(57)【要約】【課題】反芻動物におけるメタンガス生成を抑制することができる、反芻動物用飼料へ添加するための組成物及びその製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物とシリカゲルとを含む反芻動物用メタン生成抑制組成物を用いることにより、反芻動物からのメタン生成が抑制されることを見いだした。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物と、シリカゲルとを含む、反芻動物用メタン生成抑制組成物。
【請求項２】
脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物が、（ａ）油脂、（ｂ）水酸化カルシウム、（ｃ）水、及び（ｄ）リパーゼの混合物のケン化物である、請求項１に記載の反芻動物用メタン生成抑制組成物。
【請求項３】
前記混合物中の、（ｂ）水酸化カルシウムのモル数に対する（ａ）油脂由来の総脂肪酸モル数の比が１以上である、請求項２記載の反芻動物用メタン生成抑制組成物。
【請求項４】
前記混合物が、（ｅ）抗酸化性を有するカラメルをさらに含む、請求項２または３記載の反芻動物用メタン生成抑制組成物。
【請求項５】
（ａ）油脂中のトリグリセリドが、不飽和脂肪酸を主要な構成脂肪酸として含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の反芻動物用メタン生成抑制組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の反芻動物用メタン生成抑制組成物を含む反芻動物用飼料組成物。
【請求項７】
（ａ）油脂、
（ｂ）水酸化カルシウム、
（ｃ）水、及び
（ｄ）リパーゼ、
を含む混合物を反応させて、脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物を生成する工程、及び
前記脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物に、シリカゲルを添加する工程、
を含む、反芻動物用メタン生成抑制組成物の製造方法。
【請求項８】
前記混合物中の、（ｂ）水酸化カルシウムのモル数に対する（ａ）油脂由来の総脂肪酸モル数の比が１以上である、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
前記混合物が、（ｅ）抗酸化性を有するカラメルをさらに含む、請求項７または８記載の製造方法。
【請求項１０】
（ａ）油脂中のトリグリセリドが、不飽和脂肪酸を主要な構成脂肪酸として含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は反芻動物から発生するメタン生成を抑制するための、反芻動物用メタン生成抑制組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
牛などの反芻動物の第一胃（ルーメン）には多数の微生物が生息しており、反芻動物はこれらの微生物によって摂取した飼料を分解し、エネルギー源として利用する一方で、二酸化炭素やメタン（ガス）を主に呼気などから体外に排出する。
呼気から発生する二酸化炭素やメタンガスは、地球の温暖化効果に大きな影響を有すると言われており、特に、温室効果が二酸化炭素に比較し、２５倍高いとされるメタンガスの排出を抑制することは環境問題の重要な課題である。地球上の反芻動物から排出されるメタンガス量は、メタンガスの全排出量に対して１５〜２０％あるいは約４０％を占めるという報告もあり、反芻動物からのメタンガスの排出を抑制することは環境保護の観点から重要な課題である。
従来、反芻動物のメタンガス排出抑制の方法として、抗生物質と特定の化合物を飼料添加物として用いる方法（特許文献１）、ユーカリ油等の成分のシクロデキストリン包摂化合物を飼料に添加する方法（特許文献２）、ネオヘスペリジンなどのかんきつ類から抽出されるフラバノングリコシドを飼料に添加する方法（特許文献３）などが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／１６０１９１
【特許文献２】特開２００２-２８１９１２号
【特許文献３】ＷＯ２０１３／１５６５７４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、反芻動物におけるメタンガス生成を抑制することができる、反芻動物用飼料へ添加するための組成物及びその製造方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、飼料の消化率あるいは飼料分解による脂肪酸量を抑制することなく、メタンガス生成を抑制することができる、反芻動物用飼料へ添加するための組成物及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物と、賦形剤としてシリカゲルとを含む組成物を用いることにより、反芻動物からのメタン生成が抑制されることを見いだし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下を提供する。
＜１＞  脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物と、シリカゲルとを含む、反芻動物用メタン生成抑制組成物。
＜２＞  脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物が、（ａ）油脂、（ｂ）水酸化カルシウム、（ｃ）水、及び（ｄ）リパーゼの混合物のケン化物である、＜１＞に記載の反芻動物用メタン生成抑制組成物。
＜３＞  前記混合物中の、（ｂ）水酸化カルシウムのモル数に対する（ａ）油脂由来の総脂肪酸モル数の比が１以上である、＜２＞記載の反芻動物用メタン生成抑制組成物。
＜４＞  前記混合物が、（ｅ）抗酸化性を有するカラメルをさらに含む、＜２＞または＜３＞記載の反芻動物用メタン生成抑制組成物。
＜５＞  （ａ）油脂中のトリグリセリドが、不飽和脂肪酸を主要な構成脂肪酸として含む、＜２＞〜＜４＞のいずれか一に記載の反芻動物用メタン生成抑制組成物。
＜６＞  ＜１＞〜＜５＞のいずれか一に記載の反芻動物用メタン生成抑制組成物を含む反芻動物用飼料組成物。
＜７＞（ａ）油脂、
（ｂ）水酸化カルシウム、
（ｃ）水、及び
（ｄ）リパーゼ、
を含む混合物を反応させて、脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物を生成する工程、及び
前記脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物に、シリカゲルを添加する工程、
を含む、反芻動物用メタン生成抑制組成物の製造方法。
＜８＞  前記混合物中の、（ｂ）水酸化カルシウムのモル数に対する（ａ）油脂由来の総脂肪酸モル数の比が１以上である、＜７＞記載の製造方法。
＜９＞  前記混合物が、（ｅ）抗酸化性を有するカラメルをさらに含む、＜７＞または＜８＞記載の製造方法。
＜１０＞  （ａ）油脂中のトリグリセリドが、不飽和脂肪酸を主要な構成脂肪酸として含む、＜７＞〜＜９＞のいずれか一に記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の反芻動物用メタン生成抑制組成物を用いることにより、反芻動物の消化活動に伴うメタン生成を抑制することができる。さらに、本発明の反芻動物用メタン生成抑制組成物は、粒状であるため反芻動物用飼料にエネルギー源として容易に添加することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施例１において各試料を添加したときのメタン生成量を示す。
【図２】実施例１において各試料を添加したときの二酸化炭素生成量を示す。
【図３】実施例２において各試料を添加したときのメタン生成量の経時変化を示す。
【図４】実施例２において各試料を添加したときの二酸化炭素生成量の経時変化を示す。
【図５】実施例３において各試料を添加したときのメタン生成量を示す。
【図６】実施例３において各試料を添加したときの二酸化炭素生成量を示す。
【図７】実施例４及び５において各試料を添加したときのメタン生成量を示す。
【図８】実施例４及び５において各試料を添加したときの二酸化炭素生成量を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の第一の態様の反芻動物用メタン生成抑制組成物は、脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物と、シリカゲルを賦形剤として含む。
【０００９】
本明細書において、「反芻動物用メタン生成抑制組成物」とは、反芻動物の飼料に混合して間接的に投与するか、あるいは飼料に混合せず反芻動物に直接投与することにより、反芻動物の飼料の消化過程におけるメタン生成を抑制するための組成物である。反芻動物は、限定されるものではないが、例えばウシ、ヤギ、ヒツジなどの反芻動物である。
本発明の「反芻動物用メタン生成抑制組成物」を添加して製造される反芻動物用飼料の原料や他の添加剤は一般に使用されているものであれば特に制限はない。
【００１０】
本明細書において「脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物」は、トリグリセリドを主成分とする油脂から、水酸化カルシウム等のカルシウムを少なくとも含むアルカリ溶液を用いたケン化反応により得られる、脂肪酸カルシウムを主成分として含むケン化物を意味する。前記脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物には、トリグリセリド、モノまたはジグリセリド、脂肪酸、グリセリン等の原料油脂由来の残存物が含まれていてもよい。
「脂肪酸カルシウムを主成分として含む」とは、ケン化物中の全成分の中で脂肪酸カルシウムを最も多く（主要な成分として）含むことを意味する。
また、本明細書において「油脂」は、トリグリセリドを主成分として含むものを意味する。「トリグリセリドを主成分として含む」とは、油脂中の成分の中で脂肪酸のトリグリセリドを最も多く（主要な成分として）含むことを意味する。
脂肪酸カルシウムを主成分として含む油脂のケン化物は、さらに、後述する、ケン化反応を促進するためのリパーゼ、抗酸化性を有するカラメルなどを含んでいてもよい。
【００１１】
本明細書において、「主成分とする」、「主成分として含む」なる記載、あるいは「主たる構成脂肪酸として含む」等のうち「主たる構成」なる記載は、全構成成分の中で最も多く含む成分であることを意味する。さらに全構成成分の中で５０質量％以上であることが好ましい。
【００１２】
本発明において、脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物は、（ａ）油脂、（ｂ）水酸化カルシウム、（ｃ）水、及び（ｄ）リパーゼの混合物のケン化物であることが好ましい。
前記脂肪酸カルシウムを主成分として含むケン化物を得るための混合物は、（ｅ）抗酸化性を有するカラメルをさらに含んでいてもよい。
【００１３】
本明細書において（ａ）油脂は特に制限されず様々なものを使用することができる。例えば、原料油脂として、動物、植物、または他の起源の油脂を用いてもよい。例えば、ラード、獣脂、アマニ油、キャノーラ油、ヒマワリ油、ベニバナ油、綿実油、キャノーラ油、オリーブ油、コーン油などの植物油が挙げられる。
【００１４】
メタン生成をより低減することから、本発明において（ａ）油脂中のトリグリセリドは好ましくは、「不飽和脂肪酸を主要な構成脂肪酸として含むトリグリセリド」である。不飽和脂肪酸を主要な構成脂肪酸として含むトリグリセリドとは、少なくとも一種の不飽和脂肪酸を主たる構成脂肪酸として含むトリグリセリドを意味する。
不飽和脂肪酸を含むトリグリセリドの質量に対して、不飽和脂肪酸量は、好ましくは５０質量％以上、より好ましくは７０質量％以上、さらに好ましくは７５質量％以上であり、よりさらに好ましくは８０質量％以上である。
【００１５】
少なくとも一種の不飽和脂肪酸は、炭素数１６以上、更に好ましくは炭素数１８以上の長鎖不飽和脂肪酸であることが好ましい。また、不飽和結合の数は２以上であることが好ましい。より好ましくは、不飽和結合の数は３以上である。最も好ましくはｎ−３系脂肪酸である。具体的なｎ−３系脂肪酸の例としては、α-リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等が挙げられる。構成脂肪酸として上述した不飽和脂肪酸を含む油脂としては、アマニ油、エゴマ油、ナタネ油、大豆油、魚油、チアシード油、グリーンナッツ油等あるいはこれらの混合物、具体的には例えば、ナタネ油とアマニ油の混合油、パーム油硬質部、ナタネ油及び大豆油の混合油等が挙げられる。
また、原料油脂の脂肪酸組成中のｎ−６／ｎ−３質量比が３０以下、好ましくは１０以下、更に好ましくは５以下、１以下のものが最も好ましい。
【００１６】
例えば、原料油脂は、不飽和脂肪酸を２０〜９５質量％含むもの、好ましくは５０〜９５質量％含むものを用いることができる。また好ましい例として、ｎ−３系脂肪酸を好ましくは１〜７０質量％、より好ましくは５〜７０質量％、更に好ましくは１０〜７０質量％、最も好ましくは５０〜７０質量％含むものが挙げられる。
原料油脂は更に飽和脂肪酸を含んでいてもよい。飽和脂肪酸量は特に限定されないが、５〜８０質量％、好ましくは５〜５０質量％の範囲程度が好ましい。
【００１７】
（ａ）油脂は、脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物を製造するための原料混合物の合計質量に対し、６５〜８５質量％であることが好ましく、７０〜８０質量％であることがさらに好ましい。
【００１８】
（ｂ）水酸化カルシウムはいずれのものを用いてもよい。また酸化カルシウムは水の存在により水酸化カルシウムになるため、本発明において「水酸化カルシウム」（Ｃａ（ＯＨ）2）（消石灰）の代わりに「酸化カルシウム」（生石灰）を用いることもできる。
脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物製造における、前記水酸化カルシウムのモル数に対する前記トリグリセリド由来の総脂肪酸モル数の比は０．８以上であることが好ましい。より好ましくは、１．８以上であり、さらに好ましくは２．５以上であり、よりさらに好ましくは２．７以上である。上限は特に制限が無いが、ケン化されていない油脂によるルーメン微生物の活性を下げないとの観点から、４以下であることが好ましい。
【００１９】
モル比の計算において使用する油脂の分子量は、油脂中の脂肪酸組成の分析値を基に、各脂肪酸分子量とそれぞれの質量％を掛けたものを平均脂肪酸分子量として計算し、平均脂肪酸分子量を有する脂肪酸がトリグリセリドになったと仮定して分子量を算出する。例えば、パルミチン酸（Ｃ１６：０）とステアリン酸（Ｃ１８：０）が５０質量％ずつ脂肪酸として含まれる油脂の平均脂肪酸分子量は、２７０（２５６×０．５＋２８４×０．５）であるから、分子量は、そのトリグリセリドとして計算して、８４８（２７０×３−９２−（１８×３））である。
【００２０】
（ａ）〜（ｃ）成分の合計質量あるいは（ａ）〜（ｃ）及び（ｅ）成分の合計質量に対し、好ましくは３〜２０質量％の（ｂ）水酸化カルシウムを添加する。より好ましくは４〜１５質量％であり、更に好ましくは５〜１０質量％である。
「水酸化カルシウム」の代わりに「酸化カルシウム」を加える場合には、分子量から「水酸化カルシウム」（分子量７４）に換算して上記量となるように「酸化カルシウム」（分子量５６）を加える。
【００２１】
本発明において、「脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物」を製造するにあたり、（ｃ）水を添加してもよい。（ｃ）水（添加水）は、反応溶媒としての役割も果たす。また、酸化カルシウムを使用した場合には、酸化カルシウムと反応して水酸化カルシウムを提供するものである。「水」は蒸留水、脱イオン水、水道水など適宜使用することができる。
（ａ）〜（ｃ）成分の合計質量あるいは（ａ）〜（ｃ）及び（ｅ）成分の合計質量に対し、１５質量％以下の水を添加することが好ましく、１２質量％以下の水を添加することがより好ましく、１１質量％以下であることがさらに好ましい。また、水の量の下限値は１質量％以上であることが好ましく、３質量％以上であることがより好ましく、５質量％以上であることがさらに好ましく、６質量％以上であることがさらにより好ましい。
【００２２】
本発明において（ｃ）水と、（ａ）油脂の質量比は、脂肪酸の二価金属塩への反応効率、得られた組成物の成形性その他の性状に影響を及ぼすことがある。特に型枠に入れる際に、油とカラメルを含む水相部が分離しやすいため、（ａ）油脂に対する（ｃ）「水」の質量比は、０．０５以上であることが好ましく、０．０５〜０．５０程度であることが更に好ましく、０．０７〜０．３０がより好ましく、０．０８〜０．２０が更になお好ましく、０．１０〜０．１８が更により好ましい。
【００２３】
本発明において、「脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物」を製造するにあたり、（ｄ）リパーゼを添加してもよい。本明細書において「リパーゼ」とは、動物、植物、微生物起源、何れのリパーゼを使用することができ、限定されないが、アルカリ性において油脂分解力の強く、耐熱性の高いものが好ましい。微生物起源のリパーゼとして、天野エンザイム  リパーゼＡＹ「アマノ」３０ＳＤ、リパーゼＲ「アマノ」、リパーゼＡ「アマノ」６、リパーゼＭＥＲ「アマノ」、リパーゼＤＦ「アマノ」１５、リパーゼＧ「アマノ」５０、名糖産業  リパーゼＭＹ、リパーゼＯＦ、リパーゼＰＬ，リパーゼＰＬＣ、リパーゼＱＬＭ，リパーゼＱＬＣ、ノボザイム社  リポザイムＴＬ  １００Ｌ、リポザイムＣＡＬＢ Ｌ、Ｐａｌａｔａｓｅ２０００Ｌなどが挙げられ、リパーゼの添加量は油脂分解力により添加量を調整する事が可能である。
【００２４】
本発明において、「脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物」を製造するにあたり、（ｅ）抗酸化性を有するカラメルを添加してもよい。「抗酸化性を有するカラメル」とは、糖類を加熱処理することにより得られる抗酸化性を有するカラメルであり、特開平８−３１２２２４号に記載されるカラメルを代表的なものとして挙げることができる。
（ｅ）抗酸化性を有するカラメルを添加する場合には、上述の（ａ）〜（ｃ）及び（ｅ）成分の合計質量に対し、１〜１０質量％であることが好ましく、２〜７質量％であることがさらに好ましい。
【００２５】
本明細書において、カラメルの抗酸化性は、カラメルと１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）との反応性により評価したものをいう。すなわち、適量のカラメルをエタノール４ｍｌに溶解し、これに０．５ｍＭ ＤＰＰＨエタノール溶液１ｍｌを加え、３７℃で３０分間保持した後、５１７ｎｍの吸光度を測定し、カラメル１ｍｇ当たりの吸光度の減少量を求めた。また、同様にＴｒｏｒｏｘを溶液のＤＰＰＨ抗酸化性を測定し、カラメル１ｍｇ当たりのＴｒｏｒｏｘ当量を求めた。脂肪酸カルシウムを含む組成物中の不飽和脂肪酸の酸化に対する安定性の観点から、３０００ｎｍｏｌＴｒｏｒｏｘ当量／ｍｌ以上であることが好ましく、４０００ｎｍｏｌＴｒｏｒｏｘ当量／ｍｌ以上であることがより好ましく、５０００ｎｍｏｌＴｒｏｒｏｘ当量／ｍｌ以上であることがさらに好ましい。３０００ｎｍｏｌＴｏｒｏｘ当量未満の抗酸化性の低いカラメルでは、脂肪酸カルシウムを含む組成物へ多く添加する事が必要となり、粉状成型可能な脂肪酸カルシウムを製造する事が困難となるからである。
【００２６】
「抗酸化性を有するカラメル」は、グルコースの高濃度水溶液を、塩基性化合物の存在下、好ましくは１００℃以上、より好ましくは１２０〜１５０℃で加熱することにより得られる。加熱時間は、好ましくは１〜１０時間、より好ましくは２〜８時間程度であることが好ましい。
得られたカラメルのｐＨは、５以下であることが好ましい。
【００２７】
塩基性化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等のアルカリ金属炭酸水素塩、酢酸やクエン酸等の有機酸のアルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）またはアンモニウム塩、及び水酸化アンモニウムが挙げられる。
【００２８】
グルコースの高濃度水溶液の加熱処理前のｐＨは、好ましくは７以上、さらに好ましくは８以上、最も好ましくは９以上である。反応温度（加熱処理温度）が１２０℃より低いと反応が充分に進行しない。また１５０℃より高いと反応系が固化・炭化するおそれが大きくなるだけでなく、得られたカラメルの抗酸化性が低くなるので好ましくない。好ましい反応温度は１２５〜１３５℃であり、最も好ましい反応温度は１３０℃前後である。また、塩基性化合物の量が１質量部より少ないと反応が充分に進行しない。すなわち、抗酸化性を有するカラメルが得られない。また１０質量部より多いと、反応が激しく進行し、気泡が多量にしかも短時間に発生し、反応容器からふきこぼれる恐れがあるなど危険性が生じる。反応時間が１時間未満では反応が充分に進行しない場合がある。また反応時間が長くなるにつれて、反応が進行して徐々に粘性が増加する傾向にある。
【００２９】
本明細書において「賦形剤」は、前記脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物を粒状とするために添加されるものである。本発明は賦形剤としてシリカゲルを含む。シリカゲルにさらに他の賦形剤、例えば、珪藻土、バーミキュライト、ベントナイト、ゼオライト、タルク、カオリン、ケイ酸、ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ素、天然ケイ酸アルミニウム等をシリカゲルの効果を妨げない程度において添加してもよい。
本発明の第一の態様において、賦形剤はシリカゲルである。シリカゲルは、好ましくは０．１〜２００μｍ、さらに好ましくは１〜２５μｍの平均粒径を有していてもよい。本明細書において、「平均粒径」は、レーザー分析法（条件  ISO 13320に準拠）により測定した粒子径を意味する。
シリカゲルの平均粒径は、より好ましくは１〜２０μｍ、さらに好ましくは０．５〜１０μｍ、さらにより好ましくは１〜１０μｍまたは１０〜１８μｍである。
【００３０】
本発明の賦形剤として含まれるシリカゲルは、天産品、合成品あるいは結晶性、非結晶性のシリカを使用する事が出来、合成非晶質シリカであるCarplex（カープレックス）（エボニック社）やSipernat（エボニック社）等の商品名で販売されているものなどを用いることができる。
【００３１】
本発明の第一の態様の組成物において、シリカゲルは、ケン化物質量（（ａ）〜（ｃ）成分の合計質量あるいは（ａ）〜（ｃ）及び（ｅ）成分の合計質量）(１００質量部)に対して、５〜１００質量部程度用いることが好ましく、さらに好ましくは５〜５０質量部程度用いてもよい。
本発明において、本発明の第一の態様の組成物を、飼料組成物に混合して用いる場合には、適切な量を添加すればよい。例えば、飼料組成物中の基質（例えば大麦）の質量に対して、油脂ケン化物中の油脂相当量が、好ましくは１〜１０質量％、より好ましくは１〜５質量％程度となるように加えてもよい。
【００３２】
本発明の第二の態様は、上述の反芻動物用メタン生成抑制組成物を含む反芻動物用飼料組成物である。
飼料の組成は特に限定されないが、例えば、植物の茎葉を乾燥させた乾草や稲わら、さらに、乳酸発酵させて貯蔵性を高めたサイレージなどの粗飼料や、大麦、とうもろこしやこうりゃん等の穀類や大豆の搾油残渣の油粕、フスマや米ヌカなどを配合し、エネルギーや蛋白質含有量を高めた飼料である濃厚飼料を含む。粗飼料と濃厚飼料を適宜混合してｍのであってもよい。
【００３３】
本発明の第三の態様は、
（ａ）油脂、
（ｂ）水酸化カルシウム、
（ｃ）水、及び
（ｄ）リパーゼ、
を含む混合物を反応させて脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物を生成する工程、及び
前記脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物にシリカゲル添加する工程、
を含む、反芻動物用メタン生成抑制組成物の製造方法、
である。
【００３４】
上記方法において、（ａ）油脂、（ｂ）水酸化カルシウム、（ｃ）水、（ｄ）リパーゼ、「賦形剤」、「脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物」及び「反芻動物用メタン生成抑制組成物」の定義や好ましい態様は上で述べたとおりである。
前記（ａ）〜（ｄ）を含む混合物は、（ｅ）抗酸化性を有するカラメルをさらに含んでいてもよく、（ｅ）抗酸化性を有するカラメルの定義及び好ましい態様も上で述べたとおりである。
【００３５】
上記方法は、（ａ）油脂、（ｂ）水酸化カルシウム、（ｃ）水、及び（ｄ）リパーゼ、好ましくはさらに（ｅ）抗酸化性を有するカラメルを含む混合物を、適切な温度、好ましくは６０℃以下の温度、で反応させて脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物を生成する工程を有する。
前記油脂のケン化物に、シリカゲルを添加することにより、本発明の反芻動物用メタン生成抑制組成物を製造することができる。
本発明の方法は、以下に限定されるものではないが、より詳細には、例えば、（ａ）油脂、及び（ｂ）水酸化カルシウムを混合し、前記混合物に、（ｃ）水、及び（ｄ）リパーゼ、さらに任意に（ｅ）抗酸化性を有するカラメルを加えて、適切な温度で反応を行い、その後シリカゲルを添加する。
【実施例】
【００３６】
［製造例１］
２５質量部の水、８０質量部の糖類（グルコース）、５質量部の塩基性化合物（クエン酸ナトリウム）を混合し、１３０℃で３時間反応させ、最後に水４０質量部を加えカラメル１を１２０質量部得た。
【００３７】
［実施例１］
あまに種子から抽出したオイルを脱酸、脱色して精製したアマニ油７８質量部に、消石灰（水酸化カルシウム）７質量部を加え、混合槽内で混合撹拌した。
前記混合物に、抗酸化性を有するカラメル（製造例１で製造したカラメル１）５質量部、水１０質量部、リパーゼ（アマノＡＫ）０．０１５質量部を混合し、液温を４０℃に加温し、さらに３０分間撹拌し、さらにシリカゲル２７．３質量部を添加して、均一に混合し、試料１を製造した。
【００３８】
［脂肪酸カルシウムを主成分として含む、油脂のケン化物の製造参考例１〜３及び比較例１］
各成分の量を表１記載の配合量に変更し、さらにシリカゲルを加えなかったこと以外は、実施例１と同様にして製造参考例１〜３及び比較例１の油脂のケン化物を製造した（表１参照）。なお、比較例１の圧ぺん大麦粉末の粒径は粒子径が大きい為、レーザー法では測定不可であり、大凡１ｍｍ以上の大きさである。表１における圧ぺん大麦粉末の量（７５質量部）は、組成物を固形状（粉末）にするための最低限の量である。飼料の圧ぺん大麦のみで油脂のケン化物を添加しない場合をコントロールとした。
【００３９】
表１
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【００４０】
製造した各ケン化物の消化率、ｐＨ及び窒素量（表２）、並びに総ＶＦＡ（揮発性脂肪酸（英: volatile fatty acid））濃度（表３）及び各ガス生成量（表４）を測定した。各測定方法は後述するとおりである。表２における「基質に対する添加量（％）」とは、飼料中の圧ペン大麦の質量に対する、添加した油脂ケン化物中の油脂相当量（質量％）を意味する。
【００４１】
表２
2020156475.tif 000004
【００４２】
表３
2020156475.tif 000005
【００４３】
表４
2020156475.tif 000006
【００４４】
＜培養液の調整＞
・濃厚飼料とライグラスストロー６：４で飼養したルーメンカニューレ装着の緬羊４頭からルーメン液を１２０ｍｌずつ採取し、４重ガーゼでろ過し、５００ｘｇで遠心分離した上澄みを等量ずつ混合して、人工唾液で５倍希釈した培養液を調整した。
・培養液４０ｍｌに、圧ぺん大麦０．５ｇ（乾物量）を基質とし、各製剤を加え、５０ｍＬ容の遠沈管で、３９℃で４８時間培養した。（１処理につき３反復。）
【００４５】
・測定項目
１）ガス生成量
培養０〜４８時間目におけるガス生成量を以下の方法で記録した。培養遠沈管内を９９．９％ＣＯ2ガスで置換して嫌気条件とし、５０ｍＬのシリンジ付きシリコン栓で閉じて、培養後３、６、９、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８時間時の発生ガス量をシリンジの目盛りで読み取った。シリンジは、ガスが満杯となる培養後１８時間時に交換した。
【００４６】
２）ガス組成
培養１８時間に発生したガスのＣＯ2とＣＨ4の濃度をガスクロマトグラフ（条件は以下のとおり）により測定した。
・機器：ジーエルシーサイエンス社製イノルガポータブルＴＣＤガスクロマトグラフ
・カラム：１／１６×１．０ｍｍφ×３ｍ
ステンレスパックドカラム  （充填剤  Porapak  Q 80/100mesh）
・キャリアガス；Ｈｅ    ４ｍＬ／分
・検出器；ＴＣＤ    
【００４７】
３）消化率
乾物（ＤＭ）と粗蛋白質の消化率は、以下の方法により、測定した。
測定は、嫌気的条件下で４８時間培養後の培養液中の乾物と粗蛋白質の消失量を以下の方法で、測定した。
乾物摂取量は、培養前後の乾物重量を、夫々１０５℃３時間乾燥させた残渣重量を測定し、培養前の重量からの変化を、消失量として求めた。
また、粗蛋白質量は、培養前後の粗蛋白質量を、ケルダール法により、求め、培養前の蛋白質量からの培養後の変化を、消失量として求めた。
【００４８】
４）発酵産物
培養後の上澄みのｐＨ、アンモニア態窒素とＶＦＡ濃度の濃度は、下記の装置と方法で測定した。
・ｐＨ；堀場製作所製ガラス電極  ｐＨメータ
・アンモニア態窒素；コンウェイユニットを用いた微量拡散法（Ｃｏｎｗａｙ  １９６２）
・ＶＦＡ濃度；ガスクログラフ法により分析した
ＶＦＡ濃度は、農研機構の「家畜における生化学病性鑑定のための臨床生化学的検査マニュアル」
http://www.naro.affrc.go.jp/laboratory/niah/disease/biochem/gc_vfa/index.html
に従い、サンプルの処理を行い、ガスクロマトグラフへの注入サンプルを調整した。
【００４９】
ガスクロマトグラフ条件
・機器：島津製作所製ＧＣ−２０１４  ＦＩＤガスクロマトグラフ
・カラム、パックドガラスカラム（Thermon ３０００−２％ Shimalite ＴＰＡ６０／８０ ３．２ｍｍφ×２．１ｍ；島津製作所）
・カラム温度：１２０℃
・注入器および検出器温度；２００℃
・キャリアガス；Ｎ2
・燃焼ガス；Ｈ2
・検出器；ＦＩＤ
【００５０】
・統計処理
測定データはＳＡＳ（２００８）のＧＬＭプロシジャーを用いて解析した。
Ｙｉｊｋ＝μ＋Ｔｉ＋Ｌｊ＋（ＴＬ）ｉｊ＋ｅｉｊｋ
Ｙｉｊｋ：変数，μ：全平均，Ｔｉ：脂肪酸の効果，Ｌｊ：添加量の効果，（ＴＬ）ｉｊ＋：脂肪酸と添加量の相互作用の効果，ｅｉｊｋ：誤差である。
最小二乗平均値間の差の検定：TukeyとKramerの多重比較法(Kramer、1956)。
さらに対照区を加えた多重検定を別途行った。
【００５１】
［実施例２及び比較例２〜７］
油脂の量、賦形剤の種類及び量を表５に記載のとおり変えた以外は、実施例１と同様にして、粒状物を作成した（表５参照）。比較例７は製剤に含まれる含有量相当のシリカゲルのみを添加した場合である。表５において、シリカゲル、珪藻土、バーミキュライト、ベントナイト、ゼオライトの添加量は、ケン化物の固体化（粒子状化あるいは粉末化）に必要であった最低量である。
【００５２】
表５
2020156475.tif 000007
【００５３】
実施例２及び比較例２〜７の各ケン化物の消化率、ｐＨ及び窒素量（表６）、並びに総ＶＦＡ（揮発性脂肪酸（英: volatile fatty acid））濃度（表７）及び各ガス生成量（表８〜９）を測定した。各測定方法は前述のとおりである。表６〜９においてコントロールは、飼料の圧ぺん大麦のみで油脂のケン化物を添加しない場合である。
【００５４】
表６
2020156475.tif 000008
【００５５】
表７
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【００５６】
表８
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【００５７】
表９
2020156475.tif 000011
【００５８】
ガス総生成量、メタン生成量、二酸化炭素生成量の経時変化をグラフにしたものが図３及び４である。図３及び４から明らかなとおり、実施例２のシリカゲルを用いた場合においてのみメタン生成抑制が見られ、他の賦形剤を用いた場合にはメタン生成抑制が見られなかった。
本発明の反芻動物用メタン生成抑制組成物は、メタン生成抑制に加えて、酸化安定性、匂い、嗜好性に優れた反芻動物飼料用飼料を提供することができた。
【００５９】
［実施例３］
製造参考例２のアマニ油の量及びシリカゲルの種類と量を表１０に記載のとおり変えた以外は、実施例１と同様にして、粒状物を作成した（実施例３）。表１１〜１２においてコントロールは、飼料の圧ぺん大麦のみで油脂のケン化物を添加しない場合である。実施例２と同様に、メタン産生量及び二酸化炭素産生量を測定した（表１１及び１２）。
【００６０】
表１０
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【００６１】
表１１
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【００６２】
表１２
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【００６３】
実施例３の４８時間後のメタン生成量及び二酸化炭素生成量についてグラフにした（図５及び図６）。
シリカゲルの粒径が８μｍのものを１０％用いた場合（実施例３）は、若干効果が低かったが、メタンの産生を抑制した。この結果から、油脂のケン化物に添加するシリカゲルの量によりメタン生成抑制の程度が異なることが推測される（実施例３）。
実施例３の本発明の反芻動物用メタン生成抑制組成物は、メタン生成抑制に加えて、酸化安定性、匂い、嗜好性に優れた反芻動物飼料用飼料を提供することができた。
【００６４】
［実施例４及び５］
製造参考例３のアマニ油の量及びシリカゲルの種類と量を表１３に記載のとおり変えた以外は、実施例１と同様にして、粒状物を作成した（実施例４及び５）。またリパーゼを加えない以外は実施例４と同様に粒状物を作成した（比較例８）。表１４〜１５においてコントロールは、飼料の圧ぺん大麦のみで油脂のケン化物を添加しない場合である。賦形剤を用いないものを比較例２−３とした。実施例２と同様に、メタン産生量及び二酸化炭素産生量を測定した（表１４及び１５）。
【００６５】
表１３
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【００６６】
表１４
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【００６７】
表１５
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【００６８】
実施例４、５及び比較例の４８時間後のメタン生成量及び二酸化炭素生成量についてグラフにした（図５及び図６）。
シリカゲルの粒径が８μｍのものを用いた場合（実施例４）は、１２５μｍ（実施例５）と比べて効果が低かったが、いずれもメタンの産生を抑制した。
実施例４及び５の本発明の反芻動物用メタン生成抑制組成物は、メタン生成抑制に加えて、酸化安定性、匂い、嗜好性に優れた反芻動物飼料用飼料を提供することができた。
【００６９】
［実施例６］
肥育後期の去勢牛４頭を試験に用いた。各２頭ずつ、実施例４で作成した製剤の給餌区、製剤の非給餌区の２グループに分け、馴致１２日間おいた後、各頭３日間、呼気の測定期間とする試験を、２回繰り返すクロスオーバー法による試験を実施した。
なお、本発明の脂肪酸カルシウム製剤（脂肪酸カルシウムを主成分として含む油脂のケン化物）は、乾物摂取あたり２質量％量を通常飼料にトップドレスし給餌した。水分、ミネラルは自由摂食とした。
【００７０】
各個体の体重の応じ、下記濃厚飼料を８０質量％、粗飼料２０質量％となる様、給餌した。
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【００７１】
飼料の給餌は、定量秤量給与し、定期的に残餌量を測定し、摂取した飼料摂取量から、摂取したＴＤＮを算出した。
また、試験期間の初日と最終日の体重測定を行い、１回目（前半）の試験は初日の体重を、また２回目（後半）の試験は最終日の体重を用いた。
ガス測定は、インラインフィルター、吸引ポンプ、流量計、吸引ビン、レーザー型携帯用ガス分析装置およびＰＣで構成される測定システムを用い、飼槽に、左右および前面の３面および上面をカバーする透明アクリル板（縦５０ｃｍ×横８０ｃｍ（飼槽の幅）×奥行５０ｃｍ）を設置し、飼槽上部と飼槽下部の２か所から呼気ガスを採取した。
【００７２】
測定項目は以下のとおりである。
１．飼料摂取量（DMI kg/day）
２．メタン／二酸化炭素濃度比（CH4/CO2）
３．体重（試験期間初日と最終日）（BW(kg)）
【００７３】
＜メタン産生量の推定＞
メタン/二酸化炭素濃度比（CH4/CO2）を、下記の推定式に代入して「メタン産生量」を算出した。
メタン産生量（Ｌ／日）＝（熱産生量／４．９）×CH4/CO2／１００×１０００
上記式では、乳牛の一日熱産生量（Ｍｃａｌ）/一日の二酸化炭素量（Ｌ／日）を、乾乳牛に乾草給餌した際の二酸化炭素産生量と熱産生量の測定事例（https://ocw.kyoto-u.ac.jp/ja/faculty-of-agriculture-jp/5240000/lecturenote）から平均値４．９として求めて使用した。
【００７４】
「熱産生量」（ＨＰ）（Ｍｃａｌ）は以下の考え方により算出した 。
熱産生量（ＨＰ）＝成長に使われるエネルギー＋維持エネルギー
＝（エネルギー摂取量−維持エネルギー）×（１−０．５２）＋ 維持エネルギー
＝  エネルギー摂取量×０．４８＋維持エネルギー×０．５２
上記式では、エネルギー摂取量の維持エネルギーへの利用効率を０．５２として計算した。
成長に使われるエネルギー：HPgrowth
エネルギー摂取量：ME intake（Ｍｃａｌ）＝ＴＤＮ（可消化養分総量）intake×３．６１ 
維持エネルギー：ME maintenance（Ｍｃａｌ）＝ＡＥ×ＢＷ0.75
ＢＷ（ｋｇ）：牛の体重
ＡＥ（Ｍｃａｌ）：肉用牛の体重ＢＷ0.75（ｋｇ）当りの活動エネルギー量（＝０．１１２４）（日本飼養標準 『肉用牛』(2008年版)  中央畜産会より）
【００７５】
表１６
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【００７６】
表１７
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*1乾物摂取量当りのメタン産生量    *2 体重当りのメタン産生量
【００７７】
実際に牛に給餌したところ、本発明の油脂のケン化物からなる組成物により、呼気中のメタン産生を抑制することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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