(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト疾患の処置における免疫療法およびそれに関連する補助刺激Ｔ細胞受容体（ＩＣＯＳ）アゴニスト抗体を含むＩＣＯＳ結合タンパク質の提供。【解決手段】特定の配列からなるアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２および／もしくはＣＤＲＬ３、または前記ＣＤＲ中に２つまでのアミノ酸置換を有する各ＣＤＲの直接的等価物のうちの１以上を含んでなる、ＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるＣＤＲＨ１；配列番号２に示されるＣＤＲＨ２；配列番号３に示されるＣＤＲＨ３；配列番号４に示されるＣＤＲＬ１；配列番号５に示されるＣＤＲＬ２および／もしくは配列番号６に示されるＣＤＲＬ３、または前記ＣＤＲ中に２つまでのアミノ酸置換を有する各ＣＤＲの直接的等価物のうちの１以上を含んでなる、ＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分。
【請求項２】
配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでなるＶＨドメインおよび／または配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインを含んでなり、ヒトＩＣＯＳと特異的に結合する、請求項１に記載のＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分。
【請求項３】
前記ＩＣＯＳ結合タンパク質がＩＣＯＳアゴニストである、請求項１または２に記載のＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分。
【請求項４】
前記ＩＣＯＳ結合タンパク質が、ヒトＩＣＯＳと、親和性がＢＩＡｃｏｒｅにより測定される場合に、
（ｉ）少なくとも１×１０５Ｍ−１ｓ−１の結合速度定数（ｋｏｎ）；および６×１０−５ｓ−１未満の解離速度定数（ｋｏｆｆ）；または
（ｉｉ）約１００ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）
で結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分。
【請求項５】
ＩＣＯＳ結合タンパク質が配列番号１；配列番号２；および配列番号３を含んでなる重鎖可変領域を含んでなり、かつ、前記ＩＣＯＳ結合タンパク質が配列番号４；配列番号５；および配列番号６を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分。
【請求項６】
配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでなるＶＨドメインと、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインとを含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分。
【請求項７】
前記ＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分が、ヒトＩｇＧ１アイソタイプまたはその変異体およびヒトＩｇＧ４アイソタイプまたはその変異体から選択される足場を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分。
【請求項８】
前記ＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分が、ｈＩｇＧ４ＰＥ足場を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分。
【請求項９】
モノクローナル抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＩＣＯＳ結合タンパク質。
【請求項１０】
ヒト化されている、請求項９に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
完全にヒト型である、請求項９に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
配列番号１；配列番号２；および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲと、配列番号４；配列番号５；および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲとを含んでなる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
ヒトＩＣＯＳに対するアゴニストであり、かつ、ＩｇＧ４アイソタイプ足場またはその変異体を含んでなる、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】
ｈＩｇＧ４ＰＥ足場を含んでなる、請求項１３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１５】
請求項１〜１４のＩＣＯＳ結合タンパク質のいずれか１つに比べて、ヒトＩＣＯＳとの結合に関してＩＣＯＳ−リガンドと交差競合する、ＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＩＣＯＳ結合タンパク質またはモノクローナル抗体と、薬学上許容可能な担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１７】
必要とするヒトにおいて癌、感染性疾患、または敗血症から選択される疾患を処置する方法であって、前記ヒトに請求項１６に記載の医薬組成物を投与する工程を含んでなる、方法。
【請求項１８】
前記ヒトに、少なくとも１種類の抗新生物薬、少なくとも１種類の第２の免疫調節薬、および／または少なくとも１つの免疫刺激性アジュバントを投与することをさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の免疫調節薬が、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤＬ１抗体および抗ＯＸ４０抗体から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
必要とするヒトにおいて、癌、感染性疾患および／または敗血症の処置において使用するための、請求項１６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ヒト疾患の処置における免疫療法およびそれに関連する有害事象の軽減に関する。より具体的には、本発明は、ＩＣＯＳアゴニスト抗体を含むＩＣＯＳ結合タンパク質の使用ならびに癌、感染性疾患および／または敗血症の処置における免疫調節剤としてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗腫瘍Ｔ細胞機能の増強およびＴ細胞増殖の誘導は、癌治療の有力かつ新規なアプローチである。３つの免疫腫瘍学抗体（例えば、免疫調節薬）が現在市販されている。抗ＣＴＬＡ−４（ヤーボイ(YERVOY)／イピリムマブ）は、Ｔ細胞プライミングの時点で免疫応答を増強すると考えられ、抗ＰＤ−１抗体（オプジーボ(OPDIVO)／ニボルマブおよびキートルーダ（KEYTRUDA）／ペンブロリズマブ）は、局部的腫瘍微小環境で、すでにプライミングされ活性化された腫瘍特異的Ｔ細胞阻害的チェックポイントを緩和することにより作用すると考えられる。
【０００３】
ＩＣＯＳは、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４−Ｉｇスーパーファミリーと構造的および機能的に関連を持つ補助刺激Ｔ細胞受容体である(Hutloff, et al., "ICOS is an inducible T-cell co-stimulator structurally and functionally related to CD28", Nature, 397: 263-266 (1999))。ＩＣＯＳの活性化は、ＩＣＯＳ−Ｌ（Ｂ７ＲＰ−１／Ｂ７−Ｈ２）による結合を介して起こる。Ｂ７−１もＢ７−２も（ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４のリガンド）ＩＣＯＳと結合または活性化しない。しかしながら、ＩＣＯＳ−Ｌは、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の両方に弱く結合することが示されている(Yao S et al., “B7-H2 is a costimulatory ligand for CD28 in human”, Immunity, 34(5); 729-40 (2011))。ＩＣＯＳの発現はＴ細胞に限定されると思われる。ＩＣＯＳ発現レベルは、異なるＴ細胞サブセット間で、またＴ細胞の活性化状態で異なる。ＩＣＯＳの発現は、休止中のＴＨ１７細胞、Ｔ濾胞性ヘルパー（ＴＦＨ）細胞および制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞において示されているが、ＣＤ２８とは異なり、ナイーブＴＨ１およびＴＨ２エフェクターＴ細胞集団では発現は高くない(Paulos CM et al., “The inducible costimulator (ICOS) is critical for the development of human Th17 cells”, Sci Transl Med, 2(55); 55ra78 (2010))。ＩＣＯＳの発現は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞で、ＴＣＲ結合を介した活性化の後に誘導が高まる(Wakamatsu E, et al., “Convergent and divergent effects of costimulatory molecules in conventional and regulatory CD4+ T cells”, Proc Natal Acad Sci USA, 110(3); 1023-8 (2013))。ＩＣＯＳ受容体を介した補助刺激シグナル伝達は、同時ＴＣＲ活性化シグナルを受け取っているＴ細胞にのみ生じる(Sharpe AH and Freeman GJ. “The B7-CD28 Superfamily”, Nat. Rev Immunol, 2(2); 116-26 (2002))。活性化された抗原特異的Ｔ細胞では、ＩＣＯＳは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびその他を含むＴＨ１およびＴＨ２の両サイトカインの産生を調節する。ＩＣＯＳはまた、ＣＤ２８よりは程度は小さいが、エフェクターＴ細胞の増殖も刺激する(Sharpe AH and Freeman GJ. “The B7-CD28 Superfamily”, Nat. Rev Immunol, 2(2); 116-26 (2002))。
【０００４】
ますます多くの文献が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞でのＩＣＯＳの活性化が抗腫瘍能を有することを裏づけている。ＩＣＯＳ−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＡ−１（肉腫）、Ｍｅｔｈ  Ａ（線維肉腫）、ＥＭＴ６（乳癌）およびＰ８１５（肥満細胞腫）およびＥＬ−４（形質細胞腫）同系腫瘍を有するマウスで腫瘍増殖の遅延および完全な腫瘍根絶を生じたが、免疫原性が不十分であることが分かっているＢ１６−Ｆ１０（黒色腫）腫瘍モデルでは活性は見られなかった(Ara G et al., “Potent activity of soluble B7RP-1-Fc in therapy of murine tumors in syngeneic hosts”, Int. J Cancer, 103(4); 501-7 (2003))。ヌードマウスで増殖させた腫瘍では活性が完全に失われたことから、ＩＣＯＳ−Ｌ−Ｆｃの抗腫瘍活性は、完全な免疫応答に依存した。ＩＣＯＳ−Ｌ−Ｆｃ処置マウス由来の腫瘍の分析では、処置に応答した腫瘍でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤の顕著な増大が示され、これらのモデルにおいてＩＣＯＳ−Ｌ−Ｆｃの免疫刺激効果が示唆された。
【０００５】
ＩＣＯＳ−／−およびＩＣＯＳ−Ｌ−／−マウスを用いた別の報告では、Ｂ１６／Ｂｌ６黒色腫同系腫瘍モデルで抗ＣＴＬＡ４抗体の抗腫瘍活性の媒介にＩＣＯＳシグナル伝達が必要であることが示された(Fu T et al., “The ICOS/ICOSL pathway is required for optimal antitumor responses mediated by anti-CTLA-4 therapy”, Cancer Res, 71(16); 5445-54 (2011))。ＩＣＯＳまたはＩＣＯＳ−Ｌを欠くマウスは、抗ＣＴＬＡ４抗体処置後に野生型マウスに比べて有意に低い生存率を示した。別の研究では、Ｂ１６／Ｂｌ６腫瘍細胞に組換えマウスＩＣＯＳ−Ｌを過剰発現させるように形質導入が行われた。これらの腫瘍は、対照タンパク質で形質導入されたＢ１６／Ｂｌ６腫瘍細胞に比べ、抗ＣＴＬＡ４処置に対する感受性が有意に高いことが判明した(Allison J et al., “Combination immunotherapy for the treatment of cancer”、ＷＯ２０１１／０４１６１３Ａ２（２００９）)。これらの研究は、ＩＣＯＳアゴニスト、単独で、また、他の免疫調節抗体の併用で抗腫瘍能の証拠を示す。
【０００６】
抗ＣＴＬＡ４抗体で処置された患者からの新たなデータも、抗腫瘍免疫応答の媒介におけるＩＣＯＳ＋エフェクターＴ細胞の積極的な役割を指し示している。イピリムマブ処置後に循環および腫瘍浸潤ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋およびＣＤ８＋ＩＣＯＳ＋Ｔ細胞の絶対数が増加した転移性黒色腫患者(Giacomo AMD et al., “Long-term survival and immunological parameters in metastatic melanoma patients who respond to ipilimumab 10 mg/kg within an expanded access program”, Cancer Immunol Immunother., 62(6); 1021-8 (2013))；尿路上皮癌患者(Carthon BC et al., “Preoperative CTLA-4 blockade: Tolerability and immune monitoring in the setting of a presurgical clinical trial” Clin Cancer Res., 16(10); 2861-71 (2010))；乳癌患者(Vonderheide RH et al., “Tremelimumab in combination with exemestane in patients with advanced breast cancer and treatment-associated modulation of inducible costimulator expression on patient T cells”, Clin Cancer Res., 16(13); 3485-94 (2010))；および前立腺癌患者は、増加が限られていたかまたは見られなかった患者よりも処置に関連する転帰が有意に良好であった。重要なこととしては、イピリムマブはＩＣＯＳ＋Ｔエフェクター：Ｔｒｅｇ比を変化させ、処置前のＴｒｅｇの存在量を、処置後にＴｒｅｇに対して有意なＴエフェクターの存在量に逆転させることが示された(Liakou CI et al., “CTLA-4 blockade increases IFN-gamma produci
ng CD4+ICOShi cells to shift the ratio of effector to regulatory T cells in cancer patients”, Proc Natl Acad Sci USA. 105(39); 14987-92 (2008)) and (Vonderheide RH et al., Clin Cancer Res., 16(13); 3485-94 (2010))。よって、ＩＣＯＳ陽性Ｔエフェクター細胞は、イピリムマブ応答の陽性予測バイオマーカーであり、アゴニストＩＣＯＳ抗体でこの細胞集団を活性化することの潜在的利点を指し示す。
【０００７】
よって、癌の治療においてさらなるＴ細胞増殖誘導分子の必要がある。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の１つの実施態様では、配列番号１に示されるＣＤＲＨ１；配列番号２に示されるＣＤＲＨ２；配列番号３に示されるＣＤＲＨ３；配列番号４に示されるＣＤＲＬ１；配列番号５に示されるＣＤＲＬ２および／または配列番号６に示されるＣＤＲＬ３または前記ＣＤＲ中に２つまでのアミノ酸置換を有する各ＣＤＲの直接的等価物のうちの１以上を含んでなるＩＣＯＳ結合タンパク質または抗原結合部分が提供される。
【０００９】
本発明の１つの実施態様では、ヒトＩＣＯＳと特異的に結合するＩＣＯＳ結合タンパク質または抗原結合部分が提供され、前記ＩＣＯＳ結合タンパク質は、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでなるＶＨドメインおよび／または配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインを含んでなる。
【００１０】
１つの実施態様では、配列番号１；配列番号２；および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲと配列番号４；配列番号５；および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲとを含んでなるヒト化モノクローナル抗体またはそれらの抗原結合部分が提供される。１つの実施態様では、ｈＩｇＧ４ＰＥ足場；配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでなるＶＨドメイン；および配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインを含んでなるヒト化モノクローナル抗体が提供される。本発明の抗体は、Ｔ細胞と接触した際にサイトカイン産生を刺激し得る。
【００１１】
１つの実施態様では、ヒトＩＣＯＳとの結合について本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質またはそれらの抗原結合部分のいずれか１つと競合するＩＣＯＳ結合タンパク質が提供される。
【００１２】
１つの実施態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質または本発明の少なくとも１つのＩＣＯＳ結合タンパク質を含んでなる医薬組成物で癌、感染性疾患および／または敗血症を処置するための方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ産生。
【図２】ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖。
【図３】抗ＩＣＯＳ  ４２２．２のＨ２Ｌ５ヒト化変異体は、ＰＢＭＣ細胞において良好なサイトカイン産生を示す。
【図４】４２２  Ｈ２Ｌ５  ＩｇＧ１はＴ細胞生存率の低下を誘導し、これはＦｃ無効型アイソタイプまたはｈＩｇＧ４ＰＥアイソタイプには見られなかった。
【図５】Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの用量応答は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞において炎症性サイトカイン誘導を誘発した。
【図６】Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥは、健康なヒトドナー由来の活性化ＰＢＭＣにおいて増殖、サイトカイン産生および細胞傷害能の増強を誘導する。
【図７】Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥによるＩＣＯＳ−ＬのＩＣＯＳへの結合の阻害を示すメソ・スケール・ディスカバリー（ＭＳＤ）アッセイであり、それがＩＣＯＳ上の、ＩＣＯＳ−Ｌと同じエピトープに結合し、結合をめぐって競合することが示される。
【図８】ハイブリドーマクローン４２２．２のＲＮＡから回収した抗体ＶＨおよびＶＬ遺伝子。
【図９】シグナル配列を有するＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの重鎖および軽鎖のタンパク質配列。
【図１０】シグナル配列を有するＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ重鎖のコード領域のＤＮＡ配列。
【図１１】シグナル配列を有するＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ軽鎖のコード領域のＤＮＡ配列。
【図１２】カニクイザルにおけるＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの血漿濃度。濃度は、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの（Ａ）初回または（Ｂ）２回目の投与（１５日目）の後に測定した。２回目の投与の４８時間後に組織サンプルの採取および組織病理学的分析のために動物を犠牲にした。
【図１３】サルの脾臓および腋窩リンパ節からのＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの結合の検出。組織は２回目の投与の４８時間後（１７日目）に採取した。
【図１４】カニクイザル由来の血中ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの受容体の占有率。  （Ａ）フローサイトメトリーにより使用される抗ＩＣＯＳ蛍光標識抗体の陽性結合により測定されるＩＣＯＳ「フリー受容体」、これはＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥが存在しない場合にのみ結合する。  （Ｂ）蛍光標識抗ヒトＩｇＧにより測定される、末梢血ＣＤ４＋細胞上のＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥと結合した受容体。
【図１５】（ａ）Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥで処理したＢａ／Ｆ３−ＩＣＯＳ細胞におけるホスホ−ＡＫＴ（Ｔ３０８）発現レベル−細胞内シグナル伝達抗体アレイ、（ｂ）Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥで処理したＢａ／Ｆ３−ＩＣＯＳ細胞におけるホスホ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）発現レベル−細胞内シグナル伝達抗体アレイ。
【図１６】ＰＢＭＣ前刺激アッセイにおいて、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥとイピリムマブの組合せは、単一抗体処理に比べて炎症性サイトカイン産生の増大をもたらす。
【図１７】ＰＢＭＣ前刺激アッセイにおいて、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥとペンブロリズマブの組合せは、単一抗体処理に比べて炎症性サイトカイン産生の増大をもたらす。
【図１８】Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥとイピリムマブの組合せは、ＣＥＦＴペプチドとプレインキュベーションで改変したＭＬＲアッセイにおいて、炎症性サイトカイン産生の増大を誘導する。
【図１９】Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥとペンブロリズマブの組合せは、ＣＥＦＴペプチドとプレインキュベーションで改変したＭＬＲアッセイにおいて、炎症性サイトカイン産生の増大を誘導する。
【図２０】Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ抗ＩＣＯＳアゴニストｍＡｂは単独で、また、ペンブロリズマブとの組合せで、ヒトＰＢＭＣ  Ａ２０５８黒色腫マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖阻害をもたらす。
【図２１】抗ＩＣＯＳマウスサロゲートｍＡｂは、ＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおいて、抗ＰＤ１マウスサロゲートｍＡｂとの組合せで、有意な腫瘍増殖阻害および生存期間の増大をもたらす。
【図２２】抗ＩＣＯＳマウスサロゲートｍＡｂは、ＥＭＴ６マウス腫瘍モデルにおいて、抗ＰＤ１マウスサロゲートｍＡｂとの組合せで、有意な腫瘍増殖阻害および生存期間の増大をもたらす。
【発明の具体的説明】
【００１４】
定義
本明細書で使用する場合、「ＩＣＯＳ」は、任意の誘導性Ｔ細胞補助刺激タンパク質を意味する。ＩＣＯＳ(Inducible T-cell COStimulator)の仮称として、ＡＩＬＩＭ；ＣＤ２７８；ＣＶＩＤ１、ＪＴＴ−１またはＪＴＴ−２、ＭＧＣ３９８５０、または８Ｆ４が含まれる。ＩＣＯＳは、活性化されたＴ細胞で発現されるＣＤ２８スーパーファミリー補助刺激分子である。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４細胞表面受容体ファミリーに属す。ＩＣＯＳはホモ二量体を形成し、細胞間シグナル伝達、免疫応答、および細胞増殖の調節に重要な役割を果たす。ヒトＩＣＯＳのアミノ酸配列を以下に配列番号１０として示す。
【化１】
2020079252.tif 000002
【００１５】
本明細書で使用する場合、「ＩＣＯＳ−Ｌ」および「ＩＣＯＳリガンド」は互換的に使用され、ヒトＩＣＯＳの膜結型合天然リガンドを意味する。ＩＣＯＳリガンドは、ヒトではＩＣＯＳＬＧ遺伝子によりコードされているタンパク質である。ＩＣＯＳＬＧは、ＣＤ２７５（分化抗原群２７５）とも呼ばれている。ＰＩＣＯＳ−Ｌの仮称として、Ｂ７ＲＰ−１およびＢ７−Ｈ２が含まれる。
【００１６】
本明細書で使用する場合、用語「アゴニスト」は、ＩＣＯＳと接触した際に、（１）ＩＣＯＳ受容体を刺激または活性化すること、（２）ＩＣＯＳの活性、機能もしくは存在を増強、増大もしくは促進、誘導もしくは延長すること、および／または（３）ＩＣＯＳの発現を増強、増大、促進もしくは誘導することのうち１以上を生じる抗原結合タンパク質、例えば、ＩＣＯＳ結合タンパク質を意味する。アゴニスト活性は、限定されるものではないが、細胞シグナル伝達、細胞増殖、免疫細胞活性化マーカー、サイトカイン産生の測定などの当技術分野で公知の様々なアッセイによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することができる。アゴニスト活性はまた、限定されるものではないが、Ｔ細胞増殖またはサイトカイン産生の測定などのサロゲートエンドポイントを測定する様々なアッセイによってｉｎ  ｖｉｖｏで測定することもできる。
【００１７】
本明細書で使用する場合、用語「結合をめぐって交差競合する」とは、ＩＣＯＳとの結合をめぐって本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質のいずれかと競合するいずれのＩＣＯＳ結合タンパク質も意味する。ＩＣＯＳをめぐる２分子間の結合の競合は、フローサイトメトリー、メソ・スケール・ディスカバリーおよびＥＬＩＳＡを含む当技術分野で公知の様々な方法によって試験することができる。結合は直接測定することができ、これは２つ以上の結合タンパク質をＩＣＯＳと接触させることができ、一方またはそれぞれに関して結合が測定可能であることを意味する。あるいは、対象とする分子(molecules or interest)の結合を結合リガンドまたは天然リガンドに対して試験し、互いに定量的に比較することもできる。
【００１８】
用語「ＩＣＯＳ結合タンパク質」は、本明細書で使用する場合、抗体およびＩＣＯＳと結合し得る、ドメインなどの他のタンパク質構築物を意味する。場合によっては、ＩＣＯＳはヒトＩＣＯＳである。用語「ＩＣＯＳ結合タンパク質」は、「ＩＣＯＳ抗原結合タンパク質」と互換的に使用できる。よって、当技術分野で理解されるように、抗ＩＣＯＳ抗体および／またはＩＣＯＳ抗原結合タンパク質は、ＩＣＯＳ結合タンパク質と見なされよう。本明細書で使用する場合、「抗原結合タンパク質」は、ＩＣＯＳなどの抗原と結合する、限定されるものではないが抗体、ドメインおよび他の構築物を含む任意のタンパク質である。本明細書で使用する場合、ＩＣＯＳ結合タンパク質の「抗原結合部分」は、限定されるものではないが、抗原結合抗体フラグメントを含む、ＩＣＯＳと結合し得るＩＣＯＳ結合タンパク質の任意の部分を含む。
【００１９】
用語「抗体」は、本明細書では、免疫グロブリン様ドメインを有する分子（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）を意味して広義で使用され、モノクローナル抗体、組換え抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体を含む多重特異性抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体；単一可変ドメイン（例えば、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、ドメイン抗体（ｄＡｂ（商標）））、抗原結合抗体フラグメント、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド結合ｃＦｖ、ダイアボディ、ＴＡＮＤＡＢＳ（商標）など、ならびに以上のいずれかの改変型を含む。
【００２０】
もう１つの抗体形式として、抗原結合タンパク質の１以上のＣＤＲが、アフィボディ、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、アビマーまたはＥＧＦドメインなどの好適な非免疫グロブリンタンパク質足場または骨格上に配置させることができる別の足場が含まれる。
【００２１】
用語「ドメイン」は、タンパク質の残部とは独立にその三次構造を保持する折り畳まれたタンパク質構造を意味する。一般に、ドメインはタンパク質の別個の機能的特性を担い、多くの場合、そのタンパク質のおよび／またはそのドメインの残部の機能欠失なく他のタンパク質に付加、除去または移入可能である。
【００２２】
用語「単一可変ドメイン」は、抗体の可変ドメインに特徴的な配列を含んでなる折り畳まれたポリペプチドドメインを意味する。よって、これには、ＶＨ、ＶＨＨおよびＶＬなどの完全な抗体可変ドメイン、および例えば、１以上のループが、抗体可変ドメインに特徴的ではない配列で置換された改変型抗体可変ドメイン、または末端切断された、もしくはＮ末端もしくはＣ末端延長を含んでなる抗体可変ドメイン、ならびに全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれたフラグメントが含まれる。単一可変ドメインは、異なる可変領域またはドメインとは独立に抗原またはエピトープと結合し得る。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ（商標）」は、「単一可変ドメイン」と同じと見なされ得る。単一可変ドメインは、ヒト単一可変ドメインであり得るが、齧歯類、テンジクザメおよびラクダ科動物ＶＨＨ  ｄＡｂ（商標）などの他種由来の単一可変ドメインも含む。ラクダ科動物ＶＨＨは、軽鎖を天然に欠いた重鎖抗体を産生する、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。このようなＶＨＨドメインは、当技術分野で利用可能な標準的技術に従ってヒト化してもよく、このようなドメインも単一可変ドメイン」と見なされる。本明細書で使用する場合、ＶＨにはラクダ科動物ＶＨＨドメインが含まれる。
【００２３】
抗原結合フラグメントは、「非抗体タンパク質足場に１以上のＣＤＲを配置する手段により提供され得る。「タンパク質足場」には、本明細書で使用する場合、限定されるものではないが、免疫グロブリン（Ｉｇ）足場、例えば、ＩｇＧ足場が含まれ、４鎖抗体であっても２鎖抗体であってもよく、または抗体のＦｃ領域のみを含んでなってもよく、または抗体由来の１以上の定常領域を含んでなってもよく、その定常領域はヒトもしくは霊長類起源のものであってよく、またはヒトおよび霊長類定常領域の人工キメラであってもよい。
【００２４】
タンパク質足場は、Ｉｇ足場、例えば、ＩｇＧ、またはＩｇＡ足場であってよい。ＩｇＧ足場は、抗体の一部または総てのドメイン（すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ、ＶＬ）を含んでなり得る。抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＧ４ＰＥから選択されるＩｇＧ足場を含んでなり得る。例えば、足場はＩｇＧ１であり得る。足場は抗体のＦｃ領域からなってもよく、または含んでなってもよく、またはその一部である。
【００２５】
タンパク質足場は、ＩＣＯＳなどの天然リガンド以外の抗原への結合を得るためにタンパク質操作を受けた、ＣＴＬＡ−４、リポカリン、プロテインＡ由来分子、例えば、プロテインＡのＺドメイン（アフィボディ、ＳｐＡ）、Ａドメイン（アビマー／マキシボディ）；熱ショックタンパク質、例えば、ＧｒｏＥｌおよびＧｒｏＥＳ；トランスフェリン（トランスボディ）；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；ヒトγ−クリスタリンおよびヒトユビキチン（アフィリン）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のサソリ毒素クニッツ型ドメイン；およびフィブロネクチン／アドネクチンからなる群から選択される足場の誘導体であり得る。
【００２６】
抗原結合部位は、ある抗原に特異的に結合し得る抗原結合タンパク質上の部位を意味し、これは単一可変ドメインであってもよいし、または標準的な抗体に見られ得るように、ＶＨ／ＶＬドメイン対であってもよい。単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）ドメインもまた抗原結合部位を提供し得る。用語「エピトープ結合ドメイン」は、異なるドメインとは独立に、エピトープとして知られる抗原の領域と特異的に結合するドメインを意味する。
【００２７】
多重特異性抗原結合タンパク質という用語は、少なくとも２つの異なる抗原結合部位を含んでなる抗原結合タンパク質を意味する。これらの各抗原結合部位は、同じ抗原上に存在しても異なる抗原上に存在してもよい異なるエピトープに結合し得る。多重特異性抗原結合タンパク質は、２つ以上の抗原、例えば、２つの抗原、または３つの抗原、または４つの抗原に特異性を有する。
【００２８】
多重特異性抗原結合タンパク質の例には、各末端において結合ドメインに直接または間接的に（例えば、リンカー配列を介して）連結された抗体のＦｃ領域、またはその一部からなる、またはから本質的になるものを含む。このような抗原結合タンパク質は、Ｆｃ領域により分離された２つの結合ドメイン、またはその一部を含んでなり得る。分離されたとは、結合ドメインが互いに直接連結されず、Ｆｃ領域の反対の末端（Ｃ末端とＮ末端）に、または他の任意の足場領域に配置されてもよいことを意味する。
【００２９】
抗原結合タンパク質は、直接またはリンカーを介して間接的に、２つの結合ドメインに、例えば各足場領域のＮ末端とＣ末端においてそれぞれ結合された２つの足場領域を含んでなり得る。各結合ドメインは異なる抗原と結合してよい。
【００３０】
本明細書で使用する場合、用語ｍＡｂｄＡｂは、さらなる結合ドメイン、特に、単一可変ドメインに連結されたモノクローナル抗体、例えば、ドメイン抗体を意味する。ｍＡｂｄＡｂは少なくとも２つの抗原結合部位を有し、そのうち少なくとも１つはドメイン抗体に由来し、少なくとも１つはＶＨ／ＶＬドメイン対に由来する。
【００３１】
「ｄＡｂ（商標）コンジュゲート」は、薬物が共有結合または非共有結合の手段により化学的にコンジュゲートされたｄＡｂを含んでなる組成物を意味する。好ましくは、ｄＡｂと薬物は共有結合される。このような共有結合は、ペプチド結合、または修飾側鎖を介するものなどの他の手段によるものであり得る。非共有結合は、直接的（例えば、静電気的相互作用、疎水性相互作用）または間接的（例えば、相補的結合間（例えば、ビオチンとアビジン）の非共有結合を介し、一方のパートナーは薬物に共有結合され、相補的結合パートナーはｄＡｂ（商標）に共有結合される）であり得る。相補的結合パートナーが使用される場合、それらの結合パートナーの一方は薬物に直接または好適なリンカー部分を介して共有結合させることができ、相補的結合パートナーはｄＡｂ（商標）に直接または好適なリンカー部分を介して共有結合させることができる。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「ｄＡｂ（商標）融合物」は、ｄＡｂ（商標）とポリペプチド薬物（ｄＡｂ（商標）またはｍＡｂであり得る）を含んでなる融合タンパク質を意味する。ｄＡｂ（商標）およびポリペプチド薬物は、単一の連続ポリペプチド鎖の離散部（部分）として存在する。
【００３３】
１つの実施態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒトＩＣＯＳとカニクイザルＩＣＯＳなどの別種由来のＩＣＯＳの間で交差反応性を示す。１つの実施態様では、本発明の抗原結合タンパク質は、ヒトおよびカニクイザルＩＣＯＳと特異的に結合する。ヒトおよびサル種と結合し得る薬物を提供することにより、これらの系における結果を検定し、同じ薬物を用いてデータを対照比較することが可能となる。疾患モデルで使用される他種、例えば、イヌまたはサル、特にサルとの公差反応性が想定される。
【００３４】
ＩＣＯＳ結合タンパク質と参照ＩＣＯＳ結合タンパク質の間の競合は、競合ＭＳＤ、ＥＬＩＳＡ、ＦＭＡＴまたはＢＩＡｃｏｒｅにより決定可能である。１つの実施態様では、競合アッセイは、ＩＣＯＳ結合タンパク質はＩＣＯＳリガンド結合との比較により行われる。この競合にはいくつかの可能性のある理由がある：２つのタンパク質は、同じもしくはオーバーラップするエピトープと結合し得ること、結合の立体的阻害が存在し得ること、または第１のタンパク質の結合が抗原にコンフォメーション変化を引き起こすことがあり、これが第２のタンパク質の結合を回避もしくは低減すること。
【００３５】
用語「中和する」は、本明細書で使用される場合、ＩＣＯＳとＩＣＯＳ−Ｌの間の相互作用が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＩＣＯＳ結合タンパク質の不在下でのＩＣＯＳとＩＣＯＳ−Ｌの相互作用と比較して本明細書に記載の抗原結合タンパク質の存在下で低減されることを意味する。中和は、ＩＣＯＳのそのリガンドへの結合を遮断すること、ＩＣＯＳがそのリガンドにより活性化されるのを防ぐこと、ＩＣＯＳもしくはその受容体をダウンレギュレートすること、またはエフェクター機能に影響を与えることのうち１以上により得る。例えば、実施例３および５に記載のリガンド結合がＩＣＯＳ結合タンパク質の中和能を評価するために使用できる。
【００３６】
ＩＣＯＳとＩＣＯＳ−Ｌの間の相互作用に対するＩＣＯＳ結合タンパク質の効果は部分的であっても完全であってもよい。ＩＣＯＳ結合タンパク質の中和は、ＩＣＯＳとＩＣＯＳ−Ｌの相互作用を、ＩＣＯＳ結合タンパク質の不在下でのＩＣＯＳとＩＣＯＳ−Ｌの相互作用の少なくとも２０％、３０％  ４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％遮断し得る。
【００３７】
中和は、当業者に公知のまたは本明細書に記載の１以上のアッセイを用いて決定または測定され得る。
【００３８】
親和性は、ある分子、例えば、本発明の抗原結合タンパク質と、別の分子、例えば、その標的抗原との単一結合部位での結合の強度である。抗原結合タンパク質とその標的の結合親和性は、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）もしくはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、または速度論（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析）により決定され得る。例えば、実施例５に記載のＢｉａｃｏｒｅ（商標）法が結合親和性を測定するために使用できる。
【００３９】
アビディティは、複数の部位での、例えば、相互作用の価数を考慮に入れた、２分子の相互結合の強度の合計である。
【００４０】
１つの実施態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質−ＩＣＯＳ相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下である。あるいは、ＫＤは、５〜１０ｎＭの間、または１〜２ｎＭの間であり得る。ＫＤは、１ｐＭ〜５００ｐＭの間、または５００ｐＭ〜１ｎＭの間であり得る。当業者は、ＫＤの数値が小さいほど結合が強いことを認識するであろう。ＫＤの逆数（すなわち、１／ＫＤ）は、Ｍ−１を単位とする平衡会合定数（ＫＡ）である。当業者は、ＫＡの数値が大きいほど結合が強いことを認識するであろう。
【００４１】
解離速度定数（ｋｄ）または「解離速度」は、１秒当たりに減衰するＩＣＯＳ結合タンパク質ＩＣＯＳ複合体、すなわち、複合体画分の安定性を表す。例えば、ｋｄ０．０１ｓ−１は、１秒当たり１％の複合体の減衰に相当する。１つの実施態様では、解離速度定数（ｋｄ）は、１×１０−３ｓ−１以下、１×１０−４ｓ−１以下、１×１０−５ｓ−１以下、または１×１０−６ｓ−１以下である。ｋｄは１×１０−５ｓ−１〜１×１０−４ｓ−１の間、または１×１０−４ｓ−１〜１×１０−３ｓ−１の間であり得る。
【００４２】
結合速度定数（ｋａ）または「結合速度」は、ＩＣＯＳ結合タンパク質−ＩＣＯＳ複合体形成の速度を意味する。１つの実施態様では、結合速度定数（ｋａ）は、約１．０×１０５Ｍ−１ｓ−１である。
【００４３】
「単離された」により、抗原結合タンパク質または核酸などの分子が、天然に見られ得る環境から取り出されていることを意図する。例えば、その分子は、天然に通常ともに存在する物質から精製され得る。例えば、サンプル中のその分子の質量は、総質量の９５％であり得る。
【００４４】
用語「発現ベクター」は、本明細書で使用する場合、真核細胞もしくは原核細胞などの細胞、または無細胞発現系（対象とする核酸配列がタンパク質などのペプチド鎖として発現される）に対象とする核酸を導入するために使用できる単離された核酸を意味する。このような発現ベクターは、例えば、対象とする核酸を含んでなるコスミド、プラスミド、ウイルス配列、トランスポゾン、および直鎖核酸であり得る。ひと度、発現ベクターが細胞または無細胞発現系（例えば、網状赤血球溶解液）に導入されれば、対象とする核酸にコードされているタンパク質が転写／翻訳機構により産生される。本開示の範囲内の発現ベクターは、真核生物または原核生物発現に必要な要素および誘導型ウイルスプロモーター駆動ベクター、例えば、ＣＭＶプロモーター駆動ベクター、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＥＰ４、およびそれらの誘導体、バキュロウイルス発現ベクター、ショウジョウバエ発現ベクター、およびヒトＩｇ遺伝子プロモーターなどの哺乳動物遺伝子プロモーターにより駆動される発現ベクターを提供し得る。他の例としては、原核生物発現ベクター、例えば、Ｔ７プロモーター駆動ベクター、例えば、ｐＥＴ４１、ラクトースプロモーター駆動ベクターおよびアラビノース遺伝子プロモーター駆動ベクターが挙げられる。当業者は、多くの他の好適な発現ベクターおよび発現系を認識するであろう。
【００４５】
用語「組換え宿主細胞」は、本明細書で使用する場合、対象とする核酸配列を含んでなり、その細胞への導入前に単離された細胞を意味する。例えば、対象とする核酸配列は発現ベクターであってよく、細胞は原核生物または真核生物細胞であり得る。例示的真核細胞は、限定されるものではないが、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、ＨｅｐＧ２、６５３、ＳＰ２／０、ＮＳ０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫細胞またはその任意の誘導体などの哺乳動物細胞である。最も好ましくは、真核細胞は、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＳＰ２／０、またはＣＨＯ細胞である。大腸菌は一例としての原核細胞である。本発明の組換え細胞は、トランスフェクション、細胞融合、不死化、または当技術分野で周知の他の手法により作出され得る。細胞にトランスフェクトされた、発現ベクターなどの対象とする核酸配列は染色体外にあってもまたは細胞の染色体に安定して組み込まれてもよい。
【００４６】
「キメラ抗体」は、ドナー抗体に由来する天然可変領域（軽鎖および重鎖）をアクセプター抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域と組み合わせて含む操作抗体の一種を意味する。
【００４７】
「ヒト化抗体」は、そのＣＤＲ非がヒトドナー免疫グロブリンに由来し、その分子の残りの免疫グロブリン由来部分が１以上のヒト免疫グロブリンに由来する操作抗体の一種を意味する。加えて、フレームワーク支持残基は、結合親和性を保存するように変更されてよい（例えば、Queen et al. Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson, et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)参照）。好適なヒトアクセプター抗体は、従来のデータベース、例えば、ＫＡＢＡＴ（商標）データベース、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓデータベース、およびＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースから、ドナー抗体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列との相同性により選択されたものであり得る。ドナー抗体のフレームワーク領域との相同性（アミノ酸に基づく）を特徴とするヒト抗体は、ドナーＣＤＲの挿入のための重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに好適であり得る。軽鎖定常または可変フレームワーク領域を供与し得る好適なアクセプター抗体も同様の方法で選択することができる。アクセプター抗体重鎖および軽鎖は同じアクセプター抗体に起源する必要は無いことに留意されたい。従来技術は、このようなヒト化抗体を生産するいくつかの方法を記載している−、例えば、ＥＰ−Ａ−０２３９４００およびＥＰ−Ａ−０５４９５１参照。
【００４８】
用語「完全ヒト抗体」には、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域（存在する場合）を有する抗体が含まれる。本発明のヒト配列抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは無作為もしくは部位特異的変異誘発、またはｉｎ  ｖｉｖｏでは体細胞変異によって挿入される変異）を含み得る。完全ヒト抗体は、最終的にヒト起源のポリヌクレオチドによりコードされたアミノ酸配列またはこのような配列と同一のアミノ酸配列を含んでなる。本明細書で意味されるように、トランスジェニックマウスで産生されたマウスゲノムに挿入されたヒト免疫グロブリンコードＤＮＡによりコードされた抗体は、最終的にヒト起源のＤＮＡによりコードされているので、完全ヒト抗体である。この場合、ヒト免疫グロブリンコードＤＮＡは、マウス内で（抗体をコードするために）再構成され得、体細胞変異も起こり得る。マウス内でこのような変化を受けた、元々ヒトＤＮＡによりコードされた抗体は、本明細書で意味されるような完全ヒト抗体である。このようなトランスジェニックマウスの使用により、ヒト抗原に対して完全ヒト抗体を選択することが可能となる。当技術分野で理解されているように、完全ヒト抗体は、ヒトＤＮＡライブラリーがヒト生殖細胞系ＤＮＡ配列を含んでなる抗体の作製のためのファージに挿入されるファージディスプレー技術を用いて作製できる。
【００４９】
用語「ドナー抗体」は、その可変領域、ＣＤＲ、またはその他のその機能的フラグメントまたは類似体のアミノ酸配列を第１の免疫グロブリンパートナーに供与する抗体を意味する。従って、ドナーは、変更された免疫グロブリンコード領域と結果として発現される、ドナー抗体に特徴的な抗原特異性および中和活性を有する変更された抗体を提供する。
【００５０】
用語「アクセプター抗体」は、その重鎖および／もしくは軽鎖フレームワーク領域ならびに／またはその重鎖および／もしくは軽鎖定常領域をコードするアミノ酸配列の全部（またはいずれか一部）を第１の免疫グロブリンパートナーに供与する、ドナー抗体とは異種の抗体を意味する。ヒト抗体はアクセプター抗体であり得る。
【００５１】
用語「ＶＨ」および「ＶＬ」は、本明細書では、抗原結合タンパク質のそれぞれ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を意味して使用される。
【００５２】
「ＣＤＲ」は、抗原結合タンパク質の相補性決定領域アミノ酸配列と定義される。これらは免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部分には３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）が存在する。よって、「ＣＤＲ」は、本明細書で使用する場合、３つ総ての重鎖ＣＤＲ、３つ総ての軽鎖ＣＤＲ、総ての重鎖および軽鎖ＣＤＲ、または少なくとも２つのＣＤＲを意味する。
【００５３】
本明細書を通して、可変ドメイン配列および全長抗体配列のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリング規則に従って符番される。同様に、実施例で使用する用語「ＣＤＲ」、「ＣＤＲＬ１」、「ＣＤＲＬ２」、「ＣＤＲＬ３」、「ＣＤＲＨ１」、「ＣＤＲＨ２」、「ＣＤＲＨ３」もナンバリング規則に従う。さらに詳しくは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1991)を参照。
【００５４】
可変ドメイン配列および全長抗体配列のアミノ酸残基には別のナンバリング規則も存在することは当業者に自明であろう。ＣＤＲ配列、例えば、Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883に示されているものなどの別のナンバリング規則も存在する。抗体の構造およびタンパク質の折り畳みは、他の残基がＣＤＲ配列の考慮される部分であり得、当業者にはそのように理解されるであろうことを意味する。
【００５５】
当業者に利用可能なＣＤＲ配列の他のナンバリング規則には、「ＡｂＭ」（バース大学）および「ｃｏｎｔａｃｔ」（ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン）法が含まれる。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭおよびｃｏｎｔａｃｔ法のうち少なくとも２つを用いて最小オーバーラッピング領域を決定し、「最小結合単位」を提供することができる。最小結合単位は、ＣＤＲの下位部分であり得る。
【００５６】
以下の表１は、各ＣＤＲまたは結合単位に関して各ナンバリング規則を用いて１つの定義を表している。Ｋａｂａｔナンバリング法は、表１で可変ドメインアミノ酸配列を符番するために使用されている。ＣＤＲ定義のいくつかは個々の刊行物によって異なる場合があることに留意されたい。
【００５７】
【表１】
2020079252.tif 000003
【００５８】
よって、ＩＣＯＳ結合タンパク質は、以下のＣＤＲのいずれか１つまたは組合せを含んでなるものが提供される。
CDRH1: DYAMH(配列番号1)
CDRH2: LISIYSDHTNYNQKFQG(配列番号2)
CDRH3: NNYGNYGWYFDV(配列番号3)
CDRL1: SASSSVSYMH(配列番号4)
CDRL2: DTSKLAS(配列番号5)
CDRL3: FQGSGYPYT(配列番号6)
【００５９】
本発明の１つの実施態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域にＣＤＲＨ１（配列番号１）、ＣＤＲＨ２（配列番号２）、およびＣＤＲＨ３（配列番号３）を含んでなる。配列番号７に示されるヒト化重鎖可変領域を含んでなる本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、「Ｈ２」と呼称される。いくつかの実施態様では、本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含んでなる。好適には、本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、配列番号７と約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，または１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含んでなり得る。
【００６０】
ヒト化重鎖（ＶＨ）可変領域（Ｈ２）：
【化２】
2020079252.tif 000004
【００６１】
本発明の１つの実施態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域にＣＤＲＬ１（配列番号４）、ＣＤＲＬ２（配列番号５）、およびＣＤＲＬ３（配列番号６）を含んでなる。配列番号８に示されるヒト化軽鎖可変領域を含んでなる本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、「Ｌ５」と呼称される。よって、配列番号７の重鎖可変領域と配列番号８の軽鎖可変領域を含んでなる本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、本明細書ではＨ２Ｌ５と呼称することができる。
【００６２】
好適には、重鎖可変鎖および軽鎖構築物のリーダー配列は図９で示され、限定されるものではないが、MGWSCIILFLVATATGVHS（配列番号１１）を含む。
【００６３】
いくつかの実施態様では、本発明のＣＯＳ結合タンパク質は、配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含んでなる。好適には、本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、配列番号８と約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含んでなり得る。
【００６４】
ヒト化軽鎖（ＶＬ）可変領域（Ｌ５）
【化３】
2020079252.tif 000005
【００６５】
ＣＤＲまたは最小結合単位は、少なくとも１個のアミノ酸の置換、欠失または付加により改変され得、ここで、この変異体抗原結合タンパク質は、クローン４２２．２から産生されたマウス抗体または配列番号７および配列番号８を含んでなる抗体などの非改変タンパク質の生物学的特徴を実質的に保持している。
【００６６】
ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３のそれぞれは単独でまたは任意の順列もしくは組合せでの他の任意のＣＤＲとの組合せにおいて改変され得ることが認識されるであろう。１つの実施態様では、ＣＤＲは、３個までのアミノ酸、例えば、１または２個のアミノ酸、例えば、１個のアミノ酸の置換、欠失または付加によって改変される。一般に、改変は、置換、特に、例えば、以下の表２に示されるような保存的置換である。
【００６７】
【表２】
2020079252.tif 000006
【００６８】
例えば、変異体ＣＤＲにおいて、最小結合単位のアミノ酸残基は同じものを保持してよいが、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａ定義の一部としてＣＤＲを含んでなる隣接残基は、保存的アミノ酸残基で置換され得る。
【００６９】
上記のように改変されたＣＤＲまたは最小結合単位を含んでなるこのような抗原結合タンパク質は、本明細書では、「機能的ＣＤＲ変異体」または「機能的結合単位変異体」と呼ばれ得る。好適には、１つの実施態様では、配列番号１、２、３、４、５、および／もしくは６に示されるアミノ酸配列ならびに／またはそれらの機能的ＣＤＲ変異体を有する１以上のＣＤＲを含んでなるＩＣＯＳ結合タンパク質が提供される。
【００７０】
用語「エピトープ」は、本明細書で使用する場合、抗原結合タンパク質の特定の結合ドメインと接触させる抗原の部分を意味する。エピトープは直鎖または立体配座的／不連続であり得る。立体配座エピトープまたは不連続エピトープは、他の配列により分離されたアミノ酸残基を含んでなり、すなわち、抗原の一次配列において連続的な配列ではない。これらの残基はペプチド鎖の異なる領域に由来し得るが、それらは抗原の三次元構造では近接している。多量体抗原の場合、立体配座エピトープまたは不連続エピトープは、異なるペプチド鎖由来の残基を含み得る。エピトープ内に含まれる特定の残基は、コンピューターモデリングプログラムまたはＸ線結晶学などの当技術分野で公知の方法によって得られる三次元構造を介して決定することができる。
【００７１】
ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１およびＨ２は、有限数の主鎖立体配座のうちの１つを構造上示す傾向がある。ＣＤＲの特定のカノニカル構造クラスは、ＣＤＲの長さ、およびＣＤＲとフレームワーク領域の両方においてキーポジションに位置する残基（構造決定残基(structurally determining residues)またはＳＤＲ）により決定されるループパッキングの両方により定義される。Martin and Thornton (1996; J Mol Biol 263:800-815)は、「キー残基」カノニカル鋳型を定義するための自動法を作出している。クラスター分析がＣＤＲセットのカノニカルクラスを定義するために使用され、次に、カノニカル鋳型が埋没疎水基、水素結合残基、および保存されたグリシンおよびプロリンを分析することにより同定される。抗体配列のＣＤＲは、配列をキー残基鋳型と比較し、同一性または類似性マトリックスを用いて各鋳型をスコア化することによってカノニカルクラスに割り付けることができる。
【００７２】
ＣＤＲ、対応するＣＤＲ、結合単位、重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖、および抗原結合タンパク質について複数の変異体ＣＤＲカノニカル位置があり得るので、抗原結合タンパク質がＩＣＯＳと特異的に結合可能なようにＣＤＲのカノニカル構造が維持される限り、本発明の抗原結合タンパク質にいずれの置換組合せが存在してもよい。
【００７３】
上記で述べたように、ＣＤＲの特定のカノニカル構造クラスは、ＣＤＲの長さ、およびＣＤＲとフレームワーク領域の両方においてキーポジションに位置する残基により決定されるループパッキングの両方により定義される。
【００７４】
クエリー核酸配列とサブジェクト核酸配列の間の「同一性パーセント」は、サブジェクト核酸配列が、ペアワイズＢＬＡＳＴＮアラインメントが実施された後にクエリー核酸配列と１００％のクエリーカバー率を有する際にＢＬＡＳＴＮアルゴリズムにより計算される、パーセンテージとして表される「同一性」値である。このようなクエリー核酸配列とサブジェクト核酸配列の間のペアワイズＢＬＡＳＴＮアラインメントは、低複雑性領域用のフィルターがオフにされた、デフォルト設定の、the National Center for Biotechnology Instituteのウェブサイトで利用可能なＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用することにより実施される。重要なこととして、クエリー核酸配列は、本明細書の１以上の請求項で特定される核酸配列により記載され得る。
【００７５】
クエリーアミノ酸配列とサブジェクトアミノ酸配列の間の「同一性パーセント」は、サブジェクトアミノ酸配列が、ペアワイズＢＬＡＳＴＰアラインメントが実施された後にクエリーアミノ酸配列と１００％のクエリーカバー率を有する際にＢＬＡＳＴＰアルゴリズムにより計算される、パーセンテージとして表される「同一性」値である。このようなクエリーアミノ酸配列とサブジェクトアミノ酸配列の間のペアワイズＢＬＡＳＴＰアラインメントは、低複雑性領域用のフィルターがオフにされた、デフォルト設定の、the National Center for Biotechnology Instituteのウェブサイトで利用可能なＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用することにより実施される。重要なこととして、クエリーアミノ酸配列は、本明細書の１以上の請求項で特定されるアミノ酸配列により記載され得る。
【００７６】
クエリー配列は、サブジェクト配列と１００％同一であり得、またはそれはサブジェクト配列と比較した場合に、同一性％が１００％未満となるような特定の整数までのアミノ酸またはヌクレオチド変異を含み得る。例えば、クエリー配列は、サブジェクト配列と少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である。このような変異は、少なくとも１個のアミノ酸欠失、置換（保存的および非保存的置換を含む）、または挿入を含み、ここで、前記変異は、クエリー配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端に、またはクエリー配列内のアミノ酸もしくはヌクレオチド間に個々に、もしくはクエリー配列内の１以上の連続する群として挿入された、そのような末端の位置と末端の位置の間のいずれかの場所に見られてよい。
【００７７】
同一性％は、ＣＤＲを含むクエリー配列の全長にわたって決定してもよい。あるいは、同一性％はＣＤＲを除外してもよく、例えば、ＣＤＲはサブジェクト配列と１００％同一であり、同一性％の変動はクエリー配列の残部にあり、結果として、ＣＤＲ配列は固定される／そのままである。
【００７８】
変異体配列は、配列番号７または配列番号８などの非改変タンパク質の生物学的特徴を実質的に保持する。
【００７９】
ＶＨまたはＶＬ配列は、１５個までのアミノ酸置換、付加または欠失を有する変異体配列であってもよい。例えば、変異体配列は１５個まで、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個のアミノ酸置換、付加または欠失を有してよい。
【００８０】
配列変動はＣＤＲを除外してもよく、例えば、ＣＤＲはＶＨもしくはＶＬ（またはＨＣもしくはＬＣ）配列と同じであり、変動はＶＨもしくはＶＬ（またはＨＣもしくはＬＣ）配列の残部にあり、結果として、ＣＤＲ配列は固定される／そのままである。
【００８１】
当業者は、抗体などの抗原結合タンパク質の生産時に、特に、使用する細胞株および抗原結合タンパク質の特定のアミノ酸配列によって翻訳後修飾が起こり得ることを認識するであろう。例えば、これは、特定のリーダー配列の切断、様々なグリコシル化およびリン酸化パートナーにおける様々な糖部分の付加、脱アミド化、酸化、ジスルフィド結合スクランブル化、異性化、Ｃ末端リシンクリッピング、およびＮ末端グルタミン環化を含み得る。本発明は、１以上の翻訳後修飾下にあった、または１以上の翻訳後修飾を受けた抗原結合タンパク質の使用を包含する。よって、本発明の「抗原結合タンパク質」または「抗体」は、本明細書に記載されるような翻訳後修飾を受けた、始めに定義された、それぞれ「抗原結合タンパク質」または「抗体」を含む。
【００８２】
脱アミド化は、主としてアスパラギン（Ｎ）をイソアスパラギン酸およびアスパラギン酸（Ｄ）におよそ３：１比で変換する酵素反応である。それほどではないにせよ、脱アミド化はグルタミン残基でも同様に起こり得る。ＣＤＲにおける脱アミド化は分子の電荷に変化をもたらすが、一般に、抗原結合には変化を生じず、ＰＫ／ＰＤにも影響しない。
【００８３】
酸化は、生産および保存中に（すなわち、酸化条件の存在下で）起こり得、直接的には反応性酸素種により、または間接的には酸化ストレスの二次的副生成物との反応により誘導されるタンパク質の共有結合的修飾をもたらす。酸化は主としてメチオニン残基で起こるが、場合によってはトリプトファンおよび遊離システイン残基でも起こり得る。
【００８４】
ジスルフィド結合スクランブル化は、生産および基本的保存条件で起こり得る。特定の状況で、ジスルフィド結合が不適切に破断または形成して不対合システイン残基（−ＳＨ）が生じることがある。これらの遊離（不対合）スルフヒドリル（−ＳＨ）はシャッフリングを促進する場合がある。
【００８５】
異性化は一般に、生産、精製、および保存（酸性ｐＨ下）中に起こり、通常、アスパラギン酸が化学的プロセスを経てイソアスパラギン酸に変換される際に起こる。
【００８６】
重鎖および／または軽鎖のＮ末端グルタミンは、ピログルタミン酸塩（ｐＧｌｕ）を形成する可能性がある。ほとんどのｐＧｌｕ形成は生産バイオリアクター内で起こるが、処理のｐＨおよび温度ならびに保存条件によっては非酵素的に形成される場合もある。ｐＧｌｕの形成は、組換えｍＡｂの主要分解経路の１つと考えられる。
【００８７】
Ｃ末端リシンクリッピングは、カルボキシペプチダーゼにより触媒される酵素反応であり、組換えｍＡｂにおいて一般に見られる。このプロセスの変種として、一方または両方の重鎖からのリシンの除去が含まれる。リシンクリッピングは生物活性に影響を及ぼすとは思われず、ｍＡｂのエフェクター機能にも影響はない。
【００８８】
ヒトにはタンパク質と結合し得る天然自己抗体が存在する。よって、自己抗体は内在タンパク質（ナイーブ対象に存在）ならびに処置のために対象に投与されたタンパク質またはペプチドに結合し得る。治療用タンパク質結合自己抗体および薬物処置に応答して新たに形成される抗体は、抗薬物抗体(anti-drug antibodies)（ＡＤＡ）と総称される。対象に投与された治療用タンパク質およびペプチドなどの分子に対する既存の抗体はそれらの有効性に影響を及ぼすことがあり、投与反応、過敏性、処置された患者の臨床応答の変化およびその分子を持続させる、排除するまたは中和することによるバイオアベイラビリティの変化をもたらし得る。免疫原性が低減された（すなわち、対象、特に、ヒト対象に投与した際に既存のＡＤＡに結合する能力が低減されたヒト免疫グロブリン（抗体）単一可変ドメインまたはｄＡｂ（商標）を含んでなる治療用分子を提供することが有利であり得る。
【００８９】
よって、本発明の１つの実施態様では、等価な非改変分子に比べて既存の抗体（ＡＤＡ）との結合能が低減された改変型ｄＡｂ（商標）が提供される。結合能の低減とは、改変分子が既存のＡＤＡと低減された親和性がまたは低減されたアビディティで結合することを意味する。前記改変ｄＡｂ（商標）は、（ａ）Ｃ末端付加、延長、欠失もしくはタグ、および／または（ｂ）１以上のアミノ酸フレームワーク置換、から選択される１以上の改変を含んでなる。
【００９０】
本開示のポリペプチドおよびｄＡｂ（商標）ならびにこれらを含んでなるアゴニストは、例えば、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体または少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体Ｆｃ領域の付加によって、または抗体ドメインとのコンジュゲーションによって、より大きい流体力学的サイズを有するような形式とすることができる。例えば、ポリペプチドｄＡｂ（商標）およびアゴニストは、抗体のより大きな抗原結合フラグメントの、または抗体の形式とすることができる（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ＩｇＧ、ｓｃＦｖの形式）。
【００９１】
本明細書で使用する場合、「流体力学的サイズ」は、水溶液中での分子の拡散に基づいた分子（例えば、抗原結合タンパク質）の見掛けのサイズを意味する。タンパク質の見掛けのサイズを導くように溶液中でのタンパク質の拡散または運動を処理することができ、そのサイズはタンパク質粒子の「ストークス半径」または「流体力学的半径」で示される。タンパク質の「流体力学的サイズ」は質量および形状（立体配座）の両方に依存し、従って、同じ分子量を有する２つのタンパク質は、そのタンパク質の全体的な立体配座および電荷に基づいて異なる流体力学的サイズを持ち得る。流体力学的サイズの増大は関連の腎クリアランスの低下をもたらし、半減期（ｔ１／２）の延長が見られる。
【００９２】
本開示の抗原結合タンパク質（例えば、ドメイン抗体単量体および多量体）の流体力学的サイズは、当技術分野で周知の方法を用いて決定することができる。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーが抗原結合タンパク質の流体力学的サイズを決定するために使用できる。架橋アガロースマトリックスなど、抗原結合タンパク質の流体力学的サイズを決定するための好適なゲル濾過マトリックスは周知であり、容易に入手できる。
【００９３】
抗原結合タンパク質形式のサイズ（例えば、抗体単量体にＰＥＧ部分ドメインが結合されたもののサイズ）は所望の適用によって異なり得る。例えば、抗原結合タンパク質が循環を離れて末梢組織へ入ることを意図する場合には、ＩＣＯＳ結合タンパク質の流体力学的サイズは血流からの溢出を促すように小さく維持することが望ましい。あるいは、抗原結合タンパク質をより長時間体循環に留まらせたい場合には、例えばＩｇ様タンパク質の形式とすることにより抗原結合タンパク質のサイズを大きくすることができる。
【００９４】
医薬組成物
本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、本明細書に記載のヒト疾患の処置に使用するために医薬組成物中に組み込むことができる。１つの実施態様では、医薬組成物は、抗原結合タンパク質を場合により１種類以上の薬学上許容可能な担体および／または賦形剤と組み合わせて含んでなる。
【００９５】
このような組成物は、許容可能な製薬実務によって知られ、呼称される薬学上許容可能な担体を含んでなる。
【００９６】
医薬組成物は、注射または持続的注入（例として、限定されるものではないが、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内および門脈内を含む）により投与され得る。１つの実施態様では、組成物は、静脈内投与に好適である。医薬組成物は、局所投与（限定されるものではないが、経皮、吸入、鼻腔内または眼内投与を含む）または経腸投与（限定されるものではないが、経口または直腸投与を含む）に好適であり得る。
【００９７】
医薬組成物は、０．５ｍｇ〜１０ｇの間のＩＣＯＳ結合タンパク質、例えば、５ｍｇ〜１ｇの間の抗原結合タンパク質を含んでなり得る。あるいは、組成物は、５ｍｇ〜５００ｍｇの間、例えば、５ｍｇ〜５０ｍｇの間を含んでなり得る。
【００９８】
このような医薬組成物の調製方法は当業者に周知である。投与様式および使用する特定のタンパク質に適当であれば、組成物に他の賦形剤を加えてもよい。種々の賦形剤およびそれらの使用の例は、Lowe et al.(2011)に記載されている。
【００９９】
抗原結合タンパク質を投与するための有効用量および処置計画は、患者の齢、体重および健康状態、ならびに処置される疾患などの因子によって異なり得る。このような因子は主治医の範囲内にある。適当用量を選択する指針は例えばBai et al.(2012)に見出すことができる。
【０１００】
医薬組成物は、他の薬剤を伴う抗原結合タンパク質のパーツキットを、場合により使用説明書とともに含んでなり得る。便宜には、キットは、所定量の試薬を使用説明書とともに含んでなり得る。
【０１０１】
用語「個体」、「対象」および「患者」は、本明細書では互換的に使用される。１つの実施態様では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、マーモセットまたはサルである。別の実施態様では、対象はヒトである。
【０１０２】
本明細書に記載の抗原結合タンパク質はまた、処置法にも使用可能である。処置は、治療、予防または回避であり得る。処置は、疾患の少なくとも１つの態様または症状の緩和、軽減、または回避を包含し、本明細書に記載の疾患の回避または治癒を包含する。
【０１０３】
本明細書に記載のＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分は、治療的、予防的または回避的処置に有効な量で使用される。本明細書に記載のＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分の治療上有効な量は、疾患の１以上の症状の改善もしくは軽減に、または疾患の回避もしくは治癒に有効な量である。
【０１０４】
よって、１つの実施態様では、本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分は、療法において使用するために提供される。１つの実施態様では、本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分は、癌、感染性疾患および／または敗血症の処置において使用するために提供される。本発明はまた、癌、感染性疾患および／または敗血症の処置のための薬剤の製造における本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分の使用も提供する。
【０１０５】
よって、本明細書では、癌、感染性疾患および／または敗血症の処置に使用するための、単離されたＩＣＯＳ結合タンパク質もしくはそれらの抗原結合部分または前記の単離されたＩＣＯＳ結合タンパク質もしくはそれらの抗原結合部分を含んでなる医薬組成物が提供される。
【０１０６】
製造方法
抗原結合タンパク質は、いくつかの従来技術のいずれによって調製してもよい。例えば、抗原結合タンパク質は、それらを天然に発現する細胞から精製してもよく（例えば、抗体はそれを産生するハイブリドーマから精製することができる）、または組換え発現系で生産してもよい。
【０１０７】
いくつかの異なる発現系および精製計画が本発明の抗原結合タンパク質を作製するために使用可能である。一般に、宿主細胞は、所望の抗原結合タンパク質をコードする組換え発現ベクターで形質転換させる。原核生物（グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌(Escherichia coli)、バチルス(Bacilli)種、シュードモナス(Pseudomonas)種、コリネバクテリウム(Corynebacterium)種を含む）、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)）、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)）、真菌（例えば、アスペルギルス(Aspergilus)種）、または昆虫細胞および哺乳動物起源の細胞株（例えば、ＣＨＯ、Ｐｅｒｃ６、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ）を含む高等真核生物を含む真核生物を含め、広範囲の宿主細胞が使用可能である。
【０１０８】
宿主細胞は、単離された宿主細胞であり得る。宿主細胞は通常、多細胞生物（例えば、植物または動物）の一部ではない。宿主細胞は非ヒト宿主細胞であり得る。
【０１０９】
細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主とともに使用するための適当なクローニングおよび発現ベクター、ならびにクローニング方法は当技術分野で公知である。
【０１１０】
これらの細胞を、抗原結合タンパク質の発現を促進する条件化で培養し、ポリペプチドを従来のタンパク質精製手順により回収することができる。本明細書で使用が企図される抗原結合タンパク質には、夾雑材料を実質的に含まない、実質的に均質な抗原結合タンパク質が含まれる。
【０１１１】
当業者は、抗原結合タンパク質の生産時に、特に、使用する細胞株および抗原結合タンパク質の特定のアミノ酸配列によって、翻訳後修飾が起こり得ることを認識するであろう。これは特定のリーダー配列の切断、様々なグリコシル化パターンでの様々な糖部分の付加、脱アミド化（例えば、アスパラギンまたはグルタミン残基における）、酸化（例えば、メチオニン、トリプトファンまたは遊離システイン残基における）、ジスルフィド結合スクランブル化、異性化（例えば、アスパラギン酸残基における）、Ｃ末端リシンクリッピング（例えば、一方または両方の重鎖に由来）、およびＮ末端グルタミン環化（例えば、重鎖および／または軽鎖における）を含み得る。本発明は、１以上の翻訳後修飾下にあった、または１以上の翻訳後修飾を受けた抗体の使用を包含する。修飾はＣＤＲ、可変フレームワーク領域、または定常領域で起こり得る。修飾は分子の電荷の変化をもたらし得る。この修飾は一般に、抗原結合、機能、生物活性の変化をもたらさず、ＩＣＯＳ結合タンパク質の薬物動態的（ＰＫ）または薬力学的（ＰＤ）特徴にも影響を及ぼさない。
【０１１２】
用語「エフェクター機能」は、本明細書で使用する場合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）介在応答、Ｆｃ介在性貪食作用または抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）およびＦｃＲｎ受容体を介した抗体リサイクリングのうち１以上を意味するものとする。
【０１１３】
抗原結合タンパク質の定常領域とＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む種々のＦｃ受容体（ＦｃＲ）の間の相互作用は、抗原結合タンパク質のエフェクター機能を媒介すると考えられる。有意な生物学的効果は、エフェクター機能の結果であり得る。通常、エフェクター機能媒介能は、抗原結合タンパク質の抗原への結合を必要とし、総てではないが抗原結合タンパク質はあらゆるエフェクター機能を媒介する。
【０１１４】
エフェクター機能は、ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰエフェクター機能に関して評価するために、例えば、ナチュラルキラー細胞ではＦｃγＲＩＩＩの結合を介するものまたは単球／マクロファージではＦｃγＲＩを介するものを含むいくつかの方法で測定することができる。例えば、本発明の抗原結合タンパク質は、ナチュラルキラー細胞アッセイでＡＤＣＣエフェクター機能に関して評価することができる。ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ機能を評価するための実際のアプローチは、(Kellner C et al., “Boosting ADCC and CDC activity by Fc engineering and evaluation of antibody effector functions”, Methods, 1;65(1):105-13 (2014))に見出すことができる。
【０１１５】
ヒト定常領域のいくつかのアイソタイプ、特に、ＩｇＧ４およびＩｇＧ２アイソタイプは、ａ）古典的経路による補体の活性化；およびｂ）抗体依存性細胞介在性細胞傷害性の機能が低減されている。所望のエフェクター特性によって、抗原結合タンパク質の重鎖定常領域に対する種々の改変を行うことができる。特定の変異を含有するＩｇＧ１定常領域は、Ｆｃ受容体への結合を低減すること、従って、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを低減することが別に記載されている(Kellner C et al., “Boosting ADCC and CDC activity by Fc engineering and evaluation of antibody effector functions”, Methods, 1;65(1):105-13 (2014))。
【０１１６】
本発明の１つの実施態様では、抗原結合タンパク質のＡＤＣＣおよび／または補体活性化またはエフェクター機能が低減されるような定常領域を含んでなる抗原結合タンパク質が提供される。１つのこのような実施態様では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４アイソタイプの、天然状態で無効の定常領域または変異したＩｇＧ１定常領域を含んでなり得る。一例は、２３５番および２３７番（ＥＵインデックスナンバリング）のアラニン残基の置換を含んでなる。
【０１１７】
抗体のサブクラスは、補体活性化またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）などの二次的なエフェクター機能を部分的に決定する(Huber, et al., Nature 229(5284): 419-20 (1971); Brunhouse, et al., Mol Immunol 16(11): 907-17 (1979))。特定の適用に最適な抗体のタイプを特定する上で、抗体のエフェクター機能を考慮することができる。例えば、ｈＩｇＧ１抗体は比較的長い半減期を有し、補体結合において極めて有効であり、それらはＦｃγＲＩとＦｃγＲＩＩの両方に結合する。対照的に、ヒトＩｇＧ４抗体は、半減期が短く、補体を結合せず、ＦｃＲに対する親和性が低い。ＩｇＧ４のＦｃ領域のセリン２２８をプロリンで置換すると（Ｓ２２８Ｐ）、ｈＩｇＧ４で見られるヘテロ性が小さくなり、血清半減期が延長する(Kabat, et al., “Sequences of proteins of immunological interest” 5.sup.th Edition (1991); Angal, et al., Mol Immunol 30(1): 105-8 (1993))。ロイシン２３５をグルタミン酸で置換する第２の変異（Ｌ２３５Ｅ）は、残存するＦｃＲ結合活性および補体結合活性を排除する(Alegre, et al., J Immunol 148(11): 3461-8 (1992))。結果として得られる両変異を有する抗体は、ＩｇＧ４ＰＥと呼ばれる。ｈＩｇＧ４アミノ酸のナンバリングはＥＵナンバリング参照：Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969). PMID: 5257969からのものであった。本発明の１つの実施態様では、置換Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅを含んでなるＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含んでなるＩＣＯＳ抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ４ＰＥの名称を持ち得る。よって、重鎖可変領域Ｈ２および軽鎖可変領域Ｌ５およびＩｇＧ４ＰＥ  Ｆｃ領域を有するＩＣＯＳ結合タンパク質は、Ｈ２Ｌ５  ＩｇＧ４ＰＥまたは同義的にＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥと呼称される。
【０１１８】
ＡＤＣＣ／ＣＤＣの増強
当技術分野で理解されるように、抗体のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を増強する様々な技術が知られている。これらには、限定されるものではないが、Ｆｃ領域における様々な変異、コンプリジェントおよびポテリジェント技術が含まれる。本発明の１つの態様では、１以上のＡＤＣＣ／ＣＤＣ増強技術が本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質に適用されてよい。
【０１１９】
変異
また、特定の変異または残基Ａｓｎ２９７のグリコシル化の変更を含むヒトＩｇＧ１定常領域もＦｃ受容体への結合を増強するために記載されている。場合によっては、これらの変異がＡＤＣＣおよびＣＤＣを増強することも示されている、例えば、Kellner (2013)参照。
【０１２０】
本発明の１つの実施態様では、このような変異は、２３９、３３２および３３０（ＩｇＧ１）、または他のＩｇＧアイソタイプのける等価な位置から選択される位置の１以上に存在する。好適な変異の例は、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌである。１つの実施態様では、本明細書に記載される本発明の抗原結合タンパク質は、２３９番および３３２番で変異を受け、例えば、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅであり、またはさらなる実施態様では、それは２３９および３３２および３３０から選択される３以上の位置で変異を受け、例えば、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌ（ＥＵインデックスナンバリング）である。
【０１２１】
コンプリジェント
本発明の１つの実施態様では、キメラ重鎖定常領域を含んでなる抗原結合タンパク質、例えば、抗原結合タンパク質が増強されたエフェクター機能を有するように、例えば、それが増強されたＡＤＣＣもしくは増強されたＣＤＣ、または増強されたＡＤＣＣとＣＤＣ機能を有するように、ＩｇＧ３由来の少なくとも１つのＣＨ２ドメインを有するキメラ重鎖定常領域を含んでなる抗原結合タンパク質が提供される。１つのこのような実施態様では、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ３由来の１つＣＨ２ドメインを含んでなり得るか、または両ＣＨ２ドメインがＩｇＧ３に由来し得る。
【０１２２】
また、
ａ）本明細書に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程、ここで、前記発現ベクターは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３の両Ｆｃドメインアミノ酸残基を有するＦｃドメインをコードする核酸配列を含んでなる；および
ｂ）前記抗原結合タンパク質を回収する工程
を含んでなる、本発明による抗原結合タンパク質の製造方法も提供される。
【０１２３】
このような抗原結合タンパク質の生産方法は、例えば、BioWa, Inc. (Princeton, NJ) and Kyowa Hakko Kogyo (now, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) Co., Ltd.から入手可能なコンプリジェント（商標）技術システムを用いて実施することができる。この場合、組換え宿主細胞は発現ベクターを含んでなり、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３の両Ｆｃドメインアミノ酸残基を有するキメラＦｃドメインをコードする核酸配列が発現されて、このようなキメラＦｃドメインを欠いた、それ以外の点では同一の抗原結合タンパク質に比べて増強された高い補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する抗原結合タンパク質を産生する。コンプリジェント（商標）技術システムの態様は、ＷＯ２００７０１１０４１およびＵＳ２００７０１４８１６５に記載され、これらはそれぞれ引用することにより本明細書の一部とされる。別の実施態様において、ＣＤＣ活性は、ＩｇＧ鎖のＦｃ領域に配列特異的変異を導入することにより増強してもよい。当業者はまた他の適当なシステムも認識するであろう。
【０１２４】
ポテリジェント
本発明はまた、
ａ）本明細書に記載の単離された核酸含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程、ここで、前記組換え宿主細胞ではα−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が不活性化されている；および
ｂ）前記抗原結合タンパク質を回収する工程
を含んでなる、本発明による抗原結合タンパク質の製造方法も提供する。
【０１２５】
このような抗原結合タンパク質の生産方法は、例えば、BioWa, Inc. (Princeton, NJ)から入手可能なポテリジェント（商標）技術システムを用いて実施することができ、このシステムでは、ＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを欠くＣＨＯＫ１ＳＶ細胞は、機能的ＦＵＴ８遺伝子を有する細胞で産生される同一のモノクローナル抗体に比べて増強された、高い抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有するモノクローナル抗体を産生する。ポテリジェント（商標）技術システムの態様は、ＵＳ７２１４７７５、ＵＳ６９４６２９２、ＷＯ００６１７３９およびＷＯ０２３１２４０に記載され、これらは総て、引用することにより本明細書の一部とされる。当業者はまた他の適当なシステムも認識するであろう。
【０１２６】
当業者には、このような改変は単独で使用できるだけでなく、エフェクター機能をさらに増強するために互いに組み合わせて使用できることを認識するであろう。
【０１２７】
本発明の１つのこのような実施態様では、変異型のキメラ重鎖定常領域を含んでなる重鎖定常領域を含んでなる抗原結合タンパク質、例えば、ＩｇＧ３由来の少なくとも１つのＣＨ２ドメインとＩｇＧ１由来の１つのＣＨ２ドメインを含んでなり、抗原結合タンパク質が増強されたエフェクター機能を有するように、例えば、それが以下の機能、すなわち、ＡＤＣＣの増強またはＣＤＣの増強のうち１以上を有するように、例えば、それが増強されたＡＤＣＣと増強されたＣＤＣを有するように、前記ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインが２３９および３３２および３３０から選択される位置に１以上の変異を有する（例えば、前記変異はＳ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌから選択され得る）抗原結合タンパク質が提供される。１つの実施態様では、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインは、変異Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅを有する。
【０１２８】
本発明の別の実施態様では、キメラ重鎖定常領域を含んでなり、グリコシル化プロフィールが変更された抗原結合タンパク質が提供される。このような１つの実施態様では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ３由来の少なくとも１つのＣＨ２ドメインとＩｇＧ１由来の１つのＣＨ２ドメインを含んでなり、フコースとマンノースの比が０．８：３以下となるようにグリコシル化プロフィールが変更され、例えば、抗原結合タンパク質は、前記抗原結合タンパク質が、前記変異およびグリコシル化プロフィールの変更を欠く免疫グロブリン重鎖定常領域を有する等価な抗原結合タンパク質に比べて増強されたエフェクター機能を有するように、例えば、それが以下の機能、すなわち、ＡＤＣＣの増強またはＣＤＣの増強のうち１以上を有するように、例えば、それが増強されたＡＤＣＣと増強されたＣＤＣを有するように、脱フコシル化される。
【０１２９】
別の実施態様では、抗原結合タンパク質は、少なくとも１つのＩｇＧ３  ＣＨ２ドメインと少なくとも１つのＩｇＧ１由来重鎖定常ドメインを有し、ここで、両ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインは、本明細書に記載の制限に従って変異を受ける。
【０１３０】
本発明の１つの態様では、
ａ）本明細書に記載の単離された核酸を含有する発現ベクターを含有する組換え宿主細胞を培養する工程、前記発現ベクターは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３の両Ｆｃドメインアミノ酸残基を有するキメラＦｃドメインをコードするＦｃ核酸配列をさらに含んでなり、前記組換え宿主細胞ではα−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が不活性化されている；および
ｂ）前記抗原結合タンパク質を回収する工程
を含んでなる、本明細書に記載の、本発明による抗原結合タンパク質の製造方法が提供される。
【０１３１】
このような抗原結合タンパク質の生産方法は、キメラＦｃドメインを欠き、オリゴ糖にフコースを有する、それ以外の点では同一のモノクローナル抗体に比べて増強されたＡＤＣＣおよびＣＤＣの両増強活性を有する抗原結合タンパク質を生産するために、例えば、BioWa, Inc. (Princeton, NJ)から入手可能な、ポテリジェント（商標）とコンプリジェント（商標）技術システムを合わせたアクリタマブ（商標）技術システムを用いて実施することができる。
【０１３２】
本発明のさらに別の実施態様では、変異型のキメラ重鎖定常領域を含んでなる抗原結合タンパク質が提供され、前記抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質が増強されたエフェクター機能を有するように、例えば、それが以下の機能、すなわち、ＡＤＣＣの増強またはＣＤＣの増強のうち１以上を有するように、変更されたグリコシル化プロフィールを有する。１つの実施態様では、前記変異は２３９および３３２および３３０の位置から選択され、例えば、前記変異はＳ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌから選択される。さらなる実施態様では、重鎖定常領域は、少なくとも１つのＩｇＧ３由来ＣＨ２ドメインと１つのＩｇＧ１由来Ｃｈ２ドメインを含んでなる。１つの実施態様では、重鎖定常領域は、フコースとマンノースの比が０．８：３以下となるように変更されたグリコシル化プロフィールを有し、例えば、抗原結合タンパク質は、前記抗原結合タンパク質が等価な非キメラ抗原結合タンパク質または前記変異およびグリコシル化プロフィールの変更を欠く免疫グロブリン重鎖定常領域に比べて増強されたエフェクター機能を有するように、脱フコシル化される。
【０１３３】
ＩｇＧ抗体の長い半減期は、そのＦｃＲｎとの結合に依存することが報告されている。従って、定常領域を操作することによる、相互作用のｐＨ依存性を維持しつつｐＨ６．０でのＦｃＲｎに対するＩｇＧの結合親和性を増強する置換が鋭意研究されているKuoおよびAveson (2011)。
【０１３４】
本発明の抗原結合タンパク質を改変する別の手段には、免疫グロブリン定常ドメインまたはＦｃＲｎ（Ｆｃ受容体新生児型(Fc receptor neonate)）結合ドメインの改変による、このようなタンパク質のｉｎ−ｖｉｖｏ半減期の延長が含まれる。
【０１３５】
成体哺乳動物では、新生児型Ｆｃ受容体としても知られるＦｃＲｎは、ＩｇＧアイソタイプの抗体と結合してそれを分解から救う保護受容体として働くことによって血清抗体レベルを維持するという重要な役割を果たす。ＩｇＧ分子は内皮細胞によりエンドサイトーシスを受け、それらがＦｃＲｎに結合すれば、循環中へ再利用される。対照的に、ＦｃＲｎに結合しないＩｇＧ分子は細胞に入り、リソソーム経路に向けられ、そこで分解される。
【０１３６】
新生児型ＦｃＲｎ受容体は、抗体クリアランスと組織間のトランスサイトーシスの両方に関与すると考えられている、KuoおよびAveson (2011)。ヒトＦｃＲｎと直接相互作用することが決定付けられているヒトＩｇＧ１残基としては、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４およびＨｉｓ４３５が含まれる。本節に記載されるこれらの位置のうちいずれかにおける切り替えが、本発明の抗原結合タンパク質の血清半減期の延長および／またはエフェクター特性の変更を可能とし得る。
【０１３７】
ＦｃＲｎに対する親和性の増強により半減期を延長するための変異
本発明の抗原結合タンパク質は、ＦｃＲｎに対する定常ドメインまたはそのフラグメントの親和性を増強する１以上のアミノ酸改変を有してよい。これらは、これらのタンパク質の半減期の延長をもたらし得るKuoおよびAveson (2011)。治療用および診断用ＩｇＧおよびその他の生物活性分子の半減期の延長は、これらの分子の投与の量および／または頻度の低減を含む多くの利益を有する。よって、１つの実施態様では、これらのアミノ酸改変のうち１以上を有するＩｇＧ定常ドメインの全部もしくは一部（ＦｃＲｎ結合部分）およびこのような改変ＩｇＧ定常ドメインにコンジュゲートされた非ＩｇＧタンパク質または非タンパク質分子を含んでなる、本明細書で提供される本発明による抗原結合または融合タンパク質が提供され、ここで、前記改変ＩｇＧ定常ドメインの存在は、前記抗原結合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長する。
【０１３８】
半減期の延長をもたらし得るいくつかの方法が知られており(KuoおよびAveson (2011))、アミノ酸改変は、アラニンスキャニング変異誘発、ランダム変異誘発、ならびにＦｃＲｎへの結合および／またはｉｎ  ｖｉｖｏ挙動を評価するためのスクリーニングを含む技術によって作出できる。コンピューター戦略とその後の変異誘発も、アミノ酸変異の１つを選択して変異させるために使用可能である。
【０１３９】
よって、本発明は、ＦｃＲｎとの結合が最適化された抗原結合タンパク質の変異体を提供する。好ましい実施態様では、抗原結合タンパク質の前記変異体は、前記抗原結合タンパク質のＦｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸改変を含んでなり、前記改変は、前記親ポリペプチドに対してＦｃ領域の２２６、２２７、２２８、２３０、２３１、２３３、２３４、２３９、２４１、２４３、２４６、２５０、２５２、２５６、２５９、２６４、２６５、２６７、２６９、２７０、２７６、２８４、２８５、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９４、２９７、２９８、２９９、３０１、３０２、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１５、３１７、３２０、３２２、３２５、３２７、３３０、３３２、３３４、３３５、３３８、３４０、３４２、３４３、３４５、３４７、３５０、３５２、３５４、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３６２、３６９、３７０、３７１、３７５、３７８、３８０、３８２、３８４、３８５、３８６、３８７、３８９、３９０、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１  ４０３、４０４、４０８、４１１、４１２、４１４、４１５、４１６、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２４、４２６、４２８、４３３、４３４、４３８、４３９、４４０、４４３、４４４、４４５、４４６および４４７からなる群から選択され、ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸のナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。
【０１４０】
本発明のさらなる態様では、改変はＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅである。
【０１４１】
加えて、様々な刊行物が、それらの分子にＦｃＲｎ結合ポリペプチドを導入することによって、またはそれらの分子をＦｃＲｎ結合親和性が提供されるが他のＦｃ受容体に対する親和性が大幅に低減されている抗体と融合させるか、もしくは抗体のＦｃＲｎ結合ドメインと融合させることによって、半減期が改変された生理活性分子を得るための方法を記載している、例えば、Kontermann (2009)。
【０１４２】
半減期を延長するためのｐＨ切り替え技術
定常領域における置換は治療用ＩｇＧ抗体の機能を有意に改善することができるが、厳格に保存された定常領域における置換には、ヒトでの免疫原性というリスクがあり、多様性の高い可変領域配列における置換は免疫原性が低い可能性がある。可変領域に関する報告では、抗原に対する結合親和性を改善するためのＣＤＲ残基の操作および安定性を改善し免疫原性リスクを低減するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の操作が含まれる。知られているように、抗原に対する親和性の改善は、無作為化ライブラリーのファージまたはリボソームディスプレーを用いた親和性成熟により達成することができる。
【０１４３】
安定性の改善は、配列および構造に基づく合理的設計から合理的に得ることができる。免疫原性リスク（脱免疫化）の低減は、様々なヒト化戦略およびｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ技術を用いて推定できるかまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより決定できるＴ細胞エピトープの除去によって達成することができる。加えて、可変領域は、より低いｐＩに操作されている。これらの抗体では、同等のＦｃＲｎ結合にもかかわらず、野生型抗体に比べて長い半減期が見られた。抗体および／または抗原の半減期を変更するためにｐＨ依存的抗原結合を有する抗体を操作または選択する、例えば、ＩｇＧ２抗体の半減期は、抗原を介したクリアランス機構が通常、抗原と結合した際に抗体を分解すれば、短縮できる。同様に、抗原：抗体複合体も抗原の半減期に影響を与えることができ、典型的な分解プロセスから抗原を保護することにより半減期を延長するか、または抗体を介した分解により半減期を短縮する。１つの実施態様は、エンドソームのｐＨ（すなわち、ｐＨ５．５〜６．０）に比べてｐＨ７．４で抗原に対してより高い親和性を有する、ｐＨ５．５／ｐＨ７．４またはｐＨ６．０／ｐＨ７．４でのＫＤ比が２以上となるような抗体に関する。例えば、抗体の薬物動態（ＰＫ）および薬力学的（ＰＤ）特性を高めるために、ＣＤＲ残基にヒスチジンを導入することにより、抗体に対するｐＨ感受性結合を操作することができる。
【０１４４】
加えて、生体半減期が短縮された抗原結合タンパク質を生産する方法も提供される。Ｈｉｓ４３５がアラニンに変異された変異体ＩｇＧは、ＦｃＲｎ結合の選択的欠如および有意に短縮された血清半減期を生じる（例えば、米国特許第６，１６５，７４５号を参照、これは抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡセグメントに変異を導入することにより生体半減期が短縮された抗原結合タンパク質を生産する方法を開示している）。この変異には、Ｆｃヒンジドメインの２５３、３１０、３１１、４３３、または４３４の位置におけるアミノ酸置換が含まれる。
【０１４５】
リンカー
タンパク質足場は、Ｉｇ配列などの天然配列と同じであってよく、または天然配列のフラグメントであってもよく、かつ、異なる供給源または合成に由来する、天然であり得る付加的配列を含んでもよく、それらは足場のＮ末端またはＣ末端に付加されてよい。このような付加的配列は、それらが、本明細書に定義されるものなどのエピトープ結合ドメインとタンパク質足場を連結する場合にはリンカーと見なされ得る。
【０１４６】
別の態様では、抗原結合構築物は、各末端においてエピトープ結合ドメインと直接または間接的に（例えば、リンカー配列を介して）連結された、抗体のＦｃ領域、またはその一部からなる、またはから本質的になる。このような抗原結合構築物は、Ｆｃ領域により分離された２つのエピトープ結合ドメイン、またはその一部を含んでなり得る。分離されるとは、エピトープ結合ドメインが互いに直接連結されていないことを意味し、１つの態様では、Ｆｃ領域の反対の末端（Ｃ末端およびＮ末端）、または他のいずれかの足場領域に位置する。
【０１４７】
１つの態様では、抗原結合構築物は、２つのエピトープ結合ドメインと、例えば、各足場領域のＮ末端およびＣ末端で直接またはリンカーを介して間接的にそれぞれ結合された２つの足場領域を含んでなる。
【０１４８】
本発明のタンパク質足場は、リンカーの使用によってエピトープ結合ドメインと連結されてよい。好適なリンカーの例としては、１アミノ酸長〜１５０アミノ酸長、または１アミノ酸長〜１４０アミノ酸長、例えば、１アミノ酸長〜１３０アミノ酸長、または１〜１２０アミノ酸長、または１〜８０アミノ酸長、または１〜５０アミノ酸長、または１〜２０アミノ酸長、または１〜１０アミノ酸長、または５〜１８アミノ酸長であり得るアミノ酸配列が含まれる。このような配列は、それら固有の三次元構造を有してよく、例えば、本発明のリンカーは単一可変ドメインを含んでなり得る。リンカーのサイズは、１つの実施態様では、単一可変ドメインに相当する。好適なリンカーは、長さが１〜１００Åのサイズであり得、例えば２０〜８０Åのサイズであり得、または例えば２０〜６０Å、または例えば４０Å未満、または２０Å未満、または５Å未満のサイズであり得る。
【０１４９】
本発明の１つの実施態様では、配列番号１に示されるＣＤＲＨ１；配列番号２に示されるＣＤＲＨ２；配列番号３に示されるＣＤＲＨ３；配列番号４に示されるＣＤＲＬ１；配列番号５に示されるＣＤＲＬ２および／または配列番号６に示されるＣＤＲＬ３、または前記ＣＤＲ中に２つまでのアミノ酸置換を有する各ＣＤＲの直接的等価物のうちの１以上を含んでなるＩＣＯＳ結合タンパク質が提供される。
【０１５０】
本発明の１つの実施態様では、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでなるＶＨドメインおよび／または配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインを含んでなり、ヒトＩＣＯＳと特異的に結合するＩＣＯＳ結合タンパク質が提供される。１つの態様では、本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質はまたカニクイザルＩＣＯＳにも結合する。１つの態様では、それらはマウスＩＣＯＳには結合しない。
【０１５１】
１つの実施態様では、本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、ＩＣＯＳアゴニストである。１つの態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質は、Ｔ細胞の存在下でＩＦＮ−γ産生を増大させる。別の態様では、本発明のＣＯＳ結合タンパク質はＴ細胞の増殖を刺激する。
【０１５２】
１つの実施態様では、本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、ヒトＩＣＯＳと、
少なくとも１×１０５Ｍ−１ｓ−１の結合速度定数（ｋｏｎ）；および６×１０−５ｓ−１未満の解離速度定数（ｋｏｆｆ）；または
１００ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）
で結合し、高い親和性がＢｉａｃｏｒｅにより測定される。
【０１５３】
１つの実施態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号３）または配列番号３の変異体を含んでなる。別の実施態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１（配列番号１）；ＣＤＲＨ２（配列番号２）；ＣＤＲＨ３（配列番号３）；ＣＤＲＬ１（配列番号４）；ＣＤＲＬ２（配列番号５）；および／またはＣＤＲＬ３（配列番号６）のうち１以上を含んでなる。１つの実施態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質は、配列番号１；配列番号２；および配列番号３に示される重鎖ＣＤＲと配列番号４；配列番号５；および配列番号６に示される軽鎖ＣＤＲとを含んでなる。
【０１５４】
１つの実施態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質は、配列番号７に示されるアミノ酸配列と９０％の配列同一性を有するＶＨドメイン；および配列番号８に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列と９０％の配列同一性を有するＶＬドメインを含んでなる。１つの態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインと、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインとを含んでなる。１つの態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質は、配列番号７からなる重鎖可変ドメインを含んでなる。１つの態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質は、配列番号８からなる軽鎖可変ドメインを含んでなる。
【０１５５】
１つの実施態様では、本発明は、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでなるＶＨドメイン；および配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインを含んでなるＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分を提供し、前記ＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分は、ヒトＩＣＯＳと特異的に結合する。１つの実施態様では、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでなるＶＨドメイン；および配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインを含んでなるＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分（前記ＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分は、ヒトＩＣＯＳと特異的に結合する）は、配列番号１；配列番号２；および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲと、配列番号４；配列番号５；および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲをさらに含んでなる。１つの態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでなるＶＨドメイン；配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインを含んでなる。１つの実施態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分は、ヒトＩＣＯＳに対するアゴニストである。１つの実施態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ４アイソタイプ足場またはその変異体をさらに含んでなる。１つの実施態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分は、ｈＩｇＧ４ＰＥ足場を含んでなる。
【０１５６】
１つの実施態様では、本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、配列番号２３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２，％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である。
【化４】
2020079252.tif 000007
【０１５７】
１つの実施態様では、本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２，％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である。
【化５】
2020079252.tif 000008
【０１５８】
１つの実施態様では、本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、配列番号２３に示される重鎖アミノ酸配列と配列番号２４に示される軽鎖アミノ酸配列とを含んでなるヒト化モノクローナル抗体である。１つの実施態様では、本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、ｈＩｇＧＰＥ足場をさらに含んでなる。
【０１５９】
１つの実施態様では、前記ＩＣＯＳ結合タンパク質がヒト化モノクローナル抗体である、ＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分。また、本発明により、請求項のＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分と薬学上許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物も提供される。
【０１６０】
本発明は、必要とするヒトにおいて癌、感染性疾患、および／または敗血症から選択される疾患を処置する方法を提供し、その方法は、前記ヒトに本発明の医薬組成物を投与する工程を含んでなる。１つ態様では、本方法は、少なくとも１種類の抗新生物薬、少なくとも１種類の第２の免疫調節薬、および／または少なくとも１種類の免疫刺激アジュバントを前記ヒトに投与することをさらに含んでなる。１つの態様では、第２の免疫調節薬は、抗ＣＴＬＡ４抗体、および抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤＬ１抗体および抗ＯＸ４０抗体から選択される。１つの態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体はイピリムマブである。１つの態様では、抗ＰＤ−１抗体は、ペンブロリズマブおよび／またはニボルマブから選択される。
【０１６１】
本発明の１つの実施態様では、治療上許容可能な量のＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分をヒトに投与することを含んでなる、ヒトにおいて癌を処置するための方法が提供される。いくつかの態様では、癌は、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、食道癌、子宮頸癌、膀胱癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、黒色腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、ＥＣ扁平上皮細胞癌、非小細胞肺癌、中皮腫、および前立腺癌から選択される。
【０１６２】
１つの実施態様では、治療上許容可能な量のＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分をヒトに投与することを含んでなる、ヒトにおいて感染性疾患を処置するための方法が提供される。１つの態様では、感染性疾患はＨＩＶである。
【０１６３】
１つの実施態様では、治療上許容可能な量のＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分をヒトに投与することを含んでなる、ヒトにおいて敗血症を処置するための方法が提供される。
【０１６４】
１つの実施態様では、本発明の医薬組成物をヒトに投与することを含んでなる、ヒトにおいてＴ細胞増殖を刺激する、Ｔ細胞の活性化を誘導する、および／またはサイトカイン産生を誘導するための方法が提供される。
【０１６５】
本発明はまた、本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドも提供する。１つの実施態様では、本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質またはそれらの抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞が提供される。本発明はまた、ａ）本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞を、前記ＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分を発現するために好適な条件下で培養する工程；およびｂ）前記ＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分を単離する工程、を含んでなるＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分の作製方法を提供する。
【０１６６】
本発明は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでなるＶＨドメイン；配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメイン；およびｈＩｇＧ４足場またはその変異体を含んでなる単離されたヒト化モノクローナル抗体を提供する。１つの態様では、ｈＩｇＧ４足場はｈＩｇＧ４ＰＥである。
【０１６７】
１つの実施態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分が、ヒトＩＣＯＳに対する結合をめぐって、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでなるＶＨドメイン；および配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインを含んでなる参照抗体またはその抗原結合部分と交差競合する、ＩＣＯＳ結合タンパク質またはそれらの抗原結合部分が提供される。
【０１６８】
１つの実施態様では、本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、Ｔ細胞と接触させて置いた場合にＴ細胞の増殖を刺激する。１つの実施態様では、本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、Ｔ細胞と接触させて置いた場合にＴ細胞の活性化を誘導する。Ｔ細胞の活性化は、限定されるものではないが、ＣＤ６９、ＣＤ２５、および／またはＯＸ４０などの特定の活性化マーカーの発現レベル％の増大によって測定することができる。１つの実施態様では、本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、Ｔ細胞接触させて置いた場合にサイトカイン産生を刺激する。ＩＣＯＳ結合タンパク質はヒトＦｃγＲＩＩｂと結合するが、ヒトＦｃγＲＩＩａまたはヒトＦｃγＲＩＩＩａとは結合しない。加えて、ＩＣＯＳ結合タンパク質は好適には、ＩＣＯＳ発現Ｔ細胞接触させて置いた場合にＩＣＯＳ発現Ｔ細胞を枯渇させない。いくつかの態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質は、第２の細胞の存在下でＴ細胞と接触させて置いた場合にＴ細胞と第２の細胞を架橋する。この架橋は、ＩＣＯＳ結合タンパク質と第２の細胞上のＦｃγＲとの会合を介して起こり得る。ＦｃγＲ発現細胞としては、限定されるものではないが、単球、Ｂリンパ球、濾胞性樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、および肥満細胞が含まれる。よって、１つの実施態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質は哺乳動物に投与することができ、そこでＩＣＯＳ結合タンパク質はＴ細胞上のＩＣＯＳにアゴニストとして働き、第２の細胞上のＦｃγＲも会合させる。
【０１６９】
１つの実施態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプまたはその変異体およびヒトＩｇＧ４アイソタイプまたはその変異体から選択される足場を含んでなる。好適には、足場は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ足場またはその変異体を含んでなる。１つの態様では、足場は、ｈＩｇＧ４ＰＥ足場を含んでなる。
【０１７０】
１つの実施態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質はモノクローナル抗体である。好適には、ＩＣＯＳ結合タンパク質はヒト化モノクローナル抗体である。１つの態様では、本発明のモノクローナル抗体は、完全ヒト型であり得る。
【０１７１】
別の態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニ抗体、ミニボディ、単離されたＶＨまたは単離されたＶＬであるフラグメントである。１つの実施態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質は、その抗原結合部分である。
【０１７２】
いくつかの態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質は、ヒトＩＣＯＳに、０．６ｎＭより強い親和性で結合する。１つの態様では、親和性は１００ｎＭ以上である。１つの実施態様では、ＩＣＯＳ結合タンパク質は、ＩＣＯＳに対して１００ｎＭのＫＤを有する。好適には、ＩＣＯＳに対するＩＣＯＳ結合タンパク質のＫＤは、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、２ｎＭ未満または１ｎＭ未満である。
【０１７３】
１つの実施態様では、本発明は、ヒトＩＣＯＳに対するアゴニストであるヒト化モノクローナル抗体を提供する。１つの実施態様では、本発明は、配列番号１；配列番号２；および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲと、配列番号４；配列番号５；および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲＳとを含んでなるヒト化モノクローナル抗体を提供する。１つの態様では、ヒト化モノクローナル抗体は、Ｔ細胞と接触させた場合に、補体、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを誘導することなく、サイトカイン産生および／またはＴ細胞増殖を刺激することができる。１つの実施態様では、ヒト化モノクローナル抗体は、変異体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を有する。１つの実施態様では、ヒト化モノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域またはその変異体を有する。１つの実施態様では、ヒト化モノクローナル抗体は、ｈＩｇＧ４ＰＥ  Ｆｃ領域を有する。１つの態様では、ヒト化モノクローナル抗体は、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでなるＶＨドメイン；および配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインを含んでなる。１つの態様では、ヒト化モノクローナル抗体は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでなるＶＨドメイン；および配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインを含んでなる。１つの態様では、ヒト化モノクローナル抗体は、ｈＩｇＧ４ＰＥ足場を含んでなる。さらに、本発明のヒト化モノクローナル抗体は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞と接触させた場合にＴ細胞の増殖を刺激することが示される。本発明のヒト化モノクローナル抗体は、Ｔ細胞活性化を誘導し、かつ、サイトカイン産生を刺激することが示される。
【０１７４】
１つの実施態様では、ヒト化モノクローナル抗体はＩｇＧ４ＰＥ足場を含んでなり、かつ、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含んでなるＶＨドメインと、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインとを含んでなる。本発明の抗体は、Ｔ細胞と接触させた場合にサイトカイン産生を刺激し得る。
【０１７５】
１つの実施態様では、ＩＣＯＳ結合をめぐって本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質と競合するＩＣＯＳ結合タンパク質が提供される。当技術分野で理解され、本明細書に記載されているように、結合の競合は、１以上のＩＣＯＳ結合タンパク質の存在下でＩＣＯＳへのリガンドの結合の競合を比較することによって測定することができる。これもまた当技術分野で理解されているように、ＩＣＯＳはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞ならびにＴｒｅｇ細胞で発現される。本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、Ｔ細胞上のＩＣＯＳに対してアゴニストとして働く。それらはまた、ＩＣＯＳ−Ｌと、Ｔ細胞およびＴｒｅｇ細胞の両方で発現されるＩＣＯＳの間の相互作用を遮断する働きもする。よって、１つの実施態様では、ＩＣＯＳ−ＬとＴｒｅｇ細胞上のＩＣＯＳとの相互作用を遮断するための方法が提供される。ＩＣＯＳ発現Ｔｒｅｇ細胞は、リンパ腫などの液性腫瘍を含む様々なタイプの腫瘍に見出すことができる。よって、本発明の１つの態様では、本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質を投与することを含んでなる癌の治療法が提供され、そこでＩＣＯＳ結合タンパク質は、ＩＣＯＳ−ＬとＴｒｅｇ細胞上のＩＣＯＳとの相互作用を遮断する。
【０１７６】
本明細書に記載のＩＣＯＳ結合タンパク質またはモノクローナル抗体を含んでなる医薬組成物も本発明に付け加えられる。１つの態様では、本発明の医薬組成物は、少なくとも１種類の抗新生物薬をさらに含んでなる。１つの態様では、本発明の医薬組成物は、少なくとも１種類の第２の免疫調節薬をさらに含んでなる。１つの態様では、本発明の医薬組成物は、少なくとも１の種類の免疫刺激性アジュバントをさらに含んでなる。
【０１７７】
１つの実施態様では、必要とするヒトにおいて癌および／または感染性疾患を処置するための方法が提供され、前記方法は、前記ヒトに本発明の医薬組成物を投与する工程を含んでなる。１つの実施態様では、前記ヒトは癌を有する。１つの実施態様では、前記ヒトは感染性疾患を有する。１つの実施態様では、前記ヒトはＨＩＶを有する。１つの態様では、前記方法は、前記ヒトに少なくとも１種類の抗新生物薬を投与することをさらに含んでなる。別の態様では、前記方法は、前記ヒトに少なくとも１種類の第２の免疫調節薬を投与することをさらに含んでなる。さらに別の態様では、前記方法は、前記ヒトに免疫刺激性アジュバントを投与することをさらに含んでなる。
【０１７８】
１つの態様では、前記ヒトは固形腫瘍を有する。１つの態様では、前記腫瘍は、頭頸部癌、胃癌、黒色腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、食道癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌および膵臓癌から選択される。１つの態様では、前記ヒトは、以下：結腸直腸癌（ＣＲＣ）、食道癌、子宮頸癌、膀胱癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、黒色腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、ＥＣ扁平上皮細胞癌、非小細胞肺癌、中皮腫、および前立腺癌のうち１以上を有する。別の態様では、前記ヒトは、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病(chronic lyphomblastic leukemia)（ＣＬＬ）、濾胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病などの液体腫瘍を有する。
【０１７９】
本開示はまた、脳癌（神経膠腫）、膠芽腫、バナヤン−ゾナナ症候群、カウデン病、レルミット−デュクロス疾患、乳癌、炎症性乳癌、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、脳室上衣細胞腫、髄芽細胞腫、結腸、頭頸部、腎臓、肺、肝臓、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、骨肉腫、骨の巨細胞腫瘍、甲状腺癌、リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性好中球性白血、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、形質細胞腫、免疫芽球性大細胞白血病、マントル細胞白血病、多発性骨髄腫  巨核芽球性白血病、多発性骨髄腫、急性巨核球性白血病、前骨髄球性白血病、赤白血病、悪性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ芽球性Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、神経芽腫、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌、外陰癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、中皮腫、食道癌、唾液腺癌、肝細胞癌、胃癌、鼻咽頭癌、頬粘膜癌、口腔癌、ＧＩＳＴ（消化管間質腫瘍）および精巣癌から選択される癌を処置するまたはその重篤度を減弱する方法にも関する。
【０１８０】
用語「処置する」およびその文法的変形は、本明細書で使用する場合、治療的療法を意味する。特定の病態に関して処置は、（１）その病態の生物学的発現の１以上の状態を改善または予防すること、（２）（ａ）その病態につながるもしくはその病態の原因である生物学的カスケードの１以上の点、もしくは（ｂ）その病態の生物学的発現の１以上に干渉すること、（３）その病態もしくはその処置に関連する症状、効果もしくは副作用の１以上を緩和すること、（４）その病態もしくはその病態の生物学的発現の１以上の進行を緩徐化すること、および／または（５）寛解の期間に付加的処置無く、その発現に関して寛解状態であると見なされる期間、その病態の生物学的発現の１以上を排除するもしくは検出不能なレベルにまで軽減することにより、前記病態もしくは前記病態の生物学的発現の１以上を治癒させることを意味する。当業者は、特定の疾患または病態に関して寛解と見なされる期間を理解するであろう。予防的療法もまた企図される療法である。当業者は、「予防」が絶対的な用語でないことを認識するであろう。医学では、「予防」は、ある病態もしくはその生物学的発現の尤度もしくは重篤度を実質的に減らすため、またはこのような病態もしくはその生物学的発現の発生を遅延させるための薬物の予防的投与を意味すると理解される。予防的療法は、例えば、対象が癌の強い家族歴を有する場合または対象が発癌物質に曝されていた場合など、対象に癌を発症する高いリスクがあると見なされる場合に適当である。
【０１８１】
本明細書で使用する場合、用語「癌」、「新生物」、および「腫瘍」は、単数形または複数形で互換的に使用され、それらを宿主生物にとって病的とする悪性化を受けた細胞を意味する。原発性癌細胞は、十分に確立された技術、特に組織学的検査によって非癌性細胞から容易に識別することができる。癌細胞の定義は、本明細書で使用する場合、原発性癌細胞だけでなく、癌細胞祖先に由来するいずれの細胞も含む。これには転移癌細胞、ならびに癌細胞に由来するｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物および細胞株が含まれる。通常固形腫瘍として顕在化する癌のタイプに関して、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、例えばコンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、Ｘ線、超音波または身体検査時の触診などの手法による腫瘍量に基づいて検出可能な、および／または患者から取得可能なサンプル中での１以上の癌特異的抗原の発現のために検出可能なものである。腫瘍は、「液性腫瘍」と呼ばれることもある、造血系（または血液性(hematologic or haematological)または血液関連）癌、例えば、血液細胞または免疫細胞由来癌であり得る。血液性腫瘍に基づく臨床症状の具体例としては、慢性骨髄球性白血病、急性骨髄球性白血病、慢性リンパ球性白血病および急性リンパ球性白血病などの白血病；多発性骨髄腫、ＭＧＵＳおよびワルデンストロームマクログロブリン血症などの形質細胞悪性腫瘍；非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫などのリンパ腫などが含まれる。
【０１８２】
癌は、異常な数の芽球もしくは望まれない細胞増殖が存在する、またはリンパ系および骨髄系の両悪性腫瘍を含め、血液性癌と診断されるいずれの癌であってもよい。骨髄性悪性腫瘍には、限定されるものではないが、急性骨髄性(myeloid)（または骨髄球性または骨髄性(myelogenous)または骨髄芽球性）白血病（未分化または分化）、急性前骨髄性(acute promyeloid)（または前骨髄球性または前骨髄性(promyelogenous)または前骨髄芽球性）白血病、急性骨髄単球性（または骨髄単芽球性）白血病、急性単球性（または単芽球性）白血病、赤白血病および巨核球性（または巨核芽球性）白血病が含まれる。これらの白血病は、急性骨髄性（または骨髄球性または骨髄性）白血病（ＡＭＬ）とともに言及され得る。骨髄性悪性腫瘍にはまた、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）が含まれ、限定されるものではないが、慢性骨髄性(chronic myelogenous)（または骨髄性(myeloid)白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、本態性血小板血症（または血小板増多症）、および真性多血症（ＰＣＶ）も含まれる。骨髄性悪性腫瘍にはまた、骨髄異形成（または骨髄異形成症候群またはＭＤＳ）、不応性貧血（ＲＡ）、芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）、および移行期の芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢＴ）と呼ぶことができる；ならびに特発性骨髄様化性を伴うまたは伴わない骨髄線維症（ＭＦＳ）も含まれる。
【０１８３】
造血系癌にはまた、リンパ節、脾臓、骨髄、末梢血、および／または節外部位に影響を及ぼし得るリンパ系悪性腫瘍も含まれる。リンパ系癌にはＢ細胞悪性腫瘍が含まれ、限定されるものではないが、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）が含まれる。Ｂ−ＮＨＬは、緩徐進行性（もしくは低悪性度）、中悪性度（もしくは急速進行性）または高悪性度（超急速進行性）であり得る。緩徐進行性Ｂ細胞リンパ腫には、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）；小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）；節性ＭＺＬ、節外性ＭＺＬ、脾性ＭＺＬおよび有毛リンパ球を伴う脾性ＭＺＬを含む辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）；リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）；および粘膜随伴リンパ系組織（ＭＡＬＴまたは節外辺縁帯）リンパ腫が含まれる。中悪性度Ｂ−ＮＨＬには、白血病関与があるまたは無いマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性大細胞（またはグレード３またはグレード３Ｂ）リンパ腫、および原発性縦隔リンパ腫（ＰＭＬ）が含まれる。高グレードＢ−ＮＨＬには、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、バーキット様リンパ腫、小型非切れ込み核細胞性リンパ腫（ＳＮＣＣＬ）およびリンパ芽球性リンパ腫が含まれる。他のＢ−ＮＨＬには、免疫芽球性リンパ腫（または免疫細胞腫）、原発性滲出液リンパ腫、ＨＩＶ関連（またはＡＩＤＳ関連）リンパ腫、および移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）またはリンパ腫が含まれる。Ｂ細胞悪性腫瘍にはまた、限定されるものではないが、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ワルデンストロームマクログロブリン血症（ＷＭ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）白血病、急性リンパ性（またはリンパ球性またはリンパ芽球性）白血病、およびキャッスルマン疾患も含まれる。ＮＨＬにはまたＴ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｔ−ＮＨＬ）も含まれ、限定されるものではないが、特定不能Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＯＳ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、血管免疫芽球性リンパ系疾患（ＡＩＬＤ）、鼻腔ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞／Ｔ細胞リンパ腫、ガンマ／デルタリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、およびセザリー症候群が含まれる。
【０１８４】
造血系癌にはまた、古典型ホジキンリンパ腫、結節性硬化型ホジキンリンパ腫、混合細胞型ホジキンリンパ腫、リンパ球優位型（ＬＰ）ホジキンリンパ腫、結節性ＬＰホジキンリンパ腫、およびリンパ球減少型ホジキンリンパ腫を含む、ホジキンリンパ腫（または疾患）も含まれる。造血系癌にはまた、形質細胞疾患または癌、例えば、くすぶり型ＭＭを含む多発性骨髄腫（ＭＭ）、意義不明の（または未知または不確定の）単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）、形質細胞腫（骨、髄外）、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、ワルデンストロームマクログロブリン血症、形質細胞白血病、および原発性類デンプン症（ＡＬ）も含まれる。造血系癌にはまた、多形核白血球（または好中球）、好塩基球、好酸球、樹状細胞、血小板、赤血球およびナチュラルキラー細胞を含むさらなる造血細胞の他の癌も含まれ得る。本明細書で「造血細胞組織」と呼ばれる、造血細胞を含む組織としては、骨髄；末梢血；胸腺；脾臓、リンパ節、粘膜関連リンパ系組織（例えば、消化管関連リンパ系組織）、扁桃腺、バイエル板および虫垂などの末梢リンパ系組織、ならびに例えば気管支内腔などの他の粘膜に関連するリンパ系組織が含まれる。
【０１８５】
本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質、抗体および抗原結合フラグメントはまた、感染および感染性疾患の治癒、予防または治療のためにも使用可能である。ＩＣＯＳ結合タンパク質は病原体、毒素、および自己抗原に対する免疫応答を刺激するために単独で使用することもできるし、またはワクチンと併用することもできる。本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、限定されるものではないが、ヒト免疫不全ウイルス、Ａ、ＢおよびＣ型肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヘルペスウイルスなどのヒトに感染するウイルスに対して免疫応答を刺激するために使用することができる。本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、細菌または真菌性の寄生体、および他の病原体による感染に対して免疫応答を刺激するために使用することができる。好適には、本発明は、特定の毒素または病原体に曝されたヒトを処置するための方法を提供する。よって、本発明の別の態様は、ＩＣＯＳ結合タンパク質、またはその抗原結合部分を対象に投与することを含んでなる、対象において感染性疾患を処置する方法を提供する。
【０１８６】
本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質が有用であり得る感染性疾患の例としては、限定されるものではないが、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、およびＣ型）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、緑膿菌(Pseudomonas Aeruginosa)が含まれる。本発明の方法により処置可能な感染を引き起こす病原ウイルスのいくつかの例としては、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、またはＣ型）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、およびＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コルノウイルス(cornovirus)、呼吸器合胞体ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デング熱ウイルス、乳頭腫ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス性脳炎ウイルスが含まれる。
【０１８７】
本発明の方法により処置可能な感染を引き起こす病原細菌のいくつかの例としては、クラミジア、リケッチア菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌およびコノコッカス(conococci)、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、バチルス、コレラ、破傷風、ボツリヌス、炭疽、ペスト、レプトスピラ症、およびライム病菌が含まれる。
【０１８８】
本発明の方法により処置可能な感染を引き起こす病原真菌のいくつかの例としては、カンジダ(Candida)（アルビカンス(albicans))、クルセイ(krusei)、グラブラータ(glabrata)、トロピカリス(tropicalis)など）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、アスペルギルス(Aspergillus)（フミガーツス(fumigatus)、ニガー(niger)など）、ケカビ属(Genus Mucorales)（ムコール(mucor)、アブシディア(absidia)、リゾプス(rhizophus)）、スポロトリクス・シェンキー(Sporothrix schenkii)、ブラストミセス・デルマティティディス(Blastomyces dermatitidis)、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス(Paracoccidioides brasiliensis)、コクシジオイデス・イミチス(Coccidioides immitis)およびヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)が含まれる。
【０１８９】
本発明の方法により処置可能な感染を引き起こす病原寄生虫のいくつかの例としては、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、大腸バランチジウム(Balantidium coli)、ネグレリア・フォーレリ(Naegleriafowleri)、アカントアメーバ種(Acanthamoeba sp.)、ランブル鞭毛虫(Giardia lambia)、クリプトスポリジウム種(Cryptosporidium sp.)、ニューモシスティス・カリニ(Pneumocystis carinii)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、バベシア・ミクロチ(Babesia microti)、ブルーストリパノソーマ(Trypanosoma brucei)、クルーズトリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)、ドノバンリーシュマニア(Leishmania donovani)、トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondi)、およびブラジル鉤虫(Nippostrongylus brasiliensis)が含まれる。
【０１９０】
敗血症は、全身の炎症状態（全身性炎症性応答症候群またはＳＩＲＳと呼ばれる）と既知または疑われる感染の存在を特徴とする命に関わり得る医学的状態である。身体は、この炎症性応答を血液、尿、肺、皮膚、またはその他の組織における微生物に対する免疫系により引き起こし得る。敗血症の一般用語は血液中毒であり、以下、この言葉はより適切に菌血症に適用される。重症敗血症は、全身性炎症性応答と感染と臓器不全の存在である。
【０１９１】
菌血症は、血流中に病原生物が存在することを意味する関連の医学用語であり、敗血症につながる。この用語は鮮明に定義されていない。
【０１９２】
敗血症と癌は、制御性Ｔ細胞の増加、骨髄由来抑制細胞の増加、負の補助刺激分子の発現の増強、単球／マクロファージＨＬＡ−ＤＲ発現の低下を含む、類似の免疫抑制機構を共通に持つ。敗血症と癌は、プロトタイプの慢性炎症障害である。慢性炎症は、制御性Ｔ細胞の拡大増殖ならびにエフェクター細胞でのＰＤ−１およびその他の負のレギュレーターのアップレギュレーションを含む、強力かつ持続的な免疫調節応答を刺激する。Barouch D.H. and Deeks S.G.; Immunologic strategies for HIV-1 remission and eradication.  Science 345:169-174 2014。よって、本発明の１つの態様では、治療上有効な量の本発明のＩＣＯＳ抗原結合タンパク質をヒトに投与することを含んでなる、それを必要とするヒトにおいて敗血症を処置するための方法が提供される。Boomer,, et al. JAMA 306:2594-2605 (2011); Meisel, et al.  Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor to reverse sepsis-associated immunosuppression: a double-blind, randomized, placebo-controlled multicenter trial. Am J Respir Crit Care Med 180:640-648 (2009);およびHall, et al.  Immunoparalysis and nosocomial infection in children with multiple organ dysfunction syndrome. Intensive Care Med 37:525-532 (2011)。
【０１９３】
本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、他の組換えタンパク質および／またはペプチド（例えば、腫瘍抗原または癌細胞など）とともに、これらのタンパク質の免疫応答を増強するために（すなわち、ワクチン接種プロトコールにおいて）使用することができる。
【０１９４】
例えば、そのＩＣＯＳ結合タンパク質は、少なくとも１つのＩＣＯＳ結合タンパク質と対象とする抗原（例えば、ワクチン）との併用投与により、抗原特異的免疫応答を刺激するために使用可能である。よって、別の態様では、本発明は、（ｉ）抗原；および（ｉｉ）本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質を対象に、前記対象において前記抗原に対する免疫応答が増強されるように投与することを含んでなる、対象において抗原に対する免疫応答を増強する方法を提供する。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体由来抗原であり得る。このような抗原の限定されない例として、限定されるものではないが、腫瘍抗原、またはウイルス、細菌もしくはその他の病原体由来の抗原が含まれる。
【０１９５】
ＨＩＶ根絶の主なハードルは、ウイルス抗原を発現せずに免疫の監視を逃れる不顕性感染細胞が持続していることである。潜伏ウイルスのリザーバーを除去するための、「キック・アンド・キル」と呼ばれる現行の戦略は、細胞の活性化はＨＩＶの再活性化をもたらすのでＨＩＶ遺伝子発現を再活性化し（「キック」）、再活性化した細胞を排除する（「キル」）ことを狙いとする。細胞の活性化は、Ｔ細胞の表面に発現される正のレギュレーターと負のレギュレーターのバランスによって支配される。正のレギュレーターを促進し、負のレギュレーターを抑制することによりこのバランスを変更すると、ＨＩＶの再活性化が促進できる。
【０１９６】
誘導性Ｔ細胞補助刺激因子（ＩＣＯＳ）は正のレギュレーターであり、その発現は、刺激後にＣＤ４  Ｔ細胞で増大する。ＩＣＯＳは、Ｔ細胞の増殖、サイトカインの産生および分化を促進する働きをする。高レベルのＰＤ−１およびＩＣＯＳを発現する１つの重要なＴ細胞のサブセットがＴ濾胞性ヘルパー細胞（Ｔｆｈ）である。Ｔｆｈ細胞は、Ｂ細胞が分化、クラススイッチ、体細胞高頻度変異を受けるのを助け、胚中心形成に必要である。Ｔｆｈ細胞は、ＨＩＶ／ＳＩＶ感染後に顕著に拡大増殖し、慢性レンチウイルス感染の際のそれらの調節不全は、Ｂ細胞の免疫障害に寄与する。選別されたＴｆｈ細胞は、他のリンパ系ＣＤ４サブセットよりも高レベルのＨＩＶ  ＤＮＡを含有することを示しており、刺激後にウイルスの増殖が見られる。Ｔｆｈ細胞は胚中心に留まり、感染を助長し得る濾胞性樹状細胞に捕捉されたＨＩＶビリオンに曝される。加えて、ＣＤ８  Ｔ細胞は、胚中心への接近が制限され、濾胞性ＣＤ８細胞はしばしば細胞傷害性の低下を示し、従って、Ｔｆｈ細胞を抗ウイルス監視から逃れさせる。よって、Ｔｆｈ細胞は、重要な保護されたＨＩＶリザーバーであり、ＰＤ−１およびＩＣＯＳを標的とする戦略は、Ｔｆｈ細胞を選択的に標的とすることができ、ＨＩＶ治癒計画の一部として有用性を持ち得る。好適には、本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質またはその抗原結合部分を投与することを含んでなる、ＨＩＶに感染したヒトを処置するための方法が提供される。
【０１９７】
本明細書で使用する場合、「腫瘍抗原」は、免疫応答、特に、Ｔ細胞媒介性免疫応答を惹起する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。用語「腫瘍抗原」は、本明細書で使用する場合、腫瘍特異的抗原および腫瘍関連抗原の両方を含む。腫瘍特異的抗原は腫瘍細胞に独特であり、身体の他の細胞には見られない。腫瘍関連抗原は腫瘍細胞に独特ではなく、抗原に対して免疫寛容の状態を誘導できない状況にある正常細胞でも発現される。腫瘍上の抗原の発現は、免疫系が抗原に応答できる条件下で見られ得る。腫瘍関連抗原は、胎児発生中、免疫系が未熟で応答できない際に正常細胞で発現される抗原であり得、または腫瘍関連抗原は、正常細胞には通常極めて低いレベルで存在するが腫瘍細胞でははるかに高いレベルで発現される抗原であり得る。
【０１９８】
腫瘍抗原の限定されない例としては、以下のもの：ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２および腫瘍特異的多系列原、例えば、限定されるものではないが、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ１０、ＭＡＧＥ１１、ＭＡＧＥ１２、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ８、ＭＡＧＥＡ９、ＭＡＧＥＢ１８、ＭＡＧＥＢ６、ＭＡＢＥＣ１、ＭＡＧＥＤ２、ＭＡＧＥＥ１、ＭＡＧＥＨ１、ＭＡＧＥＬ２、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５を含むＭＡＧＥファミリー抗原といった分化抗原；ＭＥＬ４、黒色腫関連抗原１００＋、黒色腫ｇｐ１００、ＮＲＩＰ３、ＮＹＳ４８、ＯＣＩＡＤ１、ＯＦＡ−ｉＬＲＰ、ＯＩＰ５、卵巣癌関連抗原（ＯＶ６３２）、ＰＡＧＥ４、ＰＡＲＰ９、ＰＡＴＥ、プラスチンＬ、ＰＲＡＭＥ、前立腺特異的抗原、プロテイナーゼ３、プロステイン、Ｒｅｇ３ａ、ＲＨＡＭＭ、ＲＯＰＮ１、ＳＡＲＴ２、ＳＤＣＣＡＧ８、ＳＥＬ１Ｌ、ＳＥＰＴ１、ＳＬＣ４５Ａ２、ＳＰＡＮＸ、ＳＳＸ５、ＳＴＸＧＡＬＮＡＣ１、ＳＴＥＡＰ４、サバイビン、ＴＢＣ１Ｄ２、ＴＥＭ１、ＴＲＰ１、上皮起源の腫瘍抗原、ＸＡＧＥ１、ＸＡＧＥ２、ＷＴ−１；ＣＥＡなどの過剰発現する胚抗原；過剰発現する癌遺伝子および変異腫瘍抑制遺伝子、例えば、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ；染色体転座から生じる独特な腫瘍抗原；例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ；およびエプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７などのウイルス抗原が含まれる。
【０１９９】
その他の腫瘍抗原としては、限定されるものではないが、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ  １５、ｐ  １６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトタンパク質、β−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３＼ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、神経膠腫関連抗原、β−ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、αフェトタンパク質（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸管カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体およびメソテリンが含まれる。
【０２００】
一般に、処置される感受性腫瘍に対して活性を有するいずれの抗新生物薬も本発明での癌の処置において併用投与可能である。このような薬剤の例は、Cancer Principles and Practice of Oncology, V.T. Devita and S. Hellman (編者), 第6版(2001年2月15日), Lippincott Williams & Wilkins Publishersに見出すことができる。当業者ならば、関与する薬物および癌の特定の特徴に基づいてどの薬剤の組合せが有用であるかを認識することができる。本発明において有用な特定の抗新生物薬としては、限定されるものではないが、ジテルペノイドおよびビンカアルカロイドなどの抗微小管剤；白金錯体；ナイトロジェンマスタード、オキシアザホスホリン、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素、およびトリアゼンなどのアルキル化剤；アントラサイクリン、アクチノマイシンおよびブレオマイシンなどの抗生物質薬；エピポドフィロトキシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤；プリンおよびピリミジン類似体ならびに葉酸拮抗化合物などの代謝拮抗物質；カンプトテシンなどのトポイソメラーゼＩ阻害剤；ホルモンおよびホルモン類似体；シグナル伝達経路阻害剤；非受容体型チロシンキナーゼ血管新生阻害剤；免疫治療薬；アポトーシス促進薬；および細胞周期シグナル伝達阻害剤が含まれる。
【０２０１】
本ＩＣＯＳ結合タンパク質と併用または併用投与するためのさらなる１または複数の有効成分または成分の例は、任意の化学療法薬、免疫治療薬または免疫調節薬および免疫刺激性アジュバントを含む抗新生物薬である。
【０２０２】
微小管阻害剤または有糸分裂阻害剤は、細胞周期のＭ期、すなわち有糸分裂期の間に腫瘍細胞の微小管に対して活性である細胞周期特異的薬剤である。微小管阻害剤の例としては、限定されるものではないが、ジテルペノイドおよびビンカアルカロイドが挙げられる。
【０２０３】
ジテルペノイドは、天然源に由来し、細胞周期のＧ２／Ｍ期に作用する細胞周期特異的抗癌剤である。ジテルペノイドは、微小管のβ−チューブリンサブユニットと結合することによりこのタンパク質を安定化させると考えられている。その後タンパク質の分解が阻害され、有糸分裂が停止し、細胞死をたどると思われる。ジテルペノイドの例としては、限定されるものではないが、パクリタキセルおよびその類似体であるドセタキセルが挙げられる。
【０２０４】
パクリタキセル、５β，２０−エポキシ−１，２α，４，７β，１０β，１３α−ヘキサ−ヒドロキシタクス−１１−エン−９−オン４，１０−ジアセテート２−ベンゾエートの（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−ベンゾイル−３−フェニルイソセリンとの１３−エステルは、タイヘイヨウイチイ(Taxus brevifolia)から単離された天然ジテルペン生成物であり、注射液タキソール(TAXOL)（登録商標）として市販されている。パクリタキセルは、テルペンのタキサンファミリーのメンバーである。パクリタキセルは、１９７１年にWaniら(J. Am. Chem, Soc., 93:2325. 1971)によって初めて単離され、化学法およびＸ線結晶学的方法によってその構造が同定された。その活性の１つの機構は、パクリタキセルの、チューブリンと結合し、それにより癌細胞増殖を阻害する能力に関連している。Schiff et al., Proc. Natl, Acad, Sci. USA, 77:1561-1565 (1980); Schiff et al., Nature, 277:665-667 (1979); Kumar, J. Biol, Chem, 256: 10435-10441 (1981)。いくつかのパクリタキセル誘導体の合成および抗癌活性に関する総説としては、D. G. I. Kingston et al., Studies in Organic Chemistry vol. 26, “New trends in Natural Products Chemistry 1986”, Attaur-Rahman, P.W. Le Quesne編(Elsevier, Amsterdam, 1986) pp 219-235を参照。
【０２０５】
パクリタキセルは、米国における難治性卵巣癌の治療における臨床使用(Markman et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 64:583, 1991; McGuire et al., Ann. lntem, Med., 111:273,1989)および乳癌の治療(Holmes et al., J. Nat. Cancer Inst., 83:1797,1991)に承認されている。パクリタキセルは、皮膚における新生物(Einzig et. al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 20:46)および頭頸部癌(Forastire et. al., Sem. Oncol., 20:56, 1990)の治療のための潜在的候補である。またこの化合物は、多発性嚢胞腎疾患(Woo et. al., Nature, 368:750. 1994)、肺癌、およびマラリアの治療にも可能性を示している。パクリタキセルで患者を治療すると、閾値濃度（５０ｎＭ）を超える投与期間に関連して(Kearns, C.M. et. al., Seminars in Oncology, 3(6) p.16-23, 1995)、骨髄抑制が起こる（複数の細胞系譜、Ignoff, R.J. et. al, Cancer Chemotherapy Pocket Guide, 1998）。
【０２０６】
ドセタキセル、（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−３−フェニルイソセリン，Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの５β−２０−エポキシ−１，２α，４，７β，１０β，１３α−ヘキサヒドロキシタクス−１１−エン−９−オン４−アセテート２−ベンゾエートとの１３−エステルの三水和物は、注射液としてタキソテール(TAXOTERE)（登録商標）として市販されている。ドセタキセルは、乳癌の治療に指示される。ドセタキセルは、ヨーロッパイチイの針葉から抽出した天然の前駆物質１０−デアセチル−バッカチンＩＩＩを使用して製造された、パクリタキセル（前項参照）の半合成誘導体である。ドセタキセルの用量制限毒性は好中球減少である。
【０２０７】
ビンカアルカロイドは、ニチニチソウ由来の細胞周期特異的抗新生物薬である。ビンカアルカロイドは、チューブリンと特異的に結合することによって細胞周期のＭ期（有糸分裂）に作用する。その結果、結合されたチューブリン分子は、重合して微小管になることができない。有糸分裂は中期で停止し、細胞死をたどると考えられている。ビンカアルカロイドの例としては、限定されるものではないが、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが挙げられる。
【０２０８】
ビンブラスチン、硫酸ビンカロイコブラスチンは、注射液としてベルバン(VELBAN)（登録商標）として市販されている。ビンブラスチンは、種々の固形腫瘍の第二選択療法として指示される可能性があるが、精巣癌、ならびにホジキン病、リンパ球性および組織球性リンパ腫を含む種々のリンパ腫の治療に主として指示される。骨髄抑制がビンブラスチンの用量制限副作用である。
【０２０９】
ビンクリスチン、ビンカロイコブラスチンの２２−オキソ−硫酸塩は、注射液としてオンコビン(ONCOVIN)（登録商標）として市販されている。ビンクリスチンは、急性白血病の治療に指示されており、ホジキンおよび非ホジキン悪性リンパ腫の治療計画の中でも使用されている。脱毛および神経学的作用がビンクリスチンの最も一般的な副作用であり、程度は低いが、骨髄抑制および胃腸粘膜炎作用が生じる。
【０２１０】
酒石酸ビノレルビンの注射液（ナベルビン(NAVELBINE)（登録商標））として市販されているビノレルビン、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−Ｃ’−ノルビンカロイコブラスチン［Ｒ−（Ｒ＊，Ｒ＊）−２，３−ジヒドロキシブタン二酸（１：２）（塩）］は、半合成ビンカアルカロイドである。ビノレルビンは、単剤として、またはシスプラチンなどの他の化学療法薬と組み合わせて、種々の固形腫瘍、特に、非小細胞肺癌、進行性乳癌、およびホルモン不応性前立腺癌の治療に指示される。骨髄抑制がビノレルビンの最も一般的な用量制限副作用である。
【０２１１】
白金配位錯体は、非細胞周期特異的抗癌剤であり、ＤＮＡと相互作用する。白金錯体は、腫瘍細胞に侵入し、アクア化を受け、ＤＮＡとの鎖内架橋および鎖間架橋を形成し、腫瘍に対して有害な生物学的作用を引き起こす。白金配位錯体の例としては、限定されるものではないが、シスプラチンおよびカルボプラチンが挙げられる。
【０２１２】
シスプラチン、シス−ジアンミンジクロロ白金は、注射液としてプラチノール(PLATINOL)（登録商標）として市販されている。シスプラチンは、主として転移性の精巣癌および卵巣癌ならびに進行性膀胱癌の治療に指示される。シスプラチンの主な用量制限副作用は、腎毒性（水分補給と利尿により管理可能）、および耳毒性である。
【０２１３】
カルボプラチン、ジアンミン［１，１−シクロブタン−ジカルボキシレート（２−）−Ｏ，Ｏ’］白金は、注射液としてパラプラチン(PARAPLATIN)（登録商標）として市販されている。カルボプラチンは、主として進行性卵巣癌の第一選択および第二選択治療に指示される。骨髄抑制がカルボプラチンの用量制限毒性である。
【０２１４】
アルキル化剤は、非細胞周期特異的抗癌剤(non-phase anti-cancer specific agents)であり、かつ、強力な求電子試薬である。一般に、アルキル化剤は、アルキル化によって、リン酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、およびイミダゾール基などのＤＮＡ分子の求核部分を介してＤＮＡと共有結合を形成する。このようなアルキル化によって核酸機能が破壊され細胞死に至る。アルキル化剤の例としては、限定されるものではないが、シクロホスファミド、メルファラン、およびクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタード；ブスルファンなどのスルホン酸アルキル；カルムスチンなどのニトロ尿素；ならびにダカルバジンなどのトリアゼンが挙げられる。
【０２１５】
シクロホスファミド、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］テトラヒドロ−２Ｈ−１，３，２−オキシアザホスホリン２−オキシド一水和物は、注射液または錠剤としてシトキサン(CYTOXAN)（登録商標）として市販されている。シクロホスファミドは、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、および白血病の治療に指示される。脱毛、悪心、嘔吐および白血球減少がシクロホスファミドの最も一般的な用量制限副作用である。
【０２１６】
メルファラン、４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−Ｌ−フェニルアラニンは、注射液または錠剤としてアルケラン(ALKERAN)（登録商標）として市販されている。メルファランは、多発性骨髄腫および切除不能な卵巣上皮癌の待期療法に指示される。骨髄抑制がメルファランの最も一般的な用量制限副作用である。
【０２１７】
クロラムブシル、４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］ベンゼンブタン酸は、ロイケラン(LEUKERAN)（登録商標）錠剤として市販されている。クロラムブシルは、慢性リンパ性白血病、ならびにリンパ肉腫、巨大濾胞性リンパ腫、およびホジキン病などの悪性リンパ腫の待期療法に指示される。骨髄抑制がクロラムブシルの最も一般的な用量制限副作用である。
【０２１８】
ブスルファン、ジメタンスルホン酸１，４−ブタンジオールは、マイレラン(MYLERAN)（登録商標）錠剤として市販されている。ブスルファンは、慢性骨髄性白血病の待期療法に指示される。骨髄抑制がブスルファンの最も一般的な用量制限副作用である。
【０２１９】
カルムスチン、１，３−［ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソ尿素は、ＢｉＣＮＵ（登録商標）として凍結乾燥物質の単一バイアルとして市販されている。カルムスチンは、脳腫瘍、多発性骨髄腫、ホジキン病、および非ホジキンリンパ腫用に、単剤として、または他の薬剤と組み合わせて、待期療法に指示される。遅発性骨髄抑制がカルムスチンの最も一般的な用量制限副作用である
【０２２０】
ダカルバジン、５−（３，３−ジメチル−１−トリアゼノ）−イミダゾール−４−カルボキサミドは、材料の単一バイアルとしてＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標）として市販されている。ダカルバジンは、転移性悪性黒色腫の治療、および他の薬剤と組み合わせてホジキン病の第二選択治療に指示される。悪心、嘔吐、および食欲不振がダカルバジンの最も一般的な用量制限副作用である。
【０２２１】
抗生物質系抗新生物薬は、非細胞周期特異的薬剤であり、ＤＮＡと結合するかまたはＤＮＡにインターカレートする。一般に、このような作用によって安定なＤＮＡ複合体かまたは鎖の切断が生じ、それにより核酸の通常機能が乱れ、細胞死に至る。抗生物質系抗新生物薬の例としては、限定されるものではないが、ダクチノマイシンなどのアクチノマイシン；ダウノルビシンおよびドキソルビシンなどのアントロサイクリン；ならびにブレオマイシンが挙げられる。
【０２２２】
ダクチノマイシンは、アクチノマイシンＤとしても知られ、注射液の形態でコスメゲン(COSMEGEN)（登録商標）として市販されている。ダクチノマイシンは、ウィルムス腫瘍および横紋筋肉腫の治療に指示される。悪心、嘔吐および食欲不振がダクチノマイシンの最も一般的な用量制限副作用である。
【０２２３】
ダウノルビシン、（８Ｓ−シス−）−８−アセチル−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リクソ−ヘキソピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−１−メトキシ−５，１２ナフタセンジオン塩酸塩は、リポソーム注射形態としてダウノキソーム(DAUNOXOME)（登録商標）として、または注射液としてセルビジン(CERUBIDINE)（登録商標）として市販されている。ダウノルビシンは、急性非リンパ球性白血病および進行性ＨＩＶ関連カポジ肉腫の治療における寛解導入に指示される。骨髄抑制がダウノルビシンの最も一般的な用量制限副作用である。
【０２２４】
ドキソルビシン、（８Ｓ，１０Ｓ）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リクソ−ヘキソピラノシル）オキシ］−８−グリコロイル，７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−１−メトキシ−５，１２ナフタセンジオン塩酸塩は、注射可能な形態としてルベックス(RUBEX)（登録商標）またはアドリアマイシンＲＤＦ(ADRIAMYCIN RDF)（登録商標）として市販されている。ドキソルビシンは、主として急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄芽球性白血病の治療に指示されるが、いくつかの固形腫瘍およびリンパ腫の治療における有用成分でもある。骨髄抑制がドキソルビシンの最も一般的な用量制限副作用である。
【０２２５】
ブレオマイシン、ストレプトミセス・ヴェルチシルス(Streptomyces verticillus)の株から単離された細胞傷害性グリコペプチド系抗生物質の混合物は、ベレノキサン(BLENOXANE)（登録商標）として市販されている。ブレオマイシンは、単剤として、または他の薬剤と組み合わせて、扁平上皮癌、リンパ腫、および精巣癌の待期療法に指示される。肺毒性および皮膚毒性がブレオマイシンの最も一般的な用量制限副作用である。
【０２２６】
トポイソメラーゼＩＩ阻害剤としては、限定されるものではないが、エピポドフィロトキシンが挙げられる。
【０２２７】
エピポドフィロトキシンは、マンドレイク植物由来の細胞周期特異的抗新生物薬である。エピポドフィロトキシンは、一般に、トポイソメラーゼＩＩとＤＮＡとの三元複合体を形成してＤＮＡ鎖の切断を引き起こすことによって、細胞周期のＳ期およびＧ２期において細胞に影響を及ぼす。この鎖切断が蓄積し、細胞死をたどる。エピポドフィロトキシンの例としては、限定されるものではないが、エトポシドおよびテニポシドが挙げられる。
【０２２８】
エトポシド、４’−デメチル−エピポドフィロトキシン９［４，６−０−（Ｒ）−エチリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド］は、注射液またはカプセル剤としてベプシド(VePESID)（登録商標）として市販されており、一般にＶＰ−１６として知られている。エトポシドは、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて、精巣癌および非小細胞肺癌の治療に指示される。骨髄抑制がエトポシドの最も一般的な副作用である。白血球減少の発生率の方が、血小板減少よりも重大となる傾向がある。
【０２２９】
テニポシド、４’−デメチル−エピポドフィロトキシン９［４，６−０−（Ｒ）−テニリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド］は、注射液としてブモン(VUMON)（登録商標）として市販されており、一般にＶＭ−２６として知られている。テニポシドは、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて、小児における急性白血病の治療に指示される。骨髄抑制がテニポシドの最も一般的な用量制限副作用である。テニポシドは、白血球減少および血小板減少の両方を誘発し得る。
【０２３０】
代謝拮抗性抗新生物薬は、ＤＮＡ合成を阻害すること、またはプリンもしくはピリミジン塩基の合成を阻害し、それによりＤＮＡ合成を制限することによって細胞周期のＳ期（ＤＮＡ合成）に作用する、細胞周期特異的抗新生物薬である。その結果、Ｓ期は進行せず、細胞死をたどる。代謝拮抗性抗新生物薬の例としては、限定されるものではないが、フルオロウラシル、メトトレキサート、シタラビン、メカプトプリン(mecaptopurine)、チオグアニン、およびゲムシタビンが挙げられる。
【０２３１】
５−フルオロウラシル、５−フルオロ−２，４−（１Ｈ，３Ｈ）ピリミジンジオンは、フルオロウラシルとして市販されている。５−フルオロウラシルを投与すると、チミジル酸合成が阻害され、またＲＮＡおよびＤＮＡの両方に組み込まれる。その結果は一般に細胞死である。５−フルオロウラシルは、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて、乳癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、および膵癌の治療に指示される。骨髄抑制および粘膜炎が５−フルオロウラシルの用量制限副作用である。他のフルオロピリミジン類似体としては、５−フルオロデオキシウリジン（フロクスウリジン）および５−フルオロデオキシウリジン一リン酸が挙げられる。
【０２３２】
シタラビン、４−アミノ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−２（１Ｈ）−ピリミジノンは、シトサール−Ｕ(CYTOSAR-U)（登録商標）として市販されており、一般にＡｒａ−Ｃとして知られている。シタラビンは、成長中のＤＮＡ鎖へのシタラビンの末端組み込みによってＤＮＡ鎖の伸長を阻害することにより、Ｓ期で細胞期特異性を示すと考えられている。シタラビンは、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて、急性白血病の治療に指示される。他のシチジン類似体としては、５−アザシチジンおよび２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（ゲムシタビン）が挙げられる。シタラビンは、白血球減少、血小板減少、および粘膜炎を誘発する。
【０２３３】
メルカプトプリン、１，７−ジヒドロ−６Ｈ−プリン−６−チオン一水和物は、プリントール(PURINETHOL)（登録商標）として市販されている。メルカプトプリンは、現時点でまだ特定されていないメカニズムによってＤＮＡ合成を阻害することにより、Ｓ期で細胞期特異性を示す。メルカプトプリンは、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて、急性白血病の治療に指示される。骨髄抑制および胃腸粘膜炎が、高用量のメルカプトプリンの副作用と予想される。有用なメルカプトプリン類似体はアザチオプリンである。
【０２３４】
チオグアニン、２−アミノ−１，７−ジヒドロ−６Ｈ−プリン−６−チオンは、タブロイド(TABLOID)（登録商標）として市販されている。チオグアニンは、現時点でまだ特定されていないメカニズムによってＤＮＡ合成を阻害することにより、Ｓ期で細胞期特異性を示す。チオグアニンは、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて、急性白血病の治療に指示される。白血球減少、血小板減少、および貧血を含む骨髄抑制がチオグアニン投与の最も一般的な用量制限副作用である。しかしながら、消化管副作用も起こり、用量制限となり得る。他のプリン類似体としては、ペントスタチン、エリスロヒドロキシノニルアデニン、リン酸フルダラビン、およびクラドリビンが挙げられる。
【０２３５】
ゲムシタビン、２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジン一塩酸塩（β−異性体）は、ジェムザール(GEMZAR)（登録商標）として市販されている。ゲムシタビンは、Ｓ期にて、またＧ１／Ｓ境界を通る細胞の進行を遮断することによって、細胞期特異性を示す。ゲムシタビンは、シスプラチンと組み合わせて局所進行性非小細胞肺癌の治療に指示され、また単独で局所進行性膵癌の治療に指示される。白血球減少、血小板減少、および貧血を含む骨髄抑制が、ゲムシタビン投与の最も一般的な用量制限副作用である。
【０２３６】
メトトレキサート、Ｎ−［４［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸は、メトトレキサートナトリウムとして市販されている。メトトレキサートは、プリンヌクレオチドおよびチミジル酸の合成に必要とされるジヒドロ葉酸レダクターゼの阻害を介して、ＤＮＡの合成、修復、および／または複製を阻害することによって、特にＳ期に細胞周期作用を示す。メトトレキサートは、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて、絨毛癌、髄膜白血病、非ホジキンリンパ腫、ならびに乳癌、頭部癌、頸部癌、卵巣癌、および膀胱癌の治療に指示される。骨髄抑制（白血球減少、血小板減少、および貧血）および粘膜炎が、メトトレキサート投与の予想される副作用である。
【０２３７】
カンプトテシンおよびカンプトテシン誘導体を含むカンプトテシン類は、トポイソメラーゼＩ阻害剤として入手可能または開発中である。カンプトテシン細胞傷害活性は、そのトポイソメラーゼＩ阻害活性に関連すると考えられている。カンプトテシンの例としては、限定されるものではないが、イリノテカン、トポテカン、および下記の７−（４−メチルピペラジノ−メチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０−カンプトテシンの種々の光学形態が挙げられる。
【０２３８】
イリノテカンＨＣｌ、（４Ｓ）−４，１１−ジエチル−４−ヒドロキシ−９−［（４−ピペリジノピペリジノ）カルボニルオキシ］−１Ｈ−ピラノ［３’，４’，６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオン塩酸塩は、注射液カンプトサール(CAMPTOSAR)（登録商標）として市販されている。
【０２３９】
イリノテカンは、その活性代謝物ＳＮ−３８とともにトポイソメラーゼＩ−ＤＮＡ複合体と結合する、カンプトテシンの誘導体である。細胞傷害性は、トポイソメラーゼＩ：ＤＮＡ：イリンテカンまたはＳＮ−３８の三元複合体と複製酵素との相互作用により引き起こされる回復不能な二本鎖切断の結果として生じると考えられている。イリノテカンは、結腸または直腸の転移性癌の治療に指示される。イリノテカンＨＣｌの用量制限副作用は、好中球減少を含む骨髄抑制、および下痢を含むＧＩ作用である。
【０２４０】
トポテカンＨＣｌ、（Ｓ）−１０−［（ジメチルアミノ）メチル］−４−エチル−４，９−ジヒドロキシ−１Ｈ−ピラノ［３’，４’，６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−３，１４−（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオン一塩酸塩は、注射液ハイカムチン(HYCAMTIN)（登録商標）として市販されている。トポテカンは、トポイソメラーゼＩ−ＤＮＡ複合体と結合して、ＤＮＡ分子のねじれ歪みに応答してトポイソメラーゼＩにより引き起こされる一本鎖切断の再連結を妨げるカンプトテシンの誘導体である。トポテカンは、転移性の卵巣癌および小細胞肺癌の第二選択治療に指示される。トポテカンＨＣｌの用量規制副作用は、骨髄抑制、主に好中球減少である。
【０２４１】
リツキシマブは、キメラモノクローナル抗体であり、リツキサン(RITUXAN)（登録商標）およびマブセラ(MABTHERA)（登録商標）として市販されている。リツキシマブは、Ｂ細胞上のＣＤ２０と結合し、細胞アポトーシスを引き起こす。リツキシマブは静脈内に投与され、関節リウマチおよびＢ細胞非ホジキンリンパ腫の治療に承認されている。
【０２４２】
オファツムマブは、完全ヒトモノクローナル抗体であり、アルゼラ(ARZERRA)（登録商標）として市販されている。オファツムマブは、Ｂ細胞上のＣＤ２０と結合し、フルダラビン（フルダラ）およびアレムツズマブ（キャンパス）処置に不応の成人において白血球の癌の一種である慢性リンパ球性白血病ＣＬＬを治療するために使用されている。
【０２４３】
トラスツズマブ（ハーセプチン(HEREPTIN)（登録商標））は、ＨＥＲ２受容体と結合するヒト化モノクローナル抗体である。その元の適応は、ＨＥＲ２陽性乳癌である。
【０２４４】
セツキシマブ（エルビタックス(ERBITUX)（登録商標））は、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を阻害するキメラマウスヒト抗体である。
【０２４５】
ｍＴＯＲ阻害剤としては、限定されるものではないが、ラパマイシン（ＦＫ５０６）およびラパログ、ＲＡＤ００１またはエベロリムス（アフィニトール）、ＣＣＩ−７７９またはテムシロリムス、ＡＰ２３５７３、ＡＺＤ８０５５、ＷＹＥ−３５４、ＷＹＥ−６００、ＷＹＥ−６８７およびＰｐ１２１が含まれる。
【０２４６】
ベキサロテンは、ターグレチン(Targretin)（登録商標）として市販され、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）を選択的に活性化するレチノイドのサブクラスのメンバーである。これらのレチノイド受容体は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）とは異なる生物活性を有する。化学名は４−［１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−ペンタメチル−２−ナフタレニル）エテニル］安息香酸である。ベキサロテンは、少なくとも１種類の他の薬剤で疾患が上手く治療できなかった人で、皮膚Ｔ細胞リンパ腫ＣＴＣＬ（皮膚癌の一種）を治療するために使用される。
【０２４７】
ネクサバール(Nexavar)（登録商標）として市販されているソラフェニブは、マルチキナーゼ阻害剤と呼ばれる薬剤の一種である。その化学名は、４−［４−［［４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］−Ｎ−メチル−ピリジン−２−カルボキサミドである。ソラフェニブは、進行性腎細胞癌（腎臓で始まる癌の一種）を治療するために使用される。ソラフェニブはまた、切除不能肝細胞癌（手術で処置できない肝臓癌一種）を治療するためにも使用される。
【０２４８】
ｅｒｂＢ阻害剤の例には、ラパチニブ、エルロチニブ、およびゲフィチニブが含まれる。ラパチニブ、Ｎ−（３−クロロ−４−｛［（３−フルオロフェニル）メチル］オキシ｝フェニル）−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フラニル］−４−キナゾリンアミン（示されるような式ＩＩで表される）は、ＨＥＲ２陽性転移性乳癌の治療のためにカペシタビンとの組合せで承認されている、ｅｒｂＢ−１およびｅｒｂＢ−２（ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２）チロシンキナーゼの、強力、経口、小分子、二重阻害剤である。
【化６】
2020079252.tif 000009
【０２４９】
式（ＩＩ）の化合物の遊離塩基、ＨＣｌ塩、および二トシル酸は、１９９９年７月１５日公開のＷＯ９９／３５１４６；および２００２年１月１０日公開のＷＯ０２／０２５５２に開示されている手順に従って製造することができる。
【０２５０】
商標タルセ(Tascerva)として市販されているエルロチニブ、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス｛［２−（メチルオキシ）エチル］オキシ｝−４−キナゾリンアミンは、示されるような式ＩＩＩで表される。
【化７】
2020079252.tif 000010
【０２５１】
エルロチニブの遊離塩基およびＨＣｌ塩は、例えば米国特許第５，７４７，４９８号の実施例２０に従って製造することができる。
【０２５２】
ゲフィチニブ、４−キナゾリンアミン，Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−［３−４−モルホリン）プロポキシ］は、示されるような式ＩＶで表される。
【化８】
2020079252.tif 000011
【０２５３】
商標イレッサ(IRESSA)（登録商標）（Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｎｃａ）として市販されているゲフィチニブは、白金に基づくおよびドセタキセルの両化学療法が上手くいかなかった後に局所進行性または転移性非小細胞肺癌患者の治療に単剤療法として指示されるｅｒｂＢ−１阻害剤である。ゲフィチニブの遊離塩基、ＨＣｌ塩、および二ＨＣｌ塩は、１９９６年４月２３日に出願され、１、１９９６年１０月３１日にＷＯ９６／３３９８０として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９６／００９６の手順に従って製造することができる。
【０２５４】
また、現在開発中の下式Ａ
【化９】
2020079252.tif 000012
のカンプトテシン誘導体も、化学名７−（４−メチルピペラジノ−メチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｒ，Ｓ）−カンプトテシン（ラセミ混合物）または７−（４−メチルピペラジノ−メチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｒ）−カンプトテシン（Ｒ鏡像異性体）または７−（４−メチルピペラジノ−メチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン（Ｓ鏡像異性体）として知られる、ラセミ混合物（Ｒ，Ｓ）形態ならびにＲおよびＳ鏡像異性体を含めて対象とされる。このような化合物ならびに関連化合物は、米国特許第６，０６３，９２３号；第５，３４２，９４７号；第５，５５９，２３５号；第５，４９１，２３７号および１９９７年１１月２４日出願の係属中米国特許出願第０８／９７７，２１７号に製造方法も含めて記載されている。
【０２５５】
ホルモンおよびホルモン類似体は、ホルモンと癌の成長および／または成長欠如の間に関係があれば、癌を治療するための有用な化合物となる。癌治療で有用なホルモンおよびホルモン類似体としては、限定されるものではないが、小児の悪性リンパ腫および急性白血病の治療に有用なプレドニゾンおよびプレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド；副腎皮質癌およびエストロゲン受容体を含むホルモン非依存性乳癌の治療で有用な、アミノグルテチミドおよびその他のアロマターゼ阻害剤、例えば、アナストロゾール、レトラゾール、ボラゾール、およびエキセメスタン；ホルモン非依存性乳癌および子宮内膜癌の治療で有用な酢酸メゲストロールなどのプロゲストリン；前立腺癌および良性前立腺肥大の治療で有用な、エストロゲン、アンドロゲン、および抗アンドロゲン作用薬、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸シプロテロンおよび５α−レダクターゼ、例えば、フィナステリドおよびデュタステライド；ホルモン非依存性乳癌およびその他の感受性癌の治療で有用な、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェンなどの抗エストロゲン作用薬、ならびに米国特許第５，６８１，８３５号、第５，８７７，２１９号、および第６，２０７，７１６号に記載されているものなどの選択性エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭＳ）；ならびに前立腺癌の治療のために黄体形成ホルモン(leutinizing hormone)（ＬＨ）および／または卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を刺激するゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）およびその類似体、例えば、ＬＨＲＨアゴニストおよびアンタゴニスト(antagagonists)、例えば、酢酸ゴセレリンおよびルプロリドが含まれる。
【０２５６】
シグナル伝達経路阻害剤は、細胞内変化を誘発する化学プロセスを遮断または阻害する阻害剤である。本明細書で使用する場合、この変化は、細胞増殖または分化である。本発明において有用なシグナル伝達阻害剤としては、受容体型チロシンキナーゼ、非受容体型チロシンキナーゼ、ＳＨ２／ＳＨ３ドメイン遮断薬、セリン／トレオニンキナーゼ、ホスファチジルイノシトール(phosphotidyl inositol)−３キナーゼ、ミオイノシトールシグナル伝達、およびＲａｓ癌遺伝子の阻害剤が含まれる。
【０２５７】
いくつかのタンパク質チロシンキナーゼは、細胞増殖の調節に関与する種々のタンパク質において特定のチロシル残基のリン酸化を触媒する。このようなタンパク質チロシンキナーゼは、受容体型または非受容体型キナーゼとして大きく分類することができる。
【０２５８】
受容体型チロシンキナーゼは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびチロシンキナーゼドメインを有する膜貫通タンパク質である。受容体型チロシンキナーゼは、細胞増殖の調節に関与し、一般に、成長因子受容体と呼ばれる。これらのキナーゼの多くの不適当なまたは制御を欠いた活性化、すなわち、例えば過剰発現または変異による異常なキナーゼ成長因子受容体活性が制御を欠いた細胞増殖をもたらすことが示されている。よって、このようなキナーゼの異常な活性は悪性組織の成長に関連付けられている。結果として、このようなキナーゼの阻害剤が癌治療法を提供し得る。成長因子受容体には、例えば、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦｒ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦｒ）、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ４、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦｒ）、免疫グロブリン様および上皮細胞成長因子相同ドメインを有するチロシンキナーゼ（ＴＩＥ−２）、インスリン成長因子−Ｉ（ＩＧＦＩ）受容体、マクロファージコロニー刺激因子（Ｃｆｍｓ）、ＢＴＫ、ｃｋｉｔ、ｃｍｅｔ、線維芽球成長因子（ＦＧＦ）受容体、Ｔｒｋ受容体（ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、およびＴｒｋＣ）、エフリン（ｅｐｈ）受容体、およびＲＥＴ癌原遺伝子が含まれる。成長受容体のいくつかの阻害剤が開発中であり、リガンドアンタゴニスト、抗体、チロシンキナーゼ阻害剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。成長因子受容体および成長因子受容体の機能を阻害する薬剤は、例えば、Kath, John C., Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(6):803-818; Shawver et al DDT Vol 2, No. 2 February 1997;およびLofts, F. J. et al, “Growth factor receptors as targets”, New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy, ed. Workman, Paul and Kerr, David, CRC press 1994, Londonに記載されている。
【０２５９】
成長因子受容体キナーゼでないチロシンキナーゼは、非受容体型チロシンキナーゼと呼ばれる。抗癌薬の標的または潜在的標的である、本発明において有用な非受容体型チロシンキナーゼとしては、ｃＳｒｃ、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｊａｋ、ｃＡｂｌ、ＦＡＫ（接着斑キナーゼ）、ブルトン型チロシンキナーゼ、およびＢｃｒ−Ａｂｌが含まれる。このような非受容体型キナーゼおよび非受容体型チロシンキナーゼ機能阻害する薬剤は、Sinh, S. and Corey, S.J., (1999) Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research 8 (5): 465-80;およびBolen, J.B., Brugge, J.S., (1997) Annual review of Immunology. 15: 371-404に記載されている。
【０２６０】
ＳＨ２／ＳＨ３ドメイン遮断薬は、ＰＩ３−Ｋ  ｐ８５サブユニット、Ｓｒｃファミリーキナーゼ、アダプター分子（Ｓｈｃ、Ｃｒｋ、Ｎｃｋ、Ｇｒｂ２）およびＲａｓ−ＧＡＰを含む、様々な酵素またはアダプタータンパク質において、ＳＨ２またはＳＨ３ドメインの結合を妨げる薬剤である。抗癌薬の標的としてのＳＨ２／ＳＨ３ドメインは、Smithgall, T.E. (1995), Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 34(3) 125-32に記載されている。
【０２６１】
ＭＡＰキナーゼカスケード遮断薬を含むセリン／トレオニンキナーゼの阻害剤には、Ｒａｆキナーゼ（ｒａｆｋ）、分裂促進因子または細胞外調節キナーゼ（ＭＥＫ）、および細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）の遮断；およびＰＫＣ（α、β、γ、ε、μ、λ、ι、ζ）の遮断薬を含むタンパク質キナーゼＣファミリーメンバー遮断薬が含まれる。ＩｋＢキナーゼファミリー（ＩＫＫａ、ＩＫＫｂ）、ＰＫＢファミリーキナーゼ、ＡＫＴキナーゼファミリーメンバー、およびＴＧＦβ受容体キナーゼ。このようなセリン／トレオニンキナーゼおよびそれらの阻害剤は、Yamamoto, T., Taya, S., Kaibuchi, K., (1999), Journal of Biochemistry. 126 (5) 799-803; Brodt, P, Samani, A., and Navab, R. (2000), Biochemical Pharmacology, 60. 1101-1107; Massague, J., Weis-Garcia, F. (1996) Cancer Surveys. 27:41-64; Philip, P.A., and Harris, A.L. (1995), Cancer Treatment and Research. 78: 3-27, Lackey, K. et al Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, (10), 2000, 223-226;米国特許第６，２６８，３９１号;およびMartinez-Iacaci, L., et al, Int. J. Cancer (2000), 88(1), 44-52に記載されている。
【０２６２】
ＰＩ３−キナーゼ、ＡＴＭ、ＤＮＡ−ＰＫ、およびＫｕの遮断薬を含むホスファチジルノシトール(Phosphotidyl inositol)−３キナーゼファミリーメンバーの阻害剤も本発明において有用である。このようなキナーゼは、Abraham, R.T. (1996), Current Opinion in Immunology. 8 (3) 412-8; Canman, C.E., Lim, D.S. (1998), Oncogene 17 (25) 3301-3308; Jackson, S.P. (1997), International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 29 (7):935-8;およびZhong, H. et al, Cancer res, (2000) 60(6), 1541-1545に記載されている。
【０２６３】
また、ホスホリパーゼＣ遮断薬およびミオイノシトール類似体などのミオイノシトールシグナル伝達阻害剤も本発明において有用である。このようなシグナル阻害剤は、Powis, G., and Kozikowski A., (1994 New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy ed., Paul Workman and David Kerr, CRC press 1994, Londonに記載されている。
【０２６４】
シグナル伝達経路阻害剤のもう１つの群は、Ｒａｓ癌遺伝子の阻害剤である。このような阻害剤には、ファルネシルトランスフェラーゼ、ゲラニル−ゲラニルトランスフェラーゼ、およびＣＡＡＸプロテアーゼの阻害剤ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムおよび免疫療法が含まれる。このような阻害剤は、野生型変異ｒａｓを含む細胞においてｒａｓの活性化を遮断し、それにより抗増殖薬として作用することが示されている。Ｒａｓ癌遺伝子の阻害は、Scharovsky, O.G., Rozados, V.R., Gervasoni, S.I. Matar, P. (2000), Journal of Biomedical Science. 7(4 292-8; Ashby, M.N. (1998), Current Opinion in Lipidology. 9 (2) 99-102; and Bennett, C.F. and Cowsert, L.M. BioChim. Biophys. Acta, (1999) 1489(1):19-30に考察されている。
【０２６５】
前述のように、受容体キナーゼリガンド結合に対する抗体アンタゴニストはまた、シグナル伝達阻害剤としても役立ち得る。この群のシグナル伝達経路阻害剤は、受容体型チロシンキナーゼの細胞外リガンド結合ドメインに対するヒト化抗体の使用を包含する。例えば、Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｃ２２５  ＥＧＦＲ特異的抗体（Green, M.C. et al, Monoclonal Antibody Therapy for Solid Tumors, Cancer Treat. Rev., (2000), 26(4, 269-286)参照）；ハーセプチン（登録商標）ｅｒｂＢ２抗体（Tyrosine Kinase Signalling in Breast cancer:erbB Family Receptor Tyrosine Kniases, Breast cancer Res., 2000, 2(3), 176-183参照）；および２ＣＢ  ＶＥＧＦＲ２特異的抗体（Brekken, R.A. et al, Selective Inhibition of VEGFR2 Activity by a monoclonal Anti-VEGF antibody blocks tumor growth in mice, Cancer Res. (2000) 60, 5117-5124参照）。
【０２６６】
非受容体型キナーゼ血管新生阻害剤もまた、本発明において使用が見出せる。血管新生関連ＶＥＧＦＲおよびＴＩＥ２の阻害剤は、シグナル伝達阻害剤に関して上述されている（両受容体とも受容体型チロシンキナーゼである）。ｅｒｂＢ２およびＥＧＦＲの阻害剤は血管新生、主としてＶＥＧＦ発現を阻害することが示されているので、血管新生は一般に、ｅｒｂＢ２／ＥＧＦＲシグナル伝達に関連する。よって、ｅｒｂＢ２／ＥＧＦＲ阻害剤と血管新生阻害剤の組合せは意味を成す。従って、非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤は、本発明のＥＧＦＲ／ｅｒｂＢ２阻害剤と併用可能である。例えば、ＶＥＧＦＲ（受容体型チロシンキナーゼ）を認識しないがそのリガンドと結合する抗ＶＥＧＦ抗体；血管新生を阻害するインテグリン（αｖβ３）の小分子阻害剤；エンドスタチンおよびアンギオスタチン（非ＲＴＫ）も、開示されているｅｒｂファミリー阻害剤と組み合わせると有用であることが分かり得る（Bruns CJ et al (2000), Cancer Res., 60: 2926-2935; Schreiber AB, Winkler ME, and Derynck R. (1986), Science, 232: 1250-1253; Yen L et al. (2000), Oncogene 19: 3460-3469参照）。
【０２６７】
また、免疫治療計画において使用される薬剤も、式（Ｉ）の化合物と組み合わせると有用であり得る。ｅｒｂＢ２またはＥＧＦＲに対する免疫応答を生じさせるにはいくつかの免疫戦略がある。これらの戦略は一般に、腫瘍ワクチン接種の領域にある。免疫アプローチの有効性は、小分子阻害剤を用いたｅｒｂＢ２／ＥＧＦＲシグナル伝達経路の複合阻害によって大幅に高められ得る。ｅｒｂＢ２／ＥＧＦＲに対する免疫／腫瘍ワクチンアプローチの考察は、Reilly RT et al. (2000), Cancer Res. 60:  3569-3576; and Chen Y, Hu D, Eling DJ, Robbins J, and Kipps TJ. (1998), Cancer Res. 58: 1965-1971に見出せる。
【０２６８】
アポトーシス誘導計画に使用される薬剤（例えば、ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド）もまた、本発明の組合せにおいて使用可能である。Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質のメンバーはアポトーシスを遮断する。従って、ｂｃｌ−２のアップレギュレーションは化学耐性に関連付けられている。研究によれば、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）はｂｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシスメンバー（すなわち、ｍｃｌ−１）を刺激することが示されている。従って、腫瘍においてｂｃｌ−２の発現をダウンレギュレートするように設計された戦略は、実証された臨床利益を有し、現在、第ＩＩ／ＩＩＩ相治験下にある（すなわち、ＧｅｎｔａのＧ３１３９  ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド）。ｂｃｌ−２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド戦略を使用するこのようなアポトーシス誘導戦略は、Water JS et al. (2000), J. Clin. Oncol. 18: 1812-1823; and Kitada S et al. (1994, Antisense Res. Dev. 4:  71-79に考察されている。
【０２６９】
トラスツズマブ（ハーセプチン(HEREPTIN)（登録商標））は、ＨＥＲ２受容体と結合するヒト化モノクローナル抗体である。その元の適応はＨＥＲ２陽性乳癌である。
【０２７０】
トラスツズマブエメタシン（商標カドサイラ(Kadcyla)）は、細胞傷害性薬剤メルタンシン（ＤＭ１）と連結されたモノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチン）からなる抗体−薬物コンジュゲートである。トラスツズマブは単独で、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体と結合することにより癌細胞の増殖を停止させ、一方、メルタンシンは細胞に入ってチューブリンと結合することによりそれらを破壊する。このモノクローナル抗体はＨＥＲ２を標的とし、ＨＥＲ２は癌細胞においてのみ過剰発現されるので、このコンジュゲートは毒素を腫瘍細胞に特異的に送達する。このコンジュゲートはＴ−ＤＭ１と略される。
【０２７１】
セツキシマブ（エルビタックス(ERBITUX)（登録商標））は、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を阻害するキメラマウスヒト抗体である。
【０２７２】
ペルツズマブ（２Ｃ４とも呼ばれる、商標オムニターグ(Omnitarg））は、モノクローナル抗体である。「ＨＥＲ二量体化阻害剤」と呼ばれる薬剤系列のそのクラスの筆頭。ＨＥＲ２と結合することにより、それはＨＥＲ２と他のＨＥＲ受容体との二量体化を阻害し、腫瘍増殖の緩徐化をもたらすのではないかと推測されている。ペルツズマブは２００１年１月４日公開のＷＯ０１／００２４５に記載されている。
【０２７３】
リツキシマブは、キメラモノクローナル抗体であり、リツキサン（登録商標）およびマブセラ(MABTHERA)（登録商標）として市販されている。リツキシマブは、Ｂ細胞上のＣＤ２０と結合し、細胞アポトーシスを引き起こす。リツキシマブは静脈内に投与され、関節リウマチおよびＢ細胞非ホジキンリンパ腫の治療に承認されている。
【０２７４】
オファツムマブは、完全ヒトモノクローナル抗体であり、アルゼラ（登録商標）として市販されている。オファツムマブは、Ｂ細胞上のＣＤ２０と結合し、フルダラビン（フルダラ）およびアレムツズマブ（キャンパス）処置に不応の成人において慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ；白血球の癌の一種）を治療するために使用されている。
【０２７５】
細胞周期シグナル伝達阻害剤は、細胞周期の制御に関与する分子を阻害する。サイクリン依存性キナーゼＣＤＫ）と呼ばれるタンパク質キナーゼのファミリーおよびそれらの、サイクリンと呼ばれるタンパク質ファミリーとの相互作用は、真核細胞周期の進行を制御する。細胞周期の正常な進行には、種々のサイクリン／ＣＤＫ複合体の活性化および不活性化の調和が必要である。いくつかの細胞周期シグナル伝達阻害剤が開発中である。例えば、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、およびＣＤＫ６を含むサイクリン依存性キナーゼならびにそれらの阻害剤の例が、例えば、Rosania et al, Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(2):215-230に記載されている。
【０２７６】
本明細書で使用する場合、「免疫調節薬」は、モノクローナル抗体を含め、免疫系に作用するいずれの物質も意味する。本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質は、免疫調節薬と見なすことができる。免疫調節薬は癌の治療のために抗新生物薬として使用できる。例えば、免疫調節薬としては、限定されるものではないが、イピリムマブ（ヤーボイ)などの抗ＣＴＬＡ−４抗体、ならびに抗ＰＤ−１抗体（オプジーボ／ニボルマブおよびキートルーダ／ペンブロリズマブ）が含まれる。タンパク質の免疫調節薬としては、限定されるものではないが、ＯＸ−４０抗体、ＰＤ−Ｌ１抗体、ＬＡＧ３抗体、ＴＩＭ−３抗体、４１ＢＢ抗体およびＧＩＴＲ抗体が含まれる。
【０２７７】
ヤーボイ（イピリムマブ）は、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂにより市販されている完全ヒトＣＴＬＡ−４抗体である。イピリムマブのタンパク質構造および使用方法は、米国特許第６，９８４，７２０号および第７，６０５，２３８号に記載されている。
【０２７８】
オプジーボ／ニボルマブは、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂにより市販されている、免疫増強活性を有する、負の免疫調節ヒト細胞表面受容体ＰＤ−１（プログラム細胞死−１またはプログラム細胞死−１／ＰＣＤ−１）に対する完全ヒトモノクローナル抗体である。ニボルマブは、Ｉｇスーパーファミリー膜貫通タンパク質であるＰＤ−１と結合し、そのリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２によるＰＤ−１の活性化を遮断して、Ｔ細胞の活性化および腫瘍細胞または病原体に対する細胞媒介性免疫応答をもたらす。活性化ＰＤ−１は、Ｔ細胞の活性化、およびＰ１３ｋ／Ａｋｔ経路の活性化の抑制を介したエフェクター機能に負の調節を行う。ニボルマブの他の名称としては、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、およびＯＮＯ−４５３８が含まれる。ニボルマブのアミノ酸配列ならびに使用および製造方法は、米国特許第８，００８，４４９号に開示されている。
【０２７９】
キートルーダ／ペンブロリズマブは、肺癌の治療向けにＭｅｒｃｋにより市販されている抗ＰＤ−１抗体である。ペンブロリズマブのアミノ酸配列および使用方法は、米国特許第８，１６８，７５７号に開示されている。
【０２８０】
ＯＸ４０としても知られるＣＤ１３４は、ＣＤ２８とは異なり、休止中のナイーブＴ細胞上には構成的に発現されない受容体のＮＦＲスーパーファミリーのメンバーである。ＯＸ４０は、活性化の２４〜７２時間後に発現される二次的補助刺激分子であり；そのリガンドＯＸ４０Ｌもまた休止中の抗原提示細胞では発現されないが、それらの活性化後には発現される。ＯＸ４０の発現は、Ｔ細胞の完全な活性化に依存し、ＣＤ２８が無ければ、ＯＸ４０の発現は遅れ、４分の１のレベルとなる。ＯＸ−４０抗体、ＯＸ−４０融合タンパク質およびそれらの使用方法は、米国特許第７，５０４，１０１号；同第７，７５８，８５２号；同第７，８５８，７６５号；同第７，５５０，１４０号；同第７，９６０，５１５号；ＷＯ２０１２０２７３２８；ＷＯ２０１３０２８２３１に開示されている。
【０２８１】
ＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４またはＢ７−Ｈ１とも呼ばれる）に対する抗体および使用方法は、米国特許第７，９４３，７４３号；同第８，３８３，７９６号；ＵＳ２０１３００３４５５９、ＷＯ２０１４０５５８９７、米国特許第８，１６８，１７９号；および同第７，５９５，０４８号に開示されている。ＰＤ−Ｌ１抗体は、癌治療のための免疫調節薬として開発中である。
【０２８２】
本明細書で使用する場合、「免疫刺激薬」は、免疫系を刺激することができるいずれの薬剤も意味する。本明細書で使用する場合、免疫刺激薬には、限定されるものではないが、ワクチンアジュバントが含まれる。
【０２８３】
アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）は、免疫動物におけるサイトカイン産生の刺激、マクロファージの活性化、自然免疫応答の促進、および抗体産生の増強のためのワクチンアジュバントおよび免疫刺激薬として有用であることが知られている。アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）は、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）の合成リガンドである。ＡＧＰおよびＴＬＲ４を介したそれらの免疫調節効果は、ＷＯ２００６／０１６９９７、ＷＯ２００１／０９０１２９、および／または米国特許第６，１１３，９１８号などの特許公報に開示され、文献で報告されている。さらなるＡＧＰ誘導体も、米国特許第７，１２９，２１９号、同第６，５２５，０２８号および同第６，９１１，４３４号に開示されている。特定のＡＧＰはＴＬＲ４のアゴニストとして働き、他のものはＴＬＲ４アンタゴニストとして認識される。
【０２８４】
本発明において使用されるアミノアルキルグルコサミニドホスフェート化合物は下記の通り式１に示される構造を有する。
【化１０】
2020079252.tif 000013
〔式中、
ｍは、０〜６であり；
ｎは、０〜４であり；
Ｘは、ＯまたはＳ、好ましくは、Ｏであり；
Ｙは、ＯまたはＮＨであり；
Ｚは、ＯまたはＨであり；
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、Ｃ１−２０アシルおよびＣ１−２０アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ４は、ＨまたはＭｅであり；
Ｒ５は、−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃｌ−Ｃ４）アルコキシ、−ＰＯ３Ｒ８Ｒ９、−ＯＰＯ３Ｒ８Ｒ９、−ＳＯ３Ｒ８、−ＯＳＯ３Ｒ８、−ＮＲ８Ｒ９、−ＳＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＨＯ、−ＣＯ２Ｒ８、およびＣＯＮＲ８Ｒ９からなる群から独立に選択され、ここで、
各Ｒ８およびＲ９は、Ｈおよび（Ｃｌ−Ｃ４）アルキルから独立に選択され；かつ
各Ｒ６およびＲ７は独立に、ＨまたはＰＯ３Ｈ２である。〕
【０２８５】
式１では、第１級脂肪アシル残基（すなわち、第２級アシルオキシまたはアルコキシ残基、例えば、Ｒ１Ｏ、Ｒ２Ｏ、およびＲ３Ｏ）が結合されている３’立体中心の配置は、ＲまたはＳ、好ましくは、Ｒである（カーン・インゴルド・プレローグ順位則(Cahn-Ingold-Prelog priority rules)によって設計される通り）。Ｒ４およびＲ５が結合されているアグリコン立体中心の配置は、ＲまたはＳであり得る。総ての立体異性体、鏡像異性体およびジアステレオマーの両方、ならびにそれらの混合物は、本発明の範囲内に入ると見なされる。
【０２８６】
ヘテロ原子Ｘとアグリコン窒素原子の間の炭素原子の数は、変数「ｎ」により決定され、これは０〜４の整数、好ましくは０〜２の整数であり得る。
【０２８７】
第１級脂肪酸Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の鎖長は、炭素約６〜約１６個、好ましくは炭素約９〜約１４個であり得る。鎖長は同じであっても異なってもよい。いくつかの好ましい実施態様には、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が６または１０または１２または１４である鎖長が含まれる。
【０２８８】
式１は、Ｌ／Ｄ−セリル、−トレオニル、−システイニルエーテルおよびエステル脂質ＡＧＰ、アゴニストとアンタゴニストの両方およびそれらのホモログ（ｎ＝１〜４）、ならびに種々のカルボン酸生物学的等価体（すなわち、Ｒ５は塩形成が可能な酸性基であり；リン酸基は、グルコサミン単位の４位または６位のいずれにあってもよいが、好ましくは４位にある）を包含する。
【０２８９】
式１のＡＧＰ化合物を使用する本発明の好ましい実施態様では、ｎは０であり、Ｒ５はＣＯ２Ｈであり、Ｒ６はＰＯ３Ｈ２であり、かつ、Ｒ７はＨである。この好ましいＡＧＰ化合物は、下記のような式１ａにおける構造として示される。
【化１１】
2020079252.tif 000014
〔式中、ＸはＯまたはＳであり；ＹはＯまたはＮＨであり；ＺはＯまたはＨであり；各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、Ｃ１−２０アシルおよびＣ１−２０アルキルからなる群から独立に選択され；かつ、Ｒ４はＨまたはメチルである。〕
【０２９０】
式１ａでは、第１級脂肪アシル残基（すなわち、第２級アシルオキシまたはアルコキシ残基、例えば、Ｒ１Ｏ、Ｒ２Ｏ、およびＲ３Ｏ）が結合されている３’立体中心の配置はＲまたはＳ、好ましくはＲである（カーン・インゴルド・プレローグ順位則(Cahn-Ingold-Prelog priority rules)によって設計される通り）。Ｒ４およびＣＯ２Ｈが結合されているアグリコン立体中心の配置は、ＲまたはＳであり得る。総ての立体異性体、鏡像異性体およびジアステレオマーの両方、ならびにそれらの混合物は、本発明の範囲内に入ると見なされる。
【０２９１】
式１ａは、Ｌ／Ｄ−セリル、−トレオニル、−システイニルエーテルまたはエステル脂質ＡＧＰ、アゴニストおよびアンタゴニストの両方を包含する。
【０２９２】
式１および式１ａの両方において、Ｚは、二重結合、またはそれぞれ一重結合により結合された２個の水素原子によって結合されたＯである。すなわち、その化合物は、Ｚ＝Ｙ＝Ｏの場合にはエステル結合され、Ｚ＝ＯおよびＹ＝ＮＨの場合にはアミド結合され、Ｚ＝Ｈ／ＨおよびＹ＝Ｏの場合にはエーテル結合される。
【０２９３】
式１の特に好ましい化合物は、ＣＲＸ−６０１およびＣＲＸ−５２７と呼ばれる。それらの構造は下記のように示される。
【化１２】
2020079252.tif 000015
【０２９４】
加えて、別の好ましい実施態様では、示されている構造を有するＣＲＸ  ５４７を用いる。
【０２９５】
ＣＲＸ５４７
【化１３】
2020079252.tif 000016
【０２９６】
さらに他の実施態様には、より短い第２級アシルまたはアルキル鎖を有するＡＧＰに対して安定性の増強を与える、ＣＲＸ  ６０２またはＣＲＸ  ５２６などのＡＧＰが含まれる。
【化１４】
2020079252.tif 000017
【０２９７】
１つの実施態様では、必要とする哺乳動物において癌を処置するための方法であって、そのような哺乳動物に治療上有効な量の
本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質、および
ｂ）少なくとも１種類の抗新生物薬
を投与することを含んでなる方法が提供される。
【０２９８】
１つの実施態様では、必要とする哺乳動物において癌を処置するための方法であって、そのような哺乳動物に治療上有効な量の
本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質、および
ｂ）少なくとも１種類の第２の免疫調節薬
を投与することを含んでなる方法が提供される。
【０２９９】
１つの実施態様では、前記第２の免疫調節薬は、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、および抗４１ＢＢ抗体、抗ＬＡＧ３抗体および抗ＴＩＭ３抗体の群から選択される。
【０３００】
１つの実施態様では、必要とする哺乳動物において癌を処置するための方法であって、そのような哺乳動物に治療上有効な量の
本発明のＩＣＯＳ結合タンパク質、および
ｂ）少なくとも１種類の免疫刺激薬
を投与することを含んでなる方法が提供される。
【０３０１】
１つの実施態様では、前記免疫刺激薬はＴＬＲ４アゴニストである。１つの実施態様では、前記免疫刺激薬はＡＧＰである。１つの態様では、前記免疫刺激薬は式Ｉの化合物である。１つの態様では、それは式１ａの化合物である。１つの態様では、前記免疫刺激薬は、ＣＲＸ−６０１、ＣＲＸ−５４７、ＣＲＸ−６０２、ＣＲＸ−５２７、およびＣＲＸ−５２６からなる群から選択される。
【実施例】
【０３０２】
以下の実施例は、本発明の種々の限定されない態様を説明する。
【０３０３】
実施例１：癌におけるＩＣＯＳ発現
一般に、固形腫瘍は、ＩＣＯＳが抗腫瘍免疫応答を媒介するという理論と一致して、低レベルの浸潤性ＩＣＯＳ＋Ｔ細胞を有すると思われる。種々の腫瘍組織学間のＩＣＯＳ発現分析は、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）およびその他のデータベースからの公開ｍＲＮＡ発現データセットを用いて作出した。表３は、いくらかの検出可能なレベルのＩＣＯＳ  ｍＲＮＡ発現を示した各組織学からの腫瘍の総体的パーセンテージを示す。この分析は、他の癌免疫療法アプローチに感受性があることが知られる腫瘍組織学（黒色腫、ＲＣＣ、ＮＳＣＬＣ）を、検出可能なＩＣＯＳ＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を有する腫瘍のパーセンテージが比較的高い（＞１０％）と識別し、一方、免疫原性が低いことが知られる腫瘍（前立腺、卵巣、および膵臓腫瘍）を、ＩＣＯＳ＋  ＴＩＬを有する腫瘍のパーセンテージが比較的低い（＜１０％）と識別する（表３）。興味深いことに、ウイルス感染および／または慢性炎症（Ｈ＆Ｎ、胃、食道、および子宮頸部）に関連することが知られる腫瘍種は、最高パーセンテージのＩＣＯＳ＋  ＴＩＬを示す腫瘍種の中にあった。これらのｍＲＮＡ発現分析から明らかでないものは、各個の腫瘍種においてＩＣＯＳを発現するＴＩＬの部分集団である。ＩＣＯＳは主として腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ上で発現される場合もあり、ＩＣＯＳ＋Ｔエフェクター細胞浸潤のレベルを示す場合もある。
【０３０４】
【表３】
2020079252.tif 000018
【０３０５】
種々の腫瘍種においてＴＩＬのどのサブセットがＩＣＯＳ発現に関連するかをより良く理解するために、原発性ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、前立腺癌、膵臓癌、卵巣癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）および黒色腫における免疫組織化学（ＩＨＣ）によるＩＣＯＳ発現の分析を行った（表４）。ｍＲＮＡ発現分析において見られたものと同様に、ＩＣＯＳ＋ＴＩＬの存在量は、それ以外のＣＤ４＋、ＣＤ８＋および／またはＦｏｘＰ３＋ＴＩＬは多数存在していた各腫瘍であっても比較的低かった。この場合にも、黒色腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）組織学は、いくらかのレベルの検出可能なＩＣＯＳ＋浸潤物を伴った最高パーセンテージの腫瘍を有した（表４、第２列）。結果として、前立腺、卵巣および膵臓腫瘍はほぼ無ＩＣＯＳ＋ＴＩＬを示した（表４）。これらの分析は、固形腫瘍が低い基礎レベルのＩＣＯＳ＋ＴＩＬを有し、この細胞集団の拡大および機能誘導から利益が得られ得ることを明らかに示す。原発性ヒト腫瘍を分析するためのフローサイトメトリーおよび二色免疫組織化学を用いた今後の研究は、どの特定のＴ細胞サブセットがＩＣＯＳを発現するかを決定する助けとなるであろう。
【０３０６】
【表４】
2020079252.tif 000019
【０３０７】
実施例２：ＩＣＯＳ抗体アゴニストのスクリーニング
原発性ヒトＰＢＭＣの単離
新鮮な血液を血液ドナーから取得し、フェノールレッド不含１０％ＲＰＭＩ１６４０培地で１：１希釈した。希釈血液をＵｎｉ−Ｓｅｐ  Ｍａｘ  ５０ｍｌコニカルチューブ内の密度媒体の上に重層し、室温にて２０分間４００ｘｇでブレーキをオフにして遠心分離した。得られた白色単核層（バフィーコート）を、１００μＭセルストレーナーを通して新しい５０ｍＬコニカルチューブ中へ注意深く抽出した。等容量のフェノールレッド不含１０％ＲＰＭＩ１６４０培地をバフィーコートに加え、室温にて１０分間、３００ｘｇで遠心分離した。細胞ペレットを１０ｍｌの赤血球溶解溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁させ、室温で５分間インキュベートした。細胞を培地で１回洗浄し、従前に記載したように遠心分離した。容量をフェノールレッド不含１０％ＲＰＭＩ１６４０培地で４０ｍｌとし、Ｖｉｃｅｌｌセルカウンターおよびバイアビリティアナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞を計数した。
【０３０８】
原発性ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔエフェクター細胞の単離
ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５細胞は、ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いる２工程の磁性ビーズに基づく単離手順によってＰＢＭＣからさらに精製した。まず、ＰＢＭＣ細胞を４℃で５分間ビオチン抗体カクテルとともにインキュベートし、次に、抗ビオチンマイクロビーズとともに１０分間インキュベートした。この工程は非ＣＤ４＋Ｔ細胞を標識するためのものであった。その後、細胞をＭｉｄｉＭＡＣＳセパレーターの磁場内でＬＤカラムに通した。流出液、すなわち、予め濃縮した非標識ＣＤ４＋細胞画分を回収し、４℃で１５分間ＣＤ２５マイクロビーズとともにインキュベートした。標識細胞をＭｉｎｉＭＡＣＳセパレーターの磁場内でＭＳカラムに通した。非標識ＣＤ４−ＣＤ２５−Ｔエフェクター細胞を含有するフロースルーを下流活性化アッセイのために回収した。
【０３０９】
血液からの原発性ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の直接単離
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、新鮮なヒト血液からヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エンリッチメントカクテル（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて直接単離した。ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エンリッチメントカクテル（５０μＬ／ｍＬ）を全血に加え、十分に混合した。室温で２０分のインキュベーション後、等容量のＰＢＳ＋２％ＦＢＳを穏やかに混合しながら加えた。この希釈サンプルを密度媒体の上に重層し、室温にて２０分間１２００ｘｇｆでブレーキをオフにして遠心分離した。密度媒体：血漿界面からの濃縮細胞を新しいコニカルチューブに注意深く注いだ。次に、赤血球を赤血球溶解バッファー（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で溶解させ、濃縮細胞をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を４０ｍｌのＰＢＳ＋２％ＦＢＳに再懸濁させ、Ｖｉ−Ｃｅｌｌセルカウンターで計数した。
【０３１０】
試験プロトコール
ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔエフェクター細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化アッセイ−結合アッセイ
組織培養処理が施されていない９６ウェル平底プレートを、１μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および種々の供試抗体を含有する、１００μｌ／ウェルのコーティングバッファー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で一晩コーティングした。翌日、これらのプレコーティングプレートを、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄した。ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔエフェクター細胞を単離し、記載のようにＣＦＳＥで標識し、これらのプレートに播種した。３７℃で２．５日インキュベートした後、細胞を採取し、増殖および活性化マーカーの発現に関してフローサイトメトリーで分析した。また、細胞培養上清も、メソ・スケール・ディスカバリー（ＭＳＤ）によるマルチプレックスサイトカイン測定のために回収した。
【０３１１】
ＣＦＳＥ増殖アッセイ
１５ｍｌのコニカルチューブにて、標識する細胞を１ｍｌの予温ＰＢＳに終濃度１Ｅ７細胞／ｍＬで再懸濁させた。１μｌの２ｍＭ  ＣＦＳＥ保存溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を直接細胞に加えた後、均一な標識を確保するためにすぐに旋回させた。室温で５分間インキュベートした後、１４ｍｌの氷冷細胞培養培地を加えることにより染色をクエンチした。標識された細胞を氷冷培地で３回洗浄した。細胞を計数し、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を添加したＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳで１Ｅ６細胞／ｍｌに調整し、抗ＣＤ３および供試抗体コーティングプレートに播種した。Ｔ細胞の活性化の後、細胞を採取し、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡで１回洗浄し、その後、フローサイトメトリー分析のために多色染色工程を施した。
【０３１２】
多色フローサイトメトリー
活性化Ｔ細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した。細胞をまず、販売者のプロトコールに従ってＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ細胞生体色素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。色素を洗い流した後、異なる色を結合した検出抗体を４℃で３０分間細胞とともにインキュベートした。染色細胞を氷冷ＦＡＣＳ染色バッファー（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ）で１回洗浄した後、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏまたはＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターに流した。サイトメーターの性能はＣｙｔｏｍｅｔｅｒ  Ｓｅｔｕｐ  ＆  Ｔｒａｃｋｉｎｇビーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて毎日確認し、ＰＭＴ電圧およびエリアスケーリングは非染色細胞に基づいて設定した。補正は、各蛍光色素を結合した検出抗体で個々に染色したＯｎｅＣｏｍｐまたはＵｌｔｒａＣｏｍｐビーズ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。
【０３１３】
ＭＳＤサイトカイン分析
組織培養上清のＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２およびＴＮＦ−αサイトカインレベルは、ＭＳＤヒトＶ−Ｐｌｅｘ特注キットを用いて決定した。まず、サンプルを希釈剤２で１：２００希釈した。キットマニュアルに従い、キャリブレーターもまた希釈剤２で調製した。希釈サンプルおよびキャリブレーターを黒色ＭＳＤプレートに加えた後、粘着性プレートシールで封止し、振盪しながら室温で２時間インキュベートした。希釈剤２で新たに調製した２５μＬの検出抗体溶液を各ウェルに加えた後、プレートを再封止し、振盪しながら室温でさらに２時間インキュベートした。これらのプレートを１５０μＬ／ウェルのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した後、新たに希釈した１５０μｌ／ウェルの２倍リードバッファーを加え、すぐにＭＥＳＯ  ＱｕｉｃｋＰｌｅｘリーダーで読み取った。データはＭＳＤ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウエアを用いて分析した。
【０３１４】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化アッセイ−結合型および可溶型
新たに単離したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８（３μｇ／ｍｌ）でコーティングした２４ウェルプレートにて４８時間、前刺激した。細胞を採取し、洗浄し、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地中、抗ＣＤ３Ｄｙｎａビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１：１比で混合した。次に、細胞／ビーズ混合物を非コーティングの（可溶形式の場合）またはＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥでコーティングした（結合形式の場合）９６ウェル平底プレートに１００ｋ／ウェルで播種した。可溶形式の場合には、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥを細胞の播種時にウェルに加えた。３７℃で３．５日インキュベートした後、ＭＳＤによるマルチプレックスサイトカイン測定のために細胞培養上清を回収した。
【０３１５】
可溶型ヒトＰＢＭＣｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化アッセイ
新たに単離したヒトＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）でコーティングした２４ウェルプレートにて４８時間、前刺激した。ＣＦＳＥ染色細胞を調製し、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地中、抗ＣＤ３Ｄｙｎａビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１：１比で混合した。次に、細胞／ビーズ混合物を、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体でプレコーティングした９６ウェルプレートに２００ｋ／ウェルで播種した。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥおよび対照抗体をそれらの可溶型でこれらのウェルに直接加えた。３７℃で３．５日インキュベートした後、ＭＳＤによるマルチプレックスサイトカイン測定のために細胞培養上清を回収し、フローサイトメトリーによる増殖およびマーカー発現分析のために細胞を採取した。
【０３１６】
データ分析
フローサイトメトリーデータ分析
フローデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ）により分析した。まず、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ細胞生体色素染色に基づき死細胞にゲートをかけた。ダブレットにはＦＳＣ−Ｈ：ＦＳＣ−Ｗ散布図でゲートをかけた。得られた生存単細胞をＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞などの異なるＴ細胞部分集団内の活性化マーカー発現に関して分析し、親集団のパーセンテージまたは中央蛍光強度（ＭＦＩ）として報告した。
【０３１７】
ＣＦＳＥ増殖分析
ＣＦＳＥデータもまたＦｌｏｗｊｏにより分析した。死細胞およびダブレットを除外した後、非活性化Ｔ細胞に基づいて「増殖細胞」ゲートをかけた。いずれの所与のサンプルでもこのゲートに入る細胞を増殖細胞として計数した。データは、増殖のパーセンテージとして報告した。
【０３１８】
ＦＡＣＳによる細胞枯渇分析
細胞枯渇は、ＦｌｏｗＪｏにより分析した。まず、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ細胞生体色素染色に基づいて生細胞ゲートを決定した。次に、ダブレットを従前に記載したようにゲートで除外した。細胞枯渇の指標として生ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞部分集団のパーセンテージを計算した。
【０３１９】
抗体用量応答曲線フィッティング分析
用量応答データをグラフパッド・プリズムソフトウエアにインポートし、対数スケールに変換した。データの曲線フィッティングおよびＥＣ５０値の生成のために、アゴニスト用量応答を様々な傾きモデルとともに使用した。フィッティング式を以下に挙げる。
Ｙ＝最小＋（最大−最小）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ）ヒルの傾き））
【０３２０】
結果
主要マウス抗ヒトＩＣＯＳ抗体の同定
１４のマウスｍＡｂをヒトおよびカニクイザルＩＣＯＳ結合およびアゴニスト活性に関してスクリーニングした。１２は再クローニング、配列決定、増幅、および機能研究に十分な量での精製が可能であった。ＢＩＡｃｏｒｅを用い、総てを結合特性に関して試験した。２つは、極めて弱い結合剤／非結合剤であることが判明した。１０の精製ｍＡｂを機能的「促進作用」分析によって試験した。複数の健康なヒトドナーで間の、Ｔ細胞の増殖およびＩＦＮ−γサイトカインの産生を誘導するそれらの能力に基づき、４つの最良のアゴニストｍＡｂ（以下の表で５４２２．２、２７９．１、３１４．８および８８．２と呼称）が、ヒトＩｇＧ１キメラとして選択および作製された。３１４．８、８８．２、９２．１７、１４５．１、および５３．３のＣＤＲ配列は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５７３５（ＷＯ２０１２／１３１００４）に他のＩＣＯＳ  ｍＡｂとともに示されている。
【０３２１】
クローン８８．２の重鎖可変領域は配列番号１３として下記に示される。
【化１５】
2020079252.tif 000020
【０３２２】
クローン８８．２の軽鎖可変領域は配列番号１４として下記に示される。
【化１６】
2020079252.tif 000021
【０３２３】
【表５】
2020079252.tif 000022
【０３２４】
８つの最良のＩＣＯＳ結合剤を、マウスＩｇＧ１およびＥＰＲ７１１４対照に対して設計された用量漸増におけるアッセイに基づき、細胞を用い、ＩＦＮ−γ産生およびＴ細胞増殖に関して試験した。これらのアッセイに基づき、４２２．２と呼称されるクローンがヒト化のために選択された。図１および２を参照。
【０３２５】
実施例３  抗体のヒト化
試験プロトコール
ｍＲＮＡからの抗体可変遺伝子の回収およびキメラＦｃ野生型抗体遺伝子の作出
全ＲＮＡを４２２．２ハイブリドーマ細胞ペレットから精製し、逆転写させてｃＤＮＡを作製し、それからＰＣＲによりおよそ４００ｂｐの可変遺伝子産物が単離され、アガロースゲル電気泳動により精製された。
【０３２６】
精製された可変領域フラグメントを、ヒトＩｇＧ１定常領域またはヒトκ定常領域を含有するｐＴＴ５ベクターにクローニングし、ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。コロニーを採取し、これを用いてアンピシリンを含有するＬ−ブロスに播種した。培養からＱｕｉｃｋＬｙｓｅ  ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐキットを用いてプラスミドＤＮＡを単離した。可変重鎖および軽鎖遺伝子の配列を決定し、可変重鎖および軽鎖遺伝子配列を同定するための情報科学によって配列データをアラインした。
【０３２７】
コドンが最適化されたキメラ４２２．２抗体のクローニング
成熟マウス可変領域タンパク質配列を逆翻訳してＤＮＡを得た後、コドンの最適化を行った。次に、そのＶＨおよびＶＬ配列を、各末端に好ましい５つのプライム非翻訳領域および好ましいクローニング部位を含むように改変した。適合ＶＨ配列は、ＰＣＲに基づく戦略およびオーバーラッピングオリゴヌクレオチドを用いてｄｅ  ｎｏｖｏ構築し、その後、ｐＴＴベクター中に存在するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ野生型またはＦｃ無効型ｈＩｇＧ１（Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ）またはヒンジ安定化ｈＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ）（ＩｇＧ４ＰＥ）にグラフトした。適合ＶＬ配列は、ＰＣＲに基づく戦略およびオーバーラッピングオリゴヌクレオチドを用いてｄｅ  ｎｏｖｏ構築し、その後、ｐＴＴ５ベクター中に存在するκ定常領域にグラフトした。
【０３２８】
得られたｐＴＴプラスミドをＨＥＫトランスフェクションで使用してキメラ抗体を作製した。
【０３２９】
４２２．２の可変ドメインのヒト化
ヒト可変（Ｖ）遺伝子鋳型を、適当なインハウス・ヒト生殖細胞系重鎖および軽鎖データベースを、ＢＬＡＳＴＰを用いてＣＤＲマスク４２２．２Ｖ領域で検索することにより、４２２．２のヒト化に関して選択した。上位ＢＬＡＳＴＰヒットから、４２２．２ヒト化のためのＶ遺伝子フレームワーク鋳型としてＩＧＨＶ１−６９およびＩＧＫＶ３−１１を選択した。ＩＧＨＪ６およびＩＧＫＪ２ヒト生殖細胞系連結（Ｊ）遺伝子を、４２２．２のヒト化のために選択した。
【０３３０】
復帰変異（特定のヒトフレームワーク残基をマウス残基に変化させるために作出される変異）の選択を補助するために、選択されたヒト生殖細胞系遺伝子と４２２．２配列の間の残基の違いを同定した。６つのヒト化ＶＨ変異体および６つのヒト化ＶＬ変異体が設計され、コドンを最適化し、次いで、好ましい５’および３’伸長を含むように改変した。適合可変領域配列を、ＰＣＲに基づく戦略およびオーバーラッピングオリゴヌクレオチドを用いてｄｅ  ｎｏｖｏ構築し、その後、それぞれｐＴＴベクターにクローニングした。
【０３３１】
得られたｐＴＴプラスミドを、ヒト化抗体を生産するためにＨＥＫトランスフェクションで使用した。ＨＥＫ２９３６Ｅ懸濁細胞を計数し、０．０５％ジェネティシンを添加した、およびいくつかの試験のためには１％プルロニックＦ６８を添加したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ発現培地２９３を用い、１．５×１０６細胞／ｍＬ〜２×１０６細胞／ｍＬに希釈した。ＤＮＡおよびトランスフェクション試薬（Ｇｅｍｉｎｉまたは２９３−Ｆｅｃｔｉｎ）をＯｐｔｉＭＥＭに加え、穏やかにホモジナイズした後、室温で２０〜３０分間インキュベートした。次に、ＤＮＡ−脂質複合体を細胞懸濁液と合わせ、トランスフェクト細胞を３７℃、５％ＣＯ２、１２５ｒｐｍでインキュベートした。トランスフェクションによっては、各トランスフェクションに、トランスフェクション２４〜４８時間後にトリプトンフィード（１％プルロニックＦ６８および２０％ｗ／ｖカゼイントリプトンを添加したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ発現培地２９３）を加えた。トランスフェクト細胞懸濁液を５〜８日間、生細胞が６０％を下回るまでインキュベートした後、遠心分離した（構築物による）。上清を採取し、濾過した。
【０３３２】
抗体の捕捉を可能とする１ｍＬ  ＨｉＴｒａｐプロテインＡ  ＨＰカラムに上清を通し、このカラムを１０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、５ｍＬのＩｇＧ  Ｅｌｕｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、２１００９）で溶出することにより抗体を精製した。精製されたタンパク質のバッファーを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔｓ（３０Ｋカットオフ）を用いてＰＢＳに交換し、Ｎａｎｄｒｏｐ分光光度計で定量した。
【０３３３】
結果
構築された発現プラスミド
ハイブリドーマクローン４２２．２のマウス抗体可変遺伝子配列の再生に成功し、それらの配列をそれぞれ以下の配列番号１９および２０ならびに図８に示す。
【０３３４】
422 HC
【化１７】
2020079252.tif 000023
422 LC
【化１８】
2020079252.tif 000024
【０３３５】
再生された可変領域を選択したｐＴＴ５ベクターにクローニングしたところ、ｈＩｇＧ１  Ｆｃ野生型、ｈＩｇＧ１  Ｆｃ無効型（Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ、ＥＵナンバリング）またはｈＩｇＧ４  ＰＥ（Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ、ＥＵナンバリング）上に４２２．２のキメラ軽鎖配列とキメラ重鎖配列をコードするプラスミドが作出された。これらのキメラ抗体を、クローニングされたマウスＶ領域の機能性を確認するため、および最も好適なアイソタイプを特定するために使用した。
【０３３６】
４２２．２の種々のヒト化変異体の重鎖および軽鎖をコードするｐＴＴ哺乳動物発現プラスミドの構築が首尾良く行われた。
【０３３７】
Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの発現、精製および同定
Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの成熟タンパク質配列は、付加的標識とともに図９に含まれていた。Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ重鎖および軽鎖のコード領域のＤＮＡ配列は、図１０および１１に含まれていた。
【０３３８】
実施例４：Ｈ２Ｌ５の機能的分析
Ｆｃ受容体結合
ヒト化抗体Ｈ２Ｌ５は、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）のアーム交換を防ぐため、ヒトＩｇＧ１アイソタイプから、変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ（ＥＵナンバリング）を組み込んだ改変型ヒトＩｇＧ４アイソタイプへと改変した。ヒトＩｇＧ４ＰＥはｍＡｂの、活性化しているＦｃγ受容体およびＣ１ｑへの結合を低下させ、従って、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）によりＩＣＯＳ陽性細胞の枯渇を誘導するｍＡｂの能力を低下させるので、ヒトＩｇＧ１よりも優ると選択された。加えて、ヒトＩｇＧ４ＰＥ（Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ）は、ＦｃγＲＩＩｂ（阻害性Ｆｃγ受容体）への結合を保持する。ＦｃγＲＩＩｂとの相互作用は、抗体架橋を可能とすることによるＩＣＯＳ抗体のアゴニスト活性に重要であり得る。ＦｃγＲＩＩｂとの相互作用は、ＴＮＦ−αファミリー受容体ならびにＣＤ２８を標的とする他の免疫調節抗体のアゴニスト活性に重要であることが示されている(Bartholomaeus P et al., “Cell contact-dependent priming and Fc interaction with CD32+ immune cells contribute to the TGN1412-triggered cytokine response.” J. Immunol., 192(5); 2091-8 (2014))。
【０３３９】
さらに、ヒトＩｇＧ４ＰＥは、ｍＡｂの、活性化しているＦｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩａ）およびＣ１ｑへの結合を低下させ、従って、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）によりＩＣＯＳ陽性細胞の枯渇を誘導するｍＡｂの能力を低下させることも示されている。加えて、ヒトＩｇＧ４ＰＥ（Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ）は、ＦｃγＲＩＩｂ（阻害性Ｆｃγ受容体）への結合を保持する（表６）。
【０３４０】
以下の表６は、ｈＩｇＧ１またはｈＩｇＧ４ＰＥ抗体のいずれかとしての主要Ｈ２Ｌ５の、ヒトＦｃγ受容体に対する代表的結合親和性を示す。
【０３４１】
【表６】
2020079252.tif 000025
【０３４２】
試験プロトコール
４２２．２ヒト化変異体の機能評価
４つのＩＣＯＳアゴニスト抗体をヒト化するために、マウスＶ領域とヒトＩｇＧ１  Ｆｃ部分の融合物であるマウス−ヒトキメラを作出した。これら４つのキメラ抗体を、プレート結合型としてのヒト全ＰＢＭＣ活性化アッセイで試験した。抗ＩＣＯＳキメラ４２２．２は、結合型ＰＢＭＣ活性化アッセイで最良のアゴニスト活性を示した。結合データおよび生物物理学的特性と合わせて、４２２．２クローンをヒト化のために選択した。４つのヒト化４２２．２変異体をＩＣＯＳ結合および生物物理学的特徴に基づいて選択し（４２２．２  Ｈ２Ｌ０、Ｈ２Ｌ５、Ｈ５Ｌ０およびＨ５Ｌ５）、結合型ヒトＰＢＭＣ活性化アッセイで試験した。Ｈ２Ｌ５変異体は、サイトカイン産生により評価したところ、他の変異体と比較して、同等またはより良好なＴ細胞の活性化を示した（図３）。
【０３４３】
Ｈ５変異体の重鎖（ＶＨ）可変領域および成熟重鎖を以下にそれぞれ配列番号１５および１６として表す。
【０３４４】
H5VH
【化１９】
2020079252.tif 000026
成熟H5重鎖
【化２０】
2020079252.tif 000027
【０３４５】
Ｌ０変異体の軽鎖（ＶＬ）可変領域および成熟軽鎖を以下にそれぞれ配列番号１７および１８として表す。
【０３４６】
L0 VL
【化２１】
2020079252.tif 000028
成熟L0軽鎖
【化２２】
2020079252.tif 000029
【０３４７】
アイソタイプとしてのＩｇＧ４［ＰＥ］の選択
次に、４２２  Ｈ２Ｌ５  ＩｇＧ１を、可溶型の種々の全ＰＢＭＣ活性化アッセイで試験した。この可溶形式は、全ＰＢＭＣアッセイが同じウェルにリンパ球、単球および他の免疫細胞を含有するので、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件により関連すると思われる。しかしながら、４２２  Ｈ２Ｌ５  ＩｇＧ１  ｍＡｂは、Ｔ細胞枯渇を思わせるＴ細胞集団の生存率の低下を一貫して示した。この結果は、１１名の健康なドナーにおいて様々な程度で見られ、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりもＣＤ４＋Ｔ細胞で顕著であった。対照的に、４２２  Ｈ２Ｌ５抗体は、ＩｇＧ４［ＰＥ］またはＦｃ無効型アイソタイプのいずれかとして発現された場合、Ｔ細胞生存率に有意な低下を示さず、生存率の低下がＦｃγＲに媒介される抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）によるものであった可能性があることを示唆した（図４）。
【０３４８】
ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの用量応答
Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥのＴ細胞活性化効果を定量するために、ヒト原発性ＣＤ４＋Ｔ細胞を、まず、プレート結合型抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）／抗ＣＤ２８（３μｇ／ｍｌ）により４８時間前刺激してＴエフェクター細胞集団の表面にＩＣＯＳ受容体のレベルを誘導し、次に、抗ＣＤ３ＤｙｎａビーズおよびＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥで再刺激した。前刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３Ｄｙｎａビーズの存在下、一連の濃度の結合型または可溶型Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥで処理することにより、１０点用量応答曲線を作成した。結果は、結合型および可溶型Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの両方が、２名の別の健康なヒトドナーで用量依存的にＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αサイトカインの産生を増大させたことを示した（図５）。用量応答曲線フィッティング分析を行ってＥＣ５０値を得た。興味深いことに、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ処理は、Ｔ細胞培養の上清に可溶型タンパク質として加える場合と対照的に、抗体がプレートに固定された場合に有意に大きな規模のサイトカイン誘導をもたらした。
【０３４９】
可溶型ヒトＰＢＭＣ活性化アッセイにおけるＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの機能試験
全ヒトＰＢＭＣｅｘ  ｖｉｖｏ培養でのＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの機能を試験するために、健康なヒトドナーからのＰＢＭＣを、プレート結合型抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８とともに４８時間調製し、次いで、抗ＣＤ３  Ｄｙｎａビーズの存在下（ビーズ：細胞＝１：１比）で３．５日間、可溶型Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ処理を行った。サイトカイン産生およびＴ細胞グランザイムＢ発現を、Ｔ細胞機能の読み出しとして調べた。３名のドナーからの結果を図６にまとめたが、そこからＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥが健康ヒトドナーからの活性化ＰＢＭＣにおいて増殖、サイトカイン産生および細胞傷害能の増強を誘導することを示唆する証拠が得られる（図６）。
【０３５０】
前刺激ヒトＰＢＭＣに対するＩＣＯＳ  ｍＡｂ活性
ＰＢＭＣがプレート結合型の抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３、１μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、３μｇ／ｍｌ）により４８時間前刺激されるＰＢＭＣ前刺激アッセイでＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの活性を評価した。次に、最適な前刺激条件を特定するために、ヒトＣＤ３  ＤｙｎａビーズおよびＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を種々のビーズ：細胞比で用いてＰＢＭＣを前刺激した。４８時間の前刺激の後、細胞を採取し、ビーズを磁気的に除去した後、可溶型ＩＣＯＳ  ｍＡｂの存在下または不在下で、抗ＣＤ３  Ｄｙｎａビーズ（ビーズ：細胞比＝１：１）で再刺激した。Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ  ＩＣＯＳアゴニストｍＡｂは、供試した総ての前刺激条件でアイソタイプ対照に比べてＩＦＮγの誘導をもたらしたが、ＩＦＮγ産生の規模は前刺激の強度と逆相関した。
【０３５１】
実施例５−Ｔ細胞活性化マーカー
方法
機能的エンドポイントにおける濃度依存的変化は、健康なヒトＰＢＭＣを０．６μｇ／ｍＬでの抗ＣＤ３抗体処理と同時に０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの範囲の濃度の固定化Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥで処理することによって評価した。細胞表面活性化マーカーＣＤ６９、ＯＸ４０およびＣＤ２５の発現の変化をフローサイトメトリーにより評価し、Ｔ細胞活性化の尺度とした。Ｔ細胞の増殖は、Ｋｉ６７核染色の変化によって測定した。ＣＤ３会合の存在下でＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ処理に応答した種々のＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７サイトカインのレベルの変化を、ＭＳＤプラットフォームで評価した。初期サイトカイン変化ならびに後の時点で主として着目される増殖変化の両方の捕捉を確保するために、処理後２４時間および４８時間の時点を選択した。
【０３５２】
試験準備
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
液体ナトリウムヘパリン（Ｓａｇｅｎｔ終濃度１０ＩＵ／ｍＬ）でコーティングしたシリンジを用い、健康なドナーから全血を採取し、次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１：１希釈した。希釈血液（３５ｍＬ）を１５ｍＬフィコール密度勾配媒体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の上に重層し、室温にて２０分間１２００ｘｇでブレーキを用いずに遠心分離した。白色の単核細胞層を新しい５０ｍｌチューブに注意深く移した。このチューブに等容量のＰＢＳを加え、室温にて５分間４００ｘｇで遠心分離した。ＰＢＭＣをＰＢＳで１回洗浄し、従前に記載されたように遠心分離した。ＰＢＭＣを５０ｍＬ  ＡＩＭ−Ｖ培地に再懸濁させた。Ｖｉ−Ｃｅｌｌセルカウンターおよびバイアビリティアナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞を計数した。
【０３５３】
抗体コーティング
抗ヒトＣＤ３抗体を終濃度０．６μｇ／ｍＬとなるようにコーティングバッファーで希釈した。１００μＬの希釈抗体を９６ウェル平底プレートに一晩４℃でコーティングした。翌日、１０．１ｍｇ  Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥおよび７．９ｍｇ  抗ＲＳＶ  ＩｇＧ４  ＰＥアイソタイプ対照抗体の保存溶液をコーティングバッファーで１：２連続希釈して１００〜０．１μｇ／ｍＬの範囲の最終抗体濃度を得た。１００μＬの希釈抗体を室温で４時間、抗ＣＤ３コーティングプレートにコーティングした。
【０３５４】
試験プロトコール
ヒトＰＢＭＣ活性化アッセイ
Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥを、抗ＣＤ３抗体を介したＴＣＲ会合とＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥによるＩＣＯＳの補助刺激が同時に起こるヒトＰＢＭＣ活性化アッセイで試験し、活性化効果を活性化後２４時間および４８時間にモニタリングした。この試験を４名の異なるドナーからの血液を用いて４回繰り返した（ｎ＝４）。ＡＩＭ−Ｖ培地中、２００μＬのＰＢＭＣ（１×１０６細胞／ｍＬ）を、種々の濃度のＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥまたはＩｇＧ４アイソタイプ対照を含む抗ＣＤ３抗体コーティングウェルに加えた。各アッセイ条件について３回のテクニカル反復を含めた。ＰＢＭＣを３７℃および５％ＣＯ２で、上記に示される種々の時間培養した。２４時間および４８時間の時点で上清を回収した後、ＭＳＤプラットフォームに分泌されるサイトカインの分析のために−８０℃で保存した。２４時間および４８時間の両時点で細胞を９６ディープウェルプレートに移し、１ｍＬ  ＦＡＣＳ染色バッファーで洗浄し、蛍光団を結合した抗体またはアイソタイプ対照で染色した。
【０３５５】
細胞表面染色
細胞をまず、ＰＢＳで予め１：１０００希釈した固定可能な生体色素ｅＦｌｕｏｒ  ５０６で４℃、暗所にて３０分間染色した。細胞を洗浄した後、種々の蛍光団と結合した、細胞表面マーカーに対する検出抗体ともに氷上にて３０分間インキュベートした。細胞表面抗体で染色した後、内部移行マーカーに関して染色されないサンプルを氷冷ＦＡＣＳ染色バッファーで１回洗浄した後、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターに流した。
【０３５６】
サイトメーター性能は、サイトメーターセットアップおよびトラッキングビーズを用いて毎日適切に評価した。補正は、各蛍光色素を結合した検出抗体で個々に染色したＡｂＣ抗マウスビーズキットを用いて行った。サンプルを流し、適切な補正設定の後に取得したデータを上述のビーズの混合物を用いて確認した。
【０３５７】
Ｆｏｘｐ３およびＫｉ６７に対する細胞内染色
細胞表面染色の後、細胞内マーカーの染色のために細胞を固定し、透過処理を施した。転写因子バッファーセットを用い、これを希釈バッファーで１：３希釈することにより、固定／透過バッファーを調製した。透過洗浄バッファーは、５倍Ｐｅｒｍ／洗浄バッファー保存液を脱イオン水で希釈することにより調製した。１ｍＬの固定／透過バッファーを各サンプルに加え、これらのプレートをすぐにシェーカー上で旋回させた。これらのプレートを暗所、４℃で４５分間インキュベートした。遠心分離後、全２回の洗浄に関して、１ｍＬの透過／洗浄バッファーを加え、これらのプレートを混合し、遠心分離した。内部移行カクテルを、マーカー抗体を用いて調製した。１００μＬの内部移行抗体を適当なサンプルに加え、これらのプレートを暗所、４℃で３０分間インキュベートした。サンプルを１ｍＬの透過洗浄バッファーで２回洗浄し、２５０μＬの流動バッファーに再懸濁させ、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターに流した。
【０３５８】
ヒト特注９プレックスサイトカインアッセイ
サイトカインレベルを、ＭＳＤヒト特注９プレックスキットを用いて測定した。サンプルおよびキャリブレーターを希釈剤４３で希釈した。サンプルを９プレックスアッセイの場合には１：１０希釈、記載のＩＦＮγアッセイの場合には１：２００希釈し、０．２５０μＬの希釈剤を２つの各キャリブレーターパネルに加えた。旋回させた後、キャリブレーターを氷上で少なくとも５分間インキュベートした。２００μＬの各キャリブレーターパネルを４００μＬの希釈剤に加えてキャリブレーターの最高濃度とし、１：４連続希釈を用いて、６つのさらなるキャリブレーター希釈液を調製した。希釈剤４３をプレートバックグラウンドとして使用した。５０μＬの希釈サンプル（３反復）およびキャリブレーター（２反復）をＭＳＤプレートに加えた。プレートを封止し、室温で振盪しながら２時間インキュベートした。プレートをキットの希釈ＭＳＤ洗浄バッファー１５０μＬで３回洗浄した。各プレートについて、９種類の各検出抗体６０μＬを希釈剤３で３ｍＬとしたものを合わせることにより、検出抗体溶液を調製した。２５μＬの検出抗体溶液を加えた後、これらのプレートを封止し、室温、暗所で振盪しながら２時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄した。１５０μＬの２倍リードバッファーをこれらのプレートに加え、それらをＱｕｉｃｋＰｌｅｘで読み取った。
【０３５９】
ヒトＩＦＮγサイトカインアッセイ
サンプルおよびキャリブレーターを希釈剤２で希釈した。１ｍＬの希釈剤をキャリブレーターに加えた。旋回した後、キャリブレーターを氷上で５分間インキュベートした。これをキャリブレーター１とする。１：４連続希釈を用い、６つのさらなるキャリブレーター希釈液を調製した。希釈剤２をプレートバックグラウンドとして使用した。５０μＬの希釈サンプル（３反復）およびキャリブレーター（２反復）をＭＳＤプレートに加えた。プレートを封止し、室温で２時間振盪しながらインキュベートした。プレートをキットの希釈ＭＳＤ洗浄バッファー１５０μＬで３回洗浄した。検出抗体溶液を希釈剤３で調製した。各プレートについて、合計３ｍＬの検出試薬に対して６０μＬの各検出抗体を希釈剤に加えた。２５μＬの検出抗体を加えた後、これらのプレートを封止し、室温、暗所で、振盪しながら２時間インキュベートした。プレートを３回洗浄した。リードバッファーをこれらのプレートに加え、それらをＱｕｉｃｋＰｌｅｘで読み取った。
【０３６０】
データ分析
サイトカインおよびフローサイトメトリーデータの分析
ＭＳＤサイトカインアッセイの結果を、ＭＳＤディスカバリー・ワークベンチソフトウエア、バージョン４．０（Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ）、マイクロソフト・エクセル、およびグラフパッド・プリズムを用いて分析した。フローサイトメトリーデータをＤＩＶＡにより分析し、グラフパッド・プリズムソフトウエアに数値をプロットした。
【０３６１】
抗体用量応答曲線フィッティング分析
用量応答データをグラフパッド・プリズムソフトウエアにインポートし、対数スケールに変換した。データの分析およびＥＣ５０値の生成のために、アゴニスト用量応答を様々な傾きモデルとともに使用した。フィッティング式を以下に挙げる。
Ｙ＝最小＋（最大−最小）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ）ヒルの傾き））
【０３６２】
統計分析
増殖試験におけるＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ値とアイソタイプ抗体対照値の間の違いの統計的有意性を２対応のスチューデントのｔ検定によって分析した。
【０３６３】
結果
Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥによるサイトカイン変化の評価
ＰＢＭＣを抗ＣＤ３の存在下、固定化Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥで処理すると、ＩＦＮγ、ＴＮＦαなどのＴｈ１サイトカイン、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−６およびＩＬ−１０、ならびにＴｈ１７サイトカインであるＩＬ−１７ａの分泌が濃度依存的に様々な程度で誘導された。ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３などの毒呈した他のサイトカインも、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ刺激に対して、程度は低いが濃度依存的応答を示した。４名の異なるドナーからの結果を表７にまとめる。
【０３６４】
Ｔ細胞活性化の細胞表面マーカーに対するＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ活性のフローサイトメトリーによる機能評価
不活性ヒトＰＢＭＣ（ｎ＝４ドナー）における同時ＣＤ３刺激を伴うＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ処理は、Ｔ細胞活性化マーカーに有意な変化を誘導した（表７および８））。ヒトＩｇＧ４同位体対照サンプルに比べてＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ処理サンプルで、ＣＤ２５およびＯＸ４０陽性ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞のロバストな増加が見られた。ＣＤ６９陽性ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞のパーセントも２４時間および４８時間の時点で濃度依存的に増加した。
【０３６５】
Ｔ細胞増殖に対するＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの効果の特性評価
同時的ＣＤ３の活性化を伴う固定化Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ処理は、細胞内Ｋｉ６７染色により測定したところ、ＣＤ４およびＣＤ８の両Ｔ細胞の増殖に濃度依存的増加をもたらした（ｎ＝６ドナー）（表８）。Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥはまた、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の合計で見られたものよりも程度は低いが、濃度依存的にＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の増殖を増大させた。Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥによるＴ細胞増殖の促進は、４８時間の時点でのみ見られた。制御性Ｔ細胞の増殖の増大は有意ではなかったが、ＣＤ４＋細胞の増殖の濃度依存的増加（Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥが０．４μｇ／ｍＬより大きい濃度ではｐ＜０．０５）およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の濃度依存的増加（０．２〜１．６μｇ／ｍＬの間の濃度ではｐ＜０．０５）は有意であった（表７参照）。
【０３６６】
【表７】
2020079252.tif 000030
【０３６７】
【表８】
2020079252.tif 000031
【０３６８】
考察
ＩＣＯＳがＴ細胞の活性化とおよびＴｈ１およびＴｈ２サイトカインの両方の誘導に重要であることが十分に確認される。本研究では、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ（抗ＩＣＯＳアゴニスト抗体）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性が、Ｔ細胞の活性化およびサイトカインの誘導の種々の尺度を用いて実証された。測定した総てのＴ細胞活性化マーカー、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体α鎖）、ＣＤ６９（初期活性化マーカー）およびＯＸ−４０（補助刺激マーカー）は、ＣＤ３刺激とともにＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥで処理した際にアップレギュレートされた。モニタリングした活性化マーカーの中で、ＣＤ６９およびＯＸ４０を発現するＴ細胞のパーセントはＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ処理によって強く増大された。ＣＤ６９は初期活性化マーカーであり、ゆえに、その効果は２４時間サンプルにおいて優勢である。もう１つの重要なＴ細胞活性化マーカーであるＣＤ２５は、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥで処理した際に両時点で増加し、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥがＴ細胞の活性化の維持において重要な役割を果たすことを示唆する。Ｋｉ６７は、細胞増殖に関連する核タンパク質である。Ｋｉ６７細胞内染色を伴うフローサイトメトリーデータは、固定化Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥがＴＣＲ会合の状況で、ＣＤ４およびＣＤ８の両Ｔ細胞の増殖を有意に促進したことを示した。制御性Ｔ細胞の増殖もＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥによって増強されたが、その変化は統計的に有意でなかった。
【０３６９】
ヒトＴｈ１７細胞は、抗腫瘍免疫の調節に重要な役者である[Nunez, S., et al., T helper type 17 cells contribute to anti-tumour immunity and promote the recruitment of T helper type 1 cells to the tumour. Immunology 2013; 139: 61-71]。研究では、ＩＣＯＳはヒトＴｈ１７の発達および機能に関与することが示されている[Kimura, A., et al., Regulator of Treg/Th17 balance. Eur. J. Immunol. 2010; 40: 1830-1835; Paulos CM et al.  The inducible costimulator (ICOS) is critical for the development of human Th17 cells. Sci Transl Med. (2010) 2(55); 55ra78; Nelson, M. H., et al.  The inducible costimulator augments Tc17 cell responses to self and tumor tissue. J Immunol, 2015; 194: 1737-1747]。Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの現在の機能評価では、炎症および免疫応答に関連するサイトカインの大多数は、抗ＣＤ３およびＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ刺激の後に細胞培養上清で測定された。Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥは、ヒトＰＢＭＣにおいてＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α、ならびにＴｈ１７サイトカインであるＩＬ−１７ａの分泌を強く誘導し、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥが抗腫瘍応答において重要な役割を果たす可能性があることを示唆する。ＩＬ−６はＴＧＦ−βとともに、ナイーブＴ細胞からＴｈ１７細胞の発達の誘導に重要なサイトカインである。対照的に、ＩＬ−６は、ＴＧＦ−βにより誘導されるＴｒｅｇの分化を阻害する[Kimura, A., 2010; Korn, T., et al., IL-6 controls Th17 immunity in vivo by inhibiting the conversion of conventional T cells into Foxp3+ regulatory T cells. PNAS, 2008; 105: 18460-18465]。本研究では、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥは、ＩＬ−６の分泌を増加させ、ＩＬ−６はＴｈ１７細胞の発達をさらに促進し得ることが判明した。ＣＤ２８およびＴＮＦ受容体ファミリーメンバーなどのＴ細胞受容体のアゴニスト抗体は、ベル型の用量応答曲線を描くことが示されている[White, A. L., et al., Conformation of the Human Immunoglobulin G2 Hinge Imparts Superagonistic Properties to Immunostimulatory Anticancer Antibodies. Cancer Cell, 2015, 27: 138-148; Luhder, F., et al, Topological Requirements and Signaling Properties of T Cellactivating, Anti-CD28 Antibody Superagonists. J. Exp. Med. 2003: 955-966; Stebbings, R., et al., “Cytokine Storm” in the Phase I Trial of Monoclonal Antibody TGN1412: Better Understanding the Causes to Improve PreClinical Testing of Immunotherapeutics J. Immunol., 2007, 179: 3325-3331; Rogers PR and Croft M, CD28, Ox-40, LFA-1, and CD4 Modulation of Th1/Th2 Differentiation Is Directly Dependent on the Dose of Antigen. J Immunol 2000 164:2955-2963; doi:10.4049/jimmunol.164.6.2955]。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥもまた、同様の双曲線的機能応答
曲線を示す。この情報は、使用する抗体の、最適な薬力学的応答のために最良の用量範囲を確かめる上で重要な成分である。
【０３７０】
全体的に見れば、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥは、ＣＤ３刺激を伴って、Ｔ細胞補助刺激受容体の強力なアクチベーターとしてのその役割に沿って、Ｔ細胞の活性化、増殖および炎症性サイトカインの誘導を増強することが示された。
【０３７１】
実施例６：抗ＩＣＯＳ抗体の結合
ヒト化プロトコール（実施例３）から３６の重鎖および軽鎖変異体が生成され、これらをヒトおよびカニクイザルＩＣＯＳとの結合に関してスクリーニングするととともに、それらがヒトＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４と結合しなかったことも確認した。Ｈ２Ｌ５変異体は、最小数の復帰変異を含みつつヒトおよびカニクイザルＩＣＯＳに対して高い親和性（それぞれ１．３４および０．９５ｎＭ）を有するとして同定された。
【０３７２】
Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥはヒトＩＣＯＳに対して１．３ｎＭの親和性を有するので、４２２  Ｈ２Ｌ５のアイソタイプの、ＩｇＧ１からＩｇＧ４ＰＥへの変化はこの抗体の抗原結合に影響を及ぼさない。Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥによるＩＣＯＳ／ＩＣＯＳ−Ｌ結合の濃度に基づく阻害を図７に示す。
【０３７３】
試験プロトコール
ヒトＩＣＯＳに対するＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの結合
ヒト化Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ抗体の親和性の結合動態を、表面に捕捉したＣＭ５チップ抗ＩＣＯＳ  Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥのＦｃ２上でＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００抗ヒトＩｇＧを用いて決定した。ウサギＦｃの非特異的結合を防ぐために、抗ヒトＩｇＧ表面を０．１ｍｇ／ｍＬ  ｈＩｇＧ１で遮断した。ヒトおよびカニクイザルＩＣＯＳ（ウサギＦｃ）を２５６ｎＭ、６４ｎＭ、１６ｎＭ、４ｎＭおよび１ｎＭで捕捉抗体に通した。バッファー単独を二重参照結合曲線のために使用した。表面を再生するためにＭｇＣｌ２を使用した。流動は２５℃で行った。Ｔ２００評価ソフトウエアを用いて１：１モデルにデータを当てはめた。抗体濃度：２．５μｇ／ｍＬ
【０３７４】
結果
ヒトおよびカニクイザルＩＣＯＳに対するＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの結合
ヒト化Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ抗体の結合動態親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００を用いて決定した。
【０３７５】
Ｔ２００データ分析ソフトウエアを用い、ＩＣＯＳ結合データを１：１動態モデルに当てはめた。
【０３７６】
Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの、ヒトＩＣＯＳに対する結合親和性は１．３４ｎＭであり、カニクイザルＩＣＯＳに対する結合親和性は０．９５ｎＭである（表９参照）。これらの値は同等であり、予想通り、分子のＦｃ領域に対する変化は、ＩＣＯＳ抗原に対する結合に影響を及ぼさなかったことを示す。
【０３７７】
表９は、ヒトおよびカニクイザルＩＣＯＳに対するヒト化４２２（Ｈ２Ｌ５）ＩｇＧ４ＰＥのＫａ／Ｋｄ／ＫＤを示す。
【０３７８】
【表９】
2020079252.tif 000032
【０３７９】
考察
実施例１に示されるように、マウスクローン４２２−２が主要抗ヒトＩＣＯＳマウス抗体として同定された。この抗体のヒト化により３６の重鎖および軽鎖変異体が得られ、これらをヒトおよびカニクイザルＩＣＯＳとの結合に関してスクリーニングするととともに、それらがヒトＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４と結合しなかったことも確認した。Ｈ２Ｌ５変異体は、最小数の復帰変異を含みつつヒトおよびカニクイザルＩＣＯＳに対して高い親和性（それぞれ１．３４および０．９５ｎＭ）を有するとして同定された。
【０３８０】
ＩｇＧ１からＩｇＧ４ＰＥへのアイソタイプの変更は、抗体のＩＣＯＳへの結合に影響を及ぼさない。
【０３８１】
実施例７：ヒト活性化Ｔ細胞に対するＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの結合
方法
試験準備
ＣＤ３ネガティブ単離：
ＣＤ３＋Ｔ細胞は幹細胞Ｒｏｓｅｔｔｅ  ＳｅｐヒトＴ細胞濃縮キットからネガティング単離した：Ｒｏｓｅｔｔｅ  ＳｅｐヒトＴ細胞濃縮：  １００ｍＬの新鮮な全血を、液体ナトリウムヘパリン（Ｓａｇｅｎｔｔ終濃度１０ＩＵ／ｍＬ）中でコーティングしたシリンジで採取した。各採取チューブからの血液をフラスコに合わせ、血液１ｍＬ当たり５０μＬのＲｏｓｅｔｔｅ  ＳｅｐヒトＴ細胞濃縮カクテル加えた（５ｍＬ／１００ｍＬドナー血液）。全血／Ｒｏｓｅｔｔｅ  Ｓｅｐ抗体カクテルを室温で２０分間インキュベートした。次に、血液／Ｒｏｓｅｔｔｅ  Ｓｅｐ抗体カクテルを１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋２％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）で１：１希釈した。ＦＢＳは最終容量２００ｍＬに対する。次に、２５ｍＬの希釈血液／抗体カクテルをＳｅｐｍａｔｅチューブ内の１５ｍＬのフィコール勾配上に重層した（各ドナーにつき合計９チューブ）。その後、Ｌｏａｄｅｄ  Ｓｅｐｍａｔｅチューブを室温にて１２００ｘｇで２０分間、ブレーキをオンにして遠心分離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）界面に沈降した血漿の上層をピペットで取り出し、廃棄した。残った血漿およびバフィーコート界面をＳｅｐｍａｔｅチューブから５０ｍＬコニカル遠沈管（合計４本）にデカントした。これらのチューブにＰＢＳ＋２％ＦＢＳを最高レベルまで加えて５０ｍＬとした。細胞を室温にて４００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄した。次に、各ドナーからのペレットを１本の５０ｍＬコニカルチューブに合わせ、これらのペレットを合計容量５０ｍＬ  ＰＢＳ＋２％ＦＢＳに再懸濁させた。細胞を室温にて４００ｘｇで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを２ｍＬのＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％ＦＣＳ＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン＋ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ＋ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ）に再懸濁させた。回収したＣＤ３細胞をＶｉＣｅｌｌ装置で計数し、さらに希釈して１．２×１０６細胞／ｍＬとした。Ｔ細胞単離の質を確認するために、１×１０６の回収細胞をＣＤ３  ＰＥ−Ｃｙ７に対して染色した。
【０３８２】
ＣＤ３＋Ｔ細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ  Ｔ細胞単離キットによりネガティブ単離した
ＰＢＭＣ単離：  簡単に述べれば、１００ｍＬの新鮮な全血を、液体ナトリウムヘパリン（Ｓａｇｅｎｔｔ終濃度１０ＩＵ／ｍＬ）中でコーティングしたシリンジで各ドナーから採取した。血液を、２％ＦＢＳを含むＰＢＳで希釈（１：１）し、最終容量２００ｍＬとした。２５ｍＬの希釈血液を、Ｓｅｐｍａｔｅチューブ（各ドナーにつき合計８本）中の１５ｍＬのフィコール勾配の上に重層した。次に、Ｌｏａｄｅｄ  Ｓｅｐｍａｔｅチューブを室温にて１２００ｘｇで２０分間、ブレーキをオンにして遠心分離した。ＰＢＭＣ界面に沈降した血漿の上層をピペットで取り出し、廃棄した。残った血漿およびバフィーコート界面をＳｅｐｍａｔｅチューブから５０ｍＬコニカル遠沈管（合計４本）にデカントした。これらのチューブにＰＢＳ＋２％ＦＢＳを最高レベルまで加えて５０ｍＬとした。細胞を室温にて４００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄した。次に、各ドナーからのペレットを１本の５０ｍｌコニカルチューブに合わせ、合計容量５０ｍＬ  ＰＢＳ＋２％ＦＢＳに再懸濁させた。細胞を室温にて４００ｘｇで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを任意の容量の単離バッファー（Ｔ細胞キットに供される細胞ペレットのサイズに依存）に再懸濁させた。次に、単離されたＰＢＭＣをＶｉＣｅｌｌ装置で計数し、単離バッファーで終濃度１×１０８細胞／ｍＬとした。
【０３８３】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄ  ＵｎｔｏｕｃｈｅｄヒトＴ細胞単離：  ２×１０８の単離ＰＢＭＣ（２ｍＬ）、４００μｌのＦＢＳ、次いでＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＵｎｔｏｕｃｈｅｄＴ細胞キットからの４００μｌの抗体ミックスを各１５ｍＬチューブに加え、４℃で２０分間インキュベートした。細胞を１０ｍＬの単離バッファーで洗浄し、４℃にて３５０ｘｇで８分間遠心分離した。上清を廃棄し、これらのペレットを２ｍＬの単離バッファーに再懸濁させた。次に、各チューブに２ｍＬの、予め洗浄したＤｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｄｙｎａビーズを各チューブに加えた。細胞をビーズとともに、軽く傾斜させ、旋回させながら室温で１５分間インキュベートした。このビーズのインキュベーション後に、１０ｍＬの単離バッファーを加え、細胞／ビーズ懸濁液をピペットで１０回上下させた。これらのチューブを室温で２分間、磁石中に置いた。磁気を帯びたビーズを乱さずに、未結合のＴ細胞を含有する上清を回収した。これらのビーズを１０ｍＬの単離バッファーで１回洗浄し、室温で２分間、再び磁石中に置き、ビーズを除いたバッファーを回収した。回収した細胞を室温にて４００ｘｇで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを細胞ペレットサイズによって任意の容量（２〜３５ｍＬ）のＲＰＭＩ完全培地に再懸濁させた。次に、回収したＣＤ３＋細胞をＶｉＣｅｌｌで計数し、ＲＰＭＩ完全培地で１．２×１０６細胞／ｍＬの濃度とした。
【０３８４】
ＣＤ３確認染色：  １×１０６の回収細胞を５μｌの抗ＣＤ３  ＰＥ−Ｃｙ７または５μｌのＩｇＧ１  Ｐｅ−Ｃｙ７アイソタイプで４℃、暗所で４０分間染色した。次に、４℃にて４００ｘｇで５分間遠心分離しつつ、細胞を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。染色された細胞を１％ホルムアルデヒドに再懸濁させ、暗所、４℃で２０分間インキュベートした。次に、４℃にて４００ｘｇで５分間遠心分離しつつ、細胞を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２７５μｌのＰＢＳに再懸濁させた。固定された細胞を、Ｔ細胞単離の質を確認するためのフローサイトメトリーを実施するまで、暗所、４℃で保存した。
【０３８５】
単離されたヒトＴ細胞の活性化：
Ｔ７５フラスコを、ＰＢＳ中、１μｇ／ｍｌ  ＣＤ３／ＣＤ２８  ４ｍＬで、３７℃にて２時間コーティングした。フラスコを１２ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。２５ｍＬのＲＰＭＩ完全培地中、３０×１０６の細胞を各Ｔ７５フラスコに加えた。活性化させるために、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。
【０３８６】
抗ＩＣＯＳ（Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ）の結合：
ナイーブ型および活性化型の両ＣＤ３＋Ｔ細胞でＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥの結合を評価した。０．００１２８から１００μｇ／ｍＬまで５倍希釈のＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥの８点タイトレーションを用いた。
【０３８７】
ナイーブ型および／または活性化型いずれかのＣＤ３＋Ｔ細胞を、ヒトＦｃＲ遮断溶液を含有する０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）（１ｍＬ当たり５μｌ  ＦｃＲ遮断溶液＋９５０μｌ  ＦＡＣＳバッファー）に２×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させた。２×１０５細胞／ウェルの密度で、１００μｌ細胞を２ｍＬの９６ウェルアッセイブロックに入れ、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション中、結合抗体、抗ＩＣＯＳ（Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ）またはＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体のタイトレーションは２×濃度として調製した。ＦｃＲブロックのインキュベーション後、ウェル当たり１００μｌの２倍濃縮結合抗体を、ウェル当たり１００μｌのＦｃ遮断Ｔ細胞に加えて最終１×濃度の抗ＩＣＯＳ（Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ）抗体または終濃度０．００１２８〜１００μｇ／ｍＬのＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体とした。細胞を室温で２０分間抗体とともにインキュベートした。結合インキュベーションの後、室温にて４００ｘｇで５分間遠心分離しつつ、細胞を１ｍＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。
【０３８８】
抗ＩＣＯＳ  （Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ）結合後のナイーブまたは活性化Ｔ細胞の染色：
細胞をフローサイトメトリーのために以下のカクテルで染色した：
【０３８９】
染色カクテル：
【表１０】
2020079252.tif 000033
【０３９０】
アイソタイプカクテル:
【表１１】
2020079252.tif 000034
【０３９１】
ナイーブ型または活性化型のＦｃ遮断Ｔ細胞を、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥまたは対照抗体を伴う結合インキュベーションの後に、８０μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた。ウェル当たり２０μｌの染色カクテルまたはアイソタイプカクテルを各ウェルに加えた。細胞を暗所、室温で２０分間染色した。染色インキュベーション後、室温にて４００ｘｇで５分間遠心分離しつつ、細胞を１ｍＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。
【０３９２】
染色細胞の固定：
細胞を５００μｌの１％ホルムアルデヒド（１０ｍＬの１６倍濃縮ホルムアルデヒド＋１５０ｍＬの１倍ＰＢＳ）に再懸濁させ、室温で２０分間インキュベートした。次に、室温にて４００ｘｇで５分間遠心分離しつつ、細胞を１ｍＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。その後、ペレットを２６５μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ、９６ウェル丸底プレートに移した。フローサイトメトリーによる分析まで、細胞を暗所にて４℃で保存した。
【０３９３】
フローサイトメトリー：
フローサイトメトリーは、ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ２０またはＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩのいずれかで、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウエア（バージョン８．０）を用いて行った。補正は、単一の染色ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＵｌｔｒａｃｏｍｐビーズとＦＡＣＳＤｉｖａｓの補正ソフトウエアを用いて、取得の時点で行った。
【０３９４】
データ分析
データの取得および補正は、ＢＤ  Ｄｉｖａ（バージョン８．０）ソフトウエアを用い、ＢＤ  ＦＡＣＳ装置、ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０またはＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで行った。データ分析では、Ｆｌｏｗ  Ｊｏソフトウエア（バージョン１０．０．８ｒ１）を使用した。結果は、ＭＦＩ（中央蛍光強度）および全生細胞または適当な親集団の外側のヒトＩｇＧκ軽鎖ＦＩＴＣ染色陽性の細胞のパーセントの両方として報告する。ＥＣ５０は、グラフパッド・プリズム５ソフトウエア（バージョン５．０４）を、４パラメーターの変化する傾き（ｌｏｇ（アゴニスト）対応答−−変化する傾き）を用いる変換データの非線形回帰（Ｘ＝（ｌｏｇ（Ｘ））とともに使用して決定した。
【０３９５】
結果
Ｒｏｓｅｔｔｅ  Ｓｅｐ  ＣＤ３濃縮キットまたはＤｙｎａｂｅａｄ  ＵｎｔｏｕｃｈｅｄＴ細胞単離キットのいずれかを用いた新鮮な全ヒト血液からのＴ細胞の単離は、抗ＣＤ３  ＰｅＣｙ７を用いた染色によって確認した。ドナーはＣＤ３細胞に対して６８％〜９７％陽性の間の範囲にあった。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞集団からは、抗ヒトＩｇＧ１κ軽鎖ＦＩＴＣ染色に関して評価した場合、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ濃度依存曲線が得られた。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ結合曲線を抗ヒトＩｇＧ１κ軽鎖ＦＩＴＣ陽性パーセントとＦＩＴＣ中央蛍光強度（ＭＦＩ）の両方として表す。ＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体とともにインキュベートしたＴ細胞からは、抗ヒトＩｇＧ１κ軽鎖ＦＩＴＣ染色に関して評価した場合、濃度依存曲線は得られなかった。ナイーブＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞から完全な曲線は得られなかったが、０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬで濃度依存的増加が見られた。
【０３９６】
中央（範囲）ＥＣ５０値は、それぞれＣＤ４＋  ＦＩＴＣ  ＭＦＩの場合には１．０４μｇ／ｍＬ（０．６２８〜１．３１μｇ／ｍＬ）、ＣＤ８＋ＦＩＴＣ  ＭＦＩの場合には０．６５２μｇ／ｍＬ（０．２７〜０．７４μｇ／ｍＬ）であった。中央（範囲）ＥＣ５０値は、ＣＤ４＋  ＩｇＧκ軽鎖ＦＩＴＣ陽性パーセントの場合には０．８３４μｇ／ｍＬ（０．４５〜０．９６５μｇ／ｍＬ）、ＣＤ８＋  ＩｇＧκ軽鎖ＦＩＴＣパーセントの場合には０．５８３μｇ／ｍＬ（０．３７１〜１．２３μｇ／ｍＬ）であった（表１０）。
【０３９７】
【表１２】
2020079252.tif 000035
【０３９８】
考察
本研究は、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ（抗ＩＣＯＳアゴニスト抗体）が健康なヒトドナーからの活性化Ｔ細胞上のＩＣＯＳ受容体と結合することを示した。Ｔ細胞の細胞表面へのＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥの結合は、ＦＩＴＣで標識されたヒトＩｇＧκ軽鎖に対する抗体を用いて検出した。
【０３９９】
ＣＤ３＋Ｔ細胞の単離の成功は、抗ＣＤ３  Ｐｅ−Ｃｙ７染色を用いたフローサイトメトリーにより確認した。１０名のドナーのうち９名では、単離後に８９％を超えるＣＤ３＋Ｔ細胞が得られた。しかしながら、ドナー番号２１００Ｍ３９では、単離後にわずか６８．６％のＣＤ３＋であった。ドナー番号２１００Ｍ３９のＴ細胞の単離におけるその純度低下の原因は未知である。ドナー番号２１００Ｍ３９からゲーティングされたＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団から得られたＥＣ５０値は異常であるとは思われず、まとめられた中央値に含まれた。
【０４００】
ネガティブ単離されたヒトＴ細胞においてＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥに関する結合ＥＣ５０を求めた。単離されたＴ細胞を１μｇ／ｍＬのプレート結合ＣＤ３／ＣＤ２８抗体に４８時間曝すことにより活性化した際の結合曲線を作成した。統計分析では、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋活性化Ｔ細胞からのＩｇＧκ軽鎖ＦＩＴＣ陽性細胞パーセントおよびＦＩＴＣ  ＭＦＩデータの両方を考慮した。中央ＣＤ４＋  ＥＣ５０値は、ＦＩＴＣ陽性細胞パーセントまたはＦＩＴＣ  ＭＦＩとして評価した場合、それぞれ１．０４および０．８３４μｇ／ｍＬで同等であった。中央ＣＤ８＋  ＥＣ５０値もまた、ＦＩＴＣ陽性細胞パーセントまたはＦＩＴＣ  ＭＦＩとして評価した場合、それぞれ０．６５２および０．５８３μｇ／ｍＬで同等であった。
【０４０１】
ＩｇＧ４  ＰＥアイソタイプ対照とともにインキュベートしたＴ細胞は、使用した分析方法、すなわち、ＭＦＩまたは陽性細胞パーセントに関わらず、抗ヒトＩｇＧκ軽鎖ＦＩＴＣ結合に濃度依存的増加をもたらさなかった。
【０４０２】
ナイーブ型または非活性化型のネガティブ単離されたＴ細胞からは、試験した０．００１２８〜１００μｇ／ｍＬ  Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥの範囲で完全な曲線は得られなかった。しかしながら、ドナーにおいて０．１〜１００μｇ／ｍＬ  Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥで結合に濃度依存的増加が見られた。ＥＣ５０は、ナイーブＴ細胞からの曲線が不完全であったので計算できなかった。ＩＣＯＳは休止中のＴｈ１７、Ｔ濾胞性ヘルパー（ＴＦＨ）および制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞では弱く発現するだけであることから、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥは低濃度ではナイーブまたは非活性化細胞に結合できないことが予想された。ＩＣＯＳ発現を誘導するためにはＴＣＲの会合および活性化が必要とされる。従って、ナイーブまたは非活性化細胞上で発現されるＩＣＯＳ受容体は極めて少なく、結果としてＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの結合は最小である可能性がある。
【０４０３】
実施例８：カニクイザル用量範囲探索（ＤＲＦ）試験からのＴＫ／ＰＤ結果
標的関連種におけるＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥのｉｎ  ｖｉｖｏ特性を評価するために、カニクイザルで用量範囲探索試験を行った。この試験では、ビヒクル対照コホートに加えて３用量水準（０．３、３および３０ｍｇ／ｋｇ）を検討した。それは初回用量の１４日後に２回目の用量を投与する反復用量とした。１コホートにつき男性１名と女性１名を試験した。Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥは、供試した異なる３用量でＣｍａｘ（μｇ／ｍＬ）およびＡＵＣ（μｇ．ｈ／ｍＬ）において用量依存的増加を示した。３用量水準の総てで、抗体は初回投与後２週間血漿中に検出された（図１２Ａ）。抗Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ抗体は、単回投与後の３個体のサル（０．３ｍｇ／ｋｇを投与した動物の両方ならびに３ｍｇ／ｋｇを投与した雌）で検出された。抗Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ抗体は、これらの動物において２回目の用量の投与後の血漿濃度の低下と相関があった（図１２Ｂ）。２回目の用量の４８時間後に総ての動物を犠牲にし、薬力学的活性の分析および組織病理学的分析のために組織を採取した。
【０４０４】
Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ受容体占有率（ＲＯ）を、総ての供試動物の脾臓および腋窩リンパ節由来のＣＤ４＋Ｔ細胞において測定した。両組織において、試験した用量水準でＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ結合における用量依存的増加が見られた（図１３）。
【０４０５】
供試したサルの末梢血由来のＣＤ４＋Ｔ細胞についても受容体占有率を測定した。血液を５時点で（１日目（投与前）、３日目、８日目、１５日目（２回目の投与前）および１７日目に）採取した。このアッセイでは、ＲＯを決定するために２つの異なる尺度を用いた。１つ目は、「フリー受容体」アッセイ形式であり、この場合、フローサイトメトリー検出のために使用される抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂの結合が、ＩＣＯＳ結合をめぐって競合することが示されたＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの存在下または不在下で決定された。従って、ＦＡＣＳによる抗ＩＣＯＳシグナルの不在は、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ５４ＰＥ占有受容体にとってのサロゲートであり、逆に、抗ＩＣＯＳ陽性は、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥが結合していなかった「フリー受容体」を示した。図１４−Ａは、ＩＣＯＳフリー受容体が、用量依存的かつ時間依存的に減少したことを示す。２個体のサル（２５０および３００）は、説明できない、また、これらのサルにおける抗Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ抗体の産生によるものであり得る「フリー受容体」シグナルを示した。加えて、上記の脾臓およびリンパ節で用いたものと同じアッセイにより、末梢血ＣＤ４＋細胞でもＲＯを測定した。予想されたように、０ｍｇ／ｋｇの用量はこの読み出しによるＲＯは無いことを示した（図１４−Ｂ）。興味深いことに、一部のサルは３．０および３０ｍｇ／ｋｇの用量水準で、処置時間経過に沿ってＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ結合ＣＤ４＋細胞数に時間依存的な増加を示した。特に、動物３５０は、３日目〜１７日目の間に薬物結合循環ＣＤ４＋細胞の増加を示した（＞５倍）（図１４−Ｂ）。ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋細胞数におけるこの増加は、この集団のＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥにより誘導される増殖によるものである可能性がある。
【０４０６】
実施例９：Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥは結合に応答して細胞内シグナル伝達変化を誘導する
試験準備
細胞株
Ｂａ／Ｆ３−ＩＣＯＳ細胞はＩＮＳＥＲＭ（パリ、フランス）から入手した。細胞を３７℃、加湿インキュベーター内、５％ＣＯ２下、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）、１０ｎｇ／ｍＬ組換えマウスＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ＭＮ）、および１ｍｇ／ｍＬジェネティシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ウォールサム、ＭＡ）を添加した適当な培養培地で培養した。
【０４０７】
試験プロトコール
細胞内シグナル伝達抗体アレイ
タンパク質溶解液を、ＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）細胞内シグナル伝達アレイキット（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者の説明書に従って用いてアッセイした。簡単に述べれば、ＩｇＧ４−ＰＥ（２０μｇ／ｍＬ）またはＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ（０．２、２、または２０μｇ／ｍＬ）で１、６、２４、および４８時間処理したＢａ／Ｆ３−ＩＣＯＳ細胞からの溶解液を、アレイ希釈バッファーで１μｇ／μＬとなるように希釈し、抗体アレイ上、４℃で一晩インキュベートした。アレイの画像を、Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングソフトウエア（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、リンカン、ＮＥ）を用いてキャプチャーした。
【０４０８】
ホスホ−ＡＫＴ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ＡＫＴのリン酸化を、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｏｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）ホスホ（Ｓｅｒ４７３）／全Ａｋｔ全細胞溶解液キットおよびホスホ−Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）全細胞溶解液キットを製造者の説明書に従って用いて測定した。細胞を９６ウェルＵ底プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）の適当な培養培地（１００μＬ／ウェル）に０．２５×１０６細胞／ウェルの細胞密度で播種した。細胞を、３倍希釈法（用量範囲：２０．０〜０．０３μｇ／ｍＬ）を用いた７種類の異なる濃度の対照抗体（ＩｇＧ４  ＰＥ）、抗ＩＣＯＳ  ＩｇＧ１  Ｆｃ無効抗体、またはＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥのいずれかで、２反復ウェルとして、１、２、４、６、２４，または４８時間処理した。ホスホ−ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）全細胞溶解液キットを用いる１つの試験では、細胞を、１濃度の３種類総ての抗体（１０μｇ／ｍＬ）で、３反復のウェルとして処理した。各９６ウェルプレートの一番下の列は細胞対照を含まず（２つのブランク２反復ウェル）、細胞は抗体で処理せずに残した。処理後、細胞を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有する３０μＬの氷冷溶解バッファーで溶解し、氷上で３０分間インキュベートした後、２５μＬの溶解液をＥＬＩＳＡプレートに移して４℃で一晩インキュベートした。
【０４０９】
データ分析
細胞内シグナル伝達抗体アレイのデンシトメトリー分析
デンシトメトリー分析を行って、抗体アレイ間のスポットの積分強度レベルを算出した。各スポットの強度をそのアレイ上の陽性対照の平均値に対して正規化し（式＝サンプルウェル／陽性対照の平均値）、グラフパッド・プリズム６．０（ラホヤ、ＣＡ）を用いてグラフ化した。
【０４１０】
ＭＳＤ  ＥＬＩＳＡデータの分析
リンタンパク質パーセントは、以下の計算：リンタンパク質％＝（（２×ホスホ−シグナル）／（ホスホ−シグナル＋総タンパク質シグナル））×１００を用い、各ウェルについて算出した。次に、この値を各時点の非処理細胞値に対して正規化し、マイクロソフト・エクセル２００７で「対照％」としてグラフ化した。
【０４１１】
結果
従前の研究で、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ処理はＢａ／Ｆ３−ＩＣＯＳ細胞においてホスホ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）レベルを上昇させ、抗体暴露の３０〜４０分後の間に最大応答が見られたことが示された。ここで、上昇したリン酸化レベルが数日後に持続していたかどうかをみるために、以後の時点でホスホ−ＡＫＴレベルを測定した。加えて、ＩＣＯＳ活性化による他の細胞内シグナル伝達事象の調節も評価した。Ｂａ／Ｆ３−ＩＣＯＳ細胞において、ホスホ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）レベルは、１時間および６時間の処理後にＩｇＧ４−ＰＥアイソタイプ対照抗体処理細胞に比べてＨ２Ｌ５  ＨＩＧＧ４ＰＥ処理で上昇したが、この効果は２４時間に失われた（図１５）。興味深いことに、同様の効果が、細胞が抗体のＦｃ領域が無効である抗ＩＣＯＳ抗体で処理された場合にも見られた。また、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥおよび抗ＩＣＯＳ  ＩｇＧ１  Ｆｃ無効抗体処理細胞でも、１時間の処理後にＩｇＧ４−ＰＥ（図１５）アイソタイプ対照抗体処理細胞に比べてホスホ−ＡＫＴ（Ｔ３０８）レベルの上昇が見られ、測定された最終時点であった４８時間まで持続した。ＡＫＴの下流の他の２つのホスホ−タンパク質、すなわち、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３α（ＧＳＫ３α）およびリボゾームタンパク質Ｓ６も、ＩＣＯＳ活性化時にそこそこ上昇したが、これらの効果は、ホスホ−ＡＫＴで見られたものほどロバストでなった。また、タンパク質溶解液も、リン酸化を測定する抗体アレイまたは細胞内シグナル伝達に関与する１８のタンパク質の切断を用いて分析した。このアプローチを用いたところ、ホスホ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ホスホＳ６（Ｓ２３５／２３６）、およびホスホ−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔ１８３／Ｙ１８５）の３つのタンパク質だけが、ＩＣＯＳ活性化時にリン酸化に若干の増加を示した。
【０４１２】
直接定量化を可能とするアッセイ形式を用いてＡＫＴリン酸化に対する変化を測定するために、Ｂａ／Ｆ３−ＩＣＯＳ細胞を、一定の用量範囲の対照抗体（ＩｇＧ４  ＰＥ）、抗ＩＣＯＳ  ＩｇＧ１  Ｆｃ無効抗体、またはＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥで経時的に処理し、ＥＬＩＳＡによりモニタリングした。ホスホ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）レベルの上昇は、抗ＩＣＯＳ  ＩｇＧ１  Ｆｃ無効抗体処理細胞またはＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ処理細胞において用量依存的でも時間依存的でもあった。従前に見られたように、最大ホスホ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）活性化は１時間の処理後に生じた。ホスホシグナルは２時間にやや低下し、６時間まで持続したが、結局、２４時間後に失われた。ここで、ホスホ−ＡＫＴ（Ｔ３０８）レベルを測定するＥＬＩＳＡも試験したが、このＥＬＩＳＡキットでは再現性のある活性化は見られなかった。
【０４１３】
考察
ＡＫＴシグナル伝達カスケードは、受容体型チロシンキナーゼ、インテグリン、ＢおよびＴ細胞受容体、サイトカイン受容体、Ｇタンパク質共役受容体およびＰＩ３Ｋによるホスファチジルイノシトール（３，４，５）トリスホスフェート（ＰＩＰ３）の産生を誘導するその他の刺激により活性化され得る[Carnero, 2008]。これらの脂質は、Ａｋｔおよびその上流アクチベーターＰＤＫ１のための原形質膜ドッキング部位として働く。膜において、ＰＤＫ１は、Ｔｈｒ３０８でＡＫＴをリン酸化してＡｋｔの部分的活性化をもたらす[Alessi, 1996]。ｍＴＯＲＣ２によるＳｅｒ４７３でのＡｋｔのリン酸化は、完全な酵素活性を刺激する[Sarbassov, 2005]。
【０４１４】
ＩＣＯＳは、Ｔ細胞の生存、増殖および記憶を促進することにより活性化エフェクターおよび調節ＣＤ４＋Ｔ細胞の機能に重要な役割を果たす。アゴニスト抗体によるＩＣＯＳの標的化は、Ｔ細胞の活性化およびエフェクター機能の持続におけるその役割のために、抗腫瘍免疫を増強するためのもっともらしいアプローチとなり得る。この研究で、本発明者らは、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥによるＩＣＯＳの活性化がＢａ／Ｆ３−ＩＣＯＳ細胞においてＡＫＴのリン酸化に変化をもたらしたことを見出した。続いて、ＡＫＴの下流タンパク質、例えば、ＧＳＫ３α（ＡＫＴの直接的基質）およびリボゾームタンパク質Ｓ６もまたリン酸化された。このデータは、このモデル系を用いて最近実施された研究と一致し、外部に公開されたデータと合致する[Fos, 2008]。
【０４１５】
実施例１０：ヒトＰＢＭＣアッセイにおける可溶型Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ単独および抗ＰＤ１および抗ＣＴＬＡ−４抗体との組合せの機能的効果
試験準備
初代ヒトＰＢＭＣの単離
新鮮な血液をＧＳＫヘルスセンターの血液ドナーから入手し、フェノールレッド不含１０％ＲＰＭＩ１６４０培地で１：１希釈した。希釈した血液をＵｎｉ−Ｓｅｐ  Ｍａｘ  ５０ｍｌコニカルチューブ中の密度媒体の上に重層し、室温にて４００ｘｇで２０分間、ブレーキをオフにして遠心分離した。得られた白色単核層（バフィーコート）を１００μＭセルストレーナーを通して新しい５０ｍＬコニカルチューブに注意深く抽出した。このバフィーコートに等容量のフェノールレッド不含１０％ＲＰＭＩ１６４０培地を加え、室温にて３００ｘｇで１０分間遠心分離した。この細胞ペレットを１０ｍｌの赤血球溶解溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁させ、室温で５分間インキュベートした。細胞を培地で１回洗浄し、従前に記載したように遠心分離した。容量をフェノールレッド不含１０％ＲＰＭＩ１６４０培地で４０ｍｌとし、ＶｉＣｅｌｌセルカウンターおよびバイアビリティアナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞を計数した。
【０４１６】
単球由来未熟樹状細胞（ｉＤＣ）の誘導
ヒト単球を、プラスチック接着法を用いて単離した。簡単に述べれば、２０００万個の新たに単離したＰＢＭＣを、Ｔ−７５組織培養フラスコ内のＡＩＭ−Ｖ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中で３時間培養した。プラスチックに結合していない細胞を洗い流した。接着単球を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内の１０００Ｕ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦ（カタログ番号３００−０３、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）および５００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−４（カタログ番号２００−０４）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。７〜１０日後に、ｉＤＣ細胞を、同種異系混合リンパ球反応アッセイにおいて種々のドナー由来のＴ細胞と共培養するために採取した。
【０４１７】
血液からの初代ヒトＴ細胞の直接的単離
ヒトＴ細胞を、ヒトＴ細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、新鮮なヒト血液から直接的に単離した。ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＴ細胞濃縮カクテル（５０μＬ／ｍＬ）を全血に加え、よく混合した。室温で２０分のインキュベーション後、等容量のＰＢＳ＋２％ＦＢＳを穏やかに混合しながら加えた。希釈サンプルを密度媒体の上に重層し、室温にて１２００ｘｇで２０分間、ブレーキをオフにして遠心分離した。密度媒体から濃縮された細胞：血漿界面を新しいコニカルチューブに注意深く注いだ。次に、赤血球を赤血球溶解バッファー（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で溶解させ、濃縮細胞をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄した。次に、Ｔ細胞を４０ｍｌのＰＢＳ＋２％ＦＢＳに再懸濁させ、Ｖｉ−Ｃｅｌｌセルカウンターで計数した。
【０４１８】
試験プロトコール
ヒトＰＢＭＣ前刺激アッセイ
新たに単離したヒトＰＢＭＣを、３７℃、Ｔ−７５組織培養フラスコ内の、１００ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦおよび１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地中、ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ細胞拡大Ｄｙｎａビーズで、１：２０のビーズ：細胞比にて前刺激した。４８時間後、前刺激ビーズを磁気的に除去し、細胞を洗浄し、計数し、組織培養処理を施していない９６ウェル丸底プレートにて、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地中、抗ＣＤ３  Ｄｙｎａビーズおよび治療用抗体で再刺激した。播種密度は１００ｋ細胞／１００μｌ培地／ウェルであった。３７℃で３．５日間インキュベートした後、ＭＳＤによるマルチプレックスサイトカイン測定のために細胞培養上清を採取した。
【０４１９】
ヒトＭＬＲ活性化アッセイ
健康なヒトボランティアからの単球由来ｉＤＣを、異なるドナーから新たに単離したヒトＴ細胞と１：１０比（ｉＤＣ：Ｔ）で混合し、３７℃、ＡＩＭ−Ｖ培地中、０．０２μｇ／ｍｌのＣＥＦＴペプチド混合物の存在下で２４時間、プレインキュベートした。処理抗体の種々の群をこれらのウェルに直接加え、混合し、さらに４日間インキュベートした。ＭＳＤ分析によるマルチプレックスサイトカイン測定のために細胞培養上清を回収した。
【０４２０】
ＭＳＤサイトカイン分析
組織培養上清におけるＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２およびＴＮＦ−αサイトカインレベルを、ＭＳＤヒトＶ−Ｐｌｅｘ特注キットを用いて測定した。まず、サンプルを希釈剤２で１：２００希釈した。キャリブレーターも、製造者の推奨に従い、希釈剤２で調製した。希釈サンプルおよびキャリブレーターを黒色ＭＳＤプレートに加えた後、粘着性プレートシールで封止し、振盪しながら室温で２時間インキュベートした。希釈剤２で新たに調製した２５μＬの検出抗体溶液を各ウェルに加えた後、プレートを再封止し、振盪しながら室温でさらに２時間インキュベートした。これらのプレートを１５０μＬ／ウェルのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した後、新たに希釈した１５０μｌ／ウェルの２倍リードバッファーを加え、すぐにＭＥＳＯ  ＱｕｉｃｋＰｌｅｘリーダーで読み取った。データはＭＳＤ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウエアを用いて分析した。
【０４２１】
データ分析
ＭＳＤデータ分析
ＭＳＤデータを、Ｄｉｓｏｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウエア（ＭＳＤ、バージョン４．０．９）で分析した。プレート特異的標準曲線を作成するために、製造者のキット内のキャリブレーターを各ＭＳＤプレートに含め、総ての場合でＲ２値は０．９９であった。検出されたサイトカインの量を標準曲線に基づいて計算し直し、３回の生物学的反復からの平均値および標準偏差を用いてグラフを作成した。
【０４２２】
統計分析
各処理抗体の固有アイソタイプ対照の対数変換した変化倍率データに対して一元配置ＡＮＯＶＡを行った。異なるドナー間の単剤療法と組合せの両方を比較するためにダネットの多重比較検定を行った。Ｐ＜０．０５を統計的に有意と見なした。
【０４２３】
結果
ＰＢＭＣ前刺激アッセイの開発およびＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥとイピリムマブおよびペンブロリズマブとの組合せ活性の試験
前刺激の最適条件を決定するために、ヒト抗ＣＤ３  Ｄｙｎａビーズおよび抗ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を種々のビーズ：細胞比で試験した。前刺激４８時間後に、細胞を採取し、ビーズを磁気的に除去した後、抗ＩＣＯＳ抗体単独または抗ＣＴＬＡ−４もしくは抗ＰＤ１との組合せとともに抗ＣＤ３  Ｄｙｎａビーズ（ビーズ：細胞比＝１：１）で刺激した。Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ単剤処理は、試験した総ての前刺激条件でアイソタイプ対照と比較して、ＩＦＮ−γの誘導をもたらした。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥにより誘導されたＩＦＮ−γの規模は、前刺激の強度と逆相関した。Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥとイピリムマブの組合せは、弱く前刺激されたＰＢＭＣにおいて、Ｈ２Ｌ５  ＨＩＧＧ４ＰＥまたはイピリムマブのいずれか単独に比べて、サイトカイン産生の増強を示した。この組合せ効果は、より強い前刺激条件と考えられるプレート結合型抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８前刺激条件下では失われた。これらの結果に基づき、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズをビーズ：細胞比１：２０で用いる前刺激条件を、その後の総てのＰＢＭＣアッセイのために選択した。４名の個々のドナーからの結果を抗ＣＴＬＡ−４組合せに関しては図１６に、抗ＰＤ−１との組合せに関しては図１７にまとめる。
【０４２４】
ＰＢＭＣ前刺激アッセイでの用量依存的サイトカイン誘導におけるＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥの結果
Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの用量依存的活性を、１：２０の所定ビーズ：細胞比ににて抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで前刺激したヒトＰＢＭＣにおいて評価した。抗ＲＳＶ  ＩｇＧ４ＰＥおよび抗ＩＣＯＳ  ４２２．２  ＩｇＧ１  Ｆｃ無効型を対照として含めた。８濃度のＨ２Ｌ５  ＨＩＧＧ４ＰＥを試験した（１００、３０、１０、３、１、０．３、０．１、および０．０３μｇ／ｍｌ）。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−αを、ＰＢＭＣサンプルの組織培養上清においてＭＳＤにより評価した。Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥは用量依存的にＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−α生産を誘導したが、アイソタイプ対照ＩｇＧ４またはＦｃ無効型４２２．２は誘導しなかった。これらの結果を用いて、組合せ試験で使用するＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの濃度を決定した。
【０４２５】
ヒトＭＬＲアッセイの開発
ヒトＭＬＲアッセイを最適化する試みにおいて、ヒトＴ細胞および異なるドナー由来の単球由来未熟ＤＣの共培養に加えて、抗ＣＤ３ビーズも、細胞のプライミングを助けるよう基礎的ＴＣＲ刺激を提供するためにウェルに加えた。結果は、抗ＣＤ３ビーズがＩＦＮ−γ誘導の範囲を大幅に増大したことを示した。イピリムマブ単独もまた抗ＣＤ３ビーズの不在下でＩＦＮ−γ生産を誘導し得るが、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ単独またはＨ２Ｌ５  ＨＩＧＧ４ＰＥ／イピリムマブの組合せのみが、抗ＣＤ３ビーズの存在下で、対応する対照を超えるＩＦＮ−γ生産の増強を示した。
【０４２６】
ヒトＭＬＲアッセイにおけるＨ２Ｌ５  ＨＩＧＧ４ＰＥとイピリムマブの組合せ活性
Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ単独またはイピリムマブとの組合せの免疫刺激活性を、同種異系ヒトＭＬＲアッセイで試験し、ここでは、Ｔ細胞を、０．０２μｇ／ｍｌのＣＥＦＴペプチドの存在下、不一致ドナー由来の単球由来未熟ＤＣとともに１日間プレインキュベートした。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ／イピリムマブの組合せは、いずれかの薬剤単独に比べてＩＦＮ−γ産生ｂに有意な増強をもたらした。結果は、試験下３ペアのドナーで一致したが、ドナー間で若干の変動が見られた（図１８）。
【０４２７】
ヒトＭＬＲアッセイにおけるＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥとペンブロリズマブの組合せ活性
また、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥとペンブロリズマブの組合せも、上記のヒト同種異系ＭＬＲアッセイで試験した。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥを単独で、また１０μｇ／ｍｌのペンブロリズマブとの組合せで試験した。Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥとペンブロリズマブの組合せは、いずれかの薬剤単独に比べてＩＦＮ−γの増大をもたらした。しかしながら、高いドナー変動と一部のドナーでの単剤抗ＰＤ−１処理の著明な活性のために統計的有意性には達しなかった（図１９）。
【０４２８】
考察
ＩＣＯＳは、ナイーブＴ細胞で弱く発現され、活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞では即座にアップレギュレートされる補助受容体である。ＩＣＯＳのリガンドはＩＣＯＳ−Ｌ（Ｂ７ｈ、Ｂ７ＲＰ−１、ＣＤ２７５）であり、このリガンドは、専門のＡＰＣにより、また、ＴＮＦ−α刺激後の末梢の上皮細胞および内皮細胞によって発現される。ＩＣＯＳ：ＩＣＯＳ−Ｌ経路は、Ｔ細胞の増殖および機能の重要な補助刺激シグナルを提供する。アゴニスト抗体によりＩＣＯＳの標的化は、Ｔ細胞の活性化およびエフェクター機能の持続におけるその役割のために、抗腫瘍免疫を増強するためのもっともらしいアプローチとなり得る。
【０４２９】
研究では、いくつかの癌モデルにおいて、イピリムマブによるＣＴＬＡ−４遮断の後にＩＣＯＳｈｉ  ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の頻度の増加が示されている。加えて、ＣＴＬＡ−４遮断の際に、この細胞集団はＩＣＯＳｌｏ  ＣＤ４＋Ｔ細胞よりも大きいレベルのＩＮＦ−γを産生した。実際に、ＩＣＯＳ＋  ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度の増加は、癌患者におけるイピリムマブ処置の薬力学的バイオマーカーとして特定されている。研究では、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＣＴＬＡ−４遮断療法後に８０〜９０％の腫瘍退縮が起こるが、ＩＣＯＳまたはＩＣＯＳＬノックアウトマウスでは、この有効性は５０％未満まで低下したことを示した。ＣＬＴＡ−４遮断の有効性においてＩＣＯＳが果たす重要な役割は、抗ＣＴＬＡ−４療法中にＩＣＯＳ経路を刺激すれば治療効力が増し得ることを示唆する。従って、本発明者らは、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥとイピリムマブの組合せ活性を評価することに着手した。
【０４３０】
プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）は、２０００年にもう１つの免疫チェックポイント分子であることが報告された。ＰＤ−１のリガンドの１つであるＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）の発現は、Ｔ細胞、上皮細胞、内皮細胞、および腫瘍細胞を含む多くの細胞種に見出すことができる。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を標的とする抗体もまた、複数の腫瘍種で臨床応答を示した。ＦＤＡは最近、癌治療のための第二世代免疫チェックポイント遮断薬としてペンブロリズマブおよびニボルマブを承認した。メルク社のペンブロリズマブは、進行性黒色腫患者で約３７〜３８％の応答率をもたらすことが示され、続いての研究では、事前のイピリムマブの処置後に進行性疾患を有する患者において２６％の前応答率が報告されている。ＢＭＳからの抗ＰＤ−１抗体であるニボルマブもまた、転移性黒色腫患者に臨床利益を示し、応答率は４０％であり、１年の時点の全生存率は７２．９％であることが示された。加えて、ニボルマブも、進行性または転移性非小細胞肺癌に対してＦＤＡにより承認された。ＰＤ−１チェックポイント遮断抗体は臨床において優勢な癌免疫療法となったので、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥと抗ＰＤ−１抗体の組合せをそれらの組合せ抗腫瘍活性に関して評価することが重要となろう。
【０４３１】
従前に、ＰＢＭＣ活性化アッセイが開発され、抗ＩＣＯＳアゴニスト抗体のパネルのＴ細胞刺激活性を評価するために使用された。それらの研究から得られたデータは、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥとしてＩｇＧ４ＰＥアイソタイプを有するクローン４２２．２の候補選択を支持した。従前のアッセイで、ＰＢＭＣ細胞を１μｇ／ｍｌのプレート結合型抗ＣＤ３抗体および３μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体で４８時間前刺激した後、それらを採取し、抗ＣＤ３と検討中であった可溶型ＩＣＯＳ抗体で再刺激した。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥは、ＩＦＮ−γ産生を用量依存的に誘導することが示された。前刺激の最適条件を決定するために、ヒト抗ＣＤ３  Ｄｙｎａビーズおよび抗ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を種々のビーズ：細胞比で試験した。ビーズによる刺激はより生理学的であると考えられ、刺激の強度は、種々のビーズ：細胞比を構成することにより、より容易に制御できる。４８時間の前刺激の後、細胞を採取し、ビーズを磁気的に除去した後、抗ＩＣＯＳ抗体単独または抗ＣＴＬＡ−４との組合せとともに抗ＣＤ３  Ｄｙｎａビーズ（ビーズ：細胞比＝１：１）で刺激した。結果は、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ単剤処理が、試験した総ての前刺激条件で、アイソタイプ対照に比べて、ＩＦＮ−γ誘導をもたらしたことを示した。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥによる誘導されたＩＦＮ−γの規模は、前刺激の強度と逆相関した。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥとイピリムマブの組合せは、弱く前刺激されたＰＢＭＣにおいて、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥまたはイピリムマブのいずれか単独に比べ、サイトカイン産生の増強を示した。この組合せ効果は、より強い前刺激条件と考えられるプレート結合型抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８前刺激条件下では失われた。これらの結果に基づき、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８をビーズ：細胞比１：２０で用いる前刺激条件を、その後の総てのＰＢＭＣアッセイのために選択した。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥとイピリムマブの組合せは、いずれかの抗体処理単独に比べて、ＩＦＮ−γ産生に統計的に有意な増加を示した。
【０４３２】
ビーズ：細胞比を１：２０に固定した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激を用いる場合のアッセイ最適化の試みにおいて、再刺激工程ち中に使用する抗ＣＤ３ビーズをビーズ：細胞比１：１から１：３および１：１０へ漸減した。これらの結果は、再刺激強度が低いほど、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥによるＩＦＮ−γ誘導が低くなることを示した。Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥとイピリムマブによるこの組合せ効果は、ビーズ：細胞比１：３および１：１０での再刺激下では完全に失われた。従って、その後の総ての試験では、ビーズ：細胞比１：１での抗ＣＤ３の再刺激を維持した。
【０４３３】
最適化された前刺激および再刺激条件で、このアッセイを、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの用量応答を評価するために使用した。合計８種類の抗体濃度を試験し、それは１００、３０、１０、３、１、０．３、０．１および０．０３μｇ／ｍｌであった。抗ＲＳＶ  ＩｇＧ４ＰＥ、およびＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥのＦｃ無効型である抗ＩＣＯＳ  ４２２．２  ＩｇＧ１  Ｆｃ無効型を対照として使用した。結果は、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥはＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−α産生を用量依存的に誘導したが、アイソタイプ対照ＩｇＧ４またはＦｃ無効型４２２．２は誘導しなかったことを示した。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇ  Ｇ４ＰＥのＦｃ無効型は限定されたサイトカイン誘導応答を示したことは興味深く、このことは、Ｆｃ受容体の会合がＨ２Ｌ５ｈＩｇ  Ｇ４ＰＥのＴ細胞作動機能に重要であることを示す。これらの結果はまた、組合せ研究のためのＨ２Ｌ５ｈＩｇ  Ｇ４ＰＥの用量を決定するためにも使用した。
【０４３４】
また、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇ  Ｇ４ＰＥとチェックポイント遮断抗体の組合せ効果を評価するために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイも開発した。ＭＬＲアッセイはｅｘ  ｖｉｖｏ細胞性免疫アッセイであり、ここでは、初代単球由来未熟樹状細胞（ｉＤＣ）を、異なるドナーから単離されたＴ細胞と混合した。ｉＤＣ細胞の表面の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子のミスマッチが、同種異系状況でのＴ細胞刺激を誘導し得る。診療所では、ＭＬＲアッセイは、ドナーとレシピエントの間の組織移植片の適合性を識別するために周知である。
【０４３５】
ＭＬＲアッセイを開発するために、新鮮なヒト単球を、ヒト組換えＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を添加した培地中で１週間培養し、未熟ＤＣ表現型を誘導した。次に、異なるドナーからの新鮮なヒトＴ細胞を単離し、ｉＤＣ細胞と１０：１比（Ｔ：ｉＤＣ）で混合した。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇ  Ｇ４ＰＥおよびイピリムマブ単剤療法または組合せ処置を、抗ＣＤ３ビーズの存在下または不在下でＴ細胞／ｉＤＣ共培養物に加えた。抗ＣＤ３ビーズの目的は、Ｔ細胞のプライミングを助けるために基礎的ＴＣＲ刺激を提供することであった。結果は、抗ＣＤ３ビーズがこのアッセイにおいてＩＦＮ−γ誘導の範囲を大幅に増大したことを示した。イピリムマブ単独は抗ＣＤ３ビーズの不在下でＩＦＮ−γ産生を誘導し得るが、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ単独またはＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ／イピリムマブの組合せは、抗ＣＤ３ビーズの存在下で、対応する対照を超えるＩＦＮ−γ生産の増強を示した。この結果は、このアッセイで、ＤＣ細胞単独によるＴＣＲ刺激は、ＰＢＭＣから新たに単離された休止中のＴ細胞の表面にＩＣＯＳ発現を誘導するには十分でない可能性があることを示唆する。この状況を改善するために、２４時間のｉＤＣおよびＴ細胞プレインキュベーション工程を、治療抗体の添加の前に加えた。また、Ｔ細胞をより良くプライミングするため、および抗原特異的応答を惹起するためにアッセイ手順にＣＥＦＴペプチドミックスも加えた。ＣＥＦＴペプチドプールは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＨＶ−５；ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＨＨＶ−４；ＥＢＶ）、Ａ型インフルエンザおよび破傷風菌（Clostridium tetani)由来の定義されたＨＬＡクラスＩおよびＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープから選択される２７のペプチドからなる。インフルエンザおよび破傷風菌に対する高いワクチン接種頻度ならびに一般集団におけるＣＭＶおよびＥＢＶの高い有病率を考慮すれば、ヒトサンプルの大多数にリコール抗原応答が期待された。これらの結果は、Ｔ細胞がｉＤＣ細胞とともの２４時間プレインキュベートされた場合にＩＦＮ−γ産生の増大が見られ、また、ＩＦＮ−γ産生は共培養系にＣＥＦＴペプチドが添加された場合にさらに増大したことを示した。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ単独またはイピリムマブとの組合せの免疫刺激活性を同種異系ヒトＭＬＲアッセイで試験し、ここでは、Ｔ細胞を、０．０２μｇ／ｍｌのＣＥＦＴペプチドの存在下で不一致ドナーからの単球由来未熟ＤＣとともに１日間プレインキュベートした。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ／イピリムマブの組合せは、いずれかの薬剤単独に比べて、ＩＦＮ−γ産生に有意な増強をもたらした。これらの結果は、３ペアのドナーで一致したが、ドナー間で若干の変動が見られた。
【０４３６】
同様に、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥとペンブロリズマブの組合せも、上記のヒト同種異系ＭＬＲアッセイで試験した。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥは、単独で、また、および１０μｇ／ｍｌのペンブロリズマブとの組合せで試験した。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥとペンブロリズマブの組合せは、いずれかの薬剤単独に比べてＩＦＮ−γの増大をもたらした。しかしながら、高いドナー変動と一部のドナーでの単剤抗ＰＤ−１処理の著明な活性のために統計的有意性には達しなかった。
【０４３７】
要約すると、これらの試験は、２つのヒト免疫細胞に基づくアッセイにおいて単剤療法と比べた場合、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥと２つのＦＤＡ承認チェックポイント阻害剤、イピリムマブおよびペンブロリズマブとの、より優れた組合せ活性を示した。ここに報告される試験において、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥは、生産的抗腫瘍免疫応答の特徴であるＴ細胞の活性化およびＴＨ１偏向（例えば、ＩＦＮ−γ産生）を促進することが示された。
【０４３８】
実施例１１：ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ単独ならびに抗ＰＤ１および抗ＣＴＬＡ−４抗体との組合せの機能活性
ヒトＰＢＭＣマウス腫瘍モデル
方法
試験準備
動物に関する総ての手順は、試験プロトコールの開始前にＧＳＫ所内動物実験委員会(GSK Institutional Animal Care and Use Committee)によって審査および承認された。
【０４３９】
細胞株の調製：
Ａ２０５８はＡＴＣＣプロトコールに従って増殖させた。
【０４４０】
材料：
・Ａ２０５８ヒト黒色腫細胞株：ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−１１１４７、ロット番号５９３４９３６２
・ＤＰＢＳ：ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２２００、ロット番号６３３５７４３６
・ダルベッコの改変イーグル培地：ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２００２、ロット番号６２５９６４７１  有効期限：２０１５年１０月
・ウシ胎児血清：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１２１７６ｃ−１０００ｍｌ、ロット番号１３Ｇ１８０Ｒ０Ｈ１、有効期限：２０１８年7月
・０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン−０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ：ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２１０２、ロット番号６２４２０３００
・抗生物質−抗真菌剤（１００Ｘ）：Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５２４０−０６２
・Ｔ１７５細胞培養フラスコ：Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ番号６６１１７５
・Ｔ７５細胞培養フラスコ：Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ番号６５８１７５
【０４４１】
培地：
・Ａ２０５８完全増殖培地：ダルベッコの改変イーグル培地＋１０％ＦＢＳ。培養条件：雰囲気：空気、９５％；５％二酸化炭素（ＣＯ２）；温度：３７℃
・細胞の受領時：
・３７℃の予温完全培地。
・細胞を３７℃の湯浴中で急速解凍。チューブを７０％エタノールで拭き、予温完全培地を満たした１５ｍｌチューブに細胞を移す。
・１２００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞ペレットを回収する。
・予温完全培地を満たしたＴ７５フラスコに細胞を戻し、３７℃でインキュベートする。
【０４４２】
細胞の継代培養：
・容量を７５ｃｍ２フラスコ向けとする（Ｔ１７５ｃｍ２フラスコに対して、比例的に必要とされる解離および培養培地の量を調整する）。
・培養培地を取り出し、廃棄する。
・簡単に述べれば、細胞層をＤＰＢＳですすいで、トリプシン阻害剤を含有する総ての血清痕跡を除去する。
・２．０〜３．０ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液をフラスコに加え、細胞層が分散するまで（２〜３分）倒立顕微鏡下で細胞を観察する。
・注：細胞が剥離するまで待つ間、フラスコが当たったりフラスコを振ったりすることで塊状物が細胞をかき回さないようにする。剥離困難な細胞は分散を助けるために３７℃に置いてもよい。
・１０ｍＬの完全増殖培地および穏やかなピペット操作による吸引細胞を加える。
・１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞ペレットを回収し、１０ｍｌの完全増殖培地を加える。
・細胞懸濁液の適当なアリコートを新しい培養容器に加える。３７℃で培養物をインキュベートする。
・培地の更新：２〜３日ごと。
【０４４３】
マウス接種のための腫瘍細胞の調製：
・細胞を１×ＤＰＢＳで洗浄し、３ｍｌ  １×トリプシンを２〜３分加える。
・組織培養フード内で、完全増殖培地を加え、細胞懸濁液を無菌コニカル遠沈管に回収する。
・細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞ペレットを得る。
・細胞を１×ＤＰＢＳ溶液で洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞ペレットを得る。この洗浄を２回繰り返す。
・細胞数および生存判定用の血球算定器で細胞を計数する。
・細胞を氷冷ＰＢＳにＩｎ  Ｖｉｖｏ接種のための濃度（Ａ２０５８、２．５ｅ７／ｍｌ、２．５ｅ６／１００μｌ／マウス）で再懸濁させる。
【０４４４】
ＮＳＧマウスへの腫瘍細胞株の接種
材料：
・マウス：ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ。Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔｏｃｋ：００５５５７雌  齢：６週
・Ａｔｔａｃｈｅｄ  Ｎｅｅｄｌｅ  ２５Ｇ５／８を備えた１ｍＬツベルクリンシリンジ：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号３０５５５４
・ＰＤＩ（商標）Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｐｒｅｐ  Ｐａｄｓ：Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅｓ、カタログ番号Ｂ３３９
・ＰＤＩ（商標）Ｐｏｖｉｄｏｎｅ−Ｉｏｄｉｎｅ  Ｐｒｅｐ  Ｐａｄ：Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅｓ
・カタログ番号Ｂ４０６００
・マウスの準備
・マウスは６週齢とする。
・マウスの到着後、３〜５日の馴化期間を設ける。
・マウスの右後方側腹部を剃毛する。
【０４４５】
注射の準備
・マウスの接種領域をヨウ素パッド、次いで、エタノールパッドで清浄化および消毒する。
・１ｃｃシリンジおよび２５ゲージ針を使用する。
・プランジャーを抜き、細胞を混合し、１００μｌの細胞をシリンジに入れ、プランジャーを注意深く挿入する。
・細胞をマウスの右後方側腹部の皮下に（ｓ．ｃ．）注射する。
・腫瘍増殖評価
・腫瘍を測定するために、腫瘍辺縁を容易に見出せるように柔毛を７０％エタノールで湿らせる。腫瘍サイズおよび体重を２〜３日ごとに測定する。
・腫瘍サイズをデジタルカリパスで測定し、体積を以下のように決定する：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長さ）×（幅）２／２
・ヒトＰＢＭＣの静脈内投与
・ヒトＰＢＭＣ投与は、腫瘍が平均体積およそ１００ｍｍ３に達した際の１週間後に開始できる。
【０４４６】
材料：
・新鮮なヒトＰＢＭＣ：Ａｌｌｃｅｌｌｓ、カタログ番号Ｃ−ＰＢ１０２−３Ｂ２
・Ａｔｔａｃｈｅｄ  Ｎｅｅｄｌｅ  ２５Ｇ５／８を備えた１ｍＬツベルクリンシリンジ：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号３０５５５４
・ＰＤＩ（商標）Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｐｒｅｐ  Ｐａｄｓ：Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅｓ、カタログ番号  Ｂ３３９
・ＰＤＩ（商標）Ｐｏｖｉｄｏｎｅ−Ｉｏｄｉｎｅ  Ｐｒｅｐ  Ｐａｄ：Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅｓ、カタログ番号Ｂ４０６００
・ガーゼスポンジ：Ｃｏｖｉｄｉｅｎ、カタログ番号４４１２１１
・マウス・テール・イルミネーター・レストレーナー：Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＴＩ  ＳＴＤ
・ＰＢＭＣの調製
・新鮮なヒトＰＢＭＣは、一晩の輸送によりＡｌｌｃｅｌｌｓから購入する。
・細胞を１４００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞ペレットを得る。
・細胞を１×ＤＰＢＳ溶液で洗浄し、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞ペレットを得る。
・細胞を氷冷ＰＢＳにＩｎ  Ｖｉｖｏ注射のための濃度（２０ｅ７／ｍｌ）で再懸濁させる。
・１ｃｃシリンジおよび２５ゲージ針を使用する。
・プランジャーを抜き、細胞を混合し、１００μｌの細胞をシリンジに入れ、プランジャーを注意深く挿入する。
・細胞を氷上で維持する。
・尾静脈注射
・マウスを白熱灯で温める。
・マウスをテール・イルミネーター・レストレーナーで拘束する。
・静脈を可視化するために尾をやや回転させる。
・注射部位をヨウ素パッド、次いで、エタノールパッドで清浄化および消毒する。
・針をやや角度をもって静脈に挿入し、細胞を注入する。
・針を抜き、出血が止まるまでガーゼスポンジで軽く圧迫する。
・動物をケージに戻し、出血が再開していないことを確認するために５〜１０分間観察する。
【０４４７】
治療抗体の投与
・ヒトＰＢＭＣ注射の１〜３日後に、マウスに腹腔内注射により抗体を投与する。
【０４４８】
材料：
・完全ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照：Ｅｕｒｅｋａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、カタログ番号ＥＴ−９０１（前臨床グレード）  ロット番号１５−７２６  有効期限：２０１７年２月
・イピリムマブ（ヤーボイ）：Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  ＮＤＣ  ０００３−２３２７−１１、ロット番号９２１８７３  有効期限：２０１５年４月；ロット番号４Ｈ６９４９０、有効期限：２０１６年５月
・完全ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照：Ｅｕｒｅｋａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、カタログ番号ＥＴ−９０４（前臨床グレード）  ロット番号１５−７２６  有効期限：２０１７年２月
・抗ヒトＩＣＯＳ  Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ
・ペンブロリズマブ（キートルーダ）：Ｍｅｒｃｋ、ＮＤＣ  ０００６−３０２６−０２、ロット番号  Ｌ０１０５９２、有効期限：２０１６年４月２６日
・腹腔内注射：
・投与する１００μｌをシリンジおよびニードルに吸い取る。
・針のベベルをシリンジ上の数字に揃える。
・利き腕でない手で動物を十分に拘束する。
・針の侵入点：膝のすぐ上の腹部を横切る仮想線を描き、この線に沿って動物の右側の正中付近に針を挿入する。これが雌の場合には、侵入点は最後の乳頭の頭側、やや中央よりであることが分かるであろう。
・マウスは、頭部がその後方末端より低くなるように、頭部がやや地面に向かうように傾斜させる。
・腹部に約３０°の角度で針を挿入する。
・針のシャフトは約５ミリの深さまで侵入すべきである。
・注射後、針を抜き、マウスをケージに戻す。
・血液および腫瘍のサンプリング
・材料：
・Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ  ＣＢ３００（血清）：Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＶ−ＣＢ３００１６４４０
・Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ  ＣＢ３００（血液学／カリウムＥＤＴＡ）：Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＶ−ＣＢ３００１６４４４
・血液：
・マウスは、週１回、尾静脈採血した。
・３０μｌの血液をフローサイトメトリー分析用にＭｉｃｒｏｖｅｔｔｅ  ＣＢ３００（血液学／カリウムＥＤＴＡ）に採取した。
・さらに３０μｌの血液を血清用Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ  ＣＢ３００に採取し、室温で２時間インキュベートして凝固させた後、血清を採取するために２０００ｘｇで遠心分離した。血清はさらなる分析まで−２０で保存した。
【０４４９】
腫瘍：
・腫瘍サイズが２０００ｍｍ３に達した際にマウスを安楽死させた。腫瘍を回収し、以下の手順で処理した。
【０４５０】
試験計画
試験は総て、上記に列挙された手順に従って準備した。
【０４５１】
Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ用量応答
本試験は、Ａ２０５８黒色腫を移植したヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおけるＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥの用量依存的活性を決定するように計画された。１群当たりマウス１０個体の９群とマウス７個体の１つの対照群（腫瘍のみでＰＢＭＣ無し）を各試験に割り付けた。ドナー番号７１２９由来のヒトＰＢＭＣを用いた用量応答の処置計画の概要を表１１に示す。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥは０．０４、０．４、１．２および４ｍｇ／ｋｇで投与した。イピリムマブは３ｍｇ／ｋｇで投与し、抗ＩＣＯＳアゴニストのＦｃ無効変異体は１ｍｇ／ｋｇで試験した。試験群をビヒクルおよびマッチするアイソタイプ対照群と比較して評価した。生存分析は４９日目の試験の終了時に行った。
【０４５２】
【表１３】
2020079252.tif 000036
【０４５３】
Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥをイピリムマブおよびペンブロリズマブと組み合わせて用いた場合の有効性および薬力学的（ＰＤ）活性試験
試験の目的：
Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ単剤療法の抗腫瘍活性を評価するために、０．０４ｍｇ／ｋｇおよび０．４ｍｇ／ｋｇで投与した。
【０４５４】
Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥの抗腫瘍活性を評価するために、マッチするアイソタイプ対照を用い、イピリムマブまたはペンブロリズマブと組み合わせて投与した。
【０４５５】
Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥの以降の薬力学的活性試験のための組織回収。各群マウス１０個体の合計２２の処置群をこの試験に割り付けた。群１〜１６は有効性コホートとし、１７〜２２は薬力学的活性コホートとした。
【０４５６】
組合せ処置については、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ（０．０４もしくは０．４ｍｇ／ｋｇ）とイピリムマブもしくはＩｇＧ１（３ｍｇ／ｋｇ）またはＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ（０．０４もしくは０．４ｍｇ／ｋｇ）とペンブロリズマブもしくはＩｇＧ４（５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥとイピリムマブならびにマッチするアイソタイプ対照は週２回６用量を投与し、ペンブロリズマブおよびアイソタイプ対照は、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ投与の終了まで５日ごとに投与した。薬力学的組織採取コホートについては、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥを０．００４、０．０４、０．４および１．２ｍｇ／ｋｇで投与した。処置群をビヒクル群およびアイソタイプ対照群と比較して評価した。ドナー番号６７１１由来のヒトＰＢＭＣを用いた、ビヒクル、アイソタイプおよびＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ単独およびイピリムマブおよびペンブロリズマブとの組合せの処置群を表１２に示す。分析は、５９日目の試験の終了時に結論付けた。
【０４５７】
【表１４】
2020079252.tif 000037
2020079252.tif 000038
【０４５８】
イピリムマブまたはペンブロリズマブと組み合わせて投与したＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥを評価する有効性試験
この試験は、Ａ２０５８黒色腫モデルを用い、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおいて、マッチするアイソタイプ対照を用い、イピリムマブまたはペンブロリズマブと組み合わせたＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ（０．０１および０．０４ｍｇ／ｋｇで投与）の抗腫瘍有効性を評価するように計画された。１群当たりマウス１０個体の合計１３群をこの試験に割り付けた。群２は、ヒト化ＩｇＧ１およびＩｇＧ４のアイソタイプ対照を合わせたものであった。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥは単剤として０．０１ｍｇ／ｋｇ（群１２）および０．０４ｍｇ／ｋｇ（群１３）で投与した。組合せ処置については、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ（０．０１および０．０４ｍｇ／ｋｇ）とイピリムマブまたはＩｇＧ１（３ｍｇ／ｋｇ）またはＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ（０．０１および０．０４ｍｇ／ｋｇ）とペンブロリズマブまたはＩｇＧ４（５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥおよびイピリムマブならびにマッチするアイソタイプ対照は、週２回６用量を投与し、ペンブロリズマブおよびアイソタイプ対照は、Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ投与の終了まで５日ごとに投与した。ドナー番号４５６８由来のヒトＰＢＭＣを用いた処置群の概要を表１３に示す。処置群は、ビヒクル群およびアイソタイプ対照群と比較して評価した。生存分析は、３３日目の試験の終了時に結論付けた。
【０４５９】
【表１５】
2020079252.tif 000039
【０４６０】
統計分析
生存分析のイベントは、腫瘍体積＞２０００ｍｍ３、腫瘍の潰瘍化、マウス体重減少＞２０％、瀕死または死亡の発見のいずれか早いものとした。カットオフ体積までの正確な時間は、対数腫瘍体積と２回の観察日（カットオフ体積を超えた最初の観察およびカットオフ体積の直前の一観察）の間に直線を当てはめることによって評価した。所与の時点における異なる処置群の生存確率を評価するためにカプラン・マイヤー（ＫＭ）法を行った。エンドポイントまでの中央時間およびその対応する９５％信頼区間を報告した。その後、任意の２群の間でＫＭ生存曲線が統計的に異なるかどうかをログランク検定により検定した。
【０４６１】
各群１０個体の動物が存在した最終日（すなわち、動物を安楽死させる前）からの腫瘍体積データを用いて、異なる処置群の間の腫瘍体積比較を行った。異なる処置群における分散が均等でないために、分析前に腫瘍体積を自然対数変換した。次いで、この対数転換データに対してＡＮＯＶＡとその後のペアワイズ比較を行った。
【０４６２】
腫瘍増殖および体重データをプロットするために、グラフパッド・プリズムソフトウエアを使用した。
【０４６３】
結果
Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ用量応答（図２０Ａ）
腫瘍増殖阻害：
対照群：ヒトＰＢＭＣ（ドナー７１２９）は、ＮＳＧマウスにおけるＡ２０５８腫瘍増殖に効果を示さなかった。ヒトＰＢＭＣを含むまたは含まないＡ２０５８担癌マウス、ビヒクルおよびアイソタイプ対照抗体で処置したヒトＰＢＭＣを含むＡ２０５８担癌マウスは、腫瘍を発達させ、予想通りの進行を示した（群番号１対群番号１０、群番号１対群番号２、群番号１対群番号４、ｐ＝１）。
【０４６４】
３ｍｇ／ｋｇでのイピリムマブ処置（群番号３）は、ビヒクル対照である群番号１と比べて有意な腫瘍増殖阻害（ｐ＜０．０３）を示したが、アイソタイプ対照である群番号２と比較した場合には統計的有意性は失われた（ｐ＜０．２２）。これは、アイソタイプ抗体が腫瘍増殖に影響を及ぼし得ることを示した。
【０４６５】
０．４ｍｇ／ｋｇでのＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ処置は、他の用量に比べて腫瘍増殖阻害およびマウスの生存期間の増大の傾向を示したが、それらの影響は、ビヒクルまたはアイソタイプ対照のいずれと比較しても統計的に有意でなかった。
【０４６６】
臨床所見：
マウスにおける体重減少は試験中に見られ、試験の終了時ではおよそ２０％であった。ＧｖＨＤおよび腫瘍量の両方がマウスの体重の低下をもたらし得ることが報告されているが、ＰＢＭＣ移植が行われていない担癌マウス（群番号１０）も同じ傾向を示したことから、本試験では、体重減少はＡ２０５８腫瘍により関連があると思われる。試験中に、アイソタイプ対照群を含め、複数の腫瘍で腫瘍の潰瘍化が見られた。
【０４６７】
マウスの運命：
ほとんどのマウスは、腫瘍が体積＞２０００ｍｍ３に達した際に除かれた。３個体のマウスは、腫瘍の潰瘍化のために安楽死させ、また３個体のマウスは、＞２０％の体重減少のために安楽死させた。９個体のマウスは、ビヒクル群の２個体、およびアイソタイプ対照群の合計３個体を含め、群間にランダムに死亡が見られた。これらの死亡は移植片対宿主病の病態モデルの感受性に帰因するものであり、ビヒクルまたはアイソタイプ対照群に比べて処置群で何のパターンも見られなかったことから、処置に関連するものではなかった。
【０４６８】
Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥをイピリムマブおよびペンブロリズマブと組み合わせて用いた場合の有効性試験
腫瘍増殖阻害：
対照群：ビヒクルまたはアイソタイプ対照抗体で処理したヒトＰＢＭＣを含むＡ２０５８担癌マウスは腫瘍を発達させ、予想通りに成長した。
【０４６９】
単剤療法：
３ｍｇ／ｋｇでのイピリムマブ処理とＩｇＧ４の組合せ（群番号３）は、ビヒクル対照である群番号１に比べて有意な腫瘍増殖阻害（ｐ＜０．０４）をもたらした。しかしながら、アイソタイプ対照である群番号２と比べた場合には、この統計的有意性は失われた（ｐ＜０．２３）。
【０４７０】
２．５または５ｍｇ／ｋｇでのペンブロリズマブ処置単独（群番号１３、１４）は、ビヒクルまたはアイソタイプ対照である群番号１２と比べた場合に統計的有意性はないが、観察可能な腫瘍増殖阻害を示した。ビヒクル対照である群番号１と比べた場合、ペンブロリズマブとＩｇＧ１の組合せ（群番号４）は、統計的有意性はないものの観察可能な腫瘍増殖阻害を示したが、生存期間には有意な増大が見られた（ｐ＜０．０４）。アイソタイプ対照である群番号２と比べた場合には、統計的有意性は失われた（ｐ＜０．４）。
【０４７１】
０．４ｍｇ／ｋｇでのＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ処置単独（群番号１５）は、ビヒクルまたはアイソタイプ対照である群番号１２に比べて統計的有意性はないが、観察可能な腫瘍増殖阻害を示した。０．０４または０．４ｍｇ／ｋｇのＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥとＩｇＧ１の組合せ（群番号５および６）は、統計的有意性に達しなかったが、観察可能な腫瘍進行の遅延およびマウス生存期間を示した。
【０４７２】
組合せ処置：
Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ（０．０４または０．４ｍｇ／ｋｇ）とイピリムマブ（３ｍｇ／ｋｇ）の組合せ。群番号８および９は、イピリムマブ単独（群番号３）に比べて付加的な腫瘍増殖阻害を示さなかった。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ（０．０４または０．４ｍｇ／ｋｇ）とペンブロリズマブ（５ｍｇ／ｋｇ）組合せである群番号１０および１１は、ペンブロリズマブ単剤療法である群番号４、またはＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ単剤療法である群番号５および６に比べて、有意ではないがそこそこの腫瘍増殖阻害およびマウス生存期間を示した。
【０４７３】
臨床所見：
試験中に見られたマウスの体重減少はおよそ２０％であった。腫瘍の潰瘍化は、試験中、大多数の群の複数の腫瘍で明らかであった。
【０４７４】
マウスの運命：
１６０個体のうち合計１００個体のマウスが、腫瘍体積が＞２０００ｍｍ３に達した際に安楽死された。２９個体のマウスが腫瘍の潰瘍化のために安楽死され、１８個体のマウスに死亡が見られ、１２個体のマウスが体重減少＞２０％のために安楽死され、１個体のマウスは瀕死として安楽死された。マウスは、アイソタイプ対照である群番号２を含め、群にわたって死亡が見られた。これらの死亡は移植片対宿主病の病態モデルの感受性に帰因し、アイソタイプ対照群に比べて処置群で何のパターンも見られなかったことから、処置に関連するものではなかった。
【０４７５】
イピリムマブまたはペンブロリズマブと組み合わせて投与したＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥを評価する有効性試験（図２０Ｃ）
腫瘍増殖遅延：
対照群：ビヒクルまたはアイソタイプ対照抗体で処理したヒトＰＢＭＣを含むＡ２０５８担癌マウスは腫瘍を発達させ、予想通りに成長した。
【０４７６】
単剤療法：
３ｍｇ／ｋｇのイピリムマブ処置とＩｇＧ４の組合せ（群番号３）は、ビヒクル対照である群番号１に比べて、有意な腫瘍増殖阻害（ｐ＜０．０２）および生存期間の有意な増大（ｐ＜０．０１）を示した。しかしながら、アイソタイプ対照である群番号２に比べて、腫瘍増殖阻害は有意に達せず（ｐ＜０．１３）、一方、マウス生存期間の有意な増大は維持された（ｐ＜０．０４）。
【０４７７】
５ｍｇ／ｋｇのペンブロリズマブ処置とＩｇＧ１の組合せ（群番号４）は、ビヒクルまたはアイソタイプ対照である群番号２に比べて、統計的有意性はないが腫瘍増殖阻害を示した。
【０４７８】
０．０１ｍｇ／ｋｇまたは０．０４ｍｇ／ｋｇのＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ処置単独（群番号１２および１３）は、ビヒクル対照である群番号１に比べて有意な腫瘍増殖阻害（ｐ＜０．０３）を示した。０．０４ｍｇ／ｋｇで投与したＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥはまた、ビヒクル対照である群番号１に比べて、マウス生存期間に有意な増大（ｐ＜０．０４８）を示した。しかしながら、アイソタイプ対照である群番号２と比べた場合には、腫瘍増殖阻害および生存期間は群番号１２および１３に対して統計的有意性には達しなかった。０．０１ｍｇ／ｋｇのＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥとＩｇＧ１の組合せ（群番号５）は、ビヒクル対照である群番号１に比べて、有意な腫瘍増殖阻害（ｐ＜０．０３）およびマウス生存期間（ｐ＜０．０３）を示した。しかしながら、アイソタイプ対照である群番号２と比べた場合には、腫瘍増殖遅延および生存期間は統計的有意性に達しなかった。０．０４ｍｇ／ｋｇのＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥとＩｇＧ１の組合せ（群番号６）は、観察可能な腫瘍増殖阻害およびマウス生存期間を示したが、統計的有意性には達しなかった。
【０４７９】
組合せ処置：
Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥとイピリムマブの組合せ（０．０１ｍｇ／ｋｇおよびイピリムマブ３ｍｇ／ｋｇ；群番号８）は、観察可能な腫瘍増殖阻害およびマウス生存期間を示したが、統計的有意性には達し得なかった。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥとイピリムマブの組合せ（０．０４ｍｇ／ｋｇおよびイピリムマブ３ｍｇ／ｋｇ；群番号９）は、ビヒクル対照である群番号１またはアイソタイプ対照である群番号２に比べて（ｐ＜０．０２）、有意な腫瘍増殖阻害（ｐ＜０．００）および有意なマウス生存期間の増大（ｐ＜０．０４）を示した。しかしながら、アイソタイプ対照と比べた場合には、生存期間は統計的有意性に達し得なかった。組合せ活性は、単剤療法イピリムマブの群番号３またはＨ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ単剤療法群に比べて、有意には達しなかった。
【０４８０】
Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ（０．０１ｍｇ／ｋｇまたは０．０４ｍｇ／ｋｇ）とペンブロリズマブ（５ｍｇ／ｋｇ）の組合せである群番号１０および１１は、ビヒクル対照である群番号１と比べた場合、有意な腫瘍増殖阻害（ｐ≦０．０３）および有意なマウス生存期間の増大（ｐ＜０．０３）を示した。アイソタイプ対照である群番号２と比べた場合、０．０４ｍｇ／ｋｇのＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥとペンブロリズマブの組合せにおいて腫瘍増殖阻害の有意性を維持した（ｐ＜０．０３）。しかしながら。生存利益は統計的有意性に達し得なかった。この組合せは単剤療法処置群ペンブロリズマブである群番号３またはＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥである群番号５もしくは６のいずれと比べても、有意には達し得なかった。よって、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥとペンブロリズマブ（０．０１または０．０４ｍｇ／ｋｇおよびペンブロリズマブ５ｍｇ／ｋｇ）の組合せは、腫瘍増殖阻害およびマウス生存期間の増大を示したが、アイソタイプ対照または単剤療法に比べて統計的有意性には達し得なかった。
【０４８１】
臨床所見：
試験中に見られたマウスの体重減少はおよそ２０％であった。試験中、大多数の群に腫瘍の潰瘍化が見られた。
【０４８２】
マウスの運命：
合計９１個体のマウスが＞２０００ｍｍ３の腫瘍サイズのために安楽死され、３４個体のマウスが腫瘍の潰瘍化のために安楽死され、５個体のマウスに死亡が見られた。これらの死亡は、移植片対宿主病の病態モデルの感受性に帰因した。
【０４８３】
考察
単剤療法としての、またペンブロリズマブならびにイピリムマブとの組合せとしてのＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥの有効性を、Ａ２０５８黒色腫を有するヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスモデルで評価した。ヒトＰＢＭＣが生体免疫不全ＮＳＧ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ）マウスに静注されるこのモデルは、Ｈｕ−ＰＢＭＣ  ＮＳＧモデルとして知られる。それは移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を誘発し、エフェクターおよびメモリーＴ細胞の活性を調べるために用いられている。Ｈｕ−ＰＢＭＣ  ＮＳＧモデルの皮下にヒト癌細胞株Ａ２０５８を移植して、腫瘍増殖に対するヒト免疫療法抗体の効果を調べた。このモデルの制限には、ＧｖＨＤ症状の発症、体重の減少、および高頻度の腫瘍の潰瘍化が含まれ、同系マウス腫瘍モデルで可能な時間より長時間、生存期間の監視ができない。
【０４８４】
０．０４ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇの範囲の用量でＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥを評価する初期試験では、より下方の範囲の用量ほど小さい腫瘍増殖阻害を示すことが示された。０．０４〜０．４ｍｇ／ｋｇの範囲の用量群では、腫瘍進行の遅延およびマウスの生存期間の増大が見られたが、アイソタイプ対照群と比べた場合に統計的に有意でなかった。これらの試験に基づき、２名の異なるドナー（ドナー番号４５６８および６７１１）からのＰＢＭＣグラフトを用いた２つの試験で、単独およびペンブロリズマブおよびイピリムマブとの組合せをさらに評価するために、０．０４〜０．４ｍｇ／ｋｇのＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ用量を選択した。行った２つの組合せ試験のうちの１つで、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ単剤療法およびペンブロリズマブとの組合せに対して低い応答が見られた。ＰＢＭＣドナー４５６８を用いた組合せ試験（表１３、図２０Ｃ）は単剤療法および組合せの抗腫瘍活性を示したが、ＰＢＭＣドナー６７１１を用いた試験（表１２、図２０Ｂ）は、有意な抗腫瘍効果を示さず、これは、試験間のドナーＰＢＭＣの違いの結果であった可能性があり、これは臨床で見られ得る患者応答変動を反映している。ＰＢＭＣドナー４５６８を用いたこの第２の組合せ試験では、いずれかの薬剤単独に比べて組合せ群で腫瘍増殖阻害の増強およびマウスの生存期間の増大が見られたが、この違いは統計的に有意でなかった。しかしながら、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ  ０．０４ｍｇ／ｋｇ用量とペンブロリズマブ５ｍｇ／ｋｇの組合せは、アイソタイプ対照群（ｐ≦０．０５）に比べて、初回用量の１０日後に腫瘍体積の統計的に有意な低下および生存期間の増大をもたらしたが、単剤療法はもたらさなかったことから、組合せの相乗作用が見られた。実際に、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥとペンブロリズマブの組合せ群のマウスの５０％は３３日目まで試験に残っていたが、腫瘍の潰瘍化のために除かれた４個体のマウスだけがこの組合せ群から腫瘍体積のために試験から除かれたが、ペンブロリズマブおよびアイソタイプ群では、８〜９個体のマウスが試験から除かれた。
【０４８５】
抗ＰＤ１療法は、同位体処置コホートに比べてペンブロリズマブ処置コホートで見られた腫瘍増殖および生存期間における限定された変化に見られるように、このモデルでは統計的に有意な活性を示さなかった。イピリムマブ単剤療法は、両試験でペンブロリズマブよりもやや良好な腫瘍増殖阻害傾向を示し、応答性のＰＢＭＣドナー４５６８を用いた第２の組合せ試験でアイソタイプに比べて生存期間に統計的に有意な増加を示した（ｐ≦０．０４）。Ｈ２Ｌ５ｈＩｇＧ４ＰＥ  ０．０１ｍｇ／ｋｇ用量とイピリムマブ３ｍｇ／ｋｇの組合せは、イピリムマブに比べて生存期間に有意な増大を示したが（ｐ≦０．０２）、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥ単剤療法と比べた場合にはそうではなかった。このモデルにおいていずれかの薬剤単独に比べてＨ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥとイピリムマブの組合せでは、腫瘍体積に付加的に有意な効果は見られなかった。運命表で報告されたように、およびアイソタイプ対照群を含めて総ての処置群のマウスに死亡が見られた。これらの死亡は移植片対宿主病の病態モデルの感受性に帰因し、処置に関連するものではなかった。
【０４８６】
実施例１２：ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗マウスＩＣＯＳアゴニスト抗体単独および抗ＰＤ１および抗ＣＴＬＡ−４抗体との組合せの機能活性
ＣＴ２６およびＥＭＴ６同系マウス腫瘍モデル
ＣＴ２６マウス結腸癌腫マウス腫瘍モデル
方法
本試験は、試験の開始前にＧＳＫ所内動物実験委員会により承認されたプロトコール下で行われた。
【０４８７】
動物
本試験では、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙからの１６４個体の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。マウスは、接種を受けた試験開始時に６〜８週齢であった。
【０４８８】
細胞培養および接種
ＣＴ−２６細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−２６３８）（３×１０６細胞；Ｐ−１１）のバイアル１本を−１４０℃から解凍し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩに播種した。細胞を１０日にわたって３回継代培養した。継代培養の際、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて培養フラスコからの細胞の剥離を助けた。細胞を回収し、２回洗浄し、ＦＢＳ不含のＲＰＭＩに５×１０５細胞／ｍｌで再懸濁させた。マウスの右後方側腹部に０．１ｍｌの細胞（５×１０４細胞／マウス）を皮下接種した。
【０４８９】
細胞回収および接種の当日に、細胞計数はＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｖｉ−ｃｅｌｌ  ＸＲで行い、血球計により確認した。トリプシン／ＥＤＴＡを用いて細胞をフラスコから剥離し、２回洗浄し（１回目はＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで、２回目はＲＰＭＩのみで）、１０ｍｌのＲＰＭＩに再懸濁させた。１７８×１０６細胞を２０ｍｌのＲＰＭＩに回収し、生存率は９８．８％であった。１．６８５ｍｌの細胞懸濁液（合計１５×１０６細胞）を２８．３１５ｍｌのＲＰＭＩに加えた。
１５×１０６細胞／３０ｍｌ培地＝５×１０５細胞／ｍｌ。これは５×１０４細胞／１００μｌに等しい。
【０４９０】
抗体製剤および調製
投与当日に、抗体をストックソースバイアルから無菌０．９％生理食塩水で目的の濃度に希釈した。抗ＩＣＯＳアゴニストクローンＣ３９８．４は０．０５ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇで試験した。各用量はまた、抗ＰＤ１  １０ｍｇ／ｋｇおよび抗ＣＴＬＡ−４  １ｍｇ／ｋｇの両方とともに試験した。
【０４９１】
試験プロトコール
腫瘍のモニタリングおよび投与
０日目にマウスに接種した。１１日目に体重および腫瘍体積を測定した。マウスを腫瘍サイズに基づき１０個体／群で、表１４に示される１２の試験群に無作為化した。無作為化はＳｔｕｄｙｌｏｇ  Ｓｔｕｄｙ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒソフトウエアを用いて行った。試験計画チャートに基づき、無作為化日に開始して週２回マウスに投与を行い、合計６用量を継続した。投与は、１００μｌ容量の０．９％生理食塩水ビヒクルで腹腔内（ＩＰ）とした。腫瘍体積および体重は、試験中、週３回測定した。
【０４９２】
エンドポイント
マウスは、腫瘍体積が２０００ｍｍ３より大きくなった際に腫瘍量試験から除いた。腫瘍体積は、長さと幅のカリパス測定値を下式：ＴＶ＝０．５２＊Ｌ＊Ｗ２に当てはめることにより計算した。
【０４９３】
加えて、腫瘍が開放潰瘍に発達した際にもマウスを試験から除いた。試験中、潰瘍が見られたが、痂皮のある単独潰瘍は、それが開放穿孔を形成していたとしてもエンドポイントとしなかった。
【０４９４】
本試験ではいずれのマウスにも適用しなかったが、試験の最初に確立される第３のエンドポイントが２０％の体重減少であった。
【０４９５】
薬物および材料
【表１６】
2020079252.tif 000040
【０４９６】
総ての抗体を０．９％生理食塩水で目的の濃度に希釈し、生理食塩水をビヒクル対照として用いた。
【０４９７】
データ分析
生存分析のイベントは、腫瘍体積＞２０００ｍｍ３または腫瘍の潰瘍化のいずれか早いものとする。カットオフ体積までの正確な時間は、対数腫瘍体積と２回の観察日（カットオフ体積を超えた最初の観察およびカットオフ体積の直前の一観察）の間に直線を当てはめることによって評価した。所与の時点における異なる処置群の生存確率を評価するためにカプラン・マイヤー（ＫＭ）法を行った。エンドポイントまでの中央時間およびその対応する９５％信頼区間を報告した。その後、任意の２群の間でＫＭ生存曲線が統計的に異なるかどうかをログランク検定により検定した。
【０４９８】
異なる処置群間の初回投与１７日後の腫瘍体積を比較した。異なる処置群における分散が均等でないために、分析前に腫瘍体積を自然対数変換した。次いで、この対数転換データに対してＡＮＯＶＡとその後のペアワイズ比較を行った。
【０４９９】
【表１７】
2020079252.tif 000041
【０５００】
生存分析によるイベントまでの日の比較および処置群間の１０日目の対数変換腫瘍体積の比較からの生のｐ値ならびに偽陽性率(false discovery rate)（ＦＤＲ）で補正したｐ値を上の表に示す。比較は、ＦＤＲ補正ｐ値≦０．０５を用い、統計的に有意であることが宣言される。
【０５０１】
結果
マウス運命の追跡は、その数のマウスが腫瘍量および腫瘍の潰瘍化のために試験から除かれたことを示した。腫瘍体積５７９．１６ｍｍ３であるＧ７の１個体のマウスを除き、残ったマウスは総て、試験の６１日目で腫瘍不含である。
【０５０２】
生存（エンドポイントまでの時間）について、群９および１２は、ビヒクル対照群に比べて生存期間に有意な増大を示した（それぞれｐ＝０．００８およびｐ＝０．００１）。群１２は、群２、４、および５に比べて（ｐ＝０．００６、０．００１、０．０２）、統計的に有意に延長された生存期間を示した。しかしながら、いずれかの単剤療法に比べて統計的に有意な（ｐ＜０．０５）生存期間の増大を示した組合せ群は無かった（図２１）。
【０５０３】
考察
併用療法群、特に、高用量の抗ＩＣＯＳと抗ＰＤ１の組合せ（群１２）は、単剤療法およびアイソタイプ対照群に比べて腫瘍増殖阻害および生存期間の増大を示したが、６１日目に統計的有意性に達しなかった。群１２に対するアイソタイプ対照は、ラットＩｇＧ２ａ＋ハムスターＩｇＧである群３であった。比較のための単剤療法群は、ＩＣＯＳ  １０μｇ（群６）およびＰＤ１  ２００μｇ（群８）である。群３の１個体、群６の１個体、および群８の１個体に比べて、群１２では合計５個体のマウスが腫瘍不含として残った。生存利益は、各マウスが所定の試験エンドポイントのいずれかに達した日を考慮することにより定量化した。何個体かのマウスは、腫瘍量によるのではなく、開放腫瘍潰瘍のために試験から除かれた。
【０５０４】
高用量のＩＣＯＳ＋ＣＴＬＡ−４組合せ群（群１０）では、多数のマウスが腫瘍の潰瘍化のために３日目までに除かれ、このことがこの組合せがもたらした生存利益および抗腫瘍利益を覆い隠した可能性がある。この群では、５個体のマウスが腫瘍の潰瘍化のために除かれ、２０００ｍｍ３に達する腫瘍量のために除かれたのは２個体だけであった。腫瘍の潰瘍化のために除かれた腫瘍は総て、試験を離脱した際にはまだ小さく、これらのマウスにおいて、腫瘍の潰瘍化は、療法により誘導された抗腫瘍免疫応答の結果であったのではないかと予想される。この群で３個体のマウスが６１日目に腫瘍不含を維持した。腫瘍量のために除かれたマウス２個体は、総ての群の、腫瘍量のために除かれたマウスの最低数であった。
【０５０５】
ＥＭＴ６乳癌マウス腫瘍モデル
試験プロトコール
本明細書に記載される総ての手順および安楽死の基準は、ＩＡＣＵＣプロトコールＡＵＰ０６０６に従う。動物の体重を測定し、右臀部にマウス当たり１００μｌの１×１０５ＥＭＴ６腫瘍細胞を接種した。接種したマウスの数は、この試験に必要とされるものの少なくとも１３０％に相当する。３０％の失敗率（試験の開始時に大きすぎるまたは小さすぎる）を仮定すると、目標は各群ｎ＝１０とすることであった。腫瘍細胞の接種の後、腫瘍増殖および全体重を週３回、Ｆｏｗｌｅｒ  “ＰｒｏＭａｘ”デジタルカリパスで４週間以上測定した。抗体は商業的販売者から入手し、０．９％生理食塩水で目的の濃度に希釈した。投与（ｉ．ｐ．）は、無作為化当日（０日目とする、この時、平均腫瘍体積はおよそ１００ｍｍ３、接種およそ７〜８日後）に始し、週２回で合計６用量を行った。無作為化はＳｔｕｄｙｌｏｇ  Ｓｔｕｄｙ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒ  Ｓｕｉｔｅソフトウエアを用いて行った。式（腫瘍体積＝Ｌ＊Ｗ２＊０．５２）を用いて腫瘍体積を決定するために、腫瘍の長さと幅を測定した。個々の動物で腫瘍測定値が２，０００ｍｍ３より大きければ試験から除いた。また、マウスは、体重減少（＞２０％）、腫瘍の潰瘍化、または罹患による他のいずれかの正常なマウス活性の著明な阻害のために試験から除かれる場合がある。
【０５０６】
本試験では、それぞれ表１５に示されるように、マウス１０個体の１３群について所望のサイズ範囲の腫瘍を有する十分なマウスを作出するために、合計１９１個体の動物にＥＭＴ６細胞を接種した。生理食塩水ビヒクルを注射したマウスおよびアイソタイプ対照群を、ＩＣＯＳ、ＰＤ１およびＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ処置マウスに対する対照として用いた。ＩＣＯＳに対するアイソタイプ対照（ハムスターＩｇＧ）は、１０μｇを単独で、また、ＣＴＬＡ−４に対するアイソタイプ（マウスＩｇＧ２ｂ）またはＰＤ−１に対するアイソタイプ（ラットＩｇＧ２ａ）と組み合わせて投与した。抗ＣＴＬＡ−４（９Ｄ９）および抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）に対する単剤療法処置群は、それぞれマウス当たり２０および２００μｇで投与し、ＩＣＯＳアイソタイプ対照と組み合わせて評価した。ＩＣＯＳアゴニストのＣ３９８．４クローンは、マウス当たり１０および１μｇで投与した。ＩＣＯＳアゴニストの有効性はまた、マウス当たり１０および１μｇを抗ＣＴＬＡ−４または抗ＰＤ−１と組み合わせて投与した場合でも評価した。前記濃度でのＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４のさらなる群も陽性対照比較群として含めた。腫瘍体積の統計分析は、無作為化後１３日目に行った。生存分析には、６０日間試験下にあったマウスを含んだ。
【０５０７】
【表１８】
2020079252.tif 000042
【０５０８】
薬物および材料
動物
６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスをＨａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙから受領し、ＩＡＣＵＣ標準に従って飼育した。
【０５０９】
ＥＭＴ６細胞
ＥＭＴ６細胞を解凍し、細胞培養フラスコで、接種前８日間培養した。細胞はこの間、３回継代培養した。接種当日、細胞をフラスコから完全培地に採取した。細胞を遠心分離し、Ｗｅｙｍｏｕｔｈの培地（１５％ＦＢＳ含有）に再懸濁させた。この工程を、ＦＢＳ不含のＷｅｙｍｏｕｔｈの培地で３回繰り返した。細胞密度および生存率をトリパンプルー排除によって確認した。次に、細胞を目的の密度（１×１０６細胞／ｍＬ）に希釈した。
【０５１０】
免疫療法薬
総ての治療薬は、投与当日に０．９％塩化ナトリウムで目的の濃度に希釈し、３０Ｇ針を用いてｉ．ｐ．注射した。治療薬および対照希釈液を以下の表１６に示す。
【０５１１】
【表１９】
2020079252.tif 000043
【０５１２】
データ分析
統計分析
生存分析のイベントは、腫瘍体積２０００ｍｍ３または腫瘍の潰瘍化のいずれか早いものとした。カットオフ体積までの正確な時間は、対数腫瘍体積と２回の観察日（カットオフ体積を超えた最初の観察およびカットオフ体積の直前の一観察）の間に直線を当てはめることによって評価した。所与の時点における異なる処置群の生存確率を評価するためにカプラン・マイヤー（ＫＭ）法を行った。エンドポイントまでの中央時間およびその対応する９５％信頼区間を報告した。その後、任意の２群の間でＫＭ生存曲線が統計的に異なるかどうかをログランク検定により検定した。
【０５１３】
異なる処置群間の初回投与１３日後の腫瘍体積を比較した。異なる処置群における分散が均等でないために、分析前に腫瘍体積を自然対数変換した。次いで、この対数転換データに対してＡＮＯＶＡとその後のペアワイズ比較を行った。ＳＡＳ９．３およびＲ３．０．２分析ソフトウエアを使用した。
【０５１４】
結果
Ｂａｌｂ／ｃマウスに接種を行い、８日後に処置計画に基づいて１０群に無作為化した。治療薬または対照の投与は無作為化当日（０日目）に開始、週２回、３週間続けた。
【０５１５】
生理食塩水処置群は従前のＥＭＴ−６試験に対して予想された速度で腫瘍を成長させた。生理食塩水ビヒクル群のマウスは総て、３０日目までに腫瘍サイズまたは潰瘍化のために安楽死された。ハムスターＩｇＧを単独でまたはラットＩｇＧ２ａまたはマウスＩｇＧ２ｂと組み合わせて処置した場合も、生理食塩水ビヒクル群に比べて平均腫瘍増殖または生存期間に統計的に有意な変化は生じなかった。
【０５１６】
無作為化後１３日目に、ＩＣＯＳ単剤療法群は、アイソタイプ対照に比べて、平均腫瘍増殖に観察可能な変化をほとんど示さなかった。しかしながら、高用量のＩＣＯＳ処置群（１０μｇ）は、低用量群よりも腫瘍増殖阻害が大きい著明な傾向を示した。ＣＴＬＡ−４単剤療法活性に匹敵する効果が見られた。ＰＤ−１  ｍＡｂでの単剤療法処置も、１３日目に、統計的に有意ではないもののいくつかの観察可能な平均腫瘍体積の減少をもたらした。しかしながら、ＩＣＯＳおよびＣＴＬＡ−４単剤療法の場合と同様に、これは、適当なアイソタイプ群と比較した場合、生存期間の増大をもたらさなかった。抗ＰＤ−１と１０μｇ用量での抗ＩＣＯＳ抗体クローンＣ３９８．４の組合せによる処置は、対照および単剤療法処置群に比べてかなりの腫瘍増殖阻害をもたらした（図２２）。この組合せ群の３個体のマウスが、対照または単剤療法処置群を超えるかなりの改善として、完全な腫瘍退縮に至った。しかしながら、使用した統計基準のために、統計的に有意な生存期間の改善には達しなかった。抗ＰＤ−１と１μｇのＩＣＯＳアゴニスト抗体クローンＣ３９８．４の組合せは、１３日目に、生理食塩水ビヒクル対照（ｐ＜０．０５）ならびに１および１０μｇのＩＣＯＳ単剤療法群（ｐ＜０．０５）に比べて、平均腫瘍増殖に統計的に有意な低下をもたらした。処置計画から４個体のマウスが完全な腫瘍退縮に至り、統計的有意性には達し得ないが、著しい生存期間の増大傾向をもたらした。
【０５１７】
両濃度のＩＣＯＳ抗体と抗ＣＴＬＡ−４の組合せは、いずれかの抗体での単剤療法処置に比べて、腫瘍増殖阻害または生存期間に観察可能な利益をほとんど示さなかった。
【０５１８】
考察
アイソタイプ対照は、生理食塩水ビヒクル群に比べて、平均腫瘍体積または全生存期間に著明な変化をもたらさなかったが、ハムスターＩｇＧ群（群４）およびハムスターＩｇＧおよびラットＩｇＧ２ａ（群３）には、腫瘍増殖の遅延を示した個々の動物が存在した。ハムスターＩｇＧとラットＩｇＧ２ａアイソタイプ群では、１個体のマウスが最後の生理食塩水ビヒクルマウスを超えて生存し、３６日目に、体積１１５６．５６ｍｍ３と測定された腫瘍による潰瘍化のために犠牲にされた。ハムスターＩｇＧ群の２個体のマウスは、生理食塩水群より長期間生存した。１個体は３６日目に腫瘍サイズのために、もう１個体は１４日目に１８９９．２８ｍｍ３の測定値を持つ潰瘍のために安楽死された。
【０５１９】
抗ＰＤ−１と１０μｇの抗ＩＣＯＳアゴニストの投与計画は、腫瘍増殖の観察可能な阻害をもたらし、１３日目に、アイソタイプ対照に比べて、腫瘍体積に低下を生じたが、抗ＰＤ−１単剤療法と比べた場合にはこの差はほとんど明らかでなかった。しかしながら、この組合せは、合計５個体の動物が抗ＰＤ−１単剤療法群のいずれをも超えて生存するという結果をもたらし、抗ＰＤ−１単剤療法群では存在しなかったのに対して３個体のマウスが完全な腫瘍退縮にあずかった。
【０５２０】
抗ＰＤ−１と１μｇ用量のＩＣＯＳアゴニスト抗体の組合せは、１３日目に、アイソタイプ対照および各単剤療法群に比べて、平均腫瘍サイズに観察可能な低下をもたらした。この低下は、生理食塩水ビヒクル対照（ｐ＜０．０５）および１μｇ  ＩＣＯＳ単剤療法群（ｐ＜０．０５）と比べた場合に統計的に有意であった。４個体のマウスが完全な腫瘍退縮にあずかり、ＰＤ−１単剤療法群のいずれをも超えて生存した。
【０５２１】
ＩＣＯＳ＋ＰＤ１の組合せ群で見られた生存利益は、６０日目までに対照に比べて統計的有意性に達したとは判明しなかった。しかしながら、ＩＣＯＳ＋ＰＤ１の組合せ処置群の腫瘍増殖阻害および生存利益は、ＰＤ１＋ＣＴＬＡ−４の組合せ群（本試験での抗腫瘍活性に関する陽性対照と考えられる）で見られた活性に匹敵した。このことは、ＩＣＯＳとＰＤ１抗体の組合せが、いくつかの腫瘍種で有意な臨床活性を示しているＣＴＬＡ−４とＰＤ１の組合せと同等の利益を持ち得ることを示唆する。
【０５２２】
本試験に登録された１３０個体のマウスのうち、１２個体が６０日目に生残し、うち１１個体は完全な腫瘍退縮を達成した。試験から除くエンドポイントに相当した１１８個体のマウスのうち、１１１個体は腫瘍サイズが２０００ｍｍ３に達したために除かれた。残りの７個体のマウスは、腫瘍における潰瘍化のために安楽死された。潰瘍化の発生はその群間に散発した。群１（生理食塩水）、３（ハムスターＩｇＧとラットＩｇＧ２ａ）、４（ハムスターＩｇＧ）、６（１μｇ  ＩＣＯＳ）、および１０（ＣＴＬＡ−４と１μｇ  ＩＣＯＳ）は総て、潰瘍化のために除かれた１個体を含んだ。群１３（ＣＴＬＡ−４＋ＰＤ−１）は、潰瘍化のために犠牲にされた２個体を示した。残りの群には、潰瘍化のために除かれた動物はいなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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