(57)【要約】【課題】表面選択的非線形光検出技法を使用して生物学的分子または他の生物学的実体のコンホメーション変化のハイスループット分析を実施するための方法、デバイス、およびシステムを提供すること。【解決手段】一局面では、生物学的実体と試験実体との間の相互作用を決定するための方法が提供され、この方法は、（ａ）少なくとも４つの生物学的実体のそれぞれを少なくとも１つの試験実体と接触させることと；（ｂ）少なくとも４つの生物学的実体のそれぞれに、表面選択的光学技法を使用して１つまたは複数の励起光線を照射することと；（ｃ）コンホメーション変化が、少なくとも１つの試験実体との接触によって少なくとも４つの生物学的実体のそれぞれにおいて誘導されたか否かを決定することと；を含み、コンホメーション変化の決定は、１時間当たり少なくとも１０の試験される試験実体の平均速度で実施される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
この出願は、２０１４年６月３０日に出願された米国仮出願第６２／０１９，２８５号（上記出願は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府により資金供与された研究についての声明
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎからの助成金番号ＩＩＰ−１２５６６１９の下、米国政府の支援によりなされた。
【背景技術】
【０００３】
過去２０年にわたって、ハイスループット実験の出現により、ライフサイエンスおよび生物医学研究が実施されるやり方が転換された。遺伝子操作、有機化学、材料科学、微細加工、およびマイクロエレクトロニクスなどの分野における技術の収束は、薬物発見のための化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニングから迅速な全ゲノム配列決定に及ぶ適用に対処するための新しい技術プラットフォーム（例えば、マイクロアレイ技術、マイクロフルイディックデバイスおよびシステム、ビーズベースコンビナトリアル化合物ライブラリーおよびアッセイシステム、ならびにマイクロプレートベースアッセイシステム）に導いた。
【０００４】
薬物発見のためのハイスループットスクリーニングシステムの例としては、連続流アッセイ（例えば、受容体アゴニストを同定するための受容体−リガンド結合アッセイおよび細胞ベースアッセイ）を実行するためのマイクロフルイディクスベースプラットフォーム技術、ならびに結合反応、酵素反応、または細胞ベースアッセイがマイクロウェルプレートフォーマットで実行されるマイクロプレートベースシステム、ならびに自動化された試料調製、アッセイ、および検出ステップをもたらす自動化された液体分注ステーションおよびプレート−ハンドリングロボティクスがある。薬物発見のための既存のハイスループットプラットフォーム技術の大部分は、蛍光ベース光検出を利用する。蛍光技法は、非常に高い検出感度をもたらし、一般に、２０年前の生物学的アッセイ法において優位を占めたより伝統的な放射性同位体ベース手法よりはるかに環境に優しいが、蛍光の使用に対していくつかの欠点がある。例としては、（ｉ）その性能がミスアライメントまたは機器ドリフトに敏感であることが多い洗練された光源、検出器、および光学系の要件、ならびに（ｉｉ）反復測定にかけられる試料中で時間をわたっての信号の劣化をもたらし得る光退色現象がある。
【０００５】
既存のハイスループットスクリーニング技術の別のより深刻な限定事項は、生物学的観点から魅力的な標的であるいくつかの潜在的な治療標的、例えば、潜在的ながん治療標的は、これらが一般に従来の薬物発見手法に適用できないために化学的見地から扱いにくい（「創薬が困難」）であるという意識の高まりに由来する。これらのタンパク質標的は、典型的には、他のタンパク質と相互作用するとき（すなわち、タンパク質間相互作用によって）、またはこれらがタンパク質の活性部位に極めて高い親和性を伴って結合するリガンドを有するという事実に起因して相対的に大きい接触エリアを有する。いずれの場合においても、相互作用を遮断する（すなわち、タンパク質間相互作用の場合において大きい接触エリアを妨害し、かつ／もしくは覆い隠す、または高親和性リガンドに取って代わる）従来の低分子または生物学的（タンパク質）薬物候補を見つけることは、極めて困難である。このような「創薬が困難な」標的のためのアロステリックモジュレーターは、魅力的な治療ソリューションを提供する。定義によって、アロステリック分子は、タンパク質の活性部位以外の部位に結合し、それによって付随する機能的効果（例えば、受容体の活性化）を伴ってタンパク質のコンホメーションを変更する。標的タンパク質をアロステリックにモジュレートすることは、意図されない臨床的な副作用をもたらし得る、天然リガンドのタンパク質への結合の阻害またはその結合との競合を利用しなくてもよいという利益を加えた。しかし、現在利用可能な従来の技法を使用してアロステリックモジュレーターを同定することは困難となっている。例えば、Ｘ線結晶学またはＮＭＲ法から得られる構造情報は、低スループット、低感受性、利用される非生理的条件、技法に適用できるタンパク質のサイズ、および多くの他の要因に起因して薬物発見目的にとって限られた価値のものであることが多い。したがって、必要とされているものは、候補化合物の収集物をスクリーニングし、例えば、標的タンパク質のコンホメーションをアロステリックにモジュレートすることができる作用物質を迅速に同定するためのハイスループット技法である。
【０００６】
以下でより完全に記載するように、２次高調波発生（ＳＨＧ）は、タンパク質および他の生物学的標的におけるコンホメーション変化の検出を可能にする表面選択的検出技法として構成され得る非線形光学プロセスである（例えば、米国特許第６，９５３，６９４号および米国特許出願第１３／８３８，４９１号において以前に記載されているように）。ハイスループットフォーマットでコンホメーション変化のＳＨＧベース検出を展開するために、励起光を送達するのに使用される光学系に対して担体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（分析される生物学的標的を含む）を迅速、正確、かつ互換性に位置付けるための新規機構であって、同時に励起光と担体表面との間の効率的な光カップリングが維持されることを保証する、新規機構を設計することが有利であり得る。生体試料のハイスループット光学的調査のための１つの好適なフォーマットは、ガラス底マイクロウェルプレートである。
本明細書に開示のシステムおよび方法は、ハイスループット分析システムの要求に適合する様式で全反射によって、ＳＨＧおよび他の非線形光学技法に要求される高強度励起光を担体、例えば、ガラス底マイクロウェルプレート中のガラス担体にカップリングするための機構を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，９５３，６９４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
生物学的実体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｙ）と試験実体（ｔｅｓｔ  ｅｎｔｉｔｙ）との間の相互作用を決定するための方法であって、（ａ）少なくとも４つの生物学的実体のそれぞれを少なくとも１つの試験実体と接触させることと；（ｂ）少なくとも４つの生物学的実体のそれぞれに、表面選択的光学技法を使用して１つまたは複数の励起光線を照射することと；（ｃ）コンホメーション変化が、少なくとも１つの試験実体との接触によって少なくとも４つの生物学的実体のそれぞれにおいて誘導されたか否かを決定することと；を含み、コンホメーション変化の決定は、１時間当たり少なくとも１０の試験される試験実体の平均速度で実施される、方法が本明細書に開示されている。一部の実施形態では、コンホメーション変化の決定は、１時間当たり少なくとも１００の試験される試験実体の平均速度で実施される。
【０００９】
一部の実施形態では、少なくとも４つの生物学的実体は、同じである。一部の実施形態では、少なくとも４つの生物学的実体は、異なる。一部の実施形態では、生物学的実体は、細胞、タンパク質、ペプチド、受容体、酵素、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、小分子、および炭水化物、またはこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態では、生物学的実体は、薬物標的またはこれらの一部分である。
【００１０】
一部の実施形態では、少なくとも４つの生物学的実体のそれぞれは、担体上の異なる別々の領域内に位置している。一部の実施形態では、各別々の領域は、担体表面上に最大で約１００ｍｍ２のエリアを含む。一部の実施形態では、各別々の領域は、支持脂質二重層を含む。一部の実施形態では、生物学的実体は、支持脂質二重層に繋ぎ止められており、またはその中に包埋されている。
【００１１】
一部の実施形態では、少なくとも１つの試験実体は、細胞、タンパク質、ペプチド、受容体、酵素、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、小分子、および炭水化物、またはこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態では、試験実体は、薬物候補またはこれらの一部分である。
【００１２】
一部の実施形態では、接触ステップは、溶液中で行われ、少なくとも１つの試験実体を分注するのに予めプログラムされた流体分注ユニットを利用することを含む。一部の実施形態では、接触ステップは、少なくとも４つの生物学的実体のそれぞれを異なる試験実体と接触させることを含む。一部の実施形態では、接触ステップは、少なくとも４つの生物学的実体のそれぞれを少なくとも１００の異なる試験実体と順次接触させることを含む。一部の実施形態では、接触ステップは、少なくとも４つの生物学的実体のそれぞれを少なくとも１０，０００の異なる試験実体と順次接触させることを含む。
【００１３】
一部の実施形態では、１つまたは複数の励起光線は、１つまたは複数のレーザーによってもたらされる。一部の実施形態では、表面選択的光検出技法は、平面担体表面からの少なくとも１つの励起光線の全反射の使用を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、決定ステップは、非線形光信号を分析することをさらに含む。一部の実施形態では、非線形光信号は、２次高調波光（ｓｅｃｏｎｄ  ｈａｒｍｏｎｉｃ  ｌｉｇｈｔ）、和周波光（ｓｕｍ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｌｉｇｈｔ）、および差周波光（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｌｉｇｈｔ）からなる群より選択される。
【００１５】
一部の実施形態では、方法は、１つまたは複数の励起光線の１つまたは複数の外部源の位置に対して前記担体を移動させることをさらに含む。一部の実施形態では、各別々の領域は、ともに担体の底面と一体化されている入口プリズムおよび異なる出口プリズムと光学的にカップリングされている。一部の実施形態では、照射ステップは、別々の領域のそれぞれに隣接するが、直下ではなく位置付けされた入口プリズムに入射励起光を向けることを含む。一部の実施形態では、方法は、別々の領域のそれぞれに隣接するが、直下ではなく位置付けされた出口プリズムを使用して、照射の際に別々の領域のそれぞれで発生された非線形光信号を収集することと、前記非線形光信号を検出器に向けることとをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、前記接触ステップ後に複数回照射ステップおよび決定ステップを繰り返し、それによって時間の関数として少なくとも４つの生物学的実体のそれぞれのコンホメーション変化を決定することをさらに含む。
【００１６】
（ａ）担体を備えるデバイスであって、担体は、（ｉ）担体の表面に形成されたＭ×Ｎアレイの別々の領域であって、Ｍは、別々の領域の行の数であり、Ｎは、アレイ中の別々の領域の列の数であり、各別々の領域は、生物学的実体を含有するために構成されている、Ｍ×Ｎアレイの別々の領域、および（ｉｉ）担体と一体化され、別々の領域に光学的にカップリングされたＲ×Ｓアレイのプリズムであって、Ｒは、プリズムの行の数であり、Ｓは、アレイ中のプリズムの列の数である、Ｒ×Ｓアレイのプリズム；を含み、Ｒ＝Ｍ＋２およびＳ＝Ｎ、またはＲ＝ＭおよびＳ＝Ｎ＋２である、デバイスが本明細書に開示されている。
【００１７】
一部の実施形態では、別々の領域のそれぞれは、少なくとも１つの入力プリズムおよび少なくとも１つの出力プリズムと光学的にカップリングされており、入力プリズムおよび出力プリズムは、空間的に別々である。一部の実施形態では、Ｍ＝８およびＮ＝１２である。一部の実施形態では、Ｍ＝１６およびＮ＝２４である。一部の実施形態では、Ｍ＝３２およびＮ＝４８である。一部の実施形態では、Ｍは、４超であり、Ｎは、４超である。一部の実施形態では、各別々の領域は、支持脂質二重層を含み、または支持脂質二重層の形成を助長するように構成されている。一部の実施形態では、デバイスは、別個のウェル中に各別々の領域を隔離するために、担体の上面に結合されたウェル形成コンポーネントをさらに備える。一部の実施形態では、別々の領域のそれぞれは、最大で約１００ｍｍ２のエリアを含む。一部の実施形態では、各別々の領域またはウェルは、担体と一体化されたプリズムのアレイのうちの単一のプリズムの直上に設置されている。一部の実施形態では、担体は、ガラス、石英ガラス、またはプラスチックで構成されている。
【００１８】
プラスチックからプリズムアレイ部品を製作するための射出成形方法であって、離型ステップ中にプリズムアレイ部品に均一な圧力を適用するために２つまたはそれ超の型排出デバイスを使用することを含む、方法が本明細書に開示されている。
【００１９】
一部の実施形態では、プラスチックは、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、およびアクリルからなる群より選択される。一部の実施形態では、２つまたはそれ超の型排出デバイスは、その部品の光学性能が重要ではない領域内にかぎりプリズムアレイ部品に衝撃を与える。一部の実施形態では、２つまたはそれ超の型排出デバイスは、ｍ×ｎブレード様イジェクター特徴のアレイを備える。一部の実施形態では、ｍは、２超かつ２０未満である。一部の実施形態では、ｎは、２超かつ２０未満である。
本明細書は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
生物学的実体と試験実体との間の相互作用を決定するための方法であって、
ａ）少なくとも４つの生物学的実体のそれぞれを少なくとも１つの試験実体と接触させるステップと；
ｂ）前記少なくとも４つの生物学的実体のそれぞれに、表面選択的光学技法を使用して１つまたは複数の励起光線を照射するステップと；
ｃ）コンホメーション変化が、前記少なくとも１つの試験実体との接触によって前記少なくとも４つの生物学的実体のそれぞれにおいて誘導されたか否かを決定するステップと；
を含み、コンホメーション変化の決定は、１時間当たり少なくとも１０の試験される試験実体の平均速度で実施される、方法。
（項目２）
コンホメーション変化の前記決定が、１時間当たり少なくとも１００の試験される試験実体の平均速度で実施される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記少なくとも４つの生物学的実体が同じである、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記少なくとも４つの生物学的実体が異なる、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記生物学的実体が、細胞、タンパク質、ペプチド、受容体、酵素、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、小分子、および炭水化物、またはこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記生物学的実体が、薬物標的またはこれらの一部分である、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記少なくとも４つの生物学的実体のそれぞれが、担体上の異なる別々の領域内に位置している、項目１に記載の方法。
（項目８）
各別々の領域が、担体表面上に最大で約１００ｍｍ２のエリアを含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
各別々の領域が、支持脂質二重層を含む、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記生物学的実体が、前記支持脂質二重層に繋ぎ止められており、またはその中に包埋されている、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記少なくとも１つの試験実体が、細胞、タンパク質、ペプチド、受容体、酵素、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、小分子、および炭水化物、またはこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記試験実体が、薬物候補またはこれらの一部分である、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記接触ステップが、溶液中で行われ、そして前記少なくとも１つの試験実体を分注するのに予めプログラムされた流体分注ユニットを利用することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記接触ステップが、前記少なくとも４つの生物学的実体のそれぞれを異なる試験実体と接触させることを含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記接触ステップが、前記少なくとも４つの生物学的実体のそれぞれを少なくとも１００の異なる試験実体と順次接触させることを含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記接触ステップが、前記少なくとも４つの生物学的実体のそれぞれを少なくとも１０，０００の異なる試験実体と順次接触させることを含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記１つまたは複数の励起光線が、１つまたは複数のレーザーによってもたらされる、項目１に記載の方法。
（項目１８）
表面選択的光検出技法が、平面担体表面からの少なくとも１つの励起光線の全反射の使用を含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記決定ステップが、非線形光信号を分析することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記非線形光信号が、２次高調波光、光、および差周波光からなる群より選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記１つまたは複数の励起光線の１つまたは複数の外部源の位置に対して前記担体を移動させるステップをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目２２）
各別々の領域が、ともに前記担体の底面と一体化されている入口プリズムおよび異なる出口プリズムと光学的にカップリングされている、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記照射ステップが、前記別々の領域のそれぞれに隣接するが、直下ではなく位置付けされた入口プリズムに入射励起光を向けることを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記別々の領域のそれぞれに隣接するが、直下ではなく位置付けされた出口プリズムを使用して、照射の際に前記別々の領域のそれぞれで発生された非線形光信号を収集するステップと、前記非線形光信号を検出器に向けるステップとをさらに含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記接触ステップ後に複数回前記照射ステップおよび前記決定ステップを繰り返し、それによって時間の関数として前記少なくとも４つの生物学的実体のそれぞれのコンホメーション変化を決定するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２６）
ａ）担体を備えるデバイスであって、前記担体は、
ｉ）前記担体の表面に形成されたＭ×Ｎアレイの別々の領域であって、Ｍは、別々の領域の行の数であり、Ｎは、前記アレイ中の別々の領域の列の数であり、各別々の領域は、生物学的実体を含有するために構成されている、Ｍ×Ｎアレイの別々の領域、および
ｉｉ）前記担体と一体化され、前記別々の領域に光学的にカップリングされたＲ×Ｓアレイのプリズムであって、Ｒは、プリズムの行の数であり、Ｓは、前記アレイ中のプリズムの列の数である、Ｒ×Ｓアレイのプリズム；
を含み、Ｒ＝Ｍ＋２およびＳ＝Ｎ、またはＲ＝ＭおよびＳ＝Ｎ＋２である、デバイス。
（項目２７）
前記別々の領域のそれぞれが、少なくとも１つの入力プリズムおよび少なくとも１つの出力プリズムと光学的にカップリングされており、前記入力プリズムおよび前記出力プリズムは、空間的に別々である、項目２６に記載のデバイス。
（項目２８）
Ｍ＝８およびＮ＝１２である、項目２６に記載のデバイス。
（項目２９）
Ｍ＝１６およびＮ＝２４である、項目２６に記載のデバイス。
（項目３０）
Ｍ＝３２およびＮ＝４８である、項目２６に記載のデバイス。
（項目３１）
Ｍが、４超であり、Ｎが４超である、項目２６に記載のデバイス。
（項目３２）
各別々の領域が、支持脂質二重層を含み、または支持脂質二重層の形成を助長するように構成されている、項目２６に記載のデバイス。
（項目３３）
別個のウェル中に各別々の領域を隔離するために、前記担体の上面に結合されたウェル形成コンポーネントをさらに備える、項目２６に記載のデバイス。
（項目３４）
前記別々の領域のそれぞれが、最大で約１００ｍｍ２のエリアを含む、項目２６に記載のデバイス。
（項目３５）
各別々の領域またはウェルが、前記担体と一体化された前記プリズムのアレイのうちの単一のプリズムの直上に設置されている、項目２６または３３に記載のデバイス。
（項目３６）
前記担体が、ガラス、石英ガラス、またはプラスチックで構成されている、項目２６に記載のデバイス。
（項目３７）
プラスチックからプリズムアレイ部品を製作するための射出成形方法であって、離型ステップ中に前記プリズムアレイ部品に均一な圧力を適用するために２つまたはそれ超の型排出デバイスを使用するステップを含む、方法。
（項目３８）
前記プラスチックが、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、およびアクリルからなる群より選択される、項目３７に記載の射出成形方法。
（項目３９）
前記２つまたはそれ超の型排出デバイスが、前記部品の光学性能が重要ではない領域内にかぎり前記プリズムアレイ部品に衝撃を与える、項目３７に記載の射出成形方法。
（項目４０）
前記２つまたはそれ超の型排出デバイスが、ｍ×ｎブレード様イジェクター特徴のアレイを備える、項目３７に記載の射出成形方法。
（項目４１）
ｍが、２超かつ２０未満である、項目４０に記載の射出成形方法。
（項目４２）
ｎが、２超かつ２０未満である、項目４０に記載の射出成形方法。
【００２０】
参照による組込み
本明細書に述べられているすべての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれるように具体的かつ個々に示されているのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれている。
【００２１】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において特に示されている。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用されている例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られることになる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１Ａは、蛍光についてのエネルギー準位図（吸収プロセス）の略図を提供する。  図１Ｂは、２次高調波発生についてのエネルギー準位図（２光子散乱プロセス）の略図を提供する。
【００２３】
【図２】図２は、リガンドの結合によって誘導されるタンパク質（非線形活性タグで標識された）のコンホメーション変化、ならびにタンパク質が付着されている光学的界面に対する非線形活性標識の距離および／または配向に対するその影響の略図を提供する。
【００２４】
【図３】図３Ａ〜Ｄは、２次高調波光発生を使用するアルファ−シヌクレインのスペルミンまたはスペルミジン誘導コンホメーション変化の検出を実証するデータを示す。図３Ａは、アルファ−シヌクレインの５ｍＭスペルミンへの曝露時のリアルタイムでのＳＨＧ応答を示す。矢印は、スペルミン添加を表す。ＳＨＧ強度の変化は、注入の直前の値に対して正規化されている。図３Ｂは、ＳＨＧ（ＳＨＧ濃度の変化は、パーセントシフトとして定量化されている）によって測定した場合のアルファ−シヌクレインのスペルミン誘導コンホメーション変化についての用量応答曲線（対数尺度でプロットされた）を示す。図３Ｃは、アルファ−シヌクレインの３ｍＭスペルミジンへの曝露時のリアルタイムでのＳＨＧ応答を示す。矢印は、スペルミジン添加を表す。ＳＨＧ強度の変化は、注入の直前の値に対して正規化されている。図３Ｄは、ＳＨＧ（ＳＨＧ濃度の変化は、パーセントシフトとして定量化されている）によって測定した場合のアルファ−シヌクレインのスペルミジン誘導コンホメーション変化についての用量応答曲線（対数尺度でプロットされた）を示す。エラーバー＝ＳＥＭ。Ｎ＝３。
【００２５】
【図４】図４は、非線形光検出に基づいて生物学的分子または他の生物学的実体のコンホメーション変化を決定するためのハイスループット分析システムのシステムアーキテクチャの一例を例示する。
【００２６】
【図５】図５は、非線形光検出を使用して生物学的分子のコンホメーション変化を分析するのに使用される光学セットアップの一例の概略図を示す。
【００２７】
【図６】図６は、非線形光検出を使用して生物学的分子のコンホメーション変化を分析するのに使用される光学セットアップの写真を示す。
【００２８】
【図７】図７は、励起光が担体の上面で全反射を起こすように適切な入射角で励起光を向けるためのプリズムの使用を表す略図を示す。プリズムの右の２本の点線は、反射励起光、および非線形活性種が表面に繋ぎ止められているとき担体表面で発生される非線形光信号の光路を示す。担体は、測定間で再位置付けするためのＸ−Ｙ並進ステージのアクチュエーターに任意選択で接続されている。プリズムの上面と担体の下部表面との間の曲線は、プリズムと担体との間の高い光カップリング効率を保証するのに使用される屈折率整合流体（ｉｎｄｅｘ−ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｆｌｕｉｄ）の薄層（正確な拡大縮小比ではない）の存在を示す。
【００２９】
【図８】図８Ａ〜Ｃは、プリズム（この例において光学機器に取り付けられている）と担体（この例においてマイクロウェルプレートの透明底として構成されている）との間の高い光カップリング効率をもたらすために屈折率整合流体の連続的に再循環する流れを使用するシステムの一例示的設計概念の異なる図を示す。担体（マイクロウェルプレート）は、プリズムに対して自由に並進し、一方、示された流体チャネルによってもたらされる屈折率整合流体の連続流が励起光の担体との良好な光カップリングを保証する。図８Ａ：上面正面不等角投影図。図８Ｂ：上面背面不等角投影図。図８Ｃ：底面正面不等角投影図。
【００３０】
【図９】図９は、プリズムと担体の上部表面との間の高い光カップリング効率を保証するための透明担体（この例においてマイクロウェルプレートフォーマットで構成されている）の下部表面に付着され、または隣接した屈折率整合エラストマー材料の層の使用を表す略図である。この手法の一部の実施形態では、プリズムの上部表面は、マイクロウェルプレートおよびプリズムを接触させるとき圧縮力を集中させ、それによってプリズムとエラストマー材料との間のエアギャップの形成を低減または排除するためにわずかにドーム状にされている。
【００３１】
【図１０−１】図１０Ａ〜Ｂは、励起光の担体の上面への良好な光カップリングをもたらすためにプリズムアレイが一体化されたマイクロウェルプレートを例示する。この手法では、図４、５、７、および９の略図に示されたプリズムは、担体の下側に取り付けられたプリズムアレイによって置き換えられている。図１０Ａ：上面不等角投影図。図１０Ｂ：底面不等角投影図。
【００３２】
【図１０−２】図１０Ｃ〜Ｄは、図１０Ａ〜Ｂに示したマイクロウェルプレートデバイスの分解図を示す。図１０Ｃ：上面不等角投影図。図１０Ｄ：底面不等角投影図。
【００３３】
【図１１】図１１は、図１０Ａ〜Ｂに例示した設計概念を使用して全反射を介して励起光を担体表面にカップリングするための入射光および出射光の経路を例示する。
【００３４】
【図１２】図１２は、図１０Ａ〜Ｂに例示したプリズムアレイ設計概念のプロトタイプの写真を示す。
【００３５】
【図１３】図１３Ａ〜Ｃは、本開示によるプリズムアレイ設計の一例を示す。図１３Ａ：上面図。図１３Ｂ：正面図。図１３Ｃ：右側面図。
【００３６】
【図１４】図１４は、第１の型設計および第１の射出成形プロセスを使用して製作されたプリズムアレイの交差偏光子画像を示す。観察される高レベルの応力誘起複屈折に留意されたい。
【００３７】
【図１５】図１５は、図１３Ａ〜Ｃおよび図１４に例示したプリズムアレイ設計を組み込んでいるマイクロウェルプレートデバイスの異なる位置で測定したＳＨＧ信号強度のデータを示す。ＳＨＧ信号強度を、ウェルの列番号の関数として異なる行（異なるトレース）について測定した。
【００３８】
【図１６】図１６Ａ〜Ｃは、本開示による改善されたプリズムアレイ設計の一例を示す。図１６Ａ：上面図。図１６Ｂ：正面図。図１６Ｃ：右側面図。
【００３９】
【図１７】図１７は、改善された型設計および最適化された射出成形プロセスを使用して製作されたプリズムアレイの交差偏光子画像を示す。観察される応力誘起複屈折のレベルは、図１４に示したものと比較して著しく低減されていることに留意されたい。
【００４０】
【図１８】図１８は、図１６Ａ〜Ｃおよび図１７に例示したプリズムアレイ設計を組み込んでいるマイクロウェルプレートデバイスの異なる位置で測定したＳＨＧ信号強度のデータを示す。ＳＨＧ信号強度を、ウェルの列番号の関数として異なる行（異なるトレース）について測定した。ＳＨＧ信号強度のレベルは、図１５に示したものと比較してマイクロウェルプレートにわたってより高く、より均一であることに留意されたい。
【００４１】
【図１９】図１９は、図１６Ａ〜Ｃに例示したプリズムアレイ部品を製作するのに使用した型ツールの破断図バージョンを示す。
【００４２】
【図２０】図２０は、型からの放出中にプリズムアレイ部品に均一な圧力をもたらすために型ツールにおいて使用されるブレード様排出特徴のアレイを例示する。
【００４３】
【図２１】図２１は、本明細書に開示のシステムの動作を制御するように構成することができるコンピューターシステムを例示する。
【００４４】
【図２２】図２２は、本発明の例示的な実施形態に関連して使用することができるコンピューターシステムの第１の例示的なアーキテクチャを例示するブロック図である。
【００４５】
【図２３】図２３は、複数のコンピューターシステム、複数の携帯電話および携帯情報端末、ならびにネットワーク接続型記憶装置（ＮＡＳ）を有するネットワークの一実施形態を示すダイヤグラムである。
【００４６】
【図２４】図２４は、一例示的実施形態による共有仮想アドレスメモリー空間を使用するマルチプロセッサコンピューターシステムのブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本明細書に開示のシステムおよび方法は、生物学的実体のコンホメーションのハイスループット分析に関する。さらに、記載したシステムおよび方法は、配向またはコンホメーション変化のハイスループット分析に同等に適している。本開示の一部の態様では、生物学的実体を１つまたは複数の試験実体と接触させることに応答した生物学的実体の配向、コンホメーション、または配向もしくはコンホメーションの変化を決定するためのシステムおよび方法が記載されている。本明細書で使用される場合、配向、コンホメーション、またはこれらの変化を決定することは、非線形活性標識またはタグの平均配向に関連している、かつ／または比例する非線形光信号の測定を伴い得る。本明細書で使用される場合、「ハイスループット」は、１つもしくは複数の試験実体と任意選択で接触された大多数の生物学的実体のコンホメーションの迅速分析を実施する能力、または大多数の試験実体と任意選択で接触された１つもしくは複数の生物学的実体のコンホメーションの迅速分析を実施する能力、あるいはこれらの２つのモダリティーの任意の組み合わせを指す。一般に、開示されるシステムおよび方法は、例えば、米国特許第６，９５３，６９４号および米国特許出願第１３／８３８，４９１号で以前に記載されたように、配向、コンホメーション、またはコンホメーション変化を検出するための２次高調波発生（ＳＨＧ）または関連した非線形光学技法の使用を利用する。
【００４８】
２次高調波発生を使用するコンホメーションの検出
２次高調波発生は、より広く使用されている蛍光ベース技法と対照的に、同じ励起波長または周波数の２個の光子が非線形材料と相互作用し、２倍のエネルギー、すなわち、励起光子の２倍の周波数および半分の波長を有する単一光子として再放出される非線形光学プロセスである（図１）。２次高調波発生は、反転対称性を欠く非線形材料において（すなわち、非中心対称材料において）のみ起こり、高強度励起光源を必要とする。これは、和周波発生の特別な場合であり、差周波発生などの他の非線形光学現象と関連している。
【００４９】
２次高調波発生および他の非線形光学技法は、非線形活性種の配向に対するこれらの依存性のために表面選択的検出技法として構成され得る。例えば、表面に非線形活性種を繋ぎ止めると、分子が溶液中で回転拡散を自由に起こすとき存在しない全体的な配向度を植え付けることができる。界面での非線形活性種の配向依存性をモデル化するのに一般に使用される式は、
χ（２）＝Ｎｓ＜α（２）＞
であり、式中、χ（２）は、非線形磁化率であり、Ｎｓは、界面での単位面積当たりの非線形活性分子の総数であり、＜α（２）＞は、これらの分子の非線形超分極率（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｂｉｌｉｔｙ）（α（２））の平均配向である。ＳＨＧの強度は、非線形磁化率の２乗に比例し、したがって界面での配向した非線形活性種の数およびこれらの平均配向の変化の両方に依存する。
【００５０】
２次高調波発生および他の非線形光学技法は、非線形活性種が固定化された光学的界面への励起光の送達のモードとして全反射を使用することによってさらに表面選択的にすることができる。入射励起光の全反射は、界面で「エバネッセント波」を生じ、それは、表面にごく接近している、すなわち、典型的には数十ナノメートルの程度であるエバネッセント波の空間減衰距離内にある非線形活性標識のみを選択的に励起するのに使用することができる。全反射は、表面選択的様式で蛍光を励起するのに、例えば、光学的界面に付着された蛍光ドナーを励起するのに使用することもでき、次いでそれは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）機構を介して適当なアクセプター分子にエネルギーを移動させる。本開示では、励起光の全反射によって発生されるエバネッセント波は、非線形活性標識または分子を励起するのに優先的に使用される。非線形活性種を励起する効率は、これらの平均配向、および界面へのこれらの近接の両方に強く依存することになる。
【００５１】
ＳＨＧおよび他の非線形光学技法のこの表面選択的性質は、界面に固定化された生物学的分子のコンホメーション変化を検出するのに活用することができる。例えば、リガンドの結合に起因する受容体分子のコンホメーション変化は、非線形活性標識または部分を使用して検出することができ、ここで標識は、コンホメーション変化が、界面に対する標識の配向または距離の変化（図２）、およびしたがって非線形光信号の物理的性質の変化をもたらすように受容体に付着され、または会合している。最近まで、表面選択的非線形光学技法の使用は、物理および化学の適用に主に制限されていた。なぜなら、相対的に少数の生体試料が、本質的に非線形的に活性であるためである。最近、２次高調波活性標識（「ＳＨＧ標識」）の使用が導入され、実質的に任意の分子または粒子を高度に非線形活性にすることが可能になった。これの第１の例は、タンパク質シトクロムｃをオキサゾール色素で標識し、２次高調波発生を用いて空気−水界面でタンパク質コンジュゲートを検出することによって実証された［Ｓａｌａｆｓｋｙ，  Ｊ．、「’ＳＨＧ−ｌａｂｅｌｓ’
ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」、Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．、３４２巻（５〜６号）：４８５〜４９１頁（２００１年）］。アルファ−シヌクレインのスペルミンまたはスペルミジン誘導コンホメーション変化の検出を実証するＳＨＧデータの例を図３に示す。
【００５２】
表面選択的非線形光学技法はまた、コヒーレントな技法であり、基本光線および非線形光学光線が、十分に規定された空間的関係および位相関係を伴って空間を伝播する波面を有することを意味する。生物学的分子または他の生物学的実体のコンホメーションを分析するための表面選択的非線形光検出技法の使用は、ｉ）非線形活性種の配向および／または双極子モーメント（複数可）に対する非線形信号の感度のよい、かつ直接の依存性、それによってコンホメーション変化に対して感度を付与すること；（ｉｉ）非線形光信号は、非中心対称系を生じる表面のみで発生されるので蛍光ベース検出より高い信号対雑音（より低いバックグラウンド）である、すなわち、技法が本質的に非常に狭い「被写界深度」を有すること；（ｉｉｉ）狭い「被写界深度」の結果として、技法は、測定がオーバーレイ溶液（ｏｖｅｒｌａｙｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）の存在下で実施されなければならないとき、例えば、結合プロセスが分離またはすすぎステップによって除去または妨害され得る場合に有用であることを含めて、他の光学的手法に対していくつかの固有の利点を有する。本技法のこの側面は、バルク種の存在を必要とする平衡結合測定、または測定が規定される時間にわたって行われる動力学測定を実施するのに特に有用であり得；（ｉｖ）２光子吸収断面は、典型的には、所与の分子について１光子吸収断面よりはるかに低く、ＳＨＧ（および和周波発生または差周波発生）は、吸収ではなく、散乱を伴うという事実に起因して、本技法は、蛍光で起こるものより少ない光退色および加熱効果を呈し；（ｖ）基本光学ビームおよび非線形光学ビーム（例えば、２次高調波光）は、界面に対して十分に規定された入る方向および出る方向を有するので、最小限の収集光学系が要求され、より高い信号対雑音が予期される。これは、蛍光ベース検出と比較して特に有利である。なぜなら、蛍光放出が等方性であり、焦点が外れた平面蛍光性種から生じる、検出される信号に対する大きい蛍光バックグラウンドコンポーネントも存在し得るためである。
【００５３】
ハイスループットシステムおよび方法
２次高調波発生または関連した非線形光検出技法の使用に基づいて生物学的実体のコンホメーションのハイスループット分析を実装するためのシステムおよび方法が本明細書に開示されている。本明細書で使用される場合、「ハイスループット」は、ＮＭＲまたはＸ線結晶学などの従来の技法を使用して実施される構造測定と比較して使用される相対的用語である。以下でより詳細に記載されることになるように、本明細書に開示のＳＨＧベースの方法およびシステムは、これらの従来の技法より少なくとも１桁速い速度で構造的決定を実施することができる。
【００５４】
一態様では、本開示は、１つまたは複数の生物学的実体のコンホメーションまたはコンホメーション変化をハイスループット検出するための方法であって、（ｉ）１つまたは複数の標的生物学的実体、例えば、タンパク質分子を非線形活性標識またはタグで標識することと、（ｉｉ）平面担体表面の１つまたは複数の別々の領域で１つまたは複数の標識された標的生物学的実体を固定化することであって、担体表面は、光学的界面をさらに含むことと、（ｉｉｉ）外部光源に対して担体の位置を変更することによって各別々の領域を励起光に逐次曝露することと、（ｉｖ）各別々の領域が励起光に曝露される際に各別々の領域から放出される非線形光信号を収集することと、（ｖ）前記非線形光信号を処理して、１つまたは複数の生物学的実体のそれぞれの配向、コンホメーション、またはコンホメーション変化を決定することと、を含む方法を提供する。別の態様では、方法は、（ｖｉ）励起光への第１の曝露の後に１つまたは複数の生物学的実体のそれぞれを１つまたは複数の試験実体と接触させることと、（ｖｉｉ）各別々の領域を励起光に１回または複数回引き続いて再曝露することと、（ｖｉｉｉ）各別々の領域が励起光に曝露される際に各別々の領域からの非線形光信号を収集することと、（ｉｘ）前記非線形光信号を処理して、配向またはコンホメーションの変化が、前記１つまたは複数の試験実体と接触させる結果として１つまたは複数の生物学的実体において起こったか否かを決定することとをさらに含む。本方法の一態様では、非線形光信号は、１つまたは複数の生物学的実体を１つまたは複数の試験実体と接触させた後、１回だけ検出され（すなわち、エンドポイントアッセイモード）、次いでコンホメーション変化が起こったか否かを決定するのに使用される。別の態様では、非線形光信号は、１つまたは複数の生物学的実体を１つまたは複数の試験実体と接触させた後、繰り返して、かつ規定された時間間隔で収集され（すなわち、動力学モード）、次いで１つまたは複数の生物学的実体のコンホメーション変化の動力学を決定するのに使用される。本方法の好適な態様では、担体の各別々の領域は、支持脂質二重層構造を含み、生物学的実体は、脂質二重層に繋ぎ止め、またはその中に包埋することによって各別々の領域内に固定化されている。本方法の別の好適な態様では、励起光は、全反射によって担体表面、すなわち光学的界面に送達され、担体表面の別々の領域から放出される非線形光信号は、反射励起光と同じ光軸に沿って収集される。
【００５５】
非線形光検出を使用してコンホメーションまたはコンホメーション変化のハイスループット分析を実装するために、本明細書に記載のシステムは、（ｉ）少なくとも１つの励起光線を光学的界面に送達するための少なくとも１つの適当な励起光源および光学系、（ｉｉ）光学的界面を含む互換性の担体であって、１つまたは複数の生物学的実体が、担体の別々の領域に繋ぎ止められ、または固定化された、担体、（ｉｉｉ）少なくとも１つの励起光源に対して担体を位置付けするための高精度並進ステージ、および（ｉｖ）担体の別々の領域のそれぞれに励起光を照射する結果として発生される非線形光信号を収集し、前記非線形信号を検出器に送達するための光学系、および（ｖ）検出器から受信される非線形光信号データを分析し、担体に固定化された１つまたは複数の生物学的実体のコンホメーションまたはコンホメーション変化を決定するためのプロセッサーを含めた、いくつかのコンポーネントを必要とする（図４に概略的に例示した）。一部の態様では、本明細書に開示のシステムおよび方法は、（ｖｉ）担体の別々の領域のそれぞれに試験実体を送達するためのプログラム可能な流体分注システムの使用、および（ｖｉｉ）光学系とのインターフェースで担体の自動位置付けおよび置き換えを行うためのプレートハンドリングロボティクスの使用をさらに含む。
【００５６】
本明細書に開示の方法およびシステムは、複数の試験実体と接触された単一の生物学的実体の分析、もしくは単一の試験実体と接触された複数の生物学的実体の分析、またはこれらの任意の組み合わせのために構成することができる。１つまたは複数の生物学的実体を複数の試験実体と接触させるとき、接触ステップは、逐次、すなわち、固定化された生物学的実体を単一の試験実体に指定された時間にわたって曝露し、その後、試験実体溶液を除去するための任意選択のすすぎステップを続け、次の試験実体に導入する前に固定化された生物学的実体を再生することによって実施してもよく、または並行して、すなわち、同じ固定化された生物学的実体を含む複数の別々の領域を有し、複数の別々の領域のそれぞれの中の生物学的実体を異なる試験実体に曝露することによって実施してもよい。本明細書に開示の方法およびシステムは、少なくとも１つの生物学的実体、少なくとも２つの生物学的実体、少なくとも４つの生物学的実体、少なくとも６つの生物学的実体、少なくとも８つの生物学的実体、少なくとも１０の生物学的実体、少なくとも１５の生物学的実体、または少なくとも２０の生物学的実体のコンホメーション変化の分析を実施するように構成することができる。一部の態様では、本明細書に開示の方法およびシステムは、せいぜい２０の生物学的実体、せいぜい１５の生物学的実体、せいぜい１０の生物学的実体、せいぜい８つの生物学的実体、せいぜい６つの生物学的実体、せいぜい４つの生物学的実体、せいぜい２つの生物学的実体、またはせいぜい１つの生物学的実体のコンホメーション変化の分析を実施するように構成することができる。同様に、本明細書に開示の方法およびシステムは、１つまたは複数の生物学的実体を少なくとも１つの試験実体、少なくとも５つの試験実体、少なくとも１０の試験実体、少なくとも５０の試験実体、少なくとも１００の試験実体、少なくとも５００の試験実体、少なくとも１，０００の試験実体、少なくとも５，０００の試験実体、少なくとも１０，０００の試験実体、または少なくとも１００，０００の試験実体に曝露したときのコンホメーション変化の分析を実施するように構成することができる。一部の態様では、本明細書に開示の方法およびシステムは、１つまたは複数の生物学的試験実体をせいぜい１００，０００の試験実体、せいぜい１０，０００の試験実体、せいぜい５，０００の試験実体、せいぜい１，０００の試験実体、せいぜい５００の試験実体、せいぜい１００の試験実体、せいぜい５０の試験実体、せいぜい１０の試験実体、せいぜい５つの試験実体、またはせいぜい１つの試験実体に曝露したときのコンホメーション変化の分析を実施するように構成することができる。
【００５７】
生物学的実体および試験実体
本明細書で使用される場合、語句「生物学的実体」は、それだけに限らないが、細胞、タンパク質、ペプチド、受容体、酵素、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、生物学的分子、オリゴヌクレオチド、溶媒、小分子、合成分子、炭水化物、またはこれらの任意の組み合わせを含む。同様に、語句「試験実体」も、それだけに限らないが、細胞、タンパク質、ペプチド、受容体、酵素、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、生物学的分子、オリゴヌクレオチド、溶媒、小分子、合成分子、炭水化物、またはこれらの任意の組み合わせを含む。一部の態様では、生物学的実体は、薬物標的またはこれらの一部分を含み得、一方、試験実体は、薬物候補、またはこれらの一部分を含み得る。
【００５８】
非線形活性標識および標識技法
上述したように、ほとんどの生物学的分子は、本質的に非線形活性でない。例外としては、コラーゲン、ほとんどの構造組織または荷重負荷組織中に見つかる構造タンパク質がある。ＳＨＧ顕微鏡検査は、コラーゲン含有構造、例えば、角膜の研究において広範に使用されている。他の生物学的分子または実体は、タグまたは標識などの非線形活性部分を導入することによって非線形活性にされなければならない。本発明で使用するための標識は、得られるシステムをより非線形光学的に活性にするために分子、粒子、または相（例えば、脂質二重層）に共有結合的または非共有結合的に結合することができる非線形活性部分、タグ、分子、または粒子を指す。標識は、分子、粒子、もしくは相（例えば、脂質二重層）が、システムを非線形活性にするのに非線形活性でない場合において、または追加の特徴付けパラメーターをシステムに加えるために既に非線形活性であるシステムとともに使用することができる。外因性標識を、分子、粒子、または他の生物学的実体に予め付着させることができ、任意の非結合または未反応の標識を、本明細書に記載の方法で使用する前に、標識された実体から分離することができる。本明細書に開示の方法の具体的な態様では、非線形活性部分は、担体表面の別々の領域内の標的分子または生物学的実体を固定化する前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで標的分子または生物学的実体に付着される。生物学的分子または他の生物学的実体を非線形活性標識で標識すると、相互作用が表面選択的非線形光学技法を使用して生物学的分子または実体の配向またはコンホメーションの変化をもたらす場合において、標識された生物学的分子または実体と別の分子または実体（すなわち、試験実体）との間の相互作用を検出する直接の光学的手段が可能になる。
【００５９】
本明細書に記載の方法およびシステムの代替の態様では、少なくとも２種の区別可能な非線形活性標識が使用される。次いで、付着された２種またはそれ超の区別可能な標識の配向が、発散しているコヒーレントな非線形光線の十分に規定された方向を助長するために選択される。２種またはそれ超の区別可能な標識をアッセイで使用することができ、この場合、光学的界面に対して１つまたは複数の偏光方向で入射する１つまたは複数の周波数の複数の基本光線が使用され、少なくとも２つの非線形光線の発散が生じる。
【００６０】
非線形活性のタグまたは標識の例としては、それだけに限らないが、表１に列挙した化合物、およびこれらの誘導体がある。
【表１】
2020079793.tif 000002
【００６１】
種が非線形活性であり得るか否かの評価において、以下の特性が、非線形活性についての潜在性を示すことができる：双極子モーメントの大きい差異（分子の基底状態と励起状態との間の双極子モーメントの差異）、蛍光の大きいストークスシフト、または芳香族もしくは共役結合特性。このような種のさらなる評価において、実験者は、例えば、非線形活性種が分布している空気−水界面からのＳＨＧの検出によって、非線形活性を確認するための当業者に公知の単純な技法を使用することができる。適当な非線形活性種が手近に実験のために選択された後、本明細書に開示の表面選択的非線形光学的方法およびシステムで使用するために、生物学的分子または実体に必要に応じて種をコンジュゲートさせることができる。
【００６２】
以下の参考文献およびその中の参考文献には、合成色素および多くの他の分子から標識された生物学的実体を作出するのに利用可能な技法が記載されている：Ｇｒｅｇ  Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９６年。
【００６３】
開示した方法およびシステムの具体的な態様では、金属ナノ粒子およびこれらのアセンブリーを改変して、生物学的な非線形活性標識を作出する。以下の参考文献には、金属ナノ粒子およびアセンブリーの改変が記載されている：Ｊ．Ｐ．  ＮｏｖａｋおよびＤ．  Ｌ．  Ｆｅｌｄｈｅｉｍ、「Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌｅｎｅ−Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｓｉｌｖｅｒ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｒｒａｙｓ」、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１２２巻：３９７９〜３９８０頁（２０００年）；Ｊ．Ｐ．  Ｎｏｖａｋら、「Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｒｒａｙｓ」、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１２２巻：１２０２９〜１２０３０頁（２０００年）；Ｖａｎｃｅ，  Ｆ．Ｗ．、Ｌｅｍｏｎ，  Ｂ．  Ｉ．、およびＨｕｐｐ，  Ｊ．  Ｔ．、「Ｅｎｏｒｍｏｕｓ  Ｈｙｐｅｒ−Ｒａｙｌｅｉｇｈ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｆｒｏｍ  Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ」、Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂ、１０２巻：１００９１〜９３頁（１９９９年）。
【００６４】
本明細書に開示の方法およびシステムのさらに別の態様では、システムの非線形活性を、分子ビーコンに非線形類似体を導入することによって、すなわち、フルオロフォアおよびクエンチャーの代わりに非線形活性標識（またはそのモジュレーター）を組み込むように修飾された分子ビーコンプローブによって操作することもできる。分子ビーコンのこれらの非線形光学類似体は、分子ビーコン類似体（ＭＢ類似体またはＭＢＡ）と本明細書で呼ばれる。記載した方法およびシステムで使用されるＭＢ類似体は、当業者に公知の手順に従って合成することができる。
【００６５】
検出される生物相互作用のタイプ
本明細書に開示の方法およびシステムは、使用される生物学的実体、試験実体、および非線形活性標識技法の選択に応じて、生物学的実体同士間、または生物学的実体と試験実体との間の様々な相互作用の検出をもたらす。一態様では、本開示は、受容体中で誘導される得られるコンホメーション変化によって示される、結合事象、例えば、リガンドの受容体への結合の定性的検出をもたらす。別の態様では、本開示は、異なる濃度のリガンド分子を使用して反復測定を実施し、観察される最大のコンホメーション変化のパーセント変化を使用して用量−応答曲線を生成することによって、結合事象、例えば、リガンドの受容体への結合の定量分析をもたらす。同様に、本開示の他の態様は、酵素−阻害剤相互作用、抗体−抗原相互作用、生物学的巨大分子の複合体の形成、または受容体のアロステリックモジュレーターとの相互作用を定性的および定量的に測定するための方法を提供することができる。
【００６６】
他の具体的な実施形態では、ＭＢ類似体を、溶液相ハイブリダイゼーションアッセイのような過剰量のプローブからプローブ−標的ハイブリッドを分離する必要なく、かつ標的オリゴヌクレオチドを標識する必要なく、相補的核酸標的の存在を検出することができるハイブリダイゼーションプローブとして本明細書に開示の方法に従って使用することができる。ＭＢ類似体プローブは、生細胞内のＲＮＡの検出、バイオリアクターから抜き取った試料アリコート中の特異的核酸の合成の監視、およびセルフレポーティングオリゴヌクレオチド（ｓｅｌｆ−ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）アレイの構築に使用することもできる。これらは、ＤＮＡ中の単一のヌクレオチド変化を同定するために、および界面検出のための表面に固定化された病原体または細胞を検出するために均質１ウェルアッセイを実施するのに使用することができる。
【００６７】
生物学的実体同士間、または生物学的実体と試験実体との間の相互作用（例えば、結合反応、コンホメーション変化など）は、以下の測定可能な非線形信号パラメーターに本開示の方法によって相関させることができる：（ｉ）非線形光の強度、（ｉｉ）非線形光の波長もしくはスペクトル、（ｉｉｉ）非線形光の偏光、（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）の時間経過、および／またはｖｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）の１つもしくは複数の組み合わせ。
【００６８】
レーザー光源および励起光学系
図５は、２次高調波光が試料界面（または光学的界面）を含む担体の表面からの入射基本励起光を反射することによって発生される、本明細書に開示の方法およびシステムの一態様を例示する。図６は、適当な光学セットアップの一例の写真を示す。レーザーは、試料界面で２次高調波光を発生させるのに必要な基本光をもたらす。典型的にはこれは、ピコ秒またはフェムト秒レーザーであり、波長調整可能であり、または調整可能でなく、かつ市販されている（例えば、Ｔｉ：サファイアフェムト秒レーザーまたはファイバーレーザーシステム）。基本周波数（ｗ）の光がレーザーから出て、その偏光は、例えば、光の周波数および強度に適切な半波長板（ｈａｌｆ−ｗａｖｅ  ｐｌａｔｅ）（例えば、Ｍｅｌｌｅｓ  Ｇｒｉｏｔ、Ｏｒｉｅｌ、またはＮｅｗｐｏｒｔ  Ｃｏｒｐ．から入手可能）を使用して選択される。次いでビームは、基本光を通過させるが、非線形光（例えば、２次高調波光）を遮断するように設計された高調波分離器を通過する。このフィルターは、レージング特性の障害を引き起こし得るレーザーキャビティーへの２次高調波ビームの後方反射を防止するのに使用される。次いで鏡およびレンズの組み合わせが、最終の鏡から反射する前にビームを操向し形作るのに使用され、最終の鏡は、ビームが担体表面で全反射を起こすように、プリズムを介したビームを担体表面の特定の場所および特定の角度θで衝突するように向ける。光路中の鏡の１つを、検流計制御鏡スキャナー、回転多面鏡スキャナー、ブラッグ回折器、音響光学デフレクター（ａｃｏｕｓｔｏ−ｏｐｔｉｃ  ｄｅｆｌｅｃｔｏｒ）、または鏡の位置の制御を可能にする当技術分野で公知の他の手段を使用して、必要とされる場合スキャンすることができる。光学的界面および非線形活性試料表面を含む担体を、ｘ−ｙ並進ステージ（コンピューター制御される）に据えて、２次高調波ビームを発生させるための担体表面の特定の場所を選択することができる。本記載の方法およびシステムの一部の態様では、全反射のための入射の角度をわずかに変え、それによって照射励起光スポットの位置を実質的に変更することなく、担体表面の別々の領域から放出される非線形光信号を最大にするために、１つの鏡をスキャンまたは回転させることが望ましい。一部の態様では、異なる基本周波数を有する２つ（またはそれ超）のレーザーが、非線形活性試料が固定化されている光学的界面で和周波光または差周波光を発生させるのに使用される場合がある。
【００６９】
担体フォーマット、光学的界面、および全反射
上述したように、本開示のシステムおよび方法は、担体の上面に１つまたは複数の生物学的実体を固定化するために平面担体を利用し、担体上面は、非線形光信号を励起するのに使用される光学的界面（または試料界面）をさらに含む。担体は、基本光線および２次高調波光線に対して透明であり、励起光が適切な角度で入射するとき担体／試料界面で全反射を支持するガラス、シリカ、石英ガラス、プラスチック、または任意の他の固体材料であり得る。本発明の一部の態様では、生物学的実体が含有されている別々の領域は、１次元または２次元アレイとして構成されており、疎水性コーティングまたは薄い金属層によって互いに分離されている。他の態様では、別々の領域は、担体表面にインデントを含み得る。さらに他の態様では、別々の領域は、担体がマイクロウェルプレート（またはマイクロプレート）の底を形成し、各個々の別々の領域がマイクロウェルプレート中の１つのウェルの底を形成するようにウェル形成コンポーネントによって互いに分離されている場合がある。本開示の一態様では、ウェル形成コンポーネントは、担体の上面を分離して９６の別個のウェルにする。別の態様では、ウェル形成コンポーネントは、担体の上面を分離して３８４のウェルにする。さらに別の態様では、ウェル形成コンポーネントは、担体の上面を分離して１，５３６のウェルにする。これらの態様のすべてにおいて、担体は、平面アレイで構成されていても、インデントを付けられたアレイで構成されていても、またはマイクロウェルプレートフォーマットで構成されていても、ハイスループットシステムの他の光学コンポーネントおよび機械的コンポーネントとインターフェースする使い捨てまたは消費できるデバイスまたはカートリッジを含み得る。
【００７０】
本明細書に開示の方法およびシステムは、どのように分離が別々の領域同士またはウェル同士間で維持されるかに関係なく、担体表面が分割される別々の領域またはウェルの数を指定することをさらに含む。担体により大きい数の別々の領域またはウェルを有することが、方法またはシステムの試料分析スループットを増大させる観点から有利であり得る。本開示の一態様では、１担体当たりの別々の領域またはウェルの数は、１０から１，６００の間である。他の態様では、別々の領域またはウェルの数は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１，０００、少なくとも１，２５０、少なくとも１，５００、または少なくとも１，６００である。開示した方法およびシステムのさらに他の態様では、別々の領域またはウェルの数は、せいぜい１，６００、せいぜい１，５００、せいぜい１，０００、せいぜい７５０、せいぜい５００、せいぜい４００、せいぜい３００、せいぜい２００、せいぜい１００、せいぜい５０、せいぜい２０、またはせいぜい１０である。好適な態様では、別々の領域またはウェルの数は、９６である。別の好適な態様では、別々の領域またはウェルの数は、３８４である。さらに別の好適な態様では、別々の領域またはウェルの数は、１，５３６である。当業者は、別々の領域またはウェルの数は、これらの値のいずれかによって囲まれた任意の範囲（例えば、約１２〜約１，４００）内に入り得ることを認識するであろう。
【００７１】
本明細書に開示の方法およびシステムは、どのように分離が別々の領域同士またはウェル同士間で維持されるかに関係なく、担体表面が分割される別々の領域またはウェルの表面積を指定することもさらに含む。より大きい面積の別々の領域またはウェルを有すると、一部の場合では、関連した生物学的実体のアクセスの容易さおよび操作を促進し得、一方、より小さい面積の別々の領域またはウェルを有することは、アッセイ試薬体積必要量を低減し、方法またはシステムの試料分析スループットを増大させる観点から有利であり得る。本開示の一態様では、別々の領域またはウェルの表面積は、１ｍｍ２から１００ｍｍ２の間である。他の態様では、別々の領域またはウェルの面積は、少なくとも１ｍｍ２、少なくとも２．５ｍｍ２、少なくとも５ｍｍ２、少なくとも１０ｍｍ２、少なくとも２０ｍｍ２、少なくとも３０ｍｍ２、少なくとも４０ｍｍ２、少なくとも５０ｍｍ２、少なくとも７５ｍｍ２、または少なくとも１００ｍｍ２である。開示した方法およびシステムのさらに他の態様では、別々の領域またはウェルの面積は、せいぜい１００ｍｍ２、せいぜい７５ｍｍ２、せいぜい５０ｍｍ２、せいぜい４０ｍｍ２、せいぜい３０ｍｍ２、せいぜい２０ｍｍ２、せいぜい１０ｍｍ２、せいぜい５ｍｍ２、せいぜい２．５ｍｍ２、またはせいぜい１ｍｍ２である。好適な態様では、別々の領域またはウェルの面積は、約３５ｍｍ２である。別の好適な態様では、別々の領域またはウェルの面積は、約８．６ｍｍ２である。当業者は、別々の領域またはウェルの面積は、これらの値のいずれかによって囲まれた任意の範囲内（例えば、約２ｍｍ２〜約９５ｍｍ２）に入り得ることを認識するであろう。
【００７２】
担体表面の別々の領域は、励起光源に対して担体を再位置付けすることによって励起光に逐次曝露される（照射される）。入射励起光の全反射は、試料界面で「エバネッセント波」を生じ、非線形活性標識を励起し、２次高調波光（または一部の態様では、和周波光もしくは差周波光）を発生させる。エバネッセント波の強度、およびしたがって発生される非線形光信号の強度は、励起光線の入射角に依存するので、励起ビームの光軸に対する担体面の正確な配向およびビームの担体への効率的な光カップリングが、別々の領域のアレイにわたって最適なＳＨＧ信号を達成するのに重要である。本開示の一部の態様では、全反射は、担体表面からの励起光の単一反射によって達成される。他の態様では、担体は、導波路として構成されている場合があり、その結果励起光は、それが導波路に沿って伝搬する際に複数の全反射を起こす。さらに他の態様では、担体は、ゼロモード導波路として構成されている場合があり、エバネセント場は、ナノ加工構造によって生じる。
【００７３】
図５および７に例示したものなどの光学セットアップ中の励起光線と担体との間の効率的な光カップリングは、典型的には、屈折率整合流体、例えば、鉱油、鉱油と水素化テルフェニルとの混合物、ペルフルオロカーボン流体、グリセリン、グリセロール、または１．５付近の屈折率を有する同様の流体などを使用することによって達成され、屈折率整合流体は、プリズムと担体の下部表面との間に吸い取られている。屈折率整合流体の静的無気泡膜は、担体の高速再位置付け中に破壊される可能性が高いので、本明細書に開示のシステムおよび方法は、ハイスループットシステムにおいて励起ビームの担体への効率的な光カップリングを作出するための代替手法を含む。
【００７４】
図８は、屈折率整合流体の連続的に再循環するストリームが、光学系の一部として据えられているプリズムと、マイクロウェルプレートフォーマット（例えば、ガラス底マイクロプレートフォーマット）で構成されており、プリズムに対して自由に並進する担体との間の効率的な光カップリングを維持するのに使用される、本開示のハイスループットシステムの一態様を例示する。この場合、屈折率整合流体の連続流は、プリズムと担体と間の流体の薄膜が、２つのコンポーネントが互いに対して移動する際に決して破壊されず、すなわち、流体の薄層中のあらゆる小さい気泡または切れ目が流体の流れによってプリズムと担体との間のギャップから排除され、または押し出されることを保証する。屈折率整合流体は、図面に示した２つの流体チャネルを介してギャップ内に導入され、適当なリザーバーまたはサンプ中に収集することができ、このリザーバーまたはサンプから、屈折率整合流体が小さいポンプを使用して再循環され得る。同じ概念の代替の実装では、図８に示した担体とプリズムとの間の線接触の代わりに、単一の別々の領域と円筒形全反射（ＴＩＲ）プローブとの間の点接触が利用され、この場合、屈折率整合流体は、中心流体チャネルを通じて流上し、次いで円筒形のＴＩＲプローブの側部にわたって流下して、適当なリザーバーまたはサンプ中に収集される。
【００７５】
図９は、屈折率整合エラストマー材料の薄層が、プリズムと担体との間の効率的な光カップリングを維持するのに屈折率整合流体の代わりに使用される、本開示のハイスループットシステムの別の態様を例示する。この場合、担体は、マイクロウェルプレートフォーマット（例えば、ガラス底マイクロプレートフォーマット）でやはりパッケージ化されているが、担体の下部表面に付着した、または隣接した屈折率整合エラストマー材料の薄層とともにパッケージ化されており、その結果、プリズムの上部表面と接触して配置されるとき、エラストマーは、プリズムと担体との間のギャップを満たし、効率的な光カップリングをもたらす。使用され得るエラストマー材料の例としては、それだけに限らないが、約１．４の屈折率を有するシリコーンがある。本開示の一態様では、エラストマー材料の屈折率は、約１．３５から約１．６の間である。他の態様では、屈折率は、約１．６もしくはそれ未満、約１．５５もしくはそれ未満、約１．５もしくはそれ未満、約１．４５もしくはそれ未満、約１．４もしくはそれ未満、または約１．３５もしくはそれ未満である。さらに他の態様では、屈折率は、少なくとも約１．３５、少なくとも約１．４、少なくとも約１．４５、少なくとも約１．５、少なくとも約１．５５、または少なくとも約１．６である。当業者は、エラストマー層の屈折率は、これらの値のいずれかによって囲まれた任意の範囲内（例えば、約１．４〜約１．６）に入り得ることを認識するであろう。この手法の一態様では、エラストマー材料の層の厚さは、約０．１ｍｍから２ｍｍの間である。他の態様では、エラストマー層の厚さは、少なくとも０．１ｍｍ、少なくとも０．２ｍｍ、少なくとも０．４ｍｍ、少なくとも０．６ｍｍ、少なくとも０．８ｍｍ、少なくとも１．０ｍｍ、少なくとも１．２ｍｍ、少なくとも１．４ｍｍ、少なくとも１．６ｍｍ、少なくとも１．８ｍｍ、または少なくとも２．０ｍｍである。この手法の別の態様では、エラストマー層の厚さは、せいぜい２．０ｍｍ、せいぜい１．８ｍｍ、せいぜい１．６ｍｍ、せいぜい１．４ｍｍ、せいぜい１．２ｍｍ、せいぜい１．０ｍｍ、せいぜい０．８ｍｍ、せいぜい０．６ｍｍ、せいぜい０．４ｍｍ、せいぜい０．２ｍｍ、またはせいぜい０．１ｍｍである。当業者は、エラストマー層の厚さは、これらの値のいずれかによって囲まれた任意の範囲内（例えば、約０．１ｍｍ〜約１．５ｍｍ）に入り得ることを認識するであろう。この手法の別の態様では、プリズムの上部表面は、圧縮力を集中させ、担体、エラストマー層、およびプリズム表面の間のより良好な接触をもたらすために部分的に円筒形の隆線を有し、またはドーム状にされている（図９）。この手法はまた、担体を位置付けするための並進の第３の軸の使用を必要とする場合があり、すなわち、励起ステップと検出ステップとの間で、担体（マイクロウェルプレート）は、分析される次の別々の領域の場所に担体を再位置付けする前に、エラストマー層とプリズムとの間の接触を排除するためにわずかに上昇される。
【００７６】
図１０Ａ〜Ｄは、プリズムまたは格子のアレイが担体の下部表面とともに一体化され（マイクロウェルプレートフォーマットで梱包され）、固定されたプリズムと取り替えるのに使用され、それによって屈折率整合流体またはエラストマー層の必要性を完全に排除する、本開示のハイスループットシステムの好適な態様を例示する。プリズム（または格子）のアレイは、入射励起光が、「入口プリズム」（「入口格子」）によって、入口プリズム（入口格子）に隣接するが、直上にない別々の領域またはウェルに、試料界面から励起光線の全反射を可能にする入射の角度で向けられるように（図１１を参照）、かつ、反射した励起ビーム、および照射された別々の領域で発生された非線形光信号が、調査下で別々の領域からやはりずれており（隣接するが直下にない）「出口プリズム」（「出口格子」）によって収集されるように、担体の上部表面で別々の領域またはウェルのアレイと整列されており、各別々の領域の入口プリズムおよび出口プリズム（入口格子および出口格子）は、アレイの異なる、固有ではないエレメントである。
【００７７】
一般に、Ｍ行×Ｎ列の個々の特徴を含む別々の領域のアレイについて、対応するプリズムまたは格子アレイは、Ｍ＋２行×Ｎ列、またはＮ＋２列×Ｍ行の個々のプリズムまたは格子を有することになる。一部の実施形態では、Ｍは、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０の行の値を有し得る。一部の実施形態では、Ｍは、せいぜい５０、せいぜい４５、せいぜい４０、せいぜい３５、せいぜい３０、せいぜい２５、せいぜい２０、せいぜい１８、せいぜい１６、せいぜい１４、せいぜい１２、せいぜい１０、せいぜい８、せいぜい６、せいぜい４、またはせいぜい２の行の値を有し得る。同様に、一部の実施形態では、Ｎは、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０の列の値を有し得る。一部の実施形態では、Ｎは、せいぜい５０、せいぜい４５、せいぜい４０、せいぜい３５、せいぜい３０、せいぜい２５、せいぜい２０、せいぜい１８、せいぜい１６、せいぜい１４、せいぜい１２、せいぜい１０、せいぜい８、せいぜい６、せいぜい４、またはせいぜい２の列の値を有し得る。当業者に明らかとなるように、ＭおよびＮは、同じ値または異なる値を有することができ、上記に指定した範囲内の任意の値、例えば、Ｍ＝１５およびＮ＝４５を有し得る。
【００７８】
プリズムまたは格子アレイ層の厚さを含めた個々のプリズムまたは格子の幾何学および寸法は、励起光線に対する担体（マイクロウェルプレート）の位置とは独立に高い光カップリング効率で、入射光が担体の選択された別々の領域で全反射を起こし、選択された別々の領域で発生される非線形光信号が収集されるのを保証するように最適化される。図１２は、プリズムアレイプロトタイプの写真を示す。プリズムまたは格子アレイは、当業者に公知の様々な技法によって製作することができ、例えば、好適な態様では、これらは、滑らかに流れる低複屈折材料、例えば、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）もしくは環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、アクリル、ポリエステル、または同様のポリマーなどから射出成形することができる。一部の態様では、プリズムまたは格子アレイは、別個のコンポーネントとして製作され、引き続いて担体の下部表面とともに一体化され得る。他の態様では、プリズムまたは格子アレイは、担体自体の一体型特徴として製作され得る。
【００７９】
固定化化学
本明細書に開示するように、上述したフォーマットのいずれかでの担体は、指定された別々の領域内に生物学的実体を固定化するためにさらに構成される。生物学的分子または細胞の固定化は、当業者に公知の様々な技法、例えば、アミノプロピルシラン化学を使用してガラスまたは石英ガラス表面をアミン官能基で官能化し、その後、目的の生物学的分子と直接に、または中間のスペーサーまたはリンカー分子を介してアミン反応性共役化学を使用して共有結合性カップリングを行うことによって、達成することができる。非特異的吸着も、直接的に、または例えば、ＢＳＡの分子層を表面に最初に付着させ、次いでそれをＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートで活性化することによって、ＢＳＡ−ＮＨＳ（ＢＳＡ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を使用することによって間接的に使用することができる。ＢＳＡの活性化されたリシン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸残基は、タンパク質の表面アミンと反応する。
【００８０】
本開示の好適な態様では、生物学的分子は、「支持脂質二重層」に繋ぎ止め、またはその中に包埋することによって表面に固定化することができ、後者は、疎水性相互作用および静電相互作用によってシリコンまたはガラス表面に閉じ込められた脂質二重層の小さいパッチを含み、二重層は、水性緩衝液の薄層上の担体表面の上に「浮いている」。支持リン脂質二重層も、例えば、Ｓａｌａｆｓｋｙら、「Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎａｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ：Ａ  Ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈ  Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５巻（４７号）：１４７７３〜１４７８１頁（１９９６年）；Ｇｅｎｎｉｓ，  Ｒ．、Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９８９年；Ｋａｌｂら、「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｐｌａｎａｒ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ  ｂｙ  Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｔｏ  Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ
Ａｃｔａ．、１１０３巻：３０７〜３１６頁（１９９２年）；およびＢｒｉａｎら、「Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｐｌａｎａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ」、ＰＮＡＳ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、８１巻（１９号）：６１５９〜６１６３頁（１９８４年）に記載されているように、膜タンパク質または他の膜関連コンポーネントを伴って、またはそれらを伴わずに調製することができる。これらの文献の関連した一部分は、参照により本明細書に組み込まれている。支持リン脂質二重層は、当技術分野で周知であり、これらの製作に利用可能な多数の技法が存在する。支持二重層は、典型的には、空気に曝露されたときにこれらが破壊されるのを防止するために水溶液中に浸漬されるべきである。
【００８１】
収集光学系および検出器
図５は、担体の別々の領域を逐次照射したときに発生される非線形光信号を検出するのに使用される収集光学系および検出器をさらに例示する。表面選択的非線形光学技法は、コヒーレントな技法であり、基本光線および非線形光学光線が、十分に規定された空間的関係および位相関係を伴って空間を伝播する波面を有することを意味するので、最小限の収集光学系が要求される。放出された非線形光信号は、プリズム（または上述したマイクロプレートデバイスの一体化されたプリズムもしくは格子アレイ）によって収集され、ダイクロイックレフレクターおよび鏡を介して検出器に向けられる。追加の光学コンポーネント、例えば、レンズ、光学バンドパスフィルター、鏡などが、検出器に到達する前にビームを形作り、操向、および／またはフィルタリングするのに任意選択で使用される。それだけに限らないが、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、ＣＭＯＳセンサー、またはＣＣＤデバイスを含めた様々な異なる光検出器を使用することができる。
【００８２】
Ｘ−Ｙ並進ステージ
図４に例示したように、本明細書に開示のハイスループットシステムの実装は、理想的には、励起光線に関して担体（上述したフォーマットのいずれかにおける）を再位置付けするための高精度Ｘ−Ｙ（または一部の場合では、Ｘ−Ｙ−Ｚ）並進ステージを利用する。適当な並進ステージは、いくつかの供給業者、例えば、Ｐａｒｋｅｒ  Ｈａｎｎｉｆｉｎから市販されている。精密な並進ステージシステムは、典型的には、それだけに限らないが、リニアアクチュエーター、光学式エンコーダー、サーボモーターおよび／またはステッパーモーター、ならびにモーターコントローラーまたは駆動ユニットを含むいくつかのコンポーネントの組み合わせを備える。ステージ移動の高い精度および再現性は、光検出および／または液体分注の繰り返されるステップを差し入れるとき、非線形光信号の正確な測定を保証するために、本明細書に開示のシステムおよび方法に要求される。また、励起光の焦点のサイズ［直径または側面で２０〜２００ミクロン］は、担体上の別々の領域のサイズより実質的に小さいので、本開示の一部の態様では、反復測定を行うとき所与の別々の領域内のわずかに異なる位置に戻り、または単回測定の過程にわたって別々の領域の一部分にわたって励起ビームをゆっくりスキャンし、それによって長い曝露または先の曝露の光退色効果に関する潜在的な懸念を排除することが望ましい場合もある。
【００８３】
したがって、本明細書に開示の方法およびシステムは、並進ステージが励起光線に関して担体を位置付けすることができる精度を指定することをさらに含む。本開示の一態様では、並進ステージの精度は、約１μｍから約１０μｍの間である。他の態様では、並進ステージの精度は、約１０μｍもしくはそれ未満、約９μｍもしくはそれ未満、約８μｍもしくはそれ未満、約７μｍもしくはそれ未満、約６μｍもしくはそれ未満、約５μｍもしくはそれ未満、約４μｍもしくはそれ未満、約３μｍもしくはそれ未満、約２μｍもしくはそれ未満、または約１μｍもしくはそれ未満である。当業者は、並進ステージの精度は、これらの値のいずれかによって囲まれた任意の範囲内（例えば、約１．５μｍ〜約７．５μｍ）に入り得ることを認識するであろう。
【００８４】
流体分注システム
図４に例示したように、本明細書に開示のハイスループットシステムの一部の実施形態は、担体表面に固定化された生物学的または標的実体を試験実体（または試験化合物）と接触させることにおいて使用するための自動化されたプログラム可能な流体分注（または液体分注）システムをさらに備え、試験実体は、典型的には、小有機溶媒コンポーネント、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の添加を伴うまたは伴わない水性緩衝液を含む溶液で分注される。適当な自動化されたプログラム可能な流体分注システムは、いくつかの供給業者、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｔｅｃａｎ、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  １１、および多くの他社から市販されている。本明細書に開示のシステムおよび方法の好適な態様では、流体分注システムは、液体のプログラム可能な体積（例えば、約１マイクロリットル〜数ミリリットルに及ぶ）を担体の複数のウェルまたは場所に同時送達するための多チャネル分注ヘッド、例えば、４チャネル、８チャネル、１６チャネル、９６チャネル、または３８４チャネル分注ヘッドをさらに備える。
【００８５】
プレート−ハンドリングロボティクス
本明細書に開示のハイスループットシステムの他の態様では、システムは、光励起および検出光学系に関して担体（上述したフォーマットのいずれかにおける）を自動で置き換えおよび位置付けするための、または光学機器と流体分注システムとの間で担体を任意選択で移動させるためのマイクロプレートハンドリング（またはプレートハンドリング）ロボットシステム（図４）をさらに備える。適当な自動化された、プログラム可能なマイクロプレートハンドリングロボットシステムは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｅｍｅｒ、Ｔｅｃａｎ、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  １１、および他社を含めたいくつかの供給業者から市販されている。本明細書に開示のシステムおよび方法の好適な態様では、自動化されたマイクロプレートハンドリングロボットシステムは、固定化された生物学的実体、および／または試験化合物のアリコートを含むマイクロウェルプレートの収集物を冷蔵貯蔵ユニットに、およびそれから移動させるように構成されている。
【００８６】
プロセッサー／コントローラー、および制約ベーススケジューリングアルゴリズム
本開示の別の態様では、開示したハイスループットシステムは、記載した様々なサブシステム（励起光学系および検出光学系、Ｘ−Ｙ（またはＸ−Ｙ−Ｚ）並進ステージ、流体分注システム、ならびにプレートハンドリングロボティクス）を制御し、ハイスループットコンホメーション分析の実施に伴う異なる動作ステップを同期させるシステムソフトウェアを実行するように構成されたプロセッサー（またはコントローラー、もしくはコンピューターシステム）（図４）をさらに備える。データ取得プロセス、すなわち、コンホメーション変化と関連した非線形光信号に対応する検出器からの出力電子信号の収集のハンドリングに加えて、プロセッサーまたはコントローラーはまた、典型的には、データを記憶し、データ処理を実施し、機能（配向またはコンホメーションの変化が、試験された生物学的実体、または生物学的実体および試験実体の組み合わせについて起こったか否かの決定を含む）を表示し、オペレーターによる双方向の制御についてグラフィカルユーザーインターフェースを動作させるように構成されている。プロセッサーまたはコントローラーは、他のプロセッサーとネットワークを形成し、または遠隔地の他の機器およびコンピューターと通信するためにインターネットと接続されている場合もある。
【００８７】
プロセッサー／コントローラーの典型的な入力パラメーターとして、分析されるマイクロウェルプレートの総数などのセットアップパラメーター；１プレート当たりのウェルの数；励起ステップおよび検出ステップが、担体の各別々の領域またはマイクロプレートのウェルについて実施される回数（例えば、エンドポイントアッセイモードまたは動力学的アッセイモードを指定するための）；動力学的データが各別々の領域またはウェルについて収集されるべき総時間経過；各別々の領域またはウェルに送達される試験化合物溶液の順序、タイミング、および体積；非線形光信号の収集および積分のための滞留時間；出力データファイルの名称（複数可）；ならびに当業者に公知のいくつかのシステムセットアップパラメーターおよび制御パラメーターのいずれかを挙げることができる。
【００８８】
本開示の好適な態様では、プロセッサーまたはコントローラーは、制約ベーススケジューリングアルゴリズムを実行することによってシステムスループット最適化を実施するようにさらに構成されている。このアルゴリズムは、上述したシステムセットアップパラメーターを利用して、互いに隣接していてもよく、隣接していなくてもよい別々の領域またはウェルについて差し入れられる励起／検出ステップおよび液体分注ステップの最適なシークエンスを決定し、その結果、システムの全体的なスループットは、１時間あたりに分析される生物学的実体および／または試験実体の数の観点から最大化される。システム動作ステップの最適化は、ハイスループット分析を達成する重要な側面である。開示した方法およびシステムの一部の態様では、分析システムの平均スループットは、１時間当たりに約１０の試験される試験実体〜１時間当たりに約１，０００の試験される試験実体の範囲となり得る。一部の態様では、分析システムの平均スループットは、１時間当たりに少なくとも１０の試験される試験実体、１時間当たりに少なくとも２５の試験される試験実体、１時間当たりに少なくとも５０の試験される試験実体、１時間当たりに少なくとも７５の試験される試験実体、１時間当たりに少なくとも１００の試験される試験実体、１時間当たりに少なくとも２００の試験される試験実体、１時間当たりに少なくとも４００の試験される試験実体、１時間当たりに少なくとも６００の試験される試験実体、１時間当たりに少なくとも８００の試験される試験実体、または１時間当たりに少なくとも１，０００の試験される試験実体であり得る。他の態様では、分析システムの平均スループットは、１時間当たりにせいぜい１，０００の試験される試験実体、１時間当たりにせいぜい８００の試験される試験実体、１時間当たりにせいぜい６００の試験される試験実体、１時間当たりにせいぜい４００の試験される試験実体、１時間当たりにせいぜい２００の試験される試験実体、１時間当たりにせいぜい１００の試験される試験実体、１時間当たりにせいぜい７５の試験される試験実体、１時間当たりにせいぜい５０の試験される試験実体、１時間当たりにせいぜい２５の試験される試験実体、または１時間当たりにせいぜい１０の試験される試験実体であり得る。
【００８９】
コンピューターシステムおよびネットワーク
様々な実施形態では、本発明の方法およびシステムは、コンピューターシステムにインストールされたソフトウェアプログラムおよびその使用をさらに含み得る。したがって、上述したように、データ分析および表示を含めたハイスループットコンホメーション分析の実施に伴う様々なサブシステムのコンピューター化された制御および異なる動作ステップの同期化は、本発明の範囲内である。
【００９０】
図２１に例示したコンピューターシステム５００は、媒体５１１および／または固定された媒体５１２を有するサーバー５０９に任意選択で接続することができるネットワークポート５０５からの命令を読むことができる論理装置として理解され得る。図２１に示したものなどのシステムは、ＣＰＵ５０１、ディスクドライブ５０３、キーボード５１５および／またはマウス５１６などの任意選択の入力デバイス、ならびに任意選択のモニター５０７を備えることができる。データ通信は、ローカルな場所または遠隔地のサーバーに、示された通信媒体によって達成することができる。通信媒体は、データを送信および／または受信する任意の手段を含むことができる。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続、またはインターネット接続であり得る。このような接続は、ワールドワイドウェブによる通信をもたらすことができる。本開示に関連するデータは、図２１に例示した関係者５２２による受信および／または閲覧のためにこのようなネットワークまたは接続によって送信され得ることが想定されている。
【００９１】
図２２は、本発明の例示的な実施形態に関連して使用することができるコンピューターシステム１００の第１の例示的なアーキテクチャを例示するブロック図である。図２２に表したように、例示的なコンピューターシステムは、命令を処理するためのプロセッサー１０２を備えることができる。プロセッサーの非限定的な例としては、Ｉｎｔｅｌ  Ｘｅｏｎ（商標）プロセッサー、ＡＭＤ  Ｏｐｔｅｒｏｎ（商標）プロセッサー、Ｓａｍｓｕｎｇ  ３２−ビットＲＩＳＣ  ＡＲＭ  １１７６ＪＺ（Ｆ）−Ｓ  ｖ１．０（商標）プロセッサー、ＡＲＭ  Ｃｏｒｔｅｘ−Ａ８  Ｓａｍｓｕｎｇ  Ｓ５ＰＣ１００（商標）プロセッサー、ＡＲＭ  Ｃｏｒｔｅｘ−Ａ８  Ａｐｐｌｅ  Ａ４（商標）プロセッサー、Ｍａｒｖｅｌｌ  ＰＸＡ  ９３０（商標）プロセッサー、または機能的に等価なプロセッサーがある。実行の複数のスレッドを並列処理のために使用することができる。一部の実施形態では、複数のプロセッサーまたは複数のコアを有するプロセッサーも、単一のコンピューターシステム内であっても、クラスター内であっても、または複数のコンピューター、携帯電話、および／もしくは携帯情報端末デバイスを含むネットワークによってシステムにわたって分布していても、使用することができる。
【００９２】
図２２に例示したように、高速キャッシュ１０４をプロセッサー１０２に接続し、またはその中に組み込んで、プロセッサー１０２によって最近使用された、または頻繁に使用される命令またはデータのための高速メモリーを提供することができる。プロセッサー１０２は、プロセッサーバス１０８によってノースブリッジ１０６に接続されている。ノースブリッジ１０６は、メモリーバス１１２によってランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）１１０に接続されており、プロセッサー１０２によるＲＡＭ１１０へのアクセスを管理する。ノースブリッジ１０６は、チップセットバス１１６によってサウスブリッジ１１４にも接続されている。サウスブリッジ１１４は、今度は、周辺機器用バス１１８に接続されている。周辺機器用バスは、例えば、ＰＣＩ、ＰＣＩ−Ｘ、ＰＣＩ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、または他の周辺機器用バスであり得る。ノースブリッジおよびサウスブリッジは、プロセッサーチップセットと呼ばれることが多く、プロセッサー、ＲＡＭ、および周辺機器用バス１１８上の周辺コンポーネントの間のデータ転送を管理する。一部の代替のアーキテクチャでは、ノースブリッジの機能性は、別個のノースブリッジチップを使用する代わりにプロセッサー中に組み込むことができる。
【００９３】
一部の実施形態では、システム１００は、周辺機器用バス１１８に取り付けられたアクセラレーターカード１２２を備えることができる。アクセラレーターは、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）またはある特定の処理を加速するための他のハードウェアを含み得る。例えば、アクセラレーターは、適合性データ再構築のために、または拡張されたセット処理で使用される代数式を評価するのに使用することができる。
【００９４】
ソフトウェアおよびデータは、外部記憶装置１２４に記憶されており、プロセッサーによって使用するためにＲＡＭ１１０および／またはキャッシュ１０４にロードすることができる。システム１００は、システムリソースを管理するためのオペレーティングシステムを備え、オペレーティングシステムの非限定的な例としては、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、ＭａｃＯＳ（商標）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ  ＯＳ（商標）、ｉＯＳ（商標）、および他の機能的に等価なオペレーティングシステム、ならびに本発明の例示的な実施形態に従ってデータ記憶および最適化を管理するためにオペレーティングシステム上で実行するアプリケーションソフトウェアがある。
【００９５】
本実施例では、システム１００は、外部記憶装置、例えば、ネットワーク接続型記憶装置（ＮＡＳ）および分散並列処理に使用することができる他のコンピューターシステムなどへのネットワークインターフェースをもたらすために周辺機器用バスに接続されたネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）１２０および１２１も備える。
【００９６】
図２３は、複数のコンピューターシステム２０２ａおよび２０２ｂ、複数の携帯電話および携帯情報端末２０２ｃ、ならびにネットワーク接続型記憶装置（ＮＡＳ）２０４ａ、および２０４ｂを有するネットワーク２００を示すダイヤグラムである。例示的な実施形態では、システム２０２ａ、２０２ｂ、および２０２ｃは、ネットワーク接続型記憶装置（ＮＡＳ）２０４ａおよび２０４ｂに記憶されるデータについて、データ記憶を管理し、データアクセスを最適化することができる。数学的モデルをデータに使用し、コンピューターシステム２０２ａおよび２０２ｂ、ならびに携帯電話および携帯情報端末システム２０２ｃにわたって分散並列処理を使用して評価することができる。コンピューターシステム２０２ａおよび２０２ｂ、ならびに携帯電話および携帯情報端末システム２０２ｃは、ネットワーク接続型記憶装置（ＮＡＳ）２０４ａおよび２０４ｂに記憶されたデータの適合性データ再構築のための並列処理をもたらすこともできる。図２３は、一例のみを例示し、多種多様な他のコンピューターアーキテクチャおよびシステムを本発明の様々な実施形態と併せて使用することができる。例えば、ブレードサーバーが並列処理をもたらすのに使用され得る。プロセッサーブレードを、バックプレーンを通じて接続して並列処理をもたらすことができる。記憶装置も、バックプレーンに、または別個のネットワークインターフェースを通じたネットワーク接続型記憶装置（ＮＡＳ）として接続され得る。
【００９７】
一部の例示的な実施形態では、プロセッサーは、他のプロセッサーによる並列処理のために別個のメモリー空間を維持し、ネットワークインターフェース、バックプレーン、または他のコネクターを通じてデータを転送することができる。他の実施形態では、プロセッサーの一部またはすべてが共有仮想アドレスメモリー空間を使用し得る。
【００９８】
図２４は、一例示的実施形態による共有仮想アドレスメモリー空間を使用するマルチプロセッサコンピューターシステム３００のブロック図である。システムは、共有メモリーサブシステム３０４にアクセスすることができる複数のプロセッサー３０２ａ〜ｆを含む。システムは、メモリーサブシステム３０４内に複数のプログラマブルハードウェアメモリーアルゴリズムプロセッサー（ＭＡＰ）３０６ａ〜ｆを組み込む。各ＭＡＰ３０６ａ〜ｆは、メモリー３０８ａ〜ｆおよび１つまたは複数のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）３１０ａ〜ｆを備え得る。ＭＡＰは、構成可能な機能的ユニットをもたらし、特定のアルゴリズムまたはアルゴリズムの一部分を、それぞれのプロセッサーと緊密に協調して処理するためにＦＰＧＡ３１０ａ〜ｆに提供することができる。例えば、ＭＡＰは、例示的な実施形態においてデータモデルに関する代数式を評価し、適合性データ再構築を実施するのに使用され得る。本実施例では、各ＭＡＰは、これらの目的のためにプロセッサーのすべてによって広域的にアクセス可能である。一構成では、各ＭＡＰは、直接メモリーアクセス（ＤＭＡ）を使用して関連メモリー３０８ａ〜ｆにアクセスすることができ、各ＭＡＰにそれぞれのマイクロプロセッサ３０２ａ〜ｆと独立に、かつ非同調性にタスクを実行させる。この構成では、ＭＡＰは、アルゴリズムのパイプライン化および並列実行のために別のＭＡＰに直接結果を送ることができる。
【００９９】
上記コンピューターアーキテクチャおよびシステムは、例だけであり、一般的なプロセッサー、コプロセッサー、ＦＰＧＡ、ならびに他のプログラマブルロジックデバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、ならびに他の処理およびロジックエレメントの任意の組み合わせを使用するシステムを含めた多種多様な他のコンピューター、携帯電話、ならびに携帯情報端末アーキテクチャおよびシステムを、例示的な実施形態に関連して使用することができる。一部の実施形態では、コンピューターシステムのすべてまたは一部をソフトウェアまたはハードウェアで実装することができる。ランダムアクセスメモリー、ハードドライブ、フラッシュメモリー、テープドライブ、ディスクアレイ、ネットワーク接続型記憶装置（ＮＡＳ）、ならびに他のローカルまたは分散型データ記憶デバイスおよびシステムを含めた任意の様々なデータ記憶媒体を、例示的な実施形態に関連して使用することができる。
【０１００】
例示的実施形態では、コンピューターシステムは、上記または他のコンピューターアーキテクチャおよびシステムのいずれかで実行するソフトウェアモジュールを使用して実装され得る。他の実施形態では、システムの機能は、ファームウェア、図２４で参照したフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）などのプログラマブルロジックデバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、または他の処理およびロジックエレメントで部分的または完全に実装され得る。例えば、セットプロセッサーアンドオプティマイザー（Ｓｅｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ）を、図２２に例示したアクセラレーターカード１２２などのハードウェアアクセラレーターカードを使用することによってハードウェアアクセラレーションを用いて実装することができる。
【実施例】
【０１０１】
実施例１（例示的）
Ｇタンパク質共役受容体（例えば、セロトニン、ドーパミン、グルタミン酸、ケモカイン、およびヒスタミン受容体）は、リガンドによって活性化されるときコンホメーション変化を起こすタンパク質の一クラスであり、したがって本発明を使用する研究に適用できる。本質的に非線形活性でないＧＰＣＲは、非線形活性標識を使用して標識することができ、コンホメーション変化は、非線形活性標識の配向の変化を介して検出される。１種または複数の標識ＧＰＣＲタンパク質を、例えば、ガラス担体上の支持脂質二重層構造のアレイ中にタンパク質分子を包埋することによって表面に付着させることができ、この場合、アレイ中の各二重層構造は、単一種のＧＰＣＲ分子を含有する。本発明の好適な実施形態では、各支持脂質二重層構造は、マイクロプレートの個々のウェル内に閉じ込められている。リガンドの結合がＧＰＣＲ受容体を活性化するとき生じるコンホメーション変化は、分子が固定化されている光学的界面に対する標識の配向の変化、およびしたがって、非線形光ビーム（例えば、２次高調波光）の性質、例えば、強度、波長、または偏光などの変化を引き起こす。
【０１０２】
スクリーニング実験では、固定化されたＧＰＣＲを含有するマイクロウェルプレートをハイスループット分析システムの並進ステージ機構に位置付けし、第１のウェルの信号を測定する位置に移動させる。バックグラウンド信号は、第１のウェルからの非線形光信号を測定し、マイクロウェルプレートを第２のウェルに再位置付けしてバックグラウンド測定を繰り返すなどによって固定化されたＧＰＣＲ分子を試験化合物に曝露する前に１種または複数のＧＰＣＲ試料について測定することができる。次いで非線形光信号の繰り返し測定を、試験化合物を添加した後の１つ（エンドポイントアッセイモード）またはそれ超（動力学的測定モード）の規定された時点で各ウェルについて行い、分析して試験化合物が１種または複数のＧＰＣＲ種のコンホメーション変化を誘導したか否かを決定する。
【０１０３】
一部の場合では、試験化合物がＧＰＣＲ分子に結合すると、ＧＰＣＲが試験化合物によって活性化されなくても測定される非線形光学的性質が変化し得る。例えば、これは、受容体分子のコンホメーションの変化ではなく、受容体分子に対する付着された標識の配向を変更する結合複合体中の試験化合物とＧＰＣＲ分子との間の相互作用に起因し得る。例えば、所与のＧＰＣＲ受容体に結合するがコンホメーション変化を生じさせないことが公知である化合物を使用することによって、非線形光学的性質の測定された変化を受容体の結合または活性化に割り当てるのに、必要に応じてコントロールを実施することができる。必要であれば、ＧＰＣＲ上の標識の位置は、非線形光信号の観察された変化が受容体活性化またはコンホメーション変化に相関することを保証するために、標識の共役化学を変化させ、かつ／または受容体を遺伝的に改変して新しい標識部位を導入することによって変更することができる。
【０１０４】
上述した例では、ガラス担体上の脂質二重層構造のアレイに固定化された（かつＧＰＣＲ分子が存在するウェルによってさらに分離された）ＧＰＣＲ分子のそれぞれを、上記に開示した再循環する屈折率整合流体、屈折率整合エラストマー、またはプリズム格子の設計を介して効率的な光カップリングを維持しながら、精密なＸ−Ｙ並進ステージを使用することにより励起光線に対してガラス担体（マイクロプレート）を再位置付けすることによって測定および分析にかけられる。
【０１０５】
典型的には、マイクロプレートのウェルへの試験化合物溶液の分注は、光学機器システムに一体化されているプログラム可能な、自動化された液体分注ユニットによって実施されることになる。マイクロプレートのウェルに固定化されたＧＰＣＲ種のそれぞれは、同じ試験化合物に曝露されてもよく、またはそれぞれは、異なる試験化合物に曝露されてもよい。本発明の一部の態様では、ハイスループット分析システムは、分析されるＧＰＣＲ試料を含むマイクロウェルプレートを外部記憶装置システムから並進ステージの「ホーム」位置に移動させるため、または分析が完了したＧＰＣＲ含有マイクロプレートを新しい試料プレートに置き換えるためのロボティクスをさらに備えることになる。本発明の他の態様では、ハイスループット分析システムは、試験化合物の収集物を含有する標準的なマイクロプレートを液体分注ユニットの「ホーム」位置内に、またはその外に移動させるための追加のロボティクスをさらに備えることになる。
【０１０６】
本発明の好適な態様では、コンピューターシステム（すなわち、プロセッサーまたはコントローラー）は、（ｉ）ハイスループット分析システムのすべてのプログラム可能なコンポーネントを制御し、（ｉｉ）位置内にかつ位置の外にマイクロウェルプレートを移動させるステップ、バックグラウンド光学的測定を取るステップ、試験化合物溶液を分注するステップ、およびエンドポイントアッセイまたは動力学的モードアッセイで使用するために光学的測定を繰り返すステップの動作ステップを同期させ、（ｉｉｉ）検出器から受信した非線形光信号データを記憶および処理し、（ｉｖ）入力システムセットアップパラメーター（例えば、分析されるマイクロウェルプレートの数、１プレート当たりのウェルの数、試験される試験化合物の数、エンドポイント測定モード対動力学的測定モードなど）を使用して各マイクロプレート上の異なるウェルについてバックグラウンド測定ステップ、試験化合物分注ステップ、および繰り返し測定ステップを差し入れるための最適な順序を計算することによって、分析の全体的なスループットを最適化する（例えば、１時間あたりに分析されるＧＰＣＲ試料／試験化合物組み合わせの数の観点から）ためのソフトウェアを実行するように構成されている。
【０１０７】
実施例２（プリズムアレイを製作するための型設計＆プロセス）
型を作出して、特殊光学成形所（ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍｏｌｄｉｎｇ  ｈｏｕｓｅ）（Ａｐｏｌｌｏ  Ｏｐｔｉｃａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）によって実施される射出成形プロセスを用いて、図１３に示した最初の「スキッププリズム（ｓｋｉｐ−ｐｒｉｓｍ）」設計を製作した。得られた部品は、応力複屈折を示し（図１４中の交差偏光子画像を参照）、測定されるＳＨＧ信号は、この複屈折によって悪影響を受け（図１５）、プリズムアレイの長さに沿って信号が低下する。
【０１０８】
ＳＨＧ信号に対する複屈折効果を低減または排除するために、本発明者らは、使用されるプラスチックのタイプ（ＣＯＰ、ＣＯＣ、アクリルなど）、異なる成形加工条件（温度、圧力、流量、サイクル時間など）、および成形後アニーリングについて実験した。本発明者らは、中程度に複屈折を低減させる材料およびプロセスパラメーターを見つけることができたが、これらの条件は、プラスチック部品を型にしっかりと接着させ、型から放出すると破損させる傾向もあった。（注：この型は、排出デバイスを含有し、それは、部品のベント端部およびゲート端部でのみ押した）。部品をアニールすると応力複屈折が著しく低減されたが、部品の過剰な機械的な反りを引き起こし、それによって部品を使用不可能にした。
【０１０９】
射出成形フローシミュレーションは、応力が平面ゲートからプリズム構造部品への移行部で主に生じることを示した（結果を示さず）。シミュレーション結果は、部品を要求されるより長く作製し、次いで切り取って長さを整え、それによって成形部品の応力のかかった領域を機械的に除去し、最初の設計と同じ最終長さのプリズムアレイをもたらすことができることも予測した。
【０１１０】
型フローシミュレーションの結果を使用していくつかの重要な変更を含む新しい型を設計した。
１．部品の全長を増大させて複屈折移行ゾーンを切り取ることを可能にした。
２．ゲート特徴およびベント特徴をより長くしてプラスチック中のせん断応力を低減した。
３．型排出特徴を部品の長さおよび幅に沿って加えて、型からの放出を助長し、放出中に部品を破損する機会を低減した。
４．「接着剤隆起（ｇｌｕｅ  ｂｕｍｐ）」をアレイの平面側に添加して、プリズムアレイがガラス底マイクロプレートに積層されるときの接着剤層の厚さを制御し、温度変動中の接着剤接着を改善した。
【０１１１】
ゲート（左）特徴およびベント（右）特徴を含む新しい部品設計を図１６に示す。図１９は、型ツールの破断図バージョンを示す。放出中の部品により均一な圧力を適用するのに離型中に使用される６×３アレイの「イジェクターブレード」デバイス（すなわち、「排出デバイス」）が存在することに留意されたい（図２０）。追加の排出特徴（図示せず）もゲート領域およびベント領域中に使用される。一般に、光学品質成形部品は、イジェクター特徴をまったく使用しない。なぜなら、イジェクターは、部品の表面に衝撃を与え、傷を作出し得るためである。本発明者らのプリズムアレイ設計は、光学的に対処されないいくつかの領域を有するので、本発明者らは、部品の光学性能が重要ではない領域内にかぎり部品に衝撃を与えるようにイジェクターブレードを配列することができた。
【０１１２】
一般に、排出デバイスのｍ×ｎアレイ中のブレード様イジェクター特徴の数が大きいほど、より均一な圧力が離型中に部品に発揮される。一部の実施形態では、ｍおよび／またはｎは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の値を有することになる。一部の実施形態では、ｍおよび／またはｎは、せいぜい２０、せいぜい１９、せいぜい１８、せいぜい１７、せいぜい１６、せいぜい１５、せいぜい１４、せいぜい１３、せいぜい１２、せいぜい１１、せいぜい１０、せいぜい９、せいぜい８、せいぜい７、せいぜい６、せいぜい５、せいぜい４、せいぜい３、またはせいぜい２の値を有することになる。ｍおよびｎの値は、同じであってもよく、または異なっていてもよく、上記指定範囲内の値の任意の組み合わせを含み得る。
【０１１３】
新しい型設計、具体的には排出特徴は、射出成形業者に最初の型において放出−破損を引き起こしたはずである異なる圧力および温度プロファイルで実験することを可能にした。これらの条件は、成形プロセス中のプラスチックの応力を有効に解消するが、部品を光学型表面によりしっかりと接着させる。部品の長さおよび幅にわたって分布したイジェクター特徴は、部品が破損することなく型から排出されることを可能にする。新しい型で作製されるプリズム部品は、図１７の交差偏光子画像に示したように、無視できる応力複屈折を有する。ＳＨＧデータも、プリズムアレイの長さに沿ってはるかにより均一な信号応答を示す（図１８）。残留複屈折は、依然として検出可能であるが、部品の追加の長さは、本発明者らに最も大きな複屈折が存在する移行領域（データを示さず）を切り離す切り取り場所を最適化することを可能にした。
【０１１４】
本発明の好適な実施形態を本明細書に示し、記載してきたが、このような実施形態は、単なる例として提供されていることが当業者に明白となるであろう。多数のバリエーション、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者に今では見出されるであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替案が、本発明の実践において使用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにこれらの均等物は、それによって包含されることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月13日(2020.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デバイスであって、該デバイスは、
ａ）担体を備え、該担体は、
ｉ）該担体の表面上のＭ×Ｎアレイの別々の領域であって、Ｍは、別々の領域の行の数であり、Ｎは、該アレイ中の別々の領域の列の数である、Ｍ×Ｎアレイの別々の領域、および
ｉｉ）該担体と一体化され、該別々の領域に光学的にカップリングされたＲ×Ｓアレイのプリズムであって、Ｒは、プリズムの行の数であり、Ｓは、該アレイ中のプリズムの列の数である、Ｒ×Ｓアレイのプリズム；
を含み、各別々の領域は、該担体と一体化された該プリズムのアレイの単一のプリズム上に直接位置付けられ、
Ｒ≠ＭおよびＳ＝Ｎであるか、またはＲ＝ＭおよびＳ≠Ｎである、デバイス。
【請求項２】
Ｒ＝Ｍ＋２およびＳ＝Ｎであるか、またはＲ＝ＭおよびＳ＝Ｎ＋２である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記別々の領域のそれぞれが、入力プリズムとして機能する前記アレイ中の少なくとも１つのプリズムおよび出力プリズムとして機能する前記アレイ中の少なくとも１つのプリズムと光学的にカップリングされており、前記入力プリズムおよび前記出力プリズムは、空間的に別々である、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
デバイスであって、該デバイスは、
ａ）担体を備え、該担体は、
ｉ）該担体の表面上のＭ×Ｎアレイの別々の領域であって、Ｍは、別々の領域の行の数であり、Ｎは、該アレイ中の別々の領域の列の数である、Ｍ×Ｎアレイの別々の領域、および
ｉｉ）該担体と一体化され、該別々の領域に光学的にカップリングされたＲ×Ｓアレイのプリズムであって、Ｒは、プリズムの行の数であり、Ｓは、該アレイ中のプリズムの列の数である、Ｒ×Ｓアレイのプリズム；
を含み、各別々の領域は、該担体と一体化された該プリズムのアレイの単一のプリズム上に直接位置付けられ、
該別々の領域のそれぞれが、入力プリズムとして機能する該アレイ中の少なくとも１つのプリズムおよび出力プリズムとして機能する該アレイ中の少なくとも１つのプリズムと光学的にカップリングされており、該入力プリズムおよび該出力プリズムは、空間的に別々であり、該別々の領域の直下に直接位置付けられていない、デバイス。
【請求項５】
Ｍ＝８およびＮ＝１２である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６】
Ｍ＝１６およびＮ＝２４である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項７】
Ｍ＝３２およびＮ＝４８である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８】
Ｍが、４より大きく、Ｎが４より大きい、請求項１〜４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９】
各別々の領域が、支持脂質二重層を含むか、または支持脂質二重層の形成を助長するように構成されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０】
別個のウェル中に各別々の領域を隔離するために、前記担体の上面に結合されたウェル形成コンポーネントをさらに備える、請求項１〜９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記別々の領域のそれぞれが、最大で約１００ｍｍ２のエリアを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記担体が、ガラス、石英ガラス、またはプラスチックで構成されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のデバイス。