(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト組織試料におけるインフルエンザＡウイルス（Ｆｌｕ  Ａ）およびインフルエンザＢウイルス（Ｆｌｕ  Ｂ）を検出する方法の提供。【解決手段】インフルエンザＡウイルスのマトリックス遺伝子およびインフルエンザＢウイルスの非構造遺伝子それぞれに特異的な配列を有するプライマー対を用いて増幅することにより、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、またはＨ７Ｎ９、およびインフルエンザＢウイルスの存在を検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疑われる試料中のインフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、またはＨ７Ｎ９、およびインフルエンザＢウイルスの存在を検出する方法であって、
（ａ）インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、またはＨ７Ｎ９のマトリックス遺伝子を含むことが疑われる試料を用意するステップであって、前記試料がまた、インフルエンザＢウイルスの非構造遺伝子を含むことも疑われる、ステップと、
（ｂ）第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む、インフルエンザＡウイルスの前記マトリックス遺伝子を検出するための一組のプライマーを用意するステップであって、前記第１のプライマーが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８の群から選択され、前記第２のプライマーが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８の群から選択される、ステップと、
（ｃ）第３のプライマーおよび第４のプライマーを含む、インフルエンザＢウイルスの前記非構造遺伝子を検出するための一組のプライマーを用意するステップであって、前記第３のプライマーが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６の群から選択され、前記第４のプライマーが、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６の群から選択される、ステップと、
（ｄ）ｍｓ２のフォワードおよびリバースプライマーを内部対照として含む、一組のプライマーを用意するステップであって、前記フォワードプライマーが、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、および配列番号４１の群から選択され、前記リバースプライマーが、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６の群から選択される、ステップと、
（ｅ）逆転写酵素および鋳型依存性ポリメラーゼを用いて標的核酸を増幅するステップと、
（ｆ）第１のプローブおよび第２のプローブを前記標的核酸にアニーリングして、ハイブリダイズした産物をステップ（ｅ）の間に形成するステップであって、前記第１のプローブの配列が、インフルエンザＡウイルスの前記マトリックス遺伝子に対して特異的であり、配列番号９および配列番号１０の群から選択され、前記第２のプローブが、インフルエンザＢウイルスの前記非構造遺伝子に対して特異的であり、配列番号２７および配列番号２８の群から選択される、ステップと、
（ｇ）前記ｍｓ２に対して特異的なプローブをアニーリングして、ハイブリダイズした産物をステップ（ｅ）の間に形成するステップであって、前記プローブ配列が、配列番号４２の配列である、ステップと、
（ｈ）前記ハイブリダイズした産物から生成されたシグナルを、前記標的核酸が存在する指標として検出するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記ハイブリダイズした産物から生成された前記シグナルが、蛍光シグナルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、および前記ｍｓ２のプローブのすべての５’末端が、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣ、ＣＹ３、ＣＹ５、ＴＥＴ、ＡＬＥＸＡ５９４、およびＡＬＥＸＡ６４３からなる群から選択される蛍光レポーターを保有し、前記３つのプローブの３’末端が、ＴＡＭＲＡ、ＭＧＢ、およびＢＨＱからなる群から選択されるクエンチャーを保有し、前記３つのプローブのすべての前記蛍光レポーターが別個である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ハイブリダイズした産物から生成された３つの別個の蛍光シグナルが、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ加水分解により前記標的核酸とハイブリダイズした前記第１または前記第２のプローブから切断された、前記蛍光レポーターの断片の量によりそれぞれ検出される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第１の蛍光シグナルの存在により、前記疑われる試料中に前記インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、またはＨ７Ｎ９が存在することが示され、前記第１の蛍光シグナルの非存在により、前記疑われる試料中に前記インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、またはＨ７Ｎ９が存在しないことが示される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第２の蛍光シグナルの存在により、前記疑われる試料中に前記インフルエンザＢウイルスが存在することが示され、前記第２の蛍光シグナルの非存在により、前記疑われる試料中に前記インフルエンザＢウイルスが存在しないことが示される、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、ヒト組織試料におけるインフルエンザＡウイルス（Ｆｌｕ  Ａ）およびインフルエンザＢウイルス（Ｆｌｕ  Ｂ）を検出する方法に関する。特に、Ｆｌｕ  Ａに関しては、本発明は、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９のうちの少なくとも１つを検出するためのプライマー、プローブおよび他の関連試薬を提供する。Ｆｌｕ  Ｂに関しては、本発明は、インフルエンザＢウイルスを検出するためのプライマー、プローブおよび他の関連試薬を提供する。
【０００２】
背景
インフルエンザは、局所的アウトブレイクまたは伝染病において、世界中で一般的に見られる。伝染病は、いつでも現れ得るが、通常、湿度が高い月に集中する。これらは、ほとんど、またはまったく予告なしに突然発生する。感染した人数は、数百人から数十万人まで変化し得る。伝染病は短命であり、数日または数週間持続し得るが、伝染病がより大規模になると、数カ月間持続し得る。インフルエンザは、ほとんどの個人において軽度の疾患であるが、高齢者または衰弱した個人にとっては、生命にかかわる疾患である。伝染病は、大きな生産性損失の原因となる。ＷＨＯは、感染するウイルスの抗原変化および感染拡大をモニタリングするために、情報交換研究室の国際ネットワークを委任した。
【０００３】
世界保健機関の調査およびデータによれば、インフルエンザＡおよびＢウイルスは、インフルエンザ検出の大部分を占めた。ヒトインフルエンザＡおよびＢウイルスは、ほとんど毎冬、北米、東アジア、および東南アジアにおいて疾患の季節的流行を引き起こす。インフルエンザＣ型感染症は、一般に、軽度の呼吸器疾患を引き起こし、伝染病の原因となるとは考えられない。インフルエンザＤウイルスは、ウシにのみ感染し、ヒトにおいて疾病を感染させる、またはヒトにおいて疾病の原因となるとは知られていない。
【０００４】
インフルエンザＡウイルスは、ウイルスの表面上の２つのタンパク質、ヘマグルチニン（Ｈ）およびノイラミニダーゼ（Ｎ）に基づいて亜型に分けられる。１８種の異なるヘマグルチニン亜型および１１種の異なるノイラミニダーゼ亜型がある。インフルエンザＡウイルスは、異なる株にさらに分類することができる。インフルエンザＡウイルスは、螺旋対称型の、ｓｓＲＮＡエンベロープウイルスの一種である、オルソミクソウイルス科のオルソミクソウイルス属に属する。インフルエンザＡウイルスのゲノムは、８つのＲＮＡ断片に分かれている。インフルエンザＡウイルスには４つの抗原が存在し、これは、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヌクレオカプシド（ＮＰ）およびマトリックス（Ｍ）タンパク質である。ＮＡは、Ａ、ＢおよびＣの３つの型に発生する型特異的抗原であり、これは、ヒトインフルエンザウイルスを分類する上での基礎を提供する。マトリックスタンパク質は、ヌクレオカプシドを囲み、３５〜４５％の粒子量を占める。ＨＡは、ウイルスが細胞受容体へ付着するのを媒介する。ノイラミニダーゼ分子は、エンベロープ中に、より少量存在する。
【０００５】
インフルエンザＡウイルスは、あらゆる年齢の人に感染し、死に至ることさえあり得る重篤な疾病を引き起こし得る、ヒト季節性インフルエンザの主要なものの１つである。季節性インフルエンザは、温暖な地域では主に冬に発生するが、熱帯地域では一年中蔓延し、いくつかの季節流行的特徴を有する、インフルエンザＡウイルスによって引き起こされる重要な世界的ヒト呼吸器疾患である。現在、世界的に大流行する感染症となり得る、ヒトに蔓延するインフルエンザＡウイルスの２つの亜型、すなわちＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２がある。また、ヒトがＨ５Ｎ１およびＨ７Ｎ９に感染すると、重度の疾患を引き起こす可能性があり死亡率が高まるため、Ｈ５Ｎ１およびＨ７Ｎ９は、重要な亜型と考えられている。
【０００６】
インフルエンザＢウイルスは、オルソミクソウイルス科の別の属である。インフルエンザＢウイルスゲノムは、１４５４８ヌクレオチド長であり、直鎖状マイナスセンス一本鎖ＲＮＡの８つの分節からなる。分節ゲノムは、カプシドに覆われており、各分節は、別々のヌクレオカプシド中に存在し、ヌクレオカプシドは、１つのエンベロープにより囲まれている。インフルエンザＢウイルスは、亜型には分けられないが、系統および株にさらに細分化することができる。現在、表面糖タンパク質ヘマグルチニンの抗原特性に基づいた、インフルエンザＢウイルスの２つの共循環系統がある。この系統は、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様ウイルスと名付けられている。インフルエンザＢウイルスのカプシドは、エンベロープに覆われており、さらに、そのビリオンは、エンベロープ、マトリックスタンパク質、核タンパク質複合体、ヌクレオカプシド、およびポリメラーゼ複合体からなる。
【０００７】
インフルエンザＡおよびＢウイルス感染症は、呼吸飛沫を介して伝播する。ウイルス粒子は、ウイルス受容体に富んだ呼吸上皮の細胞に結合する。ウイルス粒子上に存在するノイラミニダーゼは、上皮細胞の表面に存在する粘膜により結合している、ウイルス粒子を放出することにより感染過程を助ける。インフルエンザの典型的な症状は、感染後に現れ、著しい発熱、頭痛、羞明、悪寒、乾性咳嗽、倦怠感、筋肉痛、および咽喉における乾性のむずがゆさを伴う。発熱は持続性であり、３日ほど続く。インフルエンザＢウイルスの症状および治療は、インフルエンザＡウイルスの症状および治療に類似しているが、インフルエンザＢウイルスから重度の合併症が進行する確率は、インフルエンザＡウイルスから進行する確率よりも低い。
【０００８】
インフルエンザＡ亜型であるＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９は、すべて伝染性が高く、重度の合併症を引き起こし得る。インフルエンザＡ亜型のうちの１つである、Ｈ５Ｎ１は、他のインフルエンザＡ亜型およびインフルエンザＢウイルスよりも、はるかに急速に変異するため特に懸念されており、病原性が高く、男性において重度の疾患を引き起こし得ると判明している。したがって、リアルタイムで変異をモニタリングするために、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９とインフルエンザＢウイルスとを見分けることが重要である。
【０００９】
最近では、インフルエンザＡおよびＢウイルスのＲＮＡの検出に利用可能な、最大感度および特異性を提供するＲＴ−ＰＣＲアッセイがある。さらに、株の同定のために、そのＰＣＲ産物を配列決定することができる。最も高感度かつ認識可能な検体は、鼻咽頭スワブである。しかし、鼻咽頭スワブを採取する困難さを考慮すると、咽頭および鼻腔スワブが、より一般的に使用されている。
【００１０】
上記の観点から、疑われる試料中のインフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９、ならびにインフルエンザＢウイルスのうちの少なくとも１つを同時に検出するための、正確性および安定性の高いアッセイを開発することが必要とされている。
【００１１】
概要
本発明の目的は、疑われる試料中のインフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、またはＨ７Ｎ９のマトリックス遺伝子（以下「Ｍ遺伝子」）の存在を検出するため、ならびに疑われる試料中のインフルエンザＢウイルスの非構造遺伝子（以下「ＮＳ遺伝子」）の存在を同時に検出するための検出方法を提供することである。より正確には、疑われる試料が、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、またはＨ７Ｎ９のうちの少なくとも１つを含む場合、これは、本発明により検出され得る。疑われる試料が、少なくとも１つのインフルエンザＢウイルス株を含む場合、これは、本発明により検出され得る。また、疑われる試料が、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９、ならびにインフルエンザＢウイルスのうちの少なくとも１つを含む場合、これは、本発明により別々に検出され得る。
【００１２】
本発明の目的は、特に、疑われる試料中のインフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９、ならびにインフルエンザＢウイルスの存在を、それぞれ検出するための、指定のプライマーおよびプローブを提供することである。指定のプローブおよびプライマーは、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９、ならびにインフルエンザＢウイルスに対して特異的である。エキソヌクレアーゼ加水分解能を有する鋳型依存性ポリメラーゼはまた、このプロセスに含まれる。この目的は、疑われる試料中のインフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９、ならびに／またはインフルエンザＢウイルスのうちの少なくとも１つの存在の検出のための方法であって、
（ａ）インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、もしくはＨ７Ｎ９のＭ遺伝子、および／またはインフルエンザＢウイルスのＮＳ遺伝子を含むことが疑われる試料を用意するステップと、
（ｂ）インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９のＭ遺伝子に対して特異的なフォワードおよびリバースプライマーを含む、一組のプライマーを用意するステップであって、フォワードプライマーが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８の群から選択され、リバースプライマーが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８の群から選択される、ステップと、
（ｃ）インフルエンザＢウイルスのＮＳ遺伝子に対して特異的なフォワードおよびリバースプライマーを含む、一組のプライマーを用意するステップであって、フォワードプライマーが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５の群から選択され、リバースプライマーが、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６の群から選択される、ステップと、
（ｄ）逆転写酵素および鋳型依存性ポリメラーゼを用いて、疑われる試料中に含まれる核酸を増幅するステップと、
（ｅ）疑われる試料中に含まれる核酸に２つの異なるプローブをアニーリングして、ハイブリダイズした産物をステップ（ｄ）の間に形成するステップであって、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９に対して特異的な第１のプローブが、配列番号９および配列番号１０の群から選択され、インフルエンザＢウイルスに対して特異的な第２のプローブが、配列番号２７および配列番号２８の群から選択される、ステップと、
（ｆ）インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９、ならびに／またはインフルエンザＢウイルスの標的核酸が存在する指標として、ＲＴ−ＰＣＲ産物から生成された２つの別個のシグナルをそれぞれ検出するステップと
を含む、方法により、本発明に従って実現される。
本発明によれば、ハイブリダイズした産物から生成されたシグナルは、蛍光検出システムにより検出することができる。第１のプローブに対して特異的な２つの別個のシグナルのうちの一方は、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１および／またはＨ７Ｎ９が存在する指標であり、第２のプローブに対して特異的な他方は、インフルエンザＢウイルスが存在する指標である。
【００１３】
この概要は、以下の詳細な説明にさらに記載する、本発明のいくつかの態様を簡潔に特定するために提供する。この概要は、本開示の重要な、または本質的な特徴を示すことを意図するものではなく、任意の特許請求の範囲を限定することを意図するものでもない。用語「態様」は、「少なくとも１つの態様」と解釈される。本明細書に記載の、上記の態様および本開示の他の態様は、例として示すものであり、添付の図面に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】４つのインフルエンザＡ亜型のＭ遺伝子プライマー配列領域を示す図である。
【図２】実施形態１の動態ＰＣＲ増殖曲線を示す図である。
【図３】実施形態２の動態ＰＣＲ増殖曲線を示す図である。
【図４】実施形態３の動態ＰＣＲ増殖曲線を示す図である。
【図５】実施形態４の特異性試験結果を示す図である。
【００１５】
好ましい実施形態の詳細な説明
以下は、本発明の原理を単に示すものである。したがって、本明細書に明示的には記載または表示しないが、本発明の原理を具体化し、その趣旨および範囲内に含まれる様々な改編を、当業者が考案可能であることが理解される。
【００１６】
さらに、本明細書に列挙する、すべての例および条件的言語は、本開示の原理および発明者らが技術の拡大に寄与した概念を理解する上で読者を助けるため、明確に教育上の目的のみとなるように主に意図しており、このような詳細に列挙した例および条件に限定されないものとして解釈されるべきである。
【００１７】
さらに、本開示の原理、態様、および実施形態、ならびにその特定の例を列挙する、本明細書のすべての記載は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することを意図する。さらに、このような等価物が、現在既知の等価物ならびに将来開発される等価物、すなわち、構造にかかわらず同一の機能を果たす、後進のすべての要素の両方を含むことを意図する。
本明細書において他に明示的に指定しない限り、図面は、縮尺どおりではない。
【００１８】
本発明の方法が、正常に処理され得ることを確実にするために、本発明は、共役したマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）リガンドを有するＴａｑＭａｎプローブを使用した、迅速な同定のためのＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲアッセイを提供する。
【００１９】
このようなアッセイでは、型特異的プローブを、異なる蛍光レポーターで標識化することによって、型特異的蛍光の検出を確実としている。このアッセイにおいて適用したＴａｑポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ加水分解能を有するＤＮＡ依存性ポリメラーゼである。蛍光シグナルは、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ加水分解により標的核酸とハイブリダイズしたプローブから切断された、蛍光レポーターの断片の量により検出される。プライマーおよび／またはプローブは、修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含む。
【００２０】
現在、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２は、ヒトにおいて蔓延する世界的に大流行する感染症を引き起こす、一般的に見られる２つのインフルエンザＡ亜型である。一方、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９は、まれに見るインフルエンザＡ亜型であるが、これらは、重度の疾患を引き起こす可能性が非常に高く、結果としてヒトにおける死亡率を高める。したがって、このような４つのインフルエンザＡ亜型を可能な限り早く検出し、それによって、治療を早期に開始できることが重要である。また、このような４つの亜型は、すべて重要であるため、疑われる試料中のこれらのうちの任意の１つを他から識別する必要はない。本発明は、４つのインフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９のすべてに共有され、存在する特異的な配列を検出する方法を開示する。本発明の検出結果が、疑われる試料に対して陽性である場合、これは、少なくとも１つの亜型が存在することを意味する。その結果、早期治療を開始することができる。
【００２１】
Ｍ遺伝子（配列番号１）は、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９に存在しており、二量体の形態でウイルスエンベロープの下に存在し、ウイルスリボ核タンパク質（ｖＲＮＰ）複合体と相互作用して、内部コア成分と膜タンパク質との間をつなぐマトリックスタンパク質（以下「Ｍタンパク質」）に転換する。ｖＲＮＰは、宿主域の決定因子を保有している。Ｍタンパク質は、ウイルスＲＮＡおよびｖＲＮＰの両方と接触して、ＲＮＰ複合体の形成を促進し、ＲＮＰを核マトリックスから解離させる。Ｍ遺伝子は、集合部位へのウイルス成分の動員による集合において重要な役割を、およびウイルス粒子の形成を含む出芽過程において必要不可欠な役割を果たす。Ｍタンパク質を標的として、異なる亜型間を越えた保護を与える、新規ワクチンが有望であることが明らかとなってきている。
【００２２】
したがって、Ｍ遺伝子が、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９に存在することを考慮すると、本発明に開示のすべてのプライマーおよびプローブは、図１に示すように、４つのすべての亜型のＭ遺伝子から選択され、この４つのすべての亜型のＭ遺伝子に対して特異的である。より正確には、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９の検出のためのフォワードプライマーは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８の群から選択され、リバースプライマーは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８の群から選択される。配列番号９および配列番号１０の群のうちの１つであるプローブはまた、Ｍ遺伝子に対して特異的である。蛍光シグナルの存在により、試料中にインフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１またはＨ７Ｎ９が存在することが示される。
【００２３】
ＮＳ遺伝子は、複製段階でＮＳタンパク質を発現する、インフルエンザＡウイルスおよびインフルエンザＢウイルスの両方に存在する。しかし、インフルエンザＢウイルスのＮＳ遺伝子は、ｍＲＮＡ前駆体のプロセシングを阻害することがないこと、およびインフルエンザＡウイルスのＮＳ遺伝子に対する＜２０％の配列同一性を有することが、特有の生物活性であると指摘される。ＮＳタンパク質は、インフルエンザＢウイルスに見られるホモ二量体ＲＮＡ結合タンパク質であり、これは、ウイルス複製に必須の因子である。複製段階では、ＮＳタンパク質は、ｍＲＮＡのポリＡテールを核内に保持するために、ｍＲＮＡのポリＡテールに結合する。インフルエンザＢウイルスのＮＳ遺伝子（配列番号１９）が、インフルエンザＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様ウイルスの両方において高度に保存されているということを考慮すると、本発明に開示のインフルエンザＢウイルスに対して特異的なプライマーおよびプローブ配列は、ＮＳ遺伝子から選択される。
【００２４】
ｓｓＲＮＡバクテリオファージであるｍｓ２は、予備逆転写プロセス後の生物学的実験およびウイルス／病原体の検出において、内部対照として一般的に使用される。標的ウイルスの適切なプロセシングおよびＲＴ−ＰＣＲ反応における阻害因子の存在のモニタリングに内部対照を適用して、阻害またはヒューマンエラーに起因する偽陰性の結果が生じるのを防ぐ。したがって、以下の実施形態では、検出するインフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９、および／またはインフルエンザＢウイルスを含む検知管に内部対照としてｍｓ２を加える。逆転写により生成したｍｓ２の完全長相補的ＤＮＡは、配列番号３７に代表されるものである。
【００２５】
ＴａｑＭａｎプローブを使用する本発明は、従来方法よりも高感度であり、本発明の検出限界（以下ＬＯＤ）は、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、またはＨ７Ｎ９について、ならびにインフルエンザＢウイルスについて、１０１コピーに達し得る。したがって、本発明は、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９、ならびにインフルエンザＢウイルスの迅速かつ明確な検出に適する。
【００２６】
本発明の一実施形態では、既知濃度（ウイルス粒子コピー数）の試料中のインフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９、ならびにインフルエンザＢウイルスのＬＯＤを試験するための段階的ステップであって、
（ａ）インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、またはＨ７Ｎ９のうちの少なくとも１つの亜型の単一の段階希釈液を、１０３から１０２ウイルスコピー数で２つ、および１０１ウイルスコピー数で調製するステップであって、このような３つの段階希釈液が、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、またはＨ７Ｎ９のＭ遺伝子を含む、ステップと、
（ｂ）インフルエンザＢウイルスの少なくとも１つの亜型の単一の段階希釈液を、１０３から１０２ウイルスコピー数で２つ、および１０１ウイルスコピー数で調製するステップであって、このような３つの段階希釈液が、インフルエンザＢウイルスのＮＳ遺伝子を含む、ステップと、
（ｃ）インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９のＭ遺伝子に対して特異的なフォワードおよびリバースプライマーを含む、一組のプライマーを用意するステップであって、フォワードプライマーが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８の群から選択され、リバースプライマーが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８の群から選択される、ステップと、
（ｄ）インフルエンザＢウイルスのＮＳ遺伝子に対して特異的なフォワードおよびリバースプライマーを含む、一組のプライマーを用意するステップであって、フォワードプライマーが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５の群から選択され、リバースプライマーが、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６の群から選択される、ステップと、
（ｅ）インフルエンザＡウイルスおよびインフルエンザＢウイルスのすべての段階希釈液中にｍｓ２を加え、次いで、ｍｓ２のフォワードおよびリバースプライマーを内部対照として含む一組のプライマーを、すべての段階希釈液中に加えるステップであって、フォワードプライマーが、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、および配列番号４１の群から選択され、リバースプライマーが、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６の群から選択される、ステップと、
（ｆ）既知濃度のインフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルスおよび内部対照の試料中に含まれる核酸を、逆転写酵素および鋳型依存性ポリメラーゼを用いて増幅するステップと、
（ｇ）既知濃度の試料中に含まれる核酸に２つの異なるプローブをアニーリングして、ハイブリダイズした産物をステップ（ｆ）の間に形成するステップであって、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９に対して特異的な第１のプローブが、配列番号９および配列番号１０の群から選択され、インフルエンザＢウイルスに対して特異的な第２のプローブが、配列番号２７および配列番号２８の群から選択される、ステップと、
（ｈ）ｍｓ２に対して特異的なプローブをアニーリングして、ハイブリダイズした産物をステップ（ｆ）の間に形成するステップであって、プローブ配列が、配列番号４２の配列である、ステップと、
（ｉ）インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９、ならびに／またはインフルエンザＢウイルス、ならびに内部対照の標的核酸が存在する指標として、ハイブリダイズした産物から生成された３つの別個のシグナルをそれぞれ検出するステップと
を含む、段階的ステップを提供する。
【００２７】
本発明の別の実施形態では、１つの疑われる試料中のインフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９、ならびに／またはインフルエンザＢウイルスのうちの少なくとも１つの存在の検出のための方法であって、以下のステップ、
（ａ）インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９のＭ遺伝子、ならびに／またはインフルエンザＢウイルスのＮＳ遺伝子を含むことが疑われる試料を用意するステップと、
（ｂ）インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９のＭ遺伝子に対して特異的なフォワードおよびリバースプライマーを含む、一組のプライマーを用意するステップであって、フォワードプライマーが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８の群から選択され、リバースプライマーが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８の群から選択される、ステップと、
（ｃ）インフルエンザＢウイルスのＮＳ遺伝子に対して特異的なフォワードおよびリバースプライマーを含む、一組のプライマーを用意するステップであって、フォワードプライマーが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５の群から選択され、リバースプライマーが、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６の群から選択される、ステップと、
（ｄ）ｍｓ２、ならびにｍｓ２のフォワードおよびリバースプライマーを含む一組のプライマーを内部対照として用意するステップであって、フォワードプライマーが、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、および配列番号４１の群から選択され、リバースプライマーが、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６の群から選択される、ステップと、
（ｅ）逆転写酵素および鋳型依存性ポリメラーゼを用いて、疑われる試料および内部対照に含まれる核酸を増幅するステップと、
（ｆ）疑われる試料中に含まれる核酸に２つの異なるプローブをアニーリングして、ハイブリダイズした産物をステップ（ｅ）の間に形成するステップであって、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９に対して特異的な第１のプローブが、配列番号９および配列番号１０の群から選択され、インフルエンザＢウイルスに対して特異的な第２のプローブが、配列番号２７および配列番号２８の群から選択される、ステップと、
（ｇ）ｍｓ２に対して特異的なプローブをアニーリングして、ハイブリダイズした産物をステップ（ｅ）の間に形成するステップであって、プローブ配列が、配列番号４２の配列である、ステップと、
（ｈ）インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９、ならびに／またはインフルエンザＢウイルス、ならびに内部対照の標的核酸が存在する指標として、ハイブリダイズした産物から生成する３つの別個のシグナルをそれぞれ検出するステップと
を含む、方法を提供する。
【実施例】
【００２８】
実施形態１  インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９のＬＯＤ
インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９の代表として、既知濃度のＨ３Ｎ２粒子を本実施形態で使用した。段階希釈液を１０３から１０２コピー数で２つ、および１０１コピー数で調製した。配列番号５（Ｆ）および配列番号１８（Ｒ）を有するプライマーを使用して、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、またはＨ７Ｎ９のＭ遺伝子を増幅した。配列番号９を有するプローブをまた、本実施形態で使用する。プローブはまた、配列番号１０に交換してもよい。内部対照については、配列番号３９（Ｆ）および配列番号４５（Ｒ）を有するプライマーを使用して、ｍｓ２を増幅した。配列番号４２を有するプローブをまた、本実施形態で使用する。プライマーおよびプローブ配列を、表１に示す。
【表１】
2020068763.tif 000002
【００２９】
増幅を行い、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９６  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）上で、リアルタイムで測定およびモニタリングした。各反応混合物量は、２０μｌであり、以下の条件下で増幅した。
【表２】
2020068763.tif 000003
【００３０】
反応混合物を最初に、２分間５０℃で逆転写に供した。実際の増幅反応は、まず、９５℃で２分間インキュベートし、次いで、以下のスキームに従って５０サイクル実行した。
９５℃で１秒→６０℃で１秒
【００３１】
図２は、所与の組のプライマー、プローブ、および内部対照の動態ＰＣＲ増殖曲線を示す。１０３、１０２、および１０１のＨ３Ｎ２粒子の増殖曲線が、閾値を超えた場合、明確かつ特異的なシグナルが、最初に検出可能である。検出限界は、このような条件およびプライマー配列の下で１０１コピー数に達することができた。
【００３２】
言い換えると、疑われる試料が、すべてＭ遺伝子配列を含む、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、またはＨ７Ｎ９に感染していた場合、動態ＰＣＲ増殖曲線に上昇曲線が表れることとなる。その間に、ｍｓ２シグナルがまた、適切なプロセスを表すものとして検出可能である。
【００３３】
実施形態２  インフルエンザＢウイルスのＬＯＤ
インフルエンザＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様ウイルス株である、Ｍａｌａｙｓｉａ２５０６／２００４株をインフルエンザＢウイルスの２つの系統の代表として、本実施形態で使用した。１０３から１０２ウイルスコピー数で２つ、および１０１ウイルスコピー数で段階希釈液を調製した。配列番号２２（Ｆ）および配列番号３３（Ｒ）を有するプライマーを使用して、インフルエンザＢウイルスの疑われるＮＳ遺伝子を増幅する。配列番号２８を有するプローブをまた、本実施形態で使用する。プローブはまた、配列番号２７に交換してもよい。内部対照については、配列番号３９（Ｆ）および配列番号４５（Ｒ）を有するプライマーを使用して、ｍｓ２を増幅する。配列番号４２を有するプローブをまた、本実施形態で使用する。プライマーおよびプローブ配列を、表３に示す。
【表３】
2020068763.tif 000004
【００３４】
増幅を行い、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９６  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）上で、リアルタイムで測定およびモニタリングした。各反応混合物量は、２０μｌであり、以下の条件下で増幅した。
【表４】
2020068763.tif 000005
【００３５】
反応混合物を最初に、２分間５０℃で逆転写に供した。実際の増幅反応は、まず、９５℃で２分間インキュベートし、次いで、以下のスキームに従って５０サイクル実行した。
９５℃で１秒→６０℃で１秒
【００３６】
図３は、所与の組のプライマー、プローブ、および内部対照の動態ＰＣＲ増殖曲線を示す。１０３、１０２、および１０１のＭａｌａｙｓｉａ２５０６／２００４粒子の増殖曲線が、閾値を超えた場合、明確かつ特異的なシグナルが、最初に検出可能である。検出限界は、この条件下で１０１コピー数に達することができた。
【００３７】
言い換えると、疑われる試料が、ＮＳ遺伝子配列を含むインフルエンザＢウイルスに感染していた場合、動態ＰＣＲ増殖曲線に上昇曲線が表れることとなる。その間に、ｍｓ２シグナルがまた、適切なプロセスを表すものとして検出可能である。
【００３８】
実施形態３  インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９、ならびにインフルエンザＢウイルスの検出
本発明は、４つのインフルエンザ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９、ならびに／またはインフルエンザＢウイルスのうちの少なくとも１つの存在をそれぞれ検出する方法を開示する。本発明は、試料調製のステップを含まないことが好ましい。咽頭／鼻腔スワブまたは鼻咽頭スワブであり得る、疑われる試料から核酸を精製または単離した後、試料採取緩衝液に核酸を含む。
【００３９】
本実施形態は、インフルエンザ様症状を有する未知の患者の疑われる試料において、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、またはＨ７Ｎ９のＭ遺伝子の存在を検出するための検出方法であって、上述のように、疑われる試料の核酸を試料採取緩衝液に含む、検出方法を提供するものである。インフルエンザＢウイルスのＮＳ遺伝子の存在はまた、同時に検出される。より正確には、疑われる試料が、少なくとも１つのインフルエンザ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、またはＨ７Ｎ９を含む場合、これら４つの亜型のうちどれが存在するかにかかわらず、インフルエンザＡウイルスの少なくとも１つの亜型が、この疑われる試料中に存在するという結果を、検出結果が反映することとなる。また、疑われる試料が、少なくとも１つのインフルエンザＢウイルス株を含む場合、これも本発明により同時に検出される。そしてまた、疑われる試料が、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９、ならびに／またはインフルエンザＢウイルスのうちの少なくとも１つを含む場合、これは、別々に検出される。
【００４０】
インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、またはＨ７Ｎ９のうちの少なくとも１つを検出するには、配列番号５（Ｆ）および配列番号１８（Ｒ）を有するプライマーを使用して、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、またはＨ７Ｎ９のＭ遺伝子を増幅する。配列番号９を有するプローブをまた、本実施形態で使用する。内部対照については、配列番号３９（Ｆ）および配列番号４５（Ｒ）を有するプライマーを使用して、ｍｓ２を増幅する。配列番号４２を有するプローブをまた、本実施形態で使用する。プライマーおよびプローブ配列を、表１に示す。
【００４１】
インフルエンザＢウイルスを検出するには、配列番号２２（Ｆ）および配列番号３３（Ｒ）を有するプライマーを使用して、インフルエンザＢウイルスの疑われるＮＳ遺伝子を増幅する。配列番号２８を有するプローブをまた、本実施形態で使用する。内部対照については、配列番号３９（Ｆ）および配列番号４５（Ｒ）を有するプライマーを使用して、ｍｓ２を増幅する。配列番号４２を有するプローブをまた、本実施形態で使用する。プライマーおよびプローブ配列を、表３に示す。
【００４２】
増幅を行い、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９６  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）上で、リアルタイムで測定およびモニタリングした。各反応混合物量は、２０μｌであり、以下の条件下で増幅した。
【表５】
2020068763.tif 000006
【００４３】
反応混合物を最初に、２分間５０℃で逆転写に供した。実際の増幅反応は、まず、９５℃で２分間インキュベートし、次いで、以下のスキームに従って５０サイクル実行した。
９５℃で１秒→６０℃で１秒
【００４４】
図４は、所与の組のプライマー、プローブ、および内部対照の動態ＰＣＲ増殖曲線を示す。図４では、検出結果は、疑われる試料が、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９、ならびにインフルエンザＢウイルスのうちの少なくとも１つを含んでいたことを示す。次いで、配列決定手順を用いて疑われる試料を処理し、この結果、疑われる試料が、インフルエンザＡ  Ｈ３Ｎ２およびインフルエンザＢウイルスＭａｌａｙｓｉａ２５０６／２００４を含んでいたことを示した。
【００４５】
実施形態４  インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９、ならびにインフルエンザＢウイルスのランダム検出
本実施形態では、本発明の検出特異性についての試験を提供する。臨床的検出の特異性とは、疾患／症状の存在しない試料を正確に同定する検出能力を指す。したがって、１００％の特異性を有する検出では、疾患／症状の存在しない、すべての試料を正確に同定する。８０％の特異性を有する検出では、疾患／症状の存在しない試料の８０％を検出陰性（真陰性）として正確に報告するが、疾患／症状の存在しない試料の２０％は、検出陽性（偽陽性）として誤って同定される。本発明の特異性を試験するために、以下に列挙する、オルソミクソウイルス種に属さない４つの試料を本実施形態で提供する。各種のＴＣＩＤ５０は、１．４３×１０５／ｍｌより高い。
【表６】
2020068763.tif 000007
【００４６】
インフルエンザＡ  Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９（プライマー：配列番号５および配列番号１８、プローブ：配列番号９）、ならびにインフルエンザＢウイルス（プライマー：配列番号２２および配列番号３３、プローブ：配列番号２８）に対して特異的な指定のプライマーおよびプローブを含む、同様の調製手順および増幅条件を、これらの４つの試料にそれぞれ使用する。ｍｓ２粒子、プライマー、およびプローブ（プライマー：配列番号３９および配列番号４５、プローブ：配列番号４２）をまた、本実施形態で内部対照として使用する。
【００４７】
増幅を行い、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９６  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）上で、リアルタイムで測定およびモニタリングした。各反応混合物量は、２０μｌであり、以下の条件下で増幅した。
【表７】
2020068763.tif 000008
【００４８】
反応混合物を最初に、２分間５０℃で逆転写に供した。実際の増幅反応は、まず、９５℃で２分間インキュベートし、次いで、以下のスキームに従って５０サイクル実行した。
９５℃で１秒→６０℃で１秒
【００４９】
図５は、所与の組のプライマー、プローブ、および内部対照の動態ＰＣＲ増殖曲線を示す。図５では、このような４つの試料の検出結果は、試料が、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９としても、インフルエンザＢウイルスとしても検出、認識されなかったが、各種の内部対照は、正常に検出されたことを示す。したがって、本発明の特異性は、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、またはＨ７Ｎ９、ならびにインフルエンザＢウイルスの同定において１００％の特異性補正を達成することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2020068763.tif 000013
【配列表】
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【外国語明細書】
2020068763000001.pdf