(57)【要約】【課題】単独の生物活性配列のみを有するが、天然コラーゲン又は従来の人工コラーゲン様ペプチドを用いた細胞培養足場材よりも細胞接着能がより優れた細胞培養足場材を開発すること、また生理活性配列を有さない細胞培養足場材を開発することが望まれていた。【解決手段】単独の生物活性配列を有し、すなわちインテグリン結合配列のみを細胞接着配列として有する、かつ細胞接着能の高い細胞培養足場材を開発した。また天然には存在しない、生物活性配列を一切有さない人工コラーゲン様ペプチドを用いた細胞培養足場材を開発した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
N末端及びC末端にそれぞれ3つのシステイン（Cys）残基を有するペプチドであって、それらのシステイン残基間に（POG）n［式中、P：プロリン；O：4-ヒドロキシプロリン；G：グリシン；n：4〜16の任意の整数］で表されるトリペプチドリピート配列を有するペプチド。
【請求項２】
前記トリペプチドリピート配列中の繰り返し単位であるPOG同士の間にインテグリン結合配列をさらに有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記インテグリン結合配列が、GFOGER又はGLOGENのアミノ酸配列である、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号3又は4に記載するアミノ酸配列を有する、請求項１〜３の何れか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号9に記載するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか一項に記載するペプチドを含む細胞接着用ゲル化剤であって、
前記ペプチドにより形成される三重らせん構造を有する三本鎖ペプチドを重合単位として、三本鎖ペプチド間に生じるジスルフィド結合によって重合する、ゲル化剤。
【請求項７】
前記細胞接着が、間葉系幹細胞の接着である、請求項６に記載のゲル化剤。
【請求項８】
請求項６又は７に記載するゲル化剤を含む、ゲル。
【請求項９】
請求項６若しくは７に記載のゲル化剤又は請求項８に記載のゲルでコーティングされた間葉系幹細胞の培養プレート。
【請求項１０】
請求項６若しくは７に記載のゲル化剤、請求項８に記載のゲル又は請求項９の培養プレート、及び血小板由来成分を含む間葉系幹細胞培養キット。
【請求項１１】
血小板由来成分がUltraGRO（商標） である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
間葉系幹細胞を培養する方法であって、
間葉系幹細胞を請求項９に記載する培養プレート上に播種する工程；及び
前記間葉系幹細胞を血小板由来成分と共に前記培養プレート上で培養する工程、を含む方法。
【請求項１３】
前記血小板由来成分がUltraGRO（商標）である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物活性配列としてインテグリン結合配列のみを有する人工コラーゲン様ペプチド、生物活性配列を有さない配列のみから構成される人工コラーゲン様ペプチド、それらの人工コラーゲン様ペプチドを用いたゲル化剤、そのゲル化剤を用いたゲル、そのゲル化剤又はゲルでコーティングした培養プレート、それらのゲル化剤、ゲル又は培養プレートを有するキット、及びそれらを用いた間葉系幹細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然コラーゲンを利用した医療用足場材には、天然コラーゲンに起因するプリオン病等の感染症のリスクやアレルギー反応のリスクがあった。また、細胞膜上のコラーゲン受容体として、インテグリン、ジスコイジンドメイン受容体（DDR）やヘパラン硫酸プロテオグリカン鎖を有する膜結合型プロテオグリカンであるシンデカン等が知られているが、これらの受容体が天然コラーゲン上の生物活性配列と結合して、シグナル伝達が起こってしまうため、細胞とコラーゲンとの間の相互作用において、どの受容体がどの程度の役割を果たしているのかが不明であった。このような細胞とコラーゲン間のシグナル解析のために、単独の生物活性配列のみを有する人工コラーゲン様ペプチド、例えば生物活性配列として一種類のインテグリン結合配列のみを有する人工コラーゲン様ペプチドなどが必要であった。こういった状況下で、上記のような感染症やアレルギー反応のリスクを排除しつつ、単独の生物活性配列のみを有する人工コラーゲン様ペプチドからなる細胞培養足場材の開発が進められてきた（特許文献１）。
【０００３】
また間葉系幹細胞は中胚葉性組織に由来する体性幹細胞であり、間葉系の細胞である骨細胞、心筋細胞、又は血液細胞等の分化が可能な幹細胞である。中でも脂肪由来の間葉系幹細胞は骨髄由来の間葉系幹細胞と比較して、細胞増殖が速い、再生促進因子を多く分泌する、免疫抑制能が高いといった特徴を有することが知られている（特許文献２）。
【０００４】
しかしこれまでに、単独の生物活性配列のみを有し又は生物活性配列を有さない、かつ細胞接着能が低い細胞であっても高い接着力を発揮できる人工コラーゲン様ペプチドを用いた細胞培養足場材は無く、再生医療用として応用し得る間葉系幹細胞を培養可能な人工コラーゲン様ペプチドを用いた細胞培養足場材についても無かった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】再表２０１６／２０８６７３
【特許文献２】特開２０１７−０９３４３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
単独の生物活性配列のみを有するが、天然コラーゲン又は従来の人工コラーゲン様ペプチドを用いた細胞培養足場材よりも細胞接着能がより優れた細胞培養足場材の開発、また細胞とコラーゲン間の相互作用の解析において、受容体を介するシグナルによる影響を受けない、生物活性配列を一切有さない人工コラーゲン様ペプチドについての開発が求められていた。さらに、再生医療分野に応用するために、間葉系幹細胞に使用することのできる人工コラーゲン様ペプチドを用いた細胞培養足場材の開発が望まれていた。さらに再生医療の現場において、幹細胞の自己複製能及び分化能といった幹細胞が有する機能を制御する観点から、間葉系幹細胞の増殖を制御する方法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、単独の生物活性配列のみ、すなわちインテグリン結合配列のみを細胞接着配列として有する、かつ細胞接着能の高い細胞培養足場材を開発した。また天然には存在しない生物活性配列を一切有さない人工コラーゲン様ペプチドを用いた細胞培養足場材を開発した。そして、その生物活性配列を一切有さない人工コラーゲン様ペプチドを用いた細胞培養足場材は、間葉系幹細胞の接着に使用することができることを見出した。さらに、本発明の細胞培養方法によれば、人工コラーゲン様ペプチドを用いた細胞培養足場材及び血小板由来成分を併用することによって、間葉系幹細胞の細胞接着能は維持しつつ、細胞培養できること、特に間葉系幹細胞の細胞増殖を制御した培養が可能であることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］N末端及びC末端にそれぞれ3つのシステイン（Cys）残基を有するペプチドであって、それらのシステイン残基間に（POG）n［式中、P：プロリン；O：4-ヒドロキシプロリン；G：グリシン；n：4〜16の任意の整数］で表されるトリペプチドリピート配列を有するペプチド。
［２］前記トリペプチドリピート配列中の繰り返し単位であるPOG同士の間にインテグリン結合配列をさらに有する、［１］のペプチド。
［３］前記インテグリン結合配列が、GFOGER又はGLOGENのアミノ酸配列である、［２］のペプチド。
［４］配列番号3又は4に記載するアミノ酸配列を有する、［１］〜［３］のペプチド。
［５］配列番号9に記載するアミノ酸配列を有する、［１］のペプチド。
［６］［１］〜［５］に記載するペプチドを含む細胞接着用ゲル化剤であって、
前記ペプチドにより形成される三重らせん構造を有する三本鎖ペプチドを重合単位として、三本鎖ペプチド間に生じるジスルフィド結合によって重合する、ゲル化剤。
［７］前記細胞接着が、間葉系幹細胞の接着である、［６］のゲル化剤。
［８］［６］又は［７］に記載するゲル化剤を含む、ゲル。
［９］［６］若しくは［７］に記載のゲル化剤又は［８］に記載のゲルでコーティングされた間葉系幹細胞の培養プレート。
［１０］［６］若しくは［７］のゲル化剤、［８］のゲル又は［９］の培養プレート、及び血小板由来成分を含む、間葉系幹細胞培養キット。
［１１］血小板由来成分がUltraGRO（商標）である、［１０］のキット。
［１２］間葉系幹細胞を培養する方法であって、
間葉系幹細胞を［９］に記載する培養プレート上に播種する工程；及び
前記間葉系幹細胞を血小板由来成分と共に前記培養プレート上で培養する工程、を含む方法。
［１３］前記血小板由来成分がUltraGRO（商標）である、［１２］の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、細胞接着配列がインテグリン結合配列のみから構成される人工コラーゲン様ペプチド、細胞接着配列を有さない配列のみから構成される人工コラーゲン様ペプチド、それらの人工コラーゲン様ペプチドを用いたゲル化剤、そのゲル化剤を用いたゲル、及びそれらのゲル化剤又はゲルを有するキットによって、より細胞接着能の優れた細胞培養足場材を得ることができる。また、この細胞培養足場材を用いることにより、天然コラーゲンと同等以上の細胞接着性を得ることができる。本発明の細胞培養足場材は、特に間葉系幹細胞の細胞接着に効果がある。さらに血小板由来成分を併用することによって、間葉系幹細胞を培養することが可能であり、特に細胞増殖を制御した間葉系幹細胞の培養が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ラット副腎褐色腫細胞株（PC12）の天然コラーゲン及び人工コラーゲン様ペプチドに対する細胞接着活性の評価を示す図である。それぞれの人工コラーゲン様ペプチドにおいて生物活性配列の濃度条件を調製した。天然コラーゲンは、I型、II型及びIII型コラーゲンを用い、人工コラーゲン様ペプチドは、C3、C3-GFOGER、C3-GLOGEN、C3-GVXGFO又はC3-KGHRGFで表される配列を組み込んだ人工コラーゲン様ペプチドを用いた。C3-GFOGER又はC3-GLOGENで表される配列がインテグリン結合配列を有する配列であり、C3-GVXGFO又はC3-KGHRGFで表される配列が非インテグリン型のコラーゲン受容体に結合する配列を有する配列である。C3はインテグリン結合配列及び非インテグリン型のコラーゲン受容体に結合する配列を有さない配列である。上図は神経成長因子（NGF）によるプライミング未処置のPC12を用いたものであり、下図はNGFによるプライミング処置後のPC12を用いたものである。細胞接着活性は、コラーゲンに接着したPC12細胞をクリスタルバイオレット染色した後、細胞の洗浄及び風乾を行い、その後メタノールによって溶出したクリスタルバイオレットの570 nmにおける吸光度測定値に基づき評価した。それぞれ平均値±標準偏差（n=3）である。
【図２−１】ラット副腎褐色腫細胞株（PC12）の天然コラーゲン及び人工コラーゲン様ペプチドに対する神経細胞分化促進活性の評価を示す図である。PC12細胞に対して、NGFによるプライミング処置後のPC12を用い、37℃で2日間培養した後の顕微鏡図である。
【図２−２】図２−１のつづき。
【図２−３】ラット副腎褐色腫細胞株（PC12）の天然コラーゲン及び人工コラーゲン様ペプチドに対する神経細胞分化促進活性の評価を示す図である。図２−１及び図２−２に基づき、20μm以上の神経突起を有する細胞を神経細胞分化した細胞とし、神経細胞分化率を測定し、神経細胞分化促進活性を評価した図である。
【図３−１】ラット副腎褐色腫細胞株（PC12）の天然コラーゲン及び人工コラーゲン様ペプチドに対する神経突起伸長活性の評価を示す図である。PC12細胞に対して、NGFによるプライミング処置後のPC12を用い、37℃で2日間培養した後の顕微鏡図である。
【図３−２】図３−１のつづき。
【図３−３】ラット副腎褐色腫細胞株（PC12）の天然コラーゲン及び人工コラーゲン様ペプチドに対する神経突起伸長活性の評価を示す図である。図３−１及び図３−２に基づき、顕微鏡視野の細胞当たりの神経突起の長さの合計を測定し、神経突起伸長活性を評価した図である。
【図４−１】各種株化細胞の細胞接着活性を評価した図である。ヒト真皮線維芽細胞（HDF）、ヒト線維肉腫細胞（HT-1080）及びヒト乳腺がん細胞（MDA-MB-231）に対して、図１と同様の方法による細胞接着活性の評価を行った。それぞれ平均値±標準偏差（n=3）である。白のカラムはEDTA添加なしであり、グレーのカラムはEDTA添加ありである。
【図４−２】各種株化細胞の細胞接着活性を評価した図である。ヒト前立腺がん細胞（LNCaP）、ヒト前立腺がん細胞（PC3）及びヒト肺がん細胞（A549）に対して、図１と同様の方法による細胞接着活性の評価を行った。それぞれ平均値±標準偏差（n=3）である。白のカラムはEDTA添加なしであり、グレーのカラムはEDTA添加ありである。
【図４−３】各種株化細胞の細胞接着活性を評価した図である。ヒト悪性黒色腫細胞（A375）、ヒト表皮角化細胞（HaCaT）及びヒト子宮頸部がん細胞（HeLa）に対して、図１と同様の方法による細胞接着活性の評価を行った。それぞれ平均値±標準偏差（n=3）である。白のカラムはEDTA添加なしであり、グレーのカラムはEDTA添加ありである。
【図５】ヒト脂肪由来間葉系幹細胞のコラーゲンへの細胞接着活性を評価した図である。天然コラーゲン又は人工コラーゲン様ペプチドでコートした96ウェルプレートに、培養液中に5体積％のUltraGRO（商標）（AventaCell BioMedical）を含むMSF-BM培地（日水製薬）で培養したサブコンフルエント（約80％コンフルエント）のヒト脂肪由来間葉系幹細胞を0.05％トリプシン／EDTAで剥離し、遠心分離により回収した細胞を無血清MSF-BM培地で懸濁し、4×105個／mLの細胞懸濁液とした。これを上記96ウェルプレートに100 μLずつ播種し、37℃で1時間培養した。培養後、PBSで洗浄し、接着した細胞を4％p-ホルムアルデヒド／リン酸緩衝液で固定、0.5％クリスタルバイオレット／20％メタノールで染色し、視野あたりの接着細胞数を計数することにより細胞接着活性を評価した。それぞれ平均値±標準偏差（n=3）である。
【図６】人工コラーゲン様ペプチドでコートした96ウェルプレート上における間葉系幹細胞の増殖活性を評価した図である。培養液中に5体積％のUltraGRO（商標）（AventaCell BioMedical）を含むMSF-BM培地（日水製薬）で培養したサブコンフルエントのヒト脂肪由来間葉系幹細胞を0.05％トリプシン／EDTAで剥離し、遠心分離により回収した細胞を無血清培地または5％UltraGROを含んだMSF-BM培地で懸濁し、4×104個／mLの細胞懸濁液とした。これを上記96ウェルプレートに100 μLずつ播種し、37℃で培養した。一定時間培養後、Cell Counting Kit 8（同人科学研究所）を10 μL／ウェル添加し、37℃で2時間培養後、450 nmの吸光度を測定することで生細胞数を定量した。次に、それぞれの結合配列を組み込んだ人工コラーゲン様ペプチド上での細胞増殖能について検討した。その結果、血小板由来成分UltraGRO（商標）を含まない培地中では有意な細胞増殖促進効果は見られなかった。また、UltraGRO（商標）を添加した培地中では、天然I型コラーゲンにはプラスチック上と比較して増殖促進効果が見られたのに対し、人工コラーゲン様ペプチド上ではむしろプラスチック上よりも増殖能が低下している結果となった。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜N末端及びC末端に3つずつのシステイン残基を有し、それらのシステイン残基間に（POG）nで表すリピート配列を有する人工コラーゲン様ペプチド＞
本発明は、N末端及びC末端にそれぞれ3つのシステイン（Cys）残基を有するペプチドであって、それらのシステイン残基間に（POG）n［式中、P：プロリン；O：4-ヒドロキシプロリン；G：グリシン；n：4〜16の任意の整数］で表されるトリペプチドリピート配列を有する人工コラーゲン様ペプチド（以下では、本発明のペプチドということがある）を提供する。
【００１２】
本発明のペプチドは、N末端及びC末端にそれぞれ3つのシステイン（Cys）残基及びその間の（POG）n［式中、P：プロリン；O：4-ヒドロキシプロリン；G：グリシン；n：4〜16の任意の整数］で表されるトリペプチドリピート配列のみからなるペプチドであってもよく、そのトリペプチドリピート配列中の任意の位置に1又は複数の任意のアミノ酸残基を含んでもよい。
本発明において、トリペプチドとは3つのアミノ酸からなるペプチドのことである。また、トリペプチドリピート配列とは前記トリペプチドが複数回繰り返された配列のことである。
【００１３】
本発明のペプチドは、前記トリペプチドリピート配列中の繰り返し単位であるPOG同士の間にさらに任意のインテグリン結合配列を有してもよい。
例えば、N末端側のトリペプチドリピート配列の繰り返し単位数が2〜8であり、かつC末端側のトリペプチドリピート配列の繰り返し単位数は2〜8である。好ましくは、N末端側のトリペプチドリピート配列の繰り返し単位数が4〜6であり、かつC末端側のトリペプチドリピート配列の繰り返し単位数は4〜6である。さらに好ましくは、N末端側のトリペプチドリピート配列の繰り返し単位数が5であり、かつC末端側のトリペプチドリピート配列の繰り返し単位数は5である。
【００１４】
インテグリン結合配列は、インテグリンに結合できる配列であれば限定されることはないが、好ましくはインテグリンα2β1結合配列であるGFOGER（配列番号1）又はインテグリンα1β1結合配列であるGLOGEN（配列番号2）の配列である。
【００１５】
インテグリン結合配列を有する本発明のペプチドは、好ましくは配列番号3又は4で表される次のアミノ酸配列を有するペプチドである。
C3-GFOGER；CCC(POG)5PPGFOGERGPPG(POG)5CCC  （配列番号3）
C3-GLOGEN；CCC(POG)5PPGLOGENGPPG(POG)5CCC  （配列番号4）
なお、アミノ酸はすべて一文字表記であり、Oは4-ヒドロキシプロリン（4Hyp）を表す。
【００１６】
本発明のペプチドは、インテグリン結合配列を有さず、非インテグリン型のコラーゲン受容体結合配列を有してもよい。例えばジスコイジンドメイン受容体結合配列であるGVXGFO（配列番号5）又はシンデカン結合配列であるKGHRGF（配列番号6）の配列を含むものであり、配列番号7又は8で表される次のアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。
C3-GVXGFO；CCC(POG)5PRGQOGVXGFOG(POG)5CCC  （配列番号7）
C3-KGHRGF；CCC(POG)5PKGHRGFSGLOG(POG)5CCC  （配列番号8）
なお、アミノ酸はすべて一文字表記であり、Oは4-ヒドロキシプロリン（4Hyp）を表し、Xはノルロイシン（Nle）を表す。
【００１７】
本発明のペプチドは、インテグリン結合配列及びその他のコラーゲン受容体結合配列を有さなくてもよい。この場合、前記トリペプチドリピート配列中の繰り返し単位であるPOG同士の間に挿入される配列は、生物活性配列を有さない配列である限り、任意の配列であってよい。例えば、配列番号9で表される次のアミノ酸配列を有するペプチドである。
C3；CCC(POG)5PPGPPGPRGPPG(POG)5CCC  （配列番号9）
なお、アミノ酸はすべて一文字表記であり、Oは4-ヒドロキシプロリン（4Hyp）を表す。
【００１８】
本発明において、ペプチドの合成法は特に限定されることはなく、当業者に周知の化学合成法により合成することができる。化学合成法としては、例えばFmoc型固相合成法を用いることができる。
【００１９】
＜上記人工コラーゲン様ペプチドを含む細胞接着用ゲル化剤又はゲル＞
本発明は、上記ペプチドを含む細胞接着用ゲル化剤又はゲルであって、前記ペプチドにより形成される三重らせん構造を有する三本鎖ペプチドを重合単位として、三本鎖ペプチド間に生じるジスルフィド結合によって重合する、ゲル化剤又はゲルを提供する。
【００２０】
本発明においてゲル化剤とは、上記ペプチドが三重らせん構造を有する三本鎖ペプチドを形成し、その三本鎖ペプチド同士がジスルフィド結合によって重合したポリペプチドのことであり、ゲル化する前の状態のポリペプチドを表す。
本発明においてゲルとは、ゲル化剤に溶媒を加えたものであり、ゲル化した後の状態のポリペプチドを表す。特に限定されることはないが、例えば溶媒として水を用いることが出来る。
【００２１】
本発明においてゲルの合成法は、特に限定されることはなく、当業者に周知の方法により合成することができる。ゲルの合成は、例えばペプチドを変性温度95℃で変性時間5分間加熱することでペプチドを変性させ、4℃で一晩静置することでペプチドの三重らせん構造を有する三本鎖ペプチドを形成させ、さらにこの三本鎖ペプチド同士をジスルフィド結合によって重合することによりゲルを形成することができる。ジスルフィド結合は、例えばゲルの合成溶液中の終濃度が10％となるように酸化剤であるジメチルスルホキシドを添加し、1mg／mLのペプチド溶液を室温で4日間静置することで行うことができる。
【００２２】
上記変性において、変性温度及び変性時間は上記ペプチドが変性可能である限り、特に限定されない。
上記変性後の三本鎖ペプチドの形成において、温度及び時間は上記三本鎖ペプチドが形成される限り、特に限定されない。
上記ジスルフィド結合において、ジメチルスルホキシド添加濃度、温度及び時間はジスルフィド結合による三本鎖ペプチド間の重合が可能である限り、特に限定されない。また、酸化剤は任意のものを用いることもでき、上記三本鎖ペプチド同士をジスルフィド結合に
よって重合できる限り、任意の添加濃度、温度及び時間で用いることができる。
【００２３】
また溶媒中で、上記ペプチドの変性、三本鎖ペプチドの形成、及びジスルフィド結合による重合を行うことによって、ゲル化剤の網目構造間に溶媒を取り込むことができ、ゲルを合成することができる。好ましくは、溶媒は水であり、合成されるゲルはヒドロゲルである。すなわち、本発明の重合ペプチドは、ゲル化剤としての用途を有する。
【００２４】
ゲル化剤の平均重合度は、少なくとも2以上である。上記ゲル化剤を使用して、ゲルを合成できる平均重合度であれば特に限定されず、例えば、平均重合度は100未満であってもよく、100〜1,000、1,000〜10,000又は10,000以上であってもよい。
【００２５】
本発明のゲル化剤を用いたヒドロゲルは、間葉系幹細胞の接着能の観点から有利である。生物活性配列を有さないペプチドを用いたヒドロゲルであっても、間葉系幹細胞が接着できること、特にヒト脂肪由来間葉系幹細胞が接着できることにおいて有利である。
【００２６】
本発明において、ゲルが形成できる限り特に限定されないが、例えば、ゲル中の人工コラーゲン様ペプチドの濃度は0.1〜10質量％、又は0.5〜5質量％である。ゲル中の他の成分は、例えば溶媒として使用する水等が挙げられるが、さらにその他の成分を含んでもよい。
【００２７】
＜上記ゲル化剤又は上記ゲルをコーティングした間葉系幹細胞の培養プレート＞
本発明は、上記ゲル化剤又は上記ゲルをコーティングした間葉系幹細胞の培養プレートを提供する。
プレートを人工コラーゲン様ペプチドでコーティングする方法は、プレートを人工コラーゲン様ペプチドでコーティングできる限り特に限定されず、各試薬の濃度、時間、温度も限定されないが、例えば次のように行うことができる。
人工コラーゲン様ペプチドをそれぞれ個別に脱気した0.05％トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液に溶解（1.11 mg／mL）し、95℃で5分間加熱することで変性し、4℃で一晩静置することで三重らせん構造を有する三本鎖ペプチドを形成させる。これらに対して合成溶液中の終濃度が10％となるように酸化剤であるジメチルスルホキシドを添加し、室温で4日間静置することでジスルフィド結合させ、人工コラーゲン様ペプチドを用いたゲルとした。その後96ウェルプレートに対し、上記ゲルを各ウェル当たり50 μg／mLの濃度で50 μLずつ添加し、風乾させることでウェルを上記ゲルでコーティングする。
【００２８】
本発明のゲル化剤又はゲルは細胞接着において有用であるが、細胞接着活性は、例えばラット副腎褐色腫細胞株（PC12）、ヒト真皮線維芽細胞（HDF）、ヒト線維肉腫細胞（HT-1080）、ヒト乳腺がん細胞（MDA-MB-231）、ヒト前立腺がん細胞（LNCaP）、ヒト前立腺がん細胞（PC3）、ヒト肺がん細胞（A549）、ヒト悪性黒色腫細胞（A375）、ヒト表皮角化細胞（HaCaT）、ヒト子宮頸部がん細胞（HeLa）又は間葉系幹細胞を使用して確認できる。
【００２９】
細胞接着活性は特に限定されることはないが、例えば次の方法による細胞接着性試験によって確認することができる。10％FBS（Gibco）を含むD-MEM／Ham’s F-12培地（フジフィルム和光純薬）で培養したサブコンフルエントのPC12細胞を2mM EDTA／PBSで剥離し、遠心分離により回収した細胞を無血清D-MEM／Ham’s F-12培地で懸濁し、4×105個／mLの細胞懸濁液とする。NGF処理したPC12細胞懸濁液を調製する際には、PC12細胞の培地に50 ng／mLとなるようにマウスNGF（Alomone labs）を添加し、37℃で1日間培養（プライミング）する。これら細胞懸濁液を人工コラーゲン様ペプチドでコーティングした96ウェルプレートに100 μLずつ播種し、37℃で1時間培養する。このとき、インテグリンに非依存的な細胞接着活性を調べるため、細胞懸濁液中の終濃度が4mMとなるようにEDTAを添加した場
合についても同様に試験し、比較する。培養後、PBSで洗浄し、接着した細胞を4％p-ホルムアルデヒド／リン酸緩衝液で固定、0.5％クリスタルバイオレット／20％メタノールで染色し、純水で洗浄した後、風乾する。これに100 μL／ウェルの20％メタノールを添加し、室温で30分間振盪し、溶出したクリスタルバイオレットの570 nmにおける吸光度を測定する。
細胞接着活性は、例えば次の評価基準によって評価することができる。溶出したクリスタルバイオレットの570 nmにおける吸光度において、人工コラーゲン様ペプチドにおける吸光度が、天然コラーゲンであるI型、II型及びIII型コラーゲンにおける吸光度よりも高い場合に細胞接着活性が高いと評価することができる。
【００３０】
本発明のゲル化剤又はゲルは細胞分化促進活性の観点からも有用である。細胞分化活性は特に限定されることはないが、例えば次の方法による細胞分化活性試験によって確認することができる。10％FBSを含むD-MEM／Ham’s F-12培地で培養したサブコンフルエントのPC12細胞を2mM EDTA／PBSで剥離し、遠心分離により回収した細胞を無血清D-MEM／Ham’s F-12培地で懸濁し、3×103個／mLの細胞懸濁液とする。これに細胞懸濁液中の終濃度が50
ng／mLとなるようにNGFを添加し、人工コラーゲン様ペプチドでコーティングした96ウェルプレートに100 μL／ウェルずつ播種し、37℃で2日間培養する。このとき、20 μm以上の神経突起を有する細胞を神経細胞分化した細胞とし、顕微鏡視野あたりの神経細胞分化率を測定する。
神経細胞分化促進活性は例えば次の評価基準によって評価することができる。人工コラーゲン様ペプチドを用いた場合の神経細胞分化率が、天然コラーゲンであるI型、II型及びIII型コラーゲンを用いた場合の神経細胞分化率と同程度であれば、神経細胞分化促進活性を有すると評価できる。例えば、人工コラーゲン様ペプチドを用いた場合の神経細胞分化率が、天然コラーゲンを用いた場合の神経細胞分化率の50％以上、好ましくは80％以上である場合に、神経細胞分化促進活性を有すると評価できる。
【００３１】
本発明のゲル化剤又はゲルは神経細胞の神経突起伸長活性の観点からも有用である。神経突起伸長活性は特に限定されることはないが、例えば次の方法による神経突起伸長活性試験によって確認することができる。あらかじめPC12細胞に、50 ng／mLのNGFを添加し、37℃で1日間培養（プライミング）する。その後、10％FBSを含むD-MEM／Ham’s F-12培地で培養したサブコンフルエントのPC12細胞を2mM EDTA／PBSで剥離し、遠心分離により回収した細胞を無血清D-MEM／Ham’s F-12培地で懸濁し、3×103個／mLの細胞懸濁液として、人工コラーゲン様ペプチドでコーティングした96ウェルプレートに同様に播種し、37℃で2日間培養し、顕微鏡視野の細胞当たりの神経突起の長さ合計を測定し、神経突起伸長活性を評価することができる。
具体的には、人工コラーゲン様ペプチドを用いた場合の神経突起の長さ合計が、天然コラーゲンであるI型、II型及びIII型コラーゲンを用いた場合の神経突起の長さ合計と同程度であれば、神経突起伸長活性を有すると評価できる。例えば、人工コラーゲン様ペプチドを用いた場合の神経突起の長さ合計が、天然コラーゲンを用いた場合の神経突起の長さ合計の50％以上、好ましくは80％以上である場合に神経突起伸長活性を有すると評価できる。
【００３２】
＜上記ゲル化剤、ゲル又は培養プレート、及び血小板由来成分を含む、間葉系幹細胞培養キット＞
本発明は、上記ゲル化剤、ゲル又は培養プレート、及び血小板由来成分を含む間葉系幹細胞培養キットを提供する。
【００３３】
キットの内容は、細胞培養に必要な機器又は試薬の組み合わせにより構成されるが、以下に述べる各構成要素と本質的に同一、又はその一部と本質的に同一な物質が含まれていれば、構成又は形態が異なっていても、本発明のキットに包含される。
本キットは、試薬としては、ゲル化剤及び血小板由来成分を含む。さらにMSF-BM培地等の間葉系幹細胞の培養が可能な培地、トリプシン／EDTA、及び／又はヘパリンを含んでもよい。
血小板由来成分とは、例えば、増殖因子やサイトカインを含むヒト血小板溶解物のことである。好ましくは、血小板由来成分はUltraGRO（商標）である。UltraGRO（商標）の濃度は間葉系幹細胞の培養ができる限り限定されないが、例えば培養液中の濃度は3〜8体積％、又は4〜6体積％である。
【００３４】
＜間葉系幹細胞を培養する方法＞
本発明は、間葉系幹細胞を培養する方法であって、間葉系幹細胞を前記培養プレート上に播種する工程；及び間葉系幹細胞を血小板由来成分と共に前記培養プレート上で培養する工程、を含む方法を提供する。
【００３５】
本発明の方法は間葉系幹細胞の増殖を制御する観点からも有用である。この間葉系幹細胞の増殖制御に関しては、特に限定されることはないが、例えば次の方法による細胞増殖活性試験によって確認することができる。
培養液中の濃度が5体積％であるUltraGRO（商標）（AventaCell BioMedical）を含むMSF-BM培地（日水製薬）で培養したサブコンフルエントの間葉系幹細胞を0.05％トリプシン／EDTAで剥離し、遠心分離により回収した細胞を無血清培地または細胞懸濁液中の濃度が5体積％であるUltraGRO（商標）を含んだMSF-BM培地で懸濁し、4×104個／mLの細胞懸濁液とする。これを上記96ウェルプレートに100 μLずつ播種し、37℃で培養する。一定時間培養後、Cell Counting Kit 8(同仁化学研究所) を10 μL／ウェル添加し、37℃で2時間培養後、450 nmの吸光度を測定することで生細胞数を定量し、細胞増殖活性を評価することができる。
UltraGRO（商標）の濃度は間葉系幹細胞の増殖能調節ができる限り限定されないが、好ましくは培養液中の濃度が3〜8体積％、さらに好ましくは4〜6体積％である。また、トリプシン／EDTAの濃度及び添加量は細胞を剥離するものであれば、特に限定されない。遠心分離時の遠心力については、細胞を沈殿させることができれば、特に限定されない。細胞懸濁液の濃度については、細胞培養において通常の範囲内の濃度であれば特に限定されないが、好ましくは1×104〜1×105個／mLである。
細胞増殖活性の評価については、限定されることはないが、例えば、人工コラーゲン様ペプチドを使用した場合の450 nmの吸光度が、天然コラーゲンを使用した場合よりも小さければ、生細胞数が少なく、細胞増殖活性が低いと評価できる。
【実施例】
【００３６】
以下実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲が実施例のみに限定されないことは言うまでもない。
【００３７】
＜実施例１＞人工コラーゲン様ペプチドを用いたゲルの合成
上記配列番号3〜4及び7〜9の配列を有するペプチドをそれぞれ個別に脱気した0.05％トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液に溶解（1.11 mg／mL）し、95℃で5分間加熱することで変性し、4℃で一晩静置することで三重らせん構造を有する三本鎖ペプチドを形成させた。これらに対して合成溶液中の終濃度が10％となるように酸化剤であるジメチルスルホキシドを添加し、室温で4日間静置することでジスルフィド結合させ、人工コラーゲン様ペプチドを用いたゲルとした。生理活性配列の濃度が異なる人工コラーゲン様ペプチドを調製する場合には、生理活性配列を組み込んだペプチドとC3ペプチドを重合反応直前に混合し、共重合させることでその組成を調整した。
その後、96ウェルプレートに対し、上記ゲルを各ウェル当たり50 μg／mLの濃度で50 μLずつ添加し、風乾させることでウェルを上記ゲルでコーティングした。コントロールとしては、50 μL／ウェルの天然I型コラーゲン（ウシ真皮由来、AteloCell type I-AC、高研
）、天然II型コラーゲン（ウシ軟骨由来、AteloCell type II、高研）、及び天然III型コラーゲン（ウシ真皮由来、ニッピ）によってウェルをコーティングしたものを用いた。
これらのウェルをリン酸緩衝液（PBS）で洗浄し、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）／PBSを添加し、室温で1時間ブロッキングし、PBSで洗浄して以下の実施例に使用した。
【００３８】
＜実施例２＞ラット副腎褐色腫細胞株PC12における細胞接着活性試験
10％FBS（Gibco）を含むD-MEM／Ham’s F-12培地（フジフィルム和光純薬）で培養したサブコンフルエントのPC12細胞を2mM EDTA／PBSで剥離し、遠心分離により回収した細胞を無血清D-MEM／Ham’s F-12培地で懸濁し、4×105個／mLの細胞懸濁液とした。NGF処理したPC12細胞懸濁液を調製する際には、PC12細胞の培地に50 ng／mLとなるようにマウスNGF（Alomone labs）を添加し、37℃で1日間培養（プライミング）して使用した。これら細胞懸濁液を上記96ウェルプレートに100 μLずつ播種し、37℃で1時間培養した。このとき、インテグリンに非依存的な細胞接着活性を調べるため、終濃度4mMとなるようにEDTAを添加した場合についても同様に試験し、比較した。培養後、PBSで洗浄し、接着した細胞を4％p-ホルムアルデヒド／PBSで固定、0.5％クリスタルバイオレット／20％メタノールで染色し、純水で洗浄した後、風乾した。これに100 μL／ウェルの20％メタノールを添加し、室温で30分間振盪し、溶出したクリスタルバイオレットの570 nmにおける吸光度を測定し、定量した。
天然I型、II型、III型コラーゲンおよびコラーゲン由来生物活性配列GFOGER、GLOGEN、GVXGFO（Xはノルロイシン、メチオニンの構造類似体として使用）、KGHRGF配列をそれぞれ組み込んだ人工コラーゲン様ペプチドで96ウェルプレートをコートし、これらに対するPC12細胞の接着活性を評価した。各種生物活性配列と細胞接着活性の量的関係を調べるため、生物活性配列の濃度が異なる人工コラーゲン様ペプチドをいくつか調製し、同様に評価した。図1に示すように、天然I型、II型、III型コラーゲンへのPC12細胞の接着はEDTAを添加することによってほとんどが阻害された。EDTAには二価のイオンと結合する性質があり、またインテグリンには二価のイオン（特にMg2+やMn2+）を介した結合様式をとる性質があることに鑑みると、PC12細胞は天然コラーゲンに対してインテグリンを主な接着因子としていると考えられる。また、C3に対して細胞接着がほとんど見られない一方で、インテグリン結合配列等の生物活性配列を組み込んだ人工コラーゲン様ペプチドに対して明らかな細胞接着活性が見られた。さらに、これらの細胞接着活性は生物活性配列の量依存的な傾向を示していた。これらのことから、PC12細胞はこれら生物活性配列に対して細胞接着活性を示していることが分かった。C3-GFOGERやC3-GLOGENに対する細胞接着活性はC3-GVXGFOやC3-KGHRGFに対する細胞接着活性よりも強いことから、PC12細胞はインテグリンを主なコラーゲン受容体として接着していることが分かった。一方で、C3-GVXGFOやC3-KGHRGFにおいて、EDTAを添加しても細胞接着活性が維持されることが分かった。
【００３９】
＜実施例３＞ラット副腎褐色腫細胞株PC12の分化促進活性試験
10％FBSを含むD-MEM／Ham’s F-12培地で培養したサブコンフルエントのPC12細胞を2mM EDTA／PBSで剥離し、遠心分離により回収した細胞を無血清D-MEM／Ham’s F-12培地に懸濁し、3×103個／mLの細胞懸濁液とした。これに終濃度50 ng／mLとなるようにNGFを添加し、上記96ウェルプレートに100 μL／ウェルずつ播種し、37℃で2日間培養した。このとき、20 μm以上の神経突起を有する細胞を神経細胞分化した細胞とし、顕微鏡視野あたりの神経細胞分化率を測定した。
人工コラーゲン様ペプチド内の種々の生物活性配列のうち、どの配列に神経細胞分化促進活性があるのかを明らかにするため、それぞれの生物活性配列を組み込んだ人工コラーゲン様ペプチドでコートした96ウェルプレート上にPC12細胞を播種し、神経成長因子NGFの存在下で2日間培養の神経細胞分化を観察した。図2に示すように、C3-GFOGERまたはC3-GLOGENでコートした96ウェルプレート上で天然コラーゲン上と同様に神経突起の形成が見られた。20 μm以上の神経突起を持つ細胞の割合を分化率として比較したところ、分化率はおおよそこれら生物活性配列の含有量に応じて上昇した。これらの結果から、天然コラー
ゲン由来の生物活性配列のうち、GVMGFOやKGHRGFのような非インテグリン型のコラーゲン受容体に結合する配列は神経細胞分化には必要ではないということが分かり、逆に、インテグリン結合配列だけがあれば神経細胞分化が可能であるということが分かった。
【００４０】
＜実施例４＞ラット副腎褐色腫細胞株PC12の神経突起伸長活性試験
あらかじめPC12細胞に50 ng／mLのNGFを添加し、37℃で1日間培養（プライミング）する。その後、10％FBSを含むD-MEM／Ham’s F-12培地で培養したサブコンフルエントのPC12細胞を2mM EDTA／PBSで剥離し、遠心分離により回収した細胞を無血清D-MEM／Ham’s F-12培地で懸濁し、3×103個／mLの細胞懸濁液として、上記96ウェルプレートに播種し、37℃で2日間培養し、顕微鏡視野の細胞当たりの神経突起の長さ合計を測定し、神経突起伸長活性を評価した。
神経突起伸長活性を調べるため、あらかじめNGF処理により分化させたPC12細胞を人工コラーゲン様ペプチドでコートした96ウェルプレート上に播種し、NGF存在下で2日間培養し、細胞当たりの神経突起の長さを比較した。この結果、図3に示すように、神経突起伸長活性はおおむね神経細胞分化促進活性と同様の傾向を示したことから、神経突起伸長においてもインテグリン結合配列だけがあれば十分であり、非インテグリン型のコラーゲン受容体結合配列は必要でないことが分かった。
【００４１】
＜実施例５＞様々な株化細胞における細胞接着活性試験
下記表の株化細胞を使用して、細胞接着試験を行った。
【表１】
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サブコンフルエントの細胞を2mM EDTA／PBSまたは0.05％トリプシン／EDTAで剥離し、それぞれの細胞に適した無血清培地に懸濁し、5×105個／mLの細胞懸濁液とした。これらの細胞を上記96ウェルプレートに100 μL／ウェルずつ播種し、37℃で1時間培養した。このとき、インテグリンに非依存的な細胞接着活性を観察するため、終濃度4mMとなるようにEDTAを添加した場合についても同様に試験して比較した。その後、PBSで洗浄し、4％p-ホルムアルデヒド／PBSで固定化し、0.5％クリスタルバイオレット／20％メタノールで染色し、純水で洗浄して風乾した。各ウェルに20％メタノールを100 μL／ウェル添加し、室温で30分間振盪して、溶出したクリスタルバイオレットの570 nmにおける吸光度を測定して細胞接着活性を評価した。
ヒト由来の9種類の株化細胞を用いてコラーゲン由来の各種生物活性配列を組み込んだ人工コラーゲン様ペプチドへの細胞接着活性試験を行った。図4より、いずれの細胞においてもC3-GFOGERに対する高い接着活性が見られた。ヒト前立腺がん細胞LNCaPにおいては、
もともとLNCaPが接着能の低い細胞であり、天然コラーゲンへの接着はほとんどないにも関わらず、C3-GFOGERに対する接着活性を有することが確認できた。また、ヒト前立腺がん細胞LNCaPを除く8種類の細胞について、C3-GLOGENに対する接着活性が見られた。この結果より、いずれの細胞においてもコラーゲン受容体を介した細胞接着に、インテグリンが関与していることが分かった。また、C3-GLOGENに対する接着活性が見られる細胞のうち、PC3とHeLaでは、C3-GLOGENに対してC3-GFOGERと同程度以上の接着活性を示した。他の7種類の細胞においてはC3-GLOGENに対する接着活性はC3-GFOGERと比較すると低く、これらの細胞においてはコラーゲン認識に用いているインテグリンのタイプが異なるためだと考えられる。C3-GFOGERにはインテグリンα2β1が優位に接着し、またC3-GLOGENにはインテグリンα1β1が優位に接着することから、PC3及びHeLaを除く7種類の細胞ではインテグリンα2β1が優位に人工コラーゲン様ペプチドに接着していると考えられる。C3-GLOGENはインテグリンα1β1が優位に接着することから、インテグリンα1β1の発現が強い細胞においてはC3-GFOGERの方が細胞接着足場材として有用であると考えられる。
HeLa、HT1080およびA549においては、C3-GVXGFOに対する細胞接着活性がほとんど見られなかった。他の細胞についても接着は見られているが、その程度はインテグリンと比較すると低かった。C3-KGHRGFに対する細胞接着活性に関しても同様の傾向が見られ、全ての細胞において接着は見られたが、その程度はインテグリンよりも低かった。これらの結果より、DDRとシンデカンは受容体単独での細胞接着への関与は小さいことが考えられる。
【００４２】
＜実施例６＞間葉系幹細胞における細胞接着活性試験
細胞培養液中の濃度が5体積％であるUltraGRO（商標）（AventaCell BioMedical）を含むMSF-BM培地（日水製薬）で培養したサブコンフルエントのヒト脂肪由来間葉系幹細胞を0.05％トリプシン／EDTAで剥離し、遠心分離により回収した細胞を無血清MSF-BM培地で懸濁し、4×105個／mLの細胞懸濁液とした。これを上記96ウェルプレートに100 μLずつ播種し、37℃で1時間培養した。培養後、PBSで洗浄し、接着した細胞を4％p-ホルムアルデヒド／リン酸緩衝液で固定し、0.5％クリスタルバイオレット／20％メタノールで染色し、視野あたりの接着細胞数を計数することにより細胞接着活性を定量した。
間葉系幹細胞の人工コラーゲン様ペプチドへの細胞接着活性を調べた結果、図5に示すように、間葉系幹細胞は生物活性配列を含まないC3を含め、すべての人工コラーゲン様ペプチドに対して強い細胞接着活性を示した。この結果から、間葉系幹細胞は、インテグリン結合配列等の生物活性配列の関与がなくても、人工コラーゲン様ペプチドと強く接着できることが分かった。
【００４３】
＜実施例７＞間葉系幹細胞における細胞増殖活性評価
細胞培養液中の濃度が5体積％であるUltraGRO（商標）（AventaCell BioMedical）を含むMSF-BM培地（日水製薬）で培養したサブコンフルエントのヒト脂肪由来間葉系幹細胞を0.05％トリプシン／EDTAで剥離し、遠心分離により回収した細胞を無血清培地または細胞懸濁液中の濃度が5体積％のUltraGRO（商標）を含んだMSF-BM培地に懸濁し、4×104個／mLの細胞懸濁液とした。これを上記96ウェルプレートに100 μLずつ播種し、37℃で培養した。一定時間培養後、Cell Counting Kit 8（同人科学研究所）を10 μL／ウェル添加し、37℃で2時間培養後、450 nmの吸光度を測定することで生細胞数を定量した。
それぞれの生物活性配列を組み込んだ人工コラーゲン様ペプチド上において細胞培養可能か検討した結果、図6に示すように、本発明の人工コラーゲン様ペプチドを用いることによって、血小板由来成分UltraGRO（商標）の添加の有無によらず細胞培養することが可能であると分かった。さらに、細胞増殖能について検討した結果、血小板由来成分UltraGRO（商標）を含まない培地においては有意な細胞増殖促進効果は見られなかった一方で、血小板由来成分UltraGRO（商標）を含む培地においては、天然I型コラーゲンの場合はコントロールである非コーティングプラスチックを利用した場合と比較して細胞増殖能の促進が見られたのに対し、人工コラーゲン様ペプチドの場合はコントロールである非コーティングプラスチックの場合よりも細胞増殖能の低下が見られた。すなわち、本発明の方法に
よれば、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞を用いる場合において、細胞増殖の制御が可能であることが分かった。この結果は、再生医療の現場に有用なものであり、また本発明の人工コラーゲン様ペプチドを細胞接着足場材として用いることによって、天然コラーゲンを細胞接着足場材とした場合とは異なる間葉系幹細胞の分化制御につながる可能性があることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の人工コラーゲン様ペプチドは、天然コラーゲン又は従来の人工コラーゲン様ペプチドを用いた細胞培養足場材よりも細胞接着能がより優れた細胞培養足場材として利用可能である。特に、本発明の人工コラーゲン様ペプチドは、間葉系幹細胞接着に有用であり、再生医療分野における優れた細胞培養足場材として利用可能である。さらに、本発明の人工コラーゲン様ペプチドを血小板由来成分と組み合わせて使用することによって、間葉系幹細胞の増殖を制御することができるため、幹細胞の自己複製能及び分化能といった幹細胞が有する機能を制御する観点から、再生医療分野において非常に有用である。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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