(57)【要約】【課題】  ティザレラ属細菌の菌数を効果的に抑制することができる菌数抑制剤、菌数抑制用食品組成物および菌数抑制用飼料を提供することを目的とする。【解決手段】  １−ケストースを有効成分とするティザレラ属細菌の菌数抑制剤。本発明によれば、ティザレラ属細菌の菌数を効果的に抑制することができ、もってティザー病の予防に寄与することができる。また、本発明によれば、安全性も高く、様々な食品や医薬品等に容易に配合することないし日常的に簡便に摂取することができるティザレラ属細菌の菌数抑制剤を得ることができる。【選択図】  無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
１−ケストースを有効成分とする、ティザレラ属細菌の菌数抑制剤。
【請求項２】
ティザー病の予防に用いられることを特徴とする、請求項１に記載の菌数抑制剤。
【請求項３】
１−ケストースを有効成分とする、ティザレラ属細菌の菌数抑制用食品組成物。
【請求項４】
１−ケストースを有効成分とする、ティザレラ属細菌の菌数抑制用飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１−ケストースを有効成分とする、ティザレラ属細菌の菌数を抑制する剤、食品組成物および飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ティザレラ属細菌（Tyzzerella）のティザレラ・ピリフォルミス（Tyzzerella piliformis）は、芽胞を形成し、周毛性鞭毛を有する、偏性細胞内寄生性のグラム陰性桿菌である（非特許文献１；第８７６頁左欄第２段落）。ティザレラ・ピリフォルミスは、ティザー病の原因微生物として単離され、当初、バチルス・ピリフォルミス（Bacillus piliformis）として報告された。その後、クロストリジウム科クロストリジウム属に分類され、クロストリジウム・ピリフォルミス（Clostridium piliformis）とされていたが、現在は、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）ティザレラ属に分類されている。ティザレラ・ピリフォルミスは現在のところ公的な微生物株保存期間に寄託されていないため、ティザレラ・ネキシリス（Tyzzerella nexilis）がティザレラ属の基準株（ＡＴＣＣ  ２７７５７、ＤＳＭ  １７８７）である（非特許文献２：第１０頁など、非特許文献３）。
【０００３】
ティザー病は、肝腫大や体重減少、立毛、下痢などの症状を呈する疾病であり、マウスやラット、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、サル類など多くの実験動物や家畜において感染が報告されている（非特許文献１、４）。特に、仔ウマにおいては発症した場合、急性の致死性肝炎を起こし、ほぼ１００％の個体が死亡する。本疾病は、糞便中に排泄されたティザレラ属細菌の芽胞を経口摂取することで感染する。多くの場合、症状を呈さない不顕性感染で推移するが、腸内細菌叢のバランスが崩れた場合や免疫能が低下した場合などに発症すると考えられる。ヒトでは、ＨＩＶ−１感染患者でみられた皮膚病変を本菌の感染によるものと診断した症例報告がある（非特許文献５；第２７頁左欄第４段落）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Swerczek TW., Tyzzer’s disease in foals: Retrospective studies from 1969 to 2010., Can. Vet. Jour., vol. 54, September 2013, pp.876-880.
【非特許文献２】Natalya Yutin and Michael Y. Galperin, A genomic update on clostridial phylogeny: Gram-negative spore-formers and other misplaced clostridia, Environ. Microbiol., vol. 15, no. 10, October 2013, pp.2631-2641, doi: 10.1111/1462-2920.12173.
【非特許文献３】UniProt, Supporting data, Taxonomy - [Clostridium] piliforme (Tyzzer's bacillus), [online], [平成３０年１０月１１日検索]、インターネット，<URL: https://www.uniprot.org/taxonomy/1524>
【非特許文献４】Thomson G. W. et. al., Tyzzer's disease in the foal: case reports and review, Can. Vet. Jour., vol. 18, no. 2, February 1977, pp41-43.
【非特許文献５】國田  智、ティザー菌（Clostridium piliformis）、実験動物ニュース、ｖｏｌ．６５、Ｎｏ．２、２０１６年４月、第２６−２９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明者らは、生体内のティザレラ属細菌の菌数を抑制できれば、ヒトや動物の生活環境中に排泄される菌数を抑制できることから、他個体への感染可能性を低減できると考えた。すなわち、本発明は、ティザレラ属細菌の菌数を効果的に抑制することができ、もってティザー病の予防に寄与しうる、菌数抑制剤、菌数抑制用食品組成物ならびに菌数抑制用飼料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究の結果、１−ケストースが、腸内のティザレラ属細菌の菌数を顕著に抑制することを見出した。そこで、この知見に基づいて、下記の各発明を完成した。
【０００７】
（１）本発明に係るティザレラ属細菌の菌数抑制剤は、１−ケストースを有効成分とする。
【０００８】
（２）本発明に係る菌数抑制剤は、ティザー病の予防に好適に用いることができる。
【０００９】
（３）本発明に係るティザレラ属細菌の菌数抑制用食品組成物は、１−ケストースを有効成分とする。
【００１０】
（４）本発明に係るティザレラ属細菌の菌数抑制用飼料は、１−ケストースを有効成分とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ヒトや動物の生体におけるティザレラ属細菌の菌数を効果的に抑制することができる。また、本発明によれば、ティザレラ属細菌の菌数を抑制することにより、ティザー病の予防に寄与することができる。
【００１２】
また、本発明が有効成分とする１−ケストースは、タマネギやニンニク、大麦、ライ麦などの野菜や穀物にも含まれているオリゴ糖の一種であり、古来より食経験を有する物質であることや、変異原性試験、急性毒性試験、亜慢性毒性試験および慢性毒性試験のいずれにおいても毒性が認められていないことから、安全性は極めて高い（食品と開発、Ｖｏｌ．４９、Ｎｏ．１２、第９頁、２０１４年）。したがって、本発明によれば、安全性への懸念を全く生じさせずにティザレラ属細菌の菌数を抑制することができる。
【００１３】
また、１−ケストースは、水溶性が高く、砂糖に似た良好な甘味質を有するため、そのまま、あるいは甘味料等の調味料として、日常的に簡便に摂取することができるほか、様々な食品や医薬品、飼料等に容易に配合することができる。したがって、本発明によれば、安全性が高く、そのまま、あるいは様々な食品や医薬品、飼料等に容易に配合して日常的に簡便に摂取することができる、ティザレラ属細菌の菌数抑制剤、菌数抑制用食品組成物ならびに菌数抑制用飼料を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明に係るティザレラ属細菌の菌数抑制剤、菌数抑制用食品組成物ならびに菌数抑制用飼料（以下、まとめて「本発明の剤等」という場合がある。）について詳細に説明する。
【００１５】
本発明において、「ティザレラ属細菌」は、ティザレラ属に属する微生物をいう。係る微生物としては、例えば、ティザレラ・ネキシリス（Tyzzerella nexilis）、ティザレラ・コリナ（Tyzzerella colina）、ティザレラ・ネオプロピオニカ（Tyzzerella neopropionica）、ティザレラ・ピリフォルミス（Tyzzerella piliformis）、ティザレラ・プロピオニカ（Tyzzerella propionica）などを挙げることができる。
【００１６】
本発明の剤等は、１−ケストースを有効成分とする。１−ケストースは、１分子のグルコースと２分子のフルクトースからなる三糖類のオリゴ糖である。
【００１７】
１−ケストースは、スクロースを基質として、特開昭５８−２０１９８０号公報に開示されているような酵素による酵素反応を行うことにより作ることができる。具体的には、まず、β−フルクトフラノシダーゼをスクロース溶液に添加し、３７℃〜５０℃で２０時間程度静置することにより酵素反応を行って、１−ケストース含有反応液を得る。この１−ケストース含有反応液を、特開２０００−２３２８７８号公報で開示されているようなクロマト分離法に供することよって、１−ケストースと他の糖（ブドウ糖、果糖、ショ糖、４糖以上のオリゴ糖）とを分離して精製し、高純度１−ケストース溶液を得る。続いて、この高純度１−ケストース溶液を濃縮した後、特公平６−７００７５号公報に開示されているような結晶化法で結晶化することにより、１−ケストースを結晶として得ることができる。
【００１８】
また、１−ケストースは市販のフラクトオリゴ糖に含まれているため、これをそのまま、あるいは、フラクトオリゴ糖から上述の方法により１−ケストースを分離精製して用いてもよい。すなわち、本発明の１−ケストースとして、１−ケストースを含有するオリゴ糖などの１−ケストース含有組成物を用いてもよい。１−ケストース含有組成物を用いる場合、１−ケストースの純度は８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましい。なお、本発明において、１−ケストースの「純度」とは、糖の総質量を１００とした場合の、１−ケストースの質量％をいう。
【００１９】
本発明の剤等は、ヒトまたは動物に経口摂取させることにより使用することができるほか、有効成分を経腸栄養剤に添加して、これを、胃や小腸などの消化管に挿入したチューブを経由して経腸栄養法により投与する方法で使用してもよい。
【００２０】
本発明の菌数抑制剤の形態としては、有効成分である１−ケストースのみからなるもののほか、医薬品や食品添加剤、サプリメントなどの形態を挙げることができる。医薬品や食品添加剤、サプリメントの形態とする場合、その剤型としては、例えば、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、顆粒剤、ドライシロップ剤、液剤、シロップ剤、ドロップ剤、ドリンク剤等の固形または液状の剤型を挙げることができる。
【００２１】
上記各剤型の医薬品や食品添加剤、サプリメントは、当業者に公知の方法で製造することができる。例えば、散剤であれば、１−ケストース８００ｇおよび乳糖２００ｇをよく混合した後、９０％エタノール３００ｍＬを添加して湿潤させる。続いて、湿潤粉末を造粒した後、６０℃で１６時間通風乾燥し、その後、整粒して、適当な細かさの散剤１０００ｇ（１−ケストース含有量８００ｍｇ／１ｇ）を得ることができる。また、錠剤であれば、１−ケストース３００ｇ、粉末還元水飴３８０ｇ、コメデンプン１８０ｇおよびデキストリン１００ｇをよく混合した後、９０（ｖ／ｖ）％エタノール３００ｍＬを添加して湿潤させ、湿潤粉末を得る。この湿潤粉末を押し出し造粒した後、６０℃で１６時間通風乾燥して顆粒を得る。この顆粒を８５０μｍの篩を用いて整粒した後、顆粒４７０ｇに対してショ糖脂肪酸エステル５０ｇを添加して混合する。これを、ロータリー打錠機（６Ｂ−２、菊水製作所）に供して打錠することにより、直径８ｍｍ、重量２００ｍｇの錠剤５０００錠（１−ケストース含有量６０ｍｇ／１錠）を得ることができる。
【００２２】
また、本発明の菌数抑制用食品組成物の形態としては、有効成分である１−ケストースのみからなるもののほか、菓子や飲料、加工食品、健康食品、乳幼児食品などの通常の飲食物の形態を挙げることができる。飲食物の形態とする場合は、通常の製造過程で、有効成分を添加して製造することができる。１−ケストースの甘味度は３０で、その味質・物性・加工性はショ糖に近いことから、各種飲食物の製造過程において、砂糖の一部または全部を１−ケストースに置き換えるなどして、砂糖と同様に扱って各種飲食物を製造することができる。
【００２３】
本発明の菌数抑制用飼料の形態もまた、有効成分である１−ケストースのみからなるもののほか、ウマやウシ、ブタ、ニワトリなどの家畜用飼料、マウスやラット、ハムスター、スナネズミ、ウサギ、モルモット、サルなどの実験動物用飼料、イヌやネコなどの愛玩動物用飼料（ペットフード）といった通常の加工飼料の形態を挙げることができる。通常の加工飼料の形態とする場合は、その製造過程で有効成分を添加して製造することができる。
【００２４】
本発明の剤等をヒトや動物に対して用いる場合の有効成分の摂取量（投与量）としては、例えば、１日あたり０．０４ｇ／ｋｇ体重以上を挙げることができる。係る摂取量は、１日１回に限らず、複数回に分割して摂取してもよい。
【００２５】
本発明において、ティザレラ属細菌の「菌数を抑制する」とは、生体のいずれかの細胞ないし組織・器官における当該細菌の細胞数の増加を抑制することをいう。
【００２６】
例えば、腸におけるティザレラ属細菌の菌数は、盲腸内容物あるいは糞便中の当該細菌の菌数と相関していると考えられるため、盲腸内容物あるいは糞便中の当該細菌の菌数を計測することにより、腸においてティザレラ属細菌の菌数が抑制されたか否かを確認することができる。具体的には、例えば、本発明の剤等の摂取前後の盲腸内容物あるいは糞便、または、摂取した個体からの盲腸内容物あるいは糞便と摂取していない個体からの盲腸内容物あるいは糞便とを試料として、ティザレラ属細菌に特異的なプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ法を行って１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）コピー数を計測する。当該細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数と当該細菌の菌数とは相関関係にあるため、１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数は、菌数の指標とすることができる。よって、当該細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数を計測した結果、摂取後の試料における１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数が摂取前よりも小さければ、あるいは、摂取した個体からの試料における１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数が摂取していない個体よりも小さければ、本発明の剤等によりティザレラ属細菌の菌数が抑制されたと判断することができる。
【００２７】
ティザレラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的なプライマーは、公知の塩基配列に基づいて設計することができる。例えば、ティザレラ・ピリフォルミスであれば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ０７４１６（配列番号１）の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に基づいて設計することができる。また、ティザレラ・ピリフォルミスに特異的なプライマーとしては、T. Furukawa et al., Detection by PCR of the Tyzzer's Disease Organism (Clostridium piliforme) in Feces, Exp. Anim., vol. 51, no. 5, 2002, 513-516に記載のＲＪ−１（配列番号２）およびＲＪ−２Ｃ（配列番号３）を例示することができる。
【００２８】
また、後述する実施例１（３）に示すように、本発明の剤等の摂取前後の盲腸内容物あるいは糞便、または、摂取した個体からの盲腸内容物あるいは糞便と摂取していない個体からの盲腸内容物あるいは糞便とを試料として、次世代シークエンサーにより試料中の細菌由来１６Ｓ ｒＤＮＡの網羅的解析を行い、ティザレラ属の配列（配列番号４）と相同性の高い配列データの存在比率を算出する。当該存在比率は、ティザレラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数、すなわち当該細菌の菌数と相関関係にあるといえる。よって、摂取後の試料における当該配列データの存在比率が摂取前よりも小さければ、あるいは、摂取した個体の試料における当該配列データの存在比率が摂取していない個体のものよりも小さければ、本発明の剤等によりティザレラ属細菌の菌数が抑制されたと判断することができる。
【００２９】
上述のとおり、ティザー病は、感染個体から糞便中ないし環境中に排泄されたティザレラ属細菌の芽胞を他個体が経口摂取することで感染する（非特許文献５；第２６頁右欄下から第２−３行目など）。生体内のティザレラ属細菌の菌数を抑制できれば、ヒトや動物の生活環境中に排泄される菌数を抑制できることから、他個体への感染可能性を低減してティザー病を予防できると考えられる。したがって、本発明の剤等は、ティザー病を予防する用途に用いることができる。
【００３０】
以下、本発明について、各実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。また、本実施例においては、「１−ケストース」として、純度９９質量％で１−ケストースを含有する組成物（物産フードサイエンス社）を用いた。
【実施例】
【００３１】
＜実施例１＞１−ケストース摂取によるティザレラ属細菌の菌数変化
（１）ラットの飼育
１２匹のＳＤラット（日本エスエルシー社）を６匹ずつ２つの群に分け、一方を対照群、他方をケストース摂取群とした。対照群には１−ケストースを溶解していない水道水を、ケストース摂取群には１−ケストースを２（ｗ／ｖ）％となるよう溶解した水道水を、それぞれ自由摂取させながら、１９週間飼育した。飼育条件は温度２３±２℃、明期１２時間（８：００〜２０：００）および暗期１２時間（２０：００〜８：００）とした。その後、解剖して盲腸を摘出し、盲腸の内容物を採取して、−８０℃で凍結保存した。
【００３２】
なお、ラットにおける薬物の摂取量は、下記の式１により、ヒト成人における摂取量に換算できることが報告されている（特開２０１４−５２６５２１号公報の段落［００６５］、Ｓｈａｎｎｏｎ Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈａｗら、Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ、Ｖｏｌ．２２、２００７年３月、第６５９〜６６１頁）。そこで、式１により、本実施例１のラットにおける１日の１−ケストース摂取量を、ヒト成人におけるものに換算した。その結果を表１に示す。
《式１》ヒト成人における１日の１−ケストース摂取量（ｇ／ｋｇ体重）＝ラットにおける１日の１−ケストースの摂取量（ｇ／ｋｇ体重）×６／３７
【００３３】
（２）総ＤＮＡの抽出
〈Ｓｈｕｎｓｕｋｅ Ｔａｋａｈａｓｈｉら、ＰＬｏｓＯＮＥ、第９巻、第８号、ｅ１０５５９２、２０１４年８月：参考文献１〉に記載の方法に従って、本実施例１（１）の盲腸内容物から総ＤＮＡを抽出した。具体的には、まず、４Ｍのグアニジンチオシアネート、１００ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ９．０）および４０ｍＭのＥＤＴＡを含む水溶液に、氷上で融解した盲腸内容物１００ｍｇを懸濁し、FastPrep FP100A(MP Biomedicals)を用いてジルコニアビーズで粉砕して懸濁液を得た。Magtration System 12GC（Precision System Science）およびGC series MagDEA DNA 200（Precision System Science）を用いて、この懸濁液からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの濃度を分光測光器ND-1000（NanDrop Technologies）を用いて測定し、１０ｎｇ／μＬとなるように調製して、これを盲腸内容物由来総ＤＮＡとした。
【００３４】
（３）盲腸内容物中の細菌由来ＤＮＡの網羅的解析
上記参考文献１に記載の方法に従い、本実施例１（１）の盲腸内容物に含まれる細菌の種類と存在比率の網羅的解析を行った。すなわち、まず、本実施例１（２）の盲腸内容物由来総ＤＮＡを鋳型として、下記配列番号５および６のユニバーサルプライマーを用いてＤｕａｌ−ｉｎｄｅｘ法（Ｈｉｓａｄａ Ｔａｋａｙｏｓｈｉら、Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９７巻、第７号、第９１９‐３４頁、２０１５年６月）によりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、細菌由来の１６Ｓ ｒＤＮＡを増幅した。
フォワードプライマー（３４１ｆ）：ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号５）
リバースプライマー（Ｒ８０６）：ＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ（配列番号６）
【００３５】
続いて、次世代シークエンサーＭｉＳｅｑ（Illumina）によりＰＣＲ増幅産物の塩基配列をペアエンド法により解読した。得られた塩基配列データはデータの質（クオリティ）が低いものおよびキメラ配列由来のものを排除した。決定した塩基配列についてデータベースによる検索を行い、同一性が９７％以上で検出される分類群を１菌種（属）として同定した。ティザレラ属として同定された配列（１６Ｓ ｒＤＮＡの部分配列）を配列番号４に示す。存在比率は、総リード数に占める各群のリード数の割合を百分率として算出した。なお、クオリティのチェックは参考文献１に、キメラ配列のチェックは〈Robert C. Edgarら、BIOINFORMATICS、第２７巻、１６号、第２１９４−２２００頁、２０１１年６月〉に、データベースによる検索は〈Ｈｉｓａｄａ Ｔａｋａｙｏｓｈｉら、Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９７巻、第７号、第９１９‐３４頁、２０１５年６月〉に、それぞれ記載の方法に準じて行った。この網羅的解析の結果を表１に示す。なお、表１において、リード数および存在比率の値は、各群６匹のラットにおける平均値である。また、括弧内に、各群６匹のラットにおける数値範囲を示す。
【表１】
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【００３６】
表１に示すように、ティザレラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡのリード数の平均値は、対照群では８０７であったのに対して、ケストース摂取群では４であった。すなわち、ケストース摂取群のリード数は、対照群の約１／２０１以下と、顕著に小さかった。また、ティザレラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの存在比率は、対照群では４．０６であったのに対して、ケストース摂取群では０．０２であった。すなわち、ケストース摂取群の存在比率は、対照群の１／２０３と、顕著に小さかった。この結果から、１−ケストースの摂取により、盲腸内容物中のティザレラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの存在比率が減少することが明らかになった。すなわち、１−ケストースは、生体内においてティザレラ属細菌の菌数を抑制する効果を有することが明らかになった。
【配列表】
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