(57)【要約】【課題】２種類以上の被験物質を測定する方法及びキットを提供する。【解決手段】２種類以上の被験物質を測定する方法であって、各被験物質に対応する第１の結合物質が固定された作用電極に、試料と、前記各被験物質に対応する第２の結合物質が固定された金属微粒子とを接触させて、前記試料中の前記各被験物質の量に対応した量の前記金属微粒子を、前記作用電極近傍に局在化させる工程と、前記作用電極近傍に局在化させた前記金属微粒子を電気化学的に酸化、還元、再酸化して、前記再酸化の際に生じる電流値を測定し、前記電流値に基づいて、各被験物質を測定する工程と、を含み、前記第２の結合物質には、前記第２の結合物質が対応する前記被験物質毎に異なる種類の金属微粒子が固定されており、前記電解液に含まれる陰イオンと前記金属イオンとで形成される塩において、前記金属イオンの溶解度が、１×１０−５以上である、方法。【選択図】図１
2020079765.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種類以上の被験物質を測定する方法であって、
（ａ）前記２種類以上の各被験物質にそれぞれ対応する第１の結合物質が固定された作用電極に、試料と、前記各被験物質にそれぞれ対応する第２の結合物質が固定された金属微粒子とを接触させて、前記試料中の前記各被験物質の量に対応した量の前記金属微粒子を、前記作用電極近傍に局在化させる工程と、
（ｂ）前記作用電極近傍に局在化させた前記金属微粒子に、電解液を接触させる工程と、
（ｃ）前記電解液に接触させた前記金属微粒子を、前記作用電極の電位制御により、電気化学的に酸化して金属イオンとして溶解させる工程と、
（ｄ）前記金属イオンを、前記作用電極の電位制御により、電気化学的に還元して前記作用電極表面上に金属として析出させる工程と、
（ｅ）前記金属を、前記作用電極の電位制御により、電気化学的に酸化して金属イオンとして溶解させ、前記溶解の際に生じる電流値を測定し、前記電流値に基づいて、前記各被験物質を測定する工程と、
を含み、
前記第２の結合物質には、前記第２の結合物質が対応する前記被験物質毎に異なる種類の金属微粒子が固定されており、
前記電解液に含まれる陰イオンと前記各金属イオンとで形成される各塩において、２９８Ｋの水に対する前記各金属イオンの溶解度が、１×１０−５以上である、
方法。
【請求項２】
前記金属微粒子のうちの２種類は、銀微粒子及びパラジウム微粒子である、請求項１に記載の２種類以上の被験物質を測定する方法。
【請求項３】
前記金属微粒子のうちの１種類が銀微粒子であり、
前記電解液が、塩化物イオン（Ｃｌ−）、硝酸イオン（ＮＯ３−）及びリン酸イオン（ＰＯ４３−）からなる群より選択される陰イオンを含む、
請求項１に記載の２種類以上の被験物質を測定する方法。
【請求項４】
前記金属微粒子のうちの１種類がパラジウム微粒子であり、
前記電解液が、塩化物イオン（Ｃｌ−）、硝酸イオン（ＮＯ３−）及びリン酸イオン（ＰＯ４３−）からなる群より選択される陰イオンを含む、
請求項１に記載の２種類以上の被験物質を測定する方法。
【請求項５】
前記金属微粒子のうちの２種類は、銀微粒子及びパラジウム微粒子であり、
前記電解液が、塩化物イオン（Ｃｌ−）、硝酸イオン（ＮＯ３−）及びリン酸イオン（ＰＯ４３−）からなる群より選択される陰イオンを含む、
請求項１に記載の２種類以上の被験物質を測定する方法。
【請求項６】
２種類以上の被験物質を測定するためのキットであって、
（Ａ）前記２種類以上の各被験物質にそれぞれ対応する第１の結合物質が固定された作用電極を備えた電極デバイスと、
（Ｂ）前記各被験物質にそれぞれ対応する第２の結合物質が固定された、前記各被験物質毎に異なる種類の金属微粒子と、
（Ｃ）電解液であって、前記電解液に含まれる陰イオンと前記各金属微粒子が溶解して生じる各金属イオンとで形成される各塩において、２９８Ｋの水に対する前記各金属イオンの溶解度が、１×１０−５以上である、電解液と
を含むキット。
【請求項７】
前記金属微粒子のうちの２種類は、銀微粒子及びパラジウム微粒子である、請求項６に記載の２種類以上の被験物質を測定するためのキット。
【請求項８】
前記金属微粒子のうちの１種類が銀微粒子であり、
前記電解液が、塩化物イオン（Ｃｌ−）、硝酸イオン（ＮＯ３−）及びリン酸イオン（ＰＯ４３−）からなる群より選択される陰イオンを含む、
請求項６に記載の２種類以上の被験物質を測定するためのキット。
【請求項９】
前記金属微粒子のうちの１種類がパラジウム微粒子であり、
前記電解液が、塩化物イオン（Ｃｌ−）、硝酸イオン（ＮＯ３−）及びリン酸イオン（ＰＯ４３−）からなる群より選択される陰イオンを含む、
請求項６に記載の２種類以上の被験物質を測定するためのキット。
【請求項１０】
前記金属微粒子のうちの２種類は、銀微粒子及びパラジウム微粒子であり、
前記電解液が、塩化物イオン（Ｃｌ−）、硝酸イオン（ＮＯ３−）及びリン酸イオン（ＰＯ４３−）からなる群より選択される陰イオンを含む、
請求項６に記載の２種類以上の被験物質を測定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験物質を測定する方法及び被験物質を測定するためのキットに関する。本発明の方法及びキットは、特に、被験物質が２種類以上である場合に有用である。
【背景技術】
【０００２】
試験溶液中の微量物質を簡便且つ高感度に測定する方法の１つとして、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が知られている。免疫測定法としては、酵素で標識した抗体を用い、酵素反応に由来する発色や発光等の信号を得ることにより被検物質の検知や濃度測定を行うＥＬＩＳＡ法が知られ、幅広い分野で採用されている。しかしながら、ＥＬＩＳＡ法では、発色や発光等の信号検出時に光学系を必要とするため、大型の測定機が必要となる。また、正確な定量を行う場合には、発色等の測定結果を電気的な信号に変換する作業が必要となる等、複雑な処理を行う必要がある。
【０００３】
そこで、発色標識や蛍光標識のような汎用の標識物質を用いた免疫測定法等において、検出に際して電気化学的測定法を利用する方法が提案されている（例えば、特許文献１）。電気化学的測定に用いる装置は、ＥＬＩＳＡ等に用いられる機器に比べて小型化が可能であることから、測定機器の小型化と検出感度の向上との両立が期待されている。例えば、特許文献１においては、金属微粒子を化学的処理によって溶解した後、電気化学的測定を行い、得られた金属微粒子の酸化に伴うピーク電流に基づいて被検物質の定性分析又は定量分析を行っており、小型の装置で高感度な分析が可能であることが利点として挙げられている。
【０００４】
しかしながら、特許文献１においては、溶液等を用いた化学的処理により金属微粒子を完全に溶解する工程が電気化学的測定に先立って必要となるため、測定操作が煩雑になるといった不都合がある。また、複数の被験物質を検出する場合には、被験物質の数に応じた電極を用意する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００４−５１２４９６号公報
【発明の概要】
【０００６】
本発明の一実施態様は、２種類以上の被験物質を測定する方法であって、（ａ）前記２種類以上の各被験物質にそれぞれ対応する第１の結合物質が固定された作用電極に、試料と、前記各被験物質にそれぞれ対応する第２の結合物質が固定された金属微粒子とを接触させて、前記試料中の前記各被験物質の量に対応した量の前記金属微粒子を、前記作用電極近傍に局在化させる工程と、（ｂ）前記作用電極近傍に局在化させた前記金属微粒子に、電解液を接触させる工程と、（ｃ）前記電解液に接触させた前記金属微粒子を、前記作用電極の電位制御により、電気化学的に酸化して金属イオンとして溶解させる工程と、（ｄ）前記金属イオンを、前記作用電極の電位制御により、電気化学的に還元して前記作用電極表面上に金属として析出させる工程と、（ｅ）前記金属を、前記作用電極の電位制御により、電気化学的に酸化して金属イオンとして溶解させ、前記溶解の際に生じる電流値を測定し、前記電流値に基づいて、前記各被験物質を測定する工程と、を含み、前記第２の結合物質には、前記第２の結合物質が対応する前記被験物質毎に異なる種類の金属微粒子が固定されており、前記電解液に含まれる陰イオンと前記各金属イオンとで形成される各塩において、２９８Ｋの水に対する前記各金属イオンの溶解度が、１×１０−５以上である、方法である。
【０００７】
また、本発明の一実施態様は、２種類以上の被験物質を測定するためのキットであって、（Ａ）前記２種類以上の各被験物質にそれぞれ対応する第１の結合物質が固定された作用電極を備えた電極デバイスと、（Ｂ）前記各被験物質にそれぞれ対応する第２の結合物質が固定された、前記各被験物質毎に異なる種類の金属微粒子と、（Ｃ）電解液であって、前記電解液に含まれる陰イオンと前記各金属微粒子が溶解して生じる各金属イオンとで形成される各塩において、２９８Ｋの水に対する前記各金属イオンの溶解度が、１×１０−５以上である、電解液と、を含むキットである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の１実施形態にかかる被験物質を測定する方法の一例を示す。図１Ａは、第１の結合物質として抗体が固定化された作用電極の一例を示す。図１Ｂは、工程（ａ）の一例を示す。図１Ｃは、工程（ｂ）の一例を示す。図１Ｄは、工程（ｃ）の一例を示す。図１Ｅは、工程（ｄ）の一例を示す。図１Ｅは、工程（ｅ）の一例を示す。
【図２】工程（ｅ）において測定される電流値グラフの一例を示す。
【図３】本発明の１実施形態にかかる被験物質を測定する方法の一例を示す。図３Ａは、第１の結合物質として核酸プローブが固定化された作用電極の一例を示す。図３Ｂは、工程（ａ）の一例を示す。
【図４】プレーナ型印刷電極デバイスの一例を示す平面図である。
【図５】２９８Ｋの水に対する銀イオンを含む塩の溶解度積と銀イオンの溶解度を示す表である。
【図６】図６Ａは、０．０１Ｎ塩酸溶液中での銀（Ａｇ）及びパラジウム（Ｐｄ）の微分パルスボルタンメトリーによる酸化電流測定の結果を示す特性図である。図６Ｂは、０．０１Ｎ塩酸溶液中での銀（Ａｇ）及びパラジウム（Ｐｄ）の酸化電流のピーク値と、銀及びパラジウムの混合比の相関を示す図である。
【図７】図７Ａは、５ｍＭリン酸バッファー（ＮａＨ２ＰＯ４溶液  ｐＨ７．４）中での銀（Ａｇ）及びパラジウム（Ｐｄ）の微分パルスボルタンメトリーによる酸化電流測定の結果を示す特性図である。図７Ｂは、５ｍＭリン酸バッファー（ＮａＨ２ＰＯ４溶液  ｐＨ７．４）中での銀（Ａｇ）及びパラジウム（Ｐｄ）の酸化電流のピーク値と、銀及びパラジウムの混合比の相関を示す図である。
【図８】図８Ａは、１Ｍ硝酸カリウム溶液中での銀（Ａｇ）及びパラジウム（Ｐｄ）の微分パルスボルタンメトリーによる酸化電流測定の結果を示す特性図である。図８Ｂは、１Ｍ硝酸カリウム溶液中での銀（Ａｇ）及びパラジウム（Ｐｄ）の酸化電流のピーク値と、銀及びパラジウムの混合比の相関を示す図である。
【図９】４ｍＭチオシアンカリウム溶液中での銀（Ａｇ）の微分パルスボルタンメトリーによる酸化電流測定の結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
【００１０】
≪被験物質を測定する方法≫
一実施形態において、本発明は、２種類以上の被験物質を測定する方法を提供する。本実施形態の方法は、（ａ）前記２種類以上の各被験物質にそれぞれ対応する第１の結合物質が固定された作用電極に、試料と、前記各被験物質にそれぞれ対応する第２の結合物質が固定された金属微粒子とを接触させて、前記試料中の前記各被験物質の量に対応した量の前記金属微粒子を、前記作用電極近傍に局在化させる工程と、（ｂ）前記作用電極近傍に局在化させた前記金属微粒子に、電解液を接触させる工程と、（ｃ）前記電解液に接触させた前記金属微粒子を、前記作用電極の電位制御により、電気化学的に酸化して金属イオンとして溶解させる工程と、（ｄ）前記金属イオンを、前記作用電極の電位制御により、電気化学的に還元して前記作用電極表面上に金属として析出させる工程と、（ｅ）前記金属を、前記作用電極の電位制御により、電気化学的に酸化して金属イオンとして溶解させ、前記溶解の際に生じる電流値を測定し、前記電流値に基づいて、前記各被験物質を測定する工程と、を含む。前記第２の結合物質には、前記第２の結合物質が対応する前記被験物質毎に異なる種類の金属微粒子が固定されている。前記電解液に含まれる陰イオンと前記各金属イオンとで形成される各塩において、２９８Ｋの水に対する前記各金属イオンの溶解度は、１×１０−５以上である。
【００１１】
図１Ａ〜１Ｆに基づき、本実施形態の方法の概略を説明する。図１Ａ〜１Ｆは、被験物質がタンパク質（抗原）であり、結合物質が抗体である場合の例である。
図１Ａは、被験物質である各抗原に対する一次抗体１０ａ〜１０ｃが固定された作用電極１を示す。一次抗体１０ａ〜１０ｃは、第１の結合物質として機能する。
図１Ｂは、本実施形態の方法の工程（ａ）の一例を示す。一次抗体１０ａ〜１０ｃが固定された作用電極１に、試料と、各抗原に対応する二次抗体３０ａ〜３０ｃが固定された金属微粒子４０ａ〜４０ｃとを接触させる。試料中に被験物質である抗原２０ａ〜２０ｃが含まれている場合、抗原２０ａ〜２０ｃは、それぞれ対応する一次抗体１０ａ〜１０ｃに結合する。さらに、抗原２０ａ〜２０ｃには、それぞれ対応する二次抗体３０ａ〜３０ｃが結合する。これにより、二次抗体３０ａ〜３０ｃに固定された金属微粒子４０ａ〜４０ｃが、作用電極１の近傍に局在化する。ここで、金属微粒子４０ａ〜４０ｃが作用電極１の近傍に局在化する量は、それぞれ試料中の抗原２０ａ〜２０ｃの量に対応する。金属微粒子４０ａ〜４０ｃは、抗原２０ａ〜２０ｃに対応して、それぞれ異なる種類の金属Ｘ，Ｙ，Ｚから構成されている。
図１Ｃは、本実施形態の方法の工程（ｂ）の一例を示す。作用電極１に電解液を供給して、金属微粒子４０ａ〜４０ｃに、電解液を接触させる。図１Ｃ中、Ａ−は、電解液に含まれる陰イオンを表す。
図１Ｄは、本実施形態の方法の工程（ｃ）の一例を示す。作用電極１の電位制御により、電解液に接触させた金属微粒子４０ａ〜４０ｃを電気学的に酸化して金属イオンとして溶解させる。図１Ｄ中、Ｘ＋，Ｙ＋，Ｚ＋は、金属Ｘ，Ｙ，Ｚから生じる金属イオンを表す。電解液が含む陰イオンＡ−と、Ｘ＋，Ｙ＋又はＺ＋と、で形成される塩において、金属イオンの溶解度は、１×１０−５以上となる。
図１Ｅは、本実施形態の方法の工程（ｄ）の一例を示す。作用電極１の電位制御により、溶解した金属イオンＸ＋，Ｙ＋，Ｚ＋を電気化学的に還元して、作用電極１の表面上に金属Ｘ，Ｙ，Ｚを析出させる。
図１Ｆは、本実施形態の方法の工程（ｅ）の一例を示す。作用電極１の電位制御により、作用電極１の表面上に析出した金属Ｘ，Ｙ，Ｚを電気化学的に酸化し、金属イオンＸ＋，Ｙ＋，Ｚ＋として溶解させ、その際に生じる電流値を測定する。金属Ｘ，Ｙ，Ｚは、それぞれ固有の酸化電位を有するため、各金属の酸化電位に応じた電位で発生する電流値を測定することにより、金属Ｘ，Ｙ，Ｚの酸化電流値をそれぞれ測定することができる（図２参照）。当該電流値は、作用電極１の近傍に局在化した金属微粒子４０ａ〜４０ｃの量に比例し、試料中の抗原２０ａ〜２０ｃの量に比例するため、当該電流値に基づき、試料中の抗原２０ａ〜２０ｃの量を求めることができる。
以下、各工程の詳細を説明する。
【００１２】
［工程（ａ）］
工程（ａ）は、各被験物質にそれぞれ対応する第１の結合物質が固定された作用電極に、試料と、前記各被験物質にそれぞれ対応する第２の結合物質が固定された金属微粒子とを接触させて、前記試料中の前記各被験物質に対応した量の前記金属微粒子を前記作用電極近傍に局在化させる工程である。
【００１３】
本実施形態の方法には、例えば、絶縁基板上に作用電極及び対極が形成された電極デバイスを用いることができる。電極デバイスとしては、任意の構成のものを用いることができるが、小型で取り扱いが容易な電極デバイスとして、例えばプレーナ型の印刷電極デバイスを挙げることができる。
図４に、プレーナ型の印刷電極デバイスの一例を示す。図４に示すプレーナ型の印刷電極デバイス１００は、レジストからなる絶縁被膜１０２に設けられた略円形の開口部１０２ａに露出した作用電極１０３と、作用電極１０３の外周の少なくとも一部を取り囲むように配された対極１０４と、参照極１５とが短冊状の絶縁基板１０６上に印刷形成されたものである。絶縁被膜１０２上には絶縁被膜１０２より疎水性の高い表面を有する帯状のダム構造部材１０７が印刷電極デバイス１００のほぼ全幅に亘って積層形成され、作用電極１０３等に滴下された溶液がコネクタとの接続部分へ到達することを防いでいる。
【００１４】
本明細書において、「被験物質」とは、本実施形態の方法による測定対象となる物質を意味する。被験物質は、特に限定されず、生体物質や合成物質等、あらゆる物質を対象とすることができる。被験物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖、レクチン、生理活性物質等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
本明細書において、「結合物質」とは、被験物質に特異的に結合する物質を意味する。「被験物質に特異的に結合する」とは、被験物質に対する結合親和性が高く、他の物質に対しては結合親和性が低いことを意味する。例えば、「被験物質に特異的に結合する」物質は、被験物質及び他の物質に競合的に接触させた場合に、主に被験物質に結合する。
結合物質は、被験物質に特異的に結合する物質であれば、特に限定されず、被験物質の種類に応じて適宜選択可能である。被験物質と結合物質との組み合わせとしては、例えば、抗原と抗体、核酸と当該核酸に相補的な核酸、核酸と核酸結合タンパク質、アプタマーとその標的分子、レセプターとリガンド、レクチンと糖鎖、酵素と基質等が挙げられるが、これらに限定されない。前記の各組合せにおいて、被験物質は前者と後者のいずれであってもよい。
【００１６】
「第１の結合物質」とは、作用電極に固定される結合物質である。作用電極に第１の結合物質を固定する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。固定方法としては、例えば、物理的吸着、作用電極及び第１の結合物質に互いに化学結合する官能基を導入する方法等が挙げられる。
「第２の結合物質」とは、金属微粒子に固定される結合物質である。第２の結合物質が結合する被験物質の部位は、第１の結合物質が結合する被験物質の部位とは異なっている。そのため、第２の結合物質は、第１の結合物質及び被験物質を介して、作用電極上に結合され得る。金属微粒子に第２の結合物質を固定する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。固定方法としては、前記第１の結合物質の固定方法と同様の方法が挙げられる。
【００１７】
本明細書において、「金属微粒子」とは、金属元素から構成される微粒子を意味する。金属元素としては、例えば、銀（Ａｇ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、銅（Ｃｕ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｕ）、イリジウム（Ｉｒ）等が挙げられるが、これらに限定されない。微粒子は、溶液中でコロイドを形成するものであってもよい。微粒子の粒径としては、例えば、１μｍ以下が挙げられ、１０〜１００ｎｍが例示される。
【００１８】
本明明細書において、金属微粒子が「作用電極近傍に局在化」するとは、作用電極表面上に金属微粒子が存在することを意味する。より具体的には、作用電極に固定された第１の結合物質、第１の結合物質に結合した被験物質、及び当該被験物質に結合した第２の結合物質を介して、金属微粒子が作用電極に固定されることを意味する。
【００１９】
工程（ａ）では、各被験物質に対応する第１の結合物質が固定された作用電極に、試料と、各被験物質に対応する第２の結合物質が固定された金属微粒子とを接触させる。
【００２０】
作用電極に接触させる試料は、被験物質を含み得るものであれば、特に限定されない。試料としては、例えば、生体から採取された生体試料、生体試料を適当な希釈率で希釈したもの、生体試料から一部の成分を分離したもの、細胞抽出物等が挙げられる。生体試料としては、例えば、血液、リンパ、組織液、各種器官の組織検体から調製された抽出液、尿、唾液、ぬぐい液、鼻汁喀痰、糞便、吐しゃ物、呼吸器洗浄液が挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態の方法においては、試料は、２種類以上の被験物質を含むことができる。
【００２１】
図１Ａの例では、被験物質としての抗原２０ａ〜２０ｃを測定するために、第１の結合物質としての一次抗体１０ａ〜１０ｃが作用電極１に固定されている。一次抗体１０ａ〜１０ｃは、それぞれ抗原２０ａ〜２０ｃに特異的に結合する。
図１Ｂの例では、第２の結合物質として二次抗体３０ａ〜３０ｃを用いている。二次抗体３０ａ〜３０ｃは、それぞれ抗原２０ａ〜２０ｃに特異的に結合する。二次抗体３０ａ〜３０ｃは、それぞれ、互いに異なる種類の金属である金属Ｘ，Ｙ，Ｚからなる金属微粒子４０ａ〜４０ｃに固定されている。金属微粒子として用いる金属は、特に限定されず、例えば、前記に例示した金属を用いることができる。一例として、金属微粒子のうちの２種類は、銀微粒子及びパラジウム微粒子であってもよい。
【００２２】
図１Ａに示す作用電極１に、試料と、二次抗体３０ａ〜３０ｃが固定された金属微粒子４０ａ〜４０ｃとを接触させると、図１Ｂに示すように、一次抗体１０ａ〜１０ｃに試料中の抗原２０ａ〜２０ｃが結合し、さらに抗原２０ａ〜２０ｃに二次抗体３０ａ〜３０ｃが結合する。その結果、金属微粒子４０ａ〜４０ｃを、作用電極近傍に局在化させることができる。すなわち、金属微粒子４０ａ〜４０ｃが、一次抗体１０ａ〜１０ｃ、抗原２０ａ〜２０ｃ、及び二次抗体３０ａ〜３０ｃを介して、作用電極１に固定される。このとき、金属微粒子４０ａ〜４０ｃが作用電極近傍に局在化する量は、試料に含まれる抗原２０ａ〜２０ｃの量にそれぞれ対応（比例）する。例えば、抗原２０ａを例にとると、試料中の抗原２０ａの量が多いほど、作用電極１の近傍に局在化する金属微粒子４０ａの量は多くなる。試料中に抗原２０ａが存在しない場合には、金属微粒子４０ａは作用電極１の近傍に局在化しない。
【００２３】
図１Ａ及び図１Ｂでは、被験物質が抗原であり、結合物質が抗体である場合を示したが、被験物質及び結合物質が他の物質である場合も同様に行うことができる。例えば、図２Ａ及び図２Ｂは、被験物質及び結合物質が核酸である場合の例である。
図２Ａの例では、被験物質としての核酸２１ａ〜２１ｃを測定するために、第１の結合物質としての第１プローブ１１ａ〜１１ｃが作用電極１に固定されている。第１プローブ１１ａ〜１１ｃは、それぞれ核酸２１ａ〜２１ｃに相補的な配列を含んでおり、当該相補配列により核酸２１ａ〜２１ｃと特異的に結合する。
図２Ｂの例では、第２の結合物質として第２プローブ３１ａ〜３１ｃを用いている。第２プローブ３１ａ〜３１ｃは、それぞれ核酸２１ａ〜２１ｃに相補的な配列を含んでおり、当該相補配列により核酸２１ａ〜２１ｃと特異的に結合する。第２プローブ３１ａ〜３１ｃは、それぞれ、互いに異なる種類の金属である金属Ｘ，Ｙ，Ｚからなる金属微粒子４０ａ〜４０ｃに固定されている。
図２Ａに示す作用電極１に、試料と、第２プローブ３１ａ〜３１ｃが固定された金属微粒子４０ａ〜４０ｃとを接触させると、図２Ｂに示すように、第１プローブ１１ａ〜１１ｃに試料中の核酸２１ａ〜２１ｃが結合し、さらに核酸２１ａ〜２１ｃに第２プローブ３１ａ〜３１ｃが結合する。その結果、金属微粒子４０ａ〜４０ｃを、作用電極近傍に局在化させることができる。
【００２４】
作用電極に、試料と、第２の結合物質が固定された金属微粒子と、を接触させる方法は、特に限定されない。例えば、まず作用電極に試料を接触させ、任意に作用電極の洗浄を行った後、第２の結合物質が固定された金属微粒子を作用電極に接触させてもよい。あるいは、試料と第２の結合物質が固定された金属微粒子とを混合し、当該混合物を作用電極に接触させてもよい。第２の結合物質が固定された金属微粒子は、例えば、金属コロイド溶液として用いることができる。
接触時間は、被験物質、第１の結合物質、及び第２の結合物質の種類に応じて、被験物質と第１の結合物質、及び被験物質と第２の結合物質の結合反応が起こるのに十分な時間であればよく、例えば、１０分〜１８０分程度とすることできる。結合反応の際の温度は、被験物質及び結合物質の組み合わせに応じて適宜選択すればよく、例えば、抗原及び抗体の組み合わせであれば２０〜４０℃程度が例示され、核酸どうしの組み合わせであれば６０〜８０℃程度が例示される。
結合反応後は、適宜、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液で作用電極の洗浄を行ってもよい。
【００２５】
［工程（ｂ）］
工程（ｂ）は、作用電極に局在化させた金属微粒子に、電解液を接触させる工程である。
【００２６】
電解液としては、金属微粒子を構成する金属から生じる陽イオンと塩を形成し得る陰イオンを含有するものであって、当該塩において、２９８Ｋの水に対する前記金属イオンの溶解度が、１×１０−５以上であるものを用いる。前記条件を満たす電解液を用いることにより、電極に流れる電流値が検出可能な程度に維持される。以下、特記しない限り、「溶解度」は、２９８Ｋの水に対する溶解度を意味する。２９８Ｋは、熱力学温度を表す。
例えば、図１Ｃの例では、電解液として、陰イオンＡ−を含む電解液を用いている。陰イオンＡ−は、金属微粒子４０ａ〜４０ｃを構成する金属Ｘ，Ｙ，Ｚから生じる金属イオンＸ＋，Ｙ＋及びＺ＋のそれぞれと、塩を形成することができるものである。さらに、当該塩において、金属イオンＸ＋，Ｙ＋及びＺ＋のそれぞれの溶解度は、１×１０−５以上である。
【００２７】
陰イオンと金属イオンとで形成される塩において、金属イオンの溶解度は、下記式（１）により求めることができる。下記式（１）中、「＾」はべき乗を表す。
【００２８】
【数１】
2020079765.tif 000003
【００２９】
前記式（１）中の溶解度積は、各塩において公知のものを用いることができる。一例として、図５に、銀イオンが形成する各塩の２９８Ｋの水に対する溶解度積と、前記式（１）により求められる銀イオンの溶解度を示す。金属微粒子として銀微粒子を用いる場合、電解液としては、例えば、図５に示す表において塩化銀（ＡｇＣｌ）よりも上に記載される塩を形成する陰イオンを含む電解液を用いればよい。
【００３０】
前記式（１）中の溶解度積は、公知の方法により求めてもよい。溶解度積を求める方法としては、沈殿滴定法、及び標準電極電位の差を用いた計算方法等が挙げられる。沈殿滴定法は、溶解度積の測定対象となる塩に含まれるイオンを徐々に滴下し、沈殿が生じる濃度を測定する方法である。沈殿が生じる終点の指示法としては、電位差測定法、拡散電流測定法、電導度測定法、及び指示薬を使用する方法等が挙げられる。
標準電極電位差を用いた測定方法では、測定対象の塩をイオン化するイオン化反応式を電気化学反応式に分解し、それぞれの電気化学反応式の電位差から塩１モル当たりの反応ギブスエネルギーを算出する。この値を用いて、下記式（２）に示す反応ギブスエネルギーと平衡定数の関係式から溶解度積を求めることができる。下記式（２）中、ΔＧは反応ギブスエネルギー、Ｒは気体定数、Ｔは温度、Ｋｓｐは溶解度積を表す。
【００３１】
【数２】
2020079765.tif 000004
【００３２】
一例として、塩化銀（ＡｇＣｌ）の溶解度積を、標準電極電位差を用いた方法で算出する場合を例示する。ＡｇＣｌのイオン化反応式を電気化学反応式に分解すると、下記のようになる。
ＡｇＣｌ＋ｅ− → Ａｇ＋ ＋Ｃｌ− ＋０．２２２３Ｖ  （ｖｓ．  ＳＨＥ）
Ａｇ → Ａｇ＋ ＋ ｅ− ＋０．７９９Ｖ（ｖｓ．  ＳＨＥ）
１モル当たりの反応ギブスエネルギーに変換すると、下記のようになる。
ΔＧ＝（０．７９９ｅＶ − ０．２２２３ｅＶ）×９６．５ｋＪ／ｅＶ＝５５．６ｋＪ
上記式（２）に示す反応ギブスエネルギーと平衡定数の関係式から、溶解度積は下記のとおり求められる。
Ｋｓｐ＝ｅｘｐ（−ΔＧ／ＲＴ）＝ｅｘｐ（−５．５６×１０４／（８．３１４×２９８））＝１．８０×１０−１０
【００３３】
標準電極電位の測定方法としては、サイクリックボルタンメトリー法等が挙げられる。サイクリックボルタンメトリーで生じた、カソード側とアノード側のピークの中心地が電極電位となり、水素標準電極の値に換算した値が、標準電極電位となる。
【００３４】
金属微粒子及び電解液の組み合わせは、前記式（１）を満たす限り、特に限定されない。銀微粒子と組み合わせる電解液としては、例えば、図５に示す表において、塩化銀よりも上部に記載される陰イオンを含む電解液が挙げられる。一例として、塩化物イオン（Ｃｌ−）、硝酸イオン（ＮＯ３−）、又はリン酸イオン（ＰＯ４３−）を含む電解液が挙げられる。また、パラジウム微粒子と組み合わせる電解液としては、例えば、塩化物イオン（Ｃｌ−）、硝酸イオン（ＮＯ３−）、又はリン酸イオン（ＰＯ４３−）を含む電解液が挙げられる。したがって、金属微粒子として、銀微粒子及びパラジウム微粒子を用いる場合には、電解液として、塩化物イオン（Ｃｌ−）、硝酸イオン（ＮＯ３−）及びリン酸イオン（ＰＯ４３−）からなる群より選択される陰イオンを含む電解液を用いることができる。そのような電解液としては、例えば、塩酸（ＨＣｌ）、硝酸カリウム溶液（ＫＮＯ３）、リン酸バッファー（ＮａＨ２ＰＯ４溶液など）等が挙げられる。より具体的には、０．００１Ｎ〜１Ｎ程度の塩酸、０．１〜５Ｍ程度の硝酸カリウム溶液、０．５〜１０ｍＭ程度のリン酸バッファー等が例示される。
【００３５】
作用電極に局在化させた金属微粒子に電解液を接触させる方法は、特に限定されず、例えば、作用電極に適量の電解液を滴下する方法等が挙げられる。
【００３６】
［工程（ｃ）］
工程（ｃ）は、電解液に接触させた金属微粒子を、作用電極の電位制御により、電気化学的に酸化して金属イオンとして溶解させる工程である。
【００３７】
作用電極の電位を、金属微粒子が電気的に酸化する電位に所定時間保持すると、金属微粒子が酸化され、金属微粒子を構成する金属が金属イオンとなって電解液中に溶解する。
図１Ｄの例では、金属微粒子４０ａ〜４０ｃを構成する金属Ｘ，Ｙ，Ｚが酸化可能な電位に、作用電極１の電位を制御することにより、金属微粒子４０ａ〜４０ｃを酸化して金属イオンＸ＋，Ｙ＋，Ｚ＋として電解液に溶解させることができる。金属微粒子４０ａ〜４０ｃを酸化させるに際して、作用電極１の電位は、金属微粒子４０ａ〜４０ｃを構成する金属Ｘ，Ｙ，Ｚの種類に応じて、金属Ｘ，Ｙ，Ｚが酸化可能な電位に適宜設定すればよい。酸化可能な電位は、金属の種類によるが、例えば、銀塩化銀参照電極に対して＋０．８Ｖ〜＋２．０Ｖとすることができる。酸化電位の保持時間は、金属Ｘ，Ｙ，Ｚの種類に応じて、金属Ｘ，Ｙ，Ｚが電解液中に溶解するのに十分な時間であればよく、例えば、１０〜１００秒等が例示される。
【００３８】
［工程（ｄ）］
工程（ｄ）は、電解液中の金属イオンを、作用電極の電位制御により、電気化学的に還元して作用電極表面上に金属として析出させる工程である。
【００３９】
工程（ｄ）では、作用電極の電位を還元側に制御することにより、前記工程（ｃ）により電解液に溶解した金属イオンを還元して、金属として作用電極表面上に析出させる。
図１Ｅの例では、作用電極１の電位を還元側に制御することにより、金属イオンＸ＋，Ｙ＋，Ｚ＋を還元して、作用電極１の表面上に金属Ｘ，Ｙ，Ｚを析出させている。析出する金属Ｘ，Ｙ，Ｚの量は、工程（ａ）において作用電極１の近傍に局在化した金属微粒子４０ａ〜４０ｃの量に対応（比例）しており、試料中の抗原２０ａ〜２０ｃの量に対応する。例えば、試料中に含まれる抗原２０ａの量が多ければ、工程（ａ）において作用電極１の近傍に局在化する金属微粒子４０ａの量も多くなり、その結果、本工程により作用電極１表面上に析出する金属Ｘの量も多くなる。
【００４０】
金属イオンＸ＋，Ｙ＋，Ｚ＋を還元するに際して、作用電極１の電位は、金属Ｘ，Ｙ，Ｚの種類に応じて、金属イオンＸ＋，Ｙ＋，Ｚ＋が還元される電位に適宜設定すればよい。還元電位は、金属の種類によるが、例えば、銀塩化銀参照電極に対して−０．１Ｖ〜−２．０Ｖとすることができる。還元電位の保持時間は、金属Ｘ，Ｙ，Ｚの種類に応じて、金属Ｘ，Ｙ，Ｚが析出するのに十分な時間であればよく、例えば、１０〜１００秒等が例示される。
【００４１】
［工程（ｅ）］
作用電極表面上に析出した金属を、作用電極の電位制御により、電気化学的に酸化して金属イオンとして溶解させ、前記溶解の際に生じる電流値を測定し、前記電流値に基づいて、各被験物質を測定する工程である。
【００４２】
工程（ｅ）では、作用電極の電位を酸化側に制御することにより、工程（ｄ）において作用電極表面上に析出させた金属を酸化し、金属イオンとして電解液中に溶解させる。この際、工程（ｄ）において析出した金属の量に対応した量の電流が発生する。そのため、当該電流値を測定することにより、工程（ｄ）で析出した金属の量を求めることができ、結果として、試料中に含まれる被験物質の量を求めることができる。
【００４３】
析出した金属の酸化電流の測定方法は、特に限定されないが、例えば、微分パルスボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー等のボルタンメトリー、アンペロメトリー、クロノメトリー等の方法が挙げられる。
【００４４】
図１Ｆの例では、作用電極１の電位を酸化側に制御することにより、作用電極１の表面上に析出していた金属Ｘ，Ｙ，Ｚが酸化され、金属イオンＸ＋，Ｙ＋，Ｚ＋となって電解液中に再溶解する。この際に発生する酸化電流は、工程（ｄ）における金属Ｘ，Ｙ，Ｚの析出量に基づく。また、酸化電流が生じる酸化電位は、金属Ｘ，Ｙ，Ｚの種類に応じて異なっている。そのため、例えば、図２に例示するように、金属Ｘ，Ｙ，Ｚの種類に応じた電位において、酸化電流のピーク値を測定することができる。このようにして、金属Ｘ，Ｙ，Ｚの酸化電流値をそれぞれ測定することができ、当該電流値に基づいて、試料中の抗原２０ａ〜２０ｃの量をそれぞれ求めることができる。
【００４５】
［任意工程］
本実施形態の方法は、上記工程（ａ）〜（ｅ）に加えて、任意の工程を含んでいてもよい。任意の工程は、特に限定されないが、例えば、試料を調製する工程（被験物質の濃縮若しくは希釈、不純物の除去など）、工程（ａ）と工程（ｂ）の間あるいは工程（ｄ）と工程（ｅ）の間等に作用電極を洗浄する工程等が挙げられる。
【００４６】
本実施形態の方法では、各被験物質の種類に対応させた２種類以上の金属微粒子を用い、当該金属微粒子と所定の関係を有する電解液を用いる。これにより、工程（ｅ）において、作用電極表面上に析出した金属の種類ごとに、酸化電流値を測定することが可能となり、当該酸化電流値に基づいて、試料中の各被験物質の量を算出することができる。
したがって、本実施形態の方法によれば、１つの電極デバイスで２種類以上の被験物質を測定することが可能である。
【００４７】
≪被験物質を測定するためのキット≫
一実施形態において、本発明は、２種類以上の被験物質を測定するためのキットを提供する。本実施形態のキットは、（Ａ）各被験物質にそれぞれ対応する第１の結合物質が固定された作用電極を備えた電極デバイスと、（Ｂ）前記各被験物質にそれぞれ対応する第２の結合物質が固定された、前記各被験物質毎に異なる種類の金属微粒子と、（Ｃ）電解液であって、前記電解液に含まれる陰イオンと前記各金属微粒子が溶解して生じる各金属イオンとで形成される各塩において、２９８Ｋの水に対する前記各金属イオンの溶解度が、１×１０−５以上である、電解液と、を含む。
【００４８】
［（Ａ）電極デバイス］
電極デバイスとしては、任意の構成のものを用いることができ、例えば、絶縁基板上に作用電極及び対極が形成された電極デバイスが例示される。一例として、図４に示すプレーナ型の印刷電極デバイスが挙げられる。
【００４９】
電極デバイスは、作用電極に、測定対象である各被験物質に対応する第１の結合物質が固定されたものである。被験物質及び第１の結合物質としては、上記「≪被験物質を測定する方法≫」で挙げたものと同様のものが挙げられる。
【００５０】
［（Ｂ）金属微粒子］
金属微粒子は、測定低対象となる被験物質毎に異なる種類の金属で構成されるものが用意される。金属微粒子には、測定対象となる被験物質に対応する第２の結合物質が固定されている。金属微粒子に用いられる金属及び粒径、並びに第２の結合物質としては、「≪被験物質を測定する方法≫」で挙げたものと同様のものが挙げられる。
【００５１】
［（Ｃ）電解液］
電解液は、下記条件を満たす電解液である。
電解液に含まれる陰イオンと前記金属微粒子が溶解して生じる金属イオンとで形成される塩において、金属イオンの溶解度が、１×１０−５以上である。
【００５２】
電解液は、前記（Ｂ）の金属微粒子を構成する金属の種類に応じて、上記条件を満たす電解液が選択される。一例として、前記金属微粒子が、銀微粒子を含む場合、電解液としては、塩化物イオン（Ｃｌ−）、硝酸イオン（ＮＯ３−）及びリン酸イオン（ＰＯ４３−）からなる群より選択される陰イオンを含むものを選択することができる。また、前記金属微粒子が、パラジウム微粒子を含む場合、電解液としては、塩化物イオン（Ｃｌ−）、硝酸イオン（ＮＯ３−）及びリン酸イオン（ＰＯ４３−）からなる群より選択される陰イオンを含むものを選択することができる。したがって、前記金属微粒子が、銀微粒子及びパラジウム微粒子を含む場合、電解液としては、塩化物イオン（Ｃｌ−）、硝酸イオン（ＮＯ３−）及びリン酸イオン（ＰＯ４３−）からなる群より選択される陰イオンを含むものを選択することができる。
そのような電解液の具体例としては、例えば、塩酸（ＨＣｌ）、硝酸カリウム溶液（ＫＮＯ３）、リン酸バッファー（ＮａＨ２ＰＯ４溶液など）等が挙げられる。より具体的には、０．００１Ｎ〜１Ｎ程度の塩酸、０．１〜５Ｍ程度の硝酸カリウム溶液、０．５〜１０ｍＭ程度のリン酸バッファー等が例示される。
電解液は、濃縮液の形態で提供されてもよい。この場合、電解液、使用時に、適切な濃度に希釈されて使用される。
【００５３】
［任意の構成］
本実施形態のキットは、上記（Ａ）〜（Ｃ）の構成に加えて、任意の構成を含んでいてもよい。任意の構成は、特に限定されないが、例えば、作用電極を洗浄するための洗浄バッファー、試料の調製用試薬（希釈液、特定成分の抽出液、細胞溶解液、分解酵素等）、ブロッキングバッファー等が挙げられる。
【００５４】
本実施形態のキットは、上記「≪被験物質を測定する方法≫」で挙げた方法を実施するために用いることができる。
【００５５】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５７】
［方法］
金属微粒子溶液として、銀（Ａｇ）コロイド溶液（ＢＢＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、及びパラジウム（Ｐｄ）コロイド溶液（ワインレッドケミカル社製）を用いた。Ｐｄコロイドを蒸留水で１／０に希釈し、下記の比率となるようにＡｇコロイド及びＰｄコロイドを混合した。
（Ａｇ：Ｐｄ）＝（１０：０）、（８：２）、（５：５）、（２：８）、（０：１０）
【００５８】
上記のように混合した溶液を、２μＬずつ丸型カーボン電極（ＤＥＰ−Ｃｈｉｐ  ＥＲ−Ｎ（バイオデバイステクノロジー社））の作用電極上に滴下して、乾燥させた。次いで、前記作用電極に３０μＬの電解溶液を滴下し、以下のように作用電極の電位制御を行って、Ａｇ及びＰｄの溶解、再析出、再溶解を電気化学的に行い、再溶解時の酸化電流値の測定を行なった。電気化学測定には、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｒ  （ａｌｓ１２３２Ｂ）を用いた。
【００５９】
＜電位制御＞
（１）１．９Ｖ  ２０秒間印加（酸化：金属のイオン化）
（２）−０．６Ｖ  ６０秒間印加（還元：金属の析出）
（３）−０．４Ｖ〜１Ｖまで、微分パルスボルタンメトリー
電位増加分、０．００４Ｖ、振幅０．０５Ｖ、パルス周期０．２秒、
パルス幅０．１秒、サンプリング幅０．０３３３３秒、静止期間２秒
【００６０】
［結果］
図６Ａ及び６Ｂは、電解液として、０．０１Ｎ塩酸（ＨＣｌ）を用いたときの結果である。図６Ａは、微分パルスボルタンメトリーによる酸化電流測定の結果を示す特性図であり、図６Ｂは、のＡｇ及びＰｄの酸化電流のピーク値と、銀及びパラジウムの混合比の相関を示す図である。
図６Ａに示すように、ＡｇとＰｄの酸化電流のピーク値をそれぞれ異なる電位で検出されており、Ａｇ及びＰｄのそれぞれについて酸化電流値を測定することができた。測定されたピーク電流値は、図６Ｂに示すように、Ａｇ及びＰｄの混合比と相関していることが確認された。
【００６１】
図７Ａ及び７Ｂは、電解液として、５ｍＭリン酸バッファー（ＮａＨ２ＰＯ４溶液  ｐＨ７．４）を用いたときの結果である。図７Ａは、微分パルスボルタンメトリーによる酸化電流測定の結果を示す特性図であり、図７Ｂは、のＡｇ及びＰｄの酸化電流のピーク値と、銀及びパラジウムの混合比の相関を示す図である。
図７Ａに示すように、ＡｇとＰｄの酸化電流のピーク値をそれぞれ異なる電位で検出されており、Ａｇ及びＰｄのそれぞれについて酸化電流値を測定することができた。測定されたピーク電流値は、図７Ｂに示すように、Ａｇ及びＰｄの混合比と相関していることが確認された。
【００６２】
図８Ａ及び８Ｂは、電解液として、１Ｍ硝酸カリウム溶液（ＫＮＯ３溶液）を用いたときの結果である。図８Ａは、微分パルスボルタンメトリーによる酸化電流測定の結果を示す特性図であり、図８Ｂは、のＡｇ及びＰｄの酸化電流のピーク値と、銀及びパラジウムの混合比の相関を示す図である。
図８Ａに示すように、ＡｇとＰｄの酸化電流のピーク値をそれぞれ異なる電位で検出されており、Ａｇ及びＰｄのそれぞれについて酸化電流値を測定することができた。測定されたピーク電流値は、図８Ｂに示すように、Ａｇ及びＰｄの混合比と相関していることが確認された。
【００６３】
図９は、電解液として、４ｍＭチオシアンカリウム溶液（ＫＳＣＮ溶液）と用いたときの結果であり、微分パルスボルタンメトリーによる酸化電流測定の結果を示す特性図である。図９に示すように、電解液としてＫＳＣＮ溶液を用いた場合には、Ａｇの酸化電流のピークを確認することができなかった。
【符号の説明】
【００６４】
１…作用電極、１０ａ，１０ｂ，１０ｃ…一次抗体、１１ａ，１１ｂ，１１ｃ…第１プローブ、２０ａ，２０ｂ，２０ｃ…被験物質（抗原）、２１ａ，２１ｂ，２１ｃ…被験物質（核酸）、３０ａ，３０ｂ，３０ｃ…二次抗体、３１ａ，３１ｂ，３１ｃ…第２プローブ、４０ａ，４０ｂ，４０ｃ…金属微粒子、１００…プレーナ型印刷電極デバイス、１０２…絶縁被膜、１０２ａ…開口部、１０３…作用電極、１０４…対極、１０５…参照極、１０６…絶縁基板、１０７…ダム構造部材
【図１】
2020079765.tif 000005
【図２】
2020079765.tif 000006
【図３】
2020079765.tif 000007
【図４】
2020079765.tif 000008
【図５】
2020079765.tif 000009
【図６】
2020079765.tif 000010
【図７】
2020079765.tif 000011
【図８】
2020079765.tif 000012
【図９】
2020079765.tif 000013