(57)【要約】      （修正有）【課題】目的タンパク質を発現及び／又は分泌するように能力を改善された宿主細胞を提供する。【解決手段】目的タンパク質を製造するための組換え宿主細胞であって、宿主細胞が、遺伝子操作する前の宿主細胞と比較して、ある特定のアミノ酸配列、別の特定のアミノ酸配列、他の特定のアミノ酸配列又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するノックアウト（ＫＯ）タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現するように操作されており、機能的相同体が、前記ある特定のアミノ酸配列、別の特定のアミノ酸配列、他の特定のアミノ酸配列に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する、宿主細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質を製造するための組換え宿主細胞であって、宿主細胞が、遺伝子操作する前の宿主細胞と比較して、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現するように操作されており、機能的相同体が、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する、宿主細胞。
【請求項２】
前記のＫＯタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、操作する前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ（配列番号：２５及び２６）及び／又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂ（配列番号：２９及び３０）の収量を増加させる、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
過小発現が、前記宿主細胞のゲノムからＫＯタンパク質又はその機能的相同体をコードするポリヌクレオチドをノックアウトすること、宿主細胞においてＫＯタンパク質又はその機能的相同体をコードするポリヌクレオチドを破壊すること、前記のＫＯタンパク質又はその機能的相同体をコードするポリペプチドと作動可能に連結されたプロモーターを破壊すること、又は転写後遺伝子サイレンシングによって達成される、請求項１又は２における宿主細胞。
【請求項４】
宿主細胞が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）、及びコマガタエラ（Komagataella）、及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５】
目的タンパク質が、酵素、治療用タンパク質、食品添加物、飼料添加物、又は抗体若しくは抗体断片である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６】
宿主細胞が、ヘルパータンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項７】
ヘルパータンパク質が、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１６２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有し、機能的相同体が、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１６２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
ＫＯタンパク質１、ＫＯタンパク質２、及び／若しくはＫＯタンパク質３、又はその機能的相同体を過小発現する細胞を提供し、そして、当該細胞を、操作し、ＫＯ１、ＫＯ２及び／若しくはＫＯ３、又はその機能的相同体をコードする遺伝子を過小発現させることによって得られる、宿主細胞。
【請求項９】
宿主細胞が、操作され：
（ｉ）配列番号：１０又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過小発現し、さらに操作され、配列番号：１又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するヘルパータンパク質及び配列番号：２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させるか、又は
（ｉｉ）配列番号：１０又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過小発現し、さらに操作され、配列番号：４又はその機能的相同体及び配列番号：１又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させる請求項１〜８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
目的タンパク質を製造するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１１】
宿主細胞における目的タンパク質の収量を増加させる方法であって、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現させることを含み、機能的相同体が、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する、方法。
【請求項１２】
以下：
−宿主細胞を、操作し、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現させること、ここで、機能的相同体は、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する、
−前記宿主細胞において、目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを組換えること、
−前記宿主細胞を、目的タンパク質を発現するための好適な条件下で培養すること、並びに場合により
−細胞培養物から目的タンパク質を単離すること
を含む、宿主細胞における目的タンパク質の収量を増加させる方法。
【請求項１３】
以下：
−操作された宿主細胞を提供し、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現させること、ここで、機能的相同体は、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有し、ここで、前記宿主細胞は、目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含む；
−宿主細胞を、目的タンパク質を発現するための好適な条件下で培養すること、並びに場合により
−細胞培養物から目的タンパク質を単離すること
を含む、宿主細胞において目的タンパク質を産生する方法。
【請求項１４】
目的タンパク質が、酵素、治療用タンパク質、食品添加物又は飼料添加物、好ましくは解毒酵素である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記のＫＯタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、操作する前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ及び／又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂの収量を増加させる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、組換えバイオテクノロジーの分野、特に、タンパク質発現の分野に属する。本発明は、一般に、宿主細胞から目的タンパク質（protein of interest）（ＰＯＩ）を発現する方法に関する。本発明は、特定すると、目的タンパク質を発現及び／又は分泌するように宿主細胞の能力を改善すること並びに当該宿主細胞のタンパク質発現のための使用に関する。本発明はまた、細胞培養技術、より具体的には、医療目的又は食品製品のための所望の分子を産生するために細胞を培養することに関する。
【０００２】
発明の背景
成功した目的タンパク質（ＰＯＩ）の産生は、原核生物宿主と真核生物宿主の両方で成し遂げられている。最も顕著な例は、大腸菌（Escherichia coli）のような細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）若しくはハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）のような酵母、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）若しくはトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）のような糸状菌（filamentous fungi）、又はＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞である。一部のタンパク質の収量は高い割合で容易に達成されるが、多くの他のタンパク質は比較的低いレベルで産生されるだけである。
【０００３】
組換えタンパク質の分泌を改善するために、１つの戦略は、タンパク質のフォールディング及びプロセッシングが関与する宿主の分泌経路をターゲットにすることである。
【０００４】
WO 93/25676において、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）をコードするｃＤＮＡ及び異種ジスルフィド（disulphide）結合タンパク質をコードするｃＤＮＡの共発現が異種タンパク質の収量を増加させる手段として最初に示唆された。WO 93/25676は、アンチスタシン及びダニ抗凝固タンパク質の組換え発現がＰＤＩとの共発現によって増加され得ることを報告した。
【０００５】
WO 94/08012は、Ｈｓｐ７０シャペロンタンパク質、すなわちＫＡＲ２／ＢｉＰ、又はＰＤＩシャペロンタンパク質の発現を増加させることによって、酵母において過剰発現されたタンパク質の分泌を増加させるための方法を提供した。
【０００６】
WO 05/0617818及びWO 06/067511は、２μmベースの発現プラスミドを使用することによって、酵母において所望の異種タンパク質を産生するための方法を提供した。１以上のシャペロンタンパク質に関する遺伝子及び異種タンパク質に関する遺伝子が同じプラスミド上で共発現される場合に、異種タンパク質の収量が実質的に増加することが実証された。
【０００７】
WO 2008/128701 A2は、以下のタンパク質：ＢＭＨ２、ＢＦＲ２、ＣＯＧ６、ＣＯＹ１、ＣＵＰ５、ＩＭＨ１、ＫＩＮ２、ＳＥＣ３１、ＳＳＡ４及びＳＳＥ１の１つを用いることによる、真核生物細胞からのＰＯＩの分泌を増加させるための発現系を記載した。
【０００８】
タンパク質産生を増加させるための別のアプローチは、非折り畳みタンパク応答（unfolded protein response）（ＵＰＲ）を活性化する転写因子であるＨＡＣ１の過剰発現に基づいている。転写解析は、３３０を超える遺伝子がＨＡＣ１によって制御され、それらのほとんどが分泌顆粒の分泌に又は生物発生に関与することを明らかにした。WO 01/72783は、上昇した非折り畳みタンパク応答（ＵＰＲ）を誘導することによる、真核生物細胞から分泌される異種タンパク質の量を増加させるための方法を記載しており、ここで、ＵＰＲは、ＨＡＣ１、ＰＴＣ２及びＩＲＥ１からなる群より選択されるタンパク質の共発現によってモジュレートされる。
【０００９】
Wentz等は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）酵母表面提示遺伝子ライブラリーを用いて、適切な選択圧を適用することによって改善した分泌株を同定した。酵母ｃＤＮＡのＣＣＷ１２、ＳＥＤ１、ＣＷＰ２、ＲＰＰ０は、ｓｃＴＣＲの提示を温度依存的に増大させることが見出された。ＥＲＯ１は、２０℃で誘導された場合にタンパク質分泌を増大させた（Wentz et al., Appl. Environ. Microbiol. (2007) 73(4):1189-1198）。
【００１０】
Liu等（Biotechnol. Prog. (2006), 22:1090-1095）は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）におけるＫａｒ２の共過剰発現が、ｒｈＧ−ＣＳＦ発現を５．６倍増加させることを示した。ＫＡＲ２をＳｅｃ６３、ＰＤＩ及びＹＤＪと組み合わせると、結果として、２．８、６．５及び５．９４倍の増加をもたらした。Blatt等によって実施された実験では、ＫＡＲ２（ＢｉＰ）の共過剰発現は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）におけるＡ３３ｓｃＦｖ発現を２倍増加させた。ＫＡＲ２をＰＤＩと組み合わせると、正のＫＡＲ２効果をほとんど消失させた（Blatt et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2007, 74:381-389）。
【００１１】
Guerfall等は、ピキア・パストリス（P. pastoris）における内因性ＨＡＣ１を過剰発現する効果を調査した。さらに、ＨＡＣ１は、構成的かつ誘導的に過剰発現された。全ての場合に、誘導されたＵＰＲの結果として増加されたＫＡＲ２発現が同定された。完全長ＨＡＣ１の構成的過剰発現は、ほとんど又は全く効果を有さないが、一方で、ＨＡＣ１の誘導型の過剰発現は、４つのケースのうち１つでタンパク質分泌の増加を導き、４つのケースのうち３つで減少を導いた（Guerfall et al., Microbial Cell Factories, (2010), 9:49）。
【００１２】
Sleep等は、Ｌｈｓ１の共過剰発現がｒＨＡの濃度を増加させることを示した。ＬＨＳ１をＳＩＬ１、ＪＥＭ１及びＳＣＪ１と組み合わせたが、力価はＪＥＭ１のみと共過剰発現させた場合よりも低かった。ＳＩＬ１、ＬＨＳ１及びＪＥＭ１の同時の共過剰発現は、培養培地に依存して、ＧＭ−ＣＳＦ発現を１．４５倍、そして、ｒＨＡ発現をおよそ１．１及び２倍増加させた（Sleep et al. Applied and Environmental Microbiology, (2008) 74(24):7759-7766）。
【００１３】
US 2009221030 A1は、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）における、種々のヘルパータンパク質（とりわけ、ＢｉＰ１）の単独での及び他のヘルパータンパク質（とりわけ、ＬＨＳ１）との組み合わせでの共発現を記載した。ＢｉＰ１単独で最も高い発現値が得られ、そして、ＢｉＰ１とＬＨＳ１の組み合わせは、８％低い分泌タンパク質力価を導いた。
【００１４】
US 8,440,456は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）のゲノム配列を提供し、かつ、シグナルペプチド、シャペロン及びプロモーターをコードする核酸配列を開示した。それは、当該核酸配列を含む発現ベクター及び１４のシャペロンの過剰発現が可能な遺伝的に操作された酵母を開示した。ＲＯＴ１、ＳＨＲ３及びＳＩＬ１が試験のために具体的に選択されたが、ＳＩＬ１については発現が観察されず、そして、ＲＯＴ１又はＳＨＲ３の過剰発現は失敗し、異種タンパク質の分泌の任意の顕著な増大を導いた。通常、目的タンパク質の発現を増大させるために、ヘルパータンパク質をコードする遺伝子の過剰発現が適用されるが、タンパク質をコードする遺伝子の過小発現又はさらにはそれをコードする遺伝子のノックアウトは適用されることはないか又は適用されてもまれである。
【００１５】
宿主細胞における高レベルのタンパク質収量は、フォールディング、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、細胞内の輸送、又は細胞からの放出のような、１以上の異なる工程で制限され得る。関与するメカニズムの多くは、まだ完全に理解されておらず、そして、宿主生物のゲノム全体のＤＮＡ配列が入手可能であっても、これを現在の最先端の知識に基づいて予測することはできない。
【００１６】
目的タンパク質を産生及び／又は分泌するように宿主細胞の能力を改善するための方法について継続的なニーズがある。本発明の１つの目的は、単純かつ効率的であり、工業的方法での使用に適する、宿主細胞におけるタンパク質の収量を増加させるための新規方法を提供することである。別の目的は、この目的を達成するための宿主細胞を提供することである。
【００１７】
本明細書において使用されるとおり、単数形「a」、「an」及び「the」は、反対に文脈が明確に他のことを示していない限り、複数の指示対象を含むことに留意すべきである。したがって、例えば、「ある宿主細胞（a host cell）」又は「ある方法（a method）」への言及は、それぞれ、そのような宿主細胞又は方法の１以上を含み、そして、「当該方法（the method）」への言及は、当業者に公知の修飾又は置換され得る等価な工程及び方法を含む。同様に、例えば、「方法（methods）」又は「宿主細胞（host cells）」への言及は、それぞれ、「ある宿主細胞（a host cell）」又は「ある方法（a method）」を含む。
【００１８】
特に指示のない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、その一連の全ての要素を指すものと理解されるべきである。当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の態様に対する多数の等価物を、わずかなルーチン実験を使用して認識するか又は確認できるであろう。そのような等価物は、本発明に包含されるものと意図される。
【００１９】
用語「及び／又は」は、本明細書において使用される場合はいつも、「及び」、「又は」及び「前記用語によって連結された要素の全て又は任意の他の組み合わせ」の意味を含む。例えば、Ａ、Ｂ及び／又はＣは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ及びＡ＋Ｂ＋Ｃを意味する。
【００２０】
用語「約」又は「およそ」は、本明細書において使用されるとおり、所与の値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。それはまた、具体的な数を含み、例えば、約２０は、２０を含む。
【００２１】
用語「〜未満（より少ない）」、「〜超（を超える）」又は「〜より多い」は、具体的な数を含む。例えば、２０未満は、≦２０を意味し、そして、２０を超えるは、≧２０を意味する。
【００２２】
本明細書及び特許請求の範囲又は項目全体を通して、文脈が別に必要としない限り、語「〜を含む（comprise）」並びに「comprises」及び「comprising」などの変形型は、規定の整数（又は工程）又は整数（又は工程）の群の包含を意図するものと理解されよう。それは、任意の他の整数（又は工程）又は整数（又は工程）の群を排除するわけではない。本明細書において使用される場合、用語「〜を含む（comprising）」は、「〜を含有する（containing）」、「〜から構成される（composed of）」、「〜を含む（including）」、「〜を有する（having）」又は「〜を担持する（carrying）」で置換され得る。本明細書において使用される場合、「〜からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲／項目において明示されていないあらゆる整数又は工程を排除する。本明細書において使用される場合、「〜から本質的になる（consisting essentially of）」は、特許請求の範囲／項目の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない整数又は工程を排除しない。本明細書における各場合において、用語「〜を含む（comprising）」、「〜から本質的になる（consisting essentially of）」及び「〜からなる（consisting of）」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかで置き換えられ得る。
【００２３】
さらに、本発明の代表的な実施態様を記載する上で、本明細書は、本発明の方法及び／又はプロセスを特定の工程シーケンスとして提示し得る。しかしながら、本方法又はプロセスが本明細書に記載される特定の工程の順序に依拠しない限りは、本方法又はプロセスは記載される特定の工程シーケンスに限定されるべきではない。当業者が理解するように、他の工程シーケンスも可能であり得る。このため、本明細書に記載される特定の工程の順序は、特許請求の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。加えて、本発明の方法及び／又はプロセスを対象とする特許請求の範囲は、書かれた順序でのそれらの工程のパフォーマンスに限定されるべきではなく、そして、当業者は、当該シーケンスが変更され得ること、そして、これが依然として本発明の精神及び範囲の範囲内に留まることを容易に理解することができる。
【００２４】
本発明が、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、材料、試薬及び物質などに限定されないと理解されるべきである。本明細書において使用される専門用語は、特定の実施態様を記載することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は、特許請求の範囲／項目によってのみ定義される。
【００２５】
本明細書のテキスト全体を通して引用されている全ての刊行物及び特許（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造会社の仕様書、説明書などを含む）は、前出又は後出を問わず、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。本明細書において、本発明が先行発明によって係る開示に先行する資格を有しないことを承認するものと解釈されるべきではない。参照によって組み入れられる材料が本明細書と矛盾する又は一致しない範囲では、本明細書は、あらゆるそのような材料に取って代わるであろう。
【００２６】
概要
本発明は、その発現が、宿主細胞からのＰＯＩの収量に負の影響を有することが観察された、数種のタンパク質（本明細書において、ノックアウト（ＫＯ）タンパク質と称され、ＫＯ１、ＫＯ２、ＫＯ３（本明細書において、それぞれＫＯタンパク質１、ＫＯタンパク質２、及びＫＯタンパク質３とも称される）を含む）、及びその機能的相同体の驚くべき知見に一部基づくものである。機能的相同体の意味は、本出願の後の部分で定義される。さらに、突然変異又は欠失などの遺伝子の修飾が、ＰＯＩの収量を増加させることができることが発見された。この開示は、本発明者等によって同定された遺伝子を過小発現するように宿主細胞を操作することによって、ＰＯＩの収量を改善するために有用な方法及び材料を提供する。用語「収量」は、例えば、操作された細胞から収集された、本明細書に記載されるとおりのＰＯＩ又はモデルタンパク質、特にＳＤＺ−Ｆａｂ（配列番号：２５及び２６）及びＨｙＨＥＬ−Ｆａｂ（配列番号：２９及び３０）それぞれの量を指し、そして、増加した収量は、宿主細胞によるＰＯＩの産生又は分泌の増加した量に起因し得る。収量は、ＰＯＩ（mg）／宿主細胞のバイオマス（g）（乾燥細胞重量又は湿潤細胞重量として測定される）によって表示され得る。用語「力価」は、本明細書において使用される場合、同様に、ＰＯＩ（mg）／培養液上清（L）として表示される、産生されたＰＯＩ又はモデルタンパク質の量を指す。収量の増加は、操作された宿主細胞から得られた収量を、操作する前の宿主細胞から、すなわち、操作されていない宿主細胞から得られた収量と比較した場合に決定され得る。
【００２７】
好ましくは、「収量」は、本明細書において使用される場合、本明細書に記載されるとおりのモデルタンパク質の文脈において、実施例５ｃに記載されるとおりに決定される。したがって、「収量」は、本明細書において使用される場合、本明細書に記載されるとおりのモデルタンパク質の文脈において、「Ｆａｂ収量」又は「Ｆａｂ力価」とも称される。Ｆａｂ力価は、mg/Lとして、そして、Ｆａｂ収量は、mg/バイオマス（乾燥細胞重量又は湿潤細胞重量として測定される）として与えられる。
【００２８】
簡潔に述べると、モデルタンパク質ＨｙＨＥＬ−Ｆａｂ及びＳＤＺ−Ｆａｂをそれぞれ発現する、ピキア・パストリス（P. pastoris）株ＣＢＳ７４３５ｍｕｔＳ  ｐＰＭ２ｄ＿ｐＡＯＸ  ＨｙＨＥＬ及び／又はＣＢＳ７４３５ｍｕｔＳ  ｐＰＭ２ｄ＿ｐＡＯＸ  ＳＤＺ（それらの生成については実施例１を参照のこと）を、本明細書に記載されるとおりのヘルパータンパク質又はその機能的相同体をコードするポリヌクレオチドを用いて操作する。共過剰発現のために、ヘルパータンパク質をコードする遺伝子を、実施例４に記載されるとおり、ピキア・パストリス（P. pastoris）ＧＡＰプロモーターの制御下でクローニングし、Ｆａｂ産生株へと形質転換する。過小発現のために、ＫＯターゲット又はその機能的相同体をコードする遺伝子を、Ｆａｂ産生株のゲノムからノックアウトする（実施例６を参照のこと）。操作した細胞を、１０g/Lグリセロール及び５０μg/mLゼオシンを含有するＹＰ培地中、２５℃で一晩成長させる（実施例５ａを参照のこと）。そのような培養物のアリコート（２．０の最終ＯＤ６００に相当する）を、２０g/Lグルコース及びグルコースフィードタブレットを含有する合成培地Ｍ２（実施例５ａに記載される）に移し、２５℃で２５時間インキュベートする。培養物を洗浄し、これを合成培地Ｍ２中に再懸濁し、そして、アリコート（４．０の最終ＯＤ６００に相当する）を、５g/Lメタノールを補充した合成培地Ｍ２に移す。メタノール（５g/L）を、１２時間毎にさらに３回加える。４８時間後、細胞を遠心分離によって収集する。バイオマスを、細胞懸濁液１mLから生じる細胞ペレットの重量を測定することによって決定する。上清を、ＥＬＩＳＡによるＳＤＺ−Ｆａｂ又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂそれぞれの定量化に使用する（実施例５ｃに記載される）。具体的には、抗ヒトＩｇＧ抗体（例えば、ab7497, Abcam）をコーティング抗体として使用し、そして、例えば、ヤギ抗ヒト抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）抗体（例えば、Sigma A8542、アルカリホスファターゼコンジュゲート）を検出抗体として使用する。市販のヒトＦａｂ／κＩｇＧ断片を１００ng／mLの出発濃度で標準として使用し、上清サンプルを適宜希釈する。収量の増加は、ＫＯタンパク質をコードするポリペプチドを過小発現するように細胞を操作した前後のＰＯＩ収量の比較に基づいて決定され得る。実施例に示されるとおりの標準試験を使用して、収量差を決定し得る。
【００２９】
本発明は、本発明者等によって発見された以下のノックアウトタンパク質に一部基づくが、それらに限定されない。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
本発明は、ＫＯタンパク質をコードする１以上の過小発現された遺伝子を有する遺伝的に操作された組換え宿主細胞を提供する。本明細書において使用されるとおり、「操作された」宿主細胞は、遺伝的操作を使用して、すなわちヒトの介入によって操作された宿主細胞である。宿主細胞が所与のタンパク質を「過小発現するように操作されている」場合、宿主細胞は、機能性ＫＯタンパク質の発現レベルが過小発現を達成する遺伝子操作の前の同じ条件下の宿主細胞と比較して減少するように操作される。遺伝的操作に供されるべき宿主細胞は、ＫＯタンパク質又はその機能的相同体をコードする少なくとも１、例えば少なくとも２、又は少なくとも３つのポリヌクレオチド配列を含む。遺伝的操作は、ＫＯタンパク質をコードする遺伝子の過小発現をもたらす。好ましくは、操作は、ＫＯタンパク質について検出可能でないレベルを有する細胞をもたらすだろう。過小発現は、操作された宿主細胞と上に述べた操作の前の宿主細胞を指す「対応する親株」とを比較することによって観察され得る。本明細書において使用されるとおり、ＫＯタンパク質は、本発明において、複数形又は単数形で互換的に称されるが、これは、他に明示的に指定されない限り、単数形であると理解されるべきである。
【００３２】
ノックアウトされなければならない遺伝子に関して−シャペロン（ＫＯ２、ＫＯ３）から、過剰発現が有益であると期待しただろうが、実際には、それは正の効果を有する欠失である。
【００３３】
パン酵母における凝集で役割を担うＫＯ１について、その欠失がタンパク質分泌を増大させることは期待しなかったであろう。パン酵母における凝集は、交配に関係なく、細胞が植物の成長段階で可逆的に集合する場合の現象である。
【００３４】
第一の態様において、本発明は、目的タンパク質を製造するための組換え宿主細胞であって、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現するように操作されており、機能的相同体が、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有する宿主細胞を提供する。
【００３５】
組換え宿主細胞は、最初に、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞（ここで、機能的相同体は、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有する）を提供し、次いで、宿主細胞をポリヌクレオチドを過小発現するように操作することによって得られる。
【００３６】
好ましい実施態様において、宿主細胞は、本発明のＫＯタンパク質を含まない及び／又はＫＯタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含まない、酵母細胞、好ましくはピキア（Pichia）属、より好ましくはピキア・パストリス（Pichia pastoris）の宿主細胞である。１つの実施態様にいて、宿主細胞は、配列番号：２２、２３、２４、又はその相同体に示されるとおりのポリヌクレオチド配列を欠失させることによって得られるものである。
【００３７】
本明細書において使用されるとおり、ポリペプチドの「相同体」又は「機能的相同体」は、ポリペプチドがそれらの一次、二次又は三次構造中の対応する位置に同じ残基又は保存された残基を有することを意味するものとする。その用語はまた、相同なポリペプチドをコードする２以上のヌクレオチド配列まで拡張される。特に、実施例に記載されるＫＯ１、ＫＯ２及びＫＯ３に相同なポリペプチドは、完全長の天然配列又はその任意の断片に関して、少なくとも約３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％のアミノ酸配列同一性を有し得る。好ましくは、相同なポリペプチドは、天然化合物、又は完全長化合物の任意の他の具体的に定義された断片に対して、少なくとも約３５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約４５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約５０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約５５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約６５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するだろう。ＫＯ１、ＫＯ２及びＫＯ３タンパク質としての機能がそのような相同体で証明された場合、その相同体は、「機能的相同体」と呼ばれる。機能的相同体は、それが由来するＫＯタンパク質又はヘルパータンパク質と同じ又は実質的に同じ機能を実施し、すなわち、それは、本明細書に記載されるとおりのモデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ及び／又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂの収量を増加させる。その機能は、当技術分野において公知のアッセイによって、又は、好ましくは実施例７又は実施例５ｃに記載されるとおりの、特定すると「Ｆａｂ力価」又は「Ｆａｂ収量」の文脈で本明細書に上述したとおりのモデルタンパク質を使用したアッセイで試験され得る。
【００３８】
潜在的な機能的相同体の機能は、機能的に等価なバリアント配列が挿入されている発現カセットを提供し、試験タンパク質（実施例で使用されるモデルタンパク質の１つ又は特定のＰＯＩなど）をコードする配列を担持する宿主細胞を形質転換し、そして、同一条件下でモデルタンパク質又はＰＯＩの収量の差を決定することによって試験され得る。
【００３９】
１つの実施態様にいて、宿主細胞は、ＫＯタンパク質１を過小発現するように操作される。宿主細胞は、好ましくは、配列番号：１０又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過小発現するように操作され、ここで、機能的相同体は、配列番号：１０に示されるとおりのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有する。
【００４０】
別の実施態様において、宿主細胞は、ＫＯ２を過小発現するように操作される。宿主細胞は、好ましくは、配列番号：１１又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過小発現するように操作され、ここで、機能的相同体は、配列番号：１１に示されるとおりのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有する。
【００４１】
さらなる実施態様において、宿主細胞は、ＫＯ３を過小発現するように操作される。宿主細胞は、好ましくは、配列番号：１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過小発現するように操作され、ここで、機能的相同体は、配列番号：１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有する。
【００４２】
本発明は、配列番号：２２、配列番号：２３、又は配列番号：２４を含む、から本質的になる、又はからなる単離ポリヌクレオチド配列を提供し、さらに、本発明は、配列番号：１０、１１、１２のいずれか１つ又はその機能的相同体を含むポリペプチド配列をコードする単離ポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、配列番号：２２、２３、２４からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有する単離ポリヌクレオチド配列を提供する。より好ましくは、単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４と１００％の配列同一性を有する。
【００４３】
さらに、本発明は、配列番号：１０、１１、１２のいずれか１つ又はその機能的相同体のポリペプチド配列を含む単離ポリペプチドを提供する。好ましくは、本発明は、配列番号：１０又はその機能的相同体のポリペプチド配列を含む単離ポリペプチドを提供する。好ましくは、本発明は、配列番号：１１又はその機能的相同体のポリペプチド配列を含む単離ポリペプチドを提供する。好ましくは、本発明は、配列番号：１２又はその機能的相同体のポリペプチド配列を含む単離ポリペプチドを提供する。さらなる態様において、本発明は、配列番号：１０、１１、又は１２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を伴う単離ポリペプチドを提供する。
【００４４】
本明細書において使用される用語「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかを指す。「核酸配列」又は「ポリヌクレオチド配列」又は単に「ポリヌクレオチド」は、５’から３’末端へと読まれるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを指す。それは、自己複製プラスミド、ＤＮＡ又はＲＮＡの感染性ポリマー、及び非機能的ＤＮＡ又はＲＮＡの両方を含む。
【００４５】
用語「ポリヌクレオチドを発現すること」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡがポリペプチドへと翻訳される場合を意味する。用語「過小発現させる」は、一般に、ＫＯタンパク質を過小発現するように操作する前の宿主細胞である参照基準によって示された発現レベルよりも小さい任意の量を指す。本発明における、用語「過小発現する」、「過小発現させること」、「過小発現された」及び「過小発現」は、宿主細胞の遺伝的変化の前の又は遺伝的に変化されていない同等な宿主における同じ遺伝子産物又はポリペプチドの発現よりも小さいレベルでの遺伝子産物又はポリペプチドの発現を指す。「〜未満」は、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０、９０％以上を含む。遺伝子産物又はポリペプチドの発現がないことも、用語「過小発現」に包含される。
【００４６】
宿主細胞は、ＫＯタンパク質１又はその機能的相同体を発現する細胞を提供し、そして、当該細胞を、ＫＯタンパク質１をコードする遺伝子を過小発現するように操作することによって得られ得る。宿主細胞はまた、ＫＯタンパク質２又はその機能的相同体を発現する細胞を提供し、そして、当該細胞を、ＫＯタンパク質２をコードする遺伝子を過小発現するように操作することによって得られ得る。さらに、宿主細胞は、ＫＯタンパク質３又はその機能的相同体を発現する細胞を提供し、そして、当該細胞を、ＫＯタンパク質３をコードする遺伝子を過小発現するように操作することによって得られ得る。
【００４７】
好ましい実施態様において、ＫＯタンパク質１は、好ましくは過小発現された場合、宿主細胞におけるモデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂの産生を、ＫＯタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過小発現するように操作する前の宿主細胞と比較して、少なくとも１％、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は少なくとも２００％以上増加させ得る。驚くべきことに、実施例に記載される例示的な組換え細胞が全て、モデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂの収量を少なくとも２０％増加（１．２倍率変化）させることができたことが見出された。
【００４８】
好ましい実施態様において、ＫＯタンパク質２は、好ましくは過小発現された場合、宿主細胞におけるモデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂの産生を、操作する前の宿主細胞と比較して、少なくとも１％、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は少なくとも２００％以上増加させ得る。驚くべきことに、実施例に記載される例示的な組換え細胞が全て、モデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂの収量を少なくとも２０％増加（１．２倍率変化）させることができたことが見出された。
【００４９】
好ましい実施態様において、ＫＯタンパク質３は、好ましくは過小発現された場合、宿主細胞におけるモデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂの産生を、操作する前の宿主細胞と比較して、少なくとも１％、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は少なくとも２００％以上増加させ得る。驚くべきことに、実施例に記載される例示的な組換え細胞が全て、モデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂの収量を少なくとも２０％増加（１．２倍率変化）させることができたことが見出された。
【００５０】
第三の態様において、本発明は、目的タンパク質を製造するための、本明細書に記載される組換え宿主細胞のいずれかの使用を提供する。
【００５１】
第四の態様において、本発明は、宿主細胞における目的タンパク質の収量を増加させる方法であって、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現させることを含み、機能的相同体が、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有する方法を提供する。
【００５２】
好ましくは、本方法は、配列番号：１０又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過小発現させることを含み、ここで、機能的相同体は、配列番号：１０に示されるとおりのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有する。
【００５３】
好ましくは、本方法は、配列番号：１１又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過小発現させることを含み、ここで、機能的相同体は、配列番号：１１に示されるとおりのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有する。
【００５４】
好ましくは、本方法は、配列番号：１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過小発現させることを含み、ここで、機能的相同体は、配列番号：１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有する。
【００５５】
第五の態様において、本発明は、以下を含む、宿主細胞における目的タンパク質の収量を増加させる方法を提供する：
−宿主細胞を、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１、例えば少なくとも２、又は少なくとも３つのポリヌクレオチドを過小発現するように操作すること（ここで、機能的相同体は、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有する）、
−前記宿主細胞において、目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを組換えること、及び
−前記宿主細胞を、目的タンパク質を発現するための好適な条件下で培養すること。
【００５６】
タンパク質の収量を増加させるための方法の文脈において、「操作工程」及び「組換え工程」の順序は、「組換え工程」が「操作工程」に先立つように、代替的に逆転され得る。とりわけ、本明細書に記載されるとおり、目的タンパク質の収量は、ＫＯタンパク質が過小発現された及び／又はヘルパータンパク質が過剰発現された場合に増加する。
【００５７】
操作工程及び組換え工程がその示した順序で実施される必要がないことに留意すべきである。異なる順序で工程を実施することが可能である。
【００５８】
好ましくは、本発明は、以下を含む、宿主細胞における目的タンパク質の収量を増加させる方法を提供する：
−宿主細胞を、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現するように操作すること（ここで、機能的相同体は、配列番号：１０に示されるとおりのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有する）、
−前記宿主細胞において、目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを組換えること、及び
−前記宿主細胞を、目的タンパク質を発現するための好適な条件下で培養すること。
【００５９】
好ましくは、本発明は、以下を含む、宿主細胞における目的タンパク質の収量を増加させる方法を提供する：
−宿主細胞を、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現するように操作すること（ここで、機能的相同体は、配列番号：１１に示されるとおりのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有する）、
−前記宿主細胞において、目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを組換えること、及び
−前記宿主細胞を、目的タンパク質を発現するための好適な条件下で培養すること。
【００６０】
好ましくは、本発明は、以下を含む、宿主細胞における目的タンパク質の収量を増加させる方法を提供する：
−宿主細胞を、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現するように操作すること（ここで、機能的相同体は、配列番号：１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有する）、
−前記宿主細胞において、目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを組換えること、及び
−前記宿主細胞を、目的タンパク質を発現するための好適な条件下で培養すること。
【００６１】
第六の態様において、本発明は、以下を含む、宿主細胞において目的タンパク質を産生する方法を提供する：
−配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのＫＯタンパク質配列をコードする少なくとも１、例えば少なくとも２、又は少なくとも３つのポリヌクレオチドを過小発現するように操作された宿主細胞を提供すること（ここで、機能的相同体は、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸を有し、ここで、前記宿主細胞は、目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含む）；及び
−宿主細胞を、目的タンパク質を発現するための好適な条件下で培養すること。
【００６２】
好ましくは、本発明は、以下を含む、宿主細胞において目的タンパク質を産生する方法を提供する：
−配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現するように操作された宿主細胞を提供すること（ここで、機能的相同体は、配列番号：１０に示されるとおりのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有し、ここで、前記宿主細胞は、目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含む）；及び
−宿主細胞を、目的タンパク質を発現するための好適な条件下で培養すること。
【００６３】
好ましくは、本発明は、以下を含む、宿主細胞において目的タンパク質を産生する方法を提供する：
−配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現するように操作された宿主細胞を提供すること（ここで、機能的相同体は、配列番号：１１に示されるとおりのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有し、ここで、前記宿主細胞は、目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含む）；及び
−宿主細胞を、目的タンパク質を発現するための好適な条件下で培養すること。
【００６４】
好ましくは、本発明は、以下を含む、宿主細胞において目的タンパク質を産生する方法を提供する：
−配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現するように操作された宿主細胞を提供すること（ここで、機能的相同体は、配列番号：１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有し、ここで、前記宿主細胞は、目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含む）；及び
−宿主細胞を、目的タンパク質を発現するための好適な条件下で培養すること。
【００６５】
本発明は、ＫＯ１、ＫＯ２及びＫＯ３遺伝子の２つ又は全ての過小発現を包含する。本発明はまた、目的タンパク質を製造するための組換え宿主細胞であって、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも２、３以上のポリヌクレオチドを過小発現するように操作されており、機能的相同体が、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する宿主細胞を包含する。いくつかの実施態様において、宿主細胞において、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体から選択されるＫＯタンパク質の２、３、４、５、６以上が過小発現される。機能的相同体は、ＫＯタンパク質の生物学的に活性な断片であり得る。一般に、タンパク質の生物学的に活性な断片は、完全長タンパク質の生物学的効果に類似する又は匹敵する生物学的効果を発揮する断片を意味するものとする。そのような断片又はバリアントは、例えば、アミノ及び／又はカルボキシ末端の欠失によって並びに内部欠失によって産生され得る。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１−１】ＨＰ１、ＨＰ２、ＨＰ３、ＨＰ４、ＨＰ５、ＨＰ６、ＨＰ７、ＨＰ８、ＨＰ９、ＨＰ１０、ＫＯ１、ＫＯ２及びＫＯ３のアミノ酸配列及びポリヌクレオチド配列を示す。
【図１−２】ＨＰ１、ＨＰ２、ＨＰ３、ＨＰ４、ＨＰ５、ＨＰ６、ＨＰ７、ＨＰ８、ＨＰ９、ＨＰ１０、ＫＯ１、ＫＯ２及びＫＯ３のアミノ酸配列及びポリヌクレオチド配列を示す。
【図１−３】ＨＰ１、ＨＰ２、ＨＰ３、ＨＰ４、ＨＰ５、ＨＰ６、ＨＰ７、ＨＰ８、ＨＰ９、ＨＰ１０、ＫＯ１、ＫＯ２及びＫＯ３のアミノ酸配列及びポリヌクレオチド配列を示す。
【図１−４】ＨＰ１、ＨＰ２、ＨＰ３、ＨＰ４、ＨＰ５、ＨＰ６、ＨＰ７、ＨＰ８、ＨＰ９、ＨＰ１０、ＫＯ１、ＫＯ２及びＫＯ３のアミノ酸配列及びポリヌクレオチド配列を示す。
【図１−５】ＨＰ１、ＨＰ２、ＨＰ３、ＨＰ４、ＨＰ５、ＨＰ６、ＨＰ７、ＨＰ８、ＨＰ９、ＨＰ１０、ＫＯ１、ＫＯ２及びＫＯ３のアミノ酸配列及びポリヌクレオチド配列を示す。
【図１−６】ＨＰ１、ＨＰ２、ＨＰ３、ＨＰ４、ＨＰ５、ＨＰ６、ＨＰ７、ＨＰ８、ＨＰ９、ＨＰ１０、ＫＯ１、ＫＯ２及びＫＯ３のアミノ酸配列及びポリヌクレオチド配列を示す。
【図１−７】ＨＰ１、ＨＰ２、ＨＰ３、ＨＰ４、ＨＰ５、ＨＰ６、ＨＰ７、ＨＰ８、ＨＰ９、ＨＰ１０、ＫＯ１、ＫＯ２及びＫＯ３のアミノ酸配列及びポリヌクレオチド配列を示す。
【図１−８】ＨＰ１、ＨＰ２、ＨＰ３、ＨＰ４、ＨＰ５、ＨＰ６、ＨＰ７、ＨＰ８、ＨＰ９、ＨＰ１０、ＫＯ１、ＫＯ２及びＫＯ３のアミノ酸配列及びポリヌクレオチド配列を示す。
【図２−１】モデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ及びＨｙＨＥＬ−Ｆａｂそれぞれの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列及びポリヌクレオチド配列を示す。
【図２−２】モデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ及びＨｙＨＥＬ−Ｆａｂそれぞれの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列及びポリヌクレオチド配列を示す。
【００６７】
発明の項目（Items of the Invention）
１．目的タンパク質を製造するための組換え宿主細胞であって、宿主細胞が、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現するように操作されており、機能的相同体が、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する、宿主細胞。
【００６８】
２．前記のＫＯタンパク質又はその機能的相同体をコードするポリヌクレオチドが、好ましくは過小発現された場合、モデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ（配列番号：２５及び２６）及び／又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂ（配列番号：２９及び３０）の収量を、操作する前の宿主細胞と比較して、好ましくは少なくとも２０％増加させる、項目１の宿主細胞。
【００６９】
３．過小発現が、前記宿主細胞のゲノムからＫＯタンパク質又はその機能的相同体をコードするポリヌクレオチドをノックアウトすることによって達成される、項目１又は２における宿主細胞。
【００７０】
４．過小発現が、宿主細胞においてＫＯタンパク質又はその機能的相同体をコードするポリヌクレオチドを破壊することによって達成される、項目１又は２における宿主細胞。
【００７１】
５．過小発現が、前記のＫＯタンパク質又はその機能的相同体をコードするポリペプチドと作動可能に連結されたプロモーターを破壊することによって達成される、項目１又は２における宿主細胞。
【００７２】
６．過小発現が、転写後遺伝子サイレンシングによって達成される、項目１又は２における宿主細胞。
【００７３】
７．宿主細胞が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）、及びコマガタエラ（Komagataella）、及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）である、先行する項目のいずれか１つにおける宿主細胞。
【００７４】
８．目的タンパク質が、酵素、治療用タンパク質、食品添加物又は飼料添加物、好ましくは解毒酵素である、先行する項目のいずれか１つの宿主細胞。
【００７５】
９．治療用タンパク質が、抗体又は抗体断片を含む、項目８の宿主細胞。
【００７６】
１０．前記のＫＯタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、好ましくは過小発現された場合、モデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ（配列番号：２５及び２６）及び／又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂ（配列番号：２９及び３０）の収量を、操作する前の宿主細胞と比較して、好ましくは少なくとも２０％増加させる、先行する項目のいずれかにおける宿主細胞。
【００７７】
１１．前記のＫＯタンパク質又はその機能的相同体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現し、そして、目的タンパク質を発現する、先行する項目のいずれか１つにおける宿主細胞。
【００７８】
１２．ヘルパータンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、先行する項目のいずれか１つにおける宿主細胞。
【００７９】
１３．ヘルパータンパク質が、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１６２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有し、機能的相同体が、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１６２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する、項目１２の宿主細胞。
【００８０】
１４．ヘルパータンパク質又はその機能的相同体を発現又は過剰発現するように操作される、項目１２又は１３の宿主細胞。
【００８１】
１５．以下のように操作される、先行する請求項のいずれか一項に記載の宿主細胞。
（ｉ）配列番号：１０又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過小発現し、かつ配列番号：１又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するヘルパータンパク質及び配列番号：２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現するようにさらに操作される、又は
（ｉｉ）配列番号：１０又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過小発現し、かつ配列番号：４又はその機能的相同体及び配列番号：１又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現するようにさらに操作される。
【００８２】
１６．ＫＯタンパク質１又はその機能的相同体を発現する細胞を提供し、そして、当該細胞を、ＫＯ１をコードする遺伝子を過小発現するように操作することによって得られる、宿主細胞。
【００８３】
１７．ＫＯタンパク質２又はその機能的相同体を発現する細胞を提供し、そして、当該細胞を、ＫＯ２をコードする遺伝子を過小発現するように操作することによって得られる、宿主細胞。
【００８４】
１８．ＫＯタンパク質３又はその機能的相同体を発現する細胞を提供し、そして、当該細胞を、ＫＯ３をコードする遺伝子を過小発現するように操作することによって得られる、宿主細胞。
【００８５】
１９．目的タンパク質を製造するための、先行する項目のいずれか１つにおける宿主細胞の使用。
【００８６】
２０．宿主細胞における目的タンパク質の収量を増加させる方法であって、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現させることを含み、機能的相同体が、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する、方法。
【００８７】
２１．以下を含む、宿主細胞における目的タンパク質の収量を増加させる方法：
−宿主細胞を、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現するように操作すること（ここで、機能的相同体は、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する）、
−前記宿主細胞において、目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを組換えること、
−前記宿主細胞を、目的タンパク質を発現するための好適な条件下で培養すること、並びに場合により
−細胞培養物から目的タンパク質を単離すること。
【００８８】
２２．以下を含む、宿主細胞において目的タンパク質を産生する方法：
−配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現するように操作された宿主細胞を提供すること（ここで、機能的相同体は、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有し、ここで、前記宿主細胞は、目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含む）；
−宿主細胞を、目的タンパク質を発現するための好適な条件下で培養すること、並びに場合により
−細胞培養物から目的タンパク質を単離すること。
【００８９】
２３．過小発現が、前記宿主細胞のゲノムからＫＯタンパク質又はその機能的相同体をコードするポリヌクレオチドをノックアウトすることによって達成される、項目２０〜２２のいずれか１つにおける方法。
【００９０】
２４．過小発現が、宿主細胞においてＫＯタンパク質又はその機能的相同体をコードするポリヌクレオチドを破壊することによって達成される、項目２０〜２２のいずれか１つにおける方法。
【００９１】
２５．過小発現が、前記のＫＯタンパク質又はその機能的相同体をコードするポリペプチドと作動可能に連結されたプロモーターを破壊することによって達成される、項目２０〜２３のいずれか１つにおける方法。
【００９２】
２６．過小発現が、転写後遺伝子サイレンシングによって、好ましくはＫＯタンパク質をコードするポリヌクレオチドからの転写産物に結合する異種ＲＮＡ配列の発現によって達成される、項目２０〜２４のいずれか１つにおける方法。
【００９３】
２７．宿主細胞が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）、及びコマガタエラ（Komagataella）、及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）である、項目２０〜２６のいずれか１つにおける方法。
【００９４】
２８．目的タンパク質が、酵素、治療用タンパク質、食品添加物又は飼料添加物、好ましくは解毒酵素である、項目２０〜２７のいずれかにおける方法。
【００９５】
２９．治療用タンパク質が、抗体又は抗体断片を含む、項目２８の方法。
【００９６】
３０．前記のＫＯタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、好ましくは過小発現された場合、モデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ（配列番号：２５及び２６）及び／又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂ（配列番号：２９及び３０）の収量を、操作する前の宿主細胞と比較して、好ましくは少なくとも２０％増加させる、項目２０〜２９のいずれかの方法。
【００９７】
３１．宿主細胞が、少なくとも１つのヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、項目２０〜３０のいずれか１つにおける方法。
【００９８】
３２．ヘルパータンパク質が、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１６２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有し、機能的相同体が、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１６２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する、項目３１の方法。
【００９９】
３３．宿主細胞が、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１６２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するヘルパータンパク質を発現又は過剰発現するように操作され、機能的相同体が、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１６２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する、項目３１又は３２のいずれか１つの方法。
【０１００】
３４．目的タンパク質の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％と項目１３に定義されるとおりのヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む組成物であって、前記ポリヌクレオチドが、異種プロモーターと作動可能に連結される、組成物。
【０１０１】
発明の詳細な説明
本発明は、宿主細胞におけるＫＯ１、ＫＯ２及び／又はＫＯ３遺伝子の操作に関する。驚くべきことに、操作された宿主が、発現された目的タンパク質を産生する増加した能力を有することが見出された。
【０１０２】
第一の態様において、本発明は、目的タンパク質を製造するための組換え宿主細胞であって、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１、例えば少なくとも２、又は少なくとも３つのポリヌクレオチドを過小発現するように操作されており、機能的相同体が、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する宿主細胞を提供する。
【０１０３】
本発明の目的のために、用語「ＫＯタンパク質」はまた、ＫＯ１、ＫＯ２、又はＫＯ３の機能的相同体を包含することも意味する。
【０１０４】
ＫＯタンパク質１
パン酵母におけるＦＬＯ８の機能は、おそらく、二倍体フィラメント体の成長及び半数体の浸潤性成長及び凝集に必要な転写活性因子である。酵母又は宿主細胞においてタンパク質産生の増加した収量を導くことがこれまで示唆されていなかった。
【０１０５】
ＫＯタンパク質２
ＫＯ２は、パン酵母において、コシャペロンＨＣＨ１をコードする。いくつかの酵母におけるＨＣＨ１がＨｓｐ９０機能を調節することが見出された（Armstrong et al., PLoS One. 2012;7(11):e49322.）。このタンパク質の過小発現が宿主細胞におけるＰＯＩの増加した収量を導くことが今まで示唆されていなかった。
【０１０６】
ＫＯタンパク質３
ＫＯタンパク質３は、パン酵母において、細菌シャペロンＤｎａＪの数種の相同体の１つをコードする。このタンパク質の過小発現が宿主細胞におけるＰＯＩの増加した収量を導くことが今まで示唆されていなかった。
【０１０７】
シャペロン（ＫＯ２、ＫＯ３）から、過剰発現が有益であると期待しただろうが、実際には、それは正の効果を有する欠失である。パン酵母における凝集で役割を担うＫＯ１について、その欠失がタンパク質分泌を増大させることは期待しなかったであろう。パン酵母における凝集は、交配に関係なく、細胞が植物の成長段階で可逆的に集合する場合の現象である。しかしながら、当業者はほとんど、凝集遺伝子をノックアウトすることがタンパク質分泌を増大させると想定しなかったであろう。
【０１０８】
「配列同一性」又は「％の同一性」は、標準化アルゴリズムを使用してアラインされた少なくとも２つのポリペプチド又はポリヌクレオチド配列間の残基の一致の百分率を指す。そのようなアルゴリズムは、２つの配列間のアライメントを最適化するために、比較される配列中にギャップを標準化された再現可能な様式で挿入し、それによって２つの配列のより有意義な比較を達成し得る。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列又はヌクレオチド間の配列同一性は、NCBI BLAST プログラムバージョン 2.2.29（Jan-06-2014）（Altschul et al., Nucleic Acidss Res. (1997) 25:3389-3402）を使用して決定される。２つのアミノ酸配列の配列同一性は、以下のパラメーターでblastpセットを用いて決定され得る：Matrix: BLOSUM62, Word Size: 3; Expect value: 10; Gap cost: Existence = 11, Extension = 1; Filter = low complexity activated; Filter String: L; Compositional adjustments: Conditional compositional score matrix adjustment。本発明の目的のために、２つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、以下のパラメーターでblastnセットを用いて、NCBI BLAST プログラムバージョン 2.2.29（Jan-06-2014）を使用して決定される：Word Size: 11; Expect value: 10; Gap costs: Existence = 5 , Extension = 2; Filter = low complexity activated; Match/Mismatch Scores: 2,-3; Filter String: L; m。
【０１０９】
宿主細胞
本明細書において使用されるとおり、「宿主細胞」は、タンパク質発現及び場合によりタンパク質分泌が可能である細胞を指す。そのような宿主細胞が本発明の方法に適用される。その目的のために、ポリペプチドを発現する宿主細胞について、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が細胞中に存在するか又は導入される。本発明によって提供される宿主細胞は、原核生物又は真核生物であることができる。当業者によって理解されるとおり、原核生物細胞は膜結合核を欠いているが、真核生物細胞は膜結合核を有する。真核生物細胞の例は、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、線虫細胞、昆虫細胞、幹細胞、真菌細胞又は酵母細胞を含むが、それらに限定されない。
【０１１０】
酵母細胞の例は、サッカロミセス（Saccharomyces）属（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ウバルム（Saccharomyces uvarum））、コマガタエラ（Komagataella）属（コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）、コマガタエラ・シュードパストリス（Komagataella pseudopastoris）又はコマガタエラ・ファフィ（Komagataella phaffii））、クルイベロミセス（Kluyveromyces）属（例えば、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus））、カンジダ（Candida）属（例えば、カンジダ・ユチリス （Candida utilis）、カンジダ・カカオイ（Candida cacaoi））、ゲオトリクム（Geotrichum）属（例えば、ゲオトリカム・ファーメンタンス（Geotrichum fermentans））、並びにハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）及びヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）を含むが、それらに限定されない。
【０１１１】
Pichia属が特に興味深い。Pichiaは、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）、及びピキア・アングスタ（Pichia angusta）種を含む、多数の種を含む。最も好ましいのは、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）種である。
【０１１２】
前者のピキア・パストリス（Pichia pastoris）種は、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）及びコマガタエラ・ファフィ（Komagataella phaffii）に分類及び改名されている。このため、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）は、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）及びコマガタエラ・ファフィ（Komagataella phaffii）の両方の同義語である。
【０１１３】
本発明において有用なピキア・パストリス（Pichia pastoris）株についての例は、Ｘ３３及びそのサブタイプＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ；ＣＢＳ７４３５（ｍｕｔ＋）及びそのサブタイプＣＢＳ７４３５  ｍｕｔｓ、ＣＢＳ７４３５  ｍｕｔｓΔＡｒｇ、ＣＢＳ７４３５  ｍｕｔｓΔＨｉｓ、ＣＢＳ７４３５  ｍｕｔｓΔＡｒｇ、ΔＨｉｓ、ＣＢＳ７４３５  ｍｕｔｓ  ＰＤＩ＋、ＣＢＳ  ７０４（＝ＮＲＲＬ  Ｙ−１６０３＝ＤＳＭＺ  ７０３８２）、ＣＢＳ  ２６１２（＝ＮＲＲＬ  Ｙ−７５５６）、ＣＢＳ  ９１７３−９１８９及びＤＳＭＺ  ７０８７７並びにその突然変異体である。
【０１１４】
大腸菌（E. coli）の例は、大腸菌（Escherichia coli）Ｋ１２株に由来するもの、具体的には、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＮＭ５３３、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｃ６００、ＤＨ１、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、並びにＢ株に由来するもの、具体的にはＢＬ−２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）などを含む。
【０１１５】
さらに好ましい実施態様によれば、宿主細胞は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）及びコマガタエラ（Komagataella）、及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）である。それはまた、ウスチラゴ・メイディス（Ustilago maydis）由来の宿主細胞でもあり得る。
【０１１６】
好ましくは、宿主細胞によって発現されるヘルパータンパク質は、同じ細胞に由来するか、又は同じ種、属若しくはファミリーの細胞から組換えられる。本明細書において使用されるとおり、「組換え」は、ヒトの介入による遺伝物質の変化を指す。典型的には、組換えは、クローニング及び組換えを含む分子生物学（組換えＤＮＡ技術）法による、ウイルス、細胞、プラスミド又はベクター中のＤＮＡ又はＲＮＡの操作を指す。組換え細胞、ポリペプチド、又は核酸は、典型的には、天然に存在する対応物（「野生型」）とどのように異なるかを参照して記載され得る。「組換え細胞」又は「組換え宿主細胞」は、前記細胞にネイティブではない核酸配列を含むように遺伝的に変化された細胞又は宿主細胞を指す。
【０１１７】
用語「製造する（manufacture）」又は「製造すること（manufacturing）」は、現在使用されているとおり、目的タンパク質が発現されるプロセスを指す。「目的タンパク質を製造するための宿主細胞」は、目的タンパク質をコードする核酸配列が導入され得る宿主細胞を指す。本発明の範囲内の組換え宿主細胞は、目的タンパク質をコードする核酸配列を必ずしも含有する必要はない。宿主細胞中へ所望のヌクレオチド配列を挿入するために、例えばキットで宿主細胞が提供され得ることが当業者に理解される。
【０１１８】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用される。用語「ポリペプチド」は、２以上のアミノ酸、典型的には少なくとも３、好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも５０のアミノ酸を含有する、タンパク質又はペプチドを指す。したがって、ポリペプチドは、アミノ酸配列を含み、このため、アミノ酸配列を含むポリペプチドは、本明細書において「ポリペプチド配列を含むポリペプチド」と称されることがある。したがって、本明細書において、用語「ポリペプチド配列」は、用語「アミノ酸配列」と互換的に使用される。
【０１１９】
用語「アミノ酸」は、天然に存在する及び合成のアミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、並びに後に修飾されるそのようなアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタマート、及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合しているα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが天然に存在するアミノ酸と同様に機能する、化学化合物を指す。
【０１２０】
好ましい実施態様において、本発明は、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過小発現するように操作された宿主細胞であって、機能的相同体が、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する宿主細胞を提供し、ここで、過小発現が起こる場合、モデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ（重鎖について配列番号：２５及び軽鎖について配列番号：２６；図２）及び／又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂ（重鎖について配列番号：２９及び軽鎖について配列番号：３０；図２）の収量は、操作する前の宿主細胞と比較して少なくとも１０％増加する。
【０１２１】
本明細書において使用されるとおり、「操作された」宿主細胞は、遺伝的操作を使用して、すなわちヒトの介入によって操作された宿主細胞である。宿主細胞が所与のタンパク質を「過小発現するように操作されている」場合、宿主細胞は、宿主細胞がＫＯタンパク質又は機能的相同体を発現する能力（例えば、操作されていない宿主細胞がもつ）をもはや有さないように操作され、それによって、所与のタンパク質、例えばＰＯＩ又はモデルタンパク質の発現は、操作前の同じ条件下の宿主細胞と比較して増加する。
【０１２２】
「操作する前」は、本発明の宿主細胞の文脈において使用される場合、そのような宿主細胞が、ＫＯタンパク質又はその機能的相同体をコードするポリヌクレオチドが過小発現されるように操作されていないことを意味する。したがって、前記用語はまた、宿主細胞が、ＫＯタンパク質又はその機能的相同体をコードするポリヌクレオチドを過小発現しないこと又はＫＯタンパク質又はその機能的相同体をコードするポリヌクレオチドを過小発現するように操作されていないことも意味する。
【０１２３】
用語「過小発現」は、ＫＯ１、ＫＯ２、ＫＯ３又はその機能的相同体の１以上の機能的発現を抑制又は低下させる任意の方法を含む。この結果、その公知の機能を発揮することができないか又は低下させる。過小発現の手段は、遺伝子サイレンシング（例えば、ＲＮＡｉ遺伝子アンチセンス）、ノックアウトすること、発現レベルを変化させること、発現パターンを変化させること、遺伝子配列を突然変異誘発すること、配列を破壊すること、挿入、付加、突然変異、発現制御配列を修飾することなどを含み得る。本明細書に述べるように、本発明の宿主細胞は、好ましくは、本明細書に定義されるとおりのアミノ酸を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過小発現するように操作される。これは、宿主細胞がそのようなポリヌクレオチドの２以上のコピーを有し得る場合、そのようなポリヌクレオチドの他のコピーがまた過小発現されることを含む。例えば、本発明の宿主細胞は、半数体であり得るだけでなく、二倍体、四倍体又はさらに多くの染色体数であり得る。したがって、好ましい実施態様において、そのようなポリヌクレオチドの全てのコピー、例えば２、３、４，５、６又はさらに多くのコピーが過小発現される。
【０１２４】
過小発現の方法
好ましくは、過小発現は、宿主細胞においてＫＯタンパク質をコードするポリヌクレオチドをノックアウトすることによって達成される。遺伝子は、コーディング配列の全体又は一部を欠失させることによってノックアウトされ得る。遺伝子ノックアウト体を作製する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Kuhn and Wurst (Eds.) Gene Knockout Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press (March 27, 2009) を参照のこと。遺伝子はまた、遺伝子配列の一部又は全てを除去することによってノックアウトされ得る。代替的に、遺伝子は、耐性遺伝子などのヌクレオチド配列の挿入によってノックアウト又は不活性化され得る。代替的に、遺伝子は、そのプロモーターを不活性化することによってノックアウト又は不活性化され得る。
【０１２５】
ある実施態様において、過小発現は、宿主細胞において遺伝子をコードするポリヌクレオチドを破壊することによって達成される。
【０１２６】
「破壊」は、破壊する前の元々の配列と比較して、１以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換を生じたヌクレオチド又はアミノ酸配列の変化である。
【０１２７】
「挿入」又は「付加」は、破壊する前の元々の配列と比較して、１以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基が付加された核酸又はアミノ酸配列の変化である。
【０１２８】
「欠失」は、１以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基がそれぞれ除去されている（すなわち、存在しない）、ヌクレオチド又はアミノ酸配列のいずれかの変化として定義される。欠失は、配列全体の欠失、コーディング配列の一部の欠失、又は単一のヌクレオチド若しくはアミノ酸残基の欠失を包含する。
【０１２９】
「置換」は、一般に、ヌクレオチド又はアミノ酸残基の、他のヌクレオチド又はアミノ酸残基での置き換えを指す。「置換」は、部位特異的突然変異、ランダム突然変異の生成、及びギャップド・デュプレックス（gapped-duplex）アプローチによって実行され得る
（例えば、米国特許第4,760,025号; Moring et al., Biotech. (1984) 2:646 ; 及び Kramer et al., Nucleic Acids Res., (1984) 12:9441) を参照のこと）。部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーの使用を伴うＰＣＲによってインビトロで成し遂げられ得る。部位特異的突然変異誘発はまた、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド中のある部位での制限酵素による開裂、その後のポリヌクレオチド中の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドのライゲーションを伴う、カセット突然変異誘発によってインビトロで実施され得る。通常、プラスミド及びオリゴヌクレオチドを消化する制限酵素は同じであり、それによってプラスミドのスティッキー末端とインサートを互いにライゲートすることが可能である。例えば、Scherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; 及び Barton et ai, 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966 を参照のこと。部位特異的突然変異誘発はまた、当技術分野において公知の方法によってインビボで成し遂げられ得る。例えば、米国特許出願公報第2004/0171154号；Storici et ai, 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et ai, 1998, Nat. Med. 4: 285-290; 及び Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16 を参照のこと。合成遺伝子構築法は、目的のポリペプチドをコードする設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成を伴う。遺伝子合成は、Tian等によって記載されている多重マイクロチップベース技術（2004, Nature 432: 1050-1054）並びに光プログラム可能なマイクロ流体チップ上でオリゴヌクレオチドが合成及び構築される類似の技術などの、多数の技術を利用して実施され得る。単一又は多重のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入は、突然変異誘発、組換え、及び／又はシャッフリングの公知の方法を使用し、続いて、Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241:53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; 又は WO 95/22625 に開示されている手順などの妥当なスクリーニング手順によって実施及び試験され得る。使用され得る他の方法は、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Lowman et al, 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; 米国特許第5,223,409号; WO 92/06204）及び領域特異的（region-directed）突然変異誘発（Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7:127）を含む。突然変異誘発／シャッフリング法は、ハイスループット自動スクリーニング法と組み合わされて、宿主細胞によって発現されたクローン化された突然変異ポリペプチドの活性を検出することができる（Ness et a/., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896）。活性ポリペプチドをコードする突然変異ＤＮＡ分子は、当技術分野における標準的な方法を使用して、宿主細胞から回収され、迅速に配列決定され得る。これらの方法は、ポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な決定を可能にする。半合成遺伝子構築法は、合成遺伝子構築法、及び／又は部位特異的突然変異誘発、及び／又はランダム突然変異誘発、及び／又はシャッフリングの態様を組み合わせることによって成し遂げられる。半合成構築法は、ＰＣＲ技術と組み合わされる、合成されたポリヌクレオチド断片を利用するプロセスに代表される。したがって、遺伝子の規定の領域は、デノボで合成され得、一方で、他の領域は部位特異的突然変異誘発プライマーを使用して増幅され得、一方で、さらに他の領域は、エラープローンＰＣＲ又は非エラープローンＰＣＲ増幅に供され得る。次いで、ポリヌクレオチドサブ配列がシャッフリングされ得る。代替的に、相同体は、近縁又は遠縁の微生物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることなどによって、天然源から得られ得る。
【０１３０】
好ましくは、破壊は、結果として、フレームシフト突然変異、早期停止コドン（early stop codon）、重要な残基の点突然変異、意味のない又はそうでなければ非機能的なタンパク質産物の翻訳を生じる。
【０１３１】
別の実施態様において、過小発現は、前記のＫＯタンパク質をコードするポリペプチドと作動可能に連結されたプロモーターを破壊することによって達成される。プロモーターは、下流遺伝子の転写を指示する。プロモーターは、所与の遺伝子を発現するために、リボソーム結合部位、転写開始配列及び停止配列、翻訳開始配列及び停止配列、並びにエンハンサー配列又は活性化配列などの他の発現制御配列と一緒に必要である。このため、ＫＯタンパク質をコードするポリペプチドの発現を妨害するために発現制御配列のいずれかを破壊することも可能である。
【０１３２】
核酸は、同じ核酸分子上の別の核酸配列と機能的関係にある場合に「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターは、そのコーディング配列の発現を実行することが可能である場合に、組換え遺伝子のコーディング配列と作動可能に連結される。
【０１３３】
別の実施態様において、過小発現は、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）によって達成される。当技術分野において一般的に使用される技術であるＰＴＧＳは、破壊を必要する遺伝子に対して高頻度にアンチセンスな異種ＲＮＡ配列の発現を介して、遺伝子の発現レベルを減少させる（Lechtreck et al., J. Cell Sci (2002). 115:1511-1522; Smith et al., Nature (2000). 407:319-320; Furhmann et al., J. Cell Sci (2001). 114:3857-3863; Rohr et al., Plant J (2004). 40(4):611-21）。転写後遺伝子サイレンシングは、典型的には、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ｓｉＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡを含む低分子ＲＮＡを使用して特定のｍＲＮＡ分子の破壊を引き起こすことによって、ＲＮＡ分子が遺伝子発現を阻害する、生物学的プロセスである。遺伝子サイレンシングは、転写の遮断（遺伝子結合の場合）、ｍＲＮＡ転写産物の分解（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はＲＮａｓｅ−Ｈ依存性アンチセンスによる）、又は、ｍｉＲＮＡを含む、他の機能性ＲＮＡの成熟に使用されるｍＲＮＡ翻訳、プレ−ｍＲＮＡスプライシング部位、若しくはヌクレアーゼ切断部位のいずれかの遮断（例えば、モルホリノオリゴ又は他のＲＮａｓｅ−Ｈ非依存性アンチセンスによる）のいずれかを通して起こり得る。これらの低分子ＲＮＡは、他の特定のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に結合して、例えばｍＲＮＡがタンパク質を産生することを抑制することによって、それらの活性を減少させることができる。例示的なｓｉＲＮＡ分子は、約１０〜５０以上のヌクレオチド長を有する。低分子ＲＮＡ分子は、ターゲット特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を指示する、ターゲットｍＲＮＡ配列に「十分に相補な」配列を有する少なくとも１つの鎖を含む。低分子干渉ＲＮＡは、細胞内に由来し得るか又は細胞内に外から導入され得る。細胞内に導入されたら、外因性ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって処理される。ｓｉＲＮＡは、発現抑制されるべきターゲットｍＲＮＡに相補的であり、そして、ＲＩＳＣは、ターゲットｍＲＮＡの位置を特定するためのテンプレートとしてｓｉＲＮＡを使用する。ＲＩＳＣがターゲットｍＲＮＡの位置を特定した後、ＲＮＡはリボヌクレアーゼによって切断され得る。その鎖は、ＲＮＡｉ機構又はプロセスによってターゲットｍＲＮＡの破壊を誘発するのに十分な配列を有し、二本鎖ｓｉＲＮＡ（ds-siRNA）分子の文脈において通常アンチセンス鎖と称される。ｓｉＲＮＡ分子は、全ての残基がターゲット分子中の残基と相補的であるように設計され得る。ＰＴＧＳは、多くの生物において見出される。酵母細胞について、分裂酵母であるシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）は、ヘテロクロマチン形成及びセントロメア静止に関与する活性なＲＮＡｉ経路を有する（Raponi et al., Nucl. Acids Res. (2003) 31 (15): 4481-4489）。また、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）及びクリベロマイセス・ポリスポラス（Kluyveromyces polysporus）を含むいくつかの出芽酵母もそのようなＲＮＡｉ経路を有することが見出された（Bartel et la., Science Express doi:10.1126/ science.1176945, published online 10 September 2009）。「過小発現」は、遺伝���発現を低下させる当技術分野において任意の公知の技術で達成され得る。例えば、ＫＯタンパク質をコードするポリペプチドと作動可能に連結されたプロモーターは、より低いプロモーター活性を有する別のプロモーターと置き換えられ得る。プロモーター活性は、その転写効率によってアッセイされ得る。これは、プロモーターからのｍＲＮＡ転写の量の測定（例えば、ノーザンブロッティング、定量的ＰＣＲによる）によって直接的に、又はプロモーターから発現された遺伝子産物の量の測定によって間接的に決定され得る。
【０１３４】
過小発現は、別の実施態様において、ＫＯタンパク質が機能的になるために適切に折り畳まれることがないように、発現されたＫＯタンパク質のフォールディングに干渉することによって達成され得る。例えば、突然変異を導入して、ＫＯタンパク質のジスルフィド結合形成を排除するか又はαヘリックス及びβシートの形成を破壊することができる。
【０１３５】
目的タンパク質
用語「目的タンパク質」（ＰＯＩ）は、本明細書において使用されるとおり、宿主細胞において組換え技術によって産生されたタンパク質を指す。より具体的には、タンパク質は、宿主細胞において天然に存在しないポリペプチド、すなわち、異種タンパク質であり得るか、又は宿主細胞にネイティブな、すなわち、宿主細胞に相同なタンパク質であり得るかのいずれかであるが、例えば、ＰＯＩをコードする核酸配列を含有する自己複製ベクターを用いた形質転換によって、又は宿主細胞のゲノム中へのＰＯＩをコードする核酸配列の１以上のコピーの組換え技術による組み込みで、又はＰＯＩをコードする遺伝子の発現を制御する１以上の制御配列の、例えば、プロモーター配列の組換え修飾によって産生される。一般に、本明細書において称される目的タンパク質は、当業者に周知の組換え発現の方法によって産生され得る。
【０１３６】
目的タンパク質（ＰＯＩ）に関して制限はない。ＰＯＩは、通常、真核生物又は原核生物のポリペプチド、そのバリアント又は誘導体である。ＰＯＩは、任意の真核生物又は原核生物のタンパク質であることができる。タンパク質は、天然に分泌されるタンパク質又は細胞内タンパク質（すなわち、天然に分泌されないタンパク質）であることができる。本発明はまた、タンパク質の生物学的に活性な断片を含む。別の実施態様において、ＰＯＩは、アミノ酸鎖であり得るか、又は二量体、三量体、ヘテロ二量体、多量体若しくはオリゴマーなどの複合体で存在し得る。
【０１３７】
目的タンパク質は、例えば食品製品、飼料産生物、又は化粧品における、栄養剤、規定食、消化剤、サプリメントとして使用されるタンパク質であり得る。食品製品は、例えば、ブイヨン、デザート、シリアルバー、菓子類、スポーツドリンク、ダイエット製品又は他の栄養製品であり得る。好ましくは、目的タンパク質は、食品添加物である。
【０１３８】
別の実施態様において、目的タンパク質は、動物飼料において使用され得る。ＰＯＩは、マイコトキシン分解酵素などの解毒酵素であり得る。解毒酵素は、毒性を低下させるように毒素を破壊する酵素を意味する。マイコトキシンは、作物に容易に定着する真菌によって産生される有毒の二次代謝産物であり、しばしば作物に損害を与える能力によって特徴付けられ、人及び動物に健康上の問題を引き起こす。マイコトキシン分解酵素は、アフラトキシンデトキシザイム（aflatoxin detoxizyme）、ゼアラレノンエステラーゼ、ゼアラレノンラクトナーゼ、ゼアラレノンヒドロラーゼ、フモニシンカルボキシルエステラーゼ、フモニシンアミノトランスフェラーゼ、アミノポリオールアミンオキシダーゼ、デオキシニバレノールエポキシドヒドロラーゼを含む。ＰＯＩはまた、オクラトキシン誘導体又は麦角アルカロイドを分解する酵素でもあり得る。オクラトキシンは、アスペルギルス （Aspergillus）又はペニシリウム（Penicillium）科の数種の真菌によって二次代謝産物として産生されるマイコトキシンの一群であり、イソクマリンの誘導体からなる弱有機酸である。Ａ、Ｂ及びＣで表示される３種の一般に認識されているオクラトキシンがある。オクラトキシンＡは、オクラトキシンファミリーの最も豊富に存在するメンバーであり、このことから最も一般的に検出されるが、加えて最も毒性が強い。オクラトキシンＡ（ochratoxin A）は、穀物中及び他の高デンプン食物中に存在する腎毒性、催奇形性、肝毒性、及び発癌性のマイコトキシンである。麦角アルカロイドは、アミド結合を含有する化合物であり、例えば、エルゴコルニン、エルゴコルニニン、エルゴクリスチン、エルゴクリスチニン、エルゴクリプチン、エルゴクリプチニン、エルゴメトリン、エルゴシン、エルゴタミン及びエルゴタミニンを含む。これらの化合物は、ヒト及び家畜を含む生きている生物に毒性である。そのような酵素の例は、オクラトキシンアミダーゼ、エルゴタミンヒドロラーゼ、エルゴタミンアミラーゼを含む。動物飼料中のマイコトキシン分解酵素は、飼料のマイコトキシン汚染を制御するのに有用である。
【０１３９】
ＰＯＩのさらなる例は、ラクトフェリン、リゾチーム、ラクトフェリシン、ラクトヘドリン、κ−カゼイン、ハプトコリン、ラクトパーオキシダーゼ、乳タンパク質、急性期タンパク質（例えば、感染に応答して産生動物において通常産生されるタンパク質）、及び低分子抗菌タンパク質（リゾチーム及びラクトフェリンなど）などの抗菌タンパク質を含む。他の例は、殺菌タンパク質、抗ウイルスタンパク質、急性期タンパク質（感染に応答して産生動物において誘導される）、プロバイオティクスタンパク質、静菌タンパク質、及びカチオン性抗菌タンパク質を含む。
【０１４０】
「飼料」は、任意の天然若しくは人工の餌、食事など、又はヒト以外の動物による食べる、摂取する、消化することを意図した若しくはそれに適したそのような食事の成分を意味する。「飼料添加物」は、一般に、飼料中に加えられる物質を指す。それは、典型的には、ビタミン類、ミネラル類、酵素並びに好適な担体及び／又は賦形剤などの１以上の化合物を含む。本発明については、食品添加物は、酵素又は他のタンパク質であり得る。飼料添加物として使用され得る酵素の例は、フィターゼ、キシラナーゼ及びβ−グルカナーゼを含む。「食品」は、任意の天然若しくは人工の餌、食事など、又はヒトによる食べる、摂取する、消化することを意図した若しくはそれに適したそのような食事の成分を意味する。
【０１４１】
「食品添加物」は、一般に、食品中に加えられる物質を指す。それは、典型的には、ビタミン類、ミネラル類、酵素並びに好適な担体及び／又は賦形剤などの１以上の化合物を含む。本発明については、食品添加物は、酵素又はタンパク質であり得る。食品添加物として使用され得る酵素の例は、プロテアーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、トランスグルタミナーゼ、アミラーゼ、β−グルカナーゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ及びラッカーゼを含む。
【０１４２】
いくつかの実施態様において、食品添加物は、例えば以下を含む、抗菌タンパク質である：（ｉ）抗菌乳タンパク質（ヒト又は非ヒトのいずれか）ラクトフェリン、リゾチーム、ラクトフェリシン、ラクトヘドリン、κ−カゼイン、ハプトコリン、ラクトパーオキシダーゼ、α−１−アンチトリプシン、及び免疫グロブリン、例えばＩｇＡ、（ｉｉ）急性期タンパク質、例えばＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）；ラクトフェリン；リゾチーム；血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）；フェリチン；ハプトグロビン（Ｈｐ）；補体２〜９、特に補体３；血清ムコイド；セルロプラスミン（Ｃｐ）；１５−ケト−１３，１４−ジヒドロ−プロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦＭ）；フィブリノーゲン（Ｆｂ）；α（１）−酸糖タンパク質（ＡＧＰ）；α（１）−アンチトリプシン；マンノース結合タンパク質；リポ多糖結合タンパク質；α−２マクログロブリン及び種々のディフェンシン、（ｉｉｉ）セクロピン、マガイニン、ディフェンシン、タキプレシン、パラシンＩ、ブフォリンＩ、ＰＭＡＰ−２３、モロネシジン、アノプリン、ガンビシン、及びＳＡＭＰ−２９などの抗菌ペプチド、並びに（ｉｖ）ＣＡＰ３７、グラニュリシン、分泌型白血球プロテアーゼ阻害剤、ＣＡＰ１８、ユビキシジン、ウシ抗菌タンパク質−１、Ａｃｅ−ＡＭＰ１、タキプレシン、ビッグディフェンシン、Ａｃ−ＡＭＰ２、Ａｈ−ＡＭＰ１、及びＣＡＰ１８を含む他の抗菌タンパク質。
【０１４３】
ＰＯＩは、酵素であり得る。好ましい酵素は、例えば洗剤、デンプン、燃料、織物、パルプ及び紙、油、パーソナルケア製品の製造における、又は、例えば焼き付け、有機合成などのための産業用途に使用され得るものである。そのような酵素の例は、染み抜き及び洗浄用のプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ及びセルロース；デンプンの液状化及び糖化用のプルラナーゼアミラーゼ及びアミログルコシダーゼ；グルコースからフルクトースへの変換用のグルコースイソメラーゼ；シクロデキストリン生産用のシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ；燃料及びデンプン中の粘度（xiscosity）低下用のキシラナーゼ；パン生地安定性及び焼き付けの条件付け用のアミラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、グルコース、オキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、トランスグルタミナーゼ；デニム仕上加工及び綿軟化用の織物製造におけるセルラーゼ；繊維の糊抜き用のアミラーゼ；精練用のペクチン酸リアーゼ；漂白終了用のカタラーゼ；漂白用のラッカーゼ；過剰な染料除去用のペルオキシダーゼ；パルプ及び紙生産におけるリパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、セルロース；エステル交換反応用のリパーゼ並びに脂肪及び油の脂肪加工における脱ガム（de-gumming）用のホスホリパーゼ；有機合成におけるキラルアルコール及びアミドの分割用のリパーゼ；半合成ペニシリンの合成用のアシラーゼ、エナンチオピュアなカルボン酸の合成用のニトリラーゼ；革生産用のプロテアーゼ及びリパーゼ；パーソナルケア製品製造用のアミログルコシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、及びペルオキシダーゼを含む（Kirk et al., Current Opinion in Biotechnology (2002) 13:345-351 を参照のこと）。
【０１４４】
治療用タンパク質
ＰＯＩは、治療用タンパク質であり得る。ＰＯＩは、抗体又は抗体断片、成長因子、ホルモン、酵素、ワクチンなどのような生物医薬物質として好適なタンパク質であり得るが、これらの限定されない。
【０１４５】
ＰＯＩは、天然に分泌されるタンパク質又は細胞内タンパク質（すなわち、天然に分泌されないタンパク質）であり得る。本発明はまた、天然に分泌された又は天然に分泌されないタンパク質の機能的相同体、機能的に等価なバリアント、誘導体及び生物学的に活性な断片の組換え産生を提供する。機能的相同体は、好ましくは、配列が同一であるか又は対応し、かつ配列の機能的特徴を有する。
【０１４６】
ＰＯＩは、ネイティブなタンパク質と構造的に類似し得、そして、ネイティブなタンパク質のＣ末端及びＮ末端のいずれか若しくは両方又は側鎖への１以上のアミノ酸の付加、ネイティブなアミノ酸配列の１つの部位又は多数の異なる部位における１以上のアミノ酸の置換、ネイティブなタンパク質の一方若しくは両方の末端又はアミノ酸配列の１つ若しくはいくつかの部位における１以上のアミノ酸の欠失、あるいは、ネイティブなアミノ酸配列の１以上の部位における１以上のアミノ酸の挿入によって、ネイティブなタンパク質から誘導され得る。そのような修飾は、上に挙げたタンパク質の数種について周知されている。
【０１４７】
好ましくは、目的タンパク質は、哺乳動物のポリペプチドであるか又はさらにより好ましくはヒトポリペプチドである。とりわけ好ましい治療用タンパク質は、哺乳動物に投与され得る、任意のポリペプチド、タンパク質、タンパク質バリアント、融合タンパク質及び／又はその断片を指す。本発明に係る治療用タンパク質が細胞と異種であると予想されるが、その必要はない。本発明の細胞によって産生され得るタンパク質の例は、非限定的に、酵素、調節タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカイン、スキャフォールド結合タンパク質（例えば、アンチカリン）、構造タンパク質、リンホカイン、接着分子、受容体、膜又は輸送タンパク質、並びにアゴニスト若しくはアンタゴニストとして働く及び／又は治療的若しくは診断的用途を有し得る任意の他のポリペプチドである。さらに、目的タンパク質は、ワクチン接種、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質のために使用されるような抗原であり得る。それはまた、当技術分野において公知の任意の好適な抗原結合抗体断片を含むことができる、抗体の抗原結合断片でもあり得る。例えば、抗体断片は、限定されないが、Ｆｖ（ＶＬ及びＶＨを含む分子）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）（ペプチドリンカーによって結合されたＶＬ及びＶＨを含む分子）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（単一の可変ドメイン及び３つのＣＤＲを含む分子）、及びそれらの多価提示物を含み得る。抗体又はその断片は、マウス、ヒト、ヒト化若しくはキメラ抗体又はその断片であり得る。治療用タンパク質の例は、抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、抗体断片（Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジ−ｓｃＦｖ、ビ−ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、二重特異性タンデムｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ナノボディ、ＶＨ、及びＶＬなど）、又はヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、イントラボディ（intrabody）、ミニボディ又はモノボディを含む。
【０１４８】
そのような治療用タンパク質は、インスリン、インスリン様成長因子、ｈＧＨ、ｔＰＡ、サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８など）、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮω又はＩＦＮτ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ＴＮＦα及びＴＮＦβ、ＴＲＡＩＬ；Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１及びＶＥＧＦを含むが、それらに限定されない。
【０１４９】
好ましい実施態様において、タンパク質は、抗体である。用語「抗体」は、エピトープに適合しこれを認識する、特定の形状を有する任意のポリペプチド鎖含有分子構造を含むことを意図し、そこで１以上の非共有結合相互作用がその分子構造とエピトープ間の複合体を安定化させる。原型的な抗体分子は、免疫グロブリンであり、全ての供給源（例えば、ヒト、齧歯動物、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、他の哺乳動物、ニワトリ、他のトリ類など）に由来する、免疫グロブリンの全てのタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど）が「抗体」であると考慮される。多数の抗体コーディング配列が記載されており；そして、他のものは、当技術分野において周知の方法によって作製され得る。
【０１５０】
例えば、抗体又は抗原結合断片は、当技術分野において公知の方法によって産生され得る。一般に、抗体産生細胞は、所望の抗原又は免疫原へ感作される。抗体産生細胞から単離されたメッセンジャーＲＮＡは、ＰＣＲ増幅を使用してｃＤＮＡを作製するためのテンプレートとして使用される。増幅された免疫グロブリンｃＤＮＡの適切な切片の発現ベクター中への挿入によって、初期抗原特異性を保持する、１つの重鎖遺伝子及び１つの軽鎖遺伝子を各々含有するベクターのライブラリーが産生される。コンビナトリアルライブラリーは、重鎖遺伝子ライブラリーと軽鎖遺伝子ライブラリーとを組み合わせることによって構築される。これは、結果として、重鎖及び軽鎖（抗体分子のＦａｂ断片又は抗原結合断片と類似する）を共発現するクローンのライブラリーを生じる。これらの遺伝子を担持するベクターは、宿主細胞中に共トランスフェクトされる。抗体遺伝子合成がトランスフェクトされた宿主中で誘導される場合、重鎖及び軽鎖タンパク質は自己集合して、抗原又は免疫原を用いたスクリーニングによって検出され得る活性な抗体を生成する。
【０１５１】
目的の抗体コーディング配列は、天然配列によってコードされるもの、並びに、遺伝暗号の縮重のために、開示された核酸と配列が同一ではない核酸及びそのバリアントを含む。バリアントポリペプチドは、アミノ酸（ａａ）置換、付加又は欠失を含むことができる。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換、あるいは、グリコシル化部位を変化させるか又は機能にとって必須ではない１以上のシステイン残基の置換若しくは欠失によるミスフォールディングを最小限に抑えるためなどの、非必須アミノ酸を除去する置換であることができる。バリアントは、タンパク質の特定の領域（例えば、機能性ドメイン、触媒性アミノ酸残基など）の生物活性を保持するか又は増大するように設計され得る。バリアントはまた、本明細書に開示されるポリペプチドの断片、特に、生物学的に活性な断片及び／又は機能性ドメインに対応する断片を含む。クローニングされた遺伝子のインビトロ突然変異誘発のための技術は公知である。また、タンパク質分解に対する抵抗性を改善する又は溶解性を最適化する又は治療薬剤としてより適したものにするように、通常の分子生物学的技術を使用して修飾されたポリペプチドも、主題発明に含まれる。
【０１５２】
キメラ抗体は、ある種の抗体産生細胞から得られた可変軽鎖及び重鎖領域（ＶＫ及びＶＨ）と別の種からの定常軽鎖及び重鎖領域とを組み合わせることよる組換え手段によって作製され得る。典型的には、キメラ抗体は、ヒトドメインが優勢である抗体を産生するために、齧歯動物又はウサギの可変領域及びヒトの定常領域を利用する。そのようなキメラ抗体の産生は、当技術分野において周知であり、標準的な手段によって達成され得る（例えば、米国特許第5,624,659号に記載されているとおり）。
【０１５３】
ヒト化抗体は、さらに多くのヒト様免疫グロブリンドメインを含有するように、かつ動物由来抗体の相補性決定領域だけを組み込むように操作される。これは、モノクローナル抗体の可変領域の超可変ループの配列を注意深く検査し、そして、それらをヒト抗体鎖の構造に適合することによって成し遂げられる。表面的には複雑であるが、そのプロセスは実際のところ単純である。例えば、米国特許第6,187,287号を参照のこと。
【０１５４】
免疫グロブリン全体（又はそれらの組換え対応物）に加えて、エピトープ結合部位を含む免疫グロブリン断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は他の断片）が合成され得る。「断片」又は最小免疫グロブリンは、組換え免疫グロブリン技術を利用して設計され得る。例えば、本発明における使用のための「Ｆｖ」免疫グロブリンは、可変軽鎖領域及び可変重鎖領域を合成することによって産生され得る。抗体の組み合わせ、例えば２つの別個のＦｖ特異性を含む二特異性抗体もまた興味深い。
【０１５５】
本発明の方法及び組成物において、免疫グロブリンが、例えば、化学リンカー、検出可能な部分（例えば、蛍光色素、酵素、基質、化学発光部分など）を加えるために、翻訳後修飾され得るか、又は特異的結合部分（例えば、ストレプトアビジン、アビジン、又はビオチンなど）が利用され得る。
【０１５６】
治療用タンパク質のさらなる例は、血液凝固因子（ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ）、フザリウム（Fusarium）由来のアルカリプロテアーゼ、カルシトニン、ＣＤ４受容体ダルベポエチン、ＤＮａｓｅ（嚢胞性線維症）、エリスロポエチン、ユートロピン（ヒト成長ホルモン誘導体）、卵胞刺激ホルモン（フォリトロピン）、ゼラチン、グルカゴン、グルコセレブロシダーゼ（ゴーシェ病）、アスペルギルス・ニガー（A. niger）由来のグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（A. niger）由来のグルコースオキシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子（ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ）、成長ホルモン（ソマトトロピン）、Ｂ型肝炎ワクチン、ヒルジン、ヒト抗体断片、ヒトアポリポタンパク質ＡＩ、ヒトカルシトニン先駆体、ヒトコラゲナーゼＩＶ、ヒト上皮成長因子、ヒトインスリン様成長因子、ヒトインターロイキン６、ヒトラミニン、ヒトプロアポリポタンパク質ＡＩ、ヒト血清アルブミンインスリン、インスリン及び突然変異タンパク質、インスリン、インターフェロンα及び突然変異タンパク質、インターフェロンβ、インターフェロンγ（突然変異タンパク質）、インターロイキン２、黄体形成ホルモン、モノクローナル抗体５Ｔ４、マウスコラーゲン、ＯＰ−１（骨原性、神経保護因子）、オプレルベキン（インターロイキン１１−アゴニスト）、有機ホスホヒドロラーゼ、ＰＤＧＦ−アゴニスト、フィターゼ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、組換えプラスミノゲン活性化因子Ｇ、スタフィロキナーゼ、幹細胞因子、破傷風毒素断片Ｃ、組織プラスミノゲン活性化因子、並びに腫瘍壊死因子を含む（Schmidt, Appl Microbiol Biotechnol (2004) 65:363-372 を参照のこと）。
【０１５７】
リーダー配列
目的タンパク質は、宿主細胞からＰＯＩの分泌を引き起こすリーダー配列と連結され得る。発現ベクター中のそのような分泌リーダー配列の存在は、組換え発現及び分泌を意図するＰＯＩが、天然に分泌されずこのため天然の分泌リーダー配列を欠いているか又はそのヌクレオチド配列がその天然の分泌リーダー配列なしにクローニングされている、タンパク質である場合に必要とされる。一般に、宿主細胞からＰＯＩの分泌を引き起こすのに効果的な任意の分泌リーダー配列が本発明において使用され得る。分泌リーダー配列は、酵母源、例えば酵母α−因子、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＭＦａ、又は酵母ホスファターゼに、哺乳動物若しくは植物源などに由来し得る。適切な分泌リーダー配列の選択は、当業者に明らかである。代替的に、分泌リーダー配列は、発現ベクターにおけるヌクレオチド配列のクローニングの前に、又は天然分泌リーダー配列を含むＰＯＩをコードするヌクレオチド配列が発現ベクター中にクローニングされる前に、当業者に公知の慣用のクローニング技術によって、組換え発現を意図するＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に融合され得る。これらの場合、発現ベクター中の分泌リーダー配列の存在は必要ではない。
【０１５８】
プロモーター
ＰＯＩをコードする配列は、プロモーターに作動可能に連結され得る。用語「プロモーター」は、本明細書において使用されるとおり、特定の遺伝子の転写を容易にする領域を指す。プロモーターは、典型的には、ヌクレオチド配列から発現された組換え産物の量を、プロモーターが存在しない場合に発現された組換え産物の量と比較して増加させる。ある種の生物由来のプロモーターを利用して、別の生物起源の配列からの組換え産物発現を増大させることができる。プロモーターは、当技術分野において公知の方法を使用した相同組換えによって、宿主細胞の染色体中に組み込まれ得る（例えば、Datsenko et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97(12): 6640-6645 (2000)）。加えて、１つのプロモーター要素は、タンデムに結合された複数の配列について発現された生成物の量を増加させることができる。このことから、１つのプロモーター要素は、１以上の組換え産物の発現を増大させることができる。
【０１５９】
プロモーターは、「誘導性プロモーター」又は「構成的プロモーター」であることもできる。「誘導性プロモーター」は、特定の因子の存在又は非存在によって誘導され得るプロモーターを指し、そして、「構成的プロモーター」は、その関連する遺伝子の連続的な転写を可能にする未制御のプロモーターを指す。
【０１６０】
好ましい実施態様において、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターによって駆動される。
【０１６１】
多くの誘導性プロモーターが当技術分野において公知である。多くは、Gatz, Curr. Op. Biotech., 7: 168 (1996) による概説に記載されている（Gatz, Ann. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89 (1997) もまた参照のこと）。例は、テトラサイクリン抑制系、Ｌａｃ抑制系、銅誘導性系、サリチル酸誘導性系（PR1 a系など）、グルココルチコイド誘導性（Aoyama et al., 1997）、アルコール誘導性系、例えば、ＡＯＸプロモーター、及びエクジソーム（ecdysome）誘導性系を含む。また、ベンゼンスルホンアミド誘導性（米国特許第5,364,780号）及びアルコール−誘導性（WO 97/06269及びWO 97/06268）誘導性系、並びにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼプロモーターも含まれる。
【０１６２】
酵母宿主細胞との使用に適するプロモーター配列は、Mattanovich et al., Methods Mol. Biol. (2012) 824:329-58 に記載されており、そして、これは、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ又はＧＡＰ）及びそのバリアント、ラクターゼ（ＬＡＣ）及びガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）のような解糖酵素、ピキア・パストリス（P. pastoris）グルコース−６−リン酸イソメラーゼプロモーター（ＰＰＧＩ）、３−ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＰＧＫ）、グリセロールアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＰＧＡＰ）、翻訳伸長因子プロモーター（ＰＴＥＦ）、及びピキア・パストリス（P. pastoris）エノラーゼ１（ＰＥＮＯ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＰＴＰＩ）、リボソームサブユニットタンパク質（ＰＲＰＳ２、ＰＲＰＳ７、ＰＲＰＳ３１、ＰＲＰＬ１）のプロモーター、アルコールオキシダーゼプロモーター（ＰＡＯＸ）又は修飾された特徴を有するそのバリアント、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼプロモーター（ＰＦＬＤ）、イソクエン酸リアーゼプロモーター（ＰＩＣＬ）、α−ケトイソカプロン酸デカルボキシラーゼプロモーター（ＰＴＨＩ）、ヒートショックタンパク質ファミリーメンバー（ＰＳＳＡ１、ＰＨＳＰ９０、ＰＫＡＲ２）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＧＮＤ１）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＰＭ１）、トランスケトラーゼ（ＰＴＫＬ１）、ホスファチジルイノシトールシンターゼ（ＰＰＩＳ１）、フェロ−Ｏ２−オキシドレダクターゼ（ＰＦＥＴ３）、高親和性鉄パーミアーゼ（ＰＦＴＲ１）、抑制性アルカリホスファターゼ（ＰＰＨＯ８）、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ（ＰＮＭＴ１）、フェロモン応答転写因子（ＰＭＣＭ１）、ユビキチン（ＰＵＢＩ４）、一本鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ＰＲＡＤ２）のプロモーター、ミトコンドリア内膜の主要ＡＤＰ／ＡＴＰキャリアのプロモーター（ＰＰＥＴ９）（WO2008/128701）並びにギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）プロモーターを含む。ＧＡＰプロモーター、ＡＯＸプロモーター、又はＧＡＰ若しくはＡＯＸプロモーターに由来するプロモーターが特に好ましい。ＡＯＸプロモーターは、メタノールによって誘導され得、そして、例えばグルコースによって抑制される。
【０１６３】
好適なプロモーターのさらなる例は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、並びにマルターゼ遺伝子プロモーター（ＭＡＬ）を含む。
【０１６４】
酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Romanos et al, 1992, Yeast 8:423-488 によって記載されている。
【０１６５】
E. coliとの使用に適するプロモーター配列は、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン／ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポタンパク質（ｌｐｐ）プロモーター、及びプラスミド中のλファージＰＬプロモーターを含む。
【０１６６】
実施例に示されるとおり、本発明者らは、遺伝子が過小発現された場合、ＰＯＩ（ＳＤＺ−Ｆａｂ又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂ）の収量が過小発現なしの宿主細胞と比較して少なくとも２０％までであることを発見した。
【０１６７】
好ましい実施態様において、ＫＯ１遺伝子の過小発現は、宿主細胞におけるモデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂの収量を、操作する前の宿主細胞と比較して、少なくとも１％、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は少なくとも２００％以上増加させる。
【０１６８】
好ましい実施態様において、ＫＯ２遺伝子の過小発現は、宿主細胞におけるモデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂの収量を、操作する前の宿主細胞と比較して、少なくとも１％、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は少なくとも２００％以上増加させる。
【０１６９】
好ましい実施態様において、ＫＯ３遺伝子の過小発現は、宿主細胞におけるモデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂの収量を、操作する前の宿主細胞と比較して、少なくとも１％、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は少なくとも２００％以上増加させる。
【０１７０】
好ましい実施態様において、宿主細胞が培養されて目的タンパク質を産生する場合、当該細胞は、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド（ここで、機能的相同体は、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する）を過小発現し、そして、目的タンパク質を発現することが想定される。
【０１７１】
さらなる態様において、本発明は、目的タンパク質を製造するための、操作された宿主細胞の使用を提供する。宿主細胞は、１以上のＰＯＩをコードするポリヌクレオチドを導入するために有利に使用され得、その後、好適な条件下で培養され、ＰＯＩを発現し得る。そのような使用の詳細は、本発明の方法に関する後続の項に記載される。
【０１７２】
ＰＯＩコーディングポリヌクレオチドは、１つのベクター中に関連する遺伝子をライゲーションし、そして、そのベクターで宿主細胞を形質転換することによって、宿主細胞中で組換えられ得る。さらなる教示は、本出願の以下の項に見出され得る。
【０１７３】
一般に、目的タンパク質は、宿主細胞を適切な培地中で培養し、培養物から発現されたＰＯＩを単離し、そして、特に細胞からＰＯＩを分離するための、発現された生成物に適切な方法によってそれを精製することによって産生され得る。
【０１７４】
別の態様において、本発明は、宿主細胞における目的タンパク質の収量を増加させる方法であって、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現させることを含み、機能的相同体が、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する方法を提供する。
【０１７５】
本明細書において使用されるとおり、用語「宿主細胞における目的タンパク質の収量を増加させる」は、目的タンパク質の収量が、同じ培養条件下で同じＰＯＩを発現する同じ細胞と比較した場合に増加するが、ノックアウトタンパク質が過小発現されないことを意味する。
【０１７６】
当業者に理解されるとおり、本ＫＯタンパク質の過小発現は、ＰＯＩの生成物収量を増加させることが示された。このため、増加したとするレベルでＰＯＩを発現した所与の宿主細胞について、本ＫＯタンパク質を過小発現させることによって本発明を適用することが可能である。
【０１７７】
なおさらなる態様において、本発明は、宿主細胞における目的タンパク質の収量を増加させる方法を提供する。本方法は、（ｉ）宿主細胞を、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現するように操作すること（ここで、機能的相同体は、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する）、（ｉｉ）前記宿主細胞において、目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを組換えること、及び（ｉｉｉ）前記宿主細胞を、目的タンパク質を発現するための好適な条件下で培養することを含む。
【０１７８】
本明細書において使用されるとおり、用語「組換えること」は、本明細書において使用されるとおり、本発明の宿主細胞が目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを備える、すなわち、本発明の宿主細胞が目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含有するように操作されることを意味する。これは、例えば、形質転換又はトランスフェクション、又は宿主細胞中へのポリヌクレオチドの導入のための当技術分野において公知の任意の他の好適な技術によって達成され得る。
【０１７９】
ポリヌクレオチド配列（例えば、ＰＯＩをコードする）、プロモーター、エンハンサー、リーダーなどを操作するために使用される手順は、当業者に周知であり、例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)に記載されている。
【０１８０】
ＰＯＩ又はヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチドなどの外来又はターゲットポリヌクレオチドは、種々の手段によって、例えば、相同組換えによって又は組み込み部位で配列を特異的にターゲッティングするハイブリッドリコンビナーゼを使用することによって染色体中に挿入され得る。上述した外来又はターゲットポリヌクレオチドは、典型的には、ベクター（「挿入ベクター」）中に存在する。これらのベクターは、典型的には環状であり、そして、相同組換えに使用される前に線形化される。代替として、外来又はターゲットポリヌクレオチドは、融合ＰＣＲによって結合されたＤＮＡ断片であるか又は合成的に構築されたＤＮＡ断片であり得、その後宿主細胞中で組換えられる。相同なアームに加えて、ベクターはまた、選択又はスクリーニングに適するマーカー、複製起点、及び他の要素を含有し得る。
【０１８１】
ターゲット配列をコードするポリヌクレオチドはまた、発現ベクター上に存在し得る。そのようなベクターは当技術分野において公知であり、既に上述している。発現ベクターにおいて、プロモーターは、異種タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置し、遺伝子の発現を調節する。マルチクローニングベクターは、そのマルチクローニングサイトのためにとりわけ有用である。発現のために、プロモーターは、一般に、マルチクローニングサイトの上流に位置する。ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドの組み込みのためのベクターは、最初にＰＯＩをコードするＤＮＡ配列全体を含有するＤＮＡ構築物を調製し、その後、この構築物を好適な発現ベクター中に挿入するか、又はリーダー配列、ターゲットＤＮＡ配列などの個々の要素に関する遺伝情報を含有するＤＮＡ断片を連続的に挿入し、続いてライゲーションするかのいずれかによって構築され得る。断片の制限及びライゲーションの代替として、付着部位（ａｔｔ）及び組換え酵素に基づいた組換え法が使用され、ＤＮＡ配列がベクター中に挿入され得る。そのような方法は、例えば、Landy (1989) Ann. Rev. Biochem. 58:913-949 に記載されており；当業者に公知である。
【０１８２】
本発明に係る宿主細胞は、ターゲットポリヌクレオチド配列を含むベクター又はプラスミドを細胞中に導入することによって得られ得る。真核生物細胞をトランスフェクト若しくは形質転換する又は原核生物細胞を形質転換するための技術は、当技術分野において周知である。これらは、脂質小胞媒介取り込み、ヒートショック媒介取り込み、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈降）、ウイルス感染（特定すると、例えば、操作アデノウイルスなどの操作ウイルスを使用した）、マイクロインジェクション及びエレクトロポレーションを含むことができる。原核生物の形質転換のために、技術は、ヒートショック媒介取り込み、インタクトな細胞との細菌原形質体融合、マイクロインジェクション及びエレクトロポレーションを含むことができる。植物の形質転換のための技術は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）によるなどのアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介移入、急速に推進されたタングステン又は金マイクロプロジェクト（microprojectile）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション及びポリエチレングリコール（polyethylyne glycol）媒介取り込みを含む。ＤＮＡは、一本鎖又は二本鎖、線状又は環状、弛緩又はスーパーコイルＤＮＡであることができる。哺乳動物細胞をトランスフェクトするための種々の技術については、例えば、Keown et al. (1990) Processes in Enzymology 185:527-537 を参照のこと。
【０１８３】
さらなる態様において、本発明は、宿主細胞において目的タンパク質を製造する方法であって、（ｉ）配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現するように操作された宿主細胞を提供すること（ここで、機能的相同体は、配列番号：１０、１１、１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有し、ここで、前記宿主細胞は、目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含む）；及び（ｉｉ）宿主細胞を、目的タンパク質を発現するための好適な条件下で培養することを含む方法を提供する。本明細書に開示される方法は、前記組換え宿主細胞を、ＰＯＩの発現を可能にする条件下で培養することをさらに含み得ることが理解される。組換えにより産生されたＰＯＩは、次いで、発現系及び発現されるタンパク質の性質、例えば、タンパク質がシグナルペプチドに融合しているか否か及びタンパク質が可溶性であるか若しくは膜に結合しているか否かに応じて、細胞又は細胞培養培地から単離され得る。当業者に理解されるとおり、培養条件は、宿主細胞の種類、特に用いられる発現ベクターを含む要因に従って変わるだろう。シグナルペプチドは、一般に、正に荷電したＮ末端と、それに続く疎水性コアと、それに続くシグナルペプチダーゼとして公知の酵素のための認識部位を含有する。この酵素は、移行の間にタンパク質からシグナルペプチドを開裂する。タンパク質は、小胞体からゴルジ装置へと輸送され、次いで、タンパク質の性質に応じて分泌経路中の多数の経路の１つを進む。タンパク質は、例えば、培養培地中に分泌され得るか又は細胞表面上に保持され得る。細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを含む特定の受容体は、細胞膜上に保持され得るタンパク質の例であり、唯一細胞外ドメインだけが細胞外に位置している。特定の分泌されたタンパク質のリーダー配列は、シグナルペプチドに対してＣ末端に位置するペプチドを含み、シグナルペプチドの開裂の後に成熟目的タンパク質からプロセッシングされる。そのようなリーダーは、しばしばプレプロペプチドと称され、その中で、プレ領域はシグナル配列であり、そして、プロ領域はリーダーの残部を指定する。
【０１８４】
１つの例は、シグナルペプチド（Ｃ末端シグナルペプチダーゼ認識部位ＡｌａＬｅｕＡｌａを含む）と、それに続くＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシング部位を構成する塩基性アミノ酸対ＬｙｓＡｒｇを含有するプロ領域と、その直後にプロ領域のＣ末端にペプチドＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａを含有する、酵母α−因子リーダーである。このリーダーのプロセッシングは、シグナルペプチダーゼによるシグナルペプチドの除去、続く、ＫＥＸ２プロテアーゼによるＬｙｓ残基とＡｒｇ残基間の開裂を伴う。ＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａ残基は、その後、ＳＴＥ１３遺伝子の生成物であるペプチダーゼによって除去される（Julius et al., Cell (1983) 32:839）。酵母α−因子リーダーは、米国特許4,546,082号に記載されている。酵母細胞によって天然に分泌されたタンパク質に由来するシグナルペプチドが、酵母における異種タンパク質の産生のための組換え発現系に用いられている。また、酵母発現系における哺乳動物シグナルペプチドの使用も報告されているが、哺乳動物シグナルペプチドのある種のものは、酵母における異種タンパク質の分泌の促進に効果的ではなかった。
【０１８５】
語句「所望のポリペプチドが発現されるように好適な条件下で培養すること」は、微生物を、所望の化合物を得る又は所望のポリペプチドを得るために適切な又は十分な条件（例えば、温度、圧力、ｐＨ、期間など）下で維持及び／又は成長させることを指す。
【０１８６】
好ましい実施態様において、宿主細胞はまた、ヘルパータンパク質を発現する。ヘルパータンパク質は、本出願の後続の項に記載される。ヘルパー遺伝子及び／又はＰＯＩのための異なるプロモーター及び／又はコピー及び／又は組み込み部位を使用して、ＰＯＩの発現に関する誘導の時点及び強度に対してヘルパー遺伝子の発現が制御され得る。例えば、ＰＯＩ発現の誘導の前に、ヘルパータンパク質が最初に発現され得る。これは、ヘルパータンパク質がＰＯＩ翻訳の開始時に既に存在するという利点を有する。代替的に、ヘルパータンパク質及びＰＯＩは、同時に誘導され得る。
【０１８７】
ＰＯＩ遺伝子での形質転換によって得られる本発明に係る宿主細胞は、好ましくは、異種タンパク質を発現する負担なしに多数の細胞を効率的に成長させる条件で最初に培養され得る。ＰＯＩ発現のために細胞が調製されると、好適な培養条件が選択及び最適化されてＰＯＩが産生される。
【０１８８】
誘導性刺激が適用されるとすぐに活性化され、その制御下で遺伝子の転写を指示する、誘導性プロモーターが使用され得る。誘導性刺激のある成長条件下では、細胞は、通常、標準的な条件下よりもゆっくりと成長するが、培養物が前段階で高細胞数まで既に成長しているため、培養系は全体として多量の異種タンパク質を産生する。誘導性刺激は、好ましくは、適切な薬剤（例えば、ＡＯＸ−プロモーターについてはメタノール）の添加又は適切な栄養素（例えば、ＭＥＴ３−プロモーターについてはメチオニン）の枯渇である。また、エタノール、メチルアミン、カドミウム又は銅、並びに熱又は浸透圧増加剤の添加も発現を誘導することができる。
【０１８９】
本発明に係る宿主を、バイオリアクター中、最適化された成長条件下で培養して、少なくとも１g/L、好ましくは少なくとも１０g/L細胞乾燥重量、より好ましくは少なくとも５０g/L細胞乾燥重量の細胞密度を得ることが好ましい。実験室スケールだけでなく、パイロット又は産業スケールでもそのような収量のＰＯＩを達成するのに有利である。
【０１９０】
本発明によれば、ＫＯタンパク質の過小発現のために、ＰＯＩを高収量で得ることが可能であり、これは、ＰＯＩ（mg）／乾燥バイオマス（ｇ）で測定され、１〜２００、例えば５０〜２００、例えば１００〜２００の範囲であり得、実験室、パイロット及び産業スケールで実現可能である。本発明に係る産生宿主の比収量（specific yield）は、ヘルパータンパク質の過小発現なしの生成物の発現と比較して、好ましくは少なくとも１．１倍、より好ましくは少なくとも１．２倍、少なくとも１．３又は少なくとも１．４倍の増加を提供し、いくつかの場合においては、２倍を超える増加が示され得る。
【０１９１】
本発明に係る宿主細胞は、標準試験、例えばＥＬＩＳＡ、活性アッセイ、ＨＰＬＣ、表面プラズモン共鳴（Biacore）、ウエスタンブロット、キャピラリー電気泳動（Caliper）又はSDS-Pageによって、その発現／分泌能又は収量に関して試験され得る。
【０１９２】
好ましくは、細胞は、好適な炭素源を含有する無機培地中で培養され、それによって単離プロセスが顕著にさらに単純化される。例として、無機培地は、利用可能な炭素源（例えば、グルコース、グリセロール又はエタノール）、多量元素を含有する塩（カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、塩化物、硫酸塩、リン酸塩）及び微量元素を含有する塩（銅、ヨウ化物、マンガン、モリブデン酸塩、コバルト、亜鉛、及び鉄塩、及びホウ酸）を含有する。
【０１９３】
酵母細胞の場合、細胞は、上述した発現ベクター又はプラスミドの１以上で形質転換され、交配して二倍体株を形成し、そして、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅させるために適宜操作された慣用の栄養素培地中で培養され得る。酵母の成長に適する多数の最少培地が当技術分野において公知である。これらの培地のいずれかには、必要に応じて、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、バッファー（ＨＥＰＥＳ、クエン酸及びリン酸バッファーなど）、ヌクレオシド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質、微量元素、ビタミン類、及びグルコース又は等価なエネルギー源が補充され得る。当業者に公知であろう任意の他の必要なサプリメントも適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に使用されたものであり、当業者に公知である。他の種類の宿主細胞のための細胞培養条件もまた公知であり、当業者によって容易に決定され得る。種々の微生物のための培養培地の記載は、例えば、教本“Manual of Methods for General Bacteriology” of the American Society for Bacteriology (Washington D.C, USA, 1981) に含有される。
【０１９４】
細胞は、液体培地中で培養（例えば、維持及び／又は成長）され得、好ましくは、静置培養、試験管培養、振盪培養（例えば、回転振盪培養、振盪フラスコ培養など）、給気撹拌培養、又は発酵などの慣用の培養方法によって、連続的又は断続的のいずれかで培養される。いくつかの実施態様において、細胞は、振盪フラスコ又はディープウェルプレート中で培養される。さらに他の実施態様において、細胞は、バイオリアクター中で（例えば、バイオリアクター培養プロセスで）培養される。培養プロセスは、バッチ、フェッドバッチ及び連続培養方法を含むが、それらに限定されない。用語「バッチプロセス」及び「バッチ培養」は、培地、栄養素、サプリメント添加物などの組成が培養の開始時に設定されて培養の間変化を受けない閉鎖系を指すが、ｐＨ及び酸素濃度などのそのような因子を制御して、過剰な培地酸性化及び／又は細胞死を防止する試みもされ得る。用語「フェッドバッチプロセス」及び「フェッドバッチ培養」は、バッチ培養を指すが、培養が進行するにつれて１以上の基質又はサプリメントが加えられる（例えば、徐々に又は連続的に加えられる）ことは除く。用語「連続プロセス」及び「連続培養」は、既定の培養培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、等量の使用済み又は「調整済み」培地が同時に除去される（例えば、所望の生成物の回収のために）系を指す。種々のそのようなプロセスが開発されており、当技術分野において周知である。
【０１９５】
いくつかの実施態様において、細胞は、約１２〜２４時間培養され、他の実施態様において、細胞は、約２４〜３６時間、約３６〜４８時間、約４８〜７２時間、約７２〜９６時間、約９６〜１２０時間、約１２０〜１４４時間、又は１４４時間よりも長い期間培養される。さらに他の実施態様において、培養は、ＰＯＩの望ましい産生収量に達するのに十分な時間継続される。
【０１９６】
上に挙げた方法は、発現されたＰＯＩを単離する工程をさらに含み得る。ＰＯＩが細胞から分泌される場合、それは、最先端技術を使用して、培養培地から単離及び精製され得る。細胞からのＰＯＩの分泌が一般に好ましく、それは、生成物が、複雑なタンパク質の混合物から（細胞が破壊されて細胞内タンパク質を放出することになる）ではなく、培養液上清から回収されるためである。精製の間にタンパク質分解を阻害するのにフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼ阻害剤が有用であり得、そして、外来の汚染菌の成長を防止するために抗生物質が含まれ得る。組成物は、当技術分野において公知の方法を使用して、濃縮、濾過、透析などされ得る。代替的に、培養された宿主細胞はまた、音波によって又は機械的に、酵素的に若しくは化学的に破裂され、所望のＰＯＩを含有する細胞抽出物が得られ得、そこからＰＯＩが単離及び精製され得る。
【０１９７】
ＰＯＩを得るための単離及び精製方法として、溶解度の差を利用する方法（塩析及び溶媒沈降など）、分子量の差を利用する方法（限外濾過及びゲル電気泳動など）、電荷の差を利用する方法（イオン交換クロマトグラフィーなど）、特異的親和性を利用する方法（親和クロマトグラフィーなど）、疎水性の差を利用する方法（逆相高速液体クロマトグラフィーなど）、並びに等電点の差を利用する方法（等電点電気泳動など）に基づく方法が使用され得る。また発現されてＰＯＩ調製を汚染するであろう任意のヘルパータンパク質を除去するために、特定の精製工程が好ましく用いられる。
【０１９８】
単離及び精製されたＰＯＩは、ウエスタンブロッティング又はその活性についての特定のアッセイなどの慣用の方法によって同定され得る。精製されたＰＯＩの構造は、アミノ酸解析、アミノ末端解析、一次構造解析などによって定義され得る。ＰＯＩが大量にかつ高純度で得られ得ることが好ましく、したがって医薬組成物中の活性成分として又は飼料若しくは食品添加物として使用されるための必要要件に適合する。
【０１９９】
ヘルパータンパク質
本発明の宿主細胞は、ヘルパータンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを追加的に含み得る。当技術分野において公知の任意のヘルパータンパク質が使用され得る。
【０２００】
「ヘルパータンパク質」は、本発明において使用されるとおり、目的タンパク質の発現及び／又は分泌を増大させるタンパク質を意味する。この用語は、広範に理解されるべきであり、シャペロン又はシャペロン様タンパク質に限定されるべきではない。
【０２０１】
ヘルパータンパク質は、例えば、シャペロンであり得る。シャペロンは、一般に、別のタンパク質に結合して、他の不安定なコンフォマーを安定化させる機能を有する。制御された結合及び放出によって、シャペロンは、フォールディング、オリゴマー集合、特定の細胞内コンパートメントへの輸送、又は分解による廃棄であれ、そのインビボでの正確な運命を容易にする。この種類のシャペロンタンパク質は、当技術分野において、例えば、Stanford Genome Database (SGD), http://db. yeastgenome.org or http://www. yeastgenome.orgにおいて公知である。好ましいシャペロンは、真核生物シャペロンであり、とりわけ好ましいシャペロンは、ＡＨＡ１、ＣＣＴ２、ＣＣＴ３、ＣＣＴ４、ＣＣＴ５、ＣＣＴ６、ＣＣＴ１、ＣＣＴ８、ＣＮＳ１、ＣＰＲ３、ＣＰＲ６、ＥＲＯ１、ＥＵＧ１、ＦＭＯ１、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ１２、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ３０、ＨＳＰ４２、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７８、ＨＳＰ８２、ＪＥＭ１、ＭＤＪ１、ＭＤＪ２、ＭＰＤ１、ＭＰＤ２、ＰＤＩ１、ＰＦＤ１、ＡＢＣ１、ＡＰＪ１、ＡＴＰ１１、ＡＴＰ１２、ＢＴＴ１、ＣＤＣ３７、ＣＰＲ７、ＨＳＣ８２、ＫＡＲ２、ＬＨＳ１、ＭＧＥ１、ＭＲＳ１１、ＮＯＢ１、ＥＣＭ１０、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＣ１、ＳＳＥ２、ＳＩＬ１、ＳＬＳ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、ＰＥＲ１、ＰＴＣ２、ＰＳＥ１、ＵＢＩ４及びＨＡＣ１又は短く切断されたイントロン無しのＨＡＣ１（Valkonen et al. 2003, Applied Environ Micro., 69, 2065）、並びにＴＩＭ９、ＰＡＭ１８（ＴＩＭ１４としても公知）及びＣＰ１（ＣＣＴ１としても公知）を含む、酵母シャペロンである。例えば、宿主細胞は、ＢＭＨ２、ＢＦＲ２、ＣＯＧ６、ＣＯＹ１、ＣＵＰ５、ＩＭＨ１、ＫＩＮ２、ＳＥＣ３１、ＳＳＡ４、ＳＳＥ１又はＫＡＲ２をコードするポリヌクレオチドを含み得る（WO2008128701）。
【０２０２】
好ましくは、宿主細胞は、本発明のヘルパータンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、すなわち、ＨＰ１、ＨＰ２、ＨＰ３、ＨＰ４、ＨＰ５、ＨＰ６、ＨＰ７、ＨＰ８、ＨＰ９、ＨＰ１０又はその機能的相同体を含む。本発明のヘルパータンパク質は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１６２及びその機能的相同体のアミノ酸配列を含む。本発明のヘルパータンパク質は、配列番号：１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は１６３のヌクレオチド配列によってコードされ得る。したがって、用語「ヘルパータンパク質」は、ＨＰ１〜ＨＰ１０の文脈において使用される場合、ＨＰ１、ＨＰ２、ＨＰ３、ＨＰ４、ＨＰ５、ＨＰ６、ＨＰ７、ＨＰ８、ＨＰ９及びＨＰ１０並びにＨＰ１、ＨＰ２、ＨＰ３、ＨＰ４、ＨＰ５、ＨＰ６、ＨＰ７、ＨＰ８、ＨＰ９、及びＨＰ１０それぞれの機能的相同体を包含することを意味する。
【０２０３】
本明細書において使用されるとおり、そのようなヘルパータンパク質は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１６２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。ヘルパータンパク質ＨＰ１〜ＨＰ１０のアミノ酸配列は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１６２に列挙される。
【０２０４】
本発明のヘルパータンパク質は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＣＢＳ７４３５株から当初単離された。メチロトローフ酵母ピキア・パストリス（Pichia pastoris）（Komagataella phaffii）ＣＢＳ７４３５は、一般的に使用されるピキア・パストリス（P. pastoris）組換えタンパク質産生宿主の親株である。その完全なゲノム配列は、Kuberl等（J Biotechnol. (2011) 154(4):312-20）に記載されている。本明細書において同定されるヘルパータンパク質をコードするこれらの遺伝子は、タンパク質収量に与える有益効果にこれまで関連付けられていなかった。
【０２０５】
ヘルパータンパク質は、宿主細胞の種若しくは属に対してネイティブであり得るか、あるいは他の原核生物又は真核生物から採取され得るか又はそれに由来し得る。ヘルパータンパク質をコードする外来ＤＮＡ配列は、種々の供給源から、好ましくは、植物、昆虫、真菌又は哺乳動物種から、好ましくはサッカロミセス綱（class of Saccharomycetes）から、好ましくはサッカロミセス目（order of Saccharomycetales）から、好ましくはサッカロミセス科（family of Saccharomycetaceae）から、好ましくはコマガタエラ（genus of Komagataella）属から得られ得る。脊椎動物などの他の生物由来の相同のヌクレオチド配列も使用され得る。
【０２０６】
実施例中の各ヘルパータンパク質のアミノ酸配列及びそれらの対応する名称を以下の表２に列挙する：
【０２０７】
【表２】
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【０２０８】
特に、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）における分泌ヘルパー因子についてのスクリーニングの中から、５５の候補遺伝子を同定し、これらを、最有力候補遺伝子を選択するためにウエットラボ発現実験によって検証した。最有力候補遺伝子は、本明細書に記載されるとおりの２つのモデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ＃９及び／又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂ＃８の収量を、最有力候補遺伝子を過剰発現しないピキア・パストリス（P. pastoris）株（すなわち、本明細書に記載されるとおりの操作する前の宿主細胞）と比較して、２０％以上の程度まで増大させる候補である。この目的のために、５５の遺伝子の中で、９つの最有力候補を同定した。４つの最有力候補、すなわち、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ３−０６０７、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ３−０９３３、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ２−０２２０（ＳＢＨ１）、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ３−０６３９（ＣＰＲ６）は、モデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ及びＨｙＨＥＬ  Ｆａｂの両方の２０％を超える分泌及び／又は発現の増大を示し、そして、５つのさらなる候補（ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ４−０１０８（ＭＸＲ２）、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ１−１２３２、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ１−１２２５（ＭＤＲ１）、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ１−０６６７、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ４−０４４８）は、２つのモデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ及びＨｙＨＥＬ  Ｆａｂ（それぞれ、過剰発現された場合）の１つについて＞２０〜３０％の分泌収量の増大を示した。
【０２０９】
スクリーニングの原理は、ピキア・パストリス（P. pastoris）産生株とピキア・パストリス（P. pastoris）非産生株の転写プロファイルの直接比較であり、これにより５５の遺伝子の同定に至った。これらの遺伝子は、種々の代謝経路に属しており、異なる機能を有し、又は未知の機能すら有し得る。したがって、そのように得られたヘルパー因子の性質に関して、その遺伝子又はそれによってコードされたタンパク質から明らかな指針はない。したがって、潜在的な分泌ヘルパー因子が実条件下で実際にヘルパー因子であるか否かを検証するために、試験を実施しなければならなかった。しかしながら、産生株中のその増大された転写産物の出現によって同定されたという理由だけで、潜在的なヘルパー因子が実際にヘルパー因子であるかは一見明らかではない。事実、潜在的なヘルパー因子がタンパク質分泌に正の効果を有さない又は負の効果さえ有し得る可能性がある。このことは、本発明者等によって、分泌を増大させると十分に期待できる、５５の遺伝子の中から同定されたシャペロンをコードする２つの遺伝子（ＳＣＪ１、ＨＣＨ１）が正反対のものであったことから実際に観察された。したがって、各遺伝子についての試験が必要とされるが、そのおよそ６０の遺伝子の１つによってコードされるどのタンパク質が実際に分泌ヘルパー因子であるかに関する指針は存在しない。
【０２１０】
このことから、「真の」分泌ヘルパー因子の発見は、単純な問題ではなく、発明に関する選択事項であるが、これに対して、本発明者等によって行われたとおりのスクリーニングにおいて同定された単なる遺伝子／タンパク質配列又はタンパク質の機能から入手可能な又は明らかな指針はない。
【０２１１】
また、本明細書に記載されるとおり過剰発現されなければならない最有力候補遺伝子に関して通常でないことは−これらが、典型的な分泌ヘルパー因子ではないこと、すなわち、タンパク質分泌で役割を担うと思われない機能を有するタンパク質をコードする又は未知の機能すら有する遺伝子であることである。
【０２１２】
好ましい実施態様において、宿主細胞は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１６２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するヘルパータンパク質をコードする少なくとも１、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、又は少なくとも９つのポリヌクレオチドを発現又は過剰発現するようにさらに操作され、ここで、機能的相同体は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１６２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する。
【０２１３】
好ましくは、本発明は、目的タンパク質を製造するための組換え宿主細胞であって、配列番号：１に対して少なくとも４０％の配列同一性、配列番号：２に対して４５％の配列同一性、配列番号：３に対して５０％の配列同一性、配列番号：４に対して４５％の配列同一性、配列番号：５に対して５０％の配列同一性、配列番号：６に対して４５％の配列同一性、配列番号：７に対して４０％の配列同一性、配列番号：８に対して４０％の配列同一性、配列番号：９に対して４０％の配列同一性、又は配列番号：１６２に対して４５％の配列同一性を有するアミノ酸を有するヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現するように操作されている宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞が本明細書に記載される方法及び使用に適用される。
【０２１４】
好ましくは、宿主細胞は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１６２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヘルパータンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現又は過剰発現するように操作される。ポリヌクレオチドが宿主細胞中に既に存在している場合、宿主細胞は、後に記載するように、これらが過剰発現されるように操作され得る。
【０２１５】
好ましい実施態様において、本発明によって開示されるヘルパータンパク質の２、３、４、５、６、７、８、９以上のタイプが過剰発現される。例えば、宿主細胞は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１６２又はその機能的相同体から選択されるヘルパータンパク質の２、３、４、５、６、７、８以上を過剰発現するように操作され得、ここで、その機能的相同体は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１６２に対して少なくとも３０％の配列同一性を有するアミノ酸を有する。
【０２１６】
用語「過剰発現する」は、一般に、参照基準によって示された発現レベルよりも大きい又はそれに等しい任意の量を指す。本発明における、用語「過剰発現する」、「過剰発現すること」、「過剰発現された」及び「過剰発現」は、宿主細胞の遺伝的変化の前の又は既定の条件で遺伝的に変化されていない同等な宿主における同じ遺伝子産物又はポリペプチドの発現よりも大きいレベルでの遺伝子産物又はポリペプチドの発現を指す。宿主細胞が所与の遺伝子産物を含まない場合、発現のために宿主細胞に遺伝子産物を導入することが可能であり；この場合、任意の検出可能な発現は、用語「過剰発現」に包含される。しかしながら、宿主細胞がヘルパータンパク質ＨＰ１〜ＨＰ１０又はその機能的相同体を過剰発現することが好ましいが、その必要はない。
【０２１７】
宿主細胞によるヘルパータンパク質の過剰発現
過剰発現は、当業者に公知の任意の方法で達成され得る。一般に、それは、遺伝子の転写／翻訳を増加させることによって、例えば、遺伝子のコピー数を増加させること又は遺伝子の発現と関連する制御配列若しくは部位を変化若しくは修飾することによって達成され得る。例えば、遺伝子は、高い発現レベルに達するために、強い構成的プロモーター及び／又は強いユビキタスプロモーターに作動可能に連結され得る。そのようなプロモーターは、内因性プロモーター又は組換えプロモーターであることができる。代替的に、発現が構成的になるように制御配列を除去することが可能である。プロモーターを、当該遺伝子の発現を増加する又は遺伝子の構成的発現を導く異種プロモーターで置換することが可能である。誘導性プロモーターを追加的に使用して、培養の過程で発現を増加させることが可能である。さらに、過剰発現はまた、例えば、特定の遺伝子の染色体位置を修飾すること、リボソーム結合部位又は転写ターミネーターなどの特定の遺伝子に隣接する核酸配列を変化させること、オープンリーディングフレーム中にフレームシフトを導入すること、遺伝子の転写及び／又は遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性化因子など）を修飾すること、又は当技術分野においてルーチンな特定の遺伝子の発現をデレギュレートする任意の他の従来手段（限定されないが、例えば抑制タンパク質の発現を遮断するためのアンチセンス核酸分子の使用、又は過剰発現されるべき所望の遺伝子の発現を通常抑制する転写因子の遺伝子を欠失若しくは突然変異させることを含む）によって達成され得る。また、ｍＲＮＡの寿命を延長させることも発現のレベルを改善し得る。例えば、特定のターミネーター領域を使用して、ｍＲＮＡの半減期を伸ばし得る（Yamanishi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. (2011) 75:2234 及び US 2013/0244243）。複数の遺伝子のコピーが含まれる場合、遺伝子は、可変のコピー数のプラスミド中に位置するか又は染色体中に組み込まれて増幅されるかのいずれかであり得る。宿主細胞がヘルパータンパク質をコードする遺伝子産物を含まない場合、発現のために宿主細胞中に遺伝子産物を導入することが可能である。この場合、「過剰発現」は、当業者に公知の任意の方法を使用して遺伝子産物を発現することを意味する。
【０２１８】
ヘルパータンパク質をコードするポリペプチドの過剰発現は、当技術分野において公知の他の方法によって、例えば、Marx et al., 2008 (Marx, H., Mattanovich, D. and Sauer, M. Microb Cell Fact 7 (2008): 23)、及び Pan et al., 2011 (Pan et al., FEMS Yeast Res. (2011) May; (3):292-8) によって記載されているとおりそれらの内因性調節領域を遺伝的に修飾することによって達成され得、そのような方法は、例えば、ヘルパータンパク質の発現を増加させる組換えプロモーターの組み込みを含む。形質転換は、Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385 に記載されている。
【０２１９】
当業者は、Martin等（Biotechnology 5, 137-146 (1987)）、Guerrero等（Gene 138, 35-41 (1994)）、Tsuchiya 及び Morinaga（Biotechnology 6, 428-430 (1988)）、Eikmanns等（Gene 102, 93-98 (1991)）、EP 0 472 869、US 4,601,893、Schwarzer 及び Puehler（Biotechnology 9, 84-87 (1991)）、Reinscheid等（Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)）、LaBarre等（Journal of Bacteriology 175, 1001- 1007 (1993)）、WO 96/15246、Malumbres等（Gene 134, 15- 24 (1993)）、JP-A-10-229891、Jensen 及び Hammer（Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) 並びにMakrides（Microbiological Reviews 60, 512-538 (1996)）において、とりわけ遺伝学及び分子生物学の周知の教本において関連性のある説明書を見出すであろう。
【０２２０】
好ましい実施態様によれば、ヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチドは、１細胞当たり単一コピーで又は複数のコピーで提示され得る。そのコピーは、互いに隣接していても離れていてもよい。別の好ましい実施態様によれば、本発明の方法は、宿主細胞のゲノム中への組み込みに適する１以上のプラスミド上に１細胞当たり単一コピーで又は複数のコピーで提供されたヘルパータンパク質をコードする組換えヌクレオチド配列を用いる。そのコピーは、互いに隣接していても離れていてもよい。過剰発現は、１宿主細胞当たり、ポリヌクレオチドの複数のコピー、例えば前記ポリヌクレオチドの２、３、４、５、６以上のコピーを発現させることによって達成され得る。
【０２２１】
ＰＯＩをコードする組換えヌクレオチド配列、並びにヘルパータンパク質をコードするものはまた、１以上の自己複製プラスミド上に１細胞当たり単一コピーで又は複数のコピーで提供され得る。
【０２２２】
代替的に、ＰＯＩをコードする組換えヌクレオチド配列及びタンパク質分泌を増加させるタンパク質をコードする組換えヌクレオチド配列は、同じプラスミド上に１細胞当たり単一コピー又は複数のコピーで存在する。
【０２２３】
ヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる。用語「ゲノム」は、一般に、ＤＮＡ（又は特定のウイルス種についてはＲＮＡ）中にコードされている、生物の遺伝情報全体を指す。それは、染色体中に、プラスミド若しくはベクター上に、又は両方に存在し得る。好ましくは、ヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチドは、前記細胞の染色体中に組み込まれる。
【０２２４】
ヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチドは、その天然遺伝子座中に組み込まれ得る。「天然遺伝子座」は、特定の染色体上の位置を意味し、そこで、ヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば表１に示されるとおりのＨＰ１〜９の天然遺伝子座に位置する。しかしながら、別の実施態様において、ヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチドは、それらの天然遺伝子座ではなく宿主細胞のゲノム中に存在するが、異所的に組み込まれる。用語「異所的な組み込み」は、微生物のゲノム中へのその通常の染色体遺伝子座以外の部位での核酸の挿入、すなわち、所定の又はランダムな組み込みを意味する。別の実施態様において、ヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチドは、その天然遺伝子座中にかつ異所的に組み込まれる。異種組換えを使用して、ランダムな又はターゲッティングできない組み込みを達成することができる。異種組換えは、ＤＮＡ分子と顕著に異なる配列との間の組換えを指す。組換えの方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Boer et al., Appl Microbiol Biotechnol (2007) 77:513-523 に記載されている。また、酵母細胞の遺伝子操作については、Principles of Gene Manipulation and Genomics by Primrose and Twyman (7thedition, Blackwell Publishing 2006) を参照することもできる。
【０２２５】
酵母細胞について、ヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチド及び／又はＰＯＩをコードするポリヌクレオチドは、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＥＮＯ１、ＴＥＦ、ＨＩＳ４（Zamir et al., Proc. NatL Acad. Sci. USA (1981) 78(6):3496-3500）、ＨＯ（Voth et al. Nucleic Acids Res. 2001 June 15; 29(12): e59）、ＴＹＲ１（Mirisola et al., Yeast 2007; 24: 761-766）、Ｈｉｓ３、Ｌｅｕ２、Ｕｒａ３（Taxis et al., BioTechniques (2006) 40:73-78）、Ｌｙｓ２、ＡＤＥ２、ＴＲＰ１、ＧＡＬ１、ＡＤＨ１などの所望の遺伝子座中に挿入され得るか又は５ＳリボソームＲＮＡ遺伝子と統合され得る。
【０２２６】
他の実施態様において、ヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチド及び／又はＰＯＩをコードするポリヌクレオチドは、プラスミド又はベクター中に組み込まれ得る。用語「プラスミド」及び「ベクター」は、自己複製ヌクレオチド配列並びにゲノム組み込みヌクレオチド配列を含む。当業者は、使用される宿主細胞に応じて好適なプラスミド又はベクターを採用することができる。
【０２２７】
好ましくは、プラスミドは、真核生物発現ベクター、好ましくは酵母発現ベクターである。
【０２２８】
好ましくは、プラスミドは、真核生物発現ベクター、好ましくは酵母発現ベクターである。宿主として酵母を使用したプラスミドの例は、ＹＩｐ型ベクター、ＹＥｐ型ベクター、ＹＲｐ型ベクター、ＹＣｐ型ベクター、ｐＧＰＤ−２、ｐＡＯ８１５、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺα、ｐＰＩＣ３Ｋ、ｐＨＷＯ１０、ｐＰＵＺＺＬＥ及び２μmプラスミドを含む。そのようなベクターは、公知であり、例えば、Cregg et al., Mol Biotechnol. (2000) 16(1):23-52 に記載されている。
【０２２９】
プラスミドは、クローニングされた組換えヌクレオチド配列の、すなわち組換え遺伝子の転写、及び好適な宿主生物におけるそれらのｍＲＮＡの翻訳のために使用され得る。プラスミドはまた、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)によって記載されているような当技術分野において公知の方法によって、ターゲットポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノム中に組み込むために使用され得る。「プラスミド」は、通常、宿主細胞中の自己複製起点、選択マーカー、多数の制限酵素開裂部位、好適なプロモーター配列及び転写ターミネーターを含み、その成分は、一緒に作動可能に連結される。目的のポリペプチドコーディング配列は、宿主細胞におけるポリペプチドの発現を提供する転写及び翻訳制御配列に作動可能に連結される。
【０２３０】
ほとんどのプラスミドは、１細菌細胞当たり１コピーのみで存在する。しかしながら、いくつかのプラスミドは、より多くのコピー数で存在する。例えば、プラスミドＣｏｌＥ１は、典型的には、E. coli中の１染色体当たり１０〜２０のプラスミドコピーで存在する。本発明のヌクレオチド配列がプラスミド中に含有される場合、プラスミドは、１宿主細胞当たり２０〜３０、３０〜１００以上のコピー数を有し得る。高いコピー数のプラスミドを用いて、細胞によってヘルパータンパク質を過剰発現させることが可能である。
【０２３１】
大多数の好適なプラスミド又はベクターが当業者に公知であり、多くが市販されている。好適なベクターの例は、Sambrook et al, eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) 及び Ausubel et al, eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1997) に提供されている。
【０２３２】
本発明のベクター又はプラスミドは、酵母の人工染色体を包含し、これは、異種ＤＮＡ配列（例えば、３０００ｋｂほどの大きさのＤＮＡ配列）を含有するように遺伝的に修飾され得る、テロメア、セントロメア、及び複製の起点（複製起点）配列を含有する、ＤＮＡ構築物を指す。
【０２３３】
本発明のベクター又はプラスミドはまた、細菌の人工染色体（ＢＡＣ）を包含し、これは、異種ＤＮＡ配列（例えば、３００ｋｂほどの大きさのＤＮＡ配列）を含有するように遺伝的に修飾され得る、複製配列の起点（Ｏｒｉ）を含有しかつ１以上のヘリカーゼ（例えば、ｐａｒＡ、ｐａｒＢ、及びｐａｒＣ）を含有し得る、ＤＮＡ構築物を指す。
【０２３４】
それらの宿主として大腸菌（Escherichia coli）を使用したプラスミドの例は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＶＣ１１９、ｐＳＰ６４、ｐＳＰ６５、ｐＴＺ−１８Ｒ／−１８Ｕ、ｐＴＺ−１９Ｒ／−１９Ｕ、ｐＧＥＭ−３、ｐＧＥＭ−４、ｐＧＥＭ−３Ｚ、ｐＧＥＭ−４Ｚ、ｐＧＥＭ−５Ｚｆ（−）、及びpBluescript KSTM（Stratagene）を含む。大腸菌（Escherichia coli）における発現に適するプラスミドの例は、ｐＡＳ、ｐＫＫ２２３（Pharmacia）、ｐＭＣ１４０３、ｐＭＣ９３１、及びｐＫＣ３０を含む。
【０２３５】
ヘルパータンパク質及びＰＯＩをコードするポリヌクレオチドは、１つのベクター中に関連する遺伝子を各々ライゲーションすることによって、宿主細胞中で組換えられ得る。遺伝子を担持する単一のベクター、又は、一方がヘルパータンパク質遺伝子を担持し他方がＰＯＩ遺伝子を担持する２つの別々のベクターを構築することが可能である。これらの遺伝子は、そのようなベクター（１つ又は複数）を使用して宿主細胞を形質転換することによって、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ得る。いくつかの実施態様において、ＰＯＩをコードする遺伝子は、ゲノム中に組み込まれ、そして、ヘルパータンパク質をコードする遺伝子は、プラスミド又はベクター中に組み込まれる。いくつかの実施態様において、ヘルパータンパク質をコードする遺伝子は、ゲノム中に組み込まれ、そして、ＰＯＩをコードする遺伝子は、プラスミド又はベクター中に組み込まれる。いくつかの実施態様において、ＰＯＩ及びヘルパータンパク質をコードする遺伝子はゲノム中に組み込まれる。いくつかの実施態様において、ＰＯＩ及びヘルパータンパク質をコードする遺伝子は、プラスミド又はベクター中に組み込まれる。ＰＯＩをコードする複数の遺伝子が使用される場合、ＰＯＩをコードするいくつかの遺伝子はゲノム中に組み込まれ、一方、他のものは同じ又は異なるプラスミド又はベクター中に組み込まれる。ヘルパータンパク質をコードする複数の遺伝子が使用される場合、ヘルパータンパク質をコードする遺伝子のいくつかはゲノム中に組み込まれ、一方、他のものは同じ又は異なるプラスミド又はベクター中に組み込まれる。
【０２３６】
組換え細菌細胞における内因性ポリペプチドの過剰発現は、発現制御配列を修飾することによって達成され得る。発現制御配列は、当技術分野において公知であり、そして、例えば、宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現を提供する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）などを含む。発現制御配列は、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する（Maniatis et al.、Science、236: 1237-1245 (1987)）。例示的な発現制御配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) に記載されている。
【０２３７】
好ましい実施態様において、過剰発現は、ヘルパータンパク質を発現するエンハンサーを使用することによって達成される。転写エンハンサーは、比較的配向及び位置に依存せず、転写ユニットの５’及び３’、イントロン内、並びにコーディング配列自体の内部に見出されている。エンハンサーは、コーディング配列の５’又は３’位置で発現ベクターにスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’部位に位置する。ほとんどの酵母遺伝子は、一般にキャップ部位の数百塩基対内にある唯一１つのＵＡＳを含有し、そして、ほとんどの酵母エンハンサー（ＵＡＳ）は、プロモーターの３’に位置している場合機能することができないが、より高等な真核生物中のエンハンサーは、プロモーターの５’及び３’の両方で機能することができる。
【０２３８】
多くのエンハンサー配列が、現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、ＲＳＶ、ＳＶ４０、ＥＭＣ、エラスターゼ、アルブミン、ａ−フェトタンパク質及びインスリン）から公知である。また、ＳＶ４０後期エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーなどの、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用し得る。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＵＡＳ／Ｇａｌ系などの、上流活性化配列（ＵＡＳ）とも呼ばれる酵母エンハンサーが、酵母プロモーターと共に有利に使用され得る（欧州特許第0317254号及びRudoni et al., The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, (2000), 32(2):215-224 に記載されている）。
【０２３９】
組換え細胞における内因性ポリペプチドの過剰発現は、宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現を提供する転写及び翻訳制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）などを含む）を修飾することによって達成され得る。そのような配列は、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する（Maniatis et al., Science, 236: 1237-1245 (1987））。例示的な配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。ＰＯＩ及び／又はヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、宿主細胞における発現を提供する転写及び翻訳制御配列に作動可能に連結される。用語「転写制御配列」は、本明細書において使用されるとおり、遺伝子核酸配列に関連しかつ遺伝子の転写を制御する、ヌクレオチド配列を指す。用語「翻訳制御配列」は、本明細書において使用されるとおり、遺伝子核酸配列に関連しかつ遺伝子の翻訳を制御する、ヌクレオチド配列を指す。転写及び／又は翻訳制御配列は、プラスミド若しくはベクター中に位置するか又は宿主細胞の染色体中に組み込まれるかのいずれかであり得る。転写及び／又は翻訳制御配列は、それを制御する遺伝子の同じ核酸分子中に位置する。
【０２４０】
例えば、組換え細胞における内因性ヘルパータンパク質の過剰発現は、プロモーターを修飾することによって、例えば、高い発現レベルに達するために、ヘルパータンパク質に作動可能に連結された内因性プロモーターを別のより強いプロモーターに置き換えることによって達成され得る。そのようなプロモーターは、誘導的又は構成的であり得る。内因性プロモーターの修飾は、当技術分野において公知の方法を使用した突然変異又は相同組換えによって実施され得る。
【０２４１】
ヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチドの過剰発現は、当技術分野において公知の他の方法によって、例えば、Marx et al., 2008 (Marx, H., Mattanovich, D. and Sauer, M. Microb Cell Fact 7 (2008): 23)、及び Pan et al., 2011 (Pan et al., FEMS Yeast Res. (2011) May; (3):292-8) によって記載されているとおりそれらの内因性調節領域を遺伝的に修飾することによって達成され得、そのような方法は、例えば、ヘルパータンパク質の発現を増加させる組換えプロモーターの組み込みを含む。形質転換は、Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385 に記載されている。「組換え」プロモーターは、その発現が当該プロモーターによって駆動される配列に関して称される。本明細書において使用されるとおり、組換えプロモーターは、プロモーターが所与の配列に関して天然のプロモーターではない場合、すなわち、プロモーターが天然に存在するプロモーター（「天然のプロモーター」）とは異なる場合を意味する。用語「プロモーター」は、本明細書において使用されるとおり、特定の遺伝子の転写を容易にする領域を指す。プロモーターは、典型的には、ヌクレオチド配列から発現された組換え産物の量を、プロモーターが存在しない場合に発現された組換え産物の量と比較して増加させる。ある種の生物由来のプロモーターを利用して、別の生物起源の配列からの組換え産物発現を増大させることができる。プロモーターは、当技術分野において公知の方法を使用した相同組換えによって、宿主細胞の染色体中に組み込まれ得る（例えば、Datsenko et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97(12): 6640-6645 (2000)）。加えて、１つのプロモーター要素は、タンデムに結合された複数の配列について発現された生成物の量を増加させることができる。このことから、１つのプロモーター要素は、１以上の組換え産物の発現を増大させることができる。
【０２４２】
プロモーター活性活性は、その転写効率によってアッセイされ得る。これは、プロモーターからのｍＲＮＡ転写の量の測定（例えば、ノーザンブロッティング、定量的ＰＣＲによる）によって直接的に、又はプロモーターから発現された遺伝子産物の量の測定によって間接的に決定され得る。
【０２４３】
プロモーターは、「誘導性プロモーター」又は「構成的プロモーター」であることもできる。「誘導性プロモーター」は、特定の因子の存在又は非存在によって誘導され得るプロモーターを指し、そして、「構成的プロモーター」は、その関連する遺伝子の連続的な転写を可能にする未制御のプロモーターを指す。
【０２４４】
好ましい実施態様において、ヘルパータンパク質及びＰＯＩをコードするヌクレオチド配列の両方は、誘導性プロモーターによって駆動される。別の好ましい実施態様において、ヘルパータンパク質及びＰＯＩをコードするヌクレオチド配列の両方は、構成的プロモーターによって駆動される。さらに別の好ましい実施態様において、ヘルパータンパク質をコードするヌクレオチド配列は構成的プロモーターによって駆動され、そして、ＰＯＩは誘導性プロモーターによって駆動される。さらに別の好ましい実施態様において、ヘルパータンパク質をコードするヌクレオチド配列は誘導性プロモーターによって駆動され、そして、ＰＯＩは構成的プロモーターによって駆動される。例として、ＨＰは構成的ＧＡＰプロモーターによって駆動され得、そして、ＰＯＩは誘導性ＡＯＸ１プロモーターによって駆動され得る。１つの実施態様において、ヘルパータンパク質及びＰＯＩをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター活性及び／又は発現挙動の点で同じプロモーター又は類似のプロモーターによって駆動される。
【０２４５】
多くの誘導性プロモーターが当技術分野において公知である。多くは、Gatz, Curr. Op. Biotech., 7: 168 (1996) による概説に記載されている（Gatz, Ann. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89 (1997) もまた参照のこと）。例は、テトラサイクリン抑制系、Ｌａｃ抑制系、銅誘導性系、サリチル酸誘導性系（PR1 a系など）、グルココルチコイド誘導性（Aoyama et al., 1997）、アルコール誘導性系、例えば、ＡＯＸプロモーター、及びエクジソーム（ecdysome）誘導性系を含む。また、ベンゼンスルホンアミド誘導性（米国特許第5,364,780号）及びアルコール−誘導性（WO 97/06269及びWO 97/06268）、並びにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼプロモーターも含まれる。
【０２４６】
酵母宿主細胞との使用に適するプロモーター配列は、Mattanovich et al., Methods Mol. Biol. (2012) 824:329-58 に記載されており、そして、これは、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ又はＧＡＰ）及びそのバリアント、ラクターゼ（ＬＡＣ）及びガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）のような解糖酵素、ピキア・パストリス（P. pastoris）グルコース−６−リン酸イソメラーゼプロモーター（ＰＰＧＩ）、３−ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＰＧＫ）、グリセロールアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＰＧＡＰ）、翻訳伸長因子プロモーター（ＰＴＥＦ）、及びピキア・パストリス（P. pastoris）エノラーゼ１（ＰＥＮＯ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＰＴＰＩ）、リボソームサブユニットタンパク質（ＰＲＰＳ２、ＰＲＰＳ７、ＰＲＰＳ３１、ＰＲＰＬ１）のプロモーター、アルコールオキシダーゼプロモーター（ＰＡＯＸ）又は修飾された特徴を有するそのバリアント、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼプロモーター（ＰＦＬＤ）、イソクエン酸リアーゼプロモーター（ＰＩＣＬ）、α−ケトイソカプロン酸デカルボキシラーゼプロモーター（ＰＴＨＩ）、ヒートショックタンパク質ファミリーメンバー（ＰＳＳＡ１、ＰＨＳＰ９０、ＰＫＡＲ２）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＧＮＤ１）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＰＭ１）、トランスケトラーゼ（ＰＴＫＬ１）、ホスファチジルイノシトールシンターゼ（ＰＰＩＳ１）、フェロ−Ｏ２−オキシドレダクターゼ（ＰＦＥＴ３）、高親和性鉄パーミアーゼ（ＰＦＴＲ１）、抑制性アルカリホスファターゼ（ＰＰＨＯ８）、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ（ＰＮＭＴ１）、フェロモン応答転写因子（ＰＭＣＭ１）、ユビキチン（ＰＵＢＩ４）、一本鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ＰＲＡＤ２）のプロモーター、ミトコンドリア内膜の主要ＡＤＰ／ＡＴＰキャリアのプロモーター（ＰＰＥＴ９）（WO2008/128701）並びにギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）プロモーターを含む。ＧＡＰプロモーター、ＡＯＸプロモーター、又はＧＡＰ若しくはＡＯＸプロモーターに由来するプロモーターが特に好ましい。ＡＯＸプロモーターは、メタノールによって誘導され得、そして、例えばグルコースによって抑制される。
【０２４７】
好適なプロモーターのさらなる例は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、並びにマルターゼ遺伝子プロモーター（ＭＡＬ）を含む。
【０２４８】
酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Romanos et al, 1992, Yeast 8:423-488 によって記載されている。
【０２４９】
E. coliとの使用に適するプロモーター配列は、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン／ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポタンパク質（ｌｐｐ）プロモーター、及びプラスミド中のλファージＰＬプロモーターを含む。
【０２５０】
ヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーターは、好ましくは、ヘルパー遺伝子のプロモーターに対して内因性ではない。好ましくは、組換えプロモーターは、ヘルパータンパク質遺伝子の内因性プロモーターの代わりに使用される。「組換え」プロモーターは、その発現が当該プロモーターによって駆動される配列に関して称される。本明細書において使用されるとおり、組換えプロモーターは、プロモーターが所与の配列に関して天然のプロモーターではない場合、すなわち、プロモーターが天然に存在するプロモーター（「天然のプロモーター」）とは異なる場合を意味する。そのようなプロモーターはまた、本明細書において異種プロモーターと称されることもある。
【０２５１】
好ましい実施態様において、過剰発現は、ヘルパータンパク質の発現を駆動するプロモーター活性を増大させるエンハンサーを使用することによって達成される。転写エンハンサーは、比較的配向及び位置に依存せず、転写ユニットの５’及び３’、イントロン内、並びにコーディング配列自体の内部に見出されている。エンハンサーは、コーディング配列の５’又は３’位置で発現ベクターにスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’部位に位置する。ほとんどの酵母遺伝子は、一般にキャップ部位の数百塩基対内にある唯一１つのＵＡＳを含有し、そして、ほとんどの酵母エンハンサー（ＵＡＳ）は、プロモーターの３’に位置している場合機能することができないが、より高等な真核生物中のエンハンサーは、プロモーターの５’及び３’の両方で機能することができる。
【０２５２】
多くのエンハンサー配列が、現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、ＲＳＶ、ＳＶ４０、ＥＭＣ、エラスターゼ、アルブミン、ａ−フェトタンパク質及びインスリン）から公知である。また、ＳＶ４０後期エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーなどの、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用し得る。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＵＡＳ／Ｇａｌ系などの、上流活性化配列（ＵＡＳ）とも呼ばれる酵母エンハンサーが、酵母プロモーターと共に有利に使用され得る（欧州特許第0317254号及びRudoni et al., The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, (2000), 32(2):215-224 に記載されている）。
【０２５３】
ＫＯタンパク質を過小発現する本宿主細胞が、目的タンパク質及び配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１６２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヘルパータンパク質を発現することが好ましい。
【０２５４】
好ましくは、宿主細胞は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１６２又はその機能的相同体から選択されるヘルパータンパク質の２、３、４、５、６、７、８以上を過剰発現するように操作され得る。好ましい実施態様において、宿主細胞は、（１）ＫＯタンパク質ＫＯ１、ＫＯ２、ＫＯ３又はその機能的相同体の１、２、３以上を過小発現し、そして、（２）ヘルパータンパク質ＨＰ１、ＨＰ２、ＨＰ３、ＨＰ４、ＨＰ５、ＨＰ６、ＨＰ７、ＨＰ８、ＨＰ９、ＨＰ１０又はその機能的相同体の１、２、３、４、５、６、７、８、９以上を過剰発現するように操作され得る。
【０２５５】
しかしながら、ヘルパータンパク質ＨＰ３（配列番号：２）又は機能的相同体とＨＰ１（配列番号：４）又は機能的相同体、又はヘルパータンパク質ＨＰ１０（配列番号：１６２）又は機能的相同体とＨＰ３（配列番号：２）又は機能的相同体の特定の組み合わせは、本発明の方法及び使用に好ましく適用される本発明の宿主細胞の好ましい実施態様である。
【０２５６】
また、ヘルパータンパク質ＨＰ２（配列番号：１）又は機能的相同体とＨＰ３（配列番号：２）又は機能的相同体とＫＯタンパク質ＫＯ１（配列番号：１０）、又はヘルパータンパク質ＨＰ２（配列番号：１）又は機能的相同体とＨＰ１（配列番号：４）又は機能的相同体とＫＯタンパク質ＫＯ１（配列番号：１０）の特定の組み合わせは、本発明の方法及び使用において好ましく適用される本発明の宿主細胞の好ましい実施態様である。
【０２５７】
そのような組み合わせを反映するように操作されている宿主細胞が、好ましい実施態様において想定される。これらの宿主細胞が、本明細書に記載される方法及び使用に好ましく適用される。「反映された（reflected）」は、ヘルパータンパク質が過剰発現され、一方でＫＯタンパク質が過小発現されることを、当業者が本発明の教示に従って知っていることを意味する。
【０２５８】
目的タンパク質を製造するための本宿主細胞が、配列番号：１０、１１、１２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現し、かつ配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１６２又はその機能的相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するヘルパータンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをさらに過剰発現するように操作されることが好ましく、ここで、ヘルパータンパク質の機能的相同体は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１６２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有する。
【０２５９】
好ましい実施態様において、ＫＯタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの過小発現は、ヘルパータンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの過剰発現と協調して、宿主細胞における目的タンパク質、例えばＳＤＺ−Ｆａｂ（配列番号：２５及び２６）又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂ（配列番号：２９及び２０）の収量を、ＫＯタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過小発現するように操作する前の宿主細胞と比較して、少なくとも１％、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は少なくとも２００％以上増加させ得る。
【０２６０】
本発明は、記載される特定の方法論、プロトコール、細胞株、動物種又は属、構築物、及び試薬に限定されず、それ自体は当然ながら変化し得ることが理解されるべきである。また、本明細書において使用される専門用語は、特定の実施態様を記載することだけを目的としており、本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるであろうことが理解されるべきである。
【０２６１】
他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似の又は等価な任意の方法、デバイス及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法、デバイス及び材料をここに記載する。
【０２６２】
本明細書に挙げた全ての刊行物は、その刊行物中に記載されている、例えば細胞株、構築物、及び方法論を記載及び開示することを目的としており、これは、ここに記載した発明と併せて使用され得る。上記及び本明細書全体を通して議論された刊行物は、本出願の出願日の前の開示のために単に提供される。本明細書において、本発明者等が先行発明によって係る開示に先行する資格を有しないことを承認するものと解釈されるべきではない。
【０２６３】
以下の実施例は、主題発明の作製及び使用方法の完全な開示及び記載を当業者に提供するために提示されるものであり、本発明とみなされる及び特許請求の範囲に定義される範囲を限定することを意図するものではない。使用される数（例えば、量、温度、濃度など）に関して正確さを確保するように努めてきたが、いくつかの実験誤差及び偏差は許容されるべきである。特に指示のない限り、部（parts）は、重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度はセルシウス度であり；そして、圧力は大気圧又は近大気圧である。
【０２６４】
実施例
以下の実施例は、新たに同定された遺伝子が、過小発現後、組換えタンパク質の力価（１体積当たりの生成物、mg/L単位）及び収量（１バイオマス当たりの生成物、mg／バイオマス（ｇ）単位、乾燥細胞重量又は湿潤細胞重量として測定される）をそれぞれ増加させることを実証するであろう。例として、酵母ピキア・パストリス（Pichia pastoris）における組換え抗体Ｆａｂ断片及び組換え酵素の収量が増加する。振盪培養（振盪フラスコ又はディープウェルプレートで実行した）及び実験室スケールのフェッドバッチ培養において正の効果が示された。
【０２６５】
実施例１  ピキア・パストリス（P. pastoris）産生株の生成
ａ）抗体Ｆａｂ断片ＨｙＨＥＬを分泌するピキア・パストリス（P. pastoris）株の構築
ピキア・パストリス（P. pastoris）ＣＢＳ７４３５（ＣＢＳ、Kuberl et al. 2011によってゲノム配列決定された）ｍｕｔＳバリアントを宿主株として使用した。ｐＰＭ２ｄ＿ｐＧＡＰ及びｐＰＭ２ｄ＿ｐＡＯＸ発現ベクターは、ｐＵＣ１９細菌複製起点及びゼオシン抗生物質耐性カセットからなる、WO2008/128701A2に記載されるｐＰｕｚｚｌｅ＿ＺｅｏＲベクター骨格の誘導体である。異種遺伝子の発現は、ピキア・パストリス（P. pastoris）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーター又はアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）プロモーターのそれぞれ及びサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）ＣＹＣ１転写ターミネーターによって媒介される。抗体Ｆａｂ断片ＨｙＨＥＬの軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）（図２）を、表３中のＨｙＨＥＬ−ＨＣ及びＨｙＨＥＬ−ＬＣのためのプライマーを使用して、ベクターＤＮＡテンプレート（目的の遺伝子とＮ末端にサッカロミセス・セレビシエ(S. cerevisiae）α接合因子シグナルリーダー配列を担持する)から増幅させ、ＳｂｆＩ及びＳｆｉＩで消化したｐＰＭ２ｄ＿ｐＧＡＰ及びｐＰＭ２ｄ＿ｐＡＯＸの両方のベクター中に各々ライゲーションした。ＬＣ断片を、ｐＰＭ２ｄ＿ｐＧＡＰ及びｐＰＭ２ｄ＿ｐＡＯＸのバリアント中にライゲーションし、そこで後続の線形化を可能にするためにプロモーター領域中の１つの制限酵素部位を別のものに交換し（ｐＰＭ２ｄ＿ｐＧＡＰ中のＡｖｒＩＩの代わりにＮｄｅＩ、ｐＰＭ２ｄ＿ｐＡＯＸ中のＢｐｕ１１０２Ｉの代わりにＢｓｕ３６Ｉ）、ＨＣ断片を、非修飾バージョンのベクター中にライゲーションした。ＬＣ及びＨＣの配列検証後、コンパティブルな制限酵素ＭｒｅＩ及びＡｇｅＩを使用することによって、両方の鎖のための発現カセットを１つのベクター上で組み合わせた。
【０２６６】
プラスミドを、ピキア・パストリス（P. pastoris）へのエレクトロポレーション（Gasser et al. 2013. Future Microbiol. 8(2):191-208 に記載されている標準的な形質転換プロトコールを使用した）の前に、ＮｄｅＩ制限酵素（ｐＰＭ２ｄ＿ｐＧＡＰについて）又はＢｓｕ３６Ｉ制限酵素（ｐＰＭ２ｄ＿ｐＡＯＸについて）をそれぞれ使用して線形化した。陽性の形質転換体の選択を、５０μg/mLのゼオシンを含有するＹＰＤプレート（１リットル当たり：酵母抽出物１０ｇ、ペプトン２０ｇ、グルコース２０ｇ、寒天（agar-agar）２０ｇ）上で実施した。コロニーＰＣＲを使用して、形質転換されたプラスミドの存在を確保した。このため、ゲノムＤＮＡを、ピキア・パストリス（P. pastoris）コロニーをそれぞれ５分間クッキング及び凍結することによって得て、適切なプライマーを用いたＰＣＲに直接適用した。
【０２６７】
ｂ）抗体Ｆａｂ断片ＳＤＺを分泌するピキア・パストリス（P. pastoris）株の構築
抗体Ｆａｂ断片ＳＤＺの軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）（図２）を、表３中のＳＤＺ−ＨＣ及びＳＤＺ−ＬＣのためのプライマーを使用してベクターＤＮＡテンプレート（目的の遺伝子とＮ末端にα接合因子シグナルリーダー配列を担持する）から増幅させ、ＳｂｆＩ及びＳｆｉＩで各々消化した、Ｂｓｕ３６Ｉ制限部位を有するｐＰＭ２ｄ＿ｐＡＯＸ又はｐＰＭ２ｄ＿ｐＡＯＸのバリアントそれぞれへ各々ライゲーションした。ＬＣ及びＨＣの配列検証後、コンパティブルな制限酵素ＭｒｅＩ及びＡｇｅＩを使用することによって、両方の鎖のための発現カセットを１つのベクター上で組み合わせた。
【０２６８】
プラスミドを、ピキア・パストリス（P. pastoris）へのエレクトロポレーション（Gasser et al. 2013. Future Microbiol. 8(2):191-208 に記載されている標準的な形質転換プロトコールを使用した）の前にＢｓｕ３６Ｉ制限酵素を使用して線形化した。陽性の形質転換体の選択を、５０μg/mLのゼオシンを含有するＹＰＤプレート（１リットル当たり：酵母抽出物１０ｇ、ペプトン２０ｇ、グルコース２０ｇ、寒天２０ｇ）上で実施した。コロニーＰＣＲを使用して、形質転換されたプラスミドの存在を確保した。このため、ゲノムＤＮＡを、ピキア・パストリス（P. pastoris）コロニーをそれぞれ５分間クッキング及び凍結することによって得て、適切なプライマーを用いたＰＣＲに直接適用した。
【０２６９】
表３は、ＨｙＨＥＬ  ＬＣ及びＨＣ並びにＳＤＺ  ＬＣ及びＨＣのＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを示す（α−接合因子＿フォワードは、全てのＦａｂ鎖の増幅のためのフォワードプライマーである）
【０２７０】
【表３】
2020072697.tif 000004
【０２７１】
実施例２  ケモスタット培養
１．０Ｌの最大可動体積の１．４ＬのＤＡＳＧＩＰリアクター（Eppendorf, Germany）で培養を実施した。
【０２７２】
以下の培地を使用した：
【０２７３】
ＰＴＭ１微量塩ストック溶液（１リットル当たり）は、以下を含有する：６．０g ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０８g ＮａＩ、３．３６g ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．２g Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２g Ｈ３ＢＯ３、０．８２g ＣｏＣｌ２、２０．０g ＺｎＣｌ２、６５．０g ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び５．０mL Ｈ２ＳＯ４（９５％〜９８％）。
【０２７４】
グリセロールバッチ培地（１リットル当たり）は、以下を含有する：２g クエン酸一水和物（Ｃ６Ｈ８Ｏ７・Ｈ２Ｏ）、３９．２g グリセロール、２０．８g ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、０．５g ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．６g ＫＣｌ、０．０２２g ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．８mg ビオチン及び４．６mL ＰＴＭ１微量塩ストック溶液。ＨＣｌを加えてｐＨ５に設定した。
【０２７５】
グルコースケモスタット培地（１リットル当たり）は、以下を含有する：２．５g クエン酸一水和物（Ｃ６Ｈ８Ｏ７・Ｈ２Ｏ）、５５．０gグルコース一水和物、２１．８gＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、１．０gＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５gＫＣｌ、０．０４g ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、４．０mgビオチン及び２．４３mLＰＴＭ１微量塩ストック溶液。ＨＣｌを加えてｐＨ５に設定した。
【０２７６】
メタノール／グリセロールケモスタット培地（１リットル当たり）は、以下を含有する：２．５g クエン酸一水和物（Ｃ６Ｈ８Ｏ７・Ｈ２Ｏ）、８．５g メタノール、５０．０g グリセロール、２１．８g ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、１．０g ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５g ＫＣｌ、０．０４g ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、４．０mg ビオチン及び２．４３mL ＰＴＭ１微量塩ストック溶液。ＨＣｌを加えてｐＨ５に設定した。
【０２７７】
溶存酸素を、スターラー速度（４００〜１２００rpm）及び給気率（１２〜７２の標準リットル／時間（sL/h））の大気でＤＯ＝２０％に制御し、温度を２５℃に制御し、そしてｐＨ設定点５をＮＨ４ＯＨ（２５％）の添加で制御した。必要に応じて消泡剤（５％Glanapon 2000）の添加にって発泡を制御した。
【０２７８】
培養を開始するために、０．４Ｌのバッチ培地を無菌濾過し、無菌作業ベンチ下で発酵槽に移し、そして、開始光学密度（ＯＤ６００）１で植菌した（５０μg/mLゼオシンを含有するＹＰＧ中、１８０rpm、２８℃で一晩前培養したピキア・パストリス（P. pastoris）を）。およそ２４時間のバッチフェーズは、およそ２０g/Lの乾燥バイオマス濃度に達し、それに続いて、培養物の同時一定除去を行いながら、ケモスタット培地を４０mL/h（μ＝Ｄ＝０．１／時間について）で一定供給して、全体積を一定に維持した。７滞留時間（７０時間）後におよそ２５g/Lの乾燥バイオマス濃度に達したところで、マイクロアレイ実験用のサンプルを採取し、培養を終了した。このケモスタット培養を産生株（グルコースケモスタット培地を使用したＣＢＳ７４３５  ｐＧＡＰ  ＨｙＨＥＬ−Ｆａｂ、そして、メタノール／グリセロールケモスタット培地を使用したＣＢＳ７４３５ｍｕｔＳ  ｐＡＯＸ  ＨｙＨＥＬ−Ｆａｂ）及び非産生野生型対照株（それぞれ、ＣＢＳ７４３５  ｐＧＡＰ対照及びＣＢＳ７４３５ｍｕｔＳ  ｐＡＯＸ対照）毎に３回実施して、信頼性の高いマイクロアレイ解析に必要な生物学的レプリケートを得た。
【０２７９】
およそ７０時間後、ケモスタットの定常状態でサンプルを採取した。光学密度又は酵母乾燥質量の決定としてのルーチンサンプリング、定性的顕微鏡検査及び細胞生存解析を各培養の間に並行して行った。マイクロアレイ解析のために、サンプルを採取し、以下のように処理した：最適なクエンチングのために、細胞培養液９mLを氷冷５％フェノール（Sigma）溶液（無水エタノール中）４．５mLと直ちに混合し、分割した。各２mLを予冷捕集チューブ（GE healthcare, NJ）中で遠心分離し（１３，２００rpmで１分間）、上清を完全に除去し、チューブをＲＮＡ単離まで−８０℃で保存した。
【０２８０】
実施例３  マイクロアレイ＆トランスクリプトーム実験のためのデータ評価
ａ）マイクロアレイハイブリダイゼーションのためのＲＮＡ単離及びサンプル調製
ＴＲＩ試薬を使用し、供給業者の指示（Ambion, US）に従って、ケモスタットサンプル細胞からＲＮＡを単離した。細胞ペレットをＴＲＩ試薬に再懸濁し、FastPrep 24（M.P. Biomedicals, CA）を使用し５ms-1で４０秒間、ガラスビーズでホモジナイズした。クロロホルムの添加後、サンプルを遠心分離し、イソプロパノールを加えることによって水相からトータルＲＮＡを沈殿させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、ＲＮＡｓｅフリー水に再懸濁した。Nanodrop 1000分光光度計（NanoDrop products, DE）を使用してＯＤ２６０を測定することによってＲＮＡ濃度を決定した。DNA free Kit（Ambion, CA）を使用してサンプルからの残留ＤＮＡを除去した。ＲＮＡ１０μgに等しいサンプル体積をＲＮＡｓｅフリー水中５０μLに希釈し、次いでＤＮＡｓｅバッファーＩ及びｒＤＮＡｓｅＩを加えて、３７℃で３０分間インキュベートした。DNAse Inactivation Reagentの添加後、サンプルを遠心分離し、上清を新たなチューブに移した。上述したように再度ＲＮＡ濃度を決定した。加えて、ＲＮＡナノチップ（Agilent）を使用してＲＮＡ完全性を解析した。増幅及び標識からサンプルのハイブリダイゼーションまでのマイクロアレイワークフローをモニタリングするために、Spike In Kit（Agilent, Product Nr.: 5188-5279）を陽性対照として使用した。それは、増幅、標識及び自己のＲＮＡサンプルと一緒にコハイブリダイズする、アデノウイルスからの１０の異なるポリアデニル化複写産物を含有する。Quick Amp Labelling Kit（Agilent, Prod. Nr.5190-0444）を使用して、サンプルをＣｙ３及びＣｙ５で標識した。このため、精製したサンプルＲＮＡ５００ngをＲＮＡｓｅフリー水８．３μL中に希釈し、Ｓｐｉｋｅ  Ａ又はＢ  ２μL、及びＴ７プロモータープライマー１．２μLを加えた。混合物を６５℃で１０分間変性させ、氷上で５分間維持した。次いで、ｃＤＮＡマスターミックス（１サンプル当たり：４μL ５×ファーストストランドバッファー、２μL ０．１M ＤＴＴ、１μL １０mM ｄＮＴＰミックス、１μL ＭＭＬＶ−ＲＴ、０．５μL RNAse out）８．５μLを加え、４０℃で２時間インキュベートし、次いで、６５℃で１５分間に移して、氷上に５分間置いた。転写マスターミックス（１サンプル当たり：１５．３μL ヌクレアーゼフリー水、２０μL 転写バッファー、６μL ０．１M ＤＴＴ、６．４μL ５０％ＰＥＧ、０．５μL ＲＮＡｓｅ阻害剤、０．６μL 無機ホスファターゼ、０．８μL Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、２．４μL シアニン３又はシアニン５）を調製し、各チューブに加えて、４０℃で２時間インキュベートした。得られた標識ｃＲＮＡを精製するために、RNeasy Mini Kit（Qiagen, Cat.No. 74104）を使用した。サンプルを−８０℃で保存した。ｃＲＮＡ濃度及び標識効率の定量化をNanodrop分光光度計で行った。
【０２８１】
ｂ）マイクロアレイ解析
Gene Expression Hybridisation Kit（Agilent, Cat. No. 5188-5242）を標識サンプルｃＲＮＡのハイブリダイゼーションに使用した。ハイブリダイゼーションサンプルの調製のために、ｃＲＮＡ（Ｃｙ３及びＣｙ５）各３００ng及び１０倍ブロッキング剤６μLをヌクレアーゼフリー水で希釈して、２４μLの最終体積にした。２５倍フラグメンションバッファー１μLの添加後、混合物を６０℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＧＥｘハイブリダイゼーションバッファーＨＩ−ＲＰＭ２５μLを加えて、反応を停止した。１３，２００rpmで１分間の遠心分離後、サンプルを氷上で冷却し、直ちにハイブリダイゼーションに使用した。社内で設計したピキア・パストリス（P. pastoris）特異的オリゴヌクレオチドアレイ（AMAD-ID: 034821, 8x15K custom arrays, Agilent）を使用した。Microarray Hybridisation Chamber User Guide（Agilent G2534A）に従ってマイクロアレイハイブリダイゼーションを行った。最初に、ガスケットスライドのカバーを取り、チャンバー基部上に載せ、Agilentラベルを上に向ける。サンプル（１アレイ当たり４０μL）を８つの正方形の各々の中央にロードした。次いで、マイクロアレイスライドを注意深くガスケットスライド上に載せ（Agilentラベルを下に向ける）、チャンバーカバーを載せクランプで固定した。全てのサンプルを、色素入れ替え法で参照プールサンプルに対してハイブリダイズさせた。プールＲＮＡサンプルは、種々の培養物からのＲＮＡを等量組み合わせることによって生成された。ハイブリダイゼーションを、ハイブリダイゼーションオーブン中、６５℃で１７時間行った。スキャンの前に、マイクロアレイチップを洗浄した。このため、チャンバーを取り外し、洗浄バッファー１中に浸水させながらサンドイッチスライドを互いに引き剥がした。マイクロアレイを洗浄バッファー１と共に別のディッシュに直接移し、１分間洗浄し、洗浄バッファー２（少なくとも３０℃の温度）に移し、さらに１分間洗浄した。スライドの端をティッシュで触れることによってマイクロアレイスライドを乾燥させた後、それをスライドホルダーに入れた（Agilentラベルを上に向ける）。スライドホルダーをカルーセルに入れ、スキャンを開始した。
【０２８２】
ｃ）マイクロアレイデータのデータ取得及び統計学的評価
G2565AA Microarray scanner（Agilent）を用いて５０nmの解像度で画像をスキャンし、Ａgilent Feature Extraction 9.5ソフトウェアにインポートした。Agilent Feature Extraction 9.5 をスポット強度の定量化に使用した。次いで、未加工の平均スポット強度データを、さらなる正規化及びデータ解析のためにオープンソースソフトウェアＲにインポートした。
【０２８３】
差次的発現値を計算する前に、強度データを正規化（バックグラウンド補正なし、スライド内正規化法Loess及びスライド間正規化法Aquantileを使用した）に供した。線形モデル適合（limma R package）を使用して、差次的発現値に関連したｐ値を計算し、その後これらをBenjamini及びYekutieliの方法（limma R packageのＢＹ法）を使用した多重検定用に調整した。ＨｙＨＥＬ−Ｆａｂ産生株についてそれらの各々の対照と比較したＬｏｇ２倍率変化を計算した。
【０２８４】
ＨｙＨＥＬ−Ｆａｂ産生ＣＢＳ７４３５のケモスタットトリプリケートとその非産生宿主対照との間で発現レベル（倍率変化＞１．５）に有意（調整されたｐ値＜０．０５）差のあるエントリーについて、マイクロアレイデータを拾い読みした。
【０２８５】
表４は、ＨｙＨＥＬ−Ｆａｂ産生ピキア・パストリス（P. pastoris）のマイクロアレイ解析からのアップレギュレートされた遺伝子を示す。
【０２８６】
【表４】
2020072697.tif 000005
【０２８７】
実施例４  同定された遺伝子を過剰発現する株の生成
Ｆａｂ分泌に与える正の効果の調査のために、同定された遺伝子を、２つの異なるＦａｂ産生株：ＣＢＳ７４３５  ｐＰＭ２ｄ＿ｐＡＯＸ  ＨｙＨＥＬ（マイクロアレイデータのソースであった）（実施例３を参照のこと）及びＣＢＳ７４３５  ｐＰＭ２ｄ＿ｐＡＯＸ  ＳＤＺ（生成は、実施例１を参照のこと）で過剰発現させた。
【０２８８】
ａ）同定された潜在的な分泌ヘルパー遺伝子の増幅及びｐＰＭ２ａＫ２１発現ベクターへのクローニング
【０２８９】
実施例３で同定された遺伝子を、ＰＣＲ（Phusion Polymerase, New England Biolabs）によって、表５に示されるプライマーを使用して開始コドンから停止コドンまで増幅させた。２つの制限酵素ＳｂｆＩ及びＳｆｉＩを用いて、その配列をｐＰＭ２ａＫ２１発現ベクターのＭＣＳにクローニングした。ｐＰＭＫａＫ２１は、ｐＰＭ２ｄの誘導体であり（実施例１ａに記載される）、これは、ＡＯＸターミネーター配列（天然ＡＯＸターミネーター遺伝子座への組み込みのための）、E. coli（ｐＵＣ１９）の複製起点、E. coli及び酵母における選択のための抗生物質耐性カセット（カナマイシン及びＧ４１８に対する耐性を付与するｋａｎＭＸ）、目的の遺伝子（ＧＯＩ）のための発現カセット（ＧＡＰプロモーター、マルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）及びサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）ＣＹＣ１転写ターミネーターからなる）からなる。遺伝子配列をサンガー配列決定によって検証した。
【０２９０】
【表５】
2020072697.tif 000006
2020072697.tif 000007
2020072697.tif 000008
【０２９１】
ｂ）ピキア・パストリス（P. pastoris）Ｆａｂ産生株における同定された遺伝子の共過剰発現
実施例３で同定され実施例４ａでクローニングされた遺伝子の共過剰発現のための宿主株として、ピキア・パストリス（P. pastoris）Ｆａｂ過剰産生株ＣＢＳ７４３５ｍｕｔＳ  ｐＡＯＸ  ＨｙＨＥＬ−Ｆａｂ及びＣＢＳ７４３５ｍｕｔＳ  ｐＡＯＸ  ＳＤＺ−Ｆａｂを使用した。Ｆａｂ産生株への形質転換の前に、実施例３で同定された分泌ヘルパー遺伝子を含有するｐＰＭ２ａＫ２１ベクターを、ＡＯＸターミネーター配列において制限酵素ＡｓｃＩを用いて線形化する。陽性の形質転換体を、Ｇ４１８を含有するＹＰＤ寒天プレート上で選択した。
【０２９２】
実施例５  Ｆａｂ発現のためのスクリーニング
小スケールスクリーニングでは、各分泌ヘルパー遺伝子の８〜１２の形質転換体を、操作されていない親宿主と比較して試験し、そして、細胞成長、Ｆａｂ力価及びＦａｂ収量に及ぼす影響に基づいてランク付けした。全ての試験したクローンの中で、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ３−０９３３、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ２−０２２０、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ３−０６３９、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ１−１２３２、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ１−１２２５、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ３−０６０７、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ４−０４４８、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ４−０１０８、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ１−０６６７が、最良の結果（Ｆａｂ力価又は収量が少なくとも１．２倍増加）を示すことが見出された。
【０２９３】
実施例７では、制御された産生プロセスにおける株改良の検証のために、次に、これらのクローンの全て（ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ１−０６６７は除く）をバイオリアクター中で培養した。
【０２９４】
ａ）ピキア・パストリス（Pichia pastoris）Ｆａｂ産生株の小スケール培養
１０g/Lグリセロール及び５０μg/mLゼオシンを含有するＹＰ培地（１０g/L酵母抽出物、２０g/Lペプトン）２mLに、単一コロニーのピキア・パストリス（P. pastoris）株を植菌し、２５℃で一晩成長させた。これらの培養物のアリコート（２．０の最終ＯＤ６００に相当する）を、２０g/Lグルコース及びグルコースフィードタブレット（Kuhner, Switzerland; CAT# SMFB63319）を補充した合成スクリーニング培地Ｍ２（培地組成は以下に与える）２mLに移して、２４ディープウェルプレート中１７０rpmにて、２５℃で２５時間インキュベートした。培養物を遠心分離によって１回洗浄し、次いで、ペレットを合成スクリーニング培地Ｍ２に再懸濁して、アリコート（４．０の最終ＯＤ６００に相当する）を新たな２４ディープウェルプレート中の合成スクリーニング培地Ｍ２  ２mLに移した。メタノール（５g/L）を１２時間毎に４８時間かけて繰り返し加えた後、室温での２５００×ｇで１０分間の遠心分離によって細胞を収集し、解析用に調製した。細胞懸濁液１mLの細胞重量を測定することによってバイオマスを決定し、一方で、上清中の組換え分泌タンパク質の決定は以下の実施例５ｂ〜６ｃに記載する。
【０２９５】
合成スクリーニング培地Ｍ２は、１リットル当たり以下を含有した：２２．０g クエン酸一水和物、３．１５g （ＮＨ４）２ＰＯ４、０．４９g ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．８０g ＫＣｌ、０．０２６８g ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、１．４７mL ＰＴＭ１微量金属、４mg ビオチン；ｐＨは、ＫＯＨ（固体）で５に設定した。
【０２９６】
ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＆ウエスタンブロット解析
タンパク質ゲル解析のために、１２％Bis-Tris又は４〜１２％Bis-Trisゲル及びＭＯＰＳランニングバッファーを使用した、NuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）Bis-Tris系（全てInvitrogenから）を使用した。電気泳動後、タンパク質を、銀染色によって可視化するか又はウエスタンブロット解析のためにニトロセルロース膜に転写した。このため、XCell II（商標）Blot Module for wet (tank) transfer（Invitrogen）を使用し、製造業者の指示に従って、タンパク質をニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。ブロッキング後、ウエスタンブロットを以下の抗体でプローブ化した：Ｆａｂ軽鎖について：抗ヒトκ軽鎖（結合及び遊離）−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート抗体、Sigma A3813（１：５，０００）；Ｆａｂ重鎖について：マウス抗ヒトＩｇＧ抗体（Ab7497, Abcam）（１：１，０００に希釈）及び二次抗体としてヤギで産生された抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）−アルカリホスファターゼ抗体（A1418, Sigma）（１：５，０００に希釈）。
【０２９７】
ＡＰコンジュゲート体についてはＮＢＴ／ＢＣＩＰ系に基づく比色ＡＰ検出キット（ＢｉｏＲａｄ）で、又はＨＲＰコンジュゲート体については化学発光 Super Signal West Chemiluminescent Substrate（Thermo Scientific）で検出を実施した。
【０２９８】
ｃ）ＥＬＩＳＡによるＦａｂの定量化
コーティング抗体として抗ヒトＩｇＧ抗体（ab7497, Abcam）、そして、検出抗体としてヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）−アルカリホスファターゼコンジュゲート抗体（Sigma A8542）を使用して、ＥＬＩＳＡによるインタクトなＦａｂの定量化を行った。ヒトＦａｂ／κＩｇＧ断片（Bethyl P80-115）を標準として１００ng/mLの出発濃度で使用し、上清サンプルを適宜希釈する。ｐＮＰＰ（Sigma S0942）で検出を行った。コーティング−、希釈−及び洗浄バッファーは、ＰＢＳベースであり（２mM ＫＨ２ＰＯ４、１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、２．７mM g ＫＣｌ、８mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、適宜、ＢＳＡ（１％（w/v））及び／又はTween20（０．１％（v/v））で完成させた。
【０２９９】
実施例６  選択された同定遺伝子を過小発現する株の生成
実施例３で同定された遺伝子のいくつかは、ＨｙＨＥＬ−Ｆａｂ産生ピキア・パストリス（P. pastoris）宿主株で過剰発現された場合、より少ないＦａｂの分泌をもたらした（実施例４及び５において）。これらの遺伝子の２つは、シャペロン、すなわち細胞質シャペロンＨＣＨ１／ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ３−１０６２（ＫＯ２）及びＥＲ（小胞体）内シャペロンＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ１−０１７６（ＫＯ３）をコードしていた。この知見は、シャペロンが一般に発現／分泌増大効果を有すると見なされることから非常に驚くべきことである。本発明者等が驚くべきことに、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ１−０１７６の過剰発現は、有害であって、親の操作されていないＨｙＨＥＬ−Ｆａｂ又はＳＤＺ−Ｆａｂ産生株の８０％未満までＦａｂ力価及び収量を減少させた。また、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ３−１０６２の過剰発現は、親の操作されていない株の８０％未満までＨｙＨＥＬ  Ｆａｂ力価及び収量を減少させた。したがって、これらの遺伝子（ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ１−０１７６／ＳＣＪ１、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ３−１０６２／ＨＣＨ１）は、両方の宿主株において破壊されていた。トランスクリプトーム実験（実施例３）において多くの凝集関連遺伝子が強くダウンレギュレート（倍率変化＜０．６６）されることが分かった後、凝集転写因子ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ４−０２５２／ＦＬＯ８をノックアウトターゲットとして追加的に選択した。
【０３００】
ピキア・パストリス（P. pastoris）Ｆａｂ過剰産生株ＣＢＳ７４３５ｍｕｔＳ  ｐＡＯＸ  ＨｙＨＥＬ−Ｆａｂ及びＣＢＳ７４３５ｍｕｔＳ  ｐＡＯＸ  ＳＤＺ−Ｆａｂを宿主株として使用した。Heiss et al. (2013) [ApplMicrobiol Biotechnol. 97(3):1241-9.] に記載されているとおりにスプリットマーカーカセットアプローチを使用して、破壊された遺伝子座を有する形質転換体を生成した。Ｇ４１８上で成長可能であった形質転換体のゲノムＤＮＡ及び破壊カセット以外のプライマーを使用して、ＰＣＲによって陽性ノックアウト株の検証を行った（表６）。
【０３０１】
表６は、ノックアウトカセットの構築に使用された全てのプライマーを列挙する（１ノックアウトターゲット当たり２つの重複スプリットマーカーカセット）：プライマー対のＡ＿フォワード／Ａ＿バックワード、Ｂ＿フォワード／Ｂ＿バックワード、Ｃ＿フォワード／Ｃ＿バックワード、Ｄ＿フォワード／Ｄ＿バックワードを使用して、ＰＣＲ（Phusion Polymerase, New England Biolabs）によって、断片Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを増幅させた。断片Ａは、ゲノムピキア・パストリス（P. pastoris）ＤＮＡから、それぞれのＡＴＧ（ターゲット遺伝子の）の５プライム方向で１７００ｂｐから開始し、ＡＴＧの５プライム方向で２００ｂｐまで増幅される。断片Ｄは、ゲノムピキア・パストリス（P. pastoris）ＤＮＡから、それぞれのＡＴＧ（ターゲット遺伝子の）の３プライム方向で２００ｂｐから開始し、ＡＴＧの３プライム方向で１７００ｂｐまで増幅される。断片Ｂは、ＫａｎＭＸ選択マーカーカセットの最初の３分の２からなり、ｐＰＭ２ａＫ２１ベクターＤＮＡテンプレートから増幅される。断片Ｂは、ＫａｎＭＸ選択マーカーカセットの最後の３分の２からなり、ｐＰＭ２ａＫ２１ベクターＤＮＡテンプレートから増幅される。断片Ａ及びＢは、プライマーＡ＿フォワード及びＢ＿バックワードを使用したオーバーラップＰＣＲによって一緒にアニーリングされる（ＡＢ）。断片Ｃ及びＤは、プライマーＣ＿フォワード及びＤ＿バックワードを使用したオーバーラップＰＣＲによって一緒にアニーリングされる（ＣＤ）。ノックアウト株を生成するために、Ｆａｂ産生宿主株を、断片ＡＢ及びＣＤ（両方が同様に重複する）の合計０．５μgのＤＮＡで形質転換した。５００μg/mL Ｇ４１８を含有するＹＰＤ寒天プレート上で細胞を選択した。プライマー対のチェック＿フォワード（プライマー配列Ａ＿フォワードに近い５プライム領域で結合）及びチェック＿バックワード（プライマー配列Ｄ＿バックワードに近い３プライム領域で結合）を使用したＰＣＲによって、陽性ノックアウトクローンを検証した。４００ｂｐ領域（ＡＴＧの周辺）をＫａｎＭＸカセットで置き換えたために、陽性ノックアウト株のＰＣＲ産物のバンドは、野生型配列のものよりも大きい。
【０３０２】
【表６】
2020072697.tif 000009
2020072697.tif 000010
【０３０３】
実施例７．フェッドバッチ培養
小スケール培養で最良のパフォーマンス（モデルタンパク質の収量を少なくとも１．２倍率変化で増加した）を有する実施例５及び６からのヘルパー因子操作株を、フェッドバッチバイオリアクター培養で、産生宿主株の改善の検証について解析した。２つのプロトコールを使用した。
【０３０４】
ａ）フェッドバッチプロトコールＡ
フェッドバッチを、１．０Ｌの最大可動体積の１．４ＬのＤＡＳＧＩＰリアクター（Eppendorf, Germany）で実行した。培養温度を２５℃に制御し、ｐＨを２５％水酸化アンモニウムの添加によって５．０に制御し、そして、溶存酸素濃度を、スターラー速度を４００〜１２００rpmの間、及び大気流を２４〜７２sL/hの間に制御することによって２０％超の飽和度に維持した。
【０３０５】
フェッドバッチ培養のための植菌材料を、２０g/Lグリセロール及び５0μg/mLゼオシンを含有するＹＰ培地１００mLを含有する振盪フラスコ中で培養し、２８℃及び１８０rpmでおよそ２４時間インキュベートした。その培養物を使用して、バイオリアクター中０．４Ｌの出発体積を１．０の出発光学密度（６００nm）まで植菌した。およそ２４時間後バッチを終了し、最初（１０mL）の塩シュート（salt shot）を与えた。
【０３０６】
次いで、グリセロールフェッドバッチ溶液を５mL/hの一定速度で５時間供給した。次いで、メタノールパルス（methanol pulse）（２ｇ）及び塩シュート（１０mL）を培養物に与えた。培養物中の溶存酸素濃度の増加によってメタノールパルス消費が示された後、メタノールフェッドバッチ溶液の一定供給を１．０g/hの供給速度で開始した。メタノール供給培地約４３ｇに相当する新たに形成されたバイオマス１０ｇ毎に塩シュート１０mLを与える。メタノール供給を短時間止めたときの培養物中の溶存酸素の突然の増加のためにメタノール蓄積が妨げられる可能性がある場合には、バイオマス濃度の増加と共に、メタノール供給速度を適切に増加させた。最終メタノール供給速度は２．５g/hであった。
【０３０７】
バイオマスの決定及びＦａｂの定量化のためにサンプルを頻繁に採取した（実施例６に記載されるとおり）。およそ１００時間後、細胞密度が１００g/L（細胞乾燥重量）超に達したときに培養物を収集した。
【０３０８】
培地は、以下のとおりであった：
【０３０９】
バッチ培地（１リットル当たり）は、以下を含有した：２．０g クエン酸、１２．４g （ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．０２２g ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．９g ＫＣｌ、０．５g ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４０g グリセロール、４．６mL ＰＴＭ１微量塩ストック溶液。２５％ＨＣｌでｐＨを５．０に設定する。
【０３１０】
グリセロールフェッドバッチ溶液（１リットル当たり）は、以下を含有した：６２３g グリセロール、１２mL ＰＴＭ１微量塩ストック溶液及び４０mg ビオチン。ＰＴＭ１の組成は、実施例１に与えられる。
【０３１１】
純粋メタノールのメタノールフェッドバッチ溶液（１リットル当たり）は、以下を含有した：１２mL ＰＴＭ１微量塩ストック溶液及び４０mg ビオチン。
【０３１２】
塩シュート溶液（１リットル当たり）は、以下を含有した：２０．８g ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４１．６  ＫＣｌ、１．０４g ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ。
【０３１３】
ｂ）フェッドバッチプロトコールＢ
それぞれの株を、ＹＰｈｙＧ  ５０mLで満たした広口のバッフル付きの蓋付き３００mL振盪フラスコに植菌し、１１０rpmにて２８℃で一晩振盪した（前培養１）。前培養２（１０００mL広口のバッフル付きの蓋付き振盪フラスコ中のＹＰｈｙＧ  １００mL）に、ＯＤ６００（６００nmで測定される光学密度）が夕方におよそ２０（ＹＰｈｙＧ培地に対して測定された）に達するように、前培養１を植菌した（倍加時間：およそ２時間）。前培養２のインキュベーションを同様に１１０rpmにて２８℃で実施した。
【０３１４】
フェッドバッチを、１．０Ｌの可動体積のバイオリアクター（Minifors, Infors, Switzerland）で実行した。全てのバイオリアクター（およそｐＨ５．５のＢＳＭ培地４００mLで満たした）に、２．０のＯＤ６００まで前培養２を個々に植菌した。一般に、ピキア・パストリス（P. pastoris）をグリセロール上で成長させてバイオマスを生成し、その後、培養物をグリセロール供給、続くメタノール供給に供した。
【０３１５】
初期バッチフェーズでは、温度を２８℃に設定した。産生フェーズを開始する前の１時間にわたって、温度は２５℃まで低下し、残りのプロセスを通してこのレベルで維持し、その間にｐＨは５．０まで低下し、このレベルで維持した。酸素飽和度を、プロセス全体を通して３０％に設定した（カスケード制御：スターラー、流量、酸素補給）。撹拌を７００〜１２００rpmで適用し、１．０〜２．０Ｌ／分の流量範囲（大気）を選択した。２５％アンモニウムを使用して、ｐＨ５．０の制御を達成した。必要に応じて、消泡剤Glanapon 2000の添加にって発泡を制御した。
【０３１６】
バッチフェーズの間、およそ１１０〜１２０g/Lの湿潤細胞重量（ＷＣＷ）までバイオマスが生成された（μ〜０．３０／時間）。古典的なバッチフェーズ（バイオマス生成）は、約１４時間続くだろう。６ｇ／（Ｌ＊ｈ）の一定グリセロール供給を１１時間後に開始し、５時間続けた。最初のサンプリング点を１６時間で選択した（以下、誘導時間の「０時間」と命名される）。
【０３１７】
合計２９０ｇのメタノールをおよそ９５時間にわたって供給した（方程式１＋０．０４＊ｔ（g/L）によって定義される、線形に増加する供給速度で）。
【０３１８】
サンプルを、種々の時点で、以下の手順により採取した：サンプリングした培養液（シリンジで）の最初の３mLを廃棄した。新たに採取したサンプル（３〜５mL）の１mLを１．５mL遠心チューブに移し、１３，２００rpm（１６，１００ｇ）で５分間スピンした。上清を分離バイアルに念入りに移した。
【０３１９】
培養液１mLを、風袋計量したエッペンドルフバイアル中、１３，２００rpm（１６，１００ｇ）で５分間遠心分離し、得られた上清を正確に除去した。バイアルを計量し（精度０．１mg）、空のバイアルの風袋重量を減算し、湿潤細胞重量を得た。
【０３２０】
培地は、以下のとおりであった：
【０３２１】
ＹＰｈｙＧ前培養培地（１リットル当たり）は、以下を含有した：２０g フィトン−ペプトン（Phytone-Peptone）、１０g Bacto-Yeast Extracｔ、２０g グリセロール。
【０３２２】
バッチ培地：操作基礎塩培地（Modified Basal salt medium）（ＢＳＭ）（１リットル当たり）は、以下を含有した：１３．５mL Ｈ３ＰＯ４（８５％）、０．５g ＣａＣｌ・２Ｈ２Ｏ、７．５g ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、９g Ｋ２ＳＯ４、２g ＫＯＨ、４０g グリセロール、０．２５g ＮａＣｌ、４．３５mL ＰＴＭ１、８．７mg ビオチン、０．１mL Glanapon 2000（消泡剤）。
【０３２３】
供給−溶液グリセロール（１kg当たり）は、以下を含有した：６００g グリセロール、１２mL ＰＴＭ１。
【０３２４】
供給−溶液メタノールは、以下を含有した：純粋メタノール。
【０３２５】
ｃ）結果
表７は、操作されていないＦａｂ産生対照株と比較して、過剰発現がフェッドバッチ産生プロセスでのピキア・パストリス（P. pastoris）におけるＦａｂ分泌を増加させることが示された遺伝子を列挙する。Ｆａｂ産物をＥＬＩＳＡによって定量化した（実施例５ｃ）。バイオマスを湿潤細胞重量又は乾燥細胞重量として決定した。産物の力価及び収量の変化は、それぞれの対照株に対する倍率変化値として表される。倍率変化値は、直接比較のために並行して成長及びサンプリングされたＡＯＸ  ＨｙＨＥＬ及びＡＯＸ  ＳＤＺ親宿主に対する、フェッドバッチ産生プロセスでの力価及び産物収量の改善を示す。
【０３２６】
【表７】
2020072697.tif 000011
【０３２７】
示されるとおり、列挙した遺伝子は全て、過剰発現されたとき、モデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ又はＨｙＨＥＬ−Ｆａｂの収量（mg／バイオマス）の少なくとも２０％（倍率変化＞１．２）の増加に成功した。
【０３２８】
表８は、操作されていないＦａｂ産生対照株と比較して、欠失がフェッドバッチ産生プロセスでのピキア・パストリス（P. pastoris）におけるＦａｂ分泌を増加させることが示された遺伝子を列挙する。Ｆａｂ産物をＥＬＩＳＡによって定量化した（実施例５ｃ）。産物の力価及び収量の変化は、それぞれの対照株に対する倍率変化値として表される。
【０３２９】
【表８】
2020072697.tif 000012
【０３３０】
示されるとおり、列挙した遺伝子は全て、過小発現されたとき、モデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂ又はＨｙＨＥＬ−ＦａｂのＦａｂ力価（mg/L）又はＦａｂ収量（mg／バイオマス）に関して産生を少なくとも２８％（倍率変化＞１．２８）増加させることができた。
【０３３１】
実施例８：ＨＰ及びＨＰとＫＯタンパク質の組み合わせ
【０３３２】
過剰発現ターゲットの組み合わせのために、構成的ｐＧＡＰプロモーター（実施例４ａ及びｂに記載されるとおり生成された）の制御下でＨＰ３（‘３’）又はＨＰ１０（‘３４’）のいずれかを過剰発現するＣＢＳ７４３５ｍｕｔＳ  ｐＡＯＸ  ＳＤＺ−Ｆａｂ株を使用した。過小発現ターゲットとの過剰発現の組み合わせのために、破壊されたＫＯ１遺伝子座（実施例６に記載される）を有するＣＢＳ７４３５ｍｕｔＳ  ｐＡＯＸ  ＳＤＺ−Ｆａｂ株を使用した。全てのそれらの株において、モデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂをコードするプラスミドは、選択マーカーとしてゼオシンベースであったが、ＨＰの共過剰発現のためのプラスミド又はＫＯ遺伝子座の破壊に使用されるカセットは、同一方向ｌｏｘＰ認識部位によってフランキングされたＫａｎＭＸ耐性カセットを担持した。
【０３３３】
さらなるＨＰ又はＫＯカセットでの形質転換の前に、マーカー遺伝子発現カセット（ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰ部位によってフランキングされた）をＣｒｅリコンビナーゼによってリサイクルした。このため、バックグラウンド株をエピソーマルｐＴＡＣ＿Ｃｒｅ＿ＨｐｈＭＸ４プラスミド（サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）ＴＰＩプロモーターの制御下でＣｒｅリコンビナーゼを発現し、かつ、ハイグロマイシン（Ｈｙｇ）による選択圧が培養培地中に存在する限りピキア・パストリス（Ｐ. pastoris）において一過性に維持される）で形質転換した。形質転換体を、ＹＰＤ／Ｚｅｏ／Ｈｙｇ寒天プレート上、２８℃で２日間成長させ、成長用選択寒天プレート上、２８℃でさらに２日間レプリカプレーティングした。２〜３回のプレーティングラウンド後にＧ４１８及びＨｙｇ上で成長する能力を喪失したクローンのみを、２４ディープウェルプレート（ＤＷＰ）スクリーニングのために選択した（実施例５ａに記載される）。Ｆａｂ力価及び収量を実施５ｃ例に記載されるとおり決定した。次いで、Ｆａｂ収量及び／又は力価の点で最良の株を、ＨＰタンパク質を過剰発現する別のプラスミドで形質転換した（実施例４ａ及びｂに記載される）。２つの組み合わされたＨＰ又はＫＯを有する形質転換体を、選択寒天プレート（Ｚｅｏ及びＧ４１８を含有する）上で選択し、実施例５に記載されるとおりＦａｂ分泌についてスクリーニングした。さらなる組み合わせの工程のために、上述した手順を繰り返し、したがって３つの組み合わせなどを有する株を生成した。全てのスクリーニング実験において、親（＝先行）株を標準として使用した。
【０３３４】
結果は、以下のとおりである−表９：
【０３３５】
【表９】
2020072697.tif 000013
【０３３６】
「起源株」は、それぞれＨＰなしの又はノックアウトなしのピキア・パストリス（P. pastoris）株ｐＡＯＸ−ＳＤＺ−Ｆａｂ＃９を意味する。
【０３３７】
「親株」は、それぞれ、次のＨＰ又はＫＯでの形質転換のための宿主株として役立つＳＤＺ−Ｆａｂ発現ピキア・パストリス（P. pastoris）株（例えば、ＨＰ３及びＨＰ１の組み合わせのためのＨＰ３のみを過剰発現する株、ＫＯ１  ＨＰ２とＨＰ３又はＨＰ１の組み合わせのためのＨＰ２を過剰発現するＫＯ１のノックアウトを有する株）を意味する。組み合わせの各々が、起源株及び親株の両方と比較して、モデルタンパク質ＳＤＺ−ＦａｂのＦａｂ力価の増加を導くことが見出され得る。親株と比較したＦａｂ力価の増加は、ＨＰ又はＨＰとＫＯタンパク質の組み合わせが、モデルタンパク質ＳＤＺ−Ｆａｂによって例示されるＰＯＩの収量をさらに改善できることを示す。
【図１−１】
2020072697.tif 000014
【図１−２】
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【図１−３】
2020072697.tif 000016
【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
2020072697.tif 000020
【図１−８】
2020072697.tif 000021
【図２−１】
2020072697.tif 000022
【図２−２】
2020072697.tif 000023
【配列表】
2020072697000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月21日(2020.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種の目的タンパク質を製造するための組換え宿主細胞であって、宿主細胞が、異種の目的タンパク質を発現するように操作され、かつ、過小発現を達成するよう遺伝子操作する前の宿主細胞と比較して、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質又はその相同体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現するように操作された酵母であり、過小発現が、前記宿主細胞のゲノムからＫＯタンパク質又はその相同体をコードするポリヌクレオチドをノックアウトすること、宿主細胞においてＫＯタンパク質又はその相同体をコードするポリヌクレオチドを破壊すること、前記のＫＯタンパク質又はその相同体をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーターを破壊すること、前記のＫＯタンパク質又はその相同体をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーターを、より低いプロモーター活性を有する別のプロモーターに置換すること、又はリボソーム結合部位、転写開始配列及び停止配列、翻訳開始配列及び停止配列、及びエンハンサー配列又は活性化配列のようなＫＯタンパク質又はその相同体の発現制御配列を破壊することによって達成され、相同体が、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、宿主細胞。
【請求項２】
前記のＫＯタンパク質をコードするポリヌクレオチドの過小発現が、操作する前の宿主細胞と比較して、配列番号：２５及び２６の各アミノ酸配列を有するタンパク質及び／又は配列番号：２９及び３０の各アミノ酸配列を有するタンパク質の収量を増加させる、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
宿主細胞が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）、及びコマガタエラ（Komagataella）、及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）である、請求項１又は２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
目的タンパク質が、酵素、治療用タンパク質、食品添加物、飼料添加物、又は抗体若しくは抗体断片である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５】
宿主細胞が、ヘルパータンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６】
ヘルパータンパク質が、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１６２に示されるとおりのアミノ酸配列又はその相同体を有し、相同体が、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１６２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
配列番号：１０、１１又は１２をコードするポリヌクレオチドを発現する酵母細胞を提供し、前記ポリヌクレオチドをコードする遺伝子を過小発現させるように当該細胞を操作し、そして、異種の目的タンパク質を発現するように当該細胞を操作することによって得られる、宿主細胞。
【請求項８】
宿主細胞が、操作され：
（ｉ）配列番号：１０に示されるとおりのアミノ酸配列を有するタンパク質又はその相同体をコードするポリヌクレオチドを過小発現し、さらに操作され、配列番号：１に示されるとおりのアミノ酸配列を有するヘルパータンパク質又はその相同体及び配列番号：２に示されるとおりのアミノ酸配列を有するヘルパータンパク質又はその相同体をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させるか、又は
（ｉｉ）配列番号：１０に示されるとおりのアミノ酸配列を有するタンパク質又はその相同体をコードするポリヌクレオチドを過小発現し、さらに操作され、配列番号：４又はその相同体及び配列番号：１又はその相同体に示されるとおりのアミノ酸配列を有するヘルパータンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させる、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項９】
異種の目的タンパク質を製造するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１０】
異種の目的タンパク質を発現するように操作された酵母宿主細胞における異種の目的タンパク質の収量を増加させる方法であって、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質又はその相同体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現させることを含み、相同体が、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、方法。
【請求項１１】
以下：
−宿主細胞を、操作し、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質又は配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するその相同体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現させること、
−前記宿主細胞において、目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを導入すること、
−前記宿主細胞を、目的タンパク質を発現するための好適な条件下で培養すること、並びに
−細胞培養物から目的タンパク質を単離すること
を含む、宿主細胞における異種の目的タンパク質の収量を増加させる方法。
【請求項１２】
以下：
−配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＫＯタンパク質又はその相同体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを過小発現するよう操作された宿主細胞を提供すること、ここで、相同体は、配列番号：１０、１１又は１２に示されるとおりのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、ここで、前記宿主細胞は、目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含む；
−宿主細胞を、目的タンパク質を発現するための好適な条件下で培養すること、並びに
−細胞培養物から目的タンパク質を単離すること
を含む、宿主細胞において異種の目的タンパク質を産生する方法。
【請求項１３】
目的タンパク質が、酵素、治療用タンパク質、食品添加物、飼料添加物又は解毒酵素である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記のＫＯタンパク質をコードするポリヌクレオチドの過小発現が、操作する前の宿主細胞と比較して、配列番号：２５及び２６の各アミノ酸配列を有するタンパク質及び／又は配列番号：２９及び３０の各アミノ酸配列を有するタンパク質の収量を増加させる、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【外国語明細書】
2020072697000001.pdf