(57)【要約】      （修正有）【課題】バイオセンサのプローブにおいて、酵素およびレドックスメディエータの外部への流出を防止して、耐久性を向上させる。【解決手段】バイオセンサプローブのセンシング部分を構成するベースとなる絶縁性基板１１１の縦断面における形状を、上底が下底に対して短い台形とする。【選択図】図８
2020156911.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオセンサ用のプローブであって、平面図において、生体内に挿入するセンシング部分およびバイオセンサ本体の内部回路と電気的接続するための端子部分からなり、前記センシング部分は、
絶縁性基板であって、表側の面を上側とし裏側の面を下側とする縦断面における形状が、上底が下底に対して短い台形である絶縁性基板、
前記絶縁性基板の表側の面および裏側の面に形成された導電性薄膜、
前記絶縁性基板の表側の導電性薄膜上に形成された作用電極および参照電極、
前記絶縁性基板の裏側の導電性薄膜上に形成された対極、
前記絶縁性基板の表側の面に形成された導電性薄膜上に形成された検知層、ならびに
前記作用電極、前記参照電極、前記対極および前記検知層を被覆する生体性適合保護膜
を備えた、プローブ。
【請求項２】
前記台形が、略等脚台形であり、その上底と脚とが形成する角における前記脚の接線と上底とがなす角度が１０５〜１３０°である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記検知層は、少なくともレドックスメディエータおよび検体応答性酵素を含む、請求項１または２に記載のプローブ。
【請求項４】
前記検知層は、レドックスメディエータを含むメディエータ層および検体応答性酵素を含む酵素層から構成される多層膜である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項５】
バイオセンサ用のプローブの製造方法であって、
プローブのベースとなる絶縁性基板を裁断して、前記プローブを、平面図において、生体内に挿入するセンシング部分およびバイオセンサ本体の内部回路と電気的接続するための端子部分からなり、かつ、前記センシング部分を、表側の面を上側とし裏側の面を下側とする縦断面における形状を、上底が下底に対して短い台形とする工程、
前記絶縁性基板の表側の面および裏側の面に導電性薄膜を形成する工程、
前記絶縁性基板の表側の面に形成された導電性薄膜導電性薄膜上に検知層を形成する工程；ならびに、
前記作用電極、前記参照電極、前記対極および前記検知層を生体性適合保護膜で被覆する工程
を含む、プローブの製造方法。
【請求項６】
前記台形が、略等脚台形であり、その上底と脚とが形成する角における前記脚の接線と上底とがなす角度が１０５〜１３０°である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記絶縁性基板を裁断する工程が、ピナクルダイを用いるピナクルカット法で形成される、請求項５または６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、例えば、液体試料の被検体に含まれる特定物質の濃度を計測するバイオセンサを構成するプローブおよびその製造方法に関する。より詳しくは、本開示により、体内に挿入されるバイオセンサプローブに形成された検知層に含まれる酵素やメディエータの漏出または変質を防止することによって、バイオセンサの耐久性を向上したバイオセンサプローブおよびその製造方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサとは、生体の有する分子認識能を利用あるいは模倣して物質を計測するシステムであり、例えば、酵素−基質、抗原−抗体、ホルモン−レセプターなどの組合せのうち一方を検体（測定対象物質）とし、他方を受容体として検体とその受容体との間の分子認識反応によって発生する化学的な変化をトランスデューサーで電気信号に変換し、得られた電気信号の強さに応じて検体の量を測定する測定装置である。
【０００３】
バイオセンサに用いる生体分子として、上記以外にも遺伝子、糖鎖、脂質、ペプチド、細胞、組織なども含まれる。なかでも、酵素を用いたバイオセンサは盛んに開発が行われており、その代表例が、自己血糖測定に用いられるグルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOx）やグルコース脱水素酵素 (Glucose dehydrogenase; GDH)などを用いた電気化学式グルコースセンサである。
【０００４】
自己血糖測定に用いられる電気化学式グルコースセンサは、概略、その表面に電極が形成された絶縁基板の上に、スペーサーを介してカバーが配置されている構成である。前記電極上には検体応答性酵素、レドックスメディエータ（電子伝達体）等を含む試薬が配置されており、この部分が分析部となる。この分析部には、血液を導入するための流路の一端が連通しており、前記流路の他端は外部に向かって開口しており、ここが血液供給口となる。このようなセンサを用いた血糖値の測定は、例えば、次のようにして行われる。すなわち、まず、前記センサを専用の測定装置（メータ）にセットする。そして、指先等をランセットで傷つけて出血させ、これに前記センサの血液供給口を接触させる。血液は、毛細管現象によりセンサの流路に吸い込まれ、これを通って分析部に導入され、ここで、前記試薬と接触する。そして、検体応答性酵素E（例えば、GOx、GDH）は、血液中のグルコースと特異的に反応することでグルコースを酸化する。レドックスメディエータMは、酸化によって発生した電子を受容する。電子を受容して還元されたレドックスメディエータMは、電極で電気化学的に酸化される。還元体レドックスメディエータMの酸化によって得られる電流値や電荷量などの大きさから、血液中のグルコース濃度、すなわち血糖値が簡便に検出される。
【０００５】
このような電気化学式血糖センサは、糖尿病治療における血糖値管理に重要な役割を果たし、糖尿病患者は血糖値に基づく適切なインスリン投与や食事制限を行うことができる。しかしながら、一日に何度も血糖値を測定しなければならず、その都度血液採取をすることは患者に苦痛を強いることとなるので、生活の質（Quality of Life; QOL）を維持することが困難であった。
【０００６】
すでに埋め込み型電気化学式グルコースセンサが開発されている。このような埋め込み型電気化学式グルコースセンサ1の本体10を生体2に貼り付けてプローブ11を生体内に挿入して継続的に血糖値の測定を行う（図１および２）。これにより、その都度血液採取することなく、長時間にわたり血糖値を測定することができる。
【０００７】
厚生労働省は、「平成9年遠隔診療通知（平成9年12月24日付け健政発第1075号厚生省健康政策局長通知）」を行い、遠隔診療の基本的考え方や医師法第20条等との関係から留意すべき事項を示した。その後、情報通信機器の開発・普及の状況を踏まえ、２０１５年８月１０日付けで情報通信機器を用いた診療（いわゆる「遠隔診療」）について各都道府県知事に向けて事務連絡を行った。２０１５年通知により、遠隔診療は事実上解禁され、２０１６年には情報通信機器3（スマートフォン）と専用アプリケーションを用いて、バイオセンサ1と無線データ通信する遠隔診療ツールが世の中に出回り始めた（図３）。さらに、２０１７年７月１４日付けで、遠隔診療の取扱いについて、再度周知、明確化する趣旨で通知（医政発0714第4号）が行われた。２０１５年通知によれば、遠隔診療は、当事者が医師および患者本人であることが確認できる限り、テレビ電話や、電子メール、ソーシャルネットワーキングサービス等の情報通信機器を組み合わせた遠隔診療についても、直接の対面診療に代替し得る程度の患者の心身の状況に関する有用な情報が得られる場合には、直ちに医師法第20条等に抵触するものではない、とした。この２０１７年通知によって、情報通信機器を利用した遠隔診療がさらに発展するであろう。したがって、埋め込み型センサの需要はますます高まることが期待される。
【０００８】
従来のイン・ビボ型（埋め込み型）のバイオセンサの構成として、主面を有するベース基板と、前記ベース基板の主面上に形成され、作用極と対極とを有する電極層と、被検体と反応する試薬層と、前記試薬層を含む、被検体と試薬が反応する空間を覆う生体性適合膜と、を備えたものであった（特許文献１）。また、イン・ビトロ型のバイオセンサでは、絶縁性の基板の表面に、少なくとも測定電極と対電極を形成し、その上に少なくとも一部を覆うように試薬層を形成し、試薬層の厚さを調整するための絶縁部を設け、試薬層を形成するための絶縁部が、凹部を形成したバイオセンサもある（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第８３２６３９３号明細書
【特許文献２】特開２０００−２２１１５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記従来のイン・ビボの埋め込み型センサは、そのプローブを長時間体内に挿入するので、構成要素である検体応答性酵素やレドックスメディエータが流出する機会が増大する。検体応答性酵素やレドックスメディエータがセンサ外部に流出すれば、センサ感度が劣化するのみならず、生体に対して害を与えることとなる。また、検体応答性酵素やレドックスメディエータが外部に流出すれば、センサの耐久性も低下する。したがって、検体応答性酵素やレドックスメディエータの流出を防止する対策が非常に重要である。
【００１１】
従来のイン・ビボの埋め込み型のバイオセンサでは、ベースとなる絶縁性基板上に電極層を形成し、その上に検知層を形成し、その試薬層を生体性適合の保護膜で覆って、検体応答性酵素やレドックスメディエータなどの試薬が外部に流出することを防止しているが、絶縁性基板上に形成した検知層に対して、保護膜の膜厚が薄くなる部分が生じ、試薬が膜の外部に漏れ出す場合があり、その結果、バイオセンサの測定の耐久性が低下してしまうのであった。
【００１２】
したがって、本開示では、バイオセンサの測定の耐久性を向上するために、ベース基板上に形成した検知層に対して、保護膜の膜厚が薄くなる部分が存在しないバイオセンサプローブおよびその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本開示により、プローブのセンシング部分の縦断面における形状が略長方形の場合と比較して、縦断面における形状が上底の長さが下底の長さより短い略台形の場合、検知層側上部の保護膜の厚さが増大することが、初めて確認された。
そこで、上記課題を解決するために、本開示では、バイオセンサにおいて、バイオセンサプローブのセンシング部分を構成するベースとなる絶縁性基板の縦断面を、上底が下底に対して短い台形状にし、その上底に検知層を形成する。
【００１４】
より具体的には、本開示は、バイオセンサ用のプローブであって、平面図において、生体内に挿入するセンシング部分およびバイオセンサ本体の内部回路と電気的接続するための端子部分からなり、前記センシング部分は、
絶縁性基板であって、表側の面を上側とし裏側の面を下側とする縦断面における形状が、上底が下底に対して短い台形である絶縁性基板、
前記絶縁性基板の表側の面および裏側の面に形成された導電性薄膜、
前記絶縁性基板の表側の導電性薄膜上に形成された作用電極および参照電極、
前記絶縁性基板の裏側の導電性薄膜上に形成された対極、
前記絶縁性基板の表側の面に形成された導電性薄膜上に形成された検知層、ならびに
前記作用電極、前記参照電極、前記対極および前記検知層を被覆する生体性適合保護膜
を備えた、プローブを提供する。
【００１５】
本開示の態様は、バイオセンサ用のプローブに、表側の面を上側とし裏側の面を下側とする縦断面において、上底が下底に対して短い台形状である絶縁性基板を用いる。
【００１６】
絶縁性基板から形成されたプローブのセンシング部分は、縦断面において、上底の長さが下底の長さの７５〜９０％、好ましくは、８０〜８５％であり、高さが下底の長さの５０〜６０％、好ましくは５３〜５７％である、略等脚台形状である。また、上底と脚とが構成する角における前記脚の接線と上底とがなす角度は、１０５〜１３０°、好ましくは１１０〜１２５°である。例えば、下底の長さが３６０μｍ、高さが２００μｍの等脚台形において、上底の長さは２７０〜３２４μｍ、好ましくは２８８〜３０６μｍである。なお、下底の長さは、プローブの設計に依存して、限定されないが、例えば、２００〜４００μｍの範囲で適宜定めることができる。
【００１７】
本開示によるバイオセンサ用のプローブの製造方法は、
プローブのベースとなる絶縁性基板を裁断して、前記プローブを、平面図において、生体内に挿入するセンシング部分およびバイオセンサ本体の内部回路と電気的接続するための端子部分からなり、かつ、前記センシング部分を、表側の面を上側とし裏側の面を下側とする縦断面における形状を、上底が下底に対して短い台形とする工程、
前記絶縁性基板の表側の面および裏側の面に導電性薄膜を形成する工程、
前記絶縁性基板の表側の面に形成された導電性薄膜導電性薄膜上に検知層を形成する工程；ならびに、
前記作用電極、前記参照電極、前記対極および前記検知層を生体性適合保護膜で被覆する工程
を含む。
【００１８】
絶縁性基板を裁断して、プローブを形成する工程において、絶縁性基板を裁断できる方法であれば、レーザーカット、ピナクルダイを用いたダイカットなどのいずれの方法も用いることができる。
【００１９】
生体適合保護膜で被覆する工程において、前記プローブのセンシング部分の軸を下方に向けて、容器に収容された生体適合保護膜形成用の樹脂を含む溶液に、センシング部分を１または複数回浸漬する。適当回数の浸漬が終了したら、前記プローブの裏側の面を下にして静置した状態で乾燥させる。
【００２０】
本開示によりプローブのセンシング部分の縦断面における形状を上底の長さが下底の長さより短い略台形とした場合には、略長方形などとした場合と比較して、検知層側上部の保護膜の厚さが１０〜２０％増大する。
【発明の効果】
【００２１】
本開示によれば、絶縁性基板から形成されたプローブのセンシング部分を、表側の面を上側とし裏側の面を下側とする縦断面において、上底が下底に対して短い台形状としたので、検知層上の保護膜の膜厚を十分に厚く形成することが可能となり、その結果、試薬の外部への漏出を防ぐことができる。これにより、バイオセンサの測定の耐久性を向上することができた。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】埋め込み型バイオセンサが生体（人体）に取り付けられた状態を示す概略図。
【図２】生体（人体）に取り付けられた状態の埋め込み型バイオセンサを示す断面図。
【図３】スマートフォンと測定データを無線通信する埋め込み型バイオセンサの概略図。
【図４】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。
【図５】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。
【図６】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。
【図７】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程における、保護膜の形成手順を示す概略図。
【図８】プローブのセンシング部分の縦断面における形状の違いによる、保護膜断面形状の比較を示す概略図。
【図９】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブ表側の上面図。
【図１０】図９におけるA-A’切断線での断面図。
【図１１】図１０におけるB-B’切断線での断面図。
【図１２】図１０におけるC-C’切断線での断面図。
【図１３】略台形断面形状を有するセンシング部分を含むプローブＡおよび略長方形断面形状を有するセンシング部分を含むプローブＢのセンシング部分の断面の顕微鏡像。
【図１４】略台形断面形状を有するセンシング部分を含むプローブＡおよび略長方形断面形状を有するセンシング部分を含むプローブＢのグルコース応答特性を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
１．埋め込み型バイオセンサのプローブの製造方法
本開示のひとつの実施形態の埋め込み型バイオセンサ1のプローブ11の製造方法を説明する。以下に示す構造および製造方法は、本開示のひとつの具体例であり、本開示の特徴である略等脚台形断面形状を有するセンシング部分が形成されていれば、下記した構成に限定されるものではない。
【００２４】
（１）絶縁性基板の準備
埋め込み型バイオセンサ1は本体10とプローブ11を含み、プローブ11は、概略、生体内に挿入するセンシング部分およびバイオセンサ本体10の内部回路と電気的接続するための端子部分からなる鍵形状である。センシング部分は体内に挿入できるように細く形成され、端子部分はバイオセンサ本体10に挿入して電気的接続を形成するように一定の大きさを有する。したがって、まず、鍵形状の絶縁性基板111を準備する（図４ａ）。上段には表側から見た上面図を示し、下段には裏側から見た上面図を示す（以下、同様）。この絶縁性基板111は、生体内に挿入するプローブとして使用できる材料および厚さであれば、特に限定されることなく、例えば、約200 μm厚のポリエチレンテレフタレート (PET)を用いることができる。
鍵形状の絶縁性基板111は、材料を裁断することによって準備するが、裁断する方法は、特に限定されず、レーザーカット、ピナクルダイを用いたダイカットなどの分野公知の方法で裁断することができる。
【００２５】
（２）導電性薄膜の形成
絶縁性基板111の両面に、炭素または金、銀、白金もしくはパラジウムなどの金属よりなる群から選択される導電性金属材料をスパッタ法、蒸着法、イオンプレーティングなどにより堆積することによって導電性薄膜112を形成する（図４ｂ）。導電性薄膜の好ましい厚さは、10 nm〜数百nmである。
【００２６】
（３）電極リードの形成
絶縁性基板111の表側に形成した導電性薄膜112にレーザー描写することによって絶縁性基板111の表面に達する深さの溝113を形成して、作用電極リード112aと参照電極リード112bに分離して電気的絶縁する（図５ｃ）。
【００２７】
（４）絶縁性レジスト膜の形成
絶縁性基板111の表側に、作用電極114および参照電極115ならびに本体10と電気接続するための作用電極用端子114aおよび参照電極用端子115aとして用いる領域を除いた部分に、スパッタ法、スクリーン印刷法などにより、開口を有する絶縁性レジスト膜116aを形成し、絶縁性基板111の裏側に、対極117および本体10と電気接続するための対極用端子117aとして用いる領域を除いた部分に、スパッタ法、スクリーン印刷法などにより、開口を有する絶縁性レジスト膜116bを形成する（図５ｄ）。絶縁性レジスト膜の好ましい厚さは、5〜40 μmである。
【００２８】
（５）参照電極の形成
絶縁性基板111の表側に形成したレジスト膜116aの参照電極用の開口にAg/AgClをスクリーン印刷法やインクジェット法により堆積させて、参照電極115を形成する（図５ｅ）。参照電極の好ましい厚さは、5〜40 μmである。
【００２９】
（６）検知層の形成
作用電極114の上に、カーボン粒子などの導電性粒子、検体応答性酵素およびレドックスメディエータの混合水溶液を塗布乾燥して、導電性粒子、検体応答性酵素およびレドックスメディエータを含む検知層118を形成する（図６ｆ）。検知層の導電性を向上させるために、適宜、カーボン粒子などの導電性粒子を用いることができる。開示において、「検体応答性酵素」とは、検体の酸化または還元を特異的に触媒することのできる生化学物質を意味する。バイオセンサの検出目的に使用できれば、いかなる生化学物質でもよい。例えば、グルコースを検体とする場合、適した検体応答性酵素は、グルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOx）やグルコース脱水酵素 (Glucose dehydrogenase; GDH)などである。「レドックスメディエータ」とは、電子伝達を仲介する酸化還元物質を意味し、バイオセンサにおいて、検体（アナライト）の酸化還元反応によって生じる電子の伝達を担う。例えば、フェナジン誘導体などが含まれるが、これに限定されず、バイオセンサの検出目的に使用できれば、いかなる酸化還元物質でもよい。検知層の好ましい厚さは、5〜80 μmである。
【００３０】
本開示において、検知層は、少なくともレドックスメディエータおよび検体応答性酵素を含み、レドックスメディエータを含むメディエータ層および検体応答性酵素を含む酵素層から構成される多層膜であってもよい。
【００３１】
（７）保護膜の形成
センシング部分を、センサ保護用の生体適合性樹脂を含む溶液に浸漬して、センシング部分の両面、側面および先端に保護膜119を形成する（図６ｇ）。保護膜119は、作用電極用端子114a、参照電極用端子115aおよび対極用端子117aを被覆することなく、少なくとも、作用電極114、参照電極115、対極117および検知層118を被覆し、生体内に挿入される長さ以上に形成する。保護膜の好ましい厚さは、5〜200 μmである。
【００３２】
センサ保護用の生体適合性樹脂として、限定されないが、ポリ（4-ビニルピリジン）を用いることができ、ポリ（4-ビニルピリジン）はポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE)などの架橋剤により架橋されていてもよく、例えば、ポリ(tert-ブチルメタクリレート)-b-ポリ(4-ビニルピリジン)、ポリスチレン-co-4-ビニルピリジン-co-オリゴ[プロピレングリコールメチルエーテル]メタクリレートなどが挙げられる。
【００３３】
図７を参照して、保護膜の形成手順を詳説する。鍵型プローブのセンシング部分の軸を下方に向けて、容器に収容された生体適合保護膜形成用の樹脂溶液に浸漬する。プローブの製造条件に依存するが、１または複数回浸漬を繰り返す。適当回数の浸漬が終了したら、前記プローブの裏側の面（すなわち、縦断面における台形の下底）を下にして静置する。この状態で、室温（１８〜２５℃）にて３〜６０時間乾燥させる。
【００３４】
ポリ（4-ビニルピリジン）は、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE)などの架橋剤により架橋されていてもよい。
【００３５】
前記保護膜は、添加剤として、例えば、ポリ(2-メトキシエチルアクリレート)をさらに含有してもよい。これにより、保護膜の生体適合性が向上する。
【００３６】
プローブのセンシング部分の縦断面における形状を、本開示によって上底の長さが下底の長さより短い略台形とした場合（図８ａ）、縦断面における形状を、常法に従って略長方形にした場合（図８ｂ）と比較して、検知層側上部の保護膜の厚さが増大する。
プローブに付着した樹脂溶液は、表面張力により球形になろうとするが、重力および内部のプローブ形状に依存して、保護膜の形状が定まる。縦断面形状が略長方形の場合には、上辺と縦辺とが形成する角（センシング部分を立体的にみたとき、辺）が、樹脂溶液の流動を妨害するため、球状になりにくく、センシング部分の表側の面上に存在する樹脂溶液量が少なくなる。一方、本開示によって上底の長さが下底の長さより短い略台形とすると、上底の上方に存在する樹脂溶液と、両脚横に存在する樹脂溶液とが一体となり、球状になりやすくなり、結果として、センシング部分の表側の面上に存在する樹脂溶液量が多くなると想定される。
【００３７】
２．埋め込み型バイオセンサのプローブの内部構造
本開示のひとつの実施形態の埋め込み型バイオセンサ1のプローブ11の内部構造をさらに説明する。
【００３８】
図９に、センシング部分に保護膜まで形成された状態のプローブ11の表側から見た上面図を示す。図９のA-A’切断線での断面図を図１０に示す。絶縁性基板111の両側に導電性薄膜112が形成されている。表側の導電性薄膜112では、溝113によって作用電極リード112aと参照電極リード112bの２つのリードに分離され、電気的に絶縁されている。作用電極リード112aの一部が作用電極114として機能し、作用電極114上に検知層118が形成されている。検知層118は、一層で示されているが、作用電極上にメディエータ層118aを形成し、その上にレドックスメディエータ層118bを形成して二層構造とすることができ、実施形態に依存して、その他の構成も許容される。また、絶縁性レジスト膜116aの開口部分に参照電極115が形成されて、参照電極リード112bと電気的に接続している。裏側の導電性薄膜112は対極リード112cとなり、その一部が対極117として機能する。
【００３９】
図１０のB-B’切断線での断面図を図１１に示す。絶縁性基板111の表側に作用電極115が形成され、その上に検知層118が形成され、裏側に対極117が形成されている。さらに、センシング部分の周囲全体が本開示の保護膜119で被覆されていることが分かる。
なお、図１１において、プローブ内部の基本的構造を説明する趣旨から、絶縁性基板の断面形状は長方形として、簡便に描写している。
【００４０】
図１０のC-C’切断面での断面図を図１２に示す。絶縁性基板111の表側に、溝113で電気的に分離された作用電極リード112aと参照電極リード112bとが形成され、その上に絶縁性レジスト膜116aが形成されている。絶縁性レジスト膜116aの開口部に参照電極115が形成されている。基板111の裏側に対極リード112cが形成され、その上に絶縁性レジスト膜116bが形成されている。さらに、センシング部分の周囲全体が本開示の保護膜119で被覆されていることが分かる。
なお、図１２において、プローブ内部の基本的構造を説明する趣旨から、絶縁性基板の断面形状は長方形として、簡便に描写している。
【実施例】
【００４１】
［実施例１］
＜プローブの作製＞
（１）絶縁性基板の準備
図４ａに示すように、ポリエチレンテレフタレート (PET)シート（東レ株式会社製ルミラーR E20 #188; 189 μm厚）を裁断して、鍵形状の絶縁性基板を準備した。この実施例において、ＰＥＴシートの裁断は、ピナクルダイを用いるダイカット（以下、「ピナクルカット」と称する。）により行った。絶縁性基板の縦断面の形状は略台形であった（後で示す）。
【００４２】
（２）導電性薄膜の形成
図４ｂに示すように、前記絶縁性基板の両面に、スパッタ法により金を堆積することによって、導電性薄膜（厚さ30 nm）を形成した。
【００４３】
（３）電極リードの形成
図５ｃに示すように、絶縁性基板の表側に形成した導電性薄膜にレーザー描写することによって絶縁性基板の表面に達する深さの溝を形成して、作用電極リードと参照電極リードに分離して電気的分離した。
【００４４】
（５）絶縁性レジスト膜の形成
図５ｄに示すように、絶縁性基板の表側に、作用電極および参照電極ならびに、埋め込み型バイオセンサの本体と電気接続するための作用電極用端子および参照電極用端子として用いる領域を除いた部分に開口を有する絶縁性レジスト膜をスクリーン印刷法により形成し、絶縁性基板の裏側に、対極および本体と電気接続するための対極用端子として用いる領域を除いた部分に開口を有する絶縁性レジスト膜（厚さ10-15 μm）をスクリーン印刷法により形成した。
【００４５】
（６）参照電極の形成
図５ｅに示すように、絶縁性基板の表側に形成したレジスト膜の参照電極用の開口にAg/AgClをスクリーン印刷法により堆積させて、参照電極（厚さ10-15 μm）を形成した。
【００４６】
図では、基板上での各構成の位置関係が明確になるように、鍵形状に裁断した基板に対して種々の構成を図示しているが、実際のプローブ作製に際しては、ここまでの工程を行ってから、加工された基板を鍵形状に裁断した。
【００４７】
（７）検知層の形成
図６ｆに示すように、絶縁性基板の表側に形成した絶縁性レジスト膜の開口部から露出した導電性薄膜を作用電極とし、その上に、レドックスメディエータとしてフェナジン誘導体を含む水溶液約0.3 μlを塗布し乾燥して、メディエータ層を形成し、このメディエータ層の上に、検体応答性酵素としてグルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOD）およびポリアクリル酸ナトリウムを含む水溶液を塗布し乾燥して酵素層を形成することによって、二層構造の検知層（厚さ15 μm）を形成した。
【００４８】
（８）保護膜の形成
図６ｇに示すように、センシング部分を、架橋剤および保護膜用ポリマーを含むエタノール溶液に浸漬して、センシング部分の両面、側面および端面に保護膜（厚さ5-40 μm）を形成した。
より具体的には、ポリ（4-ビニルピリジン） 600 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 47 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で６回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブAを得た。
【００４９】
プローブＡのセンシング部分（先端から約１ｍｍの部位）を縦に切断して、図１０に示すB-B’切断線での断面図に相当する切断面を光学顕微鏡により観察した顕微鏡像を図１３（ａ）に示す。
絶縁性基板は、上底が約３００μｍ、下底が約３６０μｍ、高さが約２００μｍの略等脚台形であった。また、下底より下方に形成された保護膜の厚さが約８０μｍ、上底より上方に形成された保護膜の厚さが約１１５μｍ、左右の脚の側方に形成された保護膜の厚さが、６０〜７０μｍであった。また、上底と脚とが構成する角における前記脚の接線と上底とがなす角度は、約１１５〜１２０°の範囲内であった。
前記寸法および角度の測定要領は、プローブAの切断面を例にして、図１３（ｃ）に示される。
【００５０】
＜プローブ特性の測定＞
［耐久性］
プローブAを37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中で保管した。保管前(0日目)と、保管後3, 7および15日目に、プローブAを埋め込み型アンペロメトリックグルコースセンサに取り付けて、37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中にプローブを設置した。このPBS溶液にグルコースを700 mg/dL添加して、電流応答値（nA）を測定した。0日目の電流応答値を100%として、各濃度での応答率 (%)を算出した。
保管後15日目の応答特性は、保管前の20%以上残存しており、耐久性は良好であった。結果を表１にまとめ、図１４に示した。
【００５１】
【表１】
2020156911.tif 000003
【００５２】
［比較例１］
＜プローブの作製＞
実施例１において、ＰＥＴシートの裁断をレーザーカットにより行って、絶縁性基板の縦断面の形状を略長方形とした（後で示す）以外は、実施例１と同様の条件で、プローブＢを得た。
【００５３】
プローブＡのセンシング部分（先端から約１ｍｍの部位）を縦に切断して、図１０に示すB-B’切断線での断面図に相当する切断面を光学顕微鏡により観察した顕微鏡像を図１３（ｂ）に示す。
絶縁性基板は、上辺が約３６０μｍ、下辺が約３６０μｍ、高さが約２００μｍの略長方形であった。また、下辺より下方に形成された保護膜の厚さが約８０μｍ、上辺より上方に形成された保護膜の厚さが約１００μｍ、左右の辺の側方に形成された保護膜の厚さが、６０〜７０μｍであった。また、上底と脚とが構成する角における前記脚の接線と上底とがなす角度は、約９５°であった。
前記寸法および角度の測定要領は、プローブAの切断面を例にして、図１３（ｃ）に示される。
【００５４】
＜プローブ特性の測定＞
［耐久性］
プローブBの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
応答特性は、保管後3日目で保管前の50%程度にまで低下し、15日目には10%を下回り、耐久性は不良であった。結果を表２にまとめ、図１４に示した。
【００５５】
【表２】
2020156911.tif 000004
【００５６】
実施例１において、プローブのセンシング部分の断面形状を上底の長さが下底の長さより短い略等脚台形としたので、比較例１において常法で得られたセンシング部分の断面形状が略長方形のプローブと比較して、検知層上方の保護膜の厚さが増大し、その結果、耐久性が向上した。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
簡便な方法で、プローブのセンシング部分の断面形状を上底の長さが下底の長さより短い略等脚台形とすることができるので、耐久性が向上した埋め込み型バイオセンサを高い効率で製造することが可能となった。
【符号の説明】
【００５８】
1    埋め込み型バイオセンサ
10   本体
11   プローブ
111  絶縁性基板
112  導電性薄膜
112a 作用電極リード
112b 参照電極リード
112c 対極リード
113  溝
114  作用電極
115  参照電極
116  絶縁性レジスト
117  対極
118  検知層
119  保護膜
2    生体
3    情報通信機器
【図１】
2020156911.tif 000005
【図２】
2020156911.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020156911.tif 000014
【図１１】
2020156911.tif 000015
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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