(57)【要約】【課題】挿入発癌の最小のリスクを伴った、赤血球系特異的かつ分化段階特異的様式でのグロビン遺伝子の治療的発現を可能にし、サラセミアおよび鎌状赤血球患者を処置する際に使用される場合に高レベルの形質導入を可能にし、したがってそれらの安全性を改善する、新規グロビン発現カセットを提供する。【解決手段】エンハンサー遮断性インシュレーターが提供され、ある特定のインシュレーターは、バリアインシュレーター活性をさらに有する。１つまたは複数のインシュレーターを含む発現カセットもまた提供され、グロビン遺伝子の発現を可能にする。かかる発現カセットを含むベクター、かかる発現カセットまたはかかるベクターで形質導入された細胞、およびヘモグロビン異常症（例えば、β−サラセミアおよび鎌状赤血球貧血）を処置するためのかかる発現カセットの使用もまた、提供される。【選択図】図１
2020079327.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１４年９月４日に出願された米国仮出願第６２／０４５，９９７号の優先権を主張し、その内容全体が本明細書中に参照によって組み込まれる。
【０００２】
補助金情報
本発明は、国立心肺血液研究所からの補助金番号第ＨＬ０５３７５０号のもとの政府支援で行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本明細書で開示される主題は、グロビンタンパク質、例えばヒトβ−グロビンタンパク質を発現する発現カセット、およびかかる発現カセットを含むベクターを提供する。本明細書で開示される主題は、複数のＤｎａｓｅ  Ｉ高感受性部位を含むβ−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）に作動可能に連結したグロビン遺伝子またはその機能的部分を含む発現カセットをさらに提供する。本明細書で開示される主題の発現カセットは、エンハンサーエレメントの効果を相殺する１つまたは複数のインシュレーターを含む。本明細書で開示されるインシュレーターは、本明細書で開示される発現カセットを含むベクターの力価に対して、実質的に有害に影響しない。これらの発現カセットおよびベクターは、ヘモグロビン異常症、例えば、β−サラセミアおよび鎌状赤血球貧血を処置するために使用され得る。
【背景技術】
【０００４】
β−サラセミアおよび鎌状赤血球貧血は、ヘモグロビンのβ鎖を欠損して産生することによって引き起こされる重症の先天性貧血である。β−サラセミアでは、β鎖欠損は、過剰なα−グロビン鎖の細胞内沈殿をもたらし、効果のない赤血球生成および溶血性貧血を引き起こす（ＷｅａｔｈｅｒａｌｌおよびＣｌｅｇｇ（１９８１年）、Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓら、（１９９４年）、Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ（２００１年）、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ（２００１年））。ホモ接合体または複合ヘテロ接合体において見出される最も重症の形態では、貧血は、任意の処置の非存在下では、人生の最初の数年以内に死に至る（ＣｏｏｌｅｙおよびＬｅｅ（１９２５年））。貧血を修正し、効果のない赤血球生成を抑制し、消化管鉄吸収を阻害するために、生涯にわたる輸血治療が必要とされる（ＷｅａｔｈｅｒａｌｌおよびＣｌｅｇｇ（１９８１年）、Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓら（１９９４年）、Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ（２００１年）、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ（２００１年））。しかし、輸血治療自体は、処置されなければ死に至る鉄過負荷をもたらす。鉄過負荷の予防および処置は、現行の患者管理の主要な目標である（Ｇｉａｒｄｉｎａ（２００１年））。β−サラセミアを治癒させるための唯一の現行の治癒的処置は、同種骨髄移植（ＢＭＴ）を介して、正常グロビン遺伝子を保有する赤血球系前駆体を提供することである（ＧｉａｒｄｉｎｉおよびＬｕｃａｒｅｌｌｉ（１９９４年）、Ｂｏｕｌａｄら（１９９８年）、Ｌｕｃａｒｅｌｌｉら（１９９９年）、ＴｉｓｄａｌｅおよびＳａｄｅｌａｉｎ（２００１年））。
【０００５】
鎌状赤血球貧血では、ヘモグロビンβ鎖は、アミノ酸６位において変異しており（Ｇｌｕ→Ｖａｌ）、正常βＡ鎖の代わりにβＳの合成をもたらす（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ（２００１年）、Ｐａｕｌｉｎｇら（１９４９年））。生じたヘモグロビンＨｂＳは、加速された赤血球破壊、赤血球系過形成および有痛性の血管閉塞性「クリーゼ」を引き起こす（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ（２００１年））。血管閉塞は、臓器を損傷し得、最終的に、長期能力障害を引き起こし（例えば、脳卒中または骨壊死後）、時々、突然死を引き起こす。非常に重篤な障害ではあるものの、鎌状赤血球症の過程は、典型的には予測不能である（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ（２００１年））。胎児ヘモグロビンの産生を増加させ（ＳｗａｎｋおよびＳｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ（１９９８年））、造血発生を抑制することによって、ヒドロキシウレアは、測定可能な臨床的利益を生じ得る（Ｐｌａｔｔら（１９８４年））、Ｃｈａｒａｃｈｅら（１９９２年）、ＡｔｗｅｈおよびＬｏｕｋｏｐｏｕｌｏｓ（２００１年））。ヒドロキシウレアは細胞傷害剤であるので、γ−グロビン遺伝子発現を誘導するための、代替的な毒性の低い薬物が、大いに必要とされている（Ｐｅｒｒｉｎｅら（２００５年）、Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ（２００５年））。β−サラセミアに対してと同様、同種骨髄移植（ＢＭＴ）は、現時点で、鎌状赤血球症に対する唯一の治癒的治療である（ＴｉｓｄａｌｅおよびＳａｄｅｌａｉｎ（２００１年）、Ｖｅｒｍｙｌｅｎら（１９９８年）、ＬｕｚｚａｔｔｏおよびＧｏｏｄｆｅｌｌｏｗ（１９８９年））。
【０００６】
しかし、ＢＭＴは、ほとんどの個体にとっての、ＨＬＡが適合した骨髄ドナーの欠如に起因して、β−サラセミアまたは鎌状赤血球症に罹患しているほとんどの患者にとって、治療選択肢として利用可能ではない。さらに、潜在的に治癒的ではあるものの、同種ＢＭＴは、合併症を欠かない。安全な移植は、移植片拒絶および移植片対宿主病のリスクを最小化するために、組織適合性ドナーの同定を必要とする（ＴｉｓｄａｌｅおよびＳａｄｅｌａｉｎ（２００１年）、Ｖｅｒｍｙｌｅｎら（１９９８年）、ＬｕｚｚａｔｔｏおよびＧｏｏｄｆｅｌｌｏｗ（１９８９年））。適合した無関係の移植片または不適合の移植片と関連するより大きいリスクに起因して、ほとんどの患者は、効果のない赤血球生成を修正せず、全身性の鉄蓄積を増悪させる、生涯にわたる輸血治療に同意しなければならない。さらに、過去数十年における平均余命におけるかなりの改善（Ｂｏｒｇｎａ−Ｐｉｇｎａｔｔｉら（２００４年）、Ｔｅｌｆｅｒら（２００９年）、Ｌａｄｉｓら（２０１１年））にもかかわらず、ウイルス感染、鉄毒性および肝硬変症から長期にわたって生じる一部の重篤な合併症のリスクが残る（Ｍａｎｃｕｓｏら（２００６年））。これらの医療上のリスクは、慢性β−サラセミアの社会経済的費用と併せて、安全で有効な治癒的治療の必要性を強調する。
【０００７】
重症のβ−サラセミアを処置するのではなく治癒させるための唯一の手段は、健常な造血幹細胞（ＨＳＣ）を患者に提供することである。ＨＳＣは、成人において、１日当たり２００億個のＲＢＣを含む、全ての血球型を通常生じる。ＨＳＣは、正常含量のヘモグロビンを有する長寿命赤血球（ＲＢＣ）を得るために、野生型β−グロビン遺伝子を有するドナーから回収され得る。あるいは、患者自身のＨＳＣを遺伝学的に修正し得、これは即座に、ドナーについての探索を解決し、同種ＢＭＴと関連する移植片対宿主病および移植片拒絶のリスクを排除する（Ｓａｄｅｌａｉｎ（１９９７年）、Ｓａｄｅｌａｉｎら（２００７年））。グロビン遺伝子移入は、β−サラセミア被験体自身の造血性幹細胞の能力を回復させて、十分なヘモグロビン含量を有するＲＢＣを生じさせることを目的とする（Ｓａｄｅｌａｉｎら（２００７年）、ＰｅｒｓｏｎｓおよびＴｉｓｄａｌｅ（２００４年）、Ｓａｄｅｌａｉｎ（２００６年））。鎌状赤血球貧血を有する患者における目標は、鎌状化を予防することであり、これは、ベクターにコードされたグロビン鎖を取り込む非鎌状化Ｈｂで内因性ＨｂＳを希釈することによって達成され得る。患者自身のＨＳＣは、長期持続性の治療利益を確実にし、治癒的な幹細胞ベースの治療を達成するために、遺伝学的に改変される必要がある細胞である。
【０００８】
重症のβ−サラセミアおよび鎌状赤血球貧血の処置のためのグロビン遺伝子移入の実行は、ＨＳＣにおける調節されたヒトβ−またはβ様グロビン遺伝子の効率的導入を必要とする。β−グロビン遺伝子（またはβ様バリアント）は、特に、輸血依存的ベータ−ゼロサラセミアの処置のために、赤血球系特異的様式で、高レベルで発現されなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
今日までに開発されたグロビンベクターは、サラセミアおよび鎌状赤血球患者におけるそれらの安全な使用を制限し得、またはさらには妨げ得る欠点を提示する。ベクター中に含有されるβ−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）構成要素の一部、特にＤｎａｓｅ  Ｉ高感受性部位−２（ＨＳ２）は、非赤血球系活性を有し得、非特異的発現ベクターで見られるような挿入発癌のリスクに患者を曝露させ得る。さらに、大きいＬＣＲセグメントの使用は、高力価ベクターの産生および患者ＨＳＣの効率的形質導入にとって、有害であり得る。したがって、挿入発癌の最小のリスクを伴った、赤血球系特異的かつ分化段階特異的様式でのグロビン遺伝子（例えば、ヒトβ−グロビン遺伝子）の治療的発現を可能にし、サラセミアおよび鎌状赤血球患者を処置する際に使用される場合に高レベルの形質導入を可能にし、したがってそれらの安全性を改善する、新規グロビン発現カセットが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書で開示される主題は、一般に、エンハンサー遮断性インシュレーターを提供し、ある特定のインシュレーターは、バリアインシュレーター活性をさらに有する。本明細書で開示される主題は、１つまたは複数のインシュレーターを含む発現カセットもまた提供し、グロビン遺伝子（例えば、ヒトβグロビン遺伝子）の発現を可能にする。かかる発現カセットを含むベクター、かかる発現カセットまたはかかるベクターで形質導入された細胞、およびヘモグロビン異常症（例えば、β−サラセミアおよび鎌状赤血球貧血）を処置するためのかかる発現カセットの使用もまた、提供される。
【００１１】
ある特定の非限定的な実施形態では、本明細書で開示される主題は、配列番号１８に示されるＣＴＣＦ結合部位配列を含むインシュレーター、例えば、それらに限定されないが、配列番号２４または配列番号２５を含むインシュレーター、例えば、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するインシュレーターを提供する（以下を参照のこと）。本明細書で開示される主題は、配列番号１８に示されるＣＴＣＦ結合部位配列を含むインシュレーター、例えば、それらに限定されないが、配列番号２４または配列番号２５を含むインシュレーター、例えば、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するインシュレーターを少なくとも１つ含む、発現カセットもまた提供する。非限定的な実施形態では、発現カセットは、配列番号１８に示されるＣＴＣＦ結合部位配列を含むインシュレーター、例えば、それらに限定されないが、配列番号２４または配列番号２５を含むインシュレーター、例えば、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するインシュレーターを少なくとも１つ、およびβ−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）に作動可能に連結したグロビン遺伝子またはその機能的部分を含む。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲは、Ｄｎａｓｅ  Ｉ高感受性部位−２（ＨＳ２）領域を含まない。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ２のコア配列を含まない。非限定的な一実施形態では、ＨＳ２のコア配列は、配列番号２０に示されるヌクレオチド配列を有する。非限定的な一実施形態では、ＨＳ２のコア配列は、配列番号２１に示されるヌクレオチド配列を有する。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲは、ＨＳ２のエンハンサー活性を維持するＨＳ２領域を含まない。非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲは、Ｄｎａｓｅ  Ｉ高感受性部位−１（ＨＳ１）領域、Ｄｎａｓｅ  Ｉ高感受性部位−３（ＨＳ３）領域およびＤｎａｓｅ  Ｉ高感受性部位−４（ＨＳ４）領域を含む。ある特定の実施形態では、このＨＳ３領域は、ＨＳ１領域とＨＳ４領域との間に置かれる。
【００１２】
ある特定の実施形態では、上記ＨＳ１領域は、約１．１ｋｂ  ｂｐの長さである。非限定的な一実施形態では、このＨＳ１領域は、約５００ｂｐから約１０００ｂｐの間の長さである。非限定的な一実施形態では、このＨＳ１領域は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有する。ある特定の実施形態では、このＨＳ１領域は、約６００ｂｐの長さである。非限定的な一実施形態では、このＨＳ１領域は、６０２ｂｐの長さである。ある特定の実施形態では、このＨＳ１領域は、約５００ｂｐから約６００ｂｐの間の長さである。非限定的な一実施形態では、このＨＳ１領域は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する。ある特定の実施形態では、このＨＳ１領域は、約４９０ｂｐの長さである。非限定的な一実施形態では、このＨＳ１領域は、４８９ｂｐの長さである。非限定的な一実施形態では、このＨＳ１領域は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する。非限定的な一実施形態では、上記β−グロビンＬＣＲは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ１領域、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域および配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含み、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ２領域を含まない。非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ１領域、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域および配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含み、このβ−グロビンＬＣＲは、ＨＳ２領域を含まない。非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲは、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ１領域、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域および配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含み、このβ−グロビンＬＣＲは、ＨＳ２領域を含まない。
【００１３】
ある特定の実施形態では、上記β−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ１領域を含まずおよび／またはＨＳ２領域を含まず、このβ−グロビンＬＣＲは、ＨＳ２のコア配列を含まない。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲは、ＨＳ１のコア配列を含まない。非限定的な一実施形態では、ＨＳ１のコア配列は、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列を有する。非限定的な一実施形態では、ＨＳ１のコア配列は、配列番号２３に示されるヌクレオチド配列を有する。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲは、ＨＳ１の機能を維持するＨＳ１領域を含まない。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲは、ＨＳ３領域およびＨＳ４領域を含み、ＨＳ１のコア配列を含まない。ある特定の実施形態では、このＨＳ３領域は、グロビン遺伝子またはその機能的部分とＨＳ４領域との間に置かれる。ある特定の実施形態では、このＨＳ３領域は約２００ｂｐから約１４００ｂｐの間の長さ、例えば、約１３００ｂｐから１４００ｂｐの間の長さである。ある特定の実施形態では、このＨＳ３領域は、約１３００ｂｐの長さである。非限定的な一実施形態では、このＨＳ３領域は、１３０１ｂｐの長さである。非限定的な一実施形態では、このＨＳ３領域は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有する。ある特定の実施形態では、このＨＳ４領域は、約２００ｂｐから約１２００ｂｐの間の長さ、例えば、約４００ｂｐから１１００ｂｐの間の長さである。ある特定の実施形態では、このＨＳ４領域は、約１．１ｋｂの長さである。非限定的な一実施形態では、このＨＳ４領域は、１０６５ｂｐの長さである。非限定的な一実施形態では、このＨＳ４領域は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有する。非限定的な一実施形態では、このＨＳ４領域は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有する。ある特定の実施形態では、このＨＳ４領域は、約４５０ｂｐの長さである。非限定的な一実施形態では、このＨＳ４領域は、４４６ｂｐの長さである。非限定的な一実施形態では、このＨＳ４領域は、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有する。非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域および配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含み、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ１領域もＨＳ２領域も含まない。
【００１４】
あるいは、上記β−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ２領域、ＨＳ３領域およびＨＳ４領域を含み得る。ある特定の実施形態では、このＨＳ２領域は、約４００ｂｐから約１０００ｂｐの間の長さ、例えば、約８００ｂｐから９００ｂｐの間の長さである。ある特定の実施形態では、このＨＳ２領域は、約８６０ｂｐの長さである。非限定的な一実施形態では、このＨＳ２領域は、配列番号９に示されるヌクレオチド配列を有する。ある特定の実施形態では、このＨＳ３領域は、約１３００ｂｐの長さである。非限定的な一実施形態では、このＨＳ３領域は、１３０１ｂｐの長さである。非限定的な一実施形態では、このＨＳ３領域は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有する。ある特定の実施形態では、このＨＳ４領域は、約１．１ｋｂの長さである。非限定的な一実施形態では、このＨＳ４領域は、１０６５ｂｐの長さである。非限定的な一実施形態では、このＨＳ４領域は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有する。非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、配列番号９に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ２領域、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域および配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含む。さらに、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ１領域をさらに含み得る。
【００１５】
ある特定の実施形態では、上記グロビン遺伝子は、β−グロビン遺伝子、γ−グロビン遺伝子およびδ−グロビン遺伝子からなる群から選択される。非限定的な一実施形態では、このグロビン遺伝子は、ヒトβ−グロビン遺伝子である。非限定的な実施形態では、このヒトβ−グロビン遺伝子は、野生型ヒトβ−グロビン遺伝子、イントロン配列の１つまたは複数の欠失を含む、欠失したヒトβ−グロビン遺伝子、および少なくとも１つの抗鎌状化アミノ酸残基をコードする、変異したヒトβ−グロビン遺伝子からなる群から選択される。非限定的な一実施形態では、このヒトβ−グロビン遺伝子は、コドン８７におけるスレオニンからグルタミンへの変異をコードするヒトβＡ−グロビン遺伝子（βＡ−Ｔ８７Ｑ）である。
【００１６】
ある特定の実施形態では、上記発現カセットは、配列番号１８に示されるＣＴＣＦ結合部位配列を含むインシュレーター、例えば、それらに限定されないが、配列番号２４または配列番号２５を含むインシュレーター、例えば、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するインシュレーターを、１つ含む。ある特定の実施形態では、この発現カセットは、配列番号１８に示されるＣＴＣＦ結合部位配列を各々が含む２つのインシュレーターを含み、例えば、それらに限定されないが、ここで、一方または両方のインシュレーターは、配列番号２４もしくは配列番号２５を含むおよび／または配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。
【００１７】
ある特定の実施形態では、上記発現カセットは、β−グロビンプロモーターをさらに含む。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンプロモーターは、グロビン遺伝子またはその機能的部分とβ−グロビンＬＣＲ領域との間に置かれる。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンプロモーターは、約２００ｂｐから約７００ｂｐの間の長さである。非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンプロモーターは、約６１３ｂｐの長さであるヒトβ−グロビンプロモーターである。非限定的な実施形態では、このヒトβ−グロビンプロモーターは、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を有する。別の非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンプロモーターは、約２６５ｂｐの長さであるヒトβ−グロビンプロモーターである。非限定的な一実施形態では、このβヒトβ−グロビンプロモーターは、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を有する。
【００１８】
ある特定の実施形態では、上記発現カセットは、ヒトβ−グロビン３’エンハンサーをさらに含む。ある特定の実施形態では、このヒトβ−グロビン３’エンハンサーは、上記グロビン遺伝子またはその機能的部分の上流に置かれる。ある特定の実施形態では、このβ−グロビン３’エンハンサーは、約７００ｂｐから約９００ｂｐの間の長さ、例えば、約８００ｂｐから９００ｂｐの間の長さである。非限定的な一実施形態では、このヒトβ−グロビン３’エンハンサーは、約８７９ｂｐの長さである。非限定的な一実施形態では、このヒトβ−グロビン３’エンハンサーは、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を有する。
【００１９】
ある特定の実施形態では、上記発現カセットは、少なくとも１つの赤血球系特異的エンハンサーをさらに含む。ある特定の実施形態では、この少なくとも１つの赤血球系特異的エンハンサーは、上記グロビン遺伝子またはその機能的部分と上記β−グロビンＬＣＲ領域との間に置かれる。ある特定の実施形態では、この少なくとも１つの赤血球系特異的エンハンサーは、配列番号１３、１４、１５、１６および１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。ある特定の実施形態では、この少なくとも１つの赤血球系特異的エンハンサーは、約１００ｂｐから約２００ｂｐの間の長さである。ある特定の実施形態では、この発現カセットは、１つ、２つまたは３つの赤血球系特異的エンハンサーを含む。
【００２０】
ある特定の実施形態では、上記発現カセットは、哺乳動物における上記グロビン遺伝子またはその機能的部分の発現を可能にする。非限定的な一実施形態では、この発現カセットは、ヒトβ−グロビン遺伝子の発現を可能にする。ある特定の実施形態では、このグロビン遺伝子またはその機能的部分の発現は、赤血球系組織に限定される。
【００２１】
本明細書で開示される主題は、上記発現カセットを含む組換えベクターもまた提供する。ある特定の実施形態では、この組換えベクターは、レトロウイルスベクターである。非限定的な一実施形態では、このレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、この組換えベクター中に含まれる発現カセットは、１つのインシュレーターを含む。ある特定の実施形態では、この組換えベクターは、このベクターの３’長末端反復（ＬＴＲ）中にウッドチャック肝炎ポスト調節エレメント（ｐｏｓｔ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＷＰＲＥ）をさらに含む。ある特定の実施形態では、この組換えベクターは、このベクターの３’長末端反復（ＬＴＲ）中にウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルをさらに含む。
【００２２】
さらに、本明細書で開示される主題は、上記発現カセットを含む、天然に存在しないまたは操作されたヌクレアーゼを提供する。ある特定の実施形態では、このヌクレアーゼは、天然に存在しないまたは操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、天然に存在しないまたは操作されたメガヌクレアーゼ、および天然に存在しないまたは操作された転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインを含む。ある特定の実施形態では、このヌクレアーゼは、ゲノムセーフハーバー部位（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓａｆｅ  ｈａｒｂｏｒ  ｓｉｔｅ）に結合する。ある特定の実施形態では、このヌクレアーゼは、ゲノムセーフハーバー部位において二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす。ある特定の実施形態では、このヌクレアーゼ中に含まれる発現カセットは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するインシュレーターを２つ含む。ある特定の実施形態では、このヌクレアーゼは、上記発現カセットの標的化された送達を可能にする。本明細書で開示される主題は、上記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、およびこのポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供する。非限定的な一実施形態では、このベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００２３】
さらに、本明細書で開示される主題は、上記発現カセットを含む天然に存在しないまたは操作されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。ある特定の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓヌクレアーゼおよびシングルガイドＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ゲノムセーフハーバー部位に結合する。ある特定の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ゲノムセーフハーバー部位において二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす。ある特定の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系中に含まれる発現カセットは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するインシュレーターを２つ含む。ある特定の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓは、上記発現カセットの標的化された送達を可能にする。本明細書で開示される主題は、上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチド、およびこのポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供する。非限定的な一実施形態では、このベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００２４】
一部の実施形態では、上記ゲノムセーフハーバー部位は、遺伝子外のゲノムセーフハーバー部位である。ある特定の実施形態では、このゲノムセーフハーバー部位は、第１染色体上に位置する。一部の実施形態では、このゲノムセーフハーバーは、以下の５つの判定基準：（１）任意の遺伝子の５’末端から（例えば、その遺伝子の５’末端から）少なくとも５０ｋｂの距離、（ｉｉ）任意のがん関連遺伝子から少なくとも３００ｋｂの距離、（ｉｉｉ）開いた／アクセス可能なクロマチン構造内（天然のまたは操作されたヌクレアーゼによるＤＮＡ切断によって測定される）、（ｉｖ）遺伝子転写単位の外側の位置、および（ｖ）ヒトゲノムの超保存領域（ＵＣＲ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡまたは長い非コードＲＮＡの外側の位置のうち全てを満たす。
【００２５】
さらに、本明細書で開示される主題は、上記発現カセットで形質導入された細胞、上記組換えベクターで形質導入された細胞、上記ヌクレアーゼで形質導入された細胞、上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系で形質導入された細胞を提供する。さらに、本明細書で開示される主題は、上記ベクターで形質導入された細胞を提供する。ある特定の実施形態では、この細胞は、造血幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞および造血内皮細胞からなる群から選択される。非限定的な一実施形態では、この造血幹細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞である。ある特定の実施形態では、この細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入される。
【００２６】
上記細胞の有効量、および薬学的に許容されるキャリアを含む、医薬組成物もまた提供される。本明細書で開示される主題は、上記細胞の有効量、および薬学的に許容されるキャリアを含む、ヘモグロビン異常症を処置するための医薬組成物もまた提供する。
【００２７】
さらに、本明細書で開示される主題は、上記細胞を含む、ヘモグロビン異常症を処置するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、このキットは、ヘモグロビン異常症を有する被験体を処置するためにこの細胞を使用するための書面の指示をさらに含む。
【００２８】
さらに、本明細書で開示される主題は、被験体においてヘモグロビン異常症を処置する方法であって、上記細胞の有効量を被験体に投与するステップ、それによって、正常ヘモグロビンを含有する赤血球を生成する被験体の能力を回復させるステップを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、細胞を被験体に投与するステップの後に、治療的に適切なレベルのヘモグロビンがこの被験体において産生される。ある特定の補正では、この方法は、上記組換えベクターで形質導入された細胞の有効量を投与するステップを含む。一部の実施形態では、被験体において治療的に適切なレベルのヘモグロビンを提供する、細胞中の組換えベクターのベクターコピー数は、細胞１個当たり約０．５〜２ベクターコピー数である。ある特定の実施形態では、この方法は、被験体において効果のない赤血球生成を修正する。ある特定の実施形態では、この方法は、被験体において移植片対宿主病のリスクをきたさない。ある特定の実施形態では、この方法は、免疫抑制剤を投与するステップを含まない。ある特定の実施形態では、この細胞は、造血幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞および造血内皮細胞からなる群から選択される。非限定的な一実施形態では、この被験体はヒトである。ある特定の実施形態では、この細胞は、被験体由来である。非限定的な一実施形態では、この細胞は、被験体の骨髄由来である。
【００２９】
本明細書で開示される主題によれば、上記ヘモグロビン異常症は、ヘモグロビンＣ病（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血、遺伝性貧血、サラセミア、β−サラセミア、重症型サラセミア（ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ  ｍａｊｏｒ）、中間型サラセミア（ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、α−サラセミアおよびヘモグロビンＨ病（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ｈ  ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選択され得る。非限定的な一実施形態では、このヘモグロビン異常症は、β−サラセミアである。別の非限定的な実施形態では、このヘモグロビン異常症は、鎌状赤血球貧血である。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
配列番号１８に示されるＣＴＣＦ結合部位配列を含む、インシュレーター。
（項目２）
配列番号２４または配列番号２５を含む、項目１に記載のインシュレーター。
（項目３）
配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する、項目２に記載のインシュレーター。
（項目４）
項目１から３のいずれかに記載のインシュレーター、およびβ−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）領域に作動可能に連結したグロビン遺伝子またはその機能的部分を含む、発現カセット。
（項目５）
前記β−グロビンＬＣＲ領域が、Ｄｎａｓｅ  Ｉ高感受性部位−２（ＨＳ２）領域を含まない、項目４に記載の発現カセット。
（項目６）
前記β−グロビンＬＣＲ領域が、ＨＳ２のコア配列を含まない、項目５に記載の発現カセット。
（項目７）
ＨＳ２の前記コア配列が、配列番号２０に示されるヌクレオチド配列を有する、項目６に記載の発現カセット。
（項目８）
ＨＳ２の前記コア配列が、配列番号２１に示されるヌクレオチド配列を有する、項目６に記載の発現カセット。
（項目９）
前記β−グロビンＬＣＲ領域が、ＨＳ２のエンハンサー活性を維持するＨＳ２領域を含まない、項目４に記載の発現カセット。
（項目１０）
前記β−グロビンＬＣＲ領域が、Ｄｎａｓｅ  Ｉ高感受性部位−１（ＨＳ１）領域、Ｄｎａｓｅ  Ｉ高感受性部位−３（ＨＳ３）領域およびＤｎａｓｅ  Ｉ高感受性部位−４（ＨＳ４）領域を含む、項目４から９のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目１１）
前記ＨＳ３領域が、前記ＨＳ１領域と前記ＨＳ４領域との間に置かれる、項目１０に記載の発現カセット。
（項目１２）
前記ＨＳ１領域が約１．１ｋｂの長さである、項目１０または１１に記載の発現カセット。
（項目１３）
前記ＨＳ１領域が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有する、項目１２に記載の発現カセット。
（項目１４）
前記ＨＳ１領域が約６００ｂｐの長さである、項目１０または１１に記載の発現カセット。
（項目１５）
前記ＨＳ１領域が６０２ｂｐの長さである、項目１４に記載の発現カセット。
（項目１６）
前記ＨＳ１領域が、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する、項目１５に記載の発現カセット。
（項目１７）
前記ＨＳ１領域が約４９０ｂｐの長さである、項目１０または１１に記載の発現カセット。
（項目１８）
前記ＨＳ１領域が４８９ｂｐの長さである、項目１７に記載の発現カセット。
（項目１９）
前記ＨＳ１領域が、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する、項目１８に記載の発現カセット。
（項目２０）
前記β−グロビンＬＣＲ領域が、ＨＳ１領域を含まない、項目４または５に記載の発現カセット。
（項目２１）
前記β−グロビンＬＣＲ領域が、ＨＳ１のコア配列を含まない、項目２０に記載の発現カセット。
（項目２２）
ＨＳ１の前記コア配列が、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列を有する、項目２１に記載の発現カセット。
（項目２３）
ＨＳ１の前記コア配列が、配列番号２３に示されるヌクレオチド配列を有する、項目２１に記載の発現カセット。
（項目２４）
前記β−グロビンＬＣＲ領域が、ＨＳ１の機能を維持するＨＳ１領域を含まない、項目２０に記載の発現カセット。
（項目２５）
前記β−グロビンＬＣＲ領域が、ＨＳ３領域およびＨＳ４領域を含む、項目２０から２４のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目２６）
前記ＨＳ３領域が、前記グロビン遺伝子またはその機能的部分と前記ＨＳ４領域との間に置かれる、項目２５に記載の発現カセット。
（項目２７）
前記ＨＳ３領域が約１３００ｂｐの長さである、項目１０から２６のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目２８）
前記ＨＳ３領域が１３０１ｂｐの長さである、項目２７に記載の発現カセット。
（項目２９）
前記ＨＳ３領域が、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有する、項目２８に記載の発現カセット。
（項目３０）
前記ＨＳ４領域が約１．１ｋｂの長さである、項目１０から２９のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目３１）
前記ＨＳ４領域が１０６５ｂｐの長さである、項目３０に記載の発現カセット。
（項目３２）
前記ＨＳ４領域が、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有する、項目３１に記載の発現カセット。
（項目３３）
前記ＨＳ４領域が、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有する、項目３１に記載の発現カセット。
（項目３４）
前記ＨＳ４領域が約４５０ｂｐの長さである、項目１０から２９のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目３５）
前記ＨＳ４領域が４４６ｂｐの長さである、項目３４に記載の発現カセット。
（項目３６）
前記ＨＳ４領域が、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有する、項目３５に記載の発現カセット。
（項目３７）
前記β−グロビンＬＣＲ領域が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ１領域、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域および配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含み、該β−グロビンＬＣＲ領域が、ＨＳ２領域を含まない、項目５から１１のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目３８）
前記β−グロビンＬＣＲ領域が、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ１領域、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域および配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含み、該β−グロビンＬＣＲ領域が、ＨＳ２領域を含まない、項目５から１１のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目３９）
前記β−グロビンＬＣＲ領域が、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ１領域、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域および配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含み、該β−グロビンＬＣＲ領域が、ＨＳ２領域を含まない、項目５から１１のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目４０）
前記β−グロビンＬＣＲ領域が、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域および配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含み、該β−グロビンＬＣＲ領域が、ＨＳ１領域もＨＳ２領域も含まない、項目２０から２５のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目４１）
前記β−グロビンＬＣＲ領域が、ＨＳ２領域、ＨＳ３領域およびＨＳ４領域を含む、項目４に記載の発現カセット。
（項目４２）
前記ＨＳ２領域が８６０ｂｐの長さである、項目４１に記載の発現カセット。
（項目４３）
前記ＨＳ２領域が、配列番号９に示されるヌクレオチド配列を有する、項目４２に記載の発現カセット。
（項目４４）
前記ＨＳ３領域が約１３００ｂｐの長さである、項目４１から４２のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目４５）
前記ＨＳ３領域が１３０１ｂｐの長さである、項目４４に記載の発現カセット。
（項目４６）
前記ＨＳ３領域が、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有する、項目４５に記載の発現カセット。
（項目４７）
前記ＨＳ４領域が約１．１ｋｂの長さである、項目４１から４６のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目４８）
前記ＨＳ４領域が１０６５ｂｐの長さである、項目４７に記載の発現カセット。
（項目４９）
前記ＨＳ４領域が、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有する、項目４９に記載の発現カセット。
（項目５０）
前記β−グロビンＬＣＲ領域が、配列番号９に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ２領域、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域および配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含む、項目４１に記載の発現カセット。
（項目５１）
前記β−グロビンＬＣＲ領域が、ＨＳ１領域をさらに含む、項目４１から５０のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目５２）
前記グロビン遺伝子が、β−グロビン遺伝子、γ−グロビン遺伝子およびδ−グロビン遺伝子からなる群から選択される、項目４から５１のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目５３）
前記グロビン遺伝子が、ヒトβ−グロビン遺伝子である、項目５２に記載の発現カセット。
（項目５４）
前記ヒトβ−グロビン遺伝子が、野生型ヒトβ−グロビン遺伝子、イントロン配列の１つまたは複数の欠失を含む、欠失したヒトβ−グロビン遺伝子、および少なくとも１つの抗鎌状化アミノ酸残基をコードする、変異したヒトβ−グロビン遺伝子からなる群から選択される、項目５３に記載の発現カセット。
（項目５５）
前記ヒトβ−グロビン遺伝子が、コドン８７におけるスレオニンからグルタミンへの変異をコードするヒトβＡ−グロビン遺伝子（βＡ−Ｔ８７Ｑ）である、項目５４に記載の発現カセット。
（項目５６）
配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するインシュレーターを１つ含む、項目４から５５のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目５７）
配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する前記インシュレーターを２つ含む、項目４から５５のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目５８）
β−グロビンプロモーターをさらに含む、項目４から５７のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目５９）
前記β−グロビンプロモーターが、前記グロビン遺伝子またはその機能的部分と前記β−グロビンＬＣＲ領域との間に置かれる、項目５８に記載の発現カセット。
（項目６０）
前記β−グロビンプロモーターが、約６１３ｂｐの長さであるヒトβ−グロビンプロモーターである、項目５８または５９に記載の発現カセット。
（項目６１）
前記ヒトβ−グロビンプロモーターが、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を有する、項目６０に記載の発現カセット。
（項目６２）
前記β−グロビンプロモーターが、約２６５ｂｐの長さであるヒトβ−グロビンプロモーターである、項目５８または５９に記載の発現カセット。
（項目６３）
前記ヒトβ−グロビンプロモーターが、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を有する、項目６２に記載の発現カセット。
（項目６４）
ヒトβ−グロビン３’エンハンサーをさらに含む、項目４から６３のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目６５）
前記ヒトβ−グロビン３’エンハンサーが、前記グロビン遺伝子またはその機能的部分の上流に置かれる、項目６４に記載の発現カセット。
（項目６６）
前記ヒトβ−グロビン３’エンハンサーが約８７９ｂｐの長さである、項目６４または６５に記載の発現カセット。
（項目６７）
前記ヒトβ−グロビン３’エンハンサーが、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を有する、項目６６に記載の発現カセット。
（項目６８）
少なくとも１つの赤血球系特異的エンハンサーをさらに含む、項目５から６７のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目６９）
前記少なくとも１つの赤血球系特異的エンハンサーが、前記グロビン遺伝子またはその機能的部分とβ−グロビンＬＣＲ領域との間に置かれる、項目６８に記載の発現カセット。
（項目７０）
前記少なくとも１つの赤血球系特異的エンハンサーが、配列番号１３、１４、１５、１６および１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、項目６８または６９に記載の発現カセット。
（項目７１）
１、２または３つの赤血球系特異的エンハンサーを含む、項目６８から７０のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目７２）
哺乳動物における前記グロビン遺伝子またはその機能的部分の発現を可能にする、項目４から７１のいずれか一項に記載の発現カセット。
（項目７３）
ヒトβ−グロビン遺伝子の発現を可能にする、項目７２に記載の発現カセット。
（項目７４）
前記グロビン遺伝子またはその機能的部分の発現が、赤血球系組織に限定される、項目７１または７２に記載の発現カセット。
（項目７５）
項目４から７４のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、組換えベクター。
（項目７６）
レトロウイルスベクターである、項目７５に記載の組換えベクター。
（項目７７）
前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、項目７６に記載の組換えベクター。
（項目７８）
前記発現カセットが、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するインシュレーターを１つ含む、項目７５から７７のいずれか一項に記載の組換えベクター。
（項目７９）
前記ベクターの３’長末端反復（ＬＴＲ）中にウッドチャック肝炎ポスト調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む、項目７５から７７のいずれか一項に記載の組換えベクター。
（項目８０）
前記ベクターの３’長末端反復（ＬＴＲ）中にウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルをさらに含む、項目７９に記載の組換えベクター。
（項目８１）
項目４から７４のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、天然に存在しないまたは操作されたヌクレアーゼ。
（項目８２）
天然に存在しないまたは操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、天然に存在しないまたは操作されたメガヌクレアーゼ、および天然に存在しないまたは操作された転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）からなる群から選択される、項目８１に記載のヌクレアーゼ。
（項目８３）
ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインを含む、項目８１または８２に記載のヌクレアーゼ。
（項目８４）
ゲノムセーフハーバー部位に結合する、項目８１から８３のいずれか一項に記載のヌクレアーゼ。
（項目８５）
前記ゲノムセーフハーバー部位において二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす、項目８４に記載のヌクレアーゼ。
（項目８６）
前記ゲノムセーフハーバー部位が、遺伝子外のゲノムセーフハーバー部位である、項目８４または８５に記載のヌクレアーゼ。
（項目８７）
前記ゲノムセーフハーバー部位が、第１染色体上に位置する、項目８４から８６のいずれか一項に記載のヌクレアーゼ。
（項目８８）
前記ゲノムセーフハーバー部位が、以下の５つの判定基準：（１）任意の遺伝子の５’末端から（例えば、該遺伝子の５’末端から）少なくとも５０ｋｂの距離、（ｉｉ）任意のがん関連遺伝子から少なくとも３００ｋｂの距離、（ｉｉｉ）開いた／アクセス可能なクロマチン構造内（天然のまたは操作されたヌクレアーゼによるＤＮＡ切断によって測定される）、（ｉｖ）遺伝子転写単位の外側の位置、および（ｖ）ヒトゲノムの超保存領域（ＵＣＲ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡまたは長い非コードＲＮＡの外側の位置のうち全てを満たす、項目８４から８６のいずれか一項に記載のヌクレアーゼ。
（項目８９）
前記発現カセットが、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する前記インシュレーターを２つ含む、項目８１から８８のいずれか一項に記載のヌクレアーゼ。
（項目９０）
前記発現カセットの標的化された送達を可能にする、項目８１から８９のいずれか一項に記載のヌクレアーゼ。
（項目９１）
項目８１から９０のいずれか一項に記載のヌクレアーゼをコードする、ポリヌクレオチド。
（項目９２）
項目９１に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目９３）
レンチウイルスベクターである、項目９２に記載のベクター。
（項目９４）
項目４から７４のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、天然に存在しないまたは操作されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
（項目９５）
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓヌクレアーゼおよびシングルガイドＲＮＡを含む、項目９４に記載の系。
（項目９６）
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、ゲノムセーフハーバー部位に結合する、項目９４または９５に記載の系。
（項目９７）
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、前記ゲノムセーフハーバー部位において二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす、項目９６に記載の系。
（項目９８）
前記ゲノムセーフハーバー部位が、遺伝子外のゲノムセーフハーバー部位である、項目９６または９７に記載の系。
（項目９９）
前記ゲノムセーフハーバー部位が、第１染色体上に位置する、項目９６から９８のいずれか一項に記載の系。
（項目１００）
前記ゲノムセーフハーバー部位が、以下の５つの判定基準：（１）任意の遺伝子の５’末端から（例えば、該遺伝子の５’末端から）少なくとも５０ｋｂの距離、（ｉｉ）任意のがん関連遺伝子から少なくとも３００ｋｂの距離、（ｉｉｉ）開いた／アクセス可能なクロマチン構造内（天然のまたは操作されたヌクレアーゼによるＤＮＡ切断によって測定される）、（ｉｖ）遺伝子転写単位の外側の位置、および（ｖ）ヒトゲノムの超保存領域（ＵＣＲ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡまたは長い非コードＲＮＡの外側の位置のうち全てを満たす、項目９６から９９のいずれか一項に記載の系。
（項目１０１）
前記発現カセットが、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する前記インシュレーターを２つ含む、項目９４から１００のいずれか一項に記載の系。
（項目１０２）
前記発現カセットの標的化された送達を可能にする、項目９４から１０１のいずれか一項に記載の系。
（項目１０３）
項目９４から１０２のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をコードする、ポリヌクレオチド。
（項目１０４）
項目１０３に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目１０５）
レンチウイルスベクターである、項目１０４に記載のベクター。
（項目１０６）
項目４から７４のいずれか一項に記載の発現カセットで形質導入された、細胞。
（項目１０７）
項目７５から８０のいずれか一項に記載の組換えベクターで形質導入された、細胞。
（項目１０８）
項目８１から９０のいずれか一項に記載のヌクレアーゼで形質導入された、細胞。
（項目１０９）
項目９４から１０２のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系で形質導入された、細胞。
（項目１１０）
項目９２、９３、１０４および１０５のいずれか一項に記載のベクターで形質導入された、細胞。
（項目１１１）
造血幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞および造血内皮細胞からなる群から選択される、項目１０６から１１０のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１１２）
前記造血幹細胞がＣＤ３４＋造血幹細胞である、項目１１１に記載の細胞。
（項目１１３）
ｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入される、項目１０６から１１２のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１１４）
項目１０６から１１３のいずれか一項に記載の細胞の有効量、および薬学的に許容されるキャリアを含む、医薬組成物。
（項目１１５）
項目１０６から１１３のいずれか一項に記載の細胞の有効量、および薬学的に許容されるキャリアを含む、ヘモグロビン異常症を処置するための医薬組成物。
（項目１１６）
前記ヘモグロビン異常症が、ヘモグロビンＣ病、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血、遺伝性貧血、サラセミア、β−サラセミア、重症型サラセミア、中間型サラセミア、α−サラセミアおよびヘモグロビンＨ病からなる群から選択される、項目１１５に記載の医薬組成物。
（項目１１７）
前記ヘモグロビン異常症がβ−サラセミアである、項目１１６に記載の医薬組成物。
（項目１１８）
前記ヘモグロビン異常症が鎌状赤血球貧血である、項目１１６に記載の医薬組成物。
（項目１１９）
項目１０６から１１３のいずれか一項に記載の細胞を含む、ヘモグロビン異常症を処置するためのキット。
（項目１２０）
ヘモグロビン異常症を有する被験体を処置するために前記細胞を使用するための書面の指示をさらに含む、項目１１９に記載のキット。
（項目１２１）
前記ヘモグロビン異常症が、ヘモグロビンＣ病、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血、遺伝性貧血、サラセミア、β−サラセミア、重症型サラセミア、中間型サラセミア、α−サラセミアおよびヘモグロビンＨ病からなる群から選択される、項目１１９または１２０に記載のキット。
（項目１２２）
前記ヘモグロビン異常症がβ−サラセミアである、項目１２１に記載のキット。
（項目１２３）
前記ヘモグロビン異常症が鎌状赤血球貧血である、項目１２１に記載のキット。
（項目１２４）
被験体においてヘモグロビン異常症を処置する方法であって、項目１０６から１１３のいずれか一項に記載の細胞の有効量を該被験体に投与するステップ、それによって、正常ヘモグロビンを含む赤血球を生成する該被験体の能力を回復させるステップを含む、方法。
（項目１２５）
前記細胞を前記被験体に投与するステップの後に、治療的に適切なレベルのヘモグロビンが該被験体において産生される、項目１２４に記載の方法。
（項目１２６）
項目７５から８０のいずれか一項に記載の組換えベクターで形質導入された細胞の有効量を投与するステップを含む、方法。
（項目１２７）
前記被験体において治療的に適切なレベルのヘモグロビンを提供する、前記細胞中の前記組換えベクターのベクターコピー数が、細胞１個当たり約０．５〜２ベクターコピー数である、項目１２６に記載の方法。
（項目１２８）
前記被験体において効果のない赤血球生成を修正する、項目１２４から１２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２９）
前記被験体に対する移植片対宿主病のリスクをきたさない、項目１２４から１２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３０）
免疫抑制剤を投与するステップを含まない、項目１２４から１２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３１）
前記ヘモグロビン異常症が、ヘモグロビンＣ病、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血、遺伝性貧血、サラセミア、β−サラセミア、重症型サラセミア、中間型サラセミア、α−サラセミアおよびヘモグロビンＨ病からなる群から選択される、項目１２４から１３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３２）
前記ヘモグロビン異常症がβ−サラセミアである、項目１３１に記載の方法。
（項目１３３）
前記ヘモグロビン異常症が鎌状赤血球貧血である、項目１３１に記載の方法。
（項目１３４）
前記細胞が、造血幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞および造血内皮細胞からなる群から選択される、項目１２４から１３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３５）
前記被験体がヒトである、項目１２４から１３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３６）
前記細胞が前記被験体由来である、項目１２４から１３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３７）
前記細胞が、前記被験体の骨髄由来である、項目１３６に記載の方法。
【００３０】
例として与えられるが、記載された具体的実施形態に本発明を限定することを意図しない以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本明細書で開示される主題の非限定的な一実施形態に従う発現カセットを含む組換えベクター（ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）を示す。
【００３２】
【図２】図２は、本明細書で開示される主題の非限定的な一実施形態に従う発現カセットを含む組換えベクター（ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）を示す。
【００３３】
【図３】図３は、本明細書で開示される主題の非限定的な一実施形態に従う発現カセットを含む組換えベクターを示す。
【００３４】
【図４】図４は、本明細書で開示される主題の非限定的な一実施形態に従う発現カセットを含む組換えベクターを示す。
【００３５】
【図５】図５Ａ〜Ｃは、インシュレーターＡ１の遺伝子毒性を示す。（Ａ）は、使用したガンマレトロウイルスベクター遺伝子毒性アッセイを明示する。（Ｂ）は、インスレートされたガンマレトロウイルスベクターで形質導入された３２Ｄ細胞を受けているマウスの増加した生存を示す。ｃＨＳ４およびインスレートされていない対照を用いて得られた結果もまた示す。（Ｃ）は、インシュレーターＡ１が、遺伝子毒性のリスクを減少させたことを示している。
【００３６】
【図６】図６は、処置の８週間後および４４週間後のサラセミアＨｂｂｔｈ３／＋マウスにおける、正規化されたβ鎖発現を示す。
【００３７】
【図７】図７は、非赤血球系Ｋ５６２細胞におけるエンハンサー活性の評価を示す。
【図８】図８は、本明細書で開示される主題のある特定の実施形態に従う赤血球系特異的エンハンサーを示す。
【００３８】
【図９】図９は、本明細書で開示される主題のある特定の実施形態に従う赤血球系特異的エンハンサーを示す。
【００３９】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜Ｂは、本明細書で開示される発現カセットを含む種々の組換えベクターを示す。
【００４０】
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜Ｂは、本明細書で開示される発現カセットを含む種々の組換えベクターを示す。
【００４１】
【図１１】図１１は、本明細書で開示される発現カセットを含む組換えベクターの力価を示す。
【００４２】
【図１２】図１２は、本明細書で開示される発現カセットを含む組換えベクターの力価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本明細書で開示される主題は、一般に、グロビン遺伝子（例えば、ヒトβ−グロビン遺伝子）の発現を可能にする発現カセットを提供する。非限定的な一例では、この発現カセットは、配列番号１８に示されるＣＴＣＦ結合部位配列を含むインシュレーター、例えば、それらに限定されないが、配列番号２４または配列番号２５を含むインシュレーター、例えば、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するインシュレーターを少なくとも１つ、およびβ−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）領域に作動可能に連結したグロビン遺伝子またはその機能的部分を含む。本明細書で開示される発現カセットによって誘導されるグロビン遺伝子の発現は、赤血球系特異的、分化段階特異的、高レベルであり、持続性である。本明細書で開示される主題は、組換えベクター、天然に存在しないまたは操作されたヌクレアーゼ、ならびにかかる発現カセットを含む天然に存在しないまたは操作されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、ならびにかかる発現カセット、組換えベクター、ヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系で形質導入された細胞もまた提供する。本明細書で開示される発現カセットおよびそれを含むベクターは、細胞１個当たり低いベクターコピー数（例えば、０．５〜２、１〜２またはさらには０．５〜１）で治療的導入遺伝子発現が達成される（例えば、治療的に適切なレベルのヘモグロビンが産生される）場合、安全な遺伝子移入治療を提供する。さらに、本明細書で開示される主題は、ヘモグロビン異常症（例えば、β−サラセミアおよび鎌状赤血球貧血）を処置するために、かかる形質導入された細胞を使用する方法を提供する。
【００４４】
Ｉ．定義
別段定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される用語の多くの一般的定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版、１９９４年）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８年）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第５版、Ｒ．  Ｒｉｅｇｅｒら（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１年）；ならびにＨａｌｅおよびＭａｒｈａｍ、Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１年）。本明細書で使用する場合、以下の用語は、別段特記しない限り、以下のそれらに帰せられる意味を有する。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「発現カセット」とは、標的細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の特定化された核酸エレメントを有する、組換えまたは合成によって生成された核酸構築物を指す。発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルスまたは核酸領域中に組み込まれ得る。発現カセット部分は、転写される遺伝子、およびその遺伝子の発現を制御するエレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「β−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）領域」とは、ＨＳ１領域、ＨＳ２領域、ＨＳ３領域およびＨＳ４領域を含む、１つまたは複数のＤｎａｓｅ  Ｉ高感受性部位（ＨＳ）領域から構成されるポリヌクレオチドを指す。ヒト（Ｌｉら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９８５年）；２６０巻：１４，９０１頁；Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（１９９０年）８７巻：８２０７頁）；マウス（Ｓｈｅｈｅｅら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（１９８９年）；２０５巻：４１頁）；ウサギ（Ｍａｒｇｏｔら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（１９８９年）；２０５巻：１５頁）；およびヤギ（Ｌｉ，  Ｑ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９１年）；９巻：４８８頁）などの、β−グロビン遺伝子の多くのＬＣＲの構造が公開されており、これらは各々、参照によって本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、上記β−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ２領域を含む（例えば、ＨＳ２領域、ＨＳ３領域およびＨＳ４領域を含むβ−グロビンＬＣＲ領域；ならびにＨＳ１領域、ＨＳ２領域、ＨＳ３領域およびＨＳ４領域を含むβ−グロビンＬＣＲ領域）。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ２領域を含まない（例えば、ＨＳ１領域、ＨＳ３領域、ＨＳ４領域を含むβ−グロビンＬＣＲ領域）。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ２領域もＨＳ１領域も含まない（例えば、ＨＳ３領域およびＨＳ４領域を含むβ−グロビンＬＣＲ領域）。
【００４７】
本明細書で使用する場合、用語「組換え」は、異種核酸の導入によって改変された細胞もしくはベクターに対する言及、または細胞がそのように改変された細胞由来であることを含む。したがって、例えば、組換え細胞は、ネイティブ（非組換え）形態の細胞内で同一の形態で見出されない遺伝子を発現する、または故意のヒト介入の結果として、他の方法で異常に発現される、過小発現される、もしくは全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する、またはネイティブ遺伝子の、低減もしくは排除された発現を有し得る。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「グロビン」とは、酸素の結合および輸送に関与するヘム含有タンパク質のファミリーを指す。脊椎動物および無脊椎動物のヘモグロビンのサブユニット、脊椎動物および無脊椎動物のミオグロビンまたはそれらの変異体は、用語グロビンによって包含される。
【００４９】
本明細書で使用する場合、用語「野生型」とは、いずれの変異または改変を有さない、天然に見出される正常な遺伝子、ウイルスまたは生物を指す。
【００５０】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、相互交換可能に使用される。これらは、任意の長さの、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかのポリマー性形態のヌクレオチド、またはそれらのアナログを指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、公知または知られていない任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子領域のコード領域または非コード領域、連鎖分析から定義された遺伝子座（複数もしくは単数）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の改変されたヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含み得る。特定の実施形態では、本明細書で開示される主題は、１つまたは複数のグロビン遺伝子またはその機能的（ｆｕｃｔｉｏｎａｌ）部分をコードするポリヌクレオチドを提供する。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリマーのアセンブリの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、標識構成要素とのコンジュゲーションによって、重合後にさらに改変され得る。かかるポリヌクレオチドは、内因性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には、実質的な同一性を示す。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズすることが可能である。「ハイブリダイズする」とは、ストリンジェンシーの種々の条件下で、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される遺伝子）またはそれらの部分間で二本鎖分子を形成するように対合することを意味する。（例えば、Ｗａｈｌ，  Ｇ．  Ｍ．およびＳ．  Ｌ．  Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５２巻：３９９頁；Ｋｉｍｍｅｌ，  Ａ．  Ｒ．（１９８７年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５２巻：５０７頁を参照のこと）。
【００５１】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、好ましくは約５００ｍＭ未満のＮａＣｌおよび５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、より好ましくは約２５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えば、ホルムアミドの非存在下で得られ得るが、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得られ得る。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約３０℃の、より好ましくは少なくとも約３７℃の、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含む。種々のさらなるパラメーター、例えば、ハイブリダイゼーション時間、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの洗剤の濃度、およびキャリアＤＮＡを含むか含まないかは、当業者に周知である。変動するレベルのストリンジェンシーが、必要に応じて、これらの種々の条件を組み合わせることによって達成される。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび１％ＳＤＳ中で、３０℃で起こる。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミドおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中で、３７℃で起こる。最も好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミドおよび２００μｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡ中で、４２℃で起こる。これらの条件に対する有用なバリエーションは、当業者に容易に明らかである。
【００５２】
ほとんどの適用について、ハイブリダイゼーション後の洗浄ステップも、ストリンジェンシーを変動させる。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度および温度によって定義され得る。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を減少させることまたは温度を上昇させることによって、増加され得る。例えば、洗浄ステップのためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは、約３０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、最も好ましくは約１５ｍＭ未満のＮａＣｌおよび１．５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。洗浄ステップのためのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも約４２℃の、なおより好ましくは少なくとも約６８℃の温度を含む。好ましい実施形態では、洗浄ステップは、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ中で、２５℃で行われる。より好ましい実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ中で、４２℃で行われる。より好ましい実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ中で、６８℃で行われる。これらの条件に対するさらなるバリエーションは、当業者に容易に明らかである。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、例えば、ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６巻：１８０頁、１９７７年）；ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＲｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ  ７２巻：３９６１頁、１９７５年）；Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１年）；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９８７年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマー、ならびにそのバリアントおよび合成アナログを指すために、相互交換可能に使用される。したがって、これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、合成の天然に存在しないアミノ酸、例えば、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログであるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で開示される主題の特定の実施形態は、ポリペプチド「バリアント」もまた含む。ポリペプチド「バリアント」とは、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、トランケーションおよび／または置換によって参照ポリペプチドから識別され、生物学的活性を保持する、ポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、ポリペプチドバリアントは、当該分野で公知のように、保存的または非保存的であり得る１または複数の置換によって、参照ポリペプチドから識別される。ある特定の実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照ポリペプチドの対応する配列に対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ超の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、アミノ酸の付加または欠失は、参照ポリペプチドのＣ末端の端および／またはＮ末端の端で生じる。ある特定の実施形態では、アミノ酸欠失は、アミノ酸の全ての介在する数、例えば、２５、２６、２７、２９、３０・・・１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５・・・１７０、１７１、１７２、１７３、１７４個などを含む、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１６５、約１７０もしくは約１７５またはそれ超のアミノ酸の、Ｃ末端トランケーションを含む。
【００５４】
上述のように、本明細書で開示される主題のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、トランケーションおよび挿入を含む種々の方法で変更され得る。かかる操作のための方法は、一般に、当該分野で公知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡ中の変異によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ８２巻：４８８〜４９２頁）、Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５４巻：３６７〜３８２頁）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，  Ｊ．  Ｄ．  ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第４版、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ、１９８７年）およびそれらで引用された参考文献を参照のこと。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８年）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）のモデル中に見出され得る。
【００５５】
本明細書で使用する場合、用語「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記載される核酸配列のいずれか１つ）に対して少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。好ましくは、かかる配列は、比較のために使用される配列に対して、アミノ酸レベルまたは核酸で、少なくとも６０％、より好ましくは８０％または８５％、より好ましくは９０％、９５％またはさらには９９％同一である。
【００５６】
配列同一性または相同性は、典型的には、配列分析ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７０５、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰまたはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測定される。かかるソフトウェアは、種々の置換、欠失および／または他の改変に、相同性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列を一致させる。同一性または相同性の程度を決定するための１つの例示的なアプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムが、密接に関連する配列を示す、ｅ−３とｅ−１００との間の確率スコアで、使用され得る。２つの配列間の同一性の百分率は、ＤＮＡＭＡＮ（Ｌｙｎｎｏｎ  Ｂｉｏｓｏｆｔ、バージョン３．２）などのプログラムを用いても決定され得る。このプログラムを使用して、２つの配列は、最適なアラインメントアルゴリズムを使用してアラインされ得る（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１年）。２つの配列のアラインメント後、同一性百分率が、アラインされた配列の長さマイナス全てのギャップの長さによって、２つの配列間で同一のヌクレオチドの数を除算することによって、計算され得る。
【００５７】
ポリヌクレオチドの配向を記述する用語には、以下が含まれる：５’（通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）および３’（通常、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の配向または３’から５’の配向で注釈付けされ得る。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「シングルガイドＲＮＡ」または「合成ガイドＲＮＡ」とは、ガイド配列、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。用語「ガイド配列」とは、標的部位を特定するガイドＲＮＡ内の約２０ｂｐの配列を指し、用語「ガイド」または「スペーサー」と相互交換可能に使用され得る。用語「ｔｒａｃｒメイト配列」はまた、用語「ダイレクトリピート（複数可）」と相互交換可能に使用され得る。
【００５９】
用語「天然に存在しない」または「操作された」は、相互交換可能に使用され、人の手の関与を示す。これらの用語は、核酸分子またはポリペプチドに言及する場合、その核酸分子またはポリペプチドが、天然において天然に会合する、および天然に見出される、少なくとも１つの他の構成要素を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
【００６０】
本明細書で使用する場合、用語「発現」とは、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へと）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡがペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質へと引き続いて翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされるポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と呼ばれ得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ由来である場合、発現は、真核生物細胞中でのｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００６１】
本明細書で使用する場合、用語「処置すること」または「処置」とは、処置されている個体または細胞の疾患過程を変更することを試みる臨床的介入を指し、予防のため、または臨床病理の過程の間のいずれかで、実施され得る。処置の治療効果には、限定なしに、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減退、転移の予防、疾患進行の速度の減少、疾患状態の軽減または寛解、および軽快または改善された予後が含まれる。疾患または障害の進行を予防することによって、処置は、罹患したもしくは診断された被験体、または障害を有する疑いがある被験体における、その障害に起因する悪化を予防できるが、処置はまた、障害のリスクがあるまたは障害を有する疑いがある被験体における、障害または障害の症状の発生を予防し得る。
【００６２】
本明細書で使用する場合、用語「被験体」とは、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類など（例えば、特定の処置のレシピエントである、またはそこから細胞が回収される）が含まれるがこれらに限定されない任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。
【００６３】
本明細書で使用する場合、用語「単離された細胞」とは、その細胞と天然に付随する分子構成要素および／または細胞構成要素から分離された細胞を指す。本明細書で使用する場合、用語「単離された」とは、そのネイティブ状態で見出される場合にそれと通常付随する構成要素を含まない、実質的に含まない、または変動する程度まで本質的に含まない、材料を指す。「単離する」は、元の供給源または周囲からのある程度の分離を指す。
【００６４】
本明細書で使用する場合、用語「細胞集団」とは、類似のまたは異なる表現型を発現する、少なくとも２つの細胞の群を指す。非限定的な例では、細胞集団は、類似のまたは異なる表現型を発現する、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０３個の細胞、少なくとも約１０４個の細胞、少なくとも約１０５個の細胞、少なくとも約１０６個の細胞、少なくとも約１０７個の細胞または少なくとも約１０８個の細胞を含み得る。
【００６５】
本明細書で使用する場合、用語「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破損を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が含まれるがこれらに限定されない種々の方法によって開始され得る。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または粘着末端のいずれかの生成を生じ得る。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドが、標的化された二本鎖ＤＮＡ切断のために使用される。
【００６６】
本明細書で使用する場合、用語「切断ハーフドメイン」とは、第２のポリペプチド（同一または異なるのいずれか）とともに、切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成する、ポリペプチド配列を指す。用語「第１および第２の切断ハーフドメイン」；「＋および−切断ハーフドメイン」および「右側および左側の切断ハーフドメイン」は、ダイマー化する切断ハーフドメインの対を指すために、相互交換可能に使用される。
【００６７】
本明細書で使用する場合、用語「染色体」とは、細胞のゲノムの全てまたは一部分を含むクロマチン複合体を指す。細胞のゲノムは、その細胞のゲノムを含む全ての染色体の集合体であるその核型によってしばしば特徴付けられる。細胞のゲノムは、１つまたは複数の染色体を含み得る。
【００６８】
本明細書で使用する場合、用語「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびにそのような調節配列がコード配列および／または転写された配列に近接するか否かに関わらず、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域、を含む。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位および遺伝子座制御領域が含まれるがこれらに限定されない。
【００６９】
用語「作用的連結」および「作用的に連結した」（または「作動可能に連結した」）は、２またはそれ超の構成要素（例えば、配列エレメント）の並置に関して相互交換可能に使用され、そこでは、該構成要素が配置され、その結果、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうち少なくとも１つが、他方の構成要素のうち少なくとも１つに対して及ぼされる機能を媒介できる可能性が許容される。例示として、プロモーターなどの転写調節配列は、その転写調節配列が、１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応答して、コード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に作用的に連結している。転写調節配列は、一般に、コード配列と、シスで作用的に連結されるが、それと直接近接している必要はない。例えば、エンハンサーは、それらが隣接していない場合であっても、コード配列に作用的に連結した転写調節配列である。
【００７０】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的領域」または「機能的部分」は、その配列が、全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、その全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能をなおも保持する、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的領域は、対応するネイティブ分子よりも多い、それよりも少ない、もしくはそれと同じ数の残基を有し得る、および／または１つもしくは複数のアミノ酸置換もしくはヌクレオチド置換を含有し得る。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当該分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は、周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度−シフトまたは免疫沈降アッセイによって決定され得る。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によってアッセイされ得る。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは遺伝学的および生化学的の両方の補完によって決定され得る。
【００７１】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。用語「エンハンサー」とは、増強された転写を提供することが可能な配列を含有し、一部の場合には、別の制御配列に対するそれらの配向とは独立して機能し得る、ＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサーエレメントと協調的にまたは相加的に機能し得る。
【００７２】
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」とは、適切な制御エレメントと関連する場合に複製が可能であり、細胞中に遺伝子配列を移入させることができる、任意の遺伝エレメント、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどを指す。したがって、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターおよびプラスミドベクターを含む。
【００７３】
本明細書で使用する場合、用語「モジュレートする」とは、正にまたは負に変更することを指す。例示的なモジュレーションには、約１％、約２％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％または約１００％の変化が含まれる。
【００７４】
本明細書で使用する場合、用語「増加させる」とは、約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％または約１００％正に変更することが含まれるがこれらに限定されない、少なくとも約５％正に変更することを指す。
【００７５】
本明細書で使用する場合、用語「低減させる」とは、約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％または約１００％負に変更することが含まれるがこれらに限定されない、少なくとも約５％負に変更することを指す。
【００７６】
本明細書で使用する場合、用語「約」または「およそ」とは、その値が如何にして測定または決定されたか、即ち、測定システムの制約に一部依存する、当業者によって決定される特定の値について、許容可能な誤差範囲内であることを意味する。例えば、「約」とは、当該分野での実務に従って、３標準偏差以内または３よりも大きい標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」とは、所与の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、より好ましくはさらには最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に、生物学的な系またはプロセスに関して、この用語は、ある桁以内（ｗｉｔｈｉｎ  ａｎ  ｏｒｄｅｒ  ｏｆ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）、好ましくはある値の５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。
【００７７】
ＩＩ．インシュレーター
ベクター関連悪性形質転換のいくつかの例が、ベクターにコードされたエンハンサーによる細胞癌遺伝子の活性化と関連して、臨床状況において報告されており（Ｂａｕｍら（２００６年）、Ｎｉｅｎｈｕｉｓら（２００６年）、Ｒａｍｅｚａｎｉら（２００６年））、種々のベクター改変が、ベクター遺伝子毒性を低減させるために実施または提唱されてきた（Ｂａｕｍら（２００６年）、Ｎｉｅｎｈｕｉｓら（２００６年）、Ｒａｍｅｚａｎｉら（２００６年））。クロマチンインシュレーターとして公知のＤＮＡエレメントのクラスは、ベクターの安全性および性能を改善するための１つのアプローチとして認識されている（Ｅｍｅｒｙ（２０１１年））。
【００７８】
インシュレーターは、近接するクロマチンドメイン間の機能的境界を形成することを助ける（ｈｅｌｐ  ｆｒｏｍ）、天然に存在するＤＮＡエレメントである。インシュレーターは、クロマチンを改変するタンパク質に結合し、局所遺伝子発現を変更する。本明細書に記載されるベクター中でのインシュレーターの配置は、以下が含まれるがこれらに限定されない種々の潜在的利益を提供する：１）フランキング染色体による発現の多様位置効果（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ）からのベクターの遮蔽（即ち、位置効果およびベクターサイレンシングを減少させ得るバリア活性）；および２）ベクターによる内因性遺伝子発現の挿入性トランス活性化からフランキング染色体を遮蔽すること（エンハンサー遮断）。２つの基本的なクラスのクロマチンインシュレーターが存在する：（ａ）サイレンシングヘテロクロマチンの、転写を許容する開いたクロマチンの隣接領域中への侵食を遮断するバリアインシュレーター、および（ｂ）隣接領域のエンハンサー媒介性の転写活性化を防止するエンハンサー遮断性インシュレーター。これらの活性を媒介する配列は、物理的に分離可能であり、機構的に別個である（Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａら（２００２年））。クロマチンインシュレーターは、それ自体では固有の転写増強活性または抑圧活性を示さない。このように、これらは、遺伝子移入ベクターと標的細胞ゲノムとの間の相互作用を低減させるための理想的なエレメントを構成する。インシュレーターは、ゲノムまたは遺伝子コンテクスト中に埋め込まれた遺伝子または転写単位の独立した機能を保つ助けをし得、さもなければ、それらの発現は、ゲノムまたは遺伝子コンテクスト内の調節シグナルによって影響を受ける可能性がある（例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ−Ｂｅｕｓｓｅら（２００２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９９巻：１６４３３頁；およびＺｈａｎら（２００１年）Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．、１０９巻：４７１頁を参照のこと）。
【００７９】
ウイルスベクターの挿入性変異誘発によって生じる問題は、遺伝子毒性のリスクがクロマチンインシュレーターの使用によって低減され得ることから明らかなように（Ａｒｕｍｕｇａｍら（２００７年）、Ｅｍｅｒｙ（２０１１年）、Ｅｖａｎｓ−Ｇａｌｅａら（２００７年）、Ｒｉｖｅｌｌａら（２０００年）、Ｅｍｅｒｙら（２０００年）、Ｅｍｅｒｙら（２００２年）、Ｙａｎｎａｋｉら（２００２年）、Ｈｉｎｏら（２００４年）、Ｒａｍｅｚａｎｉら（２００３年）、Ｒａｍｅｚａｎｉら（２００８年））広く公知である（Ｎｉｅｎｈｕｉｓ（２０１３年）、Ｂａｕｍら（２００６年）、Ｎｉｅｎｈｕｉｓら（２００６年））。本明細書で開示される主題は、強力なエンハンサー遮断性インシュレーターである新規インシュレーターを提供し、ある特定のインシュレーターは、バリアインシュレーター活性をさらに有する。脊椎動物では、エンハンサー遮断性インシュレーターの機能は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合因子ＣＴＣＦを介して媒介される（ＧａｓｚｎｅｒおよびＦｅｌｓｅｎｆｅｌｄ（２００６年）、ＷａｌｌａｃｅおよびＦｅｌｓｅｎｆｅｌｄ（２００７年））。一般に、これらのエレメントは、近接するインシュレーターエレメント間のＣＴＣＦ媒介性の相互作用によって、または核内の構造エレメントへのクロマチン線維のＣＴＣＦ媒介性の係留を介して確立される、物理的ループ構造を介して機能すると考えられる。最初に特徴付けられた脊椎動物クロマチンインシュレーターは、ニワトリβ−グロビン遺伝子座制御領域内に位置する。このエレメントは、ＤＮａｓｅ−Ｉ高感受性部位−４（ｃＨＳ４）を含み、ニワトリβ−グロビン遺伝子座の５’境界を構成するようである（Ｐｒｉｏｌｅａｕら（１９９９年）ＥＭＢＯ  Ｊ．  １８巻：４０３５〜４０４８頁）。ｃＨＳ４エレメントを含有する１．２ｋｂ領域は、細胞株中でのグロビン遺伝子プロモーターとエンハンサーとの相互作用を遮断する能力（Ｃｈｕｎｇら（１９９３年）Ｃｅｌｌ、７４巻：５０５〜５１４頁）、ならびにＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ（同文献）、形質転換された細胞株（Ｐｉｋａａｒｔら（１９９８年）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １２巻：２８５２〜２８６２頁）およびトランスジェニック哺乳動物（Ｗａｎｇら（１９９７年）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５巻：２３９〜２４３頁；Ｔａｂｏｉｔ−Ｄａｍｅｒｏｎら（１９９９年）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．、８巻：２２３〜２３５頁）において、位置効果から発現カセットを保護する能力を含む、古典的なインシュレーター活性を示す。この活性の多くは、２５０ｂｐ領域中に含有される。このストレッチ内には、エンハンサー遮断アッセイに関与するジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質ＣＴＣＦ（Ｂｅｌｌら（１９９９年）Ｃｅｌｌ、９８巻：３８７〜３９６頁）と相互作用する、４９ｂｐのｃＨＳ４エレメント（Ｃｈｕｎｇら（１９９７年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９４巻：５７５〜５８０頁）がある。
【００８０】
ｃＨＳ４などのインシュレーターは、エンハンサーとプロモーターとの間の相互作用を、それがこれらのエレメント間に配置された場合、遮断できる（Ｅｖａｎｓ−Ｇａｌｅａら（２００７年）、Ｃｈｕｎｇら（１９９７年）、Ｂｅｌｌら（１９９９年）、Ｒｙｕら（２００７年）、Ｒｙｕら（２００８年））。いくつかの研究により、ガンマレトロウイルスベクター（Ｅｖａｎｓ−Ｇａｌｅａら（２００７年）、Ｒｉｖｅｌｌａら（２０００年）、Ｅｍｅｒｙら（２０００年）、Ｅｍｅｒｙら（２００２年）、Ｙａｎｎａｋｉら（２００２年）、Ｈｉｎｏら（２００４年）、Ｒａｍｅｚａｎｉら（２００６年）、Ｙａｏら（２００３年）、Ｎｉｓｈｉｎｏら（２００６年）、Ａｋｅｒら（２００７年）、ＬｉおよびＥｍｅｒｙ（２００８年））およびレンチウイルスベクター（Ｂａｎｋら（２００５年）、Ａｒｕｍｕｇａｍら（２００７年）、Ｐｕｔｈｅｎｖｅｅｔｉｌら（２００４年）、Ｅｖａｎｓ−Ｇａｌｅａら（２００７年）、Ｒａｍｅｚａｎｉら（２００３年）、Ａｋｅｒら（２００７年）、Ｍａら（２００３年）、Ｃｈａｎｇら（２００５年）、Ｐｌｕｔａら（２００５年））の位置効果サイレンシングを低減させるｃＨＳ４インシュレーターの能力が実証されている。これらの適切に設計された研究により、１．２ｋｂバージョンのｃＨＳ４インシュレーターを含めることが、少なくとも一部の状況において、ベクター導入遺伝子発現の見込みおよび／または一貫性を増加させたことが実証された（Ａｒｕｍｕｇａｍら（２００７年）、Ｅｍｅｒｙ（２０１１年）、Ｅｖａｎｓ−Ｇａｌｅａら（２００７年）、Ｅｍｅｒｙら（２００２年）、Ｙａｎｎａｋｉら（２００２年）、Ｈｉｎｏら（２００４年）、Ｒａｍｅｚａｎｉら（２００６年）、Ａｋｅｒら（２００７年）、ＬｉおよびＥｍｅｒｙ（２００８年）、Ｐｌｕｔａら（２００５年）．Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら（２００４年））。それにもかかわらず、ｃＨＳ４インシュレーターによって与えられる保護の程度は、完全にはほど遠い。さらに、１．２ＫｂのｃＨＳ４を含めることは、ベクター力価に悪影響を与え得るが、最も小さいｃＨＳ４コアは無効であると証明されている（Ａｋｅｒら（２００７年）、Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら（２００４年））。対照的に、本明細書で開示される主題のインシュレーターは、ウイルスベクターの力価に悪影響を与えず、ｃＨＳ４インシュレーターよりも強力かつ有効である。
【００８１】
本明細書で開示されるインシュレーターは、ゲノムアプローチを介して、例えば、ヒトゲノムの強力なエンハンサー遮断因子およびバリアインシュレーターであるインシュレーターを同定するためのゲノムアプローチを使用して、同定される。本明細書で開示されるインシュレーターは、遺伝子治療（例えば、幹細胞遺伝子治療、グロビン遺伝子治療）の安全性を増強する。ヘモグロビン異常症の遺伝子治療のために、強力なエンハンサーが、治療レベルのグロビン遺伝子発現を達成するために必要とされる。したがって、強力なインシュレーターは、組込みベクターの強力なエンハンサーからゲノム環境を保護するための１つの手段を提示する。
【００８２】
本明細書で開示されるインシュレーターは、強力なエンハンサー遮断活性を有する。例えば、限定目的ではなく、本開示のインシュレーターは、エンハンサーエレメントの活性を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％低減させ得る。ある特定の実施形態では、これらのインシュレーターは、エンハンサー遮断活性に加えて、バリア活性を有する。本明細書で開示されるインシュレーターは、ウイルスベクターと関連する挿入性変異誘発および遺伝子毒性のリスクを実質的に減少させる。さらに、本明細書で開示されるインシュレーターがベクター中に取り込まれる場合、このインシュレーターは、ベクターのベクター力価に悪影響を与えない。ある特定の実施形態では、これらのインシュレーター（例えば、インシュレーターＡ１）は、グロビン遺伝子またはその機能的部分のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を増加させる。
【００８３】
ある特定の実施形態では、このインシュレーターは、転写リプレッサーＣＴＣＦ結合部位を含み、これは、以下に提供される配列番号１８に示されるヌクレオチド配列を有する：
【化１】
2020079327.tif 000003
。
【００８４】
非限定的な一実施形態では、このインシュレーターは、以下に提供される配列番号１に示されるヌクレオチド配列、または配列番号１に対して少なくとも約９５パーセント相同もしくは少なくとも約９８パーセント同一（相同）である配列を有する。配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するこのインシュレーターは、インシュレーターＡ１と称される。
【化２】
2020079327.tif 000004
【００８５】
ある特定の実施形態では、このインシュレーターは、配列番号２４に示されるヌクレオチド配列、または配列番号２４に対して少なくとも約９５パーセント同一もしくは少なくとも約９８パーセント同一である配列を含む。
【化３】
2020079327.tif 000005
【００８６】
ある特定の実施形態では、このインシュレーターは、配列番号２５に示されるヌクレオチド配列（これは、配列番号１の逆相補体である）、または配列番号２５に対して少なくとも約９５パーセント同一もしくは少なくとも約９８パーセント同一である配列を含む。
【化４】
2020079327.tif 000006
【００８７】
ある特定の実施形態では、このインシュレーターは、第１染色のｈｇ１８座標７６２２９９３３〜７６２３０１１５に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００８８】
ある特定の実施形態では、このインシュレーターは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ第１染色体クローンＲＰ１１−５５０Ｈ２、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ０９２８１３．２の、残基６８０４１と６８１６０との間、もしくは残基６８０４１と６８２１０との間、もしくは残基６８０４１と６８２８０との間、もしくは残基６８００５と６８３０５との間のヌクレオチド配列、またはそれらに対して少なくとも９５もしくは９８パーセント同一な配列を含む。
【００８９】
ＩＩＩ．発現カセット
本明細書で開示される主題は、１つまたは複数の上に開示したインシュレーター（例えば、インシュレーターＡ１）を含む発現カセットを提供する。ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するインシュレーターを少なくとも１つ、およびβ−グロビンＬＣＲ領域に作動可能に連結したグロビン遺伝子またはその機能的部分を含む。
【００９０】
β−グロビンＬＣＲ領域
ヒトβ−グロビン遺伝子クラスターは、多くの嗅覚受容体遺伝子アレイのうち１つの内に埋め込まれた５つの遺伝子からなる（Ｂｕｌｇｅｒら、ＰＮＡＳ（１９９９年）；９６巻：５１２９〜５１３４頁）。このクラスターは、染色体１１ｐ１５．４上の８０ｋｂに及び、５つの発現されるβ様遺伝子、および個体発生の間のそれらの段階特異的発現を指示するシス作用性調節エレメントを含む（Ｆｏｒｇｅｔ（２００１年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｂｅｔａ  Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ  ＭＨら編、Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）。これらの遺伝子は、それらの発生上の発現の順序、５’−ε−Ｇγ−Ａγ−ψη−δ−β−３’で配置されている（Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓら（２００１年）Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ．、Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｇら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｗ．Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）。α様グロビン遺伝子クラスター（５’−ξ２−ψξ１−ψα２−ψα１−α２−α１−θ−３’）は、第１６染色体の短腕のテロメアに非常に近い位置にあり、約４０ｋｂに及ぶ。これら２つの独立したクラスター内にコードされる遺伝子の発現は、赤血球系細胞に限定され、β−グロビン様鎖のアウトプットがα鎖のものと一致するように、バランスがとられる。この微調整されたバランスは、転写レベル、転写後レベルおよび翻訳後レベルで調節される。
【００９１】
発生段階特異的発現は、いくつかの近位または遠位のシス作用性エレメントおよびそれらに結合する転写因子によって制御される。β−グロビン遺伝子（ＨＢＢ）の場合、近位調節エレメントは、β−グロビンプロモーターおよび２つの下流エンハンサーを含み、一方のエンハンサーはβ−グロビンの２番目のイントロン中に位置し、他方のエンハンサーはこの遺伝子のおよそ８００ｂｐ下流に位置する（Ａｎｔｏｎｉｏｕら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８８年）；７巻：３７７〜３８４頁；Ｔｒｕｄｅｌら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．（１９８７年）；１巻：９５４〜９６１頁；Ｔｒｕｄｅｌら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．（１９８７年）；７巻：４０２４〜４０２９頁）。最も卓越した遠位調節エレメントは、ＨＢＢの５０〜６０ｋｂ上流に位置し、赤血球系細胞におけるＤＮａｓｅＩに対する増大した感受性を有するいくつかのサブ領域から構成される、β−グロビンＬＣＲである（Ｆｏｒｇｅｔ（２００１年）；Ｇｒｏｓｖｅｌｄら、Ｃｅｌｌ（１９８７年）；５１巻：９７５〜９８５頁；Ｔａｌｂｏｔら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９年）；３３８巻：３５２頁）。ＬＣＲの最も卓越した特性は、その強い転写増強活性である。第１１染色体上のヒトβ−グロビン領域の例示的なヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号１９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＧ＿０００００７．３）に示される：
【化５】
2020079327.tif 000007
【化６】
2020079327.tif 000008
【化７】
2020079327.tif 000009
【化８】
2020079327.tif 000010
【化９】
2020079327.tif 000011
【化１０】
2020079327.tif 000012
【化１１】
2020079327.tif 000013
【化１２】
2020079327.tif 000014
【化１３】
2020079327.tif 000015
【化１４】
2020079327.tif 000016
【化１５】
2020079327.tif 000017
【化１６】
2020079327.tif 000018
【化１７】
2020079327.tif 000019
【化１８】
2020079327.tif 000020
【化１９】
2020079327.tif 000021
【化２０】
2020079327.tif 000022
【化２１】
2020079327.tif 000023
【化２２】
2020079327.tif 000024
【００９２】
５つの５’高感受性部位（ＨＳ）部位（ＨＳ１〜ＨＳ５）および１つの３’ＨＳ部位が、ヒトβ−グロビンＬＣＲにおいて同定されている（Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓら（２００１年））。５’ＨＳ１〜４は、Ｄｎａｓｅ  Ｉ高感受性部位である。ＨＳ２およびＨＳ３エレメントは、多くのグループが裏付けたように、ＬＣＲ内の最も強力な単一のエレメントである（Ｅｌｌｉｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９６年）、１５巻：５６２〜５６８頁；Ｃｏｌｌｉｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９０年）９巻：２３３〜２４０頁）。トランスジェニックマウスにおいてβＹＡＣの環境においてＨＳ２を欠失させることは、ＨＳ部位形成、および全ての発生段階における全てのヒトβ−グロビン遺伝子の発現に、大きく影響を与える（Ｂｕｎｇｅｒｔら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９９年）；１９巻：３０６２〜３０７２頁）。ＨＳ２の欠失は、卵黄嚢由来赤血球における胚性εｙおよびβｈｉグロビン遺伝子の発現を最小限に低減させたことが報告された（Ｌｅｙら、Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（１９９８年）；８５０巻：４５〜５３頁；Ｈｕｇら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９６年）；２６巻：２９０６〜２９１２頁）。ＨＳ２は、主にエンハンサーとして機能する。
【００９３】
ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ２領域を含む。非限定的な一例では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ２領域、ＨＳ３領域およびＨＳ４領域を含む。ある特定の実施形態では、β−グロビンＬＣＲ領域内のＨＳ２領域、ＨＳ３領域およびＨＳ４領域は、隣接している。非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ２領域、ＨＳ３領域およびＨＳ４領域から本質的になる。別の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ３領域とＨＳ４領域との間の接合部において、２つの導入されたＧＡＴＡ−１結合部位を含む。ＨＳ３領域は、ＨＳ２領域とＨＳ４領域との間に存在し得る。ＨＳ２領域の長さおよび配列は、変動し得る。このＨＳ２領域は、約４００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、例えば、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、または約９００ｂｐ〜約１０００ｂｐの長さを有し得る。非限定的な一実施形態では、このＨＳ２領域は、８６０ｂｐの長さを有する。非限定的な一例では、このＨＳ２領域は、以下に提供される配列番号９に示されるヌクレオチド配列を有する：
【化２３】
2020079327.tif 000025
【００９４】
ある特定の実施形態では、このＨＳ２領域は、約８４０ｂｐの長さを有する。ある特定の実施形態では、このＨＳ２領域は、約６５０ｂｐ（例えば、６４６ｂｐ）の長さを有する。ある特定の実施形態では、このＨＳ２領域は、約４２０ｂｐ（例えば、４２３ｂｐ）の長さを有する。
【００９５】
ＨＳ３領域の長さおよび配列は、変動し得る。このＨＳ３領域は、約２００ｂｐ〜約１４００ｂｐ、例えば、約２００ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約１０００ｂｐ〜約１１００ｂｐ、約１１００ｂｐ〜約１２００ｂｐ、約１２００ｂｐ〜約１３００ｂｐ、または約１３００ｂｐ〜約１４００ｂｐの長さを有し得る。ある特定の実施形態では、このＨＳ３領域は、約１３００ｂｐの長さを有する。非限定的な一実施形態では、このＨＳ３領域は、１３０８ｂｐの長さを有する。非限定的な一実施形態では、このＨＳ３領域は、１３０１ｂｐの長さを有する。非限定的な一例では、このＨＳ３領域は、以下に提供される配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有する：
【化２４】
2020079327.tif 000026
【００９６】
ある特定の実施形態では、このＨＳ３領域は、約８５０ｂｐ（例えば、８４５ｂｐ）の長さを有する。ある特定の実施形態では、このＨＳ３領域は、約２８０ｂｐ〜約２９０ｂｐ（例えば、２８０ｂｐおよび２８７ｂｐ）の長さを有する。
【００９７】
同様に、ＨＳ４領域の長さおよび配列は、変動し得る。このＨＳ４領域は、約２００ｂｐ〜約１２００ｂｐ、例えば、約２００ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約１０００ｂｐ〜約１１００ｂｐ、または約１１００ｂｐ〜約１２００ｂｐの長さを有し得る。
【００９８】
ある特定の実施形態では、このＨＳ４領域は、約１．０ｋｂまたはそれ超の長さを有する。ある特定の実施形態では、このＨＳ４領域は、約１．１ｋｂの長さを有する。ある特定の実施形態では、このＨＳ４領域は、約１１５０ｂｐ（例えば、１１５３ｂｐ）の長さを有する。非限定的な一実施形態では、このＨＳ４領域は、１０６５ｂｐの長さを有する。非限定的な一例では、このＨＳ４領域は、以下に提供される配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有する：
【化２５】
2020079327.tif 000027
【００９９】
非限定的な一例では、このＨＳ４領域は、以下に提供される配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有する：
【化２６】
2020079327.tif 000028
【０１００】
ある特定の実施形態では、このＨＳ４領域は、約１．０ｋｂ未満、例えば、約９００ｂｐ未満、約７００ｂｐ未満、約６００ｂｐ未満または約５００ｂｐ未満の長さを有する。ある特定の実施形態では、このＨＳ４領域は、約５００ｂｐ未満の長さを有する。ある特定の実施形態では、このＨＳ４領域は、約４５０ｂｐの長さを有する。非限定的な一実施形態では、このＨＳ４領域は、約４４６ｂｐの長さを有する。非限定的な一例では、このＨＳ４領域は、以下に提供される配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有する：
【化２７】
2020079327.tif 000029
【０１０１】
ある特定の実施形態では、このＨＳ４領域は、約２８０ｂｐ（例えば、２８３ｂｐ）の長さを有する。ある特定の実施形態では、このＨＳ４領域は、約２４０ｂｐ（例えば、２４３ｂｐ）の長さを有する。
【０１０２】
ある特定の非限定的な実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、配列番号９、配列番号２０または配列番号２１に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ２領域、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域、および配列番号６、配列番号７または配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含む。
【０１０３】
非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、図１に示すように、配列番号９に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ２領域、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域および配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含む。
【０１０４】
別の非限定的な実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ１領域をさらに含む、即ち、β−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ１領域、ＨＳ２領域、ＨＳ３領域およびＨＳ４領域を含む。ある特定の実施形態では、β−グロビンＬＣＲ領域内のＨＳ１領域、ＨＳ２領域、ＨＳ３領域およびＨＳ４領域は、隣接している。非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ１領域、ＨＳ２領域、ＨＳ３領域およびＨＳ４領域から本質的になる。別の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ３領域とＨＳ４領域との間の接合部において、２つの導入されたＧＡＴＡ−１結合部位を含む。
【０１０５】
ＨＳ１領域の長さおよび配列は、変動し得る。ある特定の実施形態では、このＨＳ１領域は、約３００ｂｐ〜約１５００ｂｐの長さ、例えば、約３００ｂｐ〜約１１００ｂｐの長さである。ある特定の実施形態では、このＨＳ１領域は、約１．０ｋｂまたはそれ超、例えば、約１．１ｋｂ、約１．２ｋｂ、約１．３ｋｂ、約１．４ｋｂまたは約１．５ｋｂの長さを有する。ある特定の実施形態では、このＨＳ１領域は、約１．１ｋｂの長さを有する。非限定的な一例では、このＨＳ１領域は、１０７４ｂｐの長さを有する。非限定的な一例では、このＨＳ１領域は、以下に提供される配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有する：
【化２８】
2020079327.tif 000030
【０１０６】
ある特定の実施形態では、このＨＳ１領域は、約１．０ｋｂ未満、例えば、約４００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、または約９００ｂｐ〜約１．０ｋｂの長さを有する。ある特定の実施形態では、このＨＳ１領域は、約７００ｂｐ未満の長さを有する。ある特定の実施形態では、このＨＳ１領域は、約６００ｂｐの長さを有する。非限定的な一実施形態では、このＨＳ１領域は、６０２ｂｐの長さを有する。非限定的な一例では、このＨＳ１領域は、以下に提供される配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する：
【化２９】
2020079327.tif 000031
【０１０７】
ある特定の実施形態では、このＨＳ１領域は、約５００ｂｐ未満の長さを有する。ある特定の実施形態では、このＨＳ１領域は、約４９０ｂｐの長さを有する。非限定的な一実施形態では、このＨＳ１領域は、４８９ｂｐの長さを有する。非限定的な一例では、このＨＳ１領域は、以下に提供される配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する：
【化３０】
2020079327.tif 000032
【０１０８】
最近の研究により、ＨＳ２は赤血球系特異的ではないが、他の細胞株および系統において発現され（実施例３および図７を参照のこと）、未分化のヒト胚性幹細胞中にも存在する（Ｃｈａｎｇら、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１３年）；９巻：３９７〜４０７頁）ことが示されている。ＨＳ２の非赤血球系活性に起因して、ＨＳ２含有グロビンベクターは、例えば、サラセミアおよび鎌状赤血球患者を処置するための臨床的処置におけるそれらの安全な使用に対してリスクをもたらし得る。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ２領域を含まない。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ２のコア配列を含まない。ＨＳ２のコア配列は、位置非依存的な高レベルの発現を提供する。さらに、ＨＳ２のコア配列は、ＨＳ２のエンハンサー活性を維持する。例えば、ＨＳ２のコア配列は、グロビン遺伝子（例えば、ヒトβ−グロビン遺伝子）の転写を増強する。さらに、ＨＳ２のコア配列は、ＡＰ１ファミリーのタンパク質のメンバー（例えば、ＮＦ−Ｅ２）、ＧＡＴＡ−１（「ＮＦ−Ｅ１」または「ＮＦＥ１」としても公知）、クルッペル様Ｚｎフィンガータンパク質（例えば、遍在性タンパク質Ｓｐ１およびＹＹ１、ならびに赤血球系限定的因子赤血球系クルッペル様因子（ＥＫＬＦ））および塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）タンパク質（Ｅボックス）（例えば、ＵＳＦおよびＴＡＬ１）が含まれるがこれらに限定されない遍在性および組織特異的（例えば、赤血球系特異的）タンパク質（例えば、転写因子）に対する、１つまたは複数の結合部位または結合モチーフを含む。ＡＰ１結合部位は、増強および誘導のために必要とされる（ＭｏｉおよびＫａｎ（１９９０年）；Ｎｅｙら（１９９０年）；ＴａｌｂｏｔおよびＧｒｏｓｖｅｌｄ（１９９１年））。さらに、ＮＦ−Ｅ２の結合は、ＨＳ２において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再構成されたクロマチンの破壊を引き起こし得る（ＡｒｍｓｔｒｏｎｇおよびＥｍｅｒｓｏｎ（１９９６年））。ＧＡＴＡ−１結合部位における変異は、トランスジェニックマウスにおいてＨＳ２のエンハンサー活性の低減を引き起こし得る（Ｃａｔｅｒｉｎａら（１９９４年））。ＡＰ１（例えば、ＡＰ１／ＮＦ−Ｅ２）結合部位およびＧＡＴＡ１結合部位の両方がコア機能にとって重要であるものの、これらの因子を欠くマウスは、障害されたグロビン遺伝子発現を示さない（Ｗｅｉｓｓら、１９９４年）。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ２のコア配列の全長を含まない。ある特定の実施形態では、ＨＳ２領域のコア配列は、ヒトＨＳ２のコア配列である。非限定的な一実施形態では、ヒトＨＳ２のコア配列は、ＡＰ１ファミリーのタンパク質のメンバー（例えば、ＮＦ−Ｅ２）（「ＡＰ１／ＮＦ−Ｅ２」結合部位と呼ばれる）に対する結合部位のタンデム対（例えば、ＧＣＴＧＡＧＴＣＡおよびＧＡＴＧＡＧＴＣＡ）、クルッペル様Ｚｎフィンガータンパク質に対する１つの結合部位（例えば、ＡＧＧＧＴＧＴＧＴ）、１つのＧＡＴＡ−１結合部位（例えば、ＣＴＡＴＣＴ）、および３つのＥボックス（ＣＡＮＮＴＧ、例えば、ＣＡＧＡＴＧおよびＣＡＣＣＴＧ）を含む。非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、以下に提供される配列番号２０に示されるヌクレオチド配列を有する、ヒトＨＳ２の３８８ｂｐのコア配列の全長を含まない：
【化３１】
2020079327.tif 000033
【０１１０】
配列番号２０に示されるヌクレオチド配列は、配列番号１９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＧ＿０００００７．３）のヌクレオチド１６６７１位〜１７０５８位に対応する。配列番号２０では、ＧＣＴＧＡＧＴＣＡのヌクレオチド配列を有する１つのＡＰ１／ＮＦ−Ｅ２結合部位は、１７５位〜１８３位に位置し、ＧＡＴＧＡＧＴＣＡのヌクレオチド配列を有する１つのＡＰ１／ＮＦ−Ｅ２結合部位は、１８５位〜１９３位に位置し、ＡＧＧＧＴＧＴＧＴのヌクレオチド配列を有する、クルッペル様Ｚｎフィンガータンパク質に対する１つの結合部位は、２０５位〜２１３位に位置し、その各々がＣＡＧＡＴＧのヌクレオチド配列を有する２つのＥボックスは、２１７位〜２２２位および２７８位〜２８３位に位置し、ＣＴＡＴＣＴのヌクレオチド配列を有する１つのＧＡＴＡ−１結合部位は、２４６位〜２５１位に位置し、ＣＡＣＣＴＧのヌクレオチド配列を有する１つのＥボックスは、３０６位〜３１１位に位置する。
【０１１１】
非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、以下に提供される配列番号２１に示されるヌクレオチド配列を有する、ヒトＨＳ２の３８７ｂｐのコア配列の全長を含まない：
【化３２】
2020079327.tif 000034
【０１１２】
配列番号２１では、ＧＣＴＧＡＧＴＣＡのヌクレオチド配列を有する１つのＡＰ１／ＮＦ−Ｅ２結合部位は、１７５位〜１８３位に位置し、ＧＡＴＧＡＧＴＣＡのヌクレオチド配列を有する１つのＡＰ１／ＮＦ−Ｅ２結合部位は、１８５位〜１９３位に位置し、ＡＧＧＧＴＧＴＧＴのヌクレオチド配列を有する、クルッペル様Ｚｎフィンガータンパク質に対する１つの結合部位は、２０４位〜２１２位に位置し、その各々がＣＡＧＡＴＧのヌクレオチド配列を有する２つのＥボックスは、２１６位〜２２１位および２７７位〜２８２位に位置し、ＣＴＡＴＣＴのヌクレオチド配列を有する１つのＧＡＴＡ−１結合部位は、２４５位〜２５０位に位置し、ＣＡＣＣＴＧのヌクレオチド配列を有する１つのＥボックスは、３０５位〜３１０位に位置する。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ２のコア配列を含むＨＳ２領域を含まない。ＨＳ２のコア配列を含むＨＳ２領域は、長さおよび配列が変動し得る。非限定的な例では、ＨＳ２のコア配列を含むＨＳ２領域は、約４００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、例えば、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、または約９００ｂｐ〜約１０００ｂｐの長さである。非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、８４０ｂｐのＨＳ２領域（例えば、米国特許第７，５４１，１７９号に開示されるグロビンベクターＴＮＳ９中に含まれるＨＳ２領域）を含まない。非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、８６０ｂｐのＨＳ２領域を含まない。非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、約６５０ｂｐのＨＳ２領域を含まない。非限定的な一例では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、６４６ｂｐのＨＳ２領域（例えば、「β８７」としても公知の、グロビンベクターＬｅｎｔｉＧｌｏｂｉｎ（商標）中に含まれるＨＳ２領域）を含まない。非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、約４２０ｂｐのＨＳ２領域を含まない。非限定的な一例では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、４２３ｂｐのＨＳ２領域（例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）（１９９５年）；９２巻：６７２８〜６７３２頁に開示されるグロビンベクター中に含まれるＨＳ２領域）を含まない。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ２のエンハンサー活性を維持するＨＳ２領域を含まない。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、グロビン遺伝子（例えば、ヒトβ−グロビン遺伝子）の転写を増強することが可能なＨＳ２領域を含まない。非限定的な例では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、グロビン遺伝子（例えば、ヒトβ−グロビン遺伝子）の転写を増強するその能力が、ネイティブＨＳ２領域と比較して６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上であるＨＳ２領域を含まない。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、以下の結合部位のうち１、２、３、４、５、６または７つを含むＨＳ２領域を含まない：２つの（タンデム対の）ＡＰ１／ＮＦ−Ｅ２結合部位（例えば、ＧＣＴＧＡＧＴＣＡおよびＧＡＴＧＡＧＴＣＡ）、クルッペル様Ｚｎフィンガータンパク質に対する１つの結合部位（例えば、ＡＧＧＧＴＧＴＧＴ）、１つのＧＡＴＡ−１結合部位（例えば、ＣＴＡＴＣＴ）、および３つのＥボックス（ＣＡＮＮＴＧ、例えば、ＣＡＧＡＴＧおよびＣＡＣＣＴＧ）。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、上記結合部位のうち６つを含むＨＳ２領域を含まない。例えば、ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、２つのＡＰ１／ＮＦ−Ｅ２結合部位、クルッペル様Ｚｎフィンガータンパク質に対する１つの結合部位、１つのＧＡＴＡ−１結合部位、および３つではなく２つのＥボックスを含むＨＳ２領域を含まない。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、２つではなく１つのＡＰ１／ＮＦ−Ｅ２結合部位、クルッペル様Ｚｎフィンガータンパク質に対する１つの結合部位、１つのＧＡＴＡ−１結合部位、および３つのＥボックスを含むＨＳ２領域を含まない。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、２つのＡＰ１／ＮＦ−Ｅ２結合部位、１つのＧＡＴＡ−１結合部位、および３つのＥボックスを含み、クルッペル様Ｚｎフィンガータンパク質に対する１つの結合部位を含まないＨＳ２領域を含まない。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、２つのＡＰ１／ＮＦ−Ｅ２結合部位、クルッペル様Ｚｎフィンガータンパク質に対する１つの結合部位、および３つのＥボックスを含み、１つのＧＡＴＡ−１結合部位を含まないＨＳ２領域を含まない。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ１領域、ＨＳ３領域およびＨＳ４領域を含み、ＨＳ２領域を含まない。ある特定の実施形態では、β−グロビンＬＣＲ領域内のＨＳ１領域、ＨＳ３領域およびＨＳ４領域は、隣接している。非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ１領域、ＨＳ３領域およびＨＳ４領域から本質的になる。別の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ３領域とＨＳ４領域との間の接合部において、２つの導入されたＧＡＴＡ−１結合部位を含む。このＨＳ３領域は、ＨＳ１領域とＨＳ４領域との間に存在し得る。
【０１１７】
ある特定の非限定的な実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２２または配列番号２３に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ１領域、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域、および配列番号６、配列番号７または配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含み、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ２領域を含まない。
【０１１８】
非限定的な一実施形態では、図２に示すように、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ１領域、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域および配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含み、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ２領域を含まない。
【０１１９】
非限定的な一実施形態では、図３に示すように、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ１領域、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域および配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含み、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ２領域を含まない。
【０１２０】
非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ１領域、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域および配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含み、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ２領域を含まない。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ１領域もＨＳ２領域も含まない。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ１のコア配列を含まない。ＨＳ１のコア配列は、ＨＳ１の活性、例えばエンハンサー活性を維持し、または他のＨＳ領域、例えばＨＳ２〜４のエンハンサー活性を係留するための促進因子もしくは調節エレメントとして機能する。さらに、ＨＳ１のコア配列は、ＧＡＴＡ−１およびクルッペル様Ｚｎフィンガータンパク質（例えば、赤血球系限定的因子ＥＫＬＦ）が含まれるがこれらに限定されない遍在性および組織特異的（例えば、赤血球系特異的）タンパク質（例えば、転写因子）に対する、１つまたは複数の結合部位または結合モチーフを含む。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ１のコア配列の全長を含まない。ある特定の実施形態では、ＨＳ１領域のコア配列は、ヒトＨＳ１のコア配列である。非限定的な一実施形態では、ヒトＨＳ１のコア配列は、２つのＧＡＴＡ−１結合部位（例えば、ＴＴＡＴＣＴおよびＣＴＡＴＣＡ）、およびＥＫＬＦに対する１つの結合部位（例えば、ＣＣＡＣＡＣＡＣＡ）を含む。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ヒトＨＳ１の２８６ｂｐのコア配列の全長を含まない。非限定的な一実施形態では、ヒトＨＳ１の２８６ｂｐのコア配列は、以下に提供される配列番号２２に示されるヌクレオチド配列を有する：
【化３３】
2020079327.tif 000035
【０１２３】
配列番号２２では、ＴＴＡＴＣＴのヌクレオチド配列を有する１つのＧＡＴＡ−１結合部位は、１７３位〜１７８位に位置し、ＣＴＡＴＣＡのヌクレオチド配列を有する１つのＧＡＴＡ−１結合部位は、２１０位〜２１５位に位置し、ＣＣＡＣＡＣＡＣＡのヌクレオチド配列を有する、ＥＫＬＦに対する１つの結合部位は、１８３位〜１９１位に位置する。
【０１２４】
別の非限定的な一実施形態では、ヒトＨＳ１の２８６ｂｐのコア配列は、以下に提供される配列番号２３に示されるヌクレオチド配列を有する：
【化３４】
2020079327.tif 000036
【０１２５】
配列番号２３に示されるヌクレオチド配列は、配列番号１９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＧ＿０００００７．３）のヌクレオチド２１４８１位〜２１７６６位に対応する。配列番号２３では、ＴＴＡＴＣＴのヌクレオチド配列を有する１つのＧＡＴＡ−１結合部位は、１７３位〜１７８位に位置し、ＣＴＡＴＣＡのヌクレオチド配列を有する１つのＧＡＴＡ−１結合部位は、２１０位〜２１５位に位置し、ＣＣＡＣＡＣＡＣＡのヌクレオチド配列を有する、ＥＫＬＦに対する１つの結合部位は、１８３位〜１９１位に位置する。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ１のコア配列を含むＨＳ１領域を含まない。ＨＳ１のコア配列を含むＨＳ１領域は、長さおよび配列が異なり得る。非限定的な例では、ＨＳ１のコア配列を含むＨＳ１領域は、約３００ｂｐ〜約１２００ｂｐ、例えば、約３００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約１０００ｂｐ〜約１１００ｂｐ、または約１１００ｂｐ〜約１２００ｂｐの長さである。非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、約１．０ｋｂ  ｂｐのＨＳ１領域を含まない。非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、約１．１ｋｂのＨＳ１領域を含まない。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ１の活性、例えばエンハンサー活性を維持し、または他のＨＳ領域、例えばＨＳ２〜４のエンハンサー活性を係留するための促進因子もしくは調節エレメントとして機能するＨＳ１領域を含まない。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、グロビン遺伝子（例えば、ヒトβ−グロビン遺伝子）の転写を増強することが可能なＨＳ１領域を含まない。非限定的な例では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、グロビン遺伝子（例えば、ヒトβ−グロビン遺伝子）の転写を増強するその能力が、ネイティブＨＳ１領域と比較して６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上であるＨＳ１領域を含まない。非限定的な例では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ２〜ＨＳ４のうち１種または複数種のエンハンサー活性を係留するその能力が、ネイティブＨＳ１領域と比較して６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上であるＨＳ１領域を含まない。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、以下の結合部位のうち１、２または３つを含むＨＳ１領域を含まない：２つのＧＡＴＡ−１結合部位（例えば、ＴＴＡＴＣＴおよびＣＴＡＴＣＡ）、およびＥＫＬＦに対する１つの結合部位（例えば、ＣＣＡＣＡＣＡＣＡ）。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、上記結合部位のうち２つを含むＨＳ１領域を含まない。例えば、ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、２つのＧＡＴＡ−１結合部位を含み、ＥＫＬＦに対する１つの結合部位を含まないＨＳ１領域を含まない。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、２つではなく１つのＡＰ１／ＮＦ−Ｅ２結合部位およびＥＫＬＦに対する１つの結合部位を含むＨＳ１領域を含まない。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ３領域およびＨＳ４領域を含み、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ１領域もＨＳ２領域も含まない。ある特定の実施形態では、β−グロビンＬＣＲ領域内のＨＳ３領域およびＨＳ４領域は、隣接している。非限定的な一実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ３領域およびＨＳ４領域から本質的になる。別の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ３領域とＨＳ４領域との間の接合部において、２つの導入されたＧＡＴＡ−１結合部位を含む。このＨＳ３領域は、グロビン遺伝子またはその機能的部分とＨＳ４領域との間に存在し得る。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域、および配列番号６、配列番号７または配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含み、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ１領域もＨＳ２領域も含まない。
【０１３１】
非限定的な一実施形態では、図４に示すように、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域および配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含み、このβ−グロビンＬＣＲ領域は、ＨＳ１領域もＨＳ２領域も含まない。
【０１３２】
グロビン遺伝子
本明細書で開示される主題によれば、発現カセットは、グロビン遺伝子またはその機能的部分を含む。このグロビン遺伝子は、β−グロビン遺伝子、γ−グロビン遺伝子またはδ−グロビン遺伝子であり得る。ある特定の実施形態では、この発現カセットは、ヒトβ−グロビン遺伝子を含む。本明細書で開示される主題によれば、このヒトβ−グロビン遺伝子は、野生型ヒトβ−グロビン遺伝子、イントロン配列の１つまたは複数の欠失を含む、欠失したヒトβ−グロビン遺伝子、または少なくとも１つの抗鎌状化アミノ酸残基をコードする、変異したヒトβ−グロビン遺伝子であり得る。非限定的な一実施形態では、本明細書で開示される発現カセットは、野生型ヒトβ−グロビン遺伝子を含む。別の実施形態では、本明細書で開示される発現カセットは、コドン８７におけるスレオニンからグルタミンへの変異をコードするヒトβＡ−グロビン遺伝子（βＡ−Ｔ８７Ｑ）を含む。ガンマ−グロビン鎖中の８７位のグルタミン残基は、成人のベータ鎖の酸素結合特徴を保ちつつ、ベータ鎖と比較してガンマ鎖の抗鎌状化活性を増進する（Ｎａｇｅｌら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７９年）；７６巻：６７０〜６７２頁）。ある特定の実施形態では、グロビン遺伝子の機能的部分は、対応する野生型参照ポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１３３】
プロモーターおよびエンハンサー
本明細書で開示される主題によれば、この発現カセットは、β−グロビンプロモーターをさらに含み得る。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンプロモーターは、グロビン遺伝子またはその機能的部分とβ−グロビンＬＣＲ領域との間に置かれるる。このβ−グロビンプロモーターの長さおよび配列は、変動し得る。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンプロモーターは、約１００ｂｐ〜約１６００ｂｐの長さ、例えば、約２００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約１０００ｂｐ〜約１１００ｂｐ、約１１００ｂｐ〜約１２００ｂｐ、約１２００ｂｐ〜約１３００ｂｐ、約１３００ｂｐ〜約１４００ｂｐ、約１４００ｂｐ〜約１５００ｂｐ、または約１５００ｂｐ〜約１６００ｂｐの長さである。ある特定の実施形態では、このβ−グロビンプロモーターは、約１３０ｂｐ、約６１３ｂｐ、約２６５ｂｐまたは約１５５５ｂｐの長さであるヒトβ−グロビンプロモーターである。一実施形態では、このβ−グロビンプロモーターは、約６１３ｂｐの長さであるヒトβ−グロビンプロモーターである。非限定的な一例では、このヒトβ−グロビンプロモーターは、以下に提供される配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を有する：
【化３５】
2020079327.tif 000037
【０１３４】
一実施形態では、このβ−グロビンプロモーターは、約２６５ｂｐの長さであるヒトβ−グロビンプロモーターである。非限定的な一例では、このヒトβ−グロビンプロモーターは、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を有する。
【化３６】
2020079327.tif 000038
【０１３５】
さらに、またはあるいは、本明細書で開示される発現カセットは、ヒトβ−グロビン３’エンハンサーをさらに含み得る。ある特定の実施形態では、このヒトβ−グロビン３’エンハンサーは、グロビン遺伝子またはその機能的部分の上流に置かれる。ある特定の実施形態では、このβ−グロビン３’エンハンサーは、約５００ｂｐ〜約１０００ｂｐの長さ、例えば、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、または約８００ｂｐ〜約９００ｂｐの長さである。一実施形態では、このヒトβ−グロビン３’エンハンサーは、約８７９ｂｐの長さである。一例では、このヒトβ−グロビン３’エンハンサーは、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を有する。
【化３７】
2020079327.tif 000039
【０１３６】
さらに、本明細書で開示される発現カセットは、少なくとも１つの赤血球系特異的エンハンサーをさらに含み得る。本明細書で開示される発現カセットは、赤血球系特異的様式でのグロビン遺伝子（例えば、ヒトβ−グロビン遺伝子）の発現を可能にする。この赤血球系特異的エンハンサーは、赤血球系特異的様式でのグロビン遺伝子の発現を増強し得る。例えば、この赤血球系特異的エンハンサーは、非赤血球系組織ではエンハンサー活性を欠く。特に、発現エンハンサーとして主に機能するＨＳ２領域を欠くβ−グロビンＬＣＲ領域について、１つまたは複数の赤血球系特異的エンハンサーの付加は、ＨＳ２領域の増強活性を補償し得る。さらに、本明細書で開示される赤血球系特異的エンハンサーは、上記発現カセットを含むベクターの力価を減少も低減もさせない。この赤血球系特異的エンハンサーの長さは、例えば、約１００ｂｐから約２００ｂｐまで、約１００ｂｐから約１２０ｂｐまで、約１２０ｂｐから約１４０ｂｐまで、約１４０ｂｐから約２００まで（例えば、約１４０ｂｐから約１５０ｂｐまで、約１５０ｂｐから約１６０ｂｐまで、約１６０ｂｐから約１７０ｂｐまで、約１７０ｂｐから約１８０ｂｐまで、約１８０ｂｐから約１９０ｂｐまで、または約１９０ｂｐから約２００ｂｐまで）変動し得る。ある特定の実施形態では、この赤血球系特異的エンハンサーは、約１４０ｂｐ〜約２００ｂｐの長さを有する。非限定的な一実施形態では、この赤血球系特異的エンハンサーは、以下に提供される配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を有する、１５２ｂｐの長さを有する：
【化３８】
2020079327.tif 000040
【０１３７】
非限定的な一実施形態では、この赤血球系特異的エンハンサーは、以下に提供される配列番号１４に示されるヌクレオチド配列を有する、１５７ｂｐの長さを有する：
【化３９】
2020079327.tif 000041
【０１３８】
非限定的な一実施形態では、この赤血球系特異的エンハンサーは、以下に提供される配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を有する、１４１ｂｐの長さを有する：
【化４０】
2020079327.tif 000042
【０１３９】
非限定的な一実施形態では、この赤血球系特異的エンハンサーは、以下に提供される配列番号１６に示されるヌクレオチド配列を有する、１７１ｂｐの長さを有する：
【化４１】
2020079327.tif 000043
【０１４０】
非限定的な一実施形態では、この赤血球系特異的エンハンサーは、以下に提供される配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を有する、１９５ｂｐの長さを有する：
【化４２】
2020079327.tif 000044
【０１４１】
赤血球系特異的エンハンサーは、当該分野で公知の任意の適切な方法によって同定および決定され得る。これらの赤血球系特異的エンハンサーは、β−グロビンＬＣＲ領域の３’ＬＴＲ（下流）または５’ＬＴＲ（下流）に置かれ得る。一実施形態では、この少なくとも１つの赤血球系特異的エンハンサーは、β−グロビンＬＣＲ領域の５’ＬＴＲ、例えば、ＨＳ３領域の上流に置かれる。上記発現カセットは、１、２、３、４または５つの赤血球系特異的エンハンサーを含み得る。一実施形態では、この発現カセットは、１つの赤血球系特異的エンハンサーを含む。別の実施形態では、この発現カセットは、２つの赤血球系特異的エンハンサーを含む。さらに別の実施形態では、この発現カセットは、３つの赤血球系特異的エンハンサーを含む。ある特定の実施形態では、この発現カセットは、４つの赤血球系特異的エンハンサーを含む。非限定的な実施形態では、この発現カセットは、５つの赤血球系特異的エンハンサーを含む。
【０１４２】
インシュレーター
本明細書で開示される主題によれば、上記発現カセットは、上記インシュレーターのうち少なくとも１つを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される発現カセットは、配列番号１８に示されるＣＴＣＦ結合部位配列を含むインシュレーター、例えば、それらに限定されないが、配列番号２４または配列番号２５を含むインシュレーター、例えば、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するインシュレーター（即ち、インシュレーターＡ１）を少なくとも１つ含む。種々の非限定的な実施形態では、このインシュレーターは、一方もしくは両方のＬＴＲ中に、または細胞ゲノム中に組み込まれる本明細書で開示される発現カセットの領域中の他の場所に、取り込まれ得るまたは挿入され得る。一実施形態では、このインシュレーターは、発現カセットの３’末端に置かれる。一実施形態では、このインシュレーターは、発現カセットの５’末端に置かれる。一実施形態では、この発現カセットは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するインシュレーターを２つ含み、一方のインシュレーターは、発現カセットの３’末端に置かれ、他方のインシュレーターは、発現カセットの５’末端に置かれる。
【０１４３】
本明細書で開示されるインシュレーターは、強力なエンハンサー遮断活性を有する。ある特定の実施形態では、これらのインシュレーターは、エンハンサー遮断活性に加えて、バリア活性を有する。本明細書で開示されるインシュレーターは、ウイルスベクターと関連する挿入性変異誘発および遺伝子毒性のリスクを実質的に減少させる。さらに、本明細書で開示されるインシュレーターがベクター中に取り込まれる場合、このインシュレーターは、ベクターのベクター力価に悪影響を与えない。ある特定の実施形態では、これらのインシュレーター（例えば、インシュレーターＡ１）は、グロビン遺伝子またはその機能的部分のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を増加させる。
【０１４４】
限定ではなく例示の目的で、図１〜４は、本明細書で開示される主題のある特定の実施形態に従う例示的な発現カセットを含む組換えベクターを示す。図１は、８６０ｂｐのＨＳ２領域（例えば、配列番号９に示されるヌクレオチド配列を有するもの）、１３０１ｂｐのＨＳ３領域（例えば、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するもの）および１０６５ｂｐのＨＳ４領域（例えば、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有するもの）を含むβ−グロビンＬＣＲ領域に作動可能に連結したヒトβＡ−Ｔ８７Ｑグロビン遺伝子を含む本明細書で開示される発現カセットを含む組換えベクターを示す。
【０１４５】
図２は、本明細書で開示される主題の一実施形態に従う発現カセットを含む１つの例示的な組換えベクターを示す。図２は、１．１ｋｂのＨＳ１領域（例えば、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有するもの）、１３０１ｂｐのＨＳ３領域（例えば、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するもの）および１０６５ｂｐのＨＳ４領域（例えば、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するもの）を含むβ−グロビンＬＣＲ領域に作動可能に連結したヒトβＡ−Ｔ８７Ｑグロビン遺伝子を含む本明細書で開示される発現カセットを含む組換えベクターを示す。
【０１４６】
図３は、本明細書で開示される主題の一実施形態に従う発現カセットを含む１つの例示的な組換えベクターを示す。図３は、６０２ｂｐのＨＳ１領域（例えば、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有するもの）、１３０１ｂｐのＨＳ３領域（例えば、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するもの）および４４６ｂｐのＨＳ４領域（例えば、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するもの）を含むβ−グロビンＬＣＲ領域に作動可能に連結したヒトβＡ−Ｔ８７Ｑグロビン遺伝子を含む本明細書で開示される発現カセットを含む組換えベクターを示す。
【０１４７】
図４は、本明細書で開示される主題の一実施形態に従う発現カセットを含む１つの例示的な組換えベクターを示す。図４は、１３０１ｂｐのＨＳ３領域（例えば、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するもの）および１０６５ｂｐのＨＳ４領域（例えば、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するもの）を含むβ−グロビンＬＣＲ領域に作動可能に連結したヒトβＡ−Ｔ８７Ｑグロビン遺伝子を含む本明細書で開示される発現カセットを含む組換えベクターを示す。図４に示される発現カセットは、以下の５つの赤血球系特異的エンハンサー（図４中で「ＥＥ５」と示される）もまた含む：配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を有する１つの赤血球系特異的エンハンサー、配列番号１４に示されるヌクレオチド配列を有する１つの赤血球系特異的エンハンサー、配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を有する１つの赤血球系特異的エンハンサー、配列番号１６に示されるヌクレオチド配列を有する１つの赤血球系特異的エンハンサー、および配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を有する１つの赤血球系特異的エンハンサー。
【０１４８】
図１〜４に示すように、これらの発現カセットの各々は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するインシュレーター（即ち、インシュレーターＡ１）を含む。さらに、図１〜４に示すように、これらの発現カセットの各々は、ヒトβ−グロビン遺伝子の上流に置かれた、８７９ｂｐのヒトβ−グロビン３’エンハンサーを含む。さらに、図１〜４に示すように、これらの組換えベクターの各々は、ベクターの３’長末端反復（ＬＴＲ）中（例えば、３’ＬＴＲ中のＲ領域に対して３’側）にウッドチャック肝炎ポスト調節エレメント（ＷＰＲＥ）およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。
【０１４９】
ＩＩＩ．ベクター、ヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系
本明細書で開示される主題は、上記発現カセットを含むベクターおよび送達系（例えば、天然に存在しないまたは操作されたヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系）を提供する。これらのベクターおよび送達系は、細胞においてグロビンタンパク質（ヒトβ−グロビンタンパク質）の発現を増加させるための、広範囲の標的細胞のゲノム中へのグロビン遺伝子（例えば、ヒトβ−グロビン）の安定な導入に適切な送達ビヒクルである。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、上記ベクターは、宿主細胞（例えば、造血幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞または造血内皮細胞）のゲノム中への上記発現カセットの導入または形質導入に使用されるレトロウイルスベクター（例えば、ガンマレトロウイルスまたはレンチウイルス）である。ある特定の実施形態では、このレトロウイルスベクターは、上記インシュレーターのうち１つ、例えば、インシュレーターＡ１を含む発現カセットを含む。このインシュレーターは、発現カセットの３’末端または５’末端に置かれ得る。一実施形態では、このインシュレーターは、発現カセットの３’末端に置かれる。逆転写およびベクター組込みの間に、３’末端に置かれたインシュレーターは、発現カセットの５’末端へとコピーされる。得られたトポロジーは、組み込まれたウイルスの５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲに位置するゲノム領域間にインシュレーターのコピー、ならびに、５’ＬＴＲからのエンハンサー活性および内部パッケージプロモーターを配置するが、３’ＬＴＲ中にエンハンサーを含まない。このトポロジーは、遺伝子毒性を減少させ得、それによって、動物の腫瘍形成の減少および生存の増加を生じさせる。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、上記組換えベクターは、ベクターの３’長末端反復（ＬＴＲ）中（例えば、ベクターの３’ＬＴＲ中のＲ領域に対して３’側）に、ウッドチャック肝炎ポスト調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む。ある特定の実施形態では、この組換えベクターは、ベクターの３’長末端反復（ＬＴＲ）中（例えば、ベクターの３’ＬＴＲ中のＲ領域に対して３’側）に、ＷＰＲＥに加えて、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルをさらに含む。治療的グロビンベクターの本質的な特性は、患者細胞の有効な形質導入に十分な高い力価を達成することである。遺伝子、プロモーター、エンハンサーおよび／またはＬＣＲエレメントを含むそれらの大きいカーゴのおかげで、グロビンレンチウイルスベクターは、それらの製造を困難にし、それらの臨床的使用を限定する、低い力価を固有に有する。この問題は、ベクターのサイズをさらに増加させるインシュレーターなどのさらなるゲノムエレメントの取込みによって、さらに複雑にする。ＷＰＲＥは、組換えベクターの力価を増加させ得る。ＷＰＲＥへのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルの付加は、組換えベクターの力価をさらに増加させ得る。ある特定の実施形態では、ＷＰＲＥおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルは、発現カセット内に含まれず、したがって、組換えベクターで形質導入された細胞に移入されない。グロビンレンチウイルスベクターの産生を増強するためのこれらのエレメントの取込みは、より高い力価を得るため、したがって、本出願に記載されるベクターの臨床的有用性のために重要である。
【０１５２】
非限定的な一例では、本明細書で開示される発現カセットは、レトロウイルスベクター中にクローニングされ得、発現は、その内因性プロモーターから、レトロウイルス長末端反復から、または代替的内部プロモーターから、駆動され得る。レトロウイルスベクターおよび適切なパッケージング株の組合せもまた適切であり、ここで、カプシドタンパク質は、ヒト細胞に感染するのに機能的である。ＰＡ１２（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８５年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５巻：４３１〜４３７頁）；ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８６年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ６巻：２８９５〜２９０２頁）；およびＣＲＩＰ（Ｄａｎｏｓら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：６４６０〜６４６４頁）が含まれるがこれらに限定されない、種々のアンホトロピックウイルス産生細胞株が公知である。非アンホトロピック粒子、例えば、ＶＳＶＧ、ＲＤ１１４またはＧＡＬＶエンベロープで偽型粒子、および当該分野で公知の任意の他のものもまた、適切である。
【０１５３】
形質導入の適切な方法には、例えば、Ｂｒｅｇｎｉら（１９９２年）Ｂｌｏｏｄ  ８０巻：１４１８〜１４２２頁の方法による、細胞と産生細胞との直接的共培養、または例えば、Ｘｕら（１９９４年）Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔ．  ２２巻：２２３〜２３０頁；およびＨｕｇｈｅｓら（１９９２年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８９巻：１８１７頁の方法による、適切な成長因子およびポリカチオンありもしくはなしの、ウイルス上清単独もしくは濃縮ベクターストックとの培養もまた含まれる。
【０１５４】
形質導入ウイルスベクターは、宿主細胞（例えば、造血幹細胞、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞）においてグロビン遺伝子（例えば、ヒトβ−グロビン遺伝子）を発現させるために使用され得る。好ましくは、選択されたベクターは、高効率の感染ならびに安定な組込みおよび発現を示す（例えば、Ｃａｙｏｕｅｔｔｅら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９７年）；８巻：４２３〜４３０頁；Ｋｉｄｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９６年）；１５巻：８３３〜８４４頁；Ｂｌｏｏｍｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９７年）；７１巻：６６４１〜６６４９頁；Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６年）；２７２巻：２６３  ２６７頁；およびＭｉｙｏｓｈｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９４巻：１０３１９頁、１９９７年を参照のこと）。使用され得る他のウイルスベクターには、例えば、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、またはヘルペスウイルス、例えば、エプスタイン・バーウイルスが含まれる（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９０年）；１５〜１４頁；Ｆｒｉｅｄｍａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９年）；２４４巻：１２７５〜１２８１頁；Ｅｇｌｉｔｉｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６巻：６０８〜６１４頁、１９８８年；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０年）；１巻：５５〜６１頁；Ｓｈａｒｐ、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ（１９９１年）；３３７巻：１２７７〜１２７８頁；Ｃｏｒｎｅｔｔａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７年）３６巻：３１１〜３２２頁；Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４年）；２２６巻：４０１〜４０９頁；Ｍｏｅｎ、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ（１９９１年）；１７巻：４０７〜４１６頁；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８９年）；７巻：９８０〜９９０頁；Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３年）；２５９巻：９８８〜９９０頁；およびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｃｈｅｓｔ（１９９５年）；１０７巻：７７Ｓ〜８３Ｓ頁のベクターもまた参照のこと）。レトロウイルスベクターは、特に十分に開発されており、臨床状況において使用されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ（１９９０年）；３２３巻：３７０頁；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４６号）。
【０１５５】
効率的送達および組込みの要求は、レトロウイルスベクターを、本明細書で開示される発現カセットを形質導入するのに適切なものにする。レトロウイルスベクターは、レトロウイルス科の３つの属由来であり得る：γ−レトロウイルス（Ｃ型マウスレトロウイルスまたはオンコレトロウイルスとしても公知）、レンチウイルスおよびスプーマウイルス（泡沫状ウイルスとしても公知）。複製欠損レトロウイルス粒子の生成のための分子アプローチを詳述するいくつかの総説が、入手可能である（Ｃｏｒｎｅｔｔａら（２００５年）；ＣｏｃｋｒｅｌｌおよびＫａｆｒｉ（２００７年））。治療的導入遺伝子またはｃＤＮＡをコードするベクターはそれ自体、パッケージング細胞株におけるウイルス粒子のパッケージング、逆転写および組込みを可能にするために必要な最小限のウイルス配列を保持する。このパッケージング細胞は、形質導入された細胞におけるその逆転写および組込みに必要なベクター配列ならびに機構を含有する感染性組換え粒子をアセンブルするために必要とされる必要な構造タンパク質および酵素を発現する。
【０１５６】
全てのレトロウイルスベクター型の製造態様は、同じ一般原則に従うが、γ−レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびスプーマウイルスベクターは、それらの固有の生物学的特性の一部が異なる。プロトタイプのマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）を含むガンマ−レトロウイルスは、多くの細胞型に有効に感染するが、感染直後にＳ期に進行しない細胞中では組み込まれることができない。対照的に、レンチウイルスおよびそれらのベクター誘導体は、核に移動し、細胞分裂の非存在下で組み込まれるそれらの能力（ＬｅｗｉｓおよびＥｍｅｒｍａｎ、１９９４年；Ｇｏｆｆ、２００１年）に起因して、非分裂細胞を形質導入できる（ＦｏｌｌｅｎｚｉおよびＮａｌｄｉｎｉ、２００２年；ＳａｌｍｏｎおよびＴｒｏｎｏ、２００２年）。レンチウイルスベクターの別の基本的属性は、ＭＬＶベースのグロビンベクターのゲノム不安定性（Ｌｅｂｏｕｌｃｈら、１９９４年；Ｓａｄｅｌａｉｎら、１９９５年）とは対照的に、グロビンレンチウイルスベクターについて確立されたような（Ｍａｙら、２０００年）、それらの相対的なゲノム安定性である。レンチウイルスおよび泡沫状ベクターは、より大きいパッケージング能力をさらに提供する（Ｋｕｍａｒら、２００１年；Ｒｅｔｈｗｉｌｍ、２００７年）。３つ全てのベクター型が、サイトカイン活性化ＨＳＣの形質導入のために、首尾よく使用されてきた（Ｍｉｙｏｓｈｉら、１９９９年；Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎら、２００２年；Ｌｅｕｒｓら、２００３年）。
【０１５７】
これら３つのベクター系は、それらの組込みパターンが異なる。レトロウイルスの組込みパターンは、半ランダムであり、全ての組込み事象のおよそ３分の２において、遺伝子およびそれらの近傍に向かって偏っている（Ｓｃｈｒｏｄｅｒら、２００２年；Ｗｕら、２００３年；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、２００４年；Ｄｅ  Ｐａｌｍａら、２００５年；Ｔｒｏｂｒｉｄｇｅら、２００６年）。しかし、それらの正確な分布には、僅かな、おそらくは有意な差異が存在する。ガンマ−レトロウイルスは、転写される遺伝子の上流に組み込まれる性向を有するが、レンチウイルスおよびレンチウイルスベクターは、転写される遺伝子配列全体を標的化する。泡沫状ベクターは、遺伝子内組込みの傾向が低いようである（Ｔｒｏｂｒｉｄｇｅら、２００６年）。一実施形態では、発現カセットを含むベクターは、レンチウイルスベクターである。これらのベクターは、ヒト免疫不全−１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全−２（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジェンブラナ病（Ｊｅｍｂｒａｎａ  Ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス（ＪＤＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）などに由来し得る。非限定的な一実施形態では、このレンチウイルスベクターは、ＨＩＶベクターである。ＨＩＶベースの構築物は、ヒト細胞の形質導入において最も効率的である。
【０１５８】
ベクター組込みの半ランダムパターンは、ベクターが近隣の癌遺伝子をトランス活性化する場合、挿入発癌のリスクに患者を曝す。これは、クローン増殖（ｃｌｏｎａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）（Ｏｔｔら、２００６年；Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏら、２０１０年）、脊髄形成異常症（Ｓｔｅｉｎら、２０１０年）または白血病（Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ−Ａｂｉｎａら、２００３年、２００８年；Ｈｏｗｅら、２００８年）を生じさせ得る。天然に存在しないまたは操作されたヌクレアーゼ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）、メガヌクレアーゼ、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が含まれるがこれらに限定されない）またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を利用する、標的化された遺伝子送達戦略は、レトロウイルスベクターの使用に固有の挿入発癌の懸念を低減またはさらには排除し得る。
【０１５９】
真核生物細胞は、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答して、２つの別個のＤＮＡ修復機構（ｒｅｐａｉｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を利用する：相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）。ＨＲ修復機構（ｒｅｐａｉｒ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）の活性化は、細胞周期状態に依存し、これは、Ｓ期およびＧ２期に限定される；対照的に、ＮＨＥＪ経路は、細胞周期を通じて活性である。機構的に、ＨＲは、損傷したＤＮＡ鎖を修復するために相同な鋳型を必要とするので、誤りのないＤＮＡ修復機構である。他方、ＮＨＥＪは、ＤＮＡ切断部位における挿入または欠失をもたらす修復の間のＤＮＡ末端プロセシングに起因して、不正確な鋳型非依存的修復機構である（ＭｏｙｎａｈａｎおよびＪａｓｉｎ、２０１０年）。その相同性ベースの機構に起因して、ＨＲは、異なる種のゲノムを部位特異的に操作するためのツールとして使用されてきた。治療的観点から、ＨＲは、変異した遺伝子を修復するために首尾よく使用されており、したがって、一遺伝子疾患の細胞媒介性処置のための有望なアプローチを提供する（Ｐｏｒｔｅｕｓら、２００６年）。
【０１６０】
ＨＲによる遺伝子標的化は、目的の導入遺伝子／標的部位に隣接する２つの相同性アームの使用を必要とする。一般に、標準的なプラスミドＤＮＡは、陽性選択および陰性選択のための導入遺伝子と共に、５〜１０ｋｂの相同性アームを送達するために使用されてきた。この方法は、マウス胚性幹（ｍＥＳ）細胞において遺伝子をノックアウト／ノックインするために一般に使用されている（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、２００５年；図２Ｂ）。ヒト細胞では、このアプローチの使用は、ｍＥＳ細胞中よりも低い、治療的に実用的でない、１０−６のオーダーの効率での遺伝子標的化を可能にしてきた。ＨＲ効率は、特異的希少切断エンドヌクレアーゼを使用した標的部位におけるＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）の導入によって増加され得、正確な遺伝子標的化における１，０００倍を超える増加を生じる（Ｊａｓｉｎ、１９９６年）。この現象の発見は、異なる種のゲノムにおいて部位特異的ＤＳＢを作り出すための方法の開発を促進した。種々のキメラ酵素、即ち、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼおよび転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が、過去十年にわたって、この目的のために設計されてきた。
【０１６１】
ＺＦＮは、ＺＦベースのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）およびＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを含有するモジュラーキメラタンパク質である（ＰｏｒｔｅｕｓおよびＣａｒｒｏｌｌ、２００５年）。ＤＢＤは通常、３つのＺＦドメインから構成され、これらは各々、３塩基対の特異性を有する；ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、２つの隣接するＺＦＮによって標的化されるＤＮＡニック形成活性を提供する。ＤＢＤのモジュラー性質に起因して、ゲノム中の任意の部位が、原理上標的化され得る。しかし、単一のＺＦＮがＤＮＡに結合でき、ＤＮＡにニック形成できるので、挿入／欠失を導入し得るまたは非特異的様式で標的化ベクターを組込み得るＮＨＥＪ経路の活性化を生じる、高い数のオフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）効果の潜在性が存在する。真正（Ｏｂｌｉｇａｔｅ）ＦｏｋＩドメインであって、それらがヘテロダイマーを形成する場合にのみそのそれぞれのＤＮＡ鎖にニック形成し得る真正ＦｏｋＩドメインが、最近報告された（Ｄｏｙｏｎら、２０１１年）。かかる真正ＺＦＮの使用は、このアプローチの遺伝毒性効果を低減させ得る。
【０１６２】
メガヌクレアーゼ（ＭＮ）／ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）は、真核生物ゲノムにおいて、大きいＤＮＡ部位（１４〜４０ｂｐ）を認識し、それを低い切断頻度で切断するｄｓＤＮＡヌクレアーゼである（ＰａｑｕｅｓおよびＤｕｃｈａｔｅａｕ、２００７年）。これは、潜在的標的部位を制限するが、ＭＮ−ＤＮＡ構造は、ＭＮ特異性を変化させるためにＤＮＡ相互作用性残基を特異的に改変するためのガイドとして使用されてきた（Ｍａｒｃａｉｄａら、２０１０年）。Ｉ−ＣｒｅＩは、ヒトＸＰＣ遺伝子およびＲＡＧ１遺伝子を標的化するキメラメガヌクレアーゼを生成するように首尾よく操作されており、これらは、明白な遺伝子毒性なしに哺乳動物細胞においてＨＲ活性を刺激することが示されている（Ｒｅｄｏｎｄｏら、２００８年；Ｇｒｉｚｏｔら、２００９年）。このアプローチの遺伝子毒性は、ＺＦＮおよびＴＡＬＥヌクレアーゼのものと比較される必要がある。
【０１６３】
ＴＡＬＥＮは、植物病原性細菌によって使用される病原性因子である転写アクチベーター様エフェクター（ｅｆｆｃｅｔｏｒ）（ＴＡＬＥ）にＤＢＤが由来することを除いて、類似のＺＦＮである（Ｈｅｒｂｅｒｓ、１９９２年）。ＴＡＬＥ  ＤＢＤは、モジュラーであり、３４残基リピートから構成され、そのＤＮＡ特異性は、リピートの数および順序によって決定される（Ｈｅｒｂｅｒｓ、１９９２年）。各リピートは、２つの残基だけを介して、標的配列中の単一のヌクレオチドを結合する（Ｂｏｃｈ、２０１１年）。ＺＦＮテクノロジーを上回る利点は、ＤＢＤの迅速な構築である。
【０１６４】
いくつかの研究が、それらの標的部位において遺伝子付加または遺伝子修復のいずれかのためにＨＲを刺激するために、これらのキメラ酵素を使用してきた（ＰａｑｕｅｓおよびＤｕｃｈａｔｅａｕ、２００７年；Ｕｒｎｏｖら、２０１０年）。Ｐｏｒｔｅｕｓは、鎌状赤血球変異ヌクレオチドを取り囲むヒトＨＢＢ由来の半分の部位の配列に対するＺＦＮを設計した（Ｐｏｒｔｅｕｓ、２００６年）。このＺＦＮは、この配列を標的化し、Ｚｉｆ２６８結合部位を標的化するＺＦＮと組み合わせた場合、キメラＤＮＡ標的におけるＨＲを刺激する。臍帯血ＣＤ３４＋細胞中の遺伝子を標的化することにおいて、最近進歩があった。ＺＦＮを送達するための非組込みレンチウイルスおよびこれらの細胞においてＣＣＲ５遺伝子を標的化するためのドナーＤＮＡの使用は、Ｌｏｍｂａｒｄｏら、２００７年に報告された。Ｌｏｍｂａｒｄｏら、２００７年は、陽性選択された細胞の８０％における正確な標的化で、この遺伝子座における遺伝子付加を示した。
【０１６５】
本明細書で開示される主題は、上記のような、本明細書で開示される発現カセットを含む天然に存在しないまたは操作されたヌクレアーゼを提供する。適切なヌクレアーゼには、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼおよびＴＡＬＥＮが含まれるがこれらに限定されない。本明細書で開示されるヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインを含む。ヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、最適な配列、例えば所定の部位に結合するように操作され得る。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するヌクレアーゼと比較して、異なる結合特異性を有し得る。操作方法には、合理的設計および種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。任意の適切な切断ドメインが、ヌクレアーゼを形成するために、ＤＮＡ結合ドメインに作用的に連結され得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインは、その操作されたＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインを介してその意図した核酸標的を認識でき、ヌクレアーゼ活性を介してＺＦＰ結合部位の近傍でＤＮＡが切断されるようにする機能的実体−ＺＦＮを作り出すために、ヌクレアーゼ切断ドメインに融合され得る。例えば、Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９６年）；９３巻（３号）：１１５６〜１１６０頁を参照のこと。同様に、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥＮを作り出すために、ヌクレアーゼ切断ドメインに融合され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号を参照のこと。
【０１６６】
この切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、例えばメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、および異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメインにとって異種であり得る。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから取得され得る。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるがこれらに限定されない。例えば、２００２〜２００３年  Ｃａｔａｌｏｇ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．；およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁を参照のこと。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵ＤＮａｓｅ  Ｉ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年もまた参照のこと）。これらの酵素（またはその機能的領域）のうち１つまたは複数が、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用され得る。
【０１６７】
同様に、切断ハーフドメインは、切断活性のためにダイマー化を必要とする上記ヌクレアーゼ由来であり得る。一般に、２つの融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、該融合タンパク質が切断のために必要とされる。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質が使用され得る。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的部分）由来であり得、または各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的部分）由来であり得る。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、上記ヌクレアーゼは、上記インシュレーターを２つ、例えば、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するインシュレーターを２つ含む発現カセットを含む。２つのインシュレーターのうち一方は、発現カセットの３’末端に置かれ、他方のインシュレーターは、発現カセットの５’末端に置かれる。
【０１６９】
本明細書で開示される主題は、上記発現カセットを含む天然に存在しないまたは操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系もまた提供する。ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）−Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）系は、ゲノム操作のために使用され得る、細菌系に基づく操作されたヌクレアーゼ系である。これは、多くの細菌および古細菌の適応免疫応答の一部に基づく。ウイルスまたはプラスミドが細菌に侵入するとき、侵入者のＤＮＡのセグメントは、「免疫」応答によってＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に変換される。次いで、ｃｒＲＮＡは、部分的相補性の領域を介して、ｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる別の型のＲＮＡと会合し、「プロトスペーサー」と呼ばれる、標的ＤＮＡ中のｃｒＲＮＡに対して相同な領域へと、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼをガイドする。このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断して、ｃｒＲＮＡ転写物内に含有される２０ヌクレオチドのガイド配列によって特定される部位のＤＳＢにおいて、平滑末端を生成する。このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼは、部位特異的なＤＮＡの認識および切断のために、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする。この系は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが１つの分子（「シングルガイドＲＮＡ」）へと組み合わされ得るように操作されている；シングルガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ相当部分は、任意の所望の配列を標的とするようにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼをガイドするように操作され得る（Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２年）；３３７巻：８１６〜８２１頁を参照のこと）。したがって、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ゲノム中の所望の標的においてＤＳＢを作り出すように操作され得る。ある特定の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓヌクレアーゼおよびシングルガイドＲＮＡを含む。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼの適切な例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２．Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、またはそれらの改変されたバージョンが含まれるがこれらに限定されない。これらのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼは公知である；例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、受託番号Ｑ９９ＺＷ２の下でＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース中に見出され得る。一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９など、ＤＮＡ切断活性を有する。ある特定の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９である。このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼは、標的配列（例えば、ゲノムセーフハーバー部���）の位置において、一方または両方の鎖の切断を誘導し得る。さらに、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼは、標的配列の最初のまたは最後のヌクレオチドから、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００塩基対またはそれ超以内での、一方または両方の鎖の切断を誘導し得る。
【０１７０】
本明細書で開示されるヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、発現カセットの標的化された送達を可能にする。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系または本明細書で開示されるヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ゲノムセーフハーバー部位に結合する。ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、このゲノムセーフハーバー部位において二本鎖切断を引き起こす。ゲノムセーフハーバー部位は、宿主細胞または生物に対する有害作用なしに、新たに組込まれたＤＮＡの予測可能な発現を提供することができる、ヒトゲノムの遺伝子内または遺伝子外領域である。有用なセーフハーバーは、ベクターにコードされたタンパク質または非コードＲＮＡの所望のレベルを得るために十分な導入遺伝子発現を可能にしなければならない。ゲノムセーフハーバー部位はまた、細胞に悪性形質転換が生じ易くさせることも、細胞機能を変更することもあってはならない。ゲノムセーフハーバー部位を同定するための方法は、それらの全体が参照によって組み込まれる、Ｓａｄｅｌａｉｎら、「Ｓａｆｅ  Ｈａｒｂｏｕｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１２年）；１２巻：５１〜５８頁；Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕら、「Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓａｆｅ  ｈａｒｂｏｒｓ  ｐｅｒｍｉｔ  ｈｉｇｈ  β−ｇｌｏｂｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ」Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１年）１月；２９巻（１号）：７３〜８頁に記載されている。本明細書で開示されるゲノムセーフハーバー部位は、以下の５つの判定基準：（１）任意の遺伝子の５’末端から（例えば、その遺伝子の５’末端から）少なくとも５０ｋｂの距離、（ｉｉ）任意のがん関連遺伝子から少なくとも３００ｋｂの距離、（ｉｉｉ）開いた／アクセス可能なクロマチン構造内（天然のまたは操作されたヌクレアーゼによるＤＮＡ切断によって測定される）、（ｉｖ）遺伝子転写単位の外側の位置、および（ｖ）ヒトゲノムの超保存領域（ＵＣＲ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡまたは長い非コードＲＮＡの外側の位置のうち１つまたは複数（１、２、３、４または５つ）を満たす。最も一般的な挿入発癌事象は、近隣の腫瘍促進遺伝子のトランス活性化であるので、最初の２つの判定基準は、遺伝子、特に、ヒトがんに機能的に関与する遺伝子またはモデル生物におけるがんに関与する遺伝子のヒトホモログであるがん関連遺伝子のプロモーター近傍に位置するヒトゲノムの部分を排除する。ｍｉＲＮＡは、細胞の増殖および分化を含む多くの細胞プロセスの調節に関与するので、ｍｉＲＮＡ遺伝子に対する近接は、１つの排除判定基準である。転写単位内でのベクター組込みは、腫瘍サプレッサー遺伝子の機能喪失または異常にスプライシングされた遺伝子産物の生成を介して遺伝子機能を破壊し得るので、４番目（ｉｖ）の判定基準は、転写される遺伝子の内部に位置する全ての部位を排除する。複数の脊椎動物にわたって高度に保存され、エンハンサーおよびエクソンについて富化されていることが公知の領域であるＵＣＲ、ならびに長い非コードＲＮＡもまた、排除される。ある特定の実施形態では、このゲノムセーフハーバー部位は、遺伝子外のゲノムセーフハーバー部位である。ある特定の実施形態では、このゲノムセーフハーバー部位は、第１染色体上に位置する。
【０１７１】
本明細書で開示される主題は、上記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、上記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチド、および上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供する。
【０１７２】
ヌクレアーゼおよびこれらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系およびこのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドは、任意の適切な手段によって、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで送達され得る。例えば、本明細書に記載されるヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドを含むベクターによって、細胞（例えば、造血幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞または造血内皮細胞）に送達され得る。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター（例えば、γ−レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよび泡沫状ウイルスベクター）、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴（ａｄｅｎａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ウイルスベクターなどが含まれるがこれらに限定されない任意のベクターが、使用され得る。一実施形態では、上記ヌクレアーゼまたは上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、レンチウイルスベクターである。特定の一実施形態では、このレンチウイルスベクターは、非組込みレンチウイルスベクターである。非組込みレンチウイルスベクターの例は、Ｏｒｙら（１９９６年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａ  ｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３巻：１１３８２〜１１３８８頁；Ｄｕｌｌら（１９９８年）Ｊ．  Ｖｉｒａｌ．７２巻：８４６３〜８４７１頁；Ｚｕｆｆｅｒｙら（１９９８年）Ｊ．  Ｖｉｒａｌ．  ７２巻：９８７３〜９８８０頁；Ｆｏｌｌｅｎｚｉら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５巻：２１７〜２２２頁；米国特許出願公開第２００９／０５４９８５号に記載されている。
【０１７３】
さらに、非ウイルスアプローチもまた、細胞におけるグロビン遺伝子の発現のために使用され得る。例えば、核酸分子は、リポフェクションの存在下で核酸を投与すること（Ｆｅｉｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８４巻：７４１３頁、１９８７年；Ｏｎｏら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７巻：２５９頁、１９９０年；Ｂｒｉｇｈａｍら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  ２９８巻：２７８頁、１９８９年；Ｓｔａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１巻：５１２頁、１９８３年）、アシアロオロソムコイド−ポリリシンコンジュゲート化（Ｗｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６３巻：１４６２１頁、１９８８年；Ｗｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６４巻：１６９８５頁、１９８９年）または手術条件下でのマイクロインジェクション（Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７巻：１４６５頁、１９９０年）によって、細胞中に導入され得る。遺伝子移入のための他の非ウイルス手段には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーションおよびプロトプラスト融合を使用した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのトランスフェクションが含まれる。リポソームもまた、細胞中へのＤＮＡの送達のために潜在的に有益であり得る。被験体の罹患組織中への正常遺伝子の移植は、培養可能な（ｃｕｌｔｉｖａｔａｂｌｅ）細胞型（例えば、自家もしくは異種の初代細胞またはその後代）中にｅｘ  ｖｉｖｏで正常核酸を移入させることによって達成され得、その後、その細胞（またはその子孫）が、標的組織中に注射される、または全身的に注射される。組換え受容体はまた、トランスポザーゼを使用して、誘導または取得され得る。一過的発現は、ＲＮＡエレクトロポレーションによって得られ得る。
【０１７４】
ＩＶ．細胞
細胞（例えば、造血幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞および造血内皮細胞）の遺伝子改変は、実質的に均質な細胞組成物を、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物（例えば、上記発現カセットを含むベクターまたは送達系）で形質導入することによって、達成され得る。本明細書で開示される主題は、「形質導入された細胞」と総称される、上記発現カセットで形質導入された細胞、上記ベクターで形質導入された細胞、および上記ヌクレアーゼで、またはこれらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質導入された細胞、および上記ＣＡＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系で、またはこのＣＡＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質導入された細胞、を提供する。上記のように、ベクター、ヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、グロビン遺伝子（例えば、ヒトβ−グロビン遺伝子）を発現させるための、細胞への発現カセットの形質導入のために使用される。ある特定の実施形態では、これらの形質導入された細胞は、造血の疾患、障害または状態を処置および／または予防するために、被験体に投与される。本明細書で開示されるインシュレーターは、細胞への発現カセットの形質導入の効率を増強し得る。
【０１７５】
適切な形質導入された細胞には、幹細胞、前駆体細胞および分化した細胞が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で使用する場合、用語「前駆体」または「前駆体細胞」とは、自己再生し、より成熟した細胞へと分化する能力を有する細胞を指す。前駆体細胞は、多能性および複能性幹細胞と比較して低い能力を有する。多くの前駆体細胞が、単一の系統に沿って分化するが、極めて広範な増殖能も有し得る。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、上記形質導入された細胞は、幹細胞である。幹細胞は、特定の生物学的ニッチにｉｎ  ｖｉｖｏで投与された場合、適切な細胞型へと分化する能力を有する。幹細胞は、（１）長期自己再生、または元の細胞の少なくとも１つの同一コピーを生成する能力、（２）単一細胞レベルでの、複数の特殊化した細胞型、一部の場合には１つだけの特殊化した細胞型への分化、および（３）組織のｉｎ  ｖｉｖｏでの機能的再生、が可能な未分化細胞である。幹細胞は、それらの発生潜在力に従って、全能性、多能性、複能性および少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）／単能性として、下位分類される。本明細書で使用する場合、用語「多能性」とは、身体または細胞体の全ての系統を形成する細胞の能力（即ち、胚本体）を意味する。例えば、胚性幹細胞は、３つの胚葉、外胚葉、中胚葉および内胚葉の各々由来の細胞を形成できる、多能性幹細胞の型である。本明細書で使用する場合、用語「複能性」とは、１つの系統の複数の細胞型を形成する、成体幹細胞の能力を指す。例えば、造血幹細胞は、血球系統、例えば、リンパ系細胞および骨髄系細胞の全ての細胞を形成することが可能である。
【０１７７】
ある特定の実施形態では、上記形質導入された細胞は、胚性幹細胞、骨髄幹細胞、臍帯幹細胞、胎盤幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、肝臓幹細胞、膵幹細胞、心幹細胞、腎臓幹細胞および／または造血幹細胞である。一実施形態では、上記形質導入された細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。ＨＳＣは、生物の生涯にわたって成熟血球の全レパートリーを生成することが可能な関与する造血前駆体細胞（ＨＰＣ）を生じる。用語「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」とは、骨髄系系統（例えば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ系系統（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む、生物の全ての血球型を生じる複能性幹細胞を指す。致死的に放射線照射された動物またはヒト中に移植した場合、造血幹細胞および前駆体細胞は、赤血球系、好中球−マクロファージ、巨核球およびリンパ系造血細胞プールを再配置させ得る。
【０１７８】
ＨＳＣは、骨髄、臍帯血または末梢血から単離または収集され得る。ＨＳＣは、特定の表現型または遺伝子型マーカーに従って同定され得る。例えば、ＨＳＣは、それらの小さいサイズ、系統（ｌｉｎ）マーカーの欠如、生体色素、例えばローダミン１２３（ｒｈｏｄａｍｉｎｅＤＵＬＬ、ｒｈｏｌｏとも呼ばれる）またはＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２による低い染色（サイドポピュレーション）、およびそれらの表面上での、その多くが表面抗原分類シリーズに属する（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１０５、ＣＤ４５、Ｔｅｒｌ１９、およびｃ−ｋｉｔ、幹細胞因子に対する受容体）種々の抗原性マーカーの存在、によって同定され得る。一実施形態では、上記形質導入された細胞は、ＣＤ３４＋ＨＳＣである。
【０１７９】
一実施形態では、上記形質導入された細胞は、胚性幹細胞である。別の実施形態では、この形質導入された細胞は、人工多能性幹細胞である。さらに別の実施形態では、この形質導入された細胞は、造血内皮細胞である。
【０１８０】
ＨＳＣは、長期造血発生を回復させるための天然のビヒクルであるが、それらの使用は、いくつかの重要な制限を有する。第１は、それらの相対的な欠乏であり、これは、回収された細胞生成物が小さすぎる場合に、自家ＨＳＣ治療を最終的に妨げ得る。第２は、バイオセイフティー試験、例えば、組込み部位分析を実施すること、および結果として、選択された組込み部位を有する細胞を選択することの困難さであり、それは、成体ＨＳＣが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは複製できないからである。第３の制限は、現行のテクノロジーを使用する相同組換えが、実際的には不可能であり、したがって、遺伝子修正の到来を損なうことである。これらの制限は全て、成体ＨＳＣが、それらの幹細胞の能力を喪失することなしにｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させることができないという事実に最終的に起因する。これらの制限は、安定な遺伝子移入を達成するにあたり顕著に迅速かつ効率的なウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターの決定的な重要性を説明する。これは、限定的な量でしか利用可能でないＨＳＣを扱う場合に重要である。
【０１８１】
グロビン遺伝子治療のためのＥＳおよび人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の使用は、Ｍｏｉら、Ｈａｅｍａｔｏｌ、２００８年３月１日；９３巻（３号）：３２５〜３３０頁に開示されている。胚性幹（ＥＳ）細胞は、多分化能を喪失することのない制限のないｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞分裂を必要とする遺伝子標的化および遺伝子修正を受けやすい。Ｃｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００６年；１０３巻：１０３６〜４０頁は、鎌状赤血球貧血を有するマウスにおける相同組換えアプローチの実現可能性の原理の証拠を提供した。Ｔａｋａｈａｓｈｉら  Ｃｅｌｌ  ２００６年；１２６巻：６６３〜７６頁は、胚性幹様状態への線維芽細胞の首尾よい再プログラミングを報告した。人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞と呼ばれる、この逆分化プロセスによって取得された細胞は、胚性幹細胞中で生理学的に活性であるが、分化が進行したときには一般にオフになる４つの転写因子をコードするガンマレトロウイルスベクターに、胚性または若年成体バルク線維芽細胞培養物を曝露させることによって、生成された。これらの培養細胞は、ＥＳ細胞コロニーと類似のコロニーを形成した。これらの知見は、マウスおよびヒトの両方の線維芽細胞について、他の研究者らによって確認および拡大されている（Ｍｅｉｓｓｎｅｒら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００７年；２５巻：１１７７〜８１頁；Ｎａｋａｇａｗａら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００７年；２６巻：１０１〜６頁；Ｏｋｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  ２００７年；４４８巻：３１３〜７頁；Ｐａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ２００７年；４５１巻：１４１〜６頁；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ２００７年；２巻：３０８１〜９頁；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋら、Ｃｅｌｌ  ２００７年；１３１巻：８６１〜７２頁；Ｗｅｒｎｉｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ２００７年；４４８巻：３１８〜２４頁；Ｙｕ  Ｊら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７年；３１８巻：１９１７〜２０頁）。Ｒｕｄｏｌｆ  Ｊａｅｎｉｓｃｈおよび共同研究者らは、ＥＳ様ｉＰＳ細胞における相同組換えを使用して、鎌状赤血球症のマウスモデルにおいて首尾よい遺伝子治療を達成した（Ｈａｎｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７年；３１８巻：１９２０〜３頁）。このプロセスは、これまで、皮膚生検から回収された線維芽細胞に主に適用されており、これらは次いで、４つの幹細胞転写因子をコードするレトロウイルスベクターによる形質導入によって、ｉＰＳになるように誘導される。ｉＰＳは、標準的な相同組換え技術によるＳＣ変異の修正に従順であり、次いで、制限されない量の造血幹細胞へと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化され得る。プロセス全体は、そのＳＣ疾患がこれから治癒される元のマウスドナー中への修正されたＨＳＣの自家移植で終わる。この技術は、相同組換えに有用なだけではなく、詳細な組込み部位分析および細胞をレシピエント中に注入する前の適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖を実施するための手段を提供することによって、β−サラセミアの処置のためのレンチウイルス媒介性のグロビン遺伝子移入を増強することもできる。
【０１８２】
本明細書で開示される主題の細胞は、自家（「自己」）または非自家（「非自己」、例えば、同種、同系または異種間（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ））であり得る。本明細書で使用する場合、「自家」とは、同じ被験体由来の細胞を指す。本明細書で使用する場合、「同種」とは、比較される細胞とは遺伝学的に異なる同じ種の細胞を指す。本明細書で使用する場合、「同系」とは、比較される細胞と遺伝学的に同一である異なる被験体の細胞を指す。本明細書で使用する場合、「異種間」とは、比較される細胞とは異なる種の細胞を指す。ある特定の実施形態では、細胞は自家であり、例えば、本明細書で開示される発現カセットで形質導入された細胞が、細胞が被験体から収集されるその被験体に投与され、例えば、細胞は、被験体の骨髄、臍帯血、末梢血および／または脂肪組織から収集される。ある特定の実施形態では、この細胞は、被験体の骨髄から取得または収集される。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、発現カセットによる形質導入の前に、細胞は、例えば、１種もしくは複数種のサイトカイン（例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、Ｋｉｔリガンド（「幹細胞因子（ＳＣＦ）」としても公知）およびＦｌｔ−３リガンド）および／または１種もしくは複数種の糖タンパク質（例えば、トロンボポエチンおよびフィブロネクチン）の存在下で事前刺激される。非限定的な一例では、この細胞は、Ｆｌｔ−３リガンド、ＳＣＦ、トロンボポエチン、インターロイキン−３およびフィブロネクチンの存在下で事前刺激される。この細胞は、約２４時間またはそれよりも長く、例えば、約４８時間または約３６時間にわたって事前刺激され得る。引き続いて、この細胞は、本明細書で開示される発現カセット、またはかかる発現カセットを含むベクターもしくは別の送達系で形質導入される。形質導入は、新鮮な細胞に対してまたは凍結細胞に対して実施され得る。細胞のゲノムＤＮＡは、例えば、サザンブロット分析および／または定量的ＰＣＲによって、ベクターコピー数を決定し、組込み部位または組み込まれたベクター構造を分析するために、単離される。グロビンｍＲＮＡの定量（例えば、ヒトβ−グロビン導入遺伝子分析）のために、総ＲＮＡが、細胞から抽出される。定量的プライマー伸長アッセイが、グロビンｍＲＮＡの定量に使用され得る。
【０１８４】
Ｖ．組成物および製剤
本明細書で開示される主題は、上述された本明細書で開示される形質導入された細胞および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物を提供する。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容されるキャリア」には、薬学的に許容される細胞培養培地を含む、生理学的に適合性である、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容されるキャリアは、非経口（例えば、静脈内、筋内、皮下または腹腔内）、脊髄または表皮投与（例えば、注射、注入またはインプランテーションによる）に適切であり得る。投与の経路に依存して、活性化合物、例えば形質導入された細胞は、その化合物を不活性化し得る酸および他の天然の条件の作用からその化合物を保護するための材料でコーティングされ得る。
【０１８５】
薬学的に許容されるキャリアには、滅菌水性溶液または分散物、および無菌の注射可能な溶液または分散物の即座の調製のための無菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および作用物質（ａｇｅｎｔ）の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または作用物質が形質導入された細胞と不適合性である場合を除き、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が企図される。
【０１８６】
本明細書で開示される主題の医薬組成物は、単独で、または治療の１つもしくは複数の他のモダリティと組み合わせてのいずれかで、細胞または動物への投与のための薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液中に製剤化された、本明細書に記載される１種または複数種のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、形質導入された細胞などをさらに含み得る。所望の場合、本明細書で開示される主題の医薬組成物は、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子または種々の薬学的に活性な作用物質が含まれるがこれらに限定されない他の作用物質と組み合わせて投与され得る。意図した遺伝子治療を送達する組成物の能力に悪影響を与えない任意のさらなる作用物質が、組成物中に含められ得る。
【０１８７】
本明細書で開示される主題の医薬組成物では、薬学的に許容される賦形剤およびキャリア溶液の製剤化は、例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内および筋内の投与および製剤を含む種々の処置レジメンにおいて本明細書に記載される特定の組成物を使用するための適切な投薬レジメンおよび処置レジメンの開発と同様、当業者に周知である。
【０１８８】
本明細書で開示される主題の医薬組成物は、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号に記載されるように、非経口（例えば、静脈内、筋内または腹腔内）で送達され得る。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中、ならびに油中でも、調製され得る。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための防腐剤を含む。
【０１８９】
薬学的に許容されるキャリアには、滅菌水性溶液または分散物、および無菌の注射可能な溶液または分散物の即座の調製のための無菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および作用物質の使用は、当該分野で公知である。任意の従来の媒体または作用物質が活性化合物と不適合性である場合を除き、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が企図される。補足的な活性化合物もまた、これらの組成物中に組み入れられ得る。
【０１９０】
治療的組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。この組成物は、高い薬物濃度に適切な溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または他の秩序だった構造物として製剤化され得る。薬学的に許容されるキャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合に必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによって、もたらされ得る。
【０１９１】
本明細書で開示される主題の医薬組成物は、選択されたｐＨへと緩衝化され得る、無菌の液体調製物、例えば、等張水性溶液、懸濁物、エマルジョン、分散物または粘稠性組成物として、慣習的に提供され得る。液体調製物は、通常、ゲル、他の粘稠性組成物および固体組成物よりも、調製が容易である。さらに、液体組成物は、特に注射によって投与するのに、いくらかより簡便である。他方、粘稠性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間を提供するために、適切な粘度範囲内で製剤化され得る。液体または粘稠性組成物は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得るキャリアを含み得る。
【０１９２】
無菌の注射可能な溶液は、所望に応じて、必要な量の適切な溶媒中に、本明細書で開示される主題の組成物を、種々の量の他の成分と共に組み入れることによって、調製され得る。かかる組成物は、適切なキャリア、希釈剤または賦形剤、例えば、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどとの混合物中であり得る。これらの組成物はまた、凍結乾燥され得る。これらの組成物は、所望される投与の経路および調製物に依存して、補助的物質、例えば、湿潤剤、分散剤または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化添加剤または粘度増強性添加剤、防腐剤、香味剤、色素などを含み得る。参照によって本明細書に組み込まれる「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥ」、第１７版、１９８５年などの標準的な教科書が、過度の実験なしに適切な調製物を調製するために、調べられ得る。
【０１９３】
抗菌防腐剤、抗酸化剤、キレート剤および緩衝剤が含まれる、組成物の安定性および無菌性を増強する種々の添加剤が、添加され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確実にされ得る。注射可能な医薬品形態の長期にわたる吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム（ａｌｕｍ  ｉｎｕｒｎ  ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ）およびゼラチンの使用によって、もたらされ得る。
【０１９４】
これらの組成物は、等張であり得る、即ち、血液および涙液と同じ浸透圧を有し得る。本明細書で開示される主題の組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム、あるいは他の薬学的に許容される作用物質、例えば、デキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールまたは他の無機もしくは有機の溶質を使用して達成され得る。塩化ナトリウムが、特に、ナトリウムイオンを含む緩衝液にとって好ましい。
【０１９５】
水性溶液での非経口投与のために、例えば、この溶液は、必要な場合適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤が、十分な食塩水またはグルコースで最初に等張にされる。無菌の注射可能な溶液は、上に列挙された成分のうち１つまたはそれらの組合せと共に、適切な溶媒中に必要とされる量で活性化合物を組み入れ、必要に応じてその後精密濾過滅菌することによって、調製され得る。一般に、分散物は、基本的分散媒および上で列挙したものからの必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクル中に、活性化合物を取り込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性成分プラス以前に無菌濾過されたその溶液由来の任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、上記組成物は、鼻腔内スプレー、吸入および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。経鼻エアロゾルスプレーを介して、遺伝子、ポリヌクレオチドおよびペプチド組成物を肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および米国特許第５，８０４，２１２号に記載されている。リゾホスファチジル−グリセロール化合物を使用して薬物を送達する方法は、例えば、米国特許第５，７２５，８７１号に記載されている。ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）支持体マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、例えば、米国特許第５，７８０，０４５号に記載されている。本明細書で開示される主題の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、ナノ粒子などのいずれかに被包して、送達のために製剤化され得る。かかる送達ビヒクルの製剤化および使用は、公知の従来の技術を使用して実施され得る。本明細書で開示される主題の製剤および組成物は、単独で、または治療の１つもしくは複数の他のモダリティと組み合わせてのいずれかで、細胞または動物への投与のための薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液（例えば、培養培地）で製剤化された、本明細書に記載される、任意の数のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび小分子の組合せを含む、１種または複数種のリプレッサーおよび／またはアクチベーターを含み得る。
【０１９７】
ある特定の態様では、本明細書で開示される主題は、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）ベクターが含まれるがこれらに限定されないウイルスベクター系の送達（即ち、ウイルス媒介性形質導入）に適した製剤または組成物を提供する。ｅｘ  ｖｉｖｏ送達のための例示的な製剤は、当該分野で公知の種々のトランスフェクション剤、例えばリン酸カルシウム、エレクトロポレーション、熱ショックおよび種々のリポソーム製剤（即ち、脂質媒介性トランスフェクション）の使用もまた含み得る。リポソームは、水性流体の一部（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を封入する脂質二重層である。ＤＮＡは、カチオン性リポソームの外部表面と（その電荷によって）自発的に会合し、これらのリポソームは、細胞膜と相互作用する。
【０１９８】
当業者は、本明細書で開示される主題の組成物中の、および本明細書で開示される主題の方法において投与される、細胞ならびに任意選択の添加剤、ビヒクルおよび／またはキャリアの量を、容易に決定できる。典型的には、任意の添加剤（形質導入された細胞（複数可）および／または作用物質（複数可）に加えて）は、リン酸緩衝食塩水中に、約０．００１重量％〜約５０重量％）溶液の量で存在し、活性成分は、マイクログラムからミリグラムのオーダー、例えば、約０．０００１ｗｔ％〜約５ｗｔ％、約０．０００１ｗｔ％〜約１ｗｔ％、約０．０００１ｗｔ％〜約０．０５ｗｔ％、約０．００１ｗｔ％〜約２０ｗｔ％、約０．０１ｗｔ％〜約１０ｗｔ％、または約０．０５ｗｔ％〜約５ｗｔ％で存在する。動物またはヒトに投与される任意の組成物のために、および投与の任意の特定の方法のために、毒性は、例えば、適切な動物モデル、例えば、マウスなどのげっ歯類における致死用量（ＬＤ）およびＬＤ５０；ならびに適切な応答を惹起する、組成物（複数可）の投薬量、その中の構成要素の濃度、および組成物（複数可）の投与のタイミングを決定することによって、決定すべきである。かかる決定は、当業者の知識、本開示および本明細書で引用された文書から、過度の実験を必要としない。そして、逐次的投与のための時間は、過度の実験なしに確認され得る。
【０１９９】
ＶＩ．使用および方法
本明細書で開示される発現カセットを含むベクターおよび他の送達系（ヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系）は、遺伝子治療の改善された方法を提供する。本明細書で使用する場合、用語「遺伝子治療」とは、遺伝子および／または遺伝子の発現を回復、修正または改変する、細胞のゲノム中へのポリヌクレオチドの導入を指す。種々の非限定的な実施形態では、本明細書で開示されるベクターまたは他の送達系（例えば、ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系）は、造血系の疾患、障害もしくは状態を有すると診断された被験体またはそれを有する疑いがある被験体に、治癒的、予防的または軽減的利益を提供する、グロビンタンパク質（例えば、ヒトβグロビンタンパク質）をコードするグロビン遺伝子またはその機能的部分を含む発現カセットを含む。このベクターまたは他の送達系（例えば、ヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系）は、細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで感染および形質導入することができる。ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの実施形態では、形質導入された細胞は、次いで、治療を必要とする被験体に投与され得る。本明細書で開示される主題は、本明細書で開示される主題のベクターおよび他の送達系（例えば、ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系）、ウイルス粒子、ならびに形質導入された細胞が、被験体における造血系の疾患、障害または状態、例えばヘモグロビン異常症を処置、予防および／または軽減させるために使用されることを企図する。
【０２００】
本明細書で使用する場合、用語「ヘモグロビン異常症」または「ヘモグロビン異常症状態」には、血液中の異常なヘモグロビン分子の存在が関与する任意の障害が含まれる。ヘモグロビン異常症の例には、ヘモグロビンＣ病、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血およびサラセミアが含まれたがこれらに限定されない。異常なヘモグロビンの組合せが血液中に存在するヘモグロビン異常症（例えば、鎌状赤血球／Ｈｂ−Ｃ病）もまた含まれる。
【０２０１】
本明細書で使用する場合、「サラセミア」とは、ヘモグロビンを欠損して産生することを特徴とする遺伝性障害を指す。サラセミアの例には、α−サラセミアおよびβ−サラセミアが含まれる。β−サラセミアは、ベータグロビン鎖における変異によって引き起こされ、重症型または軽症型形態（ｍａｊｏｒ  ｏｒ  ｍｉｎｏｒ  ｆｏｒｍ）で生じ得る。重症型形態のβ−サラセミアでは、小児は誕生時には正常であるが、人生の１年目の間に貧血を発症する。軽度形態のβ−サラセミアは、小さい赤血球を生成し、これらのサラセミアは、グロビン鎖からの遺伝子（単数または複数）の欠失によって引き起こされる。α−サラセミアは、典型的には、ＨＢＡ１遺伝子およびＨＢＡ２遺伝子が関与する欠失から生じる。これらの遺伝子は両方とも、ヘモグロビンの構成要素（サブユニット）であるα−グロビンをコードする。各細胞ゲノム中には、２コピーのＨＢＡ１遺伝子および２コピーのＨＢＡ２遺伝子が存在する。結果として、α−グロビンを産生する４つの対立遺伝子が存在する。異なる型のサラセミアは、これらの対立遺伝子の一部または全ての喪失から生じる。最も重症形態のサラセミアである、Ｈｂ  Ｂａｒｔ症候群は、４つ全てのα−グロビン対立遺伝子の喪失から生じる。ＨｂＨ病は、４つの［アルファ］−グロビン対立遺伝子のうち３つの喪失によって引き起こされる。これら２つの状態では、［アルファ］−グロビンの不足は、細胞が正常ヘモグロビンを作製することを防止する。その代り、細胞は、ヘモグロビンＢａｒｔ（Ｈｂ  Ｂａｒｔ）またはヘモグロビンＨ（ＨｂＨ）と呼ばれる、異常な形態のヘモグロビンを産生する。これらの異常なヘモグロビン分子は、身体の組織へ酸素を有効に運搬することができない。正常ヘモグロビンのＨｂ  ＢａｒｔまたはＨｂＨへの置換は、貧血、およびサラセミアと関連する他の重篤な健康問題を引き起こす。
【０２０２】
本明細書で使用する場合、用語「鎌状赤血球症」とは、グロビン遺伝子における変異から生じ、異常な硬直した鎌状形状をとる赤血球を特徴とする、常染色体劣性の遺伝的血液障害の群を指す。これらは、グルタミン酸がペプチドのアミノ酸６位においてバリンによって置換されたβ−グロビン鎖バリアントをコードするβＳ−遺伝子、および臨床的表現型をもたらすＨｂＳの結晶化を可能にする変異を有する第２のβ−遺伝子の存在によって定義される。本明細書で使用する場合、用語「鎌状赤血球貧血」とは、ＨｂＳを引き起こす変異についてホモ接合性である患者における、鎌状赤血球症の特定の形態を指す。他の一般的な形態の鎌状赤血球症には、ＨｂＳ／β−サラセミア、ＨｂＳ／ＨｂＣおよびＨｂＳ／ＨｂＤが含まれる。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される主題の遺伝子治療方法は、ヘモグロビンＣ病、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血、遺伝性貧血、サラセミア、β−サラセミア、重症型サラセミア、中間型サラセミア、α−サラセミアおよびヘモグロビンＨ病からなる群から選択されるヘモグロビン異常症を処置、予防または軽減させるために使用される。非限定的な実施形態では、このヘモグロビン異常症は、β−サラセミアである。別の非限定的な一実施形態では、このヘモグロビン異常症は、鎌状赤血球貧血である。
【０２０４】
種々の非限定的な実施形態では、本明細書で開示される発現カセットを含むベクターまたは他の送達系（例えば、ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系）は、遺伝子治療を必要とする被験体の細胞、組織または臓器へのｉｎ  ｖｉｖｏでの直接注射によって投与される。種々の他の実施形態では、細胞は、本明細書で開示される主題のベクターまたは他の送達系（例えば、ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系）でｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入され、任意選択でｅｘ  ｖｉｖｏで増殖される。次いで、形質導入された細胞、例えば、本明細書に開示される医薬製剤内の該細胞が、遺伝子治療を必要とする被験体に投与される。
【０２０５】
本明細書で開示される主題は、形質導入された細胞を被験体に提供する方法を提供する。種々の非限定的な実施形態では、この方法は、本明細書で開示される発現カセットまたはかかる発現カセットを含むベクターもしくは別の送達系（例えば、ヌクレアーゼもしくはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系）で形質導入された１個または複数の細胞（細胞の集団）を、被験体に（例えば、非経口）投与するステップを含む。
【０２０６】
本明細書で開示される主題は、被験体においてヘモグロビン異常症を処置する方法を提供する。種々の非限定的な実施形態では、この方法は、本明細書で開示される形質導入された細胞または本明細書で開示される形質導入された細胞（例えば、ＨＳＣ、胚性幹細胞またはｉＰＳＣ）の集団の有効量を被験体に投与するステップを含む。
【０２０７】
処置のために、投与される量は、所望の効果を生じるのに有効な量である。有効量は、１回の投与または一連の投与で提供され得る。有効量は、ボーラスで、または持続的灌流によって、提供され得る。「有効量」（または「治療有効量」）は、処置の際に、有益なまたは所望の臨床結果を及ぼすのに十分な量である。有効量は、１または複数の用量で被験体に投与され得る。処置に関して、有効量は、疾患の進行を寛解、軽減、安定化、逆転もしくは緩徐化させるのに、または他の方法で疾患の病理学的結果を低減させるのに十分な量である。有効量は、一般に、ケースバイケースで医師によって決定され、当業者の技術範囲内である。いくつかの因子が、有効量を達成するための適切な投薬量を決定する場合に、典型的には考慮される。これらの因子には、被験体の年齢、性別および体重、処置されている状態、状態の重症度、ならびに投与される免疫応答性細胞の形態および有効濃度が含まれる。
【０２０８】
非限定的な一例では、本明細書で開示される形質導入された細胞のうち１種または複数種の投与の後、被験体の末梢血が収集され、ヘモグロビンレベルが測定される。治療的に適切なレベルのヘモグロビンが、本明細書で開示される形質導入された細胞のうち１種または複数種の投与の後に産生される。治療的に適切なレベルのヘモグロビンは、（１）貧血を改善または修正するため、（２）正常ヘモグロビンを含む赤血球を生成する被験体の能力を回復させるため、（３）被験体において効果のない赤血球生成を修正するため、（４）髄外造血発生（例えば、脾および肝での髄外造血発生）を修正するため、ならびに／または（５）例えば、末梢組織および臓器における鉄蓄積を低減させるために十分なヘモグロビンのレベルである。治療的に適切なレベルのヘモグロビンは、少なくとも約７ｇ／ｄＬのＨｂ、少なくとも約７．５ｇ／ｄＬのＨｂ、少なくとも約８ｇ／ｄＬのＨｂ、少なくとも約８．５ｇ／ｄＬのＨｂ、少なくとも約９ｇ／ｄＬのＨｂ、少なくとも約９．５ｇ／ｄＬのＨｂ、少なくとも約１０ｇ／ｄＬのＨｂ、少なくとも約１０．５ｇ／ｄＬのＨｂ、少なくとも約１１ｇ／ｄＬのＨｂ、少なくとも約１１．５ｇ／ｄＬのＨｂ、少なくとも約１２ｇ／ｄＬのＨｂ、少なくとも約１２．５ｇ／ｄＬのＨｂ、少なくとも約１３ｇ／ｄＬのＨｂ、少なくとも約１３．５ｇ／ｄＬのＨｂ、少なくとも約１４ｇ／ｄＬのＨｂ、少なくとも約１４．５ｇ／ｄＬのＨｂ、または少なくとも約１５ｇ／ｄＬのＨｂであり得る。さらに、またはあるいは、治療的に適切なレベルのヘモグロビンは、約７ｇ／ｄＬのＨｂ〜約７．５ｇ／ｄＬのＨｂ、約７．５ｇ／ｄＬのＨｂ〜約８ｇ／ｄＬのＨｂ、約８ｇ／ｄＬのＨｂ〜約８．５ｇ／ｄＬのＨｂ、約８．５ｇ／ｄＬのＨｂ〜約９ｇ／ｄＬのＨｂ、約９ｇ／ｄＬのＨｂ〜約９．５ｇ／ｄＬのＨｂ、約９．５ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１０ｇ／ｄＬのＨｂ、約１０ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１０．５ｇ／ｄＬのＨｂ、約１０．５ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１１ｇ／ｄＬのＨｂ、約１１ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１１．５ｇ／ｄＬのＨｂ、約１１．５ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１２ｇ／ｄＬのＨｂ、約１２ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１２．５ｇ／ｄＬのＨｂ、約１２．５ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１３ｇ／ｄＬのＨｂ、約１３ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１３．５ｇ／ｄＬのＨｂ、約１３．５ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１４ｇ／ｄＬのＨｂ、約１４ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１４．５ｇ／ｄＬのＨｂ、約１４．５ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１５ｇ／ｄＬのＨｂ、約７ｇ／ｄＬのＨｂ〜約８ｇ／ｄＬのＨｂ、約８ｇ／ｄＬのＨｂ〜約９ｇ／ｄＬのＨｂ、約９ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１０ｇ／ｄＬのＨｂ、約１０ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１１ｇ／ｄＬのＨｂ、約１１ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１２ｇ／ｄＬのＨｂ、約１２ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１３ｇ／ｄＬのＨｂ、約１３ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１４ｇ／ｄＬのＨｂ、約１４ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１５ｇ／ｄＬのＨｂ、約７ｇ／ｄＬのＨｂ〜約９ｇ／ｄＬのＨｂ、約９ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１１ｇ／ｄＬのＨｂ、約１１ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１３ｇ／ｄＬのＨｂ、または約１３ｇ／ｄＬのＨｂ〜約１５ｇ／ｄＬのＨｂであり得る。ある特定の実施形態では、治療的に適切なレベルのヘモグロビンは、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間（または１年間）、少なくとも約２４ヶ月間（または２年間）にわたって被験体において維持される。ある特定の実施形態では、治療的に適切なレベルのヘモグロビンは、最大約６ヶ月間、最大約１２ヶ月間（または１年間）、最大約２４ヶ月間（または２年間）にわたって被験体において維持される。ある特定の実施形態では、治療的に適切なレベルのヘモグロビンは、約６ヶ月間、約１２ヶ月間（または１年間）、約２４ヶ月間（または２年間）にわたって被験体において維持される。ある特定の実施形態では、治療的に適切なレベルのヘモグロビンは、約６ヶ月間〜約１２ヶ月間（例えば、約６ヶ月間〜約８ヶ月間、約８ヶ月間〜約１０ヶ月間、約１０ヶ月間〜約１２ヶ月間）、約１２ヶ月間〜約１８ヶ月間（例えば、約１２ヶ月間〜約１４ヶ月間、約１４ヶ月間〜約１６ヶ月間、または約１６ヶ月間〜約１８ヶ月間）、または約１８ヶ月間〜約２４ヶ月間（例えば、約１８ヶ月間〜約２０ヶ月間、約２０ヶ月間〜約２２ヶ月間、または約２２ヶ月間〜約２４ヶ月間）にわたって被験体において維持される。
【０２０９】
ある特定の実施形態では、この方法は、上述された本明細書で開示される発現カセットを含む組換えベクターで形質導入された１種または複数種の細胞を投与するステップを含む。被験体において治療的に適切なレベル（例えば、９〜１０ｇ／ｄＬ）のヘモグロビンを提供する、細胞中の組換えベクターのベクターコピー数は、細胞１個当たり約０．５〜約２、約０．５〜約１、または約１〜約２ベクターコピー数である。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるベクターのベクターコピー数は、細胞１個当たり約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９または約２．０ベクターコピー数である。
【０２１０】
ある特定の実施形態では、上記被験体は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が適合したドナーを欠く。ある特定の実施形態では、上記形質導入された細胞は、同じ被験体由来である。一実施形態では、この形質導入された細胞は、同じ被験体の骨髄由来である。したがって、形質導入された細胞の投与は、被験体において移植片対宿主病のリスクをきたさない。この方法は、移植片拒絶を予防するための免疫抑制を必要とせず、例えば、この方法は、被験体に免疫抑制剤を投与するステップを含まない。
【０２１１】
本明細書で開示される主題は、被験体において、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）または白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）と比較して、赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）または赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）の割合を増加させる方法もまた提供する。種々の非限定的な実施形態では、この方法は、本明細書で開示される形質導入された細胞または本明細書で開示される形質導入された細胞（例えば、ＨＳＣ、胚性幹細胞またはｉＰＳＣ）の集団の有効量を被験体に投与するステップを含み、ここで、造血幹細胞の赤血球後代細胞の割合は、被験体において、造血幹細胞の白血球後代細胞と比較して増加する。
【０２１２】
任意の特定の理論に束縛されることは望まないが、本明細書で開示される主題の発現カセット、ベクターおよび他の送達系（例えば、ヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系）、組成物ならびに方法によって提供される重要な利点は、既存の方法と比較して、より低い百分率の形質導入された細胞を含む細胞の集団を投与することによって達成され得る、高い効力のグロビン遺伝子治療である。これは、形質導入された細胞における細胞遺伝子の有害な変異、形質転換または癌遺伝子活性化の低減された機会と関連する、重要な安全性の利点を提供する。形質導入された細胞は、骨髄切除治療を受けたまたは受けていない個体において、骨髄または臍帯血移植の一部として投与され得る。
【０２１３】
本明細書に記載される発現カセットで形質導入された本明細書で開示される細胞（「形質導入された細胞」）の治療的使用に関する１つの考慮事項は、最適な効果を達成するために必要な細胞の量である。投与される形質導入された細胞の量は、処置されている被験体によって変動する。一実施形態では、約１×１０４〜約１×１０５細胞／ｋｇ、約１×１０５〜約１×１０６細胞／ｋｇ、約１×１０６〜約１×１０７細胞／ｋｇ、約１×１０７〜約１×１０８細胞／ｋｇ、約１×１０８〜約１×１０９細胞／ｋｇ、または約１×１０９〜約１×１０１０細胞／ｋｇの本明細書で開示される形質導入された細胞が、被験体に投与される。より有効な細胞は、さらに少ない数で投与され得る。一部の実施形態では、少なくとも約１×１０８細胞／ｋｇ、少なくとも約２×１０８細胞／ｋｇ、少なくとも約３×１０８細胞／ｋｇ、少なくとも約４×１０８細胞／ｋｇ、または少なくとも約５×１０８細胞／ｋｇの本明細書で開示される形質導入された細胞が、被験体に投与される。有効な用量とみなされるものの正確な決定は、特定の被験体の大きさ、年齢、性別、体重および状態を含む、各被験体にとって個別の因子に基づき得る。投薬量は、本開示および当該分野の知識から、当業者が容易に確認でき得る。
【０２１４】
種々の実施形態では、本明細書で開示される主題の発現カセット、ベクターおよび他の送達系（ヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系）、組成物ならびに方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療を使用する遺伝子治療および自家移植の改善された方法を提供する。発現カセットで形質導入された細胞の、またはヘモグロビン異常症を有する被験体中への移植は、疾患の長期修正を生じる。
【０２１５】
１種または複数種の本明細書で開示される形質導入された細胞は、非経口投与（例えば、筋内投与、静脈内投与、皮下投与または腹腔内投与）、脊髄投与および表皮投与が含まれるがこれらに限定されない、当該分野で公知の任意の方法によって投与され得る。非限定的な一実施形態では、１種または複数種の形質導入された細胞が、被験体に静脈内送達される。１種または複数種の本明細書で開示される形質導入された細胞は、注射、注入またはインプランテーションによって投与され得る。非限定的な一実施形態では、１種または複数種の形質導入された細胞は、注射によって投与される。別の非限定的な実施形態では、１種または複数種の形質導入された細胞は、静脈内注射によって投与される。
【０２１６】
上記被験体は、進行形態の疾患を有し得、この場合、処置目標には、疾患進行の緩和もしくは逆転、および／または副作用の軽減が含まれ得る。これらの被験体は、それに対して被験体が既に処置された状態の病歴を有し得、この場合、治療目標には、典型的には、再発のリスクにおける減少または遅延が含まれる。
【０２１７】
ＶＩＩ．キット
本明細書で開示される主題は、ヘモグロビン異常症の処置または予防のためのキットを提供する。一実施形態では、このキットは、単位剤形中に、本明細書で開示される発現カセットで形質導入された細胞の有効量を含む、治療的または予防的組成物を含む。非限定的な一実施形態では、このキットは、本明細書に開示される１つまたは複数の発現カセットを含む。ある特定の実施形態では、このキットは、本明細書に開示される発現カセットを含む１種または複数種のベクターを含む。一部の実施形態では、このキットは、箱、アンプル、ビン、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当該分野で公知の他の適切な容器形態であり得る、無菌容器を含む。かかる容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、または医薬を保持するのに適切な他の材料で作製され得る。
【０２１８】
所望の場合、上記形質導入された細胞は、ヘモグロビン異常症を有する被験体またはヘモグロビン異常症を発症するリスクがある被験体にこの細胞を投与するための指示と一緒に提供される。これらの指示は、ヘモグロビン異常症の処置または予防のための組成物の使用に関する情報を一般に含む。他の実施形態では、これらの指示は、以下のうち少なくとも１つを含む：治療剤の説明；ヘモグロビン異常症またはその症状の処置または予防のための投薬スケジュールおよび投与；基本的注意；警告；適応症；対抗適応症（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）；過量服薬情報；有害反応；動物薬理学；臨床研究；および／または参考文献。あるいはまたはさらに、このキットは、１つまたは複数の発現カセットおよび／またはかかる発現カセットを含むベクターで細胞を形質導入するための指示を含み得る。これらの指示は、容器（存在する場合）上に直接、または容器に張り付けられたラベルとして、または容器中に入ったもしくは容器と同梱された、別々のシート、パンフレット、カードもしくはフォルダーとして、印刷され得る。
【実施例】
【０２１９】
本明細書で開示される主題の実施は、特記しない限り、当業者の技術範囲内に十分に入る、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用する。かかる技術は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９年）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｇａｉｔ、１９８４年）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８７年）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｗｅｉｒ、１９９６年）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ、１９８７年）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌ、１９８７年）；「ＰＣＲ：  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、（Ｍｕｌｌｉｓ、１９９４年）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ、１９９１年）などの文献中に、十分に説明されている。これらの技術は、本明細書で開示される主題のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、したがって、本明細書で開示される主題を構成および実施する際に考慮され得る。特定の実施形態のために特に有用な技術は、以下のセクションで議論される。
【０２２０】
以下の実施例は、本明細書で開示される主題の発現カセット、ベクター、送達系および治療方法を如何にして構成および使用するかの完全な開示および説明を当業者に提供するために示され、本発明者らが本発明者らの発明とみなすものの範囲を限定することは意図しない。
【０２２１】
（実施例１）
新規インシュレーターの発見
遺伝子毒性のリスクが、クロマチンインシュレーターの使用によって低減され得ることから明らかなように（Ａｒｕｍｕｇａｍら（２００７年）、Ｅｍｅｒｙ（２０１１年）、Ｅｖａｎｓ−Ｇａｌｅａら（２００７年）、Ｒｉｖｅｌｌａら（２０００年）、Ｅｍｅｒｙら（２０００年）、Ｅｍｅｒｙら（２００２年）、Ｙａｎｎａｋｉら（２００２年）、Ｈｉｎｏら（２００４年）、Ｒａｍｅｚａｎｉら（２００３年）、Ｒａｍｅｚａｎｉら（２００８年））、ウイルスベクターの挿入性変異誘発によって生じる問題は、広く知られている（Ｎｉｅｎｈｕｉｓ（２０１３年）、Ｂａｕｍら（２００６年）、Ｎｉｅｎｈｕｉｓら（２００６年））。ヒトゲノムにおけるエンハンサー遮断性インシュレーターの効率的同定を可能にするアプローチが開発されている。これらの新たなインシュレーターは、平均１５０ｂｐで短く、ウイルスベクターの力価に悪影響を与えず、インシュレーターｃＨＳ４よりも数倍強力である。ゲノムアプローチを使用して、ヒトゲノムの最も強力なエンハンサー遮断因子およびバリアインシュレーターを発見した。ヘモグロビン異常症の遺伝子治療のために、強力なエンハンサーが、治療レベルのグロビン遺伝子発現を達成するために必要である。したがって、強力なインシュレーターは、組込みベクターの強力なエンハンサーからゲノム環境を保護するための１つの手段を提供し得る。
【０２２２】
いくつかの研究が、ガンマレトロウイルスベクター（Ｅｖａｎｓ−Ｇａｌｅａら（２００７年）、Ｒｉｖｅｌｌａら（２０００年）、Ｅｍｅｒｙら（２０００年）、Ｅｍｅｒｙら（２００２年）、Ｙａｎｎａｋｉら（２００２年）、Ｈｉｎｏら（２００４年）、Ｒａｍｅｚａｎｉら（２００６年）、Ｙａｏら（２００３年）、Ｎｉｓｈｉｎｏら（２００６年）、Ａｋｅｒら（２００７年）、ＬｉおよびＥｍｅｒｙ（２００８年））およびレンチウイルスベクター（Ｅｖａｎｓ−Ｇａｌｅａら（２００７年）、Ｒａｍｅｚａｎｉら（２００３年）、Ｐｕｔｈｅｎｖｅｅｔｉｌら（２００４年）、Ａｒｕｍｕｇａｍら（２００７年）、Ｂａｎｋら（２００５年）、Ａｋｅｒら（２００７年）、Ｍａら（２００３年）、Ｃｈａｎｇら（２００５年）、Ｐｌｕｔａら（２００５年））の位置効果サイレンシングを低減させるｃＨＳ４インシュレーターの能力を実証している。適切に設計されたそれらの研究により、１．２ｋｂバージョンのｃＨＳ４インシュレーターを含めることが、少なくとも一部の状況において、ベクター導入遺伝子発現の見込みおよび／または一貫性を増加させたことが実証された（Ａｒｕｍｕｇａｍら（２００７年）、Ｅｖａｎｓ−Ｇａｌｅａら（２００７年）、Ｅｍｅｒｙら（２００２年）、Ｙａｎｎａｋｉら（２００２年）、Ｈｉｎｏら（２００４年）、Ｒａｍｅｚａｎｉら（２００６年）、Ａｋｅｒら（２００７年）、ＬｉおよびＥｍｅｒｙ（２００８年）、Ｐｌｕｔａら（２００５年）、Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら（２００４年））。それにもかかわらず、ｃＨＳ４インシュレーターによって与えられる保護の程度は、完全にはほど遠い。さらに、１．２ＫｂのｃＨＳ４を含めることは、ベクター力価に悪影響を与え得るが、最も小さいｃＨＳ４コアは無効であると証明されている（Ａｋｅｒら（２００７年）、Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら（２００４年））。
【０２２３】
遺伝子毒性に対する効果を、マウスにおける腫瘍形成の定量に基づくｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して試験した。インシュレーターＡ１によってインスレートされたベクターは、インスレートされていない対照またはｃＨＳ４でインスレートされた対照を受けたマウスと比較して、造血キメラにおいて、ランダムベクター組込みによって誘導される腫瘍形成を減少させた。
【０２２４】
ベクター力価に対する影響を評価するために、インシュレーターＡ１を、構成的パッケージプロモーターからＧＦＰを発現する第３世代レンチウイルスベクターの二重コピー領域中に導入し、ウイルス力価およびＧＦＰ発現を測定した。インシュレーターＡ１は、ベクターＧＦＰ発現に悪影響を与えなかった。
【０２２５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子毒性アッセイでは、ガンマレトロウイルスベクターで形質導入された細胞株は、マウスにおいて移植後に腫瘍を生成し、無腫瘍生存の割合を測定することによる遺伝毒性効果の定量を可能にした。遺伝子毒性に対するインシュレーターの効果を、マウスにおいて形成された腫瘍の数および無腫瘍生存の割合によって定量した。インシュレーターＡ１を、３’ＬＴＲの近位部分中に挿入し、そこから、それを、逆転写およびベクター組込みの間に５’ＬＴＲへとコピーする。得られたトポロジーは、組み込まれたプロウイルスの５’側および３’側に位置するゲノム領域間にインシュレーターのコピー、ならびに、５’ウイルスＬＴＲからのエンハンサー活性および内部Ｐｇｋプロモーターを配置するが、３’ＬＴＲ中にエンハンサーを含まない。これは、遺伝子毒性を減少させ得、したがって、動物の腫瘍形成の減少および生存の増加を生じさせる。インシュレーターＡ１または制御領域が隣接したガンマレトロウイルスレポーターベクターを使用して、成長因子依存的細胞株３２Ｄを形質導入し、各ベクターについて１０個の独立したサブプールを、同系Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス中に移植した。モック形質導入された細胞を移植した１０匹のマウスは全て、３２Ｄ細胞由来腫瘍を含まないままであったが、インサートを含まないまたは７９０ｂｐの中性スペーサー（ｎｅｕｔｒａｌ  ｓｐａｃｅｒ）を含むベクターで形質導入された３２Ｄ細胞を移植したほぼ全てのマウスは、１６週間の中央値以内に腫瘍を発症した（図５Ｂ）。このベクターをｃＨＳ４インシュレーターと隣接させることは、腫瘍形成の発生を数週間遅延させ、腫瘍を発症した動物の頻度を、１０匹中６匹まで低減させた。対照的に、１０匹の動物のうち２匹だけが、インシュレーターＡ１が隣接したベクターで形質導入した３２Ｄ細胞による移植後に、腫瘍を生じさせた（図５Ｂ）。腫瘍を有する動物の頻度および元のサブプールにおけるベクター形質導入事象の数は、ベクターをインシュレーターＡ１と隣接させることが、腫瘍形成の全体的割合を、１０５のプロウイルス当たり４６．９腫瘍から１０５のプロウイルス当たり３．９腫瘍まで、１２分の１に低減させたことを示唆した（図５Ｃ）。比較して、ｃＨＳ４インシュレーターは、腫瘍形成の全体的割合を（１０５のプロウイルス当たり１６．９腫瘍まで）２．８分の１に低減させたが、中性スペーサーは、腫瘍形成の割合に対して統計的に識別可能な影響を有さなかった。これらの結果は、発見されたエンハンサー遮断性インシュレーターが、挿入性変異誘発および遺伝子毒性のリスクを実質的に減少させ得ることを示している。
【０２２６】
（実施例２）
少なくとも１つのインシュレーターを含むグロビンベクターの特徴付け。
インシュレーターＡ１、ならびに配列番号９に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ２領域、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域および配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含むβ−グロビンＬＣＲ領域に作動可能に連結したコドン８７におけるスレオニンからグルタミンへの変異をコードするヒトβＡ−グロビン遺伝子（βＡ−Ｔ８７Ｑ）を含む、本明細書で開示される発現カセット（「発現カセット１」と称される；図１に示される）を、生成した。バリアントβ鎖（βＡ）を使用するための理論的根拠は、ベクターにコードされるβ−グロビン遺伝子の検出を促進して、内因性のまたは注入されたベータ鎖からそれを識別することである。γ−グロビン鎖中の８７位のグルタミン（ＧＬＮ）残基は、成人のβ鎖の酸素結合特徴を保ちつつ、β鎖と比較してガンマ鎖の抗鎌状化活性を増進する（Ｎａｇｅｌら（１９７９年））。ベクター１では、コドン８７を変更する点変異（βＡ−Ｔ８７Ｑ即ちβ８７）は、正常スレオニンをグルタミンで置き換え、ベクターがコードするβ鎖の抗鎌状化活性を増進する。このβ８７鎖は、ＨｂＥ−サラセミアを有する患者において安全に使用されてきた（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏら（２０１０年））。
【０２２７】
発現カセット１を、レンチウイルスベクター（「ベクター１」と称される）に組み入れまたは導入した。ベクター１を、Ｃ５７ＢＬ／６−Ｈｂｂ  ｔｈ３／＋マウスの骨髄細胞中に導入し、以前に記載されたように、同系の致死的に放射線照射されたレシピエントに移植した（Ｍａｙら（２０００年）、Ｍａｙら（２００２年）、Ｌｉｓｏｗｓｋｉら（２００７年））。Ｖ１のベクター力価は、インシュレーターＡ１を欠く発現カセットを含むレンチウイルスベクターのものと匹敵した。ベクター１のβ−グロビン発現を、インシュレーターを欠き、配列番号９に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ２領域、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域および配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含むβ−グロビンＬＣＲ領域に作動可能に連結した野生型（ｗｉｌｄ）ヒトβ−グロビン遺伝子を含む発現カセットを含むレンチウイルスベクター（「ベクター２」と称される）のものと比較した。ベクター２と比較して、ベクターコピーに対して正規化したベクター１のβ−グロビン発現は、図６に示すように、等価または僅かに増加しており、このことは、隣接するバリアエレメントによって提供されるｉｎ  ｖｉｖｏ発現のための追加の利益を示唆している。
【０２２８】
（実施例３）
非赤血球系Ｋ５６２細胞におけるエンハンサー活性の評価
ＨＳ２のエンハンサー活性を、非赤血球系Ｋ５６２細胞において評価した。図７に示すように、エンハンサーなし（「空」）、ＨＳ２、ＨＳ３−４、ＨＳ２−３−４または陽性対照として使用したｒｕｎｘ１エンハンサー（「ＲＵＮＸ１」）と連結したミニマルプロモーターによって駆動されるベクターで形質導入されたＫ５６２細胞におけるＧＦＰ発現。バックグラウンドの発現は、およそ（ｏｎ  ｔｈｅ  ｏｒｄｅｒ  ｏｒ）０．０１％（「空」）であったが、ＨＳ２−３−４では１０倍超増加した（「Ｌｃｒ９」、０．１７％）。この増強は、大部分はＨＳ２に起因し（０．１５％）、ＨＳ３−４には起因しなかった（０．０５％）。全ての細胞株を、同等に形質導入した（平均ベクターコピー数２．５）。これらの結果は、ＨＳ３−ＨＳ４ではなくＨＳ２が、非赤血球系造血幹細胞および前駆体細胞において発癌のリスクを有し得ることを支持している。
【０２２９】
（実施例４）
新規赤血球系特異的エンハンサー
図８および９に示すように、５つの赤血球系特異的エンハンサーがＨＳ２を置換した：ＡＬＡＳイントロン１、ＡＬＡＳイントロン８、ＢＬＶＲＢ、ＰＰＯＸおよびスペクトリン−アルファ。本発明者らは、これら５つ全てのエンハンサーが、強力なエンハンサーであり、非赤血球系組織においてエンハンサー活性を欠き、ベクター力価を低減させないことを示した。
【０２３０】
（実施例５）
３’ＬＴＲ改変を介してグロビンレンチウイルスベクター産生を増加させる
治療的グロビンベクターの本質的な特性は、患者細胞の有効な形質導入に十分な高い力価を達成することである。遺伝子、プロモーター、エンハンサーおよび／またはＬＣＲエレメントを含むそれらの大きいカーゴのおかげで、グロビンレンチウイルスベクターは、それらの製造を困難にし、それらの臨床的使用を制限する、低い力価を固有に有する。この問題は、ベクターのサイズをさらに増加させるインシュレーターなどのさらなるゲノムエレメントの組み入れによって、さらに複雑にする。
【０２３１】
本発明者らは、グロビンベクターの力価を増加させるために、グロビンベクターの３’長末端反復（ＬＴＲ）の異なる改変を調査した。１から６２まで番号を付けた、６２にわたるバリエーションを評価し、配列番号９に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ２領域、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域および配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含むβ−グロビンＬＣＲ領域に作動可能に連結したヒトβ−グロビン遺伝子を含むレンチウイルスベクターでモデル化した。言い換えると、ベクター１番からベクター６２までの全てが、配列番号９に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ２領域、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ３領域および配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有するＨＳ４領域を含むβ−グロビンＬＣＲ領域を含む。３’ＬＴＲ中に標準的なＵ３欠失を含むベクター１８番は、ベースラインとして機能した。ベクター１番（示さず）は、臨床的には使用できない、完全な、即ち野生型のＬＴＲを含んだ。３’ＬＴＲに対する改変は、図１０Ａおよび１０Ｂに示され、それらの力価は、図１１および１２に示される（Ｙ軸は、製造され、厳密に同一の条件下で試験されたベクターストックのベクターコピー数を示す）。力価決定は、三重の複製（ｔｒｉｐｌｅ  ｒｅｐｌｉｃａｓ）で測定し、２人のオペレーターが並行して実施し、複数の実験において反復した。
【０２３２】
図１１および１２に示すように、ベクター５５番は、より高い力価を反復して示した。このベクターは、３’ＬＴＲ中のＲ領域に対して３’側に、ウッドチャック肝炎ポスト調節エレメント（ＷＰＲＥ）およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。したがって、このＷＰＲＥエレメントは、形質導入された細胞に移入されない。
【０２３３】
グロビンレンチウイルスベクターの産生を増強するためのこれらのエレメントの組み入れは、より高い力価を得るため、したがって、本出願に記載されるベクターの臨床的有用性のために重要である。
【０２３４】
参考文献
【化４３】
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【化４４】
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【化４５】
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【化４６】
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【化４７】
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【化４８】
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【化４９】
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【化５０】
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【化５１】
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【化５２】
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【化５３】
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【化５４】
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【化５５】
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【化５６】
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【０２３５】
上述の説明から、バリエーションおよび改変が、本明細書に記載される本明細書で開示される主題に対してなされ得、それを種々の用法および条件に適合させ得ることが明らかである。かかる実施形態もまた、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０２３６】
本明細書において言及される全ての特許および刊行物ならびに受託番号または参照番号によって言及される配列は、各個々の特許および刊行物ならびに配列が、具体的かつ個々に参照によって組み込まれると示されるのと同じ程度まで、参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2020079327000001.pdf