(57)【要約】【課題】シロキサン結合のネットワークを形成する市販の材料を脂質分子に添加し、容易に架橋反応を起こすことによって、脂質二重膜の安定性を制御した、実用的価値の高い、リポソームを提供することを目的とする。【解決手段】脂質二重膜が形成されたリポソームであり、上記脂質二重膜の表面に、下記式（１）で表されるアルキルシランにより形成されたシロキサン結合のネットワークを有し、上記アルキルシランは、上記脂質二重膜を構成する脂質に対して２０〜１００ｍｏｌ％含まれる。【化１】2020172445.tif 000009（式中、Ｒ１はアルキル基であり、ｎは１１〜１７の整数を表す。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質二重膜が形成されたリポソームであり、
上記脂質二重膜の表面に、下記式（１）で表されるアルキルシランにより形成されたシロキサン結合のネットワークを有し、
上記アルキルシランは、上記脂質二重膜を構成する脂質に対して２０〜１００ｍｏｌ％含まれることを特徴とするリポソーム。
【化１】
2020172445.tif 000007
（式中、Ｒ１はアルキル基であり、ｎは１１〜１７の整数を表す。）
【請求項２】
上記脂質は、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）であることを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
上記アルキルシランは、上記脂質に対して４０〜１００ｍｏｌ％含まれることを特徴とする請求項１または２に記載のリポソーム。
【請求項４】
脂質と、下記式（１）で表されるアルキルシランとを、該アルキルシランが該脂質に対して２０〜１００ｍｏｌ％の配合量となるように用意する工程と、
上記脂質及び上記アルキルシランを上記配合量で混合した状態で、該脂質によって脂質二重膜を形成する工程と、
上記脂質二重膜が形成された状態で、１．０〜５０ｍＭの酸又はアルカリを添加することによって上記アルキルシランを脱アルコール化し、該脂質二重膜の表面に、シロキサン結合のネットワークを形成する工程と、を有することを特徴とするリポソームの製造方法。
【化２】
2020172445.tif 000008
（式中、Ｒ１はアルキル基であり、ｎは１１〜１７の整数を表す。）
【請求項５】
上記脂質は、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）であることを特徴とする請求項４に記載のリポソームの製造方法。
【請求項６】
上記アルキルシランは、上記脂質に対して４０〜１００ｍｏｌ％含まれることを特徴とする請求項４または５に記載のリポソームの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソーム及びリポソームの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、リン脂質を主成分とする脂質二重膜構造を有する閉鎖小胞である。細胞膜と類似する構造を有するリポソームは、生体内において高い安全性を示し、生分解性を有することから、その小胞内に薬物を封入し、薬物送達システム（Drug Delivery System，DDS）として応用する研究は多くなされている。
【０００３】
ＤＤＳは、標的部位に到達するまでは薬物を保持する必要があり、標的部位に到達すると、薬物を放出する必要があるため、リポソームの脂質二重膜の安定性の制御は重要な課題であった。
【０００４】
非特許文献１には、内部架橋型として、ジアセチレン脂質分子の膜内で光架橋反応を用いたことが記載されており、非特許文献２には、表面架橋型として、膜表面でシロキサン結合のネットワークを形成するセラソームについて記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８２，１０４，３０５
【非特許文献２】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００２，１２４，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献１および非特許文献２に記載されているリポソームは、いずれも高度に設計された脂質分子が新たに合成されて用いられており、構成する脂質分子すべての間で架橋が行われている。このように、複雑な構造を有する脂質分子を合成して用いるのは、非常に煩雑であり、実用的とは言えない。
【０００７】
そこで、本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、その目的は、シロキサン結合のネットワークを形成する市販の材料を脂質分子に加え、容易に架橋反応を起こすことによって、脂質二重膜の安定性を制御した、実用的価値の高い、リポソームを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明のリポソームは、脂質二重膜が形成されたリポソームであり、上記脂質二重膜の表面に、下記式（１）で表されるアルキルシランにより形成されたシロキサン結合のネットワークを有し、上記アルキルシランは、上記脂質二重膜を構成する脂質に対して２０〜１００ｍｏｌ％含まれることを特徴とする。
【０００９】
【化１】
2020172445.tif 000002
（式中、Ｒ１はアルキル基であり、ｎは１１〜１７の整数を表す。）
【００１０】
本発明のリポソームは、上記脂質が、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）であることが好ましい。
【００１１】
また、本発明のリポソームは、上記アルキルシランが、上記脂質に対して４０〜１００ｍｏｌ％含まれることがより好ましい。
【００１２】
そして、本発明のリポソームの製造方法は、脂質と、下記式（１）で表されるアルキルシランとを、該アルキルシランが該脂質に対して２０〜１００ｍｏｌ％の配合量となるように用意する工程と、上記脂質及び上記アルキルシランを上記配合量で混合した状態で、該脂質によって脂質二重膜を形成する工程と、上記脂質二重膜が形成された状態で、１．０〜５０ｍＭの酸又はアルカリを添加することによって上記アルキルシランを脱アルコール化し、該脂質二重膜の表面に、シロキサン結合のネットワークを形成する工程と、を有することを特徴とする。
【００１３】
【化２】
2020172445.tif 000003
（式中、Ｒ１はアルキル基であり、ｎは１１〜１７の整数を表す。）
【発明の効果】
【００１４】
本発明のリポソームによれば、シロキサン結合のネットワークを形成する市販の材料を脂質分子に加え、容易に架橋反応を起こすことによって、脂質二重膜の安定性を制御した、実用的価値の高い、リポソームを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施例に係るリポソームに界面活性剤を添加した際の光散乱強度を測定したグラフである。
【図２】本発明の実施例に係るリポソームの加水分解の進行度を示す１Ｈ ＮＭＲスペクトルデータである。
【図３】添加する塩酸の濃度を変化させて光散乱強度を測定したグラフである。
【図４】ドデシルトリエトキシシランの添加量を変化させて光散乱強度を測定したグラフである。
【図５】オクタドデシルトリエトキシシランの添加量を変化させて光散乱強度を測定したグラフである。
【図６】静置温度を変化させて光散乱強度を測定したグラフである。
【図７】本発明の実施例に係るリポソームを電子顕微鏡で撮像した画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施形態に係るリポソームは、脂質二重膜が形成されたリポソームであり、上記脂質二重膜の表面に、下記式（１）で表されるアルキルシランにより形成されたシロキサン結合のネットワークを有するものである。上記アルキルシランは、上記脂質二重膜を構成する脂質に対して２０〜１００ｍｏｌ％含まれ、好ましくは、４０〜１００ｍｏｌ％含まれる。
【００１７】
【化３】
2020172445.tif 000004
【００１８】
上記脂質は、例えば１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）である。なお、リポソームを形成する脂質としては、ＤＭＰＣに限定されることはなく、他のリン脂質を用いても良い。また、上記式（１）においてＲ１は、例えばエチル基であるが、エチル基に限定されることはなく、他のアルキル基であってもよい。
【００１９】
リポソームの製造を製造する場合、脂質と、上記式（１）で表されるアルキルシランとを、上記アルキルシランが上記脂質に対して２０〜１００ｍｏｌ％の配合量となるように用意し、それら脂質及びアルキルシランを上記配合量で混合した状態で、該脂質によって脂質二重膜を形成する。その後、上記脂質二重膜が形成された状態で、１．０〜５０ｍＭの酸又はアルカリを添加することによって上記アルキルシランを脱アルコール化し、該脂質二重膜の表面に、シロキサン結合のネットワークを形成する。シロキサン結合のネットワークを形成するために添加するものとして、例えば塩酸が用いられるが、他の酸またはアルカリを用いてもよい。
【実施例】
【００２０】
以下に、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、これらの実施例を本発明の趣旨に基づいて変形、変更することが可能であり、それらを本発明の範囲から除外するものではない。
【００２１】
（実施例１）
（２ｍＭ  ＤＭＰＣリポソーム（２０ｍｏｌ％  ドデシルトリエトキシシラン）溶液の調製）
脂質として、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）を用いたリポソームに、アルキルシランとして、上記式（１）においてＲ１をエチル基とし、ｎ＝１１で表される市販のドデシルトリエトキシシラン（以下において、Ｄｏｔｓと示すことがある）を用いることにより、シロキサン結合のネットワークを形成したリポソームを生成した。
【００２２】
具体的には、まず、５０ｍＭのＤＭＰＣクロロホルム溶液８０μＬと、１０ｍＭのドデシルトリエトキシシラン-クロロホルム溶液８０μＬとを用意した。なお、ドデシルトリエトキシシランはＤＭＰＣに対して２０ｍｏｌ％の配合量である。そして、これらをガラス容器に入れ、窒素ガスを吹き付けることで溶媒を留去し薄膜を形成した。そして、一晩静置後、重水１．０ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで撹拌した。脂質二重膜を単層にするために、液体窒素および５０℃の湯浴に交互に浸す凍結融解を７回繰り返した。その後、エクストルーダー（アベスチンフィルター；細孔径５０ｎｍ）に１１回通した。脂質二重膜が形成された状態で、この溶液に２．０ｍＭの塩酸を１．０ｍＬ加え、１日静置することにより、ドデシルトリエトキシシランを脱エタノール化し、脂質二重膜の表面にシロキサン結合のネットワークを形成することで、最終脂質濃度が２ｍＭのＤＭＰＣリポソーム(２０ｍｏｌ％  ドデシルトリエトキシシラン)溶液（最終塩酸濃度１ｍＭ）を得た。
【００２３】
（実施例２）
（２ｍＭ  ＤＭＰＣリポソーム（２０ｍｏｌ％  オクタドデシルトリエトキシシラン）溶液の調製）
実施例１と同様の方法にて、上記式（１）においてＲ１をエチル基とし、ｎ＝１７で表される市販のオクタデシルトリエトキシシラン（以下において、Ｏｄｔｓと示すことがある）を用い、２ｍＭ  ＤＭＰＣリポソーム（２０ｍｏｌ％  オクタデシルトリエトキシシラン）溶液を得た。
【００２４】
（比較例１乃至３）
実施例１と同様の方法にて、脂質として、ＤＭＰＣを用いたリポソームに、アルキルシランとして、上記式（１）においてＲ１をエチル基とし、ｎ＝５で表される市販のへキシルトリエトキシシラン（以下において、Ｈｔｓと示すことがある）を用い、２ｍＭ  ＤＭＰＣリポソーム（２０ｍｏｌ％  へキシルトリエトキシシラン）溶液を調製して比較例１とした。
【００２５】
また、上記式（１）においてＲ１をエチル基とし、ｎ＝７で表される市販のオクチルトリエトキシシラン（以下において、Ｏｔｓと示すことがある）を用い、２ｍＭ  ＤＭＰＣリポソーム（２０ｍｏｌ％  オクチルトリエトキシシラン）溶液を調製して比較例２とした。
【００２６】
さらに、上記式（１）においてＲ１をエチル基とし、ｎ＝９で表される市販のデシルトリエトキシシラン（以下において、Ｄｅｔｓと示すことがある）を用い、２．０ｍＭ  ＤＭＰＣリポソーム（２０ｍｏｌ％  デシルトリエトキシシラン）溶液を調製して比較例３とした。
【００２７】
（蛍光分光器を用いたリポソームの安定性評価）
実施例１および２、ならびに比較例１乃至３で得られた、ＤＭＰＣリポソーム（２０ｍｏｌ％  アルキルトリエトキシシラン）溶液における、リポソームの構造安定性の評価を、界面活性剤であるトリトンＸ−１００（ＴＸ−１００）を添加することにより行った。蛍光分光器には、ＨＩＴＡＣＨＩ製のＦ−２７００を用いた。
【００２８】
リポソームは、およそ１００ｎｍのサイズであるため、その溶液は若干白濁しており、光散乱している。そこで、４００ｎｍの光を照射したときの４００ｎｍの散乱光を蛍光分光器で測定することによって、リポソームの崩壊度を評価した。
【００２９】
具体的には、ＴＸ−１００を０％添加したときの散乱強度を１００％として、ＴＸ−１００の添加による散乱強度の減少によってリポソームの崩壊を確認した。なお、散乱強度が１５％を切ったときをリポソームが完全に崩壊したと判断した。
【００３０】
図１に、本発明の実施例及び比較例に係るリポソームに界面活性剤を添加した際の光散乱強度を測定したグラフを示す。図１中、アルキルシランを加えないＤＭＰＣリポソームのみの測定結果を○および灰一点鎖線で示す。また、Ｈｔｓを加えたＤＭＰＣリポソーム（比較例１）を●および黒実線、Ｏｔｓを加えたＤＭＰＣリポソーム（比較例２）を▲および灰実線、Ｄｅｔｓを加えたＤＭＰＣリポソーム（比較例３）を■および黒点線、Ｄｏｔｓを加えたＤＭＰＣリポソーム（実施例１）を▼および灰点線、そして、Ｏｄｔｓを加えたＤＭＰＣリポソーム（実施例２）を◆および黒一点鎖線で示す。なお、これらは、ＤＭＰＣに対して２０ｍｏｌ％のアルキルシランを加えたＤＭＰＣリポソームであり、塩酸水溶液を加えた後、２０℃で２４時間静置後に測定を行った。
【００３１】
ＤＭＰＣのみからなるリポソームはＴＸ−１００を４当量添加することで、完全に崩壊した。同様に、Ｈｔｓ、Ｏｔｓ、Ｄｅｔｓ、及びＯｄｔｓを２０ｍｏｌ％加えたＤＭＰＣリポソームでは、ＴＸ−１００を４当量添加することで完全に崩壊したため、安定性の向上は見られなかった。これに対して、Ｄｏｔｓを２０ｍｏｌ％加えたリポソームではＴＸ−１００を１０当量添加しても安定であった。
【００３２】
（１Ｈ ＮＭＲスペクトルによる加水分解の確認）
アルキルシランを加えたリポソームに、酸またはアルカリを加えると、水中においてアルキルシランは下記式（２）のように、まず水と反応して加水分解し、その後シロキサン結合のネットワークが形成される。加水分解する際にアルコールを発生させるため、本発明の実施例において、エタノールを１Ｈ ＮＭＲスペクトルによって検出することによって、加水分解の進行度を決定した。核磁気共鳴測定装置には、Ｖａｒｉａｎ製、４００−ＭＲを用いた。
【００３３】
【化４】
2020172445.tif 000005
【００３４】
図２に示す１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおいて、○で示したピークがエタノールに帰属されるものであり、基準物質として３ｍＭとなるように加えたジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と積分値を比較することで、エタノール濃度を決定した。この結果を反応進行度として表１に示す。なお、図２（Ａ）はＨｔｓを加えたＤＭＰＣリポソーム（比較例１）、図２（Ｂ）はＯｔｓを加えたＤＭＰＣリポソーム（比較例２）、図２（Ｃ）はＤｅｔｓを加えたＤＭＰＣリポソーム（比較例３）、図２（Ｄ）はＤｏｔｓを加えたＤＭＰＣリポソーム（実施例１）、および図２（Ｅ）はＯｄｔｓを加えたＤＭＰＣリポソーム（実施例２）を示す。なお、これらは、ＤＭＰＣに対して２０ｍｏｌ％のアルキルシランを加えたＤＭＰＣリポソームであり、塩酸水溶液を加えた後、２０℃で２４時間静置後に測定を行った。
【００３５】
【表１】
2020172445.tif 000006
【００３６】
アルキル鎖が短いＨｔｓ（比較例１）、Ｏｔｓ（比較例２）、およびＤｅｔｓ（比較例３）では加水分解があまり起こっていないことがわかった。ＤＭＰＣに対してアルキルトリエトキシシランのアルキル鎖が短いことでトリエトキシシランの部位がリポソームの脂質二重膜の中、つまり疎水場に存在することが示唆されており、このため、水と接触できず加水分解があまり進行しなかったものと考えられる。加水分解が進行していないため、この後のシロキサン結合ができる反応は進行せず、これらのアルキルトリエトキシシランでは安定性が向上しなかったことがわかった。
【００３７】
これに対して、Ｄｏｔｓ（実施例１）とＯｄｔｓ（実施例２）はアルキル鎖が十分長く、トリエトキシシランの部位がバルク溶媒に接触できるため、加水分解が進行したものと考えられる。よって、上記式（１）において、ｎ＝１１以上であることが好ましく、より好ましくはｎ＝１１〜１７である。
【００３８】
なお、加水分解が５０％以下の値であるのは、リポソームの内膜に存在するＤｏｔｓとＯｄｔｓは、内水相が中性条件であるため、加水分解が進行しなかったものと考えられる。
【００３９】
（酸の濃度による安定性評価）
次に、シロキサン結合のネットワークを形成する際に添加する酸の濃度を変化させて、リポソームの安定性評価を行った。
【００４０】
図３は、添加する塩酸の濃度を変化させて光散乱強度を測定したグラフである。測定の方法は図１において説明した方法と同じであり、ＤＭＰＣに対して２０ｍｏｌ％のＤｏｔｓを加えたＤＭＰＣリポソームへ、所定の濃度の塩酸水溶液を加えた後、２０℃で２４時間静置後に測定を行った。
【００４１】
図３中、０ｍＭの塩酸水溶液を添加した場合を●および黒実線、０．５ｍＭの塩酸水溶液を添加した場合を▲および灰実線、１．０ｍＭの塩酸水溶液を添加した場合を■および黒点線、２．５ｍＭの塩酸水溶液を添加した場合を▼および灰点線、５．０ｍＭの塩酸水溶液を添加した場合を◆および黒一点鎖線、そして、５０ｍＭの塩酸水溶液を添加した場合を○および灰一点鎖線で示す。なお、０ｍＭの塩酸水溶液の場合、加水分解が進行せず、シロキサン結合も形成されないため、安定性は全く変化しなかった。
【００４２】
１．０ｍＭの塩酸水溶液では、安定性の向上が確認できた。それ以上塩酸濃度の高い条件において、ＴＸ−１００をＤＭＰＣに対して１０当量加えたときの安定性を比較するとそれほど大きな違いは無かった。以上のことより、シロキサンネットワークを形成するためにはリポソーム溶液の最終塩酸濃度が１．０ｍＭ以上であればよく、１．０〜５０ｍＭの酸を添加することが好ましいことがわかった。なお、アルカリについても同様の効果が期待される。
【００４３】
（Ｄｏｔｓの添加量の変化による安定性評価）
次に、Ｄｏｔｓの添加量を変化させて、リポソームの安定性評価を行った。図４は、本発明の実施例に係るリポソームに界面活性剤を添加した際の光散乱強度を測定したグラフである。測定の方法は図１において説明した方法と同じである。
【００４４】
図４中、ＤｏｔｓをＤＭＰＣリポソームに対して１０ｍｏｌ％加えたリポソーム（比較例４）を●および黒実線で示す。また、ＤｏｔｓをＤＭＰＣリポソームに対して２０ｍｏｌ％加えたリポソーム（実施例１）を▲および灰実線、ＤｏｔｓをＤＭＰＣリポソームに対して４０ｍｏｌ％加えたリポソーム（実施例３）を■および黒点線、ＤｏｔｓをＤＭＰＣリポソームに対して７０ｍｏｌ％加えたリポソーム（実施例４）を▼および灰点線、そして、ＤｏｔｓをＤＭＰＣリポソームに対して１００ｍｏｌ％加えたリポソーム（実施例５）を◆および黒一点鎖線で示す。２０ｍｏｌ％の添加量においても、安定性は見られたが、４０ｍｏｌ％以上の添加量でＴＸ−１００をＤＭＰＣに対して１０当量加えたときの安定性がほぼ１００％であることがわかった。以上のことから、Ｄｏｔｓの添加量は２０ｍｏｌ％以上であることが好ましく、より好ましくは４０〜１００ｍｏｌ％である。
【００４５】
（Ｏｄｔｓの添加量の変化による安定性評価）
図２において、Ｏｄｔｓ（実施例２）は、トリエトキシシリル基がバルク溶媒に大きく出ているため自由度が大きく、このあとのシロキサン結合のネットワークがうまく形成されなかったものと考えられる。しかしながら、Ｏｄｔｓの添加量を変化させることによりリポソームの安定性が向上した。
【００４６】
図５は、本発明の実施例に係るリポソームに界面活性剤を添加した際の光散乱強度を測定したグラフである。測定の方法は図１において説明した方法と同じである。
【００４７】
図５中、Ｏｄｔｓを加えないＤＭＰＣリポソームのみ（比較例５）を●および黒実線で示す。また、ＯｄｔｓをＤＭＰＣリポソームに対して２０ｍｏｌ％加えたリポソーム（実施例２）を▲および灰実線、ＯｄｔｓをＤＭＰＣリポソームに対して４０ｍｏｌ％加えたリポソーム（実施例６）を■および黒点線で示す。Ｏｄｔｓは、ＤＭＰＣリポソームに対する添加量を４０ｍｏｌ％に増やすことで安定性が向上した。この結果により、Ｏｄｔｓは脂質に対して４０ｍｏｌ％以上の配合量とするのが好ましいことがわかった。
【００４８】
（２４時間静置する際の温度の影響による安定性評価）
本発明の実施例におけるリポソームは、脂質二重膜を形成させ、酸またはアルカリを添加した後、２４時間静置することにより、シロキサン結合のネットワークを形成させる。そこで、２４時間静置する際の温度によってリポソームの安定性に変化が見られるかを調べた。
【００４９】
図６は、本発明の実施例に係るリポソームに塩酸を添加し、異なる温度で静置した際の光散乱強度を示すグラフである。測定の方法は図１において説明した方法と同じである。また、この評価は、ＤＭＰＣリポソームに対して４０ｍｏｌ％のＤｏｔｓを添加したリポソームを、１ｍＭ塩酸溶液中にて、所定の温度で２４時間静置後に測定することにより行った。
【００５０】
図６中、静置温度を４℃とした場合を●および黒実線、２０℃とした場合を▲および灰実線、８０℃とした場合を■および黒点線で示す。
【００５１】
その結果、４℃では安定性の向上が見られなかった。これは、温度が低いため加水分解が進行しなかったものと考えられる。一方、２０℃と８０℃では同じように安定性の向上が確認された。以上のことから、静置温度は２０℃以上が好ましいことがわかった。
【００５２】
（透過型電子顕微鏡によるリポソームの構造確認）
ＤＭＰＣリポソームに対して４０ｍｏｌ％のＤｏｔｓを添加したリポソームについて、構造確認を行うため透過型電子顕微鏡測定を行った結果を図７に示す。透過型電子顕微鏡は日本電子社のＪＥＭ−１４００を用いた。図７（Ａ）に示すように、ＤＭＰＣリポソームに対して４０ｍｏｌ％のＤｏｔｓを添加したリポソームは、球状構造をとっていることが確認された。また、このリポソームにＴＸ−１００を４当量添加した場合も、図７（Ｂ）に示されるように、球状構造は維持されており、リポソームが安定に存在していることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の活用例としては、製薬分野における薬物送達システムおよび有機合成化学分野におけるソフトマテリアルの開発に応用可能である。
【図１】
2020172445.tif 000010
【図２】
2020172445.tif 000011
【図３】
2020172445.tif 000012
【図４】
2020172445.tif 000013
【図５】
2020172445.tif 000014
【図６】
2020172445.tif 000015
【図７】
2020172445.tif 000016