(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト免疫グロブリンとラクダ科免疫グロブリンとから誘導される新規の抗体ベースの結合剤の提供。【解決手段】ＩｇＧ抗体と、２組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体と、２組の連結された第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含む四重特異性の八量体型結合剤であって、前記ＩｇＧ抗体は２つのアームを含み、各アームは、可変領域を欠いた重鎖及び可変領域を欠いた軽鎖を含み、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＧ抗体と、２組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体と、２組の連結された第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含む四重特異性の八量体型結合剤であって、
前記ＩｇＧ抗体は２つのアームを含み、各アームは、可変領域を欠いた重鎖及び可変領域を欠いた軽鎖を含み、かつ各鎖は、アミノ末端を有しており、
該抗体の各アームにつき、１組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体が、該軽鎖のアミノ末端に結合されており、かつ１組の連結された第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体が、該重鎖のアミノ末端に結合されており、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤。
【請求項２】
第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体は、それぞれ異なるエピトープに対する結合特異性を有する、請求項１に記載の結合剤。
【請求項３】
前記ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ前記ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する、請求項１に記載の結合剤。
【請求項４】
前記ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する、請求項１に記載の結合剤。
【請求項５】
前記結合剤の軽鎖は、配列番号４６に示されるアミノ酸配列（ＡＡ６／Ｅ３κ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ前記結合剤の重鎖は、配列番号４４に示されるアミノ酸配列（ＡＨ３／５Ｄ重鎖）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している、請求項１に記載の結合剤。
【請求項６】
前記配列変異体の変異アミノ酸は、前記ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置している、請求項５に記載の結合剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合剤のヒト化された変異体。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合剤のエピトープ結合断片。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合剤をコードするヌクレオチド配列又はその相補鎖を含む単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項１０】
前記軽鎖は、配列番号４７に示される核酸配列によってコードされ、かつ前記重鎖は、配列番号４５に示される核酸配列によってコードされる、請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項１１】
請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１２に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項１５】
結合剤を製造する方法であって、請求項１３に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
【請求項１６】
結合剤を製造する方法であって、請求項１４に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
【請求項１７】
ＩｇＧ抗体と、第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含む二重特異性又は四重特異性の四量体型結合剤であって、
前記ＩｇＧ抗体は２つのアームを含み、各アームは、可変領域を欠いた重鎖及び可変領域を欠いた軽鎖を含み、かつ各鎖は、アミノ末端を有しており、
該抗体の第一のアームにつき、第一のＶＨＨペプチド単量体は、該軽鎖のアミノ末端に結合されており、かつ第二のＶＨＨペプチド単量体は、該重鎖のアミノ末端に結合されており、
該抗体の第二のアームにつき、第三のＶＨＨペプチド単量体は、該軽鎖のアミノ末端に結合されており、かつ第四のＶＨＨペプチド単量体は、該重鎖のアミノ末端に結合されており、かつ、
それらのＶＨＨペプチド単量体は、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤。
【請求項１８】
前記結合剤は、二重特異性であり、ここで、第一の単量体及び第二の単量体は、異なるエピトープに対する結合特異性を有し、第一の単量体及び第三の単量体は、同一のアミノ酸配列を有し、かつ第二の単量体及び第四の単量体は、同一のアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載の結合剤。
【請求項１９】
前記ＶＨＨペプチド単量体のうち１つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ前記ＶＨＨペプチド単量体のうち１つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する、請求項１８に記載の結合剤。
【請求項２０】
前記結合剤は、四重特異性であり、ここで、前記ＶＨＨペプチド単量体の各々は、異なるエピトープに対する結合特異性を有する、請求項１７に記載の結合剤。
【請求項２１】
前記ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ前記ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する、請求項２０に記載の結合剤。
【請求項２２】
前記ＶＨＨペプチド単量体の各々は、ＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有する、請求項１７に記載の結合剤。
【請求項２３】
前記ＶＨＨペプチド単量体の各々は、ＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する、請求項１７に記載の結合剤。
【請求項２４】
前記ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する、請求項１７に記載の結合剤。
【請求項２５】
前記結合剤の軽鎖は、配列番号４０に示されるアミノ酸配列（ＡＡ６κ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ前記結合剤の重鎖は、配列番号３６に示されるアミノ酸配列（ＡＨ３重鎖）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している、請求項１７に記載の結合剤。
【請求項２６】
前記結合剤の軽鎖は、配列番号４２に示されるアミノ酸配列（Ｅ３κ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ前記結合剤の重鎖は、配列番号３８に示されるアミノ酸配列（５Ｄ重鎖）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している、請求項１７に記載の結合剤。
【請求項２７】
前記配列変異体の変異アミノ酸は、前記ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置している、請求項２５に記載の結合剤。
【請求項２８】
前記配列変異体の変異アミノ酸は、前記ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置している、請求項２６に記載の結合剤。
【請求項２９】
請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の結合剤のヒト化された変異体。
【請求項３０】
請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の結合剤のエピトープ結合断片。
【請求項３１】
請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の結合剤をコードするヌクレオチド配列又はその相補鎖を含む単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３２】
前記軽鎖は、配列番号４１に示される核酸配列（ＡＡ６κ）によってコードされ、かつ前記重鎖は、配列番号３７に示される核酸配列（ＡＨ３重鎖）によってコードされる、請求項３１に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３３】
前記軽鎖は、配列番号４３に示される核酸配列（Ｅ３κ）によってコードされ、かつ前記重鎖は、配列番号３９に示される核酸配列（５Ｄ重鎖）によってコードされる、請求項３１に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３４】
請求項３１に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項３５】
請求項３２に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項３６】
請求項３３に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項３７】
請求項３４に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項３８】
請求項３５に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項３９】
請求項３６に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項４０】
結合剤を製造する方法であって、請求項３７に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
【請求項４１】
結合剤を製造する方法であって、請求項３８に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
【請求項４２】
結合剤を製造する方法であって、請求項３９に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
【請求項４３】
抗体のＦｃドメインと、２組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含む四重特異性の八量体型結合剤であって、
前記抗体のＦｃドメインは２つのアームを含み、各アームは、抗体重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、かつ各アームは、アミノ末端を有しており、
該Ｆｃドメインの各アームにつき、１組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体が、該アームのアミノ末端に結合されており、かつ、
それらのＶＨＨペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤。
【請求項４４】
第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体は、それぞれ異なるエピトープに対する結合特異性を有する、請求項４３に記載の結合剤。
【請求項４５】
前記ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ前記ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する、請求項４３に記載の結合剤。
【請求項４６】
前記ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する、請求項４３に記載の結合剤。
【請求項４７】
前記結合剤は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列（ＡＢＡＢ−Ｆｃ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している、請求項４３に記載の結合剤。
【請求項４８】
前記配列変異体の変異アミノ酸は、前記ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置している、請求項４７に記載の結合剤。
【請求項４９】
請求項４３〜４８のいずれか一項に記載の結合剤のヒト化された変異体。
【請求項５０】
請求項４３〜４８のいずれか一項に記載の結合剤のエピトープ結合断片。
【請求項５１】
請求項４３〜４８のいずれか一項に記載の結合剤をコードするヌクレオチド配列又はその相補鎖を含む単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項５２】
前記結合剤は、配列番号２３に示される核酸配列（ＡＢＡＢ−Ｆｃ）によってコードされる、請求項５１に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項５３】
請求項５１に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項５４】
請求項５２に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項５５】
請求項５３に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項５６】
請求項５４に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項５７】
結合剤を製造する方法であって、請求項５５に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
【請求項５８】
結合剤を製造する方法であって、請求項５６に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
【請求項５９】
抗体のＦｃドメインと、２組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体とを含む二重特異性の四量体型結合剤であって、
前記抗体のＦｃドメインは２つのアームを含み、各アームは、抗体重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、かつ各アームは、アミノ末端を有しており、
該Ｆｃドメインの各アームにつき、１組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体が、該アームのアミノ末端に結合されており、かつ、
それらのＶＨＨペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤。
【請求項６０】
第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体は、同じ又は異なるエピトープに対する結合特異性を有する、請求項５９に記載の結合剤。
【請求項６１】
前記ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する、請求項５９に記載の結合剤。
【請求項６２】
前記結合剤は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列（ＡＨ３／５Ｄ−Ｆｃ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している、請求項５９に記載の結合剤。
【請求項６３】
前記結合剤は、配列番号３４に示されるアミノ酸配列（ＡＡ６／Ｅ３−Ｆｃ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該
配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している、請求項５９に記載の結合剤。
【請求項６４】
前記配列変異体の変異アミノ酸は、前記ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置している、請求項６２に記載の結合剤。
【請求項６５】
前記配列変異体の変異アミノ酸は、前記ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置している、請求項６３に記載の結合剤。
【請求項６６】
請求項５９〜６５のいずれか一項に記載の結合剤のヒト化された変異体。
【請求項６７】
請求項５９〜６５のいずれか一項に記載の結合剤のエピトープ結合断片。
【請求項６８】
請求項５９〜６５のいずれか一項に記載の結合剤をコードするヌクレオチド配列又はその相補鎖を含む単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項６９】
前記結合剤は、配列番号３３に示される核酸配列（ＡＨ３／５Ｄ−Ｆｃ）によってコードされる、請求項６８に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項７０】
前記結合剤は、配列番号３５に示される核酸配列（ＡＡ６／Ｅ３−Ｆｃ）によってコードされる、請求項６８に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項７１】
請求項６８に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項７２】
請求項６９に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項７３】
請求項７０に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項７４】
請求項７１に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項７５】
請求項７２に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項７６】
請求項７３に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項７７】
結合剤を製造する方法であって、請求項７４に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
【請求項７８】
結合剤を製造する方法であって、請求項７５に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
【請求項７９】
結合剤を製造する方法であって、請求項７６に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
【請求項８０】
少なくとも１つのＶＨＨペプチド単量体を含むＶＨＨペプチド結合剤であって、各々のＶＨＨペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）の固有のエピトープに対して結合特異性を有する、結合剤。
【請求項８１】
２つの連結されたＶＨＨペプチド単量体を含む、請求項８０に記載の結合剤。
【請求項８２】
３つの連結されたＶＨＨペプチド単量体を含む、請求項８０に記載の結合剤。
【請求項８３】
４つの連結されたＶＨＨペプチド単量体を含む、請求項８０に記載の結合剤。
【請求項８４】
前記ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ前記ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する、請求項８３に記載の結合剤。
【請求項８５】
前記ＶＨＨペプチド単量体は、ＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）、Ｅ３（配列番号３）、ＡＡ６（配列番号５）及びＡＨ３（配列番号７）からなる群から選択される、請求項８０〜８４のいずれか一項に記載の結合剤。
【請求項８６】
前記ＶＨＨペプチド単量体は、リンカー−１（配列番号９）、リンカー−２（配列番号１１）及びリンカー−３（配列番号１３）から独立して選択されるリンカーを使用して連結される、請求項８１〜８４のいずれか一項に記載の結合剤。
【請求項８７】
前記結合剤は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している、請求項８３に記載の結合剤。
【請求項８８】
前記配列変異体の変異アミノ酸は、前記ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置している、請求項８７に記載の結合剤。
【請求項８９】
請求項８０〜８４及び８７〜８８のいずれか一項に記載の結合剤のヒト化された変異体。
【請求項９０】
請求項８０〜８４及び８７〜８８のいずれか一項に記載の結合剤のエピトープ結合断片。
【請求項９１】
請求項８０〜８４及び８７〜８８のいずれか一項に記載の結合剤をコードするヌクレオチド配列又はその相補鎖を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９２】
請求項８５に記載の結合剤をコードするヌクレオチド配列又はその相補鎖を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９３】
請求項８６に記載の結合剤をコードするヌクレオチド配列又はその相補鎖を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９４】
請求項９１に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項９５】
請求項９２に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項９６】
請求項９３に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項９７】
請求項９４に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項９８】
請求項９５に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項９９】
請求項９６に記載の発現ベクターを含む単離された細胞。
【請求項１００】
結合剤を製造する方法であって、請求項９７に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
【請求項１０１】
結合剤を製造する方法であって、請求項９８に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
【請求項１０２】
結合剤を製造する方法であって、請求項９９に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
【請求項１０３】
請求項１〜８、１７〜３０、４３〜５０、５９〜６７及び８０〜９０のいずれか一項に記載の結合剤と、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬製剤。
【請求項１０４】
被験体におけるＣ．ディフィシルによって誘発された疾患症状を治療又は予防する方法であって、治療的有効量の１種以上の請求項１〜８、１７〜３０、４３〜５０、５９〜６７及び８０〜９０のいずれか一項に記載の結合剤を、Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１０５】
Ｃ．ディフィシルにより感染された被験体におけるＣ．ディフィシルのトキシンＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢを中和する方法であって、治療的有効量の１種以上の請求項１〜８、１７〜３０、４３〜５０、５９〜６７及び８０〜９０のいずれか一項に記載の結合剤を、Ｃ．ディフィシル感染症を伴う被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１０６】
被験体におけるＣ．ディフィシル感染症を治療又は予防する方法であって、治療的有効量の１種以上の請求項１〜８、１７〜３０、４３〜５０、５９〜６７及び８０〜９０のいずれか一項に記載の結合剤を、Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１０７】
前記中和は、部分的又は完全な中和である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０８】
治療的有効量の抗生物質を前記被験体に投与することを更に含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記結合剤は、該結合剤及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬製剤において存在する、請求項１０４〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記結合剤の治療的有効量は、前記被験体の体重当たりの結合剤量として１０μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの間である、請求項１０４〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記結合剤を、前記被験体へと経口で、非経口で、又は直腸内で投与する、請求項１０４〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載］
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＤＫ０８４５０９による政府の支援を受けてなされたものである。合衆国政府は本発明における一定の権利を有し得る。
【０００２】
［配列表］
電子形式（ＡＳＣＩＩテキストファイル）の配列表は、本出願と同時に提出され、引用することにより本明細書の一部をなす。ＡＳＣＩＩテキストファイルのファイル名は、「２０１６＿００４５Ａ＿ＳＴ２５」であり、そのファイルは、２０１６年２月５日に作成されたものであり、ファイルサイズは１０８ＫＢである。
【背景技術】
【０００３】
細菌のクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）は、院内抗生物質
関連下痢症の最も一般的な原因であるだけでなく、偽膜性腸炎の病原体である。アメリカ合衆国では、年間５００，０００件を超えるＣ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＩ）が発生していると見積もられており、その年間死亡率は、菌株に依存して約３％〜１７％の範囲である。
【０００４】
ＣＤＩ患者の治療のために利用することができる選択肢は限られており、再発率は高い（患者の２０％〜３５％）。再発患者におけるＣＤＩの更なる症状の発現（episodes：エピソード）のリスクは、５０％を上回ることがあり、それらの患者の一部は、何度も再発を繰り返すこととなる。再発性ＣＤＩは、同じ菌株又は異なる菌株によって引き起こされることがある。強毒性で抗生物質耐性の菌株の出現により、Ｃ．ディフィシル感染症を伴う患者における死亡発生率は、急速に高まっている。
【０００５】
標準的な療法には、抗生物質治療（バンコマイシン及びメトロニダゾール）が含まれるが、それは、十分に効果的であるとは言えず、腸内微生物叢に破壊的な作用をもたらし、何度も再燃を引き起こす。その他の介入（例えば、プロバイオティクス、トキシン吸収性ポリマー及びトキソイドワクチン）が試みられたが、予防戦略も治療戦略も、この感染症の発生率及び重症度の増加に追いついていない。
【０００６】
より新しい免疫ベースの療法は、臨床試験にて或る程度効果があることが裏付けられており、それには、重症ＣＤＩに対する免疫グロブリン静注（ＩＶＩＧ）及び再発性ＣＤＩに対するヒトモノクローナル抗体が含まれる。スペクトルが狭い大環状抗生物質であるフィダキソマイシンは、ＣＤＩに対する経口バンコマイシンと類似した効果を示したが、再燃率の低下についてはかなり良くなっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＣＤＩは、治療することが困難な苛立たしい状態であり、何ヶ月にもわたって、それどころか何年にもわたって患者を冒すため、甚大な罹患率及び死亡率が引き起こされることがある。したがって、原発性ＣＤＩ及び再発性ＣＤＩの両方に関する新たな治療並びにＣＤＩを発症するリスクのある被験体に関する予防が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
Ｃ．ディフィシル関連疾患は、主に、該細菌によって産生された２種の大きな外毒素、すなわちトキシンＡ（ＴｃｄＡ）及びトキシンＢ（ＴｃｄＢ）によって引き起こされる。これらのトキシンは、構造的に類似した、宿主細胞に類似の作用機序を示す３００ｋＤａの単鎖タンパク質である。両者のトキシンとも宿主のＲｈｏ  ＧＴＰアーゼを標的とし、酵素不活性化に続いて、細胞骨格崩壊及びアポトーシスを起こす。腸上皮細胞において、ＴｃｄＡは、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼのグルコシル化を触媒し、細胞の完全な円形化のような形態変化を伴ってアクチン細胞骨格の再構築が起こり、そして腸管バリア機能が破壊される。それらのトキシンは、動物において個別にＣＤＩを引き起こすことができ、当該細菌のＴｃｄＡ−  ＴｃｄＢ−菌株は無毒性である。
【０００９】
それらのトキシンに対する全身性抗体及び粘膜性抗体は、ＣＤＩに対する防御を与える。ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢは、Ｃ．ディフィシルにとっての必須の病原性因子であるため、両者のトキシンに対して産生された抗体は、動物モデルにおける毒素産生Ｃ．ディフィシル感染症の治療及びそれに対する防御を可能にする。
【００１０】
本発明は、ＣＤＩ及びＣＤＩの症状の治療及び予防のための抗ＴｃｄＡ抗体及び抗ＴｃｄＢ抗体に関する既存の知識を基礎とするものである。本明細書では、ヒト免疫グロブリンとラクダ科免疫グロブリンとから誘導される新規の抗体ベースの結合剤が提供される。これらの結合剤は、Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢを認識してそれらに特異的に結合する。これらの結合剤の一部は、トキシン中和活性を示す。これらの結合剤は、原発性ＣＤＩ及び再発性ＣＤＩ並びに原発性ＣＤＩ及び再発性ＣＤＩの症状を治療又は予防するために使用することができる。
【００１１】
以下で詳細に論じられるように、ラクダ科動物は、軽鎖を欠いた、つまりは重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）である機能的な免疫グロブリンのクラスを産生する。ＶＨＨと呼ばれるＨＣＡｂのＶＨドメインは、通常のヒトＶＨドメインと類似しているが、固有の配列及び構造的特徴を有している。このドメインをコードするＤＮＡは、簡単にクローニングすることができ、そして微生物中で発現させることで、元となるＨＣＡｂの抗原結合特性を維持した可溶性タンパク質単量体を得ることができる。これらのＶＨＨペプチド単量体型の結合剤は、小さく（〜１５ｋＤａ）、製造しやすく、かつ一般的に従来の抗体フラグメントと比べてより安定である。該結合剤は、ヒト抗体、例えばＩｇＧ、及び、ヒト抗体のフラグメント、例えばＦｃドメイン、との融合タンパク質として製造することもできる。
【００１２】
したがって、本発明の結合剤には、単純なＶＨＨペプチド単量体及び連結されたＶＨＨペプチド単量体の群（２つ、３つ、４つ又はそれより多くの単量体を含む）、並びに抗体のＦｃドメインに結合されたＶＨＨペプチド単量体を含むより複雑な結合剤、並びに部分ＩｇＧ抗体又は完全ＩｇＧ抗体に結合されたＶＨＨペプチド単量体が含まれる。
【００１３】
第一の実施の形態においては、本発明は、ＶＨＨペプチド単量体を含む結合剤、及び２つ、３つ、４つ又はそれより多くの単量体を含む連結されたＶＨＨペプチド単量体の群を含む結合剤であって、該単量体の各々がＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに、好ましくは特異的に結合する、結合剤に関する。このように、本発明は、少なくとも１つのＶＨＨペプチド単量体を含むＶＨＨペプチド結合剤であって、各々のＶＨＨペプチド単量体が、Ｃ．ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）の固有のエピトープに対して結合特異性を有する、結合剤を包含する。或る特定の態様において、これらの結合剤は、２つ、３つ、４つ又はそれより多くの連結されたＶＨＨペプチド単量体を含む。ＶＨＨペプチド単量体には、限定されるものではないが、ＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）、Ｅ３（配列番号３）、ＡＡ６（配列番号５）及びＡＨ３（配列番号７）が含まれる。
【００１４】
２つ以上の単量体が連結されている上記実施の形態の態様においては、それらの単量体は、一般的に１０個から２０個の間のアミノ酸を含むフレキシブルなペプチドリンカーによって連結され得る。適切なリンカーには、限定されるものではないが、リンカー−１（配列番号９）、リンカー−２（配列番号１１）及びリンカー−３（配列番号１３）が含まれる。
【００１５】
上記実施の形態の或る特定の態様においては、結合剤は、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに特異的に結合する。上記実施の形態の或る特定の態様においては、結合剤は、ＴｃｄＡ中和活性及び／又はＴｃｄＢ中和活性を示す。
【００１６】
上記実施の形態の具体的な一態様においては、結合剤は、連結された４つのＶＨＨペプチド単量体を含み、該単量体のうち２つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ該単量体のうち２つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する。ＴｃｄＡのエピトープは、同一又は異なってよい。ＴｃｄＢのエピトープは、同一又は異なってよい。
【００１７】
上記実施の形態の具体的な一態様においては、結合剤は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体（sequence variant）を含み、該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又はトキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している。幾つかの場合に、配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置している。
【００１８】
第二の実施の形態においては、本発明は、ＩｇＧ抗体に結合されたＶＨＨペプチド単量体を含む結合剤であって、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに結合する、結合剤に関する。これらのＩｇＧベースの結合剤においては、ＩｇＧ抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域が、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれより多くのＶＨＨペプチド単量体によって置き換えられている。
【００１９】
上記実施の形態の或る特定の態様においては、これらの結合剤は、ＩｇＧの軽鎖及び重鎖のアミノ末端に可変領域の代わりに結合された２つ、３つ、４つ又はそれより多くの連結されたＶＨＨペプチド単量体を含む。ＶＨＨペプチド単量体には、限定されるものではないが、ＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）、Ｅ３（配列番号３）、ＡＡ６（配列番号５）及びＡＨ３（配列番号７）が含まれる。
【００２０】
２つ以上の単量体が連結されている上記実施の形態の態様においては、それらの単量体は、一般的に１０個から２０個の間のアミノ酸を含むフレキシブルなペプチドリンカーによって連結され得る。適切なリンカーには、限定されるものではないが、リンカー−１（配列番号９）、リンカー−２（配列番号１１）及びリンカー−３（配列番号１３）が含まれる。
【００２１】
第一の下位実施の形態においては、本発明は、ＩｇＧ抗体と、２組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体と、２組の連結された第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含む四重特異性の八量体型結合剤であって、上記ＩｇＧ抗体は２つのアームを含み、各アームは、可変領域を欠いた重鎖及び可変領域を欠いた軽鎖を含み、かつ各鎖は、アミノ末端を有しており、該抗体の各アームにつき、１組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体が、該軽鎖のアミノ末端に結合されており、かつ１組の連結された第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体が、該重鎖のアミノ末端に結合されており、か
つそれらのＶＨＨペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤に関する。この結合剤は、４種の異なるトキシンのエピトープを認識するため、「四重特異性」と呼ばれる。この結合剤は、８つのＶＨＨペプチド単量体（同じ第一の単量体を２つ、同じ第二の単量体を２つ、同じ第三の単量体を２つ及び同じ第四の単量体を２つ）を有するため、「八量体型」と呼ばれる。
【００２２】
上記の下位実施の形態においては、第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体は、それぞれ異なるエピトープに対する結合特異性を有する。
【００２３】
上記の下位実施の形態の或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する。
【００２４】
上記の下位実施の形態の或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する。
【００２５】
上記の下位実施の形態の特定の態様において、結合剤の軽（κ）鎖は、配列番号４６に示されるアミノ酸配列（ＡＡ６／Ｅ３κ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ結合剤の重鎖は、配列番号４４に示されるアミノ酸配列（ＡＨ３／５Ｄ重鎖）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含む。この結合剤が、ＩｇＧベースの結合剤である場合には、示されたアミノ酸配列を有する２つの重鎖ポリペプチド及び２つの軽鎖ポリペプチドが、ジスルフィド結合を通じて集合されて、完全な結合剤が提供されることは、当業者に明らかであろう。配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置してよい。
【００２６】
第二の下位実施の形態においては、本発明は、ＩｇＧ抗体と、第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含む二重特異性又は四重特異性の四量体型結合剤であって、上記ＩｇＧ抗体は２つのアームを含み、各アームは、可変領域を欠いた重鎖及び可変領域を欠いた軽鎖を含み、かつ各鎖は、アミノ末端を有しており、該抗体の第一のアームにつき、第一のＶＨＨペプチド単量体は、該軽鎖のアミノ末端に結合されており、かつ第二のＶＨＨペプチド単量体は、該重鎖のアミノ末端に結合されており、該抗体の第二のアームにつき、第三のＶＨＨペプチド単量体は、該軽鎖のアミノ末端に結合されており、かつ第四のＶＨＨペプチド単量体は、該重鎖のアミノ末端に結合されており、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体は、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤に関する。結合剤が「四重特異性」である場合に、該結合剤は、４種の異なるトキシンのエピトープを認識し、「二重特異性」の場合には、該結合剤は、２種の異なるトキシンのエピトープを認識する。結合剤は、それらが４つのＶＨＨペプチド単量体を有する場合には「四量体型」である（二重特異性の場合に、第一の単量体及び第三の単量体は同じ配列を有し、同じエピトープに結合し、かつ第二の単量体及び第四の単量体は同じ配列を有し、同じエピトープに結合する；四重特異性の場合に、各々の単量体は異なる配列を有し、異なるエピトープに結合する）。
【００２７】
結合剤が二重特異性である場合、第一の単量体及び第二の単量体は、異なるエピトープに対する結合特異性を有し、第一の単量体及び第三の単量体は、同一のアミノ酸配列を有し、かつ第二の単量体及び第四の単量体は、同一のアミノ酸配列を有する。ＶＨＨペプチド単量体のうち１つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有することができ、かつＶＨＨペプチド単量体のうち１つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有することができる。
【００２８】
結合剤が四重特異性である場合、ＶＨＨペプチド単量体の各々は、異なるエピトープに対する結合特異性を有する。ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有することができ、かつＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有することができる。
【００２９】
上記の下位実施の形態の或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体の各々は、ＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有する。
【００３０】
上記の下位実施の形態の或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体の各々は、ＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する。
【００３１】
上記の下位実施の形態の或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する。
【００３２】
上記の下位実施の形態の特定の態様において、結合剤の軽（κ）鎖は、配列番号４０に示されるアミノ酸配列（ＡＡ６κ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ結合剤の重鎖は、配列番号３６に示されるアミノ酸配列（ＡＨ３重鎖）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含む。この結合剤が、ＩｇＧベースの結合剤である場合には、示されたアミノ酸配列を有する２つの重鎖ポリペプチド及び２つの軽鎖ポリペプチドが、ジスルフィド結合を通じて集合されて、完全な結合剤が提供されることは、当業者に明らかであろう。配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置してよい。
【００３３】
上記の下位実施の形態の別の特定の態様において、結合剤の軽（κ）鎖は、配列番号４２に示されるアミノ酸配列（Ｅ３κ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ結合剤の重鎖は、配列番号３８に示されるアミノ酸配列（５Ｄ重鎖）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含む。この結合剤が、ＩｇＧベースの結合剤である場合には、示されたアミノ酸配列を有する２つの重鎖ポリペプチド及び２つの軽鎖ポリペプチドが、ジスルフィド結合を通じて集合されて、完全な結合剤が提供されることは、当業者に明らかであろう。配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置してよい。
【００３４】
上記の実施の形態及び下位実施の形態の或る特定の態様においては、結合剤は、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに特異的に結合する。上記実施の形態の或る特定の態様においては、結合剤は、ＴｃｄＡ中和活性及び／又はＴｃｄＢ中和活性を示す。
【００３５】
第三の実施の形態においては、本発明は、抗体のＦｃドメインに結合されたＶＨＨペプ
チド単量体を含む結合剤であって、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに結合する、結合剤に関する。これらのＦｃドメインベースの結合剤においては、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれより多くのＶＨＨペプチド単量体が、抗体重鎖のＦｃドメインの各アームのヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域に結合されている。したがって、ペプチド単量体は、抗体のＦａｂ領域と置き換えられている。
【００３６】
上記実施の形態の或る特定の態様においては、これらの結合剤は、Ｆｃドメインのアームのアミノ末端に結合された２つ、３つ、４つ又はそれより多くの連結されたＶＨＨペプチド単量体を含む。ＶＨＨペプチド単量体には、限定されるものではないが、ＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）、Ｅ３（配列番号３）、ＡＡ６（配列番号５）及びＡＨ３（配列番号７）が含まれる。
【００３７】
２つ以上の単量体が連結されている上記実施の形態の態様においては、それらの単量体は、一般的に１０個から２０個の間のアミノ酸を含むフレキシブルなペプチドリンカーによって連結され得る。適切なリンカーには、限定されるものではないが、リンカー−１（配列番号９）、リンカー−２（配列番号１１）及びリンカー−３（配列番号１３）が含まれる。
【００３８】
第一の下位実施の形態においては、本発明は、抗体のＦｃドメインと、２組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含む四重特異性の八量体型結合剤であって、上記抗体のＦｃドメインは２つのアームを含み、各アームは抗体重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、かつ各アームはアミノ末端を有しており、該Ｆｃドメインの各アームにつき、１組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体が、該アームのアミノ末端に結合されており、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤に関する。この結合剤は、４種の異なるトキシンのエピトープを認識するため、「四重特異性」と呼ばれる。この結合剤は、８つのＶＨＨペプチド単量体（同じ第一の単量体を２つ、同じ第二の単量体を２つ、同じ第三の単量体を２つ及び同じ第四の単量体を２つ）を有するため、「八量体型」と呼ばれる。
【００３９】
上記の下位実施の形態の或る特定の態様において、第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体は、それぞれ異なるエピトープに対する結合特異性を有する。
【００４０】
上記の下位実施の形態の或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する。
【００４１】
上記の下位実施の形態の或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する。
【００４２】
上記の下位実施の形態の特定の態様において、結合剤は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列（ＡＢＡＢ−Ｆｃ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している。この結合剤が、Ｆｃドメインベースの結合剤である場合
に、示されたアミノ酸配列を有する２つの同一のポリペプチドが、該結合剤のアームとして機能すること、及び該アームが、ジスルフィド結合を通じて集合されて、完全な結合剤が得られることは、当業者には明らかであろう。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置してよい。
【００４３】
第二の下位実施の形態においては、本発明は、抗体のＦｃドメインと、２組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体とを含む二重特異性の四量体型結合剤であって、上記抗体のＦｃドメインは２つのアームを含み、各アームは抗体重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、かつ各アームはアミノ末端を有しており、該Ｆｃドメインの各アームにつき、１組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体は、該アームのアミノ末端に結合されており、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤に関する。この結合剤は、２種の異なるトキシンのエピトープを認識するため、「二重特異性」と呼ばれる。この結合剤は、４つのＶＨＨペプチド単量体（同じ第一の単量体を２つ及び同じ第二の単量体を２つ）を有するため、「四量体型」と呼ばれる。
【００４４】
上記の下位実施の形態の或る特定の態様において、第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体は、同じ又は異なるエピトープに対する結合特異性を有する。
【００４５】
上記の下位実施の形態の或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する。
【００４６】
上記の下位実施の形態の特定の態様において、結合剤は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列（ＡＨ３／５Ｄ−Ｆｃ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している。この結合剤が、Ｆｃドメインベースの結合剤である場合に、示されたアミノ酸配列を有する２つの同一のポリペプチドが、該結合剤のアームとして機能すること、及び該アームが、ジスルフィド結合を通じて集合されて、完全な結合剤が得られることは、当業者には明らかであろう。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置してよい。
【００４７】
上記の下位実施の形態の別の特定の態様において、結合剤は、配列番号３４に示されるアミノ酸配列（ＡＡ６／Ｅ３−Ｆｃ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している。この結合剤が、Ｆｃドメインベースの結合剤である場合に、示されたアミノ酸配列を有する２つの同一のポリペプチドが、該結合剤のアームとして機能すること、及び該アームが、ジスルフィド結合を通じて集合されて、完全な結合剤が得られることは、当業者には明らかであろう。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置してよい。
【００４８】
上記の実施の形態及び下位実施の形態の或る特定の態様においては、結合剤は、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに特異的に結合する。上記実施の形態の或る特定の態様においては、結合剤は、ＴｃｄＡ中和活性及び／又はＴｃｄＢ中和活性を示す。
【００４９】
本発明には、本明細書で定義される様々な実施の形態及び態様において規定される各々
の結合剤のヒト化された変異体が含まれる。同様に、本発明には、本明細書で定義される様々な実施の形態及び態様において規定される各々の結合剤のエピトープ結合断片が含まれる。
【００５０】
本発明には、１種以上の本明細書で定義される結合剤及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬製剤が含まれる。
【００５１】
本発明には、本明細書で定義される様々な実施の形態及び態様において規定される各々の結合剤をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド並びにそれらの相補鎖が含まれる。また本発明には、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び該発現ベクターを含む宿主細胞も含まれる。さらに、本発明には、本明細書で定義される結合剤を製造する方法であって、宿主細胞を、発現ベクターによってコードされる結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法が含まれる。
【００５２】
第四の実施の形態においては、本発明は、被験体におけるＣ．ディフィシルによって誘発された疾患症状を治療又は予防する方法であって、治療的有効量の１種以上の本明細書で定義される結合剤を、Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む、方法に関する。
【００５３】
第五の実施の形態においては、本発明は、Ｃ．ディフィシルによって感染された被験体におけるＣ．ディフィシルのトキシンＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢを中和する方法であって、治療的有効量の１種以上の本明細書で定義される結合剤を、Ｃ．ディフィシル感染症を伴う被験体に投与することを含む、方法に関する。
【００５４】
第六の実施の形態においては、本発明は、被験体におけるＣ．ディフィシル感染症を治療又は予防する方法であって、治療的有効量の１種以上の本明細書で定義される結合剤を、Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む、方法に関する。
【００５５】
第六の実施の形態の或る特定の態様においては、該方法は、治療的有効量の抗生物質を被験体に投与することを更に含む。
【００５６】
これらの方法の或る特定の態様においては、結合剤は、該結合剤及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬製剤において存在する。
【００５７】
これらの方法の或る特定の態様においては、結合剤の治療的有効量は、被験体の体重当たりの結合剤量として１０μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの間である。
【００５８】
これらの方法の或る特定の態様においては、結合剤は、被験体へと経口で、非経口で、又は直腸内で投与される。
【００５９】
上記は、以下の本発明の詳細な説明をよりよく理解することができるように本発明の特徴及び技術的な利点を幅広く概説した。本発明の追加の特徴及び利点が本明細書に記載され、本発明の特許請求の範囲の主題をなす。本明細書に開示される任意の概念及び具体的な実施形態は、本発明の同じ目的を実施するため他の構造を修飾又は設計するための基礎として容易に利用可能であることが、当業者に理解される。また、かかる等価な構築物は、添付の特許請求の範囲に述べられる本発明の趣旨及び範囲から逸脱しないことが、当業者によって明確に理解されなければならない。本発明の構成及び操作方法の両方について、本発明の特性と考えられる新規な特徴は、更なる目的及び利点と共に、添付の図面と組
み合せて考慮される場合に以下の記載からより良く理解されるであろう。しかしながら、あらゆる記載、図面、実施例等が解説及び説明の目的に対してのみ提供され、本発明の限定を定義することは何ら意図されないことが明確に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】Ｃ．ディフィシルのトキシンＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの、各トキシンのグルコシルトランスフェラーゼドメイン（ＧＴ）、システインプロテアーゼドメイン（ＣＰＤ）、移行ドメイン（ＴＤ）及び受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を示す図である。異なるトキシンドメインを認識してそれらに結合するＶＨＨが示されている。下線を引いたＶＨＨは、トキシン中和活性を有するものである。
【図２】単量体又は二量体のＶＨＨは強力な中和活性を有する。ＶＨＨはＴｃｄＡ（図２のＡ）又はＴｃｄＢ（図２のＢ）によって誘発される細胞円形化をｎＭ濃度で阻止する。（図２のＣ）ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢに対する２つのヘテロ二量体の図である。Ｎ末端にあるＨｉｓ（６）タグが精製を容易にし、フレキシブルなスペーサー（ＦＳ）が、２つのＶＨＨを隔てている。（図２のＤ）二量体５Ｄ／Ｅ３は、２種のＶＨＨの単純な混合物に対してその中和活性を少なくとも１０倍高める。ヘテロ二量体は、ＴｃｄＢ（図２のＥ）又はＴｃｄＡ（図２のＦ）による致死的な腹腔内負荷からマウスを十分に防御した。
【図３】ＡＢＡＢの図である。Ｈｉｓ−タグ及びＥ−タグは、それぞれ精製及び検出のためのエピトープタグである。ＦＳ：フレキシブルなリンカー；ＡＢＰ：アルブミン結合ペプチド。
【図４Ａ】ＡＢＡＢは、Ｃ．ディフィシルの芽胞（図４Ａ）及びトキシン（図４Ｂ）の負荷からマウスを防御するにあたって非常に強力である。ＭＫ  ＨｕＭａｂｓ：臨床試験中のMerck社の抗ＴｃｄＡヒトモノクローナル抗体及び抗ＴｃｄＢヒトモノクローナル抗体の混合物。
【図４Ｂ】ＡＢＡＢは、Ｃ．ディフィシルの芽胞（図４Ａ）及びトキシン（図４Ｂ）の負荷からマウスを防御するにあたって非常に強力である。ＭＫ  ＨｕＭａｂｓ：臨床試験中のMerck社の抗ＴｃｄＡヒトモノクローナル抗体及び抗ＴｃｄＢヒトモノクローナル抗体の混合物。
【図５】両方のトキシンに対する抗トキシン血清は、マウスをＣＤＩから防御する。マウスに、Ｃ．ディフィシルの芽胞（ＵＫ１菌株、１０６芽胞／マウス）の接種前に４時間にわたって、ＴｃｄＡに対するアルパカ抗血清（「Ａｎｔｉ−Ａ」）５０μｌ、ＴｃｄＢに対するアルパカ抗血清（「Ａｎｔｉ−Ｂ」）５０μｌ、ＴｃｄＡ＋ＴｃｄＢに対するアルパカ抗血清（「Ａｎｔｉ−Ａ＋Ａｎｔｉ−Ｂ」）５０μｌ、又は免疫前血清（presera）若しくはＰＢＳ（「ＣＴＲ」）１００μｌを腹腔内注射した。マウス生存率（図５のＡ；Ａｎｔｉ−Ａ＋Ａｎｔｉ−Ｂ対ＰＢＳ、ｐ＝０．００６）及び体重減少率（図５のＢ）が図説されている（＊、Ａｎｔｉ−Ａ＋Ａｎｔｉ−Ｂと対照との間でｐ＜０．０５）。
【図６】本発明の結合剤の作製戦略の図である。
【図７】細胞培養物からのＡＢＡＢ−Ｆｃ（「Ｆｃ−ＡＢＢＡ」）の分画及び精製を示す図である。
【図８】ＡＢＡＢ分子及びＡＢＡＢ−ＩｇＧ分子の図である。
【図９】ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１を発現するＨＥＫ２９３細胞からの細胞上清の分画を示す図である。ピークは、プロテインＡビーズから溶出されたＡＢＡＢ−ＩｇＧ１のＵＶ  ＯＤ指示値を示している。
【図１０】精製されたＡＢＡＢ−ＩｇＧ１（「ＩｇＧ−ＡＢＢＡ」及び「Ｈａｂａｂ」）の還元電気泳動及び非還元電気泳動のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図１１Ａ】個々のＶＨＨのそれぞれのトキシンに対する結合と比較した、ＡＢＡＢ−ＩｇＧのＴｃｄＡに対する結合のＥＬＩＳＡ分析を示す図である。
【図１１Ｂ】個々のＶＨＨのそれぞれのトキシンに対する結合と比較した、ＡＢＡＢ−ＩｇＧのＴｃｄＢに対する結合のＥＬＩＳＡ分析を示す図である。
【図１２Ａ】四重特異性の抗体ＩｇＧ−ＡＢＡＢのＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方に対する同時結合のサンドウィッチＥＬＩＳＡ分析を示す図である。図１２Ａは、ＴｃｄＡ（ＴｘＡ）に引き続き、ＴｃｄＢ（ＴｘＢ）でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに添加された連続希釈されたＡＢＡＢ−ＩｇＧを示している。
【図１２Ｂ】四重特異性の抗体ＩｇＧ−ＡＢＡＢのＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方に対する同時結合のサンドウィッチＥＬＩＳＡ分析を示す図である。図１２Ｂは、ＴｃｄＢ（ＴｘＢ）に引き続き、ＴｃｄＡ（ＴｘＡ）でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに添加された連続希釈されたＡＢＡＢ−ＩｇＧを示している。
【図１３Ａ】ＡＢＡＢ−ＩｇＧのＴｃｄＡに対する中和活性を示す図である。
【図１３Ｂ】ＡＢＡＢ−ＩｇＧのＴｃｄＢに対する中和活性を示す図である。
【図１４】Merck社のＴｃｄＡ及びＴｃｄＢに対する抗体と比較した、マウスにおけるＣ．ディフィシル感染症に対するＡＢＡＢ−ＩｇＧのｉｎ  ｖｉｖｏ中和活性を示すグラフである。
【図１５】予防的ＡＢＡＢ−ＩｇＧのＣ．ディフィシル感染症に対する効果の研究の設計を示す図である。
【図１６】ＡＢＡＢ−ＩｇＧのＣＤＩに対する効果：予防的処置の概要を示す図である。
【図１７】ＡＢＡＢ−ＩｇＧのＣＤＩに対する効果：再負荷の概要を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
Ｉ．定義
特に指定のない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は例えば、Benjamin Lewin, Genes VII, Oxford University Press刊行, 2000(ISBN019879276X)、Kendrew et al.（編）；The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Publishers刊行, 1994(ISBN0632021829)、及びRobert A. Meyers（編）, Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, Wiley, John & Sons, Inc.刊行, 1995(ISBN0471186341)、並びに他の同様の技術的参照文献に見ることができる。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、「a」又は「an」は１つ以上を意味する場合がある。本
明細書中で使用される場合、「a」又は「an」という単語は、「を含む（comprising）」
という単語とともに使用される場合に１つ以上を意味する場合がある。本明細書中で使用される場合、「別の」は少なくとも２つ目又はそれ以上を意味する場合がある。さらに、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単数形の用語は複数のものを含み、複数形の用語は単数のものを含む。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、「約」は、明示されているか否かを問わず、例えば整数、分数及びパーセンテージを含む数値を指す。「約」という用語は一般に、当業者が列挙した値と同等である（例えば、同じ機能又は結果を有する）と考え得る数値の範囲（例えば、列挙した値の±５％〜１０％）を指す。場合によっては、「約」という用語は、最も近い有効数字まで概数にした数値を含み得る。
【００６４】
ＩＩ．本発明
動物におけるＣＤＩの一次作用因子は、Ｃ．ディフィシルの外毒素ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢ（トキシンＡ及びトキシンＢ）である。これらのトキシンは、構造的に類似した、宿主細胞に類似の作用機序を示す３００ｋＤａの単鎖タンパク質である。両者のトキシンとも宿主のＲｈｏ  ＧＴＰアーゼを標的とし、酵素不活性化に続いて、細胞骨格崩壊及びアポトーシスを起こす。腸上皮細胞において、ＴｃｄＡは、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼのグルコシル化を触媒し、細胞の完全な円形化のような形態変化を伴ってアクチン細胞骨格の再構築が起こり、そして腸管バリア機能が破壊される。それらのトキシンは、動物において個別にＣＤＩを引き起こすことができ、当該細菌のＴｃｄＡ−  ＴｃｄＢ−菌株は無毒性であ
る。
【００６５】
数多くの独立した研究によって、それらのトキシンに対する全身性抗体及び粘膜性抗体は、ＣＤＩに対する防御を与えることが裏付けられている。ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢは、Ｃ．ディフィシルにとっての必須の病原性因子であるため、両者のトキシンに対して産生された抗体は、動物モデルにおける毒素産生Ｃ．ディフィシル感染症に対する防御を可能にする。ヒトにおいては、抗トキシン抗体の高い血清濃度は、疾患の重症度の軽減及び再燃の発生率の低下と関連している。したがって、全身性投与及び経口投与された抗トキシン抗体について予防的根拠はある。しかしながら、単独のエピトープを標的とするモノクローナル抗体は、一般的に親和性が低く、そのような抗体の使用は、該トキシンのエピトープ内に突然変異を誘発し、更なる菌株を生成する危険性をはらんでいる。したがって、多数の主要な保存されたトキシンエピトープを標的とする中和性抗トキシンが強く望まれている。
【００６６】
ラクダ科動物は、軽鎖を欠いた、つまりは重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）である機能的な免疫グロブリンのクラスを産生する。ＨＣＡｂは、標的抗原に、従来のヒトＩｇＧによって達成されるのと同等の結合特性をもって結合する。ＶＨＨと呼ばれるＨＣＡｂのＶＨ領域は、通常のＶＨドメインと類似しているが、固有の配列及び構造的特徴を有している。このドメインをコードするＤＮＡは、簡単にクローニングすることができ、そして微生物中で発現させることで、元となるＨＣＡｂの抗原結合特性を維持した可溶性タンパク質単量体を得ることができる。これらのＶＨＨペプチド単量体型の結合剤は、小さく（〜１５ｋＤａ）、製造しやすく、かつ一般的に従来の抗体フラグメントと比べてより安定である。該結合剤は、ＩｇＧ抗体及び抗体のＦｃドメインと共に製造することもできる。
【００６７】
本発明は、ＣＤＩの治療及び予防で使用することができる結合剤の製造においてＨＣＡｂの有利な特徴を利用している。ＶＨＨペプチド単量体は、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢのエピトープの認識及び結合についてスクリーニングされた。エピトープへの結合を示すとともにトキシン中和活性を有するこれらの単量体を連結させることで、本発明の結合剤を製造した。結合剤には、単純なＶＨＨペプチド単量体及び連結されたＶＨＨペプチド単量体の群（２つ、３つ、４つ又はそれより多くの単量体を含む）、並びに抗体のＦｃドメインに結合されたＶＨＨペプチド単量体を含むより複雑な結合剤、並びにＩｇＧ抗体に結合されたＶＨＨペプチド単量体が含まれる（図６を参照）。
【００６８】
ＶＨＨ単量体及びＶＨＨヘテロ二量体
本発明者らは、Ｃ．ディフィシルの両方のトキシンの特異的ドメインに対するＶＨＨ単量体をスクリーニングするための効果的なプラットフォームを確立した。免疫原性の高い非毒性のホロトキシンを免疫化のために使用し、かつ生体活性のキメラ型トキシン（通常のドメイン機能を有する）をスクリーニングのために使用することで、ＶＨＨ単量体の、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢの異なるドメインへの結合のパネルを作製した。これらのＶＨＨ単量体の多くが強力な中和活性を有しており、それらの特異的ドメインへの結合を確認した（図１）。
【００６９】
ＶＨＨ単量体の幾つかは、高度に保存されたＴｃｄＡ／ＴｃｄＢエピトープに結合する。例えば、Ｅ３  ＶＨＨ単量体は、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ結合部位に結合し、グリコシル化を阻止し、ＡＨ３  ＶＨＨ単量体は、該トキシンのＧＴドメインに結合し、７Ｆ  ＶＨＨ単量体は、システインプロテアーゼ開裂部位に結合し、そしてＧＴドメインの開裂及び放出を阻止する。幾つかのＶＨＨ単量体は強力なトキシン中和活性を有しており、トキシンの細胞毒性活性をｎＭ濃度で阻止することが可能である（図１で下線を引いた単量体、図２のＡ及びＢも参照）。表１は、これらのＶＨＨペプチド単量体の一部の野生型及びコドン最適化された形式の両方についての配列表中のアミノ酸配列及び核酸配列を表してい
る。最適化された形式及び最適化されていない形式の両方とも本発明の様々な結合剤の製造において使用することができるが、哺乳動物細胞での発現のためにはコドン最適化された形式が好ましい。
【００７０】
本発明には、表１に引用された各々のＶＨＨペプチド単量体、並びにペプチド配列全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、かつ野生型ペプチドのトキシン結合活性及び／又は中和活性を維持しているそれらの配列変異体が含まれる。また本発明には、表１の各々のＶＨＨペプチド単量体をコードするポリヌクレオチド配列及びそれらの配列変異体、並びにそれらの相補鎖も含まれる。
【００７１】
【表１】
2020072685.tif 000003
【００７２】
ペプチド単量体の結合活性を高めるために、２つのＶＨＨペプチド単量体が連結されたＶＨＨペプチドのホモ二量体型及びヘテロ二量体型の結合剤を作製した（図２のＣ）。ホモ二量体型の結合剤は、２種の異なるトキシンにある同一のエピトープに結合する２つの同一の単量体を含む。ヘテロ二量体型の結合剤は、同じトキシンの２種の異なるエピトープ又は２種の異なるトキシンにある異なるエピトープに結合する２つの異なる単量体を含む。ＶＨＨヘテロ二量体は、ヘテロ二量体を含む個別のＶＨＨペプチド単量体の等モルの混合物と比較して、実質的に増強された中和活性を有することが分かった（図２のＤ）。確かにヘテロ二量体５Ｄ／Ｅ３及びＡＨ３／ＡＡ６は、致死的な全身性のＴｃｄＢ負荷又はＴｃｄＡ負荷からそれぞれマウスを十分に防御することが見出されたが、５ＤとＥ３とを混合したもの、又は単独のＡＡ６は、部分的にのみ防御性であるに過ぎなかった（図２のＥ及びＦ）。
【００７３】
ホモ二量体及びヘテロ二量体におけるＶＨＨ単量体は、１０個から２０個の間のアミノ酸の短いフレキシブルなリンカーを使用して連結される。適切なリンカーには、表２で規定されたリンカーが含まれる。また表２には、コドン最適化された形式の３種のリンカーも含まれる。最適化された形式及び最適化されていない形式の両方とも本発明の様々な結合剤の製造において使用することができるが、哺乳動物細胞における発現のためにはコドン最適化された形式が好ましい。
【００７４】
【表２】
2020072685.tif 000004
【００７５】
当業者によれば、上記ペプチドの特性から逸脱することなく、フレキシブルなリンカーの配列に小さな変更を加えることができることは理解されよう。したがって、ペプチド配列の全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、かつ基礎を成すリンカーの特性を維持しているフレキシブルなリンカーの配列変異体を使用することができる。
【００７６】
本発明には、先に定義されたフレキシブルなリンカーによって連結された、表１に列挙された単量体のいずれかの対を含むＶＨＨペプチドホモ二量体型の結合剤が含まれる。また本発明には、先に定義されたフレキシブルなリンカーによって連結された、表１に列挙された単量体の２つの任意の組み合わせを含むＶＨＨペプチドヘテロ二量体型の結合剤も含まれる。ヘテロ二量体の例は、表３に規定される。
【００７７】
【表３】
2020072685.tif 000005
【００７８】
また本発明には、タンパク質配列の全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、かつ野生型タンパク質のトキシン結合活性及び／又は中和活性を維持しているＶＨＨペプチドホモ二量体及びヘテロ二量体の配列変異体も含まれる。さらに、本発明には、各々のＶＨＨペプチドホモ二量体、ヘテロ二量体をコードするポリヌクレオチド配列及びそれらの配列変異体、並びにそれらの相補鎖が含まれる。
【００７９】
また本発明には、３つの単量体が、先の表２で定義されたフレキシブルなリンカーを使用して連結された、ＶＨＨペプチドホモ三量体型及びヘテロ三量体型の結合剤も含まれる。同じ単量体を３つ含む三量体、同じ単量体を２つ及び別の単量体を１つ含む三量体、並びに異なる単量体を３つ含む三量体を含む表１の単量体の任意の組み合わせを使用することができる。タンパク質配列の全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、かつ野生型タンパク質のトキシン結合活性及び／又は中和活性を維持しているＶＨＨペプチドホモ三量体及びヘテロ三量体の配列変異体が本発明に含まれる。さらに、本発明には、各々のＶＨＨペプチドホモ三量体、ヘテロ三量体をコードするポリヌクレオチド配列及びそれら
の配列変異体、並びにそれらの相補鎖が含まれる。
【００８０】
ＡＢＡＢ
ペプチド単量体及びヘテロ二量体の成功によって、本発明者らは、４つの連結されたＶＨＨペプチド単量体を含む結合剤の開発が可能となった。このことは、研究の目標であった。それというのも、過去の研究では、殆どの病原性Ｃ．ディフィシル菌株に対する十分な防御をもたらすためにはＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方を同時に中和することができることが必要であると考えられるため、それが可能な単独の抗体がＣＤＩの治療及び予防において最も有効な結合剤であることを示しているからである。各々のトキシンにある２種のエピトープを認識し結合する四重特異性の結合剤を作製することによって、該タンパク質の結合活性及び中和活性を強化することができる。したがって、４ドメイン型（四重特異性）ＶＨＨ結合剤が作製された。
【００８１】
四重特異性の四量体型結合剤は、表１の単量体のいずれかの組み合わせから製造することができ、ここで該単量体は、表２のフレキシブルなリンカーを使用して連結される。これらの結合剤は、同じ単量体を４つ有する結合剤から、同じ単量体を３つ有する結合剤まで、同じ単量体を２つ有する結合剤まで、４つの固有の単量体を有する結合剤までの範囲及びその範囲内の別形となる。タンパク質配列の全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、かつ野生型タンパク質のトキシン結合活性及び／又は中和活性を維持している該四量体の配列変異体が本発明に含まれる。さらに、本発明には、各々の四量体をコードするポリヌクレオチド配列及びそれらの配列変異体、並びにそれらの相補鎖が含まれる。
【００８２】
ＡＢＡＢは、４つの連結されたＶＨＨ単量体を含み、その各々がＴｃｄＡ又はＴｃｄＢの異なるエピトープに対して結合特異性を有する、本発明の特定の結合剤である。したがって、ＡＢＡＢ（本明細書及び図面において時々「ＡＢＢＡ」とも呼ばれる）は、４つの異なる中和性ＶＨＨ単量体からなり、２つがＴｃｄＡに対するものであり、かつ２つがＴｃｄＢに対するものである、四重特異性の四量体型結合剤である。この構造的特徴は、ＡＢＡＢが、各々のトキシンにある２種の異なる中和エピトープに同時に結合することを可能にする。以下に記載されるように、ＡＢＡＢの親和性／結合力及び中和活性は、ＣＤＩの治療のために現在臨床試験中のヒトモノクローナル抗体（ＨｕＭａｂ）と比べて３−ｌｏｇ超も高い。
【００８３】
ＡＢＡＢ結合剤は、ＶＨＨ単量体のＡＨ３、５Ｄ、Ｅ３及びＡＡ６（表１）をフレキシブルなリンカー（表２）を用いて連結させることによって製造した。この結合剤は、保存された重複していないエピトープを標的とし、優れたトキシン中和活性を有する。ＡＢＡＢ（図３）の設計において、ＶＨＨペプチド単量体ＡＨ３及びＡＡ６を、それらの間に５Ｄを配置することによって隔離した。それというのも、ＡＨ３及びＡＡ６は、互いに空間的に距離が置かれたＧＴ及びＴＤにそれぞれ結合するからである（図１）。この設計により、ＡＨ３及びＡＡ６は、ＴｃｄＡに同時に結合することが可能となった。
【００８４】
ＡＢＡＢを含む完全なアミノ酸配列は、配列番号１９に規定され、そのタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２０に規定されている。したがって、本発明には、配列番号１９に規定されるＡＢＡＢ結合剤、並びにタンパク質配列の全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、かつ野生型タンパク質のトキシン結合活性及び／又は中和活性を維持している該ＡＢＡＢ結合剤の配列変異体が含まれる。さらに、本発明には、該ＡＢＡＢ結合剤をコードするポリヌクレオチド配列（例えば配列番号２０）及びそれらの配列変異体、並びにそれらの相補鎖が含まれる。
【００８５】
ＡＢＡＢ結合剤の一つの別形において、Ｈｉｓ（６）−タグ（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号６６）を、該タンパク質のアミノ末端に精製の補助のために設け、そしてＥ−タグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ；配列番号６７）を、該タンパク質のカルボキシ末端に検出の補助のために設けた（図３を参照）。ＶＨＨ単量体は、２時間〜３時間の半減期を有することから、もう一つの別形においては、アルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ、ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＤ；配列番号２１）を、該構築物のカルボキシル末端にその血清中半減期を１０時間まで延ばすために配置した（図３を参照）。
【００８６】
これらの結合剤は、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに特異的に結合する。本発明の或る特定の態様においては、結合剤は、ＴｃｄＡ中和活性及び／又はＴｃｄＢ中和活性を示す。
【００８７】
明快にするために、本明細書で使用される場合に「一重特異性」、「二重特異性」、「三重特異性」、「四重特異性」等は、特定の結合剤が１種、２種、３種、４種等といった異なるエピトープにそれぞれ結合することを意味すると述べることができる。本明細書で使用される場合に、「単量体型」、「二量体型」、「三量体型」、「四量体型」等は、特定の結合剤が、１つ、２つ、３つ、４つ等の、それぞれのエピトープに結合する別々のＶＨＨペプチド単量体を有することを意味する。したがって、一重特異性の二量体型結合体は、同じエピトープに結合する２つのＶＨＨペプチド単量体（例えばホモ二量体）を表し、二重特異性の二量体型結合剤は、２種の異なるエピトープに結合する２つのＶＨＨペプチド単量体（例えばヘテロ二量体）を有することとなる。四重特異性の八量体型結合剤は、４種の異なるエピトープを認識する８つのＶＨＨペプチド単量体を有する。
【００８８】
ＶＨＨ−Ｆｃ
キメラＦｃ融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質の半減期を高める能力を有することがよく知られている。この戦略は、幾つかのＦＤＡ認可薬剤、例えばエタネルセプトで利用されている。原理証明研究は、単鎖抗体が、正しく集合し、かつヒトコブラクダＶＨＨ及びヒトＩｇＧのＦｃドメインをコードするｍｉｎｉ−Ｉｇ構築物を有するトランスジェニックマウスのＢ細胞によって発現されることを示している。またキメラ抗ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＶＨＨ，ＥＧ２−Ｆｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏで優れた腫瘍集積を示し、膠芽細胞腫のターゲティングを改善し得る薬物動態特性を有する。
【００８９】
本発明には、抗体のＦｃドメインに結合されたＶＨＨペプチド単量体（ＶＨＨ−Ｆｃ）を含む結合剤であって、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに結合する、結合剤が含まれる。これらのＦｃドメインベースの結合剤においては、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれより多くのＶＨＨペプチド単量体が、抗体重鎖のＦｃドメインのヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域に結合されている。したがって、ペプチド単量体は、該抗体のＦａｂ領域と置き換えられている。
【００９０】
ＶＨＨペプチド単量体は、先の表１に規定されたいずれかの単量体であってよく、該単量体には、ＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）、Ｅ３（配列番号３）、ＡＡ６（配列番号５）及びＡＨ３（配列番号７）が含まれる。２つ以上の単量体が連結されている場合には、それらの単量体は、一般的に１０個から２０個の間のアミノ酸を含むフレキシブルなペプチドリンカーによって連結され得る。適切なリンカーには、表２に規定されるリンカー、例えばリンカー−１（配列番号９）、リンカー−２（配列番号１１）及びリンカー−３（配列番号１３）が含まれる。
【００９１】
ＶＨＨ−Ｆｃが一般的に、産生後に細胞内で自己集合する２つの同一鎖から構成される場合には、本発明には、２種の異なるＦｃ鎖を含むＶＨＨ−Ｆｃ結合剤も含まれる。そのような状況において、１種以上のＶＨＨ単量体の配列だけが、２つのＦｃ鎖の間で異なっていてもよく、又はＦｃ鎖自体が、異なる配列であってよく、又は１種以上のＶＨＨ単量
体及びＦｃ鎖の両方が、異なる配列であってよい。
【００９２】
ＶＨＨ−Ｆｃ結合剤の１つの型は、抗体のＦｃドメインと、第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含む八量体型結合剤であって、ＶＨＨペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有し、上記第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体は、共に連結され、かつ両方の抗体のＦｃドメインのアミノ末端に結合され、かつ上記抗体のＦｃドメインが、抗体重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む、結合剤である。この結合剤は、４つのＶＨＨペプチド単量体を有することから、該結合剤は、一重特異性（単量体の全てが同じエピトープに結合する場合）、二重特異性（単量体が２種の異なるエピトープに結合する場合）、三重特異性（単量体が３種の異なるエピトープに結合する場合）又は四重特異性（単量体が４種の異なるエピトープに結合する場合）であってよい。
【００９３】
四重特異性のＶＨＨ−Ｆｃ結合剤の具体的な一例は、ＡＢＡＢ−Ｆｃ結合剤、つまりは抗体のＦｃドメインと、２組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含む四重特異性の八量体型結合剤であって、上記抗体のＦｃドメインは２つのアームを含み、各アームは抗体重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、かつ各アームはアミノ末端を有しており、該Ｆｃドメインの各アームにつき、１組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体が、該アームのアミノ末端に結合されており、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤である。この結合剤は、４種の異なるトキシンのエピトープを認識するため、「四重特異性」と呼ばれる。この結合剤は、８つのＶＨＨペプチド単量体（同じ第一の単量体を２つ、同じ第二の単量体を２つ、同じ第三の単量体を２つ及び同じ第四の単量体を２つ）を有するため、「八量体型」と呼ばれる。ＡＢＡＢ−Ｆｃは、特異的な結合活性及び中和活性を示すことが判明した。
【００９４】
ＡＢＡＢ−Ｆｃ結合剤は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに結合されたＶＨＨペプチド単量体ＡＨ３／５Ｄ／ＡＡ６／Ｅ３（示される順序で連結される）をコードする発現ベクターを作製することによって製造した。それらのＶＨＨペプチド単量体は、表２のフレキシブルなリンカーによって隔離されている。それぞれの鎖をコードする核酸配列は、配列番号２３に規定されている。それぞれの鎖のアミノ酸配列は、配列番号２２に規定されている。発現後の対となる鎖の自己集合にあたり、四重特異性の八量体型結合剤が得られた。本発明には、配列番号２２のＡＢＡＢ−Ｆｃ結合剤、並びにタンパク質配列の全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、かつ野生型タンパク質のトキシン結合活性及び／又は中和活性を維持している配列変異体が含まれる。さらに、本発明には、これらの配列変異体をコードするポリヌクレオチド配列及びそれらの相補鎖が含まれる。
【００９５】
一重特異性のＶＨＨ−Ｆｃ結合剤（ＡＨ３−Ｆｃ、５Ｄ−Ｆｃ、Ｅ３−Ｆｃ、ＡＡ６−Ｆｃ）及び二重特異性のＶＨＨ−Ｆｃ結合剤（例えば、ＡＨ３／５Ｄ−Ｆｃ及びＡＡ６／Ｅ３−Ｆｃ）も、このＦｃ融合系を使用して作られた。一重特異性の結合剤に関しては、単独のＶＨＨペプチド単量体を、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに結合させた。発現及び集合において、対となる鎖から、一重特異性の二量体型結合剤（それらの鎖が同一である場合）又は二重特異性の二量体型結合剤（それらの鎖が異なる場合）が得られた。二重特異性の結合剤に関しては、２つの連結されたＶＨＨペプチド単量体（ＶＨＨホモ二量体又は
ヘテロ二量体）を、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに結合させた。発現及び集合において、対となる鎖から二重特異性の四量体型結合剤（それらの鎖が同一である場合）又は四重特異性の四量体型結合剤（それらの鎖が異なる場合）が得られた。表４は、これらの幾つかの結合剤についての配列を規定している。
【００９６】
【表４】
2020072685.tif 000006
【００９７】
１つの単量体との具体的な対合には、５Ｄ−Ｆｃ＋５Ｄ−Ｆｃ；Ｅ３−Ｆｃ＋Ｅ３−Ｆｃ；ＡＡ６−Ｆｃ＋ＡＡ６−Ｆｃ；ＡＨ３−Ｆｃ＋ＡＨ３−Ｆｃ；５Ｄ−Ｆｃ＋Ｅ３−Ｆｃ；５Ｄ−Ｆｃ＋ＡＡ６−Ｆｃ；５Ｄ−Ｆｃ＋ＡＨ３−Ｆｃ；Ｅ３−Ｆｃ＋ＡＡ６−Ｆｃ；Ｅ３−Ｆｃ＋ＡＨ３−Ｆｃ；及びＡＡ６−Ｆｃ＋ＡＨ３−Ｆｃが含まれる。２つの単量体との具体的な対合には、ＡＨ３−５Ｄ−Ｆｃ＋ＡＨ３−５Ｄ−Ｆｃ；ＡＡ６−Ｅ３−Ｆｃ＋ＡＡ６−Ｅ３−Ｆｃ；及びＡＨ３−５Ｄ−Ｆｃ＋ＡＡ６−Ｅ３−Ｆｃが含まれる。
【００９８】
抗体のＦｃドメインと、２組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体とを含む二重特異性の四量体型ＶＨＨ−Ｆｃ結合剤であって、上記抗体のＦｃドメインは２つのアームを含み、各アームは抗体重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、かつ各アームはアミノ末端を有しており、該Ｆｃドメインの各アームにつき、１組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体は、該アームのアミノ末端に結合されており、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤が製造された。この結合剤は、２種の異なるトキシンのエピトープを認識するため、「二重特異性」と呼ばれる。この結合剤は、４つのＶＨＨペプチド単量体（同じ第一の単量体を２つ及び同じ第二の単量体を２つ）を有するため、「四量体型」と呼ばれる。第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体は、同じエピトープ又は異なるエピトープに対する結合特異性を有してよい。ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有してよい。
【００９９】
二重特異性の四量体型ＶＨＨ−Ｆｃ結合剤の具体的な一例は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列（ＡＨ３／５Ｄ−Ｆｃ）を含む。また本発明には、少なくとも９５％の配列同一性を有し、トキシン中和活性を維持しているその配列変異体も含まれる。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置してよい。
【０１００】
二重特異性の四量体型ＶＨＨ−Ｆｃ結合剤の具体的な一例は、配列番号３４に示されるアミノ酸配列（ＡＡ６／Ｅ３−Ｆｃ）を含む。また本発明には、少なくとも９５％の配列同一性を有し、トキシン中和活性を維持しているその配列変異体も含まれる。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置してよい。
【０１０１】
ＶＨＨ−Ｆｃ結合剤は、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢに特異的に結合する。本発明の或
る特定の態様においては、結合剤は、ＴｃｄＡ中和活性及び／又はＴｃｄＢ中和活性を示す。
【０１０２】
ＶＨＨ−ＩｇＧ
また本発明には、Ｆｃドメインのみではなく抗体に結合されたＶＨＨペプチド単量体を含む結合剤も含まれる。ＶＨＨ−ＩｇＧ結合剤は、抗体の可変領域を欠いたＩｇＧ抗体の軽（κ又はλ）鎖及び重鎖に結合された１つ、２つ、３つ、４つ又はそれより多くのＶＨＨペプチド単量体を含む。したがって、ペプチド単量体は、該抗体の可変領域と置き換えられている。
【０１０３】
ＶＨＨペプチド単量体は、先の表１に規定されたいずれかの単量体であってよく、該単量体には、ＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）、Ｅ３（配列番号３）、ＡＡ６（配列番号５）及びＡＨ３（配列番号７）が含まれる。２つ以上の単量体が連結されている場合には、それらの単量体は、一般的に１０個から２０個の間のアミノ酸を含むフレキシブルなペプチドリンカーによって連結され得る。適切なリンカーには、表２に規定されるリンカー、例えばリンカー−１（配列番号９）、リンカー−２（配列番号１１）及びリンカー−３（配列番号１３）が含まれる。
【０１０４】
ＶＨＨ−ＩｇＧ結合剤には、ＩｇＧ抗体と、第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含む八量体型結合剤であって、ＶＨＨペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有し、上記第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体は、共に連結され、かつ上記抗体の、抗体可変領域を欠いた両方の軽鎖のアミノ末端に結合され、かつ上記第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体は、共に結合され、かつ上記抗体の、抗体可変領域を欠いた両方の重鎖のアミノ末端に結合されている、結合剤が含まれる。この結合剤は、４つのＶＨＨペプチド単量体を有することから、該結合剤は、一重特異性（単量体の全てが同じエピトープに結合する場合）、二重特異性（単量体が２種の異なるエピトープに結合する場合）、三重特異性（単量体が３種の異なるエピトープに結合する場合）又は四重特異性（単量体が４種の異なるエピトープに結合する場合）であってよい。
【０１０５】
四重特異性のＶＨＨ−ＩｇＧ結合剤の具体的な一例は、ＡＢＡＢ−ＩｇＧ結合剤、つまりはＩｇＧ抗体と、２組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体と、２組の連結された第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含む四重特異性の八量体型結合剤であって、上記ＩｇＧ抗体は２つのアームを含み、各アームは、可変領域を欠いた重鎖及び可変領域を欠いた軽鎖を含み、かつ各鎖は、アミノ末端を有しており、該抗体の各アームにつき、１組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体が、該軽鎖のアミノ末端に結合されており、かつ１組の連結された第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体が、該重鎖のアミノ末端に結合されており、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤である。この結合剤は、４種の異なるトキシンのエピトープを認識するため、「四重特異性」と呼ばれる。この結合剤は、８つのＶＨＨペプチド単量体（同じ第一の単量体を２つ、同じ第二の単量体を２つ、同じ第三の単量体を２つ及び同じ第四の単量体を２つ）を有するため、「八量体型」と呼ばれる。或る特定の態様において、第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体は、それぞれ異なるエピトープに対する結合特異性を有することができる。或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有することができ、かつＶＨ
Ｈペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有することができる。或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する。
【０１０６】
四重特異性の八量体型ＡＢＡＢ−ＩｇＧ結合剤の具体的な一例は、配列番号４６に示されるアミノ酸配列を有する軽（κ）鎖（ＡＡ６／Ｅ３κ）又はその配列に少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体、及び配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖（ＡＨ３／５Ｄ重鎖）又はその配列に少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含む。この態様においては、該配列変異体は、トキシン中和活性を維持している。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置してよい。この結合剤は、第一の発現ベクターが、可変領域を欠いたヒトＩｇＧ１抗体重鎖に結合されたＶＨＨペプチド単量体ＡＨ３／５Ｄ（示される順序で連結される）をコードし、第二の発現ベクターが、可変領域を欠いたヒトＩｇＧ１抗体の軽（κ）鎖に結合されたＶＨＨペプチド単量体ＡＡ６／Ｅ３（示される順序で連結される）をコードする２つの別個の発現ベクターを作製することによって製造された。ＡＡ６／Ｅ３−ＩｇＧ１軽（κ）鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４７に規定されている。ＡＨ３／５Ｄ−ＩｇＧ１重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４５に規定されている。本発明には、タンパク質配列の全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、かつ野生型タンパク質のトキシン結合活性及び／又は中和活性を維持しているＡＢＡＢ−ＩｇＧの配列変異体が含まれる。さらに、本発明には、これらの配列変異体をコードするポリヌクレオチド配列及びそれらの相補鎖が含まれる。
【０１０７】
二重特異性又は四重特異性の四量体型ＩｇＧ結合剤は、本発明に含まれる。そのような結合剤は、ＩｇＧ抗体と、第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体とを含み、上記ＩｇＧ抗体は２つのアームを含み、各アームは、可変領域を欠いた重鎖及び可変領域を欠いた軽鎖を含み、かつ各鎖は、アミノ末端を有しており、該抗体の第一のアームにつき、第一のＶＨＨペプチド単量体は、該軽鎖のアミノ末端に結合されており、かつ第二のＶＨＨペプチド単量体は、該重鎖のアミノ末端に結合されており、該抗体の第二のアームにつき、第三のＶＨＨペプチド単量体は、該軽鎖のアミノ末端に結合されており、かつ第四のＶＨＨペプチド単量体は、該重鎖のアミノ末端に結合されており、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体は、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有する。結合剤が「四重特異性」である場合に、該結合剤は、４種の異なるトキシンのエピトープを認識し、「二重特異性」の場合には、該結合剤は、２種の異なるトキシンのエピトープを認識する。結合剤は、それらが４つのＶＨＨペプチド単量体を有する場合には「四量体型」である（二重特異性の場合に、第一の単量体及び第二の単量体は同じ配列を有し、同じエピトープに結合し、かつ第三の単量体及び第四の単量体は同じ配列を有し、同じエピトープに結合する；四重特異性の場合に、各々の単量体は異なる配列を有し、異なるエピトープに結合する）。
【０１０８】
結合剤が二重特異性である場合に、第一の単量体及び第三の単量体は、異なるエピトープに対する結合特異性を有し、第一の単量体及び第二の単量体は、同一のアミノ酸配列を有し、かつ第三の単量体及び第四の単量体は、同一のアミノ酸配列を有する。或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体のうち１つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつＶＨＨペプチド単量体のうち１つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する。
【０１０９】
結合剤が四重特異性である場合に、ＶＨＨペプチド単量体の各々は、異なるエピトープ
に対する結合特異性を有する。或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する。
【０１１０】
或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体の各々は、ＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有する。他の態様において、ＶＨＨペプチド単量体の各々は、ＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する。
【０１１１】
或る特定の態様において、ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する。
【０１１２】
二重特異性の四量体型ＩｇＧ結合剤の具体的な一例は、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有する軽（κ）鎖（ＡＡ６κ）及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖（ＡＨ３重鎖）を含む。また本発明には、少なくとも９５％の配列同一性を有し、トキシン中和活性を維持しているその配列変異体も含まれる。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置してよい。
【０１１３】
二重特異性の四量体型ＩｇＧ結合剤のもう一つの具体的な例は、配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する軽（κ）鎖（Ｅ３κ）及び配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖（５Ｄ重鎖）を含む。また本発明には、少なくとも９５％の配列同一性を有し、トキシン中和活性を維持しているその配列変異体も含まれる。配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置してよい。
【０１１４】
表５は、二重特異性のＶＨＨ−ＩｇＧ結合剤を作製するために使用される配列を規定している。その他の適切な対合には、（ｉ）５Ｄ−ＩｇＧ１−重鎖＋ＡＡ６−軽（κ又はλ）鎖、及び（ｉｉ）ＡＨ３−ＩｇＧ１−重鎖＋Ｅ３−軽（κ又はλ）鎖が含まれる。
【０１１５】
【表５】
2020072685.tif 000007
【０１１６】
しかしながら、本発明には、ＡＨ３、５Ｄ、ＡＡ６及びＥ３のいずれかに結合されたＩｇＧ１重鎖、並びにＡＨ３、５Ｄ、ＡＡ６及びＥ３のいずれかに結合されたＩｇＧ１軽（κ又はλ）鎖が含まれる。さらに、重鎖及び軽（κ又はλ）鎖の全ての可能な組み合わせが、本明細書に包含される。
【０１１７】
ヒト化された結合剤
ＶＨＨペプチド単量体は、それらの小さいサイズ及びそれらの骨格のファミリーＩＩＩのヒトＶＨ骨格との高度の同一性のため、ヒトに投与される場合に低い免疫原性しか示さないことが期待される。小さい一価ＶＨＨ単量体の全身性適用は、あってもごく僅かな中和性の抗体応答しか誘発しないと思われるが、タンパク質の免疫原性は、一般的にサイズ及び複雑さに伴って増大する。ＶＨＨ単量体の繰り返しの及び／又は長期にわたるｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のための２つの大きな障壁は、それらの短いと考えられる半減期及び潜
在的な免疫原性である。価数及び血中半減期を高めるために、ＶＨＨ単量体は、本明細書で論じられるようにヒトＩｇＧ及びＦｃドメインと融合させることができる。考えられる免疫原性に対処するために、ＶＨＨ単量体は、その発現レベル、親和性、可溶性及び安定性を損なうことなく、必要に応じてヒト化することができる。これらの戦略は、ループドナーＶＨＨの抗原特異性及び親和性を維持しながら、ヒト化されたＶＨＨ単量体（ｈＶＨＨ単量体）の良好な発現、安定性及び可溶性をもたらすはずである。
【０１１８】
１つ以上のヒトＶＨ遺伝子との最高の同一性を確保し、最高の結合／中和活性を有するｈＶＨＨ単量体を選択し、その後に、該単量体は、ＶＨＨ−Ｆｃ及びＶＨＨ−ＩｇＧ構築物へと変換され、こうして完全ヒト化された結合剤、例えば完全ヒト化されたＡＢＡＢ−ＩｇＧ結合剤及びＡＢＡＢ−Ｆｃ結合剤が作製される。これらのヒト化された結合剤のタンパク質配列は、抗体のその標的抗原への結合能を担うＣＤＲセグメントの幾つかが非ヒト起源であるにもかかわらず、ヒト抗体変異体の配列と本質的に同一であり得る。したがって、この戦略は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの潜在的な免疫原性の可能性を低下させることで、ｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの安全性及び半減期を高める。
【０１１９】
したがって、本発明の結合剤は、本明細書で定義されたそれぞれの結合剤の、ｈＶＨＨペプチド単量体を含むヒト化された形式を包含する。
【０１２０】
抗体フラグメント
本発明の結合剤には、本明細書で定義されるＶＨＨ−Ｆｃ結合剤及びＶＨＨ−ＩｇＧ結合剤のそれぞれのエピトープ結合断片が含まれる。ＶＨＨ−Ｆｃ結合剤及びＶＨＨ−ＩｇＧ結合剤は、可変領域がＶＨＨ単量体によって置き換えられたヒトＩｇＧ抗体と構造の点で同等であることから、ヒト抗体フラグメントに関する用語は、そのような結合剤についても該当し得る。該フラグメントには、限定されるものではないが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体、及びＦａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメント、並びに二重特異性抗体及び三重特異性抗体が含まれる。
【０１２１】
本発明のＶＨＨ−Ｆｃ結合剤及びＶＨＨ−ＩｇＧ結合剤には、完全にヒト型の結合剤、ヒト化された結合剤、及びキメラ型結合剤が含まれる。結合剤は、モノクローナル型又はポリクローナル型であってよい。さらに、結合剤は、組換え型の結合剤であってよい。
【０１２２】
結合剤は、任意の種の動物において、けれども好ましくは哺乳動物、例えばヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ又はネコにおいて産生させることができる。例えば結合剤は、ヒト型若しくはヒト化されたものであってよく、又はヒトへの投与に適したあらゆる結合剤調製物であってよい。
【０１２３】
ポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞及び作製方法
本発明には、本明細書で規定される各々の結合剤をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド及びそれらの相補鎖が含まれる。
【０１２４】
また本発明には、上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び該発現ベクターを含む宿主細胞も含まれる。適切な発現ベクターには、例えばｐｃＤＮＡ３．１及びｐＳｅｃ−Ｈｉｓが含まれる。適切な宿主細胞には、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）及びヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３細胞）が含まれる。
【０１２５】
さらに、本発明には、本明細書で定義される結合剤を製造する方法であって、宿主細胞を、発現ベクターによってコードされる結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法が含まれる。
【０１２６】
治療及び予防の方法
本発明の結合剤は、被験体におけるＣ．ディフィシルによって誘発される疾患症状を治療又は予防する方法において使用することができる。これらの方法は、一般的に、治療的有効量の１種以上の本明細書で定義される結合剤を、Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む。
【０１２７】
また本発明の結合剤は、Ｃ．ディフィシルにより感染された被験体においてＣ．ディフィシルのトキシンＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢを中和するにあたり使用することもできる。これらの方法は、一般的に、治療的有効量の１種以上の本明細書で定義される結合剤を、Ｃ．ディフィシル感染症を伴う被験体に投与することを含む。
【０１２８】
さらに、本発明の結合剤は、被験体におけるＣ．ディフィシル感染症を治療する方法において使用することができる。これらの方法は、一般的に、治療的有効量の１種以上の本明細書で定義される結合剤を、Ｃ．ディフィシル感染症を伴う被験体に投与することを含む。これらの同じ方法は、本明細書で定義されるように、ＣＤＩの治療のために使用することができる。
【０１２９】
また結合剤は、即時的なＣＤＩの脅威を予防するための免疫予防において使用することもできる。さらに、受動免疫予防は、即時的及び長期的なＣＤＩの脅威の両方を予防するために使用することができる。それぞれのアプローチは、それ自体に特定の利点を伴い、特定の高リスク集団を対象とするために適している。これらの方法は、一般的に、治療的有効量の１種以上の本明細書で定義される結合剤を、Ｃ．ディフィシル感染症を発症するリスクがある被験体に投与することを含む。
【０１３０】
本発明の各々の方法は、１種以上の結合剤を、該結合剤及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬製剤において投与することを含み得る。
【０１３１】
本明細書で使用される場合に、用語「治療する」、「治療している」、及び「治療」は、それらの通常かつ慣例的な意味を有し、その用語には、被験体におけるＣ．ディフィシル感染症若しくはＣ．ディフィシル関連疾患の阻止、回復若しくはそれらの症状の重症度及び／又は頻度の低下；及び／又はＣ．ディフィシルに感染した被験体におけるＣ．ディフィシルのＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢの生物学的活性の部分的若しくは完全な阻害及び／又はその免疫学的クリアランスの増進；及び／又は被験体におけるＣ．ディフィシル細胞の成長、分裂、伝播若しくは増殖、又はＣ．ディフィシル感染；の１つ以上が含まれる。治療とは、本発明の方法を実施していない被験体に対する約１％〜約１００％の阻止、回復、低下又は阻害を意味する。好ましくは、その阻止、回復、低下又は阻害は、本発明の方法を実施していない被験体に対して約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又は１％である。
【０１３２】
本明細書で使用される場合に、用語「予防する」、「予防している」、及び「予防」は、それらの通常かつ慣例的な意味を有し、その用語には、被験体におけるＣ．ディフィシルのコロニー形成、発生若しくは進展の停止、防止、回避、軽減若しくは阻止；及び／又はＣ．ディフィシルに感染した被験体におけるＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢの生物学的活性及び／又は毒性効果の部分的若しくは完全な阻害；及び／又は被験体における細菌細胞の成長、分裂、伝播若しくは増殖、又は細菌感染の、停止、防止、回避、軽減若しくは阻止；の１つ以上が含まれる。予防は、予防処置がされていない被験体に対して、少なくとも約９５％だけ停止することを意味する。好ましくは、その停止は、約１００％、約９９％、約９８％、約９７％、約９６％又は約９５％である。予防の成果は、日数単位（例え
ば、１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日）、週単位（例えば、１週間、２週間、３週間又は４週間）、又は月単位（例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月以上）の期間にわたって継続し得る。
【０１３３】
本明細書で規定される治療及び予防の方法は、治療的有効量の抗生物質を被験体に投与することによっても補うことができる。好ましくは、抗生物質は、Ｃ．ディフィシルに対する抗菌活性を有することとなる。
【０１３４】
医薬製剤
結合剤が被験体に直接的に投与され得る場合には、本発明の方法は、好ましくは１種以上の結合剤及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬製剤を投与することを基礎とする。したがって、本発明には、１種以上の本明細書で定義される結合剤及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬製剤が含まれる。
【０１３５】
薬学的に許容可能な担体及び希釈剤は、一般的に知られており、投与される具体的な結合剤及び投与方法に応じて様々であってよい。一般的に使用される担体及び希釈剤の例には、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール及びそれらの組み合わせ、安定化剤、可溶化剤及び界面活性剤、緩衝剤及び保存剤、等張剤、増量剤並びに滑沢剤が含まれる。結合剤を含む製剤は、一般的に、任意の非ヒト成分、例えば動物血清（例えばウシ血清アルブミン）の不存在下に調製及び培養されることとなる。
【０１３６】
１種以上の結合剤を含む医薬製剤は、当業者に既知の方法及び技術を使用して被験体へと投与することができる。ＣＤＩ疾患の特徴により、該製剤は、治療剤の注腸的送達、すなわち結合剤の下部ＧＩ管、例えば大腸又は結腸に対する狙いを定めた送達を使用する治療及び予防のためにより適したものになり得る。その他の送達方法には、限定されるものではないが、経口投与、経肛門投与、静脈内注射又はエアロゾル投与が含まれる。他の方法には、限定されるものではないが、皮内、皮下（ｓ．ｃ．、ｓ．ｑ．、ｓｕｂ−Ｑ、Ｈｙｐｏ）、筋内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、髄内、心臓内、関節内（関節）、髄液包内（髄液領域）、頭蓋内、髄腔内及びくも膜下（髄液）が含まれる。
【０１３７】
投与の手段に応じて、投与量は、一度に全て、例えばカプセル剤若しくは液剤の経口用製剤で投与されてよく、又はゆっくりと時間をかけて、例えば筋内若しくは静脈内投与で投与されてよい。
【０１３８】
被験体に投与される単独の又は医薬製剤中の結合剤の量は、感染症の治療又は予防のために有効な量である。したがって、治療的有効量は、本発明の方法が実施される場合に被験体に投与される。一般的に、被験体の体重１ｋｇ当たりに約１μｇから約１０００ｍｇの間の結合剤が投与される。また適切な範囲には、約５０μｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇの間が含まれ、かつ約１０μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの間も含まれる。しかしながら、被験体に投与される結合剤の量は、感染症の部位、起源、程度及び重症度、治療されるべき被験体の年齢及び状態等に依存して広い限度の間で変動することとなる。医師は、最終的に使用すべき適切な投与量を決定するであろう。
【０１３９】
結合剤及び結合剤を含む医薬製剤の適用回数は、細菌感染の部位、治療又は予防されるべき感染症の詳細、及び投与方法を含む要因に応じて変動することとなる。それぞれの製剤は、独立して、１日４回、３回、２回若しくは１回、１日置きに、２日置きに、３日置きに、４日置きに、５日置きに、１週間に１回、７日置きに、８日置きに、９日置きに、隔週で、毎月、そして隔月で投与してよい。
【０１４０】
治療又は予防の期間は、治療される感染の位置及び重症度又は感染症に罹る相対リスクを基礎とすることとなり、所属医師によって最良の決定がなされることとなる。しかしながら、治療の継続は、何日間、何週間、又は何ヶ月にもわたり継続するように検討される。
【０１４１】
本発明のそれぞれの実施形態及び態様においては、被験体は、ヒト、非ヒトの霊長類、トリ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、伴侶動物、例えばイヌ、ネコ若しくは齧歯類又は他の哺乳動物である。本発明の方法が適用され得る被験体には、Ｃ．ディフィシル感染症により罹りやすくなる潜在的な疾患又は状態を伴う被験体が含まれる。
【０１４２】
本発明は、１種以上の結合剤又は結合剤を含む医薬製剤を充填した１つ以上の容器を含むキットも提供する。キットは使用説明書も含み得る。医薬品又はバイオ製品の製造、使用又は販売を規制する行政機関によって指定される形式の、ヒト投与のための製造、使用又は販売の機関による認可を反映する通知もキットに更に付属し得る。
【実施例】
【０１４３】
ＩＶ．実施例
ＶＨＨ単量体型及びヘテロ二量体型結合剤
単独のドメイン（単量体型）の、トキシンＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの特異的ドメインに対する一重特異性のＶＨＨペプチド単量体をスクリーニングするための効果的なプラットフォームを確立した。免疫原性の高い非毒性のホロトキシンを免疫化のために使用し、かつ生体活性のキメラ型トキシン（通常のドメイン機能を有する）をスクリーニングのために使用することで、ＶＨＨ単量体の、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢの種々のドメインへの結合のパネルを作製した。これらのＶＨＨ単量体の多くが強力な中和活性を有し、それらの特異的ドメインへの結合を確認した（図１）。その非毒性のホロトキシンは、従来に記載（Wang
et al., 2012）される通り、それらの酵素的グルコシルトランスフェラーゼドメインに
点突然変異を有する。生体活性のキメラ型トキシンを、また従来に記載（Wang et al., 2012）される通り、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの間で機能的ドメインを交換することによって
作製した。
【０１４４】
ＶＨＨ単量体の幾つかは、高度に保存されたＴｃｄＡ／ＴｃｄＢエピトープに結合する。例えば、ＶＨＨ  Ｅ３単量体は、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ結合部位に結合し、グリコシル化を阻止し、ＶＨＨ  ＡＨ３単量体は、該トキシンのＧＴドメインに結合し、ＶＨＨ  ７Ｆ単量体は、システインプロテアーゼ開裂部位に結合し、そしてＧＴドメインの開裂及び放出を阻止する。幾つかのＶＨＨ単量体は強力な中和活性を有しており、トキシンの細胞毒性活性をｎＭ濃度で阻止することが可能である（表１；図２のＡ及び図２のＢを参照）。
【０１４５】
結合活性を高めるために、２つのドメイン（二量体型）の二重特異性のＶＨＨヘテロ二量体を作製（表３；図２のＣ）することで、単独のタンパク質が、トキシンの２種の異なるエピトープを標的とすることが可能となった。これらの二重特異性のＶＨＨヘテロ二量体は、同じ２つのＶＨＨ単量体の等モルの混合物と比較して、実質的に増強された中和活性を有していた（図２のＤ）。ヘテロ二量体５Ｄ／Ｅ３及びＡＨ３／ＡＡ６は、致死的な全身性のＴｃｄＢ負荷又はＴｃｄＡ負荷からそれぞれマウスを十分に防御することが見出されたが、５ＤとＥ３とを混合したもの、又はＡＡ６単独は、部分的にのみ防御性であるに過ぎなかった（図２のＥ及びＦ）。
【０１４６】
ヘテロ二量体を含むＶＨＨ単量体は、配列番号９〜配列番号１３（表２）から選択されるフレキシブルなリンカーを使用して連結させた。
【０１４７】
ＡＢＡＢ結合剤
ＡＢＡＢと称される４つのドメイン（四量体型）の四重特異性のＶＨＨ結合剤を、ＶＨＨ単量体ＡＨ３、５Ｄ、Ｅ３及びＡＡ６を連結させることによって作製した。この四重特異性の四量体型結合剤は、保存された重複していないエピトープを標的とし、優れたトキシン中和活性を有する。ＡＢＡＢ（図３）の設計において、ＶＨＨペプチド単量体ＡＨ３及びＡＡ６を、それらの間に５Ｄ単量体を配置することによって隔離した。それというのも、ＡＨ３及びＡＡ６は、それぞれ互いに空間的に距離が置かれたＧＴ及びＴＤに結合するからである（図１）。この設計により、ＡＨ３及びＡＡ６は、ＴｃｄＡに同時に結合することが可能となった。
【０１４８】
ＡＢＡＢ結合剤の構築において、フレキシブルなリンカーを、ＶＨＨ単量体の間に配置した（図３を参照）。ＡＢＡＢをコードする完全な核酸配列は、配列番号２０に規定され、そのタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１９に規定されている。
【０１４９】
或る特定の別形においては、Ｈｉｓ（６）−タグを、該タンパク質のアミノ末端に精製の補助のために設け、Ｅ−タグを、該タンパク質のカルボキシ末端に検出の補助のために設け、及び／又はアルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ、ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＤ；配列番号２１）は、該タンパク質の血清中半減期を高めるために該構築物のカルボキシル末端に配置した（図３を参照）。
【０１５０】
ＡＢＡＢは、個々の単量体にわたって実質的に高められた結合親和性（表６）及び中和活性（表７）を示すことが分かった。表７において、ベロ細胞を、連続希釈されたＡＡ６、ＡＨ３、ＡＢＡＢ又はMerck社の抗ＴｃｄＡ  ＨｕＭａｂ（Lowy et al., 2010）の存在下で５ｎｇ／ｍｌのＴｃｄＡに曝した。ＴｃｄＡに誘発される細胞円形化から細胞を防御する抗体の最低用量を示す。
【０１５１】
【表６】
2020072685.tif 000008
【０１５２】
【表７】
2020072685.tif 000009
【０１５３】
ＡＢＡＢは、競合ＥＬＩＳＡにおいて全ての４つの個々のＶＨＨペプチド単量体と競合し、そしてサンドウィッチＥＬＩＳＡによって測定した場合にＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方に同時に結合し得ることも分かった。さらに、ＡＢＡＢは反応性が広範であり、最近の流行性菌株の殆どを代表する１３種の異なるＣ．ディフィシル菌株由来のトキシンを中和
することができる。
【０１５４】
ＡＢＡＢは、両方のトキシンへの結合及び中和に高い効力を示すことから、劇症性ＣＤＩの治療におけるその効力を評価した。Ｃ．ディフィシル芽胞の負荷１日後に、たった４０μｇ／ｋｇのＡＢＡＢによる単回注射だけで、マウスにおける劇症性ＣＤＩが一転した。ＡＢＡＢ処置されたマウスは死ななかったが、対照マウスの５０％は、感染３日後に瀕死の状態となった（図４、左のパネル）。ＡＢＡＢは、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢでの全身性負荷後の死亡の予防においてMerck社のＨｕＭａｂｓ（図４、右のパネル）（Lowy et al., 2010）と比べて４−ｌｏｇも強力である。このように、ＡＢＡＢは、Ｃ．ディフィシルのトキシン及び芽胞の負荷に対して並外れたｉｎ  ｖｉｖｏ効力を有する。
【０１５５】
動物及びヒトの研究によって、受動投与された抗トキシン抗体がＣＤＩに対する防御をもたらすことが裏付けられた。初期の研究でも、抗トキシン多価血清が、マウスを原発性ＣＤＩ（図５）及び再発性／再燃性ＣＤＩから防御することが示された。これらの知見及び図４からの結果は、仮説を支持しており、ＣＤＩの予防のための非経口ＡＢＡＢ免疫化戦略の開発のための根拠を与えた。ＡＢＡＢを全身性送達のために最適化するという目標を達成するために、図６に図説されるキメラ型及びヒト化されたＡＢＡＢを、すなわちＶＨＨ−Ｆｃ結合剤及びＶＨＨ−ＩｇＧ結合剤並びにヒト化されたタンパク質ｈＶＨＨ−Ｆｃ及びｈＶＨＨ−ＩｇＧを、作製し、その後に、有力なタンパク質を、動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ中和活性及び防御について評価した。追加の結合剤の製造及び試験に関する詳細は、以下の段落に規定されている。
【０１５６】
ＡＢＡＢ−Ｆｃ
ＡＢＡＢ−Ｆｃ結合剤は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに結合されたＶＨＨペプチド単量体ＡＨ３／５Ｄ／ＡＡ６／Ｅ３（示される順序で連結される）をコードする発現ベクターを作製することによって製造した。ＶＨＨペプチド単量体は、表２のフレキシブルなリンカーによって隔離した。該タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２３に規定されている。ＡＢＡＢ−Ｆｃは、安定にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞系統の培養上清からプロテインＡビーズを使用して（図７）、ジスルフィド結合形成及び二価の分子産生を可能にする条件下で発現及び精製した。発現レベルは、培養上清１Ｌ当たりに約２０ｍｇであった。ＡＢＡＢ−Ｆｃは、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方との結合及び中和において十分に機能的である。ＡＢＡＢ−Ｆｃのアミノ酸配列は、配列番号２２に規定されている。
【０１５７】
一重特異性のＶＨＨ−Ｆｃ結合剤（ＡＨ３−Ｆｃ、５Ｄ−Ｆｃ、Ｅ３−Ｆｃ、ＡＡ６−Ｆｃ）及び二重特異性のＶＨＨ−Ｆｃ結合剤（ＡＨ３／５Ｄ−Ｆｃ及びＡＡ６／Ｅ３−Ｆｃ）も、このＦｃ融合系を使用して作製した。上記表４は、これらの追加の結合剤についての配列を規定している。
【０１５８】
ＡＢＡＢ−ＩｇＧ
図６に図説されるように、二重特異性のＶＨＨ−ＩｇＧ（ＡＨ３／５Ｄ−ＩｇＧ及びＥ３／ＡＡ６−ＩｇＧ）は、単量体を、ヒトＩｇＧ重鎖及び軽（κ又はλ）鎖と個別に融合させることによって作製することができる。四重特異性のＶＨＨ−ＩｇＧ（ＡＢＡＢ−ＩｇＧ）は、二量体を、ヒトＩｇＧ重鎖及び軽鎖と個別に融合させることによって作製することができる。重鎖及び軽鎖の構築物を同時トランスフェクションすることで、ＡＨ３／５Ｄ−ＩｇＧ、Ｅ３／ＡＡ６−ＩｇＧ及びＡＢＡＢ−ＩｇＧのキメラタンパク質が生成する。２つのＶＨＨを重鎖及び軽鎖へと分けると、恐らく二重特異性及び四重特異性のＶＨＨキメラ型タンパク質の収率及び安定性が改善する。これによって、ＶＨＨ−ヒトＩｇＧキメラ型抗体がＡＢＡＢのｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性及び効力を補助するか否かを決定することができる。同様に、ＡＢＡＢ−ＩｇＧのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の更なる改善は、Ｆ
ｃＲｎ受容体に対する高められた結合親和性を有するＡＢＡＢ−ＩｇＧ変異体において試験することもできる。
【０１５９】
二重特異性（ＡＨ３／５Ｄ−ＩｇＧ１及びＥ３／ＡＡ６−ＩｇＧ１）並びに四重特異性（ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１）のＩｇＧ１結合剤は、それぞれの結合剤の重鎖及び軽（κ）鎖をコードする発現ベクターを同時トランスフェクションすることによって製造した。それらのＶＨＨペプチド単量体を、表２のフレキシブルなリンカーによって隔離した。
【０１６０】
二重特異性の四量体型ＶＨＨ−ＩｇＧ１結合剤は、第一の発現ベクターが、重鎖可変領域を欠いたヒトＩｇＧ１抗体重鎖（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）に結合されたＶＨＨペプチド単量体をコードし、第二の発現ベクターが、軽鎖可変領域を欠いたヒトＩｇＧ１抗体の軽（κ）鎖（ＣＫ）に結合されたＶＨＨペプチド単量体をコードする、２つの別個の発現ベクターを作製することによって製造した。これらの結合剤は、得られた結合剤のそれぞれの軽鎖が第一のＶＨＨ単量体に連結され、かつ得られた結合剤のそれぞれの重鎖が第二のＶＨＨ単量体に連結されているため二重特異性で四量体型である。上記表５は、これらの追加の結合剤についての配列を規定している。適切な組み合わせには、（ｉ）ＡＨ３−ＩｇＧ１−重鎖＋ＡＡ６−軽（κ又はλ）鎖、（ｉｉ）５Ｄ−ＩｇＧ１−重鎖＋Ｅ３−軽（κ又はλ）鎖、（ｉｉｉ）５Ｄ−ＩｇＧ１−重鎖＋ＡＡ６−軽（κ又はλ）鎖、及び（ｉｖ）ＡＨ３−ＩｇＧ１−重鎖＋Ｅ３−軽（κ又はλ）鎖が含まれる。
【０１６１】
四重特異性の八量体型ＡＢＡＢ−ＩｇＧ結合剤を製造した。これらの結合剤は、得られた結合剤のそれぞれの軽（κ又はλ）鎖が２つ（第一及び第二）の連結されたＶＨＨ単量体に結合され、かつ得られた結合剤のそれぞれの重鎖が２つ（第三及び第四）の連結されたＶＨＨ単量体に結合され、ここで第一の単量体、第二の単量体、第三の単量体及び第四の単量体は、異なるエピトープに結合するため、四重特異性で八量体型である。
【０１６２】
特定の四重特異性の八量体型ＡＢＡＢ−ＩｇＧ（図８）結合剤は、第一の発現ベクターが、重鎖可変領域を欠いたヒトＩｇＧ１抗体重鎖（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）に結合されたＶＨＨペプチド単量体ＡＨ３／５Ｄ（示される順序で連結される）をコードし、第二の発現ベクターが、軽鎖可変領域を欠いたヒトＩｇＧ１抗体の軽（κ）鎖（ＣＫ）に結合されたＶＨＨペプチド単量体ＡＡ６／Ｅ３（示される順序で連結される）をコードする、２つの別個の発現ベクターを作製することによって製造した。ＡＨ３／５Ｄ−ＩｇＧ１重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４５に規定されており、そのアミノ酸配列は、配列番号４４に規定されている。ＡＡ６／Ｅ３−ＩｇＧ１κ鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４７に規定されており、そのアミノ酸配列は、配列番号４６に規定されている。
【０１６３】
二重特異性（ＡＨ３／５Ｄ−ＩｇＧ１及びＥ３／ＡＡ６−ＩｇＧ１）及び四重特異性（ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１）のＩｇＧ１結合剤は、安定にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞系統の培養上清からプロテインＡビーズを使用して（ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１については図９を参照）、ジスルフィド結合形成及び二価の分子産生を可能にする条件下で発現及び精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、９０％超の純度の精製されたＡＢＡＢ−ＩｇＧ１が、非還元ゲルにおいて約２１８ＫＤａの合計分子量（軽鎖及び重鎖を一緒にした分子量）を有することが示される（図１０）。還元ゲルにおいて、重鎖の分子量は６８ＫＤａであることが示され、かつ軽鎖の分子量は４１ＫＤａであることが示される。
【０１６４】
ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１のＴｃｄＡ及びＴｃｄＢへの結合を確認した。図１１Ａ及び図１１Ｂは、ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１の両方のトキシンへの結合と、個別の構成要素（ＡＨ３、ＡＡ６、Ｅ３及び５Ｄ）との比較を図説している。図１１Ａは、プレートを１μｇ／ｍｌのＴｃｄＡ（ＴｘＡ）でコーティングした実験の結果を示している。連続希釈されたＡＢＡＢ
−ＩｇＧを、０ｎｇ／ｍｌ、０．６４ｎｇ／ｍｌ、３．２ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ及び２０００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。それらのプレートを洗浄し、Merck社の抗体（抗ＴｃｄＡ）、Ｆｃ−ＡＢＢＡ（ＡＢＡＢ−Ｆｃ）
、Ｈａｂａｂ（ＡＢＡＢ−ＩｇＧ）並びにＶＨＨ抗ＴｃｄＢ単量体ＡＡ６及びＡＨ３を、示された量（ｎｇ／ｍｌ）で添加した。適切な標識された抗体を検出のために使用した。図１１Ｂは、プレートを１μｇ／ｍｌのＴｃｄＢ（ＴｘＢ）でコーティングした実験の結果を示している。連続希釈されたＡＢＡＢ−ＩｇＧを、０ｎｇ／ｍｌ、０．６４ｎｇ／ｍｌ、３．２ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ及び４００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。それらのプレートを洗浄し、Merck社の抗体（抗ＴｃｄＢ）、Ｆｃ−ＡＢＢＡ
（ＡＢＡＢ−Ｆｃ）、Ｈａｂａｂ（ＡＢＡＢ−ＩｇＧ）並びにＶＨＨ抗ＴｃｄＢ単量体Ｅ３及び５Ｄを、示された量（ｎｇ／ｍｌ）で添加した。適切な標識された抗体を検出のために使用した。
【０１６５】
予想されるように、四重特異性の抗体は、サンドウィッチＥＬＩＳＡによって測定されるように、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢに同時に結合することができる（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。第一の実験構成においては、プレートを１μｇ／ｍｌのＴｃｄＡ（ＴｘＡ）でコーティングした。連続希釈されたＡＢＡＢ−ＩｇＧ（Ｈａｂａｂ）を、０ｎｇ／ｍｌ、１．６ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ及び１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。それらのプレートを洗浄し、以下の量：１．６ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ及び１０００ｎｇ／ｍｌのＴｃｄＢを添加した。マウス抗ＴｘＢ抗体（５００×）及びヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（３０００×）抗体を検出のために使用した。図１２Ａに与えられた結果は、ＴｘＢがＴｘＡのコーティングによって検出されることを示しており、それは、ＩｇＧ−ＡＢＡＢがＴｘＡ／Ｂに同時に結合することを示唆している。第二の実験構成においては、プレートを１μｇ／ｍｌのＴｃｄＢ（ＴｘＢ）でコーティングした。連続希釈されたＡＢＡＢ−ＩｇＧ（Ｈａｂａｂ）を、０ｎｇ／ｍｌ、１．６ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ及び１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。それらのプレートを洗浄し、以下の量：１．６ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ及び１０００ｎｇ／ｍｌのＴｃｄＡを添加した。マウス抗ＴｘＡ抗体（５００×）及びヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（３０００×）抗体を検出のために使用した。図１２Ｂに与えられた結果は、ＴｘＡがＴｘＢのコーティングによって検出されることを示しており、これもまたＩｇＧ−ＡＢＡＢがＴｘＡ／Ｂに同時に結合することを示唆している。
【０１６６】
培養細胞においてそれらのトキシンの細胞変性効果に対するＡＢＡＢ−ＩｇＧ１の中和活性も調べた。ＴｃｄＡ（１００ｎｇ／ｍｌ、図１３Ａ）を、連続希釈されたMerck社の
抗ＴｃｄＡヒトモノクローナル抗体、ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１（Ｈａｂａｂａ）及びＶＨＨ抗ＴｃｄＡ単量体ＡＡ６及びＡＨ３と混合してから、それを１００μｌの培養培地中のベロ細胞単層に添加し、３７℃で２４時間にわたってインキュベートした。図１３Ａに与えられた結果は、ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１が、ＴｃｄＡの中和においてMerck社の抗体よりも少な
くとも１０００倍も強力であることを示している。同様の実験において、ＴｃｄＢ（１０ｐｇ／ｍｌ、図１３Ｂ）を、連続希釈されたMerck社の抗ＴｃｄＢヒトモノクローナル抗
体、ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１（Ｈａｂａｂａ）並びにＶＨＨ抗ＴｃｄＢ単量体Ｅ３及び５Ｄと混合してから、それを１００μｌの培養培地中のベロ細胞単層に添加し、３７℃で２４時間にわたってインキュベートした。図１３Ｂに与えられた結果は、ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１が、ＴｃｄＢの中和においてMerck社の抗体よりも少なくとも１０００倍も強力であること
を示している。
【０１６７】
ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１のｉｎ  ｖｉｖｏ中和活性を、ＣＤＩのマウスモデルにおいて研究し、その結果を図１４に示す。マウスを、致死用量のＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの混合物（マウス当たりに２５ｎｇの各々のトキシン）で負荷し、４時間後に、ＡＢＡＢ−ＩｇＧ（１
０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ又は１００μｇ／ｋｇ）、Merck社の抗トキシンＡ抗体及
び抗トキシンＢ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物又はＰＢＳを、そのマウスに投与した。それらの結果は、ＡＢＡＢ−ＩｇＧの中和活性が、より低い濃度でもMerck社の抗体より
も断然高いことを裏付けている。
【０１６８】
ＡＢＡＢ−ＩｇＧの動物試験
ＡＢＡＢ−ＩｇＧ１結合剤を、予防処置アッセイ及び再負荷生存アッセイの両方で試験した。図１５は、両方の研究の実験デザインを示している。６週齢〜８週齢の雌のＣ５７マウスを使用し、含まれる条件は、ＰＢＳ：１０ｍｌ／ｋｇ、腹腔内、ｎ＝１４；ＡＢＡＢ−ＩｇＧ：２００μｇ／ｋｇ、腹腔内、ｎ＝１０；ＡＢＡＢ−ＩｇＧ：１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、ｎ＝１０；ＡＢＡＢ−ＩｇＧ：５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、ｎ＝１０であった。
【０１６９】
図１６中の表は、マウスのＣ．ディフィシルの芽胞に対する予防的処置で見られた結果の概要を示している。ＡＢＡＢ−ＩｇＧ又はＰＢＳを、Ｃ．ディフィシルの芽胞の投与１日前に投与した。そこから明らかなように、ＡＢＡＢ−ＩｇＧは、ＣＤＩに対して用量に関連した予防的防御を示した。ここで、５ｍｇ／ｋｇでは、調べた全てのパラメータに対して完全な防御が示され、２００μｇ／ｋｇは、２００μｇ／ｋｇの二重特異性のＶＨＨ融合抗体ＡＢＡ（Yang et al., 2014）よりも強力であることが判明した。
【０１７０】
図１７中の表は、マウスのＣ．ディフィシルの芽胞に対する再負荷で見られた結果の概要を示している。ＡＢＡＢ−ＩｇＧ又はＰＢＳを、Ｃ．ディフィシルの芽胞の投与１５日前に投与した。そこから明らかなように、ＡＢＡＢ−ＩｇＧの１用量は、芽胞の再負荷によって引き起こされたＣＤＩに対して或る程度の防御を示したが、その防御は、一次負荷の間の防御と比較して大幅に効果が低かった。これは、時間に伴う抗体レベルの降下と、一次負荷後のＰＢＳ群における抗体生成とによるものであると考えられる。
【０１７１】
結合剤の発現、精製及び評価
様々な選択基準を用いて、本明細書のアプローチに記載される実験で作製された結合剤を選択する。第一に、本明細書に定義される構築物の各々は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる小規模組換えタンパク質の製造のための２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにおいて使用することができる。各々の構築物の産生収率は、定量的ＥＬＩＳＡによって測定することができる。第二に、組換えタンパク質の結合活性をＥＬＩＳＡ及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用してスクリーニングすることで、それらのトキシンに対する本来の結合活性を維持している構築物を選択することができる。第三に、それらのタンパク質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて中和活性について評価する（図２）。
【０１７２】
観察結果を総合すると、組換え型結合剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの多重反応性及び／又は自己反応性が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの安全性及び半減期に関する潜在的な問題であることが示唆される。原発急性ＣＤＩの予防のための全身性結合剤として選択されたＡＢＡＢ結合剤の適用には、キメラ型のヒト化されたＡＢＡＢタンパク質の多重反応性及び／又は自己反応性が制限されることが恐らく必要とされる。タンパク質プロテオミクスの進歩により、組換え型抗体の多重反応性及び自己反応性についてｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングすることが可能となった。それは、代用となる治療用抗体のための優れたツールである。したがって、良好な収率、高い結合親和性及び強力な中和活性を有する選択されたヒト化された結合剤を、潜在的な多重反応性及び自己反応性について、自己抗原マイクロアレイ試験及びＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ（Invitrogen）を用いて更に試験することができる。
【０１７３】
上記ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイから、ＡＢＡＢ−Ｆｃ結合剤及びＡＢＡＢ−ＩｇＧ結合
剤の候補を、それらのｉｎ  ｖｉｖｏ毒性、血清中半減期及び免疫原性について評価することができる。
【０１７４】
本発明はその或る特定の実施形態を参照して記載されているが、当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な修飾を行い得ることを理解する。添付の特許請求の範囲は、記載される具体的な実施形態に限定されない。
【０１７５】
参考資料
本明細書で言及される全ての特許及び出版物は、本発明の属する技術分野の当業者の技術水準の指標である。各々の引用される特許及び出版物はその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。以下の参考資料は、全て本出願で引用されている。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月22日(2020.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
四重特異性の八量体型結合剤を含む医薬製剤であって、該結合剤はヒト化結合剤であり、該ヒト化結合剤は、下記（ａ）又は（ｂ）を含み：
（ａ）ＩｇＧ抗体、２組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体、並びに２組の連結された第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体を含み、
前記ＩｇＧ抗体は２つのアームを含み、各アームは、可変領域を欠いた重鎖及び可変領域を欠いた軽鎖を含み、かつ各鎖は、アミノ末端を有しており、
該抗体の各アームにつき、１組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体及び第二のＶＨＨペプチド単量体が、該軽鎖のアミノ末端に結合されており、かつ１組の連結された第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体が、該重鎖のアミノ末端に結合されており、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有する；
（ｂ）抗体のＦｃドメイン、２組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、並びに第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体を含み、
前記抗体のＦｃドメインは２つのアームを含み、各アームは、抗体重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、かつ各アームは、アミノ末端を有しており、
該Ｆｃドメインの各アームにつき、１組の連結された第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体が、該アームのアミノ末端に結合されており、かつ、
それらのＶＨＨペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対する結合特異性を有する；
前記（ａ）及び（ｂ）の結合剤において、前記ＶＨＨペプチド単量体は、（ｉ）ＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）、（ｉｉ）ＶＨＨペプチド単量体Ｅ３（配列番号３）、（ｉｉｉ）ＶＨＨペプチド単量体ＡＡ６（配列番号５）、（ｉｖ）ＶＨＨペプチド単量体ＡＨ３（配列番号７）、又は（ｖ）これらの１つ以上の変異体であって、９５％の配列同一性を有し、かつ野生型のＶＨＨペプチド単量体のトキシン結合特異性及び／又はトキシン中和活性を維持する、
医薬製剤。
【請求項２】
前記ヒト化結合剤の第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体及び第四のＶＨＨペプチド単量体は、それぞれ異なるエピトープに対する結合特異性を有し；
前記ヒト化結合剤の前記ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ前記ヒト化結合剤の前記ＶＨＨペプチド単量体のうち２つはＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する；又は
前記ヒト化結合剤の前記ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する；
請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３】
前記ヒト化結合剤が（ａ）のヒト化結合剤であり、前記結合剤の軽鎖は、配列番号４６に示されるアミノ酸配列（ＡＡ６／Ｅ３κ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ前記結合剤の重鎖は、配列番号４４に示されるアミノ酸配列（ＡＨ３／５Ｄ重鎖）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している、請求項１に記載の結合剤。
【請求項４】
前記ヒト化結合剤が（ｂ）のヒト化結合剤であり、前記結合剤は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列（ＡＢＡＢ−Ｆｃ）又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している、請求項１に記載の結合剤。
【請求項５】
Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体においてＣ．ディフィシルによって誘発される疾患症状を治療又は予防するため；
Ｃ．ディフィシルに感染された被験体におけるＣ．ディフィシルのトキシンＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢを中和する方法であって、前記中和が部分的又は完全な中和である方法に使用される；又は
Ｃ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体においてＣ．ディフィシル感染症を治療又は予防する方法に使用される；
請求項１〜４のいずれかに記載の医薬製剤。
【請求項６】
前記ヒト化結合剤の前記ＶＨＨペプチド単量体がヒト化されている、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬製剤。
【請求項７】
前記ヒト化結合剤が（ａ）のヒト化結合剤である、請求項６に記載の医薬製剤。
【請求項８】
前記ヒト化結合剤が（ｂ）のヒト化結合剤である、請求項６に記載の医薬製剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬製剤で充填された１以上の容器を含む、キット。 
【外国語明細書】
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2020072685000002.pdf
2020072685000003.pdf
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