(57)【要約】      （修正有）【課題】インプラント周囲炎の予防や治療に使用する物質をスクリーニングする方法、及びインプラント周囲炎の予防用、及び／又は治療用の組成物を提供する。【解決手段】インプラント周囲炎由来線維芽細胞を含むコラーゲンゲルと、コラーゲンゲル上に歯肉上皮細胞を播種したインプラント周囲炎三次元培養系モデルを用い、インプラント周囲炎治療薬をスクリーニングした。その結果、ケイシゴモツトウ、ケイヒ、オンジがコラーゲン分解能を抑制し、インプラント周囲炎治療に効果があることが示唆された。さらに、生薬成分を解析した結果、ヒドロキシケイヒ酸にインプラント周囲炎由来線維芽細胞のコラーゲン分解能を抑制する効果があることが明らかとなった。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インプラント周囲炎由来線維芽細胞を含むコラーゲンゲルと、
前記コラーゲンゲル上に歯肉上皮細胞を播種したインプラント周囲炎三次元培養系モデルを用い、
インプラント周囲炎の予防、及び／又は治療に用いる物質をスクリーニングする方法。
【請求項２】
前記インプラント周囲炎三次元培養系モデルにおいて、
コラーゲンゲルに被験物質を混合して効果を解析する請求項１記載のインプラント周囲炎治療薬の予防、及び／又は治療に用いる物質をスクリーニングする方法。
【請求項３】
前記インプラント周囲炎由来線維芽細胞が、
インプラント周囲炎関連線維芽細胞（ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ＰＩＡＦ）であることを特徴とする請求項１、又は２記載のインプラント周囲炎の予防、及び／又は治療に用いる物質をスクリーニングする方法。
【請求項４】
前記インプラント周囲炎三次元培養系モデルにおいて、
コラーゲンゲルの収縮によって、
被験物質の効果を確認する請求項１〜３いずれか１項記載のインプラント周囲炎の予防、及び／又は治療に用いる物質をスクリーニングする方法。
【請求項５】
ヒドロキシケイヒ酸を有効成分とするインプラント周囲炎の予防用及び／又は治療用組成物。
【請求項６】
前記ヒドロキシケイヒ酸がクマリン、コーヒー酸、及び／又はフェルラ酸である請求項５記載のインプラント周囲炎の予防用及び／又は治療用組成物。
【請求項７】
前記有効成分が、
生薬組成物に含有されるものである請求項５、又は６記載のインプラント周囲炎の予防用及び／又は治療用組成物。
【請求項８】
前記生薬組成物が
ケイシゴモツトウ（桂枝五物湯）、ケイヒ（桂皮）、オンジ（遠志）、ウコン（鬱金）、ボウフウ（防風）、シンピ（秦皮）、ドクカツ（独活）、センキュウ（川▲キュウ▼）、コウホン（藁本）、ショウマ（升麻）のいずれかである請求項７記載のインプラント周囲炎の予防用及び／又は治療用組成物。
【請求項９】
前記組成物が、
インプラント部の歯茎の腫れ、骨吸収、違和感を予防及び／又は治療するものである請求項５〜８いずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
チュアブル剤、トローチ剤、含嗽剤、軟膏剤、サプリメント、飲食品、又は歯磨剤の形態として提供されることを特徴とする請求項５〜９いずれか１項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインプラント周囲炎の治療、及び／又は予防のための組成物、また、これをスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯科（口腔）インプラントを受ける患者は毎年増加傾向にある。約２割の歯科診療所でインプラント手術が実施されており、歯科用のインプラント材の生産及び輸入数量は、２０１３年には、２００２年と比較して、約２倍となっており、２０１１年以降は年間１００万本以上のインプラント材が生産、輸入されている（厚生労働省、「歯科医師需給問題を取り巻く状況」による。）。
【０００３】
これに伴い、インプラント周囲炎を発症する患者の増加が問題となってきている。インプラント周囲炎とは、歯科インプラント周囲の粘膜に炎症が生じ、インプラントを維持している歯槽骨が進行的に失われる病態と定義されている。
【０００４】
日本歯周病学会会員に対するインプラント治療に関するアンケート調査でも、歯科医師が経験した合併症のうち最も多いのがインプラント周囲炎であり、合併症全体の約２割を占めていた（非特許文献１）。インプラント周囲炎は発生頻度の高い合併症であるにもかかわらず、適切な治療が行えず、最終的に摘出に至るケースもある。
【０００５】
天然歯は、歯肉、セメント質、歯根膜と歯槽骨で維持されているのに対し、インプラントは、歯肉と歯槽骨とくに歯槽骨とインプラントのオッセオインテグレーションで維持されている。維持機構が異なり、特にインプラントには歯根膜が存在しないため、一旦罹患すると進行が速い。
【０００６】
インプラント周囲炎への対処方法は、非外科的にはインプラント体の清掃、抗菌、外科的には歯肉切除、骨の再生療法などである。しかし、再生療法を行っても治癒しないケースもあり、その場合にはインプラントの摘出を余儀なくされている。
【０００７】
インプラント周囲炎と歯周炎は、人工歯、あるいは天然歯周囲に炎症が生じるという点では類似しているが、病態は異なることが示されている（非特許文献２〜６）。非特許文献２〜４には、インプラント周囲炎の病態が、歯周炎と比較されており、インプラント周囲炎と歯周炎の病態分類が行われている。すなわち、インプラント周囲炎と歯周炎が異なる疾患であると認識したうえで、両者を分類している。非特許文献５には、インプラント周囲炎と歯周炎の組織を比べると、ｍＲＮＡ発現のパターンが異なっていることが示されている。非特許文献６には、インプラント周囲炎と歯周炎の組織学的な比較解析から、両疾患が相違していることが示されている。
【０００８】
本発明者らは、慢性歯周炎患者より得た歯肉線維芽細胞を用いた解析により、コラーゲン分解阻害効果のあるいくつかの生薬を歯周炎治療薬として開示している（特許文献１）。歯周炎関連線維芽細胞を用いた三次元培養系で、多数の生薬を解析した結果、オウレン、オンジ、センコツの熱水抽出物、オウレン、オンジ、キョウカツ、コウボク、ゴシュユ、ショウキョウ、ショウブコン、シンイのメタノール抽出物はコラーゲンゲル収縮を抑制し、歯周炎治療薬として有効であることを示している。しかしながら、上述のように、インプラント周囲炎と歯周炎は異なる疾患であることから、これら歯周炎に効果のある生薬がインプラント周囲炎にも効果を有するかは疑問の余地がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１１−２５６１３６号公報
【特許文献２】特表２０１６−５３９９５９号公報
【特許文献３】特表２０１６−５１９０９２号公報
【特許文献４】特開２０１０−２２０５６１号公報
【特許文献５】特開２００３−６６０３９号公報
【特許文献６】特開２０１７−１６６８３１号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】辰巳順一  他、２０１２年、日歯周誌、第５４巻、第３号、第２６５〜２７６頁
【非特許文献２】Caton, J.G. et al., 2018, J. Periodontol.,Vol.89 (Suppl.1), S1-S8.
【非特許文献３】Schwarz, F. et al., 2018, J. Clin. Periodontol., Vol.45 (Suppl.20), S246-S266.
【非特許文献４】Schwarz, F. et al., 2018, J. Periodontal.,Vol. 89 (Suppl. 1), S267-S290.
【非特許文献５】Becker, S.D. et al, 2014, Clin. ImplantDent. Relat. Res., Vol.16, pp.401-411.
【非特許文献６】Carcuac, O. & Berglundh, T., 2014, J.Dent. Res., Vol.93(11), p.1083-1088.
【非特許文献７】網塚  憲生ら、2015、顕微鏡、Vol.50,No.3, pp.191-196.
【非特許文献８】Ohshima, M. et al., 2002, J. PeriodontalRes. https://doi.org/10.1034/j.1600-0765.2001.360605.x
【非特許文献９】Ohshima, M. et al., 2002, J. Oral Sci.,Vol.44, No.1, pp.35-39.
【非特許文献１０】Luan、X.et al, Int. J. Oral Sci. 10, Article number: 24, 2018,https://www.nature.com/articles/s41368-018-0025-y
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
インプラント周囲炎の予防、治療については種々の方法が提案されている。特許文献２にはハロゲン化合物、特許文献３にはＮ−アセチルシステインを含む治療薬が開示されている。しかしながら、これら治療薬はインプラント周囲炎が歯周炎とは異なるという報告が多数あるにもかかわらず、歯周炎と同様に細菌などの微生物の除去、抗炎症を目的としているに過ぎず、インプラント周囲炎を根本的に治療するものとはなっていない。
【００１２】
また、インプラント周囲炎を研究するための良いモデル動物はなく、また、インプラント周囲炎を模倣するモデル細胞も得られていない。そのため、インプラント周囲炎に効果のある薬剤をスクリーニングする良い系はない。
【００１３】
本発明は、インプラント周囲炎を予防し、治療するための組成物や化合物をスクリーニングするための方法を提供することを課題とする。また、このスクリーニング法を用いて得られた生薬に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明はインプラント周囲炎を予防し、治療するための組成物や化合物をスクリーニングする方法、及びこれを用いて得た生薬に関する。
（１）インプラント周囲炎由来線維芽細胞を含むコラーゲンゲルと、前記コラーゲンゲル上に歯肉上皮細胞を播種したインプラント周囲炎三次元培養系モデルを用い、インプラント周囲炎の予防、及び／又は治療に用いる物質をスクリーニングする方法。
（２）前記インプラント周囲炎三次元培養系モデルにおいて、コラーゲンゲルに被験物質を混合して効果を解析する（１）記載のインプラント周囲炎治療薬の予防、及び／又は治療に用いる物質をスクリーニングする方法。
（３）前記インプラント周囲炎由来線維芽細胞が、インプラント周囲炎関連線維芽細胞（ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ＰＩＡＦ）であることを特徴とする（１）、又は（２）記載のインプラント周囲炎の予防、及び／又は治療に用いる物質をスクリーニングする方法。
（４）前記インプラント周囲炎三次元培養系モデルにおいて、コラーゲンゲルの収縮によって、被験物質の効果を確認する（１）〜（３）いずれか１つ記載のインプラント周囲炎の予防、及び／又は治療に用いる物質をスクリーニングする方法。
（５）ヒドロキシケイヒ酸を有効成分とするインプラント周囲炎の予防用及び／又は治療用組成物。
（６）前記ヒドロキシケイヒ酸がクマリン、コーヒー酸、及び／又はフェルラ酸である（５）記載のインプラント周囲炎の予防用及び／又は治療用組成物。
（７）前記有効成分が、生薬組成物に含有されるものである（５）、又は（６）記載のインプラント周囲炎の予防用及び／又は治療用組成物。
（８）前記生薬組成物が、ケイシゴモツトウ（桂枝五物湯）、ケイヒ（桂皮）、オンジ（遠志）、ウコン（鬱金）、ボウフウ（防風）、シンピ（秦皮）、ドクカツ（独活）、センキュウ（川▲キュウ▼）、コウホン（藁本）、ショウマ（升麻）のいずれかである（７）記載のインプラント周囲炎の予防用及び／又は治療用組成物。
（９）前記組成物が、インプラント部の歯茎の腫れ、骨吸収、違和感を予防及び／又は治療するものである（５）〜（８）いずれか１つ記載の組成物。
（１０）チュアブル剤、トローチ剤、含嗽剤、軟膏剤、サプリメント、飲食品、又は歯磨剤の形態として提供されることを特徴とする（５）〜（９）いずれか１つ記載の組成物。
（１１）マルチキナーゼ阻害剤を有効成分とするインプラント周囲炎の予防薬及び／又は治療薬。
（１２）前記マルチキナーゼ阻害剤が、チロシンキナーゼ阻害剤である（１１）記載の予防薬及び／又は治療薬。
（１３）局所投与を行うものである、（１１）、又は（１２）記載の予防薬及び／又は治療薬。
（１４）前記マルチキナーゼ阻害剤が、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）の機能を阻害するものであることを特徴とする（１１）〜（１３）いずれか１つ記載の予防薬及び／又は治療薬。
（１５）前記チロシンキナーゼ阻害剤が、イマチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、スニチニブ、ニンテダニブのいずれかであることを特徴とする（１１）〜（１４）いずれか１つ記載の予防薬及び／又は治療薬。
【発明の効果】
【００１５】
今までモデル動物やモデル細胞系がなく、予防薬や治療薬の良いスクリーニング方法がなかったインプラント周囲炎においてスクリーニング方法を提供することができる。また、今まで有効な予防用組成物や治療用組成物のなかったインプラント周囲炎に対して、有効かつ安全な予防用組成物や治療用組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】インプラント周囲炎と慢性歯周炎の組織像。
【図２】インプラント周囲炎関連線維芽細胞（ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ＰＩＡＦ）によるコラーゲンゲルの収縮を示す写真。
【図３】浮遊培養開始後１０日目のコラーゲンゲルを示す写真。
【図４】ＨＧＦ、抗ＨＧＦ中和抗体のＰＩＡＦ、歯周炎関連線維芽細胞（Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ＰＡＦ）に対する異なる効果を示す写真。
【図５】ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ阻害剤のＰＩＡＦ、ＰＡＦに対する異なる効果を示す写真。
【図６】ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析の結果を示す図。
【図７】ＰＩＡＦに対する生薬の効果を示す写真。
【図８】（Ａ）はＰＩＡＦに対するヒドロキシケイヒ酸であるクマリンの効果を示す写真。（Ｂ）は各ゲルのＨＥ染色、シリウスレッド染色による顕微鏡写真。（Ｃ）はＰＩＡＦに対するヒドロキシケイヒ酸であるコーヒー酸、フェルラ酸の効果を示す写真。（Ｄ）は各ゲルのＨＥ染色、シリウスレッド染色、抗ビメンチン抗体による免疫染色による顕微鏡写真。
【図９】（Ａ）はＰＩＡＦに対するイマチニブ（グリベック）の効果を示す写真。（Ｂ）は各ゲルのＨＥ染色による顕微鏡写真。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下の実施例で示すスクリーニング方法は、主として生薬を対象として行っている。生薬は植物体から得られる天然由来のものであり、古くから種々の疾患に用いられている。したがって、その安全性はすでに確認されており、生薬を組み合わせた漢方薬は、副作用が比較的少ない安全な薬であるとされている。インプラント周囲炎の予防は、インプラント治療を実施した後、永続的に行う必要がある。またインプラント周囲炎の治療は長期にわたることが多い。したがって、インプラント予防用、治療用組成物は、安全に長期間使用できる組成物であることが望ましく、そのためにも生薬は理想的であるといえる。しかし、本発明のスクリーニング方法は、生薬以外にも小分子化合物、核酸医薬、抗体医薬など、通常医薬品として使用される物質を用いてスクリーニングを行うことができる。
【００１８】
また、生薬原料から抽出物を得るには、当該技術分野で一般的に採用されている方法で行うことができる。具体的には、水又はエタノール含量が３０重量％以下の含水エタノールを抽出溶媒として用いて、原料を常温乃至高温条件下で抽出処理する方法が挙げられる。また、抽出物の有効成分が明らかになった場合には、有効成分のみを化学合成して使用してもよい。
【００１９】
さらに、本実施形態に係る剤は、例えば、医薬品、医薬部外品といった医薬用組成物だけではなく、特定保健用食品、栄養機能食品、特別用途食品、機能性表示食品、健康補助食品（サプリメント）、飲食品（飲料、食品）、あるいは歯磨剤などの化粧品の成分として使用することができる。
【００２０】
本実施形態の組成物を医薬品又は医薬組成物として治療に用いる場合には、塗布、注射、内服などの方法によることができる。特に、本発明に係る医薬は、経口用又は口腔用であることが好ましい。本発明に係る医薬は、錠剤、カプセル剤、チュアブル剤、トローチ剤、ゲル剤、フィルム剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、徐放性製剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤、液剤、軟膏剤、貼付剤、含嗽剤、スプレー剤等の剤形でありうるが、これらに限定されない。また、本発明に係る医薬は、保存剤、賦形剤、緩衝剤、界面活性剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁化剤、コーティング剤などの製薬上許容される担体又は添加剤をさらに含んでよい。
【００２１】
また、医薬部外品、化粧品、予防用組成物の具体的な製品形態としては、歯磨剤、液体ハミガキ、歯肉マッサージ用ジェル、洗口液（マウスウォッシュ）など、オーラルケアに使用する製品形態とすることができる。さらに、実施形態に係る剤が食品として使用される場合、当該食品は効果があることが明らかになった生薬又はその有効成分、及び必要に応じてその他の成分を配合したものであってもよい。このような食品としては、ガム、飴、グミ等のように、口腔内に長時間留まる食品であって、長期保存できるものが好ましい。また、茶飲料、コーヒー飲料、乳飲料などの液体食品のように、摂取回数の多い食品形態であることが好ましいがこれらに限定されることはない。
【００２２】
インプラント周囲炎は、初期段階ではインプラント部の歯茎の腫れ、違和感などがあるものの、はっきりとした自覚症状がない場合が多い。こういった初期段階のインプラント周囲炎を予防、又は治療するためにはオーラルケア製品、あるいはサプリメントなどの形態で継続的に使用することが好ましい。また、骨の有機質の９０％程度がコラーゲンだと言われており（非特許文献７）、コラーゲン分解能の抑制は、インプラント周囲炎の進行を抑制するものと考えられる。したがって、インプラント周囲炎と診断された場合、その進行を抑制する治療薬、医薬部外品として使用することが好ましい。
【００２３】
以下に詳細に説明するが、歯周炎とインプラント周囲炎は、原因となる線維芽細胞の性質が異なっていることが本発明者らの解析によって明らかとなった。歯周炎由来の線維芽細胞もインプラント周囲炎由来の線維芽細胞も、コラーゲン分解能が健常組織の線維芽細胞と比較して高いという点では同じであるが、インプラント周囲炎由来の線維芽細胞の方がよりコラーゲン分解能が高い。また、コラーゲン分解を抑制し得る薬剤や生薬由来の有効成分も異なっていたことから、コラーゲン分解に至る機構が異なっているものと考えられる。インプラント周囲炎由来の線維芽細胞の性質を詳細に解析することによって、新たな治療薬を得られる可能性がある。
【００２４】
［実施例１］インプラント周囲炎と歯周炎との比較解析
１．組織染色による検討
非特許文献２〜６に示されているように、インプラント周囲炎と歯周炎は異なる疾患である。しかし、炎症を伴うことなど類似点も多いことから、違いを明らかにするために、まず組織染色により解析を行った（図１）。
【００２５】
外科手術によって得られたインプラント周囲炎、歯周炎組織をホルマリン固定後、常法によりＨＥ染色を行った。インプラント周囲炎、歯周炎で上皮組織を比較すると、インプラント周囲炎では顕著な上皮の肥厚が観察された。また、歯周炎では、歯根に面している側に、濃く染色される炎症細胞の浸潤が数多く見られるのに対し、インプラント周囲炎組織では、インプラント体に面している側でも炎症性細胞の浸潤はほとんど見られない。このように、どちらも炎症を伴う疾患でありながらその組織像は大きく異なることが明らかとなった。
【００２６】
２．三次元培養系による検討
コラーゲンゲル三次元培養技術によって、インプラント周囲炎組織より得た線維芽細胞を用いたインプラント周囲炎モデル系を確立した。コラーゲンゲル三次元培養技術は、特許文献１、及び４に記載されている歯周炎組織由来の線維芽細胞を用いた培養技術において、歯周炎由来の線維芽細胞の代わりに、インプラント周囲炎由来の線維芽細胞を用いた他は同じ手法による。
【００２７】
１）細胞の調製
インプラント周囲炎治療のための外科手術の際に切除され不要となった歯肉片を細切後、組織片をプレートに静置し、組織片から外生した細胞を第１代として継代培養を行い、ヒト歯肉線維芽細胞を得た。このインプラント周囲炎組織由来の線維芽細胞は以下のデータで示すように高いコラーゲン分解能を有していた。
【００２８】
また、インプラント周囲炎治療のための外科手術、または歯周外科手術の際に切除され、不要となった歯肉片をディスパーゼ処理し、結合組織部分から剥離した上皮細胞を細切後、組織片をプレートに静置し、組織片から外生した歯肉上皮細胞を第１代として継代培養を行った。継代培養をした歯肉上皮細胞を用いてコラーゲンゲルを構築し解析に用いた。
【００２９】
２）コラーゲンゲルの構築
セルマトリックスｔｙｐｅ−Ａ（新田ゼラチン）、５×ＤＭＥＭ、再構成用緩衝液（新田ゼラチン）を混合し、コラーゲン混合溶液を作製した。このコラーゲン混合溶液に、インプラント周囲炎由来の線維芽細胞を懸濁した後、６穴プレートで３０分間ゲル化させ、インプラント周囲炎由来線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを構築した。次に、コラーゲンゲル上に、上記で調製した上皮細胞をトリプシンで分散させた後に播種し、上皮細胞層を形成させ、三次元コラーゲンゲルを作製した。
【００３０】
３）コラーゲンゲル収縮の観察
上皮細胞、インプラント周囲炎由来線維芽細胞を含むコラーゲンゲルをコラーゲンゲル構築２４時間後（培養１日目）にプレートの底から浮かせ、コラーゲンゲル浮遊培養を開始する。浮遊培養開始後経時的に、コラーゲンゲルの収縮レベルを観察した（図２）。いずれもインプラント周囲炎組織に由来する線維芽細胞（ＩｍｐＧＦ）、上皮細胞（ＩｍｐＧＥ）を用いて三次元培養を行った結果を示す。慢性歯周炎組織に由来する歯周炎関連線維芽細胞（Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、以下、ＰＡＦという。）では、浮遊培養開始後４日目から５日目にコラーゲンゲル収縮が起こる。これに対し、インプラント周囲炎由来細胞の中には、図２のＢＤ６に示すように、浮遊培養開始後２．５日という極端に早期にコラーゲンゲル収縮を引き起こす細胞が存在している。
【００３１】
インプラント周囲炎由来細胞を用いた三次元培養によって、ＰＡＦと比較して、極端に速くコラーゲンを分解する細胞を、ここでは、インプラント周囲炎関連線維芽細胞（ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ＰＩＡＦ）と呼ぶ。
【００３２】
図３に浮遊培養開始後１０日目のコラーゲンゲルの状態を示す。インプラント周囲炎組織に由来する線維芽細胞（ＩｍｐＧＦ）、上皮細胞（ＩｍｐＧＥ）を用いて三次元培養を行った場合には（ＩｍｐＧＥ／ＩｍｐＧＦ）、著しくコラーゲンゲルの収縮が見られたのに対し、線維芽細胞のみ（−／ＩｍｐＧＦ）、上皮細胞のみ（ＩｍｐＧＥ／−）を培養した場合には、著しいゲルの収縮は観察されなかった。
【００３３】
歯周炎組織由来の三次元培養系においても、線維芽細胞はコラーゲン分解能を有し、上皮細胞はコラーゲン分解能を高める細胞として作用する。インプラント周囲炎由来線維芽細胞、上皮細胞の場合においても、同様にインプラント周囲炎由来線維芽細胞はコラーゲン分解能を有し、上皮細胞はコラーゲン分解能を高める細胞として作用する。しかし、インプラント周囲炎に由来する線維芽細胞、ＰＩＡＦは、ＰＡＦに比べてコラーゲン分解能が非常に高い。コラーゲン分解能が非常に高い線維芽細胞の存在は、歯周炎にはなく、インプラント周囲炎を特徴付ける現象である。
【００３４】
本発明者らは、歯周炎に由来する細胞を用いた三次元培養系でコラーゲンゲル分解能を抑制する効果を有する物質をすでに見出している。そこで、歯周炎組織由来の三次元培養系で、コラーゲンゲル分解能を抑制する効果が見られた物質を用いて、インプラント周囲炎線維芽細胞に対する効果を解析した。
【００３５】
４）ＨＧＦ、抗ＨＧＦ中和抗体の効果
本発明者らは、歯周炎罹患歯の歯肉溝滲出液では肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）の産生が増加しており歯周炎マーカーとして使用できることを開示している（非特許文献８〜９、特許文献５〜６）。コラーゲンゲルの三次元培養系を用いた解析では、歯周炎由来のＰＡＦでは、ＨＧＦをゲルに添加することによって、コラーゲン収縮能が高まり、抗ＨＧＦ中和抗体を添加することによって、コラーゲン収縮能が抑制することを見出している。
【００３６】
そこで、ＨＧＦ、あるいは抗ＨＧＦ中和抗体のＰＩＡＦに対する効果を検討した。ＨＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）、抗ＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社）をそれぞれ５０ｎｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌの濃度になるようにコラーゲンゲルに添加し、２つの異なる症例から得られたＰＩＡＦを用いてコラーゲンゲル収縮の解析を行った。比較として慢性歯周炎から得たＰＡＦを用いて同様の解析を行った結果を示す（図４）。
【００３７】
慢性歯周炎由来の線維芽細胞であるＰＡＦを用いた場合には、ＨＧＦを添加するとコラーゲンゲル収縮の程度が増強し、抗ＨＧＦ中和抗体を添加した場合には、コラーゲンゲル収縮が抑制されるのが観察される。すなわち、ＨＧＦによってコラーゲン分解能が増強され、抗ＨＧＦ中和抗体によりコラーゲン分解能が抑制される。これに対し、インプラント周囲炎由来の線維芽細胞であるＰＩＡＦを用いた場合には、ＨＧＦによるコラーゲン分解能の増強も、抗ＨＧＦ中和抗体による抑制も観察されなかった。したがって、ＰＩＡＦには強いコラーゲン分解能が見られるが、これはＨＧＦ経路とは異なる経路であることが示唆される。
【００３８】
５）ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ阻害剤の効果
ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐは歯周炎患者に特徴的に高発現するｍｉＲＮＡである（非特許文献１０）。ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ阻害剤の効果をＰＡＦ、ＰＩＡＦを用いて検討した。
【００３９】
ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ阻害剤（ＥＸＩＱＯＮ社製、ＬＮＡ、２１−５ｐ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）をリポフェクションによって、ＰＩＡＦ、ＰＡＦに導入した（図５）。ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ阻害剤は、歯周炎由来の線維芽細胞であるＰＡＦでは、コラーゲン分解能を抑制する効果を示す。これに対し、インプラント周囲炎由来の線維芽細胞であるＰＩＡＦでは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ阻害剤の効果は全く見られない。すなわち、ｍｉＲＮＡ発現もＰＡＦ、ＰＩＡＦでは異なっていることが示された。
【００４０】
６）マイクロアレイ発現解析による検討
ＰＩＡＦ、ＰＡＦにおいて、三次元培養ゲルをＧｅｎｅＣｈｉｐ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて、ＲＮＡの発現解析を行った。インプラント周囲炎２症例から得られた線維芽細胞（ＰＩＡＦ）と、歯周炎５症例から得られた線維芽細胞細胞（ＰＡＦ）を用い、ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析を行った。その結果、両者では大きく遺伝子発現が異なっていることが明らかとなった。
【００４１】
５４７６５のＧｅｎｅＣｈｉｐのＰｒｏｂｅによって得られたＲａｗ値をＮｏａｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｐｔｉｏｎ［Ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ  ｓｈｉｆｔ（７５％）］を行った後、Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ値をＸ軸をインプラント周囲炎、Ｙ軸を歯周炎としてプロットしたスキャッタープロットを示す（図６）。図６中の３本の線は、左から２倍変動、変動なし（インプラント周囲炎と歯周炎で発現量が同じであることを示す。）、０．５倍変動を意味している。両者で２倍以上、あるいは０．５倍以下の変動を示している多数のＲＮＡ発現が認められることは、インプラント周囲炎（ＰＩＡＦ）、歯周炎（ＰＡＦ）が異なる性質を有する線維芽細胞であることを示している。
【００４２】
多数の遺伝子の発現が異なっていることが認められるが、ＰＡＦと比較して、ＰＩＡＦでは２６．８倍ＡＰＯＢＥＣ３Ａが、１９．５倍ＣＥＡＣＡＭ５が高発現していた。これら遺伝子は、それぞれ頭頚部癌、大腸癌で発現亢進が認められている遺伝子である。今後の解析を待つ必要があるが、これらＰＩＡＦで発現亢進が認められている遺伝子について、発現抑制に作用する化合物をスクリーニングすることができれば、インプラント周囲炎の治療につなげる薬剤が得られる可能性がある。さらに、ＰＩＡＦで発現が減少している遺伝子の発現を増強、あるいは維持することのできる化合物は、インプラント周囲炎を予防することが可能であると考えられる。
【００４３】
以上、インプラント周囲炎、歯周炎は、コラーゲン分解能が高い線維芽細胞が増悪の原因となっていると考えられるものの、組織染色の結果、ＰＩＡＦ及びＰＡＦを用いたコラーゲンゲルの収縮の程度、ＨＧＦ、抗ＨＧＦ中和抗体、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ阻害剤のＰＩＡＦ、ＰＡＦに対する効果の違い、ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析の結果は、両疾患は異なる疾患であることを示している。また、遺伝子発現が大きく異なることから、インプラント周囲炎に効果のある治療薬は歯周炎に効果のある治療薬とは異なるものと考えられた。
【００４４】
［実施例２］生薬のスクリーニング
１）スクリーニング方法
インプラント周囲炎に効果のある物質を探索するために、三次元培養系を作製する際のコラーゲン混合溶液に被検物質を添加し、インプラント周囲炎由来の線維芽細胞を懸濁した。また、浮遊培養開始時に、再度被検物質を培養液に加えた。浮遊培養開始後経時的に、コラーゲンゲルの収縮レベルを観察し、コラーゲンゲル収縮の程度を抑制する物質をインプラント周囲炎に効果のある物質としてスクリーニングを行った。
【００４５】
２）被験物質
生薬は熱水抽出、あるいはエタノール抽出し、スクリーニングに用いた。熱水抽出物は、各生薬１０ｇを精秤し、煎じ器（株式会社ウチダ和漢薬）にいれ、生薬重量の２０倍量である精製水２００ｍｌを加え、電熱器で沸騰させ、水の量が半量になるまで加熱した。カスを濾し、熱水抽出液を室温まで冷ましてから遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分、１５℃）を行った。上清を吸引濾過し、濾液を凍結乾燥し、熱水抽出物とした。
【００４６】
エタノール抽出物は、各生薬１０ｇを精秤し、ナス型フラスコに入れ、１５０ｍｌの７０％エタノールを加え、４０分間還流抽出を行った。熱時濾過し、残渣に新たに７０％エタノール１５０ｍｌを加え、再度４０分間還流抽出を行った。熱時濾過し、先に得た濾液と合わせ、エバポレーターを用いて減圧濃縮した。エタノールが消失した後、凍結乾燥し、エタノール抽出物とした。
【００４７】
熱水抽出物、エタノール抽出物による効果をＰＩＡＦを用いた三次元培養系で検討した。その結果、ケイシゴモツトウ、ケイヒ熱水抽出物、オンジ熱水抽出物にコラーゲン分解能を抑制する作用が見られた（図７）。したがって、これらを用いることによって、インプラント周囲炎を治療することができる。
【００４８】
ケイシゴモツトウは、ケイヒ、オウゴン、キキョウ、ジオウ、ブクリョウの５つの生薬を配合したものである。ケイシゴモツトウに含まれるケイヒの量は１/５以下であることを考えれば、ケイシゴモツトウに含まれるケイヒが単独で作用しているのではなく、他の成分もコラーゲン分解の抑制に作用しているものと考えられる。
【００４９】
これら生薬は、インプラント周囲炎由来の線維芽細胞のコラーゲン分解能を抑制する効果がある。骨の有機質の９０％がコラーゲンであることを考えると、歯槽骨が溶けるというインプラント周囲炎で最も問題となる症状を抑えることができる可能性が高く、治療の難しいインプラント周囲炎の治療を行うことができる可能性が高い。
【００５０】
インプラント周囲炎由来の線維芽細胞のコラーゲン分解能を抑制する効果があったケイシゴモツトウ、ケイヒ、オンジにはヒドロキシケイヒ酸が含まれる。そこで、ヒドロキシケイヒ酸が有効成分として作用する可能性を解析した。ヒドロキシケイヒ酸としては、まず、クマリンを用いて解析を行った。クマリンは生薬、あるいは食品中でクマル酸から生成されるラクトンであるが、クマリンもクマル酸もヒドロキシケイヒ酸の一種である。
【００５１】
まず、二次元培養細胞を用いて、クマリンの細胞毒性を解析した。ＷＳＴ−８アッセイにより解析したところ、１００μｇ/ｍｌでほとんどの細胞が死滅したことから、１μｇ/ｍｌで、３次元培養系を用いて解析を行った（図８Ａ）。その結果、クマリンによってインプラント周囲炎由来の線維芽細胞のコラーゲン分解を抑制する効果が認められた。
【００５２】
ゲルを常法によりホルマリン固定し薄切後、細胞の状態をＨＥ染色、シリウスレッド染色により観察した（図８Ｂ）。ＨＥ染色の結果からは、クマリンを添加したゲルでは、コントロールに比べてコラーゲンゲルが収縮していないため、細胞同士が比較的間隔を開けて存在していることが示された。また、コラーゲンを染色するシリウスレッド染色によれば、クマリンを添加した場合には、コントロールに比べコラーゲン分解による空隙が少なくなっていることが観察された。
【００５３】
クマリンにコラーゲン分解抑制能が見られたことから、他のヒドロキシケイヒ酸であるコーヒー酸、フェルラ酸についても解析を行った。まず、二次元培養細胞を用いて、コーヒー酸、フェルラ酸の細胞毒性を解析した。ＷＳＴ−８アッセイにより解析したところ、コーヒー酸は０．２、２、２０μＭ、フェルラ酸は０．５、５、５０μＭいずれの濃度でも細胞毒性は認められなかった。そこで、コーヒー酸２０μＭ、フェルラ酸５０μＭの濃度で、３次元培養系を用いて解析を行った（図８Ｃ）。コーヒー酸、フェルラ酸いずれもインプラント周囲炎由来の線維芽細胞のコラーゲン分解を抑制する効果が認められた。また、ここではデータを示さないがフェルラ酸は１００μＭ濃度でも、細胞毒性がなく、より強いコラーゲン分解抑制効果が認められた。なお、コーヒー酸は５０μＭ濃度では細胞毒性が認められた。
【００５４】
上記と同様に、ゲルを常法によりホルマリン固定し薄切後、細胞の状態をＨＥ染色、シリウスレッド染色、抗ビメンチン抗体による免疫染色により観察した（図８Ｄ）。ＨＥ染色の結果からは、コーヒー酸、フェルラ酸を添加したゲルでは、コントロールに比べてコラーゲンゲルが収縮していないため、細胞同士が比較的間隔を開けて存在していることが示された。また、コラーゲンを染色するシリウスレッド染色によれば、コーヒー酸、フェルラ酸を添加した場合には、コントロールに比べコラーゲン分解による空隙が少なくなっていることが観察された。さらに、抗ビメンチン抗体による免疫染色結果からも、コーヒー酸、フェルラ酸を添加した場合には、ビメンチンが構成する細胞骨格が保持されていることが観察された。
【００５５】
上記結果から、ケイヒ、オンジに含まれる成分であるクマリン、コーヒー酸、フェルラ酸に代表されるヒドロキシケイヒ酸は、インプラント周囲炎由来の線維芽細胞のコラーゲン分解能を抑制する効果を備えていることが示された。したがって、ヒドロキシケイヒ酸を含有する生薬組成物には、インプラント周囲炎を予防、又は治療する効果を期待することができる。ヒドロキシケイヒ酸が含まれる生薬としては、ケイシゴモツトウ（桂枝五物湯）、ケイヒ（桂皮）、オンジ（遠志）、ウコン（鬱金）、ボウフウ（防風）、シンピ（秦皮）、ドクカツ（独活）、センキュウ（川▲キュウ▼）、コウホン（藁本）、ショウマ（升麻）などがある。また、精製されたヒドロキシケイヒ酸を含む医薬、食品等をインプラント周囲炎の予防、治療のための組成物とすることもできる。
【００５６】
また、ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析の結果を詳細に検討したところ、高発現の認められる遺伝子の中に血小板由来成長因子受容体（ｐｌａｔｅｌｅｔ-ｄｅｒｉｖｅｄ  ＰＤＧＦＲ）があった。ＰＤＧＦＲは受容体型チロシンキナーゼであり、慢性骨髄性白血病をはじめとして種々の癌で変異や高発現が認められる遺伝子である。
【００５７】
先に述べたＰＩＡＦで高発現の認められる遺伝子であるＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＣＥＡＣＡＭ５は、分子標的治療薬が開発されていないが、ＰＤＧＦＲに対する分子標的治療薬としては、イマチニブ（商品名：グリベック）がある。イマチニブは、チロシンキナーゼのＡＴＰ結合部位に結合するように分子デザインされた化合物の誘導体であり、ＰＤＧＦＲ、Ｂｃｒ-Ａｂｌ、ｃ−ｋｉｔなどのチロシンキナーゼを分子標的とすることから、慢性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、急性リンパ性白血病などの治療に使用されている医薬品である。
【００５８】
ＰＩＡＦにおいて、ＰＤＧＦＲの発現増強が認められたことから、イマチニブの効果をインプラント周囲炎組織より得た三次元培養系モデルを用いて解析を行った。三症例のインプラント周囲炎の患者から得られたＰＩＡＦを用いて解析を行ったところ、１０μＭの濃度でイマチニブを作用させることによって、いずれの症例でも顕著なコラーゲン収縮の抑制が観察された（図９（Ａ））。
【００５９】
さらに、得られたゲルをＨＥ染色により観察を行った（図９（Ｂ））。イマチニブを添加した場合には、コントロールに比べコラーゲン分解による空隙が少なくなっていることが観察され、コラーゲン分解能が抑制されていることが確認された。これらの結果から、イマチニブなどＰＤＧＦＲのキナーゼ活性を抑制することができるキナーゼ阻害剤はインプラント周囲炎の治療薬として適用できる可能性が示された。また、ここではイマチニブを使用したが、同様の活性を有するチロシンキナーゼ阻害剤であれば使用できることは言うまでもない。そのようなチロシンキナーゼ阻害剤は他にダサチニブ、ボスチニブ、スニチニブ、ニンテダニブがある。
【００６０】
イマチニブは抗がん剤であることから、通常経口投与が行われている。しかし、インプラント周囲炎の場合、抗がん剤としての使用とは異なり、局所に塗布、又は注射によって適用すればよい。局所投与であることから、用量も少なくてよいと考えられる。したがって、吐き気、嘔吐など、イマチニブの副作用とされている症状も生じない可能性が高い。
【００６１】
上記結果で示してきたように、インプラント周囲炎は歯周炎とは異なる疾患であり、異なる治療薬、あるいは予防薬によって治療や予防をする必要がある。上記で示したヒドロキシケイヒ酸を含む生薬、あるいはキナーゼ阻害剤は、インプラント周囲炎の新しい予防薬、治療薬の有効成分として使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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