(57)【要約】      （修正有）【課題】疾患に苦しんでいる対象の、治療薬又は治療薬の組み合わせに対する反応を予測して判定するために有用な組成物及び方法の提供。【解決手段】少なくとも１種の担体を含みかつカチオン性界面活性剤を含まない組成物であって、前記少なくとも１種の担体が、（ａ）少なくとも１種の治療薬の単細胞治療有効量；及び（ｂ）少なくとも１種の前記治療薬を一義的に特定する、１種又は複数の核酸分子のバーコードを含む組成物、及び該組成物を対象に投与した後に、前記対象から取得された細胞を含む試料において、前記異なる治療薬又は用量の効力を、前記細胞における核酸分子のバーコードにより特定することを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の担体を含みかつカチオン性界面活性剤を含まない組成物であって、前記少なくとも１種の担体が、
（ａ）少なくとも１種の治療薬の単細胞治療有効量；および
（ｂ）（ａ）の少なくとも１種の治療薬を一義的に特定する１種または複数のバーコード、を含む、組成物。
【請求項２】
全身投与用として処方される組成物であって、複数のタイプの５〜２５０ｎｍの直径を有する脂質系粒子を含み、それぞれの粒子のタイプは核酸分子のバーコードおよび異なる治療薬または治療薬の用量を含み、各粒子は独立に、
（ａ）前記異なる治療薬の最小有効量（ＭＥＤ）の最大で０．１％；および
（ｂ）（ａ）の少なくとも１種の治療薬を一義的に特定し、かつ５〜４００ヌクレオチド長の前記核酸分子のバーコード、を含む、組成物。
【請求項３】
前記複数のタイプの担体が、１５０００種のタイプの担体、１〜５００種のタイプの担体、１〜１０種のタイプの担体、および１〜５種のタイプの担体から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
治療薬を含まない少なくとも１種の対照担体をさらに含み、かつ前記対照担体を一義的に特定する１種または複数の核酸分子のバーコードを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
カチオン性界面活性剤を含まない、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項６】
前記核酸分子が、二本鎖または一本鎖ＤＮＡ分子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記核酸分子が、５〜２００ヌクレオチド長である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記核酸分子のバーコードが、天然に存在する核酸配列と結合し得る１０塩基を超えるヌクレオチド配列を含まない、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記脂質系粒子が、リポソームである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記脂質系粒子が、ミセルである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記脂質系粒子が、タグをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記タグが、フルオロフォア、発色団、化学発光分子、磁気粒子、染料、金属、希土類元素、金属、および放射性同位元素からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、疾患に苦しんでいる対象の前記異なる治療薬または用量に対する反応を予測するセラノスティックス方法において使用され、前記核酸分子のバーコードは、前記対象の細胞の核酸分子に対して同一または相補的ではない配列からなる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記使用は、前記組成物を投与された後に前記対象から取得された細胞を含む試料において、前記異なる治療薬または用量の効力を、前記細胞における核酸分子のバーコードを特定することにより、特定することを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記対象が癌に苦しんでおり、かつ前記組成物が、静脈内注射用に処方されており、前記対象の腫瘍の単細胞当たり１〜２００個の脂質系粒子を含む、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記対象が癌に苦しんでおり、かつ前記組成物が、腫瘍内注射用に処方されており、前記対象の腫瘍の単細胞当たり１〜２０個の脂質系粒子を含む、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記対象から取得される試料が、前記組成物の投与後の２４〜７２時間または２４〜４８時間の時間枠内に取得される、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記試料が、前記特定の前に単細胞懸濁液に分解される、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記少なくとも１種の担体または脂質系粒子がタグをさらに含み、前記試料の細胞が、ＦＡＣＳ、磁気ビーズ選別、マイクロ流体ベース選別、細胞張力ベース選別、およびＥＬＩＳＡからなる群より選択される方法を使って選別される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記懸濁液は、細胞の生存率に基づいて選別され、かつ生細胞と比較した死細胞における治療薬または用量のバーコードの過剰発現は、前記治療薬または用量に対する前記対象の反応を示す、請求項１８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、個別化された治療薬の治療効力および活性の予測に有用な組成物およびアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
患者は、薬物療法に対して異なった応答をし、処置の成功は、それぞれの患者に対する適切な薬剤の選択に大きく依存している。「個別化医療」は、それぞれの患者の独特の症状に対処することを目的としている。個別化医療を必要とする疾患および障害には、悪性疾患、炎症性疾患および神経変性疾患が含まれる。
【０００３】
非限定的例としての癌は、医院での薬物に対する実際の奏効率が低い。例えば、乳癌、食道癌、結腸癌、胃癌の患者の治療への応答は６０％未満であり、統計値は、肺癌、黒色腫、膵臓癌、肝臓癌または再発性卵巣癌の患者では３０％未満に低下する。したがって、それぞれの患者独特の症状に対処する適切な治療薬の選択により、処置転帰を顕著に改善することができる。
【０００４】
患者特異的抗癌活性についての薬剤のプレスクリーニングは困難な仕事である。癌処置が成功するかどうかの予測を試みる既存の手法では、短い化学療法的サイクルの後に、生検材料が患者の腫瘍から採取され、腫瘍反応が組織学的に検査される。画像処理技術により、腫瘍縮小／進行、血管系増殖および代謝活性に対する処置の効果をリアルタイムで追跡することが可能となった。複数の薬剤および薬剤の組み合わせの抗癌活性をプレスクリーニングするために、エクスビボおよびインビトロアッセイが開発された。これらのアッセイは、患者から生検用に採取し、その後、インビトロで増殖させるか、または免疫欠損マウスにインビボ移植した腫瘍組織に基づいている。
【０００５】
不均一な多細胞の腫瘍微小環境がないために、細胞培養手法が治療転帰の予測に効果的であることは実証されていない。第２の手法は、幾分効果的であることが実証されているが、その手法は、十分な数の選別用マウスを生成するのに７〜１２ヶ月かかる。したがって、軽度の非進行性腫瘍の患者のみが、このアッセイの適用を選択することができる。
【０００６】
遺伝子情報および患者特異的バイオマーカーは個別化医療を進めるのに有用であった。しかし、ほぼ５０％の患者は未だ非効果的処置と組み合わされ、その結果、「非奏効者」に分類されることになる。
【０００７】
ナノテクノロジーは、腫瘍特異的体内分布、細胞内取り込みの増加、および水溶性および不溶性薬剤の運搬能力を含む、癌処置に対する大きな将来性を有する。ナノ粒子はまた、抗腫瘍活性をインサイツ画像処理するための造影剤と一緒に治療用積荷を同時に運ぶ能力も有する（すなわち、セラノスティックス）（Ｚｈａｎｇ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ５２，９５８−９６４）。
【０００８】
生物化学剤の個別化された治療効力および活性を調べるための組成物および方法に対する満たされていない要求が存在する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、疾患に苦しんでいる対象の、治療薬または治療薬の組み合わせに対する反応を予測し、判定するために有用な組成物および方法を提供する。
【００１０】
本発明は、患者特異的効力に関して、１細胞解像度で複数の治療薬の同時選別を可能とする個別化された手法を初めて提示する。その結果、本明細書で開示の組成物および方法により、医師は、個別の患者に応じた新しい薬剤選択手段を与えられる。
【００１１】
一態様では、本発明は、少なくとも１種の担体を含む組成物を提供し、前記少なくとも１種の担体は、
（ａ）単細胞治療有効量の少なくとも１種の治療薬；および
（ｂ）（ａ）の少なくとも１種の治療薬を一義的に特定する１種または複数のバーコード、を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、組成物は複数のタイプの担体を含み、それぞれのタイプの担体は、
（ａ）単細胞治療有効量の少なくとも１種の治療薬；および
（ｂ）（ａ）の少なくとも１種の治療薬を一義的に特定する１種または複数のバーコード、を独立に含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、前記複数のタイプの担体は、１〜５０００種のタイプの担体である。いくつかの実施形態では、前記複数のタイプの担体は、１〜４０００種のタイプの担体である。いくつかの実施形態では、前記複数のタイプの担体は、１〜２０００種のタイプの担体である。いくつかの実施形態では、前記複数のタイプの担体は、１〜５００種のタイプの担体である。いくつかの実施形態では、前記複数のタイプの担体は、１〜２００種のタイプの担体である。いくつかの実施形態では、前記複数のタイプの担体は、１〜１０種のタイプの担体である。いくつかの実施形態では、前記複数のタイプの担体は、１〜５種のタイプの担体である。いくつかの実施形態では、前記複数のタイプの担体は、１〜４種のタイプの担体である。
【００１４】
別の実施形態では、組成物は少なくとも１種の対照担体をさらに含み、前記対照担体は治療薬を欠いており、前記対照担体を一義的に特定する１種または複数のバーコード（例えば、核酸分子）を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、前記治療有効量は、実質的に単細胞治療有効量である。別の実施形態では、前記治療有効量は、単細胞の状態を調節するために十分である。別の実施形態では、前記単細胞の状態を調節することは、細胞増殖を調節すること、細胞死を調節すること、細胞の薬剤耐性を調節すること、および細胞の機能、活性または生理機能を調節すること、から選択される。前記少なくとも１種の治療薬が細胞膜を通過できないいくつかの実施形態では、より高い濃度の前記治療有効量を使用してよい。
【００１６】
別の実施形態では、前記バーコードは、前記対照担体を一義的に特定する１種または複数の核酸分子である。別の実施形態では、前記核酸分子は、５〜１０００ヌクレオチド長である。別の実施形態では、前記核酸分子は、５〜５００ヌクレオチド長である。別の実施形態では、前記核酸分子は、５〜４００ヌクレオチド長である。別の実施形態では、前記核酸分子は、５〜３００ヌクレオチド長である。別の実施形態では、前記核酸分子は、５〜２５０ヌクレオチド長である。別の実施形態では、前記核酸分子は、１５〜２００ヌクレオチド長である。
【００１７】
別の実施形態では、前記核酸分子は、前記細胞の核酸と実質的に同じではない、またはそれと相補的ではない配列を含む。別の実施形態では、前記核酸分子は、細胞の核に入らない。別の実施形態では、前記核酸分子は、細胞の核に入ることができる成分（例えば、核移行シグナル（ＮＬＳ）または核トランスポーター）を欠いている。
【００１８】
別の実施形態では、前記バーコードは、希土類元素、フルオロフォア、発色団、化学発光分子、磁気粒子、染料、および放射性同位元素からなる群から選択される。別の実施形態では、前記バーコードは希土類元素である。別の実施形態では、前記希土類元素はランタニドである。
【００１９】
別の実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、最大で２５０ｎｍ（ナノメートル）の直径を有する。別の実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、少なくとも５０ｎｍの直径を有する。別の実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、脂質系粒子である。別の実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、リポソームおよびミセルから選択される。別の実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、ポリマーナノ粒子、ナノゲル、金属ナノ粒子（限定されないが、金または酸化鉄ナノ粒子を含む）、カーボンナノチューブ、交互積層粒子およびゾルゲルセラミック粒子などの治療薬と複合体を形成している。別の実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【００２０】
別の実施形態では、少なくとも１種の治療薬および前記少なくとも１種の治療薬を一義的に特定する核酸分子を独立に含む複数の担体を含む組成物が提供される。別の実施形態では、前記組成物は、全身投与用として処方される。別の実施形態では、前記組成物は、腫瘍内投与用として処方される。
【００２１】
別の実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、タグ（例えば、トレーサー）をさらに含む。別の実施形態では、前記タグは、フルオロフォア、発色団、化学発光分子、磁気粒子または染料、金属、希土類元素および放射性同位元素からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記タグは、前記担体により首尾よく標的にされている細胞を選別および／または検出するために有用である。いくつかの実施形態では、前記タグは、前記治療薬の活性を検出するためにさらに有用である。
【００２２】
別の態様では、疾患に苦しんでいる対象の、治療薬に対する反応を予測する方法が提供され、該方法は、
（ａ）複数のタイプの担体を含む組成物を対象に投与するステップであって、それぞれのタイプの担体が、単細胞治療有効量の少なくとも１種の治療薬および前記少なくとも１種の治療薬を一義的に特定する１種または複数のバーコード（核酸分子）を独立に含むステップと、
（ｂ）前記対象から細胞を含む試料を取得するステップと、
（ｃ）１〜５種のタイプの担体を含む細胞中で、前記少なくとも１種の治療薬の効力を特有のバーコードにより特定するステップを含み、それにより、疾患に苦しんでいる対象の治療薬に対する反応を予測する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、前記対象は癌に苦しんでいる。いくつかの実施形態では、前記投与は、静脈内注射であり、前記組成物は前記対象の腫瘍の単細胞当たり１〜２００個の担体を含む。いくつかの実施形態では、前記投与は、腫瘍内注射であり、前記組成物は前記対象の腫瘍の単細胞当たり１〜２０個の担体を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、前記取得ステップは、前記組成物の投与後の２４〜７２時間の時間枠内に実施される。いくつかの実施形態では、前記取得ステップは、前記組成物の投与後の２４〜４８時間の時間枠内に実施される。
【００２５】
別の実施形態では、前記方法は、前記核酸分子をシーケンシングするステップをさらに含む。別の実施形態では、前記方法は、前記核酸分子を増幅するステップをさらに含む。
【００２６】
別の実施形態では、前記試料は、ステップ（ｃ）の前に単細胞懸濁液に分解される。
【００２７】
別の実施形態では、前記組成物の前記少なくとも１種の担体は、少なくとも１種のタグをさらに含む。別の実施形態では、前記試料の前記細胞は、ＦＡＣＳ、磁気ビーズ選別、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、マイクロ流体ベース選別、細胞張力ベース選別、などからなる群より選択される方法を使って選別される。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態および適用可能な全ての範囲は、以降で示される詳細説明から明らかになろう。しかし、詳細な説明および具体的実施例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、実例として与えられているにすぎず、この詳細な説明から、本発明の趣旨および範囲内で様々な変更および修正が当業者には明らかであることは理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】Ａ〜Ｅ。患者の腫瘍内の抗癌治療薬の効力を予測するための非限定的例の模式図である。（Ａ）薬剤、ＤＮＡバーコード、および蛍光染料を含むナノ粒子の製造。（Ｂ）異なる薬剤を含むナノ粒子混合物が極めて低用量で対象に投与される。（Ｃ）４８時間後、腫瘍からコア生検材料が採取され、単細胞懸濁液中に解離される。（Ｄ）ナノ粒子内の蛍光染料を使って、懸濁液がナノ粒子取り込みに基づいて選別される（例えば、ＦＡＣＳにより）。その後、（Ｅ）生存率染色を使って、薬剤効力（活性／不活性、１／０）にしたがって選別し、細胞内のＤＮＡバーコード濃度を測定することにより、活性を内部薬剤または薬剤の組み合わせと関係づけた。対照として、無処置細胞（ｅ‘）の結果が同様に分析される。
【図２】用いられたナノ粒子を合成およびバーコード化するためのハイスループット手法の非限定的例の模式図である。マイクロ流体装置（左）：水相（下部の灰色チャネル）−ＤＮＡおよび親水性治療薬が粒子中に充填される。水性のパルス状フローを使って、マイクロ流体装置中の剪断速度が調節される。有機相（上部白色チャネル）−種々の脂質構成成分および疎水性の薬剤が制御ポンプを使って混ぜ合わされて、粒子の構造パラメータが変えられる。各粒子は、バーコードに対応するただ１種の薬剤のみを含む。
【図３】Ａ〜Ｆ。悪性細胞中のバーコード化ナノ粒子。ＤＮＡバーコードは、１，０００（Ａ）、５００（Ｂ）、５（Ｃ）細胞のクラスター内で、さらには単細胞（Ｄ）内でも検出された。バーコードは、種々の長さ−５０、８５、および１２０ｂｐ（Ｅ）とすることができ、または追加の手段を使って標識することができる。（Ｆ）４Ｔ１乳癌細胞内のＤＮＡバーコード化ナノ粒子の共焦点顕微鏡像。細胞膜は赤色に染色され（灰色に示されている）、核は青色に染色され（矢印で示されている）、粒子は白色スポットとして示されている。
【図４】原発腫瘍および実験的転移。４Ｔ１細胞の局所的注射（大腿部の原発腫瘍、下段の画像）または静脈内（肺転移、上段の画像）注射により、ＢＡＬＢ／ｃマウスで、トリプルネガティブ転移性乳癌モデルを確立した。原発腫瘍を有する動物にバーコード化ナノ粒子を静脈内に注射した。原発および転移部位への粒子の体内分布を評価し、種々の薬剤の治療効力を選別した。
【図５】腫瘍組織内へのバーコードの分布を示す棒グラフ。グラフは、封入されていないバーコードを投与された動物と、封入されたバーコードを投与された動物との間のバーコード濃度を示す。対照はバーコード不含であった。
【図６】棒グラフは異なるサイズのリポソームのＤＮＡ細胞取り込みを示す。
【図７】Ａ〜Ｂ。ＤＯＸ処置後の生存および死腫瘍細胞内のバーコードの分布を示す棒グラフ。プラセボＮＰ（Ａ）とＤＯＸ（Ｂ）を含むバーコード化ＮＰとの間の腫瘍細胞内のバーコード分布の比較。
【図８−１】Ａ〜Ｂ。バーコード化セラノスティックスナノ粒子を示す棒グラフ。対照化合物または異なる薬剤：プラセボ（Ａ）、カフェイン（Ｂ）、シスプラチン（Ｃ）、ドキソルビシン（Ｄ）およびゲムシタビン（Ｅ）を含むバーコード化ナノ粒子を同時に、後肢大腿に原発腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈内に注射した。４８時間後、粒子が腫瘍中蓄積し、治療活性を発揮することができるようにし、腫瘍から生検材料を採取した。その後、生検組織を単細胞懸濁液中に解離させ、細胞をその生存率（生／死）により選別した。生細胞に比べて、死細胞で高レベルの薬剤（ゲムシタビン、シスプラチン）のバーコードが見つかった。中性化合物のカフェインは、生存細胞および死細胞の両方で類似のバーコードレベルを有していた。ｙ−軸は、細胞内で見つかったバーコードの数を示す。（Ｆ）それぞれの薬剤に対し、死細胞から抽出したバーコードの数を生細胞から抽出したバーコードの数で除算することにより、薬剤の効力を計算した。値は、対数スケールで表されている。
【図８−２】Ｃ〜Ｆ。バーコード化セラノスティックスナノ粒子を示す棒グラフ。対照化合物または異なる薬剤：プラセボ（Ａ）、カフェイン（Ｂ）、シスプラチン（Ｃ）、ドキソルビシン（Ｄ）およびゲムシタビン（Ｅ）を含むバーコード化ナノ粒子を同時に、後肢大腿に原発腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈内に注射した。４８時間後、粒子が腫瘍中蓄積し、治療活性を発揮することができるようにし、腫瘍から生検材料を採取した。その後、生検組織を単細胞懸濁液中に解離させ、細胞をその生存率（生／死）により選別した。生細胞に比べて、死細胞で高レベルの薬剤（ゲムシタビン、シスプラチン）のバーコードが見つかった。中性化合物のカフェインは、生存細胞および死細胞の両方で類似のバーコードレベルを有していた。ｙ−軸は、細胞内で見つかったバーコードの数を示す。（Ｆ）それぞれの薬剤に対し、死細胞から抽出したバーコードの数を生細胞から抽出したバーコードの数で除算することにより、薬剤の効力を計算した。値は、対数スケールで表されている。
【図９−１】Ａ〜Ｂ。バーコード分析に基づく治療効力。図９Ａ〜ＢおよびＤは、異なる治療薬群間での腫瘍体積変化を比較した棒グラフである。各群は、化学薬剤ドキソルビシン、シスプラチン、またはゲムシタビン投与を毎週受けた。対照群は食塩水を投与された。各群の代表的腫瘍寸法。腫瘍は処置開始後２３日に抽出された。各群の腫瘍／体重。屠殺の日に腫瘍寸法および体重を測定した（９Ｃ）。（ｎ＝６／群）の平均±ＳＤＥとしてデータを計算した。＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図９−２】Ｃ〜Ｄ。バーコード分析に基づく治療効力。図９Ａ〜ＢおよびＤは、異なる治療薬群間での腫瘍体積変化を比較した棒グラフである。各群は、化学薬剤ドキソルビシン、シスプラチン、またはゲムシタビン投与を毎週受けた。対照群は食塩水を投与された。各群の代表的腫瘍寸法。腫瘍は処置開始後２３日に抽出された。各群の腫瘍／体重。屠殺の日に腫瘍寸法および体重を測定した（９Ｃ）。（ｎ＝６／群）の平均±ＳＤＥとしてデータを計算した。＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、病変に対する治療薬または治療薬の組み合わせの治療効力を予測し、判定するために有用な組成物および方法を提供する。本明細書で開示の組成物および方法は、それぞれの患者に特有の症状に対処するように処置の調整を可能とする。
【００３１】
本明細書中以下において示すように、担体（例えば、ナノ粒子）は、処置周期の開始前に、病変（例えば、癌病変）内の薬剤または薬剤の組み合わせの治療効力を検査するためのセラノスティックスゲージとしての役割を果たす。
【００３２】
いくつかの実施形態では、担体は治療薬および対応するバーコード、ならびに任意でタグを含む。それぞれの担体は、１個のみの細胞を処置するのに十分な、全身治療閾値より遥かに少ない、極めて低用量の薬剤を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の担体を含む組成物が提供され、前記少なくとも１種の担体は、治療有効量の少なくとも１種の治療薬、少なくとも１種の治療薬を一義的に特定する核酸分子、および任意でタグ（すなわち、トレーサー）を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の治療薬および核酸分子は、少なくとも１種の担体内に封入される。担体がタグを含むいくつかの実施形態では、少なくとも１種の治療薬、核酸分子、およびタグが少なくとも１種の担体内に封入される。
【００３５】
別の実施形態では、複数の担体を含む組成物が提供され、それぞれの担体は、少なくとも１種の治療薬および前記少なくとも１種の治療薬を一義的に特定する核酸分子を独立に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療薬またはその組み合わせを独立に含む１〜５種のタイプの担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療薬またはその組み合わせを独立に含む１〜１０種のタイプの担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療薬またはその組み合わせを独立に含む１〜２００個の担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療薬またはその組み合わせを独立に含む１〜２０００個の担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療薬またはその組み合わせを独立に含む２〜５００種のタイプの担体を含む。従って、本発明の組成物および方法は、複数の治療薬またはこれらの組み合わせの、１細胞解像度での同時選別を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、腫瘍治療薬またはこれらの組み合わせの、１細胞解像度での同時選別を提供する。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「担体のタイプ」は、その後の類似の投与用量で、同じ構成の１種または複数の治療薬を含む担体を意味する。
【００３７】
治療薬
いくつかの実施形態では、前記治療有効量は、実質的に単細胞治療有効量である。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」または「有効量」は、所望の治療結果を達成するために、必要な期間にわたり、投与において効果的な量を意味する。治療薬の治療有効量は、障害または状態の性質、および特定の薬剤に依存するであろうが、当業者に既知の標準的臨床技術により決定することができる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「単細胞治療有効量」は、所望の治療結果を単細胞で達成するために十分で効果的な量を意味する。特定の実施形態では、治療薬の前記単細胞治療有効量は、前記治療薬の最小有効量（ＭＥＤ）に比較して、相当低い薬剤用量である。いくつかの実施形態では、前記単細胞治療有効量は、前記治療薬の最小有効量（ＭＥＤ）と比較して、薬剤量の、最大で０．１％、０．０１％、０．００１％または０．０００１％である。いくつかの実施形態では、「単細胞治療有効量」は、所望の治療結果を単細胞で達成するために十分に効果的な最小限の量を意味する。その量は、細胞型、薬剤タイプ、および／または処置期間に応じて異なり得る。
【００４０】
目的の薬剤が組成物の他の成分と反応する場合の別の実施形態では、単細胞当たりの治療有効量の薬剤を提供するために過剰量の薬剤が使用される。非限定的例として、シスプラチンはバーコードＤＮＡと反応する可能性があり、そのために、治療有効量のシスプラチンを含む細胞を提供するために、過剰量が封入される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、限られた量の治療薬を使用可能である。非限定的例として、シュードモナス毒素のただ１個のコピーで、標的細胞を死滅させるのに十分である。
【００４２】
別の実施形態では、前記単細胞治療有効量は、単細胞の状態を調節するのに、または単細胞で目的の治療結果を得るのに十分である。別の実施形態では、前記単細胞治療有効量は、単細胞の状態を調節するのに、または単細胞で目的の治療結果を得るのに十分な量の、５０％、４０％、３０％、２０％または１０％以下である。
【００４３】
治療結果は、例えば、症状の低減、生存の延長、改善された可動性、などであってよい。治療結果は、「治癒」である必要はない。治療結果はまた、予防であってもよい。
【００４４】
別の実施形態では、前記単細胞の状態を調節することは、細胞増殖を調節すること、細胞死を調節すること、細胞の薬剤耐性を調節すること、および細胞の機能、活性または生理機能を調節すること、から選択される。いくつかの実施形態では、細胞機能または活性を調節することは、限定されないが、ＲＮＡ転写、例えば、細胞内または膜貫通型タンパク質または脂質を含む、１種または複数のタンパク質の翻訳を含む。別の実施形態では、単細胞の状態を前記調節することには、細胞成分またはバイオマーカーの存在、非存在、レベル（例えば、増加または減少）、活性化または抑制が含まれる。細胞成分またはバイオマーカーには、限定されないが、遺伝子、遺伝子産物（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）およびアミノ酸分子（例えば、タンパク質）が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞の活性は代謝活性である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１種の治療薬は、前記細胞の膜を通過できない。前記実施形態では、前記治療有効量は、例えば、単細胞を処置するための濃度に比べて、より高い濃度であってよい。細胞膜を通過できない治療薬の例としては、ＲＮＡおよび親水性薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
バーコード
一実施形態では、前記バーコードは、１種または複数の核酸分子である。ＤＮＡ鎖などの核酸分子は、無制限の数のバーコード化オプションを提供する。本発明全体を通して使用される「バーコード」、「ＤＮＡバーコード」は、全て相互に置き換え可能であり、同じ意味を有する。ＤＮＡバーコードとして機能する本発明の核酸分子は、デオキシ核酸もしくはリボ核酸または両方のポリマーであり、一本鎖または二重鎖で、任意選択で、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、核酸分子は、例えば、ビオチン、放射標識、または蛍光標識で標識される。
【００４７】
当業者に理解されるように、特有のＤＮＡバーコードの治療薬担体中への組込み（封入）により、限定されないが、マイクロアレイシステム、ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーション（「ブロッティング」を含む）またはハイスループットシーケンシングなどのアッセイを使って個々の治療薬の特定が可能となる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡバーコードの本発明の担体内への封入により、負に帯電したＤＮＡバーコードが、細胞の負に帯電した脂質二重層を通って侵入することが可能となる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、核酸分子の配列は、配列、パターン、シグネチャ、または環境中で天然に存在する、もしくは特に本発明の方法および組成物により標的にされている前記細胞中で天然に存在する材料／物質／粒子に結合するいずれか他の核酸配列を含まない。さらなる実施形態では、核酸分子の配列は、天然に存在するヌクレオチド配列、特にエキソンに結合する１０塩基を超えるヌクレオチド配列を含まない。別の実施形態では、前記核酸分子は、前記細胞のゲノム物質に実質的に同じでないまたは相補的でない配列を含む（例えば、核酸分子と細胞のゲノム物質、特に前記細胞のエキソンとのハイブリダイゼーションを阻止するためにおよび／または擬陽性の増幅結果を阻止するために）。
【００５０】
いくつかの実施形態では、前記核酸配列は分子標識としてさらに機能してもよい。前記核酸配列は通常、ヘアピン形状などの一本鎖分子であってよい。前記核酸分子は、細胞内の遺伝子変異の検出のためなどの細胞中の相補遺伝子を検出するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、前記核酸は変異を有する配列に相補的な配列を有する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、予め決定された特有の配列を含むか、またはそれから構成される。本明細書で使用される場合、「特有の配列」または「一義的に特定する」という用語は、独自性を保持する単射機能（一対一の機能とも呼ばれる）に基づく配列を意味する。
【００５２】
特有のバーコード（例えば、特有の配列を有する核酸）は、本発明の予測法を実施後に、担体内の対応する少なくとも１種の治療薬を特定するのに好適である。核酸配列の存在の検出および特定の方法は、当業者には既知であり、これらには、複数のバーコードの存在を強調できるシーケンシングおよびアレイ（例えば、マイクロアレイ）システムが含まれる（例えば、Ｉｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃから市販されている）。
【００５３】
正確さを高めることが望ましい場合などのいくつかの実施形態では、核酸分子は、シーケンシングおよび／または増幅アッセイ（例えば、ＰＣＲ）に好適する長さを有する。別の実施形態では、前記核酸分子は、本発明の担体中に添加するために適する長さ、好ましくはナノスケールの長さを有する。前記核酸分子の長さは、本発明の組成物および方法で使用される担体のタイプおよびサイズに依存することを理解されたい（例えば、ナノ粒子中で使用するためにはより短い配列が好適し、微小粒子中ではより長い配列が使用されるであろう）。
【００５４】
別の実施形態では、前記核酸分子は、最大で１０００、最大で９００、最大で８００、最大で７００、最大で６００、最大で５００、最大で４５０、最大で４００、最大で３５０、最大で３００、最大で２５０、最大で２００、最大で１９０、最大で１８０、最大で１７０、最大で１６０、最大で１５０、最大で１４０、最大で１３０または最大で１２０塩基の長さを有し、それぞれの可能性が本発明の別々の実施形態を構成する。別の実施形態では、前記核酸分子は、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０塩基、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９または少なくとも３０塩基、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００または少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００塩基の長さを有し、それぞれの可能性が本発明の別々の実施形態を構成する。
【００５５】
核酸長さの非制限的例には、限定されないが、５〜５０塩基、５〜４０塩基、５〜３０塩基、５〜２５塩基、５〜２４塩基、５〜２３塩基、５〜２２塩基、５〜２１塩基、５〜２０塩基、５〜１９塩基、５〜１８塩基、５〜１７塩基、５〜１６塩基または５〜１５塩基、１５〜５０塩基、１５〜６０塩基、１５〜７０塩基、１５〜８０塩基、１５〜９０塩基、１５〜１００塩基、１５〜２００塩基、１５〜２５０塩基または１５〜５００塩基が挙げられる。
【００５６】
別の実施形態では、それぞれの担体内の前記核酸分子は、担体当たりまたは標的細胞当たり、ある濃度の１個または複数の鎖を有する。核酸分子の量の決定は、十分に当業者の能力下にある。別の実施形態では、前記１種または複数の核酸分子は、１〜１００００個の核酸分子である。別の実施形態では、前記１種または複数の核酸分子は、１〜１０００個の核酸分子である。別の実施形態では、前記１種または複数の核酸分子は、１〜５０００個の核酸分子である。別の実施形態では、前記１種または複数の核酸分子は、１〜５００個の核酸分子である。別の実施形態では、前記１種または複数の核酸分子は、５〜５００個の核酸分子である。当業者なら、各粒子中の核酸分子の量は、実施される特定のアッセイ、例えば、シーケンシングおよび／または増幅アッセイに適合するように予め決定し得ることを理解するであろう。
【００５７】
いくつかの実施形態では、各粒子は特有のバーコードを含む。当業者なら、各粒子（すなわち、担体）に特有のバーコードでバーコード化することにより、単細胞に入った粒子の量を示し得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、本発明は、疾患を処置するための治療量を決定する方法を提供し、該方法は、複数のタイプの担体を含む組成物を対象に投与することを含み、それぞれのタイプの担体は、１種または複数の治療薬を含み、それぞれのタイプの担体は、前記１種または複数の治療薬の用量が異なる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、それぞれのタイプの粒子（すなわち、担体）は、前記タイプの担体を特定する特有のバーコード（例えば、核酸配列）を含む。いくつかの実施形態では、各粒子（すなわち、担体）は、前記タイプの担体を特定する特有のバーコード（例えば、核酸配列）を含む。
【００５９】
別の実施形態では、前記バーコードは、希土類元素、フルオロフォア、発色団、化学発光分子、磁気粒子、染料、および放射性同位元素からなる群から選択される。
【００６０】
別の実施形態では、前記バーコードは希土類元素である。別の実施形態では、前記希土類元素はランタニドである。いくつかの実施形態では、前記ランタニドは、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジウム（Ｎｄ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、スカンジウム（Ｓｃ）およびイットリウム（Ｙ）から選択される。別の実施形態では、前記希土類元素はランタニドである。いくつかの実施形態では、前記ランタニドは、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、ＹｂおよびＬｕから選択される。
【００６１】
希土類元素（例えば、ランタニド）は、発光標識と複合体を形成する際に有用な場合があり、通常、ランタニド錯体と目的の試料とを、検出可能な光学的応答を得るように選択された条件下で混合することにより使用される。試料は、光学的応答を誘発するように選択された波長で照射され得る。
【００６２】
別の実施形態では、組成物内の前記担体は、前記核酸分子を細胞中のバーコードとして操作可能なように使用するために、追加の薬剤（例えば、化学的または生物学的製剤）をさらに含む。前記薬剤の非限定的例には、ＤＮＡまたはＲＮＡバーコードの内在性または外因性の酵素による分解を防止するなどのために、それぞれ、ＤＮアーゼまたはＲＮアーゼが挙げられる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物を形成する溶液中のバーコード濃度は、２〜１００マイクロモル／リットル（μＭ）の範囲で変えることができる。いくつかの実施形態では、溶液中のバーコード濃度は、１０〜９０マイクロモル／リットル（μＭ）の範囲で変えることができる。いくつかの実施形態では、溶液中のバーコード濃度は、２０〜８０マイクロモル／リットル（μＭ）の範囲で変えることができる。いくつかの実施形態では、溶液中のバーコード濃度は、３０〜７０マイクロモル／リットル（μＭ）の範囲で変えることができる。
【００６４】
一実施形態では、本明細書で記載の組成物は、データの統計的有意性を確保するように、分析される細胞の量に比べて、少数のナノ粒子を含む。典型的な例では、薬剤（単一または複数）の腫瘍に対する治療効果を分析する場合、１ミリメートル３の癌組織中の腫瘍細胞の平均数は、１０６細胞である。全組織中の合計細胞数は、数千万細胞である。すなわち、細胞当たりの理論的組み合わせの可能性の数は、Ｎ！（階乗）であり、式中、Ｎは、それぞれの細胞中に入る十分なバーコードが存在すると仮定した場合のバーコードの数である。選択肢の数を減らすために、組織分析する細胞当たりのバーコード化ナノ粒子の数は、５個未満であるのが好ましい。
【００６５】
一実施形態では、細胞当たり、１〜５種のタイプの担体（すなわち、バーコード化ナノ粒子）が存在する。別の実施形態では、細胞あたり、１〜５種のタイプの担体の存在は、十分なデータおよび高い信号対雑音比（ＳＮＲ）を提供する。別の実施形態では、細胞あたり１〜５種のタイプの担体を含む細胞が分析される。別の実施形態では、細胞あたり１〜４種のタイプの担体を含む細胞が分析される。
【００６６】
本発明の一部は、細胞あたり最大で５種のバーコードタイプの存在を達成するために、注入する必要がある粒子の量は、静脈内に注射される用量の６〜７％が腫瘍部位に蓄積し、実際に腫瘍部位に到達するナノ粒子の５％が細胞に取り込まれ、残りは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に捕捉されることを考慮して計算可能であるという知見に基づいている。
【００６７】
一実施形態では、腫瘍細胞当たり、１〜２００個の粒子が静脈内注射経由で投与される。別の実施形態では、腫瘍細胞当たり、１〜３００個の粒子が静脈内注射経由で投与される。別の実施形態では、腫瘍細胞当たり、１〜４００個の粒子が静脈内注射経由で投与される。別の実施形態では、腫瘍細胞当たり、１〜５００個の粒子が静脈内注射経由で投与される。別の実施形態では、腫瘍細胞当たり、１〜１０００個の粒子が静脈内注射経由で投与される。
【００６８】
別の実施形態では、腫瘍細胞当たり、１〜２０個の粒子が腫瘍内投与される。別の実施形態では、腫瘍細胞当たり、１〜１０個の粒子が腫瘍内投与される。別の実施形態では、腫瘍細胞当たり、１〜５０個の粒子が腫瘍内投与される。別の実施形態では、腫瘍細胞当たり、１〜１００個の粒子が腫瘍内投与される。
【００６９】
いくつかの実施形態では、粒子内のバーコード分子の量は、少なくとも１個、あるいは少なくとも５個、あるいは少なくとも１０個、あるいは少なくとも２０個、あるいは少なくとも３０個、あるいは少なくとも４０個、あるいは少なくとも５０個、あるいは少なくとも６０個、あるいは少なくとも７０個、あるいは少なくとも８０個、あるいは少なくとも９０個、あるいは少なくとも１００個、あるいは少なくとも５００個、あるいは少なくとも１０００個、あるいは少なくとも５０００個、あるいは少なくとも１００００個のバーコード分子／粒子である。いくつかの実施形態では、粒子内のバーコード分子の量は、最大で５個、あるいは最大で１０個、あるいは最大で２０個、あるいは最大で３０個、あるいは最大で４０個、あるいは最大で５０個、あるいは最大で６０個、あるいは最大で７０個、あるいは最大で８０個、あるいは最大で９０個、あるいは最大で１００個、あるいは最大で５００個、あるいは最大で１０００個、あるいは最大で５０００個のバーコード分子／粒子である。いくつかの実施形態では、粒子内のバーコード分子の量は、５〜１００個のバーコード分子／粒子の範囲である。いくつかの実施形態では、粒子内のバーコード分子の量は、１０〜９０個のバーコード分子／粒子の範囲である。いくつかの実施形態では、粒子内のバーコード分子の量は、２０〜８０個のバーコード分子／粒子の範囲である。それぞれを本発明の別々の実施形態とすることが可能である。いくつかの実施形態では、粒子内のバーコード分子の量は、１〜１０００個のバーコード分子／粒子の範囲である。いくつかの実施形態では、粒子内のバーコード分子の量は、１〜１００００個のバーコード分子／粒子の範囲である。
【００７０】
タグ
別の実施形態では、本発明の前記少なくとも１種の担体は、少なくとも１種のタグまたは検出可能部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、同一のタグが全担体で使用される。他の実施形態では、特有のタグが担体のサブセットに使用される。
【００７１】
本発明の組成物および方法で使用可能なタグには、限定されないが、フルオロフォア、発色団、化学発光分子、放射性マーカー、金属、希土類元素、磁気粒子または染料が挙げられる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、タグまたは検出可能部分は、限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ビーズ、チップまたはプレートベースマルチプレックスイムノアッセイなどの免疫アッセイ、質量分析、電気泳動、免疫比濁法、免疫混濁度測定、酵素アッセイ、比色分析または例えば、光度測定、および蛍光結合細胞分取（ＦＡＣＳ）ベース分析によりまたはその他の臨床的に確立されたアッセイにより評価可能な蛍光分析アッセイ、を含むアッセイで有用なタグである。これら全ての方法は、当業者によく知られており、文献に記載されている。
【００７３】
通常、タグの量は、実施されるアッセイに依存し、当業者により決定でき、その能力の下で十分である。いくつかの実施形態では、担体は、前記タグを１分子、またはそれより多い分子含む。
【００７４】
担体
いくつかの実施形態では、治療薬（単一または複数）、前記治療薬（単一または複数）のＤＮＡバーコーディングに有用な核酸配列および任意でタグのための担体が提供される。本発明の方法を実施するために使われる前記担体は、細胞表面ポリペプチド、例えば、異常増殖細胞、癌細胞、免疫細胞および変性細胞上のポリペプチドを含むポリペプチドなどの生体分子を含む特定の分子を標的にしてよい。
【００７５】
代替実施形態では、本発明は、（本発明の方法を実施するために使用される化合物を含むことに加えて）異常増殖、病的、感染、機能障害性細胞および／または細胞受容体を選択的に標的にする分子、例えば、ペプチドまたは抗体を含むナノ粒子の形で、およびリポソーム膜の形で担体を提供する。
【００７６】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、担持される物質（治療薬、核酸分子および任意でタグ）が内部コアの内側にある小胞の形態である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、脂質系粒子である。別の実施形態では、前記脂質系粒子はリポソームである。別の実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、ミセルである。
【００７７】
いくつかの実施形態では、溶液は指定された細胞に不活性であり、それに影響を与えない。いくつかの実施形態では、治療薬を除く組成物の全ての成分は、指定された細胞に不活性であり、それに影響を与えない。いくつかの実施形態では、溶液は水溶液である。別の実施形態では、本発明の組成物は、カチオン性界面活性剤を含まない（カチオン性界面活性剤は細胞に影響を与え、かつ／または治療薬の活性に影響を与え、治療薬の影響の正確な分析を妨げる場合があるので）。
【００７８】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、担持される物質（治療薬、核酸分子および任意でタグ）が、ポリマー／タンパク質／塩などの別の薬剤を含有または非含有の担持される物質と複合体／粒子を形成する小胞の形態である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、デンドリマー様構造を形成し、その構造中では、成分がファンデルワールスまたは疎水性相互作用を介して、ポリマー骨格に結合するかまたは複合体を形成する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、ポリマーナノ粒子である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、ナノゲルである。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、金属ナノ粒子（例えば、金または酸化鉄ナノ粒子）である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、カーボンナノチューブである。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、交互積層粒子である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、ゾルゲルセラミック粒子である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、薬剤とのタンパク質複合体である。
【００８０】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、デンドリマー様構造を形成し、その構造中では、成分がファンデルワールスまたは疎水性相互作用を介して、ポリマー骨格に結合するかまたは複合体を形成する。
【００８１】
一実施形態では、担体（例えば、リポソーム）は、細胞外マトリックスを通って細胞へ容易に侵入できるように、５００ｎｍ未満の直径である。一実施形態では、担体（例えば、リポソーム）は、細胞外マトリックスを通って細胞へ容易に侵入できるように、４００ｎｍ未満の直径である。
【００８２】
一実施形態では、担体（例えば、リポソーム）は、３００ｎｍ未満の直径、２５０ｎｍ未満、２００ｎｍ未満の直径、１５０ｎｍ未満の直径、１００ｎｍ未満の直径、５０ｎｍ未満の直径、２０ｎｍ未満の直径、１０ｎｍ未満の直径または  ５ｎｍ未満の直径である。別の実施形態では、担体（例えば、リポソーム）は、少なくとも１ｎｍの直径、少なくとも５ｎｍの直径、少なくとも１０ｎｍの直径、少なくとも２０ｎｍの直径、少なくとも３０ｎｍの直径、少なくとも４０ｎｍの直径、少なくとも５０ｎｍの直径、少なくとも６０ｎｍの直径、少なくとも７０ｎｍの直径、少なくとも８０ｎｍの直径、少なくとも９０ｎｍの直径、少なくとも１００ｎｍの直径、少なくとも１５００ｎｍの直径、少なくとも２００ｎｍの直径、少なくとも２５０ｎｍの直径または少なくとも３００ｎｍの直径である。それぞれを本発明の別々の実施形態とすることが可能である。
【００８３】
別の実施形態では、担体は１〜３００ｎｍの直径である。別の実施形態では、担体は１０〜２５０ｎｍの直径である。別の実施形態では、担体は５〜２５０ｎｍの直径である。別の実施形態では、リポソームは２０〜１５０ｎｍの直径である。別の実施形態では、リポソームは５〜１５０ｎｍの直径である。別の実施形態では、リポソームは２０〜１５０ｎｍの直径である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、静脈内投与用の担体は、５〜２５０ｎｍの直径である。いくつかの実施形態では、静脈内投与用の担体は、リポソームであり、担体は、４０〜２５０ｎｍの直径である。いくつかの実施形態では、腫瘍内投与用の担体は、５〜３００ｎｍの直径である。腫瘍内投与用の担体がリポソームであるいくつかの実施形態では、担体は、４０〜３００ｎｍの直径である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、担体の形態は、球状または実質的に球状、非球状（例えば、楕円形、管状、など）、不規則形状などであってよい。
【００８６】
治療薬および核酸の標的細胞への送達を要しにするために、本発明では、リポソーム移入ビークルの使用が意図されている。リポソーム（例えば、リポソーム脂質ナノ粒子）は、一般に、研究、産業、および薬物における種々の用途に有用であり、特に診断または治療化合物の移入ビークルとしてのそれらのインビボでの使用に有用であり（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７−３２１，１９９８；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，５１：６９１−７４３，１９９９）、通常、１個または複数の二重層の膜により外部の媒質から隔離された内部水領域を有する顕微鏡レベルの小胞として特徴付けられる。リポソームの二重層膜は通常、空間的に分割された親水性および疎水性ドメインを含む、合成または天然起源の脂質などの両親媒性分子で形成される（Ｌａｓｉｃ、同上）。リポソームの二重層膜はまた、両親媒性ポリマーおよび界面活性剤により形成することができる（例えば、ポリマーソーム、ニオソーム、など）。
【００８７】
一実施形態では、担体は治療薬および核酸分子（ＤＮＡバーコード）の標的細胞への送達を最適化するように選択および／または調製し得る。例えば、標的細胞が肝細胞の場合、移入ビークルの性質（例えば、サイズ、電荷および／またはｐＨ）を最適化して、このような移入ビークルを標的細胞に効果的に送達し得る。あるいは、標的細胞が中枢神経系である場合（例えば、神経変性疾患の治療予測のために）、移入ビークルの選択および調製は、血液脳関門への侵入、およびその内部での保持について、および／またはこのような移入ビークルをこのような標的細胞に直接に送達する別の手段の使用について考慮する必要がある。
【００８８】
目的の実体のリポソーム中への組込みのプロセスは、多くの場合、「充填」と呼ばれる（Ｌａｓｉｃ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５−２５８，１９９２）。リポソームに組込んだ治療薬、核酸および／またはタグは、リポソームの二重層膜内のリポソームの内部領域中に完全にまたは部分的に配置されてよい。薬剤のリポソーム中への組込みはまた、本明細書では「封入」とも呼ばれ、薬剤は完全にリポソームの内部空間内に収容される。典型的な例では、担体（例えば、リポソーム）内への薬剤の封入のために、薬剤と担体との間の共有結合などの化学結合は必要ない。リポソームなどの移入ビークル中への薬剤の組込みの目的は、多くの場合、薬剤（例えば、核酸）を劣化させる酵素または化学薬品を含む可能性のある環境から薬剤を保護すること、および／または薬剤の急速な排出を引き起こすシステムまたは受容体から薬剤を保護することである。したがって、本発明の好ましい実施形態では、選択された移入ビークルは、その中に収容された治療薬および核酸分子および任意でタグの安定性を向上させることができる。リポソームは、封入された薬剤を標的細胞に到達させることができ、かつ／または封入された薬剤を標的細胞に優先的に到達させてもよく、あるいは、薬剤のその他の望ましくない標的部位または細胞への送達を制限してもよい。
【００８９】
いくつかの実施形態では、担体は、封入された治療有効量の少なくとも１種の治療薬、少なくとも１種の治療薬を一義的に特定する核酸分子および任意のタグの細胞への侵入を容易にする。いくつかの実施形態では、治療有効量の少なくとも１種の治療薬、少なくとも１種の治療薬を一義的に特定する核酸分子および任意のタグの細胞への侵入は、担体内への封入により可能となる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、リポソーム移入ビークルは、１種または複数の目的の薬剤を封入するように調製され、それにより、組成物は、高い遺伝子導入効率および向上した安定性を示す。リポソームは核酸の標的細胞中への導入を容易にすることができるが、コポリマーとしてのポリカチオン（例えば、ポリ−Ｌ−リジンおよびプロタミン）の添加により遺伝子導入を容易にし、いくつかの事例では、いくつかの細胞株において、インビトロおよびインビボでの両方で、いくつかのタイプのカチオン性リポソームによる遺伝子導入効率を２〜２８倍まで大きく高めることができる。（Ｎ．Ｊ．Ｃａｐｌｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９５；２：６０３；Ｓ．Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９７；４，８９１を参照されたい）。
【００９１】
別の実施形態では、前記少なくとも１種の担体は、ナノリポソームまたは脂質ナノ粒子である。ナノリポソームは、生物活性剤の特性を、それらの溶解度およびバイオアベイラビリティ、インビトロおよびインビボ安定性を改善することにより、ならびにその他の分子との望ましくない相互作用を防ぐことにより、高めることができる。ナノリポソームの別の利点は、細胞特異的ターゲティングであり、これは、標的細胞中で最適な治療効力に必要な薬剤濃度を得ると同時に、健康な細胞および組織への有害作用を最小限にするために必須である。
【００９２】
本明細書で使用される場合、語句の「脂質ナノ粒子」は、１種または複数の脂質（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、およびＰＥＧ修飾脂質）を含む移入ビークルを意味する。好ましくは、脂質ナノ粒子は、１種または複数の薬剤を１種または複数の標的細胞に送達するように配合される。適切な脂質の例には、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシド）が挙げられる。ポリマーの、単独でまたはその他の移入ビークルと組み合わせた、移入ビークルとしての使用も意図されている。適切なポリマーとしては、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド−ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、デンドリマーおよびポリエチレンイミンが挙げられる。一実施形態では、移入ビークルは、核酸の標的細胞への遺伝子導入を容易にするその能力に基づいて選択される。
【００９３】
本発明は、核酸の封入および／または核酸の標的細胞への送達を強化するためのカチオン性脂質を含む移入ビークルとしての脂質ナノ粒子の使用を意図している。本明細書で使用される場合、語句の「カチオン性脂質」は、選択されたｐＨ、例えば、生理的なｐＨで、真の正電荷を有するいくつかの脂質種のいずれかを意味する。意図される脂質ナノ粒子は、１種または複数のカチオン性脂質、非カチオン性脂質およびＰＥＧ修飾脂質を用いた種々の比率の多成分脂質混合物を含めることにより調製され得る。いくつかのカチオン性脂質は、文献に記載されており、その多くは市販されている。
【００９４】
本発明の組成物および方法で使用するために適切なカチオン性脂質には、国際公開第２０１０／０５３５７２号に記載のものが含まれる。この特許は、参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、イオン化可能カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子を用いる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、すなわち「ＤＯＴＭＡ」が使用される。（米国特許第４，８９７，３５５号）。ＤＯＴＭＡは、単独で処方することができ、または中性脂質、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）またはその他のカチオン性または非カチオン性脂質と共に、リポソーム移入ビークルまたは脂質ナノ粒子中に混入することができ、このようなリポソームを使って、核酸の標的細胞への送達を強化することができる。その他の適切なカチオン性脂質としては、例えば、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミドすなわち「ＤＯＧＳ」、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムすなわち「ＤＯＳＰＡ」（米国特許第５，１７１，６７８号；米国特許第５，３３４，７６１号）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパンすなわち「ＤＯＤＡＰ」、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパンすなわち「ＤＯＴＡＰ」が挙げられる。意図されるカチオン性脂質としては、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンすなわち「ＤＳＤＭＡ」、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンすなわち「ＤＯＤＭＡ」、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンすなわち「ＤＬｉｎＤＭＡ」、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンすなわち「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドすなわち「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミドすなわち「ＤＤＡＢ」、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミドすなわち「ＤＭＲＩＥ」、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３−β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパンすなわち「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２−［５’−（コレスタ−５−エン−３−β−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチ  １−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９’，１−２’−オクタデカジエノキシ）プロパンすなわち「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンすなわち「ＤＭＯＢＡ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンすなわち「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３−ジリノレオイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピルアミンすなわち「ＤＬｉｎＤＡＰ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンすなわち「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、１，２−ジリノレオイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンすなわち「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソランすなわち「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランすなわち「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」、および２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジ−メチルエタンアミン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）（国際公開第２０１０／０４２８７７号；Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２−１７６（２０１０）参照）、またはこれらの混合物も含まれる。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７：２７６−２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｄ  Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３−１００７（２００５）；国際公開第２００５／１２１３４８Ａ１号）。
【００９５】
コレステロールベースカチオン性脂質の使用も本発明により意図されている。このようなコレステロールベースカチオン性脂質は、単独でまたは他のカチオン性もしくは非カチオン性脂質と組み合わせて、使用することができる。適切なコレステロールベースカチオン性脂質としては、例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノプロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３，１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥが挙げられる。
【００９６】
さらに、遺伝子導入効力を高めるいくつかの試薬が市販されている。好適例としては、リポフェクチン（ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、リポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ：ＤＯＰＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＵＧＥＮＥ、トランスフェクタム（ＤＯＧＳ）、およびＥＦＦＥＣＴＥＮＥが挙げられる。
【００９７】
ジアルキルアミノベース脂質、イミダゾールベース脂質、およびグアニジニウムベース脂質などのカチオン性脂質も同様に意図されている。例えば、特定の実施形態は、１種または複数のイミダゾールベースカチオン性脂質を含む組成物に関する。
【００９８】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質および誘導体化脂質、例えば、Ｎ−オクタノイルスフィンゴシン−１−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］（Ｃ８ＰＥＧ−２０００セラミド）などの誘導体化セラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）も、単独でまたは好ましくは移入ビークル（例えば、脂質ナノ粒子）を含む他の脂質と一緒に組み合わせとして、本発明により意図されている。このような成分の添加は、複雑な凝集を防止し得、また、延長された循環寿命および脂質−核酸組成物の標的細胞への向上した送達（Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５−２３７）を提供し得、またはそれらは、インビボ配合物から迅速に置換するように選択され得る（米国特許第５，８８５，６１３号を参照）。特に有用な置換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧセラミドである。本発明のＰＥＧ修飾リン脂質および誘導体化脂質は、リポソーム移入ビークル中に存在する脂質全体の約０％〜約２０％、約０．５％〜約２０％、約１％〜約１５％、約４％〜約１０％、または約２％のモル比で含まれてよい。
【００９９】
本発明はまた、非カチオン性脂質の使用も意図している。本明細書で使用される場合、語句の「非カチオン性脂質」は、任意の中性、双性イオン性またはアニオン性脂質を意味する。本明細書で使用される場合、語句の「アニオン性脂質」は、選択されたｐＨ、例えば、生理的なｐＨで、真の負電荷を有するいくつかの脂質種のいずれかを意味する。非カチオン性脂質としては、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセリン（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセリン（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−ｔｒａｎｓＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイルホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。このような非カチオン性脂質は単独で使用してよいが、他の賦形剤、例えば、カチオン性脂質と組み合わせて使用するのが好ましい。カチオン性脂質と組み合わせて使用される場合、非カチオン性脂質は、移入ビークル中に存在する脂質全体の５％〜約９０％、または好ましくは約１０％〜約７０％のモル比で含まれてよい。
【０１００】
いくつかの実施形態では、移入ビークル（例えば、脂質ナノ粒子）は、複数の脂質および／またはポリマー成分を混合することにより調製される。脂質ナノ粒子を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質および／またはＰＥＧ修飾脂質の選択、ならびにこのような脂質間の相対的モル比は、選択脂質（単一または複数）の特性、目的の標的細胞の性質および送達される薬剤の特性に基づいて決定される。さらなる考慮すべき点には、例えば、選択される脂質（単一または複数）のアルキル鎖の飽和度、ならびに、サイズ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、膜融合性および毒性が挙げられる。
【０１０１】
本発明の組成物で使用するリポソーム移入ビークルは、現時点で当該技術分野において既知の種々の技術により調製することができる。多重層膜小胞（ＭＬＶ）は、従来技術、例えば、選択脂質を適切な溶媒に溶解して、適切な容器または器の内壁上に沈着させた後に溶媒を蒸発させて器の内側上に薄膜を残すか、またはスプレー乾燥することにより調製し得る。その後、水相を器に添加し、ボルテックス運動を加えることにより、ＭＬＶが形成される。次いで、多重層膜小胞をホモジナイゼーション、超音波処理または押出成形により、単層小胞（ＵＬＶ）を形成することができる。さらに、単層小胞は合成洗剤除去技術により形成することができる。
【０１０２】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、インビトロおよびインビボ用途の両方で検出可能な診断放射性核種、蛍光物質またはその他の物質を添加されていてもよい。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子担体は、その粒子の高スループット合成および標識に適応するように構成されたインラインマイクロ流体装置を使って脂質から作製される。このような製造方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｊａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２３，６２８９−６２９３）。通常、治療に有効な負荷量を収容するのに適切なサイズの粒子が作製される。
【０１０４】
Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２３，４０１９−４０２５により示されるように、化学薬品を安定なＨＳＰＣ粒子中に充填し得る。生物学的治療薬（タンパク質／ＲＮＡ）は「タンパク質産生ナノ粒子」内で合成してよい。いくつかの実施形態では、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １２，２６８５−２６８９，（２０１２）で示されるように、合成ナノ粒子は、標的部位で、タンパク質およびＲＮＡの合成を制御可能に誘発する。これらのナノ粒子は、感光性保護基でケージ化したアミノ酸、リボソーム、およびＤＮＡを含む、転写および翻訳を行う分子装置を詰め込んだ脂質小胞からなる。粒子は、ＲＮＡ／タンパク質を産生することができるナノ工場として機能する。インビトロおよびインビボでのタンパク質／ＲＮＡ合成は、空間的におよび時間的に制御可能であり、また、ミリ秒の時間尺度でミクロンスケール組織領域を照射することにより開始することができる。したがって、このプラットフォームを使って、ＲＮＡ（Ｐｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１２  Ｎａｔｕｒｅ  ４８１，１９０−１９４）およびタンパク質をその活性、例えば、抗癌活性により選別し得る。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子（例えば、担体）は、リポソーム形成脂質がナノ粒子の４０〜１００モル％を構成するナノ粒子である。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、０〜５０モル％のコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、１〜８モル％のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、０〜１０モル％の機能性脂質（例えば、カチオン性脂質または標的指向性部分を有する脂質）を含む。
【０１０６】
本明細書および当該技術分野において使用される場合、モルパーセント（モル％）は、ナノ粒子を構成する成分または化合物の合計モル数を基準にした特定の成分または化合物の割合を意味する。例えば、ナノ粒子が３モルの化合物Ａおよび１モルの化合物Ｂを含む場合、化合物Ａは、混合物の７５モル％、化合物Ｂは２５モル％含まれる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子（例えば、担体）は、４０〜７０モル％のリポソーム形成脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、２０〜５０モル％のコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、４〜８モル％のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、０〜３モル％の機能性脂質（例えば、カチオン性脂質または標的指向性部分を有する脂質）を含む。特定の実施形態では、４０〜７０モル％のリポソーム形成脂質、２０〜５０モル％のコレステロール、４〜８モル％のＰＥＧ脂質および０〜３モル％の機能性脂質を含むナノ粒子は、静脈内投与に好適する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子（例えば、担体）は、５０〜８０モル％のリポソーム形成脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、０〜５０モル％のコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、０〜３モル％のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、４〜８モル％の機能性脂質（例えば、カチオン性脂質または標的指向性部分を有する脂質）を含む。特定の実施形態では、５０〜８０モル％のリポソーム形成脂質、０〜５０モル％のコレステロール、０〜３モル％のＰＥＧ脂質および４〜８モル％の機能性脂質を含むナノ粒子は、腫瘍内投与に好適する。
【０１０９】
セラノスティックス用途
いくつかの実施形態では、疾患に苦しんでいる対象の治療薬に対する反応の予測に使用するために、治療有効量の少なくとも１種の治療薬および前記少なくとも１種の治療薬を一義的に特定する核酸分子を独立に含む複数の担体を含む組成物が提供される。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、疾患に苦しんでいる対象の、治療薬に対する反応を予測する方法が提供され、該方法は、
（ａ）治療有効量の少なくとも１種の治療薬および前記少なくとも１種の治療薬を一義的に特定する核酸分子を独立に含む複数の担体を含む組成物を対象に投与するステップと、
（ｂ）前記対象から得られた試料において、前記少なくとも１種の治療薬の効力を前記特有の核酸分子により特定するステップと、を含み、
それにより、疾患に苦しんでいる対象の治療薬に対する反応を予測する。
【０１１１】
別の実施形態では、前記方法は、前記核酸分子をシーケンシングするステップをさらに含む。別の実施形態では、前記方法は、前記核酸分子を増幅するステップをさらに含む。核酸を増幅する方法および核酸のシーケンシング方法は、当業者にはよく知られている。
【０１１２】
別の実施形態では、前記方法は、薬剤の標的細胞とのインキュベーション後に、洗浄およびＤＮアーゼ処理ステップをさらに含む。別の実施形態では、前記試料は、治療効力の判定の前に単細胞懸濁液に分解される。細胞試料を単細胞懸濁液に分解する方法は、当技術分野において既知であり、例えば、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（登録商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを挙げてもよい。
【０１１３】
別の実施形態では、前記方法は、細胞選別ステップをさらに含む。細胞選別方法は、当該技術分野において周知であり、ＦＡＣＳ、磁気ビーズ選別、ＥＬＩＳＡ、マイクロ流体ベース選別、細胞張力ベース選別、などが挙げられるが、これらに限定されない。有利な実施形態では、それぞれの治療薬の活性は、標的細胞を選別し、細胞状態（例えば、生／死細胞）とＤＮＡバーコードとを相互に関連付けることにより、分析される。さらなる実施形態では、この手法により、それらの患者特異的および細胞特異的活性に対する複数の薬剤の選別が可能となる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示の方法は、治療薬がその治療活性を発揮するための維持時間量を与えることを含む。標的細胞をサンプリングする前のこの維持時間量は、障害または状態の性質、および特定の薬剤に依存するであろうが、当業者に既知の標準的臨床技術により決定することができる。非限定的例として、維持時間量には、組成物の投与後の、約２４、約３０、約４８時間、またはさらに２４時間が含まれる。それぞれを本発明の別々の実施形態とすることが可能である。いくつかの実施形態では、細胞内のバーコードのＤＮアーゼ分解を回避するために、維持時間量は７２時間未満である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、標的細胞のサンプリング前の維持時間量は、２４〜７２時間の範囲である。いくつかの実施形態では、標的細胞のサンプリング前の維持時間量は、２４〜４８時間の範囲である。他の実施形態では、標的細胞のサンプリング前の維持時間量は、３０〜４８時間の範囲である。他の実施形態では、試料は組成物の投与後、少なくとも２４時間で取得される。他の実施形態では、試料は組成物の投与後、少なくとも３０時間で取得される。他の実施形態では、試料は組成物の投与後、少なくとも４８時間で取得される。他の実施形態では、試料は組成物の投与後、最大４８時間で取得される。他の実施形態では、試料は組成物の投与後、最大６０時間で取得される。他の実施形態では、試料は組成物の投与後、最大７２時間で取得される。他の実施形態では、試料は組成物の投与後、２４〜４８時間で取得される。他の実施形態では、試料は組成物の投与後、３０〜４８時間で取得される。標的細胞のサンプリングのための正確な時間枠は、使われるバーコードおよび検査される治療薬のタイプと量を含む、いくつかの因子により決定し得る。非限定的例として、核酸分子は通常、投与（特に全身投与）後４８時間、分解を受けやすいが、希土類元素は、より長期間にわたり検出することができる。他の実施形態では、治療薬は、それらが標的細胞に作用する時間により異なる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、治療薬（例えば、シスプラチン）は特有のバーコードを含む。当業者なら、このような実施形態において、前記担体は治療薬（例えば、シスプラチン）を含んでよく、また、追加のバーコードを加える必要はないことを理解するであろう。
【０１１７】
別の実施形態では、前記組成物は、全身投与用として処方される。別の実施形態では、前記全身投与は、静脈内注射による。別の実施形態では、前記投与は腫瘍内注射などの組織への注射である。
【０１１８】
いくつかの態様では、１〜４種のタイプの本発明の担体を含む少なくとも１種の細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、１〜４種のタイプの担体を含む少なくとも１種の細胞を含む組成物が提供され、それぞれのタイプの担体は、単細胞治療有効量の少なくとも１種の治療薬、および少なくとも１種の治療薬を一義的に特定する１〜１０，０００個の核酸分子を独立に含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞を含む組成物が提供され、それぞれの細胞は１〜４種のタイプの担体を含み、それぞれのタイプの担体は、単細胞治療有効量の少なくとも１種の治療薬、および少なくとも１種の治療薬を一義的に特定する１〜１０，０００個の核酸分子を独立に含む。
【０１１９】
本発明の方法および組成物を使って、膨大な数の標的細胞を優先的に標的にしてよい。例えば、意図される標的細胞としては、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心臓細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑膜表層細胞、卵巣細胞、精巣細胞、繊維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、および腫瘍細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「腫瘍細胞」には、原発癌細胞ならびに転移細胞が含まれる。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、用語の「対象」は、任意の動物（例えば、哺乳動物）を意味し、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、などが含まれ、それらに対し、本発明の組成物および方法が投与される。いくつかの実施形態では、用語の「対象」および「患者」は、ヒト対象に関して、本明細書では同義に使用される。他の実施形態では、用語の「対象」および「患者」は、非ヒト対象に関して、本明細書では同義に使用される。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、悪性疾患に苦しんでいる対象の治療薬に対する反応を決定または予測するために有用である。いくつかの実施形態では、前記悪性疾患は、癌、癌転移および前悪性病変である。
【０１２２】
癌治療薬の例には、例えば、限定されないが、アビラテロン、アシトレチン、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アミホスチン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、ヒ素、アスパラギナーゼ、アスパラギナーゼ、エルウィニア、アキシチニブ、アザシチジン、ＢＣＧ、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブレンツキシマブ、ブロモクリプチン、ブセレリン、ブスルファン、カバジタキセル、カベルゴリン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シクロスポリン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、デガレリクス、デノスマブ、デキサメタゾン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシンペグ化リポソーム、エンザルタミド、エピルビシン、エリブリン、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イニパリブ、インターフェロンα−２ｂ、イピリムマブ、イリノテカン、イクサベピロン、ラムブロリズマブ、ランレオチド、ラパチニブ、レナリドマイド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレザト、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニロチニブ、ニルタミド、オクトレオチド、オファツムマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、ＡＣＬｉｔａｘｅｌナノ粒子、アルブミン結合（ｎａｂ）、パミドロネート、パニツムマブ、パゾパニブ、ペメトレキセド、ペルツズマブ、ポルフィマー、プロカルバジン、キナゴリド、ラルチトレキセド、レオウイルス血清型３−Ｄｅａｒｉｎｇ株、リツキシマブ、ロミデプシン、ルクソリチニブ、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、タモキシフェン、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、チロトロピンα、トシリズマブ、トポテカン、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、トラスツズマブ、エムタンシン（カドサイラ（登録商標））、トレオスルファン、トレチノイン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビンが挙げられる。
【０１２３】
治療薬として使用される化学療法剤の例には、例えば、限定されないが、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、アジリジン、エポキシド、スルホン酸アルキル）、シスプラチンおよびその類似体（例えば、カルボプラチン、オキサリプラチン）、抗代謝剤（例えば、メトトレザト，５−フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、フルダラビン）、トポイソメラーゼ相互作用剤（例えば、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、テニポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン）、微小管阻害剤（例えば、ビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびビノレルビン；タキサン、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、インターフェロン、インターロイキン−２、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、モノクローナル抗体、エストロゲン調節薬（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン）、メゲストロール、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、オクトレオチド）、オクトレオチド、抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド、カソデックス）、キナーゼおよびチロシン阻害剤（例えば、イマチニブ（ＳＴＩ５７１またはグリーバック）；ゲフィチニブ（イレッサ）；およびエルロチニブ（タルセバ）、など、例えば、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄｅｖｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １５，１６，１７，ａｎｄ  ６３を参照）が挙げられる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、炎症性疾患または障害に苦しんでいる対象の治療薬に対する反応を決定または予測するために有用である。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、変性疾患または障害に苦しんでいる対象の治療薬に対する反応を決定または予測するために有用である。一実施形態では、前記変性疾患は変形性関節症である。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、神経疾患または障害に苦しんでいる対象の治療薬に対する反応を決定または予測するために有用である。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、値に組み合わされる場合、言及値±１０％を意味する。例えば、約１０００ナノメートル（ｎｍ）の長さは、１０００ｎｍ±１００ｎｍの長さを意味する。
【０１２８】
本発明の追加の目的、利点、および新規特徴は、限定を意図するものではない次の実施例を考察することにより、当業者に明らかとなるであろう。さらに、本明細書中で上記に詳述されたような、および、下記の特許請求の範囲のセクションにおいて請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれに関し、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【０１２９】
実施例
通常、本明細書で使用される命名法および本発明で使用される検査法には、分子、生化学、微生物学および組み換えＤＮＡ技術が含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば、以下の文献を参照されたい。”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，”Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）”Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号に記載のような方法；”Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；”Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”  ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），”Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これら全ての文献は参照により本明細書に組み込まれる。その他の一般的な文献は、本明細書全体を通して提供される。
【０１３０】
リポソーム合成／調製
当該技術分野において既知の方法を用いてリポソームを調製した。ＨＳＰＣ、ＰＥＧ−ＤＳＰＥおよびコレステロールの５８％、２％、４０％を純粋なエタノール中に溶解し、完全に溶解するまで６５℃で加熱した。
【０１３１】
リポソームの合成：リポソームは５８モル％の水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、Ｍｗ７６２．１；２モル％のポリエチレングリコールジステアロイルホスホエタノールアミン（ｍ２０００ＰＥＧ  ＤＳＰＥ）（この役割は、立体効果に起因するリポソームの凝集／融合を減らすことである）、Ｍｗ２８０５．５４；および４０モル％のコレステロール、Ｍｗ３８６．６５、の脂質組成物を含む。脂質全体の作用濃度は、溶液中の５０ｍＭである。培地は脱イオン水中の１０％ＰＢＳ／５％デキストロースとした。最初に、脂質を純粋なエタノールに溶解し、６５℃に暖め、１ｍｌの培地（これも同じ温度に暖めた）を加えた。直接注入およびピペット操作後、最終の脂質濃度に達するまでさらに培地を加えた。水素化大豆ホスファチジルコリンは、Ｌｉｐｏｉｄ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から提供を受け；ｍ２０００ＰＥＧ−ＤＳＰＥは、Ａｖａｎｔｉ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡ）から、およびコレステロール（カタログ番号：Ｃ８６６７−５００ＭＧ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）から購入した。
【０１３２】
ＤＮＡ封入：２５ナノモルの脱塩した、５０〜１２０の範囲の塩基対長さのｓｓＤＮＡオリゴをＳｉｇｍａ＆ＩＤＴ（Ｌｅｕｖｅｎ  Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入した。２種のｓｓＤＮＡのアニーリング後、ストックを１００μＭに希釈し、１００マイクロリットル（μｌ）の一定分量に分割した。５ｍｌの脂質溶液用として、溶解した脂質を加える前に、３００μｌのｄｓＤＮＡを１ｍｌの培地溶液に加えた（３ｍｌに対し、１５０μｌのｄｓＤＮＡ）。封入後、押出機を使って２００ｎｍのリポソームを作製した。
【０１３３】
押出プロセス：脂質溶液を４００ｎｍおよび２００ｎｍ膜を通して３回押し出した。押出成形機の温度を６５℃に設定した。
【０１３４】
ＤＬＳ（動的光散乱）による粒径測定−押出成形後、ＤＬＳ（ＺｅｔａＳｉｚｅｒ−ＺＳＰ）によりサイズ測定を行った。ＰＤＩ範囲は０．００３〜０．０８であった。
【０１３５】
インビトロ遺伝子導入：Ｂ−１６（黒色腫）および４Ｔ１（乳癌）マウス癌細胞の両方に対し、８／３．５ｃｍ組織培養プレートでインビトロ実験を行った。細胞をＲＰＭＩ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）中で培養し、２４時間後、１０％（ｖ／ｖ）のリポソーム溶液を新しい培地と共に細胞培養液に加えた。細胞を３７℃で２４時間インキュベートした後、分析した。
【０１３６】
ＤＮＡ抽出：残存するリポソームを含む培地を廃棄し、細胞をＰＢＳＸ１（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）で３回洗浄した。細胞をトリプシンを使ってプレートから分離し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中に移した。細胞を１２００ｒｐｍで７分間遠心分離し、トリプシンを廃棄した。Ｂｌｉｇｈ  ＆  Ｄｙｅｒ法（１６７μｌの１：２のクロロホルム：メタノール（ｖ／ｖ）、５５．５μｌのクロロホルム、および１００μｌの脱イオン水）を使ってＤＮＡ抽出を行った。１０００ｒｐｍで５分の遠心分離後、上部水相を集めた。
【０１３７】
ＤＮＡ増幅：５０μｌの反応液のレディーミックス（「Ｏｒｎａｔ」）を使って、ｄｓＤＮＡをｔｈｅｒｍｏ  ｃｙｃｌｅｒ（「Ｄａｎｉｅｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ」）で増幅した。ＰＣＲ後、溶液を３％（ｗ／ｗ）アガロースゲル（「Ｈｙ−Ｌａｂｓ」）に加え、２５分間泳動した。
【０１３８】
ＲＴ−ＰＣＲ：ＤＮＡ抽出後、その鎖を増幅し、ＴａｑＭａｎプローブを使ってＲＴ−ＰＣＲ  ｔｈｅｒｍｏ  ｃｙｃｌｅｒで（「Ｂｉｏ  Ｒａｄ」）で解析した。
【０１３９】
細胞選別：１５ｍｌの１０６／ｍｌの濃度の細胞懸濁液を流動活性化細胞選別（ＦＡＣＳ−ＡＲＩＡ）に投入した。細胞をゲーティング後、それらを１，０００細胞、１００細胞、１０細胞および単細胞に選別した。全ての細胞をポリプロピレン製円錐形透明９６ウエル中に選別した。選別後、Ｂｌｉｇｈ  ＆  Ｄｙｅｒ法およびＰＣＲを行った。
【０１４０】
細胞希釈：細胞を１ｍｌの培地中に懸濁し、計数した。次の段階は、１０３細胞までの一連の希釈−１００μｌを９００μｌのＰＢＳＸ１中への希釈である。１０３、１０２および１０細胞を得るために、各希釈液の１０μｌを９０μｌの脱イオン水に加えて、再度１０倍希釈する。最終的に、理論的に単細胞を得るために、１００細胞希釈液から１μｌを採取し、９９μｌのＰＢＳＸ１に入れる。
【０１４１】
共焦点／細胞観察装置：ＤＮＡ封入−ＦＡＭ標識ＤＮＡを含むリポソームを上記方法を使用して調製した。そのリポソームを１０％ＰＢＳに対して２４時間透析した（膜タイプ）。透析前後の試料の蛍光（３回の繰り返し）を、それぞれ、ＤＬＳ（製品）励起および発光：５６６〜３４５ｎｍを使って測定した。透析前後の蛍光値を細分割して、封入パーセンテージを得た。
【０１４２】
インビボ遺伝子導入：１０６細胞／ｍｌの４Ｔ１（乳癌）の１００μｌを１０週齡ｂａｌｂ／ｃ雌マウスの皮下に注射した。約１４週後（原発腫瘍が十分大きくなったときに）、１００μｌのリポソーム溶液を静脈内注射した。３６時間後、マウスを屠殺し、その後のステップのために、その器官（＋腫瘍）を氷中に採取した。
【０１４３】
実施例１
ナノ粒子製造および標識
粒子の高スループット合成および標識に適応するように構成されたインラインマイクロ流体装置（Ｊａｈｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００７，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２３，６２８９−６２９３）を使って、ナノ粒子が脂質から製造される（図２）。治療ペイロードを収容するのに適切なサイズの粒子が作製される。化学薬品が安定なＨＳＰＣ粒子中に充填され（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．２００７，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２３，４０１９−４０２５）、約２００ｎｍの「タンパク質産生ナノ粒子」内で生物学的治療薬（例えば、タンパク質／ＲＮＡ）が合成される。最近開発されたのは、標的部位で、タンパク質およびＲＮＡの合成を制御可能に誘発することができる合成ナノ粒子である（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １２，２６８５−２６８９）。これらのナノ粒子は、感光性保護基でケージ化したアミノ酸、リボソーム、およびＤＮＡを含む、転写および翻訳を行う分子装置を詰め込んだ脂質小胞からなる。粒子は、ＲＮＡ／タンパク質を産生することができるナノ工場として機能する。インビトロおよびインビボでのタンパク質／ＲＮＡ合成は、空間的におよび時間的に制御可能であり、また、ミリ秒の時間尺度でミクロンスケール組織領域を照射することにより開始することができる。我々は、このプラットフォームを使って、ＲＮＡおよびタンパク質を、それらの抗癌活性により選別することになる。
【０１４４】
原発腫瘍および転移腫瘍治療活性のインビトロおよびインビボモデルを作ることができる。複数の薬剤を同時に選別するために、ナノ粒子はＤＮＡバーコードでタグ付けされる（図３）。図３で認められるように、ＤＮＡバーコードは、１，０００（図３Ａ）５００（図３Ｂ）、５（図３Ｃ）細胞のクラスター内で、さらには単細胞（図３Ｄ）内でも検出された。
【０１４５】
実施例２
原発腫瘍および転移腫瘍モデルのアッセイ
最初のインビボ調査を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（図４）中の４Ｔ１乳癌モデル（Ｗｅｉｎｂｅｒｇと共同研究者により報告された）を使って行った。これらのモデルの臨床的精度を確認するために、セラノスティックスナノ粒子の体内分布および活性を、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）テラトーマで樹立されたヒト由来腫瘍でも同様に試験した。これらの腫瘍は、微小環境、腫瘍内の形態的不均質性、癌細胞亜集団および細胞表現型を含む臨床的シナリオを正確に反映すると考えられている（Ｂｕｒｇｏｓ−Ｏｊｅｄａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．２０１３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７３，３５５５−３５６５，２８４５）。
【０１４６】
最初に、リポソームを使ったバーコードの送達の効率を試験するために、バーコード含有リポソームまたは裸のバーコードをマウスに投与した。注射の４８時間後、腫瘍を採取、ホモジナイズし、バーコードを抽出、増幅した。この基本の増幅は、ＲＴ−ＰＣＲによるバーコードの非特異的増幅である。腫瘍組織中で検出されたバーコードの量は、担体（リポソーム）を使った場合に有意に多かった（図５）。ＤＮＡ鎖（バーコード）および細胞膜の両方が負電荷なので、ＤＮＡはメディエーターなしでは細胞内に入れない。したがって、腫瘍中の封入されていないバーコードの存在は、細胞ではなく、腫瘍の余分な細胞マトリックスにＤＮＡ鎖が到達したことにより説明することができる。
【０１４７】
１００ｎｍの直径を有するバーコード化ナノ粒子およびミクロンの直径を有するバーコード化ナノ粒子を、乳癌腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈内に注射した。注射の４８時間後、腫瘍を単細胞懸濁液中に解離させ、ＦＡＣＳを使って細胞を集めた。ＤＮＡバーコードを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲで増幅した。結果は、ナノメータ−サイズのナノ粒子の取り込みがミクロンサイズのナノ粒子の取り込みより有意に多いことを示した（図６）。これらの結果は、リポソームの取り込みは、サイズ依存性であり、より小さい粒子を優先することを示唆する。
【０１４８】
インビボ技術の最初の試験は、乳癌に対する薬剤モデルとしてドキソルビシン（ＤＯＸ）を使用して行った。ＤＯＸを含むバーコード化ナノ粒子（ＢＮＰ）と、バーコードのみを含み薬剤を含まないプラセボＢＮＰとの間で何らかの差異があるかどうかの判定をするために、手順には、バーコード化リポソームを２つのバッチ：１．バーコードのみを含むリポソーム、２．バーコードとＤＯＸを含むリポソーム、を使って合成することを含めた。バーコードは、受動的に封入し、一方、ＤＯＸは能動的に封入した。プラセボＢＮＰを１つのマウス群（ｎ＝３）に、ＤＯＸ  ＢＮＰを別の群に、別々に注射した。注射の４８時間後、腫瘍を抽出し、単細胞懸濁液中に解離させた。細胞を細胞生存率測定用試薬（７ＡＡＤ）で染色し、ＦＡＣＳにより生／死細胞として選別した。各群からバーコードを抽出した。抽出後、ＤＮＡバーコードをＲＴ−ＰＣＲで増幅した。各群（生／死）のバーコード濃度をバーコードの量に変換し、細胞当たりのＤＮＡバーコード分子を得るための細胞量で正規化した。図７（Ａ）は、プラセボでは、バーコード化ＮＰが、主に生細胞中に蓄積されたことを示す。これは、死細胞ではほとんど取り込みが起こらないという仮説と一致する。第２のＤＯＸ処置群では、死細胞中での選択分布を示した（図７Ｂ）。
【０１４９】
卵巣癌は、効果的治療法がほとんどなく、社会に蔓延している。この疾患は往々にして肝臓または腹部領域への転移後に検出される。
【０１５０】
以前記載したように（Ｂｕｒｇｏｓ−Ｏｊｅｄａ、前出）、この調査では、卵巣腫瘍は、ＳＣＩＤ／ベージュマウスのｈＥＳＣテラトーマ中で増殖される。抗癌剤を充填されたバーコード化ナノ粒子が静脈内に投与される。ナノ粒子の治療作用の評価は、腫瘍中に蓄積され、治療が可能となる、４８時間後行われる。４８時間の時間は、４Ｔ１細胞を使って確認された（図８参照）。死後の組織の組織学的評価を行って腫瘍体内分布が調査される。その後、生検試料を単細胞懸濁液中に解離させ、抗体を使って細胞を亜集団（ＣＤ４５、ＣＤ１１Ｂ、Ｆ４／８０、ＣＤ１３、ＲＥＳＴ）および生存率（生／死）により選別した。
【０１５１】
５種の異なる薬剤または対照化合物（図８にプラセボ、カフェイン、シスプラチン、ドキソルビシンおよびゲムシタビンを示す）を含むバーコード化ナノ粒子を、後肢大腿に原発腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスに同時に静脈内注射を行った。４８時間後、腫瘍から生検材料を採取した。その後、生検組織を単細胞懸濁液中に解離させ、細胞をその生存率（生／死）に従って選別した。生細胞に比べて、死細胞で高レベルの薬剤（ゲムシタビン、シスプラチン）のバーコードが見つかった。中性化合物のカフェインは、生存細胞および死細胞の両方で類似のバーコードレベルを有していた。図８Ａ〜Ｅに示されるように、この腫瘍の治療に対し、ゲムシタビンはシスプラチンより効果が大きい。
【０１５２】
結果は、それぞれのバーコードの特有の分布を示す。予想した通りに、ＤＯＸおよびシスプラチンの両方が明確な治療効果を示した。カフェインは、ほとんど効果がなく、その分布は、死細胞と生存細胞との間でほぼ等しく分配された（図８Ａ〜Ｅ）。最も驚くべき結果は、治療薬スケールの両端：プラセボとゲムシタビンから得られた。ゲムシタビンは、その分布に基づいて、最も効果的な薬剤であることが明らかになった。ほとんど全てのゲムシタビンバーコードが死細胞中に、生細胞に比べて６，０００倍を超えて、蓄積された（図８Ｅ）。その他の治療効力スケールでは、プラセボＢＮＰは、−死細胞に比べて、１０，０００倍を超えて、ほとんど生細胞中に蓄積された（図８Ａ）。このデータは、細胞が生存している限り、プラセボＢＮＰは細胞中で蓄積し続けるであろうことを示唆している。これが分布を強く生細胞側にシフトさせる。
【０１５３】
本実施例は、処置周期開始前に、薬剤の細胞特異的効力を決定するための、ならびに腫瘍微小環境内の薬剤の治療プロファイルを調査するためのセラノスティックスプラットフォームを示す（図８Ｆ）。
【０１５４】
３種の化学療法薬−ドキソルビシン、シスプラチンおよびゲムシタビン、のバーコード分析を確認するために、治療処置を行った。実験には、それぞれ６匹のマウスを含む４つの群を含めた。腫瘍誘導後１０日から開始して、各群を単一薬剤で２４時間処置した。各用量を週１回静脈内投与した。各群を５ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン、６ｍｇ／ｋｇのシスプラチン、１２５ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンまたは対照としての１００μｌの食塩水で処置した。腫瘍体積を、キャリパーで測定し、長さ／２＊（幅）２として計算した。図９Ａを考察すると、薬剤効力は、腫瘍体積変化パーセンテージの差異に基づいて直接評価できる。これらの結果は、３種の薬剤の内で、ゲムシタビンを最も効果的な薬剤であると評価した診断分析を裏付ける。ゲムシタビンは、ドキソルビシンおよび対照処置に比べて、腫瘍の増殖を有意に弱めた。実験期間中に、臨床的毒性は観察されなかった。処置開始２４日後に、さらなる分析を行うために、各マウスの腫瘍を抽出した。図９Ｂは、各群からの典型的な腫瘍を示す。この腫瘍の可視化も診断結果を裏付け、それぞれの処置間の差異を示す。この結果を裏付ける別の指標は、腫瘍／体重比である。腫瘍重量がより少ないと、体重がより大きくなり、薬剤がより効果的である。図９Ｃでは、ゲムシタビンの場合に最小の腫瘍／体重比をもたらす傾向がある。この傾向は、腫瘍寸法および腫瘍体積の変化と相関する。腫瘍重量パラメータは、薬剤の腫瘍増殖を抑制し、その増殖を損なうことに対する有効性を反映している。体重パラメータは、薬剤の身体に与える影響を反映するか、または薬剤の副作用がどの程度重篤であるかを反映している。これらのパラメータを組み合わせることにより、どの薬剤が腫瘍を処置するのに最も効果的な薬剤であるか、およびどの薬剤が身体に対し少ない毒性を示すかを判定するのを容易にできる。組織レベルで異なる群間の差異を調べるために、全ての腫瘍を組織学的に調査した。腫瘍由来の組織スライドをヘマトキシリン・エオシンで染色した。そのスライドの顕微鏡検査は、高度に細胞性の固形腫瘍を示す。興味深いことに、治療に対し臨床反応を示した腫瘍は、細胞がより少なく、腫瘍細胞分裂像数がより少なかった。さらに、組織スライドを、ウサギモノクローナル抗Ｋｉ６７抗体（ＳＰ６；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）で免疫組織化学的に染色し、増殖指数（示さず）を決定した。スライドの分析により、対照、ドキソルビシン、シスプラチンおよびゲムシタビン処置腫瘍でそれぞれ８５％、９０％、６５％、および４０％の増殖指数を有するより効果的な治療を受けた腫瘍におけるより低い増殖指数が示された。
【０１５５】
実施例３
プロセスの実現性
インビボ実験は、２μＭより低いバーコード濃度を使うことにより、検出が阻害されることを示した（システムのＬＯＤ下で）。細胞の単層の内側の粒子があふれ出すのを防ぐため、インビトロ調査で使用された粒子の濃度は、インビボ調査で使用された粒子の濃度の百分の１であった。この濃度は良好な統計およびロバスト解析を可能とする。封入されたバーコードの解析により、粒子内の十分なバーコード分子の範囲は、５〜１００個のバーコード分子／粒子の範囲とする必要があることが示された（これは、脂質に対するＤＮＡのモル比をベースに計算された）。結果の統計分析について、効果的な粒子濃度は、２〜２０μＭの範囲であることが明らかになった。２μＭより低い濃度を使用する場合は、全ての細胞が少なくとも１個の粒子を含むとは限らない可能性が高い。この濃度を超えると、システムのＳＮＲ（信号対雑音比）が低すぎると思われる。
【０１５６】
粒子投与後の細胞採取の最適時点を決定するためには、粒子の組織中への蓄積に要する時間、薬剤が細胞を死滅させるのに要する時間、および細胞中でバーコードが分解されるのに要する時間の全てを考慮に入れる必要がある。これらのパラメータを考慮して、生検を行うことにより粒子を採取する前の粒子の循環期間を、４８時間に最適化した。
【０１５７】
体内分布におけるインビボ研究では、粒子が腫瘍組織中で最大濃度に到達するのに２４時間要することが示された。さらに、インビトロ研究では、いくつかの薬剤の最大治療効力に達するまでの平均時間は、２４時間から４８時間の間で変動することが示された。粒子が組織に到達するのに要する時間、および薬剤が細胞中で致死量に達するのに要する時間を考慮すると、最適時間は３０〜４８時間とすべきである。この時間を延長することは、細胞内に存在するＤＮアーゼによってバーコードが分解されるため、バーコード分析を危うくすることになる。
【０１５８】
実施例４
静脈内および腫瘍内投与用の粒子組成物
特有の脂質要素から構成される好ましい粒子が、投与モード、特に静脈内対腫瘍内投与に適合するように調製された。静脈内投与粒子および腫瘍内投与粒子の代表的組成物を表１にまとめている。
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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