(57)【要約】【課題】胃がん幹細胞の細胞機能と密接に関連する新たな糖鎖マーカーを見出すこと【解決手段】本発明は、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖の、胃がん幹細胞マーカーとしての使用に関する。これらの糖鎖抗原は、胃がん幹細胞マーカーである接着分子CD44v9を胃がん細胞へ導入することにより発現が誘導される。一態様において、硫酸化糖鎖は、HSO3-Galβ(1-4)Glc-、HSO3-Hex-Galβ(1-4)Glc-、又はHSO3-Hex-GlcNAcβ-の構造を有する。一態様において、フコシル化糖鎖は、以下の式のいずれかの構造を有する。2020204471.tif 000019【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖の発現を測定する工程を含む、胃がん幹細胞の検出方法。
【請求項２】
被検試料中のCD44v9の発現を測定する工程を更に含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
糖鎖が硫酸化糖鎖である、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】
硫酸化糖鎖が、HSO3-Galβ(1-4)Glcβ-、HSO3-Hex-Galβ(1-4)Glcβ-、又はHSO3-Hex-GlcNAcβ-の構造を有する、請求項3記載の方法。
【請求項５】
糖鎖がフコシル化糖鎖である、請求項1又は2記載の方法。
【請求項６】
フコシル化糖鎖が、以下のいずれかの構造を有する、請求項5記載の方法。
【化１】
2020204471.tif 000017
【請求項７】
硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖に特異的に結合する抗体又はレクチンを含む、胃がん幹細胞の検出用試薬。
【請求項８】
CD44v9に特異的に結合する抗体を更に含む、請求項7記載の試薬。
【請求項９】
がん細胞に、CD44をコードする核酸を導入することを含む、該がん細胞における、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖の発現を誘導する方法。
【請求項１０】
CD44をコードする核酸を導入したがん細胞における、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖の発現を評価することを更に含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
糖鎖が硫酸化糖鎖である、請求項9又は10記載の方法。
【請求項１２】
硫酸化糖鎖が、HSO3-Galβ(1-4)Glcβ-、HSO3-Hex-Galβ(1-4)Glcβ-、又はHSO3-Hex-GlcNAcβ-の構造を有する、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
糖鎖がフコシル化糖鎖である、請求項9又は10記載の方法。
【請求項１４】
フコシル化糖鎖が、以下のいずれかの構造を有する、請求項13記載の方法。
【化２】
2020204471.tif 000018
【請求項１５】
CD44が、CD44s又はCD44v9である、請求項9〜14のいずれか1項記載の方法。
【請求項１６】
がん細胞が、胃がん細胞である、請求項9〜15のいずれか1項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖抗原を用いた胃がん幹細胞の検出方法及び検出用試薬に関する。また、本発明は、がん細胞において糖鎖抗原の発現を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの再発、転移はがん治療を最も困難にしているが、近年その要因としてがん幹細胞（Cancer Stem Cells, CSC）が考えられている。がん幹細胞は、自己複製能と多分化能を有するがん細胞である。1つのがん幹細胞から、がん組織を再構築できるので、がん幹細胞が治療で完全に除去されないとがんの再発、転移を引き起こすと考えられる。さらに、がん幹細胞は、治療薬に対して感受性が低く、高い転移能を持つと言われている。そこで、再発や転移を防ぐために、がん幹細胞の特徴的なマーカーや性質を解析することでリスクの少ないがん治療が求められている（非特許文献1）。以上のことから、がん治療において悪性化した細胞における糖鎖発現の変化を腫瘍マーカーとして利用することが期待されている。
【０００３】
現状では30種類のがん幹細胞マーカーが知られているが、マーカーの大半は細胞表面上の糖タンパク質である（非特許文献1）。その中でもCD44は、ヒアルロン酸結合能を有し、多様な臓器で発現していることから、重要ながん幹細胞マーカーとして注目されている。CD44分子は、細胞外領域、膜内領域、及び細胞内領域に大きく分けることができ、細胞外領域にヒアルロン酸とのリンクモジュールが存在し、高度な糖鎖修飾を受けてヒアルロン酸に接着する。この糖鎖修飾がヒアルロン酸結合能の調節に関与している。また、CD44には、がん幹細胞特異的に発現しているバリアントアイソフォームが存在しており、CD44を構成する20個の構成エキソンのうち10個のエキソンが選択的スプライシングされる。バリアントエキソンを持たない標準型のCD44はCD44 standard（CD44s）と呼ばれ、リンパ球など様々な細胞で発現している（非特許文献1）。一方でCD44 variant 9（CD44v9）は胃がん幹細胞などに多く発現しているバリアントアイソフォームである（非特許文献2）。CD44v9陽性である胃がん幹細胞では、ピロリ菌の持つエフェクタータンパク質CagAが蓄積する。正常細胞では、CagAはオートファジーにより排除されるが、胃がん幹細胞では、CagAは、発がんタンパク質SHP2や極性制御タンパク質PAR1との相互作用により異常な細胞増殖シグナルの上昇を起こす（非特許文献3、4）。以上のことからCD44-v9は早期胃がんの転移に関与し異所性再発の有用なマーカーになることが示唆されてきた（非特許文献1）。さらにCD44は様々な部位に発現しているが、正常細胞のCD44は血液内に遊離しないことやヒアルロン酸と結合する前に活性化される必要があるため、がん細胞上のCD44を標的治療に利用することが期待されている（非特許文献5）。
【０００４】
一方、糖鎖は様々な生命現象に関連しており、特にがん化に伴う発現糖鎖の変化は古くから知られている（非特許文献6）。そのため、がん細胞から分泌される複合糖質を血清などから検出することでがん腫瘍マーカーとして用いることができる。このとき、より検出感度が高く早期発見が可能な糖鎖マーカーが有効である。そのため、がん研究の進歩にはがんと糖鎖の関係を知ることが非常に重要である。
【０００５】
また、糖鎖は、がん転移において重要な生体機能分子として働くことが知られている。正常細胞では、発現する糖鎖は遺伝子により精密に制御されている。しかし、がん細胞では、遺伝子変異が蓄積して制御機構が大きく乱れる。その結果、がん細胞では正常細胞には見られない異常な糖鎖の新生と糖鎖不全現象が起こる。糖鎖不全現象とは正常細胞で発現している複雑な構造を有する糖鎖が、がん細胞では合成が阻害され単純な糖鎖が蓄積する現象である（非特許文献7）。YoshimuraらはN−アセチルグルコサミン転移酵素III（GnT-III）でマウスメラノーマ細胞にGlcNAcを付加させることで高転移性のがん細胞の転移を劇的に低下させることを発見した（非特許文献8）。この作用機序として細胞分子であるE-カドヘリンへの異常な糖鎖付加が原因であると報告されている（非特許文献9）。また、E-カドヘリンは糖タンパク質であるグリピカン-3（GPC3）によって制御されている（非特許文献10）。このように細胞接着分子であるE-カドヘリンへの異常な糖鎖付加が細胞接着を喪失させる。
【０００６】
E-カドヘリンのような細胞-細胞間の接着と異なり、血管内皮細胞への接着という転移の過程において細胞−基質間の接着は原発巣からの離脱に必要な因子である。糖脂質や糖タンパク質に見られるsLeaやsLex抗原が血管内皮細胞に発現している細胞接着分子E-セレクチンと結合することが知られている（非特許文献11）。また、E-セレクチンのレセプターとして糖タンパク質CD44がある。CD44はヒアルロン酸結合能を有する糖タンパク質で細胞-細胞マトリックス間の接着を媒介する分子である。CD44はヒアルロン酸への結合による様々な生体機能を有しており、CD44上の脱シアル化および硫酸化などの糖鎖修飾がヒアルロン酸結合能を誘導することが明らかになった（非特許文献12）。
【０００７】
更に、硫酸化糖鎖やフコシル化糖鎖が、腫瘍細胞の遊走性に関与することが知られている（非特許文献13、14）。
【０００８】
このようにがん細胞が原発巣から離脱し、血管内を循環して血管内皮細胞へ着床するまでに様々な糖鎖が関連するため、がん研究において糖鎖のもつ機能解明は転移機構の解明につながると期待される。しかしながら、がん幹細胞、特に胃がん幹細胞に関しては、その転移性等の細胞機能と相関する糖鎖マーカーはほとんど解析されていない。
【０００９】
本発明者らは、糖鎖プライマー法という手法を用いて、細胞の糖鎖生合成能力を利用して、オリゴ糖を産生させて、該細胞の糖鎖生合成特性を反映した糖鎖ライブラリを構築する技術を開発している。糖鎖プライマー法とは、アルキルグリコシドである糖鎖プライマーを細胞培養中の培地へ投与し細胞内に取り込ませ、培地に放出された糖鎖伸長生成物を得るという手法である。この手法を用いることで、細胞の糖鎖生合成経路に沿った糖鎖を十分量入手することが可能となる。本発明者らは、この糖鎖プライマー法により、実際に、糖脂質型糖鎖、グリコサミノグリカン型糖鎖、O-結合型糖鎖を獲得している。
【００１０】
細胞内の糖転移酵素と糖鎖プライマーを反応させるためにはゴルジ体内に取り込ませて糖鎖伸長させる必要がある。Suzukiらは、比較的疎水性に富んだアグリコンが細胞膜やゴルジ体内を透過することを確認している（非特許文献15）。また、Miuraらは、糖脂質の分野においてラクトシルセラミド（Lac-Cer）がほとんど全てのスフィンゴ糖脂質の生合成前駆体であることに着目し、Lac-Cer誘導体を合成して培養細胞に投与した。Lac-Cer誘導体とは、ラクトシルセラミドの脂質部分のセラミドをアルキル鎖に置換した化合物である。すると、誘導体は細胞内において糖鎖伸長を受け、細胞外へと放出されることが分かった（非特許文献16）。この考えに基づき、Nakajimaらによってスフィンゴ糖脂質生合成経路の前駆体であるLac-Cerを模倣して、親水部にLac、疎水部にアルキル鎖を持つラクトース型糖鎖プライマーであるLac-C12が設計された。このときラクトシド化合物のアルキル鎖は炭素数12（C12）であると培地中への放出効率や糖鎖付加効率が高いことが分かった（非特許文献17、18）。このほかに、ラクト系列、ネオラクト系列のスフィンゴ糖脂質に対応する糖鎖の前駆体としてGlcNAc-C12が合成された（非特許文献19）。GlcNAc-C12は生合成経路で、Lac-CerにGlcNAcが結合した構造をモチーフにしている。プライマーが糖鎖伸長することはGlcNAc-C12をHL-60細胞に投与した実験で報告されている。プライマーを投与されたHL-60細胞は、培地中にsLex型の糖鎖を放出し、ネオラクト系列の糖鎖が合成されることを確認した（非特許文献19）。
【００１１】
【化１】
2020204471.tif 000002
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Brody M., Joe T., Glycoconjugate Journal 34, 441-452 (2017)
【非特許文献２】Kennrou H. et al., British Journal of Cancer 109, 379-386 (2013)
【非特許文献３】Sato S. et al., Japanese Journal of Cancer Research 90 (5), 485-489 (1999)
【非特許文献４】Tsugawa H. et al., Cell Host Microbe 12 (69), 764-777 (2012)
【非特許文献５】Rom E., Francis S. Jr, Cancer Research 61, 2592-2601 (2001)
【非特許文献６】Maureen T., Kurt D., 糖鎖生物学入門, 科学同人 (2005)
【非特許文献７】Reiji K. et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 26 (4), 220-234, (1988)
【非特許文献８】Yoshimura M. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 92, 8754-8758 (1995)
【非特許文献９】Yoshimura M. et al., The Journal of Biological Chemistry 271, 13811-13815 (1996)
【非特許文献１０】Maria P. et al., Oncotarget 7 (37), 60133-60154 (2016)
【非特許文献１１】Takada A. et al., R. Cancer Research 53, 354-361 (1993)
【非特許文献１２】Kannagi R. et al., Trends in Glycoscience and Glycotechnology 16 (89), 211-223 (2004)
【非特許文献１３】J. Garcia et al., Glycobio. 17,185-196 （2007）
【非特許文献１４】J. Rodrigues et al., Cell. Immunol., 333, 46-57 （2018）
【非特許文献１５】Okayama M. et al., The Journal of Biological Chemistry 74, 1069-1073
【非特許文献１６】Miura Y. et al., Carbohydrate Research 289, 193-199 (1996)
【非特許文献１７】Nakajima H. et al., The Journal of Biological Chemistry 124, 148-156 (1998)
【非特許文献１８】Miura Y., Yamagata T., Biochemical and Biophysical Research Communications 241, 698-703 (1997)
【非特許文献１９】T. Sato, M. Takashiba, R. Hayashi, X. Zhu, T. Yamagata, Carbohydrate Research, 343, 831-838 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、胃がん幹細胞の細胞機能と密接に関連し得る新たな糖鎖マーカーを見出すことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、胃がん幹細胞の運動性について解析するため、胃がん細胞株（MKN28）に、種々の組織由来のがん幹細胞のマーカーとして知られるCD44sや、胃がん幹細胞マーカーとして知られるCD44v9をトランスフェクトしたところ、細胞の遊走性が上昇した。このトランスフェクタントが発現する糖鎖を、糖鎖プライマー法を用いて網羅的に解析したところ、驚くべきことに、CD44sトランスフェクタント及びCD44v9トランスフェクタントにおいて、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖の発現が上昇することを見出した。このことは、CD44という接着分子の発現が、一見これとは無関係な、細胞の糖鎖合成特性及び発現する糖鎖構造を変化させた可能性があることを意味する。CD44v9は、胃がん幹細胞のマーカーとして知られていることから、CD44v9の発現により誘導される硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖も、CD44v9と同様に、胃がん幹細胞のマーカーとして使用し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
即ち、本発明は以下に関する。
［1］被検試料中の硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖の発現を測定する工程を含む、胃がん幹細胞の検出方法。
［2］被検試料中のCD44v9の発現を測定する工程を更に含む、［1］記載の方法。
［3］糖鎖が硫酸化糖鎖である、［1］又は［2］記載の方法。
［4］硫酸化糖鎖が、HSO3-Galβ(1-4)Glcβ-、HSO3-Hex-Galβ(1-4)Glcβ-、又はHSO3-Hex-GlcNAcβ-の構造を有する、［3］記載の方法。
［5］糖鎖がフコシル化糖鎖である、［1］又は［2］記載の方法。
［6］フコシル化糖鎖が、以下のいずれかの構造を有する［5］記載の方法。
【００１６】
【化２】
2020204471.tif 000003
【００１７】
［7］硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖に特異的に結合する抗体又はレクチンを含む、胃がん幹細胞の検出用試薬。
［8］CD44v9に特異的に結合する抗体を更に含む、［7］記載の試薬。
［9］がん細胞に、CD44をコードする核酸を導入することを含む、該がん細胞における、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖の発現を誘導する方法。
［10］CD44をコードする核酸を導入したがん細胞における、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖の発現を評価することを更に含む、［9］記載の方法。
［11］糖鎖が硫酸化糖鎖である、［9］又は［10］記載の方法。
［12］硫酸化糖鎖が、HSO3-Galβ(1-4)Glcβ-、HSO3-Hex-Galβ(1-4)Glcβ-、又はHSO3-Hex-GlcNAcβ-の構造を有する、［11］記載の方法。
［13］糖鎖がフコシル化糖鎖である、［9］又は［10］記載の方法。
［14］フコシル化糖鎖が、以下のいずれかの構造を有する、［13］記載の方法。
【００１８】
【化３】
2020204471.tif 000004
【００１９】
［15］CD44が、CD44s又はCD44v9である、［9］〜［14］のいずれか記載の方法。
［16］がん細胞が、胃がん細胞である、［9］〜［15］のいずれか記載の方法。
【００２０】
［17］硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖の、胃がん幹細胞検出用バイオマーカーとしての使用。
［18］糖鎖が硫酸化糖鎖である、［17］記載の使用。
［19］硫酸化糖鎖が、HSO3-Galβ(1-4)Glcβ-、HSO3-Hex-Galβ(1-4)Glcβ-、又はHSO3-Hex-GlcNAcβ-の構造を有する、［18］記載の使用。
［20］糖鎖がフコシル化糖鎖である、［17］記載の使用。
［21］フコシル化糖鎖が、以下のいずれかの構造を有する［20］記載の使用。
【００２１】
【化４】
2020204471.tif 000005
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、胃がん幹細胞の細胞機能と密接に関連し得る新たな糖鎖マーカーが提供される。また、本発明により、がん細胞における当該糖鎖マーカーの新たな誘導方法が提供される。本発明の誘導方法は、糖鎖抗原とがん細胞の幹細胞性（stemness）との関連を解析するリサーチツールとして有用であり、脱幹細胞化のための創薬への応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図1は、トランスウェル移動アッセイの結果を示す。エラーバーはS.D.を示す。N=3、*P<0.05、**P<0.01。
【図２】図2は、MKN28-W.T.細胞を用いた創傷治癒アッセイの実験開始時（0h）及び実験開始24時間後（24h）における創傷の顕微鏡写真である。
【図３】図3は、MKN28-CD44-s細胞を用いた創傷治癒アッセイの実験開始時（0h）及び実験開始24時間後（24h）における創傷の顕微鏡写真である。
【図４】図4は、MKN28-CD44-v9細胞を用いた創傷治癒アッセイの実験開始時（0h）及び実験開始24時間後（24h）における創傷の顕微鏡写真である。
【図５】図5は、創傷治癒アッセイの結果を示す。エラーバーはS.D.を示す。N=3、*P<0.05、**P<0.01。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
1．胃がん幹細胞の検出方法
本発明は、被検試料中の硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖の発現を測定する工程を含む、胃がん幹細胞の検出方法（以下、「本発明の検出方法」という場合がある。）を提供するものである。
【００２５】
本発明の検出方法は、インビボ、インビトロのいずれにおいても実施することができるが、好ましくは、インビトロで実施する。
【００２６】
本明細書において、「がん幹細胞」とは、「自己複製能」と「分化能（組織形態の再現性）」を備えるがん細胞をいう。
【００２７】
本発明の検出方法において、被検試料は、胃がん幹細胞を含む可能性がある、臓器、器官又は組織から摘出した腫瘍組織もしくはその周辺組織とすることができる。また、被検試料は、生検材料に由来する、胃がん幹細胞を含む可能性がある組織試料又は細胞試料であってよい。さらに、被検試料は、胃がん幹細胞を有すると疑われる被検個体から採取された体液試料（例：全血、血清、血漿等の血液由来の試料、リンパ液、唾液、尿、組織抽出液等）であってもよい。腫瘍組織は、原発巣（胃）に限られず、胃から他の臓器、器官又は組織へ転移した転移巣であってもよい。被検試料は、好ましくは、ヒトに由来する。
【００２８】
本発明において、硫酸化糖鎖とは、硫酸基を含有する糖鎖である。糖鎖の組成、分子量は特に限定されない。本発明の検出方法において測定する硫酸化糖鎖は、好ましくは、HSO3-Galβ(1-4)Glc-、HSO3-Hex-Galβ(1-4)Glc-、及びHSO3-Hex-GlcNAcβ-からなる群から選択される、少なくとも1つである。ここで、硫酸基がGal又はHexへ置換する位置は、特に限定されないが、硫酸基は、好ましくは、Gal又はHexの3位、4位又は6位、より好ましくは、3位の水酸基へ置換する。
【００２９】
本発明において、フコシル化糖鎖とは、フコースを含有する糖鎖である。糖鎖の組成、分子量は特に限定されない。本発明の検出方法において測定するフコシル化糖鎖は、好ましくは、以下から選択される少なくとも1つである。
【００３０】
【化５】
2020204471.tif 000006
【００３１】
ここで、FucとGlcNAcとの結合様式は、特に限定されないが、好ましくは、Fucα(1-3)GlcNAc又はFucα(1-4)GlcNAcであり、より好ましくは、Fucα(1-3)GlcNAcである。
【００３２】
一態様において、被検試料中のHSO3-Galβ(1-4)Glc-、HSO3-Hex-Galβ(1-4)Glc-、及びHSO3-Hex-GlcNAcβ-からなる群から選択される少なくとも2つの硫酸化糖鎖（即ち、HSO3-Galβ(1-4)Glc-及びHSO3-Hex-Galβ(1-4)Glc-、HSO3-Galβ(1-4)Glc-及びHSO3-Hex-GlcNAcβ-、或いはHSO3-Hex-Galβ(1-4)Glc-及びHSO3-Hex-GlcNAcβ-）の発現を測定する。一態様において、被検試料中のHSO3-Galβ(1-4)Glc-、HSO3-Hex-Galβ(1-4)Glc-、及びHSO3-Hex-GlcNAcβ-の3つの硫酸化糖鎖の発現を測定する。
【００３３】
一態様において、被検試料中の以下の2つのフコシル化糖鎖の発現を測定する。
【００３４】
【化６】
2020204471.tif 000007
【００３５】
一態様において、被検試料中の硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖の発現を測定する。本態様において、硫酸化糖鎖は、好ましくは、HSO3-Galβ(1-4)Glc-、HSO3-Hex-Galβ(1-4)Glc-、及びHSO3-Hex-GlcNAcβ-からなる群から選択される少なくとも1つ、2つ、又は3つであり、フコシル化糖鎖は、好ましくは、以下から選択されるいずれか1つ、又は2つである。
【００３６】
【化７】
2020204471.tif 000008
【００３７】
硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖の発現を測定する方法は、特に限定されないが、例えば、検出対象の糖鎖（硫酸化糖鎖又はフコシル化糖鎖）に特異的に結合する抗体やレクチンを用いて、フローサイトメトリー、免疫組織染色、ウェスタンブロッティング等の周知の生化学的手法により実施することができる。一般に、がん幹細胞のポピュレーションは非常に小さいので、細胞単位で硫酸化糖鎖又はフコシル化糖鎖の発現を測定可能な方法を採用することが好ましい。そのような方法としては、フローサイトメトリー及び免疫組織染色を挙げることができる。特に、フローサイトメトリーを用いると、細胞ごとの発現レベルを定量的なシグナルとして取得することができるので、好ましい。
【００３８】
硫酸化糖鎖又はフコシル化糖鎖に特異的に結合する抗体は、意図した糖鎖抗原を免疫原として使用し、当該分野で周知の方法に準じて作製することができる。例えば、Kennet et al.，(Ed.) Monoclonal Antibodies，Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses，Plenum Press，New York，1980を参照すればよい。必要に応じて、糖鎖抗原を、キーホールリンペットヘモシアン（KLH）、カゼイン、血清アルブミン等のキャリアタンパク質に結合させてもよい。抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。
【００３９】
本明細書において「抗体」の用語には、「抗体の機能性断片」も含まれるものとする。「抗体の機能性断片」とは、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Fab、F(ab’)2、scFv等を含む。また、F(ab’)2を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるFab’も抗体の機能性断片に含まれる。ただし抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。機能性断片には、抗体タンパク質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生されたタンパク質も含まれる。
【００４０】
３位が硫酸化されたガラクトースに特異的に結合する抗体、６位が硫酸化されたＮ-アセチルグルコサミンに特異的に結合する抗体、及び６位が硫酸化されたガラクトースに特異的に結合する抗体が知られている（特開2013-039043号公報）。また、ケラタン硫酸に特異的に結合する抗体として、Tra-1-60抗体及びTra-1-81抗体が知られている（Badcock G, Pigott C, Goepel J, Andrews PW., Cancer Res. 1999 Sep 15;59(18):4715-9.）。ケラタン硫酸は、６位が硫酸化されたガラクトース（Gal）とＮ-アセチルグルコサミン（GlcNAc）の繰り返しで構成され、硫酸基はGal及びGlcNAcの両方又は片方の６位の炭素に結合している構造を有している。また、多様な抗ルイスX抗体及び抗ルイスA抗体が市販されている。
【００４１】
硫酸化糖鎖に特異的に結合するレクチンとしては、アネキシンレクチン(ヒトアネキシン2(hANXA2、hANXA5))、β-プリズムレクチン(ヒトZG16p)、Galectin-3（Biochemistry. 2016 Aug 16;55(32):4541-51）等が知られているが、これらに限定されない。Galectinは、6位が硫酸化されたLacNAcに特異的に結合する。フコシル化糖鎖に特異的に結合するレクチンとしては、Aspergillus oryzae由来のレクチン（H. Ishida, T et.al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002, 66, 1002.）、AAL、PhoSL、LTL(Lotus)、UEA-1等が知られているが、これらに限定されない。
【００４２】
尚、後述する糖鎖プライマー法を用いて、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖の発現を測定してもよい。しかしながら、がん幹細胞のポピュレーションは非常に小さいので、がん幹細胞をわずかしか含まない被検試料に、糖鎖プライマー法を用いると、がん幹細胞以外の細胞に由来する糖鎖伸長生成物のノイズによって、がん幹細胞に由来する糖鎖伸長生成物のシグナルがかき消されてしまう可能性が高い。糖鎖プライマー法は、クローン化された細胞や株化細胞の硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖の発現測定に、好適に用いられる。
【００４３】
胃がん幹細胞においては、幹細胞ではない胃がん細胞（胃がん非幹細胞）と比較して、硫酸化糖鎖及び／又はフコシル化糖鎖の発現が亢進しているので、被検試料中の硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖が高発現している細胞を、胃がん幹細胞である可能性の高い細胞として検出することができる。なお、発現レベルは低いものの、胃がん非幹細胞も、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖を発現する。従って、被検試料として、単離された胃がん細胞集団や、胃がん細胞集団を含む生体試料を用いた場合、胃がん幹細胞は、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖の発現レベルが低い胃がん非幹細胞集団の中に、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖を高発現する細胞が点在する形で観察され得る。
【００４４】
胃がん幹細胞における、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖の発現レベル（単位タンパク質量あたりの糖鎖モル数）としては、対応する胃がん非幹細胞（例、該胃がん幹細胞の子孫である胃がん非幹細胞、同一腫瘍組織内の胃がん非幹細胞）と比較して、2〜3倍程度を例示することができるが、これに限定されない。例えば、胃がん非幹細胞における、硫酸化糖鎖及び／又はフコシル化糖鎖の発現レベルをあらかじめ測定し、その測定値に基づき適切な閾値（例、胃がん非幹細胞の発現レベルの1.5〜2.0倍）として設定し、この閾値を超える硫酸化糖鎖及び／又はフコシル化糖鎖の発現レベルを有する細胞を、胃がん幹細胞である可能性の高い細胞として検出してよい。
【００４５】
尚、複数種類の硫酸化糖鎖及び／又はフコシル化糖鎖の発現を測定する場合、いずれか1種の硫酸化糖鎖又はフコシル化糖鎖の発現が、対応する胃がん非幹細胞と比較して亢進していれば、該細胞を胃がん幹細胞である可能性の高い細胞として検出してよい。
【００４６】
本発明の検出方法において、被検試料中のCD44v9の発現を併せて測定してもよい。CD44v9は、胃がん幹細胞のマーカーとして知られており、また、CD44v9と硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖との間には、胃がん細胞にCD44v9をトランスフェクトすると、該細胞における硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖の発現が上昇するという、機能的な関連性があることから、硫酸化糖鎖及び／又はフコシル化糖鎖と併せて、CD44v9の発現を測定することにより、より高い精度で胃がん幹細胞を検出することが期待できる。
【００４７】
CD44は、ヒアルロン酸結合能を有する公知の接着分子である。CD44には、多数のバリアントアイソフォームが存在しており、CD44を構成する20個の構成エキソンのうち10個のエキソンが選択的スプライシングされる。バリアントエキソンを持たない標準型のCD44はCD44 standard（CD44s）と呼ばれる。バリアントアイソフォームとしては、CD44 variant 1（CD44v1）、CD44 variant 2（CD44v2）、CD44 variant 3（CD44v3）、CD44 variant 4（CD44v4）、CD44 variant 5（CD44v5）、CD44 variant 6（CD44v6）、CD44 variant 7（CD44v7）、CD44 variant 8（CD44v8）、CD44 variant 9（CD44v9）、及びCD44 variant 10（CD44v10）が知られている。
【００４８】
本発明の検出方法において測定されるCD44 v9の生物種は、被検試料と同一である。例えば、ヒトの被検試料を用いる場合、ヒトCD44v9の発現が測定される。
【００４９】
CD44v9の発現を測定する方法は、特に限定されないが、例えば、CD44v9に特異的に結合する抗体を用いて、フローサイトメトリー、免疫組織染色、ウェスタンブロッティング等の周知の生化学的手法により実施することができる。一般に、がん幹細胞のポピュレーションは非常に小さいので、細胞単位でCD44v9の発現を測定可能な方法を採用することが好ましい。そのような方法としては、フローサイトメトリー及び免疫組織染色を挙げることができる。特に、フローサイトメトリーを用いると、細胞ごとの発現レベルを定量的なシグナルとして取得することができるので、好ましい。
【００５０】
CD44v9に特異的に結合する抗体は、CD44のv9領域を含む組み換えタンパク質を免疫原として使用し、当該分野で周知の方法に準じて作製することができる。例えば、Kennet et al.，(Ed.) Monoclonal Antibodies，Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses，Plenum Press，New York，1980を参照すればよい。必要に応じて、抗原を、キーホールリンペットヘモシアン（KLH）、カゼイン、血清アルブミン等のキャリアタンパク質に結合させてもよい。抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。市販の抗体を使用することも可能であり、例えば、ヒトCD44v9に特異的に結合するモノクローナル抗体（クローンRV3）（特許第6041333号）がコスモバイオ社から販売されている。
【００５１】
CD44v9を測定する場合、被検試料中、CD44v9を発現し（CD44v9陽性）、被検試料中の硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖が高発現している細胞を、胃がん幹細胞である可能性の高い細胞として検出することができる。被検試料として、単離された胃がん細胞集団や、胃がん細胞集団を含む生体試料を用いた場合、胃がん幹細胞は、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖の発現レベルが低い胃がん非幹細胞集団の中に、CD44v9を発現し（CD44v9陽性）、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖を高発現する細胞が点在する形で観察され得る。
【００５２】
2．胃がん幹細胞の検出用試薬
本発明は、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖に特異的に結合する抗体又はレクチンを含む、胃がん幹細胞の検出用試薬（以下、本発明の試薬、という場合がある。）を提供するものである。上記本発明の検出方法において、本発明の試薬を用いることにより、容易に胃がん幹細胞の検出を行うことが出来る。本発明の試薬は、胃がん幹細胞の検出用キットであり得る。
【００５３】
「硫酸化糖鎖」、「フコシル化糖鎖」を含む各用語の定義は、特に言及しない限り、上記1に記載したものと同一である。
【００５４】
硫酸化糖鎖又はフコシル化糖鎖に特異的に結合する抗体又はレクチンとしては、上記1に列挙したものを挙げることが出来る。複数種類の抗体やレクチンを組み合わせてもよい。例えば、例えば、一態様において、本発明の試薬は、硫酸化糖鎖に特異的に結合する抗体又はレクチン、及びフコシル化糖鎖に特異的に結合する抗体及びレクチンを含む。
【００５５】
本発明の試薬は、CD44v9に特異的に結合する抗体を更に含んでいてもよい。CD44v9に特異的に結合する抗体を用いることにより、上記本発明の検出方法において、被検試料におけるCD44v9の発現を容易に測定することが出来る。
【００５６】
本発明の試薬に含まれる抗体又はレクチンは、標識剤により標識されていてもよい。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなどが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、125I、131I、3H、14Cなどが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。
【００５７】
本発明の試薬は、測定方法の種類に応じて、標識二次抗体、発色基質、ブロッキング液、洗浄緩衝液、ELISAプレート、ブロッティング膜等をさらに含むことができる。
【００５８】
本発明の試薬に含まれる各構成要素は、適宜、各々別個に（あるいは可能であれば混合した状態で）水もしくは適当な緩衝液（例：TEバッファー、PBSなど）中に適当な濃度となるように溶解されるか、あるいは凍結乾燥された状態で、適切な容器中に収容される。
【００５９】
3．糖鎖の発現を誘導する方法
一態様において、本発明は、がん細胞における、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖の発現を誘導する方法（以下、本発明の誘導方法、と称する場合がある。）を提供するものである。本発明の誘導方法は、がん細胞に、CD44をコードする核酸を導入することを特徴とする。
【００６０】
各用語の定義は、特に言及しない限り、上記1及び2に記載したものと同一である。
【００６１】
本発明の誘導方法は、CD44（例、CD44s、CD44v9）トランスフェクタントにおいて、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖の発現が上昇するとの知見に基づくものである。導入したCD44をコードする核酸から、CD44タンパク質が強制的に発現し、発現したCD44に起因して、がん細胞における、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖の発現が上昇する。その結果、CD44をコードする核酸を導入していない対照がん細胞と比較して、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖の発現レベルが高いがん細胞を得ることが出来る。
【００６２】
本発明の誘導方法においては、CD44s、CD44v1、CD44v2、CD44v3、CD44v4、CD44v5、CD44v6、CD44v7、CD44v8、CD44v9及びCD44v10のいずれのアイソフォームのCD44を用いることができるが、好ましくは、CD44は、CD44s又はCD44v9である。
【００６３】
本発明の誘導方法において用いられるCD44は、好ましくは、哺乳動物のCD44である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくはげっ歯類（マウス等）又は霊長類（ヒト等）である。
【００６４】
ヒトCD44s及びヒトCD44v9のcDNA配列情報及びアミノ酸配列情報は、NCBI accession number（Gene ID：960）に開示された配列情報及びProc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.89, pp.12160-12164, 1992に開示されたヒトCD44遺伝子座のExon領域のDNA配列を参照することにより、当業者であれば容易に取得できる。Exons 6-15がvariable exons 1-10に相当し、発現するvariable exonの種類によりCD44のバリアントが決定される。ヒトCD44sは、Exons 1-5、16-18及び20によってコードされ、Exons 6-15 (variable exons 1-10)の挿入を欠く。一方、ヒトCD44v9は、Exon 14 (variable exon 9)の挿入を有する。当業者であれば、ヒト以外の哺乳動物のCD44s及びCD44v9のcDNA配列情報もヒトと同様にNCBI GenBankのデータベースから容易に取得することができる。当業者は、当該cDNA配列情報に基づいて、常法により、CD44をコードする核酸を調製することができる。
【００６５】
本発明の誘導方法においては、CD44をコードする核酸（RNA又はDNA）を導入する。RNAの形態で導入する場合、例えば、CD44をコードするmRNAをがん細胞に導入する。DNAの形態で導入する場合、例えば、CD44発現ベクター（例、ウイルス、プラスミド、人工染色体）をがん細胞に導入する。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる。ベクターには、CD44が発現可能なように、導入するがん細胞において機能可能な、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができる。使用されるプロモーターとしては、例えばEF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。CD44をコードするベクターは、好ましくは、導入するがん細胞において機能可能なプロモーター及びそれに作動可能に連結されたCD44をコードする核酸を含む。さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など)、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子を用いることにより、導入した外来性のCD44をコードする核酸が、染色体内に組み込まれ、安定してCD44を発現する、安定なトランスフェクタントを容易に取得することができる。CD44をコードする核酸は、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの周知な手法によってがん細胞内に導入することができる。
【００６６】
本発明の誘導方法において用いられる「がん細胞」は、自律的に制御できない増殖能を獲得した細胞であれば特に限定されず、任意の細胞が包含される。本発明の誘導方法において用いられるがん細胞は、例えば、上皮細胞由来のがん細胞であり得るが、非上皮性の肉腫細胞や血液がん細胞であってもよい。例えば、頭頸部のがん（例えば、上顎がん、咽頭がん、喉頭がん、舌がん、甲状腺がん）、胸部のがん（例えば、乳がん、肺がん（非小細胞肺がん、小細胞肺がん））、消化器のがん（例えば、食道がん、胃がん、十二指腸がん、大腸がん（結腸がん、直腸がん）、肝がん（肝細胞がん、胆管細胞がん）、胆嚢がん、胆管がん、膵がん、肛門がん）、泌尿器のがん（例えば、腎がん、尿管がん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、精巣（睾丸）がん）、生殖器のがん（例えば、子宮がん（子宮頸がん、子宮体がん）、卵巣がん、外陰がん、膣がん）、皮膚のがん（例えば、基底細胞がん、有棘細胞がん）を含むが、これらに限定されない。本発明の誘導方法において用いられるがん細胞は、好ましくは、胃がん細胞である。本発明の誘導方法において用いられるがん細胞は、ヒト由来のがん細胞であることが好ましい。
【００６７】
本発明の誘導方法において用いられるがん細胞は、個体から単離された初代培養細胞であってもよく、あるいはインビトロにおいて無限に増殖する能力を獲得（不死化）した株化細胞であってもよい。本発明の誘導方法において用いられるがん細胞は、好ましくは、株化細胞、とりわけ、胃がん株化細胞が好ましい。胃がん株化細胞としては、例えば、MKN28、KATOIII、NCI-N87、SNU-16、SNU-5、AGS、SNU-1等が挙げられるが、本発明の誘導方法においては、特に好ましくは、MKN28細胞が用いられる。MKN28細胞はATCC等から入手可能である。
【００６８】
本発明の誘導方法においてがん細胞を誘導するための培地は、哺乳動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでいてもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含んでいてもよい。これらの添加物は、培養するがん細胞の種類に応じて、当業者は適宜選択することができる。
【００６９】
薬剤耐性遺伝子を用いて、安定なトランスフェクタントを樹立する場合、使用した薬剤耐性遺伝子に対応した選択培地中で、CD44をコードする核酸に接触させたがん細胞を培養することによって、導入した外来性のCD44をコードする核酸が、染色体内に組み込まれ、安定してCD44を発現する、安定なCD44トランスフェクタントを樹立することができる。安定なCD44トランスフェクタントは、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖を安定して高発現することが期待できる。
【００７０】
培養法の例としては、がん細胞へCD44をコードする核酸を導入した後、例えば、37℃、5% CO2下にて、10% FBS、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するRPMI1640培地中で、培養する方法が挙げられる。培養期間は、導入したCD44をコードする核酸から、CD44タンパク質が発現し、それに起因して、がん細胞における、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖の発現が上昇するのに十分な時間であれば、特に限定されないが、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、またはそれ以上が例示される。このとき、一定期間経過後、培地を新鮮な培地で置換することが好ましい。
【００７１】
本発明の誘導方法において誘導される硫酸化糖鎖は、好ましくは、HSO3-Galβ(1-4)Glc-、HSO3-Hex-Galβ(1-4)Glc-、及びHSO3-Hex-GlcNAcβ-からなる群から選択される、少なくとも1つである。ここで、硫酸基がGal又はHexへ置換する位置は、特に限定されないが、硫酸基は、好ましくは、Gal又はHexの3位、4位又は6位、より好ましくは、3位の水酸基へ置換する。
【００７２】
本発明の誘導方法において誘導されるフコシル化糖鎖は、好ましくは、以下から選択される少なくとも1つである。
【００７３】
【化８】
2020204471.tif 000009
【００７４】
ここで、FucとGlcNAcとの結合様式は、特に限定されないが、好ましくはFucα(1-3)GlcNAc又はFucα(1-4)GlcNAcであり、より好ましくは、Fucα(1-3)GlcNAcである。
【００７５】
一態様において、がん細胞における、HSO3-Galβ(1-4)Glc-、HSO3-Hex-Galβ(1-4)Glc-、及びHSO3-Hex-GlcNAcβ-からなる群から選択される少なくとも1つの硫酸化糖鎖の発現が誘導される。一態様において、がん細胞における、HSO3-Galβ(1-4)Glc-、HSO3-Hex-Galβ(1-4)Glc-、及びHSO3-Hex-GlcNAcβ-からなる群から選択される少なくとも2つの硫酸化糖鎖（即ち、HSO3-Galβ(1-4)Glc-及びHSO3-Hex-Galβ(1-4)Glc-、HSO3-Galβ(1-4)Glc-及びHSO3-Hex-GlcNAcβ-、或いはHSO3-Hex-Galβ(1-4)Glc-及びHSO3-Hex-GlcNAcβ-）の発現が誘導される。一態様において、がん細胞における、HSO3-Galβ(1-4)Glc-、HSO3-Hex-Galβ(1-4)Glc-、及びHSO3-Hex-GlcNAcβ-の3つの硫酸化糖鎖の発現が誘導される。
【００７６】
一態様において、がん細胞における、以下の2つのフコシル化糖鎖の発現が誘導される。
【００７７】
【化９】
2020204471.tif 000010
【００７８】
一態様において、がん細胞における、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖の発現が誘導される。本態様において、硫酸化糖鎖は、好ましくは、HSO3-Galβ(1-4)Glc-、HSO3-Hex-Galβ(1-4)Glc-、及びHSO3-Hex-GlcNAcβ-からなる群から選択される少なくとも1つ、2つ、又は3つであり、フコシル化糖鎖は、好ましくは、以下から選択されるいずれか1つ、又は2つの構造の糖鎖である。
【００７９】
【化１０】
2020204471.tif 000011
【００８０】
一態様において、胃がん細胞に、CD44sをコードする核酸を導入することにより、HSO3-Hex-GlcNAcβ-の構造を有する硫酸化糖鎖の発現が誘導される。この場合、HSO3-Galβ(1-4)Glc-及び／又はHSO3-Hex-Galβ(1-4)Glc-の構造を有する硫酸化糖鎖の発現は誘導されなくてもよい。
【００８１】
一態様において、胃がん細胞に、CD44v9をコードする核酸を導入することにより、HSO3-Galβ(1-4)Glc-、HSO3-Hex-Galβ(1-4)Glc-、及びHSO3-Hex-GlcNAcβ-からなる群から選択される少なくとも1つ、2つ、又は3つの硫酸化糖鎖が誘導される。
【００８２】
一態様において、胃がん細胞に、CD44s又はCD44v9をコードする核酸を導入することにより、以下から選択される少なくとも1つ又は2つのフコシル化糖鎖の発現が誘導される。
【００８３】
【化１１】
2020204471.tif 000012
【００８４】
本発明の誘導方法において、がん細胞へCD44をコードする核酸を導入した後で、該がん細胞における、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖の発現を評価し、該がん細胞において、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖の発現が誘導されたことを確認してもよい。
【００８５】
例えば、CD44をコードする核酸を導入したがん細胞における、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖の発現を測定し、測定された糖鎖の発現レベルを、CD44をコードする核酸を導入していない陰性対照がん細胞におけるものと比較することにより、該がん細胞において、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖の発現が誘導されたことを確認することができる。
【００８６】
硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖の発現を測定する方法は、特に限定されないが、例えば、検出対象の糖鎖（硫酸化糖鎖又はフコシル化糖鎖）に特異的に結合する抗体やレクチンを用いて、フローサイトメトリー、免疫組織染色、ウェスタンブロッティング等の周知の生化学的手法により実施することができる。硫酸化糖鎖に特異的に結合する抗体又はレクチン、及びフコシル化糖鎖に特異的に結合する抗体又はレクチンとしては、上記2に列挙したものを使用することが出来る。
【００８７】
一態様において、糖鎖プライマー法により、がん細胞における硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖の発現を測定してもよい（非特許文献15〜19）。糖鎖プライマー法とは、アルキルグリコシドである糖鎖プライマーを細胞培養中の培地へ投与し細胞内に取り込ませ、培地に放出された糖鎖伸長生成物を得るという手法である。
【００８８】
糖鎖プライマーとしては、以下の式の化合物を例示することができる。
【００８９】
【化１２】
2020204471.tif 000013
【００９０】
Lac-C12は、スフィンゴ糖脂質生合成経路の前駆体であるラクトシルセラミドの模倣物であり、糖脂質型（グロボ系列、ガングリオ系列、ラクト系列、又はネオラクト系列）糖鎖の発現測定に適している。
GlcNAc-C12は、ラクト系列又はネオラクト系列の糖鎖の発現測定に適している。
GalNAc-Thr-C12は、ムチン型糖鎖の発現測定に適している。
Xyl-Ser-C12は、グリコサミノグリカン型糖鎖の発現測定に適している。
【００９１】
本発明において、硫酸化糖鎖の発現測定に使用できる糖鎖プライマーは、Lac-C12、GlcNAc-C12、GalNAc-Thr-C12、又はXyl-Ser-C12であり、好ましくは、Lac-C12又はGlcNAc-C12である。Lac-C12及びGlcNAc-C12を組み合わせて使用してもよい。
【００９２】
HSO3-Galβ(1-4)Glc-の構造を有する硫酸化糖鎖の発現測定は、Lac-C12を糖鎖プライマーとして用いることで実施することができる。
HSO3-Hex-Galβ(1-4)Glc-の構造を有する硫酸化糖鎖の発現測定は、Lac-C12を糖鎖プライマーとして用いることで実施することができる。
HSO3-Hex-GlcNAcβ-の構造を有する硫酸化糖鎖の発現測定は、GlcNAc-C12を糖鎖プライマーとして用いることで実施することができる。
Lac-C12とGlcNAc-C12を組み合わせて用いることにより、HSO3-Galβ(1-4)Glc-、HSO3-Hex-Galβ(1-4)Glc-、及びHSO3-Hex-GlcNAcβ-の発現を同時に測定することができる。
【００９３】
HSO3-Galβ(1-4)Glc-、HSO3-Hex-Galβ(1-4)Glc-、及びHSO3-Hex-GlcNAcβ-において、硫酸基がGal又はHexへ置換する位置は、特に限定されないが、硫酸基は、好ましくは、Gal又はHexの3位、4位又は6位、より好ましくは、3位の水酸基へ置換する。4位又は6位の硫酸基は、主にムチン型糖鎖又はグリコサミノグリカン型糖鎖に含まれる。一方、Lac-C12及びGlcNAc-C12を糖鎖プライマーとして用いると、それぞれ糖脂質型糖鎖、及びラクト系列又はネオラクト系列の糖鎖の発現が測定され、これらの糖鎖においては、硫酸基は、主にGal又はHexの3位の水酸基へ置換する。
【００９４】
本発明において、フコシル化糖鎖の発現測定に使用できる糖鎖プライマーは、GlcNAc-C12である。
【００９５】
以下の構造を有するフコシル化糖鎖の発現測定は、GlcNAc-C12を糖鎖プライマーとして用いることで実施することができる。
【００９６】
【化１３】
2020204471.tif 000014
【００９７】
FucとGlcNAcとの結合様式は、特に限定されないが、好ましくはFucα(1-3)GlcNAc又はFucα(1-4)GlcNAcであり、より好ましくは、Fucα(1-3)GlcNAcである。
【００９８】
このような確認工程を経ることにより、硫酸化糖鎖及びフコシル化糖鎖からなる群から選択される少なくとも1つの糖鎖の誘導的発現が確認されたCD44トランストランスフェクタントがん細胞を得ることが出来る。
【００９９】
本明細書において、糖の略号はIUPAC-IUBの生化学命名委員会に従って表記した。
Hex：hexose(へキソース)
HexNAc：N-acetylhexosamine(N-アセチルへキソサミン)
Glc：glucose(グルコース)
Gal：galactose(ガラク卜-ス)
GalNAc：N-acetylgalactosamine(N-アセチルガラクトサミン)
GlcNAc：N-acetylglucosamine(N-アセチルグルコサミン)
Lac：lactose(ラクト-ス)
Cer：ceramide(セラミド)
GalCer：galactosylceramide(ガラクトシルセラミド)
LacCer：lactosylceramide(ラクトシルセラミド)
【０１００】
本明細書において、「ヘキソース」とは、６個の炭素原子を有する単糖であり、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースが含まれる。本明細書において、「ヘキソサミン」とは、２位炭素原子にアミノ基を有するヘキソースであり、例えば、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、フルクトサミンが含まれる。本明細書において、「ヘキソース」には「ヘキソサミン」は含まれない。アミノ基がアセチル化されたヘキソサミンが「N−アセチルヘキソサミン」である。「N−アセチルヘキソサミン」には、例えば、N−アセチルグルコサミン、N−アセチルガラクトサミン、N−アセチルマンノサミンが含まれる。
【０１０１】
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【実施例】
【０１０２】
［実施例1：CD44高発現株の遊走性評価］
1-1  序論
CD44が発現していない胃がん細胞（MKN28-W.T.）にCD44の遺伝子を導入することでCD44の発現による遊走性の変化を調べた。遊走能の評価はトランスウェル移動アッセイ（Transwell Migration Assay）、および創傷治癒アッセイ（Wound Healing Assay）という二種類の方法で行った。
【０１０３】
1-2  実験方法
1-2-1  細胞培養
MKN28-W.T.細胞は、10%FBS、及び5mLのペニシリン-ストレプトマイシン混合溶液（code21253-84、nacalaitesque）を添加したRPMI1640を用いて、無菌恒温槽内（37℃、5%CO2-95%air）で培養した。MKN28-W.T.細胞にヒトCD44-s発現ベクター及びヒトCD44-v9発現ベクターをトランスフェクションし、G418を含有する培地で選択培養に付すことにより、安定的なトランスフェクタントであるMKN28-CD44-s細胞及びMKN28-CD44-v9細胞をそれぞれ樹立した。発現ベクターとしては、pRc/CMV（5.5kb）を用いた。MKN28-CD44-s細胞とMKN28-CD44-v9細胞は、4mLのG418（アミノグリコシド系抗生物質）溶液を添加したRMPI1640/10%FBS培地を用いて維持培養した。
【０１０４】
1-2-2  細胞遊走アッセイ
細胞の遊走性はTranswell migration assayおよびWound healing assayにより評価した。Transwell migration assayは、インサート（8.0μmポアサイズ、BD falcon cell culture insert）内に細胞懸濁液を加え、24時間インキュベートし、メンブレンを通過した細胞の数をカウントすることにより行った。Wound healing assayでは、細胞を6well plateに1.0×106cells/well播種して、48hインキュベートすることにより、コンフルエントな状態にした。得られた細胞単層に傷をつけ、24時間インキュベート後にwoundの回復を測定した。woundの回復は顕微鏡を用いて観察し、回復距離をImageJを用いて算出した。アッセイは、FBS（1%）及びAphidicolin（1μL/mL）を含有する増殖阻害培地を用いて行った。
【０１０５】
1-3  結果
1-3-1  トランスウェル移動アッセイ
図1に示すように、CD44s高発現細胞及びCD44v9高発現細胞において、遊走能の有意な上昇が確認された。MKN28-CD44s細胞及びMKN28-CD44v9細胞では、それぞれ、膜を通過した細胞の数がMKN28-W.T.細胞と比べて、2.66倍及びで2.95倍であった。
【０１０６】
1-3-2  創傷治癒アッセイ
実験開始時（0h）及び24h後における創傷の顕微鏡写真を図2〜4に示す。また、0hおよび24hの創傷面積から算出した回復面積を図5に示す。
Wound Healing AssayでもCD44s高発現細胞及びCD44v9高発現細胞において、遊走能の有意な上昇が確認された。MKN28-CD44s細胞及びMKN28-CD44v9細胞の回復面積は、MKN28-W.T.細胞と比べて、それぞれ、2.12倍及び1.97倍であった。
【０１０７】
［実施例2：糖鎖プライマー法によるCD44高発現株で発現する糖鎖伸長生成物のLC-MS解析］
2-1  序論
CD44を高発現させたヒト胃がん細胞（MKN28-W.T.）を用いてがん幹細胞における糖鎖発現を評価した。
【０１０８】
2-2  実験方法
2-2-1  糖鎖プライマー法
1 dishあたり2.0×106個の細胞を播き、糖鎖プライマー（Lac-C12、及びGlcNAc-C12）（最終濃度：50μM）を培養物中に投与した。プライマーを投与してから48時間後、培養上清を回収した。培養上清をSep-PakC18カラムに付し、MeOHで溶出した画分を糖鎖生成物として回収した。遠心エバポレータにて回収した画分からovernightで溶媒を除き、残渣を-30℃で保存した。
【０１０９】
2-2-2  高速液体クロマトグラフィー/質量分析（LC-MS）による構造解析
精製した糖鎖伸長生成物の構造をLC-MSで解析した。LCにはAgilent1100SeriesLCSystem（Agilent）を用い、MSにはElectrospray Ionization（ESI）/Ion Trap（IT）Type Mass Spectrometer（AmaZone, Bruker Daltonics）を用いた。また、HPLCにおける順相カラムとしては、UK-silica（150mm,φ2mm）（UKS25,imtakt）を使用した。
測定後、対象のm/zの値におけるExtracted Ion Chromatogram（EIC）を作成し、発現を評価した。さらにEICからピーク面積を参照し、糖鎖の発現量を定量的に解析した。ピーク面積の値（Area値）は、プロテインアッセイで求めたタンパク質量で補正した。
【０１１０】
2-2-3  プロテインアッセイ
タンパク質の定量は、BIO-RAD社のDC Protein Assay Kitを用いて、Lowry法のStandard Assayに従い行った。標準物質にはAlbumin from Bovine Serum（BSA）を用い、界面活性剤にはSodium Dodecyl Sulfate（SDS）を用いた。
【０１１１】
2-3  結果
2-3-1  Lac-C12由来の糖鎖伸長生成物のLC/MS解析
結果を表1に示す。
驚くべきことに、CD44v9強制発現株では、親株（W.T.）と比較して硫酸化糖鎖（HSO3-P、HSO3-Hex-P）の発現が有意に増加していた。
【０１１２】
【表１】
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【０１１３】
2-3-2  GlcNAc-C12由来の糖鎖伸長生成物のLC/MS解析
結果を表2に示す。
Lac-C12プライマーの発現解析結果と同様に、GlcNAc-C12プライマーを用いた場合においても、CD44s強制発現株及びCD44v9強制発現株では、親株（W.T.）と比較して硫酸化糖鎖（HSO3-Hex-P）の発現が有意に増加していた。更に、CD44s強制発現株及びCD44v9強制発現株では、親株（W.T.）と比較してフコシル化糖鎖（Hex-(Fuc-)P、HexNAc-Hex-(Fuc-)P）の発現が有意に増加していた。
【０１１４】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明により、胃がん幹細胞の細胞機能と密接に関連し得る新たな糖鎖マーカーが提供される。また、本発明により、がん細胞における当該糖鎖マーカーの新たな誘導方法が提供される。本発明の誘導方法は、糖鎖抗原とがん細胞の幹細胞性（stemness）との関連を解析するリサーチツールとして有用であり、脱幹細胞化のための創薬への応用が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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