(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物を高純度で効率的に得る製造方法の提供。【解決手段】式（２）2020037522.tif 000021のビオチンとハロゲン化物とを反応させて、式（４）2020037522.tif 000022（式中Ｒはアルキル基等）のエステル化合物を得、次いで加水分解する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
2020037522.tif 000017
（式中、Ｒは、炭素数１〜２０の置換、又は非置換のアルキル基、又は炭素数１〜２０の置換、又は非置換のアラルキル基である）
で示されるＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物の製造方法であって、
非プロトン性極性溶媒、及び塩基の存在下、下記式（２）
【化２】
2020037522.tif 000018
で示されるビオチンと下記式（３）
【化３】
2020037522.tif 000019
（式中、Ｒは前記式（１）と同義であり、Ｘはハロゲン原子である）
で示されるハロゲン化物とを反応させて、下記式（４）
【化４】
2020037522.tif 000020
（式中、Ｒは前記式（１）と同義である。）
で示される、Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物を得、
次いで、得られたＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物を加水分解することにより、前記式（１）で示されるＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物を得るＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物の製造方法。
【請求項２】
前記式（３）におけるＲがベンジル基、α―メチルベンジル基、４−メトキシベンジル基、４−ニトロベンジル基である請求項１記載のＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物の製造方法。
【請求項３】
前記塩基が、水酸化アルカリ金属塩であり、前記非プロトン性極性溶媒として、ジメチルスルホキシドを用い、且つ、前記式（３）におけるＸが塩素原子である請求項１又は２記載のＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物の製造方法。
【請求項４】
前記式（２）に示されるビオチン１モルに対し、塩基を３．０〜１０．０モル、前記式（３）で示されるハロゲン化物を２．０〜１０．０モル用いる請求項１〜３記載のＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物の新規な製造方法に関する。詳しくは、タンパク質の標識物質や、ウイルス逆転写酵素阻害剤として有用なＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物を高純度で効率的に得る製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
下記式（２）
【０００３】
【化１】
2020037522.tif 000002
【０００４】
で示されるビオチンは、ビオチンは、糖尿病予防効果等が期待される医薬品、及び飼料添加剤等に使用される水溶性ビタミンである。また、ビオチンのＮ、Ｎ’−ジ置換体（以下、「Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物」と言う）は、タンパク質の標識物質（特許文献１及び非特許文献１参照）、ウイルス逆転写酵素阻害剤（非特許文献１参照）などとして有用な化合物である。
【０００５】
上記Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物は、ビオチン製造時の合成中間体として製造される。例えば、Ｎ、Ｎ’−ジベンジルビオチンは、以下の合成ルートにより製造される。
【０００６】
【化２】
2020037522.tif 000003
【０００７】
一方、Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物の製造方法として、ビオチンのＮ，Ｎ’−ジ置換化反応による製造方法も知られている。例えば、非特許文献１のＳｕｐｐｏｔｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、ビオチンに塩基として存在下、ベンジルブロマイドを接触させる方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１０／１０６３４７号公報
【特許文献２】米国特許第５７６３４６９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２０１５，３１，１２５７３−１２５７８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上記方法を本発明者らが追試したところ、目的物のＮ，Ｎ’−ジベンジルビオチンの他、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルビオチンエステルが副生し、収率的にも満足いくものでないことが判明した。したがって、本発明の目的は、高純度のＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物を効率的に得る製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。前記文献記載の方法では、ビオチン１当量に対し、塩基として水素化ナトリウム２．４当量、ベンジルブロマイドを２．４当量用いている結果、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルビオチンの他に、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルビオチンベンジルエステルが副生することに着目し、予めＮ，Ｎ’−ジベンジルビオチンベンジルエステルを生成せしめた後、加水分解によって脱ベンジルエステル化を行うことで、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルビオチンを高収率で且つ高純度で得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、下記式（１）
【００１２】
【化３】
2020037522.tif 000004
【００１３】
（式中、Ｒは、炭素数１〜２０の置換、又は非置換のアルキル基、又は炭素数１〜２０の置換、又は非置換のアラルキル基である）
で示されるＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物の製造方法であって、
非プロトン性極性溶媒、及び塩基の存在下、下記式（２）
【００１４】
【化４】
2020037522.tif 000005
【００１５】
で示されるビオチンと下記式（３）
【００１６】
【化５】
2020037522.tif 000006
【００１７】
（式中、Ｒは前記式（１）と同義であり、Ｘはハロゲン原子である）
で示されるハロゲン化物とを反応させて、下記式（４）
【００１８】
【化６】
2020037522.tif 000007
【００１９】
（式中、Ｒは前記式（１）と同義である。）
で示される、Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物を得、
次いで、得られたＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物を加水分解することにより、前記式（１）で示されるＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物を得るＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物の製造方法である。
【００２０】
上記本発明のＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物の製造方法では以下の態様を好適に採りうる。
（１）前記式（３）におけるＲがベンジル基、α―メチルベンジル基、４−メトキシベンジル基、４−ニトロベンジル基であること。
（２）前記塩基が、水酸化アルカリ金属塩であり、前記非プロトン性極性溶媒として、ジメチルスルホキシドを用い、且つ、前記式（３）におけるＸが塩素原子であること。
（３）前記式（２）に示されるビオチン１モルに対し、塩基を３．０〜１０．０モル、前記式（３）で示されるハロゲン化物を２．０〜１０．０モル用いること。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の方法によれば、Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物を高収率かつ高純度に製造することができる。特に、非プロトン性極性溶媒として、ジメチルスルホキシドを用いることで、塩基として水酸化アルカリ金属塩を、またハロゲン化物としてベンジルクロリド等のクロリドを用いてＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物を得ることが可能となり、比較的温和で安全性の高い原料を用いてＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物を製造することが可能であり、工業的に効率良くＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の製造方法では、
非プロトン性極性溶媒、及び塩基の存在下、下記式（２）
【００２３】
【化７】
2020037522.tif 000008
【００２４】
で示されるビオチンと下記式（３）
【００２５】
【化８】
2020037522.tif 000009
【００２６】
（式中、Ｒは前記式（１）と同義であり、Ｘはハロゲン原子である）
で示されるハロゲン化物とを反応させて、下記式（４）
【００２７】
【化９】
2020037522.tif 000010
【００２８】
（式中、Ｒは前記式（１）と同義である。）
で示される、Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物を得、
次いで、得られたＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物を加水分解することにより、前記式（１）で示されるＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物を得る。
【００２９】
（Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物）
本発明の製造方法では、下記式（１）
【００３０】
【化１０】
2020037522.tif 000011
【００３１】
（式中、Ｒは、炭素数１〜２０の置換、又は非置換のアルキル基、又は炭素数１〜２０の置換、又は非置換のアラルキル基である）
で示されるＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物を得る。
【００３２】
前記式中Ｒは炭素数１〜２０のアルキル基、又はアラルキル基である。かかる基として具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基等のアルキル基、ベンジル基、α―メチルベンジル基、ジフェニルメチル基、トリチル基・・・等のアラルキル基が好適に挙げられる。また、上記アルキル基、又はアラルキル基は非置換であっても、基の一部が置換されていても良い。置換基を有する場合において、置換基を含めた炭素数が１〜２０の範囲にあれば良い。かかるアルキル基、又はアラルキル基の置換基として具体的には、メチル基、エチル基等のアルキル基、メトキシ基、メトキシメチル基等のアルコキシ基、クロロ基、ブロモ基等のハロゲン原子、ニトロ基、ベンジルオキシ基等のアラルキルオキシ基等が挙げられる。
【００３３】
上記Ｒの中でも、タンパク質の標識物質やウイルス逆転写酵素阻害剤等の用途の観点から、ベンジル基、α―メチルベンジル基、４−メトキシベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、４−ニトロベンジル基、４−クロロベンジル基、メトキシメチル基、ベンジルオキシメチル基から選ばれる１種を好適に用いることができ、特にベンジル基、α―メチルベンジル基、４−メトキシベンジル基、４−ニトロベンジル基が最も好適に用いることができる。
【００３４】
（ハロゲン化物）
本発明の製造方法に用いるハロゲン化物は、下記式（３）
【００３５】
【化１１】
2020037522.tif 000012
【００３６】
（式中、Ｒは前記式（１）と同義であり、Ｘはハロゲン原子である）
で示される。上記式（３）におけるＲは前記Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物に記載されたものを好適に用いることができる。またＸで示されるハロゲン原子としては、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
【００３７】
上記本発明の製造方法に用いるハロゲン化物として具体的には、ベンジルクロライド、α―メチルベンジルクロライド、４−メトキシベンジルクロライド、３，４−ジメトキシベンジルクロライド、４−ニトロベンジルクロライド、４−クロロベンジルクロライド、メトキシメチルクロライド、ベンジルオキシメチルクロライド等のクロライド；ベンジルブロマイド、α―メチルベンジルブロマイド、４−メトキシベンジルブロマイド、３，４−ジメトキシベンジルブロマイド、４−ニトロベンジルブロマイド、４−クロロベンジルブロマイド、メトキシメチルブロマイド、ベンジルオキシメチルブロマイド等のブロマイド；α―メチルベンジルアイオダイド、４−メトキシベンジルアイオダイド、３，４−ジメトキシベンジルアイオダイド、４−ニトロベンジルアイオダイド、４−クロロベンジルアイオダイド、メトキシメチルアイオダイド、ベンジルオキシメチルアイオダイド等のアイオダイドが挙げられる。
【００３８】
上記ハロゲン化物の使用量は、反応が進行するに十分な量を用いれば良く、ビオチン１モルに対して、好ましくは、２．０〜１０モル、より好ましくは、３．０〜８．０モル、特に好ましくは、４．０〜７．０モルの範囲で用いることが好適である。
【００３９】
なお、ハロゲン化物の使用量がビオチン１モルに対して３モル未満である場合には、Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物とＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物の混合物が得られるが、得られた混合物を加水分解に供することで、高純度のＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物を得ることができる。
【００４０】
（塩基）
本発明の製造方法に用いる塩基としては、求核置換反応に用いる塩基を好適に用いることができる。かかる塩基として具体的には、水素化ナトリウム、水素化カリウム・・・等の水素化アルカリ塩；ｔ−ブトキシカリウム、ｔ−ブトキシナトリウム・・・等のアルカリ金属アルコキシド；水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム等の水酸化アルカリ金属塩等が挙げられる。これらの塩基の中でも温和な条件で製造できる点から、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム等の水酸化アルカリ金属塩を用いることが好適である。
【００４１】
上記塩基の使用量は、反応が進行するに十分な量を用いれば良く、ビオチン１モルに対して、好ましくは、２．０〜１０モル、より好ましくは、３．０〜８．０モル、特に好ましくは、４．０〜７．０モルの範囲で用いることが好適である。
【００４２】
（非プロトン性極性溶媒）
本発明の製造方法に用いる非プロトン性極性溶媒としては、求核置換反応に用いる非プロトン性極性溶媒を好適に用いることができる。かかる非プロトン性極性溶媒として具体的には、アセトニトリル、プロピオニトリル、ＴＨＦ、２−メチル−ＴＨＦ、酢酸エチル、酢酸ブチル、Ｎ−Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が挙げられる。
これらの溶媒は単独で使用しても或いは上記溶媒の混合溶媒としても良い。また、後述する他の溶媒との混合溶媒として用いても良い。かかる非プロトン性極性溶媒中でも、ＴＨＦ、ジメトキシエンタン、ＤＭＦ、ＤＭＡ、ＮＭＰ、ＤＭＳＯ及びＤＭＳＯを含む混合溶媒が好適であり、さらに反応性の点からＤＭＳＯ及びＤＭＳＯの混合溶媒を用いることが特に好適である。
【００４３】
（その他の溶媒）
上記非プロトン性極性溶媒と混合して用いる溶媒として具体的には、１，４−ジオキサン、ｔ−ブチルーメチルエーテル、ジメトキシエタン、ジグライム、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン、クロロベンゼン、トルエン、キシレン等が挙げられる。
【００４４】
本発明の製造方法において、溶媒の使用量は、反応容器の容量等を勘案して適宜決定すれば良いが、通常ビオチン１質量部に対して、１〜１００容量部の範囲で用いれば良い。
【００４５】
（塩基、ハロゲン化物、非プロトン性極性溶媒の好適な組み合わせ）
本発明の製造方法では、上記した塩基、ハロゲン化物、及び非プロトン性極性溶媒を各々組み合わせて用いることが可能である。特に非プロトン性溶媒としてＤＭＳＯ及びＤＭＳＯを含む混合溶媒を用いた場合には、反応性が高く、塩基として水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム等の水酸化アルカリ金属塩を用いることが特に好適である。
【００４６】
なお、塩基として上記水酸化アルカリ金属塩を用いた場合、ハロゲン化物としてブロミド及びヨージドを用いると、ブロミド及びヨージドが水酸化アルカリ金属塩で水酸化されて分解する虞があるため、かかる場合には、ハロゲン化物としてクロリドを用いることが好適である。
【００４７】
（反応条件）
本発明の製造方法における反応温度、及び反応時間については、通常−７８〜１００℃、好ましくは、−２０〜５０℃の温度範囲で、０．５〜４８時間の範囲で適宜設定すれば良い。上記の反応により下記式（４）
【００４８】
【化１２】
2020037522.tif 000013
【００４９】
（式中、Ｒは前記式（１）と同義である。）
で示される、Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物を得る。
【００５０】
得られた上記Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物を加水分解することにより、前記式（１）で示されるＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物を得ることができる。加水分解は、上記Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物を得た反応液からそのまま加水分解を行ってもよいし、Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物を単離した後、加水分解を行ってもよい。
【００５１】
Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物を単離する方法としては、反応後、反応液を氷水中に加え、酸を加えて酸性にした後、酢酸エチルなどの有機溶媒でＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物で抽出後、洗浄、濃縮することにより、Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物を得ることができる。本発明の製造方法では、得られたＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物をそのまま加水分解に供してもよいが、該エステル化合物を精製した後、加水分解に供してもよい。かかる場合の精製方法としては、自動分取精製装置を用いたシリカゲルカラム精製等が挙げられる。
【００５２】
（加水分解）
本発明の製造方法では、上記方法により得られたＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物を加水分解することにより、前記式（１）で示されるＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物を得る。加水分解の方法としては、エステル化合物の加水分解方法を特に制限無く採用することができる。
【００５３】
例えば、上記Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物を得た反応液からそのまま加水分解を行う場合には、該反応液がアルカリ性であることから、水を加えることで加水分解を行うことができる。加水分解反応後は、酢酸エチルなどの有機溶媒で中性不純物を除去後、酸を加えて酸性にした後、酢酸エチルなどの有機溶媒で抽出後、洗浄、濃縮することにより、Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物を得ることができる。
【００５４】
或いは、得られたＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチンエステル化合物をメタノール等の有機溶媒に溶解した後、水酸化アルカリ金属塩を加えて加水分解を行うことができる。反応終了後、メタノールの有機溶媒を減圧留去し、得られたＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物のアルカリ金属塩水溶液を有機溶媒で洗浄し、中性不純物を除去後、酸を加えて酸性にした後、酢酸エチルなどの有機溶媒で抽出後、洗浄、濃縮することにより、Ｎ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物を得ることができる。
【００５５】
上記加水分解により、高純度のＮ、Ｎ’−ジ置換ビオチン化合物を得ることができるが、自動分取精製装置を用いたシリカゲルカラム精製等により精製することも可能である。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５７】
実施例１
以下の反応式に示すＮ、Ｎ’−ジベンジルビオチンエステル（ＨＶＣ）を合成した。
【００５８】
【化１３】
2020037522.tif 000014
【００５９】
窒素雰囲気下、水素化ナトリウム（６０％、２．７０ｇ、６７．５ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、８０ｍＬ）に２５℃で加え縣濁させた。この懸濁液を０℃に冷やし、ビオチン（５．０ｇ、２０．５ｍｍｏｌ）を加えて、同温で、４０分間攪拌した。ここへ、ベンジルブロミド（７．３４ｇ、４３．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液を０℃で加え、２５℃で２２時間攪拌した。
【００６０】
反応終了後、反応液を氷水中に加え、１０％塩酸でｐＨ１に調整した。ここへ酢酸エチル（３００ｍＬ）を加えて分液し、得られた水層を再度酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合し、水洗（３ｘ３００ｍＬ）後、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上乾燥させた。有機層を濃縮することにより、ＨＶＣの粗体（１２．３ｇ）を得た。
【００６１】
この粗体にメタノール（４０ｍＬ）と水（２０ｍＬ）を加えて溶解させ、０℃で水酸化ナトリウム（２．０５ｇ、５１．２ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で６９時間攪拌した。
【００６２】
反応終了後、反応液を濃縮した。濃縮残渣に水（７００ｍＬ）を加えて溶解させ、水層をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（２００ｍＬ）で洗浄した。水層を０℃に冷やし、１０％塩酸でｐＨ１に調整した。ここへ酢酸エチル（４００ｍＬ）を加えて分液し、得られた水層を再度酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合し、水洗（３ｘ３００ｍＬ）、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄、硫酸マグネシウム上乾燥および、減圧濃縮後、Ｉｓｏｌｅｒａ（バイオタージ社）（溶出溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１／２）で精製することにより、ＨＶＣ（７．５０ｇ、８６．４％）を得た。
【００６３】
比較例１（非特許文献１の方法の追試）
以下の反応式に示すＮ、Ｎ’−ジベンジルビオチンエステル（ＨＶＣ）を合成した。
【００６４】
【化１４】
2020037522.tif 000015
【００６５】
実施例１で、水素化ナトリウム２．４当量、ベンジルブロミド２．４当量に変えて、他は同じ反応、処理を行った。この時、ＨＶＣの収率は、２３％だった。
【００６６】
実施例２
以下の反応式に示すＮ、Ｎ’−ジベンジルビオチンエステル（ＨＶＣ）を合成した。
【００６７】
【化１５】
2020037522.tif 000016
【００６８】
ビオチン（１．０ｇ、４．０９ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、２０ｍＬ）に溶解させ、２５℃で、水酸化カリウム（７５８ｍｇ、１３．５ｍｍｏｌ）を加えた。ここへ同温で、ベンジルクロリド（１．５５ｍＬ、１３．５ｍｍｏｌ）を加えて１５時間攪拌した。
【００６９】
反応終了後、０℃で１０％塩酸を加え、ｐＨ１に調整した。ここへ酢酸エチル（８０ｍＬ）を加えて分液し、得られた水層を再度酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合し、水洗（３ｘ１００ｍＬ）後、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上乾燥させた。有機層を濃縮することにより得た濃縮残渣にメタノール（８ｍＬ）と水（４ｍＬ）を加えて溶解させ、０℃で水酸化ナトリウム（０．４１ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１７時間攪拌した。
【００７０】
反応終了後、反応液を濃縮した。濃縮残渣に水（１４０ｍＬ）を加えて溶解させ、水層をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（４０ｍＬ）で洗浄した。水層を０℃に冷やし、１０％塩酸でｐＨ１に調整した。ここへ酢酸エチル（８０ｍＬ）を加えて分液し、得られた水層を再度酢酸エチル（２０ｍＬ）で抽出した。有機層を合し、水洗（３ｘ６０ｍＬ）、飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄、硫酸マグネシウム上乾燥および、減圧濃縮後、Ｉｓｏｌｅｒａ（バイオタージ社）（溶出溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１／２）で精製することにより、ＨＶＣ（１．２３ｇ、７１．０％）を得た。