(57)【要約】      （修正有）【課題】廃水のバイオレメディエーションの実施および銅ナノ粒子の工業的規模での生産のためのヒポクレア・リキシイまたはトリコデルマ・コニンギオプシスの死菌バイオマスの使用方法を提供する。【解決手段】本発明は、ヒポクレア・リキシイ（Hypocrea lixii）およびトリコデルマ・コニンギオプシス（Trichoderma koningiopsis）から選択される真菌から、銅ナノ粒子を得る方法を提供する。さらに本発明では、還元剤として真菌トリコデルマ・コニンギオプシスまたはヒポクレア・リキシイを使用して、迅速で、低価格で、環境に優しく、容易に規模拡張可能な、銅ナノ粒子を生合成および除去する合成方法が開発される。【選択図】図１
2020072711.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒポクレア・リキシイ（Hypocrea lixii）およびトリコデルマ・コニンギオプシス（Trichoderma koningiopsis）から選択される真菌から銅ナノ粒子を得る方法であって、
ａ．ヒポクレア・リキシイおよびトリコデルマ・コニンギオプシスから選択される真菌を単離する工程、
ｂ．工程ａの単離真菌の銅耐性を決定する工程、
ｃ．銅ストック溶液を調製する工程、
ｄ．前記単離真菌を、培養培地サブロー液体培地に添加して、生菌バイオマスを生じさせる工程、
ｅ．生菌バイオマスをオートクレーブに供して、死菌バイオマスを生じさせる工程、
ｆ．生菌バイオマスを乾燥して、乾燥バイオマスを生じさせる工程、および
ｇ．該生菌バイオマス、乾燥バイオマス、および死菌バイオマス中の銅ナノ粒子の滞留を決定する工程、
を含んでなる方法。
【請求項２】
廃水のバイオレメディエーションの実施のための、ヒポクレア・リキシイ抽出物およびトリコデルマ・コニンギオプシス抽出物から選択される真菌の使用。
【請求項３】
ヒポクレア・リキシイ抽出物がヒポクレア・リキシイの死菌体（dead mass）である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
トリコデルマ・コニンギオプシス抽出物がトリコデルマ・コニンギオプシスの死菌体である、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
銅ナノ粒子の生産用である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
ヒポクレア・リキシイおよびトリコデルマ・コニンギオプシスから選択される真菌から、廃水のバイオレメディエーションを利用して生産される銅ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒポクレア・リキシイ（Hypocrea lixii）およびトリコデルマ・コニンギオプシス（Trichoderma koningiopsis）から選択される真菌から、銅ナノ粒子を得る方法に関する。
【０００２】
本発明は、銅ナノ粒子を生産するために、ヒポクレア・リキシイおよびトリコデルマ・コニンギオプシスから選択される真菌の死菌バイオマス（dead biomass）を使用して、銅を含有する廃水バイオレメディエーションを実施することに関する。本発明は、銅ナノ粒子を工業的規模で生産することを可能にする。
【背景技術】
【０００３】
重金属は河川および工業廃水の主な汚染物質である。重金属は、例えば、クロム、カドミウム、および水銀などの極少量でも非常に有毒なものがあるので、生体系にいて非常に反応性に富み、生体内に蓄積されやすい元素であることに、特別な注意が払われてきた。これらの汚染物質の除去または削減における菌類および酵母の使用は、この種のレメディエーションによって生じる環境影響が小さいので、環境的に好適な代替法である。
【０００４】
近年、無機ナノ粒子の合成は、多くの物理学的および化学的手段によって示されてきている。しかし、化学的方法は、きわめて強烈に有害であり、生態系に優しくなく、生産性が低いため、現在では、世界的に生物学的合成の重要性が強調されている（（Varshney R, Bhadauria S, Gaur MS (2012) A review: Biological synthesis of silver and copper nanoparticles. Nano Biomed Eng 4: 99-106）。その特有の物理学的および化学的性質ならびに低コストでの調製のため、最近では銅ナノ粒子が大きな興味の対象となってきている。さらに、銅ナノ粒子には、ガスセンサー、触媒プロセス、高温超伝導体、太陽電池、木材防腐処理などの潜在的な産業用途がある（Li Y, Liang J, Tao Z, Chen J (2007) CuO particles and plates: Synthesis and gas-sensor application. Mater Res Bull 43: 2380-2385; and Guo Z, Liang X, Pereira T, Scaffaro R, Hahn HT (2007) CuO nanoparticle filled vinyl-ester resin nanocomposites: Fabrication, characterization and property analysis. Compos Sci Tech 67: 2036-2044）。
【０００５】
現在のところ、金属ナノ粒子合成の新しい選択肢は、細菌、菌類、酵母、および植物を通して模索されている（Thakkar KN, Mhatre SS, Parikh RY (2010) Biological synthesis of metallic nanoparticles. Nanomedicine 6: 257-262）。銅採掘からの廃水は、金属を抽出、選鉱、および加工する間に生成される、この有害な金属を高濃度に含有することが多い。ここ数年は、銅のように有害な金属の生物吸着を通したバイオレメディエーションが、科学的に新しいだけではなく、その潜在的な産業用途からも、非常に多くの注目を集めいてきている。
【０００６】
この新規の方法は、競争力があり、効果的で、安価である（Volesky B (2001) Detoxification of metal bearing effluents: biosorption for the next century. Hydrometallurgy 59: 203-216）。この点において、菌類は、ｐＨ、温度、および栄養素利用性の多様な極限条件下でも、金属が高濃度でも適応し、生育することができる汎用的なグループであるので、バイオレメディエーションプロセスに使用されてきた（Anand P, Isar J, Saran S, Saxena RK (2006) Bioaccumulation of copper by Trichoderma viride. Bioresource Technol 97: 1018-1025）。結果として、物理学的および化学的方法の代替として、銅ナノ粒子を調製する生合成法の開発には、多くの関心が存在している。
【０００７】
これまでの研究の文献調査（Varshney R, Bhadauria S, Gaur MS (2012) A review: Biological synthesis of silver and copper nanoparticles. Nano Biomed Eng 4: 99-106）により、銅ナノ粒子の生合成について、論文がほとんど発表されておらず、菌類ヒポクレア・リキシイ（H.lixii）およびトリコデルマ・コニンギオプシス（T.koningiopsis）を使用した研究に関する論文はないことが明らかになった。また、銅ナノ粒子に関する生合成研究の大部分は、生体内還元段階にのみ注目し、プロセスの重要な生物吸着段階を無視していた。
【０００８】
金属ナノ材料の生合成および廃水のバイオレメディエーションのための生物学的な系の範囲を広げる目標に向かって研究し、銅イオンの銅ナノ粒子への取り込みおよび還元に、菌類ヒポクレア・リキシイおよびトリコデルマ・コニンギオプシスを使用することを初めて探究する。よって、ヒポクレア・リキシイおよびトリコデルマ・コニンギオプシスの死菌バイオマスを使用して、銅ナノ粒子のバイオレメディエーションおよびグリーン合成が本研究において達成されている。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、バッチ生物吸着研究を示す。ヒポクレア・リキシイの生菌バイオマス、乾燥バイオマス、および死菌バイオマス（live, dried and dead biomass）への、物理化学的因子の影響。（Ａ）生物吸着剤の量の影響。（Ｂ）ｐＨの影響。（Ｃ）温度の影響。（Ｄ）接触時間の影響。（Ｅ）攪拌速度の影響。（Ｆ）初期銅濃度の影響。
【００１０】
【図２】図２は、ヒポクレア・リキシイの生物吸着等温式モデルおよび生物吸着動態を示す。生菌バイオマス（Ａ）、乾燥バイオマス（Ｂ）、および死菌バイオマス（Ｃ）のラングミュアプロット。生菌バイオマス（Ｄ）、乾燥バイオマス（Ｅ）、および死菌バイオマス（Ｆ）の擬２次モデル。
【００１１】
【図３】図３は、ヒポクレア・リキシイ断面のＴＥＭ顕微鏡写真を示す。（Ａ）対照（銅を含まない）、（Ｂ）銅ナノ粒子の細胞外局在を示す真菌の断面、および（Ｃ）銅ナノ粒子。
【００１２】
【図４】図４は、ＳＥＭ−ＥＤＳによって分析されたヒポクレア・リキシイの死菌バイオマスを示す。（Ａ）対照（銅を含まない）および（Ｂ）銅に曝したバイオマス。
【００１３】
【図５】図５は、（Ａ）銅溶液への曝露前および（Ｂ）銅への曝露後のヒポクレア・リキシイの死菌バイオマスの記録ＥＤＳスペクトルを示す。
【００１４】
【図６】図６は、（Ａ）銅イオンでの飽和前および（Ｂ）飽和後のヒポクレア・リキシイの死菌バイオマスのＦＴＩＲスペクトルを示す。
【００１５】
【図７】図７は、バッチ生物吸着研究を示す。トリコデルマ・コニンギオプシスの生菌バイオマス、乾燥バイオマス、および死菌バイオマス（live, dried and dead biomass）への、物理化学的因子の影響。（Ａ）生物吸着剤の量の影響。（Ｂ）ｐＨの影響。（Ｃ）温度の影響。（Ｄ）接触時間の影響。（Ｅ）攪拌速度の影響。（Ｆ）初期銅濃度の影響。
【００１６】
【図８】図８は、トリコデルマ・コニンギオプシスの生物吸着等温式モデルおよび生物吸着動態を示す。生菌バイオマス（Ａ）、乾燥バイオマス（Ｂ）、および死菌バイオマス（Ｃ）のラングミュアプロット。生菌バイオマス（Ｄ）、乾燥バイオマス（Ｅ）、および死菌バイオマス（Ｆ）の擬２次モデル。
【００１７】
【図９】図９は、トリコデルマ・コニンギオプシス断面のＴＥＭ顕微鏡写真を示す。（Ａ）金属を含まない、細胞壁、細胞膜、および細胞質を示す、金属イオンとの接触前、（Ｂ）ナノ粒子（最も暗い矢印）および細胞壁外領域におけるその付着（薄い矢印）を示す、銅金属イオンとの接触後、ならびに（Ｃ）細胞壁の外側領域（明るい矢印）に付着したナノ粒子の凝集（最も暗い矢）。
【００１８】
【図１０】図１０は、ＳＥＭ−ＥＤＳによって分析されたトリコデルマ・コニンギオプシスの死菌バイオマスを示す。（Ａ）対照（銅を含まない）および（Ｂ）銅に曝したバイオマス。
【００１９】
【図１１】図１１は、（Ａ）銅溶液への曝露前および（Ｂ）銅への曝露後のトリコデルマ・コニンギオプシスの死菌バイオマスの記録ＥＤＳスペクトルを示す。
【００２０】
【図１２】図１２は、（Ａ）銅イオンでの飽和前および（Ｂ）飽和後のトリコデルマ・コニンギオプシスの死菌バイオマスのＦＴＩＲスペクトルを示す。
【発明の概要】
【００２１】
本発明は、ヒポクレア・リキシイとトリコデルマ・コニンギオプシスから選択される真菌から銅ナノ粒子を得る方法に関する。
【００２２】
また、本発明は、廃水のバイオレメディエーションの実行および銅ナノ粒子の工業的規模での生産のためのヒポクレア・リキシイの死菌バイオマスの使用にも関する。
【００２３】
さらに、本発明は、廃水のバイオレメディエーションの実行および銅ナノ粒子の工業的規模での生産のためのトリコデルマ・コニンギオプシスの死菌バイオマスの使用にも関する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
ヒポクレア・リキシイおよびトリコデルマ・コニンギオプシスの死菌バイオマスを使用して廃水からのナノ粒子の生合成および銅の取り込みのための生物学的な系を、初めて解析し、記載した。
【００２５】
本発明では、糸状菌トリコデルマ・コニンギオプシスおよびヒポクレア・リキシイの死菌バイオマスを利用して廃水からの銅ナノ粒子の細胞外生合成および取り込みを初めて探究する。
【００２６】
本発明では、還元剤として真菌トリコデルマ・コニンギオプシスおよびヒポクレア・リキシイを使用して、迅速で、低価格で、環境に優しく、容易に規模拡張可能な、銅ナノ粒子を生合成および除去する合成方法が開発される。
【００２７】
本発明は、ヒポクレア・リキシイおよびトリコデルマ・コニンギオプシスから選択される真菌から銅ナノ粒子を得る方法であって、
ａ．ヒポクレア・リキシイおよびトリコデルマ・コニンギオプシスから選択される真菌を単離する工程、
ｂ．工程ａの単離真菌の銅耐性を決定する工程、
ｃ．銅ストック溶液を調製する工程、
ｄ．前記単離真菌を、培養培地サブロー液体培地に添加して、生菌バイオマスを生じさせる工程、
ｅ．生菌バイオマスをオートクレーブに供して、死菌バイオマスを生じさせる工程、
ｆ．生菌バイオマスを乾燥して、乾燥バイオマスを生じさせる工程、および
ｇ．該生菌バイオマス、乾燥バイオマス、および死菌バイオマス中の銅ナノ粒子の滞留を決定する工程、
を含んでなる方法に関する。
【００２８】
単離真菌の生物吸着による銅の滞留の決定は、バイオマス（生、乾燥、および死）各々を、項目
【００２９】
の工程ｃの銅溶液に加えることによって行う。
【００３０】
真菌の死菌バイオマス、乾燥バイオマス、および生菌バイオマスへの銅の生物吸着は、初期金属濃度（５０〜５００ｍｇ・Ｌ−１）、ｐＨ（２〜６）、温度（２０〜６０℃）、撹拌（５０〜２５０ｒｐｍ）、種菌量（０．１５〜１．０ｇ）、および接触時間（５〜３６０分）の関数として行った。
【００３１】
本発明の開発を以下の非包括的な例によって説明する。
【実施例】
【００３２】
試験および結果の概要
初期金属濃度、ｐＨ、温度、撹拌、および種菌量の関数として、真菌の死菌バイオマス、乾燥バイオマス、および生菌バイオマスへの銅の生物吸着の平衡および動態試験を行った。
【００３３】
死菌バイオマスについて、銅の生物吸着能の範囲を観察し、接触の６０分以内に完了し、ｐＨ５．０、温度４０℃において、攪拌速度１５０ｒｐｍで、ヒポクレア・リキシイでは最大銅生物吸着が１５〜３０ｍｇ・ｇ−１、トリコデルマ・コニンギオプシスでは２０〜３５ｍｇ・ｇ−１であった。
【００３４】
平衡データは、ラングミュア等温式を用いてより良く説明され、動態解析は擬２次モデルを示した。
【００３５】
真菌によって生合成されたナノ粒子の平均サイズ、形態、および位置を、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、エネルギー分散型Ｘ線分光分析法（ＥＤＳ）、および透過電子顕微鏡観法（ＴＥＭ）よって決定した。
【００３６】
ナノ粒子の形状は主に、ヒポクレア・リキシイでは、平均サイズが１５〜３５ｎｍの球状で、細胞外での合成が見られ、トリコデルマ・コニンギオプシスでは、平均サイズが７０〜９５ｎｍで、まれに３２８．２７ｎｍの凝集体があり、細胞外に合成された。減衰全反射（ＡＴＲ）でのフーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）試験により、アミド基が粒子に結合していることが明らかになり、それによりナノ粒子の安定性が説明できる。さらに、銅ナノ粒子を囲む安定化剤およびキャッピング剤として、タンパク質の存在が確認された。
【００３７】
これらの試験は、ヒポクレア・リキシイおよびトリコデルマ・コニンギオプシスの死菌バイオマスの水のバイオレメディエーションおよび銅ナノ粒子の工業的規模での生産のための経済的で技術的に実行可能な選択肢を提供することを示した。
【００３８】
実施例１（廃水のバイオレメディエーションの実施および銅ナノ粒子の工業的規模での生産のためのヒポクレア・リキシイの死菌バイオマスの使用）
１．生物の培養および維持
ヒポクレア・リキシイは、カナラン・ドス・カラジャース（Cana dos Carajas）、パラ（Para）、ブラジルアマゾン地域（南緯０６°２６’および西経５０°４’）に位置するソッセゴ（Sossego）鉱山の銅廃棄物の溜め池から採集した水から単離した。ヒポクレア・リキシイを、サブローデキストロース寒天培地（ＳＤＡ）（オクソイド、イングランド）で維持および活性化した[Kumar BN, Seshadri N, Ramana DKV, Seshaiah K, Reddy AVR (2011) Equilibrium, Thermodynamic and Kinetic studies on Trichoderma viride biomass as biosorbent for the removal of Cu (II) from water. Separ Sci Technol 46: 997-1004]。
【００３９】
２．寒天培地での最小発育阻止濃度
単離した真菌の銅耐性を、スポットプレート法（spot plate method）によって最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）として決定した[Ahmad I, Ansari MI, Aqil F (2006) Biosorption of Ni, Cr and Cd by metal tolerante Aspergillus niger and Penicillium sp using single and multi-metal solution. Indian J Exp Biol 44: 73-76]。さまざまな濃度の銅（５０〜２０００ｍｇ  Ｌ−１）を含有するＳＤＡプレートを調製し、試験真菌の種菌を金属および対照プレート（金属を含まないプレート）上にスポットした。プレートを、２５℃で少なくとも５日間インキュベーションした。ＭＩＣは、目に見える単離菌の成長を阻害する金属の最低濃度として定義する。
【００４０】
３．生物吸着剤による銅ナノ粒子滞留の決定
３．１．吸着質溶液の調製
本試験で使用した化学薬品はすべて、分析グレードであり、さらに精製することなく使用した。希釈液はすべて、２回脱イオン水（ミリポアミリＱ、伝導率１８．２Ωｃｍ−１）で調製した。銅ストック溶液を、ＣｕＣｌ２２Ｈ２０（Carlo Erba、イタリア）を２回脱イオン水に溶解することによって調製した。このストック溶液を希釈することによって、作業溶液を調製した。
【００４１】
３．２．バイオマス調製
真菌のバイオマスを、サブロー液体培地（Ｓｂ）（オクソイド、イングランド）で調製し、２５℃で５日間、１５０ｒｐｍでインキュベーションした。インキュベーションした後、沈渣を採取し、２回脱イオン水で洗浄し、これを生菌バイオマスとした。死菌バイオマスの調製は、適当量の生菌バイオマスをオートクレーブした。乾燥バイオマスは、真菌マットを５０℃でパリパリになるまで乾燥することを通して得た。乾燥したマットを粉砕して、均一なサイズの粒子を得た[Salvadori MR, Lepre LF, Ando RA, do Nascimento CAO, Correa B (2013) Biosynthesis and uptake of copper nanoparticles by dead biomass of Hypocrea lixii isolated from the metal mine in the Brazilian Amazon region. Plos One 8: 1-8].
【００４２】
３．３．生物吸着剤による銅ナノ粒子吸着の効率への物理化学的因子の影響に関する試験
銅の除去について、ｐＨ（２〜６）、温度（２０〜６０℃）、接触時間（５〜３６０分）、初期銅濃度（５０〜５００ｍｇ  Ｌ−１）、および攪拌速度（５０〜２５０ｒｐｍ）を解析した。そのような実験を、プラスチックフラスコ中で、１００ｍｇ  Ｌ−１のＣｕ（ＩＩ）テスト試験溶液を４５ｍＬ用いて所望のｐＨ、温度、金属濃度、接触時間、攪拌速度、および生物吸着剤投与量（０．１５〜１．０ｇ）に最適化した。
【００４３】
幾つかの濃度（５０〜５００ｍｇ  Ｌ−１）の銅（ＩＩ）を、銅（ＩＩ）ストック溶液の適切な希釈により調製した。ｐＨはＨＣＬまたはＮａＯＨで調整した。次に、所望のバイオマス投与量を加え、フラスコの内容物を電気式温度自動調節往復振とう器で、必要とされる攪拌速度で所望の接触時間振とうした。振とう後、銅（ＩＩ）溶液を、ミリポア膜を通して真空ろ過することによってバイオマスから分離した。ろ過液中の金属濃度を、フレーム原子吸光分光光度計（ＡＡＳ）により決定した。金属除去の効率（Ｒ）を以下の方程式を用いて算出した。
Ｒ＝（Ｃｉ−Ｃｅ）／Ｃｉ．１００
（式中、ＣｉおよびＣｅはそれぞれ、初期および平衡金属濃度である。）
金属取り込み能、ｑｅ、を以下の方程式を用いて算出した。
ｑｅ＝Ｖ（Ｃｉ−Ｃｅ）／Ｍ
（式中、ｑｅ（ｍｇ・ｇ−１）は任意の時間における生物吸着剤の生物吸着能、Ｍ（ｇ）はバイオマス投与量、およびＶ（Ｌ）は溶液の量である。）
【００４４】
３．４．生物吸着等温式モデル
生物吸着は、次の吸着剤濃度、５０〜５００ｍｇ  Ｌ−１を用いてバッチ平衡法により分析した。フロイントリッヒおよびラングミュア等温式モデルを用いて、平衡データを当てはめた[Volesky B (2003) Biosorption process simulation tools. Hydrometallurgy 71: 179-190]。線形化ラングミュア等温式モデルは、
Ｃｅ／ｑｅ＝１／（ｑｍ．ｂ）＋Ｃｅ／ｑｍ
であり、式中、ｑｍは吸着剤の単分子層吸着能（ｍｇ・ｇ−１）、ｂはラングミュア吸着定数（Ｌ・ｍｇ−１）である。線形化フロイントリッヒ等温式モデルは、
ｌｎｑｅ＝ｌｎＫＦ＋１／ｎ．ｌｎＣｅ
であり、式中、ＫＦは生物吸着能に関連する定数、１／ｎは吸着剤の吸着強度に関する。
【００４５】
３．５．生物吸着動態
Ｃｕ（ＩＩ）生物吸着の速度動態の結果を、擬１次モデルおよび擬２次モデルを用いて解析した。線形擬１次モデル[Lagergren S (1898) About the theory of so called adsorption of soluble substances. Kung Sven Veten Hand 24: 1-39]は、以下の方程式によって表わすことができる。
ｌｏｇ（ｑｅ−ｑｔ）＝ｌｏｇｑｅ−Ｋ１／２．３０３．ｔ
（式中、ｑｅ（ｍｇ・ｇ−１）およびｑｔ（ｍｇ・ｇ−１）はそれぞれ、平衡時間および任意の時間ｔおける吸着剤に吸着される金属の量であり、Ｋ１（分−１）は擬１次吸着プロセスの速度定数である。）
線形擬２次モデル[Ho YS, Mckay G (1999) Pseudo-second-order model for sorption process. Process Biochem 34: 451-465]は、以下の方程式によって表わすことができる。
ｔ／ｑｔ＝１／Ｋ２．ｑｅ２＋ｔ／ｑｅ
（式中、Ｋ２（ｇ・ｍｇ−１・分−１）は、擬２次の平衡速度定数である。）
【００４６】
４．ヒポクレア・リキシイによる金属銅ナノ粒子の生合成
生菌バイオマスおよび乾燥バイオマスと比較して、高い銅金属イオン吸着能を示したヒポクレア・リキシイの死菌バイオマスのみを、この試験では使用した。銅（ＩＩ）溶液が１００ｍｇ・Ｌ−１の濃度における平衡モデルデータを使用して、ヒポクレア・リキシイの死菌バイオマスによる銅ナノ粒子の生合成を調べた。
【００４７】
４．１．ＴＥＭ観察
サイズ、形状、および生物吸着剤上の銅ナノ粒子を位置を決定するために、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）による解析を用い、検体の超薄切片を透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ−１０１０）で観察した。
【００４８】
４．２．ＳＥＭ−ＥＤＳ分析
銅ナノ粒子の形成前後の生体材料小さい断片の分析をピンスタブ上で行ない、次いで真空下で金でコーティングし、エネルギー分散型分光計（ＥＤＳ）を備えたＪＥＯＬ  ６４６０  ＬＶでＳＥＭによって試験した。
【００４９】
４．３．ＦＴＩＲ−ＡＴＲ分析
赤外振動分光法（ＦＴＩＲ）を使用して、バイオマスに存在する官能基を同定し、銅ナノ粒子の存在によって引き起こされるスペクトル変動を評価した。赤外吸収スペクトルを、ブルカーモデルＡＬＰＨＡ干渉分光計で得た。試料を、単一反射の全反射測定法アクセサリー（白金−結晶ダイヤモンドを用いたＡＴＲ）を使用して、試料コンパートメントに直接置いた。４ｃｍ−１のスペクトル分解能を用いて、試料各々について８０スペクトルを蓄積した。
【００５０】
銅山から単離されたヒポクレア・リキシイをさまざまな銅濃度（５０〜２０００ｍｇ・Ｌ−１）における最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）に供し、その結果は、ヒポクレア・リキシイが銅に対する高い耐性（５２８ｍｇ・Ｌ−１）を呈することを示した。
【００５１】
４．４．物理化学的因子の生物吸着への影響
本試験は、バイオマス投与量、ｐＨ、温度、接触時間、撹拌速度、および金属イオン濃度などの物理化学的因子もよって、ヒポクレア・リキシイバイオマスによる銅除去が影響されることを示した。生物吸着剤投与量は、金属の所与の初期濃度に対する生物吸着剤の容量・能力を決定するため、重要なパラメーターである。
【００５２】
図１Ａに見られるように、ヒポクレア・リキシイの生菌バイオマスおよび乾燥バイオマスによる銅に除去は、バイオマス濃度の増加とともに増加し、０．７５ｇ・Ｌ−１で飽和に達し、一方で死菌バイオマスでは、飽和は１．０ｇ・Ｌ−１で達せられる（図１Ａ）。死菌バイオマスによる銅の除去パーセント割合は、生菌バイオマスおよび乾燥バイオマスで観察された割合より大きかった（図１Ａ）。死菌バイオマスは、Ｃｕ（ＩＩ）除去について以下の有利な点を提供する：金属除去系が毒性に供されない、成長培地を必要としない、吸着金属イオンを容易に脱着できる、死菌バイオマスは再利用することができる。生菌バイオマスおよび乾燥バイオマスによる銅除去は、０．７５ｇ・Ｌ−１超ではバイオマス濃度の増加とともに減少した。
【００５３】
この結果は、死菌バイオマスが、生菌バイオマスおよび乾燥バイオマスバイオマスと比べて、銅に対してより高い親和性を有することを示す。バイオマス投与量の増加に伴う除去容量の増加は、全表面積より大きいことや、結果として結合部位の数がより多いことに帰することができる。図１Ｂに示されるように、最大の銅の除去は、３種類のバイオマスで、ｐＨ５．０において見られた。より低いｐＨ値では、ヒポクレア・リキシイの細胞壁が、正の電荷を帯びるようになり、それが生物吸着能の減少の原因となる。対照的に、より高いｐＨ（ｐＨ５）では、細胞壁表面が負の電荷をより帯びるようになり、それによるバイオマスと正の電荷を帯びた金属イオンとの引力のためにヒポクレア・リキシイのＣｕ（ＩＩ）の生物吸着は高い。
【００５４】
最大の銅の除去は、３種類のバイオマスで、４０℃において見られた（図１Ｃ）。金属の生物吸着への温度の影響は、金属と細胞壁上のリガンドとの相互作用を示唆した。グラフ（図１Ｄ）は３種類のバイオマスのすべてで、酵素触媒反応の特徴であるシグモイド型動態に従うことが観察された。死菌バイオマスに対する銅ナノ粒子形成の動態は、８９％を超える粒子が反応の６０分以内に形成されたことを示し、銅ナノ粒子の形成が指数関数的であることを示唆した。最適な銅除去は、３種類のバイオマスのすべてで、攪拌速度１５０ｒｐｍにおいて見られた（図１Ｅ）。高攪拌速度では、ボルテックス現象が生じ、懸濁液はもはや均一ではなく、実際にも金属除去を損なう（Liu YG, Fan T, Zeng GM, Li X, Tong Q et al. (2006) Removal of cadmium and zinc ions from aqueous solution by living Aspergillus niger. Trans Nonferrous Met Soc China 16: 681-686）。
【００５５】
図１Ｆに示されるように、３種類のバイオマスで、銅吸着の％割合は、金属濃度（５０〜５００ｍｇ・Ｌ−１）の増加とともに減少した。
【００５６】
４．５．吸着等温式および動態モデル
ラングミュアおよびフロイントリッヒ等温式モデルを使用して、生物吸着データを当てはめ、生物吸着能を決定した。３種類のヒポクレア・リキシイバイオマスから得られたＣｕ（ＩＩ）生物吸着に関するラングミュア等温式を図２Ａ、図２Ｂ、および図２Ｃに示す。等温式定数、ラングミュアおよびフロイントリッヒモデルによって推定される最大積載能力、回帰係数を、表１に示す。ラングミュアモデルは、フロイントリッヒモデルと比べて、より良くＣｕ（ＩＩ）生物吸着等温式を説明した。
【００５７】
この試験で観察されたヒポクレア・リキシイによるＣｕ（ＩＩ）の最大吸着率（１９．０ｍｇ・ｇ−１）は、吸着率がそれぞれ６．２、１．５２、１５．０８、および１９．０ｍｇ・ｇ−１である、ウスラヒラタケ（Pleurotus pulmonaris）、スエヒロタケ（Schizophyllum commune）、ペニシリウムの複数種（Penicillium spp）、およびリゾプス・アリズス（Rhizopus arrhizus）などの他の公知の生物吸着剤に関して報告されている吸着率と同様かまたは高かった（Veit MT, Tavares CRG, Gomes-da-Costa SM, Guedes TA (2005) Adsorption isotherms of copper (II) for two species of dead fungi biomasses. Process Biochem 40: 3303-3308; Du A, Cao L, Zhang R, Pan R (2009) Effects of a copper-resistant fungus on copper adsorption and chemical forms in soils. Water Air Soil Poll 201: 99-107; Rome L, Gadd DM (1987) Copper adsorption by Rhizopus arrhizus, Cladosporium resinae and Penicillium italicum. Appl Microbiol Biotechnol 26: 84-90）。
【００５８】
ヒポクレア・リキシイの３種類のバイオマスすべてのＣｕ（ＩＩ）生物吸着動態を、擬１次および擬２次モデルを用いて解析した。定数および回帰係数をすべて、表２に示す。図２Ｄ、図２Ｅ、および図２Ｆに示されるように、本試験では、ヒポクレア・リキシイによる生物吸着は、擬２次動態モデルを用いて最も良く説明される。この吸着動態は、２価の金属の生物吸着剤への吸着に典型的である（Reddad Z, Gerent C, Andres Y, LeCloirec P (2002) Adsorption of several metal ions onto a low-cost biosorbents: kinetic and equilibrium studies. Environ Sci Technol 36: 2067-2073）。
【００５９】
４．６．銅ナノ粒子の生合成
生物学的な系によるナノ粒子の形成の複雑な機序を研究することは、さらにより信頼でき、再現可能なその生合成の方法を決定するために重要である。真菌のバイオマスでのナノ粒子の形成の理解に向けて、一部分の死菌バイオマスをＴＥＭによって調査した。ヒポクレア・リキシイにおけるナノ粒子の位置を調べると、電子顕微鏡像から、ナノ粒子は細胞壁に見られるが細胞質および細胞膜には見られず、対照ではナノ粒子が存在しないことが明らかになり、対照およびオートクレーブプロセスにより銅が浸潤したバイオマスでは、細胞質材料の萎縮などの超微細構造変化が観察された（図３Ａおよび図３Ｂ）。細胞外に位置することは、生産プロセスにおける、より迅速で、大量にナノ粒子の獲得、容易な除去、バイオマスの再使用の可能性という有利な点を提供する。ナノ粒子の形状およびサイズは、ナノスケール材料の物理的、化学的、光学的、および電子的性質を制御する最も重要な特徴のうちの２つである（Alivisatos AP (1996) Perspectives on the physical chemistry of semiconductor nanocrystals. J Phys Chem 100: 13226-13239; Aizpurua J, Hanarp P, Sutherland DS, KaII M, Bryant GW, et al. (2003) Optical properties of gold nanorings. Phys Rev Lett 90: 57401-57404）。
【００６０】
本試験では、銅ナノ粒子は、２４．５ｎｍの平均直径を示した。図３Ｃに示されるように、１００ｎｍの拡大では、粒子は主に球形である。銅ナノ粒子の存在をスポットプロファイルＳＥＭ−ＥＤＳ測定によって確認された。真菌のバイオマスによるＣｕ（ＩＩ）の生物吸着の前後に記録されたＳＥＭ顕微鏡写真をそれぞれ、図４Ａおよび図４Ｂに示す。我々は、銅ナノ粒子が真菌バイオマスの表面に結合した後、不規則性を増加することによって、表面の変形が起こることを観察した。菌糸の調査領域で記録されたＥＤＳスペクトルは、菌類の銅からのシグナルを示す（図５Ａおよび図５Ｂ）。
【００６１】
これとは別に、Ｃ、Ｎ、および０のシグナルは、銅ナノ粒子表面のキャッピング物質としてのタンパク質の存在を示す。そのようなシグナルは、菌類により分泌されたタンパク質によると見られ、銅ナノ粒子の合成および安定化（キャッピング物質）に関与しうる銅と生理活性分子との潜在的な相互作用を特定する、銅ナノ粒子の形成に関するＦＴＩＲ−ＡＴＲ測定によって支持されている。
【００６２】
タンパク質中のアミノ酸残基間のアミド結合は、電磁スペクトルの赤外域における周知の特徴を生み出す。ＦＴＩＲスペクトルは、アミドＩおよびアミドＩＩの変角振動にそれぞれ相当する１６４９および１５３２ｃｍ−１に、２つのバンドを示現する（図６）。そのような形態は、銅ナノ粒子に結合したペプチド／タンパク質に起因し、キャッピング剤として作用するこれらの物質の可能性を示唆している[Bansal V, Ahamad A, Sastry M (2006) Fungus-mediated biotransformation of amorphous silica in rice husk to nanocrystalline Silica. J Am Chem Soc 128: 14059-14066]。
【００６３】
この試験では、バイオマス試料を銅（ＩＩ）イオンで飽和した後、純粋な試料に関するＦＴ−ＩＲスペクトルにおいて、幾つかのバンドシフトが、特にアミド基にあたるバンドで観察された。１６４４、１６３２、および１５３７ｃｍ−１のバンドがそれぞれ、１６４９、１６２７、および１５３２ｃｍ−１にシフトした（図６）。そのシフトは、生物吸着が利用可能なバイオマス内の銅イオンとアミド基との相互作用によることを示唆する。１３７５および１０７３ｃｍ−１に観察される２つのバンドはそれぞれ、芳香族および脂肪族アミンのＣ−Ｎ伸縮振動に当てられることができる（図６）（Vigneshwaran N, Kathe AA, Varadarajan PV, Nachane RP, Balasubramanya RH (2007) Silver-protein (core-shell) nanoparticle production using spent mushroom substrate. Langmuir 23: 7113-7117）。
【００６４】
そのような観察結果は、タンパク質の存在、および潜在的な安定化につながるタンパク質の銅ナノ粒子との結合を示す。おそらく死菌バイオマスでは、細胞からのタンパク質はオートクレーブ過程の間に遊離して、細胞表面に結合する。この観察結果は、球状形態の銅ナノ粒子は、たぶんナノ粒子の表面に結合し、それによって球状ナノ粒子の安定化剤として作用するタンパク質とともに存在することを示す。また、本試験で得られたＦＴＩＲの結果は、タンパク質のアミド基は強い親和性を有して金属に結合すること明らかにした。しかし、試験された銅のナノ粒子との相互作用に関与するタンパク質の種類は、決定されないままである。そのような理解は、銅ナノ粒子を生産するための、より効率的な、環境に優しいプロセス（green process）につながりうる。
【表１】
2020072711.tif 000003
【表２】
2020072711.tif 000004
【００６５】
実施例２（廃水のバイオレメディエーションの実施および銅ナノ粒子の工業的規模での生産のためのトリコデルマ・コニンギオプシスの死菌バイオマスの使用）
１．生物の培養および維持
トリコデルマ・コニンギオプシスは、カナラン・ドス・カラジャース（Canaa dos Carajas）、パラ（Para）、ブラジルアマゾン地域（南緯０６°２６’および西経５０°４’）に位置するソッセゴ（Sossego）鉱山の銅廃棄物の溜め池から採集した沈殿物から単離した。トリコデルマ・コニンギオプシスを、サブローデキストロース寒天培地（ＳＤＡ）（オクソイド、イングランド）で維持および活性化した（Kumar BN, Seshadri N, Ramana DKV, Seshaiah K, Reddy AVR (2011) Equilibrium, Thermodynamic and Kinetic studies on Trichoderma viride biomass as biosorbent for the removal of Cu (II) from water. Separ Sci Technol 46: 997-1004）。
【００６６】
２．寒天培地での最小発育阻止濃度
単離した真菌の銅耐性を、スポットプレート法（spot plate method）によって最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）として決定した（Ahmad I, Ansari MI, Aqil F (2006) Biosorption of Ni, Cr and Cd by metal tolerante Aspergillus niger and Penicillium sp using single and multi-metal solution. Indian J Exp Biol 44: 73-76）。さまざまな濃度の銅（５０〜２０００ｍｇ・Ｌ−１）を含有するＳＤＡプレートを調製し、試験する真菌の種菌を金属および対照プレート（金属を含まないプレート）上にスポットした。プレートを、２５℃で少なくとも５日間インキュベーションした。ＭＩＣは、目に見える単離菌の成長を阻害する金属の最低濃度として定義する。
【００６７】
３．生物吸着剤による銅ナノ粒子滞留の決定
３．１．吸着質溶液の調製
本試験で使用した化学薬品はすべて、分析グレードであり、さらに精製することなく使用した。希釈液はすべて、２回脱イオン水（ミリポアミリＱ、伝導率１８．２Ωｃｍ−１）で調製した。銅ストック溶液を、ＣｕＣｌ２２Ｈ２０（Carlo Erba、イタリア）を２回脱イオン水に溶解することによって調製した。このストック溶液を希釈することによって、作業溶液を調製した。
【００６８】
３．２．バイオマス調製
真菌のバイオマスを、サブロー液体培地（Ｓｂ）（オクソイド、イングランド）で調製し、２５℃で５日間、１５０ｒｐｍでインキュベーションした。インキュベーションした後、沈渣を採取し、２回脱イオン水で洗浄し、これを生菌バイオマスとした。死菌バイオマスの調製は、適当量の生菌バイオマスをオートクレーブした。乾燥バイオマスは、真菌マットを５０℃でパリパリになるまで乾燥することを通して得た。乾燥したマットを粉砕して、均一なサイズの粒子を得た（Salvadori MR, Lepre LF, Ando RA, do Nascimento CAO, Correa B (2013) Biosynthesis and uptake of copper nanoparticles by dead biomass of Hypocrea lixii isolated from the metal mine in the Brazilian Amazon region. Plos One 8: 1-8）。
【００６９】
３．３．生物吸着剤による銅ナノ粒子吸着の効率への物理化学的因子の影響に関する試験
銅の除去について、ｐＨ（２〜６）、温度（２０〜６０℃）、接触時間（５〜３６０分）、初期銅濃度（５０〜５００ｍｇ・Ｌ−１）、および攪拌速度（５０〜２５０ｒｐｍ）を解析した。そのような実験を、プラスチックフラスコ中で、１００ｍｇ  Ｌ−１のＣｕ（ＩＩ）テスト試験溶液を４５ｍＬ用いて所望のｐＨ、温度、金属濃度、接触時間、攪拌速度、および生物吸着剤投与量（０．１５〜１．０ｇ）に最適化した。
【００７０】
幾つかの濃度（５０〜５００ｍｇ・Ｌ−１）の銅（ＩＩ）を、銅（ＩＩ）ストック溶液の適切な希釈により調製した。ｐＨはＨＣＬまたはＮａＯＨで調整した。次に、所望のバイオマス投与量を加え、フラスコの内容物を電気式温度自動調節往復振とう器で、必要とされる攪拌速度で所望の接触時間振とうした。振とう後、銅（ＩＩ）溶液を、ミリポア膜を通して真空ろ過することによってバイオマスから分離した。ろ過液中の金属濃度を、フレーム原子吸光分光光度計（ＡＡＳ）により決定した。金属除去の効率（Ｒ）を以下の方程式を用いて算出した。
Ｒ＝（Ｃｉ−Ｃｅ）／Ｃｉ．１００
（式中、ＣｉおよびＣｅはそれぞれ、初期および平衡金属濃度である。）
金属取り込み能、ｑｅを以下の方程式を用いて算出した。
ｑｅ＝Ｖ（Ｃｉ−Ｃｅ）／Ｍ
（式中、ｑｅ（ｍｇ・ｇ−１）は任意の時間における生物吸着剤の生物吸着能、Ｍ（ｇ）はバイオマス投与量、およびＶ（Ｌ）は溶液の量である。）
【００７１】
３．４．生物吸着等温式モデル
生物吸着は、次の吸着剤濃度、５０〜５００ｍｇ  Ｌ−１を用いてバッチ平衡法により分析した。フロイントリッヒおよびラングミュア等温式モデルを用いて、平衡データを当てはめた（Volesky B (2003) Biosorption process simulation tools. Hydrometallurgy 71: 179-190）。線形化ラングミュア等温式モデルは、
Ｃｅ／ｑｅ＝１／（ｑｍ・ｂ）＋Ｃｅ／ｑｍ
であり、式中、ｑｍは吸着剤の単分子層吸着能（ｍｇ・ｇ−１）、ｂはラングミュア吸着定数（Ｌ・ｍｇ−１）である。線形化フロイントリッヒ等温式モデルは、
ｌｎｑｅ＝ｌｎＫＦ＋１／ｎ．ｌｎＣｅ
であり、式中、ＫＦは生物吸着能に関連する定数、１／ｎは吸着剤の吸着強度に関する。
【００７２】
３．５．生物吸着動態
Ｃｕ（ＩＩ）生物吸着の速度動態の結果を、擬１次モデルおよび擬２次モデルを用いて解析した。線形擬１次モデル（Lagergren S (1898) About the theory of so called adsorption of soluble substances. Kung Sven Veten Hand 24: 1-39）は、以下の方程式によって表わすことができる。
ｌｏｇ（ｑｅ−ｑｔ）＝ｌｏｇｑｅ−Ｋ１／２．３０３．ｔ
（式中、ｑｅ（ｍｇ・ｇ−１）およびｑｔ（ｍｇ・ｇ−１）はそれぞれ、平衡時間および任意の時間ｔおける吸着剤に吸着される金属の量であり、Ｋ１（分−１）は擬１次吸着プロセスの速度定数である。）
線形擬２次モデル（Ho YS, Mckay G (1999) Pseudo-second-order model for sorption process. Process Biochem 34: 451-465）は、以下の方程式によって表わすことができる。
ｔ／ｑｔ＝１／Ｋ２．ｑｅ２＋ｔ／ｑｅ
（式中、Ｋ２（ｇ・ｍｇ−１・分−１）は、擬２次の平衡速度定数である。）
【００７３】
４．トリコデルマ・コニンギオプシスによる金属銅ナノ粒子の生合成
生菌バイオマスおよび乾燥バイオマスと比較して、高い銅金属イオン吸着能を示したトリコデルマ・コニンギオプシスの死菌バイオマスのみを、この試験では使用した。銅（ＩＩ）溶液が１００ｍｇ・Ｌ−１の濃度における平衡モデルデータを使用して、トリコデルマ・コニンギオプシスの死菌バイオマスによる銅ナノ粒子の生合成を調べた。
【００７４】
４．１．ＴＥＭ観察
サイズ、形状、および生物吸着剤上の銅ナノ粒子を位置を決定するために、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）による解析を用い、検体の超薄切片を透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ−１０１０）で観察した。
【００７５】
４．２．ＳＥＭ−ＥＤＳ分析
銅ナノ粒子の形成前後の生体材料小さい断片の分析をピンスタブ上で行ない、次いで真空下において金でコーティングし、エネルギー分散型分光計（ＥＤＳ）を備えたＪＥＯＬ  ６４６０  ＬＶでＳＥＭによって試験した。
【００７６】
４．３．ＦＴＩＲ−ＡＴＲ分析
赤外振動分光法（ＦＴＩＲ）を使用して、バイオマスに存在する官能基を同定し、銅ナノ粒子の存在によって引き起こされるスペクトル変動を評価した。赤外吸収スペクトルを、ブルカーモデルＡＬＰＨＡ干渉分光計で得た。試料を、単一反射の全反射測定法アクセサリー（白金−結晶ダイヤモンドを用いたＡＴＲ）を使用して、試料コンパートメントに直接置いた。４ｃｍ−１のスペクトル分解能を用いて、試料各々について８０スペクトルを蓄積した。
【００７７】
銅山から単離されたトリコデルマ・コニンギオプシスをさまざまな銅濃度（５０〜２０００ｍｇ  Ｌ−１）における最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）に供し、その結果は、トリコデルマ・コニンギオプシスが銅に対する高い耐性（１０５７ｍｇ・Ｌ−１）を示すことを示した。
【００７８】
４．４．物理化学的因子の生物吸着への影響
本試験は、バイオマス投与量、ｐＨ、温度、接触時間、撹拌速度、および金属イオン濃度などの物理化学的因子もよって、トリコデルマ・コニンギオプシスによる銅除去が影響されることを示した。
【００７９】
生物吸着剤投与量は、金属の所与の初期濃度に対する生物吸着剤の容量・能力を決定するため、重要なパラメーターである。図７Ａに見られるように、トリコデルマ・コニンギオプシスの生菌バイオマスおよび乾燥バイオマスによる銅に除去は、バイオマス濃度の増加とともに増加し、０．７５ｇ・Ｌ−１で飽和に達したのに対し、死菌バイオマスでは、飽和は１．０ｇ・Ｌ−１で達せられた（図７Ａ）。
【００８０】
死菌バイオマスによる銅の除去パーセント割合は、生菌バイオマスおよび乾燥バイオマスで観察された割合より大きかった（図７Ａ）。Ｃｕ（ＩＩ）除去に関して、死菌バイオマスは次の有利な点を提供する：金属除去系が毒性に供されない、成長培地を必要としない、吸着金属イオンを容易に脱着できる、死菌バイオマスは再利用することができる。生菌バイオマスおよび乾燥バイオマスによる銅除去は、０．７５ｇ・Ｌ−１超ではバイオマス濃度の増加とともに減少した。
【００８１】
この結果は、死菌バイオマスが、生菌バイオマスおよび乾燥バイオマスバイオマスと比べて、銅に対してより高い親和性を有することを示す。バイオマス投与量の増加に伴う除去容量の増加は、全表面積より大きいことや、結果として結合部位の数がより多いことに帰することができる。図７Ｂに示されるように、最大の銅の除去は、３種類のバイオマスで、ｐＨ５．０において見られた。より低いｐＨ値では、トリコデルマ・コニンギオプシスの細胞壁が、正の電荷を帯びるようになり、それが生物吸着能の減少の原因となる。対照的に、より高いｐＨ（ｐＨ５）では、細胞壁表面が負の電荷をより帯びるようになり、それによるバイオマスと正の電荷を帯びた金属イオンとの引力のためにトリコデルマ・コニンギオプシスのＣｕ（ＩＩ）の生物吸着は高い。
【００８２】
最大の銅の除去は、３種類のバイオマスで、４０℃において見られた（図７Ｃ）。金属の生物吸着への温度の影響は、金属と細胞壁上のリガンドとの相互作用を示唆した。グラフ（図７Ｄ）は３種類のバイオマスのすべてで、酵素触媒反応の特徴であるシグモイド型動態に従うことが観察された。死菌バイオマスに対する銅ナノ粒子形成の動態は、９１％を超える粒子が反応の６０分以内に形成されたことを示し、銅ナノ粒子の形成が指数関数的であることを示唆した。最適な銅除去は、３種類のバイオマスのすべてで、攪拌速度１５０ｒｐｍにおいて見られた（図７Ｅ）。高攪拌速度では、ボルテックス現象が生じ、懸濁液はもはや均一ではなく、実際にも、金属除去を損なう（Liu YG, Fan T, Zeng GM, Li X, Tong Q et al. (2006) Removal of cadmium and zinc ions from aqueous solution by living Aspergillus niger. Trans Nonferrous Met Soc China 16: 681-686）。
【００８３】
図７Ｆに示されるように、３種類のバイオマスで、銅吸着の％割合は、金属濃度（５０〜５００ｍｇ・Ｌ−１）の増加とともに減少した。
４．５．吸着等温式および動態モデル
【００８４】
ラングミュアおよびフロイントリッヒ等温式モデルを使用して、生物吸着データを当てはめ、生物吸着能を決定した。３種類のトリコデルマ・コニンギオプシスバイオマスから得られたＣｕ（ＩＩ）生物吸着に関するラングミュア等温式を図８Ａ、図８Ｂ、および図８Ｃに示す。等温式定数、ラングミュアおよびフロイントリッヒモデルによって推定される最大積載能力、回帰係数を、表３に示す。ラングミュアモデルは、フロイントリッヒモデルと比べて、より良くＣｕ（ＩＩ）生物吸着等温式を説明した。
【００８５】
この試験で観察されたトリコデルマ・コニンギオプシスによるＣｕ（ＩＩ）の最大吸着率（２１．１ｍｇ・ｇ−１）は、吸着率がそれぞれ６．２、１．５２、１５．０８、１９．０、１９．６、１５．８５、および２．７６ｍｇ・ｇ−１である、ウスラヒラタケ（Pleurotus pulmonaris）、シゾフィラム・コムーネ（Schizophyllum commune）、ペニシリウム属の複数種（Penicillium spp）、リゾプス・アリズス（Rhizopus arrhizus）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）、ピクノポラス・サンギネウス（Pycnoporus sanguineus）などの他の公知の生物吸着剤に関して報告されている吸着率と同様かまたは高かった（Veit MT, Tavares CRG, Gomes-da-Costa SM, Guedes TA (2005) Adsorption isotherms of copper (II) for two species of dead fungi biomasses. Process Biochem 40: 3303-3308; Du A, Cao L, Zhang R, Pan R (2009) Effects of a copper-resistant fungus on copper adsorption and chemical forms in soils. Water Air Soil Poll 201: 99-107; Rome L, Gadd DM (1987) Copper adsorption by Rhizopus arrhizus, Cladosporium resinae and Penicillium italicum. Appl Microbiol Biotechnol 26: 84-90; Kumar BN, Seshadri N, Ramana DKV, Seshaiah K, Reddy AVR (2011) Equilibrium, Thermodynamic and Kinetic studies on Trichoderma viride biomass as biosorbent for the r
emoval of Cu (II) from water. Separ Sci Technol 46: 997-1004; Yilmazer P, Saracoglu N (2009) Bioaccumulation and biosorption of copper (II) and chromium (III) from aqueous solutions by Pichia stiptis yeast. J Chem Technol Biot 84: 604-610; Yahaya YA, Matdom M, Bhatia S (2008) Biosorption of copper (II) onto immobilized cells of Pycnoporus sanguineus from aqueous solution: Equilibrium and Kinetic studies. Hazard Mater 161: 189-195）。
【００８６】
細菌由来の生物吸着剤との比較は、トリコデルマ・コニンギオプシスのＣｕ（ＩＩ）吸着率がバチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）ＩＡＭ１０２６の吸着率（２０．８ｍｇ・ｇ−１）に匹敵することを示した（Nakajima A, Yasuda M, Yokoyama H, Ohya-Nishiguchi H, Kamada H (2001) Copper sorption by chemically treated Micrococcus luteus cells. World J Microb Biot 17: 343-347）。
【００８７】
トリコデルマ・コニンギオプシスの３種類のバイオマスすべてのＣｕ（ＩＩ）生物吸着動態を、擬１次および擬２次モデルを用いて解析した。定数および回帰係数をすべて、表４に示す。図８Ｄ、図８Ｅ、および図８Ｆに示されるように、本試験では、トリコデルマ・コニンギオプシスによる生物吸着は、擬２次動態モデルを用いて最も良く説明される。この吸着動態は、２価の金属の生物吸着剤への吸着に典型的である（Reddad Z, Gerent C, Andres Y, LeCloirec P (2002) Adsorption of several metal ions onto a low-cost biosorbents: kinetic and equilibrium studies. Environ Sci Technol 36: 2067-2073）。
【００８８】
４．６．銅ナノ粒子の生合成
生物学的な系によるナノ粒子の形成の複雑な機序を研究することは、さらにより信頼でき、再現可能なその生合成の方法を決定するために重要である。真菌のバイオマスでのナノ粒子の形成の理解に向けて、一部分の死菌バイオマスをＴＥＭによって調査した。トリコデルマ・コニンギオプシスにおけるナノ粒子に位置を調べると、電子顕微鏡像から、ナノ粒子は細胞壁に見られるが細胞質および細胞膜には見られず、対照ではナノ粒子が存在しないことが明らかになり、対照およびオートクレーブプロセスにより銅が浸潤したバイオマスでは、細胞質材料の萎縮などの超微細構造変化が観察された（図９Ａおよび図９Ｂ）。細胞外に位置することは、生産プロセスにおける、より迅速で、大量にナノ粒子の獲得、容易な除去、バイオマスの再使用の可能性という有利な点を提供する。ナノ粒子の形状およびサイズは、ナノスケール材料の物理的、化学的、光学的、および電子的性質を制御する最も重要な特徴のうちの２つである（Alivisatos AP (1996) Perspectives on the physical chemistry of semiconductor nanocrystals. J Phys Chem 100: 13226-13239; Aizpurua J, Hanarp P, Sutherland DS, KaII M, Bryant GW, et al. (2003) Optical properties of gold nanorings. Phys Rev Lett 90: 57401-57404）。
【００８９】
本試験では、図９Ｂに示されるように、銅ナノ粒子は平均直径が８７．５ｎｍで、主として球形を示した。平均直径が３２８．２７ｎｍのナノ粒子の稀な凝集体が見られた（図９Ｃ）。
【００９０】
銅ナノ粒子の存在をスポットプロファイルＳＥＭ−ＥＤＳ測定によって確認された。真菌のバイオマスによるＣｕ（ＩＩ）の生物吸着の前後に記録されたＳＥＭ顕微鏡写真をそれぞれ、図１０Ａおよび図１０Ｂに示す。我々は、銅ナノ粒子が真菌バイオマスの表面に結合した後、不規則性を増加することによって、表面の変形が起こることを観察した。菌糸の試験領域で記録されたＥＤＳスペクトルは、菌類の銅からのシグナルを示す（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。
【００９１】
これとは別に、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｎａ、Ｐ、Ｃｌ、およびＫのシグナルは、銅ナノ粒子表面のキャッピング物質としてのタンパク質の存在を示す。そのようなシグナルは、菌類により分泌されたタンパク質によると見られ、銅ナノ粒子の合成および安定化（キャッピング物質）に関与しうる銅と生理活性分子との潜在的な相互作用を特定する、銅ナノ粒子の形成に関するＦＴＩＲ−ＡＴＲ測定によって支持されている。
【００９２】
タンパク質中のアミノ酸残基間のアミド結合は、電磁スペクトルの赤外域における周知の特徴を生み出す。ＦＴＩＲスペクトルは、アミドＩおよびアミドＩＩの変角振動にそれぞれ相当する１６４９および１５３４ｃｍ−１に、２つのバンドを示現する（図１２）。そのような形態は、銅ナノ粒子に結合したペプチド／タンパク質に起因し、キャッピング剤として作用するこれらの物質の可能性を示唆している（Bansal V, Ahamad A, Sastry M (2006) Fungus-mediated biotransformation of amorphous silica in rice husk to nanocrystalline Silica. J Am Chem Soc 128: 14059-14066）。
【００９３】
この試験では、バイオマス試料を銅（ＩＩ）イオンで飽和した後、純粋な試料に関するＦＴ−ＩＲスペクトルにおいて、幾つかのバンドシフトが、特にアミド基にあたるバンドで観察された。１６２６および１５３７ｃｍ−１のバンドがそれぞれ、１６２２および１５３４ｃｍ−１にシフトした（図１２）。そのシフトは、生物吸着が利用可能なバイオマス内の銅イオンとアミド基との相互作用によることを示唆する。１３７７および１０６８ｃｍ−１に観察される２つのバンドはそれぞれ、芳香族および脂肪族アミンのＣ−Ｎ伸縮振動に当てられることができる（図１２）（Vigneshwaran N, Kathe AA, Varadarajan PV, Nachane RP, Balasubramanya RH (2007) Silver-protein (core-shell) nanoparticle production using spent mushroom substrate. Langmuir 23: 7113-7117）。
【００９４】
そのような観察結果は、タンパク質の存在、および潜在的な安定化につながるタンパク質の銅ナノ粒子との結合を示す。おそらく死菌バイオマスでは、細胞からのタンパク質はオートクレーブ過程の間に遊離して、細胞表面に結合する。この観察結果は、球状形態の銅ナノ粒子は、たぶんナノ粒子の表面に結合し、それによって球状ナノ粒子の安定化剤として作用するタンパク質とともに存在することを示す。また、本試験で得られたＦＴＩＲの結果は、タンパク質のアミド基は強い親和性を有して金属に結合すること明らかにした。しかし、試験された銅のナノ粒子との相互作用に関与するタンパク質の種類は決定されないままである。そのような理解は、銅ナノ粒子を生産するための、より効率的な、環境に優しいプロセス（green process）につながり得る。
【表３】
2020072711.tif 000005
【表４】
2020072711.tif 000006
【図１】
2020072711.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2020072711.tif 000015
【図１０】
2020072711.tif 000016
【図１１】
2020072711.tif 000017
【図１２】
2020072711.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月5日(2020.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒポクレア・リキシイ（Hypocrea lixii）およびトリコデルマ・コニンギオプシス（Trichoderma koningiopsis）から選択される真菌から銅ナノ粒子を得る方法であって、
ａ．ヒポクレア・リキシイおよびトリコデルマ・コニンギオプシスから選択される真菌を単離する工程、
ｂ．工程ａの単離真菌の銅耐性を決定する工程、
ｃ．銅ストック溶液を調製する工程、
ｄ．前記単離真菌を、培養培地サブロー液体培地に添加して、生菌バイオマスを生じさせる工程、
ｅ．生菌バイオマスをオートクレーブに供して、死菌バイオマスを生じさせる工程、
ｆ．生菌バイオマスを乾燥して、乾燥バイオマスを生じさせる工程、および
ｇ．該生菌バイオマス、乾燥バイオマス、および死菌バイオマス中の銅ナノ粒子の滞留を決定する工程、
を含んでなる方法。