(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から洞房結節様ペースメーカー心筋細胞（ＳＡＮＬＣＭ）および心室様心筋細胞（ＶＬＣＭ）を作製するための方法の提供。【解決手段】心筋細胞集団を産生する方法であって、ａ．心血管中胚葉細胞を、ＷＮＴ阻害剤、ＶＥＧＦまたはその両方を含む心臓誘導培地中で、一定期間インキュベートして、ＮＫＸ２−５を発現する心血管前駆細胞を生成し；ｂ．ＶＥＧＦを含む基礎培地中で前記心血管前駆細胞を一定期間インキュベートして、ＮＫＸ２−５ｐｏｓｃＴｎＴｐｏｓ細胞に富む心筋細胞集団を生成する工程を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋細胞集団を産生する方法であって、その工程が：心血管中胚葉細胞を：
ｉ．
１．ＢＭＰ成分、選択された量を上回る随意にＢＭＰ４、およびレチノイン酸（ＲＡ）、および随意に１または複数のＦＧＦ阻害剤、ＷＮＴ阻害剤、随意にＩＷＰ２、ＶＥＧＦおよびアクチビン／ノーダル阻害剤、随意にＳＢ−４３１５４２を含む心臓誘導培地中で；一定期間インキュベートして、ＴＢＸ１８を発現する心血管前駆細胞を生成し；かつ
２．ＶＥＧＦを含む基礎培地中で前記心血管前駆細胞を一定期間インキュベートして、ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団を生成する工程；
または
ｉｉ．
１．１または複数のＷＮＴ阻害剤、随意にＩＷＰ２、およびＶＥＧＦ；ならびに随意にＦＧＦ成分および／またはアクチビン／ノーダル阻害剤、随意にＳＢ−４３１５４２を含む心臓誘導培地中で；一定期間インキュベートして、ＮＫＸ２−５を発現する心血管前駆細胞を生成し；かつ
２．ＶＥＧＦを含む基礎培地中で前記心血管前駆細胞を一定期間インキュベートして、ＮＫＸ２−５ｐｏｓｃＴｎＴｐｏｓ細胞に富み、ＳＡＮＬＣＭを実質的に欠く心筋細胞集団を生成する工程と；
随意に、１または複数の心筋細胞特異的表面マーカーを使用して前記心筋細胞集団を単離する工程とを含み、随意に、前記マーカーは、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）および胸腺細胞分化抗原１（ＴＨＹ−１／ＣＤ９０）である、方法。
【請求項２】
洞房結節様ペースメーカー心筋細胞（ＳＡＮＬＣＭ）に富む心筋細胞集団を産生するための請求項１に記載の方法であって、以下の工程：
ａ．心血管中胚葉細胞を、選択された量を上回るＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４、およびレチノイン酸（ＲＡ）、および随意に１または複数のＦＧＦ阻害剤、ＷＮＴ阻害剤、随意にＩＷＰ２、ＶＥＧＦおよびアクチビン／ノーダル阻害剤、随意にＳＢ−４３１５４２を含む心臓誘導培地中で；一定期間インキュベートして、ＴＢＸ１８を発現する心血管前駆細胞を生成する工程と；
ｂ．ＶＥＧＦを含む基礎培地中で前記心血管前駆細胞を一定期間インキュベートして、ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団を生成する工程と；
ｃ．随意に、１または複数の心筋細胞特異的表面マーカーを使用してＳＡＮＬＣＭに富む前記心筋細胞集団を単離する工程であって、随意に前記マーカーがシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）であり、かつ／または前記マーカーがＳＩＲＰＡおよびＴＨＹ−１／ＣＤ９０を含み、前記単離された集団がＳＩＲＰＡｐｏｓＣＤ９０ｎｅｇ細胞に富む、工程と
を含む、方法。
【請求項３】
前記心血管中胚葉細胞が、前記ＦＧＦ阻害剤とともにインキュベートされ、そのＦＧＦ阻害剤が心臓誘導段階の全部または一部に提供され、随意に２．５日目、３日目または４日目に、かつ５日目の前に添加される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＳＡＮＬＣＭを実質的に欠く心筋細胞集団を作製するための請求項１に記載の方法であって、以下の工程：
ａ．心臓前駆細胞を１または複数のＷＮＴ阻害剤、随意にＩＷＰ２、およびＶＥＧＦ；ならびに随意にＦＧＦ成分および／またはアクチビン／ノーダル阻害剤、随意にＳＢ−４３１５４２を含む心臓誘導培地中で；一定期間インキュベートして、ＮＫＸ２−５を発現する心血管前駆細胞を生成する工程と
ｂ．ＶＥＧＦを含む基礎培地中で前記心血管前駆細胞を一定期間インキュベートして、ＮＫＸ２−５ｐｏｓｃＴＮＴｐｏｓ細胞に富みＳＡＮＬＣＭを実質的に欠く心筋細胞集団を生成する工程と；
ｃ．随意に、１または複数の心筋細胞特異的表面マーカーを使用して前記心筋細胞集団を単離する工程であって、随意に前記マーカーはシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）であり、および／または前記マーカーはＳＩＲＰＡおよび胸腺細胞分化抗原１（ＴＨＹ−１／ＣＤ９０）であり、単離された集団は、ＳＩＲＰＡｐｏｓＣＤ９０ｎｅｇ細胞に富む、工程と
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記心血管前駆細胞が、
ａ．前記ＰＳＣを、ＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４を含み、随意にＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤をさらに含む胚様体培地中で一定期間インキュベートして胚様体を生成する工程と；
ｂ．前記胚様体を、ＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４、およびアクチビン成分、随意にアクチビンＡおよび随意にＦＧＦ成分、随意にｂＦＧＦを含む中胚葉誘導培地中で一定期間インキュベートして、心血管中胚葉細胞を生成する工程
を含む方法に従って多能性幹細胞（ＰＳＣ）から生成される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＳＣがヒトＰＳＣ（ｈＰＳＣ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ｈＰＳＣが誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ｈＰＳＣが、ＮＫＸ２−５レポーター構築物を含むｈＰＳＣである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団を単離する工程が：
ａ．ＳＩＲＰＡ陽性心筋細胞、随意にＳＩＲＰＡｐｏｓＣＤ９０ｎｅｇ心筋細胞を単離すること；および／または
ｂ．ＮＫＸ２−５発現に対して陰性の心筋細胞を選択すること
を含む、請求項１〜３および５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＳＡＮＬＣＭを実質的に欠く心筋細胞集団を単離する工程が：
ａ．ＳＩＲＰＡ陽性心筋細胞、随意にＳＩＲＰＡｐｏｓＣＤ９０ｎｅｇ心筋細胞を単離すること；および／または
ｂ．ＮＫＸ２−５発現に対して陽性の心筋細胞を選択すること
を含む、請求項１、および４〜８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団が、少なくとももしくは約３０％のＳＡＮＬＣＭ、少なくとももしくは約４０％のＳＡＮＬＣＭ、少なくともしくは約５０％のＳＡＮＬＣＭ、少なくとももしくは約６０％のＳＡＮＬＣＭ、少なくとももしくは約７０％のＳＡＮＬＣＭ、少なくとももしくは約８０％のＳＡＮＬＣＭまたは少なくとももしくは約９０％のＳＡＮＬＣＭを含む、請求項１〜３および５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記心筋細胞集団が、少なくとももしくは約１５％のＶＬＣＭ、少なくとももしくは約２０％のＶＬＣＭ、少なくとももしくは約３０％のＶＬＣＭ、少なくとももしくは約５０％のＶＬＣＭ、少なくとももしくは約７０％のＶＬＣＭ、または少なくとももしくは約９０％のＶＬＣＭを含む、請求項１、４〜８および１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＳＣ、随意にｈＰＳＣが、前記胚様体培地中で約６時間〜約２日間、随意に１８時間インキュベートされ胚様体を生成する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記胚様体が、前記中胚葉誘導培地中で約１〜約４日間、随意に２日間インキュベートされて心血管中胚葉細胞を生成する、請求項５〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記心血管中胚葉細胞が、心血管前駆細胞を生成するために前記心臓誘導培地中で約１〜約４日間、随意に２日間インキュベートされる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記心血管前駆細胞が、前記基礎培地中で約４日間以上、随意に約４、約５、約９、約１５または約２０日間インキュベートされて、心筋細胞を生成する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記中胚葉誘導培地が、ＢＭＰ４を、約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍＬ、随意に約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、もしくは約２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約３ｎｇ／ｍＬの濃度で含み、かつ／またはアクチビンＡを、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬ、随意に約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、もしくは約２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２ｎｇ／ｍｌの濃度で含み、より好ましくは、前記中胚葉誘導培地が、ＢＭＰ４を約３ｎｇ／ｍＬの濃度で含み、アクチビンＡを約２ｎｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記心血管中胚葉細胞が、ＢＭＰ４で約１日〜約４日間、随意に２日間、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約８０ｎｇ／ｍＬ、随意に約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１．０ｎｇ／ｍＬ、約１．５ｎｇ／ｍＬ、約２．０ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約３．０ｎｇ／ｍＬ、約５．０ｎｇ／ｍＬ、約１０．０ｎｇ／ｍＬ、２０．０ｎｇ／ｍｌ、４０．０ｎｇ／ｍｌ、もしくは８０．０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約２．５ｎｇ／ｍＬの濃度で、かつ／またはＲＡで約１日〜約２日間、随意に１日間、約２０ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌ、随意に２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、もしくは約１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１５０ｎｇ／ｍＬの濃度で処置される、請求項１〜３、５〜９、および１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記心血管中胚葉細胞が、少なくとも、それらが望ましいレベルのＴＢＸ１８またはＮＫＸ２−５および随意にＭＥＳＰ１、ＰＤＧＦＲａｌｐｈａおよび／もしくはＫＤＲの１または複数を発現するまでインキュベートされ、かつ／または、前記心血管前駆細胞および／もしくは心筋細胞が、それらが望ましいレベルの心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）を発現するまでインキュベートされる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞が、前記ＢＭＰ成分およびＲＡで処置していない心血管中胚葉由来細胞と比較して、増加したレベルのＴＢＸ１８を発現し、かつ／またはＭＹＬ２およびＩＲＸ４を発現せず、かつ、同じレベルのＴＢＸ２および／またはＭＳＸ２を発現する、請求項１〜３、５〜９、１１、１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＳＡＮＬＣＭの最小拍動数が、少なくとも５０拍動／分（ＢＰＭ）、少なくとも６０ＢＰＭ、少なくとも８０ＢＰＭ、少なくとも９０ＢＰＭ、少なくとも１００ＢＰＭ、少なくとも１１０ＢＰＭ、少なくとも１２０ＢＰＭ、少なくとも１４０、少なくとも１６０ＢＭＰ、少なくとも１８０ＢＰＭ、または２００ＢＭＰまでである、請求項１〜３、５〜９、１１、および１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＳＡＮＬＣＭを心筋細胞集団から単離する工程が、ａ）ＮＫＸ２−５レポーター構築物を含むｈＰＳＣから心筋細胞集団を作製し、ＳＡＮＬＣＭに富む集団を作製するために請求項５〜９、１１、および１３〜２１のいずれか一項に記載の方法に従って前記ｈＰＳＣを処置すること、およびｂ）ＮＫＸ２−５陰性心筋細胞を選択することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２３】
ＶＬＣＭの集団を心筋細胞集団から単離する工程が、ａ）ＳＡＮＬＣＭを実質的に欠く集団を作製するために請求項５〜８、１０、１２〜１７および１９のいずれか一項に記載の方法に従ってＮＫＸ２−５レポーター構築物を含むｈＰＳＣから心筋細胞集団を作製すること、およびｂ）ＮＫＸ２−５陽性心筋細胞を選択することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＮＫＸ２−５レポーター構築物が、蛍光ＮＫＸ２−５レポーター構築物、随意にＮＫＸ２−５：ＧＦＰレポーター構築物である、請求項８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法に従って得た、心筋細胞の単離された集団であって：
ａ．ＳＡＮＬＣＭに富み、少なくとももしくは約３０％のＳＡＮＬＣＭ、少なくとももしくは約４０％のＳＡＮＬＣＭ、少なくとももしくは約５０％のＳＡＮＬＣＭ、少なくとももしくは約６０％のＳＡＮＬＣＭ、少なくとももしくは約７０％のＳＡＮＬＣＭ、少なくとももしくは約８０％のＳＡＮＬＣＭ、または少なくとももしくは約９０％のＳＡＮＬＣＭを含む、または
ｂ．ＳＡＮＬＣＭを実質的に欠き、かつ／またはＶＬＣＭに富み、少なくとももしくは約１５％のＶＬＣＭ、少なくとももしくは約２０％のＶＬＣＭ、少なくとももしくは約３０％のＶＬＣＭ、少なくとももしくは約５０％のＶＬＣＭ、少なくとももしくは約７０％のＶＬＣＭ、または少なくとももしくは約９０％のＶＬＣＭを含む、
集団。
【請求項２６】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法に従って得た、ＮＫＸ２−５レポーター構築物を含むＳＡＮＬＣＭもしくはＶＬＣＭ、またはＮＫＸ２−５レポーター構築物を含むＳＡＮＬＣＭの集団。
【請求項２７】
請求項２５または２６に記載の前記細胞または単離された心筋細胞集団および製薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項２８】
被験体における生体内ペースメイキングのための、ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞の単離された集団および／もしくはＳＡＮＬＣＭの集団の使用、または、心筋梗塞後の心筋再生（ｒｅｍｕｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）のための、ＳＡＮＬＣＭを実質的に欠きＶＬＣＭに富む心筋細胞の単離された集団の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる２０１５年２月１７日出願の米国特許仮出願第６２／１１７，１０７号の優先権に基づく米国特許法第１１９条の利益を主張する特許協力条約出願である。
配列表の組み込み
【０００２】
ＥＦＳ−ＷＥＢによって提出され、２０１６年２月１７日に作製された、配列表「Ｐ４７９０７ＰＣ００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」（５，５７８バイト）のコンピュータ読取可能形式は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から洞房結節様ペースメーカー心筋細胞（ＳＡＮＬＣＭ）および心室様心筋細胞（ＶＬＣＭ）を作製するための方法、およびそれを含む組成物を提供する。
【背景技術】
【０００４】
洞房結節（ＳＡＮ）は心臓の主要なペースメーカーであり、生涯を通して心拍を確立する働きをする１、２。先天的疾患または加齢に起因するＳＡＮ機能不全は徐脈をもたらし、それは最終的に循環虚脱を導く。ＳＡＮ不全患者の標準的な処置は、電子ペースメーカーの移植であり、それはホルモン応答性の欠如および電子リードによる感染のリスクを含む不利点を有する３、４。幹細胞分野の進歩は今やｈＰＳＣ由来の心筋細胞の効率的な作製（９０％）を可能にするので５−７、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に由来する生物学的ペースメーカーは、有望な代替物となり得る。心筋細胞集団は、心室細胞、心房細胞およびペースメーカー細胞の混合物で構成される８、９。しかし、現在、これらの心筋細胞のサブタイプの各々を特異的に生成し単離する戦略は限られている。
【０００５】
Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．２３では、ｈＰＳＣから作製した結節の表現型を有する前駆細胞が、ＮＲＧ−１β／ＥｒｂＢシグナル伝達の抑制によって増加した。ペースメーカー細胞は、ＧＡＴＡ−６プロモータ／エンハンサーｅＧＦＰレポーターを使用してｈＰＳＣ由来の心筋細胞集団から選択された。結節細胞の種類は特定されなかった。Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２４に示されるように、二次房室（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）（ＡＶＮ）細胞は、マウス心臓内のＧＡＴＡ−６レポーターで同定することができる。
【０００６】
Ｋｅｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．３０では、試験管内で胚様体分化系を用いてｈＰＳＣから心筋細胞移植片を生成し、ペースメーカー細胞を選択せずに、房室ブロックを持つブタの心臓に移植した。１３匹の動物のうちの６匹だけにおいて、ヒト移植片によって活性化された安定した異所性調律を見ることができた。
【０００７】
Ｉｏｎｔａ  ｅｔ  ａｌ．３１では、マウスＥＳＣ分化の間のヒトＳＨＯＸ２を発現するアデノウイルスベクターでの形質導入によるＳＨＯＸ２の過剰発現がペースメーカー遺伝子プログラムをアップレギュレートし、その結果、試験管内で自動性が強化され、ラットでの移植において生物学的ペーシングが誘導されたことが報告された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．
【非特許文献２】Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．
【非特許文献３】Ｋｅｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．
【非特許文献４】Ｉｏｎｔａ  ｅｔ  ａｌ．
【発明の概要】
【０００９】
一態様には、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来の心筋細胞集団を作製する方法が含まれ、その工程は以下を含む：
ａ．ＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４を含み、随意にＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤をさらに含む胚様体培地中でｈＰＳＣを一定期間インキュベートして胚様体を生成する工程；
ｂ．ＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４、およびアクチビン成分、随意にアクチビンＡ、および随意にＦＧＦ成分、随意にｂＦＧＦを含む中胚葉誘導培地中で胚様体を一定期間インキュベートして心血管中胚葉細胞を生成する工程；
ｃ．心血管中胚葉細胞を、
ｉ．
１．選択された量を上回るＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４、およびレチノイン酸（ＲＡ）、および随意に１または複数のＦＧＦ阻害剤、ＷＮＴ阻害剤、随意にＩＷＰ２、ＶＥＧＦおよびアクチビン／ノーダル阻害剤、随意にＳＢ−４３１５４２を含む心臓誘導培地中で；一定期間インキュベートして、ＴＢＸ１８を発現する心血管前駆細胞を生成し、該心血管中胚葉細胞が好ましくはＦＧＦ阻害剤とともにインキュベートされ、そのＦＧＦ阻害剤が心臓誘導段階の全部または一部に提供され；かつ
２．ＶＥＧＦを含む基礎培地中で心血管前駆細胞を一定期間インキュベートして、ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団を生成する工程；または
ｉｉ．
１．１または複数のＷＮＴ阻害剤、随意にＩＷＰ２、およびＶＥＧＦ；ならびに随意にＦＧＦ成分および／またはアクチビン／ノーダル阻害剤、随意にＳＢ−４３１５４２を含む心臓誘導培地中で；一定期間インキュベートして、ＮＫＸ２−５を発現する心血管前駆細胞を生成し、かつ
２．ＶＥＧＦを含む基礎培地中で心血管前駆細胞を一定期間インキュベートして、ＮＫＸ２−５ｐｏｓｃＴＮＴｐｏｓ細胞に富み、ＳＡＮＬＣＭを実質的に欠く心筋細胞集団を生成する工程；および
ｄ．随意に、心筋細胞特異的表面マーカーを使用して心筋細胞集団を単離する工程、随意に、該マーカーは、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）、および胸腺細胞分化抗原１（ＴＨＹ−１／ＣＤ９０）であり、随意に該単離された集団はＳＩＲＰＡｐｏｓＣＤ９０ｎｅｇである。
【００１０】
一実施形態では、中胚葉誘導培地は、ＢＭＰ４を約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、もしくは約２０ｎｇ／ｍｌ以下、随意に約３ｎｇ／ｍＬの濃度で含み、かつ／またはアクチビンＡを約１ｎｇ／ｍＬ以下、約２ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、もしくは約２０ｎｇ／ｍＬまで、随意に約２ｎｇ／ｍＬの濃度で含み、好ましくは、中胚葉誘導培地はＢＭＰ４を約３ｎｇ／ｍＬの濃度で、アクチビンＡを約２ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。
【００１１】
もう一つの実施形態では、心血管中胚葉細胞は、約１日〜約４日間、随意に２日間または３日間、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１．０ｎｇ／ｍＬ、約１．５ｎｇ／ｍＬ、約２．０ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約３．０ｎｇ／ｍＬ、約５．０ｎｇ／ｍＬ、約１０．０ｎｇ／ｍＬ、約２０．０ｎｇ／ｍＬ、または約４０．０ｎｇ／ｍＬ、または約８０．０ｎｇ／ｍＬ、随意に約２．５ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＭＰ４とともに、そして、約１日〜約２日間、随意に１日間、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、または約１０００ｎｇ／ｍＬ、随意に約１５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＲＡとともにインキュベートされる。一態様には、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来の洞房結節様ペースメーカー心筋細胞（ＳＡＮＬＣＭ）に富む心筋細胞集団を作製する方法が含まれ、その工程は以下を含む：
ａ．ＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４を含み、随意にＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤をさらに含む胚様体培地中で、ｈＰＳＣを一定期間インキュベートして胚様体を生成する工程；
ｂ．ＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４、およびアクチビン成分、随意にアクチビンＡおよび随意にＦＧＦ成分、随意にｂＦＧＦを含む中胚葉誘導培地中で、胚様体を一定期間インキュベートして心血管中胚葉細胞を生成する工程；
ｃ．
ｉ．心血管中胚葉細胞を、選択された量を上回るＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４、およびレチノイン酸（ＲＡ）、および随意に１または複数のＦＧＦ阻害剤、ＷＮＴ阻害剤、随意にＩＷＰ２、ＶＥＧＦおよびアクチビン／ノーダル阻害剤、随意にＳＢ−４３１５４２を含む心臓誘導培地中で；一定期間インキュベートしてＴＢＸ１８を発現する心血管前駆細胞を生成する工程；該心血管中胚葉細胞は、好ましくはＦＧＦ阻害剤とともにインキュベートされ、そのＦＧＦ阻害剤は心臓誘導段階の全部または一部に提供される；かつ
ｉｉ．ＶＥＧＦを含む基礎培地中で心血管前駆細胞を一定期間インキュベートして、ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団を生成する工程；ならびに
ｄ．随意に、心筋細胞特異的表面マーカーを使用してＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団を単離する工程、随意に、該マーカーは、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）および胸腺細胞分化抗原１（ＴＨＹ−１／ＣＤ９０）であり、随意に該単離された集団はＳＩＲＰＡｐｏｓＣＤ９０ｎｅｇである。
【００１２】
ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団を作製するための実施形態では、心血管中胚葉細胞は、好ましくは、選択された量を上回るＢＭＰ４、ＲＡ、およびＦＧＦ阻害剤を含む心臓誘導培地中でインキュベートされる。
【００１３】
一実施形態では、ＦＧＦ阻害剤は、ＰＤ１７３０７４（Ｔｏｒｃｉｓ）、ＳＵ５４０２（Ｔｏｒｃｉｓ）、および任意のその他のＦＧＦ受容体阻害剤またはＦＧＦシグナル伝達阻害剤から選択される。
【００１４】
一実施形態では、心血管中胚葉細胞は、ＦＧＦ阻害剤とともに約２〜約７日、随意に約２日、約３日、約４日または約５日間インキュベートされる。
【００１５】
一態様には、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来のＳＡＮＬＣＭを実質的に含まない心筋細胞集団を作製する方法が含まれ、その工程は以下を含む：
ａ．ＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４を含み、随意にＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤をさらに含む胚様体培地中で、ｈＰＳＣを一定期間インキュベートして胚様体を生成する工程；
ｂ．ＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４、およびアクチビン成分、随意にアクチビンＡおよび随意にＦＧＦ成分、随意にｂＦＧＦを含む中胚葉誘導培地中で、胚様体を一定期間インキュベートして心血管中胚葉細胞を生成する工程；
ｃ．
ｉ．心血管中胚葉細胞を、１または複数のＷＮＴ阻害剤、随意にＩＷＰ２、およびＶＥＧＦ；ならびに随意にＦＧＦ成分および／またはアクチビン／ノーダル阻害剤、随意にＳＢ−４３１５４２を含む心臓誘導培地中で；一定期間インキュベートして、ＮＫＸ２−５を発現する心血管前駆細胞を生成し；かつ
ｉｉ．ＶＥＧＦを含む基礎培地中で心血管前駆細胞を一定期間インキュベートして、ＮＫＸ２−５ｐｏｓｃＴＮＴｐｏｓ細胞に富み、ＳＡＮＬＣＭを実質的に欠く心筋細胞集団を生成する工程；ならびに
ｄ．随意に、心筋細胞特異的表面マーカーを使用して心筋細胞集団を単離する工程、随意に、該マーカーは、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）および胸腺細胞分化抗原１（ＴＨＹ−１／ＣＤ９０）であり、随意に該単離された集団はＳＩＲＰＡｐｏｓＣＤ９０ｎｅｇである。
【００１６】
ＳＡＮＬＣＭを実質的に欠く心筋細胞集団を得ることに関する実施形態では、心血管中胚葉細胞は、好ましくはＦＧＦ成分、随意にｂＦＧＦとともにインキュベートされる。
【００１７】
一実施形態では、心血管中胚葉細胞は、ＦＧＦ成分とともに約２〜約７日、随意に約２日、約３日、約４日または約５日間インキュベートされる。
【００１８】
本開示のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、本開示の精神および範囲内の様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかとなるため、詳細な説明および具体的な例は、本開示の好ましい実施形態を示すものであるが、説明のためだけに記載されていることは当然理解される。
【００１９】
本開示の実施形態は、これから以下の図面に関連して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＮＫＸ２−５陰性、ＳＩＲＰＡ陽性細胞を選別することによる、洞房結節ペースメーカー様心筋細胞の濃縮を示す図である。図１Ａ：ｈＥＳＣの心筋細胞への分化に使用される、発達的に段階分けしたプロトコールのスキーム。図１Ｂ：分化の間の異なる時点でのペースメーカーマーカーのＱ−ＰＣＲ分析。図１Ｃ：ＮＫＸ２−５：ＧＦＰ  ｈＥＳＣ株を使用する、分化の間のＳＩＲＰＡ／ｃＴＮＴおよびＮＫＸ２−５発現の代表的なＦＡＣＳプロット。図１Ｄ：分化の２０日目のＮＫＸ２−５＋ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０−およびＮＫＸ２−５−ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０−集団の選別戦略の代表的なＦＡＣＳプロット。図１Ｅ：ＮＫＸ２−５＋ＳＩＲＰＡ＋およびＮＫＸ２−５−ＳＩＲＰＡ＋選別集団の明視野およびＧＦＰチャネルオーバーレイイメージおよび拍動数の数量化（ｎ＝３０）。スケールバーは２００μｍを表す。図１Ｆ〜Ｉ：ＮＫＸ２−５＋ＳＩＲＰＡ＋およびＮＫＸ２−５−ＳＩＲＰＡ＋選別細胞における：全心筋細胞および心室マーカー（ｆ）、ＳＡＮペースメーカーマーカー（Ｇ）、ＡＶＮペースメーカーマーカー（Ｈ）および心臓イオンチャネル（ｉ）のＱ−ＰＣＲ分析。胎児組織を発現基準として使用した。ハウスキーピング遺伝子であるＴＢＰに対する発現は、ｈＥＳＣ由来の細胞集団についてＮＫＸ２−５＋ＳＩＲＰＡ＋に正規化され、胎児組織試料についてＦ−Ｖに正規化された。Ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊ＮＫＸ２−５＋ＳＩＲＰＡ＋細胞に対してＰ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｆ−Ｖまたは示された試料に対してＰ＜０．０１（ｎ＝５）。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。図１Ｊ、Ｋ：２０日培養物由来のＮＫＸ２−５＋ＳＩＲＰＡ＋およびＮＫＸ２−５−ＳＩＲＰＡ＋選別細胞中の心室収縮装置マーカーＭＬＣ２Ｖ（ｊ）およびペースメーカー転写因子ＳＨＯＸ２（Ｋ）の免疫染色。細胞をｃＴＮＴで対比染色して、心筋細胞を標識し、ＤＡＰＩで対比染色して細胞核を標識した。スケールバーは１００μｍを表す。ＢＰＭ、１分間の拍動数；ｄ、日；ＰＳ、原条；Ｆ−Ｖ、胎児心室；Ｆ−ＳＡＮ、胎児洞房結節；Ｆ−ＡＶＮ、胎児房室結節。
【図２】ＢＭＰ４シグナル伝達がＳＡＮＬＣＭペースメーカー集団を特定することを示す図である。図２Ａ：シグナル伝達分子を効率的に送達するための中胚葉段階（３日目）のＥＢの解離を含む、修正された分化プロトコールのスキーム。図２Ｂ〜Ｄ：１０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、６ｎｇ／ｍｌ  ＡＣＴＡ（Ｂ）；５ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、４ｎｇ／ｍｌ  ＡＣＴＡ（Ｃ）；３ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、２ｎｇ／ｍｌ  ＡＣＴＡ（Ｄ）：によって中胚葉形成を誘導した培養中で３〜５日目からのＢＭＰ４の滴定の後のＮＫＸ２−５およびｃＴＮＴに関する２０日のＦＡＣＳ結果の概要。Ｔ検定：内因性（Ｅ）ＢＭＰ４レベルのＮＫＸ２−５−ＣＴＮＴ＋細胞に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（ｎ＝４）。図２Ｅ：分化３〜５日目から２．５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４で処置した培養中のＮＫＸ２−５−ｃＴＮＴ＋／ＮＫＸ２−５−ＳＩＲＰＡ＋  ＳＡＮＬＣＭ集団の増加を示す、分化２０日目の代表的なＦＡＣＳプロット。図２Ｆ：ＳＡＮＬＣＭ集団を増加させるために効率的なＢＭＰ４処置の時間窓を分析するＦＡＣＳ結果の概要。Ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊未処置対照に対してＰ＜０．０１（ｎ＝３）。図２Ｇ：未処置対照とＢＭＰ４（３〜５日目、２．５ｎｇ／ｍｌ）処置培養とを比較した、分化４日目から１２日目までのＴＢＸ１８発現のＱ−ＰＣＲ分析（ｎ＝３）。図２Ｈ：免疫染色からのＴＢＸ１８＋細胞の定量（ｎ＝３）。図２Ｉ：分化６日目の対照およびＢＭＰ４処置培養中のＴＢＸ１８の免疫染色。ＤＡＰＩを用いて細胞核を対比染色した。スケールバーは１００μｍを表す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。Ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。ｄ、日；Ｄｏｒｓｏ、ドルソモルフィン；Ｅ、内因性／未処置。
【図３】レチノイン酸シグナル伝達がＳＡＮペースメーカー表現型を増強することを示す図である。図３Ａ：分化の間の異なる時点のレチノイン酸（ＲＡ）処置のＮＫＸ２−５−ｃＴＮＴ＋  ＳＡＮＬＣＭ集団のサイズへの効果を分析するＦＡＣＳ結果の概要（ｎ＝４）。図３Ｂ：示される時点にＲＡで処理した培養由来の、ＮＫＸ２−５−ＳＩＲＰＡ＋で選別されたＳＡＮＬＣＭでの分化２０日目のＴＢＸ５およびＳＨＯＸ２のＱ−ＰＣＲ分析。ハウスキーピング遺伝子ＴＢＰと比較した発現。Ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊未処置対照に対してＰ＜０．０１（ｎ＝４）。図３Ｃ：ＳＡＮＬＣＭ集団のサイズへのＢＭＰ４（３〜５日目）、ＲＡ（３日目）およびＲＡ／ＢＭＰ４の組合せの処置の効果に関するＦＡＣＳ結果の概要。Ｔ検定：＊＊Ｐ＜０．０１。図３Ｄ〜Ｆ：２０日培養由来のＮＫＸ２−５−ＳＩＲＰＡ＋で選別されたＳＡＮＬＣＭにおける、ＳＡＮペースメーカーマーカー（Ｄ）、心室マーカーおよび心臓イオンチャネル（Ｅ）およびＡＶＮペースメーカーマーカー（Ｆ）の発現へのＢＭＰ４、ＲＡおよびＲＡ／ＢＭＰ４の組合せの処置の効果のＱ−ＰＣＲ分析。ハウスキーピング遺伝子ＴＢＰと比較した発現。Ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊未処置対照に対してＰ＜０．０１（ｎ＝５）。図３Ｇ：分化２０日目のＳＡＮＬＣＭの拍動数へのＢＭＰ４、ＲＡおよびＲＡ／ＢＭＰ４の組合せの処置の効果。Ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊未処置対照に対してＰ＜０．０１、示された試料に対して＃Ｐ＜０．０５（ｎ＝１０）。図３Ｈ：ＢＭＰ４およびＲＡシグナル伝達による、ｈＰＳＣ由来のＳＡＮＬＣＭ系列特定化の示唆されるモデルの概要スキーム。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。ｄ、日；ＲＡ、レチノイン酸。
【図４】ＳＡＮＬＣＭが機能的なペースメーカー特性を有することを示す図である。図４Ａ、Ｂ：ＮＫＸ２−５＋ＳＩＲＰＡ＋で選別されたＶＬＣＭ（Ａ）およびＮＫＸ２−５−ＳＩＲＰＡ＋で選別されたＳＡＮＬＣＭ（Ｂ）について記録した自発的活動電位の最初のトレース。図４Ｃ：ＳＡＮＬＣＭおよびＶＬＣＭにおいて記録された最大立ち上がり速度（ｄＶ／ｄｔｍａｘ）の分布を示すヒストグラムプロット。図４Ｄ：ＳＡＮＬＣＭで記録された様々な膜電位でのペースメーカーのファニー電流（Ｉｆ）の最初のトレース、ならびにＶＬＣＭおよびＳＡＮＬＣＭにおける−１２０ｍＶの最大Ｉｆ電流密度の平均値（ｎ＝１２）。図４Ｅ：ＶＬＣＭで記録された様々な膜電位でのナトリウム電流（ＩＮａ）の最初のトレース、ならびにＶＬＣＭおよびＳＡＮＬＣＭにおける−２０ｍＶの最大ＩＮａ電流密度の平均値（ｎ＝１１）。Ｔ検定：＊＊ＶＬＣＭに対してＰ＜０．０１。図４Ｆ：多電極アレイで培養したＶＬＣＭ単層の試験管内でのペーシング実験に使用される実験構成のスキーム。図４Ｇ〜Ｉ：ＳＡＮＬＣＭ集合体の添加前のＶＬＣＭ単層。ＶＬＣＭ単層の低倍率明視野画像（Ｇ）。表される単層における電気シグナル伝播の代表的なグレースケールマップ。グレースケールマップは、単層における電気的な伝播のスナップ写真を表し、電気シグナルが左下の隅（白色）で開始され、右上の隅（黒色）に伝播されることを示す（Ｈ）。１分当たりの拍動数（ｂｐｍ）で表される、単層の拍動数は、電極６５で記録された最初の電場電位として提示される（Ｉ）。図４Ｊ〜Ｌ：テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）で標識したＳＡＮＬＣＭ集合体の添加後のＶＬＣＭ単層。低倍率明視野およびＴＭＲＭ、ＧＦＰチャネル画像。ＳＡＮＬＣＭ集合体は、電極６５の上部に位置する。挿入図：２．５倍の倍率（Ｊ）。ＳＡＮＬＣＭ集合体を配置した後の単層における電気的な伝播の代表的なグレースケールマップ。電極６５、４６、および２８で記録された最初の電場電位は、電気シグナルがＳＡＮＬＣＭ集合体によって開始されることを強調する（電極６５）（Ｋ）。１分当たりの拍動数（ｂｐｍ）で表される、培養の拍動数は、電極６５および電極２８で記録された最初の電場電位として下に表される（Ｌ）。スケールバーは２５０μｍを表す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。
【図５】図５Ａ：分化４日目のＰＤＧＦＲα＋、ＫＤＲ＋心臓中胚葉および結果として生じる分化２０日目のｃＴＮＴ集団についての代表的なＦＡＣＳプロットを示す図である。図５Ｂ：分化の間の異なる時点での中胚葉マーカーおよび心臓マーカーのＱ−ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。図５Ｃ：選別後のＮＫＸ２−５＋ＳＩＲＰＡ＋およびＮＫＸ２−５−ＳＩＲＰＡ＋集団におけるｃＴＮＴ分析の代表的なＦＡＣＳプロットを示す図である。図５Ｄ：ＰＦＡで固定した２０日培養物由来のＮＫＸ２−５＋ｃＴＮＴ＋およびＮＫＸ２−５−ＣＴＮＴ＋細胞の選別戦略の代表的なＦＡＣＳプロットを示す図である。図５Ｅ〜Ｈ：ＮＫＸ２−５＋ｃＴＮＴ＋およびＮＫＸ２−５−ＣＴＮＴ＋選別細胞における；選別マーカー（Ｅ）、ＡＶＮペースメーカーマーカー（Ｆ）、ＳＡＮペースメーカーマーカー（Ｇ）、心室マーカーおよび心臓イオンチャネル（Ｈ）のＱ−ＰＣＲ分析。ハウスキーピング遺伝子ＴＢＰと比較した発現。Ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊ＮＫＸ２−５＋ｃＴＮＴ＋細胞に対してＰ＜０．０１（ｎ＝３）。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。
【図６】図６Ａ：２０日培養物由来のＮＫＸ２−５＋ＳＩＲＰＡ＋およびＮＫＸ２−５−ＳＩＲＰＡ＋選別細胞におけるペースメーカー転写因子ＴＢＸ３の免疫染色を示す図である。細胞をｃＴＮＴで対比染色して、心筋細胞を標識し、ＤＡＰＩで対比染色して細胞核を標識した。図６Ｂ：選別後３０日のＮＫＸ２−５＋ＳＩＲＰＡ＋およびＮＫＸ２−５−ＳＩＲＰＡ＋選別細胞におけるｃＴＮＴの免疫染色を示す図である。ＮＫＸ２−５：ＧＦＰ導入遺伝子発現を視覚化して、ＮＫＸ２−５−で選別された心筋細胞が選別後３０日までＮＫＸ２−５陰性のままであることを証明した。スケールバーは１００μｍを表す。図６Ｃ：選別後３０日のＮＫＸ２−５：ＧＦＰおよびｃＴＮＴについてのＮＫＸ２−５＋ＳＩＲＰＡ＋およびＮＫＸ２−５−ＳＩＲＰＡ＋選別細胞の代表的なＦＡＣＳプロットを示す図である。
【図７】図７Ａ：分化１日目に指定された量のＢＭＰおよびＡＣＴＡで中胚葉を誘導した後の、全ｃＴＮＴおよびｃＴＮＴ＋細胞のＮＫＸ２−５＋／ＮＫＸ２−５−の割合の分析を示す図である。図７Ｂ：異なる濃度のドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏ）またはＢＭＰ４による処置後の分化２０日目の細胞の総数を示す図である（ｎ＝４）。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。
【図８】図８Ａ：レチノイン酸（ＲＡ）（３日目）、ＢＭＰ４（３〜５日目）およびＲＡ＋ＢＭＰ４の組合せの処置後のＮＫＸ２−５およびｃＴＮＴについての２０日目のＦＡＣＳ結果の概要を示す図である。Ｔ検定：＊＊未処置対照条件のＮＫＸ２−５−ＣＴＮＴ＋細胞に対してＰ＜０．０１（ｎ＝４）。図８Ｂ：３日目に５００ｎＭ  ＲＡで、および３〜５日目に示されたＢＭＰ４濃度で分化したＨ７  ｈＥＳＣ株の２０日培養物におけるＮＫＸ２−５およびｃＴＮＴ染色の代表的なＦＡＣＳプロットを示す図である。図８Ｃ：３日目に５００ｎＭ  ＲＡで、および３〜５日目から示されたＢＭＰ４濃度で分化したＭＳＣ−ｉＰＳ１  ｉＰＳＣ株の２０日培養物におけるＮＫＸ２−５およびｃＴＮＴ染色の代表的なＦＡＣＳプロットを示す図である。図８Ｄ：ＮＫＸ２−５＋ｃＴＮＴ＋およびＮＫＸ２−５−ＣＴＮＴ＋細胞の選別戦略の代表的なＦＡＣＳプロットを示す図である。ＳＡＮＬＣＭ特異的表面マーカーがないため、ＭＳＣ−ｉＰＳ１培養物を２０日目にＰＦＡで固定し、ＮＫＸ２−５およびｃＴＮＴについて染色した。図８Ｅ：選別マーカーのＱ−ＰＣＲ分析を示す図である。図８Ｆ：ＡＶＮペースメーカーマーカーのＱ−ＰＣＲ分析を示す図である。図８Ｇ：ＳＡＮペースメーカーマーカーのＱ−ＰＣＲ分析を示す図である。ハウスキーピング遺伝子ＴＢＰと比較した発現。Ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊ＮＫＸ２−５＋ｃＴＮＴ＋細胞に対してＰ＜０．０１（ｎ＝４）。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。
【図９】図９Ａ：ＳＡＮＬＣＭおよびＶＬＣＭにおけるペースメーカーファニー電流密度（Ｉｆ）の電流−電圧の関係を示す図である。挿入図：電圧プロトコールは、−４０ｍＶ電流の保持電位から−１０ｍＶの３ｓ電圧ステップで−１２０ｍＶまで引き出された。電流密度は、３秒の電圧ステップの終わりの電流から瞬時電流（ｔ＝０）を引き算することによって測定した。図９Ｂ：タイロード液中の様々な膜電位での最初のペースメーカーファニー電流トレースを示す図である。図９Ｃ：２ｍＭセシウム（Ｃｓ＋）の適用によってブロックされた最初のペースメーカーファニー電流トレースを示す図である。挿入図：電圧プロトコールは、−４０ｍＶ電流の保持電位から−１０ｍＶの３ｓ電圧ステップで−１２０ｍＶまで引き出された。図９Ｄ：ＳＡＮＬＣＭおよびＶＬＣＭにおけるナトリウム電流密度（ＩＮａ）の電流−電圧の関係を示す図である。挿入図：電圧プロトコールは、−１００ｍＶ電流の保持電位から、５ｍＶの８０ｍｓ電圧ステップで＋４０ｍＶまで引き出された。電流密度は、ピーク内向き電流として測定した。図９Ｅ：バリウム（Ｂａ２＋）感受性内向き整流性カリウム電流密度（ＩＫ１）の分析：様々な膜電位でのバリウム感受性内向き整流性カリウム電流成分の最初のトレースを示す図である。図９Ｆ：ＳＡＮＬＣＭおよびＶＬＣＭにおけるバリウム感受性電流密度の電流−電圧の関係および−１２０ｍＶでの最大ＩＫ１電流密度の平均を示す図である。挿入図：電圧プロトコールは、−４０ｍＶ電流の保持電位から−１０ｍＶの３ｓ電圧ステップで−１２０ｍＶまで引き出された。Ｔ検定：＊ＶＬＣＭにおける最大電流密度に対してＰ＜０．０５。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。
【図１０】図１０Ａ〜Ｃ：ＶＬＣＭ対照集合体の添加前のＶＬＣＭ単層を示す図である。ＶＬＣＭ単層の低倍率明視野画像（Ａ）。表される単層における電気シグナル伝播の代表的なグレースケールマップ。グレースケールマップは、単層における電気的な伝播のスナップ写真を表し、電気シグナルが右下の隅（白色）で開始され、左上の隅（黒色）に伝播されることを示す（Ｂ）。１分当たりの拍動数（ｂｐｍ）で表される、単層の拍動数は、電極６５で記録された最初の電場電位として提示される（Ｃ）。図１０Ｄ〜Ｆ：テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）で標識したＶＬＣＭ対照集合体の添加後のＶＬＣＭ単層。低倍率明視野およびＴＭＲＭ、ＧＦＰチャネル画像。ＶＬＣＭ対照集合体は、電極６５の上部に位置する。挿入図：２．５倍の倍率。注、ＶＬＣＭ単層およびＶＬＣＭ対照集合体は、ＮＫＸ２−５：ＧＦＰ＋である（Ｄ）。ＶＬＣＭ対照集合体を配置した後の単層における電気的な伝播の代表的なグレースケールマップ。電極６５、４６、および２８で記録された最初の電場電位は、電気シグナルが対照ＶＬＣＭ集合体によって開始されないことを強調する（電極６５）（Ｅ）。１分当たりの拍動数（ｂｐｍ）で表される、培養の拍動数は、電極６５および電極２８で記録された最初の電場電位として下に表される（Ｆ）。スケールバーは２５０μｍを表す。
【図１１】ＳＡＮＬＣＭがインビボで生物学的ペースメーカーとして働くことができることを示す図である。図１１Ａ、Ｂ：移植後１４日に回収したＶＬＣＭ移植片（１−２×１０６細胞）を持つラット心臓の例。ランゲンドルフ単離心臓モデルでのメタコリン＋リドカインの適用前後の最初のＥＣＧトレース（Ａ）。示された移植部位（楕円）を持つラット心臓の写真およびＥＣＧトレースに対応する電気活性の心臓全体の光学マッピング画像（Ｂ）。図１１Ｃ、Ｄ：移植後１４日に回収したＳＡＮＬＣＭ移植片（１−２×１０６細胞）を持つラット心臓の例。ランゲンドルフ単離心臓モデルでのメタコリン＋リドカインの適用前後の最初のＥＣＧトレース（Ｃ）。示された移植部位（楕円）を持つラット心臓の写真およびＥＣＧトレースに対応する電気活性の心臓全体の光学マッピング画像（Ｄ）。特に、異所性拍動の開始部位は移植部位に相関する。図１１Ｅ、Ｆ：ＶＬＣＭ（Ｅ）およびＳＡＮＬＣＭ（Ｆ）移植片を持つラット心臓の凍結切片の免疫染色。ヒト特異的ｃＴｎＴ（ｈｃＴｎＴ）抗体を使用してヒト移植片を特定した。切片をｃＴＮＴで対比染色してラットおよびヒト心筋細胞を標識した。切片をＭＬＣ２Ｖについて染色してＶＬＣＭ（ＭＬＣ２Ｖ＋）およびＳＡＮＬＰ（ＭＬＣ２Ｖ−）移植片を識別した。ＤＡＰＩを使用して細胞核を標識した。点線はヒト移植片を示す。スケールバーは２００μｍを表す。ＴＰ、移植片。
【図１２】ＳＡＮＬＣＭは、トランスジェニックＮＫＸ２−５：ＧＦＰレポーターを用いずにｈＰＳＣ株から単離することができることを示す図である。（Ａ）３〜６日目からＢＭＰ（２．５ｎｇ／ｍｌ）およびＲＡ（０．５μＭ）で、そして４〜６日目からｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）かまたはＦＧＦｉ（４８０ｎＭ）のいずれかで処置した後のＮＫＸ２−５＋ｃＴＮＴ＋およびＮＫＸ２−５−ｃＴＮＴ＋細胞の割合についての２０日培養物のフローサイトメトリー分析。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。一元配置分散分析とそれに続くボンフェローニの多重比較（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）：＊＊内因性（Ｅ）ｂＦＧＦレベルのＮＫＸ２−５−ｃＴＮＴ＋細胞に対してＰ＜０．０１、内因性（Ｅ）ｂＦＧＦレベルのＮＫＸ２−５＋ｃＴＮＴ＋細胞に対して＃＃Ｐ＜０．０１（ｎ＝４）。（Ｂ）３〜６日目からＢＭＰ（２．５ｎｇ／ｍｌ）およびＲＡ（０．５μＭ）で、そして４〜６日目からｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）かまたは追加のｂＦＧＦ（内因性）なしかまたはＦＧＦｉ（４８０ｎＭ）のいずれかで処置した、２０日目の集団におけるＮＫＸ２−５−ｃＴＮＴ＋ＳＡＮＬＣＭとＮＫＸ２−５＋ｃＴＮＴ＋細胞の割合を示す代表的なフローサイトメトリー分析。（Ｃ）３〜６日目からＢＭＰ（２．５ｎｇ／ｍｌ）およびＲＡ（０．５μＭ）で、そして４〜６日目から示される量のＦＧＦｉで処置後のＮＫＸ２−５＋ｃＴＮＴ＋およびＮＫＸ２−５−ｃＴＮＴ＋細胞の割合についての２０日培養物のフローサイトメトリー分析。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す（ｎ＝２）。（Ｄ）３〜５日目からＢＭＰ（２．５ｎｇ／ｍｌ）およびＲＡ（０．５μＭ）で、そして示される時点でのＦＧＦｉ（４８０ｎＭ）で処置した後のＮＫＸ２−５＋ｃＴＮＴ＋およびＮＫＸ２−５−ｃＴＮＴ＋細胞の割合についての２０日培養物のフローサイトメトリー分析。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。一元配置分散分析とそれに続くボンフェローニの多重比較：＊＊未処置対照中のＮＫＸ２−５−ｃＴＮＴ＋細胞に対してＰ＜０．０１、未処置対照中のＮＫＸ２−５＋ｃＴＮＴ＋細胞に対して＃＃Ｐ＜０．０１（ｎ＝３）。（Ｅ）３日目のＢＭＰおよびＲＡおよび４日目のＦＧＦｉによって特定された２０日目の集団におけるＮＫＸ２−５−ＳＩＲＰＡ＋細胞とＣＤ９０−ＳＩＲＰＡ＋細胞の割合を示す、生きている培養物の代表的なフローサイトメトリー分析。ＳＡＮＬＣＭを濃縮するために、培養をＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０−発現（強調された四分円）に基づいて選別し、固定細胞でのＮＫＸ２−５：ＧＦＰおよびｃＴＮＴフローサイトメトリー分析によってそれらの選別後の純度を確認した。（Ｆ）ＮＫＸ２−５−ｃＴＮＴ＋ＳＡＮＬＣＭとＮＫＸ２−５＋ｃＴＮＴ＋細胞の割合を示す、３〜５日目からＢＭＰ（２．５ｎｇ／ｍｌ）およびＲＡ（０．５μＭ）で、そして３〜５日目からｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）かまたは追加のｂＦＧＦ（内因性）なしかまたはＦＧＦｉ（２４０ｎＭ）のいずれかによって特定された、ＨＥＳ２  ｈＥＳＣ株由来の２０日培養物の代表的なフローサイトメトリー分析。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
Ｉ．定義
用語「洞房結節様心筋細胞」または「ＳＡＮＬＣＭ」とは、本明細書において、洞房結節（ＳＡＮ）細胞特異的マーカーＴＢＸ１８、ＴＢＸ３、ＳＨＯＸ２およびＩＳＬ１を発現し、ペースメーカー活性を有する心筋細胞のサブタイプをさす。ＳＡＮ細胞のように、ＳＡＮＬＣＭは、低レベルのＮＫＸ２−５を発現し、心室様心筋細胞などのその他の心筋細胞サブタイプよりも速い拍動数（例えば、１分当たりの拍動数）を有する。
【００２２】
用語「心室様心筋細胞」または「ＶＬＣＭ」とは、本明細書において、心室特異的マーカーＭＹＬ２およびＩＲＸ４、ならびに高いレベルのＮＫＸ２−５を発現する心筋細胞のサブタイプをさす。
【００２３】
用語「房室（ＡＶＮ）心筋細胞」は、本明細書において、ＴＢＸ２およびＭＳＸ２を発現する心筋細胞のサブタイプであり、二次的なペースメーカーとして働くことができる。ＡＶＮ心筋細胞は、ＴＢＸ２および／またはＭＳＸ２を発現しないＳＡＮＬＣＭと区別できる。
【００２４】
用語「心筋細胞」は、本明細書において、ｃＴＮＴおよびＳＩＲＰＡを発現する心臓系列細胞である。
【００２５】
用語「ＮＫＸ２−５」とは、本明細書において、ヒトにおいてＮＫＸ２−５遺伝子によってコードされる心臓ホメオボックスタンパク質ＮＫＸ２−５をさす。この遺伝子は心臓分化に関与し、心室心筋細胞などの心筋細胞サブタイプに発現する。ＮＫＸ２−５の発現は、例えばＮＫＸ２−５に特異的な抗体を使用して、または例えばＮＫＸ２−５レポーター構築物を使用することによって測定することができる。
【００２６】
用語「ＮＫＸ２−５陰性細胞」は、本明細書において、例えばフローサイトメトリーによって分析した場合に、検出可能なＮＫＸ２−５タンパク質発現のない細胞および／または選択された閾値を下回る検出可能な発現のある細胞を意味する。例えば、ＮＫＸ２−５発現は、本明細書に記載されるＧＦＰレポーターアッセイなどのレポーターアッセイを使用して、またはＮＫＸ２−５タンパク質の細胞内抗体を使用して検出することができる。細胞内抗体を使用する場合、試験される細胞のアリコートは固定され、図１２Ｆおよび実施例の項に記載される方法に記載されるように染色される。
【００２７】
閾値は、例えば、本明細書に記載される方法に従って調製された心筋細胞系列細胞の混合集団に基づくことができ、この際閾値は混合集団を２つの群に分ける発現レベルに基づいて選択される。閾値はまた、対照に対する比較に基づくこともできる。例えば、対照は、細胞をＮＫＸ２−５発現に染色する場合、未分化ｈＰＳＣであってもよいし、ＮＫＸ２−５を発現しないことが公知の線維芽細胞株であってもよい。本明細書において、「ＮＫＸ２−５陰性細胞」はまた、例えばフローサイトメトリーによって分析した場合に蛍光タンパク質の検出可能な発現のない、または閾値よりも低いか対照と比較して低い発現のある、ＮＫＸ２−５レポーター、例えばＮＫＸ２−５：ＧＦＰレポーターを含む細胞を意味する。例えば、ＮＫＸ２−５レポーター系統の例では、良好な陰性対照は、レポーターを保有しないｈＰＳＣ系統から分化した心筋細胞を使用することになる。その上、内部対照を使用することができる。例えば、細胞は、ｃＴＮＴの抗体と共染色することができる。そのような例ではｃＴＮＴ陰性非心筋細胞は、ＮＫＸ２−５を発現しないことになり、内部陰性対照として使用することができる。
【００２８】
用語「ＢＭＰ成分」は、本明細書において、任意の分子、随意に任意のＢＭＰ、またはＢＭＰ４の受容体を活性化する増殖分化因子（ＧＤＦ）を意味し、それには例えばＢＭＰ４およびＢＭＰ２が含まれる。
【００２９】
用語「ＢＭＰ４」（例えば遺伝子ＩＤ：６５２）とは、本明細書において、骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）４、例えばヒトＢＭＰ４、ならびに、例えばＢＭＰ４受容体シグナル伝達を活性化することのできる活性複合体およびその断片をさす。
【００３０】
用語「アクチビン成分」は、本明細書において、１もしくは複数の成分、またはノーダルシグナル伝達を活性化する前記１もしくは複数の成分を含む組成物を意味し、随意にそれはアクチビンＡおよび／またはノーダルなどのアクチビンＡ活性を有する。
【００３１】
用語「アクチビン」または「ＡｃｔＡ」とは、本明細書において、「アクチビンＡ」、（例えば、遺伝子ＩＤ：３６２４）、例えばヒトアクチビンＡ、ならびに、ノーダルシグナル伝達を活性化することのできる活性複合体およびその断片をさす。
【００３２】
用語「アクチビン／ノーダル阻害剤」および／または「アクチビン／ノーダル／ＴＧＦ−βＲ阻害剤」は、本明細書において、アクチビン／ノーダル経路のシグナルを阻害する任意の分子、特に、受容体ＡＬＫ４、ＡＬＫ７および／またはＴＧＦ−βＲＩを阻害する任意の分子を意味し、それには、限定されるものではないが、ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）Ａ８３−０１（Ｔｏｃｒｉｓ、２９２９）、Ｄ  ４４７６、ＧＷ  ７８８３８８、ＬＹ  ３６４９４７、ＲｅｐＳｏｘ、ＳＢ  ５０５１２４、ＳＢ  ５２５３３４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＳＤ２０８が挙げられる。
【００３３】
用語「ｗｎｔ阻害剤」は、本明細書において、ｗｎｔシグナル伝達を阻害するどんな化合物および／またはタンパク質も含むどんな薬剤も意味し、それには限定されるものではないが、Ｗｎｔリガンド自体と結合するかまたはＷｎｔ受容体と結合するｗｎｔアンタゴニスト、例えばＤｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）タンパク質、Ｗｎｔ阻害因子−１（ＷＩＦ−１）、および分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ｓＦＲＰ）、ならびにｗｎｔインバースアゴニスト（例えば、アゴニストと同じ受容体と結合するが、アゴニストと反対の薬理学的応答を誘導する薬剤）が挙げられる。Ｗｎｔ阻害剤の例としては、ｗｎｔプロセシングの阻害剤であるＸＡＶ９３９、ＩＷＰ２、およびβ−カテニン応答性転写（ＣＲＴ）の強力な阻害剤であるｉＣＲＴ１４（その両方はＴｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅより入手可能である）、ならびにその組合せが挙げられる。
【００３４】
用語「ＦＧＦ成分」は、本明細書において、例えばＦＧＦを含むサイトカインなどの分子、またはＦＧＦシグナル伝達経路を活性化する、例えば、ＦＧＦ受容体と結合し、それを活性化させる小分子を意味する。用語「ＦＧＦ」とは、本明細書において、どんな線維芽細胞増殖因子も、例えばヒトＦＧＦ１（遺伝子ＩＤ：２２４６）、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ；遺伝子ＩＤ：２２４７としても公知）、ＦＧＦ３（遺伝子ＩＤ：２２４８）、ＦＧＦ４（遺伝子ＩＤ：２２４９）、ＦＧＦ５（遺伝子ＩＤ：２２５０）、ＦＧＦ６（遺伝子ＩＤ：２２５１）、ＦＧＦ７（遺伝子ＩＤ：２２５２）、ＦＧＦ８（遺伝子ＩＤ：２２５３）、ＦＧＦ９（遺伝子ＩＤ：２２５４）およびＦＧＦ１０（遺伝子ＩＤ：２２５５）もさし、随意に天然に存在する活性複合体および断片を含む活性複合体およびその断片を含む。ある種の実施形態では、ＦＧＦは、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ４および／またはＦＧＦ２である。
【００３５】
用語「レチノイン酸」または「ＲＡ」には、ビタミンＡおよびビタミンＡの機能を媒介するビタミンＡの代謝産物が含まれ、例えば全トランス型ＲＡ（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｒ２６２５）、９−シスＲＡ（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｒ４６４３）、およびレチノール（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｒ７６３２）ならびにＲＡ類似体（例えば、ＲＡＲアゴニスト）、例えばＡＭ５８０、選択的ＲＡＲαアゴニスト（Ｔｏｃｒｉｓ  ０７６０）、ＡＣ５５６４９、選択的ＲＡＲβアゴニスト（Ｔｏｃｒｉｓ  ２４３６）、およびＣＤ４３７、選択的ＲＡＲγアゴニスト（Ｔｏｃｒｉｓ  １５４９）が挙げられる。
用語「ＦＧＦ阻害剤」は、本明細書において、どんなＦＧＦ受容体阻害剤（ＦＧＦＲ１，２，３，４）またはＦＧＦシグナル伝達阻害剤（すなわち、下流のｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤）も意味し、それには限定されるものではないが、ＰＤ１７３０７４（Ｔｏｃｒｉｓ）およびＳＵ５４０２（Ｔｏｒｃｉｓ）およびｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０３５８０（Ｔｏｃｒｉｓ）が含まれる。
【００３６】
用語「ＳＩＲＰＡ」とは、本明細書において、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）全心筋細胞細胞表面マーカーをさし、例えばヒトＳＩＲＰＡ（例えば、遺伝子ＩＤ：１４０８８５）が含まれる。
【００３７】
用語「胚様体培地」は、本明細書において、胚性／多能性幹細胞からの集合体（例えば、浮遊集合体）の形成を支持し、ＳｔｅｍＰｒｏ  ３４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＭｅｓｏＦａｔｅ（商標）（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＲＰＭＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒおよび他社）、ＨＥＳ培地（ノックアウト血清置換を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒおよび他社）などの最少培地と、例えばＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４を含み、さらに随意にＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地である。胚様体培地の一例は、実施例１に記載されている。
【００３８】
用語「胚様体集合段階」は、本明細書において、集合していないｈＰＳＣが、例えば本明細書に記載される胚様体培地で培養され、ＢＭＰ成分と、随意にＲＯＣＫ阻害剤および／または胚様体をもたらすその他の成分（すなわち、分化させることのできる胚性／多能性幹細胞集合体）で処理される期間を意味する。成分処置は、同時であっても、重複していても、別々であってもよい。例えば、第１の成分は培地に含まれることができ、第２の成分は胚様体集合段階の間に培地に添加されることができる。
【００３９】
用語「中胚葉誘導培地」は、本明細書において、心血管中胚葉細胞の形成を支持し、ＳｔｅｍＰｒｏ  ３４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＭｅｓｏＦａｔｅ（商標）（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＲＰＭＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒおよび他社）などの最少培地と、例えば選択された量を上回るＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４、およびアクチビン成分、随意にアクチビンＡおよび随意にＦＧＦ成分、随意にｂＦＧＦを含む培地である。中胚葉誘導培地の一例は、実施例１に記載されている。
【００４０】
用語「中胚葉誘導段階」は、本明細書において、中胚葉細胞が中胚葉誘導培地で培養され、ＢＭＰ成分およびアクチビン成分ならびに随意にＦＧＦ成分および／または心血管中胚葉細胞をもたらすその他の成分で処理される期間を意味する。成分処置は、同時であっても、重複していても、別々であってもよい。例えば、第１の成分は培地に含まれることができ、第２の成分は中胚葉誘導段階の間に培地に添加されることができる。
【００４１】
用語「心臓誘導培地」は、本明細書において、例えばＷＮＴ阻害剤、随意にＩＷＰ２、ＶＥＧＦおよび／または随意にアクチビン／ノーダル阻害剤、随意にＳＢ−４３１５４２を含むＳｔｅｍＰｒｏ−３４最少培地などの心筋前駆細胞を支持する培地である。望ましい細胞型に応じて、心臓誘導培地はＢＭＰ成分、レチノイン酸、ＦＧＦ阻害剤またはＦＧＦ成分をも含んでよい。心臓誘導培地の一例は、実施例１に記載されている。心臓誘導培地（標準心臓誘導培地とも呼ばれる）の一例は、０．５μＭ  ＩＷＰ２、１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、および随意に５．４μＭ  ＳＢ−４３１５４２を含有するＳｔｅｍＰｒｏ−３４最少培地である。使用することのできるその他の最少培地としては、ＭｅｓｏＦａｔｅ（登録商標）（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）およびＲＰＭＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒおよび他社）が挙げられる。
【００４２】
用語「心臓誘導段階」は、本明細書において、心臓前駆細胞が心臓誘導培地で培養され、例えばＢＭＰ成分およびＲＡならびに随意にＦＧＦ阻害剤またはＦＧＦ成分および／または心血管前駆細胞をもたらすその他の成分で処理される期間を意味する。処置は、同時であっても、重複していても、別々であってもよい。例えば、第１の成分は培地に含まれることができ、第２の成分は心臓誘導段階の間に培地に添加されることができる。
【００４３】
用語「基礎培地」は、本明細書において、ＳｔｅｍＰｒｏ  ３４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＭｅｓｏＦａｔｅ（商標）（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＲＰＭＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒおよび他社）、および例えばＶＥＧＦなどの最少培地を含む、心血管前駆細胞および心筋細胞の成長を支持する培地である。基礎培地の一例は、実施例１に記載されている。
【００４４】
用語「基礎段階」は、本明細書において、心血管前駆細胞が基礎培地で培養され、ＶＥＧＦおよび／または心筋細胞をもたらすその他の成分で処理される期間を意味する。処置は、同時であっても、重複していても、別々であってもよい。
【００４５】
用語「インキュベートすること」には、本明細書において、随意に周囲条件がインキュベーターの中のように制御され、および随意に細胞の継代を含む、単層、ビーズ、フラスコ、または三次元培養を含む、細胞集団を維持および／または増殖するどんなインビトロ法も含まれる。細胞をより多くまたはより多くの成分とともにインキュベートすることを含むステップにおいて、成分は、同時に添加されてもよいし、異なる時点で添加されてもよいし、重複する期間に添加されてもよいし、別々の期間に添加されてもよい。因子は、細胞が例えば誘導培地でインキュベートを開始した後に培地に添加することができる、または因子は、培地が細胞に加えられる前に培地に添加することができる。さらに、細胞は、例えば前のインキュベーション由来の成分のレベルを低下させるために、インキュベーション間に洗浄されてよい。
【００４６】
用語「培養すること」には、本明細書において、随意に周囲条件がインキュベーターの中のように制御されている、単層、ビーズ、フラスコ、または三次元培養を含む、少なくとも１回の細胞分裂を経た細胞集団を維持し増殖するどんなインビトロ法も意味する。
【００４７】
用語「ＳＡＮＬＣＭを実質的に欠く」は、本明細書において、３０％未満、２５％未満、２０％未満、または１５％未満、１０％未満、または５％未満のＳＡＮＬＣＭを含む細胞集団を意味する。一実施形態では、ＳＡＮＬＣＭを実質的に欠く集団は、ＶＬＣＭに富む。
【００４８】
用語「ＳＡＮＬＣＭに富む」は、本明細書において、例えば２０日培養物において実施例に記載される方法を使用して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％から１００％までのＳＡＮＬＣＭを含む細胞集団を意味する。「ＳＡＮＬＣＭに富む」集団は、例えばＳＩＲＰＡｐｏｓまたはＳＩＲＰＡｐｏｓＮＫＸ２−５ｎｅｇに基づく細胞選別を使用する、細胞の単離または精製によってさらに濃縮または精製することができる。ＳＩＲＰＡｐｏｓＣＤ９０ｎｅｇに基づく単離および／または精製されたＳＡＮＬＣＭは、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％から１００％までがＮＫＸ２−５ｎｅｇＳＡＮＬＣＭである心筋細胞集団を結果としてもたらすことができる。
【００４９】
用語「被験体」には、本明細書において、哺乳動物を含む動物界の全てのメンバーが含まれ、適切にはヒトをさす。
【００５０】
細胞に適用される、用語「処置する」、「処置すること」、「処置」などには、細胞をあらゆる種類のプロセスもしくは条件にさらすこと、またはあらゆる種類の操作または手順を細胞に実施することが含まれる。被験体に適用される場合、これらの用語は、個体に医学的または外科的注意、ケア、または管理を提供することをさす。
【００５１】
被験体に適用される、用語「処置」は、本明細書において、臨床結果を含む有益または望ましい結果を得ることを目的とする手法をさし、それには、癌を治療するための、医学的手技および用途が含まれ、例えば医薬品による治療介入、手術、放射線療法および自然療法による介入ならびに試験処置が挙げられる。有益または望ましい臨床結果としては、限定されるものではないが、検出可能であろうと検出不能であろうと、１または複数の症状または状態の軽減または寛解、疾患の程度の減少、安定した（すなわち、悪化していない）疾患状態、疾患の蔓延の予防、疾患の進行の遅延または緩徐化、疾患状態の寛解または緩和、および（部分的または全体的な）緩解を挙げることができる。「処置」はまた、処置を受けていない場合に予測される生存と比較した、生存の延長を意味することもできる。
【００５２】
本明細書において、用語「投与すること」、「導入すること」および「移植すること」は、結果として望ましい部位での導入細胞の少なくとも部分的な局在をもたらす方法または経路によって細胞を被験体に送達する状況において同義的に使用される。
【００５３】
本明細書において言及される用語「培地」は、細胞生存力を維持し、増殖および随意に分化を支持する栄養分を含有する細胞を培養するための培地である。培地は、以下のいずれか：１または複数の塩、１または複数の緩衝液、アミノ酸、グルコースまたはその他の１または複数の糖、抗生物質、血清または血清代替物、およびその他の成分、例えばペプチド増殖因子、ビタミンなどを適切な組合せで含んでよい。例えば、ＳｔｅｍＰｒｏは、培地として使用することができる。
【００５４】
用語「多能性幹細胞」または「ＰＳＣ」は、本明細書において、様々な条件下で１以上の分化した細胞型に分化する能力、および例えば３つの生殖細胞層に特有の細胞型に分化する能力を持つ細胞をさし、胚幹細胞および誘導多能性幹細胞を含む。多能性細胞は、例えばヌードマウス奇形腫形成アッセイを使用して複数の細胞型に分化するその能力を特徴とする。多能性は、胚幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現によっても証明される。本明細書において、多能性幹は、細胞株および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および胚幹細胞（ＥＳＣ）を含むことができる。
【００５５】
一実施形態では、用語「胚幹細胞」は、ヒト胚などの胚の破壊を伴う幹細胞を除外する。
【００５６】
本明細書において、用語「ｉＰＳＣ」および「誘導多能性幹細胞」は、同義的に使用され、非多能性細胞、一般に成体体細胞から、例えば、１または複数の遺伝子（限定されないが、ＳＯＸ２（遺伝子ＩＤ；６６５７）、ＫＬＦ４（遺伝子ＩＤ；９３１４）、ｃＭＹＣ（遺伝子ＩＤ；４６０９）、ＮＡＮＯＧ（遺伝子ＩＤ；７９９２３）、ＬＩＮ２８／ＬＩＮ２８Ａ（遺伝子ＩＤ；７９７２７）と組み合わせたＰＯＵ４Ｆ１／ＯＣＴ４（遺伝子ＩＤ；５４６０）を含む）の発現を誘導することによって人工的に導かれた（例えば、誘導されたかまたは完全な逆転による）多能性幹細胞をさす。
【００５７】
用語「胚幹細胞」は、胚性胚盤胞の内細胞塊の多能性幹細胞をさすために使用される（例えば、米国特許第５，８４３，７８０号、６，２００，８０６号を参照）。そのような細胞は、体細胞核移植から得られる胚盤胞の内細胞塊から得ることもできる（例えば、米国特許第５，９４５，５７７号、５，９９４，６１９号、６，２３５，９７０号参照）。胚幹細胞の際立った特徴は、胚性幹細胞の表現型を規定する。したがって、細胞が他の細胞と区別されることができるような胚幹細胞の特有の特徴を１または複数有する場合に、細胞は胚幹細胞の表現型を有する。例となる際立った胚幹細胞の特徴としては、限定されるものではないが、遺伝子発現プロフィール、増殖能、分化能、核型、特定の培養条件に対する応答性などが挙げられる。
【００５８】
用語「製薬上許容される担体」は、本明細書において、医薬組成物の生物活性の有効性を妨げない、本質的に化学的に不活性な無毒の組成物を含む。適した製薬担体の例としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水溶液、グリセロール溶液、エタノール、Ｎ−（１（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、ジオレシルホスホチジル（ｄｉｏｌｅｓｙｌ−ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌ）−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびリポソームが挙げられる。そのような組成物は、被験体に直接投与するための形態を提供するのに適した量の担体とともに、治療上有効な量の１または複数の化合物を含有するべきである。
【００５９】
用語「発現」とは、ＲＮＡおよびタンパク質の産生ならびに必要に応じてタンパク質の分泌、ならびに細胞表面発現（適切な場合、限定されるものではないが、例えば、転写、翻訳、折り畳み、修飾およびプロセシング）に関与する細胞のプロセスをさす。「発現産物」には、遺伝子から転写されたＲＮＡ、および遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られるポリペプチドが含まれる。
【００６０】
本開示の範囲を理解する上で、用語「濃度」は、本明細書において、例えば培地中のＢＭＰ４、アクチビンＡ、レチノイン酸などの物質の終濃度を意味する。別に指定されない限り、濃度は重量／体積比に基づく。
【００６１】
本開示の範囲を理解する上で、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその派生語は、本明細書において、述べられる特徴、要素、成分、群、整数、および／または工程の存在を指定するが、その他の述べられない特徴、要素、成分、群、整数、および／または工程の存在を除外しないオープンエンドの用語であることを意図する。前述の内容は、用語、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびそれらの派生語などの同様の意味を有する言葉にも当てはまる。最後に、「実質的に」、「約」および「およそ」などの程度を表す用語は、本明細書において、最終結果が著しく変わることのないような修飾された用語の合理的な偏差量を意味する。これらの程度を表す用語は、それが修飾する言葉の意味をこの偏差が否定しない限り、修飾された用語の少なくとも±５％の偏差を含むものと解釈される。
【００６２】
本開示の範囲を理解する上で、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」およびその派生語は、本明細書において、述べられる特徴、要素、成分、群、整数、および／または工程の存在を指定し、その上にその他の述べられない特徴、要素、成分、群、整数、および／または工程の存在を除外するクローズエンドの用語であることを意図する。
【００６３】
終点による数値範囲の列挙は、本明細書において、その範囲内に含まれる全ての数および分数を含む（例えば、１〜５には１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、および５が含まれる）。また、その全ての数および分数は、「約」という語によって修飾されると推定されることも当然理解される。さらに、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈上明白に別の意味が述べられていない限り、複数形への言及が含まれることは当然理解される。用語「約」は、参照される数のプラスマイナス０．１〜５０％、５〜５０％、または１０〜４０％、好ましくは１０〜２０％、より好ましくは１０％または１５％を意味する。
【００６４】
さらに、特定の節に記載される定義および実施形態は、当業者に理解されるようにそれらが適していると記載されている本明細書中のその他の実施形態に適用可能であることが意図される。例えば、以下の節では、本発明の様々な態様がより詳細に定義される。そのように定義される各々の態様は、反対のことが明示されない限り、任意のその他の１または複数の態様と組み合わされてよい。特に、好ましいまたは有利であると示されるどんな特徴も、好ましいまたは有利であると示される任意のその他の１または複数の特徴と組み合わされてよい。
【００６５】
ＩＩ．方法および産物
ＳＡＮＬＣＭを豊富に含むかまたは実質的に含まない細胞集団を生成および単離するための方法が本明細書において開示される。この細胞型を指定するための成分および条件、ならびにこれらの細胞の出現をモニターするためのマーカーが記載される。
【００６６】
一態様には、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から洞房結節様ペースメーカー心筋細胞（ＳＡＮＬＣＭ）に富む心筋細胞集団を作製する方法が含まれ、その工程は以下を含む：
ａ．心血管中胚葉細胞を、選択された量を上回るＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４、およびレチノイン酸（ＲＡ）、および随意に１または複数のＷＮＴ阻害剤、随意にＩＷＰ２、ＶＥＧＦ；およびアクチビン／ノーダル阻害剤、随意にＳＢ−４３１５４２を含む心臓誘導培地中で；一定期間インキュベートして、ＴＢＸ１８を発現する心血管前駆細胞を生成する工程；
ｂ．ＶＥＧＦを含む基礎培地中で心血管前駆細胞を一定期間インキュベートして、ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団を生成する工程；および
ｃ．随意に、心筋細胞特異的表面マーカーを使用してＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団を単離する工程、随意に、該マーカーはシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）であり、随意に、該単離された集団はＳＩＲＰＡｐｏｓＣＤ９０ｎｅｇである。
【００６７】
一部の実施形態では、出発集団は、心血管中胚葉細胞である。そのような細胞は、図５ａに示されるように、表面マーカーＰＤＧＲＦａｌｐｈａ（ｈｉｇｈ）およびＫＤＲ（ｌｏｗ）を発現する。その上、これらの細胞は、表面マーカーＣＤ５６を発現する。図５Ｂに示されるように、これらの細胞は、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによってＭＥＳＰ１およびＴ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）を発現し、本明細書中に、例えば実施例１に記載される条件下でｃＴＮＴ＋心筋細胞を生じることができる。
【００６８】
図１２に実証されるように、ＦＧＦ阻害剤を心血管中胚葉細胞に添加することは、培養２０日で評価した場合のＳＡＮＬＣＭの割合を劇的に増加させる。
【００６９】
したがって、一実施形態では、心血管中胚葉細胞は、心臓誘導段階の全部または一部でＦＧＦ阻害剤でも処置される。
【００７０】
ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団を作製するための実施形態では、心血管中胚葉細胞は、好ましくは、選択された量を上回るＢＭＰ４、ＲＡ、ＷＮＴ阻害剤、ＶＥＧＦ、アクチビン／ノーダル阻害剤、およびＦＧＦ阻害剤を含む心臓誘導培地中でインキュベートされる。
【００７１】
一実施形態では、ＦＧＦ阻害剤は、ＰＤ１７３０７４（Ｔｏｒｃｉｓ）、ＳＵ５４０２（Ｔｏｒｃｉｓ）、および任意のその他のＦＧＦ受容体阻害剤またはＦＧＦシグナル伝達阻害剤から選択される。
【００７２】
例となる濃度としては、ＰＤ１７３０７４について６０ｎＭ〜５マイクロモル、ＳＵ５４０２について５マイクロモル〜１０ｍＭ、またはｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０３５８０について１マイクロモル〜１ｍＭが挙げられる。述べた範囲の間の１ナノモルの増分も考えられる。例えば、ＰＤ１７３０７４の濃度は、６１ｎＭ、６２ｎＭ、６３ｎＭなどであり得る。
【００７３】
一実施形態では、ＰＤ１７３０７４の濃度は、６０ｎＭ〜５マイクロモルの間、例えば、少なくともまたは約０．１２マイクロモル、少なくともまたは約０．２４マイクロモル、少なくともまたは約０．５マイクロモル、少なくともまたは約０．７５マイクロモル（ｍｉｃｒｏＭｏａｌａｒ）、少なくともまたは約１マイクロモル、少なくともまたは約２マイクロモル、少なくともまたは約３マイクロモル、少なくともまたは約４マイクロモルまたは約５マイクロモルを含むかまたはそうであるように選択される。一実施形態では、ＰＤ１７３０７４の濃度は、約２４０〜約９６０ｎＭである。
【００７４】
一実施形態では、心血管中胚葉細胞は、ＦＧＦ阻害剤とともに約２〜約７日間、随意に約２日、約３日、約４日または約５日間インキュベートされる。
【００７５】
ＦＧＦ阻害剤は、分化の約２．５日〜５日の間に添加され得る。ＦＧＦ阻害剤は、ＰＤＲＧＦａｌｐｈａおよびＣＤ５６の同時発現がフローサイトメトリーによって最初に検出可能であり、かつＱ−ＲＴ  ＰＣＲによって求められるＴ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）およびＭＥＳＰ１発現がその最大発現に達する期間に相当する約２．５日〜約５日の間に添加される。本明細書において示されるように、Ｔ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）とＭＥＳＰ１の両方は３日前後に発現がピークになり、その後低下する−図５Ｂ参照）。
【００７６】
図１２において実証されるように、本方法は、ＦＧＦ阻害剤が心臓誘導段階に添加される場合に、ＮＫＸ２−５＋細胞を含まない（または少ししか含まない）培養を得ることが可能となり、ＮＫＸ２−５レポーターなしで実施することができる。これらの培養は主にＳＡＮＬＣＭおよび非心筋細胞を含む。ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０−細胞について選別することにより、非心筋細胞からのＳＡＮＬＣＭの精製（ＮＫＸ２−５＋細胞はほとんど培養中に存在しないため）が可能になる。
【００７７】
もう一つの態様には、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からＳＡＮＬＣＭを実質的に欠く心筋細胞集団を作製する方法が含まれ、その工程は以下を含む：
ａ．心血管中胚葉細胞を１または複数のＷＮＴ阻害剤、随意にＩＷＰ２、およびＶＥＧＦ；および随意にＦＧＦ成分および／またはアクチビン／ノーダル阻害剤、随意にＳＢ−４３１５４２を含む心臓誘導培地中で；一定期間インキュベートして、心血管前駆細胞を生成する工程；
ｂ．ＶＥＧＦを含む基礎培地中で心血管前駆細胞を一定期間インキュベートして、ＮＫＸ２−５ｐｏｓｃＴＮＴｐｏｓに富み、ＳＡＮＬＣＭを実質的に欠く心筋細胞集団を生成する工程；および
ｃ．随意に、心筋細胞特異的表面マーカーを使用してＳＡＮＬＣＭを実質的に欠くＮＫＸ２−５ｐｏｓｃＴＮＴｐｏｓである心筋細胞集団を単離する工程、随意に、該マーカーはシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）であり、随意に、該単離された集団はＳＩＲＰＡｐｏｓＣＤ９０ｎｅｇである。
【００７８】
ＳＡＮＬＣＭを実質的に欠く集団が望まれる実施形態のために心血管中胚葉細胞の間にアクチビン／ノーダル阻害剤を添加することが、随意に用いられてよい。例えば、内因性レベルの比較的高いアクチビンシグナル伝達を有するｈＥＳＣまたはｈＩＰＳＣ細胞株は、ＳＢ−４３１５４２などのアクチビン／ノーダル阻害剤で処置されることが好ましい。
【００７９】
一実施形態では、心臓誘導培地は、ＷＮＴ阻害剤およびＶＥＧＦを含む。一実施形態では、ＷＮＴ阻害剤かまたはＶＥＧＦのいずれかを使用することができる。本明細書において示されるように、両方の成分を含めることにより、ＮＫＸ２−５ｐｏｓｃＴＮＴｐｏｓ細胞を生成する効率が増加する。例えば、組合せは、ＮＫＸ２−５ｐｏｓｃＴＮＴｐｏｓ細胞を含む培養の最大８０％をもたらすことができる。
【００８０】
一実施形態では、心臓中胚葉細胞を処置するために使用されるＦＧＦ成分は、ｂＦＧＦである。本明細書に記載されるその他のＦＧＦ成分も使用することができる。
【００８１】
一実施形態では、心臓誘導培地中のｂＦＧＦの濃度は、約０．２５〜１００ｎｇ／ｍｌまたはその間の任意の０．１ｎｇ／ｍｌの増分、例えば約１ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、または約１００ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、ＦＧＦ成分はｂＦＧＦ以外のＦＧＦであり、約０．２５〜１００ｎｇ／ｍｌまたはその間の任意の０．１ｎｇ／ｍｌの増分のｂＦＧＦに等しい濃度である。
【００８２】
一実施形態では、心血管中胚葉細胞は、ＦＧＦ成分とともに約２〜約７日間、随意に約２日、約３日、約４日または約５日間インキュベートされる。
【００８３】
本明細書において示されるように、心血管前駆細胞は、ＴＢＸ１８を発現することができ、本明細書に記載される方法を用いてＳＡＮＬＣＭを生じさせることができる。また、心血管前駆細胞は、ＮＫＸ２−５を発現し、ＶＬＣＭを生じさせることもできる。
【００８４】
一実施形態では、心血管中胚葉細胞は胚様体から作製され、該方法は以下を含む：
【００８５】
胚様体を、ＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４、およびアクチビン成分、随意にアクチビンＡ、および随意にＦＧＦ成分、随意にｂＦＧＦを含む中胚葉誘導培地中で一定期間インキュベートして、心血管中胚葉細胞を生成する工程。胚様体および心血管中胚葉細胞を含む心筋細胞集団を作製するための方法は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる２０１４年９月１２日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１４／０００６８７号（標題「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ  ＥＰＩＣＡＲＤＩＵＭ  ＣＥＬＬＳ」）に開示されている。
【００８６】
胚様体は、ＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４を含み、随意にＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤をさらに含む胚様体培地中で、ｈＰＳＣを一定期間インキュベートして、胚様体を生成することによって得ることができる。
【００８７】
もう一つの実施形態では、心血管中胚葉細胞を得るために使用される胚様体は、ＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４を含み、随意にＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤をさらに含む胚様体培地中で、ｈＰＳＣを一定期間インキュベートして、胚様体を生成することによって得ることができる。
【００８８】
一実施形態では、心血管中胚葉細胞は、ＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４、およびアクチビン成分、随意にアクチビンＡおよび随意にＦＧＦ成分、随意にｂＦＧＦを含む中胚葉誘導培地中で、胚様体を一定期間インキュベートして、心血管中胚葉細胞を生成することによって得ることができる。
【００８９】
したがって、もう一つの態様には、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から洞房結節様ペースメーカー心筋細胞（ＳＡＮＬＣＭ）に富む心筋細胞集団を作製する方法が含まれ、その工程は以下を含む：
ａ．ＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４を含み、随意にＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤をさらに含む胚様体培地中で、ｈＰＳＣを一定期間インキュベートして胚様体を生成する工程；
ｂ．ＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４、およびアクチビン成分、随意にアクチビンＡおよび随意にＦＧＦ成分、随意にｂＦＧＦを含む中胚葉誘導培地中で、胚様体を一定期間インキュベートして心血管中胚葉細胞を生成する工程；
ｃ．心血管中胚葉細胞を、選択された量を上回るＢＭＰ成分、随意にＢＭＰ４、およびレチノイン酸（ＲＡ）、および随意に１または複数のＦＧＦ阻害剤、ＷＮＴ阻害剤、随意にＩＷＰ２、ＶＥＧＦおよびアクチビン／ノーダル阻害剤、随意にＳＢ−４３１５４２を含む心臓誘導培地中で；一定期間インキュベートしてＴＢＸ１８を発現する心血管前駆細胞を生成する工程；該心血管中胚葉細胞は、好ましくはＦＧＦ阻害剤とともにインキュベートされ、そのＦＧＦ阻害剤は心臓誘導段階の全部または一部に提供される；
ｄ．ＶＥＧＦを含む基礎培地中で心血管前駆細胞を一定期間インキュベートして、ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団を生成する工程；ならびに
ｅ．随意に、心筋細胞特異的表面マーカーを使用してＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団を単離する工程、随意に、該マーカーは、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）であり、随意に該単離された集団はＳＩＲＰＡｐｏｓＣＤ９０ｎｅｇである。
【００９０】
本明細書において実証されるように、例えば患者の血液または皮膚試料に由来する例えば胚幹細胞株および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、どんなヒト多能性幹細胞株も使用することができる。ｉＰＳＣを作製するための方法は当技術分野で公知であり、ｉＰＳＣは、終末分化した細胞を含む複数の異なる細胞型から誘導することができる。ｉＰＳＣは、ＥＳ細胞様の形態を有し、当業者に公知の１または複数の主要な多能性マーカー（限定されるものではないが、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ  １、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａ１、ＴＥＲＴ、およびｚｆｐ４２を含む）を発現する。ｉＰＳＣを生成し、特徴づける方法の例は、例えば、米国特許出願公開第２００９００４７２６３号、同第２００９００６８７４２号、同第２００９０１９１１５９号、同第２００９０２２７０３２号、同第２００９０２４６８７５号、および同第２００９０３０４６４６号に見出すことができ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。一般に、ｉＰＳＣを生成するために、体細胞には、体細胞が多能性幹細胞となるように再プログラムするために当技術分野で公知の再プログラム化因子（例えば、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ２．ＫＬＦ４、ＭＹＣ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８など）が提供される。
【００９１】
本明細書において示されるように、ｈＰＳＣ株は、ＳＡＮＬＣＭに富む培養を作製するために使用することができ、それは細胞選別を使用してさらに濃縮／精製されることができる。例えば、ＦＧＦ阻害剤を使用してＳＡＮＬＣＭの割合を増加させる（ＮＫＸ２−５＋ｃＴＮＴ＋心筋細胞集団を低下させる）実施形態では、ＳＩＲＰＡ＋およびＣＤ９０−細胞についてのフロー支援（Ｆｌｏｗ  ａｓｓｉｓｔｅｄ）細胞選別（ＦＡＣＳ）によるこれらの培養からの心筋細胞の選択は、ＳＡＮＬＣＭが高度に濃縮された（例えば、７０〜９０％）培養を達成する。
【００９２】
一実施形態では、ｈＰＳＣは、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。一実施形態では、ｈＰＳＣはヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）である。
【００９３】
その他の実施形態では、例えば限定されるものではないがマウスおよびラットなどのげっ歯類ＰＳＣ、非ヒト霊長類ＰＳＣおよびブタＰＳＣを含む、哺乳動物ＰＳＣが本明細書に記載される方法で使用される。
【００９４】
一実施形態では、ｈＥＳＣは、Ｈ７細胞、ＨＥＳ２細胞またはＨＥＳ３細胞である。一実施形態では、ｉＰＳＣはＭＳＣ−ｉＰＳ１細胞である。さらなる実施形態では、ｉＰＳＣは、被験体から得た細胞から調製される。
【００９５】
ｉＰＳＣは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，２７８，１０４号および米国特許第８，０５８，０６５号に開示される方法などの公知の方法に従って作製することができる。
【００９６】
一部の実施形態では、レポーター構築物を含むｈＰＳＣ（または哺乳動物ＰＳＣ）は、心筋集団（ｃａｒｄｉａｃ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）の発生をモニターするために使用される。一実施形態では、ｈＰＳＣは、ＮＫＸ２−５レポーター構築物を含むｈＰＳＣである。
【００９７】
一実施形態では、ＢＭＰ成分はＢＭＰ４である。もう一つの実施形態では、ＢＭＰ成分はＢＭＰ２である。
【００９８】
もう一つの実施形態では、ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団を単離または精製することは：
ａ．ＳＩＲＰＡマーカー陽性心筋細胞を単離すること；および／または
ｂ．ＮＫＸ２−５発現に対して陰性かつ／またはＣＤ９０発現に対して陰性の心筋細胞を選択すること
を含む。
【００９９】
もう一つの実施形態では、ＳＡＮＬＣＭを実質的に欠く心筋細胞集団を単離することは：
ａ．ＳＩＲＰＡマーカー陽性心筋細胞を単離すること；および／または
ｂ．ＮＫＸ２−５発現に対して陽性かつ／またはＣＤ９０発現に対して陰性の心筋細胞を選択すること
を含む。
【０１００】
本明細書において実証されるように、心筋細胞に富む集団を単離するために、心筋細胞細胞表面マーカーを使用することができる。例えば、ＳＩＲＰＡは、ヒト多能性幹細胞に由来する心筋細胞を単離するために使用することのできる心筋細胞特異的細胞表面マーカーである１０。例えば、幹細胞分化培地などの細胞は、ＳＩＲＰＡに対する抗体によって選別されることができる。Ｄｕｂｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１０では、ＳＩＲＰＡに対する抗体による細胞選別が、最大９８％の心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）陽性細胞集団を生じることが示された。
【０１０１】
ＮＫＸ２−５またはホメオボックスタンパク質ＮＫＸ２−５は、心筋細胞形成の調節に関与する転写因子である。それは心室心筋細胞などの一部の心筋細胞サブタイプで発現するが、他の心筋細胞サブタイプ、例えばＳＡＮＬＣＭなどでは発現しない。
【０１０２】
ＮＫＸ２−５陰性細胞を選択することによりＳＡＮＬＣＭが濃縮され、本明細書に記載されるようにＦＧＦを含む心臓誘導培地で処置した培養からＮＫＸ２−５陽性細胞を選択することにより心室様心筋細胞が濃縮されることが本明細書において実証される。ＮＫＸ２−５細胞の選択は、例えば、ＮＫＸ２−５レポーターアッセイを使用する方法において使用されることができる。ＮＫＸ２−５発現レベルの測定は、得られる集団が望ましい集団であることを確認するため、かつ／または望ましくない細胞の量を確認するためにも使用されることができる。例えば、ＳＡＮＬＣＭを濃縮するために本明細書に記載される方法に従って処置された心筋細胞集団のアリコートを試験して、ＮＫＸ２−５発現のレベルが低い（例えば、非精製集団と同様）または事実上存在しない（例えば、ＳＩＲＰＡｐｏｓＣＤ９０ｎｅｇ細胞について精製された集団と同様）ことを確認することができる。同様に、ＳＡＮＬＣＭを実質的に欠く集団を作製するために、本明細書に記載される方法に従って（例えば、心臓誘導段階のＶＥＧＦおよびＩＷＰ２を使用して）処置された心筋細胞集団のアリコートを試験して、ＮＫＸ２−５発現のレベルが高いことを確認することができる。
【０１０３】
実証されるように、ＮＫＸ２−５陰性で選択された心筋細胞は、ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞である。
【０１０４】
もう一つの実施形態では、ＮＫＸ２−５陽性で選択された心筋細胞は、心室様心筋細胞（ＶＬＣＭ）に富む心筋細胞である。
【０１０５】
例えば、ＮＫＸ２−５レポーター構築物を使用して、幹細胞由来心筋細胞などの心筋細胞を特定することができる。Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．１６に示されるように、強化されたＧＦＰをコードする配列が相同組換えによってＮＫＸ２−５遺伝子座に導入され、ＮＫＸ２−５：ＧＦＰ陽性ｈＥＳＣは心臓前駆細胞に分化した。
【０１０６】
免疫蛍光分析などの蛍光検出技法を使用して、ＮＫＸ２−５  ｅＧＦＰ発現細胞を選択または決定することができる。例えば、レポーター細胞に蛍光が存在することは、その細胞がＮＫＸ２−５を発現することを示す。例えば、蛍光が存在しないことは、その細胞がＮＫＸ２−５を発現しないか、または高レベルのＮＫＸ２−５を発現しないことを示す。その他のＮＫＸ２−５レポーター構築物を使用することもできる。
【０１０７】
細胞は、例えばマーカー発現（例えば、細胞表面マーカー）に基づくフローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）を使用して、かつ／または蛍光に基づくレポーターを使用する場合に、単離されることができる。
【０１０８】
その他の方法は、その他のレポーターとともに使用することができる。例えば、抗生物質耐性レポーター遺伝子を含む細胞は、例えば、ジェネティシン（登録商標）、ピューロマイシンまたはハイグロマイシンＢに対するそれらの抗生物質耐性に基づいて単離されることができる。
【０１０９】
その他のレポーター構築物は、ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団を作製するために使用することができる。例えば、ＳＡＮ特異的マーカーを使用することができる。一実施形態では、レポーター構築物は、ＳＨＯＸ−２レポーター構築物である。もう一つの実施形態では、レポーター構築物は、ＴＢＸ１８レポーター構築物である。
【０１１０】
ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団を作製するためにＮＫＸ２−５レポーター構築物を使用する必要はないが、ＮＫＸ２−５レポーターを含むｈＰＳＣ細胞株を使用するか、またはＮＫＸ２−５レポーター構築物をｈＰＳＣ株などの幹細胞に導入することにより、ＳＡＮＬＣＭ分化プロトコールをモニターし、かつ／または最適化することができる。例えば、ＮＫＸ２−５発現の存在を測定することができ、プロトコールをそれに応じて、ＮＫＸ２−５発現の不在および／または望ましい最低限の存在が例えば免疫蛍光分析によって検出されるまで調節することができる。
【０１１１】
あるいは、上記のＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団を作製する方法は、ＮＫＸ２−５に特異的な抗体の使用を含むことができる。例えば、ウサギ抗ヒトＮＫＸ２−５（１：８００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）などのＮＫＸ２−５に対する抗体を使用することができる。
【０１１２】
例えば、細胞培養のアリコートを評価して、ＮＫＸ２−５および／または本明細書に記載される１または複数のマーカーのレベルを測定して、例えば望ましいレベルまたは数の細胞が本明細書に記載される段階に関連するマーカーを発現していることを評価することができる。細胞培養は、１または複数の段階で、かつ／または、作製されるＳＡＮＬＣＭの数の測定が終わると試験されることができる。１または複数のマーカー（細胞表面または細胞内）のレベルは、免疫に基づく方法、例えば、ＦＡＣＳを含むフローサイトメトリーを用いて、または定量的ＲＴ−ＰＣＲなどのｍＲＮＡ発現に基づく方法を用いて測定することができる。
【０１１３】
一実施形態では、ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団は、少なくとももしくは約３０％のＳＡＮＬＣＭ、少なくとももしくは約５０％のＳＡＮＬＣＭ、少なくとももしくは約７０％のＳＡＮＬＣＭ、または少なくとももしくは約９０％のＳＡＮＬＣＭを含む。
【０１１４】
一実施形態では、ＶＬＣＭに富む心筋細胞集団は、少なくとももしくは約１５％のＶＬＣＭ、少なくとももしくは約２０％のＶＬＣＭ、少なくとももしくは約３０％のＶＬＣＭ、少なくとももしくは約５０％のＶＬＣＭ、少なくとももしくは約７０％のＶＬＣＭ、または少なくとももしくは約９０％のＶＬＣＭを含む。
【０１１５】
図１Ａは、心筋細胞へのｈＥＳＣの分化のための、発達的に段階分けされたプロトコールのスキームを例示する。一実施形態では、ｈＰＳＣは、分化プロセスの０日目に胚様体培地中でインキュベートされる。一実施形態では、胚様体は、分化プロセスの約１日目〜約３日目に中胚葉誘導培地中でインキュベートされる。一実施形態では、心血管中胚葉細胞は、分化プロセスの約３日目〜約５日目に心臓誘導培地中でインキュベートされる。一実施形態では、心血管前駆細胞は、分化プロセスの約５日目〜約２０日目に基礎培地中でインキュベートされる。
【０１１６】
一実施形態では、ｈＰＳＣは、胚様体培地中で約６時間〜約２日間、随意に１８時間インキュベートされて、胚様体を生成する。
【０１１７】
一実施形態では、胚様体は、中胚葉誘導培地中で約１〜約４日、随意に２日間インキュベートされて、心血管中胚葉細胞を生成する。
【０１１８】
一実施形態では、心血管中胚葉細胞は、心臓誘導培地中で約１〜約４日間、随意に２日間インキュベートされて、心血管前駆細胞を生成する。
【０１１９】
一実施形態では、心血管前駆細胞は、基礎培地中で約４日間以上、随意に約４、約５、約９、約１５または約２０日間インキュベートされて、心筋細胞を生成する。一実施形態では、心血管前駆細胞は、基礎培地中で約４日〜約２０日間または４日〜２０日の間の任意の日数の間インキュベートされて、心筋細胞を生成する。一実施形態では、心血管前駆細胞は、基礎培地中で２０日間以上インキュベートされて、心筋細胞を生成する。
【０１２０】
一実施形態では、中胚葉誘導培地は、ＢＭＰ４を約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約５ｎｇ／ｍＬの間、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約３ｎｇ／ｍＬの間、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約８ｎｇ／ｍＬの間、約２ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬの間、０．５ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬの間、または０．５ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬの間の範囲の濃度で含む。濃度は、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬまでの間の任意の０．１ｎｇ／ｍＬの増分であり得るかまたはそれに及び得る。
【０１２１】
一実施形態では、中胚葉誘導培地は、ＢＭＰ４を約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬ、または約２０ｎｇ／ｍＬまで、随意に約３ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。
【０１２２】
一実施形態では、中胚葉誘導培地は、アクチビンＡを約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約３ｎｇ／ｍＬの間、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約４ｎｇ／ｍＬの間、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約５ｎｇ／ｍＬの間、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬの間、約１ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬの間、０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬの間、または０．１ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬの間の範囲の濃度で含む。濃度は、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬまでの間の任意の０．１ｎｇ／ｍＬの増分であり得るかまたはそれに及び得る。
【０１２３】
もう一つの実施形態では、中胚葉誘導培地は、アクチビンＡを約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、または約２０ｎｇ／ｍＬ、随意に約２ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。
【０１２４】
一実施形態では、中胚葉誘導培地は、ＢＭＰ４を約３ｎｇ／ｍＬの濃度で、アクチビンＡを約２ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。
【０１２５】
ＢＭＰ４シグナル伝達は、中胚葉段階（３日目前後）のペースメーカー集団の特定化に重要な役割を果たし、したがってＢＭＰ４による十分な投薬および処置時間がＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞の生成において重要である。ＢＭＰシグナル伝達の遮断および高レベルのＢＭＰ４への曝露が心筋細胞の著しい減少をもたらすことは以前に示された。図２Ｂ〜Ｄおよび図７Ｂに示されるように、より低いレベルのＢＭＰ４は、ＳＡＮＬＣＭの割合の増加を導く。
【０１２６】
一実施形態では、心血管中胚葉細胞は、ＢＭＰ４を含む心臓誘導培地で約１日〜約４日間、随意に２日間、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１．０ｎｇ／ｍＬ、約１．５ｎｇ／ｍＬ、約２．０ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約３．０ｎｇ／ｍＬ、約５．０ｎｇ／ｍＬ、約１０．０ｎｇ／ｍＬ、約２０．０ｎｇ／ｍＬ、約３０．０ｎｇ／ｍＬ、約４０．０ｎｇ／ｍＬ、約５０．０ｎｇ／ｍＬ、約６０．０ｎｇ／ｍＬ、約７０．０ｎｇ／ｍＬ、または約８０．０ｎｇ／ｍＬ、随意に２．５ｎｇ／ｍＬの濃度で処置される。
【０１２７】
図３に示されるように、ＲＡシグナル伝達も、ＳＡＮＬＣＭの発生に影響を及ぼす。ＲＡを分化プロセスの２日目に添加すると心筋細胞の生成が遮断されたが、ＲＡを後の時点で添加しても全心筋細胞またはＳＡＮＬＣＭの頻度に影響がなかった。３日目〜５日目の間のＲＡの添加が、後方の（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）心筋細胞マーカーＴＢＸ５およびＳＡＮマーカーＳＨＯＸ２を著しくアップレギュレートすることは、本明細書において示される。ＲＡシグナル伝達がＳＡＮ前駆細胞においてペースメーカー表現型を強化することは実証される（図３Ｈ）。
【０１２８】
一実施形態では、心血管中胚葉細胞は、ＲＡを含む心臓誘導培地で約１日〜約４日間、随意に１日間、約５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、もしくは約１０００ｎｇ／ｍＬ、随意に１５０ｎｇ／ｍＬの濃度で、または約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬまでの間の任意の濃度またはその間の任意の０．１ｎｇ／ｍＬの増分からの範囲の濃度で（あるいは約１００ｎＭ〜約３ｍＭまたは１００ｎＭ〜３ｍＭの間の任意の１ｎＭの増分で）処置される。
【０１２９】
一実施形態では、ＲＡは、約２０ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの間の濃度、随意に約１５０ｎｇ／ｍＬの濃度の全トランス型ＲＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｒ２６２５）または９−シスＲＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｒ４６４３）である。
【０１３０】
もう一つの実施形態では、ＲＡはＲＡ類似体である。一実施形態では、ＲＡ類似体は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度、随意に約１８ｎｇ／ｍＬの濃度の選択的ＲＡＲαアゴニストであるＡＭ５８０（Ｔｏｃｒｉｓ  ０７６０）である。一実施形態では、ＲＡ類似体は、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度、随意に約８０ｎｇ／ｍＬの濃度の選択的ＲＡＲβアゴニストであるＡＣ５５６４９（Ｔｏｃｒｉｓ  ２４３６）である。一実施形態では、ＲＡ類似体は、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約５０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度、随意に約６００ｎｇ／ｍＬの濃度の選択的ＲＡＲγアゴニストであるＣＤ４３７（Ｔｏｃｒｉｓ  １５４９）である。
【０１３１】
３日目〜５日目の間のＢＭＰ４とＲＡによる心血管中胚葉細胞の組み合わせ処置がＳＡＮＬＣＭ分化プロセスを増加させることは本明細書において示される。図３に示されるように、組み合わせたＲＡ／ＢＭＰ４のシグナル伝達は、ペースメーカーイオンチャネル遺伝子ＨＣＮ４およびＨＣＮ１（図３Ｆ）の発現を著しく増加させたが、ＡＶＮ特異的遺伝子ＴＢＸ２およびＭＳＸ２の発現は増加させなかった。また、組み合わせたＲＡ／ＢＭＰ４のシグナル伝達は細胞の拍動数を著しく増加させた（図２Ｇ）。さらに、ＲＡ単独で、およびＢＭＰ４と組み合わせた処置は、ＴＢＸ５、ＳＨＯＸ２およびＩＳＬ１の発現を増加させた（図３Ｅ）が、ＭＹＬ２（心室マーカー）の発現を低下させた。
【０１３２】
もう一つの実施形態では、心血管中胚葉細胞はＢＭＰ４およびＲＡで処置される。さらに別の実施形態では、心血管中胚葉細胞は約２．５ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＭＰ４および約１５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＲＡで処置される。
【０１３３】
もう一つの実施形態では、心血管中胚葉細胞はＢＭＰ２およびＲＡで処置される。一部の実施形態では、心血管中胚葉細胞はＲＡ（例えば、ＢＭＰ成分の不在下で）で処置される。
【０１３４】
図１２に実証されるように、心血管中胚葉細胞をＦＧＦ阻害剤で処置することにより、ＳＡＮＬＣＭの割合が増加する。理論に縛られることを望むものではないが、抑制ＦＧＦシグナル伝達は、ＮＫＸ２−５ｐｏｓｃＴｎＴｐｏｓ心筋細胞集団を除去する。
【０１３５】
さらに、図１２Ａに示されるように、心血管中胚葉細胞をＦＧＦで処置することにより、ＳＡＮＬＣＭの割合が減少し、ＳＡＮＬＣＭを実質的に欠くＮＫＸ２−５ｐｏｓ心筋細胞培養が生成される。理論に縛られることを望むものではないが、ＦＧＦシグナル伝達は、ＮＫＸ２−５ｎｅｇｃＴＮＴｐｏｓ心筋細胞集団および任意のペースメーカー細胞を除去する。
【０１３６】
したがって、もう一つの実施形態では、心血管中胚葉細胞はＢＭＰ２、ＲＡおよびＦＧＦ阻害剤、随意にＰＤ１７３０７４で処置される。他の実施形態では、心血管中胚葉細胞はＢＭＰ２、ＲＡおよびＦＧＦ、随意にｂＦＧＦで処置される。
【０１３７】
一実施形態では、心血管中胚葉細胞は、少なくとも、それらが望ましいレベルのＭＥＳＰ１、ＰＤＧＦＲａｌｐｈａおよび／またはＫＤＲおよび／または望ましい割合の、ＭＥＳＰ１、ＰＤＧＦＲａｌｐｈａおよび／またはＫＤＲを発現する細胞を発現するまでインキュベートされる。
【０１３８】
ＭＥＳＰ１、ＫＤＲおよび／またはＰＤＧＦＲａｌｐｈａは、心血管中胚葉細胞の発生をモニターするために使用することができる。例えば、免疫に基づく方法を用いて、ＫＤＲの発現は、例えばＫＤＲに特異的な抗体を使用するＦＡＣＳによってモニターされることができる。ＰＤＧＦＲａｌｐｈａの発現は、ＰＤＧＦＲａｌｐｈａに特異的な抗体を使用するＦＡＣＳによってモニターされることができる。これらのマーカーは、フローサイトメトリーを用いてモニターされることができる。例えば、ＭＥＳＰ１、ＫＤＲおよびＰＤＧＦＲａｌｐｈａの発現は、モニターされることができ、かつ／またはこれらのマーカーを発現している細胞は、細胞選別、例えばＦＡＣＳまたはその他の免疫染色法を用いて単離することができる。
【０１３９】
もう一つの実施形態では、心血管前駆細胞および／または心筋細胞は、それらが望ましいレベルの心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）を発現するまでインキュベートされる。
【０１４０】
ｃＴＮＴは、心筋細胞の発生をモニターするために使用することができる。ｃＴＮＴの発現は、ｃＴｎＴに特異的な抗体、例えばｃＴＮＴの抗心臓アイソフォーム（クローン１３−１１；１：２０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）を用いてモニターするために使用することができる。ｃＴＮＴの発現は、フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳを用いてモニターすることができる。ｃＴＮＴの発現は、免疫染色によってもモニターすることができる。
【０１４１】
ＣＤ９０は、分化培地の非筋細胞集団を単離するために使用することのできる細胞表面間葉系マーカーである。一実施形態では、ＣＤ９０を使用して、非筋細胞を枯渇させ、かつ／または心筋細胞を単離することができる。
【０１４２】
もう一つの実施形態では、心筋細胞サブタイプＳＡＮＬＣＭおよびＶＬＣＭは、例えばＦＡＣＳによって、ＮＫＸ２−５、ＳＩＲＰＡおよびＣＤ９０発現に従って選別されることができる。例えば、図１Ｄおよび５Ｃに示されるように、心筋細胞集団は、分化２０日目のＮＫＸ２−５＋ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０−およびＮＫＸ２−５−ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０−集団について選別される。
【０１４３】
ＴＢＸ１８、ＳＨＯＸ２およびＴＢＸ３は、ＳＡＮ特異的マーカーである。一実施形態では、ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞は、ＢＭＰ成分およびＲＡで処置していない心血管中胚葉細胞と比較して増加したレベルのＴＢＸ１８、ＳＨＯＸ２および／またはＴＢＸ３を発現する。
【０１４４】
ＭＹＬ２およびＩＲＸ４は、心室心筋細胞特異的マーカーである。一実施形態では、ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞は、ＢＭＰ成分およびＲＡで処置していない心血管中胚葉細胞と比較して低下したレベルのＭＹＬ２およびＩＲＸ４を発現する。
【０１４５】
ＳＡＮＬＣＭが、ＶＬＣＭと比較して著しく速い自発活動電位速度を有することは本明細書において実証されている（図４Ａ〜Ｂ）。
【０１４６】
一実施形態では、ＳＡＮＬＣＭの最小または平均自発拍動数は、少なくとも５０拍動／分（ＢＰＭ）、少なくとも６０ＢＰＭ、少なくとも８０ＢＰＭ、少なくとも９０ＢＰＭ、少なくとも１００ＢＰＭ、少なくとも１１０ＢＰＭ、少なくとも１２０ＢＰＭ、少なくとも１４０ＢＰＭ、少なくとも１６０ＢＰＭ、少なくとも１８０ＢＰＭ、最大約２００ＢＰＭである。
【０１４７】
拍動数は、ＳＡＮＬＣＭのペースメーカーとしての機能性を評価するために測定されることができる。実施例１に記載されるように、ＳＡＮＬＣＭの機能性は、心室様心筋細胞（ＶＬＣＭ）を、随意にＦＡＣＳによって単離し、例えば多電極アレイの上に電気的に統合させた単層を形成することによって求めることができる。ＳＡＮＬＣＭの集合体をＶＬＣＭ単層に載せ、培養して電気的に統合させる。ＳＡＮＬＣＭ集合体が隣接する単層を通して電気活性を安定して開始し伝播することができ、結果として拍動回数を６３．１±２．５から１１２．５±１８．５ｂｐｍに増加させることが示される（表２）。
もう一つの態様には、ａ）ｈＰＳＣからＮＫＸ２−５レポーター構築物を含む心筋細胞集団を、随意に本明細書に記載される方法に従って作製すること、およびｂ）ＮＫＸ２−５陰性または陽性心筋細胞を選択することを含む、ＳＡＮＬＣＭまたはＶＬＣＭを心筋細胞集団から単離する方法が含まれる。
【０１４８】
一実施形態では、ＮＫＸ２−５レポーター構築物は、蛍光ＮＫＸ２−５レポーター構築物である。
【０１４９】
一実施形態では、蛍光レポーターは、ＧＦＰ（随意に増強されたＧＦＰ）レポーター遺伝子を含む。その他の蛍光タンパク質ならびに非蛍光マーカーを使用することができる。
【０１５０】
一実施形態では、本明細書に記載される方法の１または複数または全ての工程は、試験管内で実施される。
【０１５１】
さらなる態様には、本明細書に記載される方法に従って得た、少なくとももしくは約３０％のＳＡＮＬＣＭ、少なくとももしくは約５０％のＳＡＮＬＣＭ、少なくとももしくは約６０％のＳＡＮＬＣＭ、少なくとももしくは約７０％のＳＡＮＬＣＭ、少なくとももしくは約８０％のＳＡＮＬＣＭまたは少なくとももしくは約９０％のＳＡＮＬＣＭを含む、ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞の単離された集団が含まれる。
【０１５２】
さらなる態様には、本明細書に記載される方法に従って得た、少なくとももしくは約１５％のＶＬＣＭ、少なくとももしくは約２０％のＶＬＣＭ、少なくとももしくは約３０％のＶＬＣＭ、少なくとももしくは約５０％のＶＬＣＭ、少なくとももしくは約６０％のＶＬＣＭ、少なくとももしくは約７０％のＶＬＣＭ、少なくとももしくは約８０％のＶＬＣＭまたは少なくとももしくは約９０％のＶＬＣＭを含む、ＶＬＣＭに富む心筋細胞の単離された集団が含まれる。
【０１５３】
もう一つの態様には、本明細書に記載される方法に従って得た、ＮＫＸ２−５レポーター構築物を含むＳＡＮＬＣＭもしくはＶＬＣＭまたはＮＫＸ２−５レポーター構築物を含むＳＡＮＬＣＭの集団が含まれる。
【０１５４】
さらなる態様には、心筋細胞、例えばＳＡＮＬＣＭを実質的に欠く心筋細胞（ＶＬＣＭ）またはＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞の単離された集団の様々な使用が含まれる。使用には、例えば生体内ペースメイキングのための（ＳＡＮＬＣＭ）または心筋梗塞後の心筋再生（ｒｅｍｕｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）のための（ＶＬＣＭ）被験体での移植片、疾患のモデル化および候補薬物の試験が含まれる。その他の使用としては、ＳＡＮＬＣＭおよびＶＬＣＭへの潜在的な副作用についての薬物（心疾患を処置するために開発されていない）の安全性薬理試験の研究、ヒト幹細胞系を使用するＳＡＮペースメーカーまたはＶＬＣＭ細胞の開発、ならびにヒトＳＡＮペースメーカーおよびＶＬＣＭ生理学の研究（健康なヒト試料は容易に入手できないため）が挙げられる。
【０１５５】
したがって、さらなる態様は、
ａ．本明細書に記載される方法に従ってＳＡＮＬＣＭを生成する工程；
ｂ．ＳＡＮＬＣＭと候補試験薬物を接触させる工程；
ｃ．ＳＡＮＬＣＭの拍動数、活動電位特性および／またはイオン電流を測定する工程；
ｄ．ＳＡＮＬＣＭの拍動数、活動電位特性および／またはイオン電流を、候補試験薬物で処置していない対照ＳＡＮＬＣＭと比較する工程；および
ｅ．候補薬物として対照細胞と比較した拍動数および／または活動電位を調節する候補試験薬物を選択する工程
を含む、候補薬物を特定する方法である。
【０１５６】
一実施形態では、ＳＡＮＬＣＭは、ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団に含まれる。
【０１５７】
多様な当分野で公知の方法を使用して、細胞の活動電位を測定することができる。一実施形態では、細胞の活動電位は、低スループットパッチクランプを使用して測定される（図４Ａ〜Ｅに示される通り）。
【０１５８】
一実施形態では、細胞の電気シグナルは、多電極アレイ（ＭＥＡ）を使用して測定される（図４Ｆおよび図１０参照）。ＭＥＡシステムは、イオンチャネル／電流への薬物の効果を示すことのできる電場電位を記録する中スループットシステムである。
【０１５９】
ＳＡＮＬＣＭ集合体およびＶＬＣＭ単層を含む試験管内ペースメイキングアッセイを用いて、候補薬物がＶＬＣＭ単層を鼓動させるＳＡＮＬＣＭの能力を混乱させることができるかどうかを試験することができる。例えば、ＶＬＣＭ細胞をＭＥＡに載せ、電気的に統合された単層が形成されるまで培養する。その後、ＳＡＮＬＣＭの集合体をＶＬＣＭ単層に載せた後に、ＳＡＮＬＣＭ集合体およびＶＬＣＭ単層を電気的に統合させ、電場電位を記録する。
【０１６０】
一実施形態では、試験管内ペースメイキングアッセイは、安全性薬理学検査として使用される。
【０１６１】
一実施形態では、候補薬物は、洞不全症候群（ＳＳＳ）、徐脈、頻脈、加齢に起因する洞結節停止／遮断（主に洞結節線維症）または遺伝障害をはじめとする、ＳＡＮに影響を及ぼす疾患の処置のためのものである。
【０１６２】
記載されるＳＳＳを引き起こす遺伝障害としては、例えばＳＣＮ５ａ（遺伝子ＩＤ：６３３１）ナトリウムチャネル変異、ＨＣＮ４（遺伝子ＩＤ：１００２１）変異、Ｃｘ４０（遺伝子ＩＤ：２７０２）変異、Ｍｙｈ６（遺伝子ＩＤ：４６２４）変異およびアンキリン−Ｂ（遺伝子ＩＤ：２８７）変異が挙げられる。
【０１６３】
疾患のモデル化は、ペースメーカー細胞に影響を及ぼす疾患状態または障害を持つ被験体からＳＡＮＬＣＭを調製することによって達成することができる。
【０１６４】
したがって、一実施形態では、ｈＰＳＣは、ペースメーカー細胞またはＶＬＣＭ細胞に影響を及ぼしている疑いのある疾患、状態または障害を持つ被験体から調製された誘導ｈＰＳＣである。細胞は、薬物候補を試験するために、かつ／または分子、ゲノム、プロテオーム、生理的（活動電位、イオン電流を含む）またはその他の分析用に使用することができる。
【０１６５】
一実施形態では、この使用または方法は、生体内ペースメイキングのためのものである。実施例２に示されるように、ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞の単離された集団および／またはＳＡＮＬＣＭの実質的に純粋な集団は、ペースメーカー能力を与えるための生体内移植に使用することができる。
【０１６６】
一実施形態では、この使用または方法は、例えば心筋梗塞後の心筋再生のための心室細胞移植をはじめとする、ペースメーカー細胞を含まない細胞集団を必要とする処置のためのものである。
【０１６７】
細胞が生体内ペースメーカーとして機能する能力は、細胞集合体をラット心臓の尖部に移植することによって試験された。心拍は、最初にヒト心拍のものに類似するように薬理学的に低下させた。ＳＡＮＬＣＭ移植片を受けているラット心臓が、房室（ＡＶ）ブロックの導入後にかなり速い心室の異所性調律を提示したことは生体外で示された。
【０１６８】
例えばＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞またはＳＡＮＬＣＭは、カテーテルに基づく手法を用いて最小限の侵襲的な方法によって心臓に導入することができる。カテーテルは、腿、鎖骨下、頸静脈または腋窩静脈を経由して心内膜移植アプローチによって心室、心房またはＳＡＮ領域に挿入することができる。あるいは、細胞は、胸部に挿入されたニードルを使用して、心外膜アプローチによって心室、心房またはＳＡＮ領域に移植することができる。両方のアプローチにおいて、蛍光透視法（Ｘ線に基づく方法）または三次元マッピングを使用してカテーテル／ニードルを意図する注射部位に導くことができる。
【０１６９】
細胞がペースメーカーとして機能する能力は、生体外でも評価した。移植後１０日に、心臓を回収し、実施例２に示されるように、心電図記録および蛍光電圧イメージングを実施した。光学マッピングにより、ＳＡＮＬＣＭ移植部位から新しい異所性調律が開始されたことを確認した。
【０１７０】
したがって、さらなる態様には、ＳＡＮＬＣＭもしくはＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞集団、本明細書に記載される細胞または組成物、または生物学的ペースメーカー（例えば、３Ｄおよび／または内皮細胞、間葉系細胞および／または平滑筋細胞を含む３Ｄ、随意に３Ｄ組織を形成するために使用される細胞外マトリックス）を被験体に投与することを含む、処置を必要とする被験体を処置する方法が含まれる。
【０１７１】
同様に、ＳＡＮＬＣＭを含まないＮＫＸ２−５＋心筋細胞培養を、ペースメーカー細胞を含まない集団を必要とする（例えば、心筋梗塞後の心筋再生のための心室細胞移植のための）細胞治療アプローチで使用することができる。
【０１７２】
したがって、さらなる態様には、ＳＡＮＬＣＭを実質的に欠く心筋細胞集団、本明細書に記載される細胞または組成物に被験体に投与することを含む、処置を必要とする被験体を処置する方法が含まれる。
【０１７３】
本明細書に記載される処置を必要とする被験体を処置するための細胞集団の使用も想定される。
【０１７４】
被験体への、例えばＳＡＮＬＣＭに富む、またはＳＡＮＬＣＭからなる、またはＳＡＮＬＣＭを実質的に欠く心筋細胞をはじめとする心筋細胞集団の投与は、例えばＥＳＣ由来（ＨＬＡクラスが適合、必ずしも患者特異的でない）細胞の使用によるか、または例えばｉＰＳＣ由来（患者自身の細胞）ＳＡＮＬＣＭもしくはＶＬＣＭの使用によって行うことができる。細胞は、カテーテルを経由して（上記参照）、単一細胞または小さい集合体として左心室または右心室壁または心臓の尖部に注入することができる。
【０１７５】
その上、生体内での使用の前に、心筋細胞サブタイプを確認し、かつ／または望ましい量のＳＡＮＬＣＭまたはＶＬＣＭが入手されたことを確実にすることが可能である。
【０１７６】
上記のように、これは、細胞試料のアリコートを採取し、例えばウサギ抗ヒトＮＫＸ２−５などのＮＫＸ２−５に特異的な抗体を使用して、ＳＡＮマーカー（例えば、Ｓｈｏｘ２、Ｔｂｘ１８、Ｔｂｘ３、ＩＳＬ１）もしくはその他のマーカーまたはＮＫＸ２−５発現を含むそれらの不在についてその試料を試験することによって達成することができる。このプロトコールは、細胞の生体内使用の前のＳＡＮＬＣＭ分化の品質管理に適用することができる。
【０１７７】
例えば、少量の細胞アリコートを採取して、ＳＡＮＬＣＭの許容できる数または密度について試験することができる。
【０１７８】
さらなる態様は、例えばＳＡＮＬＣＭに富むかまたはそれを実質的に欠く心筋細胞の単離された集団、および／または単離されたＳＡＮＬＣＭまたはＶＬＣＭおよび製薬上許容される担体を含む組成物である。一実施形態では、単離された集団は、ＮＫＸ２−５  ＧＦＰレポーターなどのＮＫＸ２−５レポーターを含む細胞を含む。一実施形態では、単離された集団は、ＥＳＣ細胞株またはｉＰＳＣに由来するクローン集団である。
【０１７９】
その名前によって示されるように、ＳＡＮＬＣＭはＳＡＮ様のＣＭであり、ＶＬＣＭはＶ様のＣＭである。それらは胎児の発生段階を表すことがあり、そのため、成体ＳＡＮＣＭおよびＶＣＭとは１以上の違いがあることがある。ＳＡＮＬＣＭは、例えば、約６０〜１００ｂｐｍ拍動する成体ＳＡＮペースメーカー細胞よりも速く拍動する（例えば約１２０ｂｐｍ、または約１５０ｂｐｍ）。一実施形態では、本明細書に記載されるＶＬＣＭは、成体心室心筋細胞と比較して、低いレベルのＫｉｒ２．１イオンチャネル、高いレベルのＨＣＮ４、ＨＣＮ２を発現することがあり、かつ／または未熟なカルシウム処理特性を有することがある。
【０１８０】
なおさらなる態様は、ＳＡＮＬＣＭに富む心筋細胞の単離された集団および／または単離されたＳＡＮＬＣＭおよび製薬上許容される担体を含む生物学的ペースメーカーである。
【０１８１】
生物学的ペースメーカーを設計する際に、三次元（３Ｄ）組織を使用して、移植細胞の血管新生および潜在的な神経支配を確実にすることができる。
【０１８２】
一実施形態では、生物学的ペースメーカーは、内皮細胞、間葉系細胞および／または平滑筋細胞および随意に三次元組織を形成するために使用される細胞外マトリックスをさらに含む。
【０１８３】
例えば、Ｔｏｌｌｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．３３は、ヒト胚幹細胞およびヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞を使用し、内皮および間質細胞との自己組織化共培養中で、コラーゲンに基づく、生物工学によって作製されたヒト三次元心臓組織構築物を開発した。
【０１８４】
一実施形態では、本明細書において開示される、心室特異的マーカー（例えば、ＭＹＬ２およびＩＲＸ４）およびＳＡＮ特異的マーカー（例えば、ＴＢＸ１８、ＴＢＸ３、ＳＨＯＸ２およびＩＳＬ１）などのマーカーは、表３のプライマー配列のいずれか一つを使用して検出することができる。
【０１８５】
本明細書中で言及されるように、ＶＬＣＭ集団は、ＦＧＦシグナル伝達を活性化させて、ＮＫＸ２−５ｐｏｓ心筋細胞の培養物を生成することによって作製することができる。一部の方法では、ＶＬＣＭを作製および／または単離するための方法は、レポーター構築物を使用することを含む。例えば、一実施形態は、ａ）本明細書に記載されるようにＮＫＸ２−５レポーター構築物を含むＰＳＣから心筋細胞集団を作製すること、およびｂ）ＮＫＸ２−５陽性心筋細胞を選択することおよび／またはＮＫＸ２−５陰性心筋細胞を除去することを含む、心室様心筋細胞を心筋細胞集団から単離する方法を提供する。
【０１８６】
ＶＬＣＭ細胞を作製する方法は公知であり、例えば参照により本明細書に組み込まれる、ｔｈｅ  Ｗｉｔｔｙ  Ａ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３００２（２０１４）に記載されている。Ｗｉｔｔｙ  ｅｔ  ａｌに記載される方法は、例えば心臓誘導段階の間にＦＧＦ成分を添加することによって強化することができる。
【０１８７】
本明細書において、ＮＸＫ２−５レポーター発現に従って心筋細胞集団からＶＬＣＭ細胞を単離および／または除去することができることが実証される。
【０１８８】
例えば、レポータータンパク質発現について陽性であるＮＫＸ２−５レポーター構築物を含む細胞は本明細書に記載される方法に従って生成される心筋細胞集団から単離するかまたは枯渇させることができる。
【０１８９】
さらなる態様には、ＶＬＣＭに富む心筋細胞の単離された集団および／または被験体での生体内移植のためのＮＫＸ２−５発現細胞の枯渇したＶＬＣＭの集団の使用が含まれる。
【０１９０】
ＶＬＣＭがペースメーカー能力を低下させたことが本明細書において実証される（図１１Ａ）。ＳＡＮＬＣＭの枯渇したｈＰＳＣから調製したＶＬＣＭには、いくらかの利益があり得る。例えば、ＳＡＮＬＣＭを枯渇させることにより、ＶＬＭＣの移植（例えば心筋梗塞後の心筋再生のための心室細胞移植）による不整脈を低下させることができた。
【０１９１】
上記の開示は、大体において本願を説明する。より完全な理解は、以下の具体例を参照することによって得ることができる。これらの例は説明の目的のためだけに記載されるものであり、本願の範囲を制限することを意図するものではない。形態の変更および等価物の置換は、好都合であると状況が示唆するかまたは表すことができると考えられる。特定の用語が本明細書に用いられているが、そのような用語は説明的な意味で意図され、限定のためのものではない。
【０１９２】
以下の限定されない例は、本開示を説明する：
【実施例】
【０１９３】
[実施例１]
方法
ｈＰＳＣの維持および分化
ヒト多能性幹細胞株（Ｈｅｓ３  ＮＫＸ２−５：ＧＦＰ）１０Ｈ７（ＮＩＨ登録番号００６１３２により承認されたＨＥＳＣ株）およびＭＳＣ−ｉＰＳ１１１を、記載されるように培養した１２。心臓系列への分化のため、確立されたプロトコール６を、次の変更を行って用いた（図１Ａ）。８０％コンフルエントのｈＰＳＣ培養物を、単一細胞に分離させ、１ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４および１０μＭ  ＲＯＣＫ阻害剤を含有するＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地に懸濁し、１８時間オービタルシェーカーでインキュベートして、胚様体（ＥＢ）を生成した。翌日（分化の１日目）、ＥＢを中胚葉誘導培地：１０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、６ｎｇ／ｍｌ  アクチビンＡ、５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを含有するＳｔｅｍＰｒｏ−３４に移した。分化の３日目に、ＥＢを、ＩＭＤＭを用いて１回洗浄し、心臓誘導培地：０．５μＭ  ＩＷＰ２、１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、および随意に５．４μＭ  ＳＢ−４３１５４２（ＳＢ、アクチビン／ノーダル／ＴＧＦβ阻害剤）を含有するＳｔｅｍＰｒｏ−３４に懸濁した。分化の５日目に、ＥＢを、基礎培地：５ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦを含有するＳｔｅｍＰｒｏに切り替えた。培地は、分化の１２日目までＶＥＧＦを添加し、４日毎に変えた。別途示されない場合、全てのサイトカインはＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓより購入した。ＥＢは、１２日目まで５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２の低酸素条件下で、そして培養期間の残りを５％ＣＯ２の、通常の空気条件下で培養した。
【０１９４】
ペースメーカー（ＳＡＮＬＣＭ）最適化プロトコール
ＥＢを、中胚葉段階（分化３日目）に、各細胞への効率的なサイトカイン供給を確保するようにＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を合理的に使用して単一細胞に分離させた。再集合してＥＢとなるように、細胞を示されたサイトカインおよび５μＭ  ＲＯＣＫ阻害剤とともに、９６ウェル低クラスタープレートに８０，０００細胞／ウェルで入れた（図２Ａ）。分化の５日目にＥＢを２４ウェル低クラスタープレートに移し、上記のように基礎培地中で培養し続けた。
【０１９５】
ＳＡＮＬＣＭペースメーカーの効率的な特定化のために、中胚葉を分化１日目に３Ｂ／２Ａ条件（３ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、２ｎｇ／ｍｌ  ＡＣＴＡ）で誘導した。３日目にＥＢを上記のように分離し、基準心臓誘導培地に加えて２．５ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４および０．５μＭ  ＲＡで処置した。
【０１９６】
ＮＫＸ２−５＋心筋細胞を含まないＳＡＮＬＣＭ培養の生成のために、中胚葉を分化１日目に３Ｂ／２Ａ条件（３ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、２ｎｇ／ｍｌ  ＡＣＴＡ）で誘導した。このプロトコールのために、ＥＢを無傷のまま保持し、３日目に２．５ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、０．５μＭ  ＲＡおよび９６０ｎＭ  ＦＧＦ阻害剤（ＰＤ１７３０７４、Ｔｏｃｒｉｓ）で基準心臓誘導培地に加えて３日目または４日目に処置した。
【０１９７】
フローサイトメトリーおよび細胞選別
３日目〜１２日目にＥＢを分離するために、ＴｒｙｐＬＥを使用した。１２〜３０日目に、ＴｙｐＬＥ分離の前にＥＢを１ｍｇ／ｍｌ  ２型コラーゲン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を含有するＨＡＮＫ緩衝液中で穏やかに振盪しながら室温で一晩インキュベートした。細胞を、抗ＰＤＧＦＲａ−ＰＥ（１：２０）抗ＫＤＲ−ＡＰＣ（１：１０）、（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＳＩＲＰＡ−ＰｅＣｙ（クローンＳＥ５Ａ５、１：１０００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ９０−ＡＰＣ（ＢＤ）、ｃＴｎＴの抗心臓アイソフォーム（クローン１３−１１；１：２０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）、ウサギ抗ヒトＮＫＸ２−５（１：８００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡＰＣ（１：２５０、ＢＤ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＰＥ（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、ロバ抗ウサギＩｇＧ  Ａ６４７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で５×１０６細胞／ｍｌの濃度で染色した。細胞表面マーカーには、５％ＦＣＳを含有するＰＢＳ中で染色を行った。細胞内染色には、細胞を、４％ＰＦＡを用いて４℃で１０分間固定し、５％ＦＣＳおよび０．５％サポニン（ｃＴＮＴ）または０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ（ＮＫＸ２−５）を含有するＰＢＳ中で染色した。ＬＳＲ  ＩＩ  フローサイトメーター（ＢＤ）を用いて染色した細胞を分析した。細胞選別には、細胞を、５％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ中で保持し、ＭｏＦｌｏ（ＢＤ）およびＩｎｆｌｕｘ（ＢＤ）ソーターを用いて１０６細胞／ｍｌの濃度で選別した。その後のＲＮＡ単離のためにＰＦＡ固定細胞を選別するには、染色緩衝液および細胞収集のためのＰＢＳに５ｍＭ  ＤＴＴおよび１００Ｕ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。全ての緩衝液成分は、ＲＮＡｓｅフリーであって、試料は厳密に氷上で保持され、ＰＦＡ固定から３時間以内に選別された。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いて分析した。
【０１９８】
免疫細胞化学
細胞は、４％ＰＦＡで１０分間４℃で固定し、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、２００ｍＭグリセリンを使用して室温で２０分間透過処理した。試料を、ブロッキング緩衝液（ＢＢ）：１０％ロバ血清、２％ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ中で室温で３０分間ブロッキングした。以下の一次抗体を、ＢＢ中で一晩４℃でインキュベートした：ｃＴｎＴの抗心臓アイソフォーム（クローン１３−１１；１：１００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）、ウサギ抗ヒトＭＬＣ２ｖ（１：１００）、ウサギ抗ヒトＳＨＯＸ２（１：２００）、（Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗ヒトＴＢＸ３（１：１００）、ヤギ抗ヒトＴｂｘ１８（１：５０）、（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）。それぞれの二次抗体を、３０分間室温でインキュベートした：ロバ抗マウスＩｇＧ  Ａ６４７（１：４００）、ロバ抗ウサギＩｇＧ  Ａ４６７（１：４００）、（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｃｙ３（１：４００）、ロバ抗ウサギＩｇＧ  Ｃｙ３（１：８００）、ロバ抗ヤギＩｇＧ  Ｃｙ３（１：８００）、（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）。ＤＡＰＩを使用して細胞核を対比染色し、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄａｋｏ）を用いてスライドを取り付けた。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  １０００レーザー走査型共焦点顕微鏡およびＦＶ１０−ＡＳＷソフトウェアをイメージングに使用した。
【０１９９】
ＤＡＰＩおよびＴＢＸ１８陽性細胞核の定量化には、ＩＭＡＧＥ  Ｊソフトウェア・プラグインＩＣＴＮを使用した。各条件に対して、３回の独立した実験の３枚の無作為に撮影された画像（図３Ｆ）を分析した。
【０２００】
定量的リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡは、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）とそれに続くＤＮａｓｅ消化ステップ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて単離した。ＰＦＡで固定した細胞からのＲＮＡの単離には、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用した。５００ｎｇ〜１μｇのＲＮＡを、ランダムヘキサマーおよびＯｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ＱＰＣＲｓは、ＱｕｎｔｉＦａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従って使用して、ＥＰ  ＲｅａｌＰｌｅｘ  ＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で実施した。２５ｎｇ／μｌから２．５ｐｇ／μｌに及ぶヒトゲノムＤＮＡ標準物質の１０倍希釈系列を使用してＰＣＲの効率を評価し、以前に記載されたようにハウスキーピング遺伝子ＴＢＰと比較して各遺伝子のコピー数を計算した１３。プライマー配列は表３に記載される。ヒト胎児心臓組織妊娠段階１７をＮｏｖｏｇｅｎｉｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより購入した。心室、洞房結節および房室結節組織を切開した後、ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ法（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単離し、ＤＮアーゼ（Ａｍｂｉｏｎ）で処置した。
【０２０１】
パッチクランプ
活動電位および膜電流は、Ａｘｏｐａｔｃｈ増幅器を使用して、基準電流および電圧クランプ技術によって測定された。データ獲得および分析には、ｐＣＬＡＭＰソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用した。ホウケイ酸ガラス微小電極は、ピペット溶液で満たされると２〜５ＭΩの先端抵抗を有した。直列抵抗および細胞キャパシタンスは７０％まで補償された。自発的活動電位、ファニー電流（Ｉｆ）および内向き整流性カリウム電流電流（ＩＫｒ）は、穿孔パッチ法（ナイスタチン）１４を次の浴溶液：ＮａＣｌ  １２４、ＫＣｌ  ５．４、ＣａＣｌ２  １．２、ＭｇＣｌ２  １、およびグルコース  ５、Ｈｅｐｅｓ  １０（ｐＨ７．４、ＮａＯＨで調節）（単位ｍＭ）とともに使用して３７℃で記録された。ピペット溶液は、ＮａＣｌ  ５、ＫＣｌ  １０、グルコン酸カリウム  １３０、ＭｇＣｌ２  １、およびＨｅｐｅｓ  １０（ｐＨ７．４、ＫＯＨで調節）（単位ｍＭ）から成っていた。ナトリウム電流（ＩＮａ）は、より良好な電圧制御のために電流振幅を低下させるために、低Ｎａ＋を含有するカルシウムフリーの浴溶液中で全細胞破裂パッチ法を使用して２５℃で記録された：ＮａＣｌ  ３０、ＴＥＡ−Ｃｌ  １１５、ＣａＣｌ２  ０．０１、ＭｇＣｌ２  １、およびグルコース  ５、Ｈｅｐｅｓ  １０（ｐＨ７．４、ＮａＯＨで調節）（単位ｍＭ）。ピペット溶液は：Ｃｓ−アスパラギン酸塩  １１２、ＣｓＣｌ  ２０、ＭｇＣｌ２  １、Ｍｇ−ＡＴＰ  ５、Ｃｓ−ＥＧＴＡ  １０、Ｈｅｐｅｓ  １０（ｐＨ７．４、ＣｓＯＨで調節）（単位ｍＭ）から成った。個々の電流を誘発するための電圧プロトコールは、それぞれの図に示される。
【０２０２】
多電極アレイ実験
試験管内ペーシング実験のために、１×１０６ＶＬＣＭをマトリゲルでコーティングされた多電極アレイ（ＭＥＡ）に播種し、５〜７日間培養して、電気的に統合された単層を形成した。テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）で標識したＳＡＮＬＣＭまたはＶＬＣＭ（対照）集合体（３×１０４細胞）を、これらの確立したＶＬＣＭ単層上の特定の場所に置いた。電気シグナル（電場電位）を、Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ増幅器、加熱装置およびＣａｒｄｉｏ−２Ｄソフトウェアを用いて３７℃の基礎培地中で記録した。電気シグナル伝播のグレースケールマップを、Ｃａｒｄｉｏ−２Ｄ＋ソフトウェア（Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して生成した。
【０２０３】
統計
データは、平均値±標準誤差として提示した。統計分析は、スチューデントＴ検定を用いて実施した。結果は、ｐ＜０．０５（＊／＃）で有意であるとみなされ、ｐ＜０．０１（＊＊／＃＃）で非常に有意であるとみなされた。
【０２０４】
結果
ｈＥＳＣ由来の心血管細胞を生成するために、Ｔ（ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ）を発現する原条様集団の形成（２〜３日目）とその後のＭＥＳＰ１およびＰＤＧＦＲα／ＫＤＲの発現を特徴とする心臓中胚葉の誘導（３〜４日目）を含む、発達的に段階分けしたプロトコール６、１５を使用した。このＰＤＧＦＲα＋ＫＤＲ＋中胚葉は、６０〜９０％のｃＴｎＴ＋心筋細胞を生じさせる（２０日目）（図１Ａおよび図５Ａ、Ｂ）。このプロトコールによって、ＴＢＸ１８、ＳＨＯＸ２およびＴＢＸ３を含む洞房結節（ＳＡＮ）の発生に関与する転写因子の発現１６が分化の３〜８日の間にアップレギュレートされ、ペースメーカー細胞がこれらの条件下で特定化されていることが示唆される（図１Ｂ）。マウスおよびヒトの両方の研究は、ＳＡＮ細胞が全心筋細胞転写因子ＮＫＸ２−５を発現しない前駆細胞に由来することを示すので１７−１９、ＮＫＸ２−５の発現に基づいてｈＰＳＣ由来のペースメーカー細胞をその他の心筋細胞から識別することが可能であると仮定された。これを試験するために、ＨＥＳ３  ＮＫＸ２−５：ＧＦＰレポーター株１０を全心筋細胞表面マーカーＳＩＲＰＡと組み合わせて使用して、ＮＫＸ２−５＋／ＮＫＸ２−５−心筋細胞の存在について培養物をモニターした１３。最初のＮＫＸ２−５：ＧＦＰ＋ＳＩＲＰＡ＋細胞は、分化の６日以内に生成され、集団のサイズは増加して１６日目までに培養の６０±３％となった（図１Ｃ）。また、明確なＮＫＸ２−５：ＧＦＰ−ＳＩＲＰＡ＋集団が１６日目までに検出された。これらの細胞の心筋細胞である性質は、ｃＴｎＴ染色によって確認し、それにより大きい（６３±８％）ＮＫＸ２−５：ＧＦＰ＋ｃＴｎＴ＋集団および小さい（６±２％）ＮＫＸ２−５：ＧＦＰ−ｃＴＮＴ＋集団が明らかになった。
【０２０５】
ＮＫＸ２−５：ＧＦＰ−心筋細胞が、ＳＡＮペースメーカー細胞を表すかどうかを判定するため、ＮＫＸ２−５：ＧＦＰ＋ＳＩＲＰＡ＋（ＮＫＸ２−５＋）およびＮＫＸ２−５：ＧＦＰ−ＳＩＲＰＡ＋（ＮＫＸ２−５−）部分を２０日目の集団から単離した。間葉系マーカーＣＤ９０を含めて、ＮＫＸ２−５：ＧＦＰ−部分から非筋細胞を枯渇させた（図１Ｄおよび図５Ｃ）。ペースメーカー表現型に一致して、ＮＫＸ２−５−集団に由来する集合体は、ＮＫＸ２−５＋集合体（４０±３ｂｐｍ）よりも著しく速い拍動数（８３±４ｂｐｍ）を有した（図１Ｅ）。
【０２０６】
分子分析により、ＮＫＸ２−５＋およびＮＫＸ２−５−集団が、匹敵する心筋細胞含有量を示す同様のレベルのｃＴｎＴ発現したことが明らかになった（図１Ｆ）。ＮＫＸ２−５−細胞は、ＮＫＸ２−５＋細胞よりも著しく少ないＮＫＸ２−５を発現し、選別戦略と一致した。心室マーカーＭＹＬ２およびＩＲＸ４は、ＮＫＸ２−５−細胞よりもＮＫＸ２−５＋細胞において高いレベルで発現し、ＮＫＸ２−５＋集団が心室様心筋細胞を含むことが示される。ＴＢＸ１８、ＴＢＸ３、ＳＨＯＸ２およびＩＳＬ１をはじめとする、ペースメーカー特異的転写因子をコードする遺伝子は、反対のパターンを示し、ＮＫＸ２−５−細胞において著しく高いレベルで発現した（図１Ｇ）。含められた胎児心臓組織により、マウス心臓で確立されたＳＡＮマーカーＴＢＸ１８、ＳＨＯＸ２およびＩＳＬ１１６も、心室組織（Ｆ−Ｖ）および二次ペースメーカー房室結節組織（Ｆ−ＡＶＮ）と比較してヒトＳＡＮ組織（Ｆ−ＳＡＮ）において高いレベルで発現したことが確認された。したがって、ＴＢＸ２およびＭＳＸ２を含むＡＶＮペースメーカーを規定するマーカー２０、２１は、ＡＶＮ組織において最大レベルで発現した（図１Ｈ）。これらのＡＶＮ特異的遺伝子の発現はｈＥＳＣ由来のＮＫＸ２−５−集団においてアップレギュレートされなかった、このことは、それがＡＶＮ細胞を含まないことを示す。ペースメーカーイオンチャネル遺伝子、ＨＣＮ４、ＨＣＮ１およびＫＣＮＪ３は、ＮＫＸ２−５＋細胞と比較してＮＫＸ２−５−細胞において高いレベルで発現したが（図１Ｉ）、一方、ナトリウムチャネルＳＣＮ５ａは反対のパターンを示した。これらの発現プロフィールは、ｃＴｎＴおよびＮＫＸ２−５発現に基づく細胞内ＦＡＣＳによって（ＮＫＸ２−５＋／ｃＴｎＴ＋およびＮＫＸ２−５−／ｃＴｎＴ＋）２０日目に単離された集団で確認された（図５Ｄ〜Ｈ）。
【０２０７】
免疫染色は、分子研究から得た知見を確認し、ＮＫＸ２−５−でなくＮＫＸ２−５＋筋細胞が心室タンパク質ＭＬＣ２ＶならびにＮＫＸ２−５を発現することを示した（図１Ｊ）。ＳＨＯＸ２およびＴＢＸ３は、逆のパターンを示し、ＮＫＸ２−５−細胞においてはるかに高いレベルで検出された。（図１Ｋおよび図６Ａ）。培養中で最大３０日間維持されると、ほんの小さい割合（５±１％）のＮＫＸ２−５−部分がＮＫＸ２−５：ＧＦＰ発現をアップレギュレートし、これらの細胞の大部分がＮＫＸ２−５発現を開始していない未熟な前駆細胞よりもむしろ心筋細胞の別個の部分母集団を表すことを示す（図６Ｂ、Ｃ）。
【０２０８】
既存のプロトコールはＳＡＮＬＣＭの発生を促進したが、これらの細胞を生成する効率は低かった（５〜９％）。そのため、ＳＡＮ系列の発生をより良く理解するためにｈＥＳＣ−分化モデルを使用した。このために、シグナル伝達経路を操作する効果を２つの別個の段階：中胚葉誘導段階（１〜３日目）および心血管特定化（３〜５日目）で調査した。中胚葉誘導ステップに関して、ＢＭＰ４およびＡＣＴＡの濃度はこれらのシグナル伝達経路が心血管中胚葉の発生を調節すると変動した６。効率的な心筋細胞の分化（７０〜７５％）は、これらの経路アゴニストの３つの異なる組合せによって達成された；基準濃度、１０Ｂ／６Ａ（１０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、６ｎｇ／ｍｌ  ＡＣＴＡ）ならびに５Ｂ／４Ａ（５ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、４ｎｇ／ｍｌ  ＡＣＴＡ）および３Ｂ／２Ａ（３ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、２ｎｇ／ｍｌ  ＡＣＴＡ）を含む低い濃度。（図７Ａ）。これらの組合せのどれもが、ＳＡＮＬＣＭの割合の増加をもたらさなかった（１０Ｂ／６Ａで７±３％に対し、５Ｂ／４Ａで８±３％、そして３Ｂ／２Ａで８±２％）。
【０２０９】
心外膜系列である、ＳＡＮペースメーカーを含む共通する前駆細胞から発生する細胞型が、ＢＭＰ４シグナル伝達によって心血管中胚葉から特定されるとすると２２、ＢＭＰ４経路を操作することが３つの異なる中胚葉からのＳＡＮＬＣＭの発生に影響を及ぼすかどうかが次に試験された（図２Ａ）。以前に報告されたように２２、分化の３〜５日目の間のＢＭＰシグナル伝達のブロッキング（ドルソモルフィン）または高レベルのＢＭＰ４（１０〜２０ｎｇ／ｍｌ）への曝露は、心筋細胞全体の大幅な減少をもたらした（図２Ｂ〜Ｄおよび図７Ｂ）。重要なことに、低レベルのＢＭＰ４（１．２５〜５ｎｇ／ｍｌ）は、３５±１％までのＳＡＮＬＣＭの割合の顕著な増加をもたらした。これらの条件下で、ＮＫＸ−２−５：ＧＦＰ−ＳＡＮＬＣＭは、ｃＴｎＴ／ＳＩＲＰＡ発現に基づいて別個の集団として容易に分離することができた（図２Ｅ）。この効果は３Ｂ／２Ａで誘導された中胚葉で最大であった（３５±１％、それに対して１０Ｂ／６Ａで１５±２％、それに対して５Ｂ／４Ａで２１±１％）、そのことはＳＡＮＬＣＭが、低濃度のＢＭＰ４およびＡＣＴＡに誘導される中胚葉の別個の部分母集団に由来することを示す。ＳＡＮＬＣＭの割合の増加は、分化の３〜４日目の間にＢＭＰ４を添加した場合に最も顕著であった（図２Ｆ）。ＢＭＰ４を長期間にわたって添加してもＳＡＮＬＣＭの割合を増加させなかったが、早期の（２〜３、２〜４日目）または後期の（４〜５、４〜６日目）経路の活性化はＳＡＮＬＣＭの頻度の低下をもたらした。これらの知見は、ｈＰＳＣ分化における系列特定化の動的性質および適切な発生段階でのシグナル伝達経路の操作の重要性を強調する。
【０２１０】
ＳＡＮがＴＢＸ１８＋前駆細胞に由来すると考えて、ＢＭＰ４に誘導されるＳＡＮＬＣＭの特定化の間のＴＢＸ１８の発現をモニターした。最初の分析と一致して（図１Ｂ）、ＴＢＸ１８発現は分化の４〜６日目の間にアップレギュレートされ、ＢＭＰ４による処置は、ＴＢＸ１８を著しくアップレギュレートした（図２Ｇ）。免疫染色は、発現研究を確認し、ＢＭＰ４に誘導された集団が対照集団よりもかなり多くのＴＢＸ１８＋細胞を含んでいたことを示した（図２Ｈ、Ｉ）。特に、６日目のＴＢＸ１８＋細胞の数（３８±２％）は、２０日目のＳＡＮＬＣＭの数（３５±１％）と相関した、この知見はＳＡＮＬＣＭがＴＢＸ１８＋前駆細胞に由来するという解釈を支持する。
【０２１１】
レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達は、心臓管の後方の領域に位置する前駆細胞に由来する心房心筋細胞の形成に中心的役割を果たすことが公知である２３、２４。ＳＡＮも後心臓管から発生するので、次に問題となるのはＲＡシグナル伝達がＳＡＮＬＣＭの発生に影響を及ぼすかどうかである。ＲＡ（５００ｎＭ、例えば約１５０ｎｇ／ｍＬ）を２日目に添加すると、心筋細胞の生成が遮断された（図３Ａ）。後に添加した場合（３〜１２日目）、ＲＡは全心筋細胞の生成およびＳＡＮＬＣＭの頻度に影響を及ぼさなかった。ＲＡはＳＡＮＬＣＭ発生の効率に影響を及ぼさなかったが、単離したＮＫＸ２−５−ＳＩＲＰＡ＋部分のｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＲＡを３〜５日の間に培養に添加した場合、後方の心筋細胞マーカーＴＢＸ５およびＳＡＮマーカーＳＨＯＸ２の大幅なアップレギュレーションが明らかとなった（図３Ｂ）。
【０２１２】
重要なことに、ＲＡの添加（３日目）は、ＳＡＮＬＣＭの特定化のＢＭＰ４に誘導される増加に影響を及ぼさず（図３ｃおよび図８Ａ）、ＴＢＸ１８発現のレベルも変えなかった（図３Ｄ）。ＲＡ単独で、およびＢＭＰ４と組み合わせた処置は、ＴＢＸ５、ＳＨＯＸ２およびＩＳＬ１の発現を増加させ、ＭＹＬ２の発現をさらに低下させた（図３Ｅ）。組み合わせたＲＡ／ＢＭＰ４のシグナル伝達は、ペースメーカーイオンチャネル遺伝子ＨＣＮ４およびＨＣＮ１の発現を著しく増加させたが、ＡＶＮ遺伝子ＴＢＸ２およびＭＳＸ２の発現は増加させなかった（図３Ｆ）。改良されたＲＡ／ＢＭＰに誘導されるペースメーカー発現プロフィールは、細胞の拍動数の大幅な増加に関係していた（１３８±７ｂｐｍ）（図３Ｇ）。これらの拍動数は、１２０〜１６０ｂｐｍのヒト胎児心拍の範囲内である２５。
【０２１３】
総合すると、これらの知見は、ＴＢＸ１８＋前駆細胞を介するＢＭＰシグナル伝達によって適切に誘導された中胚葉集団（３Ｂ／２Ａ）からＳＡＮ系列が特定されるモデルを支持する。対照的にＲＡシグナル伝達はＳＡＮ系列特定化の効率に影響を及ぼさず、むしろＳＡＮ前駆細胞においてペースメーカー表現型を強化する（図３Ｈ）。この戦略を用いてＳＡＮＬＣＭをＨ７  ｈＥＳＣ株およびＭＳＣ−ｉＰＳ１  ｈｉＰＳＣ株から生成することができた（図８Ｂ〜Ｇ）。
【０２１４】
電気生理学的分析により、ＳＡＮＬＣＭが、ＶＬＣＭと比較して著しく速い自発活動電位速度を有することが明らかになった（図４Ａ、Ｂ）。９０パーセントのＳＡＮＬＣＭが、遅い最大立ち上がり速度（＜３０Ｖ／ｓ）、小さい活動電位振幅および短い活動電位持続時間をはじめとする典型的なペースメーカー特性をもつ活動電位を示した（図４Ｃ、表１）。その上、ＳＡＮＬＣＭは、ＶＬＣＭよりも著しく多いペースメーカーファニー電流（Ｉｆ）および少ないナトリウム電流（ＩＮａ）を含んでいた（図４Ｄ、Ｅおよび図９Ａ〜Ｄ）。その上、より少ない内向き整流性カリウム電流（ＩＫ１）がＳＡＮＬＣＭにおいて観察され、ペースメーカー細胞の過分極拡張期膜電位と一致した（図９Ｅ、Ｆ）。
【０２１５】
ＳＡＮＬＣＭがペースメーカーとして機能することができたかどうかを判定するため、ＶＬＣＭの拍動数を制御するそれらの能力を試験した。これらの分析のため、ＶＬＣＭをＦＡＣＳによって単離し、多電極アレイ（ＭＥＡ）に播種して電気的に統合された単層を形成した。テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）で標識したＳＡＮＬＣＭまたはＶＬＣＭ（対照）の集合体を、これらの確立したＶＬＣＭ単層上の特定の場所に置いた。組み合わせた集合体／単層の集団を１週間培養して、電気的に統合させた（図４Ｆ）。電気シグナル伝播の分析により、集合体の不在下で、単層における電気活性の開始部位はランダムに変化したことが示された（図４Ｇ〜Ｉ、図１０Ａ〜Ｃ）。対照的に、電気活性はＳＡＮＬＣＭ集合体によって安定して開始され（電極６５）、隣接する単層を通して伝播した（図４Ｊ〜Ｌ）。このペーシング活性の結果として、単層の拍動頻度は、６３．１±２．５から１１２．５±１８．５ｂｐｍまで増加した（表２）。実験の７５パーセントにおいて、ＳＡＮＬＣＭは、１４日の実験期間の間ＶＬＣＭ単層を鼓動させることができた。ＶＬＣＭの集合体は、電気活性の開始がこれらの培養においてランダムなままであったので、このペーシング能力を示さなかった（図１０Ｄ〜Ｆ）。
【０２１６】
胚心臓発生の間、神経外胚葉によって分泌されるＦＧＦシグナル伝達は、ＮＫＸ２−５＋心臓前駆細胞の特定化に関与する２６。本発明者らは、ＦＧＦシグナル伝達を抑制することが、ＮＫＸ２−５−ＳＡＮＬＣＭの生成を好むＮＫＸ２−５＋前駆細胞の発生を抑制することができたと推論した。そのため本発明者らはＦＧＦ受容体阻害剤ＰＤ１７３０７４（Ｔｏｃｒｉｓ）を本発明者らのペースメーカー分化条件（ＢＭＰ＋ＲＡ）に適用し、４〜６日目からのＦＧＦシグナル伝達の抑制が、２０日培養物において３３±１％〜４８±３％のＮＫＸ２−５−ｃＴＮＴ＋ＳＡＮＬＣＭの増加をもたらすことを見出した。対照的に、ｂＦＧＦを用いるＦＧＦシグナル伝達の活性化は、ＳＡＮＬＣＭ集団を減少させた（１２±１％）。重要なことに、ＦＧＦ阻害剤を２４０〜９６０ｎＭの範囲の濃度で適用すると、ＮＫＸ２−５＋心筋細胞の発生が遮断された（５±１％、それに対して、例えばＦＧＦを培地に添加しない、内因性（ｅ）ｂＦＧＦレベルでは３５±５％）。ＮＫＸ２−５＋心筋細胞の発生の遮断は、ＦＧＦ阻害剤を３〜４日目の間に適用した場合に最も効率的であったが、５日目以降に適用した場合には効果がなかった。このことは、ＮＫＸ２−５＋前駆細胞がおよそ３〜４日目に特定化されることを示唆し、それは分化の６日目のＮＫ２−５：ＧＦＰ＋細胞の最初の検出に相関する。（図１２Ａ〜Ｄ）。
【０２１７】
ＦＧＦ阻害剤で処置した培養は少数のＮＫＸ２−５＋心筋細胞しか含まないので、ＳＩＲＰＡ＋およびＣＤ９０−心筋細胞について選択することにより、比較的純粋なＳＡＮＬＣＭの集団を単離することができる（ＮＫＸ２−５−ｃＴｎＴ＋ＳＡＮＬＣＭの選別後純度７６％）（図１２Ｅ）。この手法を用いて、ＮＫＸ２−５：ＧＦＰ導入遺伝子発現と関係なく任意のヒト多能性幹細胞株からＳＡＮＬＣＭの高度に濃縮された集団を得ることが可能である。原理の証明として、本発明者らは本発明者らのプロトコールをＨＥＳ−２胚幹細胞株に適用した。本発明者らは、ＦＧＦ阻害剤の存在下で２．５ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰおよび０．５μＭ  ＲＡを使用して心臓中胚葉を特定した。培養物をＳＡＮＬＣＭの割合について分析するために、２０日目にＮＫＸ２−５タンパク質およびｃＴｎＴについての細胞内染色とその後のフローサイトメトリー分析を適用した。ＨＥＳ２株に関して、３〜５日目からの２４０ｎＭ  ＦＧＦｉによる処置は、最良の結果を得、最大３６％のＮＫＸ２−５−ｃＴＮＴ＋ＳＡＮＬＣＭとほんの少しの割合のＮＫＸ２−５＋筋細胞（５％、それに対して内因性ｂＦＧＦレベルの４３％）を含む培養を生成した（図１２Ｆ）。
【０２１８】
ヒトペースメーカー細胞は、これまでにｃＧａｔａ６レポーターを用いてｈＰＳＣ由来の心筋細胞集団から単離されている２７。これらのペースメーカー細胞の表現型は特定されていないが、ｃＧａｔａ６レポーターがマウス心臓においてＡＶＮを特異的に標識するので、それらは二次ＡＶＮペースメーカーに似ている可能性が最も高い２８。ここで、ＮＫＸ２−５：ＧＦＰレポーターを使用して、ＳＡＮに似ているペースメーカー細胞をｈＰＳＣ由来の心筋細胞集団から単離することができることが最初に示される。ＳＡＮ系列特定化を制御する２つの新規なシグナル伝達経路ＢＭＰ４およびＲＡが同定された。心臓への移植によって重篤な不整脈を引き起こすことのあり得るｈＰＳＣ由来の心室集団からペースメーカーを汚染することを排除することも可能にするので、ペースメーカー開発を理解する利益は２倍である。したがって、ＳＡＮＬＣＭは、生物学的ペースメーカーを生成するための魅力的な供給源を提示する。生物学的ペースメーカーへの現在のアプローチには、ペースメーカーイオンチャネルの過剰発現および現在の機能している心筋細胞の再プログラム化が含まれる２９、３０。ｈＰＳＣ由来のＳＡＮＬＣＭは、ヒト発生の再現によって精製されるので、本物の生物学的ペースメーカーを代表することが示唆される。
【０２１９】
[実施例２]
生体内移植および生体外同時ＥＣＧ記録および光学マッピングのための方法
ＳＡＮＬＣＭおよびＶＬＣＭの生体内ペースメーカー能力の評価のために、８匹の成体Ｆｉｓｃｈｅｒ−３４４（２００〜３００ｇ）ラットを使用した。動物に麻酔し（ケタミン８７ｍｇ／ｋｇ、キシラジン１３ｍｇ／ｋｇ）、挿管し、機械的人工呼吸を行った（Ｏ２  １００％、体積１ｍｌ／ｋｇ）。左開胸術の後、１〜２×１０６  ＳＡＮＬＣＭまたはＶＬＣＭ（低クラスター９６ウェルプレートに８０，０００細胞／ウェルで集合）を、２８Ｇニードルを使用して心尖部に近い左心室前壁に注入した。ヒト細胞移植片の免疫拒絶を防ぐために、動物をシクロスポリンＡ（１３ｍｇ／ｋｇ／日）およびメチルプレドニゾロン（２ｍｇ／ｋｇ／日）で処置した。
【０２２０】
光学マッピング調査のために、移植後１４日目に、心臓を回収し、特注の光学マッピングチャンバ（同時心電図記録および蛍光電圧イメージングが可能）に移し、ランゲンドルフ装置と酸素化タイロード（Ｔｙｒｏｄ’ｓ）溶液を用いて逆行性灌流した。
【０２２１】
デジタルＥＣＧデータ収集システム（Ｂｉｏｐａｃ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して単極筋電図を記録した。高速ＣＣＤに基づく光学マッピング技術（Ｓｃｉｍｅｄｉａ）を用いてラット心臓の電気的活性化パターンを調査した。この目的のため、電圧感受性染料Ｄｉ−４−ＡＮＢＤＱＢＳ（４０μＬ、２９．６１ｍＭｏｌ／Ｌ）を、電圧マッピングの前に負荷用の灌流液に加えた。光学マッピングは、電子シャッタおよび６６０±１０ｎｍの励起フィルタ（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ）を装備した１，０００ワットの石英タングステンハロゲンランプ（Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）によって心臓を照らすことによって実施した。ＣＣＤカメラに近接したロングパスフィルタ＞７１５ｎｍ（Ｅｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ）を使用して発光を測定した。
【０２２２】
カスタムベースのコンピュータソフトウェア（ＯＭｐｒｏＣＣＤ）を光学マッピングシグナルのデータ分析に利用した。データは、電気活性化波面の電波を示す動的表示（動画）かまたは活性化マップのいずれかとして見られた。活性化（等時間）マップは、各々の画像化された画素で電気活性化のタイミング（最大ｄＦ／ｄｔのタイミング）を測定することによって作製された。完全な房室ブロックを誘導し、接合部補充調律を抑制することを目的として、心臓をベースライン（洞調律）でマッピングし、その後メタコリン（１μＭ、０．１ｍｌ）およびリドカイン（０．００５％、０．１ｍｌ）を適用した。
【０２２３】
ＳＡＮＬＣＭが生体内ペースメーカーとして機能する能力を、細胞集合体としてそれらをラット心臓の尖部に移植することによって試験した。１４日後に細胞移植の効果を評価するために、単離したランゲンドルフ灌流心臓モデルを使用して光学マッピングを行った。ラットの心拍数は約３００ｂｐｍであり、ヒト心臓の拍動数よりも非常に速い。そのため、移植片の潜在的なペースメーカー活性を明らかにするために、薬理学的アプローチ（０．１ｍｌメタコリン（１μＭ）＋リドカイン（０．００５％）の適用）を開発して、一過性の完全な房室（ＡＶ）ブロックを誘導し、心室補充調律を抑制した。このアプローチを使用して、対照ＶＬＣＭを注入した３つの心臓のうちの３つが完全な房室ブロックを示し、接合部補充調律は７６±４ｂｐｍまで遅くなった（図１１Ａ）。光学マッピングにより、この内因性の遅い補充調律は、（細胞移植の領域から離れた）中隔で開始され、その後伝播されて残りの心室を活性化したことが確認された（図１１Ｂ）。対照的に、ＳＡＮＬＣＭ移植片を受けた３つの心臓のうちの３つは、房室ブロックの導入後にかなり速い心室異所性調律を提示した（１４５±８ｂｐｍ）。光学マッピングにより、この新しい異所性調律が移植部位に一致する心臓の尖部から開始されたことが明らかになった（図１１Ｃ、Ｄ）。移植片の存在およびその心室／ペースメーカー同一性は、ヒト特異的ｃＴＮＴおよびＭＬＣ２ｖについての免疫染色によって確認された（図１１Ｅ、Ｆ）。これらの実験を総合すると、精製されたＳＡＮＬＣＭは試験管内と生体内の両方で生物学的ペースメーカーとして機能することができるが、ＶＬＣＭはペースメーカー能力を持たないという原理が証明される。
【０２２４】
【表１】
2020182465.tif 000002
【０２２５】
【表２】
2020182465.tif 000003
【０２２６】
【表３】
2020182465.tif 000004
【０２２７】
本願は、好ましい例であると現在考えられる内容を参照して記載されているが、本願が開示される例に限定されないことは当然理解される。それとは反対に、本願は、添付される特許請求の範囲の精神および範囲に含まれる様々な変更および等価な配置を網羅することを意図する。
【０２２８】
全ての刊行物、特許および特許出願は、各々の個々の刊行物、特許および特許出願が、その全文が参照により本明細書に組み込まれると具体的かつ個別に指定されているのと同程度に、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。特に、表または他所に記載される、例えば受託番号および／またはバイオマーカー配列（例えば、タンパク質および／または核酸）をはじめとする、本明細書中に記載される各々の受託番号に関連する配列は、その全文が参照により組み込まれる。
【０２２９】
本明細書中の参考文献の引用
１  Ｂｏｙｅｔｔ，Ｍ．Ｒ．，Ｈｏｎｊｏ，Ｈ．＆Ｋｏｄａｍａ，Ｉ．Ｔｈｅ  ｓｉｎｏａｔｒｉａｌ  ｎｏｄｅ，ａ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｐａｃｅｍａｋｅｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４７，６５８−６８７（２０００）．
２  Ｍｏｎｆｒｅｄｉ，Ｏ．，Ｄｏｂｒｚｙｎｓｋｉ，Ｈ．，Ｍｏｎｄａｌ，Ｔ．，Ｂｏｙｅｔｔ，Ｍ．Ｒ．＆Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｍ．Ｔｈｅ  ａｎａｔｏｍｙ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｎｏａｔｒｉａｌ  ｎｏｄｅ−−ａ  ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｐａｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ：ＰＡＣＥ  ３３，１３９２−１４０６，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１５４０−８１５９．２０１０．０２８３８．ｘ（２０１０）．
３  Ｎｏｆ，Ｅ．，Ｇｌｉｋｓｏｎ，Ｍ．＆Ａｎｔｚｅｌｅｖｉｔｃｈ，Ｃ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｓｉｎｕｓ  Ｎｏｄｅ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｔｒｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ  １，３２８−３３６（２００９）．
４  Ｌａｕ，Ｄ．Ｈ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｋ．Ｃ．＆Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｐ．Ｓｉｎｕｓ  ｎｏｄｅ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ２６，５５−５９，ｄｏｉ：１０．１０９７／ＨＣＯ．０ｂ０１３ｅ３２８３４１３８ｆ４（２０１１）．
５  Ｌａｆｌａｍｍｅ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｒａｔ  ｈｅａｒｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５，１０１５−１０２４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１３２７（２００７）．
６  Ｋａｔｔｍａｎ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｉｎ／ｎｏｄａｌ  ａｎｄ  ＢＭＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ８，２２８−２４０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１０．１２．００８（２０１１）．
７  Ｂｕｒｒｉｄｇｅ，Ｐ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １１，８５５−８６０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２９９９（２０１４）．
８  Ｈｅ，Ｊ．Ｑ．，Ｍａ，Ｙ．，Ｌｅｅ，Ｙ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．＆Ｋａｍｐ，Ｔ．Ｊ．Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｉｎｔｏ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ：ａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９３，３２−３９，ｄｏｉ：１０．１１６１／０１．ＲＥＳ．０００００８０３１７．９２７１８．９９（２００３）．
９  Ｍａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ  ｐｕｒｉｔｙ  ｈｕｍａｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ：ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ  ａｎｄ  ｉｏｎｉｃ  ｃｕｒｒｅｎｔｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３０１，Ｈ２００６−２０１７，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００６９４．２０１１（２０１１）．
１０  Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＮＫＸ２−５（ｅＧＦＰ／ｗ）  ｈＥＳＣｓ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ８，１０３７−１０４０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１７４０（２０１１）．
１１  Ｐａｒｋ，Ｉ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｗｉｔｈ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５１，１４１−１４６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０６５３４（２００８）．
１２  Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．，Ｄ’Ｓｏｕｚａ，Ｓ．Ｌ．，Ｌｙｎｃｈ−Ｋａｔｔｍａｎ，Ｍ．，Ｓｃｈｗａｎｔｚ，Ｓ．＆Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０９，２６７９−２６８７，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００６−０９−０４７７０４（２００７）．
１３  Ｄｕｂｏｉｓ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．ＳＩＲＰＡ  ｉｓ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９，１０１１−１０１８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２００５（２０１１）．
１４  Ｏｋａｄａ，Ｙ．＆ＳｐｒｉｎｇｅｒＬｉｎｋ（Ｏｎｌｉｎｅ  ｓｅｒｖｉｃｅ）．ｉｎ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋｓ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｊａｐａｎ，，Ｔｏｋｙｏ，２０１２）．
１５  Ｙａｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｆｒｏｍ  ａ  ＫＤＲ＋  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５３，５２４−５２８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０６８９４（２００８）．
１６  Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｌｓ，Ｖ．Ｍ．，Ｓｍｉｔｓ，Ｇ．Ｊ．，Ｋｉｓｐｅｒｔ，Ａ．＆Ｍｏｏｒｍａｎ，Ａ．Ｆ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｃｅｍａｋｅｒ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｒｔ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０６，２４０−２５４，ｄｏｉ：１０．１１６１／ＣＩＲＣＲＥＳＡＨＡ．１０９．２０５４１９（２０１０）．
１７  Ｍｏｍｍｅｒｓｔｅｅｇ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｓｉｎｕｓ  ｖｅｎｏｓｕｓ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｓｅｐａｒａｔｅ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄ  ｈｅａｒｔ  ｆｉｅｌｄｓ  ｅａｒｌｙ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８７，９２−１０１，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｃｖｒ／ｃｖｑ０３３（２０１０）．
１８  Ｓｉｚａｒｏｖ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｒｔ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ４，５３２−５４２，ｄｏｉ：１０．１１６１／ＣＩＲＣＥＰ．１１１．９６３４２１（２０１１）．
１９  Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｌｓ，Ｖ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｅｎｏｕｓ  ｐｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｒｔ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ＮＫＸ２−５−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｔｂｘ１８．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９８，１５５５−１５６３，ｄｏｉ：１０．１１６１／０１．ＲＥＳ．００００２２７５７１．８４１８９．６５（２００６）．
２０  Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｌｓ，Ｖ．Ｍ．＆Ｍｏｏｒｍａｎ，Ａ．Ｆ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ：ｗｈｙ  ａｒｅ  ｓｏｍｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｒｔ  ｍｏｒｅ  ａｒｒｈｙｔｈｍｏｇｅｎｉｃ  ｔｈａｎ  ｏｔｈｅｒｓ？  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２，１９５−２０７，ｄｏｉ：１０．１１６１／ＣＩＲＣＥＰ．１０８．８２９３４１（２００９）．
２１  Ｈｏｒｓｔｈｕｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｎｏｄｅ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｂｘ３−ｂａｓｅｄ  ｎｏｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０５，６１−６９，ｄｏｉ：１０．１１６１／ＣＩＲＣＲＥＳＡＨＡ．１０８．１９２４４３（２００９）．
２２  Ｗｉｔｔｙ，Ａ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３００２（２０１４）．
２３  Ｘａｖｉｅｒ−Ｎｅｔｏ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｓｉｎｏ−ａｔｒｉａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｈｅａｒｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６，２６７７−２６８７（１９９９）．
２４  Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｎ．＆Ｘａｖｉｅｒ−Ｎｅｔｏ，Ｊ．Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｂｏｔｔｏｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｒｔ：ａｎｔｅｒｏｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １２，７４２−７４６（２０００）．
２５  Ｐｉｌｄｎｅｒ  ｖｏｎ  Ｓｔｅｉｎｂｕｒｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｗｈａｔ  ｉｓ  ｔｈｅ  “ｎｏｒｍａｌ”  ｆｅｔａｌ  ｈｅａｒｔ  ｒａｔｅ？  ＰｅｅｒＪ  １，ｅ８２，ｄｏｉ：１０．７７１７／ｐｅｅｒｊ．８２（２０１３）．
２６  Ｋｅｒｅｎ−Ｐｏｌｉｔａｎｓｋｙ，Ａ．，Ｋｅｒｅｎ，Ａ．＆Ｂｅｎｇａｌ，Ｅ．Ｎｅｕｒａｌ  ｅｃｔｏｄｅｒｍ−ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ＦＧＦ  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＮＫＸ２．５  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｖｉａ  ａ  ｐ３８  ＭＡＰＫ／ＣＲＥＢ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ３３５，３７４−３８４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｄｂｉｏ．２００９．０９．０１２（２００９）．
２７  Ｚｈｕ，Ｗ．Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ／ＥｒｂＢ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０７，７７６−７８６，ｄｏｉ：１０．１１６１／ＣＩＲＣＲＥＳＡＨＡ．１１０．２２３９１７（２０１０）．
２８  Ｄａｖｉｓ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ＧＡＴＡ−６  ｇｅｎｅ  ｈｅａｒｔ−ｒｅｇｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅａｎｓ  ｔｏ  ｍａｒｋ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｅ  ａ  ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０８，１０５−１１９（２００１）．
２９  Ｌｉ，Ｒ．Ａ．Ｇｅｎｅ−  ａｎｄ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｂｉｏ−ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｐａｃｅｍａｋｅｒ：ｗｈａｔ  ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｈａｖｅ  ｗｅ  ｌｅａｒｎｅｄ？  Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  １９，５８８−５９５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２０１２．３３（２０１２）．
３０  Ｈｕ，Ｙ．Ｆ．，Ｄａｗｋｉｎｓ，Ｊ．Ｆ．，Ｃｈｏ，Ｈ．Ｃ．，Ｍａｒｂａｎ，Ｅ．＆Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ，Ｅ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐａｃｅｍａｋｅｒ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｂｙ  ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｉｎ  ｐｉｇｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｈｅａｒｔ  ｂｌｏｃｋ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６，２４５ｒａ２９４，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００８６８１（２０１４）．
【図１】
2020182465.tif 000005
【図２】
2020182465.tif 000006
【図３】
2020182465.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020182465.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2020182465000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月14日(2020.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋細胞集団を産生する方法であって、
ａ．心血管中胚葉細胞を、ＷＮＴ阻害剤、ＶＥＧＦまたはその両方を含む心臓誘導培地中で、一定期間インキュベートして、ＮＫＸ２−５を発現する心血管前駆細胞を生成し；
ｂ．ＶＥＧＦを含む基礎培地中で前記心血管前駆細胞を一定期間インキュベートして、ＮＫＸ２−５ｐｏｓｃＴｎＴｐｏｓ細胞に富む心筋細胞集団を生成する工程と含む、方法。
【請求項２】
前記心血管中胚葉細胞が、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から生成される、請求項１に記載の方法であって、
ａ．前記ＰＳＣを、ＢＭＰ成分を含む胚様体培地中で一定期間インキュベートして、胚様体を生成する工程と；
ｂ．前記胚様体を、ＢＭＰ成分およびアクチビン成分を含む中胚葉誘導培地中で一定期間インキュベートして、心血管中胚葉細胞を生成する工程
を含む方法に従って、心血管中胚葉細胞が生成される、方法。
【請求項３】
前記ＰＳＣがヒトＰＳＣ（ｈＰＳＣ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｈＰＳＣが、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ｈＰＳＣが、ＮＫＸ２−５レポーター構築物を含むｈＰＳＣである、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
更に、前記心筋細胞集団から心室様心筋細胞（ＶＬＣＭ）集団を単離する工程であって、ＮＫＸ２−５レポーター構築物の発現に従って、ＮＫＸ２−５陽性心筋細胞を選択する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＮＫＸ２−５レポーター構築物が、蛍光ＮＫＸ２−５レポーター構築物である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記心臓誘導培地は、ＷＮＴ阻害剤を含む、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記心臓誘導培地は、更にＶＥＧＦを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＷＮＴ阻害剤は、ＩＷＰ２である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記心臓誘導培地は、更にＦＧＦ成分およびアクチビン／ノーダル阻害剤の少なくとも１種を含む、請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記心臓誘導培地は、更にＳＢ−４３１５４２を含む、請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
更に、心筋細胞特異的表面マーカーを使用して前記心筋細胞集団を単離する工程を含む、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記心筋細胞集団を単離する工程は、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）および胸腺細胞分化抗原１（ＴＨＹ−１／ＣＤ９０）を使用して行う、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記胚様体培地中のＢＭＰ成分が、ＢＭＰ４であり、前記中胚葉誘導培地中のＢＭＰ成分が、ＢＭＰ４である、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記胚様体培地は、更にＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含み、前記中胚葉誘導培地中のアクチビン成分は、アクチビンＡであり、前記中胚葉誘導培地は、更にｂＦＧＦを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記心血管中胚葉細胞が、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から生成される、請求項１２に記載の方法であって、
ａ．前記ＰＳＣを、ＢＭＰ成分を含む胚様体培地中で一定期間インキュベートして、胚様体を生成する工程と；
ｂ．前記胚様体を、ＢＭＰ成分およびアクチビン成分を含む中胚葉誘導培地中で一定期間インキュベートして、心血管中胚葉細胞を生成する工程と
を含む方法に従って、心血管中胚葉細胞が生成される、方法。
【請求項１８】
前記胚様体培地中のＢＭＰ成分が、ＢＭＰ４であり、前記中胚葉誘導培地中のＢＭＰ成分が、ＢＭＰ４である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記胚様体培地は、更にＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含み、前記中胚葉誘導培地中のアクチビン成分は、アクチビンＡであり、前記中胚葉誘導培地は、更にｂＦＧＦを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＳＣがヒトＰＳＣ（ｈＰＳＣ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｈＰＳＣが、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記蛍光ＮＫＸ２−５レポーター構築物が、ＮＫＸ２−５：ＧＦＰレポーター構築物である、請求項７に記載の方法。
【外国語明細書】
2020182465000001.pdf