(57)【要約】      （修正有）【課題】超音波媒介胃腸薬物送達のためのシステム、装置、及び方法を提供する。【解決手段】物質を投与するための装置は、近位端及び遠位端を有する細長い本体を有する。細長い本体は、遠位端に物質を導くための近位端と遠位端との間に延在する内部チャンバを画定し、遠位端は先端２６１０と接続し、先端は、被験体の体腔の開口部内に少なくとも部分的に挿入され、少なくとも部分的な挿入時に開口部からの物質の漏洩を低減するよう構成される形状を有する。先端は、内部チャンバから体腔内に物質を通過させるための開口部、及び、先端から体腔内に超音波を射出することにより、物質を体腔内の組織に投与するためのトランスデューサを含む。【選択図】図２９
2020168421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質を投与するための装置であって、
近位端及び遠位端を有する細長い本体であって、前記細長い本体は、前記遠位端に前記物質を導くための前記近位端と前記遠位端との間に延在する内部チャンバを画定し、前記遠位端が先端と接続し、前記先端は、被験体の胃腸管である体腔のオリフィスに少なくとも部分的に挿入される、前記細長い本体を備え、
前記先端は、
使用中に前記オリフィスに対する封止を形成するための凹部領域と、
前記内部チャンバから前記体腔内に前記物質を通過させるための開口部を含む送達領域であって、前記開口部が前記装置に対して放射状方向に配向され、かつ前記送達領域の直径が前記凹部領域の直径よりも大きい、前記送達領域と、
前記装置に対して軸方向に沿って、前記先端から前記体腔内に超音波を射出することによって、前記物質を前記体腔内の組織に投与するためのトランスデューサと、
を備える、
前記装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が本明細書に参照文献として援用され、「Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ  a
Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ」と題する、２０１４年４月８日出願の米国仮特許出願第６２／１４４，８４２号の利益の優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、一般に物質を被験体に送達するためのシステム、装置、及び方法に関する。より詳細には、本開示は超音波媒介胃腸薬物送達のためのシステム、装置、及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
胃腸（ＧＩ）管を渡る高分子の送達は、最も詳しく調査されている薬物送達の研究分野の１つである。しかしＧＩ管を介した送達は、依然として低分子に限定される。ほとんどの薬物が活性医薬成分を安定させ、ＧＩ管における最適な吸収をもたらす特定の調剤を必要とすることが多いため、低分子の送達ですら困難であり得る。迅速なＧＩ薬物送達を容易にする技術は存在しない。
【発明の概要】
【０００４】
時間及び費用がかかる再調剤を必要としない広範囲の治療薬の送達を可能にし得るプラットフォームが、送達科学におけるパラダイムシフトを提示し、広範な臨床的影響をもたらす可能性がある。超音波などの薬物送達の物理的方法により、広範な調剤開発の必要性を回避しながら高分子を送達することが可能であってもよい。本開示は、物質を投与するためのシステム、装置、及び方法について説明する。いくつかの実施形態においては、直腸などの体腔内への物質の超音波媒介投与のためにこれらのシステム及び方法を利用することができる。
【０００５】
一実施形態において、物質を投与するための装置は、近位端及び遠位端を有する細長い本体を含む。細長い本体は、近位端と遠位端との間に延在して物質を遠位端に導く内部チャンバを画定し、遠位端が先端と接続し、先端が被験体の体腔のオリフィス（orifice）内に少なくとも部分的に挿入されて、少なくとも部分的な挿入の際に物質のオリフィスからの漏洩を低減するよう構成される形状を有し、物質を内部チャンバから体腔内に通過させるための開口部（opening）及び、先端から体腔内へと超音波を射出し、それによって物質を体腔内の組織に投与するトランスデューサを含む。
【０００６】
別の実施形態において、装置が物質を投与するための、被験体の直腸内に少なくとも部分的に挿入される先端は、装置の内部チャンバから少なくとも直腸内に物質を通過させる開口部を含む。先端は、少なくとも部分的な挿入時に物質の直腸からの漏洩を低減するよう構成される形状及び、先端から少なくとも直腸内に超音波を射出し、それによって物質を少なくとも直腸内の組織に投与するトランスデューサを有する。
【０００７】
別の実施形態において、装置が物質を投与するためのシースは、装置の少なくとも一部を保護し、直腸と直接接触する先端を含み、超音波の減衰を低減するための、音響透過性及び音響伝導性の少なくとも１つである材料を備え、開口部との位置決めを行う穿孔を画定するためのカバーを含む。シースは、装置の直腸への露出を低減するよう構成されるカバー開口部周囲の弾性バンド、装置の直腸への露出を低減するよう構成される弾性ラップ、先端を滑る剛性部品を含んでもよい。第１の剛性部品及び第２の剛性部品は、第１の剛
性部品が第２の剛性部品に接続し、及び／または、第１の剛性部品が先端の端部のヒンジによって第２の剛性部品に連結されるように先端の両側から取り付けられる。
【０００８】
別の実施形態において、装置が物質を投与するためのカートリッジは、物質を備えるリザーバを画定するハウジングを含み、装置との流体連通を確立する内部チャンバに挿入される。
【０００９】
別の実施形態において、物質の投与時に利用されるキットは、物質を投与するための、近位端及び遠位端を有する細長い本体を含む装置を含む。細長い本体は近位端と遠位端との間に延在する内部チャンバを画定して、物質を遠位端に導く。キットはまた、遠位端に接続するための先端を含み、先端は被験体の体腔のオリフィスに少なくとも部分的に挿入される。先端は少なくとも部分的な挿入時に物質のオリフィスからの漏洩を低減するよう構成される形状を有し、内部チャンバから体腔内に物質を通過させる開口部及び、先端から体腔内に超音波を射出するトランスデューサを含む。キットはさらに、装置との流体連通を確立する内部チャンバ内に挿入されるカートリッジを含み、カートリッジは物質を備えるリザーバを画定するハウジングを含む。
【００１０】
別の実施形態において、物質を投与するための装置の組立方法は、被験体の体腔のオリフィス内に少なくとも部分的に挿入される先端を遠位端に接続することであって、先端は、少なくとも部分的な挿入時に物質のオリフィスからの漏洩を低減するよう構成される形状を有し、物質を内部チャンバから体腔内に通過させるための開口部及び先端から体腔内に超音波を射出するためのトランスデューサを含む、接続することを含む。本方法はまた、装置との流体連通を確立するための、物質を備えるリザーバを画定するハウジングを含むカートリッジを内部チャンバ内に挿入することを含む。
【００１１】
別の実施形態において、物質の投与方法は、装置の先端の少なくとも一部を被験体の体腔のオリフィスに挿入することであって、先端は、少なくとも部分的な挿入時に物質のオリフィスからの漏洩を低減するよう構成される形状を有する、挿入すること、先端の開口部を介して、物質を体腔内に通過させること、及び、同時に、及び／またはその後、先端のトランスデューサを介して、超音波を体腔内に射出することによって物質を体腔内の組織に投与すること、を含む。
【００１２】
上述の概念及び以下により詳細に記載する付加的な概念の組み合わせの全て（このような概念が互いに矛盾しない場合）は、本明細書に開示の発明の主題の一部と見なされることを理解されたい。特に、本開示の最後に記載の請求項に記載された主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示の発明の主題の一部と見なされる。参照のために組み込まれるいかなる開示においても記載され得る本明細書にて明示的に使用される用語には、本明細書に開示の特定の概念と最も一致する意味が付与されるべきであることも理解されたい。
【００１３】
他のシステム、プロセス、及び特徴は、以下の図面と詳細な説明を考察することによって、当業者に明らかになる。このような全ての付加的なシステム、プロセス、及び特徴は本明細書内、また、本発明の範囲に含まれ、そして添付の特許請求の範囲によって保護されることを意図している。
【００１４】
図面は主に例示を目的としており、本明細書に記載の発明の主題の範囲を限定することを意図するものではないことが当業者には理解される。図面は必ずしも原寸に比例したものではない。場合によっては、本明細書に開示の発明の主題の様々な態様は、異なる特徴を容易に把握するために、図面において誇張して、または拡大して示されてもよい。図面において、類似の参照符号は概して類似の特徴（例えば、機能的に類似の、及び／または構造的に類似の要素）を指す。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】いくつかの実施形態による、超音波振動数を示すチャートである。
【図２Ａ】いくつかの実施形態による、フランツ拡散セルを示す図である。
【図２Ｂ】いくつかの実施形態による、グルコースの様々な組織型へのｅｘ  ｖｉｖｏ送達を示すグラフである。
【図３】図３Ａ〜３Ｅは、いくつかの実施形態による、様々な物質の様々な組織型へのｅｘ  ｖｉｖｏ送達を示すグラフである。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、いくつかの実施形態による、様々な物質の様々な組織型へのｅｘ  ｖｉｖｏ送達を示すグラフである。
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、いくつかの実施形態による、様々な物質の様々な組織型へのｅｘ  ｖｉｖｏ送達を示すグラフである。
【図６】いくつかの実施形態による、音響流動または攪拌に伴う送達の相対的な増強を示すグラフである。
【図７Ａ】いくつかの実施形態による、送達の熱影響を示す熱画像である。
【図７Ｂ】いくつかの実施形態による、送達の熱影響を示す熱画像である。
【図７Ｃ】いくつかの実施形態による、送達の熱影響を示す熱画像である。
【図８】いくつかの実施形態による、熱影響に伴う送達の相対的な増強を示すグラフである。
【図９Ａ】いくつかの実施形態による、過渡的なキャビテーションを示すグラフである。
【図９Ｂ】いくつかの実施形態による、過渡的なキャビテーションを示す画像である。
【図９Ｃ】いくつかの実施形態による、過渡的なキャビテーションを示す画像である。
【図９Ｄ】いくつかの実施形態による、過渡的なキャビテーションを示す画像である。
【図１０Ａ】いくつかの実施形態による、超音波増強送達の機構を示す図である。
【図１０Ｂ】いくつかの実施形態による、超音波増強送達の機構を示す図である。
【図１０Ｃ】いくつかの実施形態による、超音波増強送達の機構を示す図である。
【図１１Ａ】いくつかの実施形態による、小腸のｌｏｇ（Ｐｉｎｕｌｉｎ）に対するｌｏｇ（Ｐｇｌｕｃｏｓｅ）を示すプロットである。
【図１１Ｂ】いくつかの実施形態による、小腸のｌｏｇ（Ｐｉｎｕｌｉｎ）に対するｌｏｇ（Ｐｇｌｕｃｏｓｅ）を示すプロットである。
【図１２Ａ】いくつかの実施形態による、２０ｋＨｚの超音波を用いた治療の有無を問わず、蛍光活性化３ｋＤａデキストランまたは７０ｋＤａデキストランに曝露された大腸組織の断面を示す画像である。
【図１２Ｂ】いくつかの実施形態による、２０ｋＨｚの超音波を用いた治療の有無を問わず、蛍光活性化３ｋＤａデキストランまたは７０ｋＤａデキストランに曝露された大腸組織の断面を示す画像である。
【図１２Ｃ】いくつかの実施形態による、２０ｋＨｚの超音波を用いた治療の有無を問わず、蛍光活性化３ｋＤａデキストランまたは７０ｋＤａデキストランに曝露された大腸組織の断面を示す画像である。
【図１２Ｄ】いくつかの実施形態による、２０ｋＨｚの超音波を用いた治療の有無を問わず、蛍光活性化３ｋＤａデキストランまたは７０ｋＤａデキストランに曝露された大腸組織の断面を示す画像である。
【図１３Ａ】超音波処理前後の物質のＮＭＲスペクトルである。
【図１３Ｂ】超音波処理前後の物質のＮＭＲスペクトルである。
【図１３Ｃ】いくつかの実施形態による、超音波処理前後の物質の活性を示すグラフである。
【図１４Ａ】いくつかの実施形態による、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達の手順を示すフロー図である。
【図１４Ｂ】いくつかの実施形態による、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達の手順を示す図である。
【図１５Ａ】いくつかの実施形態による、超音波処理の大腸組織への影響を示す肉眼図である。
【図１５Ｂ】いくつかの実施形態による、超音波処理の大腸組織への影響を示す肉眼図である。
【図１５Ｃ】いくつかの実施形態による、超音波処理の大腸組織への影響を示す組織学的画像である。
【図１５Ｄ】いくつかの実施形態による、超音波処理の大腸組織への影響を示す組織学的画像である。
【図１６】いくつかの実施形態による、組織生検の質量によって正規化される、組織生検内の薬物含有量のプロットである。
【図１７Ａ】相対的な血中グルコースのプロットである。
【図１７Ｂ】相対的な血中グルコースのプロットである。
【図１７Ｃ】いくつかの実施形態による、超音波処理のインスリン投与への影響を示す相対的な血中グルコースのグラフである。
【図１８Ａ】いくつかの実施形態による、プローブ装置の画像である。
【図１８Ｂ】いくつかの実施形態による、治療スケジュールを示す図である。
【図１９Ａ】いくつかの実施形態による、超音波の血液マーカへの影響を示すグラフである。
【図１９Ｂ】いくつかの実施形態による、超音波の組織学スコアへの影響を示すプロットである。
【図２０】いくつかの実施形態による、超音波の糞便スコアへの影響を示すプロットである。
【図２１Ａ】いくつかの実施形態による、超音波のサイトカイン提示への影響を示すグラフである。
【図２１Ｂ】いくつかの実施形態による、超音波のサイトカイン提示への影響を示すグラフである。
【図２１Ｃ】いくつかの実施形態による、超音波のサイトカイン提示への影響を示すグラフである。
【図２１Ｄ】いくつかの実施形態による、超音波のサイトカイン提示への影響を示すグラフである。
【図２２Ａ】いくつかの実施形態による、超音波の組織への影響を示す画像である。
【図２２Ｂ】いくつかの実施形態による、超音波の組織への影響を示す画像である。
【図２２Ｃ】いくつかの実施形態による、超音波の組織への影響を示す画像である。
【図２２Ｄ】いくつかの実施形態による、超音波の組織への影響を示す画像である。
【図２２Ｅ】いくつかの実施形態による、超音波の組織への影響を示す画像である。
【図２２Ｆ】いくつかの実施形態による、超音波の組織への影響を示す画像である。
【図２３Ａ】いくつかの実施形態による、超音波の合計糞便スコアへの影響を示すグラフである。
【図２３Ｂ】いくつかの実施形態による、超音波の合計糞便スコアへの影響を示すグラフである。
【図２４】いくつかの実施形態による、超音波の組織学スコアへの影響を示すグラフである。
【図２５Ａ】いくつかの実施形態による、超音波の組織への影響を示す画像である。
【図２５Ｂ】いくつかの実施形態による、超音波の組織への影響を示す画像である。
【図２５Ｃ】いくつかの実施形態による、超音波の組織への影響を示す画像である。
【図２５Ｄ】いくつかの実施形態による、超音波の組織への影響を示す画像である。
【図２５Ｅ】いくつかの実施形態による、超音波の組織への影響を示す画像である。
【図２６】いくつかの実施形態による、手持ち式超音波射出薬物送達装置を示す概略図である。
【図２７】いくつかの実施形態による、手持ち式超音波射出薬物送達装置及び薬物カートリッジを示す概略図である。
【図２８】いくつかの実施形態による、手持ち式超音波射出薬物送達装置及び外部薬物リザーバを示す概略図である。
【図２９】いくつかの実施形態による、手持ち式超音波射出薬物送達装置の利用を示す概略図である。
【図３０】いくつかの実施形態による、平衡型圧電結晶を用いた手持ち式超音波射出薬物送達装置を示す概略図である。
【図３１】いくつかの実施形態による、突起を有する揺動軸を用いた手持ち式超音波射出薬物送達装置を示す概略図である。
【図３２】いくつかの実施形態による、高アスペクト比結晶を用いた手持ち式超音波射出薬物送達装置を示す概略図である。
【図３３】いくつかの実施形態による、手持ち式超音波射出薬物送達装置の内部部品を示す概略図である。
【図３４】いくつかの実施形態による、手持ち式超音波射出薬物送達装置の帯状シースを示す概略図である。
【図３５】いくつかの実施形態による、手持ち式超音波射出薬物送達装置の伸縮性シースを示す概略図である。
【図３６Ａ】いくつかの実施形態による、手持ち式超音波射出薬物送達装置の剛性シースを示す概略図である。
【図３６Ｂ】いくつかの実施形態による、手持ち式超音波射出薬物送達装置の剛性シースを示す概略図である。
【図３６Ｃ】いくつかの実施形態による、手持ち式超音波射出薬物送達装置の剛性シースを示す概略図である。
【図３７】いくつかの実施形態による、手持ち式超音波射出薬物送達装置のシースの固定機構を示す概略図である。
【図３８Ａ】いくつかの実施形態による、治療レジメンを示す図である。
【図３８Ｂ】いくつかの実施形態による、核酸送達のための超音波の合計糞便スコアへの影響を示すバーグラフである。
【図３９Ａ】いくつかの実施形態による、組織採点法を示す画像である。
【図３９Ｂ】いくつかの実施形態による、組織採点法を示す画像である。
【図３９Ｃ】いくつかの実施形態による、核酸送達のための超音波の組織学スコアへの影響を示すバーグラフである。
【図４０】いくつかの実施形態による、超音波媒介ワクチン接種の身体スコアへの影響を示すプロットである。
【図４１Ａ】いくつかの実施形態による、大型動物の大腸炎モデルを示す画像である。
【図４１Ｂ】いくつかの実施形態による、大型動物の大腸炎モデルを示す画像である。
【図４２Ａ】いくつかの実施形態による、大型動物の大腸炎モデルにおける大腸生検組織の変化を示す可変的な詳細の画像である。
【図４２Ｂ】いくつかの実施形態による、大型動物の大腸炎モデルにおける大腸生検組織の変化を示す可変的な詳細の画像である。
【図４２Ｃ】いくつかの実施形態による、大型動物の大腸炎モデルにおける大腸生検組織の変化を示す可変的な詳細の画像である。
【図４３Ａ】いくつかの実施形態による、大型動物の大腸炎モデルにおける大腸生検組織の変化を示す可変的な詳細の画像である。
【図４３Ｂ】いくつかの実施形態による、大型動物の大腸炎モデルにおける大腸生検組織の変化を示す可変的な詳細の画像である。
【図４４Ａ】いくつかの実施形態による、大型動物の大腸炎モデルにおける大腸生検組織の変化を示す可変的な詳細の画像である。
【図４４Ｂ】いくつかの実施形態による、大型動物の大腸炎モデルにおける大腸生検組織の変化を示す可変的な詳細の画像である。
【図４５Ａ】いくつかの実施形態による、大型動物の大腸炎モデルにおける大腸生検組織の変化を示す可変的な詳細の画像である。
【図４５Ｂ】いくつかの実施形態による、大型動物の大腸炎モデルにおける大腸生検組織の変化を示す可変的な詳細の画像である。
【図４６Ａ】いくつかの実施形態による、大型動物の大腸炎モデルにおけるヘマトクリット及びヘモグロビンの変化を示すプロットである。
【図４６Ｂ】いくつかの実施形態による、大型動物の大腸炎モデルにおけるヘマトクリット及びヘモグロビンの変化を示すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
図１に示すように超音波は、（可聴範囲を超える、例えば、２０ｋＨｚを上回る）振幅及び周波数を特徴とする長手方向圧力波である。超音波は臨床的に、超音波診断、腫瘍アブレーション、及び砕石術を含む様々な現場において利用される。これらの産科及び治療への応用は主に、（例えば、１ＭＨｚを上回る）高周波超音波を利用する。しかし、より低い周波数（例えば、図１の約２０ｋＨｚから約１００ｋＨｚの範囲１００）において超音波は、過渡的なキャビテーションとして知られる現象によって、治療物質を過渡的に透過処理し、組織内に推進する能力を含む特異な特性を有する。過渡的なキャビテーションは、軸方向の、また放射状の射出の利用を含む様々な超音波プローブ構成を利用して誘発することができる。さらに、最適な超音波構成は治療疾患に応じて調節され、このモダリティの潜在的な一般化可能性を最大化し得る。
【００１７】
ＧＩ管への薬物送達を最大化するための超音波などの物理的送達モダリティの利用は、広範な臨床的有用性を有し得る。炎症性腸疾患は、超音波援用薬物投与に従ってもよい１セットの疾患を表す。この衰弱性の高い疾患のセットは、高い疾病率及び生活の質への悪影響に関連する。最も一般的なサブタイプは、潰瘍性大腸炎である。潰瘍性大腸炎の第１選択療法は、経口及び／または経直腸経路を介して投与されるアミノサリチル酸を含み、後者は、特に疾患活動性が軽度から中程度である場合により有効であると認識されている。しかし、経直腸治療（すなわち、注腸薬剤）効能は、保持時間及び組織の薬物吸収に直接依存するし、それらはいずれも下痢及び頻繁な便通に苦しむ患者にとっては困難である。したがって、注腸に必要な保持時間を短縮しながら直腸内のアミノサリチル酸の局所粘膜濃度を最大化するための超音波の利用は、注腸薬剤を現在自己投与しなければならない患者への重大な臨床的影響及び利点を有する潜在的な本技術の応用の１つであってもよい。
【００１８】
直腸への局所的な治療的送達に加えて、物理的送達のモダリティもまた、疾病を標的とし、治療する方法を変えながら、化合物の広範囲の全身送達を可能にし得る。この認識により、物理的送達プラットフォームとしての超音波の利用が極めて多量の薬物のＧＩ管の全てのセグメント内への送達を可能にすることを示唆する。例えば超音波は、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＧＩ管の全ての部分モデルにおける治療薬の広範囲の分子量に渡る送達を可能にする。場合によっては、例えば炎症性腸疾患の管理に現在利用されている局所的治療薬の送達のために、本技術が直腸を介して利用され得る。
【００１９】
炎症性腸疾患の現在の標準治療は、注腸薬剤の自己投与である。その結果、注腸薬剤の投与も行う超音波プローブの同時応用は、これらの患者への採用は困難となる。加えて、
これらの薬剤の粘膜濃度が高まるほど、疾患活動性の低減との相関が以前は示されていた。
【００２０】
ＧＩ管の全体を通じた活性薬物送達モダリティとしての超音波の前臨床利用が、本出願において示される。本明細書に示すように、超音波により、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＧＩ管の全部品において、広範な範囲の分子量でモデル化合物の送達を効果的に向上させることが可能であった。さらに驚くべきことは、これに必要とされる治療時間が比較的短い（１分の合計超音波照射）ことである。増強方法の調査により、観察される薬物送達の増強の原因となる音響流動または熱影響の可能性がなくなり、過渡的なキャビテーションが送達増強に大きく寄与することを示唆する。実際、１ＭＨｚの超音波を用いた熱影響及び超音波処理は、送達の増強を誘発しないことが発見された。加えて、治療の結果としてのｉｎ  ｖｉｖｏでの温度上昇が、１．０４±０．６６℃のみであることが発見された。さらに、２０、４０、または６０ｋＨｚの超音波を用いた超音波処理の結果としてのアルミニウム箔試料でのピットの発生は、ここで試験される強度での過渡的なキャビテーションの発生を支持する。２０ｋＨｚの超音波の組織内で生成される理論上の孔径への影響がまた、定量化され、超音波治療の結果として大幅に増大することが発見された。さらなる治療レジメンの調査及び装置の実装によって、さらにいっそうの送達の増強を実現することが可能である。
【００２１】
ｅｘ  ｖｉｖｏでの超音波媒介胃腸送達（ＵＭＧＩＤ）のこの現在の理解及び最適化に基づき、直腸における（１）軸方向の、また（２）放射状の超音波射出の２つの構成がｉｎ  ｖｉｖｏで試験される。家庭での自己投与に従う小さく、移動可能な形状因子の複数の構成において超音波を生成する能力は、ＵＭＧＩＤの一般化可能性及びそのチューナビリティを支持する。これは、広範な臨床及び研究の応用性にとって最も重要である。注腸がすでに標準治療として確立されている炎症性腸疾患などの疾病のための経直腸送達の即時の使用事例において患者は、高い周囲組織透過度を実現し、薬物送達を向上させるために、小型の、超音波を放射状に射出する手持ち式装置を利用してもよい。超音波小型化の継続的な改善によって様々な異なる操作形式が可能になり、簡便な方法で全身送達を容易にするための、摂取可能な超音波射出カプセルを含む、ＧＩ管の全部品への簡便な超音波照射が可能になり得る。
【００２２】
動物の組織の組織学的検査及び臨床モニタリングに基づき、ブタにおける軸方向の射出が安全であることが示された。超音波はまた、メサラミンの送達を桁違いに大きく増強することが証明された。たった１分の超音波の応用でこのレベルの送達が実現可能であるという事実が、ＵＭＧＩＤの潜在的な能力を示す。さらに、モデル生物製剤としてのインスリンの送達は、より大きい分子の直腸を通じた、また、潜在的にＧＩ管の可変的なセグメントを通じた全身送達を実現するための軸方向の射出能力を強調する。実験都合上インスリンが選択されたが、その送達の成功は、生物製剤の機能を維持しながらそれらを直腸へと局所的に送達する能力を例証することに留意されたい。生物製剤の局所送達には、様々な疾病に有用となる可能性がある。例えば潰瘍性大腸炎に関して、ＴＮＦを標的とするモノクローナル抗体の局所送達は、炎症誘発プロセスを減少させる上で有益となり得る。現在の形式の本技術はまた、大腸癌治療のための直腸における化学療法剤及び生物製剤の局所送達において有益となり得る。実際、これらの薬剤の局所送達を実現する現在の戦略は調剤技術に大きく依存するが、多くの薬物を送達する上での低い積載効率及び広範な応用性の欠如が問題となる。
【００２３】
軸方向の射出に加えて、臨床的に関連するマウス大腸炎モデルにおいて放射状の射出が試験された。軽度から中程度の大腸炎の最も有効な治療法は、直腸投与である。しかし活性疾病は、投薬を困難とする可能性がある。例えば、炎症性腸疾患の治療のためのＲｏｗａｓａ（登録商標）（メサラミン、４ｇ、ニュージャージー州、サマセット、ＭｅｄａＰ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓより入手可能）の直腸投与の現在の手順には、患者がまず排便することが必要である。患者はその後、左のわき腹を下にして横になるよう指示される。患者はその後、アプリケータ先端部を直腸内に挿入し、薬物を静かに注入しなければならない。患者は少なくとも３０分間はこの体位を保ち、注腸を１晩維持するよう指示される。これは、夜間に我慢しなければならない危険かつ不快な経験を招き得る。これは、活性大腸炎を患う、頻繁な便通の緊急性を経験している患者にとっては特に困難である。このレジメンが厳密に守られる場合であっても、疾病再発率は高い。ＵＭＧＩＤにメサラミンの迅速な送達を促進し、それによって治療効能を向上させる能力があるか否かを検査する上で、放射状の射出を伴う超音波プローブが、より広域の組織を透過処理するその能力のために利用された。軸径≦３ｍｍの特注設計の超音波プローブの利用は、本技術を大幅に小型化する能力を示す。注腸薬剤と組み合わせた超音波は、疾病指標を大幅に改善することが発見された。ＱＯＤ群の臨床転帰の改善への傾向は、超音波治療ＱＯＤが軽度なケースの大腸炎において、また、投薬を準最適に遵守する患者においては有用であり得ることを示唆する。超音波治療ＱＤの、現在の標準治療と比較して臨床的かつ組織学的に優れた疾病予後は目覚ましく、より短い治療レジメンで実現される寛解をＵＭＧＩＤが可能にし得ることを示唆する。さらにそれにより、迅速な疾病関連ＧＩ通過時間が療薬の吸収を制限する臨床環境において薬物送達を促進するための解決法を提示する。その結果本技術では、注腸の保持を延長する必要がなくなる。
【００２４】
ＵＭＧＩＤには、抗炎症性の局所的な特定部位の治療から高分子のさらに広範な送達への範囲に及ぶ多くの潜在的な応用がある。さらなる工夫により、本技術を摂取に対応する寸法に小型化し、摂取可能な超音波射出カプセルの全身送達を可能にし得る。本明細書に記載の研究に基づき、超音波技術はナノ粒子、モノクローナル抗体、またはワクチンなどの物質を送達し、粘膜性免疫応答を調節する可能性を有する。加えて超音波は、送達にいくつかの生物学的障壁を克服することが必要となるＤＮＡ及びＲＮＡベースの治療薬などの新規クラスの治療薬送達を潜在的に可能にし得る。さらなる研究により、本技術は、臨床及び研究の両方の現場において非常に有用であり、療法の改善ならびに、局所直腸送達及び、最終的には摂取可能な装置を利用した経口投与を可能にするＧＩ管及び新規医療装置に応用される研究技術の拡大を可能にすると証明され得る。
【実施例】
【００２５】
実施例１：Ｅｘ  ｖｉｖｏでの薬物送達のための超音波の実証実験利用
薬物送達の増強を可能にし、ＵＭＧＩＤのための最適な条件を特定する上で、超音波がＧＩ組織を安全に透過処理し得るか否かを理解するために、フランツ拡散セル（図１ａ参照）に装着された新鮮なブタＧＩ組織を利用してｅｘ  ｖｉｖｏプラットフォームが開発された。典型的な強度でのキャビテーション活性の同じ強度での高周波（１ＭＨｚを上回る）超音波と比較しての増大を裏付ける以前のデータを考慮し、低周波（１００ｋＨｚ未満）超音波の利用に焦点が当てられている。
【００２６】
Ａ．実験準備
リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）、ハイドロコルチゾン、メサラミン、Ｄａｈｌｉａ  Ｔｕｂｅｒｓのイヌリン（５，０００Ｄａ）、及び重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）がＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州、セントルイス）から得られた。顆粒Ｄ−グルコースがＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ニュージャージー州、フィリップスバーグ）から得られた。Ｌｙｓｉｎｅ−ｆｉｘａｂｌｅ３及びＴｅｘａｓ  Ｒｅｄで標識した７０ｋＤａデキストランがインビトロジェン（カリフォルニア州、カールスバッド）から購入された。他の放射性標識浸透物がＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．（ミズーリ州、セントルイス）から取得され、３Ｈ標識グルコース及びハイドロコルチゾン及び１４Ｃ標識メサラミン及び５，０００Ｄａイヌリンが含まれた。保存溶液の放射性標識内容物に応じて約０．００１％から約２．５
％の範囲の放射性標識内容物を用いて、１ｍｇ／ｍＬの濃度の４種類の化合物の溶液が調製された。
【００２７】
ＭＩＴ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅは、本研究の動物関連の研究面を認可した。全ての組織はＲｅｓｅａｒｃｈ  ８７，Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州、ボイルストン）から取得された。ヨークシャーピッグのＧＩ組織（例えば、舌、食道、胃、腸、及び大腸組織）が動物の安楽死の２０分以内に調達され、約４℃で保存された。薬物送達試験は安楽死の６時間以内に行われた。送達時に、新鮮なブタ組織はＰＢＳによって洗浄され、余分な脂肪が慎重に切開された。舌組織を除外して、組織の全厚が試験のために利用された。組織はおよそ２ｃｍ×２ｃｍ片に分割され、ＰＢＳで水和し続ける。舌組織の厚さの変動性により、拡散チャンバ内での全厚の装着が妨げられた。その代わりに、上面が電動デルマトーム（オハイオ州、ドーバー、Ｚｉｍｍｅｒ  Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  ＳｕｒｇｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ）から約７００μｍの厚さに分離され、その後、およそ１平方インチの断片に切開された。
【００２８】
低周波（例えば、未満１００ｋＨｚ）超音波が利用され、組織に直接投与され、未治療組織からなる対照と比較された。送達効果は、フランツ拡散セルを利用して組織を挿通する放射性標識浸透物の送達を定量化することによって評価された。図２Ａはいくつかの実施形態による、フランツ拡散セル２００を示す図である。各フランツ拡散セル２００は、超音波射出プローブ装置２０２、供与チャンバ２０４、組織試料２０６、受取チャンバ２０８、及び採取口２１０を含む。複数のフランツ拡散セル２００の各受取チャンバ２０８（直径１５ｍｍ、ＰｅｒｍｅＧｅａｒ、ペンシルベニア州、ヘラータウンより入手可能）はＰＢＳで満たされ、新鮮なＧＩ組織２０６の断片が腔側を上にして各受取チャンバ２０８上に配置された。各拡散セル２００により、組織の曝露面が約１．７７ｃｍ２となる。特に記載のない限り、送達量は、この領域上に送達された浸透物合計量を表す。各拡散セル２００には、組織２０６の上面に供与チャンバ２０４が配置され、漏洩を防止するためにアセンブリ全体が共に強く締め付けられていた。各供与チャンバ２０４はその後、組織２０６を水和し続けるために治療前にＰＢＳで満たされた。全ての必要な組織が切開され、フランツ拡散セル内に装着された後に、拡散セルは様々な実験群に無作為に割り当てられた。
【００２９】
超音波治療の直前に、各供与チャンバ２０４内のＰＢＳ溶液は排出され、供与溶液と共に再配置され、すなわち、対象の放射性標識化合物を含む１ｍｇ／ｍＬ溶液となった。
【００３０】
ＶＣＸ５００、ＶＣＸ１３０、カスタム注文のプローブをそれぞれが含む３つの別個の超音波発生器（コネチカット州、ニュートン、Ｓｏｎｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．より入手可能）を利用して、２０、４０、及び６０ｋＨｚの超音波周波数を発生した。各プローブまたはホーン２０２は、超音波を軸方向に射出させるための直径１３ｍｍの先端を有していた。各周波数の３つの別個の電力が試験され、ラインのないデュワーを利用して、それぞれが熱量測定法により校正された。熱量測定法は通常、超音波出力を予測するために文献にて一般的に利用されるため、この特定の方法が利用された。２０ｋＨｚの３つの電力は、２．５、５、及び７．５Ｗ／ｃｍ２であった。４０ｋＨｚにおいて、３つの電力は、７．３、１０．５、及び１３．４Ｗ／ｃｍ２であった。６０ｋＨｚにおいて、３つの電力は、９．６、１１．５、及び１２．４Ｗ／ｃｍ２であった。各周波数において試験された電力の差異は、各超音波発生器の感度及び効率性によるものであった。
【００３１】
超音波を加えるために、超音波プローブまたはホーン２０２の先端を組織２０６の表面から約３ｍｍ離れて位置するように、先端が各供与チャンバ２０４内の浸透物溶液に浸漬した。周波数または電力に関わらず、治療の持続時間は、５０％のデューティサイクル（
５ｓ  ｏｎ、５ｓ  ｏｆｆ）を利用して２分間であり、１分間の超音波照射となった。
【００３２】
超音波治療の直後に供与溶液が排出され、組織２０６内に送達されなかったあらゆる残留放射性標識材料を除去するために、各供与チャンバ２０４はＰＢＳによって洗浄された。受取溶液は、１５ｍＬの全量ピペット（例えば、ペンシルベニア州、ラドナー、ＶＷＲより入手可能）を利用して、拡散セルの採取口２１０を通じて各受取チャンバ２０８から収集され、別個のシンチレーションバイアルに移送された。対象化合物に曝露された各組織の部分は切除され、また、別個のシンチレーションバイアルに配置され、あらゆる残りの組織が排出されていた。全ての治療条件について、反復の数は３から１０の範囲に及んだ。一般的に、未治療組織にはより多くの反復（ｎ＝６）が必要となった。食道にはまた、組織の肉眼的不均一性のため、より多くの反復が必要になった。
【００３３】
Ｂ．送達増強の定量化
組織型に応じて、組織を可溶化するために、組織可溶化材Ｓｏｌｕｅｎｅ（登録商標）−３５０（マサチューセッツ州、ウォルサム、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒより入手可能）の５ｍＬ（舌及び腸）または１０ｍＬ（全ての他の組織型）のいずれかが曝露された組織と共にシンチレーションバイアルに添加された。各組織混合物は加熱され、組織が完全に溶解するまで静置することが可能であった。組織に関わらず、５ｍＬの各組織混合物は、放射分析のために、シンチレーションバイアルの第２の群に分取された。
【００３４】
収集された受取溶液のそれぞれは完全に混合され、その後、０．５ｍＬ試料がシンチレーションバイアル第２の群に分取された。
【００３５】
約１５ｍＬのＨｉｏｎｉｃ−Ｆｌｕｏｒ（商標）シンチレーション溶液（マサチューセッツ州、ウォルサム、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒより入手可能）はその後、受取溶液一定量試料及び組織一定量試料のそれぞれに添加され、信号が平衡化するために約１時間静置することが可能であった。試料は、Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ（登録商標）Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（マサチューセッツ州、ウォルサム、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒより入手可能）上で評価された。
【００３６】
まず、トリチウム化グルコースの輸送は、ＧＩ管の全ての主要セグメントへのその送達と比較して、モデル浸透物として評価された。２０ｋＨｚの超音波が利用され、７．５Ｗ／ｃｍ２の強度に校正された。この強度は熱量測定法に基づいて選択され、無視してもよい程度の結合溶液の温度上昇を示し、それにより熱影響を最小限に留める。図２Ｂは、いくつかの実施形態による、超音波（２０ｋＨｚ）を用いた、または超音波を用いない（対照）放射性標識グルコースの皮膚、腸、及び大腸組織内での送達と比較して、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）調査を示すグラフである。送達が１分間の超音波治療（両側のスチューデントのｔ検定、Ｐ＜０．０３）と組み合わせられた際に、ＧＩ組織に送達されたグルコースの質量は、桁違いに増大した。
【００３７】
さらに周波数及び強度依存性を理解し、ＵＭＧＩＤの最適なパラメータを特定するために、ＧＩ管の全ての組織型において各周波数のための３つの別個の強度における３つの別の周波数、２０、４０、及び６０ｋＨｚを利用して、グルコース送達が試験された。過渡的なキャビテーションは主要機構であると仮定されたため、キャビテーション閾値を超え得るようにこれらの周波が選択された。
【００３８】
図３Ａ〜３Ｅは、いくつかの実施形態による、治療を行った、または治療を行っていない（対照）、異なる組織型の供与チャンバにおける１ｍｇ／ｍＬの濃度での放射性標識浸透物の送達のｉｎ  ｖｉｔｒｏ調査を示すグラフである。図３Ａにおいて、超音波（２０ｋＨｚ）を用いた、また、超音波を用いない（対照）ＧＩ管の様々な組織に送達されたグ
ルコースの量が比較された。治療には、７．５Ｗ／ｃｍ２に熱量的に校正された２０ｋＨｚの超音波ホーンが利用された。図３Ｂにおいて、腸及び大腸組織に送達されたグルコースの量が、各周波数にとって考えられる最低強度での２０ｋＨｚ及び４０ｋＨｚの超音波を利用した対照によって比較される。
【００３９】
分析物の分子量の影響を評価するために、また、グルコースがグルコース輸送体によりＧＩ管に渡って積極的に吸収されるため、この同じ調査はイヌリン（５，０００Ｄａ）を利用して実施された。イヌリンは、ＧＩ上皮を介した活性吸収が認識されないために選択された。この試験の結果として、送達は、６０ｋＨｚと比較して２０及び４０ｋＨｚの周波数により大幅に増強することが発見された。送達は比較的、全ての周波数における強度に非感受性であった。図３Ｃにおいて、腸及び大腸組織に送達された５，０００Ｄａイヌリン量は、各周波数にとって考えられる最低強度における２０ｋＨｚ及び４０ｋＨｚの超音波を利用した対照によって比較される。
【００４０】
超音波がｅｘ  ｖｉｖｏでＧＩ管内にて遭遇する全ての組織型及び、特定されたこの送達モダリティの最適な治療条件について送達を増大し得ることが証明され、２０及び４０ｋＨｚの軸方向の射出を利用した、炎症性腸疾患の管理のために現在利用されている局所的治療薬の送達が研究された。これらの薬剤の粘膜濃度が高くなると、疾患活動性の低下と相関していることが以前は示されていた。いずれも炎症性腸疾患の局所的治療として認識された放射性標識メサラミン（５−アミノサリチル酸）及びハイドロコルチゾンがＵＭＧＩＤによって評価された。メサラミンは、臨床的に利用される小腸及び大腸において評価された。ハイドロコルチゾンは、その広範な臨床的応用を保ちながらＧＩ管全体を通して評価された。全ての治療時間は１分間の合計超音波照射を維持し、臨床的内視鏡及び患者により自己投与される注腸の高スループットの性質に対応する実用的な治療レジメンを確保した。メサラミンの腸への送達は、同様に２０及び４０ｋＨｚで、超音波なし（対照）では１４．９７±５．１０、４１．５２±４．４５、及び４４．４３±３．６７μgで
あった。大腸への送達は、それぞれ２０、及び４０ｋＨｚの対照に関して１８．４０±２．７３、７３．７０±８．３９、及び４７．３７±３．０５μgであった。ハイドロコル
チゾン送達は、同様に２０及び４０ｋＨｚの超音波を利用してＧＩ管全体を通して２〜５倍に増強された。
【００４１】
図３Ｄにおいて、腸及び大腸組織に送達された臨床的に関連する化合物ハイドロコルチゾンの量が、各周波数にとって考えられる最低強度における２０ｋＨｚ及び４０ｋＨｚの超音波を利用した対照によって比較される。図３Ｅにおいて、腸及び大腸組織に送達された臨床的に関連する化合物メサラミンの量が、各周波数にとって考えられる最低強度における２０ｋＨｚ及び４０ｋＨｚの超音波を利用した対照によって比較される。図４Ａ〜４Ｂにおけるグラフはまた、いくつかの実施形態による、超音波（２０ｋＨｚまたは４０ｋＨｚ）を用いた、または超音波を用いない（対照）、腸及び大腸組織における放射性標識ハイドロコルチゾン及びメサラミンの送達をそれぞれ比較した、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ調査を示す。これらのグラフが示すように、超音波は、ハイドロコルチゾン及びメサラミンの組織への送達を大幅に増強する。
【００４２】
図５Ａ〜５Ｂは、いくつかの実施形態による、治療を行った、または治療を行っていない（対照）、異なる組織型の放射性標識浸透物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ調査をさらに示すグラフである。図５Ａはグルコース送達（ｎ＝３〜７）を示し、図５Ｂはイヌリン送達（ｎ＝３〜９）を示し、図５Ｃはハイドロコルチゾン送達（ｎ＝６）を示す。治療は、それぞれ２．５Ｗ／ｃｍ２、７．３Ｗ／ｃｍ２、及び９．６Ｗ／ｃｍ２の強度での２０ｋＨｚ、４０ｋＨｚ、または６０ｋＨｚ（グルコース及びイヌリンのみ）の１分間の超音波の照射であった。エラーバーは、１標準偏差を表す。
【００４３】
実施例２：送達増強の基礎となる機構の特徴
液体を通じた超音波透過に関連する現象を評価する以前の研究に基づき、１つ以上の機構は、（１）音響流動、（２）熱影響、及び（３）過渡的なキャビテーションを含むが、それに限定されない観察される増強に寄与し得る。どの機構が主要であるのかを明瞭にするために、（拡散境界層を低減する一般的な攪拌を模倣するための）供与チャンバの攪拌及び、過渡的なキャビテーションが音響流動の影響を隔離し、組織を加熱するための閾値未満の強度の１ＭＨｚの超音波を用いた超音波処理の隔離影響のもと、トリチウム化グルコースの小腸への送達が評価された。これらのレジメンは、２０及び４０ｋＨｚの超音波を利用した送達と比較された。
【００４４】
Ａ．音響流動
音響流動及び攪拌の影響を調査するために、上記の通り組織試料がフランツ拡散セル内に装着された。２μＣｉ／ｍＬトリチウム化グルコースを添加したグルコースの１ｍｇ／ｍＬ溶液が、モデル浸透物として利用された。治療直前に、供与チャンバは１．５ｍＬのグルコース溶液で満たされ、５ｍｍ磁気攪拌棒が追加された。供与チャンバはその後キャッピングされ、逆攪拌プレートがセルの上面に配置され、攪拌棒が組織を直接攪拌することなく供与溶液を確実に攪拌した。Ｂｅｌｌ−ｅｎｎｉｕｍ（商標）９−ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｔｉｒｒｅｒ（ニュージャージー州、バインランド、Ｂｅｌｌｃｏ  Ｇｌａｓｓ，Ｉｎｃ．より入手可能）が、受取チャンバを５００ＲＰＭで攪拌するために利用された。供与チャンバは合計で２分間攪拌され、その後直ちに除去された。拡散セルはその後分解され、上述の手順に従って、受取溶液及び組織が放射分析のために採取された。
【００４５】
攪拌された試料は、上述の同じ治療条件に従って、同じグルコース溶液ならびに、２．５Ｗ／ｃｍ２の２０ｋＨｚの超音波及び７．３Ｗ／ｃｍ２の４０ｋＨｚの超音波の１つを用いて治療された試料と比較された。各研究群は６反復を利用した。攪拌は送達を対照と比較して２．１０倍に増強した。しかし、その増強及びグルコースの絶対量は４０ｋＨｚの超音波で実現された量を大幅に下回った。
【００４６】
過渡的なキャビテーション及び音響流動の増強の機構への寄与率を調査するために、組織が１ＭＨｚの超音波によって超音波処理され、本研究において考えられる最高強度（１３．４Ｗ／ｃｍ２の強度で４０ｋＨｚ）を利用して送達された際に組織に送達された同じエネルギーを実現した。特に、過渡的なキャビテーションの閾値が臨床的に実現可能な強度を十分に上回ると認識される際に、過渡的なキャビテーションなしに安定したキャビテーション及び音響流動を誘発するため、１ＭＨｚが選択された。したがって、送達の任意の増強は、音響流動または安定したキャビテーションの結果となる。
【００４７】
市販の高周波超音波プローブの直径が大きくなると、より大きな拡散セルの利用が必要となった。具体的には、２９ｍＬの受取チャンバ容量を有する直径２９ｍｍの拡散セルが利用された。これらの拡散セルは、組織の曝露面が６．６ｃｍ２となる。組織は上述のように装着された。供与チャンバは、トリチウム化グルコースを含む１ｍｇ／ｍＬ溶液で満たされた。１ＭＨｚの超音波が、２Ｗ／ｃｍ２の強度（熱量測定法を介して５．２２Ｗであると判断される）にデジタル的にプログラムされたＤｙｎａｔｒｏｎ  Ｄ１２５の超音波プローブ及び連続運転を利用して生成された（ユタ州、ソルトレイクシティ、Ｄｙｎａｔｒｏｎｉｃｓより入手可能）。電力が低減されたことにより、治療が２分間以上実施された。具体的には、組織に送達された合計超音波出力を試験された最高強度（１３．４Ｗ／ｃｍ２において４０ｋＨｚ）において一定に保つように、組織が曝露された。結果としての治療時間は、したがって３．４分間であった。治療後、供与溶液は排出され、上述の通り組織は洗浄されて破断された。各治療条件（１ＭＨｚの超音波または超音波なし）が３回反復された。グルコース曝露時間及び曝露された組織領域の差異の結果として、治療
済み及び未治療組織に送達されたグルコース比として結果が提示された。
【００４８】
図６はいくつかの実施形態による、３．４分間の（ｎ＝３）、２Ｗ／ｃｍ２（実際は５．２２Ｗ）に設定された１ＭＨｚの超音波、供与チャンバ（対照ｎ＝５、攪拌ｎ＝６）の攪拌、及び、１３．４Ｗ／ｃｍ２（対照ｎ＝５、超音波ｎ＝３）の強度に設定された４０ｋＨｚの超音波を用いた治療の結果としての小腸におけるグルコースへの送達の相対的な増強、供与チャンバ攪拌または１ＭＨｚにおける超音波に対して２０ｋＨｚまたは４０ｋＨｚにおける超音波から定量化された送達の増強を示すグラフである。この治療は、グルコース送達の増強につながらなかった。図７に示すように、２０ｋＨｚまたは４０ｋＨｚでの超音波を利用した送達増強は、１ＭＨｚの超音波の攪拌または利用を上回る。アスタリスク（＊＊）は、治療と両側のスチューデントのｔ検定によって判定されたそのそれぞれの対照との間の統計的差を示す。
【００４９】
Ｂ．熱影響
送達増強への熱影響の役割をいっそう理解するために、腸組織がｅｘ  ｖｉｖｏで治療され、治療の間組織の温度が遠隔監視された。具体的には、上述の通り組織が直径１５ｍｍのフランツ拡散セル内で装着された。組織はその後、５０％のデューティサイクル（１分間の超音波）において７．５Ｗ／ｃｍ２の強度に設定された２０ｋＨｚの超音波を用いて２分間治療された。治療の間、熱画像カメラ（例えば、ＦＬＩＲ（登録商標）Ｅ５０、オレゴン州、ウィルソンヴィル、ＦＬＩＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓより入手可能）を利用して供与チャンバの温度が遠隔監視された。治療の直後に、結合溶液が排出され、組織温度を定量化するために組織表面が熱カメラで撮像された。３度の生物学的反復が実行された。測定温度が４０℃を下回ることが注目された。
【００５０】
図７Ａ〜７Ｃは、いくつかの実施形態による、熱画像カメラを利用して撮像された典型的な赤外線ヒートマップである。図７Ａは、治療前に（t＝０）撮像された、供与チャン
バの熱画像である。治療は、合計２分間の５０％のデューティサイクルでの７．５Ｗ／ｃｍ２の強度に設定された２０ｋＨｚの超音波からなる。図７Ｂは、治療の２分後に（t＝
２分）撮像された供与チャンバの熱画像である。図７Ｃは、治療後に結合溶液を排出した直後に撮像された腸組織の熱画像である。視野内の温度の上限及び下限が各画像の右側に示される。各画像の左上に表示された温度は、十字線の温度である。
【００５１】
超音波治療の間の上述の温度はその後、組織の加熱が送達を増強し得るか否かを試験するために利用された。具体的には、別個の組織試料が直径１５ｍｍのフランツ拡散セル内に装着された。循環恒温水槽（例えば、ペンシルベニア州、ラドナー、ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより入手可能）を利用して熱処理が加えられた。具体的には、７ｍｍの外径を有する管が水槽の出入口に嵌合され、絶縁された。この管はその後拡散セルの供与チャンバ内に、供与チャンバが一定のレベルの流体を確実に満たし、維持する向きに配置された。水槽は脱イオン水で満たされ、デジタル温度制御装置を利用して、４０℃の温度に設定され、温度計によって確認された。治療は、２または５分間のいずれかの組織に渡る温水の連続的な流れからなった。流水の結果としての任意の組織破壊を制御するために、別個の拡散セルがまた、常温水を用いるのと同様に処理された。治療直後に、供与チャンバは、トリチウム化グルコースを含む１ｍｇ／ｍＬ溶液で満たされた。この溶液は、実験の間浸透物接触時間を一定に維持しながら２分間拡散することが可能であった。曝露後、上述の通り組織及び受取チャンバが放射内容物のために収集され、採取された。水槽治療ごとに３回の生物学的反復が実行された。
【００５２】
７．５Ｗ／ｃｍ２で２０ｋＨｚの超音波を利用してフランツ拡散セル内に装着されたｅｘ  ｖｉｖｏの組織の治療は、治療終了時に供与チャンバ温度を４０℃に上昇させることが発見された。治療終了時の供与チャンバ温度とプローブ温度との間に差異はなかった。
したがって、組織の４０℃への加熱の結果としての送達の増強が試験された。図８は、いくつかの実施形態による、２または５分間（治療ごとにｎ＝３）循環恒温水槽を利用した、４０℃に維持された水への組織の曝露の結果としてのグルコースの小腸への送達の相対的な増強を示すグラフである。対照は、２または５分間の、常温水の再循環からなった。これは、合計２分間（対照ｎ＝５、超音波ｎ＝３）の５０％のデューティサイクルにおける７．５Ｗ／ｃｍ２の強度に設定された２０ｋＨｚの超音波を利用して送達の増強と比較された。アスタリスク（＊＊）は、治療と、両側のスチューデントのｔ検定によって判定されたそのそれぞれの対照との間の統計的差を示す。２または５分間の、ｅｘ  ｖｉｖｏの小腸組織の４０℃への加熱は、対照と比較した送達の増強をもたらさなかった。
【００５３】
Ｃ．過渡的なキャビテーション
組織の加熱が送達の増強をもたらさない事実は、熱影響が、記載された時間間隔の間低周波超音波を利用して観察された送達に大幅に寄与することを示唆する。同様に音響流動も、いかなる送達の増強をも可能にすることのない１ＭＨｚの超音波の利用に基づくと、増強のメカニズムに重大な寄与をもたらさないと思われる。総合的に考えると、これらの結果は、観察される薬物送達の増大の原因となる音響流動または熱的影響の可能性をなくし、ＵＭＧＩＤが過渡的なキャビテーションの結果であることを示唆する。
【００５４】
ｅｘ  ｖｉｖｏ実験準備において、本研究で試験された様々な低周波超音波プローブの応用による過渡的なキャビテーションの発生を確認するために、アルミニウム箔孔食実験が実施された。アルミニウム箔の孔食は以前、過渡的なキャビテーションのアッセイとして有効であった。
【００５５】
ｅｘ  ｖｉｖｏの本研究に利用された強度における２０ｋＨｚ、４０ｋＨｚ、または６０ｋＨｚを利用して過渡的なキャビテーションが発生するか否かを評価するために、文献（１７、１８）にて行われたように、超音波治療の結果としてのピットがアルミニウム箔において定量化された。アルミニウム箔のシートは、しわが寄らないように平方インチ片に切断された。真空用グリースを利用して、正方形のアルミニウム箔が直径１５ｍｍのフランツ拡散セルの受取チャンバ上に装着された。真空用グリースにより、アルミニウム箔が拡散セルの受取チャンバに付着することが可能になった。受取チャンバはその後ＰＢＳで満たされ、セルはＰＢＳに浸漬した。試料は２０ｋＨｚ、４０ｋＨｚ、または６０ｋＨｚの超音波の１つで、各周波数にとって考えられる最高強度にて２秒間治療された。ホーンの先端は、アルミニウム箔の表面の１ｃｍ上に位置した。これにより、個別のピット数が定量化するには多すぎることが確実になった。治療後、試料は静かに受取チャンバから剥離され、重いカード原紙に装着された。これらはその後、ＣａｎｏＳｃａｎ８８００Ｆ
ｆｌａｔｂｅｄ  Ｓｃａｎｎｅｒ（日本、東京、Ｃａｎｏｎより入手可能）を利用して、グレースケールモードにて１２００ｄｐｉでスキャンされ、ＢＭＰファイル形式で保存された。ピットはその後、これらの画像から手動で計数された。
【００５６】
図９Ａはいくつかの実施形態による、２０ｋＨｚ、４０ｋＨｚ、または６０ｋＨｚの超音波を２秒間、各周波数にとって考えられる最高強度（周波数ごとにｎ＝５）で利用した治療時に上述のアルミニウム箔孔食実験において観察されたピット数を示すグラフである。図９Ｂ、９Ｃ、及び９Ｄは、２０ｋＨｚ、４０ｋＨｚ，または６０ｋＨｚの超音波でそれぞれ治療された、孔食のあるアルミニウム箔試料の典型的な画像である。これらの画像におけるスケールバーは、３ｍｍを表す。２０及び４０ｋＨｚによって生成されたピット数が６０ｋＨｚの超音波（複数の比較による一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）、Ｐ＜０．０２３）によって生成されたピット数を統計的に上回ることが発見された。一方、１ＭＨｚの超音波が加えられた際には、孔食はまったく視認できなかった。
【００５７】
これらの結果は過渡的なキャビテーションが発生していることを示唆するため、２０ｋ
Ｈｚの超音波での治療の結果としての小腸内で生成される理論上の孔径が、モデル浸透物として放射性標識グルコース及びイヌリンを用いた阻害移送理論（ｈｉｎｄｅｒｅｄ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｔｈｅｏｒｙ）を利用して算出された。
【００５８】
内径９ｍｍのＳｉｄｅ−Ｂｉ−Ｓｉｄｅ（商標）拡散セル（ペンシルベニア州、ヘラータウン、ＰｅｒｍｅＧｅａｒより入手可能）が、透過性を判定するために利用された。組織が２つのチャンバ間に配置され、腔側と共に供与チャンバに面して締め付けられた。攪拌棒は供与及び受取チャンバの両方に添えられ、Ｂｅｌｌ−ｅｎｎｉｕｍ（商標）９−ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｔｉｒｒｅｒを利用して攪拌された。
【００５９】
供与溶液は、２μＣｉ／ｍＬ３Ｈ−グルコース及び２μＣｉ／ｍＬ１４Ｃ標識イヌリンからなった。各供与チャンバは３ｍＬのこの溶液で満たされ、受取溶液は３ｍＬの新鮮なＰＢＳで満たされた。１時間の間に１０分間の間隔で、１００μＬの試料は受取チャンバから採取され、新鮮なＰＢＳと等しい容量で再配置された。その後、１５ｍＬのＨｉｏｎｉｃ  Ｆｌｕｏｒがこれらの試料に添加され、トリチウム分解及び１４Ｃ分解のために分析された。７反復が対照試料のために実行され、１７反復が治療済み試料のために実行された。透過処理の異成分からなる性質の結果として、超音波治療群のためのより多くの反復が必要とされた。
【００６０】
図１０Ａ〜１０Ｃは、１つの仮定された超音波増強ＧＩ送達機構を示す図である。図１０Ａに示すように、プローブまたはホーン先端１０００からの超音波射出は、組織１００４上の結合流体１００２内でのキャビテーション気泡の発生につながる。治療が続く限り、核気泡数は増加し、気泡は混沌と動き回り、図１０Ｂに示す整流拡散として知られるプロセスを通じて大型化する。最終的に、気泡の一部は、安定しないサイズ以上の閾値サイズに到達する。これらの気泡は内破し、図１０Ｃに示すように組織に衝突し、薬物を組織内に運搬する、マイクロジェットと称される流体の噴射を発生させる。
【００６１】
ＵＭＧＩＤの増強機構をさらに明瞭にするために、膜に渡る拡散をモデルするために以前は利用されていた阻害移送理論を利用して理論上の孔径予測が行われた。孔膜を横切る分子の透過性Ｐは、以下の式１に通り表すことができる。
【００６２】
【数１】
2020168421.tif 000003
ここで、Ｃは膜の特性のみに依拠して一定であり、Ｄは溶液内の分子の自由拡散係数である。Ｆ（λ）は障害因子として知られ、分子の流体力学的半径及び膜孔径の比λに依拠する。Ｆ（λ）の最も高度な表現は、式２において以下の通りである。
【００６３】
【数２】
2020168421.tif 000004
【００６４】
式１のＣ及び膜孔径（λに埋め込まれる）の両方が未知であるため、式３において以下の通り２つの浸透物分子がＣを排除するために利用されてもよい。
【００６５】
【数３】
2020168421.tif 000005
【００６６】
式３において唯一未知であるのは、λの孔径である。したがって、Ｐは膜孔径を予測するために、各浸透物のために実験的に決定されてもよい。式４における以下の表現を利用して透過性を判明させることができる。
【００６７】
【数４】
2020168421.tif 000006
ここで、Ａは浸透物に曝露された膜の領域であり、Ｃｉは供与チャンバ内の浸透物の濃度である。ｄＱｉ／ｄｔは、受取チャンバにおける浸透物量のプロットのスロープ対誘導期後の時間である。
【００６８】
超音波未治療の組織内の各分子の透過性はそれぞれ、１．２８ｘ１０−４±５．０５ｘ１０−５及び１．３６ｘ１０−５±６．７７ｘ１０−６ｃｍ／分であることが発見された。超音波治療済み試料において、グルコース及びイヌリンの平均透過性はそれぞれ、１．９５ｘ１０−４±４．８４ｘ１０−５及び２．９４ｘ１０−５±１．３６ｘ１０−５ｃｍ／分であった。超音波は、グルコース及びイヌリン（両側のスチューデントのｔ検定、Ｐ≦０．００８）に関して、統計的により高い透過性につながることが発見された。これらの値は拡散係数に連動し、ブタ小腸が２０ｋＨｚで２分間、５０％のデューティサイクルにおいて治療された際に、グルコース及びイヌリンの流体力学的半径が、生成された理論上の孔径を算出するために式１〜４において利用された。回帰スロープの９５％の信頼区間が、表１の試料サイズｎ及び膜径２乗ｒ２で提示される。
【００６９】
【表１】
2020168421.tif 000007
【００７０】
上記の式３から、ｌｏｇ（Ｐｙ）に対してｌｏｇ（Ｐｘ）のプロットが、１及びｌｏｇ（Ｋ）のＹ軸切片のスロープと共に線形曲線を生成するべきであることが分かる。したがって、線形回帰は、ｌｏｇ（Ｐｇｌｕｃｏｓｅ）対ｌｏｇ（Ｐｉｎｕｌｉｎ）の対照及び治療されたプロットの両方に当てはめられ、スロープの９５％の信頼区間が１の理論上の値を含むことが必要とされた。１の理論上のスロープが両方の実験群の９５％の信頼区間に含まれるという事実はこの分析の有効性を支持し、したがって、式２及び３を利用して孔径を推測することは合理的である。
【００７１】
図１１Ａ及び１１Ｂはいくつかの実施形態による、小腸に関する、ｌｏｇ（Ｐｉｎｕｌｉｎ）対ｌｏｇ（Ｐｇｌｕｃｏｓｅ）を示すプロットである。特に図１１Ａは未治療組織におけるこの関係を示し、一方図１１Ｂは５０％のデューティサイクルにおいて２０ｋＨｚの超音波で２分間（すなわち、合計１分間の超音波照射）治療された組織における関係を示す。
【００７２】
全ての試料に関してＫの値が上記の式３を利用して算出された。孔径の平均、ならびに下限及び上限予測値は、Ｋの平均値及びＫの９５％の信頼区間に基づく。
【００７３】
表２は、このモデルを利用して超音波照射の結果として小腸組織において生成された孔径の下限、平均、及び上限予測値を提示する。算出された未治療の腸の理論上の孔径の上限は、治療済み試料の９０Ａの上限と比較して５３Åとなることが発見された。
【００７４】
【表２】
2020168421.tif 000008
【００７５】
分子の透過を可視化し、超音波媒介分析物送達の組織分布を特徴づけるために、供与チャンバ内でＴｅｘａｓ  Ｒｅｄで標識されたデキストランによって大腸組織がｉｎ  ｖｉｔｒｏで治療された。具体的には、上述の通り直径１５ｍｍのフランツ拡散セル内でブタ組織が装着された。上述の通り考えられる最高電力における２０ｋＨｚの超音波で皮膚が治療された。結合溶液は、１ｍｇ／ｍＬの濃度における３ｋＤａデキストランまたは７０ｋＤａデキストランのいずれかを含んだ。治療直後に、結合溶液は排出され、組織はＰＢＳで完全に洗浄されて、あらゆる残留デキストランを除去した。拡散セルはその後分解され、組織はデキストランに伸長に曝露され、切開され、１０％ホルマリン内に固定された。組織断片はその後、パラフィンブロック内に装着された。２００μｍのステップによって分離された２つの８μｍの厚さの断片がその後、続く組織の撮像のためにガラスの顕微鏡スライドに装着された。超音波未治療の組織試料はまた、浸透物接触時間を一定（２分間）に保ちながらデキストランに曝露された。これらの試料はその後、同様に処理された。
【００７６】
結果としての組織スライドは、２５ｘ、１．０５Ｎ．Ａ．対物レンズのＦｌｕｏＶｉｅｗ（商標）ＦＶ１０００ＭＰ多光子顕微鏡（日本、東京、オリンパスより入手可能）によって撮像された。Ｔｉ−Ｓａｐｐｈｉｒｅパルスレーザ（カリフォルニア州、サンタクララ、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ、より入手可能）を利用して、８６０ｎｍにて試料が励起された。射出が６０７／７０ｎｍのバンドパスフィルタ及びコラーゲンと共に収集され、４３０ｎｍにおいて第２の調波発生によって撮像された。個別の画像チャネルはＩｍａｇｅＪにおいて組み合わせられた。
【００７７】
図１２Ａ〜１２Ｄは、いくつかの実施形態による、２０ｋＨｚの超音波での治療の有無を問わない、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄで標識された３ｋＤａデキストランまたは７０ｋＤａデキストランに曝露された大腸組織の断面の多光子顕微鏡画像である。赤色チャネル及び第２の調波が示されている。スケールバーは、５００μｍを表す。
【００７８】
超音波なしでは、３または７０ｋＤａデキストランの大腸組織への透過はまったく視認できなかった。これは、３及び７０ｋＤａデキストランの両方の組織への大幅な浸透を可能にする、２０ｋＨｚの超音波の利用と対照的である。デキストランは、超音波が利用された際に、大腸組織の全厚全体を通して観察された。これは、超音波が、薬物が組織に迅速に浸透することを可能にすることを示唆する。これはさらに、組織と受取チャンバとの間の放射性標識化合物の分布の分析によって確認された。組織内の浸透性内容物は、超音波治療の結果として受取チャンバ内で提示されるそれを大幅に上回った。イヌリンの大腸組織への送達組織は例えば、受取チャンバ内の平均と比較して、組織内に９０倍を上回るイヌリンをもたらした。
【００７９】
実施例３：治療用化合物構造及び機能への超音波処理の影響
メサラミン及びハイドロコルチゾンの分子構造への超音波処理の影響が、核磁気共鳴（ＮＭＲ）を利用して、超音波処理後に分子を分析することによって調査された。メサラミン及びハイドロコルチゾン試料が重ＤＭＳＯにおいて４ｍｇ／ｍＬの濃度で調製された。１．５ｍＬの試料が、上述の通り考えられる最高強度における２０ｋＨｚの超音波で超音波処理された。３生物学的反復が実行された。超音波未処理の試料が、対照として利用された。Ｖａｒｉａｎ５００（１Ｈ、５００ＭＨｚ）分光器が、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを記録するために利用され、その後、Ｍｎｏｖａ  ＮＭＲソフトウェア（スペイン、ア・コルーニャ、Ｍｅｓｔｒａｌａｂ  Ｒｅｓｅａｒｃｈより入手可能）を利用して処理された。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、残留した重水素化されていない溶媒シフト（ＤＭＳＯ−ｄ５＝２．５ｐｐｍ）と関連付けられた。全てのシフトがｐｐｍで報告される。キャッピングされていないバイアルにおいて実施された超音波治療後の揮発性内部テトラメチルシラ
ン（ＴＭＳ）の消失の基準に留意されたい。
【００８０】
図１３Ａ〜１３Ｂはいくつかの実施形態による、超音波処理前後のメサラミン及びハイドロコルチゾンの典型的なＮＭＲスペクトルを示す。図１３Ａは、超音波処理１３００後の、また、超音波処理１３０２前の、メサラミンの典型的なＮＭＲスペクトルを示す。超音波処理１３００後：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ  Ｍａｊｏｒｉｔｙ：７．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ）；６．９０−６．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８、８．８Ｈｚ）；６．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）．Ｍｉｎｏｒｉｔｙ：７．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ）；６．９８−６．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．１、８．９Ｈｚ）；６．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ）。超音波処理１３０２前：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ７．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ）；６．８７−６．８４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８、８．８Ｈｚ）；６．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）。
【００８１】
図１３Ｂは、超音波処理１３０４後及び超音波処理１３０６前のハイドロコルチゾンの典型的なＮＭＲスペクトルを示す。超音波処理１３０４後：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ５．５６（１Ｈ，s）；５．１９（１Ｈ，s）；４．５２−４．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．１Ｈｚ）；４．３０（１Ｈ，ｂｍ）；４．２５（１Ｈ，ｂｍ）；４．０９−４．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１９．１Ｈｚ）；２．５６（１Ｈ，ｍ）；２．４０（２Ｈ，ｍ）；２．２０（２Ｈ，ｍ）；２．０７（１Ｈ，ｍ）；１．９０（３Ｈ，ｍ）；１．７８（１Ｈ，ｍ）；１．６５（２Ｈ，ｍ）；１．５４（１Ｈ，ｍ）；１．４０（１Ｈ，ｍ）；１．３６（３Ｈ，s）；１．２６（１Ｈ，ｍ）；０．９９（１Ｈ，ｍ）；０．８５（１
Ｈ，ｍ）；０．７４（３Ｈ，s）。超音波処理１３０６前：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ
、ＤＭＳＯ）δ５．５６（１Ｈ，s）；５．１９（１Ｈ，s）；４．６７（１Ｈ，ｍ）；４．５２−４．４７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．９、１９．１Ｈｚ）；４．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．３２）；４．２５（１Ｈ、p、Ｊ＝３．３２）；４．１０−４．０５（１Ｈ，ｄｄ
，Ｊ＝５．９、１９．１Ｈｚ）；２．５６（１Ｈ，ｍ）；２．４０（２Ｈ，ｍ）；２．２０（２Ｈ，ｍ）；２．０７（１Ｈ，ｍ）；１．９２（３Ｈ，ｍ）；１．７８（１Ｈ，ｍ）；１．６５（２Ｈ，ｍ）；１．５４（１Ｈ，ｍ）；１．４０（１Ｈ，ｍ）；１．３６（３Ｈ，s）；１．２６（１Ｈ，ｍ）；０．９９（１Ｈ，ｍ）；０．８５（１Ｈ，ｍ）；０．
７４（３Ｈ，s）。３生物学的反復が超音波処理済み及び超音波未処理の試料の両方のた
めに実行された。
【００８２】
溶解する重溶媒との分析物の交換に際して、重水素交換が不安定プロトンとして発生する。この交換は図１３Ａ〜１３Ｂに示すように、超音波反応の間触媒され、超音波試料後に明らかである。プロトンの重水素による代替は、積分比の減少またはピークの完全な消失のいずれかとして示される信号の損失につながる。重水素交換の他の徴候には、ピーク形状の微小な拡大、ピーク位置のシフト、及びＪ結合値の微小な変化が含まれる。これらの変化は、溶液における不安定プロトンの自然平衡を反映し、全ての分子構造に渡る変化を反映しない。
【００８３】
最終的に、超音波処理のインスリン構造への影響も評価された。２００ユニットの即効型インスリンが、１０ｍＬのＰＢＳにおいて調剤された。この試料はその後、上述の通り考えられる最高強度において２０ｋＨｚの超音波で超音波処理された。３生物学的反復が、超音波処理済み及び超音波未処理の群の両方のために実行された。インスリン構造は、ＺＯＲＢＡＸ  ＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓ  Ｃ１８カラム（４．６ｘ１００ｍｍ、３．５μｍ）（マサチューセッツ州、レキシントン、Ａｇｉｌｅｎｔより入手可能）を利用して、１５分間、アセトニトリルにおいて水中の９５％から５％の酢酸（１．５％）の移動相グラジエントで、逆相分析ＨＰＬＣによって分析された。図１３Ｄはいくつかの実施形態による、超音波処理のインスリン機能への影響を示すグラフである。平均及び標準偏差が示
される。７．５Ｗ／ｃｍ２（両側のスチューデントのｔ検定、Ｐ＝０．４８）の強度に設定された２０ｋＨｚでの超音波処理の結果としての活性インスリンの濃度に統計的差は発見されなかった。
【００８４】
実施例４：Ｉｎ  ｖｉｖｏ送達研究
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＵＭＧＩＤの効能及び、従来の方法による薬物送達が一般的にｉｎ  ｖｉｔｒｏよりもｉｎ  ｖｉｖｏの方が大きいという以前の観察を考慮すると、本技術は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのよりいっそうの薬物送達増強と解釈することができる。さらに、ＵＭＧＩＤの２つの異なる構成が送達効果のためにｉｎ  ｖｉｖｏで試験された。すなわち、ブタにおける軸方向の射出及びマウスにおける放射状の射出（以下に記載）である。
【００８５】
Ａ．ブタにおける軸方向のＵＭＧＩＤを利用したＩｎ  ｖｉｖｏ送達
図１４Ａはいくつかの実施形態による、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達の手順の概略を示す流れチャートである。ステップ１４００において、手順のために被験体が用意される。本研究にはブタモデルが、組織構造、サイズ、及び代謝を含むその解剖学的特徴とヒト被験体のそれとの間の類似性により、選択された。ある研究のために、ベンダーの性別の利用可能性に基づき、４５〜８０ｋｇの間の重量の雌及び雄の両方のヨークシャーピッグが利用された。Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅによって認可されたプロトコルにしたがって、全ての手順が実行された。全ての実験前に、動物は１晩餌を与えられていなかった。Ｔｅｌａｚｏｌ（登録商標）チレタミン、５ｍｇ／ｋｇ（ニュージャージー州、フローラム、Ｚｏｅｔｉｓ，Ｉｎｃ．より入手可能）、キシラジン２ｍｇ／ｋｇ、及びアトロピン０．０４ｍｇ／ｋｇの筋肉注射によって、鎮静が誘発された。動物はその後挿管され、イソフルラン（１〜３％吸入）によって鎮静が維持された。
【００８６】
ステップ１４０２において、被験体の直腸は、例えば水道水の注腸によって洗浄される。本研究において、治療前の大腸内視鏡検査により清潔な直腸が確認された。
【００８７】
ステップ１４０４において、注腸薬剤が注入される。本研究において、臨床的に利用されるものと同じ容量（６０ｍＬ）及び濃度（６６．６ｍｇ／ｍＬ）メサラミンのＰＢＳ溶液が調製され、注入された。
【００８８】
ステップ１４０６において、超音波が加えられる。本研究において、対照及び治療試験が別の日に実行された。治療試験に関して、７．５Ｗ／ｃｍ２の強度で、５０％デューティサイクルにおいて２分間２０ｋＨｚホーンを利用して超音波治療が応用された。対照試験に関して、超音波プローブが大腸に挿入されたが、電源を入れていない（ｎ＝１６）。
【００８９】
加えて、超音波治療の結果としての温度上昇もまた定量化された。このために、熱電対（例えば、デンマーク、ランゲスコフ、Ｋｒｕｕｓｅより入手可能）が治療中、直腸に直接配置された。２分間の治療全体を通して、温度測定値が継続的に記録された。温度に関して、この治療では、１．０４±０．６６℃（ｎ＝３）の温度の平均上昇につながることが発見された。短い治療時間及び注腸の容量（６０ｍＬ）を考慮すると、温度への最小限の影響が予想された。無視してもよい程度の温度上昇はさらに、熱影響が薬物送達の増大の原因とならないという仮説を支持する。
【００９０】
ステップ１４０８において、さらなる評価のために、組織には生検が行われた。薬物送達評価のための内視鏡の生検鉗子（例えば、オハイオ州、メンター、ＵＳ  Ｅｎｄｏｐｓｙより入手可能）及び組織学的分析（ｎ＝１３）を利用して、超音波で治療された大腸領域の生検が行われた。
【００９１】
図１４Ｂはいくつかの実施形態による、この実験準備を示す図である。注腸薬剤１４１２の送達のためのプロトタイプの手持ち式プローブ１４１０が、超音波射出体１４１４及び注腸投与装置１４１６を含むよう設計された。図１４Ｂにおいてプローブ１４１０は、注腸薬剤の送達及び２０ｋＨｚの超音波のために被験体の直腸内に挿入して示される。いくつかの実施形態において、手持ち式プローブ装置は、被験体の直腸への挿入に従う寸法で、軽量である。例えば、挿入されるプローブ先端のサイズは、標準的な大腸内視鏡のサイズと比較可能であってもよい。
【００９２】
動物の臨床モニタリングは、全ての初期の安全性を示した。治療部位及び隣接する大腸粘膜の未治療領域の生検が続く２０ｋＨｚのプローブの直腸への挿入を通じて安全性評価が実行された。組織学的検査は、臨床病理医によって決定されるように検査された＜５％の治療領域の軽微な上皮破壊のみを示した。具体的には、固定手順のためにアーチファクトであるよう決定された対照試料に軽微な細胞の混乱が存在した。超音波で治療された試料において、脂肪組織のむらのある鹸化処理が注目された。さらに、表面粘膜下層に位置する粘膜内の毛細血管の最小限の充血が注目された。上皮損傷は認められず、粘膜構造が維持された。図１５Ａ〜１５Ｂはそれぞれ、未治療及び治療済みの組織の肉眼図である。図１５Ｃ〜１５Ｄはそれぞれ、未治療及び治療済みの組織の組織学的画像である。外形を示された領域１５００は、検査された治療領域の＜５％の筋の軽微な局所的鹸化処理を示す。スケールバーは、１００μｍを表す。
【００９３】
メサラミン送達の効能はその後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において利用された同じ１分間の治療レジメンによって評価された。臨床的に利用される濃度及び容量でのメサラミン注腸（６０ｍＬの懸濁液内の、Ｒｏｗａｓａ（登録商標）メサラミン、４ｇ（ニュージャージー州、サマセット、ＭｅｄａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓより入手可能）がブタ直腸に注入され、直後にＵＭＧＩＤが続いた。ガスクロマトグラフィー／質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）に基づく、ＵＭＧＩＤの直後に採取された組織生検におけるメサラミンの定量化は、超音波を利用した送達において、超音波未治療の大腸組織と比較して２２．４倍の上昇を示した（Ｐ＝４．０６ｘ１０−４）。図１６はいくつかの実施形態による、２０ｋＨｚの超音波なし（対照）、及び２０ｋＨｚの超音波を伴う（治療）、大腸内のメサラミン注腸の配置の結果としての組織生検の質量による、組織生検正規化におけるメサラミン薬物含有量を示すグラフである。各点は、１生体学的反復（制御についてはｎ＝１６、治療についてはｎ＝１３）を表す。Ｐ値は、両側のスチューデントのｔ検定を表す。未治療試料の２分の１は、検出限界（５０ｎｇ／ｇ組織）を下回る薬物含有量を有することが発見されたことにさらに留意されたい。超音波を用いた治療後のメサラミンの化学的安定性を確認するために１Ｈ  ＮＭＲの分光分析が利用された（上述の例３を参照）。
【００９４】
メサラミンの送達に加えて、ＵＭＧＩＤの、より大きな、生物学的活性分子を送達する可能性を判定するために、モデル生物製剤であるインスリンが評価された。インスリン注腸による同じ１分間の超音波治療は、強い低血糖反応をもたらした。図１７Ａ〜１７Ｂはいくつかの実施形態による、それぞれ同時の２０ｋＨｚの超音波治療を伴う、または伴わない、１００Ｕインスリンを含む注腸の配置の結果としてのその開始値への血糖値の平常化を示すグラフである。図１７Ａ〜１７Ｂにおける各個別の曲線は、生物学的反復である。図１７Ｃは、モニタリングの４０分後の平均及び標準偏差を表すバーグラフである。Ｐ値は、両側のスチューデントのｔ検定を表す。インスリンの超音波処理は同様に、その活性タンパク質構造に影響しないことが発見された（上述の例３を参照）。分子量が桁で変化する薬物送達の成功は、ＵＭＧＩＤの広範な応用可能性を支持する。
【００９５】
Ｂ．マウスにおける、放射状のＵＭＧＩＤを利用したＩｎ  ｖｉｖｏ送達
メサラミン送達の増強の臨床的関連性が、デキストラン硝酸ナトリウム（ＤＳＳ）によ
って誘発される急性大腸炎のマウスモデルにおいて分析された。局所的メサラミン投与の利益を得ないと認識されているため、このマウスモデルが選択された。したがって、超音波治療の結果としてのこのモデルにおける疾病指標の改善は、ＵＭＧＩＤの影響を強調する。大腸の生体構造及び大腸炎の関与が円周方向であることが多い性質を考慮すると、炎症組織の最大領域に渡って治療を導くために放射状のＵＭＧＩＤが最も有益となり得ることが仮定された。
【００９６】
いくつかの実施形態による、マウス大腸への直接の挿入に従う寸法（プローブ直径≦３ｍｍ）を有する特注設計のミニチュア超音波プローブを利用して、放射状の射出が実現された。図１８Ａは、２ｍｍの軸径を有する超音波プローブ先端の画像である。示される２つの隆起は３ｍｍの直径を有し、放射状の超音波射出を増強する。この装置には、短い治療時間の結果としての測定可能な温度上昇をもたらさないことが発見され、ピットの発生がアルミニウム箔試料で確認された。
【００９７】
この装置の耐容性が大腸炎を患っていない健康な動物でまず試験された。具体的には、毎日のプローブ挿入及び超音波処理が続くプローブ挿入の影響が、続く疾病群との比較のために１４日間試験された。図１８Ｂはいくつかの実施形態による、メサラミンのｉｎ  ｖｉｖｏでの放射状のための、ＵＭＧＩＤの大腸炎誘発及び治療スケジュールを示す図である。反復されたプローブ挿入の結果及び超音波処理が続くプローブ挿入が、操作を受けなかった対照群と比較された。毎日の（ＱＤ）レジメンが続く治療が図１８Ｂに提示された。治療は良好な耐容性を示すことが発見され、全ての動物は１４日間、苦痛の臨床兆候を示さなかった。
【００９８】
健康な動物大腸で直接誘発された局所的外傷可能性に関して、超音波を用いた、また、用いない、プローブ挿入前後のマウスが、直腸出血または炎症をもたらす局所的外傷につながる治療を判定するために評価された。肉眼的検査において、内臓には特筆すべき斑状出血もなく内臓は正常に思われた。
【００９９】
図１９Ａは、いくつかの実施形態による、直腸超音波の血液マーカへの影響を示すバーグラフである。ヘマトクリット及びヘモグロビンレベルに関して、そこで示される一元配置分散分析は、任意の群の最終的に正常化されるヘマトクリットまたはヘモグロビンの間に統計的差がないことを示し、プローブ挿入及び超音波処理が重大な失血を誘発せず、良好な耐容性を示すことを示唆した。図１９Ａにおいて、健康な動物（対照）に関して、ヘマトクリット及びヘモグロビンは１日目までに正常化し、健康な動物は毎日のプローブ挿入（プローブ挿入）を受け、毎日の超音波処理（ＵＳ）を受けた。各群においては５体の動物が利用されたが、１日目及び１４日目からのいくつかの血液試料は凝固し、いくつかの群に関して５つ未満の値となった。
【０１００】
反復した薬物投与の影響を評価し、臨床的に利用される１４日間の治療を受ける誘発された疾病を患った動物からの結果との比較を可能にするために、１４日目における組織学的検査が選択された。組織学スコアはまた、疾病が誘発された任意の他の群よりもプローブ挿入及びＵＳ群の両方が、統計的により良好な組織学スコアを有することを示した（複数の比較を行う一元配置分散分析試験、Ｐ＜０．０１５）。図１９Ｂはいくつかの実施形態による、１４日目における組織断片の組織学スコアへの経直腸超音波の影響を示すグラフである。中央値、２５、及び７５パーセンタイル値が示され、ウィスカは最も極端なデータ点を示す。
【０１０１】
治療を受ける健康な動物の合計糞便スコアもまた、正常であった。具体的には、プローブ挿入と超音波群との間の対になった、両側ｔ検定では、いずれの日においてもそれらのスコア間に重大な差異が示されなかった。１４日間の試験に渡る、対照のための合計糞便
スコアにおいて観察される最大の標準偏差、プローブ挿入、及びＵＳ群はそれぞれ、０．５４、２．６８、及び３．２８である。１４日間の試験に渡る群ごとの平均標準偏差はそれぞれ、０．１７、０．９９、及び１．５６である。図２０はいくつかの実施形態による、直腸超音波の糞便スコアへの影響を示すグラフである。
【０１０２】
治療の耐容性はさらに、大腸組織におけるサイトカインの定量化によって確認された。急性炎症の結果として増強されるとして知られるサイトカインレベルは、大腸組織からプロファイリングされた。ＵＭＧＩＤのみからの結果としての潜在的な毒性をさらに評価するために、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、及びＩＬ−１７を含むサイトカイン発現が、全ての３つの群からの大腸組織から実行された。図２１Ａ〜２１Ｄはいくつかの実施形態による、サイトカイン提示への経直腸超音波の影響を示すグラフ（全ての群に関して、ｎ＝４生物学的反復）である。特に図２１ＡはＴＮＦ−αのサイトカインレベルを示し、図２１ＢはＩＦＮ−γのサイトカインレベルを示し、図２１ＣはＩＬ−６のサイトカインレベルを示し、図２１ＤはＩＬ−１７のサイトカインレベルを示す。試料において提示されるｍＲＮＡの数を物理的にカウントし、内部能動スパイクイン対照を利用して試料に渡ってこれらのカウントを正常する、Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｐａｎｅｌ（ワシントン州、シアトル、ｎａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより入手可能）を利用して、カウントが評価された。全てのグラフは、平均及び標準偏差を表す。示された試料サイズは、生物学的反復である。治療群間の炎症誘発サイトカインＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、またはＩＬ−１７の発現量に統計的差は発見されなかった（複数の比較による一元配置分散分析試験）。貧血症がないこと、低糞便スコア、低組織学スコア、及び正常なサイトカインレベルを通じて評価される毒性は、ＧＩ管におけるこの薬物送達モダリティの可能性の高い安全性を支持する。
【０１０３】
体の他の部位でキャビテーションが発生する可能性を評価するために、プローブの挿入または、超音波処理が続くプローブの挿入を受ける健康な動物を肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、小腸、及び大腸で組織学的検査が行われた。臨床病理医による組織の盲検評価により、大腸を超える組織が、全ての群において細胞学的異常がなく、正常構造であることが判定される。プローブの挿入及び超音波処理を受ける群においてのみ、大腸のみに軽微な破壊があった。これらの動物の大腸組織の組織学スコアは統計的に、誘発された大腸炎が任意の群に観察されたスコアよりも良好であった。図２２Ａ〜２２Ｆはそれぞれ、治療のない（ｎ＝５）、電源を入れていないプローブ挿入（ｎ＝５）、またはプローブ挿入及び超音波処理（ｎ＝５）のいずれかの１４日間の治療レジメン後のマウスの肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、小腸、及び大腸の典型的な組織学的画像である。スケールバーは、２００μｍを表す。
【０１０４】
貧血症がないこと、低糞便スコア、低組織学スコア、及び正常なサイトカインレベルを通じて評価された最小限の毒性は、ＧＩ管のこの薬物送達モダリティの可能性の高い安全性を支持する。
【０１０５】
図１８Ｂに示すように、２日目に開始される併用治療投与を伴う７日間の自由摂取による３％ｗ／ｗＤＳＳによって大腸炎が誘発された。ＱＤ超音波治療と組み合わせたメサラミンの投与及び全ての他の日（ＱＯＤ）により、合計糞便スコアによって評価されるように、メサラミン注腸（現在の標準治療）のみの毎日の投与と比較してより大幅に迅速な大腸炎の症状からの回復が可能となった。具体的には、超音波治療を受けている群の両方が、１２日目からの疾病群及び注腸群と比較した際に合計糞便スコアの改善を示し（複数の比較による一元配置分散分析、Ｐ＜０．０４７）、１４日目に４未満の合計糞便スコアを示した。これは、治療を受けていない疾病群及び、１４日目に大幅に高い合計糞便スコアとしてなお示した、ＱＤのみのメサラミン注腸を受けている疾病群の両方と対照的である。
【０１０６】
図２３Ａ〜２３Ｂはいくつかの実施形態による、健康な動物（対照）及びＤＳＳ誘発性大腸炎を患う動物の合計糞便スコアを示すグラフである。動物は、治療を受けていない（疾病）、毎日のメサラミン注腸を受けている（薬物注腸ＱＤ）、毎日の超音波治療によるメサラミン注腸を受けている（ＵＳ治療ＱＤ）、及び全ての他の日の超音波治療によるメサラミン注腸を受けている（ＵＳ治療ＱＯＤ）動物である。全ての群は、５体の動物を備えた。アスタリスク（＊）は超音波治療群治療を受けていないまたはメサラミン注腸のみの群との間の統計的差を示す（複数の比較による一元配置分散分析試験、Ｐ＜０．０４７）。
【０１０７】
合計糞便スコアに加えて、大腸組織は試験の終了時に、予備知識なしで組織学的に評価された。図２４はいくつかの実施形態による、１４日目の組織断片の組織学スコアを示すグラフである。中央値、２５及び７５パーセンタイル値が示される。ウィスカは、最も極端なデータ点を示す。アスタリスク（＊）は、超音波ＱＤ群と全ての他の大腸炎群との間の統計的差を示す（複数の比較による。一元配置分散分析試験、Ｐ＜２．９ｘ１０−４）。
【０１０８】
図２５Ａ〜２５Ｅはいくつかの実施形態による、１４日目の大腸組織の組織学的画像である。図２５Ａはスコア０（健康な組織）であり、図２５Ｂはスコア１であり、図２５Ｃはスコア２であり、図２５Ｄはスコア３であり、また、図２５Ｅはスコア４（病変組織）である。図２５Ａ及び２５Ｅのスケールバーは、５００μｍを表す。図２５Ｂ〜２５Ｄのスケールバーは、２００μｍを表す。超音波治療ＱＤ群は、任意の他の治療レジメンよりも統計的に低い組織学スコア及び疾病群を有する。超音波治療ＱＤ群における組織は、他の大腸炎群との比較時に、上皮のただれが大幅に少なく、陰窩の短縮がごく軽微でるように思われた。
【０１０９】
Ｃ．大腸生検からの薬物質量評価
組織は粉砕され、リン酸緩衝塩類溶液と混合され、１０％のトリクロロ酢酸が析出された。結果としての上澄み液が酢酸エチルと共に抽出された。この抽出は無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥され、ガラス管に移送され、気化され、窒素のもとで乾燥される。その後、試料はトルエンを用いて再構成され、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド及びトリメチルクロロシラン（ＢＳＴＦＡ＋ＴＭＣＳ）、９９：１（ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈより入手可能）で誘導化され、６０℃で３０分間加熱された。最終的に、試料は常温まで冷却し、ＧＣ／ＭＳに分析することが可能であった。Ｒｔｘ−５、３０ｍ  ｘ０．２５ｍｍ  ｘ０．１μｍカラムを有するＡｇｉｌｅｎｔ５９７３  ＭＳＤ／６８９０  Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ（ペンシルベニア州、ベルフォント、Ｒｅｓｔｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより入手可能）が分析のために利用された。この評価は、ＭＰＩ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．（ペンシルベニア州、ステートカレッジ）により予備知識なしで実行された。
【０１１０】
Ｄ．インスリン送達
上述の準備に加えて、頻繁な血液採取を可能にするセルディンガー法を利用して、中心静脈カテーテルが大腿静脈に配置された。インスリンの投与前に、４ｍＬの血液試料が大腿静脈から脱血され、動物の初期血糖値レベルを定量化した。ＴＲＵＥｔｒａｃｋ（登録商標）血糖値計（フロリダ州、フォートローダーデール、Ｎｉｐｒｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．より入手可能）を利用して、リアルタイムの読み出しが実現された。残りの血液試料は、さらなるグルコース代謝を最小化するために、フッ化ナトリウム及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて採血管に保存された。示された全てのデータは、採血管から定量化された血糖値を表し、これは、予備知識なしで評価された。
【０１１１】
直腸が洗浄され、動物の基準血糖値が定量化されると、１００ユニットのＮｏｖｏＬｏｇ（登録商標）即効型インスリンアスパルト（デンマーク、バウスベア、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋより入手可能）を含む１０ｍＬの注腸剤が大腸に注入され、血液試料がおよそ２分間隔で採取された。超音波治療レジメンはメサラミン試験のために利用されたものから変化しなかった。血糖値への実験の影響に応じて、血糖値が少なくとも４０分間モニタリングされた。必要に応じて、５０％デキストロースの静脈内大量投与（超音波治療が行われた場合に必要とされる）によって低血糖症が正された。提示される血糖値は、インスリン投与前に観察される最終血糖値として定義された動物の開始値によって正常化される。各治療レジメンは３回反復された。
【０１１２】
Ｅ．デキストラン硝酸ナトリウムにより誘発されたマウス大腸炎モデル
生後１５週の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスが、デキストラン硝酸ナトリウム（ＤＳＳ）により誘発された大腸炎の誘発及び治療のために、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州、ウィルミントン）から購入された。群ごとに５体の動物が利用された。これは、超音波を利用した薬物送達の桁違いの上昇を示すブタの結果に利用した電力算出に基づいた。したがって、メサラミンを３％及び３０％投与された便スコアに、ラットにおける以前の実験に見られたのと同様の改善が保守的に予測された。ブタモデルにおいて観察されるメサラミン送達の予測される桁違いの改善を仮定すると、０．０５の重要度を利用して、群ごとの５体の動物の試料サイズは、便スコアの４の予測差分を検出するために９０％の電力を実現する。作業を実行する研究者によって、受領され、実験群が無作為に割り当てられた通りに、各ケージ（群）が利用された。１日目に、血液が全てのマウスから脱血され、各動物の初期重量が計測された。４０〜５０ｋＤａデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）（例えば、カリフォルニア州、サンタクララ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．より入手可能）により、大腸炎が誘発された。１日目より、飲料水の自由摂取時に３％ｗ／ｗＤＳＳ溶液が投与された。３日目及び５日目に、飲料溶液が新鮮なＤＳＳ溶液と共に再配置された。７日目には、ＤＳＳ溶液が除去され、正常な飲料水と共に再配置された。
【０１１３】
治療が２日目に行われた。治療は、メサラミン注腸のみまたは超音波との組み合わせのいずれかからなる。注腸は、ＰＢＳ内の０．５％ｗ／ｗカルボキシメチルセルロース（例えば、ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈより入手可能）溶液におけるメサラミン（６６．６ｍｇ／ｍＬ）からなる。ここで、カスタム設計の４０ｋＨｚプローブが、大腸への挿入を可能にするように製造された（コネチカット州、ニュートン、Ｓｏｎｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．）。軸は、放射状の超音波射出を実現するために、直径が２ｍｍであり、半波長間隔での２つの、３ｍｍ直径の突起を含んだ。超音波治療の電力は、熱量測定法によって４．０Ｗに校正された。プローブが０．５秒間、直腸に挿入され、電源を入れられた。動物は毎日、Ｈｅｍｏｃｃｕｌｔカード（カリフォルニア州、パサディナ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を利用して、重量、便の硬さ、便潜血の有無をモニタリングされた。
【０１１４】
便の硬さ及び血液の有無は、以前に公開されたプロトコルに基づいてスコアをつけられた。具体的には、便性が以下のようにスコアをつけられた。すなわち、（１）正常なペレット状の便、（２）容易には再可能な便のペレット（３）細粒の存在する、軟らかい水様便、または（４）下痢、である。毎日の便潜血試験によって、血液の有無が確認された。陰性の便潜血結果の動物が、スコアをつけられた（１）。陽性の便潜血結果がさらに、以下の通り階層化された。すなわち、（２）表面上に個別の血斑のある便、（３）血液で染まった便、または（４）血液で完全に覆われた便、または肛門周囲の血液汚れの存在、である。合計糞便スコアは、粘度及び血液スコアの合計であった。したがって、合計糞便スコアは、２〜８の範囲であった。便が個別の日に収集されなかった場合、その動物には８の合計糞便スコアが割り当てられた。
【０１１５】
１４日目に、最終重量が計測され、糞便スコアが評価された。血液が採取され、動物は安楽死させられた。安楽死の直後に、大腸は切開され、肉眼的に撮像された。その後、１０％ホルマリン内に固定された。固定されると、大腸が２〜６部位に分割され、パラフィンに装着された。２つの、８μｍ断片が、２００μｍステップによって分離された各パラフィンブロックから採取された。断片はヘマトキシリン及びエオシンによって染色され、ガラスの顕微鏡スライド上に装着された。
【０１１６】
組織学的検査がマサチューセッツ総合病院において、臨床病理医によって単盲検で実行された。微小な修正を加えた以前に公開されたプロトコルに従って、表３において以下のようにスコアが判定された。
【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
顕微鏡スライド（ｎ＝２〜６）上に存在する各組織断面は、（最近似の四分位数に丸めた）対応するパーセンテージ関与と共に０〜４の間で個別にスコアをつけられた。所与の研究群の全ての動物のために検査された断面ごとに結果として得られたスコアはその後、その研究群の組織学スコアを判定するために平均化された。
【０１１９】
疾病を誘発されなかった別個の動物の集団が、直腸内の超音波の安全性及び耐容性を検査するために利用された。直腸へのプローブの挿入の影響（ｎ＝５）、及び超音波処理が続くプローブの挿入（ｎ＝５）が健康な動物において、治療のみのあらゆる潜在的な悪影響を評価するために試験された。すでに詳細に記し、図１８Ｂにおいて視覚的に示した同じＱＤ治療レジメンを利用して、プローブ挿入及び超音波処理が毎日行われた。これらの群は、治療をまったく受けていない対照群と比較された（ｎ＝５）。合計糞便スコアは毎日評価され、ヘマトクリット及びヘモグロビンは１日目及び１４日目に定量化された。１４日目に上述のように、動物は安楽死させられ、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、小腸、及び大腸が慎重に切開され、ホルマリン内に固定され、パラフィンに装着され、破断されて染色された。加えてサイトカイン定量のために、別個の大腸組織試料が保存され、−８０℃で直ちに冷凍された。
【０１２０】
ＲＮＡを抽出するために、これらの組織試料が処理された。ＡｍｂｉｏｎＰｕｒｅｌｉｎｋ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを利用して、メーカのプロトコルに従ってＲＮＡが隔離された。ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（マサチューセッツ州、ウォルサム、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用して、結果として
得られるＲＮＡの濃度及び品質が決定された。メーカのプロトコルに従ってｎａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（シアトル、ワシントン州）のＭｏｕｓｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｐａｎｅｌを利用して、サイトカインｍＲＮＡが定量化された。具体的には、各試料の１００ｎｇの合計ＲＮＡが、メーカによって良好に供給される別の試料に添加された。その後、６００視野が自動的に撮像され、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｄｉｇｉｔａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ワシントン州、シアトル、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）によって計数され、遺伝子ごとに分子数が判定された。各試料のカウントが、内蔵型能動スパイクイン対照を利用した機器により、自動的に正規化された。
【０１２１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのブタ実験の統計的分析が、統計的有意性を判定するために、両側のスチューデントのｔ検定を利用して実行された。ｉｎ  ｖｉｖｏでのマウス実験の統計的分析が、複数の比較による一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験を利用して実行された。正常ベースの９５％の信頼区間を利用して、回帰スロープの信頼区間が確立された。本研究において分析から除外された試料はなかった。統計的有意性は全体を通して、Ｐ＜０．０５として定義された。ＭａｔＬａｂ（登録商標）Ｒ２０１４ａソフトウェア（マサチューセッツ州、ネイティック、ＭａｔｈＷｏｒｋｓより入手可能）を利用して、全ての算出が実行された。
【０１２２】
実施例５：超音波増強送達のための装置
図２６はいくつかの実施形態による、薬用溶液の大腸への（自己）投与のための再利用可能な手持ち式、超音波射出薬物送達装置２６００の側面図である。装置２６００は、装置の長さが細くなる円筒形であってもよいハウジング２６０２を含む。ハウジング２６０２は、装置の電源を入れ、または電源を切るための電力制御（例えば、ボタンまたはスイッチ）２６０４を含み、または画定してもよい。ハウジングは、ユーザによる装置の保持、位置決め、及び／または把持を支持する凹部２６０６を含んでもよい。電力制御２６０４及び凹部２６０６は装置の近位端側に位置してもよいが、対して反対の遠位端は、大腸への挿入のための先端２６０８を含む。先端２６０８の近位基部は、先端２６０８及び直腸周囲を封止するための凹部２６１０を含んでもよい。先端２６０８は、装置内部から物質を送達するための少なくとも１つの開口部２６１２を画定してもよい。少なくとも１つの開口部２６１２は放射状に（図２６に示すように）、または装置２６００の軸方向に配向されてもよい。
【０１２３】
装置２６００はまた、装置から送達するための物質を含むカートリッジを受けるポート２６１４を画定してもよい。図２７は、交換可能であってもよい、このようなカートリッジ２７００を示す。カートリッジ２７００は、装置内に挿入されるとカートリッジが適切に留まる頂部２７０２を有してもよい。カートリッジの代わりに、またはそれに加えて装置２６００は、圧縮可能であり、そのため容器２８００を圧縮することによってユーザが物質を手動で放出することを可能にしてもよい外側容器２８００から物質を受けてもよい。容器２８００は、例えば、可撓性管２８０２により、装置２６００に接続されてもよい。
【０１２４】
先端を除く装置のハウジングは、ユーザが装置をしっかりと保持することを可能にするゴムコーティングまたは材料を含んでもよい。先端は、先端の直腸への円滑な挿入を可能にする摩擦のないまたは低摩擦のコーティングまたは材料を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ハウジング及び／または先端は、清掃のために耐水性または防水性である。装置の寸法は、約１４ｃｍから約４０ｃｍの長さ、装置の上部で約４ｃｍから約６ｃｍの直径、及び、装置の先端で直径約１ｃｍから約３ｃｍを含む。
【０１２５】
図２９はいくつかの実施形態による、装置２６００の利用を示す図である。凹部２６１
０が直腸との封止を形成し、開口部２６１２が大腸と流体連通するように、装置２６００の先端２６０８が腸２９００内に挿入された。装置２６００が作動すると、先端２６０８から低周波数の超音波２９０２が射出され、放射状の射出を最大化する。拡大ボックス２９０４に示すように、低周波数の射出２９０２により、開口部２６１２から腸へと解放された物質２９０６の、腸上皮２９００を透過する送達が可能である。
【０１２６】
図３０はいくつかの実施形態による、装置３０００の超音波機構を示す。装置３０００は、揺動軸３００６に接続された（結晶平衡のための裏当て３００４を有する）平衡型圧電結晶３００２を利用して超音波を射出する。圧電結晶３００２は伸縮し、軸３００６を超音波周波数で揺動させる。圧電結晶３００２は、ジルコン酸チタン酸鉛（ＰＺＴ）、石英、またはセラミックであってもよい。理想的には、圧電結晶３００２は電気―機械間の高変換効率及び低熱出力を有する。装置３０００の先端２６０８から射出される超音波振動数は、約１５ｋＨｚから約５００ｋＨｚまたは約５００ｋＨｚから約３０００ｋＨｚであってもよい。揺動軸３００６の長さは約１ｃｍから約７ｃｍであってもよく、揺動軸の直径は約０．１ｃｍから約２．０ｃｍであってもよい。図３１は別の実施形態による、揺動軸３００６が突起３１０２を有する、装置３１００の超音波機構を示す。１つ以上の突起３１０２は、軸３００６に沿って位置し、放射状の射出を最大化するために利用されてもよい。突起３１０２の直径は、揺動軸３００６の直径を超えて約１．０ｃｍ未満であってもよい。
【０１２７】
図３２はいくつかの実施形態による、装置３２００の超音波機構を示す。装置３２００は、挿入先端２６０８に直接組み込まれた（裏当て支持プレート３２０４を有する）円形の圧電結晶３２０２の高アスペクト比の積層を利用して超音波を射出する。結晶は放射状の超音波射出を実行するために、防水性及び／または音響透過性材料３２０６で覆われていてもよい。
【０１２８】
図３３はいくつかの実施形態による、装置３３００の内部部品を示す。装置３３００は、物質を有するカートリッジまたは物質自体を受けるためのポートまたはリザーバ３３０２を含む。カートリッジ／リザーバ内の物質の流体連通を確立するために導管（例えば、針）３３０４が利用される。装置３３００は、先端の少なくとも１つの開口部からの溶出のために、１つ以上の流体チャネル３３０８を介してカートリッジ／リザーバから装置の遠位端へと物質を運搬するポンプを有してもよい。装置３３００は熱のリアルタイムモニタリングを行うために、内部部品及び／または遠位端における熱電対３３１２に電力を供給するバッテリ３３１０を含んでもよい。
【０１２９】
装置は、例えば約２０秒間未満の、物質の迅速な排出を可能にするよう設計されてもよい。先端は、先端から物質を噴霧し、物質による組織の最大限のコーティングを可能にする傾斜開口部を画定してもよい。物質を噴霧するか、または渦動させ、物質が組織を放射状に覆うことを可能にするために、開口部は周囲超音波先端に対して、約４５°から約９０°で傾斜してもよい。代替的な実施形態において、物質は超音波射出軸の中心を通じて溶出し、物質の霧化及び噴霧を可能にしてもよい。
【０１３０】
装置先端は、超音波射出軸または結晶積層、少なくとも１つの溶出開口部、及び／または、熱のリアルタイムのモニタリングのための熱電対を含んでもよい。先端の長さは約１ｃｍから約１０ｃｍであってもよく、半径は約１ｃｍから約３ｃｍであってもよい。様々な条件、及び解剖学的位置、特に粘膜組織の治療を可能にするように、先端は固定されるか、または交換可能な先端を可能にするために取り外し可能であってもよい。装置の利用のための解剖学的位置は、直腸、膣、耳、鼻、及び口腔（例えば、口、頬、または舌）を含んでもよいが、それに限定されない。
【０１３１】
先端を肛門組織及び排泄物との直接接触から保護するために、装置の先端をシースにより覆うことができる。図３４、３５、及び３６Ａ〜３６Ｃはいくつかの実施形態による、異なるシースの図である。シースは洗浄可能または使い捨てであってもよい。シースは、体内に挿入される装置全体を覆ってもよい。シースの材料は、音響透過性／伝導性であってもよい（すなわち、超音波信号の減衰を可能にしない）。シースの材料は、容易な挿入及び装置の体からの取り外しを可能にするよう、摩擦がないか、または低摩擦であってもよい。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、図３４に示すように、シースの近位端は、プローブ先端周囲を封止するための（例えば、弾性の）バンド３４００を含む。シースの反対の遠位端はゲルまたは液体３４０２を含んでもよく、シースの遠位端は、先端において少なくとも１つの開口部と整合する少なくとも１つの穿孔３４０４を画定してもよい。ゲルまたは液体３４０２は、先端射出体からシースへの超音波信号の適切なコンダクタンスを可能にする。他の実施形態において、（例えば、弾性特性を有する）シースは伸張してプローブ先端の周囲を、及び／または、その上から覆う。図３５Ａに示すような取り付けられる前のシースは、図３５Ｂに示すようにプローブ先端全体に伸長した際に、プローブ先端の全部の周囲の密封を可能にする。
【０１３３】
シースは、先端に少なくとも１つの開口部を有する少なくとも１つの穿孔３４０４の患者による位置決めを補助するための視覚的インジケータを有してもよい。代わりに、装置からの物質の溶出時に、シースは穿刺され、物質が装置から溶出する場所であってもよい。
【０１３４】
図３６Ａは、先端形状とほぼ一致し、先端の少なくとも１つの開口部と整合するよう少なくとも１つの穿孔３４０４を画定する、剛性材料（例えば、ハードプラスチック）から製造されたシース３６００の側面図である。シースは、超音波透過性／伝導性特性及び、挿入される先端全体を覆うことを可能にする寸法を有してもよい。先端射出体からシースへの超音波信号の適切なコンダクタンスのために、ゲルまたは液体３４０２が含まれてもよい。図３６Ｂは、装置の先端周囲を、及び／またはその全体を共に固定する、少なくとも２つの別個の部品を備える剛性シースを示す。代わりに、２つの別個の部品は図３６Ｃに示すように、（例えば、シースの２つの部品がしっかりとかみ合い、プローブ先端周囲を固定することを可能にするヒンジ機構３６００によって）当初は一端で接続されてもよい。図３７Ａはいくつかの実施形態による、壁の厚さを示すための、シースの少なくとも一部の横断面図である。図３７Ｂに示すように、シースの内壁は、いくつかの実施形態による、プローブ装置３７０４の本体上で受け側湾入または他の固定機構３７０２と整合するよう構成される、フック、ラッチ、及び／または他の固定機構３７００を含む。
【０１３５】
実施例６：核酸の送達
分解のために具体的に特定のｍＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を標的とするよう設計された人工ＲＮＡ二本鎖などの核酸を送達するために、いくつかの実施形態が利用されてもよい。細胞信号伝達タンパク質腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）に対する（非カプセル化された）ｓｉＲＮＡの送達が、いくつかの実施形態によるデキストラン硝酸ナトリウム（ＤＳＳ）大腸炎モデルにおいて試験された。図３８Ａは、いくつかの実施形態による治療レジメンを示す図である。２００ｎｇ未満の非カプセル化されたｓｉＲＮＡ（と比較された数千ナノグラムのカプセル化されたｓｉＲＮＡ）が直腸を介して投与された。図３８Ｂはいくつかの実施形態による、（ｓｉＲＮＡのみの送達に対して）超音波及びｓｉＲＮＡ送達の合計糞便スコアへの影響を示すバーグラフである。ｓｉＲＮＡは超音波によって効果的に送達され、優れた臨床値を示した。
【０１３６】
組織は臨床病理医により、上述と同様のメトリクスに従って予備知識なしで検証された
。図３９Ａは健康な組織（スコア０）の組織画像であり、図３９Ｂは疾病組織（スコア４）の組織画像である。図３９Ｃは、ｓｉＲＮＡ及び超音波を受けている動物にとってははるかに良好であった組織学スコアを示すバーグラフである。
【０１３７】
本研究は、治療上の関連性を有する核酸の送達の成功を示す。核酸配列は、超音波とのより大きな共同作用のために設計されてもよい。すなわち、特定の核酸配列には、超音波の結果としての増強が起こることがある。さらなる評価のために送達を可能にするためには、現在の方法には潜在的な薬剤候補の調剤が必要であるが、それは非常に困難であるため、調剤のない錯体分子の送達を介した薬物候補を遮断するために本技術が利用されてもよい。
【０１３８】
実施例７：超音波媒介ワクチン接種
免疫反応は、抗原投与のルートに基づき、偏っている場合がある。例えば、粘膜表面を感染させる疾病に対する粘膜表面におけるワクチン接種は有益であってもよく、超音波はいくつかの実施形態により、免疫反応を優先的に向上させてもよい。
【０１３９】
いくつかの実施形態により、クロストリジウムディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆ）による感染に対するワクチン接種が試験された。便を通じて広がる菌、Ｃ．ｄｉｆｆは本研究のためのモデル候補である。Ｃ．ｄｉｆｆ感染は、病院では多く、再発率が高い。抗生物質が腸内のナチュラルフローラを一掃した後に、Ｃ．ｄｉｆｆは腸に定着し、腸上皮を攻撃する毒素Ａ及びＢを分泌する。Ｃ．ｄｉｆｆを治療するために、フィダキソマイシン、メトロニダソール、及びバンコマイシンなどの一層強力な抗生物質が必要とされる。マウスはいくつかの実施形態により、分泌された抗体に免疫反応を偏らせて、定着を予防するために、ＧＩ管を介してＣ．ｄｉｆｆによる感染に対してワクチン接種された。不活性化毒素Ａ及びＢがモデル抗原として利用された。
【０１４０】
予防接種に利用される合計タンパク質内容物は大きく変化するが、研究により、比較的大量のアジュバントと混合されたトキソイドが示される。しかし、超音波媒介ＧＩワクチン接種には、１０μｇのみの合計トキソイドが利用され、１つまたは２つの治療のためにアジュバントは増大しなかった。各ワクチン接種後に、血液及び結腸洗浄が収集された。動物はＣ．ｄｉｆｆ栄養細胞及び毒素に曝露された。それらの健康状態は、重量損失及び便性に関してモニタリングされた。図４０はいくつかの実施形態による、曝露後の６日間の相対的な重量のプロットである。超音波媒介ＧＩワクチン接種群（超音波）は、対照群及び皮下投与（針）を介してワクチン接種された第３群に対して曝露後４日目までに統計的に優れた身体スコアを示した。同様の結果が糞便スコアに見られた。針群については利点が示されなかったため、Ｃ．ｄｉｆｆに対するワクチン接種の困難さが強調された。
【０１４１】
本研究は、現在効果的なワクチンがない、いくつかの疾病を含む疾病に対する超音波媒介粘膜ワクチン接種によって提供される優れた保護を示す。いくつかの実施形態によると、超音波媒介ワクチン接種は、分泌された免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）反応に免疫反応を偏らせることを可能にしてもよく、これは、Ｃ．ｄｉｆｆ及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などの、粘膜表面を通じて侵入してくる疾病の予防に有益である。
【０１４２】
実施例８：大型動物の大腸炎モデル
ヒューマンスケール装置の試験のための疾病モデルが有益である。ブタにおいて、直腸にデキストラン硝酸ナトリウム（ＤＳＳ）を注入して炎症をもたらすことで、大腸炎モデルが開発された。ブタにおいて再生可能かつ長く続く大腸炎を誘発するための投与レジメンが、組織及び血液マーカに基づいて確認された。統計的検出力のために３体の動物がモニタリングされた。
【０１４３】
図４１Ａは、大腸内視鏡を通じて撮像された健康なブタ大腸の画像である。図４１Ｂはいくつかの実施形態による、大腸内視鏡を通じて撮像された、大腸炎を患ったブタ大腸の画像である。図４２Ａ〜４２Ｃは、構造が保全された正常な大腸粘膜を有する健康な動物の大腸生検組織を示す可変的な詳細の画像である。図４３Ａ及び４３Ｂは、疾病誘発後７日間の疾病誘発大腸生検組織を示す変化のある詳細の画像である。これらの画像は、重篤な急性大腸炎の場合の全疾病を示す。図４４Ａ及び４４Ｂは、疾病誘発後１４日間の疾病誘発大腸生検組織を示す変化のある詳細の画像である。これらの画像は、７日目の提示に相当する重篤な急性大腸炎を示す。図４５Ａ及び４５Ｂは、疾病誘発後の２１日間の疾病誘発大腸生検組織を示す変化のある詳細の画像である。これらの画像は、１４日目の提示に相当する重篤な急性大腸炎を示す。フィブリン膿性懐死組織片もまた、これらの画像で視認できる。
【０１４４】
血液マーカヘマトクリット（すなわち、血液中の赤血球のパーセンテージ）及びヘモグロビンが評価された。図４６Ａ及び４６Ｂはそれぞれ、この時間のヘマトクリット及びヘモグロビンの変化を示すプロットである。ヘマトクリット及びヘモグロビンの両方の統計的に大幅な減少は、直腸内の炎症からの失血を示す。
【０１４５】
いくつかの実施形態により、この大腸炎モデルが前臨床効能のためのヒトのサイズの装置の試験を可能にする。
【０１４６】
結論
本明細書において様々な本発明の実施形態が説明され、示されたが、当業者は、機能の実行及び／または結果の取得及び／または本明細書に記載の１つ以上の利点のための様々な他の手段及び／または構造を容易に想定し、このような変更及び／または修正のそれぞれが本明細書に記載の本発明の実施形態の範囲内にあると見なされる。より一般的に、本明細書に記載の全てのパラメータ、寸法、材料、及び構成が例示的であることを意味するものであり、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／または構成が本発明の教示が利用される具体的な応用（複数可）に依拠することを、当業者は容易に理解する。単なる通常の実験を利用して、当業者は本明細書に記載の具体的な本発明の実施形態の多くの均等物を認識するか、または、確認することができる。したがって、上述の実施形態が例示のためにのみ提示され、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内で、本発明の実施形態は明細記載され、特許請求された通り以外にも実施できるものであることが理解されるべきである。本開示の本発明の実施形態は、本明細書に記載の各個別の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法を対象とする。さらに、２つ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法の任意の組み合わせが、このような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法が相互に矛盾しない場合に、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
【０１４７】
上述の実施形態は、多数の方法の内のいずれかで実施可能である。例えば、本明細書に開示の保持／送達構造の設計及び製作の実施形態が、ハードウェア、ソフトウェアまたはその組み合わせを利用して実施されてもよい。ソフトウェアにおける実装時には、ソフトウェアコードが任意の好適なプロセッサまたはプロセッサの集合において、単一のコンピュータにおいて提供されて、または、複数のコンピュータ間で分散されて、実行可能である。
【０１４８】
さらに、コンピュータが、ラックマウント型コンピュータ、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、またはタブレットコンピュータなどのいくつかの形式のいずれかで具体化されてもよいことを理解されたい。加えて、コンピュータは、一般的にはコンピュータとして見なされないが好適な処理能力を有する、携帯情報端末（ＰＤＡ）、スマートフォンまたは任意の他の好適なポータブルまたは固定電子デバイスを含む装置に
埋め込まれてもよい。
【０１４９】
また、コンピュータは１つ以上の入出力装置を有してもよい。これらの装置は、特に、ユーザインターフェースを提示するために利用することができる。ユーザインターフェースを提示するために利用することができる出力装置は、出力の視覚的提示のためのプリンタまたは表示画面及び出力の可聴可能な提示のためのスピーカまたは他の音発生装置を含む。ユーザインターフェースのために利用することができる入力装置の例は、キーボード及び、マウス、タッチパッド、及びデジタイジングタブレットなどのポインティング装置を含む。別の例として、コンピュータは音声認識を通じて、または他の可聴形式において、入力情報を受けてもよい。
【０１５０】
このようなコンピュータは、企業ネットワーク、及びインテリジェントネットワーク（ＩＮ）またはインターネットなどの、ローカルエリアネットワークまたは広域ネットワークを含む任意の好適な形式における１つ以上のネットワークによって相互接続されてもよい。このようなネットワークは任意の好適な技術に基づいてもよく、任意の好適なプロトコルに従って動作してもよく、無線ネットワーク、有線ネットワークまたは光ファイバネットワークを含んでもよい。
【０１５１】
本明細書に概要を記した、様々な方法またはプロセス（例えば、すでに開示した保持／送達構造の設計及び製作）は、様々なオペレーティングシステムまたはプラットフォームのいずれかを利用する１つ以上のプロセッサ上で実行可能であるソフトウェアとして符号化されてもよい。加えて、このようなソフトウェアは、いくつかの好適なプログラミング言語及び／またはプログラミングまたはスクリプトツールのいずれかを利用して書き込まれてもよく、また、フレームワークまたは仮想マシン上で実行される、実行可能機械語コードまたは中間コードとしてコンパイルされてもよい。
【０１５２】
また、様々な本発明の概念が、例が提示されている１つ以上の方法として具体化されてもよい。方法の一環として実行された行動が任意の好適な方法で順序付けられてもよい。したがって、例示的な実施形態において一連の行動として示されるが、示されるものとは異なる順序で行動が実行される実施形態が確立されてもよく、これは、いくつかの行動の同時の実行を含んでもよい。
【０１５３】
全ての刊行物、特許出願、特許、及び、以下の参照文献を含むが、それに限定されない本明細書に記載の他の参考文献が、その全体を本明細書に参照文献として援用される。：
１．Ａｌｅｘ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ
Ｍｕｒｉｎｅ  ＤＳＳ  ａｎｄ  ＴＮＢＳ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｃｏｌｉｔｉｓ，”  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １５，  ３４１−３５２  （２００９）．
２．Ｂａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｉ：  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｔｏ  Ｓｔｕｄｙ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，”  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ５９，  １５４−１６３  （１９７０）．
３．Ｂａｗｉｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｆｉｎｉｔｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｃ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２０−１００  ｋＨｚ  Ｆｌｅｘｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｌｌｙ  Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｏｒ，”  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  ５３，  ５１１−５１７  （２０１２）．
４．Ｂｒｏｔｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｂｂｌｅｓ  ｉｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
Ｓｏｕｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ，”  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂ  １１４，  １１０１０−１１０１６  （２０１０）．
５．Ｃａｐｕｒｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｐＨ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅ  ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ，”  Ｙａｌｅ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．
＆  Ｍｅｄ．  ８４，  ２８５−２８８  （２０１１）．
６．Ｃｅｒｕｔｔｉ，  “Ｌｏｃａｔｉｏｎ，  Ｌｏｃａｔｉｏｎ，  Ｌｏｃａｔｉｏｎ：  Ｂ−ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｇｕｔ  Ｌａｍｉｎａ  Ｐｒｏｐｒｉａ，”  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １，  ８−１０  （２００８）．
７．Ｃｅｒｕｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，”  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２９，  ２７３−２９３  （２０１１）．
８．Ｃｉａｒｌｅｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｒｏｗａｓａ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｅｎｅｍａ  （Ｍｅｓａｌａｍｉｎｅ，  ＵＳＰ），”  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  Ｎｕｒｓｉｎｇ  ＫＷ  −  １２  （１９８９）．
９．Ｃｏｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｆｉｂｒｅｏｐｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｎｅ，”  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｉｎ  Ｍｅｄ．  ＆  Ｂｉｏｌ．  ２４，  １４３−１５１  （１９９８）．
１０．Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｃｏｌｉｔｉｓ，”  Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ６９（２），  ２３８−２４９  （１９９３）．
１１．Ｄａｎｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｌｉｔｉｓ，”  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３６５，  １７１３−１７２５  （２０１１）．
１２．Ｄｅｃｈａｄｉｌｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｈｉｎｄｒａｎｃｅ  Ｆａｃｔｏｒｓ
ｆｏｒ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｏｒｅｓ，”
Ｉｎｄｕｓ．  ＆  Ｅｎｇ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  ４５，  ６９５３−６９５９  （２００６）．
１３．Ｅｎｓｉｇｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｏｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：  Ｔｈｅ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｍｕｃｕｓ  Ｂａｒｒｉｅｒｓ，”  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６４，  ５５７−５７０  （２０１２）．
１４．Ｆｒｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｕｃｏｓａｌ  ５−ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  Ｉｎｖｅｒｓｅｌｙ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｎｉｃ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｌｉｔｉｓ，”  Ｇｕｔ  ４７，  ４１０−４１４  （２０００）．
１５．Ｇｉａｎｎａｓｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｅｒｕｍ  Ａｎｔｉｔｏｘｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｈａｍｓｔｅｒｓ，”  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６７（２），  ５２７−５３８  （１９９９）．
１６．Ｈｏｌｌａｎｄ，  “Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｐｕｌｓｅｄ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｉｎ  ａ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，”  Ｊ．  Ａ
ｃｏｕｓｔ．  Ｓｏｃ．  Ａｍ．  ８８，  ２０５９−２０６９  （１９９０）．
１７．Ｈｏｒｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｕｌｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｍｐｈｉｂｉａｎ  Ｏｏｃｙｔｅ，”  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ６０，  ４０５  （１９７４）．
１８．Ｋａｒａｃａ−Ｍａｎｄｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｏｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｏｓｔｓ，”  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ７，  ｅ３０ｓ−ｅ３７ｓ  （２０１１）．
１９．Ｋｅｄｉａ，  “Ｏｎｃｅ−Ｄａｉｌｙ  ＭＭＸ  Ｍｅｓａｌａｍｉｎｅ  ｆｏｒ
ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｌｄ−ｔｏ−Ｍｏｄｅｒａｔｅ  Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｌｉｔｉｓ，”  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ＆  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｉｓｋ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ３，  ９１９−９２７  （２００７）．
２０．Ｋｅｎｎｅｄｙ，  “Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ：  Ｈｉｇｈ−Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｆｏｃｕｓｅｄ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｕｒｓ，”  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ５，  ３２１−３２７  （２００５）．
２１．Ｋｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ，  “Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｄｉａｒｒｈｅａ，”  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２８（３），  ７６４−７７０  （２００５）．
２２．Ｌｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｂｕｂｂｌｅ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）．
２３．Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｐｕｌｓｅｄ  ＨＩＦＵ  Ｅｘｐｏｓｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｅｘ  Ｖｉｖｏ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ
Ｔｕｍｏｒｓ，”  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｉｎ  Ｍｅｄ．  ＆  Ｂｉｏｌ．  ４０，
１５２３−１５３４  （２０１４）．
２４．Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｆａｃｔｏｒｓ  Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｔｏ  ２０  ｋＨｚ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ，”  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２０，  ６１００−６１０６  （２００４）．
２５．Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “ＰＥＧ−Ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  Ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，”  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９，  １０９８−１１０５  （２００３）．
２６．Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｎｏｎ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，”  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １５，  ９１８−９２４  （１９９８）．
２７．Ｍａｌｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ａｎａｌｙｔｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒＴＭ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，”  ＢＭＣ  Ｒｅｓ．  Ｎｏｔｅｓ  ２，  ８０  （２００９）．２８．Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｐｕｔｔｉｎｇ  Ｒｅｃｔａｌ  ５−Ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ｉｎ  Ｉｔｓ  Ｐｌａｃｅ：  Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ
ｉｎ  Ｄｉｓｔａｌ  Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｌｉｔｉｓ，”  Ａｍ．  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ９５，  １６２８−１６３６  （２０００）．
２９．Ｍｏｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  “ＤＮＡ  Ｄｒｕｇｓ  Ｃｏｍｅ  ｏｆ  Ａｇｅ，”  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ３０３，  ４８−５３  （２０１０）
．
３０．Ｎａｇａｎｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｎｉｃ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ５−Ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓ  Ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  Ｉｔｓ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  Ｄｉｓｔａｌ  Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｌｉｔｉｓ：  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｏｒａｌｌｙ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  Ｍｅｓａｌａｍｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ，”  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ７，  ２２１−２２５  （２００１）．
３１．Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｒｅｂａｍｉｐｉｄｅ  Ｅｎｅｍａ  ｉｓ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｃｏｌｉｔｉｓ
ｉｎ  Ｒａｔｓ，”  Ｄｉｇ．  Ｄｉｓ．  Ｓｃｉ．  ５０，  Ｓ１２４−Ｓ１３１  （２００５）．
３２．Ｎｅｕｒａｔｈ，  “Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ，”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
１４，  ３２９−３４２  （２０１４）．
３３．Ｎｅｕｒａｔｈ，  “Ｎｅｗ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｈｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，”  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７，  ６−１９  （２０１４）．
３４．Ｐａｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｂｉｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，”  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ９８，  ２８７−２９５  （１９９１）．
３５．Ｐｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｈｉｎｄｅｒｅｄ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌａｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｐｏｒｅ  Ｒａｄｉｉ  Ｅｓｔｉｍａｔｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔａｃｔ  ａｎｄ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ，”  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １１，  １３０６−１３１４  （１９９４）．
３６．Ｐｅｃｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  “ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃ：  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ，”  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  １１，  ５９−６７  （２０１１）．
３７．Ｐｅｌｅｋａｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｂｊｅｒｋｎｅｓ
Ｆｏｒｃｅｓ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｔｗｏ  Ｂｕｂｂｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ  ｏｆ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｓｔｒｅａｍｅｒｓ，”  Ｊ．  Ｆｌｕｉｄ  Ｍｅｃｈ．  ５００，  ３１３−３４７  （１９９９）．
３８．Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ
ｂｙ  Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ  Ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ，”  Ｎａｔ．  Ｐｈｙｓ．  １，  １０７−１１０  （２００５）．
３９．Ｓａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＩＢＤ  ａｎｄ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
Ｔｈｅｒｅｏｆ  ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  ＤＳＳ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｃｏｌｉｔｉｓ  ｉｎ
Ｍｉｃｅ，”  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ９２，  ７０８−７１８  （２０１３）．
４０．Ｓｃｈｏｅｌｌｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄ．  ７（３１０），  ３１０ｒａ１６８  （２０１５）．  
４１．Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ
Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｒａｄｉｉ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  Ｖｉｓｃｏｍｅｔｒｙ，”  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ
．  ４４，  １１８９  （１９６１）．
４２．Ｓｅｉｂｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｐｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｓ  Ｕｎｄｅｒｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｌｉｔｉｓ，”  Ｊ．  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ＆  Ｃｏｌｉｔｉｓ  ＪＡ  ８，  ５６−６３  ＰＢ  （２０１４）．
４３．Ｓｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ａｎｄ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｌａｕｒｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｐｅｒｍｅａｎｔｓ：  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｆｕｌｌ−Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ａｎｄ  Ｓｐｌｉｔ−Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  Ｐｉｇ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｋｉｎ，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １４５，  ２６−３２
（２０１０）．
４４．Ｓｋａｌｋｏ−Ｂａｓｎｅｔ，  “Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ：  Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”
Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ：  Ｔａｒｇｅｔｓ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８，  １０７−１１４
（２０１４）．
４５．Ｓｔｅｉｎ，  Ｃｈａｎｎｅｌｓ，  Ｃａｒｒｉｅｒｓ，  ａｎｄ  Ｐｕｍｐｓ：
Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉ．  ２０１２）．
４６．Ｔｅｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｓｏｌｕｔｅｓ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｌｏｗ−Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｓｏｎｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ
ａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｒｏｕｓ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｍｏｄｅｌ，”  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ９２，  ３８１−３９３  （２００３）．
４７．Ｔｅｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｌｏｗ−Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ａｓ  ａ  Ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ａｄｊｕｖａｎｔ，”  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３（２９）  ３８００−３８０７  （２００５）．
４８．Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｒｍａｌｉｎ−Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ−Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｂｙ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｒｏｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈａｍｓｔｅｒｓ，”
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６３，  ４６１９−４６２７  （１９９５）．  Ｖｅｅｒｅｍａｎ，  “Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ
Ｉｎｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｆｒｕｃｔｏｓｅ，”  Ｊ．  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ
１３７，  ２５８５Ｓ−２５８９Ｓ  （２００７）．
４９．Ｖｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａｎ  Ｏｒａｌｌｙ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｄｏｘ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｔｈａｔ  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｏｌｏｎｉｃ  Ｍｕｃｏｓａ  ａｎｄ  Ｒｅｄｕｃｅｓ  Ｃｏｌｉｔｉｓ  ｉｎ
Ｍｉｃｅ，”  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １４３，  １０２７−１０３６．ｅ３  （２０１２）．
５０．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｔｏｘｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，”  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８０（８），  ２６７８−２６８８  （２０１２）．５１．Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｏｒａｌｌｙ  Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  Ｔｈｉｏｋｅｔａｌ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｌｏａｄｅｄ  ｗｉｔｈ  ＴＮＦ−α−ｓｉＲＮＡ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅｓ，”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ９（１１），  ９２３−９２８  （２０１０）．
５２．Ｗｉｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｍｏｕ
ｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２，  ５４１−５４６  （２００７）．
５３．Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ：  Ｓｏｒｔｉｎｇ  Ｏｕｔ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｏｐｔｉｏｎｓ，”
Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ６９，  ６２１−６２６  （２００２）．
５４．Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｌａｒｇｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ，  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｏｒａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｏ
Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｇｅｎｉｔｏｒｅｃｔａｌ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  １８，  １２９１−１２９６  （２０１２）．
【０１５４】
本明細書において定義され、利用される通り、全ての定義は、辞書上の定義、参照文献として援用される文書における定義、及び／または定義された用語の通常の意味を制御するよう理解されるべきである。
【０１５５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される通り、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、そうでないことが明らかにされない限り、「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ（少なくとも１つ）」を意味すると理解されるべきである。
【０１５６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される通り、「ａｎｄ／ｏｒ（及び／または）」の句は、「ｅｉｔｈｅｒ  ｏｒ  ｂｏｔｈ（いずれかまたは両方）」のそのように連結される要素、すなわち、ある場合によっては接続的に提示され、他の場合によっては分離して提示される要素を意味すると理解されるべきである。「ａｎｄ／ｏｒ（及び／または）」を用いて記載されている複数の要素は、同様に、すなわち、「ｏｎｅ  ｏｒ
ｍｏｒｅ（１つまたは複数の）」要素がそのように連結されるものとして解釈されるべきである。「ａｎｄ／ｏｒ（及び／または）」節によって具体的に特定される要素以外の他の要素が、具体的に特定されたこれらの要素に関連するか関連しないかに関わらず、所望により存在してよい。このように、非限定的実施例として、「Ａ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｂ（Ａ及び／またはＢ）」への言及は、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（を備える）」などの非限定語と関連して利用される場合に、一実施形態において、Ａのみ（所望によりＢ以外の要素を含む）、別の実施形態において、Ｂのみ（所望によりＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態において、Ａ及びＢの両方（所望により他の要素を含む）などを指すことができる。
【０１５７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される通り、「ｏｒ（または）」は既に定義された通り、「ａｎｄ／ｏｒ（及び／または）」と同じ意味を有するものと理解されるべきである。例えば、リストの中のアイテムを分離する時に、「ｏｒ（または）」または「ａｎｄ／ｏｒ（及び／または）」は、包括的である、すなわち、いくつかの要素または要素リスト、また所望により、さらなるリストにない項目の、少なくとも１つの包含であるが、また１つ以上を含むものと解釈されるものとする。反対に明白に示された用語のみ、例えば、「ｏｎｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ（の１つのみ）」または「ｅｘａｃｔｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ（の正確に１つ）」、または特許請求の範囲において使用される場合、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（からなる）」が、いくつかの要素または要素リストの正確に１つの要素の包含を指す。一般的に、「ｏｒ（または）」の用語は本明細書にて使用される通り、排除性の用語（すなわち、「ｅｉｔｈｅｒ（いずれか）」、「ｏｎｅ  ｏｆ（の１つ）」、「ｏｎｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ（の１つのみ）」、または「ｅｘａｃｔｌｙ  ｏｎｅ
ｏｆ（の正確に１つ）」により先行された場合に単に排他的な選択肢（すなわち、「ｏｎｅ  ｏｒ  ｔｈｅ  ｏｔｈｅｒ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｂｏｔｈ（一方または他方であるが両方でない）」）のみとして解釈するものとする。特許請求の範囲において用いられている場合、「Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（から基本的になる）
」は、特許法の分野において用いられる、その通常の意味を有するであろう。
【０１５８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される通り、１つ以上の要素のリストを参照した「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ（少なくとも１つ）」の句は、要素のリスト上の任意の１つ以上の要素から選択されたが、要素のリスト内に具体的に記載されたあらゆる要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、要素のリスト上の要素の任意の組み合わせを除外しない、少なくとも１つの要素を意味するものと理解されるべきである。この定義によりまた、「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ（少なくとも１つ）」が言及する要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の他の要素が、具体的に特定されたこれらの要素に関連するか関連しないかに関わらず、所望により存在することが可能になる。このように、非限定的実施例として、「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ（Ａ及びＢの少なくとも１つ）」（または同等に、「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ｏｒ  Ｂ（ＡまたＢの少なくとも１つ）」または、同等に、「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｂ（Ａ及び／またはＢの少なくとも１つ）」）は、一実施形態において、所望により１つ以上、Ｂが存在しない状態でＡを含む（また、所望により、Ｂ以外の要素を含む）少なくとも１つ、別の実施形態において、所望により１つ以上、Ａが存在しない状態でＢを含む（また、所望により、Ａ以外の要素を含む）、少なくとも１つ、さらに別の実施形態において、所望により１つ以上、Ａを含む、及び所望により１つ以上、Ｂを含む（また、所望により他の要素を含む）、少なくとも１つ、などを指すことができる。
【０１５９】
特許請求の範囲及び上述の明細書において、全ての移行句は、例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（を備える）」「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（を含む）」「ｃａｒｒｙｉｎｇ（を担持する）」「ｈａｖｉｎｇ（を有する）」「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（を含有する）」「ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ（を含む）」、「ｈｏｌｄｉｎｇ（を保持する）」「ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ（から構成される）」などは、非限定、すなわち、限定されるものではないが、含むことを意味すると理解されたい。移行句「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（からなる）」及び「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（から本質的になる）」のみ、それぞれ、米国特許庁特許審査便覧、第２１１１．０３項に記載のクローズドまたはセミクローズドの移行句であるものとする。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2020168421.tif 000014
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ−１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
2020168421.tif 000035
【図１２Ｃ−１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ−１５Ｂ】
2020168421.tif 000042
【図１５Ｃ−１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７Ａ−１７Ｂ】
2020168421.tif 000045
【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２３Ａ−２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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