(57)【要約】【課題】γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの少なくともいずれかを高含有するコク味付与物質含有酵母の製造方法及びコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法を提供する。【解決手段】細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性の酵母を、イソロイシン及びバリンを含有する培地で培養し、増殖させる酵母増殖工程と、前記培地中のイソロイシンの含有量が０．２質量％未満のときに、バリンを前記培地に加えて前記酵母を培養し、コク味付与物質を生成させるコク味付与物質生成工程とを含み、前記コク味付与物質が、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの少なくともいずれかであるコク味付与物質含有酵母の製造方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性の酵母を、イソロイシン及びバリンを含有する培地で培養し、増殖させる酵母増殖工程と、
前記培地中のイソロイシンの含有量が０．２質量％未満のときに、バリンを前記培地に加えて前記酵母を培養し、コク味付与物質を生成させるコク味付与物質生成工程とを含み、
前記コク味付与物質が、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの少なくともいずれかであることを特徴とするコク味付与物質含有酵母の製造方法。
【請求項２】
前記酵母が、グルタチオンの生成能が増強されるように改変された酵母である請求項１に記載のコク味付与物質含有酵母の製造方法。
【請求項３】
前記コク味付与物質生成工程において、更にスレオニンを前記培地に加える請求項１から２のいずれかに記載のコク味付与物質含有酵母の製造方法。
【請求項４】
前記コク味付与物質含有酵母におけるコク味付与物質の含有量が、酵母乾燥菌体重量あたり０．３％以上である請求項１から３のいずれかに記載のコク味付与物質含有酵母の製造方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のコク味付与物質含有酵母の製造方法で得られたコク味付与物質含有酵母から酵母エキスを調製することを特徴とするコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法。
【請求項６】
前記コク味付与物質含有酵母エキスにおけるコク味付与物質の含有量が、酵母エキス乾燥重量あたり１％超である請求項５に記載のコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの少なくともいずれかを含有するコク味付与物質含有酵母の製造方法、及び前記酵母を用いるコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母菌体から調製される酵母エキスは、食品に旨味やコク味などを付与する機能を有し、調味料等のような食品添加剤などとして食品分野で幅広く使用されている。近年の天然志向の高まりから、酵母エキスの需要は増加傾向にある。
【０００３】
食品にコク味を付与する成分の１つとして、グルタミン酸、システイン、及びグリシンからなるトリペプチドであるグルタチオン（以下、「ＧＳＨ」と称することがある。）が知られている。
これまでに、酵母菌体中のＧＳＨ含量を高めるための技術として、ＤＯＡ１遺伝子の少なくとも一部及びＭＥＴ３０遺伝子の少なくとも一部を欠損又は変異させた酵母変異株とする技術（例えば、特許文献１参照）、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株に突然変異処理をし、グルタチオン含量が高い酵母変異株を２株以上得て、得られた酵母変異株を掛け合わせることにより、ＧＳＨ含量がより高い酵母変異株を得る技術（例えば、特許文献２参照）が提案されている。
【０００４】
また、食品にコク味を付与する成分としては、γ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（ＸはＣｙｓ及びその誘導体を除くアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す。）も知られている（例えば、特許文献３参照）。
これまでに、前記コク味を付与する成分含有量を高めるための技術として、Ａｂｕ（Ｌ−２−アミノ酪酸）及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ（Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−２アミノ酪酸）を添加した培地で酵母を培養し、得られた菌体からγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを含む酵母エキスを調製する技術（例えば、特許文献４参照）、細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変し、酵母菌体内におけるＡｂｕ、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙから選択される少なくとも１種の含有量を高める技術（例えば、特許文献５参照）などが提案されている。
【０００５】
上記したように、食品にコク味を付与する成分の含量を高める技術について様々な検討が行われているものの、工業的規模での生産などを考慮した場合、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの少なくともいずれかの酵母又は酵母エキスにおける含量は未だ十分とは言えず、前記含量を更に高める技術の速やかな提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−２９１４７号公報
【特許文献２】特開２０１１−１６０７３９号公報
【特許文献３】特許第５８５７９７３号公報
【特許文献４】特許第５９５４１７８号公報
【特許文献５】国際公開第２０１５／００５３７８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの少なくともいずれかを高含有するコク味付与物質含有酵母の製造方法及びコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記目的を達成するべく鋭意検討を行った結果、細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性である酵母を増殖させ、培地中のイソロイシンの含有量が０．２質量％未満のときに、前記培地にバリンを加えて酵母を培養することで、前記酵母におけるγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの少なくともいずれかの含有量を顕著に高めることができることを知見した。
【０００９】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性の酵母を、イソロイシン及びバリンを含有する培地で培養し、増殖させる酵母増殖工程と、
前記培地中のイソロイシンの含有量が０．２質量％未満のときに、バリンを前記培地に加えて前記酵母を培養し、コク味付与物質を生成させるコク味付与物質生成工程とを含み、
前記コク味付与物質が、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの少なくともいずれかであることを特徴とするコク味付与物質含有酵母の製造方法である。
＜２＞  前記酵母が、グルタチオンの生成能が増強されるように改変された酵母である前記＜１＞に記載のコク味付与物質含有酵母の製造方法である。
＜３＞  前記コク味付与物質生成工程において、更にスレオニンを前記培地に加える前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のコク味付与物質含有酵母の製造方法である。
＜４＞  前記コク味付与物質含有酵母におけるコク味付与物質の含有量が、酵母乾燥菌体重量あたり０．３％以上である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のコク味付与物質含有酵母の製造方法である。
＜５＞  前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のコク味付与物質含有酵母の製造方法で得られたコク味付与物質含有酵母から酵母エキスを調製することを特徴とするコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法である。
＜６＞  前記コク味付与物質含有酵母エキスにおけるコク味付与物質の含有量が、酵母エキス乾燥重量あたり１％超である前記＜５＞に記載のコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの少なくともいずれかを高含有するコク味付与物質含有酵母の製造方法及びコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａは、試験例１の本培養における培養上清中のイソロイシンの含有量を測定した結果を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、試験例１の本培養における培養上清中のバリンの含有量を測定した結果を示す図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、試験例１の本培養における酵母乾燥菌体重量を測定した結果を示す図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、試験例１の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕの量を測定した結果を示す図である。
【図１Ｅ】図１Ｅは、試験例１の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの量を測定した結果を示す図である。
【図１Ｆ】図１Ｆは、試験例１の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのＡｂｕの量を測定した結果を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、試験例２の本培養における培養上清中のイソロイシンの含有量を測定した結果を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、試験例２の本培養における培養上清中のバリンの含有量を測定した結果を示す図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、試験例２の本培養における酵母乾燥菌体重量を測定した結果を示す図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、試験例２の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕの量を測定した結果を示す図である。
【図２Ｅ】図２Ｅは、試験例２の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの量を測定した結果を示す図である。
【図２Ｆ】図２Ｆは、試験例２の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのＡｂｕの量を測定した結果を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、試験例３の本培養における培養上清中のイソロイシンの含有量を測定した結果を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、試験例３の本培養における培養上清中のバリンの含有量を測定した結果を示す図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、試験例３の本培養における酵母乾燥菌体重量を測定した結果を示す図である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、試験例３の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕの量を測定した結果を示す図である。
【図３Ｅ】図３Ｅは、試験例３の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの量を測定した結果を示す図である。
【図３Ｆ】図３Ｆは、試験例３の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのＡｂｕの量を測定した結果を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、試験例５の本培養における培養上清中のイソロイシンの含有量を測定した結果を示す図−１である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、試験例５の本培養における培養上清中のバリンの含有量を測定した結果を示す図−１である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、試験例５の本培養における酵母乾燥菌体重量を測定した結果を示す図−１である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、試験例５の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕの量を測定した結果を示す図−１である。
【図４Ｅ】図４Ｅは、試験例５の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの量を測定した結果を示す図−１である。
【図４Ｆ】図４Ｆは、試験例５の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのＡｂｕの量を測定した結果を示す図−１である。
【図４Ｇ】図４Ｇは、試験例５の本培養における培養上清中のイソロイシンの含有量を測定した結果を示す図−２である。
【図４Ｈ】図４Ｈは、試験例５の本培養における培養上清中のバリンの含有量を測定した結果を示す図−２である。
【図４Ｉ】図４Ｉは、試験例５の本培養における酵母乾燥菌体重量を測定した結果を示す図−２である。
【図４Ｊ】図４Ｊは、試験例５の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕの量を測定した結果を示す図−２である。
【図４Ｋ】図４Ｋは、試験例５の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの量を測定した結果を示す図−２である。
【図４Ｌ】図４Ｌは、試験例５の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのＡｂｕの量を測定した結果を示す図−２である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（コク味付与物質含有酵母の製造方法）
本発明のコク味付与物質含有酵母の製造方法は、増殖工程と、コク味付与物質生成工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
本発明におけるコク味付与物質とは、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの少なくともいずれかをいう。なお、本発明において、Ａｂｕ及びＧｌｕはＬ体である。
【００１３】
＜増殖工程＞
前記増殖工程は、細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性の酵母を、イソロイシン及びバリンを含有する培地で培養し、増殖させる工程である。
【００１４】
−酵母−
前記酵母は、細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性である。
【００１５】
前記酵母は、出芽酵母であってもよいし、分裂酵母であってもよい。
前記出芽酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のサッカロミセス属、キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）等のキャンディダ属、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等のピヒア属、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）等のハンゼヌラ属等に属する酵母などが挙げられる。
前記分裂酵母としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等のシゾサッカロミセス属等に属する酵母などが挙げられる。
これらの中でも、酵母エキスの生産によく用いられているサッカロミセス・セレビシエやキャンディダ・ユティリスが好ましい。
前記酵母は、１倍体でもよいし、２倍性またはそれ以上の倍数性を有するものであってもよい。
【００１６】
前記細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性の酵母は、酵母菌体内におけるＡｂｕ、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙから選択される少なくとも１種を高含有することが知られている（国際公開第２０１５／００５３７８号参照）。
前記細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性の酵母は、改変等により作製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
【００１７】
前記アセト乳酸シンターゼとは、ピルビン酸及びα−ケト酪酸（α−ＫＢ）からα−アセトヒドロキシ酪酸及びＣＯ２を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう（ＥＣ  ２．２．１．６）。また、同活性を「アセト乳酸シンターゼ活性」ともいう。本発明において、アセト乳酸シンターゼは、２分子のピルビン酸からアセト乳酸及びＣＯ２を生成する反応を触媒する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。
【００１８】
細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性となるように酵母を改変する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、国際公開第２０１５／００５３７８号に記載されている方法などが挙げられる。
具体的には、例えば、アセト乳酸シンターゼの活性サブユニットをコードするＩＬＶ２遺伝子を破壊することにより、細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下し、イソロイシン及びバリン要求性となる。
前記ＩＬＶ２遺伝子の塩基配列情報は、公共のデータベースなどから取得することができ、例えば、サッカロミセス・セレビシエのＩＬＶ２遺伝子の塩基配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／）に開示されている。
前記ＩＬＶ２遺伝子を破壊する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【００１９】
アセト乳酸シンターゼ活性が低下したことは、例えば、改変前の酵母と改変後の酵母よりそれぞれ粗酵素液を調製し、そのアセト乳酸シンターゼ活性を比較することにより、確認できる。アセト乳酸シンターゼ活性は、例えば、公知の方法（Ｆ．Ｃ．  Ｓｔｏｒｍｅｒ  ａｎｄ  Ｈ．Ｅ．  Ｕｍｂａｒｇｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １７，  ５，  ５８７−５９２（１９６４））により測定できる。
【００２０】
前記酵母は、細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性という性質以外にも、必要に応じて更にその他の性質を有していてもよい。
前記その他の性質としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、グルタチオンの生成能が増強されていることが好ましく、更にスレオニン耐性を有することがより好ましい。
【００２１】
前記酵母のグルタチオンの生成能を増強する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グルタチオンの生成能が増強されるように改変された酵母と、前記細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性の酵母とを公知の方法により掛け合わせることで、細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性であり、かつ、グルタチオンの生成能が増強された酵母を選抜することができる。
【００２２】
前記グルタチオンの生成能が増強されるように改変された酵母は、改変等により作製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
【００２３】
グルタチオンの生成能が増強されるように酵母を改変する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、特開２０１０−２９１４７号公報（特許第５４９６４８０号公報）に記載されているようなＤＯＡ１遺伝子の少なくとも一部及びＭＥＴ３０遺伝子の少なくとも一部を欠損又は変異させる方法、特開２０１１−１６０７３９号公報（特許第５６６７３６５号公報）に記載されているような変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株に突然変異処理をし、グルタチオン含量が高い酵母変異株を２株以上得て、得られた酵母変異株を掛け合わせることにより、グルタチオン含量がより高い酵母変異株を得る方法などが挙げられる。
【００２４】
グルタチオンの生成能が増強されたことは、例えば、改変前の酵母と改変後の酵母における総グルタチオン量をＴｉｔｚｅらの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．２７、ｐ５０２、１９６９）に従って測定し、その総グルタチオン量を比較することにより、確認できる。
【００２５】
前記スレオニン耐性を有する酵母を取得する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、培地にスレオニンを添加し、生育した酵母を選抜する方法などが挙げられる。
【００２６】
−培地−
前記増殖工程に用いる培地としては、イソロイシン及びバリンを少なくとも含み、前記酵母が増殖できる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２７】
前記増殖工程に用いる培地におけるイソロイシンの含有量としては、前記酵母が増殖することができる限り、特に制限はなく、目的とする酵母の量などに応じて適宜選択することができるが、０．０１質量％〜２．０質量％が好ましく、０．１質量％〜１．０質量％がより好ましい。
【００２８】
前記増殖工程に用いる培地におけるバリンの含有量としては、前記酵母が増殖することができる限り、特に制限はなく、目的とする酵母の量などに応じて適宜選択することができるが、０．０１質量％〜２．０質量％が好ましく、０．１質量％〜１．０質量％がより好ましい。
【００２９】
前記増殖工程に用いる培地におけるイソロイシン及びバリン以外の成分及びその量としては、特に制限はなく、酵母などの微生物の培養に利用されているものを適宜選択することができる。
例えば、炭素源としては、グルコース、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩、コーンスティプリカー、カゼイン、酵母エキス、ペプトン等の含窒素有機物などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
また、過リン酸石灰、リン安等のリン酸成分、塩化カリウム、水酸化カリウム等のカリウム成分、硫酸マグネシウム、塩酸マグネシウム等のマグネシウム成分、亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩、ビタミンなどを培地に添加してもよい。
【００３０】
−培養−
前記増殖工程における前記酵母の培養形式としては、特に制限はなく、一般的な酵母の培養形式を適宜選択することができ、例えば、回分培養、流加培養、連続培養などが挙げられる。これらの中でも、工業的規模で生産する観点からは、流加培養、連続培養が好ましい。
【００３１】
前記増殖工程における前記酵母の培養条件としては、特に制限はなく、一般的な酵母の培養条件を適宜選択することができる。
例えば、温度としては、２０℃〜４０℃が好ましく、２５℃〜３５℃がより好ましい。
ｐＨとしては、３．５〜７．５が好ましく、４．０〜６．９がより好ましい。
また、前記培養は、好気的条件で行うことが好ましく、通気又は撹拌を行いながら培養することがより好ましい。前記通気の量と撹拌の条件としては、特に制限はなく、培養の容量や時間、菌の初発濃度などを考慮して適宜選択することができ、例えば、通気は、０．２Ｖ．Ｖ．Ｍ．（Ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒ  ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅｓ）〜２Ｖ．Ｖ．Ｍ程度、撹拌は、５０ｒｐｍ〜９００ｒｐｍ程度で行うことができる。
培養時間としては、特に制限はなく、目的とする酵母の量に応じて適宜選択することができる。
【００３２】
前記増殖工程後の培養物中の酵母の量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酵母乾燥菌体重量として、０．５％〜６％程度などが挙げられる。
前記酵母乾燥菌体重量の測定方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【００３３】
＜コク味付与物質生成工程＞
前記コク味付与物質生成工程は、前記培地中のイソロイシンの含有量が０．２質量％未満のときに、バリンを前記培地に加えて前記酵母を培養し、コク味付与物質を生成させる工程である。
【００３４】
−バリンを加えるときの培地中のイソロイシンの量−
前記コク味付与物質生成工程においてバリンを培地に加えるときの培地中のイソロイシンの含有量としては、０．２質量％未満であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０５質量％以下が好ましく、０．０２質量％以下がより好ましく、０．０１質量％以下が特に好ましい。
前記培地中のイソロイシンの量の測定方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、後述する実施例の項目に記載の方法などが挙げられる。
【００３５】
−バリンを加えるときの培地中のバリンの量−
前記コク味付与物質生成工程においてバリンを培地に加えるときの培地中のバリンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１質量％以下が好ましく、０．０５質量％以下がより好ましく、０．０１質量％以下が特に好ましい。
前記培地中のバリンの量の測定方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、後述する実施例の項目に記載の方法などが挙げられる。
【００３６】
−培地に加えるバリンの量−
前記コク味付与物質生成工程において培地に加えるバリンの量としては、前記コク味付与物質を生成することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１回あたりの量（質量）として、酵母乾燥菌体重量あたり、０．５％以上が好ましく、１％以上がより好ましく、２．５％以上が特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、前記コク味付与物質の生成量をより多くすることができる点で、有利である。
前記培地に加えるバリンの量の上限値としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１回あたりの量として、酵母乾燥菌体重量あたり５％などが挙げられる。
【００３７】
前記コク味付与物質生成工程において培地にバリンを加える回数としては、１回であってもよいし、２回以上であってもよい。
【００３８】
−培地に加えるスレオニンの量−
前記コク味付与物質生成工程では、更にスレオニンを培地に加えることが好ましい。
前記スレオニンは、前記バリンと同時期に培地に加えてもよいし、異なる時期に加えてもよいが、前記コク味付与物質の生成量をより多くすることができる点で、バリンと同時期に加えることが好ましい。
前記コク味付与物質生成工程において培地に加えるスレオニンの量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１回あたりの量（質量）として、酵母乾燥菌体重量あたり、０．５％以上が好ましく、１％以上がより好ましく、２．５％以上が特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、前記コク味付与物質の生成量をより多くすることができる点で、有利である。
前記培地に加えるスレオニンの量の上限値としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１回あたりの量として、酵母乾燥菌体重量あたり１０％などが挙げられる。
【００３９】
前記コク味付与物質生成工程において培地にスレオニンを加える回数としては、１回であってもよいし、２回以上であってもよい。
【００４０】
−培地−
前記コク味付与物質生成工程に用いる培地としては、上記したイソロイシン及びバリン、並びに必要に応じてスレオニンの量以外は、前記増殖工程に用いる培地と同様のものを用いることができる。
【００４１】
−培養−
前記コク味付与物質生成工程における前記酵母の培養形式、培養条件としては、特に制限はなく、一般的な酵母の培養形式を適宜選択することができ、例えば、前記増殖工程と同様とすることができる。
【００４２】
−コク味付与物質−
前記コク味付与物質生成工程で得られる酵母における前記コク味付与物質の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの合計量（質量）として、酵母乾燥菌体重量あたり、０．３％以上が好ましく、０．６％以上がより好ましく、１．０％以上が更に好ましく、１．３％以上が特に好ましい。
前記コク味付与物質生成工程で得られる酵母における前記コク味付与物質の含有量の上限値としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの合計量（質量）として、酵母乾燥菌体重量あたり５％などが挙げられる。
【００４３】
前記γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕと、前記γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙとの含有量の比率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４４】
前記酵母中におけるコク味付与物質の量の測定方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、後述する実施例の項目に記載の方法などが挙げられる。
【００４５】
なお、前記酵母は、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ以外のコク味の付与に寄与する成分を含んでいてもよい。
【００４６】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記増殖工程に用いる酵母を調製する前培養工程などが挙げられる。
【００４７】
前記前培養工程における前記酵母の培養方法、培養条件、及び培地としては、特に制限はなく、酵母などの微生物の培養に一般的に利用されている培養方法、培養条件、及び培地を目的に応じて適宜選択することができる。
【００４８】
前記コク味付与物質生成工程で得られる酵母の培養物は、乾燥処理し、前記コク味付与物質の含有量が高い酵母乾燥菌体としてもよい。
前記乾燥処理の方法としては、特に制限はなく、酵母乾燥菌体を調製する際に通常行われている方法を適宜選択することができ、例えば、凍結乾燥法、スプレードライ法、ドラムドライ法などが挙げられる。
また、得られた酵母乾燥菌体は、粉末状に加工してもよい。
【００４９】
本発明のコク味付与物質含有酵母の製造方法によれば、前記コク味付与物質を高含有する酵母を製造することができ、工業的規模での生産にも適用可能である。
【００５０】
（コク味付与物質含有酵母エキスの製造方法）
本発明のコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法は、上記した本発明のコク味付与物質含有酵母の製造方法で得られたコク味付与物質含有酵母から酵母エキスを調製する。
【００５１】
前記酵母エキスを調製する方法としては、特に制限はなく、一般的な酵母エキスの調製方法を適宜選択することができ、例えば、酵母菌体内に本来あるタンパク質分解酵素等を利用して菌体を可溶化する自己消化法、微生物や植物由来の酵素製剤を添加して酵母を可溶化する酵素分解法、熱水中に一定時間浸漬することにより菌体を可溶化する熱水抽出法、種々の酸又はアルカリを添加して菌体を可溶化する酸・アルカリ分解法、凍結と融解を１回以上行うことにより菌体を破砕する凍結融解法、物理的な刺激により菌体を破砕する物理的破砕法などが挙げられる。
前記物理的刺激としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、超音波処理、高圧下におけるホモジェナイズ、グラスビーズ等の固形物との混合による磨砕などが挙げられる。
【００５２】
−コク味付与物質−
前記酵母エキスにおける前記コク味付与物質の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの合計量（質量）として、酵母エキス乾燥重量あたり、１％超が好ましく、５％以上がより好ましく、１０％以上が特に好ましい。
前記酵母エキスにおける前記コク味付与物質の含有量の上限値としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの合計量（質量）として、酵母エキス乾燥重量あたり１７％などが挙げられる。
【００５３】
前記γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕと、前記γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙとの含有量の比率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５４】
前記酵母エキス中におけるコク味付与物質の量の測定方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、上記した酵母中におけるコク味付与物質の量の測定方法と同様にして測定する方法などが挙げられる。
【００５５】
なお、前記酵母エキスは、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ以外のコク味の付与に寄与する成分を含んでいてもよい。
【００５６】
本発明のコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法によれば、前記コク味付与物質を高含有する酵母エキスを製造することでき、工業的規模での生産にも適用可能である。
【００５７】
本発明の製造方法により得られたコク味付与物質含有酵母及びコク味付与物質含有酵母エキスの用途としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、各種飲食品やサプリメントなどに用いることができる。
【実施例】
【００５８】
以下に調製例及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの調製例及び試験例に何ら限定されるものではない。
【００５９】
（調製例１：酵母の調製）
以下のようにして、細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性であり、グルタチオンの生成能が増強され、スレオニン耐性を有する酵母株を調製した。
【００６０】
＜親株（１倍体：ａ型）＞
細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性である株として、ＩＬＶ２変異株であるＮＣＹＣ８６８株（ａ型）（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓより入手）を用いた。
【００６１】
＜親株（１倍体：α型）＞
グルタチオンの生成能が増強されるように改変された株として、特開２０１１−１６０７３９号公報（特許第５６６７３６５号公報）に記載のサッカロマイセス・セレビシエＡＢＹＣ１５８８株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２４、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１）に寄託された株であり、受託日は２００７年１０月１９日である。）を用い、常法により、１倍体（α型）を入手した。
【００６２】
＜選抜−１＞
前記１倍体（ａ型）と、前記１倍体（α型）とを常法により接合し、以下のようにして培養した。
−前培養−
５ｍＬのＹＰＤ培地に１白金耳のコロニーを植菌し、３０℃で一晩培養したものを前培養液とした。
【００６３】
−本培養−
下記組成の糖蜜尿素培地を２００ｍＬバッフル付き三角フラスコに準備し、前記前培養液を全量接種し、３０℃、撹拌数２００ｒｐｍで４８時間培養した。
−−糖蜜尿素培地−−
・  糖蜜（全糖換算）                              ・・・  ８．０質量％
・  尿素                                          ・・・  ０．３質量％
・  硫酸アンモニウム                              ・・・  ０．０８質量％
・  リン酸水素２アンモニウム                      ・・・  ０．０４質量％
・  ＹＮＢ  ｗ／ｏ  ＡＡ  ＡＳ（Ｄｉｆｃｏ社製）  ・・・  ０．１７質量％
・  アデニン硫酸塩                                ・・・  ０．００５質量％
・  Ｌ−リシン                                    ・・・  ０．０１質量％
・  Ｌ−チロシン                                  ・・・  ０．０１質量％
・  Ｌ−イソロイシン                              ・・・  ０．０２質量％
・  Ｌ−バリン                                    ・・・  ０．０２質量％
・  グリシン                                      ・・・  ０．１質量％
【００６４】
前記本培養後の酵母乾燥菌体重量（以下、「ＤＣＷ」と称することがある。）を常法により測定した。また、Ｔｉｔｚｅらの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．２７、ｐ５０２、１９６９）に従って、前記本培養後の酵母中の総グルタチオン量（以下、「ＧＳＨ含量」と称することがある。）を測定した。
前記測定したＤＣＷとＧＳＨ含量とを指標として、優れた２倍体株を複数選抜した。
【００６５】
＜選抜−２＞
前記＜選抜−１＞で選抜した２倍体株に対し、Ｔｅｔｒａｄ分離を行った。分離した菌を以下の培地に塗布し、（ｉｖ）イソロイシン及びバリンを含有するＳＤ培地のみで生育した株（イソロイシン及びバリン同時要求性株）を単離した。
−培地−
（ｉ）  ＳＤ培地
（ｉｉ）  イソロイシン０．０１質量％を含有するＳＤ培地
（ｉｉｉ）  バリン０．０１質量％を含有するＳＤ培地
（ｉｖ）  イソロイシン０．０１質量％及びバリン０．０１質量％を含有するＳＤ培地
【００６６】
前記単離した株について、前記＜選抜−１＞に記載の培養と同様にして、前培養及び本培養を行った。
【００６７】
前記培養後の酵母乾燥菌体重量を常法により測定した。また、前記培養後の酵母中のコク味付与物質であるγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙと、その前駆体であるＡｂｕの含有量を以下のようにして測定した。
【００６８】
−コク味付与物質等の測定−
ペプチドを６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）を用いて蛍光誘導体化し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより検出することより行った。
具体的には、適当な濃度に希釈したサンプル２．５μＬ又は、１μＭのＡｂｕ、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ、及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙを含む標準液２．５μＬに、ＭｉｌｌＱ水２．５μＬ、５μＭ内部標準物質溶液（３−ｍｅｔｈｙｌ−Ｈｉｓ−ｄ２（シグマ社）、Ｇｌｙ−ｄ２（シグマ社）。いずれも安定同位体で標識されている。）５μＬ、硼酸緩衝液（日本ウォーターズ社製ＡｃｃＱ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）試薬キット付属品）３０μＬを添加した。
前記混合物に、ＡＱＣ試薬溶液（上記試薬キットの試薬粉末をアセトニトリル１ｍＬ中に溶解することにより調製）１０μＬを添加した。得られた混合物を１０分間、５５℃で加熱後、０．１％のギ酸水溶液１００μＬを加え、分析サンプルとした。
【００６９】
次に前述のように調製した分析サンプルを、下記逆相の液体クロマトグラフィーで分離後に、質量分析装置に導入した。分離条件は下記の通りとした。
−−分離条件−−
（１）  ＨＰＬＣ  ：  Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズ
（２）  分離カラム  ：  Ｕｎｉｓｏｎ  ＵＫ−Ｐｈｅｎｙｌ（内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径３μｍ（Ｉｍｔａｋｔ社製））
（３）  カラム温度  ：  ４０℃
（４）  移動相Ａ  ：  ２５ｍＭギ酸水溶液をアンモニア水でｐＨ６．０に調整した水溶液
（５）  移動相Ｂ  ：  メタノール
（６）  流速  ：  ０．２５ｍＬ／分間
（７）  溶出条件  ：  溶出は、移動相Ａ及び移動相Ｂの混合液を用いて行った。混合液に対する移動相Ｂの比率は以下の通り。０分（５％）、０分〜１７分（５％〜４０％）、１７分〜１７．１分（４０％〜８０％）、１７．１分〜１９分（８０％）、１９分〜１９．１分（８０％〜５％）、１９．１分〜２７分（５％）。
【００７０】
その後、前述の分離条件によって溶出されたＡｂｕ、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ、及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの誘導体化物を質量分析計に導入してマスクロマトグラムにより定量を行った。分析条件は下記の通りとした。
−−分析条件−−
（１）  質量分析装置  ：  ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ３２００  ＱＴＲＡＰ
（２）  検出モード  ：  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ポジティブイオンモード）
（３）  選択イオン  ：  下記表１参照
【００７１】
【表１】
2020089301.tif 000002
【００７２】
Ａｂｕ、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ、及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの誘導体化物の定量は、解析ソフトＡｎａｌｙｓｔ  ｖｅｒ  １．４．２（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）を用いて行った。定量を行うための内部標準物質として、Ａｂｕの誘導体化物の場合は３−ｍｅｔｈｙｌ−Ｈｉｓ−ｄ２の誘導体化物を、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ又はγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの誘導体化物の場合はＧｌｙ−ｄ２の誘導体化物を、各々用いた。
なお、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕの定量の際に、極まれにサンプルによって夾雑ピークが見られた場合は、第２のマスアナライザーでの選択イオンを、１４５．２、或いは、１０４．１を用いて定量した。
【００７３】
前記測定したコク味付与物質の含有量と酵母乾燥菌体重量とを指標として、優れた１倍体株を選抜した。
【００７４】
＜２倍体の取得＞
前記＜選抜−２＞で得られた１倍体の株をａ型とα型とに選別し、常法により交配を実施し、２倍体株を複数取得した。
【００７５】
＜選抜−３＞
前記＜２倍体の取得＞で得られた株をフラスコ又はジャーを用い、以下のようにして流加培養を実施した。
−培養（フラスコ）−
前記＜選抜−１＞に記載の培養と同様にして、前培養及び本培養を行った。
【００７６】
−培養（ジャー）−
−−前培養−−
下記組成の培地を容量３，０００ｍＬで２本作製した（丸菱バイオエンジジャーファーメンタ）。前記培地は、混合後、１２１℃で１５分間、オートクレーブ滅菌した。
［培地］
・  糖蜜（全糖換算）                              ・・・  ８．０質量％
・  尿素                                          ・・・  ０．３質量％
・  硫酸アンモニウム                              ・・・  ０．０８質量％
・  リン酸水素２アンモニウム                      ・・・  ０．０４質量％
・  アデニン硫酸塩                                ・・・  ０．００５質量％
・  Ｌ−リシン                                    ・・・  ０．０１質量％
・  Ｌ−チロシン                                  ・・・  ０．０１質量％
・  Ｌ−イソロイシン                              ・・・  ０．０２質量％
・  Ｌ−バリン                                    ・・・  ０．０２質量％
・  グリシン                                      ・・・  ０．１質量％
【００７７】
前記組成の前培養用培地に、ＹＰＤ平板培地で生育させた前記＜２倍体の取得＞で得られた株を１白金耳植菌し、以下の培養条件で培養した。
培養終了後、遠心分離（３，０００ｇ×５分間）で菌体を全量回収し、等量の滅菌水で菌体を洗浄した。その後、再度遠心分離を行って菌体を回収し、滅菌水で懸濁し、固形分濃度が１０質量％〜２０質量％になるように調整し、これを前培養菌体液とした。
［培養条件］
・  培養温度  ：  ３０℃
・  振とう    ：  ４００ｒｐｍ
・  培養時間  ：  ２４時間
・  通気量    ：  ３Ｌ／分間（１Ｖ．Ｖ．Ｍ．）
【００７８】
−−本培養−−
下記組成の培地を用い、下記培養条件で、流加培養により、前記株を培養した。
［培地］
・  前培養菌体液                ・・・  １５０ｍＬ
・  水                          ・・・  ２，０００ｍＬ
・  硫酸アンモニウム（９７％）  ・・・  １．３３ｍＬ
・  糖蜜（糖度３６％）          ・・・  ６．７ｍＬ
・  リン酸水素２アンモニウム    ・・・  ０．０６質量％
・  Ｌ−イソロイシン            ・・・  ０．４質量％
・  Ｌ−バリン                  ・・・  ０．３５質量％
［培養条件］
・  培養温度  ：  ３０℃
・  培養条件  ：  １８時間
・  ｐＨ      ：  下限５．５、上限６．７となるように、２５％苛性ソーダ又は４７％硫酸で制御。
・  撹拌      ：  ６００ｒｐｍ〜８００ｒｐｍ
・  流加培地  ：  糖蜜（糖度３６％）  ８７０ｍＬ〜１，０００ｍＬ
アンモニア水（１０％）  １００ｍＬ〜２００ｍＬ
リン酸（８５％）  ５ｇ〜２０ｇ
【００７９】
前記本培養後の酵母乾燥菌体重量を常法により測定した。また、前記本培養後の酵母中のコク味付与物質の含有量を、前記＜選抜−２＞の項目中に記載した方法と同様にして測定した。
前記測定したコク味付与物質の含有量と酵母乾燥菌体重量とを指標として、優れた２倍体株（以下、「Ｋ１６株」と称することがある。）を選抜した。
前記Ｋ１６株は、細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性であり、グルタチオンの生成能が増強された株である。
【００８０】
＜選抜−４＞
ＹＰＤ培地にスレオニンを２質量％添加した培地に、前記＜選抜−３＞で得られたＫ１６株を塗布し、３０℃で培養し、生育したコロニーを２つ（以下、「Ｋ１６−１株」、「Ｋ１６−２株」と称することがある。）取得した。
前記各コロニーについて、前記＜選抜−１＞に記載の培養と同様にして、前培養及び本培養を行った。
【００８１】
前記本培養後の酵母乾燥菌体重量を常法により測定した。また、前記本培養後の酵母中のコク味付与物質等の含有量を、前記＜選抜−２＞の項目中に記載した方法と同様にして測定した。
その結果、酵母乾燥菌体重量あたりのコク味付与物質の含有量は、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕについては、Ｋ１６−１株では０．４３％、Ｋ１６−２株では０．５２％であり、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙについては、Ｋ１６−１株では０．４６％、Ｋ１６−２株では０．７０％であった。なお、酵母乾燥菌体重量あたりのＡｂｕの含有量は、Ｋ１６−１株及びＫ１６−２株共に、０．５３％であった。
【００８２】
なお、前記＜選抜−３＞で得られたＫ１６株についても同様にして培養し、酵母乾燥菌体重量及びコク味付与物質等の含有量を測定したところ、酵母乾燥菌体重量あたりのコク味付与物質の含有量は、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕは０．０８％、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙは０．１０％であった。また、酵母乾燥菌体重量あたりのＡｂｕの含有量は、０．０６％であった。
【００８３】
以上の結果から、酵母にスレオニン耐性を付与することで、コク味付与物質の含有量が高まり、また、コク味付与物質前駆体の含有量も高まることがわかった。
【００８４】
（試験例１）
前記調製例１で得られたＫ１６−２株を用い、下記＜試験例１−１＞及び＜試験例１−２＞の項目に記載の条件で培養を行った以外は、前記調製例１の＜選抜−３＞におけるジャーを用いた場合と同様にして、前培養及び本培養を行った。
【００８５】
＜試験例１−１＞
前記本培養において、開始から７時間後に、バリンを培地に１，０００ｐｐｍ添加（酵母乾燥菌体重量あたり２．９％）し、本培養を続けた。
なお、前記バリン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、１１８ｐｐｍ（０．０１１８質量％）であり、バリンの含有量は、３６３ｐｐｍ（０．０３６３質量％）であった。また、前記バリン添加直前の培地中の酵母の量は、酵母乾燥菌体重量で３．４５％であった。
【００８６】
＜試験例１−２＞
前記本培養において、開始から６時間後に、イソロイシンを培地に２，０００ｐｐｍ添加し、また、７時間後に、バリンを培地に１，０００ｐｐｍ添加（酵母乾燥菌体重量あたり２．９％）し、本培養を続けた。
なお、前記バリン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、１，９７３ｐｐｍ（０．１９７３質量％）であり、バリンの含有量は、８９９ｐｐｍ（０．０８９９質量％）であった。また、前記バリン添加直前の培地中の酵母の量は、酵母乾燥菌体重量で３．３６％であった。
【００８７】
＜測定＞
−培養上清中のイソロイシン及びバリンの含有量の測定−
前記本培養開始時、４時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、及び１６時間後の培養上清中のイソロイシン及びバリンの含有量を以下のようにして、測定した。
結果を図１Ａ（イソロイシン）、図１Ｂ（バリン）に示す。なお、図１Ａ〜１Ｂ中、「●、実線」は試験例１−１、「□、点線」は試験例１−２の結果を示す。
−−イソロイシン及びバリンの含有量の測定−−
バリン及びイソロイシンの含有量は、ウオーターズ社（米国）製「Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ」分析装置を用いて、アキュタグウルトラ（ＡｃｃＱ−Ｔａｇ  Ｕｌｔｒａ）ラベル化法により測定した。
【００８８】
−酵母乾燥菌体重量の測定−
前記本培養開始時、２時間後、４時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、１６時間後、及び１８時間後の酵母乾燥菌体重量（以下、「ＤＣＷ」と称することがある。）を常法により測定した。
結果を図１Ｃに示す。なお、図１Ｃ中、「●、実線」は試験例１−１、「□、点線」は試験例１−２の結果を示す。
【００８９】
−コク味付与物質等の測定−
前記本培養開始６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、及び１６時間後に酵母を回収し、コク味付与物質であるγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙと、その前駆体であるＡｂｕの酵母中の含有量（酵母乾燥菌体重量あたりの量）を、前記（調製例１）の＜選抜−２＞の項目中に記載した方法と同様にして測定した。
結果を図１Ｄ（γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ）、図１Ｅ（γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ）、及び図１Ｆ（Ａｂｕ）に示す。なお、図１Ｄ〜１Ｆ中、「●、実線」は試験例１−１、「□、点線」は試験例１−２の結果を示す。
【００９０】
図１Ａ〜１Ｆに示したように、前記本培養において、培養上清中のイソロイシンの含有量が０．２質量％未満のときにバリンを添加して酵母を培養した試験例１−１では、コク味付与物質であるγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙが生成され、また、コク味付与物質の前駆体であるＡｂｕの生成も認められた。一方、培養上清中のイソロイシンの含有量が０．２質量％のときにバリンを添加して酵母を培養した試験例１−１では、コク味付与物質及びその前駆体の生成が非常に少なかった。
したがって、本発明の方法により、コク味付与物質の生成量を顕著に高めることができることが確認された。
【００９１】
（試験例２）
前記調製例１で得られたＫ１６−２株を用い、下記＜試験例２−１＞〜＜試験例２−３＞の項目に記載の条件で培養を行った以外は、前記調製例１の＜選抜−３＞におけるジャーを用いた場合と同様にして、前培養及び本培養を行った。
【００９２】
＜試験例２−１＞
前記本培養において、開始から６時間後に、バリンを培地に１，０００ｐｐｍ添加（酵母乾燥菌体重量あたり３．３％）し、本培養を続けた。
なお、前記バリン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、３６１ｐｐｍ（０．０３６１質量％）であり、バリンの含有量は、９１１ｐｐｍ（０．０９１１質量％）であった。また、前記バリン添加直前の培地中の酵母の量は、酵母乾燥菌体重量で２．９８％であった。
【００９３】
＜試験例２−２＞
前記本培養において、開始から７時間後に、バリンを培地に１，０００ｐｐｍ添加（酵母乾燥菌体重量あたり２．９％）し、本培養を続けた。
なお、前記バリン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、１１８ｐｐｍ（０．０１１８質量％）であり、バリンの含有量は、３６３ｐｐｍ（０．０３６３質量％）であった。また、前記バリン添加直前の培地中の酵母の量は、酵母乾燥菌体重量で３．４５％であった。
【００９４】
＜試験例２−３＞
前記本培養において、開始から８時間後に、バリンを培地に１，０００ｐｐｍ添加（酵母乾燥菌体重量あたり２．５％）し、本培養を続けた。
なお、前記バリン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、１４．９ｐｐｍ（０．００１４９質量％）であり、バリンの含有量は、１８．６ｐｐｍ（０．００１８６質量％）であった。また、前記バリン添加直前の培地中の酵母の量は、酵母乾燥菌体重量で４．０１％であった。
【００９５】
＜測定＞
−培養上清中のイソロイシン及びバリンの含有量の測定−
前記本培養開始時、４時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、及び１６時間後の培養上清中のイソロイシン及びバリンの含有量を前記試験例１と同様にして測定した。
結果を図２Ａ（イソロイシン）、図２Ｂ（バリン）に示す。なお、図２Ａ〜２Ｂ中、「△、実線」は試験例２−１、「●、実線」は試験例２−２、「◇、実線」は試験例２−３の結果を示す。
【００９６】
−酵母乾燥菌体重量の測定−
前記本培養開始時、２時間後、４時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、１６時間後、及び１８時間後の酵母乾燥菌体重量を前記試験例１と同様にして測定した。
結果を図２Ｃに示す。なお、図２Ｃ中、「△、実線」は試験例２−１、「●、実線」は試験例２−２、「◇、実線」は試験例２−３の結果を示す。
【００９７】
−コク味付与物質等の測定−
前記本培養開始６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、及び１６時間後に酵母を回収し、コク味付与物質であるγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙと、その前駆体であるＡｂｕの酵母中の含有量（酵母乾燥菌体重量あたりの量）を、前記（調製例１）の＜選抜−２＞の項目中に記載した方法と同様にして測定した。
結果を図２Ｄ（γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ）、図２Ｅ（γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ）、及び図２Ｆ（Ａｂｕ）に示す。なお、図２Ｄ〜２Ｆ中、「△、実線」は試験例２−１、「●、実線」は試験例２−２、「◇、実線」は試験例２−３の結果を示す。
【００９８】
図２Ａ〜２Ｆに示したように、前記本培養においてバリンを添加するときの培養上清中のイソロイシン及びバリンの含有量が少ないほど、より多くのコク味付与物質及びその前駆体が生成されていた。
【００９９】
（試験例３）
前記調製例１で得られたＫ１６−２株を用い、下記＜試験例３−１＞及び＜試験例３−２＞の項目に記載の条件で培養を行った以外は、前記調製例１の＜選抜−３＞におけるジャーを用いた場合と同様にして、前培養及び本培養を行った。
【０１００】
＜試験例３−１＞
前記本培養において、開始から８時間後に、バリンを培地に１，０００ｐｐｍ添加（酵母乾燥菌体重量あたり２．５％）し、本培養を続けた。
なお、前記バリン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、１４．９ｐｐｍ（０．００１４９質量％）であり、バリンの含有量は、１８．６ｐｐｍ（０．００１８６質量％）であった。また、前記バリン添加直前の培地中の酵母の量は、酵母乾燥菌体重量で４．０１％であった。
【０１０１】
＜試験例３−２＞
前記本培養において、開始から８時間後に、バリン１，０００ｐｐｍ（酵母乾燥菌体重量あたり２．６％）、及びスレオニン２，０００ｐｐｍ（酵母乾燥菌体重量あたり５．２％）を培地に添加し、本培養を続けた。
なお、前記バリン及びスレオニン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、１４．５ｐｐｍ（０．００１４５質量％）であり、バリンの含有量は、１８．３ｐｐｍ（０．００１８３質量％）であった。また、前記バリン添加直前の培地中の酵母の量は、酵母乾燥菌体重量で３．８６％であった。
【０１０２】
＜測定＞
−培養上清中のイソロイシン及びバリンの含有量の測定−
前記本培養開始時、４時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、及び１６時間後の培養上清中のイソロイシン及びバリンの含有量を前記試験例１と同様にして測定した。
結果を図３Ａ（イソロイシン）、図３Ｂ（バリン）に示す。なお、図３Ａ〜３Ｂ中、「◇、実線」は試験例３−１、「●、一点鎖線」は試験例３−２の結果を示す。
【０１０３】
−酵母乾燥菌体重量の測定−
前記本培養開始時、２時間後、４時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、１６時間後、及び１８時間後の酵母乾燥菌体重量を前記試験例１と同様にして測定した。
結果を図３Ｃに示す。なお、図３Ｃ中、「◇、実線」は試験例３−１、「●、一点鎖線」は試験例３−２の結果を示す。
【０１０４】
−コク味付与物質等の測定−
前記本培養開始６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、及び１６時間後に酵母を回収し、コク味付与物質であるγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙと、その前駆体であるＡｂｕの酵母中の含有量（酵母乾燥菌体重量あたりの量）を、前記（調製例１）の＜選抜−２＞の項目中に記載した方法と同様にして測定した。
結果を図３Ｄ（γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ）、図３Ｅ（γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ）、及び図３Ｆ（Ａｂｕ）に示す。なお、図３Ｄ〜３Ｆ中、「◇、実線」は試験例３−１、「●、一点鎖線」は試験例３−２の結果を示す。
【０１０５】
図３Ａ〜３Ｆに示したように、前記本培養においてバリンを添加するときにスレオニンも加えることで、より多くのコク味付与物質及びその前駆体が生成されていた。
【０１０６】
（試験例４）
前記試験例３−２の培養条件における本培養の培養時間をバリン及びスレオニンを添加した後、１２時間に変更した以外は同様にして培養した後の培養物（即ち、本培養開始２０時間後の培養物）を用い、以下のようにして酵母エキスを調製した。
まず、前記培養物を遠心分離処理することにより、培養物に含有されていた酵母を沈殿として回収し、蒸留水で洗浄した。その後、菌体濃度が１０重量％〜１５重量％となるように適量の蒸留水を加えて酵母懸濁液を作製した。前記酵母懸濁液を８５℃で７０秒間加熱した後に急速冷却し、遠心分離することにより、エキス分を回収した。回収したエキス分を乾燥させて、酵母エキスとした。
【０１０７】
＜＜測定＞＞
−コク味付与物質の測定−
前記酵母エキス中におけるコク味付与物質であるγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの含有量（酵母エキス乾燥重量あたりの量）を、前記（調製例１）の＜選抜−２＞の項目中に記載した方法と同様にして測定した。その結果、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕの酵母エキス乾燥重量あたりの含有量は９．４０％であり、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙの酵母エキス乾燥重量あたりの含有量は１．１３％であった。したがって、本発明の方法により、酵母エキス乾燥重量あたりのコク味付与物質の含有量が１０％を超える酵母エキスを製造することができることが確認された。
【０１０８】
（試験例５）
前記調製例１で得られたＫ１６−２株を用い、下記＜試験例５−１＞〜＜試験例５−５＞の項目に記載の条件で培養を行った以外は、前記調製例１の＜選抜−３＞におけるジャーを用いた場合と同様にして、前培養及び本培養を行った。
【０１０９】
＜試験例５−１＞
前記本培養において、バリン及びスレオニンの添加を行わずに、本培養を続けた（対照）。
【０１１０】
＜試験例５−２＞
前記本培養において、開始から７．５時間後に、バリン５００ｐｐｍ（酵母乾燥菌体重量あたり１．５％）を培地に添加し、本培養を続けた。
なお、前記バリン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、１２．３ｐｐｍ（０．００１２３質量％）であり、バリンの含有量は、１６．０ｐｐｍ（０．００１６０質量％）であった。
【０１１１】
＜試験例５−３＞
前記本培養において、開始から７．５時間後に、バリン１，０００ｐｐｍ（酵母乾燥菌体重量あたり３．０％）を培地に添加し、本培養を続けた。
なお、前記バリン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、０ｐｐｍであり、バリンの含有量は、０ｐｐｍであった。
【０１１２】
＜試験例５−４＞
前記本培養において、開始から７．５時間後に、バリン１，５００ｐｐｍ（酵母乾燥菌体重量あたり４．５％）を培地に添加し、本培養を続けた。
なお、前記バリン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、０ｐｐｍであり、バリンの含有量は、０ｐｐｍであった。
【０１１３】
＜試験例５−５＞
前記本培養において、開始から７．５時間後に、バリン１，０００ｐｐｍ（酵母乾燥菌体重量あたり３．０％）、及びスレオニン１，０００ｐｐｍ（酵母乾燥菌体重量あたり３．０％）を培地に添加し、本培養を続けた。
なお、前記バリン及びスレオニン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、０ｐｐｍであり、バリンの含有量は、７．５ｐｐｍ（０．０００７５質量％）であった。
【０１１４】
＜測定＞
−培養上清中のイソロイシン及びバリンの含有量の測定−
前記本培養開始時、２時間後、４時間後、６時間後、７．５時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１２時間後、及び１４時間後の培養上清中のイソロイシン及びバリンの含有量を前記試験例１と同様にして測定した。
結果を図４Ａ及び図４Ｇ（イソロイシン）、図４Ｂ及び図４Ｈ（バリン）に示す。なお、図４Ａ、４Ｂ、４Ｇ、４Ｈ中、「△、点線」は試験例５−１、「○、実線」は試験例５−２、「■、一点鎖線」は試験例５−３、「□、実線」は試験例５−４、「◇、一点鎖線」は試験例５−５の結果を示す。
【０１１５】
−酵母乾燥菌体重量の測定−
前記本培養開始時、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、及び１４時間後の酵母乾燥菌体重量を前記試験例１と同様にして測定した。
結果を図４Ｃ及び図４Ｉに示す。なお、を図４Ｃ及び図４Ｉ中、「△、点線」は試験例５−１、「○、実線」は試験例５−２、「■、一点鎖線」は試験例５−３、「□、実線」は試験例５−４、「◇、一点鎖線」は試験例５−５の結果を示す。
【０１１６】
−コク味付与物質等の測定−
前記本培養開始８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、及び１４時間後に酵母を回収し、コク味付与物質であるγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙと、その前駆体であるＡｂｕの酵母中の含有量（酵母乾燥菌体重量あたりの量）を、前記（調製例１）の＜選抜−２＞の項目中に記載した方法と同様にして測定した。
結果を図４Ｄ及び図４Ｊ（γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ）、図４Ｅ及び図４Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ）、並びに図４Ｆ及び図４Ｌ（Ａｂｕ）に示す。なお、図４Ｄ、４Ｅ、４Ｆ、４Ｊ、４Ｋ、４Ｌ中、「△、点線」は試験例５−１、「○、実線」は試験例５−２、「■、一点鎖線」は試験例５−３、「□、実線」は試験例５−４、「◇、一点鎖線」は試験例５−５の結果を示す。
【０１１７】
図４Ａ〜４Ｌに示したように、前記本培養において添加するバリンの量を増やすことで、より多くのコク味付与物質及びその前駆体が生成されていた。また、バリンを添加する際にスレオニンも加えることで、より多くのコク味付与物質及びその前駆体が生成されることが本試験例でも確認された。
【図１Ａ】
2020089301.tif 000003
【図１Ｂ】
2020089301.tif 000004
【図１Ｃ】
2020089301.tif 000005
【図１Ｄ】
2020089301.tif 000006
【図１Ｅ】
2020089301.tif 000007
【図１Ｆ】
2020089301.tif 000008
【図２Ａ】
2020089301.tif 000009
【図２Ｂ】
2020089301.tif 000010
【図２Ｃ】
2020089301.tif 000011
【図２Ｄ】
2020089301.tif 000012
【図２Ｅ】
2020089301.tif 000013
【図２Ｆ】
2020089301.tif 000014
【図３Ａ】
2020089301.tif 000015
【図３Ｂ】
2020089301.tif 000016
【図３Ｃ】
2020089301.tif 000017
【図３Ｄ】
2020089301.tif 000018
【図３Ｅ】
2020089301.tif 000019
【図３Ｆ】
2020089301.tif 000020
【図４Ａ】
2020089301.tif 000021
【図４Ｂ】
2020089301.tif 000022
【図４Ｃ】
2020089301.tif 000023
【図４Ｄ】
2020089301.tif 000024
【図４Ｅ】
2020089301.tif 000025
【図４Ｆ】
2020089301.tif 000026
【図４Ｇ】
2020089301.tif 000027
【図４Ｈ】
2020089301.tif 000028
【図４Ｉ】
2020089301.tif 000029
【図４Ｊ】
2020089301.tif 000030
【図４Ｋ】
2020089301.tif 000031
【図４Ｌ】
2020089301.tif 000032