(57)【要約】【課題】間葉系幹細胞の分離・選別方法、培養方法及びそれに用いる選別材料を提供する。【解決手段】特定分子量が２０００〜４０００のＮ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーがコーティングされた細胞培養用材料のコーティング面に間葉系幹細胞を含有する細胞集団を播種し培地を入れた後培地交換を行わず播種後２日〜１０日後に培地交換を行うことを特徴とする間葉系幹細胞の分離・選別方法である。また、前記培地交換後、さらに少なくとも１０日間培養することが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
重量平均分子量が２０００〜４０００のＮ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーがコーティングされた選別材料のコーティング面に間葉系幹細胞を含有する細胞集団を播種し培地を入れた後培地交換を行わず播種後２日〜１０日後に培地交換を行うことを特徴とする間葉系幹細胞の分離・選別方法。
【請求項２】
前記間葉系幹細胞を含有する細胞集団を播種し培地を入れた後培地交換を行わず播種後５日〜１０日後に培地交換を行う、請求項１記載の間葉系幹細胞の分離・選別方法。
【請求項３】
前記Ｎ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーを０．０１〜１０００μｇ／ｍＬ含有するコーティング剤を細胞培養基材の表面を全てコーティング剤で覆うようにコーティングし、４℃から常温のいずれかの温度で溶媒を捨てることなく乾燥させることを特徴とする請求項１又は２記載の間葉系幹細胞の分離・選別方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分離・選別方法で分離・選別された間葉系幹細胞を、前記培地交換後、さらに少なくとも１０日間培養することを特徴とする間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項５】
重量平均分子量が２０００〜４０００の範囲のＮ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーであり、該ポリマーは次の化学式で表される化合物であり、該ポリマーが培養基材上にコーティングされていることを特徴とする間葉系幹細胞選別材料。
【化１】
2020068779.tif 000004
式中ｎは３〜１５の整数である。
【請求項６】
前記Ｎ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーは数平均分子量が３０００〜５０００の範囲にあり、かつ重量平均分子量と数平均分子量との比が０．８以上、１．５未満の範囲であることを特徴とする請求項５記載の間葉系幹細胞選別材料。
【請求項７】
前記培養基材は表面が親水性を有することを特徴とする請求項５記載の間葉系幹細胞選別材料。
【請求項８】
前記Ｎ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーを０．０１〜１０００μｇ／ｍＬ含有するコーティング剤を細胞培養基材の表面を全てコーティング剤で覆うようにコーティングし、４℃から常温のいずれかの温度で溶媒を捨てることなく乾燥させることを特徴とする請求項５ないし７のいずれかに記載の間葉系幹細胞選別材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞の分離・選別方法、培養方法及びそれに用いる選別材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞は、骨髄中や脂肪などの組織に存在し、骨や脂肪、軟骨への分化能を有する組織幹細胞である。この間葉系幹細胞は、肝臓や神経、血管内皮細胞など様々な組織への分化が報告されており、再生医療の細胞ソースとしてその臨床応用が期待されている。
また間葉系幹細胞は、ｉＰＳ細胞と異なりガン化や分化誘導の煩雑さなどの障壁がなく、生体からの単離における倫理的問題の少なさや分化誘導の簡便さからも注目されている。そして、間葉系幹細胞の臨床への応用では、間葉系幹細胞を用いた細胞移植療法により肝線維化治療や関節の軟骨再生、骨組織再生、歯周組織再生、脳傷害時の治療など非常に多くの疾患に対する治療が期待されている。さらに間葉系幹細胞自身が産生するサイトカインや増殖因子、エクソソームの傷害組織への修復再生に有効であることが示されてきた。そこで、細胞移植治療だけでなく、培養間葉系細胞の培養上清を精製し、生体に投与する治療も試みられている。
【０００３】
しかしながら、間葉系幹細胞の分化能やサイトカイン産生能は、生体組織からの樹立法やその日数、培養継代回数などの樹立条件によって大きく左右される。このため、現在では常に良い状態の間葉系幹細胞を得ることが難しく、高い治療効果を維持した治療の実現が困難となっている。基本的には、継代回数が少なく培養日数を経ていない間葉系幹細胞は分化能やサイトカイン産生能が高く治療に有効であるが、培養日数を経るに伴って、その効果は低下し治療効果が期待できない。従って、間葉系幹細胞を利用した再生医療を実現するには、生体からできるだけ多くの間葉系幹細胞を単離して、短期間の培養で細胞数を増加させ治療に使用することが重要である。間葉系幹細胞は、骨髄や脂肪中には、およそ０．００１〜０．０１％で存在しており、これらを効率よく分離・選別することが重要である。
【０００４】
骨髄や脂肪から間葉系幹細胞の分離・選別する方法としては主に骨髄細胞を細胞培養用ディッシュに播種し、接着する細胞を間葉系幹細胞として単離している（非特許文献１）。この単離法では、非特異的な細胞培養用ディッシュへの接着に基づいて実施されるために間葉系幹細胞以外の細胞が混入し、この混入した細胞が間葉系幹細胞の分化能や増殖能、遊走能を失わせたり、失わせないまでも能力を低下させるなど間葉系幹細胞の性能低下の原因となり、結果的に十分な量の間葉系幹細胞を得られないという問題があった。そのためディッシュ表面にフィブロネクチンをコートしたものも使用されているが、フィブロネクチンは血清を含む培地に含まれているので、フィブロネクチンでコーティングされたディッシュの使用は、組織培養ディッシュと比較して十分な性能が得られていない。そのため間葉系幹細胞の表面マーカーを用いて細胞を単離する方法が提案されている。この時の間葉系幹細胞のマーカーとしては例えば陽性マーカーとしてＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ７３（ecto-5' nucleotidase, SH3, SH4）、ＣＤ１０５（endoglin, SH2）、ＣＤ１６６（ALCAM）が陰性マーカーとしてはＣＤ３４、ＣＤ４５（LCA：leukocyte common antigen）等が同定されている。さらにＣＤ２７１（LNGFR）、ＣＤ１４０ｂ（PDGFR-β）、ＣＤ３４０（HER-2/erbB2）、ＣＤ３４９（frizzled-9）等を用いて単離する方法も提案されている（非特許文献２）。さらにヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から前記ＣＤ２７１（LNGFR）とＣＤ９０（Thy-1）を発現している細胞を選別することによりヒト間葉系幹細胞を濃縮する方法（特許文献１）やヒト間葉系幹細胞を含む細胞集団からＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞の存在比率を定量して各細胞集団の合否判定を行い、合格の細胞集団のみを選別するヒト間葉系幹細胞の分離・選別方法（特許文献２）が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−０６０８４０号公報
【特許文献２】国際公開第２０１６／０１７７９５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Pittenger, M.F., Mackay, A.M., Beck, S.C., Jaiswal, R.K., Dougla s, R., Mosca, J.D., Moorman, M.A., Simonetti, D.W., Craig, S., and Marshak, D.R. (1999). Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284, 143-147.
【非特許文献２】Buhring Hans-Jorg, et al, Novel markers for the prospective isolation of human MSC, Annals of the New York Academy of Sciences, annals-1392-000,Haematopoietic Stem Cells VI, 10-Nov-2006.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のような知見はあるものの、間葉系幹細胞以外の細胞が混入することで間葉系幹細胞の質が低下したり、複数のマーカーを用いて選別するためコストや細胞への影響、継代回数の増加等があるなど、骨髄や脂肪から簡単でしかも効率的な間葉系幹細胞の単離・選別する方法がないのが現状であった。また、選別後培養により間葉系幹細胞を増加させる場合、継代回数が増えるなどのため間葉系幹細胞の増殖性や分化能に影響のない培養方法が無いのが現状であった。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、間葉系幹細胞の分離・選別方法、培養方法及びそれに用いる選別材料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、例えば骨髄細胞集団中には、骨髄球、赤血球、赤芽球、好酸球、造血幹細胞、間質細胞（間葉系幹細胞）が存在しているが、これらの細胞種の中で、ビメンチンを発現する細胞は間葉系幹細胞を含む間質細胞のみであること、ビメンチンは細胞内分子にもかかわらず、ガン細胞や間葉系細胞の細胞表面に出現すること及びこの細胞表面に出現したビメンチンが、Ｎ−アセチルグルコサミンに結合することを発見した。この結合は特定のＮ−アセチルグルコサミン基含有ポリマー（以下、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーともいう）を用いることにより非常に強い結合を有するものであった。そこで本発明者らは、当該知見から鋭意検討し、特定表面上に骨髄等の間葉系幹細胞を含有する細胞集団を播種すると特定表面上のＮ−アセチルグルコサミンに間葉系幹細胞のみが選択的に結合することにより他の細胞から間葉系幹細胞を分離・選別できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は間葉系幹細胞の分離・選別方法、培養方法及びそれに用いる選別材料に関する、以下の［１］〜［８］である。
［１］  重量平均分子量が２０００〜４０００のＮ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーがコーティングされた選別材料のコーティング面に間葉系幹細胞を含有する細胞集団を播種し培地を入れた後培地交換を行わず播種後２日〜１０日後に培地交換を行うことを特徴とする間葉系幹細胞の分離・選別方法。
［２］  前記間葉系幹細胞を含有する細胞集団を播種し培地を入れた後培地交換を行わず播種後５日〜１０日後に培地交換を行う、前記［１］記載の間葉系幹細胞の分離・選別方法。
［３］  前記Ｎ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーを０．０１〜１０００μｇ／ｍＬ含有するコーティング剤を細胞培養基材の表面を全てコーティング剤で覆うようにコーティングし、４℃から常温のいずれかの温度で溶媒を捨てることなく乾燥させることを特徴とする前記［１］又は［２］記載の間葉系幹細胞の分離・選別方法。
［４］  前記［１］ないし［３］のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分離・選別方法で分離・選別された間葉系幹細胞を、前記培地交換後、さらに少なくとも１０日間培養することを特徴とする間葉系幹細胞の培養方法。
［５］  重量平均分子量が２０００〜４０００の範囲のＮ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーであり、該ポリマーは次の化学式で表される化合物であり、該ポリマーが培養基材上にコーティングされていることを特徴とする間葉系幹細胞選別材料。
【００１１】
【化１】
2020068779.tif 000002
式中ｎは３〜１５の整数である。
【００１２】
［６］  前記Ｎ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーは数平均分子量が３０００〜５０００の範囲にあり、かつ重量平均分子量と数平均分子量との比が０．８以上、１．５未満の範囲であることを特徴とする前記［５］記載の間葉系幹細胞選別材料。
［７］  前記培養基材は表面が親水性を有することを特徴とする前記［５］記載の間葉系幹細胞選別材料。
［８］  前記Ｎ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーを０．０１〜１０００μｇ／ｍＬ含有するコーティング剤を細胞培養基材の表面を全てコーティング剤で覆うようにコーティングし、４℃から常温のいずれかの温度で溶媒を捨てることなく乾燥させることを特徴とする前記［５］ないし［７］のいずれかに記載の間葉系幹細胞選別材料。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、間葉系幹細胞の分離・選別方法、培養方法及びそれに用いる選別材料を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーを重合する際に用いるＲＡＦＴ剤の使用量及び重合により得られたポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）、ＭｗとＭｎとの比率並びに重合度を示す。なお、重合度（Number of carbohydrates per polymer）は次の式で求められる。（Ｍｗ−３６４［ＤＴＭＰＡ］）／３４６［ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃｍｏｎｏｍｅｒ］
【図２】ビオチン化スクシニル化ＷＧＡ(wheat germ agglutinin)を用いてポリスチレンディッシュ上の各ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーのコーティングの状態をディッシュ上のＡＣ−ＧｌｃＮＡｃの吸着量として、ビオチン化スクシニル化ＷＧＡとＡＣ−ＧｌｃＮＡｃとの相互作用に基づいて評価した。ディッシュ上のビオチン化スクシニル化ＷＧＡの量をＨＲＰ−ニュートラビジンおよびＴＭＢ溶液により発色させ、それをマイクロプレートリーダー（製品名：iMark、Bio-Rad Laboratories社製）を用いて４５０ｎｍにおける各ウェルの吸光度を測定した。
【図３】ヒト不死化ＵＥ７Ｔ−１３間葉系幹細胞における細胞表面ビメンチン及びβ−アクチンの発現を示すウエスタンブロットである。左側がビメンチンの発現、右側がβ−アクチンの発現をそれぞれ示す。１は細胞表面タンパク質、２は全細胞溶解液のウエスタンブロットをそれぞれ示す。
【図４】ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュへのヒト不死化ＵＥ７Ｔ−１３間葉系幹細胞の接着を示したグラフである。左側が３７℃、右側が４℃における接着をそれぞれ示す。  *P<0.01、n＝3。
【図５】ビメンチン、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ５及びＰＶ−ＭＡによる、ヒト不死化ＵＥ７Ｔ−１３間葉系幹細胞のＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュへの接着の阻害を示したグラフである。左側が３７℃における接着の阻害、右側が４℃における接着の阻害をそれぞれ示す。  n＝4。
【図６】ビメンチンノックダウンＵＥ７Ｔ−１３細胞及び陰性コントロールであるＵＥ７Ｔ−１３細胞におけるビメンチン及びβ−アクチンの発現を示すウエスタンブロットである。１がコントロールＵＥ７Ｔ−１３細胞、２がビメンチンノックダウンＵＥ７Ｔ−１３細胞のウエスタンブロットをそれぞれ示す。
【図７】ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ５コートディッシュへのビメンチンノックダウン細胞およびコントロール細胞の４℃での接着数を示したグラフである。１がコントロール細胞、２がビメンチンノックダウン細胞の接着数をそれぞれ示す。  * P <0.01、n＝5。
【図８】ラット骨髄細胞における細胞表面ビメンチンの発現のフローサイトメトリー分析の結果を示した図である。左側は抗マウスＩｇＧ抗体を用いた場合、右図は細胞表面ビメンチンモノクローナル抗体を用いた場合のフローサイトメトリーの結果をそれぞれ示す。
【図９】培養１０日目の１．ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（選別材料）と３．組織培養用ディッシュとに形成されたコロニーの位相差画像を示した図である。左側が３．組織培養用ディッシュ、右側が１．ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュの画像を示す。それぞれの下段の画像は、上段の画像の拡大図である。
【図１０】ラット骨髄から分離・選別した間葉系幹細胞の１．ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（選別材料）および３．組織用培養ディッシュ上でのコロニー形成性を示す図である。上段の写真のうち、左側が３５ｍｍの組織培養用ディッシュ、右側は３５ｍｍの細胞培養ディッシュ上にＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーをコートしたディッシュ（選別材料）を用いラット骨髄を播種し２ｍＬの培地で３〜１６日間培養後の各ディッシュ上のコロニーの画像を示し、下段のグラフは、培養３〜１６日後のＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（選別材料）および組織培養用ディッシュ上の全ディッシュ領域に対するコロニーの面積（％）をグラフ化したものである。  * P <0.01、n = 3。
【図１１】１．ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（選別材料）および３．組織培養用ディッシュ上でのラット骨髄から分離・選別した間葉系幹細胞のコロニー形成性の示す図である。上段の写真のうち、左側が３５ｍｍの組織培養用ディッシュ、右側は３５ｍｍの細胞培養ディッシュ上にＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーをコートしたディッシュ（選別材料）を用いラット骨髄を播種し２ｍＬの培地で１７日間培養後の各ディッシュ上のコロニーの代表的な画像であり、下段のグラフは、培養１７日後のＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（選別材料）および組織培養用ディッシュ上の全ディッシュ領域に対するコロニーの面積（％）をグラフ化したものである。  * P <0.01、n = 8。
【図１２】１．ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ、２．ＰＶ−ＭＡコートディッシュおよび３．組織培養用ディッシュを用いラット骨髄を播種し２ｍＬの培地で１０日間培養後の各ディッシュ上のコロニーの代表画像及び全ディッシュ面積に対するおよび各ディッシュのコロニーの面積（％）をグラフ化したものである。  * P <0.01、n = 3。
【図１３】１．ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ及び３．組織培養用ディッシュの各々に形成されたコロニーについて、コロニー形成された細胞の間葉系幹細胞マーカーの発現状況を間葉系幹細胞のポジティブマーカー（CD106およびCD90）と間葉系幹細胞ネガティブマーカー（CD11b/c）を用いて観察した。ＰＥ結合抗ラットCD106抗体（赤色）、ＦＩＴＣ結合抗ラットCD11b/c抗体（緑色）、およびＦＩＴＣ結合抗ラットCD90抗体（緑色）を用いてCD106、CD11b/cおよびCD90を染色した。ビメンチンは、マウスモノクローナル抗ビメンチン抗体およびAlexaFluor647結合抗マウスIgG抗体（赤色）によって染色された。DAPIを用いて核染色も行った結果を示す。スケールバーは５００μｍである。
【図１４】１．ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ及び３．組織培養用ディッシュで増殖した細胞における間葉系幹細胞のポジティブマーカー（CD90、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105およびCD106）及び間葉系幹細胞のネガティブマーカー(CD34、CD45およびCD11b/c）発現のフローサイトメトリー分析の代表的なチャートを示す。
【図１５】１．ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ及び３．組織培養用ディッシュで増殖した細胞における間葉系幹細胞のポジティブマーカー（CD90、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105およびCD106）及び間葉系幹細胞ネガティブマーカー(CD34、CD45およびCD11b/c）を発現している細胞の、全細胞数に対する細胞数の割合を示したグラフである。
【図１６】アリザリンレッド染色およびオイルレッドＯ染色を用いて骨形成および脂肪生成分化を伴うコロニーを染色した。スケールバーは２００μｍである。
【図１７】ラット骨髄細胞（３×１０６細胞）を０．０１〜１０００μｇ／ｍＬのＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（１及び４〜８の選別材料）及び組織培養用ディッシュ（３の選別材料）に播種し、１３日間培養した細胞の細胞数を示したグラフである。
【図１８】上段のチャートは、ラット骨髄細胞（３×１０６細胞）を０．０１〜１０００μｇ／ｍＬのＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（１及び４〜８の選別材料）及び組織培養用ディッシュ（３の選別材料）に播種し、１３日間培養した細胞のCD11b/c発現をフローサイトメトリーで分析した結果である。下段のグラフは、CD11b/cポジティブ細胞の、全細胞数に対する細胞数の割合（％）を示す。
【図１９】上段のチャートは、ラット骨髄細胞（３×１０６細胞）を０．０１〜１０００μｇ／ｍＬのＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（１及び４〜８の選別材料）及び組織培養用ディッシュ（３の選別材料）に播種し、１３日間培養した細胞のCD90の発現をフローサイトメトリーで分析した結果である。下段のグラフは、CD90ポジティブ細胞の、全細胞数に対する細胞数の割合（％）を示す。  **P<0.05、n＝3。
【図２０】１．ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ及び３．組織培養用ディッシュで増殖した細胞のＳＡ−β−ガラクトシダーゼ活性のフローサイトメトリー分析の代表的なチャートを示す。
【図２１】１．ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ及び３．組織培養用ディッシュで増殖した細胞のＳＡ−β−ガラクトシダーゼ活性を示したグラフである。  *P<0.01、n＝11。
【図２２】１．ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ及び３．組織培養用ディッシュから回収した細胞を、それぞれ骨分化誘導培地、脂肪分化誘導培地、及び軟骨分化誘導培地を用いて、３５ｍｍ組織培養用ディッシュで３週間培養し、アリザリンレッド、オイルレッドＯ、およびアルシアンブルーによる染色した画像を示す。上段がＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ、下段が組織培養用ディッシュで増殖した細胞の染色像を示す。
【図２３】ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（１及び４〜８の選別材料）、ｗｅｔ１００及び組織培養用ディッシュ（３の選別材料）上にラット骨髄細胞（Rat21）を２９７×１０４ｃｅｌｌｓ／３５ｍｍとなるよう播種した。培地はMesenCult Expansion medium(ベリタス社製)を使用し、細胞を播種してから３日後に培地交換し、その後３日毎に培地交換を行なった。そして１３日後に細胞を回収し細胞数を計測し、グラフ化したものである。
【図２４】ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（１及び４〜８の選別材料）、組織培養用ディッシュ（３の選別材料）及びｗｅｔ１００上にラット骨髄細胞（Rat21）を２９７×１０４ｃｅｌｌｓ／３５ｍｍとなるよう播種した。培地はMesenCult Expansion medium(ベリタス社製)を使用し、細胞を播種してから３日後に培地交換し、その後３日毎に培地交換を行なった。そして１３日後に細胞を回収し、ＣＤ１１ｂ／ｃ抗体で染色し、染色細胞をフローサイトメトリーで検討した。
【図２５】ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（１及び４〜８の選別材料）、組織培養用ディッシュ（３の選別材料）及びｗｅｔ１００上にラット骨髄細胞（Rat21）を２９７×１０４ｃｅｌｌｓ／３５ｍｍとなるよう播種した。培地はMesenCult Expansion medium(ベリタス社製)を使用し、細胞を播種してから３日後に培地交換し、その後３日毎に培地交換を行なった。そして１３日後に細胞を回収しＣＤ９０抗体で染色し、染色細胞をフローサイトメトリーで検討した。
【図２６】ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（１及び４〜８の選別材料）、組織培養用ディッシュ（３の選別材料）及びｗｅｔ１００上にラット骨髄細胞（Rat21）を２９７×１０４ｃｅｌｌｓ／３５ｍｍとなるよう播種した。培地はMesenCult Expansion medium(ベリタス社製)を使用し、細胞を播種してから３日後に培地交換し、その後３日毎に培地交換を行なった。そして１３日後に細胞を回収しＣＤ１０６をフローサイトメトリーで検討した。
【図２７】ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（１及び４〜８の選別材料）、組織培養用ディッシュ（３の選別材料）及びｗｅｔ１００の各ディッシュで培養したラット骨髄細胞（Rat21）を回収し、ＣＤ１１ｂ／ｃ抗体で染色し、全細胞数に対する陽性細胞の割合（陽性率（％））を算出し、グラフ化したものである。
【図２８】ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（１及び４〜８の選別材料）、組織培養用ディッシュ（３の選別材料）及びｗｅｔ１００の各ディッシュで培養したラット骨髄細胞（Rat21）を回収し、ＣＤ９０抗体で染色し、全細胞数に対する陽性細胞の割合（陽性率（％））を算出し、グラフ化したものである。
【図２９】ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（１及び４〜８の選別材料）、組織培養用ディッシュ（３の選別材料）及びｗｅｔ１００の各ディッシュで培養したラット骨髄細胞（Rat21）を回収し、抗ＣＤ１０６抗体で染色し、組織培養用ディッシュ（３の選別材料）での平均蛍光強度を１としたときの、各ディッシュでの平均蛍光強度（相対蛍光強度）をグラフ化したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の間葉系幹細胞の分離・選別方法は、培養基材上に特定のＮ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーを表面にコートした間葉系幹細胞選別材料上に骨髄や脂肪等の間葉系幹細胞を含有する細胞集団を播種し培地を入れ、培地交換をすることなく培養し、播種後２〜１０日後に培地交換を行うことにより細胞集団から間葉系幹細胞のみを効率よく分離・選別することができる。
【００１６】
本発明の間葉系幹細胞の培養方法は、前記培地交換後、適宜培地交換を行い培養することで間葉系幹細胞からなるコロニーを形成し、間葉系幹細胞を増加させることができる。
【００１７】
以下、本発明の間葉系幹細胞の分離・選別方法、培養方法及びそれに用いる選別材料について詳述する。
【００１８】
［Ｎ−アセチルグルコサミン基含有ポリマー］
本発明ではＮ−アセチルグルコサミン基を含有し、これにアクリル酸、メタクリル酸、スチレン、ポリエチレンイミン又はPoly-L-lysine、ビオチンなどの化合物が結合したポリマーで、これらＮ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーの重量平均分子量は２，０００〜４，０００の範囲のものが用いられる。このＮ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーの重量平均分子量が２，０００未満あるいは４，０００超であるとポリスチレンや細胞培養用のディッシュやプレートへのコート性が低下するので好ましくない。
Ｎ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーとしては重合による化合物の収率性面から重量平均分子量は３，０００〜４，０００の範囲であり、ディッシュやプレートへのコート性からは２，０００〜３，０００の範囲である。
【００１９】
Ｎ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーの重合方法としては、例えばＮ−アセチルグルコサミン基の還元末端にスチレンやアクリル酸等を結合したものやカチオン性ポリマーであるポリエチレンイミンやpoly-L-lysineなどを結合したものが挙げられる。
Ｎ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーの製造方法は特に限定はなく、ラジカル重合やリビングラジカル重合、連鎖移動剤（ＲＡＦＴ剤）を用いた可逆的付加−開裂連鎖移動型重合法（ＲＡＦＴ重合法）等を用いることができる。例えば、前記Ｎ−アセチルグルコサミン基を有するモノマーを重合して得られるポリマーの製造方法としては、Ｎ−アセチルグルコサミンの還元末端に、アクリル酸２−カルボキシエチル等の疎水性基を有する化合物が結合したモノマーを重合する方法等が挙げられる。より詳しい製造方法としては、疎水性基を有する化合物であるアクリル酸２−カルボキシエチルとアミノ化したＮ−アセチルグルコサミンとをＤＭＴ−ＭＭにより縮合反応することによって、Ｎ−アセチルグルコサミン基を導入したアクリル系モノマーを得た後、該モノマーを重合させて製造する方法等が挙げられる。また、前記高分子化合物にＮ−アセチルグルコサミンを結合させたポリマーの製造方法としては、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖の還元末端でカチオン性ポリマーであるポリエチレンイミンやｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ等の疎水性基を有するポリマー化合物とを結合する方法等が挙げられる。
ここで、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖を化合物に結合させる方法は、特に限定されないが、例えば、アミノ基を有する化合物のアミノ基と、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖の還元末端とを、還元アミノ化法で結合することができる。また、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖のヒドロキシ基をカルボキシル基で置換し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）カップリング法等によって、アミノ基を有する化合物のアミノ基と結合させてもよい。
また、分子量を制御するためにＲＡＦＴ重合法を用いると分子量分布を狭くすることができるので好ましい。分子量の制御においては重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比率（Ｍｗ／Ｍｎ）を０．８以上、１．５未満とするようにすることで細胞培養材料表面にＮ−アセチルグルコサミンを多く存在させることができるため細胞集団中の間葉系幹細胞をより多く捉えることができるようになる。
重合方法の具体例としてはＮ−アセチルグルコサミン、疎水性基を有する化合物としてアクリル酸２−カルボキシエチルとをモル比で１：１の割合で混合し、ＤＭＴ−ＭＭ、ＤＭＳＯ又は水などの溶液中で縮合反応させＡＣ−ＧｌｃＮＡｃモノマーを調整する。ＲＡＦＴ重合法によりpoly(N-ethylacrylic acid-O-2-acetamide-2-deoxy-β-D-glucopyranosylamine)（以下、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーという）を得ることができる。
【００２０】
また、本発明のＮ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーは、前記Ｎ−アセチルグルコサミン基を１分子当たり３〜１５個であることが好ましい。この数より少ないとビメンチンとの結合性が低下する傾向にあり、この数を超えると単位面積当たりのＮ−アセチルグルコサミン量が少なくなるためやはりビメンチンとの結合性が低下する。したがってより好ましい個数は３〜１４個の範囲であり、さらに好ましい個数は５〜１４個の範囲であり、特に好ましい個数は８〜１３個の範囲である。
【００２１】
＜選別材料＞
本発明の選別材料は培養基材、例えば、ディッシュ（培養皿とも称する）、シャーレやプレート（６穴、２４穴、４８穴、９６穴、３８４穴、９６００穴などのマイクロタイタープレート、マイクロプレート、ディープウェルプレート等）、フラスコ、チャンバースライド、チューブ、セルファクトリー、ローラーボトル、スピンナーフラスコ、フォロファイバー、マイクロキャリア、ビーズ等の表面に前記したＮ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーがコートされているものである。これらの培養基材は、ガラス等の無機材料又はポリスチレン等の有機材料のいずれからなっていてもよいが、Ｎ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーに対する吸着性が高いポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等の材料や、又は吸着性を高める処理、例えば親水処理や疎水処理等を施した材料の使用が好適である。また、滅菌可能な耐熱性及び耐水性を有している材料からなるのが好ましい。そのための好適な器材の一例としては、主に大腸菌等の培養に頻用される、細胞培養用の処理を特にしていないポリスチレン製ディッシュ及び／又はプレート（以下、無処理ポリスチレン製プレートと称する）や表面を親水処理等した組織培養用ディッシュ及び／又はプレート（以下、細胞培養用プレートということもある）を挙げることができるが、細胞増殖性の面からは表面を親水処理した組織培養用ディッシュを用いるのが好ましい。これら当該培養基材は一般に市販されているものを用いてもよいし、特性に合わせ製造したものを用いてもよい。
【００２２】
本発明の選別材料では、この培養基材の表面にＮ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーをコートする必要がある。コート方法としては吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法を適用することができるが、操作の容易さから吸着による方法が好ましい。例えば、プレート等の培養基材固相表面に当該化合物の溶液を接触させ、一定時間後に溶媒を除去する方法（ウェットコーティング）により、簡便に当該化合物を吸着させたり、当該化合物の溶液を接触させた後、溶媒を除去することなく乾燥させる方法（ドライコーティング）により当該化合物を吸着することができるが、ドライコーティングはＮ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーが培養基材固相表面に重層されることから、Ｎ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーとビメンチンとの結合性をより向上させることができる。さらに具体的には、例えば、蒸留水やＰＢＳ等を溶媒とするＮ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーの溶液を、ろ過、滅菌した後、プレート等の培養基材に接触させ、例えば数時間から１週間、好ましくは一昼夜放置するだけで、当該ポリマーが固定又はコーティングされた選別材料が得られる。
このときのＮ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーの濃度は、好ましくは０．０１〜１０００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０〜２００μｇ／ｍＬ、特に好ましくは１０〜１００μｇ／ｍＬ程度とすることでビメンチンとの結合性のよい表面を形成し易くなる。
【００２３】
＜間葉系幹細胞の分離・選別及び培養方法＞
＜細胞集団＞
本発明で用いる細胞集団とは間葉系幹細胞を含有する細胞集団である。このよう細胞集団としては例えば、骨髄や末梢血、胎盤羊膜、臍帯又は歯髄等が挙げられる。また細胞集団の形状は特に限定されることはなく、細胞浮遊液や細胞懸濁液、細胞ペレット又は細胞凝集塊等を適宜選択して使用することができる。
また、脊椎、胸骨、腸骨等の骨髄を用いる場合は骨を非血清培地で洗い流すことにより骨から骨髄を単離し、溶血剤で骨髄中の赤血球を溶血させ、さらに遠心分離することにより単核細胞を回収し、これを細胞集団として用いることにより血液に由来したＮ−アセチルグルコサミンとビメンチンとの結合への影響や間葉系幹細胞自体の数を減少させるなどの影響を少なくすることができる。
＜間葉系幹細胞の分離・選別及び培養方法＞
本発明の間葉系幹細胞の分離・選別方法は前記の選別材料表面に骨髄や脂肪など間葉系幹細胞を含有する細胞集団を播種し間葉系幹細胞培養用の培地を入れ、培地交換をすることなく培養し、少なくとも２日間、好ましくは２〜１０日間、より好ましくは５日間〜１０日間、さらに好ましくは７〜１０日間培養後、培地交換を行ない、Ｎ−アセチルグルコサミンに結合しない細胞を除去することにより細胞集団から間葉系幹細胞のみを単離・選別することができる。播種する細胞の数は使用する選別材料の大きさにより適宜選択すればよいが、例えば３５ｍｍディッシュの場合、５〜７×１０6ｃｅｌｌ程度とすることで、１度に回収できる間葉系幹細胞の数とその後の培養により得られる数とを調整でき、継代回数を少なくすることができる。
また播種から２〜１０日後に培地交換した後は細胞の状態を観察しながら適宜培地交換を行い、間葉系幹細胞をさらに少なくとも１０日間培養することでコロニーが形成される。培地交換は通常３〜４日に１度の割合で行い、選別材料全面にコロニーが形成されたら継代する。
継代する場合、細胞の回収はＥＤＴＡやトリプシン等細胞培養において通常用いられるものを使用することができる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されることはない。なお、以下において「％」とあるのは、特に断りのない限り、すべて質量基準である。
【００２５】
［実施例１］
＜Ｎ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーの重合＞
ポリスチレンディッシュ上にコーティングできる最適なＮ−アセチルグルコサミン基含有ポリマーを検討するために、Reversible Addition Fragmentation chain Ttransfer（ＲＡＦＴ）剤を用いて様々な分子量のＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーを重合した。具体的な重合方法は次のとおりである。
＜ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃモノマーの作製＞
５ｇのＧｌｃＡＮｃを５０ｍＬの水に溶解し、ＮＨ4ＣＯ3を飽和させるまで加えた。ナスフラスコで攪拌し、３０〜３５ ℃で４〜５日間、蓋を開けた開放系でインキュベーションしＮＨ4ＣＯ3の沈澱がなくなったら適宜加えた。ＴＬＣでＧｌｃＮＡｃ−ＮＨ2の合成を確認した。４〜５日後、水を反応液に加えエバポレーター（３０℃）を行うことで、余分なＮＨ4ＣＯ3を取り除いた。なお、この操作は匂いがしなくなるまで、何度も繰り返し行った。エバポレーター後、凍結乾燥を行った。次にＧｌｃＮＡｃ−ＮＨ2（４．５ｍｏｌ： 約１ｇ）をＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解して、2-carboxyethyl acrylate （４．５ｍｍｏｌ）を加えた。溶解後に、ＤＭＴ−ＭＭ （６．８ｍｍｏｌ） を加えて１８時間、室温でインキュベーションを行った。インキュベーション後、反応物を２００〜３００ｍＬのクロロホルムに滴下した。沈澱が得られるので、桐山ロートで回収した。回収した沈澱をメタノールで溶解させ、不溶物を桐山ロートで取り除き、メタノールで溶解したものを回収した。エバポレーターを行い、メタノールを除去した。メタノールを除去した固形物を水で溶解し、その後、分取型ＨＰＬＣ（水／アセトニトリル）で精製を行い、下記化学式のＡＣ−ＧｌｃＮＡｃモノマーを得た。
＜ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーの重合＞
ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃモノマー ５０ｍｇを２５０μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。ＲＡＦＴ剤（２−（ドデシルチオカルバモイルチオイル）−２−メチルプロパン酸（ＤＴＭＰＡ：シグマ社製）を約５．２６ｍｇとＡＩＢＮ１ｍｇ （モノマーに対して２％)を加え、脱気後（凍結融解脱気を三回程度繰り返す）、６５℃で約１８時間インキュベーションを行った。重合後、イソプロパノールで重合物を沈澱させ、遠心後回収して水に溶解し、透析（ＭＷ１００−５００）を約１日行い、未反応のモノマーを除いた。透析後、凍結乾燥を行い、重合物（ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ１０）を得た。
なお、その他のＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーの重合はＲＡＦＴ剤の配合割合を図１のとおりとし前記と同様にして重合物を得た。ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーの分子量はＤＴＭＰＡの濃度を変えることにより制御した。また各分子量はGel Permeation Chromatography(ＧＰＣ)装置（製品名：ＬＣ−９１１０Ｇ  ＮＥＸＴ。日本分析工業（株）社製）を用いて、次の条件で各材料の各平均分子量を測定した。カラムは、ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ５１０を用いて溶離液は、２００ｍＭ  硝酸ナトリウム／アセトニトリル＝８０／２０で行った。流量は１ｍＬ／ｍｉｎ、検出器はＲＩ検出器、カラム温度は４０℃で行った。分子量の標準曲線はプルランで実施した。このものの物性を図１に示す。
【００２６】
【化２】
2020068779.tif 000003
【００２７】
なお、図１中Ｅｎｔｒｙに記載のＡＣ−ＧｌｃＮＡｃはＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーであって、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃモノマーとＲＡＦＴ剤との比率によりモノマー／ＲＡＦＴ剤が５のものをＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ５、１０のものをＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ１０、１５のものをＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ１５、２０のものをＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ２０、３０のものをＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ３０、４０のものをＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ４０、５０のものをＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ５０とした。
【００２８】
＜ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーのコーティング条件の検討＞
前記で製造した各ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーを１００μｇ／ｍＬで水に溶解し、それぞれのＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマー溶液５０μＬを浮遊培養用ポリスチレンディッシュ（Ｎｏｎ  Ｃｏａｔｉｎｇ）の９６ｗｅｌｌプレートの１ｗｅｌｌに入れ、蓋を開放したままで一晩インキュベーションし、溶液を乾燥させることによりコートを行なった。
乾燥コーティング後に０．００２％ＢＳＡ水溶液で１時間、２５℃でブロッキングを行なった後、１００μＬの０．２５μｇ／ｍＬのビオチン化スクシニル化ＷＧＡ(wheat germ agglutinin)を添加して１時間、２５℃でインキュベーションを行なった。その後、０．０５μｇ／ｍＬ HRP-neutravidin を１００μＬ添加して２５℃で２時間インキュベーションを行なった。そして、１００μＬのＴＭＢ溶液（SeraCare Life Sciences社製）を各ｗｅｌｌに添加して発色させた後、１００μＬの塩酸溶液（１Ｍ）を各ｗｅｌｌに加え反応を停止させた。これらのディッシュをマイクロプレートリーダー（製品名：iMark、Bio-Rad Laboratories社製）を用いて４５０ｎｍにおける各ウェルの吸光度を測定し、コーティング条件を検討した。その結果を図２に示す。
図２の結果から重量平均分子量が２６００であるＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ５と重量平均分子量が３５００のＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ１０が高いコーティング性を示した。これはＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ５および１０の親水性部分の主鎖がＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ１５のそれよりも短いため、疎水性部分であるＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーの末端のアルキル鎖がポリスチレンディッシュとの相互作用に寄与していると推測される。
また前記化学式のＧｌｃＮＡｃモノマーを用いて同様の評価を行った結果、吸光度は０．１未満となりＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ５０よりもコーティング性が悪い結果となった。
これらの結果からＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ５及びＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ１０がコーティング性に優れていることが分かる。
【００２９】
＜細胞表面のビメンチンの発現およびＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュへの間葉系細胞の接着＞
間葉系細胞が細胞表面のビメンチンを介してＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュに接着するかどうかを判断するために、ヒト不死化ＵＥ７Ｔ−１３間葉系幹細胞上で細胞表面のビメンチンの発現を調べた。ＵＥ７Ｔ−１３ヒト不死化間葉系幹細胞（以下、ＵＥ７Ｔ−１３細胞ともいう）は、JCRB Cell Bankから購入した。
まず、５００μｇ／ｍＬのBiotin-AC5-Sulfo-Osu（同仁化学社製）と４℃で２０分間インキュベーションし、総細胞表面タンパク質をビオチン化した。次に、Manosphere（登録商標）MS300／Streptavidin（タカラバイオ社製）を用いて、総ビオチン化タンパク質を収集し、細胞表面タンパク質及び全細胞溶解液を以下のウエスタンブロッティングで分析した。
細胞を１％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、およびプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤カクテル（ナカライタスク社製）で溶解し、２００００×ｇで４℃、１５分間の遠心分離により可溶性画分を収集した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ゲル内のタンパク質をImmobilon-P PVDFメンブレン（EMD Millipore社製）に転写した。タンパク質は、マウス抗ビメンチンモノクローナル抗体（Ｖ９、シグマ社製）および抗β−アクチン抗体（シグマ社製）を用いて検出した。検出は、C-DiGit（登録商標）Blot Scanner（LI-COR社製）を用いて行い、ブロッティングデータは、Image Studio Liteソフトウェア（LI-COR社製）を用いて解析した。
その結果を図３に示す。図３に示したように、ストレプトアビジンビーズを用いて収集した間葉系幹細胞からのビオチン化表面タンパク質の画分に、ビメンチンのバンドが検出されたが、β−アクチンは検出されなかった。この結果から、ビメンチンは、細胞表面タンパク質であると推定された。
【００３０】
次に、ＵＥ７Ｔ−１３細胞がＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュに接着するかどうかを確認した。ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーでコーティングされたウェルは、０．００２％ＢＳＡを用いて３７℃で１時間ブロッキングした。ブロッキング後、無血清ＤＭＥＭ中の２×１０４細胞／ウェルを９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、非接着細胞をＰＢＳで洗浄することにより除去し、１０％メチルチアゾールテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイ試薬（同仁化学社製）／１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を各ウェルに添加し、続いて５％ＣＯ２で３７℃、２時間インキュベーションした。インキュベーション後、ＭＴＴホルマザンを１００μＬのジメチルスルホキシドを用いて溶解した。得られた溶液の５７０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダーを使用して測定した。接着細胞の数は、ホルマザン産生に基づく標準曲線によって決定した。その結果を図４に示す。図４に示したように、３７℃でのインキュベーション中、播種されたＵＥ７Ｔ−１３細胞の８０〜９０％がＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ５及び１０をコーティングしたディッシュに接着し、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ５及び１０をコーティングしたディッシュへの接着数の方が、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ１５、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ２０、又はＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ３０コーティングしたディッシュへの接着数よりも大きかった。また、４℃での接着は３７℃での接着よりも少なかったが、４℃、３７℃のいずれにおいてもＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ５及びＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ１０をコートしたディッシュへの接着の方が、より長いポリマーをコートしたディッシュへの接着よりも大きかった。
【００３１】
次に、ＵＥ７Ｔ−１３細胞のＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュへの接着が細胞表面ビメンチンとＧｌｃＮＡｃ間の相互作用に起因するかどうかを確認した。
組換えビメンチン、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ５、又はグルコース担持ポリマーである、Poly[N-p-vinylbenzyl-O-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-D-gluconamide]（以下、ＰＶ−ＭＡという）の細胞懸濁液への添加後に、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ５でコートされたディッシュへのＵＥ７Ｔ−１３細胞接着が阻害されるかどうかを調べた。ＰＶ−ＭＡは、主鎖としてポリスチレン、側鎖としてグルコースで構成されており、ビメンチンと相互作用しない。ＵＥ７Ｔ−１３細胞を２０μｇ／ｍＬの組換えビメンチン、５００μｇ／ｍＬのＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマー、又は５００μｇ／ｍＬのＰＶ−ＭＡと３０分間、３７℃でインキュベーションした。インキュベーション後、これらの細胞懸濁液をＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ５をコートしたディッシュ上で３７又は４℃で１時間インキュベーションした。接着は、ＭＴＴアッセイにより評価した。その結果を図５に示す。図５に示すように、３７℃及び４℃でのインキュベーション中、接着は組換えビメンチンによって約４０％減少し、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーによって約８０％減少したが、ＰＶ−ＭＡを用いた場合、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーを用いた場合よりも接着の低下は著しく低くなった。
【００３２】
ビメンチンが接着に必要かどうかを判断するために、ビメンチンノックダウンＵＥ７Ｔ−１３細胞及び陰性コントロールＵＥ７Ｔ−１３細胞を調製した。ビメンチンノックダウンＵＥ７Ｔ−１３細胞は、pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR−ヒトビメンチン（ビメンチン-miRNAベクター、サーモ社製）を用いるトランスフェクションにより作製した。陰性コントロールＵＥ７Ｔ−１３細胞は、pcDNA 6.2-GW/ EmGFP-MIR−陰性対照プラスミド（陰性miRNAベクター、サーモ社製）をトランスフェクトすることにより作製した。細胞は、Neon（登録商標）Transfection System（サーモ社製）を用いたベクターによりトランスフェクトした。調製３日後、ビメンチンノックダウンＵＥ７Ｔ−１３細胞と陰性コントロールＵＥ７Ｔ−１３細胞とでのビメンチン及びβ−アクチンの発現を上記と同様のウエスタンブロッティングにより解析した。その結果を図６に示す。図６に示したようには、ビメンチンノックダウンＵＥ７Ｔ−１３細胞のビメンチンの発現は陰性コントロールＵＥ７Ｔ−１３細胞よりも有意に低かった。
ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ５をコートしたディッシュへのビメンチンノックダウンＵＥ７Ｔ−１３細胞の接着を明確にするため、ビメンチンノックダウン細胞及び陰性コントロールＵＥ７Ｔ−１３細胞（２×１０４細胞）をＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ５をコートしたディッシュ上で、４℃で１時間インキュベーションし、それぞれの細胞のＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ５コートディッシュへの接着を調べた。その結果を図７に示す。図７に示すように、ビメンチンノックダウンＵＥ７Ｔ−１３細胞の接着は、陰性コントロールＵＥ７Ｔ−１３細胞の接着の約半分となった。
【００３３】
＜選別及び培養＞
＜選別材料の調整＞
選別材料として次のものを準備した。
１．１００μｇ／ｍＬで水に溶解したＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ１０の１ｍＬを３５ｍｍの組織培養用ディッシュ（製品名：Ｎｕｎｃ、サーモサイエンチフィック社製）に入れ蓋を開放したまま４℃で一晩インキュベーションし、溶媒を乾燥させることによりコーティングを行ない３５ｍｍの選別材料を得た。
２．１００μｇ／ｍＬで水に溶解したＰＶ−ＭＡの１ｍＬを３５ｍｍの組織培養用ディッシュ（製品名：Ｎｕｎｃ、サーモサイエンチフィック社製）に入れ蓋を開放したまま４℃で一晩インキュベーションし、溶媒を乾燥させることによりコーティングを行った３５ｍｍのＰＶ−ＭＡコートディッシュを得た。
３．３５ｍｍの組織培養用ディッシュ（製品名：Ｎｕnｃ、サーモサイエンチフィック社製）。
なお、２のＰＶ−ＭＡコートディッシュは比較のために用いた。
【００３４】
＜分離・選別及び培養＞
６〜９週齢のメスのウィスターラットの骨髄をｐＨ７．６５の溶血剤（０．１５Ｍ塩化アンモニウム、１７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ２Ｎａ）により骨髄から赤血球を溶血後、２００×ｇで３分間遠心分離し単核細胞を回収し細胞集団を得た。この細胞集団に細胞表面ビメンチン発現細胞が存在するかをフローサイトメトリーにより調べた。フローサイトメトリーは、上記で得られた細胞集団を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに懸濁し、抗細胞表面ビメンチンモノクローナル抗体（クローン８４−１；１：１００；Ａｂｎｏｖａ社製）で４℃、１時間インキュベーション後、細胞をＣＦ４８８結合抗マウスＩｇＧ二次抗体（１：５００；Ｂｉｏｔｉｕｍ社製）と４℃で１時間インキュベーションすることにより行った。その結果を図８に示す。図８に示したように、前記細胞集団には細胞表面ビメンチン発現細胞が１４±２％（ｎ＝７）の頻度で認められた。この結果から、間葉系幹細胞は、この細胞集団内に含まれると推定された。
【００３５】
次に、この細胞集団から細胞数が５〜７×１０6ｃｅｌｌｓとなるように前記１〜３の選別材料又はディッシュに播種し、２ｍｌの培地（製品名：MesenCult proliferation medium with MesenPure、ベリタス社製）を用いて１７日間培養を行った。途中、播種から７日後に培地交換を行い、接着していない細胞を除去し、その後、３〜４日毎に培地交換を行った。図９に、形成されたコロニーの１０日後の位相差画像を示す。図９に示したように、１の選別材料（ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ）で形成されたコロニーでの細胞間接触は多かったが、３の組織培養用ディッシュでは少なかった。６、１０、１３、及び１６日目に、１の選別材料（ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ）と３の組織細胞用ディッシュでのコロニー形成をクリスタルバイオレットにより染色し確認した。確認方法は形成された染色されたコロニーの領域を画像解析ソフト（製品名：ＩｍａｇｅＪ１．６４ｒ。米国国立衛生研究所）を用いて面積を測定し、３５ｍｍディッシュの全体の面積に対するコロニーの面積の割合を算出することにより行った。その結果を図１０に示す。図１０の写真は骨髄を播種してから３〜１６日後の細胞の状態を撮影したもの、下のグラフはコロニー状態を面積として算出した結果を示す。図１０に示したように、１０日目には、３の組織培養用ディッシュよりも１のＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュでより多くのコロニーが検出され、１６日目では、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュはより大きなコロニーを形成した。増殖率は、３の組織培養用ディッシュでは１３〜１６日目に減少したが、１のＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュでは１６日目まで維持された。
１７日後のコロニーの状態をクリスタルバイオレットにより染色し確認した。その結果を図１１に示す。
図１１の写真は骨髄を播種してから１７日後の細胞の状態を撮影したもの、下のグラフはコロニー状態を面積として算出した結果を示す。写真の左側が３の通常の組織培養用ディッシュ、右側の写真は１の選別材料である。３の組織培養用ディッシュでは、コロニーの占める割合は１０％程度であるが、１の選別材料（ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ）では ３０〜４０％程度であった。また形成されたコロニーは、１の選別材料では３の通常の組織培養用ディッシュと比較して大きく、また数も多いことが分かる。このことから、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーをコートした選別材料は、増殖性の高い細胞が数多く接着していると考えられる。さらに ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃとビメンチンを介した相互作用によって 間葉系幹細胞 が分離・選別されるかについて検討するためにビメンチンに相互作用しないポリマーであるＰＶ−ＭＡを細胞培養用ディッシュにコートしたものを２として用いた。この２上で前記と同様の方法により骨髄細胞を培養した結果を図１２に示す。
図１２の結果からＰＶ−ＭＡ上の骨髄細胞の培養（写真中央）では、培養初期では多くの細胞の接着が観察されたが、その後、コロニー形成は観察されず、形成されたコロニーは、３の組織培養用ディッシュ上のコロニー形成と同様の傾向であった。このことから、ＰＶ−ＭＡをコートした細胞培養用ディッシュは、コロニーを形成可能な細胞が接着できないことが示され、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃによってビメンチンを介した相互作用によってコロニー形成が促進されていることが明らかになった。これらの結果から以上のことから、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーをコートした選別材料を用いることで、骨髄細胞から増殖性の高いコロニー形成能を持つ細胞が分離・選別及び培養できることが分かる。
【００３６】
＜分離・選別・培養された細胞の確認＞
前記１の選別材料と３の組織培養用ディッシュを用いて培養されコロニー形成された細胞を２４−ｗｅｌｌに播種してｗｅｌｌに対して細胞数が７０〜８０％程度となるまで培養を行った。その細胞を回収して４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、メタノール又は０．１％４‐（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル‐ポリエチレングリコール（製品名：Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００。シグマアルドリッチ社製）／ＰＢＳで透過性にした後、細胞を間葉系幹細胞のポジティブマーカーであるＣＤ１０６及びＣＤ９０、ネガティブマーカーであるＣＤ１１ｂ／ｃにて免疫染色を行い、顕微鏡（製品名：ＦＶ３０００。オリンパス社製）で観察した。その時の蛍光画像はＦＶ−３１Ｓ−ＳＷ（オリンパス社製）を用いて処理した。その結果を図１３に示す。
図１３の結果からポジティブマーカーであるＣＤ１０６及びＣＤ９０での染色は、３の組織培養用ディッシュおよび１のＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（選別材料）から得られたコロニーの両方で確認され、ネガティブマーカーであるＣＤ１１ｂ／ｃの染色は確認されなかった。ビメンチンの発現についても両方の細胞で同様に観察されている。以上のことから、いずれのディッシュから得られたコロニーも間葉系幹細胞であることが分かる。
【００３７】
次に、前記１の選別材料と３の組織培養用ディッシュを用いて培養され形成されたコロニーが、間葉系幹細胞の特性を持っているかどうかを判断するために、フローサイトメトリーにより間葉系幹細胞ポジティブマーカーと間葉系幹細胞ネガティブマーカーの発現を調べた。
前記１の選別材料と３の組織培養用ディッシュで骨髄細胞を約３週間培養後、増殖した細胞を回収した。これらの細胞の継代回数は、０または１とした。回収したラット骨髄細胞は、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに懸濁し、抗細胞表面ビメンチンモノクローナル抗体（クローン８４−１；１：１００；Abnova社製）で４℃、１時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をＣＦ４８８結合抗マウスＩｇＧ二次抗体（１：５００；Biotium社製）と４℃で１時間インキュベーションした。増殖細胞は、Accutase（ナカライテスク社製）を用いて剥離することにより採取した。細胞を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに懸濁し、ＦＩＴＣ結合抗ラットＣＤ１１ｂ／ｃ抗体（１：１００）、ＦＩＴＣ結合抗ラットＣＤ９０抗体（１：１００）、ＦＩＴＣ結合抗ラットＣＤ２９抗体（１：１００）ＦＩＴＣ結合抗ラットＣＤ４４抗体（１：１００）、ＰＥ結合抗ラットＣＤ５４抗体（１：１００）、又はＰＥ結合抗ラットＣＤ１０６抗体（１：１００）（全て、BioLegend社製）とインキュベーションした。ＣＤ３４の染色及びＣＤ４５の染色では、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭの細胞を抗ＣＤ３４抗体（１：１００、Santa Cruz Biotechnology社製）又は抗ＣＤ４５抗体（１：１００；Abcam社製）と４℃、１時間、次にＣＦ４８８結合抗ウサギＩｇＧ二次抗体（１：５００、Biotium社製）と４℃で１時間インキュベーションした。ＣＤ７３の染色およびＣＤ１０５の染色では、採取した細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／ＰＢＳで固定した。固定後、細胞を抗ＣＤ７３（１：５０、Proteintech社製）または抗ＣＤ１０５（１：５０、Bioss Antibodies社製）で４℃、１時間、次にＣＦ４８８結合抗ウサギＩｇＧ二次抗体（１：５００、Biotium社製）と４℃、１時間インキュベーションした。マウスＩｇＧ（和光純薬工業社製）およびウサギＩｇＧ（サーモ社製）をアイソタイプコントロールとして使用した。
その結果を図１４及び図１５に示す。図１４に示したように、前記１の選別材料でコーティングされたディッシュおよび３の組織培養用ディッシュのコロニーからの増殖細胞は、間葉系幹細胞ポジティブマーカーであるＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＣＤ１０６を発現したが、間葉系幹細胞ネガティブマーカーであるＣＤ３４、ＣＤ４５及びＣＤ１１ｂ／ｃを発現しなかった。前記１の選別材料でコーティングされたディッシュ及び３の組織培養用ディッシュの細胞集団中、それぞれＣＤ９０陽性細胞は９４±５％及び８１±１９％、ＣＤ３４陽性細胞は０．６５±０．２３％及び１．８±０．４６％、ＣＤ４５陽性細胞は０．７１±０．０９％及び１．６±０．１５％、ＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞は、４．６±３．７％及び３．１±１．７％であった。また、図１５に示したように、前記１の選別材料からのＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、およびＣＤ７３陽性細胞の割合は、すべて約８０％で、３の組織培養用ディッシュからの割合よりも多かった。
前記１の選別材料のディッシュからのＣＤ１０６陽性細胞は、全細胞の３５±１３％であったが、３の組織培養用ディッシュでは、１６±１１％であった。図１５に示したように、前記１の選別材料でコーティングされたディッシュでのＣＤ１０６発現レベルは、３の組織培養用ディッシュでのＣＤ１０６発現レベルよりも有意に高かった。ＣＤ１０６は、線維芽細胞では発現せず、ＣＤ１０６陽性間葉系幹細胞は高い増殖活性を有するため、間葉系幹細胞の信頼できるマーカーであることが報告されている。上記の結果は、前記１の選別材料であるＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュからの増殖細胞の方が、３のコーティングされていない組織細胞用ディッシュからの増殖細胞よりも間葉系幹細胞の特性を持つ細胞の割合が高いことを示している。
【００３８】
＜分化能の確認＞
前記１の選別材料と３の組織培養用ディッシュを用いて培養されコロニー形成された細胞をＡｃｃｔａｓｅ（ナカライタスク社製）を用いて解離させ、各々の細胞を別々の３５ｍｍ組織培養用ディッシュに再播種し、細胞数が７０〜８０％コンフルエンスに達するまで培養を行った。その後、骨分化誘導培地および脂肪分化誘導培地（ベリタス社製）にて２１日間培養を行った後、それぞれの細胞を骨分化についてはアリザリンレッド染色（４０ｍＭ  アリザリンレッド。シグマ社製）、脂肪分化についてはオイルレッドＯ染色（０．５％オイルレッドＯ。和光純薬工業社製））を実施した。その結果を図１６に示す。
図１６の結果から３の組織培養用ディッシュと１の選別材料の両方のコロニーから得た細胞は骨分化および脂肪分化していることが確認された。以上のことから、１の選別材料で得られた細胞は分化能を有する間葉系幹細胞であることが分かる。
これらの結果から本発明の１の選別材料を用いて間葉系幹細胞を含有する細胞集団から間葉系幹細胞を分離・選別することにより、従来用いられている３の組織培養用ディッシュに比べ約４倍量の間葉系幹細胞を得ることができるものであり、しかも細胞集団からの選別する際、従来の方法では複数のマーカー（抗体）を多量に使用したり、フローサイトメーターやＦＡＣＳ等の選別手段を必要とするなど１度に大量に選別することができず、かつ非常に高額な費用がかかるが、本発明の方法及び材料を持ちることで１度に大量の選別処理ができ、しかも合成ポリマーを用いること、特別な選別機器が不要であるなどコスト面でも優れるものである。さらに選別後そのまま培養することができるので細胞剥離や各種マーカーテストなどによる外的ストレスを与えることが無いため細胞の性質を維持したまま細胞数を増加することができる。
また本発明の選別材料は表面が親水性を有する培養基材を用いることで選別材料上で細胞増殖させる際には、初期接着時にＮ−アセチルグルコサミンとビメンチンとの相互作用により強力に接着し、長期培養により培養基材とＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーとの接着が不安定になり、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃが外れ、その空間に間葉系幹細胞が出すフィブロネクチンやコラーゲンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分が選別材料に沈着することができるようになり間葉系幹細胞増殖が促進させると推察される。
【００３９】
［実施例２］
＜選別及び培養＞
＜選別材料の調整＞
選別材料として、実施例１で調製した１〜３の選別材料の他に、以下の４〜８の選別材料を準備した。
４．  １０μｇ／ｍＬで水に溶解したＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ１０の１ｍＬを３５ｍｍの組織培養用ディッシュ（製品名：Ｎｕｎｃ、サーモサイエンチフィック社製）に入れ蓋を開放したまま４℃で一晩インキュベーションし、溶媒を乾燥させることによりコーティングを行ない３５ｍｍの選別材料を得た。
５．  １μｇ／ｍＬで水に溶解したＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ１０の１ｍＬを３５ｍｍの組織培養用ディッシュ（製品名：Ｎｕｎｃ、サーモサイエンチフィック社製）に入れ蓋を開放したまま４℃で一晩インキュベーションし、溶媒を乾燥させることによりコーティングを行ない３５ｍｍの選別材料を得た。
６．  ０.１μｇ／ｍＬで水に溶解したＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ１０の１ｍＬを３５ｍｍの組織培養用ディッシュ（製品名：Ｎｕｎｃ、サーモサイエンチフィック社製）に入れ蓋を開放したまま４℃で一晩インキュベーションし、溶媒を乾燥させることによりコーティングを行ない３５ｍｍの選別材料を得た。
７．  ０．０１μｇ／ｍＬで水に溶解したＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ１０の１ｍＬを３５ｍｍの組織培養用ディッシュ（製品名：Ｎｕｎｃ、サーモサイエンチフィック社製）に入れ蓋を開放したまま４℃で一晩インキュベーションし、溶媒を乾燥させることによりコーティングを行ない３５ｍｍの選別材料を得た。
８．  １０００μｇ／ｍＬで水に溶解したＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ１０の１ｍＬを３５ｍｍの組織培養用ディッシュ（製品名：Ｎｕｎｃ、サーモサイエンチフィック社製）に入れ蓋を開放したまま４℃で一晩インキュベーションし、溶媒を乾燥させることによりコーティングを行ない３５ｍｍの選別材料を得た。
【００４０】
＜分離・選別及び培養＞
選別材料として、実施例１に記載の１の選別材料及び３の組織培養用ディッシュの他に、上記４〜８の選別材料を用いる以外は実施例１と同様にして、骨髄細胞を培養した。その結果を図１７に示す。
図１７に示すように、０．０１〜１０００μｇ／ｍＬのＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（１及び４〜８の選別材料）の増殖細胞数は、３の組織培養用ディッシュの増殖細胞数の約２倍となった。１０及び１００μｇ／ｍＬのＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（４及び１の選別材料）からのＣＤ１１ｂ／ｃポジティブ細胞の割合を図１８に示す。図１８に示したように、１０及び１００μｇ／ｍＬのＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュからのＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞の割合は低く、約５％であった。
０．０１〜１００μｇ／ｍＬのＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（１及び２〜５の選別材料）からのＣＤ９０ポジティブ細胞の割合を図１９に示す。図１９に示したように、０．０１〜１００μｇ／ｍＬのＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュからのＣＤ９０ポジティブ細胞の割合は約９０％であった。ただし、１０００μｇ／ｍＬのＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（８の選別材料）及び３の組織培養用ディッシュからのＣＤ９０ポジティブ細胞の割合は約８０％であった。他の種類の細胞の間葉系幹細胞への混入が、１０００μｇ／ｍＬのＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（８の選別材料）と３の組織培養用ディッシュで認められたが、間葉系幹細胞は１０〜１００μｇ／ｍＬのＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーを用いることにより高純度で分離することができた。以上の結果は、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーの最適濃度が１０〜１００μｇ／ｍＬであることを示唆している。
【００４１】
＜老化効率及び分化能の確認＞
老化に関連するβ−ガラクトシダーゼ（以下、ＳＡ−βＧａｌともいう）活性を測定することにより、増殖した細胞の老化を分析した。細胞老化検出キットＳＰｉＤＥＲ−βＧａｌ（同仁化学社製）を増殖した細胞に適用するため、１の選別材料及び３の組織培養用ディッシュで約３週間培養した後の増殖細胞を、各々３５ｍｍ組織培養用ディッシュで１日間、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで培養し、細胞老化検出キットＳＰｉＤＥＲ−βＧａｌ（同仁化学社製）を用いて染色した。染色した細胞は、Guava EasyCyte Flow Cytometry System（EMD Millipore社製）を用いて分析した。図２０に、１の選別材料又は３の組織培養用ディッシュで培養した増殖細胞のフローサイトメトリーの結果を、図２１に、各増殖細胞のＳＡ−β−ガラクトシダーゼ活性を示す。図２１に示したように、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーがコーティングされていない３の組織培養用ディッシュで培養した細胞は、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（１の選別材料）の細胞よりもＳＡ−βＧａｌ活性が有意に高かった。このことから、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュで分離した間葉系幹細胞は、長期継代においても変化がないと考えられる。
【００４２】
間葉系幹細胞は、骨形成、脂肪生成、および軟骨形成へ分化する能力を有する。そこで、増殖細胞のアリザリンレッド染色、オイルレッドＯ染色、およびアルシアンブルー染色により、間葉系幹細胞の骨分化、脂肪分化、及び軟骨分化能力を調べた。
ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュ（１の選別材料）及び３の組織培養用ディッシュから回収した細胞を、それぞれ骨分化誘導培地、脂肪分化誘導培地、及び軟骨分化誘導培地を用いて、３５ｍｍ組織培養用ディッシュで３週間培養した。その結果を図２２に示す。
図２２に示したように、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュで分離した間葉系幹細胞の長期間培養における大きな変化は観察されなかった。以上の結果は、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーコートディッシュにより得られた間葉系幹細胞は、組織培養用ディッシュで得られた間葉系幹細胞と同様に分化能を有することを示している。
【００４３】
［実施例３］
＜選別及び培養＞
＜選別材料の調整＞
選別材料として実施例１で調製した１の選別材料、３の組織培養用ディッシュ、実施例２で調製した４〜８の選別材料及びｗｅｔ１００（詳細は後述する）を準備した。
【００４４】
＜分離・選別及び培養＞
６〜９週齢のメスのウィスターラットの骨髄をｐＨ７．６５の溶血剤（０．１５Ｍ塩化アンモニウム、１７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ２Ｎａ）により骨髄から赤血球を溶血後、２００×ｇで３分間遠心分離し単核細胞を回収し細胞集団を得た。
【００４５】
次に、この細胞集団から細胞数が５〜７×１０6ｃｅｌｌｓとなるように実施例１に記載の１の選別材料、３の組織培養用ディッシュ、実施例２に記載の４〜８の選別材料及び１００μｇ／ｍＬで水に溶解したＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ１０の１ｍＬを３５ｍｍの組織培養用ディッシュ（製品名：Ｎｕｎｃ、サーモサイエンチフィック社製）に入れ３７℃、２時間のインキュベーション後、ＡＣ−ＧｌｃＮＡｃ１０含有水を取り除き、さらに乾燥させることによりコーティングした選別材料（ｗｅｔ１００）を準備しこれに播種し、２ｍｌの培地（製品名：MesenCult proliferation medium with MesenPure、ベリタス社製）を用いて１３日間培養を行った。途中、播種から３日後に培地交換を行い、接着していない細胞を除去し、その後、３日毎に培地交換を行った。そして１３日後に細胞を回収した。図２３に細胞数を示す。回収した細胞はＣＤ１１ｂ／ｃ抗体、ＣＤ９０抗体の各々で染色し、染色された細胞をフローサイトメトリーで検討した。図２４はＣＤ１１ｂ／ｃ抗体のフローサイトメトリーの結果を、図２７はＣＤ１１ｂ／ｃ陽性率をそれぞれ示す。図２５はＣＤ９０抗体のフローサイトメトリーの結果を、図２８はＣＤ９０陽性率をそれぞれ示す。
図２３の結果から、３の細胞培養用ディッシュに比べ１及び４〜８の選別材料を用いた場合、２倍程度細胞数が増加していることが分かった。またＡＣ−ＧｌｃＮＡｃポリマーにより多くのコロニーが出現していた。図２４及び図２７の結果から、ネガティブマーカーであるＣＤ１１ｂ／ｃの発現量がＡＣ−ＧｌｃＮＡｃのコーティング濃度により違いがあることが分かった。このＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞はマクロファージであることから、その発現量の違いはマクロファージの混入率の違いを示す。ＣＤ１１ｂ／ｃの混入率は１及び４〜５の選別材料で低く、それ以外の選別材料及び３の細胞培養用ディッシュでは混入率が高い傾向にあった。
【００４６】
また、図２５及び図２８の結果から間葉系幹細胞の未分化マーカーであるＣＤ９０は、１、４〜８及びｗｅｔ１００の選別材料では陽性率が高く、３の細胞培養用ディッシュでは発現率が低いことが分かった。ＣＤ９０は間葉系幹細胞の純度を示す指標として考えるとコーティング濃度が０．０１〜１０μｇ／ｍＬである４〜６の選別材料及びコーティング濃度が１０００μｇ／ｍＬの８の選別材料が特に好ましいことが分かった。
【００４７】
さらに、図２７及び図２８の結果からマクロファージの混入率が低くかつ間葉系幹細胞の純度の両方を満足する選別材料は４〜５の選別材料であることが分かった。
【００４８】
次に、１及び４〜８の選別材料、３の組織培養用ディッシュ及びｗｅｔ１００上にラット骨髄細胞（Rat21）を２９７×１０４ｃｅｌｌｓ／３５ｍｍとなるよう播種した。培地はMesenCult Expansion medium(ベリタス社製)を使用し、細胞を播種してから３日後に培地交換し、その後３日毎に培地交換を行なった。そして１３日後に細胞を回収し、その細胞について間葉系幹細胞のポジティブマーカーであるＣＤ１０６を、抗ＣＤ１０６抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーで検討した。その結果を図２６に示す。図２６の結果から３の細胞培養用ディッシュで得られた細胞はＣＤ１０６が陰性、１及び４〜８の選別材料及びｗｅｔ１００で得られた細胞はいずれもＣＤ１０６が陽性であることが分かった。このＣＤ１０６が陽性である間葉系幹細胞は増殖性や免疫寛容の働きが高い等の性質を有する細胞の指標とすることもできる。
図２６のＣＤ１０６抗体の染色結果において、陰性（未染色）であった３の組織培養用ディッシュでの平均蛍光強度を１としたときの、各ディッシュでの平均蛍光強度（相対蛍光強度）を図２９に示す。図２９に示したように、３の組織培養用ディッシュと比較して、他の全ての選別材料は１．３倍以上の蛍光強度を示した。中でも５、６及び８の選別材料は２．７倍以上の蛍光強度を示し、特に、５の選別材料は３倍の蛍光強度を示した。したがって、上記の結果から、間葉系幹細胞の選別には、４〜８の選別材料が好ましく、特に５、６及び８の選別材料はＣＤ１０６の発現量が高い細胞が得られるものであることが分かった。
上記のＣＤ１１ｂ／ｃ及びＣＤ９０の陽性率、並びにＣＤ１０６の発現結果から、特に４〜６の選別材料を用いることにより純度が高く、優れた性質を有する間葉系幹細胞が得られることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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