(57)【要約】【課題】エミリン−１の産生を促進することを本発明の課題とする。【解決手段】加水分解オクラ種子エキス、デキストリン、グリセリルグルコシドから選択される１種又は２種以上を含有するエミリン−１産生促進剤、及びそのエミリン−１産生促進剤を含有することを特徴とするエミリン−１産生促進用の皮膚外用剤、エミリン−１産生促進用の化粧料である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
加水分解オクラ種子エキス、デキストリン、グリセリルグルコシドから選択される１種又は２種以上を含有するエミリン−１産生促進剤。
【請求項２】
請求項１に記載のエミリン−１産生促進剤を含有することを特徴とするエミリン−１産生促進用の皮膚外用剤。
【請求項３】
請求項１に記載のエミリン−１産生促進剤を含有することを特徴とするエミリン−１産生促進用の化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
エミリン−１の産生を促進する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
エミリン−１はFibrillinで構成されるmicrofibrilsとtropoelastinの界面に存在し、Fibrillin-1のみで構成される微細線維であるオキシタラン線維と共局在することが報告されており（非特許文献１）、エラスチン線維構造維持のキータンパクである。
従って、エミリン−１の産生を促進することにより、エラスチン線維構造を正常化し、健康な皮膚を実現することが期待される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】J Cell Biol, 195, 131-45 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
エミリン−１の産生を促進する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
１．加水分解オクラ種子エキス、デキストリン、グリセリルグルコシドから選択される１種又は２種以上を含有するエミリン−１産生促進剤。
２．請求項１に記載のエミリン−１産生促進剤を含有することを特徴とするエミリン−１産生促進用の皮膚外用剤。
３．請求項１に記載のエミリン−１産生促進剤を含有することを特徴とするエミリン−１産生促進用の化粧料。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、エミリン−１の産生を促進することができる。エミリン−１の産生が促進されることによって、エラスチン線維の正常化が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】加水分解オクラ種子エキスのエミリン−１産生促進効果を示すグラフである（実施例１）。
【図２】デキストリンのエミリン−１産生促進効果を示すグラフである（実施例２）。
【図３】マルトデキストリンのエミリン−１産生促進効果を示すグラフである（実施例２）。
【図４】グリセリルグルコシドのエミリン−１産生促進効果を示すグラフである（実施例３）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、加水分解オクラ種子エキス、デキストリン、グリセリルグルコシドを皮膚細胞に適用することにより、エミリン−１の産生を促進するものである。
【０００９】
本発明に用いる加水分解オクラ種子エキスは、化粧品表示名称として登録されている化粧品原料であり、オクラの種子から得られるタンパク質を加水分解して精製したエキスである。オクラは南アジアやアフリカに植生し、食用とされている。
本発明に用いる加水分解オクラ種子エキスは市販品を用いることができ、ＢＡＳＦ社製ＭＹＯＸＹＮＯＬ  ＬＳ  ９７３６（加水分解オクラ種子エキス５０質量％、デキストリン５０質量％含有）を用いることができる。
エミリン−１産生促進剤に含有させる加水分解オクラ種子エキスの濃度は、０．０００５質量％以上、１質量％以下が好ましく、０．００１質量％以上、０．５質量％以下がさらに好ましい。
【００１０】
本発明に用いるデキストリンは、デンプンを酸またはアミラーゼで加水分解することにより、種々の重合度の分解生成物として得ることができる。α１→４、α１→６の鎖状オリゴ−Ｄ−グルコピラノシドや環状のα１→４オリゴ−Ｄ−グルコピラノシドが存在する。デキストリンはヨウ素デンプン反応の程度により、アミロデキストリン（青色に呈色）、エリトロデキストリン（赤色に呈色）、アクロデキストリン（呈色しない）、マルトデキストリン（呈色しない）に分類される。
本発明に用いるデキストリンは、一般に流通している試薬を用いることができる。
エミリン−１産生促進剤に含有させるデキストリンの濃度は、０．０００５質量％以上、１０質量％以下が好ましく、０．００１質量％以上、５質量％以下がさらに好ましい。
【００１１】
本発明に用いるグリセリルグルコシドはグリセリンとグルコースの脱水縮合物であり、１−α−グリセリルグルコシド、１−β−グリセリルグルコシド、２−α−グリセリルグルコシド、２−β−グリセリルグルコシド等の混合物である。
本発明に用いるグリセリルグルコシドは、市販品を用いることができ、東洋製糖（株）製ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ（グルコピラノシルグリセロール７４質量％（グリセリルグリコシドはＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ中に約６５質量％）、グリセリン６質量％、水２０質量％含有）を用いることができる。
エミリン−１産生促進剤に含有させるグリセリルグルコシドの濃度は、０．００５質量％以上、１０質量％以下が好ましく、０．０１質量％以上、５質量％以下がさらに好ましい。
【００１２】
本発明のエミリン−１産生促進剤は皮膚外用剤や化粧料として適用することができる。
【実施例１】
【００１３】
[加水分解オクラ種子エキスによるエミリン−１産生促進試験]
実験方法
新生児由来正常ヒト線維芽細胞（Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ以下「ＮＨＤＦ」、ＬＯＮＺＡ）は、６−ｗｅｌｌプレートに４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種して、２４時間培養した。培養後、培地を除去して、ＭＹＯＸＹＮＯＬ  ＬＳ  ９７３６含有培地に替えた。
ＭＹＯＸＹＮＯＬ  ＬＳ  ９７３６は、１％（ｖ／ｖ）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）含有ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地（ＧＩＢＣＯ）（以下ＤＭＥＭ培地という。）で０．２質量％となるよう希釈した。この培地にはＭＹＯＸＹＮＯＬ  ＬＳ  ９７３６に由来する０．１質量％のデキストリンが含まれている。０．２質量％に調製したＭＹＯＸＹＮＯＬ  ＬＳ  ９７３６を０．１質量％ デキストリン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）含有ＤＭＥＭ培地で段階希釈して、０．０１２５、０．０５質量％のＭＹＯＸＹＮＯＬ  ＬＳ  ９７３６含有培地を調製した。こうすることにより、各希釈培地中のデキストリンの濃度は０．１質量％に統一される。
ＭＹＯＸＹＮＯＬ  ＬＳ  ９７３６は、加水分解オクラ種子エキス５０質量％、デキストリン５０質量％を含有しており、希釈溶液は０．１質量％のデキストリンを含有しているので、０．０１２５質量％のＭＹＯＸＹＮＯＬ  ＬＳ  ９７３６含有培地は０．００６２５質量％の加水分解オクラ種子エキスを含有し、０．０５質量％のＭＹＯＸＹＮＯＬ  ＬＳ  ９７３６含有培地は０．０２５質量％の加水分解オクラ種子エキスを含有し、０．２質量％のＭＹＯＸＹＮＯＬ  ＬＳ  ９７３６含有培地は０．１質量％の加水分解オクラ種子エキスを含有する。
サンプル添加処理から４８時間培養した後、培養上清を１ｍＬ回収し、アミコンウルトラ−０．５ ｍＬ 遠心式フィルター  １００Ｋデバイス（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。濃縮培地を４×ＳＤＳ−ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒと混合し、９５°Ｃで３分間熱処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてタンパク質を分離した。ゲル内のタンパク質は、電気的にＰＶＤＦ膜に転写した。
転写後、膜をＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に浸し、約３０分間ブロッキングした。
次に、ＰＶＤＦ膜をＣａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１（ＴＯＹＯＢＯ）で７５０倍希釈した一次抗体（Ａｎｔｉ−ＥＭＩＬＩＮ−１、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）に浸し、４°Ｃで一晩反応させた。次いで、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）を用いて３回洗浄後、１０，０００倍希釈した二次抗体（Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＨＲＰ、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に浸し、室温で１時間反応させた。
ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、化学発光検出装置（ＬＡＳ−４０００  ｍｉｎｉ、Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ）でシグナルを検出した。
検出されたバンドのシグナル強度を解析（Ｍｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ，フジフィルム株式会社）し、デキストリンコントロールに対する相対値を算出しＥＭＩＬＩＮ−１の増加量を評価した。
【００１４】
結果
結果を図１に示す。
コントロールに対して、０．１質量％のデキストリンを含有するデキストリンコントロールのエミリン−１産生量は約２倍となっており、デキストリンにエミリン−１産生促進効果が認められる。しかしながら、０．１質量％のデキストリンを含有するデキストリンコントロールに対して、０．００６２５質量％の加水分解オクラ種子エキスと０．１質量％のデキストリンを含有する０．０１２５質量％のＭＹＯＸＹＮＯＬ  ＬＳ  ９７３６含有培地、０．０２５質量％の加水分解オクラ種子エキスと０．１質量％のデキストリンを含有する０．０５質量％のＭＹＯＸＹＮＯＬ  ＬＳ  ９７３６含有培地、０．１質量％の加水分解オクラ種子エキスと０．１質量％のデキストリンを含有する０．２質量％のＭＹＯＸＹＮＯＬ  ＬＳ  ９７３６含有培地のエミリン−１産生量はそれぞれ、１．２５倍、１．８０倍、２．９６倍となり、加水分解オクラ種子エキスのエミリン−１産生促進効果が認められた。
【実施例２】
【００１５】
[デキストリンによるエミリン−１産生促進試験]   
実験方法
ＮＨＤＦ細胞は、６−ｗｅｌｌプレートに４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種して、２４時間培養した。培養後、培地を除去して、デキストリンおよびマルトデキストリン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を含有する培地に替えた。
デキストリンを含有する培地は、デキストリンをＤＭＥＭ培地で０．０２５、０．０１、０．４質量％となるよう希釈し、調製した。マルトデキストリンを含有する培地は、デキストリンをＤＭＥＭ培地で１、４質量％となるよう希釈し、調製した。
サンプル添加処理から４８時間培養した後、培養上清を１ｍＬ回収し、アミコンウルトラ−０．５ ｍＬ 遠心式フィルター  １００Ｋデバイスを用いて濃縮した。濃縮培地を４×ＳＤＳ−ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒと混合し、９５°Ｃで３分間熱処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてタンパク質を分離した。ゲル内のタンパク質は、電気的にＰＶＤＦ膜に転写した。
転写後、膜をＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒに浸し、約３０分間ブロッキングした。
次に、ＰＶＤＦ膜をＣａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１で７５０倍希釈した一次抗体（Ａｎｔｉ−ＥＭＩＬＩＮ−１、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）に浸し、４°Ｃで一晩反応させた。次いで、ＰＢＳＴを用いて３回洗浄後、１０，０００倍希釈した二次抗体（Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＨＲＰ、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に浸し、室温で１時間反応させた。
ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、化学発光検出装置でシグナルを検出した。
検出されたバンドのシグナル強度を解析し、コントロールに対する相対値を算出しＥＭＩＬＩＮ−１の増加量を評価した。
【００１６】
結果
結果を図２、図３に示す。
コントロールに対して、デキストリンを０．０２５、０．０１、０．４質量％含有する培地では、エミリン−１の産生量が１．５６倍、１．６７倍、２．２２倍となり、デキストリンのエミリン−１産生促進効果が認められた。
コントロールに対して、マルトデキストリンを１、４質量％含有する培地では、エミリン−１の産生量が３．５８倍、４．９８倍となり、デキストリンのエミリン−１産生促進効果が認められた。
【実施例３】
【００１７】
[グリセリルグルコシドによるエミリン−１産生促進試験]
実験方法
ＮＨＤＦ細胞は、６−ｗｅｌｌプレートに４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種して、２４時間培養した。培養後、培地を除去して、ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ含有培地に替えた。
ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ含有培地は、ＤＭＥＭ培地でＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇが２質量％となるよう希釈して調製した。さらに、２質量％に調製したＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ含有培地をＤＭＥＭ培地で段階希釈して、０．１２５、０．５質量％のＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ含有培地を調製した。
ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇは６５質量％のグリセリルグルコシドを含有するので、０．１２５質量％、０．５質量％、２質量％ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ含有培地は、０．０８１３質量％、０．３２５質量％、１．３質量％のグリセリルグルコシドを含有する。
サンプル添加処理から４８時間培養した後、培養上清を１ｍＬ回収し、アミコンウルトラ−０．５ ｍＬ 遠心式フィルター  １００Ｋデバイスを用いて濃縮した。濃縮培地を４×ＳＤＳ−ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒと混合し、９５°Ｃで３分間熱処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてタンパク質を分離した。ゲル内のタンパク質は、電気的にＰＶＤＦ膜に転写した。
転写後、膜をＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒに浸し、約３０分間ブロッキングした。
次に、ＰＶＤＦ膜をＣａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１で７５０倍希釈した一次抗体（Ａｎｔｉ−ＥＭＩＬＩＮ−１、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）に浸し、４°Ｃで一晩反応させた。次いで、ＰＢＳＴを用いて３回洗浄後、１０，０００倍希釈した二次抗体（Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＨＲＰ、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に浸し、室温で１時間反応させた。
ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、化学発光検出装置でシグナルを検出した。
検出されたバンドのシグナル強度を解析し、コントロールに対する相対値を算出しＥＭＩＬＩＮ−１の増加量を評価した。
【００１８】
結果
結果を図４に示す。
コントロールに対して、０．１２５質量％ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ含有培地（０．０８１３質量％のグリセリルグルコシドを含有）、０．５質量％ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ含有培地（０．３２５質量％のグリセリルグルコシドを含有）、２質量％ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ含有培地（１．３質量％のグリセリルグルコシドを含有）では、エミリン−１の産生量が、それぞれ２．５１倍、３．３４倍、３．７６倍となり、グリセリルグルコシドのエミリン−１産生促進効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
本発明によって、エミリン−１の産生が促進され、エラスチン線維の正常化が期待できるので、健康な皮膚の実現が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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