(57)【要約】      （修正有）【課題】ＣＤ４７＋疾患細胞、例えばＣＤ４７＋癌細胞を治療する、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７軸を通じたシグナル伝達を遮断する剤を提供する。【解決手段】ＣＤ４７＋疾患細胞の成長および／または増殖を阻害するために有用なヒトＳＩＲＰα融合タンパク質であって、特定の配列を含むヒトＳＩＲＰα融合タンパク質。融合タンパク質は、無視できるＣＤ４７アゴニズムおよび無視できる赤血球結合を示す。融合タンパク質は、ヒトＳＩＲＰαの全細胞外領域のアフィニティよりも少なくとも５倍高いアフィニティでヒトＣＤ４７に結合する、ヒトＳＩＲＰαの変異体２由来のＩｇＶドメイン、およびエフェクター機能を有するＦｃを含む。融合タンパク質は、エフェクター機能を欠く対応物よりも、少なくとも５倍、より強力である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４７＋疾患細胞の成長および／または増殖を阻害するために有用なヒトＳＩＲＰα融合タンパク質であって、配列番号２６を含む、前記ヒトＳＩＲＰα融合タンパク質。
【請求項２】
配列番号２６からなる、ヒトＳＩＲＰα融合タンパク質。
【請求項３】
検出可能標識をさらに含む、請求項１または２記載のヒトＳＩＲＰα融合タンパク質。
【請求項４】
薬学的に許容されうるキャリアー、およびＣＤ４７＋疾患細胞の成長または増殖を阻害するために有効な量の請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、薬学的組成物。
【請求項５】
ＣＤ４７＋疾患細胞の増殖を阻害する必要がある被験体に投与される、ＣＤ４７＋疾患細胞の増殖の阻害に使用するための、請求項４記載の薬学的組成物。
【請求項６】
疾患細胞がＣＤ４７＋癌細胞である、請求項４または５記載の薬学的組成物。
【請求項７】
疾患細胞がＣＤ４７＋血液学的癌細胞である、請求項６記載の薬学的組成物。
【請求項８】
疾患細胞がＣＤ４７＋白血病細胞である、請求項７記載の薬学的組成物。
【請求項９】
疾患細胞がＣＤ４７＋癌細胞を含む固形腫瘍である、請求項６記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒトＳＩＲＰα融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項１１】
発現可能であるように取り込まれた請求項１０記載のＤＮＡ構築物を含む、タンパク質産生宿主細胞。
【請求項１２】
ヒトＳＩＲＰα融合タンパク質を産生するための方法であって、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒトＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現のために取り込んだタンパク質産生宿主細胞を培養する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ４７＋疾患細胞を提示する被験体の治療に特に有用な療法的Ｆｃ融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、ヒトＳＩＲＰαの細胞外領域内のドメインに基づき、そして融合タンパク質の抗癌効果を増進させるＦｃ領域を取り込む。
【背景技術】
【０００２】
シグナル制御タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜貫通タンパク質であり、そしてＣＤ４７の受容体である。ＳＩＲＰαのヒト型のクローニングおよび発現は、ＵｌｌｒｉｃｈらによってＵＳ  ６５４１６１５に記載されてきている。癌および他の疾患の病因におけるＳＩＲＰαおよびＣＤ４７の関与は、ＳａｒｆａｔｉらによってＷＯ１９９９／０４０９４０に、そしてＶａｎ  ｄｅｎ  ＢｅｒｇらによってＷＯ００／６６１５９に暗示されてきており、ＳＩＲＰα阻害剤の療法的使用が示唆されている。より最近、Ｊａｉｓｗａｌらは、ＷＯ２００９／０９１６０１において、造血性癌の治療のためのＣＤ４７に対する抗体の使用を示唆している。ＳＩＲＰαおよびＣＤ４７の間の相互作用は、マクロファージによる、白血病細胞および白血病幹細胞（ＬＳＣ）の食作用の制御に重要な役割を果たす。ＣＤ４７に対する遮断抗体は、マクロファージによるＬＳＣの食作用を促進することが示されてきている。さらに、Ｗａｎｇらは、ＷＯ  ２０１０／１３００５３において、ＳＩＲＰα融合タンパク質に基づく癌治療を示唆してきている。免疫障害を治療するため、Ｓｍｉｔｈらは、ＵＳ２００８／０１３１４３１において、ＣＤ４７に基づくＦｃ融合体の使用を示唆してきている。炎症性および免疫障害の治療はまた、Ｒａｙｍｏｎｄらによって、ＷＯ２０１０／０７００４７において解説されている。
【０００３】
癌および他の疾患の治療において使用するための、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７軸を通じたシグナル伝達を阻害する剤を提供することが有用であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＵＳ  ６５４１６１５
【特許文献２】ＷＯ１９９９／０４０９４０
【特許文献３】ＷＯ００／６６１５９
【特許文献４】ＷＯ２００９／０９１６０１
【特許文献５】ＷＯ  ２０１０／１３００５３
【特許文献６】ＵＳ２００８／０１３１４３１
【特許文献７】ＷＯ２０１０／０７００４７
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、構成要素がＣＤ４７／ＳＩＲＰα軸の最適な阻害に関して選択されるＦｃ融合タンパク質としてＳＩＲＰαを提供する。本発明者らは、ヒトＳＩＲＰαの細胞外領域内の特定のおよび単一のドメインが、ヒトＳＩＲＰαの損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞外領域よりも高いアフィニティでＣＤ４７に結合することを見いだした。また、本明細書において、ＳＩＲＰαＦｃ融合体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は、定常（Ｆｃ）領域がエフェクター機能を有するものである場合、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα軸の阻害がこうした活性を全く必要としないにもかかわらず、そしてエフェクターを含まないＦｃ領域が好ましいはずであるというｉｎ  ｖｉｔｒｏでの示唆にもかかわらず、驚くほどそして劇的に改善されることを立証する。
【０００６】
本ＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質はまた、無視できるＣＤ４７アゴニズムを示し、これらがｉｎ  ｖｉｖｏで、ＳＩＲＰα仲介性シグナル伝達の専用阻害剤として作用することを可能にする。さらなる属性として、融合タンパク質は、赤血球への無視できる結合を示す。これは、この軸の他の阻害剤、例えばＣＤ４７抗体とは非常に対照的であり、該抗体は、赤血球に強く結合し、ある場合には赤血球凝集を引き起こす。本融合タンパク質では、投与された薬剤がＲＢＣ結合型で隔離され、そして不活性化される「シンク」効果を考慮する必要はないし、またはＲＢＣ相互作用によって引き起こされるいかなる不都合な事象も考慮する必要がない。
【０００７】
側面の１つにおいて、細胞に結合したＣＤ４７のＳＩＲＰα仲介性刺激を阻害するのに有用なＳＩＲＰα融合タンパク質であって、ＳＩＲＰαタンパク質構成要素、およびそれと融合した抗体定常領域（Ｆｃ）構成要素を含み、ＳＩＲＰαタンパク質構成要素がヒトＳＩＲＰαのＶドメインからなるかまたは該ドメインを含み、そしてＦｃ構成要素がエフェクター機能を有するＩｇＧの定常領域である、前記ＳＩＲＰα融合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、Ｆｃは、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体の定常領域から選択される。
【０００８】
関連する側面において、一本鎖ポリペプチドとしてＳＩＲＰαＦｃ融合体の分泌可能な型をコードするポリヌクレオチドを提供する。別の関連する側面において、ＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質を産生するために有用な細胞宿主であって、発現可能であるように（ｅｘｐｒｅｓｓｉｂｌｙ）取り込まれたポリヌクレオチドを有する、前記宿主を提供する。また、別の態様において、ＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質を得るための方法であって、宿主を培養するかまたは増殖させ、そして二量体タンパク質としてＳＩＲＰαＦｃ融合体を回収する工程を含む、前記方法を提供する。態様において、宿主は、発現されたタンパク質をグリコシル化する任意の種の真核生物宿主である。
【０００９】
別の側面において、本発明は、ＣＤ４７＋である疾患細胞を提示する被験体を治療するために有用な薬学的組成物であって、薬学的に許容されうるキャリアー、およびＣＤ４７＋疾患細胞の成長または増殖を阻害するために有効な量のＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質を含む、前記組成物を提供する。
【００１０】
さらなる側面において、本発明は、ＣＤ４７＋疾患細胞を提示する被験体を治療するための方法であって、被験体に、疾患細胞の成長および／または増殖を阻害するために有効な量のＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質を投与する工程を含む、前記方法を提供する。関連する側面において、本発明は、ＣＤ４７＋疾患細胞が存在する癌または任意の他の疾患を治療するためのＳＩＲＰαＦｃタンパク質の使用を提供する。また、ＣＤ４７＋疾患細胞が存在する癌または別の疾患の治療のための薬剤製造のための、ＳＩＲＰαＦｃタンパク質の使用も提供する。同様に、ＣＤ４７＋疾患細胞を治療する際に使用するための薬学的組成物であって、ＳＩＲＰα−Ｆｃタンパク質および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、前記薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、疾患細胞は、特にＣＤ４７＋白血病細胞、例えばＡＭＬを含む、ＣＤ４７＋癌細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本発明のこれらのおよび他の側面を、付随する図に言及しながら、ここでより詳細に記載する。
【図１】図１は、直接結合アッセイ（図１Ａ）および間接的競合アッセイ（図１Ｂ）を用いて、ヒトＣＤ４７に対するＴＴＩ−６０２およびＴＴＩ−６１６と称するＳＩＲＰα融合体の結合を比較する。より具体的には、単一Ｎ末端ＳＩＲＰα  Ｖ−ドメインを含むＳＩＲＰαＦｃ（ＴＴＩ−６１６）の結合を、３つすべて（Ｖ−Ｃ−Ｃ）の細胞外ＳＩＲＰαドメインからなる融合体（ＴＴＩ−６０２）に比較した。Ａ）直接結合アッセイ。ＣＤ４７＋ヒトＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を滴定量のＴＴＩ−６０２またはＴＴＩ−６１６とインキュベーションし、そしてポリクローナル抗ＩｇＧ抗体を用いたフローサイトメトリーによって結合を分析した。Ｂ）競合的阻害アッセイ。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ビオチン化ＳＩＲＰαＦｃ（ＴＴＩ−６０１）と、滴定量の未標識競合剤ＴＴＩ−６０２またはＴＴＩ−６１６の存在下でインキュベーションした。フローサイトメトリーによって結合を測定し、そして０％を競合剤の非存在下での結合と定義して、結果を阻害パーセントに変換した。
【図２】図２は、３つの異なるＳＩＲＰα融合タンパク質に関する結合プロファイル（Ｋｄ）を示す。非常に類似の結合プロファイルが明らかになり、ほぼ同一のアフィニティ結合（Ｋｄ）値（２．３〜２．４ｎＭ）が生じた。これは、３つのタンパク質すべてが同じＳＩＲＰα領域を含有し、そしてＦｃ領域がリガンド結合に影響を及ぼさないと予測されるため、予期されたことであった。より具体的には、ＣＤ４７＋ヒトＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を滴定量の融合タンパク質とインキュベーションし、そしてポリクローナル抗ＩｇＧ抗体を用いたフローサイトメトリーによって結合を分析した。次いで、幾何平均を規準化し、そして一部位結合モデルにデータを適合させる非線形回帰を用いるＰｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）によって、結合曲線およびＫｄ値を生じた。
【図３】図３（図６もまた参照されたい）は、ＴＴＩ−６２１およびＴＴＩ−６２２が類似の食作用促進活性を示す一方、ＴＴＩ−６１６が明らかにより弱い（これは特に１０ｎＭ用量で明らかである）ことを示す。これは、マクロファージによる最大ＳＩＲＰαＦｃ誘発腫瘍細胞殺傷には、野生型ＩｇＧ４またはＩｇＧ１  Ｆｃ領域のいずれかが必要であることを示す。より具体的には、マクロファージは、ヒト末梢血ＣＤ１４＋単球を、単球コロニー刺激因子の存在下で、少なくとも１週間培養することによって生成され、そして次いで、インターフェロン−ガンマ（一晩）およびＬＰＳ（１時間）で活性化された。ＯＣＩ／ＡＭＬ−２細胞をＣＦＳＥで標識し、そして示す濃度のＳＩＲＰαＦｃ融合体または１ｍＭの対照Ｆｃタンパク質（突然変異ｈＩｇＧ４  Ｆｃ（ＴＴＩ−４０１）またはｈＩｇＧ１  Ｆｃ（ＴＴＩ−４０２））と３０分間インキュベーションするか、あるいは未処理で放置した（ＵＴ）。次いで、ＡＭＬ−２細胞およびマクロファージを２時間共培養し、そしてマクロファージを小麦胚芽凝集素Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５コンジュゲートで染色し、そして共焦点顕微鏡によって分析した。食作用インデックスを、１００マクロファージあたりに貪食されたＡＭＬ細胞の数と定義し、試料あたり少なくとも２００のマクロファージを計数した。突然変異ｈＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含む融合タンパク質を白いバー、野生型ｈＩｇＧ４を灰色のバー、そして野生型ＩｇＧ１を黒いバーで示した。アイソタイプ対照に対して、＊＊ｐ＜０．０５、＊ｐ＜０．０１（一方向ＡＮＯＶＡおよびダネットの事後検定）。
【図４】図４は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を所持するＴＴＩ−６２１融合タンパク質が、移植部位（注射大腿）で抗白血病効果を仲介可能な唯一のタンパク質であったことを示す。非注射骨髄において、明らかなＦｃ依存性効果があり、ＴＴＩ−６２１（完全Ｆｃ活性）＞ＴＴＩ−６２２（低Ｆｃ活性）＞ＴＴＩ−６１６（非Ｆｃ活性）であった。ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ（ＮＯＤ．ＳＣＩＤ）マウス（８〜１２週齢）を、１３７Ｃｓ  ｇ−照射装置から２７５ｃＧｙで致死量以下に照射し、そして抗ＣＤ１２２抗体で処置した（ＮＫ細胞を枯渇させるため）後、ヒト白血病患者から収集したＡＭＬ細胞を大腿内注射した。移植３週後から開始して、マウスをＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質（週あたり３回の８ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）、あるいは等モル用量の対照Ｆｃタンパク質ＴＴＩ−４０１（突然変異ヒトＩｇＧ４）またはＴＴＩ−４０２（ヒトＩｇＧ１）で治療した。治療４週後、マウスを屠殺し、そして注射大腿、非注射骨髄および脾臓内のヒト白血病細胞を、ヒトＣＤ４５およびヒトＣＤ３３マーカーの発現に関して染色してフローサイトメトリー分析によって検出した。ＡＭＬ生着を、各区画におけるヒトＣＤ４５＋ＣＤ３３＋細胞の割合として表した。
【図５】ＣＤ４７＋ヒトＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を一晩、ＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質または対照Ｆｃ（３ｍＭ）とインキュベーションするか、あるいは未処理で放置し（ＵＴ）、そして次いで、アネキシン−Ｖに関して染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。１ｍＭのアポトーシス促進剤スタウロスポリン（Ｓｔａｕｒ）を陽性対照として含めた。ＴＴＩ−６０２を含有する１つの試料をＣＤ４７遮断抗体であるＢ６Ｈ１２で前処理した。
【図６】図６は、図３に関して記載したプロトコルを用いるが、より発展したデータセットを用いた結果を示す。
【図７】Ａ）ヒト赤血球を滴定量の抗ＣＤ４７抗体Ｂ６Ｈ１２またはＴＴＩ−６１６で染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。Ｂ）ヒト赤血球を抗ＣＤ４７モノクローナル抗体パネル（２Ｄ３、Ｂ６Ｈ１２、ＢＲＩＣ１２６およびＣＣ２Ｃ６）またはＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質ＴＴＩ−６２２で染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。各試薬を、先の最適化実験で同定した飽和濃度で用いた。ＴＴＩ−４０１を対照Ｆｃとして用いた。示すデータは、６人のドナーからプールされたものである。Ｃ）ＡＭＬ−２腫瘍細胞をＣＤ４７抗体またはＴＴＩ−６６２で染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。各試薬の単一の高用量（６６０ｎＭ）に関してデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、抗体定常領域、またはＦｃと直接または間接的に融合した形のヒトＳＩＲＰαタンパク質に関する。別に言及しない限り、用語「ヒトＳＩＲＰα」は、本明細書において、ヒトＳＩＲＰαの野生型内因性成熟型を指す。ヒトにおいて、ＳＩＲＰαタンパク質は、２つの主要な型で見いだされる。１つの型、変異体１またはＶ１型は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿５４２９７０．１（残基２７〜５０４が成熟型を構成する）として示されるアミノ酸配列を有する。別の型、変異体２またはＶ２型は、１３アミノ酸異なり、そしてＧｅｎＢａｎｋにＣＡＡ７１４０３．１（残基３０〜５０４が成熟型を構成する）として示されるアミノ酸配列を有する。ＳＩＲＰαのこれらの２つの型が、ヒトに存在するＳＩＲＰαの型の約８０％を構成し、そしてどちらも、本明細書において用語「ヒトＳＩＲＰα」に含まれる。用語「ヒトＳＩＲＰα」にやはり含まれるのは、ヒトに対して内因性であり、そして結合した際にＣＤ４７を通じたシグナル形質導入を誘発する同じ特性を有する、少数型である。本発明は、最も具体的には、変異体２型、またはＶ２に関する。
【００１３】
本ＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質は、ヒトＳＩＲＰαの細胞外領域内にある３つのいわゆる免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインの１つを取り込む。より具体的には、本ＳＩＲＰαＦｃタンパク質は、ヒトＳＩＲＰαの残基３２〜１３７（１０６量体）を取り込み、これは、現在の命名法にしたがって、Ｖ２型のＩｇＶドメインを構成し、そして定義する。以下に示すこのＳＩＲＰα配列は、本明細書において、配列番号１と称する。
【００１４】
【化１】
2020089387.tif 000002
【００１５】
好ましい態様において、ＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質は、配列番号１によって定義されるようなＩｇＶドメイン、およびＳＩＲＰα配列内の連続するさらなる隣接残基を取り込む。ヒトＳＩＲＰαのＶ２型の残基３１〜１４８によって示されるＩｇＶドメインのこの好ましい型は、以下に示す配列番号２２を有する１１８量体である：
【００１６】
【化２】
2020089387.tif 000003
【００１７】
ヒトＳＩＲＰαのこのＶ２型の活性は、ＣＤ４７結合アフィニティに関して、ＳＩＲＰαの全細胞外ドメインのＣＤ４７結合アフィニティに比較して、驚くほどより高いことが見いだされてきている。この結合アフィニティは、全細胞外ドメインの結合アフィニティより少なくとも２倍高い。いくつかの態様において、アフィニティは、全細胞外ドメインに比較して、Ｖ２ドメインに関して、少なくとも３倍、４倍、５倍またはそれより高い。直接結合アッセイにおいて、本明細書の実施例１に報告するように、このＳＩＲＰαドメインを取り込む融合タンパク質は、全ＳＩＲＰα細胞外ドメインを取り込む融合タンパク質よりもおよそ１０倍高い結合アフィニティを有する。同様に、本明細書の実施例１にやはり報告する間接的競合アッセイにおいて、Ｖ２／ＩｇＶ単一ドメイン融合体は、ＳＩＲＰαの全細胞外領域を取り込む融合体のＣＤ４７結合アフィニティより優れた結合アフィニティを提供する。したがって、この好ましいＶドメインに基づくＳＩＲＰαＦｃ融合体は、ＳＩＲＰαと結合した際に刺激されるＣＤ４７シグナル伝達を阻害する、より高い能力に関する潜在能力を有する。
【００１８】
本ＳＩＲＰα融合タンパク質はまた、エフェクター機能を有するＦｃ領域も取り込む。エフェクター機能に関する優先性はまったく驚くべきことであり、そしてＣＤ４７／ＳＩＲＰα軸に関する現在の情報では説明が困難である。エフェクター不含Ｆｃ領域は、この軸を阻害するために十分な活性を有し、そしてエフェクター機能を組み込むことによってそれ以上が得られることはないと予期することが可能であった。にもかかわらず、本明細書の特に実施例５に提示するようなデータは、融合体の抗白血病ｉｎ  ｖｉｖｏ活性に関して、エフェクター活性Ｆｃに利点が付随することを明らかに示す。これは、融合体の食作用活性が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、エフェクター活性またはエフェクター不含Ｆｃ構成要素のいずれに基づく融合体に関しても、特定の優先性を持たないことを示すようである、実施例４に示す結果を考慮すると特に驚くべきことである。
【００１９】
したがって、本ＳＩＲＰαＦｃ融合体において使用するために適切なＦｃ構成要素は、エフェクター機能を有するものである。「エフェクター機能を有する」Ｆｃ構成要素は、少なくともいくつかのエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性に少なくともある程度の寄与を、または補体を固定するある程度の能力を有するＦｃ構成要素である。また、Ｆｃは、少なくともＦｃ受容体に結合するであろう。これらの特性は、この目的のために確立されたアッセイを用いると、明らかになりうる。機能アッセイには、ターゲット細胞溶解を検出する標準的クロム放出アッセイが含まれる。この定義によって、野生型ＩｇＧ１またはＩｇＧ４であるＦｃ領域はエフェクター機能を有し、一方、Ｐｒｏ２３３、Ｖａｌ２３４、Ａｌａ２３５を含む改変シリーズの取り込み、およびＧｌｙ２３６の欠失（ＥＵ）によってエフェクター機能を除去するように突然変異されたヒトＩｇＧ４のＦｃ領域は、エフェクター機能を持たないと見なされる。好ましい態様において、Ｆｃは、ＩｇＧ１アイソタイプのヒト抗体に基づく。これらの抗体のＦｃ領域は、当業者に容易に同定可能であろう。いくつかの態様において、Ｆｃ領域には、下部（ｌｏｗｅｒ）ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインが含まれる。
【００２０】
特定の態様において、Ｆｃ領域は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔにおいてＰ０１８５７、残基１０４〜３３０として示されるヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列に基づ
き、そして以下に示し、そして本明細書において、配列番号２と称するアミノ酸配列を有する：
【００２１】
【化３】
2020089387.tif 000004
【００２２】
したがって、いくつかの態様において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１定常領域の野生型またはコンセンサス配列のいずれかを有する。別の態様において、融合タンパク質中に取り込まれるＦｃ領域は、典型的なエフェクター活性定常領域を有する任意のＩｇＧ１抗体に由来する。こうしたＦｃ領域の配列は、例えば、以下のＩｇＧ１配列（すべてＧｅｎＢａｎｋより引用）、例えば：ＢＡＧ６５２８３（残基２４２〜４７３）、ＢＡＣ０４２２６．１（残基２４７〜４７８）、ＢＡＣ０５０１４．１（残基２４０〜４７１）、ＣＡＣ２０４５４．１（残基９９〜３２０）、ＢＡＣ０５０１６．１（残基２３８〜４６９）、ＢＡＣ８５３５０．１（残基２４３〜４７４）、ＢＡＣ８５５２９．１（残基２４４〜４７５）、およびＢＡＣ８５４２９．１（残基２３８〜４６９）のいずれかのＦｃ領域に対応することも可能である。
【００２３】
他の態様において、Ｆｃ領域は、野生型ヒトＩｇＧ４定常領域の配列を有する。別の態様において、融合タンパク質中に取り込まれるＦｃ領域は、存在するが、天然には、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域よりも有意により強力でないエフェクター活性を伴う定常領域を有する、任意のＩｇＧ４抗体に由来する。こうしたＦｃ領域の配列は、例えば、以下のＩｇＧ４配列：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔのＰ０１８６１（残基９９〜３２７）およびＧｅｎＢａｎｋのＣＡＣ２０４５７．１（残基９９〜３２７）のいずれかのＦｃ領域に対応することも可能である。
【００２４】
特定の態様において、Ｆｃ領域は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔにおいてＰ０１８６１、残基９９〜３２７に示されるヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列に基づき、そして以下に示し、そして本明細書において、配列番号２３と称するアミノ酸配列を有する：
【００２５】
【化４】
2020089387.tif 000005
【００２６】
いくつかの態様において、Ｆｃ領域は１またはそれより多い改変、通常は約５より多くないこうした改変を取り込み、これには、特定のＦｃ特性に影響を及ぼすアミノ酸置換が含まれる。１つの特定のおよび好ましい態様において、Ｆｃ領域は、２２８位（ＥＵ番号
付け）での改変を取り込み、ここで、この位のセリンがプロリンによって置換され（Ｓ２２８Ｐ）、それによってＦｃ二量体内のジスルフィド連結が安定化される。Ｆｃ領域内の他の改変には、グリコシル化を改変する置換、例えばグリシンまたはアラニンによるＡｓｎ２９７の置換；半減期を増進させる改変、例えばＵＳ６２７７７３７５に解説されるような、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５３Ｓ、およびＴ２５６Ｆ、ならびに多くのその他のものが含まれうる。特に有用であるのは、Ｆｃ特性を増進させつつ、残りはコンホメーションに関してサイレントである、例えばＦｃ受容体結合を保持する改変である。
【００２７】
特定の態様において、そしてＦｃ構成要素がＩｇＧ４  Ｆｃである場合、Ｆｃは、少なくともＳ２２８Ｐ突然変異を取り込み、そして以下に示し、そして本明細書において配列番号２４と称するアミノ酸配列を有する：
【００２８】
【化５】
2020089387.tif 000006
【００２９】
したがって、本発明は、ヒトＳＩＲＰαおよびヒトＣＤ４７の結合を阻害し、それによってＳＩＲＰαに結合したＣＤ４７を通じて仲介されるシグナルの伝達を阻害するかまたは減少させるために有用な融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は、ヒトＳＩＲＰα構成要素およびそれに融合したＦｃ構成要素を含み、ＳＩＲＰα構成要素はヒトＳＩＲＰα  Ｖ２の単一のＩｇＶドメインを含むかまたは該ドメインからなり、そしてＦｃ構成要素はエフェクター機能を有するヒトＩｇＧの定常領域である。
【００３０】
１つの態様において、融合タンパク質は、少なくとも、野生型ヒトＳＩＲＰαのＶ２型の残基３２〜１３７、すなわち配列番号１からなるＳＩＲＰα構成要素を含む。好ましい態様において、ＳＩＲＰα構成要素は、ヒトＳＩＲＰαのＶ２型の残基３１〜１４８、すなわち配列番号２２からなる。別の態様において、Ｆｃ構成要素は、Ｐ０１８５７と称するヒトＩｇＧ１のＦｃ構成要素であり、そして特定の態様において、その下部ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域を取り込むアミノ酸配列、すなわち配列番号２を有する。
【００３１】
したがって、好ましい態様において、本発明は、発現された一本鎖ポリペプチドとして、そして分泌される二量体融合体としての両方として、ＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質を提供し、ここで、該融合タンパク質は、配列番号１および好ましくは配列番号２２を有するＳＩＲＰα構成要素、ならびにエフェクター機能を有し、そして配列番号２を有する、ＳＩＲＰα構成要素に付着した、Ｆｃ領域を取り込む。ＳＩＲＰα構成要素が配列番号１である場合、この融合タンパク質は、以下に示す配列番号３を含む：
【００３２】
【化６】
2020089387.tif 000007
【００３３】
ＳＩＲＰα構成要素が配列番号２２である場合、この融合タンパク質は、以下に示す配列番号２５を含む：
【００３４】
【化７】
2020089387.tif 000008
【００３５】
別の態様において、融合タンパク質のＦｃ構成要素は、ＩｇＧ４に、そして好ましくはＳ２２８Ｐ突然変異を取り込むＩｇＧ４に基づく。融合タンパク質が配列番号２２の好ましいＳＩＲＰα  ＩｇＶドメインを取り込む場合、生じるＩｇＧ４に基づくＳＩＲＰα−Ｆｃタンパク質は、以下に示すような配列番号２６を有する：
【００３６】
【化８】
2020089387.tif 000009
【００３７】
本発明の好ましい態様において、融合タンパク質は、融合タンパク質のＳＩＲＰα  ＩｇＶドメインとして、配列番号２２である配列を含む。好ましいＳＩＲＰαＦｃは、配列番号２５である。
【００３８】
ＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質において、ＳＩＲＰα構成要素およびＦｃ構成要素は、直接または間接的のいずれかで融合されて、単一ポリペプチド鎖を提供し、これは最終的に、Ｆｃ領域内で形成される鎖内ジスルフィド結合を通じて一本鎖ポリペプチドがカップ
リングされている二量体として産生される。融合領域の性質は重要ではない。融合は２つの構成要素間で直接であってもよく、この場合、ＳＩＲＰ構成要素が融合体のＮ末端を構成し、そしてＦｃ構成要素はＣ末端を構成する。あるいは、融合は、１またはそれより多いアミノ酸、望ましくは遺伝的にコードされるアミノ酸、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸、あるいは５〜１００アミノ酸の間の任意の数のアミノ酸、例えば５〜５０、５〜３０または５〜２０の間のアミノ酸で構成されるリンカーを通じて、間接的であってもよい。リンカーは、制限部位、例えばＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩ部位等を構成するＤＮＡによってコードされるペプチドであることも可能である。
【００３９】
リンカーアミノ酸は、典型的には、そして望ましくは、ＦｃおよびＳＩＲＰ構成要素がその活性コンホメーションを採用することを可能にするためにある程度の柔軟性を提供するであろう。こうした柔軟性を可能にする残基は、典型的には、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒであり、したがって、リンカー内のこれらの残基（そして特にＧｌｙおよびＳｅｒ）の実質的に任意の組み合わせが、望ましい連結効果を提供するようである。１つの例において、こうしたリンカーは、いわゆるＧ４Ｓ配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）に基づき、これは（Ｇ４Ｓ）ｎ、式中、ｎは１、２、３またはそれより多い、として反復されてもよく、あるいは、（Ｇｌｙ）ｎ、（Ｓｅｒ）ｎ、（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）ｎまたは（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ等に基づく。別の態様において、リンカーは、ＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳ（配列番号２１）である。この配列は、Ｃ末端でＩｇＶドメインに隣接するＳＩＲＰα配列を構成する（この隣接配列は、リンカーまたは上述のＩｇＶ最小配列とカップリングした際のＩｇＶドメインの異なる型のいずれかと見なされうると理解される）。融合領域またはリンカーが、構成要素が活性コンホメーションを採用することを可能にし、そしてこれが当該技術分野において有用なリンカーの任意の型によって達成可能であることのみが必要である。
【００４０】
ＳＩＲＰαＦｃ融合体は、ＳＩＲＰαおよびＣＤ４７の間の相互作用を阻害し、それによってこの軸を渡るシグナル伝達を遮断するために有用である。ＣＤ４７によるマクロファージ上のＳＩＲＰαの刺激は、マクロファージ内にターゲットを引き入れる際に関与するミオシンＩＩおよび収縮性細胞骨格活性を不活性化することによって、マクロファージ仲介性食作用を阻害することが知られる。したがって、このカスケードの活性化は、ＣＤ４７＋疾患細胞の生存に重要であり、そしてこの経路の遮断は、マクロファージがＣＤ４７＋疾患細胞集団を根絶することを可能にする。
【００４１】
用語「ＣＤ４７＋」は、本ポリペプチドによる結合に関してターゲットとされる細胞の表現型に関して用いられる。ＣＤ４７＋である細胞は、ＣＤ４７抗体をアフィニティリガンドとして用いたフローサイトメトリーによって同定されうる。適切に標識されたＣＤ４７抗体は、この使用のため、商業的に入手可能である（例えば、クローンＢ６Ｈ１２は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより入手可能である）。ＣＤ４７表現型に関して調べる細胞には、標準的腫瘍生検試料が含まれてもよく、特に内因性ＣＤ４７＋癌細胞を宿すると推測される被験体から採取される血液試料が含まれる。本融合タンパク質を用いた療法に関するターゲットとして、特に関心が持たれるＣＤ４７疾患細胞は、ＣＤ４７を「過剰発現する」ものである。これらのＣＤ４７＋細胞は、典型的には疾患細胞であり、そして表面上に、所定のタイプの細胞に関する通常のＣＤ４７密度を超える密度で、ＣＤ４７を提示する。ＣＤ４７過剰発現は、異なる細胞タイプに渡って多様であろうが、本明細書において、例えば本明細書において例示するようなフローサイトメトリーによって、または免疫染色によって、または遺伝子発現分析等によって、その細胞タイプに関して正常であるＣＤ４７表現型を有する対応する細胞上で測定可能なレベルよりも高いと決定されるいかなるＣＤ４７レベルも指すことを意味する。
【００４２】
したがって、療法的使用のため、薬学的に許容されうるキャリアー、および本ＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質の療法的有効量を含む、薬学的組成物を提供する。本明細書において、「薬学的に許容されうるキャリアー」は、生理学的に適合可能であり、そしてタンパク質／抗体製剤の分野において有用である、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を意味する。薬学的に許容されうるキャリアーの例には、１またはそれより多い水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、ならびにその組み合わせが含まれる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。薬学的に許容されうるキャリアーは、薬理学的剤の有効期間または有効性を増進させる、微量の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝剤をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、療法的抗体製剤の分野において標準的な実施を用いて、ＳＩＲＰαＦｃ融合体を配合する。例えば注射または注入による、静脈内投与に適した溶液が特に有用である。
【００４３】
必要に応じて上に記載する成分の１つまたは組み合わせとともに、適切な溶媒中に必要な量の活性化合物を取り込み、その後、無菌精密濾過することによって、無菌注射可能溶液を調製してもよい。一般的に、分散物は、基本的な分散媒体、および上に列挙するもののうち必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル内に活性化合物を取り込むことによって調製される。無菌粉末の場合、調製には、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）を行い、先に無菌濾過した溶液由来の任意のさらなる望ましい成分を含む、活性成分の粉末を生じる。
【００４４】
本明細書において、「有効量」は、望ましい療法的結果を達成するために必要な投薬量および特定の期間に渡る、有効な量を指す。薬理学的剤の療法的有効量は、疾患状態、個体の年齢、性別、および体重、ならびに薬理学的剤が個体において望ましい反応を誘発する能力などの要因にしたがって多様でありうる。療法的有効量はまた、薬理学的剤の任意の毒性または有害な影響よりも、療法的に有益な効果が勝る量でもある。
【００４５】
ＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質を、タンパク質送達のために確立された任意の経路、特に静脈内、皮内および皮下注射または注入、あるいは経口または鼻投与を通じて、被験体に投与してもよい。融合タンパク質は、典型的には、１日あたり０．５〜１５ｍｇ／ｋｇ被験体体重の範囲の用量で投与されるであろう。有効量（癌細胞または塊の増殖またはサイズの成長または速度の減少によって明らかとなるような、疾患または状態を治療する際に有効な量）は、被験体の年齢および全身の健康状態、ならびに治療しようとする疾患の重症度を含む、いくつかの要因にしたがって多様であろうことが認識されるであろう。
【００４６】
単一投薬型を産生するためのキャリアー物質と組み合わせてもよい活性成分の量は、治療中の被験体、および特定の投与様式に応じて多様であろう。単一の単位投薬型を産生するために必要な活性成分の量は、一般的には、療法効果を生じる組成物の量であろう。一般的に、１００パーセントのうち、この量は、薬学的に許容されうるキャリアーと組み合わせて、活性成分約０．０１パーセント〜約９９パーセント、好ましくは約０．１パーセント〜約７０パーセント、例えば活性成分約１パーセント〜約３０パーセントの範囲であろう。
【００４７】
当該技術分野に知られる多様な方法の１つまたはそれより多くを用いて、１つまたはそれより多くの投与経路を通じて、本発明の組成物を投与することも可能である。当業者には理解されるであろうように、投与経路および／または様式は、望ましい結果に応じて多様であろう。本発明の融合タンパク質のための好ましい投与経路には、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路、例えば注射または注入によるものが含まれる。句「非経口投与」には、静脈内、筋内、動脈内、クモ膜下腔内、嚢内、眼窩内
、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入などの注射が含まれる。
【００４８】
あるいは、本発明の融合タンパク質を、非経口経路を通じて、例えば滴下によって、あるいは局所、上皮または粘膜投与経路によって、例えば鼻内、経口、膣内、直腸または舌下で投与してもよい。
【００４９】
投薬措置を調整して、最適に望ましい反応（例えば療法反応）を提供する。例えば、単回ボーラスを投与してもよいし、あるいはいくつかの分割用量を長期間に渡って投与してもよいし、あるいは療法状況によって示されるように、用量を比例して減少させるかまたは増加させてもよい。投与の容易さおよび投薬量の均一性のため、非経口組成物を投薬単位型で配合することが特に好適である。「単位投薬型」は、本明細書において、治療しようとする被験体のための、単位投薬として適切な物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要な薬学的キャリアーと関連して、望ましい療法効果を産生するように計算された、あらかじめ決定された量の活性化合物を含有する。本発明の投薬単位型の明細は、（ａ）活性化合物のユニークな特性および達成しようとする特定の療法効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の治療に関するこうした活性化合物を配合する分野における本来的な限界によって、指示され、そしてこれらに直接依存する。
【００５０】
融合タンパク質投与のため、単位用量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、そしてより一般的には０．０１〜５ｍｇ／宿主体重ｋｇの範囲内であろう。例えば、投薬量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重、あるいは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。例示的な治療措置は、週あたり１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、１ヶ月に１回、３ヶ月ごとに１回または３〜６ヶ月ごとに１回の投与を含む。本発明の融合タンパク質に関する好ましい投薬措置には、静脈内投与を通じた１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重が含まれ、融合タンパク質は、以下の投薬スケジュールの１つを用いて投与される；（ｉ）６回の投薬に関して４週ごと、次いで、３ヶ月ごと；（ｉｉ）３週ごと；（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、その後、１ｍｇ／ｋｇ体重を３週ごと。いくつかの方法において、投薬量を調整して、約１〜１０００μｇ／ｍｌ、そしていくつかの方法において約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿融合タンパク質濃度を達成する。
【００５１】
本融合タンパク質は、赤血球に対して無視できる結合を示す。したがって、有効投薬措置を確立する際、ＲＢＣ「シンク」を考慮する必要はない。ＲＢＣに結合される他のＳＩＲＰα／ＣＤ４７阻害剤に比較して、本ＳＩＲＰ−Ｆｃ融合体は、ＲＢＣに結合するようになる薬剤、例えばＣＤ４７抗体に関して必要とされる用量の半分未満の用量で有効でありうる。
【００５２】
さらに、ＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質は、結合した際、無視できるＣＤ４７アゴニズムを示すため、ＳＩＲＰα仲介性シグナルの専用アンタゴニストである。したがって、医学的に有用な単位投薬措置を確立する際、薬剤によって誘導されるいかなる刺激も考慮する必要はない。
【００５３】
融合タンパク質はまた、持続放出配合物として投与してもよく、この場合、より頻繁でない投与しか必要とされない。投薬量および頻度は、患者における融合タンパク質の半減期に応じて多様である。投薬量および投与頻度は、治療が予防的または療法的であるかに応じて多様でありうる。予防的適用において、比較的低い投薬量を、比較的頻繁でない間隔で、長期に渡って投与する。ある患者は、余生に渡って治療を受け続ける。療法的適用において、疾患進行を減少させるかまたは終結させるまで、そして好ましくは患者が疾患の症状の部分的なまたは完全な寛解を示すまで、ときには、比較的高い投薬量を比較的短
い間隔で投与することが必要である。したがって、予防的措置を用いて患者を治療することも可能である。
【００５４】
本発明のＳＩＲＰαＦｃタンパク質は、多様なＣＤ４７＋疾患細胞を治療するために有用である。これらには、液体および固形腫瘍を含む、特定のＣＤ４７＋癌細胞が含まれる。１つの態様において、ＳＩＲＰαＦｃタンパク質は、血液学的癌の成長または増殖を阻害するために用いられる。本明細書において、「血液学的癌」は、血液の癌を指し、そしてこれには、とりわけ、白血病、リンパ腫および骨髄腫が含まれる。「白血病」は、感染と戦うことができない白血球があまりにも多く作製され、したがって、血液を構成する他の部分、例えば血小板および赤血球を押し出してしまう血液の癌を指す。白血病の症例は、急性または慢性と分類されると理解される。白血病の特定の型は、例えば、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄増殖性障害／新生物（ＭＰＤＳ）；および骨髄異形性症候群であることも可能である。「リンパ腫」は、とりわけ、ホジキンリンパ腫、緩慢性および侵襲性非ホジキンリンパ腫両方、バーキットリンパ腫、および濾胞性リンパ腫（小細胞および大細胞）を指すことも可能である。骨髄腫は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫、および軽鎖またはベンス−ジョーンズ骨髄腫を指すことも可能である。
【００５５】
いくつかの態様において、ＳＩＲＰαＦｃタンパク質で治療する血液学的癌は、ＣＤ４７＋白血病、好ましくは急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、および骨髄異形性症候群より選択されるもの、好ましくはヒト急性骨髄性白血病である。
【００５６】
他の態様において、ＳＩＲＰαＦｃタンパク質で治療する血液学的癌は、ホジキンリンパ腫、緩慢性および侵襲性両方の非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫（小細胞および大細胞）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫、および軽鎖またはベンス−ジョーンズ骨髄腫ならびに平滑筋肉腫より選択される、ＣＤ４７＋リンパ腫または骨髄腫である。
【００５７】
固形腫瘍もまた、本融合タンパク質で治療して、そのサイズ、数または増殖速度を減少させ、そして癌幹細胞の増殖を制御することも可能である。こうした固形腫瘍には、膀胱、脳、乳房、肺、結腸、卵巣、前立腺、肝臓および他の組織のＣＤ４７＋腫瘍もまた含まれる。
【００５８】
ＳＩＲＰαＦｃタンパク質を単独で、単一療法として、またはターゲットとされる徴候の治療において有用な任意の他の剤と組み合わせて、投与してもよい。
【００５９】
ＳＩＲＰαＦｃタンパク質はまた、ＣＤ４７+細胞の存在を検出するためにも有用であ
る。これは、間接的に、まずタンパク質および試験細胞を融合タンパク質とインキュベーションし、そして次いで、融合タンパク質に結合する検出可能な剤で探査する（ｐｒｏｂｉｎｇ）ことによって間接的に、または標識型で融合タンパク質を提供することによって、直接、達成することも可能である。
【００６０】
別の側面において、本発明は、診断または療法部分、例えば検出可能マーカー、細胞毒素、薬剤または放射毒素にコンジュゲート化された融合タンパク質を特徴とする。１またはそれより多い細胞毒素を含むコンジュゲートは、「免疫毒素」または薬剤コンジュゲートと称される。細胞毒素または細胞傷害剤には、細胞に有害である（例えば細胞を殺す）任意の剤が含まれる。例には、タキソール、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダ
ウノルビシン、ミトキサントロン、ミグラマイシン、およびアクチノマイシンＤが含まれる。療法剤にはまた、例えば代謝拮抗剤（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、およびシタラビン）、アルキル化剤（例えばシクロホスファミド、ブスルファン、マイトマイシンＣ、およびシスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシンおよびドキソルビシン）、および抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ）、および抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン））が含まれる。
【００６１】
融合タンパク質をコンジュゲート化可能な検出可能なマーカーの限定されない例には、フルオレセイン、シアニン、Ｃｙ−３、ビオチン、Ｉ−１２３およびＩ−１２５を含む放射性同位体等が含まれる。融合タンパク質を、当該技術分野に知られる方法によって、こうした検出可能マーカーで標識してもよい。
【００６２】
当該技術分野で利用可能なリンカー技術を用いて、本発明の融合タンパク質に細胞毒素をコンジュゲート化してもよい。細胞毒素を融合タンパク質にコンジュゲート化するために使用されてきているリンカータイプの例には、限定されるわけではないが、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチド含有リンカーが含まれる。
【００６３】
本発明の融合タンパク質を放射性同位体にコンジュゲート化して、放射コンジュゲートとも称される、細胞毒性放射薬剤を生成してもよい。診断的または療法的に使用するために、融合タンパク質にコンジュゲート化可能な放射性同位体の例には、限定されるわけではないが、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０、およびルテチウム１７７が含まれる。放射コンジュゲートを調製するための方法が当該技術分野に確立されている。
【００６４】
１つの態様において、融合タンパク質を用いて、ＣＤ４７のレベル、または膜表面上にＣＤ４７を含有する細胞のレベルを検出してもよい。ＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質を用いたＣＤ４７の検出は、例えば、試料（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料）および対照試料を、融合タンパク質およびＣＤ４７の間の複合体の形成を可能にする条件下で、融合タンパク質と接触させることによって、達成可能である。融合タンパク質およびＣＤ４７の間で形成される任意の複合体を検出し、そして試料および対照において比較する。例えば、本発明の組成物を用いて、当該技術分野に周知の標準的検出法、例えばＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーアッセイを行ってもよい。
【００６５】
したがって、融合タンパク質は、試料試験およびｉｎ  ｖｉｖｏ画像法を含めた診断目的のために、そして１つの特徴として、ＣＤ４７が上方制御されている疾患細胞を有する疾患を治療する、療法目的のために、有用である。
【００６６】
いずれの目的に関しても、融合タンパク質を適切な剤にコンジュゲート化して、薬剤コンジュゲートを形成してもよい。疾患を治療するために適した剤には、例えば化学療法剤および放射療法剤などの細胞傷害剤が含まれる。診断目的のため、適切な剤は、全身画像法に関しては、放射性同位体、そして試料試験に関しては、放射性同位体、酵素、蛍光標識および他の適切な抗体タグがある。
【００６７】
ＣＤ４７検出のため、検出可能標識は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断法の分野で、現在用いられる多様なタイプのいずれであってもよく、これには、金属ゾル、例えばコロイド性金、例えばＮ２Ｓ２、Ｎ３ＳまたはＮ４型のペプチド性キレート剤とともに提示されるＩ１２５またはＴｃ９９などの同位体、蛍光マーカー、発光マーカー、リン光マーカー等を含む発色団、ならびに所定の基質を検出可能マーカーに変換する酵素標識、ならびにポリメラ
ーゼ連鎖反応によるなどの増幅後に明らかになるポリヌクレオチドタグが含まれる。適切な酵素標識には、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等が含まれる。例えば、標識は、酵素、アルカリホスファターゼであってもよく、該酵素は、１，２ジオキセタン基質、例えばアダマンチルメトキシホスホリルオキシフェニルジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）、二ナトリウム３−（４−（メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ｛３．３．１．１．３，７｝デカン｝−４−イル）フェニルホスフェート（ＣＳＰＤ）、ならびにＣＤＰおよびＣＤＰ−ｓｔａｒ（登録商標）、または当業者に周知の他の発光基質、例えば適切なランタニド、例えばテルビウム（ＩＩＩ）およびユーロピウム（ＩＩＩ）のキレートの変換後の化学発光の存在または形成を測定することによって、検出される。検出手段は、選択した標識によって決定される。標識またはその反応産物の出現は、標識が粒子であり、そして適切なレベルで集積する場合、裸眼を用いて達成可能であるし、またはすべて標準的実施にしたがって、分光光度計、ルミノメーター、蛍光光度計等の装置を用いて達成可能である。
【００６８】
ＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質に基づく療法のため、細胞毒素を融合タンパク質に、非共有相互作用を通じてコンジュゲート化してもよいが、より望ましくは、直接、またはより好ましくは適切なリンカーを通じて、共有結合によってカップリングする。好ましい態様において、コンジュゲートは、細胞毒素および融合タンパク質を含む。融合タンパク質および細胞毒素のコンジュゲートを、多様な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート、イミノチオラン、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌなどのイミドエステルの二官能性誘導体、スベリン酸ジスクシニミジルなどの活性エステル、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド、ビス−アジド化合物、例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、トルエン２，６−ジイソシアネートなどのジイソシアネート、およびビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作製される。Ｃ１４標識１−イソチオシアノベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に放射性核種をコンジュゲート化させるために適したキレート剤である。
【００６９】
免疫コンジュゲートの細胞毒素構成要素は、化学療法剤、療法抗体、毒素、例えば細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的活性毒素、またはその断片、または小分子毒素、または放射性同位体、例えば２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅ、あるいは癌細胞の成長または増殖を阻害するように働く、任意の他の剤であってもよい。
【００７０】
こうした薬剤コンジュゲートの生成において有用な化学療法剤には、ＤＭ−１およびＤＭ−４を含むメイタンシノイド、オーリスタチン、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、シトキシン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、タキソイド、例えばパクリタキセル、およびドセタキセル、タキソテール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホサミド（ｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン、５−ＦＵ、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、アクチノマイシンＤ、ＶＰ−１６、クロラムブシル、メルファラン、および他の関連ナイトロジェン・マスタードが含まれる。やはり含まれるのは、腫瘍に対するホルモン作用を制御するかまたは阻害するように働くホルモン剤、例えばタモキシフェンおよびオナプリストンである。使用可能な毒素およびその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、
アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｄｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、サポリン、マイトジェリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコスセン（ｔｒｉｃｏｔｈｃｅｎｅ）が含まれる。小分子毒素には、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、パリトキシンおよびＣＣ１０６５が含まれる。
【００７１】
融合タンパク質は、ターゲット抗原ＣＤ４７に選択的に結合し、そして本発明の側面にしたがって、癌および他の疾患細胞をスクリーニングして、高密度でＣＤ４７抗原を提示する細胞を検出するために用いられる。好ましい態様において、ＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質療法の候補である被験体から採取した癌細胞試料に、スクリーニングを適用する。高密度でＣＤ４７抗原を提示する癌細胞に関して陽性の試験結果を示す被験体を、次いで、本融合タンパク質またはそのコンジュゲートハイブリッドでの療法のために予定することも可能である。本明細書記載の融合タンパク質と組み合わせ、標準技術を用いて、癌細胞をスクリーニングすることも可能である。望ましくは、融合タンパク質は検出可能標識を取り込む。標識は、それ自体検出可能であってもよいし（例えば放射性同位体標識または蛍光標識）、あるいは酵素標識の場合、検出可能である、基質化合物または組成物の化学的改変を触媒することも可能である。検出可能標識として働きうる放射性核種には、例えば、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、およびＰｄ−１０９が含まれる。
【００７２】
免疫蛍光または免疫電子顕微鏡検査によって、本抗体または断片を用いて、ＣＤ４７＋癌細胞への結合のｉｎ  ｓｉｔｕ検出を実行してもよい。この目的のため、組織学的標本を患者から取り除いて、そして好ましくは生物学的試料上に抗体を重層することによって、融合タンパク質の標識型をこれに適用する。この方法はまた、生検腫瘍組織内で、ＣＤ４７抗原の分布を調べることも可能にする。当業者には、非常に多様な組織学的方法がｉｎ  ｓｉｔｕ検出のために容易に利用可能であることが明らかであろう。
【００７３】
より具体的には、本発明のＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質を用いて、標準検出アッセイを用い、生物学的試料（例えば組織生検、細胞、または体液）中の融合タンパク質反応性の存在または非存在を監視することも可能である。免疫学的アッセイは、直接検出を伴うことも可能であり、そして特に、ＣＤ４７＋である癌細胞の存在に関して、多量の試料をスクリーニングするのに適している。例えば、融合タンパク質を任意の標準イムノアッセイ形式（例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、フローサイトメトリーまたはＲＩＡアッセイ）で、任意の抗体の役割において用いて、複合体形成を測定することも可能である。直接または間接的に視覚化可能な任意の適切な標識をこれらの検出アッセイで利用してもよく、これには、限定されるわけではないが、任意の放射性、蛍光、発色（例えばアルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）、または化学発光標識、あるいは標識されたハプテン特異的抗体または他の結合パートナー（例えばアビジン）を用いて視覚化可能なハプテン（例えばジゴキシゲニンまたはビオチン）が含まれる。例示的なイムノアッセイが、例えばＡｕｓｕｂｅｌら、上記、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ニューヨーク（１９８８）、ならびにＭｏｙｎａｇｈおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４００：１０５，  １９９９に記載される。例えば、本明細書記載の融合タンパク質を用いて、高密度ＣＤ４７は、標準的フローサイトメトリー法を用いて、細胞表面で容易に検出される。適切な対照試料に比較して標識複合体を含有することが見いだされた試料は、高密度ＣＤ４７の存在を示すとされ、そしてしたがって、本融合タンパク質での治療を受け入れられる癌
または他の疾患の指標である。
【００７４】
本融合タンパク質が２つの分子を含み、各々がＦｃ構成要素に融合したＳＩＲＰαタンパク質構成要素を取り込む一本鎖ポリペプチドを含むことが認識されるであろう。
【００７５】
二量体を形成する一本鎖ポリペプチドの融合は、一本鎖ポリペプチドが、これを産生する宿主細胞から分泌される際に、Ｆｃ構成要素間で形成されるジスルフィド架橋から生じる。したがって、融合タンパク質から回収される産物は、Ｆｃ構成要素およびＳＩＲＰα構成要素の両方を取り込む一本鎖ポリペプチドの２つの分子間のジスルフィド連結から生じる二量体タンパク質である。
【００７６】
したがって、本発明は、ＳＩＲＰαタンパク質構成要素が、Ｆｃ領域、すなわちＣＨ構成要素に融合している一本鎖ポリペプチドを提供するだけでなく、２コピーのこれらの一本鎖ポリペプチドがそれぞれのＦｃ構成要素を通じて融合している二量体融合タンパク質も提供する。２コピーより多い各ポリペプチドが融合している多量体型もまた、本発明の範囲内である。
【００７７】
本ＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質を産生するため、一本鎖ポリペプチドの分泌型をコードするＤＮＡを得て、適切な発現／分泌ベクター内に取り込み、そして次いで、適切な産生宿主内にトランスフェクションする。生じたトランスフェクタントを培養すると、分泌産物として二量体融合タンパク質が生じ、これを次いで採取し、そして精製することも可能であり、これらはすべて、一般的に、確立された実施にしたがい、そして本明細書に例示されるとおりである。一本鎖型のポリペプチドを同様に得ることも可能であるが、該ポリペプチドは、分泌シグナルの補助なしに、そして原核生物などの宿主において産生され、したがって二量体化は起こらず、そしてポリペプチドは細胞内タンパク質として回収可能である。
【００７８】
したがって、本発明はまた、発現に際して、本融合タンパク質を構成する一本鎖ポリペプチドの分泌可能型を生じる、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むポリヌクレオチドも提供する。好ましいおよび分泌可能な一本鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８を有するＤＮＡ配列を含み、ここで、最初の９０残基は、ヒトＳＩＲＰαに天然である３０量体分泌シグナルをコードし、そして残りの核酸残基（配列番号７）は、一本鎖ＦＳＩＲＰαＦｃポリペプチドをコードする。態様には、１またはそれより多いコドンが、例示するものと同義のコドンによって置換されているポリヌクレオチドも含まれる。
【００７９】
関連する態様において、配列番号２５を有するＩｇＧ１に基づく融合タンパク質の分泌可能型をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号２７を含むポリヌクレオチドを提供する。やはり提供するのは、配列番号２６を有するＩｇＧ４に基づく融合タンパク質の分泌可能型をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号２８を含むポリヌクレオチドである。
【００８０】
標準的遺伝子合成ならびにクローニングおよび増幅技術を用いて、ポリヌクレオチドを新規合成して、損なわれていないポリヌクレオチドに組み立ててもよい。あるいは、そして例えば、ＳＩＲＰαタンパク質構成要素をコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号５）および選択するＦｃ構成要素をコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号６）を、これらの遺伝子の公的に入手可能な供給源からＰＣＲ増幅によって得ることも可能であり、そして増幅されたポリヌクレオチドを直接、あるいは生物学的活性に関して無害である１またはそれより多いアミノ酸残基をコードするリンカーを通じて、連結によって連結することも可能であり、これらはすべて確立された技術にしたがい、そして本明細書に例示するとおりである。
【００８１】
発現のため、分泌型の一本鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、選択した融合タンパク質産生宿主において、ポリヌクレオチドを発現するのに適したプラスミドなどのベクター内に取り込む。こうしたベクターは、商業的に入手可能であり、そして典型的には、選択した宿主において、発現を駆動するために有効なプロモーターの制御下で、直接、分泌可能融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの導入を可能にするように、構築される。宿主トランスフェクション法は、当該技術分野でよく確立されており、そしてベクターを含む発現系およびこうしたベクターのための発現宿主は、商業的に入手可能である。これらには、宿主２９３、ＣＨＯまたはＮＳＯ内に同時トランスフェクションして、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なＣＭＶプロモーター下で融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させるのに適したｐｃＤＮＡベクター、およびやはりＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手可能な、ＣＭＶプロモーター下で、そして２９３、ＣＨＯまたはＮＯＳ宿主において、二シストロン性ＲＮＡから、融合タンパク質鎖を発現するためのｐＴａｎｄｅｍ−１ベクター系が含まれる。本明細書の実施例に記載する、別の有用な発現系は、ＣＭＶプロモーターを利用し、そしてカナダ・モントリオールのＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより商業的に入手可能である。
【００８２】
本発明の融合タンパク質に適した産生宿主は、分泌可能型の融合体形成一本鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを一過性にまたは安定してのいずれかで取り込む細胞である。融合タンパク質の発現される型は、宿主からの各融合タンパク質鎖の分泌を可能にするシグナル配列を取り込み、それによって、産生された融合タンパク質鎖内のおよび鎖に渡る、望ましいジスルフィド連結の形成を可能にし、そして機能する融合タンパク質を提供する。分泌シグナルは、選択した宿主において機能性である、任意のこうしたシグナルによってコードされてもよい。１つの態様において、分泌シグナルは、ＳＩＲＰαタンパク質構成要素と通常関連する分泌シグナルである。
【００８３】
本発明の組換え融合タンパク質を発現するために適した哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞およびＣＨＯｃＴＡ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＳＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。特定の態様において、宿主はＣＨＯ細胞株、例えばＣＨＯ−Ｓ細胞株である。ＮＳＯ骨髄腫細胞とともに使用するため、別の好ましい発現系は、ＷＯ  ８７／０４４６２、ＷＯ  ８９／０１０３６およびＥＰ  ３３８，８４１に開示するＧＳ遺伝子発現系である。宿主細胞が増殖する培地内への融合タンパク質の分泌を可能にするのに十分な期間、トランスフェクションされた宿主細胞を培養することによって、融合タンパク質を産生する。すべて、明細書に例示するように、標準的タンパク質精製法を用いて、融合タンパク質を培地から回収することも可能である。
【実施例】
【００８４】
続く研究の説明において、融合タンパク質にはコードによって言及する。便宜上、参照融合体の機能性構成要素を以下に要約する：
表１
【００８５】
【表１】
2020089387.tif 000010
【００８６】
すべてのヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、アステリスク（＊）で示す場合以外は、ヒンジ安定化Ｓ２２８Ｐ突然変異を所持する。「ｍｕｔ」と示すＩｇＧ４  Ｆｃは、ＦｃγＲ結合をさらに減少させる、２３３〜２３６位（ＥＵ番号付け系）の突然変異を含有する（Ａｒｍｏｕｒら  １９９９  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９：２６１３）。∧ＦＤ６突然変異（Ｌ４Ｖ、Ｖ６Ｉ、Ａ２７Ｉ、Ｉ３１Ｆ、Ｅ４７Ｖ、Ｋ５３Ｒ、Ｅ５４Ｑ、Ｈ５６Ｐ、Ｖ６３Ｉ、Ｌ６６Ｔ、Ｋ６８Ｒ、Ｖ９２Ｉ）およびＣＶ１突然変異（Ｖ６Ｉ、Ａ２７Ｉ、Ｉ３１Ｆ、Ｅ４７Ｖ、Ｋ５３Ｒ、Ｅ５４Ｑ、Ｈ５６Ｐ、Ｌ６６Ｔ、Ｖ９２Ｉ）は、Ｗｅｉｓｋｏｐｆら  ２０１３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１：８８に記載される。＊＊商業的に入手可能なタンパク質は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号４５４６−ＳＡ−０５０）によって販売される。
【００８７】
１．  ＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質産生
以下に示すプライマーを用いて、３段階クローニングプロセスによって、ＳＩＲＰαＦｃ構築物を生成した：
【００８８】
【化９】
2020089387.tif 000011
【００８９】
最初のＰＣＲ反応において、１００ｎｇのテンプレートＤＮＡ（合成ヒトＳＩＲＰα  ＧｅｎＢａｎｋ  ＃ＡＡＨ２６６９２、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、各０．４ｍＭ  ｄＮＴＰおよび各２０ｐｍｏｌのプライマー中、白金Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、以下の条件にしたがって増幅した：
ＴＴＩ−６０２：プライマーＰ＃５８６３およびＰ＃５９２９；最初の融解９４℃５分間、その後、９４℃１分間、５６℃２分間、および６８℃２分間からなる３０周期。
【００９０】
ＴＴＩ−６１６：プライマーＰ＃５８６３およびＰ＃０８７４；最初の融解９４℃５分間、その後、９４℃１分間、５０℃１．５分間、および６３℃３分間からなる３０周期。
【００９１】
ＴＴＩ−６２１：プライマーＰ＃５８６３およびＰ＃４１９７；最初の融解９４℃５分間、その後、９４℃０．５分間、５０℃１．５分間、および６３℃３分間からなる３０周期。
【００９２】
ＴＴＩ−６２２：プライマーＰ＃５８６３およびＰ＃４１９５；最初の融解９４℃５分間、その後、９４℃０．５分間、５０℃１．５分間、および６３℃３分間からなる３０周期。
【００９３】
次いで、反応を７２℃で１０分間保持し、そして４℃に冷却した。１〜１．４％アガロースゲルを通じて反応産物を電気泳動し、そしてエチジウムブロミドで視覚化した。
【００９４】
次に、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、各０．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、各２０ｐｍｏｌのプライマーおよび１００ｎｇのテンプレートＤＮＡ（ヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ４、あらかじめクローニング）中、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、以下の条件下で、反応ＰＣＲ２において、ＩｇＧ  Ｆｃ断片を増幅した：
ＴＴＩ−６０２：プライマーＰ＃５９３０およびＰ＃１０３５；最初の融解９４℃５分間、その後、９４℃１分間、５６℃２分間、および７２℃２分間からなる３０周期。
【００９５】
ＴＴＩ−６１６：プライマーＰ＃０８７５およびＰ＃１０３５；最初の融解９４℃５分間、その後、９４℃１分間、５０℃１．５分間、および６３℃３分間からなる３０周期。
【００９６】
ＴＴＩ−６２１：プライマーＰ＃４１９８およびＰ＃１７３７；最初の融解９４℃５分間、その後、９４℃０．５分間、６０℃０．５分間、および６８℃０．５分間からなる３０周期。
【００９７】
ＴＴＩ−６２２：プライマーＰ＃４１９６およびＰ＃２０５８；最初の融解９４℃５分間、その後、９４℃０．５分間、５０℃１．５分間、および６３℃３分間からなる３０周期。
【００９８】
次いで、反応を７２℃で１０分間保持し、そして４℃に冷却した。１〜１．４％アガロースゲルを通じて反応産物を電気泳動し、そしてエチジウムブロミドで視覚化した。
【００９９】
最後に、反応ＰＣＲ３において、重複ＰＣＲによって、ＳＩＲＰαおよびＦｃ  ｃＤＮＡを組み立てた。ＰＣＲ１およびＰＣＲ２の産物（１００ｎｇ）を、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、および各０．４〜０．８ｍＭのｄＮＴＰ中、白金Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、９４℃５分間、その後、９４℃３０秒間〜１分間、次いで５２〜６０℃８０秒間〜３分間からなる１０周期でインキュベーションし、そして４℃に冷却した。次いで、プライマー（各２０〜４０ｐｍｏｌ）を第一の反応に添加し、そして以下の条件下で、第二段階の反応を行った：９４℃５分間で融解、その後、９４℃３０秒間〜１分
間、５０〜５６℃３０秒間〜３分間からなる３０周期、および３０秒間。各条件の詳細を以下に示す：
ＴＴＩ−６０２：プライマーＰ＃５８６３およびＰ＃１０３５を用いて、９４℃１分間および５６℃３分間で１０周期、その後、９４℃１分間、５５℃２．５分間、および７２℃３分間の３０周期。
【０１００】
ＴＴＩ−６１６：最初のＰＣＲ周期なし；プライマーＰ＃５８６３およびＰ＃１０３５を用いて、９４℃１分間、５０℃２分間、および６３℃３．５分間の３０周期。
【０１０１】
ＴＴＩ−６２１：プライマーＰ＃５８６３およびＰ＃１７３７を用いて、９４℃１分間および５２℃３分間で１０周期、その後、９４℃１分間、５２℃２分間、および６３℃４分間の３０周期。
【０１０２】
ＴＴＩ−６２２：プライマーＰ＃５８６３およびＰ＃２０５８を用いて、９４℃１分間および６０℃３分間の１０周期、その後、９４℃１分間、５２℃２分間、および６３℃４分間の３０周期。
【０１０３】
次いで、反応を６８〜７２℃で７〜８分間保持し、そして４℃に冷却した。反応産物を１〜１．４％アガロースゲルを通じて分離し、そしてエチジウムブロミドで視覚化し、そして以下のようにｐＭＰＧ発現ベクター（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カナダ・モントリオール）内に連結した：  ＰＣＲ増幅由来の関心対照のＤＮＡバンドを切除し、そしてＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いることによって、アガロースゲルから精製した。この精製ＰＣＲ産物を、ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）によって消化し、そしてＱｉａｑｕｉｃｋゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲルから精製した。次いで、ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ酵素によって同様に消化されているｐＭＰＧ発現プラスミド内に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって断片を連結した。ｐＭＰＧプラスミドは、ＣＭＶプロモーターおよびＴＫポリＡターミネーターを用い、そしてハイグロマイシン耐性選択マーカーを含有する。次いで、製造者の指示にしたがって、２μｌの連結反応を２５μｌのコンピテント大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に形質転換した。形質転換体を、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＬＢ寒天プレート上にスプレッドし、その後、３７℃で２０時間、インキュベーションした。ＱＩＡｐｒｅｐスピン・ミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いることによって、小規模大腸菌培養からプラスミドＤＮＡを抽出し、そして精製し、そして蛍光色素コンジュゲート化ｄｄＮＴＰを用いた自動化配列決定によって、ＤＮＡ配列を確認した（ヨーク大学コア分子生物学施設）。トランスフェクションのため、ＥｎｄｏＦｒｅｅプラスミドマキシキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、大量のプラスミドＤＮＡを調製し、次いで、蛍光色素コンジュゲート化ｄｄＮＴＰを用いた自動化配列決定によって、ＤＮＡ配列を再確認した（ヨーク大学コア分子生物学施設）。
【０１０４】
細胞株産生
ＣＨＯ−Ｓ細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、安定トランスフェクタントを生成した。簡潔には、単離したプラスミドＤＮＡを、ＸｂａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）によって直線化し、そしてＱＩＡＧＥＮカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。８ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１ｘＨＴ補充剤を補充した、血清不含で化学的に定義された培地（ＣＤ−ＣＨＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させたＣＨＯ−Ｓ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、直線化プラスミドでトランスフェクションした。４８時間後、細胞を９６ウェルプレートに移し、そして６００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する培地中、異なる濃度（１００００、５０００、または２０００細胞／ウェル）でプ
レーティングした。混合物にＤＮＡを添加せず、同一の方式で、偽トランスフェクション対照を行った。トランスフェクションの２〜３週後、薬剤耐性オリゴクローンパネルを摘み取り、そして４８時間の発現研究由来の上清を、以下のように、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした：  ９６ウェルプレートを、０．１μｇ／ウェルの捕捉Ａｂ（ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ）でコーティングし、そして４℃で一晩インキュベーションした。ウェルを洗浄し、そして２００μｌのＰＢＳＴ中の２％ＢＳＡで室温で１時間ブロッキングした。洗浄後、１００μｌの試料をＰＢＳＴ中の１％ＢＳＡで希釈し、ウェルに添加し、１時間インキュベーションし、洗浄し、そして次いで、ＨＲＰコンジュゲート化検出Ａｂ（ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ）と室温で１時間インキュベーションした。次いで、ウェルを洗浄し、そしてＴＭＢ基質（Ｍｏｓｓ  Ｉｎｃ．）を添加し、そして室温で３〜５分間インキュベーションした。ｉＭａｒｋマイクロプレート読み取り装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、４５０ｎｍ／６５５ｎｍ波長で吸光度を測定し、そして既知の量の精製融合タンパク質を用いて、標準曲線を構築した。３つの最高発現オリゴクローンの第二の限界希釈を、６００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含有する完全ＣＤ−ＣＨＯ培地中、より低い細胞濃度（０．１、０．２５、および０．５細胞／ウェル）で行った。２〜３週後、薬剤耐性クローンを、上述のようなＥＬＩＳＡによって、組換えタンパク質産生に関して再び評価した。生産性をｐｇ／細胞／日で表し、そしてこれは、ヒトＳＩＲＰα融合タンパク質に関しては、１．４〜２３．９ｐｇ／細胞／日の範囲であった。最高に発現している単一細胞クローンを、ＷＡＶＥバイオリアクター系において、上清バッチ産生のために用いた。いくつかの例において、単一クローン段階に到達する前に、最適オリゴクローンを産生に用いた。
【０１０５】
タンパク質精製
小ロットタンパク質の迅速産生のため、一過性トランスフェクション２９３Ｆ細胞において、いくつかのＳＩＲＰα−Ｆｃバッチを作製した。簡潔には、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、２９３Ｆ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させ、非直線化プラスミドＤＮＡおよび２９３Ｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクションし、そして体積８０〜１００ｍＬ／フラスコ中、３７℃、５％ＣＯ２で３〜６日間、振盪装置フラスコバッチ中で増殖させた。細胞生存度が〜９０％に低下するまで、細胞密度および生存度を毎日監視した。バッチ採取物の細胞生存度は、８５〜９０％の範囲であった。
【０１０６】
ＣＨＯ−Ｓ細胞からの精製のため、ＷＡＶＥ使い捨てバッグバイオリアクター系Ｂａｓｅ２０／５０  ＥＨＴ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で、安定トランスフェクション高発現オリゴまたは単一細胞クローンから、５または１０Ｌ培養上清を生成した。簡潔には、ＣＨＯ−Ｓトランスフェクタントを、完全増殖培地（８ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｘＨＴ補充剤、および６００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢを補充したＣＤ−ＣＨＯ）中、静的Ｔ１５０フラスコ中、３７℃で増殖させて、それぞれ、５Ｌまたは１０Ｌ実行のため、０．５ｘ１０６細胞／ｍＬで、１Ｌまたは２Ｌ培養を開始するために十分な細胞数を生じた。バイオリアクターバッグに接種し、そして次いで、１５〜２０ｒｐｍの振盪速度、角度７°、および気流０．２〜０．４Ｌｐｍで細胞をインキュベーションした。培養が、２〜２．５ｘ１０６細胞／ｍＬの密度に到達したら（通常、接種の２〜３日以内）、バイオリアクターを５Ｌまたは１０Ｌまでさらにスケールアップし、そして３７℃、１０％ＣＯ２、振盪速度１５〜２０、角度７°、気流０．２〜０．４Ｌｐｍでさらにインキュベーションした。細胞が１〜１．５ｘ１０６細胞／ｍＬの密度に到達したら、温度を３０℃に低下させ、そして上に明記する条件で、培養をさらに７〜１０日間インキュベーションした。第０日、３０℃で開始して、培養に１％ＣＨＯフィードバイオリアクター補充物（Ｓｉｇｍａ）を２日ごとに供給し、そして細胞生存度がほぼ９０％に低下したら、採取した。上清を収集し、３０００ｘｇ、４℃で４０分間、遠心分離し、そして精製するまで、−２０℃で凍結した。
【０１０７】
最初にプロテインＡクロマトグラフィを用いる２工程法ですべてのタンパク質を精製した。緩衝液交換した上清を、９倍の結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｎａ−Ｐおよび３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．８）で希釈し、そしてｒプロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に、２〜３ｍＬ／分（装填体積および装填時間に応じる）の流速で、４℃で一晩装填した。次いで、カラムを結合緩衝液（３ｍＬ／分で２０体積）で洗浄し、そしてタンパク質を０．１Ｍクエン酸ｐＨ  ４．０およびｐＨ  ２．２、３ｍＬ／分で溶出させた。溶出させた物質を、１Ｍで中性までｐＨ調整し、そして続いて、ＨｉＴｒａｐフェニルＨＰクロマトグラフを用いて精製した。簡潔には、０．２Ｍ硫酸アンモニウムｐＨ７．５でタンパク質を少なくとも４倍希釈し、そしてＨｉＴｒａｐフェニルＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に、２〜３ｍＬ／分（カラムサイズおよび装填時間に応じる）で装填した。非凝集ＳＩＲＰαＦｃタンパク質を、フロースルー分画中に収集した。ＢｉｏＭａｘ  １０膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた接線流濾過を用いて、タンパク質をＰＢＳ
ｐＨ７．４中に濃縮し、そして緩衝液交換した。各タンパク質の品質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ヤギ抗ＩｇＧＦｃ抗体およびウサギ抗ヤギＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲートを用いたウェスタンブロット、ならびにＨＰＬＣ分析によって決定した。すべてのタンパク質の同一性を、Ｎ末端配列決定および質量分析によって確認した。
【０１０８】
１．  １ドメインおよび３ドメインＳＩＲＰαＦｃ融合体の比較
ＳＩＲＰαは、３つの細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインからなるが、ＣＤ４７への結合は、Ｎ末端ドメインに局在化される。ＳＩＲＰαＦｃ融合体のための最適なＳＩＲＰα領域を決定するため、本発明者らは、３つすべての細胞外ＳＩＲＰαドメイン（ＴＴＩ−６０２）または単一のＮ末端ドメイン（ＴＴＩ−６１６）のいずれかを取り込むタンパク質を生成した。
【０１０９】
どちらのタンパク質も、エフェクター機能を欠く突然変異ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ主鎖上に構築した。本発明者らは、直接結合アッセイ（図１Ａ）および間接的競合アッセイ（図１Ｂ）を用いてヒトＣＤ４７へのＴＴＩ−６０２およびＴＴＩ−６１６の結合を比較した。直接結合アッセイのため、ＣＤ４７＋ヒトＪｕｒｋａｔ細胞を多様な濃度（示す通り）のｈＳＩＲＰαＦｃタンパク質と氷上で１時間インキュベーションした。次いで、細胞を洗浄して、いかなる未結合タンパク質も除去し、そして次いで、抗ｈＩｇＧ  Ｆｃｇ特異的（Ｆａｂ’）２  ＦＩＴＣ抗体と氷上で１時間インキュベーションした。次いで、細胞を洗浄し、そして２％パラホルムアルデヒド溶液と一晩インキュベーションすることによって、固定した。次いで、固定溶液を洗い流し、そして細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ
ＦＡＣＳｃａｎ）によって分析した。非線形回帰を用いて、データを一部位結合モデルに適合させた。間接的アッセイのため、固定飽和量のビオチン化ヒトＳＩＲＰαＦｃ（ＴＴＩ−６０１）を単独で、または滴定量のＴＴＩ−６０２またはＴＴＩ−６１６と氷上で１５分間インキュベーションした。次いで、この混合物をヒトＣＤ４７＋  Ｊｕｒｋａｔ細胞に添加し、氷上で１時間インキュベーションし、洗浄して、未結合タンパク質を除去し、そして次いで、飽和量のストレプトアビジン−ＰＥと氷上、暗所で１時間インキュベーションした。次いで、上述のように、細胞を洗浄し、固定し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。次いで、幾何平均を規準化し、１００％阻害をストレプトアビジン−ＰＥ単独の幾何平均とし、そして０％阻害をビオチン化ＴＴＩ６０１単独の幾何平均とした。シグモイド用量−反応曲線適合（Ｐｒｉｓｍ、Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いた非線形回帰分析によって、最適適合の曲線を得た。
【０１１０】
図１Ａおよび１Ｂのデータは、ＴＴＩ−６０２およびＴＴＩ−６１６の間の結合相違を示し、ＴＴＩ−６１６の結合はどちらのアッセイでもより高いアフィニティであった。直接結合アッセイにおいて、ＴＴＩ−６１６は、ＴＴＩ−６０２よりも１０倍高いアフィニティで結合した（ＥＣ５０値：１３．４ｎＭ対１３９ｎＭ）。間接的結合アッセイにおい
て、ＴＴＩ−６１６は、ＴＴＩ−６０２よりも７倍高いアフィニティで結合した（ＥＣ５０値：４．５ｎＭ対３２．１ｎＭ）。先に公表されたデータは、ＳＩＲＰαのＮ末端ドメインが、３つの細胞外ドメインすべてを含有するＳＩＲＰαに匹敵するアフィニティで、ＣＤ４７に結合することを示す（Ｈａｔｈｅｒｌｅｙら  ２００７  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８２：１４５６７）ため、これらの結果は予期せぬものであった。
【０１１１】
２．  異なるＦｃ領域を含むヒトＳＩＲＰαＦｃ融合体の設計
単一ＳＩＲＰαドメインを取り込む融合タンパク質に関する優先性が確立されたため、最適Ｆｃ領域を決定するための研究を行った。同じＳＩＲＰα領域（３１〜１４８）を含有するが、多様なエフェクター活性を有する異なるＦｃ構成要素上に構築される、３つの異なるヒトＳＩＲＰαＦｃ融合体を生成した。設計詳細を以下の表２に要約する。注釈付きのＤＮＡおよびタンパク質配列を付録１に示す。
【０１１２】
表２．  ヒトＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質の設計
【０１１３】
【表２】
2020089387.tif 000012
【０１１４】
＊ＥＵ番号付け系における２２８位に対応し、そしてＩｇＧ４ヒンジ領域を安定化させ、そして単量体形成を導く鎖内ジスルフィドの形成を防止するよう意図される（Ａｎｇａｌら  １９９３  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５）。
【０１１５】
＊＊ＥＵ番号付け系における２３３〜２３６位に対応し、そしてＦｃγ受容体結合をさらに減少させるよう意図される（Ａｒｍｏｕｒら  １９９９  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９：２６１３）。
【０１１６】
３．  ＣＤ４７に対するＳＩＲＰαＦｃ融合体の結合
３つのＳＩＲＰαＦｃ融合体を、細胞表面ヒトＣＤ４７に対する結合に関して比較した。簡潔には、ＣＤ４７＋ヒトＪｕｒｋａｔ細胞を、多様な濃度（示す通り）のｈＳＩＲＰαＦｃタンパク質と氷上で１時間インキュベーションした。次いで、細胞を洗浄して、いかなる未結合タンパク質も除去し、そして次いで、抗ｈＩｇＧ  Ｆｃｇ特異的（Ｆａｂ’）２  ＦＩＴＣ抗体と氷上で１時間インキュベーションした。次いで、細胞を洗浄し、そして２％パラホルムアルデヒド溶液と一晩インキュベーションすることによって、固定した。次いで、固定溶液を洗い流し、そして細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳｃａｎ）によって分析した。次いで、幾何平均を規準化し、そして、一部位結合モデルにデータを適合させる非線形回帰を用いて、Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）によって、結合曲線およびＫｄ値を生成した。
【０１１７】
図２に示すように、３つの融合タンパク質は、非常に類似の結合プロファイルを示し、ほぼ同一のアフィニティ結合（Ｋｄ）値（２．３〜２．４ｎＭ）を生じた。これは、３つのタンパク質すべてが同じＳＩＲＰα領域を含有し、そしてＦｃ領域がリガンド結合に影
響を及ぼすとは予測されないため、予期されることであった。
【０１１８】
４．  ＳＩＲＰαＦｃ融合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ食作用促進活性
ＳＩＲＰαＦｃによるＣＤ４７の遮断は、活性化ヒトマクロファージによるヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）腫瘍細胞の食作用を増進する。３つの融合タンパク質の食作用促進活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで比較して、Ｆｃ領域がＡＭＬ食作用に影響を及ぼすかどうかを決定した。磁気選択を用いて、Ｆｉｃｏｌｌ精製ヒト末梢血単核細胞からＣＤ１４＋単球をまず単離することによって、ヒトマクロファージを生成した。２０ｎｇ／ｍｌでヒト単球コロニー刺激因子を含有するＸ−ｖｉｖｏ培地中で、少なくとも１週間、単球を培養して、マクロファージへの発生を促進した。次いで、マクロファージを２４ウェル培養プレート中で、ガラススライド上にプレーティングし、そしてヒトインターフェロンガンマと一晩インキュベーションした。翌日、ウェルを洗浄し、そしてＬＰＳを少なくとも１時間添加した。ヒトＡＭＬ細胞を計数し、そしてＣＦＳＥで標識した。標識後、ＡＭＬ細胞を、ＰＢＳ、ＳＩＲＰαＦｃタンパク質またはアイソタイプ対照と、室温（ＲＴ）で１５分間インキュベーションした。次いで、ＡＭＬ細胞を個々のウェルに添加し、混合し、そして３７℃、５％ＣＯ２加湿細胞インキュベーター中で、２時間、インキュベーションした。インキュベーション後、ウェルを洗浄し、そしてマクロファージを小麦胚芽凝集素Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｗ３２４６４）で、ＲＴで１５分間振盪しながら標識した。次いで、ウェルを洗浄し、そして２％パラホルムアルデヒドで、ＲＴで３０分間固定した。次いで、ウェルを洗浄し、そして暗所、４℃で一晩維持した。走査型共焦点顕微鏡（Ｑｕｏｒｕｍ  Ｗａｖｅ
ＦＸ−Ｘ１回転ディスク共焦点系、Ｑｕｏｒｕｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カナダ・オンタリオ州グェルフ）によって、ガラススライドを分析した。以下のように、食作用インデックスを用いて、ＡＭＬ細胞の食作用を定量化した：（マクロファージ内部のＡＭＬ細胞／マクロファージ数）ｘ１００；試料あたり少なくとも２００のマクロファージを計数。図３に示すように、ＴＴＩ−６２１およびＴＴＩ−６２２は、類似の食作用活性を示し、一方、ＴＴＩ−６１６は明らかにより弱い（これは特に、１０ｎＭ用量で明らかである）。これは、マクロファージによる最大ＳＩＲＰαＦｃ誘発腫瘍細胞殺傷には、野生型ＩｇＧ４またはＩｇＧ１  Ｆｃ領域のいずれかが必要であることを示す。
【０１１９】
ターゲットとしてＡＭＬ細胞株ＯＣＩ／ＡＭＬ−２を用いて、食作用活性に関して、ＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質の拡張パネルを評価した。図６に示すように、データは、最高レベルのＡＭＬ−２食作用が、単一ＳＩＲＰαドメインおよび野生型ＩｇＧ４またはＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含有する融合タンパク質（すなわちＴＴＩ−６２２、−６２０またはＴＴＩ−６２１）によって誘導されることを明らかに示す。いかなるＦｃエフェクター機能（例えばＴＴＩ−６１６）も欠く融合タンパク質も、食作用を誘発可能であるが、効果はかなりより低い。これは、図３に報告するデータと一致する。３つの細胞外ドメインを持つＳＩＲＰαＦｃ（ＴＴＩ−６０１、ＴＴＩ−６０２およびＲ＆Ｄ）もまた、低レベルの食作用活性しか持たず、そしてＲ＆Ｄ融合体の場合、この劣った活性は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域で克服不能である。さらに、実質的により高いＣＤ４７結合を与える突然変異ＳＩＲＰα配列を含有する融合タンパク質（ＴＴＩ−６２３およびＴＴＩ−６２４）は、同じＦｃ領域を所持する野生型ＳＩＲＰαＦｃ（ＴＴＩ−６１６）に比較して、より高い食作用活性を生じない。これらの結果によって、野生型単一ＳＩＲＰαドメインで達成されるレベルを超えてＣＤ４７結合アフィニティを増加させても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでいかなるさらなる利点も生じないことが示唆される。ＩｇＧ４  Ｆｃに連結されたＦＤ６およびＣＶ１突然変異ＳＩＲＰαが、野生型ＳＩＲＰα−ＩｇＧ４よりも高い食作用促進活性を有することが報告されている（Ｗｅｉｓｋｏｐｆら  ２０１３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１：８８）ため、この結論は予期せぬことであった。
【０１２０】
５．  ＳＩＲＰαＦｃ融合体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗白血病活性
標準的異種移植モデルにおいて、ヒトＡＭＬ腫瘍細胞の増殖を制御する能力に関して、３つのＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質を試験した。ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ（ＮＯＤ．ＳＣＩＤ）マウス（８〜１２週齢）を、１３７Ｃｓ  γ−照射装置から２７５ｃＧｙで致死量以下に照射した後、ヒト白血病患者から収集したＡＭＬ細胞を大腿内注射した。移植３週後から開始して、マウスをＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質（週あたり３回の８ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）、あるいは等モル用量の対照Ｆｃタンパク質ＴＴＩ−４０１（突然変異ヒトＩｇＧ４）またはＴＴＩ−４０２（ヒトＩｇＧ１）で治療した。治療４週後、マウスを屠殺し、そして注射した大腿、注射していない骨髄および脾臓内のヒト白血病細胞を、ヒトＣＤ４５およびヒトＣＤ３３マーカーの発現に関して染色してフローサイトメトリー分析によって検出した。ＡＭＬ生着は、各区画におけるヒトＣＤ４５＋ＣＤ３３＋細胞の割合として表した。
【０１２１】
図４に示すように、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を所持するＴＴＩ−６２１融合タンパク質は、移植部位（注射大腿）で、抗白血病効果を仲介可能な唯一のタンパク質であった。非注射骨髄において、明らかなＦｃ依存性効果があり、ＴＴＩ−６２１（完全活性）＞ＴＴＩ−６２２（低Ｆｃ活性）＞ＴＴＩ−６１６（非Ｆｃ活性）であった。３つすべての融合タンパク質が脾臓において抗白血病活性を示したが、全体の生着レベル（対照マウスにおいて見られるようなもの）は、注射または非注射骨髄におけるより、はるかにより低いため、この部位は、活性のはるかにより厳密でない試験である。総合すると、これらの結果は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を所持するＳＩＲＰαＦｃタンパク質が、ヒトＡＭＬ異種移植モデルにおいて、最高の活性を有することを示す。ＩｇＧ１に基づく融合体の優れたｉｎ  ｖｉｖｏ活性は、ＴＴＩ−６２１およびＴＴＩ−６２２が類似の活性を示す、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ食作用データ（図２）に基づくと予測されなかったであろう。
【０１２２】
６．  ＳＩＲＰαＦｃ融合体の赤血球凝集アッセイ
健康なドナー由来のヘパリン処理全血を用いて、ヒト赤血球を調製した。４ｍＬの全血を１５ｍＬコニカル試験管中にピペッティングし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を重層し、そして２００ｘｇ、室温で１０分間遠心分離して、血小板を除去した。血小板分画を吸引した後、試験管に１５ｍＬまでＰＢＳを重層し、試験管を反転させることによって、内容物をよく混合し、そしてＲＢＣを１５００ｒｐｍ、５分間の遠心分離によって、充填させた。この洗浄をさらに３回反復した。最終洗浄後、上清を吸引し、そして十分なＰＢＳを添加して、充填された赤血球が１０％ＲＢＣ溶液となるようにした（例えば、１ｍＬの充填ＲＢＣが得られた場合、これらを９ｍＬ  ＰＢＳでさらに希釈して、１０％ＲＢＣ溶液を作製した）。４℃で保存した１０％ＲＢＣ溶液は、１週間以内に使用可能であった。赤血球凝集アッセイ直前に、新鮮な１％ＲＢＣ溶液を作製した。
【０１２３】
ＣＨＯまたは２９３細胞のいずれかにおいて発現されたＳＩＲＰαＦｃタンパク質を、ＲＢＣ凝集およびＲＢＣペレット形成防止によって立証されるように、ヒトＲＢＣを凝集させる能力に関して分析した。９６ウェル非組織培養処理低タンパク質結合丸底プレートでアッセイを行った。新鮮な１％ＲＢＣ溶液を赤血球凝集アッセイ直前に作製した。５０μＬの１％ＲＢＣ溶液を各ウェルに移した。３μＭ最終濃度から開始して３倍連続希釈ヒトＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質またはビヒクル対照を、適切なウェルに、ウェルあたり５０μＬで添加した。ウェルを穏やかに混合し、そして３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベーションした。一晩インキュベーション後、プレートの写真を撮影した。架橋の非存在下で、赤血球はウェルの底に転がり、そして緊密なペレットであるように見える。よく明示されたＲＢＣペレットに比較して、もやのように見える安定しないＲＢＣの存在によって、赤血球凝集の証拠が立証される。赤血球凝集を誘発するＳＩＲＰα融合タンパク質は、ＲＢＣペレットの形成を防止し、そしてしたがって拡散したまたはもやのようなパターンを生じるであろう。結果によって、３ドメインＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質ＴＴＩ−６０１およびＴＴＩ−６０２が、単一ドメイン融合体に比較して、赤血球凝集を誘導
する傾向が増加していることが示される。これによって、単一ドメインＳＩＲＰαＦｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＲＢＣ毒性を引き起こす可能性はより低いであろうことが示唆される。
【０１２４】
７．  ＳＩＲＰαＦｃ融合体のＣＤ４７アゴニスト活性
ヒトＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞クローンＥ６−１をＡＴＣＣ（カタログ番号ＴＢ−１５２）より購入し、そして１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ１６４０中で増殖させた。抗ＣＤ４７  ｍＡｂクローンＢ６Ｈ１２、２Ｄ３、ＢＲＩＣ１２６、およびＣＣ２Ｃ６の細胞表面結合を示すことによって、フローサイトメトリーにより、ＣＤ４７発現を分析した。アゴニストアッセイの前日、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、完全増殖培地中、〜３ｘ１０５細胞／ｍＬで、Ｔ７５／Ｔ１５０組織培養フラスコ中に植え付けた。
【０１２５】
非常に生存度が高い（＞９５％）Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を採取し、そして丸底９６ウェル組織培養プレート中、ウェルあたり２ｘ１０５細胞／２００μＬで完全増殖培地中にプレーティングした。細胞を培地のみまたはウェルあたり１２．５μｇ／２０μＬのＣＤ４７遮断抗体クローンＢ６Ｈ１２のいずれかで、３７℃、５％ＣＯ２で１時間、前処理した。２０μＬ／ウェル中、３μＭ最終濃度で、ＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質または対照Ｆｃを添加し、そしてアポトーシス促進剤スタウロスポリンを陽性対照として用いて、２０μＬ／ウェル中、１μＭで添加した。未処理細胞（ＵＴ）は、２０μＬ／ウェルの培地のみを添加された。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベーションした。一晩インキュベーション後、製造者の指示にしたがって、細胞を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのアネキシン−Ｖ：ＦＩＴＣ／７−ＡＡＤアポトーシス検出キット（カタログ番号８８−８００５−７５）で染色し、そしてアポトーシス進行を防止するため、染色４時間以内に、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１２６】
図５に示すように、３ドメイン融合体であるＴＴＩ−６０２は、単一ドメイン融合タンパク質ＴＴＩ−６１６およびＴＴＩ−６２０よりもはるかに高いレベルのＪｕｒｋａｔアポトーシスを誘導した。ＴＴＩ−６０２の効果は、細胞をＣＤ４７遮断抗体であるＢ６Ｈ１２で前処理することによって中和されるため、明らかにＣＤ４７特異的であった。これらの結果は、単一ドメインＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質が、ＣＤ４７アゴニスト活性を最小限にするため、３ドメインＳＩＲＰαＦｃよりも好ましいことを示す。
【０１２７】
８．  赤血球結合
ＣＤ４７に基づく療法に関する１つの懸念は、巨大な抗原シンクとして作用し、そして血液学的毒性を引き起こす潜在能力を有する、赤血球（ＲＢＣ）表面上のターゲットの発現である。実際、高アフィニティＳＩＲＰαＦｃ変異体およびＣＤ４７特異的抗体で治療した動物において、貧血が報告されてきている。したがって、ヒト赤血球へのＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質の結合を、フローサイトメトリーによって評価した。ヘパリン処理全血を用いて、ヒトＲＢＣを調製した。全血を２００ｘｇ、室温で１０分間、遠心分離して、血小板を除去した。血小板分画を吸引した後、試験管に元来の体積までＰＢＳを重層し、試験管を反転させることによって、内容物をよく混合し、そして１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、ＲＢＣをペレットにした。この洗浄をさらに３〜５回反復した。最終洗浄後、上清を吸引し、そして試験管に、元来の血液体積までＰＢＳを重層した。血球計算板を用いてＲＢＣを計数し、そしてＲＢＣ結合アッセイ前に、５ｘ１０８細胞／ｍＬで再懸濁した。抗ヒトＣＤ２３５ａを示すフローサイトメトリーによって、赤血球の純度を評価した（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  カタログ番号１２−９９７８）。
【０１２８】
野生型ＳＩＲＰα配列を含有する融合タンパク質は、ヒト赤血球には非常にわずかしか
結合せず、高濃度であっても、バックグラウンドを２倍より越えないシグナルしか生じないことが観察された。対照的に、ＣＤ４７モノクローナル抗体は、典型的には、バックグラウンドより＞１００倍高く結合する。ＳＩＲＰαＦｃおよびＣＤ４７抗体の間のＲＢＣ結合の顕著な相違を図７Ａに示し、ここで、ある範囲の濃度に渡る、ＴＴＩ−６１６のＣＤ４７抗体Ｂ６Ｈ１２の結合を比較する。この現象がＢ６Ｈ１２にユニークではないことを立証するため、３つのさらなるＣＤ４７抗体（２Ｄ３、ＢＲＩＣ１２６およびＣＣ２Ｃ６）を評価した。図７Ｂに示すように、４つの抗体はすべて、ＳＩＲＰαＦｃよりも劇的により高いレベルで、ヒトＲＢＣに結合した。Ｆｃアイソタイプあるいは１または３ドメイン構造であるかにかかわらず、ＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質がヒトＲＢＣにあまり結合しないことに注目されたい（データ未提示）。さらに、ＳＩＲＰαＦｃおよびＣＤ４７抗体の間の赤血球結合の相違は、ＣＤ４７アフィニティの相違を単純に反映するのではなく、これはどちらのクラスのタンパク質もＡＭＬ腫瘍細胞株に同様に結合するためである（図７Ｃを参照されたい）。
【０１２９】
これらの研究から、いくつかの予期せぬ結果が得られた。まず、３ドメインＳＩＲＰαＦｃと比較した、単一ドメインＳＩＲＰαＦｃの優れた結合アフィニティは、公表された文献と一致しない。第二に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの白血病細胞の除去におけるＦｃ領域の強い役割は、ＣＤ４７抗体の有効性が、ＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用の遮断によると議論する他の研究者によって公表されるデータと一致しない。また、ＴＴＩ−６２１（ＩｇＧ１）の優れたｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ食作用データに基づいては予測されないであろう。さらに、赤血球への単一ドメインＳＩＲＰαＦｃの非常に低い結合、および低いＣＤ４７アゴニスト活性は、すべて、他のＣＤ４７阻害剤より好ましい、本明細書に解説するＳＩＲＰαＦｃの医学的使用を支持する。
【０１３０】
総合すると、これらのデータは、最適ヒトＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質が、エフェクター適合Ｆｃ領域、例えばヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、または好ましくはヒトＩｇＧ４のＦｃ領域に適切なように連結された単一（Ｎ末端）ＳＩＲＰαドメインを含有すべきであることを示す。
本願は以下の発明を包含する。
［項目１］  ＣＤ４７＋疾患細胞の成長および／または増殖を阻害するために有用なヒトＳＩＲＰα融合タンパク質であって、無視できるＣＤ４７アゴニズムおよび無視できる赤血球結合を有し、ヒトＳＩＲＰαの全細胞外領域のアフィニティよりも少なくとも５倍高いアフィニティでヒトＣＤ４７に結合するのに有効なヒトＳＩＲＰαドメイン、およびエフェクター機能を有するヒトＩｇＧ定常領域（Ｆｃ）を含み、該融合タンパク質の強度がエフェクター機能を欠くＦｃ領域から形成されるＳＩＲＰαＦｃ融合体の強度よりも少なくとも５倍高く、ヒトＳＩＲＰαドメインが、ヒトＳＩＲＰα変異体２の残基３２〜１３７（配列番号１）を含むＩｇＶドメインである、前記ヒトＳＩＲＰα融合タンパク質。
［項目２］  ヒトＳＩＲＰαドメインが、ヒトＳＩＲＰα変異体２の残基３１〜１４８（配列番号２２）からなる、項目１記載のヒトＳＩＲＰα融合タンパク質。
［項目３］  エフェクター機能を有するＦｃが、（ａ）ヒトＩｇＧ１抗体の定常領域、および（ｂ）ヒトＩｇＧ４抗体の定常領域より選択される、項目１または項目２記載のヒトＳＩＲＰα融合タンパク質。
［項目４］  エフェクター機能を有するＦｃが、ヒトＩｇＧ１抗体の定常領域である、項目３記載のヒトＳＩＲＰα融合タンパク質。
［項目５］  ヒトＩｇＧ１抗体の定常領域が配列番号２を含む、項目４記載のヒトＳＩＲＰα融合タンパク質。
［項目６］  配列番号３を含む、項目５記載のヒトＳＩＲＰα融合タンパク質。
［項目７］  配列番号２５を含む、項目５記載のヒトＳＩＲＰα融合タンパク質。
［項目８］  エフェクター機能を有するＦｃが、ヒトＩｇＧ４抗体の定常領域である、項目３記載のヒトＳＩＲＰα融合タンパク質。
［項目９］  ＦｃがＳｅｒ２２８Ｐｒｏ（ＥＵ）突然変異を含む、項目８記載のヒトＳＩＲＰα融合タンパク質。
［項目１０］  Ｆｃが配列番号２４を含む、項目９記載の融合タンパク質。
［項目１１］  配列番号２６を含む、項目１０記載の融合タンパク質。
［項目１２］  検出可能標識をさらに含む、項目１〜１１記載の融合タンパク質。
［項目１３］  薬学的に許容されうるキャリアー、およびＣＤ４７＋疾患細胞の成長または増殖を阻害するために有効な量の項目１〜１１のいずれか記載の融合タンパク質を含む、薬学的組成物。
［項目１４］  融合タンパク質が配列番号２５を含む、項目１３記載の薬学的組成物。
［項目１５］  融合タンパク質が配列番号２６を含む、項目１３記載の薬学的組成物。
［項目１６］  ＣＤ４７＋疾患細胞の増殖を阻害する必要がある被験体において、ＣＤ４７＋疾患細胞の増殖を阻害するための方法であって、項目１３〜１５のいずれか１項に記載の組成物を投与する工程を含む、前記方法。
［項目１７］  疾患細胞がＣＤ４７＋癌細胞である、項目１６記載の方法。
［項目１８］  疾患細胞がＣＤ４７＋血液学的癌細胞である、項目１７記載の方法。
［項目１９］  疾患細胞がＣＤ４７＋白血病細胞である、項目１８記載の方法。
［項目２０］  疾患細胞がＣＤ４７＋癌細胞を含む固形腫瘍である、項目１７記載の方法。
［項目２１］  項目１〜１０のいずれか１項に記載のヒトＳＩＲＰα融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ構築物。
［項目２２］  発現可能であるように取り込まれた項目２１記載のＤＮＡ構築物を含む、タンパク質産生宿主細胞。
［項目２３］  ヒトＳＩＲＰα融合タンパク質を産生するための方法であって、項目１〜１１のいずれか１項に記載のヒトＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現のために取り込んだタンパク質産生宿主細胞を培養する工程を含む、前記方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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