(57)【要約】      （修正有）【課題】ｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究装置及び方法の提供。【解決手段】乾燥地、林地、湿地及び人工地盤のそれぞれから、活動が集中しているサンプリングポイントを２キロメートルの間隔距離で７個選択して、滅菌済みのＰＰ広口瓶を用いて１Ｌのサンプリング量でサンプリングし、異なるキットでＤＮＡサンプルを別々抽出し、プライマーを用いてＰＣＲ増幅、遺伝子検出を行い、検出された遺伝子配列結果をＮＣＢＩデータベースの遺伝子配列と比較する、ｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究方法であって、
乾燥地、林地、湿地及び人工地盤のそれぞれから、活動が集中しているサンプリングポイントを２キロメートルの間隔距離で７個選択して、滅菌済みのＰＰ広口瓶を用いて１Ｌのサンプリング量でサンプリングし、サンプリングポイントごとに同じサンプルを二つ収集し、６ヵ月おきに１回サンプリングするステップＳ１と、
収集されたサンプルの表層水から１５ｍｌ取り、３Ｍの酢酸ナトリウム１．５ｍｌを加えて、さらに無水エタノール３３ｍｌを加え、均一に混合し、−２０℃で３０００ｒｄ遠心分離して、１０ｍｉｎ後に取り出し、沈殿物の発生を観察し、異なるキットでＤＮＡサンプルを別々抽出するステップＳ２と、
Ｓ２で抽出されたＤＮＡサンプルを超微量分光光度計に入れて検出し、サンプルＤＮＡの濃度を分析し、カバーする種が最も多く且つ同定精度が最も高いユニバーサルプライマーを選択し、プライマーを用いて多様性ＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をＤＮＡ試薬で精製して回収し、ＤＮＡ精製において複数回の溶出を行い、精製したＤＮＡを４℃の冷蔵庫に入れて冷蔵保存し、クローンシーケンシングライブラリーを構築して、ＰＣＲ増幅後のＤＮＡ断片について遺伝子検出を行い、検出された遺伝子配列結果をＮＣＢＩデータベースの遺伝子配列と比較するステップＳ３と、
遺伝子シーケンシングの比較結果について検出種の分類学基準に従って上記検出結果を統計して、シャノン・ウィナー指数によって数学モデルを作成し、種の豊富さ及び均等度を総合的に評価し、その表現式は、
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であり、
式中、Ｈは、Ｓｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ指数であり、Ｓは、種の豊富さであり、Ｐｉは、総個体数に占めるｉ番目の個体の割合を示すステップＳ４と、
土地利用のタイプによってサンプリングするごとにサンプリングポイントを分類して統計し、毎回のサンプリングにおけるサンプリングポイントのある種類の土地の総面積をＳ０、Ｓ１、．．．Ｓｎとして、計算式（Ｓｎ−Ｓｎ−１）／Ｓｎ−１＊１００％＝ηによりサンプリングポイントの土地利用の変化トレンドを計算し、
式中、ηは、土地利用の変化トレンドであるステップＳ５と、
まず、いずれかのサンプリングポイントの各土地利用のタイプとＳｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ指数との相関性を分析し、次に、各サンプリングポイントのＳｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ指数と土地利用の変化トレンドの両方の間のトレンドを分析するステップＳ６と、を含む、ことを特徴とするｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究方法である。
【請求項２】
前記Ｓ３におけるクローンシーケンシングライブラリーの構築には、
Ｓ３における精製ＰＣＲ産物２ｕＬをベクターｐＭＤ１８−Ｔと連結して、ＤＨ５ａコンピテントセルを形質転換し、３７℃で２４−３２ｈ恒温培養するステップと、
クローニングが終了した後、５０個のシングルコロニーをピックアップし、プライマーＦ及びＲを用いてコロニーＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により検出して、ターゲットバンドであると確認すると、後続の実験を行うステップと、
上記サンプルのそれぞれから３０個のシングルコロニーをピックアップして一晩拡大培養し、ＴＳＩＮＧＫＥプラスミド抽出キットでプラスミドを抽出して、ＡＢＩ  ３７３０ＸＬシーケンサーを用いて上記サンプルに対してシーケンシング検出を行うステップと、を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性
への影響の研究方法である。
【請求項３】
前記土地利用のタイプは、それぞれ、乾燥地、森林地、低木林地、疎林地、ほかの林地、高植被率草地、低植被率草地、貯水池・池沼、干潟、都市用地、農村集落地及びほかの建設用地であり、
森林地、低木林地、疎林地、ほかの林地、高植被率草地及び低植被率草地を林地、貯水池・池沼及び干潟を湿地、都市用地、農村集落地及びほかの建設用地を人工土地として取り扱い、
合計乾燥地、林地、湿地及び人工地盤の４種類の土地利用のタイプに分けられ、前記Ｓ６においてＳＰＳＳ２０．０を用いて各土地利用のタイプとＳｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ指数との相関性を分析した結果、前記Ｓ６における各土地利用のタイプとＳｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ指数との相関性分析の結果は、０．０５水準で有意的に相関する場合と０．０１水準で有意的に相関する場合に分けられる、ことを特徴とする請求項１に記載のｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究方法である。
【請求項４】
Ｓ６における各サンプリングポイントのＳｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ指数と土地利用の変化トレンドの両方のトレンドによって、土地利用のタイプを制御する、ことを特徴とする請求項３に記載のｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究方法である。
【請求項５】
ｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究装置であって、
ｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究方法に適用される装置であり、
ボトル本体（２）、ボトルキャップ（１）及び保護ハウジング（３）を備え、前記ボトル本体（２）は保護ハウジング（３）の内部に移動可能に当接され、前記ボトル本体（２）の上端の内部にボトルキャップ（１）が移動可能に当接され、前記ボトル本体（２）の右側の内壁に接続装置が固定して取り付けられ、前記ボトル本体（２）の前側の外面に目盛りが設けられ、前記ボトルキャップ（１）の内部に接続孔（２２）が周方向に等間隔で設置され、前記ボトルキャップ（１）の内部の軸心に回動軸（２１）の下端が移動可能に当接され、前記回動軸（２１）の上端が回動板（１９）の軸心に移動可能に当接され、前記回動板（１９）の下面がボトルキャップ（１）の上面に密着し、前記回動板（１９）の内部に接続孔（２２）に合わせた固定孔（２０）が周方向に等間隔で設置される、ことを特徴とするｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究装置である。
【請求項６】
前記接続装置は、制限チューブ（２３）、移動板（５）、接続チューブ（１２）、シールチューブ（１６）、固定チューブ（１５）及び回動チューブ（１３）を備え、前記制限チューブ（２３）の右端がボトル本体（２）の内壁に固定して接続され、前記制限チューブ（２３）の内部の上下両側に制限溝（１８）が設置され、前記制限溝（１８）の内部に制限ロッド（４）が移動可能に当接され、前記制限ロッド（４）の右端がバネ（９）の左端に固定して接続され、前記バネ（９）の右端が制限溝（１８）の内部の底端に固定して接続され、前記制限ロッド（４）の左端が移動板（５）の右側の上下両端に固定して接続され、前記移動板（５）の内側面の上下両側が固定ロッド（７）の左端に固定して接続され、前記固定ロッド（７）の右端が接続チューブ（１２）の左端に固定して接続され、前記接続チューブ（１２）の右端が回動チューブ（１３）の内部に移動可能に当接され、前記回動チューブ（１３）の外部が固定チューブ（１５）の内部に移動可能に当接され、前記固定チューブ（１５）の左端がボトル本体（２）の右側に固定して接続され、前記固定チューブ（１５）の左端の内部にシールチューブ（１６）が移動可能に当接され、前記シールチューブ（１６）の左端が制限チューブ（２３）の右端に固定して接続され、前記接続チューブ（１２）の左端が制限チューブ（２３）の内部に移動可能に当接される、ことを特徴とする請求項５に記載のｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研
究装置である。
【請求項７】
前記接続チューブ（１２）の左端の上下両側に固定溝（１０）が設置され、前記固定溝（１０）の内部に係合ピン（８）が移動可能に当接され、前記係合ピン（８）の内側端が圧縮バネ（６）の外側端に固定して接続され、前記圧縮バネ（６）の内側端が固定溝（６）の底端に固定して接続され、前記制限チューブ（２３）の内部の左右両端の上下両側に係合溝（１７）が設置され、前記係合溝（１７）は係合ピン（８）と嵌め合いし、前記回動チューブ（１３）の左端の上下両側が安定ロッド（１１）の内側端に固定して接続され、前記固定チューブ（１５）の右端の内部の上下両側に安定溝（１４）が設置され、前記安定溝（１４）の内部に安定ロッド（１１）が移動可能に当接される、ことを特徴とする請求項６に記載のｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究装置である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類多様性の研究分野に関し、特にｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
数百年にわたって陸上生物の多様性が劇的に減少したと同様に、水生生物の多様性も同じ課題に直面しており、ほとんどの漁場は、長期間の乱獲のために保護と再建を必要とする。関連する機関及び専門家は、魚類の詳細な分布、個体群特徴などの情報を基礎にして、各種魚類の生理学的特性及び生態学的ニーズに基づいて、効果的な魚類保護プログラムを作成する必要がある。しかし、水生生態系の光線透過率が低く、魚類の移動経路が変化するなどの原因から、基本的な情報の取得は非常に困難であった。従来の魚類の調査方法は、比較的単純であり、魚類の生存パターン、多様性、個体群の密度や個体群構造などの基本的な生態学的情報を明確でタイムリーに提供できないため、魚類の生態学において大量の基本的なデータが欠如し又は遅れになっている。特に、一部の希少魚類は、検出率が非常に低いが、その検出率に反比例するほど生態系に対して重要な役割を果たす。現在、これらの基本的なデータの欠如及び遅れは、魚類生態学の発展を制限するボトルネックとなっている。
【０００３】
分子生物学の発展に伴い、ｅＤＮＡは、高効率的で正確かつ非侵襲的な新しい魚類検出技術を提供し、魚類生態学の研究への応用が期待でき、魚類生態学のビッグデータ化を可能にする。近年、ｅＤＮＡは、希少魚類の保護、侵入種の調査、魚類多様性の分析や魚群数の予測などの分野において一定の進歩及びブレークスルーを遂げた。ｅＤＮＡは、メタゲノミクスとＤＮＡシーケンシング技術に基づいたものであり、両方の方法の制限とボトルネックを継承している。たとえば、ハイスループットシーケンシングにおける配列アセンブリングと遺伝子予測の精度及び速度との矛盾である。通常、配列アセンブリングと遺伝子予測には多くのアルゴリズムが必要とされるが、高速アルゴリズムは、しばしば精度を犠牲にしている。また、生態学が直面する従来の問題の解決に用いる場合、水域ｅＤＮＡには、複雑な環境の要因も存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】中国特許出願公開第107475385号明細書
【特許文献２】中国特許出願公開第109825563号明細書
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、従来の魚類多様性を研究するときに、適時性が低く、環境に悪く、調査結果の精度が低いという問題を解決するために、ｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究装置及び方法を提案し、従来の魚類多様性を研究するときに、適時性が低く、環境に悪く、調査結果の精度が低いという問題を効果的に解決する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成させるために、本発明は、下記技術案を採用する。
【０００７】
ｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究方法であって、
乾燥地、林地、湿地及び人工地盤のそれぞれから、活動が集中しているサンプリングポイントを２キロメートルの間隔距離で７個選択して、滅菌済みのＰＰ広口瓶を用いて１Ｌの
サンプリング量でサンプリングし、サンプリングポイントごとに同じサンプルを二つ収集し、６ヵ月おきに１回サンプリングするステップＳ１と、
収集されたサンプルの表層水から１５ｍｌ取り、３Ｍの酢酸ナトリウム１．５ｍｌを加えて、さらに無水エタノール３３ｍｌを加え、均一に混合し、−２０℃で３０００ｒｄ遠心分離して、１０ｍｉｎ後に取り出し、沈殿物の発生を観察し、異なるキットでＤＮＡサンプルを別々抽出するステップＳ２と、
Ｓ２で抽出されたＤＮＡサンプルを超微量分光光度計に入れて検出し、サンプルＤＮＡの濃度を分析し、カバーする種が最も多く且つ同定精度が最も高いユニバーサルプライマーを選択し、プライマーを用いて多様性ＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をＤＮＡ試薬で精製して回収し、ＤＮＡ精製において複数回の溶出を行い、精製したＤＮＡを４℃の冷蔵庫に入れて冷蔵保存し、クローンシーケンシングライブラリーを構築して、ＰＣＲ増幅後のＤＮＡ断片について遺伝子検出を行い、検出された遺伝子配列結果をＮＣＢＩデータベースの遺伝子配列と比較するステップＳ３と、
遺伝子シーケンシングの比較結果について検出種の分類学基準に従って上記検出結果を統計して、シャノン・ウィナー指数によって数学モデルを作成し、種の豊富さ及び均等度を総合的に評価し、その表現式は、
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であり、
式中、Ｈは、Ｓｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ指数であり、Ｓは、種の豊富さであり、Ｐｉは、総個体数に占めるｉ番目の個体の割合を示すステップＳ４と、
土地利用のタイプによってサンプリングするごとにサンプリングポイントを分類して統計し、毎回のサンプリングにおけるサンプリングポイントのある種類の土地の総面積をＳ０、Ｓ１、．．．Ｓｎとして、計算式（Ｓｎ−Ｓｎ−１）／Ｓｎ−１＊１００％＝ηによりサンプリングポイントの土地利用の変化トレンドを計算し、
式中、ηは、土地利用の変化トレンドであるステップＳ５と、
まず、いずれかのサンプリングポイントの各土地利用のタイプとＳｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ指数との相関性を分析し、次に、各サンプリングポイントのＳｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ指数と土地利用の変化トレンドの両方の間のトレンドを分析するステップＳ６と、を含む。
【０００８】
好ましくは、前記Ｓ３におけるクローンシーケンシングライブラリーの構築には、
Ｓ３における精製ＰＣＲ産物２ｕＬをベクターｐＭＤ１８−Ｔと連結して、ＤＨ５ａコンピテントセルを形質転換し、３７℃で２４−３２ｈ恒温培養するステップと、
クローニングが終了した後、５０個のシングルコロニーをピックアップし、プライマーＦ及びＲを用いてコロニーＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により検出して、ターゲットバンドであると確認すると、後続の実験を行うステップと、
上記サンプルのそれぞれから３０個のシングルコロニーをピックアップして一晩拡大培養し、ＴＳＩＮＧＫＥプラスミド抽出キットでプラスミドを抽出して、ＡＢＩ  ３７３０ＸＬシーケンサーを用いて上記サンプルに対してシーケンシング検出を行うステップと、を含む。
【０００９】
好ましくは、前記土地利用のタイプは、それぞれ、乾燥地、森林地、低木林地、疎林地、ほかの林地、高植被率草地、低植被率草地、貯水池・池沼、干潟、都市用地、農村集落地及びほかの建設用地であり、
森林地、低木林地、疎林地、ほかの林地、高植被率草地及び低植被率草地を林地、貯水池・池沼及び干潟を湿地、都市用地、農村集落地及びほかの建設用地を人工土地として取り
扱い、
合計乾燥地、林地、湿地及び人工地盤の４種類の土地利用のタイプに分けられ、前記Ｓ６においてＳＰＳＳ２０．０を用いて各土地利用のタイプとＳｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ指数との相関性を分析した結果、前記Ｓ６における各土地利用のタイプとＳｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ指数との相関性分析の結果は、０．０５水準で有意的に相関する場合と０．０１水準で有意的に相関する場合に分けられる。
【００１０】
好ましくは、Ｓ６における各サンプリングポイントのＳｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ指数と土地利用の変化トレンドの両方のトレンドによって、土地利用のタイプを制御する。
【００１１】
ｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究装置は、ｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究方法に適用される装置であり、ボトル本体、ボトルキャップ及び保護ハウジングを備え、前記ボトル本体は保護ハウジングの内部に移動可能に当接され、前記ボトル本体の上端の内部にボトルキャップが移動可能に当接され、前記ボトル本体の右側内壁に接続装置が固定して取り付けられ、前記ボトル本体の前側の外面に目盛りが設けられ、前記ボトルキャップの内部に接続孔が周方向に等間隔で設置され、前記ボトルキャップの内部の軸心に回動軸の下端が移動可能に当接され、前記回動軸の上端が回動板の軸心に移動可能に当接され、前記回動板の下面がボトルキャップの上面に密着し、前記回動板の内部に接続孔に合わせた固定孔が周方向に等間隔で設置される。
【００１２】
好ましくは、前記接続装置は制限チューブ、移動板、接続チューブ、シールチューブ、固定チューブ及び回動チューブを備え、前記制限チューブの右端がボトル本体の内壁に固定して接続され、前記制限チューブの内部の上下両側に制限溝が設置され、前記制限溝の内部に制限ロッドが移動可能に当接され、前記制限ロッドの右端がバネの左端に固定して接続され、前記バネの右端が制限溝の内部の底端に固定して接続され、前記制限ロッドの左端が移動板の右側の上下両端に固定して接続され、前記移動板の内側面の上下両側が固定ロッドの左端に固定して接続され、前記固定ロッドの右端が接続チューブの左端に固定して接続され、前記接続チューブの右端が回動チューブの内部に移動可能に当接され、前記回動チューブの外部が固定チューブの内部に移動可能に当接され、前記固定チューブの左端がボトル本体の右側に固定して接続され、前記固定チューブの左端の内部にシールチューブが移動可能に当接され、前記シールチューブの左端が制限チューブの右端に固定して接続され、前記接続チューブの左端が制限チューブの内部に移動可能に当接される。
【００１３】
好ましくは、前記接続チューブの左端の上下両側に固定溝が設置され、前記固定溝の内部に係合ピンが移動可能に当接され、前記係合ピンの内側端が圧縮バネの外側端に固定して接続され、前記圧縮バネの内側端が固定溝の底端に固定して接続され、前記制限チューブの内部の左右両端の上下両側に係合溝が設置され、前記係合溝は係合ピンと嵌め合いし、前記回動チューブの左端の上下両側が安定ロッドの内側端に固定して接続され、前記固定チューブの右端の内部の上下両側に安定溝が設置され、前記安定溝の内部に安定ロッドが移動可能に当接される。
【発明の効果】
【００１４】
従来技術に比べて、本発明は、ｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究装置及び方法を提供し、以下の有益な効果を有する。
（１）本発明の方法は、ｅＤＮＡ技術を用いて、数ミリリットル〜数リットルの水サンプルを収集して、水に残留された生物の遺伝子を検出することによって魚類の有無を決定する調査方法である。わずか数時間でＤＮＡ抽出とｑＰＣＲ分析を完了し、データベースと比較して種を高速に同定できる。ほとんどの生物の遺伝物質であるＤＮＡは、一意の属性を持ち、環境において比較的安定しているため、検出された種の分類に関する論争は、従
来の分類方法よりもはるかに低下する。河川の生態学的多様性の調査におけるｅＤＮＡ法と従来の生物学的調査方法の長所と短所を比較した結果、ｅＤＮＡは従来の調査方法よりも感度が高く、適時性が高く、環境にやさしいなどの特徴を有し、さらに２世代ハイスループットシーケンシング技術と３世代遺伝子検出技術の発展は、水生生物検定を効率的かつ正確に行うために基礎を築き、生物多様性の調査速度を大幅に向上させ、ｅＤＮＡ技術により複数の種の存在を同時に検出することを可能にする。
（２）本発明の方法は、土地利用方式の変化がマクロからミクロまで魚類の個体群構造及び組成をさまざまな点で変化させるため、土地利用方式の変化を調べることによって、魚類の個体群構造の変化を分析する。たとえば、人工地盤は、地表温度の上昇を引き起こし、さらに水域の温度を上昇させて、冷水魚の優位に悪影響を与え、湿地面積の減少又は湿地生息環境の断片化は、魚類の回遊を妨げ、深刻な場合は魚類の生息地を破壊し、土地利用の変化に河流の幅、流速などの変化が伴う場合が多く、それによって、一部の種の優位又は劣位を変える。さらに、人工土地の増加は、一般的には、人間の活動が増加していることを意味し、人間は、意図的又は非意図的に地元の魚類の群集を直接変化させ、たとえば、放流や繁殖などの方式により侵入種を導入し、これらの直接的な影響以外、土地利用による蓄積効果も、水生生態系へ脅威をもたらす。Ｍａｌｏｎｅｙらの研究者は、米国のジョージア州で歴史的な土地利用方式により生じる物理化学的影響による魚類、藻類などの生物多様性への影響を研究したところ、土地利用方式による水生生態系への影響を確実に確認し、また、土地利用方式が河川の生物完全性へ一定の影響を与えることを予測し、土地利用変化による生態学的効果は、非常に複雑であり、魚類は、明らかに最も敏感なアクセプター及び指標生物の１つであり、魚類の多様性変化と土地利用との関係の研究は、水生生物多様性のさらなる保護にとって重要なことである。
（３）本発明の方法を使用するときに、収集された試料をｅＤＮＡに基づく土地利用の変化による魚類多様性への影響の研究装置に入れて、所定時間経過した後、試料の内部が分離したときに、ボトル本体の右側に設置された接続装置で装置の内部における試料を収集し、収集チューブを接続チューブに固定して接続し、次に、回動チューブを回して接続チューブを内へ移動させることによって、固定ロッドを押して外へ移動させ、さらに制限ロッドを外へ移動させ、移動板を外へ移動させ、それによって移動板と制限チューブとの間に隙間が生じて、この隙間から試料を取り出すことができ、本装置によれば、装置を開けずに装置の内部の上・中・下部分における試料を取り出すことができ、試料の汚染を防止できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明によるｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究装置の正面構造模式図である。
【図２】本発明によるｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究装置のＡ部分の拡大構造模式図である。
【図３】本発明によるｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究装置のボトルキャップの三次元構造模式図である。
【図４】本発明によるｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究装置のボトルキャップの分解構造模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施例における図面を参照しながら、本発明の実施例における技術案を明瞭で完全に説明するが、明らかなように、説明する実施例は、本発明の実施例の一部に過ぎず、すべての実施例ではない。
【００１７】
なお、本発明の説明において、「上」、「下」、「前」、「後」、「左」、「右」、「頂」、「底」、「内」、「外」などの用語により示される方位又は位置関係は、図面に示される方位又は位置関係に基づくものであり、本発明を容易に説明し説明を簡素化させるた
めに過ぎず、示される装置又は素子が必ず特定の方位を有したり、特定の方位で構造又は操作されたりすることを指示又は示唆するものではなく、そのため、本発明を限制するものとして理解すべきではない。
【００１８】
実施例１
ｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究方法は、
乾燥地、林地、湿地及び人工地盤のそれぞれから、活動が集中しているサンプリングポイントを２キロメートルの間隔距離で７個選択して、滅菌済みのＰＰ広口瓶を用いて１Ｌのサンプリング量でサンプリングし、サンプリングポイントごとに同じサンプルを二つ収集し、６ヵ月おきに１回サンプリングするＳ１と、
収集されたサンプルの表層水から１５ｍｌ取り、３Ｍの酢酸ナトリウム１．５ｍｌを加えて、さらに無水エタノール３３ｍｌを加え、均一に混合し、−２０℃で３０００ｒｄ遠心分離して、１０ｍｉｎ後に取り出し、沈殿物の発生を観察し、異なるキットでＤＮＡサンプルを別々抽出するステップＳ２と、
サンプルろ過膜の破片を取り出して、ＤＮＡ抽出試薬でろ過膜の破片のサンプルにＤＮＡ抽出実験を行い、抽出されたＤＮＡサンプルを超微量分光光度計に入れて検出し、サンプルＤＮＡの濃度を分析し、カバーする種が最も多く且つ同定精度が最高であるユニバーサルプライマーを選択し、プライマーを用いて多様性ＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をＤＮＡ試薬で精製して回収し、ＤＮＡ精製において複数回の溶出を行い、精製したＤＮＡを４℃の冷蔵庫に入れて冷蔵保存し、クローンシーケンシングライブラリーを構築して、ＰＣＲ増幅後のＤＮＡ断片について遺伝子検出を行い、検出された遺伝子配列結果をＮＣＢＩデータベースの遺伝子配列と比較するステップＳ３と、
遺伝子シーケンシングの比較結果について検出種の分類学基準に従って上記検出結果を統計して、シャノン・ウィナー指数によって数学モデルを作成し、種の豊富さ及び均等度を総合的に評価し、その表現式は、
2020089363.tif 000004
であり、
式中、Ｈは、Ｓｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ指数であり、Ｓは、種の豊富さであり、Ｐｉは、総個体数に占めるｉ番目の個体の比例を示すステップＳ４と、
土地利用のタイプによってサンプリングするごとにサンプリングポイントを分類して統計し、毎回のサンプリングにおけるサンプリングポイントのある種類の土地の総面積をＳ０、Ｓ１、．．．Ｓｎとして、計算式（Ｓｎ−Ｓｎ−１）／Ｓｎ−１＊１００％＝ηによりサンプリングポイントの土地利用の変化トレンドを計算し、
式中、ηは、土地利用の変化トレンドであるステップＳ５と、
まず、いずれかのサンプリングポイントの各土地利用のタイプとＳｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ指数との相関性を分析し、次に、各サンプリングポイントのＳｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ指数と土地利用の変化トレンドの両方の間のトレンドを分析するステップＳ６と、を含む。
さらに、好ましくは、Ｓ３におけるクローンシーケンシングライブラリーの構築には、
Ｓ３における精製ＰＣＲ産物２ｕＬをベクターｐＭＤ１８−Ｔと連結して、ＤＨ５ａコンピテントセルを形質転換し、３７℃で２４−３２ｈ恒温培養するステップと、
クローニングが終了した後、５０個のシングルコロニーをピックアップし、プライマーＦ及びＲを用いてコロニーＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により検出して、ターゲットバンドであると確認すると、後続の実験を行うステップと、
上記サンプルのそれぞれから３０個のシングルコロニーをピックアップして一晩拡大培養し、ＴＳＩＮＧＫＥプラスミド抽出キットでプラスミドを抽出して、ＡＢＩ  ３７３０Ｘ
Ｌシーケンサーを用いて上記サンプルに対してシーケンシング検出を行うステップと、を含む、
【００１９】
さらに、好ましくは、土地利用のタイプは、それぞれ、乾燥地、森林地、低木林地、疎林地、ほかの林地、高植被率草地、低植被率草地、貯水池・池沼、干潟、都市用地、農村集落地及びほかの建設用地であり、
森林地、低木林地、疎林地、ほかの林地、高植被率草地及び低植被率草地を林地、貯水池・池沼及び干潟を湿地、都市用地、農村集落地及びほかの建設用地を人工土地として取り扱い、
合計乾燥地、林地、湿地及び人工地盤の４種類の土地利用のタイプに分けられ、Ｓ６においてＳＰＳＳ２０．０を用いて各土地利用のタイプとＳｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ指数との相関性を分析した結果、Ｓ６における各土地利用のタイプとＳｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ指数との相関性分析の結果は、０．０５水準で有意的に相関する場合と０．０１水準で有意的に相関する場合に分けられる。
【００２０】
さらに、好ましくは、Ｓ６における各サンプリングポイントのＳｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ指数と土地利用の変化トレンドの両方のトレンドによって、土地利用のタイプを制御する。
【００２１】
実施例２
実施例１を基礎としたが、以下の点が異なる。
本発明の方法は、ｅＤＮＡ技術を用いて、数ミリリットル〜数リットルの水サンプルを収集して、水に残留された生物の遺伝子を検出することによって魚類の有無を決定する調査方法である。わずか数時間でＤＮＡ抽出とｑＰＣＲ分析を完了し、データベースと比較して種を高速で同定できる。ほとんどの生物の遺伝物質であるＤＮＡは、一意の属性を持ち、環境において比較的安定しているため、検出された種の分類に関する論争は、従来の分類方法よりもはるかに低下する。河川の生態学的多様性の調査におけるｅＤＮＡ法と従来の生物学的調査方法の長所と短所を比較した結果、ｅＤＮＡは従来の調査方法よりも感度が高く、適時性が高く、環境にやさしいなどの特徴を有し、さらに２世代ハイスループットシーケンシング技術と３世代遺伝子検出技術の発展は、水生生物検定を効率的かつ正確に行うために基礎を築き、生物多様性の調査速度を大幅に向上させ、ｅＤＮＡ技術により複数の種の存在を同時に検出することを可能にする。
【００２２】
実施例３
実施例１及び２を基礎としたが、以下の点が異なる。
本発明の方法は、土地利用方式の変化がマクロからミクロまで魚類の個体群構造及び組成をさまざまな点で変化させるため、土地利用方式の変化を調べることによって、魚類の個体群構造の変化を分析する。たとえば、人工地盤は、地表温度の上昇を引き起こし、さらに水域の温度を上昇させて、冷水魚の優位に悪影響を与え、湿地面積の減少又は湿地生息環境の断片化は、魚類の回遊を妨げ、深刻な場合は魚類の生息地を破壊し、土地利用の変化に河流の幅、流速などの変化が伴う場合が多く、それによって、一部の種の優位又は劣位を変える。さらに、人工土地の増加は、一般的には、人間の活動が増加していることを意味し、人間は、意図的又は非意図的に地元の魚類の群集を直接変化させ、たとえば、放流や繁殖などの方式により侵入種を導入し、これらの直接的な影響以外、土地利用による蓄積効果も、水生生態系へ脅威をもたらす。Ｍａｌｏｎｅｙらの研究者は、米国のジョージア州で歴史的な土地利用方式により生じる物理化学的影響による魚類、藻類などの生物多様性への影響を研究したところ、土地利用方式による水生生態系への影響を確実に確認し、また、土地利用方式が河川の生物完全性へ一定の影響を与えることを予測し、土地利用変化による生態学的効果は、非常に複雑であり、魚類は、明らかに最も敏感なアクセプター及び指標生物の１つであり、魚類の多様性変化と土地利用との関係の研究は、水生生
物多様性のさらなる保護にとって重要なことである。
【００２３】
実施例４
実施例１、２及び３を基礎としたが、以下の点が異なる。
ｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究装置は、ｅＤＮＡに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究方法に適用される装置であり、ボトル本体２、ボトルキャップ１及び保護ハウジング３を備え、ボトル本体２は保護ハウジング３の内部に移動可能に当接され、ボトル本体２の上端の内部にボトルキャップ１が移動可能に当接され、ボトル本体２の右側内壁に接続装置が固定して取り付けられ、ボトル本体２の前側の外面に目盛りが設けられ、ボトルキャップ１の内部に接続孔２２が周方向に等間隔で設置され、ボトルキャップ１の内部の軸心に回動軸２１の下端が移動可能に当接され、回動軸２１の上端が回動板１９の軸心に移動可能に当接され、回動板１９の下面がボトルキャップ１の上面に密着し、回動板１９の内部に接続孔２２に合わせた固定孔２０が周方向に等間隔で設置される。
接続装置は、制限チューブ２３、移動板５、接続チューブ１２、シールチューブ１６、固定チューブ１５及び回動チューブ１３を備え、制限チューブ２３の右端がボトル本体２の内壁に固定して接続され、制限チューブ２３の内部の上下両側に制限溝１８が設置され、制限溝１８の内部に制限ロッド４が移動可能に当接され、制限ロッド４の右端がバネ９の左端に固定して接続され、バネ９の右端が制限溝１８の内部の底端に固定して接続され、制限ロッド４の左端が移動板５の右側の上下両端に固定して接続され、移動板５の内側面の上下両側が固定ロッド７の左端に固定して接続され、固定ロッド７の右端が接続チューブ１２の左端に固定して接続され、接続チューブ１２の右端が回動チューブ１３の内部に移動可能に当接され、回動チューブ１３の外部が固定チューブ１５の内部に移動可能に当接され、固定チューブ１５の左端がボトル本体２の右側に固定して接続され、固定チューブ１５の左端の内部にシールチューブ１６が移動可能に当接され、シールチューブ１６の左端が制限チューブ２３の右端に固定して接続され、接続チューブ１２の左端が制限チューブ２３の内部に移動可能に当接される。
【００２４】
接続チューブ１２の左端の上下両側に固定溝１０が設置され、固定溝１０の内部に係合ピン８が移動可能に当接され、係合ピン８の内側端が圧縮バネ６の外側端に固定して接続され、圧縮バネ６の内側端が固定溝６の底端に固定して接続され、制限チューブ２３の内部の左右両端の上下両側に係合溝１７が設置され、係合溝１７は係合ピン８と嵌め合いし、回動チューブ１３の左端の上下両側が安定ロッド１１の内側端に固定して接続され、固定チューブ１５の右端の内部の上下両側に安定溝１４が設置され、安定溝１４の内部に安定ロッド１１が移動可能に当接される。
【００２５】
本発明の方法を使用するときに、収集された試料をｅＤＮＡに基づく土地利用の変化による魚類多様性への影響の研究装置に入れて、所定時間経過した後、試料の内部が分離したときに、ボトル本体２の右側に設置された接続装置で装置の内部における試料を収集し、収集チューブを接続チューブ１２に固定して接続し、次に、回動チューブ１３を回して固定チューブ１５の内部で回動させることによって、接続チューブ１２を内へ移動させて、接続チューブ１２の左端の上下両側における係合ピン８と係合溝１７を互いに分離し、係合ピン８と他側の係合溝１７とを互いに嵌め合わせることによって、固定ロッド７を押して外へ移動させ、さらにバネ９を外へ移動させるように制限ロッド４を駆動し、移動板５を外へ移動させ、それによって移動板５と制限チューブ２３との間に隙間が生じて、この隙間から試料を取り出すことができ、本装置によれば、装置を開けずに装置の内部の上・中・下部分における試料を取り出すことができ、試料の汚染を防止でき、試料の取出が終了した後、回動チューブ１３を回して固定チューブ１５の内部で回動させて、接続チューブ１２を外へ移動させることによって、接続チューブ１２の左端の上下両側の係合ピン８と係合溝１７を互いに分離し、係合ピン８と他側の係合溝１７を互いに嵌め合わせること
によって、固定ロッド７を押して内へ移動させ、バネ９を介して制限ロッド４を内へ移動させて、移動板５を内へ移動させ、それにより、移動板５と制限チューブ２３の間をシール状態に保持する。
【００２６】
以上は、本発明の特定の好適実施方式に過ぎず、本発明の特許範囲は、それに制限されず、当業者が本発明で開示された技術的範囲内で、本発明の技術案及びその発明構想に基づいて実施する同等置換又は変化は、すべて本発明の保護範囲に含まれる。
【符号の説明】
【００２７】
１ボトルキャップ、２ボトル本体、３保護ハウジング、４制限ロッド、５移動板、６固定溝、７固定ロッド、８係合ピン、９バネ、１０固定溝、１１安定ロッド、１２接続チューブ、１３回動チューブ、１４安定溝、１５固定チューブ、１６シールチューブ、１７係合溝、１８制限溝、１９回動板、２０固定孔、２１回動軸、２２接続孔、２３制限チューブ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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