(57)【要約】【課題】肝臓組織再生用組成物、特には、肝疾患の治療ための肝臓組織再生用組成物を提供する。【解決手段】肝臓組織再生用組成物に、有効成分としてヒト歯髄幹細胞を含有させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト歯髄幹細胞を有効成分として含む、哺乳動物の肝臓組織再生用組成物。
【請求項２】
前記ヒト歯髄幹細胞が肝細胞に分化している、請求項１に記載の肝臓組織再生用組成物。
【請求項３】
前記ヒト歯髄幹細胞がヒト乳歯歯髄幹細胞である、請求項１または２に記載の肝臓組織再生用組成物。
【請求項４】
前記ヒト歯髄幹細胞が、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６を発現し、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ１３３を発現しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の肝臓組織再生用組成物。
【請求項５】
ヒトの肝疾患を治療するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の肝臓組織再生用組成物。
【請求項６】
非ヒト哺乳動物の肝疾患を治療するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の肝臓組織再生用組成物。
【請求項７】
肝疾患の治療の対象となる前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物の体重１５ｋｇ当たり５×１０６〜４×１０１０個のヒト歯髄幹細胞が、前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物に投与される、請求項５または６に記載の肝臓組織再生用組成物。
【請求項８】
前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物の脾洞に投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の肝臓組織再生用組成物。
【請求項９】
前記肝疾患が、肝臓がん、肝不全、肝硬変、肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患および転移性がん、ならびに、がんの化学療法に起因する副作用に対し補助療法を必要とする病態からなる群から選択される、請求項５〜８のいずれか一項に記載の肝臓組織再生用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓組織再生用組成物、特には、肝疾患の治療のための肝臓組織再生用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、各種組織の修復や再生、疾患の治療を目的として細胞移植が行われてきた。細胞移植は、組織を構成する細胞自体または組織の構築を補助する細胞を成体に投与するものであることから直接的な治療効果が期待される。例えば、肝臓組織の再生や肝疾患の治療の分野において、これまでの前臨床研究および臨床研究では、例えばＣＤ３４陽性骨髄幹細胞を肝臓等に移植することがなされてきた（例えば、非特許文献１）。しかしながら、肝疾患の治療という観点からは、このようなＣＤ３４陽性骨髄幹細胞の移植では、肝疾患の若干の改善が見られるにとどまり、治癒には程遠く、余命または死体肝移植・生体肝移植を待つ期間を長くする程度の効果があるに過ぎなかった。
【０００３】
一方で、歯髄幹細胞は、乳歯や智歯といった、従来は廃棄されていた脱落歯や抜去歯から容易に採取可能であることから、組織の再生や疾患の治療に利用できる幹細胞として期待されている。しかしながら、これまで、歯髄幹細胞から肝臓細胞を分化・成熟させ、肝臓組織を哺乳動物体内で大量に作製（再生）する方法は未だ確立されていない。また、歯髄幹細胞を用いて肝疾患を治療する方法についても確立していないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Nakamura et al., Journal of Gastroenterology and Hepatology, Vol. 29, 2014, pages 1830-1838
【発明の概要】
【０００５】
本発明者は、今般、鋭意研究を行った結果、特定の歯髄幹細胞を用い、肝臓組織を効果的に再生し得ることを見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【０００６】
したがって、本発明は、ヒト歯髄幹細胞を有効成分として含む、哺乳動物の肝臓組織再生用組成物を提供することを目的とする。
【０００７】
すなわち、本発明としては、具体的には以下のものが例示される。
［１］ヒト歯髄幹細胞を有効成分として含む、哺乳動物の肝臓組織再生用組成物。
［２］前記ヒト歯髄幹細胞が肝細胞に分化している、［１］に記載の肝臓組織再生用組成物。
［３］前記ヒト歯髄幹細胞がヒト乳歯歯髄幹細胞である、［１］または［２］に記載の肝臓組織再生用組成物。
［４］前記ヒト歯髄幹細胞が、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６を発現し、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ１３３を発現しない、［１］〜［３］のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
［５］ヒトの肝疾患を治療するための、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
［６］非ヒト哺乳動物の肝疾患を治療するための、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
［７］肝疾患の治療の対象となる前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物の体重１５ｋｇ当たり５×１０６〜４×１０１０個のヒト歯髄幹細胞が、前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物に投与される、［５］または［６］に記載の肝臓組織再生用組成物。
［８］前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物の脾洞に投与される、［１］〜［７］のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
［９］前記肝疾患が、肝臓がん、肝不全、肝硬変、肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患および転移性がん、ならびに、がんの化学療法に起因する副作用に対し補助療法を必要とする病態からなる群から選択される、［５］〜［８］のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
【０００８】
本発明によれば、容易に採取可能なヒト歯髄幹細胞を用いて、哺乳動物の肝臓組織再生を行うことが可能となる。また、本発明によれば、非アルコール性肝疾患（Non-Alcoholic Fatty Liver Disease（ＮＡＦＬＤ））をはじめとする肝疾患の治療を効果的に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】肝疾患（非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ））モデル動物（マイクロミニブタ）の肝臓組織の生検写真。
【図２】本発明の組成物の適用前、適用開始時および適用開始後４週間の血中アルブミン濃度を表すグラフ。
【図３】本発明の組成物の適用前、適用開始時および適用開始後４週間の血中総コレステロール濃度を表すグラフ。
【図４】本発明の組成物の適用前、適用開始時および適用開始後４週間の血中ＩＶ型コラーゲン濃度を表すグラフ。
【図５】本発明の組成物の適用前、適用開始時および適用開始後４週間の血中ヒアルロン酸濃度を表すグラフ。
【図６】本発明の組成物の適用前、適用開始時および適用開始後４週間の血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度を表すグラフ。
【図７】脾臓に本発明の組成物を適用後４週間経過時の肝疾患モデル動物（マイクロミニブタ）の脾臓組織の生検写真。
【発明の具体的説明】
【００１０】
本発明の肝臓組織再生用組成物は、ヒト歯髄幹細胞を有効成分として含んでなる。本発明の組成物に含まれるヒト歯髄幹細胞は、ヒトの乳歯、永久歯または智歯（親知らず）のいずれに由来するものであってもよいが、脱落乳歯または智歯に由来する歯髄幹細胞であることが好ましい。
【００１１】
本発明において用いられる歯髄幹細胞は、本発明を実施する前に予め調製したものを使用してもよく、また、一般に市販されているものを使用してもよい。本発明の組成物における歯髄幹細胞を調製する場合、歯髄幹細胞を採取する個体は、当該歯髄幹細胞を含む本発明の組成物の適用対象となる個体と同一の個体または異なる個体のいずれであってもよい。歯髄幹細胞を採取する個体と、当該歯髄幹細胞を含む本発明の組成物の適用対象となる個体とが異なる場合、両個体のヒト白血球抗原（HLA：Human Leucocyte Antigen）型が一致していることが必須であり、両個体がHLA型の一致する近親個体であることがより好ましい。これらのうち、組成物適用時の拒絶反応の発生を抑制し生着効率および再生効率を高めるという観点から、本発明の組成物においては、本発明の組成物の適用対象となる個体と同一の個体から採取された歯髄幹細胞を用いることが最も好ましく、次いでHLA型が一致する近親者の歯髄幹細胞を用いることが好ましい。一方、一般に市販されているヒト歯髄幹細胞としては、例えば、ヒト歯髄幹細胞（ＣＬＩ社製、製品番号：３００７０２−ＳＦ）やｈＤＰＳＣ−歯髄幹細胞（ロンザジャパン株式会社製、製品番号：ＰＴ−５０２５）等が挙げられる。
【００１２】
本発明において、予め調製した歯髄幹細胞を用いる場合の、歯髄幹細胞の採取および処理方法の一例を以下に示す。この採取および処理方法では、（１）歯髄の採取、（２）酵素処理、（３）細胞培養、（４）細胞の回収を順に行う。
【００１３】
（１）歯髄の採取
自然脱落直前に抜去したヒトの乳歯または親知らずなどの永久歯をクロロヘキシジンまたはイソジン溶液で消毒した後、滅菌した抜髄針またはスプーンエキスカベータ―を用いて、歯根管または歯髄腔を介して歯髄組織を採取する。
【００１４】
（２）酵素処理
採取した歯髄組織を、それぞれ４ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩおよびディスパーゼにより、３７℃で１時間処理する。
【００１５】
（３）細胞培養
酵素処理により得られた細胞懸濁液を、面積２５ｃｍ２のディッシュに播種し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、ＣＯ２濃度５％の下で培養する。培養細胞が８５〜９０％のコンフルエントに達するまで細胞を培養し、面積２５ｃｍ２の新たなディッシュに約１０５個／ｃｍ２となるように播種する。
【００１６】
（４）細胞の回収
培養細胞を、トリプシン処理等によりディッシュから剥離した後、遠心処理を施すことによって細胞を回収して、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ：Hanks’ Balanced Salt Solution）に約２×１０６個／１００μｌとなるように再懸濁する。このようにして回収した細胞を、本発明で使用する歯髄幹細胞として用いる。
【００１７】
調製された細胞が歯髄幹細胞であることを確認する方法としては、歯髄幹細胞に特異的なマーカーの発現パターンを指標として確認する方法が挙げられる。具体的には、歯髄幹細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６を発現しており、一方で、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ１３３を発現していないことを一つの特徴としている。これらのマーカーの発現は、いずれも、例えば、免疫蛍光染色法やＦＡＣＳ（Fluorescence activated cell sorting）等によって検出・確認することができる。
【００１８】
本発明において用いられるヒト歯髄幹細胞は、肝細胞に分化させて用いることが好ましい。歯髄幹細胞を肝細胞に分化させる方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、歯髄幹細胞を従来公知の方法（例えば、Okada et al., “Hydrogen sulphide increases hepatic differentiation of human tooth pulp stem cells compared with human bone marrow stem cells,” International Endodontic Journalに記載の方法）に基づいて行うことができる。具体的には、歯髄幹細胞を、１％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムおよび胚栄養因子を添加した無血清ＤＭＥＭで、７０％程度のコンフルエントになるまで培養した後、２０ｎｇ／ｍｌの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を添加して５日間処理し、その後、オンコスタチンＭおよびデキサメタゾンを添加してさらに１５日間処理する。
【００１９】
歯髄幹細胞が肝細胞に分化したことを確認する方法としては、特に限定されるものではないが、実際に生体の肝臓に移植してその分化能を確認する方法や、アルブミンやα−フェトプロテイン等の肝細胞分化に特徴的な遺伝子マーカーの発現レベルをＥＬＩＳＡやリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ等を用いて解析する方法により行われる。なお、歯髄幹細胞から分化した肝細胞を選択するにあたっては、α−フェトプロテインの免疫組織学的な発現が認められ、かつ、移植後のα−フェトプロテインの血中濃度が２０ｎｇ／ｍｌ以上になる程度の幼弱な肝細胞を選択することが好ましい。このような肝細胞を用いた場合、肝臓組織に付随する脈管や胆管等を含めた肝臓組織の再生が見込まれる。
【００２０】
本発明の組成物に含まれるヒト歯髄幹細胞は、分離した状態の歯髄幹細胞であってもよいが、組成物適用時の歯髄幹細胞の生着効率および再生効率を高めるために、スフィア（sphere）を形成した状態の歯髄幹細胞を用いてもよい。また、本発明の組成物は、ヒト歯髄幹細胞を有効量含めば固体または液体のいずれの形態をとってもよく、組成物を適用する方法に応じて、薬学上許容される担体または添加剤を配合して、固体または液体状の組成物として調製することもできる。
【００２１】
本発明の組成物に含有されるヒト歯髄幹細胞の量は、肝臓組織を再生できる限り特に制限されないが、適用対象となる哺乳動物の種類や重量に合わせて適宜設定することができ、例えば、適用対象となる哺乳動物の体重１５ｋｇに対して、５×１０６〜４×１０１０個の歯髄幹細胞を含有させる。好ましくは、対象となる哺乳動物の体重１５ｋｇに対して、１×１０７〜４×１０７個の歯髄幹細胞を含有させる。
【００２２】
本発明の組成物を適用する対象は、哺乳動物であれば特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、非ヒト哺乳動物であってもよい。また、本発明の組成物は、例えば、霊長目、偶蹄目、鯨偶蹄目または奇蹄目等に属する高等哺乳動物に対して特に好ましく用いられる。
【００２３】
また、本発明の組成物の適用箇所としては、特に限定されるものではないが、肝臓、脾臓および腹膜等の臓器である。また、本発明の組成物の適用方法としては、適用箇所となる臓器または組織等に、注入、埋入、填入または塗布等の従来公知の方法によって適用される。適切な溶媒等の担体を用いて本発明の組成物を適度な流動性を有するゲル状に調製することにより、填入、注入または塗布等の、簡便な手法で適用することができる。また、ゲル状であれば、注射針等を用いて対象臓器等に容易に適用することができる。例えば、本発明の組成物を脾臓に適用する場合は、直接脾臓に適用してもよいが、脾洞に、注射器で注入して、血流により脾臓に搬送して適用してもよい。本発明の組成物を使用して、肝臓以外の臓器に肝臓組織を再生した場合、当該臓器の機能を損なうことなく肝臓組織を再生できることが確認されている。
【００２４】
本発明の組成物を用いて肝臓組織の再生を行う場合、組成物の適用による免疫反応を抑制するために、組成物の適用前に適用対象となる動物に対して免疫抑制処理を行うことが好ましい。免疫抑制処理は、市販の免疫抑制剤を使用して行うことができる。市販の免疫抑制剤としては、例えば、タクロリムス（製品名：プログラフ（登録商標）、アステラス製薬株式会社製）等を使用することができる。免疫抑制処理は、使用する免疫抑制剤ごとに従来公知の方法によって行うことができる。
【００２５】
免疫抑制剤としてプログラフを使用して本発明の組成物を適用する場合の、プログラフおよび本発明の組成物の適用スケジュールの一例を以下に示す。
【００２６】
まず、本発明の組成物の適用前日の早朝と夜のそれぞれに、プログラフ顆粒１ｍｇ包（顆粒５００ｍｇ）および０．２ｍｇ包（顆粒１００ｍｇ）を用いて、顆粒０．０７５ｍｇ／ｋｇ体重の量で経口投与する（１日の合計投与量０．１５ｍｇ／ｋｇ体重）。適用当日は、０．１５ｍｇ／ｋｇ体重の量のプログラフ注射液（５ｍｇ／ｍｌ）を生理食塩水２００ｍｌに溶解したプログラフ生理食塩水溶液を、早朝と夜にそれぞれ１００ｍｌずつ、２時間の持続点滴により静脈内投与する（１日の合計投与量は０．１５ｍｇ／ｋｇ体重）。
適用の翌日から適用後２８日までは、０．１０ｍｇ／ｋｇ体重の量のプログラフ注射液（５ｍｇ／ｍｌ）を生理食塩水２００ｍｌに溶解したプログラフ生理食塩水溶液を、早朝と夜にそれぞれ１００ｍｌずつ、２時間の持続点滴により静脈内投与する（１日の合計投与量は０．１０ｍｇ／ｋｇ体重）。体重が１５ｋｇの個体に投与する場合は、本発明の組成物の適用前日の朝と夕方にそれぞれ、プログラフ１１２５ｍｇ（プログラフ顆粒１ｍｇ包を２包と０．２ｍｇ包を１と１／４包）を経口投与する。適用当日は、２．２５ｍｇ（プログラフ注射液（５ｍｇ／ｍｌ）を４５０μｌ）を２００ｍｌの生理食塩水に溶解したプログラフ生理食塩水溶液を、早朝と夜にそれぞれ１００ｍｌずつ、２時間の持続点滴により静脈内投与する。適用の翌日から適用後２８日までは、１．５ｍｇ（プログラフ注射液（５ｍｇ／ｍｌ）を３００μｌ）を２００ｍｌの生理食塩水に溶解したプログラフ生理食塩水溶液を、早朝と夜にそれぞれ１００ｍｌずつ、２時間の持続点滴により静脈内投与する。なお、本発明の組成物適用の翌日以降は、プログラフの血中濃度を毎日測定し、血中濃度が０．０１ｍｇ／ｍｌ以下とならないように、１．５ｍｇ（プログラフ注射液（５ｍｇ／ｍｌ）３００μ）を２００ｍｌの生理食塩水に溶解したプログラフ生理食塩水溶液を適宜静脈内投与することが好ましい。
【００２７】
本発明の組成物の適用後４〜１０週間に、適用した本発明の組成物に含まれるヒト歯髄幹細胞およびそこから分裂・増殖した細胞を含む組織（細胞群）を採取する。肝臓組織の再生がされているかどうかの確認は、採取された組織（細胞群）と正常個体の肝臓組織とを、組織染色等の組織学的解析、各種肝臓マーカーに対する免疫染色、in situハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、ＲＴ−ＰＣＲもしくはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いた分析、または電子顕微鏡解析等を用いて比較して行う。各種肝臓マーカーとしては、特に限定されるものではないが、アルブミン、α−フェトプロテインおよびＣＰＳ（カルバモイルリン酸合成酵素）、ならびに、ミトコンドリア等が挙げられる。これらの肝臓マーカーが、正常個体の肝臓における発現量と同程度に発現している場合、また、肝臓の機能が欠損している対象に適用する場合には、欠損した肝臓の機能が改善および／または補完されている場合に、採取された細胞群は肝臓組織に分化したもの、すなわち肝臓組織が再生したものと判断する。
【００２８】
本発明の組成物は、哺乳動物の肝疾患の治療に用いることができる。したがって、本発明の別の態様によれば、本発明の組成物を含む医薬組成物が提供される。また、本発明の別の態様によれば、医薬組成物の製造における、本発明の組成物の使用が提供される。また、本発明の好ましい態様によれば、上記医薬組成物は、哺乳動物の肝疾患の治療に用いられる。上記医薬組成物においては、本発明の組成物をそのまま用いてもよく、本発明の組成物に、薬学上許容可能な担体を適宜添加して用いてもよい。
【００２９】
本発明の組成物の治療対象となる肝疾患は、特に限定されるものではないが、肝臓がん、肝不全、肝硬変、肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患および転移性がん、ならびに、がんの化学療法に起因する副作用に対し補助療法を必要とする病態などである。がんの化学療法に起因する副作用に対し補助療法が必要な病態とは、具体的には、肝不全や肝転移がんのような病態のことを意味する。また、本発明の組成物の適用対象となる哺乳動物は、上記肝疾患とともに、肥満、糖尿病、高脂血症または高血圧などの生活習慣病を併発していてもよい。
【００３０】
本発明の組成物における肝疾患の治療効果の確認は、本発明の組成物を適用した後に、本発明の組成物を適用した臓器または組織の全体の組織染色による病理学的所見、および／または通常行われている血液検査に基づいて行うことができる。ここで、「本発明の組成物を適用した臓器または組織の全体」とは、適用された本発明の組成物に含まれるヒト歯髄幹細胞およびそこから分裂・増殖した細胞からなる細胞群を含む臓器または組織を意味する。
【００３１】
本発明の組成物の肝疾患治療効果の確認を血液検査に基づいて行う場合、以下の（１）〜（６）から選択される少なくとも１つのパラメータについて正常個体と比較することにより行われる。
（１）血中総コレステロール濃度
（２）血中アルブミン濃度
（３）ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）の値
（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度
（５）血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度
（６）血中ヒアルロン酸濃度
具体的には、肝疾患に罹患した哺乳動物の個体において、本発明の組成物を適用した場合に、上記パラメータの少なくとも１つが正常個体と同程度の値となるか、または、正常個体の値に近づく傾向を示した場合に、本発明の組成物が肝疾患に対する治療効果を有するものであると判断する。
【００３２】
また、本発明の別の態様によれば、哺乳動物における上記肝疾患を治療する方法であって、本発明の組成物の有効量を、哺乳動物に投与することを含む方法が提供される。
【００３３】
本発明の組成物の有効量は、特に限定されるものではないが、対象となる哺乳動物の種類、年齢、性別、状態等に応じて医師により適宜決定される。
【００３４】
本発明の組成物の投与方法は、特に限定されるものではないが、例えば、上述した肝臓組織の再生と同様の手順により行うことができる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これら実施例により制限されるものではない。
【００３６】
歯髄幹細胞の調製
常法に従い、６〜１２歳の健常なヒトから乳歯を採取した。なお、乳歯の採取、ならびに採取した乳歯の歯髄幹細胞の調製および使用については、事前に対象またはその保護者に説明し、同意を得てから行った。採取した乳歯から、滅菌した抜髄針を用いて歯根管を介して歯髄組織を採取した。採取した歯髄組織を、４ｍｇ／ｍｌのディスパーゼＩＩ（GIBCO社製、製品番号：1728484）および４ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩ（和光純薬工業株式会社製、製品番号：CTH2297）を用いて３７℃で１時間消化した。消化後の細胞懸濁液を、面積２５ｃｍ２のディッシュ（TPP社製）を用いて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Invitrogen社製、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢを含有）で、ＣＯ２濃度５％の雰囲気下、３７℃の環境下で培養した。培養細胞が８５〜９０％のコンフルエントに達するまで培養した後、新たなディッシュに１×１０５個／ｃｍ２となるように継代した。
【００３７】
１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で３回継代した後、トリプシンを用いて細胞をディッシュから剥離した。剥離した細胞をManual MACS（登録商標） Cell Separation protocolに供して、ＣＤ１１７＋歯髄幹細胞を単離した。ＣＤ１１７＋歯髄幹細胞を、２０ｎｇ／ｍｌの肝細胞増殖因子（HGF社製）を含む血清非含有ＤＭＥＭで５日間培養し、その後、１０ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭ（R&D社製）および１０ｎＭのデキサメタゾン（和光純薬株式会社製）を培地に添加して、さらに１５日間培養した。培養終了後の細胞をハンクス平衡塩溶液（Gibco社製）に懸濁して約１×１０７個／ｍｌとし、本発明の組成物として用いた。
【００３８】
肝疾患罹患動物モデルの作製
マイクロミニブタを用いて、以下の手順で肝疾患（非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ））罹患の動物モデルを作製した。
【００３９】
約７ヶ月齢（体重約１０ｋｇ）の雄マイクロミニブタ（系統：Fuji Micromini Pig）を富士マイクラ株式会社から購入し、１２個体について、自然換気、温度：２０±５℃、相対湿度：５５±２５％、照明サイクル：７：００〜１９：００が明、１９：００〜７：００が暗の飼育環境の下、通常飼料である固形飼料ＭＰ−Ａ（オリエンタル酵母株式会社製、含有コリン：０．２９％、含有粗タンパク質：１５．３％）を飼料として、１日３００ｇ給餌して馴化を行った。なお、給餌は各日の８：００頃に行った。
【００４０】
一週間程度の馴化期間の終了後の正常な１２個体（正常個体）の血液検査を行った。具体的には、正常な１２個体のそれぞれについて静脈血の採血を行い血清を得、得られた血清試料を用いて、以下の（１）〜（６）の各項目について測定を行い、その測定値を「正常値」とした。（１）〜（６）の各項目と、その正常値は以下の通りであった。
（１）血中総コレステロール濃度：２１４ｍｇ／ｄｌ
（２）血中アルブミン濃度：４．１９２ｍｇ／ｄｌ
（３）ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）の値：２１．９％
（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度：０．０９５μｇ／ｍｌ
（５）血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度：３２Ｕ／ｌ
（６）血中ヒアルロン酸濃度：３２ｎｇ／ｍｌ
【００４１】
上記（１）〜（６）の各項目の測定は、以下の手法およびキット等を用いて行った。
（１）血中総コレステロール濃度については、コレステロール脱水素酵素（ＵＶ）法を用いて測定した。
（２）血中アルブミン濃度については、ネフェロメトリー（ＢＣＰ改良法）を用いて測定した。
（３）ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）値については、凝固時間測定を用いて測定した。
（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度については、Type IV collagen ELISA kit, ACB（フナコシ株式会社製）を用いて測定した。
（５）血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度については、ＪＳＣＣ標準化対応法を用いて測定した。
（６）血中ヒアルロン酸濃度については、ラテックス凝集免疫比濁法を用いて測定した。
【００４２】
正常値を測定した後、タンパク質を実質的に含有しないＣＤＡＡ飼料（RESERCH DIETS社製、製品番号：A15022101）を飼料として、１日３００ｇ給餌して、同一の飼育環境の下、１６週間にわたり自由摂餌により飼育した。なお、給餌は各日の８：００頃に行った。１６週間にわたる自由摂餌により飼育した後の１２個体を肝疾患罹患モデルとした。１２個体の肝疾患罹患モデルについて、正常個体と同様に血液検査を行った。
【００４３】
得られた肝疾患罹患モデルのうちの１個体の肝臓組織を取り出して生検写真を得た。生検写真を図１に示す。図１の生検写真において、灰色で示す部分は肝細胞を示し、白色の小さな粒状部分は脂肪（脂肪滴）を示す。本発明の方法により得られたマイクロミニブタの肝臓組織においては、正常の肝臓組織では認められないような、多量の脂肪（脂肪滴）の肝細胞への沈着が生じており、生検写真からも肝疾患の所見が認められた。
【００４４】
また、１２個体の肝疾患罹患モデルの血液検査の結果は以下の通りであった。これらの測定値を「罹患値」とした。
（１）血中総コレステロール濃度：８７ｍｇ／ｄｌ
（２）血中アルブミン濃度：１．７６８ｍｇ／ｄｌ
（３）ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）の値：６．９％
（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度：０．９９８μｇ／ｍｌ
（５）血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度：２４６Ｕ／ｌ
（６）血中ヒアルロン酸濃度：５１ｎｇ／ｍｌ
【００４５】
上記血液検査の結果から、肝疾患の所見（マーカー）である、（１）血中総コレステロール濃度の低下、（２）血中アルブミン濃度の低下、（３）ＨＰＴ値の低下、（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度の上昇、（５）血中ＡＬＴ濃度の上昇、および（６）血中ヒアルロン酸濃度の上昇が認められた。
【００４６】
このように、得られた肝疾患罹患モデルは、生検写真による所見および血液検査による所見から、肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に外挿可能な肝疾患罹患モデルであった。
【００４７】
＜実施例：歯髄幹細胞を含む組成物の適用による肝疾患の治療効果の検討＞
上述した方法により調製された、歯髄幹細胞を含む本発明の組成物を、上述した方法により作製された肝疾患罹患モデルの脾臓に適用して、本発明の組成物の肝疾患治療効果について検討した。
【００４８】
上述した方法により作製された１２個体の肝疾患罹患モデルを、本発明の組成物を適用する６個体の適用群と、適用しない６個体のコントロール群とに分けた。
【００４９】
適用群には、以下の方法により、歯髄幹細胞を含む本発明の組成物を肝疾患罹患モデルの脾臓に適用した。まず、適用群の６個体に対して、本発明の組成物の適用開始の前日に、タクロリムス（製品名：プログラフ（登録商標）顆粒、アステラス製薬株式会社製）を、１回のプログラフ投与量が０．０７５ｍｇ／ｋｇ体重となるように、早朝と夜の２回経口投与して免疫抑制を行った（１日の合計投与量は０．１５ｍｇ／ｋｇ体重）。次に、上述した方法により作製された本発明の組成物（歯髄幹細胞を約１×１０７個／ｍｌ含む）を、１ｍｌ注射器（Terumo社製、製品番号：SS-01T）を用いて、適用群の６個体の脾洞に注射した。適用開始４週間後に、各個体について静脈血の採血を行い血清を得、得られた血清試料を用いて血液検査を行った。なお、本発明の組成物適用の当日に、プログラフ（登録商標）注射液（５ｍｇ／ｍｌ）を、１回のプログラフ投与量が０．０７５ｍｇ／ｋｇ体重となるように、生理食塩液（大塚製薬株式会社製、製品番号：D05352）１００ｍｌに溶解して、早朝と夜の２回静脈内投与して免疫抑制を行った（１日の合計投与量は０．１５ｍｇ／ｋｇ体重）。本発明の組成物適用の翌日以降は、プログラフ（登録商標）注射液（５ｍｇ／ｍｌ）を、１回のプログラフ投与量が０．０５ｍｇ／ｋｇ体重となるように、生理食塩水１００ｍｌに溶解して、早朝と夜の２回静脈内投与して免疫抑制を行った（１日の合計投与量は０．１０ｍｇ／ｋｇ体重）。なお、本発明の組成物適用の翌日以降は、各個体のプログラフの血中濃度を毎日測定し、静脈血中のプログラフ濃度が約０．０１３ｍｇ／ｍｌとなるように、１．５ｍｇ（プログラフ注射液（５ｍｇ／ｍｌ）３００μｌ）のプログラフを２００ｍｌの生理食塩水に溶解したプログラフ生理食塩水溶液を適宜静脈内投与して免疫抑制を維持した。コントロール群ではプログラフに代えて同量の生理食塩水を投与した。
【００５０】
適用群およびコントロール群のそれぞれの血液検査の結果（６個体の平均値：「処置値」）と、正常値および罹患値を項目ごとにまとめたグラフを図２〜６に示す。図２〜６の結果から明らかなように、適用群においては、血液検査における肝疾患の各マーカーが、本発明の組成物の適用開始４週間で正常値に近づいており（罹患値から処置値への推移）、これは、本発明の組成物を適用したことにより肝疾患が治癒していることを意味するものである。なお、図には示していないが、本発明の組成物の適用開始４週間後の血液検査において、ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）の値は１１．０％であり、血中ＩＶ型コラーゲン濃度は０．３８２μｇ／ｍｌであった。これらの肝疾患マーカーも、本発明の組成物の適用開始４週間で正常値に近づく傾向を示しており、本発明の組成物を適用したことにより肝疾患が治癒していることを示すものである。
【００５１】
一方、コントロール群においては、肝疾患の各マーカーが、罹患値と処置値の間でほとんど変化がなかった。具体的には、処置値が正常値にわずかに近づく傾向を示すか、処置値が罹患値よりも正常値から離れる結果となった。これらの結果は、肝疾患がほとんど治癒されていないか、むしろ進展していることを示すものである。
【００５２】
また、適用群から、本発明の組成物の適用開始４週間後に１個体の脾臓組織を取り出して、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いて染色した。染色後の生検写真を図７に示す。
図７の生検写真において、黒色の小さな粒状部分が肝臓細胞を示す。この生検写真から、本発明の組成物を適用した脾臓においては、肝臓組織が再生しており、肝臓の機能を補完する、いわば第２の肝臓が作出されていることが分かる。病理学的所見に基づけば、この生検写真の結果は、さらなる時間の経過に伴って肝臓組織の再生がさらに進行し、肝臓疾患の治癒に至る病理像を示すものである。
【００５３】
以上より、血液検査および生検写真に基づき、ヒト歯髄幹細胞を含む本発明の組成物を適用することにより、肝臓組織の再生、およびそれに伴う肝疾患の治療という効果が奏されることが明らかとなった。また、この結果から、ヒト歯髄幹細胞を含む本発明の組成物が、肝臓組織の再生および肝疾患の治療に用いられ得ると言える。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明により、脱落歯や抜去歯から容易に採取可能なヒト歯髄幹細胞を用いて、肝臓組織の再生および肝疾患の治療のための組成物を製造することが可能となる。
【図１】
2020079329.tif 000002
【図２】
2020079329.tif 000003
【図３】
2020079329.tif 000004
【図４】
2020079329.tif 000005
【図５】
2020079329.tif 000006
【図６】
2020079329.tif 000007
【図７】
2020079329.tif 000008