(57)【要約】      （修正有）【課題】メディトープのためのモノクローナル抗体フレームワーク結合インターフェース、メディトープ送達系、及びその使用法の提供。【解決手段】特定の配列を有する環状メディトープ、cQFD及びcQYNのための抗体フレームワーク結合インターフェース、及びその使用法。また、結合インターフェースは、抗体又はその機能性フラグメントの、相補性決定領域ではなくフレームワーク領域により形成される。他では、ヒトまたはヒト化治療用抗体は、１つ又はそれ以上のヒト・フレームワーク残基が１つ又はそれ以上の対応するマウス残基で置換され、それによってcQFD又はcQYNを有するメディトープは１つ又はそれ以上のヒト・フレームワーク残基に安定に結合できる。【選択図】図４ＡＢ
2020055823.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列CQFDLSTRRLKC（SEQ ID NO:1）、CQYNLSSRALKC（SEQ ID NO:2）、またはその改変体を有するメディトープに結合するマウス-ヒト・キメラ抗体またはその機能性フラグメント
のフレームワーク領域を含有するフレームワーク結合インターフェース。
【請求項２】
メディトープは環状である、請求項１記載のフレームワーク結合インターフェース。
【請求項３】
メディトープは直鎖状である、請求項１記載のフレームワーク結合インターフェース。
【請求項４】
結合インターフェースはマウス-ヒト・キメラ抗体またはその機能性フラグメントのFab軽鎖およびFab重鎖の間に位置する、請求項１記載のフレームワーク結合インターフェース
。
【請求項５】
フレームワーク領域はFab部分から構成される、請求項１記載のフレームワーク結合イン
ターフェース。
【請求項６】
抗体はセツキシマブまたはその機能性フラグメントである、請求項１記載のフレームワーク結合インターフェース。
【請求項７】
長鎖リンカー、多価スキャホールド、小化学スキャホールド、ビオチン-ストレプトアビ
ジン、またはIgG Fcドメインのいずれか１つを用いて結合している２つまたはそれ以上のメディトープを含有する多価メディトープ連結体。
【請求項８】
２つまたはそれ以上のメディトープはCQFDLSTRRLKC（SEQ ID NO:1）、CQYNLSSRALKC（SEQ
ID NO:2）、またはその改変体から選択される、請求項７記載の多価メディトープ連結体。
【請求項９】
多価メディトープ連結体は２価、３価、または４価のメディトープ連結体である、請求項７記載の多価メディトープ連結体。
【請求項１０】
多価メディトープ連結体は２つまたはそれ以上のメディトープ使用可能治療用抗体またはその機能性フラグメントを連結するために使用される、請求項７記載の多価メディトープ連結体。
【請求項１１】
多価メディトープ連結体はメディトープ使用可能モノクローナル抗体またはその機能性フラグメントの結合安定性および／または有効性を向上する、請求項７記載の多価メディトープ連結体。
【請求項１２】
メディトープ使用可能モノクローナル抗体は、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アレムツズマブ、アトリズマブ、ペンテト酸アルツムマブ、アナツムマブマフェナトックス、アルシツムマブ、バシリキシマブ、ベクツムマブベンラリズマブ、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、セルトリズマブ、セツキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エタラシズマブエトルマキソマブファノレソマブ、FBTA05、フォントリズマブ、ゲムツズマブ、ギレンツシキマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、メポリズマブ、ムロモナブ-CD3、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴモマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、チウキセタン、トシツモマブ、トラスツズマブ、TRBS07、ウステキヌマブ、ビジリズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、またはそれらの機能性フラ
グメントから選択されるメディトープ使用可能治療用抗体である、請求項１１記載の多価メディトープ連結体。
【請求項１３】
イメージング剤、治療剤、またはその両方を更に含有する、請求項７記載の多価メディトープ連結体。
【請求項１４】
イメージング剤、治療剤、またはその両方が金属イオンに結合した金属キレート剤である、請求項１３記載の多価メディトープ連結体。
【請求項１５】
１つまたはそれ以上の治療物質、イメージング物質、またはそれらを組み合わせたものと共にメディトープを含有する組成物。
【請求項１６】
メディトープは配列CQFDLSTRRLKC（SEQ ID NO:1）またはCQYNLSSRALKC（SEQ ID NO:2）を含有する、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
治療物質は１つまたはそれ以上の小分子、化学療法剤、治療用抗体もしくはその機能性フラグメント、毒物、放射性同位体、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子、RNAi分子、キレート剤、ホウ素化合物、光反応性物質、色素、またはそれらを組み合わせたものである、請求項１５記載の組成物。
【請求項１８】
イメージング物質は１つまたはそれ以上の蛍光もしくは発光物質、酵素、造影剤、放射性物質、またはナノ粒子である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１９】
治療物質はCovX-BodyTMを伴う、請求項１５記載の組成物。
【請求項２０】
治療用ヒトまたはヒト化抗体を改変する方法であって、Fab中央空洞部分のヒト・フレー
ムワーク領域内に位置する１つまたはそれ以上のヒト・フレームワーク残基を、配列CQFDLSTRRLKC（SEQ ID NO:1）、CQYNLSSRALKC（SEQ ID NO:2）、またはその改変体を有するメディトープが１つまたはそれ以上のヒト・フレームワーク残基に結合するように、対応する１つまたはそれ以上のマウス残基で置換することを含む、上記方法。
【請求項２１】
１つまたはそれ以上の置換は、軽鎖のP8、V9、I10、S14、E17、Q38、R39、T40、N41、G42、S43、P44、D82、I83、A84、D85、Y86、Y87、G99、A100、G101、T102、K103、L104、E105、K107、R142、S162、V163、T164、E165、Q166、D167、S168、もしくはY173位；または
重鎖のQ6、P9、R38、Q39、S40、P41、G42、K43、G44、L45、S87、D89、T90、A91、I92、Y93、Y94、W109、G110、Q111、G112、T113、L114、V115、T116、Y151、E154、P155、V156
、T171、F172、P173、A174、V175、Y182、S183、もしくはL184位のフレームワーク残基である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
１つまたはそれ以上の置換は、セツキシマブ軽鎖のS9I、S10L、K39R、P40T、P40S、G41N
、K42G、A43S、F83I、F83V、T85N、T85D、もしくはQ100A；または重鎖のA36SもしくはV89Iである、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
置換によって、治療用ヒト抗体またはその機能性フラグメントの結合および／または治療効果を向上させる多価メディトープ連結体の結合が可能となる、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
フレームワークへの結合は、メディトープとフレームワークとの間に少なくとも１つのジスルフィド結合または少なくとも１つの非天然アミノ酸との結合を伴う、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
配列CQFDLSTRRLKC（SEQ ID NO:1）、CQYNLSSRALKC（SEQ ID NO:2）、またはその改変体を有するメディトープに結合するキメラ化マウス抗体またはその機能性フラグメントのフレームワーク結合インターフェースを有する治療用抗体を含有するメディトープ使用可能モノクローナル抗体。
【請求項２６】
結合インターフェースはキメラ化マウス抗体またはその機能性フラグメントのFab軽鎖とFab重鎖との間に位置する、請求項２５記載のメディトープ使用可能モノクローナル抗体。
【請求項２７】
フレームワーク領域はFab部分から構成される、請求項２５記載のメディトープ使用可能
モノクローナル抗体。
【請求項２８】
抗体は、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アレムツズマブ、アトリズマブ、ペンテト酸アルツムマブ、アナツムマブマフェナトックス、アルシツムマブ、バシリキシマブ、ベクツムマブ、ベンラリズマブ、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、セルトリズマブ、クリバツズマブテトラキセタン、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エタラシズマブ、エトルマキソマブ、ファノレソマブ、FBTA05、フォントリズマブ、ゲムツズマブ、ギレンツシキマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、メポリズマブ、ムロモナブ-CD3、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴモマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、チウキセタン、トシツモマブ、トラスツズマブ、TRBS07、ウステキヌマブ、ビシリズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、またはそれらの機能性フラグメントである、請求項２５記載のメディトープ使用可能モノクローナル抗体。
【請求項２９】
モノクローナル抗体またはその機能性フラグメントの精製法であって、
メディトープまたはメディトープ改変体を固相に結合させ；
結合したメディトープまたはメディトープ改変体を、モノクローナル抗体またはその機能性フラグメントを含有するかまたは含有する疑いのある溶液と接触させて、モノクローナル抗体またはその機能性フラグメントをメディトープに結合させる
ことを含む、上記方法。
【請求項３０】
モノクローナル抗体は、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アレムツズマブ、アトリズマブ、ペンテト酸アルツムマブ、アナツムマブマフェナトックス、アルシツムマブ、バシリキシマブ、ベクツムマブ、ベンラリズマブ、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、セルトリズマブ、セツキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エタラシズマブ、エトルマキソマブ、ファノレソマブ、FBTA05、フォントリズマブ、ゲムツズマブ、ギレンツシキマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、メポリズマブ、ムロモナブ-CD3、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴモマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、チウキセタン、トシツモマブ、トラスツズマブ、TRBS07、ウステキヌマブ、ビシリズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、またはそれらの機能性フラグメントから選択されるメディトープ使用可能治療用抗体である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
疾病または病態の治療、イメージング、または診断の方法であって、治療的有効量の医薬組成物を被験体に投与することを含み、医薬組成物は、抗体-メディトープ複合体；モノ
クローナル抗体またはその機能性フラグメントと組み合わせた多価連結剤；またはそれらを組み合わせたものを含有する、上記方法。
【請求項３２】
抗体-メディトープ複合体；モノクローナル抗体またはその機能性フラグメントと組み合
わせた多価連結剤；またはそれらを組み合わせたものは、疾病もしくは病態の診断もしくはイメージングのための１つもしくはそれ以上の診断剤もしくはイメージング剤、疾病を治療するための１つもしくはそれ以上の治療剤、またはそれらを組み合わせたものにコンジュゲートされている、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
治療剤は、１つまたはそれ以上の小分子、化学療法剤、治療用抗体もしくは機能性フラグメント、毒物、放射性同位体、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子、RNAi分子、キレート剤、ホウ素化合物、光反応性物質、色素、またはそれらを組み合わせたものである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
診断剤またはイメージング剤は、１つまたはそれ以上の蛍光もしくは発光物質、酵素、造影剤、放射性物質、またはナノ粒子である、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
抗体-メディトープ複合体；モノクローナル抗体もしくはその機能性フラグメントと組み
合わせた多価連結剤；またはそれらを組み合わせたものは、治療用抗体単独での治療、診断、またはイメージングの有効性を向上する、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
抗体-メディトープ複合体は、メディトープおよびメディトープ使用可能モノクローナル
抗体を含有し、メディトープ使用可能モノクローナル抗体またはその機能性フラグメントは、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アレムツズマブ、アトリズマブ、ペンテト酸アルツムマブ、アナツムマブマフェナトックス、アルシツムマブ、バシリキシマブ、ベクツムマブ、ベンラリズマブ、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、セルトリズマブ、セツキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エタラシズマブ、エトルマキソマブ、ファノレソマブ、FBTA05、フォントリズマブ、ゲムツズマブ、ギレンツシキマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、メポリズマブ、ムロモナブ-CD3、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴモマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、チウキセタン、トシツモマブ、トラスツズマブ、TRBS07、ウステキヌマブ、ビシリズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、またはそれらの機能性フラグメントから選択される治療用抗体である、請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
多価連結剤は、治療的有効量のセツキシマブを被験体に投与した後、または治療的有効量のセツキシマブを被験体に投与するのと同時に投与される、請求項３１記載の方法。
【請求項３８】
腫瘍バイオマーカーを過剰発現する細胞を標的化する方法であって、治療的有効量のメディトープ使用可能モノクローナル抗体またはその機能性フラグメントを、メディトープ、メディトープ改変体、または多価連結剤と組み合わせて、バイオマーカーを過剰発現する、または過剰発現する疑いのある細胞集団に投与することを含む、上記方法。
【請求項３９】
腫瘍バイオマーカーはEGFRであり、メディトープ使用可能モノクローナル抗体はセツキシマブである、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
メディトープ改変体の結合親和性を改変する方法であって、メディトープ改変体を１つまたはそれ以上の位置で改変して、低pHレベルでのメディトープの結合親和性を増加または低下させることを含む、上記方法。
【請求項４１】
リソソーム薬剤送達を行うために、メディトープ改変体は低pHレベルにおいて低下した結合親和性を有する、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
腫瘍細胞への特異的結合を行うために、メディトープ改変体は低pHおよび低酸素環境において増加した結合親和性を有する、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
メディトープまたはメディトープと同様のフレームワーク結合機能性を有する小分子をスクリーニングする方法であって、
推定されるメディトープまたは小分子のライブラリーをメディトープ使用可能抗体と接触させ；
推定されるメディトープまたは小分子がメディトープ使用可能抗体にフレームワーク結合インターフェースで結合するか否かを測定し；
１つまたはそれ以上の候補となるメディトープまたはメディトープと同様のフレームワーク結合機能性を有する小分子を同定し；
１つまたはそれ以上の候補の結合親和性を測定し；そして、
結合解離定数が少なくとも0.70μMである場合に、１つまたはそれ以上の候補をメディ
トープまたはメディトープと同様のフレームワーク結合機能性を有する小分子であると同定する
ことを含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は米国特許仮出願第61/391,558号（2010年10月8日出願）（参照によりその全体
が本明細書に組み込まれる）に基づく優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌は、活発に免疫系を抑制することによって免疫監視を回避する。このような免疫抑制に対抗することを目的とする方法の一つは、腫瘍細胞によって特異的に発現または過剰発現される抗原のエピトープを用いるワクチン接種によるものである。例えば、シグナル伝達経路を阻害する、増殖因子を抑制する、および／または免疫応答を誘導するモノクローナル抗体（mAb）は、癌および他の疾病を治療するために臨床導入され、成果を上げてき
た。その好適な特性および臨床における成果のため、mAbは、これまでも、また現在も、
タンパク質工学において重点的な取り組み課題となっている。これらの取り組みにより、改善された標的化のための二重特異性mAb；向上された腫瘍浸潤性および血液クリアラン
スのための1本鎖Fab可変領域フラグメント（scFv）、ダイアボディ（diabody）、および
ミニボディ（minibody）；そして、（変異またはグリコシル化による）免疫刺激の変更または薬物動態学的／薬力学的特性の改善を目的とした改変型Fcが開発されてきた。同様に、mAbを再設計し、送達改善のために小分子の部位特異的コンジュゲートを可能にするこ
と（例えばThioMAB）、または、その抗原に不可逆的に結合させること（例えば無限（infinite）親和性mAb）が行われてきた。また、生体活性ペプチドおよび他の生物製剤（例えばCovXbody）の循環および提示を向上するためのmAbも開発されてきた。ヘテロ多量体scFv、または、アビジンに融合したscFvもしくはmAbも、事前標的化療法および腫瘍イメージングの検出限界向上のために開発されてきた。
【０００３】
mAbは有効であり、小分子より優れた点もあるが、オフターゲット相互作用による有害
な副作用または放射性核種がコンジュゲートしたmAbの長時間循環に付随する損傷のよう
な問題点から、その有効性（向上された標的化および相乗効果など）を改善する余地がかなり残されている。従って、抗体および小分子の治療有効性の向上は、癌および他の疾病の治療に有用かつ必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
抗体結合ペプチドである、C-QFDLSTRRLK-C（cQFD;SEQ ID NO:1）およびC-QYNLSSRALK-C（cQYN;SEQ ID NO:2）は、新規のmAb結合特性を有することが明らかにされた。特に、cQFDおよびcQYN（別名「メディトープ（meditope）」）は、抗EGFR mAbであるセツキシマブ
のFabフレームワーク領域に結合し、抗原が結合する相補性決定領域（CDR）には結合しないことが明らかにされた。そのFabフレームワーク上の結合領域は、他のフレームワーク
結合抗原（例えばスーパー抗原、黄色ブドウ球菌プロテインA（SpA）（Grailleら, 2000
）およびペプトストレプトコッカス・マグヌス（Peptostreptococcusmagnus）プロテインL（PpL）（Grailleら, 2001））とは異なっており、これまで知られていなかった。従っ
て、第1の態様は、配列CQFDLSTRRLKC（SEQ ID NO:1）またはCQYNLSSRALKC（SEQ ID NO:2
）を有する環状メディトープに結合する、ユニークなマウス-ヒト抗体またはその機能性
フラグメントのフレームワーク領域を含有するフレームワーク結合インターフェースである。
【０００５】
表面プラズモン共鳴によるメディトープのキャラクタリゼーションによれば、cQFDおよびcQYNは、それぞれ約0.70-0.95および2-5μMの解離定数でFabに結合する。特異的相互作用が破綻するように設計した点変異により、その構造モデルが更に立証されている。FACS分析から、高濃度のcQFDメディトープ（60μM）によって生ずる、EGFR受容体を過剰発現
するMDA-MB-468細胞へのセツキシマブの結合能の相違は、無視できる程度のものであることが明らかになった。従って、メディトープ結合は、抗原結合に影響しない。更に、メディトープを蛍光基とコンジュゲートさせたところ、セツキシマブで前処理したMDA-MB-468細胞には結合するが、マウス抗EGFR抗体（M425）で前処理したMDA-MB-468細胞には結合しないことが明らかとなった（図２９）。総合すると、これらのデータからFabフレームワ
ーク内のメディトープ結合インターフェースが明確となり、メディトープ結合は抗原結合を阻害しない（例えばアロステリック調節剤として作用しない）ことが明らかとなる。
【０００６】
別の態様では、上記の新規結合特性を有するメディトープ（例えばcQYNまたはcQFD）またはその改変体を用いて治療用モノクローナル抗体（「mAb」）に機能性を付与すること
ができる。更なる態様では、本明細書に記載するメディトープを使用して、治療物質、例えばモノクローナル抗体またはその機能性フラグメント、または他の物質、例えば小分子の有効性に作用を及ぼすことができる。更に別の態様では、タグまたは検出可能標識をメディトープに結合させることによって、診断または治療に使用するために特定のタイプの細胞または組織を同定することができる。
【０００７】
別の態様では、メディトープはシステインを含有し、これがFabのメディトープ結合部
位のシステインと共有結合を形成する。メディトープを任意の物質、分子、または化合物にコンジュゲートさせる。それらは治療用分子、例えば診断用小分子、例えばマーカーであることができる。「Cysメディトープ」は、コンジュゲートをIgGへ誘導し、共有結合を介して結合する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】セツキシマブのメディトープ・ペプチド結合フレームワーク・ループを示す。図１A：セツキシマブFab（軽鎖をVLおよびCL、重鎖をVHおよびCHで示す）および環状CQFDLSTRRLKC（灰色で示し、「メディトープ」と表示する部分）（SEQ ID NO:1）の複合体は、メディトープが、セツキシマブのCDRループとは異なる、Fabフレームワークのインターフェースに結合することを示している。図１Bは、cQFDメディトープを棒モデルで示したものである。図１Cは、cQYNメディトープを棒モデルで示したものである。N末端およびC末端システインは溶媒に暴露されており、高い温度因子を示す。
【図２】セツキシマブのFab結合インターフェースの態様を示す。セツキシマブはマウスキメラであり、従って、マウスIg可変ドメインおよびヒト定常Igドメインを混合して有する。図２Aは、ファージ「陰性」選択（ch14.18）、およびメディトープと接触するヒト化トラスツズマブの対応する残基を示す。図２B（上段）は、セツキシマブのマウス配列にコードされる異なるポケットを占めるcQFDメディトープのArg９の立体像を示す（最前面）。トラスツズマブFab（1N8Z.pdb；後面）（Choら, 2003）を重ね合わせてある。Asp85からメディトープArg9のグアニジニウム基およびLeu10のバックボーンアミドまで塩橋がある。図２B（下段）は、Fabフラグメントを重ね合わせたものであり、メディトープ中のFによるYへのわずかな影響を示している。特に、疎水性基F/Y3 L5およびL10はほぼ同じ位置にあるが、cQYNメディトープ中のY5のヒドロキシル基は、cQFDメディトープで観察されるように、R8とQ111バックボーンとの相互作用を妨害する（「立体的衝突」）。この再配列により、β回転（「バックボーン回転」）のバックボーン残基が同時に変化する。
【図３Ａ】cQFDおよびcQYNとFabフラグメントとの表面プラズモン共鳴（SPR）トレースを示す二重線グラフである。結晶学的解析に使用したセツキシマブFabを、CM5チップに低密度で結合させた。cQFD（図３A）およびcQYN（図３B）メディトープの濃度を漸増した時のトレースを示す。一連のトレースは、単純な指数（例えば、シグナル=A*exp[kon*time]）を用いる単結合部位モデルにフィットさせた。それぞれの残差を下段に示す。
【図３Ｂ】cQFDおよびcQYNとFabフラグメントとの表面プラズモン共鳴（SPR）トレースを示す二重線グラフである。結晶学的解析に使用したセツキシマブFabを、CM5チップに低密度で結合させた。cQFD（図３A）およびcQYN（図３B）メディトープの濃度を漸増した時のトレースを示す。一連のトレースは、単純な指数（例えば、シグナル=A*exp[kon*time]）を用いる単結合部位モデルにフィットさせた。それぞれの残差を下段に示す。
【図４ＡＢ】本発明のメディトープは過去に仮定されていたようにCDRに結合するのではないことを示す。図４Aは2.0Aの結晶構造を示し、メディトープはセツキシマブFabの中央部の「穴」に結合する。抗原であるEGFRドメインIIIは、メディトープ結合部位から有意に離れた位置にある相補性決定領域に結合する。図４Bの左側にゲルの結果を、右側に関連するサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。個々の成分、Fab、EGFRドメインIII、およびSMT-cQFDメディトープ、並びに3つ全ての混合物のサイズ排除実験は、ヘテロ3量体複合体の形成および共溶出を示している。非還元SDS-PAGEゲルは第1に溶出された画分を示しており、混合物で観察された新規のピーク（「複合体」の最も左側の灰色で示すピーク）中に3つの成分全てが存在することを示している。図４CはFACS分析の結果を示しており、メディトープがセツキシマブの存在下でのみ、EGFR陽性MD-MBA-468細胞に結合することを示している（矢印）。メディトープ単独またはM425（マウスEGFR抗体）存在下でのメディトープは結合しない。図４Dおよび４Eは、セツキシマブのscFvを結合させたセンサーチップを用いた表面プラズモン共鳴実験の結果を示す。実験は、cQFDメディトープが、100μMという高濃度でもscFvを飽和しないことを示している。セツキシマブFabを結合させたセンサーチップを用いた同じ実験では、完全な飽和を示した。この実験の解離定数は660nMであった。コントロールSPR実験は、セツキシマブscFvが可溶性EGFRドメインIIIフラグメントに容易に結合することを示しており、CDRループが機能的であることを示している。
【図４Ｃ】本発明のメディトープは過去に仮定されていたようにCDRに結合するのではないことを示す。図４Aは2.0Aの結晶構造を示し、メディトープはセツキシマブFabの中央部の「穴」に結合する。抗原であるEGFRドメインIIIは、メディトープ結合部位から有意に離れた位置にある相補性決定領域に結合する。図４Bの左側にゲルの結果を、右側に関連するサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。個々の成分、Fab、EGFRドメインIII、およびSMT-cQFDメディトープ、並びに3つ全ての混合物のサイズ排除実験は、ヘテロ3量体複合体の形成および共溶出を示している。非還元SDS-PAGEゲルは第1に溶出された画分を示しており、混合物で観察された新規のピーク（「複合体」の最も左側の灰色で示すピーク）中に3つの成分全てが存在することを示している。図４CはFACS分析の結果を示しており、メディトープがセツキシマブの存在下でのみ、EGFR陽性MD-MBA-468細胞に結合することを示している（矢印）。メディトープ単独またはM425（マウスEGFR抗体）存在下でのメディトープは結合しない。図４Dおよび４Eは、セツキシマブのscFvを結合させたセンサーチップを用いた表面プラズモン共鳴実験の結果を示す。実験は、cQFDメディトープが、100μMという高濃度でもscFvを飽和しないことを示している。セツキシマブFabを結合させたセンサーチップを用いた同じ実験では、完全な飽和を示した。この実験の解離定数は660nMであった。コントロールSPR実験は、セツキシマブscFvが可溶性EGFRドメインIIIフラグメントに容易に結合することを示しており、CDRループが機能的であることを示している。
【図４Ｄ】本発明のメディトープは過去に仮定されていたようにCDRに結合するのではないことを示す。図４Aは2.0Aの結晶構造を示し、メディトープはセツキシマブFabの中央部の「穴」に結合する。抗原であるEGFRドメインIIIは、メディトープ結合部位から有意に離れた位置にある相補性決定領域に結合する。図４Bの左側にゲルの結果を、右側に関連するサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。個々の成分、Fab、EGFRドメインIII、およびSMT-cQFDメディトープ、並びに3つ全ての混合物のサイズ排除実験は、ヘテロ3量体複合体の形成および共溶出を示している。非還元SDS-PAGEゲルは第1に溶出された画分を示しており、混合物で観察された新規のピーク（「複合体」の最も左側の灰色で示すピーク）中に3つの成分全てが存在することを示している。図４CはFACS分析の結果を示しており、メディトープがセツキシマブの存在下でのみ、EGFR陽性MD-MBA-468細胞に結合することを示している（矢印）。メディトープ単独またはM425（マウスEGFR抗体）存在下でのメディトープは結合しない。図４Dおよび４Eは、セツキシマブのscFvを結合させたセンサーチップを用いた表面プラズモン共鳴実験の結果を示す。実験は、cQFDメディトープが、100μMという高濃度でもscFvを飽和しないことを示している。セツキシマブFabを結合させたセンサーチップを用いた同じ実験では、完全な飽和を示した。この実験の解離定数は660nMであった。コントロールSPR実験は、セツキシマブscFvが可溶性EGFRドメインIIIフラグメントに容易に結合することを示しており、CDRループが機能的であることを示している。
【図５】細胞カウントに対する蛍光強度のグラフであり、cQFDの存在下における蛍光標識したセツキシマブのMDA-MB468細胞への結合を示す。セツキシマブはペプチドの非存在下、および6μMおよび60μMのペプチドの存在下、並びにアイソタイプコントロールの存在下でMDA-MB468細胞に結合する。
【図６】メディトープおよびEGFRがどのように異なる部位に結合するかを示す。上段の図は、cQFD-Fab複合体およびEGFR-Fab複合体（1YY8）を立体的に重ね合わせたものである。下段の図は、重鎖の残基39-46がフレキシブルであり、メディトープを受容できることを示す。
【図７】Fabフレームワーク結合物質を示す。メディトープ、プロテインA、およびプロテインLに結合したFabを重ね合わせたものであり、それぞれがFab上の独自の部位に結合することを示している。
【図８】腫瘍治療向上のための１つの作用機序を示す。腫瘍細胞上に過剰発現した抗原（例えばErbB受容体ファミリー）は２価抗体に結合し（左図）、受容体シグナリングを阻害し、エンドサイトーシスおよび受容体リサイクリングを改変し、そして／または免疫応答を惹起する。多価メディトープの添加によって治療用mAbが連結／架橋され、その治療可能性を向上することができる（右）。右側に、３価メディトープから予測されるデイジーチェーンの図を示す。
【図９】scFv-メディトープ・リンカーを示す。scFvを、12-20アミノ酸長のリンカー（一般的に｛GGGS｝3-5）を介して軽鎖可変ドメインを重鎖可変ドメインに（またはその逆で）融合させることによって作製する。
【図１０】メディトープがマウス・セツキシマブに選択的に結合することを示すゲルの画像である。ビオチン化したcQFDペプチドを、アビジンを結合したビーズに添加し、完全に洗浄し、PBS中で平衡化した。次いで、セツキシマブをビーズに添加し（レーン１）、洗浄し（レーン２-４）、その後、溶出した（レーン５）。最上部のバンドはIgG重鎖であり、下部のバンドはIgG軽鎖である。
【図１１】立体的遮蔽を示す図である。メディトープを、腫瘍関連プロテアーゼ部位を含有するフレキシブル・リンカーを介してFab軽鎖または重鎖のN末端に融合させることができる。図に示すように、分子内相互作用により抗原結合部位は立体的に遮蔽される。
【図１２】セツキシマブ上のアビジン-ペプチド遮蔽のオフレート測定を示す。左図は、ビオチン化したcQFDメディトープの結合反応速度を、固定化したセツキシマブIgGを用いるSPRによって測定した。表面プラズモン共鳴トレースの上の図は、２価IgG上部を通過する１価メディトープを示すイラストである。右図に示すように、アビジンはビオチン化したメディトープで飽和され、同じ固定化されたセツキシマブIgG上を通過する。多価メディトープのオフレートは、少なくとも36倍低下した（2つの実験ではタイムスケールが異なることに留意されたい）。SPRトレース上部の図は、４価メディトープおよび２価IgG間の「２価-２価相互作用」を示す。
【図１３】いくつかの態様にかかる２量体および３量体メディトープの合成を図示する。
【図１４】フルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識したメディトープ２量体７のキャラクタリゼーションを示す。左図は最終の２価メディトープのHPLCトレースを、右図はそのマススペクトルを示す。
【図１５】いくつかの態様にかかるメディトープ-Fc連結剤の核酸配列（SEQ ID NO:3）および対応するアミノ酸配列（SEQ ID NO:4）を示す。
【図１６】２価メディトープの構造を示す。メディトープはIgGのFc領域に直接融合したペプチドリンカーのN末端に直接融合している。Fcは天然ではホモ２量体である。従って、メディトープ-Fc構築物は２価である。
【図１７】代表的なFACS分析結果を示す。EGFR受容体を過剰発現するMDA-MB-468細胞を10nMのセツキシマブで30分間前処理し、洗浄した後、4段階の濃度のメディトープ-Fc構築物または単量体メディトープで処理した。一番下のトレースは陰性コントロールである（抗体無し）。次の４つのトレースは、単量体メディトープがセツキシマブで前処理した細胞に濃度依存的に結合することを示している。上から4つのトレースは、２価のメディトープFcがセツキシマブで前処理した細胞に、濃度依存的に、しかし、より高度の親和性で結合する（例えば右にシフトする）ことを示している。これは予測されたことであり、多価相互作用と一致する。
【図１８】特定の態様で使用することができる、代替となるリンカー（コイルト゛コイルなど）を示す。
【図１９】NMRによるフラグメント・スクリーニング。セツキシマブ添加前（赤色トレース）および添加後（青色トレース）のフラグメントプールの代表的なNMRスペクトルを示す。この方法を用いてリード化合物を同定し、回折解析を用いて結合部位を決定する。
【図２０】標的化ランダムライブラリーを用いて、メディトープ部位でのメディトープまたは化合物結合のためにmAbの結合親和性を改変および／または向上する段階を示す。特に、メディトープ結合部位の内表面に並ぶmAb残基のコドンがNNKで置換される場合、FACSソーティング（メディトープおよび抗原は異なる発色団で標識される）によって遺伝子ライブラリーを選択することができる。GPIリンカーにより、選択されたmAbが遺伝子配列をコードする細胞に結合したままとなる。選択された細胞由来の軽鎖および重鎖をコードする遺伝子のシーケンシングにより、高親和性を有するmAbが同定される。方法を反復して、より親和性の高いメディトープまたはメディトープ類似体を選択することができる。
【図２１】配列相違の表面の３D表示。上段の濃灰色の部分はセツキシマブと完全長ヒト・トラスツズマブ・フレームワーク間のアミノ酸の相違を示す。囲み内の残基は、トラスツズマブ・フレームワーク上で変異が施与されている。トラスツズマブのCDRループを同定し（下段；暗色部分）、セツキシマブ・フレームワーク上に移植した。
【図２２】メディトープ使用可能トラスツズマブはメディトープ-Fcに結合することを示す。上段のグラフは、メディトープ結合部位をトラスツズマブ（腫瘍抗原Her2に結合する完全長ヒトmAb）上に作製した。FACS分析では、メディトープ使用可能トラスツズマブがHer2を過剰発現するSKBR3細胞に結合することを示している（上から２つのトレース）。下段のグラフでは、メディトープ-Fcがメディトープ使用可能トラスツズマブに結合するが（上から２つのトレース；ピークが右にシフトしている）、野生型トラスツズマブ（下から2番目のトレース）または陰性コントロール（一番下のトレース）とは結合しないことを示している。
【図２３ＡＢ】図２３Aは、メディトープ使用可能トラスツズマブ重鎖配列の核酸配列（SEQ ID NO:5）を示す。シグナルペプチド配列を灰色の網掛けで示す。図２３Bは、メディトープ使用可能トラスツズマブ重鎖配列のアミノ酸配列（SEQ ID NO:6）を、野生型（SEQ ID NO:7）と比較して示す。相違を灰色の網掛けで示す。図２３Bに示すアミノ酸の後には、ヒト重鎖配列と相違はない。図２３Cは、メディトープ使用可能トラスツズマブ軽鎖配列の核酸配列（SEQ ID NO:8）を示す。シグナルペプチド配列を灰色の網掛けで示す。図２３Dは、メディトープ使用可能トラスツズマブ軽鎖配列のアミノ酸配列（SEQ ID NO:9）を、野生型（SEQ ID NO:10）との比較で示す。相違を灰色の網掛けで示す。
【図２３ＣＤ】図２３Aは、メディトープ使用可能トラスツズマブ重鎖配列の核酸配列（SEQ ID NO:5）を示す。シグナルペプチド配列を灰色の網掛けで示す。図２３Bは、メディトープ使用可能トラスツズマブ重鎖配列のアミノ酸配列（SEQ ID NO:6）を、野生型（SEQ ID NO:7）と比較して示す。相違を灰色の網掛けで示す。図２３Bに示すアミノ酸の後には、ヒト重鎖配列と相違はない。図２３Cは、メディトープ使用可能トラスツズマブ軽鎖配列の核酸配列（SEQ ID NO:8）を示す。シグナルペプチド配列を灰色の網掛けで示す。図２３Dは、メディトープ使用可能トラスツズマブ軽鎖配列のアミノ酸配列（SEQ ID NO:9）を、野生型（SEQ ID NO:10）との比較で示す。相違を灰色の網掛けで示す。
【図２４】セツキシマブ・フレームワーク上に移植されたHer2 CDRループがメディトープ-Fcに結合することを示す。図２４Aは、トラスツズマブのHer2 CDRループがセツキシマブ上に移植されており、これがメディトープに結合する。FACS分析は、Her2 CDRを移植したメディトープ使用可能mAbがHer2を過剰発現するSKBR3細胞に結合することを示している（種々の濃度での上から３つのトレース）。図２４Bは、メディトープ-FcがHer2 CDRを移植したメディトープ使用可能mAbに結合し（上から３つのトレース。ピークは濃度依存的に右側にシフトしている）、野生型トラスツズマブ（下から2番目）または陰性コントロール（一番下のトレース）には結合しないことを示している。
【図２５Ａ】図２５Aに、Her2 CDRを移植したメディトープ結合mAb重鎖の核酸配列（SEQ ID NO:11）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO:12）を、制限酵素部位および分泌配列と共に示す。図２５Bに、Her2 CDRを移植したメディトープ結合mAb軽鎖の核酸配列（SEQ ID NO:13）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO:14）を、制限酵素部位および分泌配列と共に示す。下線および網掛け部分は、メディトープの結合を可能とするために使用した変更を示す。メディトープの特異性を向上または変更するための更なる変更を、同様に移植してもよい。
【図２５Ｂ】図２５Aに、Her2 CDRを移植したメディトープ結合mAb重鎖の核酸配列（SEQ ID NO:11）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO:12）を、制限酵素部位および分泌配列と共に示す。図２５Bに、Her2 CDRを移植したメディトープ結合mAb軽鎖の核酸配列（SEQ ID NO:13）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO:14）を、制限酵素部位および分泌配列と共に示す。下線および網掛け部分は、メディトープの結合を可能とするために使用した変更を示す。メディトープの特異性を向上または変更するための更なる変更を、同様に移植してもよい。
【図２６】IgGおよびIgE Fabドメインの配列および構造アラインメントの例であり、メディトープ結合部位の近傍にあるIgE上の残基を示す。
【図２７】表面プラズモン共鳴（SPR）実験のグラフである。種々のメディトープ（cQFD、cQYN、およびcQYD）のセツキシマブへの結合親和性を、種々のpHで測定した。
【図２８】２価メディトープ-Fcの有効性を単量体メディトープのものと比較したMTTアッセイの結果を示す。図２８Aは、セツキシマブと合わせた際に、メディトープ-Fcだけが細胞増殖を阻害し、単量体メディトープは阻害しないことを示している。図２８Bは、メディトープ-Fcによってセツキシマブの細胞死滅能が向上されることを示している。
【図２９】メディトープがユニークなセツキシマブ・フレームワークに結合し、ヒト・フレームワークまたは他のマウスキメラ・フレームワークには結合しないことを示す。表面プラズモン共鳴実験では、野生型メディトープをCM5チップにコンジュケートさせ、セツキシマブ（メディトープ結合Fab）、トラスツズマブ（完全長ヒト・フレームワーク）、およびリツキシマブ（マウス-ヒト・キメラ・フレームワーク）を0.01、0.05、0.1、0.5、および1μMの濃度で試験した。セツキシマブだけがメディトープをコンジュゲートさせたチップに結合した。トラスツズマブ（1N8Z；Choら 2003）およびリツキシマブ（2OSL；Duら 2007）の分子構造を、メディトープが結合したセツキシマブFab構造に重ね合わせることによって、フレームワークの独自性が更に明らかになる。更に、この構造比較により、セツキシマブFabに由来するいずれの残基がメディトープ結合に寄与し、それらをどのように他のFabフレームワーク領域に移植できるかが明白となる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
治療剤またはイメージング剤を標的組織に選択的に送達させる抗体送達システム、およびそれらの使用法を本明細書で提供する。抗体送達システムは、抗体フレームワーク結合インターフェース（「フレームワーク結合インターフェース」または「結合インターフェース」）が抗体結合分子（または「メディトープ」）に結合して抗体-メディトープ複合
体を形成したものを含んでもよい。抗体-メディトープ複合体は、下記に詳述する方法に
使用するための１つまたはそれ以上の更なる抗体-メディトープ複合体、治療剤、イメー
ジング剤、またはそれらを組み合わせたものに更にコンジュゲートしていてもよい。
【００１０】
ある態様では、メディトープが結合できる抗体フレームワーク結合インターフェースは、抗体またはその機能性フラグメントの相補性決定領域（CDR）ではなく、フレームワー
ク領域で形成される。本明細書で使用する「抗体またはその機能性フラグメント」とは、特定の抗原またはエピトープに特異的に結合する、またはそれらと免疫学的に反応する免疫グロブリン分子をいい、それらにはポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が包含される。「抗体」という用語は、遺伝子操作または他の改変を行った免疫グロブリン、例えばイントラボディ（intrabody）、ペプチボディ（peptibody）、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、メディトープ使用可能抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体（例えば二重特異性抗体、ディアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テ
トラボディ（tetrabody）、タンデムdi-scFv、タンデムtri-scFv）を包含する。「機能性抗体フラグメント」という用語は抗体の抗原結合フラグメントを包含し、それらには、限定される訳ではないが以下がある：抗原結合（Fab）フラグメント、F(ab')2フラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント、組換えIgG（rIgG）フラグメント、１本鎖可変フ
ラグメント（scFv）、および単一ドメイン抗体（例えばsdAb、sdFv、ナノボディ（nanobody））フラグメント。
【００１１】
ある態様では、抗体またはその機能性フラグメントの結合およびイメージングを向上するために、結合インターフェースを開発または最適化することができる。別の態様では、メディトープはシステイン残基を含有し、これがメディトープ結合部位で、Fabに組換え
導入したシステインに結合することができる（例えばThioMAb）。これによって、メディ
トープを任意の診断および／または治療ための物質、分子、または化合物にコンジュゲートする。例えば、物質は診断用小分子、例えばマーカーであってもよい。「Cysメディト
ープ」は、コンジュゲートをIgGへ誘導し、共有結合を介して結合する。あるいはまた、
メディトープはFabのメディトープ結合部位に導入された1つまたはそれ以上の非天然アミノ酸にコンジュゲートすることができる。非天然アミノ酸と共に形成することができる結合の例として以下がある：（ｉ）p-アセチルフェニルアラニン、m-アセチルフェニルアラニン、p-（3-オキソブタノイル）-1-フェニルアラニン、およびp-（2-アミノ-3-ヒドロキシエチル）フェニルアラニンの導入による安定なヒドラゾン結合およびオキシム結合、（ｉｉ）フェニルセレニジルアラニン（phenylselenidylalanine）の導入による反応性チオール、（ｉｉｉ）p-ベンゾイル-1-フェニルアラニンの導入によるベンゾフェノン含有UV
架橋、（ｉｖ）p-イソプロピルチオカルボニルまたはp-エチルチオカルボニルフェニルアラニンの導入による反応性アミン、（ｖ）p-プロパルギルオキシフェニルアラニンまたはp-アジドフェニルアラニンの導入によるアジド-アルキン・ヒュスゲン環化付加、または
当該分野で公知の任意の他の好適な非天然アミノ酸。ある態様では、メディトープがFab
に導入された非天然アミノ酸（例えばp-アセチルフェニルアラニン）に反応基を誘導してもよい。
【００１２】
更に、メディトープのためのフレームワーク結合インターフェースを他のmAbに移植し
、メディトープ使用可能mAbを作製することができる。メディトープ結合部位を他のmAbに移植できるため、この結合インターフェースは、EGFRを標的とする場合のセツキシマブと
だけでなく、任意のモノクローナル抗体と共に使用することができる、汎用性の高いプラットフォーム技術である。「メディトープ使用可能な（meditope-enabled）」抗体、モノクローナル抗体、または治療用抗体とは、そのフレームワーク結合インターフェースでメディトープと結合することができる任意の抗体（例えばセツキシマブ）をいう。従って、プラットフォームは、治療用抗体を用いて治療または標的化しうる任意の癌、疾病、または他の症状の治療、診断、またはイメージングへの使用まで拡大することができ、それらの癌、疾病、または症状には、限定される訳ではないが以下がある：白血病およびリンパ腫（例えばアレムツズマブ、ベクツムマブ（bectumumab）、ゲムツズマブ、FBTA05、イブリツモマブ・チウキセタン、オファツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブを用いて治療またはイメージングできるもの）、乳癌（例えばトラスツズマブ、アデカツムマブ（adecatumumab）、エトルマキソマブ（etrumaxomab）を用いて治療またはイメージングできる
もの）、前立腺癌（例えばアデカツムマブ、カプロマブペンデチド（capromabpendetide
）、エタラシズマブ（etaracizumab）を用いて治療またはイメージングできるもの）、結腸直腸癌（例えばラベツズマブ（labetuzumab）、パニツムマブ、ペンテト酸アルツムマ
ブ（altumumabpentetate）、ボツムマブ（votumumab）を用いて治療またはイメージング
できるもの）、消化管癌（例えばアルシツムマブ（arcitumumab）、カツマキソマブ（catumaxomab）を用いて治療またはイメージングできるもの）、卵巣癌（例えばアバゴボマブ（abagovomab）、カツマキソマブ、エタラシズマブ、イゴボマブ（igovomab）、オレゴモマブ（oregovomab）を用いて治療またはイメージングできるもの）、肺癌（例えばアナツムマブマフェナトックス（anatumumabmafenatox）を用いて治療またはイメージングでき
るもの）、膵臓癌（例えばクリバツズマブテトラキセタン（clivatuzumabtetraxetan）を用いて治療またはイメージングできるもの）、腎臓癌（例えばギレンツシキマブ（girentuximab）を用いて治療またはイメージングできるもの）、黒色腫（例えばエタラシズマブ、イピリムマブ、TRBS07を用いて治療またはイメージングできるもの）、神経膠腫（例えばニモツズマブを用いて治療またはイメージングできるもの）、骨転移（例えばデノスマブを用いて治療またはイメージングできるもの）、頭頸部癌（例えばザルツムマブ（zalutumumab）を用いて治療またはイメージングできるもの）、心血管疾患（例えばアブシキ
シマブを用いて治療またはイメージングできるもの）、自己免疫疾患（例えばアダリムマブ、インフリキシマブを用いて治療またはイメージングできるもの）、リウマチ性関節炎（例えばアトリズマブ（atlizumab）、ゴリムマブ、インフリキシマブを用いて治療また
はイメージングできるもの）、移植拒絶反応（例えばバシリキシマブ、ダクリズマブ、ムロモナブ-CD3を用いて治療またはイメージングできるもの）、クローン病（例えばセルトリズマブ、フォントリズマブ、ナタリズマブ、インフリキシマブ、ビジリズマブ（visilizumab）を用いて治療またはイメージングできるもの）、ヘモグロビン尿症（例えばエク
リズマブを用いて治療またはイメージングできるもの）、乾癬（例えばエファリズムマブ、インフリキシマブ、ウステキヌマブを用いて治療またはイメージングできるもの）、多発性硬化症（例えばナタリズマブ、ウステキヌマブを用いて治療またはイメージングできるもの）、喘息（例えばベンラリズマブ（benralizumab）、メポリズマブ、オマリズマブを用いて治療またはイメージングできるもの）、呼吸器合胞体ウイルス（例えばパリビズマブを用いて治療またはイメージングできるもの）、黄斑変性症（例えばラニビズマブを用いて治療またはイメージングできるもの）、虫垂炎（例えばファノレソマブ（fanolesomab）を用いて治療またはイメージングできるもの）、および、抗体で標的化（targeting）または治療しうる他の任意の病態。上記の抗体および関連する疾病または障害は単なる実例であり、プラットフォームを制限するものではない。
【００１３】
ある態様では、環状抗体結合ペプチドC-QFDLSTRRLK-C（cQFD；SEQ ID NO:1）およびC-QYNLSSRALK-C（cQYN；SEQ ID NO:2）は、非共有結合性相互作用を介して抗体フレームワーク結合インターフェースに結合できる。この結合相互作用の非共有結合性により、フレームワーク結合インターフェース、ペプチド、またはその両方を改変するための新規の代替法が得られ、特異性の高いメディトープ改変体作製の可能性が広がる。ある態様では、cQ
FDおよびcQYNペプチドは、下記の回折データおよび生物物理学データが示すように、セツキシマブのFab領域の（CDR領域ではなく）フレームワーク領域に結合する。この結合部位は、他のフレームワーク結合抗原（例えばスーパー抗原、黄色ブドウ球菌プロテインA（SpA）およびペプトストレプトコッカス・マグヌス・プロテインL（PpL））の結合部位とは異なる（図７）。更に、プロテインAおよびプロテインLは、患者中に存在するIgGと結合
する。従って、相互作用は特異的である。
【００１４】
X線結晶解析により、ペプチドは、重鎖および軽鎖を輪郭とするFab空洞内に-700nMの結合定数で結合することが明らかにされている。この相互作用を利用して、特に、ネイキッドmAbの治療有効性の改善、イメージング剤または治療剤の標的化送達の向上、およびmAbに基づくイメージング法の改善を行うことができる。
【００１５】
cQFDおよびcQYNメディトープは、セツキシマブ中に存在するような、キメラ・フレームワーク結合領域に結合する。本明細書で使用する「メディトープ（meditope）」（medius（ラテン語で「中間」）＋topos（ギリシャ語で「場所」））という用語は、抗体のFab軽鎖および重鎖の間に結合する抗体結合ペプチド（例えばcQFDおよびcQYNペプチドまたはその改変体）をいう。他の分子も、メディトープと同様のフレームワーク結合機能性で抗体のFab重鎖および軽鎖の間に結合しうる。それらの分子には、限定される訳ではないが小
分子、アプタマー、核酸分子、ペプチボディ、および任意の他の物質で、メディトープと同じ結合インターフェースに結合できるものが包含される。本明細書に記載するフレームワーク結合インターフェースは、抗原エピトープに結合するＣＤＲとは別のもので、離れた位置にある（図４）。更に、生化学アッセイおよび細胞に基づくアッセイでは、cQFDおよびcQYN環状ペプチドは予めEGFRに結合させたマウスキメラ化セツキシマブと結合できることが明らかになっている（図４）。
【００１６】
セツキシマブはユニークなマウス-ヒト・キメラであり、cQFDおよびcQYNメディトープ
とセツキシマブFabの間の数種の相互作用は、このマウス-ヒト・キメラIgGフレームワー
ク残基に特異的であることが、本明細書に記載する原子モデルから明らかになっている。更に、メディトープはヒトIgGフレームワーク（例えばトラスツズマブ）には結合せず、
この相互作用はこのマウスキメラ抗体に特異的であって、他のマウスキメラ（例えばリツキシマブ）には特異的でないことを示している（図２９）。これは、セツキシマブ・フレームワークが高度に特異的であることを立証するものである。セツキシマブ-環状ペプチ
ド構造上に複数のヒトおよびマウスFabを重ね合わせることにより、このペプチドとマウ
ス-ヒト・キメラFab間の鍵となる相互作用は、ヒトのみ、およびマウスのみのIgG構造に
は存在しないことが明らかとなる。環状ペプチド内の主要な残基に点変異を施与するとFabへの結合親和性は低下し、このことは高度な特異性および構造モデルを裏付けている（
データ未掲載）。従って、相互作用はこの特異的マウス-ヒト・キメラFabの中央空洞部に特異的であると考えられる。これに対し、PpLおよびSpAはマウス特異的ではない。PpLは
マウスIgGカッパ軽鎖の〜６６％、ヒトIgGカッパ軽鎖の〜５０％に結合し、SpAはマウス
重鎖可変領域の１２％、ヒト重鎖可変領域の５０％に結合する（Grailleら,2002）。
【００１７】
セツキシマブは現在、EGFRを発現する転移性結腸直腸癌および頭頸部癌の治療に使用されている。セツキシマブは立体構造エピトープ（例えば、折りたたまれたEGFRドメインIII）を認識する。小分子抗原、ペプチド、およびタンパク質エピトープを認識する抗体を
比較することにより、インターフェースが異なる特性を有する傾向にあることが明らかになっている（Collisら, 2003）。小分子は小さなポケットにはめ込まれ；ペプチドは並列して（linear grove）フィットし；タンパク質は広い表面と接触する傾向がある。従って、セツキシマブ-EGFRとの場合と同様のタンパク質-抗体相互作用を再現できるペプチドは、一般に、広い接触表面があり、折りたたまれていないドメインを有するタンパク質抗原のものである。例えば、トラスツズマブはタンパク質抗原（立体構造エピトープ）を認識
するが、主として、多くの幾何学的に拘束されたループと接触する（Duら, 2007；Choら,
2003）。このタイプの生物学的認識は、ペプチド模倣物との適合性がより高い。
【００１８】
cQFDおよびcQYNメディトープは、当初、セツキシマブのCDR領域に結合するペプチド候
補として同定された。ファージディスプレー・ライブラリーが、確立された治療用抗体の相補性決定領域（CDR）に結合するペプチドを同定するために使用されてきたが、これは
、ペプチドが抗原エピトープを模倣して、その抗原への免疫応答を人工的に惹起するという推測に基づいている（Riemerら, 2004；Riemerら., 2005；Liら, 2006）。これらのペ
プチド模倣物（別名ミモトープまたは抗イディオタイプ）を化学的に合成し、起こりうる生物学的汚染を回避し、コストを低減することができる。しかしながら、この意図に基づくワクチンで得られるのは部分的な応答であり、多くの場合、その後、腫瘍抗原への免疫応答は消失せず、疾病が再発する（Sharavら, 2007）。
【００１９】
cQFDおよびcQYNメディトープはCDR領域ではなくフレームワークに結合するので、それ
らのメディトープがワクチン用の特異的セツキシマブ様抗体の免疫原候補となる可能性は低い。Reimerらの知見によれば、KLHを結合させたメディトープで免疫化したマウスから
回収した血清から、A431細胞に結合してその増殖を阻害する抗体が産生されたが（Riemerら, 2005）、本明細書に記載する研究は、アジュバントに結合した複数コピーのメディトープによって、ワクチンがマウスIgGとの無差別架橋剤となる（スーパー抗原と類似する
）ことを示している。この態様を裏付けるものとして、BLASTにおいて、類似した生殖細
胞系またはB細胞由来フレームワーク配列がマウス軽鎖、並びにマウスおよびヒトの重鎖
に見られる。従って、メディトープ・ペプチドをアジュバントに連結させた場合、保存されたフレームワーク領域を有するB細胞集団を活性化し、ワクチンに必要とされる特異的
免疫応答ではなく、全身免疫応答を惹起しうる。報告されているELISA競合アッセイでは
、EGFRの特異的結合部位も、ポリクローナル血清がEGFR上のセツキシマブ・エピトープにどの程度特異的であるかも明らかにされていない（例えば報告は、血清由来IgGが未標識
セツキシマブによって阻害されるか否かを示していない）。回折解析および生化学的試験は、ヒトにおけるワクチンとしてのcQYNまたはcQFDメディトープの使用を支持していない。
【００２０】
本明細書に記載する態様において使用することができる更なるメディトープには、セツキシマブまたは他の治療用抗体の抗体フレームワーク結合インターフェース（すなわちFabの軽鎖および重鎖の間）に結合する任意の小ペプチドが含まれる。例えば、環状ペプチ
ドcQFDおよびcQYNの他に、ある態様ではcQFDおよびcQYNの1つまたはそれ以上の改変体が
含まれる。
【００２１】
構造的および生物物理学的方法または改変を化学合成と併用し、（例えばpHの変更（下記実施例に記載）によって）セツキシマブへの親和性が未改変メディトープ、cQFDおよびcQYNに比較して向上または改変されたメディトープ改変体を開発することができる。更に、未改変メディトープまたは改変型メディトープを多価連結体（tether entity）または
スキャホールドにコンジュゲートさせることにより、全体の親和性、および腫瘍関連抗原に結合したメディトープ使用可能mAbへの多価メディトープの標的化が有意に向上されう
る。高親和性を有するメディトープ改変体の作製に使用することができるcQFDおよびcQYNメディトープへの改変には、当該分野で公知の任意のペプチド改変法が包含される。各アミノ酸位置は、変性アミノ酸に変更するか、または化学的にフラグメントにコンジュゲートさせてもよい。
【００２２】
ある態様では、１つまたはそれ以上のメディトープ、メディトープ改変体、多価メディトープ連結剤、または多価メディトープ改変体連結剤を1つまたはそれ以上のイメージン
グ剤、治療的有効量の治療的有効薬剤もしくは化合物、またはその両方にコンジュゲート
させ、メディトープまたはその改変体が治療的に有効な化合物を有する1つまたはそれ以
上のメディトープ使用可能抗体に結合することによって疾病または病態を治療、予防、診断、またはモニタリングできるようにすることができる。そのような高親和性かつ／またはメディトープ使用可能mAbに結合した多価メディトープのコンジュゲーションにより、
非常に汎用性の高いプラットフォーム技術が得られ、それによって、疾病の治療および検出のためのmAbに基づく治療法およびイメージング法が著しく向上される（図８参照）。
【００２３】
ある態様では、マウス特異的cQFDおよびcQYNメディトープまたはその誘導体を使用して、２つまたはそれ以上の抗体またはその機能性フラグメントを連結させることができる。後述の連結法に使用する場合、メディトープは多価連結剤（別名「メディトープ・スキャホールド」または「スキャホールド」）の一部であって、癌または腫瘍の治療およびイメージングを向上させることができる。
【００２４】
多価連結剤には、２つまたはそれ以上のcQFDおよびcQYNメディトープ、または任意の他の新規メディトープ改変体で、長鎖リンカーおよびビオチンを介してストレプトアビジンに結合し、多価メディトープ連結体を形成しているものがある。ある態様では、多価メディトープ連結体は４価メディトープ連結剤である。表面プラズモン共鳴によれば、４量体連結体は１価ペプチドに比較してIgGへの結合が向上されており、これは多価相互作用と
整合性がある。FACS分析によれば、４価メディトープはEGFR陽性細胞におけるセツキシマブの結合親和性も向上する。
【００２５】
多価メディトープ・スキャホールドを腫瘍関連抗原に結合したスキャホールドまたは「デイジーチェーン」メディトープ使用可能mAbに使用し、リガンド拮抗作用の向上、受容
体エンドサイトーシスの改変、および／またはADCC/CDCを介する免疫応答の向上を行うことができる（図８）。モノクローナル抗体（mAb）は２量体Fcに結合した２つのFabドメインをコードする。そのため、これらの２価IgGは抗原を発現する細胞に高密度で結合する
。同じ抗原上の独自のエピトープに結合する第２のmAbにより、受容体のクラスター形成
および、より効果的な腫瘍細胞の死滅が可能となることが明らかになっている。このクラスター形成は、多価メディトープの使用によって再現できる。多価メディトープを使用すれば第２のmAbを同定する必要がなく、その開発に伴う多額の費用が回避される。
【００２６】
メディトープ、メディトープ改変体、多価メディトープ連結剤、および多価メディトープ改変体連結剤の特性および結合を使用し、１つまたはそれ以上のメディトープ使用可能モノクローナル抗体と併せて投与して、治療剤、診断剤（例えばイメージング剤）、またはそれらを組み合わせたものを送達し、疾病または病態の治療、診断、またはイメージングを行うことができる。従って、メディトープ使用可能モノクローナル抗体を投与した後にメディトープ、メディトープ改変体、多価メディトープ連結剤、または多価メディトープ改変体連結剤を投与することにより、多価メディトープを使用して事前標的化療法およびイメージングを行うことができる。更に、多価メディトープの使用によって、遺伝子操作によって得たscFvまたは化学的にコンジュゲートさせたmAbで明らかになっているのと
同様に選択性を向上し、腫瘍検出を改善しつつ、それらの非ヒト構築物に内在する免疫原性の可能性を回避することができる。
【００２７】
ある態様では、メディトープ使用可能抗体と共投与されるメディトープ、抗体-メディ
トープ複合体、メディトープ使用可能抗体と共投与される多価連結剤、またはそれらを組み合わせたものを、１つまたはそれ以上のイメージング剤にコンジュゲートさせることができる。ある観点では、イメージング剤には、限定される訳ではないが、蛍光、発光、または磁性のタンパク質、ペプチド、またはそれらの誘導体（例えば遺伝子操作した改変体）がある。mRNA要素によって発現させることができる蛍光タンパク質には緑色蛍光タンパク質（GFP）、改良型GFP（EGFP）、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光
タンパク質、シアン蛍光タンパク質、サファイア蛍光タンパク質、およびサンゴ蛍光タンパク質がある。mRNA要素によって発現させることができる発光タンパク質には、ルシフェラーゼ、エクオリン、およびそれらの誘導体がある。多数の蛍光および発光色素およびタンパク質が当該分野で知られている（例えば以下参照：米国特許出願第2004/0067503号；Valeur, B., "Molecular Fluorescence: Principles and Applications," John Wiley and Sons, 2002；Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Molecular Probes社, 増補第9版, 2002；およびThe Handbook--A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Invitrogen社,第10版（Invitrogen社ウェブサイトで入手可）（
いずれも、参照により、本明細書に完全に記載されているのと同様に本明細書に組み込まれる））。
【００２８】
他の観点では、メディトープ使用可能抗体と共投与されるメディトープ、抗体-メディ
トープ複合体、メディトープ使用可能抗体と共投与される多価連結剤、またはそれらを組み合わせたものを、非タンパク質イメージング剤または送達媒体、例えばナノ粒子、放射性物質（例えば放射性同位体、放射性核種、放射能標識、または放射性トレーサ）、色素、造影剤、蛍光化合物もしくは分子、生物発光化合物もしくは分子、酵素、および増強剤（例えば常磁性イオン）に更にコンジュゲートまたは結合させることができる。更に、留意すべきことに、一部のナノ粒子、例えば量子ドットおよび金属ナノ粒子（後述）も、イメージング剤または治療剤として使用するのに好適であり得る（例えば高温度療法および光線力学療法を使用して、また、蛍光および／もしくはMRI造影剤によるイメージング剤
）。
【００２９】
本開示の態様において更なるイメージング剤として使用することができる蛍光物質および発光物質には、限定される訳ではないが、一般に「色素」、「標識」、または「指示薬」と呼ばれる多様な有機または無機小分子がある。それらの例として、フルオレセイン、ローダミン、アクリジン色素、Alexa色素、およびシアニン色素がある。
【００３０】
本開示の態様において更なるイメージング剤として使用することができる酵素には、限定される訳ではないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、またはβ-ラクトマーゼがある。それらの酵素を色原体、蛍光性化合物、または
発光性化合物と併用して検出可能シグナルを生成させてもよい。
【００３１】
本開示の態様において更なるイメージング剤として使用することができる放射性物質には、限定される訳ではないが、18F、32P、33P、45Ti、47Sc、52Fe、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、77As、86Y、90Y、89Sr、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、99Mo、105Pd,105Rh、111Ag、111In、123I、124I、125I、131I、142Pr、143Pr、149Pm、153Sm、154-1581Gd
、161Tb、166Dy、166Ho、169Er、175Lu、177Lu、186Re、188Re、189Re、194Ir、198Au、199Au、211At、211Pb、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra、および225Acがある。本開示の態様
において更なるイメージング剤として使用することができる常磁性イオンには、限定される訳ではないが、遷移イオンおよびランタニド金属（例えば、原子番号21-29、42、43、44、または57-71の金属）がある。これらの金属には、Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、およびLuイオンがある。
【００３２】
イメージング剤が放射性金属または常磁性イオンの場合、物質を別の長い尾部を有する物質（それらのイオンを結合させるための１つまたはそれ以上のキレート化基が結合した長い尾部を有するもの）と反応させることができる。長い尾部は、ポリマー、例えばポリリシン、多糖、または、金属もしくはイオンへの結合のためのペンダント基を有する誘導体化された、もしくは誘導体化可能な鎖であってもよい。本開示において使用することができるキレート化基の例には、限定される訳ではないが、エチレンジアミン四酢酸（EDTA
）、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）、DOTA、NOTA、NETA、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビスチオセミカルバゾン、ポリオキシムなどの基がある。キレートのPSMA抗体または機能性抗体フラグメントへの結合は、通常、免疫反応性の喪失を最小限に抑え、凝集および／または内部架橋を最小限に抑えて分子との結合形成を可能とするような基によってなされる。同じキレートが、非放射性金属（例えばマンガン、鉄、およびガドリニウム）と複合体を形成する場合、本明細書に記載する抗体およびキャリアと併用すると、MRIに有用である。大環状キレート（例えばNOTA、DOTA、およびTETA）は、種
々の金属および放射性金属と併用すると有益であり、それらにはそれぞれ、限定される訳ではないが、ガリウム、イットリウム、および銅の放射性核種がある。核種を安定に結合することを目的とする、大環状ポリエーテルのような他の環状キレート（例えばRAIT用の223Ra複合体）を使用してもよい。ある態様では、キレート部分を用いてPETイメージング剤（例えばAI-18F複合体）を標的分子に結合させ、PET分析に使用してもよい。
【００３３】
ある態様では、メディトープ、抗体-メディトープ複合体、多価連結剤、またはそれら
を組み合わせたものを、１つまたはそれ以上の治療剤にコンジュゲートさせてもよい。
【００３４】
本明細書で使用する「治療剤」とは、本明細書に記載する癌または他の病態の治療に有用な原子、分子、または化合物である。抗体-メディトープ複合体、多価連結剤、または
それらを組み合わせたものにコンジュゲートさせることができる治療剤の例には、限定される訳ではないが、薬物、化学療法剤、治療用抗体および抗体フラグメント、毒物、放射性同位体、酵素（例えば腫瘍部位でプロドラッグを開裂して細胞傷害性物質とする酵素）、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、RNAi分子（例えばsiRNAまたはshRNA）、キレート剤、ホウ素化合物、光反応性物質、および色素がある。また治療剤には、金属、金属合金、金属間化合物、またはコアシェルのナノ粒子をキレート剤に結合させたものがあり、これは放射線増感剤として作用し、標的細胞の放射線治療に対する感受性を健常細胞に比較してより高くする。更に、治療剤にはMRI造影剤用
の常磁性ナノ粒子（例えばマグネタイトまたはFe3O4）があり、これを他のタイプの療法
（例えば光線力学療法および高温度療法）およびイメージング（例えば蛍光イメージング（AuおよびCdSe））と併用してもよい。
【００３５】
化学療法剤は多くの場合、細胞傷害性または細胞増殖抑制性を有し、それらには、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、ホルモン療法、標的化療法、および免疫療法がある。本開示の態様において治療剤として使用することができる化学療法剤には、限定される訳ではないが以下がある：13-cis-レ
チノイン酸、2-クロロデオキシアデノシン、5-アザシチジン、5-フルオロウラシル、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、アクチノマイシン-D、アドリアマイシン、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、オールトランスレチノイン酸、アルファインターフェロン、アルトレタミン、アメトプテリン、アミフォスチン、アナグレリド、アナストロゾール、アラビノシルシトシン、三酸化ヒ素、アムサクリン、アミノカンプトテシン、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、アザシチジン、バチルス・カルメット・ゲラン（bacillus calmette-guerin、ＢＣＧ）、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ボルテゾミブ、ブレオマイシン、ブスルファン、ロイコボリンカルシウム、シトロボラム因子、カペシタビン、カネルチニブ、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、コルチゾン、シクロホスファミド、シタラビン、ダルベポエチン・アルファ、ダサチニブ、ダウノマイシン、デシタビン、デニロイキン・ディフティトックス、デキサメタゾン、デキサゾン、デキスラゾキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ダカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキシフルリジン、エニルウラシル、エピルビシン、エポエチン・アルファ、エルロチニブ、エベロリムス、エキセメスタン、エストラムスチン、エトポシド、フィルグラスチム、フルオキシメステロン、フルベストラント、フラボピリドール、フロクス
ウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、ゴセレリン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヘキサメチルメラミン、ヒドロコルチゾン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、インターフェロン・アルファ、インターロイキン2、インターロイ
キン11、イソトレチノイン、イクサベピロン、イダルビシン、イマチニブメシレート、イホスファミド、イリノテカン、ラパチニブ、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、リポソーマルAra-C、ロムスチン、メクロレタミン、メゲストロール、
メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、メチルプレドニゾロン、マイトマイシンC、ミトタン、ミトキサントロン、ネララビン、ニルタミド、オクトレオ
チド、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、パニツムマブ、ペグインターフェロン、ペグアスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペグ-L-アスパラギナーゼ、ペントスタチン、プリカマイシン、プレドニゾロン、
プレドニゾン、プロカルバジン、ラロキシフェン、リツキシマブ、ロミプロスチム、ラリトレキセド（ralitrexed）、サパシタビン、サルグラモスチム、サトラプラチン、ソラフェニブ、スニチニブ、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テガフール、テガフール・ウラシル、テムシロリムス、テモゾロミド、テニポシド、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、トリメトレキサート、バルルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリノスタット、またはゾレドロン酸。
【００３６】
本開示の態様において治療剤として使用することができる治療用抗体およびその機能性フラグメントには、限定される訳ではないが、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エドレコロマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、パニツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、およびトラスツズマブ、そして、本明細書に記載する特定の疾病に関連する抗体がある。
【００３７】
本開示の態様において治療剤として使用することができる毒素には、限定される訳ではないが、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（RNase）、DNase I、ブドウ球菌エンテロトキシンA、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン（gelonin）、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、および緑膿菌内毒素がある。
【００３８】
本開示の態様において治療剤として使用することができる放射性同位体には、限定される訳ではないが、32P、89Sr、90Y、99mTc、99Mo、131I、153Sm、177Lu、186Re、213Bi、223Ra、および225Acがある。
【００３９】
メディトープ-mAb技術により、抗体-メディトープ複合体の作製に使用できるシステム
が可能となり、その複合体を１つまたはそれ以上のメディトープ使用可能抗体、治療剤、イメージング剤、またはそれらを組み合わせたものに更にコンジュゲートさせることができる。従って、一式のメディトープまたは高親和性メディトープ改変体（それぞれ独自の細胞傷害性物質またはイメージング剤にコンジュゲートされている）によって、所望のメディトープ・コンジュゲートおよびメディトープ使用可能mAbを共投与して治療を行うこ
とが可能となる。メディトープ・コンジュゲートは、化学修飾による特異性の低下またはペイロードの遊離のようなマイナス面を有する現行の抗体-薬剤コンジュゲートより優れ
ている。
【００４０】
このプラットフォーム技術はmAb送達分野に広範な影響を及ぼすものであり、セツキシ
マブが適応となるEGFR陽性癌、例えば結腸直腸癌、扁平上皮癌、頭頸部癌の治療および診断に有用な手段となる。更に、フレームワーク結合インターフェースを他の治療用抗体上に移植することにより、このプラットフォーム技術を、いくつかの他の癌、疾病、および他の病態（例えば前述のもの）の治療法および診断法に用いることができる。
【００４１】
治療用抗体またはその機能性フラグメントの結合親和性を向上する方法を本明細書で提供する。それらの方法には、治療的有効量の医薬組成物を好適な投与経路で被験体に投与するものがある。医薬組成物は、メディトープ使用可能抗体と組み合わせたメディトープまたはメディトープ改変体、メディトープ使用可能治療用抗体と組み合わせた多価メディトープまたはメディトープ改変体連結体、メディトープ使用可能治療用抗体またはその機能性フラグメント、医薬的に許容されるキャリア、およびそれらを任意に組み合わせたものを含んでもよい。細胞表面に結合したIgGの多価架橋によって多価メディトープの結合
親和性を向上することができる。（親マウス425抗体を介する、または抗IgGIgMを用いる
）IgGの架橋により、シグナリング、受容体エンドサイトーシスおよびリサイクリング、
そして細胞死に有意な影響が与えられる。従って、多価ペプチドは治療用モノクローナル抗体と相乗的に作用し、その治療効果を向上しうる。
【００４２】
ある態様では、メディトープ（単独で、または連結体の一部として）はシステイン、または結合部位でFabシステインに結合する他の好適なアルキル化剤を含有し、それによっ
てシステイン-システイン相互作用を形成してもよい。あるいはまた、メディトープは非
天然アミノ酸（例えばp-アセチルフェニルアラニン）でFabに結合してもよい。Cysメディトープを任意の物質にコンジュゲートさせ、そのコンジュゲートをIgGに結合させてもよ
い。
【００４３】
抗体-メディトープ複合体は、治療用抗体が標的としうる疾病または病態における特定
のタイプの細胞または細胞集団に対して治療を行うための方法に使用することができる。それらの治療法には、治療的有効量の医薬組成物を疾病または病態に罹患した被験体に好適な投与経路で投与するものがある。医薬組成物は、メディトープ使用可能抗体と組み合わせたメディトープまたはメディトープ改変体、メディトープ使用可能抗体と組み合わせた多価メディトープまたはメディトープ連結体、メディトープ使用可能治療用抗体またはその機能性フラグメントがある。
【００４４】
他の態様では、腫瘍または他の組織のイメージング法を提供する。それらの方法では、未改変治療用抗体を、対応する抗原を過剰発現する腫瘍または他の組織を標的として投与することができる。その後、イメージング剤で標識した多価メディトープ連結体を任意の投与経路で投与し、標的腫瘍または組織に結合した治療用抗体に結合させる。図８参照。イメージング剤の例として、限定される訳ではないが、放射性標識（例えば3H、14C,35S
、90Y、99mTc、125I、131I、177Lu、166Ho、および153Sm）、金属または磁気標識（例え
ば金、鉄、ガドリニウム）、ビオチン、キレート剤（例えば1,4,7,10-テトラアザシクロ
ドデカン-N,N',N'',N'''-四酢酸（「DOTA」））、または任意の上記物質がある。ある態
様では、本明細書に記載する方法で使用するイメージング剤はDOTAである。
【００４５】
上記のイメージング法または治療法には、既知の方法より優れた点がいくつかある。第１に、治療用モノクローナル抗体IgGが２価であることにより、腫瘍への選択性が向上さ
れる。以下に詳述するように、この選択性の向上はscFvおよび他のミニボディを使用すると失われ、親和性の向上では創出できないものである。第２に、標識された多価メディトープ連結体の体積は腎臓での濾過閾値未満（60kD未満、おそらくは-10kDという低さ）で
あり、このため容易に体外に排出される。一方、治療用抗体IgGをイメージング剤または
他の治療剤で直接標識することは、それが体内で長時間にわたって循環されるため、回避される。従って、腫瘍または他の疾病臓器のイメージングは、多くの場合、選択性のより低いscFvを使用して行われる。
【００４６】
更なる態様では、cQFDおよびcQYNメディトープまたはその改変体を使用し、２つまたはそれ以上の治療分子を結合させて医薬品とし、医薬組成物の一部として治療的有効量で被
験体に投与して、癌、自己免疫疾患、または他の症状の治療を行うことができる。２つまたはそれ以上の治療分子には、それに限定される訳ではないが、腫瘍または疾病特異的受容体（例えば前述のもの）を標的とする機能性抗体フラグメント（例えばF(ab')2またはFabフラグメント）、ペプチド、または他の小分子がある。治療分子は、２つまたはそれ以上の同じ治療分子であるか、または、同じ腫瘍もしくは疾病罹患組織を標的とする２つまたはそれ以上の異なる分子であってもよい。
【００４７】
ある態様では、医薬品は、特許抗体またはその一部（例えばCovX-BodyTM）の使用を含
んでもよい。例えば、メディトープをリンカーとして使用して、特異的に設計したCovX抗体の結合インターフェースまたは結合部位に２つまたはそれ以上の治療分子を結合させてもよい。CovX特異的リンカーの機能を果たすメディトープに結合する小分子、ペプチド、またはscFvは、そのフレームワーク結合インターフェース（CovX抗体の活性結合部位である）によって認識される。これらの成分が合わさって得られる２価CovX-BodyTMは、小分
子、ペプチド、またはscFvの生体作用を有しつつ、抗体の延長された半減期も保持する。
【００４８】
上記の治療用モノクローナル抗体に関する利点に加え、治療分子に連結または結合するためのリンカーとして使用されるメディトープは、合成可能であり、製造のためのコスト効率がモノクローナル抗体より優れている。例えば、多くの前臨床試験／臨床試験において２つのモノクローナル抗体の共投与が研究されるが、そのような治療の製造コストおよびマーケティングコストは法外な高さとなりうる。
【００４９】
セツキシマブFabのscFv（１本鎖Fab可変フラグメント）フォーマットのEGFRドメインIIIへの結合親和性はFab自体より実質的に低く、これは他の臨床的に興味が持たれているscFvも同様である。これは、少なくとも一部には、Fab定常ドメインの欠如（これは、Fvド
メインの配向性、構造的揺らぎに直接影響を与える）によるものであり、そしておそらくは、リンカー設計が十分でないことによるものである。
【００５０】
従って、ある態様では、scFvの安定性および親和性を向上する方法を提供する。方法は、scFvリンカーにペプチド・メディトープを導入してscFvを安定化させることを含む。これによって可変ドメインが適正な配向性となり、それによって親和性が向上する（図９）。
【００５１】
上記の態様は、１つまたはそれ以上のヒト・フレームワーク残基を対応するマウス残基で置換する（すなわち１つまたはそれ以上の点変異を導入する）ことによって、ヒトまたはヒト化抗体（例えばトラスツズマブ）に適用することができる。対応するマウス残基で置換されるヒト残基はヒト・フレームワークのFab中央の空洞内に存在しており、免疫系
に暴露されることがない（例えば、抗原とならない）。更に、抗原性予測アルゴリズムを用いて、点変異を有するヒト配列が抗原性を有さないと考えられることを示してもよい。
【００５２】
ある態様では、対応するマウス残基で置換される１つまたはそれ以上のヒト・フレームワーク残基は、軽鎖フレームワーク残基10、39-43、83、85、100、および104（Kabatナンバー）および／または重鎖フレームワーク残基40、89、111（Kabatナンバー）から選択することができる（図２参照）。ある態様では、対応するマウス残基で置換される１つまたはそれ以上のヒト・フレームワーク残基には、限定される訳ではないが軽鎖フレームワーク残基40、41、83、および85などがある。特に、ある態様では、軽鎖フレームワークPro40がThr（P40T）またはSer（P40S）で置換され、軽鎖フレームワークGly41がAsn（G41N）
で置換され、軽鎖フレームワークPhe83がIle（F83I）またはVal（F83V）で置換され、軽
鎖フレームワークThr85がAsp（T85D）またはAsn（T85N）で置換される。このヒト・モノ
クローナル抗体内にあるFab空洞部へのメディトープ部位の移植（または「マウス化（murinization）」もしは「マウス様化（mousification）」）を用いて、メディトープ結合の
ためのユニークなハンドルを作製し、前述の技術と共に使用してもよい。更に、ファーマコフォア結合モデルを作製することによって更なる点変異を作製し、メディトープの親和性を更に向上してもよい。
【００５３】
本明細書に記載する態様により、Fabフレームワーク内の新規のインターフェースが同
定およびキャラクタライズされ、Fabの抗原への結合を妨害しない、またはEGFR結合のア
ロステリックなアンタゴニストとして作用しないことが明らかとなる。更に、２つのペプチドはセツキシマブCDRに結合せず、抗原（EGFR）を模倣しない。
【００５４】
「治療的有効量」、「治療的有効濃度」、または「治療的有効用量」とは、被験体において所望の治療効果を生じる（例えば、標的病態を予防もしくは治療する、病態に伴う症状を緩和する、所望の生理学的効果を生ずる、または、疾病もしくは病態の治療につながる病態のイメージングもしくは診断を可能とする）化合物の量である。正確な治療的有効量は、所定の被験体において、治療有効性の点で最も有効な結果をもたらす組成物の量である。この量は種々の因子によって異なるが、それらの因子には、限定される訳ではないが以下がある：治療化合物の特性（活性、薬物動態、薬力学、および生物学的利用能など）、被験体の生理学的状態（年齢、性別、疾病のタイプおよびステージ、全身的な身体状態、所定の用量に対する反応性、および薬物のタイプなど）、製剤中の医薬的に許容されるキャリア（単数または複数）の性質、および投与経路。医学および薬理学分野の当業者は、慣例的な試験、すなわち、化合物の投与に対する被験体の反応性をモニタリングし、投与量を適宜調整することによって、治療的有効量を決定することができる。更なる指針は、Remington：The  Science and Practice of Pharmacy,第21版, Univ. of Sciences in Philadelphia  (USIP), Lippincott Williams & Wilkins,ペンシルバニア州フィラデルフィア（2005）を参照されたい。
【００５５】
「医薬的に許容されるキャリア」とは、医薬的に許容される物質、組成物、または媒体で、1つの組織、器官、または身体部分から別の組織、器官、または身体部分への目的化
合物の送達または輸送に関与するものをいう。例えばキャリアは、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、もしくはカプセル化材料、またはそれらを組み合わせたものであってもよい。キャリアの各成分は、製剤中の他の成分と適合性を有するという点で「医薬的に許容され」なければならない。また、遭遇しうるいずれの組織、器官、または身体部分との接触にも好適でなければならない。すなわち、その治療効果を過度に上回る毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または他の問題のリスクを伴ってはならない。
【００５６】
「投与経路」とは、当該分野で公知の任意の投与経路をいい、それらには、限定される訳ではないがエアロゾル、経腸、経鼻、眼、経口、非経口、直腸、経皮、または経膣がある。「経皮」投与は、局所クリームまたは軟膏を使用するか、または経皮パッチによって行ってもよい。「非経口」とは、一般に注射を伴う投与経路をいい、それらには眼窩下、輸液、動脈内、関節包内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、髄腔内、子宮内、静脈内、くも膜下、被膜下、皮下、経粘膜、または経気管がある。
【００５７】
本明細書で使用する「組み合わせて」または「〜と組み合わせて」とは、被験体における同じ疾病または病態を治療する過程で、２つまたはそれ以上の物質、薬剤、治療計画、治療様式、またはそれらを組み合わせたもの（例えばメディトープまたは多価連結剤と組み合わせた抗体）を任意の順序で使用することをいう。これには、同時投与（または「共投与」）、第１の薬剤の投与前または投与後に第２の薬剤を投与すること、および、第１の薬剤と第２の薬剤を最大で数日間の間隔を開けて投与することが含まれる。それらの併用療法には、任意の１つまたはそれ以上の薬剤、薬物、治療計画、または治療様式の複数回投与も含まれる。更に、２つまたはそれ以上の薬剤、薬物、治療計画、治療様式、またはそれらを組み合わせたものの投与は、同じ投与経路または異なる投与経路によって行っ
てもよい。
【００５８】
「治療用抗体」とは、癌、自己免疫疾患、移植拒絶反応、心血管疾患、または他の疾病もしくは病態（例えば本明細書に記載するもの）を治療するために使用する任意の抗体またはその機能性フラグメントをいう。本明細書に記載する態様において使用することができる治療用抗体の例として、限定される訳ではないがマウス抗体、マウス化もしくはヒト化キメラ抗体、またはヒト抗体があり、それらには、限定される訳ではないが以下がある：エルビタックス（セツキシマブ）、レオプロ（アブシキマブ）、シムレクト（バシリキシマブ）、レミカデ（Remicade）（インフリキシマブ）；オルソクローンOKT3（ムロモナブ-CD3）；リツキサン（リツキシマブ）、ベキサー（Bexxar）（トシツモマブ）、ヒュミラ（アダリムマブ）、キャンパス（アレムツズマブ）、シムレクト（バシリキシマブ）、アバスチン（ベバシズマブ）、シムジア（セルトリズマブ・ペゴル）、ゼナパックス（ダクリズマブ）、ソリリス（エクリズマブ）、ラプティヴァ（エファリズマブ）、マイロターグ（ゲムツズマブ）、ゼヴァリン（イブリツモマブ・チウキセタン）、タイサブリ（ナタリズマブ）、ゾレア（オマリズマブ）、シナジス（パリビズマブ）、ベクティビックス（パニツムマブ）、ルセンティス（ラニビズマブ）、およびハーセプチン（トラスツズマブ）。
【００５９】
病態を「治療する」または病態の「治療」とは、病態の予防、病態の発症または進行の遅延、病態の発症リスクの低減、病態に伴う症状の発症の予防もしくは遅延、病態に伴う症状の低減もしくは終息、病態の完全もしくは部分的軽減、またはそれらを組み合わせたものをいう。
【００６０】
ある態様では、新規のメディトープまたはメディトープと同様のフレームワーク結合機能性を有する小分子のスクリーニング法を提供する。それらの方法には、限定される訳ではないが以下の段階が含まれる：推定されるメディトープまたは小分子のライブラリーをメディトープ使用可能抗体と接触させ；推定されるメディトープまたは小分子がフレームワーク結合インターフェースでメディトープ使用可能抗体に結合するか否かを測定し；１つまたはそれ以上の候補となるメディトープまたはメディトープと同様のフレームワーク結合機能性を有する小分子を同定し；１つまたはそれ以上の候補の結合親和性を測定し；そして、１つまたはそれ以上の候補の結合解離定数が少なくとも0.70μMであれば、その
候補をメディトープまたはメディトープと同様のフレームワーク結合機能性を有する小分子であると同定する。更に、新規のフレームワーク結合インターフェースをスクリーニングする方法も提供し、これについては以下の実施例で更に記述する。
【００６１】
本発明について態様および実施例に関連して記載したが、当業者に認識されるように、記載および例証する本発明を、本明細書に開示する本発明の意図および範囲から逸脱することなく改変することができる。実施例は本発明の理解を促すために記載するものであり、その範囲をいかなるようにも制限することを意図せず、また制限するものと解釈されるべきではない。実施例では、慣例的な方法の詳細な説明を行っていない。それらの方法は当業者に公知であり、多くの文献に報告されている。更に、上記および下記の実施例で引用する文献は全て、参照により、本明細書に完全に記載するのと同様に、その全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００６２】
実施例１：結晶構造の決定
試料と方法
試料。セツキシマブの抗原結合フラグメント［F(ab)'］（または「Fab」）を得るため
、IgGを固定化パパイン（Pierce社）で消化し、その後、プロテインAによる逆相精製およびSuperdex75カラム（GE Healthcare社）によるサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を
行った。セツキシマブの1本鎖結合フラグメント（scFvC225）を、軽鎖および重鎖の間に20アミノ酸長のリンカーを挿入して合成した。scFvC225および可溶性上皮細胞増殖因子受
容体ドメインIII（sEGFRdIII）をSf9細胞で発現させ、過去の報告（Donaldsonら, 2009）に従って精製した。
【００６３】
過去の報告（Riemerら, 2005）でファージディスプレーから単離されたメディトープCQFDLSTRRLKC（cQFD；SEQ ID NO:1）およびCQYNLSSRALKC（cQYN；SEQ ID NO:2）を、シティ・オブ・ホープ  合成化学／高分子化学コア施設（City of Hope Synthetic and Polymer
Chemistry Core Facility）で合成、酸化、および精製した。
【００６４】
結晶化および回折データ。セツキシマブのFabフラグメント（5mg/mL）を個々のメディ
トープと1:10（モル比）で混合し、Qiagen社JCSG Core Suites（IIV）を使用し、20℃に
おいてスクリーニングを行った。2.2A以上の回折を示す共結晶が、100mMリン酸ナトリウ
ム／クエン酸（pH4.5）、2.5Mリン酸ナトリウム／カリウム、および1.6％（w/v）メソ・
エリスリトール中で形成された。結晶を14%（w/v）メソ・エリスリトールを通してウィッキングし、液体窒素中で急速冷凍した。結晶化試験と初期スクリーニングはシティ・オブ・ホープのX線施設で実施した。Stanford Synchrotron Radiation Labで回折データを得
た（ビームライン9.1および11.1）。リガンド非結合型セツキシマブ（pdb:1YY8-A鎖およ
びB鎖）（Liら, 2005）で、Phaserプログラム（McCoyら, 2007）を使用し、分子置換法によって初期位相を求めた。２つのFabを非対称単位に配置したところ、Mathews係数は3.26、溶媒含有率は62.4%であった。Zスコア（平均値に対する解の標準偏差）は、ローテショナル・サーチでは27および25、トランスレーショナル・サーチでは38および71であった。第３のFabフラグメントは配置することができなかった（非対称単位セル中のFabを３分子とすると、溶媒43％で適正なMathews係数（2.18）となる）。Coot（Emsleyら, 2004）お
よびPhenix（Adamsら, 2002）を用いて複数回反復し、手動でメディトープを密度に組み
込んだ。
【００６５】
結晶化および構造決定
セツキシマブ上のメディトープ結合部位を同定するために、Fabフラグメントを作製お
よび精製し、cQFDメディトープと1:10の割合で混合し、市販の因子（factorials）を用いて結晶形成のスクリーニングを行った。20℃で1-3日後に結晶が形成された。これらの結
晶の初期回折解析から、ユニット・セルは、既にProtein Data Bankに登録されているセ
ツキシマブFab（1YY8.pdb）（Liら, 2005）と同様であることが明らかとなり、結晶パッ
キング（例えば、CDRが除去された）から、ペプチドがCDRループに存在しないことが示唆された。しかしながら、分子置換によって構造が解明され、実験で得られたマップの解析から、メディトープと一致するモデリングされていない電子密度が同定された。初期Fo-Fcマップは、Fabフラグメントの中央部分が可能性のある結合部位であることを明示している（図１）。Fabモデルだけを用いる初期ラウンドの精密化の後、メディトープと一致す
るひと続きのモデリングされていない密度が観察された。メディトープを密度に組み込み、それに伴ってRおよびRFreeは低下した。Phenix（Adamsら, 2002）を用いた精密化の際
に、水分子を付加した。回折データおよび精密化統計値を、以下の表３に示す。
【００６６】
【表１】
2020055823.tif 000003
【００６７】
これらの知見と比較から、ファージディスプレーで同定された第2のメディトープ、cQYNに結合したセツキシマブFabの結晶を得た。前述同様、明らかなモデリングされていない電子密度が、Fabの中央部分に観察された。第1の構造を用いて、配列の相違を適宜モデリングし、複数回ラウンドの精密化を行った。両メディトープの代表的な電子密度マップを図１BおよびCに示す。
【００６８】
実施例２：メディトープはセツキシマブFabのマウス・フレームワーク領域に特異的であ
る
試料と方法
上記実施例１に記載するものに加え、以下の  試料および方法を使用した。
メディトープおよび点変異。上記のように、CQFDLSTRRLKC（cQFD；SEQ ID NO:1）およ
びCQYNLSSRALKC（cQYN；SEQ ID NO:2）の合成、酸化、および精製をシティ・オブ・ホー
プ  合成化学／高分子化学コア施設で行った。アラニン点変異をcQFDメディトープ中の残基３（Phe3をAlaに）、残基５（Leu5をAlaに）、残基８（Arg8をAlaに）、および残基１
０（Leu10をAlaに）に作製し、SMT3のC末端にこのペプチドをコードさせ、細菌を用いて
生成した（Mossessovaら, 2000）。ユビキチン様プロテアーゼ（Ulp1）をサンプルに添加してペプチドを遊離させた後、表面プラズモン共鳴（SPR）分析を行った。
【００６９】
メディトープ-Fabインターフェースのキャラクタリゼーション。SPRのアフィニティー
分析を、過去の報告（Donaldsonら, 2009；Liら, 2005）に従って実施した。簡潔に記載
すると、scFvC225またはFabC225を、アミン化学を用いてCM5チップ上に固定化した。ペプチドまたはsEGFRdIIIの親和性を20℃において平衡法によって測定し、式RU=[Rmax*[L]]/[[L]*Kd]+Roffsetに適用した。Superdex 200 10/30カラム（GE Healthcare社）を用いてSECを行った。タンパク質を混合し、室温で20分間インキュベートし、4℃でカラムに適用した。
【００７０】
MDA-MB-468細胞株を用いて、ペプチドメディトープの存在下で、セツキシマブの結合を試験した。標識したセツキシマブ（AF488。Invitrogen社）を、60μMのcQFDペプチドの存在下または非存在下、4℃で20分間添加した。標識したMOPS-21を同位体コントロールとして使用した。FACS Calibur装置（BD Biosciences社）を用いて細胞の蛍光を測定した。
【００７１】
メディトープ／Fabインターフェースの解析
本明細書で同定されたメディトープおよびFab間の結合部位のインターフェースは、IgGの4つのドメイン全てで形成される（例えば重鎖および軽鎖の可変ドメインおよび定常ド
メイン）。PISAサーバーを用いて、cQFDまたはcQYNメディトープ-Fabインターフェースの埋没した表面領域は、それぞれ904（±28）A2および787（±42）A2であり、軽鎖および重鎖に等しく分布していた。図２および４に、メディトープと接触するFabの残基およびル
ープを示す。
【００７２】
両メディトープは、セツキシマブFabと複数の水素結合および疎水性接触を成す。図２Aは、セツキシマブFab（マウスキメラIgG）、ファージディスプレー実験で同位体コントロールとして使用したヒト化モノクローナルIgG（ch14.18）、およびヒト化トラスツズマブFabの間のわずかな相違を示している。ヒト化トラスツズマブFabをセツキシマブFabに重
ね合わせることにより、cQFDメディトープのArg9はマウス軽鎖可変領域が形成するユニークな空洞に結合することが判明した。特に、マウス軽鎖可変領域のAsp85、Ile83、およびThr40は、cQFDメディトープのArg9残基への結合に重要である（図２B）。マウス・フレームワーク中のAsp85は、cQFDメディトープのArg9のグアニジニウム基と塩橋を形成する（dNE---OD1=2.8A & dNH1/2---OD2=3.0A）。また、Asp85のカルボキシル基はcQFDメディトープのLeu10のバックボーンアミドと水素結合を形成する（dOD2---HN=2.7A）。更に、軽鎖
のThr40の水素基はメディトープArg9のグアニジニウム基と水素結合を形成する（dOG1---NH1=3.1A）。ヒトFab中のPhe83のフェニル環およびPro40のピロリジン環は、Arg9の側鎖
を立体的に遮蔽する。
【００７３】
cQFDメディトープ中のArg9側鎖の選択によってマウスおよびヒトFab配列間の相違が明
らかとなったが、これだけでなく、cQYNメディトープがcQFDメディトープ中のArg9と同じ位置にアラニンをコードしており、従って、ヒトFabに結合する可能性があることが明ら
かになった。ファージライブラリーをhu14.18抗体で前処理したにも拘わらず、なぜcQYN
メディトープが選択されたのかを解明するために、cQFDおよびcQYNメディトープ間の相違およびそれらのセツキシマブFabとの相互作用を測定した。cQFDおよびcQYN構造からの重
鎖および軽鎖FabのCa原子の重ね合わせにより、各メディトープのPhe/Tyr3、Leu5、およ
びLeu10残基の疎水性側鎖がほぼ同じ場所に位置することが明らかである（図２B）。しかしながら、cQFDおよびcQYNペプチドのバックボーン・トレースはかなり逸脱する。特に、cQFDメディトープのArg8側鎖構造は伸長されており、Fab重鎖のGln111のバックボーン・
カルボニルと強力なバックボーン水素結合を形成している（dNH---0=C=2.8A）。一方、cQYNペプチドのTyr3のヒドロキシル基は立体的にArg8側鎖に干渉し（図２B)、cQYNメディトープのArg8と重鎖のAsn111間の相互作用を阻害する。この知見と一致して、cQYN複合体中の両Arg8側鎖は、電子密度マップ中で不明瞭であり、少なくとも２つの異なる回転体をとる（非対称単位中に２つのFab-メディトープ複合体が存在する）。この変化に伴って、バ
ックボーン水素結合パターンのシフトが観察された。cQFDメディトープ中のThr7のアミドカルボニルは、セツキシマブFab軽鎖中のアミドAsn41と水素結合を形成する（dNH---OC=2.7A）。この水素結合は、cQYNペプチドではAsn41バックボーンのアミドでArg8バックボーンのカルボニルにシフトする(dC=0---HN=3.0A)。
【００７４】
総合すると、cQFDおよびcQYN間の相違（例えばR8および重鎖Fab間の塩橋の喪失）およ
びcQFD中のArg9が結合するFab軽鎖中の箇所における配列の相違（例えばいずれのメディ
トープもAsp85とLeu10のアミド間の水素結合が喪失している）は、マウスキメラに結合するように選択されたメディトープが、ヒトFabフレームワークと実質的により弱い相互作
用を有し、選択の際の洗浄で除去されたことを示唆している。
【００７５】
メディトープはFabに大きなコンフォメーション変化をもたらさない
メディトープ-Fabインターフェースの位置に基づいて、メディトープがリガンド非結合型構造および／またはリガンド結合型構造に対するIgGドメインの相対配向を妨害するか
否かを確認した。まず、両メディトープ複合体の非対称単位セル内の軽鎖および重鎖を比較した後、各鎖をリガンド非結合型構造およびEGFRリガンド結合型構造と比較した。いずれのメディトープに結合した軽鎖の可変ドメインも、本質的にセツキシマブのリガンド非結合型構造と同一であった（r.m.s.d.平均：cQFD,0.231±0.014A；cQYN,0.18±0.01A）。しかしながら、重鎖の可変ドメインは、有意に高い相違性を示した（r.m.s.d.平均：cQFD,0.85±0.01A；cQYN,0.88±0.01A）。留意すべきことに、この相違は主に、フレームワーク・ループ２（残基39-46）の位置に起因するものであり、これは、このループ中の残基
を欠失させてr.m.s.d.を再計算すると、かなり低い値となるためである（cQFD,0.18±0.01A；cQYN,0.31±0.01A）（図６）。更に、このループはFab C225-EGFR共結晶構造中では
移動され、その相対B-factor値は、これがフレキシブルであることを示している（図６）。最後に、メディトープの存在は、EGFR結合型または非結合型構造関してCDR構造に有意
な変化を与えない。EGFRリガンド結合型構造の重鎖CDRループ３中のTyr101のバックボー
ンは、いずれのメディトープに結合したFab構造と比較しても反転しているが、この反転
は、リガンド非結合型セツキシマブFab構造でも観察される（Liら, 2005）。
【００７６】
メディトープ残基のインターフェースへの寄与
cQFDメディトープ-Fab複合体の構造、並びに、cQYNおよびcQFDの配列同一性に基づき、いくつかの点変異をcQFDメディトープ中に作製し（Phe3→Ala、Leu5→Ala、Arg8→Ala、
およびLeu10→Ala）、メディトープの全体的な結合親和性に対するこれらの残基の役割をキャラクタライズした。結合親和性を評価するために、標準的なアミン化学を用いてFab
フラグメントをCM5チップに結合させた。次に、合成cQFDおよびcQYNメディトープのセツ
キシマブFabに対する親和性を測定した。cQFDメディトープは950±30nMの親和性でFabに
結合し、cQYNメディトープの結合親和性は3.5±0.1μΜであった（n=3）。結合反応速度
も測定した（図３）。二分子相互作用とした場合の結合定数は、cQFDおよびcQYNでそれぞれ4.2(±0.1)x104M-1s-1および1.8(±0.1)x104M-1s-1であった。解離定数は、cQFDおよびcQYNでそれぞれ2.5(±0.1)x10-2s-1および8.6(±0.1)x10-2s-1であった。それらの測定値に基づくKD値（cQFDで430(±30)nM、およびcQYNで3.5(±0.1)μΜ）は、平衡測定とほぼ
一致する。
【００７７】
次に、各変異型cQFDメディトープの親和性を測定した。点変異型および野生型cQFDメディトープを、SMT3のC末端融合体として作製し、Ulp1で開裂した後、分析した。生物学的
に生成した野生型cQFDメディトープは合成したcQFDと同様、770nMの親和性で結合したが
、Phe3→Ala、Leu5→Ala、およびArg8→Ala変異は、Fabに対する親和性を著しく低下させた（表４）。特に、Arg8→Ala変異では、結合親和性が140倍低下した。
【００７８】
【表２】
2020055823.tif 000004
【００７９】
最後に、ヒト化治療用モノクローナル抗体、トラスツズマブのFabをCM5チップに結合させ、ヒト・フレームワークに対するcQFDおよびcQYNメディトープの親和性をキャラクタライズした。平衡測定により、いずれのメディトープの解離定数も150μMを超えることが明らかになった。
【００８０】
実施例３：セツキシマブFabはメディトープおよびEGFRに同時に結合する
試料と方法
上記実施例１および２に記載するものに加え、以下の試料および方法を使用した。
試薬。セツキシマブの１本鎖結合フラグメント（scFvC225）を、軽鎖および重鎖の間に20アミノ酸長のリンカーを挿入して合成した。ScFvC225および可溶性上皮細胞増殖因子受容体ドメインIII（sEGFRdIII）をSf9細胞中で発現させ、過去の報告（Donaldsonら, 2009）に従って精製した。
【００８１】
メディトープおよび点変異。上記のように、CQFDLSTRRLKC（cQFD；SEQ ID NO:1）およ
びCQYNLSSRALKC（cQYN；SEQ ID NO:2）の合成、酸化、および精製をシティ・オブ・ホー
プ  合成化学／高分子化学コア施設で行った。アラニン点変異をcQFDメディトープ中の残基３（Phe3をAlaに）、残基５（Leu5をAlaに）、残基８（Arg8をAlaに）、および残基１
０（Leu10をAlaに）に作製し、SMT3のC末端にこのペプチドをコードさせ、細菌を用いて
生成した（Mossessovaら, 2000）。ユビキチン様プロテアーゼ（Ulp1）をサンプルに添加してペプチドを遊離させた後、表面プラズモン共鳴（SPR）分析を行った。
【００８２】
FabへのEGFRおよびメディトープの同時結合
回折データは、これらのペプチドがワクチンとして有効であるという仮説と矛盾する。特に、原子モデルは、メディトープがCDRに直接結合しておらず、そのため、抗原エピト
ープを模倣しないことを示している。しかしながら、cQYNメディトープを接種したマウスから採取した血清は、細胞増殖を阻害した（Riemerら, 2005）。従って、メディトープが抗原結合を遮蔽するか否かを試験するために、セツキシマブFabをEGFRドメインIIIおよびcQFDと共にインキュベートし、SEC分析カラムに施与した。13.9mLにピークが観察され、
このピークの非還元SDS-PAGEにより、３つの成分全ての存在が確認された（図４B）。個
々の成分は15.2mL（Fab C225）、15.6mL（sEGFRdIII）、および16.3mL（SMT-CQFDLSTRRLKC；SEQ ID NO:1）に溶出された。
【００８３】
更に、メディトープがセツキシマブのscFvに結合しうるか否かを確認した。scFvでは、CDRループは無傷のままであるが、Fab可変ドメインは短鎖ペプチドリンカーを介して直接結合しており、Fab定常ドメインは除去されている。すなわち、scFvではメディトープ結
合ポケットが除去されており、CDRは最低限の影響しか受けていない。SPRは、EGFRドメイ
ンIIIおよびcQFDメディトープがCM5チップに連結されたセツキシマブFabに結合すること
を示している（図４B参照）。更に、EGFRドメインIIIは、第2のCM5チップに連結したscFvに、親和性をほとんど喪失せずに結合した。しかしながら、Fab結合に比較して、cQFDメ
ディトープは、100μMという高濃度でもscFvを飽和しなかった。これは、メディトープのCDRへの親和性が（あったとしても）最低限であることを示しており、結晶学的解析と一
致している。
【００８４】
メディトープはセツキシマブのEGFR発現細胞への結合に影響を与えない
FabはメディトープおよびEGFRドメインIIIへ同時に結合できるが、メディトープが完全長IgGとしてのセツキシマブのEGFR発現細胞への結合に影響を与えるか否かを確認した。
これを試験するために、FACS分析を用いて、メディトープ濃度の関数として、IgGのMDA MB-468細胞（EGFRを過剰発現する）への結合を追跡した。細胞を、漸増濃度のcQFDメディ
トープ存在下でセツキシマブと共にインキュベートした。60μMを超えるメディトープ濃
度でも、セツキシマブの細胞への結合に有意な変化は見られなかった（図５）。この知見は上記のSEC分析と一致しており、メディトープが抗原結合のアロステリック調節剤とし
て作用しないことを示している。
【００８５】
EGFRドメインIIIおよびメディトープがFabに同時に結合していることが、メディトープのKdより有意に高い濃度で明らかになっている。cQFDおよびcQYNメディトープと同様、スーパー抗原SpAおよびPpLはFabフレームワーク領域に結合し、抗原結合に影響を与えない
（Grailleら, 2000；Grailleら, 2001；Grailleら, 2002；Youngら, 1984）。
【００８６】
更に、固相に化学結合させたメディトープを用いてマウスキメラ化セツキシマブを精製することができ、これは、マウスキメラIgG、並びに、メディトープを移植したIgGの新規の精製法である。図１０参照。この精製法にはいくつかの利点がある。第1に、メディト
ープは合成が容易であり、一般的な固相（例えば磁性ビーズ）に容易に付加することができる。第２に、メディトープの親和性は点変異によって容易に調節されるため、精製工程の微調整が可能であり、激しい条件（例えば、抗体の溶出に一般的に使用される低pH）が回避される。最後に、本明細書に記載するように、メディトープを２価または多価とし（例えば後述の実施例４に記載するように）、これを使用して無傷のマウスまたはマウス化ヒトIgGを抽出することができる。また、ペプチドの使用には、プロテインAまたはプロテインLを使用する現行の精製法に優る利点がある（例えば、プロテインAまたはプロテインLの生成に伴う高コスト、ライフサイクルが限られていること、および外来の生体物質（
例えば細菌性病原体）導入の可能性）。
【００８７】
立体的遮蔽
メディトープを、マウスキメラ化またはマウス化ヒトmAbの軽鎖または重鎖N末端に、フレキシブルなリンカーを介して連結することができる（図１１）。mAbIgGのN末端は抗原
結合部位と並列しており、フレキシブル・リンカーを介するN末端からの伸長によって抗
原結合は立体的に妨害される。リンカー内に腫瘍特異的プロテアーゼ部位（例えばMMP9、MMP14、前立腺特異的抗原（PSA）セリンプロテアーゼ、または他の好適な部位）をコードさせることにより、分子内「遮蔽された」IgG構築物の立体的な制約が腫瘍部位切断され
、抗体結合が可能となる。この設計原理では、分子内「遮蔽された」IgGの正常組織への
結合が阻害され、オフターゲット結合による有害な副作用が回避される。セツキシマブ上のアビジン-ペプチド遮蔽のオフレート測定を図１２に示す。この図は、多価メディトー
プが１価メディトープより高い親和性で結合するが、遮蔽はしないことを示している。
【００８８】
実施例４：多価メディトープの作製
同じ抗原（例えばEGFR）上の独自のエピトープを認識する複数のモノクローナル（mAb
）を組み合わせることにより、細胞死が促進され、腫瘍増殖が阻害されることが明らかに
なっている。この細胞死促進の正確なメカニズムは議論されているところであるが（免疫応答vs受容体の抑制的制御vsリガンド拮抗の促進）、過去の研究から、いずれのmAbも、
細胞死を促進するためには多価（例えば完全長IgGまたはF(ab)'2）である必要があることが示唆されている。そのように、多価メディトープを、後述のように第２の抗体として代用してもよい。従って、本明細書に記載するメディトープをスキャホールドに連結させ、選択性および結合親和性を向上するための多価メディトープ作製してもよい。
【００８９】
特異性および親和性は、多くの場合、多価性によって得られる。これは、２価リガンドではΔGTotal=ΔG1+ΔG2-ΔGlinkerで表され、KTotal=K1*K2/Klinkerと等しい。リンカーが自由エネルギーに寄与しない場合（Klinker〜1）、２価標的では、２価リガンドの見かけの親和性は単量体結合定数の積である。従って、親和性を有意に増加させることができる（例えばKD=1μΜのメディトープでは、２価メディトープの親和性の「理論値」は1pM
である）。しかしながら、そのような増加が見られるのは稀であり、これは主に、２価／３価／多価受容体の幾何学的構造による。受容体の幾何学的構造によってリンカーは厳しい制約を受けるが、これによって、標的化送達の重要なゴールである特異性が保証される。
【００９０】
リンカーに対する受容体の制約に対処するため、未改変メディトープまたは最適化メディトープを多価スキャホールドに結合させることができる。これを行うために、リンカーを最適化する。腫瘍細胞は抗原密度が高いため、多価メディトープを隣接するIgGにはめ
込むように結合（latch-on）させ、「デイジーチェーン」様アレイを形成させるべきである（図８）。２価メディトープとIgGの分子内結合が可能であるが、IgGのC2対称性により、それらの相互作用ではリンカーに厳しい幾何学的制約が与えられる。３価またはそれ以上のスキャホールドにより、１つより多い抗体が「デイジーチェーン」を成すことが保証される。第３のメディトープ・アームを包含させることにより、３価メディトープの抗原結合抗体への初期接触のライフタイムが延長される。同様に、これにより、近接する抗原結合抗体に更なるアームが結合する可能性が上昇し、複合体全体が安定化される。
【００９１】
スキャホールドの合成
FITC標識した２価メディトープの合成を、（化合物２）を用い、「クリック」ケミストリーに基づいて行った（図１３）。テンプレート４および５（図１３）を使用することにより、それぞれから２価および３価メディトープの形成が可能となる。この合成はすばらしい進歩である。なぜなら、この発見は多価メディトープ調製のために開発された化学を表すものであり、最適な結合のために種々の長さのポリエチレングリコール（PEG）（ま
たは他の）リンカーの検討に重点的に取り組むことができる。合成法はまた、放射性核種イメージングのためのDOTA導入にも適している。例えば30AのPEG２価アームが、FITC標識された２価メディトープ（すなわち化合物１３）の合成で導入された（図１３）。IgG内
でのCDR領域間の距離は〜130Aである。このように、PEGリンカーの長さは体系的に多様であり、この方法は確かに最適である。市販のPEGの末端から末端までの距離は90Aであり（Pierce社）、IgGの距離より長い。
【００９２】
多価性のキャラクタリゼーション
それぞれの多価メディトープのキャラクタリゼーションをSPRおよびITCによって行い、多価スキャホールドへのコンジュゲーションがメディトープ-IgG相互作用に影響しないことを確認した。しかながらこれらの測定は、IgGが腫瘍表面に結合しないため、多価性の
測定における有効性に限界がある。これに代わって、FACS分析および細胞生存率アッセイを使用して、多価メディトープの影響をEGFRを過剰発現する細胞上で直接定量してもよい。
【００９３】
FACS分析では、EGFRを過剰発現する細胞株（MDA-MB-468およびA431）を、種々の濃度（
1nMから100nM）のセツキシマブと共にインキュベートした。次に、セツキシマブ処理した細胞を漸増濃度（0.1nMから1μM）の標識された多価メディトープと共にインキュベート
し（図１７；メディトープ-Fc）、CyAn FACSソーターを用いて結合特性を分析した。１価メディトープで観察されたよりかなり低い濃度でのシフト（図１７）および／またはシフトする細胞のパーセンテージの増加が観察される。多価メディトープで期待されるこれ以外の効果を更に確認するために、標識されていない１価メディトープを用いて、抗原が結合したセツキシマブを巡って、標識された多価メディトープと競合させてもよい。
【００９４】
細胞生存率アッセイを用いて、セツキシマブ介在型細胞死の向上の際の多価メディトープの有効性を測定することができる。簡潔に記載すると、MDA-MB-468およびA431細胞を播種し、種々の濃度のセツキシマブおよび多価メディトープで処理する。セツキシマブ単独と同じ結果を生じる１価メディトープをコントロールとして用いる。MTT（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を用いて生存細胞数を
定量してもよい。活性を示す多価メディトープは、ウエスタンブロット分析を行い、EGFR並びにEGFRシグナリング経路の一部であるAKTおよびMAPのリン酸化状態を追跡してもよい。その後、これらのデータをセツキシマブ単独処理細胞およびチロシンキナーゼ阻害剤処理細胞（AG1478）からのデータと比較する。総合すると、これによって細胞死が多価メディトープ濃度の関数として増加すると考えられる。
【００９５】
MTTアッセイ
セツキシマブと併用した場合の単量体メディトープまたは２価メディトープ-Fcの細胞
死誘導に対する効果を、MTTアッセイを用いて評価した。4000個のMDA-MB-468細胞を80μlの培養液中、96ウェルプレートの各ウェルに播種した。10μlの1μMセツキシマブを10μlの0.1、1、または10μMのメディトープまたはメディトープ-Fcと共に添加し、最終濃度を0.1μMセツキシマブ、および、0.01、0.1、および1μMメディトープまたはメディトープ-Fcとする。また、コントロールとして各成分を単独でPBSと共に添加した。48時間のイン
キュベーション後、10μlのMTT試薬を添加し、更に4時間インキュベートした。その後、
培養液上清を除去し、100μlのMTT結晶溶解液を添加し、プレートを630nmで測定した。メディトープまたはメディトープ-Fc単独では細胞増殖は有意に変更されなかったが、メデ
ィトープ-Fcだけがセツキシマブとの併用で細胞増殖を阻害した（単量体メディトープは
阻害しなかった）（図２８A）。
【００９６】
多価メディトープがセツキシマブへの添加で第２の抗EGFR抗体の効果と同様の細胞死滅促進効果を有することを示すために、セツキシマブ＋メディトープ-Fcまたはセツキシマ
ブ＋M425のいずれかによる腫瘍細胞増殖阻害効果を比較した。4000個のMDA-MB-468細胞を80μlの培養液中、96ウェルプレートの各ウェルに播種した。10μlの1μMセツキシマブを10μlの2、4、または8μMのメディトープFcまたはM425と共に添加し、最終濃度を0.1μM
セツキシマブ、および、0.2、0.4、または0.8μMメディトープ-FcまたはM425とする。コ
ントロールとしてセツキシマブをPBSと共に添加した。48時間のインキュベーション後、10μlのMTT試薬を添加し、更に4時間インキュベートした。その後、培養液上清を除去し、100μlのMTT結晶溶解液を添加し、プレートを630nmで測定した。メディトープ-Fcはセツ
キシマブの細胞死滅能の向上を示したが、M425ほどの有効性はなかった(図２８B）。
【００９７】
別の方法として、種々のスキャホールドおよびリンカーを用いて高親和性多価メディトープを作製してもよい。例えば、DNAをメディトープのスキャホールドとして使用し、よ
り柔軟性の低いスキャホールドを作製してもよい。
【００９８】
メディトープ（野生型）をIgGのFc領域のN末端に、フレキシブルなリンカーを介して融合させた（「メディトープ-Fc」）（図１５；SEQ ID NO:3-4）。メディトープ-Fcの配列
および構造をそれぞれ図１５および１６に示す。Fc領域の「２量体化」リガンドへの使用
は十分確立されている（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18215087）。この例では
グリシンおよびセリンから成る１７アミノ酸長のリンカーを選択したが、任意の好適な長さのリンカーを使用してもよい。多価性による結合の向上を証明するために、0.5x106個
のMDA-MB-468細胞を10nMのセツキシマブで、室温において30分間標識し、洗浄した後、0.1、0.3、1、および3μMの２価メディトープ-Fcまたは単量体メディトープと共に室温で３０分間インキュベートし、洗浄し、FACS分析を行った。図１７に示すように、FACS分析は、メディトープ-Fc（化学量論的に補正）がセツキシマブで前処理した細胞に有意に高い
親和性で結合することを示している。更に出願人は、この相互作用がメディトープ使用可能mAb（セツキシマブ）に特異的であることを証明する。このデータは、メディトープ-Fcとメディトープ使用可能mAbの組み合わせが相乗的であり、第２の抗体を代替できること
を示している。
【００９９】
生物学的および化学的起源の異なるスキャホールドを使用して多価性を得ることができる。これには、限定される訳ではないが、ストレプトアビジンまたはコラーゲン（http://ip.com/patapp/EP2065402A1）を用いる２価または３価スキャホールド、４価スキャホールドとしてのストレプトアビジンを用いるもの、ユニークなスキャホールド（http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283611000283）、Origami DNA（http://www.nature.com/nnano/journal/v4/n4/abs/nnano.2009.5.html）などを使用するものがある。化学スキャホールドの作製は、限定される訳ではないが以下のような分子を使用して行うことができる：DNA（１本鎖、２本鎖、ホリディ構造（Holliday junction）、アプタマーなど）、RNA（１本鎖、ヘパリン、ステム・ループ、アプタマーなど）、PNA（ペプチド核酸）、DNA/PNA２本鎖および３本鎖（柔軟性を低くするため）、ナノ粒子（直接結合
するか、またはPEGのような有機ポリマーを介して結合する）、それ自身と、および／ま
たはDNAもしくはPNAと２本鎖を形成することができる有機ポリマー。例えば図１３では、３価のメディトープの合成に成功した。図１４は、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識したメディトープダイマー７のキャラクタリゼーションを示す。
【０１００】
更に、Fcおよびメディトープの組成およびその間の距離は、親和性および特異性が最適となるように、体系的に検討することができる。ある態様では、それぞれの天然型または非天然型残基をリンカー内の任意の位置で置換して最適化を行うことができる。更に、２-100、またはそれ以上の残基間にリンカーを施与することが可能である（例えば    、現行の、および今後開発されるDNA合成装置によって作製し、メディトープおよびFc領域間
に挿入してもよい）。また、リンカーの「柔軟性を低下」させ、旋回範囲を制限してFc-
メディトープの親和性および特異性を向上してもよい。例えば、コイルドコイルドメインをメディトープおよびFc間に配してもよい（図１８）。あるいはまた、不活性なタンパク質ドメイン（例えば免疫グロブリン折りたたみ構造）をリンカーの代わりに用いてもよい。複数の免疫グロブリン折りたたみ構造を、メディトープおよびFcドメイン間に配することができる。ある態様では、リンカーの組成は、抗原性の可能性を軽減するために、ヒト由来のものであってもよい。
【０１０１】
実施例５：メディトープポケットの改変
メディトープ部位の内表面に並ぶ残基を体系的または無作為的に変更し（縮重ライブラリーおよび選択）、メディトープまたはメディトープ類似体の特異性を向上および／または変更することができる（改変方法については、例えばSheedyら 2007およびAkamatsuら 2007（参照により本明細書に組み込まれる）参照）。これらの位置を非天然アミノ酸、天然アミノ酸、またはその両方で置換し、メディトープ相互作用の親和性を向上することができる。近年、二重特異性抗体を作製するための非天然アミノ酸の抗体への導入が報告された（Hutchinsら 2001）。
【０１０２】
メディトープに接触し／空洞の内表面に並ぶ（結合したメディトープ-cQFDのいずれか
の原子から8A以内にある）残基で、体系的または無作為的に変更して水素結合、イオン相互作用、静電相互作用、または立体相互作用を介するメディトープ親和性を向上することができるものとして、１つまたはそれ以上の軽鎖残基（例えば、軽鎖のP8、V9、I10、S14、E17、Q38、R39、T40、N41、G42、S43、P44、D82、I83、A84、D85、Y86、Y87、G99、A100、G101、T102、K103、L104、E105、K107、R142、S162、V163、T164、E165、Q166、D167
、S168、もしくはY173；または重鎖のQ6、P9、R38、Q39、S40、P41、G42、K43、G44、L45、S87、D89、T90、A91、I92、Y93、Y94、W109、G110、Q111、G112、T113、L114、V115、T116、Y151、E154、P155、V156、T171、F172、P173、A174、V175、Y182、S183、もしくはL184）、またはそれらを組み合わせたものがある。更に、メディトープ結合領域中の他の
残基を変異させ、メディトープ群がこれと水和し、高親和性で結合できるようにしてもよい。例えば、軽鎖のTyr87残基、重鎖のTyr94残基、またはその両方を使用して、メディトープ類似体由来のアルデヒドまたはホウ素含有化合物と水和させてもよい。
【０１０３】
メディトープ部位の発展。メディトープは抗原結合に影響を与えず、薬物の送達、他の抗体のデイジーチェーン／架橋、または治療用抗体の効率および有効性を増加させるための他の方法に使用できることが明らかにされた。メディトープ結合部位の組成を改変し、現行のメディトープに高親和性で結合できるように、または、種々のメディトープ類似体もしくはDOTA（放射性物質送達のための）のような小分子に結合できるようにしてもよい。メディトープ結合部位の内表面に並ぶ各残基を体系的に改変、作製、およびキャラクタライズしてもよい。しかしながら、変異の数は膨大である（>206の組み合わせ、可能性としては>2016の組み合わせ）。メディトープへの結合を可能とするFab中の変異をより効率的に同定するために、各アミノ酸が所定の部位で置換されるようにして、IgGのライブラ
リーをDNAレベルで構築してもよい。最も有用な組み合わせを選択し、詳細にキャラクタ
ライズし、それを用いて更なる改変を行う。
【０１０４】
これを行う一つの方法は、目的の部位（例えば重鎖のIle90、Thr92、Leu114、およびThr116、および、軽鎖のLys103およびGlu165）に縮重オリゴを用いてDNAライブラリーを作
製し、これらの部位に20個の天然型アミノ酸全てをコードさせる。更に、GPIドメインをIgG重鎖のC末端に付加してもよい。標準的な方法によってライブラリーをトランスフェク
トし、独自のIgGを発現させてもよい。抗原結合が影響されないようにするため、蛍光標
識した抗原（例えばHer2、EGFR、IGFR、CLTA-4など）に結合する細胞をFACSでソーティングしてもよい（図２０）。その後、抗原に結合した細胞を、特定のメディトープ、メディトープ類似体、または他の目的分子（例えばDOTA）への結合について選択する。細胞をソーティングした後、PCRを用いてメディトープ／類似体／小分子結合を可能とする、また
は促進する変異を同定する。これを複数回反復し、結合を「発展／最適化」することができる。
【０１０５】
実施例６：メディトープ使用可能抗体の作製
ある態様では、メディトープ結合部位を既存の抗体および全ての今後開発される抗体、例えばIgG1-4（λおよびκアイソフォーム）、IgE、IgA1、IgA2、IgD、およびIgM上に、
他のIgG（例えばヒト、マウス、またはニワトリ）の残基の変異を介して作製することが
できる。
【０１０６】
メディトープに結合するフレームワークはユニークであり、Fab可変領域（Fv）がマウ
スであり、Fab定常領域（CH1）がヒトである。更に、このFabは成熟して（既知のIgGの配列アラインメントに基づいて）マウスまたはヒトキメラIgGには見られない残基の組み合
わせを各IgGドメイン内に生ずる。これを明らかにするために、元のメディトープが完全
長ヒト血清IgGまたは完全長マウス血清IgGに結合しないことを実証した。そのため、メディトープ結合部位を任意のフレームワーク（ヒトIgGを含む）上にマッピング（または遺
伝子操作もしくは変異）し、メディトープ結合を可能にすることができる。現行のメディ
トープ使用可能モノクローナル抗体の抗原特異性を、既存のモノクローナル抗体のCDRを
移植するによって改変してもよい（図２１）。
【０１０７】
ヒトフレームワーク配列およびセツキシマブ・フレームワーク間の配列相違をセツキシマブFabの結晶構造上にマッピングした。メディトープ部位の内表面に並ぶヒトフレーム
ワーク中の残基（トラスツズマブ-1N8Z.pdb）を、セツキシマブ中の対応する残基に変異
した。標準的な方法を用いて重鎖および軽鎖を合成し、標準的な哺乳動物発現ベクターにサブクローニングし、標準的な方法を用いて変異型IgGを精製し、Her2およびメディトー
プ結合についてキャラクタライズした。図２３Aおよび２３Cは、それぞれ重鎖（SEQ ID NO:5）および軽鎖（SEQ ID NO:8）の核酸配列を示す；図２３Bおよび２３Dに、軽鎖（SEQ ID NO:6）および重鎖（SEQ ID NO:9）の対応するアミノ酸配列をメディトープ使用可能トラスツズマブの野生型配列（SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:10）と比較して示す。
【０１０８】
抗原結合をキャラクタライズするために、標準的なプロトコルを使用して野生型トラスツズマブおよびメディトープ使用可能トラスツズマブをAlexa647で標識した。同様に、メディトープ-Fcを同じプロトコルを用いてAlexa488で標識した。メディトープ-Fcがメディトープ使用可能トラスツズマブに結合し、野生型トラスツズマブには結合しないことを示すために、Her2を過剰発現するSKBR3細胞（0.5x106）を、標識された野生型トラスツズマブまたはメディトープ使用可能トラスツズマブと共に30分間インキュベートした。未結合の抗体を洗浄し、細胞をメディトープ-Fcコンストラクトと共に30分間インキュベートし
た。抗体結合およびメディトープ結合のFACS分析を行った。「メディトープ移植」の重要な要素として、メディトープ使用可能トラスツズマブはSKBR3で発現されたHer2に結合す
ることがFACSのデータから明らかである（例えば、抗原特異性を喪失させずにメディトープ部位を抗体上に移植できる）（図２２A）。また、FACSデータから、メディトープ-Fcはメディトープ使用可能トラスツズマブに結合するが、野生型トラスツズマブには結合しないことが明らかである（図２２B）。
【０１０９】
留意されるように、メディトープ使用可能トラスツズマブの生成は、正確な定量的キャラクタリゼーションを行えるよう、より多くの物質が得られるように最適化しなくてはならず、これはみかけ上の親和性の低下（例えば、メディトープ使用可能トラスツズマブの最終濃度とAlexa647での標識が不確実であること）の要因である。同様に、抗原結合並びにメディトープ結合を最適化する標準的な方法もある（メディトープ結合部位の最適化を参照）。いずれにせよ、データから、メディトープ使用可能トラスツズマブがHer2過剰発現SKBR3細胞に結合し、メディトープ使用可能トラスツズマブで前処理した細胞はメディ
トープに結合することは明らかである。
【０１１０】
Her2CDRを移植したメディトープ使用可能抗体。CDR移植は現在、ヒト化モノクローナル抗体の作製に標準的に実施されている。メディトープ結合部位はセツキシマブ・フレームワークに独自のものである（そして、ヒト、マウス、または他のマウス-ヒトキメラ（例
えばリツキシマブ）にはない）。別の態様では、他の抗体のCDRループをセツキシマブ・
フレームワーク上に移植し、トラスツズマブのCDRループをセツキシマブ・フレームワー
ク上に移植することによってメディトープ結合を提供することができる。mAbのCDRループの「境界線」は一般に配列ホモロジー構造法によって明確に定義されているが、トラスツズマブの結晶構造をセツキシマブ上に重ね合わせ、各残基の位置を確認して、CDRループ
のコンフォメーションへの二次的影響を有しうるCDRループ外の相違の可能性を検討した
。得られた軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（例えばセツキシマブ上のトラスツズマブCDR
ループ）をDNA配列に翻訳し、それぞれをコードする遺伝子を合成した。その後、遺伝子
を残りのIgG DNA配列中にインフレームでサブクローニングし、DNAシーケンシングによって確認し、個々の発現ベクターに配した。得られた発現ベクターをNS0細胞に形質転換し
、重鎖および軽鎖を共発現させた。発現された完全長のCDR移植IgGが分泌されるので、遠
心分離によって上清を得、濃縮し、プロテインAカラムを通過させた。低pH溶液を用いてIgGを溶出し、直ちに中和した。還元条件下で完全長CDR移植IgGのSDS-PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行ったところ、軽鎖および重鎖の質量と一致する明白な2つのタ
ンパク質バンドが観察された。バンドの位置は野生型セツキシマブと同様の位置に泳動した。
【０１１１】
抗原結合をキャラクタライズするために、標準的なプロトコルを使用して、野生型トラスツズマブおよびトラスツズマブのCDRを移植したメディトープ使用可能mAbをAlexa647で標識した。前回同様、メディトープ-Fcを同じプロトコルを用いてAlexa488で標識した。
メディトープ-FcがトラスツズマブCDRを移植したメディトープ使用可能mAbに結合し、野
生型トラスツズマブには結合しないことを示すために、Her2を過剰発現するSKBR3細胞（0.5x106）を標識した野生型トラスツズマブまたはメディトープ使用可能mAbと共に30分間
インキュベートした。未結合の抗体を洗浄し、細胞をメディトープ-Fc構築物と共に30分
間インキュベートした。抗体結合およびメディトープ結合をFACSで分析した。「CDR移植
」の重要な要素として、トラスツズマブCDRを移植したメディトープ使用可能mAbはSKBR3
細胞で発現されたHer2に結合することがFACSのデータから明らかである（例えば、CDRル
ープをセツキシマブ・フレームワーク領域上に移植し、Her2に結合させることができる）（図２４A）。また、FACSデータから、メディトープ-FcはトラスツズマブのCDRを移植し
たメディトープ使用可能mAbに結合するが、野生型トラスツズマブには結合しないことが
明らかである（図２４B）。
【０１１２】
留意されるように、メディトープ使用可能トラスツズマブの生成は、正確／定量的なキャラクタリゼーションを行えるよう、より多くの物質が得られるように最適化しなくてはならず、これはみかけ上の親和性の低下（例えば、メディトープ使用可能トラスツズマブの最終濃度とAlexa647での標識が不確実であること）の要因である。当該分野で公知の抗原結合最適化のための方法があり、これをメディトープ結合に適用することができる。データはメディトープ使用可能トラスツズマブがHer2過剰発現SKBR3細胞に結合し、メディ
トープ使用可能トラスツズマブで前処理した細胞はメディトープに結合することを明らかに示している。Her2CDRを移植したメディトープ結合mAbの配列を図２５A（重鎖；SEQ ID NO:11-12）および図２５B（軽鎖；SEQ ID NO:13-14）に示す。
【０１１３】
この方法を、抗体を産生する任意の生物（限定される訳ではないが、ニワトリ、マウス、ラット、ウシ、霊長類、およびヤギ）由来の、任意の抗体（IgA、IgE、IgD、およびIgMなど）に使用することができる。一例として、IgGおよびIgEの「Fab」ドメインの配列お
よび構造アラインメント（メディトープ結合部位近傍のIgE上の残基）を示す（図２６）
。
【０１１４】
実施例７：pHの関数としてのメディトープ結合親和性
メディトープの組成を変更して、pHの関数として結合親和性に影響を与えることができる。図２７に示すように、3つの異なるメディトープ改変体の結合親和性を、バッファーpHの関数として測定した。QYDメディトープ改変体は、低pHで著しい親和性の低下を示す。QYN改変体中のアスパラギン酸をアスパラギンに置換すると、pH依存性はフラットとなる
。同様に、QFD改変体の親和性は、pHが高くなるにつれ、わずかに上昇する。総合すると
、これらの実験は、メディトープ-mAb相互作用の親和性はpHに合わせて調整できることを示している。
【０１１５】
従って、ある態様では、低pHで（例えば薬剤送達のためのリポソーム中で）特異的に遊離されるようなメディトープ改変体（または「類似体」）の改変；および低酸素環境において高度の親和性で結合するようなメディトープの改変を提供する（例えば腫瘍間質のpHは多くの場合、正常組織より低い）。
【０１１６】
前述の本発明の実施例および方法は、単に例証であって、本発明をいかなる様にも制限することを意図しない。当業者に認識されるように、前述の種々の改変は本発明の意図の範囲内にある。
【０１１７】
参考文献
下記および明細書に引用されるすべての参考文献は、すべてが本明細書に記載されているように、その全体が参照として組み込まれる。
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４ＡＢ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３ＡＢ】
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【図２３ＣＤ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月23日(2019.12.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載された発明。