(57)【要約】【課題】本発明は、培地中に血清やアルブミンを含有することなく、高い増殖性を示す多能性幹細胞の接着培養用の培地、および、かかる培地を用いた汎用性の高い多能性幹細胞の接着培養の方法を提供することを課題とする。【解決手段】従来、細胞培養基材表面に対する細胞の接着を抑制するとして知られていた親水性ポリマーを培地に添加することで、多能性幹細胞の細胞培養基材表面に対する接着性を高めることにより、多能性幹細胞の接着培養において血清やアルブミンを含有せずに、高い増殖性が付与されることとなる。また、かかるポリマーとともに抗酸化物質を培地に添加することで、多能性幹細胞の接着培養において、極めて高い増殖性が付与されることとなる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性ポリマーを含有し、実質的にアルブミンを含有しない、多能性幹細胞接着培養用培地。
【請求項２】
さらに、抗酸化物質を含有する、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
親水性ポリマーが、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンである、請求項１または２に記載の培地。
【請求項４】
抗酸化物質が、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、還元型グルタチオン、ビタミンＣ、ビタミンＥおよびクロロゲン酸からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２または３に記載の培地。
【請求項５】
抗酸化物質が、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の培地。
【請求項６】
さらに、アルブミン以外のタンパク質成分を含有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の培地。
【請求項７】
アルブミン以外のタンパク質成分が、インスリン、トランスフェリンおよび塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項６に記載の培地。
【請求項８】
さらに、分化抑制剤を含有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の培地。
【請求項９】
分化抑制剤が、ＧＳＫ３β（グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β）阻害剤、および／またはＤＹＲＫ（Ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）阻害剤である、請求項８に記載の培地。
【請求項１０】
ＧＳＫ３β阻害剤が、１−Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅである、請求項９に記載の培地。
【請求項１１】
ＤＹＲＫ阻害剤が、ＩＤ−８である、請求項９に記載の培地。
【請求項１２】
さらに、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞核内因子）阻害剤を含有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１３】
ＮＦＡＴ阻害剤が、Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓである、請求項１２に記載の培地。
【請求項１４】
多能性幹細胞が、ヒト由来である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１５】
多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１６】
親水性ポリマー、抗酸化物質ならびにＧＳＫ３β阻害剤およびＤＹＲＫ阻害剤からなる分化抑制剤を含有する、多能性幹細胞接着培養用培地。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の培地を用いる、多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１８】
多能性幹細胞の培養基材への接着を増強する方法であって、培地に親水性ポリマーを添加することを含む、前記方法。
【請求項１９】
請求項１７または１８の方法により製造された、多能性幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞用未分化維持培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの多能性幹細胞は、分化多能性および自己複製能を有しており、再生医療をはじめとした再生医療分野や医学研究分野などにおいて様々な利用が期待されている。多能性幹細胞の培養は、安全な条件下で、未分化を維持した状態で増殖させることが必要である。
従来、細胞培養には、血清やアルブミンを含む細胞培地が用いられてきた。アルブミンは、生体由来のものと遺伝子組み換えのものとがあり、生体由来のものであれば、ドナーがウイルス等に感染している場合、それらのウイルス等を培地に含むおそれがある。またウイルス等に感染していなくとも、アルブミンの精製中に何らかの因子が夾雑し、培地に含まれ、かかる因子に起因して細胞が意図しないタイミングで分化することもあり得る。加えて、生体由来であるため、ロット間で微量成分の濃度などや品質の差異が生じ、かかる差異により培養結果が変化し得る。一方で遺伝子組み換えのアルブミンは費用が高額となる。したがって、多能性幹細胞の培養には、アルブミンを含有しない培地を使用することが好ましい。
【０００３】
近年、多能性幹細胞の培養に適した無血清培地の開発が進められている。特許文献１には、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンド、およびセロトニンレセプターに対するリガンドを含む無血清培地が開示されている。特許文献２には、プルロニック系非イオン性界面活性剤や動物系加水分解物などを含み、アルブミンを含有しない、無血清培地が開示されている。特許文献３には、ポリビニルアルコールを含有し、アルブミンを含有しない培地を用いることで、胚性幹細胞の培養皿への接着を防ぎながら培養する方法が開示されている。特許文献４には、ポリビニルアルコールなどの合成ポリマーが、胚性幹細胞を含む細胞の細胞培養基材表面に対する接着を抑制することが開示されている。特許文献５には、アルブミンおよびポリビニルアルコールを含有した培地が開示されている。
しかしながら、培地中にアルブミンを含有することなく、高い増殖性を有し接着培養などに適した汎用性の高い多能性幹細胞用の培地として十分な品質を有するものは未だ存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００９／０８４６６２号公報
【特許文献２】国際公開第２０１７／１９５７４５号公報
【特許文献３】特開２００７−２２８８１５号公報
【特許文献４】特開２００７−１２４９８２号公報
【特許文献５】特許第６１９７９４７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって本発明は、培地中に血清やアルブミンを含有することなく、高い増殖性を示す多能性幹細胞の接着培養用の培地、および、かかる培地を用いた汎用性の高い多能性幹細胞の接着培養の方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、多能性幹細胞の培養細胞培養基材表面への接着性を付与する非アルブミン成分を探索したところ、親水性ポリマーが、多能性幹細胞の細胞培養基材表面に対する接着性を高め、かかるポリマーを培地に添加することで、多能性幹細胞の接着培養においてアルブミンを含有せずに、高い増殖性を付与することを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明の完成に至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下に関する。
［１］親水性ポリマーを含有し、実質的にアルブミンを含有しない、多能性幹細胞接着培養用培地。
［２］さらに、抗酸化物質を含有する、前記［１］に記載の培地。
［３］親水性ポリマーが、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンである、前記［１］または［２］に記載の培地。
［４］抗酸化物質が、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、還元型グルタチオン、ビタミンＣ、ビタミンＥおよびクロロゲン酸からなる群より選択される少なくとも１種である、前記［２］または［３］に記載の培地。
［５］抗酸化物質が、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインである、前記［２］〜［４］のいずれかに記載の培地。
［６］さらに、アルブミン以外のタンパク質成分を含有する、前記［１］〜［５］のいずれかに記載の培地。
［７］アルブミン以外のタンパク質成分が、インスリン、トランスフェリンおよび塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１種である、前記［６］に記載の培地。
［８］さらに、分化抑制剤を含有する、前記［１］〜［７］のいずれかに記載の培地。
［９］分化抑制剤が、ＧＳＫ３β（グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β）阻害剤、および／またはＤＹＲＫ（Ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）阻害剤である、前記［８］に記載の培地。
［１０］ＧＳＫ３β阻害剤が、１−Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅである、前記［９］に記載の培地。
［１１］ＤＹＲＫ阻害剤が、ＩＤ−８である、前記［９］に記載の培地。
［１２］さらに、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞核内因子）阻害剤を含有する、前記［１］〜［１１］のいずれかに記載の培地。
［１３］ＮＦＡＴ阻害剤が、Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓである、前記［１２］に記載の培地。
［１４］多能性幹細胞が、ヒト由来である、前記［１］〜［１３］のいずれかに記載の培地。
［１５］多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、前記［１］〜［１４］のいずれかに記載の培地。
［１６］親水性ポリマー、抗酸化物質ならびにＧＳＫ３β阻害剤およびＤＹＲＫ阻害剤からなる分化抑制剤を含有する、多能性幹細胞接着培養用培地。
［１７］前記［１］〜［１６］のいずれかに記載の培地を用いる、多能性幹細胞の培養方法。
［１８］多能性幹細胞の培養基材への接着を増強する方法であって、培地に親水性ポリマーを添加することを含む、前記方法。
［１９］前記［１７］または［１８］の方法により製造された、多能性幹細胞。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、親水性ポリマーを含有することにより、培地にアルブミンを含有することなく、多能性幹細胞を、未分化を維持したまま高い増殖率で培養することができる。さらに、かかる培地に、抗酸化物質を添加することで、より高い増殖率を達成することが出来るため、再生医療分野や医療研究分野で使用される多能性幹細胞を効率良く培養することができる。また発明に係る方法によれば、アルブミンを含有しない培地において、細胞の接着を増強する方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、比較例１における、アルブミンを添加した培地および無添加培地において、ｉＰＳ細胞を培養した際の、細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）量の関係を示す。−はアルブミンが無添加の培地で培養した結果を、＋Ａｌｂは、アルブミンを添加した培地で培養した結果を指す。図中の各結果の値は、無添加の培地における細胞内ＲＯＳ量を１００％とした時の相対値を示す。
【図２】図２は、比較例１における、アルブミンを添加した培地および無添加培地において、ｉＰＳ細胞を培養した際の、培養３日目における位相差像を示す。図中の−は、アルブミンを添加していない培地で培養した細胞の、＋Ａｌｂは、アルブミンを添加して培養した細胞の像を指す。細胞は状態が良いと紡錘状の形態をしており、状態が悪くなると球状の形態となる。
【図３】図３は、実施例１における、各抗酸化物質を添加した培地および無添加の培地において、ｉＰＳ細胞を培養した際の、抗酸化物質と細胞内ＲＯＳ量の関係を示す。図中の＋Ａｌｂは、アルブミンの添加を、＋ＮＡＣは、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの添加を、＋ＧＳＨは、還元型グルタチオンの添加を、＋ＶＣは、ビタミンＣの添加を、＋ＶＥは、ビタミンＥの添加を、＋ＣｈＡは、クロロゲン酸の添加をした培地で培養した細胞の結果を指す。図中の各結果の値は、無添加の培地における細胞内ＲＯＳ量を１００％とした時の相対値を示す。
【図４】図４は、実施例２における、アルブミンを添加した培地およびＮ−アセチル−Ｌ−システインを添加した培地において、ｉＰＳ細胞を培養した際の培養３日目における位相差像を示す。＋Ａｌｂは、アルブミンの添加を、＋ＮＡＣはＮ−アセチル−Ｌ−システインの添加をした培地において培養した細胞の像を指す。
【図５】図５は、実施例３における、全細胞をクリスタルバイオレットで青色に染色した時の、培養容器全体を位相差顕微鏡で撮影したものを示す。−は、無添加の培地における、培養結果を示す。＋Ａｌｂは、アルブミンを添加した培地における、培養結果を示す。＋ＰＶＡは、ポリビニルアルコールを添加した培地における、培養結果を示す。＋ＰＶＰは、ポリビニルピロリドンを添加した培地における、培養結果を示す。
【図６】図６は、実施例４における、基礎培地のみのもの、および基礎培地にＮ−アセチル−Ｌ−システインのみを添加したもの、基礎培地にポリビニルアルコールのみを添加したもの、基礎培地にＮ−アセチル−Ｌ−システインおよびポリビニルアルコールを添加したもので７日間培養した際の、相対増殖率（平均値±標準偏差）を示す。図中の基礎培地＋ＮＡＣが、基礎培地にＮ−アセチル−Ｌ−システインのみを、基礎培地＋ＰＶＡが、基礎培地にポリビニルアルコールのみを添加したもの、基礎培地＋ＮＡＣ＋ＰＶＡが、基礎培地にＮ−アセチル−Ｌ−システインおよびポリビニルアルコールを添加したものを指す。また、図中の縦軸の数値は基礎培地のみの場合の増殖率を１として、相対的に示したものを指す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明について、本発明の好適な実施態様に基づき、詳細に説明する。
本発明に係る「多能性幹細胞接着培養用培地」は、多能性幹細胞を接着培養するために用いる培地である。本発明に係る「多能性幹細胞」は、生体を構成する全ての組織または細胞に分化し得る分化多能性および自己複製能を有する細胞であり、一例として、ＥＳ細胞、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、ｉＰＳ細胞を挙げることができ、好ましくはｉＰＳ細胞である。本発明に係る「多能性幹細胞」の由来となる生物種は、特に限定されず、例えばヒト、サル、マウスなどが挙げられ、好ましくはヒト由来である。
【００１１】
本発明に用いられる培地は親水性ポリマーを含有する。本発明者は、アルブミンを実質的に含有しない培地において、親水性ポリマーが細胞の培養皿に対する接着性を増強し接着培養における細胞増殖を促進することを見出した。理論に拘束されるものではないが、本発明の培地に添加される親水性ポリマーは、培養基材に接着した細胞表面に皮膜を形成することで細胞接着性を高めることが推測される。したがって、本発明において用いられる親水性ポリマーは、培養基材に対する細胞接着性を高めるものであればよく、限定されることなく、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンイミン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、デキストラン、ジェランガム、アルギン酸などが使用できる。培養基材に対するより強い接着性を付与する観点からポリビニルアルコールが好ましい。また再生医療や医療分野の研究に用いられることから、本発明における親水性ポリマーは、非天然物かつ医薬品への採用実績がある安全性の高い親水性ポリマーが好ましい。
【００１２】
本発明の培地に添加される親水性ポリマーの濃度は、培養基材に対する細胞接着性を高めることが可能な濃度であればよく、限定されることなく、例えば０．０１％〜５％、好ましくは０．０５％〜１％であり、特に接着性を増強し得る観点からポリビニルアルコールの０．１〜０．５％やポリビニルピロリドンの０．１〜０．５％がさらに好ましい。
本発明に係る培養基材への細胞接着を増強する方法は、培地に親水性ポリマーを添加することを含み、親水性ポリマーは培地製造時または培地使用時の任意のタイミングで添加してよい。本発明に係る培養基材は、公知のものを用いることができ、限定されることなく、例えばポリスチレン樹脂製やガラス製のものの他にこれらにラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン、ゼラチン、カゼインなどのタンパク質をコーティングしたものや高分子を固定化したものが使用できる。
【００１３】
生体由来アルブミンは、ロット間の差異や、因子の夾雑を含む可能性があるため、アルブミンを全く含有しないか、またはアルブミンを含有するとしても少なければ少ないほど好ましい。したがって本発明において「アルブミンを実質的に含有しない」とは、アルブミンを全く含有しないか、またはロット間の差異や因子の影響を生じない程度、すなわち多能性幹細胞の細胞増殖を促進しないか、または安定維持効果を奏しない程度のアルブミンを含有することをいう。したがって、このようなアルブミンを実質的に含有しない培地は、例えば、０．０１０％以下のアルブミンを含むものが含まれ、好ましくは、１０−６％以下のアルブミンを含むものが含まれる。
【００１４】
本発明に用いられる基礎培地は、公知のものを用いることができ、これらに限定されるものではないが、例えばＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＭＥＭ（イーグル最小必須培地）、α―ＭＥＭ（イーグル最小必須培地α改変型）、ＧＭＥＭ（グラスゴー最小必須培地）、Ｈａｍ‘ｓＦ−１２（栄養混合物Ｆ−１２ハム）、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ、ＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ−１２ハム）を包含し、好ましくは、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２等が挙げられる。
【００１５】
当該培地成分には、必要に応じて、公知の添加物を含んでよい。添加物としては、細胞増殖を阻害しないものであればよく、従来から多能性幹細胞の培養に用いられてきた各種無機塩類、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、脂質などを含んでよい。またアルブミン以外のタンパク質成分であれば添加物として含んでもよい。アルブミン以外のタンパク質成分は、例えば、成長因子、鉄の貯蔵・運搬因子などである。成長因子は、これらに限定されるものではないが、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トロンボポエチン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および直接的な作用ではないがインスリンを包含する。鉄の貯蔵・運搬因子は、これに限定されるものではないないが、トランスフェリンを包含する。さらに好ましくはアルブミン以外のタンパク質が、インスリン、トランスフェリンおよびｂＦＧＦである。これらのタンパク質の添加量は、好ましくは、インスリンの最終濃度が、１〜５０μｇ／ｍＬと、トランスフェリンの最終濃度が、１〜３０μｇ／ｍＬと、ｂＦＧＦの最終濃度が、１〜１００ｎｇ／ｍＬとなるように添加され、さらに好ましくは、インスリンの最終濃度が、１０〜３０μｇ／ｍＬと、トランスフェリンの最終濃度が、５〜２０μｇ／ｍＬと、ｂＦＧＦの最終濃度が、２．５〜２５ｎｇ／ｍＬとなるように添加される。
【００１６】
本発明の一態様において、添加物として抗酸化物質を含んでいてもよい。理論に拘束されるものではないが、本発明の培地に添加される抗酸化物質は、細胞に加わるストレスにより、細胞内に大量に産生されるＲＯＳを捕捉することにより無害化する反応に寄与することが推測される。したがって本発明に用いられる「抗酸化物質」は、ＲＯＳを捕捉することにより無害化する反応に寄与する物質を含み、これらに限定されるものではないが、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、還元型グルタチオン、ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）、ビタミンＣ誘導体、ビタミンＥ（トコフェロール）、クロロゲン酸を包含し、好ましくは、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインおよび／またはＬ−アスコルビン酸リン酸マグネシウムが挙げられる。抗酸化物質の添加量は、好ましくはＮ−アセチル−Ｌ−システインの最終濃度が、０．０５〜１０ｍＭおよび／またはＬ−アスコルビン酸リン酸マグネシウムの最終濃度が、３０〜５００μｇ／ｍＬとなるように添加され、さらに好ましくは、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの最終濃度が、０．３〜１ｍＭおよび／またはＬ−アスコルビン酸リン酸マグネシウムの最終濃度が５０〜７０μｇ／ｍＬとなるように添加される。
【００１７】
本発明の一態様において、添加剤として基礎培地に分化抑制剤を含んでいてもよい。分化抑制剤は、これらに限定されるものではないが、ＧＳＫ３β阻害剤およびＤＹＲＫ阻害剤、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、ＭＥＫ阻害剤およびＧＳＫ３阻害剤を含む。好ましくは、分化抑制剤は、ＧＳＫ３β阻害剤およびＤＹＲＫ阻害剤である。ＧＳＫ３β阻害剤は、ＧＳＫ３βの機能を阻害あるいは発現量を制限する作用を有するものであり、これらに限定されるものではないが、ＳＢ２１６７６３、ＢＩＯ、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＩＭ−１２、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、１−Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅを包含する。ＤＹＲＫ阻害剤は、ＤＹＲＫの機能を阻害あるいは発現量を制限する作用を有するもので、これらに限定されるものではないが、ＡＺ１９１、ＩＤ−８、Ｈａｒｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを包含する。さらに好ましくは、ＧＳＫ３β阻害剤が１−Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、ＤＹＲＫ阻害剤がＩＤ−８である。分化抑制剤の添加量は、好ましくは、１−Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅの最終濃度が、４００〜２０００ｎＭとなるように添加され、ＩＤ−８の最終濃度が、２００〜１０００ｎＭとなるように添加され、さらに好ましくは、１−Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅの最終濃度が、７００〜１４００ｎＭとなるように添加され、ＩＤ−８の最終濃度が、４００〜８００ｎＭとなるように添加される。
【００１８】
本発明の一態様において、基礎培地にＮＦＡＴ阻害剤を含んでいてもよい。ＮＦＡＴ阻害剤は、ＮＦＡＴの機能を阻害あるいは発現量を制限する作用を有するものである。ＮＦＡＴ阻害剤は、これらに限定されるものではないが、Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ（ＦＫ５０６）、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ、ＭＣＶ−１、ＩＮＣＡ−６を包含し、好ましくはＮＦＡＴ阻害剤が、Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓである。ＮＦＡＴ阻害剤の添加量は、好ましくは、Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓの最終濃度が、１０〜１００ｐＭとなるように添加され、さらに好ましくは、Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓの最終濃度が、１０〜５０ｐＭとなるように添加される。
【００１９】
本発明の基礎培地には、上記で挙げたもの以外であっても、多能性幹細胞の増殖を阻害しないものであれば含んでいてもよい。細胞を効率的に増殖させる観点からセレン、エタノールアミンであり、好ましくはセレンであり、さらに好ましくは、亜セレン酸ナトリウムである。
【００２０】
本発明の一態様において、培地は、接着培養用であって、基礎培地に親水性ポリマー、抗酸化物質ならびにＧＳＫ３β阻害剤およびＤＹＲＫ阻害剤からなる分化抑制剤を含む培地であってもよい。培地はさらに、必要に応じて、公知の添加物を含んでよい。添加物としては、細胞増殖を阻害しないものであればよく、従来から多能性幹細胞の培養に用いられてきた各種無機塩類、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、タンパク質、脂質などを含んでよい。
【００２１】
本発明の培地を用いた多能性幹細胞の培養は、当業者に公知の任意の接着培養法を用いて行うことができる。例として、多能性幹細胞を、ＰＢＳで洗浄後、３７℃、５分間、細胞解離処理を行い、シングルセルに分散、回収し、ラミニンコートした接着培養用６ウェルプレートに播種し、ＲＯＣＫ阻害剤を含む本発明の培地で３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養し、適宜ＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地に交換しながら７日間培養することで行うことができる。
【００２２】
以下、本発明を、実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
[比較例１：細胞培養におけるアルブミンの機能検証]
［培地の調製］
ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ｗｉｔｈ ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ培地（Ｓｉｇｍａ社製  Ｄ０５４７）１０．８ｇ、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製  １５６３０−０８０）１４ｍＬ、炭酸水素ナトリウム１．１ｇ、塩化ナトリウム０．４ｇ、Ｌ−アスコルビン酸リン酸マグネシウム（富士フイルム和光純薬社製  ０１３−１９６４１）０．０６ｇ、ＩＴＳ溶液（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製  ４１４００−０４５  Ｉｎｓｕｌｉｎ  １ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ０．５５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｅｌｅｎｉｕｍ  ０．７μｇ／ｍＬ）１８ｍＬ、１−Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製  Ａ８００９５０）３６１μｇ、ＩＤ−８（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製  １５２２２）１７９μｇ、Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製  １０００７９６５）１６ｎｇを水１Ｌに溶解、混合し、１Ｌの基礎培地を得た。
基礎培地１００ｍＬに、アルブミン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製  ０２１５２４０１８０−１００ｇ）１ｇを添加した培地を得た。
【００２４】
［ＲＯＳの測定］
無添加の基礎培地およびアルブミンを添加した培地それぞれに細胞をシングルセルで分散し1時間経過した後、それぞれＤＣＦＨ−ＤＡで細胞を蛍光染色し、フローサイトメーターを用いて蛍光強度を測定した。
［結果］
図１に示すとおり、アルブミンの添加によって、細胞内ＲＯＳ量が約６０％低減されたことが確認された。
【００２５】
［培養］
ヒトｉＰＳ細胞２５３Ｇ１株を、ＰＢＳで洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）および０．５ｍＭ  ＥＤＴＡの等量混合液で３７℃、５分間処理することでシングルセルに分散、回収し、血球計算盤を用いて細胞数を測定後、０．２５μｇ／ｃｍ２となるようにｉＭａｔｒｉｘ−５１１（マトリクソーム社）をコートした接着培養用６ウェルプレートに２５，０００細胞／ウェルで細胞を播種し、１０μＭのＹ−２７６３２（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製  １０００５５８３）を含む上記培地で３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養し、毎日Ｙ−２７６３２を含まない培地に交換しながら７日間培養した。
培養は、基礎培地に何も添加しない培地をコントロールとし、基礎培地にアルブミンを添加した培地とで行った（ｎ＝１）。
［細胞の形態の確認］
培養３日目の、無添加の基礎培地およびアルブミンを添加した培地での培養における、細胞の形態を位相差顕微鏡で観察した。
［結果］
図２に示すとおり、アルブミンを添加した培地における細胞の形態は、紡錘形を示しており、球形を示している無添加の培地における細胞の形態よりも、良い状態であることが確認された。
【００２６】
[実施例１：抗酸化物質を含む培地が細胞内ＲＯＳ量に与える影響の検証]
［培地の調製］
基礎培地を比較例１と同様に調製し、基礎培地１００ｍＬにそれぞれＮ−アセチル−Ｌ−システイン（関東化学社製  ０１７６３−３０）１６３ｍｇを添加したもの、還元型グルタチオン（関東化学社製  １７５０１−６１）３０７ｍｇを添加したもの、ビタミンＣ（富士フイルム和光純薬社製  ０１３−１９６４１）２７８ｍｇを添加したもの、ビタミンＥ（関東化学社製  ４０５６２−３０）４３０ｍｇを添加したもの、クロロゲン酸（関東化学社製  １０９２４−１Ａ）３５３ｍｇを添加したものを得た。また、対照として基礎培地に何も添加しない培地および基礎培地１００ｍＬにアルブミン１ｇを添加したものを得た。
［ＲＯＳの測定］
対照および各成分をそれぞれ添加した培地において培養した細胞をシングルセルに分散後、それぞれＤＣＦＨ−ＤＡで蛍光染色し、フローサイトメーターを用いて蛍光強度を測定した。
［結果］
図３に示すとおり、５種類の抗酸化物質を添加した培地でそれぞれ培養した細胞すべてにおいて無添加のものに比べて蛍光強度の低下が認められ、ＲＯＳ量が低下していることが示唆された。また、５種類の中でもＮ−アセチル−Ｌ−システインおよび還元型グルタチオンにおいて高い効果を認め、約５０％の細胞内ＲＯＳ量の低減が認められた。
【００２７】
[実施例２：抗酸化物質を含む培地を用いた多能性幹細胞の培養]
［培地の調製］
基礎培地を比較例１と同様に調製し、基礎培地１００ｍＬにそれぞれＮ−アセチル−Ｌ−システイン（関東化学社製  ０１７６３−３０）８．２ｍｇを添加したもの、還元型グルタチオン（関東化学社製  １７５０１−６１）１６ｍｇを添加したもの、ビタミンＣ（富士フイルム和光純薬社製  ０１３−１９６４１）１４ｍｇを添加したもの、ビタミンＥ（関東化学社製  ４０５６２−３０）２１ｍｇを添加したもの、クロロゲン酸（関東化学社製  １０９２４−１Ａ）１７ｍｇを添加したものを得た。また、対照として基礎培地に何も添加しない培地および基礎培地１００ｍＬにアルブミン１ｇを添加したものを得た。
［培養］
ヒトｉＰＳ細胞２５３Ｇ１株を、ＰＢＳで洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）および０．５ｍＭ  ＥＤＴＡの等量混合液で３７℃、５分間処理することでシングルセルに分散、回収し、血球計算盤を用いて細胞数を測定後、０．２５μｇ／ｃｍ２となるようにｉＭａｔｒｉｘ−５１１（マトリクソーム社）をコートした接着培養用６ウェルプレートに２５，０００細胞／ウェルで細胞を播種し、１０μＭ  Ｙ−２７６３２を含む上記培地で３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養し、毎日Ｙ−２７６３２を含まない培地に交換しながら７日間培養した。
培養は、対照として基礎培地に何も添加しない培地およびアルブミンを添加した培地を用意し、それらおよびＮ−アセチル−Ｌ−システインを添加した培地、還元型グルタチオンを添加した培地、ビタミンＣを添加した培地、ビタミンＥを添加した培地、クロロゲン酸を添加した培地とで行った（ｎ＝１）。
［細胞の形態の確認］
対照および５種類の抗酸化物質を代表してＮ−アセチル−Ｌ−システインを添加した培地での培養における、培養３日目の細胞の形態を位相差顕微鏡で観察した。
［結果］
図４に示すとおり、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを添加した培地において培養された細胞の形態も、紡錘形を示しており、良好な細胞状態であることが確認された。
【００２８】
[実施例３：親水性ポリマーを含む培地を用いた多能性幹細胞の培養]
［培地の調製］
基礎培地を比較例１と同様に調製し、基礎培地１００ｍＬにそれぞれポリビニルアルコール（Ｓｉｇｍａ社製  Ｐ８１３６）０．２５ｇを添加したもの、ポリビニルピロリドン（Ｓｉｇｍａ社製  ＰＶＰ４０）０．２５ｇを添加したもの、アルブミン１ｇを添加したものを得た。
［培養］
ヒトｉＰＳ細胞２５３Ｇ１株を、ＰＢＳで洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）および０．５ｍＭ  ＥＤＴＡの等量混合液で３７℃、５分間処理することでシングルセルに分散、回収し、血球計算盤を用いて細胞数を測定後、０．２５μｇ／ｃｍ２となるようにｉＭａｔｒｉｘ−５１１（マトリクソーム社）をコートした接着培養用６ウェルプレートに２５，０００細胞／ウェルで細胞を播種し、１０μＭ  Ｙ−２７６３２を含む上記培地で３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養し、毎日Ｙ−２７６３２を含まない培地に交換しながら７日間培養した。
培養は、対照として基礎培地に何も添加しない培地およびアルブミンを添加した培地を用意し、それらおよびポリビニルアルコールを添加した培地、ポリビニルピロリドンを添加した培地とで行った（ｎ＝３）。
［細胞接着の確認］
培養した細胞をそれぞれクリスタルバイオレットで染色し、位相差顕微鏡下で細胞の接着状態を確認した。
［結果］
図５（−）に示すとおり、無添加の培地においては培養容器中央にのみ染色された細胞が確認され、培養容器の周縁部には細胞が接着していないことを確認した。それに対して、図５（＋Ａｌｂ）に示すとおり、アルブミンを添加した培地では、培地容器全体に染色された細胞が確認され、細胞の剥離が生じていないことを確認した。また、図５（＋ＰＶＡ）および（＋ＰＶＰ）に示すとおり、２種類の親水性ポリマーを添加した培地でそれぞれ培養した細胞においても、両方とも無添加の条件下で培養した細胞に比べて培養容器の周縁部まで細胞が隈なく接着していることを確認した。
【００２９】
[実施例４：各成分を添加した培地の増殖率の比較]
［培地の調製］
基礎培地を、比較例１と同様に調製した。
基礎培地１００ｍＬに、それぞれＮ−アセチル−Ｌ−システイン８．２ｍｇのみを添加したもの、ポリビニルアルコール０．２５ｇのみを添加したもの、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン８．２ｍｇおよびポリビニルアルコール０．２５ｇを添加したものを得た。
【００３０】
［培養］
ヒトｉＰＳ細胞２５３Ｇ１株を、ＰＢＳで洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）および０．５ｍＭ  ＥＤＴＡの等量混合液で３７℃、５分間処理することでシングルセルに分散、回収し、血球計算盤を用いて細胞数を測定後、０．２５μｇ／ｃｍ２となるようにｉＭａｔｒｉｘ−５１１（マトリクソーム社）をコートした接着培養用６ウェルプレートに２５，０００細胞／ウェルで細胞を播種し、１０μＭ  Ｙ−２７６３２を含む上記培地で３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養し、毎日Ｙ−２７６３２を含まない培地に交換しながら７日間培養した。
培養は、対照として基礎培地に何も添加していない培地を用意し、それおよびＮ−アセチル−Ｌ−システインのみを添加した培地、ポリビニルアルコールのみを添加した培地、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインおよびポリビニルアルコールを添加した培地とで行った（ｎ＝３）。
［結果］
図６に示すとおり、基礎培地のみの培養結果に対し、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインのみを添加したもので約１．４倍、ポリビニルアルコールのみを添加したもので約１．５倍、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインおよびポリビニルアルコール両方を添加したもので約２．０倍の相対増殖率の増加が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の培地を用いることにより、多能性幹細胞をアルブミンを使用することなく、効率よく安定的に増殖させることが可能となる。かかる培地で培養された多能性幹細胞はアルブミンを使用していないため、再生医療や医療分野の研究などに幅広く用いることができ、さらに低コストであるため、多能性幹細胞を用いた再生医療や医薬品開発などを広く普及し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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