(57)【要約】【課題】有効性と安全性を両立させた鳥居株のワクチンウイルスを提供する。【解決手段】鳥居株のワクチンウイルスから無菌性髄膜炎ヴァリアントの量を減少させたワクチンウイルスであって、無菌性髄膜炎ヴァリアントは、参照配列である鳥居株ワクチンウイルスの配列(配列番号１)において、c.182A>G、c.1064A>G、c.6143A>C、c.6668C>A及びc.12704G>Aの全ての変異を有し、且つ、c.182A>Gの塩基置換はＩからＶへの変異を伴い、c.1064A>Gの塩基置換はＲからＧへの変異を伴い、c.6143A>Cの塩基置換はＤからＡへの変異を伴い、c.6668C>Aの塩基置換はＰからＴへの変異を伴い、c.12704G>Aの塩基置換はＥからＫへの変異を伴う。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥居株のワクチンウイルスから、無菌性髄膜炎を引き起こす無菌性髄膜炎ヴァリアントの量を減少させて中枢神経病原性を減弱した鳥居株のワクチンウイルスであって、
前記無菌性髄膜炎ヴァリアントは、参照配列である鳥居株流行性耳下腺炎ワクチンウイルスの配列(配列番号１)において、
c.16G>A(配列番号１における16位のグアニンからアデニンへの変異)、
c.182A>G(配列番号１における182位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.1064A>G(配列番号１における1064位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.6143A>C(配列番号１における6143位のアデニンからシトシンへの変異)、
c.6668C>A(配列番号１における6668位のシトシンからアデニンへの変異)、
c.7795A>G(配列番号１における7795位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.11554G>A(配列番号１における11554位のグアニンからアデニンへの変異)、及び、
c.12704G>A(配列番号１における12704位のグアニンからアデニンへの変異)の少なくとも何れか一つを有し、
ここで、
c.182A>Gの塩基置換はイソロイシンからバリンへの変異を伴い、
c.1064A>Gの塩基置換はアルギニンからグリシンへの変異を伴い、
c.6143A>Cの塩基置換はアスパラギン酸からアラニンへの変異を伴い、
c.6668C>Aの塩基置換はプロリンからトレオニンへの変異を伴い、
c.12704G>Aの塩基置換はグルタミン酸からリシンへの変異を伴う
ことを特徴とする、鳥居株のワクチンウイルス。
【請求項２】
前記無菌性髄膜炎ヴァリアントは、参照配列である鳥居株流行性耳下腺炎ワクチンウイルスの配列(配列番号１)において、
c.182A>G(配列番号１における182位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.1064A>G(配列番号１における1064位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.6143A>C(配列番号１における6143位のアデニンからシトシンへの変異)、
c.6668C>A(配列番号１における6668位のシトシンからアデニンへの変異)、
及び、
c.12704G>A(配列番号１における12704位のグアニンからアデニンへの変異)の少なくとも何れか一つを有し、
ここで、
c.182A>Gの塩基置換はイソロイシンからバリンへの変異を伴い、
c.1064A>Gの塩基置換はアルギニンからグリシンへの変異を伴い、
c.6143A>Cの塩基置換はアスパラギン酸からアラニンへの変異を伴い、
c.6668C>Aの塩基置換はプロリンからトレオニンへの変異を伴い、
c.12704G>Aの塩基置換はグルタミン酸からリシンへの変異を伴う
ことを特徴とする、請求項１に記載の鳥居株のワクチンウイルス。
【請求項３】
前記無菌性髄膜炎ヴァリアントは、参照配列である鳥居株流行性耳下腺炎ワクチンウイルスの配列(配列番号１)において、
c.182A>G(配列番号１における182位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.1064A>G(配列番号１における1064位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.6143A>C(配列番号１における6143位のアデニンからシトシンへの変異)、
c.6668C>A(配列番号１における6668位のシトシンからアデニンへの変異)、
及び、
c.12704G>A(配列番号１における12704位のグアニンからアデニンへの変異)の全てを有し、
ここで、
c.182A>Gの塩基置換はイソロイシンからバリンへの変異を伴い、
c.1064A>Gの塩基置換はアルギニンからグリシンへの変異を伴い、
c.6143A>Cの塩基置換はアスパラギン酸からアラニンへの変異を伴い、
c.6668C>Aの塩基置換はプロリンからトレオニンへの変異を伴い、
c.12704G>Aの塩基置換はグルタミン酸からリシンへの変異を伴う
ことを特徴とする、請求項２に記載の鳥居株のワクチンウイルス。
【請求項４】
中枢神経病原性を減弱した鳥居株のワクチンウイルスにおける無菌性髄膜炎ヴァリアントは０〜１．０％含まれることを特徴とする請求項３に記載の鳥居株のワクチンウイルス。
【請求項５】
鳥居株のワクチンウイルスから、無菌性髄膜炎を引き起こす無菌性髄膜炎ヴァリアントを減少させて中枢神経病原性を減弱した鳥居株のワクチンウイルスの製造方法であって、
前記無菌性髄膜炎ヴァリアントは、参照配列である鳥居株ワクチンウイルスの配列(配列番号１)において、
c.16G>A(配列番号１における16位のグアニンからアデニンへの変異)、
c.182A>G(配列番号１における182位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.1064A>G(配列番号１における1064位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.6143A>C(配列番号１における6143位のアデニンからシトシンへの変異)、
c.6668C>A(配列番号１における6668位のシトシンからアデニンへの変異)、
c.7795A>G(配列番号１における7795位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.11554G>A(配列番号１における11554位のグアニンからアデニンへの変異)、及び、
c.12704G>A(配列番号１における12704位のグアニンからアデニンへの変異)の少なくとも何れか一つを有し、
ここで、
c.182A>Gの塩基置換はイソロイシンからバリンへの変異を伴い、
c.1064A>Gの塩基置換はアルギニンからグリシンへの変異を伴い、
c.6143A>Cの塩基置換はアスパラギン酸からアラニンへの変異を伴い、
c.6668C>Aの塩基置換はプロリンからトレオニンへの変異を伴い、
c.12704G>Aの塩基置換はグルタミン酸からリシンへの変異を伴う
ことを特徴とする、鳥居株のワクチンウイルスの製造方法。
【請求項６】
請求項１乃至４の何れか１項に記載のワクチンウイルスが凍結乾燥されたワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流行性耳下腺炎ワクチン鳥居株に由来し中枢神経病原性を減弱した新規ワクチンウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
流行性耳下腺炎（ムンプス、おたふくかぜ）はパラミクソウイルス科ルブラウイルス属に分類されるムンプスルブラウイルス(MuV)によって引き起こされ、耳下腺のびまん性腫脹・疼痛、発熱を主症状とする感染症である。予後は一般に良好であるが、時に無菌性髄膜炎(以下、AMと略することがある。)、脳炎、難聴、膵炎、精巣炎等の合併症を引き起こす。特にムンプス難聴は予後が悪く、発生頻度が予想外に高いことで注目されている(非特許文献１)。おたふくかぜに対する特異的治療法は無く、病原性を減弱させた弱毒ウイルスを用いた生ワクチンによる予防が唯一の有効な対策である。
【０００３】
ムンプス生ワクチンは1966年のソ連におけるLeningrad-3 (L-3)株の開発に始まり(非特許文献２)、米国におけるJeryl Lynn (JL)株の開発等(非特許文献３)、10種類以上の弱毒株（星野株、鳥居株、L-3株の派生株であるL-Zagreb株等）を用いた生ワクチンが日本を含むいくつかの国で開発されている(非特許文献４)。しかしながら現行のムンプスワクチンには、MuVの特性に起因するいくつかの課題が残されている。その1つは、ワクチン接種後に副反応として発生する、重篤な無菌性髄膜炎である(非特許文献４)。例えば、ブルガリアで開発されたSofia-6株は無菌性髄膜炎が原因で、市場から撤退している。また、国産の占部株（阪大微研）では、この株を含むMMRワクチン（麻疹おたふくかぜ風疹3種混合ワクチン）導入後、占部株による無菌性髄膜炎が多発し、MMRワクチンが中止される事態に至っている。これ以降、日本国内のワクチン接種率は低迷し、おたふくかぜの流行はいまだに制御できていない。こうした国内の状況を受けて、無菌性髄膜炎を起こさない安全性の高いムンプスワクチンの提供が強く求められている。
【０００４】
一方で、ムンプスワクチンには継代培養によってその免疫性を失いやすい過弱毒化の問題が存在する。例えばスイスで開発されたRubini株や、国内で最初に開発されたTowata株は過弱毒化が原因で市場から撤退したり、実用化に至らなかった。また、AMの発生頻度が非常に低く（発生頻度：0〜1/10万人）、世界中で最も広く使用されているJL株においても、2回のワクチン接種率が90％以上に維持されている国々で、おたふくかぜの大規模流行が頻発しており、その免疫原性に疑義が生じている。
【０００５】
加えて、JL株の場合には流行株との抗原性の齟齬というJL株固有の問題点もある。MuVの系統学的分類では、JL株は遺伝子型Aに分類される。そして遺伝子型Aは他の遺伝子型から、唯一系統学的に大きく乖離していることが知られている。従って、ワクチンによる免疫が低下した状態でワクチン株と異なる遺伝子型の流行が起こった場合、遺伝子型Aのワクチン株では交差免疫が機能しにくく、相対的に防御効果が低下することが想定される(非特許文献５)。従って、ワクチン株には遺伝子型A以外のウイルスを用いることが望ましい。ちなみに国産ワクチン株の遺伝子型は全てBである。
【０００６】
従来、生ワクチンに用いられる弱毒株は培養細胞又はニワトリ胚中で野外株の継代培養を繰り返し、偶然に出現した弱毒株をワクチンとしてきた。しかし、前述したように従来の作出方法では有効性と安全性を両立させたワクチンウイルスを新規に得ることはきわめて難しい。そこで、偶然に頼ることなく、既存のワクチン株について、中枢神経病原性に関わるクローンを特定し、そのクローンを除いたワクチンを作出できれば、確実に有効性と安全性を両立したワクチン株が得られる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hashimoto H, Fujioka M, Kinumaki H, Kinki Ambulatory Pediatrics Study G. An office-based prospective study of deafness in mumps. The Pediatric infectious disease journal. 2009;28(3):173-175.
【非特許文献２】Smorodintsev AA, Luzyanina TY, Mikutskaya BA. Data on the Efficiency of Live Mumps Vaccine from Chick Embryo Cell Cultures. Acta Virol. 1965;9:240-247.
【非特許文献３】Buynak EB, Hilleman MR. Live attenuated mumps virus vaccine. 1. Vaccine development. Proc Soc Exp Biol Med. 1966;123(3):768-775.
【非特許文献４】Bonnet MC, Dutta A, Weinberger C, Plotkin SA. Mumps vaccine virus strains and aseptic meningitis. Vaccine. 2006;24(49-50):7037-7045.
【非特許文献５】Rubin S, Mauldin J, Chumakov K, Vanderzanden J, Iskow R, Carbone K. Serological and phylogenetic evidence of monotypic immune responses to different mumps virus strains. Vaccine. 2006;24(14):2662-2668.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は有効性と安全性を両立させたムンプスワクチンを確実な方法で作出し、新規ワクチンウイルスを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明にかかるワクチンウイルスは、鳥居株のワクチンウイルスから、無菌性髄膜炎を引き起こす無菌性髄膜炎ヴァリアントの量を減少させて中枢神経病原性を減弱した鳥居株のワクチンウイルスであって、前記無菌性髄膜炎ヴァリアントは、参照配列である鳥居株流行性耳下腺炎ワクチンウイルスの配列(配列番号１)において、
c.16G>A(配列番号１における16位のグアニンからアデニンへの変異)、
c.182A>G(配列番号１における182位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.1064A>G(配列番号１における1064位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.6143A>C(配列番号１における6143位のアデニンからシトシンへの変異)、
c.6668C>A(配列番号１における6668位のシトシンからアデニンへの変異)、
c.7795A>G(配列番号１における7795位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.11554G>A(配列番号１における11554位のグアニンからアデニンへの変異)、及び、
c.12704G>A(配列番号１における12704位のグアニンからアデニンへの変異)の少なくとも何れか一つを有し、
ここで、
c.182A>Gの塩基置換はイソロイシンからバリンへの変異を伴い、
c.1064A>Gの塩基置換はアルギニンからグリシンへの変異を伴い、
c.6143A>Cの塩基置換はアスパラギン酸からアラニンへの変異を伴い、
c.6668C>Aの塩基置換はプロリンからトレオニンへの変異を伴い、
c.12704G>Aの塩基置換はグルタミン酸からリシンへの変異を伴う
ことを特徴とする、鳥居株のワクチンウイルスである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、有効性と安全性を両立させた鳥居株のワクチンウイルスが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】鳥居株ワクチン液の次世代シーケンサによるヴァリアント解析の結果を示す図である。縦軸はヴァリアント（塩基置換）の含有率、横軸はMuVゲノム上の位置を示す。矢印で示した点がAMヴァリアントに特異的なアミノ酸変異を伴う塩基置換の含量とゲノム上の位置である。
【図２】鳥居株由来ヴァリアントウイルスの新生ラットにおける中枢神経病原性の評価を示す図である。（Ａ）は新生Lewisラット（生後24時間以内）の脳内に3種類のウイルス（AMV, at, OV）を接種し、接種後３日目で脳内のウイルス量を測定した図であり、(Ｂ)は接種後４週目にMRIによって、脳室の拡張の程度（NVT score %）を測定した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１３】
本発明者は、これまで鳥居株ワクチン接種後にAMを発症した患者から検出されたワクチンウイルスについて、ゲノム解析を進めてきた。その結果、鳥居株に起因するAM患者から分離されるウイルスが、ゲノム上に特徴的なアミノ酸変異を伴う塩基置換を共有していることを見いだした（AMヴァリアント）。
【００１４】
本実施形態にかかる鳥居株のワクチンウイルスは、鳥居株のワクチンウイルスから、無菌性髄膜炎を引き起こすAMヴァリアントの量を減少させたワクチンウイルスである。即ち、本実施形態にかかる鳥居株のワクチンウイルスは、配列番号１に記載の鳥居株のワクチンウイルスとAMヴァリアントとの混合であるワクチンウイルスから、AMヴァリアントの量を減少させてできるだけ配列番号１に記載のワクチンウイルスの純度を高くしたワクチンウイルスである。
【００１５】
流行性耳下腺炎ウイルスは分類学上ではパラミクソウイルス属に分類され、遺伝学的にも免疫学的にもパラインフルエンザウイルス2型や4型と同じルブラウイルスに属している。流行性耳下腺炎ウイルスのゲノム構造は1本鎖で、直鎖状のマイナス鎖RNAであり、15,384塩基から構成されている。ゲノム上の遺伝子の配列は、3’-leader-NP-M-F-SH-HN-L-trailer-5’SHを有している。
【００１６】
鳥居株ワクチン単独の無菌性髄膜炎の発症は12,718人に1人であるが、鳥居株を含む武田MMR(弱毒生ウイルス混合ワクチン)ワクチンでは1,212人に1人である(武田MMRワクチンの無菌性髄膜炎の発生頻度は約0.08％)。ムンプス単味ワクチンはMMRワクチンの約1／10の発生となっている。なおこれは麻疹・風疹ワクチンとの混合による影響なのかについての詳細は解析されていない。
【００１７】
AMヴァリアントは、参照配列である鳥居株流行性耳下腺炎ワクチンウイルスの配列(配列番号１)において、
c.16G>A(配列番号１における16位のグアニンからアデニンへの変異)、
c.182A>G(配列番号１における182位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.1064A>G(配列番号１における1064位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.6143A>C(配列番号１における6143位のアデニンからシトシンへの変異)、
c.6668C>A(配列番号１における6668位のシトシンからアデニンへの変異)、
c.7795A>G(配列番号１における7795位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.11554G>A(配列番号１における11554位のグアニンからアデニンへの変異)、及び、
c.12704G>A(配列番号１における12704位のグアニンからアデニンへの変異)の少なくとも何れか一つを有する。
【００１８】
好ましくは、AMヴァリアントは、参照配列である鳥居株流行性耳下腺炎ワクチンウイルスの配列(配列番号１)において、
c.182A>G(配列番号１における182位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.1064A>G(配列番号１における1064位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.6143A>C(配列番号１における6143位のアデニンからシトシンへの変異)、
c.6668C>A(配列番号１における6668位のシトシンからアデニンへの変異)、
、及び、
c.12704G>A(配列番号１における12704位のグアニンからアデニンへの変異)の少なくとも何れか一つを有する。
【００１９】
より好ましくは、AMヴァリアントは、参照配列である鳥居株流行性耳下腺炎ワクチンウイルスの配列(配列番号１)において、
c.182A>G(配列番号１における182位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.1064A>G(配列番号１における1064位のアデニンからグアニンへの変異)、
c.6143A>C(配列番号１における6143位のアデニンからシトシンへの変異)、
c.6668C>A(配列番号１における6668位のシトシンからアデニンへの変異)、
、及び、
c.12704G>A(配列番号１における12704位のグアニンからアデニンへの変異)の全てを有する。この鳥居株流行性耳下腺炎ワクチンウイルスの配列において、ゲノム上の位置182、1064、6143、6668及び12704の全てが塩基置換されたAMヴァリアントを配列番号２に示す。
【００２０】
ここで、上述の場合において、c.182A>Gの塩基置換はイソロイシンからバリンへの変異を伴い(ウイルスタンパク質内のアミノ酸番号は13である。)、c.1064A>Gの塩基置換はアルギニンからグリシンへの変異を伴い(ウイルスタンパク質内のアミノ酸番号は307である。)、c.6143A>Cの塩基置換はアスパラギン酸からアラニンへの変異を伴い(ウイルスタンパク質内のアミノ酸番号は533である。)、c.6668C>Aの塩基置換はプロリンからトレオニンへの変異を伴い(ウイルスタンパク質内のアミノ酸番号は19である。)、c.12704G>Aの塩基置換はグルタミン酸からリシンへの変異を伴う(ウイルスタンパク質内のアミノ酸番号は1423である。)（表１）。
【００２１】
【表１】
2020055763.tif 000003
【００２２】
本実施形態にかかる鳥居株のワクチンウイルスは、鳥居株のワクチンウイルスから、様々な方法によって無菌性髄膜炎を引き起こすAMヴァリアントの量を減少させたワクチンウイルスであるが、減少後のAMヴァリアントの含有量は例えば０〜１．０％、好ましくは０〜０．５％、より好ましくは０〜０．２％、更に好ましくは０〜０．１％である。またAMヴァリアントの量は理想的には０％とすることであるが少量含まれていても無菌性髄膜炎を起こす可能性は極めて低いため、減少後のAMヴァリアントの含有量は例えば０．００００１〜１．０％、好ましくは０．０００１〜０．５％、より好ましくは０．００１〜０．２％、更に好ましくは０．０１〜０．１％とすることも可能である。なお、減少後のAMヴァリアントの含有量は、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、０．２、０．５、及び、１．０％の中から選ばれる任意の２点間とすることも可能である。なお鳥居株のワクチンウイルスから無菌性髄膜炎を引き起こすAMヴァリアントの量を減少させる方法は、特に限定されるものではないが、例えば限界希釈法によってAMヴァリアントを除くことが可能である。
【００２３】
本実施形態にかかる生ワクチンは、中枢神経病原性を減弱したウイルス株を含む凍結乾燥状態のワクチン製剤であり、使用時に溶解して注射により投与される。
【００２４】
ワクチンの製造方法については当業者に汎用される方法を適宜採用することができ、例えば、賦形剤、pH調節剤、安定化剤、溶解補助剤、無痛化剤等の製剤用添加物を１種又は２種以上使用することができる。１バイアル中に溶解時感染価が5,000 CCID50/0.5 ml以上となるように凍結乾燥ウイルスを充填することが好ましい。
【００２５】
本発明のワクチンの使用方法は特に限定されるものではなく、投与量及び投与方法はワクチンの使用目的や患者の年齢、体重等に応じて適宜選択できるが、例えば用時に注射用蒸留水等を添加し、溶解して調製したワクチン溶液を0.5ml程度上腕伸側に皮下注射することが可能である。
【実施例】
【００２６】
国産ワクチン接種後にAMを発症した患者から検出されたワクチンウイルスについてゲノム解析を進めてきた結果、鳥居株に起因するAM患者から分離されるほぼ全てのウイルスが、上記表１に示すゲノム上に特徴的な６箇所のアミノ酸変異を伴う塩基置換を共有していることを見いだした（配列番号２に示すAMヴァリアント）。
【００２７】
そこで、元のワクチン液について次世代シーケンサによるヴァリアント解析を行い、AMヴァリアントがワクチン液にどの程度含まれているか解析した。その結果、AMヴァリアントはワクチン液に数％（2.7〜4.2％）含まれることを見いだした（図１）。
【００２８】
AMヴァリアントのそれぞれの変異部位の出現頻度は６箇所ともほぼ同じ比率であることから、６箇所の変異を１セットで保持する病原性の高いマイナークローンが数％程度ワクチン液に含まれていることが想定され、鳥居株によるAM患者由来の分離株は全てこれらの変異を保持していることから、このクローンがAMの主因であることが示唆された。従って、このクローンだけをワクチン液から除けば、鳥居株の性状を大きく変える（免疫原性を弱める）こと無く、より安全なワクチン株を作出することができると考えられる。
【００２９】
そこで、市販のワクチンから限界希釈法によって９個のクローンを採取し、それぞれの塩基配列を解析したところ、AMヴァリアントと同じ配列を持つクローン（AMV株）が１株得られた。他の８クローンはいずれもオリジナルの鳥居株とほぼ同じ塩基配列であった(at株)。
【００３０】
次に各クローンの中枢神経病原性を評価比較するため、AMV株、at株、元のワクチン液（OV）を新生ラットに脳内接種した（図２）。接種後3日目のラット脳内のウイルス量を測定したところ（図２(Ａ)）、AMV株では高いMuVゲノムコピー数が検出されたのに対し、at株ではゲノムコピー数が最も低く、OVがその中間の値を示した。さらに、接種後4週目で脳室の拡張の程度（NVT score％）をMRI撮像によって測定したところ（図２(Ｂ)）、脳内ウイルス量と同じ傾向を示した。
【００３１】
以上の結果から、AMV株はOVやat株より高い中枢神経病原性を示した。一方、OVのほうがat株より高い中枢神経病原性を示すことから、AMV株が鳥居株の中枢神経病原性を増悪していることが示唆された。従って、at株はより高い安全性を保持した新たなワクチン候補株になり得ることが期待された。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
流行性耳下腺炎のワクチンの製造に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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