(57)【要約】【課題】低コスト化を図りながら細胞を大量培養する技術を提供する。【解決手段】細胞培養方法は、以下の条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）の少なくとも一方を満たす培養液１０中で細胞８を培養する工程を含む。  条件（Ｉ）：前記培養液中の乳酸濃度が７．５ｍＭ未満である。  条件（ＩＩ）：前記培養液中のアンモニア濃度が２．５ｍＭ未満である。【選択図】図１
2020028245.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）の少なくとも一方を満たす培養液中で細胞を培養する工程を含むことを特徴とする細胞培養方法。
条件（Ｉ）：前記培養液中の乳酸濃度が７．５ｍＭ未満である。
条件（ＩＩ）：前記培養液中のアンモニア濃度が２．５ｍＭ未満である。
【請求項２】
前記細胞は、多能性幹細胞である請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項３】
前記条件（Ｉ）における乳酸濃度は、５ｍＭ以下である請求項１または２に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
前記条件（ＩＩ）におけるアンモニア濃度は、１ｍＭ以下である請求項１乃至３のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項５】
細胞および培養液を収容する培養容器と、
以下の条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）の少なくとも一方を満たすように培養液を調整する調整部と、
を備えることを特徴とする細胞培養装置。
条件（Ｉ）：前記培養液中の乳酸濃度が７．５ｍＭ未満である。
条件（ＩＩ）：前記培養液中のアンモニア濃度が２．５ｍＭ未満である。
【請求項６】
前記調整部は、
補充液を貯蔵する貯蔵容器と、
前記貯蔵容器から前記培養容器へ前記補充液を送る供給ポンプと、
前記培養液中の乳酸濃度およびアンモニア濃度の少なくとも一方を検知する濃度センサと、
前記濃度センサの検知結果に基づいて前記供給ポンプを駆動する制御部と、
を備える請求項５に記載の細胞培養装置。
【請求項７】
前記調整部は、
物質交換膜および成分調整液を収容し、前記培養液が供給されることで前記物質交換膜を介して前記成分調整液と前記培養液との間で物質交換を行う物質交換器と、
前記培養容器と前記物質交換器との間で前記培養液を循環させる循環ポンプと、
前記培養液中の乳酸濃度およびアンモニア濃度の少なくとも一方を検知する濃度センサと、
前記濃度センサの検知結果に基づいて前記循環ポンプを駆動する制御部と、
を備える請求項５に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記調整部は、
前記培養液中の乳酸およびアンモニアの少なくとも一方を吸着する吸着剤を備える請求項５に記載の細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養方法および細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品製造や再生医療などの分野において、細胞や微生物を人工的に効率よく大量培養することが求められている。大量培養が求められる細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）等の抗体産生細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞等が挙げられる。これらの細胞を長期間安定的に大量培養できれば、モノクローナル抗体等の生体物質や多能性幹細胞由来の分化誘導組織を、効率よく生産することができる。
【０００３】
細胞を工業的に大量培養する方法としては、スピナーフラスコ等の培養槽を用いた浮遊攪拌培養が考えられる。一方、浮遊攪拌培養では設備規模が大きくなる傾向がある。したがって、コストの削減を図るために、培養時の細胞密度を高めることが有効である。しかしながら、細胞密度を高めていくと、細胞の増殖が抑えられることが知られている。これは、細胞の高密度化によって培養液（液体培地）中の老廃物（代謝物）の濃度が上昇し、これにより細胞の増殖活性が低下するためである。細胞に影響を与える老廃物の代表的なものとしては、乳酸やアンモニアが知られている。
【０００４】
したがって、細胞を高密度状態で安定的に増殖させるためには、培養液中に蓄積する乳酸やアンモニアを除去することが望ましい。これに対し、例えば特許文献１には、濃度差に依存して成分を透過させる培養液成分調整膜を設けた送液ラインによって、細胞培養槽と成分調整液槽とを接続した細胞培養装置が開示されている。この細胞培養装置では、培養液中に蓄積した老廃物は、成分調整液側に移動することで培養液中での濃度が低下する。同時に、培養中に濃度が低下した栄養分は、成分調整液から培養液へ移動して補充される。これにより、培養液中の環境が細胞培養に適した状態に維持される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１２２５２８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に開示される細胞培養装置は、透析の原理を利用して培養液から老廃物を除去していた。したがって、十分な老廃物の除去を実現するために、成分調整液槽の容積を細胞培養槽の容積の１０倍以上に設定していた。また、培養液中の乳酸やアンモニアの濃度はモニタリングしていなかった。つまり、乳酸濃度やアンモニア濃度を調整する観点で、細胞培養槽から成分調整液槽へ培養液を送るタイミングや量等について十分な検討がなされていなかった。このため、必要な液量が莫大でコストがかかるという課題があった。特に、成分調整液に培養液そのものを用いる場合には、高価な培地を大量に消費することになり、より一層のコストがかかってしまう。
【０００７】
本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的の１つは、低コスト化を図りながら細胞を大量培養する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明のある態様は細胞培養方法である。この細胞培養方法は、以下の条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）の少なくとも一方を満たす培養液中で細胞を培養する工程を含む。
条件（Ｉ）：培養液中の乳酸濃度が７．５ｍＭ未満である。
条件（ＩＩ）：培養液中のアンモニア濃度が２．５ｍＭ未満である。
この態様によれば、低コスト化を図りながら細胞を大量培養することができる。
【０００９】
上記態様において、細胞は、多能性幹細胞であってもよい。また、条件（Ｉ）における乳酸濃度は、５ｍＭ以下であってもよい。また、条件（ＩＩ）におけるアンモニア濃度は、１ｍＭ以下であってもよい。
【００１０】
本発明の別の態様は、細胞培養装置である。当該細胞培養装置は、細胞および培養液を収容する培養容器と、以下の条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）の少なくとも一方を満たすように培養液を調整する調整部と、を備える。
条件（Ｉ）：培養液中の乳酸濃度が７．５ｍＭ未満である。
条件（ＩＩ）：培養液中のアンモニア濃度が２．５ｍＭ未満である。
【００１１】
上記態様において、調整部は、補充液を貯蔵する貯蔵容器と、貯蔵容器から培養容器へ補充液を送る供給ポンプと、培養液中の乳酸濃度およびアンモニア濃度の少なくとも一方を検知する濃度センサと、濃度センサの検知結果に基づいて供給ポンプを駆動する制御部と、を備えてもよい。また、調整部は、物質交換膜および成分調整液を収容し、培養液が供給されることで物質交換膜を介して成分調整液と培養液との間で物質交換を行う物質交換器と、培養容器と物質交換器との間で培養液を循環させる循環ポンプと、培養液中の乳酸濃度およびアンモニア濃度の少なくとも一方を検知する濃度センサと、濃度センサの検知結果に基づいて循環ポンプを駆動する制御部と、を備えてもよい。また、調整部は、培養液中の乳酸およびアンモニアの少なくとも一方を吸着する吸着剤を備えてもよい。
【００１２】
なお、以上の構成要素の任意の組み合わせや、本発明の構成要素や表現を方法、装置、システムなどの間で相互に置換したものもまた、本発明の態様として有効である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、低コスト化を図りながら細胞を大量培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施の形態１に係る細胞培養装置の模式図である。
【図２】実施の形態２に係る細胞培養装置の模式図である。
【図３】実施の形態３に係る細胞培養装置の模式図である。
【図４】実施の形態４に係る細胞培養装置の模式図である。
【図５】乳酸濃度と細胞密度との関係を示す図である。
【図６】乳酸添加培地で培養した細胞の光学顕微鏡画像である。
【図７】乳酸濃度と遺伝子発現量との関係を示す図である。
【図８】アンモニア濃度と細胞密度との関係を示す図である。
【図９】アンモニア添加培地で培養した細胞の光学顕微鏡画像である。
【図１０】アンモニア濃度と遺伝子発現量との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を好適な実施の形態をもとに図面を参照しながら説明する。実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。各図面に示される同一又は同等の構成要素、部材、処理には、同一の符号を付するものとし、適宜重複した説明は省略する。また、各図に示す各部の縮尺や形状は、説明を容易にするために便宜的に設定されており、特に言及がない限り限定的に解釈されるものではない。また、本明細書または請求項中に「第１」、「第２」等の用語が用いられる場合には、この用語はいかなる順序や重要度を表すものでもなく、ある構成と他の構成とを区別するためのものである。また、各図面において実施の形態を説明する上で重要ではない部材の一部は省略して表示する。
【００１６】
本発明者は、代表的な老廃物である乳酸およびアンモニアが細胞に与える影響について鋭意検討を重ね、細胞が悪影響を受ける乳酸濃度およびアンモニア濃度を見出した。また、さらに詳細な検討を重ねた結果、細胞が多能性幹細胞である場合、乳酸およびアンモニアが細胞の増殖と未分化状態とのそれぞれに、異なる濃度で影響を与えることを見出した。
【００１７】
（実施の形態１）
本実施の形態に係る細胞培養方法は、以下の条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）の少なくとも一方を満たす培養液中で細胞を培養する工程を含む。
条件（Ｉ）：培養液中の乳酸濃度が７．５ｍＭ（７．５×１０−３ｍｏｌ／Ｌ）未満である。
条件（ＩＩ）：培養液中のアンモニア濃度が２．５ｍＭ未満である。
【００１８】
培養液に乳酸が含まれる場合、乳酸濃度が７．５ｍＭ未満であるとき、細胞の増殖が阻害されることを抑制することができる。また、乳酸による培養液のｐＨ低下によって細胞の増殖が阻害されることも、抑制することができる。また、乳酸濃度が１０ｍＭ未満であるとき、細胞を未分化状態に維持することができる。したがって、条件（Ｉ）を満たす培養液を用いて細胞を培養することで、細胞の増殖と未分化状態との両方について、乳酸から受ける影響を低減することができる。
【００１９】
培養液にアンモニアが含まれる場合、アンモニア濃度が１０ｍＭ未満であるとき、細胞の増殖が阻害されることを抑制することができる。また、アンモニア濃度が２．５ｍＭ未満であるとき、細胞を未分化状態に維持することができる。したがって、条件（ＩＩ）を満たす培養液を用いて細胞を培養することで、細胞の増殖と未分化状態との両方について、アンモニアから受ける影響を低減することができる。
【００２０】
好ましくは、条件（Ｉ）における乳酸濃度は、５ｍＭ以下である。これにより、乳酸によって細胞の増殖が阻害されることを、より抑制することができる。また、好ましくは、条件（ＩＩ）におけるアンモニア濃度は、１ｍＭ以下である。これにより、細胞の未分化状態をより維持することができる。
【００２１】
培養液で培養される細胞は、例えばヒトｉＰＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトＭｕｓｅ細胞等の多能性幹細胞；間葉系幹細胞（ＭＳＣ細胞）、ネフロン前駆細胞等の体性幹細胞；ヒト近位尿細管上皮細胞、ヒト遠位尿細管上皮細胞、ヒト集合管上皮細胞等の組織細胞；ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）等の抗体産生細胞株；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（ＳＦ９細胞）等のヒト以外の動物由来の抗体産生細胞株等が挙げられる。好ましくは、細胞は、多能性幹細胞である。
【００２２】
細胞は、浮遊培養することが好ましい。浮遊培養用の培養容器としては、スピナーフラスコ、大型ステンレス培養槽、細胞培養ボトル、細胞培養バッグ等を用いることができる。培養液は、培養する細胞に応じて適宜選択することができる。
【００２３】
（細胞培養装置）
続いて、本実施の形態に係る細胞培養装置について説明する。図１は、実施の形態１に係る細胞培養装置の模式図である。細胞培養装置１は、培養容器２と、調整部６と、を主な構成として備える。培養容器２は、細胞８および培養液１０を収容するバイオリアクターである。調整部６は、上述の条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）の少なくとも一方を満たすように培養液１０を調整する。本実施の形態の調整部６は、貯蔵容器１２と、供給ポンプ１４と、濃度センサ４と、制御部１６と、を備える。
【００２４】
貯蔵容器１２は、補充液１８を貯蔵する。補充液１８は、培養容器２中の培養液１０と同一であってもよいし、培養液１０を濃縮した高濃度培養液であってもよい。また、補充液１８は、細胞８の種類に応じて成分を調合した、培地以外の溶液であってもよい。
【００２５】
貯蔵容器１２と培養容器２とは、供給管２０で連結される。供給管２０の途中には、供給ポンプ１４が接続される。供給ポンプ１４としては、ペリスタポンプやダイヤフラムポンプ等の、公知のポンプを用いることができる。
【００２６】
濃度センサ４は、培養液１０中の乳酸濃度およびアンモニア濃度の少なくとも一方を検知する。濃度センサ４としては、培地成分アナライザー等の公知のセンサを用いることができる。また、乳酸濃度およびアンモニア濃度の検出方法は、所定の測定試薬を用いた比色法、酵素の基質特異性を利用する酵素電極法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の公知の方法を採用することができる。濃度センサ４と培養容器２とは、サンプリング管５で連結される。培養容器２中の培養液１０は、サンプリング管５を介して濃度センサ４に採取される。サンプリング管５における培養容器２に接続される側の端部には、図示しないフィルタが設けられる。これにより、細胞８がサンプリング管５内に吸い込まれることが抑制される。濃度センサ４は、所定間隔で培養液１０をサンプリングし、成分測定を実施する。例えば、サンプリング管５には電磁弁５ａが設けられる。制御部１６によって電磁弁５ａの開閉が制御されることで、濃度センサ４への培養液１０の流入と遮断とが切り替えられる。
【００２７】
制御部１６は、濃度センサ４の検知結果に基づいて、供給ポンプ１４を駆動する。具体的には、濃度センサ４が乳酸濃度を検知する場合、条件（Ｉ）を満たすように供給ポンプ１４を制御する。濃度センサ４がアンモニア濃度を検知する場合、条件（ＩＩ）を満たすように供給ポンプ１４を制御する。濃度センサ４が両方の濃度を検知する場合、条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）を満たすように供給ポンプ１４を制御する。なお、濃度センサ４が両方の濃度を検知する場合であっても、制御部１６は、いずれか一方の条件のみを満たすように供給ポンプ１４を制御してもよい。
【００２８】
制御部１６は、ハードウェア構成としてはコンピュータのＣＰＵやメモリをはじめとする素子や回路で実現され、ソフトウェア構成としてはコンピュータプログラム等によって実現されるが、図１では適宜、それらの連携によって実現される機能ブロックとして描いている。この機能ブロックはハードウェア、ソフトウェアの組合せによっていろいろなかたちで実現できることは、当業者には理解されるところである。
【００２９】
制御部１６によって供給ポンプ１４が駆動されると、供給管２０を介して貯蔵容器１２から培養容器２へ補充液１８が送られる。これにより、貯蔵容器１２中の補充液１８が培養容器２に充填される。培養容器２中の培養液１０には、細胞８から排出された乳酸やアンモニアが蓄積している。一方、補充液１８は、培養液１０よりも乳酸濃度およびアンモニア濃度が低い溶液である。好ましくは、補充液１８は、乳酸およびアンモニアを含有しない。このため、補充液１８が培養液１０に添加されることで、培養液１０における乳酸濃度およびアンモニア濃度が低下する。また、細胞８の培養に必要なグルコースやタンパク質等の培地成分が培養液１０に補充される。
【００３０】
制御部１６は、濃度センサ４の検知結果に基づいて、培養液１０が条件（Ｉ）および／または条件（ＩＩ）を満たすように供給ポンプ１４をフィードバック制御する。具体的には、制御部１６は、所定のタイミングで繰り返し濃度センサ４の検知結果を受領する。制御部１６は、条件（Ｉ）を満たすように培養液１０を調整する場合、濃度センサ４の検知結果に基づいて、培養液１０中の乳酸濃度が７．５ｍＭ未満であるか判断する。制御部１６は、乳酸濃度が７．５ｍＭ以上であると供給ポンプ１４を駆動させる。そして、乳酸濃度が７．５ｍＭ未満となったときに供給ポンプ１４の駆動を停止する。
【００３１】
好ましくは、しきい値である７．５ｍＭに所定のマージンを設けた濃度範囲が定められる。そして、制御部１６は、この濃度範囲を上回ったときに供給ポンプ１４を駆動し、この濃度範囲を下回ったときに供給ポンプ１４を停止させる。より好ましくは、濃度範囲は上限が７．５ｍＭとなるように定められる。つまり、制御部１６は、乳酸濃度が７．５ｍＭよりも所定値だけ低い濃度に下がったときに、供給ポンプ１４の駆動を停止する。
【００３２】
また、制御部１６は、条件（ＩＩ）を満たすように培養液１０を調整する場合、濃度センサ４の検知結果に基づいて、培養液１０中のアンモニア濃度が２．５ｍＭ未満であるか判断する。制御部１６は、アンモニア濃度が２．５ｍＭ以上であると供給ポンプ１４を駆動させる。そして、アンモニア濃度が２．５ｍＭ未満となったときに供給ポンプ１４の駆動を停止する。
【００３３】
好ましくは、しきい値である２．５ｍＭに所定のマージンを設けた濃度範囲が定められる。そして、制御部１６は、この濃度範囲を上回ったときに供給ポンプ１４を駆動し、この濃度範囲を下回ったときに供給ポンプ１４を停止させる。より好ましくは、濃度範囲は上限が２．５ｍＭとなるように定められる。つまり、制御部１６は、アンモニア濃度が２．５ｍＭよりも所定値だけ低い濃度に下がったときに、供給ポンプ１４の駆動を停止する。
【００３４】
制御部１６は、条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）の両方を満たすように培養液１０を調整する場合、両方の条件が満たされているとき供給ポンプ１４の駆動を停止し、いずれか一方および両方の条件が満たされていないとき供給ポンプ１４を駆動する。
【００３５】
培養容器２は、排出管２２を介して、図示しない廃液槽に接続される。排出管２２の途中には、排出ポンプ２４が接続される。排出ポンプ２４としては、供給ポンプ１４と同様に公知のポンプを用いることができる。制御部１６は、排出ポンプ２４の駆動も制御する。制御部１６は、供給ポンプ１４の駆動に伴って排出ポンプ２４を駆動させる。排出ポンプ２４の駆動により、培養容器２中の培養液１０が排出管２２を介して廃液槽に送り出される。これにより、培養容器２中の液量を一定に保つことができる。排出管２２における培養容器２に接続される側の端部には、図示しないフィルタが設けられる。これにより、細胞８が排出管２２内に吸い込まれることが抑制される。排出管２２は、サンプリング管５として利用することもできる。この場合、濃度センサ４は、排出管２２を介して培養液１０を採取する。
【００３６】
以上説明したように、本実施の形態に係る細胞培養方法は、以下の条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）の少なくとも一方を満たす培養液１０中で細胞を培養する工程を含む。
条件（Ｉ）：培養液１０中の乳酸濃度が７．５ｍＭ未満である。
条件（ＩＩ）：培養液１０中のアンモニア濃度が２．５ｍＭ未満である。
【００３７】
また、本実施の形態に係る細胞培養装置１は、細胞８および培養液１０を収容する培養容器２と、上述の条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）の少なくとも一方を満たすように培養液１０を調整する調整部６と、を備える。
【００３８】
条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）の少なくとも一方を満たすように培養液１０を調整することで、乳酸およびアンモニアの少なくとも一方が細胞に与える悪影響を軽減することができる。これにより、細胞８を高密度に大量培養することができる。また、条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）の両方を満たすように培養液１０を調整することで、乳酸およびアンモニアの両方が細胞に与える悪影響を軽減することができる。これにより、より確実に細胞８を高密度に大量培養することができる。
【００３９】
また、本実施の形態では、乳酸およびアンモニアのそれぞれについて細胞８が影響を受ける濃度を特定し、この値をモニタリングして培養液１０を調整している。これにより、従来の細胞培養装置のように闇雲に培養液を透析する場合に比べて、成分調整液や培養液の消費量を減らすことができる。これにより、低コスト化を図ることができる。したがって、本実施の形態によれば、低コスト化を図りながら細胞８を大量培養することができる。
【００４０】
また、細胞８が多能性幹細胞である場合には、乳酸濃度および／またはアンモニア濃度の低減によって細胞８の高密度大量培養が可能となることに加え、細胞８が未分化の状態、つまり細胞８の多分化能（分化多能性）を維持することができる。よって、分化誘導組織作製に好適な細胞８を大量に得ることができる。このように、状態の均一な細胞集団を得ることができ、分化誘導効率の低下を抑制することができるため、細胞医薬品製造や再生医療に要するコストを削減することができる。
【００４１】
また、本実施の形態の細胞培養装置１において、調整部６は、補充液１８を貯蔵する貯蔵容器１２と、貯蔵容器１２から培養容器２へ補充液１８を送る供給ポンプ１４と、培養液１０中の乳酸濃度およびアンモニア濃度の少なくとも一方を検知する濃度センサ４と、濃度センサ４の検知結果に基づいて、供給ポンプ１４を駆動する制御部１６と、を備える。補充液１８を培養液１０に添加することで、培養液１０中の乳酸濃度およびアンモニア濃度を低減することができる。また、制御部１６は、供給ポンプ１４とともに排出ポンプ２４も駆動して、培養容器２から培養液１０を排出する。つまり、本実施の形態では、古い培地を除去しながら新鮮な培地を添加する連続培養によって、老廃物濃度の上昇を抑制している。
【００４２】
（実施の形態２）
実施の形態２は、細胞培養装置の構造が異なる点を除き、実施の形態１と共通の構成を有する。以下、本実施の形態について実施の形態１と異なる構成を中心に説明し、共通する構成については簡単に説明するか、あるいは説明を省略する。図２は、実施の形態２に係る細胞培養装置の模式図である。
【００４３】
本実施の形態に係る細胞培養装置１は、培養容器２と、調整部６と、を主な構成として備える。培養容器２には、細胞８および培養液１０が収容される。調整部６は、上述の条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）の少なくとも一方を満たすように培養液１０を調整する。本実施の形態の調整部６は、貯蔵容器１２と、供給ポンプ１４と、濃度センサ４と、制御部１６と、を備える。
【００４４】
貯蔵容器１２は、補充液１８を貯蔵する。貯蔵容器１２と培養容器２とは、供給管２０で連結される。供給管２０の途中には、供給ポンプ１４が接続される。濃度センサ４は、培養液１０中の乳酸濃度およびアンモニア濃度の少なくとも一方を検知する。制御部１６は、濃度センサ４の検知結果に基づいて、供給ポンプ１４を駆動する。制御部１６によって供給ポンプ１４が駆動されると、供給管２０を介して貯蔵容器１２から培養容器２へ補充液１８が送られる。これにより、貯蔵容器１２中の補充液１８が培養容器２に充填される。制御部１６による供給ポンプ１４の駆動タイミングは、実施の形態１と同様である。
【００４５】
実施の形態１とは異なり、本実施の形態の細胞培養装置１は、排出管２２および排出ポンプ２４を有しない。したがって、培養容器２中の液量は徐々に増加していく。つまり、本実施の形態では、培養容器２に補充液１８を供給し続ける流加培養によって、老廃物濃度の上昇を抑制している。この構成では、培養期間の経過に伴って細胞数と培養容器２中の培養液量との両方が増加していく。このため、培養液１０における細胞密度を一定に保つことができる。なお、培養容器２は、細胞８の培養期間、培養開始時に培養容器２に収容される培養液１０の量、補充液１８の添加量等を考慮して設定される。本実施の形態によっても、実施の形態１と同様の効果を奏することができる。
【００４６】
（実施の形態３）
実施の形態３は、細胞培養装置の構造が異なる点を除き、実施の形態１と共通の構成を有する。以下、本実施の形態について実施の形態１と異なる構成を中心に説明し、共通する構成については簡単に説明するか、あるいは説明を省略する。図３は、実施の形態３に係る細胞培養装置の模式図である。
【００４７】
本実施の形態に係る細胞培養装置１は、培養容器２と、調整部６と、を主な構成として備える。培養容器２には、細胞８および培養液１０が収容される。調整部６は、上述の条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）の少なくとも一方を満たすように培養液１０を調整する。本実施の形態の調整部６は、物質交換器２６と、循環ポンプ２８と、濃度センサ４と、制御部１６と、を備える。
【００４８】
物質交換器２６は、物質交換膜３０および成分調整液３２を収容する。そして、物質交換器２６は、培養容器２の培養液１０が供給されることで物質交換膜３０を介して成分調整液３２と培養液１０との間で物質交換を行う。物質交換膜３０は、中空糸等の公知の物質交換膜を用いることができる。成分調整液３２は、補充液１８と同様に、培養容器２中の培養液１０と同一であってもよいし、培養液１０を濃縮した高濃度培養液であってもよい。また、細胞８の種類に応じて成分を調合した、培地以外の溶液であってもよい。
【００４９】
培養容器２と物質交換器２６とは、循環路３４で連結される。循環路３４は、一端が培養容器２に接続され、他端が物質交換器２６に接続される往路部３４ａと、一端が物質交換器２６に接続され、他端が培養容器２に接続される復路部３４ｂとを含む。往路部３４ａおよび復路部３４ｂの物質交換器２６側の端部は、物質交換膜３０で連結される。物質交換膜３０は、成分調整液３２に浸漬されている。
【００５０】
循環ポンプ２８は、培養容器２と物質交換器２６との間で培養液１０を循環させる。具体的には、循環ポンプ２８は、第１ポンプ２８ａと第２ポンプ２８ｂとを有する。第１ポンプ２８ａは、往路部３４ａの途中に接続され、培養液１０を培養容器２から物質交換器２６の物質交換膜３０に送る。第２ポンプ２８ｂは、復路部３４ｂの途中に接続され、培養液１０を物質交換膜３０から培養容器２に送る。
【００５１】
濃度センサ４は、培養液１０中の乳酸濃度およびアンモニア濃度の少なくとも一方を検知する。制御部１６は、濃度センサ４の検知結果に基づいて、循環ポンプ２８を駆動する。制御部１６によって循環ポンプ２８が駆動されると、循環路３４を介して培養容器２と物質交換器２６との間で培養液１０が循環する。この過程で、物質交換膜３０を介して培養液１０と成分調整液３２との間の物質交換が行われる。この結果、培養液１０中の乳酸およびアンモニアは成分調整液３２に移動し、成分調整液３２中のグルコースやタンパク質等の培地成分は培養液１０に移動する。制御部１６による循環ポンプ２８の駆動タイミングは、実施の形態１における供給ポンプ１４の駆動タイミングと同様である。
【００５２】
この結果、培養液１０における乳酸濃度およびアンモニア濃度が低下する。また、細胞８の培養に必要なグルコースやタンパク質等の培地成分が培養液１０に補充される。なお、往路部３４ａにおける培養容器２に接続される側の端部には、図示しないフィルタが設けられる。これにより、細胞８が排出管２２内に吸い込まれることが抑制される。また、物質交換器２６には、老廃物の吸着剤を投入してもよい。これにより、物質交換に必要な成分調整液３２の量を減らすことができる。吸着剤としては、乳酸およびアンモニアの少なくとも一方を吸着可能な、シリカ、活性炭等の公知の吸着剤を用いることができる。
【００５３】
つまり、本実施の形態では、培養容器２から物質交換器２６中の物質交換膜３０に培養液１０を流して物質交換処理を施し、物質交換器２６の成分調整液３２中に老廃物を排出することで、老廃物濃度の上昇を抑制している。本実施の形態によっても、実施の形態１と同様の効果を奏することができる。
【００５４】
（実施の形態４）
実施の形態４は、細胞培養装置の構造が異なる点を除き、実施の形態１と共通の構成を有する。以下、本実施の形態について実施の形態１と異なる構成を中心に説明し、共通する構成については簡単に説明するか、あるいは説明を省略する。図４は、実施の形態４に係る細胞培養装置の模式図である。
【００５５】
本実施の形態に係る細胞培養装置１は、培養容器２と、調整部６と、を備える。培養容器２には、細胞８および培養液１０が収容される。調整部６は、上述の条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）の少なくとも一方を満たすように培養液１０を調整する。本実施の形態の調整部６は、吸着剤３６を備える。
【００５６】
吸着剤３６としては、シリカ、活性炭等の公知の吸着剤を用いることができる。吸着剤３６は、乳酸とアンモニアの両方を吸着する単一種類の吸着剤であってもよいし、乳酸を吸着する第１の吸着剤とアンモニアを吸着する第２の吸着剤との混合物であってもよい。培養液１０に吸着剤３６を接触させることで、上述の条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）の少なくとも一方を満たすように培養液１０が調整される。条件（Ｉ）および／または条件（ＩＩ）を満たすために要する吸着剤３６の量は、当業者が適宜設定することができる。なお、吸着剤３６は細胞８に対する毒性が低いものを選択することが好ましい。
【００５７】
吸着剤３６は、例えば粒子状であり、培養容器２に収容される。吸着剤３６は、培養容器２内で、培養液１０中に分散、沈降あるいは浮遊している。この場合、培養液１０は、細胞８に貪食されることを防ぐために、所定サイズ以上、例えば１０μｍ以上の大きさであることが好ましい。培養液１０が吸着剤３６に接触することで、培養液１０中の乳酸および／またはアンモニアが吸着剤３６に吸着する。これにより、培養液１０中の乳酸濃度および／またはアンモニア濃度が低減され、条件（Ｉ）および／または条件（ＩＩ）が満たされる。したがって、本実施の形態によっても、実施の形態１と同様の効果を奏することができる。
【００５８】
調整部６は、培養容器２と接続される図示しない吸着カラムに吸着剤３６が充填された構造を有してもよい。この場合、培養容器２中の培養液１０は、吸着カラムに送られて吸着剤３６に接触させられる。あるいは、調整部６は、培養容器２の内壁面に吸着剤３６が支持された構造を有してもよい。培養容器２の内壁面に吸着剤３６を支持させる方法としては、例えば、吸着剤３６を培養容器２の内壁面に接着させる方法や、培養容器２が樹脂製である場合には、予め吸着剤３６を混合した樹脂で培養容器２を成形する方法が挙げられる。
【００５９】
あるいは、調整部６は、培養容器２の内部が多孔質膜等の隔膜によって上段と下段に区切られ、上段に培養液１０と細胞８が収容され、下段に培養液１０と吸着剤３６が収容された構造を有してもよい。培養液１０は、隔膜を通過して上段と下段との間を行き来することができる。一方、細胞８および吸着剤３６は、隔膜を通過することができない。培養液１０が下段に収容された吸着剤３６に接触することで、培養液１０中の乳酸および／またはアンモニアを吸着剤３６に吸着させることができる。
【００６０】
また、好ましくは吸着剤３６は、ポリビニルアルコールやアルギン酸等の樹脂、コラーゲンやゼラチン等の生体由来ゲル等で被覆される。これにより、細胞８等に影響を与え得る微粒子が吸着剤３６から培養液中に流出することを抑制することができる。あるいは、吸着剤３６は、セラミックスバインダー、樹脂バインダー、生体由来ゲル等と、吸着成分とを混練して成形される。これによっても、微粒子の流出を抑制することができる。セラミックスバインダーとしては、アルミナバインダー、コロイダルシリカ等が例示される。樹脂バインダーとしては、アルギン酸、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース等が例示される。生体由来ゲルとしては、コラーゲン、ゼラチン等が例示される。
【００６１】
以上、本発明の実施の形態について詳細に説明した。前述した実施の形態は、本発明を実施するにあたっての具体例を示したものにすぎない。実施の形態の内容は、本発明の技術的範囲を限定するものではなく、請求の範囲に規定された発明の思想を逸脱しない範囲において、構成要素の変更、追加、削除等の多くの設計変更が可能である。設計変更が加えられた新たな実施の形態は、組み合わされる実施の形態および変形それぞれの効果をあわせもつ。前述の実施の形態では、このような設計変更が可能な内容に関して、「本実施の形態の」、「本実施の形態では」等の表記を付して強調しているが、そのような表記のない内容でも設計変更が許容される。以上の構成要素の任意の組み合わせも、本発明の態様として有効である。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明の実施例を説明するが、実施例は本発明を好適に説明するための例示に過ぎず、なんら本発明を限定するものではない。
【００６３】
［細胞増殖に影響を与える乳酸濃度の特定］
２４ウェルプレート（Corning cellBIND surface：Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に、ヒト多能性幹細胞を１×１０３個播種し、多能性幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ：味の素社）を添加して培養した。なお、培養２４時間までの培地には、培養基質（ｉＭａｔｒｉｘ−５１１：ニッピ社)を濃度０．５μｇ／ｍｌとなるように添加し、またＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２：富士フイルム和光純薬社）を濃度１０μＭとなるように添加した。また、培養２４時間以降の培地には、乳酸（富士フイルム和光純薬社）を各種の乳酸濃度となるように添加した。乳酸濃度は、０ｍＭ、２．５ｍＭ、５．０ｍＭ、７．５ｍＭ、１０．０ｍＭ、１５．０ｍＭとした。
【００６４】
乳酸の添加により培地のｐＨは低下する。そこで、培地のｐＨを７．２に補正した実験区と、未補正の実験区とを用意した。未補正の実験区において、乳酸濃度５．０ｍＭの培地ではｐＨ６．９、乳酸濃度７．５ｍＭの培地ではｐＨ６．８、乳酸濃度１０ｍＭの培地ではｐＨ６．７、乳酸濃度１５ｍＭの培地ではｐＨ６．５であった。
【００６５】
毎日培地交換して４日間培養した（したがって全培養期間は５日間）。培養５日経過後に、各ウェルにおける細胞数をＴＣ２０全自動セルカウンター（バイオラッド社）を用いて測定し、細胞密度を算出した。結果を図５に示す。図５は、乳酸濃度と細胞密度との関係を示す図である。
【００６６】
図５に示すように、ｐＨ補正の有無にかかわらず、乳酸濃度が７．５ｍＭ以上になると細胞密度の著しい低下が見られた。また、ｐＨ補正を施した実験区では、乳酸濃度１５ｍＭで、乳酸濃度０ｍＭに対して細胞密度が半減した。一方、ｐＨ補正を施さなかった実験区では、乳酸濃度１０ｍＭ以上で、ｐＨ補正ありの乳酸濃度１５ｍＭでの細胞密度を下回る程に著しく細胞密度が低下した。このことから、乳酸は、それ自体が細胞増殖を阻害するとともに、ｐＨ低下を引き起こすことでも細胞増殖を阻害することが確認された。
【００６７】
以上より、細胞の増殖が阻害されることを抑制するためには、乳酸濃度を７．５ｍＭ未満に維持することが有効であることが確認された。また、乳酸濃度を５ｍＭ以下に維持することで、乳酸による細胞の増殖阻害をより確実に抑制できることが確認された。
【００６８】
［細胞の未分化状態に影響を与える乳酸濃度の特定］
２４ウェルプレート（Corning cellBIND surface：Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に、多能性幹細胞を１×１０３個播種し、多能性幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ：味の素社）を添加して培養した。なお、培養２４時間までの培地には、培養基質（ｉＭａｔｒｉｘ−５１１：ニッピ社)を濃度０．５μｇ／ｍｌとなるように添加し、またＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２：富士フイルム和光純薬社）を濃度１０μＭとなるように添加した。また、培養２４時間以降の培地には、乳酸（富士フイルム和光純薬社）を各種の乳酸濃度となるように添加した。乳酸濃度は、０ｍＭ、１．０ｍＭ、２．５ｍＭ、５．０ｍＭ、７．５ｍＭ、１０．０ｍＭ、１５．０ｍＭとした。
【００６９】
毎日培地交換して４日間培養した（したがって全培養期間は５日間）。培養５日経過後の各細胞の様子を光学顕微鏡で観察した。図６は、乳酸添加培地で培養した細胞の光学顕微鏡画像である。図６に示すように、乳酸濃度が１０ｍＭ以上になると、細胞のコロニーが著しく小さくなり、細胞の増殖阻害が確認された。
【００７０】
また、RNeasy Mini Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、培養６日経過後の各細胞からｍＲＮＡを抽出し、精製した。続いて、QuantiTect Reverse Transcription Kit t（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、精製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。これらのｃＤＮＡを鋳型とし、Thermal Cycler Dice Real Time System I（タカラバイオ社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ法にてＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｔ、Ｐａｘ６およびＦｏｘ２の各遺伝子の発現量を測定した。
【００７１】
Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇは、多能性幹細胞の性質を維持していることを示す未分化マーカーである。Ｔ、Ｐａｘ６およびＦｏｘ２は、多能性幹細胞の性質を維持していないこと、つまり多能性幹細胞が分化していることを示す分化マーカーである。具体的には、Ｔ遺伝子の発現は細胞が中胚葉に分化していることを示し、Ｐａｘ６の発現は細胞が外胚葉に分化していることを示し、Ｆｏｘ２の発現は細胞が内胚葉に分化していることを示す。
【００７２】
各乳酸濃度における各遺伝子の発現量について、乳酸濃度０ｍＭでの発現量に対する比率を算出した。結果を図７に示す。図７は、乳酸濃度と遺伝子発現量との関係を示す図である。図７に示すように、乳酸濃度１０ｍＭにおいて、中胚葉分化マーカーであるＴ遺伝子の発現量が乳酸濃度０ｍＭに対して１０倍以上に増加した。このことから、細胞の未分化状態を維持するためには、乳酸濃度を１０ｍＭ未満に維持することが有効であることが確認された。
【００７３】
［細胞増殖に影響を与えるアンモニア濃度の特定］
２４ウェルプレート（Corning cellBIND surface：Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に、ヒト多能性幹細胞を１×１０３個播種し、多能性幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ：味の素社）を添加して培養した。なお、培養２４時間までの培地には、培養基質（ｉＭａｔｒｉｘ−５１１：ニッピ社)を濃度０．５μｇ／ｍｌとなるように添加し、またＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２：富士フイルム和光純薬社）を濃度１０μＭとなるように添加した。また、培養２４時間以降の培地には、塩化アンモニウム（富士フイルム和光純薬社）を各種のアンモニア（アンモニウムイオン）濃度となるように添加した。アンモニア濃度は、０ｍＭ、７．５ｍＭ、１０．０ｍＭ、１５．０ｍＭ、２５．０ｍＭとした。
【００７４】
毎日培地交換して４日間培養した（したがって全培養期間は５日間）。培養５日経過後に、各ウェルにおける細胞数をＴＣ２０全自動セルカウンター（バイオラッド社）を用いて測定し、細胞密度を算出した。結果を図８に示す。図８は、アンモニア濃度と細胞密度との関係を示す図である。
【００７５】
図８に示すように、アンモニア濃度が１０．０ｍＭ以上になると細胞密度の著しい低下が見られた。このことから、細胞の増殖が阻害されることを抑制するためには、アンモニア濃度を１０ｍＭ未満に維持することが有効であることが確認された。また、アンモニア濃度を７．５ｍＭ以下に維持することで、アンモニアによる細胞の増殖阻害をより確実に抑制できることが確認された。
【００７６】
［細胞の未分化状態に影響を与えるアンモニア濃度の特定］
２４ウェルプレート（Corning cellBIND surface：Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に、多能性幹細胞を１×１０３個播種し、多能性幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ：味の素社）を添加して培養した。なお、培養２４時間までの培地には、培養基質（ｉＭａｔｒｉｘ−５１１：ニッピ社)を濃度０．５μｇ／ｍｌとなるように添加し、またＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２：富士フイルム和光純薬社）を濃度１０μＭとなるように添加した。また、培養２４時間以降の培地には、塩化アンモニウム（富士フイルム和光純薬社）を各種のアンモニア濃度となるように添加した。アンモニア濃度は、０ｍＭ、０．１ｍＭ、１．０ｍＭ、２．５ｍＭ、５．０ｍＭ、７．５ｍＭ、１０．０ｍＭ、２０．０ｍＭとした。
【００７７】
毎日培地交換して４日間培養した（したがって全培養期間は５日間）。培養５日経過後の各細胞の様子を光学顕微鏡で観察した。図９は、アンモニア添加培地で培養した細胞の光学顕微鏡画像である。図９に示すように、アンモニア濃度が２．５ｍＭ以上になると、細胞の形態変化が見られた。
【００７８】
また、RNeasy Mini Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、培養６日経過後の各細胞からｍＲＮＡを抽出し、精製した。続いて、QuantiTect Reverse Transcription Kit t（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、精製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。これらのｃＤＮＡを鋳型とし、Thermal Cycler Dice Real Time System I（タカラバイオ社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ法にてＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｔ、Ｐａｘ６およびＦｏｘ２の各遺伝子の発現量を測定した。
【００７９】
各アンモニア濃度における各遺伝子の発現量について、アンモニア濃度０ｍＭでの発現量に対する比率を算出した。結果を図１０に示す。図１０は、アンモニア濃度と遺伝子発現量との関係を示す図である。図１０に示すように、アンモニア濃度２．５ｍＭにおいて、中胚葉分化マーカーであるＴ遺伝子の発現量、および外胚葉分化マーカーであるＰａｘ６遺伝子の発現量が、アンモニア濃度０ｍＭに対して１０倍近くまで増加した。このことから、細胞の未分化状態を維持するためには、アンモニア濃度を２．５ｍＭ未満に維持することが有効であることが確認された。また、アンモニア濃度を１ｍＭ以下に維持することで、アンモニアによる細胞の分化促進をより確実に抑制できることが確認された。
【００８０】
以上より、多能性幹細胞を未分化の状態で増殖させるためには、培地中の乳酸濃度を７．５ｍＭ未満に維持し、アンモニア濃度を２．５ｍＭ未満に維持する必要があることが確認された。
【符号の説明】
【００８１】
１  細胞培養装置、  ２  培養容器、  ４  濃度センサ、  ６  調整部、  ８  細胞、  １０  培養液、  １２  貯蔵容器、  １４  供給ポンプ、  １６  制御部、  １８  補充液、  ２６  物質交換器、  ２８  循環ポンプ、  ３０  物質交換膜、  ３２  成分調整液、  ３６  吸着剤。
【図１】
2020028245.tif 000003
【図２】
2020028245.tif 000004
【図３】
2020028245.tif 000005
【図４】
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【図５】
2020028245.tif 000007
【図６】
2020028245.tif 000008
【図７】
2020028245.tif 000009
【図８】
2020028245.tif 000010
【図９】
2020028245.tif 000011
【図１０】
2020028245.tif 000012