(57)【要約】【課題】試料用の保持具と試料液との接触界面において生じる背景反射光を抑えて、その接触界面近傍において目的とする観察対象物がうまく観察できるようにした、顕微観察方法及び顕微観察用試料保持具を提供する。【解決手段】反射光検出型顕微鏡を準備する工程と、観察対象物を含む試料液を準備する工程と、前記試料液を保持する保持具を準備する工程と、前記反射光検出型顕微鏡に備わる試料台に前記保持具に保持した前記試料液を載置する工程と、前記反射光検出型顕微鏡により前記観察対象物を検出する工程と、を備え、前記保持具には、前記試料液との接触界面を形成する該界面の少なくとも一領域に、背景反射光の生成を抑えることができる程度に前記試料液の媒質の屈折率に近い屈折率を有する材質からなる背景反射光防止層が形成されていることを特徴とする顕微観察方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
反射光検出型顕微鏡を準備する工程と、
観察対象物を含む試料液を準備する工程と、
前記試料液を保持する保持具を準備する工程と、
前記反射光検出型顕微鏡に備わる試料台に前記保持具に保持した前記試料液を載置する工程と、
前記反射光検出型顕微鏡により前記観察対象物を検出する工程と、を備え、
前記保持具には、前記試料液との接触界面を形成する該界面の少なくとも一領域に、背景反射光の生成を抑えることができる程度に前記試料液の媒質の屈折率に近い屈折率を有する材質からなる背景反射光防止層が形成されていることを特徴とする顕微観察方法。
【請求項２】
前記反射光検出型顕微鏡は、共焦点顕微鏡である、請求項１記載の顕微観察方法。
【請求項３】
顕微観察のため試料液を保持するために用いられる保持具であって、前記保持具には、前記試料液との接触界面を形成する該界面の少なくとも一領域に、背景反射光の生成を抑えることができる程度に前記試料液の媒質の屈折率に近い屈折率を有する材質からなる背景反射光防止層が形成されていることを特徴とする顕微観察用試料保持具。
【請求項４】
前記保持具の形態が、カバーガラス、ガラスボトムディッシュ、スライドガラス、又はフィルムである、請求項３記載の顕微観察用試料保持具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物試料等の顕微観察に適した顕微観察方法及び顕微観察用試料保持具に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生物試料等を非破壊的に観察するため、反射光検出型の共焦点顕微鏡を利用する技術が開発されている。この種の顕微鏡では、半導体レーザーなどの照射光を所定の焦点位置に照射し、それが対象物に当って反射して生成した反射光のデータを、観察する空間座標位置にわたって焦点位置ごとに取得して、得られたデータを再構成して顕微観察像を得る手法を採用している。これにより、例えば、微生物が形成するバイオフィルムの形成過程について、細胞レベルで経時的な３次元観察を、特殊な蛍光染色などを施さずに行うことが可能である（非特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Yawata Y, Toda K, Setoyama E, Fukuda J, Suzuki H, Uchiyama H, Nomura N.「Bacterial growth monitoring in a microfluidic device by confocal reflection microscopy」J Biosci Bioeng. 2010 Jul;110(1):130-133.
【非特許文献２】Yawata Y, Toda K, Setoyama E, Fukuda J, Suzuki H, Uchiyama H, Nomura N.「Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy」J Biosci Bioeng. 2010 Sep;110(3):377-380.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一般に、光が屈折率ｎ１の物質から屈折率ｎ２の物質に垂直入射する場合、その表面反射率Ｒｒｅｆは下記式（１）で与えられる。すなわち、対象物とその媒質との間に光に対する屈折率の差があれば、それに応じた反射光が生成する。
【０００５】
【化１】
2020112633.tif 000002
【０００６】
反射光検出型の顕微鏡においては、この原理を利用して、試料に照射光を照射して、それが対象物に当って反射して生成した反射光の情報を取得して、その情報に基づいて観察対象物を検出するものである。
【０００７】
しかしながら、反射光を検出して顕微観察する手法の場合、上記の原理上、観察対象物を含む試料液を保持して顕微鏡の試料台に載置するための保持具、例えば、典型的にはカバーガラス等と、その保持具に保持される試料液と接触界面においては、通常、界面間の構成物質の屈折率の差に起因した反射光が生じるので、その背景反射光が邪魔をして、接触界面近傍では目的とする観察対象物がうまく観察できないという問題があった。
【０００８】
よって、本発明の目的は、試料用の保持具と試料液との接触界面において生じる背景反射光を抑えて、その接触界面近傍において目的とする観察対象物がうまく観察できるようにした、顕微観察方法及び顕微観察用試料保持具を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意研究した結果、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、その第１の観点では、反射光検出型顕微鏡を準備する工程と、観察対象物を含む試料液を準備する工程と、前記試料液を保持する保持具を準備する工程と、前記反射光検出型顕微鏡に備わる試料台に前記保持具に保持した前記試料液を載置する工程と、前記反射光検出型顕微鏡により前記観察対象物を検出する工程と、を備え、前記保持具には、前記試料液との接触界面を形成する該界面の少なくとも一領域に、背景反射光の生成を抑えることができる程度に前記試料液の媒質の屈折率に近い屈折率を有する材質からなる背景反射光防止層が形成されていることを特徴とする顕微観察方法を提供するものである。
【００１１】
上記顕微観察方法によれば、観察対象物を含む試料液を、試料液の媒質の屈折率に近い屈折率を有する材質からなる背景反射光防止層が形成された保持具に保持して、これを反射光検出型顕微鏡に備わる試料台に載置して顕微観察するようにしたので、その背景反射光防止層と試料液との接触界面近傍での観察対象物の検出を、背景反射光に邪魔されることなく良好に行うことができる。
【００１２】
上記顕微観察方法においては、前記反射光検出型顕微鏡は、共焦点顕微鏡であることが好ましい。
【００１３】
一方、本発明は、その第２の観点では、顕微観察のため試料液を保持するために用いられる保持具であって、前記保持具には、前記試料液との接触界面を形成する該界面の少なくとも一領域に、背景反射光の生成を抑えることができる程度に前記試料液の媒質の屈折率に近い屈折率を有する材質からなる背景反射光防止層が形成されていることを特徴とする顕微観察用試料保持具を提供するものである。
【００１４】
上記顕微観察用試料保持具によれば、試料液との接触界面を形成する該界面の少なくとも一領域に、試料液の媒質の屈折率に近い屈折率を有する材質からなる背景反射光防止層が形成されているので、例えば反射光検出型顕微鏡により顕微観察する際に、その背景反射光防止層と試料液との接触界面近傍での観察対象物の検出を、背景反射光に邪魔されることなく良好に行うことができる。
【００１５】
上記顕微観察用試料保持具においては、その保持具の形態がカバーガラス、ガラスボトムディッシュ、スライドガラス、又はフィルムであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、反射光を検出して顕微観察する際に、試料用の保持具と試料液との接触界面において生じる背景反射光を抑えて、その接触界面近傍での観察対象物の検出を、背景反射光に邪魔されることなく良好に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明に使用可能な、共焦点顕微鏡の概略構成図である。
【図２】本発明による顕微観察方法の一実施形態を示す概略構成図である。
【図３】本発明による顕微観察方法の他の実施形態を示す概略構成図である。
【図４】試験例１において、酵母を含む試料液を倒立型共焦点レーザー顕微鏡で顕微観察（１００倍）した結果を示す顕微観察像であり、図４（ａ）は顕微観察用試料保持具として、通常のカバーガラスを使用したときの結果を示し、図４（ｂ）は顕微観察用試料保持具として、水に近似した屈折率を有する樹脂で被覆してなる樹脂被覆カバーガラスを使用したときの結果を示す。
【図５】試験例２において、大腸菌を含む試料液を倒立型共焦点レーザー顕微鏡で顕微観察（１００倍）した結果を示す顕微観察像であり、図５（ａ）は顕微観察用試料保持具として、通常のカバーガラスを使用したときの結果を示し、図５（ｂ）は顕微観察用試料保持具として、水に近似した屈折率を有する樹脂で被覆してなる樹脂被覆カバーガラスを使用したときの結果を示す。
【図６】試験例３において、顕微観察用試料保持具として、水に近似した屈折率を有する樹脂で被覆してなる樹脂被覆カバーガラスを使用して、緑膿菌を含む試料液を倒立型共焦点レーザー顕微鏡で顕微観察（６０倍）した結果を示す顕微観察像である。
【図７】試験例４において、酵母を含む試料液を倒立型共焦点レーザー顕微鏡で顕微観察（２０倍）した結果を示す顕微観察像であり、図７（ａ）は顕微観察用試料保持具として、通常のガラスボトムディッシュを使用したときの結果を示し、図７（ｂ）は顕微観察用試料保持具として、ガラスボトムディッシュの内側底面のカバーガラス部の一部の領域をポリヒドロキシメチルアクリルアミドゲルで被覆してなるポリヒドロキシメチルアクリルアミドゲル被覆ガラスボトムディッシュを使用したときの結果を示す。
【図８】試験例５において、酵母を含む試料液を倒立型共焦点レーザー顕微鏡で顕微観察（２０倍）した結果を示す顕微観察像であり、図８（ａ）は顕微観察用試料保持具として、通常のガラスボトムディッシュを使用したときの結果を示し、図８（ｂ）は顕微観察用試料保持具として、ガラスボトムディッシュの内側底面のカバーガラス部の一部の領域を寒天ゲルで被覆してなる寒天ゲル被覆ガラスボトムディッシュを使用したときの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、図面を参照しつつ本発明について更に詳細に説明する。
【００１９】
図１には、本発明に使用可能な反射光検出型顕微鏡の例として、共焦点顕微鏡１０の概略構成が示される。図１に示されるように共焦点顕微鏡においては、顕微鏡に備わる半導体レーザー等の照射光射出系１１から出た照射光Ｐ１は、ピンホール１２、コリメータレンズ１３、スプリッター１４、対物レンズ１５を通って対象物１６に当り、生じた反射光Ｐ２がスプリッター１４、結像レンズ１７、ピンホール１８を通って、顕微鏡に備わる反射光受光系１９に至る。その際、所定の孔径を有するピンホール１２を通って点光源として射出した照射光Ｐ１は、対象物１６が載置されている観察対象部分の焦点位置においては、所定の極狭領域を有する集光スポットＣ１に集光される。更に、照射光Ｐ１の集光スポットＣ１と共役な位置（像位置）である反射光Ｐ２の結像スポットＣ２には、所定の孔径を有するピンホール１８が配されており、反射光Ｐ２としてそのピンホールを通過したもののみが反射光受光系１９に到達するようにしている。これにより、反射光Ｐ２として、所定の焦点位置における集光スポットＣ１以外からの光に由来するものが排除されて、照射光Ｐ１の焦点位置に対応する反射光Ｐ２を選択的に検出するようにしている。そのうえで、図示しない走査手段により、観察する空間座標位置にわたって照射光Ｐ１を当てる所定の焦点位置を走査しつつ、反射光のデータを焦点位置ごとに取得するようにしている。そして、顕微鏡に備わる制御コンピュータ系２０において、例えば焦点位置を照射光の光軸に直交するＸＹ平面方向に走査することにより、焦点面の反射光像を再構成したり、更にはその焦点位置を光軸方向に走査することにより、３次元の反射光像を再構成したりすることができるようになっている。なお、ピンホール１２、１８の孔径は、目的に応じて任意に可変とされている。このような構成を採用しているので、共焦点顕微鏡では、照射光の光軸方向に高い解像度とコントラストが得られ、ひいては一度の操作で広視野にわたって微細な構造が顕微観察できる。
【００２０】
図２には、本発明による顕微観察方法の一実施形態が示されている。すなわち、この図では、観察対象物として微生物Ｘを含む試料液１を、保持具２に保持した状態で、反射光検出型顕微鏡に備わる試料台３に載置している。反射光検出型顕微鏡としては、例えば図１に説明した共焦点顕微鏡などである。微生物Ｘを含む試料液１は、その媒質１ａとしては、例えば水などである。保持具２は、その底板部２ａの材質としては、例えばガラスなどである。更に、保持具２の底板部２ａの試料液１に接触する側の上面に、背景反射光防止層４が形成されている。そして、反射光検出型顕微鏡に備わる照射光射出系１１から照射された照射光Ｐ１が、保持具２の底板部２ａ及びその上面に形成された背景反射光防止層４を通って、観察対象物である微生物Ｘに当たり、その結果生成した反射光Ｐ２が、再び背景反射光防止層４及びその下面側に配置している保持具２の底板部２ａを通って、反射光検出型顕微鏡に備わる反射光受光系１９で検出される。
【００２１】
ここで、背景反射光防止層４は、試料液１の媒質１ａの屈折率に近い屈折率を有する材質からなる。これにより、試験液１が接する接触界面５において、界面間の構成物質の屈折率の差に起因して生じる反射光、すなわち顕微観察の邪魔になる背景反射光が抑えられて、その近傍に存する観察対象物である微生物Ｘを良好に検出できるようになる。
【００２２】
試料液１の媒質１ａの屈折率の値と、背景反射光防止層４をなす材質の屈折率の値との差は、例えば±０．０８の範囲内であることが好ましく、±０．０５の範囲内であることがより好ましく、±０．０１の範囲内であることが更により好ましく、±０．００５の範囲内であることが特に好ましい。屈折率の値の差がこの範囲内であれば、顕微観察の邪魔になる背景反射光がより効果的に抑えられる。また、背景反射光防止層４の厚みは、その下限として０．２μｍ以上であることが好ましく、０．５μｍ以上であることがより好ましく、１μｍ以上であることが更により好ましく、２μｍ以上であることが特に好ましい。背景反射光防止層４の厚みがこの範囲であれば、一般に使用するレンズの集光スポットサイズの光軸方向の厚みよりも厚いので、顕微観察の邪魔になる背景反射光がより効果的に抑えられる。一方、背景反射光防止層４の厚みが上記範囲未満であると、保持具２の底板部２ａと背景反射光防止層４とで形成される界面６（接触界面５ではない他の界面６）と、観察対象物である微生物Ｘとの距離が十分でないため、界面６における構成物質の屈折率の差に起因して生じる反射光が、検出の邪魔をするようになってしまう場合がある。また、背景反射光防止層４の厚みは、使用するレンズの作動距離に応じて、例えば１００倍レンズの場合には、１３０μｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以下であることがより好ましく、５０μｍ以下であることが更により好ましく、５μｍ以下であることが特に好ましい。すなわち、背景反射光防止層４の厚みが、使用するレンズの作動距離に対して厚すぎる場合には、観察許容範囲を超えてしまう場合がある。
【００２３】
背景反射光防止層４の材質としては、樹脂、ゲル、特殊ガラス等であってよく、特に制限はないが、典型的に、例えば媒質１ａが水であれば、その屈折率は１．３３３（ナトリウムのＤ線・波長５８９．３ｎｍの光に対して）であるので、その屈折率に近い屈折率を有する材質を用いて背景反射光防止層４を形成する。水に屈折率が近い材質としては、市販の低屈折率樹脂（例えば、光硬化性樹脂（商品名「MY-133-EA 」、MY Polymers社製））、ポリヒドロキシメチルアクリルアミドゲル、寒天ゲル、ポリアクリルアミドゲル等が挙げられる。また、水に屈折率が近い材質のその屈折率（ナトリウムのＤ線・波長５８９．３ｎｍの光に対して）としては、屈折率の値の差が上記した範囲内であることが好ましい。例えば１．３３３±０．０８であることが好ましく、１．３３３±０．０５であることがより好ましく、１．３３３±０．０１であることが更により好ましく、１．３３３±０．００５であることが特に好ましい。
【００２４】
保持具２としては、試料液を保持して顕微鏡に備わる試料台に載置して、その試料液を顕微観察の対象とするような機能を備えたものであればよく、特に限定されるものではない。また、顕微鏡に備わる照射光射出系による照射光や、照射光が対象物に当って生成した反射光の光路を遮らない、透明性を有する観察窓部を有している場合には、その観察窓部を通した顕微観察ができるように構成されていることが好ましい。例えば、カバーガラス、ガラスボトムディッシュ、スライドガラス、フィルム等の形態であってよい。
【００２５】
背景反射光防止層４を形成する方法に特に制限はない。例えば、光硬化樹脂であれば、樹脂をスピンコート等の手段により、保持具２の試料液１に接触する側の面の少なくとも一領域に塗布した後、ＵＶ照射による硬化処理を行うことなどにより、所定厚さを有する樹脂層を形成することができる。また、ゲルであれば、保持具２の試料液１に接触する側の面の少なくとも一領域に、シリコンガスケットからなる枠体を接着して所定の深さと形状で溝部を形成して、その溝部にゲルのプレミックス液を入れて、アクリル板等により蓋をし、所定温度に冷却することなどにより、所定厚さを有するゲル層を形成することができる。
【００２６】
図３には、本発明による顕微観察方法の他の実施形態が示されている。この実施形態では、背景反射光防止層４ａは、保持具２に保持された状態の試料液１の上面に接するように形成されている。このように、背景反射光防止層４ａを、保持具２に保持された状態の試料液１の上面に接するように配置すれば、これを配置しない場合に、外気やカバーガラス等と接する界面（接触界面５ではない他の界面６）から生じる背景反射光を抑えることにより、その背景反射光防止層４ａとの接触界面近傍に存在する観察対象である微生物Ｘを良好に検出することができる。このとき、背景反射光防止層４ａの材質の種類、背景反射光防止層４ａの厚さ、試料液１の媒質１ａとの屈折率の値の差、背景反射光防止層４ａを形成する材質が呈すべき屈折率等は、図２で説明した背景反射光防止層４と同様である。
【００２７】
図３に示す実施形態のように、背景反射光防止層４ａを、保持具２に保持された状態の試料液１の上面に接するように形成する方法としては、例えば、カバーガラス上に、シリコンガスケットからなる枠体を接着して所定の深さと形状で溝部を形成して、その溝部を試料液１で満たしたうえ、上部を、上記した所望の屈折率を呈する光硬化性樹脂でコーティングしたカバーガラスや光硬化性樹脂製のシートなどを用いて、その樹脂層が試料液１に接するようにシーリングすることなどが挙げられる。また、光硬化性樹脂のかわりに、上記した所望の屈折率を呈するゲル層を形成したカバーガラスを用いて、そのゲル層が試料液１に接するようにシーリングすることなども挙げられる。更には、カバーガラス上に、上記した所望の屈折率を呈するゲルを用いてマイクロチャネルあるいはマイクロチャンバーを作り、そのマイクロチャネル内部へ試料液を通液し、マイクロチャネルを流れる試料液に接する接触界面近傍に存する観察対象物を検出する態様なども、任意に実施することができる。
【００２８】
なお、図２、３では、保持具２の底板部２ａ側から試料液１に照射光Ｐ１が照射される態様を示したが、例えば、図２、３に示した実施形態における、その保持具２の上方側から照射光Ｐ１を照射する態様を採用してもよい。
【００２９】
本発明の別の観点からは、顕微観察用保持具であって、試料液との接触界面の形成が予定される少なくとも一領域に、上記した背景反射光防止層を予め形成してなる、カバーガラス、ガラスボトムディッシュ、スライドガラス、フィルム等の顕微観察用保持具を提供することができる。この場合において、背景反射光防止層の材質の種類、背景反射光防止層の厚さ、背景反射光防止層を形成する材質が呈すべき屈折率、背景反射光防止層の形成方法等は、図２で説明した背景反射光防止層４ないし図３で説明した背景反射光防止層４ａと同様である。
【００３０】
本発明が適用される顕微観察の手法としては、例えば、反射光検出型の共焦点顕微鏡、反射型顕微鏡等が好ましく例示される。特に、共焦点顕微鏡では、半導体レーザーなどの照射光を所定の焦点位置に照射し、それが対象物に当って反射して生成した反射光のデータを、観察する空間座標位置にわたって焦点位置ごとに取得して、得られたデータを再構成して顕微観察像を得る手法を採用しているので、一度の操作で広視野にわたって微細な構造が顕微観察できる。
【００３１】
本発明が適用される観察対象は、特に制限はない。例えば、生物試料の顕微観察に好適に利用し得る。生物試料としては、例えば、細菌類、古細菌類、真菌類、酵母類、微細藻類、原生動物等の微生物が挙げられる。また、動物細胞、植物細胞、ウイルス、ファージ、及びそれらが産生する胞子、芽胞、膜小胞等が挙げられる。
【００３２】
本発明によれば、上記に説明した構成により、反射光を検出して顕微観察する際に、試料用の保持具と試料液との接触界面において生じる背景反射光を抑えて、その接触界面近傍での観察対象物の検出を、背景反射光に邪魔されることなく良好に行うことができる。これによれば、例えば、顕微観察による観察対象物の定量的な測定が容易になる。また、例えば、細胞が物質表面と相互作用するときに重要な役割を担う接着因子を、それが機能している物質表面で直接的に観察することが容易になる。
【実施例】
【００３３】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００３４】
［製造例１］（樹脂被覆カバーガラス  その１）
顕微観察用の試料保持具として、特定の屈折率を有する樹脂でカバーガラスの片側全面を被覆してなる、樹脂被覆カバーガラスを作製した。具体的には、以下のとおり作製した。
【００３５】
光硬化性樹脂（Acrylated fluoro resins、硬化前屈折率：１．３３３（５８９ｎｍ）、硬化後屈折率：１．３３８（５８９ｎｍ））（商品名「MY-133-EA 」、MY Polymers社製）の３００μＬを、カバーガラス（縦横：２４×６０ｍｍ、厚み：０．１７−０．２５ｍｍ、屈折率：ne=1.5255±0.0015、アッベ数：νe=56±2）（商品名「NEO カバーグラス」、松波硝子工業社製）の片側面に滴下し、スピンコーターを使用して被覆した（スピンコート条件: 最高速度４０００ｒｐｍ、３０秒、２０℃）。次いで、酸素を遮断するために食品用ラップフィルムでシーリングした状態で、ＵＶランプ（波長：３６５ｎｍ）の光を照射して、樹脂を硬化させた。
【００３６】
＜試験例１＞
製造例１で作製した樹脂被覆カバーガラスを用いて、酵母を含む試料液の顕微観察を行った。具体的には、以下のとおり行った。
【００３７】
酵母（Saccharomyces pombe JY1株）を、ＹＰＤ液体培地中３０℃で一晩撹拌培養し、遠心分離により菌体ペレットを回収後、リン酸緩衝液（ＰＢＳバッファー）中に分散させることにより、酵母を含む試料液を調製した。
【００３８】
反射光検出型顕微鏡としては、倒立型共焦点レーザー顕微鏡（商品名「共焦点レーザー顕微鏡システム A1」、ニコン社製）を使用し、倍率１００倍の対物レンズ（商品名「Plan Apoλ 100×1.45 Oil」、ニコン社製）で観察した。
【００３９】
製造例１で作製したカバーガラスの、樹脂を被覆した側のカバーガラス表面上に、上記試料液を３０μＬ滴下したところ、試料液はカバーガラス上で水滴状の状態で保持された。
【００４０】
上記カバーガラス上に保持した試料液を、倒立型共焦点レーザー顕微鏡の試料台に載置した。顕微観察のための照射光としては、顕微鏡システムに備わる照射光射出系による半導体レーザーとし、その照射光が対象物に当って反射して生成した反射光を、システムに備わる反射光受光系で検出した。１の照射／検出（撮像）あたりの集光スポットの領域としては、光軸方向に０．２３μｍ、光軸に直交するＸＹ平面方向に０．４８μｍとし、撮像走査範囲としてはカバーガラスよりも対物レンズに近い位置から厚み０．５μｍずつ、上部に向かって計２０μｍ分の厚みをスキャンして、撮像した座標位置ごとに検出された反射光の強度を再構成して、観察対象物である酵母の顕微観察像を得た。なお対照として、製造例１で用いた樹脂で被覆する前の、通常のカバーガラスに上記試料液を滴下して、同様の顕微観察を行った。結果を図４に示す。
【００４１】
その結果、図４（ａ）に示されるように、通常のカバーガラスを用いた場合では、カバーガラス表面近傍で酵母の菌体の輪郭が観察できなかったのに対して、図４（ｂ）に示されるように、製造例１で作製した樹脂被覆カバーガラスを用いた場合では、当該カバーガラス表面近傍で酵母の菌体の輪郭がよく観察できた。この結果は、通常のカバーガラスを用いた場合では、カバーガラスと試料液との接触界面における屈折率の差が大きく、反射光が生成して、それが共焦点顕微鏡像に大きく影響を与えたのに対して、製造例１で作製した樹脂被覆カバーガラスを用いた場合では、試料液の媒質であるリン酸緩衝液が有する屈折率（水に近似した屈折率）に近い屈折率を有する材質、すなわち製造例１で用いた光硬化樹脂により一定厚さの層が形成されているために、試料液との接触界面における反射光の生成が抑えられ、それが防止層となって共焦点顕微鏡像に影響を与える背景反射光が抑えられたためと考えられた。
【００４２】
＜試験例２＞
製造例１で作製した樹脂被覆カバーガラスを用いて、大腸菌を含む試料液の顕微観察を行った。具体的には、以下のとおり行った。
【００４３】
大腸菌（Escherichia coli K12株）を、ＬＢ液体培地中３０℃で一晩撹拌培養し、遠心分離により菌体のペレットを回収後、リン酸緩衝液（ＰＢＳバッファー）中に分散させることにより、大腸菌を含む試料液を調製した。この大腸菌を含む試料液について、試験例１と同様にして、倒立型共焦点レーザー顕微鏡による顕微観察を行った。なお、１の照射／検出（撮像）あたりの集光スポットの領域としては、光軸方向に０．２３μｍ、光軸に直交するＸＹ平面方向に０．４８μｍとし、撮像走査範囲としてはカバーガラスよりも対物レンズに近い位置から厚み０．３μｍずつ、上部に向かって計１２μｍ分の厚みをスキャンした。結果を図５に示す。
【００４４】
その結果、図５（ａ）に示されるように、通常のカバーガラスを用いた場合では、カバーガラス表面近傍で大腸菌の菌体の輪郭が観察できなかったのに対して、図５（ｂ）に示されるように、製造例１で作製した樹脂被覆カバーガラスを用いた場合では、当該カバーガラス表面近傍で大腸菌の菌体の輪郭がよく観察できた。この結果は、酵母を含む試料液を顕微観察した試験例１と同様であり、通常のカバーガラスを用いた場合では、カバーガラスと試料液との接触界面における屈折率の差が大きく、反射光が生成して、それが共焦点顕微鏡像に大きく影響を与えたのに対して、製造例１で作製した樹脂被覆カバーガラスを用いた場合では、試料液の媒質であるリン酸緩衝液が有する屈折率（水に近似した屈折率）に近い屈折率を有する材質、すなわち製造例１で用いた光硬化樹脂により一定厚さの層が形成されているために、試料液との接触界面における反射光の生成が抑えられ、それが防止層となって共焦点顕微鏡像に影響を与える背景反射光が抑えられたためと考えられた。
【００４５】
［製造例２］（樹脂被覆カバーガラス  その２）
顕微観察用の試料保持具として、特定の屈折率を有する樹脂でカバーガラスの一部の領域を被覆してなる、樹脂被覆カバーガラスを作製した。具体的には、以下のとおり作製した。
【００４６】
シリコン樹脂（商品名「SYLGARD 184」、東レ・ダウコーニング社製）からなる２ｍｍ厚のシートを、１１×２８ｍｍ画分切り出し、更にその中央部を５×６ｍｍ画分切り抜き、シリコン樹脂からなる枠を作成して、この枠を、製造例１で使用したのと同種のカバーガラス（縦横：２４×６０ｍｍ、厚み：０．１７−０．２５ｍｍ）（商品名「NEO カバーグラス」、松波硝子工業社製）にプラズマ処理により接着した。次いで、シリコン樹脂からなる枠を接着した側の、その枠に囲まれた領域のカバーガラス表面を、製造例１で使用したのと同種の光硬化性樹脂（商品名「MY-133-EA 」、MY Polymers社製）にて、そのおよそ３００μＬを使用して、製造例１と同様にして、被覆した。
【００４７】
＜試験例３＞
製造例２で作製した樹脂被覆カバーガラスを用いて、緑膿菌を含む試料液の顕微観察を行った。具体的には、以下のとおり行った。
【００４８】
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa PA01株）を、ＬＢ液体培地中３０℃で一晩撹拌培養し、これを、硝酸を１００ｍＭの濃度で含む新たなＬＢ液体培地に、濁度（６００ｎｍの吸光度で測定）が０．０１となるよう植菌した。その７０μＬ分採取して、製造例２で作製したカバーガラスの、シリコン樹脂からなる枠に囲まれた、樹脂で被覆されたカバーガラス表面の領域へ添加した後、シリコン樹脂（商品名「SYLGARD 184」、東レ・ダウコーニング社製）からなる２ｍｍ厚のシートで上部に蓋をしたうえ、真空パウチ袋内に酸素吸収剤と共存させた状態で設置して、真空パウチ袋の封をし、３０℃で２１時間静置した。
【００４９】
上記カバーガラス上に保持した試料液を、上記期間の静置後に、倒立型共焦点レーザー顕微鏡の試料台に載置し、倍率６０倍の対物レンズ(商品名「Apo 60× oil λS DIC N2」、ニコン社製)で観察した。１の照射／検出（撮像）あたりの集光スポットの領域としては、光軸方向に０．４１μｍ、光軸に直交するＸＹ平面方向に４．４１μｍとし、撮像走査範囲としてはカバーガラスよりも対物レンズに近い位置から厚み０．５μｍずつ、上部に向かって計２０μｍ分の厚みをスキャンして、撮像した座標位置ごとに検出された反射光の強度を再構成して、観察対象物である緑膿菌の顕微観察像を得た。結果を図６に示す。
【００５０】
その結果、図６に示されるように、樹脂被覆カバーガラスの表面上には、緑膿菌からなるバイオフィルムが形成されており、当該カバーガラス表面近傍に存在するバイオフィルムの底面を含め、包括的なバイオフィルム像を取得することができた。
【００５１】
［製造例３］（ポリヒドロキシメチルアクリルアミドゲル被覆ガラスボトムディッシュ）
顕微観察用の試料保持具として、ガラスボトムディッシュの底面のカバーガラス部の一部の領域がポリヒドロキシメチルアクリルアミドゲルで被覆されてなる、ポリヒドロキシメチルアクリルアミドゲル被覆ガラスボトムディッシュを作製した。具体的には、以下のとおり作製した。
【００５２】
シリコン樹脂（商品名「SYLGARD 184」、東レ・ダウコーニング社製）のプレ調製液として、「SYLGARD 184 silone elastomer base」（東レ・ダウコーニング社製）に「SYLGARD 184 silone elastomer curling agent」（東レ・ダウコーニング社製）を混合した溶液（base : curling agent=10:1）を調製し、これを、ガラスボトムディッシュ（形状：３５mm丸型、カバーガラス部の厚み：０.１５−０.１８ｍｍ）（商品名「IWAKI ガラスベースディッシュ」、ＡＧＣテクノグラス社製）の内側底面へ滴下し、空気を吹き付けながら被覆した。次いで、これを１００℃のホットプレート上に置き、シリコン樹脂を硬化させた後、ガラスボトムディッシュのカバーガラス部を覆った一部分をカッターで１０×１０ｍｍ区画分四角く切り抜いた。切り抜いた部分は厚み約１５μｍ程度の窪みとなった。次いで、この窪みの部分に、ヒドロキシメチルアクリルアミドのプレゲル溶液（8 wt% N-(hydoroxymethyl)acrylamide（東京化成工業社製）、架橋剤: N, N’-Methylenebisacrylamide（東京化成工業社製）、反応促進剤: N, N, N’, N’,-tetramethylethylenediamine（東京化成工業社製）、重合開始剤: Ammonium Peroxodisulfate（東京化成工業社製）、溶媒：水）を添加し、上部をアクリル製の板で蓋をして、その上に更に重しを置いて２時間室温でゲル化反応させた。
【００５３】
＜試験例４＞
製造例３で作製したポリヒドロキシメチルアクリルアミドゲル被覆ガラスボトムディッシュを用いて、酵母を含む試料液の顕微観察を行った。具体的には、以下のとおり行った。
【００５４】
酵母（Saccharomyces pombe JY1株）を含む試料液は、試験例１と同様にして調製した。
【００５５】
反射光検出型顕微鏡としては、試験例１と同じく倒立型共焦点レーザー顕微鏡（商品名「共焦点レーザー顕微鏡システム A1」、ニコン社製）を使用し、ただし対物レンズとしては倍率２０倍の対物レンズ（商品名「Plan Apo VC 20×0.75 DIC N2」、ニコン社製）を用いて観察した。
【００５６】
製造例３で作製したガラスボトムディッシュの内側底面の、上記ポリヒドロキシメチルアクリルアミドゲルを被覆した表面上に、上記試料液を３０μＬ滴下したところ、試料液はガラスボトムディッシュの内側底面上で水滴状の状態で保持された。
【００５７】
上記ガラスボトムディッシュの内側底面上に保持した試料液を、倒立型共焦点レーザー顕微鏡の試料台に載置した。顕微観察のための照射光としては、顕微鏡システムに備わる照射光射出系による半導体レーザーとし、その照射光が対象物に当って反射して生成した反射光を、システムに備わる反射光受光系で検出した。１の照射／検出（撮像）あたりの集光スポットの領域としては、光軸方向に０．４１μｍ、光軸に直交するＸＹ平面方向に２．８４μｍとし、撮像走査範囲としてはカバーガラスよりも対物レンズに近い位置から厚み２．５μｍずつ、上部に向かって計１００μｍ分の厚みをスキャンして、撮像した座標位置ごとに検出された反射光の強度を再構成して、観察対象物である酵母の顕微観察像を得た。なお対照として、製造例３で用いたゲルで被覆する前の、通常のガラスボトムディッシュ底面のカバーガラス部に上記試料液を滴下して、同様の顕微観察を行った。結果を図７に示す。
【００５８】
その結果、図７（ａ）に示されるように、通常のガラスボトムディッシュを用いた場合では、ガラスボトムディッシュ底面のカバーガラス部表面近傍で酵母の菌体の輪郭が観察できなかったのに対して、図７（ｂ）に示されるように、製造例３で作製したポリヒドロキシメチルアクリルアミドゲル被覆ガラスボトムディッシュを用いた場合では、当該ガラスボトムディッシュの内側底面のカバーガラス部表面近傍で酵母の菌体の輪郭がよく観察できた。この結果は、通常のガラスボトムディッシュを用いた場合では、カバーガラス部と試料液との接触界面における屈折率の差が大きく、反射光が生成して、それが共焦点顕微鏡像に大きく影響を与えたのに対して、製造例３で作製したポリヒドロキシメチルアクリルアミドゲル被覆ガラスボトムディッシュを用いた場合では、試料液の媒質であるリン酸緩衝液が有する屈折率（水に近似した屈折率）に近い屈折率を有する材質、すなわちポリヒドロキシメチルアクリルアミドゲルにより一定厚さの層が形成されているために、試料液との接触界面における反射光の生成が抑えられ、それが防止層となって共焦点顕微鏡像に影響を与える背景反射光が抑えられたためと考えられた。
【００５９】
［製造例４］（寒天ゲル被覆ガラスボトムディッシュ）
顕微観察用の試料保持具として、ガラスボトムディッシュの底面のカバーガラス部の一部の領域が寒天ゲルで被覆されてなる、寒天ゲル被覆ガラスボトムディッシュを作製した。具体的には、以下のとおり作製した。
【００６０】
製造例３と同様に、ガラスボトムディッシュ（形状：３５mm丸型、カバーガラス部の厚み：０.１５−０.１８ｍｍ）（商品名「IWAKI ガラスベースディッシュ」、ＡＧＣテクノグラス社製）の内側底面に、シリコン樹脂（商品名「SYLGARD 184」、東レ・ダウコーニング社製）を被覆し、ガラスボトムディッシュのカバーガラス部を覆った一部分をカッターで１０×１０ｍｍ区画分四角く切り抜いた。切り抜いた部分は厚み約１５μｍ程度の窪みとなった。次いで、窪みの部分に、寒天ゲルのプレゲル溶液（0.8 wt%寒天ゲル、溶媒：水）を添加し、上部をアクリル製の板で蓋をして、その上に更に重しを置いた状態で静置しゲル化させた。
【００６１】
＜試験例５＞
製造例４で作製した寒天ゲル被覆ガラスボトムディッシュを用いて、酵母を含む試料液の顕微観察を行った。具体的には、以下のとおり行った。
【００６２】
酵母（Saccharomyces pombe JY1株）を含む試料液は、試験例１と同様にして調製した。
【００６３】
反射光検出型顕微鏡としては、試験例１と同じく倒立型共焦点レーザー顕微鏡（商品名「共焦点レーザー顕微鏡システム A1」、ニコン社製）を使用し、ただし対物レンズとしては倍率２０倍の対物レンズ（商品名「Plan Apo VC 20×0.75 DIC N2」、ニコン社製）を用いて観察した。
【００６４】
製造例４で作製したガラスボトムディッシュの内側底面の、上記寒天ゲルを被覆した表面上に、上記試料液を３０μＬ滴下したところ、試料液はガラスボトムディッシュの内側底面上で水滴状の状態で保持された。
【００６５】
上記ガラスボトムディッシュの内側底面上に保持した試料液を、倒立型共焦点レーザー顕微鏡の試料台に載置した。顕微観察のための照射光としては、顕微鏡システムに備わる照射光射出系による半導体レーザーとし、その照射光が対象物に当って反射して生成した反射光を、システムに備わる反射光受光系で検出した。１の照射／検出（撮像）あたりの集光スポットの領域としては、光軸方向に０．４１μｍ、光軸に直交するＸＹ平面方向に２．８４μｍとし、撮像走査範囲としてはカバーガラスよりも対物レンズに近い位置から厚み０．９７５μｍずつ、上部に向かって計２６．６８μｍ分の厚みをスキャンして、顕微観察を行った。なお対照として、製造例４で用いたゲルで被覆する前の、通常のガラスボトムディッシュ底面のカバーガラス部に上記試料液を滴下して、対物レンズに近い位置から厚み０．６μｍずつ、上部に向かって計１１．６μｍ分の厚みをスキャンすることにより、同様に顕微観察を行った。結果を図８に示す。
【００６６】
その結果、図８（ａ）に示されるように、通常のガラスボトムディッシュを用いた場合では、ガラスボトムディッシュ底面のカバーガラス部表面近傍で酵母の菌体の輪郭が観察できなかったのに対して、図８（ｂ）に示されるように、製造例４で作製した寒天ゲル被覆ガラスボトムディッシュを用いた場合では、当該ガラスボトムディッシュの内側底面のカバーガラス部表面近傍で酵母の菌体の輪郭がよく観察できた。この結果は、通常のガラスボトムディッシュを用いた場合では、カバーガラス部と試料液との接触界面における屈折率の差が大きく、反射光が生成して、それが共焦点顕微鏡像に大きく影響を与えたのに対して、製造例４で作製した寒天ゲル被覆ガラスボトムディッシュを用いた場合では、試料液の媒質であるリン酸緩衝液が有する屈折率（水に近似した屈折率）に近い屈折率を有する材質、すなわち寒天ゲルにより一定厚さの層が形成されているために、試料液との接触界面における反射光の生成が抑えられ、それが防止層となって共焦点顕微鏡像に影響を与える背景反射光が抑えられたためと考えられた。
【符号の説明】
【００６７】
１  試料液
１ａ  媒質
２  保持具
２ａ  底板部
３  試料台
４、４ａ  背景反射光防止層
５  接触界面
６  他の界面
１０  共焦点顕微鏡
１１  照射光射出系
１２、１８  ピンホール
１３  コリメータレンズ
１４  スプリッター
１５  対物レンズ
１６  対象物
１７  結像レンズ
１９  反射光受光系
２０  制御コンピュータ系
Ｐ１  照射光
Ｐ２  反射光
Ｃ１  集光スポット
Ｃ２  結像スポット
Ｘ  微生物
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020112633.tif 000009
【図８】
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