(57)【要約】【課題】植物の成長を向上させる技術を提供する。【解決手段】野生型の植物よりも成長が向上した植物の製造方法であって、前記植物の少なくとも２種類の硫酸イオントランスポーターの機能を阻害することを含む、製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型の植物よりも成長が向上した植物の製造方法であって、前記植物の少なくとも２種類の硫酸イオントランスポーターの機能を阻害することを含む、製造方法。
【請求項２】
前記植物の成長の向上が、成長速度の促進、種子の収量の増加又は側枝の数の増加を含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記硫酸イオントランスポーターが、少なくとも１種類の低親和型硫酸イオントランスポーターを含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記少なくとも２種類の硫酸イオントランスポーターが、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記植物がアブラナ科植物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
少なくとも２種類の硫酸イオントランスポーターの機能が阻害されている、野生型の植物よりも成長が向上した植物。
【請求項７】
前記植物の成長の向上が、成長速度の促進、種子の収量の増加又は側枝の数の増加を含む、請求項６に記載の植物。
【請求項８】
前記硫酸イオントランスポーターが、少なくとも１種類の低親和型硫酸イオントランスポーターを含む、請求項６又は７に記載の植物。
【請求項９】
前記少なくとも２種類の硫酸イオントランスポーターが、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１０】
アブラナ科植物である、請求項６〜９のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか一項に記載の植物の種子。
【請求項１２】
請求項６〜１０のいずれか一項に記載の植物の花粉。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成長が向上した植物の製造方法に関する。本発明は、より詳細には、野生型の植物よりも成長が向上した植物の製造方法、野生型の植物よりも成長が向上した植物、種子及び花粉に関する。
【背景技術】
【０００２】
硫黄は、植物の必須栄養素の一つであり、主に硫酸イオン（ＳＯ４２−）として、根から吸収される。硫酸イオンの取り込みや植物体内における輸送には、硫酸イオンに対して異なった親和性を有する複数の硫酸イオントランスポーターが関与することが知られている（例えば、特許文献１を参照）。
【０００３】
シロイヌナズナのゲノム上には、１２種の硫酸イオントランスポーター（Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，ＳＵＬＴＲ）が存在している。これらの硫酸イオントランスポーターは、予測アミノ酸配列の類似性から、ＳＵＬＴＲ１、ＳＵＬＴＲ２、ＳＵＬＴＲ３、ＳＵＬＴＲ４の４つのサブファミリーに分類されている。また、個々の硫酸イオントランスポーターは、各サブファミリー内の通し番号を付して命名されている。
【０００４】
そして、ＳＵＬＴＲ１に属するＳＵＬＴＲ１；１、ＳＵＬＴＲ１；２、ＳＵＬＴＲ１；３は高親和型の硫酸イオントランスポーターであることが明らかにされている。また、ＳＵＬＴＲ２に属するＳＵＬＴＲ２；１、ＳＵＬＴＲ２；２は低親和型の硫酸イオントランスポーターであることが明らかにされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−２７２４７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
植物による有用物質の生産能力を向上させる技術が求められている。本発明は、植物の成長を向上させる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の態様を含む。
［１］野生型の植物よりも成長が向上した植物の製造方法であって、前記植物の少なくとも２種類の硫酸イオントランスポーターの機能を阻害することを含む、製造方法。
［２］前記植物の成長の向上が、成長速度の促進、種子の収量の増加又は側枝の数の増加を含む、［１］に記載の製造方法。
［３］前記硫酸イオントランスポーターが、少なくとも１種類の低親和型硫酸イオントランスポーターを含む、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記少なくとも２種類の硫酸イオントランスポーターが、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５を含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］前記植物がアブラナ科植物である、［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］少なくとも２種類の硫酸イオントランスポーターの機能が阻害されている、野生型の植物よりも成長が向上した植物。
［７］前記植物の成長の向上が、成長速度の促進、種子の収量の増加又は側枝の数の増加を含む、［６］に記載の植物。
［８］前記硫酸イオントランスポーターが、少なくとも１種類の低親和型硫酸イオントランスポーターを含む、［６］又は［７］に記載の植物。
［９］前記少なくとも２種類の硫酸イオントランスポーターが、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５を含む、［６］〜［８］のいずれかに記載の植物。
［１０］アブラナ科植物である、［６］〜［９］のいずれかに記載の植物。
［１１］［６］〜［１０］のいずれかに記載の植物の種子。
［１２］［６］〜［１０］のいずれかに記載の植物の花粉。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、植物の成長を向上させる技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実験例１の結果を示す写真である。
【図２】実験例２の結果を示すグラフである。
【図３】実験例２の結果を示す写真である。
【図４】実験例３の結果を示すグラフである。
【図５】実験例３の結果を示す写真である。
【図６】実験例４の結果を示すグラフである。
【図７】（ａ）〜（ｄ）は、実験例５の結果を示す写真である。
【図８】図７（ａ）〜（ｄ）の写真に基づいて、各植物体の高さを数値化したグラフである。
【図９】（ａ）〜（ｈ）は、実験例６の結果を示す写真である。
【図１０】図９（ｅ）〜（ｈ）の写真に基づいて、鞘の総数を計測した結果を示すグラフである。
【図１１】（ａ）〜（ｄ）は、実験例７の結果を示す写真である。
【図１２】図１１（ａ）〜（ｄ）の写真に基づいて、鞘の長さを計測した結果を示すグラフである。
【図１３】実験例８の結果を示すグラフである。
【図１４】実験例９の結果を示すグラフである。
【図１５】実験例１０の結果を示す写真である。
【図１６】実験例１０の結果を示すグラフである。
【図１７】実験例１１の結果を示すグラフである。
【図１８】（ａ）〜（ｄ）は、実験例１２の結果を示すグラフである。
【図１９】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１３の結果を示すグラフである。
【図２０】（ａ）〜（ｆ）は、実験例１４の結果を示すグラフである。
【図２１】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１５の結果を示すグラフである。
【図２２】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１５の結果を示すグラフである。
【図２３】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１５の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［遺伝子及びタンパク質の表記］
本明細書では、遺伝子及びタンパク質を特に区別せず、いずれも大文字のアルファベットで表す場合がある。また、本明細書において、例えば、「硫酸イオントランスポーター」と記載した場合、文脈上特に矛盾しない限り、硫酸イオントランスポーター遺伝子及び硫酸イオントランスポータータンパク質の双方を指すものとする。また、本明細書では、遺伝子を欠損していることを小文字のアルファベットで表す場合がある。例えば、「ｓｕｌｔｒ１；１」と表記することにより、ＳＵＬＴＲ１；１遺伝子の欠損株を表す場合がある。
【００１１】
［成長が向上した植物の製造方法］
１実施形態において、本発明は、野生型の植物よりも成長が向上した植物の製造方法であって、前記植物の少なくとも２種類の硫酸イオントランスポーターの機能を阻害することを含む、製造方法を提供する。実施例において後述するように、本実施形態の製造方法により、野生型の植物と比較して、成長が向上した植物を製造することができる。
【００１２】
ここで、野生型の植物とは、例えば、少なくとも硫酸イオントランスポーターが正常（野生型）である植物であってもよい。すなわち、少なくとも２種類の硫酸イオントランスポーターの機能を阻害した植物は、これらの硫酸イオントランスポーターの機能が正常な植物と比較して成長が向上している。
【００１３】
本実施形態の製造方法は、植物の少なくとも２種類の硫酸イオントランスポーターの機能を阻害することを含む、植物の成長を野生型の植物よりも向上させる方法であるということもできる。
【００１４】
本明細書において、植物の成長を向上させるとは、野生型の植物と比較して、植物の成長速度を促進させること、植物の種子の収量を増加させること、側枝の数を増加させること等を意味する。ここで、野生型の植物とは、少なくとも硫酸イオントランスポーターの機能が正常である植物であってもよい。
【００１５】
また、本明細書において、植物の成長速度を促進させるとは、野生型の植物と比較して、種をまいてから茎の伸長開始までの時間が短くなること、植物の高さが所定のレベルに到達するまでの時間が短くなること、植物の重量が所定のレベルに到達するまでの時間が短くなること等であってもよい。
【００１６】
また、種子の収量を増加させるとは、野生型の植物と比較して、植物１個体あたりが産生する種子の数が多くなること、植物１個体あたりが産生する種子の重量が増加すること等であってよい。ここで、種子の品質は、野生型の植物の種子の品質と少なくとも同等であることが好ましい。
【００１７】
種子の品質は、例えば、種子の重量、種子に含まれる、炭素、水素、窒素、硫黄、リン等の元素の含有量、種子をまいた時の植物の成長等により評価することができる。
【００１８】
本実施形態の製造方法において、硫酸イオントランスポーターの機能の阻害とは、硫酸イオントランスポーターの機能が完全に阻害されること、硫酸イオントランスポーターの機能が抑制されること（低下すること）等を意味する。硫酸イオントランスポーターの機能の阻害は、野生型の植物と比較して、硫酸イオントランスポーターの機能が抑制される限り特に限定されず、遺伝子レベルで行ってもよいし、タンパク質レベルで行ってもよい。
【００１９】
硫酸イオントランスポーターの機能を阻害するとは、例えば、硫酸イオントランスポーター遺伝子の発現を抑制することであってもよく、硫酸イオントランスポータータンパク質の活性を抑制することであってもよい。
【００２０】
硫酸イオントランスポーター遺伝子の発現の抑制方法は、当該遺伝子の発現が抑制される限り特に限定されず、例えば、植物のゲノム上の硫酸イオントランスポーター遺伝子を欠損させることにより行ってもよい。硫酸イオントランスポーター遺伝子の欠損は、硫酸イオントランスポーター遺伝子を完全に欠損させることにより行ってもよいし、硫酸イオントランスポーター遺伝子の一部を欠損させることにより行ってもよいし、硫酸イオントランスポーター遺伝子にフレームシフト変異、ナンセンス変異等を導入することにより行ってもよい。これらの変異は、植物のゲノムにＴ−ＤＮＡやトランスポゾンを挿入することにより導入してもよいし、ゲノム編集により導入してもよい。ゲノム編集は、ＴＡＬＥＮやＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等を用いて行うことができる。また、自然変異を生じた植物体の中から硫酸イオントランスポーター遺伝子の発現が抑制されたものを選抜してもよい。
【００２１】
あるいは、硫酸イオントランスポーター遺伝子の発現の抑制は、硫酸イオントランスポーター遺伝子の発現を抑制する阻害性核酸を植物に導入すること、又は阻害性核酸を植物中で発現させること等により行うこともできる。ここで、阻害性核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等が挙げられる。
【００２２】
硫酸イオントランスポータータンパク質の活性の抑制は、例えば、硫酸イオントランスポータータンパク質の活性を抑制する低分子化合物を植物に投与することにより行ってもよい。あるいは、抗体又は抗体断片等の硫酸イオントランスポータータンパク質に結合してその活性を抑制する特異的結合物質を植物中で発現させること等により行ってもよい。あるいは、硫酸イオントランスポーター遺伝子に、硫酸イオントランスポータータンパク質の機能を低下させるアミノ酸置換等の変異を導入することにより行ってもよい。
【００２３】
硫酸イオントランスポーターとしては、ＳＵＬＴＲ１；１、ＳＵＬＴＲ１；２、ＳＵＬＴＲ１；３等のＳＵＬＴＲ１に属する高親和型の硫酸イオントランスポーター；ＳＵＬＴＲ２；１、ＳＵＬＴＲ２；２等のＳＵＬＴＲ２に属する低親和型の硫酸イオントランスポーター；ＳＵＬＴＲ３；１、ＳＵＬＴＲ３；２、ＳＵＬＴＲ３；３、ＳＵＬＴＲ３；４、ＳＵＬＴＲ３；５等のＳＵＬＴＲ３に属する硫酸イオントランスポーター；ＳＵＬＴＲ４；１、ＳＵＬＴＲ４；２等のＳＵＬＴＲ４に属する硫酸イオントランスポーター等が挙げられる。
【００２４】
本実施形態の製造方法において、硫酸イオントランスポーターの機能の阻害は、上述した方法の１種により行ってもよいし、上述した方法の２種以上を組み合わせて行ってもよい。
【００２５】
シロイヌナズナにおける各硫酸イオントランスポーター遺伝子のＡＧＩコードを下記表１に示す。
【００２６】
【表１】
2020028228.tif 000002
【００２７】
本実施形態の製造方法において、植物の成長を向上させる対象の植物がシロイヌナズナ以外の植物である場合には、対象とする植物における、上記表１に示す硫酸イオントランスポーターの、ホモログ、パラログ、オーソログ等の機能を阻害すればよい。
【００２８】
また、機能を阻害する硫酸イオントランスポーターの種類は、２種類であってもよく、３種類であってもよく、４種類であってもよい。しかしながら、機能を阻害する硫酸イオントランスポーターは、少なくとも１種類の低親和型硫酸イオントランスポーター（すなわち、ＳＵＬＴＲ２；１、ＳＵＬＴＲ２；２等のＳＵＬＴＲ２に属する硫酸イオントランスポーター）を含むことが好ましい。
【００２９】
本実施形態の製造方法において、機能を阻害する硫酸イオントランスポーターは、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５を含むことが好ましい。
【００３０】
また、本実施形態の製造方法において、植物の成長を向上させる対象の植物は、特に限定されないが、アブラナ科植物であることが好ましい。アブラナ科植物としては、特に限定されず、例えば、アブラナ、チンゲンサイ、コマツナ、カブ、ハクサイ、キャベツ、ブロッコリー、カラシナ、クレソン、ダイコン、ワサビ、コールラビ、ケール、カリフラワー、ハボタン、ルッコラ等が挙げられる。
【００３１】
［成長が向上した植物］
１実施形態において、本発明は、少なくとも２種類の硫酸イオントランスポーターの機能が阻害されている、野生型の植物よりも成長が向上した植物を提供する。本実施形態の植物において、硫酸イオントランスポーター、硫酸イオントランスポーターの機能の阻害等については上述したものと同様である。
【００３２】
本実施形態の植物において、植物の成長の向上は、成長速度の促進であってもよいし、種子の収量の増加であってもよいし、側枝の数の増加であってもよい。
【００３３】
本実施形態の植物において、硫酸イオントランスポーターは、少なくとも１種類の低親和型硫酸イオントランスポーターを含むことが好ましい。そして、少なくとも２種類の硫酸イオントランスポーターは、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５を含むことが好ましい。また、本実施形態の植物は、アブラナ科植物であることが好ましい。アブラナ科植物については上述したものと同様である。
【００３４】
本実施形態の植物は、種子の形態であってもよいし、花粉の形態であってもよいし、植物体（栄養体）の形態であってもよい。また、本実施形態の植物は、カルスの形態であってもよいし、培養細胞の形態であってもよい。また、植物のカルス又は培養細胞は凍結されていてもよい。花粉、カルス、培養細胞等から個体を再生することも可能である。
【００３５】
また、本実施形態の植物は、上述した製造方法により作られた植物であってもよいし、当該植物の子孫であってもよい。
【実施例】
【００３６】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３７】
［実験例１］
（硫酸イオントランスポーター遺伝子欠損株の作製）
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、ｃｖ．  Ｃｏｌｕｍｂｉａ−０）のＳＵＬＴＲ２；１欠損株及びＳＵＬＴＲ３；５欠損株は次のようにして作製した。まず、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＢＲＣ）より、ＳＵＬＴＲ２；１の欠損株（ＳＭ＿３＿３９４４０、ＳＵＬＴＲ２；１のコード領域中にトランスポゾンが挿入されている。）及びＳＵＬＴＲ３；５の欠損株（ＳＭ＿３＿２４０５０、ＳＵＬＴＲ３；５のコード領域中にトランスポゾンが挿入されている。）の種子を入手した。続いて、これらの種子をそれぞれ１０粒程度ずつアガロース培地上で発芽させ、各植物体のロゼット葉一枚よりゲノムＤＮＡを抽出した。
【００３８】
続いて、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、トランスポゾンの配列をもとに作製したプライマー及びＳＵＬＴＲ２；１（又はＳＵＬＴＲ３；５）特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、ＳＵＬＴＲ２；１（又はＳＵＬＴＲ３；５）コード領域中へのトランスポゾンの挿入を確認した。
【００３９】
続いて、トランスポゾンの挿入部位を挟むように設計したＳＵＬＴＲ２；１（又はＳＵＬＴＲ３；５）特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、トランスポゾンの挿入をホモに持つ個体を選抜した。続いて、選抜した個体を育成し、次世代の種子を採取した。続いて、採取した種子を培地上に播種し、得られた複数の植物体からＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを調製し、ＰＣＲ増幅することにより、得られた植物体がＳＵＬＴＲ２；１（又はＳＵＬＴＲ３；５）を発現しないことを確認し、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株及びＳＵＬＴＲ３；５欠損株を得た。
【００４０】
また、シロイヌナズナのＳＵＬＴＲ２；１、ＳＵＬＴＲ３；５二重欠損株は、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株とＳＵＬＴＲ３；５欠損株とを交配し、雑種第２代（Ｆ２）及び雑種第３代（Ｆ３）の子孫から、二重欠損株を選抜することにより作製した。二重欠損株の選抜は、Ｆ２株及びＦ３株のゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、ＳＵＬＴＲ２；１遺伝子及びＳＵＬＴＲ３；５遺伝子の双方が欠失した株を選抜し、その後代であるＦ４株から抽出したＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の双方の発現が失われた株を選抜し、ＳＵＬＴＲ２；１、ＳＵＬＴＲ３；５二重欠損株を得た。
【００４１】
図１は、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。図１中、「ＵＢＱ２」は陽性対象としてユビキチンタンパク質遺伝子のｃＤＮＡの一部をＰＣＲ増幅した結果であることを示し、「Ｃｏｌ」はシロイヌナズナの野生型株であるＣｏｌｕｍｂｉａ株の結果であることを示し、「２；１ＫＯ」はＳＵＬＴＲ２；１欠損株の結果であることを示し、「３；５ＫＯ」はＳＵＬＴＲ３；５欠損株の結果であることを示し、「ＷＫＯ」はＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の結果であることを示す。
【００４２】
［実験例２］
（硫酸イオントランスポーター遺伝子欠損株は茎の伸長開始時期が早かった）
シロイヌナズナの野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の種子を土にまき、成長の様子を観察した。
【００４３】
本実験例では、茎の伸長開始時期を検討した。図２は、各株の茎の伸長開始時期をグラフにしたものである。図２中、グラフの縦軸は茎の伸長を開始した植物体の数を示し、横軸は種子をまいてからの時間（日）を示す。また、図３は、種子をまいてから２２日目の各株を撮影した写真である。図２及び図３中、「ＷＴ」は野生型株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１」はＳＵＬＴＲ２；１欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ３；５欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の結果であることを示す。
【００４４】
その結果、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株は、野生型株と比較して、茎の伸長開始時期が早いことが明らかとなった。また、これらの中では、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株が最も茎の伸長開始時期が早かった。
【００４５】
［実験例３］
（硫酸イオントランスポーター遺伝子欠損株と野生型株でロゼット葉の数及び重量は同じであった）
シロイヌナズナの野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の種子を土にまき、成長の様子を観察した。
【００４６】
本実験例では、ロゼット葉の数を検討した。図４は、各株のロゼット葉の枚数をグラフにしたものである。図４中、グラフの縦軸は植物１個体あたりのロゼット葉の枚数を示す。また、図５は、種子をまいてから２０日目の各株を撮影した写真である。図４及び図５中、「ｓｕｌｔｒ２；１」はＳＵＬＴＲ２；１欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ３；５欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の結果であることを示す。また、図４中の「ＷＴ」及び図５中の「ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ」は、野生型株の結果であることを示す。
【００４７】
その結果、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株のロゼット葉の枚数は、いずれも野生型株のロゼット葉の枚数と同じであることが明らかとなった。
【００４８】
［実験例４］
（硫酸イオントランスポーター遺伝子欠損株は野生型株よりもロゼット葉の重量が増加した）
シロイヌナズナの野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の種子を土にまき、成長の様子を観察した。
【００４９】
本実験例では、ロゼット葉の重量を検討した。図６は、種子をまいてから２０日目の各株のロゼット葉の重量をグラフにしたものである。図６中、「ＷＴ」は野生型株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１」はＳＵＬＴＲ２；１欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ３；５欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の結果であることを示す。また、グラフの縦軸は植物１個体あたりのロゼット葉の重量（生重量）を示す。また、「＊」は、Ｔ検定の結果、野生型株の結果と比較してｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。
【００５０】
その結果、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株のロゼット葉の重量は、野生型株のロゼット葉の重量よりも有意に増加することが明らかとなった。
【００５１】
［実験例５］
（二重欠損株は成長が速かった）
シロイヌナズナの野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の種子を土にまき、成長の様子を観察した。
【００５２】
本実験例では、植物体の高さを検討した。図７（ａ）〜（ｄ）は、種子をまいてから、それぞれ、３５、４０、４５、５５日目の各株の代表的な写真である。図７中、「ＷＴ」は野生型株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１」はＳＵＬＴＲ２；１欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ３；５欠損株の結果であることを示し、「ＷＫＯ」はＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の結果であることを示す。また、図８は、図７の結果を数値化したグラフである。図８中、グラフの縦軸は植物体の高さ（ｃｍ）を示す。また、「＊＊」は、Ｔ検定の結果、野生型株の結果と比較してｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す。
【００５３】
その結果、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株は、野生型株と比較して、成長が速いことが明らかとなった。また、これらの中では、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株が最も成長が速かった。
【００５４】
［実験例６］
（二重欠損株は鞘の総数が多かった）
シロイヌナズナの野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の種子を土にまき、成長の様子を観察した。
【００５５】
本実験例では、鞘の数を検討した。図９（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ、種子をまいてから５０日目の野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の代表的な写真である。
【００５６】
また、図９（ｅ）〜（ｈ）は、それぞれ、図９（ａ）〜（ｄ）の各株から採取した鞘の写真である。図９中、「ＷＴ」は野生型株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１」はＳＵＬＴＲ２；１欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ３；５欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の結果であることを示す。
【００５７】
また、図９（ｅ）〜（ｈ）中、鞘と鞘の間のスペースが広い部分は、枝の区切りを示す。すなわち、図９（ｅ）〜（ｈ）中、鞘は、主茎の鞘、１番目の側枝の鞘、２番目の側枝の鞘、３番目の側枝の鞘の順に並べた。また、図１０は、図９（ｅ）〜（ｈ）の結果に基づいて、鞘の総数を数値化したグラフである。図１０中、グラフの縦軸は植物１個体あたりの鞘の総数（個）を示す。また、「＊＊」は、Ｔ検定の結果、野生型株の結果と比較してｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す。
【００５８】
その結果、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株は、野生型株と比較して、植物１個体あたりの鞘の総数が多いことが明らかとなった。また、これらの中では、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株が最も鞘の総数が多かった。
【００５９】
また、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株は側枝の数が多いことが明らかとなった。図９（ａ）に示すように、野生型株の側枝は１本であった。また、図９（ｂ）に示すようにＳＵＬＴＲ２；１欠損株の側枝は１本であった。また、図９（ｃ）に示すように、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株の側枝は２本であった。これに対し、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の側枝は３本であり、他の株よりも多かった。
【００６０】
また、複数の各株について側枝の数を観察した。１４個体の野生型株を観察した結果、３個体で側枝が０本であり、８個体で側枝が１本であり、３個体で側枝が２本であった。また、１４個体のＳＵＬＴＲ２；１欠損株を観察した結果、５個体で側枝が０本であり、４個体で側枝が１本であり、３個体で側枝が２本であり、２個体で側枝が３本であった。また、１４個体のＳＵＬＴＲ３；５欠損株を観察した結果、４個体で側枝が１本であり、７個体で側枝が２本であり、３個体で側枝が３本であった。また、１４個体のＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株を観察した結果、４個体で側枝が２本であり、９個体で側枝が３本であり、１個体で側枝が４本であった。
【００６１】
［実験例７］
（二重欠損株は鞘の長さが短かった）
シロイヌナズナの野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の種子を土にまき、成長の様子を観察した。
【００６２】
本実験例では、鞘の長さを検討した。図１１（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ、野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株から採取した鞘の代表的な写真である。図１１中、「ＷＴ」は野生型株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１」はＳＵＬＴＲ２；１欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ３；５欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の結果であることを示す。
【００６３】
また、図１２は、図１１（ａ）〜（ｄ）の結果を数値化したグラフである。図１２中、グラフの縦軸は鞘の長さ（ｃｍ）を示す。また、「＊＊」は、Ｔ検定の結果、野生型株の結果と比較してｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す。
【００６４】
その結果、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の鞘は、野生型株の鞘と比較して、長さが有意に短いことが明らかとなった。また、これらの中では、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の鞘が最も短かった。
【００６５】
［実験例８］
（二重欠損株は鞘１つあたりの種子の数が少なかった）
シロイヌナズナの野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の種子を土にまき、成長の様子を観察した。
【００６６】
本実験例では、鞘１つあたりの種子の数を検討した。図１３は、野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株から採取した、鞘１つあたりの種子の数を示すグラフである。図１３中、「ＷＴ」は野生型株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１」はＳＵＬＴＲ２；１欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ３；５欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の結果であることを示す。また、グラフの縦軸は鞘１つあたりの種子の数（個）を示す。また、「＊＊」は、Ｔ検定の結果、野生型株の結果と比較してｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す。
【００６７】
その結果、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株は、鞘１つあたりの種子の数が有意に少ないことが明らかとなった。
【００６８】
［実験例９］
（二重欠損株は植物１個体あたりの種子の総重量が増加した）
シロイヌナズナの野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の種子を土にまき、成長の様子を観察した。
【００６９】
本実験例では、植物１個体あたりの種子の総重量を検討した。図１４は、野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株における、植物１個体あたりの種子の総重量を示すグラフである。
【００７０】
図１４中、「ＷＴ」は野生型株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１」はＳＵＬＴＲ２；１欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ３；５欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の結果であることを示す。また、グラフの縦軸は植物１個体あたりの種子の総重量（ｍｇ）を示す。また、「＊＊」は、Ｔ検定の結果、野生型株の結果と比較してｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す。
【００７１】
その結果、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株は、植物１個体あたりの種子の総重量が有意に増加することが明らかとなった。
【００７２】
また、実験例６〜９の結果から、二重欠損株は、鞘の長さが短く、鞘１つあたりの種子の数が少ないものの、側枝の総数及び鞘の総数が多く、結果的に植物１個体あたりの種子の収量が増加することが明らかとなった。
【００７３】
［実験例１０］
（二重欠損株の種子の重量は野生型株と変わらなかった）
シロイヌナズナの野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の種子を土にまき、成長の様子を観察した。
【００７４】
本実験例では、種子１００個あたりの重量を検討した。図１５は、野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の種子の写真である。図１５中、「ＷＴ」は野生型株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１」はＳＵＬＴＲ２；１欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ３；５欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の結果であることを示す。
【００７５】
また、図１６は、各株の種子それぞれ１００個あたりの総重量を示すグラフである。図１６中、グラフの縦軸は種子１００個あたりの総重量（ｍｇ）を示す。また、「＊」は、Ｔ検定の結果、野生型株の結果と比較してｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。
【００７６】
その結果、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の種子の重量は、野生型株の種子の重量と変わらないことが明らかとなった。なお、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株の種子の重量は、野生型株の種子の重量よりも有意に低いことが明らかとなった。
【００７７】
［実験例１１］
（二重欠損株は茎の重量が増加した）
シロイヌナズナの野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の種子を土にまき、成長の様子を観察した。
【００７８】
本実験例では、種子をまいてから６５日目の植物１個体あたりの茎の乾燥重量を検討した。図１７は、野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の茎の乾燥重量を示すグラフである。図１７中、「ＷＴ」は野生型株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１」はＳＵＬＴＲ２；１欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ３；５欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の結果であることを示す。また、グラフの縦軸は植物１個体あたりの茎の乾燥重量（ｍｇ）を示す。また、「＊＊」は、Ｔ検定の結果、野生型株の結果と比較してｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す。
【００７９】
その結果、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株は、植物１個体あたりの茎の乾燥重量が有意に増加することが明らかとなった。
【００８０】
［実験例１２］
（二重欠損株の種子中の炭素、水素、窒素、灰分含有量の検討）
シロイヌナズナの野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株について、種子中の元素量を測定した。
【００８１】
本実験例では、各株の種子における、炭素、水素、窒素及び灰分の含有量を検討した。図１８（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ、炭素、水素、窒素、灰分の含有量の測定結果を示すグラフである。図１８（ａ）〜（ｄ）中、「ＷＴ」は野生型株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１」はＳＵＬＴＲ２；１欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ３；５欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の結果であることを示す。また、グラフの縦軸は各元素の含有量（重量％）を示す。
【００８２】
その結果、いずれの株も、種子における、炭素、水素、窒素含有量は同様であることが明らかとなった。また、意外なことに、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株の種子、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株の種子、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の種子では、野生型株の種子と比較して、灰分（ミネラル分）が増加することが明らかとなった。
【００８３】
［実験例１３］
（二重欠損株の種子中の硫黄、リン含有量の検討）
シロイヌナズナの野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株について、種子中の元素量を測定した。
【００８４】
本実験例では、各株の種子における、硫黄及びリンの含有量を検討した。図１９（ａ）は硫黄含有量の測定結果を示すグラフであり、図１９（ｂ）はリン含有量の測定結果を示すグラフである。図１９（ａ）及び（ｂ）中、「ＷＴ」は野生型株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１」はＳＵＬＴＲ２；１欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ３；５欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の結果であることを示す。また、グラフの縦軸は各元素の含有量（重量％）を示す。
【００８５】
その結果、いずれの株も、種子における、硫黄、リン含有量は同様であることが明らかとなった。
【００８６】
［実験例１４］
（二重欠損株のグルコシノレート含有量の検討）
シロイヌナズナの野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株について、種子中のグルコシノレート量を測定した。
【００８７】
本実験例では、各株の種子における、グルコシノレートの含有量を検討した。グルコシノレートとしては、グルコラファニン、グルコエルシン、７−メチルチオ−ｎ−ヘプチルグルコシノレート、８−メチルチオ−ｎ−オクチルグルコシノレート、グルコヒルスチン、グルコブラシシンについて検討した。各グルコシノレートは液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により測定した。
【００８８】
図２０（ａ）〜（ｆ）は、それぞれ、グルコラファニン、グルコエルシン、７−メチルチオ−ｎ−ヘプチルグルコシノレート、８−メチルチオ−ｎ−オクチルグルコシノレート、グルコヒルスチン、グルコブラシシンの含有量を測定した結果を示すグラフである。
【００８９】
図２０（ａ）〜（ｆ）中、「ＷＴ」は野生型株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１」はＳＵＬＴＲ２；１欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ３；５欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の結果であることを示す。
【００９０】
また、グラフの縦軸は、それぞれ、内部標準を基準とした相対値を示す。また、「＊」は、Ｔ検定の結果、野生型株の結果と比較してｐ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「＊＊」は、Ｔ検定の結果、野生型株の結果と比較してｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す。
【００９１】
その結果、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の種子におけるいくつかの種類のグルコシノレートの含有量は、野生型株の種子よりも減少することが明らかとなった。
【００９２】
しかしながら、発癌抑制効果があるグルコラファニンの含有量は、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の種子と野生型株の種子で変わらないことが明らかとなった。
【００９３】
［実験例１５］
（二重欠損株の子孫の検討）
シロイヌナズナの野生型株、ＳＵＬＴＲ２；１欠損株、ＳＵＬＴＲ３；５欠損株、並びに、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の種子を培地上にまき、成長の様子を観察した。
【００９４】
本実験例では、種子をまいてから２週間目、３週間目及び４週目の植物体の地上部及び根の重量（生重量）を検討した。図２１（ａ）は、種子をまいてから２週間目の各植物体の地上部の重量を測定した結果を示すグラフである。また、図２１（ｂ）は、種子をまいてから２週間目の各植物体の根の重量を測定した結果を示すグラフである。また、図２２（ａ）は、種子をまいてから３週間目の各植物体の地上部の重量を測定した結果を示すグラフである。また、図２２（ｂ）は、種子をまいてから３週間目の各植物体の根の重量を測定した結果を示すグラフである。また、図２３（ａ）は、種子をまいてから４週間目の各植物体の地上部の重量を測定した結果を示すグラフである。また、図２３（ｂ）は、種子をまいてから４週間目の各植物体の根の重量を測定した結果を示すグラフである。
【００９５】
図２１（ａ）及び（ｂ）、図２２（ａ）及び（ｂ）、図２３（ａ）及び（ｂ）中、「ＷＴ」は野生型株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１」はＳＵＬＴＲ２；１欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ３；５欠損株の結果であることを示し、「ｓｕｌｔｒ２；１ｓｕｌｔｒ３；５」はＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の結果であることを示す。また、グラフの縦軸は植物１個体あたりの重量（生重量）を示す。また、図２３（ａ）及び（ｂ）中、グラフ中の異なる文字（ａ又はｂ）は、テューキーのＨＳＤ（ｈｏｎｅｓｔｌｙ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）検定の結果、ｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。
【００９６】
その結果、種子をまいてから２週間目、３週間目では、いずれの欠損株においても、地上部及び根の重量は野生型株と同様であることが明らかとなった。一方、種子をまいてから４週間目では、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の地上部の重量が、他の株よりも有意に増加することが明らかとなった。
【００９７】
また、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５の二重欠損株の子孫の表現型を更に検討した。その結果、二重欠損株の子孫においても、ＳＵＬＴＲ２；１及びＳＵＬＴＲ３；５が二重欠損していることが確認された。また、二重欠損株の子孫も、親と同様に成長が速く、側枝及び鞘の数、種子の収量が多いことが確認され、これらの表現型について再現性も確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明によれば、植物の成長を向上させる技術を提供することができる。
【図１】
2020028228.tif 000003
【図２】
2020028228.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2020028228.tif 000010
【図９】
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【図１０】
2020028228.tif 000012
【図１１】
2020028228.tif 000013
【図１２】
2020028228.tif 000014
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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