(57)【要約】【課題】ＩＬ−２部分とポリマーとのコンジュゲートの提供。【解決手段】ＩＬ−２部分と、１つ又は複数の非ペプチド性水溶性ポリマーとのコンジュゲートが提供される。典型的には、非ペプチド性水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）又はその誘導体である。また、特に、コンジュゲートを含む組成物、コンジュゲートの作製方法、個人への組成物の投与方法、核酸配列、発現系、宿主細胞、及びＩＬ部分の調製方法も提供される。本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−２部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、このＩＬ−２部分の残基は、放出可能な連結を介して水溶性ポリマーと共有結合する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するインターロイキン−２（ＩＬ−２）部分のコンジュゲートであって、該ＩＬ−２部分のアミノ基に放出可能なカルバメート連結を介して共有結合した１〜７個の分枝鎖状水溶性ポリ（エチレングリコール）ポリマーを含み、（ｉ）分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）ポリマーが、２個のポリ（エチレングリコール）鎖を含み、（ｉｉ）投与後に放出されると、該分枝鎖状水溶性ポリ（エチレングリコール）ポリマーが、該分枝鎖状水溶性ポリ（エチレングリコール）ポリマーに結合した該ＩＬ−２部分の該アミノ基において断片を残すことなく、インビボで該ＩＬ−２部分から離れ、そして、（ｉｉｉ）各分枝鎖状水溶性ポリ（エチレングリコール）ポリマーが、２０，０００ダルトン〜８５，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、コンジュゲート。
【請求項２】
各分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）が、約２０，０００ダルトンの重量平均分子量を有する、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）が、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシエンドキャップ基を含む、請求項１または請求項２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）が、メトキシエンドキャップ基を含む、請求項３に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記インターロイキン−２部分が、配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項１、２、３及び４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
１個、２個、３個又は４個の分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）水溶性ポリマーが、前記ＩＬ−２インターロイキン−２部分に放出可能に共有結合している、請求項１、２、３、４及び５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
１個、２個又は３個の分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）水溶性ポリマーが、前記ＩＬ−２インターロイキン−２部分に放出可能に共有結合している、請求項１、２、３、４及び５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
１個又は２個の水溶性分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）ポリマーが、前記ＩＬ−２インターロイキン−２部分に放出可能に共有結合している、請求項１、２、３、４及び５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
１個の水溶性分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）ポリマーが、前記ＩＬ−２インターロイキン−２部分に放出可能に共有結合している、請求項１、２、３、４及び５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
各々が放出可能な連結を介して前記インターロイキン−２部分のアミノ基に共有結合した、平均４個、５個、６個又は７個の分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）ポリマーを有する、請求項１、２、３、４及び５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
投与後にインビボで前記コンジュゲートからの前記分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）ポリマーの放出の前に、ほとんど又は全くインターロイキン−２活性を処理しない、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の医薬組成物であって、該組成物が個人に投与されることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載のコンジュゲートを複数含む組成物。
【請求項１５】
複数の前記コンジュゲートが、前記ＩＬ−２インターロイキン−２部分に放出可能に共有結合した平均４個またはそれより多い分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）ポリマーを有する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
癌の治療に使用するための、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
腎細胞癌、転移性黒色腫、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、若年性関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、乳癌及び膀胱癌からなる群から選択される癌の治療に使用するための、請求項１６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１０年１１月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／４１３，２３６号明細書に対する優先権の利益を主張し、その開示は全体として参照により本明細書に援用されるものとする。
【０００２】
特に、本発明の１つ又は複数の実施形態は、概してＩＬ−２部分（すなわち、ヒトＩＬ−２と同様の少なくとも何らかの活性を有する部分）とポリマーとを含むコンジュゲートに関する。加えて、本発明は、（特に）コンジュゲートを含む組成物、コンジュゲートの合成方法、及び組成物の投与方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
健康なヒトでは、免疫系は正常な細胞と癌性細胞とを区別することができる。所与の細胞が癌性であると識別すると、免疫系は、典型的にはそれを排除する。従って、免疫系が壊れたり、又は打ち負かされたりすると、損なわれた免疫系が癌細胞を区別できず、ひいてはそれを排除できないために、癌が進行し得る。癌に罹患した患者では、患者への免疫調節タンパク質の投与が、その患者の免疫系を（少なくとも一部において）正常に戻し、その人の免疫系が癌細胞を排除する能力を回復するのに役立ち得る。このようにして、癌の進行を遅らせ、又はさらにはそれを排除することができる。
【０００４】
特定の癌に罹患している患者の治療に用いられる一つのかかる免疫調節タンパク質は、インターロイキン−２である。インターロイキン−２（ＩＬ−２）は天然に存在するサイトカインであり、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の刺激因子としての活性も、及びＴ細胞増殖の誘導因子としての活性も有する。非グリコシル化形態では、ＩＬ−２は分子量が約１５，３００ダルトンである（しかしながらＩＬ−２は、生体内では様々なグリコシル化形態で存在する）。
【０００５】
市販の非グリコシル化ヒト組換えＩＬ−２生成物のアルデスロイキン（デス−アラニル−１、セリン−１２５ヒトインターロイキン−２のＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ブランドとしてＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡから入手可能）は、転移性腎細胞癌及び転移性黒色腫に罹患している患者への投与が承認されている。ＩＬ−２はまた、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、若年性関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、乳癌及び膀胱癌に罹患又は感染している患者における投与が提案されている。
【０００６】
しかしながらアルデスロイキンは、推奨用量であっても、毛細血管漏出症候群（ＣＬＳ）及び好中球機能障害を含む重度の副作用を引き起こし得る。このような重度の副作用の可能性を考慮して、且つ１５分間の静脈内注入を８時間毎に１４用量という治療サイクルが推奨されるため、アルデスロイキンの投与は臨床環境内で行われる。さらに、アルデスロイキンの市販の製剤はドデシル硫酸ナトリウムの存在を含み、これは、立体構造の安定による最適な活性の維持に必要と思われる物質である。非特許文献１を参照のこと。
【０００７】
ＩＬ−２の毒性の懸念に対処する試みが行われている。一手法では、配合手法が試みられている。例えば、特許文献１及び特許文献２及び特許文献３を参照のこと。他の手法では、ＩＬ−２の特定のコンジュゲートが提案されている。例えば、特許文献４、特許文献５、特許文献６及び特許文献７を参照のこと。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，７０６，２８９号明細書
【特許文献２】国際公開第０２／００２４３号
【特許文献３】国際公開第９９／６０１２８号
【特許文献４】米国特許第４，７６６，１０６号明細書
【特許文献５】米国特許第５，２０６，３４４号明細書
【特許文献６】米国特許第５，０８９，２６１号明細書
【特許文献７】米国特許第４，９０２，５０２号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．（１９９４）４３：５８３−５８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、そうしたアプローチにもかかわらず、依然としてＩＬ−２のコンジュゲートが必要とされている。そのため、特に、本発明の１つ又は複数の実施形態は、本明細書に記載されるとおりのコンジュゲート並びにコンジュゲートを含む組成物及び関連する方法に関し、それらは新規で、且つ当該技術分野において提案されたことが全くないものと思われる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従って、本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−２部分の残基を含むコンジュゲートが提供される。
【００１２】
本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−２部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、このＩＬ−２部分の残基は、放出可能な連結を介して水溶性ポリマーと共有結合する。
【００１３】
本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−２部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、このＩＬ−２部分は前駆ＩＬ−２部分である。
【００１４】
本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−２部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、このＩＬ−２部分は非前駆ＩＬ−２部分である。
【００１５】
本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートの送達方法であって、ＩＬ−２の残基と水溶性ポリマーとのコンジュゲートを含む組成物を患者に皮下投与するステップを含む方法が提供される。
【００１６】
本発明の１つ又は複数の実施形態では、単離核酸分子であって、ＩＬ−２部分をコードする単離核酸分子が提供され、前記核酸分子は、配列番号５に示される配列と実質的な（例えば少なくとも８０％の）配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ）を有する配列を含む。
【００１７】
本発明の１つ又は複数の実施形態では、発現ベクターであって、本明細書に提供される核酸分子を含む発現ベクター（例えば、インビトロ発現ベクター）が提供される。
【００１８】
本発明の１つ又は複数の実施形態では、宿主細胞であって、本明細書に提供されるとおりの発現ベクターを含む宿主細胞（例えば、インビトロ宿主細胞）が提供される。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
水溶性ポリマーに共有結合したＩＬ−２部分の残基を含むコンジュゲート。
（項目２）
前記水溶性ポリマーに共有結合した前記ＩＬ−２部分が、放出可能な連結を介して共有結合している、項目１に記載のコンジュゲート。
（項目３）
前記水溶性ポリマーに共有結合した前記ＩＬ−２部分が、安定な連結を介して共有結合している、項目１に記載のコンジュゲート。
（項目４）
前記水溶性ポリマーが分枝鎖状水溶性ポリマーである、項目１〜３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
（項目５）
前記水溶性ポリマーが、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、及びポリ（アクリロイルモルホリン）からなる群から選択されるポリマーである、項目１〜４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
（項目６）
前記水溶性ポリマーがポリ（アルキレンオキシド）である、項目５に記載のコンジュゲート。
（項目７）
前記ポリ（アルキレンオキシド）がポリ（エチレングリコール）である、項目６に記載のコンジュゲート。
（項目８）
前記ポリ（エチレングリコール）が、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケノキシ、置換アルケノキシ、アルキノキシ、置換アルキノキシ、アリールオキシ及び置換アリールオキシからなる群から選択されるエンドキャップ部分で末端がキャップされている、項目７に記載のコンジュゲート。
（項目９）
前記水溶性ポリマーが、約５００ダルトン〜約１００，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、項目１〜７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
（項目１０）
前記コンジュゲートが、前記ＩＬ−２部分の残基のアミン基に共有結合している、項目１〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
（項目１１）
１個、２個、３個又は４個の水溶性ポリマーが前記ＩＬ−２部分の残基に結合している、項目１〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
（項目１２）
１個、２個又は３個の水溶性ポリマーが前記ＩＬ−２部分の残基に結合している、項目１〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
（項目１３）
１個又は水溶性ポリマーが前記ＩＬ−２部分の残基に結合している、項目１〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
（項目１４）
１個の水溶性ポリマーが前記ＩＬ−２部分の残基に結合している、項目１〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
（項目１５）
水溶性ポリマーに共有結合したＩＬ−２部分の残基を含むコンジュゲートであって、前記水溶性ポリマーが、共有結合する前には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基を有するポリマー試薬である、コンジュゲート。
（項目１６）
項目１〜１５のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
（項目１７）
項目１６に記載の医薬組成物を個人に投与するステップを含む方法。
（項目１８）
コンジュゲート形成条件下で、ＩＬ−２部分をポリマー試薬と接触させるステップを含むコンジュゲートの作製方法。
（項目１９）
ＩＬ−２部分をコードする単離核酸分子であって、配列番号５に示される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む核酸分子。
（項目２０）
ＤＮＡである、項目１９に記載の核酸分子。
（項目２１）
項目１９に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
（項目２２）
プラスミドである、項目２１に記載の発現ベクター。
（項目２３）
項目２２に記載のベクターを含むインビトロ宿主細胞。
（項目２４）
タンパク質を、前記タンパク質のサイズより小さい孔径を有する透析バッグ内に入れてタンパク質が入った透析バッグを形成するステップと、前記タンパク質が入った透析バッグをタンパク質変性剤不含溶液に供するステップとを含む方法。
（項目２５）
ＩＬ−２部分と、５〜１５ｍＭ酢酸ナトリウムと、２〜７％トレハロースとを含む組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１にさらに記載される遺伝子のＤＮＡ配列及び得られるアミノ酸配列を提供する。
【図２−１】実施例２に記載される手順に従い調製された［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の陽イオン交換クロマトグラフィー後の典型的なクロマトグラムの図である。
【図２−２】実施例２にさらに記載されるとおり、［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の逆相ＨＰＬＣ分析後のクロマトグラムの図である。
【図２−３】実施例２に記載される手順に従い調製された様々なコンジュゲートの放出プロファイルのプロットである。
【図３−１】実施例３に記載される手順に従い調製された［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の陽イオン交換クロマトグラフィー後の典型的なクロマトグラムの図である。
【図３−２】実施例３にさらに記載されるとおり、［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の逆相ＨＰＬＣ分析後のクロマトグラムの図である。
【図３−３】実施例３に記載される手順に従い調製された様々なコンジュゲートのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析後の結果の図である。
【図４−１】実施例４に記載される手順に従い調製された［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の陽イオン交換クロマトグラフィー後の典型的なクロマトグラムの図である。
【図４−２】実施例４にさらに記載されるとおり、［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の逆相ＨＰＬＣ分析後のクロマトグラムの図である。
【図５】実施例５にさらに記載されるとおり、［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の陽イオン交換クロマトグラフィー後のクロマトグラムの図である。
【図６】実施例６にさらに記載されるとおり、［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の陽イオン交換クロマトグラフィー後のクロマトグラムの図である。
【図７】実施例１１にさらに記載されるとおり、アルデスロイキン及び安定な［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］に応答したＣＴＬＬ−２細胞の増殖のプロットを示す。データ点は、トリプリケートで測定した１つの実験の平均値である。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。
【図８】実施例１１にさらに記載されるとおり、アルデスロイキン、放出及び未放出［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］及び［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］に応答したＣＴＬＬ−２細胞の増殖のプロットを示す。データ点は、トリプリケートで測定した１つの実験の平均値である。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。
【図９】実施例１２にさらに記載されるとおり、マウスにおける単回注射後の濃度−時間曲線のプロットを示す。
【図１０】実施例１３にさらに記載されるとおり、数種の試験化合物についての全病変面積（ｍｍ２）のプロットを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ及び図１１Ｂは、実施例１４にさらに記載されるとおり、様々な投与スキームでの被験物質の腫瘍増殖抑制期間曲線を示すプロットである。
【図１１Ｂ】図１１Ａ及び図１１Ｂは、実施例１４にさらに記載されるとおり、様々な投与スキームでの被験物質の腫瘍増殖抑制期間曲線を示すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の１つ又は複数の実施形態を詳細に説明する前に、この発明は、特定のポリマー、合成方法、ＩＬ−２部分などに限定されず、従って異なり得ることが理解されるべきである。
【００２１】
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」が、文脈上特に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことは注記されるべきである。従って、例えば、「ポリマー（ａ  ｐｏｌｙｍｅｒ）」と言うとき、それは単一のポリマー並びに２つ以上の同じ、又は異なるポリマーを含み、「任意選択の賦形剤（ａｎ  ｏｐｔｉｏｎａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」と言うとき、それは単一の任意選択の賦形剤並びに２つ以上の同じ、又は異なる任意選択の賦形剤を指すなどする。
【００２２】
本発明の１つ又は複数の実施形態の説明及び特許請求においては、以下の専門用語を下記の定義に従い用いるものとする。
【００２３】
「ＰＥＧ」、「ポリエチレングリコール」、及び「ポリ（エチレングリコール）」は、本明細書で使用されるとき同義であり、任意の非ペプチド性水溶性ポリ（エチレンオキシド）を包含する。典型的には、本発明に従い使用されるＰＥＧは、以下の構造「−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−」（式中、（ｎ）は２〜４０００である）を含む。本明細書で使用されるとき、ＰＥＧはまた、末端酸素が例えば合成変換中に置換されたかどうかに応じて、「−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−」、及び「−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ−」も含む。本明細書及び特許請求の範囲の全体を通じて、用語「ＰＥＧ」には、様々な末端基又は「エンドキャップ」基などを有する構造が含まれることに留意しなければならない。用語「ＰＥＧ」はまた、過半数の、すなわち５０％を超える−ＯＣＨ２ＣＨ２−の反復サブユニットを含むポリマーも意味する。具体的な形態に関して、ＰＥＧは、様々な分子量、並びに「分枝鎖状」、「直鎖状」、「フォーク型」、「多官能性」などの構造又は幾何形状のうちのいずれをとってもよく、これについては以下にさらに詳細に記載される。
【００２４】
用語「エンドキャップされた」及び「末端がキャップされた」は、本明細書では同義的に用いられ、ポリマーの末端又は終点がエンドキャップ部分を有することを指す。典型的には、必須ではないが、エンドキャップ部分はヒドロキシ基又はＣ１〜２０アルコキシ基、より好ましくはＣ１〜１０アルコキシ基、さらにより好ましくはＣ１〜５アルコキシ基を含む。従って、エンドキャップ部分の例としては、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ及びベンジルオキシ）、並びに、アリール、ヘテロアリール、シクロ、ヘテロシクロなどが挙げられる。エンドキャップ部分には、ポリマー中の末端単量体の１個又は複数の原子が含まれ得ることに留意しなければならない［例えば、ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−及びＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−におけるエンドキャップ部分「メトキシ」］。加えて、前述の各々の飽和型、不飽和型、置換型、及び非置換型が想定される。さらに、エンドキャップ基はシランであってもよい。エンドキャップ基はまた、有利には検出可能標識も含み得る。ポリマーが検出可能標識を含むエンドキャップ基を有する場合、ポリマー及び／又はそのポリマーが結合している部分（例えば、活性薬剤）の量又は位置を、好適な検出器を用いて決定することができる。かかる標識としては、限定なしに、蛍光剤、化学発光剤、酵素標識に用いられる部分、比色（例えば、色素）、金属イオン、放射性部分などが挙げられる。好適な検出器としては、光度計、フィルム、分光計などが挙げられる。エンドキャップ基はまた、有利にはリン脂質も含み得る。ポリマーがリン脂質を含むエンドキャップ基を有する場合、ポリマー及び得られるコンジュゲートに固有の特性が付与される。例示的なリン脂質としては、限定なしに、ホスファチジルコリンと称されるクラスのリン脂質から選択されるものが挙げられる。具体的なリン脂質としては、限定なしに、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステロイルホスファチジルコリン、ベヘノイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン、及びレシチンからなる群から選択されるものが挙げられる。エンドキャップ基はまた、ポリマー（並びにそれに結合するあらゆるもの、例えばＩＬ−２部分）が目的の範囲に選択的に局在することができるように、標的部分も含み得る。
【００２５】
本明細書に記載されるとおりのポリマーに関して「天然に存在しない」とは、そのままの状態としては自然界に見ることのできないポリマーを意味する。しかしながら、天然に存在しないポリマーは、全体としてのポリマー構造が自然界に見られない限りにおいて、１つ又は複数の天然に存在する単量体又は単量体セグメントを含み得る。
【００２６】
「水溶性ポリマー」にあるような用語「水溶性の」ポリマーは、室温で水に対して可溶性の任意のポリマーである。典型的には、水溶性ポリマーは、ろ過後の同じ溶液により伝達される光の少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９５％を伝達する。水溶性ポリマーは、重量基準で、好ましくは水に対して少なくとも約３５％（重量）溶解することができ、より好ましくは水に対して少なくとも約５０％（重量）溶解することができ、さらにより好ましくは水に対して約７０％（重量）溶解することができ、さらにより好ましくは水に対して約８５％（重量）溶解することができる。しかしながら、最も好ましくは、水溶性ポリマーは水に対して約９５％（重量）溶解することができ、又は水に対して完全に溶解することができる。
【００２７】
水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに関連した分子量は、数平均分子量又は重量平均分子量のいずれとしても表すことができる。特に指示されない限り、本明細書で分子量と言うときは全て、重量平均分子量を指す。数平均及び重量平均のいずれの分子量の測定も、ゲル浸透クロマトグラフィー法又は他の液体クロマトグラフィー法を用いて計測することができる。また、分子量の値を計測するための他の方法を用いて、例えば、末端基分析を用いるか、若しくは束一的性質（例えば、凝固点降下、沸点上昇、若しくは浸透圧）を計測することにより数平均分子量を決定してもよく、又は、光散乱法、超遠心法若しくは粘度測定法を用いることにより重量平均分子量を決定してもよい。本発明のポリマーは、典型的には多分散系であり（すなわち、ポリマーの数平均分子量と重量平均分子量とが等しくない）、好ましくは約１．２未満、より好ましくは約１．１５未満、さらにより好ましくは約１．１０未満、なおさらにより好ましくは約１．０５未満、及び最も好ましくは約１．０３未満の低い多分散性値を有する。
【００２８】
用語「活性の」、「反応性の」、又は「活性化された」は、特定の官能基と併せて使用されるとき、別の分子上の求電子剤又は求核剤と容易に反応する反応性官能基を指す。これは、反応させるために強力な触媒又は極めて非現実的な反応条件が必要な基（すなわち、「非反応性の」、又は「不活性の」基）と対比される。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、用語「官能基」又はその任意の同義語は、その保護型並びに無保護型を包含することが意図される。
【００３０】
用語「スペーサー部分」、「連結」、及び「リンカー」は、本明細書では、例えばポリマーセグメントの末端とＩＬ−２部分又はＩＬ−２部分の求電子剤若しくは求核剤との相互接続部分を場合により連結するために用いられる結合又は原子若しくは原子集合を指して用いられる。スペーサー部分は、加水分解に対して安定であってもよく、又は生理的に加水分解可能か、若しくは酵素分解可能な連結を含んでもよい。文脈上特に明確に指示されない限り、スペーサー部分は化合物の任意の２つの要素間に場合により存在する（例えば、ＩＬ−２部分の残基と水溶性ポリマーとを含む提供のコンジュゲートは、直接的にも、又はスペーサー部分を介して間接的にも結合することができる）。
【００３１】
「アルキル」は炭化水素鎖を指し、典型的には約１〜１５個の範囲の原子長さである。かかる炭化水素鎖は、必須ではないが好ましくは飽和しており、分枝鎖状であっても、又は直鎖状であってもよく、但し典型的には直鎖状が好ましい。例示的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル、３−メチルペンチルなどが挙げられる。本明細書で使用されるとき、「アルキル」には、シクロアルキル並びにシクロアルキレン含有アルキルが含まれる。
【００３２】
「低級アルキル」は、１〜６個の炭素原子を含むアルキル基を指し、直鎖状であっても、又は分枝鎖状であってもよく、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、及びｔ−ブチルにより例示されるとおりである。
【００３３】
「シクロアルキル」は、飽和又は不飽和の環状炭化水素鎖を指し、架橋、縮合、又はスピロ環化された化合物を含み、好ましくは３〜約１２個の炭素原子、より好ましくは３〜約８個の炭素原子で構成される。「シクロアルキレン」は、環式環系における任意の２個の炭素で鎖を結合させることによりアルキル鎖に挿入されたシクロアルキル基を指す。
【００３４】
「アルコキシ」は、−ＯＲ基であって、式中、Ｒがアルキルか、又は置換アルキル、好ましくはＣ１〜６アルキル（例えば、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシなど）である−ＯＲ基を指す。
【００３５】
例えば「置換アルキル」にあるような用語「置換された」は、限定はされないが、アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、例えば、シクロプロピル、シクロブチルなど；ハロ、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨード；シアノ；アルコキシ、低級フェニル；置換フェニル；などの１つ又は複数の干渉しない置換基で置換された部分（例えば、アルキル基）を指す。「置換アリール」は、１つ又は複数の干渉しない基を置換基として有するアリールである。フェニル環に対する置換について、置換基はいかなる配向（すなわち、オルト、メタ、又はパラ）であってもよい。
【００３６】
「干渉しない置換基」は、分子中に存在するとき、典型的にはその分子中に含まれる他の官能基との反応性を有しない基である。
【００３７】
「アリール」とは、１つ又は複数の芳香環であって、各々が５個又は６個の中心炭素原子であるものを意味する。アリールは、ナフチルにおけるように縮合していることも、又はビフェニルにおけるように縮合していないこともある複数のアリール環を含む。アリール環はまた、１つ又は複数の環状炭化水素、ヘテロアリール、又は複素環式環と縮合していても、又は縮合していなくともよい。本明細書で使用されるとき、「アリール」にはヘテロアリールが含まれる。
【００３８】
「ヘテロアリール」は、１〜４個のヘテロ原子、好ましくは硫黄、酸素、若しくは窒素、又はそれらの組み合わせを含むアリール基である。ヘテロアリール環はまた、１つ又は複数の環状炭化水素、複素環式環、アリール環、又はヘテロアリール環と縮合していてもよい。
【００３９】
「複素環」又は「複素環式」とは、５〜１２個の原子、好ましくは５〜７個の原子の１つ又は複数の環であって、不飽和特性又は芳香族特性を伴うことも、又は伴わないこともあり、且つ炭素以外の少なくとも１個の環原子を有する環を意味する。好ましいヘテロ原子としては、硫黄、酸素、及び窒素が挙げられる。
【００４０】
「置換ヘテロアリール」は、１つ又は複数の干渉しない基を置換基として有するヘテロアリールである。
【００４１】
「置換複素環」は、干渉しない置換基から形成された１つ又は複数の側鎖を有する複素環である。
【００４２】
「有機ラジカル」は、本明細書で使用されるとき、アキル（ａｋｙｌ）、置換アルキル、アリール、及び置換アリールを含む。
【００４３】
「求電子剤」及び「求電子基」は、求電子中心、すなわち電子を求引する中心を有し、求核剤と反応することが可能なイオン又はイオン化し得る原子若しくは原子集合を指す。
【００４４】
「求核剤」及び「求核基」は、求核中心、すなわち求電子中心を求引する中心を有するか、又は求電子剤を伴う、イオン又はイオン化し得る原子若しくは原子集合を指す。
【００４５】
「生理学的に切断可能な」又は「加水分解可能な」又は「分解可能な」結合とは、生理学的条件下で水と反応する（すなわち、加水分解される）結合である。結合が水中で加水分解し易いかどうかは、２個の中心原子をつなぐ連結の一般的なタイプのみならず、そうした中心原子と結合する置換基にも依存し得る。加水分解に対して不安定な、又は加水分解を受け易い適切な連結としては、限定はされないが、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチド及びオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００４６】
「酵素分解可能な連結」とは、１つ又は複数の酵素により分解を受ける連結を意味する。
【００４７】
「加水分解に対して安定な」連結又は結合とは、水中で実質的に安定な、すなわち生理学的条件下で長期間にわたってもいかなる認め得る程度の加水分解も受けない化学結合、典型的には共有結合を指す。加水分解に対して安定な連結の例としては、限定はされないが、以下のもの：炭素−炭素結合（例えば、脂肪族鎖中）、エーテル、アミド、ウレタンなどが挙げられる。概して、加水分解に対して安定な連結とは、生理学的条件下で１日約１〜２％未満の加水分解率を呈するものである。代表的な化学結合の加水分解率については、多くの標準的な化学テキストを参照することができる。
【００４８】
「薬学的に許容可能な賦形剤又は担体」とは、場合により本発明の組成物中に含めることができ、患者に対して何ら有意な毒性の有害作用を引き起こすことのない賦形剤を指す。「薬理学的な有効量」、「生理学的な有効量」、及び「治療上の有効量」は、本明細書では同義的に用いられ、血流中又は標的組織中に所望のレベルのコンジュゲート（又はそれに対応する非コンジュゲート化ＩＬ−２部分）をもたらすのに必要なポリマー−（ＩＬ−２）部分コンジュゲートの量を意味する。正確な量は、例えば、特定のＩＬ−２部分、治療組成物の成分及び物理的特性、目的とする患者集団、個々の患者の考慮事項など数多くの要因に依存し、当業者は、本明細書に提供される情報に基づきそれを容易に決定することができる。
【００４９】
「多官能性の」とは、３個以上の官能基を中に含むポリマーを意味し、ここで官能基は、同じであっても、又は異なってもよい。本発明の多官能性ポリマー試薬は、典型的にはポリマー骨格内に約３〜１００個の官能基、若しくは３〜５０個の官能基、若しくは３〜２５個の官能基、若しくは３〜１５個の官能基、若しくは３〜１０個の官能基を含み、又は３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個の官能基を含む。
【００５０】
用語「ＩＬ−２部分」は、本明細書で使用されるとき、ヒトＩＬ−２活性を有する部分を指す。ＩＬ−２部分はまた、ポリマー試薬との反応に好適な少なくとも１つの求電子基又は求核基も有し得る。加えて、用語「ＩＬ−２部分」は、コンジュゲート形成前のＩＬ−２部分並びにコンジュゲート形成後のＩＬ−２部分残基の双方を包含する。以下にさらに詳細に説明するとおり、当業者は、任意の所与の部分がＩＬ−２活性を有するかどうかを決定することができる。配列番号１〜４のいずれか１つに対応するアミノ酸配列を含むタンパク質、並びにそれと実質的に相同な任意のタンパク質又はポリペプチドが、ＩＬ−２部分である。本明細書で使用されるとき、用語「ＩＬ−２部分」には、例えば部位特異的突然変異誘発によって意図的に修飾されたか、又は突然変異によって偶発的に修飾されたかかるタンパク質が含まれる。これらの用語にはまた、１〜６個のさらなるグリコシル化部位を有する類似体、タンパク質のカルボキシ末端側の終端部に、少なくとも１個のさらなるアミノ酸であって、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む１個又は複数のさらなるアミノ酸を有する類似体、及び少なくとも１つのグリコシル化部位を含むアミノ酸配列を有する類似体も含まれる。この用語には、天然の部分及び組換え産生された部分の双方が含まれる。
【００５１】
用語「実質的に相同な」とは、特定の対象配列、例えば突然変異配列が、１つ又は複数の置換、欠失、又は付加だけ基準配列と異なるが、その正味の効果としては、基準配列と対象配列との間に機能上の有害な相違は生じないことを意味する。本発明の目的上、８０パーセントより高い（より好ましくは８５パーセントより高く、さらにより好ましくは９０パーセントより高く、９５パーセントより高いことが最も好ましい）の相同性、等価な生物活性（必須ではないが等価な生物活性強度）、及び等価な発現特性を有する配列が、実質的に相同であると見なされる。相同性を決定する目的では、成熟配列のトランケーションは無視するものとする。本明細書で用いられる例示的なＩＬ−２部分には、実質的に相同な配列番号２である配列が含まれる。
【００５２】
用語「断片」とは、ＩＬ−２部分の一部又は断片のアミノ酸配列を有する任意のタンパク質又はポリペプチドであって、ＩＬ−２の生物活性を有するものを意味する。断片には、ＩＬ−２部分のタンパク質分解によって産生されたタンパク質又はポリペプチド、並びに当該技術分野においてルーチンの方法による化学合成によって産生されたタンパク質又はポリペプチドが含まれる。
【００５３】
用語「患者」とは、活性薬剤（例えば、コンジュゲート）を投与することにより予防又は治療することのできる病態を患っている、又はそうした病態に罹りやすい生物体を指し、ヒト及び動物の双方を含む。
【００５４】
「任意選択の」、又は「場合により」とは、続いて記載される状況が起こることも、又は起こらないこともあり、従ってその記載は、その状況が起こる場合と、それが起こらない場合とを含むことを意味する。
【００５５】
「実質的に」とは、ほぼ全面的又は完全に、という意味であり、例えば、以下のうちの１つ又は複数を満足する：条件の５０％超、５１％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、及び９５％以上。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、「配列同一性」は、基準ＤＮＡ配列の配列を、別のＤＮＡ配列の当該部分と比較することにより決定され、これらの配列は、配列ギャップを最小限にしながら２つの配列間の重複が最大となるように並べられ、ここで２つの配列間の任意の突出する配列は無視される。本明細書に記載される任意の配列同一性に関して、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％、なおさらにより好ましくは９５％の配列同一性であり、９６％、９７％、９８％、及び９９％の配列同一性が最も好ましい。
【００５７】
ペプチド中のアミノ酸残基は、以下のとおり略記される：フェニルアラニンはＰｈｅ又はＦであり；ロイシンはＬｅｕ又はＬであり；イソロイシンはＩｌｅ又はＩであり；メチオニンはＭｅｔ又はＭであり；バリンはＶａｌ又はＶであり；セリンはＳｅｒ又はＳであり；プロリンはＰｒｏ又はＰであり；スレオニンはＴｈｒ又はＴであり；アラニンはＡｌａ又はＡであり；チロシンはＴｙｒ又はＹであり；ヒスチジンはＨｉｓ又はＨであり；グルタミンはＧｌｎ又はＱであり；アスパラギンはＡｓｎ又はＮであり；リジンはＬｙｓ又はＫであり；アスパラギン酸はＡｓｐ又はＤであり；グルタミン酸はＧｌｕ又はＥであり；システインはＣｙｓ又はＣであり；トリプトファンはＴｒｐ又はＷであり；アルギニンはＡｒｇ又はＲであり；及びグリシンはＧｌｙ又はＧである。
【００５８】
本発明の１つ又は複数の実施形態について見ると、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと（直接、又はスペーサー部分を介して）共有結合したＩＬ−２部分の残基を含むコンジュゲートが提供される。本発明のコンジュゲートは、以下の特徴のうちの１つ又は複数を有する。
【００５９】
ＩＬ−２部分
先述のとおり、一般的にこのコンジュゲートは、水溶性ポリマーと直接、又はスペーサー部分を介して共有結合したＩＬ−２部分の残基を含む。本明細書で使用されるとき、用語「ＩＬ−２部分」は、コンジュゲート形成前のＩＬ−２部分、並びに非ペプチド性水溶性ポリマーと結合した後のＩＬ−２部分を指すものとする。しかしながら、本来のＩＬ−２部分が非ペプチド性水溶性ポリマーと結合すると、ポリマーとの連結に伴い１つ又は複数の共有結合が存在するため、ＩＬ−２部分は僅かに変化することが理解されるであろう。多くの場合に、この別の分子と結合して僅かに変化した形態のＩＬ−２部分は、ＩＬ−２部分の「残基」と称される。
【００６０】
ＩＬ−２部分は、非組換え方法からも、及び組換え方法からも得ることができ、本発明はこの点について限定されない。加えて、ＩＬ−２部分は、ヒト供給源にも、動物供給源にも、及び植物供給源にも由来し得る。
【００６１】
ＩＬ−２部分は、非組換え的に誘導することができる。例えば、生物系からＩＬ−２を単離し、及び他の方法で、培養した培地からＩＬ−２を得ることが可能である。例えば、米国特許第４，４０１，７５６号明細書及びＰａｕｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７５（１）：７３−８４に記載される手順を参照のこと。
【００６２】
ＩＬ−２部分は、組換え方法から誘導することができる。例えば、米国特許第５，６１４，１８５号明細書、本明細書に提供される開示及び実施例を参照のこと。
【００６３】
非組換え手法及び組換え手法で得られた任意のＩＬ−２部分を、本明細書に記載されるコンジュゲートの調製においてＩＬ−２部分として使用することができる。
【００６４】
ＩＬ−２部分は、細菌［例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＩＬ−２ｍ．２１（３）：２９５−３１１を参照］、哺乳動物［例えば、Ｋｒｏｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｇｅｎｅ  １２１：２９５−３０４を参照］、酵母［例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、例えば、Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２８（１）：１２１−１２９を参照］、及び植物［例えば、Ｍｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５（３）：２５９−２６６を参照］の発現系で発現させることができる。発現は、外因性発現によっても（宿主細胞が天然で所望の遺伝コードを含む場合）又は内因性発現によっても起こり得る。
【００６５】
組換えに基づくタンパク質の調製方法には違いがあり得るが、典型的には、組換え方法には、所望のポリペプチド又は断片をコードする核酸の構築、核酸の発現ベクターへのクローニング、宿主細胞（例えば、植物、細菌、酵母、トランスジェニック動物細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞若しくはベビーハムスター腎臓細胞などの哺乳動物細胞）の形質転換、及び核酸の発現による所望のポリペプチド又は断片の産生が関わる。組換えポリペプチドをインビトロで原核生物及び真核生物の宿主細胞において産生し、発現させる方法は、当業者に公知である。
【００６６】
組換えポリペプチドの同定及び精製を促進するため、エピトープタグ又は他の親和性結合配列をコードする核酸配列を、コード配列とインフレームで挿入又は付加し、それにより所望のポリペプチドと、結合に適したポリペプチドとを含む融合タンパク質を産生することができる。融合タンパク質の同定及び精製は、初めに融合タンパク質を含む混合物を、融合タンパク質中のエピトープタグ又は他の結合配列に対する結合部分（例えば、抗体）を有するアフィニティーカラムに通過させ、それによって融合タンパク質をカラム内に結合させることにより行うことができる。その後、カラムを適切な溶液（例えば、酸）で洗浄して結合した融合タンパク質を遊離させることにより、融合タンパク質を回収することができる。組換えポリペプチドはまた、宿主細胞の溶解、ポリペプチドの、例えばイオン交換クロマトグラフィーによる分離、親和性結合手法、疎水性相互作用手法により精製し、その後、ＭＡＬＤＩ又はウエスタンブロットにより同定し、及びポリペプチドを回収することもできる。組換えポリペプチドを同定及び精製するためのこれらの及び他の方法は、当業者に公知である。しかしながら、本発明の１つ又は複数の実施形態では、ＩＬ−２部分は融合タンパク質の形態ではない。
【００６７】
ＩＬ−２活性を有するタンパク質の発現に用いられる系に応じて、ＩＬ−２部分はグリコシル化されていなくても、又はグリコシル化されていてもよく、いずれも使用することができる。すなわち、ＩＬ−２部分はグリコシル化されていなくてもよく、又はＩＬ−２部分はグリコシル化されていてもよい。本発明の１つ又は複数の実施形態では、ＩＬ−２部分はグリコシル化されていない。
【００６８】
ＩＬ−２部分は、有利には、１つ又は複数のアミノ酸残基、例えば、リジン、システイン及び／又はアルギニンを含む及び／又は置換するように修飾することができ、それによりポリマーがそのアミノ酸の側鎖内の原子と結合し易くなる。ＩＬ−２部分の置換の例は、米国特許第５，２０６，３４４号明細書に記載される。加えて、ＩＬ−２部分は、天然に存在しないアミノ酸残基を含むように修飾することができる。アミノ酸残基及び天然に存在しないアミノ酸残基を付加する方法は、当業者に公知である。Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  ＩＬ−２ｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２）を参照されたい。
【００６９】
加えて、ＩＬ−２部分は、有利には、官能基の結合（官能基を含むアミノ酸残基の付加によるものは除く）を含むように修飾することができる。例えば、ＩＬ−２部分は、チオール基を含むように修飾することができる。加えて、ＩＬ−２部分は、Ｎ末端のα炭素を含むように修飾することができる。加えて、ＩＬ−２部分は、１つ又は複数の炭水化物部分を含むように修飾することができる。加えて、ＩＬ−２部分は、アルデヒド基を含むように修飾することができる。加えて、ＩＬ−２部分は、ケトン基を含むように修飾することができる。本発明の一部の実施形態では、ＩＬ−２部分は、チオール基、Ｎ末端のα炭素、炭水化物、アルデヒド基（ａｄｅｈｙｄｅ  ｇｒｏｕｐ）及びケトン基のうちの１つ又は複数を含むようには修飾されないことが好ましい。
【００７０】
例示的なＩＬ−２部分は、文献中、並びに例えば米国特許第５，１１６，９４３号明細書、同第５，１５３，３１０号明細書、同第５，６３５，５９７号明細書、同第７，１０１，９６５号明細書及び同第７，５６７，２１５号明細書及び米国特許出願公開第２０１０／００３６０９７号明細書及び同第２００４／０１７５３３７号明細書に記載されている。好ましいＩＬ−２部分としては、配列番号１〜４からなる群から選択される配列を含むアミノ酸配列を有するもの、及びそれと実質的に相同な配列が挙げられる。好ましいＩＬ−２部分は、配列番号３に対応するアミノ酸配列を有する。
【００７１】
ある場合には、ＩＬ−２部分は、対応するペプチドの単一の発現が個別の単位として体系付けられる「単量体」の形態である。別の場合には、ＩＬ−２部分は、２つの単量体形態のタンパク質が互いに（例えばジスルフィド結合により）結合されている「二量体」の形態（例えば、組換えＩＬ−２の二量体）である。例えば、組換えヒトＩＬ−２の二量体との関連では、二量体は、各単量体のＣｙｓ１２５残基から形成されるジスルフィド結合によって互いに結合した２つの単量体の形態であり得る。
【００７２】
加えて、ＩＬ−２部分として、前駆体形態のＩＬ−２を用いることができる。例示的な前駆体形態のＩＬ−２は、配列番号１の配列を有する。
【００７３】
前述の配列のいずれかのトランケート型、ハイブリッド変異体、及びペプチド模倣物もまた、ＩＬ−２部分として機能することができる。少なくともある程度のＩＬ−２活性を維持している前述のいずれかの生物学的に活性な断片、欠失変異体、置換変異体又は付加変異体もまた、ＩＬ−２部分として機能することができる。
【００７４】
任意の所与のペプチド又はタンパク質部分について、当該の部分がＩＬ−２活性を有するかどうかを決定することが可能である。当該技術分野では、インビトロのＩＬ−２活性の様々な決定方法が記載されている。例示的な手法は、以下の実施例に記載するＣＴＴＬ−２細胞増殖アッセイである。例示的な手法は、Ｍｏｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１０４７−１０５６に記載される。簡潔に言えば、非特異的結合アッセイでは、提案されるＩＬ−２部分が、ＩＬ−２の受容体を有する細胞系統の存在下で４℃で１時間予備インキュベートされる。その後、１２５Ｉ標識ＩＬ−２がその系において４℃で３時間インキュベートされる。データは、野生型ＩＬ−２に対する提案されるＩＬ−２部分活性の％阻害能として表される。電気測定法、分光測定法、クロマトグラフィー、及び放射測定法を含め、当該技術分野において公知の他の方法論もまた、ＩＬ−２機能の評価に用いることができる。
【００７５】
水溶性ポリマー
先に考察したとおり、各コンジュゲートは水溶性ポリマーと結合したＩＬ−２部分を含む。水溶性ポリマーに関して、水溶性ポリマーは非ペプチド性で、非毒性であり、天然には存在せず、且つ生体適合性である。生体適合性に関して、物質は、生体組織に関連して物質を単独で、又は別の物質（例えば、ＩＬ−２部分などの活性薬剤）と共に使用すること（例えば、患者への投与）に伴う有益な作用が、臨床医、例えば医師が評価するとき、いかなる有害な作用にも勝る場合に、生体適合性であると見なされる。非免疫原性に関して、物質は、生体内での物質の意図される使用によって望ましくない免疫反応（例えば、抗体の形成）が生じることがない場合か、又は、免疫反応が生じる場合にも、かかる反応が、臨床医の評価で臨床的に有意、又は重要とは見なされない場合に、非免疫原性であると見なされる。非ペプチド性水溶性ポリマーは、生体適合性且つ非免疫原性であることが特に好ましい。
【００７６】
さらに、このポリマーは、典型的には２〜約３００個の末端を有するものとして特徴付けられる。かかるポリマーの例としては、限定はされないが、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体などのポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチレン化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシアルキル）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（「ＰＯＺ」）（これについては、国際公開第２００８／１０６１８６号パンフレットに記載されている）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、及び前述のいずれかの組み合わせが挙げられる。
【００７７】
水溶性ポリマーは特定の構造に限定されず、直鎖状（例えば、エンドキャップされた、例えばアルコキシＰＥＧ又は二官能性ＰＥＧ）、分枝鎖状又は多腕状（例えば、フォーク型ＰＥＧ又はポリオール核と結合したＰＥＧ）、樹木状（又は星型）の構造であってもよく、各々は、１つ又は複数の分解可能な連結を有することも、又は有しないこともある。さらに、水溶性ポリマーの内部構造は、種々の反復パターンのいずれとして体系付けられてもよく、ホモポリマー、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互トリコポリマー、ランダムトリコポリマー、及びブロックトリコポリマーからなる群から選択することができる。
【００７８】
典型的には、活性化ＰＥＧ及び他の活性化水溶性ポリマー（すなわち、ポリマー試薬）は、ＩＬ−２部分上の所望の部位とのカップリングに適した好適な活性化基により活性化される。従って、ポリマー試薬は、ＩＬ−２部分と反応するための反応基を有する。代表的なポリマー試薬及びこうしたポリマーを活性部分とコンジュゲート化するための方法は、当該技術分野において公知であり、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ら、“Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌｓ）ｆｏｒ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ”、「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」所収、Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ、Ｐｌｅｎｕｓ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２年）、及びＺａｌｉｐｓｋｙ（１９９５年）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６：１５７−１８２頁にさらに記載されている。ＩＬ−２部分のカップリングに好適な例示的活性化基としては、特に、ヒドロキシル、マレイミド、エステル、アセタール、ケタール、アミン、カルボキシル、アルデヒド、アルデヒド水和物、ケトン、ビニルケトン、チオン、チオール、ビニルスルホン、ヒドラジンが挙げられる。
【００７９】
好ましくは、本明細書に記載されるコンジュゲートの調製に使用されるポリマー試薬は、ホスゲンを使用することなく調製される。このような手法は、例えば、米国特許第４，９０２，５０２号明細書に記載される開示とは対照的な位置にあり、この開示は、具体的には、クロロホルメートを形成し、続いてそれを使用してＰＥＧ活性エステルを形成し、次にそれをＩＬ−２と反応させることを記載している。ホスゲンを使用すると塩化水素が生じ、それによりポリマーの鎖開裂が起こることで不純物が増加する可能性があり、この不純物は、従来技術を用いては除去できないこともある。従って、理論による拘束を望むものではないが、ホスゲンを使用することなく形成されたポリマー試薬から調製されるＩＬ−２部分コンジュゲートは、実質的に高分子鎖分解生成物が存在しない、より高品質の組成物を提供する。また、１つ又は複数の実施形態において、水溶性ポリマーとＩＬ−２部分との間のスペーサー部分は、カルバメートを含むスペーサー部分ではない。
【００８０】
典型的には、コンジュゲート中の水溶性ポリマーの重量平均分子量は、約１００ダルトン〜約１５０，０００ダルトンである。しかしながら、例示的範囲としては、５，０００ダルトン超〜約１００，０００ダルトンの範囲、約６，０００ダルトン〜約９０，０００ダルトンの範囲、約１０，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲、１０，０００ダルトン超〜約８５，０００ダルトンの範囲、約２０，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲、約５３，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲、約２５，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲、約２９，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲、約３５，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲、及び約４０，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量が挙げられる。任意の所与の水溶性ポリマーについて、これらの範囲のうちの１つ又は複数の分子量を有するＰＥＧが好ましい。
【００８１】
水溶性ポリマーについての例示的な重量平均分子量としては、約１００ダルトン、約２００ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、約６００ダルトン、約７００ダルトン、約７５０ダルトン、約８００ダルトン、約９００ダルトン、約１，０００ダルトン、約１，５００ダルトン、約２，０００ダルトン、約２，２００ダルトン、約２，５００ダルトン、約３，０００ダルトン、約４，０００ダルトン、約４，４００ダルトン、約４，５００ダルトン、約５，０００ダルトン、約５，５００ダルトン、約６，０００ダルトン、約７，０００ダルトン、約７，５００ダルトン、約８，０００ダルトン、約９，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約１１，０００ダルトン、約１２，０００ダルトン、約１３，０００ダルトン、約１４，０００ダルトン、約１５，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン、約２２，５００ダルトン、約２５，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン、約３５，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約４５，０００ダルトン、約５０，０００ダルトン、約５５，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約６５，０００ダルトン、約７０，０００ダルトン、及び約７５，０００ダルトンが挙げられる。前述のいずれかの総分子量を有する分枝鎖型の水溶性ポリマー（例えば、２つの２０，０００ダルトンのポリマーを含む４０，０００ダルトンの分枝鎖状水溶性ポリマー）もまた、使用することができる。１つ又は複数の実施形態において、コンジュゲートは、直接的にも、又は間接的にも、約６，０００ダルトン未満の重量平均分子量を有するＰＥＧと結合したＰＥＧ部分は有しない。
【００８２】
ポリマーとして用いられるとき、ＰＥＧは、典型的には複数の（ＯＣＨ２ＣＨ２）単量体［又は（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単量体、ＰＥＧがどのように定義されるかによる］を含む。この説明全体を通じた使用について、反復単位の数は、「（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ」の添え字「ｎ」によって特定される。従って、（ｎ）の値は、典型的には以下の範囲の１つ又は複数のなかに含まれる：２〜約３４００、約１００〜約２３００、約１００〜約２２７０、約１３６〜約２０５０、約２２５〜約１９３０、約４５０〜約１９３０、約１２００〜約１９３０、約５６８〜約２７２７、約６６０〜約２７３０、約７９５〜約２７３０、約７９５〜約２７３０、約９０９〜約２７３０、及び約１，２００〜約１，９００。分子量が既知の任意の所与のポリマーについては、ポリマーの総重量平均分子量を反復単量体の分子量で除算することにより、反復単位の数（すなわち、「ｎ」）を決定することが可能である。
【００８３】
本発明での使用に特に好ましいポリマーの一つは、エンドキャップされたポリマー、すなわち、少なくとも１つの末端が下級Ｃ１〜６アルコキシ基などの比較的不活性な基で（但し、ヒドロキシル基も用いることができる）キャッピングされたポリマーである。例えば、ポリマーがＰＥＧであるとき、メトキシＰＥＧ（一般にｍＰＥＧと称される）を使用することが好ましく、このメトキシＰＥＧは、ポリマーの一方の末端がメトキシ（−ＯＣＨ３）基で、それに対し他の末端が、場合により化学修飾されていてもよいヒドロキシル又は他の官能基である直鎖型のＰＥＧである。
【００８４】
本発明の１つ又は複数の実施形態で有用な一形態において、遊離ＰＥＧ又は非結合ＰＥＧは、各末端がヒドロキシル基で終端している直鎖状ポリマー：
ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨであり、式中、（ｎ）は典型的には０〜約４，０００の範囲である。
【００８５】
上記のポリマー、α−、ω−ジヒドロキシルポリ（エチレングリコール）は、簡略な形ではＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨと表すことができ、ここでは−ＰＥＧ−記号が、以下の構造単位を表し得ることが理解される：
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−
式中、（ｎ）は上記に定義されるとおりである。
【００８６】
本発明の１つ又は複数の実施形態で有用な別のタイプのＰＥＧは、メトキシＰＥＧ−ＯＨ、又は簡略にはｍＰＥＧであり、これは一方の末端が比較的不活性なメトキシ基で、それに対し他方の末端がヒドロキシル基である。ｍＰＥＧの構造は、以下に示すとおりである。
ＣＨ３Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
式中、（ｎ）は上記のとおりである。
【００８７】
米国特許第５，９３２，４６２号明細書に記載されるような多腕状又は分枝鎖状ＰＥＧ分子もまた、ＰＥＧポリマーとして使用することができる。例えば、ＰＥＧは以下の構造を有し得る：
【化１】
2020097626.tif 000002
式中：
ｐｏｌｙａ及びｐｏｌｙｂは、メトキシポリ（エチレングリコール）などのＰＥＧ骨格であり（いずれも同じか、又は異なる）；
Ｒ”は、Ｈ、メチル又はＰＥＧ骨格などの非反応性部分であり；及び
Ｐ及びＱは、非反応性の連結である。好ましい実施形態において、分枝鎖状ＰＥＧポリマーはメトキシポリ（エチレングリコール）二置換リジンである。使用される具体的なＩＬ−２部分によっては、二置換リジンの反応性エステル官能基がさらに修飾され、ＩＬ−２部分内の標的基との反応に好適な官能基を形成してもよい。
【００８８】
加えて、ＰＥＧはフォーク型ＰＥＧを含むことができる。フォーク型ＰＥＧの例は、以下の構造によって表される：
【化２】
2020097626.tif 000003
式中：Ｘは、１個又は複数の原子のスペーサー部分であり、各Ｚは、一定長の原子鎖によってＣＨと連結された活性化末端基である。国際公開第９９／４５９６４号パンフレットは、本発明の１つ又は複数の実施形態に用いることが可能な様々なフォーク型ＰＥＧ構造を開示している。Ｚ官能基を分枝鎖状炭素原子と連結する原子鎖はテザー基として働き、例えば、アルキル鎖、エーテル鎖、エステル鎖、アミド鎖及びそれらの組み合わせを含み得る。
【００８９】
ＰＥＧポリマーは、カルボキシルなどの反応基が、ＰＥＧ鎖の末端ではなく、ＰＥＧの長さに沿って共有結合するペンダント型ＰＥＧ分子を含み得る。ペンダント型の反応基はＰＥＧと直接、又はアルキレン基などのスペーサー部分を介して結合することができる。
【００９０】
上述した形態のＰＥＧに加え、ポリマーはまた、上述のポリマーのいずれかを含め、ポリマー中に１つ又は複数の弱い、又は分解可能な連結を含むように調製することもできる。例えば、ＰＥＧは、加水分解を受けやすいエステル連結をポリマー中に含むように調製することができる。以下に示されるとおり、この加水分解の結果として、ポリマーがより低い分子量の断片に切断される：
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ−＋Ｈ２Ｏ→−ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ＋ＨＯ−ＰＥＧ−
【００９１】
ポリマー骨格内の分解可能な連結として、及び／又はＩＬ−２部分との分解可能な連結として有用な、加水分解により分解可能な他の連結としては、カーボネート連結；例えばアミンとアルデヒドとの反応から得られるイミン連結（例えば、Ｏｕｃｈｉら（１９９７年）Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ  ３８（１）：５８２−３頁を参照）；例えばアルコールをリン酸基と反応させることによって形成されるリン酸エステル連結；典型的にはヒドラジドとアルデヒドとの反応によって形成されるヒドラゾン連結；典型的にはアルデヒドとアルコールとの間の反応によって形成されるアセタール連結；例えばギ酸塩とアルコールとの間の反応によって形成されるオルトエステル連結；例えばＰＥＧなどのポリマーの末端にあるアミン基と別のＰＥＧ鎖のカルボキシル基とによって形成されるアミド連結；例えば末端イソシアネート基を有するＰＥＧとＰＥＧアルコールとの反応から形成されるウレタン連結；ＰＥＧなどのポリマーの末端にあるアミン基とペプチドのカルボキシル基とによって形成されるペプチド連結；及び、例えば、例えばポリマーの末端にあるホスホラミダイト基とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基とによって形成されるオリゴヌクレオチド連結が挙げられる。
【００９２】
コンジュゲートのかかる任意選択の特徴、すなわち、１つ又は複数の分解可能な連結を高分子鎖の中に、又はＩＬ−２部分に対して導入することは、コンジュゲートを投与したときの、その最終的な所望の薬理学的特性に対してさらなる制御をもたらし得る。例えば、大型で比較的不活性なコンジュゲート（すなわち、１つ又は複数の高分子量のＰＥＧ鎖、例えば約１０，０００より大きい分子量を有する１つ又は複数のＰＥＧ鎖がそこに結合しているもの、この場合、コンジュゲートは本質的に生物活性を有しない）が投与されてもよく、これは放出されて、元のＰＥＧ鎖の一部を有する生物活性コンジュゲートを生じる。このようにして、時間の経過に伴うコンジュゲートの生物活性が平衡するように、コンジュゲートの特性をより効果的に調整することができる。
【００９３】
コンジュゲートに関連する水溶性ポリマーはまた、「放出可能」であってもよい。すなわち、水溶性ポリマーは放出され（加水分解、酵素過程、触媒過程又は他の方法のいずれかにより）、それによりコンジュゲート化されていないＩＬ−２部分がもたらされる。ある場合には、放出可能ポリマーは、インビボで、水溶性ポリマーのいかなる断片も残さずＩＬ−２部分から離れる。別の場合には、放出可能ポリマーは、インビボで、水溶性ポリマーからの比較的小さい断片（例えば、コハク酸タグ）を残してＩＬ−２部分から離れる。例示的な開裂可能ポリマーには、カーボネート連結を介してＩＬ−２部分に結合するものが含まれる。
【００９４】
当業者は、前述の非ペプチド性水溶性ポリマーに関する考察が、何ら網羅的なものではなく、単に例示に過ぎず、上記の質を有するあらゆるポリマー材料が企図されることを認識するであろう。本明細書で使用されるとき、用語「ポリマー試薬」は、概して、水溶性ポリマーセグメントと官能基とを含み得る分子全体を指す。
【００９５】
上記のとおり、本発明のコンジュゲートは、ＩＬ−２部分と共有結合した水溶性ポリマーを含む。典型的には、任意の所与のコンジュゲートについて、１〜３個の水溶性ポリマーが、ＩＬ−２活性を有する１つ又は複数の部分と共有結合している。しかしながら、ある場合には、コンジュゲートは、ＩＬ−２部分と個々に結合した１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれ以上の水溶性ポリマーを有し得る。任意の所与の水溶性ポリマーは、ＩＬ−２部分のアミノ酸か、又はＩＬ−２部分が（例えば）糖タンパク質である場合には、ＩＬ−２部分の炭水化物と共有結合し得る。炭水化物との結合は、例えば、シアル酸−アジド化学反応を用いる代謝的官能化（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）［Ｌｕｃｈａｎｓｋｙら（２００４年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３（３８）：１２３５８−１２３６６頁］、又はグリシドールの使用によりアルデヒド基の導入を促進する［Ｈｅｌｄｔら（２００７年）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：５４２９−５４３３頁］などの他の好適な手法を利用して行ってもよい。
【００９６】
ＩＬ−２活性を有する部分とポリマーとの内部の特定の連結は、様々な要因に依存する。かかる要因としては、例えば、用いられる特定の連結の化学的特性、特定のＩＬ−２部分、ＩＬ−２部分内の利用可能な官能基（ポリマーと結合するためのものか、又は好適な結合部位に変換されるためのもの）、ＩＬ−２部分内における別の反応性官能基の存在などが挙げられる。
【００９７】
本発明のコンジュゲートは、必須ではないが、プロドラッグであってもよく、すなわちこれは、ポリマーとＩＬ−２部分との間の連結が放出可能で、それにより親部分を放出できることを意味する。例示的な放出可能な連結としては、カルボン酸エステル、リン酸エステル、チオールエステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチド及びオリゴヌクレオチドが挙げられる。かかる連結は、ＩＬ−２部分（例えば、タンパク質のカルボキシル基Ｃ末端、又はタンパク質中に含まれるセリン又はスレオニンなどのアミノ酸の側鎖ヒドロキシル基、又は炭水化物中の同様の官能基）及び／又はポリマー試薬のいずれかを、当該技術分野で一般的に用いられるカップリング方法を用いて適切に修飾することにより、容易に調製することができる。しかしながら、最も好ましくは、好適に活性化されたポリマーを、ＩＬ−２活性を有する部分中に含まれる修飾されていない官能基と反応させることにより容易に形成される放出可能な連結である。
【００９８】
或いは、加水分解に対して安定な連結、例えば、アミド、ウレタン（カルバメートとしても知られる）、アミン、チオエーテル（スルフィドとしても知られる）、又は尿素（カルバミドとしても知られる）連結もまた、ＩＬ−２部分のカップリング用連結として用いることができる。さらに、加水分解に対して安定な連結としては、アミドが好ましい。一手法では、活性化エステルを有する水溶性ポリマーを、ＩＬ−２部分のアミン基と反応させて、それによりアミド連結を生じさせることができる。
【００９９】
コンジュゲートは（コンジュゲートされていないＩＬ−２部分と対比されるものとして）、測定可能な程度のＩＬ−２活性を有することも、又は有しないこともある。すなわち、本発明に係るポリマー−ＩＬ−２部分コンジュゲートは、修飾されていない親ＩＬ−２部分の約０．１％〜約１００％の範囲の生物活性を有し得る。ある場合には、ポリマー−ＩＬ−２部分コンジュゲートは、修飾されていない親ＩＬ−２部分の１００％より大きい生物活性を有し得る。好ましくは、ＩＬ−２活性をほとんど又は全く有しないコンジュゲートは、ポリマーを部分とつなぐ加水分解可能な連結を含み、そのためコンジュゲート中に活性が欠如している（又は比較的欠如している）こととは関係なしに、加水分解可能な連結が水により誘発されて切断されると、活性な親分子（又はその誘導体）が放出される。かかる活性は、用いられるＩＬ−２活性を有する特定の部分についての既知の活性に応じて、好適なインビボ又はインビトロモデルを用いて測定し得る。
【０１００】
加水分解に対して安定な連結を有し、それがＩＬ−２活性を有する部分をポリマーとカップリングするコンジュゲートについて、このコンジュゲートは、典型的には測定可能な程度の生物活性を有する。例えば、かかるコンジュゲートは、典型的には、コンジュゲートされないＩＬ−２部分の生物活性と比べた以下の割合のうちの１つ又は複数を満足する生物活性を有するものとして特徴付けられる：少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約１００％、及び１０５％超（当該技術分野において周知のものなど、好適なモデルでの測定時）。好ましくは、加水分解に対して安定な連結（例えば、アミド連結）を有するコンジュゲートは、修飾されていない親のＩＬ−２活性を有する部分の生物活性の少なくともある程度を有する。
【０１０１】
ここで、本発明に係る例示的なコンジュゲートを説明する。典型的には、かかるＩＬ−２部分は、配列番号１〜４の少なくとも１つに提供される配列と同様のアミノ酸配列を（少なくとも一部において）共有するものと予想される。従って、配列番号１〜４内の特定の位置又は原子が参照されるものの、そうした参照は便宜上に過ぎず、当業者は、ＩＬ−２活性を有する他の部分における対応する位置又は原子を容易に決定し得る。特に、天然ヒトＩＬ−２に関して本明細書に提供される説明は、多くの場合に、前述のいずれかの断片、欠失変異体、置換変異体又は付加変異体に適用することができる。
【０１０２】
ＩＬ−２部分のアミノ基は、ＩＬ−２部分と水溶性ポリマーとの間の結合点を提供する。配列番号１〜２に提供されるアミノ酸配列を使用すると、コンジュゲートに利用し得るε−アミノ酸を有する数個のリジン残基が各々にあることは明らかである。さらに、いずれのタンパク質のＮ末端アミンもまた、結合点として機能することができる。
【０１０３】
ＩＬ−２部分の利用可能なアミンとの共有結合性の連結を形成するのに有用な好適なポリマー試薬の例は、数多くある。具体例について、対応するコンジュゲートと共に以下の表１に提供する。表中、変数（ｎ）は反復単量体単位の数を表し、「−ＮＨ−（ＩＬ−２）」は、ポリマー試薬とのコンジュゲート形成後のＩＬ−２部分の残基を表す。表１に示される各ポリマー部分［例えば、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ又は（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ］は末端が「ＣＨ３」基であるが、これは他の基（Ｈ及びベンジルなど）に置換されてもよい。
【０１０４】
【表１】
2020097626.tif 000004
【０１０５】
【表２】
2020097626.tif 000005
【０１０６】
【表３】
2020097626.tif 000006
【０１０７】
【表４】
2020097626.tif 000007
【０１０８】
【表５】
2020097626.tif 000008
【０１０９】
【表６】
2020097626.tif 000009
【０１１０】
【表７】
2020097626.tif 000010
【０１１１】
ＩＬ−２部分のアミノ基とのポリマー試薬のコンジュゲート形成は、様々な方法で達成することができる。一手法では、ＩＬ−２部分が、スクシンイミジル誘導体（又は他の活性化エステル基、この場合、そうした代替的な活性化エステル基を含有するポリマー試薬について記載されるものと同様の手法を用いることができる）により官能化されたポリマー試薬とコンジュゲート化され得る。この手法では、スクシンイミジル誘導体を有するポリマーは、ｐＨ７〜９．０の水性媒体中でＩＬ−２部分と結合し得るが、異なる反応条件を用いると（例えば、６〜７などのより低いｐＨ、又は異なる温度及び／又は１５℃未満）、結果としてポリマーは、ＩＬ−２部分の異なる位置に結合し得る。加えて、アミン末端を有する非ペプチド性水溶性ポリマーを、活性なカルボン酸基を有するＩＬ−２部分と反応させることにより、アミド連結を形成することができる。
【０１１２】
例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される
【化３】
2020097626.tif 000011
式中：
（ｎ）は、２〜４０００の値を有する整数であり；
Ｘは、スペーサー部分であり；
Ｒ１は、有機ラジカルであり；及び
ＩＬ−２は、ＩＬ−２部分の残基である。
【０１１３】
例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される：
【化４】
2020097626.tif 000012
式中、（ｎ）は２〜４０００の値を有する整数であり、及びＩＬ−２は、ＩＬ−２部分の残基である。
【０１１４】
ＩＬ−２部分のポリマー試薬とのコンジュゲート化に有用な別の手法としては、還元的アミノ化を用いることによるＩＬ−２部分の第一級アミンの、ケトン、アルデヒド又はその水和物形態（例えば、ケトン水和物、アルデヒド水和物）で官能化されたポリマー試薬とのコンジュゲート化が典型的である。この手法では、ＩＬ−２部分の第一級アミンがアルデヒド又はケトンのカルボニル基（又はそれに対応する水和アルデヒド又はケトンのヒドロキシル含有基）と反応し、それによりシッフ塩基が形成される。ひいては、次にシッフ塩基が、水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を使用することにより安定なコンジュゲートに還元的に変換され得る。特に、ケトン又はα−メチル分枝鎖アルデヒドで官能化されたポリマーを用いると、及び／又は特定の反応条件下（例えば、低いｐＨ）では、選択的な反応（例えば、Ｎ末端における）が可能である。
【０１１５】
水溶性ポリマーが分枝鎖型である本発明の例示的コンジュゲートには、水溶性ポリマーが以下の構造に包含されるものが含まれる：
【化５】
2020097626.tif 000013
式中、各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数である。
【０１１６】
本発明の例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される：
【化６】
2020097626.tif 000014
式中：
各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数であり；
Ｘはスペーサー部分であり；
（ｂ）は、２〜６の値を有する整数であり；
（ｃ）は、２〜６の値を有する整数であり；
Ｒ２は、存在するごとに、独立してＨ又は低級アルキルであり；及び
ＩＬ−２は、ＩＬ−２部分の残基である。
【０１１７】
本発明の例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される：
【化７】
2020097626.tif 000015
式中：
各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数であり；及び
ＩＬ−２は、ＩＬ−２部分の残基である。
【０１１８】
本発明の他の例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される：
【化８】
2020097626.tif 000016
式中：
各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数であり；
（ａ）は、０又は１のいずれかであり；
Ｘは、存在するとき、１つ又は複数の原子を含むスペーサー部分であり；
（ｂ’）は、０又は１〜１０の値を有する整数であり；
（ｃ）は、１〜１０の値を有する整数であり；
Ｒ２は、存在するごとに、独立してＨ又は有機ラジカルであり；
Ｒ３は、存在するごとに、独立してＨ又は有機ラジカルであり；及び
ＩＬ−２は、ＩＬ−２部分の残基である。
【０１１９】
本発明のさらに別の例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される：
【化９】
2020097626.tif 000017
式中：
各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数であり；及び
ＩＬ−２は、ＩＬ−２部分の残基である。
【０１２０】
放出可能な連結を含む例示的コンジュゲートには、ＩＬ−２部分が、以下の式に包含されるポリマー試薬とコンジュゲート化されるものが含まれる：
【化１０】
2020097626.tif 000018
式中：
ＰＯＬＹ１は、第１の水溶性ポリマーであり；
ＰＯＬＹ２は、第２の水溶性ポリマーであり；
Ｘ１は、第１のスペーサー部分であり；
Ｘ２は、第２のスペーサー部分であり；
Ｈαは、イオン化水素原子であり；
Ｒ１は、Ｈ又は有機ラジカルであり；
Ｒ２は、Ｈ又は有機ラジカルであり；
（ａ）は、０又は１のいずれかであり；
（ｂ）は、０又は１のいずれかであり；
Ｒｅ１は、存在するとき、第１の電子改変基であり；
Ｒｅ２は、存在するとき、第２の電子改変基であり；及び
（ＦＧ）は、活性薬剤のアミノ基と反応してカルバメート連結などの放出可能な連結を形成することが可能な官能基である。この式中、さらに確定的な構造を有するポリマー試薬が企図される：
【化１１】
2020097626.tif 000019
式中、ＰＯＬＹ１、ＰＯＬＹ２、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｈα及び（ＦＧ）の各々は、先に定義したとおりであり、及びＲｅ１は第１の電子改変基であり；及びＲｅ２は第２の電子改変基である。
【０１２１】
さらに別の例示的ポリマー試薬は、以下の式に含まれる：
【化１２】
2020097626.tif 000020
【化１３】
2020097626.tif 000021
式中、各構造について、かつ各例において、（ｎ）は、独立して４〜１５００の整数である。
【０１２２】
これらの放出可能な連結を提供するポリマー試薬は、米国特許出願公開第２００６／０２９３４９９号明細書に記載される手順に従い調製することができる。
【０１２３】
放出可能な連結を提供するポリマー試薬を使用して形成される例示的コンジュゲートには、以下の式のものが含まれる：
【化１４】
2020097626.tif 000022
式中：
ＰＯＬＹ１は、第１の水溶性ポリマーであり；
ＰＯＬＹ２は、第２の水溶性ポリマーであり；
Ｘ１は、第１のスペーサー部分であり；
Ｘ２は、第２のスペーサー部分であり；
Ｈαは、イオン化水素原子であり；
Ｒ１は、Ｈ又は有機ラジカルであり；
Ｒ２は、Ｈ又は有機ラジカルであり；
（ａ）は、０又は１のいずれかであり；
（ｂ）は、０又は１のいずれかであり；
Ｒｅ１は、存在するとき、第１の電子改変基であり；
Ｒｅ２は、存在するとき、第２の電子改変基であり；
Ｙ１は、Ｏ又はＳであり；
Ｙ２は、Ｏ又はＳであり；及び
（ＩＬ−２）は、ＩＬ−２部分の残基である。
【０１２４】
例示的コンジュゲートは、以下の構造を有する：
【化１５】
2020097626.tif 000023
【化１６】
2020097626.tif 000024
式中、各構造について、かつ各例において、（ｎ）は、独立して４〜１５００の整数であり、及び（ＩＬ−２）は、ＩＬ−２部分の残基である。
【０１２５】
カルボキシル基は、ＩＬ−２部分における結合点として機能し得る別の官能基を表す。
構造上、コンジュゲートは以下を含み得る：
【化１７】
2020097626.tif 000025
式中、（ＩＬ−２）及び隣接するカルボニル基は、カルボキシル含有ＩＬ−２部分に対応し、Ｘは連結鎖、好ましくはＯ、Ｎ（Ｈ）、及びＳから選択されるヘテロ原子であり、ＰＯＬＹは、場合により末端にエンドキャップ部分を有する、ＰＥＧなどの水溶性ポリマーである。
【０１２６】
Ｃ（Ｏ）−Ｘ連結は、末端官能基を有するポリマー誘導体とカルボキシル含有ＩＬ−２部分との間の反応から得られる。上記に考察されるとおり、具体的な連結は、利用される官能基のタイプに依存し得る。ポリマーがヒドロキシル基で末端官能化又は「活性化」される場合、結果として得られる連結はカルボン酸エステルとなり、ＸはＯとなる。ポリマー骨格がチオール基で官能化される場合、結果として得られる連結はチオエステルとなり、ＸはＳとなる。特定の多腕状、分枝鎖状又はフォーク型ポリマーが用いられると、Ｃ（Ｏ）Ｘ部分、特にＸ部分は比較的複雑となり得るとともに、より長い連結構造を含み得る。
【０１２７】
ヒドラジド部分を含む水溶性誘導体もまた、カルボニル及びカルボン酸におけるコンジュゲート形成に有用である。ＩＬ−２部分がカルボニル部分又はカルボン酸を含まない限りでは、当業者に公知の手法を用いて付加することができる。例えば、カルボニル部分は、カルボン酸（例えば、Ｃ末端カルボン酸）を還元することにより、及び／又はグリコシル化若しくは糖化された（この場合、付加される糖がカルボニル部分を有する）形のＩＬ−２部分を提供することにより、導入することができる。カルボン酸を含有するＩＬ−２部分に関して、ＰＥＧ−ヒドラジン試薬は、カップリング剤（例えば、ＤＣＣ）の存在下に、ＩＬ−２部分と共有結合させることができる［例えば、ｍＰＥＧ−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２＋ＨＯＣ（Ｏ）−（ＩＬ−２）の結果、ｍＰＥＧ−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨＣ（Ｏ）−ＩＬ−２が得られる］。ヒドラジド部分を含有する水溶性誘導体の具体例について、対応するコンジュゲートと共に以下の表２に提供する。加えて、活性化エステルを含有する水溶性ポリマー誘導体をヒドラジン（ＮＨ２−ＮＨ２）又はｔｅｒｔ−カルバジン酸ブチル［ＮＨ２ＮＨＣＯ２Ｃ（ＣＨ３）３］と反応させることにより、活性化エステル（例えば、スクシンイミジル基）を含有する任意の水溶性誘導体を、ヒドラジド部分を含むように変換することができる。表中、変数（ｎ）は反復単量体単位の数を表し、「−Ｃ（Ｏ）−（ＩＬ−２）」は、ポリマー試薬とのコンジュゲート形成後のＩＬ−２部分の残基を表す。場合により、ヒドラゾン連結は、好適な還元剤を用いて還元してもよい。表２に示される各ポリマー部分［例えば、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ又は（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ］は末端が「ＣＨ３」基であるが、これは他の基（Ｈ及びベンジルなど）に置換されてもよい。
【０１２８】
【表８】
2020097626.tif 000026
【０１２９】
ＩＬ−２部分中に含まれるチオール基は、水溶性ポリマーが結合する有効な部位として機能することができる。特に、システイン残基は、ＩＬ−２部分がタンパク質であるとき、チオール基を提供する。次に、かかるシステイン残基のチオール基が、チオール基との反応に特異的な活性化ＰＥＧ、例えば、Ｎ−マレイミジルポリマー又は米国特許第５，７３９，２０８号明細書及び国際公開第０１／６２８２７号パンフレットに記載されるとおりの他の誘導体と反応し得る。加えて、保護基を有するチオールを活性化糖タンパク質のオリゴ糖側鎖に導入し、続いてチオール反応性水溶性ポリマーで脱保護してもよい。
【０１３０】
試薬の具体例について、対応するコンジュゲートと共に以下の表３に提供する。表中、変数（ｎ）は反復単量体単位の数を表し、「−Ｓ−（ＩＬ−２）」は、水溶性ポリマーとのコンジュゲート形成後のＩＬ−２部分残基を表す。表３に示される各ポリマー部分［例えば、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ又は（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ］は末端が「ＣＨ３」基であるが、これは他の基（Ｈ及びベンジルなど）に置換されてもよい。
【０１３１】
例示的ＩＬ−２部分に対応する配列番号１及び２に関して、１２５位にシステイン残基があることが分かる。従って、例示的チオール結合部位は、１２５位に位置するシステインである。所与のＩＬ−２部分に関連するいかなるジスルフィド結合も分断しないことが好ましいが、これらのシステイン残基の１つ又は複数の側鎖中のポリマーを結合して、ある程度の活性を維持することが可能であり得る。加えて、従来の合成技法を用いてシステイン残基をＩＬ−２部分に付加することが可能である。例えば、システイン残基の付加については、国際公開第９０／１２８７４号パンフレットに記載される手順を参照されたく、かかる手順をＩＬ−２部分に適合させ得る。加えて、従来の遺伝子工学方法を用いてシステイン残基をＩＬ−２部分に導入することもできる。しかしながら一部の実施形態では、追加のシステイン残基及び／又はチオール基を導入しないことが好ましい。
【０１３２】
【表９】
2020097626.tif 000027
【０１３３】
【表１０】
2020097626.tif 000028
【０１３４】
１つ又は複数のマレイミド官能基を有する水溶性ポリマーから形成されたコンジュゲートに関して（マレイミドがＩＬ−２部分のアミン基と反応するか、又はチオール基と反応するかにかかわらず）、対応する１つ又は複数のマレアミド酸型の水溶性ポリマーもまたＩＬ−２部分と反応することができる。一定の条件下（例えば、ｐＨ約７〜９且つ水の存在下）では、マレイミド環が「開環」することにより対応するマレアミド酸が形成される。ひいては、マレアミド酸が、ＩＬ−２部分のアミン基又はチオール基と反応し得る。例示的なマレアミド酸ベースの反応が、以下に概略的に示される。ＰＯＬＹは水溶性ポリマーを表し、（ＩＬ−２）はＩＬ−２部分を表す。
【化１８】
2020097626.tif 000029
【０１３５】
本発明に係る代表的なコンジュゲートは、以下の構造を有し得る：
ＰＯＬＹ−Ｌ０，１−Ｃ（Ｏ）Ｚ−Ｙ−Ｓ−Ｓ−（ＩＬ−２）
式中、ＰＯＬＹは水溶性ポリマーであり、Ｌは任意選択のリンカーであり、Ｚは、Ｏ、ＮＨ、及びＳからなる群から選択されるヘテロ原子であり、Ｙは、Ｃ２〜１０アルキル、Ｃ２〜１０置換アルキル、アリール、及び置換アリールからなる群から選択され、（ＩＬ−２）はＩＬ−２部分である。ＩＬ−２部分と反応することができ、結果としてこのタイプのコンジュゲートをもたらすポリマー試薬は、米国特許出願公開第２００５／００１４９０３号明細書に記載されている。
【０１３６】
先に指摘したとおり、水溶性ポリマーが分枝鎖型である本発明の例示的コンジュゲートは、以下の構造を含む分枝鎖型の水溶性ポリマーを有し得る：
【化１９】
2020097626.tif 000030
式中、各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数である。
【０１３７】
分枝鎖型の水溶性ポリマーを有する例示的コンジュゲートは、以下の試薬を用いて調製することができ：
【化２０】
2020097626.tif 000031
これにより、以下の構造を有するコンジュゲートが形成される：
【化２１】
2020097626.tif 000032
式中：
（各構造について）各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数であり；及び
ＩＬ−２は、ＩＬ−２部分の残基である。
【０１３８】
さらなる例示的コンジュゲートは、以下の試薬を用いて形成することができ：
【化２２】
2020097626.tif 000033
これにより、以下の構造を有するコンジュゲートが形成される：
【化２３】
2020097626.tif 000034
式中：
（各構造について）（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数であり；及び
ＩＬ−２は、ＩＬ−２部分の残基である。
【０１３９】
コンジュゲートは、チオール選択的ポリマー試薬を使用して様々な方法で形成することができ、本発明はこの点について限定されない。例えば、ＩＬ−２部分−場合により好適な緩衝液（必要であれば、アミンを含有する緩衝液を含む）中にあるもの−がｐＨ約７〜８の水性媒体に入れられ、チオール選択的ポリマー試薬がモル過剰で添加される。そのまま反応を約０．５〜２時間にわたり進め、但し、ペグ化の収率が比較的低いと判断される場合、２時間より長い（例えば、５時間、１０時間、１２時間、及び２４時間の）反応時間が有用であり得る。この手法で使用することのできる例示的なポリマー試薬は、マレイミド、スルホン（例えば、ビニルスルホン）、及びチオール（例えば、オルトピリジニル又は「ＯＰＳＳ」などの官能性チオール）からなる群から選択される反応基を有するポリマー試薬である。
【０１４０】
ポリマー試薬に関して、本明細書及びその他に記載されるものは、商業的な供給業者から購入するか、又は市販の出発物質から調製することができる。加えて、ポリマー試薬の調製方法は、文献中に記載がある。
【０１４１】
ＩＬ−２部分と非ペプチド性水溶性ポリマーとの結合は直接であってもよく、この場合、ＩＬ−２部分とポリマーとの間に介在する原子は存在せず、又は結合は間接的であってもよく、この場合、ＩＬ−２部分とポリマーとの間に１個又は複数の原子が位置する。間接的な結合に関して、「スペーサー部分」が、ＩＬ−２部分の残基と水溶性ポリマーとの間のリンカーとして機能する。スペーサー部分を構成する１個又は複数の原子としては、炭素原子、窒素原子、硫黄原子、酸素原子、及びそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を挙げることができる。スペーサー部分は、アミド、第二級アミン、カルバメート、チオエーテル、及び／又はジスルフィド基を含むことができる。具体的なスペーサー部分の非限定的な例としては、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−［ＣＨ２］ｈ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、二価シクロアルキル基、−Ｏ−、−Ｓ−、アミノ酸、−Ｎ（Ｒ６）−、及び前述のいずれかの２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられ、式中、Ｒ６は、Ｈか、又は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール及び置換アリールからなる群から選択される有機ラジカルであり、（ｈ）は０〜６であり、（ｊ）は０〜２０である。他の具体的なスペーサー部分は以下の構造を有する：−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、及び−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、式中、各メチレンの後ろの添え字の値は構造中に含まれるメチレンの数を示し、例えば、（ＣＨ２）１〜６は、その構造が、１、２、３、４、５又は６個のメチレンを含み得ることを意味する。加えて、上記のスペーサー部分のいずれも、１〜２０個のエチレンオキシド単量体単位［すなわち、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜２０］を含むエチレンオキシドオリゴマー鎖をさらに含み得る。すなわち、エチレンオキシドオリゴマー鎖は、スペーサー部分の前にも、又は後ろにも、及び場合によっては２個以上の原子を含むスペーサー部分の任意の２個の原子間に、存在することができる。また、オリゴマー鎖は、オリゴマーがポリマーセグメントに隣接し、単にポリマーセグメントの延長部に相当するに過ぎないならば、スペーサー部分の一部とは見なされない。
【０１４２】
組成物
コンジュゲートは、典型的には組成物の一部である。概して、組成物は複数のコンジュゲートを含み、必須ではないが、好ましくは各コンジュゲートは同じＩＬ−２部分を含む（すなわち、組成物全体のなかに、ただ１つのタイプのＩＬ−２部分が存在する）。加えて、組成物は、任意の所与のコンジュゲートが２つ以上の異なるＩＬ−２部分からなる群から選択されるある部分を含む複数のコンジュゲートを含み得る（すなわち、組成物全体のなかに、２つ以上の異なるＩＬ−２部分が存在する）。しかしながら、最適には、組成物中の実質的に全てのコンジュゲート（例えば、組成物中の複数のコンジュゲートのうちの８５％以上）が、各々、同じＩＬ−２部分を含む。
【０１４３】
組成物は、単一のコンジュゲート種（例えば、単一のポリマーが、組成物中の実質的に全てのコンジュゲートについて同じ位置で結合するモノペグ化コンジュゲート）か、又はコンジュゲート種の混合物（例えば、ポリマーの結合が異なる部位で起こるモノペグ化コンジュゲートの混合物、及び／又は、モノペグ化、ジペグ化及びトリペグ化コンジュゲートの混合物）を含み得る。組成物はまた、４、５、６、７、８個又はそれ以上のポリマーが、ＩＬ−２活性を有する任意の所与の部分と結合している他のコンジュゲートも含み得る。加えて、本発明は、組成物が複数のコンジュゲートを含み、各コンジュゲートが、１個のＩＬ−２部分と共有結合した１個の水溶性ポリマーを含む場合、並びに１個のＩＬ−２部分と共有結合した２、３、４、５、６、７、８個、又はそれ以上の水溶性ポリマーを含む組成物も含む。
【０１４４】
組成物中のコンジュゲートに関して、組成物は、以下の特性のうちの１つ又は複数を満足し、すなわち、組成物中のコンジュゲートの少なくとも約８５％が、ＩＬ−２部分と結合した１〜４個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約８５％が、ＩＬ−２部分と結合した１〜３個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約８５％が、ＩＬ−２部分と結合した１〜２個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約８５％が、ＩＬ−２部分と結合した１個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９５％が、ＩＬ−２部分と結合した１〜５個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９５％が、ＩＬ−２部分と結合した１〜４個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９５％が、ＩＬ−２部分と結合した１〜３個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９５％が、ＩＬ−２部分と結合した１〜２個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９５％が、ＩＬ−２部分と結合した１個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９９％が、ＩＬ−２部分と結合した１〜５個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９９％が、ＩＬ−２部分と結合した１〜４個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９９％が、ＩＬ−２部分と結合した１〜３個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９９％が、ＩＬ−２部分と結合した１〜２個のポリマーを有する；及び組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９９％が、ＩＬ−２部分と結合した１個のポリマーを有する。例えば「ｘ〜ｙ個のポリマー」としてポリマーの範囲を参照するときは、ポリマーの数が、端点を含めてｘ〜ｙであることを意図している（すなわち、例えば「１〜３個のポリマー」は、１個のポリマー、２個のポリマー及び３個のポリマーを意図し、「１〜２個のポリマー」は１個のポリマー及び２個のポリマーを意図する等）ことが理解される。
【０１４５】
１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートを含む組成物は、アルブミンを含まないか、又は実質的に含まないことが好ましい。また、組成物は、ＩＬ−２活性を有しないタンパク質を含まないか、又は実質的に含まないことも好ましい。従って、組成物は、８５％、より好ましくは９５％、最も好ましくは９９％がアルブミンを含まないことが好ましい。加えて、組成物は、８５％、より好ましくは９５％、最も好ましくは９９％が、ＩＬ−２活性を有しないいかなるタンパク質も含まないことが好ましい。組成物中にアルブミンが存在する限りにおいて、本発明の例示的組成物は、ＩＬ−２部分の残基をアルブミンと連結するポリ（エチレングリコール）ポリマーを含むコンジュゲートを実質的に含まない。
【０１４６】
アルデスロイキンのＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ブランド（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡから入手可能）では、ＩＬ−２は、ドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ」）と組み合わせて提供される。対照的に、本発明の組成物は、有利にはＳＤＳが不要であってよく、ＳＤＳ並びに一般的に界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ  ２０及びＴｗｅｅｎ  ８０）を含まない（又は実質的に含まない）。結果的に、本発明の組成物及びコンジュゲートは、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ  ２０、及びＴｗｅｅｎ  ８０を添加するステップを実施することなく調製することができる。加えて、本発明の組成物及びコンジュゲートは、界面活性剤又は他の賦形剤を添加するステップを実施することなく調製することができる。さらに、本発明の組成物は、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ２０、及びＴｗｅｅｎ８０などの界面活性剤を含まない又は実質的に含まない（例えば、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、さらにより好ましくは約１０％未満、さらになおより好ましくは約９％未満、さらになおより好ましくは約８％未満、さらになおより好ましくは約７％未満、さらになおより好ましくは約６％未満、さらになおより好ましくは約５％未満、さらになおより好ましくは約４％未満、さらになおより好ましくは約３％未満、さらになおより好ましくは約２％未満、さらになおより好ましくは約１％未満、さらになおより好ましくは約０．５％未満であり、０．００１％未満が最も好ましい）。加えて、本発明の組成物及びコンジュゲートは、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ  ２０、及びＴｗｅｅｎ  ８０などの界面活性剤を（例えば限外ろ過により）除去するステップを実施することなく調製することができる。さらに、本発明の組成物及びコンジュゲートは、界面活性剤を（例えば限外ろ過により）除去するステップを実施することなく調製することができる。
【０１４７】
任意の所与の部分に対するポリマーの所望の数の制御は、適切なポリマー試薬、ポリマー試薬のＩＬ−２部分に対する比、温度、ｐＨ条件、及びコンジュゲート形成反応の他の側面を選択することにより実現することができる。加えて、精製手段により、望ましくないコンジュゲート（例えば、４個以上のポリマーが結合したコンジュゲート）の低減又は除去を実現することができる。
【０１４８】
例えば、ポリマー−ＩＬ−２部分コンジュゲートを精製して、異なるコンジュゲート化種を得る／単離することができる。具体的には、生成混合物を精製して、各ＩＬ−２部分につき平均１、２、３、４、５個又はそれ以上の範囲のＰＥＧ、典型的には、各ＩＬ−２部分につき１、２又は３個のＰＥＧを得ることができる。最終的なコンジュゲート反応混合物の精製方針は、例えば、用いられるポリマー試薬の分子量、特定のＩＬ−２部分、所望の投薬レジメン、１つ又は複数のコンジュゲートの個々の残基活性及びインビボ特性を含め、様々な要因に依存し得る。
【０１４９】
必要であれば、ゲルろ過クロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーを用いて分子量が異なるコンジュゲートを単離することができる。すなわち、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いると、その分子量の違いに基づき（この違いは、本質的に水溶性ポリマー分の平均分子量に対応する）、ポリマー−対−ＩＬ−２部分の比の大きさが異なるもの（例えば、１ｍｅｒ、２ｍｅｒ、３ｍｅｒなど、ここで「１ｍｅｒ」は、１ポリマー対ＩＬ−２部分を示し、「２ｍｅｒ」は、２ポリマー対ＩＬ−２部分を示す等）が分画される。例えば、３５，０００ダルトンのタンパク質が、約２０，０００ダルトンの分子量のポリマー試薬に対してランダムにコンジュゲート化される例示的反応では、結果として得られる反応混合物は、非修飾タンパク質（分子量約３５，０００ダルトン）、モノペグ化タンパク質（分子量約５５，０００ダルトン）、ジペグ化タンパク質（分子量約７５，０００ダルトン）などを含み得る。
【０１５０】
この手法を用いることで、異なる分子量を有するＰＥＧと他のポリマー−ＩＬ−２部分コンジュゲートとを分離することはできるが、概してこの手法は、ＩＬ−２部分中のポリマー結合部位が異なる位置アイソフォームの分離には役立たない。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いると、ＰＥＧ  １ｍｅｒ、２ｍｅｒ、３ｍｅｒなどの混合物を互いに分離することはできるが、回収したコンジュゲート組成物の各々は、ＩＬ−２部分中の異なる反応基（例えば、リジン残基）に結合した１つ又は複数のＰＥＧを含み得る。
【０１５１】
このタイプの分離を行うのに好適なゲルろ過カラムとしては、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能なＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）カラム及びＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）カラムが挙げられる。特定のカラムの選択は、望ましい所望の分画範囲に依存し得る。溶出は、概して、リン酸、酢酸などの好適な緩衝液を使用して行われる。収集された画分は、例えば、（ｉ）タンパク質含量についての２８０ｎｍの吸光度、（ｉｉ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として使用する色素ベースのタンパク質分析、（ｉｉｉ）ＰＥＧ含量についてのヨウ素試験（Ｓｉｍｓら（１９８０年）Ａｎａｌ．ＢｉｏＩＬ−２ｍ、１０７：６０−６３頁）、（ｉｖ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）と、続くヨウ化バリウムによる染色、及び（ｖ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など、様々な異なる方法により分析され得る。
【０１５２】
位置アイソフォームの分離は、好適なカラム（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又はＶｙｄａｃなどの企業から市販されているＣ１８カラム又はＣ３カラム）を使用した逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いる逆相クロマトグラフィーによるか、又はイオン交換カラム、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）イオン交換カラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーにより行われる。いずれの手法を用いても、同じ分子量を有するポリマー−活性薬剤の異性体（すなわち、位置アイソフォーム）を分離することができる。
【０１５３】
組成物は、好ましくはＩＬ−２活性を有しないタンパク質を実質的に含まない。加えて、組成物は、好ましくは他のいかなる非共有結合性の水溶性ポリマーも実質的に含まない。しかしながら、ある状況下では、組成物は、ポリマー−ＩＬ−２部分コンジュゲートと非コンジュゲート化ＩＬ−２部分との混合物を含み得る。
【０１５４】
場合により、本発明の組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む。必要であれば、薬学的に許容可能な賦形剤はコンジュゲートに添加され、組成物を形成することができる。
【０１５５】
例示的な賦形剤としては、限定なしに、炭水化物、無機塩類、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基、アミノ酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられる。
【０１５６】
糖、誘導体化された糖、例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化された糖、及び／又は糖ポリマーなどの炭水化物が、賦形剤として存在し得る。具体的な炭水化物賦形剤としては、例えば：フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖類；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどの多糖類；及びマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトール、シクロデキストリンなどのアルジトールが挙げられる。
【０１５７】
賦形剤としてはまた、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせなどの無機塩又は緩衝剤も挙げることができる。
【０１５８】
組成物はまた、微生物の繁殖を防止又は抑止するための抗菌剤も含むことができる。本発明の１つ又は複数の実施形態に好適な抗菌剤の非限定的な例としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメルソール（ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１５９】
抗酸化剤も同様に組成物中に存在し得る。抗酸化剤を使用すると酸化が防止され、それによりコンジュゲート又は調製物の他の構成成分の劣化が防止される。本発明の１つ又は複数の実施形態での使用に好適な抗酸化剤としては、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、スルホキシル酸ナトリウムホルムアルデヒド、メタ重亜硫酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１６０】
賦形剤として界面活性剤が存在してもよい。例示的な界面活性剤としては、「Ｔｗｅｅｎ  ２０」及び「Ｔｗｅｅｎ  ８０」などのポリソルベート、並びにＦ６８及びＦ８８（双方とも、ＢＡＳＦ、Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙから入手可能）などのプルロニック；ソルビタンエステル；レシチン及び他のホスファチジルコリンなどのリン脂質、ホスファチジルエタノールアミン（但し、リポソーム形態ではないことが好ましい）、脂肪酸、並びに脂肪酸エステルなどの脂質；コレステロールなどのステロイド；並びにＥＤＴＡ、亜鉛及び他のかかる好適な陽イオンなどのＩＬ−２レーティング（ＩＬ−２ｌａｔｉｎｇ）剤が挙げられる。
【０１６１】
酸又は塩基が組成物中に賦形剤として存在してもよい。使用することのできる酸の非限定的な例としては、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される酸が挙げられる。好適な塩基の例としては、限定なしに、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される塩基が挙げられる。
【０１６２】
１つ又は複数のアミノ酸は、本明細書に記載される組成物中に賦形剤として存在することができる。この関連における例示的なアミノ酸としては、アルギニン、リジン及びグリシンが挙げられる。
【０１６３】
組成物中のコンジュゲート（すなわち、活性薬剤とポリマー試薬との間で形成されるコンジュゲート）の量は、様々な要因によって異なり得るが、最適には、組成物が単位用量容器（例えば、バイアル）に保存されるとき、治療上有効な用量であり得る。加えて、医薬調製物はシリンジに収容されてもよい。治療上有効な用量は、どの量が臨床的に望ましいエンドポイントを生じるかを判断するために、コンジュゲートの量を漸増させながら反復投与することにより実験的に決定することができる。
【０１６４】
組成物中の任意の個別の賦形剤の量は、賦形剤の活性及び組成物の特定の必要性によって異なり得る。典型的には、任意の個別の賦形剤についての最適量の決定は、ルーチンの実験を通じて、すなわち、様々な量の賦形剤（低量から高量までの範囲にわたる）を含む組成物を調製して安定性及び他のパラメータを調べ、次にどの時点で有意な副作用なしに最適な効果が得られるかを決定することにより行われる。
【０１６５】
しかしながら、概して賦形剤は組成物中に約１％〜約９９重量％、好ましくは約５％〜約９８重量％、より好ましくは約１５〜約９５重量％の賦形剤の量で存在し、濃度は３０重量％未満が最も好ましい。
【０１６６】
これらの前述の医薬賦形剤は、他の賦形剤と共に、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第１９版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ、（１９９５年）、「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」、第５２版、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ、Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ（１９９８年）、及びＫｉｂｂｅ，Ａ．Ｈ．、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、第３版、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、２０００年に記載されている。
【０１６７】
組成物は、あらゆるタイプの製剤、特に注射に適したもの、例えば、再構成することのできる粉末又は親液体並びに液体を包含する。固形組成物の注射前の再構成に好適な希釈剤の例としては、注射用静菌水、水中のデキストロース５％、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、生理食塩水、滅菌水、脱イオン水、及びそれらの組み合わせが挙げられる。液状の医薬組成物に関しては、溶液及び懸濁液が想定される。
【０１６８】
本発明の１つ又は複数の実施形態の組成物は、必須ではないが、典型的には注射により投与され、従って投与直前には概して液状の溶液又は懸濁液である。医薬調製物はまた、シロップ、クリーム、軟膏、錠剤、粉末などの他の形態をとることもできる。他の投与方法には、肺内、直腸、経皮、経粘膜、経口、髄腔内、腫瘍内、腫瘍周囲、腹腔内、皮下、動脈内なども含まれる。
【０１６９】
本発明はまた、本明細書に提供されるとおりのコンジュゲートを、コンジュゲートによる治療に反応性を有する病態を患う患者に対して投与する方法も提供する。この方法は、患者に対し、概して注射により、治療上有効量のコンジュゲート（好ましくは医薬組成物の一部として提供されるもの）を投与することを含む。先述のとおり、コンジュゲートは、注射（例えば、筋肉内、皮下及び非経口）することができる。非経口投与に好適な製剤タイプとしては、特に、即時注射用溶液、使用前に溶媒と混和する乾燥粉末、即時注射用懸濁液、使用前に媒剤と混和する不溶性の乾燥組成物、並びに投与前に希釈する乳剤及び液状濃縮物が挙げられる。
【０１７０】
コンジュゲートを投与する方法は（好ましくは医薬組成物の一部として提供する）、場合により、コンジュゲートを特定の範囲に局在させるように実施することができる。例えば、コンジュゲートを含む液体、ゲル及び固形製剤を、罹患範囲（腫瘍内、腫瘍の近傍、炎症範囲内、及び炎症範囲の近傍など）に外科的に植え込んでもよい。好都合には、臓器及び組織はまた、所望の位置がコンジュゲートに対してより良好に曝露されることを確実にするため、画像化され得る。
【０１７１】
このような投与方法を用いて、コンジュゲートの投与により治癒又は予防することのできる任意の病態が治療され得る。当業者は、具体的なコンジュゲートがどの病態を有効に治療することができるのかを理解する。例えば、コンジュゲートを単独で、又は他の薬物療法との組み合わせで用いて、腎細胞癌、転移性黒色腫、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、若年性関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、乳癌及び膀胱癌からなる群から選択される疾患に罹患している患者を治療することができる。有利には、コンジュゲートは、別の活性薬剤の投与より前に、その投与と同時に、又はその投与後に患者に投与することができる。
【０１７２】
実際の投与用量は、被験体の年齢、体重、及び全般的な状態、並びに治療対象となる病態の重症度、医療従事者の判断、及び投与されるコンジュゲートによって異なり得る。治療上の有効量は当業者には公知であり、及び／又は関連する参照テキスト及び文献に記載されている。概して、治療上の有効量は約０．００１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲、好ましくは０．０１ｍｇ／日〜７５ｍｇ／日の用量、より好ましくは０．１０ｍｇ／日〜５０ｍｇ／日の用量であり得る。所与の用量は、例えば、有機リン剤中毒の症状が軽減され、及び／又は完全になくなるまで定期的に投与され得る。
【０１７３】
単位投薬量の任意の所与のコンジュゲート（ここでも、好ましくは医薬調製物の一部として提供されるもの）は、臨床医の判断、患者の必要性などに応じて様々な投薬スケジュールで投与することができる。具体的な投薬スケジュールは、当業者には周知であるか、又はルーチンの方法を用いて実験的に決定することができる。例示的な投薬スケジュールとしては、限定なしに、１日１回、週３回、週２回、週１回、月２回、月１回、及びそれらの任意の組み合わせの投与が挙げられる。臨床的なエンドポイントが達成されると、組成物の投薬は中止される。
【０１７４】
本発明は、その好ましい具体的な実施形態に関連して説明されているが、前述の説明並びに以下の実施例は例示を目的としており、本発明の範囲を限定する意図はないことが理解されるべきである。本発明の範囲内における他の態様、利点及び変更は、本発明の係る当該技術分野の当業者には明らかであろう。
【０１７５】
本明細書で参照される論文、著作、特許及び他の刊行物は全て、全体として参照により本明細書に援用される。
【実施例】
【０１７６】
本発明の実施には、特に指示されない限り、有機合成、生化学、タンパク質精製などの従来技術が用いられ、それらは当該技術分野の範囲内である。かかる方法は文献中に詳しく説明されている。例えば、Ｊ．Ｍａｒｃｈ、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、第４版（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９２年）、上記を参照のこと。
【０１７７】
以下の実施例では、使用される数（例えば、量、温度等）に関する正確性を確保するように努めたが、いくらかの実験誤差及び偏差は考慮しなければならない。特に指示がない限り、温度は摂氏温度であり、圧力は海上気圧又はその近傍におけるものである。以下の例の各々は、当業者が本明細書に記載される実施形態の１つ又は複数を実行するための教示と見なされる。
【０１７８】
本実施例で使用するため、成熟タンパク質配列である配列番号３のアミノ酸配列に対応する組換えＩＬ−２（「ｒＩＬ−２」）を含む水溶液（「ストック溶液」）を、Ｍｙｏｄｅｒｍ（Ｎｏｒｒｉｓｔｏｗｎ  ＰＡ）から入手し、又は実施例１に従い調製した。ストック溶液の濃度は、１〜１００ｍｇ／ｍＬの間で異なった。
【０１７９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
試料は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮｕＰＡＧＥシステム及びＮｏｖｅｘ  ４〜１０％ビス−トリスプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。製造者が記載するとおり試料を調製し、ゲルに負荷し、電気泳動法を実施した。
【０１８０】
陽イオン交換クロマトグラフィー
ベッドボリュームが約１００ｍｌのＳＰ−ＨＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）陽イオン交換カラム（ｃａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｌｕｍｎ）を、標準方法を用いて調製した。カラムをＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ．Ｇｉｌｅｓ，ＵＫ）ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００に接続し、調製したＰＥＧ−ｒＩＬ−２コンジュゲートを精製した。精製過程の詳細は以下に記載する。
【０１８１】
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析
Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）１１００  ＨＰＬＣシステムで逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析を実施した。試料は、Ｓｉｌｖｅｒｔｏｎ（日本）Ｉｎｔｒａｄａ  ＷＰ−ＲＰカラム（３ｕｍ粒度、２．１×１５０ｍｍ）を使用して分析した。カラムの流量は０．５ｍｌ／分であった。移動相は水中０．０９％ＴＦＡ（溶媒Ａ）及びアセトニトリル中０．０４％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）であった。
【０１８２】
実施例１
ＩＬ−２遺伝子のクローニング及びｒＩＬ−２の発現
ヒトＩＬ−２  ｃＤＮＡ配列は、生物ごとにコドン使用頻度が大きく異なるため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核生物では最適に発現しないこともある。既存のヒト由来ｃＤＮＡ配列に対して点突然変異を多数行って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン使用頻度を最大化する代わりに、ＰＣＲ技法を用いて遺伝子を完全に合成した。
【０１８３】
オーバーラッププライマーから遺伝子を合成する方法は、本質的に２つの方法の組み合わせに少し改良を加えたものであった。各個別の方法の基本的な考察は、Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２（７）：ｅ５９及びＤｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６５：１３−２２に提供される。簡潔に言えば、ＤＮＡ配列を、いくつかを除いては３５ｂｐ未満のフォワード及びリバースオリゴヌクレオチドに分割し、オリゴヌクレオチド間にギャップはなかった。各オリゴヌクレオチドは、隣接する２つが、３’末端で少なくとも１０ヌクレオチド及び５’末端で少なくとも１５ヌクレオチドだけ、対向するストランドに重なり合った。二重非対称ＰＣＲを用いて遺伝子の部分断片を構築し、それらをオーバーラップ伸長ＰＣＲを用いて組み合わせ、遺伝子全体を構築した。次に、Ｙｏｕｎｇらによって記載されるとおり、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ選択ステップを用いてミスマッチ二重鎖を取り除いた。Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２（７）：ｅ５９を参照のこと。遺伝子末端に制限酵素部位を含め、最終的な遺伝子断片を市販の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）用発現ベクターにクローニングした。ＤＮＡ配列解析を用いて、図１及び配列番号５に示されるとおり得られた配列を確認した。
【０１８４】
この手法を用いると、このアミノ酸配列では、天然の成熟ヒト配列と比較したときアミノ酸位置１位（アラニン）が除外され、及び示されるとおりの配列についてアミノ酸位置１２５位にＣ→Ｓアミノ酸突然変異が含まれる。この配列の１番目のアミノ酸は、直接的な細菌発現のメチオニンである（コードされるシグナルペプチドがない）。しかしながら発現時、最初のメチオニンは宿主のメチオニンアミノペプチダーゼによって取り除かれる。
【０１８５】
遺伝子をｐＥＴ（Ｔ７）発現ベクターの一つにクローニングした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）でタンパク質を発現させ、株の一つを典型的にはＴ７発現系に使用した。この発現系は市販されており、発現させる方法は、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙから利用可能である。この系の使用は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙのリサーチライセンスに基づき行った。ベクターにより、タンパク質が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の封入体として発現した。発現に用いられる典型的な配合は、文献中、及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｕｔｏ−Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｓｈａｋｉｎｇ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｓｔｕｄｉｅｒ著，Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｐｔｏｎ，ＮＹ  １１９７３（２００７年１２月２０日）に見出すことができる。
【０１８６】
発酵後、遠心することにより細胞を回収した。さらにホモジナイズするため、細胞マスペレットを−８０℃で保存した。凍結した細胞マスペレットを、細胞洗浄緩衝液（５０ｍＭトリス、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に１０％（Ｗ／Ｖ）の濃度となるよう再懸濁し、１３８６０×ｇで３０分間遠心した。上清を廃棄した。洗浄したペレットをホモジナイゼーション緩衝液（５０ｍＭトリス、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、１回のパスについて４〜１５℃でＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡからのＭ−１１０Ｐ）によりホモジナイズした。ホモジネートを細胞洗浄緩衝液（５０ｍＭトリス、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で２倍希釈し、１３８６０×ｇで６０分間遠心した。上清を廃棄した。封入体ペレットを、逐次的に、５０ｍＭトリス、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８．０；５０ｍＭトリス、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％デオキシコール酸ナトリウム、ｐＨ８．０；及び５０ｍＭトリス、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０の緩衝液を使用して、３段階で洗浄した。洗浄後、粗ＩＬ−２封入体が得られた。
【０１８７】
粗ＩＬ−２封入体を、６Ｍグアニジン、１００ｍＭトリス、ｐＨ８の緩衝液に溶解した。ＥＤＴＡを添加して最終濃度を２ｍＭにした。次にジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加して最終濃度を５０ｍＭにした。混合物を５０℃で３０分間インキュベートした。還元後、混合物に水を添加してグアニジン濃度を４．８に低下させた。１３８６０×ｇで１時間遠心した後、得られたゲル様ペレットを廃棄した。水を添加することにより、上清のグアニジン濃度をさらに３．５Ｍまで低下させた。１００％酢酸の滴定でｐＨを５に調整した。混合物を室温で６０分間インキュベートし、１３８６０×ｇで１時間遠心した。得られたペレットを、３．５Ｍグアニジン、２０ｍＭ酢酸塩、５ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ５の緩衝液に懸濁し、１３８６０×ｇで１時間遠心した。この洗浄ステップをもう１回繰り返した。
【０１８８】
清浄な還元したＩＬ−２封入体を、６Ｍグアニジン、１００ｍＭトリス、ｐＨ８の緩衝液に溶解した。１００ｍＭ  ＣｕＣｌ２ストックを添加して最終的なＣｕ２＋濃度を０．１ｍＭとした。混合物を４℃で一晩インキュベートした。
【０１８９】
本発明の別の実施形態は、タンパク質に三次構造をとらせる改良方法に関する。これに関連して、これまでの方法は多くの場合に段階希釈に頼るが、これはタンパク質にとって過酷であることが多い。従って、より穏やかな条件下でタンパク質のフォールディングを可能にする改良手法では、ある方法が提供され、この方法は、発現したタンパク質（例えば、本実施例に従い調製されたＩＬ−２などのＩＬ−２部分）を、発現したタンパク質のサイズより小さい孔径の透析バッグの中に入れるステップと、タンパク質変性剤不含溶液（例えば水）を（好ましくは数時間かけて、例えば６時間かけて、より好ましくは１０時間かけて、及びさらにより好ましくは１５時間かけて）添加するステップとを含む。例示的なタンパク質変性剤不含溶液を当業者は認識し、例えば、グアニジン、尿素、過塩素酸リチウム、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール及び界面活性剤を欠いている（又は実質的に欠いている）溶液（例えば、緩衝液及び水）が挙げられる。従って、この方法において、発現したＩＬ−２溶液は透析バッグ（分子量孔径が３．５キロダルトン）に入れた。透析バッグは、４．８Ｍグアニジン、０．１Ｍトリス、ｐＨ８の緩衝液が入ったリザーバに入れた。３時間平衡化させた後、リザーバのグアニジン濃度を、１５時間の時間をかけて水をリザーバに圧送することにより、２Ｍまで徐々に低下させた。リフォールディング過程の全体を、４℃で完了させた。リフォールディングされたＩＬ−２をＳＥＣ−ＨＰＬＣで確認した。
【０１９０】
リフォールディングされたＩＬ−２を１３８６０×ｇで６０分間遠心し、沈殿物を除去した。上清を、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ＴＦＦ膜システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）で濃縮した。
【０１９１】
リフォールディングして濃縮したＩＬ−２を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００  ＨＲ樹脂が詰められたＢＰＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ  Ｓｗｅｄｅｎ）に負荷した。流動緩衝液は、２Ｍグアニジン、２０ｍＭトリス、ｐＨ８であり、及び流量は２５ｍＬ／分であった。ＩＬ−２単量体ピーク下の画分をプールした。イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣクロマトグラフィー）などの、他の好適な精製方法もまた用い得ることに留意しなければならない。
【０１９２】
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ＴＦＦ膜システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を使用して、４℃及び３０〜４０ｐｓｉの動作圧でＩＬ−２単量体画分プールを約１〜２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。濃縮したＩＬ−２単量体溶液を最終配合緩衝液（１０ｍＭ酢酸Ｎａ、５％トレハロース、ｐＨ４．５）に透析し、配合緩衝液を数回交換することにより（通常は４〜５回）、グアニジン濃度を０．１ｍＭ未満に降下させた。配合されたＩＬ−２溶液を０．２２ｕｍフィルタに通すことにより無菌にし、以降の使用のため−８０℃で保存した。
【０１９３】
実施例２
ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳによるｒＩＬ−２のペグ化
【化２４】
2020097626.tif 000035
ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｏｍｃ−２０Ｋ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体、２０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳ」）
アルゴン下に−８０℃で保存したｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳを、窒素パージ下で周囲温度に加温した。ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳのストック溶液（２００ｍＧ／ｍＬ）を２ｍＭのＨＣｌ中に調製し、ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳを、ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳ対ｒＩＬ−２のモル比が１００：１に達するのに十分な量でｒＩＬ−２に添加した。混合物中のｒＩＬ−２の最終濃度は０．５ｍＧ／ｍＬ（０．０３５ｍＭ）であった。重炭酸ナトリウム緩衝液（１Ｍ、ｐＨ９．０）を混合物に添加して最終濃度を２０ｍＭとし、コンジュゲート形成を３０分間進行させると、［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］コンジュゲートが提供された。３０分後、反応混合物に１Ｍグリシン（ｐＨ６．０）を添加することによりクエンチングを達成し、最終濃度を１００ｍＭとした。次にクエンチした反応混合物を、０．５ｍＳ／ｃｍ（２５℃）未満の伝導度となるようにＨ２Ｏで希釈した。氷酢酸を使用してｐＨを４．０に調整した後、カラムクロマトグラフィー精製した。
【０１９４】
［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の典型的な陽イオン交換クロマトグラフィー精製プロファイルを、図２．１に提供する。［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］及び未反応のＰＥＧが示され、線は、様々な波長（例えば、２８０ｎｍ及び２２５ｎｍ）における吸光度に対応する。逆相ＨＰＬＣ分析による［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の純度分析から、２８０ｎｍで１００％の精製コンジュゲートの純度が検出された。図２．２を参照のこと。純度は、２０μｇの精製ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］でのクマシーブルー染色を伴う４〜１２％ＮｕＰａｇｅビス−トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ゲルは示さず）により決定するとき、９５％以上であった。見かけ上大きい、２００ｋＤａ超の分子量のコンジュゲートは、ＰＥＧ水和度が高く、その結果水力学的半が比較的大きくなることに起因して、ゲルを通じるコンジュゲートの移動度が低い結果であると考えられた。これらの試験から、３つのコンジュゲートの生成が確認された：４ｍｅｒ、３ｍｅｒ、２ｍｅｒ及び１ｍｅｒ、すなわち、４ｍｅｒについては４つの「［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］」が単一の「［ｒＩＬ−２］」に結合し、３ｍｅｒについては３つの「［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］」が単一の「［ｒＩＬ−２］」に結合し、２ｍｅｒについては２つの「［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］」が単一の［ｒＩＬ−２］に結合し、及び１ｍｅｒについては１つの「［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］」が単一の［ｒＩＬ−２］に結合する［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］。
【０１９５】
逆相ＨＰＬＣによって種の変化を検出することにより、ｒＩＬ−２を遊離する［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の放出可能な性質が示された。簡潔に言えば、精製［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］を、１００ｍＭのＮａＨＣＯ３溶液中、ｐＨ９．０、３７℃で数時間インキュベートした。一定期間ごとにこの系のアリコートを採取し、［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］コンジュゲートの消失及び遊離したｒＩＬ−２の存在を検出する試験を行った。ｒＩＬ−２の出現は、インキュベーションから約１０時間後にプラトーに達し、おそらくは沈殿により、徐々に減少した。データを図２．３に提供する。
【０１９６】
実施例３
ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳによるｒＩＬ−２のペグ化
【化２５】
2020097626.tif 000036
ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体、２０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳ」）
アルゴン下に−８０℃で保存したｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳを、窒素パージ下で周囲温度に加温した。ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳのストック溶液（２００ｍＧ／ｍＬ）を２ｍＭのＨＣｌ中に調製し、ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳを、ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳ対ｒＩＬ−２のモル比が１００：１に達するのに十分な量でｒＩＬ−２に添加した。混合物中のｒＩＬ−２の最終濃度は０．５ｍＧ／ｍＬ（０．０３５ｍＭ）であった。重炭酸ナトリウム緩衝液（１Ｍ、ｐＨ９．０）を混合物に添加して最終濃度を２０ｍＭとし、コンジュゲート形成を３０分間進行させると、［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］コンジュゲートが提供された。３０分後、反応混合物に１Ｍグリシン（ｐＨ６．０）を添加することによりクエンチングを達成し、最終濃度を１００ｍＭとした。次にクエンチした反応混合物を、０．５ｍＳ／ｃｍ（２５℃）未満の伝導度となるようにＨ２Ｏで希釈した。氷酢酸を使用してｐＨを４．０に調整した後、カラムクロマトグラフィー精製した。
【０１９７】
［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の典型的な陽イオン交換クロマトグラフィー精製プロファイルを、図３．１に提供する。［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］が示され、線は、様々な波長における吸光度に対応する。逆相ＨＰＬＣ分析による［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の純度分析から、２８０ｎｍで９８．５％の精製コンジュゲートの純度が検出された。１９．６分におけるピークは、未反応のｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳ（これが＜０．１％を構成する）に相当する。図３．２を参照のこと。純度は、２０μｇの精製［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］でのクマシーブルー染色を伴う４〜１２％ＮｕＰａｇｅビス−トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ゲルは示さず）により決定するとき、９５％以上であった。見かけ上大きい、２００ｋＤａ超の分子量のコンジュゲートは、ＰＥＧ水和度が高いことに起因してゲルを通じたコンジュゲートの移動度が低い結果であると考えられた。精製［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］コンジュゲートの分子量もまた、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光測定法により決定した。図３．３で分かるとおり、７９．６ｋＤａの主ピークは、３ｍｅｒ［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］コンジュゲートの分子量の予測範囲内にある。１００．８ｋＤａのピークは、４ｍｅｒ［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の分子量の予測範囲内にある。ＭＷ４０ｋＤａ及び５８．７ｋＤａのピークは、二価３ｍｅｒ  ＩＬ−２コンジュゲート及び４ｍｅｒ  ＩＬ−２コンジュゲートに相当し得る。
【０１９８】
実施例４
分枝鎖状ｍＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル誘導体、２０ｋＤａによるｒＩＬ−２のペグ化
【化２６】
2020097626.tif 000037
ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（Ｈｙｄｒｏｘｙｌｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）誘導体、２０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ−ＮＨＳ」）
アルゴン下に−８０℃で保存したｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ−ＮＨＳを、窒素パージ下で周囲温度に加温した。ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ−ＮＨＳのストック溶液（２００ｍＧ／ｍＬ）を２ｍＭのＨＣｌ中に調製し、ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ−ＮＨＳを、ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ−ＮＨＳ対ｒＩＬ−２のモル比が１００：１に達するのに十分な量でｒＩＬ−２に添加した。混合物中のｒＩＬ−２の最終濃度は０．５ｍＧ／ｍＬ（０．０３５ｍＭ）であった。重炭酸ナトリウム緩衝液（１Ｍ、ｐＨ９．０）を混合物に添加して最終濃度を２０ｍＭとし、コンジュゲート形成を３０進行させると、［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］コンジュゲートが提供された。３０分後、反応混合物に１Ｍグリシン（ｐＨ６．０）を添加することによりクエンチングを達成し、最終濃度を１００ｍＭとした。次にクエンチした反応混合物を、０．５ｍＳ／ｃｍ（２５℃）未満の伝導度となるようにＨ２Ｏで希釈した。氷酢酸を使用してｐＨを４．０に調整した後、カラムクロマトグラフィー精製した。
【０１９９】
［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の典型的な陽イオン交換クロマトグラフィー精製プロファイルを、図４．１に提供する。［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］及び未反応のｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ−ＮＨＳが示され、線は、様々な波長（例えば、２８０ｎｍ及び２２５ｎｍ）における吸光度に対応する。逆相ＨＰＬＣ分析による［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の純度分析から、２８０ｎｍで１００％の精製コンジュゲートの純度が検出された。図４．２を参照のこと。純度は、２０μｇの精製［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］でのクマシーブルー染色を伴う４〜１２％ＮｕＰａｇｅビス−トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ゲルは示さず）により決定するとき、９５％以上であった。見かけ上大きい、２００ｋＤａ超の分子量のコンジュゲートは、ＰＥＧ水和度が高いことに起因してゲルを通じたコンジュゲートの移動度が低い結果であった。
【０２００】
実施例５
分枝鎖状ｍＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル誘導体、４０ｋＤａによるｒＩＬ−２のペグ化
【化２７】
2020097626.tif 000038
ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（Ｈｙｄｒｏｘｙｌｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）誘導体、４０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ−ＮＨＳ」）
アルゴン下に−８０℃で保存したｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ−ＮＨＳを、窒素パージ下で周囲温度に加温した。ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ−ＮＨＳのストック溶液（２００ｍＧ／ｍＬ）を２ｍＭのＨＣｌ中に調製し、ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ−ＮＨＳを、ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ−ＮＨＳ対ｒＩＬ−２のモル比が１００：１に達するのに十分な量でｒＩＬ−２に添加した。混合物中のｒＩＬ−２の最終濃度は０．５ｍＧ／ｍＬ（０．０３５ｍＭ）であった。重炭酸ナトリウム緩衝液（１Ｍ、ｐＨ９．０）を混合物に添加して最終濃度を２０ｍＭとし、コンジュゲート形成を３０分間進行させると、［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］コンジュゲートが提供された。３０分後、反応混合物に１Ｍ  グリシン（ｐＨ４．０）を添加することによりクエンチングを達成し、最終濃度を１００ｍＭとした。次にクエンチした反応混合物を、０．５ｍＳ／ｃｍ（２５℃）未満の伝導度となるようにＨ２Ｏで希釈した。氷酢酸を使用してｐＨを４．０に調整した後、カラムクロマトグラフィー精製した。
【０２０１】
［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の典型的な陽イオン交換クロマトグラフィー精製プロファイルを、図５に提供する。［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］及び未反応のＰＥＧが示され、線は、２８０ｎｍにおける吸光度に対応する。逆相ＨＰＬＣ分析による［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の純度分析から、２８０ｎｍで１００％の精製コンジュゲートの純度が検出された。純度は、２０μｇの精製［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］でのクマシーブルー染色を伴う４〜１２％ＮｕＰａｇｅビス−トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ゲルは示さず）により決定するとき、９５％以上であった。見かけ上大きい、２００ｋＤａ超の分子量のコンジュゲート（おそらく３ｍｅｒ型の［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］）は、ＰＥＧ水和度が高いことに起因してゲルを通じたコンジュゲートの移動度が低い結果であった。カラムを通して最初は未反応のｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ−ＮＨＳが溶離され、続いて［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］コンジュゲートが溶離された。
【０２０２】
実施例６
分枝鎖状ｍＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル誘導体、４ｋＤａによるｒＩＬ−２のペグ化
【化２８】
2020097626.tif 000039
ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（Ｈｙｄｒｏｘｙｌｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）誘導体、４ｋＤａ（「ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４Ｋ−ＮＨＳ」）
アルゴン下に−８０℃で保存したｍＰＥＧ２−ｒｕ−４Ｋ−ＮＨＳを、窒素パージ下で周囲温度に加温した。ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４Ｋ−ＮＨＳのストック溶液（２００ｍＧ／ｍＬ）を２ｍＭのＨＣｌ中に調製し、ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４Ｋ−ＮＨＳを、ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４Ｋ−ＮＨＳ対ｒＩＬ−２のモル比が１００：１に達するのに十分な量でｒＩＬ−２に添加した。混合物中のｒＩＬ−２の最終濃度は、０．０１５％ＳＤＳにより可溶化されて０．５ｍＧ／ｍＬ（０．０３５ｍＭ）であった。重炭酸ナトリウム緩衝液（１Ｍ、ｐＨ９．０）を混合物に添加して最終濃度を１００ｍＭとし、コンジュゲート形成を３０分間進行させると、［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４Ｋ］−［ｒＩＬ−２］コンジュゲートが提供された。３０分後、反応混合物に１Ｍ  グリシン（ｐＨ４．０）を添加することによりクエンチングを達成し、最終濃度を１００ｍＭとした。次にクエンチした反応混合物を、０．５ｍＳ／ｃｍ（２５℃）未満の伝導度となるようにＨ２Ｏで希釈した。氷酢酸を使用してｐＨを４．０に調整した後、カラムクロマトグラフィー精製した。
【０２０３】
［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の典型的な陽イオン交換クロマトグラフィー精製プロファイルを、図６に提供する。溶離された［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４Ｋ］−［ｒＩＬ−２］コンジュゲートは、溶離画分中の３ｍｅｒ、２ｍｅｒ及び１ｍｅｒ［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４Ｋ］−［ｒＩＬ−２］コンジュゲートの混合物を示した。図６に示すとおり、３ｍｅｒ／２ｍｅｒ［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４Ｋ］−［ｒＩＬ２］の混合物を含む画分、並びに２ｍｅｒ／１ｍｅｒ［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４Ｋ］−［ｒＩＬ２］の混合物を含む画分を、個別にプールした。
【０２０４】
実施例７
直鎖状ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド誘導体、３０ｋＤａによるｒＩＬ−２のペグ化
【化２９】
2020097626.tif 000040
直鎖状ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド誘導体、３０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ」）
全ての反応成分及び緩衝液を添加した後、最終的なｒＩＬ−２濃度が２．５ｍｇ／ｍｌになるように、ペグ化反応を設計する。アルゴン下に−２０℃で保存したｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ、３０ｋＤａを、周囲温度に加温する。ペグ化されるｒＩＬ−２の１０〜５０ｍｏｌ当量に等しいＰＥＧ試薬の分量を秤量し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡに溶解して、１２％試薬溶液を形成する。１２％ＰＥＧ試薬溶液をストックｒＩＬ−２溶液のアリコートに添加し、１５〜３０分間撹拌する。次に、還元剤のシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）を、ＰＥＧ試薬に対して１０〜１００モル過剰で添加し、反応液を室温で５〜１８時間撹拌することによって第二級アミン連結を介したカップリングを確実にし、それによりコンジュゲート溶液を形成する。
【０２０５】
ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤのアルデヒド基は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元試薬により還元したとき、ｒＩＬ−２に関連する第一級アミンと反応し、第二級アミンを介してそれと共有結合することが分かっている。１つ又は複数のアミンがポリマーと結合するようになる選択性は、コンジュゲート形成条件のｐＨを調整することにより調節できる。比較的低いｐＨ条件（例えば、ｐＨ約５．５）は、Ｎ末端に対するコンジュゲート形成を誘導し得る。比較的中性のｐＨ条件（例えば、約７．５及びそれを少し上回る）では、共有結合は他の位置において（すなわち、タンパク質中に含まれるリジン残基のアミン側鎖で）より頻繁に起こるようになる。コンジュゲート形成条件のｐＨを調整すると、どの位置でコンジュゲートを生じさせるかに関してある程度制御することが可能となり、従って所望の位置異性体を実現する能力が高まり得る。
【０２０６】
この同じ手法を用いて、他の重量平均分子量を有するｍＰＥＧ−ＢｕｒｙｒＡＬＤを使用して、他のコンジュゲートが調製される。
【０２０７】
実施例８
分枝鎖状ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド誘導体、４０ｋＤａによるｒＩＬ−２のペグ化
【化３０】
2020097626.tif 000041
分枝鎖状ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド誘導体、４０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ２−ＢｕｔｙｒＡＬＤ」）
全ての反応成分及び緩衝液を添加した後、最終的なｒＩＬ−２濃度が２．５ｍｇ／ｍｌになるように、ペグ化反応を設計する。アルゴン下に−２０℃で保存したｍＰＥＧ２−ＢｕｔｙｒＡＬＤ、４０ｋＤａを、周囲温度に加温する。ペグ化されるｒＩＬ−２の１０〜５０ｍｏｌ当量に等しいＰＥＧ試薬の分量を秤量し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡに溶解して、１２％試薬溶液を形成する。１２％ＰＥＧ試薬溶液をストックｒＩＬ−２溶液のアリコートに添加し、１５〜３０分間撹拌する。次に、還元剤のシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）を、ＰＥＧ試薬に対して１０〜１００モル過剰で添加し、反応液を室温で５〜１８時間撹拌することによって第二級アミン連結を介したカップリングを確実にし、それによりコンジュゲート溶液を形成する。
【０２０８】
ｍＰＥＧ２−ＢｕｔｙｒＡＬＤのアルデヒド基は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元試薬により還元したとき、ｒＩＬ−２に関連する第一級アミンと反応し、第二級アミンを介してそれと共有結合することが分かっている。
【０２０９】
この同じ手法を用いて、他の重量平均分子量を有するｍＰＥＧ２−ＢｕｒｙｒＡＬＤを使用して、他のコンジュゲートが調製される。
【０２１０】
実施例９
直鎖状ｍＰＥＧ−スクシンイミジルα−メチルブタノエート誘導体、３０ｋＤａによるｒＩＬ−２のペグ化
【化３１】
2020097626.tif 000042
直鎖状ｍＰＥＧ−スクシンイミジルα−メチルブタノエート誘導体、３０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ−ＳＭＢ」）
全ての反応成分及び緩衝液を添加した後、最終的なｒＩＬ−２濃度が２．５ｍｇ／ｍｌになるように、ペグ化反応を設計する。アルゴン下に−２０℃で保存したｍＰＥＧ−ＳＭＢ、３０ｋＤａを、周囲温度に加温する。ペグ化されるｒＩＬ−２の１０〜５０ｍｏｌ当量に等しいＰＥＧ試薬の分量を秤量し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡに溶解して、１２％試薬溶液を形成する。１２％ＰＥＧ試薬溶液をストックｒＩＬ−２溶液のアリコートに添加し、室温で５〜１８時間撹拌することによりコンジュゲート溶液を得る。コンジュゲート溶液は、最終的なリジンモル濃度がＰＥＧ試薬モル濃度の１０〜１００倍となるように、リジン溶液（ｐＨ７．５）でクエンチされる。
【０２１１】
ｍＰＥＧ−ＳＭＢ誘導体は立体障害性の活性ＮＨＳエステルを提供することが分かっており、このエステルはリジン及び末端アミンと選択的に反応する。
【０２１２】
この同じ手法を用いて、他の重量平均分子量を有するｍＰＥＧ−ＳＭＢを使用して、他のコンジュゲートが調製される。
【０２１３】
実施例１０
ｍＰＥＧ−ＰＩＰ、２０ｋＤａによるｒＩＬ−２のペグ化
ポリマー試薬の基本構造を以下に提供する：
【化３２】
2020097626.tif 000043
全ての反応成分及び緩衝液を添加した後、最終的なｒＩＬ−２濃度が２．５ｍｇ／ｍｌになるように、ペグ化反応を設計する。アルゴン下に−２０℃で保存したｍＰＥＧ−ＰＩＰ、２０ｋＤａを、周囲温度に加温する。ペグ化されるｒＩＬ−２の１０〜５０ｍｏｌ当量に等しいＰＥＧ試薬の分量を秤量し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡに溶解して、１２％試薬溶液を形成する。１２％ＰＥＧ試薬溶液をストックｒＩＬ−２溶液のアリコートに添加し、１５〜３０分間撹拌する。次に、還元剤のシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）を、ＰＥＧ試薬に対して１０〜１００モル過剰で添加し、反応液を室温で５〜１８時間撹拌することによって第二級アミン連結を介した（第二級炭素との）カップリングを確実にし、それによりコンジュゲート溶液を形成する。コンジュゲート溶液は、最終的なリジンモル濃度がＰＥＧ試薬モル濃度の１０〜１００倍となるように、リジン溶液（ｐＨ７．５）でクエンチされる。
【０２１４】
ｍＰＥＧ−ＰＩＰのケトン基は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元試薬により還元したとき、ｒＩＬ−２に関連する第一級アミンと反応し、第二級アミンを介してそれと共有結合することが分かっている。
【０２１５】
この同じ手法を用いて、他の重量平均分子量を有するｍＰＥＧ−ＰＩＰを使用して、他のコンジュゲートが調製される。
【０２１６】
実施例１１
例示的（ｒＩＬ−２）−ＰＥＧコンジュゲートの活性
アルデスロイキン（対照）、実施例２の［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］、実施例３の［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］、及び実施例４の［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の活性を、ＣＴＬＬ−２細胞を使用した細胞増殖アッセイで評価した。
【０２１７】
ＣＴＬＬ−２細胞（マウス細胞傷害性Ｔリンパ球細胞系）を、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎仔血清、及び１０％ＩＬ−２培養添加物（Ｔ−ＳＴＩＭ（商標）、ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）含有）を補足した完全ＲＰＭＩ  １６４０培地に、５％ＣＯ２雰囲気下３７℃で維持した。細胞を、２〜３×１０５細胞／ｍＬの細胞密度に達するまで懸濁液中で培養した後、分割した。
【０２１８】
活性アッセイのため、最後の分割から３〜４日後、細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した。次に細胞を、Ｔ−ＳＴＩＭ（商標）を含まない補足培地に約２×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で再懸濁し、壁が白色で底面が透明な９６ウェルマイクロプレートに９０μｌ／ウェルで播いた。実験はまた、インキュベートする間のコンジュゲートの放出を最小限に抑えるため、ｐＨ６．７〜７に調整した補足培地（Ｔ−ＳＴＩＭ（商標）不含）を使用して実施した。次に、Ｔ−ＳＴＩＭ（商標）不含の補足培地に希釈した１０μｌの１０倍濃度の試験化合物を添加した。細胞を５％ＣＯ２雰囲気下３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間インキュベートした後、各ウェルに１００μＬのＰｒｏｍｅｇａ製ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を添加した。プレートをオービタルシェーカーで２分間混合し、次に室温で１０分間インキュベートした。次に、１秒／ウェルの積分時間でＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ製ＴｏｐＣｏｕｎｔ（登録商標）機器を使用して、ルミネセンスを記録した。
【０２１９】
実施例２の［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］放出可能コンジュゲート及び実施例３の［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］放出可能コンジュゲートについて、放出されたＩＬ−２及び未放出のコンジュゲートの双方の活性を試験した。試験化合物は酸性条件下（１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４）に保存して、コンジュゲート形成を安定化させた。コンジュゲートの活性を試験するため、アッセイの約１時間前に、貯蔵緩衝液から試料を補足培地に希釈した。放出されたＩＬ−２の活性を試験するため、放出可能コンジュゲート｛すなわち、実施例２の［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］コンジュゲート及び実施例３の［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］コンジュゲート｝を、１００ｍＭ（最終濃度）重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９に１０倍希釈し、アッセイ開始前に３７℃で８時間予備インキュベートした。
【０２２０】
ＧｒａｐｈＰａｄのＰｒｉｓｍ５．０１ソフトウェアを使用して、用量反応曲線の非線形回帰分析により細胞増殖のＥＣ５０値（最大反応の５０％を示すのに必要な試験化合物の濃度）を得た。
【０２２１】
細胞増殖アッセイを用いてアルデスロイキン及びコンジュゲートの活性を計測した。結果の概要は表４に示す。全ての被験物質が、ＣＴＬＬ−２細胞の成長を用量依存的に誘導した。放出可能コンジュゲートはタンパク質の放出を強いる条件下で予備インキュベートしたため、アルデスロイキンもまた対照として予備インキュベートすることにより、強制的な放出処理条件下におけるタンパク質それ自体の安定性について試験した。表４に示すとおり、アルデスロイキンは、放出条件下（３７℃で８時間、ｐＨ９）で予備インキュベートした後も安定したままであり、推奨条件下で保存されたアルデスロイキンに対する相対的な効力が示された。ＩＬ−２の放出を生じさせる条件下で実施例２の［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］及び実施例３の［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］を予備インキュベートした後、図８に示されるとおり、活性は回復した；これらのコンジュゲートから放出されたＩＬ−２が対照アルデスロイキンに対する相対的な効力を示した一方、未放出のコンジュゲートの一部は、アルデスロイキンと比べて効力が低かった。安定な３ｍｅｒ［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］コンジュゲートが最小の効力を示し（図７）、アルデスロイキンの０．０４％であったが、１ｍｅｒ［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］は、既知のアッセイ標準偏差を考慮すると、アルデスロイキンと同等の効力を示した。
【０２２２】
【表１１】
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【０２２３】
実施例１２
例示的（ｒＩＬ−２）−ＰＥＧコンジュゲートの薬物動態
アルデスロイキン（対照）、実施例２の［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］、実施例３の［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］、及び実施例４の［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の薬物動態プロファイルを、マウスにおける単回注射後、ＥＬＩＳＡで評価した。
【０２２４】
アルデスロイキン濃度を、不均一系のサンドイッチＥＬＩＳＡにより計測した。簡潔に言えば、９６ウェルマイクロタイタープレートをＩＬ−２に対するマウスモノクローナル抗体でコーティングし、ブロックした。試料及び標準を原血漿に調製し、続いてＩＬ−２に対するビオチン化ウサギポリクローナル抗体を含む緩衝液で１０％血漿に希釈した後、アッセイプレートでインキュベートした。ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ、続いて比色基質の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して、ＩＬ−２を検出した。停止液を添加し、吸光度を４５０ｎｍで読み取り、６５０ｎｍでバックグラウンド減算した。重み付き４パラメータアルゴリズムにより標準曲線を作成し、標準曲線に補間することにより試料濃度を決定した。定量下限は０．０５ｎｇ／ｍＬであった。
【０２２５】
プールした１ｍｅｒ／２ｍｅｒ［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］濃度を、均一系ＨＴＲＦ（登録商標）アッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ  ＵＳ，Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡ）により計測した。反応混合物（１５ｕＬ、ＩＬ−２に対するユウロピウムクロメートコンジュゲートマウスモノクローナル抗体、ストレプトアビジン−ｄ２、及びＰＥＧに対するビオチン化ウサギモノクローナル抗体）を、白色の低容量３８４ウェルマイクロタイタープレートに添加した。原血漿に希釈した試料及び標準（５ｕＬ）を添加し、プレートをインキュベートした。プレートを蛍光リーダーで６１５及び６６５ｎｍで読み取り、及びデルタＦを計算した。重み付き５パラメータアルゴリズムにより標準曲線を作成し、標準曲線に補間することにより試料濃度を決定した。定量下限は０．５ｎｇ／ｍＬであった。
【０２２６】
全ＩＬ−２アッセイで３ｍｅｒ［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］及び３ｍｅｒ［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］を計測した。［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］及び［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］コンジュゲートは放出可能コンジュゲートであるため、試料中には異なる分子種が存在し得ることから、個別の定量化は困難である；従って、全ＩＬ−２レベルを計測した。試料及び標準ストックを、原血漿中に調製して、放出緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１００ｍＭトリス−ＨＣＬ、ｐＨ９）と１：１希釈し、３７℃で３０〜３６時間インキュベートすることにより、コンジュゲートのポリマー含有成分を強制的にコンジュゲートから放出させた。インキュベーション後、２５％容量の０．１Ｍ酢酸を添加して、高ｐＨを中和した。上記に記載されるＥＬＩＳＡにより、放出されたＩＬ−２を計測した。
【０２２７】
図９は、単回の筋肉内注射（１ｍｇ／ｋｇ）後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける被験物質の濃度−時間プロットを示す。１０分の時点、及び１時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１６８時間及び３３６時間の時点で、ヘパリンナトリウム添加（ｓｏｄｉｕｍ  ｈｅｐａｒａｎｉｚｅｄ）血漿試料を回収した。各時間点につき３匹のマウスから幾何平均濃度を計算した。図９に示されるとおり、アルデスロイキンは半減期が短く、６時間後に検出できなかったが（＜０．０５ｎｇ／ｍＬ）、コンジュゲートは半減期が長く、３３６時間の時点でもなお検出された。
【０２２８】
実施例１３
肺転移性黒色腫有効性試験
ＩＬ−２活性を有するものと意図される化合物の有効性の評価には、転移性黒色腫肺モデルが広く用いられており、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで展開される。このモデルでは、初めにマウスにＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞が静脈内投与され、それにより種々の数及びサイズの肺小結節を発生させる。肺小結節の数並びにそれらの病変部の全表面積は、移植された細胞濃度に応じて異なる。次にマウスの治療群に目的の試験化合物が投与され、及び別のマウス群が、未治療のままにしておくことで対照として供される。試験化合物の有効性は、治療群と未治療群との間の各肺についての肺小結節の数及びサイズ並びに全病変面積の減少率として決定することができる。
【０２２９】
この試験では、１００，０００個のＢ１６Ｆ１０細胞（継代はＰ８以下）を尾静脈注射により移植した。細胞を移植した日から３日目に、ＩＰ（腹腔内）経路又はＩＶ（静脈内）経路のいずれかによる投与に従い目的の試験化合物（又はビヒクル）を表５に示すとおり投与した。
【０２３０】
【表１２】
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【０２３１】
細胞を移植した日から１４日目、マウスを犠牲にし、同時に肺を摘出してホルムアルデヒド含有ボーエン（Ｂｏｗｅｎ）液に１〜２日間固定した。肺（ボーエン（Ｂｏｗｅｎ）液に固定したもの）を実体顕微鏡で調べ、各肺についての病変部の数及びサイズを決定した。
【０２３２】
図１０に示されるとおり、細胞を移植した日から１４日目、マウスを犠牲にし、その摘出肺をボーエン（Ｂｏｗｅｎ）液に固定した。アルデスロイキン（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）、実施例１のＩＬ−２部分、プールした３ｍｅｒ／４ｍｅｒ［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］、プールした３ｍｅｒ／４ｍｅｒ［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］、及びプールした１ｍｅｒ／２ｍｅｒ［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］の各々について、腫瘍小結節及びそのサイズをカウントした。
【０２３３】
実施例１４
皮下Ｂ１６Ｆ１０黒色腫有効性試験
ＩＬ−２活性を有するものと意図される化合物の有効性の評価には、同系マウス、すなわちＣ５７ＢＬ／６マウスにおける極めてロバストな皮下黒色腫モデルが用いられている。簡潔に言えば、１００万個のＢ１６Ｆ１０細胞を５〜６週齢の各Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背中領域に皮下移植した。腫瘍を触知可能なサイズ、すなわち７０〜１２０平方ｍｍまで成長させた後、無作為化して、表６に示されるとおりの群に割り当てた。マウスに試験化合物、すなわち、アルデスロイキン（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）、ｒＩＬ−２−ポリマーコンジュゲート又はビヒクルを、種々の用量濃度及び用量レジームで投与した。１日おきに体重及び腫瘍容積を計測した。この試験のエンドポイントは、所与の群の腫瘍容積中央値が１５００平方ｍｍに達した時点又は４５日の、いずれか早い方である。
【０２３４】
【表１３】
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【０２３５】
アルデスロイキン（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）及びｒＩＬ−２−ポリマーコンジュゲートを種々の投与スキームで投与した後の腫瘍成長阻害の用量反応曲線を、図１１Ａ及び図１１Ｂに提供する。これらの結果は、試験したｒＩＬ−２−ポリマーコンジュゲートの単回用量での有効性が、３ｍｇ／ｋｇを１日２回５日間投与されたアルデスロイキン（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）より優れているエビデンスが得られたことを示している。
【０２３６】
図１１Ａは、ｒＩＬ−２−ポリマーコンジュゲートの単回用量投与後、腫瘍容積中央値が１５００ｍｍ３に達するまでの腫瘍増殖抑制期間を示す。腫瘍進行曲線からの腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）は、２ｍｇ／ｋｇ及び４ｍｇ／ｋｇ用量濃度のプールした３ｍｅｒ／４ｍｅｒ［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］について、それぞれ４．６日及び６．２日であることが分かった。プールした３ｍｅｒ／４ｍｅｒ［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］については、２ｍｇ／ｋｇ及び４ｍｇ／ｋｇ用量濃度でＴＧＤはそれぞれ６．４日及び７．６日であることが分かった。
【０２３７】
図１１Ｂは、ｒＩＬ−２−ポリマーコンジュゲートの単回用量投与後、腫瘍容積中央値が１５００ｍｍ３に達するまでの腫瘍増殖抑制期間を示す。腫瘍進行曲線からのＴＧＤは、６ｍｇ／ｋｇ及び８ｍｇ／ｋｇ用量濃度のプールした１ｍｅｒ／２ｍｅｒ［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］について、それぞれ３．６日及び４．６日であることが分かった。プールした１ｍｅｒ／２ｍｅｒ［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］については、ＴＧＤは２ｍｇ／ｋｇで３．８であることが分かった一方、４ｍｇ／ｋｇ用量濃度は本質的に毒性であることが分かった。腫瘍進行曲線からのＴＧＤは、２ｍｇ／ｋｇ及び４ｍｇ／ｋｇ用量濃度のプールした１ｍｅｒ／２ｍｅｒ［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−２］について、それぞれ２．２日及び３．６日であることが分かった。
【０２３８】
簡潔に言えば、肺病変転移モデル（実施例１３）及び皮下マウス黒色腫モデル（実施例１４）の双方において、ｒＩＬ−２ポリマーコンジュゲートにより、アルデスロイキン（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）と比較したとき実質的により少ない頻度の投与且つより少ない総タンパク質量で有効性が実現した。
【数１】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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