(57)【要約】      （修正有）【課題】廃水に含まれる銅のように有害な金属を、生物吸着を通してバイオレメディエーションで回収する方法、及び金属ナノ材料を生合成する方法の提供。【解決手段】酵母ロドトルラ・ムチラギノーザ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）を単離する工程、単離真菌の銅耐性を決定する工程、銅ストック溶液を調製する工程、単離真菌を培養培地ＹＥＰＤ液体培地に添加して生菌バイオマスを生じさせる工程、生菌バイオマスをオートクレーブに供して、死菌バイオマスを生じさせる工程、及び、生菌バイオマス及び死菌バイオマス中の銅ナノ粒子の滞留を決定する工程、からなるロドトルラ・ムチラギノーザから銅ナノ粒子を得る方法。【選択図】図１
2020089372.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロドトルラ・ムチラギノーザ（Rhodotorula mucilaginosa）から銅ナノ粒子を得る方法であって、
ａ．酵母ロドトルラ・ムチラギノーザを単離する工程、
ｂ．工程ａの単離真菌の銅耐性を決定する工程、
ｃ．銅ストック溶液を調製する工程、
ｄ．前記単離真菌を、培養培地ＹＥＰＤ液体培地に添加して、生菌バイオマスを生じさせる工程、
ｅ．生菌バイオマスをオートクレーブに供して、死菌バイオマスを生じさせる工程、および
ｆ．該生菌バイオマスおよび死菌バイオマス中の銅ナノ粒子の滞留を決定する工程、
を含んでなる方法
【請求項２】
廃水のバイオレメディエーションの実行への、ロドトルラ・ムチラギノーザ抽出物から選択される酵母抽出物の使用。
【請求項３】
ロドトルラ・ムチラギノーザ抽出物がロドトルラ・ムチラギノーザの死菌体（dead mass）である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
銅ナノ粒子の生産用である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
ロドトルラ・ムチラギノーザから選択される酵母から、廃水のバイオレメディエーションの間に生産される銅ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロドトルラ・ムチラギノーザ（Rhodotorula mucilaginosa）から銅ナノ粒子を得る方法に関する。
【０００２】
本発明は、銅ナノ粒子を生産するために、ロドトルラ・ムチラギノーザの死菌バイオマス（dead biomass）を使用して、銅を含有する廃水バイオレメディエーションを実施することに関する。本発明は、銅ナノ粒子を工業的規模で生産することを可能にする。
【背景技術】
【０００３】
重金属は河川および工業廃水の主な汚染物質である。重金属は、例えば、クロム、カドミウム、および水銀などの極少量でも非常に有毒なものがあるので、生体系にいて非常に反応性に富み、生体内に蓄積されやすい元素であることに、特別な注意が払われてきた。これらの汚染物質の除去または削減における菌類および酵母の使用は、この種のレメディエーションによって生じる環境影響が小さいので、環境的に好適な代替法である。
【０００４】
近年、無機ナノ粒子の合成は、多くの物理学的および化学的手段によって示されてきている。しかし、化学的方法は、きわめて強烈に有害であり、生態系に優しくなく、生産性が低いので、現在では世界的に、生物学的合成の重要性が強調されている（（Singh AV, Patil R, Anand A, Milani P, Gade WN (2010) Biological synthesis of copper oxide nanopaticles using Escherichia coli. CurrNanosci 6: 365-369）。その特有の物理学的および化学的性質ならびに低コストでの調製のため、最近では銅ナノ粒子が大きな興味の対象となってきている。さらに、銅ナノ粒子には、ガスセンサー、触媒プロセス、高温超伝導体、太陽電池などの潜在的な産業用途がある（Li Y, Liang J, Tao Z, Chen J (2007) CuO particles and plates: Synthesis and gas-sensor application. Mater Res Bull 43: 2380-2385; Guo Z, Liang X, Pereira T, Scaffaro R, Hahn HT (2007) CuO nanoparticle filled vinyl-ester resin nanocomposites: Fabrication, characterization and property analysis. Compos Sci Tech 67: 2036-2044）。
【０００５】
現在、金属ナノ粒子合成の新しい代替法は、細菌、真菌、酵母、および植物と通して探究されている（Bharde AA, Parikh RY, Baidakova M, Jouen S, Hannoyer B, Enoki T, et al. (2008) Bacteria-mediated precursor-dependent biosynthesis of super paramagnetic iron oxide and iron sulfide nanoparticles. Langmuir 24: 5787-5794; Lang C, Schiller D, Faivre D (2007) Synthesis of magnetite nanoparticles for bio-and nanotechnology: genetic engineering and biomimetics of bacterial magnetosomes. MacromolBiosci 7: 144-151）。銅採掘からの廃水は、金属を抽出、選鉱、および加工する間に生成される、この有害な金属を高濃度に含有することが多い。ここ数年は、銅のように有害な金属の生物吸着を通したバイオレメディエーションが、科学的に新しいだけではなく、その潜在的な産業用途からも、非常に多くの注目を集めいてきている。
【０００６】
この新規の方法は、競争力があり、効果的で、安価である（Volesky B (2001) Detoxification of metal bearing effluents: biosorption for the next century. Hydrometallurgy 59: 203-216）。この点において、菌類は、ｐＨ、温度、および栄養素利用性の多様な極限条件下でも、金属が高濃度でも適応し、生育することができる汎用的なグループであるので、バイオレメディエーションプロセスに使用されてきた（Anand P, Isar J, Saran S, Saxena RK (2006) Bioaccumulation of copper by Trichoderma viride. Bioresource Technol 97: 1018-1025）。結果として、物理学的および化学的方法の代替として、銅ナノ粒子を調製する生合成法の開発には、多くの関心が存在している。
【０００７】
これまでの研究の文献調査（Varshney R, Bhadauria S, Gaur MS (2012) A review: Biological synthesis of silver and copper nanoparticles. Nano Biomed Eng 4: 99-106）により、銅ナノ粒子の生合成について、論文がほとんど発表されておらず、酵母ロドトルラ・ムチラギノーザ（R. mucilaginosa）を使用した研究に関する論文はないことが明らかになった。また、銅ナノ粒子に関する生合成研究の大部分は、生体内還元段階にのみ注目し、プロセスの重要な生物吸着段階を無視していた。
【０００８】
金属ナノ材料の生合成および廃水のバイオレメディエーションのための生物学的な系の範囲を広げる目標に向かって研究し、銅イオンの銅ナノ粒子への取り込みおよび還元に、酵母ロドトルラ・ムチラギノーザを使用することを初めて探究する。よって、ロドトルラ・ムチラギノーザの死菌バイオマスを使用して、銅ナノ粒子のバイオレメディエーションおよびグリーン合成が本研究において達成されている。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、バッチ生物吸着研究を示す。ロドトルラ・ムチラギノーザの生菌バイオマスおよび死菌バイオマス（live and dead biomass）への、物理化学的因子の影響。（Ａ）生物吸着剤の量の影響。（Ｂ）ｐＨの影響。（Ｃ）温度の影響。（Ｄ）接触時間の影響。（Ｅ）攪拌速度の影響。（Ｆ）初期銅濃度の影響。
【００１０】
【図２】図２は、ロドトルラ・ムチラギノーザの生物吸着等温式モデルおよび生物吸着動態を示す。生菌バイオマス（Ａ）および死菌バイオマス（Ｂ）のラングミュアプロット。生菌バイオマス（Ｃ）および死菌バイオマス（Ｄ）の擬２次モデル。
【００１１】
【図３】図３は、ロドトルラ・ムチラギノーザ断面のＴＥＭ顕微鏡写真を示す。（Ａ）金属を含まない、細胞壁、細胞膜、および細胞質を示す、金属イオンとの接触前、（Ｂ）細胞内に蓄積したナノ粒子（最も暗い矢印）および細胞壁（明るい矢印）を示す、銅金属イオンとの接触後。
【００１２】
【図４】図４は、ＳＥＭ−ＥＤＳによって分析されたロドトルラ・ムチラギノーザの死菌バイオマスを示す。（Ａ）対照（銅を含まない）および（Ｂ）銅に曝したバイオマス。
【００１３】
【図５】図５は、（Ａ）銅溶液への曝露前および（Ｂ）銅への曝露後のロドトルラ・ムチラギノーザの死菌バイオマスの記録ＥＤＳスペクトルを示す。
【００１４】
【図６】図６は、（Ａ）銅イオンでの飽和前および（Ｂ）飽和後のロドトルラ・ムチラギノーザの死菌バイオマスのＦＴＩＲスペクトルを示す。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、ロドトルラ・ムチラギノーザ（Rhodotorula mucilaginosa）から銅ナノ粒子を得る方法について言及する。
【００１６】
本発明は、廃水のバイオレメディエーションの実行および銅ナノ粒子の工業的規模での生産のためのロドトルラ・ムチラギノーザの死菌バイオマスの使用について言及する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ロドトルラ・ムチラギノーザの死菌バイオマスを使用して廃水からのナノ粒子の生合成および銅の取り込みのための生物学的な系を、初めて解析し、記載した。
【００１８】
本発明では、酵母ロドトルラ・ムチラギノーザの死菌バイオマスを利用して廃水からの銅ナノ粒子の細胞内生合成および取り込みを初めて探究する。
【００１９】
本発明では、還元剤として酵母ロドトルラ・ムチラギノーザを使用して、迅速で、低価格で、環境に優しく、容易に規模拡張可能な、銅ナノ粒子を生合成および除去する合成方法が開発される。
【００２０】
本発明は、ロドトルラ・ムチラギノーザから銅ナノ粒子を得る方法であって、
ａ．真菌ロドトルラ・ムチラギノーザを単離する工程、
ｂ．工程ａの単離真菌の銅耐性を決定する工程、
ｃ．銅ストック溶液を調製する工程、
ｄ．前記単離真菌を、培養培地ＹＥＰＤ液体培地に添加して、生菌バイオマスを生じさせる工程、
ｅ．生菌バイオマスをオートクレーブに供して、死菌バイオマスを生じさせる工程、および
ｆ．該生菌バイオマスおよび死菌バイオマス中の銅ナノ粒子の滞留を決定する工程、
を含んでなる方法に関する。
【００２１】
単離真菌の生物吸着による銅の滞留の決定は、バイオマス（生および死）各々を、項目
【００２２】
の工程ｃの銅溶液に加えることによって行う。
【００２３】
真菌の死菌バイオマスおよび生菌バイオマスへの銅の生物吸着は、初期金属濃度（２５〜６００ｍｇ・Ｌ−１）、ｐＨ（２〜６）、温度（２０〜６０℃）、撹拌（５０〜２５０ｒｐｍ）、種菌量（０．０５〜０．７５ｇ）、および接触時間（５〜３６０分）の関数として行った。
【００２４】
本発明の開発を以下の非包括的な例によって説明する。
【実施例】
【００２５】
試験および結果の概要
初期金属濃度、ｐＨ、温度、撹拌、および種菌量の関数として、酵母の死菌バイオマスおよび生菌バイオマスへの銅の生物吸着の平衡および動態試験を行った。
【００２６】
死菌バイオマスについて、銅の生物吸着能の範囲を観察し、接触の６０分以内に完了し、ｐＨ５．０、温度３０℃において、攪拌速度１５０ｒｐｍで、最大銅生物吸着が２０〜３５ｍｇ・ｇ−１であった。
【００２７】
平衡データは、ラングミュア等温式を用いてより良く説明され、動態解析は擬２次モデルを示した。酵母によって生合成されたナノ粒子の平均サイズ、形態、および位置を、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、エネルギー分散型Ｘ線分光分析法（ＥＤＳ）、および透過電子顕微鏡観法（ＴＥＭ）よって決定した。
【００２８】
ナノ粒子の形状は、主として球状で、平均サイズが５〜２５ｎｍであり、細胞内に合成されることがわかった。ほとんどすべての銅粒子が細胞内に取り込まれ、おそらくカルボキシル基を通して細胞外に結合し、振動周波数がわずかな振動を示すナノ粒子がほとんどなかったので、減衰全反射（ＡＴＲ）でのフーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）試験により、銅との接触後に死菌バイオマスのスペクトルで観察された差異は非常にわずかであることが明らかになった。
【００２９】
これらの試験は、ロドトルラ・ムチラギノーザの死菌バイオマスの水のバイオレメディエーションおよび銅ナノ粒子の工業的規模での生産のための経済的で技術的に実行可能な選択肢を提供することを示した。
【００３０】
１．生物の培養および維持
ロドトルラ・ムチラギノーザは、カナラン・ドス・カラジャース（Canaa dos Carajas）、パラ（Para）、ブラジルアマゾン地域（南緯０６°２６’および西経５０°４’）に位置するソッセゴ（Sossego）鉱山の銅廃棄物の溜め池から採集した水から単離した。ロドトルラ・ムチラギノーザを、ＹＥＰＤ寒天培地（１０ｇ酵母エキスＬ−１、２０ｇペプトンＬ−１、２０ｇグルコースＬ−１、および２０ｇ寒天Ｌ−１）で維持および活性化し、培地化合物は、オクソイド（イングランド）から入手した（Machado MD, Soares EV, Soares HMVM (2010) Removal of heavy metals using a brewer's yeast strain of Saccharomyces cerevisiae: Chemical Speciation as a tool in the prediction and improving of treatment efficiency of real electroplating effluents. J Hazard Mater 180: 347-353）。
【００３１】
２．寒天培地での最小発育阻止濃度
単離した酵母の銅耐性を、スポットプレート法（spot plate method）によって最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）として決定した。さまざまな濃度の銅（５０〜３０００ｍｇ・Ｌ−１）を含有するＹＥＰＤ寒天培地プレートを調製し、試験する酵母の種菌を金属および対照プレート（金属を含まないプレート）上にスポットした。（Ahmad I, Ansari MI, Aqil F (2006) Biosorption of Ni, Cr and Cd by metal tolerante Aspergillus niger and Penicillium sp using single and multi-metal solution. Indian J Exp Biol 44: 73-76）。プレートを、２５℃で少なくとも５日間インキュベーションした。ＭＩＣは、目に見える単離菌の成長を阻害する金属の最低濃度として定義する。
【００３２】
３．生物吸着剤による銅ナノ粒子滞留の決定
３．１．吸着質溶液の調製
本試験で使用した化学薬品はすべて、分析グレードであり、さらに精製することなく使用した。希釈液はすべて、２回脱イオン水（ミリポアミリＱ  伝導率１８．２Ωｃｍ−１）で調製した。銅ストック溶液を、ＣｕＣｌ２２Ｈ２０（Carlo Erba、イタリア）を２回脱イオン水に溶解することによって調製した。このストック溶液を希釈することによって、作業溶液を調製した。
【００３３】
３．２．バイオマス調製
真菌バイオマスを、ＹＥＰＤ液体培地（１０ｇ酵母エキスＬ−１、２０ｇペプトンＬ−１、２０ｇグルコースＬ−１）で調製し、２５℃で５日間、１５０ｒｐｍでインキュベーションした。インキュベーション後、沈渣を採取し、２回脱イオン水で洗浄し、これを生菌バイオマスとした。死菌バイオマスの調製は、適当量の生菌バイオマスをオートクレーブした（Salvadori MR, Ando RA, do Nascimento CAO, Correa B (2014) Intracellular biosynthesis and removal of copper nanoparticles by dead biomass of yeast isolated from the wastewater of a mine in the Brazilian Amazonia. Plos One 9: 1-9）。
【００３４】
３．３．生物吸着剤による銅ナノ粒子吸着の効率への物理化学的因子の影響に関する試験
銅の除去について、ｐＨ（２〜６）、温度（２０〜６０℃）、接触時間（５〜３６０分）、初期銅濃度（２５〜６００ｍｇ・Ｌ−１）、および攪拌速度（５０〜２５０ｒｐｍ）を解析した。そのような実験を、プラスチックフラスコ中で、１００ｍｇ  Ｌ−１のＣｕ（ＩＩ）テスト試験溶液を４５ｍＬ用いて所望のｐＨ、温度、金属濃度、接触時間、攪拌速度、および生物吸着剤投与量（０．０５〜０．７５ｇ）に最適化した。
【００３５】
幾つかの濃度（２５〜６００ｍｇ・Ｌ−１）の銅（ＩＩ）を、銅（ＩＩ）ストック溶液の適切な希釈により調製した。ｐＨはＨＣＬまたはＮａＯＨで調整した。次に、所望のバイオマス投与量を加え、フラスコの内容物を電気式温度自動調節往復振とう器で、必要とされる攪拌速度で所望の接触時間振とうした。振とう後、銅（ＩＩ）溶液を、ミリポア膜を通して真空ろ過することによってバイオマスから分離した。ろ過液中の金属濃度を、フレーム原子吸光分光光度計（ＡＡＳ）により決定した。金属除去の効率（Ｒ）を以下の方程式を用いて算出した：
Ｒ＝（Ｃｉ−Ｃｅ）／Ｃｉ．１００
（式中、ＣｉおよびＣｅはそれぞれ、初期および平衡金属濃度である。）
金属取り込み能、ｑｅ、を以下の方程式を用いて算出した。
ｑｅ＝Ｖ（Ｃｉ−Ｃｅ）／Ｍ
（式中、ｑｅ（ｍｇ・ｇ−１）は任意の時間における生物吸着剤の生物吸着能、Ｍ（ｇ）はバイオマス投与量、およびＶ（Ｌ）は溶液の量である。）
【００３６】
３．４．生物吸着等温式モデル
生物吸着は、次の吸着剤濃度、２５〜６００ｍｇ・Ｌ−１を用いてバッチ平衡法により分析した。フロイントリッヒおよびラングミュア等温式モデルを用いて、平衡データを当てはめた（Volesky B (2003) Biosorption process simulation tools. Hydrometallurgy 71: 179-190）。線形化ラングミュア等温式モデルは、
Ｃｅ／ｑｅ＝１／（ｑｍ・ｂ）＋Ｃｅ／ｑｍ
であり、式中、ｑｍは吸着剤の単分子層吸着能（ｍｇ・ｇ−１）、ｂはラングミュア吸着定数（Ｌ・ｍｇ−１）である。線形化フロイントリッヒ等温式モデルは、
ｌｎｑｅ＝ｌｎＫＦ＋１／ｎ．ｌｎＣｅ
であり、式中、ＫＦは生物吸着能に関連する定数、１／ｎは吸着剤の吸着強度に関する。
【００３７】
３．５．生物吸着動態
Ｃｕ（ＩＩ）生物吸着の速度動態の結果を、擬１次モデルおよび擬２次モデルを用いて解析した。線形擬１次モデルは、以下の方程式によって表わすことができる（Lagergren S (1898) About the theory of so called adsorption of soluble substances. Kung Sven Veten Hand 24: 1-39）。
ｌｏｇ（ｑｅ−ｑｔ）＝ｌｏｇｑｅ−Ｋ１／２．３０３．ｔ
（式中、ｑｅ（ｍｇ・ｇ−１）およびｑｔ（ｍｇ・ｇ−１）はそれぞれ、平衡時間および任意の時間ｔおける吸着剤に吸着される金属の量であり、Ｋ１（分−１）は擬１次吸着プロセスの速度定数である。）
線形擬２次モデルは、以下の方程式によって表わすことができる（Ho YS, Mckay G (1999) Pseudo-second-order model for sorption process. Process Biochem 34: 451-465）。
ｔ／ｑｔ＝１／Ｋ２．ｑｅ２＋ｔ／ｑｅ
（式中、Ｋ２（ｇ・ｍｇ−１・分−１）は、擬２次の平衡速度定数である。）
【００３８】
４．ロドトルラ・ムチラギノーザによる金属銅ナノ粒子の生合成
生菌バイオマスと比較して、高い銅金属イオン吸着能を示したロドトルラ・ムチラギノーザの死菌バイオマスのみを、この試験では使用した。銅（ＩＩ）溶液が１００ｍｇ・Ｌ−１の濃度における平衡モデルデータを使用して、ロドトルラ・ムチラギノーザの死菌バイオマスによる銅ナノ粒子の生合成を調べた。
【００３９】
４．１．ＴＥＭ観察
サイズ、形状、および生物吸着剤上の銅ナノ粒子を位置を決定するために、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）による解析を用い、検体の超薄切片を透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ−１０１０）で観察した。
【００４０】
４．２．ＳＥＭ−ＥＤＳ分析
銅ナノ粒子の形成前後の生体材料小さい断片の分析をピンスタブ上で行ない、次いで真空下で金でコーティングし、エネルギー分散型分光計（ＥＤＳ）を備えたＪＥＯＬ  ６４６０  ＬＶでＳＥＭによって試験した。
【００４１】
４．３．ＦＴＩＲ−ＡＴＲ分析
赤外振動分光法（ＦＴＩＲ）を使用して、バイオマスに存在する官能基を同定し、銅ナノ粒子の存在によって引き起こされるスペクトル変動を評価した。赤外吸収スペクトルを、ブルカーモデルＡＬＰＨＡ干渉分光計で得た。試料を、単一反射の全反射測定法アクセサリー（白金−結晶ダイヤモンドを用いたＡＴＲ）を使用して、試料コンパートメントに直接置いた。４ｃｍ−１のスペクトル分析能を用いて、試料各々について８０スペクトルを蓄積した。
【００４２】
銅山から単離されたロドトルラ・ムチラギノーザをさまざまな銅濃度（５０〜３０００ｍｇ・Ｌ−１）における最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）に供し、その結果は、ロドトルラ・ムチラギノーザが銅に対する高い耐性（２０００ｍｇ・Ｌ−１）を呈することを示した。
【００４３】
４．４．物理化学的因子の生物吸着への影響
本試験は、バイオマス投与量、ｐＨ、温度、接触時間、撹拌速度、および金属イオン濃度などの物理化学的因子もよって、ロドトルラ・ムチラギノーザバイオマスによる銅除去が影響されることを示した。生物吸着剤投与量は、金属の所与の初期濃度に対する生物吸着剤の容量・能力を決定するため、重要なパラメーターである。
【００４４】
図１（Ａ）に見られるように、ロドトルラ・ムチラギノーザの死菌バイオマスおよび生菌バイオマスによる銅に除去は、バイオマス濃度の増加に伴う増加を記録し、０．７５ｇ・Ｌ−１で飽和に達した。死菌バイオマスによる銅の除去パーセント割合は、生菌バイオマスより大きかった（図１（Ａ））。Ｃｕ（ＩＩ）除去に関して、死菌バイオマスは次の有利な点を提供する：金属除去系が毒性に供されない、および成長培地または栄養素を必要としない。図１Ｂに示されるように、最大の銅の除去は、２種類のバイオマスで、ｐＨ５．０において見られた。より低いｐＨ値では、ロドトルラ・ムチラギノーザの細胞壁が、正の電荷を帯びるようになり、それが生物吸着能の減少の原因となる。対照的に、より高いｐＨ（ｐＨ５）では、細胞壁表面が負の電荷をより帯びるようになり、それによるバイオマスと正の電荷を帯びた金属イオンとの引力のためにロドトルラ・ムチラギノーザのＣｕ（ＩＩ）の生物吸着は高い。
【００４５】
最大の銅の除去は、２種類のバイオマスで、３０℃において見られた（図１Ｃ）。金属の生物吸着への温度の影響は、金属と細胞壁上のリガンドとの相互作用を示唆した。グラフ（図１Ｄ）は両種のバイオマスで、酵素触媒反応の特徴であるシグモイド型動態に従うことが観察された。死菌バイオマスに対する銅ナノ粒子形成の動態は、９０％を超える粒子が反応の６０分以内に形成されたことを示し、銅ナノ粒子の形成が指数関数的であることを示唆した。最適な銅除去は、両種のバイオマスで、攪拌速度１５０ｒｐｍにおいて見られた（図１Ｅ）。高攪拌速度では、ボルテックス現象が生じ、懸濁液はもはや均一ではなく、実際にも、金属除去を損なう（Liu YG, Fan T, Zeng GM, Li X, Tong Q et al. (2006) Removal of cadmium and zinc ions from aqueous solution by living Aspergillus niger. Trans Nonferrous Met Soc China 16: 681-686）。
【００４６】
図１Ｆに示されるように、２種類のバイオマスで、銅吸着の％割合は、金属濃度（２５〜６００ｍｇ  Ｌ−１）の増加とともに減少した。
【００４７】
４．５．吸着等温式および動態モデル
ラングミュアおよびフロイントリッヒ等温式モデルを使用して、生物吸着データを当てはめ、生物吸着能を決定した。２種類のロドトルラ・ムチラギノーザバイオマスから得られたＣｕ（ＩＩ）生物吸着に関するラングミュア等温式を図２Ａおよび図２Ｂに示す。等温式定数、ラングミュアおよびフロイントリッヒモデルによって推定される最大積載能力、回帰係数を、表１に示す。ラングミュアモデルは、フロイントリッヒモデルと比べて、より良くＣｕ（ＩＩ）生物吸着等温式を説明した。この試験で観察されたロドトルラ・ムチラギノーザによるＣｕ（ＩＩ）の最大吸着率（２６．２ｍｇ・ｇ−１）は、吸着率がそれぞれ６．２、１．５２、１５．０８、１９．０、１９．６、１５．８５、および２．７６ｍｇ・ｇ−１である、ウスラヒラタケ（Pleurotus pulmonaris）、シゾフィラム・コムーネ（Schizophyllum commune）、ペニシリウム属の複数種（Penicillium spp）、リゾプス・アリズス（Rhizopus arrhizus）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）、ピクノポラス・サンギネウス（Pycnoporus sanguineus）などの他の公知の生物吸着剤に関して報告されている吸着率と同様かまたは高かった（Veit MT, Tavares CRG, Gomes-da-Costa SM, Guedes TA (2005) Adsorption isotherms of copper (II) for two species of dead fungi biomasses. Process Biochem 40: 3303-3308; Du A, Cao L, Zhang R, Pan R (2009) Effects of a copper-resistant fungus on copper adsorption and chemical forms in soils. Water Air Soil Poll 201: 99-107; Rome L, Gadd DM (1987) Copper adsorption by Rhizopus arrhizus, Cladosporium resinae and Penicillium italicum. Appl Microbiol Biotechnol 26: 84-90; Kumar BN, Seshadri N, Ramana DKV, Seshaiah K, Reddy AVR (2011) Equilibrium, Thermodynamic and Kinetic studies on Trichoderma viride biomass as biosorbent for the removal of Cu (II) from water. Separ Sci Technol 46: 997-1004; Yilmazer P, Saracoglu N (2009) Bioaccumulation and biosorption of copper (II) and chromium (III) from aqueous solutions by Pichia stiptis yeast. J Chem Technol Biot 84: 604-610; Yahaya YA, Matdom M, Bhatia S (2008) Biosorption of copper (II) onto immobilized cells of Pycnoporus sanguineus from aqueous solution: Equilibrium and Kinetic studies. Hazard Mater 161: 189-195）。
【００４８】
細菌由来の生物吸着剤との比較は、ロドトルラ・ムチラギノーザのＣｕ（ＩＩ）吸着率がバチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）ＩＡＭ１０２６の吸着率（２０．８ｍｇ・ｇ−１）に匹敵することを示し（Nakajima A, Yasuda M, Yokoyama H, Ohya-Nishiguchi H, Kamada H (2001) Copper sorption by chemically treated Micrococcus luteus cells. World J Microb Biot 17: 343-347）、また、藻類と比較しても、酵母ロドトルラ・ムチラギノーザは、高い金属イオン吸着率を示した（高等藻類シオグサ属の複数種（Cladophora spp）およびブラダーラック（Fucus vesiculosus）（１４．２８および２３．４ｍｇ・ｇ−１））（Elmacy A, Yonar T, Ozengin N (2007) Biosorption characteristics of copper (II), chromium (III), nickel (II) and lead (II) from aqueous solutions by Chara sp and Cladophora sp. Water Environ Res 79: 1000-1005; Grimm A, Zanzi R, Bjornbom E, Cukierman AL (2008) Comparison of different types of biomasses of copper biosorption. Bioresource Technol 99: 2559-2565）。ロドトルラ・ムチラギノーザの両種のバイオマスすべてのＣｕ（ＩＩ）生物吸着動態を、擬１次および擬２次モデルを用いて解析した。定数および回帰係数をすべて、表２に示す。図２Ｃおよび図２Ｄに示されるように、本試験では、ロドトルラ・ムチラギノーザによる生物吸着は、擬２次動態モデルを用いて最も良く説明される。この吸着動態は、２価の金属の生物吸着剤への吸着に典型的である（Reddad Z, Gerent C, Andres Y, LeCloirec P (2002) Adsorption of several metal ions onto a low-cost biosorbents: kinetic and equilibrium studies. Environ Sci Technol 36: 2067-2073）。
【００４９】
４．６．銅ナノ粒子の生合成
生物学的な系によるナノ粒子の形成の複雑な機序を研究することは、さらにより信頼でき、再現可能なその生合成の方法を決定するために重要である。真菌のバイオマスでのナノ粒子の形成の理解に向けて、一部分の死菌バイオマスをＴＥＭによって調査した。ロドトルラ・ムチラギノーザにおけるナノ粒子の位置を調べると、電子顕微鏡像から、ナノ粒子の大部分が細胞内に見られ、対照ではナノ粒子が存在しないことが明らかになり、対照およびオートクレーブプロセスにより銅が浸潤したバイオマスでは、細胞質材料の萎縮などの超微細構造変化が観察された（図３Ａおよび図３Ｂ）。ナノ粒子の形状およびサイズは、ナノスケール材料の物理的、化学的、光学的、および電子的性質を制御する最も重要な特徴のうちの２つである（Alivisatos AP (1996) Perspectives on the physical chemistry of semiconductor nanocrystals. J Phys Chem 100: 13226-13239; Aizpurua J, Hanarp P, Sutherland DS, KaII M, Bryant GW, et al. (2003) Optical properties of gold nanorings. Phys Rev Lett 90: 57401-57404）。
【００５０】
本試験では、銅ナノ粒子は、１０．５ｎｍの平均直径を示した（図３Ｂ）。銅ナノ粒子の存在をスポットプロファイルＳＥＭ−ＥＤＳ測定によって確認された。真菌のバイオマスによるＣｕ（ＩＩ）の生物吸着の前後に記録されたＳＥＭ顕微鏡写真をそれぞれ、図４Ａおよび図４Ｂに示す。我々は、銅ナノ粒子が真菌バイオマスの表面に結合した後、不規則性を増加することによって、表面の変形が起こることを観察した。酵母の試験領域で記録されたＥＤＳスペクトルは、酵母の銅からのシグナルを示す（図５Ａおよび図５Ｂ）。
【００５１】
本試験では、ほとんどすべての銅粒子が細胞内に取り込まれ、おそらくカルボキシル基を通して細胞外に結合し、振動周波数がわずかな振動を示すナノ粒子がほとんどなかったので、ＦＴ−ＩＲによって、銅との接触後に死菌バイオマスのスペクトルで観察された差異は非常にわずかであることが明らかになった。１７４４および１０５７ｃｍ−１のバンドがそれぞれ、１７４２および１０５９ｃｍ−１にシフトした（図６）。前述のように、ロドトルラ・ムチラギノーザでは銅ナノ粒子が酵母細胞内に蓄積したことがわかっており、おそらく細胞内での還元プロセスが、細胞質中に存在するタンパク質および酵素によって行なわれた（Sanghi R, Verma P (2009) Biomimetic synthesis and characterization of protein capped silver nanoparticles. Bioresource Technol 100: 501-504）。しかし、試験された銅のナノ粒子との相互作用に関与するタンパク質の種類は決定されないままである。そのような理解は、銅ナノ粒子を生産するための、より効率的な、環境に優しいプロセス（green process）につながり得る。
【表１】
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【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月5日(2020.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒポクレア・リキシイ（Hypocrea lixii）およびトリコデルマ・コニンギオプシス（Trichoderma koningiopsis）から選択される真菌から銅ナノ粒子を得る方法であって、
ａ．ヒポクレア・リキシイおよびトリコデルマ・コニンギオプシスから選択される真菌を単離する工程、
ｂ．工程ａの単離真菌の銅耐性を決定する工程、
ｃ．銅ストック溶液を調製する工程、
ｄ．前記単離真菌を、培養培地サブロー液体培地に添加して、生菌バイオマスを生じさせる工程、
ｅ．生菌バイオマスをオートクレーブに供して、死菌バイオマスを生じさせる工程、
ｆ．生菌バイオマスを乾燥して、乾燥バイオマスを生じさせる工程、および
ｇ．該生菌バイオマス、乾燥バイオマス、および死菌バイオマス中の銅ナノ粒子の滞留を決定する工程、
を含んでなる方法。