(57)【要約】【課題】本発明は、ジクロフェナクによるドライアイの治療効果の最大化と副作用の低減を両立させることのできる、ドライアイ治療用点眼剤を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、０．０１〜０．０５重量／容量％のジクロフェナクまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、ドライアイ治療用点眼剤に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．０１〜０．０５重量／容量％のジクロフェナクまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、ドライアイ治療用点眼剤。
【請求項２】
０．０２〜０．０５重量／容量％のジクロフェナクまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、請求項１に記載の点眼剤。
【請求項３】
０．０１重量／容量％以上０．０５重量／容量％未満のジクロフェナクまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、請求項１に記載の点眼剤。
【請求項４】
０．０２重量／容量％以上０．０５重量／容量％未満のジクロフェナクまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、請求項３に記載の点眼剤。
【請求項５】
０．０２重量／容量％のジクロフェナクまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の点眼剤。
【請求項６】
３〜８回／日投与用に製剤化された、請求項１〜５のいずれか１項に記載の点眼剤。
【請求項７】
３回／日投与用に製剤化された、請求項３〜５のいずれか１項に記載の点眼剤。
【請求項８】
ジクロフェナクの薬学的に許容可能な塩がジクロフェナクナトリウムである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の点眼剤。
【請求項９】
前記ドライアイが、涙液の高浸透圧によるアポトーシスに起因する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の点眼剤。
【請求項１０】
前記アポトーシスが、炎症以外の要因によるアポトーシスである、請求項９に記載の点眼剤。
【請求項１１】
前記ドライアイが、ムチンの減少に起因する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の点眼剤。
【請求項１２】
ジクロフェナクまたはその薬学的に許容可能な塩の投与による副作用を低減するための、
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の点眼剤。
【請求項１３】
前記副作用が、角膜表面細胞のアポトーシスである、請求項１２に記載の点眼剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドライアイ治療用点眼剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドライアイは、様々な要因による涙液および角結膜上皮の慢性疾患であり、目の不快感や視機能異常を伴う疾患である。ドライアイは、欧米および日本では成人の１０〜２０％が罹患している主要な眼疾患であり、ディスプレイ画面の使用時間の増加、空調設備による空気の乾燥、コンタクトレンズの使用等により、患者数は増加傾向にある。
【０００３】
ドライアイは、涙腺における涙液の分泌量の減少や、涙液中の脂質やムチンの低下による水分量の蒸発促進によって、涙液の量が減ることにより引き起こされる。涙液の減少によって、角膜表面および結膜表面の慢性的な刺激や炎症が生じ、患者の生活の質の低下につながる。従来、炎症を抑制してドライアイを治療するためにステロイド剤が用いられてきたが、安全性が充分とはいえず、副作用を生じる傾向もある。ステロイド剤に代えて炎症を抑制する薬剤として、ジクロフェナクやブロムフェナク等の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が知られている。特許文献１は、ジクロフェナクを有効成分として含む抗炎症点眼剤を開示している。また、特許文献２は、ジクロフェナクが、涙液の高浸透圧によるアポトーシスを抑制するという抗炎症とは独立の作用機序により、ドライアイを治療できることを開示している。
【０００４】
医薬の投与量を増大すると、治療効果が向上する一方で、副作用も顕著に表れる。したがって、副作用を低減しつつ治療効果を最大化できる用法又は容量が求められる。ジクロフェナクについては、ドライアイの治療効果の最大化と副作用の低減を両立させる方法は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭５８−１７４３１０号公報
【特許文献２】国際公開第２０１５／０９９０１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ジクロフェナクによるドライアイの治療効果の最大化と副作用の低減を両立させることのできる、ドライアイ治療用点眼剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ジクロフェナクを含む点眼剤をドライアイ患者に投与する際に、一定条件において、副作用を低減しつつドライアイの治療効果を最大化できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、０．０１〜０．０５重量／容量％のジクロフェナクまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、ドライアイ治療用点眼剤に関する。
【０００９】
点眼剤は、０．０２〜０．０５重量／容量％のジクロフェナクまたはその薬学的に許容可能な塩を含むことが好ましい。
【００１０】
点眼剤は、０．０１重量／容量％以上０．０５重量／容量％未満のジクロフェナクまたはその薬学的に許容可能な塩を含むことが好ましい。
【００１１】
点眼剤は、０．０２重量／容量％以上０．０５重量／容量％未満のジクロフェナクまたはその薬学的に許容可能な塩を含むことが好ましい。
【００１２】
点眼剤は、０．０２重量／容量％のジクロフェナクまたはその薬学的に許容可能な塩を含むことが好ましい。
【００１３】
点眼剤は、３〜８回／日投与用に製剤化されたものであることが好ましい。
【００１４】
点眼剤は、３回／日投与用に製剤化されたものであることが好ましい。
【００１５】
ジクロフェナクの薬学的に許容可能な塩がジクロフェナクナトリウムであることが好ましい。
【００１６】
前記ドライアイが、涙液の高浸透圧によるアポトーシスに起因するものであることが好ましい。
【００１７】
前記アポトーシスが、炎症以外の要因によるアポトーシスであることが好ましい。
【００１８】
前記ドライアイが、ムチンの減少に起因するものであることが好ましい。
【００１９】
点眼剤は、ジクロフェナクまたはその薬学的に許容可能な塩の投与による副作用を低減するための点眼剤であることが好ましい。
【００２０】
前記副作用が、角膜表面細胞のアポトーシスであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のドライアイ治療用点眼剤は、副作用を低減しつつドライアイの治療効果を最大化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】点眼剤によるドライアイ治療効果を示す。
【図２】点眼剤によるＭｕｃ５ＡＣ遺伝子の発現量の変化を示す。
【図３】点眼剤によるＭｕｃ６遺伝子の発現量の変化を示す。
【図４】点眼剤による副作用を示す。
【図５】点眼剤による副作用を示す。
【図６】点眼剤による抗炎症効果、及び副作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、０．０１〜０．０５重量／容量％のジクロフェナクまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、ドライアイ治療用点眼剤に関する。
【００２４】
ジクロフェナクまたはその薬学的に許容可能な塩の、点眼剤中の濃度は、０．０１〜０．０５重量／容量％であるが、０．０１重量／容量％以上、０．０５重量／容量％未満が好ましく、０．０２〜０．０５重量／容量％がより好ましく、０．０２重量／容量％以上、０．０５重量／容量％未満がさらに好ましく、０．０２重量／容量％が最も好ましい。０．０１重量／容量％未満では、治療効果が弱くなる傾向がある。０．０５重量／容量％を超えると、後述する副作用が表れる傾向、及び治療効果が減少する傾向がある。
【００２５】
ジクロフェナクの薬学的に許容可能な塩としては、ジクロフェナクナトリウム、ジクロフェナクカリウムが挙げられる。
【００２６】
点眼剤のｐＨは、６．０〜８．５であることが好ましく、７．０〜８．０であることがより好ましい。ｐＨ６．０未満では眼刺激の緩和が得られない傾向があり、ｐＨ８．５を超えると生理的ｐＨから外れることになる。
【００２７】
点眼剤の浸透圧比は０．９〜１．４が好ましい。なお、ここでいう浸透圧比は、生理食塩液と比較した場合の浸透圧比を意味する。
【００２８】
本発明の点眼剤は、ジクロフェナクまたはその薬学的に許容可能な塩に加えて、緩衝剤、等張化剤、保存剤、増粘剤、溶解補助剤、洗浄剤を含んでいてもよい。
【００２９】
緩衝剤として、リン酸とリン酸塩との組み合わせ、ホウ酸とホウ砂との組み合わせ、有機酸と有機酸塩との組み合わせ等が挙げられる。この中でも、ホウ酸とホウ砂との組み合わせが好ましい。点眼剤における緩衝剤の含有量は、０．０１〜１０重量／容量％であることが好ましく、０．１〜３重量／容量％であることがより好ましい。０．０１重量／容量％未満では本発明の効果を充分に奏し難い傾向がある。１０重量／容量％を超えると眼刺激が生じる傾向がある。
【００３０】
等張化剤として、ブドウ糖等の糖類、プロピレングリコール、グリセリン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトール、ソルビトール、キシリトール等の糖アルコール等が挙げられる。この中でも、塩化ナトリウム、塩化カリウムが好ましい。点眼剤における等張化剤の含有量は、０．０１〜１０重量／容量％であることが好ましく、０．１〜３重量／容量％であることがより好ましい。
【００３１】
保存剤として、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムおよびグルコン酸クロルヘキシジン等の逆性石鹸類、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベンおよびブチルパラベン等のパラベン類、クロロブタノール、フェニルエチルアルコールおよびベンジルアルコール等のアルコール類が挙げられる。この中でも、クロロブタノールが好ましい。点眼剤における保存剤の含有量は０．００１〜０．５重量／容量％であることが好ましい。
【００３２】
増粘剤として、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。この中でも、ポリビニルピロリドンが好ましい。
【００３３】
溶解補助剤として、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、商品名Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレンオキシステアリン酸トリグリセライド、ポリエチレングリコール、αまたはβ−シクロデキストリン等が挙げられる。この中でも、ポリソルベート８０が好ましい。
【００３４】
眼刺激を緩和するためにカルシウム塩またはマグネシウム塩を含んでいてもよい。このような塩として、例えばパントテン酸カルシウム、塩化カルシウム、プロピオン酸カルシウム、酢酸カルシウム、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム等のカルシウム塩、または相当するマグネシウム塩が挙げられる。この中でも、パントテン酸カルシウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムが好ましい。
【００３５】
前述の併用成分の中では、ポリソルベート８０、ホウ砂、またはポリビニルピロリドンが好ましい。
【００３６】
本発明の点眼剤がポリソルベート８０を含む場合、その濃度は０．１〜５．０重量／容量％であることが好ましく、０．３〜３．０重量／容量％であることがより好ましい。
【００３７】
本発明の点眼剤がホウ砂を含む場合、その濃度は０．１〜２０.０重量／容量％であることが好ましく、０．３〜１５．０重量／容量％であることがより好ましい。
【００３８】
本発明の点眼剤がポリビニルピロリドンを含む場合、その濃度は１．０〜１５.０重量／容量％であることが好ましく、２．０〜１０．０重量／容量％であることがより好ましい。
【００３９】
本発明の点眼剤は、ドライアイ治療用に用いられる。ドライアイは、様々な要因による涙液および角結膜上皮の慢性疾患であり、目の不快感や視機能異常を伴う。ドライアイの発症原因の一つとして角膜組織のアポトーシスが挙げられ、さらに、このアポトーシスは、涙液の高浸透圧によるアポトーシスと、炎症によるアポトーシスに分類される。
【００４０】
涙液の高浸透圧によるアポトーシスの発生機序は次の通りである。涙液の分泌量の減少や空気の乾燥等により涙液が減少すると、涙液の浸透圧が上昇する。その結果、細胞内から水分が排出され、細胞が縮小するという浸透圧ストレスにさらされる。これに対して、細胞は外部のナトリウムイオン等を細胞内に取り込み、細胞内のイオン強度が上昇して、アポトーシスが生じる。アポトーシスが生じる眼組織として、角膜、結膜、涙腺が挙げられる。より具体的には、アポトーシスが生じる細胞として、角膜上皮細胞、結膜上皮細胞、涙腺細胞が挙げられる。
【００４１】
ジクロフェナクは、ＮＦＡＴ５（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ５）タンパク質の発現および核内移行を促進することにより、涙液の高浸透圧条件下でもアポトーシスを抑制する。ＮＦＡＴ５タンパク質は、ＢＧＴ−１（ｂｅｔａｉｎｅ／ＧＡＢＡ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ−１）遺伝子等を活性化する。その結果、細胞は、浸透圧ストレスに対して、イオン強度に影響しない有機性の浸透圧調節物質の細胞内への取り込みにより対応することが可能になる。細胞内のイオン強度上昇を回避できるので、涙液の高浸透圧条件でもアポトーシスが抑制されると考えられる。特許文献２は、炎症性の細胞を含まない、角膜上皮細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において、ジクロフェナクが高浸透圧によるアポトーシスを抑制することを開示している。このように、本発明の点眼剤は、涙液の高浸透圧によるアポトーシスに起因するドライアイの治療用に用いることができる。本発明の点眼剤は、涙液の高浸透圧によるアポトーシスを呈するが、炎症によるアポトーシスを呈さないドライアイ患者にも好適に処方できる。
【００４２】
本発明の点眼剤は、涙液の高浸透圧による、角膜、結膜、涙腺におけるアポトーシスを抑制することができる。より具体的には、角膜上皮細胞、結膜上皮細胞、涙腺細胞のアポトーシスを抑制することができる。
【００４３】
また、本発明者らは、ジクロフェナクを含む点眼剤は副作用を伴い得ることを見出した。この副作用としては眼組織における角結膜傷害、特にアポトーシス誘導が挙げられ、具体的には角膜上皮細胞、結膜上皮細胞のアポトーシスが挙げられる。本発明のドライアイ治療用点眼剤においては、ジクロフェナクまたはその薬学的に許容可能な塩の濃度を０．０１〜０．０５重量／容量％とすることにより、副作用が軽減されている。
【００４４】
また、本発明の点眼剤はムチンのコアタンパク質の発現量を増大させることにより、涙液中のムチンを増大させる。ドライアイの原因の一つとして、涙液中のムチンの低下による水分量の蒸発促進が挙げられるが、本発明の点眼剤はムチンを増やすことができる。ジクロフェナクを含む点眼剤にムチンを増やす効果があることは本発明者らが初めて見出した効果である。従って、本発明の点眼剤は、ムチンの減少に起因するドライアイに有効である。
【００４５】
本発明の点眼剤を使用する際、１回あたりの片眼に対する点眼量は、１〜３滴であることが好ましく、１〜２滴であることがより好ましい。また、１回あたりの片眼に対する点眼量を容量で表すと、１０〜３００μＬであることが好ましく、２０〜２００μＬであることがより好ましく、３０〜１００μＬであることが更に好ましい。
【００４６】
本発明の点眼剤は、３〜８回／日の投与用に製剤化されることが好ましく、３回／日の投与用に製剤化されることがより好ましい。特に、ジクロフェナクまたはその薬学的に許容可能な塩の、点眼剤中の濃度が０．０１重量／容量％以上０．０５重量／容量％未満のとき、０．０２重量／容量％以上０．０５重量／容量％未満のとき、または０．０２重量／容量％のときには、３回／日の投与用に製剤化されることが好ましい。
【実施例】
【００４７】
実施例において、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００４８】
（１）角膜上皮細胞の障害の抑制試験（実施例１、比較例１〜３）
ジクロフェナクナトリウムを０．０５重量／容量％（実施例１）、または０．１重量／容量％（比較例３）の濃度となるように水に添加し、点眼剤を作製した。
【００４９】
ラットの両眼の涙腺を除去し、ドライアイモデルを作製した。涙腺除去の１週間後から、上記点眼剤、又はｖｅｈｉｃｌｅ点眼剤（比較例２）を両眼に１日３回、４週間点眼投与した。涙腺除去から５週間後に眼組織の切片を作成し、角膜細胞のアポトーシスを評価するためにＴＵＮＥＬ染色を行い、ＴＵＮＥＬ陽性細胞数を算出した。その結果を図１に示す。両眼の涙腺を除去していないラットでの測定結果をＳｈａｍとして示す（比較例１）。
【００５０】
図１において、実施例１では、比較例３の半分の濃度であるにもかかわらず、角膜細胞のアポトーシスを比較例３と同等まで抑制できた。
【００５１】
（２）角結膜におけるムチン発現の測定（実施例２〜３、比較例４〜７）
ジクロフェナクナトリウムを０．０２重量／容量％（実施例２〜３）又は０．１重量／容量％（比較例５、７）の濃度で含む点眼剤を、健常ラットの両眼に、１時間おきに３回点眼投与した。比較例４、６では点眼処置を行っていないラット（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を用いた。
【００５２】
最終点眼後から１時間後に結膜および角膜を採取した。採取した結膜および角膜を用いて、下記の方法でＲＮＡを抽出し、角結膜におけるＭｕｃ５ＡＣ遺伝子、およびＭｕｃ６遺伝子の発現を調べた。
【００５３】
ＲＮＡ抽出：角結膜に含まれるＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）により抽出した。
【００５４】
逆転写反応：ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ  Ｃｏ．，ＬＴＤ．）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。
【００５５】
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：１０倍希釈したｃＤＮＡに対し、ＫＯＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ  Ｃｏ．，ＬＴＤ．）を用いてＶｉｉＡ７  リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）により定量ＰＣＲを行なった。各プライマーは１反応あたり終濃度０．２μＭとなるように添加した。定量ＰＣＲには、以下の配列を持つプライマーを使用した。
【００５６】
Ｍｕｃ５ＡＣ
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＡＡＣＴＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＣＡＡＧＣ−３’（配列番号５）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＴＧＣＣＡＴＣＴＡＴＣＣＡＡＴＣＡＧＴＣＣＡＡＴ−３’（配列番号６）
【００５７】
Ｍｕｃ６  
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＴＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＡＡＡＣ−３’（配列番号７）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＴＣＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣＧＴＣＡＣＴＧＣ−３’（配列番号８）
【００５８】
β−ａｃｔｉｎ
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＣＣＡＧ−３’（配列番号３）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＴＣＡＧＣ−３’（配列番号４）
【００５９】
定量ＰＣＲにより得られたＭｕｃ５ＡＣ遺伝子、およびＭｕｃ６遺伝子の発現量を、内在性コントロールであるβ−ａｃｔｉｎの発現量により補正した。補正後の、角結膜中のＭｕｃ５ＡＣ  ｍＲＮＡの発現量を図２に、角結膜中のＭｕｃ６  ｍＲＮＡの発現量を図３に、それぞれ示す。
【００６０】
図２〜３に示すように、０．０２重量／容量％ジクロフェナク点眼薬は、角結膜において、Ｍｕｃ５ＡＣ遺伝子（実施例２）、およびＭｕｃ６遺伝子（実施例３）の発現量を増大させており、ムチン量を増大させることが確かめられた。これに対し、０．１％ジクロフェナク点眼薬は角結膜においてムチン量を有意に増大させる効果はなく、減少させることもあった（比較例５、７）。
【００６１】
（３）副作用の抑制試験１（実施例４、比較例８〜９）
ジクロフェナクナトリウムを０．０５重量／容量％（実施例４）又は０．１重量／容量％（比較例９）の濃度で含む点眼剤、又はｖｅｈｉｃｌｅ点眼剤（比較例８）を、健常ラットの両眼に、１時間おきに８回点眼投与した。
【００６２】
最終点眼後から１時間後に眼組織の切片を作成し、角膜細胞のアポトーシスを評価するために下記の方法でＴＵＮＥＬ染色を行い、ＴＵＮＥＬ陽性細胞数を算出した。その結果を図４に示す。
【００６３】
ＴＵＮＥＬ染色は、点眼剤を投与後の試験動物から眼球を採取した。４％パラホルムアルデヒドに浸漬し、その後パラフィン包埋した。眼表面の切片は４μｍ程度の厚さとなるように作成し、ＴＵＮＥＬ染色（蛍光）を行い、蛍光染色像を撮影した。
【００６４】
図４に示すように、この試験では健常ラットを用いているため、比較例８では角膜上皮細胞のアポトーシスはほとんど観察されない。比較例９ではジクロフェナクを含む点眼剤の投与により角膜上皮細胞のアポトーシスが観察された。これに対し、実施例４ではジクロフェナクの濃度を低減することにより角膜上皮細胞のアポトーシスを抑制できた。
【００６５】
（４）副作用の抑制試験２（実施例５、比較例１０〜１１）
ジクロフェナクナトリウムを０．０２重量／容量％（実施例５）又は０．１重量／容量％（比較例１１）の濃度で含む点眼剤を、健常ラットの両眼に、１時間毎に１回、合計３回の点眼投与を行った。比較例１０では点眼処置を行っていないラット（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を用いた。
【００６６】
最終点眼の約１０分後にフルオレセイン染色により角膜を観察した。覚醒下の動物の両眼に、２μＬの０．５％フルオレセイン溶液を点眼して角膜上皮を染色した。フルオレセイン溶液の点眼から約７分後にイソフルランによる麻酔導入（３〜４％）を開始し、フルオレセイン溶液の点眼から約１０分後に麻酔下（維持１〜３％）でＧＦＰ２−ＥＴフィルターを装着した蛍光実体顕微鏡（ＭＺ１０Ｆ、Ｌｅｉｃａ）及びデジタルカメラ（ＤＦＣ４５０Ｃ、Ｌｅｉｃａ）を用いて動物の角膜を撮影した。角膜を左右上下の９つの部分に分け、下記の判定基準に従い０〜３点までスコア付けを行い、角膜上皮障害の程度を２７点満点で評価し、得られた得点の平均値を算出した。その結果を図５に示す。
０点：  ほぼ無染色
１点：  一部染色（軽度の障害）
２点：  ２／３程度の染色（中程度の障害）
３点：  ほぼ全面に染色（重度の障害）
【００６７】
図５において、比較例１１ではジクロフェナクを含む点眼剤の投与により角膜上皮障害が認められた。これに対し、実施例５ではジクロフェナクの濃度を低減することにより角膜上皮障害を抑制できた。この結果は、ジクロフェナクの濃度が０．１重量／容量％では、ジクロフェナクによる角膜上皮障害が現れてしまうのに対し、０．０２重量／容量％では角結膜障害が軽微である（図４〜５）ために抗炎症効果、及び角結膜保護効果が顕在化し、比較例１０よりも角膜上皮障害が減少したことによると考えられる。
【００６８】
（５）副作用の抑制試験３（実施例６、比較例１２〜１３）
ジクロフェナクナトリウムを０．０２重量／容量％（実施例６）又は０．１重量／容量％（比較例１３）の濃度で含む点眼剤を、健常ラットの両眼に、１時間毎に３回、合計３回の点眼投与を行った後、角結膜を採取した。比較例１２では点眼処置を行っていないラット（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を用いた。採取した角結膜を用いて、下記の方法でＲＮＡを抽出し、角結膜細胞におけるＭＭＰ−２遺伝子の発現を調べた。
【００６９】
ＲＮＡ抽出：ＴＲＩｚｏｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を用い、添付の説明書の方法に従ってＲＮＡ抽出を行なった。
【００７０】
逆転写反応：ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ  Ｃｏ．，ＬＴＤ．）を用い、添付の説明書の方法に従って逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。
【００７１】
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：１０倍希釈したｃＤＮＡに対し、ＫＯＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ  Ｃｏ．，ＬＴＤ．）を用い、添付の説明書の方法に従ってＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）で定量ＰＣＲを行なった。各プライマーは１反応あたり終濃度０．４μＭとなるように添加した。プライマーとして、以下の塩基配列を有するものを用いた。
【００７２】
Ｍｍｐ−２
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＴＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＣＴＣＡＣＴＴＴＧ−３’（配列番号１）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＣＣＡＴＣＡＧＣＧＴＴＣＣＣＡＴＡＣＴＴ−３’（配列番号２）
【００７３】
β−ａｃｔｉｎ
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＣＣＡＧ−３’ （配列番号３）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＴＣＡＧＣ−３’ （配列番号４）
【００７４】
定量ＰＣＲにより得られたＭｍｐ−２遺伝子の発現量を、内在性コントロールであるβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量により補正した。その結果を図６に示す。比較例１３ではジクロフェナクを含む点眼剤の投与によりＭｍｐ−２遺伝子の発現が認められたが、実施例６ではジクロフェナクの濃度を低減することによりＭｍｐ−２遺伝子の発現を抑制できた。Ｍｍｐ（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）−２遺伝子は角膜に恒常的に発現しており、炎症時に発現が誘導され、角結膜障害を起こす。Ｍｍｐ−２遺伝子の発現の抑制は、角膜表面障害の抑制を意味する。この結果は、ジクロフェナクの濃度が０．１重量／容量％では、ジクロフェナクによる抗炎症効果（図１）と角結膜の障害による炎症（図４〜５）が拮抗してしまうのに対し、０．０１〜０．０５重量／容量％では角結膜障害が軽微である（図４〜５）ために抗炎症効果が顕在化したことによると考えられる。
【００７５】
以上より、ジクロフェナクを０．０１〜０．０５重量／容量％の濃度で含む点眼薬は、それより高濃度で含む点眼薬と比較して角結膜を保護する作用が強力であり、かつそれ自体の角結膜障害性が軽減されていることが示された。また、ジクロフェナクを０．０１〜０．０５重量／容量％の濃度で含む点眼薬は、ジクロフェナクをそれより高濃度で含む点眼薬や、コントロール点眼薬と比較して、角結膜におけるムチンを増加させる作用が強力であることが確かめられた。よって、ジクロフェナクを０．０１〜０．０５重量／容量％の濃度で含む点眼薬は、抗炎症効果、ムチンの増大効果、及び角結膜障害性の低減が相乗的に作用することにより、ドライアイ治療を最適化できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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