(57)【要約】【課題】動脈内皮細胞を生成する方法を提供する。【解決手段】動脈内皮細胞を得る方法であって、インスリンを実質的に含まず、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、並びにＮｏｔｃｈ作動薬、ＴＧＦ−ベータ阻害剤、およびイノシトールモノホスファターゼの阻害剤のうちの少なくとも１つを含む、血清非含有、アルブミン非含有の化学的に規定された培養培地中で、中胚葉細胞を培養することにより、動脈内皮細胞を含む細胞集団を得るステップを含み、該集団の動脈内皮細胞が、エフリンＢ２（ＥＦＮＢ２）、ニューロピリン１（ＮＲＰ−１）、デルタ様４（ＤＬＬ４）、ＣＤ４４、ＣＸＣＲ４／ＣＤ１８４、Ｇａｐ結合タンパク質α−４（ＧＪＡ４）、Ｈｅｙ１、ジャギド−１（ＪＡＧ１）、Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ４からなる群から選択される１つ又は複数のマーカーを発現する、方法。【選択図】図１Ａ−１Ｄ
2020072722.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動脈内皮細胞を得る方法であって、
インスリンを実質的に含まず、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ならびにＮｏｔｃｈ作動薬、ＴＧＦ−ベータ阻害剤、およびイノシトールモノホスファターゼの阻害剤のうちの少なくとも１つを含む、血清非含有、アルブミン非含有の化学的に規定された培養培地中で、中胚葉細胞を培養することにより、動脈内皮細胞を含む細胞集団を得るステップ
を含み、
該集団の動脈内皮細胞が、エフリンＢ２（ＥＦＮＢ２）、ニューロピリン１（ＮＲＰ−１）、デルタ様４（ＤＬＬ４）、ＣＤ４４、ＣＸＣＲ４／ＣＤ１８４、Ｇａｐ結合タンパク質α−４（ＧＪＡ４）、Ｈｅｙ１、ジャギド−１（ＪＡＧ１）、Ｎｏｔｃｈ１、およびＮｏｔｃｈ４からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを発現する、方法。
【請求項２】
細胞集団が、少なくとも８０％の動脈内皮細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血清非含有、アルブミン非含有の化学的に規定された培養培地が、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｎｏｔｃｈ作動薬、ＴＧＦ−ベータ阻害剤、およびイノシトールモノホスファターゼの阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
中胚葉細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）、ＥＭＯＳ、ＦＯＸＡ２、ＭＩＸＬ１、ＭＳＸ１、およびＭＳＸ２からなる群から選択される１つまたは複数の中胚葉マーカーを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビンＡ、およびＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化因子を含む、血清非含有、アルブミン非含有の化学的に規定された細胞培養培地中で、ヒト多能性幹細胞を約２日の期間わたり培養して、中胚葉細胞を含む細胞集団を得ることによって、中胚葉細胞が得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
中胚葉細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）、ＥＭＯＳ、ＦＯＸＡ２、ＭＩＸＬ１、ＭＳＸ１、およびＭＳＸ２からなる群から選択される１つまたは複数の中胚葉マーカーを発現する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
多能性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞またはヒト誘導多能性幹細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化因子が、Ｇｓｋ３阻害剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
Ｇｓｋ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＢＩＯ−アセトキシム、ＢＩＯ、ＬｉＣｌ、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＡＲＡ０１４４１８、１−アザケンパウロン、およびビス−７−インドリルマレイミドからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｎｏｔｃｈ作動薬が、レスベラトロール（３，４’，５−トリヒドロキシスチルベン）、バルプロ酸、およびスベロイルビスヒドロキサム酸からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
ＴＧＦ−ベータ阻害剤が、ＳＢ４３１５４２である、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
イノシトールモノホスファターゼの阻害剤が、Ｌ−６９０，３３０である、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法に従って得られた、実質的に純粋な、動脈内皮細胞の単離された集団。
【請求項１４】
少なくとも９０％の動脈内皮細胞を含む、請求項１３に記載の単離された集団。
【請求項１５】
少なくとも９９％の動脈内皮細胞を含む、請求項１３に記載の単離された集団。
【請求項１６】
請求項５の方法に従って得られた、実質的に純粋な、多能性幹細胞に由来する動脈内皮細胞の単離された集団。
【請求項１７】
少なくとも９０％の動脈内皮細胞を含む、請求項１６に記載の単離された集団。
【請求項１８】
少なくとも９９％の動脈内皮細胞を含む、請求項１６に記載の単離された集団。
【請求項１９】
薬剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験薬剤を、請求項１に記載の方法に従って得られた動脈内皮細胞と接触させるステップと、
（ｂ）接触させた動脈内皮細胞への白血球の接着に対する該薬剤の効果を検出するステップと
を含む方法。
【請求項２０】
検出するステップが、白血球接着アッセイ、ＲＮＡ配列決定、遺伝子発現プロファイリング、トランスクリプトーム解析、メタボローム解析、レポーターまたはセンサーの検出、タンパク質発現プロファイリング、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、メタボリックプロファイリング、およびマイクロダイアリシスからなる群から選択される方法を実施するステップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工学的に作出された組織構築物を血管化させる方法であって、請求項１に記載の方法に従って得られた動脈内皮細胞を、工学的に作出された組織構築物と接触させるステップを含む方法。
【請求項２２】
工学的に作出された組織構築物が、血管平滑筋細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
動脈内皮細胞を得るためのキットであって、（ｉ）中胚葉細胞を動脈内皮細胞に分化させるのに適する血清非含有、アルブミン非含有の化学的に規定された培養培地であって、インスリンを実質的に含まず、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ならびにＮｏｔｃｈ作動薬、ＴＧＦ−ベータ阻害剤、およびイノシトールモノホスファターゼの阻害剤のうちの少なくとも１つを含む、培養培地と、（ｉｉ）該培養培地を利用する、中胚葉細胞を動脈内皮細胞に分化させる方法を説明する説明書とを含む、キット。
【請求項２４】
（ａ）ヒト多能性幹細胞を中胚葉細胞に分化させるのに適する、血清非含有、アルブミン非含有の化学的に規定された培養培地であって、ＢＭＰ、アクチビンＡ、およびＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化因子を含む、培養培地と、
（ｂ）ヒト多能性幹細胞を動脈内皮細胞に分化させる方法であって、（ａ）の培養培地を利用する方法について記載する説明書と
をさらに含む、請求項２３のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照として本明細書に組み込まれている２０１５年２月２０日出願の米国仮特許出願第６２／１１８，５５３号に付与された優先権を主張する。
連邦政府資金による研究または開発に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所（国立先進トランスレーショナル科学センター）より授与されたＵＨ２−ＴＲ０００５０６に基づく政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
心血管系疾患は、米国内の主な死亡原因であり、アテローム性動脈硬化症等の血管疾患のほとんどは動脈内で生ずる。アテローム性動脈硬化症は、内皮細胞の活性化、機能障害、および構造的変化により開始する慢性炎症性疾患であり、白血球−内皮接着の増加を引き起こす。
多能性幹細胞から動脈内皮細胞が生成できれば、それは、心血管系疾患を治療すると予想される疾患または状態に対する治療の開発にとって極めて有望である。ただし、一次動脈内皮細胞は培養中に脱分化するので、動脈内皮の開発が課題である。例えば、Ｐｒｏｓｐｅｒらの米国特許出願公開第２００９／０１０４１５９号は、動脈分化に対する「潜在能力」を実証する血管内皮細胞を培養および使用する方法について記載している（段落［０１３６］）。さらに、ＭｃＣｌｏｓｋｅｙらの米国特許出願公開第２０１２／００６４０４０号は、胚性幹細胞から内皮細胞を誘導するための、化学的に規定された培養条件について記載する。ただし、この開示もやはり、動脈内皮細胞を胚性幹細胞から分化させる潜在能力を単に実証するに過ぎないようであり、その成果は極めて低い。
ヒト胚性幹細胞から動脈内皮細胞を誘導する既存のプロトコールは、ほとんど成功していない。したがって、ヒト多能性幹細胞からヒト動脈内皮細胞を生成する効率的で、規定された、スケーラブルな方法に対する必要性が、当技術分野において今なお存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
第１の態様では、動脈内皮細胞を得る方法が本明細書に提示される。本方法は、インスリンを実質的に含まず、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ならびにＮｏｔｃｈ作動薬、ＴＧＦ−ベータ阻害剤、およびイノシトールモノホスファターゼの阻害剤のうちの少なくとも１つを含む、血清非含有、アルブミン非含有の化学的に規定された培養培地中で、中胚葉細胞を培養することにより、動脈内皮細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、またはそれから本質的になり得る。集団の動脈内皮細胞は、エフリン２、ニューロピリン１（ＮＲＰ−１）、デルタ様４（ＤＬＬ４）、エフリン−Ｂ２（ＥＦＮＢ２）、ＣＤ４４、ＣＸＣＲ４／ＣＤ１８４、Ｇａｐ接合タンパク質アルファ−４（ＧＪＡ４）、Ｈｅｙ１、ジャギド−１（ＪＡＧ１）、Ｎｏｔｃｈ１、およびＮｏｔｃｈ４からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを発現することができる。細胞集団は、少なくとも８０％の動脈内皮細胞を含み得る。
【０００４】
血清非含有、アルブミン非含有の化学的に規定された培養培地は、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｎｏｔｃｈ作動薬、ＴＧＦ−ベータ阻害剤、およびイノシトールモノホスファターゼの阻害剤を含み得る。中胚葉細胞は、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）、ＥＭＯＳ、ＦＯＸＡ２、ＭＩＸＬ１、ＭＳＸ１、およびＭＳＸ２からなる群から選択される１つまたは複数の中胚葉マーカーを発現することができる。
いくつかのケースでは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビンＡ、およびＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化因子を含む、血清非含有、アルブミン非含有の化学的に規定された細胞培養培地中で、ヒト多能性幹細胞を約２日の期間にわたり培養して、中胚葉細胞を含む細胞集団を得ることによって、中胚葉細胞が得られる。中胚葉細胞は、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）、ＥＭＯＳ、ＦＯＸＡ２、ＭＩＸＬ１、ＭＳＸ１、およびＭＳＸ２からなる群から選択される１つまたは複数の中胚葉マーカーを発現することができる。多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞またはヒト誘導多能性幹細胞であり得る。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化因子は、Ｇｓｋ３阻害剤であり得る。Ｇｓｋ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＢＩＯ−アセトキシム、ＢＩＯ、ＬｉＣｌ、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＡＲＡ０１４４１８、１−アザケンパウロン、およびビス−７−インドリルマレイミドからなる群から選択され得る。Ｎｏｔｃｈ作動薬は、レスベラトロール（３，４’，５−トリヒドロキシスチルベン）、バルプロ酸、およびスベロイルビスヒドロキサム酸からなる群から選択され得る。ＴＧＦ−ベータ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２であり得る。イノシトールモノホスファターゼの阻害剤は、Ｌ−６９０，３３０であり得る。
【０００５】
別の態様では、本明細書に提示する方法に従って得られた、実質的に純粋な、動脈内皮細胞の単離された集団が本明細書に提示される。該単離された集団は、少なくとも９０％の動脈内皮細胞、または少なくとも９９％の動脈内皮細胞を含み得る。
別の態様では、本明細書に提示する方法に従って得られた、実質的に純粋な、多能性幹細胞に由来する動脈内皮細胞の単離された集団が本明細書に提示される。単離された集団は、少なくとも９０％の動脈内皮細胞、または少なくとも９９％の動脈内皮細胞を含み得る。
【０００６】
さらなる態様では、薬剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法が本明細書に提示される。本方法は、試験薬剤を、本明細書に提示する方法に従って得られた動脈内皮細胞と接触させるステップと、接触させた動脈内皮細胞に対する薬剤の効果を検出するステップとを含み得る。検出するステップは、ＲＮＡ配列決定、遺伝子発現プロファイリング、トランスクリプトーム解析、メタボローム解析、レポーターまたはセンサーの検出、タンパク質発現プロファイリング、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、メタボリックプロファイリング、およびマイクロダイアリシスからなる群から選択される方法を実施するステップを含み得る。
【０００７】
なおも別の態様では、動脈内皮細胞を得るためのキットであって、（ｉ）中胚葉細胞を動脈内皮細胞に分化させるのに適する血清非含有、アルブミン非含有の化学的に規定された培養培地であって、インスリンを実質的に含まず、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ならびにＮｏｔｃｈ作動薬、ＴＧＦ−ベータ阻害剤、およびイノシトールモノホスファターゼの阻害剤のうちの少なくとも１つを含む、培養培地と、（ｉｉ）培養培地を利用する、中胚葉細胞を動脈内皮細胞に分化させる方法を説明する説明書とを含む、キットが本明細書に提示される。キットは、（ａ）ヒト多能性幹細胞を中胚葉細胞に分化させるのに適する、血清非含有、アルブミン非含有の化学的に規定された培養培地であって、ＢＭＰ、アクチビンＡ、およびＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化因子を含む、培養培地と、（ｂ）ヒト多能性幹細胞を動脈内皮細胞に分化させる方法であって、（ａ）の培養培地を利用する方法について記載する説明書とをさらに含み得る。
【０００８】
本発明のこれらおよびその他の特質、態様、および長所は、下記の記載からよりよく理解されるようになる。記載では、本明細書の一部をなす添付図面が参照され、図面では、説明を目的として非限定的に、本発明の実施形態が示されている。好ましい実施形態の記載では、修正形態、同等形態、および代替形態のすべてを含めるために、本発明を限定することは意図しない。したがって、本発明の範囲を解釈するには、本明細書に挙げた特許請求の範囲を参照すべきである。
【０００９】
下記の図面は、本明細書の一部をなし、また本明細書に提示する組成物および方法の特定の態様をさらに実証するために掲載する。本発明は、本明細書に提示する特定の実施形態の詳細な記載と組み合わせて、１つまたは複数のこれらの図面を参照することにより、よりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ−１Ｄ】単一細胞のＲＮＡ−ｓｅｑを実証する図である。（Ａ）単一細胞の動脈および静脈の遺伝子に関する階層的クラスタリング分析。（Ｂ）５つの細胞部分集団の動脈および静脈遺伝子発現の平均値。各部分集団では、各遺伝子の平均ＴＰＭ（百万個当たりの転写物）を計算し、集団Ｐ１（動脈遺伝子）またはＰ３（静脈遺伝子）に正規化した。すべての動脈遺伝子または静脈遺伝子の正規化した発現をさらに平均化し、棒グラフで示す。データを平均値±ＳＤとして表す。*：Ｐ＜０．０５、Ｐ１では細胞数ｎ＝１３、Ｐ３では細胞数ｎ＝１０。（Ｃ）Ｐ１およびＰ３の主成分分析。Ｓｉｎｇｕｌａｒ（商標）分析ツールセット２．１によりプロットを生成した。（Ｄ）動脈富化遺伝子。Ｐ１における各遺伝子の平均ＴＰＭを、Ｐ３と比較して倍率変化を計算した。ｐ値もＰ１をＰ３と比較して計算した。倍率変化＞２、Ｐ値＜０．１、およびＰ１の平均ＴＰＭ＞１０のとき、動脈富化遺伝子を識別した。これまでに報告され動脈遺伝子、ＶＥＧＦａ、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ１０、Ｄｌｌ４、およびＮｏｔｃｈ４のＰ値は、０．０１〜０．１であったので、Ｐ＜０．１を、カットオフ値として使用した。
【図２Ａ−２Ｈ】図２Ａは表１に列挙する化学的に規定された培地を使用して、ヒト多能性幹細胞から動脈内皮細胞を生成するプロトコールの概略を示す図である。まず、Ｅ８ＢＡＣ培地を使用して、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞を、中胚葉細胞に分化させた。次いで、増殖因子または小分子（Ｅ６ＦＶＢ）が補充されたＥ６培地を、中胚葉細胞を誘発して内皮細胞に分化させるのに使用した。図２Ｂは、０日目（分化前の多能性状態）および５日目（分化後の状態）におけるＣＤ３１およびＣＤ３４発現に関するフローサイトメトリーデータを示す図である。図２Ｃは、０日目および５日目におけるＫＤＲ、ＮＡＮＯＧ、およびＯＣＴ４発現に関するフローサイトメトリーデータを示す図である。図２Ｄは、精製後の内皮細胞におけるＣＤ１４４発現を、免疫染色により示す図である。図２Ｅは、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）取り込みアッセイを示す図である。図２Ｆは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標））カプセル化アッセイを示す図である。図２Ｇは、移動および血管形成を分析するｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）ゲルプラグアッセイの結果を示す図である。回収されたゲルプラグにおける血管形成を検出する免疫染色に、抗ヒトＣＤ３１特異的抗体を使用した。図２Ｈは、増殖因子および小分子の示すような組み合わせにおける、分化から５日後のＣＤ３１およびＣＤ３４発現に関するフローサイトメトリー分析を示す図である。インスリンを各組合せに含めた。分化培地にＴＧＦ阻害剤を含むとき、ＳＢ４３１５４２が１０μＭで含まれた。
【図３Ａ−３Ｆ】動静脈の特異化において重要である候補経路を示す図である。（Ａ）ＣＤ３１およびＣＤ１４４ゲート化内皮細胞上でのＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰ発現に関するフローサイトメトリー分析。まず、ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰデュアルレポーター細胞（各遺伝子がヘテロノックインされたＨ１細胞）を、Ｅ８ＢＡＣ培地（ＢＭＰ４、アクチビン−Ａ、およびＣＨＩＲ９９０２１が補充されたＥ８培地）により、中胚葉細胞に分化させた。２日目〜６日目に、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＡ、および５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４が補充されたＥ５（Ｅ８培地からＦＧＦ２、ＴＧＦβ１、およびインスリンを除いた）培地を、中胚葉細胞を誘発して内皮細胞に分化させるのに使用した。２日目〜６日目に、インスリン（２０μｇ／ｍｌ）またはＬｙ２９４００２（１６μＭ、ＰＩ３Ｋ阻害剤）のいずれかを、示すように培地に添加した。（Ｂ）ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍｍａｔｏhigh／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰlow細胞の統計学。データを平均値±ＳＤとして表す。*：Ｐ＜０．０５、ｎ＝５。（Ｃ）ＡＫＴ活性を示すウェスタンブロット。タンパク質を３日目に採取した。（Ｄ）ＣＤ３１およびＣＤ１４４ゲート化内皮細胞上でのＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析。２日目〜６日目に、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＡ、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、または１０μＭのＳＢ４３１５４２が補充されたＥ５培地を、中胚葉細胞を誘発して内皮細胞に分化させるのに使用した。（Ｅ）ＣＤ３１およびＣＤ１４４ゲート化内皮細胞上でのＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析。まず、ＥＳ細胞を、上記のように中胚葉細胞に分化させた。２日目〜６日目に、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＡおよび１０μＭのＳＢ４３１５４２が補充されたＥ５培地をベース培地として、中胚葉細胞を誘発して内皮細胞に分化させるのに使用した。その他の因子を、示すようにベース培地に添加した。（Ｆ）ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏhigh／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰlow細胞の統計学。５μＭのＬ６９０、５μｇ／ｍｌのＬＤＬ、および１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢを使用した。*：Ｐ＜０．０５、ｎ＝３。
【図４Ａ−４Ｈ】記載するように、様々な培地において分化させた後に得られるＣＤ３１−およびＣＤ１４４−ゲート化内皮細胞上でのエフリンＢ２およびエフリンＢ型受容体４レポーター構築物（ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰ）の発現に関するフローサイトメトリー分析を示す図である。図４Ｂは、図４Ａの様々な培地条件で分化させた後に得られた動脈内皮細胞（ＡＥＣ）（ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏhigh／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰlow）のパーセントについて例示する。データを平均値±ＳＤとして表す。図４Ｃは、図４Ａの条件下で３日間分化させた後の細胞から採取したタンパク質のウェスタンブロットによるＡＫＴ（タンパク質キナーゼＢ）活性を示す。図４Ｄは、記載するように、様々な培地中で分化させた後に得られるＣＤ３１−およびＣＤ１４４−ゲート化内皮細胞上でのＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰ発現に関するフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｅは、図４Ｄの様々な培地条件で分化させた後に得られるＡＥＣ（ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏHigh／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰlow）のパーセントについて例示する。５μＭのＬ−６９０，３３０（イノシトールモノホスファターゼのビスホスホネート阻害剤）、および１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢ（血小板由来の増殖因子ＢＢ）を使用した。図４Ｆは、記載する分化プロトコールに従い実施した、ＡＥＣ（ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏhigh／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰlow）および内皮細胞（ＥＣ）（ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏlow／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰhigh）のソーティングを示す。図４Ｇは、図４Ｆの記載に従いソーティングすることにより得られたＡＥＣおよびＥＣについてＲＴ−ｑＰＣＲ動脈および静脈の遺伝子発現を行い、それをβ−アクチンに対して正規化して、対数目盛で示す。データを平均値±ＳＤとして表す。*：ｐ＜０．０５。図４Ｈは、動脈内皮細胞分化に関するワーキングモデルを示す。
【図５Ａ−５Ｇ】動脈内皮細胞の特徴付けを示す図である。すべての動脈内皮細胞は、「５因子」培地により誘導した。（Ａ）バルクＲＮＡ−ｓｅｑのＴＰＭを示す。ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏhigh／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰlow（ＡＥＣ）をＲＮＡ−ｓｅｑ用にソーティングした。ＨＵＶＥＣに対するＡＥＣ（ＡＥＣ１およびＡＥＣ２の平均ＴＰＭ）の比を計算した。ＡｏＥＣ、培養後の大動脈内皮細胞。（Ｂ）単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑのＰＣＡ。ＡＥＣ：ソーティング後のＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏhigh／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰlow細胞、ｐＡＥＣ：新たに単離されたヒト胎児背側大動脈に由来する一次動脈内皮細胞、Ｈ１：Ｈ１ＥＳ細胞。（Ｃ）ＬＤＬの取り込み。スケールバー＝１００μｍ。野生型Ｈ１細胞に由来する動脈内皮細胞（継代２）を使用した。純度は、継代後約９３％であり、そのためパネルＣ〜Ｈで使用した細胞については精製しなかった。（Ｄ）Ｍａｔｒｉｇｅｌカプセル化アッセイ。レポーター細胞系統に由来する動脈内皮細胞（継代３）を使用した。スケールバー＝１００μｍ。（Ｅ）フィブリンゲル内血管形成。野生型Ｈ１細胞に由来する動脈内皮細胞（継代２）をパネルＥ〜Ｆについて使用した。スケールバー＝１００μｍ。（Ｆ）フィブリンゲル中で同時培養された内皮細胞および周皮細胞の管腔形成。管腔を視覚化するために、細胞をＣＭＦＤＡ（緑色）で染色した。ｙ−ｚおよびｘ−ｚ投影図を示す。スケールバー＝１００μｍ。（Ｇ）内皮細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで機能的な血管を形成した。野生型Ｈ１由来の動脈内皮細胞（継代２、ＣＤ１４４マイクロビーズにより精製）をＭａｔｒｉｇｅｌと混合し、ＳＣＩＤマウスに注射した。４週間後、ローダミン−デキストランを、後眼窩注射して灌流血管を強調した。スケールバー＝１００μｍ。ＣＤ３１：抗ヒトおよび抗マウスＣＤ３１抗体、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号ＳＣ−１５０６。ｈＣＤ１４４：抗ヒトＣＤ１４４−６４７抗体、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６１５６７。
【図６Ａ−６Ｆ】動脈内皮細胞は血管機能を改善することを実証する図である。（Ａ）酸素誘発性網膜症の平面的に嵌め込まれた網膜。内皮細胞をＣＤ３１抗体により染色した。血管退縮部位を線で囲んだ。スケールバー＝０．５ｍｍ。（Ｂ）血管退縮の統計学。**：Ｐ＜０．０１。Ｐ値をビヒクル群と比較することにより計算した。ビヒクル群：ｎ＝１２、独立した３実験、ＰＢＳを使用した。ＡＥＣ群：ｎ＝１６、独立した２実験。ＨＵＶＥＣ群：ｎ＝５。線維芽細胞群：ｎ＝５。（Ｃ）新生血管房を矢印で示した。内皮細胞をＣＤ３１抗体により染色した。スケールバー＝０．５ｍｍ。（Ｄ）虚血無胸腺マウスにおける血流を示す、代表的なレーザードップラー潅流画像。（Ｅ）術後４０日目の生理学的状態を示す積み上げ棒グラフ。ビヒクル群：ｎ＝１０、ＤＦ１２培地を使用した。０．３Ｍ  ＡＥＣ群：ｎ＝１１、マウス１匹当たり３×１０5個のＡＥＣを注射した。１Ｍ  ＡＥＣ群：ｎ＝１０、マウス１匹当たり１×１０6個のＡＥＣを注射した。１Ｍ  ＣＢ−ＥＣＦＣ群：ｎ＝１０、マウス１匹当たり１×１０6個のＣＢ−ＥＣＦＣを注射した。動物の死亡は、虚血関連の感染症により引き起こされた。**、Ｐ＜０．００１（カイ二乗検定、ビヒクル群と比較）。（Ｆ）ＡＥＣは血管を形成し、また平滑筋細胞をマウス四肢に補充した。ＡＥＣを、ヒト特異的ＣＤ３１抗体で染色した。スケールバー＝１００μｍ。ｈＣＤ３１：抗ヒトＣＤ３１抗体、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５０２７４。
【図７Ａ−７Ｆ】内皮細胞の動脈固有の機能に関する特徴付けを示す図である。（Ａ）一酸化窒素生成を、ＤＡＦ−ＦＭの強度により明らかにした。動脈内皮細胞（ＡＥＣ）は、「５因子」培地による野生型Ｈ１細胞に由来し、継代２または４の実験で使用した。ＤＡＦ−ＦＭは、それがＮＯと反応して蛍光ベンゾトリアゾールを形成するまで、非蛍光性である。蛍光強度を、フローサイトメトリーにより測定した。実験を３回実施し、代表的な結果の１つを示す。（Ｂ）酸素消費速度を、ＸＦ２４アナライザー（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上で測定した。オリゴマイシンを、酸素消費を無効にするのに使用した。ＦＣＣＰを、酸化的リン酸化から電子伝達鎖を脱カップリングさせ、したがって最大の呼吸能を測定するのに、使用した。電子伝達鎖を完全に遮断するために、アンチマイシンＡおよびロテノンを同時に適用した。*：Ｐ＜０．０５、ｎ＝３。ＨＵＶＥＣと比較してＰ値を計算した。ＨＣＡＥＣ、ヒト冠動脈内皮細胞。（Ｃ）剪断応力応答を、ｉｂｉｄｉポンプシステム（Ｒｅｄ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｓｅｔ、μ−Ｓｌｉｄｅ  ＶＩ０．４）上で実施した。（Ｄ）剪断応力応答の統計学データ。細胞の幅に対する長さ比を、剪断応力に応答して細胞が伸長することを実証するのに使用した。細胞型毎に、１００個の細胞を、統計学を実施するために測定した。データを平均値±ＳＤとして表す。*：Ｐ＜０．０５；***：Ｐ＜０．００１、独立した３実験に由来する細胞数ｎ＝１００。（Ｅ）白血球（円形の細胞）接着アッセイ。スケールバー＝２００μｍ。継代１または４においてＡＥＣを使用した。（Ｆ）白血球接着アッセイの統計学。画像毎に白血球数を計測した。データを平均値±ＳＤとして表す。*：Ｐ＜０．０５、独立した３実験に由来する画像数ｎ＝３。Ｐ値を、ＨＵＶＥＣとＴＮＦα処理を比較することにより計算した。
【図８Ａ−８Ｊ】レポーター細胞株の生成および特徴付けに関するデータを示す図である。（Ａ）野生型および標的ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏ対立遺伝子の模式図。Ｈ１ＥＳ細胞を遺伝子標的化に使用した。Ｔｏｍ：ｔｄＴｏｍａｔｏ。（Ｂ）野生型および標的ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰ対立遺伝子の模式図。（Ｃ）ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏ対立遺伝子の５’アームおよび３’アームのジャンクションＰＣＲ。ＷＴ：野生型、Ｃ１４：標的細胞のクローン１４。（Ｄ）ＥＦＮＢ２野生型およびノックイン（ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏ）対立遺伝子のサザンブロット。（Ｅ）ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰ対立遺伝子の５’アームおよび３’アームのジャンクションＰＣＲ。Ｃ２９：標的細胞のクローン２９。（Ｆ）ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰ対立遺伝子のサザンブロット。（Ｇ）ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏ細胞株（クローン１４）のｔｄＴｏｍａｔｏコピー数に関するｑＰＣＲ分析。データを平均値±ＳＤとして表す。ｎ＝３。Ｃｏｎ：ｔｄＴｏｍａｔｏの１つのコピーを有する対照サンプル。（Ｈ）ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰ細胞株（クローン２９）のＥＧＦＰコピーに関するｑＰＣＲ分析。データを平均値±ＳＤとして表す。ｎ＝３。Ｃｏｎ：ＥＧＦＰの１つのコピーを有する対照サンプル。（Ｉ）野生型およびレポーター細胞株の内因性ＥＦＮＢ２およびＥＰＨＢ４遺伝子発現のＲＴ−ｑＰＣＲによる比較。５日目、５日間分化。データを平均値±ＳＤとして表す。ｎ＝３。（Ｊ）ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰ細胞株（クローン２９）の核型分類。
【図９】ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。精製済みのＡＥＣを、増殖因子または小分子が補充されたＥ５培地中で３日間培養した。Ｆ：１００ｎｇ／ｍｌ、Ｖ：５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＡ、Ｉ：１０μＭのＳＢ４３１５４２、Ｗ：１００ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ３Ａ、Ｌ：１０μＭのＬ−６９０，３３０、Ｒ：５μＭのＲＥＳＶ。Ｉｎｓ：１０μｇ／ｍｌのインスリン。低めのＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰ発現、および高めのＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏ発現が、ＦＶＩＲ、ＦＶＩＲ＋Ｉｎｓ、およびＦＶＩＲＬＷ培地において見出された。
【図１０】単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑを使用して得られた発現のヒートマップを示す図である。本明細書に記載する「５因子」プロトコールにより誘導したＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏhigh／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰlow  ＡＥＣの動脈および静脈の遺伝子について階層的クラスタリング分析を実施した。
【図１１Ａ−１１Ｃ】動脈内皮細胞分化データを示す図である。（Ａ）動脈内皮細胞分化プロトコールの模式図。まず、ＥＳ細胞を、Ｅ８ＢＡＣ培地（５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、２５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、および１μＭのＣＨＩＲ９９０２１が補充されたＥ８培地）により、中胚葉細胞に分化させた。次いで、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２および１０μＭのＳＢ４３１５４２が補充されたＥ５（Ｅ８培地からＦＧＦ２、ＴＧＦβ１、およびインスリンを除いた）培地を、中胚葉細胞を誘発して内皮細胞に分化させるのに使用した。（Ｂ）ＣＤ３１およびＣＤ３４発現のフローサイトメトリー分析。Ｅ５＋１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２＋１０μＭのＳＢ４３１５４２からなる培地（「対照」）と、それに５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、５μＭのＲＥＳＶ（レスベラトロール、Ｎｏｔｃｈ活性化因子）、または５０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ３Ａを補充した培地を、中胚葉細胞を誘発して動脈内皮細胞に分化させるのに使用した。（Ｃ）ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析。
【図１２】マウスの心臓、四肢、および腸内のＭＹＨ１１陽性血管平滑筋を実証する図である。マウスの心臓および四肢では、ＭＹＨ１１陽性血管平滑筋が血管に補充される。腸では、平滑筋細胞は、ＭＹＨ１１およびＣＤ３１の両方を発現し（矢印で示す）、ＭＹＨ１１+ＣＤ３１-細胞は血管平滑筋細胞である一方、ＭＹＨ１１+ＣＤ３１+細胞は、腸の平滑筋細胞であることを実証する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書で引用する特許および特許出願を含むが、それらに限定されないすべての公開資料は、本出願にそれらの全体が記載されているかのように、本明細書において参照として組み込まれる。
本発明は、いくつかの特定の因子を組み合わせることにより、単一の因子と比較して、動脈内皮細胞の分化が大幅に改善したという、本発明者らの発見に少なくとも部分的に基づく。本明細書に記載するように、本発明者らは、ある特定の因子（インスリン、ＴＧＦβ、およびＰＤＧＦ）が動脈内皮の分化を阻害することをさらに発見した。
方法
代表的な実施形態では、本明細書に提示する方法は、中胚葉幹細胞を動脈内皮細胞に分化させるステップを含む。本明細書で使用する場合、用語「動脈内皮細胞」（ＡＥＣ）とは、本明細書に提示する方法に従って得られた動脈血管内皮系列の細胞を意味する。本発明のＡＥＣは、動脈内皮細胞マーカー、例えばエフリンＢ２、ＤＬＬ４、Ｈｅｙ−２、ジャギド−１、およびジャギド−２等の高レベルの発現により特徴付けられる。ＡＥＣは、白血球接着が低く、ＮＯ生成および酸素消費量、剪断応力に対する応答、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの血管ネットワーク形成能力がより高い一方、そのようなネットワークにおいて動脈マーカーの発現が維持されることによっても特徴付けられる。ＡＥＣは、本明細書に記載するように、細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特徴的な発現プロファイルおよび機能的特性に基づいて、内皮細胞（ＥＣ）、静脈内皮細胞、および内皮前駆細胞を含むその他の細胞型から区別可能である。
【００１２】
第１の態様では、動脈内皮細胞を得る方法が本明細書に提示される。代表的な実施形態では、本方法は、中胚葉細胞の動脈内皮細胞系列の細胞への分化を指示するステップを含む。本明細書で使用する場合、用語「中胚葉細胞（mesodermal cell）」および「中胚葉細胞（mesoderm cell）」は交換可能に使用され、中胚葉に特異的な遺伝子発現を有し、中胚葉系列、例えば骨、筋肉、例えば心筋、骨格筋、および平滑筋（例えば、腸の）等、結合組織、例えば真皮および軟骨等、腎臓、泌尿生殖系、血液または造血細胞、心臓および脈管構造等に分化する能力を有する細胞を指す。中胚葉特異的バイオマーカーには、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）が含まれる。
【００１３】
本明細書に提示するＡＥＣ分化ステップ全体を通じて、中胚葉細胞は、インスリン、アルブミン、またはヒト以外の動物に由来する構成成分をまったく含まない、実質的に含まない、または本質的に含まない（すなわち、異種物質を含まない）培養培地中で一般的に培養される。本明細書で使用する場合、用語「実質的に含まない」とは、特定の構成成分または試薬が実質的に欠損している細胞培養条件を意味する。インスリンを実質的に含まないとは、培地が、インスリンの元の濃度の１％未満、または２×１０-5質量％未満のインスリンを含有する、および好ましくは１×１０-5％未満、０．５×１０-5％未満、０．２×１０-5％未満、０．１×１０-5％未満のインスリンを含有することを意味する。
【００１４】
さらに、培養培地は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達の阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）、レスベラトロール（ＲＥＳＶ）、およびイノシトールモノホスファターゼの阻害剤のうちの１つまたは複数を含む、またはそれらから実質的になり、その場合、培養は、培養対象の中胚葉細胞が動脈内皮細胞に分化するのに十分な長さの時間行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するＡＥＣ分化法で使用される細胞培養培地は、これらの構成成分のそれぞれを含む。その他のケースでは、培養培地は、これらの成分のうちの１つまたは複数を実質的に含まない。培養は、任意の適する表面上で（例えば、二次元または三次元培養で）実施され得る。
【００１５】
いくつかのケースでは、中胚葉細胞（いくつかのケースでは、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を含む）は、中胚葉細胞の動脈内皮系列への分化を指示するのに有効な量で、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｎｏｔｃｈ作動薬、ＴＧＦβ受容体阻害剤、およびイノシトールモノホスファターゼの阻害剤を含む培地中で培養される。いくつかのケースでは、ＦＧＦは、ＦＧＦ２である。ＶＥＧＦは、特異的内皮細胞分裂促進因子として作用するヘパリン結合性糖タンパク質である。いくつかのケースでは、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ−Ａ（血管内皮増殖因子Ａ）、またはそのアイソフォーム（例えば、ＶＥＧＦ−１６５）である。代表的なヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＨ６５５２２．２、およびＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＨ１  １１７７．２を含み、ならびにそのすべてをコードする核酸、またはその非前駆体部分をコードする核酸が包含される。
本発明の方法で使用するのに適するＴＧＦβ受容体阻害剤には、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５２５３３４、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＬＹ２１０９７６、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、ＳＢ−５０５１２４、Ｄ４４７６、ＧＷ７８８３８８、ＳＤ２０８、およびＥＷ−７１９７が非限定的に含まれる。好ましくは、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、内因性アクチビンの小分子阻害剤、およびＩ型受容体（ＴＧＦβ受容体Ｉ）である（Inman et al., Mol Pharmacol. 62(1):65-74 (2002)）。
【００１６】
Ｎｏｔｃｈは、デルタ様およびジャギドファミリーを含む細胞表面リガンドのファミリーと結合するシングルパス細胞表面受容体である。本明細書で使用する場合、用語「Ｎｏｔｃｈ作動薬」および「Ｎｏｔｃｈ活性化因子」とは、Ｎｏｔｃｈ受容体に結合し、Ｎｏｔｃｈ活性化と関連したシグナル伝達イベントを開始する、または媒介する分子（例えば、生体分子、小分子、化学物質）を指す。レスベラトロール（３，４’，５−トリヒドロキシスチルベン）は、スチルベンと呼ばれるポリフェノール系化合物のクラスに属し、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の活性化因子（作動薬）である。本明細書に提示する動脈分化を促進する方法に従う使用に適するその他のＮｏｔｃｈ作動薬として、バルプロ酸およびスベロイルビスヒドロキサム酸が挙げられる。さらに、固定化または多量体化した可溶性のＮｏｔｃｈリガンド、例えば固定化ＤＬＬ４および固定化ジャギド−１ペプチド等も、Ｎｏｔｃｈ活性化因子として使用できる。
【００１７】
イノシトールモノホスファターゼ（ＩＭＰａｓｅ）は、ミオイノシトールモノホスフェートがミオイノシトールに加水分解するのを触媒し、同酵素は、ホスホイノシチド細胞シグナル伝達経路で必要とされる。いくつかのケースでは、ＩＭＰａｓｅの阻害剤は、ビホスホネートＬ−６９０，３３０（［１−（４−ヒドロキシフェノキシ）エチリデン］ビスホスホン酸）である。リチウムも、ＩＭＰａｓｅを阻害して、ホスホイノシチドシグナル伝達を弱める（Berridge et al., Cell 59:411-419 (1989)）。ホスホイノシチドシグナル伝達経路のその他の阻害剤として、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤Ｌｙ２９４００２、ピクチリシブ（Pictilisib）、ＨＳ−１７３、ＧＳＫ２６３６７７１、デュベリシブ（Duvelisib）、ＴＧ１００−１１５、ＧＳＫ１０５９６１５、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＩＫ−９３、ＢＧＴ２２６、ＡＺＤ６４８２，ＳＡＲ２４５４０９、ＢＹＬ７１９、ＣＵＤＣ−９０７、ＩＣ−８７１１４、ＴＧ１００７１３、ゲダトリシブ（Gedatolisib）、ＣＨ５１３２７９９、ＰＫＩ−４０２、ＢＡＹ８０−６９４６、ＸＬ１４７、ＰＩＫ−９０、ＰＩＫ−２９３、ＰＩＫ−２９４、ケルセチン、ウォルトマンニン（Wortmannin）、ＺＳＴＫ４７４、ＡＳ−２５２４２４、ＡＳ−６０４８５０、およびアピトリシブ（Apitolisib）が非限定的に挙げられる。
【００１８】
本明細書に記載するもの等の化学的阻害剤の適する作用濃度範囲は、約０．１μＭ〜約１００μＭ、例えば約２μＭ、５μＭ、７μＭ、１０μＭ、１２μＭ、１５μＭ、１８μＭであるか、または約０．１μＭ〜約１００μＭの間の１つまたは複数の上記化学的阻害剤の別の作用濃度である。
好ましくは、中胚葉細胞は、得られた細胞集団の少なくとも約８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）が動脈内皮細胞となるまでＡＥＣ分化培地中で培養される。動脈内皮細胞は、下記の発現プロファイル：ＣＤ３１+／ＣＤ１４４+／ＣＤ４１-／ＣＤ４５-を特徴的に有する。
【００１９】
本明細書に記載するいくつかの生物学的マーカーでは、発現はレベルが低いまたは中程度である。特定のマーカーについて「陽性」または「陰性」として細胞を呼ぶのが一般的であるが、実際の発現レベルは、定量的特性である。細胞表面上の分子の数は、数ログにわたり変化し得るが、なおも「陽性」として特徴付けられる。したがって、染色レベルの特徴付けにより、細胞集団間の微妙な区別が可能となる。発現レベルは、フローサイトメトリーにより検出またはモニタリング可能であり、その場合、レーザーが蛍光色素の定量レベル（抗体が結合した細胞表面の抗原の量に比例する）を検出する。フローサイトメトリーまたは蛍光活性化セルソーティング法（ＦＡＣＳ）が、抗体染色強度、ならびにその他のパラメーター、例えば細胞サイズおよび光散乱等に基づき、細胞集団を分離するのに使用できる。染色の絶対的なレベルは、特定の蛍光色素および抗体調製物によって異なる可能性があり、データは対照に対して正規化され得る。
【００２０】
任意の適する方法が、本明細書に記載する細胞型に特徴的な生物学的マーカーの発現を検出するのに使用できる。例えば、１つまたは複数の生物学的マーカーの有無は、例えばＲＮＡ配列決定法（例えば、ＲＮＡ−ｓｅｑ）、免疫組織化学、ポリメラーゼ連鎖反応、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）等、または遺伝子発現を検出もしくは測定するその他の技術を使用して検出できる。ＲＮＡ−ｓｅｑは、生物、組織、または細胞のＲＮＡ含有量について、ゲノム全域にわたる評価を提供するハイスループット配列決定技術である。代替的または付加的に、例えば蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開された国際公開第９８／４５４７９号を参照）、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法、例えばｑＲＴ−ＰＣＲ等を使用して、ＡＥＣの１つもしくは複数の生物学的マーカーの有無を検出またはそのレベルを測定できる。代表的な実施形態では、本明細書に提示する方法に従って得られた細胞集団は、動脈内皮細胞の生物学的マーカー、例えばＥＦＮＢ２、Ｃｘｃｒ４、デルタ様４（ＤＬＬ４）、Ｇｊａ４、Ｈｅｙ１、Ｊａｇ１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ４、およびＮｒｐ１等の発現（またはその不存在）について評価される。好ましくは、ＡＥＣは、下記の動脈内皮細胞マーカーのうちの１つまたは複数を発現する：エフリンＢ２（ＥＦＮＢ２）、ニューロピリン−１（ＮＲＰ−１）／ＣＤ３０４、デルタ様４（ＤＬＬ４）、およびＣＤ１８４（分化のクラスター１８４）。エフリンＢ２（ＥＦＮＢ２）遺伝子は、ＥＰＨＢ４およびＥＰＨＡ３受容体と結合するＥＦＮＢクラスのエフリンをコードする。血管内皮細胞増殖因子１６５受容体（ＶＥＧＦ１６５Ｒ）としても知られるニューロピリン−１（ＮＲＰ１）は、動脈内皮細胞内で主に発現する。ＤＬＬ４は、動脈内皮細胞内で発現するＮｏｔｃｈリガンドである（Shutter et al., Genes & Dev. 14:1313-18 (2000)）。ＣＤ１８４は、ＣＸＣＲ４（Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体４型）またはフーシンとしても知られている。細胞集団内で、マーカーの発現をタンパク質レベルで評価する定量的方法も、当技術分野において公知である。例えば、フローサイトメトリーが、目的とする生物学的マーカーを発現する、または発現しない所定の細胞集団内の細胞分画を決定するのに使用される。
【００２１】
用語「規定された培養培地」、「規定された培地」等とは、本明細書で使用する場合、各培地成分の組成および量が既知であることを指す。本明細書で使用する場合、用語「化学的に規定された培養条件」、「十分に規定された増殖因子非含有培養条件」、および「十分に規定された条件」とは、各培地成分の組成および量が既知であり、支持表面の組成および量が既知であることを指す。本明細書で使用る場合、用語「アルブミン非含有条件」とは、使用される培養培地には、添加されるアルブミンを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、組換えアルブミンの任意の形態、または任意のその他動物の構成成分を非限定的に含め、その形態を問わず含有しないことを指す。
【００２２】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、胚性であっても、また誘発性であっても、最初期段階のヒトの発生に関わる機会をもたらし、また多数の血管原性細胞が誘導される、細胞療法および組織工学用のプラットフォームを提供する。したがって、代表的な実施形態では、本明細書に提示する方法は、中胚葉幹細胞が動脈内皮細胞に分化するのを促進する条件下で、ヒト多能性幹細胞を分化させるステップをさらに含む。その場合、動脈内皮細胞を生成する方法は、中胚葉の分化を促進する、血清非含有、アルブミン非含有の化学的に規定された培養培地中で、ヒト多能性幹細胞を培養するステップを含む。このように、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞は、本明細書に提示するＡＥＣ分化法に従い分化し、したがって多能性幹細胞由来のＡＥＣを生成する。代表的な実施形態では、中胚葉の分化を促進する、血清非含有、アルブミン非含有の化学的に規定された培養培地は、アクチビンＡ、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、ＦＧＦ２、およびＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化因子を含む。
【００２３】
本明細書に記載する方法で使用されるような、多能性幹細胞を培養するための規定された培地および基質条件は、当技術分野において周知である。本明細書で使用する培地は、それがアルブミン非含有であるという点でのみ、限定される。いくつかのケースでは、本明細書に開示する方法に従い分化される多能性幹細胞は、血清非含有、アルブミン非含有の培地中で培養される。
【００２４】
当業者が認識するように、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路に関与してβ−カテニンの発現レベルもしくは活性、ＴＣＦおよびＬＥＦの発現レベル、またはβ−カテニン／ＴＣＦ／ＬＥＦ誘発型の転写活性を高める１つもしくは複数のタンパク質の機能を調節することにより活性化され得る。
【００２５】
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化は、Ｇｓｋ３ホスホトランスフェラーゼ活性またはＧｓｋ３結合相互作用の阻害により達成される。理論に束縛されるつもりはないが、β−カテニンのＧｓｋ３リン酸化を阻害すると、β−カテニンの促進的分解が阻害され、これによりβ−カテニンのレベルおよび活性が高まり、多能性幹細胞の内胚葉系列／中胚葉系列への分化が促進されると考えられている。Ｇｓｋ３の阻害は、Ｇｓｋ３ホスホトランスフェラーゼ活性を阻害する小分子の提供、Ｇｓｋ３のＲＮＡ干渉ノックダウン、およびドミナントネガティブ型Ｇｓｋ３の過剰発現を含むが、これらに限定されない様々な方法で達成され得る。ドミナントネガティブ型Ｇｓｋ３は、例えばＲ９６Ａ突然変異を含むＧｓｋ３について記載するHagen, T. et al. J Biol Chem, 277:23330-5 (2002)に記載されているように、当技術分野において公知である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路は、多能性幹細胞をＧｓｋ３ホスホトランスフェラーゼ活性、またはＧｓｋ３結合相互作用を阻害する小分子と接触させて、多能性幹細胞内のＧｓｋ３を阻害することにより活性化される。適する小分子のＧｓｋ３阻害剤として、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＢＩＯ−アセトキシム、ＢＩＯ、ＬｉＣｌ、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＡＲＡ０１４４１８、１−アザケンパウロン、ビス−７−インドリルマレイミド、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、およびＢＩＯ−アセトキシムのいずれかが、本明細書に記載する分化法において、多能性幹細胞内のＧｓｋ３を阻害するのに使用される。一実施形態では、使用される小分子のＧｓｋ３阻害剤は、約１μＭ〜約９μＭの範囲の濃度、例えば約１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭのＣＨＩＲ９９０２１である、または約１μＭ〜約９μＭの別の濃度のＣＨＩＲ９９０２１である。別の実施形態では、使用される小分子のＧｓｋ３阻害剤は、約０．１μＭ〜約１μＭの範囲の濃度、例えば約０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１．０μＭのＣＨＩＲ９８０１４、または約０．１μＭ〜約１μＭの別の濃度のＣＨＩＲ−９８０１４である。別の実施形態では、使用される小分子のＧｓｋ３阻害剤は、約０．１μＭ〜約１μＭの範囲の濃度、例えば約０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１．０μＭのＢＩＯ−アセトキシムは、または約０．１μＭ〜約１μＭの別の濃度のＢＩＯ−アセトキシムである。
【００２７】
その他の実施形態では、Ｇｓｋ３活性は、Ｇｓｋ３のＲＮＡ干渉ノックダウンにより阻害される。例えば、Ｇｓｋ３発現レベルは、市販のＧｓｋ３に対するｓｉＲＮＡ、例えばＳｉｇｎａｌＳｉｌｅｎｃｅ（登録商標）ＧＳＫ−３α／β  ｓｉＲＮＡ（カタログ番号６３０１、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｏｌｏｇｙ（登録商標）、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、またはＧｓｋ３に関する誘導可能な発現カセットを備えたレトロウイルスベクター、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ）から市販されているＴｅｔ−誘導可能レトロウイルスＲＮＡｉシステム、カタログ番号６３０９２６、またはＳｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ）からのｃｕｍａｔｅ誘導可能システム、例えばＳｐａｒＱ（登録商標）システム、カタログ番号ＱＭ２００ＰＡ−２を使用してノックダウンされ得る。その他の実施形態では、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路は、β−カテニンそのもの、例えば、ヒトβ−カテニン（ヌクレオチドおよびタンパク質の配列について、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｘ８７８３８およびＣＡＡ６１１０７．１）を過剰発現させることにより活性化される。一実施形態では、β−カテニンの過剰発現は、例えば任意の上記誘導可能な発現系を使用して達成される誘導可能なβ−カテニン過剰発現である。あるいは、例えばBaba, Y. et al. Constitutively active β-catenin confers multi-lineage differentiation potential on lymphoid and myeloid progenitors. Immunity 23:599-609 (2005)に記載されている点突然変異Ｓ３３Ａ、Ｓ３７Ａ、Ｔ４１Ａ、およびＳ４５Ａを含有する、β−カテニンの構成的に活性な安定化したアイソフォームが使用される。
【００２８】
なおもその他の実施形態では、多能性幹細胞におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化は、β−カテニンとβ−カテニン分解複合体のメンバーであるアキシンとの相互作用を破壊する薬剤に細胞を接触させることにより達成される。アキシン−β−カテニン相互作用を破壊すると、β−カテニンが分解複合体による分解を回避することが可能となり、これによりβ−カテニンの正味のレベルが増加して、β−カテニンシグナル伝達が促進される。例えば、多能性細胞を、例えばカタログ番号６８１６６７としてＥＭＤ４  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されている化合物５−（フラン−２−イル）−Ｎ−（３−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）プロピル）−１，２−オキサゾール−３−カルボキサミド（「ＳＫＬ２００１」）と接触させることにより、アキシン−β−カテニン相互作用は多能性細胞内で破壊され得る。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を活性化させるＳＫＬ２００１の有効濃度は、約１０μＭ〜約１００μＭの範囲、約２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭであり、または約１０μＭ〜約１００μＭのＳＫＬ２００１の別の濃度である。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化因子は、Ｇｓｋ３阻害剤である。いくつかの実施形態では、Ｇｓｋ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＢＩＯ−アセトキシム、ＢＩＯ、ＬｉＣｌ、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＡＲ  Ａ０１４４１８、１−アザケンパウロン、およびビス−７−インドリルマレイミドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｇｓｋ３阻害剤は、培地中で約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１またはＣＨＩＲ９８０１４である。一実施形態では、使用される小分子のＧｓｋ３阻害剤は、約１μＭ〜約９μＭの範囲、例えば約１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１である、または約１μＭ〜約９μＭの別の濃度のＣＨＩＲ９９０２１である。別の実施形態では、使用される小分子のＧｓｋ３阻害剤は、約０．１μＭ〜約１μＭの範囲、例えば約０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１．０μＭの濃度のＣＨＩＲ９８０１４である、または約０．１μＭ〜約１μＭの別の濃度のＣＨＩＲ９８０１４である。
【００２９】
代表的な実施形態では、多能性幹細胞は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地、Ｌ−アスコルビン酸−２−ホスフェートマグネシウム、ナトリウムセレニウム、ヒトＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ3、トランスフェリン、ＴＧＦβ１、ＢＭＰ４、アクチビン−Ａ、およびＣＨＩＲ９９０２１（「Ｅ８ＢＡＣ培地」）を含む、またはそれらから実質的になる化学的に規定された培養培地中で２日間培養される。好ましくは、培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地；Ｌ−アスコルビン酸−２−ホスフェートマグネシウム（６４ｍｇ／ｌ）；ナトリウムセレニウム（１４μｇ／ｌ）；ヒトＦＧＦ２（１００μｇ／ｌ）；インスリン（２０ｍｇ／ｌ）；ＮａＨＣＯ3（５４３ｍｇ／ｌ）；トランスフェリン（１０．７ｍｇ／ｌ）；ＴＧＦβ１（２μｇ／ｌ）；ＢＭＰ４（５μｇ／ｌ）；アクチビンＡ（２５μｇ／ｌ）；およびＣＨＩＲ９９０２１（１μＭ）を含む、またはそれらから実質的になる。ヒト多能性幹細胞は培養培地中で約２日間培養される。約２日後、得られた細胞集団の少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）が中胚葉細胞である。本明細書で使用する場合、用語「中胚葉細胞」とは、中胚葉固有の遺伝子発現を有し、中胚葉系列、例えば骨、筋肉、例えば心筋、骨格筋、および平滑筋（例えば、腸の）等、結合組織、例えば真皮および軟骨等、腎臓、泌尿生殖系、血液または造血細胞、心臓および脈管構造等に分化する能力を有する細胞を意味する。中胚葉固有のバイオマーカーとして、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）が挙げられる。培養は、任意の適する表面上で（例えば、二次元または三次元培養で）実施され得る。
【００３０】
本明細書で使用する場合、本発明の方法に従う使用に適する「多能性幹細胞」は、３種類の胚葉すべてに分化する能力を有する細胞である。本明細書で使用するのに適する多能性細胞として、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）およびヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞が挙げられる。本明細書で使用する場合、「胚性幹細胞」または「ＥＳＣ」とは、胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性細胞または多能性細胞集団を意味する。Thomson et al., Science 282:1145-1147 (1998)を参照。このような細胞は、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、およびＴＲＡ−１−８１を発現する。多能性幹細胞は、細胞質に対する核の比が高く、顕著な核小体を有する細胞を含むコンパクトなコロニーとして現れる。ＥＳＣは、ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）等の供給元から市販されている。本明細書で使用する場合、「誘導多能性幹細胞」または「ｉＰＳ細胞」とは、その分化した体細胞の起源に関して異なり得、潜在能力決定因子の特定のセットに関して異なり得、およびそれを分離するのに使用される培養条件に関して異なり得るが、それにもかかわらず、その各分化した体細胞の起源と実質的に遺伝的に同一であり、本明細書に記載するようなより高い能力を有する細胞、例えばＥＳＣ等と類似した特徴を示す多能性細胞または多能性細胞集団を意味する。例えば、Yu et al., Science 318:1917-1920 (2007)を参照。
【００３１】
誘導多能性幹細胞は、ＥＳＣと類似した形態特性（例えば、円形、大型の核小体、および乏細胞質）、および増殖特性（例えば、２倍に増える時間が約１７〜１８時間）を示す。さらに、ｉＰＳ細胞は、多能性細胞特異的マーカー（例えば、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、またはＴｒａ−１−８１、ただしＳＳＥＡ−１を除く）を発現する。しかし、誘導多能性幹細胞は、すぐに胚から誘導されない。本明細書で使用する場合、「すぐに胚から誘導されない」とは、ｉＰＳ細胞生成用の開始細胞型は、非多能性細胞、例えば多能性細胞（multipotent cell）等、または最終分化細胞、例えば出生後の個体から得られる体細胞等であることを意味する。
【００３２】
ヒトｉＰＳ細胞は、特定のヒト対象について遺伝的に相補であるＡＥＣを得るために、本明細書に記載する方法に従い使用できる。例えば、特定の哺乳動物対象の特定の疾患または障害と関連した、またはそれに起因する１つもしくは複数の特定の表現型を示すＡＥＣを得ることは有利であり得る。そのようなケースでは、ｉＰＳ細胞は、当技術分野において公知の方法に従い、特定のヒト対象の体細胞をリプログラミングすることにより得られる。例えば、Yu et al., Science 324(5928):797-801 (2009)；Chen et al., Nat. Methods 8(5):424-9 (2011)；Ebert et al., Nature 457(7227):277-80 (2009)；Howden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108(16):6537-42 (2011)を参照。誘導多能性幹細胞由来のＡＥＣは、例えば特定の疾患を有する個体において、血管組織を再現する組織構築物内で生ずる薬物応答をモデル化することができる。最も安全な薬物でさえも、特定の遺伝的背景または環境履歴を有する特定の個体において有害反応を引き起こすおそれがある。したがって、ヒト対象特異的ｉＰＳ細胞由来のＡＥＣは、様々な薬物応答に寄与する遺伝因子およびエピジェネティックな影響を識別するのに有用である。
【００３３】
ｉＰＳ細胞にリプログラミングするための対象特異的体細胞は、生検またはその他の組織サンプリング法により、目的とする標的組織から得るまたは単離することができる。いくつかのケースでは、対象特異的細胞は、使用する前に、本発明の三次元ヒドロゲルベースの組織構築物内でｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作される。例えば、対象特異的細胞は、三次元組織構築物に導入する前に、増殖、分化、遺伝子改変、ポリペプチド、核酸、もしくはその他の因子と接触、冷凍保存、またはさもなければ修飾できる。
【００３４】
本明細書に記載する方法で使用される、多能性幹細胞培養用の規定された培地および基質条件は、当技術分野において周知である。いくつかのケースでは、本明細書に開示の方法に従い分化される多能性幹細胞は、製造業者のプロトコールに従い、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）基質（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ）上で、またはＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ  ｓｕｒｆａｃｅ上で、ｍＴＥＳＲ−１（登録商標）培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ）、またはＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中で培養される。
【００３５】
好ましくは、ヒト多能性幹細胞（例えば、ヒトＥＳＣまたはｉＰＳ細胞）はフィーダー層（例えば、線維芽細胞フィーダー層）、順化培地、または十分に規定されないまたは未規定の構成成分を含む培養培地が存在しない条件で培養される。本明細書で使用する場合、用語「化学的に規定された培地」および「化学的に規定された培養培地」とは、正確な量が既知または識別可能であり、個別に制御され得る十分に開示された製剤、または識別可能な成分を含有する培養培地も指す。したがって、（１）全培地成分の化学的および構造的な組成が既知でない、（２）培地が未知の量の任意の成分を含有する、または（３）その両方に該当する場合、培養培地は、化学的に規定されていない。化学的に規定された培養培地を使用することにより培養条件を標準化すれば、細胞培養の間に細胞が曝露される材料のロット間またはバッチ間変動の可能性が最低限に抑えられる。したがって、化学的に規定された条件下で培養される細胞および組織に添加したときに、様々な分化因子の効果がより予測可能となる。本明細書で使用する場合、用語「血清非含有」とは、血清もしくは血清交換を含まない、または血清もしくは血清交換を実質的に含まない細胞培養材料を意味する。例えば、実質的に血清非含有の培地は、約１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％未満の血清を含み得る。また「血清非含有」とは、動物（例えば、ウシ胎児）血液から得られる血清または動物由来の材料を含まない培養構成成分も意味し、これは異種間のウイルスまたはプリオン伝染の可能性を低減する、または取り除く上で重要である。疑義を避けるため、血清含有培地は、化学的に規定されていない。
【００３６】
本明細書に提示する方法は、単離された多能性幹細胞由来ＡＥＣ集団を生成し、その場合、単離された集団は、実質的に純粋なＡＥＣ集団である。本明細書で使用する場合、「単離する」および「単離された」とは、周囲を取り巻く、隣接する、もしくは汚染細胞から、または別の型の細胞から、目的とする細胞型または細胞の部分集団を分離する、選択する、または富化することを指す。本明細書で使用する場合、用語「実質的に純粋」とは、細胞集団全体を構成するＡＥＣに関して、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８２％、８３％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ超）純粋である細胞の集団を意味する。換言すれば、用語「実質的に純粋」とは、分化を指示して動脈内皮細胞系列の細胞を得る際に、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８２％、８３％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ超）のＡＥＣを含有する本発明のＡＥＣの集団を意味する。用語「実質的に純粋」とは、富化、増殖ステップ、または分化ステップのいずれかを実施する前、単離された集団中には、約２０％、約１０％、または約５％未満の非ＡＥＣを含有する本発明のＡＥＣの集団も意味する。いくつかのケースでは、本明細書に提示する方法に従い生成されるＡＥＣの実質的に純粋な単離された集団は、総細胞集団全体を構成するＡＥＣに関して、少なくとも約９５％（例えば、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）純粋である。
【００３７】
特定の個体に由来するｉＰＳ細胞から生み出される動脈内皮細胞と、その同一の個体から単離された一次動脈内皮細胞との間の重要な差異は、ｉＰＳ細胞由来の細胞は、無限にスケーラブルであり、ヘイフリック限界（細胞分裂の所定数）を上回る能力を有することである。本明細書で使用する場合、用語「ヘイフリック限界」とは、細胞がもはや増殖不能となり老化に入る前の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで集団が２倍に増加する有限の数を意味する（Hayflick L. Exp Cell Res 37:614-36, 1965）。一次培養された動脈内皮細胞の固有の自己再生能力には限界があるが、本明細書に提示する方法によれば、単一の供給源（例えば、個体の体細胞）から動脈内皮細胞を、ほぼ無尽蔵に供給を得ることができる。したがって、本発明の一実施形態では、ＡＥＣは、得られる細胞の数が、２名以上の患者を治療するのに十分であるように、組織培養ラボ内で増殖する能力を有し、好ましい実施形態では、細胞バンクを形成する能力を有する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、記載する方法で得られた細胞の集団における動脈内皮細胞の割合は、細胞分離、セルソーティング、または富化法、例えば蛍光活性化セルソーティング法（ＦＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、磁気ビーズ、磁気活性化セルソーティング法（ＭＡＣＳ）、非内皮細胞のレーザー標的アブレーション、およびそれらの組合せを使用して富化される。好ましくは、ＦＡＣＳが、細胞表面抗原の発現に基づき細胞を識別および分離するのに使用される。
【００３９】
本発明の方法は、スケーラブルで安価で再現性のあるヒトＡＥＣの生成を提供する。例えば、本明細書に記載する方法に従いヒトＡＥＣを含む細胞集団を得た後に、ヒトＡＥＣ集団は、ヒト内皮細胞用無血清培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１１１１−０４４）、ＥＧＭ−２（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ−３１６２）、および内皮細胞用培養培地（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３５５０５４）を非限定的に含む、ヒトＡＥＣの増殖に適する培養培地中で増殖可能である。
【００４０】
【表１】
2020072722.tif 000003
2020072722.tif 000004
2020072722.tif 000005
【００４１】
別の態様では、本明細書に提示する方法に従って得られた動脈内皮細胞を含む治療組成物、および対象を治療するために該治療組成物を使用する方法が、本明細書に提示される。
さらなる態様では、したがって、本発明は、細胞移植、細胞の補充、および細胞または組織の交換、および脈管形成強化のための方法および組成物を提供する。本方法は、本明細書に提示する方法に従い誘導される、治療有効量の動脈内皮細胞を、それを必要としている対象に提供するステップを含み得、それにより動脈内皮細胞による対象の治療を提供する。細胞または組織の交換、および脈管形成の改善を必要とする障害として、心筋および末梢血管の虚血、その他の末梢動脈疾患、心筋梗塞（ＭＩ）、脳卒中、および糖尿病性神経障害、ならびに罹患した個体が血管形成の再生医療から利益を得るような任意のその他の障害または疾患が、非限定的に挙げられる。本発明による好ましい個々の対象として、ヒトおよび非ヒト霊長類、ならびにイヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、およびウシを非限定的に含む、哺乳動物が挙げられる。いくつかのケースでは、実質的に純粋な動脈内皮細胞の集団が、治療を必要とする対象の多能性細胞（例えば、誘導多能性幹細胞）を使用して得られる。ただし、実質的に純粋な動脈内皮細胞の集団は、好ましくは同系または同種のドナーの多能性幹細胞を使用しても得ることができる。それほど好ましくはないが、異種のドナーも使用される。
【００４２】
別の態様では、本文書は、血管の潅流を改善する方法を提供する。特に、患者の末梢動脈疾患を治療する方法が本明細書に提示され、該方法は、本明細書に記載されるように得られた動脈内皮細胞の治療用量を患者に投与するステップを含む。本明細書で使用する場合、用語「末梢動脈疾患」とは、急性および慢性の重大な四肢の虚血、ならびに組織への血液供給に影響を及ぼす障害、例えば糖尿病または動脈硬化症等と関連した虚血を意味する。いくつかのケースでは、本明細書に提示する方法に従って得られた動脈内皮細胞は、末梢動脈疾患を治療するために、患者対象に直接注射される。特定の理論のいずれにも拘束されるものではないが、そのような動脈内皮細胞は、四肢の虚血（例えば、糖尿病または心臓梗塞と関連した虚血）に対して治療的であり、非動脈内皮細胞による治療よりも有益であると期待される。代表的な実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導したＡＥＣは、患者に移植して虚血を治療する場合、患者特異的細胞またはＨＬＡ適合細胞である。例えば、ＡＥＣは、患者の体細胞を多能性にリプログラミングすることにより得られたｉＰＳ細胞から誘導され得、次いで本明細書に提示する方法に従うｉＰＳ細胞を使用して、患者特異的ＡＥＣを含む集団が得られる。患者由来のｉＰＳ細胞から得られるＡＥＣは、任意の薬学的に許容される担体、バッファー、または賦形剤に含めて患者に投与され得る。患者に対する細胞の投与経路は、静脈内または筋肉内注射であり得る。いくつかのケースでは、例えば、ヒト多能性幹細胞に由来するＡＥＣは、生理食塩溶液中に再懸濁され、そして１つまたは複数の四肢の虚血部位において筋肉注射される。
【００４３】
任意の適する投与量が、本明細書に提示する治療法で使用できる。細胞の投与量は、虚血の範囲および重症度に依存するが、好ましい範囲は、１回の投与につき、約１×１０8個の細胞／患者〜約１×１０10個の細胞／患者である。いくつかのケースでは、本明細書に記載されるように得られたＡＥＣは、例えば平滑筋細胞（例えば、血管平滑筋細胞）を含むその他の細胞型と共に対象に同時投与される。
【００４４】
細胞を対象に投与した後、治療法の効果が、所望の場合には、当技術分野の医師に公知の任意の適する方法を使用して評価され得る。治療は、必要または要求に応じて反復され得る。本明細書に提示する方法に従う治療の後、治療された対象は、四肢の虚血の陽性または陰性変化について、モニタリングされ得る。好ましい実施形態では、虚血組織への血液供給量の治療による増加は、前記細胞の移植後に血管形成（血管新生）が増加した結果である。本明細書に提示する方法は、移植後に血管形成促進性となる細胞を提供する。いくつかのケースでは、陽性の変化として、虚血性の組織に対する血液供給量の増加、切断手術を行わない生存率の増加、四肢切断の必要性の低下、対象休息時の四肢疼痛の低下、および疼痛を感じない歩行の改善（例えば、より長距離にわたる無疼痛歩行）が、非限定的に挙げられる。
別の態様では、本明細書に提示する方法に従って得られたＡＥＣは、一酸化窒素（ＮＯ）の生成が、対象に対して治療または予防上の利益をもたらすような方法で有用である。例えば、ＡＥＣを対象に投与する方法が、ＮＯを対象に提供する方法として本明細書に提示され、これにより、ＡＥＣの投与がアテローム性動脈硬化症を治療または予防する、ＤＮＡ損傷を低減する、および／または血管機能が改善するように平滑筋細胞を弛緩させる。
【００４５】
治療有効量のＡＥＣをレシピエント対象に投与する際のそのような投与は、当技術分野において周知の方法を使用して一般的に実施され、当業者にとって公知の臨床的ツールを使用して、治療上有効なＡＥＣを対象に直接注射するステップ、さもなければ導入するステップを通常含む（例えば、米国特許第６，４４７，７６５号；同第６，３８３，４８１号；同第６，１４３，２９２号；および同第６，３２６，１９８号）。例えば、本発明のＡＥＣの導入は、血管内投与、例えば、静脈内等、筋肉内、または動脈内投与、腹腔内投与等により、局所的または全身的に実施可能である。細胞は、無菌のシリンジまたはその他の無菌の移送機構を使用して輸液バッグ（例えば、Ｆｅｎｗａｌ輸液バッグ（Ｆｅｎｗａｌ，Ｉｎｃ．））内に注入され得る。次いで、細胞は、１５分間等の時間、ＩＶ投与により、自由流ＩＶライン経由で患者に速やかに注入され得る。いくつかの実施形態では、さらなる試薬、例えばバッファーまたは塩等が、レシピエント対象に対して細胞と同時に提供される。
【００４６】
代表的な実施形態では、本発明のＡＥＣは、細胞、および１つまたは複数の薬学的に許容される担体、バッファー、または賦形剤を含む医薬組成物として対象に提供される。投与用の医薬組成物は、しかるべき滅菌性および安定性を提供する標準法に従い、製剤化、製造、および保管されなければならない。また、本発明の医薬組成物は、移植される細胞の生存率もしくは生着を促進する、血管形成を促進する、細胞外マトリックスもしくは間質マトリックスの組成を調節する、および／またはその他の細胞型を移植部位に補充する１つまたは複数の増殖因子またはサイトカイン（例えば、血管形成性のサイトカイン）も含み得る。
【００４７】
別の態様では、本明細書に提示する方法に従って得られた動脈内皮細胞を使用して、工学的に作出された血管を生み出す方法が本明細書に提示される。ＡＥＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで血管を形成するために、さらなる細胞集団と併用してもよい原材料としても使用できる。そのような血管は、例えば損傷を受けた組織の血管再生や末梢動脈疾患の治療において有用である。外部から注射した細胞による生着および脈管形成は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの動物試験により示されている。例えば、Kim et al., J. Am. Coll. Cardiol. 56:593-607 (2010)を参照。
【００４８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで血管形成し、また血管ネットワークを欠く工学的に作出（engineered）された組織、例えば工学的に作出された心筋組織または心臓等を血管化（vascularization）させるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導したＡＥＣを使用する方法も、本明細書に提示される。例えば、ＡＥＣは、臨床用途、例えば患部血管の交換等を目的として、組織工学により作出された血管グラフトを生成する方法において有用である。いくつかのケースでは、組織工学により作出された血管グラフト、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された血管、またはその他の工学的に作出された血管化組織で患者を治療する方法では、患者特異的またはＨＬＡ適合ＡＥＣを使用するのが有利である。上記のように、ＡＥＣは、患者の体細胞を多能性にリプログラミングすることにより得られたｉＰＳ細胞から誘導され得、次いで本明細書に提示する方法に従いｉＰＳ細胞を使用して、患者特異的ＡＥＣを含む集団が得られる。いくつかのケースでは、臨床用途、例えばバイパス手術等を目的として、工学的に作出された血管化組織構築物、例えば工学的に作出された血管等を得るために、ＡＥＣをその他の細胞型、例えば血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）等と同時培養するのが有利である。好ましくは、ＡＥＣは、このような方法のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導した患者特異的血管平滑筋細胞と併用される。血管平滑筋細胞は、ＡＣＴＡ２、ＴＡＧＬＮ、ＭＹＨ１１、およびＥＬＮの発現について陽性であるが、ＣＤ３１については陰性である。その他のケースでは、ＡＥＣは、心臓機能を改善するのに役立つ血管化した心臓組織パッチを形成するために心筋細胞と同時培養され得る。
【００４９】
さらなる態様では、薬剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法が本明細書に提示される。例えば、候補のハイスループットスクリーニングを目的として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導された動脈内皮細胞を使用する方法が、本明細書に提示される。例えば、本明細書に記載されるように得られたＡＥＣは、アテローム性動脈硬化症の潜在的治療薬または予防薬として、白血球接着を低下させる薬剤を識別するのにスクリーニングされ得る。スクリーニング法は、（ａ）試験薬剤を、本明細書に記載されるように得られた動脈内皮細胞または動脈内皮細胞と接触させるステップと、（ｂ）１つの細胞または複数の細胞に対する薬剤の効果（例えば、ＡＥＣへの白血球接着の低下）を検出するステップとを含む、またはそれらから実質的になり得る。いくつかのケースでは、スクリーニング法は、血管組織の発達を促進する試験薬剤を識別するために、候補化合物をスクリーニングするステップを含む。その他のケースでは、候補化合物は、ヒト動脈内皮細胞または血管組織に対する毒性についてスクリーニングされ得る。いくつかのケースでは、検出するステップは、細胞の形態または寿命に対する薬剤の少なくとも１つの陽性または陰性の効果を検出するステップを含み、これにより細胞の寿命を延ばす、もしくは縮める薬剤、または細胞の形態に対して陽性もしくは陰性の効果を有する薬剤が、ヒト動脈内皮細胞または血管組織に対する効果を有するものとして識別される。いくつかのケースでは、検出するステップは、接着アッセイ、ＲＮＡ配列決定、遺伝子発現プロファイリング、トランスクリプトーム解析、メタボローム解析、レポーターまたはセンサーの検出、タンパク質発現プロファイリング、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、メタボリックプロファイリング、およびマイクロダイアリシスからなる群から選択される方法を実施するステップを含む。薬剤は、遺伝子発現に対する効果についてスクリーニングされ得、検出するステップは、非接触の細胞または細胞集団と比較して差次的遺伝子発現をアッセイするステップを含み得る。
【００５０】
代表的な実施形態では、試験化合物を動脈内皮細胞に曝露（例えば、接触）した後に、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルについて、陽性または陰性の変化を検出するステップおよび／または測定するステップは、例えばＲＮＡ配列決定を使用した全トランスクリプトーム解析を含む。そのような場合には、遺伝子発現は、例えばデータ処理ソフトウェアプログラム、例えばＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅ、ＲＳＥＭ（予測−最大化（Expectation-Maximization）によるＲＮＡ−ｓｅｑ）、Ｅｘｃｅｌ、およびＰｒｉｓｍ等を使用して計算される。Stewart et al., PLoS Comput. Biol. 9:e1002936 (2013)を参照。該当する場合には、統計比較が、ＡＮＯＶＡ解析、ボンフェローニ補正、または両側スチューデントのｔ検定による分散分析を使用して実施され得、その場合、値は、Ｐ＜０．０５のとき、有意と判定される。任意の適する方法が、神経構築物からＲＮＡまたはタンパク質を単離するのに使用できる。例えば、全ＲＮＡが、配列決定用としてｃＤＮＡを得るために単離および逆転写され得る。
【００５１】
試験化合物は、本明細書に提示するＡＥＣと接触させる前に、溶媒、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等に溶解され得る。いくつかのケースでは、識別試薬は、遺伝子発現、タンパク質の発現、細胞生存率、および細胞増殖を非限定的に含む、生物学的活性における陽性または陰性の変化について、接触させたＡＥＣを分析するステップを含む。例えば、複数の試験化合物をＡＥＣと接触させる前、間、または後に、遺伝子発現プロファイルを分析するのに、マイクロアレイ法が使用できる。いくつかのケースでは、本発明の方法は、追加の分析、例えば代謝アッセイおよびタンパク質の発現プロファイリング等をさらに含む。
【００５２】
組成物
別の態様では、ＡＥＣの調製物が本明細書に提示される。例えば、ＡＥＣ、実質的に精製されたＡＥＣの集団、ＡＥＣを含む医薬製剤、および凍結保存されたＡＥＣの調製物が、本明細書に提示される。本明細書に記載するＡＥＣは、その天然の環境に見出される少なくとも１つのタンパク質、分子、またはその他の不純物について実質的に非含有であり得る（例えば、「単離された」）。ＡＥＣは、ヒトを含む哺乳動物ＡＥＣであり得る。本発明は、ヒトＡＥＣ、実質的に精製されたヒトＡＥＣの集団、ヒトＡＥＣを含む医薬製剤、および凍結保存されたヒトＡＥＣの調製物も提供する。調製物は、ヒト胚性幹細胞由来のＡＥＣ、ヒトｉＰＳ細胞由来のＡＥＣを含む調製物、および分化後の多能性幹細胞由来のＡＥＣを含む、実質的に精製された（非ＡＥＣに関して）調製物であり得る。
【００５３】
本明細書に提示する細胞調製物は、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの用途、例えば新規血管の工学、心筋再生を目的とする心臓への内皮細胞移植、局所的虚血の治療を目的とする血管形成の誘発、および脈管構造に対して影響、例えば癌進行を減速させる血管形成阻害等を有する薬物のスクリーニングに有用である。ほとんどの血管疾患は動脈に生ずることから（Go et al., 2014）、動脈細胞は、動脈内皮細胞が活性化する様式を調査し、また活性化を防止する薬物をスクリーニングするのに使用でき、これはアテローム性動脈硬化症の理解および治癒を促進するため、疾患のモデリングにおいて極めて有用である。ＡＥＣを得るのがこれまで非常に困難であったので、この細胞は、組織工学により作出された血管グラフトおよび組織移植の予備的血管新生からほとんど除外されており（Bae et al., 2012；Campbell and Campbell, 2007）、これは不良な臨床転帰の一因であったと考えられる。本開示する方法は、ＡＥＣ集団の製造および使用を促進する。
【００５４】
臨床用途で役立つＡＥＣ細胞を含む調製物は、政府機関、例えば米国食品医薬品局等が施行する規則に従い取得しなければならない。したがって、代表的な実施形態では、本明細書に提示する方法は、医薬品製造管理および品質管理基準（ＧＭＰ）、適正組織管理実施基準（ＧＴＰ）、および医薬品安全性試験実施基準（ＧＬＰ）に従い実施される。動物由来の構成成分を含む試薬は使用されず、すべての試薬は、ＧＭＰに準拠する供給元から購入される。細胞療法製品、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏのヒト動脈内皮細胞集団等の臨床製造の環境において、ＧＴＰはドナーの同意、トレーサビリティー、および感染性疾患スクリーニングについて規定し、その場合、ＧＭＰは、一貫して安全かつ有効なヒト使用の製品を製造するための施設、プロセス、試験、および実践法に関連する。Lu et al. Stem Cells 27: 2126-2135 (2009)を参照。該当する場合には、インフォームドコンセントが得られること、安全、生物活性、適切な投与量、および製品の有効性が各相で試験されること、結果が統計的に有意であること、ならびに倫理ガイドラインに従っていることを保証するために、当局および施設パネルによる患者プロトコールの監視が想定される。
【００５５】
別の態様では、ヒト多能性幹細胞由来の中胚葉細胞をＡＥＣに分化させるための培養培地または培養培地を含む培養システムが本明細書に提示され、培養培地は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達の阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）、Ｎｏｔｃｈ作動薬（例えば、レスベラトロール（ＲＥＳＶ））、およびイノシトールモノホスファターゼの阻害剤を含む、またはそれらから実質的になる。代表的な実施形態では、培養培地は、ヒトＦＧＦ２（１００μｇ／ｌ）、ＶＥＧＦ−１６５（５０μｇ／ｌ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＲＥＳＶ（５μＭ）、およびＬ−６９０，３３０（１０μＭ）が補充されたＥ５培地を含む、またはそれらから実質的になる。そのような培養培地はインスリンを含まない。
【００５６】
製品
本発明は、ヒト多能性幹細胞をＡＥＣに分化させるキットであって、（ｉ）ヒト多能性幹細胞を中胚葉細胞に分化させるのに適する第１の培養培地と、（ｉｉ）多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を動脈内皮細胞に分化させるのに適する第２の培養培地と、（ｉｉｉ）ヒト多能性幹細胞をＣＤ３１+／ＣＤ１４４+／ＣＤ４１-／ＣＤ４５-動脈内皮細胞に分化させる方法であって、第１の培養培地および第２の培養培地を利用する方法について記載する説明書とを含むキットも提供する。
別途規定しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載する方法および材料と類似する、または同等の任意の方法および材料が、本発明の実践または試験に使用できるが、好ましい方法および材料が本明細書に記載されている。
【００５７】
本明細書および本特許請求の範囲では、用語「を含む（including）」および「を含む（comprising）」は、非制限的な用語であり、「〜を含むが、これらに限定されない」を意味するものと解釈すべきである。これらの用語は、より限定的な用語「から実質的になる」、および「からなる」を包含する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」には、文脈が別途明確に指示しない限り、複数形への言及も含まれる。同様に、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つまたは複数の」、および「少なくとも１つの」は、本明細書では交換可能に使用できる。用語「を含む（comprising）」、「を含む（including）」、「により特徴付けられる」、および「を有する」は、交換可能に使用できることにも留意されたい。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「から実質的になる培地」とは、規定された成分、および培地の基本的特徴に対して物理的に影響を及ぼさない成分を含有する培地を意味する。
本明細書で使用する場合、「有効量」とは、本発明による規定された細胞の効果を惹起するのに十分な薬剤の量を意味する。
本明細書で使用する場合、「約」とは、記載された濃度範囲、密度、温度、またはタイムフレームの５％以内を意味する。
本発明は、下記の非限定的な実施例について検討すれば、よりよい理解が得られる。開示する方法は、多能性幹細胞に一般的に適するものと特に考えられる。本明細書に開示するすべての文書および特許は、その全体が記載されているかのように、本明細書に参照として組み込まれる。
【実施例】
【００５９】
例１−多能性幹細胞のＡＥＣへの指示された分化に関するプロトコール
動脈の分化を調べるために、血清およびウシ血清アルブミンの両方を欠いている規定された培養培地を使用して、内皮細胞分化プロトコールを策定した。まず、ＢＭＰ４、アクチビン−Ａ、およびＣＨＩＲ９９０２１が補充された培養培地（Ｅ８ＢＡＣ培地）中で、異物を含まない多能性幹細胞を、中胚葉細胞に２日間分化させた。次いで、中胚葉細胞を、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦＡ、およびＢＭＰ４でさらに３日間処理し、７０％のＣＤ３１+／ＣＤ３４+内皮細胞集団を得た（図２Ａ〜Ｂ）。インスリンが、この中胚葉から内皮細胞への分化培地に含まれた。内皮細胞の生死を、ＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ４の下方制御（図２Ｃ）、ＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ２の上方制御、ＣＤ１４４の発現（ＣＤＨ５／ＶＥ−カドヘリン）（図２Ｄ）、ＬＤＬのインターナリゼーション（図２Ｅ）、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの毛細血管ネットワークの形成（図２Ｆ〜Ｇ）によりさらに確認した。このプロトコールを用いて、本発明者らは、完全に規定された培養条件下で、個々の培地構成成分の効果を調べることができた（図２Ｈ）。
【００６０】
ＣＤ３１+／ＣＤ３４+内皮細胞集団の細胞は、ＡＥＣのマーカーをほとんど発現することができなかったので（データ図示せず）、本発明者らは、ＣＤ３１+／ＣＤ１４４+／ＣＤ４１-／ＣＤ４５-内皮細胞の集団をＥ１１．５日マウス胚の胚体中胚葉の大動脈−性腺−中腎（ＡＧＭ）領域から単離した。この細胞を、ＡＧＭから単離して、動脈分化を誘発する能力を有する新たな因子を識別した。
【００６１】
個々の内皮細胞のグローバル遺伝子発現プロファイルを特徴付けるために、ＣＤ３１+／ＣＤ１４４+／ＣＤ４１-／ＣＤ４５-内皮細胞について、単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑを実施した。動脈および静脈の内皮細胞集団を区別するために、動脈マーカー（Ｅｆｎｂ２、Ｃｘｃｒ４、Ｄｌｌ４、Ｇｊａ４、Ｈｅｙ１、Ｊａｇ１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ４、およびＮｒｐ１）、および静脈マーカー（Ａｐｌｎｒ、Ｅｐｈｂ４、Ｆｌｔ４、Ｎｒ２ｆ２、およびＮｒｐ２）のセットを、ＳＩＮＧｕＬＡＲ（商標）分析ツールセットを使用して分析した。多くのマーカーは、動脈群または静脈群のいずれかにクラスタリングされたが、ＡｐｌｎｒおよびＮｏｔｃｈ１はいずれの群にもクラスタリングされなかった（図１Ａ）。この結果は、いくつかの動静脈マーカーは、一時的に非特異的であることを示唆する過去の研究と整合する（Chong et al., 2011）。マーカーの発現に基づき、ＣＤ３１+／ＣＤ１４４+／ＣＤ４１-／ＣＤ４５-内皮細胞を５つの部分集団にクラスタリングした（図１Ａ）。動脈細胞と静脈細胞を区別するために、各部分集団に含まれる動脈および静脈の遺伝子セットの正規化された発現について、その平均値を計算した（図１Ｂ）。集団１（Ｐ１）は、動脈マーカー発現が最高であり、また静脈マーカー発現が最低であったので、動脈内皮細胞として識別した（図１Ｂ）。対照的に、集団３（Ｐ３）は、動脈遺伝子発現が最低であった（図１Ｂ）。主成分分析により、Ｐ１細胞およびＰ３細胞間の明確な分離が明らかとなり（図１Ｃ）、Ｐ３細胞と比較して、Ｐ１細胞（動脈内皮細胞）内で９１８個の遺伝子が富化していることが判明した（ｐ＜０．１、ＦＣ＞２、ＴＭＰ＞１）（表４を参照）。
【００６２】
９１８個の動脈富化遺伝子内の増殖因子関連遺伝子を識別するために、５つのＡｍｉＧｏ遺伝子オントロジーデータ「用語」：増殖因子結合（ＧＯ：００１９８３８）、増殖因子活性（ＧＯ：０００８０８３）、増殖因子受容体結合（ＧＯ：００７０８５１）、受容体活性（ＧＯ：０００４８７２）、および受容体結合（ＧＯ：０００５１０２）を組み合わせた。次いで、組み合わせたリストを、原形質膜遺伝子（ＧＯ：０００５８８６）と交差させて、非細胞表面遺伝子を除去した（図１Ｄならびに表２および４）。得られた４２個の遺伝子の一部は増殖因子またはその受容体ではなかったが、増殖因子シグナル経路の上流または下流に位置した。ＶＥＧＦＡ、Ｗｎｔシグナル伝達（ＦＺＤ４、ＦＺＤ７、ＦＺＤ１０）、およびＮｏｔｃｈシグナル伝達（ＤＬＬ４およびＮｏｔｃｈ４）を含む、いくつかの周知の動静脈制御因子が、これら４２個の遺伝子内に存在した（表２）。
【００６３】
ヒト動脈分化における候補因子を試験するために、本発明者らは、規則的な間隔をあけてクラスタリングされた短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をあけてクラスタリングされた短鎖反復回文配列））−Ｃａｓ９技術を使用して、ヒトＥＳ細胞デュアルレポーター株を作製して、ｔｄＴｏｍａｏを有するＥＦＮＢ２（エフリンＢ２）、およびＥＧＦＰを有するＥＰＨＢ４（エフリンＢ型受容体４）を標的とした（図８Ａ〜８Ｂ）。例えば、Hou et al., 2013を参照。ＥＦＮＢ２およびＥＰＨＢ４はそれぞれ、最も特徴付けがなされている胚性の動脈および静脈内皮細胞マーカーである（Wang et al., 1998）。ＥＦＮＢ２およびＥＰＨＢ４遺伝子座に対する特異的標的化は、ジャンクションＰＣＲおよびサザンブロットにより確認した（図８Ｃ〜８Ｆ）。各レポーターの単一コピーのみがゲノムに組み込まれ（図８Ｇ〜８Ｈ）、レポーター細胞株内でのＥＦＮＢ２およびＥＰＨＢ４の内因性の発現は、野生型細胞内での発現と類似した（図８Ｉ）。核型はデュアル標的化後正常であり（図８Ｊ）、ＤＮＡ配列決定により、野生型対立遺伝子内にはＣＲＩＳＰＲ誘発性の挿入または欠損がないことが判明した。
本発明者らは、ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰデュアルレポーター細胞株を使用して、単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析により識別された個々の増殖因子関連遺伝子の機能を試験した。これまでに記載されているその役割と整合して、ＶＥＧＦＡ、ＷＮＴ３Ａ、およびＲＥＳＶ（Ｎｏｔｃｈ作動薬）は、すべて、動脈の特異化の向上を促進した（図１１）。
【００６４】
本発明者らは、次いで、内皮細胞分化プロトコールで幅広く使用されているので、組換えタンパク質／小分子、例えばインスリン等を添加または除去することにより、内皮細胞分化の間に認められるその他の増殖因子／シグナル伝達経路について調べた。驚くべきことに、中胚葉形成後にインスリンを除去すると、ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏhigh／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰlow細胞数の増加により証明されるように、それはＡＥＣ分化を引き起こす契機となった（図３Ａ〜Ｂ）。インスリンは、動静脈特異化の負の制御因子（Hong et al., 2006）であるＡＫＴを活性化させることができるので（Mackenzie and Elliott, 2014）、本発明者らは、ＡＫＴ活性を調べた。リン酸化されたＡＫＴ（ｐＡＫＴ）は、インスリンの存在により増加し、Ｌｙ２９４００２（ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の可逆的阻害剤）を使用してＰＩ３Ｋ活性を阻害すると、ｐＡＫＴは減少し（図３Ｃ）、そして動脈の分化の間に、インスリンの阻害効果を反転させた（図３Ａ〜３Ｂ）。これらの結果は、インスリン−ＡＫＴ経路は、動脈の分化抑制において重要な役割を演じていたことを実証する。
【００６５】
さらに、本発明者らは、ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏhigh／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰlow細胞の増加により証明されるように、下記の因子は、動脈内皮細胞の分化を増加させることを見出した：ＦＧＦ２、Ｌ−６９０，３３０（イノシトールモノホスファターゼ阻害剤）、およびＬＤＬ（低密度リポタンパク質）（図３Ｆ）。対照的に、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦ−β受容体阻害剤）を除去する、またはＰＤＧＦ−ＢＢを添加すると、動脈の分化は阻害された（図３Ｅ〜３Ｆ）。
【００６６】
これらの結果をさらに確認するために、ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏhigh／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰlow推定動脈内皮細胞、およびＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏlow／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰhigh推定静脈内皮細胞を、ＦＡＣＳによりソーティングし、ＲＴ−ｑＰＣＲにより分析した。動脈の遺伝子は、ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏhigh／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰlow細胞において、有意に上方制御されていた。これらのデータより、ＦＧＦ、Ｌ−６９０，３３０、およびＬＤＬは、ヒト多能性幹細胞の動脈内皮分化を促進する一方、インスリン、ＴＧＦ−β、およびＰＤＧＦは動脈内皮分化を阻害することが実証される。
【００６７】
動脈分化をさらに改善するために、本発明者らは、個々の因子の組合せについて調べた。動脈内皮細胞分化は、化学的に規定された培地（表１の「ＦＶＩＲＬ培地」；図４Ａ〜４Ｂも参照）内でＦＧＦ、ＶＥＧＦＡ、ＳＢ４３１５４２、ＲＥＳＶ、およびＬ−６９０，３３０（「５因子」）を組み合わせることにより、単一の因子を採用した際に観察された分化と比較して大幅に改善した。ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＢ４３１５４２、またはＲＥＳＶを個別に除去すると、ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏhigh／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰlow細胞の減少を引き起こした（図４Ａ〜４Ｂ）。２つのその他の動脈マーカーであるＣＸＣＲ４およびＤＬＬ４は、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＢ４３１５４２、またはＲＥＳＶを除去すると、同様に減少した（図４Ｃ〜４Ｆ）。しかし、ＲＥＳＶもしくはＬ−６９０，３３０を除去すると、またはＰＤＧＦを添加すると、よりわずかなＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏhigh／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰlow推定動脈内皮細胞が得られたが、ＣＤ１４４+ＣＸＣＲ４+およびＣＤ１４４+ＤＬＬ４+細胞の減少は観察されなかった（図４Ｃ〜４Ｆ）。単一の因子としてＷＮＴ３Ａは動脈分化を促進するが、外因性のＷＮＴ３Ａは、その他の５因子の状況において、動脈分化をさらに増加させなかった（図４Ａ〜４Ｆ、図９）。
【００６８】
５因子プロトコールを用いて生成した内皮細胞は、ＬＤＬを取り込み、血管ネットワークを形成し、そのようなネットワーク内でＥＦＮＢ２（エフリンＢ２）の発現を維持した（図５Ｃ〜５Ｄ）。機能的ＡＥＣの別の特徴的な特質は、静脈内皮細胞の特徴的な特質と比較して、白血球接着の減少が挙げられる（Hauser et al., J Immunol 151, 5172-5185 (1993)；Kalogeris et al., Am J Physiol 276, L9-L19 (1999)）。したがって、本発明者らは、炎症促進性サイトカインであるＴＮＦαが異なる種類の内皮細胞内で白血球接着を誘発するその能力について分析した（De Caterina et al., 1995）。
【００６９】
最終的に、本発明者らは、ヒトＥＳ細胞由来のＡＥＣが動脈特異的な機能的特徴を示すかどうか調べた。第１に、「５因子」ＡＥＣは、一次ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）に匹敵するレベルで、およびＨＵＶＥＣ細胞よりもより高いレベルでＮＯを生成した（図７Ａ）。第２に、ＡＥＣは、一次動脈内皮細胞と類似した速度で、およびＨＵＶＥＣ細胞よりも高速度で酸素を消費した（図７Ｂ）。第３に、ＡＥＣは剪断応力に応答して伸長したが、その程度は一次動脈内皮細胞と類似し、またＨＵＶＥＣ細胞よりも大きかった（図７Ｃ〜７Ｄ）。ＡＥＣは、低レベルのＴＮＦα誘発性の白血球接着を示し（Hauser et al., J Immunol 151, 5172-5185 (1993)；Kalogeris et al., Am J Physiol 276, L9-L19 (1999)）、その接着は一次動脈内皮細胞に匹敵し、ＨＵＶＥＣ細胞よりもかなり低かった（図７Ｅ〜７Ｆ）。まとめとして、本発明の結果を総合すると、ＡＥＣは、静脈内皮細胞とは異なるが、動脈内皮細胞と整合する遺伝子発現および機能的特性により特徴付けられることが実証される。
【００７０】
過去の研究より、血管平滑筋は、ＡＣＴＡ２（ＳＭＡ）、ＴＡＧＬＮ（ＳＭ２２ａ）、ＭＹＨ１１、およびＥＬＮを発現することが判明した（Owens et al., Physiol Rev 84, 767-801 (2004)）。本発明者らは、腸および血管の平滑筋細胞を区別するのに、ＣＤ３１が使用できることをさらに実証した。図１２に示す通り、ＭＹＨ１１陽性血管平滑筋が血管に補充される。腸内では、平滑筋細胞は、ＭＹＨ１１およびＣＤ３１の両方を発現し（矢印で示す）、ＭＹＨ１１+ＣＤ３１-細胞は血管平滑筋細胞である一方、ＭＹＨ１１+ＣＤ３１+細胞は腸の平滑筋細胞であることを実証する。
【００７１】
【表２】
2020072722.tif 000006
2020072722.tif 000007
2020072722.tif 000008
【００７２】
材料および方法
単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ用のマウス内皮細胞の単離：２４匹のＥ１１．５マウス（ＣＤ−１バックグラウンド）胚を採取した。頭部、尾部、四肢、内臓、および体節を取り出した。大動脈−性腺−中腎（ＡＧＭ）組織を、２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ型（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７１０４−０１９）、および０．２５ｍｇ／ｍｌのディスパーゼ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７１０５−０４１）を含む溶液中で、酵素が組織に浸透するように、氷上で１５分間インキュベートした。次いで、酵素を含む組織を、３７℃で１０分間インキュベートした。酵素を２％のＦＢＳ−ＨＢＳＳで中和し、上下にピペット吸引して細胞をさらに解離させた。細胞を免疫染色し、ＣＤ３１+ＣＤ１４４+ＣＤ４１-ＣＤ４５-内皮細胞をフローサイトメトリーによりソーティングした。ＣＤ４１およびＣＤ４５を使用して造血幹細胞を枯渇させた。
【００７３】
単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ用のヒト胎児動脈内皮細胞の単離：ヒト胎児大動脈組織（妊娠１４週）を大動脈弓から腹部分岐まで切開した。イェシーバ大学（Ｂｒｏｎｘ、ＮＹ）のアルバート・アインシュタイン医科大学にあるヒト胎児組織レポジトリから組織を得た。この研究を、ＵＷ−Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのＩＲＢ、およびアルバート・アインシュタイン医科大学のＩＲＢから承認を得て実施した。ヒト胎児背側大動脈の外膜層を完全に除去し、そして残りの組織を細かく切断した。次いで、組織を、３００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ／エラスターゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号ＬＫ００２０６７）により、３７℃で１時間消化し、組織を、２０分毎に上下にピペット吸引した。抗ＣＤ３１抗体を使用したフローサイトメトリーにより、内皮細胞をソーティングした。
【００７４】
単一細胞ＲＮＡ配列決定。マウスＡＧＭ細胞では、１５μｌの細胞懸濁物（５×１０4個の細胞を含有する）を、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ1（商標）チップに充填した。ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡライブラリー調製を、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ1（商標）単一細胞自動調製システム上で、製造業者の指示（Ｓｍａｒｔｅｒ−ｓｅｑ１プロトコール）通りに実施した。ｃＤＮＡ濃度を、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡアッセイキット（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｐ７５８９）により測定し、そして０．１〜０．３ｎｇ／μｌに希釈した。Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ＤＮＡサンプル調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＦＣ−１３１−１０２４）を使用してｃＤＮＡをタグ付けし、バーコード印字した。配列決定では（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＨｉＳｅｑ２５００）、１８〜２４個のサンプルをプールした。合計８４個の細胞について配列決定を行った。重複を排除し、外れ値を除去した後、７０個の細胞をさらなる分析に使用した。
【００７５】
「５因子」プロトコールにより誘導したＡＥＣでは、ＣＤ１４４+／ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏhigh／ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰlow細胞をソーティングし、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ1（商標）チップに充填した。上記のようにｃＤＮＡを調製し、配列決定した。合計９６個の細胞について配列決定を行い、さらなる分析に使用した。
一次ＡＥＣ（「ｐＡＥＣ」；１４週齢のヒト胎児背側大動脈から新たに単離した）では、ｃＤＮＡを調製するために、ｓｍａｒｔｅｒ−ｓｅｑ２プロトコールを、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ1（商標）単一細胞自動調製システムに適用した。Ｓｍａｒｔｅｒ−ｓｅｑ２は、ｃＤＮＡ収率および配列決定感度41を改善することが示されており、したがって、ＲＮＡの質が比較的低いサンプルに適する。合計４８個の細胞について配列決定を行い、さらなる分析に使用した。
【００７６】
Ｈ１ＥＳ細胞およびＨＵＶＥＣ細胞を、ｓｍａｒｔｅｒ−ｓｅｑ２プロトコールを使用して、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ1（商標）単一細胞自動調製システムにより調製した。２４個のＨ１細胞および４８個のＨＵＶＥＣ細胞について配列決定を行い、さらなる分析に使用した。
階層的クラスタリング：単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑデータ（ＴＰＭ）をＲＳＥＭから生成した。遺伝子毎に、ｌｏｇ２  ＴＰＭを平均値０およびばらつき１でｚスコアにスケール化した。対数化する前に、１未満のＴＰＭを１とした。細胞間のユークリッド距離を用いて階層的クラスタリングを実施した（図１）。
ＳＩＮＧｕＬＡＲ分析ツールセット２．１によるデータ分析：単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑデータ（ＴＰＭ）をＳＩＮＧｕＬＡＲ分析ツールセット２．１に充填した。外れ値を、「ｉｄｅｎｔｉｆｙＯｕｔｌｉｅｒｓ（）」コマンドにより除去した。次いで、サンプルの動脈および静脈マーカーを、「ａｕｔｏＡｎａｌｙｓｉｓ（）」コマンドにより分析した。その結果、図１ＣのＰＣＡプロットを自動的に生成した。ＡＥＣデータのヒートマップ（図１０）も、ＳＩＮＧｕＬＡＲの「ａｕｔｏＡｎａｌｙｓｉｓ（）」により生成した。
【００７７】
Ｒプログラムによる主成分分析：主成分分析（ＰＣＡ）を単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑデータについて実施した（図５Ｂ）。異なる細胞にわたる配列深度変動を調整するために、期待されるカウントを中央値−比の正規化により正規化した。潜在的な外れ値の効果を低減するために、遺伝子毎に、遺伝子特異的発現の９５番目の分位点を上回る値を、９５番目の分位点を使用して補完した。ＰＣＡ前に、正規化後の遺伝子特異的発現を、すべての遺伝子について、平均値０および標準偏差１の値に再スケール化した。Ｒのｐｒｃｏｍｐ（）関数を使用してＰＣＡ分析を実施した。
【００７８】
増殖因子関連遺伝子リストの生成：Ａｍｉｇｏ  Ｇｏの５つの用語（バージョン１．８）である増殖因子結合（ＧＯ：００１９８３８）、増殖因子活性（ＧＯ：０００８０８３）、増殖因子受容体結合（ＧＯ：００７０８５１）、受容体活性（ＧＯ：０００４８７２）、および受容体結合（ＧＯ：０００５１０２）を組み合わせた。次いで、組み合わせたリストを、原形質膜（ＧＯ：０００５８８６）と連結して、増殖因子関連遺伝子リストを生成した。リストを、表５からの「動脈富化遺伝子」とさらに連結して、表６の動脈富化増殖因子関連遺伝子リストを生成した。
Ｈ１ＥＳ細胞上での遺伝子標的化：ＥＦＮＢ２標的化ベクターの５’および３’ホモロジーアームを、ＩＤＴ（ｇＢｌｏｃｋ）により、Ｓａｌ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉ（５’アーム）制限部位、Ｂｍｔ  ＩおよびＭｌｕ  Ｉ（３’アーム）制限部位を導入しながら合成して、標的化ベクターへのサブクローニングを促進した。ＥＰＨＢ４標的化ベクターの５’および３’ホモロジーアームを、ＢＡＣ（細菌人工染色体）からＰＣＲ増幅した。
【００７９】
最良のエレクトロポレーション効率を実現するために、ヒトＥＳ細胞（Ｈ１）を、ＥＤＴＡで継代し（１：４分割）、実験２日前に８０〜９０％コンフルエンスに到達するように、培養した。実験当日、ＥＳ細胞をアキュターゼ（Accutase）により解離させ、Ｅ８培地で１回洗浄し、そして５×１０6個の細胞／ｍＬの密度で、１０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファーを含むＥ８培地（ｐＨ７．２〜７．５）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁した。エレクトロポレーションでは、４００μＬの細胞懸濁物、７．５μｇのｇＲＮＡプラスミド、７．５μｇのｓｐＣａｓ９プラスミド、および１０μｇの直線化したＤＮＡテンプレートプラスミドを４ｍｍキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で混合し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒで速やかに電気穿孔した。エレクトロポレーションパラメーターは、２５０Ｖ、５００μＦ、および無限抵抗であった。次いで、細胞を、Ｅ８培地中のＭａｔｒｉｇｅｌコーティングプレート上にプレーティングした（第１日目に１０μＭのＹ２７６３２を添加した）。ＥＦＮＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏｍ細胞株では、細胞が２０％コンフルエンスに到達したら（通常、エレクトロポレーション３〜４日後）、１００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Geneticin）を培地に添加し、薬物選択を５日間継続した。ＥＰＨＢ４−ＥＧＦＰ細胞株では、細胞が２０％コンフルエンスに到達したら、０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（puromycin）を培地に添加した。Ｅ８培地中の細胞の薬物感受性に起因して、８時間／日のピューロマイシン処理を５日間実施した。薬物選択４〜６日後に生存するコロニーを採取し、そしてＥ８培地中で増殖させた。
【００８０】
核型分類：核型分類を、ＷｉＣｅｌｌ研究機関（WiCell Research Institute）により実施した。
サザンブロット：ＰＣＲ  ＤＩＧプローブ合成キット（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１  ６３６  ０９０  ９１０）を使用してプローブを合成した。Ｒｏｃｈｅから入手したフィルターハイブリダイゼーションに関するＤＩＧアプリケーションマニュアルに従ってサザンブロットを実施した。
【００８１】
【表３】
2020072722.tif 000009
【００８２】
ヒト多能性幹細胞の培養および分化：ｉＰＳ細胞株００５Ｂ２３．１は、皮膚パンチ線維芽細胞に由来し、組換えビトロネクチンコーティングプレート上で維持した。ＤＦ１９．１１は包皮線維芽細胞に由来した。ＣＤ−３−１は臍帯血細胞に由来した。ＰＢＭＣは末梢血液単核球に由来した。Ｈ１およびＨ９ＥＳ細胞は、男性胚および女性胚にそれぞれ由来した。
【００８３】
ヒト多能性幹細胞では、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングプレート上、Ｅ８培地中で細胞を培養した（００５Ｂ２３．１を除く）。最良の分化結果を実現するために、分化２日前に、ＥＳ細胞をＥＤＴＡにより１：４の比で分割した。２日後に、細胞は８０〜９０％の集密度（confluency）に到達した。分化当日、ＥＳ細胞をアキュターゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、３７℃で３分間解離させた。細胞をビトロネクチンコーティングプレート（組み換えビトロネクチン、１０ｃｍの培養皿１枚当たり５０μｇ）上に１：３の比でプレーティングした（１．１〜１．５×１０5個の細胞／ｃｍ2）。細胞は３６時間後に１００％コンフルエンスに到達した。細胞生存率を改善するために、１０μＭのＹ２７６３２を初日に使用した。Ｅ８ＢＡＣ培地（表３を参照：５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、２５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、および１μＭのＣＨＩＲ９９０２１が補充されたＥ８培地）内で細胞を２日間培養した。次いで、増殖因子または小分子が補充されたＥ６培地（Ｅ８培地からＦＧＦ２およびＴＧＦβ１を除去）を、内皮細胞分化を誘発するのにさらに３日間使用した。培地を毎日交換した。細胞を５日目に採取した。ＣＤ３１+ＣＤ３４+細胞を単離するために、細胞をＣＤ３４磁気ビーズでラベリングし、そしてａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を通じて処理した。精製した細胞をフィブロネクチンコーティング培養皿（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３３０１６−０１５）（１０ｃｍの培養皿１枚当たり１００μｇ）、またはビトロネクチンコーティング培養皿（１０ｃｍの培養皿１枚当たり５０μｇ）上で、Ｅ７Ｖ（Ｅ６＋１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２＋５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＡ）培地を用いて培養した。
【００８４】
動脈内皮細胞の分化および増殖：ＡＥＣ分化に６日を要した。０日目〜２日目に、上記のように、まずヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞を中胚葉細胞に分化させた。２日目〜６日目に、Ｅ５培地を使用し、増殖因子または小分子を示すように添加した。「５因子」の組合せを用い、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、１０μＭのＳＢ４３１５４２、５μＭのＲＥＳＶ、および１０μＭのＬ６９０が補充されたＥ５培地により、ＡＥＣを２日目〜６日目に誘発した。
機能的アッセイの一部について、ＡＥＣをＣＤ１４４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−０９７−８５７）により精製した。最適化後（図９）、ＦＶＩＲ（Ｅ５＋１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、１０μＭのＳＢ４３１５４２、５μＭのＲＥＳＶ）、またはＦＶＩＲ＋Ｉｎｓ（ＦＶＩＲ培地＋１０μｇ／ｍｌのインスリン）培地中、フィブロネクチンまたはビトロネクチンコーティング培養皿上でＡＥＣを維持した。
【００８５】
ＬＤＬ取り込みアッセイ：ＬＤＬ取り込みアッセイを実施するために、２μｇ／ｍｌのアセチル化−ＬＤＬ−ＦＩＴＣを培地に添加し、４時間培養した。画像化する１０分前に、２μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔを培地に添加した。ＣＤ１４４と同時染色するために、抗ＣＤ１４４−６４７抗体を、画像化する２時間前に培地に添加した。培地を除去し、そして生細胞画像化のためにＨＢＳＳを添加した。細胞を固定するとＬＤＬ−ＦＩＴＣシグナルが減退するので、生きている状態で細胞を画像化することが重要である。
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）カプセル化アッセイ：１．５×１０3個の内皮細胞／μｌ、および０．７５×１０3個の周皮細胞／μｌ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号１２００）を、６．５ｍｇ／ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌ中でカプセル化した。１０μＬのＭａｔｒｉｇｅｌ／細胞溶液を２４ウェルプレートの中央にスポットし、凝固させるために３７℃で５分間インキュベートした。次いで、Ｅ７Ｖ培地を適用した。免疫染色を４日目に実施し、そしてＮｉｋｏｎ共焦点顕微鏡を使用して構造を画像化した。
【００８６】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）プラグ血管形成アッセイ：５×１０5個の内皮細胞を１００μｌのＥ７Ｖ培地に再懸濁し、２００μＬのＭａｔｒｉｇｅｌ、次いで３００μＬの細胞／Ｍａｔｒｉｇｅｌ混合物を、ヌードマウスの頸部に皮下注射した。イノキュレーションから２週間後に、Ｍａｔｒｉｇｅｌを採取し、固定化し、免疫染色した。デキストラン注射では、イノキュレーションから４週間後に、１００μｇのローダミン結合デキストランを、マウスに後眼窩注射した。デキストラン注射から１０分後に、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグを採取し、固定化し、免疫染色した。
【００８７】
フィブリンゲルカプセル化アッセイ：１．５×１０3個の内皮細胞／μｌ、および／または０．７５×１０3個の周皮細胞／μｌを、フィブリンゲル内でカプセル化した。２．５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン（ＥＭＤ、カタログ番号３４１５７８）、および０．５Ｕ／ｍｌのトロンビン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ−９３２６）により、フィブリンゲルを調製した。１０μＬのフィブリンゲル／細胞溶液を２４ウェルプレートの中央にスポットし、そして凝固させるために、３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、Ｅ７Ｖ培地を適用した。免疫染色を４日目に実施し、共焦点顕微鏡を使用して構造を画像化した。
酸素誘発性網膜症モデル：実験を、ＵＷ−Ｍａｄｉｓｏｎの眼科学およびビジュアルサイエンス（Ophthalmology and Visual Science）のＩＲＢから承認を得て実施した。これまでの記載の通り21、Ｃ５７／ＢＬ６野生型マウスで酸素誘発性網膜症を誘発した。要するに、出生後７日目に、マウスを７５％の酸素に５日間曝露した。出生後１２日目に、マウスを室内空気に戻し、５×１０4個の細胞を含有する１μｌを硝子体内注射した。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）をビヒクルとして使用し、対照として注射した。５日後に網膜を採取し、免疫染色を実施した。
【００８８】
後肢虚血モデル：ＵＷ−Ｍａｄｉｓｏｎの心血管系生理学コア施設（Cardiovascular Physiology Core Facility）のＩＲＢから承認を得て実験を実施した。これまでの記載の通り22、後肢虚血モデルを生成した。要するに、１０〜１２週齢のメス無胸腺ヌードマウス（Ｃｒｌ：ＮＵ（ＮＣｒ）−Ｆｏｘｎ１nu、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｒｏｉｅｓ、Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を使用した。高齢のマウスほど回復が遅くなり、ヒトの四肢虚血とより類似するので、４〜６週齢の代わりに１０〜２０週齢のマウスを使用した。総腸骨動脈を腹腔内で結紮し、鼠径靭帯に対してすぐ尾部側で大腿動脈を２箇所結紮し、取り出した。手術直後に、マウスを無作為に４群に割り振り、細胞またはＤＦ１２培地を注射した。細胞（マウス１匹当たり０．３×１０6個、１×１０6個、または３×１０6個の細胞）を、３００μｌのＤＦ１２培地に懸濁し、虚血脚部の大腿薄筋の６部位に筋肉内注射した。１日当たり７〜８匹のマウスに手術を実施した。
【００８９】
一酸化窒素生成アッセイ：内皮細胞をビトロネクチンコーティング２４ウェルプレートに播種した（１×１０5個の細胞／ウェル）。ＡＥＣをＦＶＩＲ＋Ｉｎｓ培地中で培養した。ＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ−２５１９）をＥＧＭ２（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ−３２０２）培地中で培養した。ＨＣＡＥＣ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ−２５８５）をＥＧＭ２培地中で１日培養し、次いでＦＶＩＲ＋Ｉｎｓ培地中でもう１日培養した。２日後、すべての培地を１μＭのＤＡＦ−ＦＭを含有する新鮮なＦＶＩＲ＋Ｉｎｓ培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｄ−２３８４４）に交換した。細胞を３０分間培養し、次いでフローサイトメトリー分析用に採取した。ＤＡＦ−ＦＭは、ＮＯと反応して蛍光ベンゾトリアゾールを形成するまで非蛍光性である。一貫した結果を実現するために、ＤＡＦ−ＦＭを添加した後、同一の細胞密度および同一の培地を使用することが重要である。
【００９０】
酸素消費アッセイ法：４×１０4個の細胞／ウェルを、ＸＦ２４ウェルプレート（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上に一晩播種した。ＡＥＣをＦＶＩＲ培地中で培養し、ＨＣＡＥＣおよびＨＵＶＥＣをＥＧＭ２培地中で培養した。１日後、培地をＭｉｔｏアッセイ培地（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に変更し、酸素消費速度をＸＦ２４アナライザーにより、製造業者の説明（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従い測定した。オリゴマイシン（０．５μＭ）をタイムポイント３において注射して、ＡＴＰ−シンターゼを阻害することにより、酸素消費を無効にした。ＦＣＣＰ（２μＭ、ミトコンドリア脱カップリング剤）をタイムポイント６において注射して、酸化的リン酸化から電子伝達鎖を脱カップリングさせ、したがって最大呼吸能を測定した。非ミトコンドリア呼吸を測定するために、タイムポイント９において、１μＭのアンチマイシンＡおよび１μＭのロテノンを同時に適用して、チトクロームｂｃ１（複合体ＩＩＩ）およびＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（複合体Ｉ）のそれぞれにおいて電子伝達鎖を完全に遮断した。
【００９１】
剪断応力応答：ｉｂｉｄｉポンプシステム（Ｒｅｄ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｓｅｔ、μ−ＳｌｉｄｅＶＩ０．４）を使用して、剪断応力応答についてアッセイした。μ−Ｓｌｉｄｅのチャンネル毎に、３０μｌの細胞懸濁物（５×１０5個の細胞／ｍｌ、１０μＭのＹ２７６３２を含む）を充填した。細胞が付着した後、１３０μｌの新鮮な培地を各チャンネルに添加した。２日後、μ−Ｓｌｉｄｅをｉｂｉｄｉポンプシステムにより灌流した。２４時間潅流した後、細胞を採取し、免疫染色した。
ＦＶＩＲ＋Ｉｎｓ培地は内皮細胞の伸長を促進したので、２４時間剪断応力応答実験の前および間に、Ｅ７Ｖ培地を、「５因子」ＡＥＣを培養するのに使用した。
【００９２】
白血球接着アッセイ：すべての内皮細胞をフィブロネクチンコーティング２４ウェルプレート上で培養した。ＡＥＣをＦＶＩＲ培地中で培養した；ＨＵＶＥＣおよびＨＣＡＥＣをＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ）中で培養した。細胞が１００％コンフルエンスに到達したら、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを含めて、または含めないで細胞を４時間処理した。次いで、１×１０6個のＵ９３７細胞を０．５ｍｌの新鮮なＲＭＰＩ１６４０＋１０％のＦＢＳに懸濁し、各ウェルに添加した。２０〜６０分後、冷却培地（ＲＭＰＩ１６４０＋１０％のＦＢＳ）を使用して、非付着性の細胞を緩やかに洗い流した。洗浄をさらに２回繰り返した。細胞を速やかに画像化した。
【００９３】
抗体試薬：抗マウスＣＤ４１−ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１３３９０４）、抗マウスＣＤ４５−ＦＩＴＣ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０７１０）、抗マウスＣＤ１４４−ＰＥ（ＢＤ、カタログ番号５６２２４３）、抗マウスＣＤ３１−ＡＰＣ（ＢＤ、カタログ番号５５１２６２）、抗ヒトＣＤ３１−ＦＩＴＣ（ＢＤ、カタログ番号５５５４４５）、抗ヒトＣＤ３１−Ｖ４２１（ＢＤ、カタログ番号５６４０８９）、抗ヒトＣＤ３１−ＰＥ（ＢＤ、カタログ番号５５５４４６）、抗ヒトＣＤ３４−６４７（ＢＤ、カタログ番号５５５８２４）、抗ヒトＣＤ１４４−６４７（ＢＤ、カタログ番号５６１５６７）、抗ヒトＤＬＬ４−ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９６−５６０）、抗ヒトＣＸＣＲ４−ＡＰＣ（ＢＤ、カタログ番号５６０９３６）、抗ＣＤ３４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０−０４６−７０３）、抗ＣＤ１４４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０−０９７−８５７）、抗ｐＡＫＴ（ｓｅｒ４７３）（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号４０６０）、抗ＡＫＴ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号４６９１）、抗ＧＡＰＤＨ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＭＡＢ３７４）。
【００９４】
参考資料
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2020072722.tif 000011
【００９５】
本発明は、最も実用的で好ましい実施形態であると現在考えられることと関連付けて記載してきた。しかし、本発明は例示目的で提示されており、開示される実施形態に限定するようには意図されない。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に記載する本発明の精神および範囲内のすべての修正および代替形態を包含するように意図されているものと、当業者は認識する。
【００９６】
【表４】
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【図１Ａ−１Ｄ】
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【図２Ａ−２Ｈ】
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【図３Ａ−３Ｆ】
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【図４Ａ−４Ｈ−１】
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【図４Ａ−４Ｈ−２】
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【図５Ａ−５Ｇ−１】
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【図５Ａ−５Ｇ−２】
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【図６Ａ−６Ｆ−１】
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【図６Ａ−６Ｆ−２】
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【図７Ａ−７Ｆ−１】
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【図７Ａ−７Ｆ−２】
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【図８Ａ−８Ｊ−１】
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【図８Ａ−８Ｊ−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−１１Ｃ】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月10日(2020.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
【表４】
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本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕動脈内皮細胞を得る方法であって、
インスリンを実質的に含まず、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ならびにＮｏｔｃｈ作動薬、ＴＧＦ−ベータ阻害剤、およびイノシトールモノホスファターゼの阻害剤のうちの少なくとも１つを含む、血清非含有、アルブミン非含有の化学的に規定された培養培地中で、中胚葉細胞を培養することにより、動脈内皮細胞を含む細胞集団を得るステップ
を含み、
該集団の動脈内皮細胞が、エフリンＢ２（ＥＦＮＢ２）、ニューロピリン１（ＮＲＰ−１）、デルタ様４（ＤＬＬ４）、ＣＤ４４、ＣＸＣＲ４／ＣＤ１８４、Ｇａｐ結合タンパク質α−４（ＧＪＡ４）、Ｈｅｙ１、ジャギド−１（ＪＡＧ１）、Ｎｏｔｃｈ１、およびＮｏｔｃｈ４からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを発現する、方法。
〔２〕細胞集団が、少なくとも８０％の動脈内皮細胞を含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕血清非含有、アルブミン非含有の化学的に規定された培養培地が、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｎｏｔｃｈ作動薬、ＴＧＦ−ベータ阻害剤、およびイノシトールモノホスファターゼの阻害剤を含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔４〕中胚葉細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）、ＥＭＯＳ、ＦＯＸＡ２、ＭＩＸＬ１、ＭＳＸ１、およびＭＳＸ２からなる群から選択される１つまたは複数の中胚葉マーカーを発現する、前記〔１〕に記載の方法。
〔５〕骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビンＡ、およびＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化因子を含む、血清非含有、アルブミン非含有の化学的に規定された細胞培養培地中で、ヒト多能性幹細胞を約２日の期間わたり培養して、中胚葉細胞を含む細胞集団を得ることによって、中胚葉細胞が得られる、前記〔１〕に記載の方法。
〔６〕中胚葉細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）、ＥＭＯＳ、ＦＯＸＡ２、ＭＩＸＬ１、ＭＳＸ１、およびＭＳＸ２からなる群から選択される１つまたは複数の中胚葉マーカーを発現する、前記〔５〕に記載の方法。
〔７〕多能性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞またはヒト誘導多能性幹細胞である、前記〔５〕に記載の方法。
〔８〕Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化因子が、Ｇｓｋ３阻害剤である、前記〔５〕に記載の方法。
〔９〕Ｇｓｋ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＢＩＯ−アセトキシム、ＢＩＯ、ＬｉＣｌ、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＡＲＡ０１４４１８、１−アザケンパウロン、およびビス−７−インドリルマレイミドからなる群から選択される、前記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕Ｎｏｔｃｈ作動薬が、レスベラトロール（３，４’，５−トリヒドロキシスチルベン）、バルプロ酸、およびスベロイルビスヒドロキサム酸からなる群から選択される、前記〔５〕に記載の方法。
〔１１〕ＴＧＦ−ベータ阻害剤が、ＳＢ４３１５４２である、前記〔５〕に記載の方法。
〔１２〕イノシトールモノホスファターゼの阻害剤が、Ｌ−６９０，３３０である、前記〔５〕に記載の方法。
〔１３〕前記〔１〕に記載の方法に従って得られた、実質的に純粋な、動脈内皮細胞の単離された集団。
〔１４〕少なくとも９０％の動脈内皮細胞を含む、前記〔１３〕に記載の単離された集団。
〔１５〕少なくとも９９％の動脈内皮細胞を含む、前記〔１３〕に記載の単離された集団。
〔１６〕前記〔５〕の方法に従って得られた、実質的に純粋な、多能性幹細胞に由来する動脈内皮細胞の単離された集団。
〔１７〕少なくとも９０％の動脈内皮細胞を含む、前記〔１６〕に記載の単離された集団。
〔１８〕少なくとも９９％の動脈内皮細胞を含む、前記〔１６〕に記載の単離された集団。
〔１９〕薬剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験薬剤を、前記〔１〕に記載の方法に従って得られた動脈内皮細胞と接触させるステップと、
（ｂ）接触させた動脈内皮細胞への白血球の接着に対する該薬剤の効果を検出するステップと
を含む方法。
〔２０〕検出するステップが、白血球接着アッセイ、ＲＮＡ配列決定、遺伝子発現プロファイリング、トランスクリプトーム解析、メタボローム解析、レポーターまたはセンサーの検出、タンパク質発現プロファイリング、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、メタボリックプロファイリング、およびマイクロダイアリシスからなる群から選択される方法を実施するステップを含む、前記〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕工学的に作出された組織構築物を血管化させる方法であって、前記〔１〕に記載の方法に従って得られた動脈内皮細胞を、工学的に作出された組織構築物と接触させるステップを含む方法。
〔２２〕工学的に作出された組織構築物が、血管平滑筋細胞を含む、前記〔２１〕に記載の方法。
〔２３〕動脈内皮細胞を得るためのキットであって、（ｉ）中胚葉細胞を動脈内皮細胞に分化させるのに適する血清非含有、アルブミン非含有の化学的に規定された培養培地であって、インスリンを実質的に含まず、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ならびにＮｏｔｃｈ作動薬、ＴＧＦ−ベータ阻害剤、およびイノシトールモノホスファターゼの阻害剤のうちの少なくとも１つを含む、培養培地と、（ｉｉ）該培養培地を利用する、中胚葉細胞を動脈内皮細胞に分化させる方法を説明する説明書とを含む、キット。
〔２４〕（ａ）ヒト多能性幹細胞を中胚葉細胞に分化させるのに適する、血清非含有、アルブミン非含有の化学的に規定された培養培地であって、ＢＭＰ、アクチビンＡ、およびＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化因子を含む、培養培地と、
（ｂ）ヒト多能性幹細胞を動脈内皮細胞に分化させる方法であって、（ａ）の培養培地を利用する方法について記載する説明書と
をさらに含む、前記〔２３〕のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動脈内皮細胞を得る方法であって、
インスリンを実質的に含まず、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ならびにＮｏｔｃｈ作動薬、ＴＧＦ−ベータ阻害剤、およびイノシトールモノホスファターゼの阻害剤のうちの少なくとも１つを含む、血清非含有、アルブミン非含有の化学的に規定された培養培地中で、中胚葉細胞を培養することにより、動脈内皮細胞を含む細胞集団を得るステップ
を含み、
該集団の動脈内皮細胞が、エフリンＢ２（ＥＦＮＢ２）、ニューロピリン１（ＮＲＰ−１）、デルタ様４（ＤＬＬ４）、ＣＤ４４、ＣＸＣＲ４／ＣＤ１８４、Ｇａｐ結合タンパク質α−４（ＧＪＡ４）、Ｈｅｙ１、ジャギド−１（ＪＡＧ１）、Ｎｏｔｃｈ１、およびＮｏｔｃｈ４からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを発現する、方法。
【外国語明細書】
2020072722000001.pdf