(57)【要約】【課題】ε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌において不要な二次代謝産物の生成を抑制し、ε−ポリ−Ｌ−リジン生産性を向上させる。【解決手段】ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路、テトラマイシン類合成経路、及びナイスタチン合成経路からなる群から選択されるいずれか１以上を破壊するように改変された、ストレプトマイセス・アルブラス（Streptmyces albulus）を生産菌として用いてポリ−Ｌ−リジンを製造する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路、テトラマイシン類合成経路、及びナイスタチン合成経路からなる群から選択されるいずれか１以上を破壊するように改変された、ストレプトマイセス・アルブラス（Streptmyces albulus）。
【請求項２】
前記ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路が、遺伝子クラスター１３に含まれる１以上の遺伝子の発現の減弱によって破壊されている、請求項１に記載のストレプトマイセス・アルブラス。
【請求項３】
前記テトラマイシン類合成経路が、遺伝子クラスター１９に含まれる１以上の遺伝子の発現の減弱によって破壊されている、請求項１に記載のストレプトマイセス・アルブラス。
【請求項４】
前記ナイスタチン合成経路が、遺伝子クラスター４及び５に含まれる１以上の遺伝子の発現の減弱によって破壊されている、請求項１に記載のストレプトマイセス・アルブラス。
【請求項５】
前記１以上の遺伝子の発現が、前記１以上の遺伝子の不活性化によって減弱されている、請求項２〜４のいずれか一項に記載のストレプトマイセス・アルブラス。
【請求項６】
前記１以上の遺伝子が欠失している、請求項５に記載のストレプトマイセス・アルブラス。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のストレプトマイセス・アルブラスを培地中で好気的に培養する工程、及び前記培地からε−ポリ−Ｌ−リジンを回収する工程を含む、ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、副生物の生成が抑制され、それによりポリリジン生産量が向上したポリリジン生産菌、及び前記生産菌を用いるポリリジンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ε−ポリ−Ｌ−リジン（以降、ＥＰＬとも記す）は、必須アミノ酸のＬ−リジンがε位置のアミノ基とα位のカルボキシル基を介して直鎖状に連なった化合物である。ＥＰＬは、強い抗菌活性や膜透過性を有し、さらに高い安全性を併せ持つことから、主に食品添加物の保存料として世界中で利用されている。
ＥＰＬは、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する放線菌の二次代謝産物として生産され、特にストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ａｌｂｕｌｕｓ）が有用な生産菌として知られている（特許文献１）。これまでに、様々な手法で、ＥＰＬ生産菌の優良株の作出が行われてきた。例えば、ニトロソグアニジン処理などの化学的変異処理によりＥＰＬアナログに耐性を有する変異株が取得されている（特許文献２〜４）。また、ストレプトミセス・アルブラスで機能し得る宿主ベクターも開発され、それを用いて該細菌へ遺伝子導入することによるＥＰＬ生産性の改良もなされている（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特公昭５９−２０３５９号公報
【特許文献２】特開平９−１７３０５７号公報
【特許文献３】特開平１０−２９０６８８号公報
【特許文献４】特開平３−１４３３９８号公報
【特許文献５】国際公開第２０１１／１０８５８５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来の変異体取得方法では、変異体の取得に時間を要するため効率的でなかったり、生産性の向上効果が限定的であったりして、必ずしも満足なものではなかった。
そこで本発明は、ゲノム配列解析及び網羅的遺伝子発現（トランスクリプトーム）解析に基づいた合理的な遺伝子工学的育種法により、ＥＰＬの生産性がさらに高められたストレプトミセス・アルブラスを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ＥＰＬ生産菌であるストレプトミセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株の全ゲノムを解読し、その機能解析を行ったところ、該細菌がＥＰＬ生合成遺伝子群の他にも、さらに３６もの二次代謝産物生合成経路に係る遺伝子群を有していることを明らかにした。そして、ストレプトミセス・アルブラスがＥＰＬ以外の代謝産物を併産しうるという知見に基づき、それら「他の代謝産物」の生産を抑制し、代謝フラックスをＥＰＬ生合成へ傾ける改変を行うことによりＥＰＬ高生産株を取得し得ることに想到し、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路、テトラマイシン類合成経路、及びナイスタチン合成経路からなる群から選択されるいずれか１以上を破壊するように改変された、ストレプトマイセス・アルブラス（Streptmyces albulus）。
［２］前記ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路が、遺伝子クラスター１３に含まれる１以上の遺伝子の発現の減弱によって破壊されている、［１］に記載のストレプトマイセス・アルブラス。
［３］前記テトラマイシン類合成経路が、遺伝子クラスター１９に含まれる１以上の遺伝子の発現の減弱によって破壊されている、［１］に記載のストレプトマイセス・アルブラス。
［４］前記ナイスタチン合成経路が、遺伝子クラスター４及び５に含まれる１以上の遺伝子の発現の減弱によって破壊されている、［１］に記載のストレプトマイセス・アルブラス。
［５］前記１以上の遺伝子の発現が、前記１以上の遺伝子の不活性化によって減弱されている、［２］〜［４］のいずれかに記載のストレプトマイセス・アルブラス。
［６］前記１以上の遺伝子が欠失している、［５］に記載のストレプトマイセス・アルブラス。
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載のストレプトマイセス・アルブラスを培地中で好気的に培養する工程、及び前記培地からε−ポリ−Ｌ−リジンを回収する工程を含む、ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、ＥＰＬ生産能がより向上したストレプトミセス・アルブラスが提供される。該細菌を培養することにより、ＥＰＬを高収率で発酵生産することができ、また副生成物の産生を抑制することができる。その結果、ＥＰＬ生産量の増大に加え、生産コストの削減や、発酵液からのＥＰＬの分離・精製工程の簡略化も実現される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例３の、クラスター１３破壊株（S. albulus Δcluster 13）と非破壊株（S. albulus NBRC14147）におけるＥＰＬ生産量の経時変化を示す図である。
【図２】実施例３の、クラスター１３破壊株（S. albulus Δcluster 13）と非破壊株（S. albulus NBRC14147）におけるＥＰＬの対糖収率の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１０】
＜１＞ε−ポリ−Ｌ−リジン（ＥＰＬ）生産菌
本発明の第一の態様は、ＥＰＬ生産菌である。
【００１１】
本明細書において「ε−ポリ−Ｌ−リジン（ＥＰＬ）生産菌」という記載は、細菌を培地中で培養した場合に、培養培地中又は細菌細胞内でＥＰＬを生産し、放出若しくは分泌し、かつ／又は蓄積させる能力を有する細菌を意味する。
また、本明細書において「ε−ポリ−Ｌ−リジン（ＥＰＬ）生産能」という記載は、細菌を培地中で培養した場合に、培養培地又は細菌細胞からＥＰＬを回収することができるようなレベルまで、培養培地中又は細菌細胞内でＥＰＬを生産し、放出若しくは分泌し、かつ／又は蓄積させる細菌の能力を意味する。
【００１２】
本発明のＥＰＬ生産菌を取得するために改変する細菌は、ストレプトマイセス・アルブラスを使用することができる。通常、ストレプトマイセス・アルブラスはＥＰＬ生産能を有するため、用いる株は特に限定されないが、好ましくは良好なＥＰＬ生産能で知られるストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株が挙げられる。
ストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物資源センター（ＮＢＲＣ）（郵便番号：292-0818、住所：千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）から入手することができる。
また、ストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株のゲノムは、大学共同利用機関法人 情報・システム研究機構 国立遺伝学研究所 ＤＤＢＪセンターに、アクセッションナンバー：BHXC01000001、BHXC01000002、BHXC01000003、BHXC01000004、BHXC01000005、BHXC01000006、BHXC01000007、及びBHXC01000008として登録されている。
【００１３】
本発明のＥＰＬ生産菌は、ストレプトマイセス・アルブラスにおいてＥＰＬ生産条件下において機能発現している二次代謝産物生合成経路、具体的にはＥＰＬ以外の二次代謝産物の生合成が抑制されている。すなわち、本発明のＥＰＬ生産菌は、ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路、テトラマイシン類合成経路、及びナイスタチン合成経路からなる群から選択されるいずれか１以上を破壊するように改変された、ストレプトマイセス・アルブラスである。
【００１４】
ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路、テトラマイシン類合成経路、又はナイスタチン合成経路は、それぞれ、該経路に関与する酵素等のタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現の減弱により、特に、細菌の染色体上にあるクラスター４、５、１３又は１９に含まれる１以上の遺伝子の発現を、該遺伝子の不活性化等により減弱させることにより破壊することができるが、これに限定されない。
【００１５】
「ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路」は、ストレプトマイセス・アルブラスの二次代謝産物の１つであるジアミノプロピオン酸ポリマーが生合成される経路を指す。
ストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株の全ゲノム解析及び遺伝子破壊実験により、ストレプトマイセス・アルブラスの遺伝子クラスター１３が、ジアミノプロピオン酸ポリマー生合成に関与する遺伝子群であることが明らかになった。クラスター１３は、ＮＢＲＣ１４１４７株のゲノムSequence6（アクセッションナンバー：BHXC01000006.1）上の第６０２４０３〜６１５８５１塩基に位置し、配列番号１に示される塩基配列の遺伝子群である。
クラスター１３の全機能は解明されていないが、少なくとも９つのＯＲＦ（ＯＲＦ１〜９）が含まれることが分かっている。ＯＲＦ４がコードするオルニチンシクロデアミナーゼにより、Ｌ−オルニチンがＬ−プロリンに変換されるとともにアンモニアが脱離し、ＯＲＦ５がコードするシステインシンターゼによりＬ−セリンと前記アンモニアからＬ−２，３−ジアミノプロピオン酸へ変換され、さらにＥＰＬ合成酵素等の既知のアミノ酸ポリマー合成酵素とは全く構造の異なるＯＲＦ１、２がコードする酵素によりポリマー化されてポリ−Ｌ−ジアミノプロピオン酸が生成されるものと推測される。したがって、ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路は、クラスター１３に含まれる１以上の遺伝子、好ましくはＯＲＦ１〜９のいずれかを含む遺伝子、より好ましくは遺伝子群全体の発現を減弱させることにより破壊される。
【００１６】
「テトラマイシン類合成経路」は、ストレプトマイセス・アルブラスの二次代謝産物の１つであるテトラマイシン類が生合成される経路を指す。ここで、「テトラマイシン類」は、２４−デメチル−２４−エチルテトリンＡ、２４−デメチル−２４−エチル−４−ヒドロキシテトリンＡ、テトリンＡ、４-ヒドロキシテトリンＡを含む環状化合物を指す。
本発明者らにより、ストレプトマイセス・アルブラスの遺伝子クラスター１９が、テトラマイシン類生合成に関与する遺伝子群であることが明らかになった。クラスター１９は、ＮＢＲＣ１４１４７株のゲノムSequence6（アクセッションナンバー：BHXC01000006.1）上の第１６５８６０２〜１７５８８０１塩基に位置し、配列番号２に示される塩基配列の遺伝子群である。
クラスター１９の機能はまだほとんど解明されていないが、該クラスターを欠損させたストレプトマイセス・アルブラスにおいてテトラマイシン類の生成が抑制されることが確認されている。したがって、テトラマイシン類合成経路は、クラスター19に含まれる１以上の遺伝子、好ましくは遺伝子群全体の発現を減弱させることにより破壊される。
【００１７】
「ナイスタチン合成経路」は、ストレプトマイセス・アルブラスの二次代謝産物の１つであるナイスタチンが生合成される経路を指す。
本発明者らにより、ストレプトマイセス・アルブラスの遺伝子クラスター４及び５として配列未解読領域を介して二分されている遺伝子群が、ナイスタチン生合成に関与することが明らかになった。クラスター４及び５は、ＮＢＲＣ１４１４７株のゲノムSequence1（アクセッションナンバー：BHXC01000001.1）上の第３１３１５７〜３５０５８４塩基（配列番号３）と、Sequence2（アクセッションナンバー：BHXC01000002.1）上の第１〜９６７３３塩基（配列番号４）にまたがって存在する遺伝子群である。
クラスター４及び５の機能はまだほとんど解明されていないが、該クラスターを欠損させたストレプトマイセス・アルブラスにおいてナイスタチンの生成が抑制されることが確認されている。したがって、ナイスタチン合成経路は、クラスター４及び５に含まれる１以上の遺伝子、好ましくは遺伝子群全体の発現を減弱させることにより破壊される。
【００１８】
「合成経路」又は「代謝経路」と呼んでもよい「経路」は、１つのバイオ分子種を他のものへと変換するための１組の同化又は異化（生）化学反応を意味するものとすることができる。よって、「経路」は、その中間体によって結び付けられた一連の（生）化学反応（すなわち、１つの反応の１以上の生成物が、後続する１以上の反応等の１又は複数の基質となっている）を含むことができる。「経路」という記載の意味は、通常は当業者に明らかである。
【００１９】
本発明のＥＰＬ生産菌は、前記３つの経路のいずれか１以上が破壊されていることが好ましいが、より好ましくは２つ以上が破壊されており、さらに好ましくは３つが破壊されている。前記３つの経路が破壊されている態様としては、ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路が破壊されている態様、テトラマイシン類合成経路が破壊されている態様、ナイスタチン合成経路が破壊されている態様、ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路とテトラマイシン類合成経路とが破壊されている態様、ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路とナイスタチン合成経路とが破壊されている態様、テトラマイシン類合成経路とナイスタチン合成経路とが破壊されている態様、及びジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路とテトラマイシン類合成経路とナイスタチン合成経路とが破壊されている態様のいずれでもよい。
また、ＥＰＬの収量増加の観点から、好ましくはジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路が破壊されていることが好ましい。また、テトラマイシン類合成経路又はナイスタチン合成経路が破壊されている態様は、副生成物の低下によりＥＰＬの精製が容易になる点で好ましい。
【００２０】
「〜経路を破壊するように改変されたストレプトマイセス・アルブラス」という記載は、改変されていないストレプトマイセス・アルブラス、例えば、野生型株又は親株、例えば、ＮＢＲＣ１４１４７株のように、前記経路が破壊されていない菌と比較して、改変された菌では、該経路の１以上の（生）化学反応を介する炭素の流束がより低いか、又は存在すらしないような様式で細菌が改変されたことを意味するものとすることができる。ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路、テトラマイシン類合成経路、又はナイスタチン合成経路を破壊するように改変されたストレプトマイセス・アルブラスにおいては、改変されていないストレプトマイセス・アルブラスの経路における炭素の流束と比較して、同経路の１以上の（生）化学反応を介する炭素の流束は、９９％以下、９５％以下、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、又は０％とすることができる。
【００２１】
また、「〜経路を破壊するように改変されたストレプトマイセス・アルブラス」という
記載は、改変された菌において、同経路が減弱されているような様式で、菌が改変されたことを意味するものとすることもできる。
「改変された細菌において、〜経路が減弱されている」という記載は、改変された菌において、同経路由来の酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱されているような様式で、菌が改変されたことを意味するものとすることができる。例えば、ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路由来の酵素をコードするＯＲＦ１〜９から選択される１又は数個の遺伝子の発現を減弱させることができ、その発現を減弱させることのできる遺伝子の組合せは特に限定されない。
【００２２】
「数個の遺伝子」という記載は、２以上の遺伝子、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の遺伝子を意味するものとすることができる。したがって、「１又は数個の遺伝子」という記載は、単一の遺伝子、オペロン、又は遺伝子クラスター全体を意味するものとすることができる。したがって、「１又は数個の遺伝子」という記載及び「少なくとも１つの遺伝子」という記載は等価であるとする。
【００２３】
「クラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の発現を減弱させるよう改変したストレプトマイセス・アルブラス」という記載は、改変されていない同クラスターを含むストレプトマイセス・アルブラス、例えば、野生型又は親株と比較して、改変した菌において、同クラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の発現が減少しているような様式で、菌が改変されたことを意味するものとすることができる。
「減弱」又は「減弱された」という記載は、細菌中の１以上の酵素の量又は活性が減少するか、又は存在しなくなり、これにより遺伝子産物の活性が減少するか、又は完全に除去されるよう、破壊対象の経路由来の酵素をコードする細菌中の少なくとも１つの遺伝子を減弱させるか、又は改変することを意味するものとすることができる。
【００２４】
「クラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子が不活性化された」という記載は、改変された遺伝子クラスターに含まれる遺伝子の少なくとも１つが、改変されていない遺伝子又は改変されていない同クラスターを含む菌と比較して、完全に不活性であるか、又は非機能性であるタンパク質をコードすることを意味するものとすることができる。
遺伝子の一部の欠失又は全遺伝子の欠失、遺伝子によってコードされるタンパク質中でアミノ酸の置換を引き起こす１以上の塩基の交換（ミスセンス変異）、ストップコドンの導入（ナンセンス変異）、遺伝子のリーディングフレームのシフトを引き起こす１又は２の塩基の欠失、薬剤耐性遺伝子及び／又は転写終止信号の挿入、又はプロモータ（１又は複数）、エンハンサ（１又は複数）、アテニュエータ（１又は複数）、リボソーム結合部位（１又は複数）（ＲＢＳ）等などの遺伝子発現を調節する配列を含む、遺伝子の隣接する領域の改変のために、破壊対象のクラスターに含まれる改変されたＤＮＡ領域の少なくとも１つが、遺伝子を自然に発現することができないということも可能である。遺伝子クラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の不活性化は、例えば、ＵＶ照射又はニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を使用する変異誘発処理、部位特異的変異誘発、相同組換えを使用する遺伝子破壊、及び／又は「Red/ET-駆動組込み（Red/ET-driven integration）」又は「λRed/ET-媒介組込み（λRed/ET-mediated integration）」に基づいた挿入−欠失変異誘発（Yu D.ら、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 2000, 97（11）:5978-5983; Datsenko K.A.とWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97（12）:6640-6645; Zhang Y.ら、Nature Genet., 1998, 20:123-128）などの従来の方法によって行うこともできる。
【００２５】
「クラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱された」という記載は、１又は数個の遺伝子の発現が減弱された改変されたストレプトマイセス・アルブラスにおける同クラスターに含まれる改変された１又は数個の遺伝子によってコードされる１又は数個のタンパク質の量が、例えば、野生型株又は親株、例えば、ＮＢＲＣ１４１４７株な
どの改変されていない菌と比較して、低減されていることを意味するものとすることができる。
【００２６】
「クラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子が減弱された」という記載は、改変されたストレプトマイセス・アルブラスが、同クラスターに含まれる１以上の遺伝子に機能的に連結した１以上の領域を含むことを意味するものとすることができ、これには、同クラスターに含まれる遺伝子の発現を調節する配列、例えば、プロモータ、エンハンサ、アテニュエータ及び転写終止信号、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、及び他の発現調節要素（これらは改変され、同クラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの減少に帰着している）、並びに他の例（例えば、WO95/34672; Carrier T.A. とKeasling J.D., Biotechnol. Prog., 1999, 15:58-64参照）が含まれる。「遺伝子に機能的に連結した」という記載は、「１以上の遺伝子に機能的に連結した」という記載の具体例であり、１又は複数の制御領域が、ヌクレオチド配列の発現（例えば、増強された、増加した、構成的な、基本的な、反終止的な、減弱された、脱制御された、減少した又は抑圧された発現）、特に、ヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子産物の発現を可能とする様式で、核酸分子又は遺伝子のヌクレオチド配列に連結されたことを意味するものとすることができる。
【００２７】
クラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の発現は、染色体ＤＮＡ上のプロモータなどの発現調節配列をより弱いものに交換することにより減弱させることができる。プロモータの強さは、ＲＮＡ合成の開始動作の頻度によって特定される。プロモータの強さ及び強いプロモータを評価する方法の例は、Goldstein M.A.ら（Goldstein M.A.とDoi R.H., 「バイオテクノロジーにおける原核プロモータ」, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1:105-128）等に記載されている。更に、国際公開WO00/18935に開示されているように、標的遺伝子のプロモータ領域にいくつかのヌクレオチドについてヌクレオチド置換を導入することにより、プロモータが弱くなるよう改変することもできる。更に、シャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列における、及び／又はＳＤ配列と開始コドンとの間のスペーサにおける、及び／又はリボソーム結合部位（ＲＢＳ）中で開始コドンから直ぐ上流及び／又は下流の配列におけるいくつかのヌクレオチドの置換は、ｍＲＮＡの転写効率に大きく影響を与えることが知られている。このＲＢＳの改変は、破壊対象のクラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の転写を減少させることと組合せることができる。
【００２８】
クラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の発現は、トランスポゾン又は挿入配列（ＩＳ）の、遺伝子のコード領域への（米国特許第5,175,107号）、又は遺伝子の発現を調節する領域における挿入によって、又は紫外線照射（ＵＶ照射）若しくはニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を用いる変異誘発などの従来の方法によって減弱させることもできる。更に、部位特異的変異の取込みは、例えば、λRed/ET-媒介組込みに基づいて、公知の染色体校正方法によって行うことができる。
【００２９】
破壊対象のクラスターに含まれる遺伝子の存在又は非存在は、染色体ＤＮＡの制限処理を行った後に、遺伝子配列に基づいたプローブを使用するサザンブロッティング、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等を行うことによって測定することができる。遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等を含む種々の周知の方法を使用し、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を測定することによって決定することができる。遺伝子によってコードされるタンパク質の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後にイムノブロッティングアッセイ（ウエスタンブロッティング解析）、又はタンパク質サンプルの質量分析解析等を行うことを含む公知の方法によって測定することができる。
【００３０】
前述のようにクラスター１３は配列番号１に示される塩基配列を有し、クラスター１９
は配列番号２に示される塩基配列を有し、クラスター４及び５は配列番号３及び４に示される塩基配列を有する。ストレプトマイセス・アルブラスの株間で、ＤＮＡ配列が幾分異なり得ることから、前記各クラスター又はそれに含まれる遺伝子の配列は前記配列にそれぞれ示す遺伝子に限定されるものではないが、該配列番号の変異体（variant）ヌクレオチド配列またはそれに相同なものであって、それぞれ該クラスターに含まれる遺伝子がコードするタンパク質の変異体をコードする遺伝子を含むものとすることができる。
【００３１】
「変異体タンパク質」という記載は、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加のいずれであるかに拘らず、破壊対象のクラスターに含まれる遺伝子がコードするタンパク質の配列と比較して、配列中に１又は数個の変更を有するが、それぞれ同タンパク質のものと類似する活性又は機能を依然として維持するか、又は同タンパク質の三次元構造が、野生型又は改変されていないタンパク質に対して有意に変更されていないタンパク質を意味するものとすることができる。変異体タンパク質における変更の数は、タンパク質の三次元構造中の位置又はアミノ酸残基の種類に依存し、厳密には限定されるものではないが、１〜３０個、他の例では１〜１５個、他の例では１〜１０個、更に他の例では１〜５個とすることができる。あるいは、破壊対象のクラスターに含まれる遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列に対して８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上のパラメータ「同一性」として特定される相同性を有し得る。
【００３２】
１又は数個のアミノ酸残基の例示的な置換、欠失、挿入、及び／付加は、保存的な１又は数個の変異とすることができる。代表的な保存的な変異は、保存的な置換である。保存的な置換は、限定されるものではないが、置換部位が芳香族アミノ酸である場合は互いにPhe, Trp及びTyrの間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合はAla, Leu, Ile及びValの間で、置換部位が親水性アミノ酸である場合はGlu, Asp, Gln, Asn, Ser, His及びThrの間で、置換部位が極性アミノ酸である場合はGln及びAsnの間で、置換部位が塩基性アミノ酸である場合はLys, Arg及びHisの間で、置換部位が酸性アミノ酸である場合はAsp及びGluの間で、置換部位が水酸基を有するアミノ酸である場合はSer及びThrの間で置換を引き起こす置換とすることができる。保存的な置換の例には、AlaについてのSer又はThrの置換、ArgについてのGln, His又はLysの置換、AsnについてのGlu, Gln, Lys, His又はAspの置換、AspについてのAsn, Glu又はGlnの置換、CysについてのSer又はAlaの置換、GlnについてのAsn, Glu, Lys, His, Asp又はArgの置換、GluについてのAsn, Gln, Lys又はAspの置換、GlyについてのProの置換、HisについてのAsn, Lys, Gln, Arg又はTyrの置換、IleについてのLeu, Met, Val又はPheの置換、Leu についてのIle, Met, Val又はPheの置換、LysについてのAsn, Glu, Gln, His又はArgの置換、MetについてのIle, Leu, Val又はPheの置換、PheについてのTrp, Tyr, Met, Ile又はLeu の置換、SerについてのThr又はAla の置換、Thr についてのSer又はAlaの置換、TrpについてのPhe又はTyrの置換、TyrについてのHis, Phe又はTrpの置換、及びValについてのMet, Ile又はLeuの置換が含まれる。
【００３３】
タンパク質又はＤＮＡの相同性の程度を評価するために、ＢＬＡＳＴサーチ、ＦＡＳＴＡサーチ及びＣｌｕｓｔａｌＷ法などのいくつかの計算方法を使用することができる。ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）サーチは、プログラムblastp, blastn, blastx, megablast, tblastn及びtblastxによって用い
られるヒューリスティックなサーチアルゴリズムであり、これらのプログラムは、Samuel
K.とAltschul S.F. （「一般的なスコアリングスキームを使用することにより分子配列特徴の統計的な有意性を評価する方法」Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-2268; 「分子配列におけるマルチプルな高スコアリング断片についての応用と統計」Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877）の統計的な方法を使用するその所見に有意性を帰するものである。コンピュータプログラムＢＬＡＳＴにより、３つのパラメータ：スコア、同一性及び類似性が計算される。ＦＡＳＴＡサーチ法は、Pearson W.R. （「FASTP及びFASTAを用いる迅速で感度の高い配列比較」, Methods Enzymol., 1990, 183:63-98
）によって記載されている。ＣｌｕｓｔａｌＷ法は、Thompson J.D.ら（「CLUSTAL W：配列の重み付け、位置特異的ギャップペナルティ及びウエイトマトリックス選択により斬新的なマルチプル配列の並びの感度を改良する」, Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680）によって記載されている。
【００３４】
さらに、破壊対象のクラスター又はそれに含まれる遺伝子は、変異体ヌクレオチド配列とすることができる。「変異体ヌクレオチド配列」という記載は、標準的な遺伝子コード表（例えば、Lewin B., 「遺伝子VIII」（Genes VIII）, 2004, Pearson Education, Inc., Upper Saddle River, NJ 07458参照）に従ういずれかの同義アミノ酸コドンを使用して、破壊対象のクラスター又はそれに含まれる遺伝子がコードするタンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味するものとすることができ、これは、同タンパク質の「変異体タンパク質」と呼ぶこともできる。
【００３５】
また、「変異体ヌクレオチド配列」という記載は、限定されるものではないが、ストリンジェントな条件下で、破壊対象のクラスター又はそれに含まれる遺伝子の配列に相補的なヌクレオチド配列、又はストリンジェントな条件下でヌクレオチド配列から調製することのできるプローブ（ただし、これは活性又は機能性のタンパク質をコードする）とハイブリダイズするヌクレオチド配列を意味するものとすることもできる。「ストリンジェントな条件」には、特異的なハイブリッド、例えば、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴを使用した場合に、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上のパラメータ「同一性」として特定される相同性を有するハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッド、例えば、前記より低い相同性を有するハイブリッドが形成されないものが含まれる。例えば、ストリンジェントな条件は、６０℃又は６５℃において、１×ＳＳＣ（標準クエン酸ナトリウム又は標準塩化ナトリウム）の塩濃度、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、又は他の例では、０．１カケルＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回以上洗浄すること、又は他の例では、２回又は３回洗浄することにより例示されるものとすることができる。洗浄の継続時間は、ブロッティングのために使用する膜の種類に依存し、通常は、製造業者によって推奨されたものとすることができる。例えば、ストリンジェントな条件下において、アマシャム・ハイボンド（登録商標）−Ｎ＋の正荷電ナイロン膜（ＧＥヘルスケア）について推奨された洗浄の継続時間は１５分である。洗浄工程は、２〜３回行うことができる。プローブとして、配列番号１、２、３又は４に示す配列に相補的な配列の一部を使用することもできる。この種プローブは、配列番号１、２、３又は４に示す配列に基づいて調製したプライマーとしてのオリゴヌクレオチド、及び鋳型としてのヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を使用し、ＰＣＲによって作製することができる。プローブの長さは、＞５０ｂｐであることが推奨されており、これは、ハイブリダイゼーション条件に依存して適切に選択することができ、通常は１００ｂｐ〜１ｋｂｐである。例えば、約３００ｂｐの長さを有するＤＮＡ断片をプローブとして使用する場合は、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件は、５０℃、６０℃又は６５℃で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより例示されるものとすることができる。
【００３６】
細菌は、既に言及した性質に加えて、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の栄養要求、薬剤耐性、薬剤感受性、及び薬剤依存性などの他の特定の性質を有するものとすることができる。
【００３７】
＜２＞ＥＰＬの製造方法
前述した本発明のストレプトマイセス・アルブラスは、ＥＰＬの製造に好適に用いることができる。すなわち、本発明の第二の態様は、本発明のＥＰＬ生産菌を用いるＥＰＬの製造方法である。
【００３８】
本発明のＥＰＬの製造方法は、ＥＰＬ生産菌である本発明のストレプトマイセス・アルブラスを培地中で好気的に培養する工程（培養工程）、及び前記培地からε−ポリ−Ｌ−リジンを回収する工程（回収工程）を含む。
【００３９】
培養工程は本発明のＥＰＬ生産菌にＥＰＬを生成させ培地中に蓄積させるものである。本工程は、微生物を使用してＥＰＬを製造する従来の発酵法と同様の方法で行うことができる。
本発明のストレプトマイセス・アルブラスの培養培地は、合成又は天然培地、例えば、炭素源、窒素源、硫黄源、無機イオン、及び必要に応じて他の有機及び無機成分を含む典型的な培地とすることができる。
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、ショ糖、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース、及び澱粉の加水分解物などの糖類；グリセリン、マンニトール、及びソルビトールなどのアルコール；グルコン酸、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸、及びコハク酸などの有機酸等を使用することができる。その含有量は０．１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましい。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、及びリン酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩；酵母エキス、ペプトン、カゼイン加水分解物、アミノ酸、大豆加水分解物などの有機窒素；アンモニアガス；アンモニア水等を使用することができる。その含有量は０．１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
硫黄源としては、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン等を含むものとすることができる。その含有量は０．１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましい。
無機イオンとしては、リン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、硫酸イオン等を与えるものが挙げられる。その含有量は０．１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
【００４０】
培養は、好気的条件下で好ましくは１０〜１５０時間、より好ましくは２０〜１２０時間振とう培養、攪拌培養等により行うことができる。培養温度は、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２５〜３５℃とする。培地のｐＨは、好ましくは３〜８、より好ましくは４〜７に調整する。ｐＨは、無機若しくは有機の酸性又はアルカリ性物質、並びにアンモニアガスを使用することにより調整すればよい。
また、培養工程の途中で、炭素源や窒素源を逐次添加してもよい。また、Ｌ−リジンを液体培地に添加することが好ましく、その量は通常０．１〜２％（ｗ／ｖ）である。また、クエン酸、リンゴ酸を添加することは好ましく、その量は通常０．１〜５％(ｗ／ｖ)である。
【００４１】
回収工程は、培養工程の後の培地から細胞及び細胞の残骸などの不溶固体成分を遠心分離又は膜ろ過によって液体培地から除去した後、カチオン交換クロマトグラフィーによりＥＰＬを精製し、濃縮した後、アセトン、エタノール等の有機溶媒で晶析することにより行うことができるが、これに限定されない。
【実施例】
【００４２】
以下、具体的な実験例をあげて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の態様にのみ限定されない。
【００４３】
＜実施例１＞ストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株の網羅的遺伝子発現解析
ＥＰＬ生産菌であるストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株の網羅的遺伝子発現解析（トランスクリプトーム解析）を行った。
（１）ストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株の培養
M3G培地（グルコース5wt%、酵母エキス0.5wt%、硫酸アンモニウム1wt%、K2HPO40.08wt%
、KH2PO4 0.136wt%、MgSO4・7H2O 0.05wt%、ZnSO4・7H2O 0.004wt%、FeSO4・7H2O 0.003wt%（pH 6.8））を用いて、ストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７を培養した。30℃で20時間好気的に培養して得た100mLの前培養液を1Lの培地に加え、3L容ジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）を使用して30℃、500rpm、通気量3.0 L/minで好気的に培養した。菌体の増殖に伴って培養液のpHは徐々に低下したため、培養液pHが4.2に達した時点（培養開始後12時間）から10w/v%アンモニア水を添加して培養液pHを4.2に維持した。この培養過程において、ＥＰＬの生産はpH4.2に低下した後にのみ観察された。従って、培養開始8時間後及び35時間後に培養液から遠心分離により菌体を回収し、それぞれ生育期菌体及び生産期菌体とした。
【００４４】
（２）培養菌体からのTotal RNAの抽出
生育期菌体及び生産期菌体それぞれを、Tris-HCl飽和フェノール／クロロホルム混合液に懸濁し、超音波で菌体を破砕した。菌体破砕液にトリイソプロピルナフタレン硫酸塩を含んだトリス／フェノール混合液を加え、良く混合後遠心分離し、水層のみを分取することでタンパク質などの不純物を除去した。分取した水層に酢酸ナトリウム、イソプロパノールを加え、静置した後、遠心分離し、上清を捨て、70v/v%エタノールを加えた。さらにこれを良く混合後、遠心分離して上清をきれいに取り除き沈殿を回収した。続いて回収した沈殿を適当な緩衝溶液に懸濁した後、塩化リチウムを加え静置し、遠心分離した。上清を捨て、沈殿したRNAを70v/v%エタノールでリンスし、風乾後適当な緩衝液に溶解させてRNA試料とした。RNA試料に対して、A260、A260/A280の吸光度測定、アガロース電気泳動により純度確認を行なった。
【００４５】
（３）シーケンスライブラリーの調製及びシーケンシング
抽出したRNA試料から、Ribo-ZeroTM Magnetic Kit (Gram-Positive Bacteria)によってrRNAを除去した。得られたmRNAを断片化し、逆転写反応により一本鎖cDNAを合成した。これを鋳型としてdUTPを取り込ませた二本鎖cDNAを合成した後、両末端を平滑化・リン酸化処理を施し、更に3’-dA突出処理を行ってIndexアダプターと連結した。続いてアダプターと連結した二本鎖cDNAを鋳型としてdUTPを持つ鎖を増幅しないポリメラーゼによりＰＣＲ増幅したものをシーケンスライブラリーとした。このライブラリーからHiSeq PE Rapid
Cluster Kit v2-HSを用いてクラスター形成を行い、イルミナ社製次世代シーケンサー（HiSeq 2500）を用いて塩基配列を取得した。シーケンス解析の結果、得られた総リード数は47,724,626（総塩基数4,772,462,600塩基）であった。
【００４６】
（４）シーケンスデータ解析
このリード配列をGenedata Profiler Genome (Genedata社)を用いてＮＢＲＣ１４１４７株のゲノムデータにマッピングした結果、97.8％のリードがマッピングされた。その後、マッピングで得られたゲノム位置情報からアノテーションを行い、遺伝子ごと、転写産物毎に発現量の算出を行った。得られた一次データからFPKM(Fragments Per Kilobase of
exon per Million mapped fragments)値を用いた正規化処理、フィルタリング（リードカウント16未満の除去）、対数変換（logFPKM値）を行った。これらのデータ前処理を行った後、Integrative Genome Viewerソフトウエアを用いて、前述のＮＢＲＣ１４１４７株のゲノムデータからAntiSMASHにより検出された３７の推定二次代謝産物生合成遺伝子群について発現量比較解析を行った。
【００４７】
その結果、オペロンを形成するＥＰＬ合成酵素遺伝子及び分解酵素遺伝子（クラスター５）は、ＥＰＬ生産期に顕著に発現量が増加することが確認された。これはＮＢＲＣ１４１４７株が培養後期にＥＰＬを生産すると言う事実ともよく一致する。
また、興味深いことにOrn cyclodeaminase遺伝子、Cysteine Synthase遺伝子、及びNRPS様酵素遺伝子を含む二次代謝遺伝子群（クラスター１３）の発現量も同様にＥＰＬ生産期に顕著に増加することが確認された。なお、別の実験において、該クラスターを破壊し
た株では、非破壊株では著量生産されるジアミノプロピオン酸ポリマーが非検出となった。一方、Zhaoxian Xuらにより（Scientific Reports, 5:17400 (2015)）ジアミノプロピオン酸ポリマー生合成遺伝子として同定されている遺伝子（pdaps）は、トランスクリプトーム解析において二次代謝期に全く発現していないことが判明し、実際に当該遺伝子を破壊しても、当該ポリマーの生産は維持された。これらのことから、pdaps遺伝子ではなくクラスター１３がジアミノプロピオン酸ポリマーの生合成に関与する遺伝子群であることが確認された。
【００４８】
さらに、Streptomyces ahygroscopicus由来のテトラマイシン生合成遺伝子群と９８％の相同性を示すTypeI ポリケチド合成酵素遺伝子群(クラスター１９)もＥＰＬ生産期に発現上昇することが確認された。なお、別の実験において、該クラスターを破壊した株では、テトラマイシンの生産が検出されなくなることから、クラスター１９はテトラマイシンの生合成に関与する遺伝子群であることが確認された。
【００４９】
さらに、Streptomyces albulus CK-15株由来のナイスタチン生合成遺伝子群とそれぞれ９７％及び９９％の相同性を示すクラスター４及び５もＥＰＬ生産期に発現上昇することが確認された。該遺伝子クラスターはゲノムデータ上では二分されているが、CK-15株由来のナイスタチン生合成遺伝子群との比較から互いに隣接して１つの遺伝子群を構成していると考えられた。実際に、別の実験において、該クラスターを一括破壊した株では、ナイスタチンの生成量が非検出となったことから、クラスター４及び５はゲノム上では隣接して存在しており、ナイスタチン生合成に関与することが確認された。
【００５０】
＜実施例２＞クラスター１３破壊株の構築
（１）クラスター１３破壊プラスミドの構築
ストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株の染色体ＤＮＡを鋳型として、クラスター１３の上流及び下流領域それぞれ約3-kbpを以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、それぞれLeft arm及び Right armとした。同様にpUC19-aac(3)IV-codAプラスミドからアプラマイシン耐性遺伝子（aac(3)IV）を含む約2.4-kbp領域をPCR増幅した。
【００５１】
【表１】
2020089297.tif 000003
【００５２】
BamHI及びHindIIIで消化したpK18mobプラスミドと、PCR増幅したLeft arm、Right arm、及びaac(3)IV断片とを混合し、ギブソンアッセンブリー反応により連結した。反応産物でE. coli NEB10βコンピテントセルを形質転換し、ネオマイシン及びアプラマイシンに二重耐性を示すクローンからプラスミドを抽出し、制限マッピングによりクラスター１３破壊プラスミド(pK18mob-Δcluster 13)の構築を確認した。
【００５３】
（２）ストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株におけるクラスター１３破壊株の構築
前記構築したプラスミドpK18mob-Δcluster13をE. coli ET12567株へ導入し、更にpUB3
07プラスミドを有するE. coli ET12567株との三親性接合伝達によってストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株へ導入した（参考文献：J Am Chem Soc 134:12434-12437、2012）。その後、アプラマイシン耐性且つネオマイシン感受性株をクラスター１３破壊候補株として選抜した。この候補株から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーを用いたマルチプレックスPCRによりクラスター１３の欠失及びaac(3)IV遺伝子との置換、すなわち当該遺伝子群の破壊を確認した。
【００５４】
【表２】
2020089297.tif 000004
【００５５】
その結果、取得した候補株染色体ＤＮＡからはクラスター１３のorf3遺伝子（配列番号１の７３９１〜８３９８番目の塩基配列）の増幅は認められず、且つaac(3)IV遺伝子の増幅が確認されたことから、クラスター１３の破壊を確認した。この一連の操作により作出した株をS. albulus Δcluster 13株とした。
【００５６】
＜実施例３＞クラスター１３破壊株と非破壊株とのＥＰＬ生産性の比較
M3G培地（グルコース5wt%、酵母エキス0.5wt%、硫酸アンモニウム1wt%、K2HPO4 0.08wt%、KH2PO4 0.136wt%、MgSO4・7H2O 0.05wt%、ZnSO4・7H2O 0.004wt%、FeSO4・7H2O 0.003wt%（pH 6.8））を用いて、S. albulus NBRC14147株及びS. albulus Δcluster 13株をそれぞれ培養した。30℃で20時間好気的に培養して得た100mLの前培養液を1Lの培地にそれぞれ加え、3L容ジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）を使用して30℃、400rpm、通気量3.0 L/minで好気的に培養した。菌体の増殖に伴って培養液のpHは徐々に低下したため、培養液pHが4.2に達した時点（培養開始後12時間）から10w/v%アンモニア水を添加して培養液pHを4.2に維持した。培養開始後24時間からフィード液（グルコース 50wt%、硫酸アンモニウム5wt%）を適宜追加してグルコース濃度をコントロールし、8時間、16時間ごとに培養液を回収して、ＥＰＬの生産を確認しつつ120時間まで培養を実施した。
なお、培養液中に蓄積したＥＰＬは、メチルオレンジを用いたItzhakiの方法（Analitical Biochemistry vol. 50, 569-574(1972)）によって定量した。すなわち、培養液上清０．１ｍＬに0.1 Mリン酸バッファー（ｐＨ6.9）1.9 mLを加えた液に1 mMメチルオレンジ水溶液2 mLを混合し、30℃で30分放置後、生じたＥＰＬとメチルオレンジの複合体を遠心分離によって除去し、その上清の465 nmにおける吸光度を測定した。一方、ＥＰＬの標準品を用いて作製した検量線から、ＥＰＬ量を算出した。さらにグルコース消費量からＥＰＬの対糖収率も算出した。
【００５７】
図１にＥＰＬ量を、図２に対糖収率をそれぞれ示す。クラスター１３を破壊したストレプトマイセス・アルブラスでは、非破壊株に比べてＥＰＬ産生量が１．５倍に、対糖収率が１．６倍に向上した。
【００５８】
クラスター１９、４又は５破壊株についても、実施例２と同様の遺伝子工学的手法による方法で構築することができ、同様に培養によるＥＰＬ生産における産生量の向上を導けることは明白である。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明により、ＥＰＬ生産能がより向上したストレプトミセス・アルブラスが提供され
る。該細菌を培養することにより、ＥＰＬを高収率で発酵生産することができ、また副生成物の産生を抑制することができる。その結果、ＥＰＬ生産量の増大に加え、生産コストの削減や、発酵液からのＥＰＬの分離・精製工程の簡略化も実現されるため、本発明は産業上の利用可能性が高い。
【図１】
2020089297.tif 000005
【図２】
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【配列表】
2020089297000001.app