向けて徐々に大きくするなどして実現することができる。
【００４６】
図１Ｆは、第一流路１および第二流路２を螺旋状に配置したデバイスを示す。細胞懸濁液および希釈液は、それぞれデバイスの中央部に設けられた注入口４および注入口５から注入され、流路を螺旋状に進みながら連通路３（図示せず）を介して希釈される。第二流路２を第一流路１の内側に配置し、希釈液に遠心力を掛けて外側の懸濁液に添加するようにすることもできる。図示されるように、流路を流路方向に向けて大きくすることもできる。第一流路１および第二流路２は、細胞懸濁液と希釈液とが並走する限り、どのように配置してもよい。
【００４７】
デバイスは、少なくとも第一流路１、第二流路２、および第一流路１と第二流路２とを連通する連通路３を含んでいればよく、一方の流路を流れる希釈液が、連通路を通して、他方の流路を流れる細胞懸濁液に添加されるように構成されている限り、どのような変形例をとることもできる。図１Ａ〜図１Ｆを参照して上記した、１以上の連通路が、流路方向に沿って配置される実施形態は、本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明したものに限定されるものではない。第一流路１、第二流路２、および連通路３は、希釈時の浸透圧変化が十分緩慢になるように構成される限り、どのように設計してもよい。
【００４８】
以上、本発明によれば、簡単な構造を有するため、製造コストを低く抑えることができ、かつ簡単な操作で、効率よく細胞懸濁液を希釈することができるため、作業者の手技に依存することなく、作業レベルを均一化することができる。
【００４９】
また、本発明によれば、凍結、融解を経ても高いバイアビリティを保ったまま細胞を回収できるため、とくに融解後に増殖培養を経ずに使用する場合であっても、十分な生細胞数を確保することが可能となる。
【００５０】
さらに、本発明によれば、細胞懸濁液を移動させながら希釈液を添加することができ、細胞懸濁液中の希釈液の分布のバラツキを抑えることができるため、生細胞の生存率が向上する。そして、細胞懸濁液と希釈液とを流路に対して間断なく流すことで、大量の細胞懸濁液を効率よく一度に希釈することができる。
【００５１】
＜第２実施形態＞
次に、本発明の第２実施形態に係るデバイスについて説明する。図２は、本発明の第２実施形態に係るデバイスの概念図である。以下、第１実施形態との相違点について詳細に説明し、同様の事項については、説明を省略する。
【００５２】
図２に示すように、本発明の第２実施形態に係るデバイスは、第一流路１、第二流路２、連通路３、注入口４、注入口５、容器部６、排出口７を含む。容器部６は、円柱形の容器形状を有し、内部は密閉された空間が形成されている。容器部６は、仕切板６１によって上段と下段とに仕切られており、下段側には、図１Ｆに示したような、螺旋状の第一流路１および第二流路２が配置されている。注入口４および注入口５は、容器部６の下面中央に設けられている。連通路３は、例えば、図１Ａ〜図１Ｆを参照して上記したように配置することができる。
【００５３】
細胞懸濁液および希釈液はシリンジなどに入れ、チューブなどを介して容器部６の下面側から注入口４、５に注入する。この際、シリンジを操作して注入圧力に圧力差を生じさせるようにしてもよい。注入口４、５から注入された細胞懸濁液および希釈液は、流路を螺旋状に進みながら連通路３を介して希釈される。流路の終端側から流れ出た、希釈された細胞懸濁液は、容器部６の外側を流れながら、仕切板６１の外側に円周方向に沿って設けられた複数の孔６２を通って、容器部６の上段側の空間に流れ込む。
【００５４】
すなわち、本実施形態に係るデバイスは、容器部６の下段側で希釈が起こり、容器部６の上段側に、希釈された細胞懸濁液が溜まるように構成されている。希釈された細胞懸濁液は螺旋状に進み、容器部６の上段側でも対流が起こるため、細胞の洗浄効果がより高まる。希釈された細胞懸濁液は、容器部６の側面に設けられた排出口７から排出される。この際、容器部６を上下反転させて、希釈された細胞懸濁液を排出口７から排出してもよい。排出口７は、容器部６の上側に配置することで、容器部６を作業台に設置したときになどにコンタミネーションなどを防ぐことができる。
【００５５】
デバイスを衛生的に取り扱うことができれば、上段側、下段側の構成を入れ替えて、容器部６の下段側に希釈された細胞懸濁液を溜めて、開閉式の排出口７から排出してもよい。複数の孔６２を開閉式にし、閉鎖することにより希釈前と希釈後の液体が混合されないようにすることもできる。容器部６の断面は方形でもよく、その場合は、流路を直線的に配置し、途中で折り返し部分を作ることで、容器部６の底面に効率よく複数の直線的な流路を配置することができる。容器部６の断面が円形である場合は、流路を螺旋状に配置することにより、容器部６の底面を効率よく利用でき、急峻なカーブが形成されにくいため、細胞の残留が起こりにくい。
【００５６】
以上、本発明によれば、簡単な構造を有するため、製造コストを低く抑えることができ、かつ簡単な操作で、効率よく細胞懸濁液を希釈することができるため、作業者の手技に依存することなく、作業レベルを均一化することができる。
【００５７】
また、本発明によれば、凍結、融解を経ても高いバイアビリティを保ったまま細胞を回収できるため、とくに融解後に増殖培養を経ずに使用する場合であっても、十分な生細胞数を確保することが可能となる。
【００５８】
さらに、本発明によれば、細胞懸濁液を移動させながら希釈液を添加することができ、細胞懸濁液中の希釈液の分布のバラツキを抑えることができるため、生細胞の生存率が向上する。そして、細胞懸濁液と希釈液とを流路に対して間断なく流すことで、大量の細胞懸濁液を効率よく一度に希釈することができる。
【００５９】
本発明においては、各構成は、同様の機能を発揮し得る任意のものと置換することができ、あるいは、任意の構成を付加することもできる。
【符号の説明】
【００６０】
１                        第一流路
２                        第二流路
３                        連通路
４                        注入口（第一流路）
５                        注入口（第二流路）
６                        容器部
６１                      仕切板
６２                      孔
７                        排出口
【図１】
2020156331.tif 000002
【図２】
2020156331.tif 000003