(57)【要約】【課題】細胞成長基盤として有用な殺菌、ゲル化、可溶化細胞外マトリクス（ＥＣＭ）組成物を調製する調整方法を提供する。【解決手段】その調整方法に従って調製された組成物ならびに組成物の使用方法も提供される。一実施形態では、ＥＣＭの中への細胞の内植を容易にし、それにより、装置の患者への適応および／または装着を容易にするためにゲル化殺菌ＥＣＭが分散されている無機マトリクスを備える義肢などの装置が提供される。【選択図】図１
2020089741.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外マトリクス由来ゲルの調製方法であって、
（ｉ）透析されていない細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を酸性溶液中の酸性プロテアーゼによって消化し可溶化して、消化物溶液を生成する可溶化ステップと、
（ｉｉ）前記消化物溶液を乾燥させて乾燥消化物を生成する乾燥ステップと、
（ｉｉｉ）前記乾燥消化物を最終滅菌する最終滅菌ステップと、
を含む調製方法。
【請求項２】
（ｉｖ）滅菌された前記乾燥消化物を水和して滅菌消化物溶液を生成する水和ステップと、
（ｖ）前記滅菌消化物溶液のｐＨを７．２〜７．８に上げて中和消化物溶液を生成する中和ステップと、
（ｖｉ）前記中和消化物溶液を２５℃を超える温度でゲル化してゲルを生成するゲル化ステップと、
をさらに含む請求項１に記載の調製方法。
【請求項３】
（ｉｖ）滅菌された前記乾燥消化物を水和し、かつ７．２〜７．８のｐＨに中和して中和消化物溶液を生成する中和ステップと、
（ｖｉ）前記中和消化物溶液を２５℃を超える温度でゲル化してゲルを生成するゲル化ステップと、
をさらに含む請求項１に記載の調製方法。
【請求項４】
前記ＥＣＭは、可溶化ステップの前に最終滅菌も、透析も、架橋処理もされない請求項１乃至３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項５】
前記乾燥ステップでは、前記消化物溶液を凍結乾燥させる請求項１乃至４のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項６】
前記最終滅菌ステップでは、前記乾燥消化物を、ガンマ線放射、電子ビーム放射、エチレンオキシドおよび／または超臨界ＣＯ２を使用して最終滅菌する請求項１乃至５のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項７】
前記ＥＣＭは哺乳動物組織に由来する請求項１乃至６のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項８】
前記哺乳動物組織は膀胱、脾臓、肝臓、心臓、中枢神経系、脂肪組織、骨、膵臓、卵巣または腸のうちの１つに由来する請求項７に記載の調製方法。
【請求項９】
前記哺乳動物組織はブタ、ウシ、サルまたはヒトに由来する請求項７または８に記載の調製方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物組織は腸に由来する請求項７に記載の調製方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物組織は大腸または結腸に由来する請求項１０に記載の調製方法。
【請求項１２】
前記ＥＣＭはブタ膀胱の上皮性基底膜および固有層を含む請求項１乃至３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１３】
前記ＥＣＭは粉砕される請求項１乃至３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１４】
前記消化物溶液、滅菌消化物溶液、または中和消化物溶液はゲル化前に２５℃以下に維持される請求項１乃至３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１５】
前記酸性プロテアーゼはペプシンである請求項１乃至３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１６】
前記ＥＣＭは２以上のｐＨで可溶化される請求項１５に記載の調製方法。
【請求項１７】
前記ＥＣＭは３〜４のｐＨで可溶化される請求項１５に記載の調製方法。
【請求項１８】
前記酸性溶液は０．０１ＭのＨＣｌを含む請求項１乃至３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１９】
前記プロテアーゼはトリプシンである請求項１乃至３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項２０】
前記消化物溶液のｐＨを上げるために基礎液または等張液が添加される請求項１乃至３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項２１】
前記基礎液または等張液はＮａＯＨまたはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である請求項２０に記載の調製方法。
【請求項２２】
前記消化物溶液は７．４のｐＨでゲル化される請求項１乃至３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項２３】
前記ゲル化ステップでは、３０℃以上でゲル化する請求項２または３に記載の調製方法。
【請求項２４】
前記ゲル化ステップでは、３７℃でゲル化される請求項２３に記載の調製方法。
【請求項２５】
前記中和消化物溶液を患者に投与するステップをさらに含み、
前記ゲル化は前記患者の体内または患者の体外で起こる請求項２または３に記載の調製方法。
【請求項２６】
消化物溶液のｐＨは、患者への投与中に前記消化物溶液を塩基または緩衝液と混合することにより上げられる請求項２５に記載の調製方法。
【請求項２７】
前記患者はヒトの患者である請求項２５に記載の調製方法。
【請求項２８】
細胞、薬剤、サイトカインおよび成長因子のうちの１つ以上をゲルに統合するステップをさらに含む請求項１乃至３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項２９】
細胞、薬剤、サイトカインおよび成長因子のうちの１つ以上が前記中和消化物溶液に混入される請求項２または３に記載の調製方法。
【請求項３０】
前記ゲルに細胞を播種するステップを含む請求項２または３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項３１】
中和中または中和後に、前記中和消化物溶液に細胞を添加するステップをさらに含む請求項２または３に記載の調製方法。
【請求項３２】
生体適合性足場のマトリクスを前記中和消化物溶液で被覆するステップと、
前記マトリクスを被覆している前記中和消化物溶液をゲル化するステップと、
をさらに含む請求項２または３に記載の調製方法。
【請求項３３】
請求項１乃至２９のいずれか１項に記載の調整方法により調製されたことを特徴とする組成物。
【請求項３４】
ハイブリッド細胞外マトリクス足場の調製方法であって、
（ｉ）消化物溶液を生成するために、透析されていない細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を酸性溶液中の酸性プロテアーゼによる消化によって可溶化するステップと、
（ｉｉ）前記消化物溶液を乾燥させて乾燥消化物を生成するステップと、
（ｉｉｉ）乾燥された前記消化物を殺菌するステップと、
（ｉｖ）前記消化物溶液を水和して殺菌消化物溶液を生成するステップと、
（ｖ）前記殺菌消化物溶液のｐＨを７．２〜７．８のｐＨに上げて中和消化物溶液を生成するステップと、
（ｖｉ）２５℃を超える温度で前記中和消化物溶液をゲル化するステップと、
を含み、
生体適合性足場は、前記ＥＣＭを可溶化するステップと前記消化物溶液を乾燥させるステップとの間の前記消化物溶液で被覆されるか、あるいは前記消化物溶液を水和するステップの後、前記中和消化物溶液がゲル化される前の前記殺菌消化物溶液または前記中和消化物溶液で被覆される調製方法。
【請求項３５】
前記生体適合性足場は、前記ＥＣＭを可溶化する工程と前記消化物溶液を乾燥させるステップとの間の前記消化物溶液で被覆される請求項３４に記載の調製方法。
【請求項３６】
前記生体適合性足場は、前記消化物溶液を水和するステップの後、前記中和消化物溶液がゲル化される前の前記殺菌消化物溶液または前記中和消化物溶液で被覆される請求項３４に記載の調製方法。
【請求項３７】
前記生体適合性足場は、非金属成分および金属成分を任意に含むコバルト−クロム合金、ステンレス鋼、チタン、タンタルおよび／またはチタン合金のうちの１つ以上を含む請求項３４に記載の調製方法。
【請求項３８】
前記足場は市販の純チタンを含む請求項３４に記載の調製方法。
【請求項３９】
前記足場は、モリブデン、タンタル、ニオブ、ジルコニウム、鉄、マンガン、クロム、コバルト、ニッケル、アルミニウムおよびランタンのうちの１つ以上を含むチタン合金を含む請求項３４に記載の調製方法。
【請求項４０】
前記足場はＴｉ、ＡｌおよびＶを含む合金を含む請求項３４に記載の調製方法。
【請求項４１】
前記合金は約９０ｗｔ％のＴｉ、約６ｗｔ％のＡｌおよび約４ｗｔ％のＶを含む請求項４０に記載の調製方法。
【請求項４２】
前記生体適合性足場はフィラメントまたは溶融ビードを備える請求項３４に記載の調製方法。
【請求項４３】
前記生体適合性足場は、カルシウムを含む無機鉱物を含む請求項３４に記載の調製方法。
【請求項４４】
前記生体適合性足場は、Ｃａ、ＰおよびＯを含む鉱物を含む請求項３４に記載の調製方法。
【請求項４５】
前記鉱物はアパタイトおよび／またはヒドロキシアパタイトである請求項４４に記載の調製方法。
【請求項４６】
前記生体適合性足場はセラミック材料を含む請求項３４に記載の調製方法。
【請求項４７】
前記生体適合性足場はポリマーを含む請求項３４に記載の調製方法。
【請求項４８】
請求項３４乃至４７のいずれか１項に記載の処理に従って調製されたハイブリッド細胞外マトリクス足場を備える生体適合性装置。
【請求項４９】
前記生体適合性装置は義肢である請求項４８に記載の生体適合性装置。
【請求項５０】
前記義肢は、手、前腕、腕、足および脚のうちの１つである請求項４９に記載の生体適合性装置。
【請求項５１】
前記生体適合性装置は大腿骨インプラントである請求項４８に記載の生体適合性装置。
【請求項５２】
請求項３２乃至４５のいずれか１項に記載の処理に従って調製されたハイブリッド細胞外マトリクス足場を備える装置を患者の組織および／または構造に装着する装着方法であって、
前記ハイブリッド細胞外マトリクス足場における患者の細胞の内植に十分な期間にわたり患者の細胞を前記ハイブリッド細胞外マトリクス足場の中へ成長させるかまたは埋め込むステップを含む装着方法。
【請求項５３】
前記ハイブリッド細胞外マトリクス足場は前記細胞と接触し、前記内植は生体内で起こる請求項５２に記載の装着方法。
【請求項５４】
前記ハイブリッド細胞外マトリクス足場は前記細胞と接触し、前記内植は生体外で起こる請求項５２に記載の装着方法。
【請求項５５】
前記装置は義肢である請求項５２に記載の装着方法。
【請求項５６】
前記義肢は手、前腕、腕、足および脚のうちの１つであることを特徴とする請求項５５記載の装着方法。
【請求項５７】
前記装置は大腿骨インプラントである請求項５２に記載の装着方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
細胞外マトリクス（ＥＣＭ）由来ゲルの殺菌方法を説明する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリクス（ＥＣＭ）足場の最終滅菌（例えば、エチレンオキシド（ＥｔＯ）ガスへの暴露、ガンマ線照射または電子ビーム放射による）は、ＥＣＭ由来のヒドロゲルの形成を抑止する。前臨床研究の結果は、ＥＣＭヒドロゲル中で濃縮されるＥＣＭ分解生成物の顕著な利点を示しており、表し続けている。ヒドロゲル生成物の臨床応用および広範にわたる商品化に先立って、ＥＣＭヒドロゲルの殺菌方法を識別しておかなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第８，３６１，５０３号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１０−０２２６８９５号公報
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２０１１／０８７７４３号
【特許文献４】国際公開第ＷＯ２０１３／００９５９５号
【特許文献５】米国特許第４，９０２，５０８号公報
【特許文献６】米国特許第４，９５６，１７８号公報
【特許文献７】米国特許第５，２８１，４２２号公報
【特許文献８】米国特許第５，３５２，４６３号公報
【特許文献９】米国特許第５，３７２，８２１号公報
【特許文献１０】米国特許第５，５５４，３８９号公報
【特許文献１１】米国特許第５，５７３，７８４号公報
【特許文献１２】米国特許第５，６４５，８６０号公報
【特許文献１３】米国特許第５，７１１，９６９号公報
【特許文献１４】米国特許第５，７５３，２６７号公報
【特許文献１５】米国特許第５，７６２，９６６号公報
【特許文献１６】米国特許第５，８６６，４１４号公報
【特許文献１７】米国特許第６，０９９，５６７号公報
【特許文献１８】米国特許第６，４８５，７２３号公報
【特許文献１９】米国特許第６，５７６，２６５号公報
【特許文献２０】米国特許第６，５７９，５３８号公報
【特許文献２１】米国特許第６，６９６，２７０号公報
【特許文献２２】米国特許第６，７８３，７７６号公報
【特許文献２３】米国特許第６，７９３，９３９号公報
【特許文献２４】米国特許第６，８４９，２７３号公報
【特許文献２５】米国特許第６，８５２，３３９号公報
【特許文献２６】米国特許第６，８６１，０７４号公報
【特許文献２７】米国特許第６，８８７，４９５号公報
【特許文献２８】米国特許第６，８９０，５６２号公報
【特許文献２９】米国特許第６，８９０，５６３号公報
【特許文献３０】米国特許第６，８９０，５６４号公報
【特許文献３１】米国特許第６，８９３，６６６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ａ．Ｗｈｉｔｅ他の「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｄｉｏｘｉｄｅ」（２００６年）、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２３（４）号、５０４〜５１５ページ
【非特許文献２】ＥＮ  Ｍａｒｉｅｂの「Ｈｕｍａｎ  Ａｎａｔｏｍｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」第２版、１９９２年、Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ社、カリフォルニア州レッドウッドシティ、７９２ページ、７９３ページ、８０２ページおよび８０３ページ
【非特許文献３】Ａ．Ｓａｒｉｋａｙａ他、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．２００２年２月、８（１）、６３〜７１ページ；ＲＬ  Ｒｉｎｇｅｌ他、Ｊ  Ｓｐｅｅｃｈ  Ｌｎａｇ  Ｈｅａｒ  Ｒｅｓ．２００６年２月、４９（１）、１９４〜２０８ページ
【非特許文献４】ＧＫ  Ｒｅｄｄｙ他の「Ａ  Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ」、（１９９６年）、Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９（３），２２５〜２２９ページ
【非特許文献５】ＲＡ  Ｇｅｌｍａｎ他の「Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｉｂｒｉｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ  ｐｒｏｃｅｓｓ」（１９７９年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４（１）、１８０〜１８６ページ
【非特許文献６】ａＲＷ  Ｃｈａｎ他のＶｉｓｃｏｓｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｉｎ  ｖｏｃａｌ  ｆｏｌｄ  ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｓｕｒｇｅｒｙ。Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ、１９９８年５月、１０８（５）、７２５〜７３１ページ
【非特許文献７】ｂＳＡ  Ｋｌｅｍｕｋ他のＶｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｖｏｃａｌ−ｆｏｌｄ  ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｔ  ｌｏｗ  ａｕｄｉｏ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ。Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ、２００４年９月、１１４（９）、１５９７〜１６０３ページ
【非特許文献８】Ｃ．Ａ．Ｈｉｇｕｅｒａ他、Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ．１０９１〜１０９９ページ（２３），２００５年
【非特許文献９】Ｓ．Ａ．Ｈａｃｋｉｎｇ他、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ、６３１〜６３８ページ（５２）２０００年
【非特許文献１０】Ｓ．Ｆ．Ｂａｄｙｌａｋ、Ｔｒａｎｓｐｌ  Ｉｍｍｕｍｏｌ．３６７〜３７７ページ（１２）２００４年
【非特許文献１１】Ｌ．Ｍ．Ｄｅｊａｒｄｉｎ他、ＡＪＳＭ．１７５〜１８４ページ（２９）、２００１年
【非特許文献１２】ＤＯ  Ｆｒｅｙｔｅｓ他、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００４年、２５（１２）、２３５３〜２３６１ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本明細書において、ＥＣＭゲルおよび関連組成物を製造する方法を説明する。通常、ＥＣＭゲルは、消化物溶液を生成するための酸性プロテアーゼによる最終滅菌ＥＣＭ材料の消化、それに続く溶液の中和および３７℃の温度への加熱を経た後にゲルを生成しない。本明細書では、この問題に対して、最終滅菌を可能にするが、再現可能なゲル化をもたらす解決方法を説明する。複数回の投与によるＥｔＯ、電子ビーム放射およびガンマ線照射を介して最終滅菌された固体シートの形のＥＣＭ足場は、ヒドロゲルの形成を支援しない。しかし、殺菌前に材料の形態をシートから凍結乾燥ＥＣＭ消化物に変化させることで、ヒドロゲルの形成が促進されることが本明細書の中で示される。例えば、以下の実施例に示されるように、ＥＣＭ消化物をフリーズドライ（凍結乾燥）し、エチレンオキシドガスに曝すことにより乾燥消化物を殺菌し、乾燥プレゲルを水で再構成することにより、中和後に３７℃で培養した時に再現可能にゲル化する消化物が生成されるが、これに限定されない。これらの結果に基づいて、許容される他の方法（例えば、電子ビーム放射、ガンマ線照射、Ｘ線、超臨界二酸化炭素）により乾燥消化物を最終滅菌しても、同様にＥＣＭヒドロゲルの形成は可能になると予想される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明に係る調製方法は、
細胞外マトリクス由来ゲルの調製方法であって、
（ｉ）消化物溶液を生成するために、透析されていない細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を酸性溶液中の酸性プロテアーゼによる消化によって可溶化するステップと、
（ｉｉ）前記消化物溶液を乾燥させるステップと、
（ｉｉｉ）乾燥消化物を殺菌するステップと、
を含む。
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明に係る組成物は、
上記の処理により調製されたことを特徴とする組成物。
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明に係る調製方法は、
ハイブリッド細胞外マトリクス足場の調製方法であって、
（ｉ）消化物溶液を生成するために、透析されていない細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を酸性溶液中の酸性プロテアーゼによる消化によって可溶化するステップと、
（ｉｉ）前記消化物溶液を乾燥させるステップと、
（ｉｉｉ）乾燥された前記消化物溶液を殺菌するステップと、
（ｉｖ）殺菌消化物溶液を生成するために前記消化物溶液を水和するステップと、
（ｖ）中和消化物溶液を生成するために、前記消化物溶液のｐＨを７．２〜７．８のｐＨに上げるステップと、
（ｖｉ）２５℃を超える温度で前記溶液をゲル化するステップと、
を含み、
生体適合性足場は、前記ＥＣＭを可溶化するステップと前記消化物溶液を乾燥させるステップとの間の前記消化物溶液で被覆されるか、あるいは前記消化物溶液を水和するステップの後、前記中和消化物溶液がゲル化される前の前記殺菌消化物溶液または前記中和消化物溶液で被覆される。
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明に係る生体適合性装置は、
上記の処理に従って調製されたハイブリッド細胞外マトリクス足場を備える。
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明に係る調装着方法は、
上記の処理に従って調製されたハイブリッド細胞外マトリクス足場を備える装置を患者の組織および／または構造に装着する装着方法であって、
前記ハイブリッド細胞外マトリクス足場における患者の細胞の内植に十分な期間にわたり患者の細胞を前記ハイブリッド細胞外マトリクス足場の中へ成長させるかまたは埋め込むステップを含む。
【発明の効果】
【００１１】
細胞成長用足場として有用な殺菌、ゲル化、可溶化細胞外マトリクス（ＥＣＭ）組成物を調製する方法が提供される。組成物は、ゲル化前の非ゲル化形態で患者に移植または投与する前に成形可能であり、組成物は体内でゲル化する。さらに、方法に従って調製された組成物ならびに組成物の使用方法も提供される。一実施形態では、ＥＣＭの中への細胞の内植を容易にし、それにより装置の患者への適応および／または装着を容易にするために、殺菌、ゲル化、可溶化ＥＣＭが分散されている無機マトリクスを備える義肢等の装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本明細書で説明される大腿骨インプラントの一実施形態を概略的に示す図である。
【図２】本明細書で説明される義手の一実施形態を概略的に示す図である。
【図３】膀胱の壁の横断面を示す概略図である（縮尺通りには示されていない）。上皮細胞層（Ａ）、基底膜（Ｂ）、固有層（Ｃ）、粘膜筋（Ｄ）、粘膜下層（Ｅ）、外筋層（Ｆ）、漿膜（Ｇ）、粘膜（Ｈ）および膀胱の内腔（Ｌ）の各構造を示す。
【図４Ａ】凍結乾燥されたブタ膀胱マトリクス（ＵＢＭ）シートを示す写真である。
【図４Ｂ】、凍結乾燥されたブタ膀胱マトリクス（ＵＢＭ）粉末を示す写真である。
【図４Ｃ】ＵＢＭの１０ｍｇ／ｍｌの濃度のペプシンを消化した溶液を示す写真である。
【図４Ｄ】ＵＢＭの４ｍｇ／ｍｌのゲルおよびＵＢＭの８ｍｇ／ｍｌのゲルを示す写真であり、比較のために４ｍｇ／ｍｌのコラーゲンＩ（Ｃｏｌ  Ｉ）のゲルを示す（Ｄ）。
【図５】ＵＢＭゲルおよびＣｏｌ  Ｉゲルのゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図６Ａ】３ｍｇ／ｍｌのＵＢＭゲルの５，０００倍の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）画像である。
【図６Ｂ】３ｍｇ／ｍｌのＵＢＭゲルの１０，０００倍の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）画像である。
【図６Ｃ】６ｍｇ／ｍｌのＵＢＭゲルの５，０００倍の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）画像である。
【図６Ｄ】６ｍｇ／ｍｌのＵＢＭゲルの１０，０００倍の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）画像である。
【図７Ａ】５，０００倍の倍率による４ｍｇ／ｍｌのＣｏｌ  ＩゲルのＳＥＭ画像である。
【図７Ｂ】５，０００倍の倍率による４ｍｇ／ｍｌのＵＢＭゲルのＳＥＭ画像である。
【図８Ａ】ゲル化中の吸光度を測定することにより分光測光方式で判定されたＣｏｌ  ＩゲルおよびＵＢＭゲルの比濁ゲル化キネティクスを示す図である。測定された吸光度値に関して結果が示される。
【図８Ｂ】ゲル化中の吸光度を測定することにより分光測光方式で判定されたＣｏｌ  ＩゲルおよびＵＢＭゲルの比濁ゲル化キネティクスを示す図である。正規化吸光度値に関して結果が示され、これにより、ｔ１／２（最大濁度の５０％に到達するまでの時間）、ｔｌａｇ（ゲル化の遅延時間）およびＳ（ゲル化の速度）などの動力学的パラメータを計算できる。
【図９】１ｍｇ／ｍｌの小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）ゲルの比濁ゲル化キネティクスを示す図である。
【図１０】ＵＢＭゲルのゲル化中の流動学的測定値を示す図であり、ゲル化は、ゲル化中に試料の振動弾性率を一定の頻度で監視することにより機械的に判定された。３ｍｇ／ｍｌのＵＢＭゲルおよび６ｍｇ／ｍｌのＵＢＭゲルに関して弾性率（Ｇ’）および粘性係数（Ｇ”）の結果が示される。
【図１１Ａ】ＬＳ（肝臓間質）ゲルおよびＳＩＳゲルのゲル化中の流動学的測定値を示す図である。５％の歪みおよび１ｒａｄ／ｓｅｃでゲル化キネティクスが判定された。結果は、６ｍｇ／ｍｌのＬＳゲル、ＳＩＳゲルおよびＵＢＭゲルに関する弾性係数（Ｇ’）を示す。
【図１１Ｂ】ＬＳ（肝臓間質）ゲルおよびＳＩＳゲルのゲル化中の流動学的測定値を示す図である。５％の歪みおよび１ｒａｄ／ｓｅｃでゲル化キネティクスが判定された。結果は、６ｍｇ／ｍｌのＬＳゲル、ＵＢＭゲルおよびＳＩＳゲルに関して同様に判定された角周波数の関数としての貯蔵弾性率（Ｇ’）を示す。
【図１２】３ｍｇ／ｍｌのＣｏｌ  Ｉゲル、３ｍｇ／ｍｌのＵＢＭゲルおよび６ｍｇ／ｍｌのＵＢＭゲルの動的粘性に対する周波数の影響を示す図である。
【図１３Ａ】ＵＢＭゲルを浸透させた多孔質チタン繊維のデジタル写真を示す図であり、繊維は超音波処理なしで処理された。スケールバーは２，０００μｍである。
【図１３Ｂ】ＵＢＭゲルを浸透させた多孔質チタン繊維のデジタル写真を示す図であり、繊維は超音波処理によって処理された。スケールバーは２，０００μｍである。
【図１４Ａ】繊維メッシュの中にＴｉ６Ａｌ４Ｖを含む多孔質金属足場のＳＥＭ画像を示す図である。
【図１４Ｂ】ハイブリッドＥＣＭ／多孔質金属足場のＥＳＥＭ画像を示す図であり、ＵＢＭゲルはＴｉ６Ａｌ４Ｖワイヤを共に被覆している。
【図１４Ｃ】市販の純チタン（ＣＰ  Ｔｉ）の焼結ビードを含む多孔質金属足場のＳＥＭ画像を示す図である。
【図１４Ｄ】超音波処理に曝した後のハイブリッドＥＣＭ／多孔質金属足場およびＣＰ  ＴｉビードのＥＳＥＭ画像を示す図である。
【図１５】最終滅菌後のヒドロゲル形成の定性的観測を示す図である。殺菌されていない対照例と比較して、最終滅菌後にヒドロゲルを形成する真皮ＥＣＭの能力は、金属リング成形型（上の画像）が取り除かれた後に廃止された。
【図１６Ａ】非殺菌凍結乾燥プレゲルを示す図である。
【図１６Ｂ】ＨＣｌで再構成した後の非殺菌凍結乾燥プレゲルを示す図である。
【図１６Ｃ】脱イオン水で再構成した後の非殺菌凍結乾燥プレゲルを示す図である。
【図１６Ｄ】ＥｔＯで殺菌し、水またはＨＣｌの中で再構成した後の凍結乾燥プレゲルを示す図である。図１６Ｂおよび図１６Ｃを比較すると、ＨＣｌでの殺菌後の試料（図１６Ｄ）を除く全ての試料に関して再構成が完了したことがわかる。
【図１７】ヒドロゲルの形成における凍結乾燥ＳＩＳ−ＥＣＭプレゲルの結果生成物の殺菌を示す。
【図１８】ヒドロゲル形成における凍結乾燥ＵＢＭプレゲルの結果生成物の殺菌を示す。
【図１９Ａ】無細胞化ＵＢＭの種々の殺菌方法の比較を示す図である。
【図１９Ｂ】図１９Ａの定性的比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本出願において指定される種々の範囲の数値の使用は、特に明示しない限り、記載される範囲の中の最小値および最大値の前に共に「約」がつけられるような近似値として述べられる。このように、記載される範囲の上下の僅かな変動は、範囲内の数値とほぼ同一の結果を実現するために使用可能である。また、特に指示されない限り、範囲の開示は、最小値と最大値との間のあらゆる値を含む連続する範囲であることが意図される。本明細書で使用されるように、単数形は１つ以上を表す。
【００１４】
本明細書で使用されるように、用語「〜を備える」は制約がなく、「〜を含む」、「〜を含有する」または「〜を特徴とする」と同義であってもよい。用語「本質的に〜から構成される」は、指定される材料または工程ならびに特許請求される発明の基本的な特徴および新規な特徴に実質的に影響を与えない材料または工程に請求の範囲の範囲を限定する。用語「〜から構成される」は、請求の範囲で指定されないあらゆる要素、工程または成分を除外する。本明細書で使用されるように、１つ以上の記載される要素または工程「を備える」実施形態は、記載されるそれらの要素または工程「から本質的に構成される」および「から構成される」実施形態も含むが、それらに限定されない。
【００１５】
種々の組織のうちのいずれかから採取された可溶化細胞外マトリクスを含む細胞外マトリクス（ＥＣＭ）由来の組成物を調製する方法を説明する。関連する組成物、装置および使用方法も説明する。組成物は逆ゲル化しており、すなわち、組成物の下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を超えて約３７℃に近い生理的温度まで加熱された時にマトリクスの粘度は増加する。非限定的な一実施形態によれば、ＥＣＭ由来の組成物は、３７℃より低い温度では注入可能な溶液であるが、３７℃の生理的温度ではゲルである。特定の実施形態によれば、無損傷ＥＣＭの全体が可溶化され、ＥＣＭ構造成分または機能成分を除去するかまたは非活性化するために透析、架橋および／または処理されることがないので、生理活性の高いゲル足場が得られる。ＥＣＭ由来のゲルを調製するための一般的な一連の原理は、膀胱、脾臓、肝臓、心臓、腎臓、卵巣、小腸、大腸、結腸、中枢神経系（ＣＮＳ）、脂肪組織および骨を含む多数の組織からゲルを調製するための特定のプロトコルと共に提供される。ＥＣＭ由来の組成物を逆ゲル化する非限定的な例は、特許文献１、特許文献２ならびに特許文献３および特許文献４で説明される。
【００１６】
本明細書で使用されるように、「最終滅菌」または「最終滅菌される」は、本質的または実質的に組成物または装置の完全な殺菌を表す。これは、例えば、無細胞化の一部または補助としてのＥＣＭ生成物の調製中の過酢酸による消毒を含まない。例えば、０．１％（ｖ／ｖ）の過酢酸（σ）、４％（ｖ／ｖ）のエタノールおよび９６％（ｖ／ｖ）の滅菌水の中に２時間浸漬することにより、ＥＣＭ組成物を消毒できる。その後、ＥＣＭ材料をＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）で１５分ずつ２回洗浄し、さらに脱イオン水で１５分ずつ２回洗浄する。これは消毒として特徴付けられるが、通常、現在の規制実施の下では最終滅菌方法としては許容されない。最終滅菌中に、生成物は、生存微生物を殺すことが検証済みである処理に曝される。ＥＣＭ生成物に関して言えば、可溶化、貯蔵および／または商用配布の前に無細胞化ＥＣＭ材料を最終滅菌に曝すことができる。当該技術では、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、ガンマ線照射、電子ビーム照射、ガスプラズマ殺菌および超臨界二酸化炭素への暴露（例えば、非特許文献１を参照）を含む種々の最終滅菌の方法が知られている。
【００１７】
組成物は、蛋白質材料を架橋させるグルタルアルデヒドによる処理によって消毒されてもよいが、この処理は、材料が徐々に再吸収されるかまたは全く吸収されず、構成的リモデリングではなく瘢痕組織の形成または被嚢により厳密に類似する異なる種類の宿主性リモデリングを励起するように材料を実質的に変化させる。蛋白質材料の架橋は、カルボジイミドまたは脱水加熱または光酸化の各方法によっても誘起される可能性がある。架橋したＥＣＭ材料は、本明細書に記載される目的にかなう無損傷ＥＣＭではないと考えられる。
【００１８】
以下の実施例で示されるように、最終滅菌のタイミングは、消化済み可溶化ＥＣＭ材料が逆ゲル化によりヒドロゲルを形成する能力に相当大きな影響を及ぼす。殺菌は、乾燥した酸性プロテアーゼ消化済みＥＣＭ組成物に対して実行される。「乾燥した」または「乾燥された」は、実際にはどの組成物からも文字通り全ての水分子を除去することが不可能であることを認識したうえで、組成物から実質的に全ての水分が除去される段階まで乾燥または凍結乾燥されることを意味する。したがって、「乾燥した」または「乾燥された」は、例えば、組成物の５．０重量パーセント（ｗｔ％）、１．０ｗｔ％、０．５ｗｔ％、０．１ｗｔ％、０．０１ｗｔ％、０．００１ｗｔ％または０．０００１ｗｔ％未満の含水率を表すが、それに限定されない。材料は、例えば、室温などの何らかの非損傷温度での単純な蒸発または凍結乾燥（フリーズドライ）等の何らかの処理により乾燥させることが可能であるが、乾燥方法はそれらに限定されない。
【００１９】
一実施形態によれば、細胞外マトリクス由来のゲルを調製する方法が提供される。この方法では、消化物溶液を生成するために、酸性溶液中でトリプシンまたはペプシンなどの酸性プロテアーゼによる消化によって、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）、例えば無損傷ＥＣＭが可溶化される。消化物溶液は、例えば自然乾燥または凍結乾燥により乾燥される。溶液が乾燥した後、乾燥した溶液は、例えば電子ビームまたはガンマ線照射、あるいはエチレンオキシドガスまたは超臨界二酸化炭素への暴露により最終滅菌される。この乾燥状態、例えば凍結乾燥状態で組成物を貯蔵し、梱包しかつ／または配布することができる。次に、殺菌消化物溶液を生成するために、殺菌された材料は、例えば水の中で溶解させるか、ＧＴＲＩＳ緩衝液またはＰＢＳなどの水溶液の中で溶解させるか、あるいは（０．９％）生理食塩水などの塩化ナトリウム溶液のような塩溶液の中で溶解させることにより水和される。次に、中和消化物溶液を生成するために、殺菌消化物溶液は、例えば、溶液を等張緩衝液またはＮａＯＨなどの塩基と混合することにより７．２〜７．８のｐＨにされるが、塩基はＮａＯＨに限定されない。溶液は２５℃を超える温度でゲル化する。７．２〜７．８のｐＨでＰＢＳなどの緩衝液の中で乾燥した殺菌組成物を再水和することにより、再水和、中和およびオプションとしてのゲル化の過程を組み合わせてもよく、これにより、再水和および中和の工程は同時に実現され、再水和溶液が２５℃を超えると、溶液はゲル化し始めるだろう。ゲル化の過程を制御し、組成物をさらに均一に再水和するために、温度を２０〜２５℃未満に維持することが望ましいだろう。
【００２０】
本明細書で説明される組成物は、例えば、最も典型的には外傷または疾病により引き起こされた組織の欠損を矯正するために修復または増強の必要がある骨または軟組織である組織に対する注入可能組織移植片（例えば、異種移植、同種異系移植または自己移植）などの用途に使用されるが、用途はそれに限定されない。組成物は、例えば、美容外科手順または外傷治療のための外科手順で使用するために所望の形状に整形された成形構成物を含むインプラント構成物の充填材として使用されてもよい。
【００２１】
組成物は、いくつかの方法により患者（ヒトまたは動物）に移植されてもよい。非限定的な一実施形態では、組成物は液体として患者の体内の所望の部位に注入される。本明細書で使用されるように、用語「播種」、「播種する」または「播種される」は、定義された容積の細胞懸濁液または定義された数の細胞を特定の組成物の中に添加すること、取り入れること、増殖させることまたは拡散させることを表す。細胞のせん断を防止するために、組成物に事前に細胞が播種され、その後、孔の大きい針、例えば１６ゲージの針を使用して、組成物が注入されるのが好ましい。非限定的な別の実施形態では、組成物は成形型の中でゲル化し、その後、ゲル化した成形生成物が患者の体内の所望の部位に移植される。ゲル化した成形生成物は、患者の細胞などの細胞と共に事前に播種されてもよい（成形ゲルの上に載置されるかまたはゲル化中に混合される）。
【００２２】
本明細書で使用されるように、用語「細胞外マトリクス」または「ＥＣＭ」は、哺乳動物およびヒトなどの多細胞生物で見られる組織の無細胞化により調製される細胞成長のための天然足場を表す。ＥＣＭは、例えば透析または架橋によりさらに処理できる。ＥＣＭは、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、抗菌剤、化学誘引物質、サイトカインおよび／または成長因子を含むがそれらに限定されない構造生体分子および非構造生体分子の複雑な混合物である。哺乳動物の場合、ＥＣＭは約９０％のコラーゲンを種々の形態で含むことが多い。ＥＣＭの組成および構造は、組織の供給源によって異なる。例えば、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、膀胱マトリクス（ＵＢＭ）および肝臓間質のＥＣＭは、各組織に必要とされる独自の細胞ニッチによって、全体的な構造および組成がそれぞれ異なる。
【００２３】
本明細書で使用されるように、用語「無損傷細胞外マトリクス」および「無損傷ＥＣＭ」は、本明細書で説明される粉砕ＥＣＭのように、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、抗菌剤、化学誘引物質、サイトカインおよび／または成長因子を含むがそれらに限定されない構造生体分子および非構造生体分子の活動を保持する細胞外マトリクスを表すが、無損傷ＥＣＭは以下に説明される粉砕ＥＣＭに限定されない。例えばＥＣＭを架橋および／または透析することにより、ＥＣＭ内部における生体分子の活動を化学的または機械的に取り除くことができる。無損傷ＥＣＭは、本質的に架橋および／または透析されておらず、すなわち、ＥＣＭは、透析処理および／または架橋処理、あるいは本明細書で説明されるように可溶化の前のＥＣＭの貯蔵および処理の間に自然に起こる過程以外の条件に曝されていない。したがって、実質的に架橋および／または透析された（本明細書で説明される用途におけるＥＣＭのゲル化および機能的特性にほぼ影響しない些末な方法以外の方法で）ＥＣＭは、「無損傷」ではないと考えられる。
【００２４】
「生体適合性」は、装置、足場組成などが、その装置、足場、組成などと接触すると考えられる細胞、組織、器官および／または器官系に対して本質的に、実用的に（所期の用途に関して）および／または実質的に無毒であるか、無害であるかまたは非抑制的であることを意味する。
【００２５】
一般に、ＥＣＭ由来のゲルを調製する方法は、ＥＣＭを関心動物および関心組織または関心器官から分離することを必要とする。特定の実施形態では、ＥＣＭは哺乳動物組織から分離される。本明細書で使用されるように、用語「哺乳動物組織」は、哺乳動物から取り出された組織を表し、組織は動物の何らかの細胞成分を含む。例えば、細胞の集合体、器官、器官の複数の部分または器官の組み合わせから組織を取り出すことができるが、それに限定されない。特定の実施形態では、ＥＣＭは、例えばヒト、サル、ブタ、ウシおよびヒツジである脊椎動物から分離されるが、それらに限定されない。特定の実施形態では、ＥＣＭは、例えば膀胱、肝臓、ＣＮＳ、脂肪組織、小腸、大腸、結腸、食道、膵臓、真皮および心臓である動物の何らかの組織から分離されるが、それに限定されない。一実施形態では、ＥＣＭは膀胱から取り出される。ＥＣＭは、ＥＣＭの基底膜部分を含んでも含まなくてもよい。特定の実施形態では、ＥＣＭは基底膜の少なくとも一部を含む。ＥＣＭは、毛細管内皮細胞または線維細胞などの元の組織を構成していた細胞要素のうちのいくつかを保持しても保持しなくてもよい。
【００２６】
本明細書で使用されるように、用語「由来」ならびに「由来の」および「由来する」などの同語源の他の語形態ではあるがそれらに限定されない用語は、記載される何らかの供給源から何らかの有用な方法により採取される１つ以上の構成要素を表す。例えば、ＥＣＭ由来のゲルは、当該技術でＥＣＭを分離する方法として知られているいくつかの方法により何らかの組織から採取されたＥＣＭの構成要素から構成されるゲルを表す。別の例では、哺乳動物組織由来のＥＣＭは、何らかの有用な方法により哺乳動物から採取された哺乳動物組織の構成要素から構成されたＥＣＭを表す。
【００２７】
関心組織の分離に続いて、例えば高張生理食塩水、過酢酸、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘまたは他の洗浄剤への暴露である種々の方法により無細胞化が実行されるが、無細胞化の方法はこれに限定されない。次に、無細胞化されたＥＣＭを凍結乾燥（フリーズドライ）または自然乾燥により乾燥させることができる。断裂、製粉、切削、研削およびせん断を含むがそれらに限定されない方法により、乾燥したＥＣＭを粉砕することができる。例えば凍結状態またはフリーズドライ状態での研削または製粉である方法により、粉砕されたＥＣＭをさらに粉末形態に処理できるが、処理方法はそれに限定されない。
【００２８】
本明細書で使用されるように、用語「粉砕する」および「粉砕」および「粉砕している」などの同語源の他の語形態ではあるがそれらに限定されない用語は、研削、混合、寸断、スライシング、製粉、切削、寸断を含むがそれらに限定されない方法により大きな粒子をより小さな粒子に縮小する処理を表す。ＥＣＭは、水和形態、凍結形態、自然乾燥形態、凍結乾燥形態、粉末化形態、シート形態を含むがそれらに限定されないどのような形態であっても粉砕可能である。
【００２９】
可溶化ＥＣＭ組織を調製するために、消化物溶液を形成するように、粉砕されたＥＣＭは酸性溶液の中で酸性プロテアーゼによって消化される。本明細書で使用されるように、用語「酸性プロテアーゼ」は、ペプチド結合を切断する酵素を表し、この酵素は、酸性のｐＨでペプチド結合を切断する活動性を増加している。例えば酸性プロテアーゼはペプシンおよびトリプシンを含むことができるが、それらに限定されない。
【００３０】
ＥＣＭの消化物溶液は、通常、室温で特定の長さの時間にわたり絶えず撹拌される状態で保持される。ＥＣＭ消化物は直ちに使用可能であるか、−２０℃で貯蔵されるか、あるいは例えば−２０℃または−８０℃ではあるがそれらには限定されない温度で凍結され、本明細書で説明される方法および組成物に関連して乾燥され、殺菌されることも可能である。次に、中和消化物溶液を生成するために、消化物溶液のｐＨは７．２〜７．８のｐＨに上げられる。例えばＮａＯＨまたはｐＨ７．４のＰＢＳなどであるがそれに限定されない塩基または等張緩衝溶液のうちの１つ以上を添加することによりｐＨを上げることができる。通常、方法は、ゲル化の前に透析工程を含まず、それにより、通常はＥＣＭに匹敵するコラーゲンまたは透析したＥＣＭの調製の場合より低速で３７℃でゲル化するさらに完全なＥＣＭ状マトリクスを得られる。したがって、ゲルは患者にさらに注入しやすく、また、サイトカインなどであるがそれに限定されない多くの天然の可溶性因子を保持するために、天然のＥＣＭの品質の多くを保持する。種々の組織から成形型に入れて使用するかまたは現場で使用するのに適するキネティクスを有するゲルに調製される非透析（全ＥＣＭ）調製物の能力は予期しないものである。
【００３１】
本明細書で使用されるように、用語「等張緩衝溶液」は、７．２〜７．８のｐＨに緩衝されかつ等張環境を促進するために均衡の保たれた塩の濃度を有する等張溶液を表す。本明細書で使用されるように、用語「塩基」は、７を超えるｐＨを有する何らかの化合物または化合物の溶液を表す。例えば、塩基はアルカリ性水酸化物またはアルカリ性水酸化物の水溶液である。特定の実施形態では、塩基はＮａＯＨまたはＰＢＳ中のＮａＯＨである。
【００３２】
この中和消化物溶液をその時点で、例えば約３７℃であるがそれには限定されない適切な温かい温度で培養し、ゲル化させることができる。中和消化物溶液は、例えば−２０℃または−８０℃であるがそれには限定されない温度で凍結し、貯蔵することができる。本明細書で使用されるように、用語「中和消化物溶液」または「中和消化物」は、ｐＨを上げた消化物または消化物溶液を表し、溶液または乾燥組成物の形態であることが可能である。例えば、中和消化物は７．２〜７．８のｐＨを有するが、それに限定されない。
【００３３】
本明細書で説明される方法、組成物および装置において、材料が最終滅菌されない限り、どのような種類の細胞外マトリクス組織でも使用可能である（一般に、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９、特許文献２０、特許文献２１、特許文献２２、特許文献２３、特許文献２４、特許文献２５、特許文献２６、特許文献２７、特許文献２８、特許文献２９、特許文献３０および特許文献３１を参照）。特定の実施形態では、ＥＣＭは脊椎動物から、例えばヒト、サル、ブタ、ウシおよびヒツジを含むがそれらに限定されない定温哺乳脊椎動物から分離される。ＥＣＭは、膀胱、腸、肝臓、食道および真皮を含むがそれらに限定されない何らかの器官または組織に由来することが可能である。一実施形態では、ＥＣＭは膀胱から分離される。別の実施形態では、ＥＣＭは腸またはその一部から分離される。腸は幽門括約筋から肛門まで続き、幽門弁から回盲弁まで続く小腸、回盲弁から延び、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、虫垂、上行結腸、横行結腸、下行結腸およびＳ状結腸の各部分を含む大腸、直腸および／または肛門管を含む（例えば、非特許文献２を参照）。ＥＣＭは、ＥＣＭの基底膜部分を含んでも含まなくてもよい。特定の実施形態では、ＥＣＭは、基底膜部分の少なくとも一部を含む。
【００３４】
創傷の治癒または組織再生の間に補充される所期の細胞の種類、置換される組織器官の天然の組織構造、ＥＣＭの組織供給源の可用性、あるいは最終的な足場の品質および足場を製造する可能性に影響を及ぼす他の要因に応じて、足場で使用されるＥＣＭの種類は異なる可能性がある。例えば、ＥＣＭは基底膜面および非基底膜面の双方を含んでもよく、これは、いずれも基底膜成分および非基底膜成分を有する膀胱、食道または血管などの組織の再構成を促進するのに有用だろう。しかし、それに限定されない。
【００３５】
非限定的な一実施形態では、ＥＣＭは、ブタの膀胱から採取される（膀胱マトリクスまたはＵＢＭとしても知られる）。簡単に言えば、ブタから膀胱組織を取り出し、脂肪組織を含む外部結合組織をトリミングすることにより、ＥＣＭを調製する。水道水による洗浄を繰り返すことにより、全ての残尿を除去する。まず、例えば高張生理食塩水、例えば１．０Ｎ生理食塩水であるがそれには限定されない食塩水である上皮分離溶液の中に１０分から４時間の範囲の時間にわたり組織を浸漬することにより、組織を離層する。高張生理食塩水に曝すことにより、下部の基底膜から上皮細胞を除去する。生理食塩水にカルシウムキレート剤が任意に添加されてもよい。初期上皮分離手順の後に残留する組織は、上皮基底膜および上皮基底膜に対する反管腔側の組織層を含む。次に、反管腔側組織の大部分を除去する一方で、上皮基底膜および固有層を維持するために、この組織を更なる処理に曝す。機械的剥離により、あるいは酵素処理（例えば、トリプシンまたはコラゲナーゼを使用する）とその後に続く水和および剥離との組み合わせにより、外部漿膜、外膜、筋層粘膜、粘膜下層および粘膜筋の大部分が残留上皮分離組織から除去される。これらの組織の機械的な除去は、例えばアドソン−ブラウン鉗子およびメッツェンバウム剪刃ではあるがそれらには限定されない鉗子および剪刃により腸間膜組織を除去し、湿潤ガーゼに包んだメスハンドルまたは他の剛性物体による長手方向拭き取り運動を使用して筋層および粘膜下層を拭き取ることにより実現される。切刃、レーザーおよび他の組織分離方法を含むロボットによる自動化手順も考えられる。これらの組織が除去された後、得られるＥＣＭは主に上皮基底膜およびその下部にある固有層（図３の層ＢおよびＣ）から構成される。
【００３６】
別の実施形態では、メスハンドルおよび湿潤ガーゼによる長手方向拭き取り運動を使用して、漿膜層および筋層（図３の層ＧおよびＦ）の双方を含む外部層を除去するために、ブタ膀胱組織を磨滅させることによりＥＣＭを調製する。組織部分の外転の後に、同一の拭き取り運動を使用して、粘膜層（図３の層Ｈ）の管腔側部分を下部組織から剥離する。粘膜下組織（図３の層Ｅ）の穿孔を防止するように留意する。それらの組織の除去後、得られるＥＣＭは主に粘膜下層（図３の層Ｅ）から構成される。
【００３７】
多数のＥＣＭ調製物が市販されており、数多くの処理により調製されている。市販の小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）調製物は、ＳｕｒｇｉｓｉｓＴＭ、Ｓｕｒｇｉｓｉｓ−ＥＳＴＭ、ＳｔｒａｔａｓｉｓＴＭおよびＳｔｒａｔａｓｉｓ−ＥＳＴＭ（インディアナ州インディアナポリスのＣｏｏｋ  Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ社）ならびにＧｒａｆｔＰａｔｃｈＴＭ（マサチューセッツ州カントンのＯｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ社）を含むが、それらに限定されない。市販の真皮調製物は、ＰｅｌｖｉｃｏｌＴＭ（欧州ではＰｅｒｍａｃｏｌＴＭとして販売されている。ジョージア州コヴィントンのＢａｒｄ社）、ＲｅｐｌｉｆｏｒｍＴＭ（マサチューセッツ州ボストンのＭｉｃｒｏｖａｓｉｖｅ社）およびＡｌｌｏｄｅｒｍＴＭ（ニュージャージー州ブランチバーグのＬｉｆｅＣｅｌｌ社）を含むが、それらに限定されない。市販の膀胱調製物は、ＵＢＭ（メリーランド州ジェサップのＡｃｅｌｌ社）を含むが、それに限定されない。これらのＥＣＭ調製物はいずれも、最終滅菌されない形態で提供可能であり、従って、本明細書で説明される方法および組成物の適切な先駆体となりうる。
【００３８】
本明細書で説明される組成物は、いくつかの方法または形態で使用可能である。例えば、第１の実施形態によれば、器官またはその一部をモデリングするために中和消化物は適切な成形型に配置されるが、それに限定されない。非限定的な一例として、肝臓組織の再生を容易にするために、組成物は肝臓の一部の中に成形される。非限定的な別の例では、組成物は、損傷した軟骨組織または切除された軟骨組織と置換するために鼻または耳の軟骨、あるいはその一部の形状に成形される。非限定的なさらに別の例では、創傷の組織の非瘢痕治癒を容易にするために、組成物は創傷の形状に成形される。成形ゲルを調製するために、中和消化物は、プラスチック成形型のような生体適合性で、好ましくは殺菌された成形型に配置され、組成物のゲル化に適する温度、例えば約３７℃であるがそれには限定されない温度でゲル化に適する時間にわたり培養される。一実施形態では、ゲル化させるために、組成物および成形型は３７℃の培養器の中に配置される。ＣＯ２はゲル化を遅延させることがわかっているので、非限定的な一実施形態では、培養器の中にＣＯ２は注入されないが、別の実施形態では、ゲル化過程を制御するためにＣＯ２および／または温度が使用されてもよい。
【００３９】
ゲル化の前に組成物に何らかの有用なサイトカイン、化学誘引物質または細胞を混入することができるか、あるいはゲル化した後に何らかの有用なサイトカイン、化学誘引物質または細胞をゲルにより拡散、吸収および／または吸着させることができる。例えば、有用な成分は成長因子、インターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、モノカイン、ホルモン、血管新生因子、薬剤および抗生物質を含むが、それらに限定されない。中和された可溶化ゲルに細胞を混入するか、あるいはゲル化された後の成形組成物の上に細胞を配置することができる。いずれの場合にも、ゲルに細胞が播種された時に、患者の体内に移植するための組成物を最適に／好都合に調製するために適切な時間にわたりバイオリアクタまたは培養器で適切な媒体の中で組成物を培養することにより、細胞を成長させかつ／または成形ＥＣＭゲルにより形成されるニッチに適応させることができる。細胞の内植、分化および／または適応を容易にするために、成形組成物に細胞を播種することができる。例えば、細胞は、ゲルを含む組成物／装置を受け入れるために患者に関して自己または同種異系でありうる。細胞は幹細胞または他の前駆細胞、あるいは分化細胞でありうる。一例では、損傷した皮膚および／またはその下部組織を修復する際に使用するために、患者から採取した真皮の層を成形型に播種する。
【００４０】
本明細書で使用されるように、用語「成形型」は、ゲルを３次元形状に整形するために使用される空洞または面を表す。例えば、成形型はウェルプレート、細胞培養皿または管でありうるか、あるいは何らかの有用な形状に整形されうるが、それに限定されない。特定の実施形態では、成形型を特定の器官または器官の一部の形状に整形できる。注入、成膜を含むがそれらに限定されない種々の方法で、ゲルを成形型に供給できる。
【００４１】
本明細書において使用されるように、用語「薬剤」は、抗生物質、ペプチド、ホルモン、有機分子、ビタミン、サプリメント、因子、蛋白質および化学誘引物質を含むがそれらに限定されない予防効果または治療効果を有する何らかの組成物を表す。
【００４２】
本明細書で使用されるように、用語「細胞」は、ラット、マウス、サルおよびヒトを含むが、それらに限定されない何らかの動物からの何らかの種類の細胞を表す。例えば、細胞は、幹細胞のような前駆細胞、あるいは内皮細胞または平滑筋細胞のような分化細胞であることが可能であるが、それに限定されない。特定の実施形態では、医療手順用の細胞は、自己手順のために患者から採取可能であるか、あるいは同種異系手順のために他のドナーから採取可能である。
【００４３】
予成形組織の使用の好ましい１つの態様は、積層組成物を生成できることである。例えば、移植される組成物の核部分を第１の供給源から採取した第１のＥＣＭゲルによって調製でき、周囲層は、第１の供給源とは異なるかまたは第１の供給源と同一であるがサイトカインまたは細胞などの異なる成分を含有する第２の供給源から採取した第２のＥＣＭゲルでありうる。
【００４４】
予成形組成物の別の実施形態では、ゲルに物理的強度を追加するために、ＥＣＭゲルは、ＳＩＳまたはＵＢＭなどの非粉砕、非消化ＥＣＭ組織の層シースの中に収容される。この実施形態では、ゲルを生成するために可溶化ＥＣＭ組織で成形型を充填する前に、当該技術で知られている何らかの方法で調製されたＥＣＭ組織の複数のシートを成形型に配置できる。ＥＣＭ組織のシートは、所望の形状に形成されかつ縫合または架橋されている限り、成形型として使用されてもよい。このように、ゲル単独の場合より高い物理的強度を有する固体組成物を生成できる。
【００４５】
非限定的な別の実施形態では、組成物は、中和消化物溶液として患者の体内に注入される。組成物は、細胞の成長にマトリクスが必要とされる患者の体内の軌道で注入される。例えば、損傷組織、罹患組織または癌組織の外傷、デブリドマンおよび／または除去によって患者の組織が除去してしまっている場合、組織の内植を容易にするために、組織除去の部位に組成物を注入できる。プレゲルを調製するために使用される水の量を変更することにより（例えば、水、酸、塩基、緩衝液（ＰＢＳなど）または他の希釈剤の量を変更することにより）、プレゲルの粘度を制御できる。内視鏡検査のような小ゲージ針が使用される用途では、粘度の低いプレゲルが必要とされ、通常、その結果としてプレゲルがゲル化した後、粘度の低いゲルが生成される。大ゲージ針を利用可能な用途では、ゲル化した時の強度が高くなる粘度の高いゲルを使用できる。また、プレゲルの粘度にかかわらず、ゲージの大きな針の使用は、細胞をせん断する危険性の少ない移植の直前に生細胞をプレゲルと混合するのに好都合である。
【００４６】
一実施形態では、酸性消化物溶液のｐＨを上げることにより中和消化物溶液が調製され、組成物は、ゲル化が大きく進行する前に患者の体内に直接注入される。一実施形態では、組成物は凍結状態にあり、注入前に解凍されかつ温められる。別の実施形態では、酸性消化物溶液は生理的温度まで温められ、注入中にスタティックミキサで適切な量の塩基および／またはＰＢＳなどの緩衝液と混合される。適切なスタティックミキサは、カナダオンタリオ州、コーバーグのＣａｍｍａｄａ社より市販されている螺旋形または正方形のスタティックミキサ、あるいはコネティカット州ノーウィッチのＰｌａｓ−Ｐａｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社より市販されているマイクロスタティックミキサ付きＭｉｎｉ−Ｄｕａｌ  Ｓｙｒｉｎｇｅを含むが、それに限定されない。
【００４７】
更なる実施形態では、本明細書で説明される組成物を含む市販のキットが提供される。キットは適切な包装材料および組成物を備える。非限定的な一実施形態では、キットは、容器の中に消化物溶液を含み、容器は包装材であってもよいが、包装材の中に収容されてもよい。この実施形態では、消化物溶液が中和される場合、溶液は凍結されてもよく、冷却されてもよく、例えば、約４℃未満などであるがそれには限定されない温度の氷点付近の温度に保持されてもよく、あるいは室温、例えば２０〜２５℃に保持されてもよい。非限定的な別の実施形態では、キットは、本明細書で説明される中和前消化物を含む酸性溶液を入れた第１の容器と、第１の容器の酸性溶液を中和消化物を形成するような生理的イオン強度およびｐＨにするための塩基および／または緩衝液を含む中和溶液を入れた第２の容器とを備える。更なる一実施形態では、第１の容器には、水または酸を任意に中和する適切な水溶液を使用して水和可能な最終滅菌しかつ凍結乾燥した中和前消化物が入っている。この実施形態では、先に説明したように凍結乾燥生成物を水和すると共に生成物を中和することが可能な中和溶液を入れた第２の容器が任意に提供されるか、あるいは中和溶液による中和に先立って凍結乾燥生成物を水和するのに有用な水または他の何らかの適切な溶液を入れた第３の容器が任意に提供される。このキットは、混合針および／または保冷剤を任意にさらに備える。容器は、キットの市販のための配布ルートで貯蔵しかつ運搬するのに適する小瓶、注射器、管または他の何らかの容器であってもよい。
【００４８】
キットのさらに別の実施形態では、ゲル組成物は、梱包および配布に先立って成形され、プレゲル化される。一実施形態では、成形ゲルは、当該技術でよく知られているように、プラスチック容器ならびに紙、プラスチックおよび／または箔より成る密封部分を備えるブリスタパックに梱包される。成形物および梱包材は、通常、梱包前または梱包後に、例えばガンマ線照射、電子ビーム照射または超臨界ＣＯ２により殺菌されるが、殺菌方法はそれに限定されない。ＰＢＳまたは生理食塩水などの何らかの適切な生理的溶液で成形組成物を包み込んでもよい。成形ゲルが生細胞を含む場合、密封ジャーまたは他の容器内の適切な細胞培養媒体に入れて成形物を搬送できる。言うまでもなく、細胞を保存するためには、細胞を含有する成形ゲルを迅速に出荷しなければならないだろう。
【００４９】
本明細書で使用するように、用語「ハイブリッド無機／ＥＣＭ足場」は、金属、水酸化カルシウム、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムなどの無機カルシウム化合物、あるいはセラミック組成物を含むがそれに限定されない生体適合性無機構造を被覆したＥＣＭ由来のゲルを表す。一実施形態では、ＥＣＭ由来のゲルの無機構造への被覆を助けるために超音波処理が使用される。本明細書で使用されるように、用語「超音波処理」は、１５ｋＨｚより高くかつ４００ｋＨｚより低い周波数の超音波に曝す処理を表す。
【００５０】
本明細書で使用されるように、用語「被覆」ならびに「被覆された」および「被覆する」などの関連同源語は、無機構造をＥＣＭ由来のゲルまたはハイブリッド無機／ＥＣＭ足場で被覆することから成る処理を表す。例えば、ＥＣＭ由来のゲルによる無機構造の被覆は、流し込み、埋め込み、積層、浸漬、噴霧などの方法を含みうるが、それらに限定されない。
【００５１】
本明細書で説明される技術の別の実施形態では、組成物は、金属、水酸化カルシウム、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムなどの無機カルシウム化合物、あるいはセラミック組成物のような生体適合性構造材料で被覆される。適切な金属の非限定的な例は、コバルト−クロム合金、ステンレス鋼合金、チタン合金、タンタル合金、チタン−タンタル合金であり、それらの合金は、モリブデン、タンタル、ニオブ、ジルコニウム、鉄、マンガン、クロム、コバルト、ニッケルアルミニウムおよびランタンのような非金属成分および金属成分を含むことができ、種々の等級のＣＰ  Ｔｉ（市販の純チタン）またはＴｉ６Ａｌ４Ｖ（９０ｗｔ％のＴｉ、６ｗｔ％のＡｌおよび４ｗｔ％のＶ）、ステンレス鋼３１６、ニチノール（ニッケル−チタン合金）、ヒドロキシアパタイトで被覆されたチタン合金を含むが、それらに限定されない。金属は、強度が高く、可撓性および生体適合性を有するので有用である。また、金属は複雑な形状に整形可能であり、多くの金属は、生物学的環境で腐食に耐えかつ摩耗を低減させることができ、組織に損傷を与えない。非限定的な一例では、金属は、股関節部の修復に使用される大腿骨または関節の構成要素である。別の例では、金属は、義肢を患者に永久的に装着する際に使用される繊維または他の隆起である。例えば、骨格構造または歯構造の修復または再形成の際、セラミックス、アラゴナイトであるがそれには限定されないようなカルシウム化合物を含む他の組成物が好ましいだろうが、用途はそれに限定されない。金属、セラミックおよび／または他の材料の組み合わせも有用であることがわかるだろう。例えば、股関節部置換の金属代替構成要素は、セラミックボールを備えてもよくかつ／または関節構成要素の場合のようにボール表面にプラスチック被膜を備えてもよい。
【００５２】
金属ならびに他の材料は、ワイヤ、箔、ビード、棒およびナノ結晶性粉末を含む粉末を含むがそれらに限定されない異なる形態で適宜有用となりうる。生理食塩水処理による表面不活性化、生体適合性プラスチックまたはセラミック、あるいは複合金属／セラミック材料による被覆など、生体適合性を確保するために、金属または他の材料の組成および表面を変更することも可能である。材料およびそれらの使用方法は、本発明の分野ではよく知られている。
【００５３】
患者の骨格構造を修復するための金属インサートに伴う問題点は、インサートを既存の骨格部分に固着／装着しなければならないことである。従来の方法はセメントおよび／またはねじを採用する。義肢の場合、典型的にはセメント接合による場合を除き、義肢は患者の組織には接続されない。したがって、患者の組織を医療装置に生物学的に装着することが望ましい。この装着は、インプラントの表面に本明細書で説明されるＥＣＭゲルで被覆することにより実現されてもよく、この方法により、組織の内植が容易になり、その結果、装置の装着が容易になる。ＥＣＭゲルが浸潤でき、後に細胞または他の組織（例えば、骨）が浸潤できる足場を形成するために、種々の多孔質構造をインプラントに装着できる。構造は、織メッシュまたは不織メッシュ、スポンジ状多孔質材料、溶融ビードなどを含むが、それらに限定されない。多孔質足場は、骨を含む生組織と装置との間に強力な接合の形成を容易にする。多孔質足場の「孔」は、足場へのゲルの浸透を助け、その後、骨、軟骨、腱、靭帯、筋膜または他の結合組織などの細胞または他の生物材料の足場への浸透を助けると考えられる超音波処理または他の処理により任意に容易になるＥＣＭゲルの浸潤を可能にするような大きさであればどのような大きさであってもよい。一実施形態では、金属繊維は、装置に装着され、本明細書で説明するＥＣＭゲルで被覆されることにより、繊維内での組織の内植が可能になる。第２の実施形態では、装置の表面に小型ビードのマトリクスが溶接されるかまたは装着され、本明細書で説明されるＥＣＭゲルをビードマトリクスに被覆することにより、ビード間における組織の内植が容易になる。一例では、装置は繊維の隆起を含み、繊維の隆起は骨の内側に挿入されることにより、金属繊維と骨との融合を可能にする。一実施形態では、骨の内植を容易にするために、自己骨芽細胞のような適切な細胞集団がＥＣＭゲルに播種され、培養される。
【００５４】
別の実施形態では、大腿骨インプラント、義手などを含むがそれらに限定されない他の構造インプラントを被覆するために、ハイブリッド無機／ＥＣＭ足場も使用できる。図１は、股関節置換手順で大腿骨１５に挿入された装置１０の一実施形態を概略的に示す。図１は装置１０を例示し、大腿骨１５に挿入するためのインサート部分２０と、ボール（図示せず）がねじ止めまたは挿入される延出部分２５とを示す。装置１０は、例えば、装置１０に溶接された金属ビードであるがそれには限定されない多孔質被膜３０を備える。図１の領域Ａは、装置１０の被膜３０の拡大図を示す。ビード３２は装置１０の金属面３４に溶接される。ビード３２の上およびビード３２の間がＥＣＭゲル３６で被覆される。ＥＣＭゲル３６の存在は、ビード３２の中への骨組織の成長を助ける。
【００５５】
義肢も、多孔質被膜を有するインサートを使用して同様に骨に固着されてよく、多孔質被膜は、患者の組織への装着が望まれる限界まで延設される。一例として、図２に示されるように、義手１００は外側部分１１５および内側部分１２０を備え、内側部分１２０は橈骨インサート部分１２２および尺骨インサート部分１２４を備える。多孔質被膜１３０は、骨への装着のためにインサート部分１２２および１２４から外側部分１１５が開始部分まで延設されて、真皮および骨と真皮との間の中間組織の付着を可能にする。
【００５６】
本明細書で説明されるような装置（例えば、義肢）に中和プレゲルで被覆でき、その後、中和プレゲルをゲル化させるためにゲルの温度を上昇させる。別の実施形態では、装置または義肢に酸性プレゲルで被覆する。次に、装置に被覆されたプレゲルを乾燥、例えば、凍結乾燥させることができ、装置全体を最終滅菌し、続いて梱包および配布できる。装置の凍結乾燥生成物をエンドユーザの手で水和し、水、生理食塩水またはＰＢＳを装置に与えることにより中和し、その後またはそれと同時に装置の温度を例えば３７℃を超える温度まで上昇させることができる。
【００５７】
使用中、本明細書で説明されるように適切な足場およびＥＣＭゲルで被覆された装置は、例えば、患者の細胞または同種異系細胞と接触する可能性があり、細胞はマトリクスに浸潤する。細胞の内植または浸潤は、方法の最適化に応じて、生体内または生体外で起こりうる。例えば、大腿骨であるがそれには限定されないインプラントの場合、インプラントを大腿骨および患者の細胞ならびに所望の骨組織に挿入でき、装置を骨と融合するために足場は浸潤する。別の実施形態では、人工腱または人工靭帯の場合、自己靭帯移植片または自己腱移植片を作成するために、患者の腱または靭帯の生検を適切な足場によって培養する。
【００５８】
実施例
実施例１−ブタ細胞外マトリクス（ＥＣＭ）（ＵＢＭ）の調製
ＵＢＭの調製については上述した［非特許文献３］。簡単に言えば、生後６か月の１０８〜１１８ｋｇのブタ（インディアナ州ホワイトシャーハムロック）から安楽死の直後にブタ膀胱を採取した。漿膜表面から結合組織および脂肪組織を除去し、水道水による洗浄を繰り返すことにより残尿を全て除去した。漿膜、外部筋層、粘膜下層および筋層粘膜の大部分を機械的に除去した。組織を１．０Ｎ生理食塩水に浸漬することにより粘膜の尿路上皮を管腔表面から解離して、基底膜およびその下の固有層から構成される膀胱マトリクス（ＵＢＭ）と呼ばれる生体材料を得た。膀胱の壁ならびにその中に含まれる構造の横断面図に関しては図３を参照。
【００５９】
ＵＢＭシートを撹拌器で、０．１％（ｖ／ｖ）の過酢酸、４％（ｖ／ｖ）のエタノールおよび９５．９％（ｖ／ｖ）の滅菌水を含有する溶液の中で２時間にわたり消毒した。殺菌リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ＝７．４）で１５分ずつ２回、滅菌水で１５分ずつ２回にわたり洗浄することにより、残留する過酢酸を除去した。次に、ＵＢＭシート（図４Ａに示す）は、ＦＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｕｌｋ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｅｒモデル８−５４を使用して凍結乾燥され（図４Ｂ）、Ｗｉｌｅｙ  Ｍｉｎｉ  Ｍｉｌｌを使用して粉末化された。
【００６０】
１ｇの凍結乾燥ＵＢＭ粉末（図４Ｂ）と、１００ｍｇのペプシンとを共に１００ｍｌの０．０１Ｍ  ＨＣｌの中で混合した。溶液を室温（２５℃）で最長４８時間まで絶えず撹拌される状態で保持した。ペプシンによる消化後、消化物溶液（図４Ｃ）を等分し、使用するまで−２０℃で貯蔵した。完成後の溶液を消化物溶液またはＥＣＭ消化物またはＥＣＭ貯蔵溶液と呼ぶ。
【００６１】
実施例２−ブタ脾臓ＥＣＭの調製
新鮮な脾臓組織を採取した。スライシングにより脾臓膜の外側の層を除去し、残留する層を均一な切片に切断した。外膜の残遺物をトリミングし、水中で３回洗浄した。ふるいを使用することにより水を濾過した。マッサージングにより脾臓細胞を溶解させた。湯せんにより０．０２％トリプシン／０．０５％ＥＤＴＡの３７℃の溶液の中で１時間にわたり脾臓スライスを培養した。必要に応じて、マッサージングにより脾臓細胞をさらに溶解させた。水洗後、スライスを３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液に浸漬し、シェーカー上に１時間載置した。必要に応じて、マッサージングにより脾臓細胞をさらに溶解させた。次に、スライスを４％のデオキシコール酸溶液に浸漬し、シェーカー上に１時間載置した。完全に水洗した後、更なる処理のために精製脾臓ＥＣＭを貯蔵した。次に、この組織を過酢酸処理によって消毒し、乾燥させた。
【００６２】
１ｇの乾燥ブタ脾臓ＥＣＭと１００ｍｇのペプシンとを共に１００ｍｌの０．０１Ｍ  ＨＣｌの中で混合した。溶液を室温（２５℃）で最長７２時間まで絶えず撹拌される状態で保持した。溶液中に浮遊する目に見えるＥＣＭの断片が存在しなければ、試料を等分し、凍結（−２０℃）させるかまたは直ちに使用する。
【００６３】
実施例３−ブタ肝臓間質ＥＣＭの調製
新鮮な肝臓組織を採取した。余分な脂肪および組織をトリミングした。スライシングにより肝臓膜の外層を除去し、残留組織を複数の均一な切片に切断した。メスまたはカミソリの刃を使用して外膜の残遺物をトリミングし、次に、水中で３回洗浄した。ふるいを使用することにより水を濾過した。マッサージングにより細胞を溶解させた。湯せんにより３７℃の０．０２％トリプシン／０．０５％ＥＤＴＡの溶液の中で１時間にわたり肝臓スライスを培養した。必要に応じて、マッサージングにより細胞をさらに溶解させた。水洗後、スライスを３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液に浸漬し、シェーカー上に１時間載置した。必要に応じて、マッサージングにより細胞をさらに溶解させた。次に、スライスを４％のデオキシコール酸溶液に浸漬し、シェーカー上に１時間載置した。完全に水洗した後に、更なる処理のために精製肝臓間質を脱イオン水の中で貯蔵した。次に、この組織を過酢酸処理によって消毒し、乾燥させた
１ｇの乾燥ブタ肝臓間質ＥＣＭと１００ｍｇのペプシンとを共に１００ｍｌの０．０１Ｍ  ＨＣｌの中で混合した。溶液を室温（２５℃）で最長２４〜４８時間にわたり絶えず撹拌される状態で保持した。溶液中で浮遊する目に見えるＥＣＭの断片が存在しなければ、試料を等分し、凍結（−２０℃）させるかまたは直ちに使用する。
【００６４】
実施例４−ヒト肝臓間質ＥＣＭの調製
新鮮な肝臓組織を採取した。余分な脂肪および組織をトリミングした。スライシングにより肝臓膜の外層を除去し、残留組織を複数の均一な切片に切断した。メスまたはカミソリの刃を使用して外膜の残遺物をトリミングし、次に、水中で３回洗浄した。ふるいを使用することにより水を濾過した。マッサージングにより細胞を溶解させた。湯せんにより３７℃の０．０２％トリプシン／０．０５％ＥＤＴＡの溶液の中で１時間にわたり肝臓スライスを培養した。必要に応じて、マッサージングにより細胞をさらに溶解させた。水洗後、スライスを３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液に浸漬し、シェーカー上に１時間載置した。必要に応じて、マッサージングにより細胞をさらに溶解させた。次に、スライスを４％のデオキシコール酸溶液に浸漬し、シェーカー上に１時間載置した。完全に水洗した後に、更なる処理のために精製肝臓間質を脱イオン水の中で貯蔵した。次に、この組織を過酢酸処理によって消毒し、乾燥させた。
【００６５】
１ｇの乾燥ヒト肝臓間質ＥＣＭと２００ｍｇのペプシンとを共に５０ｍｌの０．０１Ｍ
ＨＣｌの中で混合した。溶液を室温（２５℃）で最長３〜５日間にわたり絶えず撹拌される状態で保持した。溶液を毎日監視する必要がある。溶液中に浮遊するＥＣＭの目に見える断片が存在しなければ、試料を等分し、凍結（−２０℃）させるかまたは直ちに使用する。
【００６６】
実施例５−ブタ心臓ＥＣＭの調製
１ｇの乾燥ブタ心臓ＥＣＭを１００ｍｇのペプシンと共に５０ｍＬの０．０１Ｍ  ＨＣｌの中で混合した。溶液を室温（２５℃）で最長４８時間にわたり絶えず撹拌される状態で保持した。
【００６７】
実施例６−ブタ膵臓ＥＣＭの調製
１ｇの乾燥脱脂ブタ膵臓ＥＣＭを１００ｍｇのペプシンと共に５０ｍＬの０．０１Ｍ  ＨＣｌの中で混合した。溶液を室温（２５℃）で最長４８時間にわたり絶えず撹拌される状態で保持した。
【００６８】
実施例７−ブタ卵巣ＥＣＭの調製
採取から６時間以内に新鮮な卵巣組織を入手した。卵巣を取り出し、解剖の準備が整うまで生理食塩水の中で貯蔵し、残留する子宮組織を除去した。卵巣門を通して長手方向に切開し、卵胞を破壊させた。全ての卵胞が破壊した後に、卵巣からＥＣＭを採取した。濾水の中で３回洗浄し、ふるいを使用して水を濾過した。緩やかなマッサージングにより細胞を溶解させた。湯せんにより３７℃の０．０２％トリプシン／０．０５％ＥＤＴＡの溶液の中で１時間にわたりＥＣＭを培養し、次に水洗した。必要に応じて、マッサージングにより細胞をさらに溶解させた。ＥＣＭを３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液に浸漬し、シェーカー上に１時間載置した。水洗後、必要に応じてマッサージングにより細胞をさらに溶解させた。次に、スライスを４％のデオキシコール酸溶液に浸漬し、シェーカー上に１時間載置した。残留する界面活性剤を除去するために完全に水洗した後に、後で使用するまで殺菌／濾水の中でＥＣＭを貯蔵した。次に、この組織を過酢酸処理によって消毒し、乾燥させた。
【００６９】
１ｇの凍結乾燥卵巣ＥＣＭ粉末と１００ｍｇのペプシンとを共に１００ｍｌの０．０１Ｍ  ＨＣｌの中で混合した。溶液を室温（２５℃）で最長４８時間にわたり絶えず撹拌される状態で保持した。ペプシンによる消化後、消化物溶液を等分し、使用するまで−２０℃で貯蔵した。
【００７０】
実施例８−脊髄および硬膜のＥＣＭの調製
鉗子、鋏およびメスを使用して、豚の脊髄から硬膜を除去した。全ての残屑を除去するために、メスの刃によって硬膜の内面を擦過した。脊髄および硬膜を別個の容器に入れ、以下に示すように同様の方法で処理した。表面積を拡大するために脊髄を長手方向または横断面に切断し、カセットに収納した。トリプシン−ＥＤＴＡを使用して３７℃で３０分間にわたり組織を任意に酵素処理した。３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ＴＭ（４−オクチルフェノールポリエトキシレート）溶液の中で最長２〜３日の期間にわたり４℃で組織を培養した。６％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００ＴＭの溶液および９％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ＴＭの溶液を使用して、この工程を繰り返した。脂質を除去するために、レシチンまたはレシチン−デオキシコレートの中で組織を４℃で一晩培養した。硬膜はこの手順に曝さなかった。次に、３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ＴＭまたは１％のＳＤＳの中で組織を１〜２時間洗浄した。ＰＢＳ３Ｘの中で１５分間にわたり室温で組織を水洗した。次に、ＤＮａｓｅ  Ｉの溶液の中で１時間にわたり室温で組織を培養した。ＰＢＳの中で１５分ずつ３回、室温で組織を洗浄した。最後に、脱イオン水の中で１５分ずつ３回、室温で組織を洗浄した。この手順により、ゲル状無細胞脊髄材料および無細胞硬膜材料のシートが生成された。
【００７１】
実施例９−脂肪ＥＣＭの調製
凍結した脂肪組織を水中で解凍し、細胞の溶解を早めるために手でマッサージングした。０．０２％トリプシン／０．０５％ＥＤＴＡ溶液が入ったフラスコの中に組織を入れて、３７℃で１時間培養し、次に、蒸留脱イオン水（ｄｄＨ２Ｏ）の中で短時間洗浄し、再び手でマッサージングした。次に、３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００が入ったフラスコの中に組織を入れ、室温でオービタルシェーカーの上に１時間載置した。短時間の水洗の後に、４％のデオキシコール酸溶液の中に組織を入れ、再び室温でオービタルシェーカーの上に１時間載置した。組織を水中で３回洗浄し、４℃で一晩貯蔵した。次に、組織をオービタルシェーカー上で４％エタノールおよび０．１％過酢酸溶液に２時間曝し、その後、室温で１５分ずつ２回のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）による洗浄および１５分ずつ２回の水洗を実施した。その結果生成された材料を室温でオービタルシェーカー上で１００％のｎ−プロパノールの中で１時間洗浄し、凍結乾燥前にｎ−プロパノールを除去するために１時間にわたりｄｄＨ２Ｏを４回交換して洗浄した。
【００７２】
実施例１０−神経由来のＥＣＭゲルの調製
ネズミの脊髄組織をＥＣＭ抽出処理に必要となるまで−８０℃で貯蔵した。材料を解凍し、脊髄から硬膜を除去し、次に、脊髄を長さ約１インチおよび均一な厚さで長手方向に４つに切断した。脱細胞化の前に天然の組織構造を機械的に破壊させるために、脊髄片を４℃および１２０ｒｐｍの水中に一晩おいた。約１８時間後、約８４０μｍの穴サイズを有するメッシュまたはふるいで濾過することにより、水から脊髄片を除去した。脊髄の断片を鉗子で回収し、０．０２％トリプシン／０．０５％ＥＤＴＡ溶液によるプロテアーゼ消化のためにフラスコに入れた。１２０ｒｐｍで振動させつつ、３７℃の湯せんで１時間にわたり消化を進行させた。１時間後、溶液を濾過し、水流の下で脊髄組織を丁寧に洗浄して、必要に応じてほぐしを実施した。脊髄断片をフラスコに戻し、鉗子を使用してストレーナから可能な限り多くの組織小片を回収した。次に、組織の脱細胞化を開始させるために３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液をフラスコに添加し、フラスコを２００ｒｐｍのシェーカー上に１時間載置した。１時間後、組織を濾過し、水洗し、回収した。組織片をフラスコに戻し、次に、更なる脱細胞化のために浸透圧衝撃を与えた。高張１Ｍスクロースをフラスコに添加し、２００ｒｐｍのシェーカー上に１５分間載置した。組織を濾過し、水洗し、回収し、低張溶液（脱イオン水）と組み合わせて、残留する全ての細胞を溶解させるために、２００ｒｐｍのシェーカー上に１５分間載置した。脱細胞組織を再び濾過し、水洗し、フラスコ内に回収した。４％のデオキシコレート溶液をフラスコに添加し、２００ｒｐｍのシェーカー上に１時間載置した。その後、組織片を濾過し、界面活性剤の痕跡（気泡）が全て除去されるまで、タイプＩの水（超純水）の中で繰り返し洗浄した。この時点でＥＣＭに濃縮されている残留組織を回収し、過酢酸溶液とＥＣＭの重量との比を２０：１として、過酢酸溶液（タイプＩの水（９６％）および１００％ＥｔＯＨエタノール（４％）から構成される）を使用して消毒し、２００ｒｐｍで２時間にわたり振動させた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の中での一連の洗浄工程に続いて、ＥＣＭを−２０℃で凍結し、全ての水分が除去されるまで凍結乾燥した。１．０ｍｇ／ｍｌのペプシンを含有する０．０１Ｎ塩酸溶液の中に凍結乾燥ＥＣＭを添加することにより、ゲル足場プレゲル材料を製造したが、足場の所望の粘度に応じて約１ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌのＥＣＭ濃度を得るために材料は等張生理食塩水で希釈される。
【００７３】
実施例１１−ＥＣＭからゲルを調製する一般的方法
０．１ＮのＮａＯＨ（消化物溶液の体積の１／１０）および１０Ｘ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４（消化物溶液の体積の１／９）を４℃で適切な量で混合することにより、ＵＢＭゲルをゲルとして形成した。低温（４℃）の１Ｘ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４を使用して溶液を所望の体積および濃度にし、ゲル化を発生させるために３７℃の培養器の中に配置した（図４Ｄ）。
【００７４】
図４に示されるように、ＥＣＭは、４０分後に溶液中でマトリクスを形成できた。ＥＣＭ由来のゲルは２０℃未満の温度では液体であったが、温度を３７℃に上昇させるとゲルに変わる。
【００７５】
ＥＣＭからゲルを調製する場合、下記の溶液の全てを氷の上で保持すべきであり、以下の変数を判定しなければならない。
【００７６】
Ｃｆ＝最終ゲルの濃度（ｍｇ／ｍｌ）
Ｃｓ＝ＥＣＭ消化物溶液の濃度（ｍｇ／ｍｌ）
Ｖｆ＝実験に必要とされる最終ゲル溶液の体積
Ｖｄ＝ＥＣＭ消化物溶液から必要とされる体積（ｍｌ）
Ｖ１０Ｘ＝必要とされる１０Ｘ  ＰＢＳの体積（ｍｌ）
Ｖ１Ｘ＝必要とされる１Ｘ  ＰＢＳの体積（ｍｌ）
ＶＮａＯＨ＝必要とされる０．１Ｎ  ＮａＯＨの体積（ｍｌ）
最初に、必要とされるＥＣＭゲルの最終濃度（Ｃｆ）および体積（Ｖｆ）を判定する。次に、Ｃｆ（ｍｇ／ｍｌ）＊Ｖｆ（ｍｌ）の乗算により、必要とされるＥＣＭの質量を計算する。この値は、ＥＣＭ消化物溶液から必要とされる体積（Ｖｄ）を示し、Ｖｄ＝［Ｃｆ（ｍｇ／ｍｌ）＊Ｖｆ（ｍｌ）］／Ｃｓである。
【００７７】
計算された体積Ｖｄを９で除算することにより、必要とされる１０Ｘ  ＰＢＳの体積を計算する（Ｖ１０Ｘ＝Ｖｄ／９）。計算された体積Ｖｄを１０で除算することにより、必要とされる０．１Ｎ  ＮａＯＨの体積を計算する（ＶＮａＯＨ＝Ｖｄ／１０）。溶液を適切な濃度／体積にするために必要とされる１Ｘ  ＰＢＳの量をＶ１Ｘ＝Ｖｆ−Ｖｄ−Ｖ１０Ｘ−ＶＮａＯＨとして計算する。全ての反応剤（Ｖ１Ｘ＋Ｖｄ＋Ｖ１０Ｘ＋ＶＮａＯＨ）をＥＣＭ消化物（Ｖｄ）が入っていない適切な容器（通常は１５または５０ｍｌの遠心管）に添加する。溶液を氷の上に載置し、常時氷の上に保持する。
【００７８】
ＥＣＭ消化物溶液（Ｖｄ）からの適切な体積を先に示したように調製されたＰＢＳ／ＮａＯＨ混合物に添加し、慎重に溶液中の気泡の形成を回避しつつ、１ｍｌのマイクロピペットによって十分に混合する。ＥＣＭ消化物溶液の粘度に応じて、移し替え中にやや多くの体積の損失が起こるかもしれない。総体積を監視し、最終体積に到達するまで適切な量を添加する。プレゲル溶液のｐＨを測定する。ここで、ｐＨは約７．４であるべきである。
【００７９】
プレゲル溶液を成形型または適切なウェルに添加する。成形型またはウェルを３７℃の培養器の中に最短で４０分間配置する。ＣＯ２制御を伴う培養器の使用を避ける。水の蒸発が重要な問題である場合、培養器に配置する前に、成形型をプラスチックジップロックバッグの中に入れる。ゲル化の後、ゲルは、成形型から取り出され、１Ｘ  ＰＢＳの中に入れられる。ゲルが組織培養板で製造された場合、ゲルを水和状態に維持するために、１Ｘ  ＰＢＳを使用するまでゲルの上に置いておくことができる。
【００８０】
計算見本：１０ｍｇ／ｍｌの貯蔵溶液から６ｍｇ／ｍｌの最終濃度のゲルを６ｍｌ製造する。
【００８１】
Ｃｓ＝１０ｍｇ／ｍｌ；Ｃｆ＝６ｍｇ／ｍｌ；Ｖｆ＝６ｍｌの場合、
Ｖｄ＝    ［６ｍｇ／ｍｌ＊６ｍｌ］／１０ｍｇ／ｍｌ        ＝３．６００ｍｌ
Ｖ１０Ｘ＝  ３．６／９                                      ＝０．４００ｍｌ
ＶＮａＯＨ＝３．６／１０                                    ＝０．３６０ｍｌ
Ｖ１Ｘ＝    ６ｍｌ−３．６ｍｌ−０．４００ｍｌ−０．３６０  ＝１．６４０ｍｌ
【００８２】
実施例１２−ブタＵＢＭの組成および形態
ＵＢＭおよびラットの尾のコラーゲンタイプＩ（ＢＤ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の溶液を還元条件（５％の２−メルカプトエタノール）の下で４〜２０％のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。Ｇｅｌ−Ｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）によって蛋白質を可視化し、Ｋｏｄａｋイメージングステーションにより文書化した。ヒドロキシプロリン定量アッセイ［非特許文献４］およびＢｌｙｓｃａｎＴＭアッセイキット（北アイルランド、Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社）をそれぞれ使用して、コラーゲンおよび硫酸グリコサミノグリカン（Ｓ−ＧＡＧ）の含有量を判定した（３つの試料を試験した）。ＢｌｙｓｃａｎＴＭアッセイをメーカーの指示に従って実施した。２Ｍ  ＮａＯＨ（総体積１００μｌ）によって１２０℃のオートクレーブの中で試料を２０分間加水分解することにより、ヒドロキシプロリン含有量を判定した。試料を５０μｌの４Ｍ  ＨＣｌによって中和し、３００μｌの０．０５６Ｍ  クロラミン−Ｔ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社）と反応させ、緩やかに混合し、室温で２５分間にわたり酸化させた。次に、試料を３００μｌの１Ｍ  エールリッヒアルデヒド（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社）と混合し、６５℃で２０分間培養した。ネズミの尾のコラーゲンタイプＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して標準曲線を生成し、それを使用して、消化ＵＢＭ溶液中に存在するコラーゲンの総量を計算した。ＳｐｅｃｔｒａｌＭａｘ分光光度計を使用して、５５０ｎｍでの吸光度により比色分析変化を判定した。
【００８３】
ゲルの組成を判定した。ペプシン消化ＵＢＭのコラーゲン濃度は、乾燥した凍結乾燥ＵＢＭ粉末１ｍｇ当たり０．８±０．２ｍｇであることがわかった（平均±ＳＤ）。総Ｓ−ＧＡＧ含有量は、乾燥した凍結乾燥ＵＢＭ粉末１ｍｇ当たり５．１±０．９μｇであることがわかった（平均±ＳＤ）。電気泳動蛋白質は、図５に示されるようなエキストラバンドを伴うＵＢＭレーン上に存在するコラーゲンタイプＩに関して通常バンドを示す。この相違は、１つには、ＵＢＭゲル中に存在する追加の成分、すなわち、僅かなペプチドおよびグリコサミノグリカンによるものである可能性がある。
【００８４】
走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して、ＵＢＭゲルの表面形態を検査した。標本を低温の２．５％グルタルアルデヒドに定着し、ＰＢＳの中で水洗し、続いて、一連の段階的エタノール（３０％〜１００％）を通して脱水処理に曝し、最後にＥｍｓｃｏｐｅ  ＣＰＤ
７５０臨界点乾燥器で臨界点乾燥させた。試料をアルミニウムのＳＥＭ標本装着スタブ（ペンシルベニア州ハットフィールド、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に装着し、Ｓｐｕｔｔｅｒ  Ｃｏａｔｅｒ  １０８  Ａｕｔｏ（ペンシルベニア州バレンシア、Ｃｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を使用して金−パラジウム合金によってスパッタコーティングした。最後に、走査電子顕微鏡（ＪＥＯＬ  ６３３０Ｆ）を使用して試料を検査した。５，０００倍および１０，０００倍の倍率で画像を撮影した。走査電子顕微鏡写真は、３ｍｇ／ｍｌおよび６ｍｇ／ｍｌの濃度（図６Ａ〜図６Ｄ）ならびに４ｍｇ／ｍｌの濃度（図７Ｂ）のＵＢＭの線維状の見かけを示す。
【００８５】
実施例１０−ブタのＵＢＭゲル、ＳＩＳゲルおよびＬＳゲルの流動学的特性およびゲル化キネティクス
ゲル化中に、ＵＢＭ由来のゲルの流動学的特性を特徴付けした。ＵＢＭゲルは、２５℃未満の温度の粘性溶液と、生理的温度（３７℃）のゲルとから構成される。本明細書で説明される同様の方法を使用して、他のゲルの流動学的特性を測定できる。肝臓間質（ＬＳ）および小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）の流動学的特性も測定した。
【００８６】
先に説明したように分光光度分析により比濁ゲル化キネティクスを判定した（非特許文献５）。適切な濃度の最終プレゲル溶液を４℃に保持し、ウェルごとに１００μｌを３回投入することにより、低温９６ウェルプレートに移した。ＳｐｅｃｔｒａｌＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を３７℃に予熱し、プレートを分光光度計に配置し、４０５ｎｍで１．５時間にわたり２分ごとに各ウェルの濁度を測定した（図８Ａ）。５３０ｎｍでも濁度を測定できる（図９）。図８Ｂに示されるように、吸光度の値を記録し、正規化した。最大濁度測定値（例えば、最大吸光度の値）の５０％に到達するまでに必要とされる時間をｔ１／２と定義し、曲線の線形成長を外挿することにより遅滞期（ｔｌａｇ）を計算した。図８Ｂに示されるような曲線の成長部分の傾きを計算することにより、比濁測定値に基づくゲル化の速度（Ｓ）を判定した。
【００８７】
ゲル化の基礎研究およびゲルの粘弾性特性の特徴付けには、動的振動測定が共通して使用される。試料を以下の振動歪みに曝した。
【００８８】
【数１】
2020089741.tif 000003
式中、γ０は正弦波歪みの振幅であり、ｔは時間であり、ｆは周波数であった。試料は以下に表すような正弦波応力を発生した。
【００８９】
【数２】
2020089741.tif 000004
式中、Ｇ＊は試料の周波数に依存する複素弾性係数である。Ｇ’として示されるＧ＊の実部は、加えられる歪みと同相であり、試料の弾性変形における機械的エネルギーの蓄積に対応したために貯蔵弾性率と呼ばれた。Ｇ”として示されるＧ＊の虚部は、加えられる歪みに対して９０°位相がずれており、試料内部における粘性消散によるエネルギーの損失に対応したために損失弾性係数と呼ばれた。ゲル化の進行に伴って試料は固体的特性を発生すると予想されたため、Ｇ’は著しく増加すると予想された。
【００９０】
最後の関心特性は、次の式により定義される複素粘度の大きさであった。
【００９１】
【数３】
2020089741.tif 000005
式中、｜η＊｜は周波数に依存する複素粘度であり、Ｇ＊は周波数に依存する複素弾性係数であり、ｆは周波数であった。複素粘度対周波数データを次の形式のべき法則に当てはめるのが一般的である。
【００９２】
【数４】
2020089741.tif 000006
式中、ｋおよびｎは共に定数である。
【００９３】
直径４０ｍｍのパラレルプレートジオメトリを使用するＴＡ計器ＡＲ２０００応力制御型レオメータおよび試料温度を維持するためのペルチェセルによって流動学的実験を実施した。先に説明したように試料を調製し、１５℃の温度を維持するペルチェセルを備えるレオメータに装入した。鉱物油を塗布することにより、試料の縁部の蒸発を防止した。最初に、１５℃で１分間、試料に１Ｐａの一定応力を加えることにより、試料の粘度を測定した。次に、ゲル化を誘導するために温度を３７℃に設定したが、ペルチェセルは、典型的に、１０秒以内で３０℃の温度に達し、５０秒以内に３７℃に達した。この温度上昇およびそれに続くゲル化の間に、０．１５９Ｈｚ（１ｒａｄ／ｓ）の一定の周波数および５％の歪みで試料の振動弾性率を継続的に監視した。時間の経過に伴う弾性係数（Ｇ’）の更なる変化が無くなった時点で、ゲル化は完了したとみなした。３７℃および５％歪みで１５．９Ｈｚから０．０８Ｈｚまでの周波数掃引を実行することにより、ゲルの最終線形粘弾性特性を測定し、式４に当てはめた。
【００９４】
比濁解析ゲル化キネティクスおよび計算上のパラメータが図８に示され、その結果は表１に提示される。ＵＢＭゲルおよびコラーゲンタイプＩゲルの比濁解析ゲル化キネティクスはＳ字形状となっていた（図８Ａ）。３ｍｇ／ｍｌの濃度のコラーゲンタイプＩゲルは、ゲル化の後、３ｍｇ／ｍｌおよび６ｍｇ／ｍｌの濃度のＵＢＭゲルより高い濁度を示した（図８Ａ）。ＵＢＭゲル（３ｍｇ／ｍｌおよび６ｍｇ／ｍｌ）の遅延期間（ｔｌａｇ）および最終濁度の１／２に到達するために必要とされる時間（ｔ１／２）は、コラーゲンタイプＩ（３ｍｇ／ｍｌ）の場合より長かった。さらに、比濁解析ゲル化キネティクスの速度（Ｓ）は、コラーゲンタイプＩと比較した場合にＵＢＭのほうが低速であった。濃度の変化に伴って、ＵＢＭゲルではｔｌａｇ、ｔ１／２およびＳに変化はなかったが、到達した最大濁度には変化があった。
【００９５】
１ｍｇ／ｍｌのＳＩＳゲルの比濁解析キネティクスもＳ字形状となっていた（図９）。ＵＢＭ測定値は４０５ｎｍで取得されたが、ＳＩＳ測定値は５３０ｎｍで取得された。ＳＩＳ測定値は、最大濁度に到達する前に濁度の減少をさらに示した。
【００９６】
試料の温度を１５℃から３７℃に上昇させた後、時間の経過に伴い、ＵＢＭゲルの貯蔵弾性率（Ｇ’）および損失弾性率（Ｇ”）は共にＳ字形状に従って変化した（図１０）。Ｇ’およびＧ”は約８分後に定常状態に達し、これは、ゲル化が起こったことを示唆する。Ｇ’およびＧ”のキネティクスは比濁解析キネティクスより速かった。最大０．０８〜１５Ｈｚの周波数範囲にわたるＵＢＭおよびコラーゲンタイプＩの双方の粘度が図１２に示され、結果は表１に要約される。
【００９７】
試料の温度を３７℃に上昇させた後、時間の経過に伴い、ＬＳゲルおよびＳＩＳゲルの貯蔵弾性率（Ｇ’）もＳ字形状に従って変化した（図１１Ａ）。ＬＳゲルおよびＳＩＳゲルの双方でＧ’のキネティクスは、ＵＢＭゲルのＧ’のキネティクスより速かった。ＬＳゲル、ＳＩＳゲルおよびＵＢＭゲルの貯蔵弾性率（Ｇ’）は、角周波数の関数としても測定された（図１１Ｂ）。
【００９８】
表１：ＵＢＭゲル化キネティクスの比濁解析からの結果。データは平均値±ＳＤを表す。３つの試料を試験した（ｎ＝３）。
【表１】
2020089741.tif 000007
【００９９】
注入可能材料としてＵＢＭを使用することの実用性を検討する努力の中で、注入設定で材料を試験するために複数回の試験を実施した。生理食塩水中に懸濁させたＥＣＭ粉末およびＵＢＭゲルが声帯の増補などの医療手順で頻繁に使用される注射針を満足に通過できるか否かを知るために、それらを並行して試験した。注射針は、長さ２５ｃｍの１６ゲージ針軸に装着された長さ１ｃｍの２５ゲージ口径先端部を有していた。ＵＢＭゲルは、それらの針を容易にかつ一様に通過した。ＵＢＭ粉末懸濁液は１０ｍｇ／ｍｌの上限濃度を有しており、この濃度を超えると、針は頻繁に詰まって、供給されるＥＣＭの実際の量を判定することが困難になる。この試験は、注入可能材料としてＵＢＭゲルを使用することの実用性を示した（表２）。
【０１００】
表２：ＵＢＭゲルと市販の注入可能材料との粘度の比較
【表２】
2020089741.tif 000008
ａＲＷ  Ｃｈａｎ他のＶｉｓｃｏｓｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｉｎ  ｖｏｃａｌ  ｆｏｌｄ  ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｓｕｒｇｅｒｙ。Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ、１９９８年５月、１０８（５）、７２５〜７３１ページ（非特許文献６）ｂＳＡ  Ｋｌｅｍｕｋ他のＶｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｖｏｃａｌ−ｆｏｌｄ  ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｔ  ｌｏｗ  ａｕｄｉｏ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ。Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ、２００４年９月、１１４（９）、１５９７〜１６０３ページ（非特許文献７）
【０１０１】
実施例１４−ハイブリッド無機／ＥＣＭ足場
肢の切断および義肢との置換の後の関節キネティクスの回復は、腱の骨挿入を介して既存の筋組織を義肢に装着することが不可能であるために限定される（非特許文献８）。種々の多孔質チタンおよびタンタル合金は骨の内植を促進することに成功しているが、靭帯または腱の挿入部位を回復させる線維軟骨組織の内植を促進するための代替手段は存在しない。最近になって、機械的強度が見込まれる血管化繊維組織の内植を促進する能力に関して、多孔質タンタル足場が研究されている（非特許文献９）。ブタの小腸および膀胱（ＵＢＭ）による天然由来の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）足場も、十分に組織化された腱、靭帯、軟骨および骨、ならびに高い機械的強度を有する強靭な骨挿入部位を形成することがわかっている（非特許文献１０；非特許文献１１）。孔の中にＥＣＭを埋め込んだ多孔質タンタルまたはチタン足場が金属面の中への軟組織の内植を改善し、線維軟骨組織の形成を促進すると予想することは妥当である。現在の研究の目標は、靭帯または腱の挿入修復という最終的な用途のために多孔質チタン足場をＥＣＭゲルで被覆することの実用性を判定することであった。
【０１０２】
先に説明したようにＵＢＭ粉末を製造した（非特許文献１２）。室温で１００ｍＬの０．０１Ｍ  ＨＣｌの中で最長４８時間にわたり絶えず撹拌しながら、１ｇの凍結乾燥ＵＢＭ粉末を１００ｍｇのペプシンと混合することにより、ＵＢＭゲル消化物を調製した。ｐＨおよびイオン強度を３７℃でＰＢＳを使用して生理学的範囲に設定することにより、ＵＢＭゲルの重合を開始させた。３０分以内にゲルの完全な重合が起こった。多孔質金属足場をアセトン、メタノールおよび水で洗浄し、２４〜４５％の硝酸で不動態化させた。
【０１０３】
ＵＢＭゲル消化物（生理学的活性化前は［１０ｍｇ／ｍｌ］、生理学的活性化後は［６ｍｇ／ｍｌ］）とＣＰＴｉまたはＴｉ６Ａｌ４Ｖのシートとの接触角度を測定した。１ｍｌの消化物を各面に添加し、その後の角度判定のためにデジタル写真を撮影した。
【０１０４】
ＣＰチタン繊維メッシュまたはＣＰチタン焼結ビードのいずれかへの重合ＵＢＭゲルの浸透を促進する能力を２つの方法により試験した。各多孔質金属足場の表面全体を５分間にわたり活性化ＵＢＭゲルで被覆した。足場の半分に関しては、静止条件下でゲルを浸透させたが、試料の残り半分では、超音波処理を使用して浸透を起こした。ゲルを可視化するために染料を添加した。
【０１０５】
多孔質チタン足場の中のＵＢＭゲルの存在を検証し、ＵＢＭゲルと金属との相互作用をさらに明確に理解するために、環境制御形走査電子顕微鏡法（ＥＳＥＭ）のための標本を調製した。ＥＳＥＭによって試料を可視化できたが、まだ水和状態にあったため、脱水によりＥＣＭを破壊することなく、チタン足場とＵＢＭゲルとの間の相互作用を判定できた。
【０１０６】
ＵＢＭゲル消化物および活性化ＵＢＭゲルは、共に、ＣＰ  ＴｉおよびＴｉ６Ａｌ４Ｖウェルの表面を湿潤する（表４）。したがって、多孔質金属はＥＣＭを排除しない。これらの結果に基づいて、その後の実験は活性化ゲルに焦点を当てた。ＵＢＭゲルは、静止状態では各多孔質金属足場の厚さの半分まで浸透可能であった。超音波処理を追加することによって、孔は足場の厚さ全体にわたり浸潤された（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。ＥＳＥＭによるハイブリッド足場の検査は、多孔質チタンの中への優れた浸透性および多孔質チタンの被覆を示した（図１４Ａ〜図１４Ｄ）。
【０１０７】
ＵＢＭゲルおよび多孔質チタン足場を使用して、ハイブリッドＥＣＭ／多孔質金属足場を形成できる。将来の研究は、それらの足場が生体内における細胞の成長を支援できかつ生体内における結合組織の内植を促進できるか否かを評価することになるだろう。この努力の最終的な目標は、靭帯および腱の挿入部位として作用するように軟組織の金属内部への内植を促進する足場を開発することである。表４：チタン合金に対するＵＢＭ材料の接触角度（平均値±ＳＤ）
【表３】
2020089741.tif 000009
【０１０８】
実施例１５−消化前ＥＣＭ材料の殺菌
ＥＣＭ足場の最終滅菌は、その後のプロテアーゼ可溶化ＥＣＭ材料のヒドロゲル形成を抑止することがわかっている。以下に、透析されていない真皮ＥＣＭ（すなわち、先に説明したような無損傷ＥＣＭ）を使用して、定性ヒドロゲル形成に対する殺菌の影響を示す。ブタの真皮を先に説明したように実質的に無細胞化し、様々な最終滅菌方法に曝した。（１）１０ｋＧｙ、２５ｋＧｙおよび４０ｋＧｙの線量のガンマ線照射、（２）１０ｋＧｙ、２５ｋＧｙおよび４０ｋＧｙの線量の電子ビーム放射、ならびに（３）１６時間にわたる７５０ｍｇ／ｈの投与量のエチレンオキシド（ＥｔＯ）ガスに曝すことにより、真皮ＥＣＭシートを最終滅菌した。対照例の真皮ＥＣＭシートは殺菌しなかった。次に、殺菌済み真皮ＥＣＭおよび対照例の真皮ＥＣＭは、６０メッシュのふるいを有するＷｉｌｅｙ
Ｍｉｌｌで機械的に粉砕され、プレゲルを生成するために０．０１Ｎ  ＨＣｌの溶液の中で１ｍｇ／ｍｌのペプシンにより４℃で４８時間にわたり酵素消化され、室温（２０〜２５℃）でｐＨ約７．４に中和しかつ次にＣＯ２を含有しない培養器で３７℃まで温度を上昇させることによりヒドロゲル形成に関して試験された。図１５は、最終滅菌された真皮ＥＣＭは殺菌方法にかかわらずヒドロゲルを形成することができないが、無殺菌の真皮ＥＣＭは固体ゲルを形成し、金属リング成形型の除去後も形態を維持していたことを示す。
【０１０９】
実施例１６−凍結乾燥製品の殺菌
消化前無細胞化ＥＣＭ材料の最終滅菌の後のヒドロゲル形成効果が低いため、臨床／販売に際しては殺菌の必要があることを認識して、殺菌前の材料の形態を変化させることにより、ＥＣＭのゲル化が可能になるだろうという仮説を立てた。凍結乾燥固体ＥＣＭシートの代わりに、先に説明したように実質的に酵素消化され透析されておらず（先に説明したような無損傷ＥＣＭ）機械的に粉砕されたＥＣＭから調製した凍結乾燥プレゲルを殺菌し、ヒドロゲル形成が起こるか否かを試験した。小腸粘膜下組織由来のＥＣＭ（ＳＩＳ−ＥＣＭ）を透析なしの標準プロトコルに従って無細胞化した。ＳＩＳ−ＥＣＭ粉末を先に説明したのと同一の方法で酵素消化し、ドライアイス上で−８０℃で凍結させ、凍結乾燥した。次に、凍結乾燥したプレゲルを７５０ｍｇ／ｈの投与量のＥｔＯガスに１６時間にわたり曝すことにより殺菌しかつ／あるいは脱イオン水または０．０１Ｎ  ＨＣｌの中で再構成した（図１６Ａ〜図１６Ｄ）。図１６Ａ〜図１６Ｄは、殺菌前は、水およびＨＣｌを使用して室温で完全な再構成が起こるが、殺菌後（図１６Ｄ）には、脱イオン水の中のプレゲルのみが完全に再構成されたことを示す。
【０１１０】
脱イオン水の中のプレゲルのみが完全に再構成されたので、ヒドロゲル形成に関して、それらの試料を試験した。図１７は、中和され、ＣＯ２を含有しない３７℃の培養器の中に配置された場合に、無殺菌のプレゲルおよびＥｔＯ殺菌済みのプレゲルの双方が固体ゲルを形成し、金属リング成形型の除去後も固体ゲルが維持されたことを示す。
【０１１１】
図１７に示される結果を確証するために、膀胱由来のＥＣＭ（ＵＢＭ）を標準プロトコルに従って無細胞化し、先に示したＳＩＳ−ＥＣＭと同様の方法で試験した。その結果は、同様に、凍結乾燥プレゲルの殺菌がヒドロゲル形成につながったことを示した（図１８）。
【０１１２】
実施例１７−凍結乾燥製品の殺菌―更なる研究
以上の実施例の研究を拡張して、先に説明したように実質的に調製されたＥＣＭ材料を異なる形態で、すなわち、未消化の粉末形態および２Ｄシート形態の双方のＥＣＭ材料、未消化の水和粉末または２ＤシートのＥＣＭ材料、酸性プロテアーゼで消化されているが中和されていないプレゲル溶液、ならびに／あるいは消化されているが中和されていない凍結乾燥プレゲルの形態で殺菌した。膀胱、脾臓、肝臓、心臓、膵臓、卵巣、小腸、中枢神経系（ＣＮＳ）、脂肪組織および／または骨を含む種々の供給源からのＥＣＭ材料を試験する。
【０１１３】
材料をエチレンオキシド、ガンマ線照射（周囲温度および−８０℃で２ｋＧｙ、３０ｋＧｙ）、電子ビーム放射（周囲温度および−８０℃で２ｋＧｙ、３０ｋＧｙ）および／または超臨界ＣＯ２（低および／または高）により殺菌する。非殺菌対照例も実行される。
【０１１４】
実施例１８−種々の殺菌方法に曝された無細胞化膀胱マトリクス（ＵＢＭ）
膀胱マトリクスを標準プロトコルに従って無細胞化し、種々の殺菌方法に曝した。殺菌に続き、（１）ＵＢＭシート、（２）機械的に粉砕されたＵＢＭ粉末、ならびに（３）消化および凍結乾燥後の材料をヒドロゲル形成に関して試験した。各ゲルをリング成形型の中で形成し、撮像した（図１９Ａ）。次に、ヒドロゲル形成を試験すると、貯蔵弾性係数値により示されるように、凍結乾燥消化物により最も剛性の高いヒドロゲルが形成され、次に粉末形態が続く（図１９Ｂを参照）。ＵＢＭシートの殺菌は、その後にヒドロゲルを形成させなかった。各殺菌方法はヒドロゲル形成に影響を及ぼすが、ｓｃＣＯ２およびＥｔＯによる凍結乾燥消化物と粉末形態との貯蔵弾性係数の比較により最も明確に実証されるように、ＥＣＭ材料の開始形態によりその影響を軽減できる。興味深いことに、非殺菌の対照例の試料も、ヒドロゲル形成において、さらに剛性の高いゲルを形成する凍結乾燥消化物との間に明らかな相違を示す。定性的には、凍結乾燥消化物が最も剛性の高いヒドロゲルを形成し、次に粉末が続くが、ＵＢＭシートの殺菌は、その後にヒドロゲルを形成させなかった。ゲル剛性（すなわち、貯蔵弾性係数またはＧ’）の流動学的特性判定により、ゲルの剛性の定性的傾向を確証した。それらの図は、併せて、殺菌されるＥＣＭの形態（すなわち、シート、粉末または消化物）の重要性を強調する。
【０１１５】
あらゆる面で限定的ではなく例示的であることが意図されるいくつかの実施例に従って本発明を説明した。したがって、本発明は、本明細書に含まれる説明から当業者により導出されてもよい詳細な実現例の数多くの変形が可能であり、本発明は、以上の説明により限定されるべきではなく、添付の請求の範囲と同一の広い範囲を有すると解釈されるべきである。
【０１１６】
この出願は、２０１４年３月２１日に出願された米国仮特許出願６１／９６８，７１６を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【図１】
2020089741.tif 000010
【図２】
2020089741.tif 000011
【図３】
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【図４Ａ】
2020089741.tif 000013
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
2020089741.tif 000017
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
2020089741.tif 000031
【図１３Ｂ】
2020089741.tif 000032
【図１４Ａ】
2020089741.tif 000033
【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
2020089741.tif 000038
【図１６Ｂ】
2020089741.tif 000039
【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月12日(2020.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル化可能な細胞外マトリクス組成物であって、
脱細胞化され、酵素消化され、乾燥され、最終滅菌された、インタクトな細胞外マトリクスを含み、
水和された後、ｐＨ７．２〜７．８に中和され、その後、２５度以上に温められることによりゲルを形成可能な細胞外マトリクス組成物。
【請求項２】
プロテーゼを含む請求項１に記載の細胞外マトリクス組成物。
【請求項３】
前記プロテーゼは、ペプシンまたはトリプシンである請求項２に記載の細胞外マトリクス組成物。
【請求項４】
前記細胞外マトリクスは、生理活性を有する請求項１に記載の細胞外マトリクス組成物。
【請求項５】
前記細胞外マトリクスは、膀胱、脾臓、肝臓、心臓、膵臓、卵巣、小腸、大腸、結腸、中枢神経系組織、脂肪組織、または骨に由来する請求項１に記載の細胞外マトリクス組成物。
【請求項６】
前記細胞外マトリクスはヒト、サル、ブタ、ウシ、またはヒツジに由来する請求項１に記載の細胞外マトリクス組成物。
【請求項７】
３７度でゲル化される請求項１に記載の細胞外マトリクス組成物。
【請求項８】
最終滅菌された細胞外マトリクス消化物溶液であって、
水和され、脱細胞化され、酵素消化され、最終滅菌された、インタクトな細胞外マトリクスを含み、
ｐＨ７．２〜７．８に中和され、２５度以上に温められることによりゲルを形成可能な細胞外マトリクス消化物溶液。
【請求項９】
プロテーゼを含む請求項８に記載の細胞外マトリクス消化物溶液。
【請求項１０】
前記プロテーゼは、ペプシンまたはトリプシンである請求項９に記載の細胞外マトリクス消化物溶液。
【請求項１１】
前記細胞外マトリクスは、生理活性を有する請求項８に記載の細胞外マトリクス消化物溶液。
【請求項１２】
前記細胞外マトリクスは、膀胱、脾臓、肝臓、心臓、膵臓、卵巣、小腸、大腸、結腸、中枢神経系組織、脂肪組織、または骨に由来する請求項８に記載の細胞外マトリクス消化物溶液。
【請求項１３】
前記細胞外マトリクスはヒト、サル、ブタ、ウシ、またはヒツジに由来する請求項８に記載の細胞外マトリクス消化物溶液。
【請求項１４】
最終滅菌された細胞外マトリクス消化物溶液であって、
水和され、脱細胞化され、酵素消化され、乾燥され、最終滅菌された、インタクトな細胞外マトリクスを含み、
ｐＨ７．２〜７．８であって、２５度以上に温められることによりゲルを形成する細胞外マトリクス消化物溶液。
【請求項１５】
３７度に温められて、ゲルを形成する請求項１４に記載の細胞外マトリクス消化物溶液。
【請求項１６】
前記細胞外マトリクスは、生理活性を有する請求項１４に記載の細胞外マトリクス消化物溶液。
【請求項１７】
前記細胞外マトリクスは、膀胱、脾臓、肝臓、心臓、膵臓、卵巣、小腸、大腸、結腸、中枢神経系組織、脂肪組織、または骨に由来する請求項１４に記載の細胞外マトリクス消化物溶液。
【請求項１８】
前記細胞外マトリクスはヒト、サル、ブタ、ウシ、またはヒツジに由来する請求項１４に記載の細胞外マトリクス消化物溶液。