(57)【要約】【課題】飲料や食品中に含まれるラクトバチルス属微生物（死菌を含む）の特定の種またはその特定の種の特定の菌株を検出できる方法を提供することである。【解決手段】試料中のラクトバチルス属微生物の特定の種またはその特定の株を検出標的微生物として検出する方法であって、ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、ｉｉ）前記ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程、ｉｉｉ）前記ｃＤＮＡを鋳型として、前記検出標的微生物に特徴的な約５０ｂｐ〜約４５０ｂｐの遺伝子領域を増幅し得る２組以上のプライマー対からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、及びｉｖ）前記各プライマー対によって増幅された領域の各配列のいずれもが同じプライマー対によって増幅される前記検出標的微生物の配列のそれぞれと同一である場合に、前記試料中に検出標的乳酸菌が存在していたと決定する工程を含む方法に関する。【選択図】図６
2020068715.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のラクトバチルス属微生物（乳酸菌）の特定の種またはラクトバチルス属微生物の特定の種の特定の株を検出標的微生物として検出する方法であって、以下の工程：
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、前記検出標的微生物に特徴的な約５０ｂｐ〜約４５０ｂｐの遺伝子領域を増幅し得る２組以上のプライマー対からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、及び
ｉｖ）前記プライマーセット中の各プライマー対によって増幅された領域の各配列のいずれもが同じプライマー対によって増幅される前記検出標的微生物の配列のそれぞれと同一である場合に、前記試料中に検出標的乳酸菌が存在していたと決定する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
試料が飲料である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
試料が加熱殺菌され、２５℃で１２ヶ月以内の期間保存された、あるいはそれに相当する条件下で保存された飲料である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
試料中の乳酸菌ラクトバチルス・アミロボルス種（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）における菌株を判定する方法であって、
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、
・プライマー対（１）及び（３）からなるプライマーセットＡ：
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーAACAAATCGGTACGGTTCCACTTA（配列番号１）および
リバースプライマーTAAAGCGGTCTTAAATCCAGCTTC（配列番号２）；
ｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーAATGCGTCGTGAAGTTGGTGAA（配列番号５）および
リバースプライマーTGGCTTTGGACTTTCAAGGTGC（配列番号６）
・プライマー対（１）及び（４）からなるプライマーセットＢ：
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーAACAAATCGGTACGGTTCCACTTA（配列番号１）および
リバースプライマーTAAAGCGGTCTTAAATCCAGCTTC（配列番号２）；
ｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAATGCGTCGTGAAGTTGGTGAA（配列番号５）および
リバースプライマーGCGTCAGTAACTGAAATGTAGGCATC（配列番号７）
・プライマー対（２）及び（３）からなるプライマーセットＣ：
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーCCGATGTTTACAAGTTTGAAGGTG（配列番号３）および
リバースプライマーAAGCGGCTAAAGGTTTCAGAGAAT（配列番号４）；
ｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーAATGCGTCGTGAAGTTGGTGAA（配列番号５）および
リバースプライマーTGGCTTTGGACTTTCAAGGTGC（配列番号６）
並びに
・プライマー対（２）及び（４）からなるプライマーセットＤ：
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーCCGATGTTTACAAGTTTGAAGGTG（配列番号３）および
リバースプライマーAAGCGGCTAAAGGTTTCAGAGAAT（配列番号４）；
ｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAATGCGTCGTGAAGTTGGTGAA（配列番号５）および
リバースプライマーGCGTCAGTAACTGAAATGTAGGCATC（配列番号７）
からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、および、
ｉｖ）：前記プライマー対（１）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号１０の配列とが同一である、及び／又は、前記プライマー対（２）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号１１の配列とが同一である場合、並びに、前記プライマー対（３）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号１２の配列とが同一である、及び／又は、前記プライマー対（４）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号１３の配列とが同一である場合、ラクトバチルス・アミロボルス種（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）における菌株を判定する工程含む、前記方法。
【請求項５】
さらに、前記工程ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、
・プライマー対（７）及び（９）からなるプライマーセットＦ：
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGATGCAGCTTTAGAATTTGAACC（配列番号１７）および
リバースプライマーAGGCTCTTGCACTTCCTTGTATTC（配列番号１８）；
ｇｙｒＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーTTAGCTAAGGCTGAAGCAAGAGCA（配列番号２０）および
リバースプライマーCCAAKCCGGTCAAACGAACTAAAC（配列番号２１）
・プライマー対（７）及び（１０）からなるプライマーセットＧ：
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGATGCAGCTTTAGAATTTGAACC（配列番号１７）および
リバースプライマーAGGCTCTTGCACTTCCTTGTATTC（配列番号１８）；
ｇｙｒＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGAAGCAAGAGCACACATTCTCGA（配列番号２２）および
リバースプライマーCCAAKCCGGTCAAACGAACTAAAC（配列番号２１）
・プライマー対（８）及び（９）からなるプライマーセットＨ：
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーTGCAGCTTTAGAATTTGAACCTG（配列番号１９）および
リバースプライマーAGGCTCTTGCACTTCCTTGTATTC（配列番号１８）；
ｇｙｒＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーTTAGCTAAGGCTGAAGCAAGAGCA（配列番号２０）および
リバースプライマーCCAAKCCGGTCAAACGAACTAAAC（配列番号２１）
並びに
・プライマー対（８）及び（１０）からなるプライマーセットＩ：
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーTGCAGCTTTAGAATTTGAACCTG（配列番号１９）および
リバースプライマーAGGCTCTTGCACTTCCTTGTATTC（配列番号１８）；
ｇｙｒＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGAAGCAAGAGCACACATTCTCGA（配列番号２２）および
リバースプライマーCCAAKCCGGTCAAACGAACTAAAC（配列番号２１）
からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、
前記プライマー対（７）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号４６の配列とが同一である、及び／又は、前記プライマー対（８）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号４７の配列とが同一である場合、並びに、前記プライマー対（９）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号４８の配列とが同一である、及び／又は、前記プライマー対（１０）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号４９の配列とが同一である場合に、ラクトバチルス・アミロボルス種（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）における菌株を判定する工程
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
試料中の乳酸菌ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）ＣＰ１５６３株を検出する方法であって、
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、
・プライマー対（５）及び（６）からなるプライマーセットＥ：
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーGTATCGACGTTGAAGTAGCTTTG（配列番号８）および
リバースプライマーTAAAGCGGTCTTAAATCCAGCTTC（配列番号２）；
ｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーAATGCGTCGTGAAGTTGGTGAA（配列番号５）および
リバースプライマーTTGAATACCGATGCTGCGAAG（配列番号９）
を用いてＰＣＲを行う工程、および、
ｉｖ）前記プライマー対（５）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号１４の配列と同一であり、かつ、前記プライマー対（６）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号１５の配列と同一である場合に、前記試料中にＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株が存在していたと決定する工程、
を含む、前記方法。
【請求項７】
工程ｉｉｉ）において、プライマー対（５）を用いるＰＣＲとプライマー対（６）を用いるＰＣＲが別個の容器内で行われる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程ｉｖ）において、プライマー対（５）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列の下流にプライマー対（６）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）を結合した融合配列と配列番号１６の配列との同一性が決定される、請求項６記載の方法。
【請求項９】
下記プライマー対（５）及び（６）からなるプライマーセットを含む、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株検出用キット：
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーGTATCGACGTTGAAGTAGCTTTG（配列番号８）および
リバースプライマーTAAAGCGGTCTTAAATCCAGCTTC（配列番号２）、
並びに、
ｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーAATGCGTCGTGAAGTTGGTGAA（配列番号５）および
リバースプライマーTTGAATACCGATGCTGCGAAG（配列番号９）。
【請求項１０】
下記プライマー対（５）及び（６）からなるプライマーセット：
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーGTATCGACGTTGAAGTAGCTTTG（配列番号８）および
リバースプライマーTAAAGCGGTCTTAAATCCAGCTTC（配列番号２）、
並びに、
ｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーAATGCGTCGTGAAGTTGGTGAA（配列番号５）および
リバースプライマーTTGAATACCGATGCTGCGAAG（配列番号９）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトバチルス属微生物の特定の種及び特定の菌株の判別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来細菌や真菌の菌種同定に関してはＤＮＡまたはＲＮＡの配列解析を利用して行うのが一般的な手法である。このような一般的な菌株を同定する手法としては、純粋培養された菌株の生菌のＤＮＡを用いて、ＲｉｂｏＰｒｉｎｔｅｒやＰｕｌｓｅｄ  Ｆｉｅｌｄ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＦＧＥ）法、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ）法、Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）法，  Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ＰＣＲ（Ｒｅｐ−ＰＣＲ）法，  Ｍｕｌｔｉｌｏｃａｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｙｐｉｎｇ（ＭＬＳＴ）法，  Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｉｓｙｓ（ＭＬＳＡ）法などの解析が一般的である（非特許文献１参照）。
また、このような菌種同定の応用として、特許文献１には、乳製品中のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｉ種の細菌菌株を同定するためのＤＮＡプローブ、および、このようなプローブの調製についての試みが開示されている。また、特許文献２には、環境汚染物質の分解、除去を促進することのできるＴｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ属に属する新規微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子または１６ＳｒＲＮＡから調製したプローブを用いて、環境汚染物質分解促進能を有する細菌の検出・定量を簡便迅速に行うとともに、汚染環境のモニタリング、評価を行うことが開示されている。
このように、細菌や真菌の菌種や菌株の同定技術は、様々な場面で必要とされ、開発されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平０３−２３６７９９号公報
【特許文献２】特開２００６−２３０２５５号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｔｉｅｒｅｄ  Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｓｃｈｅｍｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｃｏｍｐｌｅｘ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．７２２０−７２２８  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１３  Ｖｏｌｕｍｅ  ７９  Ｎｕｍｂｅｒ  ２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、現在数多く販売されている死菌の乳酸菌などを混入する清涼飲料などの飲料や食品などにおいては、その製造工程中のｐＨや加熱条件、保存期間中のｐＨや温度条件において、菌体のＤＮＡが分解されてしまうため、菌種や菌株を同定するのに必要なＤＮＡを十分に得にくいという問題がある。そうすると、品質保証の観点から必要とされる製造した商品（すなわち食品や飲料）に混入している菌種や菌株を同定することが極めて困難である。
したがって、本発明の目的は、飲料や食品中に含まれるラクトバチルス属微生物（死菌を含む）の特定の種またはその特定の種の特定の菌株を検出できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究の結果、食品や飲料清涼水などの飲料中に含まれる菌体（死菌を含む）の特定の種や菌株を検出するために、これまで全く着目されてこなかった製品中の菌体の約５０−約４５０ｂｐ程度のＲＮＡ断片を使用することで、予想外にも菌種や菌株を同定するのに必要なＤＮＡ断片配列が得られることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下〔１〕〜〔１０〕に関する。
〔１〕以下の工程を含む、試料中のラクトバチルス属微生物（乳酸菌）の特定の種またはラクトバチルス属微生物の特定の種の特定の株を検出標的微生物として検出する方法であって、以下の工程：
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、前記検出標的微生物に特徴的な約５０ｂｐ〜約４５０ｂｐの遺伝子領域を増幅し得る２組以上のプライマー対からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、及び
ｉｖ）前記プライマーセット中の各プライマー対によって増幅された領域の各配列のいずれもが同じプライマー対によって増幅される前記検出標的微生物の配列のそれぞれと同一である場合に、前記試料中に検出標的乳酸菌が存在していたと決定する工程、
を含む、前記方法。
〔２〕試料が飲料である、前記〔１〕記載の方法。
〔３〕試料が加熱殺菌され、２５℃で１２ヶ月以内の期間保存された、あるいはそれに相当する条件下で保存された飲料である、前記〔１〕記載の方法。
〔４〕試料中の乳酸菌ラクトバチルス・アミロボルス種（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）における菌株を判定する方法であって、
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、
・プライマー対（１）及び（３）からなるプライマーセットＡ：
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーAACAAATCGGTACGGTTCCACTTA（配列番号１）および
リバースプライマーTAAAGCGGTCTTAAATCCAGCTTC（配列番号２）；
ｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーAATGCGTCGTGAAGTTGGTGAA（配列番号５）および
リバースプライマーTGGCTTTGGACTTTCAAGGTGC（配列番号６）
・プライマー対（１）及び（４）からなるプライマーセットＢ：
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーAACAAATCGGTACGGTTCCACTTA（配列番号１）および
リバースプライマーTAAAGCGGTCTTAAATCCAGCTTC（配列番号２）；
ｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAATGCGTCGTGAAGTTGGTGAA（配列番号５）および
リバースプライマーGCGTCAGTAACTGAAATGTAGGCATC（配列番号７）
・プライマー対（２）及び（３）からなるプライマーセットＣ：
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーCCGATGTTTACAAGTTTGAAGGTG（配列番号３）および
リバースプライマーAAGCGGCTAAAGGTTTCAGAGAAT（配列番号４）；
ｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーAATGCGTCGTGAAGTTGGTGAA（配列番号５）および
リバースプライマーTGGCTTTGGACTTTCAAGGTGC（配列番号６）
並びに
・プライマー対（２）及び（４）からなるプライマーセットＤ：
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーCCGATGTTTACAAGTTTGAAGGTG（配列番号３）および
リバースプライマーAAGCGGCTAAAGGTTTCAGAGAAT（配列番号４）；
ｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAATGCGTCGTGAAGTTGGTGAA（配列番号５）および
リバースプライマーGCGTCAGTAACTGAAATGTAGGCATC（配列番号７）
からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、および、
ｉｖ）：前記プライマー対（１）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号１０の配列とが同一である、及び／又は、前記プライマー対（２）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号１１の配列とが同一である場合、並びに、前記プライマー対（３）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号１２の配列とが同一である、及び／又は、前記プライマー対（４）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号１３の配列とが同一である場合、ラクトバチルス・アミロボルス種（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）における菌株を判定する工程含む、前記方法。
【０００７】
〔５〕さらに、前記工程ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、
・プライマー対（７）及び（９）からなるプライマーセットＦ：
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGATGCAGCTTTAGAATTTGAACC（配列番号１７）および
リバースプライマーAGGCTCTTGCACTTCCTTGTATTC（配列番号１８）；
ｇｙｒＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーTTAGCTAAGGCTGAAGCAAGAGCA（配列番号２０）および
リバースプライマーCCAAK CCGGTCAAACGAACTAAAC（配列番号２１）
・プライマー対（７）及び（１０）からなるプライマーセットＧ：
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGATGCAGCTTTAGAATTTGAACC（配列番号１７）および
リバースプライマーAGGCTCTTGCACTTCCTTGTATTC（配列番号１８）；
ｇｙｒＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGAAGCAAGAGCACACATTCTCGA（配列番号２２）および
リバースプライマーCCAAKCCGGTCAAACGAACTAAAC（配列番号２１）
・プライマー対（８）及び（９）からなるプライマーセットＨ：
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーTGCAGCTTTAGAATTTGAACCTG（配列番号１９）および
リバースプライマーAGGCTCTTGCACTTCCTTGTATTC（配列番号１８）；
ｇｙｒＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーTTAGCTAAGGCTGAAGCAAGAGCA（配列番号２０）および
リバースプライマーCCAAKCCGGTCAAACGAACTAAAC（配列番号２１）
並びに
・プライマー対（８）及び（１０）からなるプライマーセットＩ：
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーTGCAGCTTTAGAATTTGAACCTG（配列番号１９）および
リバースプライマーAGGCTCTTGCACTTCCTTGTATTC（配列番号１８）；
ｇｙｒＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGAAGCAAGAGCACACATTCTCGA（配列番号２２）および
リバースプライマーCCAAKCCGGTCAAACGAACTAAAC（配列番号２１）
からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、
前記プライマー対（７）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号４６の配列とが同一である、及び／又は、前記プライマー対（８）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号４７の配列とが同一である場合、並びに、前記プライマー対（９）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号４８の配列とが同一である、及び／又は、前記プライマー対（１０）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号４９の配列とが同一である場合に、ラクトバチルス・アミロボルス種（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）における菌株を判定する工程
をさらに含む、前記〔４〕に記載の方法。
〔６〕試料中の乳酸菌ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）ＣＰ１５６３株を検出する方法であって、
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、
・プライマー対（５）及び（６）からなるプライマーセットＥ：
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーGTATCGACGTTGAAGTAGCTTTG（配列番号８）および
リバースプライマーTAAAGCGGTCTTAAATCCAGCTTC（配列番号２）；
ｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーAATGCGTCGTGAAGTTGGTGAA（配列番号５）および
リバースプライマーTTGAATACCGATGCTGCGAAG（配列番号９）
を用いてＰＣＲを行う工程、および、
ｉｖ）前記プライマー対（５）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号１４の配列と同一であり、かつ、前記プライマー対（６）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号１５の配列と同一である場合に、前記試料中にＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株が存在していたと決定する工程、
を含む、前記方法。
〔７〕工程ｉｉｉ）において、プライマー対（５）を用いるＰＣＲとプライマー対（６）を用いるＰＣＲが別個の容器内で行われる、前記〔６〕記載の方法。
〔８〕工程ｉｖ）において、プライマー対（５）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列の下流にプライマー対（６）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）を結合した融合配列と配列番号１６の配列との同一性が決定される、前記〔６〕記載の方法。
【０００８】
〔９〕下記プライマー対（５）及び（６）からなるプライマーセットを含む、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株検出用キット：
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーGTATCGACGTTGAAGTAGCTTTG（配列番号８）および
リバースプライマーTAAAGCGGTCTTAAATCCAGCTTC（配列番号２）、
並びに、
ｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーAATGCGTCGTGAAGTTGGTGAA（配列番号５）および
リバースプライマーTTGAATACCGATGCTGCGAAG（配列番号９）。
〔１０〕下記プライマー対（５）及び（６）からなるプライマーセット：
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーGTATCGACGTTGAAGTAGCTTTG（配列番号８）および
リバースプライマーTAAAGCGGTCTTAAATCCAGCTTC（配列番号２）、
並びに、
ｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーAATGCGTCGTGAAGTTGGTGAA（配列番号５）および
リバースプライマーTTGAATACCGATGCTGCGAAG（配列番号９）。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によると、飲料中に含まれるラクトバチルス属微生物（死菌を含む）の特定の種またはその特定の種の特定の菌株を検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明で使用される各プライマー対（１）〜（６）によって増幅される領域を簡単に模式化した図である。
【図２】プライマー対（１）〜（４）によって増幅される領域に基づいて、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の表１のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．配列からそれぞれの菌株ごとのｇｙｒＢ遺伝子配列の後ろにｐｙｒＧ遺伝子配列を繋げ、それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工して比較用配列データを作成し、ＭＥＧＡ６配列解析ソフトを使用して作成した、系統樹を示す。
【図３】プライマー対（５）及び（６）によって増幅される領域の配列（配列番号１６及び配列番号２３〜３３の遺伝子配列）に関して、ＭＥＧＡ６配列解析ソフトを使用して作成した系統樹を示す。
【図４】実施例１において、得られた４種類のＰＣＲ産物に対して、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施した結果を示す図である。
【図５】実施例８において、４種類のサンプル（ア）〜（エ）から得られた各２種のＰＣＲ産物に対して、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施した結果を示す図である。
【図６】プライマー対（１）、（３）、（７）及び（９）によって増幅される領域に基づいて、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の表１のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．配列からそれぞれの菌株ごとのｇｙｒＢ遺伝子配列の後ろにｐｙｒＧ遺伝子配列を繋げ、更にその後ろに表２のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．配列からそれぞれの菌株ごとのｌｅｐＡ遺伝子配列、及びｇｙｒＡ遺伝子配列を繋げ、それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工して比較用配列データを作成し、ＭＥＧＡ６配列解析ソフトを使用して作成した、系統樹を示す。
【図７】実施例１０において、得られたＰＣＲ産物に対して、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明者らは、殺菌処理、長期保存等の過程を経た試料であっても、試料中に残存するＲＮＡを鋳型として比較的短い領域を増幅対象としてＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）を行うことにより、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種、あるいはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種の特定の株を特異的に検出することができることを見いだした。
特に、本発明者らは、殺菌処理および／または数ヶ月以上の長期保存等の過程を経た試料であっても、試料中に残存するＲＮＡに対して比較的短い領域を増幅対象としてＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓまたはＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株を特異的に検出することができることを見いだした。長期保存とは例えば１ヶ月以上、または３ヶ月以上、好ましくは３ヶ月〜６ヶ月、さらに好ましくは３ヶ月〜１２ヶ月またはこれと同等の条件下での保存をいい、特に試料が飲料や食品の場合、製造から消費期限までの期間、製造から賞味期限までの期間、またはこれらを超える期間の保存も「長期保存」に含まれる。そして、試料を２５℃の保存環境下またはそれに相当する環境下においた場合であれば、例えば９ヶ月以内、少なくとも６ヶ月以内であれば問題なく、試料中のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓまたはＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株を特異的に検出することができる。なお、保存温度は通常、４〜３５℃の条件で行われる。ただし、当該試料が例えば５５℃という過酷な温度条件下で保存された場合であっても３〜５日間程度であれば、プライマーセットの種類によっては試料中のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓまたはＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株を特異的に検出しうることがある。
したがって、本発明によれば、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の菌種または菌株を特異的に検出することができる。特に本発明によれば、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓあるいはＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株を特異的に検出することができる。
本発明によってＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ、特にＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株を特異的に検出することができる試料には、乳酸菌（乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の微生物））入りの食品、飲料、飼料等、特に乳酸菌の死菌入りの食品、飲料、飼料等が含まれる。本発明における飲料には、発酵乳、発酵乳(殺菌)、乳製品乳酸菌飲料、乳製品乳酸菌飲料(殺菌)、乳酸菌飲料及び清涼飲料水が含まれる。
本明細書において「特異的に検出」するとは、他のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属種またはＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの他の菌株とＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓまたはＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株とを区別して、弁別的にＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓまたはＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの特定の株を検出することを言う。たとえば、「Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株を特異的に検出」するとは、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの他の菌株とＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株とを区別して弁別的に試料中のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株を検出することを言う。また、「Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓを特異的に検出」するとは、他のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属種とＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓとを区別して弁別的に試料中のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓを検出することを言う。
【００１２】
本発明の方法において、１組以上のプライマー対を用いて、試料中に含まれ得る生物体由来のＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、増幅された配列の配列を決定する。１組のプライマー対では十分な特異性が得られない場合は、同じ遺伝子の他の領域または別の遺伝子を増幅するプライマー対を更に組み合わせて２組以上のプライマー対（各組の各プライマー対は、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなる）を含むプライマーセットとすることができる。本発明においては十分な特異性を得るために２組以上のプライマー対を組み合わせてプライマーセットとしてＰＣＲを行うのが好ましい。プライマーセットを構成する各プライマー対は、このプライマー対によって増幅される配列が検出標的の菌種（例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種）または特定の菌株（たとえば、特定のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種の特定の株）と他の菌種または菌株の少なくとも１つと異なるように選ばれる。各プライマー対は公知のデータベースから対象となる菌種または菌株の遺伝子配列を入手し、他の菌種または菌株の同じ遺伝子の配列を入手し、これらをアラインメントすることによって目的の菌種または菌株に特徴的な配列、好ましくは可能な限り特異性の高い配列を同定することによって設計することができる。プライマー設計のために、与えられた配列に対してプライマー配列の候補を出力するコンピュータープログラムも利用することができる。各プライマー対が増幅する領域の長さは、一般に約５０ｂｐ〜約４５０ｂｐが好ましく、約８０ｂｐ〜約４５０ｂｐがより好ましく、約１００ｂｐ〜約４５０ｂｐがさらに好ましく、約１００ｂｐ〜約３５０ｂｐがさらにより好ましく、特に約１００〜約２５０ｂｐ程度が好ましい。増幅する領域の長さを４５０ｂｐよりも長く設定した場合には、飲料中にその長さのＲＮＡが残存していない恐れがあり、所望の量に増幅できない可能性がある。
【００１３】
各プライマーセットに含まれるプライマー対の配列および数を上述のように選択することによって、特定の種（例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種）、または特定の種の特定の株（例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種の特定の株）を試料中で同定することができる。
ＰＣＲによって増幅された配列を、同じプライマーセットによって増幅される検出標的の菌種または菌株（たとえばＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株）のそれぞれの遺伝子領域の配列と比較する。２以上のプライマー対によって試料から増幅された２以上の遺伝子領域の配列が同じプライマー対によって増幅される検出標的菌種または菌株の遺伝子領域の配列とそれぞれと一致することは、目的の標的菌種または菌株を同定することの指標となる。２以上のプライマー対を含むセットを用いて増幅された２以上の遺伝子領域の（２以上の）配列の少なくとも１つが同じプライマー対によって増幅される検出標的菌種または菌株の遺伝子領域の配列と一致しない場合は、その検出標的菌種または菌株が試料中に存在したとは認められない。
【００１４】
具体的には、下記のプライマーセットのいずれかをＰＣＲに使用してＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓであるか、及びその中の菌株を特異的に検出することができる。
＜プライマーセットＡ＞
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーAACAAATCGGTACGGTTCCACTTA（配列番号１）および
リバースプライマーTAAAGCGGTCTTAAATCCAGCTTC（配列番号２）；
ｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーAATGCGTCGTGAAGTTGGTGAA（配列番号５）および
リバースプライマーTGGCTTTGGACTTTCAAGGTGC（配列番号６）
【００１５】
＜プライマーセットＢ＞
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーAACAAATCGGTACGGTTCCACTTA（配列番号１）および
リバースプライマーTAAAGCGGTCTTAAATCCAGCTTC（配列番号２）；
ｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAATGCGTCGTGAAGTTGGTGAA（配列番号５）および
リバースプライマーGCGTCAGTAACTGAAATGTAGGCATC（配列番号７）
【００１６】
＜プライマーセットＣ＞
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーCCGATGTTTACAAGTTTGAAGGTG（配列番号３）および
リバースプライマーAAGCGGCTAAAGGTTTCAGAGAAT（配列番号４）；
ｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーAATGCGTCGTGAAGTTGGTGAA（配列番号５）および
リバースプライマーTGGCTTTGGACTTTCAAGGTGC（配列番号６）
【００１７】
＜プライマーセットＤ＞
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーCCGATGTTTACAAGTTTGAAGGTG（配列番号３）および
リバースプライマーAAGCGGCTAAAGGTTTCAGAGAAT（配列番号４）；
ｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAATGCGTCGTGAAGTTGGTGAA（配列番号５）および
リバースプライマーGCGTCAGTAACTGAAATGTAGGCATC（配列番号７）
【００１８】
＜プライマーセットＥ＞
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーGTATCGACGTTGAAGTAGCTTTG（配列番号８）および
リバースプライマーTAAAGCGGTCTTAAATCCAGCTTC（配列番号２）；
ｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーAATGCGTCGTGAAGTTGGTGAA（配列番号５）および
リバースプライマーTTGAATACCGATGCTGCGAAG（配列番号９）
【００１９】
＜プライマーセットＦ＞
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGATGCAGCTTTAGAATTTGAACC（配列番号１７）および
リバースプライマーAGGCTCTTGCACTTCCTTGTATTC（配列番号１８）；
ｇｙｒＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーTTAGCTAAGGCTGAAGCAAGAGCA（配列番号２０）および
リバースプライマーCCAAKCCGGTCAAACGAACTAAAC（配列番号２１）
【００２０】
＜プライマーセットＧ＞
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGATGCAGCTTTAGAATTTGAACC（配列番号１７）および
リバースプライマーAGGCTCTTGCACTTCCTTGTATTC（配列番号１８）；
ｇｙｒＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGAAGCAAGAGCACACATTCTCGA（配列番号２２）および
リバースプライマーCCAAKCCGGTCAAACGAACTAAAC（配列番号２１）
【００２１】
＜プライマーセットＨ＞
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーTGCAGCTTTAGAATTTGAACCTG（配列番号１９）および
リバースプライマーAGGCTCTTGCACTTCCTTGTATTC（配列番号１８）；
ｇｙｒＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーTTAGCTAAGGCTGAAGCAAGAGCA（配列番号２０）および
リバースプライマーCCAAKCCGGTCAAACGAACTAAAC（配列番号２１）
【００２２】
＜プライマーセットＩ＞
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーTGCAGCTTTAGAATTTGAACCTG（配列番号１９）および
リバースプライマーAGGCTCTTGCACTTCCTTGTATTC（配列番号１８）；
ｇｙｒＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGAAGCAAGAGCACACATTCTCGA（配列番号２２）および
リバースプライマーCCAAKCCGGTCAAACGAACTAAAC（配列番号２１）
【００２３】
＜（ｉ）プライマーセットＡ〜Ｄ＞
プライマー対（１）によって増幅されるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３のｇｙｒＢ遺伝子領域の配列は配列番号１０に示され、プライマー対（２）によって増幅されるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３のｇｙｒＢ遺伝子領域の配列は配列番号１１に示され、プライマー対（３）によって増幅されるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３のｐｙｒＧ遺伝子領域の配列は配列番号１２に示され、プライマー対（４）によって増幅されるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３のｐｙｒＧ遺伝子領域の配列は配列番号１３に示される（いずれもプライマー配列を含まない）。
また、後述する方法でまた、プライマー対（１）又は（２）によって増幅されるｇｙｒＢ遺伝子配列、及び、プライマー対（３）又は（４）によって増幅されるｐｙｒＧ遺伝子配列の組み合わせでＢＬＡＳＴ解析する。ｇｙｒＢ遺伝子配列に関しては、配列同一性が高かった上位１２個までの菌種はＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ１１株及びＬ．ｓｏｂｒｉｕｓ１株であり、その配列同一性は９８−１００％である。またそれ以外にＬ．ｋｉｔａｓａｔｏｎｉｓ，Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ，Ｌ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ，Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓなどが上位に確認できるが、その配列同一性は８４−９１％程度である。ｐｙｒＧ遺伝子配列に関しては、配列同一性が高かった上位１１個までの菌種はＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓであり、その配列同一性は９９−１００％である。またそれ以外にＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ，Ｌ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ，Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓなどが上位に確認できたが、その配列同一性は９０−９１％程度である。
以上から、プライマー対（１）又は（２）によって増幅されるｇｙｒＢ遺伝子配列、及び、プライマー対（３）又は（４）によって増幅されるｐｙｒＧ遺伝子配列の組み合わせでＢＬＡＳＴ解析した場合において、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録されたＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの１２種類のいずれの菌株の配列とも上記いずれかのプライマーセットＡ〜Ｄで得られたＰＣＲ産物の配列は、９８〜１００％の配列同一性を有するが、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ以外のラクトバチルス属微生物の配列とは８４〜９１％程度の配列同一性しか有さない。
【００２４】
各プライマー対によって増幅される領域を図１に模式化した。なお、図１は、簡単な模式化であり、実際のプライマーの長さと厳密に対応するものではない。図１から分かるように、プライマーセットＡ〜Ｄの中においては、プライマー対（２）とプライマー対（４）の組み合わせからなるプライマーセットＤで得られる配列が一番長く、プライマー対（１）とプライマー対（３）の組み合わせからなるプライマーセットＡで得られる配列が一番短い。Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株を特異的に検出するためには、プライマーセットＡを使用することが特に好ましい。
【００２５】
たとえば、試料に対してプライマーセットＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマー対（１）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号１０の配列と同一であり、かつ、プライマー対（３）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号１２の配列と同一である場合に、前記試料中の乳酸菌がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株であると決定することができる。また、例えばプライマー対（１）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列の下流にプライマー対（３）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）を結合した融合配列を用いて同一性を決定してもよい。
【００２６】
また、試料に対してＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマーセットＢを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマー対（１）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号１０の配列と同一であり、かつ、プライマー対（４）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号１３の配列と同一である場合に、前記試料中の乳酸菌がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株であると決定することができる。また、例えばプライマー対（１）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列の下流にプライマー対（４）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）を結合した融合配列を用いて同一性を決定してもよい。
【００２７】
また、試料に対してＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマーセットＣを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマー対（２）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号１１の配列と同一であり、かつ、プライマー対（３）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号１２の配列と同一である場合に、前記試料中の乳酸菌がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株であると決定することができる。また、例えばプライマー対（２）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列の下流にプライマー対（３）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）を結合した融合配列を用いて同一性を決定してもよい。
【００２８】
また、試料に対してＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマーセットＤを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマー対（２）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号１１の配列と同一であり、かつ、プライマー対（４）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号１３の配列と同一である場合に、前記試料中の乳酸菌がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株であると決定することができる。また、例えばプライマー対（２）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列の下流にプライマー対（４）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）を結合した融合配列を用いて同一性を決定してもよい。
【００２９】
また、例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の下記表１のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．配列をダウンロードし、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの各菌株において上記プライマーセットで増幅されうる領域の遺伝子配列の長さを合わせて、それぞれの菌株ごとのｇｙｒＢ遺伝子配列の後ろにｐｙｒＧ遺伝子配列を繋げ、それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工して比較用配列データを作成し、ＭＥＧＡ等の配列解析ソフトを使用して系統樹解析を行い、系統樹を作成することが可能である（図２参照）。Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの各種菌株については、ｇｙｒＢ遺伝子配列およびｐｙｒＧ遺伝子配列は、以下のアクセッション番号から取得できる。本系統樹解析により、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの各種菌株のいずれかであるか同定することが可能であるが示される。
【００３０】
【表１】
2020068715.tif 000003
【００３１】
＜（ｉｉ）プライマーセットＦ〜Ｉ＞
プライマーセットＡ〜Ｄのいずれかを用いたＰＣＲ産物による解析に加えて、プライマーセットＦ〜ＩのいずれかをＰＣＲを使用することによって、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓであるか、及びその中の菌株を特異的に検出する精度をより高めることができる。
【００３２】
たとえば、試料に対してプライマーセットＦを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマー対（７）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号４６の配列と同一であり、かつ、プライマー対（９）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号４８の配列と同一である場合に、前記試料中の乳酸菌がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株であると決定することができる。また、例えばプライマー対（７）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列の下流にプライマー対（９）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）を結合した融合配列を用いて同一性を決定してもよい。
【００３３】
また、試料に対してＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマーセットＧを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマー対（７）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号４６の配列と同一であり、かつ、プライマー対（１０）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号４９の配列と同一である場合に、前記試料中の乳酸菌がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株であると決定することができる。また、例えばプライマー対（７）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列の下流にプライマー対（１０）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）を結合した融合配列を用いて同一性を決定してもよい。
【００３４】
また、試料に対してＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマーセットＨを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマー対（８）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号４７の配列と同一であり、かつ、プライマー対（９）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号４８の配列と同一である場合に、前記試料中の乳酸菌がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株であると決定することができる。また、例えばプライマー対（８）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列の下流にプライマー対（９）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）を結合した融合配列を用いて同一性を決定してもよい。
【００３５】
また、試料に対してＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマーセットＩを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマー対（８）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号４７の配列と同一であり、かつ、プライマー対（１０）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号４９の配列と同一である場合に、前記試料中の乳酸菌がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株であると決定することができる。また、例えばプライマー対（８）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列の下流にプライマー対（１０）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）を結合した融合配列を用いて同一性を決定してもよい。
【００３６】
また、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の下記表２のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．配列において、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの各菌株において上記プライマーセットＦ〜Ｉで増幅されうる領域の遺伝子配列の長さを合わせて、ｌｅｐ遺伝子配列−ｇｙｒＡ遺伝子配列の融合配列を作成してもよい。そして、このｌｅｐ遺伝子配列−ｇｙｒＡ遺伝子配列の融合配列を上述した上記表１に基づいて作成されたそれぞれの菌株ごとのｇｙｒＢ遺伝子−ｐｙｒＧ遺伝子配列の融合配列の後ろに繋げて、それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工して比較用配列データを作成し、ＭＥＧＡ等の配列解析ソフトを使用して系統樹解析を行い、系統樹を作成することが可能である（図６参照）。このような、プライマーセットＡ〜Ｄの少なくとも１つ、及び、プライマーセットＦ〜Ｉの少なくとも１つのプライマーゼットで増幅されうる領域を利用した解析により、図６に示されるような高いレベルで、サンプルに含まれるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの各種菌株を特定することができる。
なお、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの各種菌株における、ｇｙｒＡ遺伝子配列及びｌｅｐ遺伝子配列は、以下のアクセッション番号から取得できる。
【００３７】
【表２】
2020068715.tif 000004
【００３８】
＜（ｉｉｉ）プライマーセットＥ＞
試料に対して、プライマーセットＥを用いてＲＴ−ＰＣＲを行ない、含まれる菌体がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓであるか、及びその中の菌株がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３であるかを特異的に検出することができる。
【００３９】
より具体的に説明すると、試料に対してＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマーセットＥを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマー対（５）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号１４の配列と同一であり、かつ、プライマー対（６）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号１５の配列と同一である場合に、前記試料中の乳酸菌がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株であると決定することができる。
プライマー対（５）を用いるＰＣＲとプライマー対（６）を用いるＰＣＲが別個の容器内で行われることが好ましい。
【００４０】
増幅された領域の配列についてのＢＬＡＳＴ解析の結果、プライマー対（５）によって得られたｇｙｒＢ遺伝子配列及びプライマー対（６）によって得られたｐｙｒＧ遺伝子配列は、既存のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ種の配列との配列同一性が９９−１００％であり、ほぼ一致し、次以降に配列同一性が高いＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ種やＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｌｌｉａｎｕｍ等との配列同一性は８５−９０％程度であり、サンプルから得られたＰＣＲ産物の配列からＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ種であることが確認できる。
【００４１】
本発明の別の態様において、各プライマーセット中の１組のプライマー対によって増幅された領域の配列の下流に同じプライマーセット中の他の組のプライマー対によって増幅された領域の配列を結合して融合遺伝子配列をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで作成し、この配列を検出標的菌種または菌株について同じプライマー対を用いて同様に作成した融合遺伝子配列と比較することができる。融合遺伝子配列を作成する場合、プライマー配列は共通しているので、プライマー配列を除くことが好ましい。
たとえば、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株を検出標的菌株として上記プライマーセットＥを使用して増幅された配列番号１４（caatatacaaatggctataagacaacgttaatgaccttcgctaacaacattcacacctatgaaggtgggatgcac）で示されるｇｙｒＢ配列の下流に配列番号１５（actttagtaccacttcttcatgcagctcacgaaatgaagactaagccaactcaacattcagttgcagaacttcgcagcatcggtattcaaccaaac）で示されるｐｙｒＧ配列（いずれもプライマー配列を含まない）をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで結合して作成した融合遺伝子配列は以下の通りである。
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ＿ＣＰ１５６３（配列番号１６）
CAATATACAAATGGCTATAAGACAACGTTAATGACCTTCGCTAACAACATTCACACCTATGAAGGTGGGATGCACACTTTAGTACCACTTCTTCATGCAGCTCACGAAATGAAGACTAAGCCAACTCAACATTCAGTTGCAGAACTTCGCAGCATCGGTATTCAACCAAAC
【００４２】
また、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの各菌株１１種類を検出標的菌株として上記プライマーセットＥを使用して増幅されたｇｙｒＢ配列の下流にｐｙｒＧ配列をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで結合して作成した融合遺伝子配列は以下のとおりである。
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ＿ＡＴＣＣ３３１９８（配列番号２３）
CAATATACAAATGGCTATAAGACAACGTTAATGACCTTCGCTAACAACATTCACACCTATGAAGGTGGGATGCACACTTTAGTACCACTTCTTCACGCAGCTCACGAAATGAAGACTAAGCCAACTCAACATTCAGTTGCAGAACTTCGCAGCATCGGTATTCAACCAAAC
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ＿ＡＴＣＣ３３６２０（配列番号２４）
CAATATACAAATGGCTATAAGACAACGTTAATGACCTTCGCTAACAACATTCACACCTATGAAGGCGGGATGCACACTTTAGTACCACTTCTTCACGCAGCTCATGAAATGAAGACTAAGCCAACTCAACATTCAGTTGCAGAACTTCGCAGCATCGGTATTCAACCAAAC
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ＿ＡＴＣＣ３３６２１（配列番号２５）
CAATATACAAATGGCTATAAGACAACGTTAATGACCTTCGCTAACAACATTCACACCTATGAAGGCGGGATGCACACTTTAGTACCACTTCTTCACGCAGCTCACGAAATGAAGACTAAGCCAACTCAACATTCAGTTGCAGAACTTCGCAGCATCGGTATTCAACCAAAC
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ＿ＡＴＣＣ３３６２２（配列番号２６）
CAATATACAAATGGCTATAAGACAACGTTAATGACCTTCGCTAACAACATTCACACCTATGAAGGTGGGATGCACACTTTAGTACCACTTCTTCACGCAGCTCACGAAATGAAGACTAAGCCAACTCAACATTCAGTTGCAGAACTTCGCAGCATCGGTATTCAACCAAAC
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ＿ＡＴＣＣ５３６７１（配列番号２７）
CAATATACAAATGGCTATAAGACAACGTTAATGACCTTCGCTAACAACATTCACACCTATGAAGGCGGGATGCACACTTTAGTACCACTTCTTCATGCAGCTCACGAAATGAAGACTAAGCCAACTCAACATTCAGTTGCAGAACTTCGCAGCATCGGTATTCAACCAAAC
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ＿ＬＭＧ１８１７９（配列番号２８）
CAATATACAAATGGCTATAAGACAACGTTAATGACCTTCGCTAACAACATTCACACCTATGAAGGTGGGATGCACACTTTAGTACCACTTCTTCACGCAGCTCACGAAATGAAGACTAAGCCAACTCAACATTCAGTTGCAGAACTTCGCAGCATCGGTATTCAACCAAAC
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ＿ＬＭＧ１８１８０（配列番号２９）
CAATATACAAATGGCTATAAGACAACGTTAATGACCTTCGCTAACAACATTCACACCTATGAAGGTGGGATGCACACTTTAGTACCACTTCTTCACGCAGCTCACGAAATGAAGACTAAGCCAACTCAACATTCAGTTGCAGAACTTCGCAGCATCGGTATTCAACCAAAC
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ＿ＬＭＧ１８１８６（配列番号３０）
CAATATACAAATGGCTATAAGACAACGTTAATGACCTTCGCTAACAACATTCACACCTATGAAGGTGGGATGCACACTTTAGTACCACTTCTTCACGCAGCTCACGAAATGAAGACTAAGCCAACTCAACATTCAGTTGCAGAACTTCGCAGCATCGGTATTCAACCAAAC
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ＿ＬＭＧ１８１８８（配列番号３１）
CAATATACAAATGGCTATAAGACAACGTTAATGACCTTCGCTAACAACATTCACACCTATGAAGGCGGGATGCACACTTTAGTACCACTTCTTCACGCAGCTCACGAAATGAAGACTAAGCCAACTCAACATTCAGTTGCAGAACTTCGCAGCATCGGTATTCAACCAAAC
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ＿ＬＭＧ１８１９０（配列番号３２）
CAATATACAAATGGCTATAAGACAACGTTAATGACCTTCGCTAACAACATTCACACCTATGAAGGTGGGATGCACACTTTAGTACCACTTCTTCACGCAGCTCACGAAATGAAGACTAAGCCAACTCAACATTCAGTTGCAGAACTTCGCAGCATCGGTATTCAACCAAAC
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ＿ＬＭＧ１８１９２（配列番号３３）
CAATATACAAATGGCTATAAGACAACGTTAATGACCTTCGCTAACAACATTCACACCTATGAAGGCGGGATGCACACTTTAGTACCACTTCTTCATGCAGCTCACGAAATGAAGACTAAGCCAACTCAACATTCAGTTGCAGAACTTCGCAGCATCGGTATTCAACCAAAC
【００４３】
得られた配列番号１６及び配列番号２３〜３３の遺伝子配列に関して、例えばＮｅｉｇｈｂｏｒ  Ｊｏｉｎｉｎｇ  ＭｅｔｈｏｄでＭＥＧＡ６等配列解析ソフトを使用して系統樹解析を行い、作成した系統樹を図３に示す。図３に示す系統樹からも分かるように、ＣＰ１５６３株は上記ＧｅｎｅＢａｎｋ登録のすべての菌株とは配列が異なり、ＣＰ１５６３株であることを明確に確認できる。当該菌株であることが確認できる。
【００４４】
上記プライマー対（５）及び（６）からなるプライマーセットによると、試料に含まれる菌体がＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株であるか否か明確に検出することができるため、当該プライマーセットからなるキットも本発明に含まれる。プライマー対（５）及び（６）で増幅される領域は１００〜１５０ｂｐと大変小さく、試料中に多く残存している可能性が高いＲＮＡ部分をターゲットとしているため、高い確率でＲＴ−ＰＣＲを成功させることができる。また、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの菌株間の比較において、ＣＰ１５６３株に特異的な領域をターゲットとしているため、明確にＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株が試料に含まれているか否かを判別することができる。
【００４５】
本発明によって特異的に検出することができるＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株は２０１０年５月２５日に特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）（旧住所：〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター  中央第６）（ＩＰＯＤはＮＩＴＥ−ＩＰＯＤとして２０１３年４月１日に下記に移転：〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２５５が付与されている。
【００４６】
本発明の方法において、ＲＴ−ＰＣＲは当業者によく知られた方法に従って行うことができる。すなわち、試料から常法にしたがってＲＮＡを抽出し、常法に従ってオリゴｄＴプライマーなどを用いてＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、上記プライマーセットのいずれかを用いて常法にしたがってＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行うことができる。ＰＣＲの条件はプライマーのＴｍ値、増幅される領域の長さ、配列等から導かれる標準的な条件を利用することができる。プライマーセットに含まれる２組のプライマー対（各プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなる）によるＰＣＲは同一の容器中で行うこともできるが、増副産物を個別にシーケンシングする必要があるのでプライマー対ごとにそれぞれ別個の容器でＰＣＲを行うのが好ましい。得られた増副産物を電気泳動にかけ、予想される長さの断片が増幅されていることを確認し、そのＤＮＡ断片をゲルから常法に従って抽出し、当分野でよく知られた方法によってシーケンシングする。
ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡ合成、ＰＣＲ、ゲルからのＤＮＡ断片の抽出、シーケンシング等を行うための種々の方法、試薬、キットおよびこれらの操作に必要な装置等も当業者にはよく知られており、商業的に容易に入手することもできる。
【００４７】
得られた増副産物の配列とＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓまたはＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株由来の配列（たとえばｇｙｒＢおよびｐｙｒＧ配列）との比較は目視で行うこともできるが配列比較のための各種アルゴリズムやプログラムは商業的に入手可能であり、ＢＬＡＳＴＮなどのツールもＮＣＢＩ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪセンターから提供されており広く公衆に利用可能である。このようなアルゴリズムやプログラムを利用する場合、上述の融合遺伝子配列を比較すれば１回の解析で配列同一性を決定することができるので有利であろう。
またＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓまたはＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株が他の乳酸菌種または他のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ株と異なることをより理解しやすくするため、作成した融合遺伝子配列を用いて系統樹を作成することができる。系統樹作成のためのアルゴリズムや具体的なプログラムは当業者にはよく知られており、商業的あるいは公共的に利用可能である。たとえば、ＭＥＧＡなどのフリーソフトウエアや、ＮＣＢＩ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪセンターから提供されているアラインメントおよび系統樹作成用のＣｌｕｓｔａｌＷなどが利用可能である。
【００４８】
試料中の乳酸菌が殺菌処理等により本質的に死滅していると考えられる場合、特に殺菌処理および／または長期保存（例えば、４℃〜３５℃にて、１ヶ月以上または３ヶ月以上、好ましくは３ヶ月〜６ヶ月、特に好ましくは３ヶ月〜１２ヶ月、またはこれらと同等な条件下における保存）により試料中の乳酸菌が死滅し、かつ乳酸菌由来の核酸が相当程度損傷（分解等）していると考えられる場合においても、本発明によればＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓまたはＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株を特異的に検出することができる。本発明は試料が飲料や食品の場合、一般に製造から消費期限までの期間、製造から賞味期限までの期間、またはこれらを超える期間保存されていた場合でもＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓまたはＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株を特異的に検出することができる。
【００４９】
本発明によってＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株と区別され得る他の乳酸菌およびＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ株には、たとえば以下の乳酸菌が含まれるが、これらに限定されない：
Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（ＡＴＣＣ３１４、ＡＴＣＣ４３５６、ＡＴＣＣ９２２４、ＡＴＣＣ５３５４４、ＡＴＣＣ４３５７）；
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ（ＡＴＣＣ３３６２０、ＡＴＣＣ３３６２１、ＬＭＧ１８１８８、ＡＴＣＣ３３６２２、ＡＴＣＣ５３６７１、ＬＭＧ１８１９２、ＬＭＧ１８１７９、ＬＭＧ１８１９０、ＡＴＣＣ３３１９８、ＬＭＧ１８１８０、ＬＭＧ１８１８６）；
Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ（ＡＴＣＣ５３５４５、ＡＴＣＣ５５２２１、ＪＣＭ５８１０、ＬＭＧ１１４１５、ＬＭＧ１７７５３、ＡＴＣＣ３３８２０、ＬＭＧ１１４４０、ＬＭＧ１８１８７、ＬＭＧ１２００３、ＬＭＧ１２００５、ＬＭＧ１８１８９）；
Ｌ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（ＬＭＧ１４７５１、ＬＭＧ１８１８１、ＡＴＣＣ５３６７３、ＬＭＧ１４７５２、ＬＭＧ１４７５３、ＬＭＧ１４７５４、ＬＭＧ１４７５５、ＡＴＣＣ３３１９９）；
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ（ＡＴＣＣ４９６３、ＡＴＣＣ１９９９２、ＬＭＧ１１４１３、ＡＴＣＣ２９６０１、ＡＴＣＣ９８５７、ＡＴＣＣ４９６２、ＡＴＣＣ３３３２３、ＬＭＧ１０７７１、ＬＭＧ１８１７６）；
Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（ＬＭＧ１８１７５、ＬＭＧ１８１８４、ＬＭＧ１８１９３、ＮＣＣ５３３、ＡＴＣＣ３３２、ＡＴＣＣ３３２００、ＬＭＧ１８２０４、ＬＭＧ１８１９５）。
【００５０】
以下に公知のプライマー対を用いて種々の試料中のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株の検出を試みたが失敗に終わった結果を参考性１及び２として、簡単に示す。
（参考例１）
（i）Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株の生菌体、（ii）Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株を加熱殺菌し、乾燥させた菌体（死菌）、及び、（iii）Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株を飲料製品中に混合し加熱殺菌したのちに集菌した菌体（死菌）の３種類のサンプルから、それぞれ公知の方法でＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡをテンプレートとして、上記非特許文献１（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．７２２０−７２２８  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１３  Ｖｏｌｕｍｅ  ７９  Ｎｕｍｂｅｒ  ２３）に記載の試験方法に従い、６つのハウスキーピング遺伝子（ｆｕｓＡ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｌｅｐＡ、ｐｙｒＧ、ｒｅｃＡ）の一部（約５００ｂｐ〜１０００ｂｐ）を非特許文献１に記載のプライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した。結果としては、上記（i）及び（ii）のサンプルからは目的の増幅産物が確認されたが、（iii）のサンプルからは配列解析可能な増幅産物が確認されず、菌株の解析を行うことができなかった。
【００５１】
（参考例２）
（ii）Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株を加熱殺菌し、乾燥させた菌体（死菌）、及び、（iii）Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株を飲料製品中に混合し加熱殺菌したのちに集菌した菌体（死菌）の２種類のサンプルから公知の方法で抽出した、ＲＮＡをテンプレートにして、参考例１で使用したのと同じプライマー対を用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより６つのハウスキーピング遺伝子（ｆｕｓＡ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｌｅｐＡ、ｐｙｒＧ、ｒｅｃＡ）の一部（約５００ｂｐ〜１０００ｂｐ）の増幅を行った。結果としては、上記（ii）のサンプルからは目的の増幅産物を得ることができたが、（iii）のサンプルからは、目的の増幅産物を得ることができないか、又は非特異的な増幅産物が多く生成され、塩基配列解析に十分な純度の増幅産物を得ることができなかった。
【００５２】
参考例１及び２で使用したプライマーは以下のとおりであった。
2020068715.tif 000005
【００５３】
したがって、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株に対する特異的検出能力を試験するまでもなく、非特許文献１（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．７２２０−７２２８  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１３  Ｖｏｌｕｍｅ  ７９  Ｎｕｍｂｅｒ  ２３）に記載された方法およびプライマーは加熱殺菌された乳酸菌（死菌）入り飲料ではそもそもＰＣＲによる増副産物を得ることすらできず、本発明の目的には利用できないことが明らかになった。
本発明をより理解しやすくすることを目的として本発明の具体的態様を記載する。
【実施例】
【００５４】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらより何ら限定されるものではなく、また、本発明の範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えてもよい。
実施例及び比較例では、以下の実験手順によってシークエンスサンプルを得た。
【００５５】
＜実験手順＞
１．集菌とサンプルの洗浄
試料としてのサンプル飲料が入ったペットボトルを開栓前に上下に数回反転させてよく混合し、沈殿物がペットボトルの下部に残っていないことを確認した。次に、ペットボトルを開栓し、サンプル飲料液１０ｍＬを１５ｍＬ容滅菌ディスポプラスティックチューブに採取し、６０００ｒｐｍ（４８３０×ｇ）にて１０分間遠心分離した。遠心分離したサンプル飲料の上澄みを廃棄したのち、１０ｍＬの滅菌水をチューブに入れて再懸濁させた。再懸濁液を６０００ｒｐｍ（４８３０×ｇ）にて１０分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。沈殿物における下側には必要な菌体、上側には乳タンパク等の夾雑物があるため、滅菌水５ｍＬを添加して菌のペレットを崩さないように上部の乳タンパク等の夾雑物のみを軽く懸濁して上澄みを廃棄し、この洗浄作業を２回繰り返した。菌の沈殿を滅菌水１ｍＬに再懸濁し、滅菌済の１．５ｍＬチューブに採取した。そして、菌の沈殿物の再懸濁液を１４，０００ｒｐｍ（１９，０００×ｇ）にて２分間遠心分離し、滅菌水１ｍＬを添加してペレット上部を洗浄してＲＮＡ抽出用のサンプルとした。
【００５６】
２．ＲＮＡ抽出
上記１で得られたＲＮＡ抽出用のサンプルを３５０μｌのＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＬＢＰ）に懸濁しよく溶解した。そして、キットのＤＮＡ除去用カラムを用いてＤＮＡを除去した。Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡ  ｐｌｕｓキットのマニュアルに従い、ＲＮＡ抽出を行い、ＲＮＡ溶液を得た。
【００５７】
３．ＲＴ−ＰＣＲによる目的遺伝子領域の増幅
上記２で調製したＲＮＡ溶液から、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を使用して目的遺伝子領域を増幅した。
各実施例で使用する各プライマーセットに含まれるそれぞれのプライマーの１０ｐｍｏｌ／μｌの溶液を調整した。各プライマーは必要な配列をユーロフィンジェノミクス社のＰＣＲｅａｄｙプライマーにて合成依頼（５０ｐｍｏｌ／ｌ）したものを使用し、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅフリーの滅菌水にて、５倍に希釈した。
【００５８】
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて、下記反応組成通りに溶液を調製し、ＰＣＲ用の２００μｌ容チューブに下記組成を入れてよく混合した。当該キットのプロトコルではＰＣＲ反応液組成は総量５０μｌとするように指定されていたが、反応液中のＴｅｍｐｌａｔｅ濃度を上げるために総量２５μｌとし、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＲＮＡの量を４μｌとした。プライマー及びＴｅｍｐｌａｔｅ  ＲＮＡ（上記２にて調製したＲＮＡ溶液）以外はキットに付属したものを使用した。
【００５９】
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  １  ｓｔｅｐ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ      １μｌ
２×  １  ｓｔｅｐ  Ｂｕｆｆｅｒ                          １２．５μｌ
Ｆｏｒｗａｏｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（１０  μＭ）                    １μｌ
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（１０  μＭ）                      １μｌ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＲＮＡ  （２にて調整のＲＮＡ溶液）            ４μｌ
ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  ｄＨ2Ｏ                                  Ｂａｌａｎｃｅ
総量２５μｌ
上記組成で増幅産物が確認されない場合は、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＲＮＡの量を８μｌに増量し、再度ＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【００６０】
サーマルサイクラーＣ１０００Ｔｏｕｃｈ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにセットして、以下のように動かした。
ＳＴＥＰ１：５０℃、３０分、
ＳＴＥＰ２：９５℃、２分、
ＳＴＥＰ３：９５℃、３０秒、
ＳＴＥＰ４：５５℃、３０秒、
ＳＴＥＰ５：７２℃、３０秒
の条件でＳＴＥＰ３−５を計４０サイクルとして、ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。得られたサンプルについて、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施し、目的のバンドを確認した。
【００６１】
４−１．目的バンドのみがきれいに増幅されている場合
（１）反応液５μｌを新品の２００μｌ容ＰＣＲチューブ採取し、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴTM  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｒｅａｇｅｎｔを２μｌ添加してマイクロピペッターでよく混合した。
（２）サーマルサイクラーで５０℃１５分→８５℃１５分のインキュベーションを行い、ＰＣＲ産物を精製した。
【００６２】
４−２．目的バンド以外に１００ｂｐ前後のＰｒｉｍｅｒ  ｄｉｍｅｒやその他の増幅産物が確認される場合
電気泳動後にＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐを用いて精製した。
（１）定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施し、目的のバンドを確認後、アガロースゲルから目的バンドの部分を切り出し、滅菌済み１．５ｍｌチューブに採取した。
（２）ＮＴＩ溶液２００μｌを添加し、５０℃で５−１０分程度インキュベートする。インキュベート中２−３分おきにＶｏｒｔｅｘにてよく混合しゲルを完全に溶解させた。
（３）Ｎｅｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｃｏｌｕｍｎを付属の２ｍｌのコレクションチューブにセットし（２）で溶解したサンプル液全量をカラムの上に供し、１１，０００×ｇで３０秒間遠心を行った。ろ液を廃棄し、再度コレクションチューブにセットした。
（４）７００ｍｌのＮＴ３溶液をカラムに供し１１，０００×ｇで３０秒間遠心を行った。ろ液を廃棄し、再度コレクションチューブにセットする。この工程をもう１回繰り返した。
（５）１１，０００×ｇで１分間遠心を行い、カラムに残ったＮＴ＃溶液を除去した。
（６）新しい滅菌済みの１．５ｍｌチューブにカラムをセットし、ＮＥ溶液を１５μｌ添加し、室温で１分間静置した。
（７）１１，０００×ｇで１分間遠心を行い、カラムを廃棄し、シーケンス用の精製ＰＣＲ産物とした。
【００６３】
５．シーケンスサンプルの調製
Ｂｉｇｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｓｉｎｇ  Ｋｉｔ、精製したＰＣＲ産物、並びに、各菌株用のプライマーセットのプライマー対のフォワード及びリバースプライマー両方を用いてシーケンス反応を実施した。
（１）上記３にてＰＣＲに使用したプライマー対のフォワード及びリバースプライマー１０ｐｍｏｌ／μｌ溶液を、８μｌを滅菌済み１．５ｍｌチューブに採取し、９２μｌの滅菌水を用いて希釈し、０．８ｐｍｏｌ／μｌの溶液とした。
（２）Ｂｉｇｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｓｉｎｇ  Ｋｉｔ付属の溶液と４−１又は４−２で得られたＰＣＲ産物、プライマー溶液、滅菌水を用いて、下記の通りの組成のシーケンス反応用の液を２００μｌ容ＰＣＲチューブに調製した。一つのＰＣＲ産物あたりフォワード解析用とリバース解析用の２サンプルを用意した。
【００６４】
フォワード解析サンプル
精製ＰＣＲ産物                                            ２μｌ
Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｗａｔｅｒ（滅菌水）    ８μｌ
５×Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ                    ２μｌ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＲＲ−１００                        ４μｌ
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（０．８ｐｍｏｌ／μｌ）          ４μｌ
２０μｌ
リバース解析サンプル
精製ＰＣＲ産物                                            ２μｌ
Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｗａｔｅｒ（滅菌水）    ８μｌ
５×Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ                    ２μｌ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＲＲ−１００                        ４μｌ
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（０．８ｐｍｏｌ／μｌ）          ４μｌ
２０μｌ
（３）サーマルサイクラーにセットして、
９６℃、１０秒、
５０℃、５秒、
６０℃、４分の条件で計２５サイクル反応を実施した。
【００６５】
６．シーケンスサンプルの精製
（１）サンプル数の分の新しい滅菌済みの１．５ｍＬチューブ、及びＢｉｇｄｙｅ  ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用意した。
（２）ＳＡＭ溶液９０μｌとＸｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ溶液２０μｌをチューブに採取し、上記シーケンス反応産物２０μｌを添加した。
（３）チューブシェーカーにセットし、攪拌スピードを最大値にセットし３０分間攪拌した。
（４）７５０×ｇにて２分間遠心を行い、上澄み２０μｌをサンプルとして、ＨｉＤｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄを２０μｌと混合しＤＮＡシーケンサに供し、配列の解析を行った。
【００６６】
７．配列の解析と配列同一性及び菌種判別
（１）得られたそれぞれの配列フォワード、リバースの配列をＭＥＧＡ（フリーソフトウエア）の配列解析ソフトを用いて、コンセンサスシーケンスを得た。
（２）得られた配列をＮＣＢＩホームページのＢＬＡＳＴＮ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）にて既存のＤＮＡデータと配列同一性の確認を行った。
（３）データベースにＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ｎｒ／ｎｔ）を選択し、検索対象の制限を設定せずに配列同一性を確認した。
【００６７】
８．配列の解析と配列同一性及び系統樹解析による菌株判別
（１）ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の上記表１に示されるＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．配列をダウンロードし、解析した遺伝子とそれぞれの遺伝子の配列比較し、今回解析した遺伝子の配列と長さを合わせるために前後の余分な部分を削除した。
（２）長さをそろえた遺伝子の配列を用いて、それぞれの菌株のｇｙｒＢ遺伝子配列の後ろにｐｙｒＧ遺伝子配列を繋げ、それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工した。
（３）加工して作成した遺伝子配列に関して、ＭＥＧＡ等の配列解析ソフトを使用して系統樹解析を行い、系統樹を作成した。系統樹解析の結果ＣＰ１５６３株は上記ＧｅｎｅＢａｎｋ登録のすべての菌株とは配列が異なることが判明した。図２及び図３の系統樹は上述したとおりである。
（４）また、上記表２に示されるＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．配列を上記８．（１）と同様に処理し、上記８．（２）の工程において、ｇｙｒＢ遺伝子配列−ｐｙｒＧ遺伝子配列の融合配列の後ろに、さらにｌｅｐＡ遺伝子配列−ｇｙｒＡ遺伝子配列の融合配列を繋げてそれぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工し、加工して作成した遺伝子配列に関して、ＭＥＧＡ等の配列解析ソフトを使用して系統樹解析を行い、系統樹を作成することもできる（図６参照のこと）。
【００６８】
［実施例１］
試料であるサンプル飲料として、２５℃で６ヶ月間保存したペットボトル入りカラダカルピス（登録商標）を使用した。この試料に対し、プライマー対（１）〜（４）のそれぞれについて、別個の容器においてＰＣＲを行い、得られた４種類のＰＣＲ産物に対して、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施した。その結果を図４に示す。図４中レーン１がプライマー対（２）によるＰＣＲ産物を示し、レーン２がプライマー対（１）によるＰＣＲ産物を示し、レーン３がプライマー対（３）によるＰＣＲ産物を示し、レーン４がプライマー対（４）によるＰＣＲ産物を示す。
【００６９】
［実施例２］
試料であるサンプル飲料として、５５℃で４日間保存したペットボトル入りカラダカルピス（登録商標）を使用した以外は、実施例１と同様に操作した。本実施例は加速試験に該当し、サンプル飲料を２５℃で６ヶ月間保存した条件に相当する。ＰＣＲ産物が得られたことをアガロースゲルで確認した。
【００７０】
［実施例３］
試料であるサンプル飲料として、２５℃で９ヶ月間保存したペットボトル入りカラダカルピス（登録商標）を使用した以外は、実施例１と同様に操作した。ＰＣＲ産物が得られたことをアガロースゲルで確認した。
【００７１】
［実施例４］
試料であるサンプル飲料として、２５℃で１２ヶ月間保存したペットボトル入りカラダカルピス（登録商標）を使用した以外は、実施例１と同様に操作した。ＰＣＲ産物が得られたことをアガロースゲルで確認した。
【００７２】
［比較例１］
試料であるサンプル飲料として、５５℃で９ヶ月間保存したペットボトル入りカラダカルピス（登録商標）を使用した以外は、実施例１と同様に操作したが、ＰＣＲ産物が得られず解析できなかった。
【００７３】
［比較例２］
試料であるサンプル飲料として、５５℃で１２ヶ月間保存したペットボトル入りカラダカルピス（登録商標）を使用した以外は、実施例１と同様に操作したが、ＰＣＲ産物が得られず解析できなかった。
【００７４】
以上の実施例および比較例から、プライマー対（１）〜（４）を用いた場合においては、高温にて長期間保存された飲料に対しては、必要なＰＣＲ産物が得られにくいことが示された。
【００７５】
［実施例５］
実施例１〜４で得られた各ＰＣＲ産物を用いてシークエンスサンプルを作製し、塩基配列のシークエンス解析及びＢＬＡＳＴ解析を行った。
＜ｇｙｒＢ遺伝子配列について＞
実施例１〜４のサンプルのプライマー対（１）及び（２）を用いて得られたＰＣＲ産物のシークエンス解析結果は全て同じであった。また、前記プライマー対（１）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号１０の配列とが同一であり、前記プライマー対（２）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号１１の配列とが同一であることを確認した。そして、得られたシークエンス解析に基づくＢＬＡＳＴ解析の結果、配列同一性が高かった上位１２個までの菌種はＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ１１株及びＬ．ｓｏｂｒｉｕｓ１株であり、その配列同一性は９８−１００％であった。またそれ以外にＬ．ｋｉｔａｓａｔｏｎｉｓ，Ｌ．ｋａｌｉｘｅｎｓｉｓ，Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓなどが上位に確認できたが、その配列同一性は８４−９１％程度であった。以上のことからプライマー対（１）及び（２）で得られるＰＣＲ産物の解析配列はＬ．ａｍｙｌｏｂｏｒｕｓのｇｙｒＢ遺伝子であると予測された。
＜ｐｙｒＧ遺伝子配列について＞
実施例１〜４のサンプルのプライマー対（３）及び（４）を用いて得られたＰＣＲ産物のシークエンス解析結果は全て同じであった。また、前記プライマー対（３）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号１２の配列とが同一であり、前記プライマー対（４）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号１３の配列とが同一であることを確認した。そして、得られたシークエンス解析に基づくＢＬＡＳＴ解析の結果、配列同一性が高かった上位１１個までの菌種はＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓであり、その配列同一性は９９−１００％であった。またそれ以外にＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ，Ｌ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ，Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓなどが上位に確認できたが、その配列同一性は９０−９１％程度であった。以上のことからプライマー対（３）及び（４）で得られるＰＣＲ産物の解析配列はＬ．ａｍｙｌｏｂｏｒｕｓのｐｙｒＧ遺伝子であると予測された。
実施例１〜４のサンプルの含まれる当該の配列を持つ菌種はＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓである可能性が極めて高いことが明らかになった。
【００７６】
［実施例６］
＜系統樹の作成＞
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株についてプライマー対（１）によるＰＣＲ産物の塩基配列とプライマー対（３）によるＰＣＲ産物の塩基配列、プライマー対（１）によるＰＣＲ産物の塩基配列とプライマー対（４）によるＰＣＲ産物の塩基配列、プライマー対（２）によるＰＣＲ産物の塩基配列とプライマー対（３）によるＰＣＲ産物の塩基配列４、及びプライマー対（２）によるＰＣＲ産物の塩基配列とプライマー対（４）によるＰＣＲ産物の塩基配列をつなぎ合わせて、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで接続して融合遺伝子配列を作成した。また同様に、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の表１のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．配列をダウンロードし、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの各菌株において上記プライマーセットで増幅されうる領域の遺伝子配列の長さを合わせて、それぞれの菌株ごとのｇｙｒＢ遺伝子配列の後ろにｐｙｒＧ遺伝子配列をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで接続して融合遺伝子配列を作成した。それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工して比較用配列データを作成し、ＭＥＧＡ６配列解析ソフトを使用して系統樹解析を行い、系統樹を作成した。結果を図２に示す。図２からも分かるように本試験で解析した実施例１〜４のサンプルから得られたＤＮＡ配列はＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株のＤＮＡ由来の配列と１００％一致し、その他のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ株を含む１２株とは配列が異なることが分かり、サンプルに含まれる菌株はＬ．ａｍｙｌｏｖｒｕｓ  ＣＰ１５６３株であることが明らかになった。
【００７７】
［実施例７］
試料であるサンプル飲料として、以下の４種類を準備し、それぞれのサンプルについて
ｇｙｒＢ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）及びｐｙｒＧ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）のそれぞれについて、別個の容器においてＰＣＲを行った。
サンプル（ア）ペットボトル入りカラダカルピス（登録商標）製造直後
サンプル（イ）５５℃で４日間保存（２５℃で６ヶ月保存したのに相当）したペットボトル入りカラダカルピス（登録商標）
サンプル（ウ）５５℃で５日間保存（２５℃で９ヶ月保存したのに相当）したペットボトル入りカラダカルピス（登録商標）
サンプル（エ）２５℃で９ヶ月間保存したペットボトル入りカラダカルピス（登録商標）
上記４種類のサンプル（ア）〜（エ）から得られた各２種のＰＣＲ産物に対して、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施した。その結果を図５に示す。図５中レーン１がサンプル（ア）のプライマー対（５）によるＰＣＲ産物を示し、レーン２がサンプル（イ）のプライマー対（５）によるＰＣＲ産物を示し、レーン３がサンプル（ウ）のプライマー対（５）によるＰＣＲ産物を示し、レーン４がサンプル（エ）のプライマー対（５）によるＰＣＲ産物を示し、レーン５がサンプル（ア）のプライマー対（６）によるＰＣＲ産物を示し、レーン６がサンプル（イ）のプライマー対（６）によるＰＣＲ産物を示し、レーン７がサンプル（ウ）のプライマー対（６）によるＰＣＲ産物を示し、レーン８がサンプル（エ）のプライマー対（６）によるＰＣＲ産物を示す。増幅される鎖長はｇｙｒＢ遺伝子配列増幅用のプライマー対（５）で１２３ｂｐであり、ｐｙｒＧ遺伝子配列増幅用のプライマー対（６）で１３９ｂｐであった。
この結果から、プライマー対（５）及び（６）によって得られるＤＮＡ配列は、比較的短いため、５５℃で保存した後のサンプルであっても、ＰＣＲ産物が得られることが分かった。
【００７８】
［実施例８］
実施例７で得られた各ＰＣＲ産物を用いてシークエンスサンプルを作製し、塩基配列のシークエンス解析及びＢＬＡＳＴ解析を行った。
＜ｇｙｒＢ遺伝子配列について（図５のレーン１〜４）について＞
サンプル（ア）〜（エ）のそれぞれのプライマー対（５）を用いて得られたＰＣＲ産物のシークエンス解析結果は全て同じであった。そして、得られたシークエンス解析に基づくＢＬＡＳＴ解析の結果、配列同一性が高かった上位１２個までの菌種はＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ１１株及びＬ．ｓｏｂｒｉｕｓ１株であり、その配列同一性が確認できた配列は解析した配列１２３ｂｐ全体であり、その配列同一性は９８−１００％であった。またそれ以外にＬ．ｋｉｔａｓａｔｏｎｉｓ，Ｌ．ｋａｌｉｘｅｎｓｉｓ，Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓなどが上位に確認できたが、その配列同一性は８９−９３％程度であった。以上のことからプライマー対（５）で得られるＰＣＲ産物の解析配列はＬ．ａｍｙｌｏｂｏｒｕｓ又はＬ．ｓｏｂｒｉｕｓのｇｙｒＢ遺伝子であると予測された。
＜ｐｙｒＧ遺伝子配列について（図５のレーン５〜８）について＞
サンプル（ア）〜（エ）のそれぞれのプライマー対（６）を用いて得られたＰＣＲ産物のシークエンス解析結果は全て同じであった。そして、得られたシークエンス解析に基づくＢＬＡＳＴ解析の結果、配列同一性が高かった上位１１個までの菌種はＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓであり、解析した１３９ｂｐ程度のうち配列同一性が確認できたのは９１ｂｐ程度であった。その配列同一性は９８−１００％であった。また１２位以降の菌種はＬ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓやＬ．ｇａｌｌｉａｎｕｍ，Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓなどのその他の菌種であり、最も配列同一性が高くても９６％程度であった。以上のことから解析配列はＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓのｐｙｒＧ遺伝子であると考えられた。
以上の結果から、サンプル（ア）〜（エ）に含まれる当該の配列を持つ菌種はＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓである可能性が極めて高いことが明らかになった。
【００７９】
［実施例９］
＜系統樹の作成＞
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株について実施例７で使用したプライマー対（５）を用いて増幅したｇｙｒＢ遺伝子配列の下流にプライマー対（６）を用いて増幅したｐｙｒＧ遺伝子配列をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで接続して融合遺伝子配列（配列番号１６）を作成した。また、同様に、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ株を含む１２株のそれぞれについても同様に、プライマー対（５）を用いて増幅したｇｙｒＢ遺伝子配列の下流にプライマー対（６）を用いて増幅したｐｙｒＧ遺伝子配列をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで接続して融合遺伝子配列（配列番号２３〜３３）を作成した。作成した融合遺伝子配列群を用いて、ＭＥＧＡ６によりＮｅｉｂｅｒｈｏｏｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ法にて系統樹を作成した。結果を図３に示す。図３からも分かるように本試験で解析したすべてのサンプル（ア）〜（エ）から得られたＤＮＡ配列はＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株のＤＮＡ由来の配列と１００％一致し、その他のＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ株を含む１２株とは配列が異なることが分かり、サンプル（ア）〜（エ）に含まれる菌株はＬ．ａｍｙｌｏｖｒｕｓ  ＣＰ１５６３株であることが明らかになった。
【００８０】
［実施例１０］
試料であるサンプル飲料として、２５℃で６ヶ月間保存したペットボトル入りカラダカルピス（登録商標）を使用した。この試料に対し、プライマー対（７）〜（１０）のそれぞれについて、別個の容器においてＰＣＲを行い、得られた４種類のＰＣＲ産物に対して、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施した。また、ポジティブコントロールとして、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株を常法で培養したサンプルについても同様にプライマー対（７）〜（１０）のそれぞれについて、別個の容器においてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物に対して定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施した。その結果を図７に示す。なお、図７における各レーンは、以下の表３のように対応する。
【００８１】
【表３】
2020068715.tif 000006
【００８２】
［実施例１１］
＜系統樹の作成＞
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＣＰ１５６３株についてプライマー対（１）によるＰＣＲ産物の塩基配列とプライマー対（３）によるＰＣＲ産物の塩基配列、並びに、プライマー対（７）によるＰＣＲ産物の塩基配列とプライマー対（９）によるＰＣＲ産物の塩基配列によるＰＣＲ産物の塩基配列をつなぎ合わせて、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで接続して融合遺伝子配列を作成した。また同様に、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の表１及び表２のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．配列をダウンロードし、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの各菌株において上記プライマーセットで増幅されうる領域の遺伝子配列の長さを合わせて、それぞれの菌株ごとのｇｙｒＢ遺伝子配列、ｐｙｒＧ遺伝子配列、ｌｅｐＡ遺伝子配列、及びｇｙｒＡ遺伝子配列をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで接続して融合遺伝子配列を作成した。それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工して比較用配列データを作成し、ＭＥＧＡ６配列解析ソフトを使用して系統樹解析を行い、系統樹を作成した。結果を図６に示す。図６からも分かるようにサンプルから得られたＤＮＡ配列から、サンプルに含まれる菌体が、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｒｕｓ  ＣＰ１５６３株であることを特定でき、また、その他の１０株についても特定できることが明らかになった。
【図１】
2020068715.tif 000007
【図２】
2020068715.tif 000008
【図３】
2020068715.tif 000009
【図４】
2020068715.tif 000010
【図５】
2020068715.tif 000011
【図６】
2020068715.tif 000012
【図７】
2020068715.tif 000013
【配列表】
2020068715000001.app