(57)【要約】【課題】ジンセノサイドまたはその前駆体生産用組換え酵母を提供すること。また、前記組換え酵母を製造する方法を提供すること。また、前記組換え酵母を用いてジンセノサイドまたはその前駆体を高収率で生産する方法を提供すること。【解決手段】本発明は、ジンセノサイド生産能を有する酵母においてＩＮＯ２及びＩＮＯ４を過発現させたり、ＯＰＩ１を除去してジンセノサイド生産能が向上した組換え酵母及び前記酵母の製造方法と、前記酵母を用いてジンセノサイドを生産する方法に関する。【選択図】図４
2020072759.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質生合成遺伝子の転写調節因子の発現レベルが内在的発現レベルに比べて変化した、ジンセノサイドまたはその前駆体生産用組換え酵母。
【請求項２】
前記リン脂質生合成遺伝子の転写調節因子は、ＩＮＯ２、ＩＮＯ４、及びＯＰＩ１からなる群から選択された一つ以上である、請求項１に記載の組換え酵母。
【請求項３】
前記ＩＮＯ２、ＩＮＯ４または両方の発現レベルが内在的発現レベルに比べて増加したり、ＯＰＩ１の発現レベルが内在的発現レベルに比べて減少した、請求項２に記載の組換え酵母。
【請求項４】
前記ＩＮＯ２の遺伝子は配列番号１の塩基配列、ＩＮＯ４の遺伝子は配列番号２の塩基配列、ＯＰＩ１遺伝子は配列番号３の塩基配列からなる、請求項３に記載の組換え酵母。
【請求項５】
前記酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓ．  ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロミセス・ブラウディ（Ｓ．  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、サッカロミセス・ブルデリ（Ｓ．  ｂｕｌｄｅｒｉ）、サッカロミセス・カリオカヌス（Ｓ．  ｃａｒｉｏｃａｎｕｓ）、サッカロミセス・カリオカス（Ｓ．  ｃａｒｉｏｃｕｓ）、サッカロミセス・シュバリエ（Ｓ．  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）、サッカロミセス・ダイレネンシス（Ｓ．  ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・エリプソイデウス（Ｓ．  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）、サッカロミセス・ユーバヤヌス（Ｓ．  ｅｕｂａｙａｎｕｓ）、サッカロミセス・エクシグウス（Ｓ．  ｅｘｉｇｕｕｓ）、サッカロミセス・フロレンティヌス（Ｓ．  ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓ．  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・マティニアエ（Ｓ．  ｍａｒｔｉｎｉａｅ）、サッカロミセス・モナセンシス（Ｓ．  ｍｏｎａｃｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓ．  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・パラドキサス（Ｓ．  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓ．  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、サッカロミセス・スペンセロルム（Ｓ．  ｓｐｅｎｃｅｒｏｒｕｍ）、サッカロミセス・トゥリセンシス（Ｓ．  ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・ユニスポラス（Ｓ．  ｕｎｉｓｐｏｒｕｓ）、サッカロミセス・ウバルム（Ｓ．  ｕｖａｒｕｍ），またはサッカロミセス・ゾナトゥス（Ｓ．  ｚｏｎａｔｕｓ）からなる群から選択された、請求項１に記載の組換え酵母。
【請求項６】
前記酵母は、さらにジンセノサイド合成に関与する遺伝子の発現が内在的発現レベルに比べて増加した、請求項１に記載の組換え酵母。
【請求項７】
前記遺伝子は、ＰｇＤＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，  ｄａｍｍａｒｅｎｅｄｉｏｌ−ＩＩ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＰｇＰＰＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７）、ＰｇＣＰＲ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ＮＡＤＰＨ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ｔＨＭＧ１（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＭＧ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）及びＰｇＳＥ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，  ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｅｐｏｘｉｄａｓｅ）で構成された群から選択された一つ以上の遺伝子である、請求項６に記載の組換え酵母。
【請求項８】
前記前駆体は、スクアレンまたは２，３−オキシドスクアレンである、請求項１に記載の組換え酵母。
【請求項９】
ジンセノサイド生産酵母菌株にリン脂質生合成遺伝子の転写調節因子の発現レベルを変化させるステップを含む、ジンセノサイド生産能が向上した組換え酵母の製造方法。
【請求項１０】
前記リン脂質生合成遺伝子としてＩＮＯ２、ＩＮＯ４、またはその両方の発現レベルを内在的発現レベルに比べて増加させたり、ＯＰＩ１の発現レベルを内在的発現レベルに比べて減少させる、請求項９に記載の組換え酵母の製造方法。
【請求項１１】
前記ジンセノサイド生産酵母菌株は、ＰｇＤＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，  ｄａｍｍａｒｅｎｅｄｉｏｌ−ＩＩ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＰｇＰＰＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７）、ＰｇＣＰＲ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ＮＡＤＰＨ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ｔＨＭＧ１（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＭＧ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）及びＰｇＳＥ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，  ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｅｐｏｘｉｄａｓｅ）  で構成された群から選択された一つ以上の遺伝子の発現レベルが内在的発現レベルに比べて増加した、請求項９に記載の組換え酵母の製造方法。
【請求項１２】
ジンセノサイド前駆体生産酵母菌株にリン脂質生合成遺伝子の転写調節因子の発現レベルを変化させるステップを含む、ジンセノサイド前駆体の生産能が向上した組換え酵母の製造方法。
【請求項１３】
前記ジンセノサイド前駆体は、スクアレン及び２，３−オキシドスクアレンを含む、請求項１２に記載の組換え酵母の製造方法。
【請求項１４】
前記リン脂質生合成遺伝子としてＩＮＯ２、ＩＮＯ４または両方の発現レベルを内在的発現レベルに比べて増加させたり、ＯＰＩ１の発現レベルを内在的発現レベルに比べて減少させる、請求項１２に記載の組換え酵母の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え酵母を培養するステップを含む、ジンセノサイドまたはその前駆体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジンセノサイドの生産を増大するための組換え酵母及びそれを用いてジンセノサイドを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サポニンは、植物界に広く存在する配糖体において糖ではない部分が複数の環式化合物からなる物質を意味する。高麗人参または紅参に主な生理活性成分として含まれたサポニン成分である、トリテルペンサポニン（ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ  ｓａｐｏｎｉｎ）は、他の植物で発見されたサポニンとは化学構造が異なるため、このような人参サポニンを他の植物系サポニンと区別するために高麗人参（Ｇｉｎｓｅｎｇ）配糖体（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）という意味でジンセノサイド（Ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ）と呼ぶ。
【０００３】
ジンセノサイドは、アグリコン（ａｇｌｙｃｏｎｅ）の構造に応じてプロトパナキサジオール系（Ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ−ｔｙｐｅ、ＰＰＤタイプ）ジンセノサイド、プロトパナキサトリオール系（Ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｔｒｉｏｌ−ｔｙｐｅ、ＰＰＴタイプ）ジンセノサイド及びオレアノール酸系（Ｏｌｅａｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄタイプ）ジンセノサイドの３種類に分類される。これら３つのグループは、さらに化合物構造中の環の３位の炭素、６位の炭素及び２０位の炭素位置にグリコシド結合（ｇｌｙｃｏｓｉｃｉｄ  ｂｏｎｄ）により付着する糖部分（アグリコン）（ｓｕｇａｒ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ（ａｇｌｙｃｏｎｅｓ））の位置及び数によって分類される。オレアノール酸系ジンセノサイドの基本骨格は、５環状であり、これには唯一ジンセノサイドＲｏがあり、そのアグリコンはオレアノール酸（ｏｌｅａｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）である。現在、４０種類以上のジンセノサイドが分離され、これらのほとんどはＰＰＤタイプのジンセノサイドである。ＰＰＤタイプのジンセノサイドはＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｃ、Ｒｄ、ギペノシドＸＶＩＩ（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ  ＸＶＩＩ）、化合物Ｏ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｏ）、化合物Ｍｃ１（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｍｃ１）、Ｆ２、化合物Ｙ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｙ）、化合物Ｍｃ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｍｃ）、Ｒｇ３、Ｒｈ２、ＣＫが含まれる。ＰＰＴタイプのジンセノサイドにはＲｅ、Ｒｇ１、Ｒｆ、Ｒｇ２、Ｒｈ１などが含まれる。
【０００４】
高麗人参の代表的な薬理効果はジンセノサイドによって示されることが知られており、これまで約３０種類の多様なジンセノサイドが人参及び人参加工品から分離され（Ｓｈｉｂａｔａ、２００１）、抗糖尿病活性、抗炎症作用、老化防止作用、抗がん作用など、互いに異なる薬理作用を有していることが報告されている。また、ジンセノサイド以外に、他の生理活性成分としてフェノール性成分、ポリアセチレン、アルカロイド、多糖体などが知られており、フェノール性成分は、老化抑制に有効成分として１０種類以上の抗酸化性、フェノール性物質が明らかになり、これらは高血圧抑制、抗がん、抗酸化、美白活性などの生理活性としても知られている。最近の研究結果では、多様なストレスに対して非特異的に肉体的、精神的に安定状態を維持させる抗ストレス効果があることが知られた（Ｌｅｅ等、２００８年）。
【０００５】
世界的に高麗人参を商業的に栽培する国家は韓国、中国、日本、米国、カナダ、欧州などである。１９８０年末までは全世界人参の約４６％を生産していた韓国は、１９９０年代に入って３９％前後にシェアが減少し、中国が５０％以上を占め、米国とカナダの西洋人参が１０％を占めるようになり、最近では、そのシェアがさらに低下しているのが現状である。最大の理由として指摘されていることが、韓国の高麗人参が薬効は非常に優れていることが知られているが、価格競争力の面では非常に脆弱な面がある。したがって、韓国人参の特徴と利点は非常に多いが、現在急速に変化する世界情勢とＷＴＯ、国家間のバイオ産業の重点投資、経済危機など噛み合って現在人参製品の国際競争力の向上のための努力が切実に要求される時点である。
【０００６】
高麗人参の薬理学的な研究結果は、人参サポニン成分であるジンセノサイドに対する関心を増大させ、それらの大量生産の必要性が台頭しているが、一般的な耕作方法によって人参の有用物質を大量生産することは４〜６年の長い栽培期間、遮光栽培による病虫害防除の困難さ、輪作栽培などのような問題点を含むので、新たな代替生産方法に関する開発が切実に求められている。
【０００７】
最近バイオテクノロジーに基づいた人参サポニン関連遺伝子が多く発掘され、これらの遺伝子を利用してジンセノサイドを酵母から大量生産するための技術開発も最近になって注目を集め始めた。ジンセノサイドは植物体からメバロン酸生合成経路を含むイソプレノイド合成経路を通じて生合成（Ｃｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、２００８）されるため、酵母のエルゴステロール生合成経路を再設計してジンセノサイド生産菌株を開発しようとする合成生物学の研究が試みられている。最近、中国のＨｕａｎｇとＺｈａｎｇの共同研究チームで高麗人参のプロトパナキサジオールダンマレンジオール−ＩＩ合成酵素（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ  ｄａｍｍａｒｅｎｅｄｉｏｌ−ＩＩ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）プロトパナキサジオール合成酵素（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ  ｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅｓ）遺伝子をシロイヌナズナから確保したＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０還元酵素（ＮＡＤＰＨ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子とともに酵母サッカロマイセス・セレビシエに発現させてプロトパナキサジオールを生産することに成功したことを報告した。これらはスクアレン及び２，３−オキシドスクアレン（２，３−ｏｘｉｄｏｓｑｕａｌｅｎｅ）の供給を増幅させるためにＮ−末端ＨＭＧ遺伝子ｔＨＭＧ１を過発現させ、ＦＰＰ合成酵素遺伝子（ＥＲＧ２０）、スクアレン合成酵素遺伝子（ＥＦＧ９）、２，３−オキシドスクアレン合成酵素遺伝子（ＥＲＧ１）も同時に過発現させてプロトパナキサジオールの生産に必要な前駆体の供給を増幅させた。また、酵母コドンに合わせてプロトパナキサジオール合成遺伝子を合成してさらにプロトパナキサジオール変換効率を向上させ、最終的にウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ（ｕｒｉｄｉｎ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子を導入してジンセノサイド生合成経路を完成させた（Ｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。今後、より最適化作業を通じてジンセノサイド生産合成酵母は、植物体から抽出する複雑な工程過程を代替することができる経済的な生産工程を提供すると期待されている。
【０００８】
このような背景の下で、本発明者らは、酵母を用いたジンセノサイド生産量を増大させるために鋭意研究努力した結果、ジンセノサイド生産酵母の細胞小器官を改良する遺伝子の発現が調節された遺伝子組換え酵母及び前記酵母の製造方法を開発し、前記組換え酵母は、従来のジンセノサイド生産能を有する酵母よりジンセノサイド生合成の中間産物であるプロトパナキサジオールの生産量が増加することを確認し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｄｏｓａｇｅ  ａｎｄ  ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅｓ  ＩＮＯ２  ａｎｄ  ＩＮＯ４  ｏｎ  ｉｎｏｓｉｔｏｌ／ｃｈｏｌｉｎｅ−ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．  １９９７  Ｊｕｎ；３１（６）：４６２−８．  Ｓｃｈｗａｎｋ  Ｓ，  Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｂ，  Ｓｃｈ−ｕｌｌｅｒ  ＨＪ．
【非特許文献２】Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９
【非特許文献３】Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ジンセノサイドまたはその前駆体生産用組換え酵母を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記組換え酵母を製造する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、前記組換え酵母を用いてジンセノサイドまたはその前駆体を高収率で生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
これを具体的に説明すると次の通りである。一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用することができる。すなわち、本出願で開示された多様な要素の全ての組み合わせが本出願のカテゴリに属する。また、下記記述された具体的な叙述によって、本出願のカテゴリが制限されるとは見られない。
【００１４】
本発明の目的を達成するための一つの様態として、本発明は、リン脂質生合成遺伝子の転写調節因子の発現レベルが内在的発現レベルに比べて変化したジンセノサイドまたはその前駆体生産用組換え酵母を提供する。
【００１５】
本発明は、酵母の細胞小器官中のタンパク質合成、タンパク質の二次構造の形成、各機能を担当する細胞内の位置にタンパク質を輸送する機能を有する小胞体（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ、ＥＲ）を改良して小胞体のスペースを増やしたりまたはメンブレン組成及び変性タンパク質に対するストレス反応などを調節することにより、ジンセノサイドまたはその前駆体の生産を増大させる特徴がある。
【００１６】
本発明は、酵母の小胞体を改良するために、リン脂質生合成に関与する遺伝子の発現を調節するものであり、具体的には、リン脂質生合成に関与する遺伝子の発現を調節する転写調節因子の発現レベルを変形するものである。より具体的には、前記リン脂質生合成に関与する遺伝子の転写調節因子は、ＩＮＯ２、ＩＮＯ４、及びＯＰＩ１からなる群から選択された一つ以上であることができる。
【００１７】
本発明の用語、「ＩＮＯ２」及び「ＩＮＯ４」は、リン脂質生合成に関与する遺伝子を含めて蛋白質の構造形成など多様な機能を担当する７０以上の遺伝子の発現を調節する転写調節因子であり、過発現時リン脂質生合成に関与する遺伝子の発現が増加して小胞体のサイズを増加させ、細胞膜の構成要素を調節及び変性タンパク質に対するストレス反応を誘導する蛋白質である。ＩＮＯ２とＩＮＯ４は複合体として作用する転写調節因子であるが、ＩＮＯ４とは異なり、ＩＮＯ２が転写調節を決定する機能を有することが報告された  （非特許文献１、Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｄｏｓａｇｅ  ａｎｄ  ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅｓ  ＩＮＯ２  ａｎｄ  ＩＮＯ４  ｏｎ  ｉｎｏｓｉｔｏｌ／ｃｈｏｌｉｎｅ−ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．  １９９７  Ｊｕｎ；３１（６）：４６２−８．  Ｓｃｈｗａｎｋ  Ｓ，  Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｂ，  Ｓｃｈ−ｕｌｌｅｒ  ＨＪ．）。
【００１８】
前記ＩＮＯ２及びこれをコードする遺伝子の情報は、米国国立衛生研究所ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースを通じて取得することができ、その例として前記ＩＮＯ２遺伝子は、配列番号１の塩基配列を有してもよいが、これに限定されない。
【００１９】
また、前記ＩＮＯ２遺伝子は、前記配列番号１として記載した塩基配列だけでなく、前記配列と８０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９９％以上の相同性を示す塩基配列であり、実質的に前記転写因子と同一または相当する効能を示す転写因子をコードする遺伝子配列であれば制限なく含まれる。また、このような相同性を有する塩基配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加された塩基配列も、本発明の範囲内に含まれることは自明である。
【００２０】
前記ＩＮＯ４及びこれをコードする遺伝子情報は、米国国立衛生研究所ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースを通じて取得することができ、その例として前記ＩＮＯ４遺伝子は、配列番号２の塩基配列を有してもよいが、これに限定されない。
【００２１】
また、前記ＩＮＯ４遺伝子は、前記配列番号２として記載した塩基配列だけでなく、前記配列と８０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９９％以上の相同性を示す塩基配列であり、実質的に前記転写因子と同一または相当する効能を示す転写因子をコードする遺伝子配列であれば制限なく含まれる。また、このような相同性を有する塩基配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加された塩基配列も、本発明の範囲内に含まれることは自明である。
【００２２】
本発明の用語、「ＯＰＩ１」とは、リン脂質前駆体の利用可能性に対する反応としてＩＮＯ２−ＩＮＯ４転写複合体の転写抑制因子である。前駆体が制限されるとき、ＯＰＩ１は小胞体に残っており、ＩＮＯ２−ＩＮＯ４複合体は、リン脂質生合成に必要なＩＮＯ１及び他の遺伝子を活性化させる。一方、利用可能な前駆体が豊富な場合には、ＯＰＩ１は、核にアクセスし、前記遺伝子の転写を抑制する。ＯＰＩ１はＥＲ標的化のためにホスファチジン酸に直接結合し、ホスファチジン酸がリン脂質生合成に利用されて急激に枯渇されるとき、前駆体の利用可能性を感知するメカニズムとして作用することができる。
【００２３】
前記ＯＰＩ１及びこれをコードする遺伝子の情報は、米国国立衛生研究所ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースを通じて取得することができ、その例として前記ＯＰＩ１遺伝子は、配列番号３の塩基配列を有してもよいが、これに限定されない。
【００２４】
また、前記ＯＰＩ１遺伝子は、前記配列番号３として記載した塩基配列だけでなく、前記配列と８０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９９％以上の相同性を示す塩基配列であり、実質的に前記転写因子と同一または相当する効能を示す転写因子をコードする遺伝子配列であれば制限なく含まれる。また、このような相同性を有する塩基配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加された塩基配列も、本発明の範囲内に含まれることは自明である。
【００２５】
前記用語「相同性」は、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と一致する程度を意味し、パーセンテージで表示することができる。本明細書において、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と同一または類似の活性を有するその相同性配列が「％相同性」で示される。例えば、スコア（ｓｃｏｒｅ）、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）及び類似度（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）などのパラメータ（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を計算する標準ソフトウェア、具体的には、ＢＬＡＳＴ２．０を利用したり、定義された厳格な条件の下でサザン混成化実験によって配列を比較することにより確認することができ、定義される適切な混成化条件は、当該技術の範囲内であり、当業者によく知られている方法（例えば、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、非特許文献２及び非特許文献３）で決定されてもよい。
【００２６】
本発明の用語、「内在的発現レベル」とは、微生物が天然の状態またはその遺伝子の発現レベルを変形する前の親菌株で発現されるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを意味する。これは本質的に菌株などの細胞及び組織などで、正常な状況または特定の遺伝子の発現を調節する前の状況で与えられたｍＲＮＡまたはタンパク質を生産する程度である。内在的発現レベルは、菌株の種類、細胞の類型及び組織の間で比較することができ、または一部の刺激によって誘発された発現レベルと比較することができる。具体的には、リン脂質生合成遺伝子の転写調節因子の発現を調節していない微生物で発現されるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルであってもよい。
【００２７】
本発明のもう一つの具体例は、前記ＩＮＯ２、ＩＮＯ４または両方の発現レベルが内在的発現レベルに比べて増加したり、ＯＰＩ１の発現レベルが内在的発現レベルに比べて減少したものである、組換え酵母を提供する。
【００２８】
本発明の用語、「発現レベルが内在的発現レベルに比べて増加」とは、当該ポリペプチドをコードする遺伝子が自然の状態または変形前の状態より多く発現され、機能性のある該当ポリペプチドを多く生産することを意味する。
【００２９】
具体的には、本発明においてＩＮＯ２及びＩＮＯ４の発現レベルの増加は、
１）前記転写因子を暗号化するポリヌクレオチドのコピー数の増加、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形、
３）前記転写因子の活性が強化されるように、染色体上のポリヌクレオチド配列の変形、または
４）その組み合わせによって強化されるように変形する方法などにより行うことができるが、これらに限定されない。
【００３０】
前記１）ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれに限定されないが、ベクターに作動可能に連結された形態で実行されたり、宿主細胞内の染色体内に挿入されることによって実行されてもよい。具体的には、本発明の酵素を暗号化するポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製されて機能することができるベクターが宿主細胞内に導入されることによって実行されてもよく、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより、前記宿主細胞の染色体内の前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加させる方法で行ってもよい。
【００３１】
本発明で使用された用語「ベクター」は、適切な宿主内で目的タンパク質を発現させることができるように、適切な調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始することができるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそのものに統合することができる。
【００３２】
本発明で使用されるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界において公知となった任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミドで複製開始点、プロモーター及びターミネーターを含むことができる。前記複製開始点は、酵母自己複製配列（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＡＲＳ）を含むことができる。前記酵母自己複製配列は、酵母動原体配列（ｃｅｎｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＣＥＮ）によって安定化される。前記プロモーターは、ＣＹＣプロモーター、ＴＥＦプロモーター、ＧＰＤプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＡＤＨプロモーターなどからなる群から選択されたものであってもよい。前記ターミネーターはＰＧＫ１、ＣＹＣ１、及びＧＡＬ１などからなる群から選択されてもよい。前記ベクターは、選別マーカーをさらに含むことができる。
【００３３】
このように、細胞内の染色体挿入用ベクターを通じて染色体内に目的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを変異されたポリヌクレオチドで交換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界において公知となった任意の方法、例えば、相同組換えによって行ってもよいが、これに限定されない。
【００３４】
本発明において、用語「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現できさえすれば、宿主細胞の染色体に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これら両方を含む。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現することができるものであれば、如何なる形で導入されても関係ない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形で宿主細胞に導入することができる。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含むことができる。前記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよいが、これに限定されない。
【００３５】
また、前記において用語「作動可能に連結された」とは、本発明の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と、前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
【００３６】
次に、２）ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形は、特にこれに限定されないが、前記発現調節配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して実行するか、さらに強い活性を有する核酸配列で交換することによって行うことができる。前記発現調節配列は、特にこれに限定されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列などを含むことができる。
【００３７】
前記ポリヌクレオチド発現単位の上部には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されてもよいが、前記強力なプロモーターの例としては、ＧＰＤプロモーター、ＴＥＦプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＣＣＷ１２、ＧＡＬプロモーターなどがあり、より具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ由来のプロモーターであるＰＧＫ１プロモーターと作動可能に連結されて前記酵素をコードするポリヌクレオチドの発現率を向上させることができるが、これに限定されない。
【００３８】
併せて、３）染色体上のポリヌクレオチド配列の変形は、特にこれに限定されないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して実行するか、さらに強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列で交換することによって行うことができる。
【００３９】
本発明の一実施例では、ＩＮＯ２またはＩＮＯ４の過発現を誘導するために、前記遺伝子のプロモーターを高発現の常時性プロモーターであるＰＧＫ１プロモーターで置換するためのＰＧＫ１プロモーター置換ベクターを作製し、前記ベクターを用いて製作された置換カセットをＰＤＤ酵母変異株に形質導入し、ＩＮＯ２またはＩＮＯ４過発現組換え酵母を作製した（実施例２）。
【００４０】
本発明の用語、「発現レベルが内在的発現レベルに比べて減少」とは、そのポリペプチドをコードする遺伝子が発現されないか、遺伝子発現において、自然状態または変形前の状態より、特定の減少を示したり、発現されても機能性のある該当ポリペプチドを生産していないことを意味する。
【００４１】
また、当該ポリペプチドをコードする遺伝子が完全に不活性化されているだけでなく、その発現レベルが内在的発現レベルに比べて弱化されたり著しく低く、実質的に発現していないものも含まれる意味である。したがって、遺伝子不活性化は完全（ノックアウト）であるか、部分的（例えば、遺伝子が内在的発現レベル未満を示す低次型遺伝子（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈ）またはこれに影響を与える活性における部分的な減少を示す突然変異体遺伝子の生成物）であってもよい。
【００４２】
具体的には、本発明のＯＰＩ１の不活性化は、
１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部または全体の欠失、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列の変形、
３）前記タンパク質の活性が低下するように、染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形、または
４）その組み合わせなどを使用して実行されてもよいが、特にこれに限定されない。
【００４３】
１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部または全体を欠失する方法は、細胞内の染色体挿入用ベクターを通じて染色体内の内在目的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを、一部の核酸配列が欠失されたポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子で交換することにより行うことができる。前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって異なるが、具体的には、１〜３００個、より具体的には、１〜１００個、より具体的には、１〜５０個である。
【００４４】
次に、２）前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列を変形する方法は、特にこれに限定されないが、前記発現調節配列の活性をさらに弱化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して実行するか、さらに弱い活性を有する核酸配列で交換することにより行うことができる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含むことができるが、これに限定されない。
【００４５】
併せて、３）染色体上のポリヌクレオチド配列を変形する方法は、前記タンパク質の活性をさらに弱化するようにポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して実行するか、さらに弱い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列で交換することにより行うことができるが、これに限定されない。
【００４６】
本発明の一実施例では、ＯＰＩ１を除去するための欠失カセットを製作し、これをＰＤＤ酵母変異株に形質導入し、ＯＰＩ１削除された組換え酵母を作製した（実施例３）。
【００４７】
具体的な一実施例によれば、前記組換え酵母を用いてジンセノサイド生合成の中間産物であるスクアレン、２，３−オキシドスクアレン及びプロトパナキサジオールの生産量を対照群と比較して測定した結果、ＩＮＯ２及びＩＮＯ４が過発現された組換え酵母及びＯＰＩ１が除去された組換え酵母において全て対照群と比較して生産量が増加することを確認することができ、特にＩＮＯ２過発現組換え酵母で生産量が最も大きく増加することを確認した（実施例４、表５、表６、及び図４）。
【００４８】
本発明の組換え酵母は、ジンセノサイド、スクアレン及び２，３−オキシドスクアレンの生産量を増加させることができる。
【００４９】
本発明の用語、「ジンセノサイド生産用組換え酵母」とは、自然にジンセノサイド生産能を有している酵母またはジンセノサイドの生産能のない親菌株にジンセノサイドの生産能が付与された酵母を意味する。
【００５０】
本発明の用語「ジンセノサイド（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ）」とは、高麗人参由来のダンマラン（ｄａｍｍａｒａｎｅ）系サポニンまたはその誘導体を意味するが、他の植物で発見されるサポニンとは異なる特異な化学構造を有している。前記ジンセノサイドは、特にこれに限定されないが、一例としてＰＰＤ（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ）系のジンセノサイド、ＰＰＴ（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｔｒｉｏｌ）系のジンセノサイドなどであってよく、他の例としてＰＰＤ、ＰＰＴ、Ｒａ３、Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｇ１、Ｒｇ２、Ｒｇ３、Ｒｈ１、Ｒｈ２、Ｒｓ１、ＣＯ、ＣＹ、Ｃ−Ｍｃ１、Ｃ−Ｍｃ、Ｆ１、Ｆ２、コンパウンドＫ（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｋ）、ギペノシドＸＶＩＩ（  Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ  ＸＶＩＩ）、ギペノシドＬＸＸＶ（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ  ＬＸＸＶ）、Ｒｓ２、ＰＰＤ、Ｒｅ、Ｒｇ１、Ｒｆ、Ｆ１、Ｒｇ２、ＰＰＴ及びＲｈ１などを単独でまたは混合物として使用することができ、他の例としては、ＰＰＤ、ＰＰＴ、コンパウンドＫ（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｋ）、Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｆ１、Ｆ２、Ｒｇ１、Ｒｇ２、Ｒｇ３、Ｒｈ１、Ｒｈ２などを単独でまたは混合物として使用することができる。具体的には、プロトパナキサジオール系ジンセノサイドであってもよい。
【００５１】
本発明の用語、「ジンセノサイド前駆体生産用組換え酵母」とは、自然にジンセノサイド前駆体の生産能を有している酵母またはジンセノサイド前駆体の生産能のない親菌株にジンセノサイド前駆体の生産能が付与された酵母を意味する。
【００５２】
本発明の用語、「ジンセノサイド前駆体」とは、ジンセノサイド生合成代謝過程の中間生成物である。ジンセノサイド生合成は、メバロン酸代謝経路によってイソペンテニルジホスフェート及びジメチルアリルジホスフェートが生成され、これはスクアレン及びスクアレンが酸化された２，３−オキシドスクアレンに変形される。２，３−オキシドスクアレンの環化によりダンマレンジオール−ＩＩを生成し、これは、複数のジンセノサイドで合成することができる。ジンセノサイド前駆体は、このようなすべての中間生成物を含むことができる。また、この前駆体を通じて生成される他の系列のサポニンなども含んでもよい。これは、さらにベータ−アミリン（β−ａｍｙｒｉｎ）またはオレアネート（Ｏｌｅａｎａｔｅ）を含むことができる。
【００５３】
具体的には、ジンセノサイド前駆体の生産用組換え酵母は、スクアレンまたは２，３−オキシドスクアレンを生産することができる。
【００５４】
本発明の一つの具体例は、前記ジンセノサイド前駆体は、スクアレン及び２，３−オキシドスクアレンを含む、組換え酵母を提供する。
【００５５】
本発明の用語では、「スクアレン」とは、一種のイソプレノイドあるいはテルペノイド系統の化合物に属し、６個の二重結合を有している多重不飽和脂肪でＣ３０Ｈ５０の化学式を有する。スクアレンはジンセノサイド生合成の中間生産物であり、メバロン酸経路に沿って生産される。また、体内で強力な抗酸化作用があり、ステロイドホルモンとビタミンＤ、胆汁酸、細胞膜の構成成分であるコレステロールの生合成にも利用され、新型インフルエンザなどのワクチンの免疫補助剤として使用することができる。
【００５６】
本発明の用語では、「２，３−オキシドスクアレン」とは、ジンセノサイドを含むサポニンだけでなく、細胞膜ステロール前駆体であるラノステロール及びシクロアルテノールの合成前駆体である。これはスクアレンがスクアレンエポキシダーゼによる酸化によって生産される。
【００５７】
前記酵母は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジタ（Ｃａｎｄｉｄａ）、シゾサッカロミセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、イサケンキア（Ｉｓｓａｃｈｅｎｋｉａ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）またはハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）に属する菌株であることができる。
サッカロミセスに属する菌株は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓ．  ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロミセス・ブラウディ（Ｓ．  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、サッカロミセス・ブルデリ（Ｓ．  ｂｕｌｄｅｒｉ）、サッカロミセス・カリオカヌス（Ｓ．  ｃａｒｉｏｃａｎｕｓ）、サッカロミセス・カリオカス（Ｓ．  ｃａｒｉｏｃｕｓ）、サッカロミセス・シュバリエ（Ｓ．  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）、サッカロミセス・ダイレネンシス（Ｓ．  ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・エリプソイデウス（Ｓ．  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）、サッカロミセス・ユーバヤヌス（Ｓ．  ｅｕｂａｙａｎｕｓ）、サッカロミセス・エクシグウス（Ｓ．  ｅｘｉｇｕｕｓ）、サッカロミセス・フロレンティヌス（Ｓ．  ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓ．  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・マティニアエ（Ｓ．  ｍａｒｔｉｎｉａｅ）、サッカロミセス・モナセンシス（Ｓ．  ｍｏｎａｃｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓ．  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・パラドキサス（Ｓ．  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓ．  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、サッカロミセス・スペンセロルム（Ｓ．  ｓｐｅｎｃｅｒｏｒｕｍ）、サッカロミセス・トゥリセンシス（Ｓ．  ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・ユニスポラス（Ｓ．  ｕｎｉｓｐｏｒｕｓ）、サッカロミセス・ウバルム（Ｓ．  ｕｖａｒｕｍ），またはサッカロミセス・ゾナトゥス（Ｓ．  ｚｏｎａｔｕｓ）であってもよい。
【００５８】
本発明の一具体例として前記酵母はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であってもよいが、これに限定されない。
【００５９】
一般に、前記サッカロミセス・セレビシエは多様な発酵過程で使用される酵母菌の一つとして知られており、糖分をエタノールに変換する活性を有することが知られている。
【００６０】
前記ジンセノサイドを生産する酵母は、特にこれに限定されないが、ジンセノサイド生合成に不可欠な前駆体であるスクアレンの生合成の増大のためのメバロン酸代謝経路を強化するためにＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に転換するＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ｔＨＭＧ１）及びスクアレンを２，３−オキシドスクアレンに転換する人参由来スクアレンエポキシダーゼ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ、ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｅｐｏｘｉｄａｓｅ；ＰｇＳＥ）の活性を内在活性に比べて増加させるように変形し、ジンセノサイド生合成代謝経路を導入するために２，３−オキシドスクアレンをダンマレンジオール−IIに転換する人参由来ダンマレンジオール−II合成酵素（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ、ｄａｍｍａｒｅｎｅｄｉｏｌ−ＩＩ  ｓｙｎｔｈａｓｅ；  ＰｇＤＤＳ）、ダンマレンジオール−IIをプロトパナキサジオールに転換する人参由来シトクロムＰ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７；  ＰｇＰＰＤＳ）及び人参由来ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０還元酵素（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ＮＡＤＰＨ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ；  ＰｇＣＰＲ）の活性を導入するように変形されたものであってもよい。
【００６１】
本発明のもう一つの具体例は、前記酵母は、さらにジンセノサイド合成に関与する遺伝子の発現が内在的発現レベルに比べて増加したものである、組換え酵母を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記遺伝子は、ＰｇＤＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，  ｄａｍｍａｒｅｎｅｄｉｏｌ−ＩＩ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＰｇＰＰＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７）、ＰｇＣＰＲ（Ｐ  ＮＡＤＰＨ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ｔＨＭＧ１（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＭＧ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）及びＰｇＳＥ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，  ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｅｐｏｘｉｄａｓｅ）で構成された群から選択された一つ以上の遺伝子である、組換え酵母を提供する。
【００６２】
本発明の一実施例では、ジンセノサイド生合成代謝経路に関する酵素は、形質転換によって導入させ、メバロン酸代謝経路に関する酵素は高発現の常時性プロモーターであるＧＰＤ１（ＴＤＨ３）プロモーターから転写され、内在的発現に比べて増加して発現させた（実施例１）。
【００６３】
この時、前記酵素は、暗号化する遺伝子は、特にこれに限定されないが、具体的には、それぞれ配列番号３〜７として記載されている塩基配列またはこれと７０％以上、さらに具体的には、８０％以上、さらに具体的には、９０％以上の相同性を有する塩基配列を含むことができる。
【００６４】
本発明の他の態様は、ジンセノサイド生産酵母菌株にリン脂質の生合成遺伝子の転写調節因子の発現レベルを変化させるステップを含む、ジンセノサイド生産能が向上した組換え酵母の製造方法を提供する。
【００６５】
本発明の一つの具体例は、前記リン脂質生合成遺伝子としてＩＮＯ２、ＩＮＯ４または両方の発現レベルを内在的発現レベルに比べて増加させたり、ＯＰＩ１の発現レベルを内在的発現レベルに比べて減少させるものである、組換え酵母の製造方法を提供する。
【００６６】
前記ジンセノサイド生産酵母菌株、リン脂質生合成遺伝子の転写調節因子、ＩＮＯ２、ＩＮＯ４、ＯＰＩ１及び内在的発現レベル等については、前述の通りである。
【００６７】
本発明のもう一つの具体例は、前記ジンセノサイド生産酵母菌株は、ＰｇＤＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，ｄａｍｍａｒｅｎｅｄｉｏｌ−ＩＩ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＰｇＰＰＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７）、ＰｇＣＰＲ（Ｐ  ＮＡＤＰＨ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ｔＨＭＧ１（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＭＧ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）及びＰｇＳＥ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｅｐｏｘｉｄａｓｅ）で構成された群から選択された一つ以上の遺伝子の発現レベルが内在的発現レベルに比べて増加したものであり得る。
【００６８】
本発明のもう一つの態様は、ジンセノサイド前駆体生産酵母菌株にリン脂質の生合成遺伝子の転写調節因子の発現レベルを変化させるステップを含む、ジンセノサイド前駆体の生産能が向上した組換え酵母の製造方法を提供する。
【００６９】
本発明の一つの具体例は、前記ジンセノサイド前駆体は、スクアレン及び２，３−オキシドスクアレンを含む、組換え酵母の製造方法を提供する。
【００７０】
本発明のもう一つの具体例は、前記リン脂質生合成遺伝子としてＩＮＯ２、ＩＮＯ４、またはその両方の発現レベルを内在的発現レベルに比べて増加させたり、ＯＰＩ１の発現レベルを内在的発現レベルに比べて減少させるものである、組換え酵母の製造方法を提供する。
【００７１】
前記リン脂質生合成遺伝子の転写調節因子、ＩＮＯ２、ＩＮＯ４、ＯＰＩ１及び内在的発現レベル等については、前述の通りである。
【００７２】
本発明のもう一つの態様は、前記組換え酵母を培養するステップを含む、ジンセノサイドまたはその前駆体の製造方法を提供する。
【００７３】
前記方法において、前記酵母を培養する段階は、特にこれに限定されないが、公知となった回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われる。このとき、培養条件は、特に限定されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を使用して適正ｐＨ（例えば、ｐＨ  ５〜９、具体的にはｐＨ  ６〜８、最も具体的には、ｐＨ  ６．８）を調節することができ、酸素または酸素−含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持することができる。培養温度は２０〜４５℃、具体的には２５〜４０℃を維持することができ、約１０〜１６０時間培養することができる。前記培養によって生産されたジンセノサイドは培地中に分泌されたり、細胞内に残留してもよい。
【００７４】
併せて、使用される培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、澱粉及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリの種油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール、及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に使用したり、または混合して使用することができるが、これに限定されない。窒素供給源としては、窒素−含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆泊分及び尿素）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウム）などを個別に使用したり、または混合して使用することができるが、これに限定されない。リン供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に使用したり、または混合して使用することができるが、これに限定されず、その他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須の成長−促進物質を含むことができる。
【００７５】
前記方法は、生産されたジンセノサイドを回収するステップをさらに含むことができる。この回収ステップは、培養された細胞またはその上澄液から回収するステップであってもよく、回収に適切なプロセスを当業者が選択することができる。
【００７６】
本発明の前記培養段階で生産されたジンセノサイドを回収する方法は、培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などによって、当該分野において公知となった適切な方法を用いて培養液から目的とする生産物を収集することができる。
【発明の効果】
【００７７】
本発明のジンセノサイド生産性が向上した組換え酵母は、配列番号１の塩基配列を有するＩＮＯ２、配列番号２の塩基配列を有するＩＮＯ４及び両方の発現レベルが内在的発現レベルに比べて増加したり、配列番号３の塩基配列を有するＯＰＩ１の発現レベルが内在的発現レベルに比べて減少するように変形されてジンセノサイド生産能が強化されてジンセノサイド生産に効果的に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】転写調節因子であるＩＮＯ２、ＩＮＯ４及びＯＰＩ１によるリン脂質の生合成関連の遺伝子の調節及びそれに関連する細胞内機能について概要を説明した図である。
【図２】ジンセノサイド生合成代謝経路に関する図である。
【図３】ＩＮＯ２またはＩＮＯ４遺伝子を過発現するために製作されたベクターであるｐＵＣ５７−ＵＲＡ３ＨＡ−ＰＧＫ１のベクターマップを示す図である。
【図４】ＩＮＯ２またはＩＮＯ４が過発現したり、ＯＰＩ１が削除された場合に、対照群と比較してスクアレン、２，３−オキシドスクアレン及びプロトパナキサジオールの生産量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
以下、本発明を実施例及び実験例を通じてより詳しく説明する。しかし、これらの実施例及び実験例は本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。
【００８０】
実施例１：ＰＰＤ酵母変異株の作製
本特許の酵母細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ  ワイルドタイプ菌株［（ＭＡＴα  ｕｒａ３−５２；  ｔｒｐ１−２８９；  ｌｅｕ２−３，１１２；  ｈｉｓ３△  １；  ＭＡＬ２−８；  ＳＵＣ２）、ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ：  ３００００Ｂ］にジンセノサイド生合成代謝経路の導入及びジンセノサイド生合成に不可欠な前駆体であるスクアレン（ｓｑｕａｌｅｎｅ）の生合成を増大させるためのメバロン酸代謝経路の強化によるプロトパナキサジオール（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ；ＰＰＤ）を生産する酵母菌株を製作し、前記酵母菌株をＰＰＤ酵母変異株と命名した。
【００８１】
ＰＰＤ菌株の遺伝子型は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ  Δｔｒｐ１：：ＰＧＰＤ１  ｔＨＭＧ１  ＋  ＰＧＰＤ１  ＰｇＳＥ  Δｌｅｕ２：：ＰＧＰＤ１  ＰｇＤＤＳ  ＋ＰＧＰＤ１  ＰｇＰＰＤＳ  ＋  ＰＧＰＤ１  ＰｇＣＰＲである。ジンセノサイド生合成酵素であるＰｇＤＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，ｄａｍｍａｒｅｎｅｄｉｏｌ−ＩＩ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，配列番号４）、ＰｇＰＰＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７，配列番号５）及びＰｇＣＰＲ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ＮＡＤＰＨ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，配列番号６）とメバロン酸代謝経路を強化させるために代謝経路の酵素であるｔＨＭＧ１（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＭＧ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，配列番号７）及びＰｇＳＥ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ、ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｅｐｏｘｉｄａｓｅ、配列番号８）をコードする遺伝子を、それぞれ高発現の常時性プロモーターであるＧＰＤ１（ＴＤＨ３）プロモーターから転写されて発現されるようにした。
【００８２】
実施例２：ＩＮＯ２またはＩＮＯ４過発現酵母変異株の作製
ＰＰＤ酵母変異株において、リン脂質生合成に関与して小胞体（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）のサイズを増加させ、細胞膜を構成する物質の調節及び変形タンパク質に対するストレス反応を誘導するＩＮＯ２またはＩＮＯ４の過発現が、前記酵母変異株の成長及びＰＰＤの生産能に関与するかどうかを確認するために、前記遺伝子が過発現された酵母変異株を作製した。まず、ＩＮＯ２またはＩＮＯ４の過発現を誘導するために、前記遺伝子のプロモーターを高発現の常時性プロモーターであるＰＧＫ１プロモーターで置換するためのＰＧＫ１プロモーター置換ベクターを作製し、前記ベクターを用いて製作された置換カセットをＰＤＤ酵母変異株に形質導入し、ＩＮＯ２またはＩＮＯ４過発現酵母変異株を作製した。
【００８３】
具体的には、ＰＧＫ１プロモーター置換ベクターを製作するために、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１ＤのゲノムＤＮＡから高発現の常時性プロモーターであるＰＧＫ１プロモーター部位配列を５’−及び３’部位にそれぞれ制限酵素ＳａｃＩ及びＸｂａＩ認知部位を有するようにＰＧＫ１  ｐｒｏ  Ｆ及びＰＧＫ１  ｐｒｏ  Ｒプライマーの組み合わせ（表１）を用いたＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実行してＰＣＲ断片を増幅した後、これを電気泳動して目的とする断片を得た。このとき、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長過程を２５回繰り返した。前記増幅された断片をＳａｃＩ及びＸｂａＩで処理し、同じ制限酵素で処理したｐＵＣ５７−ＵＲＡ３ＨＡベクター  （Ｊｕ  Ｙｏｕｎｇ  Ｌｅｅ，  Ｃｈａｎｇ  Ｄｕｋ  Ｋａｎｇ，  Ｓｅｕｎｇ  Ｈｙｕｎ  Ｌｅｅ，  Ｙｏｕｎｇ  Ｋｙｏｕｎｇ  Ｐａｒｋ  ａｎｄ  Ｋｗａｎｇ  Ｍｙｕｎｇ  Ｃｈｏ  （２０１５）  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｄｏｘ  ｂａｌａｎｃｅ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  １１２，  ７５１−７５８．）  に挿入してｐＵＣ５７−ＵＲＡ３ＨＡ−ＰＧＫ１ベクター（図３）を作製した。
【００８４】
【表１】
2020072759.tif 000003
【００８５】
前記のように製作されたｐＵＣ５７−ＵＲＡ３ＨＡ−ＰＧＫ１ベクターを鋳型にして、ＩＮＯ２プロモーター部位の相同組換え配列であるＰ＿ＩＮＯ２  Ｆ及びＰ＿ＩＮＯ２  Ｒのプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲを行い、ＩＮＯ２プロモーターをＰＧＫ１プロモーターで置換するカセットを作製した。同様に、ＩＮＯ４プロモーター部位の相同組換え配列であるＰ＿ＩＮＯ４  Ｆ及びＰ＿ＩＮＯ４  Ｒのプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲを行い、ＩＮＯ４プロモーターをＰＧＫ１プロモーターで置換するカセットを作製した。このとき、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で２分の伸長過程を２５回繰り返した。
【００８６】
製作したＩＮＯ２プロモーターまたはＩＮＯ４プロモーター置換用カセットを前記ＰＰＤ酵母変異株にそれぞれ導入した。導入は、一般的な熱衝撃形質転換（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって実行され、形質転換後、ウラシルドロップアウト培地（Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ６．７ｇ、ＣＳＭ  ｍｉｎｕｓ  ｕｒａｃｉｌ０．７７ｇ、Ｇｌｕｃｏｓｅ２０ｇ、１Ｌ当り）で細胞を培養してゲノム上のＩＮＯ２プロモーターまたはＩＮＯ４プロモーターが、前記カセットによってＰＧＫ１プロモーターで置換されるようにした。
【００８７】
その結果、得られた酵母変異株に対してＰＧＫ１プロモーターで置換されたことを確認するために、前記細胞のゲノムを鋳型にしてＩＮＯ２  ｔｏ  ＰＧＫ１  ＦとＩＮＯ２  ｔｏ  ＰＧＫ１  Ｒプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲを行い、ＩＮＯ２プロモーターがＰＧＫ１プロモーターで置換されたことを確認した。また、ＩＮＯ４  ｔｏ  ＰＧＫ１  ＦとＩＮＯ４  ｔｏ  ＰＧＫ１  Ｒプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲを行い、ＩＮＯ４プロモーターがＰＧＫ１プロモーターで置換されたことを確認した。その結果、ＰＰＤ−ＩＮＯ２（ＰＩＮＯ２：：ＰＰＧＫ１）とＰＰＤ−ＩＮＯ４（（ＰＩＮＯ４：：  ＰＰＧＫ１）酵母変異株を作製した。
【００８８】
【表２】
2020072759.tif 000004
【００８９】
実施例３：ＯＰＩ１除去酵母変異株の作製
ＰＰＤ酵母変異株において、リン脂質生合成に関与して小胞体のサイズを増加させ、細胞膜を構成する物質の調節及び変形タンパク質に対するストレス反応を誘導する遺伝子の発現を抑制する因子であるＯＰＩ１の欠損が、前記酵母変異株の成長及びＰＰＤ生産能に関与するかどうかを確認するために、前記遺伝子が除去された酵母変異株を作製した。まず、ＯＰＩ１を除去するための欠失カセットを製作し、これをＰＤＤ酵母変異株に形質導入し、ＯＰＩ１除去酵母変異株を作製した。
【００９０】
具体的には、ＯＰＩ１欠失用カセットを製作するためにｐＵＣ５７−ＵＲＡ３ＨＡベクターを鋳型にし、ＯＰＩ１相同組換え配列であるＤｅｌ  ＯＰＩ１  ＦとＤｅｌ  ＯＰＩ１  Ｒプライマーの組み合わせ（表３）を用いたＰＣＲを行い、ＯＰＩ１欠失用カセットを得た。このとき、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１分の伸長過程を２５回繰り返した。
【００９１】
【表３】
2020072759.tif 000005
【００９２】
前記製作したＯＰＩ１欠失用カセットをＰＰＤ酵母変異株に導入した。導入は、一般的な熱衝撃形質転換（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって実行され、形質転換後、ウラシルドロップアウト培地（Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ６．７ｇ、ＣＳＭ  ｍｉｎｕｓ  ｕｒａｃｉｌ０．７７ｇ、Ｇｌｕｃｏｓｅ２０ｇ、１Ｌ当り）で細胞を培養してゲノム上のＯＰＩ１  ＯＲＦが、前記カセットで置換されるようにした。その結果、得られた菌株に対し、ＯＰＩ１の除去を確認するために、前記細胞のゲノムを鋳型にしてＯＰＩ１  Ｆ及びＯＰＩ１  Ｒプライマーの組み合わせ（表４）を用いたＰＣＲを行い、ＯＰＩ１遺伝子の除去を確認した。その結果、ＰＰＤΔＯＰＩ１（Δｏｐｉ１）酵母変異株を作製した。
【００９３】
【表４】
2020072759.tif 000006
【００９４】
実施例４：形質転換された酵母変異株の成長及びＰＰＤの生産量の確認
前記で作製された形質転換酵母変異株を２％のグルコースを含有した最小培地（ｍｉｎｉｍａｌ  ＵＲＡ  ｄｒｏｐ−ｏｕｔ  ｍｅｄｉａ）５０ｍｌにＯＤ６００値が０．５になるように接種し、３０〜２５０ｒｐｍで攪拌しながら１４４時間好気条件で培養した。培養中の細胞の成長は、分光計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて、ＯＤ６００値を測定した。培養中の細胞内代謝産物（ｓｑｕａｌｅｎｅ、２，３−ｏｘｉｄｏｓｑｕａｌｅｎｅ、Ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ）はＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を利用して分析した。
【００９５】
培養結果（１４４ｈ）、細胞の成長、すなわち、培養物のＯＤ６００値及び細胞内の各代謝産物の濃度は、下記の表５、表６及び図に示した通りである。
【００９６】
【表５】
2020072759.tif 000007
【００９７】
【表６】
2020072759.tif 000008
【００９８】
表５及び６において、対照群は、ＰＰＤ酵母変異株  （Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ  Δｔｒｐ１：：ＰＧＰＤ１  ｔＨＭＧ１  ＋  ＰＧＰＤ１  ＰｇＳＥ  Δｌｅｕ２：：ＰＧＰＤ１  ＰｇＤＤＳ  ＋ＰＧＰＤ１  ＰｇＰＰＤＳ  ＋  ＰＧＰＤ１  ＰｇＣＰＲ）を示し、ＩＮＯ２過発現酵母変異株は  ＰＰＤ−ＩＮＯ２（ＰＩＮＯ２：：ＰＰＧＫ１）、ＩＮＯ４過発現酵母変異株はＰＰＤ−ＩＮＯ４（ＰＩＮＯ４：：ＰＰＧＫ１）、ＯＰＩ１除去酵母変異株はＰＰＤΔＯＰＩ１（Δｏｐｉ１）を示す。表６における値は、対照群の酵母変異株の各代謝産物（ｓｑｕａｌｅｎｅ、２，３−ｏｘｉｄｏｓｑｕａｌｅｎｅ、ｐｒｏｔｏｐｎａｎｘａｄｉｏｌ）の生産濃度を１と置いたとき、各作製された酵母変異株で生産された代謝産物の倍数値を示す。
【００９９】
前記結果から、前記酵母変異株の形質転換は、細胞の成長にはそれほど影響がないことが確認された。また、細胞内代謝産物の濃度測定結果を見ると、ＩＮＯ２及びＩＮＯ４が過発現されたりＯＰＩ１が除去されると、リン脂質生合成が増加するにつれて、小胞体の大きさが大きくなるなどの改良を通じてジンセノサイド生合成の代謝産物が増加され、これは最終的にジンセノサイド生産能が向上したものと予測することができる。
【図１】
2020072759.tif 000009
【図２】
2020072759.tif 000010
【図３】
2020072759.tif 000011
【図４】
2020072759.tif 000012
【配列表】
2020072759000001.app