(57)【要約】【課題】ＲＮＡアプタマーが発光プローブと相互作用が可能な発光誘導性アプタマーの塩基配列のみを有するＲＮＡアプタマーである場合に比べ、発光プローブと相互作用したときに、発光プローブの発光性が増強されるＲＮＡアプタマーを提供すること。【解決手段】発光プローブと相互作用して発光能を誘導させる発光誘導性アプタマーの塩基配列と、三重鎖を協働的に形成可能な三重鎖形成性塩基配列群と、を含み、前記三重鎖形成性塩基配列群は、前記発光誘導性アプタマーの片末端側に結合した８残基以上の連続するウリジンからなる第１の塩基配列と、他方末端側に結合した８残基以上の連続するアデノシンからなる第２の塩基配列及び８残基以上の連続するウリジンからなる第３の塩基配列と、を有し、前記第１の塩基配列、前記第２の塩基配列及び前記第３の塩基配列が三重鎖を協働的に形成可能な、ＲＮＡアプタマーである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光プローブと相互作用して発光能を誘導させる発光誘導性アプタマーの塩基配列と、
三重鎖を協働的に形成可能な三重鎖形成性塩基配列群と、
を含み、
前記三重鎖形成性塩基配列群は、前記発光誘導性アプタマーの片末端側に結合した８残基以上の連続するウリジンからなる第１の塩基配列と、他方末端側に結合した８残基以上の連続するアデノシンからなる第２の塩基配列及び８残基以上の連続するウリジンからなる第３の塩基配列と、を有し、
前記第１の塩基配列、前記第２の塩基配列及び前記第３の塩基配列が三重鎖を協働的に形成可能な、ＲＮＡアプタマー。
【請求項２】
前記三重鎖形成性塩基配列群が、前記発光誘導性アプタマーの片末端側に結合した１０残基以上の連続するウリジンからなる第１の塩基配列と、他方末端側に結合した１０残基以上の連続するアデノシンからなる第２の塩基配列及び１０残基以上の連続するウリジンからなる第３の塩基配列と、を有する、請求項１に記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項３】
前記三重鎖形成性塩基配列群が、前記第２の塩基配列と第３の塩基配列との間に、ループ配列を有する、請求項１又は請求項２に記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項４】
前記発光誘導性アプタマーの塩基配列が、BabySpinach（配列番号１）、Spinach（配列番号２）、Mango（配列番号３）、Corn（配列番号４）及びBroccoli（配列番号５）からなる群より選択される１種以上を含む、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項５】
前記発光誘導性アプタマーの塩基配列が、BabySpinach（配列番号１）を含む、請求項４に記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマーと、
前記ＲＮＡアプタマーと相互作用する発光プローブと、を含む複合分子。
【請求項７】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマーと前記ＲＮＡアプタマーと相互作用する発光プローブと測定試料とを混合して測定混合物を調製する混合工程と、
前記発光プローブにおける励起波長の光を前記測定混合物に照射し前記発光プローブの発光を観測する発光観測工程と、
前記発光観測工程により観測された発光に基づき前記測定試料のｐＨを判定するｐＨ判定工程と、
を含むｐＨ判定方法。
【請求項８】
対象ＲＮＡの塩基配列の少なくとも一方の末端に、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマーの塩基配列が付加された標識化ＲＮＡ。
【請求項９】
対象ＲＮＡの塩基配列の少なくとも一方の末端に、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマーの塩基配列が付加された標識化ＲＮＡを製造する標識化ＲＮＡの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡアプタマー、複合分子、ｐＨ判定方法、標識化ＲＮＡ及び標識化ＲＮＡの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定のＲＮＡ、タンパク質等の位置を解析する手法の一つとして、ＲＮＡアプタマーを用いた標識方法が知られている。ＲＮＡアプタマーとは、有機低分子等の標的分子に対し、特異的に結合又は相互作用する性質を有するリボ核酸分子である。ＲＮＡアプタマーは、ＤＮＡからの転写により細胞内で合成することが可能であるため、ＲＮＡアプタマーを用いた標識方法は、細胞内の幅広い対象分子の標識に対し安定的な適用が期待できる。
【０００３】
ＲＮＡアプタマーを用いた標識方法の例として、発光誘導性のＲＮＡアプタマーを用いた発光標識方法が挙げられる。発光誘導性のＲＮＡアプタマーを用いた発光標識方法とは、単独では発光性が非常に低い発光プローブと、ＲＮＡアプタマーと、を相互作用させることにより、発光プローブの発光能を誘導させ、この発光を標識として利用する方法である。例えば、特許文献１には、BabySpinach配列を有する発光誘導性のＲＮＡアプタマーと、有機低分子である発光プローブと、を用いた発光標識方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１５／０１４１２８２号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来の発光誘導性のＲＮＡアプタマーを用いた発光標識方法は、十分なものではなかった。例えば、従来の発光誘導性のＲＮＡアプタマーは、発光誘導性が低い傾向にあった。すなわち、発光誘導性のＲＮＡアプタマーが発光プローブと相互作用したときに観測される、発光プローブの発光性が低い傾向にあった。そのため、従来の発光誘導性のＲＮＡアプタマーを細胞内における発光標識として用いることは困難であった。
【０００６】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、発光プローブと相互作用したときに、ＲＮＡアプタマーが発光プローブと相互作用が可能な発光誘導性アプタマーの塩基配列のみを有するＲＮＡアプタマーである場合に比べ、発光プローブの発光性を増強可能なＲＮＡアプタマーを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための手段は、以下の態様を含む。
【０００８】
［１］  発光プローブと相互作用して発光能を誘導させる発光誘導性アプタマーの塩基配列と、
三重鎖を協働的に形成可能な三重鎖形成性塩基配列群と、
を含み、
前記三重鎖形成性塩基配列群は、前記発光誘導性アプタマーの片末端側に結合した８残基以上の連続するウリジンからなる第１の塩基配列と、他方末端側に結合した８残基以上の連続するアデノシンからなる第２の塩基配列及び８残基以上の連続するウリジンからなる第３の塩基配列と、を有し、
前記第１の塩基配列、前記第２の塩基配列及び前記第３の塩基配列が三重鎖を協働的に形成可能な、ＲＮＡアプタマー。
【０００９】
［２］  前記三重鎖形成性塩基配列群が、前記発光誘導性アプタマーの片末端側に結合した１０残基以上の連続するウリジンからなる第１の塩基配列と、他方末端側に結合した１０残基以上の連続するアデノシンからなる第２の塩基配列及び１０残基以上の連続するウリジンからなる第３の塩基配列と、を有する、前記［１］に記載のＲＮＡアプタマー。
【００１０】
［３］  前記三重鎖形成性塩基配列群が、前記第２の塩基配列と第３の塩基配列との間に、ループ配列を有する、前記［１］又は［２］に記載のＲＮＡアプタマー。
【００１１】
［４］  前記発光誘導性アプタマーの塩基配列が、BabySpinach（配列番号１）、Spinach（配列番号２）、Mango（配列番号３）、Corn（配列番号４）及びBroccoli（配列番号５）からなる群より選択される１種以上を含む、前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマー。
【００１２】
［５］  前記発光誘導性アプタマーの塩基配列が、BabySpinach（配列番号１）を含む、前記［４］に記載のＲＮＡアプタマー。
【００１３】
［６］  前記［１］〜［５］のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマーと、
前記ＲＮＡアプタマーと相互作用する発光プローブと、を含む複合分子。
【００１４】
［７］  前記［１］〜［５］のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマーと前記ＲＮＡアプタマーと相互作用する発光プローブと測定試料とを混合して測定混合物を調製する混合工程と、
前記発光プローブにおける励起波長の光を前記測定混合物に照射し前記発光プローブの発光を観測する発光観測工程と、
前記発光観測工程により観測された発光に基づき前記測定試料のｐＨを判定するｐＨ判定工程と、
を含むｐＨ判定方法。
【００１５】
［８］  対象ＲＮＡの塩基配列の少なくとも一方の末端に、前記［１］〜［５］のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマーの塩基配列が付加された標識化ＲＮＡ。
【００１６】
［９］  対象ＲＮＡの塩基配列の少なくとも一方の末端に、前記［１］〜［５］のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマーの塩基配列が付加された標識化ＲＮＡを製造する標識化ＲＮＡの製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、発光プローブと相互作用したときに、ＲＮＡアプタマーが発光プローブと相互作用が可能な発光誘導性アプタマーの塩基配列のみを有するＲＮＡアプタマーである場合に比べ、発光プローブの発光性を増強可能なＲＮＡアプタマーが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】（Ａ）比較例１におけるＲＮＡアプタマー２のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの図、（Ｂ）実施例１におけるＲＮＡアプタマー１のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの図である。
【図２】実施例１における各ｐＨ環境下で観測された発光の最大発光波長の発光強度をプロットしたグラフである。
【図３】比較例１における各ｐＨ環境下で観測された発光の最大発光波長の発光強度をプロットしたグラフである。
【図４】実施例１における蛍光顕微鏡画像である。
【図５】比較例１における蛍光顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施形態に制限されるものではない。以下の実施形態は例示的なものであって、その構成要素（要素ステップ等も含む）は、特に明示した場合を除き、必須ではない。数値及びその範囲についても同様であり、本発明を制限するものではない。また、本開示に係る技術的思想の範囲内において、当業者による様々な変更及び修正が可能である。
本開示において「〜」を用いて示された数値範囲には、「〜」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示において「工程」との語には、他の工程から独立した工程に加え、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、当該工程も含まれる。
本開示において各成分は該当する物質を複数種含んでいてもよい。各成分に該当する物質が複数種存在する場合、各成分の含有率は、特に断らない限り、当該複数種の物質の合計の含有率を意味する。
また、本開示に記載された具体的かつ詳細な内容の一部又は全てを利用せずとも本発明を実施可能であることは、当業者には明らかである。
【００２０】
≪ＲＮＡアプタマー≫
本開示のＲＮＡアプタマーは、発光プローブと相互作用して発光能を誘導させる発光誘導性アプタマーの塩基配列と、三重鎖を協働的に形成可能な三重鎖形成性塩基配列群と、を含む。本開示のＲＮＡアプタマーにおける前記三重鎖形成性塩基配列群は、前記発光誘導性アプタマーの片末端側に結合した８残基以上の連続するウリジンからなる第１の塩基配列と、他方末端側に結合した８残基以上の連続するアデノシンからなる第２の塩基配列及び８残基以上の連続するウリジンからなる第３の塩基配列と、を有し、前記第１の塩基配列、前記第２の塩基配列及び前記第３の塩基配列が三重鎖を協働的に形成可能である。
【００２１】
本開示のＲＮＡアプタマーは、上記構成を有することにより、発光プローブと相互作用が可能な発光誘導性アプタマーの塩基配列のみを有するＲＮＡアプタマー（以下、「従来のＲＮＡアプタマー」とも称す。）に比べ、発光プローブと相互作用したときに、発光プローブの発光性が増強される。この要因としては必ずしも明らかではないが、以下の様に推察される。
【００２２】
発光プローブが、ＲＮＡアプタマーにおける発光誘導性アプタマーの塩基配列と相互作用すると、ＲＮＡアプタマーと発光プローブとを含む複合分子が形成される。前記複合分子における発光プローブは、発光プローブが単独で存在する場合に比べ、発光プローブの分子振動等による励起エネルギーの損失が抑制され易くなり、前記励起エネルギーが発光として放出され易くなる傾向にある。このＲＮＡアプタマーと発光プローブとの相互作用により発光プローブが発光可能となる現象又は発光が強まる現象を、本開示では「発光能が誘導される」とも称す。
本開示のＲＮＡアプタマーは、その塩基配列に、三重結合を協働的に形成可能な三重結合形成性塩基配列群を含む。この三重結合形成性塩基配列群の存在により、本開示のＲＮＡアプタマーは、複合分子を形成したときに、従来の三重結合形成性塩基配列群を有しないＲＮＡアプタマーに比べ、発光プローブにおける励起エネルギーの損失が、より小さく抑えられる傾向にある。その結果、本開示のＲＮＡアプタマーは、従来のＲＮＡアプタマーに比べ、前記励起エネルギーが発光としてより放出され易く、即ち、発光プローブの発光性が増強されると考えられる。
【００２３】
本開示の発光プローブにおける発光の起源は、蛍光発光、燐光発光及び遅延蛍光のいずれであってもよい。
【００２４】
［発光誘導性アプタマーの塩基配列］
本開示のＲＮＡアプタマーは、発光プローブと相互作用して発光能を誘導させる発光誘導性アプタマーの塩基配列を含む。
【００２５】
発光誘導性アプタマーの塩基配列は、発光プローブと相互作用して発光能を誘導可能であれば、特に制限されず、適宜公知の発光誘導性アプタマーの塩基配列を含んだ塩基配列を設計してよい。
【００２６】
発光誘導性アプタマーの塩基配列としては、例えば、BabySpinach（配列番号１）、Spinach（配列番号２）、Mango（配列番号３）、Corn（配列番号４）及びBroccoli（配列番号５）からなる群より選択される１種以上を含むことが好ましい。
【００２７】
本開示の一実施形態では、発光誘導性アプタマーの塩基配列は、BabySpinach（配列番号１）を含んでいてもよい。
【００２８】
上述した各発光誘導性アプタマーの塩基配列は、下記の通りである。
・配列番号１：BabySpinach ：ＧＧＵＧＡＡＧＧＡＣＧＧＧＵＣＣＡＧＵＡＧＵＵＣＧＣＵＡＣＵＧＵＵＧＡＧＵＡＧＡＧＵＧＵＧＡＧＣＵＣＣ
・配列番号２：Spinach     ：ＡＧＡＣＧＣＡＡＣＵＧＡＡＵＧＡＡＡＵＧＧＵＧＡＡＧＧＡＣＧＧＧＵＣＣＡＧＧＵＧＵＧＧＣＵＧＣＵＵＣＧＧＣＡＧＵＧＣＡＧＣＵＵＧＵＵＧＡＧＵＡＧＡＧＵＧＵＧＡＧＣＵＣＣＧＵＡＡＣＵＡＧＵＣＧＣＧＵＣＡＣ
・配列番号３：Mango       ：ＧＧＣＡＣＧＵＡＣＣＧＡＧＧＧＡＧＵＧＧＵＧＡＧＧＡＵＧＡＧＧＣＧＡＧＵＡＣＧＵＧＣ
・配列番号４：Corn        ：ＧＧＣＧＣＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧＵＣＵＧＡＧＧＡＧＧＵＣＡＣＵＧＣＧＣＣ
・配列番号５：Broccoli    ：ＧＡＧＡＣＧＧＵＣＧＧＧＵＣＣＡＧＡＵＡＵＵＣＧＵＡＵＣＵＧＵＣＧＡＧＵＡＧＡＧＵＧＵＧＧＧＣＵＣＣ
【００２９】
発光誘導性アプタマーの塩基配列は、発光能を誘導する性質が維持される範囲内で、上述した配列番号１〜配列番号５の塩基配列に対して、５個以内の残基（好ましくは３個以内の残基、より好ましくは１個以内の残基）を付加、置換又は欠失させた塩基配列であってもよい。
発光能が維持されるとは、発光分光分析装置（Thermo Fisher Scientific社製、製品番号MIB#5250030）を用いて、所定濃度(例えば、３μｍｏＬ／Ｌ)の発光プローブの存在下で、測定される発光誘導性アプタマーの発光強度が、付加、置換又は欠失される元の塩基配列を有する発光誘導性アプタマーの発光強度と比べて、９０％以上の発光強度を示すことをいう。なお、本測定において、前記付加、置換又は欠失させた塩基配列を有する発光誘導性アプタマーの濃度は、前記付加、置換又は欠失される元の塩基配列を有する発光誘導性アプタマーと同一であればよく、例えば、０．３μｍｏＬ／Ｌであってもよい。
【００３０】
発光誘導性アプタマーの塩基配列は、少なくとも１種の発光プローブの発光能を誘導させる塩基配列であればよく、複数種の発光プローブそれぞれの発光能を誘導させる塩基配列であってもよい。発光誘導性アプタマーの塩基配列が、前記複数種の発光プローブそれぞれの発光能を誘導させる塩基配列を含む場合、前記複数種の発光プローブそれぞれの発光能を誘導させる各塩基配列は、互いに重ならず、それぞれ異なる領域に位置する。
【００３１】
発光プローブは、発光誘導性アプタマーの種類に応じて、発光誘導性アプタマーと相互作用し発光能が誘導されることがわかっている公知の発光プローブを適用できる。発光プローブは、新規に設計された発光プローブであってもよい。
【００３２】
発光プローブは、１種の発光誘導性アプタマーに対し、１種単独であっても、２種以上の併用であってもよい。
発光プローブは、２種以上の発光誘導性アプタマーに対し、１種単独であっても、２種以上の併用であってもよい。例えば、発光誘導性アプタマーの塩基配列としてSpinach、BabySpinach及びBroccoliの３種の塩基配列を含み、且つ、発光プローブとしてＤＦＨＢＩを用いる場合、ＤＦＨＢＩは、前記３種の塩基配列それぞれと相互作用し、発光能を誘導されてもよい。
【００３３】
発光誘導性アプタマーと発光プローブとの組み合わせの例を、表１に示すが、発光誘導性アプタマーと発光プローブとの組み合わせはこれに限定されない。なお、各発光誘導性アプタマーの配列番号は省略する。
【００３４】
【表１】
2020156347.tif 000002
【００３５】
表１中、略称で記載した発光プローブの分子構造は下記の通りである。
【００３６】
【化０１】
2020156347.tif 000003
【００３７】
［三重鎖形成性塩基配列群］
本開示のＲＮＡプローブは、三重鎖を協働的に形成可能な三重鎖形成性塩基配列群を塩基配列中に含む。
三重鎖形成性塩基配列群は、前記発光誘導性アプタマーの片末端側に結合した８残基以上の連続するウリジンからなる第１の塩基配列と、他方末端側に結合した８残基以上の連続するアデノシンからなる第２の塩基配列及び８残基以上の連続するウリジンからなる第３の塩基配列と、を有する。三重鎖形成性塩基配列群は、その他の塩基配列を含んでいてもよい。
【００３８】
以下、本開示において８残基以上の連続するウリジンからなる第１の塩基配列を、単に「第１の塩基配列」とも称す。８残基以上の連続するアデノシンからなる第２の塩基配列を、単に「第２の塩基配列」とも称す。８残基以上の連続するウリジンからなる第３の塩基配列を、単に「第３の塩基配列」とも称す。
【００３９】
第１の塩基配列における連続するウリジンの残基数は、８残基以上であり、三重鎖をより安定的に形成する観点から、９残基以上であることが好ましく、１０残基以上であることがより好ましい。
第１の塩基配列における連続するウリジンの残基数は、製造上の観点から、１００残基以下であることが好ましく、６０残基以下であることがより好ましい。
【００４０】
第２の塩基配列における連続するアデノシンの残基数は、８残基以上であり、三重鎖をより安定的に形成する観点から、９残基以上であることが好ましく、１０残基以上であることがより好ましい。
第２の塩基配列における連続するアデノシンの残基数は、製造上の観点から、１００残基以下であることが好ましく、６０残基以下であることがより好ましい。
【００４１】
第３の塩基配列における連続するウリジンの残基数は、８残基以上であり、三重鎖をより安定的に形成する観点から、９残基以上であることが好ましく、１０残基以上であることがより好ましい。
第３の塩基配列における連続するウリジンの残基数は、製造上の観点から、１００残基以下であることが好ましく、６０残基以下であることがより好ましい。
【００４２】
第１の塩基配列、第２の塩基配列及び第３の塩基配列における連続するウリジン及び連続するアデノシンの残基数は、各々独立に８残基以上であれば、それぞれの残基数は制限されず、互いに同一の残基数であっても、各々独立に異なる残基数であってもよい。
【００４３】
第１の塩基配列、第２の塩基配列及び第３の塩基配列における連続するウリジン及び連続するアデノシンの各残基数は、三重鎖をより安定的に形成する観点から、互いに同一の残基数であることが好ましい。
【００４４】
三重鎖形成性塩基配列群は、前記発光誘導性アプタマーの片末端側に結合した１０残基以上の連続するウリジンからなる第１の塩基配列と、他方末端側に結合した１０残基以上の連続するアデノシンからなる第２の塩基配列及び１０残基以上の連続するウリジンからなる第３の塩基配列と、を有することが好ましい。
【００４５】
三重鎖形成性塩基配列群が、１０残基以上の連続するウリジンからなる第１の塩基配列と、１０残基以上の連続するアデノシンからなる第２の塩基配列と、１０残基以上の連続するウリジンからなる第３の塩基配列と、を有すると、三重鎖がより安定的に形成される傾向にある。その結果、三重鎖を有するＲＮＡアプタマーが発光プローブと複合分子を形成したときに、発光プローブの分子振動等による励起エネルギーの損失が、より小さく抑えられ易く、発光プローブの発光性がより増強される傾向にある。
【００４６】
第２の塩基配列と第３の塩基配列との位置関係は、第２の塩基配列及び第３の塩基配列が第１の塩基配列を有する末端側とは他方の末端側に位置していれば、互いに制限されず、第２の塩基配列が第３の塩基配列よりも末端側に位置していても、第３の塩基配列が第２の塩基配列よりも末端側に位置していてもよい。
【００４７】
三重鎖形成性塩基配列群は、第２の塩基配列と、第３の塩基配列との間に、別の塩基配列、即ち、第２の塩基配列の連続するアデノシン配列と第３の塩基配列の連続するウリジン配列に含まれない塩基配列を含んでいてもよい。この様な別の塩基配列は、ループ配列を形成する。第２の塩基配列と第３の塩基配列との間におけるループ配列としては、例えば、「・・・ＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＵＵＵＵＵＵＵＵ・・・」における「グアノシン（Ｇ）残基の様に、ウリジン及びアデノシンではない塩基からなる配列をいい、８個以内の残基（より好ましくは５個以内の残基）からなる配列であることが好ましい。
【００４８】
［その他の塩基配列］
本開示のＲＮＡアプタマーは、発光誘導性アプタマーの塩基配列と、三重鎖形成性塩基配列群と、を含むものであれば、ＲＮＡアプタマーの塩基配列は特に制限されず、発光誘導性アプタマー及び三重鎖形成性塩基配列群以外のその他の塩基配列（以下、単に「その他の塩基配列」とも称す）を含んでいてもよい。
【００４９】
ＲＮＡアプタマーは、三重鎖形成性を阻害しない範囲で、その他の塩基配列として、５個以内の残基（好ましくは３個以内の残基）を、５’末端又は３’末端に、含んでいてもよい。例えば、ＲＮＡアプタマーは、製造上の観点から、３残基以内の連続するグアノシンからなる塩基配列を、５’末端に、有していてもよい。
【００５０】
ＲＮＡアプタマーは、発光誘導性アプタマーの塩基配列と、第１の塩基配列、第２の塩基配列又は第３の塩基配列それぞれとの間に、三重鎖形成性を阻害しない範囲で、５個以内の残基（好ましくは３個以内の残基）からなるその他の塩基配列を含んでいてもよい。
【００５１】
ＲＮＡアプタマーが複数の発光誘導性アプタマーの塩基配列を有する場合、ＲＮＡアプタマーは、各発光誘導性アプタマーの三次元構造をそれぞれ維持する観点から、その他の塩基配列を介して連結されていてもよく、前記その他の塩基配列はループ配列を形成することが好ましい。この場合、前記その他の塩基配列は、８個以内の残基であることが好ましく、３個以内の残基であることがより好ましい。
【００５２】
≪複合分子≫
本開示によれば、先述した本開示のＲＮＡアプタマーと、前記ＲＮＡアプタマーと相互作用する発光プローブと、を含む複合分子が提供される。本開示の複合分子は、その他の分子を含んで構成されていてもよい。
【００５３】
ＲＮＡアプタマーと発光プローブとを含む複合分子は、例えば、後述するように、水溶液系におけるｐＨの判定、細胞中の対象ＲＮＡの標識化、及び、細胞中に含まれる対象ＲＮＡの局所的なｐＨ変化を観測するための材料として用いることができる。
【００５４】
≪ｐＨ判定方法≫
本開示のｐＨ判定方法は、本開示のＲＮＡアプタマーを用いてｐＨを判定する方法であれば、特に制限されない。本開示のｐＨ判定方法は、例えば、本開示のＲＮＡアプタマーと前記ＲＮＡアプタマーと相互作用する発光プローブと測定試料とを混合して測定混合物を調製する混合工程と、前記発光プローブにおける励起波長の光を前記測定混合物に照射し前記発光プローブの発光を観測する発光観測工程と、前記発光観測工程により観測された発光に基づき前記測定試料のｐＨを判定するｐＨ判定工程と、を含むことが好ましい。本開示のｐＨ判定方法は、その他の工程を含んでいてもよい。
【００５５】
本開示のｐＨ判定方法によれば、先述のＲＮＡアプタマーと発光プローブとの相互作用による発光プローブの発光挙動の変化から、測定試料のｐＨ判定ができる。この要因は必ずしも明らかではないが、以下の様に推察される。
【００５６】
本開示のＲＮＡアプタマーは、弱酸性〜中性の環境下（例えば、ｐＨ５〜７環境下）では、第２の塩基配列におけるアデノシンのＮＨ２基の水素原子が、第１の塩基配列及び第３の塩基配列におけるウリジンそれぞれと、ワトソン−クリック型及びフーグスティーン型の水素結合を形成する。そのため、ＲＮＡアプタマーは、弱酸性〜中性環境下では、三重鎖を形成する。三重鎖を有するＲＮＡアプタマーが、弱酸性〜中性の環境下で発光プローブと相互作用し複合分子を形成すると、先述の通り、発光プローブの発光能が誘導され、発光を示す。
一方、ＲＮＡアプタマーを、塩基性環境下（例えば、ｐＨ１０環境下）に置くと、第２の塩基配列におけるアデノシンのＮＨ２基の水素原子が、脱プロトン化される傾向にある。そのため、ＲＮＡアプタマーは、塩基性環境下では、フーグスティーン型の水素結合を形成し難い。つまり、三重鎖の形成が維持できなくなる傾向にある。その結果、三重鎖を有しないＲＮＡアプタマーが、塩基性環境下で発光プローブと相互作用し複合分子を形成しても、発光プローブの発光能は誘導されない傾向にある。つまり、弱酸性〜中性の環境下における発光プローブの発光性に比べて、塩基性環境下における発光プローブの発光性は低下すると考えられる。
【００５７】
（混合工程）
混合工程では、本開示のＲＮＡアプタマーと前記ＲＮＡアプタマーと相互作用する発光プローブと測定試料とを混合して測定混合物を調製する。
【００５８】
ＲＮＡアプタマーと発光プローブと試料とを混合する手法は、特に制限されない。前記混合する手法の一態様として、例えば、ＲＮＡアプタマー、発光プローブ、試料それぞれを、緩衝溶液等に予め溶解させ個別の溶液を調製してから、前記個別の溶液同士を混合し、測定混合物を調製してもよい。
【００５９】
ｐＨを判定する試料が水溶液系である場合、例えば、複合分子を形成していない余剰な発光プローブに由来する発光を低く抑えｐＨ判定をより容易にする観点から、ＲＮＡアプタマーを含む溶液と発光プローブを含む溶液とを予め混合し、複合分子を形成させてから、前記複合分子を測定試料と混合することが好ましい。
【００６０】
ｐＨを判定する試料が細胞である場合、例えば、試料に効率的にＲＮＡアプタマーを導入する観点から、発現ベクターにより細胞内にＲＮＡアプタマーを発現させてから、細胞に対し、発光プローブを含む液体を添加することで、細胞内で複合分子を形成させ、測定混合物を調製してもよい。この場合、細胞内においても、複合分子を形成していない余剰な発光プローブに由来する発光を低く抑えｐＨ判定をより容易にする観点から、前記測定混合物を、緩衝溶液等の溶液で洗浄することが好ましい。
【００６１】
ＲＮＡアプタマーと発光プローブと試料とを混合する際の温度及び混合時間は、特に制限されず、ＲＮＡアプタマー及び複合分子の三次元構造が崩れない範囲、並びに、細胞などの試料が壊れない範囲で、適宜設計してよい。
【００６２】
測定試料は、液体であってもよく、固体であってもよい。
測定試料が液体である場合、測定試料の未希釈液をそのまま使用してもよいし、測定試料を媒体に、懸濁、分散又は溶解した希釈液を使用してもよい。
測定試料が細胞等の固体である場合、検体を溶液媒体に懸濁、分散又は溶解した希釈液を液体検体として使用することが好ましい。溶液媒体としては、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等が挙げられる。
【００６３】
測定混合物に含まれるＲＮＡアプタマーの濃度は、特に限定されず、ｐＨを判定したい溶液の量及び種類に応じて適宜設定してよい。ＲＮＡアプタマーの濃度は、例えば、発光強度を定量的に観測する観点から、０．０１μｍｏＬ／Ｌ以上１０μｍｏＬ／Ｌ以下であることが好ましく、０．０５μｍｏＬ／Ｌ以上５μｍｏＬ／Ｌ以下であることがより好ましく、０．１μｍｏＬ／Ｌ以上３μｍｏＬ／Ｌ以下であることがさらに好ましい。
【００６４】
測定混合物に含まれる発光プローブの濃度は、特に限定されず、ｐＨを判定したい溶液の量及び種類に応じて適宜設定してよい。発光プローブの濃度は、例えば、発光強度を定量的に観測する観点から、０．１μｍｏＬ／Ｌ以上１００μｍｏＬ／Ｌ以下であることが好ましく、０．５μｍｏＬ／Ｌ以上１０μｍｏＬ／Ｌ以下であることがより好ましく、１μｍｏＬ／Ｌ以上５μｍｏＬ／Ｌ以下であることがさらに好ましい。
【００６５】
測定混合物に含まれるＲＮＡアプタマーと発光プローブとの濃度比は、特に限定されず、適宜設定してよい。ＲＮＡアプタマーと発光プローブとの濃度比（ＲＮＡアプタマー／発光プローブ）は、例えば、ＲＮＡアプタマーと発光プローブとを含む複合分子を好適に形成させる観点から、１／１００以上１／１以下であることが好ましく、１／７０以上１／２以下であることがより好ましく、１／５０以上１／５以下であることがさらに好ましい。
【００６６】
１種のＲＮＡアプタマーに対して複数種の発光プローブを用いて複合分子を形成する場合、上記発光プローブの濃度は、複数種の発光プローブにおける濃度の総和を意味する。
【００６７】
複数種のＲＮＡアプタマーを用いる場合、上記ＲＮＡアプタマーの濃度は、各ＲＮＡアプタマーそれぞれにおける濃度を意味する。
【００６８】
（発光観測工程）
発光観測工程では、前記発光プローブにおける励起波長の光を前記測定混合物に照射し前記発光プローブの発光を観測する。
【００６９】
発光プローブの発光の観測方法は、特に制限されず、目視による観測、発光分光分析装置による観測、発光顕微鏡による観測のいずれであってもよい。
発光分光分析装置を用いて発光を観測する場合、複合分子における発光プローブの発光は、例えば、Thermo Fisher Scientific社製のＭＩＢ＃５２５００３０を用いて、室温（２５℃）、発光プローブの濃度３μｍｍｏＬ／Ｌ、発光誘導性アプタマーの濃度０．３μｍｍｏＬ／Ｌの条件で測定できる。
発光顕微鏡を用いて発光を観測する場合、発光プローブの発光は、例えば、Thermo Fisher Scientific社製のEVOS FL（登録商標）を用いて、室温（２５℃）、発光プローブの濃度３μｍｍｏＬ／Ｌ、発光誘導性アプタマーの濃度０．３μｍｍｏＬ／Ｌの条件で測定できる。
【００７０】
（ｐＨ判定工程）
ｐＨ判定工程では、前記発光観測工程により観測された発光に基づき前記測定試料のｐＨを判定する。
【００７１】
測定試料のｐＨ判定は、例えば、種々のｐＨ値が既知である溶液を測定試料として用いて前記混合工程及び発光観測工程を行い、得られた各発光強度とｐＨ値との相関表、グラフ等の情報を得て、前記情報をもとに、ｐＨ値が未知の測定試料についてｐＨを判定してもよい。
例えば、ｐＨ値が未知である測定試料を用いた場合、発光観測工程で観測された複合分子における発光プローブの発光強度が、ｐＨ７環境下の発光強度よりも低く、ｐＨ９環境下の発光強度よりも高い場合、ｐＨ値が未知の測定試料は、ｐＨが７超え９未満であると判定してよい（図２参照）。
【００７２】
≪標識化ＲＮＡ≫
本開示の標識化ＲＮＡは、本開示のＲＮＡアプタマーにより、対象となるＲＮＡ（以下、「対象ＲＮＡ」とも称す）が標識化されたものであれば、特に制限されない。対象ＲＮＡは、特に制限されず、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の適宜公知のＲＮＡを適用できる。
【００７３】
標識化ＲＮＡは、例えば、製造上の観点及びＲＮＡアプタマーにおける三重鎖を効率的に形成させる観点から、対象ＲＮＡの塩基配列の少なくとも一方の末端に、先述した本開示のＲＮＡアプタマーの塩基配列が付加されたＲＮＡであることが好ましく、３’末端に前記ＲＮＡアプタマーの塩基配列が付加された標識化ＲＮＡであることがより好ましい。
【００７４】
標識化ＲＮＡは、例えば、ＲＮＡの細胞内におけるイメージング、前記ＲＮＡと相互作用した分子の同定などに用いることができる。
【００７５】
≪標識化ＲＮＡの製造方法≫
本開示の標識化ＲＮＡの製造方法は、対象ＲＮＡを、本開示のＲＮＡアプタマーを用いて標識化ＲＮＡを製造する手法であれば、特に制限されず、適宜公知の製造方法を適用してよい。標識化ＲＮＡの製造方法としては、例えば、発現ベクターを用いた形質転換により、細胞内にＲＮＡアプタマーと対象ＲＮＡとが連結された標識化ＲＮＡを発現させる製造方法；ＲＮＡアプタマーと対象ＲＮＡの両方の配列を含むＲＮＡを化学合成あるいは転写酵素を用いて合成する製造方法；細胞内にＲＮＡアプタマーと対象ＲＮＡとを導入した後に酵素等により両者を結合する製造方法などが挙げられる。
【００７６】
標識化ＲＮＡの製造方法は、例えば、製造上の観点及びＲＮＡアプタマーにおける三重鎖を効率的に形成させる観点から、対象ＲＮＡの塩基配列の少なくとも一方の末端に、先述した本開示のＲＮＡアプタマーの塩基配列が付加された標識化ＲＮＡを製造する製造方法であることが好ましい。
【実施例】
【００７７】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明は下記実施例により限定されるものではない。なお、特に断りがない限り「部」は「質量部」を意味する。
【００７８】
−ｐＨ緩衝溶液の調製−
下記に示すｐＨ４〜ｐＨ１０のｐＨ緩衝溶液をそれぞれ調製した。
（ｐＨ４緩衝溶液）
クエン酸三ナトリウム１００ｍＭ、塩化マグネシウム５ｍＭ、塩化カルシウム１２５ｍＭを含む水溶液を、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ４に調整し、これをｐＨ４緩衝溶液とした。
【００７９】
（ｐＨ５緩衝溶液）
水酸化ナトリウムを用いて前記水溶液をｐＨ５に調整した以外は、ｐＨ４緩衝溶液と同様の操作により、ｐＨ５緩衝溶液を調製した。
【００８０】
（ｐＨ６緩衝溶液）
水酸化ナトリウムを用いて前記水溶液をｐＨ６に調整した以外は、ｐＨ４緩衝溶液と同様の操作により、ｐＨ６緩衝溶液を調製した。
【００８１】
（ｐＨ７緩衝溶液）
ＨＥＰＥＳ４０ｍＭ、塩化カリウム１２５ｍＭ及び塩化マグネシウム５ｍＭを含む水溶液を、水酸化ナトリウム及び１Ｍ（ｍｍｏＬ／Ｌ）塩酸を用いてｐＨ７に調整し、これをｐＨ７緩衝溶液とした。
【００８２】
（ｐＨ８緩衝溶液）
水酸化ナトリウム及び１Ｍ（ｍｍｏＬ／Ｌ）塩酸を用いて前記水溶液をｐＨ８に調整した以外は、ｐＨ７緩衝溶液と同様の操作により、ｐＨ８緩衝溶液を調製した。
【００８３】
（ｐＨ９緩衝溶液）
２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）１００ｍＭ、塩化ナトリウム３０ｍＭ、塩化カリウム１２０ｍＭ、りん酸二水素ナトリウム１ｍＭ、塩化カルシウム１ｍＭ及びニゲリシンナトリウム塩１０μＭを含む水溶液を、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ９に調整し、これをｐＨ９緩衝溶液とした。
【００８４】
（ｐＨ１０緩衝溶液）
水酸化ナトリウムを用いて前記水溶液をｐＨ１０に調整した以外は、ｐＨ９緩衝溶液と同様の操作により、ｐＨ１０緩衝溶液を調製した。
【００８５】
（ＰＢＳ−ｐＨ７緩衝溶液）
りん酸二水素カリウム２ｍＭ、りん酸水素二ナトリウム８ｍＭ、塩化ナトリウム１３０ｍＭ、塩化カルシウム２．７ｍＭを含む水溶液を、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７に調整し、これをＰＢＳ−ｐＨ７緩衝溶液とした。
【００８６】
−ＲＮＡアプタマーの合成例−
（１）ＲＮＡアプタマー１：発光誘導性アプタマーであるBabySpinachの塩基配列と、三重鎖を協働的に形成可能な三重鎖形成性塩基配列群と、を含むＲＮＡアプタマー
HiScribeTM High Yield RNA Synthesis Kit（New England Biolabs Japan社製）を用いて、下記の塩基配列を有するＲＮＡアプタマー１が１μｍｏＬ／Ｌで含まれる水溶液を合成した。合成したＲＮＡアプタマー１のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果から、目的の長さを有するＲＮＡアプタマー１が得られていることを確認した（図１Ｂ参照）。その後、得られたＲＮＡアプタマー１を含む水溶液を、インキュベーターを用いて９０℃１０分間でアニーリングし、その後、室温（２５℃）まで放冷することで、ＲＮＡアプタマー１をフォールディングさせ、これをＲＮＡアプタマー１溶液とした。
【００８７】
・ＲＮＡアプタマー１の塩基配列：ＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＧＧＵＧＡＡＧＧＡＣＧＧＧＵＣＣＡＧＵＡＧＵＵＣＧＣＵＡＣＵＧＵＵＧＡＧＵＡＧＡＧＵＧＵＧＡＧＣＵＣＣＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号６）。
上記配列番号６における塩基配列の内訳は以下の通りである。なお、５’末端の塩基配列「ＧＧＧ」は、合成上の都合により設けられる塩基配列である。
発光誘導性アプタマーの塩基配列：「ＧＧＵＧＡＡＧＧＡＣＧＧＧＵＣＣＡＧＵＡＧＵＵＣＧＣＵＡＣＵＧＵＵＧＡＧＵＡＧＡＧＵＧＵＧＡＧＣＵＣＣ（配列番号１）」
８残基以上の連続するウリジンからなる第１の塩基配列：「ＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ」
８残基以上の連続するアデノシンからなる第２の塩基配列：「ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ」
８残基以上の連続するウリジンからなる第３の塩基配列：「ＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ」
【００８８】
（２）ＲＮＡアプタマー２：発光誘導性アプタマーであるBabySpinachの塩基配列を含み、三重鎖形成性塩基配列群を含まないＲＮＡアプタマー。
ＲＮＡアプタマー１と同様の手法を用いて、下記の塩基配列を有するＲＮＡアプタマー２が１μｍｏＬ／Ｌで含まれるＲＮＡアプタマー２溶液を合成した。合成したＲＮＡアプタマー２のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果から、目的の長さを有するＲＮＡアプタマー２が得られていることを確認した（図１Ａ参照）。
【００８９】
・ＲＮＡアプタマー２の塩基配列：ＧＧＧＧＧＵＧＡＡＧＧＡＣＧＧＧＵＣＣＡＧＵＡＧＵＵＣＧＣＵＡＣＵＧＵＵＧＡＧＵＡＧＡＧＵＧＵＧＡＧＣＵＣＣ（配列番号７）。
上記配列番号７における塩基配列の内訳は以下の通りである。なお、５’末端の塩基配列「ＧＧＧ」は、合成上の都合により設けられる塩基配列である。
発光誘導性アプタマーの塩基配列：「ＧＧＵＧＡＡＧＧＡＣＧＧＧＵＣＣＡＧＵＡＧＵＵＣＧＣＵＡＣＵＧＵＵＧＡＧＵＡＧＡＧＵＧＵＧＡＧＣＵＣＣ（配列番号１）」
８残基以上の連続するウリジンからなる第１の塩基配列：なし
８残基以上の連続するアデノシンからなる第２の塩基配列：なし
８残基以上の連続するウリジンからなる第３の塩基配列：なし
【００９０】
［実施例１］
（１）溶液系における複合分子の中の発光プローブの発光観測
ＲＮＡアプタマー１溶液と、発光プローブである３’５’−ジフルオロ−４−ヒドロキシベンジリデンイミダゾリノン（ＤＦＨＢＩ）とを、ＲＮＡアプタマー１の終濃度が終濃度３００ｎｍｏL／Ｌ、発光プローブの終濃度が３μmｏL／Ｌとなるように、０．２ｍＬのｐＨ７緩衝溶液に溶解させ、複合分子を含む溶液を調製した。この複合分子を含む溶液について、ｐＨ７環境下における室温（２５℃）での発光スペクトルを、発光分光分析装置（Thermo Fisher Scientific社製、製品番号MIB#5250030）を用いて測定した。なお、励起波長は発光プローブであるＤＦＨＢＩの励起波長４８８ｎｍ±５ｎｍとし、５０９ｎｍ±５ｎｍの発光を観測した。
次に、使用する緩衝溶液を、ｐＨ８緩衝溶液〜ｐＨ１０緩衝溶液とする仕様とした以外は、前記ｐＨ７環境下における発光観測と同様の操作により、ｐＨ８〜１０環境下における発光をそれぞれ観測した。図２に、各ｐＨ環境下において観測された発光の最大発光波長の発光強度をプロットしたグラフを示す。
【００９１】
（２）細胞内における複合分子中の発光プローブの発光観測
（２−１）ｐＨ７環境下における発光観測
制限酵素ＮｈeＩの認識配列（ＧＣＴＡＧＣ）と、下記に示すＲＮＡアプタマー３の塩基配列と、制限酵素ＸｂａＩの認識配列（ＴＣＴＡＧＡ）と、を含み、両末端にＡＴＣからなる３残基を有するＤＮＡ断片（配列番号８：ＡＴＣＧＣＴＡＧＣＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＧＧＧＴＣＣＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＴＡＣＴＧＴＴＧＡＧＴＡＧＡＧＴＧＴＧＡＧＣＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＡＧＡＡＴＣ）を設計し、合成した。前記ＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｈeＩ（Thermo Fisher Scientific社製）及び制限酵素ＸｂａＩ（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて切断した。そして、前記切断されたＤＮＡ断片を、同様の制限酵素を用いて切断したｐｃＤＮＡＴＭ３．１ベクター（Thermo Fisher Scientific社製）に挿入することで、ヒトサトメガロウイルス由来プロモーターの下流（３’末端側）にＲＮＡアプタマー３の塩基配列を含む発現ベクター（以下、「ｐｃＤＮＡ−ＲＮＡアプタマー３」と称す）を構築した。
【００９２】
・ＲＮＡアプタマー３の塩基配列：ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＧＧＵＧＡＡＧＧＡＣＧＧＧＵＣＣＡＧＵＡＧＵＵＣＧＣＵＡＣＵＧＵＵＧＡＧＵＡＧＡＧＵＧＵＧＡＧＣＵＣＣＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１０）。
ＲＮＡアプタマー３の塩基配列は、ＲＮＡアプタマー１における５’末端の塩基配列「ＧＧＧ」を除いた塩基配列である。
【００９３】
ヒト由来ＨｅＬａ細胞（凍結保存液）を３７℃の温水を用いて温浴することで溶解し、ダルベッコ改変イーグル培地（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、３７℃、二酸化炭素濃度５％の条件下で２４時間培養した。培養後の前記ヒト由来ＨｅＬａ細胞に対し、前記ｐｃＤＮＡ−ＲＮＡアプタマー３とLipofectamine （Thermo Fisher Scientific社製、製品番号11668027）とを混合して形質転換を行い、前記ヒト由来ＨｅＬａ細胞中に、ＲＮＡアプタマー３を発現させた。
その後、ＰＢＳ−ｐＨ７緩衝溶液を用いて、ＲＮＡアプタマー３により形質転換されたＨｅＬａ細胞を洗浄した。そして、前記ヒト由来ＨｅＬａ細胞を含むＰＢＳ−ｐＨ７緩衝溶液中に、終濃度が１．２μＭとなるまでＤＦＨＢＩを添加し、ＲＮＡアプタマー３と発光プローブとを含む複合分子を、細胞内で形成させた。その後、ＲＮＡアプタマー３と複合分子を形成していない余分なＤＦＨＢＩを取り除くため、前記ＨｅＬａ細胞を、ｐＨ７緩衝溶液を用いて洗浄し、室温で３０分間静置した。
得られた前記ヒト由来ＨｅＬａ細胞を、蛍光顕微鏡（Thermo Fisher Scientific社製のEVOS FL）を用いて観察し、前記ヒト由来ＨｅＬａ細胞に含まれる複合分子における発光プローブの発光を観測した。なお、蛍光顕微鏡による発光観測では、励起波長を発光プローブの励起波長４８８ｎｍとし、蛍光顕微鏡により発光を観測した。図４Ａに光非照射時の蛍光顕微鏡画像を、図４Ｂに光励起時の蛍光顕微鏡画像を示す。
【００９４】
（２−２）ｐＨ１０環境下における発光観測
ｐＨ７緩衝溶液を、ｐＨ１０緩衝溶液とする仕様とした以外は、上記（１）ｐＨ７環境下における発光観測と同様の操作により発光を観測した。図４Ｃに光非照射時の蛍光顕微鏡画像を、図４Ｄに光励起時の蛍光顕微鏡画像を示す。
【００９５】
［比較例１］
（１）溶液系における複合分子の中の発光プローブの発光観測
前記ＲＮＡアプタマー１溶液の代わりに、ＲＮＡアプタマー２溶液を用いる仕様とした以外は、実施例１に示すｐＨ７環境下〜１０環境下における発光観測と同様の手法により、発光をそれぞれ観測した。図３に、各ｐＨ環境下において観測された発光の最大発光波長の発光強度をプロットしたグラフを示す。
【００９６】
（２）細胞内における複合分子中の発光プローブの発光観測
（２−１）ｐＨ７環境下における発光観測
制限酵素ＮｈeＩの認識配列（ＧＣＴＡＧＣ）と、下記に示すＲＮＡアプタマー４の塩基配列と、制限酵素ＸｂａＩの認識配列（ＴＣＴＡＧＡ）と、を含み、両末端にＡＴＣからなる３残基を有するＤＮＡ断片（配列番号９：ＡＴＣＧＣＴＡＧＣＧＧＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＧＧＧＴＣＣＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＴＡＣＴＧＴＴＧＡＧＴＡＧＡＧＴＧＴＧＡＧＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＡＴＣ）を設計し、合成した。前記ＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｈeＩ（Thermo Fisher Scientific社製）及び制限酵素ＸｂａＩ（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて切断した。そして、前記切断されたＤＮＡ断片を、同様の制限酵素を用いて切断したｐｃＤＮＡＴＭ３．１ベクター（Thermo Fisher Scientific社製）に挿入することで、ヒトサトメガロウイルス由来プロモーターの下流（３’末端側）にＲＮＡアプタマー４の配列を含む発現ベクター（以下、「ｐｃＤＮＡ−ＲＮＡアプタマー４」と称す）を構築した。
【００９７】
・ＲＮＡアプタマー４の塩基配列：ＧＧＵＧＡＡＧＧＡＣＧＧＧＵＣＣＡＧＵＡＧＵＵＣＧＣＵＡＣＵＧＵＵＧＡＧＵＡＧＡＧＵＧＵＧＡＧＣＵＣＣ（配列番号１１）。
ＲＮＡアプタマー４の塩基配列は、ＲＮＡアプタマー２における５’末端の塩基配列「ＧＧＧ」を除いた塩基配列である。
【００９８】
そして、先述のｐｃＤＮＡ−ＲＮＡアプタマー３の代わりに、ｐｃＤＮＡ−ＲＮＡアプタマー４を用いる仕様とした以外は、実施例１に示すｐＨ７環境下における発光観測と同様の手法により、前記ヒト由来ＨｅＬａ細胞中に発現したＲＮＡアプタマー４と発光プローブとの複合分子における発光を観測した。図５Ａに光非照射時の蛍光顕微鏡画像を、図５Ｂに光励起時の蛍光顕微鏡画像を示す。
【００９９】
（２−２）ｐＨ１０環境下における発光観測
先述のｐｃＤＮＡ−ＲＮＡアプタマー３の代わりに、ｐｃＤＮＡ−ＲＮＡアプタマー４を用いる仕様とした以外は、実施例１に示すｐＨ１０環境下における発光観測と同様の手法により、前記ヒト由来ＨｅＬａ細胞中に発現したＲＮＡアプタマー４と発光プローブとの複合分子における発光を観測した。図５Ｃに光非照射時の蛍光顕微鏡画像を、図５Ｄに光励起時の蛍光顕微鏡画像を示す。
【０１００】
図２及び図３に示すように、溶液系では、いずれのｐＨ環境下においても、実施例１のＲＮＡアプタマーは、比較例１のＲＮＡアプタマーよりも、発光プローブの発光性をより強く増強することがわかった。
【０１０１】
図２に示すように、溶液系の評価では、ｐＨが塩基性環境下になるにともない、複合分子における発光プローブに由来する発光強度（以下、「発光プローブの発光強度」とも称す。）が低下する傾向にあった。さらに、図４Ｂ及び図４Ｄに示すように、細胞内の評価でも、溶液系の評価結果と同様に、ｐＨ７からｐＨ１０へと塩基性環境下になるにともない、発光プローブの発光強度は低下する傾向にあった。すなわち、実施例１のＲＮＡアプタマーは、ｐＨが塩基性環境下になるにともない、溶液系及び細胞内の両方において発光プローブの発光能を誘導しない傾向にあった。この要因としては、ｐＨが塩基性環境下になるに伴い、（１）ＲＮＡアプタマーにおける三重鎖を形成するアデノシンのプロトンが脱プロトン化され三重鎖構造が維持できなくなったこと、（２）発光誘導性アプタマーの三次元構造が変化したこと、が考えられる。
これらの結果から、本開示のＲＮＡアプタマーは、ＲＮＡアプタマーと相互作用する発光プローブの発光強度によって、測定試料中のｐＨを判定できることがわかった。
一方、図５Ｂ及び図５Ｄに示すように、比較例１のＲＮＡアプタマーは、細胞内における発光プローブに由来する発光強度が低く、ｐＨの変動にともなう発光強度の変化を検出することがより困難であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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