(57)【要約】【課題】二本鎖核酸の検出において、測定結果の信頼性が高く、測定の異常検出が可能な核酸捕捉センサの提供。【解決手段】核酸捕捉センサ１００は、第一のセンサ素子１及び第二のセンサ素子２と、前記第一のセンサ素子１の上に配置され、標的二本鎖核酸を構成する第一の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第一の配列を有する第一の捕捉プローブ４と、前記第二のセンサ素子の上に配置され、前記標的二本鎖核酸を構成する第二の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第二の配列を有する第二の捕捉プローブ５と、を備える。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一のセンサ素子及び第二のセンサ素子と、
前記第一のセンサ素子の上に配置され、標的二本鎖核酸を構成する第一の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第一の配列を有する第一の捕捉プローブと、
前記第二のセンサ素子の上に配置され、前記標的二本鎖核酸を構成する第二の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第二の配列を有する第二の捕捉プローブと、
を備える、核酸捕捉センサ。
【請求項２】
前記第一のセンサ素子及び前記第二のセンサ素子は、磁気センサ素子である、請求項１に記載の核酸捕捉センサ。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸捕捉センサと、
磁気ビーズと、
を備える核酸検出カートリッジ。
【請求項４】
前記第一の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第三の配列を有し、且つ、前記磁気ビーズを有する第一の標識プローブと、
前記第二の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第四の配列を有し、且つ、前記磁気ビーズを有する第二の標識プローブと、
を備え、
前記第一の配列及び前記第三の配列は互いに異なる配列であり、
前記第二の配列及び前記第四の配列は互いに異なる配列である、請求項３に記載の核酸検出カートリッジ。
【請求項５】
前記第一の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第三の配列、及び、前記第二の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第四の配列を有し、且つ、前記磁気ビーズを有する標識プローブを備え、
前記第一の配列及び前記第三の配列は互いに異なる配列であり、
前記第二の配列及び前記第四の配列は互いに異なる配列である、請求項３に記載の核酸検出カートリッジ。
【請求項６】
前記磁気ビーズはアビジン又はストレプトアビジンを有する、請求項３に記載の核酸検出カートリッジ。
【請求項７】
前記第一の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第三の配列を有し、且つ、ビオチンを有する第一のビオチン付プローブと、
前記第二の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第四の配列を有し、且つ、ビオチンを有する第二のビオチン付プローブと、
を更に備え、
前記第一の配列及び前記第三の配列は互いに異なる配列であり、
前記第二の配列及び前記第四の配列は互いに異なる配列である、請求項６に記載の核酸検出カートリッジ。
【請求項８】
請求項２に記載の核酸捕捉センサと、
磁気ビーズと、
を備える、核酸検出キット。
【請求項９】
前記第一の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第三の配列を有し、且つ、前記磁気ビーズを有する第一の標識プローブと、
前記第二の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第四の配列を有し、且つ、前記磁気ビーズを有する第二の標識プローブと、
を備え、
前記第一の配列及び前記第三の配列は互いに異なる配列であり、
前記第二の配列及び前記第四の配列は互いに異なる配列である、請求項８に記載の核酸検出キット。
【請求項１０】
前記第一の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第三の配列、及び、前記第二の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第四の配列を有し、且つ、前記磁気ビーズを有する標識プローブを備え、
前記第一の配列及び前記第三の配列は互いに異なる配列であり、
前記第二の配列及び前記第四の配列は互いに異なる配列である、請求項８に記載の核酸検出キット。
【請求項１１】
前記磁気ビーズはアビジン又はストレプトアビジンを有する、請求項８に記載の核酸検出キット。
【請求項１２】
前記第一の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第三の配列を有し、且つ、ビオチンを有する第一のビオチン付プローブと、
前記第二の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第四の配列を有し、且つ、ビオチンを有する第二のビオチン付プローブと、
を更に備え、
前記第一の配列及び前記第三の配列は互いに異なる配列であり、
前記第二の配列及び前記第四の配列は互いに異なる配列である、請求項１１に記載の核酸検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸捕捉センサ、並びに、前記核酸捕捉センサを備える核酸検出カートリッジ及び核酸検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、疾患の診断を目的として、血液等の体液中に存在する二本鎖核酸の有無、濃度、塩基配列等を測定するための核酸検出用の基板が開発されている。
【０００３】
特許文献１には、二本鎖核酸を検出する方法として、捕捉用プローブ核酸が具備された基板を用いて、二本鎖核酸を変性させて一本鎖核酸にする工程、一本鎖核酸と捕捉用プローブ核酸とをハイブリダイズさせる工程と、一本鎖核酸に対して蛍光等の標識物質を付加させる工程と、標識物質から検出信号を得る工程と、を含む方法が開示されている。これによれば、標識物質から検出信号を得ることで、二本鎖核酸の有無、濃度、塩基配列等の情報を得ることが可能である。さらに、特許文献１では、二本鎖核酸を検出する方法として、２種類の捕捉用プローブ核酸が具備された基板を用いて、二本鎖核酸と捕捉用プローブ核酸を高効率にハイブリダイズさせる方法が提案されている。これによれば、基板上にある２種類の捕捉用プローブ核酸の一方は、二本鎖核酸に含まれる２種類の一本鎖核酸の一方と相補的であり、チップ上に具備されている２種類の捕捉用プローブ核酸の他方は、二本鎖核酸に含まれる２種類の一本鎖核酸の他方と相補的である。そのために二本鎖核酸に含まれる２種類の一本鎖核酸の両方について、捕捉用プローブ核酸とハイブリダイズする機会が与えられる。よって、高効率に捕捉用プローブ核酸とハイブリダイズすることが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−１５９０５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載の方法では、二本鎖核酸と捕捉用プローブ核酸との高いハイブリダイゼーション効率により、大きな検出信号を得ることができると予想される一方で、得られる検出信号は一種類の二本鎖核酸に対して一種類である。診断の信頼性の高さという点では、一回の測定において、できるだけ多くの情報が得られたほうが、統計的な面から優位である。また、一般的に、血液等の体液中に含まれる二本鎖核酸の測定による診断は、未だ研究段階である側面があり、生体の組織や臓器から材料を採取して検査する生体組織診断に比べると、信頼性が低く、改良の余地がある。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、二本鎖核酸の検出において、測定結果の信頼性が高く、測定の異常検出が可能な核酸捕捉センサ、並びに、前記核酸捕捉センサを備える核酸検出カートリッジ及び核酸検出キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１）  第一のセンサ素子及び第二のセンサ素子と、前記第一のセンサ素子の上に配置され、標的二本鎖核酸を構成する第一の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第一の配列を有する第一の捕捉プローブと、前記第二のセンサ素子の上に配置され、前記標的二本鎖核酸を構成する第二の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第二の配列を有する第二の捕捉プローブと、を備える、核酸捕捉センサ。
（２）  前記第一のセンサ素子及び前記第二のセンサ素子は、磁気センサ素子である、（１）に記載の核酸捕捉センサ。
（３）  （２）に記載の核酸捕捉センサと、磁気ビーズと、を備える核酸検出カートリッジ。
（４）  前記第一の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第三の配列を有し、且つ、前記磁気ビーズを有する第一の標識プローブと、前記第二の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第四の配列を有し、且つ、前記磁気ビーズを有する第二の標識プローブと、を備え、前記第一の配列及び前記第三の配列は互いに異なる配列であり、前記第二の配列及び前記第四の配列は互いに異なる配列である、（３）に記載の核酸検出カートリッジ。
（５）  前記第一の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第三の配列、及び、前記第二の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第四の配列を有し、且つ、前記磁気ビーズを有する標識プローブを備え、前記第一の配列及び前記第三の配列は互いに異なる配列であり、前記第二の配列及び前記第四の配列は互いに異なる配列である、（３）に記載の核酸検出カートリッジ。
（６）  前記磁気ビーズはアビジン又はストレプトアビジンを有する、（３）に記載の核酸検出カートリッジ。
（７）  前記第一の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第三の配列を有し、且つ、ビオチンを有する第一のビオチン付プローブと、前記第二の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第四の配列を有し、且つ、ビオチンを有する第二のビオチン付プローブと、を更に備え、前記第一の配列及び前記第三の配列は互いに異なる配列であり、前記第二の配列及び前記第四の配列は互いに異なる配列である、（６）に記載の核酸検出カートリッジ。
（８）  （２）に記載の核酸捕捉センサと、磁気ビーズと、を備える、核酸検出キット。
（９）  前記第一の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第三の配列を有し、且つ、前記磁気ビーズを有する第一の標識プローブと、前記第二の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第四の配列を有し、且つ、前記磁気ビーズを有する第二の標識プローブと、を備え、前記第一の配列及び前記第三の配列は互いに異なる配列であり、前記第二の配列及び前記第四の配列は互いに異なる配列である、（８）に記載の核酸検出キット。
（１０）  前記第一の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第三の配列、及び、前記第二の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第四の配列を有し、且つ、前記磁気ビーズを有する標識プローブを備え、前記第一の配列及び前記第三の配列は互いに異なる配列であり、前記第二の配列及び前記第四の配列は互いに異なる配列である、（８）に記載の核酸検出キット。
（１１）  前記磁気ビーズはアビジン又はストレプトアビジンを有する、（８）に記載の核酸検出キット。
（１２）  前記第一の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第三の配列を有し、且つ、ビオチンを有する第一のビオチン付プローブと、前記第二の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第四の配列を有し、且つ、ビオチンを有する第二のビオチン付プローブと、を更に備え、前記第一の配列及び前記第三の配列は互いに異なる配列であり、前記第二の配列及び前記第四の配列は互いに異なる配列である、（１１）に記載の核酸検出キット。
【発明の効果】
【０００８】
上記態様の核酸捕捉センサによれば、二本鎖核酸の検出において、測定結果の信頼性が高く、測定の異常検出が可能な核酸捕捉センサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の一実施形態に係る核酸捕捉センサを模式的に示す斜視図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る核酸捕捉センサを模式的に示す断面図である。
【図３】標的二本鎖核酸の加熱及び冷却による解離及び結合の様子を模式的に示す図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る核酸捕捉センサと標的二本鎖核酸との結合の様子を模式的に示す図である。
【図５】本発明の第一実施形態に係る標的二本鎖核酸の検出方法に用いられる標識プローブを模式的に示す図である。
【図６】図５に示す標識プローブと標的二本鎖核酸と捕捉プローブとの結合の様子を模式的に示す図である。
【図７】本発明の第二実施形態に係る標的二本鎖核酸の検出方法に用いられる標識プローブを模式的に示す図である。
【図８】図７に示す標識プローブと標的二本鎖核酸と捕捉プローブとの結合の様子を模式的に示す図である。
【図９】本発明の第三実施形態に係る標的二本鎖核酸の検出方法における磁気ビーズと標的二本鎖核酸と捕捉プローブとの結合の様子を模式的に示す図である。
【図１０】本発明の第四実施形態に係る標的二本鎖核酸の検出方法に用いられるビオチン付プローブを模式的に示す図である。
【図１１】図１０に示すビオチン付プローブと標的二本鎖核酸と捕捉プローブとの結合の様子を模式的に示す図である。
【図１２】図１１に示すビオチン付プローブと標的二本鎖核酸と捕捉プローブとの複合体にさらに磁気ビーズが結合した様子を模式的に示す図である。
【図１３】本発明の一実施形態に係る核酸検出カートリッジを模式的に示す平面図である。
【図１４】図１３に示す核酸検出カートリッジの分解斜視図である。
【図１５】実施例における標的二本鎖核酸に対する、２種類の捕捉プローブ及びビオチン付プローブの結合領域を模式的に示す図である。
【図１６】実施例における核酸捕捉センサ上での標的二本鎖核酸、各プローブ、及び磁気ビーズの結合の流れを模式的に示す図である。
【図１７】比較例における標的二本鎖核酸に対する、１種類の捕捉プローブ及びビオチン付プローブの結合領域を模式的に示す図である。
【図１８】比較例における核酸捕捉センサ上での標的二本鎖核酸、各プローブ、及び磁気ビーズの結合の流れを模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
≪核酸捕捉センサ≫
本発明の一実施形態（以下、「本実施形態」と略記する場合がある）に係る核酸捕捉センサは、第一のセンサ素子及び第二のセンサ素子からなる２種類のセンサ素子と、第一の捕捉プローブ及び第二の捕捉プローブからなる２種類の捕捉プローブを備える。第一の捕捉プローブは、第一のセンサ素子の上に配置され、標的二本鎖核酸を構成する第一の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第一の配列を有する。第二の捕捉プローブは、第二のセンサ素子の上に配置され、前記標的二本鎖核酸を構成する第二の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第二の配列を有する。
【００１１】
本実施形態の核酸捕捉センサは上記構成を有することで、試料中の標的二本鎖核酸の検出において、試料中の一種類の標的二本鎖核酸に対して、二種類の検出信号が得られるため、測定結果の信頼性が向上する。また、後述する実施例に示すように、例えば二種類の検出信号の比を用いることで、測定の異常を検出することができる。
【００１２】
検出対象である「標的二本鎖核酸」としては、特別な限定はなく、例えば、ゲノムＤＮＡ、セルフリーＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖等が挙げられる。また、標的二本鎖核酸は、超音波や制限酵素等を用いて断片化したものであってもよく、ＰＣＲ等による増幅産物であってもよい。また、標的二本鎖核酸は、その５’末端又は３’末端にビオチン等が付加されたものであってもよい。また、標的二本鎖核酸は、人工核酸のみからなるものであってもよく、天然由来の核酸や合成された核酸と人工核酸とのキメラ核酸であってもよい。人工核酸としては、例えば、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等が挙げられる。
標的二本鎖核酸を含む試料としては、体液試料であってもよく、標的二本鎖核酸を溶解した溶液（緩衝液等）であってもよい。体液試料としては、例えば、血液、血清、血漿、尿、パフィーコート、唾液、精液、胸部滲出液、脳脊髄液、涙液、痰、粘液、リンパ液、腹水、胸水、羊水、膀胱洗浄液、気管支肺胞洗浄液、細胞抽出液、細胞培養上清等が挙げられる。標的二本鎖核酸を含む試料として、これらの体液試料をそのまま用いてもよく、体液試料から核酸を抽出することで得られる核酸抽出液を用いてもよい。
【００１３】
＜核酸捕捉センサの構造＞
本実施形態の核酸捕捉センサの構造について、以下、図面を参照しながら説明する。なお、以下の説明で用いる図は、本発明の特徴を分かり易くするために、便宜上、要部となる部分を拡大して示している場合があり、各構成要素の寸法比率等が実際と同じであるとは限らない。
【００１４】
図１は、本発明の一実施形態に係る核酸捕捉センサを模式的に示す斜視図である。
図１に示すように本実施形態の核酸捕捉センサ１００は、基板３を有し、第一のセンサ素子１及び第２のセンサ素子２が基板面内方向に離れて配置されている。第一のセンサ素子１及び第２のセンサ素子２は、それぞれ配線５１及び配線５２を介して外部と接続可能に構成されている。
【００１５】
図２は、本発明の一実施形態に係る核酸捕捉センサを模式的に示す断面図であり、図１に示した核酸捕捉センサのＩＩ−ＩＩ’の断面図である。
核酸捕捉センサ１００は、標的二本鎖核酸を構成する第一の一本鎖核酸及び第二の一本鎖核酸を捕捉するために用いられる。
図２に示すように、核酸捕捉センサ１００において、基板３内に第一のセンサ素子１及び第二のセンサ素子２が配置されており、第一のセンサ素子１の上に第一の捕捉プローブ４が配置され、第二のセンサ素子２の上に第二の捕捉プローブ５が配置されている。第一の捕捉プローブ４は、標的二本鎖核酸を構成する第一の一本鎖核酸の少なくとも一部に相補的な第一の配列からなる核酸４ａを含む。第二の捕捉プローブ５は、標的二本鎖核酸を構成する第二の一本鎖核酸の少なくとも一部に相補的な第二の配列からなる核酸５ａを含む。また、図２に示す基板３では、支持体３ａ及び保護膜３ｂがこの順に積層されている。
【００１６】
次いで、核酸捕捉センサ１００を用いた標的二本鎖核酸の捕捉方法について以下に説明する。
図３は、標的二本鎖核酸の加熱及び冷却による解離及び結合の様子を模式的に示す図である。図３に示すように標的二本鎖核酸６は、加熱することで第一の一本鎖核酸６ａと、第二の一本鎖核酸６ｂとに解離し、一方で冷却することで、再会合（アニーリング）して二本鎖核酸に戻る。
【００１７】
図４は、本発明の一実施形態に係る核酸捕捉センサと標的二本鎖核酸との結合の様子を模式的に示す図である。
図４に示すように、加熱直後の標的二本鎖核酸（第一の一本鎖核酸６ａと、第二の一本鎖核酸６ｂとに解離した状態）を含む試料溶液を核酸捕捉センサ１００に接触させることで、第一の一本鎖核酸６ａは第一の配列からなる核酸４ａを介して第一の捕捉プローブ４と結合し、第二の一本鎖核酸６ｂは第二の配列からなる核酸５ａを介して第二の捕捉プローブ５と結合する。
【００１８】
本実施形態に係る核酸捕捉センサは、図１〜２に示すものに限定されず、その効果を損なわない範囲内において、図１〜２に示すものの一部の構成が変更又は削除されたものや、これまでに説明したものにさらに他の構成が追加されたものであってもよい。
例えば、図１〜２に示す核酸捕捉センサにおいて、第一のセンサ素子１及び第２のセンサ素子２が基板内に配置されているものを例示したが、第一のセンサ素子１及び第２のセンサ素子２の種類に応じて、基板表面上に配置されていてもよい。
例えば、図１〜２に示す核酸捕捉センサにおいて、第一のセンサ素子及び第二のセンサ素子をそれぞれ１つずつ備える場合を例示したが、核酸捕捉センサは、第一のセンサ素子及び第二のセンサ素子をそれぞれ２つ以上備えてもよい。
また、例えば、図１〜２に示す核酸捕捉センサにおいて、１種類の標的二本鎖核酸を捕捉する場合を例示したが、核酸捕捉センサは、２種類以上の標的二本鎖核酸を捕捉するために、標的二本鎖核酸の塩基配列に対応した複数種類の第一の捕捉プローブ及び第二の捕捉プローブのセットを備えてもよい。
【００１９】
＜第一のセンサ素子及び第二のセンサ素子＞
第一のセンサ素子１及び第二のセンサ素子２は、それぞれ独立したセンサ素子として出力するように構成されている。つまり、第一のセンサ素子１の出力と第二のセンサ素子２の出力は互いに独立している。
第一のセンサ素子及び第二のセンサ素子としては、それぞれ第一の一本鎖核酸及び第二の二本鎖核酸の結合を検出できるものであれば特別な限定はなく、例えば、核酸捕捉センサが磁気センサを利用したものである場合、第一のセンサ素子及び第二のセンサ素子として磁気センサ素子を用いることができる。また、例えば、核酸捕捉センサが表面電荷検出型センサを利用したものである場合、第一のセンサ素子及び第二のセンサ素子として電界効果トランジスタ（Field effect transistor；FET）を用いることができる。例えば、核酸捕捉センサが表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサを利用したものである場合、第一のセンサ素子及び第二のセンサ素子として受光素子を用いることができる。例えば、核酸捕捉センサが電流検出型センサを利用したものである場合、第一のセンサ素子及び第二のセンサ素子として電極を用いることができる。中でも、第一のセンサ素子及び第二のセンサ素子としては、結合した磁気ビーズの数に応じて、検出信号が増加し、標的二本鎖核酸の濃度を高精度で定量できることから、磁気センサ素子が好ましい。
磁気センサ素子としては、例えば、磁気抵抗効果素子を用いることができる。磁気抵抗効果素子は、磁界の影響を受けて電気抵抗値が変わる現象を利用する素子であれば特に制限はなく、積層面内の一定方向に固着された磁化方向を有する磁化固定層と、外部磁界に応じて磁化方向が変化する磁化自由層と、を備えたタイプの素子であることが好ましい。また、磁気抵抗効果素子において、磁化固定層の磁化固定方向は、磁気ビーズ励磁のために印加される磁界と、略平行又は略反平行であり、かつ、前記磁気抵抗効果素子の膜面方向であることが好ましい。
本明細書において、「略平行又は略反平行」とは、凡そ平行又は反平行であればよく、０．１°以上１０゜以下の範囲でずれていてもよい。
さらに、磁気抵抗効果素子は、磁化固定層と、非磁性体の導体又は絶縁体からなる中間層と、磁化自由層と、を含み、磁化固定層と磁化自由層とで中間層を挟む積層体を有していることがより好ましい。
なお、中間層が非磁性体の導体の場合、磁気抵抗効果素子は、一般にＧＭＲ素子（巨大磁気抵抗効果素子）と呼ばれ、非磁性体の絶縁体の場合、ＴＭＲ素子（トンネル型磁気抵抗効果素子）と呼ばれる。磁気抵抗効果素子の電気抵抗値は、磁化固定層の磁化方向と磁化自由層の平均の磁化方向の角度に応じて変化する。
また、磁気抵抗効果素子の形状は特別な限定はないが、ミアンダ構造であることが好ましい。
【００２０】
磁化自由層は、例えば、ＮｉＦｅ合金等の軟磁性膜から構成されている。中間層は、例えば、Ｃｕ等の導電体膜、又は、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム等の絶縁体膜から構成されている。
磁化固定層は、一方の面が反強磁性膜と接し、他方の面が中間層と接する。反強磁性膜は、例えばＩｒＭｎやＰｔＭｎ等の反強磁性Ｍｎ合金等から構成されている。磁化固定層は、例えば、ＣｏＦｅ合金やＮｉＦｅ合金等の強磁性体から構成されているか、或いは、Ｒｕの薄膜層をＣｏＦｅ合金やＮｉＦｅ合金等の強磁性体で挟む構成をとってもよい。
【００２１】
＜第一の捕捉プローブ及び第二の捕捉プローブ＞
第一の捕捉プローブは、第一の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第一の配列を有する。
第二の捕捉プローブは、第二の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第二の配列を有する。
第一の配列及び第二の配列の塩基数の下限は、例えば１０塩基であり、１５塩基が好ましく、２０塩基がより好ましい。一方、第一の配列及び第二の配列の塩基数の上限は、例えば１５０塩基であり、１００塩基が好ましく、５０塩基がより好ましい。
第一の捕捉プローブ及び第二の捕捉プローブは、図２に示すように、それぞれ基板上に固定化されていることが好ましい。これら捕捉プローブは、３’末端が固定化されていてもよく、５’末端が固定化されていてもよい。また、各捕捉プローブが各一本鎖核酸とそれぞれ結合するために分子的な自由度を確保する観点から、基板に固定化されている側の末端にスペーサーを有してもよい。スペーサーが核酸から構成されている場合、その塩基数の下限は、特に限定されないが、例えば１塩基であり、３塩基が好ましい。一方、スペーサーの塩基数の上限は、特に限定されないが、例えば５０塩基であり、３０塩基が好ましい。また、スペーサーは核酸の代わりに、ポリエチレングリコール等のリンカー化合物から構成されていてもよい。
【００２２】
第一の捕捉プローブ及び第二の捕捉プローブは、ＤＮＡから構成されてもよく、ＲＮＡから構成されてもよく、これらを組み合わせて構成されてもよい。また、ＤＮＡ分解酵素やＲＮＡ分解酵素による分解を抑制する観点から、人工核酸を含んでもよい。
【００２３】
捕捉プローブを基板に固定化する方法としては、例えば、フォトリソグラフィ技術及び固相化学反応を用いた方法、捕捉プローブを含む溶液を基板上に滴下して固定化する方法等が挙げられる。フォトリソグラフィ技術及び固相化学反応を用いる方法の場合には、基板上において各捕捉プローブを合成してもよい。また、捕捉プローブを含む溶液を基板上に滴下して固定化する方法である場合には、捕捉プローブの３’末端又は５’末端に基板上に固定化するための官能基（以下、「固定化基」と略記する場合がある）を設けておき、一方、基板上にも固定化基と反応して結合を形成可能な官能基（以下、「反応基」と略記する場合がある）を設けておくことが好ましい。このような固定化基と反応基との組み合わせとしては、アミノ基、ホルミル基、チオール基、スクシミジルエステル基等の固定化基と、カルボキシ基、アミノ基、ホルミル基、エポキシ基、マレイミド基等の反応基との組み合わせや、金−チオール結合を利用した組み合わせ等が挙げられる。
また、捕捉プローブを含む溶液を基板上に滴下して固定化する他の方法としては、例えば、３’末端又は５’末端にシラノール基を有する捕捉プローブを、センサ素子上の部分をシリカとした基板に吐出し、配列させ、シランカップリング反応により共有結合させる方法等も挙げられる。
【００２４】
＜標的二本鎖核酸の検出方法＞
本実施形態の核酸捕捉センサを用いた標的二本鎖核酸の検出方法について、以下に詳細を説明する。
本実施形態の核酸捕捉センサが磁気センサを利用したものである場合、磁気ビーズを用いて標的核酸を検出することができる。
【００２５】
磁気ビーズは、例えば、有機材料で形成されるビーズの中に磁性粒子を含むものである。磁性粒子としては強磁性を示すもの又は超常磁性を示すものを用いることができるが、超常磁性を示すものが好ましい。例えば、コアに複数の酸化鉄粒子を含むポリスチレンビーズが挙げられる。コアに含まれる酸化鉄の粒子は、例えば、各々が粒径１００ｎｍ以下であり、超常磁性を示すものである。磁気ビーズの直径としては、保護膜の面積との兼ね合いによるが、例えば、０．０１μｍ以上１μｍ以下が好ましい。
磁気ビーズの表面は、ポリマーやシリカマトリックスでコーティング処理されていてもよい。核酸は親水性であることから、磁気ビーズの表面は親水性であることが好ましい。
【００２６】
本実施形態の核酸捕捉センサが磁気センサを利用したものである場合、一本鎖核酸に直接的又は間接的に結合するように構成されている磁気ビーズを用いることができる。
【００２７】
［第一実施形態］
図５は、本発明の第一実施形態に係る標的二本鎖核酸の検出方法に用いられる標識プローブを模式的に示す図である。図５に示すように、第一の標識プローブ１０は、第一の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第三の配列からなる核酸１０ａを含み、且つ、磁気ビーズ１２を有する。第二の標識プローブ１１は、第二の一本鎖核酸の塩基配列の少なくとも一部に相補的な第四の配列からなる核酸１１ａを含み、且つ、磁気ビーズ１２を有する。磁気ビーズ１２と、核酸１０ａ及び１１ａとの結合方法は、特に限定されず、例えば、配位結合、共有結合、水素結合、疎水性相互作用、物理吸着、アフィニティー結合等の公知の結合が挙げられ、リンカー等を介して間接的に結合していてもよい。具体的な結合方法としては、例えば、磁気ビーズ表面に存在する官能基と核酸１０ａ及び１１ａとの共有結合による結合や、アビジン又はストレプトアビジンを有する磁気ビーズ１２と、ビオチンを有する核酸１０ａ及び１１ａとのアビジン又はストレプトアビジンとビオチンとの相互作用による結合等が挙げられる。なお、第一の標識プローブ１０及び第二の標識プローブ１１を用いる場合には、測定系中に遊離の一本鎖核酸が存在すると、測定精度の低下につながることから、一本鎖核酸と捕捉プローブとの結合の後に、洗浄等の工程によって遊離の一本鎖核酸を取り除き、一本鎖核酸と捕捉プローブとの複合体に対して第一の標識プローブ１０及び第二の標識プローブ１１を結合させることが好ましい。以降の実施形態においても、同様の順番で結合反応を行なうことが好ましい。
【００２８】
図６は、図５に示す標識プローブと標的二本鎖核酸と捕捉プローブとの結合の様子を模式的に示す図である。以降の図面において共通する構成については、同じ符号を付し、説明を省略する。
図６に示すように、第一の一本鎖核酸６ａが第一の標識プローブ１０及び第一の捕捉プローブ４と結合し、第二の一本鎖核酸６ｂが第二の標識プローブ１１及び第二の捕捉プローブ５と結合するように、第一の標識プローブ１０、第二の標識プローブ１１、第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５が構成されている。第一の一本鎖核酸６ａは、第一の標識プローブ１０が含む核酸１０ａと結合し、第二の一本鎖核酸６ｂは、第二の標識プローブ１１が含む核酸１１ａと結合する。第一の一本鎖核酸６ａは、第二の捕捉プローブ５よりも第一の捕捉プローブ４と優先的に結合し、第二の一本鎖核酸６ｂは、第一の捕捉プローブ４よりも第二の捕捉プローブ５と優先的に結合する。
【００２９】
第一の一本鎖核酸６ａの塩基配列の少なくとも一部に対して、第二の捕捉プローブ５が相補的な塩基配列を有する場合、第一の一本鎖核酸６ａを、第二の捕捉プローブ５よりも第一の捕捉プローブ４と優先的に結合させるためには、第一の一本鎖核酸６ａと第一の捕捉プローブ４との特異的会合条件と、第一の一本鎖核酸６ａと第二の捕捉プローブ５との特異的会合条件とが異なる条件であることが好ましい。特異的会合条件は、標的核酸分子及び核酸プローブの塩基配列の種類や長さ等に依存する。よって、特異的会合条件が異なるように、第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５を設計することが好ましい。
【００３０】
具体的には、一本鎖核酸と捕捉プローブの特異的会合条件は、融解曲線から求めることができる。会合体の形成は一般的に温度条件や塩濃度条件に依存するため、捕捉プローブと一本鎖核酸のみを含有する溶液の温度を、高温から低温へと変化させ、当該溶液の吸光度を測定することにより、融解曲線を求めることができる。得られた融解曲線から、一本鎖状態で存在していた捕捉プローブが、一本鎖核酸と会合体を形成し始めた温度から、ほぼ全てが会合体となった温度までの範囲の温度条件を、特異的会合条件とすることができる。温度に代えて、溶液中の塩濃度を低濃度から高濃度への変化させることによっても、同様にして融解曲線を決定し、特異的会合条件を求めることができる。
【００３１】
このように、特異的会合条件は、一本鎖核酸や捕捉プローブの種類によって異なり、実験的に決定されるものであるが、一般にはＴｍ値（融解温度）で代用することができる。例えば、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、捕捉プローブの塩基配列情報から、一本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する領域のＴｍ値（２本鎖ＤＮＡの５０％が１本鎖ＤＮＡに解離する温度）を算出することができる。
【００３２】
第一の一本鎖核酸６ａを、第二の捕捉プローブ５よりも第一の捕捉プローブ４と優先的に結合させるために、第一の一本鎖核酸６ａと第一の捕捉プローブ４との会合体のＴｍ値は、第一の一本鎖核酸６ａと第二の捕捉プローブ５との会合体のＴｍ値よりも高いことが好ましく、３℃以上高いことがより好ましく、５℃以上高いことがさらに好ましく、１０℃以上高いことが特に好ましい。これにより、第二の捕捉プローブ５を第一の捕捉プローブ４よりも、第一の一本鎖核酸６ａから解離しやすくすることができる。
上記と同様に、第二の一本鎖核酸６ｂを、第一の捕捉プローブ４よりも第二の捕捉プローブ５と優先的に結合させるために、第二の一本鎖核酸６ｂと第二の捕捉プローブ５との会合体のＴｍ値は、第二の一本鎖核酸６ｂと第一の捕捉プローブ４との会合体のＴｍ値よりも、高いことが好ましく、３℃以上高いことがより好ましく、５℃以上高いことがさらに好ましく、１０℃以上高いことが特に好ましい。これにより、第一の捕捉プローブ４を第二の捕捉プローブ５よりも、第二の一本鎖核酸６ｂから解離しやすくすることができる。
【００３３】
第一の一本鎖核酸６ａの塩基配列の少なくとも一部に対して、第二の捕捉プローブ５が相補的な塩基配列を有する場合、その相補的な配列の塩基数は９塩基以下であることが好ましく、５塩基以下であることがより好ましい。第二の一本鎖核酸６ｂの塩基配列の少なくとも一部に対して、第一の捕捉プローブ４が相補的な塩基配列を有する場合、その相補的な配列の塩基数は９塩基以下であることが好ましく、５塩基以下であることがより好ましい。
【００３４】
第一の一本鎖核酸６ａに対する第一の標識プローブ１０及び第一の捕捉プローブ４の結合領域が重複しないようにする観点から、第一の配列及び第三の配列は互いに異なる配列であることが好ましく、第二の一本鎖核酸６ｂに対する第二の標識プローブ１１及び第二の捕捉プローブ５の結合領域が重複しないようにする観点から、第二の配列及び第四の配列は互いに異なる配列であることが好ましい。
さらに、第一の一本鎖核酸６ａの塩基配列のうち、第一の配列に相補的な配列と、第三の配列と相補的な配列とは、重複する配列を有さないことがより好ましく、第二の一本鎖核酸の塩基配列のうち、第二の配列に相補的な配列と、第四の配列と相補的な配列とは、重複する配列を有さないことがより好ましい。
後述する各実施形態に用いられる各種プローブにおいても上記構成であることが同様に好ましい。
【００３５】
また、第一の標識プローブ１０及び第二の標識プローブ１１が結合して標識プローブの利用効率が低下することを防ぐ観点から、第一の標識プローブ１０及び第二の標識プローブ１１が、互いに相補的な配列を有する場合、第一の標識プローブ１０と第一の一本鎖核酸６ａとの会合体のＴｍ値及び第二の標識プローブ１１と第二の一本鎖核酸６ｂとの会合体のＴｍ値は、第一の標識プローブ１０と第二の標識プローブ１１との会合体のＴｍ値よりも高いことが好ましく、３℃以上高いことがより好ましく、５℃以上高いことがさらに好ましく、１０℃以上高いことが特に好ましい。第一の標識プローブ１０及び第二の標識プローブ１１が、互いに相補的な配列を有する場合、その相補的な配列の塩基数は９塩基以下であることが好ましく、５塩基以下であることがより好ましい。
【００３６】
第一の標識プローブ１０及び第二の標識プローブ１１は、互いに測定条件下でハイブリダイズする配列を有さないことがより好ましい。ここでいう、「測定条件下でハイブリダイズする配列を有さない」とは、第一の標識プローブ１０及び第二の標識プローブ１１等のプローブ同士が標的二本鎖核酸の測定条件下で会合しないことを意味する。後述する各種プローブにおいても同様の意味で用いられる。
【００３７】
また、第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５に対して、第一の標識プローブ１０及び第二の標識プローブ１１が結合して標的二本鎖核酸の検出効率が低下することを防ぐ観点から、第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５それぞれの塩基配列の少なくとも一部に対して、第一の標識プローブ１０が相補的な塩基配列を有する場合、第一の標識プローブ１０と第一の一本鎖核酸６ａとの会合体のＴｍ値は、第一の標識プローブ１０と第一の捕捉プローブ４との会合体のＴｍ値及び第一の標識プローブ１０と第二の捕捉プローブ５との会合体のＴｍ値よりも高いことが好ましく、３℃以上高いことがより好ましく、５℃以上高いことがさらに好ましく、１０℃以上高いことが特に好ましい。また、第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５それぞれの塩基配列の少なくとも一部に対して、第二の標識プローブ１１が相補的な塩基配列を有する場合、第二の標識プローブ１１と第二の一本鎖核酸６ｂとの会合体のＴｍ値は、第二の標識プローブ１１と第一の捕捉プローブ４との会合体のＴｍ値及び第二の標識プローブ１１と第二の捕捉プローブ５との会合体のＴｍ値よりも高いことが好ましく、３℃以上高いことがより好ましく、５℃以上高いことがさらに好ましく、１０℃以上高いことが特に好ましい。このようにすることで、第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５に対して、第一の標識プローブ１０及び第二の標識プローブ１１が結合することを抑制できる。第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５それぞれの塩基配列の少なくとも一部に対して、第一の標識プローブ１０が相補的な塩基配列を有する場合、その相補的な配列の塩基数は９塩基以下であることが好ましく、５塩基以下であることがより好ましい。また、第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５それぞれの塩基配列の少なくとも一部に対して、第二の標識プローブ１１が相補的な塩基配列を有する場合、その相補的な配列の塩基数は９塩基以下であることが好ましく、５塩基以下であることがより好ましい。第一の捕捉プローブ及び第二の捕捉プローブに対して、第一の標識プローブ及び第二の標識プローブはいずれも測定条件下でハイブリダイズする配列を有さないことがより好ましい。
【００３８】
第三の配列及び第四の配列の塩基数の下限は、例えば１０塩基であり、１５塩基が好ましく、２０塩基が好ましい。一方、第三の配列及び第四の配列の塩基数の上限は、例えば１５０塩基であり、１００塩基が好ましく、５０塩基がより好ましい。
【００３９】
第一の標識プローブ及び第二の標識プローブは、ＤＮＡから構成されてもよく、ＲＮＡから構成されてもよく、これらを組み合わせて構成されてもよい。また、ＤＮＡ分解酵素やＲＮＡ分解酵素による分解を抑制する観点から、人工核酸を含んでもよい。
【００４０】
［第二実施形態］
図７は、本発明の第二実施形態に係る標的二本鎖核酸の検出方法に用いられる標識プローブを模式的に示す図である。図７に示す標識プローブ１３では、１つの磁気ビーズ１２に第三の配列からなる核酸１０ａ及び第四の配列からなる核酸１１ａが結合した構成である点で図５に示す標識プローブと異なる。当該構成を備えることで、１種類の標識プローブで標的二本鎖核酸の検出を行うことができる。
【００４１】
図８は、図７に示す標識プローブと標的二本鎖核酸と捕捉プローブとの結合の様子を模式的に示す図である。
図８に示すように、第一の一本鎖核酸６ａが標識プローブ１３及び第一の捕捉プローブ４と結合するように、第二の一本鎖核酸６ｂが標識プローブ１３及び第二の捕捉プローブ５と結合するように、標識プローブ１３、第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５が構成されている。第一の一本鎖核酸６ａは、標識プローブ１３が含む核酸１０ａと結合し、第二の一本鎖核酸６ｂは、標識プローブ１３が含む核酸１１ａと結合する。
【００４２】
また、標識プローブ１３同士が結合して標識プローブの利用効率が低下することを防ぐ観点から、標識プローブ１３同士、すなわち、核酸１０ａ及び核酸１１ａが、互いに相補的な配列を有する場合、核酸１０ａと第一の一本鎖核酸６ａとの会合体のＴｍ値及び核酸１１ａと第二の一本鎖核酸６ｂとの会合体のＴｍ値は、核酸１０ａと核酸１１ａとの会合体のＴｍ値よりも高いことが好ましく、３℃以上高いことがより好ましく、５℃以上高いことがさらに好ましく、１０℃以上高いことが特に好ましい。このようにすることで、標識プローブ１３同士が結合することを抑制できる。標識プローブ１３同士、すなわち、核酸１０ａ及び核酸１１ａが、互いに相補的な配列を有する場合、その相補的な配列の塩基数は９塩基以下であることが好ましく、５塩基以下であることがより好ましい。標識プローブ１３同士、すなわち、核酸１０ａ及び核酸１１ａは、測定条件下でハイブリダイズする配列を有さないことがより好ましい。
【００４３】
また、第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５に対して、標識プローブ１３が結合して標的二本鎖核酸の検出効率が低下することを防ぐ観点から、第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５それぞれの塩基配列の少なくとも一部に対して、標識プローブ１３、すなわち核酸１０ａ及び核酸１１ａが相補的な塩基配列を有する場合、核酸１０ａと第一の一本鎖核酸６ａとの会合体のＴｍ値及び核酸１１ａと第二の一本鎖核酸６ｂとの会合体のＴｍ値は、核酸１０ａと第一の捕捉プローブ４との会合体のＴｍ値、核酸１１ａと第一の捕捉プローブ４との会合体のＴｍ値、核酸１０ａと第二の捕捉プローブ５との会合体、及び核酸１１ａと第二の捕捉プローブ５との会合体のＴｍ値よりも高いことが好ましく、３℃以上高いことがより好ましく、５℃以上高いことがさらに好ましく、１０℃以上高いことが特に好ましい。このようにすることで、第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５に対して、標識プローブ１３が結合することを抑制できる。第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５それぞれの塩基配列の少なくとも一部に対して、標識プローブ１３が相補的な塩基配列を有する場合、その相補的な配列の塩基数は９塩基以下であることが好ましく、５塩基以下であることがより好ましい。第一の捕捉プローブ及び第二の捕捉プローブに対して、標識プローブ１３は測定条件下でハイブリダイズする配列を有さないことがより好ましい。
【００４４】
［第三実施形態］
図９は、本発明の第三実施形態に係る標的二本鎖核酸の検出方法における標的二本鎖核酸と磁気ビーズとの結合の様子を模式的に示す図である。図９では、磁気ビーズ１２が第三の配列からなる核酸１０ａ及び第四の配列からなる核酸１１ａの代わりに、アビジン又はストレプトアビジン１５を有し、標的二本鎖核酸の末端にビオチン１４が結合している点で、図６に示す結合の様子と異なる。上記構成を有することで、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジンとの相互作用を介して磁気ビーズと第一の一本鎖核酸又は第二の一本鎖核酸とを確実に結合させることができる。
図９に示すように、アビジン又はストレプトアビジン１５を有する磁気ビーズ１２は、５’末端又は３’末端にビオチン１４を有する第一の一本鎖核酸６ａ及び第二の一本鎖核酸６ｂを検出する場合に用いることができる。すなわち、アビジン又はストレプトアビジン１５を有する磁気ビーズ１２は、５’末端又は３’末端にビオチン１４を有する第一の一本鎖核酸６ａ及び第二の一本鎖核酸６ｂに直接的に結合するように構成されている。なお、５’末端又は３’末端にビオチン１４を有する第一の一本鎖核酸６ａ及び第二の一本鎖核酸６ｂは、例えば、標的二本鎖核酸を試料として、末端にビオチンを有するプライマーセットを用いたＰＣＲ等を行うことで得られる。
【００４５】
［第四実施形態］
図１０は、本発明の第四実施形態に係る標的二本鎖核酸の検出方法に用いられるビオチン付プローブを模式的に示す図である。図１０に示すように、第一のビオチン付プローブ１６は、第三の配列からなる核酸１０ａを含み、且つ、ビオチン１４を有する。第二のビオチン付プローブ１７は、第四の配列からなる核酸１１ａを含み、且つ、ビオチン１４を有する。第四実施形態は、ビオチン付プローブを用いることで、標的二本鎖核酸に直接ビオチンを付加することが難しい場合に好ましく用いることができる。
【００４６】
図１１は、図１０に示すビオチン付プローブと標的二本鎖核酸と捕捉プローブとの結合の様子を模式的に示す図である。図１１では、ビオチン付標的二本鎖核酸の代わりに、ビオチン付プローブを用いている点で、図９に示す結合の様子と異なる。
図１１に示すように、第一の一本鎖核酸６ａが第一のビオチン付プローブ１６及び第一の捕捉プローブ４と結合し、第二の一本鎖核酸６ｂが第二のビオチン付プローブ１７及び第二の捕捉プローブ５と結合するように、第一のビオチン付プローブ１６、第二のビオチン付プローブ１７、第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５が構成されている。
【００４７】
また、第一のビオチン付プローブ１６及び第二のビオチン付プローブ１７が結合してビオチン付プローブの利用効率が低下することを防ぐ観点から、第一のビオチン付プローブ１６及び第二のビオチン付プローブ１７が、互いに相補的な配列を有する場合、第一のビオチン付プローブ１６と第一の一本鎖核酸６ａとの会合体のＴｍ値及び第二のビオチン付プローブ１７と第二の一本鎖核酸６ｂとの会合体のＴｍ値は、第一のビオチン付プローブ１６と第二のビオチン付プローブ１７との会合体のＴｍ値よりも高いことが好ましく、３℃以上高いことがより好ましく、５℃以上高いことがさらに好ましく、１０℃以上高いことが特に好ましい。このようにすることで、第一のビオチン付プローブ１６と第二のビオチン付プローブ１７とが結合することを抑制できる。第一のビオチン付プローブ１６及び第二のビオチン付プローブ１７が、互いに相補的な配列を有する場合、その相補的な配列の塩基数は９塩基以下であることが好ましく、５塩基以下であることがより好ましい。第一のビオチン付プローブ１６及び第二のビオチン付プローブ１７は、互いに測定条件下でハイブリダイズする配列を有さないことがより好ましい。
【００４８】
また、第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５に対して、第一のビオチン付プローブ１６及び第二のビオチン付プローブ１７が結合して標的二本鎖核酸の検出効率が低下することを防ぐ観点から、第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５それぞれの塩基配列の少なくとも一部に対して、第一のビオチン付プローブ１６が相補的な塩基配列を有する場合、第一のビオチン付プローブ１６と第一の一本鎖核酸６ａとの会合体のＴｍ値は、第一のビオチン付プローブ１６と第一の捕捉プローブ４との会合体のＴｍ値及び第一のビオチン付プローブ１６と第二の捕捉プローブ５との会合体のＴｍ値よりも高いことが好ましく、３℃以上高いことがより好ましく、５℃以上高いことがさらに好ましく、１０℃以上高いことが特に好ましい。また、第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５それぞれの塩基配列の少なくとも一部に対して、第二のビオチン付プローブ１７が相補的な塩基配列を有する場合、第二のビオチン付プローブ１７と第二の一本鎖核酸６ｂとの会合体のＴｍ値は、第二のビオチン付プローブ１７と第一の捕捉プローブ４との会合体のＴｍ値及び第二のビオチン付プローブ１７と第二の捕捉プローブ５との会合体のＴｍ値よりも高いことが好ましく、３℃以上高いことがより好ましく、５℃以上高いことがさらに好ましく、１０℃以上高いことが特に好ましい。このようにすることで、第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５に対して、第一のビオチン付プローブ１６及び第二のビオチン付プローブ１７が結合することを抑制できる。第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５それぞれの塩基配列の少なくとも一部に対して、第一のビオチン付プローブ１６が相補的な塩基配列を有する場合、その相補的な配列の塩基数は９塩基以下であることが好ましく、５塩基以下であることがより好ましい。また、第一の捕捉プローブ４及び第二の捕捉プローブ５それぞれの塩基配列の少なくとも一部に対して、第二のビオチン付プローブ１７が相補的な塩基配列を有する場合、その相補的な配列の塩基数は９塩基以下であることが好ましく、５塩基以下であることがより好ましい。第一の捕捉プローブ及び第二の捕捉プローブに対して、第一のビオチン付プローブ１６及び第二のビオチン付プローブ１７はいずれも測定条件下でハイブリダイズする配列を有さないことがより好ましい。
【００４９】
図１２は図１１に示すビオチン付プローブと標的二本鎖核酸と捕捉プローブとの複合体にさらに磁気ビーズが結合した様子を模式的に示す図である。
図１２に示すように、アビジン又はストレプトアビジン１５を有する磁気ビーズ１２は、５’末端又は３’末端にビオチン１４を有する第一のビオチン付プローブ１６又は第二のビオチン付プローブ１７を介して、第一の一本鎖核酸６ａ及び第二の一本鎖核酸６ｂに間接的に結合するように構成されている。
【００５０】
上記第一及び第二実施形態の標的二本鎖核酸の検出方法において、第一の捕捉プローブ及び第二の捕捉プローブと第一の一本鎖核酸及び第二の一本鎖核酸との結合、第一の一本鎖核酸及び第二の一本鎖核酸と標識プローブ（第一の標識プローブ及び第二の標識プローブ）との結合の順序は特別な限定はなく、任意の順序とすることができ、複数種類の結合を同時に行ってもよい。
【００５１】
また、上記第三実施形態の標的二本鎖核酸の検出方法において、第一の捕捉プローブ及び第二の捕捉プローブとビオチンを有する第一の一本鎖核酸及び第二の一本鎖核酸との結合、ビオチンを有する第一の一本鎖核酸及び第二の一本鎖核酸とアビジン又はストレプトアビジンを有する磁気ビーズとの結合の順序は特別な限定はなく、任意の順序とすることができ、複数種類の結合を同時に行ってもよい。中でも、アビジン又はストレプトアビジンは熱により変性しやすいことから、加熱を必要する結合の後に、ビオチンを有する第一の一本鎖核酸及び第二の一本鎖核酸とアビジン又はストレプトアビジンを有する磁気ビーズとの結合を行うことが好ましい。
【００５２】
また、上記第四実施形態の標的二本鎖核酸の検出方法において、第一の捕捉プローブ及び第二の捕捉プローブと第一の一本鎖核酸及び第二の一本鎖核酸との結合、第一のビオチン付プローブ及び第二のビオチン付プローブと第一の一本鎖核酸及び第二の一本鎖核酸との結合、アビジン又はストレプトアビジンを有する磁気ビーズと第一のビオチン付プローブ及び第二のビオチン付プローブとの結合の順序は特別な限定はなく、任意の順序とすることができ、複数種類の結合を同時に行ってもよい。中でも、アビジン又はストレプトアビジンは熱により変性しやすいことから、加熱を必要する結合の後に、アビジン又はストレプトアビジンを有する磁気ビーズと第一のビオチン付プローブ及び第二のビオチン付プローブとの結合を行うことが好ましい。
【００５３】
＜その他の構成＞
本実施形態の核酸捕捉センサは、上記センサ素子及び捕捉プローブに加えて、その他の構成を備えることができる。その他の構成については、以下に示すものが例示される。
【００５４】
［基板］
基板は、図２に示すように、支持体及び保護膜がこの順に積層されていることが好ましい。
【００５５】
基板の厚さは、特に限定はないが、例えば４００μｍ以上２０００μｍ以下とすることができる。基板の厚さがこのような範囲であることで、適度な強度を有し、薄型化及び軽量化された核酸捕捉センサを得ることができる。
ここで、「基板の厚さ」とは、基板全体の厚さを意味し、例えば、複数層からなる基板の厚さとは、基板を構成するすべての層の合計の厚さを意味する。
【００５６】
（支持体）
支持体の材質としては、例えば、シリコンやＡｌＴｉＣ（アルティック）等の半導体や導電体、又はアルミナやガラス等の絶縁体等が挙げられる。支持体はこれら材質のうち１種単独で構成されているものであってもよく、２種以上で構成されているものであってもよい。また、支持体の形態は特に問われるものではない。
【００５７】
支持体は１層（単層）からなるものでもよく、２層以上の複数層からなるものでもよい。また、支持体が複数層からなる場合、これら複数層は、互いに同一でも異なっていてもよく、これら複数層の組み合わせは特に限定されない。
【００５８】
支持体の厚さは、特に限定はないが、例えば４００μｍ以上２０００μｍ以下とすることができる。
ここで、「支持体の厚さ」とは、支持体全体の厚さを意味し、例えば、複数層からなる支持体の厚さとは、支持体を構成するすべての層の合計の厚さを意味する。
【００５９】
（保護膜）
保護膜は、センサ素子を保護可能であるものであれば特に限定されない。
保護膜の材質としては、例えば、アルミナ、シリカ、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化インジウム、酸化タルタル、酸化亜鉛、酸化ガリウム、酸化スズ等の酸化物；金、銀、白金、ロジウム、ルテニウム、パラジウム等の貴金属；窒化アルミ、窒化シリコン等の無機物；ポリイミド等の有機物等が挙げられる。保護膜はこれら材質のうち１種単独で構成されているものであってもよく、２種以上で構成されているものであってもよい。また、保護膜の形態は特に問われるものではない。
【００６０】
保護膜は１層（単層）からなるものであってもよく、２層以上の複数層からなるものであってもよい。また、保護膜が複数層からなる場合、これら複数層は、互いに同一でも異なっていてもよく、これら複数層の組み合わせは特に限定されない。
【００６１】
保護膜の厚さは、例えば１０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下とすることができる。センサ素子上の保護膜の厚さは、例えば１ｎｍ以上１０００ｎｍ以下とすることができる。
ここで、「保護膜の厚さ」とは、保護膜全体の厚さを意味し、例えば、複数層からなる保護膜の厚さとは、保護膜を構成するすべての層の合計の厚さを意味する。
【００６２】
≪核酸検出カートリッジ≫
本実施形態の核酸検出カートリッジは、上記核酸捕捉センサと、磁気ビーズと、を備える。
【００６３】
本実施形態の核酸検出カートリッジによれば、上記核酸捕捉センサを備えることで、試料中の標的二本鎖核酸の検出において、試料中の一種類の標的二本鎖核酸に対して、二種類の検出信号が得られるため、測定結果の信頼性が向上する。また、後述する実施例に示すように、例えば二種類の検出信号の比を用いることで、測定の異常を検出することができる。
【００６４】
＜核酸検出カートリッジの構造＞
本実施形態の核酸検出カートリッジの構造について、以下、図面を参照しながら説明する。なお、以下の説明で用いる図は、核酸検出カートリッジの特徴を分かり易くするために、便宜上、要部となる部分を拡大して示している場合があり、各構成要素の寸法比率等が実際と同じであるとは限らない。
【００６５】
図１３〜１４は、本発明の一実施形態に係る核酸検出カートリッジ２００を示す図である。図１３は、本発明の一実施形態に係る核酸検出カートリッジ２００を模式的に示す平面図である。図１４は、図１３に示す核酸検出カートリッジ２００の分解斜視図である。
図１３に示すように、核酸検出カートリッジ２００は、核酸捕捉センサ１００と、試料溶液貯留部１０１と、洗浄溶液貯留部１０２と、磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）貯留部１０３と、を備える。
【００６６】
試料溶液貯留部１０１は、標的二本鎖核酸を含む試料溶液７を注入し、貯留するように構成されている。試料溶液貯留部１０１は、試料溶液７を注入するための開閉可能な上蓋を備えることが好ましい。
【００６７】
洗浄溶液１０２及び磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）貯留部１０３は、それぞれ洗浄溶液及び磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）を貯留するように構成されている。磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）貯留部１０３には、例えば、上述した図５に示す第一の標識プローブ１０及び第二の標識プローブ１１を含む溶液が貯留されている。他の例では、磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）貯留部１０３には、上述した図７に示す標識プローブ１３を含む溶液が貯留されている。さらに他の例では、磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）貯留部１０３には、上述した図９に示すアビジン又はストレプトアビジン１５を有する磁気ビーズ１２を含む溶液が貯留されている。これらの溶液は封止された状態で核酸検出カートリッジ内に貯留されていることが好ましい。
【００６８】
図１４に示すように、核酸検出カートリッジ２００は、ベースプレート２０１と、ベースプレート２０１上に積層される基板２０２と、基板２０２を挟み込んだ状態でベースプレート２０１上に載置されるカバープレート２０３とを備えている。
【００６９】
具体的には、核酸検出カートリッジ２００は、試料溶液貯留部１０１、洗浄溶液貯留部１０２及び磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）貯留部１０３と、核酸捕捉センサ１００と、流路１０４ｄと、試料溶液貯留部１０１に接続され、試料溶液貯留部１０１からの試料溶液を流路１０４ｄに輸送可能に構成された流路１０４ａと、両端部がそれぞれ洗浄溶液貯留部１０２及び流路１０４ｄに接続された流路１０４ｂと、両端部がそれぞれ磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）貯留部１０３及び流路１０４ｄに接続された流路１０４ｃと、流路１０４ｄに接続し、各貯留部並びに流路１０４ａ、１０４ｂ及び１０４ｃから流路１０４ｄを介して輸送された各溶液が核酸捕捉センサ１００上に輸送可能に構成された流路１０４ｅと、流路１０４ｅに接続し、核酸捕捉センサ１００上を通過した溶液を基板２０２に設けられた孔１０６を介して排液プール１０７に排出するように構成された流路１０４ｆと、を有する。
【００７０】
図１４に示す核酸検出カートリッジ２００では、試料溶液貯留部１０１、洗浄溶液貯留部１０２及び磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）貯留部１０３、並びに、流路１０４ａ、１０４ｂ、１０４ｃ、１０４ｄ、１０４ｅ及び１０４ｆがカバープレート２０３に設けられており、基板２０２に核酸捕捉センサ１００に設けられている。但し、試料溶液貯留部１０１、洗浄溶液貯留部１０２及び磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）貯留部１０３、並びに、流路１０４ａ、１０４ｂ、１０４ｃ、１０４ｄ、１０４ｅ及び１０４ｆは、これに限らず、ベースプレート２０１に設けられてもよい。
【００７１】
試料溶液貯留部１０１、洗浄溶液貯留部１０２及び磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）貯留部１０３は、カバープレート２０３の上面２０３ａに設けられており、流路１０４ａ、１０４ｂ、１０４ｃ、１０４ｄ、１０４ｅ及び１０４ｆは、カバープレート２０３の下面２０３ｂに設けられている。そして、試料溶液貯留部１０１、洗浄溶液貯留部１０２及び磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）貯留部１０３は、それぞれ不図示の連通孔を介してそれぞれ流路１０４ａ、１０４ｂ及び１０４ｃに連通している。核酸検出カートリッジ２００は、例えば透明性の樹脂で形成されており、流路１０４ａ、１０４ｂ及び１０４ｃが、カバープレート２０３の上面２０３ａ側から視認可能に構成されている。
【００７２】
また、試料溶液貯留部１０１、洗浄溶液貯留部１０２及び磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）貯留部１０３は、各溶液を送液するように弁及びポンプを備えていてもよい。或いは、試料溶液貯留部１０１、洗浄溶液貯留部１０２及び磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）貯留部１０３は、封止された状態で各貯留部外部の上面から物理的に圧力をかけることで、各溶液が流路内に押出されるように構成されていてもよい。具体的には、図１４に示すように、試料溶液貯留部１０１、洗浄溶液貯留部１０２及び磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）貯留部１０３には、それぞれ弾性部材で形成されたキャップ部材１０１ａ、１０２ａ及び１０３ａが着脱可能に取り付けられている。例えば、試料溶液貯留部１０１にキャップ部材１０１ａを取り付けた状態で注射器等の器具を用いて試料溶液貯留部１０１に試料溶液を注入して格納し、その後キャップ部材１０１ａを押圧することで、試料溶液貯留部１０１内の試料溶液が流路１０４ａ、１０４ｄ及び１０４ｅに供給される。洗浄溶液貯留部１０２及び磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）貯留部１０３に溶液を格納する場合も、上記と同様であるので、その説明を省略する。
【００７３】
基板２０２の上面２０２ａには核酸捕捉センサ１００が設けられており、核酸捕捉センサ１００は、基板２０２に上面が露出するように埋め込まれている。
【００７４】
また、核酸検出カートリッジ２００は、核酸捕捉センサ１００の下流側に設けられた流路１０４ｆと、基板２０２に設けられた孔１０６を介して流路１０４ｆに接続された排液プール１０７とを備える。図１４に示す核酸検出カートリッジ２００では、流路１０４ｆは、カバープレート２０３の下面２０３ｂに設けられており、排液プール１０７は、ベースプレート２０１の上面２０１ａに設けられている。流路１０４ｆは、試料溶液貯留部１０１に直接接続されておらず、排液プール１０７のみに直接接続されている。
【００７５】
本実施形態に係る核酸検出カートリッジは、図１３〜１４に示すものに限定されず、その効果を損なわない範囲内において、図１３〜１４に示すものの一部の構成が変更又は削除されたものや、これまでに説明したものにさらに他の構成が追加されたものであってもよい。
例えば、図１３〜１４に示す核酸検出カートリッジにおいて、試料溶液貯留部１０１及び洗浄溶液貯留部１０２の間、又は、洗浄溶液貯留部１０２及び磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）貯留部１０３の間に配置され、第一のビオチン付プローブ及び第二のビオチン付プローブを含む溶液を貯留するように構成されているビオチン付プローブ溶液貯留部と、ビオチン付プローブ溶液貯留部及び流路１０４ｄに接続しており、ビオチン付プローブ溶液を送液できるように構成されている流路と、を更に備えていてもよい。
【００７６】
＜標的二本鎖核酸の検出方法＞
次いで、本実施形態の核酸検出カートリッジを用いた標的二本鎖核酸の検出方法について、以下に説明する。
試料溶液貯留部１０１に加熱処理前又は加熱処理後の試料溶液７を注入後、核酸検出装置に挿入することで、標的二本鎖核酸の検出及び濃度測定等の処理が自動で行われる。加熱処理前の試料溶液を用いる場合には、試料溶液貯留部１０１に注入後、加熱を行ってもよい。このとき、核酸検出装置は、試料溶液貯留部を加熱するように構成されている加熱部を備える。次いで、封止された状態で試料溶液貯留部１０１外部の上面から物理的に圧力を加え、試料溶液７を試料溶液貯留部１０１から流路１０４ａに押し出し、さらに流路１０４ｄ及び１０４ｅに送液して、核酸捕捉センサ１００に到達させる。試料溶液７が核酸捕捉センサ１００に到達後、１０分間以上６０分間以下程度の時間、静置することが好ましい。このとき、試料溶液中の第一の一本鎖核酸及び第二の一本鎖核酸は、それぞれ第一の捕捉プローブ及び第二の捕捉プローブに結合する。次いで、封止された状態で洗浄溶液貯留部１０２外部の上面から物理的に圧力を加え、洗浄溶液８を洗浄溶液貯留部１０２から流路１０４ｂに押し出し、さらに流路１０４ｄ及び１０４ｅに送液して、核酸捕捉センサ１００に到達させる。このとき、核酸捕捉センサ１００に到達していた試料溶液は流路１０４ｆに送液されて、廃棄される。洗浄溶液８により核酸捕捉センサ１００が洗浄され、第一の捕捉プローブ及び第二の捕捉プローブに結合していない核酸分子やその他成分は測定系内から取り除かれる。次いで、第一のセンサ素子及び第二のセンサ素子が磁気センサ素子である場合は、洗浄溶液が核酸捕捉センサ１００に到達後から、外部磁場を印加し、核酸捕捉センサ１００中の第一のセンサ素子及び第二のセンサ素子の出力の測定を開始する。次いで、第一のセンサ素子及び第二のセンサ素子の出力の測定を継続しながら、封止された状態で磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）貯留部１０３外部の上面から物理的に圧力を加え、磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）９を磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）貯留部１０３から流路１０４ｃに押し出し、さらに流路１０４ｅに送液して、核酸捕捉センサ１００に到達させる。磁気ビーズ（標識プローブ）の一例として、図５又は図７に示す標識プローブを用いる。
【００７７】
第一のセンサ素子及び第二のセンサ素子の出力の測定を継続し、例えば、これらの出力飽和値を用いて、第一のセンサ素子の出力から算出される標的二本鎖核酸の濃度及び第二のセンサ素子の出力から算出される標的二本鎖核酸の濃度を得る。
上記標的二本鎖核酸の濃度の算出は、予め核酸検出装置（図示せず）において測定結果から自動的に計算するように設定しておくことができる。
【００７８】
本実施形態の核酸検出カートリッジを用いることで、磁気ビーズが核酸捕捉センサ上に吸着していく過程を、リアルタイムで測定することができる。
【００７９】
≪核酸検出キット≫
本実施形態の核酸検出キットは、上記核酸捕捉センサと、磁気ビーズと、を備える。
【００８０】
本実施形態の核酸検出キットによれば、試料中の標的二本鎖核酸の検出において、試料中の一種類の標的二本鎖核酸に対して、二種類の検出信号が得られるため、測定結果の信頼性が向上する。また、後述する実施例に示すように、例えば二種類の検出信号の比を用いることで、測定の異常を検出することができる。
【００８１】
本発明の一実施形態に係る核酸検出キットとしては、磁気ビーズ溶液や洗浄溶液等が予め貯留されていない上記核酸カートリッジと、磁気ビーズ溶液や洗浄溶液等がそれぞれ小分けされて封入された保存容器（例えば、チューブ等）と、を備える形態であってもよい。この核酸検出キットでは、ユーザーが試料溶液、磁気ビーズ溶液、洗浄溶液等を核酸カートリッジに充填し、封止した後、核酸検出装置にセットすることで、標的二本鎖核酸の検出や濃度測定を行うことができる。
【００８２】
本発明の別の実施形態に係る核酸検出キットとしては、上記核酸捕捉センサと、磁気ビーズ溶液や洗浄溶液等がそれぞれ小分けされて封入された保存容器（例えば、チューブ等）と、を備える形態であってもよい。この核酸検出キットでは、ユーザーが核酸捕捉センサを、内部に流路が形成されている核酸検出装置にセットし、シリンジポンプ等を用いてチューブに封入された各種溶液を核酸捕捉センサ上に送液することで、標的二本鎖核酸の検出や濃度測定を行うことができる。
【００８３】
核酸検出キットに含まれる各種溶液としては、例えば、第一標識プローブ１０及び第二標識プローブ１１の混合溶液と洗浄溶液とが、別々のチューブに小分けされている形態や、標識プローブ１３の溶液と洗浄溶液とが、別々のチューブに小分けされている形態、或いは、アビジン又はストレプトアビジン１５を有する磁気ビーズ１２の溶液と、第一のビオチン付プローブ１６及び第二のビオチン付プローブ１７を含む溶液と、洗浄溶液とが、別々のチューブに小分けされている形態等が挙げられる。
【００８４】
磁気ビーズとしては、上記核酸捕捉センサにおいて例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、第一の標識プローブ、第二の標識プローブ、標識プローブ、第一のビオチン付プローブ及び第二のビオチン付プローブとしては、上記核酸捕捉センサにおいて例示されたものと同様のものが挙げられる。
【実施例】
【００８５】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８６】
［実施例］
１．材料
（センサ）
第一のセンサ素子及び第二のセンサ素子として２つのＧＭＲ素子（ＧＭＲ１及びＧＭＲ２）を有し、ＧＭＲ素子の上の保護膜表面にカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）を有するセンサを用いた。
【００８７】
（標的二本鎖核酸）
以下に示すＮ１及びＮ２からなる二本鎖核酸を用いた。
Ｎ１：
5’-ATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGT-3’（配列番号１）
Ｎ２：
5’-ACCACCAGGATGAACAGGAAGAAGCCCACCCCGTAGCTGAGGATGCCTGCATACACACTGCCCGCCTCGTCAGCCTCCACCAGCTCCTCCTCGGCTGCAAAGACAT-3’（配列番号２）
【００８８】
（捕捉プローブ）
Ｃ１（ＧＭＲ１上に固定）：5’-AGCTCCTCCTCGGCTGCAAAGACAT-3’-NH2（配列番号３）
Ｃ２（ＧＭＲ２上に固定）：H2N-5’-ATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCT-3’（配列番号４）
【００８９】
（ビオチン付プローブ）
Ｂ１：Biotin-5’-ACCACCAGGATGAACAGGAAGAAGC-3’（配列番号５）
Ｂ２：5’-GCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGG-3’-Biotin（配列番号６）
【００９０】
なお、標的二本鎖核酸に対する、２種類の捕捉プローブ及びビオチン付プローブの結合領域を図１５に示す。
【００９１】
（溶液）
・試料溶液の組成
１ｎＭ又は５ｎＭの標的二本鎖核酸
０．１質量％のＴｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、製品番号P7949-100ML、界面活性剤)
トリス塩酸緩衝液（pH7.3）
【００９２】
・ビオチン付プローブ溶液の組成
５ｎＭのビオチン付プローブＢ１
５ｎＭのビオチン付プローブＢ２
０．１質量％のＴｗｅｅｎ  ２０
トリス塩酸緩衝液（pH7.3）
【００９３】
・洗浄溶液
０．１質量％のＴｗｅｅｎ  ２０
リン酸緩衝生理食塩水
【００９４】
・磁気ビーズ溶液
０．５質量％のストレプトアビジン付磁気ビーズ（Magnetic Beads, Coated with Streptavidin）
０．１質量％のＴｗｅｅｎ  ２０
リン酸緩衝生理食塩水
【００９５】
２．核酸捕捉センサの準備
捕捉プローブＣ１及びＣ２のＧＭＲ素子上への固定化は以下に示す手順で行った。まず、５μＭの捕捉プローブＣ１を含むＨＥＰＥＳ緩衝液をスポッターによってＧＭＲ１上の保護膜表面に滴下した後、純水で洗浄した。保護膜表面のカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）と、捕捉プローブＣ１の３’末端のアミノ基（−ＮＨ２）とが脱水縮合することでアミド結合を形成し、ＧＭＲ１上の保護膜表面に捕捉プローブＣ１を固定化した。捕捉プローブＣ２についても、ＧＭＲ２上の保護膜表面に滴下した以外は、捕捉プローブＣ１と同様の方法を用いて、ＧＭＲ２上の保護膜表面に捕捉プローブＣ２を固定化した。捕捉プローブの固定化が完了したＧＭＲ１及びＧＭＲ２を核酸検出カートリッジにセットした。核酸検出カートリッジには、洗浄溶液貯留部に上記の洗浄溶液が予め貯留され、磁気ビーズ溶液貯留部に上記の磁気ビーズ溶液が予め貯留されている。
【００９６】
３．試料溶液中の標的二本鎖核酸の測定
試料溶液中の標的二本鎖核酸の測定について、以下に示す手順で行った。また、核酸捕捉センサ上での標的二本鎖核酸、各プローブ、及び磁気ビーズの結合の流れを図１６に示す。図１６中、矢印は配列同士が相補的であることを意味する。
（１）試料溶液と、ビオチン付プローブ溶液を容量比１：１で混合して、混合液を調製した。
（２）（１）で得られた混合液を９７℃で２０分間加熱した。
（３）加熱後の混合液を氷冷後、すぐに核酸検出カートリッジの試料溶液貯留部に注入し、核酸検出装置にセットして混合液をＧＭＲ１及びＧＭＲ２上に到達させた。
（４）混合液がＧＭＲ１及びＧＭＲ２上に到達した状態で、３０分間静置した。
（５）次に、核酸検出カートリッジの洗浄溶液貯留部に貯留されている洗浄溶液をＧＭＲ１及びＧＭＲ２上に到達させて、ＧＭＲ１及びＧＭＲ２の表面を洗浄した。
（６）ＧＭＲ１及びＧＭＲ２の面内方向に３０Ｏｅの外部磁場を印加し、ＧＭＲ１及びＧＭＲ２の出力値を変換したそれぞれの抵抗値（それぞれＲ１及びＲ２）の測定を開始した。
（７）ＧＭＲ１及びＧＭＲ２の抵抗値の測定を継続しながら、核酸検出カートリッジの磁気ビーズ溶液貯留部に貯留されている磁気ビーズ溶液をＧＭＲ１及びＧＭＲ２上に送液した。
（８）磁気ビーズ溶液の送液前に対する送液から１０分後でのＧＭＲ１及びＧＭＲ２それぞれの抵抗変化率（それぞれｒ１１０及びｒ２１０）を以下に示す式を用いて算出した。式中、ｔは時刻を表し、ｔ＝０は磁気ビーズ溶液の送液開始時を表す。
【００９７】
ｒ１ｔ＝（Ｒ１ｔ−Ｒ１０）／Ｒ１０×１００
ｒ２ｔ＝（Ｒ２ｔ−Ｒ２０）／Ｒ２０×１００
【００９８】
（９）ｒ１１０及びｒ２１０と予め作成した検量線を用いてＧＭＲ１の抵抗変化率ｒ１１０から算出される標的二本鎖核酸の濃度（Ｎ１）及びＧＭＲ１の抵抗変化率ｒ２１０から算出される標的二本鎖核酸の濃度（Ｎ２）を算出した。
【００９９】
なお、１ｎＭ及び５ｎＭの標的二本鎖核酸を含む試料溶液を用いて、測定をそれぞれ５回行った。核酸捕捉センサ（ＧＭＲ１及びＧＭＲ２）及び核酸検出カートリッジは１回の測定につき１枚使用し、使い捨てとした。結果を表１に示す。
【０１００】
【表１】
2020156354.tif 000003
【０１０１】
表１では、Ｒｕｎ４において、Ｎ１とＮ２との差異およびｒ２１０／ｒ１１０の値が大きくなっており、Ｒｕｎ４の測定時に何らかのエラーが発生していると判断された。Ｒｕｎ４の測定後に解析を行ったところ、Ｒｕｎ４では核酸検出カートリッジの流路への気泡混入により、エラーが発生したものと判明した。
また、Ｒｕｎ９において、Ｎ１とＮ２との差異およびｒ２１０／ｒ１１０の値が大きくなっており、Ｒｕｎ９の測定時に何らかのエラーが発生していると判断された。Ｒｕｎ９の測定後にＧＭＲの解析を行ったところ、ＧＭＲ２の不良により、エラーが発生したものと判明した。
【０１０２】
本実施例では、例えば、基準値としてｒ２１０／ｒ１１０が０．５以上１．０以下の範囲を正常範囲とし、ｒ２１０／ｒ１１０が上記正常範囲を外れた測定に関しては、測定後の解析を行わなくてもエラーが起きていることが容易にわかる。よって、本実施例の核酸捕捉センサを用いることで、一回の測定においてｒ２１０／ｒ１１０が上記正常範囲から外れた場合には、測定時に何かエラーが起きたと判断し、再測定を行うことを選択することできる。
【０１０３】
［比較例］
１．材料
（センサ）
センサ素子として１つのＧＭＲ素子（ＧＭＲ１）を有し、ＧＭＲ素子の上の保護膜表面にカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）を有するセンサを用いた。
【０１０４】
標的二本鎖核酸としては、実施例と同様のものを用いた。また、捕捉プローブとしては、実施例に記載の捕捉プローブのうち、捕捉プローブＣ１のみを用いた。ビオチン付プローブとしては、実施例に記載のビオチン付プローブのうち、ビオチン付プローブＢ１のみを用いた。なお、標的二本鎖核酸に対する、１種類の捕捉プローブ及びビオチン付プローブの結合領域を図１７に示す。
【０１０５】
（溶液）
試料溶液、洗浄溶液及び磁気ビーズ溶液は実施例に記載のものと同様のものを使用した。
【０１０６】
・ビオチン付プローブ溶液
５ｎＭのビオチン付プローブＢ１
０．１質量％のＴｗｅｅｎ  ２０
トリス塩酸緩衝液（pH7.3）
【０１０７】
２．核酸捕捉センサの準備
捕捉プローブＣ１のＧＭＲ素子上への固定化は以下に示す手順で行った。まず、５μＭの捕捉プローブＣ１を含むＨＥＰＥＳ緩衝液をスポッターによってＧＭＲ１上の保護膜表面に滴下した後、純水で洗浄した。保護膜表面のカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）と、捕捉プローブＣ１の３’末端のアミノ基（−ＮＨ２）とが脱水縮合することでアミド結合を形成し、ＧＭＲ１上のセンサ表面に捕捉プローブＣ１を固定化した。捕捉プローブの固定化が完了したＧＭＲ１を核酸検出カートリッジにセットした。実施例と同様に、核酸検出カートリッジには、洗浄溶液貯留部に洗浄溶液が予め貯留され、磁気ビーズ溶液貯留部に磁気ビーズ溶液が予め貯留されている。
【０１０８】
３．試料溶液中の標的二本鎖核酸の測定
試料溶液中の標的二本鎖核酸の測定について、以下に示す手順で行った。また、核酸捕捉センサ上での標的二本鎖核酸、各プローブ、及び磁気ビーズの結合の流れを図１８に示す。図１８中、矢印は配列同士が相補的であることを意味する。
（１）試料溶液と、ビオチン付プローブ溶液を容量比１：１で混合して、混合液を調製した。
（２）（１）で得られた混合液を９７℃で２０分間加熱した。
（３）加熱後の混合液を氷冷後、すぐに核酸検出カートリッジの試料溶液貯留部に注入し、核酸検出装置にセットして混合液をＧＭＲ１上に到達させた。
（４）混合液がＧＭＲ１に到達した状態で、３０分間静置した。
（５）次に、核酸検出カートリッジの洗浄溶液貯留部に貯留されている洗浄溶液をＧＭＲ１上に到達させて、ＧＭＲ１の表面を洗浄した。
（６）ＧＭＲ１の面内方向に３０Ｏｅの外部磁場を印加し、ＧＭＲ１の出力値を変換したＧＭＲ１の抵抗値（Ｒ１）の測定を開始した。
（７）ＧＭＲ１の抵抗値の測定を継続しながら、核酸検出カートリッジの磁気ビーズ溶液貯留部に貯留されている磁気ビーズ溶液をＧＭＲ１上に送液した。
（８）磁気ビーズ溶液の送液前に対する送液から１０分後でのＧＭＲ１の抵抗変化率（ｒ１１０）を以下に示す式を用いて算出した。式中、ｔは時刻を表し、ｔ＝０は磁気ビーズ溶液の送液開始時を表す。
【０１０９】
ｒ１ｔ＝（Ｒ１ｔ−Ｒ１０）／Ｒ１０×１００
【０１１０】
（９）ｒ１１０と予め作成した検量線を用いてＧＭＲ１の抵抗変化率ｒ１１０から算出される標的二本鎖核酸の濃度（Ｎ１）を算出した。
【０１１１】
なお、１ｎＭ及び５ｎＭの標的二本鎖核酸を含む試料溶液を用いて、測定をそれぞれ５回行った。核酸捕捉センサ（ＧＭＲ１）及び核酸検出カートリッジは１回の測定につき１枚使用し、使い捨てとした。結果を表２に示す。
【０１１２】
【表２】
2020156354.tif 000004
【０１１３】
表２では、Ｒｕｎ３において、Ｎ１が試料溶液中の標的二本鎖核酸の濃度と大きくずれており、Ｒｕｎ３の測定時に何らかのエラーが発生していると考えられる。しかしながら、実際に病院等でユーザーが測定を行う際には標的二本鎖核酸の濃度は未知であるため、Ｒｕｎ３の測定時にエラーが発生していると判断することができない。よって、比較例の核酸捕捉センサを用いた場合では、エラーに気づかず、実際の標的二本鎖核酸の濃度とは異なる濃度を算出してしまう虞がある。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本実施形態の核酸捕捉センサによれば、二本鎖核酸の検出において、測定結果の信頼性が高く、測定の異常検出が可能な核酸捕捉センサを提供することができる。
【符号の説明】
【０１１５】
１…第一のセンサ素子
２…第二のセンサ素子
３…基板
３ａ…支持体
３ｂ…保護膜
４…第一の捕捉プローブ
４ａ…第一の配列からなる核酸
５…第二の捕捉プローブ
５ａ…第二の配列からなる核酸
６…標的二本鎖核酸
６ａ…第一の一本鎖核酸
６ｂ…第二の一本鎖核酸
７…試料溶液
８…洗浄溶液
９…磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）
１０…第一の標識プローブ
１０ａ…第三の配列からなる核酸
１１…第二の標識プローブ
１１ａ…第四の配列からなる核酸
１２…磁気ビーズ
１３…標識プローブ
１４…ビオチン
１５…アビジン又はストレプトアビジン
１６…第一のビオチン付プローブ
１７…第二のビオチン付プローブ
５１，５２…配線
１００…核酸捕捉センサ
１０１…試料溶液貯留部
１０１ａ，１０２ａ，１０３ａ…キャップ部材
１０２…洗浄溶液貯留部
１０３…磁気ビーズ溶液（標識プローブ溶液）貯留部
１０４ａ，１０４ｂ，１０４ｃ，１０４ｄ，１０４ｅ，１０４ｆ…流路
１０５…電気接続部
１０６…孔
１０７…排液プール
２００…核酸検出カートリッジ
２０１…ベースプレート
２０１ａ…上面
２０２…基板
２０２ａ…上面
２０３…カバープレート
２０３ａ…上面
２０３ｂ…下面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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