(57)【要約】【課題】木質系及び草本系のバイオマスを迅速、効率的、及び安価に分解して糖化しうる酵素を産生する新規な糸状菌、並びにこの糸状菌を用いたバイオマスの糖化方法を提供する。【解決手段】セルロース糖化活性及びヘミセルロース糖化活性を有する酵素を産生する、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１０にて特定されるクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）属に属するＹＴ１５４株である糸状菌の提供による。また、木質系及び草本系の少なくともいずれかのバイオマスと、この糸状菌及びその分泌物の少なくともいずれかを含有する糖化活性成分とを接触させる工程を有するバイオマスの糖化方法の提供による。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース糖化活性及びヘミセルロース糖化活性を有する酵素を産生する、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１０にて特定されるクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）属に属するＹＴ１５４株である糸状菌。
【請求項２】
配列番号１に記載の塩基配列に対して９９％以上の相同性を有する塩基配列からなるＩＴＳ−５．８Ｓ  ｒＤＮＡ領域を有する請求項１に記載の糸状菌。
【請求項３】
木質系及び草本系の少なくともいずれかのバイオマスと、前記バイオマスを糖化する糖化活性成分と、を接触させる工程を有し、
前記糖化活性成分が、請求項１又は２に記載の糸状菌及びその分泌物の少なくともいずれかを含有するバイオマスの糖化方法。
【請求項４】
前記糖化活性成分が、第２の糸状菌及びその分泌物の少なくともいずれかをさらに含有し、
前記第２の糸状菌が、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２２１にて特定されるペニシリウム・オキサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ）ＳＡ５７−２株である請求項３に記載のバイオマスの糖化方法。
【請求項５】
化学的な前処理及び高温高圧の水による前処理のいずれも行っていない前記バイオマスを前記糖化活性成分と接触させる請求項３又は４に記載のバイオマスの糖化方法。
【請求項６】
アンモニア水で前処理した前記バイオマスを前記糖化活性成分と接触させる請求項３又は４に記載のバイオマスの糖化方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の糸状菌及びその分泌物の少なくともいずれかを含有するバイオマスの処理剤。
【請求項８】
第２の糸状菌及びその分泌物の少なくともいずれかをさらに含有し、
前記第２の糸状菌が、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２２１にて特定されるペニシリウム・オキサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ）ＳＡ５７−２株である請求項７に記載のバイオマスの処理剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な糸状菌、及びそれを用いたバイオマスの糖化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化防止の観点から、二酸化炭素排出量の削減が求められている。生物由来の資源であるバイオマスを利用するバイオ資源は非化石燃料であり、これを燃焼しても、大気中の二酸化炭素量は実質的に増加しないものとして取り扱われる、いわゆるカーボンニュートラル効果を得ることができる。
【０００３】
従来、バイオエタノールなどのバイオ燃料の原料として、トウモロコシやサトウキビなどの農作物（第１世代バイオマス）が用いられている。しかし、第１世代バイオマスは食糧としても利用されることから、バイオ燃料の原料として大量に消費されると、食糧供給量の減少や食糧価格の高騰などの弊害が生ずる。そこで、近年、食糧とは競合しない木質系及び草本系のバイオマス（第２世代バイオマス）をバイオ燃料の原料として利用するための研究及び開発が進められている。
【０００４】
木質系及び草本系のバイオマスはセルロースを含むので、このセルロースを酵素糖化してグルコースに分解し、さらにグルコースを発酵させることでバイオエタノールを得ることができる。しかし、セルロースを単糖であるグルコースにまで酵素糖化する効率は非常に低いため、木質系及び草本系のバイオマスをバイオ燃料の原料として用いる場合には、酸やアルカリによる化学的処理、又は水熱処理などの前処理が必要とされている。しかしながら、バイオマスを化学的処理又は水熱処理すると、リグニンを含有する大量の廃液（黒液）が生成する。生成した黒液は焼却処分等せざるを得ないため、エネルギーコストがかかるといった課題がある。また、バイオマスを水熱処理する場合には、やはりエネルギーコストの面で課題がある。
【０００５】
そこで、有効なセルロース糖化活性及びヘミセルロース糖化活性を示す酵素を含む分泌物を産生する糸状菌、及びこの糸状菌やその分泌物を用いる、化学的処理等の前処理を施していないバイオマスを糖化する方法が提案されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第６２０２７１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１で提案された糸状菌は、良好なセルロース糖化活性及びヘミセルロース糖化活性を示す酵素を含む分泌物を産生しうるものであった。但し、糖化効率の面では向上させる余地があり、さらなる改善が求められていた。例えば、ヘミセルロース画分の糖化に際してオリゴ糖が産生すると、糖化速度の低下や糖化反応の停止などの問題が生ずることが懸念される。このため、ヘミセルロース画分の糖化により産生したオリゴ糖を単糖レベルまで速やかに糖化しうる新たな微生物を見出すことで、糖化効率のさらなる向上が期待される。
【０００８】
本発明は、このような従来技術の有する問題点に鑑みてなされたものであり、その課題とするところは、木質系及び草本系のバイオマスを迅速、効率的、及び安価に分解して糖化しうる酵素を産生する新規な糸状菌を提供することにある。また、本発明の課題とするところは、上記の新規な糸状菌を用いたバイオマスの糖化方法、及びバイオマスの処理剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明によれば、以下に示す糸状菌が提供される。
［１］セルロース糖化活性及びヘミセルロース糖化活性を有する酵素を産生する、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１０にて特定されるクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）属に属するＹＴ１５４株である糸状菌。
［２］配列番号１に記載の塩基配列に対して９９％以上の相同性を有する塩基配列からなるＩＴＳ−５．８Ｓ  ｒＤＮＡ領域を有する前記［１］に記載の糸状菌。
【００１０】
また、本発明によれば、以下に示すバイオマスの糖化方法が提供される。
［３］木質系及び草本系の少なくともいずれかのバイオマスと、前記バイオマスを糖化する糖化活性成分と、を接触させる工程を有し、前記糖化活性成分が、前記［１］又は［２］に記載の糸状菌及びその分泌物の少なくともいずれかを含有するバイオマスの糖化方法。
［４］前記糖化活性成分が、第２の糸状菌及びその分泌物の少なくともいずれかをさらに含有し、前記第２の糸状菌が、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２２１にて特定されるペニシリウム・オキサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ）ＳＡ５７−２株である前記［３］に記載のバイオマスの糖化方法。
［５］化学的な前処理及び高温高圧の水による前処理のいずれも行っていない前記バイオマスを前記糖化活性成分と接触させる前記［３］又は［４］に記載のバイオマスの糖化方法。
［６］アンモニア水で前処理した前記バイオマスを前記糖化活性成分と接触させる前記［３］又は［４］に記載のバイオマスの糖化方法。
【００１１】
さらに、本発明によれば、以下に示すバイオマスの処理剤が提供される。
［７］前記［１］又は［２］に記載の糸状菌及びその分泌物の少なくともいずれかを含有するバイオマスの処理剤。
［８］第２の糸状菌及びその分泌物の少なくともいずれかをさらに含有し、前記第２の糸状菌が、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２２１にて特定されるペニシリウム・オキサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ）ＳＡ５７−２株である前記［７］に記載のバイオマスの処理剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、木質系及び草本系のバイオマスを迅速、効率的、及び安価に分解して糖化しうる酵素を産生する新規な糸状菌を提供することができる。また、本発明によれば、上記の新規な糸状菌を用いたバイオマスの糖化方法、及びバイオマスの処理剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＹＴ１５４株の分生子の一形態を示す位相差顕微鏡写真である。
【図２】ＹＴ１５４株の胞子の一形態を示す位相差顕微鏡写真である。
【図３】ＹＴ１５４株の分子系統樹を示す図である。
【図４】至適ｐＨの測定結果を示す図（グラフ）である。
【図５】至適温度の測定結果を示す図（グラフ）である。
【図６】ｐＨ安定性の評価結果を示す図（グラフ）である。
【図７】温度安定性の評価結果を示す図（グラフ）である。
【図８】各基質に対する酵素活性の測定結果を示す図（グラフ）である。
【図９】粉砕処理基質を用いた糖化試験の結果を示す図（グラフ）である。
【図１０】アンモニア処理基質を用いた糖化試験の結果を示す図（グラフ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（糸状菌）
以下、本発明の実施の形態について説明するが、本発明は以下の実施の形態に限定されるものではない。本明細書における「セルロース糖化活性」とは、ポリマーであるセルロースをモノマーであるグルコースに分解する酵素活性をいう。また、「ヘミセルロース糖化活性」とは、ポリマーであるヘミセルロースをモノマーであるキシロース、ガラクトース、アラビノースなどの単糖類に分解する酵素活性をいう。
【００１５】
本発明者らは、稲わらを唯一の炭素源とする培地で生育する微生物のスクリーニングを行った（詳細は後述）。その結果、セルロース糖化活性及びヘミセルロース糖化活性を有する酵素を産生する糸状菌として、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）属に属するＹＴ１５４株を見出した。このＹＴ１５４株は、本発明者らにより、受領日：２０１９年３月６日に受託番号「ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９１０」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託された。
【００１６】
本発明の一実施形態であるクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）属に属するＹＴ１５４株（以下、単に「ＹＴ１５４株」とも記す）は、好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列に対して９９％以上の相同性を有する塩基配列からなるＩＴＳ−５．８Ｓ  ｒＤＮＡ領域を有する。
【００１７】
ＹＴ１５４株は、クラドスポリウム属に属する微生物を培養する公知の方法により培養することができる。培養時のコンタミネーションを防ぐ観点から、木質系又は草本系のバイオマスを唯一の炭素源として用いることが好ましい。液体培地を用いて培養することで、セルロース糖化活性及びヘミセルロース糖化活性を有する酵素を含む分泌物が液体培地中に分泌され、糖化酵素群が蓄積されて液体培地の糖化活性を向上することができるために好ましい。培養液のｐＨは３〜９であることが好ましい。培養温度は１５〜３２℃であることが好ましい。培養方法は、固体培養、静置培養、振盪培養、撹拌培養等、培地の種類に応じて適宜選択すればよい。
【００１８】
（バイオマスの糖化方法）
本発明のバイオマスの糖化方法の一実施形態は、木質系及び草本系の少なくともいずれかのバイオマスと、バイオマスを糖化する糖化活性成分と、を接触させる工程を有する。そして、バイオマスに接触させる糖化活性成分が、前述の糸状菌（ＹＴ１５４株）及びその分泌物の少なくともいずれかを含有する。バイオマスを糖化する糖化活性成分は、例えば、セルロース糖化活性を有する酵素、及びヘミセルロース糖化活性を有する酵素である。前述の通り、セルロース糖化活性及びヘミセルロース糖化活性を有する酵素は、培養液や培養液上清などのＹＴ１５４株の分泌物を含有する組成物に含有されている。したがって、ＹＴ１５４株をバイオマスに直接的に接触させることの他、ＹＴ１５４株の分泌物をバイオマスに接触させることでも、バイオマスに含まれるセルロースやヘミセルロースを糖化し、低分子化することができる。
【００１９】
バイオマス糖化用の既知の酵素や酵素製剤は、セルロース糖化活性及びヘミセルロース糖化活性がさほど強くないため、酸やアルカリによる化学的な前処理や、高温高圧の水による前処理を予めバイオマスに施しておくことが必須であった。しかし、バイオマスを前処理すると事後処理が困難な黒液が多量に発生するため、目的物であるバイオエタノールの製造コストが高価になる等の課題があった。これに対して、ＹＴ１５４株が産生する酵素は、セルロース糖化活性及びヘミセルロース糖化活性が強く、なかでもヘミセルロース糖化活性が特に強い。このため、ＹＴ１５４株及びその分泌物の少なくともいずれかを含有する糖化活性成分を用いる場合には、バイオマスを糖化する際に上記の前処理が不要である。すなわち、粉砕、破砕、切断等の物理的な前処理を施すだけで、木質系及び草本系の少なくともいずれかのバイオマスを直接糖化することが可能であり、バイオエタノールの製造コストを低減することができる。
【００２０】
また、化学的な前処理等を施すことなく、ＹＴ１５４株及びその分泌物の少なくともいずれかを含有する糖化活性成分を用いてバイオマスを糖化すると、処理液中には黒液が発生せず、処理液中のエタノール発酵阻害物の量も極めて少ない。このため、この処理液をエタノール発酵に直接利用することができる。さらに、糖化処理後のバイオマス残渣は目の粗い布や網目状のフィルターで漉し取るだけで回収することができるとともに、回収したバイオマス残渣は、燃焼してサーマルリサイクルすることが可能である。
【００２１】
また、アンモニア水で前処理したバイオマスを糖化活性成分と接触させることも好ましい。なかでも、木質系のバイオマスはリグニン構造が強固であるため、アンモニア水で前処理することで糖化効率を向上させることができる。なお、アンモニア水は回収して再利用することが可能であることから、硫酸等による前処理と比べて負荷が少なく、事後処理の手間もさほどかからない。アンモニア水によるバイオマスの前処理は、例えば、適当なサイズに粉砕又は切断等したバイオマスをアンモニア水に浸漬すること等によって施される。浸漬時間は、例えば、１〜４８時間程度である。また、浸漬温度は、例えば、２５〜５０℃程度である。
【００２２】
バイオマスに接触させる糖化活性成分が、第２の糸状菌及びその分泌物の少なくともいずれかをさらに含有することが好ましい。そして、第２の糸状菌が、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２２１にて特定されるペニシリウム・オキサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ）ＳＡ５７−２株であることが好ましい。ＹＴ１５４株が産生する酵素は、セルロース糖化活性に比して、ヘミセルロース糖化活性のほうが強い。これに対して、ペニシリウム・オキサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ）ＳＡ５７−２株（以下、単に「ＳＡ５７−２株」とも記す）が産生する酵素は、ヘミセルロース糖化活性に比して、セルロース糖化活性のほうが強い。したがって、ＹＴ１５４株及びその分泌物の少なくともいずれかと、ＳＡ５７−２株及びその分泌物の少なくともいずれかと、を含有する複合酵素系の糖化活性成分を用いることで、各成分が相乗的に作用し、糖化効率をさらに向上させることができる。
【００２３】
ペニシリウム・オキサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ）ＳＡ５７−２株は、２０１２年２月２０日（受領日）に独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センターに寄託され、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２２１が付与された菌株である。ペニシリウム・オキサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ）ＳＡ５７−２株の特性等、及びＳＡ５７−２株が産生する酵素等の成分の詳細については、特許第６２０２７１６号公報（特開２０１３−２２３４８９号公報）の記載内容を参酌及び援用する。
【００２４】
木質系バイオマスの具体例としては、間伐材、林地残材、建築廃材、製材廃材などを挙げることができる。また、草本系バイオマスの具体例としては、稲ワラ、もみ殻、麦ワラ、青刈りトウモロコシ、牧草、葦、タケなどを挙げることができる。さらに、海外における有望な草本系バイオマスとしては、イネ科のエリアンサス、ネピアグラスなどを挙げることができる。
【００２５】
（バイオマスの処理剤）
本発明のバイオマスの処理剤の一実施形態は、前述の糸状菌（ＹＴ１５４株）及びその分泌物の少なくともいずれかを含有する。また、処理剤は、第２の糸状菌及びその分泌物の少なくともいずれかをさらに含有することが好ましい。そして、第２の糸状菌が、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２２１にて特定されるペニシリウム・オキサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ）ＳＡ５７−２株であることが好ましい。
【００２６】
処理剤は、固形物であってもよく、液状物であってもよい。固形の処理剤としては、例えば、従来公知の方法に従って製造される微生物製剤などを挙げることができる。また、液状の処理剤としては、ＹＴ１５４株やＳＡ５７−２株を液体培養して得られる培養液及びその濃縮物などを挙げることができる。さらに、この培養液を乾燥及び製造助剤を添加して製造される固形剤としてもよい。これらの処理剤を、木質系及び草本系の少なくともいずれかのバイオマスに接触させて用いることができる。
【００２７】
以上、木質系及び草本系の未利用バイオマスから、エネルギー源として有用なバイオエタノールを生産することを中心に説明した。ところで、本発明の糸状菌（ＹＴ１５４株）は、酸やアルカリを用いる化学的な前処理などの現行の前処理を施さずとも、バイオマスを直接糖化しうる新規な微生物である。具体的には、セルロース画分からはグルコースを産生することが可能であり、ヘミセルロース画分からはキシロース、ガラクトース、アラビノースなどの単糖類を産生することが可能である。いずれの場合も、目的とする単糖類を高収率・高効率で安価に提供することができる。したがって、本発明の糸状菌（ＹＴ１５４株）は、以下に示す産業分野への応用が期待される。
［エネルギー分野］
エタノール発酵によるバイオエタノールの生産。
［バイオ化成品分野］
得られる単糖類を原料とするバイオ化成品の生産。例えば、単糖類を乳酸発酵させて乳酸を生産し、生分解性プラスチックであるポリ乳酸を容易に製造することができる。
［食品分野］
直接糖化して取得した単糖類（グルコース、キシロース、ガラクトース、アラビノースなど）の利用。また、キシロースからキシリトールへの変換による虫歯予防、ガラクトオリゴ糖への変換によるプレバイオティクスなど。
［環境分野］
黒液が排出されないことによる、廃液処理の容易化。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例、比較例中の「部」及び「％」は、特に断らない限り質量基準である。
【００２９】
＜還元糖の分析・定量方法＞
（ＤＮＳ法）
試料を１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清２０μＬを採取する。以下に示す方法で調製したＤＮＳ試薬４０μＬを添加し、９５℃で１０分間反応させる。５℃で数分間冷却した後、脱イオン水１８０μＬを添加する。１８０μＬを取り出し、５４０ｎｍの波長光の吸光度を測定する。
【００３０】
［ＤＮＳ試薬の調製方法］
４．５％水酸化ナトリウム水溶液３０ｍＬと、１％３，５−ジニトロサリチル酸８８ｍＬとを混合した後、ロッシェル塩（酒石酸ナトリウムカリウム）２２．５ｇを溶解させて第１液を得た。１０％水酸化ナトリウム水溶液２．２ｍＬに結晶フェノール１ｇを溶解させた後、蒸留水を添加して１０ｍＬに希釈した。希釈して得た液体６．９ｍＬに炭酸水素ナトリウム０．６９ｇを溶解させて第２液を得た。得られた第１液と第２液を混合した後、室温で２日間静置してＤＮＳ試薬を得た。得られたＤＮＳ試薬は褐色瓶に入れ、室温にて保存した。
【００３１】
（ソモギーネルソン法）
試料１．０ｍＬにソモギー銅液１．０ｍＬを添加し、よく混ぜた後、１００℃で２０分間煮沸する。氷水で５分間冷却した後、Ｎｅｌｓｏｎ試薬１．０ｍＬを添加する。１０分間静置した後、脱イオン水２２ｍＬを添加して１５分間静置する。１８０μＬを取り出し、６６０ｎｍの波長光の吸光度を測定する。
【００３２】
＜バイオマス直接糖化分解微生物の探索＞
（集積培養）
以下に示す組成（残部は水）の稲わら培地を９６−ｗｅｌｌ  ｄｅｅｐ  ｐｌａｔｅのウェルに１ｍＬずつ分注した。プレートシールで封止した後、１２１℃で１５分間オートクレーブをかけて滅菌した。
【００３３】
［稲わら培地（稲わら２％、ｐＨ５．４）］
・洗浄稲わら（１００ｍｅｓｈ）：２．０％
・硫酸アンモニウム：１．０％
・硝酸ナトリウム：１．０％
・リン酸二水素カリウム：０．５％
・リン酸水素二カリウム：０．１％
・硫酸マグネシウム七水和物：０．１％
・硫酸第一鉄：２０ｍｇ／Ｌ
・塩化ナトリウム：０．１％
・塩化カルシウム二水和物：０．０５％
・酵母エキス：０．１％
【００３４】
愛知県及び岐阜県の任意の場所から採取した土壌サンプル４０ｍｇ、及び未滅菌の粗粉砕稲わらを９６−ｗｅｌｌ  ｄｅｅｐ  ｐｌａｔｅのウェルに入れ、脱イオン水２００μＬを加えて懸濁した。得られた懸濁液を滅菌した稲わら培地が入ったウェルに１００μＬずつ分注し、３０℃、１，５００ｒｐｍの条件で１週間往復震盪培養した。培養後、４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。得られた上清２０μＬを取り出し、ＤＮＳ法により還元糖を測定した。糖度が高かったウェル中の培養液を平板培地（稲わら培地）に植菌し、５〜７日間培養した。適宜希釈しながら平板培地に４回継代し、単一コロニーを得た。得られた単一コロニーのうち、真菌はＰＤＡ培地に保存し、その他の菌はＬＢ培地に保存した。単一コロニーを対応する液体培地にそれぞれ植菌した。１週間培養して得た培養液を粗酵素液とした。得られた粗酵素液を以下の組成の反応液で反応させ、ＤＮＳ法により還元糖を測定した。糖度が特に高かった菌株（糸状菌）を単離した。単離した糸状菌を「ＹＴ１５４株」とした。単離したＹＴ１５４株の分生子の一形態を示す位相差顕微鏡写真を図１に示す。また、単離したＹＴ１５４株の胞子の一形態を示す位相差顕微鏡写真を図２に示す。
【００３５】
［反応液（１ｍＬ）］
・キシラン又は稲わら：２０ｍｇ
・１ｍｏｌ／Ｌ酢酸バッファー：１００μＬ
・脱イオン水：６８０μＬ
・粗酵素液：２００μＬ
【００３６】
＜単離した菌株の同定＞
単離したＹＴ１５４株の巨視的観察結果を表１に示す。
【００３７】
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【００３８】
また、ＹＴ１５４株の微視的観察結果を以下に示す。
１．栄養菌糸：菌糸は寒天表面又は寒天内に形成され、培養初期は無色、培養期間の経過に伴い明褐色〜茶褐色に着色し、有隔壁菌糸の形成が認められた。
２．無性生殖器官
（１）分生子柄及び分生子形成細胞：分生子柄は栄養菌糸より直生し、分岐又は非分岐、有隔壁で、表面は平滑、明褐色〜茶褐色であった。分生子の先端が出芽的に樹上に分岐し、その先端から出芽型分生子が形成されていた。
（２）分生子：分生子は出芽型分生子で、卵型〜レモン型、１細胞で表面は平滑、無色〜明褐色であった。
３．有性生殖器官：１ヶ月間の培養検体からは有性生殖器官は確認できなかった。
【００３９】
巨視的観察結果から、ＹＴ１５４株はＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ属に属する糸状菌であることが予測された。但し、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ属の２８ＳｒＤＮＡ領域はデータが少ないため、ＩＴＳ−５．８Ｓ  ｒＤＮＡ領域の塩基配列によって菌株の同定を試みた。ＹＴ１５４株のＩＴＳ−５．８Ｓ  ｒＤＮＡ領域の塩基配列を配列番号１に示す。その結果、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｌｌｉｃｉｎｕｍ、Ｃ．ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｅ、Ｃ．ａｎｇｕｓｔｉｓｐｏｒｕｍ、Ｃ．ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ、Ｃ．ｄｅｌｉｃａｔｕｌｕｍ、Ｃ．ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ、Ｃ．ｉｎｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｃ．ｐｈａｅｎｏｃｏｍａｅ、Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ、Ｃ．ｓｕｂｕｌｉｆｏｒｍｅ、Ｃ．ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｍ、及びＣ．ｖｅｒｒｕｃｏｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓと同一の系統樹を形成することがわかった。分子系統樹を図３に示す。上記の菌種は、すべて“Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ”と呼ばれる複数の種で構成される種群に属し、ＩＴＳ−５．８Ｓ  ｒＤＮＡ領域のみで種を識別することは困難であった。なお、機能遺伝子（ａｃｔｉｎ、ＥＦ１−α）について解析を行ったが、同定までには至らなかった。以上、巨視的観察、微視的観祭、及び遺伝子解析の結果から、単離したＹＴ１５４株をクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）属に属する糸状菌と同定した。
【００４０】
＜粗酵素液の調製＞
（ＹＴ１５４株）
ＹＴ１５４株をＰＤＡ寒天培地に植菌し、１週間培養した。培養したＰＤＡ培地から調製した胞子懸濁液１ｍＬを以下に示す組成のふすま培地に植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで５日間培養して培養液を得た。得られた培養液を１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清を得た。得られた上清を０．４５ｎｍのフィルターでろ過し、ろ液をＹＴ１５４株の粗酵素液（ＹＴ粗酵素液）とした。
【００４１】
［ふすま培地（ｐＨ５．４）］
・硫酸アンモニウム：１．０％
・硝酸ナトリウム：１．０％
・リン酸水素二カリウム：０．１％
・リン酸二水素カリウム：０．５％
・硫酸マグネシウム：０．１％
・塩化カルシウム：０．０５％
・硫酸第一鉄：２０ｍｇ／ｍＬ
・酵母エキス：０．１％
・塩化ナトリウム：０．１％
・小麦ふすま：５．０％
【００４２】
（ＳＡ５７−２株）
ＹＴ１５４株に代えてＳＡ５７−２株を用いたこと以外は、前述のＹＴ１５４株の場合と同様にして、ＳＡ５７−２株の粗酵素液（ＳＡ粗酵素液）を調製した。
【００４３】
＜酵素の至適ｐＨ及び至適温度の測定＞
（至適ｐＨの測定）
キシラン２０ｍｇ、１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３〜７）１００μＬ、脱イオン水６８０μＬ、及びＹＴ粗酵素液２００μＬ（合計１ｍＬ）を１．５ｍＬチューブに入れ、撹拌した後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。得られた上清の糖度をＤＮＳ法により測定した後、撹拌した。５０℃、１２，０００ｒｐｍの条件で２４時間反応させた後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、得られた上清の糖度をＤＮＳ法により測定した。至適ｐＨの測定結果を示す図（グラフ）を図４に示す。このグラフの縦軸では、糖度の最高値を１００％とする相対活性（％）を示す。
【００４４】
（至適温度の測定）
キシラン２０ｍｇ、１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５）１００μＬ、脱イオン水６８０μＬ、及びＹＴ粗酵素液２００μＬ（合計１ｍＬ）を１．５ｍＬチューブに入れ、撹拌した後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。得られた上清の糖度をＤＮＳ法により測定した後、撹拌した。３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、及び７０℃の各温度、１２，０００ｒｐｍの条件で２４時間反応させた後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、得られた上清の糖度をＤＮＳ法により測定した。至適温度の測定結果を示す図（グラフ）を図５に示す。このグラフの縦軸では、糖度の最高値を１００％とする相対活性（％）を示す。
【００４５】
＜酵素のｐＨ安定性及び温度安定性の評価＞
（ｐＨ安定性の評価）
ＹＴ粗酵素液２００μＬ及び１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３〜１１）５０μＬを混合し、常温で１時間放置して酵素処理液を得た。キシラン２０ｍｇ、１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５）１００μＬ、脱イオン水６８０μＬ、及び酵素処理液２００μＬ（合計１ｍＬ）を１．５ｍＬチューブに入れ、撹拌した後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。得られた上清の糖度をＤＮＳ法により測定した後、撹拌した。５０℃、１２，０００ｒｐｍの条件で２４時間反応させた後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、得られた上清の糖度をＤＮＳ法により測定した。ｐＨ安定性の評価結果を示す図（グラフ）を図６に示す。このグラフの縦軸では、糖度の最高値を１００％とする相対活性（％）を示す。
【００４６】
（温度安定性の評価）
ＹＴ粗酵素液を３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、及び８０℃の各温度で１時間インキュベートして酵素処理液を得た。キシラン２０ｍｇ、１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５）１００μＬ、脱イオン水６８０μＬ、及び酵素処理液２００μＬ（合計１ｍＬ）を１．５ｍＬチューブに入れ、撹拌した後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。得られた上清の糖度をＤＮＳ法により測定した後、撹拌した。５０℃、１２，０００ｒｐｍの条件で２４時間反応させた後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、得られた上清の糖度をＤＮＳ法により測定した。温度安定性の評価結果を示す図（グラフ）を図７に示す。このグラフの縦軸では、糖度の最高値を１００％とする相対活性（％）を示す。
【００４７】
図４〜７に示すように、ＹＴ粗酵素液中の酵素（ＹＴ酵素）は、至適ｐＨが５前後、至適温度が６０℃前後、ｐＨ３〜９の範囲内で安定であり、６０℃前後まで安定であることがわかる。公知のセルラーゼには酸性条件下で高活性のものが多い。ＹＴ１５４株が産生する酵素（ＹＴ酵素）も、公知のセルラーゼと同様に酸性条件下で高い活性を示す。なお、高温条件下で高活性である一方、７０℃ではかなりの活性が消失した。一般的に、温度が高いと酵素反応の初速度は上昇するが、酵素タンパクの失活速度も上昇する。以上の結果、５０℃前後の温度条件下で酵素反応させることが好ましいと考えられる。
【００４８】
＜各基質に対する酵素活性の測定＞
バイオマスを糖化する過程でオリゴ糖が糖化途中産物として産生する。オリゴ糖が顕著に蓄積されると、糖化速度の低下や糖化反応の停止などの問題が生ずる。そこで、各基質に対する糖化活性を測定した。バイオマス中に多く存在するグルコース、キシロース、及びアラビノースを遊離する酵素である、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）、キシラナーゼ（ＸＨ）、β−キシロシダーゼ（ＢＸＨ）、及びアラビノフラシダーゼ（ＡＦＬ）の活性をそれぞれ測測定した。ＣＢＨ活性、ＥＧ活性、及びＸＨ活性については、各基質と酵素との反応により遊離した還元糖量を測定することで測定した。また、ＢＧＬ活性、ＢＸＨ活性、及びＡＦＬ活性については、各基質と酵素との反応により遊離したｐ−ニトロフェノールの量を、最大吸光度（Ａ４００）を測定することで測定した。
【００４９】
（酵素水溶液の準備）
表２に示す種類の酵素水溶液を準備した。表２に示す酵素水溶液のうち、「ＳＡ」は前述の「ＳＡ粗酵素液」であり、「ＹＴ」は前述の「ＹＴ粗酵素液」である。
【００５０】
2020156380.tif 000004
【００５１】
（セロビオヒドラーゼ（ＣＢＨ）活性）
結晶セルロース（Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１、ＦＭＣ社製）２０ｍｇ、１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５）１００μＬ、脱イオン水６８０μＬ、及び各酵素粗酵素液２００μＬ（合計１ｍＬ）を１．５ｍＬチューブに入れ、撹拌した後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。得られた上清の糖度をソモギー法により測定した後、撹拌した。５０℃、２５０ｒｐｍの条件で３時間反応させた後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、得られた上清の糖度をソモギー法により測定した。
【００５２】
（エンドグルカナーゼ（ＥＧ）活性）
カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）２０ｍｇ、１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５）１００μＬ、脱イオン水６８０μＬ、及び各酵素粗酵素液２００μＬ（合計１ｍＬ）を１．５ｍＬチューブに入れ、撹拌した後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。得られた上清の糖度をＤＮＳ法により測定した後、撹拌した。５０℃、２５０ｒｐｍの条件で３時間反応させた後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、得られた上清の糖度をＤＮＳ法により測定した。
【００５３】
（β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性）
１ｍｍｏｌ／Ｌｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｐ−ＮＰＧ）２００μＬ、及び各酵素液１００μＬを５．０ｍＬチューブに入れ、撹拌した後、３５℃で３０分間インキュベートした。０．５ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム水溶液２．５ｍＬを添加して反応を停止させた後、得られた反応液の４００ｎｍの波長光の吸光度（Ａ４００）を測定した。
【００５４】
（キシラナーゼ（ＸＨ）活性）
キシラン２０ｍｇ、１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５）１００μＬ、脱イオン水６８０μＬ、及び各酵素粗酵素液２００μＬ（合計１ｍＬ）を１．５ｍＬチューブに入れ、撹拌した後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。得られた上清の糖度をＤＮＳ法により測定した後、撹拌した。５０℃、２５０ｒｐｍの条件で３時間反応させた後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、得られた上清の糖度をＤＮＳ法により測定した。
【００５５】
（β−キシロシダーゼ（ＢＨＸ）活性）
１ｍｍｏｌ／Ｌｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−キシロピラノシド（ｐ−ＮＰＸ）２００μＬ、及び各酵素液１００μＬを５．０ｍＬチューブに入れ、撹拌した後、３５℃で３０分間インキュベートした。０．５ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム水溶液２．５ｍＬを添加して反応を停止させた後、得られた反応液の４００ｎｍの波長光の吸光度（Ａ４００）を測定した。
【００５６】
（アラビノフラシダーゼ（ＡＦＬ）活性）
１ｍｍｏｌ／Ｌｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−アラビノフラノシド（ｐ−ＮＰＡ）２００μＬ、及び各酵素液１００μＬを５．０ｍＬチューブに入れ、撹拌した後、３５℃で３０分間インキュベートした。０．５ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム水溶液２．５ｍＬを添加して反応を停止させた後、得られた反応液の４００ｎｍの波長光の吸光度（Ａ４００）を測定した。
【００５７】
各基質に対する酵素活性の測定結果を示す図（グラフ）を図８に示す。このグラフの縦軸では、酵素活性が最も高い酵素の活性を１００％とする相対活性（％）を示す。図８に示すように、ＳＡ酵素は６種類の基質に対する活性を示し、特にセルラーゼ系の基質を分解するＣＢＨ、ＥＧ、及びＢＧＬ活性が高活性であった。一方、ＹＴ酵素は、セルラーゼ系の基質に対する活性（ＢＧＬ活性を除く）はさほど高くなかった。しかし、ＹＴ酵素はヘミセルラーゼ系の基質を分解するＸＨ、ＢＸＨ、及びＡＦＬ活性が高活性であったことから、ＹＴ酵素はヘミセルラーゼ系の基質を主体として分解する酵素であると考えられる。以上より、ＳＡ酵素の酵素活性とＹＴ酵素の酵素活性は、相補的な関係にあることがわかる。
【００５８】
市販酵素であるＣｅｌＴ酵素及びＨｃｅｌ酵素は、いずれもＢＧＬ、ＢＸＨ、及びＡＦＬ活性が非常に低かった。現状市販されているセルラーゼには、セルロースの分解過程で生成する、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの酵素反応を阻害するオリゴ糖（セロビオースやキシロビオース等）の蓄積が問題となっている。そして、ＢＧＬ、ＢＸＨ、及びＡＦＬは、いずれもオリゴ糖を分解する酵素であることから、ＳＡ酵素とＹＴ酵素とを組み合わせた複合微生物酵素系は、バイオマス分解酵素として極めて有用であることが示唆される。
【００５９】
＜バイオマスの直接糖化試験＞
（粉砕処理基質の調製）
乾燥した４種類のバイオマス（稲わら、スギ、シラカバ、及びタケ）を適当なサイズにカットした後、脱イオン水に浸漬して数回水洗した。乾燥機を使用して乾燥させた後、高速ブレンダーを使用し、２８，０００ｒｐｍで５分間粉砕した。１３メッシュ、５０メッシュ、及び１００メッシュの篩で順次篩分けして得た粉末を粉砕処理基質（稲わら、スギ、シラカバ、及びタケ）とした。
【００６０】
（アンモニア処理基質の調製）
乾燥した４種類のバイオマス（稲わら、スギ、シラカバ、及びタケ）を適当なサイズにカットした後、３０℃の２８％アンモニア水に２４時間浸漬した。ざるに移して数回水洗した後、適量の精製水を加え、さらに塩酸で中和した。脱イオン水で数回洗浄した後、乾燥機を使用して乾燥させた。高速ブレンダーを使用し、２８，０００ｒｐｍで５分間粉砕した。１３メッシュ、５０メッシュ、及び１００メッシュの篩で順次篩分けして得た粉末をアンモニア処理基質（稲わら、スギ、シラカバ、及びタケ）とした。
【００６１】
（粉砕処理基質を用いた糖化試験）
表３に示す種類及び量の各成分を１．５ｍＬチューブに入れ、撹拌した後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。得られた上清の糖度をＤＮＳ法により測定した後、撹拌した。５０℃、２５０ｒｐｍの条件で２４時間反応させた後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、得られた上清の糖度をＤＮＳ法により測定した。粉砕処理基質を用いた糖化試験の結果を示す図（グラフ）を図９に示す。
【００６２】
2020156380.tif 000005
【００６３】
（アンモニア処理基質を用いた糖化試験）
表４に示す種類及び量の各成分を１．５ｍＬチューブに入れ、撹拌した後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。得られた上清の糖度をＤＮＳ法により測定した後、撹拌した。５０℃、２５０ｒｐｍの条件で２４時間反応させた後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、得られた上清の糖度をＤＮＳ法により測定した。アンモニア処理基質を用いた糖化試験の結果を示す図（グラフ）を図１０に示す。
【００６４】
2020156380.tif 000006
【００６５】
図９及び１０に示すように、ＳＡ酵素とＹＴ酵素を組み合わせた複合酵素が最も高い糖化活性を示したことがわかる。なお、アンモニア処理したタケを基質とし、ＳＡ酵素とＹＴ酵素を組み合わせた複合酵素で糖化した場合の糖化効率は、理論値の７８％であった。また、稲わらは他のバイオマスに比してリグニンの含有率が低いため、アンモニア処理しなくてもある程度の糖を得ることができた。しかし、木質系のバイオマスであるスギ及びシラカバについては、アンモニア処理なしでは微量の糖しか得ることができなかった。このため、バイオマスを高効率に糖化するには、アンモニア処理をある程度施したバイオマスを基質とすることが望ましいと考えられる。なお、アンモニア処理に用いたアンモニアは回収して再利用することが可能であるとともに、硫酸等の酸を用いる酸糖化法に比して負荷が少なく、黒液処理などの事後処理の手間もさほどかからないため、環境負荷が小さく低コストである。なお、市販のセルラーゼとヘミセルラーゼを組み合わせた複合酵素（ＣｅｌＴ＋ＨＣｅｌ）については、糖化効率はそれほど高くなかった。これは、市販のセルラーゼ及びヘミセルラーゼはＢＧＬ活性、ＢＸＨ活性、及びＡＦＬ活性が低く、相補的に作用しなかったためと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の糸状菌は、木質系及び草本系のバイオマスを迅速、効率的、及び安価に分解して糖化しうる微生物として有用である。
【図１】
2020156380.tif 000007
【図２】
2020156380.tif 000008
【図３】
2020156380.tif 000009
【図４】
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【図５】
2020156380.tif 000011
【図６】
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【図７】
2020156380.tif 000013
【図８】
2020156380.tif 000014
【図９】
2020156380.tif 000015
【図１０】
2020156380.tif 000016
【配列表】
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