(57)【要約】【課題】「高感度検出法による検便NV検査」の価格が数千円/検体と高額なこともあって、大量調理施設以外での定期的な検便NV検査の広がりは芳しいとは言い難い。さらに、大量調理施設においても、NVの感染力の強さなどから考えると、実際の環境へのNV排出のモニタリングと検査頻度向上の双方が図れる便器NV検査を全従業員検便NV検査に併行しておこなうことは食の安全性を高めるのに有効となる。【解決手段】本発明は、定期及び／又は 随時（食中毒症状顕在者発生時など）に生活環境内のトイレ便器からの食中毒起因ウイルス存否検査を行い、該検査結果に基づき疑食中毒起因ウイルス感染者の検便検査を行うことを特徴とするウイルス感染防御方法である。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
定期及び／又は 随時に生活環境内のトイレ便器からの食中毒起因ウイルス存否検査を行い、該検査結果に基づき疑食中毒起因ウイルス感染者の検便ウイルス検査を行うことを特徴とするウイルス感染防御方法。
【請求項２】
食中毒起因ウイルス存否検査が、生活環境内のトイレ便器を拭取冶具で拭き取り、該冶具を水溶液に浸し撹拌した液に濃縮液を加えて濃縮した後、該濃縮液に含まれる標的ウイルスの遺伝子を増幅して検出を行うことを特徴とする請求項１記載のウイルス感染防御方法。
【請求項３】
濃縮液に個別もしくは混合状態のポリエチレングリコール、塩、多糖類を含む液を加えた後、遠心操作でウイルスを濃縮する工程を行うことを特徴とする請求項２記載のウイルス感染防御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に食の安全性を確保するための検査分野において、トイレ便器に付着した食中毒原因ウイルス（特にノロウイルス）を回収して検出する検査（便器ウイルス検査）を、糞便中のウイルス検査（検便ウイルス検査）の代替もしくは補完として使用することに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトに下痢症を引き起こすウイルスは、ノロウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、A型肝炎ウイルスなど、種々存在している。
【０００３】
下痢症を引き起こすウイルスのなかでも、ノロウイルス（以下、NV）は主に冬季から春先に掛けて多発する食中毒の原因ウイルスである。NVは７つの遺伝子群 (GI〜GVII)に分類されており、その内、人に感染し下痢症を引き起こすのはGI,GIIおよびGIVであるが、GI,GIIが主流となっている。NVは感染性食中毒原因全体の半分以上を占めていて、毎年１〜３万人の感染者が報告されているが、実際にはその100倍程度が感染していると推測されている。
【０００４】
NVの感染経路としては、（1）下水→貝類→人、（2）調理従事者→器具・食材→人、（3）人→人、人→施設環境→人が想定されており、従来は（1）経路が大半を占めていたが、近年は （2）、（3）の人を介した感染事例が大半を占めるようになってきている。
【０００５】
このようにNVが蔓延する原因としては、以下のNVが有している特徴が大きく関与していると考えられている。即ち、（1）NVの遺伝子本体がRNAで変異が生じ易く、かつNVに対する免疫防御が腸粘膜を介したものであるため、一度感染したとしても免疫が無効もしくは長続きしない。（2）糞便のみならず嘔吐物中にも大量のウイルスが排出される（患者便中105〜109ウイルス/g、患者嘔吐物中103〜107ウイルス/g）。（3）感染者は症状消失後も長期に渡ってNVを排出し続ける（成人で３週間、小児では1ヶ月間以上排出されたとの報告がある）。（4）症状の出ない感染者（不顕性感染者）が多数存在するが、彼らも人に感染させるに足る量のNVを糞便中に排出している。（5）100〜1,000 NVの曝露で半数の人が感染するほど感染力が強い。（6）環境中（特に低温での）生存期間が長い（乾燥状態の4℃保存で2ヶ月間、20℃保存で1ヶ月間程度と推定されている）。
【０００６】
そのような状況から、同一メニューを１回300食以上又は１日750食以上を提供する調理施設（大量調理施設）を対象とした「大量調理施設衛生管理マニュアル」（平成9年3月24日付け衛食第85号別添  最終改正：平成29年6月16日付け食安発0610第1号）の平成20年6月の改訂で、厚生労働省は「冬季に月一回以上の高感度検出法による検便NV検査」や「NV感染者の調理作業控え」などの推奨を追記した。
【０００７】
しかしながら、食中毒発生原因として未だNVは全体の半分以上を占めている。さらに
NV患者の発生施設は、飲食店、仕出し屋、旅館、製造所などの食品を直接取り扱う施設に加えて、事業所、学校、病院、販売所、家庭など多岐に渡っている。
【０００８】
上記の「高感度検出法による検便NV検査」の価格が数千円/検体と高額なこともあって、大量調理施設以外での定期的な検便NV検査の広がりは芳しいとは言い難い。さらに、検査対象である大量調理施設においても、NVの感染力の強さなどから考えると、さらに高頻度での検便NV検査が望まれる。
【０００９】
我々は、これまでの研究で、駅などの公共施設のトイレ便器が高率にNVに汚染してい
ること、NV感染者の発生に伴い便器のNV汚染も発生することを見出し、便器でのNV検査を行うことで、NV感染者の発生を発見できると考えた。
【００１０】
さて、労働安全衛生規則第628条において、「男性用大便所の便房の数は、同時に就業する男性従業員60人以内ごとに１個以上とすること」「女性用便所の便房の数は、同時に就業する女性従業員20人以内ごとに１個以上とすること」と定められている。
【００１１】
従って、便器に付着しているNV検査を検便NV検査の代替として使用することが出来れば、数的なパフォーマンスの向上は明らかである。さらに、便器NV検査における作業工程は、検査の前段で便器から回収したNVの濃縮が加わる以外は検便NV検査と同一であることから、両検査に大きな価格差が生じないと仮定すると、便器NV検査がコストパフォーマンス的にも検便NV検査に比べて格段に優れていることは明らかである。
【００１２】
勿論、便器NV検査で陽性が出た場合には、同トイレを利用者しているなどの感染疑い者（感染者からの二次感染も含めた）の検便NV検査を実施し、感染者を割り出し、該当者を食品取扱業務から外すなどが食の安全性確保上必要となる。この際の検便NV検査に要する費用を考慮しても、定期的な全員検便検査に比べて格段のコスト軽減が期待できる。さらには、月一回の検便検査実施施設においても、検便NV検査と便器NV検査を併用することで、更なる食の安全性を図ることができる。
【００１３】
さらに、便器でのNV陽性発生時には、当該便器を含めた設備や備品（便器、蛇口、ドアノブ、床など）や感染者が出入りする施設（特に厨房）の設備や備品（ドアノブ、まな板、調理用具、床など）を次亜塩素酸ナトリウムなどで消毒することで、さらなる食の安全性の向上が期待できる。
【００１４】
さて、便器などでのウイルス検出（検査）においては、まずは、ウイルス汚染が懸念される場所（便付着箇所など）を、拭取治具に付属している綿棒などを用いて拭い取る。
【００１５】
拭取綿棒などでウイルスが拭い取られた場合は、拭取治具が包含している緩衝液、生理食塩水や蒸留水に懸濁した後、ポリエチレングリコール (以下、PEG)などを含んだ濃縮液と混合しての遠心、あるいは懸濁液から直接に超遠心などでウイルスが濃縮される。
【００１６】
濃縮物中にウイルスが存在するか否かを確認するには、遺伝子で検出するのが感度、特異性において優れている。遺伝子での検出においては、検出対象のウイルスを直接もしくはその遺伝子（核酸：DNAもしくはRNA）を抽出・精製するための処理を施した後、検査対象ウイルスの遺伝子がDNAの場合はそのDNAを増幅、RNAの場合は、逆転写(RT)反応でcDNAに転換した後に増幅して検出する、(RT)-PCR法などが一般的に実施されている。増幅物の検出や解析はプローブ法などでリアルタイムに、もしくは増幅後、融解温度解析 (Melting Curve Analysis : MCA)やアガロース電気泳動などで行われている（特許文献１）。
【００１７】
しかしながら、従来のPEG沈殿法では、ウイルスを高率かつ安定的に濃縮して回収することが困難かつ作業工程が煩雑、工程時間も長く、簡便・迅速性に劣るなどの問題があった。また、超遠心法は、装置が高価な上に、操作には熟練した技術が必要であり、一度に処理できる検体数も少ないなど、汎用面での問題が大きかった。
【００１８】
そこで、我々は、PEG溶液への多糖類添加と添加量の最適化、および添加塩濃度の最適化により、水溶液中のウイルスを簡便・迅速、安定的かつ高率に濃縮する方法およびそれに使用する試薬を発明して特許出願を行った（特願２０１８−１２６７７２号）。
【００１９】
上記の方法を利用して高率に回収したウイルスは、ダイレクト（核酸の抽出・精製不要）に、検出すべき核酸がDNAの場合はPCRなど、RNAの場合は逆転写(RT)反応でcDNAに転換後PCRなどで増幅・検出することで、拭取り液中に存在するウイルスの検出やモニタリングを高速かつ容易に行えるようになった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】特開２０１８−１３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
厚生労働省発「大量調理施設衛生管理マニュアル」に則り、大量調理施設では通常、冬季月一回の割合で、高感度遺伝子検査法であるreal time RT-PCR法で検便NV検査が実施されているが、未だ、病因物質別食中毒患者の割合（平成29年度薬事・食品衛生審議会食品衛生分科会食中毒部会）では半数以上がNV由来と報告されている。その一因として、本検査の検査料が高額なこともあって、中小の調理施設やその他の食品取扱施設などへの広がりが限定的であることや、検査対象の大量調理施設においても月一回の検査と検査頻度が低いことが考えられる。従って、NV感染者の低減には、安価で利便性に優れた検査を追加することによるさらなる検査機会の増大が必要と考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
NV感染（特に食を介した）を低減するには、NV感染者を割り出すための検査機会の増大が必要となる。そのためには、検便NV検査の代替えもしくは補完に使用できる、利便性やコストパフォーマンスに優れたNV検査法の導入が求められる。
そこで、本発明は、定期及び／又は 随時（食中毒症状顕在者発生時など）に生活環境（特に職場）内のトイレ便器からの食中毒起因ウイルス（特にNV）の存否検査を行い、該検査結果に基づき疑食中毒起因ウイルス感染者の検便検査を行うことを特徴とするウイルス感染防御方法を提供する。
すなわち、本発明は、便器（洋式トイレにおいては特に便座裏）にウイルスが付着しているかの検査が、早期の感染発見と感染者割り出しのための検便ウイルス検査対象者の絞り込みなどに利用できることを見出した。
【００２３】
さらに、便器に食中毒起因ウイルスが付着していることが判明した場合、感染予防のための注意喚起や、当該便器および周辺の設備や備品の消毒などを行うことで、食中毒起因ウイルスによる環境汚染と環境を介した感染の拡大防止を図ることもできる。
【００２４】
ここで、「食中毒症状顕在者」とは、下痢、嘔吐等の食中毒の症状が見られる者をいい、「疑食中毒起因ウイルス感染者」とは、食中毒症状顕在者を含む食中毒起因ウイルス（例えばNV）陽性トイレ使用者ならびに職場の同僚、家族等、食中毒起因ウイルス（例えばNV）陽性トイレ使用者と関連のある者をいう。
また、生活環境内とは、感染者の職場、住居、通勤圏などの行動範囲内をいい、いわゆる二次感染が疑われる場所も含む。
【００２５】
食中毒起因ウイルス存否検査は、生活環境内のトイレ便器を拭取冶具で拭き取り、該冶具を水溶液に浸し撹拌した液に濃縮液を加えて濃縮した後、該濃縮液に含まれる標的ウイルスの遺伝子を増幅して検出を行うことを特徴とする。
具体的には、トイレ便器の検査においては、市販の拭取治具付属の綿棒などでウイルスの存在する可能性の高い箇所を拭い取る。拭い取った綿棒は、拭取治具内の緩衝液、生理食塩水や蒸留水に浸して撹拌し、それを検体とする。検体は、我々が先に発明したウイルス濃縮法（特願２０１８−１２６７７２号）で、ウイルスが存在する場合、そのウイルスを高率かつ安定的に濃縮して回収することができる。
すなわち、濃縮法は、ポリエチレングリコール（PEG）と多糖類などを含む濃縮液のようなウイルスを高率かつ安定的に濃縮できる液を加え、遠心操作などでウイルスを濃縮する。その後、該濃縮液中の標的ウイルスの遺伝子増幅を行う。
PEG溶液に添加する多糖類としては、PEG溶液中で懸濁状態になるものであれば使用できる可能性が高い。例として、グルコース由来のアミロペクチン、カードラン、グリコーゲン、セルロース、α-セルロース、デキストリン、N-アセチルグルコサミン由来のキチン、フルクトース由来のイヌリンが挙げられるがこれらに限定されるものではなく、またこれらを混合して使用することも可能である。上記多糖類の内、グリコーゲン、デキストリン、イヌリンが推奨されるが、最も推奨されるのはグリコーゲンである。
【００２６】
濃縮、回収したウイルスの遺伝子（核酸：DNA or RNA）はPCRやRT-PCR法などで高度に増幅することができる。なお、ウイルス遺伝子の増幅は、ウイルスから核酸を抽出・精製してから行うのが通例であるが、反応液に直接（精製なしに）添加して行う方法が簡便性や迅速性の面で有利である。増幅されたDNAやRNAは蛍光プローブなどを使用することで、高感度かつ定量的に検出することが可能となる。
【００２７】
上記検査で陽性が出た場合には、同トイレを利用者しているなどの感染疑い者（感染者からの二次感染も含めた）の検便ウイルス検査を実施し、感染者を割り出し、食品取扱業務などから外すことで、低コストかつ効率的にウイルス感染（特に食を介したNV感染）を予防することができる。
【００２８】
また、トイレ便器から食中毒起因ウイルスが検出された場合には、当該便器を含めた設備や備品（便器、蛇口、ドアノブ、床など）や感染者が出入りしたであろう施設（特に厨房）の設備や備品（ドアノブ、まな板、調理用具、床など）を消毒することで、更に安全性を高めることが可能になる。消毒は、アルコール系消毒剤、塩素系消毒剤、塩化ベンザルコニウム、グルタルアルデヒド、ペルオキシー硫酸カリウム、メタケイ酸ナトリウム、リン酸三ナトリウム、過酸化水素、加熱などあるが、特に塩素系消毒剤とメタケイ酸ナトリウムが好ましい。
【発明の効果】
【００２９】
NV感染者によって高率に汚染される可能性が高いトイレ便器（洋式トイレにおいては特に便座裏）の拭取り検査を行うことで、NV汚染の実態を把握し、陽性発生時には、同トイレを利用者しているなどの感染疑い者の検便NV検査を実施し、感染者を割り出し、食品取扱業務などから外すことで、低コストかつ効率的にNV感染（特に、食を介した）を防ぐことが可能となる。
【００３０】
さらに、便器からのNV陽性発生時には、当該便器を含めた設備や備品（便器、蛇口、ドアノブ、床など）や感染者が出入りする施設（特に厨房）の設備や備品（ドアノブ、まな板、調理用具、床など）を次亜塩素酸ナトリウムなどで消毒することで、更に安全性を高めることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】便器での拭取検査を用いた低コスト型NVモニタリング法を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
［実施例１］
便器での拭取検査を用いた低コスト型NVモニタリング法を示したのが図１である。作業工程としては、
（１）拭取治具の用意
拭取冶具としては、例えば市販されている綿棒等の拭取冶具を使用することができる。
（２）便器からの拭取検査
拭取治具中の綿棒などで、便器の糞便付着箇所などを中心に拭取を行った後、治具に戻す。拭取りは、図１（３）に示す通り、便器の糞便付着箇所などで、左右に10回、上下に10回、左斜めに10回、右斜めに10回などを行う。
拭取治具中の懸濁液からNVを濃縮・回収する工程を行った後、NVの遺伝子を増幅・検出する高感度遺伝子検査を行う。濃縮・回収は、例えば、特願2018-126772号で示すポリエチレングリコール（PEG）と多糖類などを含む濃縮液のようなウイルスを高率かつ安定的に濃縮できる液を加え、遠心操作などでウイルスを濃縮する。その後、該濃縮液中の標的ウイルスの遺伝子増幅を行う。
（４）NV陽性判定
遺伝子検査で陽性反応が出た場合には、感染疑い者の検便検査、およびNV陽性が確認されたトイレを中心とした施設の設備や備品などの消毒を行う（図１（６））。
消毒は、アルコール系消毒剤、塩素系消毒剤、塩化ベンザルコニウム、グルタルアルデヒド、ペルオキシー硫酸カリウム、メタケイ酸ナトリウム、リン酸三ナトリウム、過酸化水素、加熱などあるが、特に塩素系消毒剤とメタケイ酸ナトリウムが好ましい。
（５）NV陰性判定
現在の環境に問題がある可能性は低いので、現状維持する（図１（７））。すなわち、感染疑い者の検便検査は不要。
【００３３】
［実施例２］
大阪駅とその周辺の駅舎に設置されている62のトイレ便器におけるNV付着の程度を2018年１月に検査した。方法としては、便器を市販拭取治具（ELMEX製Swabstar）の綿棒で拭い取った後、治具に内包されている蒸留水1mlに懸濁し、内400μLを2mLのエッペンドルフチューブに分注した。そこに我々の開発したグリコーゲン添加PEG溶液を同量加えて10分間静置後、20℃、5分間の遠心(14,000G)を行った。上清を吸引、廃棄後、残った沈渣に8μlの検体処理液を加えて懸濁し、85℃で3分間の熱処理を行った。熱処理サンプルを氷冷後、11μlのNV検出用のprimerとprobeを含んだRT-PCR反応液を添加し、ダイレクトにreal time RT-PCRを行い、増幅に伴って蛍光標識probeが分解して生じる蛍光を計測した。なお、同じトイレ内に複数の便器がある場合には、拭取治具１個で２個分の便器（奇数の場合は、余りは１個分）を拭き取った。同時にコントロールとして、既知量のNV RNAを添加したreal time RT-PCRを行い、その検量線より便器から検出されたNV量を推定した結果を、100個以上を強陽性、100個以下を弱陽性として纏めたのが表１である。２個の便器を拭き取った綿棒で検出された場合はその内の１個がNVに汚染していたと仮定した場合の検出率はGI陽性が11.3%（内、強陽性6.5%）、GII陽性が30.6%（内、強陽性11.3%）となり、公共機関の便器が高い確率でNVに汚染されていることが判明した。
［表１］大阪駅周辺の駅舎設置トイレの便器を対象に行ったNV検査の結果を纏めた表
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【００３４】
［実施例３］
ある事業所においてNV感染者の発生が判明した翌日に、当該者が利用したトイレ(No.1)とそれに近接したトイレ(No.2)の便座裏とドアノブでのNV拭取り検査を実施した結果を纏めたのが表２である。実験方法は実施例２に準じて行った。表は、duplicateで検査した時の蛍光立上時のPCRサイクル数(Ct値)の平均を示している。感染者が利用したトイレの便座裏からは数100個程度のNVが検出された。さらに、感染者が利用していないトイレの便座裏からも痕跡程度のNVが検出されたことは2次感染があったことを疑わせている。なお、両トイレのドアノブからのNV検出がなかったことから、他施設への汚染伝播の可能性は低いと推測した。
［表２］NV感染者発生事業所トイレを対象に行ったNV検査の結果を纏めた表
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上記表２より、生活環境内のトイレ便器を検査することで、該便器利用者にNV感染者がいたかいなかったかの推定が可能になることを示している。
【図１】
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