(57)【要約】【課題】本発明は、全身投与後、標的組織、好ましくは骨格筋におけるタンパク質の生成を意図する発現系は、潜在的に毒性である他の組織及び器官における発現を同時に引き起こすことができ、前記発現系は治療的使用に不適切となるという、本発明者らによる確認に基づくものである。【解決手段】本発明は、タンパク質をコードする配列を含む、全身投与用の発現系であって、-  骨格筋及び/又は末梢神経系の組織を含む標的組織における治療上許容されるレベルのタンパク質の発現、並びに、-  標的組織以外の組織における、特に心臓における毒性上許容されるレベルのタンパク質の発現を可能にする発現系に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経筋障害に対する治療効果を有するタンパク質をコードする配列を含む、全身投与用の発現系であって、タンパク質の発現は少なくとも1つの組織において毒性であり、前記発現系は、
-  骨格筋及び/又は末梢神経組織を含めた標的組織における治療上許容されるレベルのタンパク質の発現、並びに
-  標的組織以外の組織における、特に心臓における毒性上許容されるレベルのタンパク質の発現
を可能にする、発現系。
【請求項２】
-  標的組織以外の組織における、好ましくはタンパク質の発現が毒性である組織における、タンパク質の発現の防止、若しくは発現のレベルの低減、並びに/又は
-  標的組織におけるタンパク質の発現の維持、及び発現のレベルの増大
を可能にする少なくとも1つの配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の発現系。
【請求項３】
タンパク質が、好ましくは配列番号1、2、又は3の配列を有するミオチューブラリンであることを特徴とする、請求項1又は2に記載の発現系。
【請求項４】
タンパク質が、好ましくは配列番号7の配列を有するカルパイン3であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の発現系。
【請求項５】
標的組織以外の組織において、好ましくはタンパク質の発現が毒性である組織において発現されるmiRNAの標的配列を含むことを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の発現系。
【請求項６】
miR208aの少なくとも1つの標的配列、好ましくは配列番号10の配列を含むことを特徴とする、請求項5に記載の発現系。
【請求項７】
標的組織以外の組織において、好ましくはタンパク質の発現が毒性である組織において、低いプロモーター活性を表し、又はプロモーター活性を表さないプロモーター配列を含むことを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の発現系。
【請求項８】
好ましくは配列番号12の配列の、カルパイン3遺伝子のプロモーター配列、又は好ましくは配列番号13の配列の、miR206のプロモーター配列を含むことを特徴とする、請求項7に記載の発現系。
【請求項９】
ベクター、好ましくはウイルスのベクターを含むことを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の発現系。
【請求項１０】
アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)、好ましくは血清型AAV8又はAAV9を含むことを特徴とする、請求項9に記載の発現系。
【請求項１１】
請求項1から10のいずれか一項に記載の発現系を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
医薬として用いるための、請求項1から10のいずれか一項に記載の発現系。
【請求項１３】
遺伝子治療において用いるための、請求項1から10のいずれか一項に記載の発現系。
【請求項１４】
神経筋障害、好ましくはミオパチー、更により好ましくは筋細管ミオパチー(XLMTM)又はLGMD2Aの処置において用いるための、請求項1から10のいずれか一項に記載の発現系。
【請求項１５】
発現系を全身性に、好ましくは静脈内注射によって投与することを特徴とする、請求項13又は14に記載の使用のための発現系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子治療に関し、特に、MTM1遺伝子における変異によって引き起こされる、筋細管ミオパチー等、骨格筋を冒す疾患の処置に関する。
【０００２】
本発明の文脈において、本発明は、治療有効量のタンパク質の、標的組織、好ましくは骨格筋における生成、及び毒性上許容される量のタンパク質の非標的組織、特に心臓における生成を確実にする、タンパク質をコードする導入遺伝子を含む発現系を提唱する。
【背景技術】
【０００３】
X染色体連鎖筋細管ミオパチー(即ち、XLMTM、OMIN 310400)は、中心核ミオパチーと呼ばれる、最も重症で一般的な形態の一群の疾患である。患者は胎児期(foetal life)の間にすでに冒されており、妊娠中に可動性の減少を示し、出生時には非進行性として現れるミオパチーを有する[1、2、3]。患者は全身性の筋力低下及び緊張低下を有し、呼吸不全をまねき、集中的に医療を行っても生後数年の間に多くが死亡する。より非定型的には、重症度の低い形態の筋細管ミオパチーが男性及び女性の対象にやはり存在し、小児期の間は症状が軽く、生後10年又は20年の間に悪化する[4]。
【０００４】
冒されている対象の骨格筋は、核及びミトコンドリア等の細胞小器官の分布が変化した細繊維を含んでおり、細胞小器官は繊維の中央に位置することが典型的であり、又はあまり重症でない症例では、筋細胞膜下領域に襟の形態で配列している[4、5]。
【０００５】
この疾患は、ミオチューブラリンと呼ばれるホスホイノシチドホスファターゼをコードする、遍在的に発現されるMTM1遺伝子における不活性化変異に起因する[6]。
【０００６】
この疾患の動物モデルは、現在、ゼブラフィッシュ、マウス、及びイヌに見られる[7、8、9、10]。これらのモデルで行った試験では、骨格筋では、ミオチューブラリンは、T管及び中間径フィラメントの組織化、興奮収縮連関、神経筋接合部の伝達、並びに衛星細胞の生存及び増殖を含めた多様なメカニズムで役割を果たすことが示されている[11、12、13、14]。
【０００７】
ベクターによる遺伝子置換療法は、筋細管ミオパチーに対する潜在的な治療取組みを表す。よって、ミオチューブラリンの筋肉特異的な症候性の障害を有するマウス(mKO)に、組換えアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を単回筋肉内注射すると、標的化された筋肉の病理及び機能を改善することができることが、概念の証明として指摘された[15]。
【０００８】
筋肉障害の処置の疑問は依然として重大である。筋肉のトランスフェクションに特に適するツールであることが見出されている、特にアデノ随伴ウイルスに由来するベクターによる遺伝子移入は、特に有望な取組みである。遺伝子移入は、前記対象によって生成される変異した不活性なタンパク質を補償する機能的なタンパク質を生成させるために、遺伝子のインタクトなコピーを患者に投与することを伴う。
【０００９】
筋肉疾患の場合、投与は、導入遺伝子を運搬するベクターを筋肉に局所注射することによって行われ得る。しかし、全身投与が臨床上好ましく、全身投与は、導入遺伝子が身体の多様な組織において見出され得ることを意味する。
【００１０】
導入遺伝子は、特に発現のレベル又は発現の組織特異性に関して、その発現を支配する制御配列の制御下に置かれることが典型的である。よって、筋肉疾患の遺伝子治療の場合、より特異的に筋肉における発現を支配するプロモーターが好ましいことがある。例えば、当業者にはよく知られており、筋肉における遺伝子発現を促進することが提唱されている合成プロモーターC5-12が開発されている。
【００１１】
しかし、標的組織において効果的な量のタンパク質の生成をまねいて変異したタンパク質の活性の欠如を補償し、他の面では処置される患者にとって安全である、神経筋疾患を処置するための遺伝子治療に対する新たなツールを開発することが明らかに必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO 2007/000668
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Mendellら、Annals of Neurology、68巻、5号、629〜638頁、2010年
【非特許文献２】Wangら、Gene Therapy、15巻、22号、1489〜1499頁、2008年
【非特許文献３】Petrovら、Methods Mol Biol、2011年、709巻、277〜86頁
【非特許文献４】Goninら、J Gene Med、2005年、7巻、782〜791頁
【非特許文献５】Laureら、Febs J.、2010年、277巻、4322〜4337頁
【非特許文献６】Bartoliら、Molecular Therapy、2006年、13巻、2号、250〜259頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、全身投与後、標的組織、好ましくは骨格筋におけるタンパク質の生成を意図する発現系は、潜在的に毒性である他の組織及び器官における発現を同時に引き起こすことができ、前記発現系は治療的使用に不適切となるという、本発明者らによる確認に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、導入遺伝子の骨格筋特異的な発現に関連する心臓の漏出に特に関する、この新たに確認された問題点に対する技術的な解決法を見出すものである。
【００１６】
より広範に、本発明は、所与の発現系に関して、
-  発現系が毒性を表すか否かを決定すること、
-  発現系が毒性を表す組織を決定すること、
-  発現系の毒性を許容レベルに低減するための手段を提供すること
を伴う。
【００１７】
よって、本発明において言及するタンパク質は、所与の発現系から発現される場合、少なくとも1つの組織において、特に非標的組織において毒性を表すタンパク質である。
【００１８】
発現系を、特に動物における、より好ましくはヒトにおける身体に全身的に投与することが有利である。
【００１９】
毒性の分析は、タンパク質をコードする配列の欠陥のあるコピーを有する身体において、即ち、「ノックアウト」(KO)動物モデル等、処置中の状態を有する身体において行うことが好ましい。実際、本発明の文脈において、ミオチューブラリン又はカルパイン3をコードする発現系に心毒性が観察された場合、心毒性は、ミオチューブラリンの場合はKOマウスのみに検出された。換言すると、毒性分析を常套手段に従って健常動物で行っても、この毒性は明らかにならない。
【００２０】
よって、全般的に、本発明は、タンパク質をコードする配列を含む発現系であって、
-  標的組織における、治療上許容されるレベルのタンパク質の発現、及び
-  標的組織以外の組織における、即ち非標的組織における、毒性上許容されるレベルのタンパク質の発現
を可能にする発現系に関する。
【００２１】
本発明によれば、標的組織は、特にこのタンパク質をコードする天然の遺伝子に欠陥がある場合、タンパク質が治療の役割を果たす組織又は器官と規定することが好ましい。本発明の特定の一実施形態によれば、標的組織は、以降本明細書で骨格筋と呼ぶ横紋骨格筋、即ち、横隔膜を含めた運動能力に関与する全ての筋肉とする。これらの筋肉は、ミオパチーと呼ばれる疾患において特に冒される。別の潜在的な標的組織は、神経筋疾患においてやはり冒され得る、末梢神経組織である。よって、標的組織が、骨格筋及び/又は末梢神経組織を含むことが有利である。
【００２２】
本発明によれば、非標的組織は、タンパク質が治療上の役割を果たさない組織又は器官、任意選択で、内因性の量を超えるタンパク質の存在が有害若しくは致死的とさえ証明されることがあり、したがって毒性である組織又は器官と規定することが好ましい。
【００２３】
本発明の文脈において、この潜在的な毒性から保護しようとする組織は、好ましくは、
-  心臓若しくは心臓横紋筋、
-  肝臓、
-  脳、
-  肺、
-  腎臓、及び/又は
-  平滑筋、特に消化管
である。
【００２４】
これらは、遺伝子発現系が蓄積する傾向がある、重要な器官又は組織である。
【００２５】
本発明の文脈において、心筋は、少なくともミオチューブラリン及びカルパイン3に対して実証される通り、特に関心をひく組織であると考えられる。特定の一実施形態によれば、発現系は、心臓における毒性上許容されるレベルのタンパク質の発現を可能にする。
【００２６】
よって、特定の態様によれば、本発明は、タンパク質をコードする配列を含む発現系であって、
-  骨格筋及び/又は末梢神経組織を含めた標的組織における、治療上許容されるレベルのタンパク質の発現、並びに
-  標的組織以外の組織における、特に心臓における、毒性上許容されるレベルのタンパク質の発現
を可能にする発現系に関する。
【００２７】
第1の特徴によれば、本発明の発現系は、導入遺伝子に相当する、タンパク質をコードする配列を含む。本発明の文脈において、「導入遺伝子」の語は、本発明の発現系を用いてトランスにおいて提供される、好ましくはオープンリーディングフレームである配列を意味する。
【００２８】
特定の一実施形態によれば、この配列は、その中に発現系を導入する身体のゲノムに存在する内因性の配列の、同一又は等価のコピーである。別の特定の一実施形態によれば、内因性の配列には、特に標的組織、即ち骨格筋において、タンパク質を部分的又は完全に、非機能的又は非存在にさえする(内因性タンパク質の発現若しくは活性の欠如)、1つ又は複数の変異がある。換言すると、好ましくは、本発明の発現系は、タンパク質をコードし、付随する病原性を有する欠陥のある配列のコピーを有する対象に投与することを意図するものである。この文脈において、本発明の発現系によって運搬される配列がコードするタンパク質は、したがって、その変異が神経筋障害を引き起こすタンパク質と規定することができる。
【００２９】
別の一実施形態によれば、これは、本発明の発現系を投与する対象における、欠陥のあるタンパク質(タンパク質の発現又は活性に関して)の不全を「補償する」ことができるタンパク質をコードする配列を伴う。よって、神経筋の病理に関連した例示により、
-  ユートロフィンを、変異し、欠損したジストロフィンの代わりに用いてもよく、
-  デコリン、フィブロモジュリン、及びルミカンは、神経筋疾患の場合に観察される筋肉の消耗を補償するのを助け、
-  アクチビンもまた、原因がこのタンパク質の変異ではない疾患における筋肉量の増大を助ける。
【００３０】
よって、より全般的に、本発明の発現系が運搬する配列は、神経筋疾患の文脈において、治療活性を有するタンパク質をコードすると規定することができる。治療活性の概念を、「治療上許容されるレベル」の語に関連して以下の通り規定する。
【００３１】
タンパク質をコードする配列は核酸配列であり、特に、DNA(デオキシリボ核酸)、RNA(リボ核酸)、又はcDNA(相補デオキシリボ核酸)であってよい。
【００３２】
前記配列が機能的なタンパク質、即ち、特に骨格筋において、その天然の、又は本質的な機能を確実にすることができるタンパク質をコードすることが有利である。対象の各タンパク質に対して、この活性を得るのに必要な、所望の活性及び配列を規定することができる。
【００３３】
好ましい一実施形態によれば、前記配列は天然のタンパク質をコードし、前記タンパク質はヒト起源であることが好ましい。これはまた、誘導体又はフラグメントが所望の活性を保持するのであれば、このタンパク質の誘導体又はフラグメントであってもよい。好ましくは、「誘導体」又は「フラグメント」の語は、対象のタンパク質のヒト配列と、少なくとも60%、好ましくは70%、更により好ましくは80%、又は更に90%、95%、又は99%の同一性を有するタンパク質の配列を意味する。例えば、他の起源(非ヒト哺乳動物等)の、又は切断されている、又は更に変異されているタンパク質であるが、活性なタンパク質が指定される。よって、本発明の文脈において、「タンパク質」の語は、その起源に関係なく全長のタンパク質、並びに機能的なその誘導体及びフラグメントと理解される。
【００３４】
本発明の文脈において、骨格筋及び/又は末梢神経組織を冒し得る神経筋疾患の治療的処置を可能にするタンパク質が包含される。一般的に「ミオパチー」と呼ばれる、骨格筋を冒す疾患の治療的処置を可能にするタンパク質が、更にとりわけ言及される。
【００３５】
特定の一態様において、これらの疾患は、タンパク質の非生成、又は完全に、若しくは部分的に非機能的なタンパク質の生成を引き起こす、少なくとも1つの遺伝子における変異によって引き起こされる。本発明によれば、発現系は、活性型のこのタンパク質、及び天然のタンパク質の非存在を少なくとも部分的に補償する量のこのタンパク質、又は天然のタンパク質の非存在を補償することができる別のタンパク質の生成を助ける。発現系を投与することで、よって、可動性及び呼吸に関して、標的組織、特に骨格筋における正常の表現型の改善又は回復が可能になる。
【００３６】
特に本発明の文脈において、恩恵のあるタンパク質は、ヒト起源(配列番号1)、マウス(配列番号2)、又はイヌ(配列番号3)のミオチューブラリンである。これらのタンパク質をコードするあらゆる配列、機能的な治療上の誘導体、又はそのフラグメントを、本発明の発現系の一部として実行することができる。よって、例示により、対応するヌクレオチド配列(cDNA)は、それぞれ配列番号4、5(又は14)、及び6の配列である。
【００３７】
MTM1遺伝子における変異は、既知の方法では、筋細管ミオパチー(MTM又はXLMTM)と呼ばれる筋肉疾患をもたらす。よって、遺伝子を置換又は移行させるための戦略に従って、例えば天然である、治療用のミオチューブラリンをコードする配列をトランスにおいて提供することが、この病状の処置の助けとなる。
【００３８】
別の一実施形態において、対象のタンパク質はカルパイン3(CAPN3)であり、その変異により、特に2A型肢帯ジストロフィー(LGMD 2A又はカルパイノパチー(calpainopathy)、OMIN 253600)と呼ばれる、劣性常染色体遺伝性疾患が引き起こされる。例えば、ヒトカルパイン3は配列番号7の配列を有する。よって、上記に記載した通り、治療用のカルパイン3をコードするあらゆる配列、例えば配列番号7の配列、又はその誘導体若しくはフラグメントが、本発明の発現系に存在してもよい。例えば、それは、配列番号8に示されるcDNA配列であってもよく、又は、そのオープンリーディングフレームに対応する307から2772のヌクレオチドであってもよい。
【００３９】
骨格筋を冒す疾患に関与し、本発明において言及するタンパク質の限定的な一覧を以下に示す:サルコグリカン(α、β、γ、δ)、ジストロフィン、ディスフェルリン(DYSF)、セレン含有タンパク質1(SEPN1)、アンフィフィジン2(BIN1)、ダイナミン(dynamien)2(DNM2)、コフィリン2(CFL2)、トロポニンT(TNNT1)、トロポミオシン3(TPM3)、ACTA1、コンタクチン1(CNTN1)、TRIM32、ラプシン(RASPN)、DOK7、アグリン(AGRN)、COLQ、CHAT、アセチルコリン受容体(CHRNE、CHRNA1、CHRNB1、CHRND)、GFPT1、MUSK。
【００４０】
特定の一実施形態によれば、本発明の発現系に含まれる配列は、サルコグリカンファミリーのタンパク質、特にα-サルコグリカン、又はより具体的に、Mendellらの文献(Annals of Neurology、68巻、5号、629〜638頁、2010年)に記載される配列をコードしない。
【００４１】
別の特定の一実施形態において、本発明の発現系に含まれる配列は、ミニジストロフィンを含めた、特にWangらの文献(Gene Therapy、15巻、22号、1489〜1499頁、2008年)に記載される、ジストロフィン様タンパク質をコードしない。
【００４２】
より一般的に、本発明は、例えば、発現系からのその生成が少なくとも1つの組織、好ましくは非標的組織、特に心臓、より網羅的に、心臓、肝臓、脳、肺、腎臓、及び平滑筋の群からの少なくとも1つの組織における毒性を表す場合、その変異が1つ又は複数の標的組織における疾患を引き起こす、神経筋疾患において治療活性を有するあらゆるタンパク質を意味するものである。
【００４３】
本発明によれば、有利には、発現系は、標的組織、好ましくは骨格筋及び/又は末梢神経組織における治療上許容されるレベルのタンパク質の発現を可能にしなければならない。更に、別の好ましい一実施形態によれば、発現系は、非標的組織、特に心臓における、毒性上許容されるレベルのタンパク質の発現を可能にしなければならない。
【００４４】
本発明の文脈において、「タンパク質発現」の語は、「タンパク質生成」と理解してよい。よって、発現系により、上記に規定したレベルのタンパク質の転写及び翻訳の両方が可能にならなければならない。
【００４５】
本発明の文脈において規定する、即ち「治療上許容される」レベル及び「毒性上許容される」レベルは、タンパク質の量、及びタンパク質の活性に関連する。
【００４６】
所与の組織において生成されるタンパク質の量の評価は、前記タンパク質に対する抗体を用いた免疫検出によって、例えば、ウエスタンブロット又はELISAによって行うことができる。或いは、PCR又はRT-PCR等により、対応するメッセンジャーRNAを定量してもよい。この定量は、組織の1試料に対して、又はいくつかの試料に対して行うことができる。よって、標的組織が骨格筋である場合は、これを、筋肉のタイプ、又はいくつかのタイプの筋肉(例えば、四頭筋、横隔膜、前脛骨筋、三頭筋等)に対して行ってもよい。
【００４７】
本発明の文脈において、「治療上許容されるレベル」の語は、本発明の発現系から生成されるタンパク質が、特に寿命及び生活の質に関して、患者の病理学的状態を改善する助けとなる事実を意味する。よって、骨格筋を冒す疾患に関連して、このタンパク質が疾患に冒されている対象の筋肉の状態を改善し、又は健常対象の筋肉の表現型に類似する筋肉の表現型を回復することを伴う。先に言及した通り、好ましくは筋肉の強度、サイズ、組織学、及び機能によって規定される筋肉の状態は、生検、強度の測定、筋肉の緊張度、体積、又は筋肉の可動性、臨床検査、医用画像、生物マーカー等の方法の一つによって評価することができる。
【００４８】
よって、骨格筋に関して治療上の利点を評価するのを助け、処置後の様々な時間に評価することができる診断基準には、特に以下がある:
-  平均余命の増大、
-  筋肉強度の増大、
-  組織学の改善、及び/又は
-  横隔膜の機能の改善。
【００４９】
本発明の文脈において、「毒性上許容されるレベル」の語は、本発明の発現系から生成されるタンパク質が、特に組織学的に、生理学的に、及び/又は機能的に、非標的組織の著しい変化を引き起こさないという事実を意味する。特に、タンパク質の発現は致死的ではないことがある。有利には、非標的組織において生成されるタンパク質の量は、特に健常対象に比べて、この組織における前記タンパク質の内因性のレベルを超えてはならない。すでに記載した通り、組織における毒性は、組織学的に、生理学的に、及び機能的に評価することができる。心臓の特定の場合において、説明上の目的で、タンパク質のあらゆる毒性を、形態学及び心臓機能の試験によって、臨床検査によって、電気生理学、画像法、生物マーカー、平均余命のモニタリング、又は線維症の検出及び/若しくは細胞浸潤物の検出を含めた組織学的分析によって、例えば、シリウスレッド及び/若しくはヘマトキシリン/エオジンでの染色によって、評価することができる。
【００５０】
有利には、本発明による発現系の有効性及び/又は毒性のレベルは、動物においてin vivoで、更により好ましくは、タンパク質をコードする遺伝子の欠陥のあるコピーを有し、よって付随する病理に冒されている動物において評価される。
【００５１】
発現系を、全身性に、例えば静脈内注射によって投与することが好ましい。
【００５２】
本発明によれば、好ましくは、本発明の発現系は、
-  非標的組織における、特にタンパク質の発現が毒性である非標的組織におけるタンパク質の発現を防止し、若しくは発現のレベルを低減すること、及び/又は
-  標的組織におけるタンパク質の発現を維持し、若しくは発現のレベルを増大すること
を可能にする少なくとも1つの配列を含む。
【００５３】
特定の一実施形態によれば、本発明は、
-  骨格筋以外の組織及び/若しくは末梢神経組織における、好ましくは、タンパク質の発現が毒性である組織における、タンパク質の発現を防止し、若しくは発現のレベルを低減すること、並びに/又は
-  骨格筋及び/若しくは末梢神経組織におけるタンパク質の発現を維持し、若しくは発現のレベルを増大すること
を可能にする少なくとも1つの配列を含む発現系に関する。
【００５４】
本発明の文脈において、「発現を防止する」の用語は、前記配列の非存在下であっても、発現が存在しない場合を意味することが好ましく、「発現のレベルを低減する」の用語は、前記配列の供給によって発現が低減(又は低下)する場合を意味する。
【００５５】
同様に、「発現を維持する」の用語は、前記配列の非存在下であっても、匹敵するレベルの発現が存在する場合を意味することが好ましく、「発現のレベルを増大する」の用語は、前記配列の提供によって、発現の増大が存在する場合を意味する。
【００５６】
本発明の文脈において、所望の目的を実現するのに少なくとも3つの方法:
-  標的組織における発現のレベルを低減せずに、非標的組織におけるタンパク質の発現を防止することができ、又は発現のレベルを低減することができる配列の使用、
-  標的組織における高レベルの発現、及び非標的組織、特にタンパク質の発現が毒性と思われる組織における低発現又は発現なしを確実にすることができる、プロモーター配列の使用、
-  適切な指向性、この場合、非標的組織に対するよりも標的組織に対して、特にタンパク質の発現が毒性であると思われる組織に対してより高い指向性を有するベクター、好ましくはウイルスのベクターの使用
が存在し、これらは組み合わせてもよい。
【００５７】
本発明の発現系が、好ましくは導入遺伝子の5'に配置され、それに対して機能的に連結されている、タンパク質をコードする配列の転写を支配するプロモーター配列を含むことが適切である。これにより、標的組織、特に骨格筋における、治療上許容されるレベルのタンパク質の発現が確実にされることが好ましい。
【００５８】
これには、誘導又は構成的なプロモーター、天然又は合成(人工)のプロモーターが含まれ得る。同様に、プロモーターは、導入遺伝子と同じ起源の、又は別の起源の、ヒトを含めた任意の起源のものであってもよい。
【００５９】
第1の実施形態によれば、プロモーター配列は、遍在性の、又は非選択的なプロモーター、即ち、組織特異性が低く、標的及び非標的両方の組織に対して、様々な組織において広範に同様のレベルの発現を確実にするプロモーターに対応する。例として、サイトメガロウイルスプロモーター(pCMV)、Mtm1プロモーターを挙げることができる。
【００６０】
特定の一実施形態によれば、これは、骨格筋及び/又は末梢神経組織に適するが、他の組織、特に他の筋肉において発現され得るプロモーターを意味する。例として、デスミンプロモーター、好ましくは配列番号11の配列、骨格アルファ-アクチンプロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーター、C5-12合成プロモーター、シナプシンI(Syn)プロモーター、又はCK6プロモーターを挙げることができる。骨格筋に関して、トロポニン、筋原性因子(myogenic factor)5(Myf5)、ミオシン軽鎖1/3ファスト(fast)(MLC1/3f)、筋肉分化1(MyoD1)、ミオゲニン(Myog)、ペアードボックス遺伝子7(Pax7)、MEF2プロモーターも挙げることができる。末梢神経組織に関して、P0及びMBP(ミエリン塩基性タンパク質)プロモーターも挙げることができる。
【００６１】
本発明の好ましい一実施形態によれば、発現系のプロモーター配列を、標的組織と非標的組織との間を区別し、この場合は標的組織において優れている、プロモーター活性に対して選択する。この場合、プロモーター配列は標的組織、好ましくは骨格筋及び/又は末梢神経組織におけるタンパク質の発現の増大を助け、一方で、非標的組織、特にタンパク質の発現が毒性である組織における発現を防止する。
【００６２】
例示により、標的組織が骨格筋である場合、プロモーターが筋肉特異的プロモーターであることが好ましい。別の有利な特徴によれば、前記プロモーターは、非標的組織、特に心臓においてプロモーター活性が低く、又はプロモーター活性がなく、これら組織における毒性上許容されるレベルのタンパク質の発現が可能になる。
【００６３】
特定の一実施形態によれば、前記プロモーター配列は、好ましくはヒト起源の、更により好ましくは配列番号12の配列の、カルパイン3遺伝子のプロモーターに対応し得る。別の適切な一プロモーター配列は、好ましくはヒト起源の、より好ましくは配列番号13の配列の、miRNA206(miR206)のプロモーター配列である。
【００６４】
よって、本発明の枠内では、少なくともカルパイン3に対して、カルパイン3又はmiRNA206プロモーターの制御下に配置した、前記タンパク質をコードする配列を含む発現系は、骨格筋における治療上許容されるレベルのタンパク質、心臓及び肝臓における毒性上許容されるレベルのタンパク質の発現を確実にすることができることが示されている。
【００６５】
別の一態様において、本発明は、したがって、配列番号12又は配列番号13の配列を有するプロモーターの制御下に配置した、タンパク質をコードする配列を含む発現系に関する。配列番号12及び配列番号13、又はこれらのフラグメントに対応する配列に由来するが、特に組織特異性、及び任意選択で有効性に関して、同様のプロモーター活性を有するプロモーター配列も、本発明の下に網羅する。
【００６６】
このプロモーター配列により、非標的組織における毒性上許容されるレベルのタンパク質の発現が可能にならない場合は、プロモーター配列は、非標的組織における、好ましくはタンパク質の発現が毒性である非標的組織における、タンパク質の発現のレベルを低減する機能を有する配列に付随することが有利である。
【００６７】
よって、例示により、ミオチューブラリン及びカルパイン3両方の場合、デスミンプロモーターを使用すると心毒性を表すことが示された。対照的に、本発明によれば、好ましくは配列番号10の配列の、miRNA-208aの少なくとも1つの標的配列に付随する、好ましくは配列番号11のデスミンプロモーターの使用は、
-  標的組織、好ましくは骨格筋におけるタンパク質の、治療上許容されるレベルの発現、
-  非標的組織、好ましくは心臓又は肝臓におけるタンパク質の、毒性上許容されるレベルの発現
の両方を可能にする。
【００６８】
すでに述べた通り、前記配列は、非標的組織における、好ましくはタンパク質の発現が毒性である非標的組織における、タンパク質の発現を防止し、又は発現のレベルを低減することが可能である。この作用は、特に、
-  タンパク質をコードする配列の転写のレベル、
-  タンパク質をコードする配列の転写に起因する転写物、例えばこれらの分解、
-  転写物のタンパク質への翻訳
に関する多様なメカニズムに従って起こり得る。
【００６９】
このような配列は、
-  マイクロRNA、
-  内因性低分子干渉RNA、即ちsiRNA、
-  トランスファーRNA(tRNA)の小型フラグメント、
-  遺伝子間領域のRNA、
-  リボソームRNA(rRNA)、
-  核内低分子RNA(snRNA)、
-  核小体低分子RNA(snoRNA)、
-  piwiタンパク質と相互作用するRNA(RNA interacting with piwi proteins)(piRNA)
等
の群から選択される小型RNA分子に対する標的であることが好ましい。
【００７０】
この配列が、発現を維持するのを助け、又は標的組織における、好ましくは骨格筋におけるタンパク質の発現のレベルを更に増大することが有利である。
【００７１】
このような配列が、タンパク質の発現が毒性である非標的組織における有効性に対して選択されることが好ましい。この配列の有効性は組織に応じて可変であり得るため、毒性が証明されている全ての標的組織における有効性に対して選択したこれらの配列をいくつか組み合わせる必要があり得る。
【００７２】
好ましい一実施形態によれば、この配列は、マイクロRNA(miRNA)に対する標的配列である。知られている通り、このような慎重に選んだ配列は、選択された組織における遺伝子発現を特異的に抑制するのを助ける。
【００７３】
よって、特定の一実施形態によれば、本発明の発現系は、心臓等、タンパク質の発現が毒性である非標的組織において発現され、又は存在する、マイクロRNA(miRNA)に対する標的配列を含む。標的組織、好ましくは骨格筋に存在するこのmiRNAの量は、非標的組織に存在するmiRNAの量より少なく、又はこのmiRNAは標的組織でも発現され得ないことが適切である。特定の一実施形態によれば、標的のmiRNAは、心臓等の非標的の標的組織において特異的に発現される。
【００７４】
当業者には知られている通り、特に所与の組織における、miRNAの発現の存在又はレベルは、PCRによって、好ましくはRT-PCRによって、又はノーザンブロットによって評価することができる。
【００７５】
様々なmiRNAが現在同定されており、その標的配列及びこれらの組織特異性は、当業者には知られており、例えば、WO 2007/000668の文書に記載されている。
【００７６】
特定の一実施形態によれば、本発明の発現系は、miRNA-208a(miR208aとも記載する、配列番号9)の標的配列を含む。好ましくは、この配列は、ヒト、イヌ、及びマウスで同一であり、22pbの配列番号10の配列を有する。もちろん、miRNA-208aによって認識される、あらゆる派生し、又は切断された配列が、本発明の一部として実行され得る。よって、本発明の枠内において、ミオチューブラリン及びカルパイン3の両方に関連して、この標的配列の使用により、心毒性、又はカルパイン3の場合は更に肝毒性の問題を解決することが可能になる。
【００７７】
すでに記載した通り、マイクロRNAに対する標的配列は、単独で、又は他の配列、有利には同一でも、若しくは異なっていてもよいマイクロRNAに対する標的配列と組み合わせて用いることができる。これらの配列は、直列で、又は反対方向で用いることができる。
【００７８】
好ましい一実施形態によれば、特にmiRNA-208aの標的配列に対して、1つ以上、特に2つ又は4つの配列を実行してもよい。これらは直列で、即ち全て同じ方向で用いることが好ましい。複数の標的配列を実行する場合、これらは、当業者には知られている方法で、ランダム配列のDNAスペーサーによって分離されていてもよい。
【００７９】
miRNA、特にmiR208aの標的配列の場合は、タンパク質をコードする配列の3'に配置することが好ましく、発現系の3'UTR(「非翻訳領域」)領域中に、好ましくはタンパク質をコードするcDNA中に、挿入することがより有利である。更により好ましくは、発現系が、タンパク質をコードするcDNAの3'にポリアデニル化シグナルを含む場合、この配列を、オープンリーディングフレームのストップコドンとポリアデニル化シグナルとの間に挿入する。
【００８０】
本発明の文脈において、miRNA-208aの少なくとも1つの標的配列は、少なくとも心臓において、特にミオチューブラリン及びカルパイン3に関して、毒性上許容されるレベルのタンパク質を得るように適用されたことが実証されている。
【００８１】
特定の一実施形態によれば、発現系は、
-  プロモーター、好ましくはデスミン、更により好ましくはヒトデスミン(配列番号11)の制御下に配置されたミオチューブラリンをコードする配列、
-  心臓で発現されるmiRNAの、好ましくはmiRNA-208aの少なくとも1つの標的配列、好ましくは配列番号10の配列等の単一の標的配列
を含む。
【００８２】
別の特定の形態の一実施形態において、発現系は、
-  プロモーター、好ましくはデスミン、更により好ましくはヒトデスミン(配列番号11)、又はカルパイン3、更により好ましくはヒトカルパイン3(配列番号12)、又はmiRNA206、更により好ましくはヒトmiRNA206(配列番号13)の制御下に配置されたカルパイン3をコードする配列;
-  心臓で発現されるmiRNAの、好ましくはmiRNA-208aの、更により好ましくは2つの直列の標的配列の、少なくとも1つの標的配列
を含む。
【００８３】
本発明によれば、発現系又は発現カセットは、存在する導入遺伝子の発現に必要なエレメントを含む。導入遺伝子の発現を確実にし、変調するための上記に規定したもの等の配列に加えて、このような系は、
-  好ましくは、コード配列の3'、又はmiRNAの標的配列の3'に挿入された、SV40又はヒトヘモグロビンのポリA等の、ポリアデニル化シグナル、
-  ヒトヘモグロビンのイントロン1等、転写を安定化するための配列、
-  エンハンサー配列、
等
のような他の配列を含むことができる。
【００８４】
本発明による発現系は、特にヒトにおける、細胞、組織、又は身体に導入することができる。当業者には知られている一方法において、導入はex vivo又はin vivoで、例えば、トランスフェクション又は形質導入によって行うことができる。別の一態様によれば、本発明は、したがって、本発明の発現系を含む、好ましくはヒト起源の、細胞又は組織を包含する。
【００８５】
本発明による発現系を、この場合は単離された核酸を、対象に、即ちネイキッドDNAの形態で投与することができる。細胞におけるこの核酸の導入を促進するために、核酸を、コロイド分散系(高分子錯体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ)、又は脂質ベース系(水中油型エマルジョン、ミセル、リポソーム)等の様々な化学的手段と組み合わせることができる。
【００８６】
或いは、別の好ましい一実施形態によれば、本発明の発現系は、プラスミド又はベクターを含む。このようなベクターはウイルスベクターであることが有利である。ヒトを含めた哺乳動物における遺伝子治療において一般に用いられるウイルスベクターは、当業者には知られている。このようなウイルスベクターは、以下の一覧:ヘルペスウイルス由来のベクター、バキュロウイルスのベクター、レンチウイルスのベクター、レトロウイルスのベクター、アデノウイルスのベクター、及びアデノ随伴ウイルスのベクター(AAV)から選択することが好ましい。
【００８７】
これが、天然の血清型(AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、及びAAV9)に対応するアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)、これらのバリアント、又は人工的な血清型であることが好ましい。当業者には知られている一方法では、キメラのAAVベクターも実行することができる。
【００８８】
本発明の発現系が、AAVベクターの2つのITR(「逆方向末端反復」)配列間に挿入されることが好ましい。
【００８９】
本発明の発現系が完全に適用可能である全身投与に関連して、血清型8又は9のAAVベクターが特に好ましい。これは、例えば、AAV2/8又はAAV2/9ベクターを含むことができる。
【００９０】
当業者には知られている一方法において、例えば、HEK293細胞の三重トランスフェクション(tri-transfection)により、又はバキュロウイルス系により、組換えウイルス粒子を得ることができる。ベクターの力価は、ミリリットルあたりのウイルスゲノム(vg/ml)として表すのが慣例的である。
【００９１】
好ましい一実施形態によれば、本発明の発現系は、タンパク質の発現が毒性と思われる場合は特に、適切な指向性、この場合、非標的組織に対するより標的組織に対して高い指向性を有するベクターを含む。このベクターは、心臓等の非標的組織の標的化/形質導入が、最小若しくはないように選択され、又は標的組織、特に骨格筋を特に標的化/形質伝達する、カプシドを含むAAVベクターであってよい。
【００９２】
上記から明らかな通り、特に組換えAAVベクター又は組換えウイルス粒子の形態における、本発明による発現系には、特に治療の分野における明白な適用がある。
【００９３】
よって、別の一態様によれば、本発明は、医薬として記載する発現系の使用に関する。換言すると、このような発現系を含む医薬組成物も網羅する。医薬組成物が、好ましくは静脈内投与等の全身投与に適用される、薬学的に許容され、且つ不活性な担体を更に含むことができることが適切である。多様な賦形剤、安定化剤、及び当業者には知られている他の既知の適切な化合物を、このような組成物に加えることができる。
【００９４】
本発明は、投与が、標的組織に局所的に行われないが、代わりに全身的に全身に行われ、非標的組織における送達をもたらす場合に記載される、発現系の利点を実証するものである。
【００９５】
よって、好ましくは、本発明による発現系は、以下の経路の1つによって投与される:経腸、非経口、経口、静脈内、動脈内、及び吸入による。
【００９６】
投与が全身投与であることが好ましく、静脈内投与がより好ましい。全身投与は、骨格筋付近等、処置エリア付近で行われ得ることに留意されたい。
【００９７】
特定の形態の一実施形態によれば、投与は局所領域的な投与ではない。より具体的には、以下は、よって排除され得る:血管内、特に静脈内の、注射(圧力下、及び止血帯の存在下で、標的筋肉に接近して行われる)、例えば、Petrovら(Methods Mol Biol、2011年、709巻、277〜86頁)によって記載されるもの等、又は動脈内注射(動脈中カテーテル、及び拡散を防ぐための、上流の動脈付近の静脈クランピング(venous clamping))、例えば、Goninら(J Gene Med、2005年、7巻、782〜791頁)によって記載されるもの。
【００９８】
本発明の組成物を注射しようとする場合、組成物が液体形態であることが好ましい。有効濃度、この場合本発明の発現系は、注射しようとする量、及び注射の頻度は、当業者によって決定される。単回投与が十分であり得る。治療効果が、少なくとも1か月、3か月、6か月、1年、5年、又はそれを超えた期間に観察されることが好ましい。
【００９９】
このような医薬は、特に、神経筋障害、より詳しくは骨格筋を主に冒す疾患(ミオパチー)の処置のための遺伝子治療を意図するものである。より全般的に、本発明は、対象における筋肉機能を改善するのを助ける。
【０１００】
処置しようとする患者は、好ましくは哺乳動物であり、特にヒトである。
【０１０１】
本発明の文脈において特に言及する疾患は中心核ミオパチーであり、より正確にはX染色体連鎖筋細管ミオパチー(XLMTM)である。更に、シャルコーマリートゥース病のいくつかの形態等、ミオチューブラリンに付随する、他の中心核ミオパチー及び神経筋疾患を処置することができる。
【０１０２】
2A型肢帯ジストロフィ(LGMD2A)も、本発明の発現系で処置することができる。
【０１０３】
より全般的に、本発明が網羅する疾患の網羅的でない一覧は以下の通りである:セレン含有タンパク質N欠損を有する先天性筋ジストロフィー、原発性メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー、ウールリッヒ型先天性筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)又はベッカー型筋ジストロフィー(BMD)、セントラルコア先天性ミオパチー、マルチミニコア(multi-minicore)先天性ミオパチー、中心核常染色体ミオパチー(centronuclear autosomal myopathy)、線維不均衡を有するミオパチー(myopathy with fibre dysproportion)、ネマリンミオパチー、先天性筋無力症候群、ミオチューブラリンに付随する他の神経筋疾患、2B型又は2D型肢帯ジストロフィー、三好型遠位型ミオパチー、ディスファーリノパシー、サルコグリカノパチー。
【０１０４】
特定の形態の一実施形態によれば、病態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)若しくはベッカー型筋ジストロフィー(BMD)でも、又はLGMD2Dでもない。
【０１０５】
したがって、このような処置の他の組織における潜在的な副作用を回避しながら、状態を改善し、よって患者の生活の質及び寿命を改善する両方が、本発明による医薬に期待される。
【０１０６】
例によって実証する通り、本発明は、筋肉疾患に対する遺伝子治療処置の潜在的な心毒性を実証し、この問題を克服する技術的解決法を提供するものである。
【０１０７】
実験例
本発明及び本発明に起因する利点は、以下に示す実現例で、及び添付する図の助けで、より良好に理解されよう。しかし、これらは網羅的なものではない。
【０１０８】
本発明を、ミオチューブラリン遺伝子(MTM1)及びカルパイン3遺伝子(CAPN3)に関連して説明する。しかし、記載する戦略は、心毒性が実証される骨格筋における対象のタンパク質をコードするあらゆる導入遺伝子に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】ベクター構築物を示す図である。  A/ miRNA-208aに対する標的配列のないMtm1発現カセット。  B/ Mtm1遺伝子の3'にmiRNA-208aに対する標的配列を1、2、又は4つ(四角)含む発現カセット。
【図２】AAV-pDES-Mtm1ベクターで処置したXLMTMマウスの心臓の断面図を示す図である。線維症エリアが、シリウスレッド染色のため赤色で見出された。
【図３】上:ベクター(vg/二倍体ゲノム)を静脈内投与し1か月後、野生型マウス(WT)の骨格筋(前脛骨筋=TA;四頭筋=QUA;三頭筋=TRI)における、及び心臓におけるベクターの分布を示す図である。  下:ベクターを投与し1か月後、野生型マウス(WT)の骨格筋及び心臓におけるMTM1タンパク質のレベルを示す図である。値は、内因性のレベルに対する増殖速度を示す。対照として、マウスに、PBS又は空のAAV8ベクター(AAV-MCS)のいずれかを注射した。
【図４】PBS、AAV8-Des-MCS、AAV8-Des-Mtm1、又はAAV8-Des-Mtm1-miRHT1のいずれかを注射した、Mtm1 KOマウス(「ノックアウト」)の、生存曲線(左)及び体重曲線(右)を示す図である。対照として野生型マウス(WT)にPBSを投与した。
【図５】in vivoにおけるCAPN3及びmiR-206のプロモーター活性の分析を示す図である。A/ PBS又はベクターAAV2/9-desm-CAPN3(pdes.C3)、AAV2/9-pC3-CAPN3(pC3.C3)、AAV2/9-pmiR206-CAPN3(p206.C3)を注射し、シリウスレッド染色(上、スケール=500μm)又はヘマトキシリンフロキシンサフラン(HPS)(下、スケール=100μm)後の、心筋の組織学的分析。B/ 注射後のWT野生型マウスの心臓における、ベクターのDNAレベルのqPCRによる評価。C/ 注射後のWT野生型マウスの心臓における、CAPN3 mRNAレベルのqPCRによる評価。「H」ラインは、WT野生型マウスの心臓におけるCAPN3内因性mRNAレベルに相当する。D/ 血清酵素の分析を示す図である。アラニンアミノトランスフェラーゼ試験(ALT)を、左に対してpC3.C3、又は右に対してp206.C3で処置したWTマウスの血清に対して行った。各条件に対する標準偏差及び平均(SEM)を、それぞれ縦棒及び丸によって示す。
【図６】in vivoにおけるmiR-208aTの活性の分析を示す図である。A/ PBS、又は同一投与量のベクターAAV2/9-desm-CAPN3(pdes.C3)若しくはAAV2/9-desmin-CAPN3-miR208aT(pdes.C3-T)を注射し35日後、シリウスレッド染色(上、スケール=500μm)又はHPS(下、スケール=100μm)の心筋の組織学的分析。B/ 注射後のWT野生型マウスの心臓におけるqPCRによるベクターDNAレベル(上)、及びCAPN3導入遺伝子のmRNAレベル(下)の評価。「H」ラインは、WT野生型マウスの心臓におけるCAPN3内因性mRNAレベルに相当する。C/ PBS、又はベクターAAV2/9-desmin-CAPN3(pdes.C3)若しくはAAV2/9-desm-CAPN3-miR208aT(pdes.C3-T)を注射したWTマウスの骨格筋及び心臓における、ウエスタンブロットによるカルパイン3の発現の分析。全タンパク質を矢印によって示し、その切断生成物(60、58、及び55kDa)をフックによって示す。D/ AAV2/9-desmin-CAPN3(pdes.C3)又はAAV2/9 desmin-CAPN3-miR208aT(pdes.C3-T)を注射したWTマウスの心臓における、miR-208a(miR208a)、HOP(Hop)、及びコネキシン40(Cnx40)のmRNAレベルの定量。pdes.C3-T状態のRNAの定量を、pdes.C3状態のRNAレベルのパーセント値として示す。
【図７】カルパイン3欠損マウスの骨格筋における、カルパイン3の移行の効率の組織学的分析を示す図である:A/ PBS又はベクターAAV2/9-desmin-CAPN3-miR208aT(pdes.C3-T)、AAV2/9-PC3-CAPN3-miR208aT(pC3.C3-T)、AAV2/9-pmiR206-CAPN3-miR208aT(P206.C3-T) (1.2×1013vg/kg)のいずれかを注射し4か月後、C3KOマウスのTA筋の横断面をHPSで染色した。スケール=100μm。B/ PBS又はベクターAAV2/9-desmin-CAPN3-miR208aT(pdes.C3-T)、AAV2/9-PC3-CAPN3-miR208aT(pC3.C3-T)、AAV2/9-pmiR206-CAPN3 -miR208aT(p206.C3-T) (1.2×1013vg/kg)のいずれかを注射したC3KOマウスのTA(左)及びPSO(右)筋における、HPSで染色した切片において測定した中心核線維(centronuclear fibre)の数(CNF/mm2)。P値<0.05の差をアステリスクによって示す。TA:前脛骨筋;PSO:腰筋。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
I)材料と方法
1)組換えAAVベクターの産生
ベクター血清型2AAVにおけるヒトデスミンプロモーター(配列番号11)の下流に、マウスMtm1遺伝子(配列番号14)のオープンリーディングフレームをクローニングすることにより、ベクターrAAV-Des-Mtm1を構築した。DNAスペーサーにより各々分離されている、22pbのmiRNA-208a(配列番号10)の標的配列(1、2、又は4つの配列、それぞれmiRHT1、miRHT2、及びmiRHT4)を、Mtm1 cDNAの3'UTR領域において加えた。対照として空ベクター(rAAV-Des-MCS)も産生した。血清型8の組換えウイルス粒子(AAV8)を、以前に記載されている通り(15)、HEK293細胞の三重トランスフェクションプロトコールを用いて得た。ベクターの力価を、1mlあたりのウイルスゲノムに関して表す(vg/ml)。
【０１１１】
同様に、ベクターrAAV-desm-CAPN3(又はAAV-desmin-CAPN3若しくはAAV-pDes-CAPN3)を、ヒトデスミンプロモーター(配列番号11)の制御下、ヒトカルパイン3のcDNA(配列番号8)を用いて構築した。rAAV-PC3-CAPN3及びrAAV-pmiR206-CAPN3ベクターを、このプロモーターを、それぞれヒトカルパイン3(配列番号12)のプロモーター領域又はmiRNA206(配列番号13)のプロモーター領域によって置き換えることによって得た。ベクターAAV-desm-CAPN3-miR208aT、AAV-PC3-CAPN3-miR208aT、及びAAV-pmiR206-CAPN3-miR208aTを、カルパイン3遺伝子の3'に、直列にmiRNA208a(配列番号9) (miR208aT)に対する標的配列2つを加えることによって得た。血清型1(AAV1)、8(AAV8)、及び/又は9(AAV9)の組換えウイルス粒子を生成した。
【０１１２】
2)in vivo実験
マウスを、動物試験に関するフランス及び欧州の法律に従って処理した。この試験では、WT C57Bl/6野生型マウス(Charles River Laboratories)、及びミオチューブラリンに対して構成的に不活性化したマウス系統(ノックアウト)である、BS53d4-129pasとも呼ぶ、KO-Mtm1を用いた。カルパイン3に対して、Laureら(Febs J.、2010年、277巻、4322〜4337頁)によって記載されるC3KOマウスモデルを用いた。
【０１１３】
組換えベクターを、指摘される投与量に従って、マウス(3週齢から2か月)の尾静脈中に指摘される通り注射した。対照として等体積のバッファー食塩水(PBS)を投与した。臨床状態及び動物の体重を、WT動物に対して毎週、変異マウスに対して1週間あたり3回モニタリングした。指摘される時間にマウスを屠殺した。
【０１１４】
3)ウエスタンブロット
イソペンタン中で凍結させた筋肉を30μmの横断面で切断し、プロテアーゼインヒビター(Roche社)のコンプリートカクテル(complete cocktail)を補った、150mM NaCl、10mM Tris HCl (pH7.4)、1mM EGTA、1mM EDTA、100mMフッ化ナトリウム、4mMピロリン酸ナトリウム、2mMオルトバナジン酸ナトリウム、1% Triton X100、及び0.5% IGEPALを含むバッファー中、氷上で溶解した。筋肉抽出物を1時間インキュベートし、4℃、12,000×gで30分間遠心分離した。上清中のタンパク質濃度を、Bio-Rad社「タンパク質アッセイキット」を用いて決定した。タンパク質をSDS-PAGEに対する遊走にかけ、ニトロセルロース膜に移した後、ミオチューブラリンに対するポリクローナル抗体(p2348 [15])及びGAPDH (#MAB374、Millipore社)とインキュベートした。タンパク質のバンドを、「Odyssey Imaging System」(LICOR Biotechnology Inc.社)を用いて赤外蛍光によって目視し(view)、「Odyssey Infrared Imaging System Software」プログラム(ソフトウエアアプリケーション、バージョン1.2、2003年)を用いて定量した。
【０１１５】
カルパイン3の検出に同様のプロトコールを用いた:[20mM Tris (pH 7.5)、150mM NaCl、2mM EGTA、0.1% Triton X-100、2mM E64 (Sigma社)]による溶解バッファー及びプロテアーゼインヒビター(Complete Miniプロテアーゼインヒビターカクテル;Roche Applied Science社、組織1mgあたり25μl)を用いて、FastPrepによって筋肉をホモジナイズした。試料を、Benzonase(Calbiochem社) 250U/100μlと4℃で30分間処理してDNAを消化した。筋肉溶解液をローディングバッファー[NuPage LDS (Invitrogen社)、TNT 3M (Sigma社)]と混合し、70℃で10分間変性させ、短時間遠心分離した。上清を、4〜12%勾配のポリアクリルアミドゲルNuPAGE Bis-Tris(Invitrogen社)によって分離した。移動後、膜を、カルパイン3に対する抗体(マウスモノクローナル抗体、Novocastra NCL-CALP-12A2、1/200希釈)と4℃で一夜、又は室温で2〜3時間ハイブリダイズした。最後に、Odyssey赤外スキャナー(LI-COR Biosciences社、Lincoln、Nebraska、USA)上で出現させるために、膜をIRDye(登録商標)とインキュベートした。
【０１１６】
4)PCR
4-1-ミオチューブラリン
DNAの筋肉からの単離を、「Gentra Puregene Tissue Kit」(Qiagen社)を用いて、製造元の指示に従って行った。DNAの全濃度を、ND-8000 Nanodrop分光光度計(Nanodrop Technologies社、フランス)を用いて決定し、各試料に対してDNA 80ngを、リアルタイムのPCRに対するマトリクスとして用いた。ウイルスゲノムのコピーを同定するためのrAAV2/Xベクター、及びタイチンのマウス遺伝子に共通のスケルトンの部分の両方に対して、各試料に対するTaqmanリアルタイムPCRを行って各試料中に存在するマウスゲノムの数を標準化した。rAAVベクターの増幅に用いたプライマーは、5'-CTCCATCACTAGGGGTTCCTTG-3'(フォワード、配列番号15)、5'-GTAGATAAGTAGCATGGC-3'(リバース、配列番号16)であった。MGBプローブは、二重標識した(FAM-NFQ):5'-TAGTTAATGATTAACCC-3'(プローブ、配列番号17)であった。タイチンに用いたプライマー及びプローブは、5'-AAAACGAGCAGTGACGTGAGC-3'(フォワード、配列番号18)、5'-TTCAGTCATGCTGCTAGCGC-3'(リバース、配列番号19)、及び5'-TGCACGGAAGCGTCTCGTCTCAGTC-3'(プローブ、配列番号20)(Applied Biosystem社)であった。タイチンの増幅は、「Absolute QPCR ROX Mix」(Thermo Fischer Scientific社)中に希釈したDNA 80ng、Taqmanプローブ0.1μM、並びにプライマー(フォワード及びリバース)0.2μM、最終体積25μMを用いて行った。サイクル条件は、95℃15分間のThermo-Start DNAポリメラーゼに対する活性化ステップ、引き続き、95℃の変性15秒、並びに60℃のハイブリダイゼーション及び伸長60秒の2ステップサイクル40サイクルからなっていた。rAAVの増幅は、Taqmanプローブ0.1μM、リバースプライマー0.3μM、及びフォワードプライマー0.05μM、最終体積25μlを用いて行った。サイクル条件は、95℃15分間のThermo-Start DNAポリメラーゼに対する活性化ステップ、引き続き、95℃の変性15秒、並びに54℃のハイブリダイゼーション及び伸長60秒の2ステップサイクル40サイクルからなっていた。PCRは、7900 HTサーモサイクラー(Applied Biosystem社)上で行った。rAAVスケルトン及びタイチンの配列を含むプラスミドの標準の希釈系列を、コピー数の対照として、リアルタイムの各PCRプレートにおいて用いた。試料及び対照は全て2回ずつ行った。データを、二倍体ゲノムあたりのウイルスゲノムのコピー数として表す。
【０１１７】
4-2-カルパイン3
Trizol法(Invitrogen社)を用いて筋肉を抽出した。抽出の間、試料画分を、定量PCRによって定量するためのDNA抽出用に保存した。全RNAを、「DNA-Free」キット(Ambion社)で処理した残余の抽出物から抽出して、残余のDNAを除去した。内因性のマイクロRNAの発現を定量するために、合計20ngのRNAを、「逆転写TaqMan MicroRNA」キット(Applied Biosystems社)を用いて逆転写にかけ、miR-208aに対してmicroRNA ID511 Taqmanアッセイ(Applied Biosystems社)によって分析した。試料の標準化を、試験ID 1232(Applied Biosystems社)でのsnoRNA202の発現で行った。
【０１１８】
内因性又は導入遺伝子のカルパイン3のmRNAを増幅するために、RNA 1μgを、ランダムヘキサマー及びオリゴdT、並びにcDNA Versoキット(Abgene社)又は「RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis」キット(Fermentas社)を用いて逆転写した。リアルタイムPCRを、以下のプライマー対(.f及び.r)及びTaqmanプローブ(.p)の助けで、ABI PRISM 7700(Applied Biosystems社)システム及び「Absolute QPCR Rox Mix」溶液(ABgene社)を適用して、TaqMan(登録商標)法を用いて行った:導入遺伝子のカルパインの定量に対してCAPN3sfr.f(配列番号21)5'_CGCCTCCAAGGCCCGT_3';CAPN3sfr.r(配列番号22)5'_GGCGGAAGCGCTGGCT_3';MGBTUCAPN3.p(配列番号23)5'_CTACATCAACATGAGAGAGGT_3;ヒトカルパインの定量に対してCAPN3.f(配列番号24)5'_CGCCTCCAAGGCCAGG_3'、CAPN3.r(配列番号25)5'_GGCGGAAGCGCTGGGA_3、及びCAPN3.p(配列番号26)5'_TACATCAACATGCGGGAGGT_3。異なる実験を比べることができるように、対照のRNAの段階希釈を各実験において用い、実験試料で処理してcDNA調製物及びPCRの効率における変動を回避した。このRNAを、プライマーの全ての対によって変異及び増幅されたcDNAカルパイン3を運搬するプラスミドから、in vitro転写反応によって調製した。
【０１１９】
コネキシン40及びHOPの発現の分析を、以下に示すTaqMan(登録商標)遺伝子発現試験(Applied Biosystens社)を用いて行った:Cnx40に対して;Gja-5[Mus Musculus]:Mm00433619_s1及びhop:HOPホメオボックス[Mus musculus]:Mm00558630_m1。qRT-PCRの結果を、遍在性のリボソームのリンタンパク質酸(phosphoprotein acid)マウス遺伝子の発現に対して任意の単位で表す(P0 GI:15029771; MH181PO.F(配列番号27):5'_CTCCAAGCAGATGCAGCAGA_3'/M267PO.R(配列番号28):5'_ACCATGATGCGCAAGGCTAT_3'/M225PO.p(配列番号29):5'_CCGTGGTGCTGATGGGCAAGAA_3')。
【０１２０】
5)組織学
心臓、肝臓、又は骨格筋の凍結切片の横断面(厚さ8μm)を、ヘマトキシリンエオジン(HE)、シリウスレッド、又はヘマトキシリンフロキシンサフラン(HFS)で、標準のプロトコールを用いて染色した。
【０１２１】
切片にEukitt培地(LABONORD社)を搭載した。CCDカメラ(Sony社)を用いてデジタル画像を取り込んだ。中心核線維の数(CNF/mm2)を規定するための骨格筋の形態計測分析を、Histolabソフトウエア(Microvision社、Evry)を用いて行った。
【０１２２】
6)ALT活性の測定
血液試料を凝固させずに採取した。遠心分離(8000g、10分、4℃)後、血清を、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)速度を決定するための「Vitros ALT DTスライド」カセットを用いて、VITROS DT60装置(Ortho Clinical Diagnostics社、UK)を用いて分析した。
【０１２３】
II)結果
A-ミオチューブラリン
1)構築物AAV-pDES-Mtm1の心毒性
ベクターAAV2/1においてCMVプロモーターの制御下でミオチューブラリン(Mtm1)遺伝子を単回筋肉内注射した有益な効果は、Buj-Belloらの文献[15]から知られていた。
【０１２４】
Mtm1ノックアウトマウスにおける全身経路による遺伝子治療の取組みを試み、変異マウスにおいてヒトデスミンプロモーターの制御下でミオチューブラリンを発現するAAV8ベクター(rAAV-Des-Mtm1)を投与すると(図1A)少なくとも6か月の延命がもたらされることが示され、横隔膜を含めた身体中の横紋筋における病理、及び運動活性の標準化における強力な改善であった(結果は示さず)。
【０１２５】
しかし、Mtm1 KOマウスにおいてベクターAAV8-DES-Mtm1を全身投与した後、ミオチューブラリンタンパク質のレベルが、骨格筋に比べて心臓では非常に高いことが観察された(結果は示さず)。更に、ウイルス注射後、様々な時間にAAVで処置したXLMTMマウスの心臓において、炎症性の浸潤物及び線維症の存在が認められた(図2)。
【０１２６】
2)心毒性のない発現系の開発
特にヒトにおける全身投与後、ベクターAAV8からの体内分布及び導入遺伝子の発現を予測することが難しいということから、心臓に影響を及ぼす潜在的な副作用を回避するために、筋肉特異性を増大する制御配列を運搬する新たなベクターを開発した。
【０１２７】
図1Bに示す通り、miRNA-208aに対する標的配列をそれぞれ1、2、又は4つ含む、ウイルス構築物を3つ(rAAV-Des-Mtm1-miRHT1、rAAV-Des-Mtm1-miRHT2、及びrAAV-Des-MTM1-miRHT4)開発した。この配列は配列番号10を有し、22塩基対からなっている。この配列がヒト、イヌ、及びマウスに保存されているのは明白である。
【０１２８】
3)WTマウスにおける注射後のMTM1の筋肉及び心臓の生成
MTM1に最も適する発現ベクターを選択するために、これらのベクターの3×1013ウイルスゲノム(vg)/kgの単回投与量を、3週齢の野生型マウスの尾静脈に投与した。内部対照として、空ベクター(AAV-Des-MCS)及びPBS(「リン酸緩衝食塩水」)を用いた。
【０１２９】
心臓における、及び様々な骨格筋(前脛骨=TA、四頭筋=QUA、三頭筋=TRI)におけるミオチューブラリンのベクター分布及びタンパク質レベルを、注射1か月後に評価した。ウエスタンブロットの結果は、これらのベクターは、心臓において特異的に、ベクターから生成されるミオチューブラリンのレベルを低減することができることを示した。加えて、miRNA208aの単一の標的配列は、この組織における発現を低減するのに十分である(図3及びTable 1 (表1))。
【０１３０】
【表１】
2020079279.tif 000002
【０１３１】
4)Mtm1変異マウス注射後のベクター構築物の確証
先の結果に基づいて、構築物rAAV-Des-Mtm1-miRHT1をさらなる実験に選択した。MTM1遺伝子を変異させた(「ノックアウト」を意味するKO)3週齢のWT野生型マウスに、AAV-Des-Mtm1、rAAV-Des-Mtm1-miRHT1、及びrAAV-Des-MCSをそれぞれ3×1013vg/kg、又はPBSを投与し、1か月間臨床的にモニタリングした。
【０１３２】
AAV8-Des-Mtm1-miRHT1を投与した変異マウスは全て試験終了まで生存し、成長曲線はAAV8-Des-Mtm1で処置したKOマウスの成長曲線と同様であり、miRHT1配列を含めても導入遺伝子の治療有効性に影響を及ぼさないことが示された(図4)。
【０１３３】
WT及びKOマウスの心臓の組織学を、処置1か月後に、ヘマトキシリンエオジン及びシリウスレッド染色で分析した。線維性のエリアが、9-AAV8-Des-Mtm1で処置した9匹のKOマウスのうち7匹の心臓に観察されたが、AAV8-Des-Mtm1-miRHT1で処置したKOマウス(n=10)には観察されなかった。ベクターAAV8-Des-Mtm1を投与しても、注射1か月後、WTマウスに線維症を引き起こさなかった(n=8)。
【０１３４】
結論として、これらの結果より、miRNA208aの単一の標的配列を含めることは、AAV8-Des-Mtm1構築物の心毒性を低減するのに十分であることが指摘される。
【０１３５】
カルパイン3(CAPN3)に関して同様の実験を行った。
【０１３６】
B-カルパイン3
Bartoliら(Molecular Therapy、2006年、13巻、2号、250〜259頁)の文献は、筋肉特異的プロモーターの制御下でカルパイン3遺伝子を運搬するAAVタイプの構築物を、筋肉内投与又は局所投与した後の有益な効果及び非毒性を指摘するものである。しかし、本発明に関連して行った実験により、このような構築物の全身投与後の毒性が明らかにされた。
【０１３７】
1)AAV-desm-CAPN3構築物の心毒性
様々な構築物を静脈注射した後、WTマウスの状態をモニタリングし、以下のTable 2 (表2)に示す。
【０１３８】
【表２】
2020079279.tif 000003
【０１３９】
試験した全てのAAVに対して、全身投与の場合に心臓組織の破壊が観察され、これらの遺伝子発現系の治療目的の使用が排除される。
【０１４０】
2)プロモーターを置き換えることによる構築物AAV-desm-CAPN3の心毒性の低減
デスミンプロモーターを、CAPN3(AAV2/9-pC3-CAPN3)又はmiR-206(AAV2/9-pmiR206-CAPN3)のプロモーターと交換することによって、2つのベクターを構築した。ベクターのウイルス調製後、静脈注射(6×1012vg/kg)によって導入した変化のin vivoの結果を、2か月齢のC57BL/6マウス(WT)において分析した。
【０１４１】
注射35日後、形質導入のレベルは同様であったのにかかわらず(図5B)、AAV2/9-desm-CAPN3を注射したマウスと異なり(図5A)、ベクターAAV2/9-pC3-CAPN3及びAAV2/9-pmiR206-CAPN3で処置したマウスに心臓の線維症は観察されなかった。AAV2/9-desm-CAPN3で処置したマウスの心臓におけるCAPN3導入遺伝子のmRNAのレベルは、内因性のレベルより約15倍高かったが(図5C)、AAV2/9-pC3-CAPN3及びAAV2/9-pmiR206-CAPN3で処置したマウスでは依然として低く(それぞれ13%及び30%、図5C)、これら2つのベクターの非毒性の効果に相関する。更に、これら2つのプロモーターは、約5週間アラニンアミノトランスフェラーゼ活性(ALT)のレベルを測定することにより、1013vg/kgを注射したWTマウスにおいて肝毒性を示さなかったことが検証された。PBSを注射した動物に比べて、注射した動物に酵素活性における増大は観察されなかった(図5D)。
【０１４２】
最後に、プロモーターCAPN3及びmiR-206は、肝毒性を引き起こさずに導入遺伝子CAPN3の心毒性を低減する。
【０１４３】
3)miR208aの2つの標的配列を加えることによるAAV-desm-CAPN3構築物の心毒性の低減
miRNA208a(配列番号10)の2つの標的配列を、miR208aTカセットにおいて直列にクローニングした。次いで、これを構築物AAV2/9-desm-CAPN3の3'UTRエリア中に挿入して、構築物AAV2/9-desm-CAPN3-miR208aTを生成した。
【０１４４】
6×1012vg/kgの投与量を注射した後、AAV2/9-desm-CAPN3を注射したマウスと異なり、処置マウスに心臓の線維症は観察されなかったが(図6A)、心臓では形質導入のレベルは同様であり、mRNAのレベルがカルパイン3の内因性のレベルに比べて5倍高かった(図6B)。タンパク質レベルに関して、カルパイン3は心筋では通常発現されず、検出されない(図6C)。AAV2/9-desm-CAPN3を注射したWTマウスでは、全体のタンパク質は検出されないが、その切断に起因するフラグメント(60、58、及び55kDa)は検出される(図6C)。対照的に、AAV2/9-desm-CAPN3-miR208aTを注射したWTマウスの心臓では全体のタンパク質も切断フラグメントも観察されず(図6C)、翻訳制御が指摘される(図6D)。まとめると、これらの結果は、miR208aTは、CAPN3導入遺伝子の心毒性を低減することができることを示す。
【０１４５】
4)2戦略の組合せ
プロモーターCAPN3及びmiR-206、並びにmiR-208a:AAV2/9-pC3-CAPN3-miR208aT及びAAV2/9-pmiR206-CAPN3-miR208aTの標的配列を2コピー、組み合わせることによって、新たなベクターを構築した。C3KOマウス(カルパイン3に対するノックアウト)に、これらのベクター1.2×1013vg/kgを注射した。
【０１４６】
野生型マウスに以前に観察された通り、3つのベクター(AAV2/9-desm-CAPN3-miR208aT、AAV2/9-pC3-CAPN3-miR208aT、及びAAV2/9-pmiR206-CAPN3-miR208aT)のどれも、注射3か月後、心臓に対するして毒性であることが証明されなかった(結果は示さず)。
【０１４７】
対照的に、これらのベクターを注射した4週齢のC3KOマウスの骨格筋の組織学的検査及び形態学的検査は、マウスモデルの病理学的徴候に対するカルパイン3の発現のポジティブな効果を示した。これらのベクターを注射した前脛骨(TA)筋は、PBSを注射したものに比べて、組織学的特徴の改善を示した(図7A)。HPSで染色したTA筋の切片の形態学的分析により、ベクターを注射した筋肉における中心核線維(CNF)における顕著な低減が明らかになった(図9B左)。PSO筋(腸腰筋)で同様の結果が得られたが、AAV2/9-pC3-CAPN3-miR208aT及びAAV2/9-pmiR206-CAPN3-miR208aTで観察された低減は統計学的に有意ではなかった。
【０１４８】
結論として、これらの結果は、これら組換えベクターを形質導入した骨格筋におけるカルパイン3の発現は、心毒性を表さずに、カルパイン3欠損のマウスの病理学的徴候を是正することができることを指摘する。
(参考文献)
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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