(57)【要約】      （修正有）【課題】抗BRDU抗体およびその使用方法を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むHVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3を含み、１）重鎖可変ドメインの30位にP、および２）重鎖可変ドメインの58位にF、および３）重鎖可変ドメインの108位にT、および４）軽鎖可変ドメインの49位にK、および５）軽鎖可変ドメインの98位にL（位置はいずれもKabatに従う）を含む、ヒト化抗BRDU抗体。およびヒト化抗BRDU抗体と、BRDUを含む核酸とを含む、複合体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（b）SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み、さらに（a）SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1、（b）SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および（c）SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含み、
・重鎖可変ドメインの30位にP、および
・重鎖可変ドメインの58位にF、および
・重鎖可変ドメインの108位にT、および
・軽鎖可変ドメインの49位にK、および
・軽鎖可変ドメインの98位にL（位置はいずれもKabatに従う）
を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
【請求項２】
（a）SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（b）SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み、さらに（a）SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1、（b）SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および（c）SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含み、
・重鎖可変ドメインの30位にP、および
・重鎖可変ドメインの58位にF、および
・重鎖可変ドメインの108位にT、および
・軽鎖可変ドメインの49位にK、および
・軽鎖可変ドメインの98位にL（位置はいずれもKabatに従う）
を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
【請求項３】
SEQ ID NO:09のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列およびSEQ ID NO:10のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列を含む、請求項1または2のいずれか一項に記載のヒト化抗BRDU抗体。
【請求項４】
SEQ ID NO:11の重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO:12の軽鎖可変ドメインを含む非ヒト抗BRDU抗体のヒト化変異体である、請求項1または2のいずれか一項に記載のヒト化抗BRDU抗体。
【請求項５】
SEQ ID NO:09のアミノ酸配列を有するVHを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のヒト化抗BRDU抗体。
【請求項６】
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有するVLを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のヒト化抗BRDU抗体。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか一項に記載のヒト化抗BRDU抗体と、BRDUを含む核酸とを含む、複合体。
【請求項８】
請求項2〜6のいずれか一項に記載のヒト化抗BRDU抗体と、システイン残基にコンジュゲートされたBRDUとを含む、共有結合複合体。
【請求項９】
請求項1〜6のいずれか一項に記載のヒト化抗BRDU抗体または請求項7もしくは8のいずれか一項に記載の複合体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的製剤。
【請求項１０】
細胞にBRDU含有核酸を送達するための抗体の使用であって、該抗体が、
a）第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体の軽鎖、および
b）第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体の重鎖であって、そのC末端で、第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来するscFvまたはscFabにコンジュゲートされている、重鎖
を含み、第1の抗体または第2の抗体のどちらか一方が請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗BRDU抗体である、前記使用。
【請求項１１】
前記抗BRDU抗体が、SEQ ID NO:09のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列およびSEQ ID NO:10のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列を含む、請求項10に記載の使用。
【請求項１２】
前記抗BRDU抗体が、SEQ ID NO:11の重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO:12の軽鎖可変ドメインを含む非ヒト抗BRDU抗体のヒト化変異体である、請求項10または11のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明はヒト化抗体BRDU抗体およびヒト化抗体BRDU誘導体抗体ならびにそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ハプテン結合性抗体は、捕捉モジュールとして治療的応用および診断的応用に応用することができる。例えば、発蛍光団、キレート試薬、ペプチド、核酸、タンパク質、脂質、ナノ粒子、および他の多くの作用物質などのハプテン結合実体は、ハプテン結合性の抗体および抗体誘導体と反応することができる。これにより、そのような「ペイロード（payload）」の効果的検出、ならびに捕捉、所望の場所における蓄積、架橋および他の抗体媒介効果が可能になる。ハプテンの特徴および組成はハプテン結合実体の組成および「挙動」（サイズ、溶解度、活性、生物物理学的特性、PK、生物学的効果その他を含む）に影響を及ぼしうるので、多種多様なハプテン結合性実体を開発することが、極めて望ましい。それにより、選択したハプテンを所与のペイロードと対応させて、最適化されたハプテンコンジュゲートを生成させることが可能になる。次に、最適なハプテン結合性実体を、該コンジュゲートと組み合わせて、最適な抗体-ハプテン-ペイロード複合体を生成させることができる。ヒト化された抗体誘導体などのハプテン結合性実体があることは、さらに望ましい。これにより、治療的応用における免疫原性などといった干渉のリスクを著しく低減した応用が可能になる。本明細書に記載する抗体は、BRDUおよびBRDU誘導体に結合する。本明細書では、これらの抗体を「BRDU結合」抗体または「抗BRDU」抗体と呼ぶ。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本発明は抗BRDU抗体および抗BRDU誘導体抗体ならびにそれらの使用方法を提供する。
【０００４】
本明細書において報告する一局面は、（a）SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（b）SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、ヒト化抗BRDU抗体である。この抗体はBRDUに特異的に結合する。
【０００５】
一態様において、本抗体は、重鎖可変ドメインの30位にプロリンアミノ酸残基を有する（ナンバリングはKabatに従う）。
【０００６】
一態様において、本抗体は、重鎖可変ドメインの58位にフェニルアラニンアミノ酸残基を有する（ナンバリングはKabatに従う）。
【０００７】
一態様において、本抗体は、重鎖可変ドメインの108位にスレオニンアミノ酸残基を有する（ナンバリングはKabatに従う）。
【０００８】
一態様において、本抗体は、重鎖可変ドメインの30位にアミノ酸残基プロリン、重鎖可変ドメインの58位にアミノ酸残基フェニルアラニン、および重鎖可変ドメインの108位にアミノ酸残基スレオニンを含む（ナンバリングはKabatに従う）。
【０００９】
一態様において、本抗体は、（1）SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（2）重鎖可変ドメインの30位にアミノ酸残基プロリン、（3）SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含むHVR-H2、（4）重鎖可変ドメインの58位にアミノ酸残基フェニルアラニン、（5）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3、および（6）重鎖可変ドメインの108位にアミノ酸残基トリプトファンを含む（ナンバリングはKabatに従う）。
【００１０】
一態様において、本抗体は、SEQ ID NO:02のアミノ酸配列を含むHVR-H1を含む。
【００１１】
一態様において、本抗体は、SEQ ID NO:03のアミノ酸配列を含むHVR-H2を含む。
【００１２】
一態様において、本抗体は、SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含むHVR-H2を含む。
【００１３】
一態様において、本抗体はさらに、（a）SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1、（b）SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および（c）SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。
【００１４】
一態様において、本抗体は、軽鎖可変ドメインの49位にアミノ酸残基リジンを含む（ナンバリングはKabatに従う）。
【００１５】
一態様において、本抗体は、軽鎖可変ドメインの98位にアミノ酸残基ロイシンを含む（ナンバリングはKabatに従う）。
【００１６】
一態様において、本抗体は、軽鎖可変ドメインの49位にアミノ酸残基リジン、および軽鎖可変ドメインの98位にアミノ酸残基ロイシンを含む（ナンバリングはKabatに従う）。
【００１７】
一態様において、本抗体は、（1）重鎖可変ドメインの30位にアミノ酸残基プロリン、重鎖可変ドメインの58位にアミノ酸残基フェニルアラニン、および重鎖可変ドメインの108位にアミノ酸残基スレオニンを含み、かつ（2）軽鎖可変ドメインの49位にアミノ酸残基リジン、および軽鎖可変ドメインの98位にアミノ酸残基ロイシンを含む（ナンバリングはKabatに従う）。
【００１８】
一態様において、本抗体は、（1）SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（2）重鎖可変ドメインの30位にアミノ酸残基プロリン、（3）SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含むHVR-H2、（4）重鎖可変ドメインの58位にアミノ酸残基フェニルアラニン、（5）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3、（6）重鎖可変ドメインの108位にアミノ酸残基トリプトファン、（7）SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1、（8）軽鎖可変ドメインの49位にアミノ酸残基リジン、（9）SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2、（10）軽鎖可変ドメインの98位にアミノ酸残基ロイシン、および（11）SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む（ナンバリングはKabatに従う）。
【００１９】
一態様において、本抗体は、（a）SEQ ID NO:09のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列、（b）SEQ ID NO:10のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列、または（c）（a）に記載のVH配列および（b）に記載のVL配列を含み、ここで本抗体は、（1）重鎖可変ドメインの30位にアミノ酸残基プロリン、重鎖可変ドメインの58位にアミノ酸残基フェニルアラニンおよび重鎖可変ドメインの108位にアミノ酸残基スレオニンを含み、かつ（2）軽鎖可変ドメインの49位にアミノ酸残基リジンおよび軽鎖可変ドメインの98位にアミノ酸残基ロイシンを含む（ナンバリングはKabatに従う）。
【００２０】
一態様において、本抗体はSEQ ID NO:09のVH配列を含む。
【００２１】
一態様において、本抗体はSEQ ID NO:10のVL配列を含む。
【００２２】
本明細書において報告する一局面は、SEQ ID NO:09のVH配列およびSEQ ID NO:10のVL配列を含む抗体である。
【００２３】
一態様において、本抗体は完全長IgG1抗体または完全長IgG4抗体である。
【００２４】
一態様において、本抗体はモノクローナル抗体である。
【００２５】
一態様において、本抗体は、BRDUに結合する抗体フラグメントである。
【００２６】
本明細書において報告する一局面は、SEQ ID NO:11のアミノ酸配列から派生した重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO:12のアミノ酸配列から派生した軽鎖可変ドメインを含み、BRDUに特異的に結合する、マウス抗体のヒト化変異体である。
【００２７】
一態様において、本抗体は、重鎖可変ドメインの30位にプロリンアミノ酸残基を有する（ナンバリングはKabatに従う）。
【００２８】
一態様において、本抗体は、重鎖可変ドメインの58位にフェニルアラニンアミノ酸残基を有する（ナンバリングはKabatに従う）。
【００２９】
一態様において、本抗体は、重鎖可変ドメインの108位にスレオニンアミノ酸残基を有する（ナンバリングはKabatに従う）。
【００３０】
一態様において、本抗体は、重鎖可変ドメインの30位にアミノ酸残基プロリン、重鎖可変ドメインの58位にアミノ酸残基フェニルアラニンおよび重鎖可変ドメインの108位にアミノ酸残基スレオニンを含む（ナンバリングはKabatに従う）。
【００３１】
一態様において、本抗体は、軽鎖可変ドメインの49位にアミノ酸残基リジンを含む（ナンバリングはKabatに従う）。
【００３２】
一態様において、本抗体は、軽鎖可変ドメインの98位にアミノ酸残基ロイシンを含む（ナンバリングはKabatに従う）。
【００３３】
一態様において、本抗体は、軽鎖可変ドメインの49位にアミノ酸残基リジンおよび軽鎖可変ドメインの98位にアミノ酸残基ロイシンを含む（ナンバリングはKabatに従う）。
【００３４】
一態様において、本抗体は、（1）重鎖可変ドメインの30位にアミノ酸残基プロリン、重鎖可変ドメインの58位にアミノ酸残基フェニルアラニンおよび重鎖可変ドメインの108位にアミノ酸残基スレオニンを含み、かつ（2）軽鎖可変ドメインの49位にアミノ酸残基リジンおよび軽鎖可変ドメインの98位にアミノ酸残基ロイシンを含む（ナンバリングはKabatに従う）。
【００３５】
本明細書において報告する一局面は、本明細書において報告する抗体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤である。
【００３６】
本明細書において報告する一局面は、医薬として使用するための、本明細書において報告する抗体である。
【００３７】
本明細書において報告する一局面は、医薬の製造における、本明細書において報告する抗体の使用である。
[本発明1001]
（a）SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（b）SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み、さらに（a）SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1、（b）SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および（c）SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含み、
・重鎖可変ドメインの30位にP、および
・重鎖可変ドメインの58位にF、および
・重鎖可変ドメインの108位にT、および
・軽鎖可変ドメインの49位にK、および
・軽鎖可変ドメインの98位にL（位置はいずれもKabatに従う）
を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
[本発明1002]
（a）SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（b）SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み、さらに（a）SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1、（b）SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および（c）SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含み、
・重鎖可変ドメインの30位にP、および
・重鎖可変ドメインの58位にF、および
・重鎖可変ドメインの108位にT、および
・軽鎖可変ドメインの49位にK、および
・軽鎖可変ドメインの98位にL（位置はいずれもKabatに従う）
を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
[本発明1003]
SEQ ID NO:09のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列およびSEQ ID NO:10のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列を含む、本発明1001または1002のいずれかのヒト化抗BRDU抗体。
[本発明1004]
SEQ ID NO:11の重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO:12の軽鎖可変ドメインを含む非ヒト抗BRDU抗体のヒト化変異体である、本発明1001または1002のいずれかのヒト化抗BRDU抗体。
[本発明1005]
SEQ ID NO:09のアミノ酸配列を有するVHを含む、本発明1001〜1004のいずれかのヒト化抗BRDU抗体。
[本発明1006]
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有するVLを含む、本発明1001〜1005のいずれかのヒト化抗BRDU抗体。
[本発明1007]
本発明1001〜1006のいずれかのヒト化抗BRDU抗体と、BRDUを含む核酸とを含む、複合体。
[本発明1008]
本発明1002〜1006のいずれかのヒト化抗BRDU抗体と、システイン残基にコンジュゲートされたBRDUとを含む、共有結合複合体。
[本発明1009]
本発明1001〜1006のいずれかのヒト化抗BRDU抗体または本発明1007もしくは1008のいずれかの複合体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的製剤。
[本発明1010]
細胞にBRDU含有核酸を送達するための抗体の使用であって、該抗体が、
a）第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体の軽鎖、および
b）第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体の重鎖であって、そのC末端で、第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来するscFvまたはscFabにコンジュゲートされている、重鎖
を含み、第1の抗体または第2の抗体のどちらか一方が本発明1001〜1006のいずれかの抗BRDU抗体である、前記使用。
[本発明1011]
前記抗BRDU抗体が、SEQ ID NO:09のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列およびSEQ ID NO:10のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列を含む、本発明1010の使用。
[本発明1012]
前記抗BRDU抗体が、SEQ ID NO:11の重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO:12の軽鎖可変ドメインを含む非ヒト抗BRDU抗体のヒト化変異体である、本発明1010または1011のいずれかの使用。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】A: 抗TfR/BRDU二重特異性抗体とBRDU標識DNAとの複合体ならびに遊離二重特異性抗体および遊離BRDU-DNAを同定し、特徴づけるために、SEC-MALLS分析を行った。複合体はカラムからMW 244.9kDaに溶出し、遊離二重特異性抗体はMW 215.4kDaに検出され、遊離BRDU-DNAはMW 16.4kDaに検出される。B: 抗TfR/BRDU二重特異性抗体とBRDU標識DNAとの複合体ならびに遊離二重特異性抗体および遊離BRDU-DNAを同定し、特徴づけるために、SEC-MALLS分析を行った。複合体は流体力学的半径6.8nmを呈し、一方、遊離二重特異性抗体は流体力学的半径6.2nmを呈する。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
発明の態様の詳細な説明
I.定義
本明細書において、重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）に記載のKabatナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、これを本明細書では、「ナンバリングはKabatに従う」という。具体的に述べると、カッパおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLには、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）のKabatナンバリングシステム（647〜660頁参照）を使用し、定常重鎖ドメイン（CH1、ヒンジ、CH2およびCH3）には、Kabat EUインデックスナンバリングシステム（661〜723頁参照）を使用する。
【００４０】
本明細書に関して「アクセプターヒトフレームワーク」とは、以下に定義するヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（VL）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（VH）フレームワークのアミノ酸配列を含む、フレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それと同じアミノ酸配列を含んでもよいし、またはアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの態様では、アミノ酸の変更の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、または2以下である。いくつかの態様では、VLアクセプターヒトフレームワークの配列は、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。
【００４１】
「親和性」は、ある分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合的相互作用の総和の強さを指す。別段の表示がある場合を除き、本明細書でいう「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば抗体と抗原）間の1:1相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Xのその結合パートナーYに対する親和性は、一般に、解離定数（Kd）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載するものを含む、当技術分野において公知の一般的方法によって測定することができる。結合親和性の測定に関して、説明的かつ例示的な具体的態様を、以下に記載する。
【００４２】
「親和性成熟」抗体は、該当する改変を持たない親抗体と比較して、1つまたは複数の超可変領域（HVR）に1つまたは複数の改変を有する抗体であって、当該改変が抗原に対する抗体の親和性の改良をもたらしているものを指す。
【００４３】
用語「抗BRDU抗体」および「BRDUに結合する抗体」は、抗体が診断剤および/または治療剤としてBRDUのターゲティングに役立つように、十分な親和性でBRDUと結合する能力を有する抗体を指す。
【００４４】
本明細書において用語「抗体」は最も広い意味で使用され、さまざまな抗体構造、例えば限定するわけではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体フラグメントなどを、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り包含する。
【００４５】
「抗体フラグメント」は、無傷の抗体のうち、無傷の抗体が結合する抗原と結合する部分を含む、無傷の抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;ダイアボディ;線状抗体;単鎖抗体分子（例えばscFv）;および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体などがあるが、それらに限定されるわけではない。
【００４６】
用語「キメラ」抗体は、重鎖および/または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来し、同時に重鎖および/または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
【００４７】
抗体の「クラス」は、その重鎖が持つ定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体の主要クラスには、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMの5つがあり、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）に、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2に分割することができる。異なる免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【００４８】
本明細書において使用する用語「細胞毒性作用物質」は、細胞の機能を阻害もしくは防止し、かつ/または細胞死もしくは細胞破壊を引き起こす物質を指す。細胞毒性作用物質には、放射性同位体（例えばAt211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212およびLuの放射性同位体）;化学療法剤または化学療法薬（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン（adriamicin）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）;成長阻害剤;酵素およびそのフラグメント、例えば核酸分解酵素;抗生物質;毒素、例えば低分子毒素または細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素的に活性な毒素（そのフラグメントおよび/または変異体を含む）;および以下に開示するさまざまな抗腫瘍または抗がん剤などがあるが、それらに限定されるわけではない。
【００４９】
「から派生した」という用語は、アミノ酸配列が、少なくとも1つの位置に改変を導入することによって親アミノ酸配列から派生したことを表す。したがって、派生したアミノ酸配列は、少なくとも1つの対応する位置において、対応する親アミノ酸配列と相違している（抗体Fc領域のナンバリングはKabat EUインデックスナンバリングシステムに従う）。一態様において、親アミノ酸配列から派生したアミノ酸配列は、対応する位置にある2つ以上のアミノ酸残基が、親アミノ酸配列と相違している。一態様において、親アミノ酸配列から派生したアミノ酸配列は、対応する位置にある11個以上のアミノ酸残基が、親アミノ酸配列と相違している。一態様において、親アミノ酸配列から派生したアミノ酸配列は、対応する位置にある16個以上のアミノ酸残基が、親アミノ酸配列と相違している。このように親アミノ酸配列は派生したアミノ酸配列の基礎を形成する。
【００５０】
「エフェクター機能」は、抗体のFc領域に帰することができる生物学的活性を指し、それは抗体クラスによって異なる。抗体エフェクター機能の例には、C1q結合および補体依存性細胞傷害（CDC）;Fc受容体結合;抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）;貪食;細胞表面受容体（例えばB細胞受容体）のダウンレギュレーション;およびB細胞活性化などがある。
【００５１】
薬剤、例えば薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的または予防的結果を達成するのに有効な量、それを達成するのに必要な投薬量および期間を指す。
【００５２】
本明細書において「Fc領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を規定するために使用される。この用語には天然型配列Fc領域および変異体Fc領域が含まれる。一態様では、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226またはPro230から重鎖のカルボキシル末端に及ぶ。ただし、Fc領域のC末端リジン（Lys447）は存在しても存在しなくてもよい。本明細書において別段の明示がある場合を除き、Fc領域または定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242に記載されているEUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）に従う。
【００５３】
「フレームワーク」または「FR」とは、超可変領域（HVR）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、一般的には、4つのFRドメイン、すなわちFR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。したがって、HVR配列およびFR配列は、一般的には、VH（またはVL）中に、次の順序で見いだされる：FR1-H1（L1）-FR2-H2（L2）-FR3-H3（L3）-FR4。
【００５４】
用語「完全長抗体」、「無傷の抗体」、および「全抗体」は、本明細書では、天然型抗体の構造に実質的に類似する構造を有するか、または本明細書に定義するFc領域を含有する重鎖を有する抗体を指すために、可換的に使用される。
【００５５】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養」は可換的に使用され、外因性核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫も含まれる。宿主細胞には「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これらには初代形質転換細胞とそこから派生する子孫とが継代数を問わずに含まれる。子孫は、核酸内容物が親細胞と完全には同一でなくて、変異を含有するかもしれない。最初に形質転換された細胞において選別または選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫は、ここに含まれる。
【００５６】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって生産された抗体またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を用いる非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義からは、非ヒト抗原結合性残基を含むヒト化抗体は特に除外される。
【００５７】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択に際して最もよく見いだされるアミノ酸残基に相当するフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は可変ドメイン配列のサブグループからなされる。一般に、配列のサブグループはKabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Helth, Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols.1-3に記載のサブグループである。一態様において、VLについては、サブグループが前記Kabat et alに記載のサブグループ・カッパIである。一態様において、VHについては、サブグループが前記Kabat et alに記載のサブグループIIIである。
【００５８】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトHVRからのアミノ酸残基とヒトFRからのアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の態様においては、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そのHVR（例えばCDR）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、FRの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含みうる。抗体（例えば非ヒト抗体）の「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体を指す。
【００５９】
本明細書において使用する用語「超可変領域」または「HVR」は、配列が超可変的であり、かつ／または構造上明確なループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般に、天然型の四本鎖抗体は6つのHVRを含み、3つはVH（H1、H2、H3）中にあり、3つはVL（L1、L2、L3）中にある。HVRは、一般に、超可変ループおよび/または「相補性決定領域」（CDR）からのアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性を有し、かつ/または抗原認識に関与する。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基26〜32（L1）、50〜52（L2）、91〜96（L3）、26〜32（H1）、53〜55（H2）、および96-101（H3）に見いだされる（Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917）。例示的なCDR（CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3）は、L1のアミノ酸残基24〜34、L2の50〜56、L3の89〜97、H1の31〜35B、H2の50〜65、およびH3の95〜102に見いだされる（Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242）。VH中のCDR1を除けば、CDRは、一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。CDRは、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」または「SDR」も含む。SDRは、短縮CDR（abbreviated-CDR）またはa-CDRと呼ばれるCDRの領域内に含有される。例示的なa-CDR（a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、およびa-CDR-H3）は、L1のアミノ酸残基31〜34、L2の50〜55、L3の89〜96、H1の31〜35B、H2の50〜58、およびH3の95〜102に見いだされる（Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633参照）。別段の表示がある場合を除き、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えばFR残基）は、本明細書では、前記Kabat et alに従ってナンバリングされる。
【００６０】
「イムノコンジュゲート」は、例えば限定するわけではないが細胞毒性作用物質などの1つまたは複数の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。
【００６１】
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えばヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、および齧歯類（例えばマウスおよびラット）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。特定の態様では、個体または対象がヒトである。
【００６２】
「単離された」抗体とは、その自然環境の構成要素から分離されたものである。いくつかの態様では、抗体が、例えば電気泳動（例えばSDS-PAGE、等電点電気泳動（IEF）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えばイオン交換または逆相HPLC）などによる決定で、95％または99％を上回る純度まで精製される。抗体純度の評価方法を概観するには、例えばFlatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87を参照されたい。
【００６３】
「単離された」核酸とは、その自然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、通常その核酸分子を含有するが、当該核酸分子が染色体外またはその自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在している細胞に含有される核酸分子も含まれる。
【００６４】
「抗BRDU抗体をコードする単離された核酸」とは、抗体重鎖および軽鎖（またはそのフラグメント）をコードする1つまたは複数の核酸分子を指し、これには、単一のベクターまたは別々のベクター中のそのような核酸分子、および宿主細胞中の1つまたは複数の場所に存在するそのような核酸分子が含まれる。
【００６５】
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、この集団を構成する個々の抗体は、考えうる変異体抗体、例えば天然の変異を含有するもの、またはモノクローナル抗体調製物の生産中に生じるもの（そのような変異体は一般に微量に存在する）を除いて、同一であり、かつ/または同じエピトープと結合する。典型的には異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体が含まれるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基を指向する。したがって「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示しているのであって、何らかの特定の方法による抗体の生産を要求していると解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば限定するわけではないがハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン座位の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法など、さまざまな技法によって作製することができ、本明細書にはモノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的方法を記載する。
【００６６】
「裸抗体」とは、異種の部分（例えば細胞毒性部分）または放射性ラベルにコンジュゲートされていない抗体を指す。裸抗体は薬学的製剤中に存在しうる。
【００６７】
「天然型抗体」とは、さまざまな構造を有する天然免疫グロブリン分子を指す。例えば天然型IgG抗体は、ジスルフィド結合した2つの同一軽鎖および2つの同一重鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、N末端からC末端に向かって、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VH）と、それに続く3つの定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）を有する。同様に、各軽鎖は、N末端からC末端に向かって、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VL）と、それに続く定常軽鎖（CL）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2つのタイプの1つに割り当てることができる。
【００６８】
「添付文書」という用語は、治療用製品の市販用梱包物に通例含まれていて、適応症、用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌および/または当該治療用製品の使用上の注意に関する情報が掲載されている、説明書を指すために使用される。
【００６９】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントが得られるように、また保存的置換を配列同一性の一部と見なさずに、配列を整列し、必要であればギャップを導入した後に、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための整列は、当技術分野の技能の範囲内にあるさまざまな方法で、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使って、達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大の整列を達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めて、配列を整列するための適当なパラメータを決定することができる。ただし、本明細書における目的には、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使って、アミノ酸配列同一性％値を生成させる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはGenentech, Inc.によって作成されたものであり、米国著作権局（Washington D.C., 20559）に利用者向け文書と共に登録申請され、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech, Inc.（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から公的に入手することができるか、またはソースコードからコンパイルすることができる。ALIGN-2プログラムはUNIXオペレーティングシステム、好ましくはdigital UNIX V4.0D上で使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータはALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。
【００７０】
アミノ酸配列比較にALIGN-2を使用する場合、所与のアミノ酸配列Aの、所与のアミノ酸配列Bへの、所与のアミノ酸配列Bとの、または所与のアミノ酸配列Bに対するアミノ酸配列同一性％（これは、所与のアミノ酸配列Bに、所与のアミノ酸配列Bと、または所与のアミノ酸配列Bに対して、一定のアミノ酸配列同一性％を有する、または含む、所与のアミノ酸配列Aと、言い換えることもできる）は、次のように計算される。
分率X/Y×100
ここで、Xは、配列整列プログラムALIGN-2が、そのプログラムによるAとBとの整列において、完全一致（identical match）と記録したアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合に、Aの、Bとのアミノ酸配列同一性％が、Bの、Aとのアミノ酸配列同一性％と等しくなくなることは、理解されるであろう。別段の明言がある場合を除き、本明細書において使用するアミノ酸配列同一性％値は全て、すぐ上の段落で説明したように、ALIGN-2コンピュータプログラムを使って得られる。
【００７１】
「薬学的製剤」という用語は、そこに含有される活性成分の生物学的活性が有効でありうるような形態にあって、その製剤が投与されるであろう対象にとって許容できないほど毒性な追加構成要素を含有しない調製物を指す。
【００７２】
「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって無毒性な、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存剤などがあるが、それらに限定されるわけではない。
【００７３】
本明細書でいう用語「BRDU」は、化学式5-ブロモ-2'-デオキシウリジンを有するブロモデオキシウリジンを指す。他の略語は、BrdU、BUdR、BrdUrdである。
【００７４】
本明細書でいう「治療」（およびその文法上の異形、例えば「治療する」または「治療すること」）は、治療される個体の自然経過を改変しようとする臨床的介入を指し、予防のために行うことも、臨床病理の過程において行うこともできる。治療の望ましい効果には、疾患の出現または再発を予防すること、症状の軽減、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の減縮、転移を予防すること、疾患進行の速度を減じること、疾患状態からの回復または疾患状態の緩和、および寛解、または予後の改善などがあるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様では、本発明の抗体が、疾患の発生を遅延させ、または疾患の進行を遅らせるために使用される。
【００７５】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗原への抗体の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は一般に類似する構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域（FR）と3つの超可変領域（HVR）とを含む（例えばKindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), 91ページ参照）。抗原結合特異性を付与するには、単一のVHまたはVLドメインで十分でありうる。さらにまた、特定の抗原と結合する抗体は、その抗原と結合する抗体からのVHまたはVLドメインを使って、それぞれ相補的VLまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングすることによって、単離することができる。例えばPortolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887、Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照されたい。
【００７６】
本明細書において使用する用語「ベクター」は、そこに連結された別の核酸を増殖させる能力を有する核酸分子を指す。この用語には、自己複製する核酸構造としてのベクターも、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターも含まれる。一定のベクターは、それらが作動的に連結されている核酸の発現を指示する能力を有する。そのようなベクターを本明細書では「発現ベクター」という。
【００７７】
「ハプテン」という用語は、タンパク質などの大きな担体に取り付けられた場合にのみ免疫応答を引き出しすることができる小分子を表す。例示的なハプテンは、アニリン、o-、m-、およびp-アミノ安息香酸、キノン、ヒドララジン、ハロタン、フルオレセイン、ビオチン、BRDU、ジゴキシゲニン、テオフィリンおよびジニトロフェノールである。一態様では、ハプテンは、ビオチンまたはジゴキシゲニンまたはテオフィリンまたはカルボランまたはBRDUである。一態様において、ハプテンはBRDUである。
【００７８】
「にコンジュゲートされたBRDU」という用語は、エフェクター核酸、ポリペプチドまたはラベルなどのさらなる部分に直接的にまたは間接的に共有結合で連結されたBRDU残基を表す。好ましい一態様において、前記さらなる部分は核酸である。
【００７９】
「共有結合複合体形成」という用語は、例えば抗BRDU抗体とBRDUとの間で起こる非共有結合複合体の形成後に、複合体中の2つのパートナー間に共有結合が形成されることを表す。共有結合の形成を起こすためにさらなる反応物を加える必要はない。
【００８０】
II.組成物および方法
一局面において、本発明は、BRDUに結合するヒト化抗体に基づく。これらの抗体は本明細書において提供される。本発明の抗体は、例えばBRDU含有核酸を結合するための単一特異性抗体として有用であり、BRDU含有核酸に対する結合特異性を本抗体の汎用ペイロード化（payloading）特性として利用することによって、あらゆる種類の疾患を診断または治療するための多重特異性抗体として有用である。
【００８１】
A.例示的な抗BRDU抗体
一局面において、本発明は、BRDUに結合する単離された抗体を提供する。特定の態様において、本抗BRDU抗体はヒト化抗BRDU抗体である。特定の態様において、本明細書において報告する抗BRDU抗体は、BRDU含有核酸に、その核酸の生物学的活性を妨害することなく結合する。それゆえにこれらの抗体は、その抗体が単一特異性抗体であるなら、BRDU含有核酸の薬物動態特性を改良するために使用することができる。また、抗体が二重特異性抗体または多重特異性抗体であって、1つの結合特異性がBRDUを指向し、汎用ペイロード化特異性として使用することができ、一方、第2の結合特異性が例えば細胞表面分子に特異的に結合して、その二重特異性抗体または多重特異性抗体のターゲティング特性/構成要素になるのであれば、これらの抗体はBRDU含有核酸の標的送達にも使用することができる。
【００８２】
細胞にまたは細胞内に核酸を（すなわちペイロード核酸を）標的送達する場合、ペイロード核酸に導入される修飾はできるだけ少ないことが望ましい。
【００８３】
核酸をポリペプチドにコンジュゲートすると、核酸には著しい修飾が導入される。
【００８４】
もう一つの選択肢として、非ヌクレオチドハプテンへの核酸のコンジュゲーションが可能である。その結果生じる核酸の修飾はポリペプチドへのコンジュゲーションと比較すると少ない。しかし、ビオチン、ジゴキシゲニン、テオフィリン、フルオレセインなどの非ヌクレオチドハプテンは、依然として、例えばその構造などが、ヌクレオチドとは著しく相違する。したがって、非ヌクレオチドハプテンへのコンジュゲーションは、依然として、容認できない修飾をもたらしうる。
【００８５】
あるチミジン類似体、すなわちブロモデオキシウリジン（BRDU）を使用することで、一方では抗体によって認識することができ、他方ではペイロード核酸に著しい修飾を導入しないハプテンを提供できることが、ここに見いだされた。
【００８６】
一局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1;（b）SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含むHVR-H2;（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3;（d）SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1;（e）SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2;および（f）SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのHVRを含む抗BRDU抗体を提供する。
【００８７】
一局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:02のアミノ酸配列を含むHVR-H1;（b）SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含むHVR-H2;（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3;（d）SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1;（e）SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2;および（f）SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのHVRを含む抗BRDU抗体を提供する。
【００８８】
一局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1;（b）SEQ ID NO:03のアミノ酸配列を含むHVR-H2;（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3;（d）SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1;（e）SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2;および（f）SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのHVRを含む抗BRDU抗体を提供する。
【００８９】
一局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:02のアミノ酸配列を含むHVR-H1;（b）SEQ ID NO:03のアミノ酸配列を含むHVR-H2;（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3;（d）SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1;（e）SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2;および（f）SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのHVRを含む抗BRDU抗体を提供する。
【００９０】
一局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1;（b）SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含むHVR-H2;および（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む抗BRDU抗体を提供する。一態様において、本抗体は、SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む。別の態様において、本抗体は、SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3およびSEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。さらなる態様において、本抗体は、SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3、SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3、およびSEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含むHVR-H2を含む。さらなる態様において、本抗体は、（a）SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1;（b）SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含むHVR-H2;および（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む。
【００９１】
別の局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1;（b）SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2;および（c）SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む抗BRDU抗体を提供する。一態様において、本抗体は、（a）SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1;（b）SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2;および（c）SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。
【００９２】
別の局面において、本発明の抗BRDU抗体は、（a）（i）SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（ii）SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（iii）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含むVHドメイン;ならびに（b）（i）SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1、（ii）SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および（c）SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含むVLドメインを含む。
【００９３】
別の局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1;（b）SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含むHVR-H2;（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3;（d）SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1;（e）SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2;および（f）SEQ ID NO:08から選択されるアミノ酸を含むHVR-L3を含む抗BRDU抗体を提供する。
【００９４】
一態様において、抗BRDU抗体はヒト化されている。
【００９５】
ヒト化抗BRDU抗体は、非ヒト化親抗体の特性を維持するために、特異的な位置に特異的残基を要求することがわかった。
【００９６】
本ヒト化抗BRDU抗体は、重鎖可変ドメイン中のKabat位置30に、アミノ酸残基Pを含む。
【００９７】
本ヒト化抗BRDU抗体は、重鎖可変ドメイン中のKabat位置58に、アミノ酸残基Fを含む。
【００９８】
本ヒト化抗BRDU抗体は、重鎖可変ドメイン中のKabat位置108に、アミノ酸残基Tを含む。
【００９９】
一態様において、ヒト化抗BRDU抗体は、上記の態様のいずれかに記載のHVRを含み、かつアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを、さらに含む。
【０１００】
一態様において、ヒト化抗BRDU抗体は、上記の態様のいずれかに記載のHVR-Hを含むVHを含み、かつ以下の1つまたは複数をさらに含む:
・重鎖可変ドメインの30位にP、および/または
・重鎖可変ドメインの58位にF、および/または
・重鎖可変ドメインの108位にT、および/または
・軽鎖可変ドメインの49位にK、および/または
・軽鎖可変ドメインの98位にL（位置はいずれもKabatに従う）。
【０１０１】
重鎖可変ドメインのKabat位置30は、SEQ ID NO:09およびSEQ ID NO:11の残基番号30に対応する。
【０１０２】
重鎖可変ドメインのKabat位置58は、SEQ ID NO:09およびSEQ ID NO:11の残基番号59に対応する。
【０１０３】
重鎖可変ドメインのKabat位置108は、SEQ ID NO:09およびSEQ ID NO:11の残基番号114に対応する。
【０１０４】
軽鎖可変ドメインのKabat位置49は、SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:12の残基番号49に対応する。
【０１０５】
軽鎖可変ドメインのKabat位置98は、SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:12の残基番号98に対応する。
【０１０６】
これらの改変（復帰変異）は、ヒト化抗BRDU抗体の結合アフィニティーを増加させるために導入することができる。
【０１０７】
別の局面では、抗BRDU抗体は、SEQ ID NO:09のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（VH）を含む。特定の態様では、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVH配列が、参照配列と比較して置換（例えば保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗BRDU抗体はBRDUに結合する能力を保っている。特定の態様では、SEQ ID NO: 09において全部で1〜10個のアミノ酸が、置換、挿入、および/または削除されている。特定の態様では、置換、挿入、または欠失が、HVR外の領域（すなわちFR中）に存在する。任意で、抗BRDU抗体は、SEQ ID NO:09中のVH配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。ある特定態様では、VHが、（a）SEQ ID NO:01または02のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（b）SEQ ID NO:03または04のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択される1つ、2つまたは3つのHVRを含む。
【０１０８】
別の局面では、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（VL）を含む抗BRDU抗体が提供される。特定の態様では、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVL配列が、参照配列と比較して置換（例えば保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗BRDU抗体はBRDUに結合する能力を保っている。特定の態様では、SEQ ID NO:10において全部で1〜10個のアミノ酸が、置換、挿入、および/または削除されている。特定の態様では、置換、挿入、または欠失がHVR外の領域（すなわちFR中）に存在する。任意で、抗BRDU抗体は、SEQ ID NO:10中のVL配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。ある特定態様では、VLが、（a）SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1、（b）SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および（c）SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択される1つ、2つまたは3つのHVRを含む。
【０１０９】
別の局面では、上に掲載した態様のいずれかのVHと上に掲載した態様のいずれかのVLとを含む抗BRDU抗体が提供される。一態様では、抗体が、それぞれSEQ ID NO:09およびSEQ ID NO:10中のVH配列およびVL配列（それらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む。
【０１１０】
本発明のさらなる局面において、上記の態様のいずれかによる抗BRDU抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。一態様では、抗BRDU抗体が抗体フラグメント、例えばFv、Fab、Fab'、scFv、ダイアボディ、またはF(ab')2フラグメントである。別の態様では、抗体が完全長抗体、例えば無傷のIgG1もしくはIgG4抗体、または本明細書において定義する他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。
【０１１１】
さらなる局面では、上記の態様のいずれかによる抗BRDU抗体が、以下の1〜5項に記載する特徴のいずれかを、一つずつまたは組み合わせて組み入れることができる。
【０１１２】
1.抗体親和性
Kdは、以下のアッセイで説明するように、関心対象の抗体のFab型とその抗原とを使って行われる放射標識抗原結合アッセイ（RIA）によって測定され得る。例えば、抗原に対するFabの溶液結合親和性（solution binding affinity）は、非標識抗原のタイトレーション系列（titration series）の存在下でFabを最小濃度の(125I)-標識抗原と平衡させ、次に結合した抗原を抗Fab抗体被覆プレートで捕捉することによって測定される（例えばChen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881参照）。アッセイのための条件を確立するために、MICROTITER（登録商標）マルチウェルプレート（Thermo Scientific）を、50mM炭酸ナトリウム（pH9.6）中、5μg/mlの捕捉用抗Fab抗体（Cappel Labs）で終夜コーティングし、次に室温（約23℃）で2〜5時間、PBS中の2％（w/v）ウシ血清アルブミンでブロッキングする。非吸着性プレート（Nunc #269620）において、100pMまたは26pM [125I]-抗原を、関心対象のFabの段階希釈液と混合する（例えばPresta, L.G. et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599における抗VEGF抗体Fab-12の評価に準じる）。次に、関心対象のFabを終夜インキュベートするが、このインキュベーションは、平衡に達することを保証するために、さらに長い期間（例えば約65時間）継続してもよい。その後、混合物を捕捉プレートに移して、室温で（例えば1時間）インキュベートする。次に、溶液を取り除き、PBS中の0.1％ポリソルベート20（TWEEN-20（登録商標））でプレートを8回洗浄する。プレートが乾燥したら、150μl/ウェルのシンチラント（MICROSCINT-20（商標）；Packard）を加え、TOPCOUNT（商標）ガンマ線計数器（Packard）でプレートを10分間カウントする。最大結合の20％以下を与える各Fabの濃度を、競合結合アッセイにおいて使用するために選択する。
【０１１３】
あるいは、Kdは、BIACORE（登録商標）-2000またはBIACORE（登録商標）-3000またはBIACORE（登録商標）T-100（BIAcore, Inc.、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを利用して測定され得る。例えば、抗原が約10応答単位（response unit）（RU）でCM5チップに固定化されて、それを25℃で用いてKd値が測定される。簡単に述べると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（CM5、BIACORE, Inc.）を、供給者の指示に従って、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩（EDC）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）で活性化する。抗原を10mM酢酸ナトリウム（pH4.8）で5μg/ml（約0.2μM）に希釈してから、5μl/分の流速で注入することにより、およそ10応答単位（RU）のタンパク質をカップリングさせる。抗原の注入に続いて、未反応基を保護するために1Mエタノールアミンを注入する。速度論的測定のために、Fabの2倍段階希釈液（0.78nM〜500nM）を、0.05％ポリソルベート20（TWEEN-20（商標））界面活性剤を含むPBS（PBST）中、25℃、およそ25μl/分の流速で注入する。単純な1対1ラングミュア結合モデル（BIACORE（登録商標）評価ソフトウェア・バージョン3.2）を使用し、会合と解離のセンサーグラムを同時にフィッティングすることによって、会合速度（kon）および解離速度（koff）を計算する。平衡解離定数（Kd）は比koff/konとして計算される。例えばChen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881参照。上記の表面プラズモン共鳴アッセイでオン速度が106M-1s-1を上回る場合は、抗原の濃度を増加させつつ、ストップフロー付き分光測光器（Aviv Instruments）または撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-AMINCO（商標）分光測光器（ThermoSpectronic）などの分光計で測定される、PBS（pH7.2）中、20nMの抗抗原抗体（Fab型）の、25℃における蛍光発光強度（励起＝295nm；蛍光＝340nm、帯域幅16nm）の増減を測定する蛍光消光技法を使って、オン速度を決定することができる。
【０１１４】
2.抗体フラグメント
特定の態様では、本明細書に規定する抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントには、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、およびscFvフラグメント、ならびに以下に述べる他のフラグメントがあるが、それらに限定されるわけではない。一定の抗体フラグメントを概観するには、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照されたい。scFvフラグメントを概観するには、例えばPlueckthun, A., In;The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp.269-315を参照されたい。また、WO 93/16185およびUS 5,571,894およびUS 5,587,458も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するFabおよびF(ab')2フラグメントに関する解説については、US 5,869,046を参照されたい。
【０１１５】
ダイアボディは、二価または二重特異性であることができる2つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントである。例えばEP 0 404 097、WO 1993/01161、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134、およびHolliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディも、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134)に記載されている。
【０１１６】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部または一部を含む抗体フラグメントである。特定の態様では、単一ドメイン抗体が、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc.、マサチューセッツ州ウォルサム;例えばUS 6,248,516 B1参照）。
【０１１７】
抗体フラグメントは、さまざまな技法によって、例えば限定するわけではないが、本明細書に記載するように、無傷の抗体のタンパク質分解消化や、組換え宿主細胞（例えば大腸菌（E. coli）またはファージ）による生産などによって作製することができる。
【０１１８】
3.キメラ抗体およびヒト化抗体
特定の態様では、本明細書に規定する抗体が、キメラ抗体である。例えばUS 4,816,567、およびMorrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855には、一定のキメラ抗体が記載されている。一例では、キメラ抗体が、非ヒト可変領域（例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）とヒト定常領域とを含む。さらなる例では、キメラ抗体が、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変化している「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体にはその抗原結合性フラグメントが含まれる。
【０１１９】
特定の態様では、キメラ抗体はヒト化抗体である。非ヒト抗体は、典型的には、親非ヒト抗体の特異性および親和性を保ったまま、ヒトに対する免疫原性を低減するために、ヒト化される。一般にヒト化抗体は、HVR、例えばCDR（またはその一部分）が非ヒト抗体に由来し、FR（またはその一部分）がヒト抗体配列に由来する、1つまたは複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部分も含む。いくつかの態様では、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基が、例えば抗体の特異性または親和性を復活させるかまたは改良するために、非ヒト抗体（例えばHVR残基の由来となった抗体）からの対応する残基で置換される。
【０１２０】
ヒト化抗体およびそれらを作製する方法については、例えばAlmagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633に総説があり、例えばRiechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329、Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033、US 5,821,337、US 7,527,791、US 6,982,321、およびUS 7,087,409、Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34（SDR（a-CDR）移植についての記載がある）、Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498（「リサーフェイシング（resurfacing）」についての記載がある）、Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60（「FRシャフリング」についての記載がある）、ならびにOsbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68およびKlimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260（FRシャフリングのための「誘導選択（guided selection）」アプローチについての記載がある）に、さらに詳しく説明されている。
【０１２１】
ヒト化に使用することができるヒトフレームワーク領域には、次に挙げるものがあるが、それらに限定されるわけではない: 「ベストフィット（best-fit）」法を使って選択されたフレームワーク領域（例えばSims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308参照）;軽鎖または重鎖可変領域の特定サブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えばCarter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289、およびPresta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632参照）;ヒト成熟（体細胞性変異型）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えばAlmagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633参照）;およびFRライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えばBaca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684およびRosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618参照）。
【０１２２】
4.多重特異性抗体
特定の態様では、本明細書に規定する抗体が多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様では、結合特異性の一方がBRDUに対するものであり、他方が他の任意の抗原に対するものである。特定の態様では、二重特異性抗体が、BRDUの2つの異なるエピトープに結合しうる。二重特異性抗体は、BRDUを発現する細胞に細胞毒性作用物質を局在化するためにも使用することができる。二重特異性抗体は完全長抗体または抗体フラグメントとして調製することができる。
【０１２３】
多重特異性抗体を作製するための技法には、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え同時発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540、WO 93/08829、およびTraunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659参照）、および「ノブ・イン・ホール（knob-in-hole）」工学（例えばUS 5,731,168参照）などがあるが、それらに限定されるわけではない。多重特異性抗体は、抗体Fc-ヘテロ二量体分子を作製するために静電的ステアリング効果（electrostatic steering effect）を工学的に操作すること（WO 2009/089004）;2つ以上の抗体またはフラグメントを架橋すること（例えばUS 4,676,980、およびBrennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83参照）；ロイシンジッパーを使って二重特異性抗体を生産すること（例えばKostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553参照）;二重特異性抗体フラグメントを作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること（例えばHolliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448参照）;および単鎖Fv（sFv）二量体を使用すること（例えばGruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374参照）;および例えばTutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作製することもできる。
【０１２４】
3つまたはそれ以上の機能的抗原結合部位を有する改変抗体（engineered antibody）も、「オクトパス抗体（Octopus antibody）」を含めて、ここに含まれる（例えばUS 2006/0025576参照）。
【０１２５】
本明細書における抗体またはフラグメントには、BRDUともう一つの異なる抗原とに結合する抗原結合部位を含む「二重作用性Fab（Dual Acting Fab）」または「DAF」も含まれる（例えばUS 2008/0069820参照）。
【０１２６】
本明細書における抗体またはフラグメントには、WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792、およびWO 2010/145793に記載の多重特異性抗体も含まれる。
【０１２７】
本明細書において報告する一態様において、本明細書において報告する多重特異性抗体は二重特異性二価抗体である。
【０１２８】
一態様において、本明細書において報告する二重特異性二価抗体は、
a）第1の抗原に特異的に結合する第1の完全長抗体の重鎖および軽鎖、ならびに
b）定常ドメインCLとCH1とが互いに入れ替えられている、第2の抗原に特異的に結合する第2の完全長抗体の改変重鎖および改変軽鎖
を含むことを特徴とする。
【０１２９】
この二重特異性二価抗体フォーマットに基づく抗体をCrossMabという。
【０１３０】
一態様において、本二重特異性二価抗体は、
a）第1の抗原に特異的に結合する第1の完全長抗体の重鎖および軽鎖、ならびに
b）重鎖のN末端がペプチドリンカーを介して軽鎖のC末端に接続されている、第2の抗原に特異的に結合する第2の完全長抗体の重鎖および軽鎖
を含むことを特徴とする。
【０１３１】
この二重特異性二価抗体フォーマットに基づく抗体を、1アーム一本鎖Fab（one-armed single chain Fab: OAscFab）という。
【０１３２】
5.抗体変異体
特定の態様では、本明細書に規定する抗体のアミノ酸配列変異体も、考慮の内である。例えば、抗体の結合親和性および/または他の生物学的特性を改良することが望ましい場合がありうる。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適当な修飾を導入するか、またはペプチド合成によって、調製することができる。そのような修飾には、例えば抗体のアミノ酸配列からの欠失、および/または抗体のアミノ酸配列への挿入、および/または抗体のアミノ酸配列内での残基の置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴、例えば抗原結合性を持つ限り、欠失、挿入および置換を任意に組み合わせて、最終構築物に到達することができる。
【０１３３】
a）置換、挿入、および欠失変異体
特定の態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換変異導入のための関心対象の部位には、HVRおよびFRが含まれる。表1では保存的置換を「好ましい置換」という見出しの下に示す。より実質的な変化は、表1では「例示的置換」という見出しの下に掲載されており、アミノ酸側鎖クラスに関連して以下にさらに詳しく説明するとおりである。アミノ酸置換を関心対象の抗体に導入し、生成物を所望の活性について、例えば保持/改良された抗原結合、減少した免疫原性、または改良されたADCCもしくはCDCなどについてスクリーニングすることができる。
【０１３４】
（表１）
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【０１３５】
アミノ酸は共通する側鎖特性に従って分類することができる。
（1）疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
（2）中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
（3）酸性:Asp、Glu;
（4）塩基性:His、Lys、Arg;
（5）鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
（6）芳香族:Trp、Tyr、Phe。
【０１３６】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを別のクラスと交換することを必然的に伴う。
【０１３７】
置換変異体の一タイプは、親抗体（例えばヒト化またはヒト抗体）の1つまたは複数の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、その結果生じてさらなる研究のために選択される変異体は、親抗体との比較で一定の生物学的特性に修飾（例えば改良）（例えば増加した親和性、低減した免疫原性）を有し、かつ/または親抗体の一定の生物学的特性を実質的に保持している。例示的な置換変異体は親和性成熟抗体であり、これは、例えば本明細書に記載するようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使って、従来の方法で生成させることができる。簡単に述べると、1つまたは複数のHVR残基を変異させ、変異体抗体をファージ上にディスプレイし、特定の生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。
【０１３８】
改変（例えば置換）は、例えば抗体親和性を改良するために、HVRに施すことができる。そのような改変は、HVR「ホットスポット」、すなわち体細胞での成熟過程で高頻度に変異を起こすコドンによってコードされる残基（例えばChowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196）および/またはSDR（a-CDR）に施すことができ、その結果生じた変異VHまたはVLは結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築し、そこから選択することによる親和性成熟は、例えばHoogenboom, H.R. らが、Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37に記載している。親和性成熟のいくつかの態様では、さまざまな方法（例えばエラープローンPCR、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド指定変異導入）のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子に多様性が導入される。次に二次ライブラリーを作成する。次に、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定するために、ライブラリーをスクリーニングする。多様性を導入するための別の方法は、数個のHVR残基（例えば一度に4〜6残基）をランダム化するHVR指向的アプローチを伴う。抗原結合に関与するHVR残基は、例えばアラニンスキャニング変異導入法やモデリングなどを使って、特異的に同定することができる。特にCDR-H3およびCDR-L3は標的とされることが多い。
【０１３９】
特定の態様では、その改変が抗原と結合する抗体の能力を実質的に低減しない限り、置換、挿入、または欠失が、1つまたは複数のHVR内に存在してもよい。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的改変（例えば保存的置換は本明細書に規定するとおりである）をHVRに施すことができる。そのような改変はHVR「ホットスポット」外またはSDR外でありうる。上掲の変異VHおよびVL配列の特定の態様では、各HVRは無改変であるか、1つ、2つまたは3つ以下のアミノ酸置換を含有する。
【０１４０】
変異導入の標的とすることができる抗体の残基または領域を同定するための有用な一方法は、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085に記載されているように、「アラニンスキャニング変異導入法」と呼ばれる。この方法では、残基または標的残基群（例えばarg、asp、his、lys、およびgluなどの荷電残基）を同定し、それを中性アミノ酸または負荷電アミノ酸（例えばアラニンまたはポリアラニン）で置き換えて、抗体の、抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。最初の置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置に、さらなる置換を導入することもできる。これに代えて、またはこれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造は、抗体と抗原の間の接触点を同定する。そのような接触残基および近隣残基は、置換の候補として標的にするか、または除外することができる。変異体をスクリーニングして、それらが所望の特性をもっているかどうかを決定することができる。
【０１４１】
アミノ酸配列挿入には、1残基から、100残基またはそれ以上を含有するポリペプチドまでにわたる長さのアミノ末端および/またはカルボキシル末端融合も、単一アミノ酸残基および複数アミノ酸残基の配列内挿入も含まれる。末端挿入の例には、N末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体のN末端またはC末端の、酵素（例えばADEPTの場合）または抗体の血清中半減期を増加させるポリペプチドへの融合が含まれる。
【０１４２】
好ましい一変異体は、重鎖可変ドメイン中のKabatによる53位のアミノ酸残基がシステインである、単一システイン変異体である。
【０１４３】
b）グリコシル化変異体
特定の態様では、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるために、本明細書に規定する抗体が改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、1つまたは複数のグリコシル化部位が作出または除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって、都合よく達成することができる。
【０１４４】
抗体がFc領域を含む場合は、そこに取り付けられる糖質を改変することができる。哺乳動物細胞によって生産される天然型抗体は、典型的には、分岐したバイアンテナ型オリゴ糖を含み、これは一般的には、Fc領域のCH2ドメインのAsn297にN結合によって取り付けられる。例えばWright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32参照。オリゴ糖は、さまざまな糖質、例えばマンノース、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびにバイアンテナ型オリゴ糖構造の「ステム」中のGlcNAcに取り付けられたフコースを含みうる。いくつかの態様では、一定の改良された特性を有する抗体変異体を作出するために、本発明の抗体中のオリゴ糖の修飾を行うことができる。
【０１４５】
一態様では、Fc領域に（直接または間接的に）取り付けられたフコースを欠く糖質構造を有する抗体変異体が提供される。例えばそのような抗体におけるフコースの量は、1％〜80％、1％〜65％、5％〜65％または20％〜40％でありうる。フコースの量は、例えばWO 2008/077546に記載されているようにMALDI-TOF質量分析によって測定されるAsn297における糖鎖内のフコースの平均量を、Asn297に取り付けられた全ての糖構造（例えば複合型、混成型および高マンノース型構造）の和と比較して算出することによって決定される。Asn297とはFc領域の297位（Fc領域残基のEUナンバリング）付近に位置するアスパラギン酸残基を指すが、抗体における軽微な配列変動ゆえに、Asn297は、297位の上流側または下流側約±3アミノ酸付近、すなわち294位と300位の間に位置する場合もありうる。そのようなフコシル化変異体は改良されたADCC機能を有しうる。例えばUS 2003/0157108、US 2004/0093621参照。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例には、US 2003/0157108、WO 2000/61739、WO 2001/29246、US 2003/0115614、US 2002/0164328、US 2004/0093621、US 2004/0132140、US 2004/0110704、US 2004/0110282、US 2004/0109865、WO 2003/085119、WO 2003/084570、WO 2005/035586、WO 2005/035778、WO 2005/053742、WO 2002/031140、Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249、Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622などがある。脱フコシル化抗体を生産する能力を有する細胞株の例には、タンパク質フコシル化欠損性のLec13 CHO細胞（Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545;US 2003/0157108;およびWO 2004/056312、特に実施例11）、およびα-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞などのノックアウト細胞株（例えばYamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622、Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688、およびWO 2003/085107参照）などがある。
【０１４６】
例えば抗体のFc領域に取り付けられた二分枝型オリゴ糖がGlcNAcによって二分されている二分されたオリゴ糖を有する抗体変異体が、さらに提供される。そのような抗体変異体は、低減したフコシル化および/または改良されたADCC機能を有しうる。そのような抗体変異体の例は、例えばWO 2003/011878、US 6,602,684、およびUS 2005/0123546に記載されている。Fc領域に取り付けられたオリゴ糖中に少なくとも1つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は改良されたCDC機能を有しうる。そのような抗体変異体は、例えばWO 1997/30087、WO 1998/58964、およびWO 1999/22764に記載されている。
【０１４７】
c）Fc領域変異体
特定の態様では、本明細書に規定する抗体のFc領域に1つまたは複数のアミノ酸修飾を導入することにより、Fc領域変異体を生成させることができる。Fc領域変異体は、1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトFc領域配列（例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4 Fc領域）を含みうる。
【０１４８】
特定の態様において、本発明では、全部ではなく一部のエフェクター機能を持つ抗体変異体が考えられる。これは、その抗体変異体を、インビボでの抗体の半減期は重要であるが、一定のエフェクター機能（例えば補体およびADCC）は不必要または有害であるような応用の望ましい候補にする。CDCおよび/またはADCC活性の低減/欠乏を確認するために、インビトロおよび/またはインビボ細胞毒性アッセイを行うことができる。例えば、抗体がFcγR結合を欠く（それゆえにおそらくADCC活性を欠く）が、FcRn結合能は保持していることを保証するために、Fc受容体（FcR）結合アッセイを行うことができる。ADCCを媒介するための主要細胞であるNK細胞がFc(RIIIだけを発現するのに対し、単球はFcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現する。造血細胞におけるFcR発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492の464ページの表3に要約されている。関心対象の分子のADCC活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、US 5,500,362（例えばHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063、およびHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502参照）、US 5,821,337（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー用のACTI（商標）非放射性細胞毒性アッセイ（CellTechnology, Inc.、カリフォルニア州マウンテンビュー）、およびCytoTox 96(登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Promega、ウィスコンシン州マディソン）参照）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞がある。これに代えて、またはこれに加えて、関心対象の分子のADCC活性は、インビボで、例えば、Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656に開示されているような動物モデルで、評価することもできる。抗体がC1qに結合することができず、したがってCDC活性を欠くことを確認するために、C1q結合アッセイを行うこともできる。例えばWO 2006/029879およびWO 2005/100402のC1qおよびC3c結合ELISA参照。補体活性化を評価するために、CDCアッセイを行うことができる（例えばGazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171、Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052、およびCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743参照）。FcRn結合およびインビボクリアランス/半減期決定も、当技術分野において公知の方法を使って行うことができる（例えばPetkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769参照）。
【０１４９】
エフェクター機能が低減している抗体には、Fc領域残基238、265、269、270、297、327および329の1つまたは複数の置換を有するものが含まれる（US 6,737,056）。そのようなFc変異体には、265位、269位、270位、297位および327位のアミノ酸の2つまたはそれ以上に置換を有するFc変異体（残基265および297のアラニンへの置換を有するいわゆる「DANA」Fc変異体（US 7,332,581）を含む）が含まれる。
【０１５０】
FcRへの結合が改良または減縮されている一定の抗体変異体が記載されている（例えばUS 6,737,056、WO 2004/056312、およびShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604参照）。
【０１５１】
特定の態様では、抗体変異体が、ADCCを改良する1つまたは複数のアミノ酸置換、例えばFc領域の298位、333位、および/または334位（残基のEUナンバリング）における置換を有するFc領域を含む。
【０１５２】
いくつかの態様では、例えばUS 6,194,551、WO 99/51642、およびIdusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に記載されているような、C1q結合および/または補体依存性細胞傷害（CDC）の改変（すなわち改良または減縮）をもたらす改変が、Fc領域に施される。
【０１５３】
半減期が増加し、胎児への母体免疫グロブリン（IgG）の移行の原因となる新生児型Fc受容体（FcRn）（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593、およびKim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）への結合が改良されている抗体は、US 2005/0014934に記載されている。これらの抗体は、FcRnへのFc領域の結合を改良する1つまたは複数の置換がそこに含まれているFc領域を含む。そのようなFc変異体には、Fc領域残基:238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424または434の1つまたは複数に置換を有するもの、例えばFc領域残基434の置換を有するものが含まれる（US 7,371,826）。
【０１５４】
Fc領域変異体の他の例に関して、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740、US 5,648,260、US 5,624,821、およびWO 94/29351も参照されたい。
【０１５５】
d）システイン改変抗体変異体
特定の態様では、システイン改変抗体（cysteine engineered antibody）、例えば抗体の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオMAb（thioMAb）」を作出することが望ましいかもしれない。特定の態様では、置換残基が抗体の接近可能部位に見いだされる。それらの残基をシステインで置換することによって抗体の接近可能部位に活性チオール基が置かれることになり、本明細書においてさらに説明するように、それを使って、抗体を他の部分、例えば薬物部分またはリンカー-薬物部分にコンジュゲートすることで、イムノコンジュゲートを作出することができる。特定の態様では、次に挙げる残基の任意の1つまたは複数をシステインで置換することができる：軽鎖のV205（Kabatナンバリング）、重鎖のA118（EUナンバリング）、および重鎖Fc領域のS400（EUナンバリング）。システイン改変抗体は、例えばUS 7,521,541に記載されているように生成させることができる。
【０１５６】
e）抗体誘導体
特定の態様では、当技術分野において公知であり容易に入手することができる追加の非タンパク質部分を含有するように、本明細書に規定する抗体をさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分には水溶性ポリマーがあるが、それらに限定されるわけではない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（PEG）、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、およびデキストランまたはポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール（propropylene glycol）ホモポリマー、ポリプロピレンオキシド（prolypropylene oxide）/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物などがあるが、それらに限定されるわけではない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性ゆえに、製造時に有利でありうる。ポリマーは任意の分子量であってよく、分岐型であっても非分岐型であってもよい。抗体に取り付けられるポリマーの数はさまざまであってよく、2つ以上のポリマーが取り付けられる場合、それらは同じ分子または異なる分子であることができる。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および/またはタイプは、例えば限定するわけではないが、改良しようとする抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が所定の条件下で治療に使用されるかどうかなどといった、考慮事項に基づいて決定することができる。
【０１５７】
別の態様では、抗体と、放射線への曝露によって選択的に加熱することができる非タンパク質部分とのコンジュゲートが提供される。一態様では、非タンパク質部分がカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は任意の波長であってよく、例えば限定するわけではないが、通常の細胞を傷つけることはないが、非タンパク質部分を、抗体-非タンパク質部分に近接する細胞が死滅する温度まで加熱する波長が含まれる。
【０１５８】
f）ヘテロ二量体化
多重特異性抗体の生成には、ヘテロ二量体型重鎖ペアリングの形成を促進することが必要になりうる。ヘテロ二量体化を強制するためのCH3修飾にはいくつかのアプローチが存在し、それらは例えばWO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291によく記述されている。そのようなアプローチのいずれにおいても、典型的には、各CH3ドメイン（またはそれを含む重鎖）がもはや自分自身とホモ二量体化することができず、工学的に改変された相補的な他のCH3ドメインとヘテロ二量体化することを強いられるように（第1のCH3ドメインと第2のCH3ドメイン（そしてそれと共に第1の重鎖と第2の重鎖）とがヘテロ二量体化し、2つの第1のCH3ドメイン間または2つの第2のCH3ドメイン間のホモ二量体は形成されないように）、第1の重鎖のCH3ドメインと第2の重鎖のCH3ドメインとの両方を、相補的な形で工学的に操作する。
【０１５９】
改良された重鎖ヘテロ二量体化のためのそれらさまざまなアプローチは、本明細書に報告する多重特異性抗体における重鎖および/または軽鎖修飾であって軽鎖ミスペアリングおよびベンス-ジョーンズ型副生成物を低減するもの（1つの結合アームにおけるVHとVLの交換/入れ替えおよびCH1/CL境界面における反対電荷を持つ荷電アミノ酸の置換の導入）と組み合わされる、さまざまな代替選択肢と考えられる。
【０１６０】
本発明の好ましい一態様（多重特異性抗体が重鎖にCH3ドメインを含む場合）において、本発明の多重特異性抗体のCH3ドメインは、例えばWO 96/027011、Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9（1996）617-621; Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16（1998）677-681; WO 98/050431に、いくつかの例と共に詳述されている「ノブ・イントゥ・ホール（knob-into-holes）」技術によって改変される。このアプローチでは、2つのCH3ドメインの相互作用表面が、それら2つのCH3ドメインを含有する両重鎖のヘテロ二量体化が増加するように改変される。（2つの重鎖の）2つのCH3ドメインのそれぞれを「ノブ」とすることができ、その場合、他方は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入はヘテロ二量体をさらに安定化して（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16（1998）677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270（1997）26-35）、ヘテロ二量体の収率を増加させる。
【０１６１】
したがって一態様において、本多重特異性抗体（各重鎖にCH3ドメインを含むもの）はさらに、以下の特徴を有する:
多重特異性抗体の第1の重鎖の第1のCH3ドメインおよび多重特異性抗体の第2の重鎖の第2のCH3ドメインがそれぞれ、抗体CH3ドメイン間の元の境界面を含む境界面において接し、
該境界面は多重特異性抗体の形成が促進されるように改変されていて、その改変は、
i）一方の重鎖のCH3ドメインが、
多重特異性抗体内の他方の重鎖のCH3ドメインの元の境界面と接する一方の重鎖のCH3ドメインの元の境界面内で、
あるアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、一方の重鎖のCH3ドメインの境界面内に、他方の重鎖のCH3ドメインの境界面内のくぼみ中に配置されうる突起を生成するように、改変されていること、
および
ii）他方の重鎖のCH3ドメインが、
多重特異性抗体内の第1のCH3ドメインの元の境界面と接する第2のCH3ドメインの元の境界面内で、
あるアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第2のCH3ドメインの境界面内に、第1のCH3ドメインの境界面内の突起が内部に配置されうるくぼみを生成するように、
改変されていること。
を特徴とする。
【０１６２】
好ましくは、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、アルギニン（R）、フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）からなる群より選択される。
【０１６３】
好ましくは、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、アラニン（A）、セリン（S）、スレオニン（T）、バリン（V）からなる群より選択される。
【０１６４】
一態様において、両CH3ドメインは、両CH3ドメイン間にジスルフィド架橋が形成されうるように、各CH3ドメインの対応する位置にアミノ酸としてシステイン（C）を導入することによって、さらに改変されている。
【０１６５】
好ましい一態様において、多重特異性抗体は、「ノブ鎖」の第1のCH3ドメイン中にアミノ酸T366W変異を含み、かつ「ホール鎖」の第2のCH3ドメイン中にアミノ酸T366S、L368A、Y407V変異を含む。例えば「ホール鎖」のCH3ドメイン中にアミノ酸Y349C変異を導入し、「ノブ鎖」のCH3ドメイン中にアミノ酸E356C変異またはアミノ酸S354C変異を導入することによって、CH3ドメイン間の追加鎖間ジスルフィド架橋を使用することもできる（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16（1998）677-681）。
【０１６６】
好ましい一態様において、多重特異性抗体（各重鎖にCH3ドメインを含むもの）は、2つのCH3ドメインの一方にアミノ酸S354C、T366W変異を含み、2つのCH3ドメインの他方にアミノ酸Y349C、T366S、L368A、Y407V変異を含む（一方のCH3ドメイン中の追加アミノ酸S354C変異と他方のCH3ドメイン中の追加アミノ酸Y349C変異とは鎖間ジスルフィド架橋を形成する）（ナンバリングはKabatに従う）。
【０１６７】
ヘテロ二量体化を強制するためのCH3修飾の他の技法は、代替選択肢であると考えられ、例えばWO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291に記載されている。
【０１６８】
一態様では、EP 1 870 459 A1に記載のヘテロ二量体化アプローチを使用する。このアプローチは、両重鎖間のCH3/CH3ドメイン境界面中の特異的アミノ酸位置における反対電荷を持つ荷電アミノ酸の置換/変異の導入に基づいている。好ましい一態様では、多重特異性抗体が（多重特異性抗体の）第1の重鎖のCH3ドメイン中にアミノ酸R409D、K370E変異を含み、（多重特異性抗体の）第2の重鎖の第2のCH3ドメイン中にアミノ酸D399K、E357K変異を含む（ナンバリングはKabatに従う）。
【０１６９】
別の態様において、本多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のCH3ドメイン中にアミノ酸T366W変異を含み、「ホール鎖」のCH3ドメイン中にアミノ酸T366S、L368A、Y407V変異を含み、さらに「ノブ鎖」のCH3ドメイン中にアミノ酸R409D、K370E変異を含み、「ホール鎖」のCH3ドメイン中にアミノ酸D399K、E357K変異を含む。
【０１７０】
別の態様において、多重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの一方にアミノ酸S354C、T366W変異を含み、2つのCH3ドメインの他方にアミノ酸Y349C、T366S、L368A、Y407V変異を含むか、または多重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの一方にアミノ酸Y349C、T366W変異を含み、2つのCH3ドメインの他方にアミノ酸S354C、T366S、L368A、Y407V変異を含み、さらに、「ノブ鎖」のCH3ドメイン中にアミノ酸R409D、K370E変異を含み、「ホール鎖」のCH3ドメイン中にアミノ酸D399K、E357K変異を含む。
【０１７１】
一態様では、WO2013/157953に記載のヘテロ二量体化アプローチを使用する。一態様において、第1のCH3ドメインはアミノ酸T366K変異を含み、第2のCH3ドメインはアミノ酸L351D変異を含む。さらなる態様において、第1のCH3ドメインはアミノ酸L351K変異をさらに含む。さらなる態様において、第2のCH3ドメインは、Y349E、Y349DおよびL368Eから選択されるアミノ酸変異（好ましくはL368E）を、さらに含む。
【０１７２】
一態様では、WO2012/058768に記載のヘテロ二量体化アプローチを使用する。一態様において、第1のCH3ドメインはアミノ酸L351Y、Y407A変異を含み、第2のCH3ドメインはアミノ酸T366A、K409F変異を含む。さらなる態様において、第2のCH3ドメインは位置T411、D399、S400、F405、N390またはK392に、例えばa）T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411EまたはT411W、b）D399R、D399W、D399YまたはD399K、c）S400E、S400D、S400RまたはS400K、F405I、F405M、F405T、F405S、F405VまたはF405W、N390R、N390KまたはN390D、K392V、K392M、K392R、K392L、K392FまたはK392Eから選択される、さらなるアミノ酸変異を含む。さらなる態様において、第1のCH3ドメインはアミノ酸L351Y、Y407A変異を含み、第2のCH3ドメインはアミノ酸T366V、K409F変異を含む。さらなる態様において、第1のCH3ドメインアミノ酸Y407A変異を含み、第2のCH3ドメインはアミノ酸T366A、K409F変異を含む。さらなる態様において、第2のCH3ドメインはアミノ酸K392E、T411E、D399RおよびS400R変異をさらに含む。
【０１７３】
一態様では、WO2011/143545に記載のヘテロ二量体化アプローチを使用し、例えば368位および409位からなる群より選択される位置においてアミノ酸修飾を行う。
【０１７４】
一態様では、WO2011/090762に記載のヘテロ二量体化アプローチを使用する。このアプローチも、上述のノブ・イントゥ・ホール（knobs-into-holes）技術を使用する。一態様において、第1のCH3ドメインはアミノ酸T366W変異を含み、かつ第2のCH3ドメインはアミノ酸Y407A変異を含む。一態様において、第1のCH3ドメインはアミノ酸T366Y変異を含み、第2のCH3ドメインはアミノ酸Y407T変異を含む。
【０１７５】
一態様では、多重特異性抗体がIgG2アイソタイプであり、WO2010/129304に記載のヘテロ二量体化アプローチが使用される。
【０１７６】
一態様では、WO2009/089004に記載のヘテロ二量体化アプローチを使用する。一態様において、第1のCH3ドメインは、負荷電アミノ酸（例えばグルタミン酸（E）、またはアスパラギン酸（D））によるアミノ酸残基K392またはN392の置換（好ましくはK392DまたはN392D）を含み、かつ第2のCH3ドメインは、正荷電アミノ酸（例えばリジン（K）またはアルギニン（R））によるアミノ酸残基D399、E356、D356またはE357の置換（好ましくはD399K、E356K、D356K、またはE357K、より好ましくはD399KおよびE356K）を含む。さらなる態様において、第1のCH3ドメインは、負荷電アミノ酸（例えばグルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D））によるアミノ酸残基K409またはR409の置換（好ましくはK409DまたはR409D）を、さらに含む。さらなる態様において、第1のCH3ドメインはさらに、または上記に代えて、負荷電アミノ酸（例えばグルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D））によるアミノ酸残基K439および/またはK370の置換を含む。
【０１７７】
一態様では、WO2007/147901に記載のヘテロ二量体化アプローチを使用する。一態様において、第1のCH3ドメインはアミノ酸K253E、D282K、およびK322D変異を含み、かつ第2のCH3ドメインはアミノ酸D239K、E240K、およびK292D変異を含む。
【０１７８】
一態様では、WO2007/110205に記載のヘテロ二量体化アプローチを使用する。
【０１７９】
B.抗BRDU抗体核酸複合体
siRNAおよびハプテン含有siRNA誘導体
siRNAの設計と構築に関する一般原理は当業者には公知であり、ここで詳細には考察しない。
【０１８０】
本発明者らのモジュール式ターゲティングアプローチの重要な特徴は、siRNAの機能性もハプテンとbsAb（二重特異性抗体）のハプテン結合ドメインとの間の相互作用も損なうことのない、ハプテンへのまたはハプテン含有部分へのsiRNAの連結である。
【０１８１】
選ばれたsiRNAにハプテンを直接カップリングするために、二本鎖siRNA誘導体のセンス鎖の3'端を選択した。siRNA中のこの位置は、追加された実体（コレステロールなど（25））を容認し、siRNAの活性に影響を及ぼさないことが以前に見いだされていた。これに合致して、3'-ハプテンコンジュゲートsiRNA誘導体の力価、すなわち標的mRNAレベルを低減するそれらの能力は、無修飾のsiRNAと同じであることが観察されている（13）。追加の修飾として、siRNAの可視化と追跡を可能にするために、Cy5などの蛍光化合物をセンス鎖の5'端に取り付けることができる（例えばDig-siRNA-Cy5）。本発明者らの経験上、センス鎖の5'端へのハプテンカップリングも良好な活性を持つsiRNAを与えるが、3'端へのカップリングより優れているということはない。
【０１８２】
ハプテン含有ナノ粒子
ハプテン結合（hapten-coupled）siRNAはbsAbと直接的に複合体を形成させることができる。これらの複合体は、各標的抗原をそれぞれの表面に発現している細胞に、siRNAを特異的に送達することができる。しかし、細胞内小胞上および細胞内小胞中（内部移行時）でのsiRNAの特異的蓄積だけでは、ほとんどの場合、特異的遺伝子ノックダウンは起こらない。その理由は、無修飾siRNAはエンドソームコンパートンメントに蓄積するものの、細胞質中にエスケープしないことである（13）。サイトゾルへの送達を可能にするために、それぞれの表面にハプテンを保持するナノ粒子中にsiRNAをパッケージングすることができる（1、2、26、27、3、28、29、30、5、31、32、9）。これらのハプテンは、（大きな）ナノ粒子の構造中に組み込んだ時に、bsAbにアクセス可能である必要がある。効果的なsiRNA送達のためのさまざまな種類のナノ粒子が記述されており、それらの多くはPEGを含有している。したがって、ハプテン含有ナノ粒子を生成させる一方法は、ハプテン結合PEG誘導体を、ナノ粒子生成のための構成要素として応用することである。製剤にこれらの試薬を組み込むとハプテン被覆（hapten-decorated）ナノ粒子（例えばDig-LNP中のsiRNA）が生成する。ハプテン被覆ナノ粒子は、場合によっては、ハプテン結合siRNAを標準的ナノ粒子に処方することによって生成させることもできる。驚いたことに、これは、それぞれの表面にハプテン分子を抗体のアクセスが可能な形で露出しているナノ粒子をもたらす。同じようにして蛍光標識siRNAをハプテン被覆ナノ粒子に蛍光シグナルを失うことなく組み込むことができる。これは、ハプテン含有bsAb誘導（bsAb-targeted）ナノ粒子の可視化および追跡に使用することができる。
【０１８３】
ダイナミックポリコンジュゲート（dynamic poly-conjugate: DPC）と脂質ベースナノ粒子（lipid-based nanoparticle: LNP）は、確立された2タイプのナノ粒子である。ハプテンコンジュゲートPEG脂質を含有するDPCおよびLNPは、細胞ターゲティング用の機能的siRNA部分の構築に使用されている（13）。DPCは、ポリエチレングリコール（PEG）による可逆的共有結合修飾によって非特異的細胞相互作用から遮蔽されたエンドソーム分解性ポリマーであるポリブチル/アミノビニルエーテル（poly butyl and amino vinyl ether: PBAVE）のようなスキャフォールド試薬を含む。siRNAとハプテンはどちらも、安定な（例えばハプテン連結用）リンカーまたはpH依存的ペイロード放出を可能にするリンカーによって、ポリマーに取り付けることができる（30、32、33）。
【０１８４】
ハプテン被覆DPCとbsAbとの複合体を所定のモル比（例えば1:1または2:1）で形成させることで、bsAb誘導DPCを生成させることができる。bsAbにsiRNA含有DPCを負荷すると、SEC-MALLSで検出することができる分子量と流体力学的半径の増加が起こる。例えば、bsAbなしのDig-ポリマー-siRNA DPCは、推定分子量300〜720kDaおよび流体力学的半径7〜10nmの分子の多分散系溶液である。bsAbを加えてハプテン-ポリマー-siRNA DPC-bsAb複合体を形成させると、分子量範囲は500〜1100kDaに、また流体力学的半径は9〜12.5nmに増加する（13）。
【０１８５】
LNPはポリエチレングリコール（PEG）-脂質を含有し、その親油性アシル鎖が親水性PEG分子を粒子に係留している。これによって粒子の安定性と構造の保全が保証される。PEG-脂質のアシル鎖はさまざまな長さを有しうる。本発明者らが使用して成功を収めたLNPは、18個のメタンジイル基からなり交換不可能と考えられる比較的長いC18アンカーを持つか、または16個のメタンジイル基からなり交換可能性が高い短いC16アンカーを持つ、PEG-脂質を含有する（34、35）。ハプテンコンジュゲートsiRNA含有LNPを、単独で、またはbsAbとの複合体として、PBS中で、動的光散乱法（DLS）によって分析することで、それらの流体力学的半径と多分散指数（Pdi）を決定することができる。LNPをbsAbと一緒に室温（約25℃;最大3時間）でインキュベートして、粒径および多分散性の変化の時間経過をDLSによって決定することができる（13, 36）。
【０１８６】
本発明者らが使用して成功を収めたハプテン被覆LNP製剤は計1.4モル％のPEG-脂質を含有していて、そのうちの0.4または0.04モル％がハプテン結合（Dig修飾）C18 PEG-脂質であった。残りのハプテン非含有PEG-脂質は、効果的なLNP非遮蔽化および高いsiRNA導入/トランスフェクション力価が可能になるように、C16脂質アンカーを含有していた（34、35、および36）。そのようなLNPを使用することにより、最高で90％ノックダウンのノックダウン効率が、1.7nMのIC50で達成された。そのうえ、他のsiRNA製剤で得られた結果とは対照的に（37）、これらのLNPでは免疫刺激効果は何も観察されなかった（13）。
【０１８７】
引用文献:
2020055861.tif 000003
2020055861.tif 000004
【０１８８】
C.組換え法および組換え組成物
抗体は、例えばUS 4,816,567に記載されているような組換え法および組換え組成物を使って生産することができる。一態様では、本明細書に記載の抗BRDU抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および/または抗体のVHを含むアミノ酸配列（例えば抗体の軽鎖および/または重鎖）をコードしうる。さらなる態様では、そのような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。さらなる態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような態様の一つでは、宿主細胞が、（1）抗体のVLを含むアミノ酸配列と抗体のVHを含むアミノ酸配列とをコードする核酸を含むベクターを含むか、または（2）抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターと抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む（例えば、前記ベクターで形質転換されている）。一態様では、宿主細胞が真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはリンパ球系細胞（例えばY0、NS0、Sp20細胞）である。一態様では、抗BRDU抗体を作成する方法であって、上に規定した抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を抗体の発現に適した条件下で培養すること、および任意で、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む方法が提供される。
【０１８９】
抗BRDU抗体の組換え生産のために、抗体をコードする核酸、例えば上述のものを単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび/または発現のために1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手法を使って（例えば抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離し、配列決定することができる。
【０１９０】
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適切な宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、特にグリコシル化およびFcエフェクター機能が必要ない場合は、抗体を細菌中で生産することができる。細菌における抗体フラグメントおよびポリペプチドの発現については、例えばUS 5,648,237、US 5,789,199、およびUS 5,840,523を参照されたい（大腸菌における抗体フラグメントの発現を記載しているCharlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology、Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp.245-254も参照されたい）。発現後に、抗体を細菌細胞ペーストから可溶性画分中に単離して、さらに精製することができる。
【０１９１】
原核生物だけでなく、糸状菌や酵母などの真核微生物も、グリコシル化経路が「ヒト化」されていて部分的または完全にヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生産をもたらす真菌株および酵母株を含めて、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主または発現宿主である。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414、およびLi, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215参照。
【０１９２】
グリコシル化抗体発現用の適切な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎生物および脊椎動物）にも由来する。無脊椎生物細胞の例には、植物細胞および昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と一緒に使用することができる、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションに使用することができる、数多くのバキュロウイルス株が同定されている。
【０１９３】
植物細胞培養を宿主として利用することもできる。例えばUS 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978、およびUS 6,417,429（トランスジェニック植物中で抗体を生産するためのPLANTIBODIES（商標）技術が記載されている）。
【０１９４】
脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁培養に適応した哺乳動物細胞株は役立ちうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7）、ヒト胎児腎臓株（Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74に記載の293または293細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（BHK）、マウスセルトリ細胞（Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載のTM4細胞）、サル腎臓細胞（CV1）、アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76）、ヒト子宮頸癌細胞（HELA）、イヌ腎臓細胞（MDCK）、バッファローラット肝臓細胞（BRL3A）、ヒト肺細胞（W138）、ヒト肝臓細胞（Hep G2）、マウス乳房腫瘍（MMT 060562）、例えばMather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載のTRI細胞、MRC5細胞、およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、DHFR- CHO細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ならびにY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株などがある。抗体生産に適した一定の哺乳動物宿主細胞株を概観するには、例えばYazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照されたい。
【０１９５】
D.アッセイ
本明細書に規定する抗BRDU抗体は、当技術分野において公知のさまざまなアッセイにより、それらの物理的/化学的特性および/または生物学的活性について、同定し、スクリーニングし、または特徴づけることができる。
【０１９６】
結合アッセイおよび他のアッセイ
一局面において、本発明の抗体は、例えばELISA、ウェスタンブロットなどの公知の方法によって、その抗原結合活性が試験される。
【０１９７】
別の局面では、BRDUへの結合に関して本明細書において報告する抗体と競合する抗体を同定するために、競合アッセイを使用することができる。
【０１９８】
例示的な競合アッセイでは、BRDUに結合する第1の標識抗体と、BRDUへの結合に関して第1の抗体と競合するその能力について試験しようとする第2の無標識抗体とを含む溶液中で、固定化BRDUがインキュベートされる。第2の抗体はハイブリドーマ上清中に存在しうる。対照として、第1の標識抗体を含むが、第2の無標識抗体を含まない溶液中で、固定化BRDUをインキュベートする。BRDUへの第1の抗体の結合を挙用する条件下でのインキュベーション後に、過剰な未結合抗体を取り除き、固定化BRDUと会合しているラベルの量を測定する。対照試料と比較して試験試料中で、固定化BRDUと会合しているラベルの量が実質的に低減していれば、それは、第2の抗体がBRDUへの結合に関して第1の抗体と競合していることを示す。Harlow, E. and Lane, D., Antibody: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)参照。
【０１９９】
E.イムノコンジュゲート
本発明は、1つまたは複数の細胞毒性作用物質、例えば化学療法剤または薬物、成長阻害剤、毒素（例えばタンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物由来の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント）、または放射性同位体にコンジュゲートされた、本明細書における抗BRDU抗体を含むイムノコンジュゲートも提供する。
【０２００】
一態様において、イムノコンジュゲートは、抗体が1つまたは複数の薬物、例えば限定するわけではないが、次に挙げるものにコンジュゲートされている、抗体-薬物コンジュゲート（ADC）である:メイタンシノイド（US 5,208,020、US 5,416,064およびEP 0 425 235 B1参照）;オーリスタチン、例えばモノメチルオーリスタチン薬物部分DEおよびDF（MMAEおよびMMAF）（US 5,635,483、US 5,780,588、およびUS 7,498,298参照）;ドラスタチン;カリケアマイシンまたはその誘導体（US 5,712,374、US 5,714,586、US 5,739,116、US 5,767,285、US 5,770,701、US 5,770,710、US 5,773,001、およびUS 5,877,296、Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342、ならびにLode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928参照）;アントラサイクリン、例えばダウノマイシンまたはドキソルビシン（Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523、Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362、Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721、Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834、Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532、King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343、およびUS 6,630,579参照）;メトトレキサート;ビンデシン;タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセル;トリコテセシン;およびCC1065。
【０２０１】
別の態様において、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素またはそのフラグメント、例えば限定するわけではないが、次に挙げるものにコンジュゲートされた、本明細書に記載の抗体を含む:ジフテリア毒素A鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、エキソトキシンA鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（PAPI、PAPII、およびPAP-S）、ニガウリ（momordica charantia）インヒビター、クルシン、クロチン、サボウソウ（sapaonaria officinalis）インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、およびトリコテセン（tricothecenes）。
【０２０２】
別の態様では、イムノコンジュゲートが、放射性コンジュゲートが形成されるように放射性原子にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗体を含む。放射性コンジュゲートの生産にはさまざまな放射性同位体を利用することができる。その例には、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212およびLuの放射性同位体などがある。放射性コンジュゲートを検出に使用する場合、それは、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばTC99mまたはI123を含むか、核磁気共鳴（NMR）イメージング（磁気共鳴イメージングMRIとも呼ばれている）用のスピンラベル、例えば、ここでもヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガンまたは鉄を含みうる。
【０２０３】
抗体と細胞毒性作用物質のコンジュゲートは、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（SPDP）、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジプイミデートHCl）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス-アジド化合物（ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えばビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン2,6-ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）など、さまざまな二官能性タンパク質カップリング剤を使って作製することができる。例えばリシン免疫毒素は、Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104に記載されているように調製することができる。炭素14標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、抗体に放射性核種をコンジュゲートするための例示的キレート剤である。WO 94/11026参照。リンカーは、細胞における細胞毒性薬の放出を容易にする「切断可能リンカー」であることができる。例えば酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131、US 5,208,020）を使用することができる。
【０２０４】
本明細書におけるイムノコンジュゲートまたはADCは、架橋試薬、（例えばPierce Biotechnology, Inc.（米国イリノイ州ロックフォード）から）市販されているBMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、およびスルホ-SMPB、およびSVSB（スクシンイミジル-(4-ビニルスルホン)ベンゾエート）などを使って調製された上述のコンジュゲートを、特に想定しているが、それらに限定されるわけではない。
【０２０５】
F.診断および検出のための方法および組成物
本明細書において使用する用語「検出する」は、定量的検出または定性的検出を包含する。
【０２０６】
一態様では、診断または検出の方法に使用するための抗BRDU抗体が提供される。そのような方法はインビトロ法またはインビボ法でありうる。
【０２０７】
特定の態様では、標識抗BRDU抗体が提供される。ラベルには、直接検出されるラベルまたは部分（例えば蛍光ラベル、発色団ラベル、高電子密度ラベル、化学発光ラベル、および放射性ラベル）、ならびに例えば酵素反応または分子相互作用などによって間接的に検出される部分、例えば酵素またはリガンドが含まれるが、それらに限定されるわけではない。例示的なラベルには、放射性同位体32P、14C、125I、3H、および131I、発蛍光団、例えば希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ（luceriferases）、例えばホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（US 4,737,456）、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）、過酸化水素を使って色素前駆体を酸化する酵素（例えばHRP、ラクトペルオキシダーゼ、またはマイクロペルオキシダーゼ）と共役させた複素環オキシダーゼ（例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、BRDU/アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定フリーラジカルなどがあるが、それらに限定されるわけではない。
【０２０８】
G.薬学的製剤
本明細書に記載の抗BRDU抗体の薬学的製剤は、望ましい純度を有するそのような抗体を1つまたは複数の随意の薬学的に許容される担体（Osol, A. (ed.) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (1980)）と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度において受容者にとって一般に無毒性であり、これには、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤;保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール）;低分子量（約10残基未満）のポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリ（ビニルピロリドン）;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン;単糖、二糖、および他の糖質、例えばグルコース、マンノース、またはデキストリン;キレート剤、例えばEDTA;糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属錯体（例えばZn-タンパク質複合体）;および/または非イオン界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（PEG）などがあるが、それらに限定されるわけではない。本明細書における、例示的な薬学的に許容される担体には、さらに、間質薬物分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（sHASEGP）、例えばヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばrhuPH20（HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.）が含まれる。rhuPH20を含む一定の例示的sHASEGPおよび使用方法は、US 2005/0260186ならびにUS 2006/0104968に記載されている。一局面では、sHASEGPが、1つまたは複数の追加グリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと併用される。
【０２０９】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、US 6,267,958に記載されている。水性抗体製剤には、US 6,171,586およびWO 2006/044908に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン-酢酸緩衝液を含む。
【０２１０】
本明細書における製剤は、治療される特定の適応症の必要に応じて、2つ以上の活性成分、好ましくは互いに有害な影響を及ぼさない相補的活性を有するものも含有しうる。そのような活性成分は、適宜、意図した目的に有効な量で組み合わされて存在する。
【０２１１】
活性成分は、例えばコアセルベーション技法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに封入するか、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）に封入するか、またはマクロエマルションに封入することができる。そのような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)に開示されている。
【０２１２】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスであって、マトリックスがフィルムまたはマイクロカプセルなどの造形品の形態にあるものなどがある。
【０２１３】
インビボ投与に使用される製剤は一般に滅菌状態にある。滅菌性は例えば滅菌濾過膜による濾過などによって容易に達成することができる。
【０２１４】
H.治療方法および治療組成物
本明細書に規定する抗BRDU抗体はいずれも治療方法に使用することができる。
【０２１５】
一局面では、医薬として使用するための抗BRDU抗体が提供される。特定の態様では、治療方法において使用するための抗BRDU抗体が提供される。
【０２１６】
さらなる局面において、本発明は、医薬の製造または調製における抗BRDU抗体の使用を提供する。
【０２１７】
さらなる局面において、本発明は、本明細書に規定する抗BRDU抗体のいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一態様では、薬学的製剤が、本明細書に規定する抗BRDU抗体のいずれかと薬学的に許容される担体とを含む。
【０２１８】
本発明の抗体は、単独で、または他の作用物質と組み合わせて、治療に使用することができる。例えば本発明の抗体は、少なくとも1つの追加治療剤と同時投与することができる。
【０２１９】
上述の併用治療には、併用投与（この場合は2つ以上の治療剤が同じ製剤または別々の製剤に含まれる）、および個別投与（この場合は、本発明の抗体の投与を、追加治療剤および/またはアジュバントの投与の前に、または同時に、または後に、行うことができる）が包含される。本発明の抗体は放射線療法と併用することもできる。
【０２２０】
本発明の抗体（および任意の追加治療剤）は、非経口投与、肺内投与、および鼻腔内投与、そして局所治療にとって望ましい場合は、病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。投薬は、投与が短期間であるか慢性的であるかにも一部依存して、任意の適切な経路、例えば静脈内注射または皮下注射などの注射によることができる。限定するわけではないが、単回投与、またはさまざまな時点にわたる複数投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含む、さまざまな投薬日程が、本明細書では考えられる。
【０２２１】
本発明の抗体は、適正医療基準（good medical practice）に合致する方法で、製剤化され、調合され、投与される。この文脈において考慮すべき因子には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与の日程計画、および医療従事者に公知の他の因子が含まれる。抗体は、問題の障害を予防または治療するために現在使用されている1つまたは複数の作用物質と共に製剤化する必要はないが、任意でそのようにしてもよい。そのような他の作用物質の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害または治療のタイプ、および上で述べた他の因子に依存する。これらは、一般に、上述したものと同じ投薬量および投与経路で使用されるか、または本明細書に記載の投薬量の約1〜99％、もしくは任意の投薬量で、実験的/臨床的に適当であると決定された任意の経路によって使用される。
【０２２２】
疾患の予防または治療に関して、本発明の抗体の適当な投薬量（単独で使用する場合、または1つもしくは複数の他の追加治療剤と併用する場合）は、治療すべき疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度および経過、抗体を予防のために投与するか治療のために投与するか、治療歴、患者の病歴および抗体に対する応答、ならびに担当医の裁量に依存する。抗体は、患者に1回で、または一連の処置で、適切に投与される。疾患のタイプおよび重症度に依存して、例えば1回または複数回の独立した投与によるか、持続注入によるかを問わず、約1μg/kg〜15mg/kg（例えば0.5mg/kg〜10mg/kg）の抗体を、患者への投与のための初回候補投薬量とすることができる。典型的な1日量は、上述の因子に依存して約1μg/kgから100mg/kgまでまたはそれ以上に及びうる。数日またはそれ以上にわたる反復投与の場合、状態に依存して、処置は一般に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで、維持される。抗体の例示的投薬量の一つは約0.05mg/kg〜約10mg/kgの範囲にある。したがって約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kgまたは10mg/kg（またはそれらの任意の組み合わせ）の1つまたは複数の用量を患者に投与することができる。そのような用量は、（例えば、患者が抗体の投与を約2回から約20回、例えば約6回受けるように）間欠的に、例えば毎週または3週間ごとに投与することができる。最初に高用量の初回負荷量を投与した後、1つまたは複数の低用量を投与することができる。この治療法の進行は、従来の技法およびアッセイで容易にモニターされる。
【０２２３】
上記の製剤または治療方法はいずれも、抗BRDU抗体の代わりに、または抗BRDU抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを使って行うことができると理解される。
【０２２４】
III.製造品
本発明の別の局面では、上述の障害の治療、予防および/または診断に有用な材料が入っている製造品が提供される。製造品は、容器、および容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。適切な容器には、例えば瓶、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどがある。容器は、ガラスまたはプラスチックなど、さまざまな素材で形成されうる。容器は、組成物を単独で、またはその状態を治療、予防および/または診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば容器は静脈内溶液バッグであるか、皮下注射針で突き刺すことができる栓を有するバイアルであることができる）。組成物中の少なくとも1つの活性作用物質は本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、その組成物が選択された状態の治療に使用されることを示す。さらにまた、製造品は、（a）本発明の抗体を含む組成物が入っている第1の容器と、（b）さらなる細胞毒性作用物質または他の治療剤を含む組成物が入っている第2の容器とを含みうる。本発明のこの態様の製造品は、さらに、特定の状態を治療するためにその組成物を使用できることを示す添付文書を含みうる。これに代えて、またはこれに加えて、製造品はさらに、薬学的に許容される緩衝液、例えば静菌性注射用水（BWFI）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液を含む第2（または第3）の容器を含みうる。商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料、例えば緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジを、さらに含みうる。
【０２２５】
上記の製造品はいずれも、抗BRDU抗体の代わりに、または抗BRDU抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含みうることを理解されたい。
【０２２６】
IV.具体的態様
1. （a）SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（b）SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
2. （a）SEQ ID NO:02のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（b）SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
3. （a）SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（b）SEQ ID NO:03のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
4. （a）SEQ ID NO:02のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（b）SEQ ID NO:03のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
5. （a）SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（b）SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
6. （a）SEQ ID NO:02のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（b）SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
7. （a）SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1、（b）SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および（c）SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3をさらに含む、態様1〜6のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
8. 重鎖の30位にプロリンアミノ酸残基を有する（ナンバリングはKabatに従う）、態様1〜7のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
9. 重鎖の58位にフェニルアラニンアミノ酸残基を有する（ナンバリングはKabatに従う）、態様1〜8のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
10. 重鎖の108位にスレオニンアミノ酸残基を有する（ナンバリングはKabatに従う）、態様1〜9のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
11. 軽鎖の49位にリジンアミノ酸残基を有する（ナンバリングはKabatに従う）、態様1〜10のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
12. 軽鎖の98位にロイシンアミノ酸残基を有する（ナンバリングはKabatに従う）、態様1〜11のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
13. 以下の1つまたは複数を含む、態様1〜12のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体:
・重鎖可変ドメインの30位にP、および/または
・重鎖可変ドメインの58位にF、および/または
・重鎖可変ドメインの108位にT、および/または
・軽鎖可変ドメインの49位にK、および/または
・軽鎖可変ドメインの98位にL（位置はいずれもKabatに従う）。
14. SEQ ID NO:09のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列およびSEQ ID NO:10のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列を含む、態様1〜13のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
15. SEQ ID NO:11の重鎖可変ドメインアミノ酸配列から派生したVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:12の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列から派生したVLアミノ酸配列を含む、態様1〜13のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
16. SEQ ID NO:11の重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO:12の軽鎖可変ドメインを含む非ヒト抗BRDU抗体のヒト化変異体である、態様1〜13のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
17. SEQ ID NO:09のアミノ酸配列を有するVHを含む、態様1〜16のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
18. SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有するVLを含む、態様1〜17のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
19. 完全長IgG1抗体または完全長IgG4抗体である、態様1〜18のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
20. モノクローナル抗体である、態様1〜19のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
21. 二価抗体である、態様1〜20のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
22. 二重特異性抗体である、態様1〜21のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
23. a）第1の抗原に特異的に結合する第1の完全長抗体の重鎖および軽鎖、ならびに
b）定常ドメインCLとCH1とが互いに入れ替えられている、第2の抗原に特異的に結合する第2の完全長抗体の改変重鎖および改変軽鎖
を含み、第1の抗原または第2の抗原のどちらか一方がBRDUである、態様1〜22のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
24. a）第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体の軽鎖、および
b）第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体の重鎖であって、そのC末端で、第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来するscFvまたはscFabにコンジュゲートされている、重鎖
を含み、第1の抗原または第2の抗原のどちらか一方がBRDUである、態様1〜22のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
25. BRDUに結合する抗体フラグメントである、態様1〜20のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体。
26. 態様1〜25のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体と、BRDUを含む核酸とを含む、複合体。
27. 態様3〜25のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体と、システイン残基にコンジュゲートされたBRDUとを含む、共有結合複合体。
28. 態様1〜25のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体または態様26〜27のいずれか一つに記載の複合体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的製剤
29. 細胞にBRDU含有核酸を送達するための、態様1〜25のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体の使用。
30. 血液脳関門を越えてBRDU含有核酸を送達するための、態様1〜25のいずれか一つに記載のヒト化抗BRDU抗体の使用。
【実施例】
【０２２７】
V.実施例
本発明の方法および組成物の例を以下に挙げる。上述した総論を考慮すれば、他にもさまざまな態様を実施しうると理解される。
【０２２８】
実施例1
マウスハイブリドーマからのマウス抗BRDU抗体のVHドメインおよびVLドメインをコードするcDNAの単離および特徴づけ
マウス抗BRDU抗体のVHドメインおよびVLドメインのタンパク質配列情報および（DNA）配列情報をハイブリドーマクローンから直接得た。引き続いて行った実験工程は（i）抗体産生ハイブリドーマ細胞からのRNAの単離、（ii）そのRNAのcDNAへの変換、VHおよびVL保因PCRフラグメントへの移入、ならびに（iii）大腸菌（E.coli）における増殖のためのプラスミドベクターへのこれらのPCRフラグメントの組み込み、およびそれらのDNA（および推定タンパク質）配列の決定である。
【０２２９】
ハイブリドーマ細胞からのRNA調製:
RNeasy Mini Kit（Qiagen）を使ってハイブリドーマ細胞からmRNAを単離した。約106個の細胞をRLT緩衝液中で溶解し、溶解物をQiashredderカラムにのせた。RNeasy Miniカラムを使ってmRNAを濃縮し、洗浄した。
【０２３０】
RACE PCRによるVHおよびVHをコードするDNAフラグメントの生成、それらのDNAフラグメントのプラスミドへのクローニング、およびそれらのDNA配列およびアミノ酸配列の決定:
cDNAの生成および特異的抗体cDNA配列の増幅は、SMART Race cDNA Amplificationキット（Clontech）を使用し、製造者のプロトコールに従って行った。特異的増幅には、キットの汎用プライマーと、それぞれ抗体軽鎖および抗体重鎖の定常領域からの特異的プライマーとを使用した。
【０２３１】
PCR産物をゲル電気泳動とアガロースからの抽出によって精製した（QIAquick Gel抽出キット; Qiagen）。
【０２３２】
PCR産物をpCR4-TOPOベクター中にクローニングした（シーケンシング用TOPO TAクローニングキット、Life Technologies）。大腸菌細胞の形質転換後に、5〜10個のコロニーを拾い、標準的技法に従ってプラスミドDNAを単離し、クローニングされたインサートをDNA配列解析にかけた。
【０２３３】
抗BRDU抗体のマウスVL配列をSEQ ID NO:12に示す。抗BRDU抗体のマウスVH配列をSEQ ID NO:11に示す。
【０２３４】
実施例2
マウス抗BRDU抗体のVHドメインおよびVLドメインのヒト化
マウスBRDU結合抗体を次のようにヒト化した。マウスハイブリドーマからのカッパ軽鎖を持つIgG1クラスのマウス抗BRDU抗体のVHドメインおよびVLドメインを含むコード配列およびアミノ酸配列の生成および特徴づけは、WO 2011/003557およびWO 2011/003780に記載されている。この情報に基づき、対応するヒト化抗BRDU抗体を、ヒト生殖細胞系フレームワークIGHV1-18-01とIGKV3-15-01の組み合わせに基づいて生成させた。ヒト化VHのアミノ酸配列をSEQ ID NO:09に示し、ヒト化VLのアミノ酸配列をSEQ ID NO:10に示す。
【０２３５】
実施例3
組換え抗BRDU抗体の組成、発現および精製
マウスおよび抗BRDU抗体可変領域をヒト起源の定常領域と組み合わせて、単一特異性または二重特異性キメラまたはヒト化抗体を形成させた。
【０２３６】
単一特異性抗BRDU抗体、およびBRDUに加えて非BRDU標的（例えば受容体チロシンキナーゼまたはIGF-1R）とも特異的に結合する二重特異性抗BRDU抗体の生成には、（i）そのような分子のアミノおよびヌクレオチド配列の設計と定義、（ii）トランスフェクト培養哺乳動物細胞におけるこれらの分子の発現、および（iii）トランスフェクト細胞の上清からのこれらの分子の精製が必要であった。これらの段階は、以前にWO 2012/093068に記載したように行った。
【０２３７】
全般的に、マウス抗BRDU抗体の結合特異性を有するIgGクラスの抗体を生成させるために、サブクラスIgG1のヒトFc領域のCH1-ヒンジ-CH2-CH3のN末端にVH配列をインフレームに融合した。同様に、ヒトCLカッパ定常領域のN末端にVL配列をインフレームに融合した。
【０２３８】
BRDU結合特異性と他の標的への特異性とを併せもつ二重特異性抗体誘導体を生成させるために、以前に記載された重鎖のC末端に、抗BRDU抗体、scFvまたはFabフラグメントをインフレームに融合した。多くの場合、適用した抗ハプテンscFvは、以前に記載されたVH44-VL100ジスルフィド結合の導入によって、さらに安定化された（例えばReiter, Y., et al., Nature biotechnology 14 (1996) 1239-1245）。
【０２３９】
発現プラスミド：
重鎖および軽鎖を発現させるための発現カセットを含む発現プラスミドは、哺乳動物細胞発現ベクター中で別々に組み立てられた。これにより、個々の要素をコードする遺伝子セグメントは、上に概説したように接続された。
【０２４０】
コドン使用頻度を推定することができるヒト軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication No 91-3242に与えられている。
【０２４１】
κ軽鎖の転写単位は次の要素から構成される：
・ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）からの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・コザック配列を含む合成5'-UT、
・シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
・5'端にユニークBsmI制限部位を配し、3'端にスプライス供与部位およびユニークNotI制限部位を配した、クローン化可変軽鎖cDNA、
・イントロン2マウスIg-κエンハンサーを含むゲノムヒトκ遺伝子定常領域（Picard, D., and Schaffner, W. Nature 307 (1984) 80-82）、および
・ヒト免疫グロブリンκ-ポリアデニル化（「ポリA」）シグナル配列。
【０２４２】
γ1重鎖の転写単位は次の要素から構成される：
・ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）からの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・コザック配列を含む合成5'-UT、
・シグナル配列イントロンを含む改変マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
・5'端にユニークBsmI制限部位を配し、3'端にスプライス供与部位およびユニークNotI制限部位を配した、クローン化単一特異性可変重鎖cDNAまたはクローン化二重特異性融合scFv可変重鎖cDNA、
・マウスIgμ-エンハンサーを含む、ゲノムヒトγ1重鎖遺伝子定常領域（Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378）、および
・ヒトγ1-免疫グロブリンポリアデニル化（「ポリA」）シグナル配列。
【０２４３】
κ軽鎖またはγ1-重鎖発現カセットの他に、これらのプラスミドは
・ハイグロマイシン耐性遺伝子、
・エプスタイン・バー・ウイルス（EBV）の複製起点oriP、
・大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18からの複製起点、
・大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子
を含有する。
【０２４４】
組換えDNA技法：
クローニングは、Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載の標準的クローニング技法を使って行った。分子生物学用試薬は（別段の表示がない場合）全て市販されており、製造者の説明書に従って使用した。
【０２４５】
コード配列、変異またはさらなる遺伝子要素を含有するDNAは、Geneart AG（レーゲンスブルク）によって合成された。
【０２４６】
DNA配列は、SequiServe（SequiServe GmbH、ドイツ）で行われた両鎖配列決定によって決定された。
【０２４７】
DNA配列およびタンパク質配列の解析ならびに配列データ管理：
配列の作成、マッピング、解析、アノテーション、および図解には、Vector NTI Advanceスイート・バージョン9.0を使用した。
【０２４８】
抗BRDU抗体および誘導体の発現：
懸濁状態のヒト胎児腎臓293（HEK293）細胞の一過性トランスフェクションによって、抗BRDU抗体を発現させた。そのために、対応する単一特異性または二重特異性抗体の軽鎖および重鎖を、上に概説したように、原核生物選択マーカーおよび真核生物選択マーカーを保有する発現ベクター中に構築した。これらのプラスミドを大腸菌中で増幅し、精製した後、一過性トランスフェクションに応用した。細胞の取り扱いには、Current Protocols in Cell Biology (2000)、Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.に記載されているように、標準的細胞培養技法を使用した。
【０２４９】
細胞を、適当な発現培地中、37℃/8％CO2で培養した。トランスフェクションの当日に、細胞を、新鮮な培地に、1〜2×106個の生細胞/mlの密度で播種した。250mlの最終トランスフェクション体積用に250μgの重鎖および軽鎖プラスミドDNAを1:1のモル比で含むOpti-MEM I培地（Invitrogen、米国）中に、トランスフェクション試薬とのDNA複合体を調製した。トランスフェクションの7日後に、14,000gで30分間の遠心分離と、滅菌フィルタ（0.22μm）での濾過によって、単一特異性または二重特異性抗体を含有する細胞培養上清を清澄化した。上清を精製まで-20℃で保存した。
【０２５０】
細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を決定するために、アフィニティHPLCクロマトグラフィーを適用した。そのために、プロテインAに結合する単一特異性もしくは二重特異性抗体またはその誘導体を含有する細胞培養上清を、200mM KH2PO4、100mMクエン酸ナトリウムを含むpH7.4の溶液中のApplied Biosystems Poros A/20カラムに適用した。このクロマトグラフィー材料からの溶出は、200mM NaCl、100mMクエン酸を含むpH2.5の溶液を適用することによって行った。UltiMate 3000 HPLCシステム（Dionex）を使用した。溶出したタンパク質をUV吸光度とピーク面積の積分によって定量した。精製IgG1抗体を標準とした。
【０２５１】
抗BRDU抗体の精製：
トランスフェクションの7日後にHEK293細胞上清を収穫した。そこに含有される組換え抗体を、プロテインA-Sepharose（商標）アフィニティクロマトグラフィー（GE Healthcare、スウェーデン）を使ったアフィニティクロマトグラフィーと、Superdex200サイズ排除クロマトグラフィーとにより、2段階で上清から精製した。簡単に述べると、抗体を含有する清澄化培養上清を、PBS緩衝液（10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaClおよび2.7mM KCl、pH7.4）で平衡化したMabSelect SuReプロテインA（5〜50ml）カラムに適用した。結合していないタンパク質を平衡化緩衝液で洗い流した。抗体（または抗体誘導体）を50mMクエン酸緩衝液（pH3.2）で溶出させた。タンパク質含有画分を0.1mlの2Mトリス（pH9.0）で中和した。次に、溶出したタンパク質画分をプールし、Amicon Ultra遠心分離フィルタデバイス（MWCO:30K、Millipore）で濃縮し、20mMヒスチジン、140mM NaCl（pH6.0）で平衡化したSuperdex200 HiLoad26/60ゲル濾過カラム（GE Healthcare、スウェーデン）にのせた。精製された抗体および誘導体のタンパク質濃度は、Pace et. al., Protein Science 4 (1995), 2411-2423に従いアミノ酸配列に基づいて算出されたモル吸光計数を使用し、280nmにおける光学密度（OD）を、バックラウンド補正としての320nmにおけるODと共に決定することによって決定した。単量体型の抗体画分をプールし、瞬間凍結し、-80℃で保存した。試料の一部を後続のタンパク質分析および特徴付けに供した。
【０２５２】
抗体の均一性は、還元剤（5mM 1,4-ジチオスレイトール（dithiotreitol））の存在下および非存在下でSDS-PAGEを行い、クーマシーブリリアントブルーで染色することによって確認した。NuPAGE（登録商標）Pre-Castゲルシステム（Invitrogen、米国）を、製造者の説明書に従って使用した（4〜20％トリス-グリシンゲル）。
【０２５３】
還元条件下で、IgGに関係するポリペプチド鎖は、SDS-PAGE上で、計算上の分子量に類似する見掛けの分子サイズに現れた。全ての構築物の発現レベルをプロテインAによって分析した。平均タンパク質収量は、上述の非最適化一過性発現実験では、細胞培養上清1リットルあたり精製タンパク質6mg〜35mgであった。
【０２５４】
図1に、BRDUおよびBRDU誘導体に結合するヒト化抗体の発現と精製の結果を示す。プロテインA（MabSelect）およびSECによる精製後に、還元SDS PAGEおよび非還元SDS PAGEにより、Kabatで53位にシステインを持つヒト化抗体およびKabatで53位にシステインを持たないヒト化抗体の組成および均一性が示される。分子量マーカーは無印のレーンにある。還元条件下では抗体H鎖（50kにある上側のバンド）および抗体L鎖（25kにある下側のバンド）がユニークバンドとして検出され、目に見える量の他のタンパク質夾雑物は存在しない。
【０２５５】
実施例5
BRDU結合性二重特異性抗体はBRDU含有ペイロードとの複合体を形成する
トランスフェリン受容体（TfR）結合性かつブロモデオキシウリジン（BRDU）結合性の二重特異性抗体（bsAb）がBRDU含有ペイロードに結合する能力を有するかどうか、そしてそれはどの程度かを評価するために、SEC-MALLS分析を応用した。それゆえに、BRDU-DNAをTfR-BRDU bsAbに2:1の化学量論比（350μg; 2.5mg/ml）で加え、bsAb/ペイロード複合体を形成させるために、室温で30分インキュベートした。対照試薬として、遊離bsAb（2.5mg/ml）および遊離BRDU-DNA（3.2mg/ml）を調製した。
2020055861.tif 000005
は、DNA1分子につき1つのBRDUをそのDNAの5'端に含有していた。複合体および対照試薬を分析まで-80℃で保存した。
【０２５６】
こうして生成させた複合体および対照試薬をSEC-MALLS分析に付すことで、遊離bsAb、遊離ペイロードおよび両者の複合体を同定し、特徴づけた。SEC-MALLS分析は、Wyatt miniDawnTREOS/QELS検出器およびOptilab rEX検出器を装備したDionex Ultimate 3000 HPLCで行った。分析物をPBS緩衝液pH7.4に1mg/mlの濃度で溶解し、0.5ml/分の流速でSuperdex200 10/300GLカラムに適用し、PBS緩衝液pH7.4で60分間溶出させた。
【０２５７】
これらの解析の結果（図1に示すもの）は、BRDU含有DNAがbsAbとの明確な複合体を形成することを示している。これらの複合体はカラムからMW 244.9kDaに溶出し（図1A）、流体力学的半径6.8nmを呈する（図1B）ことから、bsAb1分子につき約2（1.8）個のDNA分子という化学量論比を算出することができる。これに対し、遊離bsAbはMW 215.4kDaに検出され、その流体力学的半径は6.2nmと決定された。遊離BRDU-DNAはMW 16.4kDaに検出された。
【０２５８】
こうして、BRDU含有DNAはTfR-BRDU bsAbによって効果的かつ化学量論的に結合されて、2:1のモル比で複合体をもたらすことが示された。
【０２５９】
実施例6
質量分析によるBRDU結合抗体の分析
ペプチド-N-グリコシダーゼF（Roche Diagnostics GmbH、ドイツ・マンハイム）を使った酵素処理によってN-グリカンを除去した後に、BRDU結合抗体ならびにその軽鎖および重鎖の実体および完全性を、事前に還元を行ってまたは事前の還元を行わずに、エレクトロスプレーイオン化（ESI）質量分析によって確認した。還元はTCEPを使って行った。脱塩は、均一濃度ギ酸勾配（isocratic formic acid gradient）を使ってセルフパックG25-Sephadex-Superfineカラムで行った。ESIマススペクトル（+ve）は、ナノESIイオン源（TriVersa NanoMate、Advion）を装備したQ-TOF計器（maXis、Bruker）で記録した。MSパラメータ設定は次のとおりとした：導入（Transfer）：ファンネルRF（Funnel RF）、400Vpp；ISCIDエネルギー（ISCID Energy）、0eV；マルチポールRF（Multipole RF）、400Vpp；四重極（Quadrupole）：イオンエネルギー（Ion Energy）、3.0eV；下限分子量（Low Mass）、850m/z；イオン源（Source）：ドライガス（Dry Gas）、8L/分；ドライガス温度（Dry Gas Temperature）、160℃；衝突セル（Collision Cell）：衝突エネルギー、8eV；衝突RF（Collision RF）：3800Vpp；イオン冷却装置（Ion Cooler）：イオン冷却装置RF（Ion Cooler RF）、800Vpp；転送時間（Transfer Time）：140μs；プレパルスストレージ（Pre Puls Storage）、20μs；スキャン範囲（scan range）m/z 600〜2000。データ評価にはMassAnalyzerソフトウェア（自社開発）を使用した。脱グリコシル化BRDU結合抗体ならびにその軽鎖および重鎖の分子質量観測値はアミノ酸配列から算出される理論的分子質量と合致していた。
【図１】
2020055861.tif 000006
【配列表】
2020055861000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月9日(2020.1.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（b）SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み、さらに（a）SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1、（b）SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および（c）SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含み、
・重鎖可変ドメインの30位にP、および
・重鎖可変ドメインの58位にF、および
・重鎖可変ドメインの108位にT、および
・軽鎖可変ドメインの49位にK、および
・軽鎖可変ドメインの98位にL（位置はいずれもKabatに従う）
を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
【請求項２】
（a）SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（b）SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（c）SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み、さらに（a）SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含むHVR-L1、（b）SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および（c）SEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含み、
・重鎖可変ドメインの30位にP、および
・重鎖可変ドメインの58位にF、および
・重鎖可変ドメインの108位にT、および
・軽鎖可変ドメインの49位にK、および
・軽鎖可変ドメインの98位にL（位置はいずれもKabatに従う）
を含む、ヒト化抗BRDU抗体。
【請求項３】
SEQ ID NO:09のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列およびSEQ ID NO:10のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列を含む、請求項1または2のいずれか一項に記載のヒト化抗BRDU抗体。
【請求項４】
SEQ ID NO:11の重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO:12の軽鎖可変ドメインを含む非ヒト抗BRDU抗体のヒト化変異体である、請求項1または2のいずれか一項に記載のヒト化抗BRDU抗体。
【請求項５】
SEQ ID NO:09のアミノ酸配列を有するVHを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のヒト化抗BRDU抗体。
【請求項６】
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有するVLを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のヒト化抗BRDU抗体。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか一項に記載のヒト化抗BRDU抗体と、BRDUを含む核酸とを含む、複合体。