(57)【要約】【課題】細胞の接着領域ならびに非接着領域の選択制御が可能な基板を提供する。【解決手段】基板３００は、細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造１００を備える。ナノポアアレイ構造１００は、ベース１、複数の凹形状のナノポア３を備える。ベース１には、複数のナノポア３が形成される。凹形状のナノポア３があるため、ナノポアアレイ構造１００と対象物が接触した場合、対象物は見かけの表面全体で接触するわけではなく、実際の接触は限られた部分のみで起こる。マイクロスケール下では、重力よりも付着力が支配的になるスケール効果が起こり、接触面積の減少により、付着力を低減することが可能となる。また接着細胞は足場となる構造体に接着後、細胞のストレスファイバーや仮足の構造を変化させて遊走する。この際に接触領域が通常より少ないため、細胞のストレスファイバーや仮足の構造形成が抑制される。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のナノポアを備え、
前記複数のナノポアは細胞に対して非接着性あるいは接着後の細胞の仮足成長の抑制効果を有する、
細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ。
【請求項２】
前記少なくとも１つのナノポアの大きさは、
前記少なくとも１つのナノポアのポア領域を上面から楕円近似した際の長軸が３００ｎｍ以下の、
請求項１に記載のナノポアアレイ。
【請求項３】
前記少なくとも１つのナノポアは、
１μｍ２の領域に少なくとも４個形成されている、
請求項１又は請求項２に記載のナノポアアレイ。
【請求項４】
前記少なくとも１つのナノポアの深さは、
前記少なくとも１つのナノポアのポア領域を上面から楕円近似した際の長軸長さに対して、０．５倍以上の深さの、
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のナノポアアレイ。
【請求項５】
前記ナノポアアレイの領域は、
一般的な接着細胞１つの直径よりも大きい１０μｍ２以上を備えた、
請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のナノポアアレイ。
【請求項６】
請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のナノポアアレイと、
細胞接着に効果のあるフィブロネクチン、ゼラチン等のタンパク質を備えた、  胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造を有する基板。
【請求項７】
細胞接着領域と、
前記細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造を有する領域を備えた、
請求項６に記載の細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造を有する基板。
【請求項８】
前記細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造を有する基板の前記細胞接着領域は、
一般的な接着細胞１つの直径よりも大きい１０μｍ２以上を備えた、
請求項６又は請求項７に記載の細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造を有する基板。
【請求項９】
前記細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造を有する基板の前記細胞接着領域の原料は、
前記細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造を有する領域の基板の原料と同じである、
請求項６から請求項３のいずれか１項に記載の細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造を有する基板。
【請求項１０】
細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイの製造方法であって、
前記細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイは、
複数のナノポアと、
細胞に対して非接着性あるいは接着後の細胞の仮足成長の抑制効果を備え、
前記細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイを形成する工程を含み、
前記細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造と前記細胞接着領域は、
前記細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造を有する領域の基板上に配置される、製造方法。
【請求項１１】
前記細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイを形成する工程とは、
第１レイヤー工程を構成し、
前記細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイは、第１レイヤーの一部であり、
前記第１レイヤー工程では、前記第１レイヤーを形成及び処理して、前記細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイを形成する、請求項１０に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ、その構造を有する基板、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、ナノポアは、直径１μｍ以下のナノスケールの超微細なサイズの穴（ポア）である。ナノスケールの穴という構造的特性を利用して、反射防止機能を付加した光学デバイス開発等の応用研究が行われている。近年、ナノポアは、医療・バイオ分野への応用研究にも利用され、ＤＮＡの塩基配列を解読するための、イオン電流を検知するための検出器等への応用が進められている。
【０００３】
特許文献１には、基材上に、細胞を培養する領域と、接着を阻害する領域をパターニングする方法が記載されている。細胞を培養する領域と接着を阻害する領域は、化学的な処理を施行することで形成している。
【０００４】
細胞培養領域の端部は凹凸領域を有するパターン上に形成され、凹凸の凹部端から凸部端までの距離の平均が０．５μｍ〜３０μｍの範囲内であることを特徴としている。
【０００５】
フォトリソグラフィーと組み合わせることで、自由度の高い細胞パターニングのための基板が製作できる。
【０００６】
特許文献２には、凹凸を形成した基板上に細胞を載置して、目的の細胞に分化または形質転換させる方法が記載されている。
【０００７】
凹凸の形状に関しては、前記主間隙の幅が５μｍから２５μｍ、副間隙の幅が３μｍから５μｍと記載されており、細胞の構成要素であるストレスファイバーや仮足に直接作用する。
【０００８】
凹凸領域には移動性の細胞をはね返す効果があり、細胞の移動効率に直接影響を与えることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−２２９９１４号公報
【特許文献２】特開２０１５−８７０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、特許文献１では細胞の接着領域、非接着領域をエネルギー照射に伴う光触媒の作用により形成するため、細胞接着に有効な材料に対して、材料の構造の一部を破壊したり、主鎖分解を起こすため、破壊された材料が細胞に悪影響を及ぼす場合には提供することができない。
【００１１】
特許文献２ではμｍオーダーの高さを有する柱状体の構造物を形成する必要があり、また、細胞分化を対象にしたものであるため、細胞シートの形成や、細胞解析を実施するための電極等を基板上へ集積化する用途の内容によっては応用方法が制限されることが予想される。
【００１２】
本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、基板上へ化学的に異なる材料パターンを形成することや、μｍオーダーの高さを有する柱状体の構造物の形成を必要とせずに、細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ、その構造を有する基板、及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第１の観点によれば、細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイは、複数のナノポアから構成され、かつ細胞に対して非接着性あるいは接着後の細胞の仮足成長の抑制効果を有する。
【００１４】
本発明の細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイにおいて、前記少なくとも１つのナノポアの大きさは、ポア領域を上面から楕円近似した際の長軸が３００ｎｍ以下のものが好ましい。
【００１５】
本発明の細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイにおいて、前記少なくとも１つのナノポアは、１μｍ２の領域に少なくとも４個以上形成されたものが好ましい。
【００１６】
本発明の細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイにおいて、前記少なくとも１つのナノポアの深さは、ポア領域を上面から楕円近似した際の長軸長さに対して０．５倍以上の深さのものが好ましい。
【００１７】
本発明の細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイの領域は、１μｍ２以上、中でも、細胞の種類にもよるが一般的な接着細胞１つの直径よりも大きい１０μｍ２以上のものが好ましい。
【００１８】
本発明の第２の観点によれば、細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造を有する基板は、本発明の第１の観点による細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイと、細胞接着に効果のあるフィブロネクチン、ゼラチン等のタンパク質とを備える。
【００１９】
本発明の細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造を有する基板は、細胞接着領域と、前記細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造を有する領域を備えることが好ましい。
【００２０】
本発明の細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造を有する基板の前記細胞接着領域は、１μｍ２以上、中でも、細胞の種類にもよるが一般的な接着細胞１つの直径よりも大きい１０μｍ２以上のものが好ましい。
【００２１】
本発明の細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造を有する基板の前記細胞接着領域の原料は、前記細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造を有する領域の基板の原料と同じであることが好ましい。
【００２２】
本発明の第３の観点によれば、製造方法は、細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイの製造方法である。前記細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイは、複数のナノポアから構成され、かつ細胞に対して非接着性あるいは接着後の細胞の仮足成長の抑制効果を有する。製造方法は、前記細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイを形成する工程を含む。前記細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造と、前記細胞接着領域は、前記細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造を有する領域の基板上に配置される。
【００２３】
本発明の細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイの製造方法において、前記細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイを形成する工程は、第１レイヤー工程を構成し、前記細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイは、第１レイヤーの一部であり、前記第１レイヤー工程では、前記第１レイヤーを形成及び処理して、前記細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイを形成することが好ましい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、マイクロスケールで細胞の２次元パターニング培養が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の実施形態１に係るナノポアアレイを示す平面図である。
【図２】本発明の実施形態１に係るナノポアアレイを示す断面図である。
【図３】本発明の実施形態１に係るナノポアアレイと、対象物との接着状態を示す断面図である。
【図４】本発明の実施形態１に係るナノポアアレイ構造を有する基板を示す平面図である。
【図５】（ａ）〜（ｃ）本発明の実施形態１に係るナノポアアレイの製造方法の第１レイヤー工程を説明する図である。
【図６】（ａ）〜（ｃ）本発明の実施形態１に係るナノポアアレイ構造を有する基板の製造方法の第２レイヤー工程を説明する図である。
【図７】（ａ）〜（ｃ）本発明の実施形態１に係るナノポアアレイ構造を有する基板の製造方法の第１レイヤー工程を説明する図である。
【図８】（ａ）〜（ｃ）本発明の実施形態１に係るナノポアアレイ構造を有する基板の製造方法の第２レイヤー除去工程を説明する図である。
【図９】（ａ）〜（ｄ）本発明の実施形態１に係るナノポアアレイ構造を有する基板の製造方法の第２レイヤー工程の前段を説明する図である。
【図１０】（ａ）〜（ｃ）本発明の実施形態１に係るナノポアアレイ構造を有する基板の製造方法の第２レイヤー工程の後段を説明する図である。
【図１１】（ａ）（ｂ）本発明の実施形態１に係るナノポアアレイ構造を有する基板の製造方法の第１レイヤー工程を説明する図である。
【図１２】本発明の実施形態１に係るナノポアアレイ構造を有する基板の製造方法の第２レイヤー除去工程を説明する図である。
【図１３】本発明の実施形態２に係るナノポアアレイの製造方法を示すフローチャートである。
【図１４】本発明の実施形態３に係るナノポアアレイの製造方法を示すフローチャートである。
【図１５】本発明の実施形態４に係るナノポアアレイの製造方法を示すフローチャートである。
【図１６】本発明の実施形態６に係る培養基材を示す斜視図である。
【図１７】本発明の実施例１に係るナノポアアレイの顕微鏡画像を示す図である。
【図１８】本発明の実施例２に係る培養基材４００のインキュベート後の顕微鏡画像を示す図である。細胞接着領域と細胞非接着領域の境界を観察し、一部の細胞画像を拡大した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照しながら説明する。なお、図中、同一または相当部分については同一の参照符号を付して説明を繰り返さない。
【００２７】
（実施形態１）
図１は、本発明の実施形態１に係る細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ１００を示す平面図である。ナノポアアレイ１００は、例えば、ナノポアアレイである。ナノポアアレイは、二次元配列された複数のナノポアを含むＭＥＭＳ（微小電気機械素子：Ｍｉｃｒｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）である。ナノポアは、開口面積１μｍ２以下のポアと呼ばれる穴構造で有り、深さ１μｍ以下の凹形状の構造体である。
【００２８】
ナノポアアレイ１００は、ベース１、複数のナノポア３を備える。ベース１には、複数のナノポア３が形成される。ベース１の原料は、実施形態１では、ケイ素（Ｓｉ）である。ナノポア３は空洞であり、存在しない。
【００２９】
複数のナノポア３は、第１方向Ａ１（つまり、列方向Ａ１）ならびに第２方向Ａ２（つまり、行方向Ａ２）に沿って並んでいる。
【００３０】
複数のナノポア３は、互いに重ならないように配置される。
【００３１】
複数のナノポア３の配置に規則性はなくてもよい。
【００３２】
また、図１のナノポア３の開口部形状は楕円であるが、ナノポア３の開口部形状はこれに限られない。他の例として、真円、多角形、自由曲面等であってもよく、異なる形状の開口部が混在していてもよい。
【００３３】
図２は本発明の実施形態１に係る細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ１００の断面図である。
【００３４】
複数のナノポア３の深さに規則性はなくてもよく、異なる深さでもよい。
【００３５】
また、図２のナノポア３の断面形状は左右対称であるが、ナノポア３の断面形状はこれに限られない。他の例として、テーパ、逆テーパ、非対称であってもよく、異なる断面形状が混在していてもよい。
【００３６】
次に、図３を参照して、ナノポアアレイ１００の細胞接着ならびに細胞成長抑制効果について説明する。図３は本発明の実施形態１に係る細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ１００と、対象物５との接着状態を示す断面図である。
【００３７】
対象物５は、実施形態１では、マウスの皮膚に由来する繊維芽細胞である。ナノポア３は開口面積より大きな対象物５と接触した際、対象物５との接触面積量を、ポアの開口面積量に応じて減少させることができる。
【００３８】
ナノポアアレイ１００の表面には凹形状のナノポア３があるため、対象物５は見かけの表面全体５ａで接触するわけではなく、実際の接触は限られた部分５ｂのみで起こる。マイクロスケール下では、重力よりも付着力が支配的になるスケール効果が起こり、接触面積量の減少により、付着力を低減することが可能となる。また接着細胞は足場となる構造体に接着後、細胞のストレスファイバーや仮足の構造を変化させて遊走する。この際に接触領域が通常より少ないため、細胞のストレスファイバーや仮足の構造形成が抑制される。
【００３９】
また、図３の対象物５の断面形状は左右対称であるが、対象物５の断面形状はこれに限られない。
【００４０】
以上、図１〜図３を参照して説明したように、実施形態１によれば、ベース１の表面に複数のナノポア３が形成されている。従ってナノポアアレイ１００と対象物５が接触した際、ナノポア３がない場合に比べて、接触面積量が減少する。その結果、付着力を低減することが可能であり、細胞接着の抑制が可能になる。また、細胞のストレスファイバーや仮足の構造形成が抑制される。
【００４１】
また、実施形態１によれば、単位面積あたりのナノポア３の開口部で占める割合が大きいほど、接触面積量が少なくなり、より付着力の低減に繋がる。ただし、１つあたりのナノポア３の開口面積が大きい場合、対象物５がナノポア３の断面と接触しやすくなる。従って、ナノポア３は１つあたりの開口面積が少なく、単位面積当たりのナノポア３の開口部で占める割合が大きいほど、細胞接着ならびに細胞成長抑制効果が期待できる。
【００４２】
さらに、実施形態１によれば、ナノポア３の深さは、ナノポア３のポア領域を上面から楕円近似した際の長軸長さと比較して、大きな比を示す方が好ましい。対象物５が変形性に富んだ材料の場合、対象物５がナノポア３の断面と接触しやすくなるためである。
【００４３】
さらに、実施形態１によれば、ナノポアアレイ１００は、開口面積１μｍ２以下の開口面積、さらにポア領域を上面から楕円近似した際の長軸長さに対して０．５倍以上の深さのナノポア３を有するため、直径２０μｍ以下の変形性に富んだ対象物に対しても接触面積の低減が可能であり、対象物として細胞をとり扱うような研究又は産業への応用が可能である。つまり、ナノポアアレイ１００は、医療、生化学分析、又は生化学実験等の微細作業環境下で効果的に使用可能である。ただし、ナノポアアレイ１００は、これらの分野への適用に限定されず、電子部品の分野等、幅広い分野に適用可能である。つまり、ナノポアアレイ１００は汎用性が高い。
【００４４】
さらに、実施形態１によれば、細胞接着ならびに細胞成長抑制効果はナノポアアレイ１００の構造によるものであるため、化学的なパターニングを実施する手法と比較して（例えば、特許文献１参照）、耐熱性、耐光性の観点から効果がより期待できる。
【００４５】
図４は、本発明の実施形態１に係る細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造１００を有する基板３００を示す平面図である。基板３００は、例えば、基板である。
【００４６】
基板３００は、ベース１、複数のナノポア３を有する細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のある少なくとも１つのナノポアアレイ構造１００を備える。ベース１の表面には、ナノポアアレイ構造１００が形成されていない領域が存在し、上記ナノポアアレイ構造１００が形成されていない領域が細胞接着領域となる。ベース１の原料は、実施形態１では、ケイ素（Ｓｉ）である。
【００４７】
少なくとも１つのナノポアアレイ構造１００は、第１方向Ｂ１（つまり、列方向Ｂ１）ならびに第２方向Ｂ２（つまり、行方向Ｂ２）に沿って並んでいる。
【００４８】
少なくとも１つのナノポアアレイ構造１００は、互いに重ならないように配置される。
【００４９】
少なくとも１つのナノポアアレイ構造１００の配置に規則性はなくてもよい。
【００５０】
また、図４の少なくとも１つのナノポアアレイ構造１００は長方形であるが、少なくとも１つのナノポアアレイ構造１００の形状はこれに限られない。他の例として、真円、多角形、自由曲面等であってもよく、異なる形状の開口部が混在していてもよい。
【００５１】
また、基板３００を細胞接着に効果のあるフィブロネクチン、ゼラチン等のタンパク質と組み合わせることにより、応用範囲をさらに広げることができる（例えば、実施形態６）。さらに、タンパク質に応答又は反応する物質、微生物、又は細胞を、トラップしたり、トラップしなかったりして、高効率で容易にスクリーニングを実行できる。さらに、トラップ対象の局所から広範囲にいたるまで、細胞接着性や細胞成長の制御ができるため、例えば、細胞の形態変化、機能発現における境界条件の導出、又は細胞遊走の解析等への応用が期待できる。
【００５２】
さらに、実施形態１によれば、細胞接着ならびに細胞成長抑制効果はナノポアアレイ１００の構造によるものであるため、ナノポアアレイ１００の表面全面にフィブロネクチン、ゼラチン等のタンパク質を塗布しても、細胞接着ならびに細胞成長抑制効果が起こる。従って、基板表面に対して化学的に異なる材料パターニングを実施する必要がない。そのため、基板上で、細胞パターニング以外にも複数の化学的処理を実施する場合においては、化学的な干渉を防止することができる。特に細胞培養では、細胞播種を行ための前処理から、解析を実施するための後処理まで複数回化学的処理を行うため、細胞パターニングを化学的処理で実施した場合、処理の方法によっては、細胞接着と非接着領域のパターニングの効果が消失する可能性がある。上記のような、細胞パターニング以外の化学的処理を必要とする場合には効果的である。
【００５３】
図５を参照して、ナノポアアレイ１００の製造方法について説明する。ナノポアアレイ１００の製造方法は、第１レイヤー工程Ｓ１０００を含む。図５は第１レイヤー工程Ｓ１０００を説明する図である。
【００５４】
図５（ａ）は、第１レイヤーＬ１を示す斜視図である。図５（ｂ）は、第１レイヤー工程Ｓ１０００での処理後の第１レイヤーＬ１を説明する斜視図である。図５（ｃ）は、図５（ｂ）のＶＣ−ＶＣ線に沿った断面図である。
【００５５】
図５（ａ）に示すように、第１レイヤー工程Ｓ１０００では、ベース１上に第１レイヤーＬ１を形成する。ベース１の原料は、実施形態１では、ケイ素（Ｓｉ）である。第１レイヤーＬ１の原料は、実施形態１では、空洞であり、存在しない。
【００５６】
図５（ｂ）および図５（ｃ）に示すように、第１レイヤー工程Ｓ１０００では、エッチング（例えば、ドライエッチング）により、ベース１を処理して、ナノポア３を形成する。従って、ナノポア３は、第１レイヤーＬ１の一部である。処理後の第１レイヤーＬ１、つまり、ナノポア３を第１レイヤーＬ１ａと記載する場合もある。
【００５７】
図６〜図８を参照して、細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造１００を有する基板３００の製造方法について説明する。基板３００の製造方法は、第２レイヤー工程Ｓ２００、第１レイヤー工程Ｓ１００、及び第２レイヤー除去工程Ｓ２２０を含む。図６は第２レイヤー工程Ｓ２００を説明する図であり、図７は第１レイヤー工程Ｓ１００を説明する図であり、図８は第２レイヤー除去工程Ｓ２２０を説明する図である。
【００５８】
図６（ａ）は、第２レイヤーＬ２を示す斜視図である。図６（ｂ）は、第２レイヤー工程Ｓ２００での処理後の第２レイヤーＬ２を説明する斜視図である。図６（ｃ）は、図６（ｂ）のＶＩＣ−ＶＩＣ線に沿った断面図である。
【００５９】
図６（ａ）に示すように、第２レイヤー工程Ｓ２００では、ベース１上に第２レイヤーＬ２を形成する。第２レイヤーＬ２の原料は、実施形態１では、クロム（Ｃｒ）である。
【００６０】
図６（ｂ）および図６（ｃ）に示すように、第２レイヤー工程Ｓ２００では、エッチング（例えば、ドライエッチング）により、第２レイヤーＬ２を処理して、マスク材７を形成する。従って、マスク材７は、第２レイヤーＬ２の一部である。処理後の第２レイヤーＬ２、つまり、マスク材７を第２レイヤーＬ２ａと記載する場合もある。
【００６１】
第２レイヤー工程Ｓ２００の完了後、第１レイヤー工程Ｓ１００が実行される。
【００６２】
図７（ａ）は、第１レイヤーＬ１を示す斜視図である。図７（ｂ）は、第１レイヤー工程Ｓ１００での処理後の第１レイヤーＬ１を説明する斜視図である。図７（ｃ）は、図７（ｂ）のＶIIＣ−ＶIIＣ線に沿った断面図である。
【００６３】
図７（ａ）に示すように、第１レイヤー工程Ｓ１００では、ベース１上及び第２レイヤーＬ２ａの間に第１レイヤーＬ１を形成する。第１レイヤーＬ１の原料は、実施形態１では、空洞であり、存在しない。
【００６４】
図７（ｂ）および図７（ｃ）に示すように、第１レイヤー工程Ｓ１００では、エッチング（例えば、ドライエッチング）により、ベース１を処理して、ナノポア３を形成する。従って、ナノポア３は、第１レイヤーＬ１の一部である。処理後の第１レイヤーＬ１、つまり、ナノポア３を第１レイヤーＬ１ｂと記載する場合もある。
【００６５】
第１レイヤーＬ１ｂが存在する領域が、細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のある少なくとも１つのナノポアアレイ構造１００の領域となる。
【００６６】
第１レイヤー工程Ｓ１００の完了後、第２レイヤー除去工程Ｓ２２０が実行される。
【００６７】
図８（ａ）は、第２レイヤー除去後の第１レイヤーＬ１を示す斜視図である。図８（ｂ）は、第２レイヤー除去工程Ｓ２２０での処理後の第１レイヤーＬ１を説明する斜視図である。図８（ｃ）は、図８（ｂ）のＶIIIＣ−ＶIIIＣ線に沿った断面図である。
【００６８】
図８（ａ）に示すように、第２レイヤー除去工程Ｓ２２０では、第１レイヤーＬ１上の第２レイヤーＬ２を除去する。
【００６９】
図８（ｂ）および図８（ｃ）に示すように、第２レイヤー除去工程Ｓ２２０では、エッチング（例えば、ウェットエッチング）により、マスク材７を処理して、マスク材７を除去する。
【００７０】
マスク材７を除去した領域が細胞接着領域となる。
【００７１】
図９〜図１２を参照して、細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造１００を有する基板３００の製造方法の詳細について説明する。図９及び図１０は、それぞれ、第２レイヤー工程Ｓ２００の前段及び後段を説明する断面図である。図９（ａ）〜図９（ｄ）は、それぞれ、工程Ｓ１〜工程Ｓ４を説明し、図１０（ａ）〜図１０（ｃ）は、それぞれ、工程Ｓ５〜工程Ｓ７を説明する。
【００７２】
図９（ａ）に示すように、工程Ｓ１において、ベース１を用意し、洗浄する。図９（ｂ）に示すように、工程Ｓ２において、スパッタリングにより、第２レイヤーＬ２の原料によってベース１上に成膜する。その結果、ベース１上に第２レイヤーＬ２が形成される。図９（ｃ）に示すように、工程Ｓ３において、第２レイヤーＬ２上にレジスト２１を形成する。図９（ｄ）に示すように、工程Ｓ４において、マスク材７に対応するマスクを使用して、フォトリソグラフィーにより、マスク材７に対応するパターンをレジスト２１に露光する。
【００７３】
図１０（ａ）に示すように、工程Ｓ５において、現像液によって、レジスト２１のうち余分な部分、つまり、マスク材７に対応するパターン以外の部分を除去する。その結果、マスク材７に対応するパターンのレジスト２１が形成される。図１０（ｂ）に示すように、工程Ｓ６において、第２レイヤーＬ２の原料を溶解するエッチャントを使用して、第２レイヤーＬ２のうち余分な部分、つまり、第２レイヤーＬ２のうちレジスト２１で覆われていない部分を除去する。図１０（ｃ）に示すように、工程Ｓ７において、ドライ洗浄又はウェット洗浄を実行して、残ったレジスト２１を除去する。
【００７４】
以上、第２レイヤー工程Ｓ２００が完了した。次に、第１レイヤー工程Ｓ１００が実行される。
【００７５】
図１１は第１レイヤー工程Ｓ１００を説明する断面図である。図１１（ａ）〜図１１（ｂ）は、それぞれ、工程Ｓ８〜工程Ｓ９を説明する。
【００７６】
図１１（ａ）に示すように、工程Ｓ８において、エッチング（ドライ）によって、ベース１およびマスク材７をエッチングする。その結果、図１１（ｂ）に示すように、工程Ｓ９において、ナノポア３を形成することができる。第１レイヤーＬ１、つまり、ナノポア３を第１レイヤーＬ１ｂと記載する場合もある。
【００７７】
実施形態１では、工程Ｓ８におけるエッチング方法として、反応性イオンエッチングによるドライエッチングを実施した。また、反応ガスとして、四フッ化メタン（ＣＦ４）ガスと酸素（Ｏ２）の混合ガスを用いた。ベース１の原料であるケイ素（Ｓｉ）は通常四フッ化メタン（ＣＦ４）ガスのみでエッチング可能であるが、四フッ化メタン（ＣＦ４）ガスと酸素（Ｏ２）の混合ガスを用いることで、エッチング速度を上昇することが可能である。また、その際のデメリットとして、表面が荒くなるという加工精度の低下が生じるため、通常用いない。しかし、表面が荒くなることで、ナノポア３を形成することができる。
【００７８】
第１レイヤー工程Ｓ１００の完了後、第２レイヤー除去工程Ｓ２２０が実行される。
【００７９】
図１２は第２レイヤー除去工程Ｓ２２０を説明する断面図である。図１２は工程Ｓ１０説明する。
【００８０】
図１２に示すように、工程Ｓ１０において、ドライエッチング又はウェットエッチングを実行して、マスク材７を除去する。
【００８１】
さらに、図６〜図１２を参照して説明したように、実施形態１では、ベース１の原料はシリコン（Ｓｉ）である。シリコン（Ｓｉ）は、電気的及び機械的に非常に安定で、微細加工が容易であり、しかも開発実績が多く信頼性が高いからである。また、マスク材７の原料はクロム（Ｃｒ）である。クロム（Ｃｒ）も微細加工が容易であり、しかも開発実績が多く信頼性が高いからである。
【００８２】
（実施形態２）
図６及び図１３を参照して、本発明の実施形態２に係る細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造１００を有する基板３００の製造方法について説明する。実施形態２に係る製造方法によって、図４に示す細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造１００を有する基板３００を製造する。
【００８３】
図１３は、基板３００の製造方法を示すフローチャートである。製造方法は、工程Ｓ３１〜工程Ｓ３３を含む。工程Ｓ３１は第２レイヤー工程Ｓ２００を構成する。工程Ｓ３２は、第１レイヤー工程Ｓ１００を構成する。工程Ｓ３３は、第２レイヤー除去工程Ｓ２２０を構成する。
【００８４】
工程Ｓ３１において、マスク材７を形成する。実施形態２では、マスク材として実施形態１と同様に、工程Ｓ３１において、金属薄膜とレジストを形成した後、エッチングによりマスク材７を形成する。ただし、実施形態２に係る第２レイヤー工程Ｓ２００ではレジストの除去はおこなわない。すなわち、工程Ｓ７（図１０（ｃ））を省略し、パターニングされたレジストは第２レイヤーＬ２の一部であり、実施形態２に係る第２レイヤー工程Ｓ２００では、第２レイヤーＬ２を形成及び処理して、金属薄膜とレジストの両者でマスク材７を形成する。
【００８５】
工程Ｓ３２において、エッチング（ドライ）によって、ベース１およびマスク材７をエッチングする。図１１で説明した第１レイヤー工程Ｓ１００と同様である。このときエッチングの条件によってはマスク材７のレジスト部分が消失する場合がある。その場合は、金属薄膜のみがマスク材７として機能する。
【００８６】
工程Ｓ３３において、エッチング（ドライまたはウェット）によって、マスク材７をエッチングする。図１２で説明した第１レイヤー工程Ｓ２２０と同様である。マスク材にレジストが残っている場合は、レジストを除去してから、金属をエッチングする。残っているレジストの厚みによっては金属エッチングのみでレジストを剥離することも可能である。
【００８７】
以上、実施形態２に係る製造方法によれば、図１に示すナノポアアレイ１００を容易に製造できる。その他、実施形態１に係る製造方法と同様の効果を有する。
【００８８】
（実施形態３）
図６及び図１４を参照して、本発明の実施形態３に係る細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造１００を有する基板３００の製造方法について説明する。実施形態３に係る製造方法によって、図４に示す細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造１００を有する基板３００を製造する。
【００８９】
図１４は、基板３００の製造方法を示すフローチャートである。製造方法は、工程Ｓ３２〜工程Ｓ３４を含む。工程Ｓ３４は第２レイヤー工程Ｓ２００を構成する。工程Ｓ３２は、第１レイヤー工程Ｓ１００を構成する。工程Ｓ３３は、第２レイヤー除去工程Ｓ２２０を構成する。
【００９０】
工程Ｓ３４において、マスク材７を形成する。実施形態３では、マスク材としてレジストのみを形成した後、フォトリソグラフィーによりマスク材７を形成する。すなわち、工程Ｓ２（図９（ｂ））およびの工程Ｓ６（図１０（ｂ））を省略し、パターニングされたレジストは第２レイヤーＬ２の一部であり、実施形態３に係る第２レイヤー工程Ｓ２００では、第２レイヤーＬ２を形成及び処理して、レジストのみでマスク材７を形成する。
【００９１】
工程Ｓ３２において、エッチング（ドライ）によって、ベース１およびマスク材７をエッチングする。図１１で説明した第１レイヤー工程Ｓ１００と同様である。このときエッチングの条件によってはマスク材７のレジストが消失する場合がある。そのため、工程Ｓ３４において、レジストの膜厚は、工程Ｓ３２でも消失しないように、厚く形成し、中でも５μｍ以上のものが好ましい。
【００９２】
工程Ｓ３３において、マスク材７をドライ洗浄又はウェット洗浄を実行して、残ったレジストを除去する。
【００９３】
以上、実施形態３に係る製造方法によれば、図１に示すナノポアアレイ１００を容易に製造できる。その他、実施形態１に係る製造方法と同様の効果を有する。
【００９４】
（実施形態４）
図６及び図１５を参照して、本発明の実施形態４に係る細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造１００を有する基板３００の製造方法について説明する。実施形態４に係る製造方法によって、図４に示す細胞接着ならびに細胞成長抑制効果のあるナノポアアレイ構造１００を有する基板３００を製造する。
【００９５】
図１５は、基板３００の製造方法を示すフローチャートである。製造方法は、工程Ｓ３２〜工程Ｓ３３及び工程Ｓ３５を含む。工程Ｓ３５は第２レイヤー工程Ｓ２００を構成する。工程Ｓ３２は、第１レイヤー工程Ｓ１００を構成する。工程Ｓ３３は、第２レイヤー除去工程Ｓ２２０を構成する。
【００９６】
工程Ｓ３５において、マスク材７を形成する。実施形態４では、リフトオフ法によりマスク材７を形成する。マスク材７に対応するマスクを使用して、フォトリソグラフィーにより、レジストに露光する。ただしマスク材７を形成したくない箇所にレストが残るように露光する。その後金属薄膜を形成し、レジストを除去することで、金属薄膜によるマスク材７を形成する。パターニングされた金属薄膜は第２レイヤーＬ２の一部であり、実施形態４に係る第２レイヤー工程Ｓ２００では、第２レイヤーＬ２を形成及び処理して、金属薄膜のみでマスク材７を形成する。
【００９７】
工程Ｓ３２において、エッチング（ドライ）によって、ベース１およびマスク材７をエッチングする。図１１で説明した第１レイヤー工程Ｓ１００と同様である。
【００９８】
工程Ｓ３３において、マスク材７をドライ洗浄又はウェット洗浄を実行して、残った金属を除去する。
【００９９】
以上、実施形態４に係る製造方法によれば、図１に示すナノポアアレイ１００を容易に製造できる。その他、実施形態１に係る製造方法と同様の効果を有する。
【０１００】
（実施形態５）
本発明の実施形態５に係る基板３００について説明する。図４の基板３００の原料はケイ素（シリコン）である。この基板３００をマスターとし、電鋳加工、およびナノインプリント等の成形加工を組み合わせることで、基板３００の原料を、セラミック、プラスチック、金属で製作することが可能である。特に電鋳加工はナノメートルオーダーの転写精度が実現できるため、本発明のナノポア３も高精度に転写可能である。例えば、基板３００の原料を透明性の高い樹脂にし、観察用ディッシュや培養用ディッシュにすることが可能である。
【０１０１】
（実施形態６）
図１６を参照して、本発明の実施形態６に係る培養基材４００について説明する。図１６は、本発明の実施形態６に係る培養基材４００を説明する斜視図である。培養基材４００は、基板３００と、タンパク質９とを備える。基板３００は、図４に示した基板３００と同じである。タンパク質９は、基板３００を覆うように形成される。
【０１０２】
タンパク質９は、例えば、タンパク質である。タンパク質は、細胞接着に効果のあるフィブロネクチン、ゼラチン等である。ナノポアアレイ１００を除く領域で、細胞接着を起こすことが可能である。
【０１０３】
また、ナノポアアレイ１００の領域ではタンパク質が塗布されているが、非接着性の効果のため、細胞接着を防止することができる。結果的に、細胞パターニングを実現できる。
【０１０４】
また、フォトリソグラフィーにより細胞非接着領域を任意に設計できるため、様々なサイズ及び形状の人工臓器パーツを１つの基板３００によって形成できる。
【０１０５】
次に、本発明が実施例に基づき具体的に説明されるが、本発明は以下の実施例によって限定されない。
【０１０６】
（実施例１）
本発明の実施例１では、図６〜図１２を参照して説明した製造方法により、図４に示す基板３００を製作した。そして、基板３００表面におけるナノポアアレイ１００の顕微鏡画像を撮影した。
【０１０７】
図１７を参照して実施例１を説明する。図１７は、実施例１に係るナノポアレイ１００の顕微鏡画像を示す。ナノポアレイ１００が良好に形成されていることを確認できた。
【０１０８】
ナノポアアレイ構造１００を有する基板３００を以下の条件で製造した。ベース１の原料はケイ素（Ｓｉ）であった。第２レイヤーＬ２の原料はクロム（Ｃｒ）であった。
【０１０９】
工程Ｓ２（図９（ｂ））では、厚みが約５０ｎｍの第２レイヤーＬ２をスパッタリングにより形成した。
【０１１０】
工程Ｓ３（図９（ｃ））で形成したレジスト２１の厚みは約２μｍであり、レジスト２１として、ＡＺ１５００（ＡＺエレクトロニックマテリアルズ社）を使用した。
【０１１１】
工程Ｓ５（図１０（ａ））では、現像を行い、露光されたレジスト２１の一部を除去した。レジスト２１の現像液としてＮＭＤ−３（東京応化工業株式会社）を用いた。
【０１１２】
工程Ｓ７（図１０（ｃ））では、ウェット洗浄を実行して、残ったレジスト２１を除去した。レジスト２１の除去液としてＡＺリムーバー（ＡＺエレクトロニックマテリアルズ社）を用いた。
【０１１３】
工程Ｓ１０（図１２）では、ウェットエッチングを実行して、クロムを除去した。クロムの除去液としてクロム膜エッチング液（日本化学産業株式会社）を用いた。
【０１１４】
（実施例２）
図１６及び図１８を参照して、本発明の実施例２を説明する。図１６に示すように、実施例２では、実施例１で製作したデバイス３００の表面を覆うように、タンパク質９を形成し、培養基材４００を製作した。タンパク質９は、細胞接着性の高い材料であった。このタンパク質９は、透明である。さらに、マウスの皮膚に由来する繊維芽細胞を含む細胞懸濁液を、タンパク質９の上部に添加した。
【０１１５】
マウスの皮膚に由来する繊維芽細胞を含む細胞懸濁液を、培養基材４００のタンパク質９上部に添加し、二酸化炭素（ＣＯ２）５％で温度３７℃の環境下で１２時間インキュベートして、細胞を観察した。
【０１１６】
図１８は、インキュベート後の顕微鏡画像を示す。細胞接着領域と細胞非接着領域の境界を観察し、一部の細胞画像を拡大した。まず、細胞接着領域に付着した細胞数と、細胞非接着領域に付着した細胞数を比較したところ、約５倍の細胞数の違いが生じており、細胞接着抑制効果が確認できた。細胞非接着領域において一部細胞が付着していたが、形態を観察したところ、細胞接着領域の細胞とは異なっていた。細胞接着領域の細胞は仮足を延ばし細長く細胞が成長しているのに対し、細胞接着領域の細胞は仮足を延ばすことなく、円形に近い形状を維持していた。細胞接着領域に付着した仮足を延ばした細胞数と、細胞非接着領域に付着した仮足を延ばした細胞数を比較したところ、約３８倍の細胞数の違いが生じており、細胞成長抑制効果が確認できた。
【０１１７】
以上、図面（図１〜図１８）を参照しながら本発明の実施形態及び実施例について説明した。但し、本発明は、上記の実施形態及び実施例に限られるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々の態様において実施することが可能である（例えば、下記に示す（１）〜（１１））。図面は、理解しやすくするために、それぞれの構成要素を主体に模式的に示しており、図示された各構成要素の厚み、長さ、個数等は、図面作成の都合上から実際とは異なる場合もある。また、上記の実施形態で示す各構成要素の形状、寸法等は一例であって、特に限定されるものではなく、本発明の効果から実質的に逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
【０１１８】
（１）実施形態１〜実施形態６では、ナノポアアレイ１００は、３０個以上のナノポア３を有した。ただし、ナノポア３の数は、特に限定されず任意であり、同一ベース１上において異なる形状であってもよい。
【０１１９】
（２）実施形態１〜実施形態６では、ナノポアアレイ１００の領域は長方形であった。ただし、ナノポアアレイ１００の形状は、特に限定されず任意であり、同一ベース１上において異なる形状であってもよい。
【０１２０】
（３）実施形態１〜実施形態６では、ナノポアアレイ１００は、２個以上であった。ただし、ナノポアアレイ１００の数は、特に限定されず任意である。
【０１２１】
（４）実施形態１〜実施形態６（実施形態３と実施形態５を除く）では、マスク材７の原料は、例えば、プラチナ（Ｐｔ）、ニッケル（Ｎｉ）、アルミニウム（Ａｌ）、金（Ａｕ）、銅（Ｃｕ）、又は酸化ケイ素（ＳｉＯｘ）でもよい。酸化ケイ素（ＳｉＯｘ）は、例えば、ｘ＝２である。スパッタリングで成膜可能な材料であれば、置き換え可能である。また、これらは異なる材料で２層以上から成膜されてもよい。
【０１２２】
（５）実施形態１〜実施形態６（実施形態３と実施形態５を除く）では、マスク材７の成膜方法は、電解めっき、無電解めっき、真空蒸着、又は化学気相成長であってもよい。
【０１２３】
（６）実施形態１〜実施形態６（実施形態５を除く）において、第２レイヤー工程Ｓ２００、第１レイヤー工程Ｓ１００、及び第２レイヤー工程Ｓ２２０の全部又は一部で、エッチング法を採用してもよいし、リフトオフ法を採用してもよいし、エッチング法とリフトオフ法とを組み合わせて採用してもよい。例えば、全ての工程でリフトオフ法を採用する場合、エッチャントが不要であり、ナノポアアレイ３の製造コストを削減できる。また、エッチング法は、ウェット法を採用してもよいし、ドライエッチング法を採用してもよい。さらに、レジスト２１は、ポジ型でもよいし、ネガ型でもよい。
【０１２４】
（７）実施形態１〜実施形態６において、パターニングする対象物５は、例えば、細胞を含む生体、プラスチック、セラミック、金属、半導体、又は酸化ケイ素（ＳｉＯｘ）でもよい。
【０１２５】
（８）実施形態５において、基板３００の原料は、例えば、プラスチック、セラミック、金属、半導体、又は酸化ケイ素（ＳｉＯｘ）でもよい。
【０１２６】
（９）実施形態６において、タンパク質９の原料は、例えば、有機、無機、金属、非金属、又は生体由来物質でもよい。さらに、液体、気体、又は固体でもよい。
【０１２７】
（１０）実施形態１〜実施形態６において、ナノポアアレイ１００、及びナノポアアレイ構造１００を有する基板３００の上面、内部、又は下面の全部又は一部で、電極を集積してもよい。電極の集積により、温度センサ、力センサ、ヒーター、又は誘電力と組み合わせることが可能である。
【０１２８】
（１１）実施形態１〜実施形態６において、ベース１の原料は例えば、プラスチック、セラミック、金属、半導体、又は酸化ケイ素（ＳｉＯｘ）でもよい。シリコンウエハを用いる場合、ＳＯＩ（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ＯＮ  Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）ウェハであってもよい。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明は、細胞培養の分野に利用可能である。
【符号の説明】
【０１３０】
１    ベース
３    ナノポア
５    対象物
５ａ    接触領域（全体）
５ｂ    接触領域（部分的な限られた接触領域）
７    マスク材
９    タンパク質
１００    ナノポアアレイ
３００    ナノポアアレイ構造１００を有する基板
４００    培養基材
Ｌ１    第１レイヤー
Ｌ２    第２レイヤー
【図１】
2020156360.tif 000003
【図２】
2020156360.tif 000004
【図３】
2020156360.tif 000005
【図４】
2020156360.tif 000006
【図５】
2020156360.tif 000007
【図６】
2020156360.tif 000008
【図７】
2020156360.tif 000009
【図８】
2020156360.tif 000010
【図９】
2020156360.tif 000011
【図１０】
2020156360.tif 000012
【図１１】
2020156360.tif 000013
【図１２】
2020156360.tif 000014
【図１３】
2020156360.tif 000015
【図１４】
2020156360.tif 000016
【図１５】
2020156360.tif 000017
【図１６】
2020156360.tif 000018
【図１７】
2020156360.tif 000019
【図１８】
2020156360.tif 000020