(57)【要約】【課題】  生きた細胞のインスリン応答をリアルタイムに可視化する手法を提供する。【解決手段】  グルコース輸送体タンパク質と、ｐＨ応答性の蛍光または発光レポータータンパク質とが融合されてなるキメラタンパク質であって、前記レポータータンパク質が前記グルコース輸送体タンパク質の細胞外ループに挿入されている、キメラタンパク質。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース輸送体タンパク質と、蛍光性または発光性のレポーターとが融合されてなるキメラタンパク質であって、前記レポーターが前記グルコース輸送体タンパク質の細胞外ループに挿入されており、前記キメラタンパク質が細胞膜に移行すると蛍光または発光の強度および／もしくは波長が変化する、キメラタンパク質。
【請求項２】
前記グルコース輸送体タンパク質がＧＬＵＴ４である、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
前記細胞外ループが、前記グルコース輸送体タンパク質の膜貫通ドメイン１と膜貫通ドメイン２の間に位置する細胞外ループ１である、請求項１または２に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
前記レポーターがｐＨ応答性の蛍光タンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
前記ｐＨ応答性の蛍光タンパク質がｐＨｌｕｏｒｉｎである、請求項４に記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
前記レポーターがｐＨ応答性の発光酵素タンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
前記ｐＨ応答性の発光酵素タンパク質がルシフェラーゼである、請求項６に記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
前記レポーターがスプリット蛍光タンパク質断片またはスプリット発光酵素タンパク質断片である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を発現する細胞。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１３】
（１）請求項１〜８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を発現する細胞にインスリンを曝露するステップと、
（２）前記キメラタンパク質の蛍光または前記キメラタンパク質による発光を検出するステップと
を含む、インスリン応答性の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の糖取り込みを可視化するためのキメラタンパク質、およびそれを用いたインスリン応答性の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリンは膵臓から分泌されるホルモンであり、骨格筋や脂肪組織などの標的臓器に作用して糖の取り込みを促進させることにより血糖値を制御する。標的臓器のインスリン感受性が鈍化し、標的臓器の糖取り込み能が低下した状態であるインスリン抵抗性は、肥満、糖尿病、高脂血症、メタボリックシンドロームなどの、世界的に急増している生活習慣病の発症・増悪因子のひとつと考えられている。現在、インスリン抵抗性に対する第一選択薬としては、ピオグリタゾンなどのインスリン抵抗性改善薬またはグリニド薬などのインスリン分泌促進薬が使用されているが、いずれもすべての患者の予後を改善するには至っていない。
【０００３】
骨格筋や脂肪組織における糖取り込みは、グルコース輸送体タンパク質であるＧＬＵＴ４を介して行われる。ＧＬＵＴ４は、細胞内の小胞に格納されているが、インスリンに応答して細胞膜へと移行し、糖を細胞内に取り込む輸送担体として機能する。インスリン抵抗性は、細胞内におけるインスリンシグナル伝達が障害された結果として、ＧＬＵＴ４の小胞から細胞膜への移行が阻害されることにより生じると考えられている。一方、身体運動がインスリン抵抗性の改善に有効であることが古くから知られている。本発明者らを含むいくつかのグループによる研究結果は、筋収縮が、インスリンシグナル伝達経路とは独立した異なる経路を介してＧＬＵＴ４の細胞膜への移行を誘導し、糖取り込みを促進する可能性を示唆している。さらに、運動終了後２４時間程度まで、インスリン抵抗性の改善が維持されることが報告されている。しかし、こうしたメカニカルストレス依存性の糖取り込みのメカニズムは、現時点ではほとんど解明されていない。
【０００４】
ＧＬＵＴ４を標識することにより、ＧＬＵＴ４の細胞内動態を可視化し、細胞の糖取り込みをモニターしようとする試みがなされている。例えば、ＧＬＵＴ４の細胞外ドメインにＭｙｃタグを遺伝子工学的に挿入し、ＧＬＵＴ４の局在変化を観察した報告例がある（非特許文献１）。しかし、この手法では、Ｍｙｃタグを検出するために細胞を固定して免疫染色する必要があり、生きた状態の細胞におけるＧＬＵＴ４のリアルタイムの局在変化を観察することができない。また、最近では、Ｃ末端に赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙを融合させたＧＬＵＴ４の細胞内局在を観察した報告例がある（非特許文献２）。しかし、全反射照明蛍光顕微鏡や共焦点蛍光顕微鏡のような背景光を低減できる高解像度イメージング設備を使用しない限り、ｍＣｈｅｒｒｙ融合ＧＬＵＴ４の細胞内または細胞膜への局在を識別することは困難である。さらに、上記いずれの手法も、培養細胞にしか適用することができない。メカニカルストレス依存性の糖取り込みのメカニズムを解明するためには、生体内の細胞におけるＧＬＵＴ４の動態をリアルタイムに可視化できる手法の確立が不可欠である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋａｎａｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９３），Ｖｏｌ．２６８，Ｎｏ．１９，ｐｐ．１４５２３−１４５２６
【非特許文献２】Ｌｉｍ，ＣＹ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，（２０１５），Ｖｏｌ．６，Ａｒｔｉｃｌｅ  Ｎｏ．５９５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、生体内において、血流が維持された条件下での、細胞におけるグルコース輸送体タンパク質の動態、特に、収縮可能な生きた骨格筋におけるＧＬＵＴ４の動態をリアルタイムに可視化し、インスリン依存性および／または非依存性の糖取り込み活性を評価することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、グルコース輸送体タンパク質の細胞外ドメインに蛍光性または発光性のレポーターを挿入したキメラタンパク質により、生きた細胞の糖取り込み活性を評価できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、一実施形態によれば、グルコース輸送体タンパク質と、蛍光性または発光性のレポーターとが融合されてなるキメラタンパク質であって、前記レポーターが前記グルコース輸送体タンパク質の細胞外ループに挿入されており、前記キメラタンパク質が細胞膜に移行すると蛍光または発光の強度および／もしくは波長が変化する、キメラタンパク質を提供するものである。
【０００９】
前記グルコース輸送体タンパク質は、ＧＬＵＴ４であることが好ましい。
【００１０】
前記細胞外ループは、前記グルコース輸送体タンパク質の膜貫通ドメイン１と膜貫通ドメイン２の間に位置する細胞外ループ１であることが好ましい。
【００１１】
前記レポーターは、ｐＨ応答性の蛍光タンパク質であることが好ましい。
【００１２】
前記ｐＨ応答性の蛍光タンパク質は、ｐＨｌｕｏｒｉｎであることが好ましい。
【００１３】
あるいは、前記レポーターは、ｐＨ応答性の発光酵素タンパク質であることが好ましい。
【００１４】
前記ｐＨ応答性の発光酵素タンパク質は、ルシフェラーゼであることが好ましい。
【００１５】
あるいは、前記レポーターは、スプリット蛍光タンパク質断片またはスプリット発光酵素タンパク質断片であることが好ましい。
【００１６】
また、本発明は、一実施形態によれば、上記キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸または前記核酸を含む発現ベクターを提供するものである。
【００１７】
また、本発明は、一実施形態によれば、上記キメラタンパク質を発現する細胞またはトランスジェニック非ヒト動物を提供するものである。
【００１８】
また、本発明は、一実施形態によれば、（１）上記キメラタンパク質を発現する細胞にインスリンを曝露するステップと、（２）前記キメラタンパク質の蛍光または前記キメラタンパク質による発光を検出するステップとを含む、インスリン応答性の評価方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係るキメラタンパク質は、生体内の骨格筋を含む生きた細胞におけるグルコース輸送体タンパク質の動態をリアルタイムに可視化することができる。そのため、細胞における糖取り込みのメカニズムの詳細な解析や、細胞のインスリン応答性の評価が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＧＬＵＴ４−ＳＥＰキメラタンパク質によるインスリン応答性の評価方法の概略を示す模式図である。
【図２】図２は、ＧＬＵＴ４−ＳＥＰキメラタンパク質の立体構造モデルを示す図である。
【図３】図３は、実施例において作製した４種類のＧＬＵＴ４−ＳＥＰキメラタンパク質の一次構造を示す図である。
【図４】図４は、ＧＬＵＴ４−ＳＥＰキメラタンパク質を発現させたＣ２Ｃ１２細胞のインスリン応答性を確認した蛍光顕微鏡観察像を示す図である。
【図５】図５は、図４の結果を蛍光強度により表示したグラフである。
【図６】図６は、ＧＬＵＴ４−スプリットＧＦＰ断片キメラタンパク質によるインスリン応答性の評価方法の概略を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
【００２２】
本発明は、第一の実施形態によれば、グルコース輸送体タンパク質と、蛍光性または発光性のレポーターとが融合されてなるキメラタンパク質であって、前記レポーターが前記グルコース輸送体タンパク質の細胞外ループに挿入されており、前記キメラタンパク質が細胞膜に移行すると蛍光または発光の強度および／もしくは波長が変化する、キメラタンパク質である。
【００２３】
本実施形態において、「グルコース輸送体タンパク質」とは、促進拡散によってグルコースを細胞内に取り込むＧＬＵＴファミリーのタンパク質を意味する。なお、本実施形態におけるグルコース輸送体タンパク質には、ナトリウム−グルコース共輸送体であるＳＧＬＴファミリーのタンパク質は含まれない。現在のところ、ＧＬＵＴファミリータンパク質（以下、単に「ＧＬＵＴ」とも記載する）の１４種類のアイソフォームが特定されており、それらは、その配列の類似性に基づいて、クラスＩ〜ＩＩＩに分類されている（クラスＩ：ＧＬＵＴ１〜４およびＧＬＵＴ１４；クラスＩＩ：ＧＬＵＴ５、７、９、１１；クラスＩＩＩ：ＧＬＵＴ６、８、１０、１２、１３）。ヒトＧＬＵＴアイソフォームの配列情報を表１に示す
【００２４】
表１．ヒトのＧＬＵＴファミリータンパク質
【表１】
2020068696.tif 000002
【００２５】
本実施形態におけるグルコース輸送体タンパク質は、いずれのクラス／アイソフォームのＧＬＵＴであってもよいが、好ましくは、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４またはＧＬＵＴ１２であり、特に好ましくは、ＧＬＵＴ４である。
【００２６】
また、本実施形態におけるグルコース輸送体タンパク質には、上記１４種類のＧＬＵＴアイソフォームの他、これらと同等の生理機能（細胞膜への移行活性および／または糖取り込み活性）が維持されていることを限度として、これらの変異体やホモログなどが含まれる。すなわち、本実施形態におけるグルコース輸送体タンパク質には、上記ＧＬＵＴファミリータンパク質と同等の生理機能（細胞膜への移行活性および／または糖取り込み活性）が維持されていることを限度として、上記ＧＬＵＴファミリータンパク質と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。アミノ酸配列の同一性は、配列解析ソフトウェアを用いて、または、当分野で慣用のプログラム（ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなど）を用いて算出することができる。
【００２７】
本実施形態において、「蛍光性または発光性のレポーター」とは、本実施形態のキメラタンパク質の細胞膜への移行を、蛍光または発光の変化に基づいて検出することができるタンパク質またはそのスプリット断片を意味する。本実施形態における蛍光性または発光性のレポーターは、本実施形態のキメラタンパク質が細胞膜に移行すると、蛍光または発光の強度および／もしくは波長が変化する。
【００２８】
本実施形態におけるレポーターは、好ましくは、ｐＨ応答性の蛍光タンパク質である。「ｐＨ応答性の蛍光タンパク質」とは、ｐＨの変化（好ましくは、ｐＨ５．５〜７．５の範囲におけるｐＨの変化）に応答して、その蛍光強度および／または波長が変化する蛍光タンパク質を意味する。そのようなｐＨ感受性蛍光タンパク質としては、例えば、ＧＦＰやその変異体であるｐＨｌｕｏｒｉｎの他、ＤｓＲｅｄやその変異体であるｍＮｅｃｔａｒｉｎｅ、ｐＨＴｏｍａｔｏ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｐＨｏｒａｎバリアント、ｐＨｕｊｉなどが知られており（Ｓｈｅｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，（２０１４），Ｖｏｌ．２０７，Ｎｏ．３，ｐｐ．４１９−４３２）、それらのいずれのｐＨ感受性蛍光タンパク質を本実施形態におけるレポーターとして用いてよい。また、本実施形態において用いることができるｐＨ応答性の蛍光タンパク質には、同等の特性を維持するバリアント（例えば、円順列変異体など）が包含され得る。本実施形態において用いることができるｐＨ応答性の蛍光タンパク質は、好ましくはｐＨｌｕｏｒｉｎ、ｐＨｏｒａｎバリアントまたはｐＨｕｊｉであり、特に好ましくはｐＨｌｕｏｒｉｎであり、最も好ましくは、ｓｕｐｅｒ−ｅｃｌｉｐｔｉｃ  ｐＨｌｕｏｒｉｎ（ＳＥＰ）（Ｓａｎｋａｒａｎａｒａｙａｎａｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，（２０００），Ｖｏｌ．７９，Ｎｏ．４，ｐｐ．２１９９−２２０８）である。
【００２９】
あるいは、本実施形態におけるレポーターは、好ましくは、ｐＨ応答性の発光酵素タンパク質である。「ｐＨ応答性の発光酵素」とは、ｐＨの変化（好ましくは、ｐＨ５．５〜７．５の範囲における変化）に応答して、生物発光活性または化学発光活性が変化する酵素タンパク質を意味する。本実施形態において用いることができるｐＨ応答性の発光酵素タンパク質としては、特に限定されないが、例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼなどが挙げられる。それぞれの酵素タンパク質に対する発光基質としては、例えば、ルシフェリン、アダマンチルメトキシホスホリルフェニルジオキセタン、アダマンチルメトキシホスホリルフェニルジオキセタンガラクトピラノシド、アダマンチルメトキシホスホリルフェニルジオキセタングルクロニドなどが挙げられる。本実施形態において用いることができるｐＨ応答性の発光酵素タンパク質は、好ましくはルシフェラーゼであり、特に好ましくはホタルルシフェラーゼである。
【００３０】
あるいは、本実施形態におけるレポーターは、好ましくは、スプリット蛍光タンパク質断片またはスプリット発光酵素タンパク質断片である。本実施形態において、「スプリット蛍光タンパク質断片」または「スプリット発光酵素タンパク質断片」（以下、両者を単に「スプリットレポーター断片」とも記載する）とは、蛍光タンパク質または発光酵素タンパク質の部分断片であって、それ自体は蛍光または発光活性を失っているが、前記部分断片を補完する蛍光タンパク質または発光酵素タンパク質の部分断片（以下、「相補的スプリット断片」という）と会合することにより、蛍光タンパク質または発光酵素タンパク質が再構成されて、蛍光または発光活性を回復するものを意味する。
【００３１】
本実施形態におけるスプリットレポーター断片は、蛍光タンパク質または発光酵素タンパク質が任意の位置で分割された２つのスプリット断片の一方であってよく、元の蛍光タンパク質または発光酵素タンパク質のＮ末端側もしくはＣ末端側のスプリット断片のいずれであってもよい。本実施形態におけるスプリットレポーター断片は、細胞外から適用された相補的スプリット断片と会合したとき、蛍光または発光活性を回復する。そのため、本実施形態におけるスプリットレポーター断片およびその相補的スプリット断片は、スプリットレポーター断片／相補的スプリット断片の会合を仲介および支援し得る相互作用ペプチドが融合されていてよい。そのような相互作用ペプチドとしては、例えば、逆平行ロイシンジッパーを形成し得るコイルドコイル形成ペプチドや、カルモジュリン（ＣａＭ）とＭ１３ペプチドの組み合わせや、ＦＫＢＰとＲＦＢの組み合わせなどが挙げられる。
【００３２】
本実施形態におけるスプリット蛍光タンパク質断片は、例えば、ＧＦＰおよびその改変体（ＣＦＰ、ＹＦＰなど）、ならびにＧＦＰ様タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど）などの蛍光タンパク質や、それらと同等の特性を維持するバリアント（例えば、円順列変異体など）のスプリット断片であってよい。蛍光タンパク質は共通してβバレル構造を有しており、好ましくは、βストランド間のループにおいて分割され得る。例えば、ＧＦＰは、１１本のβストランドにより構成されるβバレル構造を有しており、例えば、βストランド１〜５に対応するスプリットレポーター断片とβストランド６〜１１に対応する相補的スプリット断片とに分割されてよく、または、例えば、βストランド１〜１０に対応するスプリットレポーター断片とβストランド１１に対応する相補的スプリット断片とに分割されてもよい。本実施形態におけるスプリット蛍光タンパク質断片は、好ましくはスプリットＧＦＰ断片であり、特に好ましくはβストランド１〜３、１〜６、１〜７または１〜８に対応するスプリットＧＦＰ断片であり、対応する相補的スプリット断片は、それぞれ、βストランド４〜１１、７〜１１、８〜１１または９〜１１である。
【００３３】
また、種々のスプリット蛍光タンパク質がすでに報告されており、本実施形態においては、それらを用いることもできる。本実施形態において使用できる既知のスプリット蛍光タンパク質としては、例えば、ｓｐｌｉｔ−ｍＫＧ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００８；１８１：６２９−６４０）、ｓｆＣｈｅｒｒｙ２（１−１０／１１）およびｍＮＧ２（１−１０／１１）（Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１７；８：３７０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７−０１７−００４９４−８，ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１８１．１．６２９）などが挙げられる。
【００３４】
本実施形態におけるスプリット発光酵素タンパク質断片は、例えば、ルシフェラーゼやβガラクトシダーゼなどのスプリット断片であってよい。本実施形態において使用できる既知のスプリットルシフェラーゼとしては、例えば、スプリットＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ（ＨｉＢｉＴ／ＬｇＢｉＴ，ＳｍＢｉｔ／ＬｇＢｉＴ）（ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１６；１１：４００−８，ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｃｈｅｍｂｉｏ．５ｂ００７５３）、スプリットＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ＿Ｎ１−４３７／Ｃ４３８−５４４）（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１；７３：２５１６−２１，ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃ００１３２９６）、スプリットＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（ｓＲＬ９１）（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３；７５：４１７６−８１，ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃ０３００８００）、スプリットＥｍｅｒａｌｄルシフェラーゼ（ＥＬｕｃ＿Ｎ１−４１５／Ｃ３９４−５４２）（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１０；８２：２５５２−６０，ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃ１００１０４ｑ）、スプリットＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ＿Ｎ１−９３／Ｃ９４−１６９）（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００６；３：９７７−９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ９７９）が挙げられる。βガラクトシダーゼのスプリット断片／相補的スプリット断片としては、αフラグメント／ωフラグメントを用いることができる（α相補性）。
【００３５】
本実施形態のキメラタンパク質は、グルコース輸送体タンパク質と、蛍光性または発光性のレポーターとが融合されてなる。ここで、レポーターは、グルコース輸送体タンパク質の細胞外ループに挿入される。本実施形態におけるグルコース輸送体タンパク質であるＧＬＵＴは、１２回膜貫通型であり、Ｎ末端およびＣ末端が細胞内に位置しており、細胞外ループ１〜６を有する。本実施形態のキメラタンパク質において、レポーターは、グルコース輸送体タンパク質の生理機能（細胞膜への移行活性および／または糖取り込み活性）が維持される限りにおいて、グルコース輸送体タンパク質の細胞外ループ１〜６のいずれに挿入されてもよい。好ましくは、本実施形態のキメラタンパク質において、レポーターは、グルコース輸送体タンパク質の膜貫通ドメイン１と膜貫通ドメイン２の間に位置する細胞外ループ１、または膜貫通ドメイン９と膜貫通ドメイン１０の間に位置する細胞外ループ５に挿入されることができ、グルコース輸送体タンパク質の膜貫通ドメイン１と膜貫通ドメイン２の間に位置する細胞外ループ１に挿入されることが特に好ましい。
【００３６】
本実施形態のキメラタンパク質において、レポーターは、直接またはリンカーを介してグルコース輸送体タンパク質と融合されてよい。また、リンカーを用いる場合には、リンカー中に、Ｍｙｃ、ＨＡ、ＦＬＡＧなどのエピトープタグをさらに含んでもよい。さらに、本実施形態のキメラタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に、Ｍｙｃ、ＨＡ、ＦＬＡＧなどのエピトープタグや、レポータータンパク質とは異なる蛍光波長の蛍光タンパク質マーカーが付加されていてもよい。
【００３７】
本実施形態のキメラタンパク質は、上記にしたがって設計されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸または前記核酸を含む発現ベクターを導入することにより、目的の細胞または非ヒト動物に発現させることができる。
【００３８】
すなわち、本発明は、第二の実施形態によれば、上記キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸である。本実施形態の核酸は、所定のデータベースなどから入手したグルコース輸送体タンパク質およびレポータータンパク質の配列情報を元に、従来公知の任意の遺伝子工学的方法により調製することができる。
【００３９】
本発明は、第三の実施形態によれば、上記核酸を含む発現ベクターである。本実施形態の発現ベクターは、従来公知の任意の遺伝子工学的方法により、第二の実施形態の核酸を発現ベクターにサブクローニングして調製することができる。本実施形態において用いることができる発現ベクターの種類は、特に限定されないが、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターや、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＭＶなどのプラスミドベクターであってよい。
【００４０】
本発明は、第四の実施形態によれば、上記キメラタンパク質を発現する細胞である。
【００４１】
本実施形態における細胞は、任意の脊椎動物の細胞であってよいが、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ、非ヒト霊長類、ヒトなどの哺乳動物の細胞であり、特に好ましくはヒトの細胞である。細胞が由来する組織も特に限定されず、例えば、骨格筋、心筋、脳、脂肪細胞、血管内皮細胞などであってよく、好ましくは、骨格筋または脂肪組織である。本実施形態における細胞は、生体から単離されたインビトロのものであってもよいし、動物の生体内の、すなわちインビボのものであってもよい。
【００４２】
本実施形態における細胞は、ｉＰＳ細胞などの多能性細胞を分化させて調製した骨格筋細胞や脂肪細胞などであってもよい。また、本実施形態における細胞は、不死化されていてもよい。あるいは、本実施形態における細胞は、すでに確立された骨格筋細胞株や脂肪細胞株などであってもよい。骨格筋細胞株としては、例えば、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ６、Ｓｏｌ８などを用いることができる。また、脂肪細胞株としては、例えば、３Ｔ３−Ｌ１、ＳＴ１３などを用いることができる。
【００４３】
本実施形態の細胞は、第二の実施形態の核酸または第三の実施形態の発現ベクターを細胞に導入することにより調製することができる。核酸または発現ベクターの細胞への導入は、細胞の種類に応じて、当分野において周知の方法により行うことができ、例えば、リポフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどにより行うことができる。
【００４４】
本発明は、第五の実施形態によれば、上記キメラタンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト動物である。
【００４５】
本実施形態の「動物」は、ヒトを除く任意の脊椎動物の細胞であってよいが、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ、非ヒト霊長類などの哺乳動物であってよく、特に好ましくは、マウスまたはラットである。
【００４６】
本実施形態のトランスジェニック非ヒト動物は、第二の実施形態の核酸または第三の実施形態の発現ベクターを、当分野において周知の方法により非ヒト動物に導入して調製することができる。例えば、適切なプロモーター配列を含む第二の実施形態の核酸または第三の実施形態の発現ベクターを、マイクロインジェクションなどにより受精卵に導入することにより、上記キメラタンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。
【００４７】
本発明は、第六の実施形態によれば、（１）上記キメラタンパク質を発現する細胞にインスリンを曝露するステップと、（２）前記キメラタンパク質の蛍光または発光を検出するステップとを含む、インスリン応答性の評価方法である。
【００４８】
本実施形態における「細胞」は、第四の実施形態において定義したものと同様である。
【００４９】
本実施形態の方法では、上記キメラタンパク質を発現する細胞にインスリンを曝露する。本実施形態において使用できる好ましいインスリンは、任意の脊椎動物由来のインスリンであってよいが、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ、非ヒト霊長類、ヒトなどの哺乳動物由来のインスリンであり、特に好ましくはヒト由来のインスリンである。本実施形態におけるインスリンは、公知の手法により生合成することができる。あるいは、インスリン製剤が多数市販されているため、それらを用いてもよい。好ましい市販のインスリン製剤としては、例えば、グラルギン、デグルデク、デテミルなどが挙げられる。
【００５０】
キメラタンパク質を発現する細胞がインビトロのものである場合には、培地にインスリンを添加することにより、前記細胞にインスリンを曝露することができる。インスリンの濃度は、例えば、１０〜１０００ｎＭの範囲で適宜選択することができる。なお、培地は、細胞の種類に応じて適切なものを選択して使用すればよい。
【００５１】
キメラタンパク質を発現する細胞がインビボのものである場合には、前記細胞を生体内に含む動物にインスリンを投与することにより、前記細胞にインスリンを曝露することができる。インスリンの投与経路は、特に限定されないが、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与などが挙げられる。また、インスリンは、単回または反復投与されてよく、投与量は、例えば、０．１〜１０単位／体重ｋｇの範囲で適宜選択することができる。
【００５２】
本実施形態において用いられるキメラタンパク質が、レポーターとしてスプリットレポーター断片を含むものである場合には、その相補的スプリット断片を、インスリンの曝露と同時またはそれより前に、キメラタンパク質を発現する細胞に適用すればよい。相補的スプリット断片は、化学合成または生合成により調製することができる。相補的スプリット断片の濃度は、特に限定されないが、例えば、１ｐＭ〜１０ｍＭの範囲で適宜選択することができる。
【００５３】
次いで、キメラタンパク質の蛍光またはキメラタンパク質による発光を検出する。インビトロの細胞における蛍光または発光は、例えば蛍光顕微鏡観察などにより検出することができる。また、インビボの細胞における蛍光または発光は、すでに確立された生体深部イメージング手法、例えば、二光子励起顕微鏡やＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（パーキンエルマー）などにより検出することができる。
【００５４】
ＧＬＵＴ４の細胞外ループ１にＳＥＰを挿入したキメラタンパク質（ＧＬＵＴ４−ＳＥＰ）を用いた、本実施形態のインスリン応答性の評価方法の概略を図１に示す。細胞にインスリンを曝露すると、ＧＬＵＴ４−ＳＥＰは、インスリン刺激に応答して、細胞内のＧＬＵＴ４小胞から細胞膜へと移行する。それに伴い、ＧＬＵＴ４小胞内に位置していたＳＥＰは、細胞外へと露出される。ここで、細胞内小胞の内部はｐＨ６未満であるのに対し、細胞外のｐＨは７．４前後であることから、細胞膜へと移行したＧＬＵＴ４−ＳＥＰの蛍光強度が増大する。したがって、ＧＬＵＴ４−ＳＥＰの蛍光強度変化の程度を測定することにより、細胞のインスリン応答性を評価することができる。
【００５５】
また、ＧＬＵＴ４の細胞外ループ１にスプリットＧＦＰ断片を挿入したキメラタンパク質（ＧＬＵＴ４−スプリットＧＦＰ）を用いた、本実施形態のインスリン応答性の評価方法の概略を図６に示す。細胞にインスリンを曝露すると、ＧＬＵＴ４−スプリットＧＦＰは、インスリン刺激に応答して、細胞内のＧＬＵＴ４小胞から細胞膜へと移行する。それに伴い、ＧＬＵＴ４小胞内に位置していたスプリットＧＦＰは細胞外へと露出され、細胞外において相補的スプリットＧＦＰ断片と会合し、ＧＦＰを再構成する。したがって、ＧＬＵＴ４−スプリットＧＦＰの蛍光を測定することにより、細胞のインスリン応答性を評価することができる。
【実施例】
【００５６】
以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【００５７】
＜１．ＧＬＵＴ４−ＳＥＰキメラタンパク質の立体構造モデル＞
グルコース輸送体としてマウスＧＬＵＴ４、レポーターとしてｓｕｐｅｒ−ｅｃｌｉｐｔｉｃ  ｐＨｌｕｏｒｉｎ（ＳＥＰ）を用いて、グルコース輸送体−レポーターキメラタンパク質を作製するにあたり、キメラタンパク質の立体構造モデルを構築し、ＳＥＰを挿入するのに最適なＧＬＵＴ４の部位を予測した。最初に、ＧＬＵＴ４との配列相同性を有し、かつ、立体構造が既知であるヒトＧＬＵＴ３のデータ（ＰＤＢ  ＩＤ：４ＺＷ９）を、ＰｙＭｏｌソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ／）で表示することにより、細胞膜外ドメインの候補をリスト化した。ヒトＧＬＵＴ３とマウスＧＬＵＴ４のアミノ酸配列を比較し、立体構造の割り当てを行ったところ、ＧＬＵＴ４の膜貫通ドメイン１（ＶＬＡＶＦＳＡＶＬＧＳＬＱＦＧＹＮＩＧＶＩＮＡＰ：配列番号１）と膜貫通ドメイン２（ＴＬＴＴＬＷＡＬＳＶＡＩＦＳＶＧＧＭＩＳＳＦＬＩＧＩＩ：配列番号２）の間に位置する細胞外ループ１（ＧＲＱＧＰＧＧＰＤＳＩＰＱＧ：配列番号３）において最も柔軟な構造が見られた。なお、構造の柔軟性は、αヘリックスの形成を妨げることが知られるグリシン残基およびプロリン残基に基づいて推定された。特に、グリシン残基が連続する部位において構造の柔軟性が最も高くなることから、この位置にＳＥＰを挿入することが最適であることが推察された。
【００５８】
ＧＬＵＴ４の膜貫通ドメイン１と膜貫通ドメイン２の間に位置する細胞外ループ１にＳＥＰおよびＭｙｃタグを挿入したキメラタンパク質の立体構造モデルを図２に示す。ＳＥＰおよびＭｙｃタグを細胞外ループ１に配置した場合には、ＧＬＵＴ４の立体構造に歪みが生じないものと予測された。
【００５９】
＜２．ＧＬＵＴ４−ＳＥＰキメラタンパク質発現ベクターの構築＞
以下の手順により、マウスＧＬＵＴ４遺伝子の細胞外ループ１をコードする核酸配列中に、ＳＥＰ遺伝子配列およびＭｙｃタグをコードする核酸配列を挿入し、ＧＬＵＴ４−ＳＥＰキメラタンパク質をコードする核酸を調製した。ｐＣＩ−ＳＥＰ−ＧｌｕＲ１（Ａｄｄｇｅｎｅ，＃２４０００）を鋳型として、ＳＥＰ遺伝子コード配列をＰＣＲにより増幅して、ｐＬｅｎｔｉ−ｍｙｃ−ＧＬＵＴ４−ｍＣｈｅｒｒｙ（Ａｄｄｇｅｎｅ，＃６４０４９）のＡｇｅＩサイトにサブクローニングした。ＰＣＲには、８アミノ酸からなるリンカー（ＧＧＳＧＧＳＧＧ）をコードする核酸配列を含む／含まないプライマーを用いて、ＳＥＰのＮ末端および／またはＣ末端にリンカーを含む、または含まない、４種類のＧＬＵＴ４−ＳＥＰキメラタンパク質の発現ベクタープラスミドＤＮＡを調製した。ＰＣＲに用いたプライマーのヌクレオチド配列を表２に示す。なお、下線はリンカーをコードする核酸配列を示す。
【００６０】
表２．ＰＣＲのためのプライマー
【表２】
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【００６１】
４種類のＧＬＵＴ４−ＳＥＰキメラタンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙの配列を除く）のアミノ酸配列を以下に示す。なお、配列中、太字はＳＥＰ、一重下線はＭｙｃタグ、二重下線はＧＬＵＴ４の細胞外ループ１、斜体はリンカーを示す。また、作製したＧＬＵＴ４−ＳＥＰキメラタンパク質の一次構造を図３に示す。
【００６２】
表３．ＳＳ−ＳＥＰ−ＧＬＵＴ４（リンカーを含まない）（配列番号８）
【表３】
2020068696.tif 000004
【００６３】
表４．ＳＬ−ＳＥＰ−ＧＬＵＴ４（ＳＥＰのＣ末端にリンカーを含む）（配列番号９）
【表４】
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【００６４】
表５．ＬＳ−ＳＥＰ−ＧＬＵＴ４（ＳＥＰのＮ末端にリンカーを含む）（配列番号１０）
【表５】
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【００６５】
表６．ＬＬ−ＳＥＰ−ＧＬＵＴ４（ＳＥＰのＮ末端およびＣ末端にリンカーを含む）（配列番号１１）
【表６】
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【００６６】
ＧＬＵＴ４−ＳＥＰキメラタンパク質のｐＨ応答性を確認するために、発現ベクタープラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞に導入し、ＧＬＵＴ４−ＳＥＰキメラタンパク質を一過的に発現させた。ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレートに播種し、２４時間後、５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ１（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）、１．５μＬのＴｒａｎｓＩＴ−２９３  Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ）、および０．５μｇの発現ベクタープラスミドＤＮＡの混合液を添加した。その後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で２４時間培養し、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＳＥＰの蛍光により、キメラタンパク質の発現を確認した。その後、ｐＨの異なる培地（ＤＭＥＭ−ｐＨ７．５およびＤＭＥＭ−ｐＨ５．５）を細胞に添加したところ、ＤＭＥＭ−ｐＨ７．５を添加した細胞ではＳＥＰの蛍光強度が維持されたのに対し、ＤＭＥＭ−ｐＨ５．５を添加した細胞ではＳＥＰの蛍光強度の低下が見られた。この結果から、ＧＬＵＴ４−ＳＥＰキメラタンパク質がｐＨ応答性であることが確認された（データは省略）。
【００６７】
＜３．ＧＬＵＴ４−ＳＥＰキメラタンパク質による筋肉細胞のインスリン応答性の評価＞
ＧＬＵＴ４−ＳＥＰキメラタンパク質の発現ベクタープラスミドＤＮＡ（ｐＬｅｎｔｉ−ｍｙｃ−ＳＳ−ＳＥＰ−ＧＬＵＴ４−ｍＣｈｅｒｒｙ）およびパッケージングプラスミド（ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ）をＰｌａｔ−Ａ細胞にリポフェクションし、レンチウイルスを調製した。Ｃ２Ｃ１２細胞を６ウェルプレートに１×１０６の濃度で播種し、２０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中でコンフルエントになるまで培養した。その後、Ｃ２Ｃ１２細胞に上で調製したレンチウイルスを感染させ、２日間培養した。その後、培地を交換し、Ｃ２Ｃ１２細胞を低血清条件（２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）下で５日培養し、筋管細胞へと分化誘導した。得られた筋管細胞に、終濃度１００ｎＭのインスリン（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を添加し、インスリン添加前後でのＳＥＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの蛍光強度の変化を蛍光顕微鏡により観察した。
【００６８】
ＳＳ−ＳＥＰ−ＧＬＵＴ４−ｍＣｈｅｒｒｙを発現させた筋管細胞における結果を図４および図５に示す。インスリンの添加により、ＳＥＰ由来の緑色蛍光の強度は顕著に増大したのに対し、ｍＣｈｅｒｒｙ由来の赤色蛍光の強度には有意な変化は見られなかった。この結果は、ＧＬＵＴ４−ＳＥＰキメラタンパク質が細胞内のＧＬＵＴ４小胞から細胞膜へと移行することにより、ＧＬＵＴ４小胞内（＜ｐＨ６）に位置していたＳＥＰが細胞膜外（〜ｐＨ７．４）に露出されたことを示すものと考えられた。なお、ｍＣｈｅｒｒｙはＧＬＵＴ４の移行に関係なく細胞質に位置するため、蛍光強度が変化しないものと考えられた。以上の結果から、ＧＬＵＴ４−ＳＥＰキメラタンパク質を用いて、細胞のインスリン応答性を可視化できることが示された。また、ＳＳ−ＳＥＰ−ＧＬＵＴ４−ｍＣｈｅｒｒｙ以外の、リンカーを含む３種類のＧＬＵＴ４−ＳＥＰキメラタンパク質を発現させた細胞でも、同様の結果が得られた（データは省略）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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