(57)【要約】      （修正有）【課題】処理された試料中の生存細菌と不活化細菌の相対量を区別する方法の提供。【解決手段】試料全体を単一の膜結合性色素で染色するステップ；λexcitationの入射光を試料全体に照射するステップ；試料全体について、（ｉ）波長λ１での発光強度Ｉ１および（ｉｉ）波長λ２での発光強度Ｉ２を測定するステップ；比Ｉ２／Ｉ１を算出するステップ；ならびに算出されたＩ２／Ｉ１が所定の閾値より大きいか、またはより小さいかに基づき、生存細菌と不活化細菌の相対量を決定するステップを含むことを特徴とする、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
処理された試料中の生存細菌と不活化細菌の相対量を区別する方法であって：
試料全体を単一の膜結合性色素で染色するステップ；
λexcitationの入射光を試料全体に照射するステップ；
試料全体について、（ｉ）波長λ１での発光強度Ｉ１および（ｉｉ）波長λ２での発光強度Ｉ２を測定するステップ；
比Ｉ２／Ｉ１を算出するステップ；ならびに
算出されたＩ２／Ｉ１が所定の閾値より大きいか、またはより小さいかに基づき、生存細菌と不活化細菌の相対量を決定するステップ
を含む
ことを特徴とする、方法。
【請求項２】
算出されたＩ２／Ｉ１が所定の閾値より大きいか、またはより小さいかに基づき、生存細菌あるいは不活化細菌の相対量を決定するステップは：
試料のＩ２／Ｉ１を、生存細菌のみを含む対照のＩ２／Ｉ１で割ることにより非生育パラメータを算出するステップ；
算出された非生育パラメータが閾値Ｂより大きいか、またはより小さいかに基づき、生存細菌と不活化細菌の相対量を決定するステップ
を含む
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生存細菌のみを含む対照が、試料と同じ細菌濃度を有する
ことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
閾値Ｂが１．０であり、生存細菌は、非生育パラメータ≦１．０を有し、そして、不活化細菌は、非生育パラメータ＞１．０を有する
ことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１月１２日出願の米国仮出願第６２／１０２，５０６号の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
試料中の生存細菌数を迅速に測定するための方法が記載される。該方法は、例えば、低温殺菌、塩素殺菌、ＵＶ、オゾン等の、多くの産業に豊富に存在する、種々の殺菌処理手法の効率を定量的に検証するのに有用であり、また、消費用の食品または水中の生存生物数を評価するのに有用である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
例えば、ヒトおよび動物による消費向けの食品および水にとって、試料中の細菌レベルは、大いに興味深い。水および飲料会社、食品産業、製薬（pharmaceutical）等の多くの産業では、殺菌処理の後、製品中には、細菌は全く、あるいは、最小量の細菌しか、生存していないことを保証するため、様々な殺菌方法を使用している。
【０００４】
生存微生物の定量化は、通常、細菌の培養増殖に基づく、専門的な検査法である。固体および液体培地で微生物を増殖させるため、特定の条件を、その終了時点で、単位体積当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）（例えば、ＣＦＵ／ｍｌ）数が決定される、長いインキュベーション期間にわたって維持する必要がある。実験室においては、通常、希釈数と試料体積に従って、計数されたコロニーの総数を正規化することにより、ＣＦＵを算出している。この技法では、実験装置、有資格者、および、１日〜１カ月間に及びうる長い期間が必要となる。一般的な手順では、試料を寒天プレートに塗布し、これを数時間または場合により数日間の期間インキュベートし、その後、プレートで増殖したコロニーの数を計数する。固体培地上では増殖しない微生物、また、場合によっては、嫌気性の生物に対しては、基準は、「最推定計数(most estimated count)」(ＭＥＣ)である(Holms W., J. Gen. Microbiol. 54: 255-260 (1968); Bridgewater L., American Public Health Association, American Water Works Association, and Water Environment Federation, Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. Edited by Eugene W. Rice. 22nd ed. Washington, D.C.: American Public Health Association, 2012）。この方法では、試験管系列希釈法 (tube serial dilution）、ならびに、液体の透明度の可視化法を使用しており、その後、当初の微生物濃度が算出される。しかし、細菌の培養を必要とする方法は、時間がかかり、また、費用もかかり、かつ、細菌凝集、生物を増殖させる培養培地の種類、ならびに。死滅した細胞および残骸（debris）の存在に影響を受ける。さらに、細菌には、培養物へと増殖しないものもある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、培養物基準のアッセイに依存することなく、生存細菌と不活化細菌とを弁別することによる、殺菌プロトコールを検証するための迅速な手段を有することは、多くの産業にとって有利となろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明の方法は、単一の色素による蛍光染色および分析を利用して、生存細菌の迅速な検出のための新規の手段を創り出している。本発明の方法では、強度およびスペクトル発光（spectral emission）の双方における差違を組み合わせることで、生存細菌と不活化細菌とを区別する。
【０００７】
一実施形態において、本出願は、処理された試料中の生存細菌と不活化細菌とを区別するための方法であって：
単一の膜結合性色素で試料を染色するステップ；
λexcitationの入射光を試料に照射するステップ；
各細菌細胞について、（ｉ）波長λ１での発光（emitted light）強度Ｉ１；および（ｉｉ）波長λ２での発光強度Ｉ２を測定するステップ；
比Ｉ２／Ｉ１を算出するステップ；ならびに
算出されたＩ２／Ｉ１が所定の閾値より大きいか、またはより小さいかに基づき、該細菌細胞が生存しているか、あるいは、不活化されているかを決定するステップを含む、方法を提供する。別の実施形態においては、同じプロセスを、各細胞に対し個別にではなく、試料全体に対して、実施することもでき、試料全体の強度を測定する。
【０００８】
ある実施形態においては、蛍光分析、フローサイトメトリーならびに顕微鏡観察を使用することができる。フローサイトメトリーおよび顕微鏡観察を伴っている実施形態等の（ただしこれらに限定されない）さらなる実施形態は、単一の細菌の検出および定量を利用する。
【０００９】
分析される試験試料は、液体、半液体、あるいは、乾燥試料であってもよい。一実施形態においては、試料は、飲料水、食品または飲料から採取することができる。別の実施形態においては、試料は、医薬製品、パーソナルケア製品、あるいは、体液から採取することができる。体液には、これらに限定されないが、血漿、唾液、尿、咽頭試料（throat sample）あるいは、胃腸液が含まれる。さらに別の実施形態においては、試料は、都市用水システム、井戸、飲用水(potable water)、排水、天然水源、レクリエーション用水（recreational water)、あるいは、土壌から採取される。別の実施形態においては、試験試料は、医療機器由来である。好ましくは、医療機器は、インプラント(implant)、パッチまたは弁である。
【００１０】
ある実施形態においては、膜結合性色素は、スチリル色素である。好ましい実施形態においては、膜結合性色素は、ＦＭ１−４３またはＦＭ４−６４である。ある実施形態においては、励起波長は、約３６０ｎｍ〜約６００ｎｍの間であり、そして、Ｉ１およびＩ２が測定される波長は約５２０〜約７２０ｎｍの間である。好ましい実施形態において、励起波長は４８８ｎｍであり、そして、Ｉ１およびＩ２が測定される発光波長は、それぞれ５３０ｎｍおよび６１０ｎｍである。他の実施形態においては、励起波長は、約３６０ｎｍ〜約６００ｎｍの間であり、そして、Ｉ１およびＩ２が測定される波長は、約６００〜約８００ｎｍの間である。かかる実施形態においては、励起波長は、４８８〜５７０ｎｍの範囲であり、そして、Ｉ１およびＩ２が測定される発光波長は、それぞれ６７０ｎｍおよび７８０ｎｍである。
【００１１】
上記の一般的な記述ならびに詳細な説明は、例示的かつ説明的であり、そして、特許請求される本発明のさらなる説明を提供することを意図している。本発明の詳細な理解のために、添付の図面と併せて、好ましい実施形態についての以下の詳細な説明が参照される。その他の目的、利点および新規な特徴は、当業者には、本発明についての以下の詳細な説明から容易に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、染色された細菌のスペクトル検出、ならびに、スペクトル／強度による生存細菌と不活化細菌との区別の模式的な図示である。
【図２】図２は、洗浄、そして、ＰＢＳ中に再懸濁された、染色された細菌：対数増殖期にある、１０７ｃｆｕ／ｍｌの、Ｅ．ｃｏｌｉ＃８７３９（実線）、ならびに、８５℃で１５分間不活化した後の同じ細菌（破線）中の、スチリル色素  ＦＭ１−４３の蛍光スペクトルを示す。細菌染色は、４．９μＭ  ＦＭ１−４３中、５分間行い、そして、過剰量の色素を遠心処理ステップにより洗い流した。励起は、４８８ｎｍで行った。
【図３】図３は、ＰＢＳ中のスチリル色素ＦＭ１−４３（点線）；洗浄、そして、ＰＢＳ中に再懸濁された、対数増殖期にある、１０７ｃｆｕ／ｍｌの、Ｅ．ｃｏｌｉ＃８７３９（実線）；８５℃で５分間不活化した後の同じ細菌（破線）の正規化蛍光スペクトルを示す。細菌染色は、４．９μＭ  ＦＭ１−４３中、５分間行い、そして、過剰量の色素を遠心処理ステップにより洗い流した。励起は、４８８ｎｍで行った。両方向矢印は、それぞれ、５３０および６１０ｎｍの、ＳＩＲ算出に選択された波長を示す。
【図４】図４は、標記された、異なる不活化方法で処理後の、ＦＭ１−４３染色された、１０７／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ＃８７３９の正規化蛍光スペクトルを示す。
【図５】図５は、蛍光標識細胞分取法による可視化がなされた、ＦＭ１−４３染色後の２種類の細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ＃８７３９、１０７ｃｆｕ／ｍｌ）試料（左下象限）生存細菌；（右上象限）加熱処理された細菌（低温殺菌：８５℃、１５分間）のフローサイトメトリー・ドット・プロット・オーバーレイである。フローサイトメトリー・ドット・プロットは、細菌集団について、光散乱パラメータ（ＦＳＣ／ＳＳＣ）によりゲーティング（ｇａｔｅ）されており、蛍光フィルターは、５３０（３０）ｎｍならびに６１０（２０）ｎｍである。励起は、４８８ｎｍレーザー光による。
【図６】図６Ａ〜図６Ｆは、ＦＭ１−４３染色後のＥ．ｃｏｌｉ＃８７３９（１０７ｃｆｕ／ｍｌ）試料について、識別されたドット・プロットを示す：図６Ａ．生存細菌；図６Ｂ．加熱（８５℃、１５分間）、図６Ｃ．塩素殺菌、図６Ｄ．エタノール７０％、図６Ｅ．ＵＶ−低圧、図６Ｆ．ＵＶ−中圧。フローサイトメトリー・ドット・プロットは、細菌集団について、光散乱パラメータ（ＦＳＣ／ＳＳＣ）によりゲーティングされており、蛍光フィルターは：５３０（３０）ｎｍならびに６１０（２０）ｎｍである。励起は、４８８ｎｍレーザー光によった。全ての不活化試料（図６Ｂ〜図６Ｆ）は、ｃｆｕで５〜６ｌｏｇの計数減少を示した。ドット・プロットにおけるＸおよびＹの数字は、それぞれ、印が付されたゲート内での、５３０および６１０ｎｍでの発光の平均値を表す。
【図７】図７は、種々の不活化方法の後に、ＦＭ４−６４により染色された、１０７／ｍｌの、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＃８７３９の正規化蛍光スペクトルを示す。黒色実線−生存、破線−加熱処理、点線−塩素殺菌。
【図８】図８Ａ〜図８Ｃは、ＦＭ４−６４染色後の細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＃８７３９、１０７ｃｆｕ／ｍｌ）試料のドット・プロット・オーバーレイである。図８Ａ：生存（黒色ドット）対加熱（８５℃、５分間）不活化（灰色ドット）；図８Ｂ。生存（黒色ドット）対塩素不活化（灰色ドット）；図８Ｃ。生存（黒色ドット）対ＵＶ−ＭＰ不活化（灰色ドット）。フローサイトメトリー・ドット・プロットは、細菌集団について、光散乱パラメータ（ＦＳＣ／ＳＳＣ）によりゲーティングされている。蛍光フィルターは：６７０（１４）ｎｍおよび７８０（６０）ｎｍである。励起は、５６１ｎｍレーザー光によった。
【図９】図９Ａ〜図９Ｂは、（図９Ａ）ＦＭ１−４３、ならびに、（図９Ｂ）ＦＭ４−６４で染色された、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、１０７ｃｆｕ／ｍｌの、生存：黒色ドット、および加熱（８５℃、１５分間）：灰色ドットの、ドット・プロット・オーバーレイである。
【図１０】図１０は、フローサイトメトリーおよびＦＭ１−４３による算出値と、ｃｆｕとの間における、細菌濃度の相関関係のグラフである。小さい表中には、算出された個数と、測定値間のｌｏｇエラーが含まれている。
【図１１】図１１は、フローサイトメトリーおよびＦＭ４−６４による算出値と、ｃｆｕとの間における、細菌濃度の相関関係のグラフを図示する。小さい表中には、算出された個数と、測定値間のｌｏｇエラーが含まれている。
【図１２】図１２Ａ１〜図１２Ａ３、図１２Ｂ１〜図１２Ｂ３は、ＦＭ１−４３で染色されたＥ．ｃｏｌｉの、励起＝４７０ｎｍ、発光＝５２５（５０）ｎｍでの顕微鏡蛍光イメージングを使用して、生成された。図１２Ａ１〜図１２Ａ３：生存細菌。Ｉ＝３５（±５）  ＧＬ。図１２Ｂ１〜図１２Ｂ３：加熱不活化細菌。Ｉ＝４０（±１０）  ＧＬ。グレー・レベル（ＧＬ）分析は、Ｆｉｊｉソフトウェアにより、オブジェクトごとに実施した。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｅは、ＦＭ１−４３で染色された、Ｅ．ｃｏｌｉの、励起＝４７０ｎｍ、発光＝６００（５０）ｎｍでの顕微鏡蛍光イメージングを使用して生成された。図１３Ａ：生存細菌；Ｉ＝２０〜５０  ＧＬ。図１３Ｂ：加熱不活化細菌；Ｉ＝１２８（±２０）  ＧＬ。図１３Ｃ：塩素殺菌不活化細菌；Ｉ＝１３５（±２０）  ＧＬ。顕微鏡測定前に、試料を１０ｍＭチオ硫酸塩（thiosulfate）で５分間処理した。図１３Ｄ：エタノール７０％不活化細菌；Ｉ＝９０（±１０）  ＧＬ。図１３Ｅ：ＵＶ−ＭＰ不活化細菌；Ｉ＝１２０（±２０）  ＧＬ。グレー・レベル（ＧＬ）分析は、Ｆｉｊｉソフトウェアにより、オブジェクトごとに実施した。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｃは、５時間増殖させた後、（図１４Ａ）抗生物質無しで１時間、（図１４Ｂ）アンピシリン７００μｇとともに１時間、ならびに、（図１４Ｃ）アンピシリン１５００μｇとともに１時間、増殖させた、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２のフローサイトメトリー・ドット・プロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
本発明は、スチリル色素等の蛍光膜色素により細菌を染色した際、不活化細菌に対し、生存細菌の蛍光発光（emission fluorescence）は、より弱く、かつ、偏移（ｓｈｉｆｔ）を示すという知見に基づいている。このような現象は、細胞質のより親水性の高い環境中に色素が挿入されている、不活化細胞に対し、生存細胞中における、親油性の膜環境内での色素の相互作用する結果でありうる。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、「生存細胞」または「生存細菌」は、増殖および分裂する潜在能力を有する細菌細胞を意味する。「活動を停止した」および「不活化された」は、死滅した細菌細胞を指すために、互換可能に使用される。
【００１５】
本発明は、生存細菌と不活化細菌とを区別するための方法に関する。この方法は、細胞膜色素のスペクトル強度比分析を使用して、実施される。この方法は、検体を特定の波長で励起した際、生存細菌と不活化細菌との間で、最大発光ピークおよび発光強度の双方において、測定可能な差違が、見出されるという知見に基づいている。したがって、所定の２つの波長における発光強度の比、または、スペクトル強度比（ＳＩＲ）：Ｉ２／Ｉ１が、不活化細菌から、生存細菌を区別する手段として、使用することが可能である。本発明の方法は、区別を成功させるために、単一の色素のみの使用を必須とするともに、培養に基づく検証ではなく、励起／発光に基づいた分析に依拠して、不活化細胞から生存細胞を正確かつ迅速に区別することを可能としている。したがって、この方法は、単一の膜結合性色素で試料を染色するステップ；λexcitationの入射光を試料に照射するステップ；各細菌細胞について、（ｉ）波長λ１の発光強度Ｉ１；および（ｉｉ）波長λ２の発光強度Ｉ２を測定するステップ；比Ｉ２／Ｉ１を算出するステップ；ならびに、算出されたＩ２／Ｉ１が所定の閾値より大きいか、またはより小さいかに基づき、該細菌細胞が生存しているか、あるいは、不活化されているかを決定するステップを含む。別の実施形態においては、これと同じプロセスを、各細胞に対し個別にではなく、試料全体に対して実施することもできる。さらなるこのような実施形態においては、試料が、生存細菌を含むか、あるいは、不活化細菌を含むかを決定するため、バルク強度を測定することもできる。
【００１６】
本発明の方法を実施するためのシステムは、（ただしこれらに限定されないが、）フロ
ーサイトメーター、蛍光顕微鏡、あるいは、蛍光分析が可能なその他の機器等、好ましくは、膜結合性色素の励起が可能で、そして、所定の波長λ１およびλ２での発光強度の測定が可能である機器である。
【００１７】
発光スペクトルのプロファイルは、スペクトルアナライザーまたは発光フィルター（emission filter）を用いて、測定される。励起波長は、約３６０ｎｍ〜約６００ｎｍの間であり、そして、Ｉ１およびＩ２が測定される波長は、約５２０〜約８００ｎｍの間である。好ましい実施形態においては、励起波長は、４８８ｎｍであり、そして、Ｉ１およびＩ２が測定される発光波長は、それぞれ５３０ｎｍおよび６１０ｎｍである。ＦＭ４−６４に対しては、励起波長は、４８８〜５７０ｎｍの間であってよく、そして、Ｉ１およびＩ２が測定される発光波長は、それぞれ６７０ｎｍおよび７８０ｎｍである。
【００１８】
好ましい実施形態において、各細菌細胞は、所定の閾値と比較した、ＳＩＲ値（Ｉ２／Ｉ１）に基づいて、生存または不活化に分類される。
【００１９】
ある実施形態においては、算出された試料のＳＩＲが、所定の閾値より大きいか、またはより小さいかに基づき、細菌細胞が生存しているか、あるいは、不活化されているかを決定するプロセスは、試料のＳＩＲを、生存細菌対照のＳＩＲで割ることにより算出される非生育パラメータ（non-viability parameter）（ＮＶＰ）を必要とする。次いで、前記ＮＶＰが、細菌が生存しているか、あるいは、不活化されているかを決定するため、閾値と比較される。さらなる実施形態においては、約１のＮＶＰは、生存細菌を示し、一方、有意に１を超えるＮＶＰは、死滅した細菌を示す。ＳＩＲが、試料全体について算出される、ある実施形態においては、生存細菌対照の濃度は、試験試料と同じにする必要がある。
【００２０】
試験試料が、均一な細菌集団、あるいは、既知の比の不均一な細菌集団を含む、さらなる実施形態においては、生存細菌対照のＳＩＲ値の標準曲線を使用して、細菌細胞が生存しているか、あるいは、不活化されているかを決定するための所定の閾値を規定することができる。
【００２１】
色素には、これに限定されないが、脂質二重膜中に組み込まれる蛍光色素が含まれる。蛍光色素の例には、スチリル色素およびシアニン色素が含まれる。代表的なスチリル色素には、ＦＭ（登録商標）１−４３、ＦＭ（登録商標）１−４３ＦＸ、ＦＭ（登録商標）４−６４およびＦＭ（登録商標）４−６４ＦＸ、ＦＭ（登録商標）２−１０色素が含まれる。代表的なシアニン色素には、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が含まれる。ＦＭ１−４３は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（＃Ｔ−３５３５６）より購入できる、また、Ｓｉｇｍａからも「Ｓｙｎａｐｔｏｇｒｅｅｎ」（＃Ｓ６８１４）として販売されている、Ｎ−（３−トリエチルアンモニウムプロピル）−４−（４−（ジブチルアミノ）スチリル）ピリジニウムジブロミドである。ＦＭ４−６４は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（＃Ｔ−１３３２０）、または「Ｓｙｎａｐｔｏｒｅｄ」（＃Ｓ６６８９）としてＳｉｇｍａから購入できる、Ｎ−（３−トリエチルアンモニウムプロピル）−４−（６−（４−（ジエチルアミノ）フェニル）ヘキサトリエニル）ピリジニウムジブロミドである。
【００２２】
１種類を超える色素が使用可能であるが、しかし、本方法は、単一の色素により実施可能である。単一の色素の使用は、方法が単純にするだけでなく、２種類の色素の存在により引き起こされるバラツキを低減させる。
【００２３】
分析される試験試料は、液体、半液体、あるいは。乾燥試料であってもよい。試料は、
飲料水、食品または飲料、医薬製品、パーソナルケア製品、あるいは、体液から取得することができる。体液には、これらに限定されないが、血漿、唾液、尿、咽頭試料または胃腸液が含まれる。試験試料は、都市用水システム、井戸、飲料水、排水、天然水源、レクリエーション用水または土壌から取得することができる。別の実施形態においては、試験試料は、医療機器から取得される。医療機器の例には、これらに限定されないが、インプラント、パッチならびに心臓弁が含まれる。
【００２４】
ある実施形態においては、試験試料は、（ただしこれらに限定されないが、）抗生物質または抗菌剤（antibacterial）処理、塩素による不活化、加熱、エタノール、および中圧ランプによるＵＶ照射等の、細菌不活化処理の成功、あるいは、失敗について、分析することができる。さらなる実施形態においては、前処理を施した試料のＩ２／Ｉ１を採取することにより閾値を決定することができ、次いで、これを試験試料のＩ２／Ｉ１と比較して、細菌不活化処理の有効性を決定することができる。
【００２５】
細菌には、これらに限定されないが、大腸菌群細菌、腸内細菌、Salmonella（サルモネラ属）、Listeria（リステリア属）、Shigella（赤痢菌属）、Pseudomonas（シュードモナス属）、Staphylococcus（ブドウ球菌属）またはMethanobacterium（メタノバクテリウム属）が含まれる。
【実施例】
【００２６】
以下の例は、本発明の具体的かつ好ましい実施形態の代表例として示される。これらの例は、どんな形にせよ、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の趣旨ならびに技術的範囲内において、多くの変形および変更を加えることができることを理解されたい。
【００２７】
材料および方法
色素：Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからＦＭ１−４３（＃Ｔ−３５３５６）として、またはＳｉｇｍａから「Ｓｙｎａｐｔｏｇｒｅｅｎ」（＃Ｓ６８１４）として購入される、Ｎ−（３−トリエチルアンモニウムプロピル）−４−（４−（ジブチルアミノ）スチリル）ピリジニウムジブロミド。Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからＦＭ４−６４（＃Ｔ−１３３２０）として、またはＳｉｇｍａから「Ｓｙｎａｐｔｏｒｅｄ」（＃Ｓ６６８９）として購入される、Ｎ−（３−トリエチルアンモニウムプロピル）−４−（６−（４−（ジエチルアミノ）フェニル）ヘキサトリエニル）ピリジニウムジブロミド。
【００２８】
細菌：別途明記されない限り、細菌は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、Ｉｓｒａｅｌより購入した。ＡＴＣＣ説明書に従って、乾燥された細菌を再生させ、そして、分取標本を、−２０℃のグリセロール中で保存した。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
細菌不活化：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の細菌を、以下の手順のうち１つにより不活化した：低温殺菌（加熱）：８５℃、５〜１５分間；塩素（次亜塩素酸ナトリウム）：０．０１％、１０分間；エタノール：７０％、１０分間；ＵＶ−ＭＰ照射：４〜７０ｍＪ、中圧ランプ（２００〜３００ｎｍ）、Ａｔｌａｎｔｉｕｍ  Ｔｅｃｈ．ＬＴＤ製；ＵＶ−ＬＰ照射：４〜７０ｍＪ、低圧ランプ（２５４ｎｍ）Ａｔｌａｎｔｉｕｍ  Ｔｅｃｈ．  ＬＴＤ製。
【００３１】
顕微鏡観察：生存細菌または不活化細菌を、ＰＢＳ中のＦＭ１−４３（４．９μＭ）またはＳｙｎａｐｔｏｒｅｄ（１５μＭ）により、室温で５分間染色した。ＴＡ  Ｃｏｕｎｔｓのユニーク濾過システムを使用して、カットオフ  ０．４μｍのポリカーボネート膜により試料を濾過した。ＰＢＳ  １ｍｌを使用して、フィルターを洗浄し、次いで、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ  Ｓｃｏｐｅ  Ａ１、Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、画像化した。
【００３２】
Ｚｅｉｓｓ装置（ｓｅｔｕｐ）におけるＣｕｂｅ３８に基づく、励起／発光フィルター。ＦＭ１−４３用；励起：４７０（±２０）ｎｍ、Ｂｅａｍ  Ｓｐｌｉｔｔｅｒ  ＦＴ４９５、発光：ＢＰ  ５２５（±２５）ｎｍまたは６００（±２５）ｎｍ。ＦＭ４−６４用；励起：５３５±２５ｎｍ、発光：５９０ＬＰ。
【００３３】
Ｆｉｊｉソフトウェアを使用して、定量的顕微鏡画像分析を実施した。グレー・レベル（ＧＬ）は、色に依存せず、そして、ヒトの目の色感度を考慮に入れ、個々のピクセルの輝度を示す。
【００３４】
フローサイトメトリー：生存細菌または不活化細菌を、ＰＢＳ中のＦＭ１−４３（４．９μＭ）またはＦＭ４−６４（１５μＭ）により、室温で５分間染色した。予備研究（preliminary work）により、即時測定すれば洗浄ステップが必要でないことが示された。蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ。ここでは、ＦＡＣＳＡＲＩＡ  ＩＩＩ、ＢＤ、ＵＳＡを使用した）を使用して、試料を測定した。ＦＭ１−４３で染色された細菌用の光学系構成は、ＦＳＣ／ＳＳＣ検出器および４８８ｎｍでの一次励起による光散乱パラメータ、ならびに５３０（±１５）ｎｍ、６１０（±１０）ｎｍのバンドパスフィルターを使用する蛍光測定を含む。ＦＭ４−６４で染色された細菌に対しては、６７０±７ｎｍおよび７８０±３０ｎｍのバンドパスフィルターを使用して、５６１ｎｍのレーザー光による励起により、蛍光パラメータを検出した。ｆｃｓ  ｅＸＰＲＥＳＳ  ４（ｄＥ  ｎＯＶＯ  ｓＯＦＴＷＡＲＥ、Ｕｓａ）を使用して、結果を処理した。
【００３５】
蛍光分光分析（Spectroflourimetry）：ＰＢＳ中の生存細菌または不活化細菌  １０７／ｍｌを、上記のＦＭ１−４３またはＦＭ４−６４で染色した。細菌を遠心処理し（１４，０００ｒｐｍ、３分間）、ＰＢＳ  １ｍｌ中に再懸濁させた。細菌溶液２５０μｌを黒色９６ウェルプレート（ＢｒａｎｄＴｅｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。ＦＭ１−４３で染色された試料は、４９０ｎｍで励起し、５２０ｎｍ〜７００ｎｍ間の蛍光スペクトルを測定した（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１  Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ、Ｃａｎａｄａ）。ＦＭ４−６４で染色された試料は、４９０ｎｍで励起し、５３０ｎｍ〜８５０ｎｍ間の蛍光スペクトルを測定した（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００  Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【００３６】
例
以下の例は本発明を例示するものであり、限定することを意図するものではない。
【００３７】
例１−ＦＭ１−４３で染色された細菌についてのスキャニング蛍光結果：
スチリル色素（ＦＭ１−４３）およびＰＢＳ中の染色された細菌の蛍光スペクトルを、蛍光スペクトルとして図２に、そして、スペクトルの変化の視認性を強調するため、正規化した形で、図３に提示する。不活化細菌および遊離の色素と比較して、生存細菌中では、色素の最大発光ピークが青色側に偏移していることが明らかに示されている。最大のピークは：６３５ｎｍ−遊離の色素、不活化細菌では５９５ｎｍ、生存細菌では５６０ｎｍである。５９５ｎｍでＩ＝４０，０００である、不活化細菌と比較して、生存細菌中では、５６０ｎｍでＩ＝３０００と、蛍光強度がより小さいことも示されている。従って、２つのパラメータ−スペクトルの偏移およびその強度を使用して、生存細菌集団と不活化細菌集団との区別を行うことができることが明白である。該現象を定量するため、最大効果を反映し、将来実施するのに有用な、２つの際立った波長での蛍光強度の比を算出した。図３に記す選択された波長は、５３０ｎｍおよび６１０ｎｍである。これらの波長での強度値を表１に提示する。不活化細菌中では、蛍光強度が５３０ｎｍでは４倍、６１０ｎｍでは２０倍に増加していることが見て取れる。このことは、死滅した細菌中では、蛍光染色が増大することだけでなく、蛍光スペクトルが偏移することも示している。生存細菌と比較して、不活化細菌における、前記２つの波長での、異なった増強は、ＳＩＲおよびＮＶＰを算出し、表１に纏めることができる。
【００３８】
塩素による不活化、加熱、エタノール、ならびに中圧ランプまたは低圧ランプによるＵＶ照射等の、種々の不活化方法において、同じスペクトル分析が得られた。この方法では、生存率は、ｃｆｕ法により示されるように、５〜６ｌｏｇの減少を示した。結果の蛍光スペクトルのオーバーレイ（overlay）を図４に示し、また、表１にまとめる。ＵＶ−ＬＰを除き、全ての方法において、ＮＶＰ＞１であり、ｃｆｕで実証される、細菌の非生育状態と相関していることに、注目することができる。実際、ＵＶ−ＬＰによる細菌の処理は、細菌の不活化（５ｌｏｇ）を引き起こす。しかし、ＳＩＲ効果は発生してなく、これは、おそらく、ＵＶ−ＬＰでは、ＤＮＡだけは、損傷されるが、タンパク質または細胞膜は損傷しない、２５４ｎｍに、照射は限定されていることに因っている。ＵＶ照射は、ＤＮＡを損傷することができ、複製はできないものの、しかし、暫くは、代謝可能のままである、細胞に導くことが知られている。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
例２−ＦＭ１−４３で染色された細菌のフローサイトメトリー結果：
蛍光光度計による測定は定量的であるものの、総試料の巨視的測定である。従って、溶液中の細菌濃度に依存する。前記現象は、単一の細菌でも検出することが可能であることを検証するため、染色された細菌試料のフローサイトメトリー測定を実施した。ＦＭ１−４３で染色された細菌の蛍光スペクトルに示される、スペクトル特性に、フローサイトメトリーを適応させるため、該フローサイトメトリーの４８８ｎｍ励起チャンネル、ならびに、ＳＩＲ算出用のλ１およびλ２として、５３０（３０）ｎｍおよび６１０（２０）ｎｍを使用する２つの蛍光チャンネルを使用した。
【００４１】
図５では、６１０／５３０ｎｍの蛍光パラメータについて、生存細菌  Ｅ．ｃｏｌｉ対（熱による）不活化細菌のオーバーレイ・ドット・プロットを示す。不活化された集団は、６１０ｎｍと５３０ｎｍの両方の波長において増強された蛍光を有するが、それは、６１０ｎｍにおいて、より顕性であることが明らかである。
【００４２】
５つの異なる不活化方法について、同じ細菌で上記プロセスを繰り返し、そして、上記のスキャニング蛍光光度計における、その蛍光結果は、ならびに、ここには、６１０／５３０ｎｍ発光フィルターによるフローサイトメトリー分析における結果に示された。異なる細菌状態に対する、フローサイトメトリー分析において得られたドット・プロットを、図６に提示する。各ドット・プロットについて、ゲーティングされた集団は細菌を表し、そして、その５３０および６１０ｎｍでの平均蛍光発光を、それぞれ、ＸおよびＹとして示す。これらの値から、ＳＩＲが算出可能である。例えば、生存細菌では、平均蛍光強度は：Ｉ５３０＝４２およびＩ６１０＝３１であり、ＳＩＲｌｉｖｅ＝０．７３が得られる。加熱された不活化細菌では、平均蛍光は：Ｉ５３０＝４５７およびＩ６１０＝４０４５であり、ＳＩＲｈｅａｔｅｄ＝８．８が得られる。したがって、加熱された細菌のＮＶＰは９となる。残りの試料のＳＩＲおよびＮＶＰ値を表２にまとめる。不活化細菌全ての場合で、ＳＩＲおよびその結果としてのＮＶＰ値は、ＵＶ−ＬＰ処理細菌を除いて、１より大きい。さらに、フローサイトメトリーから割り出されたデータは、蛍光光度計測定由来のデータと合致している。若干異なるものの、データは同様の大きさおよび傾向を示している。
【００４３】
ＵＶ−ＬＰ照射（２５４ｎｍに限定）は、膜またはタンパク質の不活化は伴わず、ＤＮＡ損傷のみにより細菌の不活化を引き起こし、恐らくは、分子レベルでの細菌構造は維持されている。従って、ＵＶ−ＬＰ照射による不活化は、生存細菌と比較して、異なるＦＭ１−４３染色を有する不活化細菌を生じることができない。しかし、ＵＶ−ＬＰは、大量の水の処理において、推奨されている細菌処理ではない。実際、ＥＰＡなどの当局によって、大量の水の処理には、ＵＶ−ＭＰ処理が推奨されている；ＵＶ−ＭＰでは、算出されたＮＶＰは５であった。
【００４４】
【表３】
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【００４５】
例３−ＦＭ４−６４で染色された細菌。
【００４６】
スチリル色素の別のメンバーは、これらは、ＦＭ１−４３と比較して、より長い疎水性領域および深色の（bathochromic）発光特性（λｍａｘ＝７５０ｎｍ）を特徴とする、SynaptoredまたはＦＭ４−６４である。
【００４７】
図７中に、ＦＭ４−６４で染色された、生存、加熱された（８５℃、１５分間）、あるいは、塩素殺菌されたＥ．ｃｏｌｉの、得られた正規化蛍光スペクトルを見ることができる。生存細菌では、最大発光ピークが６９０ｎｍに偏移しており、不活化細菌では、最大発光ピークは、それぞれ７４０および７６０ｎｍである。該スペクトルから、ＳＩＲを算出するための２つの波長、７８０ｎｍおよび６７０ｎｍを決めることができる。これらの波長を、単一の細菌ごとのＳＩＲ分析用のフローサイトメトリーの構成において、光学フィルターとして使用した。図８中に、６７０（１４）／７８０（６０）ｎｍ発光チャンネルにおける、生存、加熱された、ならびに、塩素殺菌された細菌集団のドット・プロット・オーバーレイを見ることができる。図から見出されるように、不活化細菌集団においては、７８０（６０）ｎｍチャンネルでの発光が増加している、低い６７０／７８０チャンネル内に、不活化細菌集団がある。ＳＩＲを算出するため、フローサイトメトリー統計値から、両波長での平均蛍光強度を導き出し、ＳＩＲ値およびＮＶＰを算出した。表３中の、これらの値は、細菌の不活化状態とＮＶＰ値の相関関係を示しており、不活化細菌では、ＮＶＰ＞１である。
【００４８】
ＦＭ４−６４で染色されたＥ．ｃｏｌｉのＮＶＰ値を、ＦＭ１−４３と比較すると、ＦＭ１−４３における、より際立った値が示された。しかし、両色素とも、ＮＶＰ＞１を示しており、従って、生存／不活化細菌の弁別を行うために使用可能である。
【００４９】
【表４】
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【００５０】
例４−グラム陽性菌。
【００５１】
グラム陰性菌では、薄いペプチドグリカンが、外側の細胞膜の内側にあるが、細胞膜の外側上により厚いペプチドグリカン層を有する点で、グラム陽性菌は、その膜構造において、グラム陰性菌と異っている。ここで示されている染色の種類は、膜依存性であるため、グラム陽性菌は、グラム陰性菌とは異なる振る舞いをすることが予期された。我々は、グラム陽性菌では、該現象が、ＦＭ１−４３色素ではより弱く、そして、より親油性の高い（lypophylic）色素、ＦＭ４−６４を使用すると、より顕性となることを観察した。違いは観察されたが、我々は、グラム陽性および陰性菌の両方を、この方法で検査できることに驚いた。
【００５２】
グラム陽性菌の例として、水系感染性（water infectious）の重要な指標である、Enterococcus faecalis（エンテロコッカス・フェカーリス）細菌を染色し、蛍光光度計分析（データは示さない）およびフローサイトメトリー分析により分析した。図９中に、ＦＭ１−４３（Ａ）およびＦＭ４−６４（Ｂ）染色両方での、染色された、生存および熱による不活化E.faecalisのフローサイトメトリー分析を提示する。塩素殺菌およびＵＶ＿ＭＰ等の、その他の不活化手段も、同様のドット・プロット・オーバーレイを示す。両染色において、生存細菌と比較して、不活化細菌では、ＳＩＲが異なっており、ＦＭ４−６４染色を使用することで、より強力な効果が得られることが明らかである。図９中に提示される、フローサイトメトリーをゲーティングした統計データを使用して、ＳＩＲおよびＮＶＰを算出した。不活化細菌にたいて、ＦＭ１−４３およびＦＭ４−６４は、ともに、ＮＶＰ＞１を示し、ＦＭ４−６４における結果はより高い。従って、より疎水性の高い色素によって、より良好に生存／不活化の弁別がなされることが実証される。
【００５３】
【表５】
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【００５４】
例５−幾つかの細菌への効果の拡大
グラム陰性菌は全て、ここでの全ての不活化方法：ＵＶ−ＭＰ、加熱および塩素殺菌において、有意なＳＩＲ効果を有する。グラム陰性菌においては、ＦＭ４−６４よりもＦＭ１−４３が好ましい。
【００５５】
グラム陽性菌は、より弱いものの、陽性のＳＩＲ効果を示し、ＦＭ４−６４において、より良好である。ＵＶ−ＭＰでは、結果は小さい。
ＵＶ−ＬＰ−効果無し
【００５６】
【表６】
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【００５７】
細菌の計数：ＦＭ１−４３またはＦＭ４−６４での染色およびフローサイトメトリー分析による、二重蛍光分析および細菌のＳＩＲ効果により、生存細菌を表す事象を、デブリ、凝集物および上記の不活化細菌を表す、その他の事象と弁別することが可能になる。これらの事象は、生存細菌のＮＶＰに対応しており、フローサイトメトリー分析中に計数される。以前文献に記載されたように、試料濃度は、流速および各試料の分析時間を知ることにより導き出すことができる。式１は、事象計数（ｇ）を１ｍｌあたりの細菌濃度（Ｃ）に変換する：
式１：［Ｃ］＝ｇ＊１０００／（流速）＊時間。
式中、流速は、μＬ／分単位、および、時間は、分単位である。
【００５８】
結果を、ＦＭ１−４３およびＦＭ４−６４染色について、それぞれ図１０および図１１に提示する。細菌１０００〜１０６の範囲において、２つの方法間には、非常に高い相関関係（ｒ２＞０．９９）がある。ノイズを細菌と弁別する能力がなく、１０００未満の低いレベルでは、ノイズがシグナルの数を上回ることがある。全ての濃度（１０００〜１００万の間）においては、誤差は、微生物学的計数において許容される、０．５Ｌｏｇ未満である。
【００５９】
例７−顕微鏡観察の結果
蛍光顕微鏡で、基準の発光フィルター５２５（５０）ｎｍにより生存細菌および不活化細菌を観察すると、強度にほとんど差がないことが示された；図１２を参照、これは本発明の知見と一致する。６００（５０）ｎｍ発光フィルターにより蛍光細菌を観察すると、生存細菌における、２０〜５０ＧＬから、種々の不活化細菌における、９０〜１５０の範囲への強度の変化、図１３を参照、が明白である。
【００６０】
例８−アンピシリン存在下のＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２（ＭＧ１６５５、ＡＴＣＣより入手）を使用する研究によって、開示される方法をさらに検証した。培地で５時間増殖させた後、Ｅ．ｃｏｌｉを３つの群に分けた：（Ａ）抗生物質無しで１時間増殖、（Ｂ）アンピシリン７００マイクログラムとともに１時間増殖、および（Ｃ）アンピシリン１５００マイクログラムとともに１時間増殖。
【００６１】
上記の手法の通り、細菌をＰＢＳ中に懸濁させ、ＦＭ１−４３（５μＭ）で染色した。
【００６２】
染色された細菌試料のフローサイトメトリー測定を実施した。ＦＭ１−４３で染色された細菌の蛍光スペクトルに示されるスペクトル特性にフローサイトメトリーを調節するため、フローサイトメトリーの［ＣＯＮＦＩＲＭ：４８８］ｎｍ励起チャンネル、ならびにＳＩＲ算出用のλ１およびλ２として、５３０（３０）ｎｍおよび６１０（２０）ｎｍを使用する２つの蛍光チャンネルを使用した。結果は、下の表にまとめ、まち、図１４に図示する。
【００６３】
【表７】
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【００６４】
これらのデータは、抗菌薬により死滅したまたは不活化された細菌にＳＩＲ技術が適用可能であることを実証するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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