(57)【要約】      （修正有）【課題】コラーゲン産生促進能を有し、細胞毒性を有さない、化粧品など肌用製品の素材の提供。【解決手段】琥珀の超臨界ＣＯ２又はアルコール抽出物。下式で示すスピロラクトンノルジテルペノイドを含有する、前記抽出物。2020200248.tif 000005【選択図】図３
2020200248.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン産生促進効果を有することを特徴とする肌用製品の素材。
【請求項２】
さらに、細胞毒性を有しないことを特徴とする請求項１に記載の肌用製品の素材。
【請求項３】
前記肌用製品の素材が、少なくともスピロラクトンノルジテルペノイド（Spirolactone norditerpenoid）を含有するものであることを特徴とする請求項１または２に記載の肌用製品の素材。
【請求項４】
前記肌用製品の素材が、琥珀超臨界ＣＯ２抽出物であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の肌用製品の素材。
【請求項５】
前記肌用製品の素材が、琥珀アルコール抽出物であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の肌用製品の素材。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の肌用製品の素材を含有することを特徴とする肌用製品。
【請求項７】
前記琥珀超臨界ＣＯ２抽出物の添加濃度が１μｇ／ｍＬより大きいことを特徴とする請求項６に記載の肌用製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肌用製品の素材に関し、特に、化粧品などの肌用製品であり、コラーゲン産生促進効果を有する肌用製品の素材に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は表皮層と真皮層の二層からなり、下側の真皮層はコラーゲン等の細胞間マトリックスと真皮繊維芽細胞で構成されている。コラーゲンは、皮膚のハリや弾力を生み出すタンパク質として知られており、コラーゲンの減少は、肌の弾力低下、シワやタルミの原因となって、肌の老化現象をもたらす一因となる。そのため、コラーゲン産生促進効果を有する物質は、アンチエイジング化粧品の原料として非常に重要である。
【０００３】
アスコルビン酸は、コラーゲン産生促進能が高い化合物として知られているが、光、熱、酸化に対して不安定であり、化粧品分野での利用が妨げられていた。例えば、特許文献１には、経時安定性を有し、コラーゲン産生促進効果を有するアスコルビン酸誘導体及びその塩が開示されている。しかしながら、これらアスコルビン酸誘導体及びその塩は、油剤への溶解性が悪く、化粧料として使用した際に、角質層との馴染みが悪く十分な浸透性が得られないという問題があった。また、コラーゲン産生促進効果についても十分に満足できるものではなかった。
【０００４】
本発明者らは、例えば岩手県久慈市で採掘される琥珀から超臨界ＣＯ２を用いて抽出したエキスとアルコールで抽出したエキスに、高いコラーゲン産生促進効果があることを見出して、本発明を完成させるに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４６８１６７０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記問題点に鑑み、なされたものであり、その目的は、コラーゲン産生促進能を有する肌用製品の素材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の肌用製品の素材は、コラーゲン産生促進効果を有することを特徴とする。
【０００８】
本発明においては、さらに、細胞毒性を有しないことが好ましい。
【０００９】
本発明の肌用製品の素材は、少なくともスピロラクトンノルジテルペノイド（Spirolactone norditerpenoid）を含有するものであることが好ましい。
【００１０】
本発明において前記肌用製品の素材は、琥珀超臨界ＣＯ２抽出物であることが好ましい。
【００１１】
本発明において肌用製品の素材は、琥珀アルコール抽出物であることが好ましい。
【００１２】
本発明の肌用製品は、上記いずれかの肌用製品の素材、すなわち、スピロラクトンノルジテルペノイド、琥珀超臨界ＣＯ２抽出物、または琥珀アルコール抽出物を少なくとも含有することを特徴とする。
【００１３】
本発明において、肌用製品は、琥珀超臨界ＣＯ２抽出物の添加濃度が１μｇ／ｍＬより大きいことが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、コラーゲン産生を効率的に促進することができる肌用製品の素材を提供することができる。また、本発明によれば、コラーゲン産生促進効果を有する肌用製品を提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）を液体クロマトグラフィーで分析した際のチャートである。
【図２】久慈産琥珀エタノール抽出物（エキス）を液体クロマトグラフィーで分析した際のチャートである。
【図３】久慈産琥珀エタノール抽出物および久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）をそれぞれ添加した正常ヒト皮膚線維芽細胞のタンパク量当たりのコラーゲン量の割合（％）を示すグラフである。
【図４】久慈産琥珀エタノール抽出物および久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）をそれぞれ添加した正常ヒト皮膚線維芽細胞の細胞生存率を示すグラフである。
【図５】久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）およびＬ−アスコルビン酸をそれぞれ添加した正常ヒト皮膚線維芽細胞のタンパク量当たりのコラーゲン量の割合（％）を示すグラフである。
【図６】スピロラクトンノルジテルペノイド（Spirolactone norditerpenoid）を添加した正常ヒト皮膚線維芽細胞のタンパク量当たりのコラーゲン量の割合（％）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の肌用製品の素材は、コラーゲン産生促進効果を有する。本発明において、肌用製品とは、人体の皮膚等に適用される製品であり、基礎化粧品、メーキャップ化粧品、洗顔石鹸やボディー石鹸、ボディー乳液等のボディーケア商品などの化粧品類のみならず、医薬部外品に分類される薬用化粧品なども含む。
【００１７】
本発明において、肌用製品の素材としては、例えば、琥珀から超臨界ＣＯ２抽出により得られた抽出物やアルコール抽出物などが挙げられ、また、後述するが琥珀から抽出されたスピロラクトンノルジテルペノイドなどが挙げられる。本発明においては、例えば、日本、バルト海沿岸、ドミニカ共和国、ミャンマー等で採掘される琥珀から得られた抽出物が好ましいものとして挙げられ、特に、岩手県久慈市で採掘される琥珀（以下「久慈産琥珀」と称すこともある）から得られた抽出物が好ましいものとして挙げられる。
【００１８】
琥珀とは、樹脂が長期間地下に埋没し凝結してできた化石で、主に樹脂、精油、コハク酸等を含む。エタノールやクロロホルムやジエチルエーテルあるいはベンゼンに少量溶ける。琥珀は採掘したものそのままでも良いし、溶融して再び固めたものであっても良く、装飾工芸品、宝石、香料などの用途がある。近年では、琥珀粉末を化粧品に配合することも知られており、琥珀粉末は琥珀を宝石として加工した際に出る削り屑等を更に粉砕したものなどを用いることができる。                                                                
【００１９】
本発明による琥珀超臨界ＣＯ２抽出物やアルコール抽出物は、正常ヒト皮膚線維芽細胞のコラーゲン産生を促進する効果が非常に高いという利点を有する。なお、本発明においては、本発明の効果を発揮する限りにおいて、超臨界ＣＯ２抽出物は亜臨界ＣＯ２抽出物も含むものとする。また、抽出物の形状としては、液体、固体、オイル状態などが挙げられ、液相、固相、オイルなども含むものとする。本発明においては、抽出物をエキスと表記することもあるが、同等のものである。
【００２０】
本発明において、琥珀超臨界ＣＯ２抽出物は、例えば粉体状の琥珀粉末を超臨界抽出システムに充填して、抽出物を得ることができる。なお、琥珀粉末の粒径は１０〜５０００μｍであることが好ましく、更に好ましくは、１５０〜１８０μｍである。粉体状の琥珀粉末は商業的に入手することができるが、琥珀を、やすりやジェットミル粉砕機等を用いて粉体状にしても良い。
【００２１】
超臨界ＣＯ２抽出システムを用いて抽出物を得る場合には、温度、圧力、ＣＯ２の流速を所定条件に設定する必要があり、温度は２５℃〜１５０℃の範囲内であり、好ましくは３２℃〜１２０℃の範囲内であり、更に好ましくは６０℃〜１００℃の範囲内である。また、圧力は５ＭＰａ〜４０ＭＰａの範囲内であり、好ましくは７．５ＭＰａ〜４０ＭＰａの範囲内であり、更に好ましくは１５ＭＰａ〜２５ＭＰａの範囲内である。また、ＣＯ２の流速は１ｍＬ／ｍｉｎ〜４０ｍＬ／ｍｉｎの範囲内であることが好ましい。
【００２２】
琥珀超臨界ＣＯ２抽出物は、コラーゲン産生促進効果を有するものである。琥珀超臨界ＣＯ２抽出物中のいかなる物質がコラーゲン産生促進効果を発揮しているのかは、非常に重要な課題であった。後述するように、本発明において、琥珀から単離・精製し、構造決定された新規化合物であるスピロラクトンノルジテルペノイド（Spirolactone norditerpenoid）は、コラーゲン産生を高効率で増加させることを見出した。このスピロラクトンノルジテルペノイド（Spirolactone norditerpenoid）は、岩手大学農学部において単離・精製されたものであり、これまでマルビイン（marubiin）の分解物であるという構造記載はあるものの単離と構造は知られておらず（D. Burn, et al., J. Chem. Soc., (1957) 2964-2974, O. K. Popoola, et al., Molecules, 18 (2013) 9049-9060）、本発明者らが初めて天然物から単離精製し、正確な構造決定を行ったものである（E. Shimizu et al., Fitoterapia. 134 (2019) 290-296）。スピロラクトンノルジテルペノイド（Spirolactone norditerpenoid）(4R＊,5S＊,8R＊,9R＊,10S＊)-14,15,16,19-Tetranorlabdan-13,9-olide)の構造式を以下に示す。
【００２３】
【化１】
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【００２４】
本発明において、上記構造式で示される化合物は、琥珀からの抽出物中の主要なコラーゲン産生促進効果を発揮させるものであることが分かった。すなわち、上記構造式で示される化合物を含有するものであれば、例えば久慈産琥珀などの琥珀に特に限定される必要はなく、さらには琥珀にも特に限定される必要はなく、したがって、琥珀抽出物など以外であっても上記化合物を含み、本発明の効果を発揮させるものであるならば、本発明に含まれるのである。
【００２５】
上記化合物を含有する素材および琥珀超臨界ＣＯ２抽出物は、コラーゲン産生を効率よく促進させることができ、有望なアンチエイジング化粧品などの原料となる。また、琥珀からのエタノール等のアルコールによる抽出物もコラーゲン産生促進効果を有し、アンチエイジング化粧品などの原料となる。
【実施例】
【００２６】
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではなく、本発明の技術的範囲を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
【００２７】
（試料の調製）
（１）琥珀超臨界ＣＯ２抽出物
久慈産琥珀粉末（粒径１５０〜１８０μｍ、久慈琥珀株式会社製）を、商業的に入手した。この久慈産琥珀粉末を、日本分光株式会社製の超臨界抽出システムに適量充填し、温度８０℃、圧力２０ＭＰａ、ＣＯ２流速３．０ｍＬ／分の条件で超臨界ＣＯ２を抽出溶媒として処理を行い、排出された久慈産琥珀からの超臨界ＣＯ２抽出物を常温常圧下で回収した。
得られた回収物をジメチルスルホキシド（Dimethyl sulfoxide：ＤＭＳＯ、富士フィルム和光純薬株式会社製）で溶解して１０ｍｇ／ｍＬの溶液とし、濾過滅菌して試料を作製した。ここで、抽出物が正常に採取されているかどうかは、久慈産琥珀の特有成分であることがすでに岩手大学農学部により明らかにされているkujigamberol (K. Kimura, et al., Fitoterapia. 83 (2012) 907-912)の含有を指標として、液体クロマトグラフィーを用いて確認した（図１参照）。なお、スピロラクトンノルジテルペノイドのピークは、ＵＶ吸収が弱いため、同じ分析条件ではチャート上には検出できない。ただし、その分析条件は、ポンプ：PU-2080 plus 日本分光（株）、検出器：MD-2018 plus  日本分光（株）、カラム：CAPCELL PAK C18 SHISEIDO（ODS 4.6mmφ×150 mm、TYPE UG 120 Å、5 μm）、データ処理：ChromNAV、流速：1.0 mL/min、波長：205 nm、移動相：（メタノール：水＝８５：１５）、注入量：50 μg  である。
【００２８】
（２）琥珀アルコール（エタノール）抽出物
久慈産琥珀粉末（粒径１５０〜１８０μｍ、久慈琥珀株式会社製）を、商業的に入手した。この久慈産琥珀粉末を容器に入れ、これに３倍重量の９９度発酵アルコール（エタノール、日本アルコール産業株式会社製）を加え、室温にて２昼夜撹拌した。撹拌終了後、濾紙を用いて粉末と液体を分離し、液体は更に孔径０．４５μｍのシリンジフィルターを通してからロータリーエバポレーターにて蒸発させた。このとき残った固形分を、久慈産琥珀からの抽出物として回収した。この回収物をＤＭＳＯで溶解し、１０ｍｇ／ｍＬの溶液とし、濾過滅菌して試料を作製した。なお、抽出物が正常に採取されているかどうかは、上記“琥珀超臨界ＣＯ２抽出物”における確認と同様にして、kujigamberolの含有を指標として、液体クロマトグラフィーを用いて確認した（図２参照）。ただし、その分析条件は、ポンプ：PU-2080 plus 日本分光（株）、検出器：MD-2018 plus  日本分光（株）、カラム：CAPCELL PAK C18 SHISEIDO（ODS 4.6mmφ×150 mm、TYPE UG 120 Å、5 μm）、データ処理：ChromNAV、流速：1.0 mL/min、波長：205 nm、移動相：（メタノール：水＝８５：１５）、注入量：50 μg  である。
【００２９】
（３）Ｌ−アスコルビン酸溶液
陽性対照用のＬ−アスコルビン酸（富士フィルム和光純薬株式会社製）を商業的に入手し、このＬ−アスコルビン酸を用いて、リン酸緩衝食塩水（Phosphate Buffered Saline：ＰＢＳ、富士フィルム和光純薬株式会社製）で２００ｍＭ（３５．２ｍｇ／ｍＬ）溶液を作製した。この溶液を濾過滅菌して試料を作製した。  
【００３０】
（４）スピロラクトンノルジテルペノイド（Spirolactone norditerpenoid）
岩手大学農学部において、久慈産琥珀から単離・精製し、構造決定された新規化合物であり、下記構造式で表される。これをメタノールに１ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、試料とした。
【００３１】
【化２】
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【００３２】
（正常ヒト皮膚線維芽細胞の培養）
正常ヒト皮膚線維芽細胞（株名：ＳＦ−ＴＹ）を、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクより商業的に入手した。正常ヒト皮膚線維芽細胞は、５％ＣＯ２、３７℃の環境下にて、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ：Biological Industries, CT）及び非必須アミノ酸（富士フィルム和光純薬株式会社製）を含有するMinimum Essential Media （MEM、富士フィルム和光純薬株式会社製）を培地とし、２５ｃｍ２フラスコ中で培養した。
【００３３】
試験例１
（正常ヒト皮膚線維芽細胞への試料の添加）
培養された正常ヒト皮膚線維芽細胞を、０．２５％トリプシン−１ｍＭ  ＥＤＴＡ混液（富士フィルム和光純薬株式会社製）によって２５ｃｍ２フラスコから剥離し、９６穴培養プレートに１×１０４cells/wellの密度で播種した。
【００３４】
播種した翌日、試料（エタノール抽出物、久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物）を目的の濃度（添加濃度：１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ）となるように培地（１０％ＦＢＳ及び非必須アミノ酸含有ＭＥＭ）に添加した（ｎ＝５）。ただし、試料の添加濃度にかかわらずＤＭＳＯ濃度が一定になるように、ＤＭＳＯを後添して調製した。
【００３５】
対照群の培地（１０％ＦＢＳ及び非必須アミノ酸含有ＭＥＭ）にも、試料添加群と同じ濃度になるようＤＭＳＯを加えて調製した（ｎ＝５）。
【００３６】
（細胞の溶解）
正常ヒト皮膚線維芽細胞へ試料を添加してから３日後、９６穴培養プレートの各wellの細胞を２００μＬのリン酸緩衝食塩水（Phosphate Buffered Saline：ＰＢＳ、富士フィルム和光純薬株式会社製）で１回洗浄し、細胞溶解バッファー（EZRIPA Lysis kit、アトー株式会社製（東京都））を１００μＬ／well加えて緩やかにピペッティングし、溶解して細胞溶解液を作製した。
【００３７】
（コラーゲン定量）
得られた細胞溶解液を、各wellから５０μＬずつ、それぞれ１．５ｍＬのチューブに採取し、シリウスレッド溶液を加えてコラーゲン・シリウスレッド結合物を形成した。ただし、シリウスレッド溶液としては、Sirius Red Total Collagen Detection Kit（Chondrex Inc. WA）付属の液を用いた。
【００３８】
形成したコラーゲン・シリウスレッド結合物を遠心機にかけて沈殿させ、上清を除去してから、１ｍＬの１０ｍＭ  ＨＣｌで１回洗浄し、４０℃の環境下で乾燥させた。その後、０．１ＭのＮａＯＨを１００μＬ加えて溶解した。この溶解した液を０．１ＭのＮａＯＨで２倍に希釈し、９６穴プレートに１００μＬずつ移した。
【００３９】
同時に、同Ｋｉｔ付属のBovine Type I Collagenについても、シリウスレッド溶液を添加して、１０ｍＭのＨＣｌにより洗浄および乾燥した後、０．１ＭのＮａＯＨで溶解して希釈系列を作り、検量線作成用の溶液として同じ９６穴プレートに移した。
【００４０】
この９６穴プレート上の各液につき、マイクロプレートリ−ダーで５４５ｎｍの吸光度を測定した。ただし、バックグラウンドを消去するため、６３０ｎｍの吸光度を差し引くように設定した。得られた測定値から、元の９６穴培養プレートの各well中の細胞が産生したコラーゲン量（μｇ／well）を算出した。
【００４１】
（タンパク定量）    
上記“細胞の溶解”の操作において作製した細胞溶解液の５０μＬに対し、それぞれ、９６穴プレート上で、ＢＣＡタンパク質定量キット（Takara BCA Protein Assay Kit、タカラバイオ株式会社製）の反応液を５０μＬ加えた。
【００４２】
同時に、同ＢＣＡタンパク質定量キット付属のＢＳＡ標準液について、精製水で希釈系列を作り、検量線作成用の溶液として同じ９６穴プレートに移し、同ＢＣＡタンパク質定量キットの反応液を加えた。
【００４３】
この９６穴プレート上の各液を３７℃の環境下で発色させた後、マイクロプレートリーダーで５４５ｎｍの吸光度を測定した。ただし、バックグラウンドを消去するため、６３０ｎｍの吸光度を差し引くように設定した。この測定値から、元の９６穴培養プレートの各well中の細胞が持っているタンパク量（μｇ／well）を算出した。
【００４４】
コラーゲン量は、測定結果から算出した各well中のコラーゲン量を各wellのタンパク量で除した上で、下記式により、対照群を１００％としたときの割合で表した。
【００４５】
タンパク量当たりのコラーゲン量の割合（％）＝｛（試料添加群の各サンプルの個別値）／（対照群の平均値）｝×１００
【００４６】
（統計処理）
測定データは、ｔ−検定により、各群の数値間につき、有意差の有無を確認した。
なお、実施例においては、後続する試験例においても、全て、同様の統計処理を行った。
【００４７】
久慈産琥珀エタノール抽出物、及び久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物を添加した正常ヒト皮膚線維芽細胞のタンパク量当たりのコラーゲン量の割合（％）を、図３に示す。
【００４８】
図３から、久慈産琥珀エタノール抽出物を１０μｇ／ｍＬを添加した群、及び、久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物を１０μｇ／ｍＬ添加した群は、対照群と比べて有意に増加していることが分かった。この場合、久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物を１０μｇ／ｍＬ添加した群の増加率の平均は１３０％以上であり、同添加濃度である久慈産琥珀エタノール抽出物を１０μｇ／ｍＬ添加した群より高い数値を示したが、両者の間に有意差はなかった。この結果から、久慈産琥珀エタノール抽出物および久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物には、正常ヒト皮膚線維芽細胞のコラーゲン産生を促進する何らかの成分が含まれていることが推測された。その結果、本発明において、上述した新規な化合物を見出したのである。
【００４９】
試験例２
（細胞生存率の測定）
試験例１における“正常ヒト皮膚繊維芽細胞への試料の添加”の操作と同様にして、正常ヒト皮膚線維芽細胞を９６穴培養プレートに播種し、翌日、上記操作と同様にして、各試料（久慈産琥珀エタノール抽出物、久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物：添加濃度１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ）を添加した。
【００５０】
３日後、各wellの細胞を２００μＬのＰＢＳで１回洗浄し、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide：ＭＴＴ、株式会社同仁化学研究所製）の０．５％ＰＢＳ溶液を１０％混合した培地を１００μＬ／well加え、５％ＣＯ２、３７℃の環境下にて２時間培養した。培養終了後、各wellの細胞を２００μＬのＰＢＳで１回洗浄し、形成されたホルマザンを１００μＬ／wellのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、富士フィルム和光純薬株式会社製）により溶解した。
【００５１】
溶媒のみの測定値を他の試料の測定値から差し引くためのブランクとして、未使用のwellにＤＭＳＯを１００μＬ入れたものを作製した。
【００５２】
この９６穴プレート上の各液について、マイクロプレートリーダーで５４５ｎｍの吸光度を測定した（ただし、ブランクの値を差し引いた）。バックグラウンドを消去するために、６３０ｎｍの吸光度を差し引くように設計した。
【００５３】
各群の細胞生存率は、下記式により求め、対照群を１００％としたときの割合で示した。
【００５４】
細胞生存率（％）＝
（試料添加群の各サンプルの個別値／対照群の平均値）×１００
【００５５】
久慈産琥珀エタノール抽出物及び久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物を添加した正常ヒト皮膚線維芽細胞の生存率を図４に示す。
【００５６】
図４から、久慈産琥珀エタノール抽出物を１μｇ／ｍＬ添加したものの平均値は８６．４６％であり、久慈産琥珀エタノール抽出物を１０μｇ／ｍＬ添加したものの平均値は８７．７６％であり、いずれも、その平均値が対照群と比較して１０％以上低く、したがって、久慈産琥珀エタノール抽出物を添加したものは細胞生存率に影響を与える傾向が見られた。
【００５７】
これに対し、久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物を添加したものは、添加濃度が１μｇ／ｍＬであっても、１０μｇ／ｍＬであっても、細胞生存率の低下は認められなかった。
【００５８】
図３および図４から、久慈産琥珀エタノール抽出物は正常ヒト皮膚線維芽細胞のコラーゲン産生を高めることはできるが、細胞生存率を低下させる可能性があることが分かった。一方、久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物は、正常ヒト皮膚線維芽細胞の増殖力に影響することなくコラーゲン産生を促進することができることが分かった。すなわち、久慈産琥珀エタノール抽出物のコラーゲンを増加させる効果は、細胞毒性等をともなうかも知れないが、これに対し、久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物のコラーゲン産生促進効果は、細胞毒性又は増殖促進作用に伴うものではないことが確認された。
【００５９】
試験例３
試験例１において、試料を陽性対照用のＬ−アスコルビン酸及び久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物とし、添加濃度をいずれも１０μｇ／ｍＬにした以外は試験例１と同様にして、正常ヒト皮膚線維芽細胞のタンパク量当たりのコラーゲン量の割合を求めた。久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物及びＬ−アスコルビン酸を添加した正常ヒト皮膚線維芽細胞のタンパク量当たりのコラーゲン量の割合（％）を図５に示す。
【００６０】
図５から、久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物を１０μｇ／ｍＬ添加した群、及び、Ｌ−アスコルビン酸を１０μｇ／ｍＬ添加した群の各well中のタンパク量当たりのコラーゲン量の割合は、いずれも対照群よりも有意に高いことが分かった。なお、久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物添加群とＬ−アスコルビン酸添加群との間には有意差はなく、これらのタンパク量当たりのコラーゲン量の割合は同等であった。すなわち、久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物のコラーゲン産生促進効果は、コラーゲン産生促進物質であるとして既に知られているＬ−アスコルビン酸と、同一濃度で比べたときには同等の効果を有することが分かった。
ただし、ヒトの皮膚の最外層を覆う角質層は脂溶性が高いので、一般的には水溶性の化合物よりも脂溶性の化合物の方が皮膚との親和性が高く、経皮吸収性が良好であるが、これに対しＬ−アスコルビン酸は水溶性の化合物であるので、皮膚との親和性が低く、経皮吸収性も低いという欠点を有する。一方、久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物は脂溶性であるので皮膚との親和性が高く、経皮吸収性もよいという利点がある。したがって、久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物は皮膚に吸収されて生きた細胞に届く効率が高く、実際に外用剤として皮膚に適用した場合には、久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物の方が、同一濃度のＬ−アスコルビン酸よりもコラーゲン産生促進効果を期待することができる。  
【００６１】
試験例４
試験例１において、試料を、新規化合物であり上述の構造式で表されるスピロラクトンノルジテルペノイド（Spirolactone norditerpenoid）に変更し、添加濃度を０．１μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬに変更し、かつ、ＤＭＳＯは用いず、各濃度の添加群のメタノール濃度が一定になるようにした以外は試験例１と同様にして、正常ヒト皮膚線維芽細胞のタンパク量当たりのコラーゲン量の割合を求めた。また、対照群（０ｍｇ／ｍＬ）の調製についても、ＤＭＳＯは用いず、メタノール濃度が一定になるようにした以外は試験例１と同様にして、正常ヒト皮膚線維芽細胞のタンパク量当たりのコラーゲン量の割合を求めた。
新規化合物を添加した正常ヒト皮膚線維芽細胞のタンパク量当たりのコラーゲン量の割合（％）を図６に示す。
【００６２】
図６から、スピロラクトンノルジテルペノイド（Spirolactone norditerpenoid）は、添加濃度が０．１μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬのいずれでもタンパク量当たりのコラーゲン量の割合は有意に増加していることが分かった。特に、添加濃度が１μｇ／ｍＬのスピロラクトンノルジテルペノイドは、図３及び図５に示されている添加濃度が１０μｇ／ｍＬの久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物に匹敵するコラーゲン産生促進効果を認めることができた。すなわち、スピロラクトンノルジテルペノイドを添加した細胞のタンパク量当たりのコラーゲン量の割合が明らかに増強されていたことから、この物質は久慈産琥珀超臨界ＣＯ２抽出物中の主要なコラーゲン産生促進化合物の１つであることが確認された。  
【００６３】
以上の結果から、琥珀超臨界ＣＯ２抽出物は極めて有望なアンチエイジング肌用製品の素材であることが分かった。また、スピロラクトンノルジテルペノイド（Spirolactone norditerpenoid）を少なくとも一部に含む肌用製品の素材も極めて有望なアンチエイジング肌用製品の素材であることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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