(57)【要約】【課題】乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−９２）を特異的に迅速かつ簡便に識別できるプライマーセットおよび該プライマーセットを用いた検出方法を提供すること。【解決手段】配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２または３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなる、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１（ＮＩＴＥ  Ｐ−９２）株検出用プライマーセット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２または３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなる、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１（ＮＩＴＥ  Ｐ−９２）株検出用プライマーセット。
【請求項２】
請求項１記載のプライマーセットを含むことを特徴とする、Ｈ６１株検出用キット。
【請求項３】
以下の工程を含む、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１（ＮＩＴＥ  Ｐ−９２）株の検出方法。
（１）請求項１記載のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程
（２）工程（１）で得られた核酸断片を検出する工程
【請求項４】
配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなる、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１（ＮＩＴＥ  Ｐ−９２）株検出用プライマーセットで増幅されることを特徴とする、配列番号４で表されるポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなる、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１（ＮＩＴＥ  Ｐ−９２）株検出用プライマーセットで増幅されることを特徴とする、配列番号５で表されるポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の乳酸菌の検出方法に関する。詳しくは、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−９２）の検出用プライマーセットおよび該プライマーセットを用いた検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、様々な作用を有することが昔から知られており、近年はプロバイオティクスとして消化管内の細菌叢の改善による整腸効果、免疫力向上効果、抗腫瘍効果などの種々の健康保持効果を有することから、人類にとって健康に深く関わる有用な微生物資源として利用されている。
乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−９２）（以下、「乳酸菌Ｈ６１株」という。）は、老化実験用のマウスを用いた試験から、骨密度の減少や潰瘍発生などの老化抑制効果を有することが報告（特許文献１）されている。また、乳酸菌Ｈ６１株の加熱処理菌体を摂取することにより、５０〜６０歳代の肌への保湿効果を向上することも報告（非特許文献１）されている。さらに、乳酸菌Ｈ６１株またはその抽出物は、メラニン産生抑制効果、育毛・発毛効果と脱毛抑制効果を有することも報告（特許文献２）されている。このように、乳酸菌Ｈ６１株は、様々な健康効果を有する機能性乳酸菌である。
【０００３】
乳酸菌Ｈ６１株を含む発酵乳やチーズ等の食品、サプリメント、ペットフードなどにおいて、機能性乳酸菌として乳酸菌Ｈ６１株の菌数を確保することが重要である。また、ヒトやマウスなどの実験動物の腸内において、摂取した乳酸菌Ｈ６１株を正確に識別し、菌数を把握することも、乳酸菌Ｈ６１株の有効性を評価するうえで重要である。上述の乳酸菌Ｈ６１株が発揮する効果は、菌株特異的なものであるから、腸内細菌と乳酸菌Ｈ６１株とを区別して検出することが求められている。さらに、乳酸菌Ｈ６１株は加熱処理菌体（死菌）でも効果があることが知られており、加熱処理した乳酸菌Ｈ６１株含有の有無を検出することも求められている。
【０００４】
近年、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって特定の微生物を検出する方法が報告されており、例えば、ハウスキーピング遺伝子の塩基配列の違いを利用したプライマーを用いて、種特異的なＰＣＲ産物を検出することで菌種の同定を行うことができるが、同属同種の異株間の識別は困難である。菌株の識別方法として、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ）法（非特許文献２）や、１０塩基程度のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法を行い、ランダムに増幅されたＰＣＲ産物の電気泳動パターンを比較するＲａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）法（非特許文献３）などが報告されている。
しかしながら、ＲＦＬＰ法やＲＡＰＤ法は何れも定量性がなく、ＲＦＬＰ法は高精度であるものの工程が複雑で時間がかかること、ＲＡＰＤ法は迅速な検出が可能であるものの、使用する機器により結果が異なり再現性に問題があった。また、生菌であれば純粋培養により菌体を増やし、遺伝子レベルの解析を行うことは容易であるが、死菌の場合、質の高いＤＮＡを調製することは困難という問題もあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２５６９９３号公報
【特許文献２】特開２０１５−０９８４４２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】日本畜産学会報、２０１２年、８３巻、３０７〜３１１頁
【非特許文献２】腸内細菌学雑誌、２００５年、１９巻、１９３〜１９８頁
【非特許文献３】Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、３５巻、３７０〜３７４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、乳酸菌Ｈ６１株を特異的に迅速かつ簡便に識別できるプライマーセットおよび該プライマーセットを用いた検出方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、乳酸菌Ｈ６１株に特異的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む検出用プライマーセットを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、具体的には次の事項を要旨とする。
１．配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２または３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなる、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１（ＮＩＴＥ  Ｐ−９２）株検出用プライマーセット。
２．１．記載のプライマーセットを含むことを特徴とする、Ｈ６１株検出用キット。
３．以下の工程を含む、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１（ＮＩＴＥ  Ｐ−９２）株の検出方法。
（１）１．記載のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程
（２）工程（１）で得られた核酸断片を検出する工程
４．配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなる、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１（ＮＩＴＥ  Ｐ−９２）株検出用プライマーセットで増幅されることを特徴とする、配列番号４の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
５．配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなる、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１（ＮＩＴＥ  Ｐ−９２）株検出用プライマーセットで増幅されることを特徴とする、配列番号５で表されるポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、乳酸菌Ｈ６１株を簡便かつ迅速に、かつ、同亜種の乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス菌と交差反応を示すことなく、検出することが可能となり、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】請求項４に特定する配列番号４の塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【図２】請求項５に特定する配列番号５の塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【図３】実施例１におけるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の写真である。
【図４】実施例３における加熱処理菌体から得たＤＮＡを用いたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のプライマーセットは、乳酸菌Ｈ６１株に特異的な塩基配列を有する染色体ＤＮＡ領域をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅することができ、乳酸菌Ｈ６１株に近縁の菌株を認識することなく、乳酸菌Ｈ６１株を特異的に認識し、乳酸菌Ｈ６１株を特異的に検出することが可能である。
なお、本発明における乳酸菌Ｈ６１株とは、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１（寄託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−９２）株を意味する。
【００１３】
本発明のプライマーセットは、以下の方法で設計した。
まず、乳酸菌Ｈ６１株の完全長ゲノム配列を、第３世代シーケンサーであるＰａｃＢｉｏ ＲＳＩＩ（デジタルバイオロジー社製）を用いて決定した。このゲノム配列と、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス菌４株（全ゲノム配列解読済み：ＭＧ１３６３株、ＳＫ１１株、ＮＺ９０００株、Ｓｃａｆｆｏｌｄｓレベルでのゲノム配列解読済み：ＪＭ１株）を比較して、タンパク質をコードするコーディングシーケンス（ＣＤＳ）を検索し、相同性の認められない領域を検出した。これらの領域の核酸配列を、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）でＢＬＡＳＴ検索し、全細菌種に対しても相同性の認められない領域を絞り込んだ。これらの配列から、ＧＣ含量が４０％以上になるような領域の２５０ｂｐから３５０ｂｐの長さのＰＣＲ産物が得られるＰＣＲプライマーを作成した。標準株であるラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスＡＴＣＣ  １９２５７株、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構  畜産研究部門保有のラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス菌１０株、および亜種ラクティス菌８株とＨ６１株から調製したゲノムＤＮＡを鋳型に用いて、当該プライマーによるＰＣＲを行ない、Ｈ６１株のみ相当する鎖長のＰＣＲ産物が得られ、他の菌株のＤＮＡを鋳型に用いてもＰＣＲ産物は得られないプライマーセットを選抜した。
【００１４】
＜本発明のプライマーセットについて＞
本発明のプライマーセットは、下記表１に示す、配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２または３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるものである。
【表１】
2020156355.tif 000002
また、本発明の検出方法において使用できるプライマーセットは、塩基長やＰＣＲ条件等に依存して、配列番号１〜３の塩基配列と実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットも含まれる。ここで、実質的に相同とは、ＰＣＲ用プライマー等として機能し得る程度の断片長と相同性を有することを意味する。
例えば、本発明のプライマーセットは、使用目的や条件によっては、必ずしも配列番号１〜３の塩基配列と１００％の相同性を有している必要はなく、目的とする領域のプライマーの５’末端付近で数塩基が異なっていてもよい。そのようなプライマーを使用しても、アニーリング温度等を検討することによって目的ＤＮＡ断片を適宜増幅させることは可能である。
詳しくは、乳酸菌Ｈ６１株の検出に際し、高い特異性が要求される場合には、完全に相同な配列部位（配列番号１〜３の塩基配列）を使用し、かつ、そのような配列でしかアニーリングしないＰＣＲ条件を選択すればよい。その反面、比較的特異性の低い条件が許容される場合には、配列番号１〜３の塩基配列とは数塩基異なる配列を使用し、かつ、それでもアニーリングするようなＰＣＲ条件を選択することができる。
【００１５】
本発明のプライマーセットは、当業者によく知られた通常のＤＮＡの合成法により、例えば、ＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。また、ＤＮＡ合成業者に合成を委託することによっても、本発明のプライマーを得ることができる。
本発明のプライマーセットを用いて、試料に含まれる被検菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、増幅産物の有無を決定することにより、試料中の乳酸菌Ｈ６１株を検出することができる。すなわち、プライマーの配列に特異的なＰＣＲの反応が起こると、乳酸菌Ｈ６１株の染色体ＤＮＡ内の、対となる各プライマーの配列に相当する配列に挟まれた領域（標的領域）が増幅される。
したがって、本発明のプライマーセットを用いて増幅産物が得られれば、被検菌は乳酸菌Ｈ６１株であると同定されるか、または、被検菌に乳酸菌Ｈ６１株が含まれていると判定される。
また、増幅産物が得られる場合は、増幅産物の有無の決定には、増幅産物の長さの決定が含まれてもよい。例えば、配列番号１および配列番号２、または配列番号１および３の各組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを含む乳酸菌Ｈ６１株検出用プライマーセットを用いた場合、被検菌に乳酸菌Ｈ６１株が含まれていれば、通常は各々３４３ｂｐ、２５１ｂｐの増幅産物が得られる。
本発明のオリゴヌクレオチドを含む乳酸菌Ｈ６１株検出用プライマーセットを用いた場合に得られる、請求項４に特定する３４３ｂｐの増幅産物である配列番号４の塩基配列を含むポリヌクレオチドを下記図１に、請求項５に特定する２５１ｂｐである配列番号５の塩基配列を含む増幅産物のポリヌクレオチドを下記図２に示す。図１、２中の下線は、乳酸菌Ｈ６１株の特異的検出のための本発明のプライマーセットが、ハイブリダイズする部位を示す。
配列番号１〜５の塩基配列は、乳酸菌Ｈ６１株に特異的な配列であることから、これらの一部の配列をＤＮＡプローブとしたＦＩＳＨ法やサザンハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーションなどを実施することも可能である。 
なお、本発明において、乳酸菌Ｈ６１株の検出とは、試料中に乳酸菌Ｈ６１株が存在するか否かを検出すること、および、被検菌が単一種である場合には、同被検菌が乳酸菌Ｈ６１株であるか否かを同定することを含む。
【００１６】
ここで、乳酸菌Ｈ６１株の検出に用いる試料としては、乳酸菌Ｈ６１株が存在し得る試料であればいずれのものであってもよく、例えば、乳酸菌の混合培養物、ヨーグルトやチーズなどの微生物を含む食品、マウスやラットなどの実験動物やヒトの糞便、土壌等の環境中に存在する細菌等を挙げることができる。被検菌は、分離された単一種であってもよく、複数の菌種を含む混合物であってもよい。
死菌であれば、試料からそのままＤＮＡを調製してＰＣＲに用いてもよく、また生菌であれば、試料からコロニー分離等により被検菌体を分離して、被検菌体からＤＮＡを調製してからＰＣＲに供してもよい。これらの試料から核酸を抽出する方法は、例えば、一般的に乳酸菌のゲノムＤＮＡ調製に用いるような、細胞壁をＬｙｓｏｚｙｍｅなどの酵素で分解またはビーズなどで物理的に破壊したのちに、市販の抽出キット（ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、Ｉｓｏｇｅｎなど）を使用することが可能であり、特に限定されるものではない。
【００１７】
＜本発明の検出方法について＞
本発明の乳酸菌Ｈ６１株の検出方法は、（１）本発明のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程と、（２）工程（１）で得られた核酸断片を検出する工程を含むものである。
本発明の検出方法として、具体的には、例えば、ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、サザンハイブリダイゼーションやドットハイブリダイゼーション等を挙げることができる。中でも、ＰＣＲ法が好ましい。
このうち、ＰＣＲ法による乳酸菌Ｈ６１株の検出方法では、本発明のプライマーセットを用いる以外は、通常用いられるＤＮＡポリメラーゼ等のＰＣＲ試薬および機器を使用することも可能であり、特に限定されるものではない。
ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定はされないが、例えば、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製) 、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ（東洋紡社製）等が好ましい。
ＰＣＲ反応条件については、用いるＤＮＡポリメラーゼの最適温度、合成するＤＮＡの長さや種類等により適宜設定すればよいが、サイクル条件であれば「９０〜９８℃で５〜３０秒（熱変性・解離）→５６℃で５〜３０秒（アニーリング）→６５〜８０℃で３０〜６０秒（合成・伸長）」を１サイクルとして合計２０〜４０サイクル行う条件が好ましい。この場合、鋳型ＤＮＡとプライマーの量比は、１０〜３０ｎｇのゲノムＤＮＡ量に対し、各プライマーを０．２４μＭ程度が好ましい。
ＰＣＲにより得られる増幅産物の有無またはその大きさは、通常の核酸の検出法によって、決定することができる。例えば、アガロース電気泳動によって電気泳動した後、エチジウムブロマイドやＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩで染色することによって、増幅産物を検出することができる。また、蛍光強度によって増幅産物の量を、分子量マーカーとの比較によって分子量を決定することができる。ＰＣＲ産物をサイクルシーケンスした後、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列と長さを測定することによっても、増幅産物の有無を確認することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、経時的に増幅反応を検出することができる。
【００１８】
本発明のプライマーセットは、他の要素と併せて、乳酸菌Ｈ６１株検出用キットとすることができる。前記の他の要素としては、例えば、核酸の抽出、ＰＣＲ、および増幅産物の検出に必要な試薬類の任意の１種または２種以上が挙げられる。また、この乳酸菌Ｈ６１株検出用キットは、陽性コントロールとして、乳酸菌Ｈ６１株の染色体ＤＮＡの配列の一部を有し、本発明のプライマーセットにより増幅され得るＤＮＡ断片、および／または、陰性コントロールとして、本発明のプライマーセットに対応するが、１塩基または数塩基のミスマッチを有する塩基配列を有するＤＮＡ断片を含んでいてもよい。
【００１９】
本発明のプライマーセットは、前記したように、乳酸菌Ｈ６１株の検出に用いることができる。また、本発明のプライマーセットを用いることにより、乳酸菌Ｈ６１株菌体または同菌体を含む飲食品等を工業的に製造するに際し、菌数の測定や発酵状態の管理を容易に行うことができる。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の技術範囲はこれらにより限定されるものではない。
＜実施例１：乳酸菌Ｈ６１株の検出１＞
（１）供試菌株
供試菌株として、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス株を８株（Ｌｃｌ１〜Ｌｃｌ８）と、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス株を１３株（Ｌｃｃ１〜Ｌｃｃ１１、乳酸菌Ｈ６１株、標準株ＡＴＣＣ  １９２５７株）、ラクトバシラス・デキストリニカス株を１株（Ｌｂ１１）使用した。
【００２１】
（２）乳酸菌ＤＮＡの調製種特異的ＰＣＲ用のＤＮＡ調製
この実施例においては、簡便なのでキットを使用しているが、他のＤＮＡ調製方法により調製してもよい。精製したＤＮＡを使った方がＰＣＲの再現性が良く好ましい。
（ａ）ＭＲＳ液体培地で供試菌株を一晩培養した。
（ｂ）ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のグラム陽性細菌のＤＮＡ調製プロトコールに従い、ＤＮＡを調製した。詳細は以下のとおりである。
（ｂ−１）培養液１ｍＬ（ＯＤ  ６００ｎｍ １．０程度の濁度）を８０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、集菌した。この上清は廃棄した。
（ｂ−２）１８０μＬのリシス溶液（２×ＴＥ (２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 ２ｍＭ  ＥＤＴＡ)１ｍＬに２０ｍｇリゾチーム、１２μＬ  Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００を加えて調製）を、上記の集菌した菌体に加え、懸濁後、３７℃、３０分間インキュベートした。
（ｂ−３） インキュベート後の上記懸濁液に２５μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋと２００μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＡＬを加え、混合後、５６℃で３０分間インキュベートした。
（ｂ−４）これに、２００μＬの１００％エタノールを加えた。
（ｂ−５）上記（ｂ−４）の溶液をスピンカラムに添加し、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、ＤＮＡをカラムに吸着させた。このカラム通過液とチューブは廃棄した。
（ｂ−６）カラムを新しいチューブにセットし、Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＷ１ ５００μＬを添加し、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。このカラム通過液とチューブは廃棄した。
（ｂ−７）カラムを新しいチューブにセットし、Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＷ２  ５００μＬを添加し、１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。
（ｂ−８）カラムを１．５ｍＬのマイクロチューブにセットし、Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＥ  ２００μＬを添加し、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
（ｂ−９）得られたＤＮＡを含む溶出液のＯＤ２６０ｎｍの吸光度を測定し、ＤＮＡ濃度（ＯＤ２６０×５０μｇ/ｍＬ）を決定し、これを鋳型ＤＮＡ溶液とした。
【００２２】
（３）ＰＣＲ反応
上記（２）において得た供試菌株のＤＮＡ溶液を鋳型とし、配列番号１および配列番号３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットを用い、ＰＣＲ反応試薬キットであるＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）の方法にしたがってＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の総量を２５μＬとすると、キット付属の１０ｘＥｘＴａｑ緩衝液２.５μＬ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ ２.０μＬ、２０μＭ  プライマー各０．３μＬ、鋳型ＤＮＡ１０〜２０ｎｇ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０.７５Ｕを含む反応液０．１５μＬを、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（アプライドバイオシステム社製）を用いて、９８℃で１０秒の予備加熱後、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを５６℃で３０秒、伸長を７２℃で６０秒のサイクルを３５サイクル行った。
【００２３】
（４）アガロース電気泳動
ＰＣＲ反応によって得られたＰＣＲ産物を、１．８％アガロースゲルで１００Ｖ、３０分電気泳動した。次に、アガロースゲルを臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍＬ）で染色後、青色ＬＥＤライト下でＰＣＲ産物の増幅を示すバンドを観察した。結果を表２と図２に、実施例２の結果とまとめて示す。表中、プライマーと反応して２５１ｂｐ（配列番号１および配列番号３のプライマーを用いた場合）のＰＣＲ産物が増幅されたものを「＋」、プライマーと反応しなかったものを「−」と表す。
【００２４】
＜実施例２：乳酸菌Ｈ６１株の検出２＞
供試菌株から調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１および配列番号２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットを用いたこと以外は、すべて実施例１と同様に行った。
結果を表２に、実施例１の結果とまとめて示す。表中、プライマーと反応して３４３ｂｐ（配列番号１および配列番号２のプライマーを用いた場合）のＰＣＲ産物が増幅されたものを「＋」、プライマーと反応しなかったものを「−」と表す。
【００２５】
【表２】
2020156355.tif 000003
【００２６】
表２と図２に示すとおり、乳酸菌Ｈ６１株のＤＮＡを使用した試験番号６と２０のみにバンドが観察され、本発明のプライマーセットにより乳酸菌Ｈ６１株だけを特異的に検出できることが確認された。同一亜種のクレモリス株であってもＨ６１株以外では増幅が見られず、乳酸菌Ｈ６１株を特異的に検出できることが明らかとなった。
【００２７】
＜実施例３：乳酸菌Ｈ６１株の検出３（生菌と加熱菌）＞
（１）供試菌株と培養条件
乳酸菌Ｈ６１株（異なる２つの保存ロット１、２を使用)を、ＭＲＳ液体培地１０ｍＬで菌を一晩培養した。
（２）加熱処理条件とＤＮＡの抽出
（２−１）一晩培養した培養液を８０００ｒｐｍで１分間遠心分離して集菌し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回菌体を洗浄した。
（２−２）菌体にＰＢＳを加えてＯＤ６００ｎｍの吸光度が１および５になるように調製した。
（２−３）ＯＤ６００５の菌体懸濁液０．５ｍＬをマイクロチューブ２本にとり、１本は１００℃で３０分間煮沸、もう１本は１２１℃で１５分間オートクレーブ処理を行った。
（２−４）ＯＤ６００１の菌体懸濁液１．０ｍＬをマイクロチューブ２本にとり、１本は１００℃で３０分間煮沸を行った。もう１本は生菌からのＤＮＡ調製に用いた。
（２−５）上記（２−３）、（２−４）により処理済みの菌体を、遠心分離により集菌し、上記実施例１の「乳酸菌ＤＮＡの調製種特異的ＰＣＲ用のＤＮＡ調製」と同様の方法でＤＮＡ調製を行った。
（２−６）得られたＤＮＡを鋳型に用いて、上記実施例１の「ＰＣＲ反応」と同様の方法でＰＣＲを行った。
結果を表３と図４に示す。
表３と図４中の試験番号１〜４は上記保存ロット１、試験番号５〜８は上記保存ロット２の乳酸菌Ｈ６１株である。また、試験番号１、５は生菌から調製した乳酸菌Ｈ６１株のＤＮＡ、試験番号２、６はＯＤ６００５に調製し１００℃で３０分間加熱した乳酸菌Ｈ６１株から調製したＤＮＡ、試験番号３、７はＯＤ６００１に調製し１００℃で３０分間加熱した乳酸菌Ｈ６１株から調製したＤＮＡ、試験番号４、８はＯＤ６００５に調製し１２１℃で１５分間オートクレーブ処理した乳酸菌Ｈ６１株から調製したＤＮＡである。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
表３と図３に示すとおり、乳酸菌Ｈ６１株の生菌のＤＮＡおよび加熱処理菌のＤＮＡを使用した試験番号１〜８全てにバンドが観察され、本発明のプライマーセットは、乳酸菌Ｈ６１株の生菌のみならず加熱処理菌（死菌）に対しても、特異的な検出能を発揮することが明らかとなった。これは、乳酸菌Ｈ６１株の生菌を利用した製品等はもとより、加熱処理した乳酸菌Ｈ６１株を利用した製品等においても、乳酸菌Ｈ６１株を検出できることを意味する結果であり、非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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