(57)【要約】      （修正有）【課題】体液中の末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、又は希少細胞をクラスター形成しているものとしていないものとを分離して捕捉することを課題とする。【解決手段】それぞれ異なる孔径のフィルターが配置されている２つの捕捉ユニットが連結されたデバイスとすることによって、クラスター形成している細胞と、単独で存在する細胞を分別して捕捉することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液中の末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、又は希少細胞を捕捉するデバイスであって、
フィルターが配置された複数の捕捉ユニットが連結されており、
前記捕捉ユニットには、それぞれ異なる孔径のフィルターが載置されているフィルターカセットを備え、
体液流入側のフィルターの孔径が、体液流出側のフィルターの孔径よりも大きいことを特徴とする捕捉デバイス。
【請求項２】
前記フィルターカセットは、フィルター台、フィルター、フィルターおさえからなり、
フィルターおさえによってフィルター台上に載置されたフィルターがずれないように構成されていることを特徴とする請求項１に記載の捕捉デバイス。
【請求項３】
前記フィルターは、電鋳金属で形成していることを特徴する請求項１又は２に記載の捕捉デバイス。
【請求項４】
前記フィルターの電鋳金属は、ニッケル又はニッケル・パラジウム合金であることを特徴とする請求項３に記載の捕捉デバイス。
【請求項５】
前記捕捉ユニットは２つの捕捉ユニットからなり、
体液流入側の捕捉ユニットのフィルターの孔径は１２μｍ以上２０μｍ以下であり、
体液流出側の捕捉ユニットのフィルターの孔径は６μｍ以上１２μｍ未満であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の捕捉デバイス。
【請求項６】
請求項１〜５記載の捕捉デバイスと
フィルタートレイを備えていることを特徴とする捕捉細胞培養キット。
【請求項７】
請求項１〜５いずれか１項に記載の捕捉デバイスを用い、
がん患者の体液を注入して、
体液中のクラスター形成をしている腫瘍細胞（クラスターＣＴＣ）が豊富な分画、単独で存在している腫瘍細胞（シングルＣＴＣ）が豊富な分画に分けて濃縮し、
分画された細胞を夫々回収することを特徴とする細胞の分離方法。
【請求項８】
請求項６記載の捕捉細胞培養キットを用い、
シングルＣＴＣ、クラスターＣＴＣを分離して細胞を培養する方法。
【請求項９】
請求項１〜５いずれか１項記載の捕捉デバイスを用い、
シングルＣＴＣ、クラスターＣＴＣを分離して細胞を解析する方法。
【請求項１０】
請求項６記載の捕捉細胞培養キットを使用して、
シングルＣＴＣ、クラスターＣＴＣを分離、培養して細胞を解析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液中の末梢循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ、以下ＣＴＣと記載する。）や体液中の希少な腫瘍細胞（以下、希少細胞と記載する。）を濃縮するデバイスに関する。特に、ＣＴＣや希少細胞の中でも、２つ以上の細胞がクラスターを形成している腫瘍細胞と、クラスターを形成していない腫瘍細胞を区別して分画するデバイスに関する。また、前記デバイスを用いて、クラスターを形成している腫瘍細胞と、クラスターを形成していない腫瘍細胞を分画し分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、特定の分子を標的として、その機能を制御することにより治療する分子標的治療が行われるようになっている。特に、がん治療の分野では、がんの増殖や転移の原因である変異を生じた分子を標的とし、その機能を特異的に抑制することによって治療を行う分子標的治療薬の開発が進んでいる。特に、肺がん、乳がんにおいては、分子標的治療薬が、有効な治療手段となってきている。
【０００３】
例えば、肺がんは日本人のがんによる死亡原因の第１位であって（厚生労働省、２０１６年統計）、そのうち、非小細胞肺がんが８０％〜８５％を占めている。非小細胞肺がんでは、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、上皮成長因子受容体）、ＡＬＫ（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｋｉｎａｓｅ、未分化リンパ腫キナーゼ）など、特定の遺伝子変異を有するものが含まれており、その遺伝子変異に応じた個別化医療が適応となる。進行期の肺がんは、ＥＧＦＲ変異が陽性であればＥＧＦＲ−ＴＫＩ（チロシンキナーゼ阻害剤）であるゲフィチニブやエルロチニブが、ＡＬＫ変異が陽性であればクリゾチニブなど、検出された変異に応じた治療が適応となる。
【０００４】
分子標的治療薬は特定の標的分子の変異に対して有効であることから、がん細胞の遺伝子変異を検査することは非常に重要である。肺がんの遺伝子変異を検出するためには、外科手術によって得られた切除サンプル、気管支鏡生検やＣＴガイド下生検、エコーガイド下生検によって得られた生検サンプルなど、侵襲的な手技によって得られる組織の病理組織検査が必須である。
【０００５】
分子標的治療薬の治療適応を決定するためには上述のような侵襲性の高い検査が必須であるが、各手技そのもの、あるいは麻酔などの周術管理による侵襲性・合併症のリスクが患者の負担となる。また、病変部位や患者の全身状態が不良であることから生検手技が不可能な症例もある。実際に組織生検を施行した約２０〜３０％の症例で、アクセス不能のために十分な生検検体が得られなかったとの報告もある（非特許文献１）。
【０００６】
さらに、分子標的治療薬による化学療法では、薬剤に対して耐性を獲得するという問題が生じる。例えば、ＥＧＦＲ陽性肺がんに対する第１世代、第２世代の分子標的治療薬で治療を行った場合、４９〜６３％でＥＧＦＲの７９０位のアミノ酸がスレオニンからメチオニンに変異するＴ７９０Ｍ耐性遺伝子が出現すると言われている。Ｔ７９０Ｍ耐性遺伝子に対しては、第３世代のＴＫＩが効果を奏する。そのため、再発がんの場合には、治療方針を決定するために再度侵襲性の高い検査が必要となる。しかし、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ治療後耐性化し再発となった４０症例について、再生検を検討したが、そのうち５０％が脳や骨などアプローチの困難なリンパ節再発であったため生検不可能だったという報告がある（非特許文献２）。また、再生検を施行しても約１０％で、検体不十分や、気胸などの手技中の有害事象で検体採取に失敗したとの報告もある（非特許文献３）。
【０００７】
そこで患者の血液から生体内のがん細胞の情報を得ることにより、低侵襲な手技で頻回に施行できる診断システムであるリキッドバイオプシーの構築が切望されている。血液中のがん由来成分をがん診断に利用することができれば、リアルタイムに適切な治療を選択することができる。血液中の末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）や、血中循環ＤＮＡ（Ｃｅｌｌ  Ｆｒｅｅ  ＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ）、あるいは体液中の希少細胞を解析することによって、がん診断に利用することができれば、患者にとってのメリットは大きい。
【０００８】
特に、がん患者の血液中を循環するＣＴＣは、転移がんの原因の一つであると考えられており、再発、予後不良の指標であると言われている。また、がんの病勢の予測因子としても有用であると考えられ、リキッドバイオプシーの対象として注目されてきた。また、非小細胞肺がんのＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性の解析から、血液検体中のＣＴＣ数とｃｆＤＮＡ中のＥＧＦＲ変異検出率が相関すること、さらに、ＣＴＣを直接分析した方がｃｆＤＮＡの解析に比べ感度が高いことが指摘されていることから、ＣＴＣでの検出がより有用であると考えられる（非特許文献４）。
【０００９】
現在ＣＴＣの診断装置として、セルサーチ・システム（ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ）が唯一ＦＤＡ（アメリカ食品医薬品局）で認可されている（非特許文献５〜７）。本発明者らも、セルサーチ・システムを用いて、ＣＴＣ数が胃がん、大腸がんの予後診断及び抗がん剤の治療効果予測診断に有用であることを報告してきた（非特許文献８、９）。
【００１０】
また、ＣＴＣには、単独の細胞で循環しているＣＴＣ（以下、シングルＣＴＣとも記載する。）だけではなく、２つ以上の細胞がクラスターを形成しているＣＴＣ（以下、クラスターＣＴＣと記載する。）があることが明らかとなってきた。クラスターＣＴＣは、がんの転移や予後に、より相関が高いことが報告されており（非特許文献１０）、ＣＴＣをシングルＣＴＣとクラスターＣＴＣを分けて解析することの必要性が認識されてきている。クラスターＣＴＣ、シングルＣＴＣを分けて濃縮することができれば、より精度良くがん細胞を検出し、診断に用いることができる。シングルＣＴＣ、クラスターＣＴＣを生細胞のまま分離、収集して解析したり、さらに培養することが可能になれば、研究面においても、がんの転移機序や薬剤耐性機序の解明、創薬の開発などに役立てることができる。
【００１１】
異なるフィルターによって目的物を分離して捕集する装置や、細胞を収集した後に培養を行うことのできるフィルター装置は開示されている（特許文献１、２）。特許文献１には、異なるサイズの物質が混在している流体を、空隙部の開口比率の異なるフィルターを用いて、目的物よりサイズの大きい粗大物と、目的物を分離捕集するフィルター装置が開示されている。全血から白血球、赤血球などの血液細胞を除去して、エクソソームの捕集に応用できることが記載されている。特許文献２には、収集した細胞を培養可能な装置が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１９２９１７号
【特許文献２】特表２０１５−５０９８２３号公報
【特許文献３】国際公開第２０１５／０１２３１５号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】VanderLaan, P.A. et al., 2014, Lung Cancer.Vol.84(1), pp.39-44,doi:10.1016/j.lungcan.2014.01.013.
【非特許文献２】Hasegawa, T. et al., 2015, Intern. Med., Vol.54, pp.1977-1980.
【非特許文献３】Hata, A. et al., 2017, In Vivo, Vol.31(3),pp.475-479.
【非特許文献４】Isobe, K., 2012, Anticancer Res. Vol.32,pp.3339-3344.
【非特許文献５】Cristofanilli M., et al., 2004, N. Engl. J.Med. Vol.351, pp.781-791.
【非特許文献６】de Bono J.S., et al. 2008, Clin. CancerRes. Vol.14, pp.6302-6309.
【非特許文献７】Cohen, S.J., et al., 2008, J. Clin. Oncol.,Vol.26, pp.3213-3221.
【非特許文献８】Matsusaka, S., et al., 2010, Cancer Sci. Vol101(4),pp.1067-1071.
【非特許文献９】Matsusaka, S., et al., 2011, Cancer Sci. Vol.102(6),pp.1188-1192.
【非特許文献１０】Aceto, N. et al., 2014, Cell,Vol.158(5), pp.1110-1122.
【非特許文献１１】Mikolajczyk, S.D. et al., 2011, J. Oncol., Vol. 2011. Article ID 252361, 10 pages
【非特許文献１２】服部正、表面技術、2011,Vol.62,No.12,pp.619-624.
【非特許文献１３】Elufeld, W. and Lhe, H., 1995, Radiat. Phys.Chem., Vol.45(3), pp.340-365.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
セルサーチ・システムは、ＥｐＣＡＭ陽性のＣＴＣを捕捉し、血液中のＣＴＣを濃縮する装置である。そのため、ＥｐＣＡＭ陰性のＣＴＣを得ることはできない。しかし、ＣＴＣには、ＥｐＣＡＭやサイトケラチンが陰性の細胞が散見することが報告されており（非特許文献１１）、セルサーチ・システムでは検査に漏れが生じることが指摘されている。また、クラスターＣＴＣ、シングルＣＴＣを分けて分離することはできず、解析を行った細胞を培養することはできない。
【００１５】
また、一般に広く使われているフィルターは不織布、あるいは樹脂を用いている。そのため、ミクロンオーダーの孔径を有する多数の孔を均一に作製することは困難である。金属フィルターを用いることによって、ＣＴＣを分離する装置は開発されているものの、クラスターＣＴＣ、シングルＣＴＣを区別して濃縮することはできない（特許文献３）。
【００１６】
特許文献１には、異なるフィルターによって目的物を分離して捕集する装置が開示されている。この捕集装置は、異なるサイズの物質が混在している流体を、空隙部の開口比率の異なるフィルターを用いて、目的物よりサイズの大きい粗大物と、目的物を分離捕集するフィルター装置である。上述のように全血から白血球、赤血球などの血液細胞を除去して、エクソソームのみを捕集する応用に使用できることが記載されている。しかしながら、この装置は目的物の量を電磁波特性によって測定する装置であって、フィルターごとに目的物が回収できるような構成にはなっていない。目的物である細胞を回収することができないことから、細胞の特性等を解析したり、さらに細胞を培養することはできない。また、エクソソームと血球のように、サイズが大きく異なるものに関しては、分離することができると思われるが、サイズがさほど異ならないシングルＣＴＣ、クラスターＣＴＣを分離することは難しい。
【００１７】
特許文献２に記載の精密濾過装置は、がん患者の末梢血からＣＴＣを収集できることが記載されている。アパーチャを第１のタイプの体液細胞を通し、第２のタイプの体液細胞を通さないサイズにすることによって、第２のサイズの細胞を収集できることが記載されている。しかしながら、２種のサイズの細胞を分離して同時に収集できるような構成にはなっていない。
【００１８】
また、培養を行う場合には、捕獲した細胞と共に、マイクロフィルターをフィルターホルダから除去して培養する、あるいは、フィルター上のリザーバーに試薬を置き、培養を行う方法が開示されている。マイクロフィルターをフィルターホルダから外して培養する場合には、フィルターホルダを分解し、マイクロフィルターをフィルターホルダから外し、シャーレ等に移して培養するという煩雑な工程が必要である。そのため、操作に時間がかかることから、細胞の生存率が低いという問題点があった。また、フィルター上のリザーバーに試薬を置き、培養を行う場合には、フィルターホルダに厚みがあることから、そのままでは顕微鏡下で観察することはできず、細胞の培養状態等を調べることはできなかった。
【００１９】
本発明は、クラスターを形成している腫瘍細胞と、クラスターを形成していない腫瘍細胞を分けて濃縮する装置を提供することを課題とする。また、得られた腫瘍細胞を生細胞のまま解析を行ったり、あるいはそのまま培養を行うことのできる装置を提供することを課題とする。それにより、診断情報を包括的に解析し、がんに対する治療方針決定のための情報を最大限に引き出すことが可能となるだけではなく、新たな研究のツールとしても有用となる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、以下の捕捉デバイス、該捕捉デバイスを用いた解析方法に関する。
（１）体液中の末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、又は希少細胞を捕捉するデバイスであって、フィルターが配置された複数の捕捉ユニットが連結されており、前記捕捉ユニットには、それぞれ異なる孔径のフィルターが載置されているフィルターカセットを備え、体液流入側のフィルターの孔径が、体液流出側のフィルターの孔径よりも大きいことを特徴とする捕捉デバイス。
（２）前記フィルターカセットは、フィルター台、フィルター、フィルターおさえからなり、フィルターおさえによってフィルター台上に載置されたフィルターがずれないように構成されていることを特徴とする（１）に記載の捕捉デバイス。
（３）前記フィルターは、電鋳金属で形成していることを特徴する（１）又は（２）に記載の捕捉デバイス。
（４）前記フィルターの電鋳金属は、ニッケル又はニッケル・パラジウム合金であることを特徴とする（３）に記載の捕捉デバイス。
（５）前記捕捉ユニットは２つの捕捉ユニットからなり、体液流入側の捕捉ユニットのフィルターの孔径は１２μｍ以上２０μｍ以下であり、体液流出側の捕捉ユニットのフィルターの孔径は６μｍ以上１２μｍ未満であることを特徴とする（１）〜（４）のいずれか１つに記載の捕捉デバイス。
（６）（１）〜（５）記載の捕捉デバイスとフィルタートレイを備えていることを特徴とする捕捉細胞培養キット。
（７）（１）〜（５）いずれか１つに記載の捕捉デバイスを用い、がん患者の体液を注入して、体液中のクラスター形成をしている腫瘍細胞（クラスターＣＴＣ）が豊富な分画、単独で存在している腫瘍細胞（シングルＣＴＣ）が豊富な分画に分けて濃縮し、分画された細胞を夫々回収することを特徴とする細胞の分離方法。
（８）（６）記載の捕捉細胞培養キットを用い、シングルＣＴＣ、クラスターＣＴＣを分離して細胞を培養する方法。
（９）（１）〜（５）いずれか１つ記載の捕捉デバイスを用い、シングルＣＴＣ、クラスターＣＴＣを分離して細胞を解析する方法。
（１０）（６）記載の捕捉細胞培養キットを使用して、シングルＣＴＣ、クラスターＣＴＣを分離、培養して細胞を解析する方法。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１（Ａ）】捕捉デバイスの側面図。
【図１（Ｂ）】捕捉デバイスを構成する捕捉ユニットの分解斜視図。
【図１（Ｃ）】フィルター部分を示す図。
【図１（Ｄ）】捕捉デバイスにより、血液細胞が分離され、シングルＣＴＣ、クラスターＣＴＣが分別されて捕捉される様子を模式的に示した図。
【図２（Ａ）】フィルターカセット、及びフィルタートレイの斜視図。
【図２（Ｂ）】フィルターおさえの上面図、断面図／側面図、斜視図。
【図２（Ｃ）】フィルター台の上面図、断面図／側面図、斜視図。
【図２（Ｄ）】フィルタートレイ断面図／側面図、斜視図。
【図３（Ａ）】シングルＣＴＣ模擬検体を濾過した場合の細胞の回収率を示す図。フィルターの孔径と、回収率を解析した結果を示す。
【図３（Ｂ）】クラスターＣＴＣ模擬検体を濾過した場合の細胞の回収率を示す図。フィルターの孔径と、回収率を解析した結果を示す。
【図４】捕捉デバイスで捕捉した細胞の培養結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、ＣＴＣを例に説明を行うが、本実施形態のデバイスは、がん患者の血液に含まれる循環腫瘍細胞だけではなく、がん患者の腹水、腹腔洗浄液、リンパ液、髄液など体液に含まれる希少な腫瘍細胞を、クラスターを形成しているもの、クラスターを形成せず単独で存在するものを別々に濃縮することができる。
【００２３】
一定の孔径を有するフィルターを備えたデバイスは、抗ＥｐＣＡＭ抗体などのキャプチャー抗体に依存せず、細胞のサイズで腫瘍細胞を捕捉することができる。そのため、ＥｐＣＡＭ陰性の腫瘍細胞であっても回収し、解析を行うことができる。
【００２４】
以下の実施態様で示すように、一定の孔径を備えたフィルターを２つ連続して使用することにより、サイズの違いによってクラスターを形成している腫瘍細胞と、クラスターを形成していない腫瘍細胞を分画して濃縮することができる。
【００２５】
上述したように、一般に広く使われているフィルターは不織布、あるいは樹脂を用いているために、ミクロンオーダーの孔径を有する多数の孔を均一に作製することは困難である。一方、本実施形態のフィルターは、電鋳金属で形成しており、材質はニッケル単体（Ｎｉ）又はニッケル・パラジウム合金（Ｎｉ・Ｐｄ）であり、孔径を均一に作製することができる。ニッケル単体の場合、毒性があるニッケルが溶出する恐れがあるが、腫瘍細胞をフィルターで捕捉して取り出す作業時間が短ければ、腫瘍細胞を生きたまま取り出すことができる。しかしながら、この作業時間が長くなると、腫瘍細胞が死んでしまう恐れがあるため、材質としてニッケル・パラジウム合金を用いた方が好ましい。この理由として、パラジウム自体の毒性が低いことと、ニッケルとパラジウムの合金は固溶体を形成することによりニッケルの溶出を防ぐことができるからである。従って、低毒性の点で、ニッケル・パラジウム合金が好ましく、例えば、ニッケル２０％、パラジウム８０％が適している。
【００２６】
この本実施形態のフィルターは、例えばＬＩＧＡ（Ｌｉｔｈｏｇａｐｈｉｅ  Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｇ  Ａｂｆｏｍｕｎｇ）技術を利用することによって作製することができる（非特許文献１２、１３）。１例として、基板上にレジスト、吸収材（任意成分）、マスクを積層し、紫外線、Ｘ線又はシンクロトロン放射光を照射してレジストパターンを形成した後、基板を電極として電鋳を行う金属メッキを行い、所定の開孔を残すところで電鋳を終え、更にレジストの除去を行うことを含む方法により電鋳フィルターを作製することができる。
【００２７】
かかる製作方法は、開口率が高いと共に孔径の均一性が極めて高く、厳密なサイズ分画の材料として最適である。例えば、本実施態様で使用した孔径８μｍ金属製のフィルターは開口率２５．６％であるのに対し、一般に広く使用されている合成繊維を編み込んだ不織布や中空糸などからなる３次元網目構造のフィルターは孔の配列が制御できずランダムであり、開口率も４．８％程度と非常に低い。
【００２８】
また、特許文献３に記載のデバイスのように、窪みを形成しないことから、同じ孔径で設計したとしても開口率は大きく、厚みは薄く設計することができる。例えば、孔径１０μｍの場合、本実施態様では１．８倍以上の開口率とすることができる。また、フィルターの厚さもＣＴＣの直径よりも小さい５μｍで製造することができる。このように、開口率が大きく、厚みが薄いために血液を流した場合に詰まりにくいという利点がある。
【００２９】
［実施態様１］
以下に図面を示しながら、詳細に説明を行うが、本発明のデバイスは下記で説明するデバイスに限定されるものではない。図１（Ａ）は、実施態様１の捕捉デバイス１の側面図を示している。捕捉デバイス１は２つの捕捉ユニット２、２’が連結された構造となっている。図１（Ｂ）は捕捉ユニット２を示すが、２つの捕捉ユニット２、２’は、内部に配置されているフィルターの孔径が異なっている他は、すべて同じ構造となっている。
【００３０】
捕捉ユニット２は、上部部材３、フィルターカセット４、下部部材５から構成されている。フィルターカセット４は、以下に示すように、フィルター台、フィルター、フィルターおさえから構成されている。フィルター６は、図１（Ｃ）の走査顕微鏡写真に示すように、同一の直径の細孔が等間隔に配置されている。そのため、上述のように既存の製品と比べて開口率を大きく設定することができる。
【００３１】
上部部材３の上部開口部７に、血液などの体液を入れたリザーバー（図示せず）を接続し、体液を捕捉デバイスに流入させ、フィルター６上に腫瘍細胞を捕捉する。流速は、リザーバー下部に三方コックなどを設けることによって調節することができる。また、上部部材３とフィルターカセット４、フィルターカセット４と下部部材５間にはパッキンを設け、注入した体液が漏れないようにすることが好ましい。
【００３２】
図１（Ｄ）に模式的に示すように、血液中には、末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、及び血球細胞が含まれている。また、ＣＴＣは、単独の細胞で循環しているシングルＣＴＣと、２つ以上の細胞がクラスターを形成しているクラスターＣＴＣがある。
【００３３】
上部の捕捉ユニット２のフィルター６は下部の捕捉ユニット２’のフィルター６’に比べて孔径の大きなものが配置されている（図１（Ｄ）、以下、上部の捕捉ユニット２に配置するフィルター６を上部フィルター、下部の捕捉ユニットに配置するフィルターを下部フィルター６’という。）。そのため、サイズの大きいクラスターＣＴＣは上部フィルター６上に捕捉されるが、クラスターを形成していないサイズの小さいシングルＣＴＣや血球系細胞は上部フィルター６を通過する。上部フィルター６を通過した、シングルＣＴＣは下部フィルター６’で捕捉されるが、血球細胞はシングルＣＴＣより小さいため下部フィルター６’を通過し捕捉デバイスの下部開口部８より流出する。その結果、上部の捕捉ユニット２では、クラスターＣＴＣを、下部の捕捉ユニット２’では、シングルＣＴＣを濃縮することができる。
【００３４】
フィルターカセット、フィルター、及びフィルタートレイの一実施態様について説明する（図２）。フィルターカセット４はフィルターおさえ９、及びフィルター台１０からなり、フィルターおさえ９とフィルター台１０の間に、適切な孔径のフィルター６を挟んで使用する（図２（Ａ））。フィルターカセット４は、下部部材５上に配置され、上部部材３によって固定される。上部部材３はスクリューキャップ状になっており、下部部材５にネジ止めされる（図１（Ｂ）参照）。上部部材３とフィルターカセット４の間、下部部材５とフィルターカセット４の間に夫々パッキン（図示せず）を配置することによって、注入される体液の漏れを防ぐことができる。
【００３５】
図２（Ｂ）はフィルターおさえ９、図２（Ｃ）はフィルター台１０の夫々上から、上面図、断面図／側面図、斜視図を示している。図２（Ｂ）、（Ｃ）の中央の図の左半分に示す断面図は、上面図のＡ-Ａ’の線における断面図を示している。
【００３６】
フィルタートレイ１１は、捕捉デバイスによって腫瘍細胞を捕捉した後、フィルターカセット４を捕捉ユニットから取り出し載置する（図２（Ｄ））。フィルター６は、フィルターカセット４に載せたままフィルタートレイ１１に載置することができるため、迅速に収集した腫瘍細胞を扱うことができる（図２（Ａ）参照）。その結果、分画して濃縮した細胞を迅速に収集することができるので、生細胞で行う必要のある解析も可能である。また、回収した細胞の培養も行うことができる。従来のフィルターは、生細胞を回収するようには設計されておらず、生細胞の回収が難しく、細胞をフィルター上で固定した後に解析を行っていた。フィルタートレイ１１を用いることによって、細胞を容易に回収することができる。
【００３７】
［フィルター孔径の検討］
上部フィルター、下部フィルターの孔径の検討を行った。対象として以下の試料を用いて行った。シングル細胞、及びクラスターを含む培養細胞ＨＴ１０８０は、Ｃａｌｃｅｉｎで染色し、１００個程度培養液に混合した擬似体液を調整した。孔径１０、１２、１５、２０μｍのフィルターを用い、各孔径のフィルター上に回収した細胞数から回収率（フィルター上に検出した細胞数／擬似体液中の細胞数×１００（％））を求めた。解析は５回行い、回収率の平均を求めている（図３）。
【００３８】
クラスターＣＴＣは細孔の直径１０μｍ〜１５μｍのフィルターを用いることにより、１００％〜７０％以上のクラスター捕捉することができた。また、直径２０μｍのフィルターであっても約６０％のクラスターＣＴＣを捕捉することができた（図３（Ｂ）、図中ＦＩＬＴＥＲ  ＳＩＺＥにおいて、Ｖは直径を表す。）。一方、シングルＣＴＣは、直径１２μｍのフィルターで約７０％の細胞を捕捉できることが明らかとなった（図３（Ａ））。同じ種類の細胞であってもサイズは一定ではなく、また形状も球形ではないことから、それぞれのフィルターでクラスターＣＴＣ、シングルＣＴＣを確実に分別して濃縮することは困難である。しかし、上記結果を鑑みると、上部フィルターは、クラスターＣＴＣを捕捉し、シングルＣＴＣの回収率がさほど高くはない１２μｍ以上２０μｍ以下、下部フィルターとしてはＣＴＣの回収率が高く、血液中に多数含まれる赤血球の通過が可能な６μｍ以上１２μｍ未満とすればよい。
【００３９】
なお、ここでは円形の細孔を有するフィルターを使用しているが、細孔の形状は真円である必要はない。例えば、血液試料を扱う場合には、クラスターＣＴＣ、シングルＣＴＣ、血球を分離することができれば良いことから、楕円などの形状であってもよい。特に、赤血球は無核であることから楕円形の細孔であっても通過することができる。赤血球の形状を考慮すると、長径８μｍ、短径６μｍ程度の楕円形とすることによって、赤血球は通過するが、シングルＣＴＣは通過しにくい形状となる。
【００４０】
［実施例１］
上記結果から、上部フィルター１５μｍ、下部フィルター１０μｍのデバイスを作製し、患者検体を用いて検討を行った。年齢２０歳以上のステージＩ〜ステージＩＶ期、もしくは放射線化学療法後または外科手術後再発で活動性担癌状態のＥＧＦＲ−Ｌ８５８Ｒ変異陽性の非小細胞肺癌患者１０例を対象とした。１０症例の年齢は４１〜８１歳、中央値は６４．５歳、男性４名、女性６名であり、全症例とも組織型は腺がんであった。過去５年以内に何らかの癌の既往がある患者、生物学的製剤の使用歴がある患者、血液疾患・自己免疫疾患の合併のある患者を除外した。
【００４１】
クラスターＣＴＣ、シングルＣＴＣは、具体的には以下のようにして分離した。
１．所望の大きさの孔径のフィルターをフィルター台に置き、フィルターおさえを置いたフィルターカセットを組み立てる。ここでは、上部フィルターとして１５μｍ、下部フィルターとして１０μｍのフィルターを用いた。
２．各フィルターカセットを各捕捉ユニット内に組み込む。
３．孔径の異なるフィルターが配置されている捕捉ユニットを２つ連結させる。血液流入側は孔径の大きいもの、すなわち１５μｍ、その下のユニットには孔径の小さいもの、すなわち１０μｍのフィルターを配置した。
４．血液を注入して細胞を分ける。
【００４２】
対象患者からＥＤＴＡ採血管にて末梢血１０ｍｌを採取した。サンプリング後は室温で保管した。ＣＴＣフィルター分画は、サンプリング後２４時間以内に施行した。フィルター直径を１０、１５μｍの径のフィルターを用い、各フィルターに捕捉される患者血液５ｍｌ中のクラスターＣＴＣ、シングルＣＴＣの数を解析した。上部フィルター１５μｍ、下部フィルター１０μｍのデバイスによって、クラスターＣＴＣ、シングルＣＴＣを濃縮し、抗ＥＰＣＡＭ抗体（ＧＥＮＥＴＥＸ社製）、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で染色し、両者とも染色陽性であった細胞をＣＴＣとして計数した。結果を表１に示す。
【００４３】
【表１】
2020112452.tif 000003
【００４４】
１５μｍのフィルター上では６例（サンプルＮｏ．１／２／３／７／８／１０）でシングルＣＴＣを分画した。得られた細胞数中央値は５（範囲２〜２１）であった。また、５例（サンプルＮｏ．１／３／６／７／８）でクラスターＣＴＣを分画した。得られた集塊数中央値は３（範囲２〜８）であった。１０μｍのフィルター上では全１０例でシングルＣＴＣを分画した。得られた細胞数中央値は９（範囲１〜１５２）であった。また、３例（サンプルＮｏ．１／８／１０）でクラスター細胞塊を分画した。得られた集塊数中央値は３（範囲２〜８）だった。
【００４５】
各フィルター上に捕捉されたＣＴＣが濃縮された細胞群、及びフィルターをすり抜けた血漿検体からＤＮＡを抽出した。各フィルター上で捕捉されたＣＴＣが濃縮された細胞群は、Ａｍｐｌｉ１  ＷＧＡ  ｋｉｔ  （コスモ・バイオ株式会社）を使用し、細胞内ＤＮＡ回収操作を行った。フィルターをすり抜けた血漿検体に対してはＭａｘｗｅｌｌ  ＲＳＣ  ｃｃｆ  ＤＮＡ  Ｐｌａｓｍａ  ｋｉｔ（プロメガ株式会社）を使用してＤＮＡを回収した。全ゲノム増幅キット（シグマ  アルドリッチ株式会社）にて遺伝子増幅し、ｄｒｏｐｌｅｔ  ｄｉｇｉａｌ  ＰＣＲを用いてＥＧＦＲ変異（Ｌ８５８Ｒ）の有無を検索した。
【００４６】
１５μｍのフィルターで捕捉された細胞から抽出したＤＮＡのうち、サンプルＮｏ．６の検体でＥＧＦＲ−Ｌ８５８Ｒが検出された。また、１０μｍのフィルターで捕捉された細胞から抽出したＤＮＡのうち、サンプルＮｏ．６と１０の２検体でＥＧＦＲ−Ｌ８５８Ｒが検出された。血漿成分から抽出したＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）からはＥＧＦＲ−Ｌ８５８Ｒは検出されなかった。ＣＴＣを解析する方がｃｆＤＮＡを解析するよりも、より感度よく遺伝子変異を検出可能であることが示された。
【００４７】
［実施例２］
次にフィルターで捕集した細胞の培養を行った。実施態様に示す捕捉ユニットで細胞を捕捉し、培養を行った。培養は以下の手順で行う。
１．捕捉デバイスで体液から細胞を分離、収集する。
２．各捕捉ユニットからフィルターをフィルター台に載置された状態で取り出し、フィルタートレイ上に置く。
３．フィルタートレイ上で培養を行う。
【００４８】
捕捉デバイスで収集した細胞が生存し、効率良く培養できるかを確認するために、以下の実験を行った。１×１０４のＰＣ−９細胞を捕捉デバイスによって収集し、上記の手順でフィルターをフィルター台とともに取り出し、フィルタートレイ上で培養を行い、４日目にＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色し、細胞が生存、増殖していることを確認した。すべて、３連で試験を行った。結果を図４に示す。
【００４９】
細胞収集直後（Ｄａｙ  ０）、細胞を収集しフィルタートレイ上にＰＢＳ、あるいは培地（Ｍｅｄｉｕｍ、ｇ〜ｌ）を入れ、４日後の試料をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭによって染色した顕微鏡写真を示す。１０ｘ、２０ｘは対物レンズの倍率を示す。細胞収集直後（ａ〜ｃ）、あるいはＰＢＳ中で４日間静置したフィルター上（ｄ〜ｆ）では染色された細胞がわずかに認められるにすぎない。一方、４日間培地を入れたトレイでは、細胞が増殖し、コロニーを形成しているのが観察される（ｇ〜ｌ、矢印で示す）。ｊ〜ｌの写真は、ｇ〜iを対物レンズを変えて撮影した写真であり、同じコロニーを矢印で示している。また、ｍ、ｎは、それぞれｉ、ｌを拡大した写真を示しているが、フィルター上に細胞が増殖しているのが確認される。ここでは、培養細胞を用いて確認しているが、ＣＴＣも同様の手順で培養を行うことができる。
【００５０】
以上示したように、本デバイスは、クラスターを形成している腫瘍細胞、形成していない腫瘍細胞を分別して濃縮することが可能である。また、濃縮後生細胞の状態で取り出すことも可能であることから、腫瘍細胞をクラスターを形成している細胞、クラスターを形成せず単独で存在している細胞に分別したうえで培養する、あるいは、生細胞を用いた解析に使用することができる。さらに、小型、低コストのデバイスであり、短時間で細胞を濃縮することが可能であることから、キットとして一般病院でも遺伝子検査に使用することができる。特に、乳がん、肺がん患者など、分子標的治療薬によって治療を行う患者において、再発後の遺伝子変異の検査を行うための細胞濃縮に有用である。
【符号の説明】
【００５１】
１…捕捉デバイス、２、２’…捕捉ユニット、３…上部部材、４…フィルターカセット、５…下部部材、６、６’…フィルター、７…上部開口部、８…下部開口部、９…フィルターおさえ、１０…フィルター台、１１…フィルタートレイ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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