(57)【要約】      （修正有）【課題】対象における神経損傷又は神経損傷を減少させるために使用しうるアミロライド及び／又はアミロライド類似体を含む組成物の提供。【解決手段】アミロライド類似体又はその薬学的に許容される塩を含む、成人ヒト対象の中枢神経系における神経損傷を減少させるための医薬組成物であって、該アミロライド類似体は、フェナミル、ベプリジル、５−（Ｎ−メチル−Ｎ−イソブチル）アミロライド、５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）アミロライド及び５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライド塩酸塩からなる群より選択され、虚血性イベントの発症の５時間以内に静脈内に投与され、神経損傷がアシドーシス誘導性の神経損傷である、前記医薬組成物。【選択図】図２０
2020079289.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロライド類似体又はその薬学的に許容される塩を含む、成人ヒト対象の中枢神経系における神経損傷を減少させるための医薬組成物であって、該アミロライド類似体は、フェナミル、ベプリジル、５−（Ｎ−メチル−Ｎ−イソブチル）アミロライド、５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）アミロライド及び５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライド塩酸塩からなる群より選択され、
虚血性イベントの発症の５時間以内に静脈内に投与され、神経損傷がアシドーシス誘導性の神経損傷である、前記医薬組成物。
【請求項２】
アミロライド類似体又はその薬学的に許容される塩が体重１Ｋｇあたり０．１ｍｇ〜１０ｍｇの用量範囲で与えられる、請求項１記載の前記医薬組成物。
【請求項３】
虚血性イベントの発症の１時間以内に投与される、請求項１記載の前記医薬組成物。
【請求項４】
虚血性イベントの発症の１〜５時間以内に投与される、請求項１記載の前記医薬組成物。
【請求項５】
神経損傷が脳損傷である、請求項１記載の前記医薬組成物。
【請求項６】
アミロライド類似体又はその薬学的に許容される塩が体重１Ｋｇあたり０．１ｍｇ〜３０ｍｇの用量範囲で与えられる、請求項１記載の前記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、神経学の分野に関する。特に、本願は、対象における神経損傷又は神経系損傷を減少させるために使用しうるアミロライド及び／又はアミロライド類似体を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経損傷は、神経系に対する化学的損傷及び物理的損傷などの多くの症状に起因し得る。多くのタイプの神経損傷は、神経細胞へのイオン流入の変化をもたらし、それにより、神経細胞死を引き起こす。したがって、様々なイオンチャンネルが、このイオン流量の変化に介在する候補となり、その結果、神経損傷の程度を減少し得る。
【発明の概要】
【０００３】
本願の一つの態様は、対象における神経損傷を減少させるための方法に関する。本方法は、アミロライド及びアミロライド類似体からなる群より選択される活性成分を含む治療的有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、静脈内、鞘内又は脳室内に投与される。
【０００４】
いくつかの実施形態において、活性成分はアミロライド又はその薬学的に許容される塩を含む。
【０００５】
その他の実施形態において、活性成分はアミロライド類似体又はその薬学的に許容される塩を含む。関連する実施形態において、アミロライド類似体は、ベンザミル、フェナミル（ｐｈｅｎｍｉｌ）、５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソブチル）−アミロライド（ＥＩＰＡ）、ベプリジル、ＫＢ−Ｒ７９４３、５−（Ｎ−メチル−Ｎ−イソブチル）アミロライド、５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）アミロライド及び５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライド塩酸塩からなる群より選択される。別の関連する実施形態において、アミロライド類似体はベンザミルである。別の関連する実施形態において、アミロライド類似体はベンザミルのメチル化類似体である。別の関連する実施形態において、アミロライド類似体はグアニジン基上に形成される１個の環を含む。別の関連する実施形態において、アミロライド類似体はアシルグアニジノ基を含む。別の関連する実施形態において、アミロライド類似体は、グアニジン基上に形成される水溶性基を含み、この水溶性基は、Ν，Ν−ジメチルアミノ基又は糖基である。
【０００６】
いくつかの実施形態において、アミロライド、アミロライド類似体又はその薬学的に許容される塩は、体重１Ｋｇあたり０．１ｍｇ〜１０ｍｇの用量範囲で与えられる。
【０００７】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、虚血性イベントの発症の１時間以内、虚血性イベントの発症の５時間以内、又は虚血性イベントの発症の１〜５時間以内に投与される。
【０００８】
いくつかの実施形態において、神経損傷は脳損傷である。
【０００９】
本願の別の態様は、対象における脳損傷を処置するための方法に関する。本方法は、アミロライド、アミロライド類似体、又はその薬学的に許容される塩を含む治療的有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、静脈内、鞘内又は脳室内に投与される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、アミロライド類似体は、ベンザミル、フェナミル（ｐｈｅｎｍｉｌ）、ＥＩＰＡ  ベプリジル、ＫＢ−Ｒ７９４３、５−（Ｎ−メチル−Ｎ−イソブチル）アミロライド、５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）アミロライド及び５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライド塩酸塩からなる群より選択される。関連する実施形態において、アミロライド類似体はベンザミルである。その他の実施形態において、アミロライド類似体は、ベンザミルのメチル化類似体、グアニジン基上に形成される１個の環を含むアミロライド類似体、アシルグアニジノ基を含むアミロライド類似体、及びグアニジン基上に形成される水溶性基を含み、この水溶性基が、Ν，Ν−ジメチルアミノ基又は糖基であるアミロライド類似体からなる群より選択される。
【００１１】
本願の別の態様は、神経細胞へのイオン流入の変化により引き起こされる神経系損傷を減少させるための方法に関する。本方法は、アミロライド、アミロライド類似体、又はその薬学的に許容される塩を含む治療的有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、静脈内、鞘内、脳室内又は筋肉内に投与される。
【００１３】
その他の実施形態において、アミロライド類似体は、ベンザミル、フェナミル（ｐｈｅｎｍｉｌ）、ＥＩＰＡ  ベプリジル、ＫＢ−Ｒ７９４３、５−（Ｎ−メチル−Ｎ−イソブチル）アミロライド、５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）アミロライド及び５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライド塩酸塩からなる群より選択される。関連する実施形態において、アミロライド類似体はベンザミルである。その他の実施形態において、アミロライド類似体は、ベンザミルのメチル化類似体、グアニジン基上に形成される１個の環を含むアミロライド類似体、アシルグアニジノ基を含むアミロライド類似体、及びグアニジン基上に形成される水溶性基を含み、この水溶性基が、Ν，Ν−ジメチルアミノ基又は糖基であるアミロライド類似体からなる群より選択される。
【００１４】
本願の別の態様は、神経系損傷を減少させるための方法に関する。本方法は、アミロライド、アミロライド類似体、又はその薬学的に許容される塩を含む治療的有効量の医薬組成物をかかる処置を必要とする対象に投与することを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、静脈内、鞘内、脳室内又は筋肉内に投与される。
【００１６】
その他の実施形態において、アミロライド類似体は、ベンザミル、フェナミル（ｐｈｅｎｍｉｌ）、ＥＩＰＡ  ベプリジル、ＫＢ−Ｒ７９４３、５−（Ｎ−メチル−Ｎ−イソブチル）アミロライド、５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）アミロライド及び５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライド塩酸塩からなる群より選択される。関連する実施形態において、アミロライド類似体はベンザミルである。その他の実施形態において、アミロライド類似体は、ベンザミルのメチル化類似体、グアニジン基上に形成される１個の環を含むアミロライド類似体、アシルグアニジノ基を含むアミロライド類似体、及びグアニジン基上に形成される水溶性基を含み、この水溶性基が、Ν，Ν−ジメチルアミノ基又は糖基であるアミロライド類似体からなる群より選択される。
【００１７】
本願の別の態様は、神経系損傷を減少させるための医薬組成物に関する。本医薬組成物は、有効量のアミロライド、アミロライド類似体又はそれらの薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含み、静脈内、鞘内又は脳室内注入用に製剤化されている。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、アミロライド類似体又はその薬学的に許容される塩を含み、このアミロライド類似体は、ベンザミル、フェナミル（ｐｈｅｎｍｉｌ）、ＥＩＰＡ  ベプリジル、ＫＢ−Ｒ７９４３、５−（Ｎ−メチル−Ｎ−イソブチル）アミロライド、５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）アミロライド及び５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライド塩酸塩からなる群より選択される
【００１９】
その他の実施形態において、本医薬組成物は、アミロライド類似体又はその薬学的に許容される塩を含み、このアミロライド類似体は、ベンザミルのメチル化類似体、グアニジン基上に形成される１個の環を含むアミロライド類似体、アシルグアニジノ基を含むアミロライド類似体、及びグアニジン基上に形成される水溶性基を含み、この水溶性基は、Ν，Ν−ジメチルアミノ基又は糖基であるアミロライド類似体からなる群より選択される。
【００２０】
本願の別の態様は、神経系損傷を減少させるための医薬組成物に関する。本医薬組成物は、有効量のアミロライド類似体又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、有効量のアミロライド、アミロライド類似体又はそれらの薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含み、静脈内、鞘内、脳室内又は筋肉内注入用に製剤化されている。
【００２２】
一つの実施形態において、アミロライド類似体はベンザミルのメチル化類似体である。別の実施形態において、アミロライド類似体はグアニジン基上に形成される１個の環を含む。別の実施形態において、アミロライド類似体はアシルグアニジノ基を含む。さらに別の実施形態において、アミロライド類似体は、グアニジン基上に形成される水溶性基を含み、この水溶性基は、Ν，Ν−ジメチルアミノ基又は糖基である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、虚血状態にある対象における神経損傷を減少させるための典型的な方法を示すフローチャートの図である。
【図２】図２は、虚血状態に関連する神経損傷を処置するための薬物を同定する典型的な方法を示すフローチャートの図である。
【図３】図３は、培養マウス皮質神経細胞における酸感知イオンチャンネル（ＡＳＩＣ）タンパク質の電気生理学及び薬理学に関する典型的なデータを表す一連のグラフである。
【図４】図４は、培養マウス皮質神経細胞におけるＡＳＩＣタンパク質の電気生理学及び薬理学に関する典型的なデータを表す更なる一連のグラフである。
【図５】図５は、本願の教示の態様に従い、虚血モデルがＡＳＩＣタンパク質の活性を促進しうることを示す、典型的なデータを表すグラフとトレースの組み合わせである。
【図６】図６及び７は、皮質神経細胞におけるＡＳＩＣタンパク質がＣａ２＋透過性でありうること、及び、Ｃａ２＋透過性がＡＳＩＣ１ａ依存性でありうることを示す典型的なデータを表すグラフとトレースの組み合わせである。
【図７】同上。
【図８】図８は、酸によるインキュベーションが、ＡＳＩＣを阻害することにより保護されるグルタミン酸受容体非依存性神経損傷を引き起こしうることを示す、典型的なデータを表す一連のグラフである。
【図９】図９は、ＡＳＩＣ１ａがインビトロにおける酸誘導性損傷に関与しうることを示す典型的なデータを表す一連のグラフである。
【図１０】図１０は、ＡＳＩＣ１ａの阻害による、及び、ＡＳＩＣ１遺伝子のノックアウトによる、インビボでの脳虚血における神経保護をデータとともに示す一連のグラフである。
【図１１】図１１は、処置の時間とタイプの関数として、動物モデル系で卒中によって生じる虚血性ダメージのパーセンテージを示す典型的なデータをプロットしたグラフである。
【図１２】図１２は、特徴が示されている様々な典型的なペプチドと一緒に、典型的なシスチンノットペプチド、ＰｃＴｘ１の一次アミノ酸配列の図である。
【図１３】図１３は、図１２のシスチンノットペプチドと、このペプチドの様々な典型的な欠失誘導体とを整列させた比較図である。
【図１４】図１４は、細胞内で発現されたＡＳＩＣファミリーメンバーの関数として、細胞内で計測されるカルシウム電流の大きさをプロットした典型的なグラフである。
【図１５】図１５は、動物モデル系での虚血性損傷を減少させる際におけるＰｃＴｘ毒の経鼻投与の有効性に関する典型的なデータを表すグラフである。
【図１６】図１６は、ベンザミル（パネルＡ）又は５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）アミロライド（ＥＩＰＡ）（パネルＢ）で処理されたＣＨＯ細胞内の代表的なＡＳＩＣ１ａ電流トレースと、アミロライド及びアミロライド類似体（パネルＣ）によってＣＨＯ細胞内で発現されるＡＳＩＣ１ａ電流の用量依存性阻害とを示す複合図である。
【図１７】図１７は、ベンザミル（パネルＡ）又は５−アミロライド（パネルＢ）で処理されたＣＨＯ細胞内の代表的なＡＳＩＣ２電流トレースと、アミロライド及びアミロライド類似体（パネルＣ）によってＣＨＯ細胞内で発現されるＡＳＩＣ２電流の用量依存性阻害とを示す複合図である。
【図１８】図１８は、アミロライド又はアミロライド類似体の脳室内注入によるマウスにおける梗塞容積の減少を示すグラフである。
【図１９】図１９は、ＭＣＡＯの６０分後に生理食塩水又はアミロライドの静脈内注入によるマウスの皮質組織における梗塞容積の減少を示す複合図である。
【図２０】図２０は、ＭＣＡＯの３時間後又は５時間後に生理食塩水又はアミロライドの静脈内注入によるマウスの皮質組織における梗塞容積の減少を示す複合図である。
【図２１】図２１は、様々なチャンネルにおける疎水性アミロライド類似体についての構造活性相関（ＳＡＲ）を示す。
【００２４】
詳細な説明
本願は、神経損傷を減少させるための方法及び組成物を提供する。神経損傷は、変性性神経系疾患、卒中、虚血、外傷、神経系に対する化学的損傷及び物理的損傷に起因しうる。本明細書において使用する場合、用語「中枢神経系（central nervous system）」は、中枢神経系及び末梢神経系の両方を含む。用語「神経系」又は「ＣＮＳ」は、脊椎動物の脳及び脊椎の全ての細胞及び組織を含む。用語「末梢神経系」とは、脳及び脊椎の外側の神経系部分、例えば、随意運動に介在する運動神経、交感神経系及び副交感神経系を含み、不随意機能を制御する自律神経系、並びに、消化管系を制御する腸管神経系など、の全ての細胞及び組織のことをいう。すなわち、用語「神経系」は、限定するものではないが、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、脳脊髄液（ＣＳＦ）内細胞、間質腔内細胞，脊髄保護被覆内細胞、硬膜外細胞（すなわち、硬膜の外側の細胞）、神経組織に隣接している又は接触している又は分布している非神経組織中の細胞、神経上膜、神経周膜、神経内膜，索、束など細胞を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、神経損傷は神経系損傷である。その他の実施形態において、神経損傷は脳損傷である。いくつかの実施形態において、神経損傷は、神経細胞へのイオン流入の変化によって引き起こされる神経系損傷である。例えば、卒中／脳虚血は、罹患率及び死亡率の主要な原因である。シナプス後のグルタミン酸受容体の過剰活性化と、続くＣａ２＋毒性が、虚血性脳損傷において重要な役割を果たす。本願は、Ｃａ２＋透過性の酸感知イオンチャンネル（ＡＳＩＣ）の活性化が、アシドーシス誘導性で、グルタミン酸受容体非依存性の虚血性脳損傷に関与することを示し、ＡＳＩＣファミリーメンバー（ＡＳＩＣ）を標的とすることによる神経保護についての新たな方向性を提供する。本願はさらに、ホモマー性のＡＳＩＣチャンネルに対する効力が増大し、水溶性が増加したＡＳＩＣの新規阻害剤を提供する。いくつかの実施形態において、本願は、ＡＳＩＣ１ａチャンネルを阻害することによる、神経損傷を減少させるための医薬組成物及び方法を提供する。
【００２６】
本願の一つの態様は、対象における神経損傷を減少させるための方法に関する。本方法は、アミロライド及びアミロライド類似体からなる群より選択される活性成分を含む治療的有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、静脈内、鞘内又は脳室内に投与される。
【００２７】
いくつかの実施形態において、活性成分は、アミロライド又はその薬学的に許容される塩を含む。その他の実施形態において、活性成分は、アミロライド類似体又はその薬学的に許容される塩を含む。関連する実施形態において、アミロライド類似体は、ベンザミル、フェナミル（ｐｈｅｎｍｉｌ）、５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソブチル）−アミロライド（ＥＩＰＡ）、ベプリジル、ＫＢ−Ｒ７９４３、５−（Ｎ−メチル−Ｎ−イソブチル）アミロライド、５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）アミロライド及び５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライド塩酸塩からなる群より選択される。別の関連する実施形態において、アミロライド類似体はベンザミルである。別の関連する実施形態において、アミロライド類似体はベンザミルのメチル化類似体である。別の関連する実施形態において、アミロライド類似体はグアニジン基上に形成される１個の環を含む。別の関連する実施形態において、アミロライド類似体はアシルグアニジノ基を含む。別の関連する実施形態において、アミロライド類似体はグアニジン基上に形成される水溶性基を含み、この水溶性基は、Ν，Ν−ジメチルアミノ基又は糖基である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、アミロライド、アミロライド類似体又はその薬学的に許容される塩は、体重１Ｋｇあたり０．１ｍｇ〜１０ｍｇの用量範囲で与えられる。その他の実施形態において、医薬組成物は、虚血性イベントの発症の１時間以内、虚血性イベントの発症の５時間以内、又は虚血性イベントの発症の１〜５時間以内に投与される。
【００２９】
本願の別の態様は、対象における脳損傷を処置するための方法に関する。本方法は、アミロライド、アミロライド類似体、又はその薬学的に許容される塩を含む治療的有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、静脈内、鞘内又は脳室内に投与される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、アミロライド類似体は、ベンザミル、フェナミル（ｐｈｅｎｍｉｌ）、ＥＩＰＡ  ベプリジル、ＫＢ−Ｒ７９４３、５−（Ｎ−メチル−Ｎ−イソブチル）アミロライド、５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）アミロライド及び５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライド塩酸塩からなる群より選択される。関連する実施形態において、アミロライド類似体はベンザミルである。その他の実施形態において、アミロライド類似体は、ベンザミルのメチル化類似体、グアニジン基上に形成される１個の環を含むアミロライド類似体、アシルグアニジノ基を含むアミロライド類似体、及び水溶性基がΝ，Ν−ジメチルアミノ基又は糖基である、グアニジン基上に形成される１個の水溶性基を含むアミロライド類似体からなる群より選択される。
【００３１】
本願の別の態様は、本願の別の態様は、神経細胞へのイオン流入の変化により引き起こされる神経系損傷を減少させるための方法に関する。本方法は、アミロライド、アミロライド類似体又はそれらの薬学的に許容される塩を含む治療的有効量の医薬組成物を、かかる処置を必要とする対象に投与することを含む。
【００３２】
本願の別の態様は、虚血を処置するため又は虚血を原因とする損傷を減少させるための組成物を提供する。本方法は、アミロライド、アミロライド類似体、及びそれらの塩からなる群より選択される治療的有効量の活性成分を、かかる処置を必要とする対象の静脈内又は鞘内に投与するステップを含む。本願の方法は、虚血治療のその他の方法と比較して一つ以上の利点を提供しうる。これらの利点には、特に、（１）より少ない虚血誘導性損傷、（２）より少ない治療の副作用（例えば、より特異的な治療標的を選択することによる）、及び／又は（３）有効な治療のより長い時間窓などを含みうる。
【００３３】
図１は、虚血状態にある対象における神経損傷を減少させる方法で行われうる典型的なステップ２２、２４を有するフローチャート２０を示す。これらのステップは、任意の適当な回数及び任意の適当な組み合わせで行ってもよい。本方法において、虚血対象（又は複数の対象）を治療のために選択しうる（ステップ２２に示される）。次に、ＡＳＩＣ選択性阻害剤を虚血対象に投与しうる（ステップ２４に示される）。虚血対象への阻害剤の投与は、対象にとって虚血誘導性損傷を減少させるために治療的有効量で、例えば、卒中に起因する脳損傷の量減少させる量で行われうる。
【００３４】
図１の虚血治療の有効性についての可能な説明が、本願の教示のデータ（例えば、実施例１参照）によって提供されうる。特に、虚血の損傷効果はアシドーシスとは同等ではない可能性があり、すなわち、虚血による組織／細胞の酸性化は、虚血誘導性損傷生じさせるのには十分でない可能性がある。それよりむしろ、虚血誘導性損傷は、多くの場合において、ＡＳＩＣファミリーメンバー、特にＡＳＩＣ１ａが介在する細胞へのカルシウム流入によって引き起こされうる。したがって、ＡＳＩＣ１ａのチャンネル活性の選択的阻害は、この有害なカルシウム流入を減少し、それにより、虚血誘導性損傷を減少しうる。
【００３５】
図２は、虚血治療のための薬物を同定する方法で行われうる典型的なステップ３２、３４を有するフローチャート３０を示す。これらのステップは、任意の適当な回数及び任意の適当な組み合わせで行ってもよい。本方法において、一つ以上のＡＳＩＣ選択性阻害剤を取得しうる（ステップ３２に示される）。次に、阻害剤を、虚血誘導性損傷に対する効果について、虚血対象で試験しうる（ステップ３４に示される）。
【００３６】
神経損傷
本願は、対象における神経損傷を減少させるための医薬組成物及び方法に関する。本明細書において使用する場合、用語「神経損傷」とは、身体的相互作用若しくは外傷、打撲傷若しくは圧迫若しくは外科的外傷、出血性若しくは虚血性損傷などの血管の薬理学的損傷から、又は、神経変性的若しくは任意のその他の神経疾患、若しくは神経系組織若しくは細胞の損傷若しくは有害症状を引き起こす任意のその他の因子から生じる神経系組織若しくは細胞に対する急性若しくは慢性の損傷又は有害症状を意味する。いくつかの実施形態において、神経損傷は、認知障害、精神障害、神経伝達物質介在性障害又は神経障害によって引き起こされる。神経損傷は、神経系に対する損傷（すなわち、神経系損傷）及び脳損傷を含む。
【００３７】
本明細書において使用する場合、用語「認知障害」とは、神経細胞の構造及び又は機能の進行性の喪失、例えば、神経細胞の死滅、が関与する又は関連すると信じられている、或いは、関与する又は関連する疾患及び症状のことをいい、それらを意図する。この場合、疾患の中心的特徴は、認知能（例えば、記憶、注意、認識及び／又は思考）障害でありうる。これらの疾患には、病原体によって引き起こされる認知障害、例えば、ＨＩＶ関連認知障害又はライム病関連認知障害が含まれる。いくつかの実施形態において、認知障害は変性性認知障害である。変性性認知障害の例としては、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、自閉症、軽度認知障害（ＭＣＩ）、卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、老齢性記憶障害（ＡＡＭＩ）及びてんかんが挙げられる。
【００３８】
本明細書において使用する場合、用語「精神障害」とは、異常な思考及び認識を引き起こすと信じられている又は引き起こす精神的疾患のことをいい、それらを意図する。精神障害は現実性の喪失により特徴付けられ、妄想、幻覚（それらが鮮明であり、実質的であり、外部の客観的空間に位置しているという意味で、現実という認識の性格を有する、外部刺激の存在しない状態で意識及び自覚しているという認識）、人格の変化及び／又は解体型思考を伴いうる。その他の一般的な症候としては、異常又は奇異な行動、並びに、社会的相互作用における困難性及び日常生活の活動を行う場合の障害が挙げられる。典型的な精神障害は、統合失調症、双極性障害、精神異常、不安症、うつ病及び慢性疼痛である。
【００３９】
本明細書において使用する場合、用語「神経伝達物質介在性障害」とは、ヒスタミン、グルタミン酸、セロトニン、ドーパミン、ノルエピネフリンなどの神経伝達物質の異常なレベル、又は、アミン作動性Ｇタンパク質結合受容体の機能不全が関与又は関連すると信じられている、或いは、関与又は関連する疾患又は症状のことをいい、それらを意図する。典型的な神経伝達物質介在性障害としては、脊髄損傷、糖尿病性ニューロパシー、アレルギー性疾患、及び老齢性毛髪喪失（脱毛症）、老齢性体重減少及び老齢性視覚障害（白内障）などの老化保護（ｇｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）活性が関与する疾患が挙げられる。異常な神経伝達物質レベルは、様々な疾患に関連し、それらとしては、限定するものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、自閉症、ギランバレー症候群、軽度認知障害、統合失調症、不安症、多発性硬化症、卒中, 外傷性脳損傷、脊髄損傷、糖尿病性ニューロパシー、線維筋痛症、双極性障害、精神異常、うつ病及び様々なアレルギー性疾患が挙げられる。
【００４０】
本明細書において使用する場合、用語「神経障害」とは、神経細胞死及び／又は神経細胞機能の障害若しくは神経細胞機能の減少が関与又は関連すると信じられている、或いは、関与又は関連する疾患又は症状のことをいい、それらを意図する。典型的な神経に関する適応症としては、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、イヌ認知障害症候群（ＣＣＤＳ）、レビー小体病、メンケス病、ウィルソン病、クロツフェルトヤコブ病、ファール病などの神経変性性疾患及び症状、虚血性又は出血性の卒中などの脳内循環に関連する急性若しくは慢性疾患又はその他の脳溢血による損傷、老齢性記憶障害（ＡＡＭＩ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、外傷性関連軽度（ＭＣＩ）、脳震盪後症候群、外傷性ストレス症候群、補助化学療法、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、神経細胞死が介在する眼疾患、黄斑変性症、老齢性黄斑変性症、自閉症（自閉症スペクトラム症候群を含む）、アスペルガー症候群、及びレット症候群、剥離損傷（ａｖｕｌｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ）、脊髄損傷、重症筋無力症、ギランバレー症候群、多発性硬化症、糖尿病性ニューロパシー、線維筋痛、脊髄損傷関連ニューロパシー、統合失調症、双極性障害、精神異常、不安症若しくはうつ病、及び慢性疼痛が挙げられる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、神経損傷又は神経系損傷は、神経細胞又は神経系組織へのイオン流入の変化によって引き起こされる。本明細書において使用する場合、用語「神経系組織」とは、神経細胞、神経網、グリア細胞、神経炎症性細胞、及び「神経系組織」と接触する内皮細胞を含む動物組織のことをいう。「神経細胞」は、限定するものではないが、ニューロンなどの当業者に知られている任意のタイプの神経細胞でありうる。本明細書において使用する場合、用語「ニューロン」とは、動物の神経系の任意の部分に由来する外胚葉性の胚起源の細胞を表す。神経細胞は、神経線維タンパク質であるＮｅｕＮ（神経細胞核マーカー）、ＭＡＰ２、及びクラスＩＩＩチューブリンなどの良く特徴付けられた神経細胞特異的マーカーを発現する。神経細胞として含まれるものは、例えば、海馬、皮質、ドーパミン作動性の中脳、脊髄運動神経、感覚、腸管神経、交感神経、副交感神経、コリン作動性の中隔、中枢神経系及び小脳の神経細胞である。本発明において有用である「グリア細胞」としては、限定するものではないが、星状細胞、シュワン細胞、及びオリゴ樹状細胞が挙げられる。本発明において有用である「神経炎症性細胞」としては、限定するものではないが、マクロファージ及びミクログリアなどの骨髄起源の細胞が挙げられる。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本願の医薬組成物及び方法は、虚血又は虚血関連症状によって引き起こされる神経損傷を減少することに関する。虚血とは、本明細書において使用する場合、器官及び／又は組織への血流が減少した状態である。血流の減少は、部分的又は完全な阻害（閉塞）、狭窄（圧縮）、及び／又は器官及び／又は組織に血流を提供する一つ以上の血管の漏出／破裂などの多くのメカニズムによって引き起こされうる。虚血は、血栓症、塞栓症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、出血、動脈瘤、手術、外傷、薬物などによって生じうる。したがって、血流の減少は、慢性、一過性、急性又は散発性でありうる。
【００４３】
任意の器官又は組織を、血流の減少を経験させ、虚血に対する処置を必要とさせた。典型的な器官及び／又は組織としては、限定するものではないが、脳、動脈、心臓、腸及び眼（例えば、視神経）が挙げられる。虚血誘導性損傷（すなわち、様々なタイプの虚血によって生じた疾患及び／又は損傷）としては、限定するものではないが、特に、虚血性ミエロパシー、虚血性視神経症、虚血性大腸炎、冠動脈心疾患、及び／又は心疾患（例えば、狭心症、心臓発作など）が挙げられる。したがって、虚血誘導性損傷は、体内の影響を受けた部位で、細胞及び／又は組織を損傷及び／又は死滅させうる。特に、例えば、壊死（梗塞）組織の発生、炎症、及び／又は組織リモデリングなどが挙げられる。本願の態様にしたがう処置によって、この損傷の発生率、程度及び／又は重症度は低減しうる。
【００４４】
虚血関連症状は、虚血のいずれかの結果でありうる。この結果は、虚血の発症と実質的に同時であってもよいし（例えば、虚血の直接的影響）、及び／又は、虚血の実質的に発症後に起こってもよいし、及び／又は、虚血が終わった後に起こってもよい（例えば、虚血の非直接的下流の影響、虚血終了時の組織の再灌流など）。典型的な虚血関連症状は、上記で列挙した症候（及び／又は症状）の任意の組み合わせを含みうる。或いは、又は更に、この症候は、局所性及び／又は全身性のアシドーシス（ｐＨ低下）、低酸素症（酸素低下）、フリーラジカルの生成などを含みうる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、虚血関連症状は卒中である。卒中とは、本明細書において使用する場合、脳の一部（又は全部）への血液供給の減少によって引き起こされる脳虚血である。卒中によって引き起こされる症候は、突然でもありうるし（例えば、意識の喪失など）、又は、数時間若しくは数日間にわたる段階的な発症を有しうる。さらに、卒中は、特に、主要な虚血性発作（完成型卒中）であっても、より主要ではない一過性の虚血性発作であってもよい。卒中によって引き起こされる症候としては、例えば、半身麻痺、半身不随、片側のしびれ、片側の弱体化、片側の麻痺、一時的な肢部の弱体化、肢部の疼き、混乱、話すことの困難、会話を理解することの困難、片方又は両方の眼でみることの困難、眼のかすみ、視覚喪失、歩行困難、めまい、転倒傾向、身体の調整喪失、突然の重症な頭痛、喘鳴、及び／又は意識喪失が挙げられる。或いは、又は更に、この症候は、試験及び／又は装置、例えば、虚血血液試験（例えば、変異したアルブミン、特定のタンパク質のイソ型、損傷したタンパク質などを試験する）、心電図、脳波図、運動ストレス試験、脳ＣＴ又はＭＲＩ走査などによってより容易に又はそれらのみにより検出しうる。
【００４６】
酸−塩基バランスは生物系にとって重要である。正常な脳機能は、そのエネルギー要求性のために、最終生成物はＣＯ２及びＨ２Ｏで、グルコースの完全な酸化に依存する。虚血時、酸素供給欠如により、嫌気性解糖の増大は乳酸の蓄積をもたらす。乳酸の蓄積は、ＡＴＰ加水分解からのＨ＋放出の増大を伴い、組織内のｐＨの低下を引き起こす。細胞外ｐＨ（ｐＨ０）は、通常、虚血時に６．５まで低下し、重篤な虚血時又は高血糖条件下では６．０より低く低下しうる。
【００４７】
神経損傷の対象
本願の方法及び医薬組成物は、神経損傷を有する又は神経損傷の履歴を有する及び／又は処置が始まった後及び処置が依然として有効である期間に神経損傷を発症する有意な可能性を有する任意の対象において使用することができる。いくつかの実施形態において、対象は虚血対象である。虚血対象とは、本明細書において使用する場合、虚血、虚血関連症状、虚血の履歴を有する、及び／又は処置が始まった後及び処置が依然として有効である期間に神経損傷を発症する有意な可能性を有する任意のヒト（ヒト対象）又は動物（動物対象）である。
【００４８】
対象は動物であってもよい。用語「動物」とは、本明細書において使用する場合、ヒトではない任意の動物のことをいう。適当でありうる典型的な動物は、血流を有する任意の動物を含み、例えば、げっ歯類（マウス、ラットなど）、イヌ、ネコ、トリ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類などが挙げられる。動物は、それ自身の目的のために、例えば、獣医学的目的のために（例えば、ペットの処置として）処置してもよい。或いは、動物は、薬物候補の力価、有効性の時間窓、副作用などを調べるように、ヒト用途のための薬物候補の試験を容易にするために、虚血などの神経損傷の動物モデルを提供しうる。
【００４９】
処置のための虚血対象は、任意の適当な基準によって選択しうる。典型的な基準は、任意の検出可能な虚血の症候、虚血の履歴、虚血のリスクを増大させる（又は虚血を誘導する）イベント（例えば、外科的処置、外傷、薬物の投与など）などを含みうる。虚血の履歴は、一つ以上の事前の虚血エピソードを伴いうる。いくつかの例において、処置のために選択された対象は、処置を始める少なくとも約１、２、又は３時間前に起こった虚血、或いは、処置を始める約１日、１２時間又は６時間より前に起こった複数の虚血エピソード（例えば、一過性の虚血性発作）が発症していた可能性がある。
【００５０】
ＡＳＩＣ阻害剤、アミロライド及びアミロライド類似体
ＡＳＩＣファミリーメンバーの阻害剤とは、本明細書において使用する場合、  ＡＳＩＣファミリー、すなわち、特に、ＡＳＩＣ１ａ、ＡＳＩＣ１ｂ、ＡＳＩＣ２ａ、ＡＳＩＣ２ｂ、ＡＳＩＣ３、及びＡＳＩＣ４の一つ以上のメンバーの活性を（部分的に、実質的に、又は完全に阻害する）減少する物質である。いくつかの例において、本阻害剤は、細胞膜を介して（細胞内及び／又は細胞外へ）イオン（例えば、特に、ナトリウム、カルシウム、及び／又はカリウム）を通過させるという細胞膜の能力などの一つ以上のメンバーのチャンネル活性を減少しうる。本物質は、化合物（約１０ｋＤａ未満の小分子、ペプチド、核酸、脂質など）、２つ以上の化合物の複合体、及び／又は混合物であってもよい。さらに、本物質は、特に、競合的、非競合的、非競争的、及び／又は混合阻害などの任意の適当なメカニズムによって、ＡＳＩＣファミリーメンバーを阻害しうる。
【００５１】
阻害剤は、酸感知イオンチャンネル１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）を阻害するＡＳＩＣ１ａ阻害剤でありうる。ＡＳＩＣ１ａとは、本明細書において使用する場合、任意の種由来のＡＳＩＣ１ａタンパク質又はチャンネルのことをいう。例えば、典型的なヒトＡＳＩＣ１ａタンパク質／チャンネルは、Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  ３８６，ｐｐ．１７３−１７７に記載され、本文献は参照により本明細書に組み入れられる。
【００５２】
「ＡＳＩＣ１ａ阻害剤」という表現は、適切な薬理学的判断の範囲内で、ＡＳＩＣ１ａとして潜在的又は現実的に薬学的に有用である生成物のことをいい、又、薬学的活性種を含み、ＡＳＩＣ１ａ阻害剤として記載され、奨励され、又は承認された物質への言及を含む。
【００５３】
ＡＳＩＣ１ａ阻害剤は、ＡＳＩＣファミリー内で選択的でありうる。ＡＳＩＣ１ａの選択的阻害とは、本明細書において使用する場合、同じ（最大以下）の濃度の阻害剤へそれぞれ曝露した後で比較した場合（例えば、培養細胞中で）、別のＡＤＩＣファミリーメンバーに関する場合よりも、ＡＳＩＣ１ａにおいて実質的により強い阻害のことである。阻害剤は、少なくとも一つのその他のＡＳＩＣファミリーメンバー（ＡＳＩＣ１ｂ、ＡＳＩＣ２ａ、ＡＳＩＣ２ｂ、ＡＳＩＣ３、ＡＳＩＣ４など）に対するのと比較して、及び／又は、全てのその他のＡＳＩＣファミリーメンバーに対するのと比較して、ＡＳＩＣ１ａを選択的に阻害することができる。選択的阻害剤の阻害の強さは、阻害が起こる阻害剤濃度（例えば、ＩＣ５０（最大阻害の５０％を生じる阻害剤濃度））又は異なるＡＳＩＣファミリーメンバーと比較した場合のＫｉ値（阻害定数又は解離定数）によって記載されうる。ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害剤は、少なくとも一つのその他のＡＳＩＣファミリーメンバー又は全てのその他のＡＳＩＣファミリーメンバーの阻害に対する濃度よりも、少なくとも約２倍、４倍、又は１０倍低い濃度（２分の１、４分の１、又は１０分の１の濃度又はそれ未満）でＡＳＩＣ１ａ活性を阻害しうる。したがって、ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害剤は、少なくとも一つのその他のＡＳＩＣファミリーメンバー及び／又は全てのその他のＡＳＩＣファミリーメンバーの阻害に対する濃度よりも、少なくとも約２倍、４倍、又は１０倍低い濃度（２分の１、４分の１、又は１０分の１の濃度又はそれ未満）でＡＳＩＣ１ａ阻害のためのＩＣ５０及び／又はＫｉを有しうる。
【００５４】
ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害剤は、選択的であることに加えて、ＡＳＩＣ１ａに対して特異的でもありうる。ＡＳＩＣ１ａ特異的阻害は、本明細書において使用する場合、ＡＳＩＣ２ａ及びＡＳＩＣ３ａなどの全てのその他のＡＳＩＣファミリーメンバーと比較して、ＡＳＩＣ１ａに対して実質的に独占的である阻害である。ＡＳＩＣ１ａ特異的阻害剤は、全てのその他のＡＳＩＣファミリーメンバーの阻害と比較して、少なくとも約２０倍低い（５％の濃度又はそれ未満）阻害剤濃度でＡＳＩＣ１ａを阻害しうる。したがって、ＡＳＩＣ１ａ特異的阻害剤は、例えば、その他のＡＳＩＣファミリーメンバーの阻害が少なくとも実質的に（又は、完全に）検出不可能であるような、少なくとも約２０倍低い（５％又はそれ未満）、ＡＳＩＣファミリーの全てのその他のメンバーと比較して、ＡＳＩＣ１ａ阻害のためのＩＣ５０及び／又はＫｉを有しうる。阻害剤濃度でＡＳＩＣ１ａを阻害しうる。いくつかの実施形態において、ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害剤は、ホモマー性のＡＳＩＣ１ａチャンネルに対して高い効力を有し、市販されているアミロライド関連ＡＳＩＣ１ａ阻害剤、例えば、アミロライドベンザミル、フェナミル、５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソブチル）アミロライド（ＥＩＰＡ）、ベプリジル、ＫＢ−Ｒ７９４３、５−（Ｎ−メチル−Ｎ−イソブチル）アミロライド、５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）アミロライド及び５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライド塩酸塩などと比較して高い水溶性を有する。
【００５５】
任意の適当なＡＳＩＣ阻害剤又は阻害剤の組み合わせを使用することができる。例えば、対象は、ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害剤及び非選択的ＡＳＩＣ阻害剤を用いて、又は、ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害剤及び非ＡＳＩＣカルシウムチャンネルなどの非ＡＳＩＣチャンネルタンパク質に対する阻害剤を用いて、処置することができる。いくつかの例において、対象は、ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害剤及びグルタミン酸アンタゴニストなどのＮＭＤＡ受容体の阻害剤を用いて処理することができる。
【００５６】
阻害剤は、ペプチドであっても、ペプチドを含んでもよい。ペプチドは、通常、少なくとも約１０〜約１０００未満のサブユニットの任意の適当な数のアミノ酸サブユニットを有しうる。いくつかの例において、ペプチドは、シスチンノットモチーフを有しうる。シスチンノットは、本明細書において使用する場合、通常、６個以上のシステインの配列を含む。これらのシステインを有するペプチドは、（１）２つのジスルフィド結合及びそれらの連結骨格部分によって形成される環と、（２）環の中を通る第３のジスルフィド結合とを含む「ノット部」を形成しうる。いくつかの例において、本ペプチドは、クモ形類動物及び／又は円錐型巻貝由来のコノトキシンでありうる。例えば、本ペプチドは、タランチュラ（Ｐｓａｌｍｏｐｏｅｕｓ  ｃａｍｂｒｉｄｇｅｉ  （Ｐｃ））由来の毒ＰｃＴｘ１（ｐｓａｌｍｏｔｏｘｉｎ  １）でありうる。
【００５７】
いくつかの例において、本ペプチドは、１個以上のアミノ酸の少なくとも一つの欠失、挿入、及び／又は置換によってペプチドとＰｃＴｘ１とが異なるように、ＰｃＴｘ１と構造的に関連している可能性がある。例えば、ペプチドは、少なくとも約２５％若しくは少なくとも約５０％の配列同一性、及び／又は少なくとも約２５％若しくは少なくとも約５０％の配列類似性をＰｃＴｘ１に対して有しうる（以下参照）。阻害剤として適しうるペプチドのさらなる態様について、以下の実施例３において記載する。
【００５８】
アミノ酸配列の同一性及び類似性スコアの比較及び作成のためのアミノ酸配列の整列方法は、当技術分野において周知である。適当でありうる典型的な整列方法としては、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎの「Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ」、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム「ＧＡＰ」、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎの類似性方法「Ｔｆａｓｔａ及びＦａｓｔａ」などが挙げられる。適当でありうるこれらの方法及びその他の方法のコンピューターアルゴリズムとしては、ＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡが挙げられる。
【００５９】
本明細書において使用する場合、２つのペプチドに関する文脈における「配列同一性」又は「同一性」は、最大に一致させて整列させた場合に、同じである対応するペプチド配列における残基の百分率に関する。いくつかの例において、同一でないペプチド残基位置は、保存的アミノ酸置換と異なっていてもよく、この場合、アミノ酸残基が、類似した化学特性（例えば、荷電性又は疎水性）を有するその他のアミノ酸残基と置換されており、その結果、この分子の機能的特性に関してより小さな効果を生じるか（又は効果を生じない）ことが予想される。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性百分率は、配列の「類似性」を与えるために上方に調整してもよく、これにより、置換の保存的特徴が修正される。例えば、それぞれの保存的置換は、完全ミスマッチとしてよりも部分的としてスコアをつけてよく、それにより、類似性スコアを提供するための配列同一性百分率を修正しうる。類似性スコアを取得するための保存的置換のスコア決定方法は、当技術分野において周知であり、任意の適当な方法、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ，ＵＳＡ）において実行されているような、ＭｅｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムにしたがって、計算することができる。
【００６０】
アミロライドは、グアニジン基を含有するピラジン誘導体であり、軽度の高血圧の処置のために使用されており、副作用はほとんど報告されていない。アミロライドは、上皮性ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）を直接阻害することにより作用し、それにより、腎臓の遠位尿細管末部、連結管、及び集合管でのナトリウムの再吸収を阻害する。また、これにより、身体からのナトリウムと水の喪失が促進されるが、カリウムは失われることはない。本明細書において使用する場合、用語「アミロライド」とは、アミロライドと、アミロライドの塩、例えば、アミロライド塩酸塩との両方のことをいう。
【００６１】
アミロライド類似体とは、本明細書において使用する場合、わずかに変化した化学構造を有するがアミロライドと同様の生物学的活性を有する化合物のことをいう。アミロライド類似体の例としては、限定するものではないが、ベンザミル、フェナミル、５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソブチル）アミロライド（ＥＩＰＡ）、ベプリジル、ＫＢ−Ｒ７９４３、５−（Ｎ−メチル−Ｎ−イソブチル）アミロライド、５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）アミロライド及び５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライド塩酸塩が挙げられる。その他の例としては、図２１に示されるように、Ｃ５−ＮＨ２位及び／又はグアニジノ基に疎水性置換基を有するアミロライド類似体、並びに、ベンザミルのメチル化類似体、グアニジン基上に形成される１個の環を含むアミロライド類似体、アシルグアニジノ基を含むアミロライド類似体、及びグアニジン基上に形成される水溶性基を含み、この水溶性基がＮ，Ｎ−ジメチルアミノ基又は糖基であるアミロライド類似体が挙げられる。いくつかの実施形態において、アミロライド類似体は、ヒトのＮａ＋／Ｃａ２＋イオン交換体を阻害しない。その他の実施形態において、アミロライド類似体は、Ｎａ＋／Ｃａ２＋イオン交換体の弱い阻害剤であり、細胞内のＣａ２＋レベルを低く維持することに役立つ。その他の実施形態において、アミロライド類似体は、１．１ｍＭ以下のＩＣ５０値を有するＮａ＋／Ｃａ２＋イオン交換体の大変弱い阻害剤である。いくつかのその他の実施形態において、アミロライド類似体は、ＡＳＩＣ２ａ及び／又はＡＳＩＣ３チャンネルを阻害しない。一つの実施形態において、アミロライド類似体は、ＡＳＩＣ３チャンネル及び／又はＡＳＩＣ２チャンネルと比較して、ＡＳＩＣ１ａに対して高い選択性を示す。
【００６２】
本明細書において使用する場合、用語「アミロライド類似体」とは、アミロライド類似体と、アミロライド類似体の塩、例えば、５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライド塩酸塩との両方のことをいう。
【００６３】
いくつかの実施形態において、アミロライド及び／又はアミロライド類似体は、ＰｃＴｘ１及びその誘導体などのその他のＡＳＩＣ阻害剤とともに使用される。
【００６４】
阻害剤の投与
投与（又は投与すること）とは、本明細書において使用する場合、任意の適当な条件、及び任意の適当な回数で阻害剤に曝露される対象の任意の経路を含む。投与は、自己投与であっても、医療従事者（例えば、医師、看護師など）などの他人による投与であってもよい。投与は、注入（特に、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、脳内、脳室内、及び／又は鞘内）、摂取（例えば、カプセル、トローチ、液体組成物などを使用）、吸入（例えば、鼻から及び／又は口から吸入されるエアロゾル（約１０ミクロン未満の平均液滴直径））、皮膚からの吸収（例えば、皮膚パッチによる）、及び／又は経粘膜（特に、例えば、口腔、経鼻及び／又は肺粘膜）などによって行われうる。粘膜投与は、例えば、スプレー（例えば、経鼻スプレー）、吸入用エアロゾルなどによって達成されうる。スプレーは、表面スプレー（平均して直径が約５０ミクロンより大きい液滴）であっても、及び／又は、空間スプレー（平均して直径が約１０〜５０ミクロンの液滴）であってもよい。いくつかの例において、虚血は、虚血対象の血液脳関門の変化を生じ、したがって、対象の血流中に導入される（例えば、注入及び／又は吸収による）阻害剤が脳に到達しうる効率が増大しうる。投与は単回又は治療として行うことができる。したがって、投与は、虚血が検出される前に（例えば、予防的に）、軽微な虚血エピソードの後に、慢性虚血時に、完成型卒中（ｆｕｌｌ  ｓｔｒｏｋｅ）後などに行ってもよい。いくつかの実施形態において、アミロライド又はアミロライド類似体は、静脈内に投与される。その他の実施形態において、アミロライド又はアミロライド類似体は、脳内に投与される。その他の実施形態において、アミロライド又はアミロライド類似体は、脳室内に投与される。その他の実施形態において、アミロライド又はアミロライド類似体は筋肉内に投与される。その他の実施形態において、アミロライド又はアミロライド類似体は鞘内に投与される。
【００６５】
治療的有効量（又は単純に「有効量」）の阻害剤を投与しうる。治療的有効量又は有効量の阻害剤とは、本明細書において使用する場合、対象に投与した場合に、有意な数の対象において、対象における虚血誘導性損傷の程度、発生率、及び／又は範囲を減少させる阻害剤の任意の量である。したがって、治療的有効量は、例えば、様々な量の阻害剤が試験対象（一般的には、対照となる対象群と比較される）に投与される臨床試験において決定されうる。治療的有効量の阻害剤又は複数の阻害剤は、１回当たりの投与あたり０．１〜５０ｍｌの単回投与又は複数回投与により与えうる。
【００６６】
いくつかの実施形態において、阻害剤は、アミロライド、アミロライド類似体又はそれらの塩であり、体重１Ｋｇあたり０．０１〜３０ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．０１〜１０ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．０１〜３ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．０１〜１ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．０１〜０．３ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．０１〜０．１ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．０１〜０．０３ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．０３〜３０ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．０３〜１０ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．０３〜３ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．０３〜１ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．０３〜０．３ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．０３〜０．１ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．１〜３０ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．１〜１０ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．１〜３ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．１〜１ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．１〜０．３ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．３〜３０ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．３〜１０ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．３〜３ｍｇ、体重１Ｋｇあたり０．３〜１ｍｇ、体重１Ｋｇあたり１〜３０ｍｇ、体重１Ｋｇあたり１〜１０ｍｇ、体重１Ｋｇあたり１〜３ｍｇ、体重１Ｋｇあたり３〜３０ｍｇ、体重１Ｋｇあたり３〜１０ｍｇ又は体重１Ｋｇあたり１０〜３０ｍｇの範囲の１日用量で（単回投与又は複数回投与として）与えられる。一つの実施形態において、アミロライド類似体は、ベンザミル、フェナミル、ＥＩＰＡ、ベプリジル、ＫＢ−Ｒ７９４３、５−（Ｎ−メチル−Ｎ−イソブチル）−アミロライド、５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）−アミロライド及び５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライド塩酸塩からなる群より選択される。別の実施形態において、アミロライド類似体は、Ｃ５−ＮＨ２位に及び／又はグアニジノ基上に疎水性置換基を有する。別の実施形態において、アミロライド類似体は、ベンザミルのメチル化類似体、グアニジン基上に形成される１個の環を含むアミロライド類似体、アシルグアニジノ基を含むアミロライド類似体、及びグアニジン基上に形成される水溶性基を含み、この水溶性基がＮ，Ｎ−ジメチルアミノ基又は糖基であるアミロライド類似体からなる群より選択されるアミロライド類似体から選択される。
【００６７】
その他の実施形態において、阻害剤は、アミロライド、アミロライド類似体又はそれらの塩であり、０．１〜１０００ｍｇ／用量、０．１〜３００ｍｇ／用量、０．１〜１００ｍｇ／用量、０．１〜３０ｍｇ／用量、０．１〜１０ｍｇ／用量、０．１〜３ｍｇ／用量、０．１〜１ｍｇ／用量、０．１〜０．３ｍｇ／用量、０．３〜１０００ｍｇ／用量、０．３〜３００ｍｇ／用量、０．３〜１００ｍｇ／用量、０．３〜３０ｍｇ／用量、０．３〜１０ｍｇ／用量、０．３〜３ｍｇ／用量、０．３〜１ｍｇ／用量、１〜１０００ｍｇ／用量、１〜３００ｍｇ／用量、１〜１００ｍｇ／用量、１〜３０ｍｇ／用量、１〜１０ｍｇ／用量、１〜３ｍｇ／用量、３〜１０００ｍｇ／用量、３〜３００ｍｇ／用量、３〜１００ｍｇ／用量、３〜３０ｍｇ／用量、３〜１０ｍｇ／用量、１０〜１０００ｍｇ／用量、１０〜３００ｍｇ／用量、１０〜１００ｍｇ／用量、１０〜３０ｍｇ／用量、３０〜１０００ｍｇ／用量、３０〜３００ｍｇ／用量、３０〜１００ｍｇ／用量、１００〜１０００ｍｇ／用量、１００〜３００ｍｇ／用量、又は３００〜１０００ｍｇ／用量の範囲の単回用量として製剤化された医薬組成物として投与される。一つの実施形態において、アミロライド類似体は、ベンザミル、フェナミル、ＥＩＰＡ、ベプリジル、ＫＢ−Ｒ７９４３、５−（Ｎ−メチル−Ｎ−イソブチル）−アミロライド、５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）−アミロライド及び５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライド塩酸塩からなる群より選択される。別の実施形態において、アミロライド類似体は、Ｃ５−ＮＨ２位に及び／又はグアニジノ基上に疎水性置換基を有する。別の実施形態において、アミロライド類似体は、ベンザミルのメチル化類似体、グアニジン基上に形成される１個の環を含むアミロライド類似体、アシルグアニジノ基を含むアミロライド類似体、及びグアニジン基上に形成される水溶性基を含み、この水溶性基がＮ，Ｎ−ジメチルアミノ基又は糖基であるアミロライド類似体からなる群より選択されるアミロライド類似体から選択される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、静脈内注入用、脳内注入用、脳室内注入用、鞘内注入用又は筋肉内注入用に製剤化される。
【００６８】
阻害剤は、任意の適当な形態且つ任意の適当な組成で対象に投与しうる。いくつかの例において、阻害剤は、薬学的に許容される塩として構成しうる。組成物は、例えば、液体担体／溶媒（ビヒクル）、保存剤、一つ以上の賦形剤、着色剤、香料、塩、消泡剤などを含有するように製剤化しうる。阻害剤は、虚血対象に投与した場合に、虚血治療のために治療的有効量の阻害剤を提供する濃度でビヒクル中に存在しうる。
【００６９】
いくつかの実施形態において、より高い水溶性又は脂溶性を有するアミロライド類似体が製造される。特定の実施形態において、アミロライド類似体は、水溶性を向上させるためにグアニジノ基に水溶性基、例えば、Ν，Ν−ジメチルアミノ基又は糖を含む（式１３〜１６、図２４）。いくつかの実施形態において、アミロライド類似体は、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ又はそれ以上の水溶性を有する。その他の実施形態において、アミロライド類似体は、単回の１０ｍｌのヒトへの投与で、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、又は５００ｍｇの用量を静脈内に投与することが可能となる溶解性を有する。さらにその他の実施形態において、アミロライド類似体は、単回の２ｍｌのヒトへの投与で、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、又は５００ｍｇの用量を脳室内に投与することが可能となる溶解性を有する。
【００７０】
アミロライド類似体の合成及びスクリーニング
本願の別の態様は、新規アミロライド類似体の合成及びスクリーニングに関する。アミロライド類似体の合成経路は、所望の類似体の構造に基づいて設計される。次に、新規に合成されたアミロライド類似体は、ＡＳＩＣファミリーメンバー、例えば、ＡＳＩＣ１ａ及びＡＳＩＣ２ａに関する阻害効果についてスクリーニングされる。一つ以上のＡＳＩＣ阻害剤、特に、上記のＡＳＩＣ１ａ阻害剤を取得しうる。本阻害剤は、任意の適当な方法により、特に、例えば、候補阻害剤の組み合わせ（例えば、２つ以上の化合物のライブラリー）をスクリーニングすることにより、及び／又は、合理的な設計により取得しうる。
【００７１】
スクリーニングは、ＡＳＩＣタンパク質と一連の候補阻害剤との間の相互作用を測定する任意の適当なアッセイ系を含んでもよい。典型的なアッセイ系は、特に、培養中で生育された細胞（「培養細胞」）を用いて、及び／又は、生物体を用いて、生化学的に行われるアッセイ（例えば、結合アッセイ）を含んでもよい。
【００７２】
いくつかの実施形態において、細胞系アッセイが、細胞内におけるイオン流量、例えば、酸感受性イオン流量について、各候補阻害剤の効果を調べるために使用される。いくつかの実施形態において、イオン流量は、カルシウム及び／又はナトリウムの流量である。いくつかの実施形態において、アッセイ系は、これらのファミリーメンバーについて各阻害剤の選択性を調べるために、ＡＳＩＣファミリーメンバー、例えば、ＡＳＩＣ１ａ若しくはＡＳＩＣ２ａを発現する細胞、又は２つ以上の識別しうるＡＳＩＣファミリーメンバー、例えば、ＡＳＩＣ１ａ及び別のＡＳＩＣファミリーメンバーを発現する細胞の２つ以上の識別しうる組を使用する。この細胞は、各ＡＳＩＣファミリーメンバーを、内因的に、又は外来核酸の導入により発現しうる。いくつかの例において、本アッセイ系は、特に、酸感受性又は膜電位感受性色素（例えば、Ｆｕｒａ−２などのカルシウム感受性色素）を用いて電気生理学的に、又は、膜電位及び／又は細胞内イオン（例えば、カルシウム）濃度の変化に感受性を有する遺伝子に基づくレポーター系を用いて、イオン流量を測定しうる。本アッセイ系は、ＡＳＩＣファミリーメンバー、特に、ＡＳＩＣ１ａの選択的阻害及び／又は特異的阻害のための候補阻害剤を試験するために使用しうる。
【００７３】
一つ以上のＡＳＩＣ阻害剤を、神経損傷の治療のための阻害剤の有効性を試験するために、神経損傷を有する対象、例えば、虚血状態にある対象に、投与してもよい。虚血状態にある対象は、ヒトであっても、動物であってもよい。いくつかの例において虚血状態にある対象は、虚血及び／又は卒中状態にある動物モデル系を提供しうる。
典型的な動物モデル系は、実験的に虚血状態が誘導されたげっ歯類（特に、マウス及び／又はラット）を含む。虚血状態は、特に、機械的に（例えば、手術的に）及び／又は薬物の投与により誘導しうる。いくつかの例において、 the 虚血状態は血管の閉塞により、例えば、中大脳動脈の狭窄により誘発しうる。
【００７４】
本願の別の態様は、神経系損傷を減少させるための医薬組成物に関する。本医薬組成物は、有効量のアミロライド、アミロライド類似体、又はそれらの薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含み、本医薬組成物は、静脈内、鞘内又は脳室内注入用に製剤化される。
【００７５】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、アミロライド類似体又はその薬学的に許容される塩を含み、アミロライド類似体は、ベンザミル、フェナミル（ｐｈｅｎｍｉｌ）、ＥＩＰＡ  ベプリジル、ＫＢ−７９４３、５−（Ｎ−メチル−Ｎ−イソブチル）アミロライド、５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）アミロライド及び５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライド塩酸塩からなる群より選択される。
【００７６】
その他の実施形態において、医薬組成物は、アミロライド類似体又はその薬学的に許容される塩を含み、アミロライド類似体は、ベンザミルのメチル化類似体、グアニジン基上に形成される１個の環を含むアミロライド類似体、アシルグアニジノ基を含むアミロライド類似体、及びグアニジン基上に形成される水溶性基を含み、この水溶性基がＮ，Ｎ−ジメチルアミノ基又は糖基であるアミロライド類似体からなる群より選択される。
【００７７】
その他の実施形態において、本医薬組成物は、一つ以上のその他のＡＳＩＣ阻害剤をさらに含む。一つの実施形態において、一つ以上のその他のＡＳＩＣ阻害剤は、ＰｃＴｘ１又はＰｃＴｘ１誘導体を含む。
【００７８】
本願の別の態様は、神経系損傷を減少させるための医薬組成物に関する。本医薬組成物は、有効量のアミロライド類似体又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む。
【００７９】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、静脈内、鞘内、脳室内又は筋肉内投与用に製剤化される。
【００８０】
一つの実施形態において、アミロライド類似体はベンザミルのメチル化類似体である。別の実施形態において、アミロライド類似体はグアニジン基上に形成される１個の環を含む。別の実施形態において、アミロライド類似体はアシルグアニジノ基を含む。さらに別の実施形態において、アミロライド類似体はグアニジン基上に形成される水溶性基を含み、この水溶性基はＮ，Ｎ−ジメチルアミノ基又は糖基である。
【００８１】
その他の実施形態において、医薬組成物は、一つ以上のその他のＡＳＩＣ阻害剤をさらに含む。一つの実施形態において、一つ以上のその他のＡＳＩＣ阻害剤は、ＰｃＴｘ１又はＰｃＴｘ１誘導体を含む。
【００８２】
本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、任意の且つあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、甘味剤などを含む。薬学的に許容される担体は、限定するものではないが、香味剤、甘味剤、並びに、特定の治療用組成物を調製するために必要となりうるバッファー及び吸収剤などの様々な物質を含む広範な物質から調製しうる。薬学的に活性な物質と併用するかかる媒質及び作用物質の使用は当技術分野において周知である。任意の従来からある媒質又は作用物質が活性成分と適合しない場合を除き、治療用組成物におけるその使用が意図される。任意に、アミロライド及び／又はアミロライド類似体は、前記したアミロライド及び／又はアミロライド類似体とは禁忌ではない補助活性成分を含む医薬組成物中に一緒に混合してもよい。
【００８３】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は静脈注入用に製剤化される。その他の実施形態において、医薬組成物は、静脈注入用に配合されたアミロライド及び／又はアミロライド類似体を含む。その他の実施形態において、医薬組成物は、脳室内注入用に配合されたアミロライド及び／又はアミロライド類似体を含む。その他の実施形態において、医薬組成物は、鞘内注入用に配合されたアミロライド及び／又はアミロライド類似体を含む。その他の実施形態において、医薬組成物は、筋肉内注入用に配合されたアミロライド及び／又はアミロライド類似体を含む。注入用途に適した医薬組成物は、滅菌水性溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び滅菌注入溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む。静脈内投与のために、適当な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）又は容易な注射針通過性が可能となる液体などが挙げられる。注射用組成物は製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒又は分散媒とそれらの適当な混合物でありうる。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散状態の場合に必要とされる（ｒｅｑｕｉｔｅｄ）粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の活動の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成しうる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを含むのが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン、を組成物中に含むことにより行われる。
【００８４】
滅菌注射用溶液は、適当な溶媒中に必要とされる量でアミロライド及び／又はアミロライド類似体を組み入れ、次いで、滅菌濾過することにより調製することができる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒体と、上記列挙されたものから必要とされるその他の成分とを含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み入れることにより調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、これにより、活性成分と、前もって滅菌濾過されたその溶液からの任意の追加の成分とが得られる。
【００８５】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は乾燥形態で提供され、錠剤又はカプセル形態に製剤化される。錠剤は当技術分野において周知の固体担体を用いて、従来の方法に従って製剤化しうる。本発明において使用される硬質及び軟質カプセルは、任意の薬学的に許容される物質、例えば、ゼラチン又はセルロース誘導体から製造することができる。
【００８６】
特定の実施形態において、医薬組成物は、即時放出、持続放出、遅延放出又はそれらの組み合わせ用に製剤化される。持続放出は、延長放出、時間放出又は期間放出、調節放出（ＣＲ）、修飾放出（ＭＲ）、連続放出（ＣＲ又はＣｏｎｔｉｎ）としても知られ、ゆっくりと溶解し、一定時間にわたり活性成分を放出させるために医薬品である錠剤又はカプセルにおいて用いられるメカニズムである。持続放出錠剤又はカプセルの利点は、同じ薬物の即時放出製剤よりも少ない頻度で摂取しうることが多い点と、それらは血流中でより安定した薬物レベルを維持し、その結果、薬物作用期間が延長する点である。
【００８７】
一つの実施形態において、医薬組成物は、活性成分をアクリル又はキチンなどの不溶性物質のマトリックス中に埋め込むことにより持続放出用に製剤化される。持続放出形態は、特定の期間、一定した薬物レベルを維持することにより、所定の割合で活性成分を放出するように設計される。これは、様々な製剤によって達成することができ、限定するものではないが、例えば、リポソームや、ハイドロゲルなどの薬物−ポリマーコンジュゲートを挙げることができる。
【００８８】
別の実施形態において、医薬組成物は、投与時に活性成分が直ぐには放出されないような遅延放出用に製剤化される。遅延放出ビヒクルの非限定的例は、胃内よりも腸管内で溶解する腸管内用コーティングされた経口薬物である。
【００８９】
その他の実施形態において、医薬組成物は、活性成分の一部の即時放出と、それに続く、活性成分の残りの持続放出のために製剤化される。一つの実施形態において、医薬組成物は、即時放出された活性成分を摂取しうるように粉末として製剤化される。別の実施形態において、医薬組成物は、液体、ゲル、懸濁液又はエマルジョン形態に製剤化される。かかる液体、ゲル、懸濁液又はエマルジョンは、そのままの形態で又はカプセルに封入されて対象に摂取されてもよい。
【００９０】
さらに別の実施形態において、本医薬組成物は、調節された且つ／又は持続した量の活性成分の局所性投与のための皮膚又は経皮パッチとして提供してもよい。
【００９１】
以下の実施例は、本願の教示の選択された態様及び実施形態を記載し、特に、ＡＳＩＣ阻害のインビトロ及びインビボでの効果を示すデータと、阻害剤として使用するための典型的なシスチンノットペプチドについて記載する。これらの実施例は、説明目的を意図するものであり、本願の教示の範囲を限定すると解釈されるべきでない。
【実施例】
【００９２】
実施例１：カルシウム透過性酸感知イオンチャンネルを阻害することによる虚血における神経保護
本実施例は、虚血性損傷に介在するＡＳＩＣ１ａの役割と、虚血性損傷を減少させるためのＡＳＩＣ１ａ阻害剤の能力を示す実験を記載する（図２〜１０参照）。Ｃａ２＋毒性が虚血性脳損傷における中心的役割を果たしている可能性がある。虚血状態の脳で生じている細胞での毒性Ｃａ２＋の負荷によるメカニズムは、グルタミン酸アンタゴニストの複数回のヒトでの試験において、卒中での有効な神経保護を示すことに失敗しているので、より不明瞭となった。アシドーシスは虚血の共通な特徴であり、脳損傷において重要な役割を果たす。本実施例は、アシドーシスがＣａ２＋透過性酸感知イオンチャンネル（ＡＳＩＣ）を活性化し、これにより、グルタミン酸受容体非依存性、Ｃａ２＋依存性神経損傷を誘導しうることを示す。したがって、内因性のＡＳＩＣが欠けている細胞は酸による損傷に対して抵抗性を示す可能性があるのに対して、Ｃａ２＋透過性ＡＳＩＣ１ａのトランスフェクションは、感受性を確立する可能性がある。局所性虚血においては、ＡＳＩＣ１ａ阻害物質の脳室内注入又はＡＳＩＣ１ａ遺伝子のノックアウトはアンアタゴニスト効果をもたらしうる。
【００９３】
正常な脳は、そのエネルギー要求を満たすため、グルコースの完全な酸化を必要とする。虚血時には、酸素の枯渇が、脳を嫌気的解糖へと変換させる。解糖系の副産物としての乳酸と、ＡＴＰ加水分解によって生じるプロトンの蓄積によって、虚血脳におけるｐＨが低下し、虚血性脳損傷を悪化させる。
【００９４】
酸感知イオンチャンネル（ＡＳＩＣ）は、哺乳動物の中枢神経系及び末梢神経系の神経全体にわたり発現しているリガンド依存性チャンネルの類である。今日まで、６種類のＡＳＩＣサブユニットがクローニングされている。これらのサブユニットのうち４つが、ナトリウム選択性、アミロライド選択性のカチオン電流を導電させるための酸性ｐＨによって活性化される機能的ホモ多量体チャンネルを形成する。ＡＳＩＣサブユニットのうちの２つ、ＡＳＩＣ１ａ及びＡＳＩＣ２ａサブユニットは、脳内において豊富であることが示されている。
【００９５】
実験手順
神経細胞培養
ハロタンを用いて麻酔した後、Ｅ１６  Ｓｗｉｓｓマウス又はＰＩ  ＡＳＩＣ１＋／＋及びＡＳＩＣ１−／−マウスから大脳皮質を切除し、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡで１０分間、３７℃にてインキュベートする。次に、組織を、火造りしたガラスピペットで細かくし、ポリ−Ｌ−オルニチンコーティングされた２４ウェルプレート又は２５ｘ２５ｍｍガラスカバースリップに、ウェルあたり２．５ｘ１０５細胞又はカバースリップあたり１０６細胞の密度でプレーティングした。神経細胞は、１０％ウマ血清を補充したＭＥＭ（Ｅ１６培養用）又はＢ２７を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＰＩ培養用）を用いて培養し、１２日後に電気生理学及び毒性研究のために使用した。グリア細胞の増殖は、５−フルオロ−２−デオキシウリジン及びウリジンの添加によって抑制され、ＮｅｕＮ及びＧＦＡＰ染色によって測定した場合に９０％の神経細胞を有する培養細胞が得られた（データ示さず）。
【００９６】
電気生理学
ＡＳＩＣ電流は、全細胞パッチクランプ及び迅速潅流技法を用いて記録した。正常細胞外溶液（ＥＣＦ）は、（単位はｍＭ）１４０  ＮａＣｌ、５．４  ＫＣｌ、２５  ＨＥＰＥＳ、２０  グルコース、１．３  ＣａＣｌ２、１．０  ＭｇＣｌ２、０．０００５  ＴＴＸ（ｐＨ７．４）を、３２０〜３３５ｍＯｓｍで含有した。低ｐＨ溶液のためには、様々な量のＨＣｌを添加した。ｐＨ＜６．０の溶液のためには、より信頼しうるｐＨバッファー効果のためにＨＥＰＥＳの代わりにＭＥＳを使用した。パッチ電極は、（単位はｍＭ）１４０  ＣｓＦ、２．０  ＭｇＣｌ２、１．０  ＣａＣ２、１０  ＨＥＰＥＳ、１１  ＥＧＴＡ、４  ＭｇＡＴＰ（ｐＨ７．３）を、３００ｍＯｓｍで含有した。Ｎａ＋非含有溶液は、ＮａＣｌの代わりに等張のＮＭＤＧ又はショ糖を含む、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳから構成された（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。マルチバレル式潅流系（ＳＦ−７７Ｂ、Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．）を、溶液の迅速交換のために使用した。
【００９７】
細胞損傷アッセイ−ＬＤＨ測定
細胞をＥＣＦで３回洗浄し、処置群にランダムに分けた。ＭＫ８０１（１０μΜ）、ＣＮＱＸ（２０μΜ）、及びニモジピン（５μΜ）を、グルタミン酸受容体及び電圧依存性Ｃａ２＋チャンネルの潜在的な二次活性化を排除するために、全ての群に添加した。酸によるインキュベーション後、神経細胞を洗浄し、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中３７℃でインキュベートした。ＬＤＨ放出は、ＬＤＨアッセイキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕ１ａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて培養培地中で測定した。培地（１００μＬ）を培養用ウェルから９６ウェルプレートに移し、キットによって提供される１００μＬの反応溶液と混合した。光学密度を、マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｐｌｕｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４９２ｎｍで３０分後に測定した。６２０におけるバックグラウンド吸収を差し引いた。１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて１５分間インキュベーションすることにより、各実験の終わりには、最大放出可能なＬＤＨを各ウェル中に取得した。
【００９８】
Ｃａ２＋イメージング
２５ｘ２５ｍｍガラスカバースリップ上で増殖させた皮質神経細胞をＥＣＦで３回洗浄して、５μΜ  Ｆｕｒａ−２−アセトキシメチルエステルを用いて４０分間２２℃でインキュベートし、３回洗浄して、通常のＥＣＦ中で３０分間インキュベートした。カバースリップを倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ３００）上の潅流チャンバーに移した。細胞は、キセノンランプを用いて照射して、４０倍ＵＶ蛍光オイル浸漬対物レンズを用いて観察し、ビデオ画像は、冷却されたＣＣＤカメラ（Ｓｅｎｓｙｓ  ＫＡＦ  １４０１、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｅｓ）を用いて取得した。デジタル化された画像は、Ａｘｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって制御されたＰＣに取得され、分析が行われた。シャッター及びフィルターホイール（Ｌａｍｂｄａ  １０−２）は、３４０又は３８０ｎｍの励起波長で細胞を適当な時間で照射を可能とするソフトウェアによって制御した。Ｆｕｒａ−２蛍光は、５１０ｎｍの発光波長で検出した。Ｒａｔｉｏ  ｉｍａｇｅｓ（３４０／３８０）を、視野中の細胞の限局領域の画素比の値を平均することにより分析した。値は、さらなる分析のためにＳｉｇｍａＰｌｏｔに外挿した。
【００９９】
フルオロセイン−ジアセテート染色及びヨウ化プロピジウム取り込み
細胞を、フルオロセイン−ジアセテート（ＦＤＡ）（５μΜ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（２μΜ）を含有するＥＣＦ中で３０分間インキュベートし、次いで、色素不含のＥＣＦを用いて洗浄した。生細胞（ＦＤＡ陽性）及び死細胞（ＰＩ陽性）を、ＰＩに関しては５８０／６３０ｎｍの励起／放射及びＦＤＡに関しては５００／５５０ｎｍの落射（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を備えた顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で観察し、計数した。画像は、ＢＱ  ８０００  ｓＶＧＡフレーム保持装置を備えたＯｐｔｒｏｎｉｃｓ  ＤＥＩ−７３０カメラを用いて収集し、コンピューターソフトウェア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ、ＴＮ）を用いて分析した。
【０１００】
ＣＯＳ−７細胞のトランスフェクション
ＣＯＳ−７細胞を、１０％ＨＳ及び１％ＰｅｎＳｔｒｅｐを含むＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。約５０％の集密度で、細胞を、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて、ｐｃＤＮＡ３ベクター中のＡＳＩＣ及びＧＦＰのためのｃＤＮＡを用いて共にトランスフェクトした。ＡＳＩＣのためのＤＮＡ（０．７５ｎｇ）及び０．２５μｇのＧＦＰのためのＤＮＡを、各３５ｍｍディッシュについて使用した。ＧＦＰ陽性の細胞をトランスフェクションの４８時間後にパッチクランプ記録のために選択した。ＡＳＩＣ１ａの安定したトランスフェクションのために、トランスフェクションの１週間後に、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を培養培地に添加した。生存するＧ４１８抵抗性細胞をさらにプレートに播き、Ｇ４１８の存在下で５世代より長く継代した。次に、細胞を、ＡＳＩＣ１ａの発現について、パッチクランプ及び免疫蛍光を用いて調べた。
【０１０１】
酸素−グルコース枯渇
神経細胞を３回洗浄し、８５％Ｎ２、１０％Ｈ２、及び５％ＣＯ２、３５℃の雰囲気を有する嫌気性チャンバー（Ｍｏｄｅｌ  １０２５，Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で、ｐＨ７．４又は６．０のグルコース不含のＥＣＦを用いてインキュベートした。酸素−グルコース枯渇（ＯＧＤ）は、グルコース不含のＥＣＦをＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地と交換し、正常細胞培養インキュベーター中で培養物をインキュベートすることにより、１時間後に終了した。ＨＥＰＥＳでバッファー化したＥＣＦを使用することで、１ｈｒのＯＧＤにより、ｐＨが７．３８から７．２８へ（ｎ＝３）及び６．０から５．９６（ｎ＝４）へとわずかに低下した。
【０１０２】
局所性虚血
一過性の局所性虚血は、挿管及び排気により１．５％イソフルラン、７０％Ｎ２Ｏ、及び２８．５％Ｏ２を用いて麻酔したオスのラット（ＳＤ，２５０〜３００ｇ）及びマウス（類遺伝子性のＣ５７Ｂ  １６バックグラウンドを有する，約２５ｇ）において中大脳動脈の縫合閉塞（ＭＣＡＯ）により誘導した。直腸及び側頭筋温度を、熱安定的に制御された加熱パッド及びランプを用いて、３７℃＋０．５℃に維持した。脳血流を経頭蓋レーザードップラーによりモニターした。血流が２０％以上減少していない動物は除外した。
【０１０３】
動物は虚血の２４時間後に抱水クロラールを用いて殺した。脳は迅速に除去して、１ｍｍ（マウス）又は２ｍｍ（ラット）間隔で冠状に切除し、生体色素（２％）２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩酸塩（ＴＴＣ）中に浸漬させることにより染色する。梗塞領域は、非虚血半球領域から虚血半球領域中のＴＴＣで染色された正常領域を差し引くことにより計算した。梗塞容積は、全ての部分の梗塞面積を合計し、切片の厚さを掛け合わせることにより計算した。ラット脳室内への注入は、十字縫合の０．８ｍｍ後部、中線の１．５ｍｍ横部、及び硬膜の３．８ｍｍ腹部で定位固定して挿入されたカニューレを有するマイクロシリンジポンプを用いる定位固定技法によって行われた。すべての操作及び分析は処置群について知らされていない個人達によって行われた。
【０１０４】
結果
（ａ）  マウス皮質神経細胞においてアシドーシスはＡＳＩＣを活性化する
図３及び４は、培養されたマウス皮質神経細胞におけるＡＳＩＣの電気生理学及び薬理学に関する典型的なデータを示す。図３Ａ及び３Ｂは、ｐＨが７．４から示されたｐＨ値に下がることにより活性化されたＡＳＩＣ電流のｐＨ依存性を示すグラフである。用量−反応曲線は、６．１８＋０．０６の平均ｐＨ０．５（ｎ＝１０）を用いてＨｉｌｌの公式に当てはめた。図３Ｃ及び３Ｄは、ＡＳＩＣ（ｎ＝５）の電流−電圧の関係を示すグラフである。様々な電圧におけるＡＳＩＣ電流の大きさは、−６０ｍＶにおいて記録された大きさに対して正規化された。図４Ａ及び４Ｂは、アミロライドによるＡＳＩＣ電流の用量依存性阻害を示すグラフである。ＩＣ５０＝１６．４＋４．１μΜ、Ｎ＝８。図４Ｃ及び４Ｄは、ＰｃＴＸ毒によるＡＳＩＣ電流の阻害を示すグラフである。＊＊ｐ＜０．０１。
【０１０５】
培養されたマウス皮質神経細胞におけるＡＳＩＣ電流を記録した（図３参照）。−６０ｍＶの維持電位で、７．０より低い値への細胞外ｐＨ（ｐＨｅ）の迅速な低下が、多くの神経細胞において、小さな安定状態にある成分とともに大きな一過性の内向き電流を引き起こした（図３Ａ）。内向き電流の大きさは、ｐＨｅが増大するにつれてシグモイド様式で増大し、６．１８＋０．０６のｐＨ０．５が得られた（ｎ＝１０、図３Ｂ）。直線状のＩ−Ｖ関係及びＮａ＋平衡電位に近似するｒｅｖｅｒｓａｌを取得した（ｎ＝６、図３Ｃ及び３Ｄ）。これらのデータは、ｐＨｅの低下がマウス皮質神経細胞における典型的なＡＳＩＣを活性化しうることを示す。
【０１０６】
酸によって活性化される電流に対する、ＡＳＩＣの非特異的阻害剤であるアミロライドの効果について試験した（図４参照）。図４に示されるように、アミロライドは、１６．４＋４．１μΜのＩＣ５０で皮質神経細胞におけるＡＳＩＣ電流を用量依存的に阻害した（ｎ＝８、図４Ａ及び４Ｂ）。皮質神経細胞における、酸によって活性化される電流に対するＰｃＴＸ毒の効果を図４Ｃ及び４Ｄに示す。１００ｎｇ／ｍＬで、ＰｃＴＸ毒は、ＡＳＩＣ電流のピークの大きさを４７％＋７％に可逆的に阻害し（ｎ＝１５、図４Ｃ及び４Ｄ）、これにより、ホモマーであるＡＳＩＣ１ａの酸活性化電流全体に対する大きな関与が示された。ＰｃＴＸ濃度の増大は、皮質神経細胞の大部分においてＡＳＩＣ電流の大きさのさらなる減少を誘導しなかった（ｎ＝８、データ示さず）。このことは、ＰｃＴＸ非感受性ＡＳＩＣ（例えば、ヘテロマー性のＡＳＩＣ１ａ／２ａ）が、これらの神経細胞に共に存在することを示す。
【０１０７】
（ｂ）モデル化された虚血によって増強されるＡＳＩＣ反応
図５は、モデル化された虚血が、ＡＳＩＣの活性を増大しうることを表す典型的なデータを示す。図５Ａは、ＯＧＤ１時間後におけるＡＳＩＣ電流の大きさの増大及び感受性抑制の低下を示す、一連の典型的なトレースである。図５Ｂは、ＯＧＤ神経細胞におけるＡＳＩＣ電流の大きさの増大を示す概要データのグラフである。Ｎ＝４０及び４４、＊ｐ＜０．０５。図５Ｃは、ＯＧＤ神経細胞におけるＡＳＩＣ電流の感受性抑制の低下を示す、一連の典型的なトレース及び概要データである。Ｎ＝６、＊＊ｐ＜０．０１。図５Ｄは、対照条件下、ＯＧＤの１時間後、ＡＳＩＣ１−／−神経細胞における、ｐＨ６．０で酸活性化電流の欠如を示す、一対の典型的なトレースである（ｎ＝1２及び１３）。
【０１０８】
アシドーシスが脳虚血の中心的特徴でありうることから、ＡＳＩＣが虚血条件下で活性化されうるかどうかと、虚血がこれらのチャンネルの特徴を修飾しうるかどうかを試験することを決定した（図５参照）。酸素グルコース枯渇（ＯＧＤ）の１時間後に神経細胞におけるＡＳＩＣ電流を記録した。簡潔に述べると、一組の培養細胞を、グルコース不含の細胞液（ＥＣＦ）で３回洗浄し、ＯＧＤに供したのに対して、対照の培養細胞を、グルコースを含有したＥＣＦでの洗浄及び通常の細胞培養インキュベーターでのインキュベーションに供した。グルコース不含のＥＣＦをＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地と交換し、通常のインキュベーターで培養液をインキュベートすることにより、ＯＧＤを１時間後に終了した。次に、神経細胞の形態変化が生じなかった場合には、ＯＧＤの１時間後に、ＡＳＩＣ電流を記録した。ＯＧＤ処置は、ＡＳＩＣ電流の大きさの軽度な増大を誘導した（対照群では１５２０＋１３８ｐＡ、Ｎ＝４４；ＯＤＡ１時間後の神経細胞では１８８６＋１８５ｐＡ、Ｎ＝４０、ｐ＜０．０５、図５Ａ及び５Ｂ）。より重要なことに、ＯＧＤは、電流減少の時間定数の増大により示されるＡＳＩＣ感受性抑制の劇的な低下を誘導した（対照の神経細胞では８１４．７＋５８．９ｍｓ、Ｎ＝６；ＯＧＤ後の神経細胞では１９２８．９＋３１５．７ｍｓ、Ｎ＝６、ｐ＜０．０１、図５Ａ及び５Ｃ）。ＡＳＩＣ１−／−マウスから培養された皮質神経細胞において、ｐＨの７．４から６．０への低下は、海馬神経細胞における従前の研究（Ｗｅｍｍｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）と同様に、いずれの内方向への電流も活性化しなかった（ｎ＝５２）。これらの神経細胞において、１時間のＯＧＤは、酸誘導性反応を活性化又は増大しなかった（図５Ｄ、ｎ＝１２及び１３）。
【０１０９】
（ｃ）アシドーシスは、ＡＳＩＣ１ａを介するグルタミン酸非依存性Ｃａ２＋侵入を誘導する
図６及び７は、皮質神経細胞におけるＡＳＩＣがＣａ２＋透過性でありうること、及び、Ｃａ２＋透過性がＡＳＩＣ１ａ依存性でありうることを示唆する典型的なデータを示す。図６Ａは、唯一の荷電担体として１０ｍＭのＣａ２＋を含有するＮａ＋不含のＥＣＦを用いて取得した典型的なトレースを示す。内方向の電流をｐＨ６．０にて記録した。平均逆転電位は、液界電位の修正後、約−１７ｍＶである（ｎ＝５）。図６Ｂは、アミロライド及びＰｃＴＸ毒による、Ｃａ２＋が介在する電流の阻害を表す代表的なトレース及び概要データを示す。Ｃａ２＋が介在する電流の大きさのピークは、１００μＭのアミロライドによって対照の値の２６％＋２％に減少し（ｎ＝６、ｐ＜０．０１）、１００ｎｇ／ｍＬのＰｃＴＸ毒によって２２％＋０．９％に減少した（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）。図７Ａは、ｐＨの関数として、典型的な３４０／３８０ｎｍ比を示し、ｐＨの６．０への低下による［Ｃａ２＋］ｉの増大を表す。神経細胞を、電圧依存性Ｃａ２＋チャンネル用阻害物質（５μΜのニモジピン及び１μΜのω−コノトキシン  ＭＶＩＩＣ）、並びに、グルタミン酸受容体（１０μΜのＭＫ８０１及び２０μΜのＣＮＱＸ）と共に、１．３ｍＭのＣａＣｌ２を含有する通常のＥＣＦ中に浸漬した。図７Ａの挿入図は、１００μΜのアミロライドによる、酸によって誘導される［Ｃａ２＋］ｉの増大の典型的な阻害を示す。図７Ｂは、アミロライド及びＰｃＴＸ毒による、酸によって誘導される［Ｃａ２＋］ｉの増大の阻害を表す典型的な概要データを示す。Ｎ＝６〜８、＊＊ｐ＜０．０１  ｐＨ６．０の群と比較。図７Ｃは、ｐＨの関数としての典型的な３４０／３８０ｎｍ比とＮＭＤＡの有無を示し、ＡＳＩＣ１−／−神経細胞における酸によって誘導される［Ｃａ２＋］ｉの増大の欠如を表し、神経細胞はＮＭＤＡに対して通常の反応を示したことを表す（ｎ＝８）。
【０１１０】
皮質神経細胞におけるＡＳＩＣのＣａ２＋透過性を、標準的なイオン置換プロトコール（Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｕｒｏｎ，１９９６，１７：９４５〜９５６）及びＦｕｒａ−２蛍光Ｃａ２＋イメージング技法（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．８７：２５５５〜２５６１）を用いて測定した。唯一の荷電担体として１０ｍＭのＣａ２＋を含有する（Ｎａ＋及びＫ＋は含有しない）浸漬溶液を用いて、−６０ｍＶの保持電位で、１８の神経細胞のうち１５に、５０ｐＡよりも大きい内方向の電流を記録した。このことにより、大部分の皮質神経細胞において、ＡＳＩＣの有意なＣａ２＋透過性が示される（図６Ａ）。ホモマー性のＡＳＩＣ１ａチャンネルの活性化と一致して、１０ｍＭのＣａ２＋によってもたらされる電流は、非特異的ＡＳＩＣ阻害剤アミロライド及びＡＳＩＣ１ａ特異的阻害剤ＰｃＴＸ毒の両方によって、大きく阻害された（図６Ｂ）。Ｃａ２＋が介在する電流の大きさのピークは、１００μＭのアミロライドによって対照の値の２６％＋２％に減少し（ｎ＝６、ｐ＜０．０１）、１００ｎｇ／ｍＬのＰｃＴＸ毒によって２２％＋０．９％に減少した（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）。Ｃａ２＋イメージングによって、その他の主要なＣａ２＋侵入経路の阻害剤（グルタミン酸受容体に対してＭＫ８０１  １０μΜ及びＣＮＱＸ  ２０μΜ；電圧依存性Ｃａ２＋チャンネルに対してニモジピン  ５μΜ及びω−コントキシンＭＶＩＩＣ  １μΜ）の存在下で、２０の神経細胞のうち１８が、細胞内Ｃａ２＋（［Ｃａ２＋］ｉ）濃度の検出可能な増大と共に、ｐＨ低下に対して反応した（図７Ａ）。一般的に、［Ｃａ２＋］ｉは、低ｐＨ溶液の長い潅流時に上昇したままである。いくつかの細胞において、［Ｃａ２＋］ｉ増大は、酸による潅流の期間よりもずっと長く続いた（図７Ａ）。長く続くＣａ２＋反応は、無傷の神経細胞におけるＡＳＩＣ反応が、全細胞記録における反応よりも感受性抑制が低い可能性があること、又は、ＡＳＩＣを介したＣａ２＋侵入によって、結果として、細胞内の貯蔵場所からＣａ２＋が放出されることを示唆する。１μΜのタプシガルジンによる神経細胞のプレインキュベーションは、Ｃａ２＋増大の持続的成分を部分的に阻害した。このことは、細胞内の貯蔵場所からＣａ２＋が放出されることも、酸によって誘導される細胞内Ｃａ２＋の蓄積に寄与しうることを示す（ｎ＝６、データ示さず）。Ｃａ２＋イオンによってもたらされる電流と同様に（図６Ｂ）、［Ｃａ２＋］ｉのピーク及び持続的増大の両方が、酸によって誘導される［Ｃａ２＋］ｉの増大におけるホモマー性のＡＳＩＣ１ａの関与と一致して、アミロライド及びＰｃＴＸ毒によって大きく阻害される（図７Ａ及び７Ｂ、ｎ＝６〜８）。ＡＳＩＣＩ遺伝子のノックアウトは、全ての神経細胞において、ＮＭＤＡ受容体が介在するＣａ２＋反応に影響を与えることなく、酸によって誘導される［Ｃａ２＋］ｉの増大を排除した（図７Ｃ、ｎ＝８）。パッチクランプ記録により、ＡＳＩＣ１ａサブユニットの不在と一致して、ｐＨ６．０で、５２のＡＳＩＣ１−／−神経細胞のうちの５２で、酸によって活性化される電流の欠如が示された。しかしながら、ｐＨを５．０又は４．０まで低下させること��より、５２のＡＳＩＣ１−／−神経細胞のうちの２４で検出可能な電流を活性化した。このことにより、これらの神経細胞におけるＡＳＩＣ２ａサブユニットの存在が示唆される（図７Ｄ）。さらなる電気生理学的研究によって、ＡＳＩＣ１−／−神経細胞が、様々な電圧依存性チャンネル及びＮＭＤＡ、ＧＡＢＡ受容体依存性チャンネルに対して通常の反応を有することが示された（データ示さず）。
【０１１１】
（ｄ）ＡＳＩＣ阻害は、アシドーシスによって誘導される、グルタミン酸非依存性の神経損傷を保護する
図８は、酸によるインキュベーションが、ＡＳＩＣ阻害によって保護されるグルタミン酸受容体非依存性の神経損傷を誘導しうることを示唆する典型的なデータを示す。図８Ａ及び８Ｂは、ｐＨ７．４（黒いバー）又は６．０（白いバー）のＥＣＦ中での皮質神経細胞の１時間（図８Ａ）又は２４時間（図８Ｂ）のインキュベーションによって誘導される時間依存性のＬＤＨ放出についての典型的なデータを表すグラフを示す。Ｎ＝２０〜２５ウェル、＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１、同じ時点でのｐＨ７．４の群と比較（フルオロセイン二酢酸塩（ＦＤＡ）を用いた酸誘導性神経損傷はまた、生きている神経細胞の細胞体の染色、並びに、死んだ神経細胞の核のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色により分析した。図８Ｃは、１００μΜのアミロライド又は１００ｎｇ／ｍＬのＰｃＴＸ毒による、酸誘導性ＬＤＨ放出の阻害を表すグラフを示す（ｎ＝２０〜２７、＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１）。ＭＫ８０１、ＣＮＱＸ、及びニモジピンは、全ての実験におけるＥＣＦ中に含有させた（図８Ａ〜Ｃ）。
【０１１２】
酸誘導性損傷を、ＭＫ８０１、ＣＮＱＸ、及びニモジピンを含有する、ｐＨ７．４又は６．０いずれかのＥＣＦ中、２４ウェル上で進行させた（図８参照）。細胞損傷は、様々な時点（図８Ａ及び８Ｂ）における乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出の測定により（ＫｏｈとＣｈｏｉ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９８７，２０：８３〜９０）、並びに、生細胞／死細胞の蛍光染色によりアッセイを行った。ｐＨ７．４での神経細胞の処理と比較して、１時間の酸によるインキュベーション（ｐＨ６．０）は、ＬＤＨ放出において時間依存性の増大を誘導した（図８Ａ）。２４時間後、４５．７％＋５．４％の最大ＬＤＨ放出が誘導された（ｎ＝２５ウェル）。ｐＨ６．０での連続的処理によって、より大きな細胞損傷が誘導された（図８Ｂ、ｎ＝２０）。ＬＤＨアッセイと一致して、フルオロセイン二酢酸塩及びヨウ化プロピジウムによる生細胞／死細胞染色によって、１時間の酸処理による細胞死において同様の増大が示された（データ示さず）。ｐＨ６．５のＥＣＦによる１時間のインキュベーションもまた、ｐＨ６．０のＥＣＦによる場合と比較して、有意ではあるがより少ないＬＤＨ放出を誘導した（ｎ＝８ウェル、データ示さず）。
【０１１３】
酸誘導性ＬＤＨ放出に対するアミロライド及びＰｃＴＸ毒の効果を、ＡＳＩＣの活性化が、酸誘導性グルタミン酸受容体非依存性神経損傷に関与するかどうかを調べるために試験した。酸インキュベーションの１０分前及び１時間のその間に、１００μΜのアミロライド又は１００ｎｇ／ｍＬのＰｃＴＸ毒のいずれかを添加することによって、ＬＤＨ放出を有意に減少させた（図８Ｃ）。２４時間の時点で、ＬＤＨ放出は、４５．３％＋３．８％から、アミロライドにより３１．１％＋２．５％へ、ＰｃＴＸ毒により２７．９％＋２．６％へ減少した（ｎ＝２０〜２７、ｐ＜０．０１）。ｐＨ７．４のＥＣＦ中での、１時間のアミロライド又はＰｃＴＸ毒の添加は、基線となるＬＤＨ放出に影響を与えなかったが、アミロライド単独との長時間にわたるインキュベーション（例えば、５時間）は、ＬＤＨ放出を増大させた（ｎ＝８、データ示さず）。
【０１１４】
（ｅ）ホモマー性のＡＳＩＣ１ａの活性化は、アシドーシスによって誘導される損傷を担っている
図９は、ＡＳＩＣ１ａがインビトロにおいて酸誘導性損傷に関与しうることを示唆する典型的なデータを表す一連のグラフである。図９Ａは、［Ｃａ２＋］ｅの減少による、酸誘導性ＬＤＨ放出の阻害を表す典型的なデータを示す（ｎ＝１１〜１２、＊＊ｐ＜０．０１  ｐＨ６．０、１．３のＣａ２＋と比較）。図９Ｂは、酸インキュベーションによって、ＡＳＩＣ１ａをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞ではＬＤＨ放出が増大したが、トランスフェクトしていないＣＯＳ−７細胞では増大しなかったことを表す典型的なデータを示す（ｎ＝８〜２０）。アミロライド（１００μΜ）は、ＡＳＩＣ１ａをトランスフェクトした細胞では酸誘導性ＬＤＨ放出を阻害した。＊ｐ＜０．０５  ７．４対６．０について、及び、６．０対６．０＋アミロライドについて。図９Ｃは、ＡＳＩＣ−／−神経細胞における誘導性損傷の欠如、並びに、アミロライド及びＰｃＴＸ毒による保護を表す典型的なデータを示す（各群ｎ＝８、ｐ＞０．０５）。図９Ｄは、ＯＧＤ条件下、培養皮質神経細胞でＬＤＨ放出の酸誘導性増大を表す典型的なデータを示す（ｎ＝５）。１時間のＯＧＤ／アシドーシスの組み合わせにより誘導されたＬＤＨ放出は、トロロックス及びＬ−ＮＡＭＥによっては阻害されなかった（ｎ＝８〜１１）。ＯＧＤはＡＳＩＣ１−／−神経細胞において酸誘導性ＬＤＨ放出を増大しなかった。＊＊ｐＨ７．４対ｐＨ６．０についてｐ＜０．０１、及び、ｐＨ６．０対６．０＋ＰｃＴＸ毒について＊ｐ＜０．０５。ＭＫ８０１、ＣＮＱＸ、及びニモジピンは、全ての実験におけるＥＣＦ中に含有させた（図９Ａ〜Ｄ）。
【０１１５】
神経細胞を、正常又は減少した［Ｃａ２＋］ｅの存在下、ｐＨ６．０のＥＣＦを用いて、Ｃａ２＋侵入が酸誘導性において役割を担っているかどうかを調べるために処理した（図９参照）。Ｃａ２＋の１．３から０．２ｍＭへの減少は、ＰｃＴＸ毒によるＡＳＩＣ１ａ阻害と同様に（ｎ＝１１〜１２、ｐ＜０．０１；図９Ａ）、酸誘導性ＬＤＨ放出を阻害した（４０．０％＋４．１％から２１．９％＋２．５％へ）。Ｃａ２＋不含の溶液は、Ｃａ２＋感受性カチオンチャンネルを介して大きな内方向への電流を活性化しうるので試験しなかった。さもなければ、それによって、データ解釈が複雑になりうる。非特異的及び特異的ＡＳＩＣ１ａ阻害剤であるアミロライド及びＰｃＴＸの両方による、並びに、［Ｃａ２＋］ｅを減少させることによる、酸損傷の阻害は、Ｃａ２＋透過性ＡＳＩＣ１ａの活性化が、酸誘導性神経損傷に関与しうることを示唆する。
【０１１６】
トランスフェクトしていないＣＯＳ−７細胞及びＡＳＩＣ１ａをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の酸損傷を、ＡＳＩＣ１ａの活性化が酸損傷に関与しているさらなる証拠を提供するために試験した。ＣＯＳ−７は、内因性のチャンネルを欠如することから、ＡＳＩＣの発現のために一般的に使用されている細胞系である。集密化後（プレーティングしてから３６〜４８時間後）、細胞を、ｐＨ７．４又は６．０のいずれかのＥＣＦを用いて、１時間処理した。酸インキュベーションの２４時間後にＬＤＨ放出を測定した。トランスフェクションしていないＣＯＳ−７細胞のｐＨ６．０のＥＣＦによる処理は、ｐＨ７．４の処理した細胞と比較した場合に、ＬＤＨ放出の増大を誘導しなかった（ｐＨ７．４に対して１０．３％＋０．８％、及び、ｐＨ６．０に対して９．４％＋０．７％、Ｎ＝１９及び２０ウェル；ｐ＞０．０５、図９Ｂ）。しかしながら、ＡＳＩＣ１ａを用いて安定してトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞において、ｐＨ６．０での１時間のインキュベーションは、１５．５％＋２．４％から２４．０％＋２．９％へとＬＤＨ放出を有意に増大させた（ｎ＝８ウェル、ｐ＜０．０５）。アミロライド（１００μΜ）の添加は、これらの細胞における酸誘導性ＬＤＨ放出を阻害した（図９Ｂ）。
【０１１７】
ＧＦＰ単独又はＧＦＰ＋ＡＳＩＣ１ａをコードするｃＤＮＡを用いて一過的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の酸損傷についても研究した。トランスフェクション後（２４〜３６時間）、細胞を酸性（ｐＨ６．０）で１時間インキュベートし、酸インキュベーションの２４時間後に、細胞損損傷についてアッセイした。１時間の酸インキュベーションは、ＧＦＰ／ＡＳＩＣ１ａ群において、生存しているＧＦＰ陽性細胞を大きく減少させたが、ＧＦＰ単独でトランスフェクトした群においては減少させなかった（データ示さず）。
【０１１８】
ＡＳＩＣ＋／＋及びＡＳＩＣ１−／−マウスから培養された皮質神経細胞における細胞毒性実験は、アシドーシス誘導性神経損傷におけるＡＳＩＣ１ａの関与をさらに示すために行われた。さらに、ｐＨ６．０でのＡＳＩＣ＋／＋神経細胞の１時間の酸インキュベーションは、アミロライド及びＰｃＴＸ毒によってもたらされる実質的なＬＤＨ放出を誘導した（ｎ＝８〜１２）。しかしながら、ＡＳＩＣ１−／−神経細胞の１時間の酸処理は、２４時間の時点でＬＤＨ放出の有意な増大を誘導しなかった（ｐＨ７．４に対して１３．８％＋０．９％、及び、ｐＨ６．０に対して１４．２％＋１．３％、Ｎ＝８、ｐ＞０．０５）。このことにより、これらの神経細胞の酸損傷に対する抵抗性が示唆される（図９Ｃ）。さらに、ＡＳＩＣ１遺伝子のノックアウトも、アミロライド及びＰｃＴＸ毒の酸誘導性ＬＤＨ放出の効果を排除した（図９Ｃ、それぞれｎ＝８）。さらにこれにより、アミロライド及びＰｃＴＸ毒による、皮質神経細胞の酸誘導性損傷の阻害が、ＡＳＩＣ１サブユニットの阻害によることが示された（図８Ｃ）。酸インキュベーションとは対照的に、ＡＳＩＣ１−／−神経細胞の１ｍＭのＮＭＤＡ＋１０μΜのグリシン（Ｍｇ２＋不含の[ｐＨ７．４]のＥＣＦ中）による１時間の処理は、２４時間の時点で最大ＬＤＨ放出の８４．８％＋１．４％を誘導した（ｎ＝４、図９Ｃ）。このことにより、その他の細胞損傷プロセスに対する通常の反応が示された。
【０１１９】
（ｆ）  モデル化された虚血は、ＡＳＩＣを介してアシドーシスによって誘導されるグルタミン酸非依存性神経細胞損傷を増大させる
ＡＳＩＣ電流の大きさは、膨潤している脳虚血細胞の細胞成分及び神経化学的成分、アラキドン酸、並びに、乳酸によって増大されうる。さらに、より重要なことに、ＡＳＩＣ電流の感受性抑制は、モデル化された虚血によって劇的に減少しうる（図５Ａ及び５Ｃ）。虚血状態におけるＡＳＩＣの活性化は、より大きな神経細胞損傷を生じることが予想される。この仮説を試験するために、酸素及びグルコース枯渇（ＯＧＤ）条件下、神経細胞を１時間の酸処理に供した。ＭＫ８０１、ＣＮＱＸ、及びニモジピンは、電圧依存性Ｃａ２＋チャンネル及びＯＧＤに関連する細胞におけるグルタミン酸受容体が介在する細胞損傷を阻害するために全ての溶液に含有させた。ＯＧＤ条件下、ｐＨ７．４のＥＣＦでの１時間のインキュベーションは、２４時間の時点で最大ＬＤＨ放出の２７．１％＋３．５％を誘導したに過ぎない（ｎ＝５、図９Ｄ）。この知見は、１時間のＯＧＤが、グルタミン酸受容体及び電圧依存性Ｃａ２＋チャンネルの阻害による実質的な細胞損傷を誘導しないという従前の報告と一致する（Ａａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。しかしながら、アシドーシス（ｐＨ６．０）と組み合わさった場合、１時間のＯＧＤは、最大ＬＤＨ放出の７３．９％＋４．３％を誘導し（ｎ＝５、図９Ｄ、ｐ＜０．０１）、これは、ＯＧＤ条件下でない場合の酸誘導性ＬＤＨ放出よりも有意に大きい（ＦＩＧ．  図８Ａ参照、ｐ＜０．０５）。ＡＳＩＣ１ａ阻害剤であるＰｃＴＸ毒（１００ｎｇ／ｍＬ）の添加は、酸／ＯＧＤによって誘導されるＬＤＨ放出を４４．３％＋５．３％まで有意に誘導した（ｎ＝５、ｐ＜０．０５、図９Ｄ）。
【０１２０】
同じ実験を、ＡＳＩＣｌ７−／−マウス由来の培養神経細胞を用いて行った。しかしながら、ＡＳＩＣＩを含有する神経細胞の場合と異なり、ＡＳＩＣ１−／−神経細胞においては、ＯＧＤ及び酸を組み合わせた１時間の処理は、わずかにＬＤＨ放出を増大したに過ぎない（２６．１％＋２．７％から３０．４％＋３．５％へ、Ｎ＝１０〜１２、図９Ｄ）。この知見は、ＯＧＤによる酸誘導性損傷の増大が、ＡＳＩＣＩが介在する毒性のＯＧＤによる増大の大きな原因でありうることを示唆する。
【０１２１】
反応性酸素／窒素種によって活性化されるＣａ２＋透過性カチオン導電性の活性化によって、グルタミン酸受容体依存性神経損傷を生じうることがこれまでに示されている（Ａａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００３，１  １５：８６３−８７７）。長期間のＯＧＤによって誘導された細胞損傷は、フリーラジカルを直接回収する薬剤（例えば、トロロクス）又はフリーラジカルの生成を減少させる薬剤（例えば、Ｌ−ＮＡＭＥ）のいずれかにより劇的に減少させうる。神経損傷を引き起こした短期間のＯＧＤとアシドーシスとの組み合わせが、同様のメカニズムが関与するかどうかを調べるために、ＯＧＤ／酸によって誘導されたＬＤＨ放出に対するトロロクス及びＬ−ＮＡＭＥの効果について試験した。図９Ｄに示されるように、トロロクス（５００μΜ）及びＬ−ＮＡＭＥ（３００μＭ）のいずれも、１時間のＯＧＤ／アシドーシスの組み合わせによって誘導された神経損傷に対して有意な効果を示さなかった（ｎ＝８〜１１）。追加の実験も、ＡＳＩＣ阻害剤であるアミロライド及びＰｃＴＸ毒はＴＲＰＭ７チャンネルの導電性に対して効果を全く示さないことを示した（Ａａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ上掲）。まとめると、これらの知見は、ＴＲＰＭ７チャンネルでなく、ＡＳＩＣの活性化が、１時間のＯＧＤ／アシドーシスの組み合わせによって誘導された神経損傷が本出願人らの研究において大きな役割を果たしうることを強く示唆する。
（ｇ）  インビボでの虚血性脳損傷におけるＡＳＩＣ１ａの活性化
図１０は、インビボでの脳虚血におけるＡＳＩＣＩ阻害及びＡＳＩＣＩ遺伝子ノックアウトによる神経保護を表すデータを示す。図１０Ａは、ＴＴＣ染色された脳切片から得られた典型的なデータのグラフを示し、このデータは、ａＣＳＦ（ｎ＝７）、アミロライド（ｎ＝１１）、又はＰｃＴＸ毒（ｎ＝５）を注入したラット由来の脳における染色された容積（「梗塞容積」）を示す。＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１  ａＣＳＦを注入した群と比較。図１０Ｂは、ＡＳＩＣ１−／−マウス由来の脳における梗塞容積の減少を表す典型的なデータのグラフを示す（各群についてｎ＝６）。＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１  ＋／＋を有する群と比較。図１０Ｃは、１０ｍｇ／ｋｇのメマンチン（Ｍｅｍ）を腹腔内投与した、又は、ＰｃＴＸ毒（５００ｎｇ／ｍＬ）の脳室内投与を伴い、メマンチンを腹腔内投与したマウス由来の脳における梗塞容積の減少を表す典型的なデータのグラフを示す。＊＊ｐ＜０．０１  ａＣＳＦ注入と比較、並びに、メマンチン及びメマンチン＋ＰｃＴＸ毒と比較（各群に対してｎ＝５）。図１０Ｄは、メマンチンを腹腔内投与した、ＡＳＩＣ１＋／＋（野生型）又はＡＳＩＣ１−／−マウスのいずれか由来の脳における梗塞容積の減少を表す典型的なデータのグラフを示す（各群においてｎ＝５）。＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１。
【０１２２】
一過性の局所性虚血のラットモデルにおけるアミロライド及びＰｃＴＸ毒の保護的効果（Ｌｏｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ，１９８９，２０：８４〜９１）を、ＡＳＩＣ１ａの活性化がインビボでの虚血性脳損傷に関与するかどうかを調べるために試験した。虚血（１００分間）を、一過性の中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）によって誘導した。合計で６μｌの人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ）単独、ａＣＳＦ含有アミロライド（１ｍＭ）、又はＰｃＴＸ毒（５００ｎｇ／ｍＬ）を、虚血の３０分前及び３０分後で脳室内に注入した。４週齢のラットの脳室内液及び脊髄液の容量は、約６０μｌであると推定される。注入されたアミロライド及びＰｃＴＸは、ＣＳＦ中で均一に分布していると思われるので、アミロライドについては−１００μΜ及びＰｃＴＸについては−５０ｎｇ／ｍＬの濃度が予想され、この濃度は、細胞培養実験で有効であることが見出されている濃度である。梗塞容積は、虚血後２４時間の時点で、ＴＴＣ染色によって測定した（Ｂｅｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ，１９８６，１７：１３０４〜１３０８）。虚血（１００分間）によって、ａＣＳＦを注入したラット（ｎ＝７）において３２９．５＋２５．６ｍｍ３の梗塞容積を生じたが、アミロライドを注入したラット（ｎ＝１１、ｐ＜０．０５）においてはわずか２２９．７＋４１．１ｍｍ３及びＰｃＴＸ毒を注入したラット（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）においては１３０．４＋５５．０ｍｍ３（約６０％の減少）の梗塞容積を生じた（図１０Ａ）。
【０１２３】
ＡＳＩＣ１−／−マウスを、インビボでの虚血性脳損傷におけるＳＩＣ１ａの関与をさらに示すために使用した。オスのＡＳＩＣ１＋／＋、ＡＳＩＣ１＋／−、及びＡＳＩＣ１−／−マウス（約２５ｇ、類遺伝子性のＣ５７Ｂ  １６バックグラウンドを有する）を、従前に記載されているように（Ｓｔｅｎｚｅｌ−Ｐｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｌａｎｃｅｔ，２００３，３６２：１０２８〜１０３７）、６０分間のＭＣＡＯに供した。ＡＳＩＣ１ａの薬理学的阻害による保護と一致して（上記）、−／−マウスは、＋／＋マウス（８４．６＋１０．６ｍｍ３、Ｎ＝６、ｐ＜０．０１）と比較して、有意に小さい（約６１％減少）梗塞容積（３２．９＋４．７ｍｍ３、Ｎ＝６）を示した。＋／−も減少した梗塞容積（５６．９＋６．７ｍｍ３、Ｎ＝６、ｐ＜０．０５）を示した（図１０Ｂ）。
【０１２４】
ＡＳＩＣ１ａチャンネルの阻害又はＡＳＩＣ１遺伝子のノックアウトが、インビボでのさらなる保護を提供しうるかどうかを調べるために、グルタミン酸受容体阻害が確立した状態において、６０分間のＭＣＡＯの直後に、メマンチン（１０ｍｇ／ｋｇ）をＣ５７Ｂ  １６マウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）に注入し、虚血の１５分前及び１５分後に０．４μｌの総容量のａＣＳＦ単独又はＰｃＴＸ毒を含有するａＣＳＦ（５００ｎｇ／ｍＬ）の脳室内注入（ｉ．ｃ．ｖ．）を伴った。生理食塩水を腹腔内投与し、ａＣＳＦを脳室内投与した対照のマウスにおいて、６０分間のＭＣＡＯは１２３．６＋５．３ｍｍ３の梗塞容積を誘導した（ｎ＝５、図１０Ｃ)。メマンチンを腹腔内投与し、ａＣＳＦを脳室内投与したマウスにおいて、同じ期間の虚血は、７３．８＋６．９ｍｍ３の梗塞容積を誘導した（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）。しかしながら、メマンチン及びＰｃＴＸ毒を注入したマウスでは、わずかに４７．０＋１．１ｍｍ３の梗塞容積が誘導された（ｎ＝５、ｐ＜０．０１  対照及びメマンチン群の両方と比較、図１０Ｃ）。これらのデータは、ホモマー性のＡＳＩＣ１ａが、ＮＭＤＡ受容体阻害が確立した状態において、インビボ虚血におけるさらなる保護を提供しうることを示唆する。薬理学的ＮＭＤＡ阻害により処理されたＡＳＩＣ１−／−マウスにおいて、さらなる保護も観察された（図１０Ｄ）。生理食塩水又は体重１Ｋｇあたり１０ｍｇのメマンチンを腹腔内注入されたＡＳＩＣ＋／＋マウスにおいて、６０分間のＭＣＡＯは、それぞれ、１０１．４＋９．４ｍｍ３又は６１．６＋１２．７  ｍｍ３の梗塞容積を誘導した（各群においてｎ＝５、図１０Ｄ）。しかしながら、メマンチンを注入したＡＳＩＣ１−／−マウスでは、同じ虚血期間で、２７．７＋１．６ｍｍ３（ｎ＝５）の梗塞容積が誘導され、メマンチンを注入したＡＳＩＣ１＋／＋マウスの梗塞容積よりも有意に小さかった（ｐ＜０．０５）。
【０１２５】
まとめると、これらのデータは、Ｃａ２＋透過性ＡＳＩＣ１ａの活性化が、虚血性脳損傷の根底にある新規のグルタミン酸依存性生物学的メカニズムであることを示す。
【０１２６】
実施例２：ＰｃＴＸ神経保護の時間窓
本実施例は、げっ歯類での卒中の発症後の異なる時間におけるＰｃＴＸ毒の神経保護効果を測定する典型的な実験について記載する（図１１参照）。簡潔に述べると、げっ歯類において、脳虚血（卒中）を中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）によって誘導した。誘導後、指示された時間において、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）、ＰｃＴＸ毒（０．５μＬ、５００ｎｇ／ｍＬ  総タンパク質）、又は不活性化（煮沸された）毒を、各げっ歯類動物の側脳室内に注入した。図１１に示されるように、ＰｃＴＸ毒の投与によって、卒中発症の１時間後及び３時間後の両方で卒中容積の６０％の減少がもたらされた。さらに、ＭＣＡＯの発症後５時間処置が控えられている場合、実質的な卒中容積の減少は、依然として維持されうる。したがって、ＡＳＩＣ阻害による神経保護は、卒中発症後長い治療的時間窓を有することができ、これにより、卒中対象は、卒中が開始してから数時間後に行われる処置から恩恵を受けうる。卒中に対する神経保護についてのＡＳＩＣ阻害のこの効果は、グルタミン酸アンタゴニストを用いたＮＭＤＡ受容体（実験的卒中治療に対する主要な標的）のカルシウムチャンネル阻害の効果よりもずっと強固である。これまで、ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害で示されたようなそのような選択的プロファイルを示すグルタミン酸アンタゴニストは存在しなかった。
【０１２７】
実施例３：典型的なシスチンノットペプチド
本実施例は、全長ＰｃＴｘ１及びＰｃＴｘの欠失誘導体などの典型的なシスチンノットペプチドについて記載し、それらは、培養細胞中でスクリーニングされ、虚血動物（例えば、マウス又はラットなどのげっ歯類）において試験され、及び／又は、虚血ヒト対象に投与されうる。
【０１２８】
図１２は、５０で示される、一文字コードの、典型的なシスチンノットペプチド、ＰｃＴｘ１の一次アミノ酸配列（配列番号１）を示し、このペプチドは、アミノ酸位置１〜４０と比較して示される様々な典型的なペプチドの特徴を有する。ペプチド５０は、シスチンノットモチーフ５８を生じるシスチン結合５２、５４、５６を形成する６個のシステイン残基を含みうる。このペプチドはまた、一つ以上のβシート領域６０及び正に荷電した領域６２を含みうる。Ｎ末端領域６４及びＣ末端領域６６はシスチンノットモチーフに隣接しうる。
【０１２９】
図１３は、図１２のＰｃＴｘ１ペプチド５０を、様々な典型的なこのペプチドの欠失誘導体と整列させた比較を示す。これらの誘導体は、Ｎ末端の欠失７０（配列番号２）、部分的なＣ末端の欠失７２（配列番号３）、完全なＣ末端の欠失７４（配列番号４）、及び／又はＮ／Ｃ末端の欠失７６（配列番号５）を含んでもよい。ＰｃＴｘ１のその他の誘導体は、例えば、元のＰｃＴｘ１配列の少なくとも約２５％又は約５０％の配列類似性又は同一性を維持しながら、一つ以上のアミノ酸の任意の欠失、挿入、又は置換を含んでもよい。
【０１３０】
各ＰｃＴｘ１誘導体を、ＡＳＩＣタンパク質を選択的に阻害するその能力について、及び／又は、もしあれば、虚血に対する効果について試験しうる。任意の適当な試験系を、この試験を行うために用いることができ、その例としては、任意の細胞系アッセイシステム及び／又は本願の教示における他の場所に記載された動物モデル系が挙げられる。ＰｃＴｘ１誘導体はまた、又は、或いは、虚血ヒト対象において試験しうる。
【０１３１】
実施例４：ＡＳＩＣ１ａに対するＰｃＴＸ毒の選択性
本実施例は、培養細胞中で発現されるその他のＡＳＩＣタンパク質又はＡＳＩＣタンパク質の組み合わせと比較して、ＡＳＩＣ１ａ単独に対するＰｃＴＸ毒（及び、すなわち、ＰｃＴｘ１毒素）の選択性を測定する実験について記載する。指定されたＡＳＩＣタンパク質を発現するＣＯＳ−７細胞を、ＰｃＴＸ毒（ＡＳＩＣ１ａ発現細胞においては２５ｎｇ／ｍＬ、並びに、ＡＳＩＣ２ａ、ＡＳＩＣ３又はＡＳＩＣ１ａ＋２ａ発現細胞においては５００ｎｇ／ｍＬ）を用いて処理した。チャンネル電流を、最大チャンネル活性化状態の半分の状態のｐＨ（ｐＨ０．５）で測定した。図１４に示されるように、ＰｃＴＸ毒は、２５ｎｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、ＡＳＩＣ１ａのホモマー性チャンネルが介在する電流の大部分を阻害し、５００ｎｇ／ｍＬで、ホモマー性のＡＳＩＣ２ａ、ＡＳＩＣ３、又はヘテロマー性のＡＳＩＣ１ａ／ＡＳＩＣ２ａが介在する電流に対しては影響が無かった（ｎ＝３〜６）。５００ｎｇ／ｍＬで、ＰｃＴＸ毒はまた、その他のリガンド依存性チャンネル（例えば、ＮＭＤＡ及びＧＡＢＡ需要体依存性チャンネル）及び電圧依存性チャンネル（例えば、Ｎａ＋、Ｃａ２＋、及びＫ＋チャンネルｓ）が介在する電流に対して影響が無かった（ｎ＝４〜５）。これらの実験は、ＰｃＴＸ毒、すなわち、ＰｃＴｘ１ペプチドが、ホモマー性のＡＳＩＣ１ａに対する特異的な阻害剤であることを示す。この細胞系アッセイシステムを用いて、ＡＳＩＣ阻害の効力及び選択性を、様々な合成ペプチド又はその他の候補阻害剤について測定しうる（例えば、実施例３参照）。
【０１３２】
実施例５：神経保護性であるＰｃＴＸ毒の経鼻投与
本実施例は、卒中の動物モデル系における虚血誘導性損傷を減少させるためにＰｃＴＸ毒を経鼻投与する有効性を示す典型的なデータを記載する。脳内虚血を、オスのマウスにおいて、中大脳動脈閉塞により誘導した。閉塞を開始してから１時間後に、動物を対照として処置するか又はＰｃＴＸ毒を用いて処置した（５０μＬの５ｎｇ／ｍＬ（総タンパク質）であるＰｃＴｘ毒を経鼻的に導入する）。図１５に示されるように、対照処置と比較して、ＰｃＴＸ毒の経鼻投与によって、梗塞容積で定義されるように、虚血誘導性損傷（虚血性損傷）の５５％の減少がもたらされた。経鼻投与は、肺内へ吸入させるよりも鼻腔内に物質として堆積させるスプレーを介して行ってもよく、及び／又は、少なくとも部分的に肺内に吸入させるエアロゾルを介して行ってもよい。いくつかの例において、経鼻投与は、その他の投与経路と比較して、脳へのより有効な送達及び／又は虚血対象による自己投与に対する適合性などの多くの利点を有しうる。
【０１３３】
実施例６：アミロライド及びアミロライド類似体によるＡＳＩＣ１ａチャンネルの阻害
図１６に示されるように、アミロライド及びアミロライド類似体ベンザミル、フェナミル及びＥＩＰＡは、用量依存的様式でＡＳＩＣ１ａ電流を阻害する。同様に、アミロライド及びアミロライド類似体ベンザミル及びＥＩＰＡは、用量依存的様式でＡＳＩＣ２ａ電流を阻害する（図１７）。表１は、アミロライド及びアミロライド類似体によるＡＳＩＣ１ａチャンネルの阻害を要約する。アミロライドは、７．７μΜのＩＣ５０を有する、このチャンネルの有効な阻害物質であった。
【表１】
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【０１３４】
実施例７：アミロライド及びアミロライド類似体の脳室内注入によるマウスにおける梗塞容積の減少
マウスを６０分間の上記した中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）に供した。アミロライド又はアミロライド類似体ベンザミル、ベプリジル（ｂｅｐｒｉｄｅｌ）、ＥＩＰＡ又はＫＢ−Ｒ７９４３を、ＭＣＡＯの１時間後に脳室内注入により投与した。動物は虚血誘導の１日後に評価した。図１８に示されるように、アミロライド又はアミロライド類似体ベンザミル、ベプリジル（ｂｅｐｒｉｄｅｌ）、ＥＩＰＡ又はＫＢ−Ｒ７９４３の脳室内注入は、梗塞容積を有効に減少する。
【０１３５】
実施例８：アミロライドの静脈内注入によるマウスにおける梗塞容積の減少
マウスを６０分間の上記した中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）に供した。アミロライドを、ＭＣＡＯの１、３又は５時間後に静脈内注入により投与した。動物は虚血誘導の１日後に評価した。図１９に示されるように、アミロライドの静脈内注入は、梗塞容積を有効に減少する。アミロライドが有効にＣＮＳへ浸透することは、血液脳関門が脳虚血／再灌流が続いて起こりやすいという事実によって説明しうる。図２０は、アミロライドの静脈内注入が５時間という長い治療的時間窓を有することを示す。
【０１３６】
実施例９：様々なチャンネルに関する疎水性アミロライド類似体の構造活性相関
表１に示されるように、アミロライドのＣ５アミノ基をアルキル基と置換することにより、ＡＳＩＣ１ａチャンネルの効力の増大をもたらした。同じ置換が、ＡＳＩＣ３チャンネルの効果を増大した（Ｋｕｄｕｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００９，１９：２５１４−２５１８）。その構造体のグアニジノ部分上に疎水性基を置換した場合には、逆の結果が得られた。実際、ベンジル置換されたグアニジノ類似体であるベンザミルは、試験した中で最も強力なＡＳＩＣ１ａ阻害化合物であった（ＩＣ５０＝４．９μΜ）。まとめると、これらの結果から、アミロライドが、７．７μΜのＩＣ５０を有する、ＡＳＵＣ１ａの有効な阻害物質であることが示された。それらは、ＡＳＩＣ１ａチャンネルを阻害しうるアミロライド類似体を設計するための構造活性相関も提供する（図２１参照）。したがって、いくつかの実施形態において、アミロライド類似体は、アミロライド構造のグアニジン部分に変化を導入することにより生成される。アミロライドは、Ｎａ＋／Ｃａ２＋イオン交換体の非常に弱い阻害剤に過ぎない（ＩＣ５０＝１．１ｍＭ）ので、アミロライド類似体も同様に、Ｎａ＋／Ｃａ２＋イオン交換体の非常に弱い阻害剤である可能性がある。いくつかの実施形態において、アミロライド類似体は、ＡＳＩＣ３チャンネルと比較してＡＳＩＣ１ａに対して高い選択性を有するように設計される。その他の実施形態において、環構造、例えば、環状グアニジン基が、ＡＳＩＣ１ａ電流の阻害活性を増大させるために、アミロライド構造中に導入される。アミロライドの１個以上のＮＨ基が３位のアミノ基又はイオンチャンネルと内部で水素結合を形成することも可能である。
【０１３７】
マウスのインビボでの結果により、３２．５μΜの血漿中濃度（５０μｌｘ１ｍＭのｉｖ用量）及び１２．５μΜの全脳内濃度（１μｌｘ５００μΜのｉｃｖ用量）で効能が達成しうることが示された。すなわち、ヒトの卒中のための急性治療に適当な有効濃度を獲得するためにはわずか１０倍の濃度の増大が必要とされることが推定される。したがって、新規類似体を、アミロライド及びベンザミルに対する４〜８μΜという値から１μΜより低い値へと、増大したＡＳＩＣ１ａのＩＣ５０濃度について、スクリーニングする。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、アミロライド類似体は、ベンザミルのメチル化類似体（図２１の式１〜５）及びベンザミルのアミジノ類似体（図２１の式６）を含む。その他の実施形態において、アミロライド類似体は、グアニジン基上に形成された１個の環を含む。その他の実施形態において、アミロライド類似体は、ＡＳＩＣ１ａ電流に対する増大した阻害効力のためにアシルグアニジノ基を含む。
【０１３９】
アミロライドは、１ｍＭで水に溶解し、１回の注入あたり５０μｌの用量でマウスモデルの虚血を処置するのに有効である。６５ｋｇのヒトを基準としたｍｇ／ｋｇでの等価用量は、４０ｍｇに近く、１６０ｍｌを超える注入用量を必要とするであろう。同様に、ベンザミルは、０．９％生理食塩水中で０．４ｍｇ／ｍｌ（１．７ｍＭ）の報告されている溶解性を有し、これにより、１０ｍｌの注入でわずか５ｍｇのベンザミル二塩酸塩の投与が可能となるに過ぎない。したがって、高い水溶性を有するアミロライド類似体が望ましい。いくつかの実施形態において、アミロライド類似体は、水溶性を向上させるために、グアニジノ基に水溶性基、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基又は糖を含む。いくつかの実施形態において、アミロライド類似体は、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ又はそれ以上の水溶性を有する。その他の実施形態において、アミロライド類似体は、単回の１０ｍｌの注入でヒトの静脈内に、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、又は５００ｍｇの用量が投与されることが可能となる溶解性を有する。さらにその他の実施形態において、アミロライド類似体は、単回の２ｍｌの注入でヒトの脳室内に、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、又は５００ｍｇの用量が投与されることが可能となる溶解性を有する。
【０１４０】
上記した開示は、独立した用途と共に、一つ以上の別個の発明を包含しうる。これらの発明のそれぞれは、その好ましい形態で記載される。これらの好ましい形態は、本明細書中に開示及び示されたようなその特定の実施形態を含むが、多数のバリエーションが可能であることから、限定された意味で解釈されることを意図するものではない。本発明の主題は、本明細書中に開示される様々な要素、特徴、機能及び／又は特性の全ての新規及び非自明の組み合わせ及び部分的組み合わせを含む。以下の特許請求の範囲は、特に、新規及び非自明と見なされる特定の組み合わせ及び部分的組み合わせを指摘する。特徴、機能、要素及び／又は特性のその他の組み合わせ及び部分的組み合わせで具現化される発明は、本願又は関連する出願から優先権を主張する出願において特許請求されうる。かかる特許請求の範囲は、異なる発明に関しようと、同じ発明に関しようと、又は、元の特許請求の範囲に対して、範囲が広かろうと、狭かろうと、同じであろうと、異なろうと、本開示の発明の主題の中に含まれるものとして見なされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月19日(2020.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のアミロライド類似体又はその薬学的に許容される塩を含む、対象の脳における神経損傷を減少させるために用いる医薬組成物であって、
該医薬組成物は虚血性イベントの発症の５時間以内に脳室内に投与され、
該アミロライド類似体はベプリジルであり、及び、
該医薬組成物は酸感知イオンチャンネル１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）を阻害する、
前記医薬組成物。
【請求項２】
アミロライド類似体又はその薬学的に許容される塩が体重１Ｋｇあたり０．１ｍｇ〜１０ｍｇの用量範囲で与えられる、請求項１記載の前記医薬組成物。
【請求項３】
虚血性イベントの発症の１時間以内に投与される、請求項１記載の前記医薬組成物。
【請求項４】
虚血性イベントの発症の１〜５時間以内に投与される、請求項１記載の前記医薬組成物。
【請求項５】
神経損傷が脳損傷である、請求項１記載の前記医薬組成物。
【請求項６】
アミロライド類似体又はその薬学的に許容される塩が体重１Ｋｇあたり０．１ｍｇ〜３０ｍｇの用量範囲で与えられる、請求項１記載の前記医薬組成物。