(57)【要約】【課題】サメ軟骨由来のプロテオグリカンを用いた変形性関節症の予防又は改善剤を提供する。【解決手段】分子量１０〜１００万のサメ軟骨プロテオグリカンを有効成分とする変形性関節症予防又は改善剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量１０〜１００万のサメ軟骨プロテオグリカンを有効成分とする変形性関節症予防又は改善剤。
【請求項２】
分子量１０〜１００万のサメ軟骨プロテオグリカンを有効成分とする変形性関節症予防又は改善用食品。
【請求項３】
分子量１０〜１００万のサメ軟骨プロテオグリカンが、サメ軟骨のクエン酸抽出物又は酵素処理物である、請求項１に記載の変形性関節症予防又は改善剤、又は請求項２に記載の変形性関節症予防又は改善用食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変形性関節症予防又は改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節症（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＯＡ）は、国内の推定２５００万人が罹患している関節疾患である。主訴は痛みであり、動作時痛、関節可動域の制限、過剰な滑液分泌による関節腫脹を伴う。コンドロイチン硫酸およびグルコサミンは、変形性関節症の痛みの緩和効果を示す素材として報告されている。
【０００３】
これに加え、分子量５００万以上のプロテオグリカンを含有する鮭軟骨抽出物に変形性関節症改善効果があることが報告されている（特許文献１）。また、鮭軟骨由来プロテオグリカンによるＯＡの疼痛緩和効果は、損傷した軟骨の再生、炎症抑制が報告されており、その効果がコンドロイチン硫酸よりも効果が高いことも報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
一方、高次捕食者として海洋生物の頂点に存在しているサメは、従来、ふかヒレ以外の部分は重要視されていなかったが、近年、サメ軟骨の粉砕物には免疫賦活作用（特許文献２）等の薬理作用があることが報告され、またサメ軟骨の粉砕物が皮膚角質水分量を高めるための化粧品原料として利用されるようになった。
【０００５】
しかしながら、サメ軟骨由来の低分子量のプロテオグリカンが変形性関節症の改善に有効であることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許０６２１８７３２号公報
【特許文献２】特開２００２−１１４６８９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Sashinami H, Takagaki K, Nakane A.(2006) Salmon cartilage proteoglycan modulates cytokine responses to Escherichia coli in mouse macrophages. Biochem Biophys Res Commun. Dec 29;351(4):1005-10.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、サメ軟骨由来のプロテオグリカンを用いた変形性関節症の予防又は改善剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、分子量１００万以下の低分子量のサメ軟骨由来のプロテオグリカンに滑膜細胞のヒアルロン酸産生を促進させると共に炎症を抑制する作用があり、その程度は鮭軟骨由来のプロテオグリカンにより優れていることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の１）〜３）に係るものである。
１）分子量１０〜１００万のサメ軟骨プロテオグリカンを有効成分とする変形性関節症予防又は改善剤。
２）分子量１０〜１００万のサメ軟骨プロテオグリカンを有効成分とする変形性関節症予防又は改善用食品。
３）分子量１０〜１００万のサメ軟骨プロテオグリカンが、サメ軟骨のクエン酸抽出物又は酵素処理物である、１）に記載の変形性関節症予防又は改善剤、又は２）に記載の変形性関節症予防又は改善用食品。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、経口摂取することで、変形性関節症を予防又は改善剤が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】サメ軟骨プロテオグリカンの分子量測定結果。
【図２】サメ軟骨プロテオグリカンを構成するコンドロイチン硫酸の構成二糖分析の結果。
【図３】プロテオグリカンによる滑膜細胞のヒアルロン酸産生促進作用。
【図４】炎症マクロファージ様Ｂ細胞におけるＮＯ産生抑制作用。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のサメ軟骨プロテオグリカンの原材料となるサメ軟骨としては、頭部軟骨、ヒレ部軟骨、背骨軟骨等のいずれでも良いが、通常、食品製品等へ加工される際に頭部は廃棄されることから、入手コストや安定供給の点から頭部軟骨が好ましい。
また、サメの種類は限定されないが、例えば、アブラツノザメ、ギンザメ、ネズミザメ、モウカザメ、アオザメ、ホシザメ、シュモクザメ、メジロザメ等が挙げられ、アブラツノザメが好ましい。
【００１４】
プロテオグリカンはムコ多糖とタンパク質の複合体であり、具体的には、全体の５〜５０％を占めるタンパク質のポリペプチド鎖をコアとして、これに数本〜数十本のムコ多糖類（グリコサミノグリカン）の鎖が結合してなる複合多糖である。プロテオグリカンの分子量は数万〜数千万であるが、本発明のサメ軟骨プロテオグリカンは、分子量が１０〜１００万のものが使用され、好ましくは１５〜８０万、より好ましくは１６〜６０万、より好ましくは１７〜４５万である。ここで、分子量はゲルクロマトグラフ法によって測定された数平均分子量を意味する。
【００１５】
サメ軟骨プロテオグリカンの構成ムコ多糖（アミノ糖とウロン酸からなる２糖の繰り返し構造を有する酸性糖）としては、主としてコンドロイチン硫酸が挙げられる。
コンドロイチン硫酸には、グルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミン４硫酸からなるコンドロイチン硫酸Ａ、イズロン酸２硫酸とＮ−アセチルガラクトサミン４硫酸からなるコンドロイチン硫酸Ｂ、グルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミン６硫酸からなるコンドロイチン硫酸Ｃ、グルクロン酸２硫酸とＮ−アセチルガラクトサミン６硫酸からなるコンドロイチン硫酸Ｄ、グルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミン４，６二硫酸からなるコンドロイチン硫酸Ｅ、イズロン酸３硫酸とＮ−アセチルガラクトサミン４硫酸からなるコンドロイチン硫酸Ｈ、グルクロン酸２硫酸とＮ−アセチルガラクトサミン４，６二硫酸を主成分とするコンドロイチン硫酸Ｋ、が知られており、サメや鮭の軟骨プロテオグリカンでは、コンドロイチン硫酸Ｃが主体であるが、サメ軟骨プロテオグリカンでは鮭プロテオグリカンと比べて、コンドロイチン硫酸Ａやコンドロイチン硫酸Ｄの比率が若干高く、硫酸化度が高いという特徴を有する（後記実施例参照）。
【００１６】
本発明の分子量が１０〜１００万のサメ軟骨プロテオグリカンは、サメ軟骨のクエン酸抽出又は酵素処理により得ることができる。したがって、本発明の変形性関節症予防又は改善剤においては、有効成分として、サメ軟骨のクエン酸抽出物又は酵素処理物を用いることができる。
用いられるサメ軟骨は、採取した軟骨をそのまま使用してもよいが、適宜、０〜２０℃の水で洗浄、また粉砕して小片化又は粉末化してから使用することができる。また、抽出又は酵素処理の前又は後に、例えばエタノールなどの有機溶媒を用いて脱脂処理を施しても良い。
【００１７】
サメ軟骨プロテオグリカンをクエン酸抽出によって取得する方法は、特許５７４９０６７号公報に記載の方法に準じて行うことができる。すなわち、サメ軟骨を、０．０５〜２質量％のクエン酸水溶液に浸漬し、プロテオグリカンを抽出、回収することにより取得することできる。
抽出に用いられるクエン酸溶液としては、プロテオグリカンの抽出効率の点から、クエン酸の希薄溶液、好ましくはクエン酸の０．０３〜３質量％の水溶液が用いられる。
【００１８】
抽出温度は、０℃から室温が使用できるが、好ましくは室温（１０〜３０℃であり、好ましくは１５℃〜２５℃）である。
抽出時間は、プロテオグリカンを十分に抽出する点から、３５〜５０時間が好ましい。      
【００１９】
上記抽出操作後、抽出物の回収は、必要に応じて脂質成分を除去（脱脂）した後、限外濾過による分子量調整、濃縮工程を経て、エタノール沈殿法等用いて沈殿回収される。
脂質成分の除去（脱脂）は、抽出物を疎水性担体や疎水プラスチックビーズを用いることにより簡便に吸着除去することが可能である。
疎水性担体としては、例えば、ＯＤＳ（オクタデシルシリル基)やオクチル基をシリカやポリマーに化学結合した樹脂が使用できる。担体の粒子径は、通常５μｍ〜１０μｍのものが好適に使用される。また、疎水性プラスチックビーズとしては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等のプラスチックのビーズが使用でき、ビーズの大きさは一般には平均直径が０．５ｍｍから３ｍｍのものが選択できる。
【００２０】
上記脂質を吸着除去した疎水性担体や疎水性ビーズを濾過分離した濾液から得られるプロテオグリカン抽出液は、通常プロテオグリカンを２〜４質量％程度含有し、少量の食塩飽和アルコールで沈澱させることにより収率よく回収することができる。沈殿は、遠心分離を使用することにより効率的に行うことができる。なお、斯かる回収工程の後に、限外濾過による分子量調整、濃縮処理を行うのが好ましい。限外濾過による分子量調整は、具体的には、遠心分離によって沈澱したプロテオグリカンを蒸留水に溶解し、メンブランフィルターを通して巨大プロテオグリカン（分子量１００万を超える分子）および複合物などを除去し、次にこの濾液からメンブランフィルターによって分子量１０万以下のプロテオグリカンやタンパク質およびミネラルなどの塩類が除去される。その後、メンブラン上に回収したプロテオグリカンは、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウムなどを添加したエタノール、好ましくは食塩飽和エタノールにより選択的に沈殿回収される。
【００２１】
このようにして得られたプロテオグリカンは、エタノール（好ましくは、１００％エタノール）で数回洗浄した後に乾燥させる。乾燥は、一般的な真空乾燥や加熱乾燥にて行われるが、加熱する場合は４０℃位の温度が好適に用いられる。
【００２２】
サメ軟骨の酵素処理は、サメ軟骨１質量部に対して２〜５質量部の水、及びサメ軟骨に対して固形分濃度０．５〜１０質量％のタンパク分解酵素を入れ、２５℃〜４０℃で８時間〜３０時間、好ましくは１２時間〜２４時間攪拌する。
タンパク分解酵素としては、例えば、バチルス・サブチリス（Bacillus subtillis）由来プロテアーゼ（ナガセケムテックス株式会社製の各種ビオプラーゼなど）、パパイン、ブロメライン、アクチジニン、フィシン、アスペルギウス（Aspergillus）属由来プロテアーゼ（ナガセケムテックス株式会社製のデナチームなど）、アスペルギウス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来プロテアーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来プロテアーゼが挙げられる。市販のプロテアーゼであってもよいし、プロテアーゼ産生微生物、プロテアーゼ産生動植物から調製したものであってもよい。
酵素処理で得られた抽出溶液には、プロテオグリカンのコアタンパク質がオリゴペプチドにまで分解され低分子化した状態で含まれている。この場合、プロテオグリカンの平均分子量としては、１４〜２２万であるのが好ましく、１５〜２１万であるのがより好ましく、１７万〜２１万であるのがより好ましい。滑膜細胞におけるヒアルロン酸産生促進活性の点から、コアタンパク質がある程度存在していることが好ましく、コアタンパク質が完全に切断されたムコ多糖（コンドロイチン硫酸）では、滑膜細胞におけるヒアルロン酸産生促進活性は低下する。
【００２３】
その後、抽出溶液を９０〜９５℃で５〜１０分間加熱し、酵素失活させる。次いで、メンブランフィルターを用いて分子量１０万以下のプロテオグリカン、タンパク質、ミネラルなどの塩類が除去される。その後、メンブラン上に回収したプロテオグリカンは、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウムなどを添加したエタノール、好ましくは食塩飽和エタノールにより選択的に沈殿回収される。
このようにして得られたプロテオグリカンは、エタノール（好ましくは、１００％エタノール）で数回洗浄した後に乾燥させる。乾燥は、一般的な真空乾燥や加熱乾燥にて行われるが、加熱する場合は４０℃位の温度が好適に用いられる。
【００２４】
上記クエン酸抽出や酵素処理によって得られたプロテオグリカンは、陰イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーやゲル濾過カラムを用いて、適宜精製することができる。
【００２５】
斯くして得られる分子量１０〜１００万のサメ軟骨プロテオグリカン（「本発明のサメ軟骨プロテオグリカン」とも称す。）は、滑膜細胞におけるヒアルロン酸の産生を促進し、滑膜細胞の炎症を抑制する。具体的には、滑膜線維芽細胞様Ａ細胞（ウサギ滑膜由来ＨＩＧ−８２細胞）におけるヒアルロン酸産生を促進し、リポポリサッカロイド（ＬＰＳ）で刺激し炎症を誘導したマウスマクロファージ由来細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞（炎症マクロファージ様Ｂ細胞）におけるＮＯ産生を抑制する作用を有する。
変形性関節症においては、滑膜が炎症を呈することが多く、滑膜中のマクロファージ様Ｂ細胞がＮＯを産生し、滑液中のヒアルロン酸を低分子化することが変形性関節症を悪化させると考えられている。また、変形性関節症の治療の一つとして、ヒアルロン酸の関節注入が行われている実態が存在する。すなわち、変形性関節症の予防又は改善には、滑液中のヒアルロン酸の低分子化を抑制すること、滑液中のヒアルロン酸量を増加させること有効であることが考えられる。
従って、本発明のサメ軟骨プロテオグリカンは変形性関節症予防又は改善剤となり得、変形性関節症を予防又は改善する食品、医薬部外品、医薬品として使用できる。また、本発明のサメ軟骨プロテオグリカンは、食品、医薬部外品、医薬品に変形性関節症の予防又は改善効果を付与するための素材又は製剤としても使用できる。
【００２６】
本発明のサメ軟骨プロテオグリカンを含有する医薬品は、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、トローチ剤等の経口用固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤とすることができる。
【００２７】
尚、経口用固形製剤を調製する場合には、本発明のサメ軟骨プロテオグリカンに賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。また、経口用液体製剤を調製する場合は、矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯味剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。
【００２８】
また、本発明のサメ軟骨プロテオグリカンは、これをそのまま飲食物中に添加して変形性関節症の予防又は改善食品とすることができる。このようにして得られる食品は、日常的に摂取することが可能であるため、変形性関節症の予防又は改善のために有用である。
【００２９】
ここで、飲食品とは、一般食品、健康食品、機能性食品、医薬部外品等を広く含むものであり、具体的には、例えば、各種飲料、麺類、菓子類、油脂及び油脂加工食品、調味料、その他種々の形態の機能性食品等が挙げられる。機能性食品としては、変形性関節症の予防又は改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した健康食品、健康・栄養補助食品、病者用食品、特定保健用食品、機能性表示食品等が挙げられる。
【００３０】
上記食品中には、通常用いられる補助的な原料や添加物、例えばブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤等を配合することができる。
【００３１】
上記医薬品や食品における本発明のサメ軟骨プロテオグリカンの配合量は、プロテオグリカンとして、製剤中０．０００５〜１００質量％、より好ましくは０．００５〜９０質量％、さらに好ましくは０．０５〜８０質量％である。
【００３２】
本発明のサメ軟骨プロテオグリカンのヒトへの投与又は摂取量は、年齢、症状の程度に応じて適宜選択され得る。通常、当該プロテオグリカンとして、成人一日あたり好ましくは１〜１０００ｍｇ、より好ましくは１０〜３００ｍｇとするのが好ましい。なお、１日１回又は複数回に分けて投与することができる。
斯かるサメ軟骨プロテオグリカンを投与する対象は、変形性関節症患者、或いは高齢者等の変形性関節症を患う可能性の高い人が挙げられる。
【実施例】
【００３３】
１．試料の調製
（１)サメ軟骨プロテオグリカンの調製
Ａ：クエン酸抽出
アブラツノザメ軟骨５０ｇを粉砕し、５００ｍＬの０．１重量％クエン酸を加えて１時間放置した。膨潤したヒレを取出し細切し、先の０．１重量％クエン酸溶液に戻し１８時間浸漬、抽出した。
ナイロンメッシュ（１５０μｍ）にて濾過後、濾液はＮｏ．２、およびＮｏ．５Ｃの濾紙、さらにガラス繊維濾紙（ＧＢ−１４０）で濾過し４００ｍＬの濾液を得た。濾液を１０００ｋカットの限外濾過にかけ、１０ｍＬまでの濃縮後、３０ｍＬの蒸留水を加え濃縮した。１０００ｋの濾過液を合わせて回収し４５０ｍＬとなった。これを１００ｋカットの限外濾過にかけた。約１０ｍＬになるまで濃縮し、３０ｍＬの蒸留水を加えて濾過する操作を３回繰り返し１００ｋ濃縮液３０ｍＬを得た。
次に、先の０．１％クエン酸抽出液の残渣を１％クエン酸５５０ｍＬで抽出し、０．１％クエン酸による抽出と同様の操作にて１０００ｋ濾過液で１００ｋ残留液２６ｍＬを得、先の１００ｋ濃縮液３０ｍＬと合わせた。
これに３倍量の食塩飽和エタノールを加えて４℃にて２４時間静置した。沈殿物を遠心分離（１０分間、３０００ｒｐｍ）にて分離し、回収した沈殿を１００％エタノールで洗浄後に遠心分離（１０分間、３０００ｒｐｍ）した。このエタノールによる洗浄沈澱を３回繰り返した。これらの操作後、沈殿を回収、乾燥してプロテオグリカン５３１．７ｍｇを得た。
【００３４】
Ｂ:酵素処理
アブラツノザメ乾燥軟骨２０ｇを粉砕し、４００ｍｇｇの水、及び０．２ｇのビオプラーゼ（ナガセケムテックス株式会社）を加え、３０℃で、２４時間攪拌した。
その後、処理溶液を１００℃で１０分間加熱し酵素失活させた。次いで、１００ｋカットの限外濾過にかけ、１００ｋ濃縮液２００ｍＬを得た。これに３倍量の食塩飽和エタノールを加えて４℃にて２４時間静置した。沈殿物を遠心分離（１０分間、３０００ｒｐｍ）にて分離し、回収した沈殿を１００％エタノールで洗浄後に遠心分離（１０分間、３０００ｒｐｍ）した。このエタノールによる洗浄沈澱を３回繰り返した。これらの操作後、沈殿を回収、乾燥して、プロテオグリカン４．４ｇを得た。
【００３５】
（２）鮭軟骨プロテオグリカンの調製
凍結保存したシロサケの鼻軟骨を用い、（１）と同様にクエン酸抽出処理して、プロテオグリカンを得た。
【００３６】
（３）各プロテオグリカン由来のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の調製
上記で調製したクエン酸抽出により得られたサメ軟骨プロテオグリカンとクエン酸抽出により得られたサメ軟骨プロテオグリカンについて、以下の方法によりプロテオグリカンのコアタンパク質部分をタンパク質分解酵素で処理して対応するグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を調製した。
各プロテオグリカン試料重量２０ｍｇあたり０．５Ｎ  ＮａＯＨ溶液を３ｍＬ加え、４℃で一晩反応させることにより、β脱離反応を行い、ＧＡＧをタンパク質から遊離させた。その後、１Ｎ  ＨＣｌ溶液を１．５ｍＬ加えて中和し、ｐＨ試験紙で中和の確認を行った。その後、２倍濃度のアクチナーゼ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５．０ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ７．８）を４．５ｍＬと超純水を同量の４．５ｍＬ加えた後、沸騰水浴中で１０分間熱変性させた。次に酵素消化反応のために、それぞれに１ｍｇのアクチナーゼ（科研製薬社製）を加え、５０℃の恒温層で２４時間振とうし、再びアクチナーゼを１ｍｇ添加し、さらに２４時間酵素消化を行った。その後、この消化液に３０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を終濃度１０％となるように４．５ｍＬ加え、４℃で一晩置くことにより、タンパク質を沈澱させた。９，０００ｒｐｍ、０℃で１５分遠心分離し、上清をＲＯ水に対して透析し、凍結乾燥を行った。乾燥物を超純水に懸濁させたものをＧＡＧ試料（クエン酸抽出により得られたサメ軟骨ＧＡＧと鮭軟骨ＧＡＧ）とした。
【００３７】
２．分子量の測定（ゲルクロマトグラフィー法）
（１）プロテオグリカンの分子量を測定するため、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。分析試料を溶離液（０．５Ｍ尿素‐０．０５Ｍリン酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０））に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬに調整した。０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターでろ過した試料を、ＨＰＬＣ  ＬＣ−８０２０  Ｍｏｄｅｌ II（東ソー社製）で分析を行った。分析条件は以下の通りである。
・送液：流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ
・カラム：ＧＳ５２０ＨＱ＋ＧＳ６２０ＨＱ（旭化成株式会社製）
・測定温度：４０℃
・検出器：スタンダード…ＲＩ；  試料…ＵＶ（２１５ｎｍ）およびＲＩ
・標準物質：高分子用標準物質Ｐｏｌｙ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅおよび低分子標準物質Ｐｏｌｙ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ計９個
【００３８】
（２）ゲルクロマトグラフィーの結果を図１に示す。これより、酵素処理により得られたサメ軟骨プロテオグリカン（サメ酵素処理）の分子量は２０７，９７１、クエン酸抽出により得られたサメ軟骨プロテオグリカン（サメクエン酸処理）は４８８，３８０、クエン酸処理により得られた鮭軟骨プロテオグリカン（鮭クエン酸処理）は６２１，７３１と推定された。
【００３９】
３．グリコサミノグリカンの構成不飽和二糖組成分析
（１）コンドロイチナーゼＡＢＣ処理によるＧＡＧの分解
上記１（３）で示す方法により、各プロテオグリカン試料からコアタンパク質を除去し、対応するＧＡＧ試料を調製した。
ＧＡＧの構成二糖を分析するために、試料を５００μｇ／１０μｌの濃度になるよう調製した。基質溶液に、５００ｍＵ／１０μｌのコンドロイチナーゼＡＢＣ溶液（生化学工業株式会社製）と３８０μｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加えた。３７℃で一晩振盪させることでＧＡＧの分解反応を行った。２４時間の反応後、１００℃で５分間沸騰することで酵素反応を停止させた。
【００４０】
（２）構成不飽和二糖分析
ＧＡＧを酵素分解したサンプルを１２，０００  ｒｐｍ、４℃で３分遠心し、上清を０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターでろ過したものをＨＰＬＣ  ＬＣ−８０２０  ＭｏｄｅｌIIで分析を行った。分析条件は以下の通りである。
・送液：流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ
・溶離液：アセトニトリル：メタノール：０．５Ｍ  ギ酸アンモニウム＝７０：５：２５で混合した緩衝液（ｐＨ４．８）
・カラム：ＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０（東ソー社製）
・測定温度：７０℃
・検出波長：２３２ｎｍ
【００４１】
（３）逆相クロマトグラフィーによる分析の結果、酵素処理により得られたサメ軟骨プロテオグリカン（サメ酵素処理）はΔｄｉ−０Ｓが１４．６４％、Δｄｉ−６Ｓが７７．１２％、Δｄｉ−４Ｓが７．８１％、Δｄｉ−ｄｉＳ（Ｄ）が０．４３％であった。クエン酸抽出により得られたサメ軟骨プロテオグリカン（サメクエン酸処理）はΔｄｉ−０Ｓが１７．４０％、Δｄｉ−６Ｓが７６．９６％、Δｄｉ−４Ｓが５．１１％、Δｄｉ−ｄｉＳ（Ｄ）が０．５３％であった。クエン酸抽出により得られた鮭プロテオグリカン（鮭クエン酸処理）はΔｄｉ−０Ｓが１６．８２％、Δｄｉ−６Ｓが８１．１５％、Δｄｉ−４Ｓが１．７８％、Δｄｉ−ｄｉＳ（Ｄ）が０．２５％であった。
【００４２】
実施例１  滑膜細胞およびマクロファージを用いたプロテオグリカンの評価
（１）滑膜細胞は、雌ニュージーランド白ウサギの膝関節滑膜組織由来のＨＩＧ−８２細胞（大日本住友製薬株式会社製）を使用した。ＨＩＧ−８２細胞は、１０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、１％抗生物質（ＰＳＡ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｍｉｘｔｕｒｅ：ＧＩＢＣＯ社製）を含むＦ−１２培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ：ＧＩＢＣＯ社製）中で５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した（ＣＯ２インキュベータＭＣＯ−１７ＡＩＣ：ＳＡＮＹＯ社製）。
マクロファージは、マウス単球性白血病由来細胞株のＲＡＷ２６４．７細胞（理化学研究所から分与）を使用した。ＲＡＷ２６４．７細胞は１０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、１％抗生物質（ＰＳＡ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｍｉｘｔｕｒｅ：ＧＩＢＣＯ社製）、１％ＮＥＡＡ（  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ：ＧＩＢＣＯ社製）を含むＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ：Ｓｉｇｍａ社製）中で５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。なおＲＡＷ２６４．７細胞の継代はＥＤＴＡ入りのトリプシンで１０分処理した後、セルスクレーパー（Ｆａｌｃｏｎ社製）を用いて細胞を機械的にはがすことで行った。炎症惹起の際にはＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１：Ｂ４由来のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社製  Ｌｏｔ  ０８８Ｍ４０６７Ｖ）を使用した。その他試薬は特級試薬を使用した。
【００４３】
（２）被験物質の添加方法
６０〜７０％の被覆率となるまで細胞を増殖させた後、増殖用培地を除去し、血清成分を取り除くためにＰＢＳ（−）で洗浄した。その後直ちに上記１で調製した試料を含む添加用培地に交換し、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。培養終了後に上清を回収し使用時まで−８０℃で保存した。
【００４４】
（３）培養上清中のヒアルロン酸量の測定方法
細胞培養上清中のヒアルロン酸量の測定は、ＥＬＩＳＡ法で行った。ヒアルロン酸結合タンパク質をプレートにコーティングし、培養上清を添加した。さらにビオチン標識抗ヒアルロン酸結合タンパク質を反応させた。
【００４５】
（４）培養上清中の一酸化窒素濃度の測定法
ＲＡＷ２６４．７細胞を培養し、炎症を惹起するためＬＰＳを添加した。４８時間後に培養上清を回収した。培養上清中のＮＯ濃度は、Ｇｒｉｅｓｓ反応を用いて定量した。スタンダードの２０、１０、５、０μＭ亜硝酸ナトリウム溶液（和光純薬株式会社製）、及び細胞の培養上清を９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ添加した。続いて、４０ｍｇ／ｍＬに調整したＧｒｉｅｓｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ社製）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、１０分反応させた後、ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００を用いて５４０ｎｍの吸光度を測定した。スタンダードの測定値から標準曲線を作成し、培養上清中のＮＯ濃度を決定した。
【００４６】
（５）結果
１）コントロール（試料無添加）上清中のＨＡ濃度が１８８．２４±１６．４ｎｇ／ｍＬであったのに対し、酵素処理により得られたサメ軟骨プロテオグリカン（サメ酵素処理）では４１４．１±３０．９ｎｇ／ｍＬ、クエン酸抽出により得られたサメ軟骨プロテオグリカン（サメクエン酸処理）では５４６．４±７４．７ｎｇ／ｍＬとなり、どちらも産生量の有意な上昇が認められた（サメ酵素処理ではｐ＜０．０５、サメクエン酸処理ではｐ＜０．０１、どちらもＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ’ｓ  ｔｅｓｔによる）。クエン酸抽出により得られた鮭軟骨プロテオグリカン（鮭クエン酸処理）では２５０．３±２５．３ｎｇ／ｍＬと若干の上昇は見られたが、有意な差ではなかった（図３）。
【００４７】
また、クエン酸抽出により得られたサメ軟骨プロテオグリカン及びクエン酸抽出により得られた鮭軟骨プロテオグリカンと、それらのコアタンパク質を除去したサメ軟骨ＧＡＧと鮭軟骨ＧＡＧについて、ヒアルロン酸産生量を評価した。コントロールを１００とした場合におけるヒアルロン酸産生量を表１に示した。その結果、クエン酸抽出により得られた鮭軟骨プロテオグリカン及びそのＧＡＧを添加することで１３３と若干、上昇した。これに対し、クエン酸抽出により得られたサメ軟骨プロテオグリカン及びそのＧＡＧの添加では、プロテオグリカンの添加で２９０、ＧＡＧの添加で２７８であった。すなわち、サメ軟骨では、ＧＡＧがタンパク質に結合しているプロテオグリカンが、ヒアルロン酸の産生量向上により有効であると考えられる。
【００４８】
【表１】
2020200288.tif 000002
【００４９】
２）プロテオグリカン添加による炎症細胞の抗炎症効果
炎症を惹起していない上清中のＮＯ濃度は１．２５±０．１２μＭであったのに対し、５μｇ／ｍＬのＬＰＳで４８時間刺激を行った群では７．７４±０．１７μＭであり、有意な上昇が確認された（ｐ＜０．０１、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔによる）。すなわち、ＬＰＳによってＲＡＷ２６４．７細胞で炎症が惹起されたことが示された。これに対し、クエン酸抽出により得られたサメ軟骨プロテオグリカン（サメクエン酸処理）では６．８３±０．１２μＭとなり、ＬＰＳコントロール群と比較して有意にＮＯ産生を抑制した（ｐ＜０．０１、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ’ｓ  ｔｅｓｔによる）。酵素処理により得られたサメ軟骨プロテオグリカン（サメ酵素処理）では７．２３±０．１μＭ、クエン酸抽出により得られた鮭軟骨プロテオグリカン（鮭クエン酸処理）では７．８１±０．０８μＭであり、ＮＯ産生量はＬＰＳコントロール群と同程度であった（図４）。
【図１】
2020200288.tif 000003
【図２】
2020200288.tif 000004
【図３】
2020200288.tif 000005
【図４】
2020200288.tif 000006