(57)【要約】【課題】神経芽腫の特定のステージに特異的な尿中腫瘍マーカーを同定し、神経芽腫の検出に使用すること。【解決手段】対象の尿中腫瘍マーカーを測定することにより、対象において、神経芽腫を検出する及び／又は神経芽腫に対する治療の効果をモニタリングするための方法、装置及びキットを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経芽腫の検出方法であって、
対象由来の尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーを測定するステップであって、
以下の（A）群：
（A）3-メトキシチラミン硫酸塩、キサントプテリン、バニルラクテート、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、シスタチオニン、コルチゾール21-グルクロニド、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩、コルチゾール、3-メトキシチロシン、及び3-メトキシチラミン
から選択される少なくとも1種の尿中腫瘍マーカーを測定すること、及び
以下の（B）群：
（B）2-ヒドロキシ-3-メチルバレレート、バニリルマンデル酸、ホモバニリン酸、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、及び3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート
から選択される少なくとも1種の尿中腫瘍マーカーを測定すること
を含む、上記ステップ；
上記測定結果に基づいて対象における神経芽腫を検出するステップ
を含み、
前記（A）群の尿中腫瘍マーカーが基準よりも高い場合、対象が神経芽腫陽性であり、ステージ4S以外のステージであることを示し、
前記（A）群の尿中腫瘍マーカーが基準よりも低いが前記（B）群の尿中腫瘍マーカーが基準よりも高い場合、対象が神経芽腫陽性であり、ステージ4Sであることを示す、方法。
【請求項２】
前記（A）群の尿中腫瘍マーカーの少なくとも3種を測定し、及び／又は前記（B）群の尿中腫瘍マーカーの少なくとも3種を測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（B）群の尿中腫瘍マーカーが少なくとも2-ヒドロキシ-3-メチルバレレートを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記（A）群の尿中腫瘍マーカーが少なくとも3-メトキシチラミン硫酸塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が1歳未満の児である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記神経芽腫の検出が、対象における神経芽腫の有無の検出、対象における神経癌腫のリスク予測、対象における神経癌腫のステージ判定、対象における神経癌腫の予後判定、又は対象に存在する神経癌腫に対する治療の効果のモニタリングである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記尿中腫瘍マーカーの測定を液体クロマトグラフィ質量分析法（LC/MS）により行う、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
神経芽腫の検出装置であって、
尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーを測定する測定部であって、
以下の（A）群：
（A）3-メトキシチラミン硫酸塩、キサントプテリン、バニルラクテート、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、シスタチオニン、コルチゾール21-グルクロニド、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩、コルチゾール、3-メトキシチロシン、及び3-メトキシチラミン
から選択される少なくとも1種の尿中腫瘍マーカー、及び
以下の（B）群：
（B）2-ヒドロキシ-3-メチルバレレート、バニリルマンデル酸、ホモバニリン酸、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、及び3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート
から選択される少なくとも1種の尿中腫瘍マーカー
を測定する測定部と、
上記測定部で測定した尿中腫瘍マーカーの測定値を基準値又は前回の測定値と比較する比較部と、
上記比較部で得られた比較結果から神経芽腫を検出する判定部と
を備えることを特徴とする装置。
【請求項９】
前記（A）群の尿中腫瘍マーカーが基準値又は前回の測定値よりも高い場合、前記判定部は、対象が神経芽腫陽性であり、ステージ4S以外のステージである、又はそのリスクがあると判定し、
前記（A）群の尿中腫瘍マーカーが基準値よりも低いが前記（B）群の尿中腫瘍マーカーが基準値又は前回の測定値よりも高い場合、前記判定部は、対象が神経芽腫陽性であり、ステージ4Sである、又はそのリスクがあると判定する、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記測定部は、前記（A）群の尿中腫瘍マーカーの少なくとも3種を測定し、及び／又は前記（B）群の尿中腫瘍マーカーの少なくとも3種を測定する、請求項８に記載の装置。
【請求項１１】
前記比較部が、前記測定部で測定した尿中腫瘍マーカーの測定値を多変量解析して得られた目的変数の計算値を、多変量解析のがん検査モデルから得られた基準値又は前回の目的変数の計算値と比較する、請求項８に記載の装置。
【請求項１２】
前記測定部が液体クロマトグラフィ質量分析（LC/MS）装置を備える、請求項８に記載の装置。
【請求項１３】
神経芽腫の検出用キットであって、
以下の（A）群：
（A）3-メトキシチラミン硫酸塩、キサントプテリン、バニルラクテート、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、シスタチオニン、コルチゾール21-グルクロニド、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩、コルチゾール、3-メトキシチロシン、及び3-メトキシチラミン
から選択される少なくとも1種の尿中腫瘍マーカーを測定するための手段、及び
以下の（B）群：
（B）2-ヒドロキシ-3-メチルバレレート、バニリルマンデル酸、ホモバニリン酸、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、及び3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート
から選択される少なくとも1種の尿中腫瘍マーカーを測定するための手段
を含むことを特徴とするキット。
【請求項１４】
質量分析用試薬セットである、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
神経芽腫の治療の有効性の評価方法であって、
被験治療薬又は治療法による処置を受けた神経芽腫を有する動物からの尿サンプルにおいて、尿中腫瘍マーカーを測定するステップであって、
以下の（A）群：
（A）3-メトキシチラミン硫酸塩、キサントプテリン、バニルラクテート、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、シスタチオニン、コルチゾール21-グルクロニド、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩、コルチゾール、3-メトキシチロシン、及び3-メトキシチラミン
から選択される少なくとも1種の尿中腫瘍マーカー、及び
以下の（B）群：
（B）2-ヒドロキシ-3-メチルバレレート、バニリルマンデル酸、ホモバニリン酸、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、及び3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート
から選択される少なくとも1種の尿中腫瘍マーカー
を測定するステップ、
上記測定結果に基づいて神経芽腫に対する被験治療薬又は治療法の有効性を評価するステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象の尿中腫瘍マーカーに基づいて、対象の神経芽腫を検出するための方法、キット及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経芽腫（神経芽細胞腫）は、0〜4歳で診断されることが多い小児がんの1種である。神経芽腫の腫瘍細胞は神経伝達物質であるカテコールアミンを産生し、このカテコールアミンはバニリルマンデル酸（VMA）及びホモバニリン酸（HVA）となって尿中に排泄される。神経芽腫の早期発見を目的として、生後6ヶ月の乳児を対象にVMA及びHVAを検出する神経芽細胞腫マススクリーニング検査が行われていたが、その有効性には疑問があり（例えば、特許文献１）、現在検査は休止されている。具体的には、検査によって死亡率減少効果が得られなかったこと、そして神経芽腫の中には予後が良好なものもあり、自然退縮する腫瘍もあるため、過度な検査及び治療が問題となっていたことがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平5-113438号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一般的に、小児がんである神経芽腫は病期が早期であればあるほど治療成績が良く、早期発見は予後に直結することが確認されている。そのため、正確かつ非侵襲的な検査方法の確立が望まれている。
【０００５】
一方、尿中代謝物は、血中の物質と比較すると酵素の影響を受けにくく構造的に安定しているため、腫瘍マーカーとなる可能性が十分にある。その上、尿中マーカーは、尿を検体に用いるため小児でも容易に採取でき、がんのスクリーニング用途としても非常に利用しやすい。そのため、本発明は、神経芽腫のための新規な尿中腫瘍マーカーを同定し、がん検査などの神経芽腫の検出に使用することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、小児がんのための尿中腫瘍マーカーを探索する過程で、神経芽腫で高値を示すマーカーのうちステージ4Sの患児ではほとんど高値とならないマーカーを見出し、予後が良好なステージ4Sを有する患児を識別するための尿中腫瘍マーカーを特定するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、尿中腫瘍マーカーである尿中代謝物を測定することにより、対象において、神経芽腫を検出する及び／又は神経芽腫に対する治療の効果をモニタリングするための方法、装置及びキットに関する。
【０００８】
一態様において、本開示は、神経芽腫の検出方法であって、
対象由来の尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーを測定するステップであって、
以下の（A）群：
（A）3-メトキシチラミン硫酸塩、キサントプテリン、バニルラクテート、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、シスタチオニン、コルチゾール21-グルクロニド、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩、コルチゾール、3-メトキシチロシン、及び3-メトキシチラミン
から選択される少なくとも1種の尿中腫瘍マーカーを測定すること、及び
以下の（B）群：
（B）2-ヒドロキシ-3-メチルバレレート、バニリルマンデル酸、ホモバニリン酸、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、及び3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート
から選択される少なくとも1種の尿中腫瘍マーカーを測定すること
を含む、上記ステップ；
上記測定結果に基づいて対象における神経芽腫を検出するステップ
を含み、
前記（A）群の尿中腫瘍マーカーが基準よりも高い場合、対象が神経芽腫陽性であり、ステージ4S以外のステージであることを示し、
前記（A）群の尿中腫瘍マーカーが基準よりも低いが前記（B）群の尿中腫瘍マーカーが基準よりも高い場合、対象が神経芽腫陽性であり、ステージ4Sであることを示す、方法を提供する。
【０００９】
別の態様において、本開示は、神経芽腫の検出装置であって、
尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーを測定する測定部であって、
以下の（A）群：
（A）3-メトキシチラミン硫酸塩、キサントプテリン、バニルラクテート、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、シスタチオニン、コルチゾール21-グルクロニド、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩、コルチゾール、3-メトキシチロシン、及び3-メトキシチラミン
から選択される少なくとも1種の尿中腫瘍マーカー、及び
以下の（B）群：
（B）2-ヒドロキシ-3-メチルバレレート、バニリルマンデル酸、ホモバニリン酸、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、及び3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート
から選択される少なくとも1種の尿中腫瘍マーカー
を測定する測定部と、
上記測定部で測定した尿中腫瘍マーカーの測定値を基準値又は前回の測定値と比較する比較部と、
上記比較部で得られた比較結果から神経芽腫を検出する判定部と
を備えることを特徴とする装置を提供する。
【００１０】
また別の態様において、本開示は、神経芽腫の検出用キットであって、
以下の（A）群：
（A）3-メトキシチラミン硫酸塩、キサントプテリン、バニルラクテート、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、シスタチオニン、コルチゾール21-グルクロニド、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩、コルチゾール、3-メトキシチロシン、及び3-メトキシチラミン
から選択される少なくとも1種の尿中腫瘍マーカーを測定するための手段、及び
以下の（B）群：
（B）2-ヒドロキシ-3-メチルバレレート、バニリルマンデル酸、ホモバニリン酸、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、及び3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート
から選択される少なくとも1種の尿中腫瘍マーカーを測定するための手段
を含むことを特徴とするキットを提供する。
【００１１】
さらなる態様において、本開示は、神経芽腫の治療の有効性の評価方法であって、
被験治療薬又は治療法による処置を受けた神経芽腫を有する動物からの尿サンプルにおいて、尿中腫瘍マーカーを測定するステップであって、
以下の（A）群：
（A）3-メトキシチラミン硫酸塩、キサントプテリン、バニルラクテート、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、シスタチオニン、コルチゾール21-グルクロニド、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩、コルチゾール、3-メトキシチロシン、及び3-メトキシチラミン
から選択される少なくとも1種の尿中腫瘍マーカー、及び
以下の（B）群：
（B）2-ヒドロキシ-3-メチルバレレート、バニリルマンデル酸、ホモバニリン酸、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、及び3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート
から選択される少なくとも1種の尿中腫瘍マーカー
を測定するステップ、
上記測定結果に基づいて神経芽腫に対する被験治療薬又は治療法の有効性を評価するステップ
を含む方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、低侵襲性で、簡便かつ低コストに神経芽腫を検出するための方法、装置及びキットが提供される。特に、予後が良好なステージ4Sの神経芽腫であるか否かを検出できるため、不要な治療及び検査を回避することができる。ステージ4S以外のステージの神経芽腫には適切な治療の選択が可能となる。また、尿による検査のため、臨床現場における採取法も非常に簡便になり、医療従事者の利便性も大きく向上する。したがって、本発明は、神経芽腫の診断、検査、治療評価、創薬などの分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明を適用した尿中腫瘍マーカーによる神経芽腫の検出フロー例である。
【図２】神経芽腫のステージ4S以外に特異的なマーカーの組み合わせ（3-メトキシチラミン硫酸塩、キサントプテリン及びコルチゾール）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図３】神経芽腫のステージ4Sでも検出されるマーカーの組み合わせ（HVA、VMA及び2-ヒドロキシ-3-メチルバレレート）をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。
【図４】神経芽腫のステージ4S以外に特異的なマーカー及び神経芽腫のステージ4Sでも検出されるマーカーの6種をがん検査モデルに適用した場合の予測値を示す参考グラフである。
【図５】本発明を適用した装置の構成例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明が提供する方法、装置及びキットでは、神経芽腫に関連する、特に神経芽腫のステージ4Sとステージ4S以外を識別する新規な尿中腫瘍マーカー及びマーカー群を利用する。この尿中腫瘍マーカーは、神経芽腫の発症や進行に伴って、また治療前後でその尿中レベルが変動し、特に神経芽腫のステージ4Sとステージ4S以外で尿中レベルに差異がある代謝物であるため、神経芽腫の検出、神経芽腫のリスク予測、神経芽腫のステージ判定、神経芽腫の予後判定、及び／又は神経芽腫に対する治療効果のモニタリングなどに有用である。
【００１５】
本発明に係る神経芽腫の検出方法は、対象由来の尿サンプル中の、尿中腫瘍マーカーを測定するステップと、その測定結果に基づいて対象における神経芽腫を検出するステップを含む。ここで、尿中腫瘍マーカーを測定するステップでは、ステージ4S以外のステージの神経芽腫で高値を示す尿中腫瘍マーカー（本明細書中、「神経芽腫のステージ4S以外に特異的なマーカー」又は「（A）群のマーカー」ともいう）と、必要に応じて神経芽腫のステージ4Sでも高値を示す尿中腫瘍マーカー（本明細書中、「神経芽腫のステージ4Sでも検出されるマーカー」又は「（B）群のマーカー」ともいう）を測定する。（A）群のマーカーが基準よりも高い場合には、神経芽腫のうちステージ4S以外のステージであると判定できる。一方、（A）群のマーカーが基準よりも低く、（B）群のマーカーが基準よりも高い場合には、神経芽腫のうちステージ4Sであると判定できる。これに対し、（A）群のマーカー及び（B）群のマーカーがいずれも基準よりも低い場合には、神経芽腫について陰性であると判定することができる。
【００１６】
本発明では、神経芽腫を検出対象とする。神経芽腫とは、小児がんの1種であり、交感神経節や副腎髄質などから発生することが知られている。がんには、原発性、転移性、再発性のものがあり、またその進行度と広がりの程度からステージに分類されている。この原発性、転移性又は再発性の違いや、ステージの違いに応じて、必要な処置（治療方法）も異なる。
【００１７】
神経芽腫の病期分類は、一般的に神経芽腫国際病期分類（INSS: International Neuroblastoma Staging System）に基づいて行われている（例えば、Brodeur et al., J Clin Oncol vol.11, pp.1466-1477, 1993年）：
【００１８】
【表１】
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【００１９】
本発明では、神経芽腫のうち、ステージ4Sとステージ4S以外の病期にある神経芽腫を識別して検出する。ステージ4Sは、乳児（特に1歳未満）に見られ、腫瘍自体はステージ1〜2bでありながら、皮膚、肝、骨髄のみには転移があり、遠隔転移もみられるにもかかわらず、治療を実施せずとも自然退縮がみられ、予後が良好であるという特殊な群である。ステージ4Sの患者は、乳児（12ヶ月齢未満）の神経芽腫患児のおよそ8％に生じていたという報告がある（Ikeda et al., British Journal of Cancer vol.86, pp.1110-1116, 2002年）。
【００２０】
本発明において測定する対象となる「尿中代謝物」又は「尿中腫瘍マーカー」は、以下の表2に列挙される尿中代謝物を意味する。尿中代謝物は、血中の物質と比較すると酵素の影響を受けにくく構造的に安定しているため、腫瘍マーカーとしての利便性が高い。その上、尿を検体に用いるため小児でも容易に採取でき、がんのスクリーニング用途としても非常に利用しやすい。また「マーカー群」とは、2以上の尿中腫瘍マーカーからなる組み合わせである。
【００２１】
「測定する」とは、代謝物の尿サンプル中の相対存在量又は絶対濃度を求めることを意味する。相対存在量とは、意図的に添加した標準物質に対して、目的とする代謝物の測定強度の比である。一方、絶対濃度とは、目的とする代謝物に対して、あらかじめ同じ代謝物を用いて検量線（代謝物の濃度と代謝物の測定強度との関係）を作成し、測定された強度からその絶対濃度を算出する方法である。また本発明では、「尿中腫瘍マーカーを測定する」とは、尿中腫瘍マーカーである代謝物を測定してもよいし、又はその派生物若しくは誘導体を測定してもよい。「派生物」及び「誘導体」とは、尿中腫瘍マーカーである代謝物から派生する物質及び当該代謝物に由来する物質をそれぞれ意味する。「派生物」及び「誘導体」には、例えば、代謝物の断片、修飾された代謝物などが含まれるが、これに限定されるものではない。
【００２２】
本発明において使用する主な尿中腫瘍マーカーを以下の表2にまとめる。健常な児58名、神経芽腫患児7名（そのうち神経芽腫ステージ4Sの患者1名）の尿中代謝物を網羅的に解析し、神経芽腫の検出に重要な代謝物を15個抽出した。表中、「代謝物」の欄では、データベースによる検索の結果、構造がわかった代謝物の名称を示す。表2の上部Aの欄には、ステージ4S以外の神経芽腫で高値を示す尿中腫瘍マーカー（（A）群のマーカー）10個が記載され、表2の下部Bの欄には、神経芽腫のステージ4Sでもステージ4S以外でも高値を示す尿中腫瘍マーカー（（B）群のマーカー）5個が記載されている。
【００２３】
表2において、「質量」の欄には、「検出プラットフォーム」の欄に記載された検出手段により検出した場合の質量を示す。「検出プラットフォーム」の欄における「LC/MS Neg」及び「LC/MS Pos」とは、それぞれ「液体クロマトグラフィ質量分析装置（LC/MS）の負イオン検出モード」及び「液体クロマトグラフィ質量分析装置（LC/MS）の正イオン検出モード」を表している。なお、この表では、検出プラットフォームとして、LC/MS正イオン検出モード又はLC/MS負イオン検出モードの一方が記載されているが、用いる装置によっては、正イオン検出モードと負イオン検出モードを高速に反転できる場合があり、その場合には、検出プラットフォームとして、正イオン検出モードと負イオン検出モードの双方が記載される。
【００２４】
また、表2に示される代謝物は、表2の「代謝経路」の項目に示すように、チロシン代謝に関係するもの、メチオニン・システイン・SAM・代謝に関係するもの（本明細書中、「メチオニン系代謝」と省略する）、コルチコステロイドに関係するもの、プテリン代謝、イソロイシン代謝に関係するものに分けられる。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
一実施形態において、（A）群のマーカーとして、表2に示す3-メトキシチラミン硫酸塩（3-methoxytyramine sulfate）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量246.04416として計測される化合物を測定する。
【００２７】
一実施形態では、（A）群のマーカーとして、表2に示すキサントプテリン（xanthopterin）を測定する。すなわち、LC/MS正イオン検出モードで質量180.0516として計測される化合物を測定する。
【００２８】
一実施形態において、（A）群のマーカーとして、表2に示すバニルラクテート（vanillactate）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量211.06119として計測される化合物を測定する。
【００２９】
一実施形態において、（A）群のマーカーとして、表2に示す3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート（3,4-dihydroxyphenylacetate）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量123.04515として計測される化合物を測定する。
【００３０】
一実施形態において、（A）群のマーカーとして、表2に示すシスタチオニン（cystathionine）を測定する。すなわち、LC/MS正イオン検出モードで質量223.07471として計測される化合物を測定する。
【００３１】
一実施形態において、（A）群のマーカーとして、表2に示すコルチゾール21-グルクロニド（cortisol 21-glucuronide）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量537.23413として計測される化合物を測定する。
【００３２】
一実施形態では、（A）群のマーカーとして、表2に示す3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩（3,4-dihydroxyphenylacetate sulfate）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量246.99179として計測される化合物を測定する。
【００３３】
一実施形態において、（A）群のマーカーとして、表2に示すコルチゾール（cortisol）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量361.20204として計測される化合物を測定する。
【００３４】
一実施形態では、（A）群のマーカーとして、表2に示す3-メトキシチロシン（3-methoxytyrosine）を測定する。すなわち、LC/MS正イオン検出モードで質量212.09174として計測される化合物を測定する。
【００３５】
一実施形態において、（A）群のマーカーとして、表2に示す3-メトキシチラミン（3-methoxytyramine）を測定する。すなわち、LC/MS正イオン検出モードで質量168.10191として計測される化合物を測定する。
【００３６】
一実施形態において、（B）群のマーカーとして、表2に示すバニリルマンデル酸（vanillylmandelate）（VMA）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量197.04555として計測される化合物を測定する。
【００３７】
一実施形態では、（B）群のマーカーとして、表2に示すホモバニリン酸（homovanillate）（HVA）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量181.05063として計測される化合物を測定する。
【００３８】
一実施形態では、（B）群のマーカーとして、表2に示す2-ヒドロキシ-3-メチルバレレート（2-hydroxy-3-methylvalerate）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量131.07136として計測される化合物を測定する。
【００３９】
一実施形態において、（B）群のマーカーとして、表2に示す3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール（3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol）を測定する。すなわち、LC/MS正イオン検出モードで質量167.07028として計測される化合物を測定する。
【００４０】
一実施形態では、（B）群のマーカーとして、表2に示す3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート（3-(4-hydroxyphenyl)lactate）を測定する。すなわち、LC/MS負イオン検出モードで質量181.05063として計測される化合物を測定する。
【００４１】
なお、表2に示した代謝物の解析に使用した質量分析計は非常に高分解能であるため、質量が小数点以下2桁、3桁、4桁又は5桁程度まで測定可能であるが、分解能の低い質量分析計を使用する場合には、整数質量又は小数点以下1桁の質量を測定することになる。
【００４２】
本発明では、表2に示した尿中腫瘍マーカーのうち、（A）群のマーカーを少なくとも1つ、必要であれば（B）群のマーカーを少なくとも1つ使用して、神経芽腫の検出や治療の効果のモニタリングを行うことができる：
（A）群：3-メトキシチラミン硫酸塩、キサントプテリン、バニルラクテート、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、シスタチオニン、コルチゾール21-グルクロニド、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩、コルチゾール、3-メトキシチロシン、及び3-メトキシチラミン
（B）群：2-ヒドロキシ-3-メチルバレレート、バニリルマンデル酸（VMA）、ホモバニリン酸（HVA）、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、及び3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート。
【００４３】
また本発明では、尿中腫瘍マーカーを少なくとも2つ、あるいは3つ以上組み合わせて使用することによって、より正確かつ高精度の神経芽腫検出や、治療の効果のモニタリングが可能となる。例えば、表2に示す尿中腫瘍マーカーのうち、（A）群のマーカーの2種以上、及び／又は（B）群のマーカーの2種以上を組み合わせることができる。マーカーの組み合わせは特に限定されるものではない。
【００４４】
好ましい実施形態では、異なる代謝経路に関係する尿中腫瘍マーカーを組み合わせて使用する。例えば、（A）群のマーカーの場合には、以下の（A-1）〜（A-4）の下位群のうち、異なる下位群のマーカーを組み合わせて使用することが好ましい：
（A-1）：チロシン代謝に関係する3-メトキシチラミン硫酸塩、バニルラクテート、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート硫酸塩、3-メトキシチロシン、及び3-メトキシチラミンから選択される少なくとも1種；
（A-2）：プテリン代謝に関係するキサントプテリン；
（A-3）：メチオニン系代謝に関係するシスタチオニン；
（A-4）：コルチコステロイドであるコルチゾール21-グルクロニド、及びコルチゾールのうち少なくとも1種。
また（B）群のマーカーの場合には、以下の（B-1）及び（B-2）の下位群のそれぞれからのマーカーを組み合わせて使用することが好ましい：
（B-1）：イソロイシン代謝に関係する2-ヒドロキシ-3-メチルバレレート；
（B-2）：チロシン代謝に関係するバニリルマンデル酸（VMA）、ホモバニリン酸（HVA）、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、及び3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテートから選択される少なくとも1種。
【００４５】
より好ましい実施形態において、（A）群の尿中腫瘍マーカーの少なくとも3種を測定する。例えば、上記の（A-1）、（A-2）及び（A-3）の組み合わせ、（A-1）、（A-2）及び（A-4）の組み合わせ、（A-2）、（A-3）及び（A-4）の組み合わせ、（A-1）、（A-3）及び（A-4）の組み合わせを測定する。具体的な実施形態では、（A-1）の3-メトキシチラミン硫酸塩、（A-2）のキサントプテリン、及び（A-4）のコルチゾールを組み合わせて測定することができる。
【００４６】
別の好ましい実施形態において、（B）群の尿中腫瘍マーカーの少なくとも3種を測定する。例えば、上記の（B-1）の1種と、（B-2）の2種の組み合わせを測定する。具体的な実施形態では、（B-1）の2-ヒドロキシ-3-メチルバレレートと、（B-2）のVMA及びHVAを組み合わせて測定することができる。
【００４７】
表2に示した尿中腫瘍マーカーは、いずれも単独で使用して神経芽腫を検出できるものである。好ましくは、（B）群のマーカーとして、少なくとも2-ヒドロキシ-3-メチルバレレートを含める。また好ましくは、（A）群のマーカーとして、少なくとも3-メトキシチラミン硫酸塩を含める。
【００４８】
なお、単独の尿中腫瘍マーカーの場合は個別に比較・解析していけばよいが、2個以上の複数の尿中腫瘍マーカーを検討する場合には、その組み合わせが多様となるため、比較・解析が非常に煩雑である。そこで、2個以上の組み合わせについて、どのような組み合わせが良いかを判断する基準として、以下に示す精度変数R2Yと予測変数Q2という評価変数を用いることができる。
【数１】
2020079729.tif 000005
【００４９】
ここで、Yobsは実測値、YcalcはOPLSによる計算値、Ypredは交差検証を行った際の予測値、
2020079729.tif 000006
は平均値を表す。交差検証とは、データを分割し、その一部をまず解析して残る部分でその解析のテストを行い、解析自身の妥当性の検証・確認に当てる手法を示す。これによれば、精度変数R2Yの値が1に近いほどモデルの精度は高く、予測変数のQ2値が1に近いほどモデルの予測性は高いといえる。この精度変数及び予測変数の値の高い組み合わせを神経芽腫の検出に使用することで、より高精度な検出が可能になると考えられる。
【００５０】
なお、尿中腫瘍マーカーの組み合わせは、対象の種類、性別、年齢や、神経芽腫の検出又は治療のモニタリングを含む目的などに応じて、適宜選択することができる。
【００５１】
尿中腫瘍マーカーの識別の方法の一例として、多変量解析の一種である部分最小二乗法、特にOPLS-DAを用いることができる。健常者に対して神経芽腫患者で変動する代謝物を複数組み合わせて多変量解析を行う場合、多次元データをそのまま用いるとデータが持つ特徴がわかりにくい場合があるため、2次元又は3次元データに縮約して視覚化することが好ましい。例えば、図２〜４に、プロットした解析結果の例を示している。多変量解析としては、主成分分析などの当技術分野で公知の解析方法を使用することも可能である。
【００５２】
尿サンプルとは、対象から採取した尿、及び当該尿を処理して得られるサンプル（例えば、トルエン、キシレン、塩酸などの保存料を添加した尿）を意味する。
【００５３】
また対象は、小児、具体的には0〜15歳までの児である。好ましくは、神経芽腫のステージ4S患児が多い1歳未満の児である。しかし、ヒトに限定されるものではなく、その他の哺乳動物、例えば霊長類（サル、チンパンジーなど）、家畜動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなど）、ペット用動物（イヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラット、ウサギなど）などであってもよい。
【００５４】
尿中腫瘍マーカーの測定は、尿サンプル中のその量又は濃度を、好ましくは半定量的又は定量的に測定することを意味し、その量は、絶対量であってもよいし又は相対量であってもよい。測定は、直接的又は間接的に行うことができる。直接的な測定は、サンプル中に存在する尿中代謝物の分子数と直接相関するシグナルに基づいて、その量又は濃度を測定することを含む。そのようなシグナルは、例えば尿中代謝物の特定の物理的又は化学的な特性に基づいている。間接的な測定は、二次成分（すなわち尿中代謝物以外の成分）、例えばリガンド、標識又は酵素反応生成物から得られるシグナルの測定である。
【００５５】
本発明の一実施形態では、尿中腫瘍マーカー、すなわち尿中代謝物を測定するが、その測定方法は、当技術分野で公知の方法又は手段を用いることができ、特に限定されるものではない。例えば、尿中腫瘍マーカーの測定は、尿中代謝物に特有の物理的又は化学的特性を測定するための手段、例えば正確な分子量又はNMRスペクトル等を測定するための手段によって行うことができる。尿中代謝物を測定するための手段としては、質量分析計、NMR分析計、二次元電気泳動装置、クロマトグラフ、液体クロマトグラフィ質量分析装置（LC/MS）等の分析装置が挙げられる。これら分析装置を単独で使用して尿中腫瘍マーカーを測定してもよいが、複数の分析装置により尿中腫瘍マーカーを測定してもよい。
【００５６】
あるいは、測定対象の代謝物を検出するための試薬、例えば免疫反応試薬、酵素反応試薬などが利用できる場合には、そのような試薬を利用して尿中の代謝物を測定することができる。
【００５７】
表2に示された尿中代謝物は、LC/MSにより見出されたものであるため、LC/MSを使用すればこれらの尿中代謝物を測定することができる。
【００５８】
以上のようにして、対象から採取した尿サンプルに含まれる尿中腫瘍マーカーを測定し、その結果に基づいて対象における神経芽腫を検出することが可能である。さらに、対象から複数の時点に採取した尿サンプルにおいて尿中腫瘍マーカーを測定してもよい。
【００５９】
本発明の神経芽腫の検出方法によって、神経芽腫の存在や進行を早期に判定することができる。特に、予後良好なステージ4Sとそれ以外のステージの神経芽腫を識別することができるため、詳細な検査や治療方針の決定に役立つ。簡便な検査でステージ4Sか否かの診断が可能となれば、治療はもちろん検査による侵襲リスクを防ぐことが期待できる。対象は、神経芽腫の治療を早期に受けたり、特定の悪性度などに適した治療を受けたりすることが可能となる。また、神経芽腫の治療の効果についてモニターすることができ、治療の効果に応じて治療の停止、継続又は変更を検討することが可能となる。さらに、尿サンプルを利用することから低侵襲性であり、簡便かつ低コストに神経芽腫を評価でき、定期的な採血が困難な小児では特に大きな利点である。
【００６０】
本発明の神経芽腫の検出方法は、尿中代謝物である尿中腫瘍マーカーを測定するための手段を備えたキット及び／又は装置を用いることによって、容易かつ簡便に行うことができる。
【００６１】
本発明に係る神経芽腫の検出用キットは、少なくとも以下の手段を含む：
上記表2に示される尿中腫瘍マーカーのうち、（A）群のマーカーの少なくとも1つを測定するための手段、及び（B）群のマーカーの少なくとも1つを尿サンプルにおいて測定するための手段。
【００６２】
本発明のキットの一例は、質量分析用試薬セットであり、例えば同位体標識試薬、分画用ミニカラム、緩衝液等により構成される。キットの別の例は、免疫反応用試薬セットであり、例えば、一次抗体を固定した基板、二次抗体等により構成される。また別の例として、酵素反応用試薬セットは、例えば、酵素、緩衝液等により構成される。本発明のキットは、本発明の方法を実施するための手順及びプロトコールを記載した説明書、神経芽腫の検出において使用する基準値又は基準範囲を示した表などを含んでもよい。
【００６３】
本発明のキットに含まれる構成要素は、個別に提供されてもよいし、又は単一の容器内に提供されてもよい。好ましくは、本発明のキットは、本発明の方法を実施するために必要な構成要素の全てを、即時に使用することができるように、例えば調整された濃度の構成要素として含む。
【００６４】
本発明に係る神経芽腫の検出装置は、以下の手段を備える：
上記表2に示される尿中腫瘍マーカーのうち、（A）群のマーカーの少なくとも1つ、及び（B）群のマーカーの少なくとも1つを尿サンプル中で測定する測定部と、
上記測定部で測定した尿中腫瘍マーカーの測定値を基準値又は前回の測定値と比較する比較部と、
上記比較部で得られた比較結果から神経芽腫を検出する判定部。
【００６５】
また、本発明に係る神経芽腫の検出装置は、多変量解析を用いる場合、以下の手段を備える：
上記表2に示される尿中腫瘍マーカーのうち、（A）群のマーカーの少なくとも1つ、及び（B）群のマーカーの少なくとも1つを尿サンプル中で測定する測定部と、
上記測定部で測定した説明変数（尿中腫瘍マーカーの量若しくは濃度、又は健常児に対して神経芽腫患者で増減している尿中腫瘍マーカーの観測されたイオンの強度比）から多変量解析して得られた計算値を、蓄積されたデータに基づいて多変量解析して得られたがん検査モデルに基づいて計算された目的変数の計算値（健常か神経芽腫か、神経芽腫のステージ4Sであるかを示す指標）である基準値又は前回までの目的変数の計算値と比較する比較部と、
上記比較部で得られた比較結果から神経芽腫を検出する判定部。
【００６６】
本発明の装置は、好ましくは、本発明の方法を実施することができるように、上記の測定部、比較部及び判定部が互いに動作可能なように連結されたシステムである。本発明の装置の一実施形態を図５に示す。
【００６７】
ここで、測定部は、上述のように、尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーを測定するための手段を含み、例えば質量分析計、NMR分析計、二次元電気泳動装置、クロマトグラフ、液体クロマトグラフィ質量分析（LC/MS）装置等の分析装置を備えている。
【００６８】
測定部は、上述したような分析装置等から得られた測定値を処理するソフトウエアと計算機よりなるデータ解析部を備えている。データ解析部は、上述したような分析装置等から得られた測定値に基づいて検量線等のデータを参照することで、尿サンプルに含まれる尿中腫瘍マーカーの量若しくは濃度を算出する。一方、データ解析部は、多変量解析を用いる場合には、上記測定部で測定した説明変数（尿中腫瘍マーカーの量若しくは濃度、又は健常児に対して神経芽腫患者で増減している尿中腫瘍マーカーの観測されたイオンの強度比）から多変量解析して得られたがん検査モデルに基づいて計算された目的変数の計算値（健常か神経芽腫か、神経芽腫のステージ4Sであるかを示す指標）を算出する。データ解析部は、例えば、シグナル表示部分、測定値を分析するユニット、コンピュータユニット等を含むことができる。
【００６９】
また、比較部は、尿中腫瘍マーカーの量若しくは濃度に関する基準値を記憶装置（データベース）等から読み出し、上記測定部で測定した尿中腫瘍マーカーの測定値と基準値とを比較する。一方、比較部は、多変量解析を用いる場合には、目的変数の基準値を記憶装置（データベース）等から読み出し、上記測定部で得られた目的変数の計算値と基準値とを比較する。このとき、比較部は、尿中腫瘍マーカーの種類に応じて適切な基準値を選択して読み出す。あるいは、同一対象における経時的モニタリングの場合には、比較部は、前回の測定値を記憶装置（データベース）等から読み出し、測定部で測定した尿中腫瘍マーカーの測定値と比較する。
【００７０】
さらに、判定部は、比較部において尿中腫瘍マーカーの測定値と基準値とを比較した結果に基づいて、あるいは比較部において複数の時点における尿中腫瘍マーカーの測定値を比較した結果に基づいて、神経芽腫を検出する。一方、判定部は、多変量解析を用いる場合、比較部において目的変数の計算値と基準値を比較した結果に基づいて、あるいは比較部において複数の時点における目的変数の計算値を比較した結果に基づいて、神経芽腫を検出する。ここで、判定部は、対象における神経芽腫の存在や神経芽腫のステージ等を示す情報を取得する。好ましい装置は、専門の臨床医の知識がなくても使用することができるものであり、例えば、単にサンプルを付加すればよい電子的装置がある。
【００７１】
本発明の装置は、データ保存部、データ出力・表示部などをさらに備えるものであってもよい。
【００７２】
本明細書中、「神経芽腫の検出」とは、対象における神経芽腫の有無を検出することだけではなく、対象における神経芽腫のリスクを予測すること、対象における神経芽腫のステージを判定すること、対象における神経芽腫の予後を判定すること、対象に存在する神経芽腫に対する治療の効果をモニタリングすること、さらには神経芽腫の診断を補助することを含む意味である。神経芽腫の悪性度、例えばステージや予後（転移、再発など）に応じて適用すべき治療が異なることから、神経芽腫のステージや予後を判定することは重要である。特に本発明では、神経芽腫の有無について、神経芽腫がステージ4Sであるか否かについて、検出する。また本発明において「検出」は、既に検出又は診断された神経芽腫の継続的なモニタリング、及び既に行った神経芽腫の検出又は診断の確認も包含する。
【００７３】
なお、本発明に係る神経芽腫の検出方法、検出用キット及び検出装置による「検出」は、統計学的に有意な割合の対象を検出できることを意図している。よって本発明に係る神経芽腫の検出方法、検出用キット及び検出装置による「検出」には、対象の全て（すなわち100％）について必ず正しい結果が得られない場合も含まれる。統計的に有意な割合は、様々な周知の統計評価ツール、例えば信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントのt検定、マン・ホイットニー検定等を用いて決定することができる。好ましい信頼区間は、少なくとも90％である。p値は、好ましくは、0.1、0.01、0.05、0.005又は0.0001である。より好ましくは、対象の少なくとも60％、少なくとも80％又は少なくとも90％を、本発明に係る神経芽腫の検出方法、検出用キット及び検出装置によって適切に検出することができる。
【００７４】
神経芽腫の検出の具体例は次のとおりである。一実施形態において、対象の尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーを測定し、その測定値を基準と比較する。複数の尿中腫瘍マーカーを測定する場合には、それぞれの尿中腫瘍マーカーをそれぞれの基準と比較してもよいし、多変量解析により得られる目的変数の計算値を求め、それを基準と比較してもよい。
【００７５】
基準（基準値）は、（A）群のマーカーの場合には、神経芽腫のステージ4S以外の存在の指標となる尿中腫瘍マーカーの量若しくは濃度、又はその量若しくは濃度の範囲であり、（B）群のマーカーの場合には、神経芽腫のステージ4Sの存在の指標となる尿中腫瘍マーカーの量若しくは濃度、又はその量若しくは濃度の範囲である。一方、多変量解析を用いる場合、健常児と神経芽腫患者又は健常児と神経芽腫ステージ4S患者を識別する目的変数の計算値が基準値となる。例えば、基準値は、健常児（集団）又は神経芽腫の低リスク者（集団）に由来するものとすることができる。あるいは、基準値は、神経芽腫のステージ4Sに罹患している又は神経芽腫のステージ4S以外のステージに罹患している又は特定の予後を示す神経芽腫を有する患者（患者集団）に由来するものとすることができる。個々の対象に適用する基準値は、対象動物の種類、年齢、性別などの様々な生理学的パラメータに応じて変化しうる。
【００７６】
好ましくは、尿中腫瘍マーカーの量又は濃度と、神経芽腫のステージ4Sの存在又はステージ4S以外のステージの存在、又は特定の予後との相関をデータベースとして記録する。そして、測定された尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーの測定値を、データベース中の基準値と比較することができる。このようなデータベースは、神経芽腫の有無やステージ4Sであるかそれ以外であるかの指標、又は予後の指標となる基準値又は基準範囲として有用である。
【００７７】
表2に示した尿中腫瘍マーカーのうち、（A）群のマーカーは、ステージ4S以外の神経芽腫患者と健常児においてその量又は濃度に差があり、神経芽腫の存在により、また治療の開始前又は開始後に、その量又は濃度が変化する。具体的には、表2に示す（A）群のマーカーは、健常児と比較してステージ4S以外の神経芽腫患者においてその量又は濃度が上昇する。したがって、（A）群のマーカーが、健常児集団に由来する基準値よりも高い場合又は神経芽腫患者集団に由来する基準値と同等若しくはそれより高い場合には、対象がステージ4S以外の神経芽腫に罹患している又はそのリスクが高いといえる。
【００７８】
また表2に示した尿中腫瘍マーカーのうち、（B）群のマーカーは、ステージ4S以外及びステージ4Sの神経芽腫患者と健常児においてその量又は濃度に差があり、神経芽腫（ステージ4S以外及びステージ4S）の存在により、その量又は濃度が変化する。具体的には、表2に示す（B）群のマーカーは、健常児と比較してステージ4S以外及びステージ4Sの神経芽腫患者においてその量又は濃度が上昇する。したがって、（B）群のマーカーが、健常児集団に由来する基準値よりも高い場合又は神経芽腫（特にステージ4S）患者集団に由来する基準値と同等若しくはそれより高い場合には、対象が神経芽腫（特にステージ4S）に罹患している又はそのリスクが高いといえる。
【００７９】
表2に示した尿中腫瘍マーカーを使用して神経芽腫を検出する場合の具体例を以下の表3に示す。
【表３】
2020079729.tif 000007
【００８０】
表3に示されるように、（A）群のマーカーが基準値より高い場合（症例1及び2）には、神経芽腫陽性であり、ステージ4S以外であると判定される。（A）群のマーカーが基準値より低く、（B）群のマーカーが基準値より高い場合（症例3）には、神経芽腫陽性であり、ステージ4Sであると判定される。（A）群のマーカーが基準値より低く、（B）群のマーカーが基準値より低い場合（症例4）には、神経芽腫陰性であると判定される。
【００８１】
また、本発明を適用した尿中腫瘍マーカーによる神経芽腫の検出フロー例を図１に示す。検出フローに従い、尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーを測定する。ステージ4S以外の症例で高値となる尿中腫瘍マーカー（すなわち（A）群のマーカー）による予測値が高値（＋）の場合には、神経芽腫陽性であり、ステージ4S以外であると判定される。（A）群のマーカーが低値（−）であり、ステージ4Sの症例で高値となる尿中腫瘍マーカー（すなわち（B）群のマーカー）による予測値が高値（＋）の場合には、神経芽腫陽性であり、ステージ4Sであると判定される。いずれの尿中腫瘍マーカーも低値（−）の場合には、神経芽腫陰性であると判定される。
【００８２】
別の実施形態では、対象から複数の時点で尿サンプルを採取し、それぞれの測定時点における尿サンプルに含まれる尿中腫瘍マーカーを測定し、尿中腫瘍マーカーの測定値をそれぞれの測定時点で比較する。より具体的には、第1の時点における尿中腫瘍マーカーの量又は濃度（a）と第2の時点における尿中腫瘍マーカーの量又は濃度（b）とを比較する。多変量解析を行った場合には、例えば、１つの成分の第1の時点における計算値と第2の時点における計算値とを比較する。測定は、経時的に少なくとも2回、3回、4回、5回、10回、15回、20回、30回、又はそれ以上の回で、例えば1日、2日、5日、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、半年、1年、2年、3年、5年、又はそれ以上の期間を空けて、行うことができる。この比較によって、経時的なモニタリングを行うことができ、神経芽腫の進行、神経芽腫の転移又は再発などを評価することができる。
【００８３】
また別の実施形態では、本発明に使用される尿中腫瘍マーカーを利用して、対象における神経芽腫に対する治療（治療薬又は治療法）の効果をモニタリングすることができる。具体的には、
（a）治療薬又は治療法による処置を受ける前に、神経芽腫を有する患者からの尿サンプルにおいて尿中腫瘍マーカーを測定するステップ、
（b）治療薬又は治療法による処置を受けた後に、神経芽腫を有する患者からの尿サンプルにおいて尿中腫瘍マーカーを測定するステップ、
（c）必要に応じて、ステップ（b）を繰り返すステップ、
（d）（a）〜（c）の測定結果に基づいて神経芽腫に対する治療薬又は治療法の効果をモニタリングするステップ
を含む。
【００８４】
上記方法では、治療薬又は治療法による処置を受ける前に、神経芽腫を有する患者から尿サンプルを採取し、尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーを測定する。神経芽腫を有する患者に治療薬又は治療法による処置が行われた後、適当な時期に尿サンプルを採取して、尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーを測定する。例えば、処置の直後、30分後、1時間後、3時間後、5時間後、10時間後、15時間後、20時間後、24時間（1日）後、2〜10日後、10〜20日後、20〜30日後、1ヶ月〜6ヶ月後に尿サンプルを採取する。尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーの測定については前記と同様に行うことができる。治療前後に尿中腫瘍マーカーを測定することによって、その治療薬又は治療法による処置の効果をモニタリングすることが可能となる。モニタリングの結果に基づいて、治療の停止、継続又は変更を検討する一助となる。
【００８５】
さらに神経芽腫の検出方法は、他の従来公知の神経芽腫の診断方法と組み合わせて行ってもよい。そのような公知の神経芽腫の診断方法としては、画像検査（例えば超音波検査、コンピュータ断層撮影（CT）、X線検査、磁気共鳴撮影（MRI）、ポジトロンCT（PET）等）、内視鏡検査、生検による病理検査（骨髄液検査等）、血中がんマーカーの測定などが挙げられる。
【００８６】
上述の評価結果に基づいて、医師は、対象の神経芽腫について診断を行い、適切な処置を行うことができる。すなわち本発明は、対象において神経芽腫を検出し、治療する方法にも関する。例えば、本発明に係る神経芽腫の検出方法に従って対象における神経芽腫を検出し、対象が神経芽腫のステージ4S以外を発症している可能性が高いと評価された場合、対象において神経芽腫を治療する又は神経芽腫の進行を予防する処置を行う。また、対象における神経芽腫のステージが進行している又は神経芽腫の予後が悪い可能性が高いと評価された場合には、治療を継続したり、必要であれば治療法の変更を検討する。あるいは、対象が神経芽腫のステージ4Sを発症している可能性が高いと評価された場合には、過度の検査及び治療を回避するため、尿中腫瘍マーカーの測定を経時的に行って、神経芽腫についてモニタリングする。また、対象において神経芽腫が存在する可能性が高いと評価された場合には、上述したような他の神経芽腫の診断方法を行って、神経芽腫の存在を確定する。さらに、治療前後での評価結果に基づいて、治療の効果をモニタリングし、治療の停止、継続又は変更を決定する。
【００８７】
神経芽腫は、外科手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、陽子線治療、重粒子線治療などを、単独で又は適宜組み合わせて行うことができる。神経芽腫の治療は、神経芽腫の種類、ステージ、悪性度、患児の性別、年齢及び状態、患児の治療に対する応答性などを考慮して、当業者であれば適宜選択することができる。
【００８８】
本発明を適用した例として、検査センタにおけるがん検査について説明する。検査センタでは、被検査者からの請求等に応じてがん検査の案内を行う。被検査者は一次検査の申し込みに際し、検査のバイオマーカー数の選択を行ってもよい。例えば、バイオマーカー数としては1〜3種類の尿中腫瘍マーカーが挙げられる。これは、他のバイオマーカーと組み合わせて、全がん検査（いろいろながんを一度に解析する）として利用することもできる。
【００８９】
続いて、検査センタは尿採取に必要な検査キットを被検査者に渡す。必要に応じて郵送などにより送付する。被検査者は検査キットを受け取った後、検査センタに検体を渡す、又は送付等行う。検査センタでは、検体を続く検査のため必要に応じて、約−80℃に冷凍保存しておく。検査センタでは一次検査を行い、検査結果を被検査者に送る。
【００９０】
被検査者は、一次検査の結果を受け取り、内容に応じて二次検査の申し込みを行ってもよいし、より詳細な診断を受けてもよい。これにより、一次検査での神経芽腫の疑いを確証したり、さらには神経芽腫のステージを特定することが可能となる。
【００９１】
また、本発明に使用される尿中腫瘍マーカーを利用して、神経芽腫の治療（治療薬又は治療法）の有効性を評価する、あるいは神経芽腫の治療薬候補をスクリーニングすることができる。具体的には、神経芽腫の治療の有効性を評価する方法、又は神経芽腫の治療薬候補をスクリーニング方法は、
（a）被験治療薬又は治療法による処置を受けた神経芽腫を有する動物からの尿サンプルにおいて、尿中腫瘍マーカーを測定するステップ、
（b）（a）の測定結果に基づいて神経芽腫に対する被験治療薬又は治療法の有効性を評価するステップ
を含む。
【００９２】
本発明の方法では、神経芽腫を有する動物、すなわち神経芽腫を発症している又は発症リスクのある動物から尿サンプルを採取し、尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーを測定する。好ましくは、被験治療薬又は治療法による処置を行う前に、神経芽腫を有する動物から尿サンプルを採取し、尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーを測定する。神経芽腫を有する動物に被験治療薬又は治療法による処置が行われた後、適当な時期に尿サンプルを採取して、尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーを測定する。例えば、処置の直後、30分後、1時間後、3時間後、5時間後、10時間後、15時間後、20時間後、24時間（1日）後、2〜10日後、10〜20日後、20〜30日後、1ヶ月〜6ヶ月後に尿サンプルを採取する。尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーの測定、神経芽腫の検出については前記と同様に行うことができる。
【００９３】
対象となる動物は、神経芽腫（好ましくは特定のステージの神経芽腫）を患うヒトであってもよいし、あるいは神経芽腫モデル動物（マウス、ラット、ウサギなど）であってもよい。一般的には、モデル動物において被験治療薬又は治療法の有効性が確認された後に、ヒトにおいて、例えば臨床試験などにより有効性の評価が行われる。
【００９４】
評価又はスクリーニングの対象となる被験治療薬又は治療法の種類は特に限定されるものではない。例えば、被験治療薬又は治療法は、任意の物質的因子、具体的には、天然に生じる分子、例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物（糖等）、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど；天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体、例えば、ペプチド擬態物、核酸分子（アプタマー、アンチセンス核酸、二本鎖RNA（RNAi）等）など；天然に生じない分子、例えば低分子有機化合物（無機及び有機化合物ライブラリー、又はコンビナトリアルライブラリー等）など；並びにそれらの混合物を挙げることができる。また治療薬又は治療法は、単一物質であってもよいし、複数の物質から構成される複合体や、食品及び食餌等であってもよい。さらに、被験治療薬又は治療法は、上記のような物質的因子に加えて、放射線、紫外線などであってもよい。
【００９５】
動物の被験治療薬又は治療法による処置は、その治療薬又は治療法の種類により異なるが、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、被験治療薬の投与量、投与期間、投与経路などの投与条件は、当業者であれば適切に決定することができる。
【００９６】
また、被験治療薬又は治療法の有効性は、いくつかの条件で検討することも可能である。そのような条件としては、被験治療薬又は治療法で処置する時間又は期間、量（大小）、回数などが挙げられる。例えば、被験治療薬の希釈系列を調製するなどして複数の用量を設定することができる。
【００９７】
さらに、複数の被験治療薬又は治療法の相加作用、相乗作用などを検討する場合には、治療薬又は治療法を組み合わせて用いてもよい。
【００９８】
被験治療薬又は治療法の処置後の動物から採取した尿サンプル中の尿中腫瘍マーカーを測定し、処置前の量又は濃度と比較することによって、被験治療薬又は治療法が、神経芽腫の消失、神経芽腫の縮小、神経芽腫による症状の改善、神経芽腫の進行の停止又は減速化に有効であるか否かを評価することができる。
【００９９】
例えば、表2に示した（A）群のマーカーの場合には、健常児と比較してステージ4S以外の神経芽腫患者においてその量又は濃度が上昇する尿中腫瘍マーカーであるため、処置後の測定値が処置前の測定値より低いことは、被験治療薬又は治療法が、神経芽腫の消失、神経芽腫の縮小、神経芽腫による症状の改善、神経芽腫の進行の停止又は減速化に有効であることを示す。一方、処置後の測定値が処置前の測定値より高い又は処置前の測定値と有意差がないことは、被験治療薬又は治療法が神経芽腫の治療に有効ではないことを示す。
【０１００】
また、例えば表2に示した（B）群のマーカーの場合には、ステージ4S以外及びステージ4Sの神経芽腫患者においてその量又は濃度が上昇する尿中腫瘍マーカーであるため、処置後の測定値が処置前の測定値より低いことは、被験治療薬又は治療法が、ステージ4S以外及びステージ4Sの神経芽腫の消失、その縮小、神経芽腫による症状の改善、神経芽腫の進行の停止又は減速化に有効であることを示す。一方、処置後の測定値が処置前の測定値より高い又は処置前の測定値と有意差がないことは、被験治療薬又は治療法が神経芽腫の治療に有効ではないことを示す。
【０１０１】
さらに、これらの複数の尿中腫瘍マーカーを用いた多変量解析を実施することも可能である。例えば、尿中腫瘍マーカー2種又は3種、4種、5種又は6種を用いた場合、図２〜４に示すようなOPLS-DA解析結果が得られるが、判別線（例えば、横軸の成分の計算値が０を通る直線）によって、健常児と神経芽腫患者（ステージ4S又はステージ4S以外）を識別できることがわかる。すなわち、新しい対象の場合、横軸の成分の計算値が神経芽腫患者の領域から健常児の領域に移ることによって、被験治療薬又は治療法が、神経芽腫の消失、神経芽腫の縮小、神経芽腫による症状の改善、神経芽腫の進行の停止又は減速化に有効であることがわかる。一方、横軸の成分の計算値が神経芽腫患者の領域のままであった場合には、被験治療薬又は治療法が神経芽腫の治療に有効でないことを示している。
【０１０２】
以上から、本発明に係る神経芽腫の治療の有効性の評価方法により、神経芽腫、特に神経芽腫のステージ4S以外を治療若しくは予防するための治療薬若しくは治療法、又はステージ4Sの神経芽腫を治療若しくは予防するための治療薬若しくは治療法を見出し、さらには治療薬又は治療法の有効性を確認することができる。
【０１０３】
以下に実施例を例示し、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のために提供するものであり、本出願において開示する発明の範囲を限定したり制限したりするものではない。
【実施例】
【０１０４】
［実施例１］神経芽腫と関連する尿中代謝物の網羅的解析
神経芽腫に特異的な尿中腫瘍マーカーを同定するため、名古屋大学医学系研究科病態外科学講座小児外科学において、健常な児58名、治療前の神経芽腫患児7名について尿中代謝物の網羅的解析を行った。
【０１０５】
具体的には、神経芽腫患児の尿と同年代の健康な児の尿中代謝物について、液体クロマトグラフィ質量分析装置（LC/MS）を用いて網羅的に解析し、健常な児に対して小児がん患児で有意に増減している代謝物を特定し、多変量解析により健常な児と小児がん患児を識別できる尿中腫瘍マーカーを見出すというものである。その結果、両者を識別できる尿中腫瘍マーカーを見出した（特願2018-055998、2018年3月23日出願）。
【０１０６】
その解析過程において、神経芽腫のステージ4Sと診断された患児1名では、他のステージの患児6名とは異なる尿中代謝物の様相が見られた：
・健常児との有意差がある代謝物の種類が、他の患児の尿サンプルに比べて明らかに少ない。
・有意差がある場合でも、ほとんどの代謝物が他の患児よりも顕著に低い。他の患児相当に数値が顕著に高値となった代謝物は1種のみである。
【０１０７】
神経芽腫ステージ4Sは、乳児に見られ、治療を実施せずとも自然退縮がみられ、予後が良いという特殊な群である。簡便な検査でステージ4Sを識別できれば過度の検査及び治療を回避できることから、ステージ4S群を識別できる尿中腫瘍マーカーの選別を試みた。具体的には、尿中代謝物のLC/MS測定値からランダムフォレスト（RF）により上位30種の尿中代謝物を選択し、そのうち外因性物質、構造未知化合物及び神経芽腫では低値となる化合物を除いた。健常児群の95％データ区間とがん患児のデータを比較した（LC/MS測定値を対数変換により正規近似）結果を以下の表に示す。
【０１０８】
【表４】
2020079729.tif 000008
【０１０９】
上記解析結果から、神経芽腫のステージ4Sでは高値とはならない尿中腫瘍マーカーが存在することがわかった。そのため、ステージ4S以外のステージの神経芽腫において高値を示す尿中腫瘍マーカー（（A）群のマーカー）と、ステージ4Sでも高値を示す尿中腫瘍マーカー（（B）群のマーカー）を組み合わせることで、神経芽腫であるか否か、さらにはステージ4Sであるか否かの診断を補助することが可能となる。
【０１１０】
［実施例２］（A）群のマーカー及び（B）群のマーカーを用いたがん評価モデルの構築
実施例１で選択した（A）群のマーカー及び（B）群のマーカーのそれぞれについて、全ての組み合わせを総当たりでOPLS-DAによる予測モデルを作成し、モデルの評価指標（特に予測変数）を求めた。特に、代謝系が異なる尿中代謝物の組み合わせをマーカー候補として選定した。
【０１１１】
具体的には、健常な児と神経芽腫患児を識別するため、OPLS判別分析法により、以下のような指標を用いてがん検査モデルを求めた。
【数２】
2020079729.tif 000009
【０１１２】
ここで、Yobsは実測値、YcalcはOPLSによる計算値、Ypredは交差検証を行った際の予測値、
2020079729.tif 000010
は平均値を表す。交差検証とは、データを分割し、その一部をまず解析して残る部分でその解析のテストを行い、解析自身の妥当性の検証・確認に当てる手法を示す。これによれば、説明変数R2Y値が1に近いほどモデルの精度は高く、予測変数Q2値が1に近いほどモデルの予測性は高いといえる。
【０１１３】
これらの評価指数が特に高値である予測モデルの結果を図２及び３に示す。図２は、神経芽腫のステージ4S以外に特異的なマーカー、すなわち（A）群のマーカー3種、3-メトキシチラミン硫酸塩（チロシン代謝）、キサントプテリン（プテリン代謝）及びコルチゾール（コルチコステロイド）の組み合わせをがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。説明変数0.857、予測変数0.804であり、ステージ4Sの患児はこれらのマーカーについては陰性に分類された。
【０１１４】
図３は、神経芽腫のステージ4Sでも検出されるマーカー、すなわち（B）群のマーカー3種、HVA（チロシン代謝）、VMA（チロシン代謝）及び2-ヒドロキシ-3-メチルバレレート（イソロイシン代謝）の組み合わせをがん検査モデルに適用した場合の予測値を示すグラフである。説明変数0.541、予測変数0.415であり、ステージ4Sの患児はこれらのマーカーについては陽性に分類された。
【０１１５】
このように、（A）群のマーカーについて陰性を示し（例えば図２）、（B）群のマーカーについて陽性を示す（例えば図３）場合には、その対象は神経芽腫のステージ4Sである可能性が高いということができる。一方、（A）群のマーカーについて陽性を示す（例えば図２）場合には、その対象は神経芽腫（特にステージ4S以外のステージ）である可能性が高いということができる。
【０１１６】
また、図３において、神経芽腫のステージ4S以外の患児のうち1名（症例No.15）は、（A）群のマーカーのうち3-メトキシチラミン硫酸塩、シスタチオニン、コルチゾール21-グルクロニド及びコルチゾールについて高値を示したが、（B）群のマーカーすべてについて陰性を示した。（B）群のマーカー（特にHVA及びVMA）が上昇しない神経芽腫は分化度が低いという報告があり、また予後不良因子として知られるN-myc（MYCN）遺伝子の増幅と逆相関することが知られている（中川原ら、日本小児外科学会雑誌 第23巻第2号第396頁）。そのため、（A）群のマーカーが陽性であり、かつ（B）群のマーカーが陰性であることは、神経芽腫の予後不良を示す可能性がある。
【０１１７】
さらに、健常児のうち、（B）群のマーカーであるHVA又はVMAの測定値が95％データ区間より高値となった児は5名であり、1名はHVA及びVMAの両方が95％データ区間を超えた。この5名はすべて生後12ヶ月未満のゼロ歳児であった（健常児58名のうちゼロ歳児は10名）。また、その他の健常児では、実施例１で行ったランダムフォレスト（RF）による上位30種の尿中代謝物のうち95％データ区間を外れた尿中代謝物は0〜1物質のみであったのに対し、上記のゼロ歳児5名では、HVA及びVMAを含む3〜7物質が95％データ区間を外れた値を示した。この結果から、ゼロ歳児の半数が尿中代謝物について神経芽腫と類似の様相を呈していた、すなわち偽陽性を呈していたため、尿中腫瘍マーカーの検査の実施の際には、年齢に応じた基準を設定したり、ゼロ歳児には特に留意する必要があることがわかった。
【０１１８】
［比較例］
参考として、図４に、上記の（A）群のマーカー3種及び（B）群のマーカー3種の合計6種の組み合わせをがん検査モデルに適用した場合の予測値を示す。説明変数0.705、予測変数0.648であり、ステージ4Sの患児は陽性に分類されているが、他の神経芽腫ステージと区別することはできない。
【０１１９】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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