(57)【要約】【課題】フォトリソグラフィー技術に依存することなく、効果的な細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイスを提供する。【解決手段】多孔膜が組み込まれたシリコーンゴムの基板内に、遊走性細胞が導入された第１の流路および化学誘引物質が導入された第２の流路を有し、第１の流路と第２の流路とが少なくとも１つの多孔膜によって隔てられている、細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔膜が組み込まれたシリコーンゴムの基板内に、遊走性細胞が導入された第１の流路および化学誘引物質が導入された第２の流路を有し、前記第１の流路と前記第２の流路とが少なくとも１つの多孔膜によって隔てられている、細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイス。
【請求項２】
前記多孔膜のうちの少なくとも１つは、前記基板内で水平面に対して４５°〜９０°の角度で形成された切込みに挿入されることによって前記基板内に組み込まれている、請求項１に記載の細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイス。
【請求項３】
前記多孔膜のうちの少なくとも１つの平均孔径が３〜１５μｍである、請求項１または２に記載の細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイス。
【請求項４】
前記第１の流路と前記第２の流路との間に配置された第３の流路をさらに含み、前記第１の流路と前記第３の流路とが第１の多孔膜によって隔てられ、前記第２の流路と前記第３の流路とが第２の多孔膜によって隔てられている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイス。
【請求項５】
前記シリコーンゴムはポリジメチルシロキサンを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイス。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイスの前記第１の流路に導入された細胞が前記多孔膜のうちの少なくとも１つを透過する細胞遊走を試験することを含み、前記細胞遊走は、前記第２の流路に導入された化学誘引物質の存在に依存する細胞遊走である、細胞遊走アッセイ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞アッセイデバイスに関する。本発明は特に、細胞遊走をアッセイするためのデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞遊走とは、細胞が化学物質（ケモカイン等の化学誘引物質）の濃度勾配に従って移動する、或いは細胞外マトリックスを分解しながら移動する現象の総称である。これらの現象は、免疫反応やがんの転移などに関わっている。
【０００３】
例えば、炎症状態の皮膚組織においては、間質に存在するマクロファージがサイトカインおよびケモカインを分泌して、サイトカインが血管透過性の亢進を引き起こすとともに、ケモカインが血管から間質への好中球の遊走を誘導し、炎症が促進される。また、がん細胞はケモカイン受容体を細胞表面に発現し、このがん細胞がケモカインに誘引されながら血管外に遊走することによって、他組織への浸潤、そして転移巣の形成へとつながることとなり得る。
【０００４】
細胞遊走を実験的に評価するための系として、基板上での遊走を見る２Ｄ  Ｇａｐ  Ｃｌｏｓｕｒｅアッセイ、および多孔膜を通過する遊走を見るＢｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒアッセイなどが知られている。しかしながらこれらのアッセイは、数ｍＬの液量を含む大きなアッセイ容器中で細胞の遊走がアッセイされるという点で、現実の血管組織等からの乖離が大きい。また、リアルタイムで細胞遊走を観察するのではなくエンドポイントにおいて遊走結果を評価するに過ぎないという欠点もある。
【０００５】
２０００年頃からは、微細加工で作製したマイクロ流路を細胞遊走の分析場とする系が報告され始めた（例えば非特許文献１）。マイクロ流路を用いることで、微小量の試薬・細胞を用いた分析や、複雑な濃度勾配下での分析などが可能となり、また、リアルタイムでの観察も可能になった。
【０００６】
非特許文献１に例示される、従来の細胞遊走分析用マイクロ流体デバイスは、フォトリソグラフィー技術によって作製されていた。すなわち、シリコン基板にフォトレジストを塗布し、次にフォトマスクを被せて紫外線露光を行って現像することによって鋳型を形成し、この鋳型にポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のプレポリマーを流し込んで硬化させ、型取りされて硬化したＰＤＭＳを鋳型から外して、流路型を有する面を平坦なガラス基板と対面させて接合させることによって、マイクロ流路が作製されていた。フォトマスクの設計により、多数の四角いカラム状構造を、互いに３〜１５μｍほどの狭い間隔で、流路中央を縦断するように一列に並べて形成することにより、細胞が通り抜けられる間隙を有する疑似血管壁が形成された。すなわち、流路の一方の側は疑似間質であって化学誘引物質で充填され、上記カラム列を隔てた流路のもう一方の側は疑似血管内腔であって細胞が流される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】K. C. Chaw et al., Biomed. Microdev. (2007) 9:597-602
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
フォトリソグラフィー技術による細胞遊走分析用マイクロ流体デバイスの作製は、現実の組織を模倣した精密な流路構造を作ることができるが、クリーンルーム設備やマスクアライナーなどの高価で大掛かりな装置を必要とし、また、フォトレジスト等の高額な消耗品も用いる必要がある。細胞遊走の生物学的実験を主眼とする生物学系の研究者にとっては、そのような高額で専門性の高い工学的設備・備品を入手あるいは利用することは容易でないという現状がある。
【０００９】
本発明者は、シリコーンゴムの基板に人工の多孔膜を組み込んだマイクロ流体デバイスを利用することにより、フォトリソグラフィーを用いることなくきわめて安価かつ簡便に、生体内環境を模倣した細胞遊走アッセイを行えることを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下の実施形態を含む。
［１］
多孔膜が組み込まれたシリコーンゴムの基板内に、遊走性細胞が導入された第１の流路および化学誘引物質が導入された第２の流路を有し、前記第１の流路と前記第２の流路とが少なくとも１つの多孔膜によって隔てられている、細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイス。
［２］
前記多孔膜のうちの少なくとも１つは、前記基板内で水平面に対して４５°〜９０°の角度で形成された切込みに挿入されることによって前記基板内に組み込まれている、［１］に記載の細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイス。
［３］
前記多孔膜のうちの少なくとも１つの平均孔径が３〜１５μｍである、［１］または［２］に記載の細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイス。
［４］
前記第１の流路と前記第２の流路との間に配置された第３の流路をさらに含み、前記第１の流路と前記第３の流路とが第１の多孔膜によって隔てられ、前記第２の流路と前記第３の流路とが第２の多孔膜によって隔てられている、［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイス。
［５］
前記シリコーンゴムはポリジメチルシロキサンを含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイス。
［６］
［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイスの前記第１の流路に導入された細胞が前記多孔膜のうちの少なくとも１つを透過する細胞遊走を試験することを含み、前記細胞遊走は、前記第２の流路に導入された化学誘引物質の存在に依存する細胞遊走である、細胞遊走アッセイ方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の実施形態により、フォトリソグラフィーを用いることなくきわめて安価かつ簡便に、生体内に近い環境での細胞遊走抑制剤（例えば抗炎症剤および抗癌剤、特に癌転移抑制剤）の薬剤評価試験を実施することなどが可能になる。本実施形態によるデバイスは、フォトリソグラフィー技術により作製されたデバイスと同様に、あるいはそれ以上に、各種マトリックスゲルや生体分子被覆を容易に適用して、それらの存在下での細胞遊走評価試験をサポートすることができ、また、例えば内皮細胞等の生細胞を膜上に培養して、細胞間の相互作用を考慮した評価試験を行うことも可能である。
【００１２】
本デバイスは、あらゆる細胞種、化学誘引物質、および阻害剤に適用できる。本デバイスによるアッセイのために必要とされる細胞数は少ないので、例えば患者由来の免疫細胞を用いた評価試験も実行可能である。
【００１３】
フォトリソグラフィー技術によるデバイスと比べて、本デバイスは、多孔膜の数、位置、孔径、孔密度などを色々と変えて作ることにも大きなコスト、労力、時間がかかることがなく、高度な工学的設備を使用することが困難な状況にある生物学者であっても、それら構造的パラメータが細胞遊走に与える影響をきわめて簡便に評価することができる。すなわち、本発明は、これまでマイクロデバイスに基づく細胞遊走の実験を容易に行うことができなかった多くの研究者にその機会を開放するものであり、細胞遊走の生物学的解明および関連医薬の研究を急速に進歩させる可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、一実施形態による細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイスの製造過程の概略（ａ）、および製造された細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイスの一例を上から撮影した写真（ｂ）を示す。
【図２】図２は、図１に示す３流路デバイスの上流路に遊走性細胞を収容し、かつ、下流路に化学誘引物質ｆＭＬＰを導入した場合（右）またはしなかった場合（左）における、実験開始から０時間後（上）と３時間後（下）の蛍光顕微鏡画像を示す。下流路は画像に含まれていない。個々の細胞は蛍光標識されており、多数の白い点として観察されている。点線は多孔膜の位置を示すために本図面に記入したものであって、実際の顕微鏡映像ではない。
【図３】図３ａは、図２の実験において中流路に検出された遊走細胞数を測定した結果を示す。図３ｂは、異なる濃度のｆＭＬＰを下流路に導入した場合の、３時間後の遊走細胞数を比較した結果を示す。図３ｃは、下流路における１００ｎＭのｆＭＬＰに加えて、異なる濃度のＷｏｒｔｍａｎｎｉｎを全ての流路に導入した場合の遊走細胞数を測定した結果を示す。
【図４】図４は、一実施形態による細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイスを用いた細胞遊走アッセイの概略を示す。上流路中、丸い細胞は遊走性細胞を表し、菱形の細胞は血管内皮細胞を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示において、「上」、「下」、「第１」、「第２」といった用語は、複数ある要素または工程を区別する便宜のために用いられており、必ずしも絶対的な位置関係や順序を特定する意図のものではない。例えば、同じ水平面上に位置する２つの流路を上流路および下流路と呼ぶことがあり、その場合、上流路と下流路という呼称を入れ替えたとしても構造上何ら変わりないということがあり得る。
【００１６】
一側面において、本開示は、多孔膜が組み込まれたシリコーンゴムの基板内に、第１の流路および第２の流路を有し、その第１の流路と第２の流路とが少なくとも１つの多孔膜によって隔てられている、細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイスを提供する。本開示におけるマイクロ流体デバイスは、シリコーンゴムをデバイス本体すなわち基板とするものである。本開示におけるシリコーンゴムは、典型的にはポリジメチルシロキサンを含むものであり、ポリジメチルシロキサンからなるものであってもよい。少なくとも一部のメチル基が例えばビニル基またはフェニル基のような他の置換基に置き換えられたものであってもよい。
【００１７】
基板は、通常は略平板状の外形を有している。平板は縦２５ｍｍ以内×横７５ｍｍ以内の大きさであることが好ましく、縦２０ｍｍ以内×横３０ｍｍ以内の大きさであることがより好ましい。「縦」「横」という用語は、平板を長方形平板に限定する意図ではない。平板の厚さは、２０ｍｍ以内であることが好ましく、１０ｍｍ以内であることがより好ましい。これらの寸法とすることによって、顕微鏡による細胞遊走観察が行いやすくなる。
【００１８】
本実施形態の細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイスは、少なくとも２つの流路、すなわち第１の流路および第２の流路を有する。マイクロ流体デバイスの流路とは、当業者に通常理解されるように、外部から（通常はポートを通じて）マイクロリットル単位の量の液体を流し入れて満たすことができる、基板内部に形成された空間である。細胞遊走アッセイの実行中は、流路中の液は流れ続けさせることもできるし、滞留させることもできる。液体ではなくゲル状の物質で流路を満たすこともできる。第１の流路と第２の流路とは、少なくとも１つの多孔膜によって隔てられる。すなわち、第１の流路に入れられた細胞または液体は、少なくとも１つの多孔膜を透過しなければ第２の流路に到達することができない。
【００１９】
多孔膜自体は、受動的に挟み込まれるものであり、シリコーンゴムと積極的に架橋を形成してもしなくてもよいので、多孔膜の素材は本質的に限定されない。多孔膜は、典型的には合成樹脂で構成される。合成樹脂の例としては、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリロニトリル、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリアミド等、およびそれらの混合物が挙げられるが、これに限定されない。多孔膜がポリエステルまたはポリカーボネートを含む、あるいは多孔膜がポリエステルまたはポリカーボネートからなることが特に好ましい。ポリエステルは好ましくはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）である。
【００２０】
多孔膜上の孔の少なくとも一部の孔径は、遊走細胞の透過を許容できる大きさであり、多孔膜の平均孔径は好ましくは３〜１５μｍ、より好ましくは５〜１５μｍ、さらに好ましくは５〜１０μｍである。本開示において、多孔膜の個々の孔の孔径は、孔と同面積の円の直径として定義することができる。平均孔径は、多孔膜の表面を電子顕微鏡で撮影して複数（例えば少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１００個）の孔径を測定し平均することにより得ることができる。例えば、市販のセルカルチャーインサートの底部は多孔性であり、これを切り出して得た多孔膜を本実施形態の細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイスに組み込むことができる。あるいは、トラックエッチング法のような手法を用いて多孔膜を調製してもよい。
【００２１】
多孔膜の厚さは、２００μｍ以下であることが好ましい。多孔膜が過度に厚いと、生体組織モデルとしての意義が薄れる可能性がある。多孔膜の厚さは、より好ましくは１００μｍ以下であり、さらに好ましくは５０μｍ以下であり、特に好ましくは２０μｍ以下である。多孔膜の厚さは、特に決まった下限は有さないが、通常は０．５μｍ以上であり、例えば１μｍ以上あるいは５μｍ以上であり得る。
【００２２】
多孔膜は、水平面に対して好ましくは４５°〜９０°、より好ましくは７０°〜９０°の角度で基板内に組み込まれていることが好ましい。基板内の各流路が略水平面方向に展開し、多孔膜がこのように略垂直に基板に組み込まれて流路を隔てていれば、顕微鏡のレンズを垂直方向すなわち基板の厚さ方向に向けることにより、多孔膜を透過する細胞遊走をリアルタイムで観察することが可能になる（図４参照）。このような角度における膜組み込みは、後述するように、基板内で水平面に対して上記の角度で切込みを形成させ、そこに膜を挿入することによって達成することができる。
【００２３】
デバイスに複数の多孔膜が組み込まれる場合、そのそれぞれが上記の素材、平均孔径、厚さ、および／または角度を有し得、それらのパラメータはそれぞれ、多孔膜間で互いに同じであってもよいし異なっていてもよい。第１の流路に接する多孔膜が上記の素材、平均孔径、厚さ、および／または角度を有することが好ましい。
【００２４】
シリコーンゴムの基板内部にマイクロ流路パターンを形成する方法は当業者に知られている。例えば、適切な素材で作製された流路鋳型を、必要に応じて型枠と組み合わせて、そこにシリコーンのプレポリマーを流し入れ、シリコーンを鋳型の形状に合わせて硬化させることにより、表面に凹に成型されたマイクロ流路パターンを有する基板材を得ることができる。この基板材の流路側表面を、もう１つの基板材の平坦な表面と対面させて接合すれば、基質表面ではなく基質内部に流路空間を有する基板を得ることができる。この接合は、例えば約１００℃で３０分程度加熱することによって好ましく行うことができるが、接合方法はこれに限定されない。上記鋳型の素材は当業者が通常の知識に基づいて適宜選択することができるが、描画ソフトウェアと組み合わせたレーザー加工技術によりマイクロメートル規模の流路を精密に加工することに適していることからアクリル樹脂が特に好ましい。基板表面から各流路へと穴を貫通させることにより、流路内を充填することや流路内に液流を発生させることを可能にするポートを形成することができる。
【００２５】
流路同士を隔てる多孔膜を基板に組み込むことは、例えば、基板の適切な箇所に切込みを入れ、その切込みに多孔膜を挟み込んだ後に加熱して切込み面を接合させることによって達成することができる（図１ａ）。シリコーンゴムの基板に切込みを入れることは、典型的には、鋭利な刃をシリコーンゴムの基質の中途まで挿入することによって達成される。切込みとは、刃が貫通してシリコーンゴム基質が完全に２つのブロックに切断されるのではなく、刃が貫通せず切られていない部分が残ることによって刃の両側の基質ブロックがつながっていることを意味する。この目的のために使用され得る切込み手段としては、カミソリが好適であるが、これに限定されない。
【００２６】
上記切込みを入れた後に、切込み口が開かれるように基板を曲げた状態に保持しながら（図１ａ右）基板にプラズマ処理（またはコロナ放電処理）を施し、その後多孔膜を挟み込んで圧着させることにより切込み面を接合させて膜組み込み型デバイスを製造すると、液漏れを起こすデバイス個体が減少し歩留りが上昇することも本発明者は見出した。上述した加熱による切込み面の接合も、接触されたシロキサン骨格同士を架橋するという点で本質的に同じであるため、加熱の代わりにプラズマ処理により架橋を行うことによって液漏れが減少することは必ずしも予測できなかった。また、このプラズマ処理を用いる製造方法によれば、例えば足場分子被覆多孔膜のような、熱により変性または破壊されるおそれがある成分を含む多孔膜も膜組み込み型マイクロ流体デバイスに組み込むことができるようになる。その結果、流路内面の全域ではなく膜面のみに足場分子を局在させることができ、細胞遊走アッセイのためのデバイス設計の自由度が大きく向上する。
【００２７】
プラズマ処理を行うためには、切込みを入れられた基板を、その切込み口が開かれるように曲げた状態に保持する。この状態は例えば、基板の全長より短い間隔で固定された２つの突起物（例えばアクリル棒）を用意し、基板の一方の端を一方の突起に留め、基板の他方の端を他方の突起に留めることにより、切込み口側を凸面として基板を反らせて保持することによって、達成することができる。基板はこの状態のまま、プラズマ処理に付される。プラズマ処理後、切込みに多孔膜を挟み込んで切込み面を圧着させる際に、切込み内に追加のシリコーンまたはそのプレポリマーを含ませる必要はない。むしろ、切込み内にシリコーンまたはそのプレポリマーを加えないで圧着を行うことが好ましい。圧着の際に切込み内に入っているのは多孔膜のみであることが好ましい。
【００２８】
多孔膜は、切込みの断面積よりも小さい面積であることが好ましい。多孔膜は、切込みに挟み込まれた際にシリコーンゴムの基板からはみ出ない寸法であることが好ましい。多孔膜は、その外縁が流路内空間に露出しない状態でデバイスに組み込まれることが好ましい。すなわち、多孔膜の膜面のみが流路内空間に晒され、膜縁は流路内空間に晒されないような配置で、多孔膜が切込みに挟み込まれていることが好ましい。
【００２９】
本実施形態の細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイスは、使用に際して、第１の流路に細胞を含み、第２の流路に化学誘引物質を含むことにより細胞遊走アッセイシステムを構成することが好ましい（図４：この図において、「上流路」が第１の流路であり、「下流路」が第２の流路であり、「中流路」が後述する第３の流路である）。この細胞遊走アッセイシステムでは、第１の流路に入れられた細胞が多孔膜を透過する細胞遊走を試験することができる。ここで試験される細胞遊走は、第２の流路に入れられた化学誘引物質の存在に依存する細胞遊走である。ここでいう試験とは、細胞の移動を顕微鏡で観察すること（観察は撮影を含み得る）、および／または多孔膜を透過した細胞数を測定することを含み得る。細胞は、遊走性を有する細胞、または遊走性の有無を試験する対象となる細胞である。以下、これらをまとめて遊走性細胞という。遊走性細胞は、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞等であり得、哺乳類細胞であることが好ましく、ヒト細胞であることがより好ましい。哺乳類細胞またはヒト細胞は、例えば好中球およびマクロファージのような免疫系細胞、またはがん細胞であり得る。
【００３０】
複数ある流路のうちの少なくとも１つが、遊走性細胞以外の細胞をさらに含んでいてもよい。例えば、第１の流路中であらかじめ血管内皮細胞を培養しておくことにより、多孔膜が内皮細胞層で裏打ちされた状態にして、生体内環境における細胞遊走をより忠実に再現することができる（図４）。別の例では、第２の流路に、化学誘引物質を分泌する細胞を含ませることができる。
【００３１】
本実施形態で使用される細胞、特に遊走性細胞は、観察および／または測定を促進するために、標識されていてもよい。細胞を標識する手段は当業者に知られており、例えば蛍光標識、および放射性標識が挙げられる。
【００３２】
多孔膜（表面と孔内）および／または流路内表面が、例えばフィブロネクチンもしくはコラーゲンのような生体分子もしくは足場分子またはマトリゲルのような生体由来組成物でコーティングされていてもよい。コーティングは、通常は、これらの分子または組成物の溶液で流路を満たした後に余剰の液体を排出することにより達成することができる。あるいは、上述したように、あらかじめこれらの分子または組成物でコーティングされた多孔膜を基板に組み込んでもよい。
【００３３】
本実施形態における化学誘引物質の種類は、ユーザーが個々のアプリケーションに応じて決定すべきものであり、当業者に知られるいずれの化学誘引物質でもあり得る。その例としては、ホルミルペプチドおよびケモカインが挙げられる。好適なホルミルペプチドの一例はｆＭＬＰ （Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）である。
【００３４】
第１の流路と第２の流路との間に、第３の流路をさらに設けることが好ましい。この場合、第１の流路と第３の流路とが第１の多孔膜によって隔てられ、第２の流路と第３の流路とが第２の多孔膜によって隔てられ得る。第１の流路と第２の流路とは隣接していないことが好ましい。第１の流路と第２の流路とは、例えば少なくとも１ｍｍ以上、２ｍｍ以上、５ｍｍ以上、または１０ｍｍ以上離隔されていてもよい。一例として、前述のｆＭＬＰに対する好中球様細胞の遊走による膜透過は、第３の流路がない場合はごくわずかにのみ観察できたのに対し、第３の流路を設けることで膜透過を特に効果的に観察できることが見出された。その理由としては、第３の流路を設けない場合は化学誘引物質が第１の流路に短時間で拡散し濃度勾配がわずかしか形成されないが、第３の流路を設けることで、化学誘引物質が第３の流路を通って第１の流路へと拡散し、化学誘引物質の濃度勾配が安定して形成され、第１の多孔膜を多くの細胞が遊走して透過したという可能性が考えられる。従って、第３の流路には化学誘引物質が導入されないか、または導入されたとしても第２の流路より低い濃度で導入されることが好ましい。ここでいう導入とは、多孔膜を通して侵入することではなく、ポート等を通じて人為的に導入することを指す。
【００３５】
細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイスに、４つ以上の流路を設けてもよく、異なる流路は、多孔膜で隔てられていてもよいし、それ以外の隔離手段で隔てられることもあり得る。例えば、上述した第３の流路がさらに複数の流路に区切られていてもよい。
【００３６】
本開示の別の側面では、上記において説明した細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイスを用いて、第１の流路に導入された細胞が多孔膜のうちの少なくとも１つを透過する細胞遊走を試験することを含む、細胞遊走アッセイ方法が提供される。ここで、試験される細胞遊走は、第２の流路に導入された化学誘引物質の存在に依存する細胞遊走である。ここでいう試験とは、細胞の移動を顕微鏡で観察すること（観察は撮影を含み得る）、および／または多孔膜を透過した細胞数を測定することを含み得る。デバイスが多孔膜を複数有する場合、第１の流路に接する多孔膜を透過する細胞遊走を試験することが特に好ましいが、他の多孔膜を試験対象とすることもできる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例を示して本発明の実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００３８】
［細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイスの作製］
細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイスは、まず鋳型を作製し、次にその鋳型を用いて、流路を有する基板材（上基板材）を作製するとともに、流路を有さない基板材（下基板材）も作製し、それら上下の基板材同士を直接貼り合わせることにより、内部に流路を有する基板を得、その基板に多孔膜を組み込むことにより取得した。以下、各工程をより詳細に説明する。
【００３９】
鋳型の作製
Ａｄｏｂｅ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ  ＣＣソフトウェアを利用して、流路パターンと、２６ｍｍ×７６ｍｍの長方形パターンとをデザインした。デザインしたパターン通りに、厚さ１ｍｍのアクリル板（クラレックス、日東樹脂工業）を、レーザー加工機（ＨＡＪＩＭＥ、オーレーザー）で切断した。流路の形状については図１参照。
【００４０】
上記長方形に切断されたアクリル板は、流路を有さない下基板材の鋳型とした。
【００４１】
一方、ブラント針（０２−１６５、ＮＩＰＲＯ）を取り付けたシリンジ（ＳＳ−０１Ｔ、ＴＥＲＵＭＯ）にアクリル樹脂用接着剤（アクリサンデー）を充填し、この接着剤を適用することによって、上記と同じ長方形のアクリル板の上に、流路の形に切断したアクリル板を接着させた。これを循環式恒温乾燥機（ＭＯＶ−１０２Ｆ、三洋電機）の中に入れ、６５℃で３０分間ベイクした。このようにして得た合板を、流路を有する上基板材の鋳型とした。
【００４２】
基板の作製
バランストレイ（１−５２３３−０４、アズワン）にポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（ＳＩＬＰＯＴ  １８４、東レダウコーニング）の主剤および硬化剤を重量比１０：１で入れてよく混ぜ合わせ、ＰＤＭＳプレポリマーとした。これを真空デシケーター（ＶＳ、アズワン）に入れ、気泡がなくなるまで脱気した。
【００４３】
脱気中に、ＰＤＭＳプレポリマーを流し込むための枠組みを作製した。アクリル板の上にベンコット不織布（スーパーＣＮ、小津産業）を敷き、その上に、上述した鋳型を置いた。上基板材の鋳型には厚さ３ｍｍの型枠をのせ、下基板材の鋳型には厚さ４ｍｍの型枠をのせた。アクリル板、ベンコット、鋳型、および型枠の重なりをクリップで６ヶ所において固定し、枠組みを完成させた。
【００４４】
次に、脱気終了後のＰＤＭＳプレポリマーを、上基板材用の枠組みについては約４．８ｇ、下基板材用の枠組みについては約６．４ｇ、型枠内を埋めるように流し込んだ。これを真空デシケーターの中に入れ、気泡がなくなるまで再び脱気した。脱気終了後、循環式恒温乾燥機の中に入れ、６５℃で１時間ベイクしてＰＤＭＳ基板材を硬化させた。ベイク終了後、ピンセットを用いて型枠から基板材を取り外し、スライドガラス（Ｓ１２２６、ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）上に置いた。その後、カッターを用いて、１８ｍｍ×２３ｍｍの寸法になるようにそれぞれの基板材をカットした。さらに、φ１．５ｍｍの生検トレパン（ＢＰＰ−１５Ｆ、カイインダストリーズ）を用いて、流路を有する上基板材の表面から流路に向けて穴を貫通させて、６ヶ所ポートを形成した（ポートの位置については図１参照）。
【００４５】
上述したように同じ１８ｍｍ×２３ｍｍの寸法に揃えられた上下の基板材を、上基板材の流路側が下基板材の平坦な表面に対面するようにして互いに直接貼り合わせて、卓上型送風乾燥機（ＭＤ−１００、ヨネザワ）の中に入れ、１００℃で３０分間ベイクすることによって基板材を接合し、内部に流路を有するＰＤＭＳ基板を得た。
【００４６】
多孔膜の組み込み
メスを用いて、セルカルチャーインサート（３５３０９３、Ｆａｌｃｏｎ）の底部から孔径８．０μｍのＰＥＴ多孔膜を切り出し、ハサミで３ｍｍ×７ｍｍの大きさにカットした。カミソリを用いて、上記ＰＤＭＳ基板の２ヶ所に、深さ約５ｍｍの切込みを入れた（切込みの位置については図１ａ参照）。その後、切り込み口を押し開いて、上記多孔膜を挟み込み、切り込み口を再閉鎖した。このようにして多孔膜が組み込まれた基板を、卓上型送風乾燥機中で１００℃で１時間ベイクして切り込み面同士を接合させ、デバイスを完成させた。
【００４７】
この例におけるデバイスは、上流路と、第１の多孔膜によって上流路から隔てられた中流路と、第２の多孔膜によって中流路から隔てられた下流路とを有するものである。図１ａにおいて、本実施形態の細胞遊走アッセイ用マイクロ流体デバイスの製作過程のうち、ＰＤＭＳ基板に切り込みを入れる工程、および切り込みに多孔膜を挟み込む工程の概略を示す。図１ｂは、完成したデバイスを上から撮影した写真である。図１ｂの写真中、上側の台形部分が上流路であり、中央の、横に長い部分が中流路であり、下側の台形部分が下流路である。これらの流路は透明なシリコーンゴム製基板材表面を通して見えている。丸く見えている６つの構造がポートである。
【００４８】
［ＨＬ−６０細胞の培養］
継代
ＨＬ−６０細胞の培養は、３７℃、５％ＣＯ２の条件で行った。培地として、ＲＰＭＩ１６４０（３０２６４−５６、ナカライテスク）５００ｍＬにウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ、５６℃・３０分間の処理で非働化したもの）１００ｍＬ、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム（ナカライテスク）５ｍＬ、ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液（ナカライテスク）５ｍＬ、および２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）４μＬを添加したものを用いた。
【００４９】
５日程度培養したフラスコ内の細胞を、倒立顕微鏡（ＣＫＸ５３、ＯＬＹＭＰＵＳ）で位相差観察し、増殖を確認した。フラスコ内の細胞懸濁液をピペットで１５ｍＬ遠沈管（１３３２−０１５Ｓ、ＷＡＴＳＯＮ）に移し、遠心分離機（２８００、久保田商事）で遠心分離して細胞を沈殿させた（２３℃、１２００ｒｐｍ、５分間）。遠心分離後、上清をアスピレーターで吸引した。遠沈管の底をタッピングして細胞をほぐした後、培地を２ｍＬ程度加え、ピペッティングで懸濁させた。この懸濁液１０μＬをマイクロチューブに取り、トリパンブルー染色液（２０７−１７０８１、和光純薬工業）３０μＬを加えて混合した。その後、フックスローゼンタール血球計算盤を用いて細胞数を測定した。測定結果から細胞濃度を算出し、培地を加えて５．０×１０５細胞／ｍＬの濃度に調整した。新しいフラスコに、濃度調整した細胞懸濁液０．５ｍＬおよび培地４．５ｍＬを加えることにより５．０×１０４細胞／ｍＬにさらに希釈し、インキュベーターに入れて培養を再開した。
【００５０】
分化誘導
ＨＬ−６０細胞にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えることによって、化学誘引物質ｆＭＬＰに対する遊走性を有する好中球様細胞への分化を誘導することは、A. Millius and O. Weiner, Methods Mol. Biol., 571, 167 (2009)に記載されており、本実施例においてもその記載に従った。具体的には、まず、継代後５日間程度培養したフラスコ内の細胞懸濁液を１５ｍＬ遠沈管に全て移し、遠心分離機で遠心分離して細胞を沈殿させた（２３℃、１２００ｒｐｍ、５分間）。一方、別の１５ｍＬ遠沈管に、培地３９３４μＬおよびＤＭＳＯ（０４１−２９３５１、和光純薬工業）６６μＬを入れてよく混合して１．３％ＤＭＳＯ溶液を調製しておいた。上記遠心分離後、上清をアスピレーターで吸引し、遠沈管の底をタッピングして細胞をほぐした後、培地１ｍＬを加えてピペッティングで懸濁させた。この細胞懸濁液および４ｍＬの上記１．３％ＤＭＳＯ溶液を合わせて元のフラスコに移し、インキュベーターに入れ、培養を行った。
【００５１】
［細胞遊走試験］
染色液
冷凍保存状態から取り出して室温に３０分程度放置しておいたＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ  ＣＭＦＤＡ（５−クロロメチルフルオレセインジアセテート）（Ｃ７０２５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ＤＭＳＯを１０μＬ加えて溶解させた。容器内の溶液全量および無血清培地１０．７８９ｍＬを１５ｍＬ遠沈管に入れてボルテックスして混合し、染色液を得た。
【００５２】
分化細胞懸濁液
上記において分化誘導のためにＤＭＳＯを加えてから５〜６日経過したフラスコ内の細胞懸濁液を、１５ｍＬ遠沈管に全て移し、遠心分離機で遠心分離して細胞を沈殿させた（２３℃、１２００ｒｐｍ、５分間）。上清をアスピレーターで吸引し、培地を１  ｍＬ程度加えてピペッティングして再懸濁させた。この懸濁液１０μＬをマイクロチューブに取り、トリパンブルー染色液３０μＬと混合した。フックスローゼンタール血球計算盤を用いて細胞数を測定した。測定結果から細胞濃度を算出し、培地を加えて５．０×１０５細胞／ｍＬの濃度に調整した。
【００５３】
ｆＭＬＰ溶液
まず、ｆＭＬＰ （Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）（０６３−０２８１１、和光純薬工業）４．４ｍｇを精密天秤で測り取った。これを１５ｍＬ遠沈管に入れ、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、１０ｍＭストック溶液とした。これをマイクロチューブに５０μＬずつ分注し、アルミホイルで遮光して冷凍保存した。
【００５４】
上記ｆＭＬＰストック溶液１０μＬおよび培地９９０μＬを混合し、１００μＭのｆＭＬＰワーキング溶液とした。この溶液はアルミホイルで遮光して冷蔵保存した。ワーキング溶液は調製から１ヶ月以内のものを使用するようにした。このワーキング溶液を、実験に応じた濃度に培地で希釈して使用した。
【００５５】
フィブロネクチン溶液
冷凍保存状態から取り出したフィブロネクチン（３５４００８、コスモバイオ）を室温で１時間程度放置した。そこに滅菌水を１ｍＬ加え、３０分間放置して溶解させた（１ｍｇ／ｍＬ）。これをマイクロチューブに３０μＬずつ分注し、冷凍保存した。
【００５６】
１×ＰＢＳ
ＰＢＳタブレット（Ｔ９００、ＴａＫａＲａ）５錠および純水５００ｍＬをびんの中に入れ、オートクレーブで溶解・滅菌した。
【００５７】
細胞遊走試験の実施
上記で作製したデバイスを、試験前日にクリーンベンチ内に入れ、一晩ＵＶ殺菌した。ＵＶ殺菌後のデバイスを真空デシケーターの中に入れ、１時間程度脱気した。冷凍保存してあったフィブロネクチン溶液を冷蔵庫に入れ、３０分間程度放置して解凍した。１  ｍｇ／ｍＬフィブロネクチン溶液３０μＬに１×ＰＢＳを２７０μＬ加えて、１００μｇ／ｍＬフィブロネクチン溶液を調製した。脱気したデバイスの流路全てにこのフィブロネクチン溶液を導入し、３０分間インキュベートした。インキュベート後、流路から溶液を除去した。この過程で、多孔膜の表面および孔ならびに流路内表面がフィブロネクチンでコーティングされた。
【００５８】
染色液中に３０分間インキュベートすることにより蛍光染色した５．０×１０５細胞／ｍＬの濃度の分化細胞懸濁液を、デバイスの上流路に導入した。その際、中流路および下流路のポートはメンディングテープで塞いでおいた。次に、今度は上流路と中流路のポートをテープで塞ぎ、下流路にｆＭＬＰ溶液を導入した。最後に、上流路と下流路のポートをテープで塞いで、中流路に培地を導入した。全ての流路にそれぞれ液を導入した後、厚さ２ｍｍのＰＤＭＳ基板で全てのポートを覆うように蓋をした。培養チャンバー（Ｃ−０７０Ａ、ブラスト）内にデバイスを置き、３時間に渡り１５分間おきに蛍光顕微鏡観察を行った。
【００５９】
図２は、上記のように培養を開始してから０時間後（上）および３時間後（下）の、上流路と中流路の境界領域の蛍光顕微鏡画像を示す。下流路にｆＭＬＰを導入しなかった場合（０ｎＭ）には、培養から３時間経過後も、中流路側に蛍光シグナルすなわち好中球様細胞の存在は実質的に検出されていない（図２左下）。つまり、化学誘引物質の非存在下では、多孔膜を通過する好中球様細胞の遊走は起こらなかった。それに対し、下流路に１００ｎＭのｆＭＬＰを導入した場合には、培養から３時間経過後に、多数の蛍光標識好中球様細胞が中流路側に検出された（図２右下）。この結果は、化学誘引物質によって好中球が誘引されて血管壁の間隙を透過する細胞遊走現象を、このデバイスが的確に再現できたことを示す。
【００６０】
図３ａは、図２の実験において中流路に検出された細胞数（遊走細胞数）を測定した結果を示している。図３ｂは、異なる濃度のｆＭＬＰを下流路に導入した場合の、３時間後の遊走細胞数を比較した結果を示している。図３ｃは、下流路における１００ｎＭのｆＭＬＰに加えて１００ｎＭまたは１μＭのＷｏｒｔｍａｎｎｉｎを全ての流路に導入した場合の遊走細胞数を測定した結果を示している。Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎは、細胞遊走に関与する分子であるＰＩ３キナーゼの阻害剤である。Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎが用量依存的に細胞遊走を抑制していることが見て取れる。この結果は、細胞遊走研究における本デバイスの有用性をさらに実証するものである。
【００６１】
図３ｂにおいて、ｆＭＬＰの濃度を１０００ｎＭまで高くすると遊走細胞数が逆に減少していく傾向が見られた。系全体として化学誘引物質の濃度を高くし過ぎると、細胞が濃度勾配を効果的に感知しにくくなる可能性が考えられる。
【００６２】
中流路を設けずに、上流路と下流路とが隣り合わせで一枚の多孔膜で隔てられているというデバイス構成にし、上流路に細胞を入れ下流路にｆＭＬＰを入れた場合にも、細胞遊走を観察することができたが、中流路を設けた場合ほどは効率的な細胞遊走が見られなかった（データは示していない）。これは中流路を設けない場合は化学誘引物質が下流路から上流路に短時間で拡散し濃度勾配がわずかしか形成されないが、中流路を設けることで、化学誘引物質が下流路から中流路を通って上流路へと拡散し、特に上流路と中流路を隔てる多孔膜の近傍において、化学誘引物質の濃度勾配が安定して形成されたためと考えられる。このような濃度勾配は、セルカルチャーインサートのような従来のアッセイでは形成できないため、本実施形態の方が、化学誘引物質の安定した濃度勾配下において細胞遊走をより精密かつ正確に評価できていると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の実施形態は、医学・生物学・薬学の研究用デバイス、医学的診断、および医薬開発の分野などで利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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