(57)【要約】【課題】ケラチノサイトにおけるメラニンの分解を抑制し、皮膚及び毛髪のメラニン蓄積を亢進するメラニン分解抑制剤の提供。【解決手段】ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上を有効成分とするケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プログアニル又はその塩を有効成分とするケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤。
【請求項２】
プログアニル又はその塩を有効成分とするケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤。
【請求項３】
プログアニル又はその塩を有効成分とする皮膚又は毛髪色黒化剤。
【請求項４】
プログアニル又はその塩を有効成分とする白髪予防又は改善剤。
【請求項５】
医薬品、医薬部外品若しくは化粧品として使用する場合における当該医薬品、医薬部外品若しくは化粧品の総量に対する前記有効成分の含有量が、プログアニル換算で、０．０１質量％以上１０質量％以下である、請求項１記載のケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、請求項２記載のケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、請求項３記載の皮膚又は毛髪色黒化剤、又は請求項４記載の白髪予防又は改善剤。
【請求項６】
プログアニル又はその塩を含有する皮膚外用剤。
【請求項７】
皮膚外用剤の総量に対するプログアニル又はその塩の含有量が、プログアニル換算で０．０１質量％以上１０質量％以下である、請求項６記載の皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケラチノサイトにおけるメラニンの分解を抑制する、メラニン分解抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚や毛髪の色を決定する因子として様々なものが報告されているが、その中でも、表皮に存在するメラニンの量や質が、皮膚や毛髪の色に大きく寄与すると考えられている。すなわち、皮膚や毛髪の色の形成は、メラニン産生細胞（メラノサイト）中のメラノソームと呼ばれる細胞小器官中でつくられたメラニンが、表皮や毛包のケラチノサイトへと転送されて表皮や毛髪全体へと広がることに大きく影響を受けるとされる。
したがって、メラニン産生の亢進やメラニン分解の抑制等により、ケラチノサイトにおけるメラニン量が増加すれば、皮膚は褐色化し、毛髪は黒色化する。
【０００３】
また、最近、本出願人は、ケラチノサイト内におけるメラニン動態にオートファジーが関与し、ケラチノサイトにおけるメラニン量とオートファジーの活性が相関することを見出している（特許文献１）。これによれば、オートファジーの活性を抑制することにより、ケラチノサイトにおけるメラニンの分解が抑制され、皮膚や毛髪色の黒化が可能であると考えられる。
【０００４】
皮膚においては、シミ、ソバカスの原因の一つとして、皮膚の紫外線暴露による刺激、ホルモンの異常又は遺伝的要素等によって皮膚内に存在するメラノサイトが活性化されメラニン産生が盛んになることが知られていることから、従来、メラニン産生を抑制したり、産生したメラニンを減少させたりする美白剤が開発されてきた。しかし一方で、欧米においては、褐色の肌を望む場合も多く、わが国においても、近年の若年層を中心に、敢えて日光浴や屋内での紫外線照射を受けることが流行し、欧米においては依然としてタンニング・ベッドによる人工的な日焼けも盛んに行われている。また、紫外線の有害性に関する啓蒙活動もあり、ジヒドロキシアセトンを主成分とするセルフタンニング剤が出回っているのが現状である。
【０００５】
このような過度の紫外線照射は皮膚に大きなダメージを与え、皮膚癌の発生を招くおそれもあり、またセルフタンニング剤においても、その作用は角層のメイラード反応により皮膚を褐色化させていることから、色合いや色合いの安定性及び紫外線防御能の向上は望めない等、効果の面で問題が指摘されている。
【０００６】
一方、白髪は、毛母メラニン産生細胞の変化によってメラニンが減少する生理的老化現象の一つであるが、その発生機序は未だ解明されていない。白色化した髪を黒髪へと変化させる方法としては、白髪を防止又は改善する成分等の報告が数多くなされているものの、いずれも有効性や安全性の点で十分なものは得られておらず、染毛剤による染毛が中心となっているのが現状である。
【０００７】
従って、ケラチノサイトに直接作用してメラニン量を増加又は蓄積させる成分が見出されれば、本来メラニンが持つ生体防御能を促進させて皮膚のダメージを予防すると共に、肌の褐色化や白髪の防止又は改善が実現できると考えられる。
【０００８】
フェンホルミン（Phenformin）は、経口糖尿病薬として開発されたビグアナイド系薬剤であり、ヒト胚性肝細胞（HEK 293T細胞）において、ＡＭＰＫ（AMP-activated protein kinase）の活性化を介してオートファジーを活性化することが報告されている（非特許文献１）。
また、ベルベリン（Berberine）は、キハダやオウレンなどの植物に含まれるベンジルイソキノリンアルカロイドの1種であり、腸内有害細菌に対する殺菌作用、胆汁分泌作用等を有することにより下痢症等の治療に使用されている。また、ベルベリンにＡＭＰＫ活性化作用があること（非特許文献２）、抗酸化及び抗炎症作用を有し、ベルベリンを多く含むBarberry rootが、白斑治療を目的とした混合ハーブの1つとして使用されていることが報告されている（非特許文献３）。
【０００９】
また、プログアニル（Ｐｒｏｇｕａｎｉｌ）は、マラリアの治療及び予防に用いられる抗マラリア剤の一つで、世界中で長年使用されてきた安全性の高い薬剤である。
【００１０】
しかし、フェンホルミン、ベルベリン及びプログアニルにケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制作用があることは全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１６２０１２号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Egan DF, et al. (2011) Science, 331: 456-461
【非特許文献２】Jeong HW, et al. (2009) Am J Physiol Endocrinol Metab, 296: E955-964
【非特許文献３】Jimi Yoon, Young-Woo Sun and Tae-Heung Kim (2011). Complementary and Alternative Medicine for Vitiligo, Vitiligo - Management and Therapy, Dr. Kelly KyungHwa Park (Ed.), ISBN: 978-953-307-731-4, InTech, Available from: http://www.intechopen.com/books/vitiligo-management-and-therapy/complementary-andalternative-medicine-for-vitiligo
【発明の概要】
【発明の詳細な説明】
【００１３】
本発明は、以下の１）〜５）に係るものである。
１）ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上を有効成分とするケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤。
２）ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上を有効成分とするケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤。
３）ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上を有効成分とする皮膚又は毛髪色黒化剤。
４）ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上を有効成分とする白髪予防又は改善剤。
５）プログアニル又はその塩を含有する皮膚外用剤。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】フェンホルミン（Phenformin）による皮膚色黒化作用。A: Hispanic、B: African American、C: African American。
【図２】フェンホルミン（Phenformin）によるメラニン蓄積作用。A: Hispanic、B: African American。
【図３】Ａ：フェンホルミン（Phenformin）によるＰｍｅｌ１７タンパク量増加作用。Ｂ：フェンホルミン（Phenformin）によるＬＣ３-ＩＩ及びｐ６２タンパク量増加作用。
【図４】フェンホルミン（Phenformin）による皮膚色黒化作用（用量依存性）。
【図５】ベルベリン（Berberine）による皮膚色黒化及びメラニン蓄積作用（Caucasian）。
【図６】ベルベリン（Berberine）による皮膚色黒化及びメラニン蓄積作用（African American）。
【図７】ベルベリン（Berberine）によるオートファジー抑制作用（表皮細胞）。
【図８】フェンホルミン（Phenformin）、ベルベリン（Berberine）、及びゴールデンシール（Golden seal）によるメラノソーム分解抑制作用。
【図９】オウバクエキスとオウレンエキスの皮膚色黒化作用。
【図１０】フェンホルミン（Phenformin）による毛色黒化作用。
【図１１】フェンホルミン（Phenformin）によるオートファジー抑制作用。
【図１２】プログアニルの用量依存的な皮膚色黒化効果。
【図１３】プログアニルによる表皮メラニン沈着の蓄積。
【図１４】プログアニルがメラノサイト単独培養系において、メラノサイトのドーパオキシダーゼ活性及び細胞呼吸鎖活性に及ぼす影響（（Ａ）、（Ｃ）  メラノサイト  （ｌｉｇｈｔｌｙ）、（Ｂ）、（Ｄ）メラノサイト（ｄａｒｋｌｙ））。
【図１５】プログアニルがメラノサイト単独培養系において、細胞内メラニン量に及ぼす影響  （（Ａ）メラノサイト（ｌｉｇｈｔｌｙ）、（Ｂ）メラノサイト（ｄａｒｋｌｙ））。
【図１６】プログアニルがケラチノサイト及びメラノサイトからなる共培養系において、メラノサイトのドーパオキシダーゼ活性及び細胞呼吸鎖活性に及ぼす影響（（Ａ）、（Ｃ）メラノサイト（ｌｉｇｈｔｌｙ）、（Ｂ）、（Ｄ）メラノサイト（ｄａｒｋｌｙ））。
【図１７】プログアニルがケラチノサイトのメラニン分解活性に及ぼす影響。
【図１８】プログアニルがケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、ケラチノサイトにおけるメラニンの分解を抑制し、皮膚又は毛髪のメラニン蓄積を亢進するメラニン分解抑制剤を提供することに関する。
【００１６】
本発明者らは、皮膚又は毛髪におけるメラニン量を増加させる物質を探索したところ、フェンホルミン、ベルベリン及びプログアニルが、ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性抑制作用及びメラニン分解抑制作用を有し、ケラチノサイトにおけるメラニンの蓄積を亢進させることを見出した。
【００１７】
本発明によれば、皮膚又は毛髪におけるメラニンの蓄積を亢進し、皮膚の褐色化や白髪の防止・改善を図ることができる。
【００１８】
本発明におけるフェンホルミン及びベルベリンは、下記式で示される。
【００１９】
【化１】
2020200349.tif 000002
【００２０】
本発明において、フェンホルミンの塩としては、製薬上許容される塩であればよく、例えば無機酸（塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等）や有機酸（酢酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸等）の塩が挙げられるが、好ましくは塩酸塩である。また、フェンホルミンは水和物又は溶媒和物の形態をとっていてもよい。
【００２１】
フェンホルミン又はその塩は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社などの一般試薬メーカーより入手可能である。
【００２２】
ベルベリンの塩としては、例えば、塩酸、硫酸、タンニン酸等の塩を例示できるが、好ましくは塩酸塩（塩化ベルベリン）である。
ベルベリン又はその塩は、生薬として利用されるキハダ、オウレンの他、ゴールデンシール、バーベリー、オレゴングレープ等に豊富に含まれており、これらの植物から抽出、精製することにより容易に高純度のものを得ることができる（１３改正日本薬局方解説書，Ｃ-405頁）。
したがって、本発明において、ベルベリン又はその塩は、ベルベリン又はその塩を含有する植物の抽出物を用いてもよい。ベルベリン又はその塩を含有する植物としては、例えばミカン科のキハダ（学名：Phellodendron amurense、樹皮の薬用名：オウバク）、キンポウゲ科のオウレン（学名：Coptis japonica）、キンポウゲ科のゴールデンシール（goldenseal、学名：Hydrastis canadensis）、メギ科のバーベリー（学名：Berberis vulgaris）、メギ科のオレゴングレープ（学名：Berberis aquifolium）等が挙げられる。
【００２３】
抽出に用いられる植物の部位は、特に限定されず、例えば全草、葉、茎、芽、花、蕾、木質部、樹皮、地衣体、根、根茎、仮球茎、球茎、塊茎、種子、果実等、又はそれらの組み合わせが挙げられる。これらのうち、キハダの場合は樹皮が、オウレン、ゴールデンシール、バーベリー及びオレゴングレープの場合は根又は根茎が好ましく用いられる。
【００２４】
本発明に用いるベルベリン又はその塩を含有する植物の抽出物の製造方法は、特に限定はなく、ベルベリン又はその塩を含有する植物を公知の方法で抽出することにより得ることができる。本発明では各種抽出溶媒による溶媒抽出法により製造した抽出物が好ましく用いられる。
【００２５】
抽出のための溶媒には、極性溶媒、非極性溶媒のいずれも用いることができるが、ベルベリン又はその塩の抽出効率の観点から、極性溶媒が好ましく用いられる。極性溶媒の具体例としては、例えば、水、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、１−ペンタノール、１−ヘキサノール、１−ヘプタノール、１−オクタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１,３−ブチレングリコール、１,４−ブチレングリコール、グリセリン等の１価〜３価のアルコール、ポリエチレングリコール等が挙げられる。これらの溶媒は、一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、物性（抽出効率、安定性）、安全性及び汎用性の点から、水、１価〜３価のアルコール、又は１価〜３価のアルコールの水溶液が好ましく用いられ、さらに１価〜３価のアルコールとしてはエタノール、メタノール、１，３−ブチレングリコール、グリセリンが好ましく用いられる。
【００２６】
抽出溶媒の使用量は、十分な抽出効率が得られる条件であれば特に限定されないが、例えば、植物の乾燥質量１ｇに対し、１〜１０００ｍＬ、好ましくは５〜１００ｍＬ等を例示することができる。
【００２７】
抽出条件は、十分な抽出効率が得られる条件であれば特に限定されない。抽出期間（時間）は、例えば、１時間以上、好ましくは１日以上、３０日間以下、好ましくは１４日間以下等を例示することができる。抽出温度は、０℃以上、使用する溶媒の沸点以下で実施することが好ましく、より好ましくは常温から使用溶媒の沸点以下の温度範囲を例示することができる。ただし、加圧条件下において実施する場合には、抽出温度は使用溶媒の沸点に限定されることなく、抽出効率に鑑みて適宜、最適な温度を設定することができる。
上記植物抽出物は、例えば化粧品や医薬品上許容し得る規格に適合し、本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよい。また、必要に応じて、液液分配、固液分配、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、等の公知の技術によって不活性な夾雑物の除去、脱臭、脱色等の処理を施すことができる。
【００２８】
上記の抽出物はそのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮若しくは凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、水−エタノール混液、水−プロピレングリコール混液、水−１，３−ブチレングリコール混液等の溶剤で溶解・希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【００２９】
本発明におけるプログアニルは、下記式で示される１−（ｐ−クロロフェニル）−５−イソプロピルビグアニドを指す。
【００３０】
【化２】
2020200349.tif 000003
【００３１】
本発明において、プログアニルの塩としては、製薬上許容される塩であればよく、例えば無機酸（塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等）や有機酸（酢酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸等）の塩が挙げられるが、好ましくは塩酸塩である。また、プログアニルの水和物又は溶媒和物も本発明のプログアニルに含めるものとする。
【００３２】
プログアニル又はその塩は商業的に入手可能であり、例えば、プログアニル・塩酸塩が、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社などのメーカーより市販されている。
【００３３】
後記実施例に示すように、フェンホルミン又はその塩、ベルベリン又はその塩、及びベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、プログアニル又はその塩（「本発明の化合物」と称する）は、ヒトケラチノサイトにおいて、メラノソーム量の指標となるＰｍｅｌ１７タンパク質量（Murase D, Hachiya A, Takano K, Hicks R, Visscher MO, Kitahara T, Hase T, Takema Y, Yoshimori T (2013). Autophagy has a significant role in determining skin color by regulating melanosome degradation in keratinocytes. J Invest Dermatol 133:2416-2424.）を増加させ、メラニンの蓄積を亢進し、当該皮膚色を黒化する作用を有する。
また、フェンホルミン又はその塩、ベルベリン又はその塩、及びベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物は、ＬＣ３−ＩＩ及びｐ６２タンパク質の蓄積を亢進する。ＬＣ３−ＩＩ及びｐ６２タンパク質は、オートファジーに必要なタンパク質であり、オートファジーによって生成、分解されることから、オートファジー活性のマーカーとして用いられている（Mizushima N, Yoshimori T (2007). How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy 3: 542-545.）。したがって、斯かる２つのタンパク質の蓄積を亢進する本発明の化合物は、オートファジー抑制作用を有するものと考えられる。
プログアニル又はその塩についても、オートリソゾームにおけるタンパク質分解を阻害するＣｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ存在下でのＬＣ３−IIの蓄積を抑制することから、オートファジー抑制作用を有するものと考えられる。なお、この場合、ＬＣ３−II自身がオートファジーで分解されるため、詳細には、分解阻害剤による分解阻害時のＬＣ３−IIの蓄積がオートファジー活性のマーカーとなる（Mizushima N, Yoshimori T (2007). How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy 3: 542-545.）。
そして、ケラチノサイト内におけるメラニンの分解にはオートファジーが関与することが明らかにされていることから（前記特許文献１）、本発明の化合物による、ケラチノサイトにおけるメラニン量の蓄積・増加、それによる皮膚色の黒化は、オートファジーの活性が抑制され、ケラチノサイトにおけるメラニンの分解が抑制されたことに基づくと考えられる。
【００３４】
したがって、本発明の化合物を、動物、好ましくはヒトに投与することにより、ケラチノサイトにおけるメラニンの分解抑制、オートファジーの抑制、皮膚又は毛髪色の黒化、白髪の予防又は改善が可能となる。
【００３５】
すなわち、本発明の化合物は、ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、皮膚又は毛髪色黒化剤、及び白髪予防又は改善剤となり、メラニン分解抑制のため、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制のため、皮膚又は毛髪色黒化のため、及び白髪の予防又は改善のために使用することができる。
【００３６】
ここで、「ケラチノサイトにおけるオートファジーの抑制」とは、ケラチノサイトにおいて、オートファジー活性の抑制、特にオートファジー経路におけるファゴフォアの発生、ファゴフォアの伸長又は成長のステップの活動を抑制することにより、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させることを意味する。
尚、オートファジーの活性は、ＬＣ３−ＩＩ及びｐ６２タンパク質の蓄積量の他、リソソーム阻害剤の添加又は未添加において、斯かるタンパク質のターンオーバーを測定するフラックス・アッセイによっても測定・評価することができる。
【００３７】
また、「皮膚又は毛髪色黒化」とは、メラニン産生能を有する皮膚又は毛髪において、メラニン量を増加してその色を暗色化させることを意味する。したがって、例えば尋常性白斑のようなメラニン産生能を喪失した皮膚に対する皮膚色の回復を含むものではない。
すなわち、本発明のケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、及び皮膚又は毛髪色黒化剤は、尋常性白斑の治療剤にはならないが、尋常性白斑の治療剤と併用することにより、メラニン分解を抑制し皮膚色を黒化するために使用することは可能であり、本発明においては斯かる使用態様を制限するものではない。
【００３８】
本明細書において、本発明の化合物のヒトへの使用は、治療的使用であってもよく、又は美容目的での使用を含む非治療的使用であってもよい。
「非治療的」とは、医療行為を含まない、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない、より具体的には医師、又は医療従事者もしくは医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。本発明の化合物の非治療的使用としては、美容的又は審美的な目的での皮膚又は毛髪色の黒化のための使用、例えばエステティシャン、美容師等による使用等が挙げられる。
また、本明細書において、「改善」とは、症状又は状態の好転、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは症状又は状態の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
また、本明細書において、「予防」とは、個体における症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の症状の発症の危険性を低下させることをいう。
【００３９】
また、本発明の化合物は、ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、皮膚又は毛髪色黒化剤、又は白髪予防又は改善剤を製造するために使用することができる。
【００４０】
本発明のケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、皮膚又は毛髪色黒化剤、及び白髪予防又は改善剤は、メラニン分解抑制、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制、皮膚又は毛髪色の黒化、又は白髪予防又は改善を目的とした、医薬品、医薬部外品若しくは化粧品であり得、又は当該医薬品、医薬部外品若しくは化粧品を製造するための原料又は素材であり得る。
【００４１】
上記医薬品又は医薬部外品は、その投与形態は任意であり、経口投与、非経口投与の何れでもよい。経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤のような固形製剤、ならびにエリキシル、シロップ及び懸濁液のような液体製剤が挙げられ、非経口投与のための剤型としては、注射、外用、経皮、経粘膜、経鼻、経腸、吸入、坐剤、貼付等の各製剤が挙げられる。好ましくは、当該医薬品又は医薬部外品は、皮膚外用剤の形態であるのが好ましく、具体的には、軟膏、クリーム、乳液、ローション、ジェル、エアゾール、パッチ、テープ、スプレー等の形態が挙げられる。
【００４２】
上記化粧品の形態としては、クリーム、乳液、ローション、懸濁液、ジェル、パウダー、パック、シート、パッチ、スティック、ケーキ、ヘアトニック、ヘアリキッド、ヘアジェル、ヘアクリーム、トリートメント、ヘアスプレー、エアゾルムース、シャンプー、リンス等、化粧品に使用され得る任意の形態が挙げられる。
【００４３】
上記医薬品、医薬部外品若しくは化粧品に係る製剤組成物は、それぞれ一般的な製造法により、本発明の化合物を、製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、pH調整剤、色素、香料等と共に混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。また、これらの製剤組成物には、本発明の化合物の他、それぞれ医薬品、医薬部外品、化粧品等の製剤の種類に応じて、適宜、植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗菌剤、清涼剤等の薬効成分を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
【００４４】
当該製剤組成物中の本発明のフェンホルミン又はその塩、ベルベリン又はその塩、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、プログアニル又はその塩の含有量は、フェンホルミン、ベルベリン又はプログアニル換算で、一般的に好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．０５質量％以上、さらに好ましくは０．１質量％以上、且つ好ましくは１０質量％以下、より好ましく５質量％以下、さらに好ましくは２質量％以下であり、また好ましくは０．０１〜１０質量％、より好ましくは０．０５〜５質量％、さらに好ましくは０．１〜２質量％である。
【００４５】
上記製剤組成物によるフェンホルミン又はその塩、ベルベリン又はその塩、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、プログアニル又はその塩の投与量は、本発明の効果を達成できる量であり得る。当該投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、成人（６０ｋｇ）１人当たり１日、フェンホルミン、ベルベリン又はプログアニル換算で、例えば好ましくは０．１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上、さらに好ましくは５ｍｇ以上であり、且つ好ましくは５，０００ｍｇ以下、より好ましくは１，０００ｍｇ以下、さらに好ましくは５００ｍｇ以下である。また、好ましくは０．１〜５，０００ｍｇ、より好ましくは１〜１，０００ｍｇ、さらに好ましくは５〜５００ｍｇである。
化粧品のような外用剤の塗布による投与の場合、１００ｃｍ２当たりの１回の投与量は、フェンホルミン、ベルベリン又はプログアニル換算で、好ましくは０．０１ｍｇ以上、より好ましくは０．０５ｍｇ以上、さらに好ましくは０．１ｍｇ以上であり、且つ好ましくは１０ｍｇ以下、より好ましくは５ｍｇ以下、さらに好ましくは２ｍｇ以下である。また、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ、より好ましくは０．０５〜５ｍｇ、さらに好ましくは０．１〜２ｍｇである。
【００４６】
また、当該製剤は、任意の摂取・投与計画に従って摂取・投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数カ月間継続して投与することが好ましい。
上記化粧品、医薬品又は医薬部外品の適用の対象としては、それを必要としていれば特に限定されないが、好ましくは、皮膚の褐色化、白髪の予防又は改善を所望するヒトである。通常は、上記の効果発現を期待する部位に直接適用することが好ましい。上記の効果発現を期待する部位としては、皮膚の褐色化の場合、紫外線防御能を向上させたい部位や、審美面から皮膚を褐色化させたい部位、例えば、日常的に紫外線や人目に晒される機会の多い顔や手足等の皮膚やセルフタンニング剤を投与する皮膚が挙げられる。また、白髪の予防又は改善の場合、毛が生えている皮膚が挙げられ、特に毛が生えている頭部の皮膚が好ましい。
【００４７】
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
【００４８】
＜１＞ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上を有効成分とするケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤。
＜２＞ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上を有効成分とするケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤。
＜３＞ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上を有効成分とする皮膚又は毛髪色黒化剤。
＜４＞ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上を有効成分とする白髪予防又は改善剤。
＜５＞プログアニル又はその塩を含有する皮膚外用剤。
＜６＞上記＜５＞において、皮膚外用剤中のプログアニル又はその塩の含有量は、プログアニル換算で、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．０５質量％以上、さらに好ましくは０．１質量％以上、且つ好ましくは１０質量％以下、より好ましく５質量％以下、さらに好ましくは２質量％以下であり、また好ましくは０．０１〜１０質量％、より好ましくは０．０５〜５質量％、さらに好ましくは０．１〜２質量％である。
【００４９】
＜７＞ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤を製造するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上の使用。
＜８＞ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤を製造するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上の使用。
＜９＞皮膚又は毛髪色黒化剤を製造するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上の使用。
＜１０＞白髪予防又は改善剤を製造するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上の使用。
【００５０】
＜１１＞ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制に使用するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上。
＜１２＞ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制に使用するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上。
＜１３＞皮膚又は毛髪色黒化に使用するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上。
＜１４＞白髪予防又は改善に使用するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上。
＜１５＞上記＜１１＞〜＜１４＞において、使用濃度は、フェンホルミン、ベルベリン、或いはプログアニル換算で、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．０５質量％以上、さらに好ましくは０．１質量％以上、且つ好ましくは１０質量％以下、より好ましく５質量％以下、さらに好ましくは２質量％以下であり、また好ましくは０．０１〜１０質量％、より好ましくは０．０５〜５質量％、さらに好ましくは０．１〜２質量％である。
【００５１】
＜１６＞ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制のための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上の使用。
＜１７＞ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制のための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上の使用。
＜１８＞皮膚又は毛髪色黒化のための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上の使用。
＜１９＞白髪予防又は改善のための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上の使用。
＜２０＞上記＜１６＞〜＜１９＞において、使用濃度は、フェンホルミン、ベルベリン、或いはプログアニル換算で、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．０５質量％以上、さらに好ましくは０．１質量％以上、且つ好ましくは１０質量％以下、より好ましく５質量％以下、さらに好ましくは２質量％以下であり、また好ましくは０．０１〜１０質量％、より好ましくは０．０５〜５質量％、さらに好ましくは０．１〜２質量％である。
＜２１＞上記＜１６＞〜＜２０＞において、上記使用は、好ましくは、美容的又は審美的な目的での皮膚又は毛髪色黒化又は白髪予防又は改善のための非治療的な使用である。
【００５２】
＜２２＞ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制方法であって、それを必要とする対象にベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
＜２３＞ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制方法であって、それを必要とする対象にベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
＜２４＞皮膚又は毛髪色黒化方法であって、それを必要とする対象にベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
＜２５＞白髪予防又は改善方法であって、それを必要とする対象にベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる１種以上を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
＜２６＞上記＜２２＞〜＜２５＞において、投与又は摂取量は、成人（６０ｋｇ）１人当たり１日、フェンホルミン、ベルベリン又はプログアニル換算で、好ましくは０．１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上、さらに好ましくは５ｍｇ以上であり、且つ好ましくは５，０００ｍｇ以下、より好ましくは１，０００ｍｇ以下、さらに好ましくは５００ｍｇ以下である。また、好ましくは０．１〜５，０００ｍｇ、より好ましくは１〜１，０００ｍｇ、さらに好ましくは５〜５００ｍｇである。
＜２７＞上記＜２２＞〜＜２５＞において、外用剤の塗布による１００ｃｍ２当たりの１回の投与量は、フェンホルミン、ベルベリン又はプログアニル換算で、好ましくは０．０１ｍｇ以上、より好ましくは０．０５ｍｇ以上、さらに好ましくは０．１ｍｇ以上であり、且つ好ましくは１０ｍｇ以下、より好ましくは５ｍｇ以下、さらに好ましくは２ｍｇ以下である。また、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ、より好ましくは０．０５〜５ｍｇ、さらに好ましくは０．１〜２ｍｇである。
＜２８＞上記＜２２＞〜＜２７＞において、上記方法は、好ましくは、美容的又は審美的な目的での皮膚又は毛髪色黒化又は白髪予防又は改善のための非治療的な方法である。
【００５３】
＜２９＞上記＜１＞〜＜４＞、＜７＞〜＜２８＞において、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物は、オレゴングレープ、キハダ、オウレン、バーベリー又はゴールデンシールの抽出物である。
＜３０＞上記＜２９＞において、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物は、オレゴングレープの根若しくは根茎、キハダの樹皮、オウレンの根若しくは根茎、バーベリーの根若しくは根茎又はゴールデンシールの根若しくは根茎の抽出物である。
＜３１＞上記＜１＞〜＜４＞、＜７＞〜＜２０＞において、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物は、極性溶媒による抽出エキスである。
＜３２＞上記＜３１＞において、極性溶媒は水、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、１−ペンタノール、１−ヘキサノール、１−ヘプタノール、１−オクタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１,３−ブチレングリコール、１,４−ブチレングリコール、グリセリン等の１価〜３価のアルコール、ポリエチレングリコール、又はこれら溶媒の一種又は二種以上を組み合わせである。
＜３３＞上記＜３１＞において、極性溶媒は水、１価〜３価のアルコール、又は１価〜３価のアルコールの水溶液である。
＜３４＞上記＜３３＞において、１価〜３価のアルコールはエタノール、メタノール、１，３−ブチレングリコール、グリセリンである。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５５】
＜評価サンプルの調製＞
・フェンホルミン（Phenformin）は、Sigma-Aldrich社から購入し、ＤＭＳＯに溶解した上で、培地中に指定の濃度で添加した。
・ベルベリン（Berberine）は、Santa Cruz Biotechnology社から購入し、ＤＭＳＯに溶解した上で、培地中に指定の濃度で添加した。
・ゴールデンシール抽出物（Goldenseal extract）は、Making Cosmetics, Inc.から購入し、培地中に指定の濃度で添加した。ゴールデンシールの根を抽出部位として使用し、グリセリン水溶液による抽出で得られた固形分２０％の抽出物である。
・オウバク抽出物（ＯＵＢＡＫＵ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｂ）は、キハダ樹皮の抽出物であり、一丸ファルコス社から入手し、培地中に指定の濃度で添加した。１，３−ブチレングリコールによる抽出で得られた固形分１．２５％の抽出物である。
・オウレン抽出物（ＯＵＲＥＮ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｂ）は、オウレン根茎の抽出物であり、一丸ファルコス社から入手し、培地中に指定の濃度で添加した。１，３−ブチレングリコールによる抽出で得られた固形分０．５％の抽出物である。
・プログアニル（Ｐｒｏｇｕａｎｉｌ）は、プログアニル塩酸塩（Ｐｒｏｇｕａｎｉｌ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（以下、単に「プログアニル」と称する）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより購入し、ＤＭＳＯに溶解した上で、培地中に所定の濃度で添加した。
【００５６】
実施例１  ヒト皮膚組織における皮膚黒化作用
（１）米国スキンバンクＮａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ）から、外科手術由来の正常ヒト皮膚組織を購入した。ヒト皮膚組織は、皮下脂肪を切除した後に、ナイフで約１ｃｍ×約１ｃｍの片に細断し、６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅを使用して３７℃  ５％ＣＯ２下にて培養した。Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を１０％（ｖ／ｖ）含むＡｄｖａｎｃｅｄ−ＤＭＥＭ培地（いずれもＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を培養に用いた。
【００５７】
（２）上記（１）の方法で調製されたヒト皮膚組織を６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに静置し、フェンホルミンを終濃度３００μＭで培地中に添加して、組織培養を開始した。２〜３日毎に培地交換を行った。６日後又は８日後の皮膚組織の外観を観察し、写真を撮影した。
１名のＨｉｓｐａｎｉｃ及び２名のＡｆｒｉｃａｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎに由来する皮膚組織（Ｈｉｓｐａｎｉｃ：培養８日後の皮膚組織、Ａｆｒｉｃａｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎ：培養６日後の皮膚組織）を用いて評価した結果、いずれの培養実験においてもフェンホルミンによって明らかな皮膚色の黒化が誘導された（図１Ａ−１Ｃ）。
【００５８】
（３）次に、培養後の皮膚組織を用いて、Ｆｏｎｔａｎａ−Ｍａｓｓｏｎ染色によりメラニンの沈着を観察した。同染色には、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍａｓｔｅｒｔｅｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．社製のＦｏｎｔａｎａ−Ｍａｓｓｏｎ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔを使用した。
Ｈｉｓｐａｎｉｃ（図１Ａの皮膚）及びＡｆｒｉｃａｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎ（図１Ｂの皮膚）の皮膚組織において、フェンホルミン処理により表皮におけるメラニンの顕著な蓄積が認められた（図２Ａ及び２Ｂ）。拡大像で示したように、フェンホルミンを添加することで、表皮の基底層のみならず、有棘層や顆粒層に至るまで、メラニンがより広範囲に沈着している様子が観察された。
【００５９】
実施例２  ヒト皮膚組織におけるメラニン蓄積亢進作用
また、実施例１（１）の方法で調製されたＡｆｒｉｃａｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎに由来する皮膚組織を６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに静置し、フェンホルミンの存在下又は非存在下で６日間培養し、皮膚組織から抽出したタンパク質を用いて、メラノソームを構成する主要なタンパク質であるＰｍｅｌ１７のタンパク質量をＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて解析した。１次抗体として、マウス抗ヒトＰｍｅｌ１７抗体（ＤＡＫＯ）を用いた。２次抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を使用し、ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅ試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とＯＤＹＳＳＥＹ  Ｆｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩＣＯＲ）を用いてシグナルを検出した。内部標準として、β−ａｃｔｉｎタンパク質を同様に検出した。メラニン沈着の誘導に一致して、フェンホルミンによるＰｍｅｌ１７タンパク質の増加も認められた（図３Ａ）。
【００６０】
実施例３  ヒト皮膚組織におけるオートファジー抑制作用
さらに、実施例１（１）の方法で調製されたＡｆｒｉｃａｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎに由来する皮膚組織を６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに静置し、異なる濃度のフェンホルミンの存在下又は非存在下で４日間培養し、皮膚組織から抽出したタンパク質を用いたＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇ解析により、オートファゴソーム膜に局在し、オートファジーによって最終的に分解されるＬＣ３−ＩＩ及びｐ６２タンパク質の発現量を定量した。１次抗体としてマウス抗ヒトＬＣ３抗体（Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ）及びウサギ抗ヒトｐ６２抗体（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いた。フェンホルミン添加によって、両マーカーに蓄積が認められたことから、オートファジーの抑制が示唆された（図３Ｂ）。
【００６１】
実施例４  ヒト皮膚組織における皮膚色黒化作用（用量依存性）
実施例１（１）の方法で調製されたヒト皮膚組織を６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに静置し、フェンホルミンを終濃度１００、２００、３００μＭで培地中に添加して、組織培養を開始した。４日後の皮膚組織の外観を観察し、写真を撮影した。４日間処理することによって、認知可能な黒化が用量依存的に観察された（図４）。なお、皮膚色の変化と相関したメラニン沈着も、Ｆｏｎｔａｎａ−Ｍａｓｓｏｎ染色によって確認済みである（データ非掲載）。
【００６２】
また、実施例１（１）の方法で調製されたＣａｕｃａｓｉａｎとＡｆｒｉｃａｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎに由来する皮膚組織を６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに静置し、ベルベリンをＣａｕｃａｓｉａｎ由来皮膚に対しては、終濃度１０、３０μＭで、Ａｆｒｉｃａｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎ由来皮膚に対しては、終濃度３０、１００μＭで培地中に添加して、組織培養を開始した。６日後又は４日後の皮膚組織の外観を観察し、写真を撮影した。
いずれの検体においても、ベルベリンの用量依存的に皮膚色の黒化が誘導され、表皮層におけるメラニン沈着を伴っていることを組織染色によっても確認した（図５及び６）。
【００６３】
実施例５  ベルベリンのオートファジー抑制作用
ベルベリンによる皮膚色黒化作用の解明の一環として、表皮細胞のオートファジーに及ぼす影響を調べた。６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種した表皮細胞に対して、ベルベリンを終濃度１０、３０、６０μＭで培地中に添加して、２４時間培養した。タンパク質を抽出し、Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇ解析により、オートファジーのマーカーであるＬＣ３−ＩＩとｐ６２タンパク質の発現量を解析した。ベルベリンの添加によって、用量依存的なＬＣ３−ＩＩ及びｐ６２タンパク質の蓄積が観察されたことから、オートファジー抑制作用が示唆された（図７）。
【００６４】
実施例６  メラノソーム分解抑制作用
フェンホルミンとベルベリンによる皮膚色黒化作用の解明の一環として、これらの成分が表皮細胞のメラノソーム分解に及ぼす影響を調べた。表皮細胞は、米国スキンバンクＮａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ）から入手した包皮組織より、所定の方法にて単離・培養した。メラノソームを、所定の方法によりＭＮＴ−１細胞株より調製し（Murase et al. (2013) J Invest Dermatol, 133:2416-2424.）、一定量のメラノソームを表皮細胞に添加し、２４時間培養した。６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの１  ｗｅｌｌあたり、３５ｃｍ２の面積で培養したＭＮＴ−１細胞株から調製したメラノソームを添加した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、メラノソームを取り込ませた表皮細胞に対して、フェンホルミンを終濃度１００、２００μＭで、ベルベリンを終濃度１０、３０、６０μＭで、及びベルベリンを多く含むゴールデンシール抽出物を終濃度０．２、０．５％（ｖ/ｖ）で添加して、更に２４時間培養した。タンパク質を抽出し、Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇ解析により、メラノソームを構成する主要なタンパク質であるＰｍｅｌ１７の発現量を解析した。いずれの成分の添加においても用量依存的なＰｍｅｌ１７タンパク質の蓄積が観察されたことから、メラノソーム分解抑制作用が示唆された（図８）。
【００６５】
実施例７  オウバクエキスとオウレンエキスの皮膚色黒化作用
実施例１（１）の方法で調製されたＡｆｒｉｃａｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎに由来する皮膚組織を６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに静置し、オウバクエキスとオウレンエキスを終濃度１％（Ｖ/Ｖ）で培地中に添加して、組織培養を開始した。６日後の皮膚組織の外観を観察し、写真を撮影した。
いずれの検体においても、オウバクエキスとオウレンエキスの添加によって皮膚色の黒化が誘導され、表皮層におけるメラニン沈着を伴っていることを組織染色によっても確認した（図９）。
【００６６】
実施例８  フェンホルミンの毛色黒化作用
ヒト毛包は、米国の皮膚科医より入手した外科手術由来の正常ヒト頭皮組織（Ｃａｕｃａｓｉａｎ由来）より、外科的に単離した。単離したヒト毛包は３７℃  ５％ＣＯ２下にて、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ培地にｉｎｓｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を２０μｇ／ｍｌ、ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を４０ｎｇ／ｍｌ、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を２ｍＭ、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１％（ｖ／ｖ）添加した培地で培養した（いずれも終濃度）。単離したヒト毛包を２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに静置し、フェンホルミンを終濃度２００μＭで培地中に添加して、組織培養を開始した。培養１日後と3日後に培地交換し、５日後の毛包組織をＯＣＴコンパウンド（ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ）で包埋して凍結した。これらの毛包組織を用いて、Ｆｏｎｔａｎａ−Ｍａｓｓｏｎ染色によりメラニンの沈着を観察した。フェンホルミン処理によって、培養した毛包組織に明らかな毛色の黒化が誘導された（図１０）。
【００６７】
実施例９  フェンホルミンのヒト毛包におけるオートファジー抑制作用
実施例８の方法で培養したヒト組織培養毛包からタンパク質を抽出し、Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇ解析により、オートファジーのマーカーであるＬＣ３−ＩＩとｐ６２タンパク質の発現量を解析した。フェンホルミンの添加によって、ＬＣ３−ＩＩ及びｐ６２タンパク質の蓄積が観察されたことから、オートファジー抑制作用が示唆された（図１１）。
【００６８】
実施例１０：プログアニルが皮膚色に及ぼす影響
（１）組織培養
医科大学の形成外科学部門より、外科手術由来の正常ヒト皮膚組織を提供頂いた。
ヒト皮膚組織は、皮下脂肪をトリミングした後に、ナイフで約１ｃｍ×１ｃｍの大きさに小片化し、６−ウェルプレートを使用して３７℃  ５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で培養した。培養には、Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を１０％（ｖ／ｖ）含むＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ培地（いずれもＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。
【００６９】
（２）プログアニルが皮膚色に及ぼす影響
ヒト皮膚組織を６−ウェルプレートに静置し、プログアニルを終濃度で１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００μＭになるように培地中に添加した上で組織培養を実施した。コントロールとしては、同量のＤＭＳＯを添加した。２〜３日毎に培地を交換しながら、培養開始から５日間経過後に皮膚組織の外観を観察し、写真撮影を行った。その結果、プログアニルは、用量依存的に皮膚色の黒化を誘導することを確認した（図１２）。
【００７０】
（３）組織切片の染色及び観察
目視で認識できる程度に皮膚色の黒化が誘導された、プログアニルを終濃度で１８０μＭ添加して５日間培養した皮膚組織を用いて、Ｆｏｎｔａｎａ−Ｍａｓｓｏｎ染色により、メラニンの沈着を観察した。具体的には、皮膚組織を包埋したパラフィンブロックを薄切して５μｍ厚のパラフィン切片を作製した後、フォンタナアンモニア銀液（武藤化学）を用いて室温で２時間反応させ、メラニン顆粒を識別できるようにした。その後、ケルンエヒトロート液（武藤化学）を用いて核染色を実施した。ＤＭＳＯを添加したコントロールの皮膚と比較して、プログアニル１８０μＭを添加した皮膚では、メラニンが表皮のより広範囲で蓄積している様子が観察された（図１３；上段）。また、同時にＨＥ染色を行うことで、プログアニルを添加することで組織にダメージが誘導されていないことも確認した（図１３；下段）。
【００７１】
実施例１１：プログアニルがメラノサイト単独培養系においてメラニン生成に及ぼす影響
（１）細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮メラニン細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ，ｎｅｏｎａｔａｌ，ｌｉｇｈｔｌｙ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｄｏｎｏｒ（ＨＥＭｎ−ＬＰ）及びＨｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ，ｎｅｏｎａｔａｌ，ｄａｒｋｌｙ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｄｏｎｏｒ（ＨＥＭｎ−ＤＰ）；メラノサイト（ｌｉｇｈｔｌｙ）及びメラノサイト（ｄａｒｋｌｙ））、表皮メラニン細胞用増殖培地（Ｍｅｄｉｕｍ２５４）、その培地用増殖添加剤（ＨＭＧＳ）はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より購入した。メラノサイトは、３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で培養した。
【００７２】
（２）プログアニルがメラノサイト単独培養系におけるメラノサイトのドーパオキシダーゼ活性に及ぼす影響
メラノサイト（ｌｉｇｈｔｌｙ及びｄａｒｋｌｙ）を２×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル（１００μＬ／ウェル）の細胞密度で９６−ウェルプレートに播種した。この時の試験用培地としては、Ｍｅｄｉｕｍ２５４（増殖添加剤（ＨＭＧＳ）のうち、ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｈＦＧＦ−Ｂ；Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂａｓｉｃ）、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン及びウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ；Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ）含有、ホルボール１２−ミリスチン酸１３−アセテート（ＰＭＡ；ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）不含）を用いた。２日後、プログアニルを終濃度で０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００μＭになるように添加し、３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で４日間培養した。コントロールとしては、同量のＤＭＳＯを添加した。培養終了後、培地を全量置換し（１００μＬ／ウェル）、アラマーブルー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）試薬を１０μＬ／ウェルになるように添加した。３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で１時間インキュベートした後、培地の蛍光強度（Ｅｘ５４４ｎｍ／Ｅｍ５９０ｎｍ）を測定することで細胞呼吸鎖（増殖）活性を評価した。その後、細胞の培養プレートをＰＢＳで３回洗浄して、抽出Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ：７．２）、１％ＮＰ−４０、０．０１％ＳＤＳ）を２０μＬ／ウェル、Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（４％ジメチルホルムアミド、１００ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ（ｐＨ：７．１））を２０μＬ／ウェル添加した。４℃にて２時間かけて細胞を可溶化し、ドーパオキシダーゼ活性の測定を行ったが、その活性測定は、ＭＢＴＨ法（Winder A. et al., 1991, Eur. J. Biochem. 198:317-326）を基本とした次に示す方法で行った。すなわち、可溶化した細胞溶液の各ウェルに、上記Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを８０μＬ、２０．７ｍＭ  ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン  ヒドラゾン）水溶液を６０μＬ、基質として５ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）水溶液を４０μＬ加え、３７℃にて３０分間反応させた後、５０５ｎｍの波長の吸光度を測定した。
その結果、ＤＭＳＯのみを添加したコントロールと比較して、プログアニルがドーパオキシダーゼ活性を促進することはなかった（図１４Ａ、１４Ｂ）。また、３０μＭ以下の添加濃度域では細胞毒性は見られなかった（図１４Ｃ、１４Ｄ）。
【００７３】
（３）プログアニルがメラノサイト単独培養系におけるメラノサイトの細胞内メラニン量に及ぼす影響
メラノサイト（ｌｉｇｈｔｌｙ及びｄａｒｋｌｙ）を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル（２ｍＬ／ウェル）の細胞密度で６−ウェルプレートに播種した。この時の試験用培地としては、Ｍｅｄｉｕｍ２５４（増殖添加剤（ＨＭＧＳ）のうち、ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｈＦＧＦ−Ｂ；Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂａｓｉｃ）、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン及びウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ；Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ）含有、ホルボール１２−ミリスチン酸１３−アセテート（ＰＭＡ；ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）不含）を用いた。翌日、プログアニルを終濃度で３、１０、３０μＭになるように添加し、３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で７日間培養した。コントロールとしては、同量のＤＭＳＯを添加した。なお、培地交換は２〜３日に１度行った。培養終了後、細胞の培養プレートをＰＢＳで洗浄し、セルスクレーパーを用いて１．５ｍＬマイクロチューブに細胞を回収した。各チューブに２Ｍ  ＮａＯＨを１５０ μＬ加えた後１００℃、６０分間の処理により細胞を溶解し、室温下において、２１，６４０ｇで１０分間の遠心処理により上清を回収した。回収した上清を４０５ｎｍの波長を用いて吸光度を測定し、ウェル当たりのメラニン量を算出した。
その結果、ＤＭＳＯのみを添加したコントロールと比較して、プログアニルは細胞内のメラニン量を増加させることはなかった（図１５Ａ、１５Ｂ）。
【００７４】
実施例１２：プログアニルがケラチノサイト及びメラノサイトからなる共培養系においてメラニン生成に及ぼす影響
（１）細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，ｎｅｏｎａｔａｌ（ＨＥＫｎ）ｌｉｇｈｔｌｙ；ケラチノサイト）及び表皮角化細胞用増殖培地（Ｅｐｉｌｉｆｅ）はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より購入した。培地用増殖添加剤（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ）は倉敷紡績より購入した。正常ヒト新生児包皮由来表皮メラニン細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ，ｎｅｏｎａｔａｌ，ｌｉｇｈｔｌｙ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｄｏｎｏｒ（ＨＥＭｎ−ＬＰ）及びＨｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ，ｎｅｏｎａｔａｌ，ｄａｒｋｌｙ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｄｏｎｏｒ（ＨＥＭｎ−ＤＰ）；メラノサイト（ｌｉｇｈｔｌｙ）及びメラノサイト（ｄａｒｋｌｙ））はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より購入した。ケラチノサイト及びメラノサイトは、３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で培養した。
【００７５】
（２）プログアニルが共培養系におけるメラノサイトのドーパオキシダーゼ活性に及ぼす影響
ケラチノサイトを９６−ウェルプレートに１×１０４ ｃｅｌｌｓ／ウェル（１００μＬ／ウェル）の細胞密度で播種し、翌日、メラノサイト（ｌｉｇｈｔｌｙ及びｄａｒｋｌｙ）を２×１０４ ｃｅｌｌｓ／ウェル（１００μＬ／ウェル）の細胞密度で播種した。さらにその翌日に、プログアニルを終濃度で０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００μＭになるように添加し、３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で４日間培養を行った。この時の試験用培地としては、ヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ；Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）以外のＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ増殖添加剤（インスリン、ハイドロコーチゾン、ＢＰＥ、ゲンタマイシン及びアンフォテリシンＢ）を含むＥｐｉｌｉｆｅを用いた。コントロールとしては、同量のＤＭＳＯを添加した。培養終了後、実施例１１と同様の方法にて、細胞呼吸鎖（増殖）活性及びドーパオキシダーゼ活性を評価した。その結果、ＤＭＳＯのみを添加したコントロールと比較して、プログアニルがドーパオキシダーゼ活性を促進することはなかった（図１６Ａ、１６Ｂ）。また、３０μＭ以下の添加濃度域では細胞毒性は見られなかった（図１６Ｃ、１６Ｄ）。
【００７６】
実施例１３：プログアニルが表皮角化細胞（ケラチノサイト）に及ぼす影響
（１）細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，ｎｅｏｎａｔａｌ（ＨＥＫｎ）ｌｉｇｈｔｌｙ；ケラチノサイト）はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より購入した。メラノーマ細胞株ＭＮＴ−１細胞は、Ｄｒ．  Ｎａｔａｌｉ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌａ  Ｓａｐｉｅｎｚａ，Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ）より供与いただいた。ケラチノサイトは培地用増殖添加剤（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ）（倉敷紡績）を添加した表皮角化細胞用増殖培地（Ｅｐｉｌｉｆｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で培養した。ＭＮＴ−１細胞の増殖用培地として、ＡＩＭ−Ｖ培地とＦｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）をそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）含むＲＰＭＩ１６４０培地（いずれもＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で培養した。
【００７７】
（２）メラノソーム画分の調製
ＭＮＴ−１細胞からメラノソーム画分を所定の方法（Murase et al. (2013) J Invest Dermatol, 133:2416-2424.）により単離調製した。具体的には、１７５ｃｍ２フラスコに培養しコンフルエントに達したＭＮＴ−１細胞を０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で回収し、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＤＰＢＳ、ｎｏ  ｃａｌｃｉｕｍ、ｎｏ  ｍａｇｎｅｓｉｕｍ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（以下、ＰＢＳと略記）にて洗浄した。続いて、２ｍＬのＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．５、１％  Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、０．０１％  ＳＤＳ）を加えて穏やかに混合し、４℃にて１時間振盪攪拌した。この細胞溶解液を１．５ｍＬマイクロチューブに分注し、１，０００ｇにて１０分間（４℃）遠心して、上清を回収した。本遠心操作を計２回繰り返し、得られた上清を続いて２０，０００ｇにて１０分間（４℃）遠心した。最後にペレットをＰＢＳで洗浄し、同条件で遠心操作を計２回繰り返して得られたペレットをメラノソーム画分（ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ−ｒｉｃｈ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）とした。
【００７８】
（３）プログアニルが表皮角化細胞 (ケラチノサイト) におけるメラニン(メラノソーム) 分解に及ぼす影響
ケラチノサイトを６−ウェルプレートに２×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル（２ ｍＬ／ウェル）の細胞密度で播種し、３日後に１７５ｃｍ２フラスコ１本分に培養したＭＮＴ−１細胞から得られたメラノソーム画分を１枚分のプレート（６−ウェル分）に対して均等量添加した。その翌日に培地を交換し、プログアニルを終濃度で１０、３０μＭになるように添加し、３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。コントロールとしては、同量のＤＭＳＯを添加した。なお、この時の試験用培地としては、Ｅｐｉｌｉｆｅ（増殖添加剤（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ）のうち、ハイドロコーチゾン、インスリン、ゲンタマイシン及びアンフォテリシンＢ含有、ヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ；Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）及びウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ；Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ）不含）を使用した。培養終了後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて回収してから、超音波処理により細胞を破砕した。その後、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、その上清について、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたＢＣＡ（ビシンコニン酸）法により、Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を標準物質としてタンパク量を定量した。その後、各群のタンパク質量を揃え、定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットに供した。一次抗体はａｎｔｉ−Ｐｍｅｌ１７（Ｄａｋｏ，１：２５０）を用いた。二次抗体は、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，ＨＲＰ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｈｅｅｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた。その後、ＥＣＬ  ｐｌｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて発色させ、ＬＡＳ４０００（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ）を用いて発現量を可視化した。内部標準としてのβ−ａｃｔｉｎの発現は、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  β−ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，１：５０００）を用いて評価した。メラノソームを取り込ませたケラチノサイトにおいて検出されたＰｍｅｌ１７のバンドの強度は、ＤＭＳＯを添加したコントロールに対して、プログアニルを処理した際に、濃度依存的に強くなっており、回収された細胞沈渣の色も濃度依存的に濃くなっていることを確認した（図１７）。Ｐｍｅｌ１７はメラノソームに特異的なタンパク質であることから、ケラチノサイトに取り込まれたメラノソームの分解がプログアニルの処理により抑制されたものと考えられる。
【００７９】
（４）プログアニルが表皮角化細胞 (ケラチノサイト) のオートファジー活性に及ぼす影響
ケラチノサイトを６−ウェルプレートに１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル（２ｍＬ／ウェル）の細胞密度で播種し、その翌日に、プログアニルを終濃度で０．３、１、３、１０、３０μＭになるように添加し、３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で培養した。コントロールとしては、同量のＤＭＳＯを添加した。なお、この時の試験用培地としては、Ｅｐｉｌｉｆｅ（増殖添加剤（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ）のうち、ハイドロコーチゾン、インスリン、ゲンタマイシン及びアンフォテリシンＢ含有、ヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ；Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）及びウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ；  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ）不含）を使用した。さらに翌日、ＬＣ３Ｂ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に付属のＣｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを終濃度で１０μＭになるように添加し、３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。培養終了後、上述した方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットに供した。一次抗体は上述したＫｉｔに付属のａｎｔｉ−ＬＣ３Ｂ（１：１０００）を用いた。二次抗体は、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，ＨＲＰ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｈｅｅｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた。その後、ＥＣＬ  ｐｌｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて発色させ、ＬＡＳ４０００（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ）を用いて発現量を可視化した。内部標準としてのβ−ａｃｔｉｎの発現は、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  β−ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，１：５０００）を用いて評価した。リソソーム阻害剤であるＣｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅの添加によって、ＬＣ３−IIの蓄積が誘導されたが、その蓄積をプログアニルは濃度依存的に緩和した（図１８）。このことは、プログアニルがオートファゴソーム膜の形成より前段階でオートファジー活性を抑制したことを意味すると考えられる。したがって、プログアニルはケラチノサイトのオートファジー活性を抑制することで、ケラチノサイトにおけるメラニン分解を抑制したと考えられる。
【図１】
2020200349.tif 000004
【図２】
2020200349.tif 000005
【図３】
2020200349.tif 000006
【図４】
2020200349.tif 000007
【図５】
2020200349.tif 000008
【図６】
2020200349.tif 000009
【図７】
2020200349.tif 000010
【図８】
2020200349.tif 000011
【図９】
2020200349.tif 000012
【図１０】
2020200349.tif 000013
【図１１】
2020200349.tif 000014
【図１２】
2020200349.tif 000015
【図１３】
2020200349.tif 000016
【図１４】
2020200349.tif 000017
【図１５】
2020200349.tif 000018
【図１６】
2020200349.tif 000019
【図１７】
2020200349.tif 000020
【図１８】
2020200349.tif 000021