(57)【要約】【課題】本発明は、悪性黒色腫、特に、粘膜悪性黒色腫の治療に有効な医薬組成物の提供を課題とする。【解決手段】本発明は、スルファサラジンまたはその誘導体を有効成分として含む、悪性黒色腫の治療のための医薬組成物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スルファサラジンまたはその誘導体を有効成分として含む、悪性黒色腫の治療のための医薬組成物。
【請求項２】
前記悪性黒色腫が粘膜悪性黒色腫であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
放射線治療と併用することを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
治療対象がイヌであることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗がん剤に関する。より具体的には、悪性黒色腫の治療剤および治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性黒色腫は、いわゆる皮膚に発生する悪性腫瘍のことで、その発生部位の違いなどから、皮膚悪性黒色腫（cutaneous melanoma）、末端型悪性黒色腫（acral melanoma）および粘膜悪性黒色腫（mucosal melanoma）などのサブタイプに分けることができる。紫外線の影響によると考えられる頭皮などに発生する皮膚悪性黒色腫は、白色系人種に多い。これに対し、口腔粘膜や鼻腔粘膜に発生する粘膜悪性黒色腫、掌や足の裏などに発生する末端型悪性黒色腫は、有色系人種に多く発生する。
【０００３】
皮膚悪性黒色腫については、比較的研究が進んでおり、皮膚悪性黒色腫由来のゲノム配列を網羅的に解析した結果から、BRAFを含むいくつかの遺伝子の突然変異が、その発生と関連することが示唆されている（非特許文献１および非特許文献２）。これに対し、粘膜悪性黒色腫については、あまり解析が進んでいないものの、ヒト粘膜の悪性黒色腫のゲノム配列解析から、BRAFの変異は、皮膚悪性黒色腫の場合とは異なり少ないことが明らかとなった（非特許文献２）。
このように、異なるタイプの悪性黒色腫では、分子遺伝学的な発生原因が異なる可能性が高く、抗がん剤や放射線等に対する感受性が異なり、各サブタイプに適した治療方法を選択する必要があると考えられる。
ヒトの口腔粘膜に発生する粘膜悪性黒色腫の治療として、手術、放射線療法または化学療法などが行われるが、治療後も、しばしば局所再発および遠隔転移が生じ、悪性度が非常に高い。疾病原因は不明で、発症機序はあまりよく分かっておらず、5年生存率30％未満といわれている（非特許文献３）。そして、他のがんに対する治療方法や治療剤等が有効かどうかについては不明が点も多い。
【０００４】
ヒトの疾患を解明する上で、動物モデルは重要な役割を果たしている。マウスは、動物モデルとしてよく用いられており、マウス悪性黒色腫モデルを使用したワクチンの開発などが進められてきた。しかし、B16マウスモデルを使用して開発されたワクチンは、ヒト悪性黒色腫の治療には効果が弱く（非特許文献４）、他の動物モデルの使用も検討されている。一方、イヌの悪性黒色腫は、一般に、口腔粘膜に発生することが多い。現在、イヌの悪性黒色腫の治療としては、放射線治療や外科的にあごを切除する治療法しかなく、薬剤による有効な化学療法は確立されていない。イヌはコンパニオンアニマルとして人々の社会生活においても非常に重要な地位を占める動物である。そのため、イヌの疾患の治療方法および治療薬の開発に対するニーズは高い。また、イヌの口腔内悪性黒色腫は、ヒト粘膜悪性黒色腫と組織学的な類似性を有し、生物学的および臨床医学的特徴も共通している（非特許文献４および非特許文献５）。従って、ヒトの粘膜性黒色腫の治療法の確立という点においても、イヌ口腔内悪性黒色腫の治療法の確立は重要な意義を持つと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Haywardら, Nature 545:175-180 2017.
【非特許文献２】Wongら, Nat Commun. Jan 21;10(1):353. doi: 10.1038/s41467-018-08081-1. 2019.
【非特許文献３】Fellerら, Scientific World Journal  2017;2017:9189812. doi: 10.1155/2017/9189812. Epub 2017 May 30.
【非特許文献４】Yoshikawaら, Int J Mol Sci. 2018 Mar 10;19(3). pii: E799. doi: 10.3390/ijms19030799.
【非特許文献５】Hernandezら, Int J Mol Sci. 2018 Jan 30;19(2). pii: E394. doi: 10.3390/ijms19020394.
【非特許文献６】Goutら, Leukemia 15:1633-1640 2001.
【非特許文献７】Yoshikawaら, Cancer Res. 73:1855-1866 2013.
【非特許文献８】Naganeら, PLoS One. 2018 Apr 12;13(4):e0195151. doi: 10.1371/journal.pone.0195151. eCollection 2018.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記事情に鑑み、本発明は、悪性黒色腫、特に、粘膜悪性黒色腫の治療に有効な医薬組成物の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、イヌの悪性黒色腫でグルタチオン合成経路が活性化していることを見いだした。そこで、イヌ悪性黒色腫細胞に対し、シスチン／グルタミン酸トランスポーター（xCT、SLC7A11）の阻害剤であるスルファサラジンの影響を調べた。
xCT阻害剤のスルファサラジン（Sulfasalazine、CAS:599-79-1）は、ヒトB細胞性非ホジキンリンパ種由来のDoHH2細胞の増殖を抑制すること（非特許文献６）、ヒト頭頸部扁平上皮がん由来のCD44v陽性な癌幹細胞様癌細胞を標的とすること（非特許文献７）、マウス皮膚由来B16F10悪性黒色腫の放射線感受性を増大させること（非特許文献８）などが報告されてきたが、口腔内などに発生する粘膜悪性黒色腫への効果については未知であった。
本発明者らは、今回、イヌの口腔内悪性黒色腫由来のMCM-N1細胞に対するスルファサラジンの細胞毒性および放射線増感作用を初めて見だし、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（４）である。
（１）スルファサラジンまたはその誘導体を有効成分として含む、悪性黒色腫の治療のための医薬組成物。
（２）前記悪性黒色腫が粘膜悪性黒色腫であることを特徴とする上記（１）に記載の医薬組成物。
（３）放射線治療と併用することを特徴とする上記（１）または（２）に記載の医薬組成物。
（４）治療対象がイヌであることを特徴とする上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、悪性度が高く予後が悪いとされる粘膜悪性黒色腫に関する新たな治療剤および治療法が提供される。
【００１０】
本発明により、外科的手術以外に有効な治療方法がないイヌの口腔内悪性黒色腫に対する有効な治療剤および治療方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】イヌの良性組織および口腔内悪性黒色腫由来の組織における、xCTの発現レベルを、抗体染色を行って観察した結果を示す。n=11  バーは20μm
【図２】イヌの口腔粘膜由来の悪性黒色腫細胞（MCM-N1）とマウス皮膚由来の悪性黒色腫細胞（B16F10）に対するスルファサラジンの影響を、コロニー形成試験を用いて解析を行った結果を示す。
【図３】イヌの口腔粘膜由来の悪性黒色腫細胞（MCM-N1）に対するスルファサラジンの放射線増感作用について、コロニー形成試験を用いて解析を行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の第１の実施形態は、スルファサラジンまたはその誘導体を有効成分として含む、悪性黒色腫の治療のための医薬組成物（以下「本発明の医薬組成物」とも記載する）である。
スルファサラジン（Sulfasalazine：SAS）は下記の式で表される化合物で、サラゾスルファピリジン（Salazosulfapyridine：SASP）などと称されることもある。スルファサラジンは製薬会社等から販売されおり、入手可能である。スルファサラジンは、水に対して難溶性であるため、抗腫瘍効果を保持する限りにおいて、水溶性を付加するような修飾（例えば、PEG修飾、WO2017/119462など）を施した誘導体を使用してもよい。
【化１】
2020172473.tif 000002
【００１３】
本発明の医薬組成物は、有効成分であるスルファサラジンまたはスルファサラジン誘導体に加えて、必要に応じて適宜1または2以上の製剤用添加物を含む医薬組成物の形態で投与してもよい。また、当該実施形態にかかる医薬組成物中には、公知の他の抗がん剤を併せて配合してもよい。
【００１４】
本発明の医薬組成物は、経口または非経口用の剤形であってもよく、特に限定はしないが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤または注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。なお、液体製剤にあっては、用時、水または他の適当な溶媒に溶解または懸濁するものであってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の抗体またはその機能的断片を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また、緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００１５】
本発明の医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、あるいは、医薬組成物の製造方法は、その形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機または有機物質、あるいは、固体または液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して、例えば、0.1重量％〜99.9重量％、1重量％〜95.0重量％、または1重量％〜90.0重量％の間で配合することができる。具体的には、製剤用添加物の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコールまたは水等が挙げられる。
【００１６】
経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分、例えば、乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウムまたは無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロースまたはポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式または乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤および顆粒剤をそのまま、あるいは、ステアリン酸マグネシウムまたはタルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒または錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいは、エチルセルロース、カルナウバロウまたは硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤または顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま、あるいは、グリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油またはオリーブ油などに溶解した後ゼラチンで被覆し軟カプセルとすることができる。
【００１７】
本発明の医薬組成物の有効成分であるスルファサラジンは、経口投与すると腸内でスルファピリジンと5-アミノサリチル酸に分解されることが知られているが、抗腫瘍効果を発揮するのは、分解前のスルファサラジンそのものである。従って、本発明の医薬組成物は、局所注射などのための注射剤の形体がより好ましい。注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて、塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウムまたはリン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、さらに、マンニトール、デキストリン、シクロデキストリンまたはゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用時溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート80またはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化させ、注射剤用乳剤とすることもできる。
【００１８】
直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジおよびモノグリセリドまたはポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し、型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコールまたは大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜等で被覆してもよい。
【００１９】
本発明の医薬組成物の投与量および投与回数は特に限定されず、治療対象疾患の悪化・進展の防止および／または治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢などの条件に応じて、医師または薬剤師の判断により適宜選択することが可能である。
一般的には、経口投与における成人1日あたりの投与量は0.01〜1,000 mg（有効成分重量）程度であり、1日1回または数回に分けて、あるいは数日ごとに投与することができる。注射剤として用いる場合には、成人に対して1日量0.001〜100ｍｇ（有効成分重量）を連続投与または間欠投与することが望ましい。
【００２０】
本発明の第２の実施形態は、本発明の医薬組成物を患者に投与することを含む、悪性黒色腫の治療方法（以下「本発明の治療方法」とも記載する）である。
ここで「治療」とは、すでに悪性黒色腫に罹患した患者において、その病態の進行および悪化を阻止または緩和することを意味し、これによってがんの進行および悪化を阻止または緩和することを目的とする処置のことである。
本発明の治療方法の対象は、悪性黒色腫、特に、粘膜悪性黒色腫を発症しているほ乳動物であれば特に限定されない。特に、好ましい治療対象は、粘膜悪性黒色腫の発症頻度が比較的高い、ヒト、イヌまたはウマである。
【００２１】
本明細書が英語に翻訳されて、単数形の「a」、「an」および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものも含むものとする。
以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、本実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００２２】
１．組織学的解析
イヌの口腔内良性組織と悪性黒色腫由来の組織を採取し、10%中性緩衝ホルマリンで4℃一晩固定し、脱水、キシレン置換、パラフィン置換の後、パラフィン包埋した。次いで、厚さ5 μmに薄切してパラフィン包埋組織切片を作製した。脱パラフィン後、蒸留水で2分間水和し、圧力鍋を用いて0.01M クエン酸緩衝液（pH6.0）中で加熱し（120pa、121℃、2.5分）、抗原の賦活化処理を行った。その後、20分間流水で冷却し、蒸留水で5分間水和を行った。水和後、切片を3％過酸化水素加PBSで5分間、抗SLC7A11抗体（Santa Cruz Biotechnology）（xCTに対する抗体）染色を行う場合は3％過酸化水素で10分間浸漬し、内因性ペルオキシダーゼの除去を行った。続いて蒸留水による水和を5分間行った後、PBS-T（0.01% TritonX100を含むPBS）で5分間3回洗浄し、Blocking Buffer（5% Goat Serumを含むPBS-T）で組織を覆い、4℃で30分間静置しブロッキングを行った。1次抗体をBlocking Bufferで必要濃度に希釈し、ブロッキング後の組織に滴下して4℃で一晩静置した。1次抗体反応後の組織をPBSで5分間3回洗浄した。洗浄後、ヒストファイン シンプルステイン MAX-PO（Cat No.424142、株式会社ニチレイバイオサイエンス）を滴下後、室温で30分間静置し、PBSで5分間3回洗浄した。DAB Substrate Kit（Cat No.SK-4105、VECTOR LABORATORIES）を用いて発色液を作成し、洗浄後の組織に発色液を滴下し酵素反応を行った。その後、蒸留水で水和し、マイヤーヘマトキシリンを用いて核染色（HE染色）を行った。封入には標本用封入材（Cat No.FX00100, M・X, 松浪硝子工業）を使用した。観察はオールインワン蛍光顕微鏡 BZ-X700（キーエンス）で行った。 
【００２３】
染色結果を図１に、抗SLC7A11抗体による染色レベルを表１に示した。良性組織においては、若干染色が見られる程度（±〜＋）であったのに対し、悪性黒色腫の組織においては、抗SLC7A11抗体による染色レベルが増大しており、（＋〜＋＋）イヌ悪性黒色腫におけるSLC7A11発現が亢進していることが確認された。
【表１】
2020172473.tif 000003
【００２４】
２．イヌ悪性黒色腫細胞に対するスルファサラジンの影響
イヌ口腔粘膜由来の悪性黒色腫MCM-N1細胞（DS Pharma Biomedical）およびマウス皮膚由来の悪性黒色腫B16F10細胞（東北大学加齢医学研究所 医用細胞資源センター・細胞バンク）は、 10 % FBS を含む DMEM培地中で加湿、37℃ならびに5% CO２  条件下で培養した。
イヌ悪性黒色腫細胞に対するスルファサラジンの影響は、コロニー形成試験により解析を行った。
イヌ由来およびマウス由来の細胞を、各々、トリプシン処理し、20〜200個/mlの細胞密度になるように調製し、60 mm ディッシュに5 ml ずつ播種した。CO2 インキュベーターで6時間培養した後、各種濃度のスルファサラジン（シグマ アルドリッチ）を含む培地2 ml に交換した。48時間後に培地を3 ml 添加し、CO2 インキュベーターにて 7〜10 日培養した。培養後、培地を除去し、メタノールを用いて細胞を固定した。10分乾燥させた後、0.03 % クリスタルバイオレットを各シャーレ2 ml ずつ加えてコロニーの染色を行った。20 分静置後、染色液を捨て、乾燥させた。50 個以上の細胞で形成されるコロニー数を計数し、以下の式を用いて生存率を算出した。
【数１】
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【数２】
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【００２５】
イヌ口腔粘膜由来の悪性黒色腫細胞（MCM-N1）に対するスルファサラジンの殺傷効果は、マウス皮膚由来の悪性黒色腫細胞（B16F10）に対する効果よりも高いことが明らかとなった（図２）。この結果から、スルファサラジンは粘膜悪性黒色腫の治療により効果的であることが示された。
【００２６】
次に、放射線照射にスルファサラジン処理を併用した場合の細胞殺傷効果について検討を行った。MCM-N1をスルファサラジン5μMで24時間処理した後、各強度のX線を照射したのち、コロニー形成試験を行った。
その結果、MCM-N1細胞をスルファサラジンで処理すると、放射線による抗がん作用が増感することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明は、粘膜悪性黒色腫の治療法を提供するもので、医学および獣医学分野における利用が期待される。
【図１】
2020172473.tif 000006
【図２】
2020172473.tif 000007
【図３】
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