(57)【要約】      （修正有）【課題】１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとしたＰＣＲ、又は細菌の同定方法に使用でき、これらを従来の方法と比較して簡易、迅速、かつ高精度とするプライマーセットなどの提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むプライマー対からなるプライマーセット、ならびに、該プライマーセットを使用してＰＣＲを行う核酸増幅方法、細菌同定方法およびブタの細菌感染診断方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーと、配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーとからなるプライマーセット、及び
（２）配列番号：１で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーと、配列番号：２で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーとからなるプライマーセットの少なくともいずれかを含むことを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程と、
前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程とを含み、
前記ＰＣＲ工程で、請求項１に記載のプライマーセットを使用してＰＣＲを行うことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項３】
検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程と、
前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程と、
前記ＰＣＲ工程で得られた産物の塩基配列解析を行う解析工程とを含み、
前記ＰＣＲ工程で、請求項１に記載のプライマーセットを使用してＰＣＲを行うことを特徴とする細菌の同定方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲ工程におけるＰＣＲ産物の長さが７５０ｂｐ以下である請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡが細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含む請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌が罹患生物由来である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
罹患ブタ由来の検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程と、
前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程と、
前記ＰＣＲ工程で得られた産物の塩基配列解析を行う解析工程と、
前記塩基配列解析に基づき、罹患ブタ由来の検体中に含まれる細菌を同定する同定工程とを含み、
前記ＰＣＲ工程で、請求項１に記載のプライマーセットを使用してＰＣＲを行うことを特徴とする罹患ブタの細菌感染診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プライマーセット、並びにプライマーセットを用いた核酸増幅方法、細菌の同定方法、及び罹患ブタの細菌感染診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細菌の同定は、増殖培養、分離培養を経て菌を単離した後、単離した菌を増殖させ、形態観察、グラム染色性、カタラーゼ試験、糖資化性など多くの性状試験の結果に基づき行なわれてきた。この同定方法は、少なくとも数日間を要し、多岐にわたる試験は煩雑であり、費用もかかっていた。
また、単離した細菌からＤＮＡを抽出し、それを膜状あるいは他の支持体上に固定し、標準菌のＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーション試験を行うことにより細菌を同定する方法がある。しかし、この同定方法も数日間を要し、さらに十分な検出感度、及び選択性を得るのが困難であった。
【０００３】
近年、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとした細菌の同定方法が報告されている。例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の全長（１５００ｂｐ）をターゲットとしたＰＣＲ及びダイレクトシークエンス法を用いた同定方法（非特許文献１）、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の部分的な塩基配列部分（約８００ｂｐ）をターゲットとしたＰＣＲ及びダイレクトシークエンス法を用いた同定方法（非特許文献２及び３）が報告されている。
【０００４】
しかし、これらの方法はシークエンスの回数が多く、多数の試料を同定するには時間を要し、迅速性の向上が困難であるという問題があり、細菌に罹患した生物の診断に時間を要することから、適切な治療の開始が遅延し、特に、細菌に罹患した生物が畜産動物である場合には甚大な被害をもたらすことも問題となっていた。
【０００５】
したがって、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとしたＰＣＲ、又は細菌の同定方法に使用でき、これらを従来の方法と比較して簡易、迅速、かつ高精度とするプライマーセット、並びにプライマーセットを用いた核酸増幅方法、細菌の同定方法、及び罹患ブタの細菌感染診断方法の開発が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９９１  １７３：６９７−７０３
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００３  ４１：４１３４−４１４０
【非特許文献３】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００４  ４２：２０６５−２０７３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとしたＰＣＲ、又は細菌の同定方法に使用でき、これらを従来の方法と比較して簡易、迅速、かつ高精度とするプライマーセット、並びにプライマーセットを用いた核酸増幅方法、細菌の同定方法、及び罹患ブタの細菌感染診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意検討を行なった結果、本発明のプライマーセットを用いることにより、従来の方法と比較して、簡易、迅速、かつ高精度な核酸増幅方法、細菌の同定方法、及び罹患ブタの細菌感染診断方法が提供できることを見出した。
【０００９】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下の通りである。即ち、
＜１＞  （１）配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーと、配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーとからなるプライマーセット、及び
（２）配列番号：１で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーと、配列番号：２で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーとからなるプライマーセットの少なくともいずれかを含むことを特徴とするプライマーセットである。
＜２＞  検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程と、
前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程とを含み、
前記ＰＣＲ工程で、前記＜１＞に記載のプライマーセットを使用してＰＣＲを行うことを特徴とする核酸増幅方法である。
＜３＞  検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程と、
前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程と、
前記ＰＣＲ工程で得られた産物の塩基配列解析を行う解析工程とを含み、
前記ＰＣＲ工程で、前記＜１＞に記載のプライマーセットを使用してＰＣＲを行うことを特徴とする細菌の同定方法である。
＜４＞  前記ＰＣＲ工程におけるＰＣＲ産物の長さが７５０ｂｐ以下である前記＜２＞又は＜３＞に記載の方法である。
＜５＞  前記ＤＮＡが細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含む前記＜２＞又は＜３＞に記載の方法である。
＜６＞  前記細菌が罹患生物由来である前記＜５＞に記載の方法である。
＜７＞  罹患ブタ由来の検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程と、
前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程と、
前記ＰＣＲ工程で得られた産物の塩基配列解析を行う解析工程と、
前記塩基配列解析に基づき、罹患ブタ由来の検体中に含まれる細菌を同定する工程とを含み、
前記ＰＣＲ工程で、前記＜１＞に記載のプライマーセットを使用してＰＣＲを行うことを特徴とする罹患ブタの細菌感染診断方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとしたＰＣＲ、又は細菌の同定方法に使用でき、従来の方法と比較して簡易、迅速、かつ高精度なプライマーセット、並びにプライマーセットを用いた核酸増幅方法、細菌の同定方法、及び罹患ブタの細菌感染診断方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例１−１及び１−２の電気泳動の結果を示す図である。
【図２】図２は、実施例４の電気泳動の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（プライマーセット）
本発明のプライマーセットは、
（１）配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーと、配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーとからなるプライマーセット、及び
（２）配列番号：１で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーと、配列番号：２で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーとからなるプライマーセットの少なくともいずれかを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００１３】
＜配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマー＞
配列番号：１で表される塩基配列からなるプライマーは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（ＡＹ８０４０１４）をコードする塩基配列の１番目から２０番目に対応するものであり、その配列は、以下のとおりである。
５’−ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃｍｔｇｇｃｔｃａｇ−３’（配列番号：１）
【００１４】
前記配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーは、前記配列番号：１で表される塩基配列からなるプライマーのうち、少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含む限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、１２塩基以上が好ましく、１５塩基以上がより好ましく、１８塩基以上がさらに好ましく、１９塩基以上が特に好ましく、配列番号：１で表される塩基配列からなるプライマーが最も好ましい。
【００１５】
前記少なくとも１０塩基以上の連続する配列は、３’末端側の１０塩基以上の連続する配列であっても、５’末端側の１０塩基以上の連続する配列であってもよいが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、３’末端側の１０塩基以上の連続する配列が好ましい。
【００１６】
また、前記配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーは、さらに任意の塩基配列や、蛍光色素などの標識が付加されたものであってもよい。
前記配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーの塩基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、３５塩基以下が好ましく、３０塩基以下がより好ましく、２２塩基以下が更に好ましく、２１塩基以下が特に好ましい。
【００１７】
前記配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーのＧＣ含量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、５０〜６０％が好ましい。
前記配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーのＴｍ値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、５０〜６０℃が好ましい。
【００１８】
＜配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマー＞
配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（ＡＹ８０４０１４）をコードする塩基配列の５０８番目から５２７番目に対応するものであり、その配列は、以下のとおりである。
５’−ｔｂｔｔａｃｃｇｃｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃａ−３’（配列番号：２）
【００１９】
前記配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーは、前記配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーのうち、少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含む限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、１２塩基以上が好ましく、１５塩基以上がより好ましく、１８塩基以上がさらに好ましく、１９塩基以上が特に好ましく、配列番号：１で表される塩基配列からなるプライマーが最も好ましい。
【００２０】
前記少なくとも１０塩基以上の連続する配列は、３’末端側の１０塩基以上の連続する配列であっても、５’末端側の１０塩基以上の連続する配列であってもよいが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、３’末端側の１０塩基以上の連続する配列が好ましい。
【００２１】
また、前記配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーは、さらに任意の塩基配列や、蛍光色素などの標識が付加されたものであってもよい。
前記配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーの塩基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、３５塩基以下が好ましく、３０塩基以下がより好ましく、２２塩基以下が更に好ましく、２１塩基以下が特に好ましい。
【００２２】
前記配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーのＧＣ含量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、５０〜６０％が好ましい。
前記配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーのＴｍ値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、５０〜６０℃が好ましい。
【００２３】
＜配列番号：１で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマー＞
配列番号：１で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（ＡＹ８０４０１４）をコードする塩基配列の１番目から２０番目の塩基配列に相補的な塩基配列に対応するものである。
【００２４】
配列番号：１で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーは、前記配列番号：１で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーのうち、少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含む限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、１２塩基以上が好ましく、１５塩基以上がより好ましく、１８塩基以上がさらに好ましく、１９塩基以上が特に好ましく、配列番号：１で表される塩基配列からなるプライマーが最も好ましい。
【００２５】
前記少なくとも１０塩基以上の連続する配列は、３’末端側の１０塩基以上の連続する配列であっても、５’末端側の１０塩基以上の連続する配列であってもよいが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、３’末端側の１０塩基以上の連続する配列が好ましい。
【００２６】
また、前記配列番号：１で表されるに相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーは、さらに任意の塩基配列や、蛍光色素などの標識が付加されたものであってもよい。
前記配列番号：１で表されるに相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーの塩基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、３５塩基以下が好ましく、３０塩基以下がより好ましく、２２塩基以下が更に好ましく、２１塩基以下が特に好ましい。
【００２７】
前記配列番号：１で表されるに相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーのＧＣ含量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、５０〜６０％が好ましい。
前記配列番号：１で表されるに相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーのＴｍ値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、５０〜６０℃が好ましい。
【００２８】
＜配列番号：２で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマー＞
配列番号：２で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（ＡＹ８０４０１４）をコードする塩基配列の５０８番目から５２７番目の塩基配列に相補的な塩基配列に対応するものである。
【００２９】
配列番号：２で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーは、前記配列番号：２で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーのうち、少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含む限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、１２塩基以上が好ましく、１５塩基以上がより好ましく、１８塩基以上がさらに好ましく、１９塩基以上が特に好ましく、配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーが最も好ましい。
【００３０】
前記少なくとも１０塩基以上の連続する配列は、３’末端側の１０塩基以上の連続する配列であっても、５’末端側の１０塩基以上の連続する配列であってもよいが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、３’末端側の１０塩基以上の連続する配列が好ましい。
【００３１】
また、前記配列番号：２で表されるに相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーは、さらに任意の塩基配列や、蛍光色素などの標識が付加されたものであってもよい。
前記配列番号：２で表されるに相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーの塩基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、３５塩基以下が好ましく、３０塩基以下がより好ましく、２２塩基以下が更に好ましく、２１塩基以下が特に好ましい。
【００３２】
前記配列番号：２で表されるに相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーのＧＣ含量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、５０〜６０％が好ましい。
前記配列番号：２で表されるに相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーのＴｍ値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、５０〜６０℃が好ましい。
【００３３】
−プライマーの製造方法−
前記プライマーの製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ自動合成機を用いた合成、プライマー合成メーカーからの購入などが挙げられる。
【００３４】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）等のバッファー、ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、及び酵素等のＰＣＲに用いる試薬などが挙げられる。
【００３５】
本発明のプライマーセットは、組成物、又は核酸増幅用キット、細菌の同定用キット、若しくは細菌感染診断用キットとして存在させることもできる。
【００３６】
（核酸増幅方法）
本発明の核酸増幅方法は、検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程と、前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００３７】
＜抽出工程＞
前記抽出工程は、検体中のＤＮＡを抽出する工程である。
【００３８】
−検体−
前記検体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細菌感染を検査される生物の血液、尿、糞便、臓器、若しくは組織、又は種を同定される生物などが挙げられる。
【００３９】
前記細菌感染を検査される生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、病原性細菌、又は非病原性細菌等に罹患した脊椎動物、無脊椎動物などが挙げられる。
前記脊椎動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、トリ、イヌ、ネコ、魚などが挙げられる。
【００４０】
前記細菌感染を検査される生物から血液、組織などを採取する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【００４１】
前記種を同定される生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する真核生物、原核生物などが挙げられる。
前記原核生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、球菌、桿菌、ラセン菌などの細菌が挙げられる。前記細菌は、罹患生物由来の同定株、未同定株であってもよい。
【００４２】
−ＤＮＡの抽出−
前記ＤＮＡの抽出方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、熱抽出法、フェノール・クロロホルム抽出法、アルカリ熱抽出法、市販のＤＮＡ抽出キットを用いた抽出法などが挙げられる。
【００４３】
前記熱抽出法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、検体に滅菌蒸留水を添加し、遠心分離により得られたペレットを滅菌蒸留水で洗浄し、９５℃で５分間加熱後、氷中で冷却し、遠心分離により得られた上清をＤＮＡ溶液とする方法、検体を滅菌蒸留水で洗浄し、１００℃で５分間加熱後、氷中で冷却し、遠心分離により得られた上清をＤＮＡ溶液とする方法などが挙げられる。
【００４４】
前記フェノール・クロロホルム抽出法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＴＥバッファーで懸濁した検体に、１０％ＳＤＳ及びプロテイナーゼＫ（１０  ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１時間ゆるやかに振盪した後、フェノール・クロロホルム溶液を添加し激しく振盪した後、水層にクロロホルム溶液を添加し激しく振盪した後、水層に１００％エタノールを添加する方法などが挙げられる。
【００４５】
＜ＰＣＲ工程＞
前記ＰＣＲ工程は、前記抽出工程で得られた前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う工程である。
【００４６】
−ＰＣＲ−
前記ＰＣＲとしては、プライマーとして本発明のプライマーセットを使用する限り、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、及び酵素を含むＰＣＲ反応液をＰＣＲサイクル処理する方法などが挙げられる。
【００４７】
−−ＰＣＲサイクル処理−−
前記ＰＣＲサイクル処理としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、初期変性を９４℃〜９５℃で１分間〜３分間行なった後、９４℃〜９５℃で３０秒間、４０℃〜６０℃で３０秒間、及び７２℃で４５秒間を１サイクルとして、これを複数サイクル行い、最後に７２℃で５分間〜１０分間の伸長反応を行なう処理などが挙げられる。
前記サイクル数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、２０サイクル以上が好ましく、２５サイクル以上がより好ましく、３０サイクル以上がさらに好ましく、３５サイクル以上が特に好ましい。
【００４８】
前記ＰＣＲにより得られるＰＣＲ産物の長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、７５０ｂｐ以下が好ましく、７００ｂｐ以下がより好ましく、６００ｂｐ以下がさらに好ましく、５５０ｂｐ以下が特に好ましく、５３０ｂｐ以下が最も好ましい。
【００４９】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記細菌感染を検査される生物から血液、組織などを採取する採取工程、前記種を同定される生物を増殖培養、分離培養などを経て単離する単離工程、前記ＰＣＲ産物を電気泳動により確認する電気泳動工程、前記ＰＣＲ産物を精製する精製工程などが挙げられる。
【００５０】
＜＜精製工程＞＞
前記精製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販のキットを用いた方法などが挙げられる。
前記市販のキットとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１，  Ｉｎｃ．）などが挙げられる。
【００５１】
（細菌の同定方法）
本発明の細菌の同定方法は、検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程と、前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程と、前記ＰＣＲ工程で得られた産物の塩基配列解析を行う解析工程とを含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記抽出工程、及びＰＣＲ工程は、前述のとおりである。
【００５２】
＜解析工程＞
前記解析工程は、前記ＰＣＲ工程で得られた産物の塩基配列解析を行う工程である。
【００５３】
−塩基配列解析−
前記塩基配列解析方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、シークエンサーを用いたＤＮＡシークエンス法により塩基配列を決定する方法などが挙げられる。
【００５４】
前記ＤＮＡシークエンス法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、大腸菌などを用いてクローニングを行なった後、シークエンス反応を行う方法、又はダイレクトシークエンスを行う方法などが挙げられる。これらの中でも、簡易、迅速、かつ高精度の点から、ダイレクトシークエンスを行う方法が好ましい。
【００５５】
前記ＤＮＡシークエンス法において使用するプライマーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、本発明のプライマーセットのうちのいずれかのプライマーを使用することができる。
【００５６】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記解析工程の塩基配列解析に基づき検体の種を同定する同定工程、生化学的手法により検体の種を同定する同定工程などが挙げられる。
【００５７】
＜＜塩基配列解析に基づき検体の種を同定する同定工程＞＞
塩基配列解析に基づき検体の種を同定する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記塩基配列解析により得られた塩基配列について、データベースを利用して、公知の配列との相同性を算出することにより同定する方法などが挙げられる。
前記データベースとしては、特に制限はなく、公知のものを適宜選択することができ、例えば、日本ＤＮＡデータバンク、ＥＢＩ／ＥＭＢＬ（ＣＬＵＳＴＡＬ．Ｗ）、ＮＣＢＩ／ＧｅｎＢａｎｋ（ＢＬＡＳＴ）などのデータベースが挙げられる。
前記塩基配列解析により得られた塩基配列と、公知の配列との相同性が９７％以上の場合は、検体の種が公知の配列に基づく種であると同定できる。
【００５８】
＜＜生化学的手法により検体の種を同定する同定工程＞＞
生化学的手法により検体の種を同定する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、市販のキットを用いた方法などが挙げられる。
前記市販のキットとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＡＰＩ  ２０（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  Ｓ．Ａ．）などが挙げられる。
【００５９】
前記細菌の同定方法において、前記ＰＣＲ工程及び前記解析工程の合計所要時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、１２時間以下が好ましく、１０時間以下がより好ましく、７時間以下が更に好ましく、５時間以下が特に好ましい。
【００６０】
（細菌感染診断方法）
本発明の細菌感染診断方法は、罹患ブタ由来の検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程と、前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程と、前記ＰＣＲ工程で得られた産物の塩基配列解析を行う解析工程と、前記塩基配列解析に基づき、罹患ブタ由来の検体中に含まれる細菌を同定する同定工程とを含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００６１】
前記罹患ブタ由来の検体中のＤＮＡを抽出する抽出工程は、前記核酸増幅方法における前記抽出工程に対応し、前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うＰＣＲ工程は、前記核酸増幅方法における前記ＰＣＲ工程に対応し、前記ＰＣＲ工程で得られた産物の塩基配列解析を行う解析工程は、前記細菌の同定方法における前記解析工程に対応し、前記罹患ブタ由来の検体中に含まれる細菌を同定する同定工程は、前記細菌の同定方法における前記塩基配列解析に基づき検体の種を同定する同定工程に対応する。
【００６２】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記同定工程における細菌の同定に基づき、罹患ブタの細菌感染を治療する治療工程などが挙げられる。
【００６３】
＜＜罹患ブタの細菌感染を治療する治療工程＞＞
前記罹患ブタの細菌感染を治療する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記罹患ブタに、感染した細菌に適した薬物を投与する方法などが挙げられる。
【００６４】
前記細菌感染診断方法において、前記ＰＣＲ工、前記解析工程、及び前記同定工程の合計所要時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、簡易、迅速、かつ高精度の点から、１４時間以下が好ましく、１２時間以下がより好ましく、９時間以下が更に好ましく、７時間以下が特に好ましい。
【実施例】
【００６５】
以下に製造例及び実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの製造例及び実施例に何ら限定されるものではない。
【００６６】
（製造例１）プライマーセット１の作製
日本ＤＮＡデータバンクのデータベース上に公開されている以下の７３菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列について、Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｘ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０及びＶｅｒｓｉｏｎ  １２を用いて、シークンスデータの処理及びアライメント解析を行い、菌株間で保存されている塩基配列、及び菌株間で相違する塩基配列を決定した。相同性検索は日本ＤＮＡデータバンクのウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｂｌａｓｔｎ？ｌａｎｇ＝ｅｎ）にてｂｌａｓｔｎ検索を用いて行った。
【００６７】
アライメント解析を行なった７３菌株は、以下のとおりである。
（１）  Ｆｕ１．  （Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  （ＦｎＳ−４０））  （Ｘ７４４０８）
（２）  Ｆｕ２．  （Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  Ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）  （Ｍ５８６８３）
（３）  Ｃｌｏ１．  （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）  （ＡＹ９４９８５９）
（４）  Ｃｌｏ２．  （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ｓｔｒ．  １３）  （ＢＡ００００１６）
（５）  Ｃｌｏ３．  （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｏｖｙｉ）（Ｘ６８１８８）
（６）  Ｃｌｏ４．  （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）  （Ｘ７４７７０）
（７）  Ｓｔａ１．  （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＤＱ２６９４９８）
（８）  Ｓｔａ２．  （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（ＡＹ６９９２８７）
（９）  Ｋｕｇｉ．  （Ｋｕｒｔｈｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）  （ＮＣＩＭＢ  ９７５８）
（１０）  Ｌｉｓｔｓｅｅ．  （Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）  （ＤＱ０６５８４３）
（１１）  Ｓｔｒｅｐｂｏ１．  （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）  （ＡＹ１７３０７９）
（１２）  Ｓｔｒｅｐｄｙｓ２．  （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ  （ＡＢ１５９６７８）
（１３）  Ｓｔｒｅｐｓｕｉｓ３．  （  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）  （ＡＦ２８４５７８）
（１４）  Ｌａｃｇａｒ．  （Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｒｖｉｅａｅ）  （ＡＹ６９９２８９）
（１５）  Ｅｒｙｓｉ１．  （Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ  ＡＴＣＣ１９４１４）  （ＡＢ０５５９０５）
（１６）  Ｅｒｙｔ．  （Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｔｏｎｓｉｌｌａｒｕｍ  （ＡＢ０５５９０６）
（１７）  Ｍｐｌａ１．  （Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ  ｓｔｒａｉｎ  Ａ５９６９）  （Ｌ３５０４３）
（１８）  Ｍｐｌａ２  （Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  （Ｙ００１４９）
（１９）  Ｍｐｌａ３．  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｓｙｎｏｖｉａｅ  （Ｕ２６７３０）
（２０）  Ｓｐｉｒｏｍｅ．  （Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ  ｍｅｌｌｉｆｅｒｕｍ）（ＡＹ３２５３０４）
（２１）  Ａｃｔ０．  （Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｖｉｓ）  （Ｘ８１０６１）
（２２）  Ａｒｐｙｏ．（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）  （Ｍ２９５５２）
（２３）  Ｍｙｃｏ１．  （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）  （ＡＹ９４５８０３）
（２４）  Ｍｙｃｏ２．  （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｓｔｒ．ｋ１０）  （ＡＥ０１７２３６）
（２５）  Ｍｙｃｏ３．  （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｏｖｉｓ  ＡＦ２１２２／９７）  （ＢＸ２４８３３８）
（２６）  Ｎｏｃａｓｅｒｉ．  （Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｅｒｉｏｌａｅ）  （ＡＹ８４６８４１）
（２７）  Ｒｈｏｅｑｕｉ．  （Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）  （Ｘ８０６１４）
（２８）  Ｓｔｂｉ．  （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＤＳＭ４０５８１）  （Ｘ７９８５１）
（２９）  Ｂｒｕ１．  （Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ａｂｏｒｔｕｓ）  （ＡＭ０４０２６５）
（３０）  Ｂｒｕ２．  （Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）  （ＡＥ０１４２９２）
（３１）  Ｅｒ１．  （Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐ．  Ｔｉｂｅｔ）  （ＡＦ４１４３９９）
（３２）  Ｅｒ２．  （Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ  ｓｔｒ．  Ｊａｋｅ）  （ＣＰ０００１０７）
（３３）  Ｅｒ３．  （Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）  （Ｘ６１６５９）
（３４）  Ａｎａ１．  （Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｍａｒｇｉｎａｌｅ）  （ＤＱ３４１３７０）
（３５）  Ａｎａ２．  （Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｏｖｉｓ）（ＡＦ３０９８６５）
（３６）  Ａｎａ３．  （Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）（Ｕ０３７７５）
（３７）  Ｒｉｃｒｉｃ．  （Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）  （Ｕ１１０２１）
（３８）  Ｐｓｅｕ１．  （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＢＥ４ｄｉｌ）  （ＡＹ２６３４７３）
（３９）  Ｐｓｅｕ２．  （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）  （ＰＢ００１２７１２）
（４０）  Ｐｓｅｕ３．  （Ｐｓｅｕｇｏｍｏｎａｓ  ｌｉｎｉ）  （ＡＹ０３５９９６）
（４１）  Ｌｅｇｐａｒ．  （Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｉｓｉｅｎｓｉｓ）  （Ｕ５９６９７）
（４２）  Ｅｎｔａｅｒｏ．  （Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）  （ＡＹ８２５０３６）
（４３）  Ｃｉｆｒｅｕ．  （Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）  （ＡＦ０２５３６５）
（４４）  Ｋｌｐｎｅｕ．  （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  （ＤＱ１８５６０４）
（４５）  Ｓｅｒｍａ．  （Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）  （ＡＢ０６１６８５）
（４６）  Ｓａｌ１．  （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）  （ＡＥ０１７２２０）
（４７）  Ｓａｌ２．  （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｄｕｂｌｉｎ）  （ＡＦ２２７８６８）
（４８）  Ｓａｌ３．  （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）  （ＡＬ６２７２６６）
（４９）  Ｅｃｏｌｉ．  （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  （ＡＹ８０４０１４）
（５０）  Ｅｒｗｐｅｒ．  （Ｅｒｗｉｎｉａ  ｐｅｒｓｉｃｉｎｕｓ）（ＡＭ１８４０９８）
（５１）  Ｙｅｒｐｓｅｕ．  （Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＩＰ  ３２９５３）  （ＢＸ９３６３９８）
（５２）  Ｖｉｐａｒａ．  （Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）  （Ｘ７４７２１）
（５３）  Ｐｈｏｔｏｄａｍ．  （Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅ  ｓｕｂｓｐ．  Ｄａｍｓｅｌａｅ）  （ＡＹ１４７８６１）
（５４）  Ａｅｒｈｙ．  （Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＡＴＣＣ  ３５６５４）（Ｘ７４６７６）
（５５）  Ｈａｅｍｏ．  （Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）  （ＡＢ００４０３９）
（５６）  Ｈｉｓｔｏ．  （Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｉ）  （  Ｍ７５０４６）
（５７）  Ｐａｓ．  （Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）  （Ｍ３５０１８）
（５８）  Ａｃｔ１．  （Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｉｓ）  （Ｍ７５０７１）
（５９）  Ａｃｔ２．  （Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｑｕｕｌｉ）  （Ｍ７５０７２）
（６０）  Ａｃｔ３．  （Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  （Ｄ３００３２）
（６１）  Ａｃｔ４．  （Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｇｎｉｅｒｅｓｉｉ）  （Ｍ７５０６８）
（６２）  Ｍａｎｖａｒ．  （Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｖａｒｉｇｅｎａ）  （ＤＱ３０１９２７）
（６３）  Ｎｅｉｇｏ．  （Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）  （Ｘ０７７１４）
（６４）  Ｂｂ．  （Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）  （ＢＸ６４０４４９）
（６５）  Ｃａｍ．  （Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｊｅｊｕｎｉ  ＮＣＴＣ  １１１６８）  （ＡＬ１３９０７４）
（６６）  Ｈｅｌｉ．  （Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）  （ＡＹ３６６４２４）
（６７）  Ｌａｗｉｎ．  （Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）  （Ｕ０６４２３）
（６８）  Ｂｏｒｂｕｒ．  （Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）（ＡＦ４７７９８９）
（６９）  Ｓｐｉｒｏ．  （Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ  ａｕｒａｎｔｉａ）（ＡＹ５９９０１９）
（７０）  Ｔｒｅｖｉ．  （Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）  （ＡＦ０３３３０９）
（７１）  Ｂｒａｈｙｏ．  （Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）  （Ｍ５７７４１）
（７２）  Ｌｅｐ．  （Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ  ｓｔｒ．  Ｆｉｏｃｒｕｚ  Ｌ１−１３０）  （ＡＥ０１７２９３）
（７３）  Ｐｏｒｐ．  （Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）  （Ｌ１６４９２）
【００６８】
上記アライメント解析に基づき、フォワードプライマー領域及びリバースプライマー領域の配列は、菌株間で保存されているが、フォワードプライマー領域とリバースプライマー領域の間の配列は、菌株間により相違する配列となること、及び増幅産物の塩基配列が、１回のシークエンスにより決定され得る長さとなることを条件に、フォワードプライマー領域及びリバースプライマー領域を選択した。
【００６９】
選択したフォワードプライマー領域及び選択したリバースプライマー領域に対応するプライマー１６Ｓ−Ｆ１及びプライマー１６Ｓ−Ｒ２を作製した。
プライマー１６Ｓ−Ｆ１の塩基配列は、（５’−ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃｍｔｇｇｃｔｃａｇ−３’）（配列番号：１）であり、プライマー１６Ｓ−Ｒ２の塩基配列は（５’−ｔｂｔｔａｃｃｇｃｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃａ−３’）（配列番号：２）である。
【００７０】
選択したフォワードプライマー領域は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（ＡＹ８０４０１４）の１番目から２０番目の塩基配列に相当し、選択したリバースプライマー領域は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（ＡＹ８０４０１４）の５０８番目から５２７番目の塩基配列に相当する。
【００７１】
（製造例２）プライマーセット２の作製
フォワードプライマー１６Ｓ−Ｆ１の５’末端側の１５塩基に対応するフォワードプライマー１６Ｓ１５ａＦ１、及びリバースプライマー１６Ｓ−Ｒ２の５’末端側の１５塩基に対応するリバースプライマー１６Ｓ１５ａＲ２を作製した。
プライマー１６Ｓ１５ａＦ１の塩基配列は、（５’−ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃｍｔｇｇ−３’）（配列番号：３）であり、プライマー１６Ｓ１５ａＲ２の塩基配列は（５’−ｔｂｔｔａｃｃｇｃｇｇｃｔｇｃ−３’）（配列番号：４）である。
【００７２】
（製造例３）プライマーセット３の作製
フォワードプライマー１６Ｓ−Ｆ１の３’末端側の１５塩基に対応するフォワードプライマー１６Ｓ１５ｂＦ１、及びリバースプライマー１６Ｓ−Ｒ２の３’末端側の１５塩基に対応するリバースプライマー１６Ｓ１５ｂＲ２を作製した。
プライマー１６Ｓ１５ｂＦ１の塩基配列は、（５’−ｔｔｇａｔｃｍｔｇｇｃｔｃａｇ−３’）（配列番号：５）であり、プライマー１６Ｓ１５ｂＲ２の塩基配列は（５’−ｃｃｇｃｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃａ−３’）（配列番号：６）である。
【００７３】
（製造例４）プライマーセット４の作製
フォワードプライマー１６Ｓ−Ｆ１の３’末端側の１０塩基に対応するフォワードプライマー１６Ｓ１５ｄＦ１、及びリバースプライマー１６Ｓ−Ｒ２の３’末端側の１０塩基に対応するリバースプライマー１６Ｓ１５ｄＲ２を作製した。
プライマー１６Ｓ１５ｄＦ１の塩基配列は、（５’−ｃｍｔｇｇｃｔｃａｇ−３’）（配列番号：７）であり、プライマー１６Ｓ１５ｄＲ２の塩基配列は（５’−ｇｃｔｇｃｔｇｇｃａ−３’）（配列番号：８）である。
【００７４】
（実施例１−１）ＰＣＲ（同定株）
表１に記載の同定株である、罹患動物由来の３９菌株（番号Ａ−１からＡ−３９）について、以下のとおり、ＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった。
各菌株の培養液、又は大きめのコロニーをマイクロチューブにとった。菌体に滅菌蒸留水１００μＬを添加して懸濁した。懸濁液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍで２分間）した。遠心分離により得られたペレットを滅菌蒸留水で洗浄し、９５℃で５分間加熱した。加熱後、氷中で冷却し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍで２分間）した。上清を鋳型ＤＮＡ溶液として、製造例１で作製した、プライマー１６Ｓ−Ｆ１、及びプライマー１６Ｓ−Ｒ２を用いてＰＣＲを行い、上記各菌株が有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子核酸を増幅した。ＰＣＲはＴａＫａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用いて行なった。
【００７５】
ＰＣＲ反応液の組成は、鋳型ＤＮＡ溶液  ５．０μＬ、１０×ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ５．０μＬ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ４．０μＬ、プライマー１６Ｓ−Ｆ１  １．０μＬ（２０ｐｍｏｌ／μＬ）、１６Ｓ−Ｒ２  １．０μＬ（２０ｐｍｏｌ／μＬ）、Ｈ２Ｏ  ３３．９μＬ、及びＥｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）  ０．１μＬで、総容量は５０．０μＬである。なお、１０×ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ及びｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅは、Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）のキットに添付されているものを使用した。
【００７６】
ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて次のように行なった。すなわち、初期変性を９５℃で３分間行なった後、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、及び７２℃で４５秒間を１サイクルとして、これを３５サイクル行い、最後に７２℃で１０分間の伸長反応を行なった。ＰＣＲ後、Ｍｕｐｉｄミニゲル泳動槽（ＡＤＶＡＮＣＥ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を用いて１．５％アガロースゲルによる電気泳動を行い、エチジウムブロマイド溶液でゲルを染色して、目的バンドの増幅の有無を確認した。
電気泳動の結果の一部を図１のレーン２から１０及び１７に示す。レーン２から１０及び１７において、約５２７ｂｐのバンドが確認できた。他のサンプルについても同様であった。
【００７７】
図１中、レーン１は分子量マーカーを表し、レーン２から１０及び１７は、以下のとおりである。
レーン２  番号Ａ−３：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ  （ｓｅｒｏｔｙｐｅ  １０）
レーン３  番号Ａ−７：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ
レーン４  番号Ａ−１１：Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ  ＡＴＣＣ１９４１４
レーン５  番号Ａ−１８：Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｔｏｎｓｉｌｌａｒｕｍ  （ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ７）
レーン６  番号Ａ−８：Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
レーン７  番号Ａ−２：Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｒｖｉｅａｅ
レーン８  番号Ａ−３０：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ（ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ２）
レーン９  番号Ａ−３６：Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ（ｐｍｔ非保有株）
レーン１０  番号Ａ−３２：Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ５）
レーン１７  番号Ａ−２０：Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｓｐ．（ｓｅｒｏｔｙｐｅ  １３）
【００７８】
（実施例１−２）ＰＣＲ（未同定株）
表１に記載の未同定株である、罹患動物由来の２８菌株（番号Ｂ−１からＢ−２８）について、実施例１−１と同様の方法で、ＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった。
電気泳動の結果の一部を図１のレーン１１から１６に示す。レーン１１から１６において、約５２７ｂｐのバンドが確認できた。他のサンプルについても同様であった。
【００７９】
図１中、レーン１は分子量マーカーを表し、レーン１１から１６は、以下のとおりである。
レーン１１  番号Ｂ−２２
レーン１２  番号Ｂ−２４
レーン１３  番号Ｂ−１４
レーン１４  番号Ｂ−１８
レーン１５  番号Ｂ−１９
レーン１６  番号Ｂ−１５
【００８０】
（実施例２−１）配列決定（同定株）
実施例１−１のＰＣＲにより増幅が確認されたサンプルをスピンカラム（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ、Ｂｉｏ１０１，  Ｉｎｃ．）によって精製し、ダイレクトシークエンス反応に供した。シークエンス反応は、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｊａｐａｎ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，  Ｃｈｉｂａ，  Ｊａｐａｎ）を用いて添付のプロトコールにしたがって行い、プライマーは、製造例１で作製したプライマー１６Ｓ−Ｆ１又は１６Ｓ−Ｒ２を使用した。塩基配列解析はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行なった。
番号Ａ−１からＡ−３９の塩基配列は、それぞれ配列番号：３〜４１に示す塩基配列であった。
【００８１】
塩基配列解析により得られた塩基配列について、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のデータベースを利用して細菌を同定した。同定した種名、及びデータベース上の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の当該部分との相同性（％）を表１に示した。
【００８２】
（実施例２−２）配列決定（未同定株）
実施例１−２のＰＣＲにより増幅が確認されたサンプルについて、実施例２−１と同様の方法で塩基配列解析及び菌株の同定を行なった。
番号Ｂ−１からＢ−２８の塩基配列は、それぞれ配列番号：４２〜６９に示す塩基配列であった。
同定した種名、及びデータベース上の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の当該部分との相同性（％）を表１に示した。
【００８３】
（実施例３−１）生化学的手法による同定（同定株）
表１に記載の同定株である、罹患動物由来の２菌株（番号Ａ−３４及びＡ−３５）について、生化学的手法により細菌の同定を行なった。
生化学的手法による細菌の同定は、２１種類の生化学試験からなる、ＡＰＩ  ２０（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  Ｓ．Ａ．）を用いて行なった。生化学的手法により同定した種名を表１に示した。表１のＮＴは、生化学的手法による同定を行なっていないことを意味する。
【００８４】
（実施例３−２）生化学的手法による同定（未同定株）
表１に記載の未同定株である、罹患動物由来の２８菌株（番号Ｂ−１からＢ−２８）について、実施例３−１と同様の方法で細菌の同定を行なった。
生化学的手法により同定した種名を表１に示した。
【００８５】
【表１】
2020089339.tif 000002
【００８６】
表１から、本発明のプライマーを用いた配列決定による細菌の同定は、１回のダイレクトシークエンスにより９９％以上の高い相同性で細菌を同定できるものであることが分かる。
また、番号Ｂ−１７からＢ−１９及びＢ−２４では、生化学的手法により同定した種名が、９９％以上の相同性で塩基配列解析により同定した種名と異なっており、本発明のプライマーを用いた配列決定による細菌の同定は、生化学的手法による細菌の同定と比較して、簡易、迅速かつ高精度に同定できるものであることが分かる。
【００８７】
（実施例４）ＰＣＲ
感染ブタより分離し、Ａｃｔ．  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと同定された菌株（Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、又はＮｏ．４）の培養液、又は大きめのコロニーをマイクロチューブにとり、滅菌蒸留水で洗浄後、１００℃で５分間加熱した。加熱後、氷中で冷却し、遠心分離（１３，５００ｒｐｍで１分間）した。上清を鋳型ＤＮＡ溶液として、製造例１から４に記載のプライマーセット１から４を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲはＴａＫａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用いて行なった。
【００８８】
ＰＣＲ反応液の組成は、鋳型ＤＮＡ  １．０μＬ、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ  ２．５μＬ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）  ２．０μＬ、フォワードプライマー  ２．５μＬ（１０ｍＭ）、リバースプライマー  ２．５μＬ（１０ｍＭ）、Ｈ２Ｏ  １４．４μＬ、及びＥｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）  ０．１μＬで、総容量は２５．０μＬである。なお、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ及びｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅは、Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）のキットに添付されているものを使用した。
【００８９】
ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて次のように行なった。すなわち、初期変性を９４℃で１分間行なった後、９４℃で３０秒間、４４℃で３０秒間、及び７２℃で４５秒間を１サイクルとして、これを２５サイクル行い、最後に７２℃で７分間の伸長反応を行なった。ＰＣＲ後、Ｍｕｐｉｄミニゲル泳動槽（ＡＤＶＡＮＣＥ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を用いて１．５％アガロースゲルによる電気泳動を行い、エチジウムブロマイド溶液でゲルを染色して、目的バンドの増幅の有無を確認した。
電気泳動の結果を図２に示す。レーン２から５、７から１０、及び１２から１９において、約５２７ｂｐのバンドが確認できた。
【００９０】
図２中、レーン１、６、１１及び２０は分子量マーカーを表し、レーン２から５、７から１０、及び１２から１９は以下のとおりである。
レーン２  製造例１のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．１）
レーン３  製造例２のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．１）
レーン４  製造例３のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．１）
レーン５  製造例４のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．１）
レーン７  製造例１のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．２）
レーン８  製造例２のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．２）
レーン９  製造例３のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．２）
レーン１０  製造例４のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．２）
レーン１２  製造例１のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．３）
レーン１３  製造例２のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．３）
レーン１４  製造例３のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．３）
レーン１５  製造例４のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．３）
レーン１６  製造例１のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．４）
レーン１７  製造例２のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．４）
レーン１８  製造例３のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．４）
レーン１９  製造例４のプライマーセット（鋳型ＤＮＡはＮｏ．４）
【００９１】
図２から、本発明のプライマーを用いた配列決定による細菌の同定は、（１）配列番号：１で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーと、配列番号：２で表される塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーとからなるプライマーセット、及び（２）配列番号：１で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーと、配列番号：２で表される塩基配列に相補的な塩基配列のうち少なくとも１０塩基以上の連続する配列を含むプライマーとからなるプライマーセットの少なくともいずれかのプライマーセットにより、１回のダイレクトシークエンスにより９９％以上の高い相同性で細菌を同定できるものであることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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