(57)【要約】      （修正有）【課題】超臨界流体クロマトグラフを用いて香気性化合物を分離する技術を提供する。【解決手段】香気性化合物を含む試料を、所定の物質の超臨界流体である移動相の流れに乗せて、不飽和炭化水素構造を有するポリマーからなる充填剤が装填されたカラムに導入する工程を含む。また、所定の測定手法により取得された、複数の香気性化合物のデータを収録した香気性化合物データベースと、不飽和炭化水素構造を有するポリマーからなる充填剤が装填されたカラムと、所定の物質の超臨界流体をカラムに送給する超臨界流体送給部と、超臨界流体送給部からカラムに至る流路に設けられ、超臨界流体に試料を注入する試料注入部と、カラムからの流出物を、順次、所定の測定手法で測定する測定部と、測定により得られたデータを、香気性化合物のデータベースに収録されたデータと照合することにより、流出物に含まれる香気性化合物を同定する香気性化合物同定部とを備える。【選択図】図１
2020204514.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
香気性化合物を含む試料を、所定の物質の超臨界流体である移動相の流れに乗せて、不飽和炭化水素構造を有するポリマーからなる充填剤が装填されたカラムに導入する工程を含む、香気性化合物の分離方法。
【請求項２】
前記移動相が、超臨界状態の二酸化炭素、又は超臨界状態の二酸化炭素にモディファイアを添加したものである、請求項１に記載の香気性化合物の分離方法。
【請求項３】
前記充填剤はポリマービーズであって、
前記ポリマービーズは、テトラヒドロフランを吸収したときの膨潤度、およびメタノールを吸収したときの膨潤度が、いずれも1.4以下であり、
前記ポリマービーズが架橋ポリマーを含む、請求項１又は２に記載の香気性化合物の分離方法。
【請求項４】
前記架橋ポリマーが、ジビニルベンゼン由来の構造単位、およびジ（メタ）アクリル酸エステル由来の構造単位からなる群から選択される１種以上を有する、請求項３に記載の香気性化合物の分離方法。
【請求項５】
前記架橋ポリマーの架橋度が、50%以上である、請求項３又は４に記載の香気性化合物の分離方法。
【請求項６】
前記ポリマービーズの平均粒子径が、1〜10μmである、請求項１から４のいずれかに記載の香気性化合物の分離方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の方法により成分ごとに分離された香気性化合物を、クロマトグラフィおよび／または質量分析により分析する、香気性化合物の分析方法。
【請求項８】
所定の測定手法により取得された、複数の香気性化合物の測定データを収録した香気性化合物データベースと、
不飽和炭化水素構造を有するポリマーからなる充填剤が装填されたカラムと、
所定の物質の超臨界流体を前記カラムに送給する超臨界流体送給部と、
前記超臨界流体送給部から前記カラムに至る流路に設けられ、前記超臨界流体に試料を注入する試料注入部と、
前記カラムからの流出物を、順次、前記所定の測定手法で測定する測定部と、
前記測定により得られた測定データを、前記香気性化合物のデータベースに収録された測定データと照合することにより、前記流出物に含まれる香気性化合物を同定する香気性化合物同定部と
を備える超臨界流体クロマトグラフ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、香気性化合物の分離方法及び該方法を実施するために用いられる超臨界流体クロマトグラフに関する。
【背景技術】
【０００２】
天然物に含まれる未知の香気性化合物を分析するために、従来、ガスクロマトグラフが用いられている（例えば特許文献１）。ガスクロマトグラフを用いた香気性化合物の分析では、天然物から採取した試料を気化させてキャリアガスの流れに乗せてカラムに導入し、他の化合物から分離する。分離した化合物は、例えば核磁気共鳴（NMR: Nuclear Magnetic Resonance）装置で測定することにより構造解析される。
【０００３】
しかし、ガスクロマトグラフで一般的に用いられるキャピラリカラムは細管の内部に固定相を塗布したものであることから、キャピラリカラム内の固定相に吸着させることができる化合物の量が少ない。NMRでは、一度の測定に少なくとも数μgの試料が必要であるが、ガスクロマトグラフで一度に分離できる化合物の量は数ngであるため、ガスクロマトグラフを用いる場合には分離を多数回繰り返さなければNMRによる構造解析に必要な量の化合物を得ることができない。
【０００４】
そこで、近年、超臨界流体クロマトグラフを用いた分析が試みられている。超臨界流体クロマトグラフでは、移動相として二酸化炭素等の超臨界流体を使用し、固定相を含む充填剤を装填したパックドカラムに試料を注入した移動相を導入して化合物を分離する。超臨界流体クロマトグラフでは、粘性が低く拡散性が高い超臨界流体を移動相として使用するため、高流速かつ高分解能というガスクロマトグラフと同様の利点を維持しつつ、パックドカラムによって一度に多くの化合物を分離することができる。
【０００５】
超臨界流体クロマトグラフでは、超臨界流体を移動相として用いることから内部の流路を高圧に維持しなければならない。そのため、カラムには、耐圧性、及び超臨界流体に対する膨潤性が低いことが求められる。そこで、超臨界流体クロマトグラフでは、これらの要件を満たすシリカゲルベースのカラムが広く用いられている。なお、シリカゲルベースのカラムとは、目的化合物の特性に応じた種類の官能基を固定相としてシリカゲルの表面に化学修飾したものが充填剤として装填されたカラムをいう。例えば、特許文献２には、オクタデシル基等を固定相としてシリカゲルに化学修飾した、シリカゲルベースのカラムが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１７−４０５３６号公報
【特許文献２】特開２０１５−２１５３２０号公報
【特許文献３】特開２０１８−１８９４４１号公報
【特許文献４】特開２０１８−１８９４４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献２には、シリカゲルベースのカラムを用いた超臨界流体クロマトグラフを用いてビタミン類を分離した例が示されている。しかし、シリカゲルベースのカラムを用いた超臨界流体クロマトグラフを用いて香気性化合物の分離を試みたところ、十分に分離することができないことが分かった。
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、超臨界流体クロマトグラフを用いて香気性化合物を分離する技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために成された本発明に係る香気性化合物の分離方法は、
香気性化合物を含む試料を、所定の物質の超臨界流体である移動相の流れに乗せて、不飽和炭化水素構造を有するポリマーからなる充填剤が装填されたカラムに導入する
工程を含む。
【００１０】
また、上記課題を解決するために成された本発明に係る超臨界流体クロマトグラフは、
所定の測定手法により取得された、複数の香気性化合物の測定データを収録した香気性化合物データベースと、
不飽和炭化水素構造を有するポリマーからなる充填剤が装填されたカラムと、
所定の物質の超臨界流体を前記カラムに送給する超臨界流体送給部と、
前記超臨界流体送給部から前記カラムに至る流路に設けられ、前記超臨界流体に試料を注入する試料注入部と、
前記カラムからの流出物を、順次、前記所定の測定手法で測定する測定部と、
前記測定により得られた測定データを、前記香気性化合物のデータベースに収録された測定データと照合することにより、前記流出物に含まれる香気性化合物を同定する香気性化合物同定部と
を備える。
【発明の効果】
【００１１】
前記香気性化合物は、例えば鎖状又は環状の不飽和炭化水素構造を有する、分子量800以下の化合物であると定義することができる。香気性化合物は、鎖状又は環状の不飽和炭化水素構造を有することから極性が小さく、その大半が分子量800以下の低分子化合物であることから分子間結合が弱く、揮発性を有する。従って、揮発性低分子化合物と定義することもできる。
また、前記不飽和炭化水素構造は、鎖状と環状のいずれか一方のみであってもよく、それら両方を含むものであってもよい。
【００１２】
本発明に係る香気性化合物の分離方法及び超臨界流体クロマトグラフでは、不飽和炭化水素構造を有するポリマーからなる充填剤が装填されたカラムを用いて香気性化合物を分離する。シリカゲルベースのカラムによって香気性化合物を分離することができなかったのは、拡散性が高い超臨界流体とともにカラムに導入された低分子化合物である香気性化合物が、固定相を通過してシリカゲルの表面まで進入し、該表面に存在する高極性のシラノール基との間で不所望の相互作用が生じたためであると考えられる。これに対し、本発明では、固定相である、不飽和炭化水素構造を有する化合物のポリマーからなる充填剤を装填したカラムを用いる。即ち、充填剤全体が固定相として機能し、不所望の相互作用を生じさせる官能基を含まないため、香気性化合物を十分に分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明に係る超臨界流体クロマトグラフの一実施例の要部構成図。
【図２】オクタデシル基で化学修飾されたシリカゲルを充填剤とするカラムを備えた超臨界流体クロマトグラムにより香気性化合物を分離した結果のクロマトグラム。
【図３】フェニル基で化学修飾されたシリカゲルを充填剤とするカラムを備えた超臨界流体クロマトグラムにより香気性化合物を分離した結果のクロマトグラム。
【図４】アミノプロピル基で化学修飾されたシリカゲルを充填剤とするカラムを備えた超臨界流体クロマトグラムにより香気性化合物を分離した結果のクロマトグラム。
【図５】本発明に係る香気性化合物の分離方法の一実施形態を本実施例の超臨界流体クロマトグラフにより実施して香気性化合物を分離した結果のクロマトグラム。
【図６】本実施例と従来の香気性化合物の分離方法により得られたクロマトグラムから求められた、各香気性化合物の保持係数をまとめた表。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明に係る香気性化合物の分離方法及び超臨界流体クロマトグラフ（SFC: Supercritical Fluid Chromatography）の一実施例について、以下、図面を参照して説明する。
【００１５】
図１は、本実施例の超臨界流体クロマトグラフの要部構成図である。この超臨界流体クロマトグラフ１は、移動相物質を収容したボンベ１１、加圧ポンプ１２、移動相に添加するモディファイア溶液を収容した液体容器１３、ポンプ１４、ミキサー１５、試料注入部１６、カラム１７、背圧制御弁１８、分光検出器１９、及びフラクションコレクタ２０を備えている。また、これらの各部の動作を制御する制御・処理部４を備えている。
【００１６】
ボンベ１１内には、移動相物質である二酸化炭素が収容されている。また、液体容器１３には、モディファイアであるメタノールが収容されている。加圧ポンプ１２と背圧制御弁１８の間の流路は、二酸化炭素が超臨界流体となる圧力及び温度に維持されている。また、カラム１７はカラムオーブン１７１内に収容されており、所定の温度に維持される。本実施例のカラム１７は、スチレンとジビニルベンゼンの重合体（ポリマー）からなるビーズを充填剤として装填したものである。カラム１７の詳細は後述する。
【００１７】
分光検出器１９は、カラム１７から溶出する試料液が導入されるフローセル１９１、該フローセル１９１内を流通する試料液に所定範囲の波長の光を照射するランプ１９２、及びフローセル１９１を透過した光を波長分離して各波長の光の強度を測定する光検出部１９３を備えている。
【００１８】
フラクションコレクタ２０は、分光検出器１９による検出結果に基づいて該香気性化合物を分取するものであり、分取容器２１と、分光検出器１９からの流出物を分取容器２１に分取する分取部２２を備えている。分取部２２を通過した流出物はドレインに廃棄される。
【００１９】
制御・処理部４は、香気性化合物データベース４１１を含む記憶部４１のほか、機能ブロックとして測定制御部４２１及び香気性化合物同定部４２２を備えている。制御・処理部４の実体はパーソナルコンピュータであり、コンピュータに予めインストールされている香気性化合物分析プログラムを実行することによりこれらの機能ブロックが具現化される。制御・処理部４には、キーボードやマウスを含む入力部５と表示部６が接続されている。
【００２０】
香気性化合物データベース４１１には、既知である複数の香気性化合物のそれぞれについて、香気性化合物の名称及び分光検出器１９により事前に得られた吸収スペクトルを含む情報が保存されている。また、香気性化合物を測定する際の測定条件（カラムの種類及び温度、移動相の種類及び流速など）も保存されている。
【００２１】
使用者が香気性化合物の測定開始を指示すると、測定制御部４２１は、香気性化合物データベース４１１に保存されている香気性化合物の中から、使用者に測定対象を選択させる画面を表示部６に表示する。使用者が適宜の操作により測定対象の香気性化合物を決定すると、測定制御部４２１は香気性化合物データベース４１１からそれらの吸収スペクトルの情報と、測定条件を読み出す。
【００２２】
次に、測定制御部４２１は、香気性化合物データベース４１１から読み出した測定条件に基づいてカラム１７を所定の温度に加熱する。カラム１７がその温度まで加熱されると、測定制御部４２１は、加圧ポンプ１２を動作させ、前記測定条件に基づいてボンベ１１に収容されている二酸化炭素を所定の圧力に加圧しつつ所定の流量で送給する。加圧ポンプ１２と背圧制御弁１８の間の流路では超臨界状態で二酸化炭素が送給される。
【００２３】
また、ポンプ１４により、液体容器１３に収容されているメタノールが所定の流量で送給される。二酸化炭素とメタノールはミキサー１５により混合される。試料注入部１６では、二酸化炭素とメタノールを混合してなる移動相の流れに試料が注入される。本実施例における試料は、複数種類の香気性化合物を含んでいる。
【００２４】
移動相に注入された試料は、移動相の流れに乗ってカラム１７に導入される。カラム１７内では、試料中の各化合物がカラム１７内の固定相と相互作用する。そして、各化合物は固定相との相互作用の大小や多寡に応じて時間的に分離され、カラム１７から流出する。
【００２５】
カラム１７から流出した各化合物は、順次、背圧制御弁１８を通過して分光検出器１９に導入される。分光検出器１９では、測定開始から測定終了までの間、ランプ１９２から所定範囲の波長の光がフローセル１９１に照射されており、該フローセル１９１を透過した光の強度が、光検出部１９３により波長毎に、所定の時間間隔で測定される。光検出部１９３で測定された各波長の光の強度は順次、記憶部４１に保存される。
【００２６】
香気性化合物同定部４２２は、記憶部４１に測定データが保存される毎に、吸収スペクトルを作成し、香気性化合物データベース４１１から読み出した測定対象の香気性化合物の吸収スペクトルと照合する。両者が予め決められた確度以上で一致すると、測定制御部４２１は、フラクションコレクタ２０に当該香気性化合物を分取させる制御信号を出力する。また、香気性化合物同定部４２２は、順次、吸収スペクトルに有意な差が現れたか否かも判定する。香気性化合物データベース４１１に保存されている吸収スペクトルは一致しないものの、吸収スペクトルに有意な差が現れている場合、カラム１７から未知の香気性化合物が流出している可能性がある。そこで、測定制御部４２１は、吸収スペクトルに有意な差が現れたと判定された場合にも、フラクションコレクタ２０にカラム１７からの流出物を分取させる制御信号を出力する。
【００２７】
測定制御部４２１から分取を指示する制御信号が出力されると、フラクションコレクタ２０では、当該香気性化合物（あるいは未知の香気性化合物を含んでいる可能性がある流出物）が分取部２２に到達するタイミングでそれらを分取容器２１に分取する。1つの香気性化合物又は流出物の分取を完了すると、分取部２２は下流側に隣接する分取容器２１の位置に移動し、測定制御部４２１からの制御信号を待つ。こうして、所望の香気性化合物及び未知の香気性化合物が順次、分取容器２１に分取される。分光検出器１９のフローセル１９１から流出し、分取部２２を通過した流出物はドレインに廃棄される。ここでは測定対象の香気性化合物と未知の香気性化合物（である可能性がある流出物）の両方を分取する場合を説明したが、測定の目的に応じていずれか一方のみを分取するようにしてもよい。
【００２８】
ここで、本実施例の香気性化合物の分取方法及び超臨界流体クロマトグラフにおいて使用するカラム１７について説明する。
【００２９】
超臨界流体クロマトグラムにおいて広く用いられているシリカゲルベースのカラムでは、官能基で化学修飾されたシリカゲルの表面に高極性のシラノール基が存在する。拡散性が高い超臨界流体とともに低分子化合物である香気性化合物を導入すると、固定相を通過してシリカゲルの表面まで進入し、該表面に存在するシラノール基との間で不所望の相互作用が生じる。従来、シリカゲルベースのカラムで香気性化合物を分離することができなかったのはこうした不所望の相互作用が原因であると推測される。
【００３０】
香気性化合物は一般に、鎖状又は環状の不飽和炭化水素構造を有することから、固定相として不飽和炭化水素構造を有する化合物を用いることが有効である。本発明者は特許文献３及び４において、不飽和炭化水素構造を有するポリマーのビーズ（以下、「ポリマービーズ」と記載。）を充填したカラムを提案しており、このカラムは香気性化合物の分離にも有効であると考えた。即ち、充填剤としてポリマービーズを用いた場合は、分離対象の香気性化合物と充填剤との間に、不所望の相互作用を生じ難く、シリカゲルや化学修飾シリカを用いた場合に比べて、シャープなピークが得られると考えた。
【００３１】
カラム１７の充填剤に用いられるポリマービーズの材料としては、アクリル系ポリマー、スチレン系ポリマー、ポリアクリルアミド系ポリマー、セルロース系ポリマー等が挙げられる。超臨界流体二酸化炭素を移動相とする超臨界流体クロマトグラフでは、分析流路に配置されるカラム１７に、二酸化炭素の臨界圧力（7.4MPa）を超える圧力がかかるため、充填剤としてのポリマービーズには耐圧性が要求される。また、二酸化炭素とモディファイアとの混合比を変化させた場合でも膨潤や収縮を生じないように、ポリマービーズには高い耐溶剤性が要求される。そのため、ポリマービーズとしては、溶媒に対する膨潤度の小さいものが好ましく用いられる。
【００３２】
カラム充填剤として用いられるポリマービーズは、架橋ポリマーを含有することが好ましい。ポリマービーズは、テトラヒドロフランを吸収したときの膨潤度およびメタノールを吸収したときの膨潤度が、いずれも1.4以下であるものが好ましい。このような低膨潤度のポリマービーズを用いることにより、良好なピーク形状が得られるとともに、ポリマービーズの耐久性が高いため、繰り返し分析を行った場合でも良好な分析結果が得られる傾向がある。また、低膨潤度のポリマービーズは、カラムへの充填時の充填圧を充分に高めることができるため、超臨界流体クロマトグラフによる分析性能の低下を抑制できる。なお、テトラヒドロフランは、移動相として用いられる物質の中で、特に樹脂材料を膨潤させやすい物質である。また、メタノールはモディファイアとして広く用いられる物質である。従って、これらの両方に対する膨潤度が低いポリマービーズを充填剤として用いることにより、様々な移動相（モディファイアを添加したものを含む）を用いた測定を行うことが可能となる。
【００３３】
ポリマービーズの膨潤度は、ポリマービーズを溶媒に分散させる前後の体積変化に基づいて決定される。ポリマービーズのテトラヒドロフランを吸収したときの膨潤度およびメタノールを吸収したときの膨潤度は、1.3以下がより好ましく、1.2以下がさらに好ましい。なお、膨潤度は一般には1.0以上である。
【００３４】
ポリマービーズの平均粒子径は、高い理論段数のカラムを得られ易いという観点から、10μm以下、5μm以下または4μm以下であってよい。使用時のカラム圧の過度な上昇を抑制する観点から、ポリマービーズの平均粒子径は、例えば、1μm以上または2μm以上であってよい。
【００３５】
カラムの理論段数を高める観点からは、ポリマービーズの粒子径（直径）の分散性を示す指標である変動係数（CV: Coefficient of Variation）の値は、小さいことが好ましく、例えば、25％以下、20％以下、15％以下または10％以下であってよい。CV値の下限は特に制限されないが、一般には1%以上である。平均粒子径およびCV値の調整等を目的として、任意の篩等を用いてポリマービーズを分級してもよい。
【００３６】
ポリマーの架橋度が高いほど、ポリマービーズの膨潤度が小さくなる傾向がある。ポリマービーズに含まれる架橋ポリマーの架橋度は、例えば、50%以上、80%以上または90%以上である。架橋度が上記範囲内であれば、超臨界流体の影響を受け難く、分析性能を向上できる。架橋ポリマーの架橋度は、重合に用いられるモノマー中の架橋モノマーの配合割合であり、重合性モノマー全質量を基準とした架橋モノマーの質量割合として定義される。
【００３７】
架橋モノマーは、2以上の重合性官能基を有する化合物であり、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン等のジビニル化合物；ジアリルフタレートおよびその異性体；トリアリルイソシアヌレートおよびその誘導体；多官能性（メタ）アクリル酸エステル等が挙げられる。架橋モノマーは1種を単独でまたは2種以上を組み合わせて用いてもよい。多官能性（メタ）アクリル酸エステルとしては、ジ（メタ）アクリル酸エステル、3官能以上の（メタ）アクリル酸エステル等が挙げられる。
【００３８】
ジ（メタ）アクリル酸エステルとしては、アルキレン基に2つの（メタ）アクリレートが結合したアルカンジオールジ（メタ）アクリレートが挙げられる。アルキレン基の炭素数は、例えば、1〜20または1〜5であってもよい。アルキレン基は、直鎖状、分枝状および環状のいずれでもよい。アルキレン基は、水酸基等の置換基を有していてもよい。
【００３９】
アルカンジオールジ（メタ）アクリレートとしては、例えば、１，３−ブタンジオールジアクリラート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，５−ペンタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、１，７−ヘプタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，８−オクタンジオールジ（メタ）アクリレート、３−メチル−１，５−ペンタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、１，１０−デカンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレートおよびグリセロールジメタクリレートが挙げられる。
【００４０】
ジ（メタ）アクリル酸エステルのその他の例は、エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、プロポキシ化エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、トリシクロデカンジメタノールジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタンジ（メタ）アクリレート、エトキシ化シクロヘキサンジメタノールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリレート；および（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）テトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の（ポリ）アルキレングリコール系ジ（メタ）アクリレートを含む。
【００４１】
3官能以上の（メタ）アクリレートとしては、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタントリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルプロパントリアクリレート等が挙げられる。
【００４２】
これらの架橋モノマーのうち、架橋密度の高いポリマー（多官能モノマー由来構造の比率の高いポリマー）が得られやすく、ポリマービーズの膨潤度を小さくできることから、例えば、ジビニルベンゼンおよびジ（メタ）アクリル酸エステルからなる群から選択される1種以上を用いてもよい。すなわち、架橋ポリマーは、ジビニルベンゼン由来の構造単位および／またはジ（メタ）アクリル酸エステル由来の構造単位を含んでいてもよい。
【００４３】
架橋モノマーとともに単官能性モノマーを用いてもよい。単官能性モノマーとしては、例えば、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ｎ−オクチル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸２−クロロエチル、アクリル酸フェニル、α−クロロアクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸ｎ−オクチル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸ステアリル等の単官能の（メタ）アクリル酸エステル；スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等のスチレンおよびその誘導体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、安息香酸ビニル、酪酸ビニル等のビニルエステル；Ｎ−ビニルピロール、Ｎ−ビニルカルバゾール、Ｎ−ビニルインドール、Ｎ−ビニルピロリドン等のＮ−ビニル化合物；フッ化ビニル、フッ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレン、アクリル酸トリフルオロエチル、アクリル酸テトラフルオロプロピル等の含フッ素化モノマー；ブタジエン、イソプレン等の共役ジエンが挙げられる。これらは1種を単独でまたは2種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４４】
ポリマービーズは、全体が架橋ポリマーからなるものでもよく、一部に架橋ポリマーを有していてもよい。膨潤度を低くする観点から、ポリマービーズの少なくとも外層に架橋ポリマーが含まれていることが好ましい。外層に架橋ポリマーを有するポリマービーズは、例えばシード重合法により得られる。
【００４５】
一般に、ビーズの粒径が小さいほどカラムの理論段数は大きくなる傾向がある。一般に、ポリマービーズはシリカゲル等と比較して粒径の小さい粒子の形成が困難な場合があるが、シード重合法は粒径の小さい粒子を形成し易い。
【００４６】
シード重合法は、重合性モノマーを含む乳化液中でシード粒子を膨潤させ、シード粒子に重合性モノマーを吸収させた後、重合性モノマーを重合する方法である。シード粒子としては、例えば、（メタ）アクリレート系粒子、スチレン系粒子等が挙げられる。
【００４７】
（メタ）アクリレート系粒子は、（メタ）アクリル酸エステルの重合により得られる。（メタ）アクリル酸エステルとしては、先に例示した直鎖状または分岐状のアルキル基を有する（メタ）アクリル酸エステル等が挙げられる。スチレン系粒子は、例えば、スチレン、ｐ−メチルスチレン、ｐ−クロロスチレン、クロロメチルスチレン、α−メチルスチレン等のスチレン系モノマーの重合により得ることができる。シード粒子を得るためのモノマーとして、上記（メタ）アクリル酸エステルおよびスチレン系モノマーの他に、アリルアルコール、フタル酸アリル、アリルエーテル等を組み合わせてもよい。これらのモノマーは1種を単独でまたは2種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４８】
シード粒子は、上記モノマーを用いて、例えば、乳化重合法、ソープフリー乳化重合法、分散重合法等の公知の方法で合成することができる。シード粒子の平均粒子径は、得られるポリマービーズの設計粒子径に応じて調整すればよい。シード粒子の平均粒子径は、重合性モノマーの吸収時間を短縮する観点から、例えば、2.0μm以下または1.5μm以下であってよい。シード粒子の平均粒子径は、均一且つ真球に近いシード粒子を効率的に得られる観点から、例えば、0.1μm以上または0.5μm以上であってよい。これらの観点から、シード粒子の平均粒子径は、0.1〜2.0μmであることが好ましく、0.5〜2.0μmであることがより好ましく、0.5〜1.5μmであることがさらに好ましい。
【００４９】
シード粒子のCV値は、例えば、得られるポリマービーズの均一性を充分に確保する観点から、10%以下または7%以下であってよい。シード粒子のCV値は一般に1%以上である。
【００５０】
ポリマービーズの平均粒子径は、シード粒子の平均粒子径に対して、例えば、2〜10倍、または2.5〜7倍となるように調整してもよい。ポリマービーズの平均粒子径を上記の範囲で調整することにより、ポリマービーズの粒子径が単分散性となり、粒子径のCV値を小さくできる。
【００５１】
重合性モノマーおよび水性媒体を含む乳化液に、シード粒子を添加してシード粒子に重合性モノマーを吸収させた後、重合性モノマーを重合することによりポリマービーズが得られる。乳化液は、公知の方法により調製できる。例えば、重合性モノマーを水性媒体に添加して、ホモジナイザー、超音波処理機、ナノマイザー等の微細乳化機により水性媒体に分散させることにより、乳化液が得られる。水性媒体としては、水、または水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系および両性イオン系のいずれを用いてもよい。
【００５２】
乳化液は、必要に応じて、有機過酸化物、アゾ系化合物等の重合開始剤を含んでいてもよい。重合開始剤は、例えば、重合性モノマー100質量部に対して、0.1〜7.0質量部の範囲で使用することができる。
【００５３】
乳化液は、シード粒子の分散安定性を向上させるために、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等の高分子分散安定剤を含んでいてもよい。高分子分散安定剤は、例えば、重合性モノマー100質量部に対して、1〜10質量部の範囲で使用することができる。
【００５４】
乳化液は、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンB類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を含んでいてもよい。重合禁止剤を含むことにより、乳化液中でのモノマーの乳化重合を抑制できる。
【００５５】
シード粒子は、乳化液に直接添加してもよく、シード粒子を水性分散体に分散させた状態で添加してもよい。例えば、シード粒子を添加した後の乳化液を、室温で1〜24時間撹拌することにより、シード粒子に重合性モノマーを吸収させることができる。乳化液を30〜50℃程度に加温することにより、重合性モノマーの吸収が促進する傾向がある。
【００５６】
シード粒子に対する重合性モノマーの混合割合は、特に制限されないが、例えば、所望の平均粒子径を有するポリマービーズを効率的に作製する観点から、シード粒子100質量部に対して800質量部以上または1500質量部以上であってよい。一方、例えば、水性媒体中で重合性モノマーが独自に懸濁重合することを抑制し、目的とする平均粒子径を有するポリマービーズを効率的に作製する観点から、重合性モノマーの混合割合は、シード粒子100質量部に対して100000質量部以下または35000質量部以下であってよい。シード粒子は、重合性モノマーを吸収することにより膨潤するため、光学顕微鏡を用いてシード粒子の粒径の拡大を確認することにより、重合性モノマーのシード粒子への吸収が終了したか否かを判定できる。
【００５７】
シード粒子に吸収させた重合性モノマーを重合させることにより、ポリマービーズが得られる。重合条件は特に限定されず、モノマーの種類等に応じて適宜選択すればよい。重合終了後、必要に応じて重合液から遠心分離またはろ過により、水性媒体を除去し、水および溶剤で洗浄した後、乾燥することにより、ポリマービーズが単離される。
【００５８】
ポリマービーズは、多孔質構造を有していてもよい。例えば、シード重合時に、水性媒体に対して不溶性または難溶性の有機溶媒を用い、相分離を促すことにより、多孔質ビーズが得られる。
【００５９】
本発明では、分離カラムの充填剤として所定のポリマービーズを用いること以外は、従来の超臨界流体クロマトグラフと同様に試料の分離・分析を実施可能であり、超臨界流体クロマトグラフの構成は図１に示すものに限定されない。
【００６０】
ポリマービーズをカラムに充填する際に用いる溶媒は、ポリマービーズが分散可能な溶媒であれば特に限定されず、例えば、水、メタノール、ＴＨＦ、アセトニトリル、クロロホルム、エチレングリコールおよび流動パラフィンが挙げられる。ポリマービーズをカラムに充填する際の充填圧は、例えば、10MPa以上または15MPa以上となるようにしてもよい。充填圧を高めることにより、超臨界流体クロマトグラフクロマトグラムにおけるピークのテーリングが抑制され、良好なピーク形状が得られやすい。ポリマービーズの変改やカラムの破損を抑制する観点から、充填圧は、例えば、60MPa以下または50MPa以下となるようにしてもよい。
【００６１】
次に、従来の超臨界流体クロマトグラフ（シリカゲルベースのカラムを備えたもの）と、本実施例の超臨界流体クロマトグラフ（スチレンとジビニルベンゼンのポリマービーズを充填剤として装填したカラムを備えたもの）のそれぞれを用いて23種類の香気性化合物を分離した結果を説明する。
【００６２】
図２はオクタデシル基で化学修飾されたシリカゲルを充填剤とするカラムを備えた従来の超臨界流体クロマトグラフにより香気性化合物を分離した結果のクロマトグラム、図３はフェニル基で化学修飾されたシリカゲルを充填剤とするカラムを備えた従来の超臨界流体クロマトグラフにより香気性化合物を分離した結果のクロマトグラム、図４はアミノプロピル基で化学修飾されたシリカゲルを充填剤とするカラムを備えた従来の超臨界流体クロマトグラフにより香気性化合物を分離した結果のクロマトグラムである。一方、図５は、本実施例の超臨界流体クロマトグラフにより実施して香気性化合物を分離した結果のクロマトグラムである。図６は、図２から図５のクロマトグラムから求めた、各香気性化合物の保持係数k’をまとめた表である。
【００６３】
図２（オクタデシル基で化学修飾したシリカゲルを充填剤とするもの）では、23種類の香気性化合物が保持時間1.0〜2.0分の時間帯に全て流出しており、ほとんど分離されていない。図３（フェニル基で化学修飾したシリカゲルを充填剤とするもの）では、図２に比べると香気性化合物が分離されているものの、依然として保持時間1.0〜4.0分の時間帯に全ての香気性化合物が流出しており、やはり分離が十分でない。図４（アミノプロピル基で化学修飾されたシリカゲルを充填剤とするもの）では、図２及び３に比べると香気性化合物が分離されているが、保持時間1.0〜2.5分の間に多数の香気性化合物が固まっており、香気性化合物を分取するには分離が不十分である。
【００６４】
一方、本実施例の超臨界流体クロマトグラフにより得られた図５のクロマトグラムでは、図２〜図４との比較から明らかに分かるように、各香気性化合物が分離されていることが分かる。香気性化合物の一部のピークが重なっている時間はあるものの、その数は少数であり、モディファイアを変更する、あるいは分取後に別のクロマトグラフィを実行することにより分離可能である。
【００６５】
上記実施例は一例であって、本発明の趣旨に沿って適宜に変更することができる。
上記実施例では、香気性化合物を分取するために、非破壊で香気性化合物を検出する分光検出器を備えた構成としたが、香気性化合物の分取を行う必要がない場合には、分光検出器に代えて（あるいは分光検出器に加えて）質量分析計を備えた構成とすることもできる。また、図５に示したクロマトグラフにおいてピークの一部に重なりが生じた香気性化合物について、それらをフラクションコレクタ２０により採取したあと、更に別のクロマトグラフで分離するようにしてもよい。
【００６６】
［態様］
上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
【００６７】
（第１態様）
本発明の第１態様に係る香気性化合物の分離方法は、香気性化合物を含む試料を、所定の物質の超臨界流体である移動相の流れに乗せて、不飽和炭化水素構造を有するポリマーからなる充填剤が装填されたカラム導入する工程を含む。
【００６８】
本発明の第１態様に係る香気性化合物の分離方法では、不飽和炭化水素構造を有するポリマーからなる充填剤が装填されたカラムを用いて香気性化合物を分離する。従来用いられているカラムにおいて官能基で化学修飾されるシリカゲルの表面には、高極性のシラノール基が存在する。シリカゲルベースのカラムによって香気性化合物を分離することができなかったのは、拡散性が高い超臨界流体とともにカラムに導入された低分子化合物である香気性化合物が、固定相を通過してシリカゲルの表面まで進入し、該表面に存在するシラノール基との間で不所望の相互作用が生じたためであると考えられる。これに対し、本発明では、固定相である、不飽和炭化水素構造を有する化合物のポリマーからなる充填剤を装填したカラムを用いる。即ち、充填剤全体が固定相として機能し、不所望の相互作用を生じさせる官能基を含まないため香気性化合物を分離することができる。
【００６９】
（第２態様）
本発明の第２態様に係る香気性化合物の分離方法は、上記第１態様に香気性化合物の分離方法において、
前記移動相が、超臨界状態の二酸化炭素、又は超臨界状態の二酸化炭素にモディファイアを添加したものである。
【００７０】
本発明の第２態様に係る香気性化合物の分離方法では、超臨界状態の二酸化炭素を主として移動相を構成する。二酸化炭素は臨界圧力が7.38MPa、臨界温度が31.1℃であり、臨界温度が常温に近く、また引火性や化学反応性がないため安全に測定を行うことができる。また、安価に高純度のものを手に入れることができる。
【００７１】
（第３態様）
本発明の第３態様に係る香気性化合物の分離方法は、上記第１態様又は第２態様の香気性化合物の分離方法において、
前記充填剤はポリマービーズであって、
前記ポリマービーズは、テトラヒドロフランを吸収したときの膨潤度、およびメタノールを吸収したときの膨潤度が、いずれも1.4以下であり、
前記ポリマービーズが架橋ポリマーを含む。
【００７２】
テトラヒドロフランは、移動相として用いられる物質の中で、特に樹脂材料を膨潤させやすい物質である。また、メタノールはモディファイアとして広く用いられる物質である。本発明の第３態様の香気性化合物の分離方法では、テトラヒドロフランとメタノールの両方に対する膨潤度が低いポリマービーズを充填剤として装填したカラムを用いるため、様々な移動相（モディファイアを添加したものを含む）を用いた測定を行うことができる。また、架橋されていないポリマーに比べると、架橋ポリマー内の結合はより強固である。そうした架橋ポリマーを含むポリマービーズを用いることによって膨潤度を小さくするとともに、耐圧性も担保することができる。
【００７３】
（第４態様）
本発明の第４態様に係る香気性化合物の分離方法は、上記第３態様の香気性化合物の分離方法において、
前記架橋ポリマーが、ジビニルベンゼン由来の構造単位、およびジ（メタ）アクリル酸エステル由来の構造単位からなる群から選択される１種以上を有する。
【００７４】
本発明の第４態様に係る香気性化合物の分離方法では、ジビニルベンゼン由来の構造単位や、ジ（メタ）アクリル酸エステル由来の構造単位からなる群から選択される１種以上を有する架橋ポリマーを用いることにより、架橋密度の高いポリマー（多官能モノマー由来構造の比率の高いポリマー）が得られやすく、ポリマービーズの膨潤度を小さくできる。
【００７５】
（第５態様）
本発明の第５態様に係る香気性化合物の分離方法は、上記第３態様又は第４態様の香気性化合物の分離方法において、
前記架橋ポリマーの架橋度が、50%以上である。
【００７６】
上述のとおり、架橋を有するポリマーを用いることにより膨潤度が小さくなり、ポリマーの架橋度が高いほど、ポリマービーズの膨潤度が小さくなる傾向がある。本発明の第５態様の香気性化合物の分離方法では50%以上の架橋度を有する架橋ポリマーを用いることで膨潤度を小さくすることができる。
【００７７】
（第６態様）
本発明の第６態様に係る香気性化合物の分離方法は、上記第１態様から第５態様のいずれかの香気性化合物の分離方法において、
前記ポリマービーズの平均粒子径が、1〜10μmである。
【００７８】
本発明の第６態様に係る香気性化合物の分離方法では、ポリマービーズの平均粒子径を10μm以下とすることにより、香気性化合物と固定相の相互作用の機会を増加して、カラムの理論段数を高めることができる。また、ポリマービーズの平均粒子径を1μm以上とすることにより、使用時にカラム内の圧力の過度な上昇を抑制できる。
【００７９】
（第７態様）
本発明の第７態様に係る香気性化合物の分離方法では、上記第１態様から第６態様の香気性化合物の分離方法において分離された香気性化合物を、さらに、クロマトグラフィ及び／又は質量分析により分析する。
【００８０】
本発明の第７態様に係る香気性化合物の分離方法においてクロマトグラフィを行うと、上記第１態様から第６態様の香気性化合物の分離方法における分離が完全でない場合でもその分離をより完全なものとすることができる。また、質量分析を行うことにより、香気性化合物の分子構造等の、より詳細な情報を得ることができる。
【００８１】
（第８態様）
本発明の第８態様に係る超臨界流体クロマトグラフは、
所定の測定手法により取得された、複数の香気性化合物の測定データを収録した香気性化合物データベースと、
不飽和炭化水素構造を有するポリマーからなる充填剤が装填されたカラムと、
所定の物質の超臨界流体を前記カラムに送給する超臨界流体送給部と、
前記超臨界流体送給部から前記カラムに至る流路に設けられ、前記超臨界流体に試料を注入する試料注入部と、
前記カラムからの流出物を、順次、前記所定の測定手法で測定する測定部と、
前記測定により得られた測定データを、前記香気性化合物のデータベースに収録された測定データと照合することにより、前記流出物に含まれる香気性化合物を同定する香気性化合物同定部と
を備える。
【００８２】
本発明の第８態様に係る超臨界流体クロマトグラフを用いると、上記第１態様と同様に、香気性化合物を十分に分離することができる。また、分離後の化合物を同定することによって、試料に未知の香気性化合物が含まれている場合に、その可能性を容易に把握することができる。
【符号の説明】
【００８３】
１…超臨界流体クロマトグラフ
１１…ボンベ
１２…加圧ポンプ
１３…液体容器
１４…ポンプ
１５…ミキサー
１６…試料注入部
１７…カラム
１７１…カラムオーブン
１８…背圧制御弁
１９…分光検出器
１９１…フローセル
１９２…ランプ
１９３…光検出部
２０…フラクションコレクタ
２１…分取容器
２２…分取部
４…制御・処理部
４１…記憶部
４１１…香気性化合物データベース
４２１…測定制御部
４２２…香気性化合物同定部
５…入力部
６…表示部
【図１】
2020204514.tif 000003
【図２】
2020204514.tif 000004
【図３】
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【図４】
2020204514.tif 000006
【図５】
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【図６】
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