(57)【要約】【課題】酪酸菌を増殖させるプレバイオティクスを提供する。【解決手段】ユリ科アロエ属植物の抽出物、又はロフェノール化合物及びシクロラノスタン化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を含有する、酪酸菌用プレバイオティクス組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユリ科アロエ属植物の抽出物を含有する、酪酸菌用プレバイオティクス組成物。
【請求項２】
前記抽出物が、ロフェノール化合物及びシクロラノスタン化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ロフェノール化合物及びシクロラノスタン化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を含有する、酪酸菌用プレバイオティクス組成物。
【請求項４】
シクロラノスタン化合物が、９，１９−シクロラノスタン−３−オール、及び２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オールからなる群から選択される、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
ロフェノール化合物が、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オールからなる群から選択される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記抽出物を組成物全体の０．１質量％以上含有する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項７】
ロフェノール化合物及びシクロラノスタン化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を合計で組成物全体の０．００００１質量％以上含有する、請求項２〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記酪酸菌が、フィーカリバクテリウム属細菌及び／又はゲンミゲル属細菌である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
飲食品である、請求項１〜８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
医薬品である、請求項１〜８の何れか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酪酸菌用プレバイオティクス組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、腸内細菌と健康との関連性に注目が集まり、世界中で研究が行われている。腸内環境改善に関連する用語として知られる「プロバイオティクス」は、一般に腸内フローラのバランスを改善することにより人に有益な作用をもたらす生きた微生物を指し、ビフィズス菌等が一般的に知られている。また、かかるプロバイオティクスが資化するものとして「プレバイオティクス」があり、これは、消化管上部で分解・吸収されず、大腸に共生する有益な細菌の選択的な栄養源となりそれらの増殖を促進し、大腸の腸内フローラ構成を健康的なバランスに改善し維持し、ヒトの健康の増進維持に役立つものを一般に意味する。
【０００３】
大腸に共生する有益な細菌のひとつとして、酪酸菌がある。酪酸は、腸内に存在する短鎖脂肪酸のひとつであり、大腸細胞にエネルギーを提供する主要な栄養素としてだけでなく、宿主の遺伝子発現、細胞分化、腸組織発生、免疫調節、酸化ストレス低下、及び下痢コントロールなど、腸内のみならず種々の機能を調節する細胞メディエーターである（非特許文献１）。
健康のために酪酸を体内に取り込むことは有用であるが、酪酸は非常に強い不快臭を放つため、食品や医薬品等の形態で摂取することは現実的ではない。また、腸内に生息する主な酪酸菌は、酸素感受性が極端に高いためにｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養が非常に困難であり、酪酸菌を製剤化して摂取することも難しい（非特許文献２）。
【０００４】
ところで、アロエ抽出物や、それに含まれるシクロラノスタン骨格を有する化合物やロフェノール骨格を有する化合物には、種々の機能性が見出されているが（特許文献１〜３等）、プロバイオティクスとしての有用性については未だ十分に解明されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許４１６２７０３号
【特許文献２】特許３８８３５６３号
【特許文献３】国際公開第２０１６／０８４９５６号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cell. 2016 Jun 2;165(6):1332-1345
【非特許文献２】Best. Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2017 Dec;31(6):643-648.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
かかる状況に鑑み、本発明者らは腸内に生息する酪酸菌を増殖させることが健康の維持・向上のために有用であると考えた。したがって、本発明は、酪酸菌を増殖させるプレバイオティクスを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、アロエ抽出物や、それに含まれるシクロラノスタン骨格を有する化合物やロフェノール骨格を有する化合物が、腸内で酪酸菌を著しく増殖させることができることを見出し、これを酪酸菌用のプレバイ
オティクスの有効成分とすることに想到し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の一態様は、ユリ科アロエ属植物の抽出物を含有する、酪酸菌用プレバイオティクス組成物である。本態様において、前記抽出物は、ロフェノール化合物及びシクロラノスタン化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を含有することが好ましい。本態様において、前記抽出物は組成物全体の０．１質量％以上含有されることが好ましい。
本発明の別の態様は、ロフェノール化合物及びシクロラノスタン化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を含有する、酪酸菌用プレバイオティクス組成物である。
本発明において、シクロラノスタン化合物は好ましくは、９，１９−シクロラノスタン−３−オール、及び２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オールからなる群から選択される。
本発明において、ロフェノール化合物は好ましくは、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オールからなる群から選択される。
本発明において好ましくは、ロフェノール化合物及びシクロラノスタン化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物は、合計で組成物全体の０．００００１質量％以上含有される。
本発明において、前記酪酸菌は好ましくは、フィーカリバクテリウム属細菌及び／又はゲンミゲル属細菌である。
本発明の組成物は、好ましくは飲食品である。
また、本発明の組成物は、好ましくは医薬品である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、腸内で酪酸菌を効率的に増殖させることができるプレバイオティクスが提供される。酪酸菌が産生する酪酸は、細胞メディエーターとして機能し健康を維持向上させるため、本発明は産業上非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】試料を添加して腸内細菌を中和培養した後の、酪酸菌（フィーカリバクテリウム・プラスニッチ）の腸内細菌全体に占める割合を示すグラフ（ｎ＝６）。
【図２】試料を添加して腸内細菌を中和培養した後の酪酸濃度を示すグラフ（ｎ＝６）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
次に、本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。
【００１３】
本発明の組成物は、アロエ抽出物、あるいはそれに含まれるシクロラノスタン骨格を有する化合物及び／又はロフェノール骨格を有する化合物を含有する。
【００１４】
アロエ抽出物を取得するアロエ植物としては、アロエベラ（Ａｌｏｅ ｂａｒｂａｄｅｎｓｉｓ Ｍｉｌｌｅｒ）、アロエフェロックスミラー（Ａｌｏｅ ｆｅｒｏｘ Ｍｉｌｌｅｒ）、アロエアフリカーナミラー（Ａｌｏｅ ａｆｒｉｃａｎａ Ｍｉｌｌｅｒ）、キダチアロエ（Ａｌｏｅ ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎ Ｍｉｌｌｅｒ ｖａｒ．ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ Ｂｅｒｇｅｒ）、アロエスピカータベイカー（Ａｌｏｅ ｓｐｉｃａｔａ Ｂａｋｅｒ）等が挙げられる。
【００１５】
抽出物の製造においては、前記植物の全体を用いてもよいが、葉肉（透明ゲル部分）を用いることが好ましい。このような植物又はその一部を、好ましくはホモジナイザー等を用いて破砕して液状化し、有機溶媒又は熱水で抽出する。有機溶媒としては、メタノール
、エタノール、ブタノール等のアルコール；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエステル；アセトン、メチルイソブチルケトン等のケトン；ジエチルエーテル、石油エーテル等のエーテル；ヘキサン、シクロヘキサン、トルエン、ベンゼン等の炭化水素；四塩化炭素、ジクロロメタン、クロホルム等のハロゲン化炭化水素；ピリジン等の複素環化合物、エチレングリコール等のグリコール；ポリエチレングリコール等のポリアルコール；アセトニトリル等のニトリル溶媒、及びこれらの溶媒の混合液等が挙げられる。また、これらの溶媒は無水であってもよく、含水状態であってもよい。これらの溶媒の中では、特に、酢酸エチル／ブタノール混合液（３：１）、若しくはクロロホルム／メタノール混合液（２：１）が好ましい。
【００１６】
抽出方法としては、通常の植物成分の抽出に用いられる方法を用いることができる。通常、新鮮な植物又は乾燥植物１質量部に対し、有機溶媒１〜３００質量部を用いて、撹拌又は振盪しながら、溶媒の沸点以下の温度で加熱還流するか、常温で超音波抽出する方法が挙げられる。抽出液は、濾過又は遠心分離等の適当な方法により、不溶物を分離して粗抽出物を得ることができる。
【００１７】
また、アロエ抽出物の製造は、超臨界抽出法により行うことも好ましい。
具体的には、前記植物の好ましくは葉皮を含まない葉肉（透明ゲル）部分を、凍結乾燥又は熱風乾燥して調製した粉末アロエベラ葉肉から、超臨界抽出法によって製造する（国際公開第２００７／６０９１１号参照）。抽出溶媒は、超臨界プロパン、超臨界エチレン、超臨界１，１，１，２−テトラフルオロエタンを用いてもよいが、抽出物を飲食品や医薬品の態様にする際の安全性の観点から超臨界二酸化炭素が好ましい。抽出温度は、２８℃〜１２０℃の温度範囲で適宜選択することができるが、抽出効率を改善し、かつアントラキノン系化合物の含有を抑制する観点から５０〜６９℃の範囲が好ましく、５０〜５９℃の範囲がさらに好ましい。抽出時の圧力は、５．５〜６０ＭＰａの範囲で適宜選択することができるが抽出効率を改善し、かつアントラキノン系化合物の含有を抑制する観点から１５〜６０Ｍｐａの範囲が好ましく、１５〜２４Ｍｐａの範囲がさらに好ましい。抽出時間は、５０〜７０分間とすることが好ましい。また、アントラキノン系化合物の含有量を少なくする観点からは、エントレーナーを使用しないことが好ましい。
【００１８】
抽出物は、各種クロマトグラフィー、例えば順相又は逆相のシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、精製することができる。順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーにおいては、溶出溶媒としてクロロホルム／メタノール混合液のグラジエントを用いると、クロロホルム：メタノール＝２５：１程度で後述の化合物１や化合物２が溶出される。また、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーにおいては、溶出溶媒としてヘキサン／酢酸エチル混合液（４：１）を用いると、化合物１や化合物２は最初の方のフラクションとして溶出される。
得られたフラクションは、さらにＨＰＬＣ等により精製することができる。
また、抽出物は凍結乾燥等により粉末状としてもよい。
【００１９】
このようにして製造されたアロエ抽出物には、シクロラノスタン骨格を有する化合物（化合物１）やロフェノール骨格を有する化合物（化合物２）が含有される（特許第３９０５９１３号公報、特許第３９２４３１０号公報等を参照されたい）。
【００２０】
ロフェノール化合物（化合物１）は、以下の一般式（１）で表される。
【００２１】
【化１】
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【００２２】
一般式（１）中、Ｒ１は、炭素数５〜１６の直鎖若しくは分岐鎖状のアルキル基、又は２重結合を１つ若しくは２つ含むアルケニル基である。また、前記アルキル基又はアルケニル基は、１又は２の水素原子がヒドロキシル基及び／又はカルボニル基に置換された置換アルキル基又は置換アルケニル基であってもよい。
また、Ｒ２及びＲ３は各々独立に水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基である。ここで、前記炭素原子数１〜３のアルキル基としては、メチル基、エチル基等が好ましく、メチル基が特に好ましい。また、前記アルキル基は、少なくとも１の水素原子がヒドロキシル基及び／又はカルボニル基に置換された置換アルキル基であってもよく、具体的には以下の式で表される基が挙げられる。
【００２３】
【化２】
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【００２４】
また、Ｒ４は環を構成する炭素原子とともにＣ＝Ｏを形成する基、−ＯＨ、及び−ＯＣＯＣＨ３の何れかである。
【００２５】
前記一般式（１）中、Ｒ１は、下記式で表される基の何れかであることが好ましい。
【００２６】
【化３】
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【００２７】
また、前記一般式（１）中、Ｒ２及びＲ３の一方が水素原子であり、他方がメチル基であることが好ましく、Ｒ４が水酸基であることが好ましい。
【００２８】
化合物１として、好ましくは、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オールが挙げられる。各化合物は、それぞれ、以下の式で表される構造を有する。
【化４】
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【００２９】
【化５】
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【００３０】
【化６】
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【００３１】
化合物１は、アロエ抽出物から取得するほか、公知の製造方法に準じて化学的に製造することができる。
例えば、Ｖｉｔａｌｉ Ｍａｔｙａｓｈ ｅｔ．ａｌ．， ＰＬＯＳ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｖｏｌｕｍｅ ２， Ｉｓｓｕｅ １０, ｅ２８０, ２００４に記載されたサプリメントデータに準じて、合成することが可能である。
【００３２】
また、化合物１は、医薬に許容される塩であってもよい。医薬に許容される塩として、金属塩（無機塩）と有機塩との両方が含まれ、それらのリストは「レミントン・ファーマシューティカル・サイエンシーズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１７版、１９８５年、第１４１８貢」に掲載されているものが例示される。
具体的には塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、及び臭化水素酸塩などの無機酸塩
や、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩、サリチル酸塩、及びステアリン酸塩などの有機酸塩が非限定的に含まれる。
また、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等の金属の塩、リジン等のアミノ酸との塩とすることもできる。また、前記化合物若しくはその医薬に許容される塩の水和物等の溶媒和物も使用できる。
【００３３】
シクロラノスタン化合物（化合物２）は、以下の一般式（２）で表される。
【００３４】
【化７】
2020156444.tif 000009
【００３５】
一般式（２）中、Ｒ５は、炭素数６〜８の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基、２重結合を１つ又は２つ含むアルケニル基である。また、前記アルキル基又はアルケニル基は、１又は２の水素原子がヒドロキシル基及び／又はカルボニル基に置換された置換アルキル基又は置換アルケニル基であってもよい。
また、Ｒ６及びＲ７は各々独立に水素原子又はメチル基である。また、Ｒ８は環を構成する炭素原子とともにＣ＝Ｏを形成する基、又は下記の基の何れかである。
【００３６】
【化８】
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【００３７】
前記一般式（２）中、Ｒ５は、下記式で表される基の何れかであることが好ましい。
【００３８】
【化９】
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【００３９】
また、前記一般式（２）中、Ｒ６及びＲ７の一方が水素原子であり、他方がメチル基であることが好ましく、Ｒ８が水酸基であることが好ましい。
【００４０】
化合物２としては、好ましくは、９，１９−シクロラノスタン−３−オール、及び２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オールが挙げられる。各化合物は、それぞれ、以下の式で表される構造を有する。
【００４１】
【化１０】
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【化１１】
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【００４２】
化合物２は、アロエ抽出物から取得するほか、公知の製造方法に準じて化学的に製造することができる。例えば、２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オール（慣用名：２４−メチレンシクロアルタノール）は、特開昭５７−０１８６１７号公報や国際公開第２０１２／０２３５９９号（γ−オリザノールから合成する方法）に開示される方法にて製造することが可能である。また、化合物２は、特開２００３−２７７２６９号公報に開示される方法にて、シクロアルテノールフェルレートの加水分解物を出発物質として製造することが可能である。
【００４３】
【化１２】
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【００４４】
また、化合物２は、医薬に許容される塩であってもよい。このような塩は化合物１について例示したものと同様である。
【００４５】
本発明の組成物は、化合物１の１種又は２種以上、及び化合物２の１種又は２種以上から、１種又は２種以上を選択される化合物を有効成分として含有する。有効成分は、化合物１又は化合物２のいずれか単独であっても化合物１及び化合物２の混合物であってもよく、化合物１及び化合物２の混合物がより好ましい。すなわち、好ましい態様において、有効成分は、化合物１の１種又は２種以上と、化合物２の１種又は２種以上とを含有する。
【００４６】
化合物１又は化合物２を単独で用いる場合としては、化合物１（主に、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、若しくは４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール）、又は化合物２（主に、９，１９−シクロラノスタン−３−オール、若しくは２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オール）の何れかであることが好ましい。
これらのうち、溶解性等の物性の観点から、化合物１としては４−メチルコレスト−７−エン−３−オールが特に好ましく、化合物２としては９，１９−シクロラノスタン−３−オールが特に好ましい。
また、化合物１と化合物２を対比した場合では、化合物１（主に、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、又は４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール）であることがより好ましい。
【００４７】
本発明の組成物は、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール、９，１９−シクロラノスタン−３−オール、及び２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オールからなる群から選択される１種又は２種以上の化合物を有効成分として含有することが好ましい。
【００４８】
本発明の組成物における前記化合物の含有量は、投与目的等に応じて適宜選択することができるが、総量で、好ましくは少なくとも０．００００１質量％以上、より好ましくは少なくとも０．０００１質量％以上、さらに好ましくは少なくとも０．０００５質量％以上、特に好ましくは少なくとも０．００１質量％以上である。また本発明の組成物における当該量の上限は特に制限されないが、総量で、９０質量％以下、好ましくは７０質量％以下、より好ましくは５０質量％以下が例示される。
【００４９】
化合物１及び化合物２の両者を組み合わせる場合（化合物１と化合物２との混合物）において、化合物１及び化合物２の質量比（化合物１：化合物２）は、好ましくは５：１〜１：５、さらに好ましくは３：１〜１：３、特に好ましくは２：１〜１：２の範囲である
。
【００５０】
たとえば、天然の植物に含まれる例として、アロエベラ中には、化合物１（主に、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール）、並びに化合物２（主に、９，１９−シクロラノスタン−３−オール、及び２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オール）が含まれていることが知られている。
【００５１】
そのため、アロエベラ抽出物を本発明の組成物の有効成分とする場合、あるいはアロエベラを原料として化合物１及び化合物２の混合物を得て本発明の組成物の有効成分とする場合は、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、若しくは４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール（化合物１）の何れか、又は９，１９−シクロラノスタン−３−オール、若しくは２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オール（化合物２）の何れかを含み、化合物１：化合物２を、５：１〜１：５、好ましくは３：１〜１：３、特に好ましくは２：１〜１：２の質量比で含む組成物とすることができる。
【００５２】
本発明の組成物におけるアロエ抽出物の含有量は、組成物の態様により適宜設定すればよく、特に限定されないが、例えば、好ましくは固形物量として、組成物全体の０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上とするのがよい。アロエ抽出物の含有量の上限は特に制限されないが、例えば組成物全体の５質量％以下、又は１００質量％以下であってよい。なお、これらの含有量は、本発明の組成物の製造時の値、流通時の値、及び摂取（投与）時の値を含む。
【００５３】
本発明の組成物は、酪酸菌用プレバイオティクスとして用いられる。すなわち、腸内の酪酸菌により資化されその増殖を促進させることができる。
【００５４】
なお、酪酸菌とは、酪酸を産生する細菌の総称である。本発明における酪酸菌は、特に限定されないが、例えばフィーカリバクテリウム属、コプロコッカス属、クロストリジウム属、ユーバクテリウム属、ゲンミゲル属等に属する細菌が挙げられ、より具体的にはヒト腸内に存在する、フィーカリバクテリウム・プラスニッチ、ゲンミゲル・フォルミシリス等が挙げられる。
【００５５】
なお、腸内で酪酸菌を増殖させることができること、すなわち酪酸菌により資化されることは、佐々木らの方法（Sasaki K. et al., PLoS ONE 12(7): e0180991）や、次の評価方法により確認することができる。
具体的には、試料を含有する培地中で腸内細菌を中和培養する培養工程、及び前記培養工程後の培地中の細菌叢の構成を解析する解析工程を含む方法により評価する。
被験試料（素材）がヒト小腸で通常吸収される糖類を含む場合は、前記培養工程の前に被験試料から分子量６６６．５８以下の糖類を除去する前処理工程を行うことが好ましい。前記前処理工程は、好ましくはエタノール沈殿により行われる。該前処理工程により被験試料（素材）からヒト小腸で通常吸収される糖類、すなわち分子量６６６．５８以下の糖類を予め除き、ヒト小腸で通常吸収されず大腸に到達する糖類を中和培養に供することにより、プレバイオティクスのヒト大腸での酪酸菌への影響を正確に感度よく評価することができる。なお、分子量６６６．５８以下の糖類としては、ニストース、ケストース、シュークロース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース等が挙げられる。
【００５６】
前記中和培養工程は、ｐＨ＞５．５、より好ましくは＞６．０の条件下で行われる。好ましくは、培養を通してｐＨが好ましくは５．５以下にならないように、より好ましくは
６．０以下にならないように、炭酸ナトリウム等の適当な中和剤を間欠的に添加する等して制御される。また、中和培養に用いる培地は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース等の小腸で吸収される糖類を実質的に含有しない限りにおいて特に限定されず、例えば糖類を含有しないＹＣＦＡ培地が挙げられる。ここで、実質的に含有しないとは、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）である。
前記試料の培地への添加量としては、培養を妨げない限りにおいて任意に設定でき、例えば０．１〜５％（ｗ／ｖ）とすることができる。
中和培養は、通常は嫌気条件下で行われる。
また、培養時間は、好ましくは１２時間以上、より好ましくは２４時間以上とし、通常は９６時間以下、より好ましくは４８時間以下とする。
【００５７】
解析工程では、培養工程後の培地中の細菌叢の構成を解析する。例えば、シークエンス解析により腸内細菌を同定し、その存在量の割合を算出することにより解析を行う。ここで、培養前後で酪酸菌が増殖し、かつ酪酸菌の割合が通常は１５％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上に維持されている場合に、被験試料は酪酸菌の増殖を促進するプレバイオティクスであると判断される。
【００５８】
本発明の組成物は、体内の酪酸が増加することにより予防又は改善しうる疾患や病態、あるいは体内の酪酸が減少することに起因する疾患や病態の対象者に対して、有用となり得る。例えば、整腸用、免疫調節用、酸化ストレス低減用、又は下痢の予防・改善用、炎症性腸疾患用、大腸がんの予防用等とすることができる。
【００５９】
本発明の別の態様は、酪酸菌用プレバイオティクス組成物の製造における、アロエ抽出物、シクロラノスタン骨格を有する化合物、及び／又はロフェノール骨格を有する化合物の使用である。
本発明の別の態様は、腸内での酪酸菌の増殖における、アロエ抽出物、シクロラノスタン骨格を有する化合物、及び／又はロフェノール骨格を有する化合物の使用である。
本発明の別の態様は、腸内で酪酸菌を増殖させるために用いられる、アロエ抽出物、シクロラノスタン骨格を有する化合物、及び／又はロフェノール骨格を有する化合物である。
アロエ抽出物、シクロラノスタン骨格を有する化合物、及び／又はロフェノール骨格を有する化合物を動物に投与することを含む、腸内で酪酸菌を増殖させ方法である。ここで、動物は、特に限定されないが、通常はヒトである。
【００６０】
本発明の組成物の摂取（投与）時期は、特に限定されず、投与対象の状態に応じて適宜選択することが可能である。
【００６１】
本発明の組成物の摂取（投与）量は、摂取（投与）対象の年齢、性別、状態、その他の条件等により適宜選択される。アロエ抽出物の固形物量として、好ましくは０．１〜１０００ｍｇ／日、より好ましくは、１〜１００ｍｇ／日の範囲となる量を目安とするのがよい。あるいは、シクロラノスタン骨格を有する化合物及び／又はロフェノール骨格を有する化合物の総量として、好ましくは０．０００１〜１００ｍｇ／日、より好ましくは、０．００１〜５０ｍｇ／日、特に好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／日の範囲を目安とする。
なお、摂取（投与）の量や期間にかかわらず、組成物は１日１回又は複数回に分けて投与することができる。
【００６２】
本発明の組成物の摂取（投与）経路は、経口又は非経口のいずれでもよいが、通常は経口である。また、非経口摂取（投与）としては、直腸投与等が挙げられる。
【００６３】
本発明の組成物は、アロエ抽出物、シクロラノスタン骨格を有する化合物、及び／又はロフェノール骨格を有する化合物とともに、酪酸菌を含有する態様でもよい。また、本発明の組成物は、酪酸菌又は酪酸菌を含有する製剤と併用して摂取されてもよい。かかる態様により、腸内における酪酸菌増殖促進効果、及びそれによる酪酸増加効果がより期待できる。
なお、これらの態様の場合、酪酸菌は生菌であることが好ましい。
【００６４】
本発明の組成物を経口摂取される組成物とする場合は、飲食品の態様とすることが好ましい。
【００６５】
飲食品としては、アロエ抽出物、シクロラノスタン骨格を有する化合物、及び／又はロフェノール骨格を有する化合物の効果を損なわず、経口摂取できるものであれば形態や性状は特に制限されず、アロエ抽出物、シクロラノスタン骨格を有する化合物、及び／又はロフェノール骨格を有する化合物を含有させること以外は、通常飲食品に用いられる原料を用いて通常の方法によって製造することができる。
【００６６】
飲食品としては、液状、ペースト状、ゲル状固体、粉末等の形態を問わず、例えば、錠菓；流動食（経管摂取用栄養食）；パン、マカロニ、スパゲッティ、めん類、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等の小麦粉製品；即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品、その他の即席食品等の即席食品類；農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）等の農産加工品；水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等の水産加工品；畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等の畜産加工品；加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等の乳・乳製品；バター、マーガリン類、植物油等の油脂類；しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等の基礎調味料；調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等の複合調味料・食品類；素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等の冷凍食品；キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、ゼリー、その他の菓子などの菓子類；炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等の嗜好飲料類、ベビーフード、ふりかけ、お茶漬けのり等のその他の市販食品等；育児用調製粉乳；経腸栄養食；機能性食品（特定保健用食品、栄養機能食品）等が挙げられる。
【００６７】
また、飲食品の一態様として飼料とすることもできる。飼料としては、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。
飼料の形態としては特に制限されず、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、マイロ等の穀類；大豆油粕、ナタネ油粕、ヤシ油粕、アマニ油粕等の植物性油粕類；フスマ、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類；魚粉、脱脂粉乳、ホエイ、イエローグリース、タロー等の動物性飼料類；トルラ酵母、ビール酵母等の酵母類；第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油脂類；単体アミノ酸；糖類等を含有するものであってよい。
【００６８】
本発明の組成物が飲食品（飼料を含む）の態様である場合、酪酸菌用プレバイオティクスであることや腸内の酪酸菌を増殖させるという用途が表示された飲食品として提供・販売されることが可能である。
【００６９】
かかる「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、前記用途を想起・類推させうるような表現であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、全て本発明の「表示」行為に該当する。
また、「表示」は、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装に前記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為等が挙げられる。
【００７０】
一方、表示内容としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示等）であることが好ましい。また、そのような表示内容を、包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ等の販売現場における宣伝材、その他の書類等へ付することが好ましい。
【００７１】
また、「表示」には、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、医薬用部外品等としての表示も挙げられる。この中でも特に、消費者庁によって認可される表示、例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、若しくは機能性表示食品に係る制度、又はこれらに類似する制度にて認可される表示等が挙げられる。具体的には、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク減少表示、科学的根拠に基づいた機能性の表示等を挙げることができ、より具体的には、健康増進法に規定する特別用途表示の許可等に関する内閣府令（平成二十一年八月三十一日内閣府令第五十七号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）及びこれに類する表示が典型的な例である。
かかる表示としては、例えば、「酪酸菌を増やしたい方」、「フィーカリバクテリウム属細菌を増やしたい方」、「酪酸で整腸作用」等と表示することが挙げられる。
【００７２】
本発明の組成物は、医薬品の態様とすることもできる。
医薬品の投与経路は、経口又は非経口のいずれでもよいが経口が好ましい。また、非経口摂取（投与）としては、直腸投与等が挙げられる。
医薬品の形態としては、投与方法に応じて、適宜所望の剤形に製剤化することができる。例えば、経口投与の場合、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等に製剤化することができる。また、非経口投与の場合、座剤、軟膏剤、注射剤等に製剤化することができる。
製剤化に際しては、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤等の成分を用いることができる。また、他の薬効成分や、公知の又は将来的に見出されるプレバイオティクスなどを併用することも可能である。
加えて、製剤化は剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。
【００７３】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられる。
【００７４】
結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マクロゴール等が挙げられる。
【００７５】
崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。
【００７６】
滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ピーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩類；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。
【００７７】
安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられる。
【００７８】
矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。
なお、経口投与用の液剤の場合に使用する担体としては、水等の溶剤等が挙げられる。
【００７９】
本発明の医薬品を摂取するタイミングは、例えば食前、食後、食間、就寝前など特に限定されない。
【実施例】
【００８０】
以下に実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８１】
＜製造例１＞
（１）超臨界抽出法によるアロエベラ抽出物の調製
アロエベラ６０kgについて、葉皮を剥き取って葉肉部分を回収し、回収した葉肉部分を凍結乾燥してアロエベラ葉肉粉末３００ｇを調製した。次いで、調製したアロエベラ葉肉粉末２０ｇを用いて超臨界抽出法により抽出を行った。超臨界抽出は、日本分光社製CO2 delivery pump(SCF-GET)、PU-2080 pump(PU-2080 plus)、Back Pressur Regulator(SCF-BPG)、及び東洋高圧社製ブランジを用い、抽出溶媒として炭酸ガスを使用した。抽出条件は、温度５０℃、圧力１５ＭＰａ、６０分間として、アロエベラ抽出物３３．０ｍｇを得た。
LC-MS(島津製作所社製)を使用し、内部標準物質としてブラシカステロール(和光純薬工業社製)を用いて、ロフェノール化合物、シクロラノスタン化合物、及びアントラキノン系化合物の含有量を測定した。アロエベラ抽出物３３．０ｍｇ中、ロフェノール化合物である４−メチルコレスト−７−エン−３−オールは０．０６０ｍｇ、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オールは０．０５２ｍｇ、及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オールは０．０５３ｍｇ含まれ、シクロラノスタン化合物である９，１９−シクロラノスタン−３−オールは０．１４４ｍｇ、及び２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オールは０．１０７ｍｇ含まれ、アントラキノン系化合物)であるアロエエモジンは０．００００９２４ｍｇ含まれていた。
【００８２】
＜試験例１＞ｉｎ ｖｉｔｒｏでの酪酸菌増殖確認試験
（１）被験試料の前処理
被験試料としては、アロエベラゲルパウダー（ＡＶＧＰ、森永乳業株式会社製）及び製造例１のアロエ抽出物を用い、以下のように調製した。
ＡＶＧＰ５ｇ及びアロエ抽出物５ｇをそれぞれ、５０ｍＬの９９．５％エタノール（Ｗａｋｏ社０５０−００４４６）で溶解した。その後×１，３００ｇで１０分間遠心、上清を除去し、次いで９９．５％エタノールを４５ｍＬ加え混和し、×１，３００ｇで１０分間遠心した。再度上清を除去し、沈殿物を凍結乾燥させて各粉末を得た。これを０．１％(w/v)になるようＭｉｌｌｉＱ水に溶解後、０．２２μｍフィルター（メルクミリポア社製）を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
市販のイヌリン（フジ日本精糖株式会社製）１０ｇを１００ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に溶解後、約１５ｍＬずつ遠心チューブ（ＦＡＬＣＯＮ社３５２０７０）に分注し、３０ｍＬの９９．５％エタノール（Ｗａｋｏ社０５０−００４４６）を加え、混和した。その後×１，３００ｇで１０分間遠心、上清を除去し、次いで９９．５％エタノールを４５ｍＬ加え混和し、×１，３００ｇで１０分間遠心した。再度上清を除去し、沈殿物を凍結乾燥させ合計８．７ｇの粉末を得た。これを０．１％(w/v)になるようＭｉｌｌｉＱ水に溶解後、０．２２μｍフィルター（メルクミリポア社製）を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
市販の純ココア（森永製菓社製）４００ｇを２０００ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に溶解後、２時間煮沸した。その後約１５ｍＬずつ遠心チューブ（ＦＡＬＣＯＮ社３５２０７０）に分注し、３０ｍＬの９９．５％エタノール（Ｗａｋｏ社０５０−００４４６）を加え、混和した。その後×１，３００ｇで１０分間遠心、上清を除去し、次いで９９．５％エタノールを４５ｍＬ加え混和し、×１，３００ｇで10分間遠心した。再度上清を除去し、沈殿物を凍結乾燥させ合計１４．３ｇの粉末を得た。これを０．１％(w/v)になるようＭｉｌｌｉＱ水に溶解後、０．２２μｍフィルター（メルクミリポア社製）を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
難消化性デキストリンであるパインファイバー（松谷化学社製）は、小腸で吸収されないため、前処理を行わず以下の中和培養に供した。
【００８３】
（２）中和培養
糖を含有しないＹＣＦＡ培地を１００ｍＬ作成し、ｐＨコントロール可能な培養装置Ｂｉｏ Ｊｒ．８（株式会社バイオット社製ＢＪＲ−２５ＮＡ１Ｓ−８Ｍ）のベッセルに入れ、（１）で前処理した各被験試料を１ｇ添加した。また、陰性対象として、被験試料を添加しない培地も用意した。各培地をベッセルごと、１１５℃２０分間のオートクレーブ処理にかけた。その後、無菌的にフィルター滅菌処理したビタミン液とシステイン液を添加し、被験試料の終濃度が１％（ｗ／ｖ）となる培養液を調製した。その後、窒素置換を一晩行うことで嫌気状態とし、生理食塩水で１０％（ｗ／ｖ）に予め調整しておいた糞便溶液１００μＬを添加し、ｐＨが６以下にならないよう１ＭのＮａ２ＣＯ３液でコントロールしながら２４時間３７℃で嫌気培養を行った。
なお、前記糞便は、通常の食餌を継続している健康なヒト（４０歳代男性１名、３０歳代男性２名、２０歳代男性２名、及び３０歳代女性１名）から提供されたものである。
陰性対照とした。
【００８４】
（３）腸内細菌の解析
前記（２）における２４時間培養後の培養液を１ｍＬ採取し、１５，０００ｇで１０分間遠心して沈殿を得た。前記沈殿を、４５０μＬの抽出液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ, ４ｍＭ ＥＤＴＡ, ｐＨ９．０）に懸濁した後、１０％ＳＤＳ溶液５０μＬ、０．１ｍｍ径のガラスビーズ３００ｍｇ、５００μＬのＴＥ飽和フェノール（和光純薬）と混合し、ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ １００Ａ（フナコシ社製）にてパワーレベル５、３０秒の破砕処理を行った。次いで、１４，０００ｇで５分間遠心後４００μＬの上清を取り、２５０μＬのフェノール・クロロホルム溶液（和光純薬）を加えて混合し、１４，０００ｇで５分間遠心後、２５０μＬの上清を取得した。さらに２−プロパノールを２５０μＬ加え
て得た沈殿を２００μＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ８．０）で溶解し、鋳型ＤＮＡ溶液とした。
【００８５】
次に細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の第３〜４可変領域を増幅させるための１ｓｔプライマーセット（配列番号１及び２）と、次世代シーケンサーMiseq （イルミナ社製）にて解析するために必要な２ｎｄプライマーセット（配列番号３及び４、なおｎは１度の解析で複数サンプルを処理するための任意の塩基配列（インデックス領域））を設計し、Life
Technologies社のオリゴプライマー作成サービスによりプライマーを合成した。
鋳型ＤＮＡ溶液および１ｓｔプライマーセットを含む総液量を２５μＬとした反応液をＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて調製した。Ｖｅｒｉｔｉ ２００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により、９４℃３分の後、９４℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃３０秒を２０回、７２℃１０分のＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動し、バンドパターンを確認した。続いて得られたＰＣＲ産物１μＬを鋳型とし、２ｎｄプライマーセットを用いて上述した条件と同様にＰＣＲを実施した。ただしＰＣＲのサイクル数は２０回ではなく１５回とした。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動し、バンドパターンを確認後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ９６ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて精製を行い、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて濃度を測定した。同濃度のＤＮＡ溶液を混合したものをＭｉｓｅｑ ｖ２ Ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（イルミナ社製）に供し、Ｍｉｓｅｑにてシークエンス解析を実施した。
【００８６】
得られたペアエンド配列をＱＩＩＭＥ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）(http://qiime.org/)にて腸内細菌叢の構成を解析し、その中の最優勢酪酸菌（フィーカリバクテリウム・プラスニッチ）及び別の酪酸菌（ゲンミゲル・フォルミシリス）の腸内細菌全体に占める割合をそれぞれ算出し、全被験者の平均を求めた。
【００８７】
図１にフィーカリバクテリウム・プラスニッチの腸内細菌全体に占める割合を示す。ＡＶＧＰ又はアロエ抽出物の存在下では、既知の酪酸菌の増加が報告されているイヌリンや、高カカオチョコと類似の組成を有する純ココア存在下に比べて、酪酸菌が増殖したことが認められた。
【００８８】
（４）酪酸濃度の測定
前記（２）における２４時間培養後の培養上清を４０μＬ用いて、以下の測定を実施した。
サンプルのラベル化はラベル化試薬ＦＡキット（ＹＭＣ）を用いて行い、Ｎａｎｏ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌｕｎｇｅｒ ｗ（ＴＨＯＭＳＯＮ）を用いて濾過し、ＨＰＬＣ測定に供した。
酪酸の測定にはａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ（ｗａｔｅｒｓ）及びＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＦＡカラム（ＹＭＣ）を用いた。移動相Ａはメタノール、移動相Ｃは０．１％ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液、移動相Ｄは０．１％ ＴＦＡを溶解したアセトニトリル液を用いた。グラジエントプログラムは、（ｉ）０〜５分：移動相Ａ １６％、移動相Ｃ ７９％、移動相Ｄ ５％、（ｉｉ）５〜３０分：移動相Ａ １６％、移動相Ｃ ５４％、移動相Ｄ ３０％、（ｉｉｉ）３０〜３５分：移動相Ａ １６％、移動相Ｃ ７９％、移動相Ｄ ３０％、（ｉｖ）３５〜４０分：移動相Ａ １６％、移動相Ｃ ７９％、移動相Ｄ ５％、（ｖ）４０〜４５分：移動相Ａ １６％、移動相Ｃ ７９％、移動相Ｄ ５％と５段階でプログラムした。流速は１．００ ｍＬ／ｍｉｎ、カラムオーブン温度は５０℃に設定した。蛍光検出器を用いて吸光２３０ ｎｍで測定した。
【００８９】
図２に酪酸濃度の測定結果を示す。接種した糞便に比べて、ＡＶＧＰを添加して中和培
養した後の培養溶液では酪酸濃度の増加が認められた。
【図１】
2020156444.tif 000015
【図２】
2020156444.tif 000016
【配列表】
2020156444000001.app