(57)【要約】【課題】１，４−ブタンジオールおよびその前駆体の生合成のための組成物および方法の提供。【解決手段】本発明は、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、またはα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を有する４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）生合成経路を有する微生物を含む天然に存在しない微生物生体触媒を提供し、ここで、外因性核酸は、単量体４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）を生産するのに十分な量で発現される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然に存在しない微生物生体触媒または方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、一般には、生物のインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）設計に関し、より具体的には、１，４−ブタンジオール生合成能力を有する生物に関する。
【０００２】
化合物である４−ヒドロキシブタン酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）（４−ヒドロキシブタン酸塩（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏａｔｅ）、４−ヒドロキシ酪酸塩（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）、４−ＨＢ）は、種々の商品および特殊な化学製品のための構成要素として産業上の潜在能力を有する４個の炭素のカルボン酸である。特に、４−ＨＢは、溶媒、レジン、ポリマー前駆体、および特殊な化学製品を含む、１，４−ブタンジオールファミリーの化学製品に新しいエントリーポイントとして役立つ潜在能力を有する。１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）は、ポリマー中間体および産業上溶媒であり、世界市場が約３０億ポンド／年である。現在、ＢＤＯは、石油化学前駆体、主としてアセチレン、無水マレイン酸、および酸化プロピレンから生産されている。
【０００３】
例えば、アセチレンをＲｅｐｐｅ合成反応（ＫｒｏｓｃｈｗｉｔｚおよびＧｒａｎｔ、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９））において２分子のホルムアルデヒドと反応させ、その後、接触水素化によって、１，４−ブタンジオールを形成する。米国で生産される９０％のアセチレンは、ブタンジオール生産のために消費されることが推定されている。あるいは、ブタンジオールは、ブタンから誘導される無水マレイン酸のエステル化および接触水素化によって形成することができる。下流では、ブタンジオールは、例えば、ピロリドンおよびＮ−メチル−ピロリドンにさらに転換することができる□−ブチロラクトンへの酸化によって、またはテトラヒドロフランへの水素化分解によって、さらに変換することができる（図１）。これらの化合物は、ポリマー中間体、溶媒、および添加物として様々な用途を有し、ほぼ２０億ポンド／年の複合市場を有する。
【０００４】
石油系原料の代わりに再生可能なエネルギーを用いるだけでなく、より少ないエネルギーおよび資本集約的なプロセスを用いる代替手段によってこれらの化学物質を生産する方法を開発することが望ましい。エネルギー省は、ブタンジオールファミリーの製品を製造するための主要な生物学的に生産される中間体として、１，４−二塩基酸、特にコハク酸を提案している（ＤＯＥレポート、”Ｔｏｐ  Ｖａｌｕｅ−Ａｄｄｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｏｍａｓｓ”，２００４）。しかしながら、コハク酸は、単離し、精製するには費用が嵩み、ブタンジオールへの接触還元のために高温および高圧を必要とする。
【０００５】
したがって、商業的量の１，４−ブタンジオールおよびその化学的前駆体を効率的に生産するための代替手段が必要である。本発明は、この必要性を満たすものであり、同様に関連した利点を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、またはα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を有する４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）生合成経路を有する微生物を含む天然に存在しない微生物生体触媒を提供し、ここで、外因性核酸は、単量体４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）を生産するのに十分な量で発現される。また、４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）および１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）生合成経路を有する微生物を含む天然に存在しない微生物生体触媒が提供され、この経路は、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸塩：ＣｏＡ転移酵素、４−酪酸キナーゼ、ホスホトランスブチリラーゼ、α−ケトグルタル酸脱炭酸酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素またはアルデヒド／アルコール脱水素酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、ここで、外因性核酸は、１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）を生産するのに十分な量で発現される。さらに、４−ＨＢを生産する方法が提供される。この方法は、実質的な嫌気的条件下で、単量体４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）を生産するのに十分な時間、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、またはα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）生合成経路を有する天然に存在しない微生物を培養することを含む。さらに、ＢＤＯを生産する方法が提供される。この方法は、４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）および１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）生合成経路を有する微生物を含む、天然に存在しない微生物の生体触媒を培養することを含み、この経路は、１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）を生産するのに十分な時間、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸塩：ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、ホスホトランスヒドロキシブチリラーゼ、α−ケトグルタル酸脱炭酸酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素またはアルデヒド／アルコール脱炭酸酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む。４−ＨＢおよび／またはＢＤＯ生産物は、培地に分泌され得る。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
天然に存在しない微生物生体触媒であって、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、またはα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）生合成経路を有する微生物を含み、該外因性核酸が、単量体４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）を分泌するのに十分な量で発現される、天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目２）
上記４−ＨＢ生合成経路が、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素およびスクシニル−ＣｏＡ合成酵素およびＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、またはα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素を含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目３）
上記外因性核酸が、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素をコードする、項目１に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目４）
外因性のα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素をコードする核酸をさらに含む、項目３に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目５）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、２以上の外因性核酸をさらに含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目６）
外因性のスクシニル−ＣｏＡ合成酵素、外因性のＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素または外因性のスクシニル−ＣｏＡ合成酵素および外因性のＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする核酸をさらに含む、項目３に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目７）
上記微生物が、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、およびα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素から選択される内因性の４ＨＢ生合成活性を欠如している、項目１に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目８）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、異種のコード化する核酸をさらに含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目９）
上記単量体４−ＨＢが、少なくとも約５ｍＭの細胞内濃度で発現される、項目１に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目１０）
約１０ｍＭ以上の細胞内濃度の上記単量体４−ＨＢをさらに含む、項目９に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目１１）
実質的に嫌気性の培地をさらに含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目１２）
４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）および１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）生合成経路を有する微生物を含む天然に存在しない微生物生体触媒であって、該経路が、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸塩：ＣｏＡ転移酵素、４−酪酸キナーゼ、ホスホトランスブチリラーゼ、α−ケトグルタル酸脱炭酸酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素またはアルデヒド／アルコール脱水素酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、該外因性核酸が１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）を生産するのに十分な量で発現される、天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目１３）
上記４−ＨＢ生合成経路が、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素およびスクシニル−ＣｏＡ合成酵素およびＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素またはα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素を含む、項目１２に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目１４）
上記外因性核酸が４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素をコードする、項目１２に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目１５）
外因性のα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素をコードする核酸をさらに含む、項目１４に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目１６）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、２以上の外因性核酸をさらに含む、項目１２の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目１７）
外因性のスクシニル−ＣｏＡ合成酵素、外因性のＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素または外因性のスクシニル−ＣｏＡ合成酵素および外因性のＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする核酸をさらに含む、項目１４に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目１８）
上記微生物が、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素およびα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素から選択される外因性の４−ＨＢ生合成活性を欠如している、項目１２に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目１９）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、異種のコード化する核酸をさらに含む、項目１２に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目２０）
上記外因性核酸が、単量体４−ヒドロキシブタン酸を生産するのに十分な量で発現される、項目１４、１５または１７に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目２１）
上記ＢＤＯ生合成経路が、アルデヒド脱水素酵素、およびアルコール脱水素酵素またはアルデヒド／アルコール脱水素酵素を含む、項目１２に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目２２）
上記ＢＤＯ生合成経路が、４−ヒドロキシ酪酸塩：ＣｏＡ転移酵素または４−酪酸キナーゼおよびホスホトランスブチリラーゼをさらに含む、項目２１に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目２３）
上記外因性核酸が、アルデヒド／アルコール脱水素酵素をコードする、項目２１に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目２４）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、２以上の外因性核酸をさらに含む、項目２１に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目２５）
上記微生物が、４−ヒドロキシ酪酸塩：ＣｏＡ転移酵素、４−酪酸キナーゼ、ホスホトランスブチリラーゼ、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素およびアルデヒド／アルコール脱水素酵素から選択される内因性のＢＤＯ生合成活性を欠如している、項目２１または２２に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目２６）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、異種のコード化する核酸をさらに含む、項目２１に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目２７）
実質的に嫌気性の培地をさらに含む、項目１２に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目２８）
上記単量体ＢＤＯが、少なくとも約５ｍＭの細胞内濃度で発現される、項目２５に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目２９）
約１０ｍＭ以上の細胞内濃度の上記単量体ＢＤＯをさらに含む、項目２８に記載の天然に存在しない微生物生体触媒。
（項目３０）
４−ＨＢを生産する方法であって、実質的な嫌気的条件下で、単量体４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）を生産するのに十分な期間、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、またはα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）生合成経路を有する天然に存在しない微生物を培養することを含む、方法。
（項目３１）
上記４−ＨＢ生合成経路が、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素およびスクシニル−ＣｏＡ合成酵素およびＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素またはα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
上記外因性核酸が、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素をコードする、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
上記天然に存在しない微生物が、外因性のα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素をコードする核酸をさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、２以上の外因性核酸をさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目３５）
外因性のスクシニル−ＣｏＡ合成酵素、外因性のＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素または外因性のスクシニル−ＣｏＡ合成酵素および外因性のＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする核酸をさらに含む、項目３２に記載の方法。（項目３６）
上記天然に存在しない微生物が、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素およびα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素から選択される内因性の４−ＨＢ生合成活性を欠如している、項目３０に記載の方法。
（項目３７）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、異種のコード化する核酸をさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目３８）
上記単量体４−ＨＢが、少なくとも約５ｍＭの細胞内濃度で発現される、項目３０に記載の方法。
（項目３９）
約１０ｍＭ以上の細胞内濃度の上記単量体４−ＨＢをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
４−ＨＢを単離することをさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目４１）
ｐＨが約７．５以下である培地をさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目４２）
γ−ブチロラクトン（ＧＢＬ）を単離することをさらに含む、項目４１に記載の方法。（項目４３）
上記ＧＢＬの単離が、ＧＢＬの分離を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
実質的に純粋なＧＢＬを生産するために蒸留をさらに含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
１−４ブタンジオール（ＢＤＯ）を生産するために、４−ＨＢ、ＧＢＬまたはそれらの混合物の化学的水素化をさらに含む、項目３０または４４に記載の方法。
（項目４６）
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を生産するために、４−ＨＢ、ＧＢＬまたはそれらの混合物の化学的水素化をさらに含む、項目３０または４４に記載の方法。
（項目４７）
ＢＤＯを生産するための方法であって、該方法は、１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）を生産するのに十分な時間、４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）および１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）生合成経路を有する微生物を含む、天然に存在しない微生物生体触媒を培養することを含み、該経路は、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸塩：ＣｏＡ転移酵素、４−酪酸キナーゼ、ホスホトランスブチリラーゼ、α−ケトグルタル酸脱炭酸酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素またはアルデヒド／アルコール脱水素酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、方法。
（項目４８）
上記４−ＨＢ生合成経路が、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素およびスクシニル−ＣｏＡ合成酵素およびＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素またはα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素を含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
上記外因性核酸が、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素をコードする、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
外因性のα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素をコードする核酸をさらに含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、２以上の外因性核酸をさらに含む、項目４７に記載の方法。
（項目５２）
外因性のスクシニル−ＣｏＡ合成酵素、外因性のＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素または外因性のスクシニル−ＣｏＡ合成酵素および外因性のＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする核酸をさらに含む、項目４９に記載の方法。（項目５３）
上記微生物が、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素およびα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素から選択される内因性の４−ＨＢ生合成活性を欠如している、項目４７に記載の方法。
（項目５４）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、異種のコード化する核酸をさらに含む、項目４７に記載の方法。
（項目５５）
上記外因性核酸が、単量体４−ヒドロキシブタン酸を生産するのに十分な量で発現される、項目４９、５０、または５２に記載の方法。
（項目５６）
上記ＢＤＯ生合成経路が、アルデヒド脱水素酵素およびアルコール脱水素酵素またはアルデヒド／アルコール脱水素酵素を含む、項目４７に記載の方法。
（項目５７）
上記ＢＤＯ生合成経路が、４−ヒドロキシ酪酸塩：ＣｏＡ転移酵素または４−酪酸キナーゼおよびホスホトランスブチリラーゼをさらに含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、２以上の外因性核酸をさらに含む、項目５６に記載の方法。
（項目５９）
上記微生物が、４−ヒドロキシ酪酸塩：ＣｏＡ転移酵素、４−酪酸キナーゼ、ホスホトランスブチリラーゼ、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素およびアルデヒド／アルコール脱水素酵素から選択される内因性のＢＤＯ生合成活性を欠如している、項目５６または５７に記載の方法。
（項目６０）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、異種のコード化する核酸をさらに含む、項目５６に記載の方法。
（項目６１）
実質的に嫌気性の培地をさらに含む、項目４７に記載の方法。
（項目６２）
上記単量体ＢＤＯが、少なくとも約５ｍＭの細胞内濃度で発現される、項目５９に記載の方法。
（項目６３）
約１０ｍＭ以上の細胞内濃度の上記単量体ＢＤＯをさらに含む、項目６２に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）ファミリーの化合物の生産物パイプラインに４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）のエントリーポイントを示す略図であり、石油化学原料から化学合成ルートとの比較である。実線の黒色の矢印は、化学合成ルートを示す；破線の青色の矢印は、４−ＨＢ、続くＢＤＯファミリー化合物への変換工程までの生合成ルートを示す。
【図２】４−ヒドロキシ酪酸塩（４−ＨＢ）生産までの生化学経路および１，４−ブタンジオール生産までの生化学経路を示す略図である。最初の５工程は、Ｅ．ｃｏｌｉに対して内因性であり、残りは、異種的に発現され得る。生合成反応を触媒する酵素は、（１）スクシニル−ＣｏＡ合成酵素；（２）ＣｏＡ非依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素；（３）α−ケトグルタル酸脱水素酵素；（４）グルタミン酸塩：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ；（５）グルタミン酸脱炭酸酵素；（６）ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素；（７）４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素；（８）α−ケトグルタル酸脱炭酸酵素；（９）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡ転移酵素；（１０）酪酸キナーゼ；（１１）ホスホトランスブチリラーゼ；（１２）アルデヒド脱水素酵素；（１３）アルコール脱水素酵素である。
【図３】Ｅ．ｃｏｌｉにおけるホモセリン生合成を示す略図である。
【図４】Ｌ−ホモセリンから４−ＨＢへの予測されるホモセリン生体経路の略図を示す。工程１は、推定されたアンモニア−リアーゼ（ＥＣクラス４．３．１）であり、推定されたΔｒｘｎＧは１２ｋＪ／ｍｏｌである。工程２は、推定された酸化還元酵素（ＥＣクラス１．３．１）であり、推定されたΔｒｘｎＧは−５９ｋＪ／ｍｏｌである。
【図５】フマル酸を介したコハク酸へのアスパラギン酸変換のための内因性Ｅ．ｃｏｌｉ経路のための略図を示す。この経路は、予測されるホモセリン生体経路に類似した化学を示す。
【図６】ＢＤＯへの、（Ａ）ホモセリン生合成経路と（Ｂ）スクシニル−ＣｏＡ生合成経路との間の比較を図示する略図を示す。
【図７】Ｅ．ｃｏｌｉにおけるアセト酢酸塩への生化学経路を示す略図である。
【図８】コハク酸セミアルデヒドを介したアセト酢酸塩からＢＤＯへの生化学経路を示す略図である。
【図９】Ｄ−リジン−５，６−アミノムターゼの反応スキームを示す略図である。
【図１０】アセチル−ＣｏＡからアセト酢酸塩への経路を示す略図である。酵素は、（１）ピルビン酸ギ酸−リアーゼ、（２）ピルビン酸脱水素酵素、（３）アセチル−ＣｏＡ：アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素、（４）アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチル転移酵素、（５）ホスホトランスアセチラーゼ、および（６）酢酸キナーゼである。酵素７は、図８における多工程のアセト酢酸塩〜ＢＤＯ経路を表す。
【図１１】４−ＨＢ経路遺伝子の種々の組み合わせを発現するプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ菌株を用いた、グルコース最少培地における４−ＨＢ生産を示す。（ａ）培養ブロス中の４−ＨＢ濃度；（ｂ）培養ブロス中のコハク酸塩濃度；（ｃ）６００ｎｍで測定される培養物ＯＤ。バーのクラスターは、２４時間、４８時間、および７２時間（測定される場合）の時間点を表す。ｘ軸に沿った記号は、用いられた菌株／プラスミドの組み合わせを示す。最初の見出しは、宿主菌株を指す：１、ＭＧ１６５５  ｌａｃＩＱ；２、ＭＧ１６５５  ΔｇａｂＤ  ｌａｃＩＱ；３、ＭＧ１６５５  ΔｇａｂＤ  ΔａｌｄＡ  ｌａｃＩＱ。２番目の見出しは、用いられるプラスミドの組み合わせを指す：１、ｐＺＥ１３−０００４−００３５およびｐＺＡ３３−００３６；２、ｐＺＥ１３−０００４−００３５およびｐＺＡ３３−００１０ｎ；３、ｐＺＥ１３−０００４−０００８およびｐＺＡ３３−００３６；４、ｐＺＥ１３−０００４−０００８およびｐＺＡ３３−００１０ｎ；５、対照ベクターｐＺＥ１３およびｐＺＡ３３。
【図１２】Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素を発現しているＥ．ｃｏｌｉ菌株におけるグルコースから４−ＨＢの生産を示す。菌株１〜３は、ｐＺＥ１３−００３２およびｐＺＡ３３−００３６を含む。菌株４は、空ベクターｐＺＥ１３およびｐＺＡ３３のみを発現する。宿主菌株は次のとおりである：１および４、ＭＧ１６５５  ｌａｃＩＱ；２、ＭＧ１６５５  ΔｇａｂＤ  ｌａｃＩＱ；３、ＭＧ１６５５  ΔｇａｂＤ  ΔａｌｄＡ  ｌａｃＩＱ。バーは、２４時間および４８時間での濃度を指す。
【図１３】組換えＥ．ｃｏｌｉ菌株における１０ｍＭの４−ＨＢからのＢＤＯ生産を示す。番号付けされた位置は、ｐＺＡ３３−００２４を含み、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのｃａｔ２を発現するＭＧ１６５５  ｌａｃＩＱを用いた実験に対応し、下記の遺伝子がｐＺＥ１３で発現される：１、なし（対照）；２、０００２；３、０００３；４、０００３ｎ；５、００１１；６、００１３；７、００２３；８、００２５；９、０００８ｎ；１０、００３５。遺伝子の番号は表６において定義されている。各位置については、バーは、それぞれ好気的、微好気的、および嫌気的条件を指す。微好気的条件は、培養チューブを密封するが、それらから気体を抜かないことによって作成した。
【図１４】４ｇ／Ｌの未標識グルコース（ａ、ｃ、ｅ、およびｇ）、均一に標識した１３Ｃ−グルコース（ｂ、ｄ、ｆ、およびｈ）で補足されたＭ９最少培地において増殖させたＭＧ１６５５  ｌａｃＩＱ  ｐＺＥ１３−０００４−００３５−０００２  ｐＺＡ３３−００３４−００３６によって生産される４−ＨＢおよびＢＤＯの質量分析を示す。（ａ）および（ｂ）は、誘導体化されたＢＤＯの、質量１１６の特徴的断片、２個の炭素原子を含む；（ｃ）および（ｄ）、誘導体化されたＢＤＯの、質量１７７の特徴的断片、１個の炭素原子を含む；（ｅ）および（ｆ）、誘導体化された４−ＨＢの、質量１１７の特徴的断片、２個の炭素原子を含む；（ｇ）および（ｈ）、誘導体化された４−ＨＢの、質量２３３の特徴的断片、４個の炭素原子を含む。
【図１５】γ−ブチロラクトンを生産するためのバイオプロセスの系統的なプロセスフロー図である。パネル（ａ）は、バッチ分離を伴う流加発酵を図示し、パネル（ｂ）は、連続分離を伴う流加発酵を図示する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）、γ−ブチロラクトンおよび１，４−ブタンジオールのための生合成生産能力を有する細胞および生物の設計および生産に関する。一態様では、本発明は、４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）および１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）の生合成生産のための代謝的設計を同定するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ代謝のインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）の化学量論的モデルを利用する。本明細書に記載される結果は、代謝経路が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよび他の細胞または生物における４−ＨＢ、並びに１，４−ブタンジオールなどの下流生産物の生合成を達成するように設計され、組換え的に操作され得ることを示す。例えば、インシリコ設計についての４−ＨＢの生合成生産は、設計された代謝遺伝子型を有する菌株の構築によって確かめることができる。また、これらの代謝的に操作された細胞または生物は、理論的に最大の増殖に近づく条件下を含む、４−ＨＢ生合成をさらに増加させるための適応進化に供され得る。
【０００９】
ある種の態様では、設計された菌株に特徴的な４−ＨＢ生合成は、それらを遺伝的に安定させ、特に連続的なバイオプロセスにおいて有用にさせる。別の菌株設計戦略は、ＣｏＡ非依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素およびＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、またはグルタミン酸塩：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼのいずれからの４−ＨＢおよび１，４−ブタンジオールを生産する代謝経路をもたらすＥ．ｃｏｌｉに、種々の非天然または異種の反応能力の組み込みを用いて同定された。Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母種の両方において、これらの代謝経路の各々から４−ＨＢの生合成をもたらすインシリコの代謝設計が同定された。１，４−ブタンジオール中間体のγ−ブチロラクトンは、ｐＨ＜７．５の条件下、特に酸性条件下、例えば、ｐＨ５．５未満、例えば、ｐＨ＜７、ｐＨ＜６．５、ｐＨ＜６、および特にｐＨ＜５．５以下で自然環化によって培養中に生産可能である。
【００１０】
プラットフォームの計算要素を介して同定された菌株は、４−ＨＢ、１，４−ブタンジオールまたは他の中間体および／または下流生産物の生合成生産をもたらす予測される代謝代替物のいずれかを遺伝子操作することによって実際の生産に乗せることができる。なお更なる態様では、これらの化合物の生合成生産を示す菌株は、さらに、生産物生合成をさらに増加するための適応進化に供され得る。また、適応進化後の生産物生合成収率のレベルは、このシステムの計算要素によって予測可能である。
【００１１】
他の特定の態様では、微生物は、コハク酸塩から４−ＨＢおよび４−ＨＢ−ＣｏＡへの酵素的工程をコードする４−ＨＢ生合成経路を発現するように構築された。宿主微生物におけるコハク酸補酵素Ａ転移酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、ＮＡＤ依存性４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素および４−ヒドロキシ酪酸補酵素Ａ転移酵素の同時発現は、４−ＨＢ生合成経路を欠如している宿主微生物と対比して、４−ＨＢの優位な生産をもたらした。更なる特定の態様では、α−ケトグルタル酸脱炭酸酵素およびＮＡＤ依存性４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードする核酸を導入することによって、基質としてα−ケトグルタル酸塩を利用する４−ＨＢを生産する微生物が生じた。
【００１２】
別の特定の態様では、４−ＨＢの存在下で培養したとき、ＢＤＯを生合成する１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）生合成経路を含む微生物を構築した。ＢＤＯ生合成経路は、多機能性アルデヒド／アルコール脱水素酵素のいずれかをコードする核酸、あるいはアルデヒド脱水素酵素およびアルコール脱水素酵素をコードする核酸からなっていた。４−ＨＢ基質による増殖を支持するために、これらのＢＤＯを生産する微生物もホスホトランスヒドロキシブチリラーゼとともに、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素または４−酪酸キナーゼを発現した。なお更なる特定の態様では、機能的な４−ＨＢ生合成経路、並びに機能的なＢＤＯ生合成経路をコードする核酸の外因性発現を通じたＢＤＯを合成する微生物を生じた。４−ＨＢ生合成経路は、コハク酸補酵素Ａ転移酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、ＮＡＤ依存性４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素および４−ヒドロキシ酪酸補酵素Ａ転移酵素からなっていた。ＢＤＯ経路は、多機能性アルデヒド／アルコール脱水素酵素からなっていた。
【００１３】
本明細書中で使用するとき、用語「天然に存在しない」とは、本発明の微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）または微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に言及して用いられる場合、微生物が、参照される種の野生型の菌株を含む、参照される種の天然に存在している菌株においては通常見いだされない少なくとも１つの遺伝的改変を有することを意味することが意図される。遺伝的改変には、例えば、代謝性ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を誘導する修飾、他の核酸付加、核酸欠失および／または微生物の遺伝物質の他の機能的破壊が挙げられる。このような修飾には、例えば、参照される種に対して、異種、同種または異種および同種ポリペプチドの両方をコードする領域およびその機能的な断片が含まれる。更なる修飾には、例えば、修飾により遺伝子またはオペロンの発現が改変される非コーディング調節領域が挙げられる。例示的な代謝性ポリペプチドには、４−ＨＢ生合成経路内の酵素、並びに化合物のＢＤＯファミリーのための生合成経路内の酵素が含まれる。
【００１４】
代謝性修飾とは、天然に存在する状態から改変される生化学的反応を指す。したがって、天然に存在しない微生物は、代謝性ポリペプチド、またはその機能性断片をコードする核酸に対する遺伝子修飾を有する。例示的な代謝性修飾は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母微生物の両方について、さらに下記に記載されている。
【００１５】
本明細書中で使用するとき、用語「単離された」とは、微生物に言及して用いられる場合、参照された微生物が天然に見いだされるときの少なくとも１つの成分が実質的にない生物を意味することが意図される。この用語には、天然の環境に見いだされるときのいくつかのまたは全ての成分から取り除かれている微生物が含まれる。また、この用語には、微生物が天然に存在しない環境において見いだされるときのいくつのまたは全ての成分から取り除かれている微生物が含まれる。したがって、単離された微生物は、他の物質とは部分的にまたは完全に分離され、それは、天然に見いだされるか、または天然に存在しない環境において増殖され、保存され、もしくは存在するためである。単離された微生物の具体的な例には、部分的には純粋な微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）、実質的に純粋な微生物、天然に存在しない培地で培養された微生物が含まれる。
【００１６】
本明細書中で使用するとき、用語「微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）」、「微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「微生物（ｍｉｃｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」とは、古細菌、細菌または真核生物（ｅｕｋａｒｙａ）の範囲内に含まれる微小細胞として存在するいずれかの生物を意味することが意図される。したがって、この用語は、原核細胞もしくは真核細胞または微小サイズを有する生物を包含することが意図され、全ての種の細菌、古細菌および真正細菌、並びに酵母および真菌などの真核微生物を含む。また、この用語は、生化学的な生産のために培養され得るいずれかの種の細胞培養物を含む。
【００１７】
本明細書中で使用するとき、用語「４−ヒドロキシブタン酸」とは、化学式Ｃ４Ｈ８Ｏ３、分子量１０４．１１ｇ／ｍｏｌ（そのナトリウム塩については１２６．０９ｇ／ｍｏｌ）である酪酸の４−ヒドロキシ誘導体を意味することが意図される。また、化合物の４−ヒドロキシブタン酸は、４−ＨＢ、４−ヒドロキシ酪酸塩、ガンマ−ヒドロキシ酪酸またはＧＨＢとして、当該技術分野において知られている。この用語は、本明細書中で使用するとき、いずれかの化合物の種々の塩の形態を含むことが意図され、例えば、４−ヒドロキシブタン酸塩および４−ヒドロキシ酪酸塩が含まれる。４−ＨＢについての塩形態の具体例には、ナトリウム４−ＨＢおよびカリウム４−ＨＢが含まれる。したがって、用語４−ヒドロキシブタン酸、４−ＨＢ、４−ヒドロキシ酪酸塩、４−ヒドロキシブタン酸塩、ガンマ−ヒドロキシ酪酸およびＧＨＢ、並びに他の技術認識された名称は、本明細書では同意語として用いられる。
【００１８】
本明細書中で使用するとき、用語「単量体」とは、４−ＨＢに言及して用いられる場合、非ポリマー性または誘導体化されていない形態である４−ＨＢを意味することが意図される。高分子性４−ＨＢの具体例には、ポリ−４−ヒドロキシブタン酸、並びに例えば、４−ＨＢおよび３−ＨＢの共重合体が含まれる。４−ＨＢの誘導体化形態の具体例は、４−ＨＢ−ＣｏＡである。他の高分子性４−ＨＢ形態および４−ＨＢの他の誘導体化形態も当該技術分野において知られている。
【００１９】
本明細書中で使用するとき、用語「γ−ブチロラクトン」とは、化学式Ｃ４Ｈ６Ｏ２、分子量８６．０８９ｇ／ｍｏｌを有するラクトンを意味することが意図される。また、化合物γ−ブチロラクトンは、ＧＢＬ、ブチロラクトン、１，４−ラクトン、４−ブチロラクトン、４−ヒドロキシ酪酸ラクトン、およびガンマ−ヒドロキシ酪酸ラクトンとして、当該技術分野において知られている。この用語は、本明細書中で使用するとき、化合物の種々の塩形態のいずれかを含むことが意図される。
【００２０】
本明細書中で使用するとき、用語「１，４−ブタンジオール」とは、化学式Ｃ４Ｈ１０Ｏ２、分子量９０．１２ｇ／ｍｏｌを有する２つのヒドロキシル基を担持するアルカンブタンのアルコール誘導体を意味することが意図される。また、化合物１，４−ブタンジオールは、ＢＤＯとして当該技術分野において知られ、ＢＤＯファミリーの化合物として本明細書において言及される化合物のファミリーの化学的中間体または前駆体であり、それらのいくつかは図１に例示されている。
【００２１】
本明細書中で使用するとき、用語「テトラヒドロフラン」とは、化学式Ｃ４Ｈ８Ｏ、分子量７２．１１ｇ／ｍｏｌを有する芳香族化合物フランの完全に水素化された類似体に対応する複素環式有機化合物を意味することが意図される。また、化合物テトラヒドロフランは、ＴＨＦ、テトラヒドロフラン、１，４−エポキシブタン、ブチレン酸化物、シクロテトラメチレン酸化物、オキサシクロペンタン、ジエチレンオキシド、オキソラン、フラニジン、ヒドロフラン、テトラ−メチレンオキシドとして、当該技術分野において知られている。この用語は、本明細書中で使用するとき、化合物の種々の塩形態のいずれかを含むことが意図される。
【００２２】
本明細書中で使用するとき、用語「ＣｏＡ」または「補酵素Ａ」とは、その存在が、活性な酵素系を形成するために多くの酵素（アポ酵素）の活性に必要とされる有機補因子または補欠分子族（酵素の非タンパク質部分）を意味することが意図される。補酵素Ａは、ある種の縮合酵素において機能し、アセチルまたは他のアシル基転移において、脂肪酸合成および酸化、ピルビン酸酸化において、並びに他のアセチル化において作用する。
【００２３】
本明細書中で使用するとき、用語「実質的に嫌気的」とは、培養または増殖条件に言及して用いられる場合、酸素量が、液体培地に含まれる溶存酸素に関して、飽和の約１０％未満であることを意味することが意図される。また、この用語は、約１％未満の酸素の雰囲気で維持された液体または固体培地の密封したチャンバーを含むことが意図される。
【００２４】
本発明の天然に存在しない微生物は、安定な遺伝的改変を含むことができ、それは、その改変を失わずに、５を超える世代間、培養することができる微生物を指す。一般に、安定な遺伝的改変には、１０を超える世代で持続する修飾を含み、特別には安定な修飾は、約２５より多い世代で持続し、より特別には安定な遺伝的修飾は、５０を超える世代であり、無限の場合を含む。
【００２５】
当業者は、本明細書中に例示された代謝性修飾を含む遺伝的改変は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母遺伝子並びにそれらの対応する代謝反応に関連して記載されていることを理解する。しかしながら、幅広い生物の完全なゲノム配列決定、並びにゲノミックスの領域における高いレベルの技術を考慮すると、当業者は、本明細書において与えられる教示およびガイダンスを本質的に全ての他の生物に容易に適用することができる。例えば、本明細書において例示されているＥ．ｃｏｌｉの代謝変調は、参照される種以外の種から同じであるかまたは類似のコード化する核酸を組み込むことによって他の種に容易に適用することができる。このような遺伝的改変には、例えば、一般には、種ホモログの遺伝的改変、具体的には、オルソログ、パラログまたは非オルソロガス遺伝子置換が含まれる。
【００２６】
オルソログは、垂直降下によって関連付けられ、異なる生物において実質的に同じ（ｓａｍｅ）または同一（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）の機能に関与している。例えば、マウスのエポキシド加水分解酵素およびヒトのエポキシド加水分解酵素は、エポキシドの加水分解の生物学的機能についてオルソログであると考えることができる。遺伝子は、例えば、それらが相同性であるか、または共通の祖先からの進化によって関連付けられていると示すのに十分な量の配列類似性をそれらが共有する場合に、垂直降下によって関連付けられる。また、遺伝子は、３次元構造を共有するが、しかし、一次配列の類似性が同一のものと確認することができない程度まで共通の祖先から進化してきたことを指示するのに十分な量の配列類似性を必ずしも共有しない場合にも、オルソログであると考えることができる。オルソロガスである遺伝子は、約２５％の配列類似性から１００％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードすることができる。また、２５％未満のアミノ酸配列の類似性を共有するタンパク質をコードする遺伝子は、それらの３次元構造も類似性を示す場合に、垂直降下によって生じていると考えることができる。組織プラスミノーゲン活性化因子およびエラスターゼを含む酵素のセリンプロテアーゼファミリーのメンバーは、共通の祖先から垂直降下によって生じていると考えられる。
【００２７】
オルソログには、例えば、進化を通じて、構造または全体の活性において分化してきた遺伝子またはそれらがコードする遺伝子産物が含まれる。例えば、ある種が２つの機能を示す遺伝子産物をコードし、そしてこのような機能が第２種における異なった遺伝子に分離されている場合、３つの遺伝子およびそれらの対応する産物はオルソログであると考えられる。生化学的生産物の増殖に連動した生産物に関して、当業者は、破壊されるべき代謝活性を含むオルソロガスな遺伝子は、天然に存在しない微生物の構築のために選択されるべきであることを理解する。分離可能な活性を示すオルソログの例は、異なる活性が、２以上の種間、または単一の種内で異なる遺伝子産物に分離されている場合である。具体例は、２つのタイプのセリンプロテアーゼ活性であるエラスターゼタンパク質分解およびプラスミノーゲンタンパク質分解を、プラスミノーゲン活性化因子およびエラスターゼとして異なる分子に分離することである。第２の例は、マイコプラズマ５’−３’エキソヌクレアーゼおよびショウジョウバエＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性の分離である。第１種のＤＮＡポリメラーゼは、第２種からのエキソヌクレアーゼもしくはポリメラーゼのいずれかまたはその両方に対してオルソログ、あるいはその逆も考えることができる。
【００２８】
対照的に、パラログは、例えば、複製、続く進化的分岐によって関連付けられるホモログであり、類似または共通した機能を有するが、同一の機能を有さない。パラログは、例えば、同種または異種を起源とするかまたは由来することができる。例えば、ミクロソームエポキシド加水分解酵素（エポキシド加水分解酵素Ｉ）および可溶性エポキシド加水分解酵素（エポキシド加水分解酵素ＩＩ）は、パラログであると考えることができ、それは、それらは、異なる反応を触媒し、同種において異なる機能を有する、共通の祖先から同時に進化した、２つの異なる酵素を示すためである。パラログは、互いに顕著な配列類似性を有する同種由来のタンパク質であって、これは、それらが相同であるか、または共通の祖先から同時の進化を通じて関連付けられることを示唆している。パラロガスなタンパク質ファミリーのグループには、ＨｉｐＡホモログ、ルシフェラーゼ遺伝子、ペプチダーゼ、およびその他が含まれる。
【００２９】
非オルソロガスな遺伝子置換は、異種における参照される遺伝子機能に置き換えることができる１つの種に由来する非オルソロガスな遺伝子である。置換には、例えば、異種における参照される機能と比較して、起源の種において同じであるかまたは類似の機能を実質的に行うことができることが含まれる。一般には、非オルソロガスな遺伝子置換は、参照される機能をコードする知られた遺伝子に構造的に関連し、構造的には関連性が小さいが、機能的には類似した遺伝子として同定可能であり、それらの対応する遺伝子産物は、それにも関わらず、なおも、本明細書中で使用するとき、この用語の意味の範囲内にある。機能的類似性は、例えば、置換されるべき機能をコードする遺伝子と比較して、非オルソロガスな遺伝子の活性部位または結合領域において少なくともいくつかの構造的類似性を必要とする。したがって、非オルソロガスな遺伝子には、例えば、パラログまたは無関係な遺伝子が含まれる。
【００３０】
したがって、４−ＨＢ、ＧＢＬおよび／またはＢＤＯ生合成能力を有する本発明の天然に存在しない微生物の同定および構築において、当業者は、本明細書において提供される教示およびガイダンスを、代謝性修飾の同定がオルソログの同定および封入または不活性化を含むことができる特定の種に適用することをもって理解する。パラログおよび／または非オルソログな遺伝子置換は、類似したまたは実質的に類似した代謝反応を触媒する酵素をコードする参照される微生物において存在するという程度まで、当業者もこれらの進化的に関連した遺伝子を利用することができる。
【００３１】
オルソログ、パラログおよび非オルソロガスな遺伝子置換は、当業者に周知な方法によって測定することができる。例えば、２つのポリペプチドのための核酸またはアミノ酸配列の調査は、比較される配列間の配列同一性および類似性を明らかにする。このような類似性に基づいて、当業者は、タンパク質が共通の祖先からの進化を通じて関連付けられることを指示するのに、この類似性が十分に高いかどうかを決定することができる。当業者に周知なアルゴリズム、例えば、Ａｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗおよびその他は、生の配列の類似性または同一性を比較し、決定し、さらに、加重またはスコアを課すことができる配列においてギャップの存在または有意性を決定する。また、このようなアルゴリズムは当該技術分野において知られ、同様に、ヌクレオチド配列の類似性または同一性を決定するのに適用可能である。関連性を測定するには十分な類似性のパラメータは、統計学的な類似性、またはランダムポリペプチドにおける類似のマッチを見いだす機会、決定されたマッチの有意性を計算するための周知な方法に基づいて計算される。また、２以上の配列のコンピュータ比較は、所望により、当業者によって視覚的に最適化可能である。関連した遺伝子産物またはタンパク質は、高い類似性、例えば、２５％〜１００％の配列同一性を有することが期待され得る。無関係のタンパク質は、十分な大きさのデータベースがスキャンされる場合、偶然に起こることが期待されるのと本質的には同じである同一性（約５％）を有することができる。５％と２４％との間の配列は、比較される配列が関連付けられることを結論付けるのに十分な相同性を示してもよくまたは示さなくてもよい。データセットの大きさを与えるこのようなマッチの有意性を決定するための更なる統計学的分析は、これらの配列の関連性を決定するために行うことができる。
【００３２】
例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いた２以上の配列の関連性を決定するための例示的なパラメータは、下記に記載することができる。要約すると、アミノ酸配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．８（１９９９年１月５日）、および次のパラメータ：  マトリックス：０  ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１１；ギャップ伸長：１；ｘ  ドロップオフ：５０；期待：１０．０；ワードサイズ：３；フィルター：オンを用いて行うことができる。核酸配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）、および次のパラメータ：マッチ：１；ミスマッチ：−２；ギャップオープン：５；ギャップ伸長：２；ｘ  ドロップオフ：５０；期待：１０．０；ワードサイズ：１１；フィルター：オフを用いて行うことができる。当業者は、比較のストリンジェンシーを増加させるかまたは減少させるために、例えば、２以上の配列の関連性を決定するために上記パラメータにいかなる修飾を行い得るかを知っている。
【００３３】
本発明は、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、ＣｏＡ非依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、グルタミン酸塩：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ、アルファ−ケトグルタル酸脱炭酸酵素、またはグルタミン酸脱炭酸酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）生合成経路を有する微生物を含む天然に存在しない微生物生体触媒を提供し、ここで、外因性核酸は、単量体４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）を生産するのに十分な量で発現される。また、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素は、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素または４−ＨＢ脱水素酵素とも呼ばれる。また、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素は、スクシニル−ＣｏＡシンターゼまたはスクシニル−ＣｏＡリガーゼとも呼ばれる。
【００３４】
また、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、またはα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）生合成経路を有する微生物を含む天然に存在しない微生物生体触媒が提供され、ここで、外因性核酸は、単量体４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）を生産するのに十分な量で発現される。
【００３５】
本発明の天然に存在しない微生物生体触媒には、本発明の化合物を生合成的に生産するための代謝反応の組み合わせを使用する微生物が含まれる。生合成された化合物は、細胞内で生産されるかおよび／または培地中に分泌され得る。天然に存在しない微生物によって生産される例示的な化合物には、例えば、４−ヒドロキシブタン酸、１，４−ブタンジオールおよびγ−ブチロラクトンが挙げられる。化学合成または生合成に関して、これらの例示的な化合物の関係が図１に例示される。
【００３６】
一態様では、天然に存在しない微生物は、４−ＨＢを生産するように操作される。この化合物は化合物の１，４−ブタンジオールファミリーへの１つの有用なエントリーポイントである。コハク酸塩から、スクシニル−ＣｏＡを介したコハク酸塩から、またはα−ケトグルタル酸塩から４−ＨＢを形成するための生化学的反応は、図２の工程１〜８に示される。
【００３７】
本発明は、本明細書においては、代謝反応、その反応物もしくは生産物を一般に参照して、または参照される代謝反応、反応物もしくは生産物と関連したまたはそれを触媒する酵素をコードする１以上の核酸もしくは遺伝子を具体的に参照して記載されている。本明細書において他の明らかに記述がなければ、当業者は、反応への言及もその反応の反応物および生産物への言及を構成することを理解する。同様に、本明細書において他の明らかに記述がなければ、反応物または生産物への言及もその反応を参照し、これらの代謝構成物のいずれかへの言及も参照される反応、反応物または生産物を触媒する酵素をコードする単数または複数の遺伝子を参照する。同様に、代謝生化学、酵素学およびゲノミックスの周知な領域を考慮すると、本明細書における遺伝子またはコードする核酸への言及も、対応するコードされた酵素およびそれが触媒する反応、並びにその反応の反応物および生産物への言及を構成する。
【００３８】
本発明の微生物を用いた生合成モードを介した４−ＨＢ生産は、それが単量体４−ＨＢを生産することができるため、特に有用である。また、本発明の天然に存在しない微生物、並びに４−ＨＢおよびＢＤＯファミリー化合物のそれらの生合成は特に有用であり、それは、４−ＨＢ生産物が、（１）分泌され；（２）補酵素Ａなどのいずれかの誘導体化がなくてもよく；（３）生合成中に熱力学的変化を避け；（４）ＢＤＯの直接的な生合成を可能にし、（５）酸性ｐＨの培地においてγ−ブチロラクトンへの４−ＨＢの自発的な化学変換を可能にするためである。また、この後者の特徴は、例えば、１，４−ブタンジオールおよび／またはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などのＢＤＯファミリー化合物の効率的な化学合成または生合成に特に有用である。
【００３９】
微生物は、一般に、４−ＨＢを合成する能力を欠損し、したがって、図１に示される化合物のいずれかは、１，４−ブタンジオールファミリーの化合物内にあることで知られ、または１，４−ブタンジオールの化合物内にあることが当業者に知られている。さらに、必要な代謝酵素能力の全てを有する生物は、記載されている酵素、並びに本明細書に例示されている経路からの４−ＨＢを生産することは知られていない。むしろ、下記にさらに記載されている数個の嫌気性微生物の可能性のある例を除いて、酵素能力を有する微生物は、例えば、コハク酸塩を生産するために基質として４−ＨＢを用いる。対照的に、本発明の天然に存在しない微生物は、生産物として４−ＨＢを生じる。上述したように、単量体形態での４−ＨＢの生合成は、ＢＤＯファミリーの化合物の化学合成に特に有用であるだけでなく、ＢＤＯファミリーの化合物の更なる生合成を可能にし、全体の化学合成手法を避ける。
【００４０】
４−ＨＢを生産することができる本発明の天然に存在しない微生物は、宿主微生物が、本発明の少なくとも１つの４−ＨＢ生合成経路の完全な生化学合成についての機能的能力を含むことを確かめることによって生産される。少なくとも１つの必要な４−ＨＢ生合成経路の確保により、宿主微生物の４−ＨＢ生合成能力が与えられる。
【００４１】
５つの必要な４−ＨＢ生合成経路が本明細書中に例示され、図２において例示を目的として示されている。１つの必要な４−ＨＢ生合成経路には、コハク酸塩からの４−ＨＢの生合成（コハク酸塩経路）が含まれる。この４−ＨＢに関与する酵素には、ＣｏＡ非依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素および４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素が含まれる。この経路では、ＣｏＡ非依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素は、図２に示される矢印とは反対の反応を触媒する。別の必要な４−ＨＢ生合成経路には、スクシニル−ＣｏＡを介したコハク酸塩からの生合成（スクシニル−ＣｏＡ経路）が含まれる。この４−ＨＢ経路に関与する酵素には、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素および４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素が含まれる。３つの他の必要な４−ＨＢ生合成経路には、α−ケトグルタル酸塩からの４−ＨＢの生合成（α−ケトグルタル酸塩経路）が含まれる。したがって、第３の必要な４−ＨＢ生合成経路は、グルタミン酸塩：セミアルデヒドトランスアミナーゼ、グルタミン酸脱炭酸酵素および４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素を介したコハク酸セミアルデヒドの生合成である。また、第４の必要な４−ＨＢ生合成経路には、α−ケトグルタル酸塩からの４−ＨＢの生合成が含まれるが、コハク酸セミアルデヒド合成を触媒するためにα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素を利用する。４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素は、コハク酸セミアルデヒドから４−ＨＢへの変換を触媒する。第５の必要な４−ＨＢ生合成経路には、スクシニル−ＣｏＡを介したα−ケトグルタル酸塩からの生合成が含まれ、上述されるスクシニル−ＣｏＡ経路に送り込むスクシニル−ＣｏＡを生産するためにα−ケトグルタル酸脱水素酵素を利用する。これらの４−ＨＢ生合成経路、それらの基質、反応物および生産物の各々は、実施例においてさらに後述される。
【００４２】
本発明の天然に存在しない微生物は、１以上の４−ＨＢ生合成経路に関与する１以上の酵素をコードする発現可能な核酸を導入することによって生産することができる。生合成について選択される宿主微生物に依存して、特定の４−ＨＢ生合成経路のいくつかまたは全てについての核酸を発現することができる。例えば、選択される宿主は、コハク酸塩から４−ＨＢへの経路において両方の酵素を欠損し、この経路が４−ＨＢ生合成のために選択される場合、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素および４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素の両方について発現可能な核酸は、その後の外因性の発現について宿主内に導入される。あるいは、選択される宿主が、内因性のＣｏＡ非依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素を示すが、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素を欠損している場合、この酵素についてコード化する核酸が、４−ＨＢ生合成を達成するために必要とされる。
【００４３】
同様に、４−ＨＢ合成が、コハク酸塩〜スクシニル−ＣｏＡ経路（スクシニル−ＣｏＡ経路）を介して生じるように選択される場合、酵素のスクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素および／または４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素における宿主の欠損のための、コード化する核酸は、レシピエント宿主において外因的に発現される。α−ケトグルタル酸塩〜コハク酸セミアルデヒド経路を介した４−ＨＢ生合成（α−ケトグルタル酸塩経路）の選択は、グルタミン酸塩：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ、グルタミン酸脱炭酸酵素および／または４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、またはα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素および４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素について、酵素の１以上における宿主の欠損のために外因性発現を利用することができる。
【００４４】
選択された宿主微生物の４−ＨＢ生合成経路の構成要素に依存して、本発明の天然に存在しない微生物の４−ＨＢ生体触媒は、少なくとも１つの外因的に発現した４−ＨＢ経路をコード化する核酸、および１以上の４−ＨＢ生合成経路に関する、最大全てのコード化する核酸を含む。例えば、４−ＨＢ生合成は、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素をコードする核酸の外因的発現を通じて、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素に欠損のある宿主において５個全ての経路から確立され得る。対照的に、４−ＨＢ生合成は、ＣｏＡ非依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、グルタミン酸塩：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ、グルタミン酸脱炭酸酵素、α−ケトグルタル酸脱炭酸酵素、α−ケトグルタル酸脱水素酵素および４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素の８個全ての外因的発現を通じて８個全ての酵素に欠損のある宿主において５個全ての経路から確立することができる。
【００４５】
本明細書において提供される教示およびガイダンスを考慮して、当業者は、発現可能な形態で導入されるコード化する核酸の数は、少なくとも、選択される宿主微生物の４−ＨＢ経路の欠損に匹敵することを理解する。したがって、本発明の天然に存在しない微生物は、１以上の４−ＨＢ生合成経路を構成する上記酵素をコードする１、２、３、４、５、６、７または８個の核酸を有することができる。いくつかの態様では、天然に存在しない微生物も、４−ＨＢ生合成を促進するかもしくは最適化し、または他の有用な機能を宿主の微生物に与える他の遺伝的修飾を含むことができる。１つのこのような他の機能性には、例えば、コハク酸塩、スクシニル−ＣｏＡおよび／またはα−ケトグルタル酸塩などの１以上の４−ＨＢ経路前駆体の合成を増大することを含むことができる。
【００４６】
いくつかの態様では、本発明の天然に存在しない微生物は、４−ＨＢを合成するための酵素的能力を含む宿主から生じる。この特定の態様では、例えば、４−ＨＢ生産に向けられた４−ＨＢ経路反応を進行するための４−ＨＢ経路産物の合成または蓄積を増加させることは有用であり得る。合成または蓄積の増加は、例えば、上述される１以上の４−ＨＢ経路酵素をコードする核酸の過剰発現によって達成することができる。単数または複数の４−ＨＢ経路酵素の過剰発現は、例えば、単数もしくは複数の内因性遺伝子の外因性発現を通じて、または単数もしくは複数の異種遺伝子の外因性発現を通じて生じさせることができる。したがって、天然に存在する生物は、４−ＨＢ生合成経路の酵素をコードする１、２、３、４、５または全６個の核酸の過剰発現を通じて本発明の天然に存在しない４−ＨＢを生産する微生物となるように容易に生じさせることができる。さらに、天然に存在しない生物は、４−ＨＢ生合成経路における酵素の活性の増加をもたらす内因性遺伝子の突然変異誘発によって生じさせることができる。
【００４７】
特に有用な態様では、コード化する核酸の外因性発現が用いられる。外因性発現は、宿主に発現および／または調節要素を必要に応じて変更する能力、並びにユーザーによって調節される所望の発現レベルを達成するための用途を与える。しかしながら、内因性発現も例えば、誘導可能なプロモーターまたは他の調節要素に連結された場合に遺伝子プロモーターの負の調節エフェクターまたは誘導を取り除くことによって、他の態様において利用することもできる。このようにして、天然に存在する誘導可能なプロモーターを有する内因性遺伝子は、適切な誘導因子を提供することによってアップレギュレートされ得るか、または、内因性遺伝子の調節領域は、誘導可能な調節要素を組み込むように操作することができ、それによって、所望時間で内因性遺伝子の発現増加を調節することができる。同様に、誘導可能なプロモーターは、天然に存在しない微生物に導入される外因性遺伝子に対して調節要素として誘導可能である（例えば、実施例ＩＩおよびＩＶを参照されたい）。
【００４８】
「外因性」とは、本明細書中で使用するとき、参照される分子または参照される活性が、例えば、宿主染色体への組み込みによって、宿主の遺伝物質にコード化する核酸を導入することを含む、宿主微生物に導入されることを意味することが意図される。したがって、この用語は、コード化する核酸の発現への参照において用いられるとき、微生物への発現可能な形態でのコード化する核酸の導入を指す。生合成活性との関連で用いられるとき、この用語は、宿主の参照生物に導入される活性を指す。供給源は、例えば、宿主の微生物への導入後の参照される活性を発現する同種または異種のコード化する核酸であり得る。したがって、用語「内因性」とは、宿主に存在する参照される分子または活性を指す。同様に、この用語は、コード化する核酸の発現との関連で用いられるとき、微生物内に含まれるコード化する核酸の発現を指す。用語「異種」とは、参照される種以外の供給源由来の分子または活性を指し、「同種」とは、宿主微生物由来の分子または活性を指す。したがって、本発明のコード化する核酸の外因性発現は、異種もしくは同種のコード化する核酸のいずれかまたはその両方を用いることができる。
【００４９】
４−ＨＢ経路酵素に対するコード化する核酸の供給源は、例えば、いずれかの種であってもよく、この場合、コードされた遺伝子産物は、参照される反応を触媒することができる。このような種には、原核生物または真核生物の両方が含まれ、例えば、限定されないが、細菌、例えば古細菌および真正細菌、ならびに真核生物、例えば、酵母、植物、昆虫、動物、および哺乳動物、例えばヒトが含まれる。このような供給源に対する例示的な種には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが挙げられる。例えば、４−ＨＢ生合成的生成を有する微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母宿主に関して、本明細書において例示されている。しかしながら、３９５の微生物ゲノム、並びに様々な酵母、真菌、植物、および哺乳動物のゲノムを含む、現在、５５０を超える種（これらの半分を超えるものがＮＣＢＩなどの公開データベースで利用可能である）について利用可能である完全なゲノム配列を用いて、例えば、知られている遺伝子のホモログ、オルソログ、パラログおよび非オルソロガスな遺伝子置換を含む、関連したまたは遠隔の種における１以上の遺伝子に対して必要な４−ＨＢ生合成活性をコードする遺伝子の同定、並びに生物間の遺伝子変化の交換は、日常的であり、当該技術分野において周知である。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母などの特定の生物との関連で、本明細書に記載されている本発明の４−ＨＢおよび他の化合物の生合成を可能にする代謝変調は、原核生物および真核生物等を含む他の微生物に容易に適用することができる。本明細書に提供される教示およびガイダンスを考慮して、当業者は、１つの生物において例示される代謝変調が他の生物に同等に適用され得ることを承知する。
【００５０】
いくつかの例では、例えば、代替の４−ＨＢ生合成経路が無関係の種に存在する場合、４−ＨＢ生合成は、参照される反応を置換するための、同様であるが同一ではない代謝反応を触媒する無関係の種からの単数または複数のパラログの外因性発現によって、宿主の種に与えることができる。代謝ネットワークのうちのある種の相違が、異なる生物間に存在するため、当業者は、種々の生物間での実際の遺伝子使用が異なる場合があることを理解する。しかしながら、本明細書に提供される教示およびガイダンスを考慮して、当業者も、本発明の教示および方法が、単量体４−ＨＢを合成する対象とする種における微生物を構築するように、本明細書に例示されているものと同じ代謝変調を用いて、全ての微生物に適用することができると理解する。
【００５１】
宿主微生物は、例えば、細菌、酵母、真菌、発酵プロセスに適用できる他の様々な微生物から選択可能であり、天然に存在しない微生物はそれらにおいて生じさせることができる。例示的な細菌には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａから選択される種が挙げられる。例示的な酵母または真菌には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓから選択される種が挙げられる。
【００５２】
４−ＨＢを生産する天然に存在しない宿主を構築し、その発現レベルを試験する方法は、例えば、当該技術分野において周知である組換え法および検出法によって行うことができる。このような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９）に記載されるように、見いだすことができる。４−ＨＢおよびＧＢＬは、例えば、Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ  ５  ＯＤＳ１カラム、７０％の１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７）および３０％のメタノールの移動相を用いたＨＰＬＣによって分離し、２１５ｎｍでのＵＶ検出器（Ｈｅｎｎｅｓｓｙら、２００４，Ｊ．Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ．４６（６）：１−９）を用いて検出することができる。ＢＤＯは、ガスクロマトグラフィーによるか、またはＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム、０．５ｍＭの硫酸の移動相を用いたＨＰＬＣおよび屈折率検出器によって検出される（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐａｊｕｅｌｏら、Ｍｅｔ．Ｅｎｇ．７：３２９−３３６（２００５））。
【００５３】
例えば、単数または複数の発現ベクターは、宿主生物において機能的な発現制御配列に操作可能に連結された、本明細書に例示される１以上の４−ＨＢ生合成経路をコード化する核酸および１以上のＢＤＯ生合成経路をコード化する核酸を含むように構築され得る。本発明の微生物宿主生物における使用に適用可能な発現ベクターには、例えば、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび人工染色体が挙げられ、宿主染色体への安定な組み込みのために操作可能なベクターおよび選択配列またはマーカーが含まれる。また、例えば、抗生物質または毒素に対する耐性を提供するか、栄養要求性欠損を補足するか、あるいは培地にはない重要な栄養素を供給する選択可能なマーカー遺伝子が含まれ得る。発現制御配列には、当該技術分野において周知である、構成的プロモーターおよび誘導可能なプロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどが含まれ得る。２以上の外因性のコード化する核酸が同時に発現されるべき場合には、両方の核酸は、例えば、単一の発現ベクターまたは別々の発現ベクターに挿入することができる。単一のベクター発現に関して、コード化する核酸は、１つの共通の発現制御配列に操作可能に連結され得るか、または１つの誘導可能なプロモーターおよび１つの構成的プロモーターなどの異なる発現制御配列に操作可能に連結され得る。代謝または合成経路に関与する外因性核酸配列の形質転換は、当該技術分野において周知である方法を用いて確かめることができる。
【００５４】
本発明の天然に存在しない微生物は、単量体４−ＨＢを生産するのに十分な量で、４−ＨＢ経路酵素をコードする少なくとも１つの核酸を外因的に発現するように、上記で例示される、当該技術分野において周知である方法を用いて構築される。各経路における４−ＨＢ酵素についての例示的な発現レベルは、実施例において下記にさらに記載されている。本明細書において提供される教示およびガイダンスに従って、本発明の天然に存在しない微生物は、約０．１〜２５ｍＭの間またはそれ以上の細胞内濃度をもたらす単量体４−ＨＢの生合成を達成することができる。一般に、単量体４−ＨＢの細胞内濃度は、約３〜２０ｍＭ、特別には約５〜１５ｍＭ、より特別には約８〜１２ｍＭであり、約１０ｍＭ以上を含む。また、これらの例示的な範囲の各々の間およびそれを超える細胞内濃度は、本発明の天然に存在しない微生物から達成することができる。
【００５５】
さらに後述されるように、４−ＨＢの生合成を達成するための一例の増殖条件は、嫌気的培養または発酵条件を含む。ある種の態様では、本発明の天然に存在しない微生物は、嫌気的条件または実質的な嫌気的条件下で、維持され、培養され、または発酵され得る。要約すると、嫌気的条件とは、酸素がない環境を指す。実質的な嫌気的条件には、例えば、培地に溶解した酸素濃度が飽和の０〜１０％に留まるような、培養、バッチ発酵または連続発酵が含まれる。また、実質的な嫌気的条件には、１％未満の酸素の雰囲気で維持された密閉されたチャンバー内で、液体培地内または固形寒天上で細胞を増殖させるかまたは静止させることが含まれる。酸素の割合は、例えば、Ｎ２／ＣＯ２混合物または他の適した単数または複数の非酸素ガスを用いて培養物に散布することによって維持することができる。
【００５６】
また、本発明によって、４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）および１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）生合成経路を有する微生物を含む天然に存在しない微生物生体触媒が提供され、この経路は、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、ＣｏＡ非依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸塩：ＣｏＡ転移酵素、グルタミン酸塩：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ、グルタミン酸脱炭酸酵素、ＣｏＡ非依存性アルデヒド脱水素酵素、ＣｏＡ依存性アルデヒド脱水素酵素またはアルコール脱水素酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、ここで、外因性核酸は、１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）を生産するのに十分な量で発現される。４−ヒドロキシ酪酸塩：ＣｏＡ転移酵素は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡ転移酵素としても知られている。
【００５７】
さらに、本発明は、４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）および１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）生合成経路を有する微生物を含む天然に存在しない微生物生体触媒を提供し、この経路は、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸塩：ＣｏＡ転移酵素、４−酪酸キナーゼ、ホスホトランスブチリラーゼ、α−ケトグルタル酸脱炭酸酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素またはアルデヒド／アルコール脱水素酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、ここで、外因性核酸は、１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）を生産するのに十分な量で発現される。
【００５８】
また、ＢＤＯを生合成する天然に存在しない微生物も生じさせることができる。本発明の４−ＨＢを生産する微生物と同様に、ＢＤＯを生産する微生物は、ＢＤＯを細胞内で生産するかまたは培地に分泌することができる。４−ＨＢを合成する微生物の構築について、以前に提供された教示およびガイダンスに従って、追加のＢＤＯ経路を、ＢＤＯおよび他のＢＤＯファミリー化合物も合成する生物を生じさせるように、４−ＨＢを生産する微生物に組み込むことができる。ＢＤＯおよびその下流生産物の化学合成は、図１に例示される。ＢＤＯ生合成を可能にする、本発明の天然に存在しない微生物は、図２に例示されるエントリーポイントとして４−ＨＢを用いて、これらの化学合成を避ける。また、さらに後述されるように、４−ＨＢ生産体を用いて、例えば、化学的に４−ＨＢをＧＢＬに、次にＢＤＯまたはＴＨＦに変換することができる。あるいは、４−ＨＢ生産体は、４−ＨＢおよび／またはＧＢＬをＢＤＯに変換する生合成能力を含むように、さらに修飾することができる。
【００５９】
４−ＨＢ生産体に導入するための追加のＢＤＯ経路には、例えば、宿主欠損バックグラウンドにおける外因性発現、または図２では工程９〜１３として例示される１以上の酵素の過剰発現が含まれる。１つのこのような経路には、例えば、図２では工程９、１２および１３として示される反応を実行するために必要な酵素活性が含まれ、ここで、アルデヒドおよびアルコール脱水素酵素は、別々の酵素、またはアルデヒドおよびアルコール脱水素酵素活性の両方を有する多機能性酵素であり得る。別のこのような経路には、例えば、図２では工程１０、１１、１２および１３として示される反応を実行するために必要な酵素活性が含まれ、同様に、アルデヒドおよびアルコール脱水素酵素は、別々の酵素、またはアルデヒドおよびアルコール脱水素酵素活性の両方を有する多機能性酵素であり得る。したがって、４−ＨＢ生産体に導入するための追加のＢＤＯ経路は、例えば、宿主欠損バックグラウンドにおける外因性発現、または４−ヒドロキシ酪酸塩：ＣｏＡ転移酵素、酪酸キナーゼ、ホスホトランスブチリラーゼ、ＣｏＡ依存性アルデヒド脱水素酵素、ＣｏＡ依存性アルデヒド脱水素酵素またはアルコール脱水素酵素の１以上の過剰発現が含まれる。４−ＨＢを修飾することができる内因性のアシル−ＣｏＡ合成酵素がない場合、ＢＤＯを生産する天然に存在しない微生物は、４−ＨＢに選択的な外因性のアシル−ＣｏＡ合成酵素、または４−ＨＢから４−ＨＢ−ＣｏＡへの正味の反応変換として有する複数の酵素の組み合わせをさらに含むことができる。下記の実施例においてさらに例示されるように、酪酸キナーゼおよびホスホトランスブチリラーゼは、ＢＤＯ経路活性を示し、４−ＨＢ基質を用いて、図２に例示される変換を触媒する。したがって、これらの酵素も、本明細書において、それぞれ４−ヒドロキシ酪酸キナーゼおよびホスホトランスヒドロキシブチリラーゼと称することもできる。
【００６０】
これらのインビボでの４−ＨＢからＢＤＯへの変換のために用いることができる例示的なアルコールおよびアルデヒド脱水素酵素は、下記の表１に列挙されている。
【００６１】
表１．４−ＨＢからＢＤＯへの変換のためのアルコールおよびアルデヒド脱水素酵素
【００６２】
【表１−１】
2020072661.tif 000002
【００６３】
【表１−２】
2020072661.tif 000003
【００６４】
【表１−３】
2020072661.tif 000004
また、上記で例示されたもの以外の経路を用いて、天然に存在しない微生物においてＢＤＯの生合成を生じさせることができる。一態様では、生合成は、Ｌ−ホモセリンからＢＤＯ経路を用いて達成することができる。この経路は、０．９０ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースのモル収率を有し、減少する同等物の利用可能性によって制限されるようである。第２の経路は、アセト酢酸塩からＢＤＯを合成し、１．０９１ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースの最大理論的収率を達成することができる。いずれかの経路の実行は、２つの外因性酵素の導入によって達成することができ、両方の経路は、スクシニル−ＣｏＡを介したＢＤＯ生産を付加的に補完することができる。経路酵素、熱力学、理論的収率、および全体の実行可能性は、さらに後述される。
【００６５】
また、ホモセリン経路は、ＢＤＯを生産する微生物を生じさせるように操作可能である。ホモセリンは、アルパラギン酸塩を介したオキサロ酢酸塩から形成される、スレオニンおよびメチオニン代謝の中間体である。オキサロ酢酸塩からホモセリンへの変換は、１個のＮＡＤＨ、２個のＮＡＤＰＨ、および１個のＡＴＰを必要とする（図３）。一度形成されると、ホモセリンは、スレオニンとメチオニンの両方に関する生合成経路へと流れ込む。大部分の生物では、高レベルのスレオニンまたはメチオニンは、ホモセリン生合成経路を抑制するためにフィードバックする（Ｃａｓｐｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：Ｄ５１１−Ｄ５１６（１９９０））。
【００６６】
ホモセリンの４−ヒドロキシ酪酸塩（４−ＨＢ）への変換は、図４に示される２つの酵素工程において達成することができる。この経路の第１工程は、推定上のアンモニアリアーゼによるホモセリンの脱アミノ化である。この反応は、熱力学的障壁が１２ｋＪ／ｍｏｌと推測されるが、濃度勾配によって前進方向に促進する可能性がある。工程２では、生産物のアルケン、４−ヒドロキシブタ−４−エノエートは、１個のＮＡＤＨのコストで推定上の還元酵素によって４−ＨＢに還元される。この反応工程は、４−ＨＢ合成の方向に非常に熱力学的に有利であり、ΔｒｘｎＧは−５９ｋＪ／ｍｏｌと推定される。次に、４−ＨＢは、上述した図２のようにＢＤＯに変換され得る。
【００６７】
上記の変換に利用可能な酵素は、図５に示される。例えば、この経路の工程１におけるアンモニアリアーゼは、アスパラギン酸アンモニア−リアーゼ（アルパルターゼ）の化学とよく似ている。アルパルターゼは、微生物において広く知られた酵素であり、広く特徴付けられている（Ｖｉｏｌａ，Ｒ．Ｅ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７４：２９５−３４１（２００８））。Ｅ．ｃｏｌｉのアルパルターゼの結晶構造が解明されていて（Ｓｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：９１３６−９１４４（１９９７））、したがって、ホモセリンを含むようにその基質特異性を変更する酵素活性部位において突然変異を直接操作することが可能である。工程２における酸化還元酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉのＴＣＡサイクルにおけるフマル酸還元酵素を含む、いくつかの十分に特徴付けられた酵素に類似した化学を有する。この反応の熱力学は非常に有利であるため、幅広い基質特異性を有する内因性の還元酵素は、４−ヒドロキシブタ−２−エノエートを還元する可能性がある。嫌気的条件下でのこの経路の収量は、０．９ｍｏｌ  ＢＤＯ／ｍｏｌグルコースであるが、図２の経路と比較すると（１．０９ｍｏｌ／ｍｏｌグルコース）、両方の経路は、代謝前躯体であるオキサロ酢酸塩から同様のエネルギー的な要求および還元的な要求を有するようである（図６）。
【００６８】
スクシニル−ＣｏＡ経路は、よりエネルギー的に効率的であるという事実に起因して、より高い収率を有することが判明した。ホモセリン経路を介したＢＤＯへの１個のオキサロ酢酸分子の変換は、２ＡＴＰ同等物の消費を必要とする。２個のオキサロ酢酸分子へのグルコースの変換は、可逆的であるＰＥＰカルボキシナーゼを想定する最大３個のＡＴＰ分子を生じることができるため、ホモセリンを介したＢＤＯへのグルコースの全変換は、負のエネルギー収率を有する。期待されるように、本発明者らは、エネルギーが呼吸を介して生じ得ることを想定する場合、ホモセリン経路の最大収量は、スクシニル−ＣｏＡ経路収率の９６％である１．０５ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースまで増加させる。スクシニル−ＣｏＡ経路は、エネルギーを消費しないで、還元同等物とスクシニル−ＣｏＡの両方を生じるために、ピルビン酸脱水素酵素を介した炭素フラックスおよびＴＣＡサイクルの酸化的分岐のいくつかを導くことができる。このようにして、フラックスの全てが、オキサロ酢酸を介したスクシニル−ＣｏＡからＢＤＯへと導入されるわけではないので、ホモセリン経路と同じエネルギー困難性に直面しない。全体として、ホモセリン経路は、ＢＤＯへの中程度に高い収率ルートを示す。１つの特別に有用な特徴は、たった２つの非天然の工程を用いた最少の操作を伴うことである。この経路は、ＢＤＯ合成の方向に熱力学的に有利である可能性がある。
【００６９】
また、アセト酢酸塩経路は、ＢＤＯを生産する微生物を生じるように操作することができる。Ｅ．ｃｏｌｉでは、アセト酢酸塩は、アセトンおよびロイシンの分解から生産される。また、アセト酢酸塩は、アセチル−ＣｏＡアセチル転移酵素およびアセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素を含む、脂肪酸代謝と関連した酵素によってアセチル−ＣｏＡから形成することができる（図７）。また、アセト酢酸塩を介した生合成ルートは、アセチル−ＣｏＡを形成するための単一の炭素化合物を代謝することができる微生物において特に有用である。
【００７０】
アセト酢酸塩からコハク酸セミアルデヒドへの３工程ルート（図８）を用いて、アセト酢酸塩からＢＤＯを合成することができる。コハク酸セミアルドデヒド（ｓｅｍｉａｌｄｄｅｈｙｄｅ）は、スクシニル−ＣｏＡから取り出された１つの還元工程、またはα−ケトグルタル酸塩から取り出された１つの脱炭酸工程であり、３つの還元工程の後にＢＤＯへと変換され得る（図２）。要約すると、アセト酢酸塩生体経路の工程１は、ω−アミノ転移酵素による３−アミノブタン酸塩へのアセト酢酸塩の変換を伴う。Ａｌｃａｌｉｇｅｎｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ由来のω−アミノ酸：ピルビン酸アミノ転移酵素（ω−ＡＰＴ）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて過剰に発現され、インビトロでは３−アミノブタン酸塩に向けた高活性を有することが示された（Ｙｕｎら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：２５２９−２５３４（２００４））。ここで必要とされる方向におけるω−ＡＰＴの活性は、反応混合物におけるアセト酢酸塩からアセトンへの自然分解により、この研究では測定されなかった。しかしながら、熱力学は、それが実行可能であることを指示する。
【００７１】
工程２では、推定上のアミノムターゼは、炭素骨格の３位から４位にアミン基をシフトする。３−アミノブタン酸塩に対するこの作用を行うアミノムターゼは特徴付けられていないが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ由来の酵素は非常に類似した代謝を有する（図９）。酵素であるＤ−リジン−５，６−アミノムターゼは、リジン生合成に関与する。
【００７２】
アセト酢酸塩からＢＤＯへの合成ルートは、グルタミン酸塩の脱炭酸から通常形成されるＥ．ｃｏｌｉにおける代謝産物である４−アミノブタン酸塩を通る。一度形成されると、４−アミノブタン酸塩は、生化学的に特徴付けられた酵素である４−アミノブタン酸トランスアミナーゼ（２．６．１．１９）によってコハク酸セミアルデヒドに変換され得る。この酵素の熱力学並びにこの経路の他の工程は平衡に近く、そのため、対象とする方向における酵素の操作は、基質および生産物濃度によって促進される可能性がある。
【００７３】
この経路における候補酵素を選択するための１つの考慮は、最初の２つの工程に関与される酵素の立体選択性である。Ａｌｃａｌｉｇｅｎｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓにおけるω−ＡＢＴは、３−アミノブタン酸塩のＬ−立体異性体に特異的であり、Ｄ−リジン−５，６−アミノムターゼは、Ｄ−立体異性体を必要とする。相補的立体特異性を有する酵素が見いだされないかまたは操作することができない場合、Ｌ−３−アミノブタン酸塩をＤ−３−アミノブタン酸塩へと変換することができるラセマーゼ活性を含む経路に第３の酵素を添加することが必要となる。アミノ酸ラセマーゼは広く知られているが、これらの酵素がω−アミノ酸に作用するかどうかは知られていない。
【００７４】
嫌気的条件下でのこの経路の最大理論的なモル収率は、１．０９１ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースである。アセト酢酸塩からＢＤＯにフラックスを生じさせるために、アセチル−ＣｏＡ：アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素（図１０では酵素３）が可逆的であることを想定することが必要であった。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるこの酵素の作用は、最初にそれらをチオエステルに変換することによって、短鎖脂肪酸を代謝することである。
【００７５】
酢酸塩を消費する方向におけるアセチル−ＣｏＡ：アセトアセチル−ＣｏＡ転移酵素の操作がＥ．ｃｏｌｉにおいて実験的に示されていないが、他の生物における類似酵素についての研究は、この反応が可逆的であるという推測を支持する。腸内微生物であるＲｏｓｅｂｕｒｉａ  ｓｐ．およびＦ．ｐｒａｓｎｉｔｚｉｉにおける酵素であるブチリル−ＣｏＡ：酢酸塩：ＣｏＡ転移酵素は、酪酸塩を生産する酢酸塩利用の方向で作動する（Ｄｕｎｃａｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６８：５１８６−５１９０（２００２））。また、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉにおけるべつの非常に類似した酵素であるアセチル：コハク酸塩ＣｏＡ転移酵素は、酢酸塩を利用する方向において作動する。この反応は、平衡に近いΔｒｘｎＧを有し、そのため、高濃度の酢酸塩は、対象とする方向において反応を促進する可能性がある。１．０９ｍｏｌ／ｍｏｌグルコースの最大理論のＢＤＯ生産率で、シミュレーションは、Ｅ．ｃｏｌｉが発酵の副産物なしに１ｍｏｌのグルコースあたり１．０９８ｍｏｌのＡＴＰを生じ得ることを予測する。このＡＴＰ収率は、細胞増殖、維持、および生産に十分でなければならない。アセト酢酸塩生体経路は、アセチル−ＣｏＡからＢＤＯへの高収率ルートである。ホモセリン経路と同様に、この経路は、最少の菌株操作しか必要とせず、ＢＤＯ経路に加えて、たった２つの天然にない工程を用いる。
【００７６】
したがって、選択された宿主における４−ＨＢ生合成を確立するための、前記で例示された種々の修飾のいずれかに加えて、ＢＤＯを生産する微生物は、４−ＨＢ経路代謝性修飾の以前の組み合わせおよび置換のいずれか、並びにＧＢＬおよび／またはＢＤＯのための生合成経路を生じさせる、ＣｏＡ非依存性アルデヒド脱水素酵素、ＣｏＡ依存性アルデヒド脱水素酵素またはアルコール脱水素酵素についての発現のいずれかの組み合わせを含むことができる。したがって、本発明のＢＤＯ生産体は、例えば、６個の４−ＨＢ経路酵素のいずれか、および／または４個のＢＤＯ経路酵素のいずれかに対応する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個全ての酵素の外因性発現を有することができる。
【００７７】
遺伝子修飾された微生物の設計および構築は、ＢＤＯを生産するのに十分な量の発現を達成するために、当該技術分野において周知である方法を用いて実行される。特に、本発明の天然に存在しない微生物は、約０．１〜２５ｍＭまたはそれ以上の細胞内濃度をもたらすＢＤＯの生合成を達成することができる。一般に、ＢＤＯの細胞内濃度は、約３〜２０ｍＭ、特別には約５〜１５ｍＭ、より特別には約８〜１２ｍＭであり、約１０ｍＭ以上を含む。また、これらの例示的な範囲の各々の間およびそれを超える細胞内濃度は、本発明の天然に存在しない微生物から達成することができる。４−ＨＢ生産体と同様に、ＢＤＯ生産体も嫌気的条件下で維持され、培養されまたは発酵され得る。
【００７８】
さらに、本発明は、４−ＨＢを生産するための方法を提供する。この方法は、実質的な嫌気的条件下で、単量体４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）を生産するのに十分な時間、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、ＣｏＡ非依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、グルタミン酸塩：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ、α−ケトグルタル酸脱炭酸酵素、またはグルタミン酸脱炭酸酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）生合成経路を有する天然に存在しない微生物を培養することを含む。この方法は、付加的に、例えば、４−ＨＢからＧＢＬ、およびＢＤＯまたはＴＨＦへの化学変換を含むことができる。
【００７９】
さらに、４−ＨＢを生産する方法が提供される。この方法は、実質的な嫌気的条件下で、単量体４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）を生産するのに十分な時間、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵またはα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）生合成経路を有する天然に存在しない微生物を培養することを含む。４−ＨＢ生産物は、培地に分泌され得る。
【００８０】
さらに、ＢＤＯを生産する方法が提供される。この方法は、１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）を生産するのに十分な時間、４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）および１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）生合成経路を有する微生物を含む、天然に存在しない微生物生体触媒を培養することを含み、この経路は、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵、４−ヒドロキシ酪酸塩：ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸キナーゼ、ホスホトランスヒドロキシブチリラーゼ、α−ケトグルタル酸脱炭酸酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素またはアルデヒド／アルコール脱水素酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む。ＢＤＯ生産物は、培地に分泌され得る。
【００８１】
本発明の方法において、１以上の外因性核酸のいずれかが微生物に導入され、本発明の天然に存在しない微生物を生産することができることは理解される。核酸は、例えば、４−ＨＢ、ＢＤＯ、ＴＨＦまたはＧＢＬ生合成経路を微生物に与えるように誘導することができる。あるいは、コード化する核酸は、４−ＨＢ、ＢＤＯ、ＴＨＦまたはＧＢＬ生合成能力を与えるのに必要な反応のいくつかを触媒するための生合成能力を有する中間微生物を生産するために導入され得る。例えば、４−ＨＢ生合成経路を有する天然に存在しない微生物は、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素およびα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素の組み合わせ；４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素およびＣｏＡ非依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素の組み合わせ；４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素およびＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素の組み合わせ；ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素およびスクシニル−ＣｏＡ合成酵素の組み合わせ；スクシニル−ＣｏＡ合成酵素およびグルタミン酸脱炭酸酵素の組み合わせなど所望の酵素をコードする少なくとも２つの外因性核酸を含むことができる。このようにして、生合成経路の２以上の酵素の任意の組み合わせは、本発明の天然に存在しない微生物に含めることができることは理解される。同様に、生合成経路の３以上の酵素の任意の組み合わせ、例えば、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、α−ケトグルタル酸脱炭酸酵素およびＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素；ＣｏＡ非依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素およびスクシニル−ＣｏＡ合成酵素；４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素およびグルタミン酸塩：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼなどを、所望の通り、所望の生合成経路の酵素の組み合わせが対応する所望の生産物の生産をもたらす限り、本発明の天然に存在しない微生物に含めることができることは理解される。
【００８２】
同様に、例えば、ＢＤＯ生産を与えるように導入される任意の１以上の外因性核酸に関して、ＢＤＯ生合成経路を有する天然に存在しない微生物は、所望の酵素の組み合わせ、例えば、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素およびα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素；４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素および４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡ転移酵素；４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素および酪酸キナーゼ；４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素およびホスホトランスブチリラーゼ；４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡ転移酵素およびアルデヒド脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡ転移酵素およびアルコール脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡ転移酵素およびアルデヒド／アルコール脱水素酵素などをコードする少なくとも２つの外因性核酸を含む。このようにして、生合成経路の２以上の酵素の任意の組み合わせは、本発明の天然に存在しない微生物に含めることができることは理解される。同様にして、生合成経路の３以上の酵素の任意の組み合わせ、例えば、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、α−ケトグルタル酸脱炭酸酵素および４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡ転移酵素；４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、酪酸キナーゼおよびホスホトランスブチリラーゼ；４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡ転移酵素およびアルデヒド脱水素酵素；４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡ転移酵素、アルデヒド脱水素酵素およびアルコール脱水素酵素；酪酸キナーゼ、ホスホトランスブチリラーゼおよびアルデヒド／アルコール脱水素酵素などが本発明の天然に存在しない微生物に含めることができることは理解される。同様に、本明細書に記載されるような生合成経路の４、５個以上の酵素の任意の組み合わせは、所望の通り、所望の生合成経路の酵素の組み合わせが対応する所望の生産物の生産をもたらす限り、本発明の天然に存在しない微生物に含めることができる。
【００８３】
前述の天然に存在しない微生物のいずれかは、本発明の生合成生産物を生産し、および／または分泌するように培養することができる。例えば、４−ＨＢ生産体は、４−ＨＢの生合成生産のために培養することができる。４−ＨＢは、ＧＢＬ、ＴＨＦおよび／またはＢＤＯを生じるように、下記に記載されるように単離または処理され得る。同様に、ＢＤＯ生産体は、ＢＤＯの生合成生産のために培養することができる。ＢＤＯは、図１に例示される下流化合物などのＢＤＯファミリー化合物の化学合成のために単離されるかまたは更なる処理に供されてもよい。
【００８４】
増殖培地は、例えば、天然に存在しない微生物に炭素供給源を供給することができるいずれかの糖質供給源であり得る。このような供給源には、例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトースおよびスターチなどの糖類が挙げられる。糖質の他の供給源には、例えば、再生可能原料およびバイオマスなどが挙げられる。本発明の方法において原料として用いることができる典型的なタイプのバイオマスには、セルロース性バイオマス、ヘミセルロース性バイオマス、およびリグニン原料または原料の一部が挙げられる。このようなバイオマス原料は、例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトースおよびスターチなどの炭素供給源として有用な糖質基質を含む。本明細書に提供される教示およびガイダンスを考慮して、当業者は、上記で例示されたもの以外の再生可能原料およびバイオマスも、本発明の４−ＨＢおよび他の化合物を生産するための本発明の微生物の培養に用いることができることを理解する。
【００８５】
したがって、本明細書に提供される教示およびガイダンスを考慮して、当業者は、糖質などの炭素供給源上で増殖される場合、本発明の生合成された化合物を分泌する天然に存在しない微生物を生産することができることを理解する。このような化合物には、例えば、４−ＨＢ経路、ＢＤＯ経路および／または組み合わせた４−ＨＢおよびＢＤＯ経路における４−ＨＢ、ＢＤＯおよび中間代謝産物のいずれかが含まれる。必要とされるもの全ては、例えば、４−ＨＢおよび／またはＢＤＯ生合成経路のいくつかまたはその全ての包含を含む所望の化合物または中間体の生合成を達成するために、図２に示される１以上の酵素活性において操作されるべきである。したがって、本発明は、糖質上で増殖した場合には４−ＨＢを分泌し、糖質上で増殖した場合にはＢＤＯを分泌し、および／または糖質上で増殖した場合は図２に示される中間代謝産物のいずれかを分泌する天然に存在しない微生物を提供する。本発明のＢＤＯを生産する微生物は、例えば、コハク酸塩、スクシニル−ＣｏＡ、α−ケトグルタル酸塩、コハク酸セミアルデヒド、４−ＨＢ、４−ヒドロキシブチリルホスフェート、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（４−ＨＢ−ＣｏＡ）および／または４−ヒドロキシブチルアルデヒドから合成を開始することができる。
【００８６】
いくつかの態様では、培養条件は、嫌気的または実質的に嫌気的な増殖または維持条件を含む。例示的な嫌気的条件は、前述され、当該技術分野において周知である。発酵プロセスのための例示的な嫌気的条件は、以下の実施例に記載されている。これらの条件のいずれかは、天然に存在しない微生物、並びに当該技術分野において周知である他の嫌気的条件とともに用いることができる。このような嫌気的条件下で、４−ＨＢおよびＢＤＯ生産体は、それぞれ単量体４−ＨＢおよびＢＤＯを、５〜１０ｍＭまたはそれ以上の細胞内濃度並びに前に例示された他の全ての濃度で合成することができる。
【００８７】
また、本発明の４−ＨＢおよびＢＤＯを生産する天然に存在しない微生物に関して、多数の下流化合物を生じさせることができる。本発明の４−ＨＢを生産する微生物に関して、単量体４−ＨＢおよびＧＢＬは、培地に平衡状態で存在する。４−ＨＢからＧＢＬの変換は、例えば、酸性ｐＨ培地で微生物を培養することによって効率的に達成され得る。７．５未満またはそれに等しいｐＨ、特にｐＨ５．５以下では、図１に例示されるように、自然に４−ＨＢはＧＢＬに変換される。
【００８８】
得られたＧＢＬは、当該技術分野において周知な様々な方法を用いて、培養物に含まれる４−ＨＢおよび他の成分から分離することができる。このような分離法は、例えば、実施例に例示される抽出手法、並びに連続液体−液体抽出、パーベーパーレイション、膜ろ過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、および限外濾過を含む方法が挙げられる。上記方法の全ては、当該技術分野において周知である。分離されたＧＢＬは、例えば、蒸留によって、さらに精製することができる。
【００８９】
本発明の４−ＨＢを生産する天然に存在しない微生物から生産され得る別の下流化合物には、例えば、ＢＤＯが含まれる。この化合物は、例えば、ＧＢＬの化学的水素化によって合成することができる。化学的水素化反応は、当該技術分野において周知である。１つの例示的な手法には、１，４−ブタンジオールを生産するために、水素とともに使用される不均一もしくは均一な水素化触媒、または化学量論的もしくは触媒的に用いられる水素化物系の還元剤を用いた、培養物由来の４−ＨＢおよび／またはＧＢＬあるいはこれらの２つの化合物の混合物の化学的還元が含まれる。
【００９０】
当該技術分野において周知である他の手法は、上記の化学反応に等しく適用可能であり、例えば、酸化銅および酸化亜鉛触媒上の気相中のガンマ−ブチロラクトンの水素化分解について記載する国際公開第ＷＯ８２／０３８５４（Ｂｒａｄｌｅｙら）を含む。英国特許第１，２３０，２７６号は、酸化銅−酸化クロム触媒を用いたガンマ−ブチロラクトンの水素化について記載する。水素化は、液相で行われる。また、高い全リアクター圧を有するバッチ反応が例示される。リアクター内の反応物および生産物の分圧は、それぞれの露点を優に上回っている。英国特許第１，３１４，１２６は、酸化ニッケル−コバルト−トリウム触媒上の液相におけるガンマ−ブチロラクトンの水素化について記載する。それぞれの成分の露点を優位に上回っている高い全圧および成分分圧を有するバッチ反応が例示される。英国特許第１，３４４，５５７は、酸化銅−酸化クロム触媒上の液相におけるガンマ−ブチロラクトンの水素化について記載する。気相または蒸気を含む混合された相は、ある場合には適していると指示される。連続流管型リアクターは、高い全リアクター圧を用いて例示される。英国特許第１，５１２，７５１号は、酸化銅−酸化クロム触媒上の液相におけるガンマ−ブチロラクトンから１，４−ブタンジオールの水素化について記載する。高い全リアクター圧を有するバッチ反応が例示され、測定できる場合には、反応物および生産物の分圧は、それぞれの露点を優位に上回っている。米国特許第４，３０１，０７７号は、Ｒｕ−Ｎｉ−Ｃｏ−Ｚｎ触媒上の１，４−ブタンジオールへのガンマ−ブチロラクトンの水素化について記載する。この反応は、液相もしくは気相または混合された液−気相において行うことができる。高い全リアクター圧および比較的低いリアクター生産力の連続流液相反応が例示される。米国特許第４，０４８，１９６号は、酸化銅−酸化亜鉛触媒上のガンマ−ブチロラクトンの液相水素化による１，４−ブタンジオールの生産について記載する。さらに、高い全リアクター圧、高い反応物および生産物の分圧で操作する連続流管型リアクターが例示される。米国特許第４，６５２，６８５号は、ラクトンからグリコールへの水素化について記載する。
【００９１】
本発明の４−ＨＢを生産する微生物から生産され得る更なる下流化合物には、例えば、ＴＨＦが含まれる。この化合物は、例えば、ＧＢＬの化学的水素化によって合成することができる。ＧＢＬからＴＨＦへの変換に適用可能な当該技術分野において周知である１つの例示的な手法には、例えば、テトラヒドロフランを生産するために、水素とともに使用される不均一もしくは均一な水素化触媒、または化学量論的もしくは触媒的に用いられる水素化物系の還元剤を用いた、培養物由来の４−ＨＢおよび／またはＧＢＬあるいはこれらの２つの化合物の混合物の化学的還元が含まれる。当該技術分野において周知である他の手法は、上記の化学反応に等しく適用可能であり、例えば、水素化触媒を用いて調製される高い表面積のゾル−ゲル経路について記載する米国特許第６，６８６，３１０号が挙げられる。また、マレイン酸からテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）および１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）に還元する手法、ガンマブチロラクトンからテトラヒドロフランおよび１，４−ブタンジオールに還元する手法が記載されている。
【００９２】
培養条件には、例えば、液体培養手法、並びに発酵、および他の大スケールな培養手法が含まれ得る。下記の実施例にさらに記載されるように、本発明の生合成生産物の特に有用な収量は、嫌気的または実質的に嫌気的な培養条件下で得ることができる。
【００９３】
さらに、本発明は、４−ＨＢを製造する方法を提供する。この方法は、実質的な嫌気的条件下で、単量体４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）を生産するのに十分な時間、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、ＣｏＡ非依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、グルタミン酸塩：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ、ａ−ケトグルタル酸脱炭酸酵素、またはグルタミン酸脱炭酸酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）生合成経路を有する天然に存在しない微生物を発酵することを含み、このプロセスは、流加発酵およびバッチ分離；流加発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離を含む。
【００９４】
また、上述される培養および化学的水素化は、４−ＨＢ、ＧＢＬ、ＢＤＯおよび／またはＴＨＦを製造するためにスケールアップおよび連続的に増大することができる。例示的な増大手法には、例えば、流加発酵およびバッチ分離；流加発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離が挙げられる。これらの手法の全ては、当該技術分野において周知である。４−ＨＢ生産体を用いることにより、同時の４−ＨＢ生合成、並びにＧＢＬ、ＢＤＯおよび／またはＴＨＦへの化学的変換を可能にし、これは、発酵などの連続培養法と同時である上記の水素化手法を用いることによる。また、他の水素化手法は、当該技術分野において周知であり、本発明の方法に等しく適用可能である。
【００９５】
発酵手法は、４−ＨＢおよび／またはＢＤＯの商業的量の生合成生産のために特に有用である。一般に、非連続的培養手法と同様に、４−ＨＢまたはＢＤＯの連続および／または連続に近い生産は、対数期にある増殖を持続および／またはほぼ持続するのに十分な栄養素および培地において、本発明の４−ＨＢまたはＢＤＯを生産する天然に存在しない生物を培養することを含む。このような条件下での連続培養は、１日、２日、３日、４日もしくは５日、６日または７日あるいはそれを超えることが含まれ得る。さらに、連続培養は、１週間、２週間、３週間、４週間もしくは５週間またはそれを超え、最大数カ月を含むことができる。あるいは、本発明の生物は、特定の適用に適切であれば、数時間培養され得る。また、連続および／または連続に近い培養条件は、これらの例示的な期間の全ての時間間隔を含むことができる。
【００９６】
発酵手法は、当該技術分野において周知である。要約すると、本発明の４−ＨＢ、ＢＤＯまたは他の４−ＨＢに由来する生産物の生合成生産のための発酵は、例えば、流加発酵およびバッチ分離；流加発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離において利用可能である。当該技術分野において周知であるバッチおよび連続発酵手法の例には、下記の実施例においてさらに例示される。
【００９７】
また、実質的な量の単量体４−ＨＢおよびＢＤＯを連続的に生産するための、本発明のそれぞれの４−ＨＢまたはＢＤＯ生産体を用いた上記の発酵手法に加えて、４−ＨＢ生産体はまた、例えば、単量体４−ＨＢから、例えばＧＢＬ、ＢＤＯおよび／またはＴＨＦへの化学的変換について前述される化学的合成手法に同時に供されることができる。ＢＤＯ生産体は同様に、例えば、ＢＤＯから、例えばＴＨＦ、ＧＢＬ、ピロリドンおよび／または他のＢＤＯファミリー化合物への化学的変換について前述される化学的合成手法に同時に供されることができる。さらに、４−ＨＢおよびＢＤＯ生産体の産物は、本明細書に開示されるように、発酵培養物から分離し、連続して化学的変換に供することができる。
【００９８】
要約すると、発酵ブロスにおけるＧＢＬの水素化は、Ｆｒｏｓｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  １８：２０１−２１１（２００２）に記載されるように行うことができる。発酵中の水素化のための別の手法には、例えば、米国特許第５，４７８，９５２号に記載される方法が含まれる。この方法は、さらに、下記の実施例に例示される。
【００９９】
したがって、本発明は、さらに、γ−ブチロラクトン（ＧＢＬ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）または１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）を製造する方法を提供する。この方法は、４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）および／または１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）生合成経路を有する天然に存在しない微生物を発酵することを含み、この経路は、実質的に嫌気的な条件下で、１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）、ＧＢＬまたはＴＨＦを生産するのに十分な時間、４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、ＣｏＡ非依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸塩：ＣｏＡ転移酵素、グルタミン酸塩：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ、α−ケトグルタル酸脱炭酸酵素、グルタミン酸脱炭酸酵素、４−ヒドロキシブタン酸キナーゼ、ホスホトランスブチリラーゼ、ＣｏＡ非依存性１，４−ブタンジオールセミアルデヒド脱水素酵素、ＣｏＡ依存性１，４−ブタンジオールセミアルデヒド脱水素酵素、ＣｏＡ非依存性１，４−ブタンジオールアルコール脱水素酵素またはＣｏＡ依存性１，４−ブタンジオールアルコール脱水素酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、この発酵は、流加発酵およびバッチ分離；流加発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離を含む。
【０１００】
本明細書に記載される本発明の４−ＨＢ、ＢＤＯおよび他の生産物の生合成に加えて、本発明の天然に存在しない微生物および方法も、互いに、そして当該技術分野において周知である他の微生物および方法とともに種々の組み合わせにおいて利用して、他のルートによる生産物生合成を達成することもできる。例えば、４−ＨＢ生産体および化学的工程の使用以外、または直接的にはＢＤＯ生産体の使用以外のＢＤＯを生産するための１つの代案は、本明細書に例示される４−ＨＢまたは４−ＨＢ生産物をＢＤＯに変換することができる別の微生物の添加を介するものである。
【０１０１】
このようなある手法には、例えば、上述および後述されるように、４−ＨＢを生産するための本発明の４−ＨＢを生産する微生物の発酵が含まれる。次に、４−ＨＢは、４−ＨＢを、例えば、ＢＤＯ、ＧＢＬおよび／またはＴＨＦに変換する第２の微生物に対する基質として用いることができる。４−ＨＢは、第２の生物の別の培養物に直接添加することができ、または４−ＨＢ生産体の元々の培養物は、例えば、細胞分離によってこれらの微生物を枯渇することができ、次に、その後の発酵ブロスへの第２の生物の添加を利用して、中間の精製工程なしに最終生産物を生産することができる。例えば、ＢＤＯへの変換のための基質として４−ＨＢを生化学的に利用する能力を有する、ある例示的な第２の生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍである（例えば、Ｊｅｗｅｌｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３：２１５−１９（１９８６）を参照されたい）。
【０１０２】
他の態様では、本発明の天然に存在しない微生物および方法は、例えば、記載されるような４−ＨＢおよび／またはＢＤＯの生合成を達成するための幅広いサブ経路に組み立てることができる。これらの態様では、本発明の所望の生産物のための生合成経路は、異なる微生物に分離することができ、異なる微生物を同時に培養して、最終生産物を生産することができる。このような生合成スキームでは、１つの微生物の生産物は、最終生産物が合成されるまで、第２の微生物のための基質となる。例えば、ＢＤＯの生合成は、前述されるように、４−ＨＢを介した内因性のコハク酸塩などの基質を最終生産物のＢＤＯに変換する生合成経路を含む微生物を構築することによって達成することができる。あるいは、ＢＤＯも、同じ容器内で２つの生物を用いて同時培養または同時発酵を介して微生物から生合成的に生産することもできる。第１の微生物は、コハク酸から４−ＨＢを生産する遺伝子を有する４−ＨＢ生産体であり、第２の微生物は、４−ＨＢをＢＤＯに変換する遺伝子を有するＢＤＯ生産体である。
【０１０３】
本明細書に提供される教示およびガイダンスを考慮して、当業者は、広範囲の組み合わせおよび置換は、他の微生物とともに、サブ経路を有する他の天然に存在しない微生物の同時培養とともに、本発明の４−ＨＢ、ＢＤＯ、ＧＢＬおよびＴＨＦ生産物を生産するための、当該技術分野において周知である他の化学的および／または生化学的手法の組み合わせとともに、本発明の天然に存在しない微生物および方法のために存在することを理解する。
【０１０４】
生産物の生合成に有利に働く代謝変調を特定し、設計するための１つの計算法は、ＯｐｔＫｎｏｃｋ計算フレームワーク、Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，８４：６４７−５７（２００３）である。ＯｐｔＫｎｏｃｋは、標的生産物を過剰生産する遺伝的に安定な微生物をもたらす遺伝子欠失戦略を示唆する代謝モデリングおよびシミュレーションプログラムである。具体的には、フレームワークは、所望の生化学物質が細胞増殖の強制的な副産物となるように強いる遺伝的操作を示唆するために、微生物の完全な代謝および／または生化学ネットワークを調べる。戦略的に配置された遺伝子欠失または他の機能的遺伝子破壊を介して、生化学的生産と細胞増殖とを結合させることによって、バイオリアクター中での長期間後の操作された菌株に与えられた増殖選択圧は、強制的な増殖を結合した生化学的生産物の結果として、性能における改善をもたらす。最後に、遺伝子欠失が構築される場合、ＯｐｔＫｎｏｃｋによって選択される遺伝子はゲノムから完全に除去されるべきであるため、設計された菌株がそれらの野生型状態に戻るごく僅かな可能性がある。したがって、この計算方法論は、４−ＨＢおよび／またはＢＤＯの生合成をもたらす代替の経路を同定するために用いられるか、または４−ＨＢおよび／またはＢＤＯ生合成の更なる最適化のために天然に存在しない微生物と関連させて用いることができる。
【０１０５】
要約すると、ＯｐｔＫｎｏｃｋは、本明細書において、細胞の代謝をモデリングするための計算法およびシステムに言及して用いられる用語である。ＯｐｔＫｎｏｃｋプログラムは、特定の制約を流束均衡解析（ＦＢＡ）モデルに組み込むモデルと方法のフレームワークに関する。これらの制約には、例えば、定性的反応速度情報、定性的規制情報、および／またはＤＮＡマイクロアレイ実験データが含まれる。また、ＯｐｔＫｎｏｃｋは、例えば、流束均衡モデルを介して誘導される流束境界を狭め、その後、遺伝子の付加または欠失の存在下で、代謝ネットワークの性能限界を探ることによって、種々の代謝問題に対する解も計算する。ＯｐｔＫｎｏｃｋ計算フレームワークは、代謝ネットワークの性能限界の効果的なクエリーを可能にするモデル公式の構築を可能にし、得られた混合整数線形計画問題を解決する方法を提供する。ＯｐｔＫｎｏｃｋとして本明細書において言及される代謝モデリングおよびシミュレーション法は、例えば、２００２年１月１０日に出願された米国特許仮出願第１０／０４３，４４０号、２００２年１月１０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／００６６０号に記載されている。
【０１０６】
生産物の生合成生産に有利に働く代謝変調を同定し、設計するための別の計算方法は、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）と称される代謝のモデリングおよびシミュレーションシステムである。この計算方法およびシステムは、例えば、２００２年６月１４日に出願された米国特許第１０／１７３，５４７号、２００３年６月１３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／１８８３８号に記載されている。
【０１０７】
ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）は、インシリコでネットワークモデルを作り出し、生物系の化学反応を通して質量、エネルギー、または電荷の流束をシミュレートして、その生物系における化学反応の任意および全ての可能な機能性を含む解空間を規定し、それによりその生物系に許容される活性の範囲を決定するために用いることができる計算システムである。このアプローチは、含まれる反応の既知の化学量論、並びに反応による最大流束に関連する反応熱力学な制約および容量制約などの制約によって、解空間が規定されるため、制約に基づくモデリングと称される。これらの制約によって規定される空間は、生物系またはその生化学成分の表現型の能力および挙動を決定するために問い合わせることができる。凸解析、線形計画法、および例えばＳｃｈｉｌｌｉｎｇら、Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．２０３：２２９−２４８（２０００）；Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．７１：２８６−３０６（２０００）、Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｐｒｏｇ．１５：２８８−２９５（１９９９年）などに記載される極限経路（ｅｘｔｒｅｍｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ）の計算は、このような表現型の能力を決定するために用いることができる。下記の実施例において記載されるように、この計算方法論を用いて、４−ＨＢを生産しない微生物における実行可能かつ最適な４−ＨＢ生合成経路を同定し、分析した。
【０１０８】
上述のように、本発明に適用可能な計算プログラムで使用される制約に基づく１つの方法は、流束均衡解析である。定常状態条件における流束均衡に基づく流束均衡解析は、例えば、ＶａｒｍａおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．１２：９９４−９９８（１９９４）に記載されているように行うことができる。流束均衡アプローチは、例えば、ＦｅｌｌおよびＳｍａｌｌ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：７８１−７８６（１９８６）に記載されている脂肪細胞代謝、ＭａｊｅｗｓｋｉおよびＤｏｍａｃｈ、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．３５：７３２−７３８（１９９０）に記載されているＡＴＰ最大化条件下でのＥ．ｃｏｌｉからの酢酸塩分泌、またはＶａｎｒｏｌｌｅｇｈｅｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｐｒｏｇ．１２：４３４−４４８（１９９６）に記載されている酵母によるエタノール分泌のシステム特性をシミュレートまたは予測するために、反応ネットワークに適用されてきた。さらにこの方法を用いて、多様な単一炭素源におけるＥ．ｃｏｌｉの増殖、またＥｄｗａｒｄｓおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：５５２８−５５３３（２０００）；ＥｄｗａｒｄｓおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７４：１７４１０−１７４１６（１９９９）およびＥｄｗａｒｄｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：１２５−１３０（２００１）に記載されるようにＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの代謝を予測またはシミュレートすることもできる。
【０１０９】
一度解空間が規定されると、様々な条件下での可能な解を決定するために解析することができる。生物系は柔軟性があり、異なる多くの方式で同じ結果に到達することができるため、この計算アプローチは生物学的現実に合致する。生物系は、全生命系が直面しなければならない基本的制約によって制限されてきた進化機構を通して設計されている。したがって、制約に基づくモデリング戦略は、これらの一般的現実を包含する。さらに、制約の強化によりネットワークモデルにさらなる制限を持続的に課す能力は、解空間のサイズの減少をもたらし、それにより生理学的能力または表現型の推測精度を向上させる。
【０１１０】
本明細書に提供される教示およびガイダンスを考慮して、当業者は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母以外の宿主微生物における４−ＨＢ、ＢＤＯ、ＧＢＬ、ＴＨＦおよび他のＢＤＯファミリー化合物の生合成を設計し、実行するための代謝のモデリングおよびシミュレーション用の様々な計算フレームワークを適用することができる。このような代謝のモデリングおよびシミュレーション法には、例えば、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）およびＯｐｔＫｎｏｃｋなどの上記で例示された計算システムが含まれる。本発明を説明するために、いくつかの方法が、モデリングおよびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋ計算フレームワークに言及して記載されている。当業者は、当該技術分野において周知であるこのような他の代謝のモデリングとシミュレーションの計算フレームワークおよび方法のいずれかに、ＯｐｔＫｎｏｃｋを用いた代謝変調の同定、設計および実施を適用する仕方を知っている。
【０１１１】
生化学的生産物を生合成的に生産する細胞または生物の能力は、インシリコのモデルを用いて計算された典型的な代謝ネットワークの生化学的生産の限界に照らして説明することができる。これらの限界は、制限基質（単数または複数）の摂取速度（単数または複数）をそれらの実験的に測定された値（単数または複数）に修正し、それぞれの到達可能な増殖レベルで生化学的生産の最大および最小速度を計算することによって得られる。所望の生化学物質の生産は、一般に、細胞内の供給源に関してバイオマス形成と直接競合する。これらの状況のもとで、強化された生化学的生産速度は必然的に最大ではない増殖速度をもたらす。ＯｐｔＫｎｏｃｋなど上記の代謝のモデリングおよびシミュレーションプログラムにより示唆されるノックアウトは、野生型菌株の代謝挙動の変化を強いる許容解の境界を制限するよう設計されている。所定の菌株の実際の解の境界は、基質の摂取速度（単数または複数）が増加あるいは減少すると拡大または縮小するが、それぞれの実験点は、その計算された解の境界内に位置する。これらのようなプロットは、設計された菌株がその性能限界にどの程度近づいているかの正確な予測を可能とし、改善の余地がどの程度であるかも示される。
ＯｐｔＫｎｏｃｋ数学的フレームワークは、生合成、特に、増殖連動型の産物生合成をもたらす遺伝子欠失を特定するために本明細書に例示されている。この手順は、支配する物理化学的制約を連続的に課すことによって、細胞系が示すことができる可能な表現型の範囲を狭める、制約に基づく代謝のモデリングを基礎としている、Ｐｒｉｃｅら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２：８８６−９７（２００４）。上述のように、制約に基づくモデルおよびシミュレーションは当該技術分野において周知であり、一般に、ネットワークの化学量論を前提に、特定の細胞目標の最適化を引き合いに出して、可能性のある流束分布を示唆する。
【０１１２】
要約すると、代謝産物のセットＮ＝｛１，．．．，Ｎ｝と代謝反応のセットＭ＝｛１，．．．，Ｍ｝を含む定常状態の代謝ネットワークの総反応流束として定量化された細胞目標の最大化は、数学的に以下のように表現される。
【０１１３】
【化１】
2020072661.tif 000005
式中、Ｓｉｊ、は反応ｊにおける代謝産物ｉの化学量論係数であり、ｖｊは反応ｊの流束であり、ｖ基質取り込みは制限基質（単数または複数）の想定あるいは測定された摂取速度（単数または複数）を表わし、ｖａｔｐ維持は非増殖関連のＡＴＰ維持要求である。ベクトルｖは内側流束および外側流束の双方を含む。この研究では、細胞目標は、多くの場合、バイオマス形成に必要とされる比率での生合成前駆体の放出となるよう想定される、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ、Ｆ．Ｃ．ら、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，１９９６，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ：ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ．２ｖ．（ｘｘ，２８２２，ｌｘｘｖｉ）。流束は、一般に、バイオマス形成が、生産されたバイオマスｇ／ｇＤＷ・ｈｒまたは１／ｈｒとして表現されるように、１ｇＤＷ・ｈｒ（乾燥重量グラム×時間）あたりで報告される。
【０１１４】
遺伝子欠失のモデリング、したがって、反応の排除は、最初に制約に基づくアプローチのフレームワークに２値変数の組み込みを行う、Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、７４：３６４−３７５（２００１）；Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ、１７：７９１−７９７（２００１）。これらの２値変数
【０１１５】
【化２】
2020072661.tif 000006
は、反応ｊが活性の場合は１の値を、不活性の場合は０の値を想定する。以下の制約
【０１１６】
【化３】
2020072661.tif 000007
によって、反応流束ｖｊが、変数ｙｊ＝０の場合のみゼロに設定されることが確保される。あるいは、ｙｊ＝１のとき、ｖｊは下限ｖｊｍｉｎと上限ｖｊｍａｘとの間の任意の値を想定できる。ここで、ｖｊｍｉｎおよびｖｊｍａｘは、上記のネットワーク制約を条件とするあらゆる反応流束をそれぞれ最小化、最大化することにより同定される、Ｍａｈａｄｅｖａｎら、Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ、５：２６４−７６（２００３）。
【０１１７】
最適な遺伝子／反応ノックアウトは、得られたネットワークの最適増殖解が、対象とする化学物質を過剰に生産するように、活性反応（ｙｊ＝１）のセットを選定する二工程最適化問題を解決することによって同定される。数学的には、この二工程最適化問題は、以下の二工程混合整数最適化問題として表現される。
【０１１８】
【化４】
2020072661.tif 000008
式中、ｖ化学物質は、例えば、コハク酸塩または他の生化学的生産物など所望の標的生産物の生産であり、Ｋは許容されるノックアウトの数である。Ｋ＝０の設定は、完全なネットワークの最大バイオマスの解を返し、Ｋ＝１の設定は、得られたネットワークがその最大バイオマス収率を前提として最大過剰生成を伴うように、単一遺伝子／反応ノックアウト（ｙｊ＝０）を同定する。最後の制約によって、得られたネットワークが最小バイオマス収率を満たすことが確保される。Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、８４：６４７−５７（２００３）は、モデル公式および解法についてのより詳細な説明を提供している。何百もの２値変数を含む問題は、ＧＡＭＳ、Ｂｒｏｏｋｅら、ＧＡＭＳ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９９８）を通じてアクセスされるＣＰＬＥＸ８．０、ＧＡＭＳ：Ｔｈｅ  Ｓｏｌｖｅｒ  Ｍａｎｕａｌｓ。２００３：ＧＡＭＳ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのモデル化環境をＩＢＭ  ＲＳ６０００−２７０ワークステーション上で用いて、数分から数時間程度で解決できる。ＯｐｔＫｎｏｃｋフレームワークは、生化学物質過剰生産のための有望な遺伝子欠失戦略を同定することが既に可能であり（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、８４：６４７−５７（２００３）；Ｐｈａｒｋｙａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、８４：８８７−８９９（２００３））、代謝および調節モデリングのフレームワークの更なる改善を必然的に網羅する体系的なフレームワークを確立する。
【０１１９】
前述の二工程ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題のいかなる解も、１セットの破壊される代謝反応を提供する。そのセット内の各反応の排除、あるいは代謝修飾により、生物の増殖相の間において強制的な生産物として４−ＨＢまたはＢＤＯをもたらすことができる。反応が知られているため、二工程ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題の解は、反応のセット内の各反応を触媒する１つ以上の酵素をコードする関連遺伝子（単数または複数）も提供する。反応のセットおよび各反応に参加する酵素をコードする対応する遺伝子の同定は、一般に、自動プロセスであり、反応と、酵素とコード化された遺伝子との間の関係を有する反応データベースとの相関によって達成される。
【０１２０】
一度同定されると、４−ＨＢまたはＢＤＯ生産を達成するために破壊される反応のセットは、標的細胞または生物において、そのセット内の各代謝反応をコードする少なくとも１つの遺伝子の機能破壊によって実施される。反応のセットの機能破壊を達成するための１つの特に有用な手段は、コード化する各遺伝子の欠失によるものである。しかしながら、いくつかの例では、例えば突然変異、プロモーターもしくは調節因子のｃｉｓ結合部位などの調節領域の欠失を含むか、または任意の数の位置でのコード化する配列の短縮による他の遺伝子異常によって反応を破壊することが有益となり得る。遺伝子のセットの全体的な欠失に満たないこととなるこれら後者の異常は、例えば、コハク酸塩共役の迅速な評価が望まれる場合、または遺伝子の復帰が起こる可能性が低い場合に有用となる。
【０１２１】
４−ＨＢまたは他の生化学生産物の増殖連動型の生合成を含む生合成をもたらすことができる、更なる破壊される反応のセットまたは代謝修飾をもたらす、上記の二工程ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題の更なる生成的な解を同定するために、整数切捨てと称される最適化方法が実施できる。この方法は、各反復に整数切捨てと称される更なる制約を組み込み、上記に例示されるＯｐｔＫｎｏｃｋ問題を反復して解決することにより進行する。整数切捨て制約は、解法が、生成物生合成を増殖に強制的に共役する、以前の任意の反復において同定されたのと全く同じ反応のセットを選定するのを効果的に防止する。例えば、以前に同定された増殖連動型の代謝修飾が、破壊される反応１、２、および３を特定する場合、ｙ１＋ｙ２＋ｙ３≧１という制約は、同じ反応が後の解で同時に検討されるのを防止する。整数切捨て方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、参考文献のＢｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，１７：７９１−７９７（２００１）に見いだすことができる。代謝のモデリングおよびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋ計算フレームワークとの組み合わせで、その使用に関連して本明細書に記載されている全ての方法と同様に、反復計算解析における冗長性を減少させる整数切捨て方法も、例えば、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）を含む当該技術分野において周知の他の計算フレームワークとともに適用することができる。
【０１２２】
上記の形式の制約は、以前に同定されたセットを含む、より大きい反応のセットの同定を防ぐ。例えば、更なる反復で上記の整数切捨て最適化方法を使用すると、破壊される反応１、２、および３を特定した４反応のセットは、これらの反応が以前に同定されているため、同定されることが防げられる。生産物の生合成生産につながる全ての可能な反応のセットを確実に同定するために、整数切捨て方法の修正を用いることができる。
【０１２３】
要約すると、修正された整数切捨て法は、反復「ゼロ」で始まり、これは野生型ネットワークの最適増殖で目的の生化学物質の最大生成を計算する。この計算は、Ｋ＝０でのＯｐｔＫｎｏｃｋ解に相当する。次に、単一のノックアウトが検討され、２つのパラメータのセットであるｏｂｊｓｔｏｒｅｉｔｅｒおよびｙｓｔｏｒｅｉｔｅｒ，ｊが導入されて、各反復ｉｔｅｒで目標関数（ｖ化学物質）および反応オン−オフ情報（ｙｊ）がそれぞれ保存される。次に、各反復で、ＯｐｔＫｎｏｃｋ公式に以下の制約が引き続き付与される。
【０１２４】
【化５】
2020072661.tif 000009
上記の方程式では、εとＭは、それぞれ小さい数および大きい数である。一般に、εは約０．０１に設定でき、Ｍは約１０００に設定できる。しかしながら、これらの数値よりも小さい数や大きい数も使用できる。Ｍは、制約が以前に同定されたノックアウト戦略のみを拘束することができることを確実にし、εは、以前に同定された戦略へのノックアウトの追加が、最適増殖での生化学的生産において少なくともεの増加をもたらさなければならないことを確実にする。このアプローチは、単一の欠失戦略が野生型菌株を改良するのに失敗したときは、常に二重欠失へと移行する。二重欠失戦略が野生型菌株を改良しない場合は、次に三重欠失が検討され、以下同様である。最適増殖での所望の生化学的生産として表わされる最終結果は、少なくとも１つのノックアウトの分だけ互いに異なる別個の欠失戦略の順位付けられたリストである。この最適化手順、および破壊された場合に多種多様な反応のセットの同定は、生化学的生産物の生合成（増殖連動型の生産を含む）をもたらす。本明細書において提供される教示および指針を前提として、当業者は、本明細書に例示される方法および代謝的操作設計が、新規な生合成経路を同定することに、および/あるいは細胞または微生物増殖の任意の生化学的生産物への強制的共役に、同等に適
用可能であることを理解する。
【０１２５】
上記に例示され、下記の実施例でさらに説明される方法は、標的の生化学的生産物を生合成的に生産する（標的の生化学的生産物の生産を、同定された遺伝子改変を有するように操作された細胞または生物の増殖に強制的に共役することを含む）細胞および生物の構築を可能にする。この関連で、４−ＨＢおよび１，４−ブタンジオールの生合成をもたらす代謝変調が同定されている。同定された代謝変調によって構成された微生物菌株は、修飾されていない微生物と比較して、高いレベルの４−ＨＢまたはＢＤＯを生産する。これらの菌株は、連続式発酵プロセスにおける、例えば４−ＨＢ、ＢＤＯ、ＴＨＦおよびＧＢＬの商業生産のために、負の選択圧を受けることなく有利に用いることができる。
【０１２６】
したがって、本明細書に記載される計算法は、ＯｐｔＫｎｏｃｋまたはＳｉｍＰｈｅｎｙから選択されるインシリコの方法によって同定される代謝修飾の同定および実施を可能にする。この代謝修飾のセットは、例えば、１以上の生合成経路酵素の付加および／または遺伝子欠失による破壊を含む１以上の代謝反応の機能破壊を含むことができる。
【０１２７】
本発明の種々の態様の活性に実質的に影響を及ぼさない修飾も、本明細書に提供される発明の定義内に含まれることが理解される。したがって、下記の実施例は、本発明を例示するためであり、限定しないことが意図される。
【実施例】
【０１２８】
（実施例Ｉ）
４−ヒドロキシブタン酸の生合成
本実施例は、４−ＨＢ生産のための生化学的経路を説明する。
【０１２９】
微生物における４−ＨＢ合成の従来の報告は、生分解性プラスチックであるポリ−ヒドロキシアルカン酸塩（ＰＨＡ）の生産における中間体としてこの化合物に焦点が当てられていた（米国特許第６，１１７，６５８号）。ポリ−３−ヒドロキシ酪酸塩ポリマー（ＰＨＢ）に対する４−ＨＢ／３−ＨＢ共重合体の使用は、脆性が少ないプラスチックをもたらすことができる（ＳａｉｔｏおよびＤｏｉ、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１６：９９−１０４（１９９４））。本明細書に記載されている単量体４−ＨＢの生産は、いくつかの理由で根本的には異なったプロセスである：（１）細胞内に生産され、細胞内に残存するＰＨＡとは対照的に、生産物が分泌される；（２）ヒドロキシブタン酸塩ポリマーを生産する微生物に対して、遊離４−ＨＢは生産されないが、むしろ、補酵素Ａ誘導体がポリヒドロキシアルカン酸塩合成酵素によって用いられる；（３）このポリマーの場合、粒状生産物の形成が熱力学を変化させる；（４）細胞外ｐＨは、このポリマーの生産のための問題ではなく、それは、４−ＨＢが遊離酸または共役塩基状態で存在するかどうか、また４−ＨＢとＧＢＬとの間で平衡して存在するかどうかに影響を及ぼす。
【０１３０】
４−ＨＢは、中間体としてコハク酸セミアルデヒドを用いて、ＴＣＡサイクルの中心的な代謝産物であるコハク酸塩から２つの酵素還元工程で生産することができる（図２）。これらの酵素のうちの最初のものであるコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素は、ＮＡＤＨ−およびＮＡＤＰＨ−依存性酵素の両方が見出されているＥ．ｃｏｌｉを含む多くの生物に天然に存在している（ＤｏｎｎｅｌｌｙおよびＣｏｏｐｅｒ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：５５５−５６１（１９８１）；ＤｏｎｎｅｌｌｙおよびＣｏｏｐｅｒ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４５：１４２５−１４２７（１９８１）；ＭａｒｅｋおよびＨｅｎｓｏｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：９９１−９９４（１９８８））。また、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素活性を支持する証拠があり（Ｒａｍｏｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４９：４０１−４０４（１９８５））、推定遺伝子は、配列相同性によって同定されている。しかしながら、大部分のレポートは、この酵素は、図２に示されるように、４−ＨＢおよびガンマ−アミノ酪酸塩の分解経路に参加しているコハク酸塩合成の方向に進むことを示している（ＤｏｎｎｅｌｌｙおよびＣｏｏｐｅｒ、上述；Ｌｕｔｋｅ−ＥｖｅｒｓｌｏｈおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１８１：６３−７１（１９９９））。また、コハク酸セミアルデヒドは、２つの酵素であるグルタミン酸塩：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼおよびグルタミン酸脱炭酸酵素の作用を介して、ＴＣＡサイクルの中間体であるα−ケトグルタル酸塩を通じてＥ．ｃｏｌｉなどのある種の微生物によって天然に生産される。コハク酸塩を分解するための偏性嫌気性菌のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉによって使用される別の経路は、コハク酸塩をスクシニル−ＣｏＡに活性化し、次に、この方向で機能することが知られている代替のコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素を使用して、スクシニル−ＣｏＡをコハク酸セミアルデヒドに変換する（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：１２１−１２７（１９９３））。しかしながら、このルートは、コハク酸塩をスクシニル−ＣｏＡに変換させるのに必要とされるＡＴＰのエネルギー消費がある。
【０１３１】
この経路の第２の酵素である４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉにも酵母にも天然で存在しないが、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉおよびＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａなどの種々の細菌に見出される（Ｌｕｔｋｅ−ＥｖｅｒｓｌｏｈおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、上述；ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８８０（１９９６）；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２７：４３−６０（１９９５）；ＷｏｌｆｆおよびＫｅｎｅａｌｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６：２０６−２１２（１９９５））。これらの酵素は、ＮＡＤＨ依存性であることが知られているが、ＮＡＤＰＨ依存性形態も存在する。アルファ−ケトグルタル酸塩から４−ＨＢへの追加の経路が、ポリ（４−ヒドロキシブタン酸）の蓄積をもたらすＥ．ｃｏｌｉにおいて示された（Ｓｏｎｇら，Ｗｅｉ  Ｓｈｅｎｇ  Ｗｕ  Ｘｕｅ．Ｂａｏ．４５：３８２−３８６（２００５））。組換え菌株は、３つの異種遺伝子であるＰＨＡシンターゼ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）および４−ヒドロキシ酪酸塩：ＣｏＡ転移酵素（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、並びに２つの天然のＥ．ｃｏｌｉ遺伝子：グルタミン酸塩：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼおよびグルタミン酸脱炭酸酵素の過剰発現を必要とした。図２における工程４および５は、代替的に、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓにおいて同定されたものなどのアルファ−ケトグルタル酸脱炭酸酵素によって実施することができる（Ｓｈｉｇｅｏｋａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８２（Ｐｔ２）：３１９−３２３（１９９２）；ＳｈｉｇｅｏｋａおよびＮａｋａｎｏ、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８８：２２−２８（１９９１）；ＳｈｉｇｅｏｋａおよびＮａｋａｎｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２９２（Ｐｔ２）：４６３−４６７（１９９３））。しかしながら、この酵素は、従来、いずれかの生物における４−ＨＢまたは関連したポリマーの製造に影響を及ぼすようには適用されていなかった。
【０１３２】
コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素の報告されている方向性は、４−ＨＢ代謝の熱力学の調査へと導く。具体的には、この研究は、４−ＨＢへのコハク酸塩またはスクシニル−ＣｏＡの変換に関与する反応が、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに存在する典型的な生理学的条件下で熱力学的に望ましい（即ち、ΔＧｒ＜０）か否かを調査した。全ての酸化／還元反応は、ＮＡＤＨを利用するものと推測されるが、ＮＡＤＰＨ利用を想定した結果は、同様である。標準生産ギブス自由エネルギー（ΔＧｆ０）は、原子団寄与法（Ｍａｖｒｏｖｏｕｎｉｏｔｉｓ，Ｍ．Ｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４４４０−１４４４５（１９９１））に基づいて、図２に示されるコハク酸塩およびスクシニル−ＣｏＡ経路において、各化合物について計算された。次に、各々の標準生産ギブス自由エネルギーは、特定の圧力、温度、ｐＨ、およびイオン強度で自然変化の基準を得るために変換された（Ａｌｂｅｒｔｙ，Ｒ．Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２０７：１−１１（１９９４））（式１）。
【０１３３】
【化６】
2020072661.tif 000010
式中、ΔＧｆ０は、標準生産ギブス自由エネルギーであり、ＮＨは、化合物中の水素原子の数であり、Ｒは、一般気体定数であり、Ｔは、２９８Ｋで一定であり、ｚは、対象とするｐＨでの分子の電荷であり、Ｉは、Ｍにおけるイオン強度であり、Ｂは、１．６Ｌ０．５／ｍｏｌ０．５に等しい定数である。
【０１３４】
方程式１は、細胞内ｐＨおよびイオン強度の両方が、熱力学的実行可能性の測定において役割を果たすことを表す。通常、細胞の細胞内ｐＨは、培養ｐＨが大きく変動する場合であっても非常に十分に制御される。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞内ｐＨはともに、文献に報告されている。Ｅ．ｃｏｌｉは、中性バッファーでの典型的な増殖状態で細胞内ｐＨを７．４〜７．７に維持するが、ｐＨ６の培地では７．２まで下がり、さらに、外部ｐＨが５である場合に対しては６．９程度の低さに達することもあり得る（Ｒｉｏｎｄｅｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈ．１１：７３５−７３８（１９９７））。しかしながら、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖は、６を下回る外部ｐＨで大幅に阻害される。酵母のｐＨは、より大きな変動を示す。指数増殖期では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの内部ｐＨは、外部ｐＨが５．０に調節されている場合、６．７〜７．０の範囲にあることが測定されている（ＤｏｍｂｅｋおよびＩｎｇｒａｍ、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：１２８６−１２９１（１９８７））。他方では、静止細胞では、内部ｐＨは、外部ｐＨが６以下である場合、６未満に下がる（ＩｍａｉおよびＯｈｎｏ、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１６５−１７２（１９９５））。この分析は、細胞内ｐＨがＥ．ｃｏｌｉでは７．４、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは６．８であると推測している。また、イオン強度は０．１５であると推測された（Ｖａｌｅｎｔｉら、上述）。
【０１３５】
変換された生産ギブスエネルギーは、標準状態（ｐＨ＝７．０、Ｉ＝０）、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｐＨ＝７．４、Ｉ＝０．１５）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ｐＨ＝６．８、Ｉ＝０．１５）の生理学的状態で計算された。次に、変換された反応ギブスエネルギー（ΔＧｒ’）は、生産物と反応物との間のΔＧｆ’における差異を測ることによって計算された。コハク酸塩またはスクシニル−ＣｏＡを４−ＨＢに変換するのに必要な変換された反応ギブスエネルギーを表２に示す。ある工程では、デルタＧが正の値として計算されたが、これらの計算および濃度勾配に対する標準誤差は、どの工程も実行可能であることを示す。グループ寄与理論によって計算されたΔＧｆの標準誤差であるＵｆ，ｅｓｔは４ｋｃａｌ／ｍｏｌであることに留意されたい。ΔＧｒ，Ｕｒ，ｅｓｔの不確定性は、各化合物のΔＧｆに対する不確定性のユークリッドノルム（Ｅｕｃｌｉｄｅａｎ  ｎｏｒｍ）として計算することができる（式）。
【０１３６】
【化７】
2020072661.tif 000011
式中、ｎは、化学量論係数（ｓｔｏｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）であり、ｉは、化合物である。試験された反応について、この不確定性は、８ｋｃａｌ／ｍｏｌのオーダーである。
【０１３７】
表２．異なるｐＨおよびイオン強度値での反応のギブス自由エネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）。第１の列は、標準条件下であり、他は、式１に従って調整される。温度は、２９８Ｋで一定である。これらの値の誤差バーは、式２により計算すると、８ｋｃａｌ／ｍｏｌのオーダーである。省略形：ｓｕｃ、コハク酸塩；ｓｕｃｓａ、コハク酸セミアルデヒド；ｓｕｃｃｏａ、スクシニル−ＣｏＡ；Ｐｉ、無機リン酸塩。
【０１３８】
【表２】
2020072661.tif 000012
表２は、本発明者らによる計算において潜在的な不確定性を考慮後の熱力学的障壁に直面する最も可能性のある反応は、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素であることを表す（図２の第１工程）。また、関与している代謝産物の想定される濃度を変更することによって、熱力学的実行可能性に近づいて、この反応が推進するかどうかも研究した。例えば、標準ギブスエネルギーは、全ての関与している化合物（水を除く）について１Ｍの濃度であることを推測する。嫌気性環境では、ＮＡＤＨは、ＮＡＤよりも数倍高い濃度で存在している。［ＮＡＤＨ］＝５×［ＮＡＤ］であると仮定して、本発明者らは、式
【０１３９】
【化８】
2020072661.tif 000013
を用いて、ΔＧｒ’への影響を計算した。
【０１４０】
この変化は、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素に対して、デルタＧ値の約１ｋｃａｌ／ｍｏｌの差をもたらす。また、式３は、反応を推進するための高いコハク酸塩濃度などの、ΔＧｒに対する他の影響を計算するために用いられた。コハク酸塩およびコハク酸セミアルデヒドの濃度における１０００倍の差は、デルタＧに約５ｋｃａｌ／ｍｏｌを寄与する。８ｋｃａｌ／ｍｏｌの推測される不確定性と合わせて考慮すると、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素が、ある一連の生理学的条件下、コハク酸セミアルデヒドに向けて動作するという可能性は、排除することができない。このようにして、コハク酸塩から４−ＨＢへの直接的なルートは、依然として、その後の分析における検討事項となる。
【０１４１】
４−ヒドロキシ酪酸塩の微生物による生産能力が、２つの微生物であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、各微生物のインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）代謝モデルを用いて調査された。４−ＨＢへの潜在的な経路は、図２に示されるように、コハク酸塩、スクシニル−ＣｏＡ、またはアルファ−ケトグルタル酸塩中間体を介して進行する。
【０１４２】
コハク酸塩からの４−ＨＢ生産経路における第１工程は、ＮＡＤＨ−またはＮＡＤＰＨ−依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素を介して、コハク酸塩からコハク酸セミアルデヒドへの変換を伴う。Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｇａｂＤは、ＮＡＤＰ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素であり、４−アミノ酪酸塩の取り込みおよび分解に関与する遺伝子クラスターの一部である（Ｎｉｅｇｅｍａｎｎら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６０：４５４−４６０  （１９９３）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：６９７６−６９８６（２００２））。ｓａｄは、ＮＡＤ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素活性のための酵素をコードすると考えられている（ＭａｒｅｋおよびＨｅｎｓｏｎ、上述）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、推定上ＵＧＡ２に指定されている、ＮＡＤＰＨ−依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素だけを含み、これは、細胞質ゾルに局在している（Ｈｕｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２５：６８６−６９１（２００３））。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの両方における４−ＨＢへのコハク酸塩経路を想定する最大収量計算は、非天然の４−ＨＢ脱水素酵素がそれらの代謝ネットワークに加わっていたという仮定だけを必要とする。
【０１４３】
スクシニル−ＣｏＡから４−ヒドロキシ酪酸塩までの経路は、４−ヒドロキシ酪酸塩単量体単位を含むポリヒドロキシアルカン酸塩を作製するためのプロセスの一部として、米国特許第６，１１７，６５８号に記載された。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉは、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素活性を有することで知られている１つの例示的な生物である（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、上述；ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、上述）。この研究では、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉまたは別の生物由来のこの酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、非天然または異種の４−ＨＢ脱水素酵素とともに発現し、スクシニル−ＣｏＡから４−ＨＢまでの経路を完成するものと想定される。アルファ−ケトグルタル酸塩から４−ＨＢまでの経路は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、乾燥細胞重量の３０％までポリ（４−ヒドロキシ酪酸）の蓄積をもたらすことが示された（Ｓｏｎｇら、上述）。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、グルタミン酸塩：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼおよびグルタミン酸脱炭酸酵素の両方を天然でまたは内因的に有するので（Ｃｏｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２４４−２５０（２００１））、ＡＫＧから４−ＨＢまでの経路は、非天然の４−ＨＢ脱水素酵素が存在することだけを仮定することによって、両生物において完成され得る。
【０１４４】
（実施例ＩＩ）
Ｅ．ｃｏｌｉにおける４−ヒドロキシブタン酸の生産
本実施例は、各生化学的経路からもたらされる４−ヒドロキシブタン酸に対する生合成収量を記載する。
【０１４５】
この節では、グルコースからの４−ＨＢの最大理論収量が計算され、図２に示される３つの代謝経路の各々がＥ．ｃｏｌｉにおいて機能的であることを想定する。Ｒｅｅｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．４：Ｒ５４（２００３）に記載されているものと類似する、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノム規模の代謝モデルが、分析の基準として用いられた。各最大収量経路のエネルギー獲得は、生産されたＡＴＰ分子の観点から計算され、他に記載がなければ、嫌気的条件であると仮定する。４−ヒドロキシ酪酸塩は、大部分の有機酸と同様に、プロトン共輸送を介してＥ．ｃｏｌｉから出るものと想定される。また、ＧＢＬは、単純拡散によって分泌される可能性があり、この場合、エネルギー論は、ここで考えられる場合よりも好都合である。また、各経路の最大収量およびエネルギー論における関与している酵素の補因子特異性（すなわち、ＮＡＤＨ依存性またはＮＡＤＰＨ依存性）の影響を調べた。
【０１４６】
分析の結果を表３Ａ〜Ｃに示す。エネルギー論および収量の観点から、コハク酸塩から４−ＨＢへの経路は最も期待される。具体的には、計算により、グルコースからの４−ＨＢの最大理論収量が１．３３ｍｏｌ／ｍｏｌ（０．７７ｇ／ｇ；０．８９Ｃｍｏｌ／Ｃｍｏｌ）であることが示され、コハク酸塩から４−ＨＢへの経路が機能的であることが想定される。さらに、コハク酸塩を介した４−ＨＢの嫌気的生産は、関与している酵素の想定される補因子特異性に依存して、グルコースあたり１．８、１．５、または１．１ｍｏｌのいずれかのＡＴＰの正味の生産をもたらす。これらのエネルギー収率は、グルコースあたり２．０ＡＴＰに匹敵し、それは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける嫌気性ホモ−４−ＨＢ生産のための潜在性を示唆するエタノールまたは乳酸塩の生産によって、基質レベルのリン酸化を介して得ることができる。
【０１４７】
４−ＨＢへのスクシニル−ＣｏＡ経路は、最大収量およびエネルギー論を考慮すると、別の有望な経路である。４−ＨＢの１．３３ｍｏｌ／ｍｏｌ収率は、経路工程の少なくとも１つがＮＡＤＨ依存性であると想定される場合、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて達成可能である。しかしながら、この経路は、スクシニル−ＣｏＡの形成を必要とするため、そのエネルギー収率は、コハク酸塩経路のエネルギー収率よりも低い。酸素要求は、ＣｏＡ−依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素および４−ＨＢ脱水素酵素工程がＮＡＤＰＨ依存性であると想定される場合、高い４−ＨＢ収量であると予測される。この場合、最大収量での４−ＨＢ生産は、正味でないＡＴＰ獲得をもたらし、おそらくＥ．ｃｏｌｉ生存に必要とされるエネルギー維持要求を支持しない。このようにして、一部のエネルギーは、ホモ−発酵性４−ＨＢ生成を可能にする酸化的リン酸化由来でなければならない。４−ＨＢへ向かう、グルタミン酸塩：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼおよびグルタミン酸脱炭酸酵素を利用するアルファ−ケトグルタル酸塩経路は、３つの潜在的なルートのうちで最も好都合でなく、最大達成可能な収量は、１ｍｏｌのグルコースあたり、１．０ｍｏｌの４−ＨＢであった。より低い最大収量に加えて、この経路は、４−ＨＢに変換されるグルコース１ｍｏｌあたり１．５ｍｏｌの酸素の利用を要求する。この経路のエネルギー論は、４−ＨＢ脱水素酵素の想定される補因子特異性によって影響を受けない。
【０１４８】
表３．４−ＨＢへの全基質の変換化学量論であり、Ａ）コハク酸塩、Ｂ）スクシニル−ＣｏＡ、またはＣ）アルファ−ケトグルタル酸塩生産ルートがＥ．ｃｏｌｉにおいて機能的であることを想定する。グルコースおよび酸素が取り込まれ、その間、他の全ての分子が生産される。
【０１４９】
【表３】
2020072661.tif 000014
この報告書において提案される計算による予測を確かめるために、４−ＨＢまでの完全な経路を発現している菌株を構築し、試験することができる。確認は、Ｅ．ｃｏｌｉ（実施例ＩＩおよびＩＶ）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（実施例ＩＩＩ）の両方を用いて行われる。Ｅ．ｃｏｌｉでは、関連遺伝子は、中または高コピーのプラスミド上で誘導可能なプロモーターの後方にある合成オペロンにおいて発現される；例えば、ｐＢＡＤ系のプラスミド上のアラビノースによって誘導されるＰＢＡＤプロモーター（Ｇｕｚｍａｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：４１２１−４１３０（１９９５））。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、遺伝子は、天然のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を置き換えて、ＰＤＣｌプロモーターの後方に、染色体内に組み込まれる。このことは、プラスミド由来よりも高い外来遺伝子の発現をもたらすことが報告され（Ｉｓｈｉｄａら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：１９６４−１９７０（２００５））、また、嫌気的条件での発現を確保する。
【０１５０】
関連構築物を含む細胞は、ＰＢＡＤプロモーター下で発現される遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉの場合にはアラビノースの添加を伴う、グルコースを含む最少培地で増殖される。試料は、遺伝子発現および酵素活性分析の両方のために周期的に採取される。酵素活性アッセイは、当該技術分野において周知である手法を用いて粗製な細胞抽出物において行われる。あるいは、全ての脱水素酵素反応工程において生産され、分光測光法によって検出可能であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化に基づくアッセイを利用することができる。さらに、抗体を用いて、特定の酵素のレベルを検出することができる。酵素活性測定の代わりにまたはそれに加えて、ＲＮＡは、逆転写酵素ＰＣＲによって測定される、対象とする遺伝子の平行な試料および転写物から単離することができる。検出可能な転写物発現を欠くいずれかの構築物は、コードしている核酸が発現可能な形態で保持されていることを確かめるために再分析される。転写物が検出される場合、この結果は、翻訳の欠損または不活性酵素の生産のいずれかを示す。当該技術分野において周知である様々な方法は、追加的に用いることができ、例えば、コドン最適化、強力なリボソーム結合部位の操作、異種由来の遺伝子の使用、およびＡｓｎ残基からＡｓｐへの変換によるＮ−グリコシル化の防止（酵母における細菌酵素の発現を目的とする）などが挙げられる。一度、必要とされる全ての酵素活性が検出されると、次の工程は、インビボにおいて４−ＨＰの生産を測定することである。三連の振とうフラスコ培養物が、必要とされる条件（上記を参照）に応じて、嫌気的または微好気的のいずれかで増殖され、試料が周期的に採取される。培養上清に存在する有機酸は、Ａｍｉｎｅｘ  ＡＨ−８７Ｘカラムを用いたＨＰＬＣによって分析される。４−ＨＢの溶出時間は、化学物質製造業者から購入した標準を用いて測定される。
【０１５１】
ＣｏＡ非依存性経路が実行され、確認のために試験することができる。この場合、過剰発現した遺伝子は、各生物由来の天然のコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、およびＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来の４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素である。一度、両方の酵素活性が、上記で検討されるように検出されると、菌株は、４−ＨＢ生産について試験される。また、ＣｏＡ依存性経路の実行から確認が得られる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来のＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素および４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素は、上述されるように発現される。さらに、天然のスクシニル−ＣｏＡ合成酵素の過剰発現も行われ、異種経路により多くのコハク酸塩を注ぎ込むためである。最終的に、４−ＨＢ生産が好ましくない場合、異なる培養条件を試験することができ、例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／ＮＡＤ（Ｐ）比を操作することができる酸素付加状態の変化が挙げられる。
【０１５２】
（実施例ＩＩＩ）
酵母における４−ヒドロキシブタン酸の生産
本実施例は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける各生化学的経路からもたらされる４−ヒドロキシブタン酸についての生合成収量を記載する。
【０１５３】
この節では、グルコースからの４−ＨＢの最大理論収量を計算し、図２に示される３つの代謝経路の各々が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて機能的であることを想定する。Ｆｏｒｓｔｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３：２４４−２５３（２００３）に記載されるものと同じように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノム規模の代謝モデルを分析用の基準として用いた。各最大収量経路のエネルギー獲得は、他に記載がなければ、嫌気的条件であると仮定して計算する。４−ヒドロキシ酪酸塩は、大部分の有機酸と同様に、プロトン共輸送を介してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから出るものと想定される。また、各経路の最大収量およびエネルギー論に対する関与している酵素の補因子特異性（即ち、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ依存性）の影響を調べた。
【０１５４】
分析からの結果を表４Ａ〜Ｃに示す。Ｅ．ｃｏｌｉと同様に、コハク酸塩から４−ＨＢへの経路は最も期待されるが、ただし、実施例１において生じた熱力学的な懸念は克服され得る。この計算は、グルコースからの４−ＨＢの最大理論収量は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて１．３３ｍｏｌ／ｍｏｌ（０．７７ｇ／ｇ；０．８９Ｃｍｏｌ／Ｃｍｏｌ）であることを表す。さらに、コハク酸塩を介した４−ＨＢの嫌気的生産は、関与している酵素の想定される補因子特異性に依存して、グルコースあたり１．４、１．１、または０．５ｍｏｌのいずれかのＡＴＰの正味の生産をもたらす。
【０１５５】
４−ＨＢまでのスクシニル−ＣｏＡ経路は、２番目に好ましい経路である。１．３３ｍｏｌ  ４−ＨＢ／ｍｏｌグルコースの最大収量は、補因子特異性に関わらずにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて達成可能である。しかしながら、最大理論収量での正味のエネルギー発生は、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素および４−ＨＢ脱水素酵素工程の両方がＮＡＤＨ依存性であると想定される場合にのみ可能である。いずれかの工程がＮＡＤＰＨ依存的である場合、正味のＡＴＰは、嫌気的４−ＨＢ生産からは何ら得られず、代替のエネルギー源（例えば、酸化的リン酸化）が細胞増殖および維持を支持するために必要とされる。４−ＨＢに向かうアルファ−ケトグルタル酸塩ルートは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて３つの潜在的な経路のうちで最も好ましくないが、１ｍｏｌのグルコースあたり１．１〜１．２ｍｏｌ  ４−ＨＢの最大収量はＥ．ｃｏｌｉに見られたものよりも僅かに高い。それにも関わらず、この経路は、エネルギー的に中立になるために、１ｍｏｌのグルコースあたり０．８〜０．９ｍｏｌ酸素の酸素取り込みを必要とする。
【０１５６】
表４．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける４−ＨＢへの全基質の変換化学量論であり、Ａ）コハク酸塩、Ｂ）スクシニル−ＣｏＡ、またはＣ）アルファ−ケトグルタル酸塩生産ルートがＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて機能的であることを想定する。グルコースおよび酸素が取り込まれ、その間、他の全ての分子が生産される。
【０１５７】
【表４】
2020072661.tif 000015
（実施例ＩＶ）
コハク酸塩およびα−ケトグルタル酸塩からの１，４−ブタンジオールの生合成
本実施例は、微生物から４−ＨＢおよびＢＤＯの構築および生合成生産を例証する。
【０１５８】
実施例Ｉ〜ＩＩＩにおいて前述されるように、図１に示される４−ＨＢからＢＤＯへの生体内変化工程の熱力学的特徴もグループ寄与によって測定された標準生産ギブス自由エネルギーに基づいて計算された。結果を表５に示す。同様に、いくつかの工程が正のデルタＧ値を計算したが、これらの計算の標準誤差および濃度勾配は、いずれかの工程が実行可能であることを指示する。
【０１５９】
表５．標準的な条件（ｐＨおよびイオン強度値）下での反応ギブス自由エネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）。温度は、２９８Ｋで一定であった。これらの値の誤差バーは、式２によって計算されるように、８ｋｃａｌ／ｍｏｌのオーダーである。省略形：４−ＨＢａｌｄ、４−ヒドロキシブチルアルデヒド。
【０１６０】
【表５】
2020072661.tif 000016
理論的収量が計算され、図２における全ての経路はＥ．ｃｏｌｉにおいて組み込まれると想定される。Ｒｅｅｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ４：Ｒ５４（２００３）に記載されるものと同様に、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノム規模の代謝モデルを分析用の基準として用いた。エネルギー中立性、および細胞増殖も維持もないことを仮定した場合の最大理論収量は、微嫌気的条件下で、１．０９ｍｏｌ  ＢＤＯ／ｍｏｌグルコースであった。嫌気的条件下で行ったシミュレーションは、ＢＤＯ生産に向けられた経路を推進するために利用することができ、共同産物として酢酸塩またはエタノールのいずれかが生産される。これらの条件下で、最大収量は、それぞれ１．０４および１．００ｍｏｌ／ｍｏｌであった。１つの代替法は、電子受容体として、制限量の硝酸塩を添加し、したがって、起こり得る呼吸量を調節することである。この条件下では、最大収量は、１．０９ｍｏｌ／ｍｏｌまで戻る。別の代替法は、ＰＥＰカルボキシル化の方向に機能し得る異種または操作されたホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼを用いて、天然のＥ．ｃｏｌｉのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼを置換することである。この酵素はＡＴＰを生産し、ＰＥＰカルボキシラーゼは生産しない。この仮定の下で、最大収量は、１．０９ｍｏｌ／ｍｏｌまで戻る。
【０１６１】
さらに、上述される経路において利用可能であるいくつかの代わりの酵素がある。コハク酸塩からスクシニル−ＣｏＡへ変換するための天然または内因性の酵素（図２では工程１）は、工程９では同じように機能する、ｃａｔ１遺伝子Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ（Ｓｏｈｌｉｎｇ，Ｂ．およびＧ．Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：１２１−１２７（１９９３））によってコードされるものなどのＣｏＡ転移酵素によって置換され得る。しかしながら、この酵素による酢酸塩の生産は最適でない場合があり、それは、アセチル−ＣｏＡに戻って変換されるというよりはむしろ分泌される場合があるためである。この点において、工程９において酢酸塩形成を排除することも有益となり得る。このＣｏＡ転移酵素に対する１つの代替として、酢酸塩からアセチル−ＣｏＡへの変換についてのＥ．ｃｏｌｉにおける酢酸キナーゼ／ホスホトランスアセチラーゼ経路と類似して、４−ＨＢが最初にＡＴＰによってリン酸化され、次にＣｏＡ誘導体に変換される機構が用いられてもよい。このルートの正味のコストは、１つのＡＴＰであり、それは、酢酸塩からアセチル−ＣｏＡを再生産するために必要とされるのと同じである。酵素であるホスホトランスブチリラーゼ（ｐｔｂ）および酪酸キナーゼ（ｂｋ）は、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍにおいて酪酸塩生産のため、非ヒドロキシル化分子に対してこれらの工程を行うことで知られている（Ｃａｒｙら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５６：１５７６−１５８３（１９９０）；Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ，Ｒ．Ｃ．およびＲ．Ｓ．Ｗｏｌｆｅ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２３５：１９４８−１９５２（１９６０））。これらの酵素は、可逆的であり、合成を４−ＨＢの方向に進行させることができる。
【０１６２】
また、ＢＤＯは、コハク酸塩を介することに加えてまたはそれに代えて、α−ケトグルタル酸塩を介して生産することもできる。前述され、さらには下記に例示されるように、生産物生合成を達成するための１つの経路は、内因性酵素を用いたα−ケトグルタル酸塩を介したコハク酸セミアルデヒドの生産を伴うものである（図２、工程４−５）。代替法は、１工程においてこの変換を行うことができるα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素を用いることである（図２、工程８；Ｔｉａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２：１０６７０−１０６７５（２００５））。
【０１６３】
ＢＤＯを生産する微生物の異なる菌株の構築について、適用可能な遺伝子のリストが、実証のために集められた。要約すると、４−ＨＢおよび／またはＢＤＯ生合成経路内の１以上の遺伝子は、利用可能な文献供給源、ＮＣＢＩ遺伝子データベース、および相同性検索を用いて、図２に示される完全なＢＤＯ生産経路の各工程について同定された。この研究においてクローニングされ、評価された遺伝子は、ポリペプチド配列に対する適切な参考文献およびＵＲＬ引用とともに、下記の表６に示される。さらに下記に検討されるように、いくつかの遺伝子は、コドン最適化のために合成され、他は、天然または野生型の生物のゲノムＤＮＡからＰＣＲを介してクローニングされた。いくつかの遺伝子については、両方のアプローチが用いられ、この場合、天然の遺伝子は、実験に用いられる場合に遺伝子の識別番号に接尾語「ｎ」によって示される。ＤＮＡ配列だけが相違し、タンパク質が同じであることに留意されたい。
【０１６４】
表６．宿主のＢＤＯを生産する微生物において発現する遺伝子
【０１６５】
【表６−１】
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【０１６６】
【表６−２】
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ＢＤＯ経路のための発現ベクター構築。ベクター骨格およびいくつかの菌株は、Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ（ｗｗｗ．ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ．ｄｅ／）のＤｒ．Ｒｏｌｆ  Ｌｕｔｚから得た。ベクターおよび菌株は、Ｄｒ．Ｒｏｌｆ  ＬｕｔｚおよびＰｒｏｆ．Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｂｕｊａｒｄ（Ｌｕｔｚ，Ｒ．およびＨ．Ｂｕｊａｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：１２０３−１２１０  （１９９７））によって開発されたｐＺ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍに基づく。得られたベクターは、ｐＺＥ１３１ｕｃ、ｐＺＡ３３１ｕｃ、ｐＺＳ＊１３１ｕｃおよびｐＺＥ２２１ｕｃであり、詰込み断片としてルシフェラーゼ遺伝子を含んでいた。適切な制限酵素部位に挟まれたｌａｃＺ−アルファ断片でルシフェラーゼ詰込み断片を置換するために、このルシフェラーゼ詰込み断片を最初にＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いた消化によって各ベクターから取り出した。ｌａｃＺ−アルファ断片は、下記のプライマー：ｌａｃＺアルファ−ＲＩ５’ＧＡＣＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＴＣＣＡＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧ  ＴＴＴＴＡＣ３’ｌａｃＺアルファ３’ＢＢ５’−ＧＡＣＣＣＴＡＧＧＡＡＧＣＴＴＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡ−３’を用いて、ｐＵＣ１９からＰＣＲ増幅した。
【０１６７】
これは、ＥｃｏＲＩ部位の５’末端、ＮｈｅＩ部位、リボソーム結合部位、ＳａｌＩ部位および開始コドンを含む断片を生じた。断片の３’末端には、終始コドン、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＡｖｒＩＩ部位が含まれる。ＰＣＲ生産物は、ＥｃｏＲＩおよびＡｖｒＩＩで消化され、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化された基礎ベクターに連結された（ＸｂａＩおよびＡｖｒＩＩは適合可能末端を有し、部位なしを生じる）。ＮｈｅＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位は、互いに連結され得る適合可能末端を生じる（しかし、ＮｈｅＩ／ＸｂａＩ部位なしを生じ、これは、いずれの酵素によっても消化されない）ため、ベクターにクローニングされた遺伝子は、互いに「バイオブリック（ｂｉｏｂｒｉｃｋ）」され得る（ｈｔｔｐ：／／ｏｐｅｎｗｅｔｗａｒｅ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｓ  ｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：ＢｉｏＢｒｉｃｋｓ）。要約すると、この方法は、同じ２つの制限部位（この部位が遺伝子の内部に現れない限りにおいて）を用いて、ベクター内に制限されない数の遺伝子を接合することができる。なぜなら、遺伝子間のこの部位が各添加後に破壊されるためである。
【０１６８】
全てのベクターは、ｐＺ記号表示、続く、文字および数字による表示、複製起点、抗生物質耐性マーカー、およびプロモーター／調節ユニットを含む。複製起点は、２番目の文字であり、ＣｏｌＥ１系起源についてはＥ、ｐ１５Ａ系起源についてはＡ、ｐＳＣ１０１系起源についてはＳによって示される。１番目の数字は、抗生物質耐性マーカーを表す（アンピシリンについては１、カナマイシンについては２、クロラムフェニコールについては３、スペクチノマイシンについては４、テトラサイクリンについては５）。最後の数は、対象とする遺伝子を調節したプロモーターを示す（ＰＬｔｅｔＯ−１については１、ＰＬｌａｃＯ−１については２、ＰＡ１ｌａｃＯ−１については３、Ｐｌａｃ／ａｒａ−１については４）。ＭＣＳおよび対象とする遺伝子は、直後に続く。本明細書において検討される作業については、本発明者らは、２つの基本ベクターであるｐＺＡ３３およびｐＺＥ１３を用い、上記で検討されるようなバイオブリック挿入物については修飾されている。一度、対象とする遺伝子（単数または複数）がそれらにクローニングされると、得られるプラスミドは、表６に示される４つの数字の遺伝子コード；例えば、ｐＺＡ３３−ＸＸＸＸ−ＹＹＹＹ−を用いて示される。
【０１６９】
宿主菌株構築。本明細書に記載される全ての研究における親菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２菌株ＭＧ１６５５である。ａｄｈＥ、ｇａｂＤ、およびａｌｄＡにおけるマーカーなしの欠失菌株は、ｒｅｄＥＴ法（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．およびＢ．Ｌ．Ｗａｎｎｅｒ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  ＳＡ  ９７：６６４０−６６４５（２０００））を用いて、第三者による請負契約により構築された。その後の菌株は、バクテリオファージＰ１を介した形質導入（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．１９７３．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）により構築された。菌株Ｃ６００Ｚ１（ｌａｃｉｑ、ＰＮ２５−ｔｅｔＲ、ＳｐＲ、ｌａｃＹ１、ｌｅｕＢ６、ｍｃｒＢ＋、ｓｕｐＥ４４、ｔｈｉ−１、ｔｈｒ−１、ｔｏｎＡ２１）は、Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓから得られ、Ｐ１形質導入のためにｌａｃＩｑ対立遺伝子の供給源として用いた。バクテリオファージＰ１  ｖｉｒは、ｌａｃＩｑに連結されたスペクチノマイシン耐性遺伝子を有するＣ６００Ｚ１  Ｅ．ｃｏｌｉ菌株上で増殖させた。Ｃ６００Ｚ１上で増殖させたＰ１溶解物を用いて、ＭＧ１６５５に感染させ、スペクチノマイシン耐性に関して選択した。次に、スペクチノマイシン耐性コロニーは、ＰＡ１ｌａｃＯ−１プロモーターに連結された遺伝子の発現を抑制する形質導入体の能力を測定することによって、連結されたｌａｃＩｑについてスクリーニングされた。得られた菌株は、ＭＧ１６５５  ｌａｃＩｑと指名された。同様の手法を用いて、欠失菌株にｌａｃＩＱを導入した。
【０１７０】
コハク酸塩から４−ＨＢの生産。コハク酸塩からの４−ＨＢ生産体の構築に関して、コハク酸塩から４−ＨＢおよび４−ＨＢ−ＣｏＡへの工程（図２では１、６、７、および９）をコードする遺伝子は、後述されるｐＺＡ３３およびｐＺＥ１３ベクター上に集められた。遺伝子の種々の組み合わせ、並びに対照としての不完全な経路を有する構築体を評価した（表７および８）。次に、プラスミドは、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導可能な発現を可能にするｌａｃＩＱを含む宿主菌株に形質転換された。野生型、並びに天然のコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（図１では工程２）をコードする遺伝子における欠失を有する宿主の両方を試験した。
【０１７１】
異種酵素の活性は、最初に、経路遺伝子を含むプラスミド構築物のための宿主として菌株ＭＧ１６５５  ｌａｃＩＱを用いて、インビトロアッセイにおいて試験された。各構築物に適切な抗生物質を含むＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ）において好気的に細胞を増殖させ、光学密度（ＯＤ６００）がおよそ０．５に達したときに、ＩＰＴＧを１ｍＭで添加することによって誘導した。６時間後に細胞を回収し、酵素アッセイを下記に検討されるように行った。
【０１７２】
インビトロ酵素アッセイ。活性アッセイについての粗製抽出物を得るために、４，５００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ａｌｌｅｇｅｒａ  Ｘ−１５Ｒ）で１０分間遠心分離することによって、細胞を回収した。ペレットは、ベンゾナーゼおよびリゾチームを含む０．３ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）試薬に再懸濁させ、溶解は、穏やかに振とうしながら１５分間、室温で進行させた。細胞を含まない溶解物は、１４，０００ｒｐｍ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４０２）で、３０分、４℃で遠心分離によって得られた。試料中の細胞タンパク質は、Ｂｒａｄｆｏｒｄら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４（１９７６）の方法を用いて測定され、特定の酵素アッセイは後述されるように行った。活性は、単位／ｍｇタンパク質で記録され、この場合は、活性の単位は、１μｍｏｌの基質が１分間、室温で、変換されるのに必要とされる酵素量として定義される。一般に、記録された値は、少なくとも３回繰り返したアッセイの平均である。
【０１７３】
スクシニル−ＣｏＡ転移酵素（Ｃａｔ１）活性は、前述の手法であるＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８８０（１９９６）に従って、スクシニル−ＣｏＡおよび酢酸塩からアセチル−ＣｏＡの形成をモニターすることによって決定された。スクシニル−ＣｏＡ合成酵素（ＳｕｃＣＤ）活性は、ＡＴＰの存在下でコハク酸塩およびＣｏＡからスクシニル−ＣｏＡの形成を追跡することによって決定された。この実験は、ＣｈａおよびＰａｒｋｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３９：１９６１−１９６７（１９６４）によって記載される手法に従った。ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＳｕｃＤ）活性は、コハク酸セミアルデヒドおよびＣｏＡの存在下、３４０ｎｍでＮＡＤからＮＡＤＨの変換を追跡することによって決定された（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：１２１−１２７（１９９３））。４−ＨＢ脱水素酵素（４ＨＢｄ）酵素活性は、コハク酸セミアルデヒドの存在下、３４０ｎｍでＮＡＤＨからＮＡＤの酸化をモニターすることによって測定された。この実験は、公開された手法であるＧｅｒｈａｒｄｔら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７４：１８９−１９９（２０００）に従った。４−ＨＢ  ＣｏＡ転移酵素（Ｃａｔ２）活性は、ＳｃｈｅｒｆおよびＢｕｃｋｅｌ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：２６９９−２７０２（１９９１）からの修飾された手法を用いて測定された。アセチル−ＣｏＡおよび４−ＨＢまたは酪酸塩からの４−ＨＢ−ＣｏＡの形成またはブチリル−ＣｏＡ形成は、ＨＰＬＣを用いて測定された。
【０１７４】
アルコール（ＡＤＨ）およびアルデヒド（ＡＬＤ）脱水素酵素は、いくつかの文献供給源（Ｄｕｒｒｅら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１７：２５１−２６２（１９９５）；ＰａｌｏｓａａｒｉおよびＲｏｇｅｒｓ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：２９７１−２９７６（１９８８）、並びにＷｅｌｃｈら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７３：３０９−３１８（１９８９））から改変された手法を用いて還元方法にアッセイされた。ＮＡＤＨの酸化は、室温で全体で２４０秒間、４秒ごとに、３４０ｎＭで吸光度を読み取ることによって追跡される。還元アッセイは、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ（ＫＯＨを用いてｐＨを７．５に調整）、０．４ｍＭ  ＮＡＤＨ、１〜５０μｌの細胞抽出物において行われた。反応は、下記の試薬：ＡＤＨについては１００μｌの１００ｍＭアセトアルデヒドもしくはブチルアルデヒド、またはＡＬＤについては１００μｌの１ｍＭアセチル−ＣｏＡもしくはブチリル−ＣｏＡを添加することによって開始される。分光光度計は即座にブランクにされ、次に、速度論的読み取りが開始される。１分あたりの３４０ｎＭでの吸光度における減少の得られた傾き、並びに３４０ｎＭでのＮＡＤ（Ｐ）Ｈのモル吸光率（６０００）、抽出物のタンパク質濃度を用いて、比活性を測定することができる。
【０１７５】
ＰＴＢの酵素活性は、Ｃａｒｙら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：４６１３−４６１８（１９８８）に記載されるように、ブチリル−ＣｏＡからブチリル−リン酸塩の方向に測定される。それは、変換については無機リン酸塩を与え、試薬である５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）、即ちＤＴＮＢを用いて遊離ＣｏＡの増加を追跡する。ＤＴＮＢは、急速にチオール基、例えば遊離ＣｏＡと反応し、モル吸光率１４，１４０Ｍｃｍ−１を有し、４１２ｎｍで吸収する黄色の２−ニトロ−５−メルカプト安息香酸（ＴＮＢ）を放出する。このアッセイバッファーは、ｐＨ７．４の１５０ｍＭリン酸カリウム、０．１ｍＭ  ＤＴＮＢ、および０．２ｍＭブチリル−ＣｏＡを含み、反応は、２〜５０μＬの細胞抽出物の添加によって開始された。ＢＫの酵素活性は、ＡＴＰを使って、酪酸塩からブチリル−リン酸塩の形成の方向に測定される。この手法は、Ｒｏｓｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１１：７３７−７５６（１９５４）に前述される酢酸キナーゼについてのアッセイに類似している。しかしながら、本発明者らは、より有用であり、高感度な、Ｓｉｇｍａによって提供される別の酢酸キナーゼ酵素アッセイプロトコールを見いだした。このアッセイは、酢酸キナーゼによるＡＴＰからＡＤＰへの変換を、ピルビン酸キナーゼによるＡＤＰとホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）からＡＴＰとピルビン酸塩への連結された変換、その後の乳酸脱水素酵素によるピルビン酸塩とＮＡＤＨから乳酸塩とＮＡＤ＋への変換に関連させる。酢酸塩の代わりに酪酸塩を用いることは、このアッセイがＢＫ酵素活性を追跡することができる唯一の主な修飾である。アッセイ混合物は、ｐＨ７．６で８０ｍＭトリエタノールアミンバッファー、２００ｍＭ酪酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＮＡＤＨ、６．６ｍＭ  ＡＴＰ、１．８ｍＭホスホエノールピルビン酸塩を含んでいた。ピルビン酸キナーゼ、乳酸脱水素酵素、およびミオキナーゼが、製造業者の使用説明書に従って添加された。反応は、２〜５０μＬの細胞抽出物を添加することによって開始され、反応は、ＮＡＤＨ酸化を指示する３４０ｎｍの吸光度の減少に基づいてモニターされた。
ＨＰＬＣによるＣｏＡ誘導体の分析。ＨＰＬＣ系アッセイは、補酵素Ａ（ＣｏＡ）転移に関する酵素反応をモニターするために開発された。開発された方法は、インビトロの反応混合物に存在するＣｏＡ、アセチルＣｏＡ（ＡｃＣｏＡ）、ブチリルＣｏＡ（ＢｕＣｏＡ）および４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ（４−ＨＢＣｏＡ）の定量的測定によって酵素活性の特徴付けを可能にした。低いμＭにいたる感度、並びに対象とする全てのＣｏＡ誘導体の優れた分解能が達成された。
【０１７６】
化学物質および試料の調製は次のように行った。要約すると、ＣｏＡ、ＡｃＣｏＡ、ＢｕＣｏＡおよび全ての他の化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得られた。溶媒であるメタノールおよびアセトニトリルは、ＨＰＬＣ等級であった。標準的な較正曲線は、０．０１〜１ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で優れた直線性を示した。酵素反応混合物は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファー（ｐＨ７）を含み、アリコートは、異なる時間点で採取され、ギ酸（最終濃度０．０４％）を用いてクエンチされ、ＨＰＬＣによって直接分析された。
【０１７７】
ＨＰＬＣ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００ＨＰＬＣシステムを用いて行われ、それは、２成分ポンプ、デガッサー、温度自動調節自動サンプラーおよびカラムコンパートメントを備え、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）は分析のために用いられた。逆相カラムであるＫｒｏｍａｓｉｌ  １００  ５ｕｍ  Ｃ１８、４．６×１５０ｍｍ（Ｐｅｅｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。２５ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７）とメタノールまたはアセトニトリルは、１ｍＬ／分の流速で水性および有機溶媒として用いられた。２つの方法が開発された：十分に分離されたＣｏＡ、ＡｃＣｏＡおよびＢｕＣｏＡの分析用にはより速い勾配を用いた短期な方法、近接して溶出するＡｃＣｏＡと４−ＨＢＣｏＡとの間を区別するためのより長期の方法。短期方法は、アセトニトリル勾配（０分−５％、６分−３０％、６．５分−５％、１０分−５％）を用い、ＣｏＡ、ＡｃＣｏＡおよびＢｕＣｏＡについてそれぞれ保持時間２．７、４．１、５．５分という結果であった。長期方法では、メタノールは、次の直線勾配とともに用いられた：０分−５％、２０分−３５％、２０．５分−５％、２５分−５％。ＣｏＡ、ＡｃＣｏＡ、４−ＨＢＣｏＡおよびＢｕＣｏＡについての保持時間は、それぞれ５．８、８．４、９．２および１６．０分であった。注入体積は５μＬであり、カラム温度は３０℃であり、ＵＶ吸光度は２６０ｎｍでモニタリングされた。
【０１７８】
結果は、各々の４つの経路工程（表６）の活性を示すが、活性は、遺伝子供給源、ベクターにある遺伝子の位置、ともに発現される他の遺伝子の状況に明確に依存している。例えば、遺伝子００３５は、０００８によってコードされるものよりも活性なコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードし、００３６および００１０ｎは、０００９よりも活性な４−ＨＢ脱水素酵素遺伝子である。また、同じオペロン上で先行する別の遺伝子がある場合、より良好な４−ＨＢ脱水素酵素活性であるように見える。
【０１７９】
表７．４−ＨＢ−ＣｏＡ経路において遺伝子を発現するプラスミドを含むＭＧ１６５５ｌａｃＩＱからの細胞抽出物におけるインビトロでの酵素活性。活性は、単位／ｍｇタンパク質として報告され、この場合、活性の単位は、１分間、室温において１μｍｏｌの基質を変換するのに必要な酵素量として定義される。
【０１８０】
【表７】
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遺伝子は、ＣｏｌＥ１起点およびアンピシリン耐性を有する高コピープラスミドであるｐＺＥ１３上のＰｌａｃから発現した。遺伝子の識別番号は、表２に与えられる。
【０１８１】
遺伝子は、ｐＡＣＹＣ起点およびクロラムフェニコール耐性を有する中程度コピープラスミドであるｐＺＡ３３上のＰｌａｃから発現した。
【０１８２】
（ｃ）細胞タンパク質は、ｍｇタンパク質／ｍＬ抽出物として与えられた。
【０１８３】
次に、４−ＨＢ経路において遺伝子を含む組換え菌株は、中心的な代謝中間体からインビボにおいて４−ＨＢを生産する能力について評価された。ＯＤ６００がおよそ０．４になるまでＬＢ培地で嫌気的に細胞を増殖させ、その後、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。１時間後、コハク酸ナトリウムを１０ｍＭまで添加し、さらに２４時間および４８時間後に分析用に試料を採取した。培養ブロスの４−ＨＢは、後述されるようにＧＣ−ＭＳによって分析された。結果は、組換え菌株が、対照の菌株において本質的にゼロと比較して、２４時間後に２ｍＭを超える４−ＨＢを生産することができることを指示する（表８）。
【０１８４】
表８．種々の組み合わせの４−ＨＢ経路遺伝子を発現するプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ菌株におけるコハク酸塩から４−ＨＢの生産。
【０１８５】
【表８】
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（ａ）正規化された４−ＨＢ濃度、μＭ／ＯＤ６００単位  。
【０１８６】
コハク酸塩からスクシニル−ＣｏＡを生産するためにＣｏＡ転移酵素（ｃａｔ１）を使用することの代替法は、スクシニル−ＣｏＡ合成酵素をコードする天然のＥ．ｃｏｌｉ  ｓｕｃＣＤ遺伝子を用いることである。この遺伝子クラスターは、ｐＺＥ１３−００３８−００３５−００３６を作るために４−ＨＢまでの残りの工程について候補遺伝子とともにｐＺＥ１３上にクローニングされた。
【０１８７】
グルコースからの４−ＨＢの生産。上記実験は、中心的な代謝中間体（コハク酸塩）からの４−ＨＢまでの機能的経路を示すが、産業プロセスは、グルコースまたはスクロースなどの低コストの糖質原料から化学物質の生産を必要とする。したがって、次のセットの実験は、グルコースで増殖中の細胞によって生産される内因性のコハク酸塩が４−ＨＢ経路に燃料を補給することができるかどうかを決定することを目的とした。２０ｇ／Ｌグルコース、緩衝能力を改善するための１００ｍＭ  ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、１０μｇ／ｍＬチアミン、および適した抗生物質を補足したＭ９最少培地（６．７８ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３．０ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１．０ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２）において嫌気的に細胞を増殖させた。０．２５ｍＭ  ＩＰＴＧは、ＯＤ６００がおよそ０．２に到達したときに添加され、誘導後、２４時間ごとに４−ＨＢ分析用に試料を採取した。全ての場合において、４−ＨＢは２４時間後にプラトーになり、最良の菌株では最大約１ｍＭとなり（図１１ａ）、一方コハク酸塩濃度は上昇し続けた（図１１ｂ）。これは、この経路へのコハク酸塩の供給が制限されそうになく、障害が酵素自体の活性またはＮＡＤＨ利用可能性において存在する可能性があることを示す。００３５および００３６は、明らかに、それぞれ、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素および４−ＨＢ脱水素酵素について最良の遺伝子候補である。知られている（ｇａｂＤ）または推定の（ａｌｄＡ）の天然のコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする遺伝子の１つまたはその両方の排除は、性能においてそれほど効果がない。最後に、細胞は、対照よりも、４−ＨＢを生産する菌株において非常に低いＯＤまで増殖したことを留意しなければならない（図１１ｃ）。
【０１８８】
グルコースからの４−ＨＢの生産のための代替の経路は、ａ−ケトグルタル酸塩を介するものである。本発明者らは、α−ケトグルタル酸塩から直接コハク酸セミアルデヒドを生産するためのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｔｉａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１０６７０−１０６７５（２００５））からのα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素の使用を調べた（図２では工程８）。この遺伝子（００３２）がインビボにおいて機能的であることを示すために、本発明者らは、ｐＺＡ３３における４−ＨＢ脱水素酵素（遺伝子００３６）と同じ宿主におけるｐＺＥ１３においてそれを発現させた。この菌株は、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いた誘導後、２４時間以内に１．０ｍＭを超える４−ＨＢを生産することができた（図１２）。この菌株は、ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素を発現しないので、スクシニル−ＣｏＡを介したコハク酸セミアルデヒド生産の可能性は排除される。また、コハク酸セミアルデヒドの生産をもたらす天然の遺伝子がこの経路において機能することができたという可能性がある（図２では工程４および５）；しかしながら、ｐＺＥ１３−００３２プラスミドが宿主から除かれた場合に生産された４−ＨＢの量は無視できる。
【０１８９】
４−ＨＢからのＢＤＯの生産。４−ＨＢからのＢＤＯの生産には２つの還元工程を必要とし、脱水素酵素によって触媒される。アルコールおよびアルデヒド脱水素酵素（それぞれＡＤＨおよびＡＬＤ）は、ともに１分子上のカルボン酸基をアルコール基に還元することができ、または逆に、カルボン酸へのアルコールの酸化を行うことができる、ＮＡＤ＋/Ｈおよび/またはＮＡＤＰ＋/Ｈ依存性酵素である。この生体内変化は、野生型のＣｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍで実証されているが（Ｊｅｗｅｌｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３：２１５−１９（１９８６））、しかし、原因となる酵素も原因となる遺伝子も同定されなかった。さらに、４−ＨＢ−ＣｏＡへの活性化が、最初に要求される（図２では工程９）かどうか、またはアルデヒド脱水素酵素（工程１２）は４−ＨＢに直接作用するかどうかは知られていない。本発明者らは、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍおよび関連する生物から候補酵素のリストを、ヒドロキシル化されていない類似体から４−ＨＢおよび経路の中間体への既知の活性に基づいて、またはこれらの特徴付けられた遺伝子に対する類似性によって作成した（表６）。候補のいくつかは、多機能性脱水素酵素であるため、それらは、アルデヒドへの酸（またはＣｏＡ誘導体）、並びにアルコールへのアルデヒドのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性還元の両方を潜在的に触媒することができた。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるこれらの遺伝子を用いて研究を開始する前に、本発明者らは、最初に、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４を用いて、上記に参照される結果を確認した。１０％ＣＯ２、１０％Ｈ２、および８０％Ｎ２の嫌気性雰囲気下、３０℃で、１０ｍＭ  ４−ＨＢを添加したＳｃｈａｅｄｌｅｒブロス（Ａｃｃｕｍｅｄｉａ，Ｌａｎｓｉｎｇ，ＭＩ）において細胞を増殖させた。培養試料を周期的に採取し、遠心分離し、後述されるＧＣ−ＭＳによってＢＤＯについてブロスを分析した。０．１ｍＭ、０．９ｍＭ、および１．５ｍＭのＢＤＯ濃度をそれぞれ１日、２日、および７日のインキュベーション後に検出した。４−ＨＢが添加されていないで増殖させた培養においてＢＤＯは検出されなかった。生産したＢＤＯがグルコースから誘導されたことを示すために、本発明者らは、最良のＢＤＯを生産する菌株ＭＧ１６５５  ｌａｃＩＱ  ｐＺＥ１３−０００４−００３５−０００２ｐＺＡ３３−００３４−００３６を、４ｇ／Ｌの均一に標識された１３Ｃ−グルコースを補足されたＭ９最少培地中で増殖させた。１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて、ＯＤ０．６７で細胞を誘導し、２４時間後に試料を採取した。培養上清の分析は、質量分析により行った。
【０１９０】
次に、４−ＨＢからＢＤＯ変換経路に対する遺伝子候補は、Ｅ．ｃｏｌｉの宿主ＭＧ１６５５  ｌａｃＩＱにおいて発現したときに、活性について試験された。ｐＺＡ３３において発現された各遺伝子候補を含む組換え菌株は、４時間、３７℃で０．２５ｍＭ  ＩＰＴＧの存在下で増殖させ、酵素の発現を完全に誘導した。誘導から４時間後、細胞を回収し、上述されるようにＡＤＨおよびＡＬＤ活性についてアッセイした。４−ＨＢ−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシブチルアルデヒドが市販されていないので、ヒドロキシル化されていない基質を用いてアッセイを行った（表９）。Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ａｄｈＥ２（０００２）およびＥ．ｃｏｌｉ  ａｄｈＥ（００１１）に対する４−炭素基質と２−炭素基質との間の活性の比は、文献Ａｔｓｕｍｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２０７：１−１１（１９９４）において以前に報告されたものと類似していた。
【０１９１】
表９．アルデヒドおよびアルコール脱水素酵素に対する遺伝子候補を発現しているｐＺＡ３３を含むＭＧ１６５５  ｌａｃＩＱからの細胞抽出物におけるインビトロの酵素活性。活性は、μｍｏｌ分−１ｍｇ細胞タンパク質−１で表される。Ｎ．Ｄ．は測定されていない。
【０１９２】
【表９】
2020072661.tif 000021
ＢＤＯ生産実験については、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  Ｗ８３（遺伝子００３４）由来のｃａｔ２は、４−ＨＢ−ＣｏＡへの４−ＨＢの変換のためのｐＺＡ３３上に含まれ、候補脱水素酵素遺伝子は、ｐＺＥ１３上で発現した。宿主菌株は、ＭＧ１６５５  ｌａｃＩＱであった。また、アルコールおよびアルデヒド脱水素酵素候補とともに、本発明者らは、基質の類似性に起因して、この工程で機能するＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（ｓｕｃＤ）の能力を試験した。１０ｍＭ  ４−ＨＢで補足されたＬＢ培地中でＯＤが約０．５になるまで細胞を増殖させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導し、２４時間後に培養ブロス試料を採取し、後述されるようにＢＤＯについて分析した。最良のＢＤＯ生産は、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのａｄｈＥ２、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉのｓｕｃＤ、またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのｓｕｃＤを用いて生じた（図１３）。興味深いことに、生産されたＢＤＯの絶対量は、好気的条件下でより高かった；しかしながら、これは、嫌気的培養において達成されたより低い細胞密度に主に起因している。細胞ＯＤに正規化した場合、単位バイオマスあたりのＢＤＯ生産は、嫌気的条件においてより高い（表１０）。
【０１９３】
表１０．Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのａｄｈＥ２、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉのｓｕｃＤ、またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのｓｕｃＤを発現している細胞の培養物（図１１の実験２、９、および１０のデータ）、並びに陰性対照からの絶対ＢＤＯ濃度および正規化されたＢＤＯ濃度（実験１）。
【０１９４】
【表１０】
2020072661.tif 000022
第２節において検討したように、副産物として酢酸塩を生じない４−ＨＢを４−ＨＢ−ＣｏＡに変換するルートを用いることは好都合な場合がある。この目的で、本発明者らは、図２における工程１０および１１を介したこの変換を行うために、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのホスホトランスブチリラーゼ（ｐｔｂ）および酪酸キナーゼ（ｂｋ）の使用を試験した。Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからの天然のｐｔｂ／ｂｋオペロン（遺伝子００２０および００２１）をクローニングし、ｐＺＡ３３において発現させた。得られた構築物を含む細胞からの抽出物を採取し、本明細書に記載されるように２つの酵素活性についてアッセイした。ＢＫの比活性は、約６５Ｕ／ｍｇであり、ＰＴＢの比活性は、約５Ｕ／ｍｇであった。活性の１単位（Ｕ）は、１分間、室温で１μＭの基質の変換として定義される。最後に、この構築物は、ＢＤＯへの４−ＨＢの変換における関与について試験された。宿主菌株は、記載されたｐＺＡ３３−００２０−００２１構築物、およびｐＺＥ１３−０００２を用いて形質転換され、図１３において上記で用いられた好気的手法を用いてＢＤＯ生産におけるｃａｔ２の使用と比較した。ＢＫ／ＰＴＢ菌株は１ｍＭ
ＢＤＯを生産し、ｃａｔ２を用いた場合の２ｍＭと比較した（表１１）。興味深いことに、結果は、宿主菌株が天然のａｄｈＥ遺伝子における欠失を含むかどうかに依存していた。
【０１９５】
表１１．ｐＺＥ１３上のＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのａｄｈＥ２、並びにｐＺＡ３３上のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのｃａｔ２（００３４）またはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのＰＴＢ／ＢＫ遺伝子のいずれかを発現している細胞の培養物からの絶対ＢＤＯ濃度および正規化されたＢＤＯ濃度。宿主菌株は、ＭＧ１６５５  ｌａｃＩＱまたはＭＧ１６５５  ΔａｄｈＥ  ｌａｃＩＱのいずれかであった。
【０１９６】
【表１１】
2020072661.tif 000023
グルコースからのＢＤＯの生産。経路確認の最終工程は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて経路の４−ＨＢセグメントおよびＢＤＯセグメントの両方を発現させ、グルコース最少培地におけるＢＤＯの生産を示すことである。全ての必要とされる遺伝子が２つのプラスミドに適合するように新しいプラスミドを構築した。一般に、ｃａｔ１、ａｄｈＥ、およびｓｕｃＤ遺伝子は、ｐＺＥ１３から発現させ、ｃａｔ２および４−ＨＢｄは、ｐＺＡ３３から発現させた。遺伝子供給源および遺伝子順序の種々の組み合わせは、ＭＧ１６５５  ｌａｃＩＱバックグラウンドにおいて試験された。２０ｇ／Ｌグルコース、緩衝能力を改善するための１００ｍＭ  ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、１０μｇ／ｍＬチアミン、および適した抗生物質を補足したＭ９最少培地（６．７８ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３．０ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１．０ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２）において嫌気的に細胞を増殖させた。０．２５ｍＭ  ＩＰＴＧは、接種から約１５時間後に添加され、培養上清試料は、誘導から２４および４８時間後、ＢＤＯ、４−ＨＢ、およびコハク酸塩分析のために採取された。ＢＤＯの生産は、遺伝子の順番への依存性を示しているように見えた（表１２）。０．５ｍＭを超える最大のＢＤＯ生産が得られ、ここでは、最初に発現したｃａｔ２に続いてｐＺＡ３３上の４−ＨＢｄであり、ｃａｔ１に続いてｐＺＥ１３上のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ｓｕｃＤであった。ｐＺＥ１３上の最後の位置におけるＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ａｄｈＥ２の添加は、僅かな改善をもたらした。また、４−ＨＢおよびコハク酸塩は、より高い濃度で生産された  表１２．２０ｇ／Ｌグルコースを補足した最少培地において増殖させた、ＢＤＯ経路遺伝子の組み合わせを発現している組換えＥ．ｃｏｌｉ菌株におけるＢＤＯ、４−ＨＢ、およびコハク酸塩の生産。濃度は、ｍＭで与えられる。
【０１９７】
【表１２】
2020072661.tif 000024
ＧＣＭＳによるＢＤＯ、４−ＨＢおよびコハク酸塩の分析。発酵および細胞培養試料におけるＢＤＯ、４−ＨＢおよびコハク酸塩は、シリル化によって誘導体化され、文献報告（（Ｓｉｍｏｎｏｖら、Ｊ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．５９：９６５−９７１（２００４））から改変された方法を用いてＧＣＭＳによって定量的に分析した。開発された方法は、１μＭにいたる良好な感度、少なくとも２５ｍＭまでの直線性、並びに優れた選択性および再現性を示した。  
【０１９８】
試料調製は、下記のとおり行った：１００μＬの濾過した（０．２μｍまたは０．４５μｍのシリンジフィルター）試料、例えば、発酵ブロス、細胞培養物または標準溶液は、約１時間、周囲温度でＳｐｅｅｄ  Ｖａｃ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｓａｖａｎｔ  ＳＶＣ−１００Ｈ）において乾燥させ、次に、ジメチルホルムアミドに含まれる、内部標準として２０μＬの１０ｍＭシクロヘキサノール溶液を添加した。混合物をボルテックスし、水浴（Ｂｒａｎｓｏｎ  ３５１０）中で１５分間超音波処理し、均質性を確保した。１％トリメチルクロロシランを含む１００μＬのシリル化誘導体化試薬であるＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロ−アセトイミド（ＢＳＴＦＡ）を添加し、混合物を７０℃で３０分間インキュベートした。誘導化された試料を５分間、遠心分離し、透明な溶液をＧＣＭＳに直接注入した。Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒから購入したＢＤＯを除いては、全ての化学物質および試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。
【０１９９】
ＧＣＭＳは、分析用に用いられた電子衝突イオン化（ＥＩ）モードで操作される質量選択検出器（ＭＳＤ）５９７３Ｎに接続されたＡｇｉｌｅｎｔガスクロマトグラフ６８９０Ｎにおいて行った。ＤＢ−５ＭＳキャピラリーカラム（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、３０ｍ×０．２５ｍｍ  ｉ．ｄ．×０．２５μｍフィルム厚を用いた。ＧＣは、２０：１のスプリット比の１μＬの試料を導入するスプリット注入モードにおいて操作された。注入ポート温度は２５０℃であった。担体ガスとしてヘリウムを用い、流速は、１．０ｍＬ／分に維持された。温度勾配プログラムは、対象とする分析物の良好な解像度、最少のマトリックス干渉を確実にするために最適化された。オーブンは、初期には８０℃で１分間保持され、次に、２℃／分で１２０℃まで上昇させ、その後、１００℃／分で３２０℃まで急速に上昇させ、最後に、３２０℃で６分間保持された。ＭＳ界面移動ラインが２８０℃で維持された。データは、「低質量」ＭＳチューンセッティングおよび３０〜４００ｍ／ｚ質量範囲スキャンを用いて獲得された。全体の分析時間は、３分の溶媒遅延を含めて２９分であった。保持時間は、ＢＳＴＦＡ誘導体化シクロヘキサノール、ＢＤＯ、４−ＨＢおよびコハク酸塩について、それぞれ５．２、１０．５、１４．０および１８．２分に対応した。定量的分析については、下記の特定の質量断片が選択された（抽出されたイオンクロマトグラム）：内部標準のシクロヘキサノールについてはｍ／ｚ１５７、ＢＤＯについては１１６、４−ＨＢとコハク酸塩の両方については１４７であった。標準の較正曲線は、できるだけ密接に試料マトリックスを適合させるために、対応する細胞培養物または発酵培地において分析物溶液を用いて構築された。ＧＣＭＳデータは、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて処理された。
【０２００】
結果は、生産された大部分の４−ＨＢおよびＢＤＯが１３Ｃを用いて標識されたことを示した（図１４、右側）。標識されていないグルコースにおいて増殖させて並行な培養からの質量スペクトルは、比較のために示される（図１４、左側）。観察されたピークは、代謝産物からの異なる数の炭素原子を含む誘導体化された分子の断片についてであることに留意されたい。また、誘導体化試薬は、天然に存在している標識分布であるいくつかの炭素および珪素原子に寄与し、そのため、結果は厳密には定量的ではない。
【０２０１】
代替の経路を用いた４−ＨＢからのＢＤＯの生産。また、種々の代替経路は、ＢＤＯ生産のために試験された。これは、コハク酸塩をスクシニル−ＣｏＡに変換する天然のＥ．ｃｏｌｉ  ＳｕｃＣＤ酵素の使用（表１３、列２〜３）、α−ケトグルタル酸塩経路におけるα−ケトグルタル酸脱炭酸酵素の使用（表１３、列４）、４−ＨＢのＣｏＡ誘導体を生じさせる代替手段としてのＰＴＢ／ＢＫの使用（表１３、列１）を含む。これらの変異体を含む、表１３に示された遺伝子を発現するプラスミドを含む菌株が構築された。結果は、全ての場合において、４−ＨＢおよびＢＤＯの生産が生じることを示す（表１３）。
【０２０２】
表１３．異なるＢＤＯ経路変異体についての組換えＥ．ｃｏｌｉ菌株遺伝子におけるＢＤＯ、４−ＨＢ、およびコハク酸塩の生産。前記菌株は、２０ｇ／Ｌグルコースで補足された最少培地において嫌気的に増殖され、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧによる誘導の２４時間後に回収された。濃度は、ｍＭで与えられる。
【０２０３】
【表１３】
2020072661.tif 000025
（実施例Ｖ）
４−ヒドロキシブタン酸、γ−ブチロラクトンおよび１，４−ブタンジオールの生合成
この実施例は、発酵および他のバイオプロセスを用いた４−ヒドロキシブタン酸、γ−ブチロラクトンおよび１，４−ブタンジオールの生合成生産を記載する。
【０２０４】
精製されたＧＢＬ、１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）およびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の生産のための完全なプロセスに４−ＨＢ発酵工程を組み込むための方法を下記に説明する。４−ＨＢとＧＢＬとは平衡にあるため、発酵ブロスは、両方の化合物を含む。低ｐＨでは、この平衡は、ＧＢＬに有利になるようにシフトされる。したがって、発酵は、ｐＨが７．５以下、一般にはｐＨが５．５以下で操作することができる。バイオマスの除去後、生産の流れは、分離工程に入り、そこでは、ＧＢＬが取り出され、４−ＨＢに富んだ残りの流れはリサイクルされる。最後に、ＧＢＬは、あらゆる不純物を取り除くために蒸留される。このプロセスは、３つの方法の１つにおいて操作する：１）流加発酵およびバッチ分離；２）流加発酵および連続分離；３）連続発酵および連続分離。これらのモードの最初の２つは、図１５において図式的に示される。また、後述される統合された発酵手法は、ＢＤＯおよびその後のＢＤＯファミリー産物の生合成についての本発明のＢＤＯを生産する細胞のために用いられる。
【０２０５】
４−ＨＢ／ＧＢＬを生産するための発酵プロトコール（バッチ）。５ｇ／Ｌリン酸カリウム、２．５ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、０．５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、および３０ｇ／Ｌのトウモロコシ浸出液を含む５Ｌのブロスを用いて、Ｎ２／ＣＯ２混合物を散布された１０Ｌのバイオリアクターにおいて生産生物を増殖させ、初期のグルコース濃度は２０ｇ／Ｌである。細胞が増殖し、グルコースを利用するので、追加の７０％グルコースが、グルコース消費をほぼ平衡にする速度でバイオリアクターに供給される。バイオリアクターの温度は、３０℃で維持される。４−ＨＢが２０〜２００ｇ／Ｌの濃度に到達するまで、増殖はおよそ２４時間継続され、細胞密度は５〜１０ｇ／Ｌである。ｐＨは調節されず、典型的には、稼働の終わりまでにｐＨ３〜６まで減少する。培養時間の完了時に、細胞分離ユニット（例えば、遠心分離機）に発酵槽の内容物を通過させ、細胞および細胞残屑を取り除き、発酵ブロスは、生産物分離ユニットに移される。４−ＨＢおよび／またはＧＢＬの単離は、希釈水溶液から有機産物を分離するための、当該技術分野において用いられる標準的な分離手法、例えば、４−ＨＢ／ＧＢＬの有機溶液を提供するための水に混和しない有機溶媒（例えば、トルエン）を用いて液体−液体抽出によって行われる。次に、得られる溶液は、有機溶媒を取り除き、リサイクルするための、並びに精製された液体として単離されるＧＢＬ（沸点２０４〜２０５℃）を提供するために、標準的な蒸留法に供される。
【０２０６】
４−ＨＢ／ＧＢＬを生産するための発酵プロトコール（完全に連続的）：生産生物は、最初に、初期のグルコース濃度が３０〜５０ｇ／Ｌであることを除いて、上述される装置および培地組成を用いてバッチモードで増殖される。グルコースが使い尽くされたとき、同じ組成の供給培地が、０．５Ｌ／時と１Ｌ／時との間の速度で連続的に供給され、液体は同じ速度で引き出される。バイオリアクター内の４−ＨＢ濃度は、３０〜４０ｇ／Ｌで一定のままであり、細胞密度は、３〜５ｇ／Ｌで一定のままである。温度は、３０℃で維持され、ｐＨは、必要に応じて、濃縮されたＮａＯＨおよびＨＣｌを用いて４．５に維持される。バイオリアクターは、１カ月間連続して操作され、試料は、４−ＨＢ濃度の一貫性を確保するために毎日採取される。連続モードでは、発酵槽の内容物は、新しい供給培地が供給されるので、一定に取り除かれる。次に、細胞、培地、産物である４−ＨＢおよび／またはＧＢＬを含む排出される流れは、細胞および細胞残屑の除去の有無に関わらず、連続的な生産物分離手法に供され、希釈水溶液から有機産物を分離するための、当該技術分野において用いられる標準的な連続分離手法、例えば、４−ＨＢ／ＧＢＬの有機溶液を提供するための水に混和しない有機溶媒（例えば、トルエン）を用いて連続的な液体−液体抽出を行う。その後、得られる溶液は、有機溶媒を取り除き、リサイクルするための、並びに精製された液体として単離されるＧＢＬ（沸点２０４〜２０５℃）を提供するために、標準的な連続蒸留法に供される。
【０２０７】
ＧＢＬ還元プロトコール：一度、ＧＢＬが上述されるように単離および精製されると、次に、１，４−ブタンジオールまたはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはそれらの混合物を生産するための、当該技術分野において周知であるプロトコール（引用された参考文献）などの還元プロトコールに供される。水素圧下でＧＢＬと組み合わせた不均一もしくは均一な水素化触媒は、生産物である１，４−ブタンジオールまたはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはそれらの混合物を提供することで周知である。上述されるように、発酵ブロスから分離される４−ＨＢ／ＧＢＬ生産物の混合物は、ＧＢＬ単離および精製前に、直接的に、生産物である１，４−ブタンジオールもしくはテトラヒドロフランまたはそれらの混合物を提供するためのこれらの同じ還元プロトコールに供されてもよいことに留意することは重要である。次に、得られる生産物、１，  ４−ブタンジオールおよびＴＨＦは、当該技術分野において周知である手法によって単離および精製される。
ＢＤＯまたはＴＨＦを直接生産するための発酵および水素化プロトコール（バッチ）：
５ｇ／Ｌリン酸カリウム、２．５ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、０．５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、３０ｇ／Ｌのトウモロコシ浸出液を含む５Ｌのブロスを用いて、Ｎ２／ＣＯ２混合物を散布された１０Ｌのバイオリアクターにおいて細胞を増殖させ、初期のグルコース濃度は２０ｇ／Ｌである。細胞が増殖し、グルコースを利用するので、追加の７０％グルコースが、およそグルコース消費を平衡にする速度でバイオリアクターに供給される。バイオリアクターの温度は、３０℃で維持される。４−ＨＢが２０〜２００ｇ／Ｌの濃度に到達するまで、増殖はおよそ２４時間継続され、細胞密度は５〜１０ｇ／Ｌである。ｐＨは調節されず、典型的には、稼働の終わりまでにｐＨ３〜６まで減少する。培養時間の完了により、細胞分離ユニット（例えば、遠心分離機）に発酵槽の内容物を通過させ、細胞および細胞残屑を取り除き、発酵ブロスは、還元ユニット（例えば、水素化容器）に移され、この場合、混合物４−ＨＢ／ＧＢＬは、直接的に、１，４−ブタンジオールもしくはＴＨＦまたはそれらの混合物のいずれかに還元される。還元手法の完了後、リアクター内容物は、生産物分離ユニットに移される。１，４−ブタンジオールおよび／またはＴＨＦの単離は、希釈水溶液から有機産物を分離するための、当該技術分野において用いられる標準的な分離手法、例えば、１，４−ブタンジオールおよび／またはＴＨＦの有機溶液を提供するための水に混和しない有機溶媒（例えば、トルエン）を用いて液体−液体抽出によって行われる。次に、得られる溶液は、有機溶媒を取り除き、リサイクルするための、並びに精製された液体として単離される１，４−ブタンジオールおよび／またはＴＨＦを提供するために、標準的な蒸留法に供される。
【０２０８】
ＢＤＯまたはＴＨＦを直接的に生産するための発酵および水素化プロトコール（完全に連続的）：細胞は、最初に、初期のグルコース濃度が３０〜５０ｇ／Ｌであることを除いて、上述される装置および培地組成を用いてバッチモードで増殖される。グルコースが使い尽くされたとき、同じ組成の供給培地が、０．５Ｌ／時と１Ｌ／時との間の速度で連続的に供給され、液体は同じ速度で引き出される。バイオリアクター内の４−ＨＢ濃度は、３０〜４０ｇ／Ｌで一定のままであり、細胞密度は、３〜５ｇ／Ｌで一定のままである。温度は、３０℃で維持され、ｐＨは、必要に応じて、濃縮されたＮａＯＨおよびＨＣｌを用いて４．５に維持される。バイオリアクターは、１カ月間連続して操作され、試料は、４−ＨＢ濃度の一貫性を確保するために毎日採取される。連続モードでは、発酵槽の内容物は、新しい供給培地が供給されるので、一定に取り除かれる。次に、細胞、培地、産物である４−ＨＢおよび／またはＧＢＬを含む排出される流れは、細胞および細胞残屑を取り除くために細胞分離ユニット（例えば、遠心分離機）を通過させ、発酵ブロスは、連続的な還元ユニット（例えば、水素化容器）に移され、この場合、混合物４−ＨＢ／ＧＢＬは、直接的に、１，４−ブタンジオールもしくはＴＨＦまたはそれらの混合物のいずれかに還元される。還元手法の完了後、リアクター内容物は、連続的な生産物分離ユニットに移される。１，４−ブタンジオールおよび／またはＴＨＦの単離は、希釈水溶液から有機産物を分離するための、当該技術分野において用いられる標準的な連続分離手法、例えば、１，４−ブタンジオールおよび／またはＴＨＦの有機溶液を提供するための水に混和しない有機溶媒（例えば、トルエン）を用いて液体−液体抽出によって行われる。次に、得られる溶液は、有機溶媒を取り除き、リサイクルするための、並びに精製された液体として単離される１，４−ブタンジオールおよび／またはＴＨＦを提供するために、標準的な連続蒸留法に供される。
【０２０９】
ＢＤＯを直接生産するための発酵プロトコール（バッチ）：５ｇ／Ｌリン酸カリウム、２．５ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、０．５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、３０ｇ／Ｌのトウモロコシ浸出液を含む５Ｌのブロスを用いて、Ｎ２／ＣＯ２混合物を散布された１０Ｌのバイオリアクターにおいて生産生物を増殖させ、初期のグルコース濃度は２０ｇ／Ｌである。細胞が増殖し、グルコースを利用するので、追加の７０％グルコースが、およそグルコース消費を平衡にする速度でバイオリアクターに供給される。バイオリアクターの温度は、３０℃で維持される。ＢＤＯが２０〜２００ｇ／Ｌの濃度に到達するまで、増殖はおよそ２４時間継続され、細胞密度は５〜１０ｇ／Ｌである。培養時間の完了により、細胞分離ユニット（例えば、遠心分離機）に発酵槽の内容物を通過させ、細胞および細胞残屑を取り除き、発酵ブロスは、生産物分離ユニットに移される。ＢＤＯの単離は、希釈水溶液から有機産物を分離するための、当該技術分野において用いられる標準的な分離手法、例えば、ＢＤＯの有機溶液を提供するための水に混和しない有機溶媒（例えば、トルエン）を用いて液体−液体抽出によって行われる。次に、得られる溶液は、有機溶媒を取り除き、リサイクルするための、並びに精製された液体として単離されるＢＤＯ（沸点２２８〜２２９℃）を提供するために、標準的な蒸留法に供される。
【０２１０】
ＢＤＯを直接生産するための発酵プロトコール（完全に連続的）：生産微生物は、最初に、初期のグルコース濃度が３０〜５０ｇ／Ｌであることを除いて、上述される装置および培地組成を用いてバッチモードで増殖される。グルコースが使い尽くされたとき、同じ組成の供給培地が、０．５Ｌ／時と１Ｌ／時との間の速度で連続的に供給され、液体は同じ速度で引き出される。バイオリアクター内のＢＤＯ濃度は、３０〜４０ｇ／Ｌで一定のままであり、細胞密度は、３〜５ｇ／Ｌで一定のままである。温度は、３０℃で維持され、ｐＨは、必要に応じて、濃縮されたＮａＯＨおよびＨＣｌを用いて４．５に維持される。バイオリアクターは、１カ月間連続して操作され、試料は、ＢＤＯ濃度の一貫性を確保するために毎日採取される。連続モードでは、発酵槽の内容物は、新しい供給培地が供給されるので、一定に取り除かれる。次に、細胞、培地、産物であるＢＤＯを含む排出される流れは、細胞および細胞残屑の除去の有無に関わらず、連続的な生産物分離手法に供され、希釈水溶液から有機産物を分離するための、当該技術分野において用いられる標準的な連続分離手法、例えば、ＢＤＯの有機溶液を提供するための水に混和しない有機溶媒（例えば、トルエン）を用いて連続液体−液体抽出によって行われる。その後、得られる溶液は、有機溶媒を取り除き、リサイクルするための、並びに精製された液体（ｍｐｔ２０℃）として単離されるＢＤＯ（沸点２２８〜２２９℃）を提供するために、標準的な連続蒸留法に供される。
【０２１１】
本出願の全体で、種々の刊行物は、括弧内に参照されている。これらの刊行物の全体の開示は、本発明が関連する当該技術の状況をより十分に記載するために、本出願において参照により援用される。
【０２１２】
本発明は、開示された態様に関連して記載されているが、当業者は、上記で詳述される具体的な実施例および研究が、本発明の単なる例示であることを容易に承認する。種々の修飾が、本発明の精神から逸脱することなしになされ得ることは理解されなければならない。したがって、本発明は、下記の特許請求の範囲にのみ制限される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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