(57)【要約】      （修正有）【課題】植物または植物の一部内で目的のタンパク質を合成し、かつ、その収率を増加させる方法の提供。【解決手段】ａ）植物または植物の一部を処理して、当該植物または当該植物の一部において二次葉生物体量の生産を増加させること；ｂ）目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、当該植物中で活性のある調節領域と動作可能に連結されたヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を、当該植物または当該植物の一部に導入すること；ｃ）当該植物または当該植物の一部を、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で培養し、それにより目的のタンパク質を生産すること、を含む方法。【選択図】図８
2020156492.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物または植物の一部内で目的のタンパク質を生産する方法であって：
ａ）植物または植物の一部を処理して、当該植物または当該植物の一部において二次葉生物体量の生産を増加させること；
ｂ）目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、当該植物中で活性のある調節領域と動作可能に連結されたヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を、当該植物または当該植物の一部に導入すること；
ｃ）当該植物または当該植物の一部を、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で培養し、それにより目的のタンパク質を生産すること、ここで、目的タンパク質の収率が、同じ条件で生育させたが二次生物体量を増やすための処理がされなかった同様の植物の同じ組織から取得される目的タンパク質の収率と比較して、増加している、
を含む方法。
【請求項２】
処理のステップである、ステップａ）において、植物または植物の一部が、０．２：１および３：１の間の二次葉生物体量：一次葉生物体量の比を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
植物を処理するステップである、ステップａ）が、１つ以上の核酸を導入するステップの約４０日前から、１つ以上の核酸を導入する日を含むその日まで、あるいは、１つ以上の核酸を導入するステップの約４０日前から、植物または植物の一部を収穫する日を含むその日までに実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
植物を処理するステップである、ステップａ）が、植物の生長期間の明期を増加させること、植物の生長期間の光強度を増加させること、植物の頂芽を剪定すること、二次茎形成を増加させる薬剤、ホルモンもしくはこれらの組み合わせの存在下で植物を培養すること、頂芽優勢を低下させる化学物質を適用すること、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
剪定が、機械的剪定または化学的剪定を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
さらに、植物を収穫するステップｄ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
さらに、植物を収穫して目的のタンパク質を精製するステップｄ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
一次茎および二次茎が収穫される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
二次茎が収穫される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、一次茎由来の中間の葉（Ｐ２）、および、一次茎由来の若葉（Ｐ１）が収穫される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
一次茎由来の中間の葉（Ｐ２）、一次茎由来の若葉（Ｐ１）、二次茎由来の老葉（Ｓ３）、二次茎由来の中間の葉（Ｓ２）、および、二次茎由来の若葉（Ｓ１）が収穫される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
当該植物の一次茎由来の老葉（Ｐ３）が、収穫から除外される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
ヌクレオチド配列が、薬剤的に活性のあるタンパク質、抗体、抗原、ワクチン、酵素、または工業用酵素をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ヌクレオチド配列が、インフルエンザＨＡタンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
発現のステップである、ステップｃ）において、核酸が植物中で一過性に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
発現のステップである、ステップｃ）において、核酸が植物中で安定的に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
植物から取得される目的のタンパク質が、ＨＡタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
二次葉生物体量の増加が、二次茎および葉の数の増加、二次茎および葉の長さの増加、または両方の結果である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ホルモンが合成サイトカイニンである、請求項４に記載の方法。
【請求項２０】
合成サイトカイニンが６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物中でタンパク質を生産する方法に関する。本発明はまた、植物における１つ以上のタンパク質の生産を増加させる方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
植物ベースのタンパク質発現プラットフォームは、生物学的治療法および診断法に対する世界的な需要の高まりへの、有用な答えである。植物細胞は、細菌または酵母と異なり、治療用抗体および診断用抗体などの、哺乳類起源の複雑なタンパク質を、正しく折り畳み、会合し、修飾することができる。植物はまた、哺乳類細胞ベースの生産システムと比較して、安全性、設備投資、およびスケールアップの簡便さの点で、優位性を示す。
【０００３】
それゆえ、植物は、例えばｍＡｂまたはインフルエンザ由来ＨＡなどのウイルス抗原のような、ライフサイエンスにおいて現在応用されるタンパク質の生産にとっての好適な宿主である。
【０００４】
WO 07016276には、２枚の子葉が交わる点で実生（seedling）を切断して、２枚の子葉と最初の本葉を除去し、切断面から新芽（new shoot）を出芽させることにより、植物を安定的に形質転換させるための方法が開示されている。この方法は、植物を損傷させて、損傷部位においてのアグロバクテリウム（Agrobacterium）の導入を促進させて、形質転換効率を上げることを包含している。切断した実生は、所望の転移ＤＮＡを有する形質転換プラスミドを含む細菌懸濁液中でボルテックスされる。損傷ステップは、形質転換ステップに先だって必要とされる。正確な切断で仲介される形質転換は、実生の切断面から生じる新芽の安定的な形質転換をもたらし得る。これらの新芽は、植物の地上部に生長し、結果として形質転換した後代を生じることができる。
【０００５】
Spokevicus et al （Functional Plant Biology 2006）は、ハコヤナギ（Populus）の木の、休眠側芽（ＤＬＢ）のインビボ形質転換を開示している。ＤＬＢは中心の垂直切断により損傷されるか、あるいは、植物の先端が除去され、残ったＤＬＢは、垂直切断と、保護カバーの適用またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）の適用の組み合わせにより、処理された。本方法において、損傷ステップは、形質転換ステップに先だって必要とされる。
【０００６】
WO 2008/151444は、一過性発現系を用いた、植物内での、目的のタンパク質の合成方法を開示している。所望の核酸コンストラクトの浸潤の前に、植物を剪定した。適当なプラスミドで形質転換されたアグロバクテリウム株による葉の減圧浸潤の前に、N. benthamiana植物の頂芽および腋芽を、摘心により植物から機械的に除去するか、化学的に剪定した。
【０００７】
Wydro et al. 2006 (Acta Biochimica Polonica, Vol 53 No.2/2006 289-298)は、最高レベルの一過性緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子発現が、A. tumefaciensにより浸潤されたN. benthamianaの一番の若葉（youngest leaves）（植物の頂端に位置する）において、検出され、一方、中間部および下部に位置するより古い葉における発現は低いことを開示している。Halfhill et al. (Plant Cell Rep 22: 338-343, 2003)により、ＧＦＰ蛍光の変化は、葉の老化に伴う可溶性タンパク質の濃度変化と関連していることが示唆された。ｇｆｐ遺伝子発現のレベルおよび可溶性タンパク質の濃度は、異なる部位のそれぞれの葉において、同様の時期に、同様の程度、減少した。Wydro et al.は、ＧＦＰ発現の低下が、葉の生理機能の一般的変化の結果であったことを、これら二因子間の密接な関係が示唆するであろうと、示唆している。
【０００８】
植物における、臨床的に有用なタンパク質の発現は、アグロインフィルトレーション（agroinfiltration）を用いた、一過性タンパク質発現の高収率系の開発によって、支えられてきた。発現を最適化させ、植物中の組換えタンパク質の量と質を、向上させる必要がある。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、植物中でタンパク質を生産する方法に関する。本発明はまた、植物中の１つ以上のタンパク質の生産を増加させる方法を提供する。
【００１０】
本発明の課題は、植物中でタンパク質を生産するための、改善された方法を提供することである。
【００１１】
本発明は、植物または植物の一部において、目的のタンパク質を生産する方法であって：
ａ）植物または植物の一部を処理して、当該植物または当該植物の一部において二次葉（secondary leaf）生物体量（biomass）の生産を増加させること；
ｂ）目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、当該植物中で活性のある調節領域と動作可能に連結されたヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を、当該植物または当該植物の一部に導入すること；
ｃ）当該植物または当該植物の一部を、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で培養し、それにより目的のタンパク質を生産すること、ここで、目的タンパク質の収率が、同じ条件で生育させたが二次葉生物体量を増やすための処理がされなかった同様の植物の同じ組織から取得された目的タンパク質の収率と比較して、増加している、
を含む方法を提供する。
【００１２】
上述の方法で用いられ得る目的のタンパク質は、抗体、抗原、ワクチンまたは酵素であってよい。目的のタンパク質は、インフルエンザＨＡタンパク質であってよく、当該ＨＡは植物または植物の一部で発現された場合、インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成し得る。
【００１３】
１つ以上の核酸は、０．２：１および３：１の間の二次葉生物体量：一次葉（primary leaf）生物体量の比を有する植物または植物の一部に導入されてよい。
【００１４】
本発明はまた、処理のステップ（ステップａ））が、１つ以上の核酸を導入するステップの約４０日前から１つ以上の核酸を導入する日まで、あるいは、１つ以上の核酸を導入するステップの約４０日前から植物または植物の一部を収穫する日までに実施される、上述の方法を提供する。本発明には、植物を処理するステップ（ステップａ））に、植物の生長期間の明期を増加させること、植物の生長期間の光強度を増加させること、植物が生長期間にさらされる波長を選択すること、植物の一次茎（primary stem）の頂芽を剪定すること、二次シュートの発育を増加させる薬剤、ホルモンもしくはこれらの組み合わせの存在下で植物を培養すること、頂芽優勢を低下させる化学物質を適用すること、機械的剪定、化学的剪定、遺伝子組換え、ノックイン、ノックアウト、および植物育種により二次生長を促すこと、またはこれらの組み合わせが含まれる、上述の方法が含まれる。
【００１５】
上述の方法において、植物は植物ホルモン存在下で培養されてよい。例えば、植物は、約５０ｐｐｍ〜９００ｐｐｍの植物ホルモン存在下で培養されてよい。植物ホルモンは、例えば６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）などの、合成サイトカイニンであってよい。
【００１６】
本発明はまた、上述の方法であって、さらに、植物を収穫するステップ、および場合により、目的のタンパク質を精製するステップを含む方法を、含む。収穫するステップにおいて、二次葉、または、一次葉および二次葉が、収穫されてよい。さらには、一次茎由来の二次葉、中間葉（intermediate leaves）（Ｐ２）、および一次茎由来の若葉（young leaves）（Ｐ１）が収穫されてよく、あるいは、一次茎由来の中間葉（Ｐ２）、一次茎由来の若葉（Ｐ１）、二次茎（secondary stem）由来の老葉（old leaves）（Ｓ３）、二次茎由来の中間葉（Ｓ２）、および二次茎由来の若葉（Ｓ１）が収穫されてよい。さらには、当該植物の一次茎由来の老葉（Ｐ３）は収穫から除外されてよい。
【００１７】
本発明は、導入ステップ（ステップｂ））において、核酸が植物中で一過性に発現されるか、あるいは核酸が植物中で安定的に発現される、上述の方法を提供する。
【００１８】
二次葉生物体量を増加させることにより、二次生物体量を増加させるための処理はされずに同一条件で育てられた植物の同じ植物組織から得られる目的タンパク質の収率と比較して、一次および二次生物体量からのタンパク質収率の増加が達成され得る。
【００１９】
この発明の概要の記載は、必ずしも、本発明の特徴を全て述べたものではない。
【００２０】
本発明のこれらまたは他の特徴は、添付の図面を参照して、以下の説明から、さらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】異なる明期（１６時間および２４時間）並びに異なる光強度（８０および１６０μｍｏｌ／ｍ２・ｓ）下で、浸潤前に、温室で生長させた植物の生物体量生産を示している。主茎の若葉（Ｐ１）、成葉（mature leaves）（Ｐ２）、および老葉（Ｐ３）、並びに、二次茎の若葉（Ｓ１）、成葉（Ｓ２）、および老葉（Ｓ３）を収穫し、生物体量を決定した。
【００２２】
【図２】異なる明期（１６時間および２４時間）並びに異なる光強度（８０および１６０μｍｏｌ／ｍ２・ｓ）下の、主茎の若葉（Ｐ１）、成葉（Ｐ２）、および老葉（Ｐ３）、並びに、二次茎の若葉（Ｓ１）、成葉（Ｓ２）、および老葉（Ｓ３）におけるＨＡ生産を示す。
【００２３】
【図３】異なる明期（１６時間および２４時間）並びに異なる光強度（８０および１６０μｍｏｌ／ｍ２・ｓ）下の、主茎の若葉（Ｐ１）、成葉（Ｐ２）、および老葉（Ｐ３）、並びに、二次茎の若葉（Ｓ１）、成葉（Ｓ２）、および老葉（Ｓ３）におけるＨＡの総収量（植物当たりのＨＡ）を示す。
【００２４】
【図４】異なる明期（１６時間および２４時間）並びに異なる光強度（８０および１６０μｍｏｌ／ｍ２・ｓ）下の、主茎の葉（下部（Ｐ））および二次茎の葉（上部（Ｓ））における、ＨＡの総収量を示す。
【００２５】
【図５】低光強度または高光強度のいずれかで、グロースチャンバー（growth chamber）で生長させた植物の生物体量生産を示す。主茎の若葉（Ｐ１）、成葉（Ｐ２）、および老葉（Ｐ３）、並びに、二次茎の若葉（Ｓ１）、成葉（Ｓ２）、および老葉（Ｓ３）を収穫し、生物体量を決定した。
【００２６】
【図６】低光強度または高光強度のいずれかで、グロースチャンバーで生長させた植物のＨＡの総収量を示す。主茎の若葉（Ｐ１）、成葉（Ｐ２）、および老葉（Ｐ３）、並びに、二次茎の若葉（Ｓ１）、成葉（Ｓ２）、および老葉（Ｓ３）を収穫し、植物当たりのＨＡの総収量を決定した。
【００２７】
【図７】一次葉（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）および二次葉（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３）を有する植物の模式図を示す。
【００２８】
【図８】植物当たりの総一次生物体量（Ｐ）と総二次生物体量（Ｓ）に対する、剪定の影響、この場合は実生移植の５、７および１２日後の植物からの頂芽の除去の影響を示す。
【００２９】
【図９Ａ】実生移植の７および／または１２日後に、１００、５００、または１，０００ｐｐｍの濃度のベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）で処理した植物における、総一次生物体量（Ｐ）への、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）の影響を示す。
【図９Ｂ】実生移植の７および／または１２日後に、１００、５００、または１，０００ｐｐｍの濃度のベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）で処理した植物における、総二次生物体量（Ｐ）への、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）の影響を示す。
【００３０】
【図１０】実生移植の７および/または１２日後に、１００、５００、または１，０００ｐｐｍの濃度の６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）で処理した植物における、平均ＨＡ生産率（新鮮重１ｇ当たりのＨＡユニット）を示す。
【００３１】
【図１１】実生移植の７および/または１２日後に、１００、５００、または１，０００ｐｐｍの濃度の６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）で処理した植物における、ＨＡの総収量（植物当たりのＨＡ）を示す。
【００３２】
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、それぞれ、プライマーＩＦ−ＰＤＩ．Ｓ１＋３ｃ（配列番号１）およびＩＦ−Ｈ１ｃＴＭＣＴ．Ｓ１−４ｒ（配列番号２）を示す。
【００３３】
【図１３】ＰＤＩＳＰ／Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（配列番号３）のヌクレオチド配列を示す。
【００３４】
【図１４】コンストラクト１１９１の模式図を示す。
【００３５】
【図１５−１】コンストラクト１１９１（配列番号４）のヌクレオチド配列を示す。ｔＤＮＡ境界配列（boarder）には下線を引いている。
【図１５−２】コンストラクト１１９１（配列番号４）のヌクレオチド配列を示す。ｔＤＮＡ境界配列（boarder）には下線を引いている。
【００３６】
【図１６】発現カセット４８４のヌクレオチド配列を示している。ＰＤＩＳＰ／Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａをコードする配列には下線を引いている。
【００３７】
【図１７】ＰＤＩＳＰ／Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（配列番号６）のアミノ酸配列を示している。
【００３８】
【図１８】コンストラクト番号４８４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ ＨＴ）の模式図を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
本発明は、植物中でタンパク質を生産する方法に関する。本発明はまた、植物中で目的のタンパク質を生産するための方法および組成物を提供する。植物または植物の一部内で、目的のタンパク質を生産する方法もまた、提供される。
【００４０】
本発明は、植物または植物の一部内で目的のタンパク質を生産する方法であって：
ａ）植物または植物の一部を処理して、当該植物または当該植物の一部において二次葉生物体量の生産を増加させること；
ｂ）目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、当該植物中で活性のある調節領域と動作可能に連結されたヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を、当該植物または当該植物の一部に導入すること；
ｃ）当該植物または当該植物の一部を、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で培養し、それにより目的のタンパク質を生産すること、ここで、目的タンパク質の収率が、同じ条件で生育させたが二次生物体量を増やすための処理がされなかった同様の植物の同じ組織から取得される目的タンパク質の収率と比較して、増加している、
を含む方法を提供する。
【００４１】
植物組織は収穫され、目的のタンパク質が当該植物から抽出されてよい。必要に応じて、目的のタンパク質は、当分野で周知の標準的技術を用いて精製されてよい。また、植物は収穫され、食品、栄養剤、または医薬サプリメントとして用いられてよく、あるいは、植物は一部加工されて、食品、栄養剤、または医薬サプリメントとして用いられる、最小限加工された植物エキスとされてよい。
【００４２】
「同様の植物」は、二次生物体量生産を増加させるように処理された植物と、同じ属、種および変種の植物を意味する。
【００４３】
一次葉生物体量に対する二次葉生物体量の比が、０．２：１および３：１の間である、あるいはその間の任意の比である場合、１つ以上の核酸が、植物または植物の一部に導入されてよい。例えば、一次葉生物体量に対する二次葉生物体量の比が、約０．２：１、０．３：１、０．４：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１、１．２：１、１．４：１、１．６：１、１．８：１、２：１、２．２：１、２．４：１、２．６：１、２．８：１、３：１、あるいはそれらの間の任意の比であってよい。
【００４４】
目的のタンパク質は、任意のタンパク質であってよく、例えば、酵素、薬剤的に活性のあるタンパク質、血液凝固因子、抗体、抗原、ワクチン、食品サプリメント、栄養サプリメント、工業用酵素、または、植物中に「ウイルス様粒子」を形成し得る１つ以上のタンパク質であってよい。
【００４５】
「ウイルス様粒子（virus like particle）」（ＶＬＰ）、または「ウイルス様粒子（virus-like particles）」または「ＶＬＰｓ」は、自己集合する構造物であって、インフルエンザＨＡタンパク質などの構造タンパク質を含む構造物を指す。ＶＬＰは、感染時に生産されるウイルス粒子と形態的および抗原的におおむね類似しているが、複製するのに足りる遺伝情報を欠き、それゆえに非感染性である。いくつかの例において、ＶＬＰは単一のタンパク質種を含んでよく、あるいは１つより多いタンパク質種を含んでもよい。例えば、WO2009/009876; WO2009/076778; WO 2010/003225を参照されたい（これらの文献はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４６】
本発明は、従って、さらに、植物においてＶＬＰを生産する方法に関する。本発明はまた、植物においてＶＬＰを生産するための方法および組成物を提供する。例えば、植物または植物の一部内で、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生産する方法であって：
ａ）植物または植物の一部を処理して、当該植物または当該植物の一部において二次葉生物体量の生産を増加させること;
ｂ）ヘマグルチニン（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列であって、当該植物中で活性のある調節領域と動作可能に連結されたヌクレオチド配列を含む、１つ以上の核酸を、当該植物または当該植物の一部に導入すること；
ｃ）当該植物または当該植物の一部を、ＨＡをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で培養し、それによりＨＡを生産すること、ここで、ＨＡの収率が、同じ条件で生育させたが二次生物体量を増やすための処理がされなかった同様の植物の同じ組織から取得されるＨＡの収率と比較して、増加している、
を含む方法が提供される。
【００４７】
植物組織は収穫されてよく、またＶＬＰが当該植物から抽出されてよい。必要に応じて、ＶＬＰは、当分野で周知の標準的技術を用いて精製されてよい（例えば、WO2009/009876; WO2009/076778; WO 2010/003225を参照されたい;これらの文献はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）。あるいは、植物は収穫され、食品、栄養剤、もしくは医薬サプリメントとして用いられてよく、または、植物は一部加工されて、食品、栄養剤、または医薬サプリメントとして用いられる、最小限加工された植物エキスとされてよい。
【００４８】
一次葉生物体量に対する二次葉生物体量の比が０．２：１および３：１の間、あるいは、その間の任意の比である場合、１つ以上の核酸が、植物または植物の一部に導入されてよい。例えば、一次葉生物体量に対する二次葉生物体量の比は、約０．２：１、０．３：１、０．４：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１、１．２：１、１．４：１、１．６：１、１．８：１、２：１、２．２：１、２．４：１、２．６：１、２．８：１、３：１またはそれらの間の任意の比であってよい。
【００４９】
図７に示したように、植物１０は、一次茎２０、頂芽４０、および一次茎２０から出る葉（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、並びにＳ１、Ｓ２およびＳ３）を含む。植物１０の頂芽４０の近くから出る新しい葉をＰ１と呼ぶ。Ｐ１葉、あるいは上部の葉は、依然として生長し、その生物体量を増加させている。Ｐ１葉は、主茎に沿って、Ｐ２葉の上部に位置し、頂端複合体（apex complex）（すなわち、頂芽および任意の新たに形成される葉）が存在する場合、「頂端複合体」の非常に若い葉を含む。若い植物、例えば２５−３０日齢植物のＰ１葉は、たいてい、葉１、葉２および頂端複合体に相当する。Ｐ２葉は、セネッセンスをまだ開始していない成葉を指す。Ｐ２葉は、その伸長期（expansion phase）がほぼ完了する葉、または既に完了している葉を含む。上から植物を見ると、Ｐ２葉は目に見える最も大きな葉であり、Ｐ３葉を隠すまたは覆うことができる。Ｐ２葉は一般的に、主茎の葉３、葉４、および葉５に相当する（葉のナンバリングは植物の先端、または頂端から開始する；Robert et al. 2013, PLoS ONE 8(7):e70203, doi:10.1371/journal.pone.0070203の図２Ａ参照；本文献は参照により本明細書に組み込まれる）。Ｐ３葉、または下部の葉は、主茎のＰ２葉より下に位置する葉である。P３葉には、若干の黄変を示し得る老化葉（senescing leaves）が含まれるが、これに限定されない。Ｐ３葉はしばしば、植物の葉５、葉６、葉７、およびより古い葉を含む。セネッセンスの徴候（例えば、クロロフィルの減少）は、しばしば葉７または葉８から、目に見えて現れる。葉５および葉６は、老化は見られないが、しばしば蛋白質の含有量は少ない。
【００５０】
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３葉は二次（および最終的には三次）茎に繋がっている。Ｓ１葉は、Ｐ１葉からでる二次茎に繋がっている葉である。Ｓ１の二次葉は、頂端に近く、Ｓ２およびＳ３葉より若い。Ｓ２葉は、Ｐ２葉からでる二次茎に繋がっており、Ｓ３葉は、Ｐ３葉からでる二次茎に繋がっている。Ｓ３葉は、最も古い二次葉であるが、若い時には、タンパク質生産において、Ｐ３葉よりも有用である。
【００５１】
植物中の二次葉生物体量を増加させることにより、目的タンパク質の総収率が増加することが分かった。同様の形質転換プロトコールを用いて同様の生育条件に置くが、核酸を植物に導入するステップの前に二次生物体量を増加させるための植物または植物の一部の処理を行っていない植物中で同一の目的タンパク質を生産する方法と比較した場合、本明細書で記載される方法を用いると、高収率の目的タンパク質が生産された。
【００５２】
図８に示したように、植物の頂端の除去（植物の剪定）は、頂端を除去しなかった場合の植物と比較した際、二次茎（Ｓ）における植物当たりの目的タンパク質（ヘマグルチニン；ＨＡ）の収量の増加、および、一次茎（Ｐ）における植物当たりの目的タンパク質（ＨＡ）の収量の低下につながる。さらに、植物の頂端の除去は、二次葉生物体量の２．１倍の増加、一次葉生物体量の減少をもたらし、二次葉生物体量と一次生物体量の比が、０．４：１から１．６：１に増加した（表３；実施例５参照）。
【００５３】
目的タンパク質の収率の増加とは、当分野で標準的な技術を用いて決定される、二次葉生物体量を増加させるための処理がなされていない植物における目的タンパク質収率と比較した、目的タンパク質収率の約５％−約５００％の増加（すなわち、最大５倍の増加）、あるいはその間の任意の量の増加を意味し、例えば、約１０％−約５０％あるいはその間の任意の量、例えば、約５、８、１０、１２、１５、１８、２０、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４５、４６、４８、５０、５２、５４、５５、５６、５８、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０または５００％の増加を意味する。
【００５４】
二次葉生物体量の増加は、当分野で標準的な技術を用いて決定される、同一の条件下で生育され二次葉生物体量を増加させるための処理がなされていない同様の植物（すなわち、同一植物の変種）と比較した、二次葉生物体量の約２％−約３００％の増加、あるいはその間の任意の量（すなわち、最大３倍の増加）の増加を意味し、例えば、約１０％−約２００％あるいはその間の任意の量、例えば約２、５、８、１０、１２、１５、１８、２０、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４５、４６、４８、５０、５２、５４、５５、５６、５８、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０または３００％の増加を意味する。生物体量は、当業者に知られているだろう任意の技術を用いて決定されてよく、新鮮重、乾燥重、タンパク質含量、容量置換（volume displacement）などの決定を含み得る。特に明記しない限り、「葉生物体量」とは、葉および葉柄の生物体量を意味する。二次葉生物体量の増加は、二次茎および葉の数の増加、二次茎および葉の長さの増加、当該葉の体積の増加、当該葉の面積の増加、またはこれらの組み合わせの結果であり得る。
【００５５】
上記方法のステップａに記載される植物を処理するステップの後、二次葉生物体量は、植物の総生物体量の２０％−５０％、あるいはその間の任意の量であってよい。例えば、二次葉生物体量のパーセント割合は（植物の総生物体量に対して）、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％もしくは４９％またはそれらの間の任意の量であってよい。
【００５６】
図２から図６および図８でわかるように、植物または植物の一部におけるタンパク質蓄積のレベルは、一次葉生物体量に対する二次葉生物体量の比に依存し、この比は例えば約０．２：１から約１：１（二次葉生物体量：一次葉生物体量）、またはその間の任意の量、例えば約０．２：１、０．３：１、０．４：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１、１．２：１、１．４：１、１．６：１、１．８：１、２：１、２．２：１、２．４：１、２．６：１、２．８：１、３：１もしくはそれらの間の任意の比（二次葉生物体量：一次葉生物体量）である。
【００５７】
植物における一次葉生物体量に対する二次葉生物体量の比は、一次葉生物体量と比較して二次葉生物体量を増やすことによって変化させることができ、例えば、植物の生長期間の明期を増やすことによって、植物の生長期間の光強度を増加させることによって、植物の頂芽４０（図７）の剪定によって、二次生物体量形成を増加させる薬剤の存在下で植物を培養することによって、二次生物体量形成を増加させるホルモンによって、頂芽優勢を低下させる化学物質を適用することによって、あるいはこれらの組み合わせによって、変化させることができる。
【００５８】
従って、本発明はまた、処理されていない同様の植物と比較して二次葉生物体量を増加させるように処理することで、一次葉生物体量に対する二次葉生物体量の比を調節することにより、目的タンパク質の収率を増加させるための方法を提供する。
【００５９】
一次葉生物体量（または一次生物体量）は、一次葉（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３および連結する葉柄）の生物体量を包含する植物の生物体量を意味する。従って、一次葉生物体量は、二次葉または三次葉由来の生物体量を含まず、根由来の生物体量も含まない。
【００６０】
一般的に、茎（シュートと呼んでもよい）は、芽、果実および葉の軸を提供する。維管束植物の構造上の主軸の１つは、主茎または一次茎である（２０、図７）。一次茎２０は、一般的に、一次葉（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）、花、芽、果実、および二次茎３０の支持を提供する。一次葉生物体量は、一次葉（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）および連結する葉柄由来の生物体量を含む。
【００６１】
「二次茎形成」は、新しい二次茎の惹起、あるいはすでに惹起された二次茎の生長のいずれか、あるいは惹起および惹起された二次茎の生長の両方を意味し、二次葉生物体量の割合の増加をもたらす。
【００６２】
植物の一次茎は、一次茎２０から直接伸長する異なる葉齢の葉を有し得る。一次茎の葉は、葉齢に基づき、古い（Ｐ３）、中間（Ｐ２）、若い（Ｐ１）に分類され得る。
【００６３】
二次葉生物体量（または二次生物体量）は、二次茎３０から取得される葉および葉柄の生物体量を意味する。さらに具体的には、二次葉生物体量は、一次葉、花、頂芽４０、または根由来の生物体量を含まない生物体量である。二次葉生物体量はまた、二次茎３０から出る三次茎または他の茎由来の葉生物体量を含みうる。
【００６４】
「二次」茎、「補助（auxiliary）」茎、「腋（axillary）」茎、または「側（lateral）」茎はまた、植物の主茎または一次茎２０から伸長してよい。従って、二次茎３０は、１つ以上の二次茎と１つ以上の二次葉（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３）を含んでよい。さらに、二次茎は、１つ以上の三次茎または他の茎を含んでよい。植物の二次茎３０は、異なる葉齢の葉を有してよく、これらの葉は、若い葉（Ｓ１）、中間の葉（Ｓ２）または古い葉（Ｓ３）に分類され得る。
【００６５】
目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸の浸潤に先立ち、二次葉生物体量を増加させるために植物を処理することが、目的タンパク質の発現レベル（合成タンパク質全体に対する％として）及び収率（タンパク質ｍｇ/新鮮重ｋｇ）を増加させることが分かった。二次葉生物体量を増やすための植物の処理には、二次生長における増加をもたらす、植物が生長期間にさらされる光強度の増加、二次生長における増加をもたらす、植物が生長期間に光にさらされる時間（明期）の増加、二次生長の増加がみられるように、植物が生長期間にさらされる波長を選択すること、二次生長の増加をもたらすように日中／夜間の温度レジーム（temperature regime）を変化させること、例えば、基準の２０℃から約±１℃〜約±１５℃の範囲またはその間の任意の値で温度を変化させること、約５分〜約１６時間あるいはその間の任意の時間にわたり基準の２０℃から約±１℃〜約±１５℃の範囲またはその間の任意の値で温度を変化させること、また、暗期または明期よりも短い、異なる温度のパルスが与えられる場合、当該パルスは明期の始めまたは終わりに与えられてよいが、例えば、明期の始めまたは終わりあるいは明期の終わりに約３０分から約２時間の異なる温度のパルスを与えること、が含まれてよいが、これらに限定されない。
【００６６】
さらに、二次葉生物体量を増加させる植物の処理には、二次茎、二次生物体量形成、あるいは両方を誘導する薬剤の存在下で培養すること、二次茎形成、二次生物体量形成、または両方を誘導するホルモンの存在下で培養すること、頂芽優勢を低下させる化学物質を適用すること、二次茎形成、二次生物体量形成、または両方を誘導するために一次頂芽４０を剪定すること、例えば二次茎形成、二次生物体量形成、または両方の増強をもたらす遺伝子のノックインまたはノックアウトなどの遺伝子組換えを行うこと、親株と比較した場合に二次生長の増加を示す植物の選択と組み合わせて植物育種すること、あるいはこれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００６７】
「光」は、植物の葉によって利用される、例えば、約４００から約７００ｎｍの波長、またはその間の任意の波長などの、波長のスペクトルを含む光を意味し、青、緑、および赤、および必要であれば電磁波スペクトルの赤外波長部分を含み得る。植物によって利用され得る波長を発する好適な任意の光源には、例えば、自然光、セラミックメタルハライド光源、メタルハライド光源、高圧ナトリウム光源、ＬＥＤ、蛍光光源、白熱光源、またはこれらの組み合わせが含まれる。
【００６８】
浸潤前に二次葉生物体量を増加させるために植物を処理するステップは、発芽（すなわち０日目）から浸潤（すなわち、組換えベクターの植物への導入）まで、あるいは植物を収穫する日まで、あるいはその間の任意の期間である植物生長周期の間ずっと行われ得る。例えば、処理が２４時間明期の場合、発芽した実生は、発芽の日から、植物の形質転換または浸潤、形質転換植物の培養のステップを経て、収穫の日までの処理期間にわたり、当該明期にさらされ得る。しかしながら、より短い処理期間もまた、使われ得る。
【００６９】
同様の方法で、二次生長を増加させるために植物を処理するステップには、植物が生長の間さらされる光の強度の、二次生長の増加をもたらす増加が含まれ得る。当該処理は、発芽から、植物の形質転換または浸潤を経て、植物を収穫する日まで、あるいはその間の任意の期間である植物生長期間の間ずっと、適用され得る。同様に、二次生長の増加をもたらすように生長期間中選択した波長に植物をさらすことを、発芽（すなわち０日目）から、浸潤（すなわち、組換えベクターを植物へ導入すること）または植物を収穫する日まで、あるいはその間の任意の期間である植物生長期間の間ずっと行い得る。日中／夜間の温度レジームを、二次植物生長を増加させるために、変化させることができ（基準の２０℃から約±１℃〜約±１５℃の範囲、またはその間の任意の値で；あるいは、温度パルスが与えられ得る）、発芽（すなわち０日目）から、浸潤（すなわち、組換えベクターを植物へ導入すること）または植物を収穫する日まで、あるいはその間の任意の期間である植物生長期間の間ずっと、植物は当該処理にさらされ得る。
【００７０】
あるいは、植物の二次葉生物体量を増加させる他の処理方法は、形質転換ステップまたは浸潤の前に適用されてよく、浸潤の約２０日前から最大で浸潤の当日まで、あるいはその間の任意の時期であってよく、例えば、浸潤の２０日前から浸潤の当日まで、あるいはその間の任意の時期であってよく、例えば、浸潤の２０日前、１９日前、１８日前、１７日前、１６日前、１５日前、１４日前、１３日前、１２日前、１１日前、１０日前、９日前、８日前、７日前、６日前、５日前、４日前、３日前、２日前、１日前から、浸潤の当日まで、あるいはその間の任意の時期であってよい。
【００７１】
二次葉生物体量を増加させるための明期の増加は、植物を、約１２時間から約２４時間またはその間の任意の時間、光に曝すことを含み、例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４時間、光に曝すことを含む。例えば、植物を、浸潤ステップの前に、一定の光に曝すように、明期は２４時間であってよい。
【００７２】
明期の増加は、発芽当日から浸潤当日まで、あるいは植物を収穫する日まで、あるいはその間の任意の期間、実行されてよい。例えば、限定されると解されるべきではないが、浸潤の４０日前、３５日前、３０日前、２５日前、２０日前、１９日前、１８日前、１７日前、１６日前、１５日前、１４日前、１３日前、１２日前、１１日前、１０日前、９日前、８日前、７日前、６日前、５日前、４日前、３日前、２日前から、浸潤当日まで、収穫する日まで、またはその間の任意の期間である。当業者であれば、剪定前の適当な期間を、容易に決定することができる。
【００７３】
光強度には、天然の太陽光、あるいは人工光で補われた太陽光、あるいは人工光が含まれてよい。人工光が単独で用いられる場合、あるいは天然の太陽光を補うために用いられる場合、約６０（μｍｏｌ／ｍ２・ｓ）から約２００（μｍｏｌ／ｍ２・ｓ）またはその間の任意の値、例えば、約６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００（μｍｏｌ／ｍ２・ｓ）、あるいはそれらの間の任意の量が用いられ得る。例えば、光強度は、１６０（μｍｏｌ／ｍ２・ｓ）であってよい。光強度の増加は、例えば、発芽（すなわち０日目）から浸潤（すなわち、植物への組換えベクターの導入）まで、あるいは、植物を収穫する日まで、あるいはその間の任意の期間である植物の生長周期中ずっと、実行されてよい。例えば、浸潤の４０日前、３５日前、３０日前、２５日前、２０日前、１９日前、１８日前、１７日前、１６日前、１５日前、１４日前、１３日前、１２日前、１１日前、１０日前、９日前、８日前、７日前、６日前、５日前、４日前、３日前、２日前、１日前から、浸潤当日まで、植物を収穫する日まで、またはその間の任意の期間である。当業者であれば、剪定前の適当な期間を容易に決定することができる。
【００７４】
剪定は、１つ以上の頂芽４０の除去、あるいは頂芽４０を含む茎の先端または上部の除去を意味する。剪定にはまた、植物から頂芽を取り除くことなく、頂芽を枯らすこと、頂芽の壊死を誘導すること、または頂芽の生長を低下させることが含まれ得る。頂芽の生長の低下は、処理されていない芽と比較して、例えば代謝活性、あるいは、規定期間の間のサイズ増加の、約５０％から１００％、あるいはその間の任意の量の減少を、芽が示すことを意味する。剪定はまた、頂芽優勢を低下させる化学物質によって達成され得る。化学物質が剪定の目的で適用される場合、用いられる投与量は、一般的に、化学物質の製造者が推奨する投与量である。
【００７５】
剪定は、当業者に知られているであろう任意の方法によって達成され得、限定されないが、例えば芽を機械的に除去すること、例えば限定されないが、切断（cutting）、刈り取り（clipping）、摘心（pinching）、加圧（compression）（例えばトングなどを用いる）、芽の生長を低下させる、あるいは芽を枯らすために、芽の温度を下げるように局所冷却すること、例えば局所的に液体窒素流を芽に当てることによる局所冷却、あるいは、液体窒素、ドライアイス、エタノールドライアイス、氷などを含む適当な冷熱源を用いて冷却されたトングまたは他の装置で芽を取り囲むことによる局所冷却が含まれる。
【００７６】
剪定にはまた、化学的剪定が含まれ、例えば、芽の生長を止めるまたは低下させる除草剤（化学物質；剪定薬剤）の適用、あるいは芽の生長を止めるまたは低下させる成長調整剤の適用が含まれる。植物上への化学物質のスプレー（spraying）、噴霧（misting）、浸漬（soaking）によって、あるいは化学物質を含む溶液への植物のディップ（dipping）により、植物を容易に処理することができるので、化学的剪定の使用は、効率的な剪定処理を可能にする。植物は、浸潤ステップの前に一度処理されてよく、あるいは、浸潤ステップの前に、一度を超えて処理されてよい。薬剤、化学物質、またはホルモンは、二次茎形成、二次生物体量形成、もしくは両方を増加させ、あるいは、頂芽優勢を低下させ、あるいはそれら効果の組み合わせをもたらす。例えば、植物は、二次茎形成を促進する、あるいは、頂芽優勢を低下させる、あるいはこれらの組み合わせをもたらす、サイトカインまたは植物ホルモンを用いて、培養または処理され得る。例えば、植物は、例えば、二次茎形成の促進を増加させるサイトカイニン（ＣＫ）などの植物ホルモンで、処理され得る。サイトカイニンは、例えば６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）（ベンジルアデニンとしても知られる）のような合成サイトカイニンであり得る。
【００７７】
植物は、約５０ｐｐｍ−約９００ｐｐｍ、またはその間の任意の量の植物ホルモンで処理されてよく、例えば、１００ｐｐｍ、１５０ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、２５０ｐｐｍ、３００ｐｐｍ、３５０ｐｐｍ、４００ｐｐｍ、４５０ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、５５０ｐｐｍ、６００ｐｐｍ、６５０ｐｐｍ、７００ｐｐｍ、７５０ｐｐｍ、８００ｐｐｍ、８５０ｐｐｍ、９００ｐｐｍあるいは、それらの間の任意の量で処理されてよい。例えば、植物は、約１００ｐｐｍ−５００ｐｐｍの、例えばＢＡＰなどの植物ホルモンで処理されてよい。
【００７８】
図９、１０および１１に示したように、ＢＡＰによる植物の処理は、一次生物体量にほとんど効果を及ぼさなかったが、二次生物体量生産には顕著な正の効果を及ぼした（図９ｂ参照）。
【００７９】
さらに、頂芽優勢を低下させる薬剤または化学物質が、植物に適用されてよく、例えば、植物は、頂芽優勢を低下させるために、化学的に剪定されてよく、あるいは他の方法で処理されてよい。使われ得る化学物質の例には、限定されないが、除草剤、例えば植物成長調整剤であるエテホン（例えばブロメフロル、セロン、クロルエセホン、エスレル、 Florel、 Prep および Flordimex）、ダミノジド（ブタン二酸モノ-2,2-ジメチルヒドラジン、-コハク酸2,2-ジメチルヒドラジン; 例えば B-ナイン; Alar、 Kylar、 SADH、 B-ナイン、 B-995、 aminozide）、Atrimmec （ジケグラックナトリウム）、マレイン酸ヒドラジド（1,2-ジヒドロ-3,6-ピリダジンジオン）などが含まれ、および、ジベレリン酸合成阻害剤、例えば、限定されないが、サイコセル（クロルメクアトクロリド）、 A-レスト（アンシミドール）、トリアゾ−ル、例えばBonzi (パクロブトラゾール)、スマギック(ウニコナゾール)、または3-アミノ-1,2,4-トリアゾール（3-AT）が含まれる。これらの化合物は、植物の生長改変のための既知の投与量範囲で用いられ得、例えば、用いられる投与量範囲は化学物質の製造者によって推奨される投与量であり得る。これらの化合物はまた、植物の生長改変のための既知の投与量範囲未満の投与量範囲で、用いられ得、例えば、用いられる投与量範囲は、化学物質の製造者により推奨される投与量範囲の７５％、５０％、２５％、１０％であってよい。これらの化合物は、選択した成長調整剤に基づき、約０．２ｐｐｍ−約５，０００ｐｐｍ、およびその間の任意の量で用いられてよい。さらに、剪定薬剤（化学物質）は、一度適用され得、あるいは、必要に応じてさらなる適用がなされ得る。例えば、浸潤の前、あるいは後に植物の化学的剪定をもたらすために、化学物質は、一度適用され得、あるいは、化学物質は、一度を超えて適用され得る。化学的剪定が用いられる場合、化学物質は浸潤の約２０日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期に適用されてよく、例えば、浸潤の１４日、７日、または５日前の化学物質の適用が効果的に用いられ得る。
【００８０】
頂芽の剪定は、浸潤の約２０日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期に実行されてよく、例えば、浸潤の１９日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期、例えば、浸潤の１８日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期、例えば、浸潤の１７日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期、例えば、浸潤の１６日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期、例えば、浸潤の１５日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期、例えば、浸潤の１４日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期、例えば、浸潤の１５日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期、例えば、浸潤の１４日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期、例えば、浸潤の１３日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期、例えば、浸潤の１２日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期、例えば、浸潤の約１１日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期、例えば、浸潤の約１０日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期、例えば、浸潤の約９日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期、例えば、浸潤の約８日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期、例えば、浸潤の約７日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期、例えば、浸潤の約６日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期、例えば、浸潤の約６日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期、例えば、浸潤の約４日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期、例えば、浸潤の約３日前から、浸潤の約２日後まで、あるいはその間の任意の時期、あるいは、浸潤の２０日、１９日、１８日、１７日、１６日、１５日、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日前から、浸潤の２日後まで、あるいはその間の任意の時期に実行されてよい。当業者であれば、剪定前の適当な期間を容易に決定することができる。
【００８１】
本発明の方法は、さらに植物または植物の一部を収穫することを含んでよい。例えば、一次茎および二次茎を含む植物全体が収穫されてよい。あるいは、二次生物体量、一次生物体量、またはそれらの組み合わせを含む植物の一部が収穫されてよい。例えば、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３葉、連結した葉柄を伴うＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３葉または任意のその組み合わせを収穫してもよい。植物の老葉は、必要に応じて収穫から除外されてよい。
【００８２】
「植物の一部」という用語は、植物由来の任意の部分を意味し、植物から取得される組織を含み、例えば、葉、葉と茎、根、植物の葉と茎と場合により花の部分を含む地上部分、細胞、プロトプラスト、または植物から取得されるこれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。例えば、「植物の一部」は、植物の葉または茎のことを指してよい。植物の一部はまた、二次生物体量、一次生物体量、またはそれらの組み合わせ、例えば、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３葉、連結した葉柄を伴うＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３葉、またはこれらの組み合わせを含んでよい。
【００８３】
「植物質（plant matter）」という用語は、植物に由来する任意の物質を意味する。植物質は、植物全体、組織、細胞、またはその任意の画分を含んでよい。さらに、植物質は、細胞内植物構成要素、細胞外植物構成要素、植物の液状もしくは固形抽出物、またはそれらの組合せを含んでよい。さらに、植物質は、植物の葉、茎、果実、根またはそれらの組合せから得られる植物、植物細胞、組織、液状抽出物、またはそれらの組合せを含んでよい。植物質は、何の加工ステップにも付されていない植物またはその一部を含みうる。しかし、植物材料を後述する最小限の加工ステップに付すか、より激しい加工、例えば当分野において広く知られている技術（例えば限定するわけではないが、クロマトグラフィー、電気泳動など）を使った部分的または実質的タンパク質精製などに付してもよいと考えられる。
【００８４】
本発明に従い生産される目的のタンパク質は、植物、植物の一部、または植物質から精製、部分精製されてよく、あるいは、当業者に知られる方法を用いて、経口ワクチンとして投与されてよい。精製には、WO 2011/035422 (本文献は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるアポプラスト画分の生産が含まれてよい。分取サイズ排除クロマトグラフィー（preparative size exclusion chromatography）のために、目的のタンパク質を含む調製物が取得され得、不溶性物質が遠心分離により除去され得る。ＰＥＧを用いた沈殿もまた、使用され得る。回収されたタンパク質は、従来の方法（例えば、Bradford アッセイ、ＢＣＡ）を用いて定量され得、抽出物は、例えばSEPHACRYLTM、SEPHADEXTM、または同様の媒体などを用いて、サイズ排除カラムを通過させ、画分が回収され得る。Blue Dextran 2000または好適なタンパク質が、較正標準として用いられ得る。抽出物はまた、陽イオン交換カラムを通過させ得、活性画分が回収され得る。クロマトグラフィーに続いて、タンパク質電気泳動、免疫ブロット、あるいは両方により画分をさらに解析して、画分の目的タンパク質およびタンパク質補体の存在を確認し得る。
【００８５】
「最小限の加工」という用語は、目的のタンパク質を含む植物質、例えば植物またはその一部が部分精製されて、植物エキス、ホモジネート、植物ホモジネートのフラクションなど（すなわち最小限に加工されたもの）を与えることを意味する。部分精製は、限定するわけではないが、植物細胞構造を破壊し、それによって可溶性植物構成要素と不溶性植物構成要素とを含む組成物を生成させることを含むことができ、それらの構成要素は、例えば限定するわけではないが遠心分離、濾過またはそれらの組合せなどによって分離することができる。これに関連して、葉または他の組織の細胞外間隙内に分泌されたタンパク質は、減圧抽出または遠心抽出を使って容易に取得するか、組織のローラー通過または粉砕などにより加圧下で抽出して、細胞外間隙内からタンパク質を絞り出すまたは遊離させることができる。最小限の加工は可溶性タンパク質の粗抽出物の調製も含みうる。というのも、そのような調製物は、二次植物産物による汚染が無視できるほどわずかだからである。さらに、最小限の加工は、葉からの可溶性タンパク質の水性抽出と、それに続く任意の適切な塩による沈殿を含みうる。他の方法として、抽出物の直接使用が可能になるように、大規模な浸漬（maceration）および搾汁を挙げることができる。
【００８６】
「目的のヌクレオチド（または核酸）配列」または「目的のコード領域」は、目的のタンパク質の生産のために、宿主生物、例えば植物内で、発現されるべき任意のヌクレオチド配列、またはコード領域（これらの用語は互換的に使われ得る）を意味する。これらの目的のヌクレオチド配列は、餌または食品のための、あるいは餌および食品用途両方のための、天然タンパク質または修飾タンパク質、工業用酵素または修飾工業用酵素、農業用タンパク質または修飾農業用タンパク質、ヘルパータンパク質、タンパク質サプリメント、薬剤的に活性のあるタンパク質、機能性食品（nutraceutical）、付加価値生産物、あるいはそれらのフラグメントをコードし得るが、これらに限定されない。
【００８７】
目的のタンパク質は、本発明のヌクレオチド配列、またはコンストラクト、またはベクターにより形質転換された任意の好適な植物宿主において発現され得る。好適な宿主の例には、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、例えば、セイヨウアブラナ、アブラナ属（Brassica spp.）、トウモロコシ（maize）、例えばベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）などのタバコ属（Nicotiana spp.）（タバコ）、アルファルファ、ジャガイモ、サツマイモ（Ipomoea batatus）、ニンジン、エンドウマメ、カラスムギ、イネ、大豆、コムギ、オオムギ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ（corn）、ライムギ（Secale cereale）、モロコシ(Sorghum bicolor、 Sorghum vulgare)、ベニバナ(Carthamus tinctorius)を含む農業作物が含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
「発現カセット」は、例えば植物細胞などの宿主細胞において目的の核酸を転写するための適当なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下にあり、それに動作可能に（または動作的に）連結している目的の核酸を含むヌクレオチド配列のことを指す。
【００８９】
「調節領域」「調節エレメント」または「プロモーター」は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか、あるいはＤＮＡおよびＲＮＡの両方からなり得る、遺伝子のタンパク質コード領域の、必ずしも上流ではないが通例上流にある核酸部分を意味する。
【００９０】
「動作的に連結された」とは、特定の配列が直接的または間接的に相互作用して、遺伝子発現の仲介または調整などの意図した機能を果たすことを意味する。動作的に連結された配列の相互作用は、例えば、動作的に連結された配列と相互作用するタンパク質によって仲介されうる。目的の配列の転写が、転写調節領域により仲介または調整されるように目的の配列が機能的に連結されている場合、転写調節領域と目的の配列が動作可能に連結されている。
【００９１】
調節領域が活性であり、目的の遺伝子と動作可能な関係にあるか、動作的に連結されている場合、これは、目的の遺伝子の発現をもたらしうる。調節エレメントは、器官特異性をもたらす能力または発生段階依存的もしくは一時的な遺伝子活性化（developmental or temporal gene activation）を制御する能力を有しうる。「調節領域」には、プロモーターエレメント、基礎プロモーター活性を示すコアプロモーターエレメント、外部からの刺激に応答する誘導性のエレメント、負の調節エレメントまたは転写エンハンサーなどのプロモーター活性を媒介するエレメントが含まれる。本明細書で用いられる場合、「調節領域」には、転写後に活性であるエレメント、例えば、翻訳および転写エンハンサー、翻訳および転写リプレッサー、上流活性化配列、およびｍＲＮＡ不安定性決定エレメント（mRNA instability determinant）などといった、遺伝子発現を調整する調節エレメントも包含される。これら後者のエレメントのいくつかは、コード領域に対して近位に位置しうる。
【００９２】
本開示の文脈において、「調節エレメント」または「調節領域」という用語は、一般的に、通常は（常にそうであるわけではないが）構造遺伝子のコード配列の上流（５’側）にあって、ある特定部位において転写が始まるように、必要なＲＮＡポリメラーゼおよび／または他の因子の認識をもたらすことにより、コード領域の発現を制御するＤＮＡの配列を指す。しかし、イントロン内または配列の３’側に位置する他のヌクレオチド配列も、目的のコード配列の発現の調節に貢献しうることは理解すべきである。特定部位における開始が保証されるようにＲＮＡポリメラーゼまたは他の転写因子の認識をもたらす調節エレメントの一例は、プロモーターエレメントである。
【００９３】
全てではないがほとんどの真核生物プロモーターエレメントは、通常は転写開始部位の約２５塩基対上流に位置するアデノシンおよびチミジンヌクレオチド塩基対から構成される保存された核酸配列であるＴＡＴＡボックスを含有する。プロモーターエレメントは、転写の開始を担う基礎プロモーターエレメントと、遺伝子発現を調整する他の調節エレメント（上に列挙したもの）を含む。
【００９４】
構成的調節領域は、植物のさまざまな部分の至るところにおいて、植物発生のあらゆる段階で継続的に遺伝子の発現を指示する。既知の構成的調節エレメントの例には、ＣａＭＶ ３５Ｓ転写産物（Odell et al., 1985, Nature, 313:810-812）、イネのアクチン１（Zhang et al., 1991, Plant Cell, 3:1155-1165）、アクチン２（An et al., 1996, Plant J., 10:107-121）またはｔｍｓ２（U.S.5,428,147；本文献は参照により本明細書に組み込まれる）、およびトリオースリン酸イソメラーゼ1（Xu et al., 1994, Plant Physiol. 106:459-467）遺伝子、トウモロコシユビキチン1遺伝子（Cornejo et al., 1993, Plant Mol. Biol. 29:637-646）、シロイヌナズナユビキチン１および６遺伝子（Holtorf et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29:637-646）、およびタバコ翻訳開始因子４Ａ遺伝子（Mandel et al., 1995 Plant Mol. Biol. 29:995-1004）に関連するプロモーターなどがある。本明細書において用いられる「構成的」という用語は、必ずしも、構成的調節領域の制御下にある遺伝子が全ての細胞タイプにおいて同じレベルで発現することを示すわけではなく、たとえ存在量の変動がしばしば観察されるとしても、その遺伝子が幅広い範囲の細胞タイプにおいて発現することを意味する。
【００９５】
別の例において、目的のタンパク質は、増幅エレメントおよび/または調節エレメントもしくは調節領域（本明細書ではエンハンサーエレメントとも呼ばれる）を含む発現系において、発現されてよい。例えば、ジェミニウイルス（geminivirus）由来の増幅エレメント、例えば、bean yellow dwarf virus （ＢｅＹＤＶ）由来の増幅エレメントなどが、目的のタンパク質発現のために用いられてよい。ＢｅＹＤＶは、双子葉植物に適応するマストレウイルス（Mastrevirus）属に属する。ＢｅＹＤＶは１本鎖の環DNAゲノムを有する非分節性（monopartite）で、ローリング・サークルメカニズムによる、非常に高コピー数の複製が可能である。ＢｅＹＤＶ由来ＤＮＡレプリコンベクター系は、植物における、迅速な高収率タンパク質生産に用いられている。
【００９６】
本明細書で用いられる場合、「増幅エレメント」という語句は、ジェミニウイルスゲノムの１つ以上の長い遺伝子間領域（ＬＩＲ）の少なくとも一部を含む、核酸セグメントを指す。本明細書で用いられる場合、「長い遺伝子間領域」は、ジェミニウイルスＲｅｐタンパク質による、切除および複製を媒介することができるｒｅｐ結合部位（rep binding site）を含有する長い遺伝子間領域のことを指す。いくつかの局面において、１つ以上のＬＩＲを含む核酸セグメントは、さらにジェミニウイルスゲノムの短い遺伝子間領域（ＳＩＲ）を含んでよい。本明細書で用いられる場合、「短い遺伝子間領域」は相補鎖のことを指す（マストレウイルスの短いＩＲ（ＳＩＲ））。任意の好適なジェミニウイルス由来増幅エレメントが、本発明において用いられてよい。例えば、WO2000/20557; WO2010/025285; Zhang X. et al. (2005, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 93, 271-279), Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, 706-714), Huang Z. et al.(2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 106, 9-17)を参照されたい；これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば２つのＬＩＲなど、１つを超えるＬＩＲがコンストラクトにおいて用いられる場合、プロモーター、ＣＭＰＶ−ＨＴ領域および目的の核酸配列、およびターミネーターが、２つのＬＩＲそれぞれによって、挟まれる。
【００９７】
エンハンサーエレメントが、目的タンパク質の高レベルな一過性発現を達成するために用いられてよい。エンハンサーエレメントは、ササゲモザイクウイルス（Cowpea mosaic virus）などのコモウイルス（comovirus）（ＣＰＭＶ; 例えば、WO2007/135480; WO2009/087391;  US 2010/0287670, Sainsbury F. et al., 2008, Plant Physiology; 148: 121-1218; Sainsbury F. et al., 2008, Plant Biotechnology Journal; 6: 82-92; Sainsbury F. et al., 2009, Plant Biotechnology Journal; 7: 682-693; Sainsbury F. et al. 2009, Methods in Molecular Biology, Recombinant Proteins From Plants, vol. 483: 25-39を参照されたい）、US 61/971,274に記載された「ＣＰＭＶ ＨＴ＋」（本文献は参照により本明細書に組み込まれる）、あるいは「ＣＰＭＶＸ」（「ＣＰＭＶ １６０」ともまた呼ばれる）および/または、US 61/925,852 に記載された「ＣＰＭＶＸ＋」（「ＣＰＭＶ １６０＋」ともまた呼ばれる）（本文献は参照により本明細書に組み込まれる）を含む、ＲＮＡ植物ウイルスに基づいてよい。
【００９８】
植物における導入遺伝子の発現の制限には、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）が関与している場合があり、導入遺伝子ｍＲＮＡの特異的分解に対抗するために、ジャガイモウイルスＹ由来のサイレンシングのサプレッサー（ＨｃＰｒｏ）の共発現を使用することができる（Brigneti et al., 1998, EMBO J. 17, 6739-6746、本文献は参照により本明細書に組み込まれる）。これに代わるサイレンシングのサプレッサーも当分野ではよく知られていて、本明細書において述べるように使用することができ(Chiba et al., 2006, Virology 346:7-14;本文献は参照により本明細書に組み込まれる)、例えば限定されるわけではないが、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ（タバコエッチ（etch）ウイルス−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ）、ＢＹＶ−ｐ２１、トマトブッシースタント（bushy stunt）ウイルス（ＴＢＳＶ ｐ１９；ｐ１９の構築はWO 2010/0003225に記載されており、本文献は参照により本明細書に組み込まれる）、トマトクリンクル（crinkle）ウイルスのキャプシドタンパク質（ＴＣＶ−ＣＰ）、キュウリモザイクウイルスの２ｂ（ＣＭＶ−２ｂ）、ジャガイモＸウイルスのｐ２５（ＰＶＸ−ｐ２５）、ジャガイモウイルスＭのｐ１１（ＰＶＭ−ｐ１１）、ジャガイモウイルスＳのｐ１１（ＰＶＳ−ｐ１１）、ブルーベリースコーチ（scorch）ウイルスのｐ１６（ＢＳｃＶ−ｐ１６）、柑橘トリステザウイルスのｐ２３（ＣＴＶ−ｐ２３）、ブドウリーフロール病関連ウイルス２のｐ２４（ＧＬＲａＶ−２  ｐ２４）、ブドウウイルスＡのｐ１０（ＧＶＡ−ｐ１０）、ブドウウイルスＢのｐ１４（ＧＶＢ−ｐ１４）、ハナウド（Heracleum）潜在ウイルスのｐ１０（ＨＬＶ−ｐ１０）、またはニンニク普通潜在ウイルス（Garlic common latent virus）のｐ１６（ＧＣＬＶ−ｐ１６）などがある。
【００９９】
従って、植物内における高レベルのタンパク質生産をさらに確実にするために、サイレンシングのサプレッサー、例えば限定するわけではないが、ＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、ＢＹＶ−ｐ２１、ＴＢＳＶ ｐ１９、ＴＣＶ−ＣＰ、ＣＭＶ−２ｂ、ＰＶＸ−ｐ２５、ｇｓｃａｍ、ＦＨＶ由来Ｂ２タンパク質、ＣＰＭＶの小コートタンパク質、およびＴＣＶ由来のコートタンパク質、ＰＶＭ−ｐ１１、ＰＶＳ−ｐ１１、ＢＳｃＶ−ｐ１６、ＣＴＶ−ｐ２３、ＧＬＲａＶ−２ｐ２４、ＧＢＶ−ｐ１４、ＨＬＶ−ｐ１０、ＧＣＬＶ−ｐ１６、またはＧＶＡ−ｐ１０などを、コモウイルスベース発現カセット、ジェミニウイルス由来増幅エレメント、および目的のタンパク質をコードする核酸配列と一緒に、共発現させることができる。
【０１００】
本発明のコンストラクトは、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを用いて、植物細胞に導入され得る。これらの技術の概略については、例えば、Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988); および Miki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants.  In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997)を参照されたい。他の方法には、直接ＤＮＡ取り込み、リポソームの使用、エレクトロポレーション、例えばプロトプラストを使用するもの、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル（microprojectile）またはウィスカー（whisker）、および減圧浸潤が含まれる。例えば、Bilang, et al. (1991, Gene 100: 247-250), Scheid et al. (1991, Mol. Gen. Genet. 228: 104-112)、 Guerche et al. (1987, Plant Science 52: 111-116)、 Neuhause et al. (1987, Theor. Appl Genet. 75: 30-36)、 Klein et al., (2987, Nature 327: 70-73); Freeman et al. (1984, Plant Cell Physiol. 29: 1353)、 Howell et al. (1980, Science 208: 1265)、 Horsch et al. (1985, Science 227: 1229-1231)、 DeBlock et al., (1989, Plant Physiology 91: 694-701)、 Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988)、 Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989)、  WO 92/09696、 WO 94/00583、 EP 331083、 EP 175966、 Liu and Lomonossoff (2002, J  Virol Meth, 105:343-348)、 EP 290395; WO 8706614; 米国特許第4,945,050号; 第5,036,006号; および第5,100,792号、1995年5月10日に出願された米国特許出願第08/438,666号、および1992年9月25日に出願された米国特許出願第07/951,715号を参照されたい（これらの文献は全て、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０１】
本発明のコンストラクトを発現させるために、一過性発現法を使用することができる（D'Aoust et al., 2009, Methods in molecular biology, Vol 483, pages41-50;  Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348を参照されたい；本文献は参照により本明細書に組み込まれる）。あるいは、Kapila et al., (1997, Plant Sci. 122, 101-108; 本文献は参照により本明細書に組み込まれる)またはWO 00/063400, WO 00/037663（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような、減圧ベースの一過性発現法を使用することもできる。これらの方法には、例えば、アグロイノキュレーション（Agro-inoculation）またはアグロインフィルトレーション、シリンジインフィルトレーション（syringe infiltration）の方法が含まれてよいが、これらに限定されず、他の一過性の方法を上述のように使用することもできる。アグロイノキュレーション、アグロインフィルトレーション、またはシリンジインフィルトレーションにより、所望の核酸を含むアグロバクテリアは、組織、例えば、葉、植物の地上部分（茎、葉、および花を含む）、植物の他の部分（茎、根、花）、あるいは植物全体の細胞間隙に侵入する。表皮を横切った後、アグロバクテリアは、感染して、細胞内にｔ−ＤＮＡコピーを導入する。ｔ−ＤＮＡはエピソームとして転写され、ｍＲＮＡが翻訳されて、感染細胞における目的のタンパク質の生産をもたらすが、核内へのｔ−ＤＮＡの通過は一過性である。
【０１０２】
本明細書に記載される一過性タンパク質発現に好適なプラットフォーム植物として用いられ得る、本発明の遺伝子コンストラクトを含有するトランスジェニック植物、植物細胞または種子もまた、本発明の一部と見なされる。植物細胞から植物全体を再生する方法もまた、当分野では知られている（例えば、Guerineau and Mullineaux（1993, Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121-148）を参照されたい）。一般的には、形質転換植物細胞が、抗生物質などの選択剤を含有し得る適当な培地で培養され、ここでは、形質転換植物細胞の同定が容易になるように、選択可能マーカーが使用される。カルスが形成されたら、既知の方法に従って適当な植物ホルモンを使用することにより、シュート形成を促し、そのシュートを発根培地に移して植物を再生させることができる。次に、それらの植物を使って、種子から、または栄養繁殖技法を使って、反復的発生（repetitive generation）を樹立することができる。トランスジェニック植物は、組織培養物を使用せずに作製することもできる。これらの生物の安定的な形質転換および再生の方法は、当分野で確立されており、当業者には知られている。利用できる技術は、Vasil et al., (Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984)、および Weissbach and Weissbach, (Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989)に概説されている。形質転換植物および再生植物を得る方法は、本発明にとっては決定的な問題ではない。
【０１０３】
植物、植物の一部、または植物細胞を、２つ以上の核酸コンストラクトにより形質転換あるいは同時形質転換しようとする場合、核酸コンストラクトはアグロバクテリウムに、核酸をプールし当該細菌の細胞に記載されたようにトランスフェクトする１回のトランスフェクションで導入され得る。あるいは、当該コンストラクトは連続的に導入され得る。この場合、第一のコンストラクトは記載されたようにアグロバクテリウムに導入され、単一の形質転換がなされた細菌のみが生育し得る選択的条件下（例えば、抗生物質存在下）で、細胞を生育する。この第一の選択ステップに続いて、第二の核酸コンストラクトが、記載されたようにアグロバクテリウムに導入され、二重に形質転換された細菌のみが生育し得る二重選択的条件下で、細胞を生育する。二重に形質転換された細菌は、本明細書に記載される植物、植物の一部、または植物細胞を形質転換するために用いられ得、あるいは、さらなる形質転換ステップの対象となり第三の核酸コンストラクトを受け入れ得る。
【０１０４】
あるいは、植物、植物の一部、または植物細胞を２つ以上の核酸コンストラクトで形質転換あるいは同時形質転換しようとする場合、核酸コンストラクトは、アグロバクテリウムの混合物を植物、植物の一部、または植物細胞に共浸潤することにより、植物に導入され得、各アグロバクテリウム細胞は、植物内に導入される１つ以上のコンストラクトを含み得る。植物、植物の一部、または植物細胞内の、コンストラクト内の目的のヌクレオチド配列の相対的発現レベルを変化させるために、浸潤ステップの間、所望のコンストラクトを含む異なるアグロバクテリウム集団の濃度を異ならせてよい。
【０１０５】
目的のタンパク質は、天然の、または非天然のシグナルペプチドを含んでよい；非天然のシグナルペプチドは、植物起源であってよい。例えば、シグナルペプチドは、タンパク質ジスルフィド異性化酵素シグナルペプチド（ＰＤＩ）であってよい。天然のシグナルペプチドは、発現されている目的のタンパク質のシグナルペプチドに相当してよい。目的のヌクレオチド配列、または目的のコード領域はまた、薬剤的に活性のあるタンパク質、例えば、増殖因子、成長調整剤、抗体、抗原、およびそれらのフラグメント、または免疫化もしくはワクチン接種などに有用なそれらの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含み得る。これらのタンパク質には、ヒト病原体であるタンパク質、ウイルスタンパク質が含まれるが、これらに限定されず、例えば限定されないが、ＲＳウイルス（Respiratorysyncytialvirus）（ＲＳＶ）、ロタウイルス（Rotavirus）、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、狂犬病ウイルス（Rabiesvirus）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エンテロウイルス（Enterovirus71）（ＥＶ７１）由来の１つ以上のタンパク質、あるいは、例えばＩＬ1からＩＬ２４、ＩＬ２６およびＩＬ２７の１つ以上などのインターロイキン、サイトカイン、エリスロポエチン（Erythropoietin）（ＥＰＯ）、インスリン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＰＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、またはこれらの組み合わせ、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγなどのインターフェロン、例えば、第ＶＩＩＩ因子（FactorVIII）、第ＩＸ因子（FactorIX）などの血液凝固因子、あるいはｔＰＡｈＧＨ、受容体、受容体アゴニスト、例えば限定されないがリツキサン（Rituxan）などの抗体、神経ポリペプチド、インスリン、ワクチン、例えば限定されないが上皮増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、形質転換増殖因子などの増殖因子、成長調整剤、抗原、自己抗原、それらのフラグメント、あるいはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
目的のタンパク質はまた、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ；WO 2009/009876参照、本文献は参照により本明細書に組み込まれる）を含んでよい。ＨＡはホモ三量体の膜Ｉ型糖タンパク質であり、一般的にシグナルペプチド、ＨＡ１ドメイン、およびＣ末端の膜貫通アンカー部位と、小さな細胞質側末端を含むＨＡ２ドメインを含む。ＨＡをコードするヌクレオチド配列は、よく知られており、利用可能である（例えば、the BioDefense and Public Health Database (Influenza Research Database; Squires et al., 2008 Nucleic Acids Research 36:D497-D503) のURL: biohealthbase.org/GSearch/home.do?decorator=Influenza；あるいは、the National Center for Biotechnology Informationによって維持されるデータベース（URL: ncbi.nlm.nih.govを参照されたい）を参照されたい。これらは共に、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０７】
ＨＡタンパク質は、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザのものであってよく、あるいは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６の群から選択されるＡ型インフルエンザＨＡのサブタイプである。本発明のいくつかの局面において、ＨＡは、Ａ型インフルエンザ由来であってよく、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７およびＨ９の群から選択されてよい。上記で挙げたＨＡのフラグメントもまた、目的のタンパク質となり得る。さらに、ＨＡタイプまたは上記で挙げたサブタイプ由来のドメインが、キメラＨＡを生産するために、組み合わされてよい（例えば、WO2009/076778参照、本文献は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０８】
ＨＡタンパク質を含むサブタイプの例には、A/New Caledonia/20/99 (H1N1)、 A/Indonesia/5/2006 (H5N1)、 A/chicken/New York/1995、 A/herring gull/DE/677/88 (H2N8)、 A/Texas/32/2003、 A/mallard/MN/33/00、 A/duck/Shanghai/1/2000、 A/northern pintail/TX/828189/02、 A/Turkey/Ontario/6118/68(H8N4)、 A/shoveler/Iran/G54/03、 A/chicken/Germany/N/1949(H10N7)、 A/duck/England/56(H11N6)、 A/duck/Alberta/60/76(H12N5)、 A/Gull/Maryland/704/77(H13N6)、 A/Mallard/Gurjev/263/82、 A/duck/Australia/341/83 (H15N8)、 A/black-headed gull/Sweden/5/99(H16N3)、 B/Lee/40、 C/Johannesburg/66、 A/PuertoRico/8/34 (H1N1)、 A/Brisbane/59/2007 (H1N1)、 A/Solomon Islands 3/2006 (H1N1)、 A/Brisbane 10/2007 (H3N2)、 A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)、 B/Malaysia/2506/2004、 B/Florida/4/2006、 A/Singapore/1/57 (H2N2)、 A/Anhui/1/2005 (H5N1)、 A/Vietnam/1194/2004 (H5N1)、 A/Teal/HongKong/W312/97 (H6N1)、 A/Equine/Prague/56 (H7N7)、 A/HongKong/1073/99 (H9N2))が含まれる。
【０１０９】
ＨＡタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７またはＨ９サブタイプであってよい。例えば、Ｈ１タンパク質は、A/New Caledonia/20/99 (H1N1)、 A/PuertoRico/8/34 (H1N1)、 A/Brisbane/59/2007 (H1N1)、 A/Solomon Islands 3/2006 (H1N1)、 A/California/04/2009 (H1N1)またはA/California/07/2009 (H1N1)株由来であってよい。Ｈ３タンパク質はまた、A/Brisbane 10/2007 (H3N2)、 A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)、 A/Victoria/361/2011 (H3N2)、 A/Texas/50/2012 (H3N2)、 A/Hawaii/22/2012 (H3N2)、 A/New York/39/2012 (H3N2)、または A/Perth/16/2009 (H3N2) 株由来であってよい。本発明のさらなる局面において、Ｈ２タンパク質は、A/Singapore/1/57 (H2N2) 株由来であってよい。Ｈ５タンパク質は、A/Anhui/1/2005 (H5N1)、 A/Vietnam/1194/2004 (H5N1)、 またはA/Indonesia/5/2005 株由来であってよい。本発明のある局面において、Ｈ６タンパク質はA/Teal/HongKong/W312/97 (H6N1)株由来であってよい。Ｈ７タンパク質は、A/Equine/Prague/56 (H7N7) 株、 またはH7 A/Hangzhou/1/2013、 A/Anhui/1/2013 (H7N9)、 またはA/Shanghai/2/2013 (H7N9) 株由来であってよい。本発明のある局面において、Ｈ９タンパク質は、A/HongKong/1073/99 (H9N2) 株由来である。本発明のさらなる局面において、ＨＡタンパク質は、B/Malaysia/2506/2004、 B/Florida/4/2006、 B/Brisbane/60/08、 B/Massachusetts/2/2012様ウイルス(山形系統)、またはB/Wisconsin/1/2010 (山形系統)を含む、Ｂ型ウイルスであり得るインフルエンザウイルス由来であってよい。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９またはＢサブタイプ由来のＨＡタンパク質のアミノ酸配列の非限定的な例には、WO 2009/009876、 WO 2009/076778、 WO 2010/003225に記載される配列が含まれる（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる）。インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、H5 Indonesiaであってよい。
【０１１０】
ＨＡは、天然の、または非天然のシグナルペプチドを含んでよい：非天然のシグナルペプチドは、植物起源であってよい。例えば、シグナルペプチドは、タンパク質ジスルフィド異性化酵素シグナルペプチド（ＰＤＩ）であってよい。天然のシグナルペプチドは、発現されているヘマグルチニンのシグナルペプチドに相当してよく、あるいは、別のヘマグルチニンに相当してよい。
【０１１１】
本発明はまた、ＨＡタンパク質をコードする配列を含む核酸分子を提供する。核酸分子は、さらに、ＨＡタンパク質をコードする配列と動作可能に連結している１つ以上の調節領域を含んでよい。核酸分子は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６またはＢ型インフルエンザ由来のＨＡをコードする配列を含んでよい。例えば、核酸分子がコードするＨＡタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９サブタイプまたはＢ型由来のＨＡであってよい。核酸がコードするＨ１タンパク質は、A/New Caledonia/20/99 (H1N1)、 A/PuertoRico/8/34 (H1N1)、 A/Brisbane/59/2007 (H1N1)、 A/Solomon Islands 3/2006 (H1N1)、 A/California/04/2009 (H1N1)またはA/California/07/2009 (H1N1) 株由来であってよい。核酸分子がコードするＨ３タンパク質は、A/Brisbane 10/2007 (H3N2)、 A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)、 A/Victoria/361/2011 (H3N2)、 A/Texas/50/2012 (H3N2)、 A/Hawaii/22/2012 (H3N2)、 A/New York/39/2012 (H3N2)、 または A/Perth/16/2009 (H3N2) 株由来であってよい。核酸分子がコードするＨ２タンパク質は、A/Singapore/1/57 (H2N2) 株由来であってよい。核酸分子がコードするＨ５タンパク質は、A/Anhui/1/2005 (H5N1)、 A/Vietnam/1194/2004 (H5N1)、 または A/Indonesia/5/2005 株由来であってよい。核酸分子がコードするＨ６タンパク質は、A/Teal/HongKong/W312/97 (H6N1) 株由来であってよい。核酸分子がコードするＨ７タンパク質は、A/Equine/Prague/56 (H7N7) 株、または H7 A/Hangzhou/1/2013、 A/Anhui/1/2013 (H7N9)、またはA/Shanghai/2/2013 (H7N9) 株由来であってよい。さらに、核酸分子がコードするＨ９タンパク質は、A/HongKong/1073/99 (H9N2) 株由来であってよい。核酸分子がコードするＨＡタンパク質は、B/Malaysia/2506/2004、 B/Florida/4/2006、 B/Brisbane/60/08、 B/Massachusetts/2/2012-likeウイルス (山形系統)、 またはB/Wisconsin/1/2010 (山形系統)を含む、インフルエンザウイルスＢ型ウイルス由来であってよい。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９またはＢサブタイプ由来のＨＡタンパク質のアミノ酸配列の非限定的な例には、WO 2009/009876、 WO 2009/076778、 WO 2010/003225に記載される配列が含まれる（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる）。インフルエンザウイルスＨＡタンパク質はH5 Indonesiaであってよい。
【０１１２】
植物材料または植物組織の形態の植物質は、対象に経口的に送達されてよい。植物質は、健康補助食品（dietary supplement）の一部として、他の食品と共に、あるいはカプセル化されて、投与されてよい。植物質または植物組織はまた、摂取し易いように濃縮されてよく、あるいは必要とされる他の物質、成分、または医薬上の賦形剤と共に提供されてよい。
【０１１３】
目的のタンパク質を含む植物は、例えば動物またはヒトなどの対象に、必要および状況に応じて、様々な方法で投与され得ることが、企図される。例えば、植物から取得した目的のタンパク質は、その使用の前に、未精製の形態、部分的に精製された形態、あるいは精製された形態のいずれかで抽出されてよい。タンパク質が精製される場合、食用または非食用植物のいずれかで生産されてよい。さらに、タンパク質が経口投与される場合、植物組織が収穫されて直接的に対象に与えられてよく、あるいは、収穫された組織を、与える前に乾燥させてよく、あるいは、事前の収穫を行わずに動物に植物を食べさせてもよい。本発明の範囲内において、収穫した植物組織が、動物用飼料内の栄養補助食品として提供されることもまた、考えられる。植物組織が、ほとんど、あるいは全く、さらなる加工なしに動物に与えられる場合、投与される植物組織は食用であることが好ましい。
【表１】
2020156492.tif 000003
【実施例】
【０１１４】
実施例１：Ａ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／ＮＯＳ（コンストラクト番号４８４)
【０１１５】
以下のPCRに基づく方法を用いて、天然のシグナルペプチドがアルファルファ タンパク質ジスルフィド異性化酵素 （ＰＤＩＳＰ／Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のシグナルペプチドにより置換されたインフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来のＨ１をコードする配列を、２Ｘ３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ−ＮＯＳ発現カセットにクローニングした。ＰＤＩＳＰ／Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ コード配列を含有するフラグメントを、プライマーＩＦ−ＰＤＩ．Ｓ１＋３ｃ（図１２Ａ、配列番号１）およびＩＦ−Ｈ１ｃＴＭＣＴ．Ｓ１−４ｒ（図１２Ｂ、配列番号２）を用いて、ＰＤＩＳＰ／Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ配列（図１３、配列番号３）をテンプレートとして用いて、増幅した。当該PCR産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Clontech, Mountain View, CA）を用いて、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系にクローニングした。コンストラクト番号１１９１（図１４）をＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で切断し、線状化プラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ会合反応に用いた。コンストラクト番号１１９１は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットにおいて、目的の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングを対象とした、アクセプタープラスミドである。本プラスミドはまた、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの支配下のサイレンシングに対するＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーの共発現のための遺伝子コンストラクトを組み込んでいる。バックボーンは、ｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、Ｔ−ＤＮＡの左境界配列（left border）から右境界配列(right border)までの配列が図１５に示されている（配列番号４）。結果として得られるコンストラクトには、番号４８４が与えられた（図１６、配列番号５）。ＰＤＩＳＰと融合したインフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来の成熟Ｈ１のアミノ酸配列は、図１７に示している（配列番号６）。プラスミド４７４の図は、図１８に示している。
【０１１６】
実施例２：アグロバクテリウムトランスフェクション
【０１１７】
アグロバクテリウム株AGL1を、D'Aoust et al 2008 (Plant Biotechnology Journal 6:930-940)により記載された方法を用いて、エレクトロポレーションにより、ＤＮＡコンストラクトでトランスフェクトした。トランスフェクトしたアグロバクテリウムを、１０ｍＭ ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補足したｐＨ５．６のＹＥＢ培地で、ＯＤ６００が０．６〜１．６に達するまで培養した。使用前にアグロバクテリウム懸濁液を遠心分離して、浸潤培地（１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．６）に再懸濁した。
【０１１８】
植物生物体量、接種物の調製、およびアグロインフィルトレーション
【０１１９】
市販のピートモス培地で満たした平箱（flat）においてNicotiana benthamiana植物を種子から生育した。植物は１６／８光周期および日中２８℃／夜間２４℃の温度レジーム下で温室において生長させた。種まきの３週間後に、個々の小植物を選定し、鉢に移植して、温室中、同じ環境条件下でさらに３週間生長させた。
【０１２０】
各コンストラクトをトランスフェクトしたアグロバクテリアを、１０ｍＭ ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補足したｐＨ５．６のＹＥＢ培地で、ＯＤ６００が０．６〜１．６に達するまで培養した。使用前にアグロバクテリウム懸濁液を遠心分離して、浸潤培地（１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．６）に再懸濁し、４℃で一晩保存した。浸潤当日、使用前に、培養バッチを２．５培養体積に希釈し、温度上昇させた。気密ステンレス鋼タンク中の細菌懸濁液に２０〜４０Ｔｏｒｒの減圧下で２分間、N. benthamianaの全植物体を上下逆さまにして入れた。浸潤させた植物をPGR15 CMP 5090 Conviron チャンバー (Conviron, Winnipeg MB, Canada)に、６〜７日のインキュベーション期間の間置き、その後収穫した。
【０１２１】
実施例３：解析手順
【０１２２】
葉タンパク質を、図７に示される模式図に基づき、一次、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３葉および葉柄、並びに、二次、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３葉および葉柄から抽出した。収穫した葉を計量し、新鮮な葉組織ベースで、生物体量生産を決定した。葉タンパク質を、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび０．０４％（ｗ／ｖ）メタ重亜硫酸ナトリウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（抽出バッファー）中で、葉組織の破壊のためにOmni bead Ruptor 24 ホモジナイザーおよび２．８−ｍｍジルコニウムビーズ(OMNI International, Kennesaw GA, U.S.A.)を用いて、抽出した。収穫した葉組織を−８０℃で凍結して、液体窒素中で破砕し、抽出バッファー中に希釈して（１５ｇの新鮮な葉破砕物を、ジルコニウムビーズ１０個を含む３ｍｌの抽出バッファーに希釈）、供給元の指示に従いOmni bead Ruptorホモジナイザーでホモジナイズした。１ｍｌの混合物を１．５ｍｌのマイクロチューブに移し、４℃、２０，０００ｇで１０分間、遠心分離し、さらなる解析のために上清を回収した。上清のタンパク質含量を、ウシ血清アルブミンをタンパク質スタンダードとして用いるブラッドフォード法（Bradford MM (1976) Analytical Biochemistry 72, 248-254）に従い、決定した。サンプルは、赤血球凝集アッセイに先立ち、氷上で保管するか、あるいは−８０℃で凍結した。
【０１２３】
赤血球凝集アッセイは、Nayak and Reichl (2004)により記載された方法に基づいた。端的に言うと、試験サンプル（１００μＬ）の段階的な２倍希釈が、１００μＬＰＢＳを含有するＶ字型の９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて行われ、ウェル当たり１００μＬの希釈サンプルが作成された。１００μＬの０．２５％シチメンチョウ赤血球懸濁液（Bio Link Inc., Syracuse, NY; 全てのＢ株、Ｈ１、Ｈ５およびＨ７に対して）または０．５％モルモット赤血球懸濁液（Ｈ３に対して）を各ウェルに添加し、プレートを、室温で２時間インキュベートした。完全な血液凝集を示す最大希釈の逆数を、ＨＡ活性として記録した。
【０１２４】
葉ＲＮＡを、図７に示される模式図に基づき、一次、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３葉および葉柄、並びに、二次、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３葉および葉柄から抽出した。ＨＡコード配列のｍＲＮＡ転写産物を、ABI PRISM 7500 Fast リアルタイムＰＣＲ装置、システムバージョン２．０．１ (Applied Biosystems)を用いて、リアルタイムＲＴ ＰＣＲにより、調べた。全ＲＮＡを、Qiagen RNeasy plant mini kit (Qiagen)を用いて、供給元の指示に従い、以前にRobert et al. (PLoS One, 8: e70203)により記載されたように、抽出した。ＲＮＡサンプルは、夾雑ＤＮＡを除去するためにDNase I (Roche Diagnostics)で処理し、Nanodrop(登録商標) ND-1000 分光光度計 (NanoDrop Technologies, Wilmington DE, USA)を用いて、質および量を評価した。一本鎖ｃＤＮＡを、４ユニットのOmniscript 逆転写酵素 (Qiagen)および、１μＭのオリゴチミジン（１５）ヌクレオチド (Roche)を用いて、５００ｎｇの全ＲＮＡから合成した。ＰＣＲ混合物は、１０μｌのFast SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)、２μｌのｃＤＮＡテンプレート、および終濃度６２５ｎＭの適当なフォワードプライマーおよびリバースプライマーを各２．５μｌ含有していた。テンプレートを配合していないコントロールを、各９６ウェルプレートに含ませた。増幅ラウンドは９５℃での２０秒の変性ステップから成り、４０回の、９５℃３秒および６０℃３０秒の二段階ステップが続いた。増幅後、SYBR Green Master Mixにより解離曲線解析を行い、その後、各サンプルのＣｔ値（cycle threshold）を、各プライマーの組に設定されたＤＮＡ検量線と比較した。検量線は、ＮＥＢ Ｔａｑポリメラーゼの所定のプロトコール（New England Biolabs）に従い、２μｌのｃＤＮＡテンプレートで作成した。増幅産物を、Illustra GFX キット(GE Healthcare)を用いて精製し、ＤＮＡ検量線を、ヌクレアーゼフリーの水における精製したＰＣＲ産物の段階希釈（１μｌ当たり、１０７から１０２コピー）により考案した。Ｃｔのデータを、対応する転写産物コピー数に対してプロットした。全ての増幅は、２連で行った。
【０１２５】
実施例４：照明アッセイ
【０１２６】
アグロインフィルトレーションの前の生物体量生産のために、標準的なグロースチャンバー条件（上記実施例２に規定）をベースライン対照（baseline comparator）として、様々な照明レジーム（lighting regime）を用いた。３週齢の実生を、上記実施例２に記載したように鉢に移し、温室（図１−４）またはConviron PGW36 3224グロースチャンバー（図５および６）に３週間保管して生物体量を生産させた。その後、植物を、インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来のＨ１（ＨＡ；実施例１）の発現のために、コンストラクト４８４で形質転換されたアグロバクテリウム 株で、アグロインフィルトレーションし、６−７日間保管して目的のタンパク質（ＨＡ）を発現させ、実施例２および３に記載されたように、生物体量とＨＡ生産を評価した。温室およびグロースチャンバー試験における光処理は、１，０００Ｗ高圧ナトリウム（ＨＰＳ）ランプ（Philips）、１，０００Ｗメタルハライド（ＭＨ）ランプ（Sylvania）およびＧｒｅｅｎＰｏｗｅｒ ＬＥＤランプ（Phillips）を含む、異なる照明装置を包含した。
【０１２７】
温室試験のために、次の照明レジームを用いた：
（１）日中１６時間／夜間８時間の光周期、８０μｍｏｌ／ｍ２．ｓの光強度；
（２）日中１６時間／夜間８時間の光周期、１６０μｍｏｌ／ｍ２．ｓの光強度；
（３）日中２４時間の光周期、８０μｍｏｌ／ｍ２．ｓの光強度；
（４）日中２４時間の光周期、１６０μｍｏｌ／ｍ２．ｓの光強度。
【０１２８】
グロースチャンバー試験のために、次の照明レジームを用いた：
（１）日中２４時間の光周期、１７５μｍｏｌ／ｍ２．ｓの光強度（低光強度コントロール）；
（２）日中２４時間の光周期、３５０μｍｏｌ／ｍ２．ｓの光強度（高光強度試験）。
【０１２９】
試験の結果は、図１−６に示す。
【０１３０】
温室試験に関して（図１−４）、１６時間または２４時間の明期にさらされた植物において、光強度の増加に伴い（８０から１６０μｍｏｌ／ｍ２．ｓ）、総葉生物体量の対応する増加が観察された（図１）。さらに、一次葉生物体量に対する二次生物体量の比は、明期の増加および光強度の増加に伴い増加し、一次葉生物体量に対する二次生物体量の比（Ｓ／Ｐ）は、６時間８０処理では０．２７：１であったのに対し、１６時間１６０処理では０．３９：１、２４時間８０処理では０．４４：１、および２４時間１６０処理では０．５３：１に増加した。これらの２つの光処理（光強度の増加および明期の増加）により二次葉生物体量が増加することが証明される。
【０１３１】
光強度および明期処理の結果、目的タンパク質（ＨＡ）の収量もまた、二次葉生物体量において増加している（図２、３および４）。さらに、二次葉生物体量からのＨＡタンパク質収量の、一次葉生物体量からのＨＡタンパク質収量に対する比（ＨＡ Ｓ／Ｐ比）は、１６時間８０処理では０．３３：１であったのに対し、１６ｈ１６０処理では０．３５：１、２４時間８０処理では０．６２：１、２４時間１６０処理では０．８９：１に増加した。これらの２つの光処理（光強度の増加および明期の増加）により二次葉生物体量における目的タンパク質の収量が増加することが証明される。葉生物体量全体（一次および二次）からの目的タンパク質の収量は、光強度の増加と明期の増加に伴い増加した（図３および４）。
【０１３２】
同様の結果が、グロースチャンバー試験で得られた（図５および６、並びに表２）。図５に示したように、光強度の増加に伴い、総葉生物体量の対応する増加が見られた。一次葉生物体量からのＨＡの収量と比較した場合の、二次葉生物体量からのＨＡの収量の増加もまた、見られた（図６）。これは、最も古い一次葉（Ｐ３）と比較して、最も古い二次葉（Ｓ３）においてＨＡ生合成のためのｍＲＮＡ転写産物の数が多いことと関連していた（表２）。
【０１３３】
これらのデータは、まとめると、浸潤および収穫前の二次葉生物体量の生長の増加により、得られる二次葉生物体量の増加に加えて、目的タンパク質の生合成率および収率が増加することを証明している。目的のタンパク質は、二次葉生物体量、一次葉生物体量、または二次葉生物体量および一次葉生物体量の両方から、取得され得ることは、理解されるべきである。
【０１３４】
【表２】
2020156492.tif 000004
【０１３５】
実施例５：実生移植後の、物理的な摘心処理
【０１３６】
収穫された生物体量全体に対する二次シュートの相対的な重要性は、浸潤の１６、１４、または９日前にそれぞれ相当する、実生移植の５、７、または１２日後に、頂芽４０（主茎の芽）（図７の「Ａ」参照）を除去することにより、増強された。３週齢の実生を、鉢に移植し、生物体量生産のために温室に１週間置き、頂端を除去して剪定した植物を作成した。剪定した植物を、さらに１６、１４または９日間、温室に置いた。剪定した植物は、その後、実施例２に記載されたように、インフルエンザ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（ＨＡ；実施例１））由来のＨ１を発現するために、コンストラクト４８４で形質転換されたアグロバクテリウムでアグロインフィルトレーションされ、PGR15 CMP 5090 Convironチャンバー内に置かれ（実施例２に規定された条件下で）、６−７日間保管された。当該期間の後、剪定した植物に対して、実施例３に記載されたように生物体量を調べた。当該期間の後、剪定した植物に対して、実施例３に記載されたように生物体量とＨＡ生産を調べた。以下の条件を、本試験に用いた：ＨＰＳ（Philips）およびＭＨ（Sylvania）ランプにより供給された、日中２４時間／夜間０時間の光周期、１６０μｍｏｌ／ｍ２．ｓの光強度、日中２８℃／夜間２４℃の温度レジーム、３３プラント／ｍ２のプラントキャノピー密度（plant canopy density）。
【０１３７】
植物形質転換の前の頂芽剪定の、植物生物体量に対する結果が、表３および図８に示されている。移植の５日後の初期の摘心が植物生長に顕著に影響したことを除いて、剪定は総葉生物体量（すなわち、一次葉生物体量と二次葉生物体量の合計）を変化させなかった（図８）。剪定の結果、葉生物体量の比は、二次葉生物体量と共に変化した（図８のHAインキュベーション後に収穫された生物体量を参照）。例えば、浸潤前に決定した二次葉生物体量は、コントロール植物（剪定なし）の１０．４ｇから、剪定した植物の２３．０ｇに増加し、一方、一次葉生物体量は２６．３ｇ（コントロール）から１４．５ｇ（剪定した植物）に減少し、一次葉生物体量に対する二次葉生物体量の比は０．４：１から１．６：１に増加した。
【０１３８】
まとめると、これらのデータは、目的のタンパク質の生産をするための浸潤前の、実生移植後の機械的な摘心が、植物全体規模における二次葉生物体量の相対的重要性を増加させる方法であることを証明している。目的のタンパク質は、二次葉生物体量、一次葉生物体量、または二次葉生物体量および一次葉生物体量の両方から、取得され得ることは、理解されるべきである。
【０１３９】
【表３】
2020156492.tif 000005
【０１４０】
実施例６：実生移植後の、合成ホルモンベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）による化学的処理
【０１４１】
収穫された生物体量全体に対する、二次シュートの相対的な重要性は、実生移植の７または１２日後、すなわちＨＡ発現のための浸潤の１４または９日前に、合成植物ホルモンベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）で植物を処理することにより、増強された。３週齢の実生を、鉢に移植し、生物体量生産のために温室に７または１２日間置き、７および／または１２日後に、水中の１００ｐｐｍ、５００ｐｐｍまたは１，０００ｐｐｍの適用量（working dose）の合成ホルモンで処理した。処理した植物を、さらに１４または９日間温室に置き、その後、実施例２に記載されたように、インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（ＨＡ；実施例１）由来のＨ１を発現するために、コンストラクト 484で形質転換されたアグロバクテリウム株でアグロインフィルトレーションし、PGR15 CMP 5090 Convironチャンバー内に置き（実施例２に規定された条件下で）、６−７日間保管した。当該期間の後、処理した植物に対して、実施例３に記載されたように生物体量とＨＡ生産を調べた。以下の条件を、本試験に用いた：ＨＰＳ（Philips）およびＭＨ（Sylvania）ランプにより供給された、日中２４時間／夜間０時間の光周期、１６０μｍｏｌ／ｍ２．ｓの光強度、日中２８℃／夜間２４℃の温度レジーム、３３プラント／ｍ２のプラントキャノピー密度（plant canopy density）。
【０１４２】
植物の形質転換の前のＢＡＰによる植物の処理の、植物生物体量およびＨＡ収率に対する結果を、図９、１０および１１に示している。ＢＡＰ処理は一次生物体量にほとんど影響しなかったが、二次生物体量生産に対して、１，０００ｐｐｍ処理が正の影響を示さなかったことを除いて、顕著な正の効果を有した（図９）。例えば、コントロール植物（非処理）のおよそ１６ｇと比較して、移植の７日後に５００ｐｐｍで処理した植物からは、およそ２２ｇの二次葉生物体量が収穫され、相対的な増加は、一次生物体量において１０％未満であったのに対して、二次葉生物体量においては約３７．５％であった。
【０１４３】
ＢＡＰ処理した植物の二次生物体量の増加割合は、新鮮重（ｇ）当たりのＨＡ生産の全体的な確かな増加（図１０）および、植物当たりのＨＡ総収量の結果的な増加（図１１）と関連していた。例えば、ＨＡ収量は、コントロール植物（非処理）においては２００，０００ユニット未満であったが（図１０）、７および１２日後に５００ｐｐｍのＢＡＰで処理した植物では新鮮重（ｇ）当たり３００，０００ユニットを超え、植物あたりの総収量は４５−５０％増加した。
【０１４４】
これらのデータは、まとめると、浸潤前に植物全体規模における二次葉生物体量の相対的な重要性を増加させるために、および浸潤後に目的のタンパク質の生産を改善するために、合成サイトカイニンＢＡＰで実生移植後に処理することは、有効であることを証明している。目的のタンパク質は、二次葉生物体量、一次葉生物体量、または二次葉生物体量および一次葉生物体量の両方から、取得され得ることは、理解されるべきである。
【０１４５】
全ての引用は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４６】
本発明を、１つ以上の実施形態に関して説明した。しかしながら、多くの変更および改変が、特許請求の範囲で規定される本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることは、当業者には明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月25日(2020.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書または図面に記載された発明。
【外国語明細書】
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