(57)【要約】      （修正有）【課題】食物栄養素及び他の適用のために、インビトロで自己複製供給源から拡張性のある食肉培養を行うための、新規で改善された方法を提供する。【解決手段】動物種の自己複製細胞株を筋原性転写因子で修飾して、筋原性転写因子修飾細胞株を生成すること、及び前記修飾細胞株を外因性調節により誘導して、前記細胞株を自己複製工程に維持するか、又は前記細胞株を筋原性分化工程に進めることを含む、培養された筋組織を生成する方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物種の自己複製細胞株を筋原性転写因子で修飾して、筋原性転写因子修飾細胞株を生成すること、及び
前記修飾細胞株を外因性調節により誘導して、前記細胞株を自己複製工程に維持するか、又は前記細胞株を筋原性分化工程に進めること、
を含む、培養された筋組織を生成する方法。
【請求項２】
前記筋組織が、家畜又は家禽種のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記筋組織が、家畜種のものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記家畜種が、ブタ又はウシである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記生成された筋組織が、ヒト及び非ヒトの食物消費に適合される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記自己複製細胞株が、胚性幹細胞株、人工多能性幹細胞株、胚体外細胞株、及び体細胞株からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記自己複製幹細胞株が、家畜又は家禽種のものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記自己複製幹細胞株が、家畜種のものである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記家畜種が、ブタ又はウシである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記自己複製幹細胞株が、ヒト及び非ヒトの食物消費を意図した任意の動物種のものであり、任意のコンパニオンアニマルであり、及び／又は研究若しくは治療薬開発に用いられる任意の動物種のものである、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記筋原性転写因子が、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＭＹＦ５、ＭＹＦ６、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、それらのパラログ、オーソログ、及び遺伝子変異体からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記筋原性転写因子が、ＭＹＯＤ１である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
未分化細胞ストック増殖のために第１の培地中に前記修飾細胞株を維持することをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞ストック増殖のためにドキシサイクリンを含む第１の培地中に前記修飾細胞株を維持することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
系譜特異的な分化のために第２の培地中に前記修飾細胞株を移し替えることをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
系譜特異的な分化のためにＥ２を含む第２の培地中で前記修飾細胞株を処理することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の培地が、古典的ＷＮＴシグナル伝達経路を活性化する試薬、エピジェネティックな調節のための試薬、又はそれらの組合わせをさらに含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の培地が、古典的ＷＮＴシグナル伝達経路を活性化する試薬をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記古典的ＷＮＴシグナル伝達経路を活性化する試薬が、ＧＳＫ３β阻害剤を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＧＳＫ３β阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、塩化リチウム、ＢＩＯ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ２１６７６３、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＴＷＳ１１９、チデグルシブ、ＩＭ−１２、１−アザケンパウロン（1-Azakenpullone）、ＡＲ−Ａ０１４４１８、及びＳＢ４１５２８６からなる群の１つ又は複数の構成員から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＧＳＫ３β阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２の培地が、エピジェネティックな調節のための試薬をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記エピジェネティックモジュレータが、５ＡＣ、ＲＧ１０８、スクリプタイド、酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、ＭＳ−２７５、ＣＩ−９９４、ＢＭＬ−２１０、Ｍ３４４、ＭＧＣＤ０１０３、ＰＸＤ１０１、ＬＢＨ−５８９、ツバスタチンＡ、ＮＳＣ３８２５、ＮＣＨ−５１、ＮＳＣ−３８５２、ＨＮＨＡ、ＢＭＬ−２８１、ＣＢＨＡ、サレルミド、ピメリン酸ジフェニルアミド、ＩＴＦ−２３５７、ＰＣＩ−２４７８１、ＡＰＨＡ化合物８、ドロキシノスタット（Droxinostat）、ＳＢ−９３９、ヒストンデアセチラーゼパラログ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼパラログ、ｔｅｔ−メチシトシンジオキシゲナーゼパラログ（tet-methycytosine dioxygenase paralogs）、ヒストンデメチラーゼパラログ、ヒストンメチルトランスフェラーゼパラログ、及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼパラログ、ヒストン、並びにＭｉ−２／ＮｕＲＤ及びＳＷＩ／ＳＮＦを含むクロマチンリモデリング複合体のサブユニットからなる群の１つ又は複数の構成員から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記エピジェネティックモジュレータが、ＤＮＡメチル化の阻害剤である、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
多核化された筋管を形成させることを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記筋組織が、骨格筋線維を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記古典的ＷＮＴシグナル伝達経路が、ＧＳＫ３β又はその基質ＣＴＮＮＢ１の遺伝子編集阻害により活性化される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法により作製されるインビトロ生成の筋組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、全体として参照により本明細書に取り込まれる、２０１３年１０月３０日出願の米国特許仮出願第６１／９６２，０６８号の利益を主張するものである。
【０００２】
配列表の組込み
本願と共に提出されたＡＳＣＩＩテキストファイル（ファイル名：52553_136621_ST25.txt；サイズ：２，９６２バイト；及び作成日：２０１４年１０月３０日）内の電子出願による配列表の内容は、全体として参照により本明細書に取り込まれる。
【０００３】
連邦政府後援による研究及び開発に関する記述
本発明は、米国政府の支援により、米国国立衛生研究所により授与された認可番号Ｒ０１ＨＤ０６９９７９／０００３２７２２の下でなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００４】
本開示は、家畜自律型（livestock-autonomous）食肉生産など、培養肉生産を増進する方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
「培養肉」（例えば、インビトロ細胞培養、組織工学、及び食品製造技法による動物自律型食肉生産）という概念的有望性には、生産効率の上昇、環境への影響の低減、料理への応用の拡大、栄養価の向上、虐待を行わない生産、及び従来式で生産された肉と比較して改善された食品安全性がある。しかし今日まで、拡張性があり経済的に耐えうる生産を支援するほど十分には、技術が進展していない。原型組織の現行の実験室規模での培養は、動物組織及び血清などの主要な動物成分を用いており、それにより動物自律型食肉生産の利点を大きく損なってきた。こうして、現在の方法は、培養肉生産による動物依存性を十分に解除して、「培養肉」の概念有望性を理解し、商業的に有利な製品を提供することができなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そのため、食物栄養素及び他の適用のためにインビトロで自己複製供給源から拡張性のある食肉培養を行うための新規で改善された方法を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
例示的実施形態は、骨格筋として分化する能力を有する細胞株を利用する骨格筋培養のための拡張性のある基盤を提供する。特定の態様において、該細胞株は、畜牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、スイギュウ、ウサギなどの家畜のものである。特定の態様において、該細胞株は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガン、ハトなどの家禽のものである。特定の態様において、該細胞株は、野生のシカ、キジ類の鳥、水鳥、ノウサギなど、一般的な狩猟動物種のものである。特定の態様において、該細胞株は、特定の魚、甲殻類、軟体類、頭足綱、クジラ目、ワニ類、カメ、カエルなど、野生の漁場若しくは水産養殖から、又は娯楽のために商業的に回収される水生又は半水生種のものである。特定の態様において、該細胞株は、外国産、保護種、又は絶滅種の動物のものである。特定の態様において、該細胞株は、骨格筋組織形成(skeletal muscle tissue specification)のための能力を示す任意の後生動物種のものである。特定の態様において、該細胞株は、ヒト、霊長類、ラット及びマウスなどのげっ歯類、並びにイヌ、ネコ、ウマなどのコンパニオンアニマルなど、研究又は治療目的のものである。特定の具体的態様において、任意の生物体から得られた細胞株が、自己複製幹細胞株である。特定の態様において、選択された細胞株は、「遺伝子スイッチ」により修飾されて、培養肉生産のために細胞から骨格筋への急速かつ効率的な変換を誘導する。例示的実施形態において、先の、又は他の態様は、選択された自己複製細胞株を筋原性転写因子により修飾して筋原性転写因子修飾細胞株を生成すること、及びそのような修飾細胞株を外因性調節により誘導して、別の自己複製又は分化工程に向けること、を含む方法により遂行され得る。
【０００８】
特定の態様において、該自己複製細胞株は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、体細胞株、又は筋電位を有する胚体外細胞株からなる群から選択される。特定の態様において、該細胞株は、食物消費を目的とする種に由来する。筋原性転写因子の例示的で非限定的な実施例としては、単独又は組合わせでの、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＭＹＦ５、ＭＹＦ６、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、それらのパラログ、オーソログ、遺伝子変異体、又は本明細書にさらに記載された筋原性転写因子の各プロモータ認識ＤＮＡ配列の転写活性化アゴニストが挙げられる。
【０００９】
特定の具体的態様において、誘導性ＭｙｏＤ転写因子が、分化系譜形成物（differentiation lineage specifier）として用いられ得る。特定の具体的態様において、ブタから誘導された多能性細胞株Ｏ２Ｋが、自己複製細胞株として使用され得る。１つの具体的態様において、該方法は、Ｏ２Ｋ幹細胞株を誘導性ＭｙｏＤ転写因子で修飾して筋原性転写因子修飾Ｏ２ＫＭ細胞株を生成すること、及びそのようなＯ２ＫＭ細胞株を外因性調節により誘導して自己複製又は分化工程に向けること、を含む。前述の修飾ステップは、該細胞株を染色体挿入ベクターで修飾してＭＹＯＤ１転写因子と、構成活性化プロモータ領域からのＥＳＲ１リガンド結合ドメインとの誘導性融合物を構成的に発現すること、をさらに含み得る。例えば、翻訳された誘導転写物質（例えば、ＭｙｏＤＥＲ）の誘導性活性は、ＥＳＲ１アゴニスト（例えば、１７−βエストラジオール（Ｅ２））の存在下で条件付きで活性化され得る。
【００１０】
特定の態様において、誘導ステップは、ダブルスイッチメカニズムにより調節された自己複製サブステップ及び分化サブステップをさらに含み得る。自己複製サブステップにおいて、修飾細胞株の未分化基底状態が、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）の存在などにより保持され、それにより該細胞株が、多能性導入遺伝子ＰＯＵ５Ｆ１及びＫＬＦ４の誘導性発現により幹細胞自己複製状態で維持される。未分化サブステップにおいて、修飾細胞株は、ＤＯＸの非存在下でＥ２などで処理されるが、該細胞株は、誘導性ＭｙｏＤ転写因子により骨格筋細胞、即ち筋原性系譜に効率的に形成されて、紡錘状形態を有する特徴的な細長い細胞を生じる。低マイトジェン性の培地でさらに培養すると、誘導された筋細胞が骨格筋線維の前駆体である多核の筋管に融合し得る。低マイトジェン性の培地での長期培養に続いて、ＭＹＯＧ、ＤＥＳ、ＭＹＨＣの高発現；融合；及び収縮能を有する筋原線維の発達により示される多核の筋管が、最終分化が可能な骨格筋線維に成熟する。分化サブステップは、古典的ＷＮＴシグナル伝達経路を活性化させて細胞死を予防し、筋原性分化を容易にするために、培地に特定の試薬を添加すること、及び筋原性遺伝子発現を増加させるために、エピジェネティックモジュレータを培地に添加してクロマチン構造を改変すること、をさらに含み得る。
【００１１】
本開示の特定の態様は、無血清培地中での、内臓肉を含まない食肉製品を構成する主な組織系譜である骨格筋への非限定的な複製能力及び効率的変換のために、遺伝子的に強化された細胞を使用する。そのような方法は、拡張性のある組織工学的アプローチと併せれば、動物自律型培養肉生産のために非限定的量の動物組織の培養を可能にすることによって、食肉を生産して消費者に販売する方法に革命を起こすことができる。企図されるさらなる適用としては、薬物スクリーニングのためのインビボ異種移植の利用及びインビトロモデル、発達生理学、並びに発達生物学のためのインビボ異種移植使用及びインビトロモデルが挙げられる。
【００１２】
本開示のさらなる特色及び利点、並びに本開示の様々な実施形態の構造及び操作を、任意の添付図面を参照しながら以下により詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＭｙｏＤＥＲのＤＮＡ配列を示す。
【図２】図２は、未分化細胞株の増殖、又は骨格筋系譜形成のためのダブルスイッチ調節メカニズムを含む方法の略図である。
【図３】図３は、ＤＯＸ又はＥ２により調節された筋原性修飾Ｏ２ＫＭ細胞株に適用されたダブルスイッチメカニズムを示す略図である。
【図４Ａ】図４Ａは、選択可能なＭｙｏＤＥＲ導入遺伝子発現カセットの略図である。矢印及び四角は、それぞれプロモータ及び遺伝子配列を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、抗ＭＹＯＤ１抗体によりブラスチシジン（blastidicin）で選択されたＯ２Ｋ中でのＭｙｏＤＥＲ導入遺伝子発現のウェスタンブロット画像検出を示す。導入遺伝子発現カセットで修飾されたＯ２Ｋは、Ｏ２ＫＭと呼称する。ＴＵＢＡ（α−チューブリン）は、内部負荷対照として検出されている。
【図５】図５は、親Ｏ２Ｋ細胞株として自己複製条件で安定していてコンパクトなコロニー形態を呈したＯ２ＫＭ細胞を示す画像である。
【図６】図６は、ポリ−Ｄリシン＋ラミニン＋マトリゲルコーティングディッシュ＋／−フェノール不含自己複製培地（ＳＲＭ）用０．２５μＭ  ５−アザシチジン（５ＡＣ）で５％Ｏ２の下、３日間培養し、その後、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１補充のフェノールレッド不含筋原性誘導培地（ＭＩＭ）中で、１７−βエストラジオール（Ｅ２）を用いて、又は用いずに、２０％Ｏ２下で２日間、ＭｙｏＤＥＲ融合タンパク質が誘導されたＯ２ＫＭを示す画像のパネルである。Ｃ．Ｅ２誘導２日目のＯ２ＫＭの位相コントラスト画像。
【図７】図７は、示された２日間Ｅ２誘導レジメンに続いて回収された分化Ｏ２ＫＭ細胞溶解物中のＭＹＯＤ１（ＭｙｏＤ）、ＭＹＦ５（Ｍｙｆ５）、及びＭＹＯＧ（ミオゲニン）のウェスタンブロット分析を示す。ＭｙｏＤＥＲ移動：約７５ｋＤ。予測された内在性ＭＹＯＤ１移動：４５〜５０ｋＤ。
【図８】図８は、２日間の１０μＭ  Ｅ２誘導タイムコース前及び後の５ＡＣ暴露Ｏ２ＫＭ培養物中の筋細胞表面マーカＮＣＡＭ（アレクサ５６８）及び核（ＤＡＰＩ）の免疫蛍光検出画像を示す。
【図９】図９は、ｉ．ＳＲＭ中、５％Ｏ２下のポリ−Ｄリシン＋ゼラチン＋ラミニンで培養された基底状態未分化Ｏ２Ｋコロニーと、ｉｉ．〜Ｖｉ．パネルｉ．に示された基底状態から、ｉｉ．０μＭ、ｉｉｉ．１μＭ、ｉｖ．３μＭ、ｖ．６μＭ、又はｖｉ．９μＭのＣＨＩＲ９９０２１を補充された２０％Ｏ２下の分化培地（ＤＭ）中で２日間分化した接着コロニーと、の位相差画像のパネルを示す。接着コロニーには、６μＭ（ｖｉｉ．）又は９μＭ（ｖｉｉｉ．）のＣＨＩＲ９９０２１に暴露された培養物中には胚様体として多く存在するものはなかった。
【図１０】図１０は、分化の際の接着Ｏ２Ｋ細胞集団の変化を示した棒グラフを示す。パーセント値は、基底状態から分化する前に計数された接着細胞（図９のパネルｉ．に示す）に対する、示された濃度のＣＨＩＲ９９０２１の存在下で２日後の培養物中で計数された接着細胞（図９のパネルｉｉ．〜ｖｉ．に示す）の比率を表す。各計数での培養条件でｎ＝３。
【図１１】図１１は、アネキシンＶ標識細胞のフローサイトメトリー分析の棒グラフを示す。未分化Ｏ２Ｋコロニーを、分析前１日間、０、１、３又は６μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１の存在下の分化培地中、２０％Ｏ２下で培養した。
【図１２】図１２は、示された濃度のＣＨＩＲ９９０２１の存在下、基底状態（図９に示された）から分化された培養物中のＧＳＫ３β基質セリン３３、３７及びトレオニン４１での相対的ＣＴＮＮＢ１（β−カテニン）レベル及びリン酸化（ｐ−ＣＴＮＮＢ１）のウェスタンブロット分析を示す。培養物を５０ｎＭ  カリクリンＡ及び３０μＭ  ＭＧ−１３２に３時間暴露した後、回収して、拮抗分析のためにｐ−ＣＴＮＮＢ１の検出可能なレベルを安定化させた。
【図１３Ａ】図１３Ａは、図１２に示されたｐ−ＣＴＮＮＢ１／ＣＴＮＮＢ１のバンドの濃度比を示したグラフを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、図１２に示されたＣＴＮＮＢ１／ＴＵＢＡのバンドの濃度比を示したグラフを示す。
【図１４】図１４は、分化マーカの経時変化によるウェスタンブロット分析を示した画像を示す。ＣＨＩＲ９９０２１の存在下で基底状態から分化されたＯ２Ｋ培養物中の多能性マーカＰＯＵ５Ｆ１及びＫＬＦ４、並びに前筋原性（pre-myogenic）沿軸中胚葉マーカＰＡＸ３の発現レベル。
【図１５】図１５は、５−アザシチジン（５ＡＣ）の非存在下（左パネル）又は存在下（右パネル）で分化されたＯ２ＫＭ筋細胞の最終分化の画像を示す。左パネル（＋５ＡＣ）の細長い多核化した筋管と対照的な左パネル（−５ＡＣ）の平坦な形態の筋細胞誘導体に留意されたい。
【図１６】図１６は、図９のパネルｉ〜ｉｉと同様に、培養物の２４時間移行の前及び後のアポトーシス細胞のアネキシンＶ標識を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、分化環境への移行（１２〜４８時間）の前（０時間）及び後（１２〜４８時間）の基底状態コロニーの全長ＣＰＰ３２（約３２ｋＤのプロカスパーゼ３ａ）及び大きな切断断片（約１７ｋＤの切断されたカスパーゼ３ａ）のウェスタンブロット検出を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、示されたＣＨＩＲ９９０２１レベルの存在下、分化環境へ４２時間移行させた後のコロニー中の全長ＣＰＰ３２及び切断断片のウェスタンブロット検出を示す。
【図１８】図１８は、２日間、６μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１含有分化環境に置き、そしてさらに１日間（３日目、左パネル）又は３日間（５日目、右パネル）のポリ−Ｄリシン＋ラミニン＋マトリゲルコーティング基質へ移し替えた後に形成された胚様体のアウトグロース形態を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａは、ＫＯＳＲを含有する分化環境において、３ｉ、ＤＯＸ、ｈＬＩＦ及びＥ２の非存在下で培養された非修飾ｐｉＰＳＣの溶解物のウェスタンブロットを示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ＤＯＸ、ＬＩＦ及び３ｉの存在下で培養されたＭｙｏＤＥＲ修飾ｐｉＰＳＣの溶解物のウェスタンブロットを示す。ＭＹＯＤＥＲ修飾ｐｉＰＳＣを、自己複製又は増殖環境で３日間培養した。
【図２０Ａ】図２０Ａは、Ｏ２ＫＭ増殖及び誘導レジメンと、その後の最終分化レジメンの略図である。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、筋管形態及び立体構造を示す。誘導後に（２日目）、ｐｉＰＳＣは、増殖及び誘導レジメンの間に５ＡＣに暴露された場合には細長い異方性の屈折した筋管として発達した。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、６日目までのミオシン重鎖の均一な発現を示す。
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、筋管の多核化を示す。左パネル：４日目の最終分化培養物の拡大画像。つながった矢印は、１つの筋管内の複数の核を示す。右パネル：ヨウ化プロピジウム標識及びフローサイトメトリー分析による筋管の倍数性による筋核分布。ｎ＝３で標準偏差と共に示した。
【図２０Ｅ】図２０Ｅのウェスタンブロットは、８日経過の間のデスミン（ＤＥＳ）及びミオゲニン（ＭＹＯＧ）の発現増加を示す。
【図２０Ｆ】図２０Ｆは、最終分化と一致した細胞周期停止を示す。
【図２０Ｇ】図２０Ｇは、６日目の筋管の透過電子顕微鏡測定を示す。筋節構造単位が、一列（左パネル）、及び千鳥状の並行の列（右パネル）に並んでいた。
【図２１Ａ】図２１Ａは、非同期の単一細胞のトランジェント周期（左、中及び右パネル）が自発的に収縮した６日目の筋管亜集団において観察されたことを示す。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、６日目の筋管内での１．０Ｈｚフィールド刺激によるカルシウムトランジェント周期のＦＯＶ活性化及び同期化を示す。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、１０ｍＭカフェインによる６日目の筋管のＦＯＶカルシウムトランジェント活性化を示す。
【図２１Ｄ】図２１Ｄ：１００ｍＭアセチルコリンによる７日目の筋管内のカルシウムトランジェント活性化の単一細胞分析。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
記述的裏づけを与えることを必要とする限りにおいて、添付の特許請求の範囲の題目及び／又は本文は、全体として参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載及び請求された例示的実施形態が、本明細書に具体的に開示された、又は開示されていない任意の引用された特色、要素又はステップの非存在下で適宜、実践され得ることは、この記述された説明の読者全てに理解されるであろう。
【００１５】
本開示を通して、用語「a」又は「an」の付く物体は、その物体の１つ又は複数を指し、例えば「a polyncleotide」は、１つ又は複数のポリヌクレオチドを表すと理解する。そのため用語「a」（又は「an」）、「１つ又は複数」及び「少なくとも１つ」は、本明細書では互換的に用いられ得る。
【００１６】
さらに、本明細書で用いられる「及び／又は」は、２つの特定の特色又は成分のそれぞれの、その他を含む、又は含まない具体的開示ととらえられなければならない。したがって、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」などの語句で用いられる用語「及び／又は」は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ（単独）」及び「Ｂ（単独）」を含むものとする。同様に「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの語句で用いられる用語「及び／又は」は、以下の態様のそれぞれを包含するものとする：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）。
【００１７】
態様が言語「含んでいる」と共に本明細書に記載されている場合はいつでも、「からなる」及び／又は「本質的に・・・からなる」に関して記載された他の類似の態様も提供される。
【００１８】
他に定義されなければ、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語が、本開示を対象とする当業者に共通して理解されるものと同じ意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press;及びthe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、当業者に、本開示で用いられる用語の多くの一般的な辞典を提供する。
【００１９】
単位、接頭辞、及び記号は、Systeme International de Unites（ＳＩ）の許容された形態で表されている。数値範囲は、範囲を画定する数を含む。他に断りがなければ、核酸配列は、５’から３’まで記載されており、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に左から右に記載されている。本明細書に提供された項目は、本明細書を全体として参照することによって得ることができる本開示の様々な態様の限定ではない。
【００２０】
本明細書に記載された方法は全て、本明細書に他に断りがなければ、任意の適切な順序で実施され得る。
【００２１】
本明細書内の言語又は用語法はいずれも、任意の請求された要素を本質的又は重大なものとして示していると解釈されるべきではない。
【００２２】
本明細書の値範囲の引用は、単にその範囲内の各別々の値を個別に参照する簡略な方法となり、各別々の値は、本明細書で個別に引用されるかのごとく、本明細書に取り込まれるものとする。値の具体的範囲が提供されている場合、間にある各値が本明細書に含まれ、より小さな下位範囲もまた含まれることを理解する。
【００２３】
本明細書において、インビトロでの細胞供給源から、遺伝子操作された組織又は他の食用製品などの食肉を培養するために、機能的骨格筋を生成する新規で改善された方法が提供される。そのような方法は、例えば家畜自律型食肉生産に企図され、その食肉は、ヒト、コンパニオンアニマル、死体が食用に使用される飼いならされた、若しくはつながれた動物、サービス動物、保護動物種、実験目的で用いられる動物、又は細胞培養物により食用品又は栄養成分として使用することを意図した任意の後生動物組織又は細胞由来食用製品である。
【００２４】
同じく、本明細書に開示された様々な態様のいずれかにおいて作製されるインビトロ生産された動物組織、例えば筋組織が提供される。特定の態様において、細胞供給源は、幹細胞供給源、例えば自己複製幹細胞株である。該方法の特定の態様は、意図する種由来の筋原性で誘導性の導入遺伝子修飾自己複製細胞株を使用する。特定の態様において、意図する種は、家畜及び家禽種をはじめとする任意の食用種であり得る。特定の態様において、意図する種は、畜牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、スイギュウ、ウサギなどの家畜種である。特定の態様において、意図する種は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガン、ハトなどの家禽種である。特定の態様において、意図する種は、野生のシカ、キジ類の鳥、水鳥、ノウサギなど、一般的な狩猟動物種である。特定の態様において、意図する種は、特定の魚、甲殻類、軟体類、頭足綱、クジラ目、ワニ類、カメ、カエルなど、野生の漁場若しくは水産養殖から、又は娯楽のために商業的に回収される水生又は半水生種である。特定の態様において、意図する種は、外国産、保護種、又は絶滅動物種である。特定の態様において、意図する種は、骨格筋組織特定のための能力を示す任意の後生動物種である。特定の態様において、意図する種は、ヒト、霊長類、ラット及びマウスなどのげっ歯類、並びにイヌ、ネコ、ウマなどのコンパニオンアニマルなど、研究又は治療目的のものである。
【００２５】
特定の態様において、細胞株は、細胞株を自己複製工程に維持する、又は筋原性分化に方向づける、のいずれかのために、ダブルスイッチメカニズムにより調節される。
【００２６】
本明細書に開示された態様の親／宿主細胞株は、不死化（自己複製）していて、分化、リプログラミング、形成、さもなければ骨格筋系譜への変換を行う能力を有する、例えば筋原性変換に向ける１種又は複数の成分を含むレジメンに従う、という特性を有する。幹細胞の３つの分類：（１）系譜が限定された初代成体前駆幹細胞単離、（２）系譜が限定された不死化細胞株、及び（３）多能性幹細胞株は、拡張性のある培養のための細胞供給源として使用され得る。これらのアプローチのそれぞれが、培養された食肉製品の細胞供給源として働く上で利点及び欠点を有することが決定された。
【００２７】
系譜が限定された初代成体前駆幹細胞単離。これらは、骨格筋などの食肉製品を構成する、系譜の定まった成体前駆体細胞を包含する。骨格筋前駆体細胞としては、衛星細胞、筋芽細胞及び筋細胞が挙げられるが、これらに限定されない。それらの利点としては：ｉ）初代成体前駆細胞が、特異的系譜に限定され、所望の系譜へのインビトロ形成をほとんど又は全く必要としないこと、及びｉｉ）初代成体前駆細胞が、系譜形成のために遺伝子修飾を必要としないこと、が挙げられる。それらの欠点としては、ｉ）それらが屠殺されたばかりの動物死体から回収されるか、又は観血的生検から獲得されなければならないこと、が挙げられる。どちらの方法も、家畜に依存し、家畜が工程で用いられる限り、家畜の自律型生産の利益を損ない、ｉｉ）初代細胞単離は、高度に非効率的な工程である。所望の細胞は、供給源の組織の画分を含む。所望の細胞の部分的画分が、単離工程に残留する。所望の細胞系譜は、残留する細胞の混合集団から単離されなければならず、更なる精製及び増殖ステップを必要とし；ｉｉｉ）初代成体前駆細胞は、細胞が増殖能力を喪失する前に限定された回数だけ分裂させることが可能な「ヘイフリック限界」を受ける。その上、初代成体前駆細胞は、継代の数と一致するように最終分化する能力を喪失する。したがってさらなる細胞を初代細胞単離物から獲得し、それにより１回の単離からの培養拡張性を限定しなければならず、ｉｖ）骨格筋などの培養された食肉製品に適用可能な組織系譜の初代細胞培養物が、付着依存性であり、つまり培養物の体積拡張性を限定する方法である。浮遊培養では、これらの細胞は、アノイキスにより細胞死を受け易い場合がある。
【００２８】
系譜が限定された不死化細胞株。これらは、最終分化又は系譜限定の能力を保持しながら、無期限に自己複製するように遺伝子改変された、系譜の定まった初代細胞である。それらの利点としては、ｉ）「永久に自己複製し」（即ち、「ヘイフリック限界」を受けず）、拡張性及び家畜自律型の培養のために無期限に増殖することができること；ｉｉ）特定の系譜に限定せず、更なるインビトロ形成をほとんど、又は全く必要としないこと、が挙げられる。それらの欠点としては、ｉ）培養食肉製品（例えば、骨格筋）に適用可能な系譜に沿って分化する能力を有する特定の種から得られた不死化系譜限定細胞株が、発達を必要とし得ること；ｉｉ）系譜が定まった細胞株の培養が付着依存性であり、拡張性を限定すること、が挙げられる。浮遊培養において、系譜が定まった細胞株は、アノイキスにより細胞死を受け易く場合があり、ｉｉｉ）「不死化」させる細胞形質転換（複数可）は、遺伝子修飾を必要とする。最終分化の能力を妨害することなく、適用可能な初代細胞集団を不死化するのに必要な遺伝子修飾が、十分に特徴づけられていない。
【００２９】
多能性幹細胞株：多能性幹細胞株は、未分化状態で自己複製する能力を維持するか、或いは任意の組織系譜に分化する、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む。それらの利点としては、ｉ）一般に多能性幹細胞株が、初代又は不死化系譜限定細胞株よりも高速で増殖し、生産工程におけるバイオマス増殖に必要な時間が低減すること；ｉｉ）多能性幹細胞を浮遊培養において胚様体として培養し、それにより培養容量単位あたりの培養拡張性を増大し得ること、が挙げられる。その上、胚様体は、マイクロモールド及びバイオプリンティング組織アセンブリ法と適合性のある「バイオインク」として培養することができ、ｉｉｉ）不死化系譜限定細胞株と同様に、多能性幹細胞が、「ヘイフリック限界」を受けず、拡張性のある家畜自律型培養のために無期限に増殖し得る。それらの欠点は、ｉ）特定の種に由来する真正の胚性幹細胞株が、発達を必要とし得ること；ｉｉ）ｉＰＳＣのリプログラミング及び自己複製のための方法が、導入遺伝子依存性であり得ること、が挙げられる。こうしてｉＰＳＣ多能性は、未分化状態の誘導及び自己複製に遺伝子修飾を必要とし得る。効率的ｉＰＳＣ分化は、所望の系譜形成に不利な転写ネットワーク活性化との競合を回避するために、分化状態と互いに排他的な未分化状態のリプログラミング及び維持に用いられる導入遺伝子をサイレンシングするためのメカニズムを必要とし、ｉｉｉ）系譜限定初代成体前駆幹細胞及び不死化細胞株に比較して、多能性幹細胞は一般に、所望の系譜形成を発展及び強化するさらなる系譜形成ステップを必要とする。
【００３０】
先に提供された３つの幹細胞分類に加えて、他の親／宿主細胞株もまた、本明細書で企図される。例えば、過去に奇形腫アッセイにより筋電位が確定されている人工栄養膜細胞株（胚型以外の非多能性で非体細胞性の不死化細胞を表す）も、筋原性変換に適し得る。例えば、一部が多能性にリプログラミングされた体細胞株は、筋電位を有し得るが、３つの胚性生殖細胞層を表す奇形腫を形成することができない。例えば存在が論争の的になっているＳＴＡＰ細胞株（刺激惹起性多能性獲得）は、筋肉生成（ｍｙｏ−ｐｏｔｅｎｔ）及び自己複製が可能である。
【００３１】
Ｏ２Ｋ細胞株。Ｏ２Ｋ細胞株は、ブタ着床前胚の内部細胞塊から樹立された人工多能性幹細胞株である。Ｏ２Ｋ細胞株を研究して、Ｏ２Ｋの自己複製状態が「Ｔｅｔ−Ｏｎ」誘導システムを用いたドキシサイクリン（即ち、ＤＯＸ）によるＰＯＵ５Ｆ１及びＫＬＦ４誘導遺伝子の転写活性化により維持され得ることが、発見された。
【００３２】
ＭＹＯＤ１転写因子。ＭＹＯＤ１（即ち、ＭｙｏＤ）は、骨格筋系譜形成の最も有力な調節因子である。図１に示された（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ネズミＭＹＯＤ１遺伝子と、ヒトエストロゲン受容体αのリガンド結合ドメインをコードする配列との遺伝子融合物からなるＭｙｏＤＥＲ構築物が、過去に記載された。図１において、ＭｙｏＤＥＲは、ＮａｒＩ制限エンドヌクレアーゼ消化部位でのネズミＭＹＯＤＩ遺伝子と、ＥＳＲ１（即ち、ヒトエストロゲン受容体α）ヌクレオチド８４４−１７８１のリガンド結合ドメインコード配列との遺伝子誘導体からなる。特定されていない配列及びＣｌａ  １リンカー配列もまた、存在する。ＭｙｏＤＥＲ融合構築物の筋原性形成活性は、エストロゲン受容体αリガンドである１７β−エストラジオール（即ち、Ｅ２）の添加により翻訳後に誘導される。１７−βエストラジオールの非存在下では、ＭｙｏＤＥＲは、依然として不活性状態である。ＭｙｏＤＥＲ構築物は、本明細書において「誘導性ＭｙｏＤ」と称される。
【００３３】
ここで図２を参照すると、一態様は、細胞ストック増殖、即ち、拡張性のある培養を継続するために細胞ストックの保持に必要な自己複製条件での細胞株の増殖である。別の態様は、系譜形成／分化、即ち、更なる組織培養工程のために筋原性系譜分化を誘導することである。したがって、特定の態様は、２つの主なステップ：ｉ）選択された自己複製細胞株を筋原性転写因子で修飾して、筋原性転写因子修飾細胞株を生成するステップ、及びｉｉ）外因性調節によりそのような修飾細胞株を誘導して、自己複製工程に維持するか、又は分化工程に進めるステップ、を含むように要約され得る。本明細書で用いられる、筋原性転写因子で細胞株を「修飾すること」は、修飾された細胞株が筋原性転写因子を発現するように、筋原性転写因子を動作可能にコードする（トランスフェクション、形質導入、形質転換などによる）核酸ベクター又は構築物を、細胞株に挿入することを指す。特定の態様において、挿入された筋原性転写因子は、誘導性のある筋原性転写因子により細胞修飾された細胞株を生成するように誘導性発現される。本明細書で用いられる「誘導性に」、「誘導性」などは、筋原性転写因子などの遺伝子産物の活性を外因的に調節するために用いられ得る任意の遺伝子工学的アプローチを指す。誘導性アプローチとしては、リガンド誘導性転写因子技術（例えば、ｔｅｔ−ｏｎ、ｔｅｔ−ｏｆｆ、ＲｅｏＳｗｉｔｃｈ）、部位特異性組換え技術（例えば、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ、ｆｌｐ−ＦＲＴ）、トランスポゾン技術（例えば、スリーピングビューティー、ピギーバック）、リガンド結合受容体融合技術（例えば、エストロゲン、プロゲステロン、アンドロゲン、甲状腺ホルモン、グルココルチコイドホルモン、タモキシフェンリガンドアゴニスト）、及び筋原性転写因子遺伝子を担う染色体外発現ベクターの一過性トランスフェクションが挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様において、核酸構築物又はベクターは、染色体により修飾された細胞株内に取り込まれる。自己複製細胞株の代表的例としては、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び不死化系譜限定細胞株からなる群から選択されるものが挙げられる。特定の態様において、そのような自己複製細胞株は、食物消費、又は研究、又は治療目的を意図した種に由来する。筋原性転写因子の代表的例としては、単独又は組合わせでの、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＭＹＦ５、ＭＹＦ６、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、それらのパラログ、オーソログ、遺伝子変異体,又は本明細書に開示された筋原性転写因子の各プロモータ認識ＤＮＡ配列の転写活性化アゴニストが挙げられる。
【００３４】
ここで、ＤＯＸ又はＥ２により調節された筋原性修飾Ｏ２ＫＭ細胞株のダブルスイッチメカニズムの例示的略図を含む図３を参照する。図３に示された通り、Ｏ２ＫＭ幹細胞の自己複製工程の間に、多能性導入遺伝子ＰＯＵ５Ｆ１及びＫＬＦ４の発現が、自己複製培地（ＳＲＭ）中のＤＯＸの存在下で誘導されるが、ＤＯＸが非存在の場合には、そのような発現は抑制される。同様に、Ｏ２ＫＭ筋原性分化工程の間、筋原性分化は、筋原性誘導培地（ＭＩＭ）中のＥ２の存在下で誘導性ＭｙｏＤ導入遺伝子により活性化されるが、Ｅ２が非存在の場合には、そのような方向づけられた分化は不活性である。
【００３５】
特定の態様は、細胞死を予防してクロマチンのエピジェネティック状態を調節するためにＭＩＭ中にＥ２以外のさらなる試薬を含む分化／形成方法を提供する。例えばグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（Glyogen Synthase Kinase-3β）（ＧＳＫ３β）阻害剤を、ＳＲＭ及びＭＩＭに添加して、古典的ＷＮＴシグナル伝達経路を活性化し、その一方で筋原性分化を促進して、ＤＯＸ除去時の細胞死を減少させることができる。理論により限定されるわけではないが、特定の態様において、エピジェネティックモジュレータが、筋原性転写因子によりクロマチン活性化を改変し、及び／又はＭＹＦ５などの筋原性転写因子の発現を増強する。
【００３６】
ＧＳＫ３β阻害が、小分子によるターゲティングを含むことを理解する。遺伝子編集もまた、ＷＮＴシグナル伝達活性化による骨格筋形成を増強するための有望なアプローチである。例えばＧＳＫ３βは、配列特異性挿入又は欠失技術（即ち、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ）のいずれかでＧＳＫ３β対立遺伝子を変異させることにより、宿主／親細胞株中で阻害され得る。内因性プロモータ領域の変異を利用して、ＧＳＫ３βの発現を抑制することができる。或いは、ＧＳＫ３βのオープンリーディングフレームを、ＧＳＫ３β活性を無効にしたのと同じ方法を利用して欠失又は変異させてもよい。同様に、ＧＳＫ３βの下流のリン酸化ターゲットであるβ−カテニン（ＣＴＮＮＢ１）を、ＧＳＫ３βによりリン酸化された残基をコードするコドンで変異させ、それによりＧＳＫ３βによるＣＴＮＮＢ１のリン酸化を予防して、構成的に活性で安定化したＣＴＮＮＢ１を得てもよい。そのような「遺伝子編集」方法は、更なる化学物質が該工程の間のＧＳＫ３β阻害に必要とならないため、小分子ターゲティングによりＧＳＫ３β阻害のコストを削減し、食肉製品の安全性プロファイルを潜在的に改善するであろう。Ｗｎｔシグナル伝達阻害の第三のアプローチが、ＧＳＫ３βに対するアンチセンス核酸阻害物質、又はＷＮＴ経路に拮抗する他の因子の使用を含むことが、企図される。これらは、配列ターゲティングｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを使用したＲＮＡ干渉方法を包含し得る。
【００３７】
特定の具体的態様は、例えばＤＯＸ除去時に、細胞生存を促進するＧＳＫ３β阻害剤の使用を提供する。ＧＳＫ３β阻害剤の１つの例示的実施例は、ＣＨＩＲ９９０２１である。更なる代表的ＧＳＫ３β阻害剤としては、塩化リチウム、ＢＩＯ、ＳＢ２１６７６３、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＴＷＳ１１９、チデグルシブ、ＩＭ−１２、１−アザケンパウロン（1-Azakenpullone）、ＡＲ−Ａ０１４４１８、及びＳＢ４１５２８６を挙げることができるが、これらに限定されない。理論に結びつけるわけではないが、ＤＯＸと同調して、未分化細胞の両方の自己複製が、ＧＳＫ３β阻害を含むＷＮＴシグナル伝達経路により維持されると考えられる。
【００３８】
理論に結びつけるわけでも、任意の具体的な代表例に限定されるわけでもないが、Ｎ−２及びＢ−２７代替血清を補充された培地からＤＯＸ及びＧＳＫ３βの両方の阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１を一時的に除去すると、４８時間以内に分化しているＯ２Ｋ親細胞株の大量の細胞死が沈殿することが観察された。ＣＨＩＲ９９０２１の存在下でのＤＯＸの除去は、分化しているＯ２Ｋを生存させた。ＧＳＫ３β阻害剤の非存在下での分化しているＯ２Ｋ細胞による死滅、及びＧＳＫ３β阻害剤の存在下での相対する生存が、形態学、細胞接着アッセイ、切断したカスパーゼ−３の蓄積、及びアネキシンＶ標識により確認された。親Ｏ２Ｋ細胞株において、ＧＳＫ３βの阻害は、古典的ＷＮＴシグナル伝達経路の下流の正のエフェクターであるリン酸化基質ＣＴＮＮＢ１の安定化と活性化を調和的にもたらした。ＷＮＴシグナル伝達は、インビボ及びインビトロ両方で、未分化基底状態の多能性からの両方の中胚葉形成、非パターン化された中胚葉からの前筋原細胞の濃縮（pre-myogenic enrichment）、及び系譜の定まった筋原細胞の最終分化において、重大な役割を担う。それと一致して、ＤＯＸの非存在下、及びＧＳＫ３β阻害剤の存在下でのＯ２Ｋ株の長期培養が、ＰＡＸ３の発現、並びにＰＯＵ５Ｆ１及びＫＬＦ４発現の同時喪失に示される通り、前筋原性沿軸中胚葉への分化を支援した。さらに、ＧＳＫ３β阻害剤は、５ＡＣと併用すると、分化しているＯ２Ｋにおいて筋原性転写因子ＭＹＦ５の発現を増強した。その上、ＣＨＩＲ９９０２１などのＧＳＫ３β阻害剤は、表１に示された通り、筋原性ネズミＣ２Ｃ１２細胞株から多核化した筋管への最終分化を促進した。
【００３９】
表１は、５日の分化時間経過に先立ち、筋管形成のサイズ及び程度の評価により、ネズミＣ２Ｃ１２筋芽細胞の最終分化に及ぼす細胞外マトリクスエフェクター（即ち、ゼラチン、ポリ−Ｄ−リシン、ラミニン、マトリゲル）及び可溶性因子（Ｅ２、ＣＨＩＲ９９０２１）の影響を列挙している（培養物を、強い筋管形成を示す［＊＊＊＊］から、検出不能の筋管形成を示す［−］までスコア付けした）。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
特定の態様において、ＧＳＫ３β阻害剤は、（１）ＤＯＸ除去に続く細胞死を抑制する、（２）前筋原性状態への分化を支援する、（３）筋原性形成を促進する、及び（４）最終分化を促進する、という多機能により、分化の際に培地（ＤＯＸの非存在下）に保持されていれば、誘導性筋原性転写因子に方向づけられた系譜形成と、それに続いて得られた筋細胞による最終分化状態に適合性があると思われる。例えばＣＨＩＲ９９０２１は、次のＥ２による系譜形成及び最終分化工程の間、ＤＯＸ除去後のＯ２ＫＭ培養物中に保持された。
【００４２】
しかし、前述のＧＳＫ３β阻害剤が抑制された培養レジメンは、Ｏ２ＫＭによる細胞生存と、特有の筋細胞様紡錘状形態を有する分化細胞への筋原性系譜形成とを支援したが、得られた細胞は、屈折した細長い筋管に最終分化することができなかった。それゆえ、その他の方法では筋原性を許容しない細胞で筋原性遺伝子の発現を増加させ、系譜の定まった筋細胞から成熟した筋線維への最終分化を促進するために、エピジェネティックモジュレータを用いた。Ｏ２ＫＭの最終分化を可能にするために、細胞を５−アザシチジン（５ＡＣ）の存在下で７２時間培養した後、Ｅ２誘導の間の４８時間はＤＯＸを除去し、その後さらに６日間、最終分化させた。５ＡＣの存在下で培養されたＯ２ＫＭ由来筋細胞において、ＭＹＦ５の発現が増加され、細胞が屈折した筋原線維形態を呈したが、５ＡＣの非存在下で得られた筋細胞は、少ないＭＹＦ５を発現し、成熟した筋原線維とは異なる平坦な形態を呈した。この差異は、ＤＯＸ除去前及び４８時間後の５ＡＣ暴露されたＯ２ＫＭのみで観察された筋原性転写因子ＭＹＦ５の発現増加により説明することができる。
【００４３】
これらの培養物の間の形態的差異は、活性トランスアクチベータとして公知の低分子量非リン酸化ミオゲニンアイソフォームの濃縮と共に、５ＡＣ暴露により増加されたＭＹＦ５発現により説明され得る。エピジェネティックな調節が、ヌクレオソーム結合ヒストンのＤＮＡメチル化パターン及び翻訳後修飾を改変することにより、クロマチン構造の改変を伴い、転写因子結合及び標的転写活性化に影響を及ぼすと理解される。エピジェネティックな調節が、エピジェネティック経路を標的とする小分子アゴニスト若しくはアンタゴニスト、又はエピジェネティック機構を含む発現タンパク質を伴い得ると理解される。小分子エピジェネティックモジュレータの一例が、５−アザシチジン（５ＡＣ）である。小分子エピジェネティックモジュレータのさらなる代表的例としては、５−アザ−２’−デオキシシチジン、ＲＧ１０８、スクリプタイド、酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、ＭＳ−２７５、ＣＩ−９９４、ＢＭＬ−２１０、Ｍ３４４、ＭＧＣＤ０１０３、ＰＸＤ１０１、ＬＢＨ−５８９、ツバスタチンＡ、ＮＳＣ３８２５、ＮＣＨ−５１、ＮＳＣ−３８５２、ＨＮＨＡ、ＢＭＬ−２８１、ＣＢＨＡ、サレルミド、ピメリン酸ジフェニルアミド、ＩＴＦ−２３５７、ＰＣＩ−２４７８１、ＡＰＨＡ化合物８、ドロキシノスタット（Droxinostat）、及びＳＢ−９３９が挙げられる。エピジェネティックモジュレータに関与するタンパク質の代表的例としては、ヒストンデアセチラーゼパラログ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼパラログ、ｔｅｔ−メチシトシンジオキシゲナーゼパラログ（tet-methycytosine dioxygenase paralogs）、ヒストンデメチラーゼパラログ、ヒストンメチルトランスフェラーゼパラログ、及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼパラログ、ヒストン、並びにＭｉ−２／ＮｕＲＤ（及びその成分、例えばメチル−ＣｐＧ結合ドメインタンパク質３（ＭＢＤ２））及びＳＷＩ／ＳＮＦ（及びその成分、例えばＢＡＦ６０及びＢＡＦ６０Ｃ）をはじめとするクロマチンリモデリング複合体のサブユニットが挙げられる。さらに、タンパク質エピジェネティックモジュレータの各活性が、小分子因子によるターゲッティング、各外因性転写産物の過剰発現、アンチセンスＲＮＡにターゲティングされた各転写産物の分解、ＲＮＡｉ、及び遺伝子座のターゲティングされた突然変異により影響を受け得ると理解される。
【００４４】
以下に開示される実施形態は、象徴に過ぎない。したがって以下の実施形態に開示される具体的構造、機能、及び手順の詳細は、限定として解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４５】
方法
Ｏ２ＫＭ細胞株。Ｏ２ＫＭ細胞株は、親Ｏ２Ｋ細胞株から、ＭｙｏＤＥＲオープンリーティングフレーム配列（ＯＲＦ）を含有するラスチジシン選択性導入遺伝子カセットのレンチウイルスでの挿入により得た。この実施例の節を参照すると、Ｏ２Ｋ細胞／細胞株とｐｉＰＳＣ細胞は、互換的に用いられている。図４Ａに示されたレンチウイルスベクターを、ＰＣＲ増幅されたＭｙｏＤＥＲ  ＯＲＦを含有するｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯエントリーベクター（ライフ・テクノロジーズ  ＃Ｋ２４３５−２０）クローンから、ａｔｔＲ１組換え部位とａｔｔＲ２組換え部位の間のｐＬｅｎｔｉＣＭＶＢｌａｓｔデスティネーションベクター（アドジーン  ＃１７４５１）のＣＭＶプロモータの下流のＭｙｏＤＥＲ  ＯＲＦ（アドジーン  ＃１３４９４）をクローニングすることにより調製した。レンチウイルス上清を調製するために、ＰｏｌｙＪｅｔトランスフェクション試薬（サイナゲン（Ｓｉｇｎａｇｅｎ）  ＃ＳＬ１００６８８）を用いて、２９３ＦＴ細胞を、調製されたｐＬｅｎｔｉＣＭＶＢｌａｓｔ［ＭｙｏＤＥＲ］プラスミド、ｐＭＤ２．Ｇエンベローププラスミド（アドジーン  ＃１２２５９）及びｐｓＰＡＸ２パッケージングプラスミド（アドジーン  ＃１２２６０）とコトランスフェクトした。Ｏ２Ｋに、２９３ＦＴ上清から濃縮されたシュードウイルスを形質導入した。形質導入されたＯ２Ｋを、フェノールレッド不含培地で培養して、１０μｇ／ｍＬブラスチシジンで４日間選択し、その後、１５μｇ／ｍＬブラスチシジンでさらに２日間選択した。選択された細胞は、Ｏ２ＫＭと呼称した。Ｏ２ＫＭストック中のＭｙｏＤＥＲの発現を、ウェスタンブロットにより検証した（図４Ｂ）。
【００４６】
ＤＯＸの存在下でのＯ２ＫＭ幹細胞ストック増殖。Ｏ２ＫＭ幹細胞複製環境を、次の例外：ＤＭＥＭ／Ｆ−１２及びニューロベーサル培地のフェノールレッド不含配合物をフェノールレッド含有配合物の代わりに使用して、ＭｙｏＤＥＲ（即ち、活性化）への多面的拮抗作用を回避したこと、を含みながら、親Ｏ２Ｋ株と同様に導いた。Ｏ２ＫＭ細胞ストック自己複製培地（ＳＲＭ）は、以下の成分からなった：フェノールレッド不含ニューロベーサル培地（ライフテクノロジーズ  ＃１２３４８−０１７）、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ−Ｆ１２（ライフテクノロジーズ  ＃１１０３９−０２１）、Ｉ×非必須アミノ酸（シグマ−アルドリッチ  ＃Ｍ７１４５）、０．５×グルタマックス（ライフテクノロジーズ  ＃３５０５００６１）、０．０００００７％β−メルカプトエタノール、０．５×Ｎ２サプリメント（ライフテクノロジーズ  ＃１７５０２０４８）、０．５×Ｂ２７サプリメント−ビタミンＡ（ライフテクノロジーズ  ＃１２５８７０１０）、０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、２μｇ／ｍＬドキシサイクリンヒクラート（即ち、ＤＯＸ）、１０ｎｇ／ｍＬヒト白血病阻害因子（ｈＬＩＦ、ミリポア＃ＬＩＦ１０５０）、３μＭ−ＣＨＩＲ９９０２１、０．８μＭ  ＰＤ０３２５９１及び０．１μΜ ＰＤ１７３０７４。本明細書では以後、３種の阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１、ＰＤ０３２５９１及びＰＤ１７３０７４は、集合的に「３ｉ」と見なす。或いは１５％ＫｎｏｃｋＯｕｔ代替血清（ＫＯＳＲ：ライフテクノロジーズ  ＃Ａ１５８７０）を、Ｎ−２及びＢ−２７代替血清の代わりに用いた。Ｏ２ＫＭは、フェノール不含ＳＲＭ中のポリ−Ｄリシン及びネズミラミニンでコーティングされた培養皿での細胞コロニーの酵素分解及び細胞の継代により、５％Ｏ２下で３日ごとに保持した。これらの自己複製条件において、Ｏ２ＫＭは、図５に示された通り、親Ｏ２Ｋ株としてのコンパクトな幹細胞様形態を維持した。
【００４７】
ＣＨＩＲ９９０２１による細胞死の阻害。自己複製ｈＬＩＦ、ＤＯＸ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＰＤ０３２５９１及びＰＤ１７３０７４、並びにＫＯＳＲを支援するＳＲＭ培地成分の非存在下での親Ｏ２Ｋ株の分化は、（１）図９のパネルｉ．〜ｉｉ．に示された位相差顕微鏡測定、（２）図１７Ａに示されたＣＰＰ３２切断、及び（３）図１６に示されたアネキシンＶ標識、により測定された通り、大量の細胞死をもたらした。しかし、ｈＬＩＦ、ＤＯＸ、ＰＤ０３２５９１及びＰＤ１７３０７４の非存在下のＳＲＭ基本培地で保持された場合の、ＣＨＩＲ９９０２１を含む培地配合物は、（１）図９のパネルｉｉｉ．〜ｖｉｉｉ．に示された位相差顕微鏡測定、（２）図１０に示された細胞接着アッセイ、（３）図１７Ｂに示されたＣＰＰ３２切断阻害、及び（４）図１１に示されたアネキシンＶ標識、により測定された通り、分化の際に両方の細胞の生存を支援した。その上、最初の分化の際のＣＨＩＲ９９０２１暴露は、胚系譜形成の際の中胚葉分化と、中胚葉前駆体の筋原性濃縮と、骨格筋細胞の最終分化と、を指揮することで知られる古典的ＷＮＴシグナル伝達経路のリン酸化制御された下流エフェクターである図１２、１３Ａ及び１３Ｂに示されたＧＳＫ３β基質：ＣＴＮＮＢ１のリン酸化状態を安定化及び調節する。これらの知見と合致して、ＣＨＩＲ９９０２１を補充された基本培地は、図１４に示された通り分化しているＯ２Ｋの前筋原性沿軸中胚葉系譜形成を支援し、筋原性ネズミＣ２Ｃ１２細胞株の低マイトジェン性の分化培養物（２％ウマ血清／ＤＭＥＭ）に含まれる場合に、表１に列挙される通り、骨格筋管への最終分化を促進した。ＣＨＩＲ９９０２１は、細胞死を抑制し、分化しているＯ２Ｋ細胞株による沿軸中胚葉への分化を支援し、Ｃ２Ｃ１２細胞株による最終分化を促進するため、全ての培養段階で該化合物を保持する慣例が確立された。こうして他に断りがなければ、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１が、増殖、誘導及び最終分化のステップ（図２０Ａ）で培地中に保持された。
【００４８】
Ｏ２ＫＭ筋原性誘導。Ｏ２ＫＭ細胞を、ポリ−Ｄリシン、ネズミラミニン及びマトリゲルをコーティングした培養皿に、４．１×１０３細胞／ｃｍ２の密度で播種し、自己複製培地中、５％Ｏ２下で３日間培養した。分化を容易にするために、培養物を、ＰＤ０３２５９１、ＰＤ１７３０７４、ＤＯＸ、ｈＬＩＦ及びβ−メルカプトエタノールの除去により設定された２０％Ｏ２基本分化環境に移し替えた。発現されたＭｙｏＤＥＲタンパク質を条件的に誘導するために、１０μＭ  Ｅ２を培地に添加した。２日間の誘導培養に続く、Ｅ２に方向づけられた筋原性系譜形成が、（１）図６に示された、処置された培養物中の骨格筋細胞による紡錘様の形態学的特徴の取り入れ、（２）図７に示された、外因性のＭＹＯＧ骨格筋転写因子の発現、及び（３）図８に示された、骨格筋細胞表面マーカＮＣＡＭの均一な発現、により確認された。
【００４９】
５ＡＣの効果。Ｅ２により仲介された「ＭｙｏＤＥＲ」誘導の前、誘導時、及び誘導の後の５ＡＣ暴露を導入して、筋細胞から屈折した糸状の筋管へＯ２ＫＭを最終分化させた。ネズミＣ２Ｃ１２細胞株を陽性対照として用いて、Ｏ２ＫＭによる最終分化の最適条件についてスクリーニングした。これらの条件には、表１に列挙された通り、Ｅ２の非存在下でのマトリゲル細胞倍マトリクス及びＣＨＩＲ９９０２１補充が含まれた。しかし、Ｅ２を含まない分化培地中の、マトリゲルコーティング培養皿で継代されたＯ２ＫＭ由来の筋細胞（Ｃ２Ｃ１２最終分化に最適と決定された条件）は、図１５及び図２０Ｂに示された通り、屈折した筋管を確定することができなかった。Ｏ２ＫＭ由来筋細胞での遺伝子発現プログラムは、確定された条件により最終分化させるのに十分ではなかった。小分子エピジェネティックモジュレータである５ＡＣは、過去に、筋原性を許容できない細胞株で骨格筋転写を可能にすることが決定されている。その上、５ＡＣ暴露はさらに、Ｃ２Ｃ１２細胞株による最終分化を促進することが決定されている。こうして図２０Ａに示された通り、２５０ｎＭ  ５ＡＣという未分化Ｏ２ＫＭにより忍容される最大用量が、増殖性のあるＯ２ＫＭの増殖及び誘導レジメンに含まれた。
【００５０】
最終分化。２日間のＥ２誘導に続いて、培養物をインサイチュで最終分化させるか、又は最終分化培地（ＴＤＭ）の入ったマトリゲルコーティング培養皿に、最終分化のために１．５６×１０５細胞／ｃｍ２で継代させた。ＴＤＭは、以下の改変以外ではＭＩＭと同じ成分から配合された：Ｅ２の除去、４μＭ  Ａ８３−０１及び１００ｎＭ  ＩＧＦ−１の添加。専らＮ−２及びＢ−２７サプリメントを、代替血清として用いた。培養物を、誘導レジメンに従って２０％Ｏ２下、最大６日間分化させた（図２０Ａ）。増殖及び誘導レジメンの間に５ＡＣに暴露された培養物は、図２０Ｂに示された通り、最終分化レジメンの際に屈折した異方性の筋管を形成した。図２０Ｃは、６日目までミオシン重鎖の均一な発現を示し、図２０Ｅは、８日の試験経過の間にデスミン（ＤＥＳ）及びミオゲニン（ＭＹＯＧ）の発現増加を示す。図２０Ｄの左パネルに示された通り、筋管の倍数性が最終分化の際に観察された。倍数性による８日目の筋管内の筋核の相対的分布が、図２０Ｄの右パネルに示されている。図２０Ｆに示された通り、複製環境（３日目のコロニー）、増殖環境（０日目培養物、図２０Ａ）、及び最終分化環境（８日目培養物、図２０Ａ）でのＳ期核の相対的占有率から、最終分化後の細胞周期停止が示された。最終分化している骨格筋の筋管の収縮能が、（１）図２０Ｇに示された整然とした筋節の構造発達；（２）図２１Ａに示された非同期性の自発収縮；（３）図２１Ｂに示された収縮刺激、及びフィールド刺激による同期化、（４）図２１Ｃに示されたカフェイン刺激による収縮、並びに（５）図２１Ｄに示されたアセチルコリン刺激による収縮、により検証された。
【００５１】
結果
アポトーシス及び分化の軸はＣＨＩＲ９９０２１により調節される。図９は、（ｉ．）自己複製環境における５％Ｏ２下、並びに（ｉｉ．）ＤＯＸ、ＬＩＦ及び３ｉの非存在下、２０％Ｏ２の下で４８時間後の、培養された基底状態ｐｉＰＳＣコロニーの位相差画像を示す。図１６は、培養物の２４時間移行前および後のアポトーシス細胞のアネキシンＶ標識を示す。図１７Ａは、分化環境移行（１２〜４８時間）の前（０時間目）及び後（１２〜４８時間目）の基底状態コロニーにおける全長ＣＰＰ３２（約３２ｋＤプロカスパーゼ３ａ）及び大きな切断画分（約１７ｋＤ切断されたカスパーゼ３ａ）のウェスタンブロット検出を示す。図９は、示された通りＣＨＩＲ９９０２１を補充された分化環境での４８時間培養後の接着培養物（ｉｉｉ、ｉｖ、ｖｉ、及びｖｉ）及び非接着性胚様体培養物（ｖｉｉ及びｖｉｉｉ）の位相差画像を示す。図１０は、１００％に標準化された、基底状態（即ち、０時間目）培養物に対する４８時間の、示されたＣＨＩＲ９９０２１を補充された分化環境培養物の接着細胞の割合を示す。＊  胚様体として生存している非接着細胞。各培養条件についてｎ＝３。図１１は、示された通りＣＨＩＲ９９０２１を補充された分化環境へ培養物を２４時間移行させた後のアポトーシス細胞のアネキシン標識を示す。図１７Ｂは、示されたＣＨＩＲ９９０２１レベルの存在下で分化環境へ４２時間移行させた後のコロニー内の全長ＣＰＰ３２及び切断画分のウェスタンブロット検出を示す。ＴＵＢＡは、内部タンパク質負荷対照として検出されている。
【００５２】
ＣＨＩＲ９９０２１はＣＴＮＮＢ１を安定化させ、基底状態からの分化を支援する。図１２は、示されたＣＨＩＲ９９０２１の存在下で分化環境へ２４時間移行させた後のＣＴＮＮＢ１及びｐ−ＣＴＮＮＢ１（それぞれ総−及びホスホ−Ｓ３３，３７，Ｔ４１  β−カテニン）のウェスタンブロット検出を示す。ＴＵＢＡは、内部タンパク質負荷対照として検出されている。図１３Ａは、ｐ−ＣＴＮＮＢ１／ＣＴＮＮＢ１のバンド比を示す。図１３Ｂは、ＣＴＮＮＢ１／ＴＵＢＡのバンド比を示す。図１３Ａ及び１３Ｂは、図１２に示されたウェスタンブロットからの濃度測定を表す（ｎ＝３）。図１８は、２日間６μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１含有分化環境に置き、そしてさらに１日間（３日目、左パネル）又は３日間（５日目、右パネル）ポリ−Ｄリシン＋ラミニン＋マトリゲルコーティング基板に移し替えた後の胚様体のアウトグロース形態を示す。図１４は、本明細書の他の箇所に記載された１つのレジメンの態様による、基底状態の環境（０日目）及び分化環境（１〜５日目）の培養物におけるＰＡＸ３、ＰＯＵ５Ｆ１及びＫＬＦ４発現のウェスタンブロット分析を示す。ＴＵＢＡ検出は、内部タンパク質負荷対照として示される。
【００５３】
５−アザシチジン及びＭｙｏＤＥＲによる内因性ＭＲＦの活性化。組込まれたＭｙｏＤＥＲ発現カセットでのｐｉＰＳＣ修飾。図４Ａは、ブラスチシジン（ＢＬＡＳＴ）選択性ＭｙｏＤＥＲ発現カセットを示す。矢印及び四角は、それぞれプロモータ及び遺伝子配列を示す。図４Ｂは、非修飾（Ｏ２Ｋ）及びＭｙｏＤＥＲ発現カセット修飾（Ｏ２ＫＭ）ｐｉＰＳＣ株におけるＭｙｏＤＥＲのウェスタンブロット検出を示す。ＭｙｏＤＥＲが、ＭｙｏＤペプチドに対する抗体の増加と共に検出された。図７は、２日間のｐｉＰＳＣ誘導後のＭｙｏＤＥＲ（約７５ｋＤ）、ＭＹＦ５及びＭＹＯＧのウェスタンブロット検出を示す。内因性ＭＹＯＤ１（予測で約４５ｋＤ）は、検出されなかった。Ｏ２ＫＭをポリ−Ｄリシン＋マトリゲル＋ネズミラミニンでコーティングされた培養皿に播種して、５ＡＣの存在下（即ち、増殖。図２０Ａ）又は非存下でｈＬＩＦ、３ｉ及びＤＯＸと共に３日間培養し、その後、Ｅ２（即ち、１７βエストラジオール）及び３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を補充された−／＋５ＡＣ分化環境に２日間それぞれ移行させた。二重の矢印：部分的に分解されたＭＹＯＧアイソフォーム。図１９Ａ及び１９Ｂ。ＭＹＦ５活性化の測定：ウェスタンブロット。図１９Ａ、ポリ−Ｄリシン＋ラミニン＋マトリゲルでの３日間の培養後に、非修飾ｐｉＰＳＣを、示された通り５ＡＣ（図７と同様）及びＣＨＩＲ９９０２１を補充された分化環境において、３ｉ、ＤＯＸ、ｈＬＩＦ及びＥ２の非存在下で２日間培養した。ＣＨＩＲ９９０２１の非存在下では、１７ｋＤ切断アイソフォームは、ＫＯＳＲ補充分化細胞では、Ｎ−２及びＢ−２７を補充された分化環境での観察とは対照的に観察されなかった（図１７Ａ、図１９Ａ）。５ＡＣにより促進された内因性ＭＹＦ５発現の活性は、図１９Ａに示された通り、同時のＣＨＩＲ９９０２１暴露に依存した。図１９Ｂは、ＤＯＸ、ＬＩＦ及び３ｉの存在下でＭＹＦ５活性化を示した。ＭＹＯＤＥＲ修飾ｐｉＰＳＣを、自己複製又は増殖環境で３日間培養した。ＤＯＸ及びＣＨＩＲ９９０２１の存在下で、５ＡＣ暴露は、増殖培養の３日後に、図１９Ｂに示された通り検出可能なＭＹＦ５発現レベルを支援した。反対にＭＹＦ５は、図１９Ｂに示された通り、複製培養（−５ＡＣ）の３日後には検出されなかった。ＴＵＢＡは、内部タンパク質負荷対照として検出する。図６は、本明細書の他の箇所に記載された系譜形成誘導培養レジメン（図２０Ａ）に続いて選択されたｐｉＰＳＣ培養物の形態を示す。図８は、５ＡＣの存在下での１０μＭ  Ｅ２暴露前（０日目、左パネル）及び暴露後（２日目、右パネル）のｐｉＰＳＣ−ＭｙｏＤＥＲ培養物の核（ＤＡＰＩ）及びＮＣＡＭの免疫細胞蛍光検出を示す。
【００５４】
系譜形成されたｐｉＰＳＣの最終的な筋原性。最終分化の前に、図２０Ａに示された通り、培養物を５ＡＣの存在下で３日間増殖させ、Ｅ２及び５ＡＣの存在下で２日間誘導し、５ＡＣ及びＥ２の存在下で最終分化させた。図２０Ｂは、筋管の形態及び立体構造を示す。誘導後（２日目）、ｐｉＰＳＣは、細長い異方性の屈折した筋管として発達した。５ＡＣが、増殖及び誘導ステップに含まれなかった場合、細胞は平坦な非屈折形態を呈した。図２０Ｃ及び図２０Ｅは、最終的筋原性のタンパク質発現を示す。０日目及び６日目の培養物を、ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）アイソフォームについて、ｐａｎ−ＭｙＨＣモノクローナル抗体のクローンＭＦ２０で染色した。図２０Ｄは、筋管の多核化を示す。左パネル：４日目の最終分化培養物の拡大画像。つながった矢印は、１つの筋管内の複数の核を示す。右パネル：ヨウ化プロピジウム標識及びフローサイトメトリー分析による筋管倍数性の筋核分布。ｎ＝３で標準偏差と共に示す。図２０Ｅは、ウェスタンブロット分析を示す。０日目〜８日目のＭｙｏＤ（ＭＹＯＤ１）、ミオゲニン（ＭＹＯＧ）及びデスミン（ＤＥＳ）の発現。ＴＵＢＡは、内部タンパク質負荷対照として検出されている。図２０Ｆは、最終分化と一致した細胞周期停止を示す。３日目の修飾されたｐｉＰＳＣ複製増殖培養物及び８日目の最終分化培養物をＥｄＵで標識し、Ｓ期画分をフローサイトメトリーで測定した。ｎ＝３で標準偏差と共に示す。図２０Ｇ：６日目の筋管の透過電子顕微鏡測定。筋節構造単位が、一列（左パネル）、及び千鳥状の並行の列（右パネル）に並んでいた。
【００５５】
ｐｉＰＳＣ由来筋管における自発的及び刺激誘導でのカルシウムトランジェント活性。収縮周期を定量するために、筋管培養物をＦｌｕｏ−４  ＡＭカルシウム色素で染色し、洗浄して、イメージシーケンスを共焦顕微鏡測定により得た。全体的視野（ＦＯＶ）又は単一細胞の力学的シグナル伝達事象を追跡して、画像測定の経過時間に対してプロットした（[ｓ]＝秒）。図２１Ａは、代表的な非同期の単一細胞のトランジェント周期（左、中及び右パネル）が、自発的に収縮した６日目の筋管亜集団で観察されたことを示す。図２１Ｂは、６日目の筋管内での１．０Ｈｚフィールド刺激によるカルシウムトランジェント周期のＦＯＶ活性化及び同期化を示す。図２１Ｃは、１０ｍＭカフェインによる６日目の筋管のＦＯＶカルシウムトランジェント活性化を示す。図２１Ｄ：１００ｎＭアセチルコリンによる７日目の筋管内の代表的なカルシウムトランジェント活性化の単一細胞分析。
【００５６】
考察
要約すると、本開示に記載された例示的実施形態の特定の態様が、培養された食肉適用物について以下の予測されなかった利点の１つ以上を示すことが発見された：
（ｉ）急速な細胞増殖速度；
（ｉｉ）急速な分化：インビトロで、１７β−エストラジオールによるＭｙｏＤＥＲ活性化及びドキシサイクリン除去の４８時間後という短時間で、Ｏ２ＫＭ細胞株が筋原性系譜に分化する。長過ぎる分化手順を必要としない；
（ｉｉｉ）効率的な分化：ＣＨＩＲ９９０２１／５ＡＣ／ＭｙｏＤＥＲに方向づけられた系譜形成が、機能的骨格筋細胞への大規模で忠実性の高い変換を確実にする。細胞選別を必要としない；
（ｉｖ）無期限の自己複製：未分化Ｏ２ＫＭの自己複製が厳密に施行され、自己複製環境で支援される；
（ｖ）無血清培地中での自己複製及び最終分化：Ｏ２ＫＭ株の自己複製及び最終筋原性分化が、両者とも無血清培地で検証された；
（ｖｉ）胚様体としての浮遊培養系との適合性：多能性状態では、親Ｏ２Ｋ及び修飾されたＯ２ＫＭが、アノイキスに耐性があり、浮遊培養において単一細胞から胚様体に培養され得る。Ｏ２ＫＭ由来胚様体は、培養された食肉生産のためのバイオプリンティング及びマイクロモールドなどの多細胞スフェロイド組立技術と適合性があり得る；そして
（ｖｉｉ）自己収縮：骨格筋として最終分化されたＯ２ＫＭは、筋節の成熟及び自己収縮を呈する。このため筋線維成熟を促進するのに、外部刺激（例えば、機械的張力、アセチルコリン受容体活性化、電気刺激）が、必要とならない可能性がある。
【００５７】
本発明をその例示的実施形態に関連して記載したが、本発明の方法がさらなる改良を可能とすることは、理解されよう。本特許出願は、本発明の原理に概ね従い、本発明が属する技術分野での公知の、又は慣例的な実務に含まれるような、そして先に示された本明細書の本質的特色及び以下に添付された特許請求の範囲に適用され得るような、本開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変更、用途、又は適合を包含するものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月17日(2020.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物種の自己複製細胞株を筋原性転写因子で修飾して、筋原性転写因子修飾細胞株を生成すること、及び
前記修飾細胞株を外因性調節により誘導して、前記細胞株を自己複製工程に維持するか、又は前記細胞株を筋原性分化工程に進めること、
を含む、培養された筋組織を生成する方法。