(57)【要約】【課題】セレウス菌が産生した嘔吐毒を簡便で迅速に検出できるセレウス菌嘔吐毒の検出方法を提供する。【解決手段】本発明のセレウス菌嘔吐毒の検出方法は、検体と、ギ酸又はトリフルオロ酢酸の水溶液と、マトリックス液とを混合して試料を作製する試料作製工程と、試料を質量分析してマススペクトルを取得するマススペクトル取得工程と、マススペクトルにおいて、セレウス菌嘔吐毒に由来するカリウムイオン付加分子のピークに基づいて、検体にセレウス菌嘔吐毒が含まれているか否かを検出する検出工程とを有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体と、ギ酸又はトリフルオロ酢酸の水溶液と、マトリックス液とを混合して試料を作製する試料作製工程と、
前記試料を質量分析してマススペクトルを取得するマススペクトル取得工程と、
前記マススペクトルにおいて、セレウス菌嘔吐毒に由来するカリウムイオン付加分子のピークに基づいて、前記検体にセレウス菌嘔吐毒が含まれているか否かを検出する検出工程と
を有する
セレウス菌嘔吐毒の検出方法。
【請求項２】
前記ギ酸水溶液の濃度が２７〜３３容量％である
請求項１に記載のセレウス菌嘔吐毒の検出方法。
【請求項３】
前記ギ酸水溶液の濃度が３０容量％である
請求項１又は２に記載のセレウス菌嘔吐毒の検出方法。
【請求項４】
前記試料作製工程は、
前記検体を前記ギ酸水溶液に懸濁して懸濁液を作製する工程と、
前記懸濁液に前記マトリックス液を混合する工程と、
前記マトリックス液を混合した前記懸濁液をプレートに滴下し、前記プレート上の前記懸濁液を乾燥させる工程とで構成される
請求項１〜３のいずれか１項に記載のセレウス菌嘔吐毒の検出方法。
【請求項５】
前記マススペクトル取得工程は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析により前記マススペクトルを取得する
請求項１〜４のいずれか１項に記載のセレウス菌嘔吐毒の検出方法。
【請求項６】
前記検出工程は、質量電荷比が１１８７．３７０〜１１９４．１９０の範囲に現れた前記ピークに基づいてセレウス菌嘔吐毒を検出する
請求項１〜５のいずれか１項に記載のセレウス菌嘔吐毒の検出方法。
【請求項７】
前記マトリックス液がシナピン酸又はα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を含む
請求項１〜６のいずれか１項に記載のセレウス菌嘔吐毒の検出方法。
【請求項８】
前記セレウス菌嘔吐毒がセレウリドである
請求項１〜７のいずれか１項に記載のセレウス菌嘔吐毒の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セレウス菌嘔吐毒の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
嘔吐型食中毒の原因菌としてBacillus cereus（以下、B. cereus又はセレウス菌という）が知られている。セレウス菌による嘔吐型食中毒は、本菌が産生するセレウリドという嘔吐毒を摂取することで発症する。セレウリドはアミノ酸とオキシ酸からなる環状のデプシペプチドである。セレウス菌を検出することに加えて、このようなセレウリドを検出することでも、セレウス菌が嘔吐型食中毒の原因菌であることを特定することができる。
【０００３】
セレウリド検出法として、細胞障害性を確認する方法やＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー/質量分析計）による分析法などが知られている。例えば、非特許文献１には、セレウス菌株の培養液の上清や食品検体にメタノールを加えてセレウリドを抽出し、セレウリド抽出液の減圧乾固物を固相抽出カラムで精製して試料を作製し、当該試料をＬＣ／ＭＳ測定し、スペクトルにおいてアンモニウムイオン付加分子ピークが検出されたか否かからセレウリドを検出する手法が開示されている。さらに、非特許文献１には、セレウリドのＨＥｐ−２細胞に対する空胞化変性活性を判定し、セレウリドを検出する手法が開示されている。具体的には、セレウス菌株の培養液を遠心分離して得た上清をＨＥｐ−２細胞の浮遊液と混合し、３７℃で２４時間培養後、倒立顕微鏡で細胞空胞化変性（細胞障害性）の有無を確認する。
【０００４】
また、セレウス菌の一部には、セレウリドを産生しないものもいる。そのため、嘔吐型食中毒の原因菌の特定のためにセレウス菌を検出する場合、食品などからセレウス菌を検出するだけでなく、食品などから分離されたセレウス菌のセレウリド産生能の有無や産生条件の確認が重要である。例えば、特許文献１には、セレウス菌について嘔吐毒合成酵素遺伝子の発現を確認することで、セレウリド産生株と非産生株を判別する方法が開示されている。具体的には、嘔吐毒合成酵素から転写されたｍＲＮＡを、逆転写酵素と特異プライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼＰＣＲ反応）により増幅し、検査対象株及び標準株（セレウリド産生株及び非産生株）の核酸量の産生曲線に基づいて、検査対象株がセレウリド産生株か否かを識別する。検査対象株がセレウリド産生株と判断された場合、セレウス菌が嘔吐型食中毒の原因菌と判断される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】公益社団法人日本食品衛生協会  著「食品衛生検査指針  微生物編  改訂第２版  ２０１８」公益社団法人日本食品衛生協会  発行  ２０１８年３月２５日
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５１４６９７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、非特許文献１に開示されているＬＣ／ＭＳを用いる手法では、前処理やＬＣ／ＭＳ測定が煩雑で時間を要することから、簡便性と迅速性に欠ける。また、非特許文献１に開示されている細胞障害性の有無を確認する手法では、細胞空胞化変性の判断に個人差が生じやすく、客観性に欠ける。さらに、細胞の前培養や空胞化変性確認培養に日数を要することから、迅速性に欠ける。
【０００８】
特許文献１に開示されている手法では、検査対象株がセレウリド産生株か否かを識別する作業が煩雑であり、さらにＲＴ−ＰＣＲ反応に時間を要するため簡便性と迅速性に欠ける。また、セレウス菌株によっては、嘔吐毒合成酵素遺伝子を有しているにもかかわらずセレウリドを産生しない菌株も存在するため、特許文献１に開示されている手法では、実際にはセレウリドが存在しないにもかかわらずセレウリドが存在する（すなわち食中毒の原因である）と誤って判断される可能性がある。そのため、セレウリドを簡便で迅速に検出できる手法が求められている。
【０００９】
そこで、本発明は、上記のような問題に鑑みてなされたものであり、セレウス菌が産生した嘔吐毒を簡便で迅速に検出できるセレウス菌嘔吐毒の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によるセレウス菌嘔吐毒の検出方法は、検体と、ギ酸又はトリフルオロ酢酸の水溶液と、マトリックス液とを混合して試料を作製する試料作製工程と、前記試料を質量分析してマススペクトルを取得するマススペクトル取得工程と、前記マススペクトルにおいて、セレウス菌嘔吐毒に由来するカリウムイオン付加分子のピークに基づいて、前記検体にセレウス菌嘔吐毒が含まれているか否かを検出する検出工程とを有する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、セレウス菌嘔吐毒であるセレウリドを簡便で迅速に検出できる。このように、セレウリドを検出することでセレウス菌を検出するので、偽陽性を抑制でき、セレウリド産生能を有するセレウス菌の迅速識別や、セレウリド産生条件の迅速評価が可能になる。よって、食中毒発生時や製品への微生物汚染事故発生時の原因調査に適切に対応できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、セレウリド標準液から作製した試料（セレウリド標準品）のマススペクトルと、食品由来セレウス菌株（セレウリド産生セレウス菌株MEP1901204）のマススペクトルの培養温度依存性を示す図である。セレウリド標準品のマススペクトル中の［Ｍ＋Ｈ］＋は水素イオン付加分子ピーク（Ｍはセレウリド分子）、［Ｍ＋Ｎａ］＋はナトリウムイオン付加分子ピーク、［Ｍ＋Ｋ］＋はカリウムイオン付加分子ピークである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（１）本発明の概要
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、各種培養条件によって培養されたセレウス菌などの菌体のコロニーから採取した検体をギ酸又はトリフルオロ酢酸の水溶液に懸濁して前処理をし、さらに質量分析用マトリックスを溶解したマトリックス液を混合して作製した試料を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF MSという）を用いて測定することで、セレウス菌嘔吐毒としてのセレウリドをカリウムイオン付加分子として簡便かつ迅速に検出できることを見出し、本発明に至った。以下で説明する発明は、この知見に基づくものである。なお、以下の実施形態は説明のための単なる例示であって、本発明は以下の実施形態に限定されるものではなく、かかる実施形態に当業者が適宜設計変更を加えたものも、本発明の特徴を備えている限り、本発明の範囲に包含される。
【００１４】
（２）本発明の実施形態のセレウス菌嘔吐毒の検出方法
本発明の実施形態のセレウス菌嘔吐毒の検出方法は、検体と、ギ酸又はトリフルオロ酢酸の水溶液と、マトリックス液とを混合して試料を作製する試料作製工程と、作製した試料を質量分析してマススペクトルを取得するマススペクトル取得工程と、得られたマススペクトルにおいて、セレウリドに由来するカリウムイオン付加分子のピークに基づいて、検体にセレウス菌嘔吐毒が含まれているか否かを検出する検出工程とを有する。
【００１５】
まず、本実施形態のセレウス菌嘔吐毒の検出方法で検査する検体について説明する。検体は、セレウリド産生能を有するセレウス菌を含むか否か検査する検査対象である食品や当該食品の周辺環境（製造工場や加工場所など）から採取した菌体を培養したものである。本実施形態では、培地に形成されたコロニーを採取したものを検体として用いる。
【００１６】
次に試料作製工程について説明する。試料作製工程では、まず、所定の濃度のギ酸又はトリフルオロ酢酸の水溶液を用意する。次に、用意したギ酸又はトリフルオロ酢酸の水溶液に検体を投入して懸濁して懸濁液を作製する。次いで、懸濁液に質量分析用マトリックスが溶解されたマトリックス液を混合する。最後に、マトリックス液を混合した懸濁液を、プレートに滴下し、プレート上の懸濁液の液滴を乾燥して試料を作製する。
【００１７】
このように、試料作製工程においてギ酸又はトリフルオロ酢酸の水溶液により検体を前処理することで、後述するマススペクトルに現れるセレウリド由来のカリウムイオン付加分子ピークの形状がシャープになり、ピーク強度も高くなり、よりピークを検出し易くなる。なお、水溶液の濃度は特に限定されないが、トリフルオロ酢酸水溶液の濃度は、好ましくは、１容量（Ｖ／Ｖ）％である。また、ギ酸水溶液の濃度は、好ましくは、３０容量％である。３０容量％の濃度のギ酸水溶液を用いることで、さらにピークの形状がシャープになり、強度も高くなり、ピークを検出し易くなる。ギ酸水溶液の濃度は、±１０％程度の誤差も許容でき、２７容量％〜３３容量％の範囲であれば、３０容量％の濃度のギ酸水溶液と同様の効果を奏する。
【００１８】
質量分析用マトリックスとしては、シナピン酸又はＨＣＣＡ：α-cyano-4-hydroxycinnamic acid（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）を用いることができる。質量分析用マトリックスとしてシナピン酸又はＨＣＣＡを用いることが好ましいが、MALDI-TOF MSの試料作製に一般的に用いられている他のマトリックス試薬を用いてもよい。マトリックス液は、このようなマトリックス試薬を、酸を含む有機溶媒などに溶解したものである。マトリックス液は、例えば、シナピン酸１０ｍｇを、１％の濃度でトリフルオロ酢酸を含む５０％の濃度のアセトニトリル溶液１ｍＬに溶解して調製する。
【００１９】
続いて、マススペクトル取得工程について説明する。マススペクトル取得工程では、試料作製工程で作製した試料を、MALDI-TOF MSにより質量分析してマススペクトルを取得する。具体的には、MALDI-TOF MS装置を用いて試料を質量分析し、試料のマススペクトルを取得する。MALDI-TOF MS装置の測定条件は、測定に用いた装置に応じて適宜設定される。
【００２０】
最後に、検出工程について説明する。検出工程では、マススペクトル取得工程で取得した試料のマススペクトルにおいて、セレウリドに由来するカリウムイオン付加分子のピーク（以下、単にカリウムイオン付加分子ピークという）に基づいて、検体にセレウリドが含まれているか否かを検出する。具体的には、マススペクトルにカリウムイオン付加分子ピークが現れている場合、検体にセレウリドが含まれていることを検出し、カリウムイオン付加分子ピークが現れていない場合、検体にセレウリドが含まれていないことを検出する。このようにして、検出工程では、検体内のセレウリドの有無を検出する。
【００２１】
カリウムイオン付加分子ピークは、カリウムイオンが付加されてイオン化されたセレウリドに対応するピークである。当該ピークは、質量電荷比（ｍ／ｚ）がカリウムイオンの付加によりイオン化したセレウリドの質量に対応する値であり、マススペクトルにおいて質量電荷比ｍ／ｚ１１９０．７８０近傍に現れる。本実施形態では、マススペクトルにおいて、質量電荷比ｍ／ｚが１１８７．３７０〜１１９４．１９０の領域にピークが現れている場合、当該ピークをカリウムイオン付加分子ピークとみなして、セレウリドを検出するようにしている。このようにすることで、他の物質に由来するピークとの混同を抑制し、かつ、セレウリドをカリウムイオン付加分子として迅速に検出できる。
【００２２】
このようにして、検体にセレウリドが含まれていることが検出された場合、セレウリド産生能を有するセレウス菌が培養に供する菌体を採取した検査対象に存在することを特定できる。菌体を採取した物又は場所から、セレウス菌の混入経路を特定でき、除菌など適切に対応できる。
【００２３】
（３）作用及び効果
実施形態のセレウス菌嘔吐毒の検出方法は、検体と、ギ酸又はトリフルオロ酢酸の水溶液と、マトリックス液とを混合して試料を作製する試料作製工程と、試料をMALDI-TOF MSにより質量分析してマススペクトルを取得するマススペクトル取得工程と、マススペクトルにおいて、セレウス菌嘔吐毒としてのセレウリドに由来するカリウムイオン付加分子のピークに基づいて、検体にセレウリドが含まれているか否かを検出する検出工程とを有する。
【００２４】
よって、実施形態のセレウス菌嘔吐毒の検出方法は、検体と、ギ酸又はトリフルオロ酢酸の水溶液と、マトリックス液とを混合して試料を作製し、セレウリドに由来するカリウムイオン付加分子のピークに基づいてセレウリドの有無を検出するので、検体からセレウリドを抽出したり、セレウリド抽出液からセレウリドを分離したりするための遠心や分画などの処理、フィルター処理などを行う必要がない。また、脂質やタンパク質などの夾雑物を除去するための洗浄処理も不要なため、試料作製工程における操作が非常に簡便である。さらに実施形態のセレウス菌嘔吐毒の検出方法は、ＬＣ／ＭＳやＲＴ−ＰＣＲなどの煩雑な測定をする必要もなく、単にMALDI-TOF MSにより試料を質量分析すればよい。よって実施形態のセレウス菌嘔吐毒の検出方法は、セレウリドを簡便で迅速に検出できる。
【００２５】
また、実施形態のセレウス菌嘔吐毒の検出方法は、セレウリドを検出することでセレウス菌の存在を特定するので、セレウリド産生能を有さないセレウス菌を検出することによる偽陽性を抑制でき、セレウリド産生能を有するセレウス菌の迅速識別が可能となる。加えて、実施形態のセレウス菌嘔吐毒の検出方法は、迅速に検体を検査できるので、種々の培養条件で培養されたセレウス菌のコロニーから採取した検体を検査することで、セレウリド産生条件の迅速評価が可能になる。よって、食中毒発生時や製品への微生物汚染事故発生時の原因調査に適切に対応できる。
【００２６】
（４）検証実験
（４−１）セレウリド由来ピークの確認
最初に、MALDI-TOF MSで得たマススペクトルに現れるセレウリド由来ピークを確認するために、セレウリド標準液をMALDI-TOF MSにより測定した。まず、濃度が５μｇ／ｍＬのセレウリド標準液（富士フイルム和光純薬社製：市販品（メタノール溶液）をアセトニトリルで希釈して調製）３．０μＬに、１２．０μＬのシナピン酸マトリックス液（組成は表１に示す）を混合し、うち１．５μＬをＭＡＬＤＩプレートに滴下して風乾し、セレウリド標準液の試料を作成した。風乾した試料をMALDI-TOF MS装置で質量分析した。測定装置及び測定条件は表２に示す通りである。
【００２７】
【表１】
2020187019.tif 000002
【００２８】
【表２】
2020187019.tif 000003
【００２９】
セレウリド標準液の試料（セレウリド標準品）を測定して得られたマススペクトルを図１の最上部に示す。図１の横軸は質量電荷比（ｍ／ｚ）、縦軸は強度（任意単位）である。マススペクトルでは、セレウリド由来ピークとして、セレウリドに水素イオンが付加された水素イオン付加分子ピーク（［Ｍ＋Ｈ］＋、Ｍはセレウリド分子）、セレウリドにナトリウムイオンが付加されたナトリウムイオン付加分子ピーク（［Ｍ＋Ｎａ］＋）及びセレウリドにカリウムイオンが付加されたカリウムイオン付加分子ピーク（［Ｍ＋Ｋ］＋）が観察された。このうち、カリウムイオン付加分子ピークの強度が最も大きかった。そのため、本発明は、カリウムイオン付加分子ピークを指標として、検体内のセレウリドの有無を検出するものである。
【００３０】
（４−２）本発明のセレウス菌嘔吐毒の検出方法の検証
次に、本発明のセレウス菌嘔吐毒の検出方法によりセレウリドの有無を検出できるか否かを確認した。具体的には、食品から分離したセレウス菌７株、陰性対照として嘔吐毒合成酵素（ＣＲＳ）遺伝子非保有セレウス菌１株（基準株）、セレウス菌と近縁のB. thuringiensis、B. mycoides及びB. weihenstephanensis各１株（それぞれ基準株）の計１１菌株を培養して得たコロニーから検体を採取し、採取した検体中のセレウリドの有無を本発明の手法により検出できるか否かを確認した。
【００３１】
まず、CycleavePCR Bacillus cereus (CRS gene) Detection Kit（タカラバイオ社製）を用いて、上記１１菌株のＣＲＳ遺伝子保有の有無を確認した。このキットは、ＣＲＳ遺伝子を検出することでセレウリド産生セレウス菌を検出するものである。ここでは、このキットを利用して、ＣＲＳ遺伝子保有の有無を判断した。その結果を表３に示す。表３に示すように、食品から分離したセレウス菌７株のうち６株（MEP1901201〜MEP1901206）がＣＲＳ遺伝子を保有していた。
【００３２】
【表３】
2020187019.tif 000004
【００３３】
次に、ＣＲＳ遺伝子を保有することが確認された食品由来セレウス菌６株（MEP1901201〜MEP1901206）と、陰性対照のＣＲＳ遺伝子非保有セレウス菌株（基準株）について、セレウリド産生能を実際に有しているか否かを確認するために、セレウス菌の培養上清中のセレウリド濃度をＬＣ／ＭＳを利用して測定した。具体的には、食品由来セレウス菌６株（MEP1901201〜MEP1901206）及び基準株を１０％脱脂粉乳培地（和光純薬社製）５０ｍＬにそれぞれ接種し、３０℃２４時間振とう培養後、培養液を遠沈管に採取した。遠沈管に採取した培養液を遠心（１，６００×ｇ、１０分）して培養上清を採取し、１００℃で１０分間加熱した。その後、培養上清２．５ｍＬを遠沈管に採取し、アセトニトリル２．５ｍＬとｎ−ヘキサン２．５ｍＬを加えて１０分間振とうした。ｎ−ヘキサン層を除去し、残った水層に再度アセトニトリルとｎ−ヘキサン各２．５ｍＬを添加して１０分間振とうした。ｎ−ヘキサン層をあわせ、窒素濃縮装置を用いて濃縮した。濃縮物をアセトニトリル５００μＬで溶解し、０．２２μｍのフィルターを通してＬＣ／ＭＳ（Agilent SL、アジレント・テクノロジー社製）で測定した。測定装置及び測定条件は表４に示す通りである。測定したセレウス菌７株の培養上清中のセレウリド濃度は、セレウリド標準液（富士フイルム和光純薬社製：市販品（メタノール溶液）をアセトニトリルで希釈して複数のセレウリド濃度の標準液を用意）の測定結果に基づいて作成した検量線から算出した。結果を上記の表３に示す。なお、表３中のｎ．ｄ．はセレウリドが検出されなかった（検出限界５ｐｐｂ）ことを意味し、ｎ．ｔ．は、上記培養上清中のセレウリド濃度を測定していないことを意味している。
【００３４】
【表４】
2020187019.tif 000005
【００３５】
表３に示すように、食品由来ＣＲＳ遺伝子保有セレウス菌６株中５株（MEP1901201〜MEP1901205）は、セレウリドが検出され、セレウリド産生能を有することを確認できた。また、陰性対照のＣＲＳ遺伝子非保有セレウス菌株（基準株）と食品由来ＣＲＳ遺伝子保有セレウス菌６株中１株（MEP1901206）は、セレウリドが検出されず、セレウリド産生能を有さないことを確認できた。なお、表３中のＪＣＭは、菌株の入手先が理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（ジャパン・コレクション・オブ・マイクロオルガニズムズ、ＪＣＭ）であることを意味し、ＮＢＲＣは、菌株の入手先が製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターであることを意味している。
【００３６】
食品由来ＣＲＳ遺伝子保有セレウス菌株MEP1901206、基準株については上述のようにセレウリド産生能を有さないことを確認し、食品由来ＣＲＳ遺伝子非保有セレウス菌株（MEP1901207）と、セレウス菌と近縁のＣＲＳ遺伝子非保有バチルス属菌株３株とはＣＲＳ遺伝子非保有なのでセレウリド産生能を有さない。そこで、セレウリド産生能を有することを確認したセレウス菌５株（MEP1901201〜MEP1901205）と、セレウリド産生能を有さないことを確認した、食品由来ＣＲＳ遺伝子保有セレウス菌株（MEP1901206）を含むバチルス属菌６株とについて、本発明のセレウス菌嘔吐毒の検出方法によりセレウリドの有無を正確に識別できるか否か検証した。
【００３７】
まず、上記の１１菌株をそれぞれ別の標準寒天平板（ＳＭＡ：Standard Method Agar、栄研化学社製）に塗抹し、３０℃で１６時間培養した。寒天平板上に形成されたコロニーを検体として採取し、３．０μＬのギ酸水溶液（濃度３０容量％、富士フイルム和光純薬社製）に検体を懸濁し、さらに、マトリックス液として表１に示す組成のシナピン酸マトリックス液を１２．０μＬ添加して混合した。この混合液１．５μＬをＭＡＬＤＩプレートに滴下して風乾して試料を作成した。この試料を菌株毎にそれぞれ作製した。さらに、マトリックス液を表１に示す組成のＨＣＣＡマトリックス液に変えて同様に菌株毎に試料を作製した。なお、セレウリド産生能を有するセレウス菌５株（MEP1901201〜MEP1901205）については、上記以外にさらに日を変えて計３回培養し、シナピン酸マトリックス液を用いて同様に試料を作製した。
【００３８】
作製した試料をそれぞれMALDI-TOF MS装置で質量分析し、マススペクトルを取得した。測定装置及び測定条件は表２に示す通りである。その後、取得したマススペクトルにおいて、観測されたピークの質量電荷比と、セレウリド標準液で観測されたカリウムイオン付加分子ピークの質量電荷比とを比較し、セレウリドに由来するカリウムイオン付加分子ピークを特定した。この作業を作製したすべての試料について行った。その結果を表３に示す。
【００３９】
表３に示す通り、セレウリド産生能を有するセレウス菌５株（MEP1901201〜MEP1901205）については、すべて、セレウリドに由来するカリウムイオン付加分子のピークが観察された。一方、食品由来セレウス菌２株（MEP1901206、MEP1901207）を含む、セレウリド産生能を有さないバチルス属菌６株については、すべて、セレウリドに由来するカリウムイオン付加分子ピークが観察されなかった。このように、本発明の手法により検体中のセレウリドの有無を検出できることが確認できた。なお、観察されたカリウムイオン付加分子のピークの質量電荷比ｍ／ｚは平均１１９０．７８０、標準偏差０．３４１であった。よって、測定誤差を考慮しても、セレウリドのカリウムイオン付加分子のピークは質量電荷比ｍ／ｚが１１８７．３７０〜１１９４．１９０（質量電荷比ｍ／ｚの平均値１１９０．７８０±１０ＳＤ（標準偏差の１０倍））の範囲で検出されると考えられる。
【００４０】
（４−３）各種培養条件によるセレウリド産生の確認
食品衛生検査指針に収載されているセレウス菌検査法などの培養条件を想定し、培地によらずセレウリドを検出できるか否かを確認するために、セレウリド産生セレウス菌５株（MEP1901201〜MEP1901205）及びセレウリド非産生セレウス菌３株（基準株、MEP1901206、MEP1901207）を、各種培地を用いて培養し、セレウリド産生セレウス菌株とセレウリド非産生セレウス菌株を正確に識別できるか確認した。使用した培地は、ＬＢ：Lysogeny Broth培地（調製培地）、ＳＭＡ培地（栄研化学社製）、ＭＹＰ：Mannitol Yolk Polymixin培地（日水製薬社製）、ＭＹＰ培地（ＢＤ:ベクトンデッキンソン社製）、ＮＧＫＧ：NaCl Glycine Kim Goepfect agar培地（栄研化学社製）であり、すべて平板である。培養条件は表５に記載の通りであり、試料作製条件（シナピン酸マトリックス液を使用）、MALDI-TOF MSの測定装置及び測定条件は、上記の検証実験と同様である。ＬＢ培地以外の培地では、培養直後の培地と、培養後に１週間冷蔵で保存した培地とからそれぞれ検体を採取した。その結果を表５に示す。
【００４１】
【表５】
2020187019.tif 000006
【００４２】
表５に示すように、培養直後及び１週間冷蔵後とも、全てのセレウリド産生セレウス菌株（MEP1901201〜MEP1901205）でセレウリド由来のカリウムイオン付加分子のピークが観察され、全てのセレウリド非産生セレウス菌株（基準株、MEP1901206、MEP1901207）でカリウムイオン付加分子のピークが観察されなかった。したがって、本発明の手法により各種培地（セレウス菌検査平板）上に形成されたコロニーからセレウリド産生を検出できることを確認できた。また、コロニーが形成された培地を冷蔵保存した場合も支障なく検出できることを確認できた。
【００４３】
（４−４）セレウス菌のセレウリド産生条件確認手法としての利用
セレウス菌のセレウリド産生条件確認に、本発明のセレウス菌嘔吐毒の検出方法を使用した。培養温度を変えてセレウス菌を培養し、採取した検体についてセレウス菌嘔吐毒の検出方法によりセレウリドの有無を検出し、培養温度とセレウリド産生の関係を調べた。
【００４４】
具体的には、セレウリド産生セレウス菌株（表３の食品由来ＣＲＳ遺伝子保有セレウス菌株MEP1901204）を４枚の標準寒天平板（ＳＭＡ、栄研化学）に塗抹し、各標準寒天平板をそれぞれ異なる温度（１２℃、１５℃、３０℃、４２℃）で４日間培養した。各寒天平板上に形成されたコロニーから検体を採取し、マトリックス液としてシナピン酸マトリックス液を用いて試料を作製し、当該試料をMALDI-TOF MS装置により質量分析した。他の試料の作製条件、測定装置及び測定条件は、上記の検証実験と同様である。その後、得られたマススペクトルにおいて、セレウリド由来のカリウムイオン付加分子のピークの有無から、セレウリドが産生されたか否か判断した。MALDI-TOF MS測定により得られたマススペクトルを図１に示す。
【００４５】
図１に示すように、１２℃、１５℃、３０℃で培養した場合は、質量電荷比ｍ／ｚが１１８７．３７０〜１１９４．１９０の範囲にピークが観察され、マススペクトルにおいてセレウリド由来のカリウムイオン付加分子のピークが有り、セレウリドが産生されたことが確認できた。一方、４２℃で培養した場合は、質量電荷比ｍ／ｚが１１８７．３７０〜１１９４．１９０の範囲にピークが観察されず、マススペクトルにおいてカリウムイオン付加分子のピークが無く、セレウリドが産生されていないことが確認できた。この実験結果は、４０℃を超える培養温度ではセレウリド産生が認められないとの文献情報（Kranzler et al. “Temperature exerts control of Bacillus cereus emetic toxin production on post-transcriptional levels.” Front Microbiol.7:1640 2016.)と一致した。このように、本発明の手法はセレウリド産生条件を簡便かつ迅速に確認する手法としても有用であった。
【図１】
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