(57)【要約】      （修正有）【課題】神経幹細胞微粒子、その製造方法、及び、治療用組成物の提供。【解決手段】外因性のタンパク質、核酸、脂質、薬物、プロドラッグ、治療薬、又は、診断薬を含む神経幹細胞エキソソーム。エキソソームは神経幹細胞株に由来するものとすることができる。神経幹細胞株は、CTX0E03（ECACCに受託番号04091601で寄託されている）などの条件的不死化された幹細胞株とすることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性のタンパク質、核酸、脂質、薬物、プロドラッグ、治療薬又は診断薬を含む神経幹細胞エキソソーム。
【請求項２】
神経幹細胞が、胎児神経幹細胞、成体神経幹細胞、又はiPS細胞由来の神経幹細胞である、請求項1に記載の神経幹細胞エキソソーム。
【請求項３】
エキソソームが、神経幹細胞株に由来するものであり、場合により該神経幹細胞株が、条件的不死化され、及び／又は無血清培地で生育されており、場合により該神経幹細胞株が、ECACC受託番号04091601を有するCTX0E03、ECACC受託番号04110301を有するSTR0C05、又はECACC受託番号04092302を有するHPC0A07である、請求項1又は2に記載の神経幹細胞エキソソーム。
【請求項４】
エキソソームが、
（a）電子顕微鏡で決定した場合に30〜200nmの若しくは30〜100nmのサイズ、又は
（b）1.1〜1.2g/mlのスクロース中密度
を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の神経幹細胞エキソソーム。
【請求項５】
RNAを含むものであり、場合により該RNAがmRNA及び／又はmiRNAであり、場合によりエキソソームが、hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532の1種、2種、3種又は4種を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の神経幹細胞エキソソーム。
【請求項６】
（a）セラミド、コレステロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール及び/若しくはホスファチジルコリンから選択される脂質、
（b）場合によりCD63、CD81、CD9、CD53、CD82及び/若しくはCD37から選択される、テトラスパニン、
（c）TSG101、Alix、CD109及び/若しくはthy-1、並びに/又は
（d）CD133、並びに/又は
（e）アクチン,細胞質2、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヒストンH4、ピルビン酸キナーゼアイソザイムM1/M2、アルファ-エノラーゼ、HSP-90-ベータ、ユビキチン-40Sリボソームタンパク質S27a、熱ショック同族体71kDaタンパク質、ハプトグロビン、及びHSP-90-アルファ
の1種以上を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の神経幹細胞エキソソーム。
【請求項７】
神経幹細胞又は神経幹細胞の条件培地の少なくとも1種の生物学的活性を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の神経幹細胞エキソソーム。
【請求項８】
治療に使用するための、請求項1〜7のいずれか1項に記載の神経幹細胞エキソソーム。
【請求項９】
請求項1〜7のいずれか1項に記載の神経幹細胞エキソソームと、薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤とを含む組成物。
【請求項１０】
神経幹細胞又は神経幹細胞の条件培地からエキソソームを単離する工程を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の神経幹細胞エキソソームの製造方法。
【請求項１１】
単離されたエキソソームに、1種以上の外因性の核酸、脂質、タンパク質、薬物、プロドラッグ、治療薬又は診断薬を負荷する工程をさらに含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
神経幹細胞が、1種以上の外因性のコード核酸配列、非コード核酸配列又は調節核酸配列を含むように遺伝子操作されている、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
神経幹細胞が、エキソソームに組み込まれた外因性のタンパク質配列又は核酸配列を発現する、請求項10又は12に記載の方法。
【請求項１４】
単離されたエキソソームに、外因性のタンパク質、核酸、脂質、薬物、プロドラッグ、治療薬又は診断薬を負荷する工程を含む、外因性のタンパク質、核酸、脂質、薬物、プロドラッグ、治療薬又は診断薬を含む神経幹細胞エキソソームの調製方法。
【請求項１５】
外因性物質がエキソソームに直接添加される、請求項11又は14に記載の方法。
【請求項１６】
外因性物質がエレクトロポレーションによりエキソソームに負荷される、請求項11、14又は15に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞微粒子、その使用及び製造に関し、具体的には神経幹細胞微粒子及びその治療における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、自己複製能力及び機能的に異なる細胞型に分化する能力を有する。成長分野である再生医療において、具体的には組織の置換、再生又は修復を必要とする再生治療において、幹細胞は強力なツールであるという可能性を有する（Banerjee他、2011）。しかしながら、治療における幹細胞の使用には以下の欠点がある：機能的安定性及び表現型安定性を有し、細胞の生成、貯蔵、輸送及び扱いに起因して関連のコストが高くかつ時間がかかる幹細胞を一貫して十分に供給する必要がある；受容者による幹細胞の拒絶反応を避けるために免疫学的適合性が要求される；並びに、腫瘍又は異所性組織形成の潜在的安全性リスクに関する複雑な規制問題がある。更に、幹細胞移植の治療効果にもかかわらず、例えば生着及び修復細胞又は置換細胞への分化による、移植した幹細胞の長期にわたる直接的な効果に関する説得力のある証拠はない。
【０００３】
神経幹細胞（NSC）は自己複製しており、神経、星状膠細胞及び乏突起膠細胞を生成する多能性幹細胞である（Kornblum、2007）。神経幹細胞の医療的可能性については十分に実証されている。損傷を受けた中枢神経系（CNS）組織の再生能は非常に限られており、その結果、神経機能がしばしば慢性的に及び進行的に喪失する。神経幹細胞（NSC）は、神経系の損壊又は疾患の幹細胞に基づく治療において有望な結果を示している（Einstein他、2008）。卒中後の動物の脳内への神経幹細胞（NSC）のインプラントにより、その後の運動試験及び認知試験において有意の回復が示されている（Stroemer他、2009）。損傷を受けた組織の機能をNSCがどのようにして回復させることができるかは完全には理解されていないが、細胞分化に適切な部位、血管新生前活性及び神経栄養性活性、並びに天然の免疫系及び他の宿主細胞による、組織修復を促進する免疫調節等の多様な修復特性をNSCが有することが現在では次第に理解されるようになっている（Miljan & Sinden、2009、Horie他、2011）。これらの効果の多くは、インプラントした神経幹細胞から宿主環境（host milieu）への一時的なシグナル伝達に依存しており、例えば虚血性の筋肉組織損傷にインプラントされた場合に、NSCは、治癒及び修復を促進するために天然の血管新生促進性及び調節性の免疫応答を導く及び増幅する炎症誘発性マーカーを一時的に発現し得る（Hicks他、未発表データ）。慢性的卒中の脳では、NSCは実質的な神経栄養効果も有する。例えば、NSCは、宿主の脳由来のダブルコルチン陽性神経芽細胞（neroblast）により、卒中によって損傷を受けた線条体脳組織の再増殖を促進する（Hassani、O'Reilly、Pearse、Stroemer他、PLoS One. 2012;7(11））。
更に、障害のある卒中患者の「CTX0E03」条件的不死化皮質由来の神経幹細胞を使用して該患者の処置を試験するために、慢性的卒中を有する動物モデルにおける大きなNSC回復効果に基づいて、ReNeuron Limited（Surrey、イギリス）により、神経幹細胞を使用する臨床試験が行われている最中である（Clinicaltrials.gov識別番号：NCT01151124）。
【０００４】
間葉系幹細胞（MSC）は、間葉系細胞型のみに、即ち脂肪細胞系統、軟骨細胞系統及び骨細胞系統に分化する可能性を有する、系統制限された幹細胞である（Pittenger他、1999;Ding他、2011）。MSC（間葉系間質細胞及び間葉系前駆細胞とも称される）は、骨髄、血液、脂肪及び他の体細胞組織等の様々な起源に由来する。しかしながら、MSCの治療的可能性は、未分化細胞としてのMSCの血管新生促進特性及び免疫調節特性の利用に対してより多く向けられている。ヒトMSCの産生は、その細胞が約15から20回の集団倍加を超えて安定して数を増大させることができないことにより制限されている。
【０００５】
間葉系幹細胞の条件培地（MSC-CM）はMSC自体の治療効果と同様の治療効果を有し、MSCに基づく治療に関するパラクリン機構を示唆する（Timmers他、2007）。WO-A-2009/105044は、MSCにより分泌される、エキソソームとして知られる粒子がMSCの少なくとも1種の生物学的特性を含むことを開示し、そのMSC粒子の治療における使用を示唆し、更にThery他、2011は、エキソソーム及び他の同様に分泌された小胞を一般的に概説する。治療薬として幹細胞を直接使用することに関するいくつかの欠点が間葉系幹細胞由来のエキソソームを使用することにより克服される（例えば貯蔵、輸送及び扱い）が、エキソソームを産生するために機能的に及び表現型的に安定である幹細胞を一貫して十分に供給するという問題が依然としてある。治療に使用するために、好ましくはエキソソームを大規模に産生する必要がある。細胞株がない場合には、幹細胞の起源からの再貯留による細胞の補充が必要であり、このことにより、各新規のバッチの試験及び確認のためのコストが繰り返し発生する。更に、MSCにより処置され得る疾患及び障害が限定される可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
幹細胞に基づく治療の改善の必要性が依然として残されている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、神経幹細胞が治療上有用な微粒子を含有するという驚くべき知見に基づく。
【０００８】
成分の培養培地への添加により、低酸素条件下での幹細胞の培養により又は他の細胞型との共培養により、幹細胞による微粒子の産生を変化させることができ、それにより幹細胞微粒子の製造方法が改善されることも発見した。
【０００９】
本発明の第1の態様は神経幹細胞微粒子を提供する。微粒子は、エキソソーム、微小胞、膜粒子、膜小胞、エキソソーム様小胞、エクトソーム様小胞、エクトソーム又はエキソベシクル（exovesicle）であることができる。典型的には、微粒子はエキソソームである。微粒子は、幹細胞の分化が可能な環境下で培養された神経幹細胞に由来することができる。微粒子は、部分的に分化した神経幹細胞から単離することができる。一実施形態では、幹細胞の分化が可能な環境は多区画のバイオリアクタであり、典型的には細胞が7日を超えて培養される多区画のバイオリアクタである。微粒子は神経幹細胞株に由来することができる。いくつかの実施形態では、神経幹細胞株は、「CTX0E03」細胞株、「STR0C05」細胞株、「HPC0A07」細胞株、又はMiljan他、Stem Cells Dev. 2009に開示されている神経幹細胞株であることができる。いくつかの実施形態では、微粒子は、培養での維持に血清を必要としない幹細胞株に由来する。微粒子は、電子顕微鏡で決定した場合に30nm〜1000nmの若しくは30〜200nmの若しくは30〜100nmのサイズ；及び／又は1.1〜1.2g/mlのスクロース中密度を有することができる。微粒子はRNAを含むことができる。RNAは、mRNA、miRNA及び／又は任意の他の低分子RNAであることができる。微粒子は、hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532の1種、2種、3種又は4種を含むことができる。微粒子は1種以上の脂質を含むことができ、典型的にはセラミド、コレステロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリンから選択される1種以上の脂質を含むことができる。微粒子は1種以上のテトラスパニンを含むことができ、典型的にはCD63、CD81、CD9、CD53、CD82及び／又はCD37を含むことができる。微粒子は、TSG101、Alix、CD109、thy-1及びCD133の1種以上を含むことができる。微粒子は、表19又は表21中に示されるタンパク質の少なくとも10種を含むことができる。微粒子は、神経幹細胞又は神経幹細胞の条件培地の少なくとも1種の生物学的活性を含むことができる。少なくとも1種の生物学的活性は組織再生活性であることができる。本発明の粒子は典型的には単離されている、又は精製されている。
【００１０】
本発明の第2の態様は、治療に使用するための神経幹細胞微粒子を提供する。治療は、組織の置換、再生又は修復を必要とする再生治療であることができ、例えば、治療は血管新生、神経新生及び／又は神経保護を必要とする。治療は、神経学的疾患、障害又は欠損に対するものであることができる。治療は、機能及び／又は認知の回復を改善することができる。治療は、卒中、末梢動脈性疾患、神経症、又は組織の再生、血行再建若しくは局所的な抗炎症作用を必要とする任意の他の疾患若しくは障害に対するものであることができ、任意の他の疾患又は障害として、
（i）神経学的障害、疾患又は欠損、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、卒中若しくはALS、
（ii）リソソーム蓄積症、
（iii）心血管障害、例えば心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢動脈性疾患、糖尿病性潰瘍、創傷治癒、
（iv）特発性肺線維症、呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺高血圧症、嚢胞性線維症及び喘息を含む肺の疾患、
（v）代謝性又は炎症性障害、例えば糖尿病（I若しくはII型）、関節リウマチ、変形性関節症、ループス、クローン病、過敏性腸疾患又は移植片対宿主病、
（vi）精神障害、例えば鬱病、双極性障害、統合失調症、又は自閉症候群障害、例えば自閉症、アスペルガー症候群若しくはレット症候群、
（vii）失明を引き起こす網膜の疾患、例えば加齢性黄斑変性、シュタルガルト病、糖尿病性網膜症、網膜色素変性症、並びに
（viii）脱髄性疾患、例えば多発性硬化症、脳性麻痺、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、白質萎縮症、ギラン・バレー症候群、抗MAG末梢神経障害及びシャルコー・マリー・トゥース病
が挙げられる。
【００１１】
一実施形態では、微粒子はエキソソームであり、治療は組織の置換、再生若しくは修復を必要とする疾患若しくは状態に関するものである。別の実施形態では、微粒子は微小胞であり、治療は血管新生を必要とする疾患又は神経学的疾患、障害若しくは欠損に関するものである。
【００１２】
治療はまた、その後に、並行して、又は同時に、微粒子が由来する幹細胞を受け入れる宿主において寛容を誘導するための予防治療であることができ、典型的には免疫寛容を誘導するための予防治療であることができる。幹細胞治療の投与前の又は幹細胞治療の投与と並行しての本発明の微粒子の患者への1回以上の用量の投与により、幹細胞治療の有害な免疫応答、即ち「拒絶反応」のリスクを低減することができる。
【００１３】
本発明の第3の態様は、疾患の処置用の医薬の製造における神経幹細胞微粒子の使用を提供する。
【００１４】
本発明の第4の態様は幹細胞微粒子の製造方法を提供し、典型的には神経幹細胞微粒子の製造方法を提供する。本方法は、幹細胞の分化が可能な環境下で幹細胞を培養すること、及び細胞により産生される微粒子を回収することを含むことができる。微粒子を、部分的に分化した神経幹細胞から単離することができる。幹細胞を、代謝老廃物の効果的な除去が可能な条件下で培養することができる。一実施形態では、幹細胞の分化が可能な環境は多区画のバイオリアクタ中の培養であり、典型的には長期にわたる（例えば7日を超える）多区画のバイオリアクタ中の培養である。本方法は、幹細胞の条件培地から微粒子を単離することを含むことができる。幹細胞の条件培地は、幹細胞による培地中への微粒子の放出を刺激する1種以上の添加成分又は薬剤を含むことができる。1種以上の成分は、形質転換増殖因子-ベータ（TGF-β）、インターフェロン-ガンマ（INF-γ）及び／又は腫瘍壊死因子-アルファ（TNF-α）から選択され得る。微粒子を、幹細胞が低酸素条件下で培養された幹細胞の条件培地から単離することができる。微粒子を、NSCニッチ環境を作り出すために別の細胞型と、典型的には内皮細胞と共培養した幹細胞により生じる幹細胞の条件培地から単離することができる。
【００１５】
本発明の第5の態様は、本発明の第4の態様に係る方法により得られる微粒子を提供する。
【００１６】
本発明の第6の態様は、神経幹細胞微粒子と、薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤とを含む組成物を提供する。
【００１７】
本発明の第7の態様は、幹細胞と候補薬剤とを接触させること、及び接触させた幹細胞による微粒子の産生速度が対照と比較して増加するか又は低下するかを観測することを含む、幹細胞による微粒子の産生を変化させる薬剤のスクリーニング方法を提供する。
【００１８】
本発明の第8の態様は、幹細胞微粒子の製造方法に使用するためのキットであって、（a）幹細胞の培養に適した培地、（b）幹細胞、（c）任意選択で、本発明の第4の態様の1種以上の成分、（d）任意選択で、対照としての使用に適した幹細胞微粒子、（e）任意選択で、産生した微粒子の特異的検出に適した検出剤、及び（f）キットを使用して幹細胞微粒子を産生するための指示書、を含むキットを提供する。
【００１９】
本発明の第9の態様は、hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532の2種、3種又は4種全てを含む組成物を提供する。この組成物は任意選択で、薬学的に許容される担体、希釈剤、ビヒクル及び／又は賦形剤を含む医薬組成物である。医薬組成物は治療における使用に適しており、典型的には前述した本発明の微粒子と同じ治療における使用に適している。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】微粒子を産生するCTX0E03条件的不死化神経幹細胞を示す電子顕微鏡写真である。パネルA〜Eは、直径30nm〜50nmのエキソソームを含有する細胞内多小胞体（MVB）を示し、パネルFは、細胞膜での出芽プロセスを経て神経幹細胞から放出された直径100nm超の微小胞を示す。
【図２】幹細胞からの微粒子の同定、特性決定及び製造に関するプロトコルの概要を示す図である。
【図３】CTX0E03の条件培地及び非条件培地に対して実施したヒト血管新生ELISAストリップの光学密度の読み取りを示す。
【図４】図4Aは、通常の培養条件（3日T175）と比較した、Integraシステムから精製した微粒子を含有する15mlの培地から抽出したタンパク質の量（BCAアッセイで測定した）を示す。図4Bは、（i）Integra培養CTX0E03エキソソーム（左上のパネル）及び微小胞（右上のパネル）におけるCD63と、（ii）Integra培養CTX0E03エキソソーム（左下のパネル）及び微小胞（右下のパネル）におけるCD81とに関する（2ug/ml、1：250での）FACS検出を示す。
【図５】通常の培養条件（3日T175）と比較した、Integraシステムからのろ過により精製した微粒子を含有する15mlの培地から抽出して260/280nmで測定した単離全RNAの量を示す。
【図６Ａ】図6Aは、CTX0E03条件培地中で培養した正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）の又は精製したCTX0E03エキソソームの添加時の正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）の遊走活性を表す創閉鎖/掻創アッセイの結果を示す。
【図６Ｂ】図6Bは、基礎の条件（エキソソームなし）に対する10μgのCTX0E03エキソソームの効果を比較する、72時間後の掻創アッセイの結果を示す。
【図６Ｃ】図6Cは、基礎の条件、2μg/mlのエキソソーム、6μg/mlのエキソソーム、20μg/mlのエキソソーム及びLSGS（低血清増殖サプリメント）陽性対照に関する治癒面積の％を示す。図6Cの上のパネルは、Integra Cellineシステム中で2週にわたって培養したCTX0E03細胞から単離したエキソソームを示し、図6Cの下のパネルは、Integra Cellineシステム中で6週にわたって培養したCTX0E03細胞から単離したエキソソームを示す。
【図６Ｄ】図6Dは、インビボの注射創傷治癒アッセイ（injection wound healing assay）においてCTX0E03細胞と陰性対照（生理食塩水）とを比較する。
【図７】標準的なCTX0E03（T175）培養からの培養培地毎に得た精製エキソソームの量 対 3週目の時点でのIntegra CELLineシステムからの培養培地毎に得た精製エキソソームの量を示す。
【図８】図8Aは、CTX0E03 Integra CELLine培養システムの1週後、2週後及び3週後の2種の異なるフラスコから回収したエキソソームの濃度を示す。図8Bは、CTX0E03細胞の6週連続培養中において単一のIntegra CELLineフラスコから回収したエキソソームの濃度を示す。
【図９】標準的な（「対照」）CTX0E03（T175）培養と比較して、Integra CELLineシステム中において3週にわたって培養したCTX0E03細胞中で測定した様々なmRNAマーカーの発現レベルの変化倍率（fold change）を示す。
【図１０】標準的なCTX0E03（T175）培養でのCTX0E03細胞における基準発現レベルに対して評価した、Integraバイオリアクタ培養で3週にわたって培養したCTX0E03細胞から得たエキソソーム中の及び標準的なCTX0E03（T175）培養から得た微粒子中の様々なmiRNAの上方制御倍率及び下方制御倍率を示す。
【図１１ａ】標準的な（T175）条件下で培養したCTX0E03細胞（「CTX」）、微小胞（「MV」）及びエキソソーム（「EXO」）からのmiRNAの大規模シーケンシングから得たmiRNAのプロファイルを示す。図11a及び図11bは2種の培養物からの結果を示す。
【図１１ｂ】標準的な（T175）条件下で培養したCTX0E03細胞（「CTX」）、微小胞（「MV」）及びエキソソーム（「EXO」）からのmiRNAの大規模シーケンシングから得たmiRNAのプロファイルを示す。図11a及び図11bは2種の培養物からの結果を示す。
【図１２Ａ】HUVECの血管新生に対するhNSC微小胞の影響を示す図である。図12Aは、基礎のHUVECと比較して、微小胞を添加した場合（右側のパネル）に観測した管形成の明確な増加を示す写真である。
【図１２Ｂ】HUVECの血管新生に対するhNSC微小胞の影響を示す図である。図12B及び図12Cは、様々な濃度（0.05μg、0.1μg、0.3μg-図12B及び0.6μg/ml-図12C）でhNSC微小胞によりもたらされる管全長の増加を示す。
【図１２Ｃ】HUVECの血管新生に対するhNSC微小胞の影響を示す図である。図12B及び図12Cは、様々な濃度（0.05μg、0.1μg、0.3μg-図12B及び0.6μg/ml-図12C）でhNSC微小胞によりもたらされる管全長の増加を示す。
【図１３】PC-12細胞における神経突起伸長に対するhNSC微小胞の影響を示す写真である。
【図１４】Agilent RNAバイオアナライザで決定したCTX0E03細胞、エキソソーム及び微小胞における全RNA含有量プロファイルを示す電気泳動図である。
【図１５】エクソンに完全に重複する遺伝子をコードする割合（％）及びイントロン又は遺伝子間配列内に位置する非コード転写産物の割合（％）を模式的に示す（GENCODE配列データセットに対してNGS BAMファイルを実行することにより作成した）。
【図１６】CTX0E03プロデューサー細胞と比較してエキソソーム及びMVに選択的にシャトルされる（shuttled）、上位にランクする新規miRNAを示す。
【図１７Ａ】1週、2週、3週、4週、5週及び6週にわたりIntegra Cellineシステム中で培養したCTX0E03エキソソーム（図17A）及び微小胞（図17B）の粒子サイズ及び濃度を決定するために行ったNanoSight分析の結果を示す。
【図１７Ｂ】1週、2週、3週、4週、5週及び6週にわたりIntegra Cellineシステム中で培養したCTX0E03エキソソーム（図17A）及び微小胞（図17B）の粒子サイズ及び濃度を決定するために行ったNanoSight分析の結果を示す。
【図１８】CTX0E03エキソソームからのプロテオームデータと微小胞からのプロテオームデータとを比較し（18A及び18B）、並びに神経幹細胞エキソソームと間葉系幹細胞エキソソームとを比較する（18C及び18D）ベン図を示す。図18Aは、2週のIntegra培養システムから単離したCTX0E03エキソソーム及び微小胞内に特有のタンパク質の数を示す。図18Bは、CTX0E03エキソソーム内において同定したタンパク質と関連する生物学的プロセスと微小胞内において同定したタンパク質と関連する生物学的プロセスとを比較する。図18Cは、CTX0E03神経幹細胞エキソソームのプロテオームと間葉系幹細胞エキソソームのプロテオームとを比較し、図18Dは、MSC由来のエキソソームにおいて同定したタンパク質と関連する生物学的プロセスと神経幹細胞由来のエキソソームと関連する生物学的プロセスとを比較する。
【図１９】NSC由来のエキソームと関連するが間葉系幹細胞エキソソームとは関連しないことが分かった30種の生物学的プロセスを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明者らは予想外にも、神経幹細胞において微粒子を同定した。この微粒子は該微粒子が由来する神経幹細胞の機能のいくつかを保持し、神経幹細胞と同じ処置に有用であり、典型的には治療上有用である。微粒子は、対応する幹細胞よりも有利である。なぜならば、微粒子はより小さくてより単純であり、それにより、より容易に産生され、維持され、貯蔵され及び輸送され、並びに幹細胞を取り巻く規制問題のいくつかを避ける可能性を有するからである。条件培地からの単離により、例えば多区画のバイオリアクタ等のバイオリアクタ中で微粒子を連続して産生することができ、これにより、大規模産生及び「画一的な」治療の提供が可能になる。多区画のバイオリアクタは、典型的には2区画のバイオリアクタである。
【００２２】
予想外にも、幹細胞が分化し始めることが可能な環境下での（神経幹細胞に限定されない任意の種類の）幹細胞の培養により、産生される微粒子の収率が著しく増加することを更に発見した。
【００２３】
発明者らは予想外にも、多区画のバイオリアクタ中での（神経幹細胞に限定されない任意の種類の）幹細胞の培養の結果、より分化した形態の幹細胞へと幹細胞が部分的に分化することを観測した。培養でのこの分化は、分化を誘導する薬剤の添加を必要としない。この分化は典型的には、少なくとも1週間の、少なくとも2週間の又は少なくとも3週間の培養期間を必要とする。多区画のバイオリアクタ中での培養中に起こる幹細胞への変化は、培養した幹細胞による微粒子の産生に反映される。従って、多区画のバイオリアクタ中で幹細胞を培養することにより、細胞の分化を誘導することができる。よって、多区画のバイオリアクタ中で培養した幹細胞から微粒子を回収することにより、部分的に分化した幹細胞から微粒子を産生することができ、該幹細胞を、典型的には少なくとも1週にわたって、少なくとも2週にわたって、少なくとも3週にわたって、少なくとも4週にわたって、少なくとも5週にわたって又は少なくとも6週にわたって多区画のバイオリアクタ中で培養する。任意選択で、NSCを10週以下にわたって培養する。一実施形態では、本発明は、部分的に分化した神経幹細胞から微粒子を単離することによる微粒子の製造方法を提供する。
【００２４】
本発明者らはまた、幹細胞からの微粒子の分泌を誘導することができることも発見した。神経幹細胞に限定されず、任意の幹細胞からの微粒子の産生に使用することもできるこの発見により、幹細胞培養から得られる微粒子の収率を改善することが可能になる。いくつかの薬剤が微粒子の分泌を様々な程度に増進することが確認されており、このことは、分泌される微粒子の量をコントロールすることができるという更なる利点を有する。低酸素条件下での幹細胞の培養により、微粒子の産生も増進される。更に、幹細胞と別の細胞型との共培養により、具体的には内皮細胞型との共培養により、幹細胞によって産生される微粒子を有利に改変することができることを発見した。
【００２５】
更なる実施形態では、本発明は、無血清幹細胞により産生される微粒子を提供し、典型的にはエキソソームを提供する。血清は多くの細胞株の良好な培養に必要であるが、血清自体のエキソソーム等の多くの夾雑物を含有する。以下で説明するように、本発明者らは、良好な培養に血清を必要としない幹細胞から微粒子を産生している。
【００２６】
神経幹細胞微粒子
本発明は一態様において、神経幹細胞から得られる微粒子を提供する。神経幹細胞微粒子は、神経幹細胞により産生される微粒子である。典型的には、微粒子は神経幹細胞から分泌される。より典型的には、微粒子はエキソソーム又は微小胞である。間葉系幹細胞等の他の細胞からの微粒子が当分野で知られている。
【００２７】
「微粒子」は、細胞から放出される直径30〜100nmの細胞外小胞である。微粒子は、生体分子を囲む脂質二重層により規定される。用語「微粒子」は当分野で公知であり、膜粒子、膜小胞、微小胞、エキソソーム様小胞、エキソソーム、エクトソーム様小胞、エクトソーム又はエキソベシクル等の多くの異なる種類の微粒子を包含する。異なる種類の微粒子は、直径、細胞内起源、スクロース中での微粒子の密度、形状、沈降速度、脂質組成、タンパク質マーカー及び分泌の様式（即ち、シグナル（誘導性）後又は自発的（構成的））に基づいて区別される。一般的な4種の微粒子及びそれらの顕著な特徴を以下の表1で説明する。
【表１】
2020072718.tif 000002
【００２８】
微粒子は、直接的な及び間接的な機構を介してドナー細胞と受容細胞との間で媒体として作用することにより細胞間連絡に関与すると考えられる。直接的な機構として、受容細胞による微粒子及びそのドナー細胞由来成分（例えばタンパク質、脂質又は核酸）の取り込みが挙げられ、該成分は、受容細胞中において生物学的活性を有する。間接的な機構として、微小胞-受容細胞の表面相互作用、及び受容細胞の細胞内シグナル伝達を調節することが挙げられる。そのため、微粒子は、受容細胞による1種以上のドナー細胞由来の特性の獲得を媒介することができる。動物モデルにおける幹細胞治療の効果にもかかわらず、幹細胞は宿主中に生着されているようには見えない。よって、幹細胞治療が効果的である機構は不明である。理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、神経幹細胞により分泌される微粒子が神経幹細胞の治療上の有用性に関与し、従って微粒子自体が治療上有用であると考える。
【００２９】
本発明の微粒子及び幹細胞は単離される。用語「単離される」とは、該用語が言及する微粒子、微粒子集団、細胞又は細胞集団がその天然環境内ではないことを示す。微粒子、微粒子集団、細胞又は細胞集団は、周囲の組織から実質的に分離されている。いくつかの実施形態では、サンプルが少なくとも約75％の、いくつかの実施形態は少なくとも約85％の、いくつかの実施形態では少なくとも約90％の、いくつかの実施形態では少なくとも約95％の微粒子及び／又は幹細胞を含む場合、微粒子、微粒子集団、細胞又は細胞集団は周囲の組織から実質的に分離されている。換言すると、サンプルが約25％未満の、いくつかの実施形態では約15％未満の、いくつかの実施形態では約5％未満の、微粒子及び／又は幹細胞以外の物質を含有する場合、サンプルは周囲の組織から実質的に分離されている。そのようなパーセント値は重量パーセントを指す。本用語は、起源である生物から取り出されて培養物中に存在している細胞又は微粒子を包含する。本用語はまた、起源である生物から取り出され、その後に生物中に再挿入されている細胞又は微粒子も包含する。再挿入された細胞を含有する生物は、細胞が取り出された生物と同じ生物であることができ、又は異なる生物であることができる。
【００３０】
神経幹細胞は、（膜小胞及び微小胞を形成するための）原形質膜の出芽等の様々な機構により、並びに細胞膜による細胞内多小胞体（微粒子を含有する）の融合及び（エキソソーム及びエキソソーム様小胞を分泌するための）細胞外区画中への微粒子の放出の結果として、微粒子を天然に産生する。
【００３１】
本発明の微粒子を産生する神経幹細胞は、例えば米国特許第5,851,832号、米国特許第6,777,233号、米国特許第6,468,794号、米国特許第5,753,506号及びWO-A-2005121318で説明されている、胎児の、胚の又は成体の神経幹細胞であることができる。胎児組織は、ヒト胎児の皮質組織であることができる。細胞は、Yuan他(2011）により説明されているように人工多能性幹（iPS）細胞の分化から神経幹細胞として選択され得る、又は（例えば、最近のTheir他、2012のように、Sox2、Klf4及びc-Mycを構成的に誘導するがOct4活性をリプログラミングの初期段階に厳密に制限することにより）体細胞から産生された直接誘導型の神経幹細胞であることができ、例えば線維芽細胞であることできる。当分野で公知であるように（例えばKlimanskaya他、2006及びChung他、2008）、ヒト胚幹細胞は、ドナー胚の生存能力を保存する方法により得ることができる。ヒト胚幹細胞を得るためのそのような非破壊方法を、本発明の微粒子を得ることができる胚幹細胞を提供するために使用することができる。あるいは、本発明の微粒子は、成体の幹細胞、iPS細胞又は直接誘導型の神経幹細胞から得ることができる。よって、本発明の微粒子は、ヒト胚の破壊、又は原料物質としてのヒト胚の使用を必要としない多くの方法により産生することができる。
【００３２】
典型的には、微粒子が産生される神経幹細胞集団は実質的に純粋である。用語「実質的に純粋」は本明細書で使用する場合、全細胞集団を構成する他の細胞に対して、少なくとも約75％の、いくつかの実施形態では少なくとも約85％の、いくつかの実施形態では少なくとも約90％の、いくつかの実施形態では少なくとも約95％の純度である幹細胞の集団を指す。例えば、神経幹細胞集団に関して、この用語は、全細胞集団を構成する他の細胞と比較して神経幹細胞が少なくとも75％の、いくつかの実施形態では少なくとも85％の、いくつかの実施形態では少なくとも約90％の、いくつかの実施形態では少なくとも約95％の純度であることを意味する。換言すると、用語「実質的に純粋」は、オリジナルの増幅されていない並びにその後の培養及び増幅前に単離されている集団における系列決定済み細胞（lineage committed cell）の約25％未満を、いくつかの実施形態では約15％未満を、いくつかの実施形態では約5％未満を含有する本発明の幹細胞の集団を指す。
【００３３】
神経幹細胞微粒子は典型的には、脂質、タンパク質及び核酸を含む環境を取り囲む少なくとも1層の脂質二重層を含む。核酸はデオキシリボ核酸（DNA）及び／又はリボ核酸（RNA）であることができる。RNAは、メッセンジャーRNA（mRNA）、マイクロRNA（miRNA）又は任意のmiRNA前駆体、例えばpri-miRNA、pre-miRNA及び／又は核内低分子RNA（snRNA）であることができる。
【００３４】
神経幹細胞微粒子は幹細胞に由来する少なくとも1種の生物学的機能を保持する。保持され得る生物学的機能として、血管新生及び／又は神経新生を促進する能力、卒中を患っている患者の脳における認知の改善をもたらす能力あるいは末梢動脈性疾患における血流の回復を加速させる能力が挙げられる。例えば、CTX0E03細胞はPBMCアッセイにおいてT細胞の活性化を阻害することが知られており、一実施形態では、本発明の微粒子は、このPBMCアッセイにおいてT細胞の活性化を阻害する能力を保持する。PBMCアッセイは当業者に公知であり、該アッセイを実施するためのキットが市販されている。
【００３５】
実施例8、表2及び図6は、CTX0E03幹細胞エキソソームが創傷治癒の「掻創」モデルにおいて創傷を閉鎖する能力を保持することを証明する。図6Aにおける結果は、CTX0E03条件培地で培養した正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）の遊走活性は、精製エキソソームの添加時に観測した遊走活性とほとんど同じであることを示す。よって、本発明の微粒子が保持することができる生物学的機能の1種は、正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）の遊走活性を刺激する能力である。
【００３６】
実施例8はまた、本発明の微粒子が初代HUVECの血管新生を刺激することができること及びPC-12細胞の神経突起伸長を刺激することができることを示す。よって、本発明の微粒子が保持することができる生物学的機能は、初代HUVECの血管新生を刺激する及び／又はPC-12細胞の神経突起伸長を刺激する能力である。
【００３７】
実施例13でのプロテオーム分析は、神経幹細胞エキソソームが、遺伝物質の産生、パッケージング、機能及び分解に関連する生物学的機能を含むことを示す。よって、一実施形態では、本発明のエキソソームは、これらの機能を保持し、典型的にはRNAポリメラーゼ機能、RNA分解機能、リボソーム機能及びスプライソソーム機能の1種以上を保持する。
【００３８】
神経幹細胞から得られた微粒子は、1000nm以下の直径を有する。典型的には、本発明の微粒子は200nm以下の直径、例えば100nm以下の直径を有することができる。上記表1に記載したように、微粒子は100nm〜1000nmの直径を有する。エキソソームは典型的には30〜100nmの直径を有すると定義されるが、ここ最近の研究では、エキソソームは100nm〜200nmの直径を有することもできることが確認されている（例えばKatsuda他、Proteomics 2013及びKatsuda他、Scientific Reports 2013）。よって、エキソソームは典型的には30nm〜150nmの直径を有する。膜粒子は50nm〜80nmの直径を有し、エキソソーム様粒子は20nm〜50nmの直径を有する。直径を任意の適切な技法、例えば電子顕微鏡法又は動的光散乱法で決定することができる。用語「微粒子」として、膜粒子、膜小胞、微小胞、エキソソーム様小胞、エキソソーム、エクトソーム様小胞、エクトソーム又はエキソベシクルが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３９】
図1のパネルA〜Eは、直径が30〜50nmのエキソソームを含有するMVBの神経幹細胞における存在を示し、更にパネルFは直径が100nmを超える微小胞を示す。表20及び図17（以下）は、典型的な神経幹細胞エキソソームは約70nm〜約150nmの範囲の直径を有すると測定され、この直径は当分野で説明されている（間葉系幹細胞由来の）エキソソームのサイズと一致することを示す。よって、本発明のエキソソームは典型的には30nm〜200nmの直径を有し、より典型的には50nm〜150nmの直径を有する。前述したように、エキソソームは典型的には、Alixマーカー（UNIPROTアクセッション番号Q8WUM4）について陽性である。
【００４０】
図1F及び表20は、モード径が約150nm〜200nmである又は中央径が約180nm〜350nmである典型的な神経幹細胞微粒子の観測したサイズを示す。よって、本発明の微粒子は典型的には100〜1000nmの直径を有し、より典型的には150nm〜350nmの直径を有する。
【００４１】
本発明の微粒子の一部はCD133表面マーカーを発現する。本発明の他の微粒子はCD133表面マーカーを発現しない。
【００４２】
「マーカー」は、存在、濃度、活性又はリン酸化状態が検出され得る及び細胞の表現型を同定するために使用され得る生体分子を指す。
【００４３】
エキソソームは、典型的には30〜100nmの直径であり、時には100nm〜200nmの直径である、エンドソーム由来の脂質微粒子であり、エキソサイトーシスにより細胞から放出される。エキソソームの放出は、制御されて機能的に適切な様式で、構成的に又は誘導時に起こる。エキソソームの生合成中に、エキソソームは広範囲の細胞質タンパク質（シャペロンタンパク質、インテグリン、細胞骨格タンパク質及びテトラスパニン等）及び遺伝物質を組み入れる。その結果、エキソソームは、親細胞微環境下において及び相当な距離にわたって細胞間でタンパク質、脂質及び遺伝物質を移動させるための細胞間連絡デバイスであると見なされる。本発明はこの理論に拘束されないが、エキソソームは神経幹細胞の効果に関与している可能性がある。従って、神経幹細胞由来のエキソソームは、それ自体が治療に効果があると予期される。
【００４４】
所望の機能を有するように設計されている微粒子
微粒子は、該微粒子を産生する幹細胞の機能の少なくともいくつかを保持する。従って、幹細胞（幹細胞は任意の幹細胞型であることができ神経幹細胞に限定されないが、本発明の神経幹細胞微粒子は実施形態として明白に含まれる）を操作することにより、1種以上の所望の機能、典型的にはタンパク質又はmiRNAを有するように微粒子を設計することができる。その操作は典型的には、1種以上の外因性のコード核酸配列、非コード核酸配列又は調節核酸配列を幹細胞に導入するための遺伝子操作であることができる。例えば、VEGF及び／又はbFGFを含有するエキソソームが所望される場合、エキソソームを産生する幹細胞を形質転換して又は該幹細胞にトランスフェクションしてVEGF及び／又はbFGFを（高レベルで）発現させることができ、次いでそれらは幹細胞により産生される微粒子中に組み入れられるだろう。同様に、iPS細胞を使用して微粒子を産生することができ、この細胞を、iPS細胞により産生される微粒子に必要なタンパク質及び核酸（例えばmiRNA）を産生するように設計することができる。従って、本発明は、微粒子が産生される幹細胞中において天然には存在しない機能を含有し（即ち、微粒子（例えばエキソソーム）は1種以上の外因性のタンパク質配列又は核酸配列を含有する）、天然には生じない及び操作されている、任意の幹細胞型由来の特別な微粒子を提供する。
【００４５】
一実施形態では、単離された又は精製された微粒子には、標的細胞中で所望の機能を発揮するように意図されている1種以上の外因性の核酸、脂質、タンパク質、薬物又はプロドラッグが多く負荷されている。このことは幹細胞の操作を必要とせず、外因性物質を任意選択で微粒子に直接添加することができる。例えば、外因性の核酸を電気穿孔（エレクトロポレーション）により微粒子中に導入することができる。次いで、微粒子を外因性物質の媒体又は担体として使用することができる。一実施形態では、微粒子を産生する細胞から単離された微粒子には、1種以上の病態遺伝子をサイレンシングするために配備され得る微粒子を産生するために、典型的には電気穿孔により外因性のsiRNAが多く含まれている。このようにして、微粒子を1種以上の薬剤、典型的には治療薬又は診断薬を標的細胞に搬送するための媒体として使用することができる。この例として、1種以上の病態遺伝子をサイレンシングすることができる外因性のsiRNAを含む神経幹細胞エキソソームが挙げられる。
【００４６】
微粒子マーカー
本発明は、単離された神経幹細胞微粒子の集団を提供し、該集団は本質的に本発明の微粒子のみを含み、即ち微粒子集団は純粋である。多くの態様では、微粒子集団は、本発明の微粒子を少なくとも約80％（他の態様では少なくとも85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％又は100％）含む。
【００４７】
本発明の単離された神経幹細胞微粒子は特定のマーカーに特有の発現プロファイルを有することを特徴とし、他の細胞型由来の微粒子と区別される。マーカーを本明細書で説明する場合、マーカーの存在又は不存在を使用して微粒子を区別することができる。例えば、用語「含むことができる」又は「発現することができる」はまた、マーカーが存在しない正反対の実施形態も開示し、即ち、フレーズ「微粒子は1種以上のテトラスパニン、典型的にはCD63、CD81、CD9、CD53、CD82及び／又はCD37を含むことができる」はまた、微粒子が1種以上のテトラスパニン、典型的にはCD63、CD81、CD9、CD53、CD82及び／又はCD37を含み得ない正反対の実施形態も説明する。
【００４８】
集団の微粒子の少なくとも約70％が検出可能なレベルのマーカーを示す場合、例えば膜粒子、膜小胞、微小胞、エキソソーム様小胞、エキソソーム、エクトソーム様小胞、エクトソーム又はエキソベシクルの70％が検出可能なレベルのマーカーを示す場合、本発明の神経幹細胞微粒子はマーカーを保有すると典型的には見なされる。他の態様では、集団の少なくとも約80％、少なくとも約90％又は少なくとも約95％又は少なくとも約97％又は少なくとも約98％以上が検出可能なレベルのマーカーを示す。特定の態様では、集団の少なくとも約99％又は100％が検出可能なレベルのマーカーを示す。マーカーの定量化は、定量的RT-PCR（qRT-PCR）の使用により又は蛍光活性化細胞選別（FACS）により検出することができる。この列挙は例としてのみ記載され、限定することを意図しないことを理解すべきである。典型的には、FACSで検出する場合に集団の微粒子の少なくとも90％が検出可能なレベルのマーカーを示す場合、本発明の神経幹細胞微粒子はマーカーを保有すると見なされる。
【００４９】
qRT-PCRで測定した細胞の発現レベルが35（qRT-PCRアレイ時の標準カットオフ）以下のクロッシングポイント（Cp）値を有する場合、本明細書で説明したマーカーは本発明の集団の細胞により発現されると見なされる。Cpは増幅曲線が検出閾値を超える箇所を表し、クロッシング閾値（ct）としても報告され得る。
【００５０】
一実施形態では、本発明は、集団の細胞がマーカーであるネスチン、Sox2、GFAP、βIIIチューブリン、DCX、GALC、TUBB3、GDNF及びIDOの1種以上を発現することを特徴とする神経幹細胞集団により産生される微粒子に関する。別の実施形態では、微粒子はエキソソームであり、エキソソームの集団はDCX（ダブルコルチン-初期神経細胞マーカー）、GFAP（グリア線維性酸性タンパク質-星状膠細胞マーカー）、GALC、TUBB3、GDNF及びIDOの1種以上を発現する。
【００５１】
本発明の神経幹細胞微粒子は、1種以上のタンパク質マーカーを、同じ種の間葉系幹細胞微粒子中での該マーカーの発現レベルよりも低い又は高いレベルで発現することができる。CTX0E03細胞微粒子により発現されるタンパク質マーカーが本明細書において及び以下で同定されている。いくつかの実施形態では、微粒子は、αチューブリン又は他のそのような対照タンパク質（単数又は複数）に比例するレベルでタンパク質マーカーを発現することができる。いくつかの実施形態では、本発明の微粒子は、このタンパク質を対照タンパク質に対して少なくとも+/-1.2倍変化するレベルで、典型的には対照タンパク質に対して少なくとも+/-1.5倍変化するレベルで、対照タンパク質に対して少なくとも+/-2倍変化するレベルで又は対照タンパク質に対して少なくとも+/-3倍変化するレベルで発現することができる。いくつかの実施形態では、微粒子はタンパク質マーカーをαチューブリン又は他の対照タンパク質に対して細胞当たり10-2〜10-6回のコピーのレベルで発現することができる。いくつかの実施形態では、本発明の微粒子は、このタンパク質をαチューブリン又は他の対照タンパク質に対して細胞当たり10-2〜10-3回のコピーのレベルで発現することができる。
【００５２】
本発明の神経幹細胞微粒子は、1種以上のmiRNA（miRNA前駆体等）を、同じ種の間葉系幹細胞微粒子におけるmiRNA（miRNA前駆体等）の発現レベルよりも低い又は高いレベルで発現することができる。CTX0E03細胞微粒子により発現されるmiRNAマーカーが以下で同定されている。いくつかの実施形態では、本発明の微粒子は、マーカーmiRNAを、内部対照遺伝子とも称されるU6B若しくは15a又は任意の他のmiRNA参照遺伝子と比較して少なくとも+/-1.5倍変化するレベルで、典型的には少なくとも+/-2倍変化するレベルで又は少なくとも+/-3倍変化するレベルで（公知であるΔΔct法に従って算出される）発現することができる。
【００５３】
本発明の神経幹細胞微粒子は、同じ種の間葉系幹細胞微粒子におけるmRNAの発現レベルよりも低い又は高いレベルで1種以上のmRNAを発現することができる。いくつかの実施形態では、本発明の微粒子は、内部対照遺伝子とも称されるATP5B若しくはYWHAZ又は任意の他の参照遺伝子に対して少なくとも+/-1.5倍変化するレベルで、典型的には少なくとも+/-2倍変化するレベルで又は少なくとも+/-3倍変化するレベルで（ΔΔct法に従って算出される）マーカーmRNAを発現することができる。
【００５４】
本発明のエキソソームは典型的には、インテグリン、テトラスパニン、MHCクラスI抗原及び／又はMHCクラスII抗原、CD抗原並びにそれらの表面上の細胞接着分子を特異的に発現し、これにより、特定の細胞型によるこれらの取り込みを促進することができる。エキソソームは、様々な細胞骨格タンパク質、GTPアーゼ、クラスリン、シャペロン及び代謝酵素を含有する（ミトコンドリアタンパク質、リソソームタンパク質及びERタンパク質は除外されており、そのため全体のプロファイルは細胞質と似ていない）。エキソソームはまた、mRNAスプライシング因子及びmRNA翻訳因子も含有する。最後に、エキソソームは一般的に、HSP70、HSP90及びアネキシン等のシグナル伝達の役割を果たすことが知られているが古典的機構（ER-ゴルジ）では分泌されないいくつかのタンパク質を含有する。
【００５５】
エキソソームの脂質二重層は典型的には、コレステロール、スフィンゴミエリン及びセラミドが多量に存在している。エキソソームはまた、1種以上のテトラスパニンマーカータンパク質も発現する。テトラスパニンとして、CD81、CD63、CD9、CD53、CD82及びCD37が挙げられる。エキソソームはまた、増殖因子、サイトカイン及びRNAも含有し、具体的にはmiRNAも含有する。エキソソームは典型的には、マーカーTSG101、Alix、CD109、thy-1及びCD133の1種以上を発現する。Alix（Uniprotアクセッション番号Q8WUM4）、TSG101（Uniprotアクセッション番号Q99816）並びにテトラスパニンタンパク質CD81（Uniprotアクセッション番号P60033）及びCD9（Uniprotアクセッション番号P21926）は特徴的なエキソソームマーカーである。
【００５６】
Alixはエンドソーム経路マーカーである。エキソソームはエンドソーム由来であり、従って、このマーカーについて陽性の微粒子はエキソソームと特性決定される。本発明のエキソソームは典型的には、Alixについて陽性である。本発明の微小胞は典型的には、Alixについて陰性である。
【００５７】
微粒子プロテオーム
表18及び20は、Integra Cellineの多区画のバイオリアクタ中で2週にわたって培養したCTX0E03細胞から単離したエキソソーム及び微小胞それぞれにおいて質量分析で検出される全てのタンパク質を列挙する。一実施形態では、本発明のエキソソームは、表18に列挙したタンパク質の少なくとも70％を、少なくとも80％を、少なくとも90％を、少なくとも95％を、少なくとも99％を又は少なくとも99.5％を含む。同様に、本発明の微小胞は典型的には、表20に列挙したタンパク質の少なくとも70％を、少なくとも80％を、少なくとも90％を、少なくとも95％を、少なくとも99％を又は少なくとも99.5％を含む。更なる実施形態では、本発明の微小胞又はエキソソームのプロテオームは、表18（エキソソーム）又は表20（微小胞）に記載されたプロテオームと少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％又は少なくとも99.5％同一である。微小胞又はエキソソームのタンパク質含有量を決定する場合、典型的には質量分析を使用し、例えば実施例13で説明するLC/MS/MS法を使用する。
【００５８】
表19及び表21は、Integra Cellineの多区画のバイオリアクタ中で2週にわたって培養したCTX0E03細胞から単離したエキソソーム及び微小胞それぞれにおいて質量分析で検出した100種の最も多量に存在するタンパク質を示す。典型的には、本発明のエキソソームは、表19に列挙した最初の10種のタンパク質を含み、より典型的には表19に列挙した最初の20種の、最初の30種の、最初の40種の又は最初の50種のタンパク質を含む。同様に、本発明の微粒子は典型的には、表21に列挙した最初の10種のタンパク質を含み、より典型的には表21に列挙した最初の20種の、最初の30種の、最初の40種の又は最初の50種のタンパク質を含む。一実施形態では、本発明のエキソソームは、表19に列挙した全100種のタンパク質を含む。一実施形態では、本発明の微小胞は、表21に列挙した全100種のタンパク質を含む。典型的には、本発明のエキソソーム又は微小胞における100種の最も多量に存在するタンパク質は、表19（エキソソーム）又は表21（微粒子）で同定されているタンパク質の少なくとも70種を含有する。より典型的には、本発明のエキソソーム又は微小胞における100種の最も多量に存在するタンパク質は、表19（エキソソーム）又は表21（微粒子）で同定されているタンパク質の少なくとも80種を、少なくとも95種を、96種を、97種を、98種を又は99種を又は全100種を含有する。
【００５９】
微粒子のmiRNA含有量
実施例12（及び関連する図11）は、CTX0E03細胞、この細胞により産生される微小胞及びエキソソーム中に存在するmiRNAの大規模シーケンシングの結果を示す。この実施例は予想外にも、微粒子中に存在する異なるmiRNA種の数は細胞中に存在する異なるmiRNA種の数と比較して大幅に減少しており、微粒子は120未満の異なるmiRNAを含有するが細胞は450〜700のmiRNA種を含有することを示す。微粒子はhsa-miR-1246の大部分を含有する。
【００６０】
実施例12のデータはまた、微粒子が4種の主要なmiRNA種、即ちhsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532で特性決定されることも示す。これらの4種のmiRNAは、微粒子中における1000回以上のリード数で存在するmiRNAのみであり、これらの4種のmiRNAは、微粒子中における他のmiRNAと比較して大きく過剰に存在する。このことは細胞中におけるプロファイルと大きく異なっており、細胞は、高い（1000を超えるリード数）レベル又は非常に高い（10,000回を超えるリード数）レベルで存在する、はるかに多い数のmiRNAを含有する。理論には拘束されないが、本発明者らは、hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532は微粒子中に選択的に運ばれ（又は組み入れられ）、微粒子の機能に関与すると考えられることを提案する。
【００６１】
典型的には、一実施形態では、本発明の微粒子、例えばエキソソームは、hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532の1種、2種、3種又は4種全てを含有する。これらのmiRNAマーカーそれぞれは典型的には、微粒子当たり少なくとも1000のリード数（任意選択で、実施例12で説明した大規模シーケンス技法を使用して決定される）で存在する。hsa-miR-1246は、微粒子当たり少なくとも2000の、5000の、10,000の、20,000の又は25,000のリード数を任意選択で有することができる。Hsa-miR-4492は、微粒子当たり少なくとも2000の、3000の、4000の又は5000のリード数を任意選択で有することができる。Hsa-miR-4532は、微粒子当たり少なくとも2000の又は3000のリード数を任意選択で有することができる。
【００６２】
一実施形態では、hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及び／又はhsa-miR-4532それぞれは、微粒子を産生した細胞中に存在する場合よりも高いリード数で微粒子中に、例えばエキソソーム中に存在する。具体的には、miR-1246の微粒子中におけるリード数は典型的には、細胞中におけるリード数の少なくとも2倍であり、より典型的には細胞中におけるリード数の4倍、5倍、6倍、7倍又は8倍であり、任意選択で細胞中におけるリード数の10倍、15倍又は20倍である。
【００６３】
一実施形態では、本発明の微粒子は、hsa-let-7a-5p、has-miR-92b-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-100-5p及び／又はhsa-99b-5pを、微粒子を産生した細胞中に存在する場合よりも低いリード数で含有する。典型的には、これらのmiRNAそれぞれの本発明の微粒子中におけるリード数は1000未満であり、より典型的には100未満であり、例えば50未満である。任意選択で、本発明の微粒子は、hsa-let-7a-5pを50未満の又は25未満のリード数で含有する。
【００６４】
一実施形態では、本発明の微粒子は、大規模シーケンシングにより分析した場合に150種未満のmiRNA（即ち様々なmiRNA種）を含有し、典型的には120種未満のmiRNAを含有する。
【００６５】
一実施形態では、hsa-miR-1246は本発明の微粒子中において最も多量に存在するmiRNAである（任意選択で、実施例12で説明した大規模シーケンス技法を使用して決定した）。典型的には、本発明の微粒子（例えば微小胞及びエキソソーム）中におけるmiRNAの総数の少なくとも40％はhsa-miR-1246である。典型的には、本発明のエキソソーム中におけるmiRNAの総数の少なくとも50％はhsa-miR-1246である。
【００６６】
hsa-miR-4492は典型的には、本発明の微粒子中において2番目に多量に存在するmiRNAである。典型的には、本発明の微粒子（例えば微小胞及びエキソソーム）中におけるmiRNAの総数の少なくとも3％はhsa-miR-4492である。より典型的には、本発明の微粒子（例えば微小胞及びエキソソーム）中におけるmiRNAの総数の少なくとも4％はhsa-miR-4492である。
【００６７】
典型的には、本発明の微粒子（例えば微小胞及びエキソソーム）中におけるmiRNAの総数の少なくとも2％はhsa-miR-4532である。
【００６８】
典型的には、本発明の微粒子（例えば微小胞及びエキソソーム）中におけるmiRNAの総数の少なくとも1％はhsa-miR-4488である。
【００６９】
一実施形態では、本発明の微粒子は、hsa-miR-4508、hsa-miR-4516の一方又は両方を、該粒子におけるmiRNAの全含有量の少なくとも0.1％のレベルで含有する。
【００７０】
hsa-miR-3676-5p、hsa-miR-4485、hsa-miR-4497、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-3195、hsa-miR-3648、hsa-miR-663b、hsa-miR-3656、hsa-miR-3687、hsa-miR-4466、hsa-miR-4792、hsa-miR-99b-5p及びhsa-miR-1973の1種以上が本発明の微粒子中に存在することができる。
【００７１】
典型的には、hsa-let-7a-5p及びhsa-100-5pそれぞれは、本発明の微粒子におけるmiRNAの総数の1％未満で存在し、より典型的には0.1％未満で又は0.05％未満で存在する。
【００７２】
本発明の典型的なエキソソームでは、miRNAの総数の少なくとも50％がhsa-miR-1246であり、miRNAの総数の0.1％未満がhsa-let-7a-5pである。
【００７３】
一実施形態では、本発明の微粒子におけるmiRNAの総数の少なくとも90％はhsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532を含む。典型的には、本発明の微粒子におけるmiRNAの総数の少なくとも95％又は96％はhsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532を含む。これらの微粒子のmiRNAの全含有量の10％未満は、hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532ではないmiRNAである。
【００７４】
上記で論じたmiRNAの実施形態の組み合わせが提供される。例えば、本発明の微粒子は典型的には、hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532それぞれを少なくとも1000のリード数で含有し、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-100-5p及びhsa-99b-5pそれぞれを100未満のリード数で含有する。典型的には、これらの微粒子における総miRNAの少なくとも90％又は少なくとも95％は、hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532である。
【００７５】
本発明の微粒子（例えば微小胞又はエキソソーム）は典型的には、最も多量に存在するmiRNAとしてhsa-miR-1246を有し、hsa-miR-4492は2番目に多量に存在するmiRNAである。本実施形態では、本発明の微粒子（例えば微小胞及びエキソソーム）におけるmiRNAの総数の少なくとも40％はhsa-miR-1246であり、該微粒子におけるmiRNAの総数の少なくとも3％はhsa-miR-4492である。この微粒子におけるmiRNAの総数の少なくとも2％はhsa-miR-4532であり、該微粒子におけるmiRNAの総数の少なくとも1％はhsa-miR-4488である。hsa-let-7a-5p及びhsa-100-5pそれぞれは、この微粒子におけるmiRNAの総数の0.1％未満で存在する。
【００７６】
エキソソーム及び微小胞中における大規模シーケンシングの結果を細胞に対する相対的な変化倍率としてプロットすることにより、hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532は細胞と比較してエキソソーム中及び微小胞中において有意に上方制御されることが確認される。この比較はまた、エキソソーム及び微小胞の両方においてmiRNAであるhsa-miR-3195が最も上方制御されたmiRNAであることを示す。hsa-miR-3195の絶対リードはエキソソーム及び微小胞に関して約40の範囲であるが、細胞中においてhsa-miR-3195は検出されない。従って、hsa-miR-3195は本発明のエキソソーム及び微小胞中に特異的に見られ、一実施形態では、本発明のエキソソーム又は微小胞はhsa-miR-3195を含む。
【００７７】
一実施形態では、本発明の微粒子は、以下のmiRNA前駆体の1種以上を含む：
AC079949.1 （配列番号738）
GGCCGCGCCCCGTTTCCCAGGACAAAGGGCACTCCGCACCGGACCCTGGTCCCAGCG；
AP000318.1 （配列番号739）
CCCACTCCCTGGCGCCGCTTGTGGAGGGCCCAAGTCCTTCTGATTGAGGCCCAACCCGTGGAAG；
AL161626.1 （配列番号740）
CGCCGGGACCGGGGTCCGGGGCGGAGTGCCCTTCCTCCTGGGAAACGGGGTGCGGC；
AC004943.1 （配列番号741）
GCTTCACGTCCCCACCGGCGGCGGCGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCTC；及び
AL121897.1 （配列番号742）
GCCGCCCCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCCGCTTTCGGCTCGGGCCTCAGGTGAGTCGGAGGGGCCGGGCGCC
【００７８】
一実施形態では、本発明の微粒子は、（実施例12のパートDに詳述した）上記に列挙した前駆体から得られる以下の成熟miRNAの1種、2種又は3種を含む：
ggcggagugcccuucuuccugg （AL161626.1-201に由来する） （配列番号743）
ggagggcccaaguccuucugau （AP000318.1-201に由来する） （配列番号744）
gaccaggguccggugcggagug （AC079949.1-201に由来する） （配列番号745）。
【００７９】
これらの5種のmiRNA前駆体及び3種の成熟miRNAはこれまで単離されておらず、従って、各配列はそれ自体が新規の配列としても提供される。よって、一態様では、本発明は、miRNA前駆体であるAC079949.1、AP000318.1、AL161626.1、AC004943.1及びAL121897.1の1種以上を含む組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、成熟miRNAであるggcggagugcccuucuuccugg（AL161626.1-201に由来する）、ggagggcccaaguccuucugau（AP000318.1-201に由来する）及びgaccaggguccggugcggagug（AC079949.1-201に由来する）の1種以上を含む組成物を提供する。任意選択で、組成物は、1種以上のmiRNA前駆体及び／又は1種以上の成熟miRNAと、薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含む医薬組成物である。実施例12で述べるように、これらのmiRNA及び前駆体はエキソソーム及び微小胞中に選択的にシャトルされると思われ、そのため、微粒子の機能に少なくとも部分的に関与することができる。
【００８０】
実施例12はまた、神経幹細胞微粒子が様々な非コードRNA種を含むことも示す。一実施形態では、本発明の微粒子は、リボソームRNA、核小体低分子RNA、核内低分子RNA、マイクロRNA、長鎖遺伝子間非コードRNA及び多種多様な他のRNA（例えばRMRP、ヴォールトRNA、後生動物SRP及び／又はRNY）の1種以上を含む。
【００８１】
実施例4は、CTX0E03細胞により産生される微粒子中に存在し、qRT-PCRアレイにより決定した場合に35未満のCpを有するmiRNAを示す。典型的には、一実施形態では、本発明の微粒子は、以下のmiRNA（Ambros他に従った及びwww.mirbase.orgで利用可能な名称により特定される）の1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、60種若しくはそれ以上又は全てを含有する。
【００８２】
2020072718.tif 000003
2020072718.tif 000004
【００８３】
一実施形態では、CTX0E03微粒子は、以下のmiRNA（該miRNAは上記リストから選択されている）の1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種又はそれ以上を含有する。
【００８４】
2020072718.tif 000005
【００８５】
ドットブロットで検出されるタンパク質
実施例5は、CTX0E03細胞により産生される微粒子中に存在し、ドットブロットで検出されるタンパク質を示す。典型的には、本発明の微粒子は、以下のタンパク質の1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種又は全てを含有する。
【００８６】
2020072718.tif 000006
【００８７】
実施例13では、エキソソーム及び微小胞中におけるガレクチン-3及びトロンボスポンジン-1の存在も確認される。実施例13では、エキソソーム中におけるTIMP-1の存在が確認される。
【００８８】
実施例5はまた、CTX0E03細胞により産生される微粒子が以下のタンパク質の1種、2種、3種、4種又は5種を発現することもできることも示す。
【００８９】
2020072718.tif 000007
【００９０】
実施例13では、エキソソーム及び微小胞中におけるEGF-R及びCskの存在も確認される。
【００９１】
ガレクチン-3、SPARC、TIMP-1、トロンボスポンジン-1、VEGF、MDC及びエンドスタチンは血管新生を調節することが知られている。よって、これらのタンパク質の1種以上を含有する微粒子は、血管新生を調節する必要がある疾患又は障害の処置に有用である。
【００９２】
IL-1a、LECT2、MCP-1及びCskは炎症を調節することが知られている。よって、これらのタンパク質の1種以上を含有する微粒子は、炎症を調節する必要がある疾患又は障害の処置に有用である。
【００９３】
（i）ガレクチン-3、SPARC、TIMP-1、トロンボスポンジン-1、VEGF、MDC及びエンドスタチンの1種以上と、（ii）IL-1a、LECT2、MCP-1及びCskの1種以上とを含有する微粒子は、血管新生及び炎症を調節する必要がある疾患又は障害の処置に有用であることができる。
【００９４】
多区画のバイオリアクタでの培養における神経幹細胞
以下の実施例10及び図9に示すように、3週にわたる多区画のバイオリアクタでの培養後に、神経幹細胞は、標準的な単一区画のT175フラスコ中において標準的な手順に従って培養された神経幹細胞よりも有意に高いレベルで多くのマーカーを発現する。一実施形態では、本発明の微粒子は、典型的には多区画のバイオリアクタ中で、少なくとも2週にわたって、典型的には少なくとも3週にわたって、少なくとも4週にわたって、少なくとも5週にわたって又は少なくとも6週にわたって培養されたNSCから単離される。任意選択で、NSCは10週以下にわたって、例えば2〜10週にわたって、3〜10週にわたって、4〜10週にわたって、5〜10週にわたって又は6〜10週にわたって培養されている。
【００９５】
多区画のバイオリアクタ中で3週にわたって培養されたCTX0E03神経幹細胞は、標準的な単一区画のT175細胞培養中で培養された神経幹細胞よりも高いレベルでDCX、GALC、GFAP、TUBB3、GDNF及びIDOを発現する。よって、多区画のバイオリアクタ中で培養されている神経幹細胞は、DCX、GALC、GFAP、TUBB3、GDNF及びIDOの1種以上を発現することができ、該神経幹細胞は、典型的には1週以上にわたって、10日以上にわたって、2週以上にわたって又は少なくとも3週にわたって、4週にわたって、5週又はそれ以上にわたって培養されている。2区画のバイオリアクタ中で培養された細胞は典型的には、DCX、GALC、GFAP、TUBB3、GDNF及びIDOの1種以上の、標準的な条件下で培養された幹細胞と比較して増加した発現を示す。多区画のバイオリアクタで培養された細胞におけるこれらのマーカーの発現レベルは典型的には、標準的な単一区画のT175培養フラスコ中で培養された細胞においてよりも有意に高い。典型的には、多区画のバイオリアクタ中で培養された幹細胞は、標準的な培養手順に従ってT-175フラスコ中で培養されたCTX0E03細胞においてよりも少なくとも2倍高いレベルでDCX1、GALC、GFAP、TUBB3、GDNF又はIDOの1種以上を発現する。一実施形態では、微粒子、典型的にはエキソソームは、標準的な条件下で培養した幹細胞と比較してDCX、GALC、GFAP、TUBB3、GDNF及びIDOの1種以上の増加した発現を示す神経幹細胞から得られる。例えば、Integra CeLLineバイオリアクタで培養した神経幹細胞から回収した、ろ過したばかりの（freshly filtered）条件培地から微粒子を得ることができる。
【００９６】
上方制御されたマーカーとして、DCX（ダブルコルチン-初期神経細胞マーカー）、GFAP（グリア線維性酸性タンパク質-星状膠細胞マーカー）、GALC、TUBB3、GDNF及びIDOが挙げられる。CTX0E03細胞は3種の異なる細胞型、即ち神経、星状膠細胞及び乏突起膠細胞に分化することができる。多区画のバイオリアクタ中での3週間後の高レベルのDCX及びGFAPは、培養した幹細胞が部分的に分化して神経細胞（DCX+細胞）系統及び／又は星状膠細胞（GFAP+細胞）系統に進入することを示す。よって、一実施形態では、本発明は、（i）神経細胞系統に関連する1種以上のマーカー、典型的にはDCX、及び／又は（ii）星状膠細胞系統に関連する1種以上のマーカー、典型的にはGFAP、を発現する神経幹細胞集団により産生される微粒子を提供する。別の実施形態では、本発明は、（i）神経細胞系統に関連する1種以上のマーカー、典型的にはDCX、及び／又は（ii）星状膠細胞系統に関連する1種以上のマーカー、典型的にはGFAP、を発現する神経幹細胞微粒子、典型的にはエキソソームを提供する。これらの細胞又はこれらの細胞に由来する微粒子（典型的にはエキソソーム）は、DCX及び／又はGFAPを、標準的な（T-175）培養における対応する幹細胞よりも高いレベルで発現する。典型的には、これらの細胞又は微粒子は、DCX及び／又はGFAPを、幹細胞の少なくとも2倍のレベルで、より典型的には標準的な培養における対応する幹細胞の少なくとも2.5倍で、標準的な培養における対応する幹細胞の少なくとも5倍で、標準的な培養における対応する幹細胞の少なくとも7.5倍で又は標準的な培養における対応する幹細胞の少なくとも10倍で発現する。DCXの発現に関して、標準的な（T-175）培養における対応する幹細胞に対する細胞又は微粒子における変化倍率は、任意選択で標準的な幹細胞の少なくとも20倍であることができ、少なくとも50倍であることができ、少なくとも100倍であることができ、少なくとも500倍であることができ、又は少なくとも1000倍であることができる。
【００９７】
用語「バイオリアクタ」は当分野における通常の意味が与えられており、即ちバイオプロセスを行うために使用される装置である。本明細書で説明されるバイオリアクタは、幹細胞培養での使用に適している。細胞培養用の単純なバイオリアクタは単一区画のフラスコであり、例えば一般的に使用されるT-175フラスコ（例えばBD Falcon(商標)175cm2細胞培養フラスコ、750ml、組織培養処理ポリスチレン、ストレートネック、ブループラグシールスクリューキャップ、BD製品コード353028）である。当分野で公知であるように、バイオリアクタは多区画を有することができる。この多区画のバイオリアクタは典型的には、細胞を含有する区画をガス及び／又は培養培地を含有する1つ以上の区画から分離する1つ以上の膜又は障壁で分離されている少なくとも2つの区画を含有する。多区画のバイオリアクタは当分野で公知である。多区画のバイオリアクタの例としてIntegra CeLLineバイオリアクタが挙げられ、該Integra CeLLineバイオリアクタは、培地区画と10kDaの半透膜によって分離されている細胞区画とを含有し、この膜により、任意の抑制性の廃棄物を同時に除去しつつ栄養素の細胞区画中への連続拡散が可能になる。個々の区画へのアクセスのしやすさにより、培養を機械的に干渉することなく細胞に新鮮な培地を提供することが可能になる。シリコーン膜は細胞区画のベースを形成し、細胞区画への短い拡散経路を設けることによって最適な酸素供給及び二酸化炭素レベルのコントロールをもたらす。任意の多区画のバイオリアクタを本発明に従って使用することができる。
【００９８】
実施例11、表3及び図10は、3週にわたって多区画のバイオリアクタ中で培養されている神経幹細胞により産生されたエキソソームのmiRNA含有量は、3週にわたって標準的なT-175フラスコ中で培養された幹細胞のmiRNA含有量と単一区画のT175培養フラスコ中で培養された神経幹細胞により産生された微粒子のmiRNA含有量と異なることを示す。一実施形態では、本発明は、少なくとも2種の、3種の、4種の、5種の、6種の又は7種のmiRNAが、制御倍率（Fold Regulation）により算出した場合に標準的なT-175フラスコ中で培養された対応する幹細胞中における場合と比較して上方制御される又は下方制御される微粒子、典型的にはエキソソームを提供する（実施例11参照）。各miRNAの制御倍率は任意選択で少なくとも2倍上方又は下方である。
【００９９】
図6C及び実施例8には、数週間にわたってNSCが培養される場合にNSCから単離されたエキソソームが予想外にも特に効果的であることが示されている。よって、一実施形態では、本発明のエキソソームは、典型的には多区画のバイオリアクタ中で、少なくとも2週にわたって、典型的には少なくとも3週にわたって、少なくとも4週にわたって、少なくとも5週にわたって又は少なくとも6週にわたって培養されたNSCから単離される。任意選択で、NSCは10週以下にわたって培養され、例えば2〜10週にわたって、3〜10週にわたって、4〜10週にわたって、5〜10週にわたって又は6〜10週にわたって培養されている。
【０１００】
一実施形態では、本発明の神経幹細胞エキソソームは、以下のmiRNAの1種、2種、3種、4種、5種、6種又は7種を、制御倍率により算出した場合に、標準的なT-175フラスコ中で培養された対応する幹細胞中で発現した場合よりも高いレベルで発現する（星印は、少なくとも2倍の制御増加が好ましいmiRNAを示す）。
【０１０１】
2020072718.tif 000008
【０１０２】
一実施形態では、本発明の神経幹細胞エキソソームは、以下のmiRNAの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種又はそれ以上を、制御倍率により算出した場合に、標準的なT-175フラスコ中で培養された対応する幹細胞中で発現した場合よりも低いレベルで発現する（星印は、少なくとも2倍の制御低下が好ましいmiRNAを示す）。
【０１０３】
2020072718.tif 000009
【０１０４】
更なる実施形態では、本発明のNSCエキソソームは、（i）標準的な培養における対応する細胞と比較してエキソソームで増加すると上記で示されているmiRNAの少なくとも1種、2種、3種、4種、5種、6種又は7種を増加したレベルで、及び（ii）標準的な培養における対応する細胞と比較してエキソソームで低下すると上記で示されているmiRNAの少なくとも1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種又はそれ以上を低下したレベルで含む。例えば、神経幹細胞エキソソームは、標準的な培養における対応する細胞と比較してエキソソームで増加すると上記に示されているmiRNAの3種以上を制御倍率の増加で、及び標準的な培養における対応する細胞と比較してエキソソームで低下すると上記に示されているmiRNAの3種以上を制御倍率の低下で含有することができる。別の例示的な実施形態では、神経幹細胞エキソソームは、標準的な培養における対応する細胞と比較してエキソソームで増加すると上記に示されているmiRNAの5種以上を制御倍率の増加で、及び標準的な培養における対応する細胞と比較してエキソソームで低下すると上記に示されているmiRNAの5種以上を制御倍率の低下で含有することができる。
【０１０５】
用語「発現される」は、細胞又は微粒子内のマーカーの存在を説明するために使用される。発現されると見なされるためには、マーカーは検出可能なレベルで存在する必要がある。「検出可能なレベル」とは、qRT-PCR若しくはqPCR、ブロッティング、質量分析又はFACS分析等の標準的な実験室方法の1種を使用して検出することができるマーカーを意味する。発現を35以下のクロッシングポイント（cp）値で適度に検出することができる場合、遺伝子は、本発明の集団の細胞又は微粒子により発現されていると見なされる。用語「発現する」及び「発現」は同様の意味を有する。このcp値未満の発現レベルでは、マーカーは発現されていないと見なされる。本発明の幹細胞又は微粒子中におけるマーカーの発現レベルと例えば間葉系幹細胞等の別の細胞又は微粒子中における同じマーカーの発現レベルとの比較を、好ましくは同じ種から単離されている2つの細胞/微粒子型を比較することにより行うことができる。好ましくは、この種は哺乳動物であり、より好ましくはこの種はヒトである。そのような比較を、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）実験を使用して都合よく行うことができる。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、用語「有意な発現」又はその等価の用語「陽性」及び「+」は、マーカーに関して使用される場合に細胞又は微粒子の集団において細胞/微粒子の細胞の20％より多くが、好ましくは30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％より多く又は更に全てが前記マーカーを発現することを意味すると見なされる。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、マーカーに関して使用する「陰性」又は「-」は、細胞又は微粒子の集団において細胞/微粒子の20％未満が、10％未満が、好ましくは9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％未満が前記マーカーを発現する、又は前記マーカーを発現する細胞/微粒子がないことを意味すると見なされる。
【０１０８】
微粒子表面マーカーの発現を、例えば、特異的微粒子表面マーカーに関するシグナルがバックグラウンドのシグナルよりも大きいかどうかを決定するために従来の方法及び装置（例えば、市販の抗体及び当分野で公知の標準的なプロトコルと共に使用されるBeckman Coulter Epics XL FACSシステム）を使用する特異的細胞表面マーカーに関するフローサイトメトリー及び／又はFACSによって決定することができる。バックグラウンドのシグナルは、各表面マーカーの検出に使用される特異的抗体と同じアイソタイプの非特異的抗体により生成されるシグナル強度として定義される。陽性と見なされるマーカーに関して、観測される特異的シグナルは、典型的にはバックグラウンドのシグナル強度に対して20％を超えており、好ましくは30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、500％、1000％、5000％、10000％又はそれ以上を超えている。目的の微粒子表面マーカーの発現を分析する代替の方法として、目的の細胞表面マーカーに対する抗体を使用する電子顕微鏡による視覚分析が挙げられる。
【０１０９】
「蛍光活性化細胞選別（FACS）」は、蛍光標識抗体の使用に基づく細胞の精製方法である。抗体は細胞表面上のマーカーを対象としており、従って目的の細胞に結合する。次いで、細胞の蛍光発光ピークに基づいて細胞が選別される。
【０１１０】
微粒子マーカー（表面タンパク質及び細胞内タンパク質等）を、粒子内マーカーのための微粒子透過化によるタンパク質発現をアッセイするために当業者に公知の様々な方法により分析することもでき、該公知の方法として、ゲル電気泳動及びその後の適切な抗体によるウエスタンブロッティング、免疫沈澱及びその後の電気泳動分析並びに/又は上記で説明した電子顕微鏡が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、1種以上のテトラスパニンの発現を、上記の方法の1種以上又は当業者に公知の任意の他の方法を使用してアッセイすることができる。マーカーの発現を評価するために、例えばqRT-PCRによりRNAレベルを分析することもできる。
【０１１１】
微粒子の機能
前述したように、神経幹細胞微粒子は幹細胞に由来する少なくとも1種の生物学的機能を保持する。保持され得る生物学的機能として、血管新生、組織再生、組織修復及び／又は神経新生を促進する能力、卒中を患っている患者の脳における認知の改善をもたらす能力あるいは末梢動脈性疾患における血流の回復を加速させる能力が挙げられる。
【０１１２】
例えば、CTX0E03細胞はPBMCアッセイにおいてT細胞の活性化を阻害することが知られており、一実施形態では、本発明の微粒子は、PBMCアッセイにおいてT細胞の活性化を阻害するこの能力を保持する。PBMCアッセイは当業者に公知であり、該アッセイを実施するためのキットが市販されている。
【０１１３】
実施例8、表2及び図6は、CTX0E03幹細胞エキソソームが創傷治癒の「掻創」モデルにおいて創傷を閉鎖する能力を保持することを証明する。結果は、CTX0E03条件培地で培養した正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）の遊走活性が、精製エキソソームの添加時に観測した遊走活性とほとんど同じであることを示す。よって、本発明の微粒子が保持することができる生物学的機能の1種は、正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）の遊走活性を刺激する能力である。NHDF遊走アッセイは当分野で公知である。NHDF遊走の刺激を、インビトロの掻創（創閉鎖）アッセイを使用して、例えば実施例8（A）のアッセイを使用して決定することができる。創閉鎖は、0時間で決定した最初の創傷部に関してNHDF細胞で覆われた面積として算出される。本アッセイにおけるNHDF遊走の刺激は典型的には創閉鎖の増加として定義され、典型的には24時間後の基礎の条件（微粒子なし）下での創閉鎖よりも少なくとも1.2倍大きい創閉鎖として、より典型的には少なくとも1.5倍大きい創閉鎖として定義される。48時間後では、創閉鎖は典型的には、基礎の条件（微粒子なし）下での創閉鎖よりも少なくとも1.2倍大きく又は1.5倍大きく、より典型的には少なくとも2倍大きい。NHDF遊走の刺激は、掻創アッセイにより決定した場合に、基礎の条件下で100％の創閉鎖が観測される少なくとも24時間前に100％の創閉鎖を生じさせるとも定義され得る。
【０１１４】
実施例8はまた、本発明の微小胞が初代HUVECの血管新生を刺激することができること及びPC-12細胞の神経突起伸長を刺激することができることを示す。よって、本発明の微粒子が保持することができる生物学的機能は、初代HUVECの血管新生を刺激する及び／又はPC-12細胞の神経突起伸長を刺激する能力である。血管新生アッセイ及び神経突起伸長アッセイは当分野で公知である。初代HUVECの血管新生の刺激を、ibidi  μ-スライド及びWimtube検出を使用する24時間血管新生アッセイ並びに管長及び分岐点の分析を使用して、例えば実施例8（B）のアッセイを使用して決定することができる。本アッセイでの血管新生の刺激は典型的には、基礎の血管新生に対する増加と定義され、例えば基礎の血管新生の100％超として、典型的には基礎の血管新生の少なくとも110％として、少なくとも120％として又は少なくとも140％として（即ち、基礎レベルの血管新生の少なくとも1.1倍として、少なくとも1.2倍として又は少なくとも1.4倍として）定義される。神経突起伸長の刺激を、1μmのインサートを介してPC-12細胞の伸長を検出することにより、例えば実施例8（C）のアッセイにより決定することができる。本アッセイでの神経突起伸長の刺激は典型的には、分光光度計により定量化した場合に、基礎の条件（微粒子なし）に対する神経突起伸長の増加として定義され、又はNGFのみの添加に対して微粒子がNGFと併用されている場合の神経突起伸長の増加として定義される。
【０１１５】
実施例13でのプロテオーム分析は、神経幹細胞エキソソームが、遺伝物質の産生、パッケージング、機能及び分解に関連する生物学的機能を含むことを示す。よって、一実施形態では、本発明のエキソソームは、これらの機能を保持し、典型的にはRNAポリメラーゼ機能、RNA分解機能、リボソーム機能及びスプライソソーム機能の1種以上を保持する。
【０１１６】
免疫原性
本発明の（同種異系の）神経幹細胞微粒子は典型的には、インビトロ若しくはインビボで免疫応答を誘発しない、又は同種の幹細胞集団の患者への注入時に誘発されると予期されるであろう免疫応答よりも実質的に弱い免疫応答を誘発する。本発明の特定の態様では、神経幹細胞微粒子は、該微粒子の少なくとも約70％が免疫応答を誘発しない場合に免疫応答を誘発しないと見なされる。いくつかの実施形態では、微粒子の少なくとも約80％が、少なくとも約90％が又は少なくとも約95％が、99％が若しくはそれ以上が免疫応答を誘発しない。好ましくは、本発明の微粒子は、抗体媒介免疫応答を誘発しない、又はヒト免疫応答を誘発しない。より好ましくは、本発明の微粒子は、インビトロで抗体媒介応答又はヒト免疫応答を誘発しない。更により好ましくは、本発明の微粒子は、混合リンパ球免疫応答を誘発しない。免疫応答を誘発する本発明の細胞の能力を様々な方法で試験することができることが当業者に理解されるだろう。
【０１１７】
肢虚血のげっ歯類モデルに移植されたCTX0E03細胞では、血管新生に関与する宿主遺伝子の、ビヒクル処置対照に対して迅速で一過性の上方制御が既に証明されており、該宿主遺伝子としてCCL11、CCL2、CXCL1、CXCL5、IGF1、IL1β、IL6、HGF、HIF1α、bFGF、VEGFA及びVEGFCが挙げられる。hNSC処置により、宿主の先天性免疫応答及び血管新生応答が一時的に上昇し、そして組織再生が加速される。
【０１１８】
ヒトPBMCアッセイを使用して、CTX0E03細胞株が免疫原性でないことは既に証明されている。よって、CTX0E03細胞により産生される微粒子も非免疫原性であると予想される。免疫原性の欠如により、宿主/患者の免疫系による微粒子の排除を避けることが可能になり、それにより有害な免疫性及び炎症性の応答なしに微粒子の治療効果をもたらすことが可能になる。
【０１１９】
神経幹細胞
微粒子を産生する神経幹細胞は幹細胞株であることができ、即ち安定して分裂する幹細胞の培養物であることができる。単一の規定の供給源を使用して幹細胞株を大量に生育させることができる。不死化は自発的事象から生じることができ、又は不死化因子をコードする外因性の遺伝情報を幹細胞中に導入することにより不死化を実現することができ、その結果、適切な培養条件下で幹細胞が無限に細胞増殖する。そのような外因性の遺伝因子として遺伝子「myc」を挙げることができ、該遺伝子「myc」は転写因子Mycをコードする。トランスフェクション又は形質導入等の様々な適切な手段により、外因性の遺伝情報を幹細胞中に導入することができる。形質導入のために、遺伝子操作されたウイルス媒体を使用することができ、該ウイルス媒体として、レンチウイルス等のレトロウイルスから得られるものが挙げられる。
【０１２０】
治療効果のある微粒子の産生に悪影響を及ぼすことなく不死化因子の発現が制御され得る、条件的不死化された幹細胞株を使用することにより、更なる利点を得ることができる。このことは、細胞に活性化剤が供給されない限り、不活性である不死化因子を導入することにより実現され得る。そのような不死化因子はc-mycER等の遺伝子であることができる。c-MycER遺伝子産物は、変異体エストロゲン受容体のリガンド結合ドメインに融合したc-Myc多様体を含む融合タンパク質である。c-MycERは、合成ステロイドである4-ヒドロキシタモキシフェン（4-OHT）の存在下でのみ細胞増殖を推進させる（Littlewood他、1995）。このアプローチにより、神経幹細胞に由来する微粒子中におけるc-Myc又は該c-Mycをコードする遺伝子の存在に起因して、宿主細胞の増殖に対する望ましくないインビボ効果（例えば腫瘍形成）を避けつつインビトロでの神経幹細胞の拡張（増殖）のコントロールが可能になる。適切なc-mycER条件的不死化神経幹細胞が米国特許第7,416,888号で説明されている。従って、条件的不死化された神経幹細胞株の使用により、従来の幹細胞微粒子の単離及び産生が改善される。
【０１２１】
好ましい条件的不死化幹細胞株として、CTX0E03神経幹細胞株、STR0C05神経幹細胞株及びHPC0A07神経幹細胞株が挙げられ、これらの神経幹細胞株はヨーロピアンコレクションオブアニマルカルチャーズ（European Collection of Animal Cultures）（ECACC）、Vaccine Research and Production laboratories、Public Health Laboratory Services、Porton Down、Salisbury、Wiltshire、SP4 0JGに受託番号04091601（CTX0E03）、受託番号04110301（STR0C05）及び受託番号04092302 （HPC0A07）で寄託されている。
【０１２２】
これらの細胞の誘導過程及び起源がEP1645626 B1で説明されている。これらの細胞の利点は、これらの細胞により産生される微粒子により保持される。
【０１２３】
CTX0E03細胞株の細胞を以下の培養条件下で培養することができる：
・ヒト血清アルブミン  0.03％
・トランスフェリン、ヒト  5μg/ml
・プトレシン二塩酸塩  16.2μg/ml
・ヒト組換えインスリン  5μ/ml
・プロゲステロン  60ng/ml
・L-グルタミン  2mM
・亜セレン酸ナトリウム（セレン） 40ng/ml。
【０１２４】
塩基性線維芽細胞増殖因子（10ng/ml）、表皮細胞増殖因子（20ng/ml）、及び4-ヒドロキシタモキシフェン100nMを加えて細胞を拡張する。4-ヒドロキシタモキシフェンを除去することにより細胞を分化させることができる。典型的には5％CO2/37℃で、又は5％、4％、3％、2％若しくは1％のO2の低酸素条件下で細胞を培養することができる。これらの細胞株の良好な培養には血清は必要ない。多くの細胞株の良好な培養には血清が必須であるが、血清は、それ自体のエキソソーム等の多くの夾雑物を含有する。CTX0E03神経幹細胞株、STR0C05神経幹細胞株若しくはHPC0A07神経幹細胞株又は血清を要しない任意の他の細胞株の更なる利点は、血清によるコンタミネーションが避けられることである。
【０１２５】
CTX0E03細胞株の細胞（及びこの細胞由来の微粒子）は元来、12週のヒト胎生副腎皮質に由来する多能性細胞である。CTX0E03細胞株の単離、作製及びプロトコルがSinden他により詳細に説明されている（米国特許第7,416,888号及びEP1645626 B1）。CTX0E03細胞は「胚性幹細胞」ではなく、即ち、CTX0E03細胞は胚胎胞の内細胞塊由来の多分化能性細胞ではなく、原細胞の単離により胚は破壊されなかった。
【０１２６】
CTX0E03細胞（及びこの細胞から得られる微粒子）は血管新生であり、そのため末梢動脈性疾患等の血管新生を必要とする疾患の処置に有用である。CTX0E03細胞（及びこの細胞に由来する微粒子）は神経新生でもあり、従って虚血（卒中）により損傷を受けた脳等の神経新生を必要とする疾患の処置に有用である。CTX0E03はレトロウイルス感染により送達された単一コピーのc-mycER導入遺伝子を含有するクローン細胞株であり、4-OHT（4-ヒドロキシタモキシフェン）により条件的に制御される。c-mycER導入遺伝子は、4-OHTの存在下で細胞増殖を刺激する融合タンパク質を発現し、従って4-OHTの存在下で培養される場合に拡張のコントロールが可能になる。この細胞株はクローン性であり、培養下で速やかに拡張し（倍加時間50〜60時間）、正常なヒト核型（46XY）を有する。この細胞株は遺伝的に安定であり大量に生育され得る。この細胞は安全であり非腫瘍形成性である。増殖因子及び4-OHTの不存在下では、この細胞の増殖は停止し、該細胞は神経細胞及び星状膠細胞へ分化する。虚血により損傷を受けた脳にインプラントされると、この細胞は組織損傷の領域のみに遊走する。
【０１２７】
CTX0E03細胞株の開発により、臨床用の安定した製品のスケールアップが可能になる。バンクに保存されている材料からの細胞の産生により、商業的に利用するために細胞を大量に生成することが可能になる（Hodges他、2007）。
【０１２８】
Pollock他、2006は、卒中（MCAo）のラットモデルにおけるCTX0E03の移植により、グラフト後6〜12週で感覚運動機能及び粗大運動の非対称性の両方において統計的に有意に改善されたことを説明する。このデータは、CTX0E03が治療用細胞株としての開発に必要とされる適切な生物学的特性及び製造特性を有することを示す。
【０１２９】
Stevanato他、2009は、CTX0E03細胞が、EGF、bFGF、及び4-OHTの除去後にインビトロの及びMCAoラット脳でのインプラント後にインビボの両方でのc-mycERTAM導入遺伝子の発現を下方制御したことを確認している。インビボでのc-mycERTAM導入遺伝子のサイレンシングにより、潜在的な臨床用途のためのCTX0E03細胞の更なる安全特性が付与される。
【０１３０】
Smith他、2012は、卒中（一過性の中大脳動脈閉塞）のラットモデルにおけるCTX0E03の前臨床効果試験を説明する。結果は、CTX0E03インプラント片が3ヶ月の期間を超えて行動機能障害を確実に回復すること及びこの効果がCTX0E03インプラント片のインプラント部位に特異的であることを示す。卒中が、より広い領域の損傷と比較してよい結果を示す線条体に限定された場合、病変トポロジーは回復において潜在的に重要な因子である。
【０１３１】
神経網膜幹細胞株（例えば米国特許第7,514,259号で説明されている）も本発明に従って使用することができる。
【０１３２】
用語「培養培地」又は「培地」は当分野で理解されており、一般に、生細胞の培養に使用される任意の材料又は調製物を指す。用語「培地」は細胞培養に関して使用する場合、細胞を取り囲む環境の成分を含む。培地は固体であることができ、液体であることができ、気体であることができ、又は相及び材料の混合物であることができる。培地として、液体増殖培地及び細胞増殖を維持しない液体培地が挙げられる。培地として、寒天マトリクス、アガロースマトリクス、ゼラチンマトリクス及びコラーゲンマトリクス等のゼラチン状培地も挙げられる。例示的な気体培地として、ペトリ皿若しくは他の固体支持体又は半固体支持体上で増殖している細胞が曝される気相が挙げられる。用語「培地」は、たとえ該培地が細胞と未だ接触していないとしても、細胞培養での使用を目的とする材料も指す。換言すると、細菌培養用に調製された、栄養素に富んだ液体が培地である。同様に、水又は他の液体と混合した場合に細胞培養に適するようになる粉末混合物を「粉末化培地」と称することができる。「限定培地」は、化学的に定義された（通常は精製された）成分で作られている培地を指す。「限定培地」は、酵母エキス及びビーフブロス等の特徴が明らかでない生物学的エキスを含有しない。「富栄養培地」として、特定種のほとんど又は完全に生存可能な形態の増殖を支持するように設計されている培地が挙げられる。富栄養培地は複雑な生物学的エキスを含むことが多い。「高密度培養の増殖に適した培地」は、他の条件（温度及び酸素移動速度等）がそのような増殖を可能とする場合に細胞培養物が3以上のOD600に到達するのが可能な任意の培地である。用語「基礎培地」は、任意の特別な栄養素補給を必要としない多くの種類の微生物の増殖を促進する培地を指す。ほとんどの基礎培地は一般的に、4種の基礎化学群、即ちアミノ酸、炭水化物、無機塩及びビタミンから成る。基礎培地は一般的に、より複雑な培地の基礎となり、該基本培地には血清、緩衝液、増殖因子、脂質等の栄養補助剤が添加される。一態様では、増殖培地は、本発明の細胞の自己複製能力を維持しつつ該細胞の増殖及び拡張の支持に必須の増殖因子を含む複雑な培地であることができる。基礎培地の例として、イーグル基礎培地、最小必須培地、ダルベッコ変法イーグル培地、199培地、栄養混合物（Nutrient Mixtures）ハムF-10及びハムF-12、マッコイ5A、ダルベッコMEM/F-I 2、RPMI 1640、並びにイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３３】
医薬組成物
本発明の神経幹細胞微粒子は治療に有用であり、従って医薬組成物として製剤化され得る。薬学的に許容される組成物は典型的には、本発明の微粒子に加えて少なくとも1種の薬学的に許容される担体、希釈剤、ビヒクル及び／又は賦形剤を含む。適切な担体の例として乳酸リンゲル液が挙げられる。そのような成分の詳細な考察がGennaro (2000） Remington: The Science and Practice of Pharmacy.  第20版、ISBN: 0683306472で説明されている。
【０１３４】
フレーズ「薬学的に許容される」は本明細書において、しっかりした医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット/リスク比に見合う毒性、刺激性、アレルギー反応又は他の問題若しくは合併症を超えることなくヒト及び動物の組織と接触して使用されるのに適している化合物、材料、組成物及び／又は剤形を指すために用いられる。
【０１３５】
必要に応じて、組成物は少量のpH緩衝剤を含有することもできる。担体は、BioLife Solutions Inc.、米国から市販されているHypothermosol(登録商標)等の貯蔵培地を含むことができる。適切な医薬担体の例がE W Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」で説明されている。そのような組成物は、予防に又は治療に効果的な量の、好ましくは精製形態の予防微粒子又は治療微粒子を、対象への適正な投与のための形態を付与するのに適した量の担体と共に含有することができる。剤形は投与方法に適していなくてはならない。好ましい実施形態では、医薬組成物は無菌であり、そして対象への投与に適した形態であり、対象は好ましくは動物対象であり、より好ましくは哺乳動物対象であり、最も好ましくはヒト対象である。
【０１３６】
本発明の医薬組成物は様々な形態であることができる。これらの形態として、例えば、凍結乾燥調製剤、溶液又は懸濁液、注射可能で不溶解性の溶液等の半固体剤形及び液体剤形を挙げることができる。医薬組成物は好ましくは注射可能である。本発明の微粒子の具体的な利点は、微粒子が得られる幹細胞と比較して微粒子の頑健性が向上されていることであり、従って、微粒子を、幹細胞には適していないであろう製剤化、例えば凍結乾燥に供することができる。
【０１３７】
本発明の方法、医薬及び組成物が、損傷した組織の処置又は回復に使用されること並びに/あるいは組織障害を伴う1種以上の症状の処置、調節、予防及び/又は寛解に使用されることが好ましい。本発明の方法、医薬、組成物及び微粒子が再生治療に、典型的には卒中、末梢動脈性疾患又は失明を引き起こす網膜の疾患の処置に使用されることが特に好ましい。
【０１３８】
医薬組成物は一般的に水性の形態である。組成物は防腐剤及び／又は抗酸化剤を含むことができる。
【０１３９】
浸透圧をコントロールするために、医薬組成物はナトリウム塩等の生理学的塩を含むことができる。塩化ナトリウム（NaCl）が好ましく、該塩化ナトリウムは1〜20mg/mlで存在することができる。存在することができる他の塩として、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムが挙げられる。
【０１４０】
組成物は1種以上の緩衝液を含むことができる。典型的な緩衝液として、リン酸塩緩衝液、Tris緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、コハク酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液又はクエン酸緩衝液が挙げられる。典型的には、緩衝液を5〜20mMの範囲の濃度で含むことができる。組成物のpHは一般的に5〜8であり、より典型的には6〜8であり、例えば6.5〜7.5であり、又は7.0〜7.8である。
【０１４１】
組成物は好ましくは無菌である。組成物は好ましくはグルテンを含まない。組成物は好ましくは非発熱性である。
【０１４２】
典型的な実施形態では、6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸（Trolox(登録商標)）、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、H2PO4-、HEPES、ラクトビオン酸塩、スクロース、マンニトール、グルコース、デキストロン-40、アデノシン及びグルタチオンを含む組成物中に微粒子が懸濁されている。典型的には、組成物は、DMSO等の双極性非プロトン溶媒を含まないだろう。適切な組成物、例えばHypoThermasol(登録商標)-FRSが市販されている。そのような組成物は有利であり、なぜならば、該組成物により、長期間（数時間〜数日）にわたって4℃〜25℃で微粒子を貯蔵することが可能になるからであり、又は凍結温度（cryothermic temperature）で、例えば-20℃未満の温度で微粒子を保存することが可能になることからからである。次いで、微粒子は解凍後に本組成物中で投与され得る。
【０１４３】
医薬組成物を任意の適切な経路で投与することができ、該経路は処置される疾患又は状態に応じて当業者に明らかであろう。典型的な投与の経路として、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、頭蓋内、鼻腔内又は腹腔内が挙げられる。脳の障害を処置するための一選択肢は、微粒子を脳内に投与することであり、典型的には損傷又は疾患の部位に投与することである。
【０１４４】
治療上効果がある又は予防上効果がある用量で微粒子を投与することができ、該用量は当業者に明らかだろう。微粒子の免疫原性が低い又は該免疫原性が存在しないことに起因して、有害な免疫応答を誘導しない用量を繰り返し投与することができる。
【０１４５】
治療用途
本発明の微粒子は、疾患の処置（治療）又は予防に有用である。よって、本発明は、本発明の微粒子を使用して患者の疾患又は障害を治療する又は予防する方法を含む。用語「患者」は、予防的処置又は治療的処置を受けるヒト対象及び他の哺乳動物対象を含む。
【０１４６】
前述したように、本発明のmiRNAを含む組成物はまた、それらの治療にも有用であり、従って、微粒子の治療用途は本明細書において、miRNAを含む組成物にも同様に当てはまることを指す。
【０１４７】
治療上有用な本発明の微粒子は再生活性を有する。再生活性を有する微粒子は、再生プロセスを活性化することができる若しくは増進させることができる又は変性プロセスを阻害することができる若しくは低減することできる微粒子である。再生プロセスは、細胞及び組織の複製、回復、修復及び／又は増殖をもたらす。変性プロセスは、細胞又は組織の完全性及び／又は機能の喪失をもたらす。このことは、損傷を受けた又は障害のある細胞又は組織、例えば卒中、精神障害、心筋梗塞、筋萎縮性側索硬化症及び末梢動脈性疾患によって生じるものを処置するのに特に有用であることができる。
【０１４８】
本発明の微粒子は組織再生に有用である。「組織再生」は、外傷後に組織中の細胞の数を増加させるプロセスである。外傷は、細胞の数を低下させるものであることができる。例えば、事故、自己免疫障害又は疾患状態が外傷をもたらすことができた。組織再生により組織内の細胞の数が増加し、組織の細胞間の接続を再構築することが可能になり、そして組織の機能性を取り戻すことが可能になる。
【０１４９】
治療は、組織の置換、再生又は修復を必要とする再生治療であることができる。治療は、神経学的疾患、障害又は欠損に対するものであることができる。治療は、機能及び／又は認知の回復を改善することができる。治療は、卒中、末梢動脈性疾患、神経症、又は組織の再生、血行再建若しくは局所的な抗炎症作用を必要とする任意の他の疾患若しくは障害に関するものであることができ、任意の他の疾患又は障害として、
（i）神経学的障害、疾患又は欠損、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、卒中若しくはALS、
（ii）リソソーム蓄積症、
（iii）心血管障害、例えば心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢動脈性疾患、糖尿病性潰瘍、創傷治癒、
（iv）特発性肺線維症、呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺高血圧症、嚢胞性線維症及び喘息を含む肺の疾患、
（v）代謝性又は炎症性障害、例えば糖尿病（I若しくはII型）、関節リウマチ、変形性関節症、ループス、クローン病、過敏性腸疾患又は移植片対宿主病、
（vi）精神障害、例えば鬱病、双極性障害、統合失調症、又は自閉症候群障害、例えば自閉症、アスペルガー症候群若しくはレット症候群、
（vii）失明を引き起こす網膜の疾患、例えば加齢性黄斑変性、シュタルガルト病、糖尿病性網膜症、網膜色素変性症、並びに
（viii）脱髄性疾患、例えば多発性硬化症、脳性麻痺、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、白質萎縮症、ギラン・バレー症候群、抗MAG末梢神経障害及びシャルコー・マリー・トゥース病
が挙げられる。
【０１５０】
一実施形態では、微粒子及び該微粒子を含有する組成物は、免疫調節のために使用されない。一実施形態では、治療は免疫調節に関連するものではない。
【０１５１】
本発明はまた、本発明の微粒子の効果的な量を投与して疾患を治療する又は予防することを含む、疾患又は状態を治療する又は予防する方法も提供する。典型的には、疾患又は状態は上記に示されている。
【０１５２】
本発明の微粒子を、該微粒子が得られる幹細胞と同じ疾患の処置（治療）に使用することができる。神経幹細胞は、卒中、脳損傷、例えば運動の、感覚の及び／又は認知の欠損、精神障害、心筋梗塞、筋萎縮性側索硬化症、肢虚血、末梢動脈性疾患等の疾患の処置に有用であることが知られている。よって、本発明の微粒子はまた、卒中、脳損傷、例えば運動の、感覚の及び／又は認知の欠損、精神障害、心筋梗塞、筋萎縮性側索硬化症、肢虚血、末梢動脈性疾患の処置にも有用である。
【０１５３】
図6及び実施例8は、神経幹細胞から得たエキソソームが創傷治癒を刺激することを証明する。よって、一実施形態では、本発明のエキソソームは、組織の置換、再生又は修復を必要とする疾患又は状態の処置（治療）に使用される。そのような状態として、糖尿病性潰瘍及び創傷治癒が挙げられる。図6Cは、6週にわたって培養したNSCから単離したエキソソームは2週にわたって培養したNSCから単離したエキソソームよりも効果的であることを示す。よって、一実施形態では、少なくとも2週にわたって、より典型的には少なくとも4週にわたって又は少なくとも6週にわたって（典型的には多区画のバイオリアクタ中で）培養されているNSC（典型的にはCTX0E03細胞）から単離したエキソソームが、組織の置換、再生又は修復を必要とする疾患又は状態の処置（治療）に使用される。任意選択で、NSCは10週以下にわたって培養されており、例えば2〜10週にわたって、3〜10週にわたって、4〜10週にわたって、5〜10週にわたって又は6〜10週にわたって培養されている。
【０１５４】
6週にわたって（多区画のバイオリアクタ中で）培養されているNSC（CTX0E03細胞）から単離したエキソソームで観測した効果の増強は、6週にわたる細胞の培養後にも生じる、エキソソームで観測したサイズの約70nmの直径への縮小と関係がある。よって、一実施形態では、少なくとも6週にわたって（典型的には多区画のバイオリアクタ中で）培養されているNSC（典型的にはCTX0E03細胞）から単離したエキソソームが、組織の置換、再生又は修復を必要とする疾患又は状態の処置（治療）に使用される。前述したように、任意選択でNSCは10週以下にわたって培養されており、例えば6〜10週にわたって培養されている。別の実施形態では、100nm未満の直径を有するNSC（典型的にはCTX0E03細胞）から単離したエキソソームが、組織の置換、再生又は修復を必要とする疾患又は状態の処置に使用され、該NSCは、典型的には80nm未満の直径、例えば約70nmの直径を有する。
【０１５５】
図12に示すように及び実施例8で論じるように、神経幹細胞から得た微小胞は血管新生を刺激する。よって、一実施形態では、本発明の微小胞は、血管新生を必要とする疾患又は状態の処置（治療）に使用され、典型的には組織再生及び／又は血管再建により処置される疾患又は障害の処置（治療）に使用される。本発明の微小胞を、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢動脈性疾患、糖尿病性潰瘍及び創傷治癒等の心血管障害の処置（治療）に使用することができる。血管新生の刺激はまた、虚血の処置にも治療上有用であり、具体的には心虚血及び肢虚血の処置にも治療上有用である。図12は、少なくとも3週にわたって培養したNSCから回収した微小胞は1週又は2週にわたって培養したNSCから単離した微小胞よりも効果的であることを示す。よって、一実施形態では、少なくとも3週にわたって、より典型的には少なくとも4週にわたって又は6週にわたって（典型的には多区画のバイオリアクタ中で）培養されているNSC（典型的にはCTX0E03細胞）から単離した微小胞が、血管新生を必要とする疾患又は状態の処置に使用される。任意選択で、NSCは10週以下にわたって培養されており、例えば3〜10週にわたって、4〜10週にわたって、5〜10週にわたって又は6〜10週にわたって培養されている。
【０１５６】
図13に示すように及び実施例8で論じるように、神経幹細胞から得た微小胞は神経突起伸長を刺激する。よって、一実施形態では、本発明の微小胞は、神経学的疾患、障害又は欠失、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、卒中、神経症若しくはALSの処置（治療）に使用される。
【０１５７】
予防用途では、医薬組成物又は医薬は、特定の疾患を罹患しやすい又は特定の疾患のリスクがある患者に、疾患のリスクを取り除く若しくは低減する又は該疾患の発症を遅らせるのに十分な量で投与される。治療用途では、組成物又は医薬は、そのような疾患の疑いがある又は該疾患を既に患っている患者に、疾患及びその合併症の症状を治癒するのに又は少なくとも部分的に抑制するのに十分な量で投与される。このことを達成するのに十分な量は、治療上効果がある又は予防上効果がある用量として定義される。予防レジメン及び治療レジメンの両方において、薬剤は典型的には、十分な応答が得られるまで何回かの投与量に分けて投与される。典型的には、応答がモニタリングされ、応答が弱くなり始める場合には投薬が繰り返される。
【０１５８】
本発明の微粒子は、併用療法を提供するために任意選択で幹細胞と併用され得る。幹細胞は任意選択で、微粒子が由来する幹細胞であり、例えば微粒子がCTX0E03細胞由来のエキソソームである場合、併用療法で使用される幹細胞はCTX0E03細胞であることができる。幹細胞及び微粒子を任意選択で、（i）単一の医薬組成物で共に投与することができ、（ii）同時期に又は同時に投与するが別々に投与することができ、あるいは（iii）別々に及び連続して投与することができ、例えば幹細胞後に微粒子を若しくは微粒子後に幹細胞を投与することができる。幹細胞及び微粒子を別々に及び連続して投与する場合、細胞の投与と微粒子の投与との間の期間は1時間であることができ、1日であることができ、1週間であることができ、2週間であることができ又はそれ以上であることができる。
【０１５９】
一実施形態では、予防的治療により、微粒子が得られる幹細胞を受ける宿主において寛容が誘導され、典型的には免疫寛容が誘導される。一実施形態では、幹細胞治療の適用前に、本発明の微粒子の用量を患者に1回以上投与して有害な免疫応答のリスク、即ち幹細胞治療の「拒絶反応」を低減することができる。別の実施形態では、上記で論じたように、幹細胞を本発明の微粒子と共に投与することにより、幹細胞に対する寛容を増強することができる。
【０１６０】
上記で説明した状態の処置（治療）に関する、本発明の組成物の効果的な用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒト又は動物であるかどうか、他の薬剤が投与されたかどうか及び処置が予防的である又は治療的であるかどうか等の多くの異なる因子に応じて変化する。通常、患者はヒトである。
【０１６１】
CTX0E03細胞株が卒中、末梢動脈性疾患、脳損傷、例えば運動の、感覚の及び／又は認知の欠損並びに精神障害の処置に効果的であることが分かっている。CTX0E03細胞は現在、身体障害のある卒中患者の処置に関する臨床試験で試験されている（Clinicaltrials.gov識別番号：NCT01151124）。WO-A-2012/004611には、単極性鬱病及び双極性鬱病、統合失調症、強迫性障害、自閉症及び自閉症候群障害等の精神障害の処置（治療）におけるCTX0E03細胞の使用が説明されている。よって、CTX0E03細胞により産生された微粒子はまた、卒中、末梢動脈性疾患、失明を引き起こす網膜の疾患（例えば網膜色素変性症）、脳損傷、例えば運動の、感覚の及び／又は認知の欠損並びに精神障害を処置（治療）することもできる。
【０１６２】
本明細書で使用する場合、用語「処置（治療）する（treat）」、「処置（治療）」、「処置（治療）する（treating）」及び「治療」は患者又は対象に対して直接使用される場合に障害に関連する1種以上の症状の改善又は障害若しくは障害に関連する1種以上の症状の防止（prevention）  若しくは予防（prophylaxis）を意味すると見なすべきである。処置する障害として、変性障害、組織破壊等の障害、腫瘍性障害、炎症性障害、自己免疫疾患又は移植された器官及び組織の拒絶反応等の免疫媒介疾患が挙げられるがこれらに限定されない。症状の改善又は防止は、前記処置を必要とする対象に本発明の微粒子又はこの微粒子を含む医薬組成物を投与することによって起こる。
【０１６３】
インビボでの投与した細胞及び微粒子の追跡
本発明は、神経幹細胞により産生された微粒子に特徴的なマーカープロファイルを提供する。従って、患者から得たサンプルを試験して該サンプルにおけるマーカープロファイルが微粒子のマーカーと一致するかどうかを決定することにより、インビボでこの微粒子の存在を検出することができる。サンプルのプロファイルが本明細書で説明した微粒子のプロファイルと一致する場合、これにより微粒子の存在が確認される。このことを使用して、微粒子自体の存在及び／又は体内分布だけでなく微粒子を産生する幹細胞の存在も検出することができる。これは、例えばADME(T）研究において、インビボで投与した幹細胞が宿主組織中に生着しているかどうか及び／又は遊走しているかどうかを検出する際に特に有用である。
【０１６４】
インビボでの微粒子の検出を、微粒子又は幹細胞が患者に投与される処置の経過のモニタリングに使用することができる。よって、患者において微粒子又は本発明の微粒子を産生する細胞の存在、不存在又は量を検出することにより、投与レジメを、例えばインビボで微粒子又は幹細胞の効果的な量を与えるのに必要な用量を増加させる又は低下させるように改変することが可能になる。
【０１６５】
微粒子の製造方法
微粒子は幹細胞の条件培地から単離する。「条件培地」（CM）は幹細胞用の増殖培地であることができ、該増殖培地は、少なくとも約12時間にわたる、少なくとも24時間にわたる、少なくとも48時間にわたる又は少なくとも72時間にわたる、典型的には最大168時間（7日）にわたる幹細胞の大量培養に使用されており、必要に応じて使用前に任意の適切な手段により、好ましくはろ過により、除去される及び無菌化される。
【０１６６】
あるいは、長期間にわたって、例えば少なくとも2週にわたって、少なくとも3週にわたって、少なくとも4週にわたって、少なくとも5週にわたって、少なくとも6週にわたって又はそれ以上にわたって細胞培養を維持することが可能になり、そのため条件培地を維持することが可能になる2区画のバイオリアクタから微粒子を回収することができる。本システムでは、10kDaの半透膜で培地のより大きいリザーバから分離されている小さい細胞区画（約15ml）内で細胞及び分泌された微粒子が維持される。このことにより、微粒子の産生を最大化するために非常に高密度の細胞を効果的に維持しつつ、代謝老廃物の効果的な除去が可能になる。実施例9並びに図7及び図8は、2区画のバイオリアクタの使用により、微粒子の収率は標準的な細胞培養フラスコ（T175フラスコ）が使用される際に得られる場合に比べてはるかに高くなることを証明する。
【０１６７】
分子量、サイズ、形状、流体力学的半径、組成、電荷、基質-リガンド相互作用、電磁波の吸収度若しくは散乱又は生物学的活性に基づいて、微粒子を他の培地成分から分離することができる。一実施形態では、所望の微粒子を分離するのに適したサイズのフィルタを使用して、例えば100K MWCOフィルタを使用して、条件培地をろ過する。任意選択で、濃縮したNSC条件培地をサイズ排除クロマトグラフィーにかけて微粒子を単離する前に、幹細胞の条件培地を濃縮する。次いで、目的の微粒子を単離するためにUV吸収画分を選択することができる。
【０１６８】
様々な単離技法及びパラメータを使用することにより、培地から様々な微粒子を単離することができる。例えば、エキソソームは1.13〜1.19g/mLの小胞密度を有し、該エキソソームを100,000〜200,000gでの分画遠心分離及びスクロース勾配超遠心分離により単離することができる。微小胞は、ろ過（100K MWCO）及び18,000〜20,000gでの分画遠心分離により単離することができる。膜粒子は1.04〜01.07g/mlの密度を有し、エキソソーム様小胞は1.1g/mlの密度を有する。
【０１６９】
典型的な製造方法は以下を含む：幹細胞を培養して条件培地を作製する；1500rpmでの遠心分離により細胞残屑を除去する；100K MWCOフィルタによる限外ろ過により微小胞（1000kDa未満）を単離する、又は120,000gでの超遠心分離によりエキソソーム（30〜100nm）を単離する；続いてBCAタンパク質アッセイを使用して定量化する。
【０１７０】
微粒子用のプロデューサー細胞としての、条件的不死化された幹細胞
本発明の一態様では、条件的不死化された幹細胞を使用して微小胞及び／又はエキソソーム等の微粒子を産生する。この条件的不死化された幹細胞は典型的には神経幹細胞であるが、任意の種類の幹細胞であることができ、例えば造血幹細胞又は間葉系幹細胞であることができる。従って、条件的不死化された幹細胞を培養する工程及び該幹細胞により産生された微粒子を回収する工程を含む、幹細胞微粒子の製造方法が提供される。上記で説明したように、幹細胞の条件的不死化は当分野で公知である。疑義を避けるために、本方法は神経幹細胞の使用に限定されない。
【０１７１】
微粒子の産生に使用する幹細胞が神経幹細胞である場合、本明細書で説明した任意の神経幹細胞、例えばCTX0E03条件的不死化細胞株はクローン性であり、標準化されており、インビトロ及びインビボで明らかに安全であり、そして安定したエキソソーム産生に特有の供給源を提供するスケールに製造され得る。また、任意選択で米国特許第7,514,259号において説明されているように、神経幹細胞は神経網膜幹細胞株であることできる。
【０１７２】
微粒子の産生に使用する幹細胞が間葉系幹細胞である場合、該間葉系幹細胞は任意選択で、条件的不死化された脂肪由来幹細胞（「ADSC」）又はWO-A-2009/105044で説明されている間葉系幹細胞の条件的不死化されたバージョンであることができ、これらの細胞はCD29+、CD44+、CD49a+/e+、CD105+、CD166+、CD34-、CD45-である。
【０１７３】
微粒子分泌の誘導方法
本発明者らは、幹細胞による微粒子の産生を増進させることができることを発見した。神経幹細胞に限定されない及び任意の幹細胞からの微粒子の産生に使用され得るこの発見により、幹細胞培養から得られる微粒子の収率を改善することが可能になる。
【０１７４】
幹細胞による微粒子の産生を増進する第1の技法は、条件培地の除去前に12〜96時間にわたって、典型的には1〜25ng/mlで、例えば10ng/mlで、TGF-β、IFN-γ又はTNF-αの1種以上により幹細胞を処理することである。
【０１７５】
以下の実施例2で説明するように、TGF-β、IFN-γ又はTNF-α（10ng/ml）の存在により多小胞体（MVB）の発生の頻度が変化することを観測した。頻度はTGF-βの存在下で最も高く、続いてIFN-γであり、続いてTNF-αであった。従って、TGF-β、IFN-γ又はTNF-αの1種以上を幹細胞培養培地に添加することにより、細胞による微粒子の産生を刺激することができる。次いで、上記で説明したように微粒子を他の成分から分離することにより、微粒子を回収することができる。
【０１７６】
幹細胞による微粒子の産生を増進する第2の技法は、低酸素条件下での細胞の培養である。低酸素条件下での細胞の培養は当業者に公知であり、O2が大気濃度未満である大気中で、即ちO2が21％未満の大気中で細胞を培養することを含む。このことは典型的には、酸素濃度を変化させることが可能な培養器中に細胞を置くことにより実現される。低酸素培養は、典型的には10％未満のO2を、より典型的には5％以下のO2を、例えば4％以下のO2を、3％以下のO2を、2％以下のO2を又は1％以下のO2を含有する大気中で培養することを含む。
【０１７７】
本発明者らはまた、別の細胞型と幹細胞とを共培養することにより、幹細胞による微粒子の産生を変化させることができることにも気付いた。別の細胞型は非幹細胞であることができ、即ち最終分化細胞型であることができる。典型的には、別の細胞型は、幹細胞とインビボで相互作用するであろう細胞型である。一実施形態では、神経幹細胞は内皮細胞等の上皮細胞と共培養され、典型的にはヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）と共培養される。NSC及び血管系が、血管に近接して又は隣接して局在化される増殖性NSCと相互作用することがインビボで観測されている。NSCが内皮細胞と共培養される場合に受容体チロシンキナーゼの活性化及びシグナルタンパク質の分泌も上方制御されることが観測されており、このことは、血管系がNSCの増殖能を調節することも示す。理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、サイトカイン発現の増幅を経て、組織再生のプロセスにおけるNSCと微小血管（即ち内皮細胞）との間の中心的な相互作用がインビボで存在すると考える。従って、内皮細胞（例えばHUVEC）と共培養したNSC（例えばCTX0E03細胞）由来の微粒子、例えばエキソソームは治療用途のために予備刺激され、なぜならば、微粒子は、幹細胞及び微粒子が活性であるインビボの環境を模倣する環境中で産生されているからである。
【０１７８】
従って、別の細胞型との幹細胞の培養により、産生された微粒子の量を増加させることができ、及び／又は微粒子の内容物を純化することができ、典型的にはその結果、幹細胞により産生される微粒子は活性化状態の組織修復に偏在する。よって、他の細胞と共培養されている幹細胞により産生された微粒子、例えば内皮細胞と共培養されたNSCにより産生された微粒子が有利である。本明細書で説明したように、この微粒子を、共培養した幹細胞の条件培地からの単離により得ることができる。
【０１７９】
予想外にも、本発明者らは、多区画のバイオリアクタ中で幹細胞を培養することにより、幹細胞により産生される微粒子の量を極めて簡単に増加させることができることに気付いた。この発見は神経幹細胞に限定されず、全ての幹細胞の培養に一般的に適用される。よって、本発明の一態様は、多区画のバイオリアクタ中で培養されている幹細胞からの微粒子の製造方法を提供する。微粒子が回収される細胞は典型的には、少なくとも1週間にわたって、典型的には少なくとも8日、9日、10日、11日、12日、13日又は14日にわたって、例えば15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日又はそれ以上にわたって、例えば少なくとも3週、4週、5週、6週又はそれ以上にわたって培養されている。図8から、週ごとに、微粒子産生の増進は相加的だけでなく指数関数的であることが分かる。長期培養は典型的には、Integra Cellineシステムの2区画のバイオリアクタ（Integra Biosciences AG、Zizers、スイスから市販されている）中で観測されるが、本発見はこの具体的な多区画のバイオリアクタに限定されず、任意の多区画のバイオリアクタを使用することができる。本培養方法を、神経幹細胞及び間葉系幹細胞を含むがそれらに限定されない任意の幹細胞型から微粒子を産生するために使用することができる。
【０１８０】
微粒子の産生を変化させる薬剤のスクリーニング方法
本発明は、幹細胞による微粒子の産生を変化させる薬剤のスクリーニング方法を提供する。本方法は、典型的には微粒子の産生に適した条件下で、幹細胞を候補薬剤と接触させること、及び（i）接触した幹細胞による微粒子の産生速度が増加するか若しくは低下するかを観測すること、又は（ii）薬剤に接触していない対照幹細胞と比較した微粒子の特徴（例えばサイズ、タンパク質、mRNA若しくはmiRNAの含有量）の変化を観測することを含む。
【０１８１】
条件培地の全RNA組成のスクリーニング方法
遠心分離（1500rpmで5分）後に、ろ過（0.02〜0.2μm又は100K MWCO）により条件培地から微粒子を回収する。トリゾールに基づく抽出を使用して、続いてQiagen RNaesyミニキットを使用する精製により全RNAを得る。水中の抽出物は、それがRNAである可能性があることを示唆する260：280nmの吸光度を有する。全RNAは、mRNA（Superscript II RT、Invitrogen）又はmiRNA（mScript RTキット、Qiagen）に適したプロトコルにより逆転写される。mRNA及びmiRNAの存在の妥当性を、miRNAに関してはATP5B及びYWHAZ用のプライマー並びにmiRNAハウスキーピング遺伝子に関してはU6B及び15a用のプライマーをそれぞれ使用するqRT-PCRで証明した。RNAを、アレイ（マイクロアレイ又はPCRに基づくアレイ）及びシーケンシング等の一般的な遺伝子発現分析アッセイにより評価することができる。
【０１８２】
キット
本発明は、本発明の微粒子の製造方法に使用するためのキットを提供する。キットは、神経幹細胞の培養培地、神経幹細胞及び本キットを使用して請求項1から16又は23のいずれかの微粒子を産生するための指示書を含む。任意選択で、キットは請求項19又は20の1種以上の成分を含む。キットはまた、対照として使用するための本発明に係る微粒子も含む。対照の微粒子は任意選択で凍結乾燥されている。キットは任意選択で、産生した微粒子の検出に適した検出剤を含有することもでき、例えば微粒子の同定に使用され得るマーカータンパク質に特異的に結合する抗体を含有することもできる。
【０１８３】
本発明の例示的な実施形態は以下を含む：
１．神経幹細胞微粒子。
２．微粒子が、エキソソーム、微小胞、膜粒子、膜小胞、エキソソーム様小胞、エクトソーム様小胞、エクトソーム又はエキソベシクルである、実施形態1に記載の神経幹細胞微粒子。
３．微粒子が神経幹細胞株に由来する、実施形態1又は2に記載の神経幹細胞微粒子。
４．神経幹細胞株が、条件的不死化され、及び／又は無血清培地で生育されている、実施形態3に記載の神経幹細胞微粒子。
５．神経幹細胞株が、ECACC受託番号04091601を有するCTX0E03、ECACC受託番号04110301を有するSTR0C05、及びECACC受託番号04092302を有するHPC0A07である、実施形態4に記載の神経幹細胞微粒子。
６．微粒子が、
（a）電子顕微鏡で決定した場合に30nm〜1000nmの若しくは30〜200nmの若しくは30〜100nmのサイズ、又は
（b）1.1〜1.2g/mlのスクロース中密度
を有する、実施形態1から5のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子。
７．RNAを含む、実施形態1から6のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子。
８．RNAがmRNA及び／又はmiRNAである、実施形態7に記載の神経幹細胞微粒子。
９．微粒子が、hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532の1種、2種、3種又は4種を含む、実施形態8に記載の神経幹細胞微粒子。
１０．（a）セラミド、コレステロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール及び/若しくはホスファチジルコリンから選択される脂質、（b）任意選択で、hsa-let-7g、hsa-miR-101、hsa-miR-10a、hsa-miR-10b、hsa-miR-126、hsa-miR-128、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-130a、hsa-miR-134、hsa-miR-137、hsa-miR-155、hsa-miR-15a、hsa-miR-15b、hsa-miR-16、hsa-miR-17、hsa-miR-182、hsa-miR-183、hsa-miR-185、hsa-miR-18b、hsa-miR-192、hsa-miR-194、hsa-miR-195、hsa-miR-20a、hsa-miR-20b、hsa-miR-210、hsa-miR-218、hsa-miR-301a、hsa-miR-302a、hsa-miR-302c、hsa-miR-345、hsa-miR-375、hsa-miR-378、hsa-miR-7、hsa-miR-9、hsa-miR-93、hsa-miR-96、及びhsa-miR-99aから選択される、miRNA、
（c）任意選択でCD63、CD81、CD9、CD53、CD82及び/若しくはCD37から選択される、テトラスパニン、
（d）TSG101、Alix、CD109及び/若しくはthy-1、並びに/又は
（e）CD133
の1種以上を含む、実施形態1から9のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子。
１１．表19又は表21に示されるタンパク質の少なくとも10種を含む、実施形態1から10のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子。
１２．神経幹細胞又は神経幹細胞の条件培地の少なくとも1種の生物学的活性を含む、実施形態1から11のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子。
１３．少なくとも1種の生物学的活性が再生活性である、実施形態12に記載の神経幹細胞微粒子。
１４．治療に使用するための、実施形態1から13のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子。１５．治療が再生治療である、実施形態14に記載の神経幹細胞微粒子。
１６．治療が、
（i）神経学的障害、疾患又は欠損、例えばパーキンソン、アルツハイマー、卒中若しくはALS、
（ii）リソソーム蓄積症、
（iii）心血管障害、例えば心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢動脈性疾患、糖尿病性潰瘍、創傷治癒、
（iv）特発性肺線維症、呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺高血圧症、嚢胞性線維症及び喘息を含む肺の疾患、
（v）代謝性又は炎症性障害、例えば糖尿病（I若しくはII型）、関節リウマチ、変形性関節症、ループス、クローン病、過敏性腸疾患又は移植片対宿主病、
（vi）精神障害、例えば鬱病、双極性、統合失調症、又は自閉症候群障害、例えば自閉症、アスペルガー症候群若しくはレット症候群、
（vii）失明を引き起こす網膜の疾患、例えば加齢性黄斑変性、シュタルガルト病、糖尿病性網膜症又は網膜色素変性症、並びに
（viii）脱髄性疾患、例えば多発性硬化症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、白質萎縮症、ギラン・バレー症候群、抗MAG末梢神経障害及びシャルコー・マリー・トゥース病
に対するものである、実施形態14又は15に記載の神経幹細胞微粒子。
１７．治療が機能及び／又は認知の回復を改変する、実施形態14から16のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子。
１８．治療が卒中、末梢動脈性疾患又は失明を引き起こす網膜の疾患に対するものである、実施形態14から17のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子。
１９．（i）微粒子がエキソソームであり、治療が組織の置換、再生若しくは修復を必要とする疾患若しくは状態に対するものである、あるいは
（ii）微粒子が微小胞であり、治療が血管新生を必要とする疾患又は神経学的障害、疾患若しくは欠損に対するものである、実施形態14から17のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子。
２０．疾患の処置用の医薬の製造における、実施形態1から19のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子の使用。
２１．神経幹細胞の条件培地から微粒子を単離することを含む、実施形態1から13のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子の製造方法。
２２．幹細胞の条件培地から微粒子を単離することを含む幹細胞微粒子の製造方法であって、
（i）幹細胞の条件培地が、幹細胞による培地中への微粒子の放出を誘導する1種以上の成分を含み、
（ii）幹細胞が低酸素条件下で培養されたものであり、
（iii）幹細胞が異なる細胞型と共培養されたものであり、
（iv）幹細胞が多区画のバイオリアクタ中で培養されたものであり、及び／又は
（v）幹細胞が部分的に分化させたものである、上記方法。
２３．幹細胞が神経幹細胞であり、任意選択で実施形態3から5のいずれかに記載の神経幹細胞である、実施形態22に記載の方法。
２４．1種以上の成分が、形質転換増殖因子-ベータ（TGF-β）、インターフェロン-ガンマ（INF-γ）及び腫瘍壊死因子-アルファ（TNF-α）から選択される、実施形態22（i）又は実施形態22（i）に従属する場合の実施形態23に記載の方法。
２５．異なる細胞型が内皮細胞である、実施形態22（iii）、実施形態22（iii）に従属する場合の実施形態23又は24に記載の方法。
２６．実施形態22から25のいずれかに記載の方法により得られる微粒子。
２７．実施形態1から13のいずれか又は実施形態26に記載の微粒子と、薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤とを含む組成物。
２８．実施形態1から13のいずれか又は実施形態26に記載の微粒子の製造方法に使用するためのキットであって、（a）培地、（b）神経幹細胞、（c）任意選択で、実施形態22から24のいずれかに記載の1種以上の成分、（d）任意選択で、対照としての使用に適した実施形態1から13のいずれか又は実施形態26に記載の微粒子、（e）任意選択で、産生した微粒子の特異的検出に適した検出剤、及び（f）キットを使用して実施形態1から13のいずれか又は実施形態26に記載の微粒子を製造するための指示書、を含むキット。
２９．幹細胞と候補薬剤とを接触させること、及び接触した幹細胞による微粒子の産生速度が対照と比較して増加するか又は低下するかを観測することを含む、幹細胞による微粒子の産生速度を変化させる薬剤のスクリーニング方法。
３０．hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532の2種、3種又は4種全てを含む組成物。
３１．薬学的に許容される担体、希釈剤、ビヒクル及び／又は賦形剤を含む医薬組成物である、実施形態30に記載の組成物。
３２．治療に使用するための、実施形態30又は31に記載の組成物。
３３．治療が実施形態16に記載したものである、実施形態32に記載の治療に使用するための組成物。
以下の非限定的な実施例を参照して本発明を更に説明する。
【実施例】
【０１８４】
［実施例1］
電子顕微鏡による可視化のための神経幹細胞及び神経幹細胞微粒子の調製
方法
電子顕微鏡のためのCTX0E03細胞の包埋
・5×70％CTX0E03培養物
・+/-4OHT、IFNγ、TNFα及びTGFβによる（全て24時間にわたる10ngでの）処理
・細胞の剥離及びpH7.4の0.1Mカコジル酸塩中の2.5％グルテルアルデヒド（Gluteraldehyde）中における終夜にわたる固定
・細胞の回転沈殿300g
・緩衝化オスミウム2％、1.5時間
・回転、洗浄水、終夜
・酢酸ウラン2％、2時間
・回転、洗浄水、30分
・エタノール勾配20、30、50、70、80、90、100％、週末の間。
【０１８５】
・100％酸化プロピレン（PO）、1時間
・回転、PO中の50％寒天LV樹脂、1時間
・75％LV樹脂/PO 5時間
・60℃で終夜にわたる100％樹脂
・室温までの冷却後に切断（60〜80nm）、200KvでのTEMの撮像。
【０１８６】
結果
図1A〜Eは、直径が約30nm〜50nmのエキソソームを含有する多小胞体（MVB）の電子顕微鏡写真を示す。図1Fは、直径が100nm超の微小胞を示す。
【０１８７】
［実施例2］
神経幹細胞株からの神経幹細胞微粒子の産生
方法
CTX0E03細胞の同じ培養物を含有する5個のサブコンフルエントフラスコを、4OHTが添加されている又は添加されていない完全増殖培地対照と共に、10ng/mlのTGF-β、10ng/mlのIFNγ又は10ng/mlのTNFαで個々に処理した。処理の72時間後、電子顕微鏡による評価のために、細胞を、トリプジーン（trypzean）/EDTAを使用して回収して洗浄し、pH7.4の0.1Mカコジル酸塩中の2.5％グルテアルデヒド中において終夜にわたり固定した。
【０１８８】
結果
TGF-β、IFN-γ又はTNF-αの存在により多小胞体（MVB）の発生の頻度が変化することを観測した。頻度はTGF-βの存在下で最も高く、続いてIFN-γであり、続いてTNF-αであった。
【０１８９】
結論
因子TGF-β、IFN-γ又はTNF-αの添加により、神経幹細胞からの微粒子の産生を刺激することができる。このことは、微粒子のより効率的な産生の可能性を有する。
【０１９０】
［実施例3］
神経幹細胞微粒子の精製、定量化、及び特性決定
方法
大量の微粒子を産生するためのプロトコルの概要を図2に示す。主要な工程は、精製、定量化、特性決定、効果試験及び製造である。
【０１９１】
（1）精製
超遠心分離により、例えば1〜2時間にわたる100000×gでの超遠心分離により、微粒子を幹細胞の条件培地から精製することができる。特異的抗体を使用する、免疫沈降等の抗体に基づく方法、磁性ビーズ精製、樹脂に基づく精製等の代替の又は追加の精製法を使用してもよい。
【０１９２】
（2）定量化
全核酸レベル又は全タンパク質レベルの定量化により、例えば様々なPCR又はBCAアッセイ等の比色タンパク質定量化法により、精製した微粒子を定量化することができる。電子顕微鏡グリッド、又は微粒子特異的マーカーに特異的に結合する抗体若しくは抗体フラグメントを使用する免疫アッセイ（例えばELISA、免疫ブロッティング）等の他の定量化技法を代替として使用することができる。
【０１９３】
（3）特性決定
微粒子を機能的に又は構造的に特性決定することができる。当分野で公知の方法（SDS-PAGE、質量分析、PCR）を使用して、RNA/mRNA/miRNA及びタンパク質プロファイリングを使用することができる。構成的に分泌された微粒子を試験し、形質転換増殖因子-ベータ（TGF-β）、インターフェロン-ガンマ（INF-γ）、及び／又は腫瘍壊死因子-アルファ（TNF-α）等の誘導剤の添加により誘導される微粒子と比較することができる。
【０１９４】
（4）治療効果
微粒子の効果をインビトロアッセイ及びインビボアッセイにより試験することができる。インビトロでの評価に関して、単球、PBMC、内皮細胞、及び／又は線維芽細胞の培養物に神経幹細胞微粒子を添加することができ、これらの細胞に対する微粒子の効果を評価することができる。適切な動物モデルへの神経幹細胞微粒子の投与を使用してインビボでの効果を評価することができる。臨床試験を実施してヒト対象における神経幹細胞微粒子の安全性及び転帰を評価することができる。
【０１９５】
（5）製造/スケールアップ
神経幹細胞微粒子の大規模製造にIntegra disposable T1000等のバイオリアクタを使用することができる。次いで、精製した微粒子を治療用製品として製剤化する。
【０１９６】
［実施例4］
CTX0E03微粒子におけるmiRNAの特性決定
方法
・3条件：標準的な培養におけるCTX0E03細胞、標準的な培養におけるCTX0E03細胞から得られる微粒子、及びIntegra CELLineシステムにおけるCTX0E03細胞から得られる精製エキソソーム（以下の実施例7〜11参照）
・製造業者の指示に従ってqRT-PCRパネル（Qiagen）を使用するmiRNAアレイの検討。このアッセイでは、方法/参照遺伝子の選択に感受性のあるデータ正規化により高精度及び高感度が実現される。このアッセイではゲノム全体の配列決定が実現されない。
【０１９７】
結果：A）（i）標準的なCTX0E03細胞、（ii）ろ過した条件培地（0.02〜0.2μmのフィルタ）、即ち微粒子、及び（iii）Integra CELLineシステムから得られるエキソソーム、において35個以下のcpが見られるmiRNAのリスト（予備miRNA qRT-PCR miscriptアレイ（Qiagen）の結果）。
【０１９８】
B）参照（ハウスキーピング）遺伝子の算術平均な及び幾何平均
2020072718.tif 000010
2020072718.tif 000011
2020072718.tif 000012
【０１９９】
［実施例5］
タンパク質ドットブロットを使用するCTX0E03条件培地の分析
方法
・条件付けした24時間及び72時間条件培地（RMM及びITS培地）
・回収した培地を透析により「濃縮」し、タンパク質をビオチン化する（典型的な全タンパク質濃度は0.5mg/mlであると思われる）。次いで、培地をRaybiotech L507ヒトタンパク質アレイでインキュベートする（全タンパク質濃度0.1mg/ml）。洗浄及びHRP結合ストレプトアビジンを有するアレイのインキュベーション後に、タンパク質の存在を化学発光により検出する。アレイは定性的データを提供する（即ち、タンパク質は存在するが、他のタンパク質と比較した発現レベルは示されない）。
【０２００】
結果
2020072718.tif 000013
2020072718.tif 000014
【０２０１】
［実施例6］
ヒト血管新生ELISAストリップ（Signosis）を使用する条件培地の分析
方法
製造業者の指示に従ってヒト血管新生ELISAストリップ（Signosis）を利用した。新鮮なRMM培地及び24時間にわたり条件付けたCTX0E03 RMM培地を8種の血管新生サイトカイン、即ち腫瘍壊死因子α（TNFα）、インスリン様増殖因子1（IGF-1）、VEGFA、インターロイキン-6（IL-6）、bFGF、形質転換増殖因子β1（TGFβ1）、EGF及びレプチンに関して分析した。特定の血管新生サイトカインに対する各一次抗体でコーティングしたストリップの個々のウェルに試験用サンプルをロードした。分光計により450nmでの吸光度を測定した。血管新生サイトカインの濃度は試験用サンプルの色強度に正比例した。  
結果を図3に示す。
【０２０２】
［実施例7］
Integra CELLINE-CTX0E03細胞から微粒子を産生するための使い捨てバイオリアクタ
細胞株からの効率的な微粒子の産生及び回収は、最大密度の細胞に関する最適培養条件の維持に依存する。細胞に供給される酸素若しくは栄養素の任意の制限又は代謝老廃物（waste metabolic product）の蓄積により培養の寿命が制限され、そのため微粒子の産生が制限されるだろう。
【０２０３】
2区画のCELLine AD 1000は、10kDaの半透膜によって、より大きな培地リザーバから分離されている小さな細胞区画内に、マトリクスインレイ（matrix inlay）に付着した接着細胞を収容するように設計されている。この膜により、より小さな細胞区画内において細胞により産生される任意の微粒子を濃縮しつつ、栄養素の連続拡散及び老廃物の除去が可能になる。大きな容積容量（1リットル）の培地区画に起因して、本システムは、培地の変更を必要とすることなく、より長期間にわたり高密度培養を維持する可能性を有する。中皮腫腫瘍細胞の培養物からのエキソソームの産生がMitchell他、2008で説明されている。
【０２０４】
方法
CELLine AD1000の最適な性能を得るために、25mlの完全増殖培地（増殖因子及び4OHTを有するRMM）をフラスコの培地区画中に配置して半透膜を予め濡らす。室温で5分にわたりフラスコを放置した後、37℃で最低1時間にわたり15mlのラミニン溶液（DMEM/F12中に20μg/ml）を細胞区画に添加することにより、マウスラミニンでマトリクスインレイをコーティングする。ラミニン溶液を除去し、15mlの温かいDMEM/F12を細胞区画に添加して過剰なラミニンを除去する。マトリクスインレイが乾燥するのを避け、合計で15mlの完全増殖培地中の約15×106個のCTX0E03細胞を緩やかに導入する。細胞区画から気泡を注意深く除去する。更に460mlの完全増殖培地を細胞区画に慎重に添加した後に、37℃で5％CO2中において終夜にわたりフラスコをインキュベートする。翌日、細胞区画から培地を除去して15mlの予め温めた増殖培地と置き換える。
【０２０５】
7日ごとに、細胞区画から微粒子/培地を回収する。5分にわたり1500rpmで培地を遠心分離して細胞残屑を除去し、-80℃で貯蔵する。更に15mlの予め温めた完全増殖培地を細胞区画中に慎重に添加し、485mlの完全増殖培地を培地区画に慎重に添加し、更に7日わたりインキュベートする。100K MWCOろ過により微粒子を単離する。必要に応じて繰り返す。
【０２０６】
図4Aは、通常の培養条件（3日T175）と比較した、Integraシステムを使用して精製した微粒子を含有する15mlの培地から抽出したタンパク質の量を示す。BCAアッセイで測定したタンパク質のミリグラムを示す。図5は、260/280nmで測定した、単離した全RNAの対応する量を示す。
【０２０７】
マーカー特性決定により、両方の精製集団（微小胞及びエキソソーム）がCD63及びCD81を発現することが示された（FACSにより決定した-図4B）。エキソソームのみが、エンドソームのマーカーAlixを発現する（ウエスタンブロットにより決定した、データを示さず）。
【０２０８】
［実施例8］
効果アッセイ
（A）創傷治癒アッセイにおける、CTX0E03条件培地の機能とCTX0E03細胞由来の精製エキソソームの機能との比較
方法-創閉鎖/掻創アッセイ
・12ウェルプレートのウェル当たり0.25×106個のNHDF（正常ヒト皮膚線維芽細胞）を播種してコンフルエントにさせる（24時間）
・24時間にわたり増殖因子を除去する
・細胞を除去し（掻創）、エキソソーム/条件培地と共にインキュベートする
・影響を受けた領域を48時間にわたって撮像する
・Image Jを使用して面積を評価する。
【０２０９】
結果
【表２】
2020072718.tif 000015
【０２１０】
創閉鎖を、0時間で決定した最初の創傷部に関して細胞で覆われた面積として算出した。創閉鎖を0時間での最初の創傷部に対する割合（％）として表す。これらのデータを図6Aにおいて写真でも示す。
【０２１１】
図6Bは、10μgのCTX0E03エキソソームが、基礎の条件（エキソソームなし）と比較して72時間後に（HDNF掻創/遊走アッセイで決定した場合に）創閉鎖を有意に増加させることを示す。
【０２１２】
更なる実験により、（増殖因子及び4OHTの存在下でIntegra CELLineバイオリアクタを使用する）連続培養中の全ての時点（2〜6週目）から精製された（超遠心分離により精製し、BCAタンパク質アッセイにより定量化し、CD63及びCD81に関して99％を超えて陽性であると特性決定され、対応する微粒子画分と比較してAlixの高い発現レベルを有する）エキソソームは、基礎の条件と比較して5〜10μg/mlのピーク反応で線維芽細胞の遊走及び創傷治癒を有意に増進することを確認した。図6Cは、基礎の条件、2μg/mlのエキソソーム、6μg/mlのエキソソーム、20μg/mlのエキソソーム及びLSGS（低血清増殖サプリメント）陽性対照に関する治癒面積の％を示す。図6Cの上のパネルは、Integra Cellineシステム中で2週にわたって培養したCTX0E03細胞から単離したエキソソームを示し、図6Cの下のパネルは、Integra Cellineシステム中で6週にわたって培養したCTX0E03細胞から単離したエキソソームを示す。これらのデータは、試験した全てのNSCエキソソームの全ての用量で基礎の条件と比較して治癒が増進し、治癒の％が72時間後に陽性対照（LSGS）に近づくことを示す。
【０２１３】
図6Cにおけるデータはまた、6週にわたって培養したNSCから単離したエキソソームでは（2週のエキソソームよりも）速く治癒し、全ての用量に関してわずか48時間後に治癒の％が100％に達することを示す。
【０２１４】
図6Dは、インビボで統計的に有意な程度でCTX0E03細胞が創傷治癒を刺激したことを裏付ける、マウスにおけるインビボの注射創傷アッセイ（injection wound assay）の結果を示す。これは、インビボで微粒子の効果を確認するのに使用され得る簡便なインビボのバイオアッセイである。
【０２１５】
結論  ヒト神経幹細胞株CTX0E03から放出されたエキソソームは創傷治癒のインビトロモデルにおいて線維芽細胞の遊走を増進し、このことは、エキソソームはhNSCが修復を促進する機序に寄与することができることを示唆する。6週にわたって培養した細胞から単離したエキソソームは、2週にわたって培養した細胞から単離した細胞と比較してインビトロでの創傷治癒効果の改善を示す。
【０２１６】
（B）血管新生の刺激
ibidi  μ-スライドを使用して、初代HUVECに対する血管新生を検出するための24時間アッセイを行い、Wimtube検出及び（管長及び分岐点の）分析を自動化した。1週目に、2週目に、3週目に、4週目に及び6週目にIntegraフラスコから回収した微小胞をHUVECに添加し、血管新生を基礎のHUVEC（添加なし）と比較した。LSGS（低血清増殖サプリメント）を陽性対照として使用した。図12に図示した結果は、神経幹細胞微粒子が血管新生を増進させることを示す。更に、これらのデータは、1週又は2週にわたって培養した微小胞によりもたらされる場合に比べて血管新生における大きな増進が、少なくとも3週間の培養後（即ち、Integra cellineバイオリアクタ中における3週の、4週の及び6週の培養後）に回収した微小胞によりもたらされることを示す。少なくとも3週にわたって培養した微小胞は、統計的に有意なレベルまで、及び陽性対照のレベルに達するレベルまで血管新生を刺激した。血管新生における最も大きな増進は4週後に回収した微小胞によりもたらされることが示されており、この微小胞は、陽性対照と同じ量まで血管新生を刺激した。  
これらのデータは、hNSC微小胞が血管新生を刺激することを示す。
【０２１７】
（C）神経突起伸長の刺激
1μmのインサートを介してPC-12細胞を使用して神経突起伸長を決定した。72時間後にPC-12細胞体を除去し、インサートの下側の神経突起を染色した。次いで、染料を抽出して分光光度計で定量化した。2週目にIntegraフラスコから回収した微小胞を0.03μg、0.3μg及び3μgでそれぞれ100ng/mlのNGF（神経増殖因子）と共に細胞に添加した。神経突起伸長を基礎の細胞（添加なし）と比較した。100ng/mlのNGFを対照として使用した。図13に示すように、3μgのhNSC微小胞の添加により、NGFのみの添加と比較して神経突起伸長が顕著に増進した。  
これらのデータは、hNSC微小胞が神経突起伸長を刺激することを示す。
【０２１８】
［実施例9］
Integra CELLineシステムを使用するエキソソームの産生
実施例7で説明したようにIntegra CELLineシステムを使用してCTX0E03細胞を培養してエキソソームを精製した。3週目の時点でCELLineシステムを使用して、及び対照として当分野で日常的に使用する標準的なT175システムを使用して、培地から精製したエキソソームの濃度を、（タンパク質含有量を評価するためのBCAアッセイを使用して）定量化した。図7は、Integra CELLineシステムを使用するエキソソームの産生が従来の培養（T175フラスコ）を使用する場合と比較して数倍に増加していることを示す。
【０２１９】
実施例7で説明したように、Integra CELLineシステムを使用して3週の期間にわたってCTX0E03細胞を培養し、エキソソームを精製して定量化するために、1週目、2週目、及び3週目に培地を回収した。図8Aは、微粒子の産生が3週の培養期間にわたって指数関数的に増加し、微粒子の効率的で大規模な産生を可能にすることを示す。次いで、単一のIntegra CELLineフラスコから回収したエキソソームの濃度を1〜6週の連続的なCTX0E03培養にわたってモニタリングし、結果を以下に及び図8に示した。
【０２２０】
2020072718.tif 000016
【０２２１】
これらの結果は、数週間にわたって、典型的には少なくとも3週にわたって、幹細胞を多区画のバイオリアクタ中で培養する場合にエキソソームの産生が驚くほど増加することを示す。
【０２２２】
［実施例10］
Integra CELLine及び標準的な（T175）培養システムから得た細胞の表現型の特性決定
実施例7で説明したように、Integra CELLineバイオリアクタ及び標準的な培養を使用してCTX0E03細胞を培養した。マーカー特異的抗体及び蛍光顕微鏡を使用して、DCXタンパク質マーカー及びGFAPタンパク質マーカーの発現を確認した。
【０２２３】
細胞から得たサンプル中において、DCXマーカー、GALCマーカー、GFAPマーカー、TUBB3マーカー、GDNFマーカー及びIDOマーカーの発現をqRT-PCRで検出した。マーカーの発現を、標準的な（T175）培養から得た微粒子と、3週間培養したIntegra CELLineシステムから得たエキソソームとの間で比較し、標準的な（T175）培養におけるCTX0E03細胞での発現レベルであるベースラインに対して評価した。
【０２２４】
本発明者らは、標準から得た対照細胞と比較してIntegra CELLineシステムから得た細胞のマーカー発現の著しい差異を観測した。標準的な培養物から得た対照細胞と比較して、Integra CELLineシステム中で培養した細胞では、部分的に分化した細胞のマーカーが数倍に増加した（図9）。特に顕著な変化は、マーカーDCX1（ダブルコルチン-神経系統への侵入に関するマーカー）、GFAP（グリア細胞線維性酸性タンパク質-星状膠細胞系統への侵入に関するマーカー）、GDNF（グリア細胞由来神経栄養因子）及びIDO（インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ）の発現の増加である。このことは、2区画のバイオリアクタ中で培養した神経幹細胞が神経系統（DCX+）又は星状膠細胞系統（GFAP+）の細胞に部分的に分化することを示す。Integra培養細胞におけるDCX及びGFAPの発現を蛍光顕微鏡で確認し、このことは、Integra CELLineバイオリアクタを使用して培養したCTX0E03細胞が、標準的なCTX0E03細胞に比べてより分化した神経細胞発現型を有することを証明する。
【０２２５】
［実施例11］
Integra CELLine培養物から得たエキソソームのmiRNA発現プロファイル及び標準的な（T175）培養物から得た微粒子のmiRNA発現プロファイルの特性決定
単一区画のT-175フラスコ中において、Integra CELLine培養を使用して及び標準的な培養で3週にわたってCTX0E03細胞を培養した。実施例7で説明したように、Integra培養物からエキソソームを精製し、標準的なT-175培養物から微粒子を精製した。標準的な培養又はIntegra CELLineシステムから得たエキソソーム及び微粒子中で発現した様々なmiRNAの相対的な発現レベルを、製造業者の指示に従ってqRT-PCRパネル（Qiagen）を使用するmiRNAアレイで決定し、標準的なCTX0E03細胞株対照群と比較した上方制御レベル及び下方制御レベルの倍率に変換した（表3及び図10参照）。これらのデータは、3週にわたるIntegra CELLine培養システムから得たエキソソーム、微粒子、及び標準的な単一のフラスコ培養から得た細胞の間で示差的なmiRNA発現プロファイルを示す。
【表３】
2020072718.tif 000017
2020072718.tif 000018
【０２２６】
以下の式を使用して生データから値を算出した。
【数１】
2020072718.tif 000019
【０２２７】
［式中、
CT=サイクル閾値
GOI=目的の遺伝子（調べたmiRNA）
HKG=ハウスキーピング遺伝子（データを正規化するために使用した参照miRNA）］。
【０２２８】
［実施例12］
全miRNA分析
細胞は、細胞外空間への放出で決定される微粒子中にRNAをシャトルすることができる。このことにより、遺伝子的にコードされたメッセージの細胞間での伝達が可能になる。本明細書において、細胞外RNAを「シャトルRNA（shuttle RNA）」と総称する。次世代シーケンシングを使用して、CTX0E03神経幹細胞（NSC）から放出された非コードRNA種を包括的に分析することを目的とした。
【０２２９】
非コードRNAは2つのカテゴリー（低分子及び長鎖）に分けられる。低分子の非コードRNAバイオタイプとして、リボソームRNA（rRNA）、核小体低分子（snoRNA）、核内低分子RNA（snRNA）、マイクロRNA（miRNA）、多種多様な他のRNA（misc_RNA、例えばRMRP、ヴォールトRNA、後生動物SRP及びRNY）が挙げられ、長鎖の非コードRNAバイオタイプとして、長鎖非コードRNA（lncRNA）及び長鎖遺伝子間非コードRNA（lincRNA）が挙げられる。
【０２３０】
本明細書において、NSC由来のエキソソーム及び微小胞（MV）から放出された、低分子の及び長鎖の非コードRNA等のシャトルRNAを特性決定して、プロデューサーNSC（producer NSC）のRNA含有量と比較した。
【０２３１】
A）Agilent RNAバイオアナライザで同定した細胞、エキソソーム及び微小胞中における全RNA含有量
図14に示すように、エキソソーム及び微小胞の両方におけるRNAは、低分子RNA種から主に成る。大部分のヌクレオチド（nt）は、分子ラダーと対比して示すように200以下であった。
【０２３２】
B）RNAの組成
大規模シーケンシング（次世代シーケンシング）により低分子RNAのシーケンシングライブラリを作成し、シャトル及び細胞内RNAの組成を調べた。結果を図15に示す。
【０２３３】
C）標準的な（T175）培養からのCTX0E03細胞、微小胞及びエキソームmiRNA発現の大規模シーケンシング
大規模シーケンシングはcDNAライブラリの調製及びその後のシーケンシングに基づいており、微小胞及びエキソソームにおける様々なmiRNAの全配列の読み取りに関する情報を提供する。これらの大規模配列データにより、上記に示すqRT-PCRアレイデータが補完され、細胞及び微粒子のmiRNAプロファイルが包括的に分析される。qRT-PCRアレイ分析とは異なり、大規模シーケンシングはプローブアレイ中に存在する配列の同定に限定されず、そのため、同定される配列は前もって既知である必要はない。大規模シーケンシングはまた、直接読み取ることもでき、非常に短い配列を配列決定する能力も有する。しかしながら、大規模シーケンシングは、発現が低い転写産物の検出に適していない。
【０２３４】
方法
分画遠心で精製した、親細胞並びにそのエキソソーム（30〜100μm）及び微小胞（100〜1000μm）中における様々なmiRNAの存在を、各サンプルに関して1つのタグ付きmiRNAライブラリの構築後の大規模シーケンシングで同定した。
【０２３５】
更に、高度にシャトルされたmiRNA（例えばhsa-miR-1246）に特異的なプライマーを設計し、インビボでの移植後にリアルタイム逆転写PCR（qRT-PCR）で使用してエキソソーム/微小胞を追跡した。
【０２３６】
大規模シーケンシングをGATC Biotech（ドイツ）で実施し、該大規模シーケンシングは、各サンプルに関するタグ付きmiRNAライブラリの調製及びその後のシーケンシング並びにmiRBaseの精査を必要とした。
【０２３７】
・タグ付きmiRNAライブラリの構築（22〜30nt）
・各サンプルの3'末端及び5'末端の両方に特異的RNAアダプターをライゲーションし、その後に逆転写、増幅及び低分子RNAライブラリの精製を行うことにより、シーケンシングライブラリを作成した（含有される低分子RNA画分のサイズ範囲は22〜30nt）。
【０２３８】
・Illumina HiSeq 2000（シングルリード）によるシーケンシング
・Illumina HiSeq 2000（シングルリード）を使用してシーケンシングを実施した。1プールの分析は最大45,000,000シングルリードを含むことができ、各リード長は最大50塩基である。FastQファイル（配列及び品質スコア）を使用してシーケンシングの品質をコントロールした。
【０２３９】
・既知のmiRNAの同定を以下のように実施した：
・得られた配列からRNAアダプターを切り取り、生データをきれいにした。生データをクラスター化し、各クラスターに関して多くのリードを付与した。miRNAをmiRBaseの精査（Ssearch）により同定した。
【０２４０】
結果
多くの微小胞及びエキソソームではmiRNAが細胞に比べて豊富であり、このことは、細胞が、細胞外へ放出するためにmiRNAを特異的に選別することを示した。更に、miRNAの含有量はエキソソーム及び微小胞の両方で類似しており、このことは、排出された微小胞中に選択的にmiRNAを取り込む共通の器官を示す。理論に拘束されることを望まないが、このことは、分泌された微小胞及びエキソソームにおけるmiRNA含有量を、hNSCサブタイプを同定するためのフィンガープリントとして使用することができることを示しうる。
【０２４１】
従って、大規模シーケンシング分析により、hNSCエキソソーム及び微小胞の両方において、これまで報告されていない特有の一連のmiRNAが同定された。排出された小胞におけるmiRNAの含有量は類似するが、hNSCと比較して選択的なmiRNA取り込みを示した。これらの知見から、hNSCに関してこれまで説明されていないシャトルmiRNAによって媒介される生物学的効果を支持することができた。
【０２４２】
結果を以下の表4〜9に詳述する。データを図11にも示し、図11は、微小胞及びエキソソームに存在するmiRNAのプロファイルが細胞と比較して有意に異なることを明確に示す。要約すると、これらのデータは、細胞と比較して微小胞及びエキソソーム中におけるhsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532の量（リード数）の大幅な増加を示す。大幅な増加はhsa-miR-4508、hsa-miR-4516、has-miR-3676-5p及びhsa-miR-4485においても見られる。hsa-let-7a-5p、has-miR-92b-3p、has-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-100-5p及びhsa-99b-5p等の特定のmiRNAの量（リード数）の大幅な減少が見られる。
【０２４３】
エキソソーム中におけるhsa-miR-1246、hsa-miR-4488、hsa-miR-4492、hsa-miR-4508、hsa-miR-4516及びhsa-miR-4532それぞれの存在をqRT-PCRで確認した（データは示さず）。
【０２４４】
エキソソーム及び微小胞での大規模シーケンシングの結果を細胞と比較した相対変化倍率としてプロットすることにより、エキソソーム及び微小胞中のhsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532が細胞と比較して有意に上方制御されることが確認される。この比較により、エキソソーム及び微小胞の両方においてmiRNAであるhsa-miR-3195が最も上方制御されるmiRNAであることも明らかになる。hsa-miR-3195の絶対リード数はエキソソーム及び微小胞に関して約40の範囲内であるが、hsa-miR-3195は細胞には存在しない。
【０２４５】
上記の実施例11で述べたように、エキソソーム、微粒子及び親細胞におけるmiRNA含有量も試験し、PCRアレイ分析を使用して確認した。qRT-PCRにより、以下のmiRNAの存在が分かった：hsa-let-7g-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-128、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-134、hsa-miR-137、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-18b-5p、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-194-5p、hsa-miR-195-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-210、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-218-5p、hsa-miR-219-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302c-3p、hsa-miR-345-5p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-9-5p、hsa-miR-96-5p、及びhsa-miR-99a-5p。
【表４】
2020072718.tif 000020
2020072718.tif 000021
2020072718.tif 000022
2020072718.tif 000023
2020072718.tif 000024
2020072718.tif 000025
2020072718.tif 000026
2020072718.tif 000027
2020072718.tif 000028
2020072718.tif 000029
2020072718.tif 000030
【０２４６】
【表５】
2020072718.tif 000031
2020072718.tif 000032
2020072718.tif 000033
2020072718.tif 000034
2020072718.tif 000035
2020072718.tif 000036
2020072718.tif 000037
2020072718.tif 000038
2020072718.tif 000039
2020072718.tif 000040
2020072718.tif 000041
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2020072718.tif 000043
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2020072718.tif 000045
2020072718.tif 000046
【０２４７】
【表６】
2020072718.tif 000047
2020072718.tif 000048
2020072718.tif 000049
【０２４８】
【表７】
2020072718.tif 000050
2020072718.tif 000051
2020072718.tif 000052
【０２４９】
【表８】
2020072718.tif 000053
2020072718.tif 000054
2020072718.tif 000055
【０２５０】
【表９】
2020072718.tif 000056
2020072718.tif 000057
2020072718.tif 000058
【０２５１】
D）エキソソーム、MV及びプロデューサー細胞（producer cell）で実施したGENCODE分析による、上位にランクするコードRNA及び非コードRNAの同定
【表１０】
2020072718.tif 000059
【０２５２】
シーケンス結果のGENCODEデータベース分析を使用して、表11に示すように、エキソソーム（EXO）、微小胞（MV）及びプロデューサー細胞中において7つの推定新規miRNA配列を同定した（出発物質の量が低いため、nb CTX0E03 07EI MVのリードは不正確である-表10参照）。これらのデータを図16に図示し、図16は、これらの配列が、細胞と比較してエキソソーム及び微小胞中に選択的にシャトルされることを示す。
【表１１】
2020072718.tif 000060
【０２５３】
新規miRNAの確認
AC079949.1-201（配列番号738）
遺伝子：AC079949.1 ENSG00000239776
>12 dna：染色体  染色体：GRCh37:12:127650616:127650672:1
GGCCGCGCCCCGTTTCCCAGGACAAAGGGCACTCCGCACCGGACCCTGGTCCCAGCG
【０２５４】
推定成熟miRNAであるAC079949.1-201に関しては、Naive Bays分類システムを使用してmiRNA前駆体配列内で成熟miRNAを発見するツールであるhttp://mirna.imbb.forth.gr/MatureBayes.htmlを使用して、gaccaggguccggugcggagug（配列番号745）を、可能性のある5'ステム成熟miRNAとして同定した。その配列の存在確認を、AGGGTCCGGTGCGGAGT（配列番号746）プライマー配列を使用して実施した。この配列をmirbase（http://www.mirbase.org/）に入力し、配列がウシ（Bos taurus）のmiR-2887-1（アクセッション番号MIMAT0013845）に類似する以下のmiRNAを発見した。
【０２５５】
2020072718.tif 000061
【０２５６】
この新規miRNAの存在を精製したエキソソームの逆転写miRNAに対するqRT-PCRで試験した。
【０２５７】
配列TGCGGAGTGCCCTTTGTCCT（配列番号748）であるAC079949の3'ステムを使用して同じ分析を実施したが、この場合には同様のmiRNAがmirbase中に認められなかった。
【０２５８】
AP000318.1-201（配列番号739）
遺伝子：AP000318.1 ENSG00000266007
>21 dna：染色体  染色体：GRCh37:21:35677430:35677493:1
CCCACTCCCTGGCGCCGCTTGTGGAGGGCCCAAGTCCTTCTGATTGAGGCCCAACCCGTGGAAG
【０２５９】
推定成熟miRNAであるAP000318.1-201に関しては、ggagggcccaaguccuucugau（配列番号744）を可能性のある5'ステム成熟miRNAとして同定した。その配列の存在確認を、GGAGGGCCCAAGTCCTTCTGAT（配列番号749）プライマー配列を使用して実施した。カエノラブディティス・レマネイ（Caenorhabditis remanei）のmiR-55ステムループを類似のmiRNAとして同定した。プライマー確認をqRT-PCRで再び行った。
【０２６０】
2020072718.tif 000062
【０２６１】
AL161626.1-201（配列番号740）
遺伝子：AL161626.1 ENSG00000241781
>9 dna：染色体  染色体：GRCh37:9:79186731:79186787:1
CGCCGGGACCGGGGTCCGGGGCGGAGTGCCCTTCCTCCTGGGAAACGGGGTGCGGC
【０２６２】
推定成熟miRNAであるAL161626.1-201に関しては、ggcggagugcccuucuuccugg（配列番号743）を可能性のある5'ステム成熟miRNAとして同定した。その配列の存在確認を、CGGAGTGCCCTTCTTCCT（配列番号751）プライマー配列を使用して実施した。トウモロコシ（Zea mays）のmiR164cステムループ及びアキポジウム・ディスタキオン（Achypodium distachyon）のmiR164fステムループを類似のmiRNAとして同定した。プライマー確認をqRT-PCRで再び行った。
【０２６３】
2020072718.tif 000063
【０２６４】
AC004943.1 （配列番号741）
遺伝子：AC004943.1 ENSG00000265573
>16 dna：染色体  染色体:GRCh37:16:72821592:72821672:-1
GCTTCACGTCCCCACCGGCGGCGGCGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCTC
AL121897.1 （配列番号742）
遺伝子：AL121897.1 ENSG00000264308
>20 dna：染色体  染色体：GRCh37:20:30865503:30865591:1
GCCGCCCCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCCGCTTTCGGCTCGGGCCTCAGGTGAGTCGGAGGGGCCGGGCGCC
【０２６５】
推定新規を含む多種多様なRNA（misc_RNA）
misc_RNAは多種多様なRNAの略であり、一連の多種多様な低分子RNAの総称である。多種多様な転写産物の特徴は他のRNAキーでは定義されない。
【０２６６】
GENCODE配列データセットを使用して同定した、上位にランクする既知のmisc_RNA及び新規のmisc_RNAのリスト：
【表１２】
2020072718.tif 000064
【０２６７】
misc_RNAの内、以下の配列がエキソソーム及びMVにおいて選択的に少なく又は多くシャトルされること、即ち、RPHI、RMRP及びVTRNA1-1がそれぞれ多くシャトルされ、Y_RNA.725-201及びY_RNA.125-201がそれぞれ少なくシャトルされることが分かった。RPHIはリボヌクレアーゼP RNA成分H1である。RMRP遺伝子は、エンドリボヌクレアーゼをプロセシングするミトコンドリアRNAのRNA成分をコードし、該エンドリボヌクレアーゼは、ミトコンドリアDNA複製のプライミング部位でミトコンドリアRNAを切断する。このRNAはまた、テロメラーゼの逆転写酵素触媒サブユニットと相互作用してRNA依存性RNAポリメラーゼ活性を有する別々のリボ核タンパク質複合体を形成し、低分子干渉RNAへとプロセシングされ得る二本鎖RNAを産生する。VTRNA1-1はヴォールトRNA成分1である。ヴォールトは大きな細胞質リボ核タンパク質であり、主要なヴォールトタンパク質であるMVP、2種の少量のヴォールトタンパク質であるTEP1及びPARP4、並びに非翻訳RNA成分であるVTRNA1-1から組成される。Y_RNA.725-201及びY_RNA.125-201は新規のmisc_RNAであり、それらの機能は明確ではない。
【０２６８】
後生動物の多種多様なRNA
7SL、6S、ffs又は4.5S RNAとしても知られるシグナル認識粒子RNAは、シグナル認識粒子（SRP）リボ核タンパク質複合体のRNA成分である。SRPは、細胞内でのタンパク質の交通を方向付けて該タンパク質の分泌を可能にする、普遍的に保存されたリボ核タンパク質である。SRP  RNAは、1種以上のSRPタンパク質と共にシグナルペプチドの結合及び放出に寄与する。この複合体のRNA成分及びタンパク質成分は高度に保存されているが、異なる界の生物の間では変化する。
【０２６９】
GENCODE配列データセットを使用して同定した、上位にランクする後生動物のmisc_RNAのリスト：
【表１３】
2020072718.tif 000065
【０２７０】
rRNA（リボソームRNA）
リボソームRNA（rRNA）はリボソームとして知られるタンパク質合成オルガネラの一部を形成し、細胞質にエクスポートされてメッセンジャーRNA（mRNA）の情報のタンパク質への翻訳を促進する。真核生物リボソーム（80S）rRNA成分は、大ユニット（rRNA 5S、5.8S及び28S）、小ユニット（rRNA 18S）である。エキソソーム及びMVでは、rRNAの28S及び5.8Sの両方が選択的に多くシャトルされる。
【０２７１】
GENCODE配列データセットを使用して同定した、上位にランクするrRNAのリスト：
【表１４】
2020072718.tif 000066
【０２７２】
核小体低分子RNA：snoRNA
核小体低分子RNA（snoRNA）は他のRNAの、即ちリボソームRNA、トランスファーRNA及び核小体低分子RNAの化学修飾を主に導く低分子RNAの一種である。snoRNAには主に2種のクラス、即ちメチル化と関係するC/DボックスsnoRNA及びプソイドウリジン化と関係するH/ACAボックスsnoRNAがある。
【０２７３】
GENCODE配列データセットを使用して同定した、上位にランクするsnoRNAのリスト：
【表１５】
2020072718.tif 000067
【０２７４】
核内低分子RNA（snRNA）
一般にU-RNAとも称される核内低分子リボ核酸（snRNA）は、U1、U2、U4、U5及びU6と名付けられている主要なスプライセオソームを構成し、いくつかのRNA-RNA相互作用及びRNA-タンパク質相互作用に関与する低分子RNAの一種である。核内低分子リボ核酸の主な機能は、核内でのプレmRNA（hnRNA）のプロセシングにある。核内低分子リボ核酸が転写因子（7SK RNA）又はRNAポリメラーゼII（B2 RNA）の制御及びテロメアの維持を補助することも分かっている。
【０２７５】
GENCODE配列データセットを使用して同定した、上位にランクするsnRNAのリスト：
【表１６Ａ】
2020072718.tif 000068
【０２７６】
lincRNA及び新規のlincRNA
長鎖遺伝子間非コードRNA（lincRNA）は、多様な細胞プロセスの主要制御因子として現れている。個々のlincRNAの機能を決定することは依然として困難である。長鎖非コードRNA（長鎖ncRNA、lncRNA）は、200ヌクレオチドよりも長い、タンパク質をコードしない転写産物である。
【０２７７】
GENCODE配列データセットを使用して同定した、上位にランクする既知の及び新規のlincRNAのリスト：
【表１６Ｂ】
2020072718.tif 000069
【０２７８】
GAS5であるlincRNAは、エキソソーム及び微小胞と比較してプロデューサー細胞中で高度に発現する（エキソソーム及びMVの両方において少なくシャトルされる）。
【０２７９】
mRNA
配列をコードするmRNAも同定した。
【表１７】
2020072718.tif 000070
【０２８０】
実施例12：結論
大規模シーケンス分析の主な目的は、神経幹細胞由来の小胞（エキソソーム及び微小胞）中におけるmiRNA成分を同定することであった。この分析により、エキソソーム及びMVの両方に選択的にシャトルされる新たな一連の既知及び新規miRNAを同定した。同定したmiRNAの内、mirbaseデータベースに既に含まれているのは、hsa-miR-1246、hsa-miR-4488、hsa-miR-4492、hsa-miR-4508、hsa-miR-4516、hsa-miR-4532であり、新規mirRNAの内ではAC079949.1、AP000318.1、AL161626.1、AC004943.1、AL121897.1であった。エキソソームにおいて新規のシャトルされたmiRNA等の上位にランクするシャトルされたmiRNAをqRT-PCRで確認した。
【０２８１】
シャトルRNAのサイズ分布は本明細書に示すように、主に20〜200ntの範囲内であり、他のRNA種は細胞により細胞外空間へ放出される。大規模シーケンシング及びGENCODE配列セットの分析により、より複雑化して多様な非コードRNA転写産物を発見した。詳細な評価によりこの分析を広げ、これにより、エキソソーム及び微小胞の両方において選択的に多く（2以上のlog2変化倍率として定義される）シャトルされる他の非コードRNA及び選択的に少なく（-2以下のlog2変化倍率として定義される）シャトルされる他の非コードRNAの発見につながった。ほぼ全ての非コードRNAサブタイプ、すなわちリボソームRNA（rRNA）、核小体低分子（snoRNA）、核内低分子RNA（snRNA）、マイクロRNA（miRNA）、多種多様な他のRNA（misc_RNA、例えばRMRP、ヴォールトRNA、後生動物SRP及びRNY）、並びに長鎖遺伝子間非コードRNA（lincRNA）において、示差的にシャトルされた非コードRNAを発見した。
【０２８２】
細胞及びシャトルRNAで検出されたRNA種の不均一な分布は、該RNA種の遺伝子制御における役割に関する証拠が増えていることと合わせると、細胞がこれらのRNAを特異的に放出し、標的細胞の機能を改変することを強く示唆する。
【０２８３】
［実施例13］
プロテオーム分析
方法
分画超遠心法を使用して、CTX0E03細胞Integra培養物（2週目）からエキソソーム画分及び微小胞画分を調製した。エキソソーム及び微小胞を変性RIPA緩衝液（50mMのTris HCl、pH8.0、150mMのNaCl、1％SDS、0.1％Triton X100、10mMのDTT、1×完全プロテアーゼ阻害剤（Roche）及び1×PhosStopホスファターゼ阻害剤（Roche））中で破砕し、1mLのツベルクリン注射器及び25ゲージ針を使用して手動でせん断した。Qubit蛍光光度計（Invitrogen）を使用して、破砕後にサンプルを再定量した。各サンプル20μgを4〜12％SDS-PAGEゲル（Novex、Invitrogen）上にロードした。ゲルをレーン毎に40個の切片に切り出し、以下のプロトコルによりロボット（ProGest、DigiLab）を使用してゲル薄片を処理した：  a）25mMの重炭酸アンモニウムで洗浄し、続いてアセトニトリルで洗浄する、
b）60℃において10mMのジチオスレイトールで還元し、続いて室温において50mMのヨードアセトアミドでアルキル化する、
c）37℃において4時間にわたりトリプシン（Promega）で消化する、
d）ギ酸でクエンチする、
e）更に処理することなく質量分析により上清を直接分析する。
【０２８４】
質量分析
ThermoFisher Q ExactiveにつないだWaters NanoAcquity HPLCシステムを使用するナノLC/MS/MSにより、各ゲル消化物を分析した。捕捉カラム及び分析カラムの両方にJupiter Proteo樹脂（Phenomenex）を充填し、ペプチドを捕捉カラム上にロードして350nL/分で75μmの分析カラムを通して溶出させた。それぞれ70,000FWHM分解能及び17,500FWHM分解能でOrbitrap中において実施したMS及びMS/MSにより、データ依存型モードで質量分析器を操作した。
【０２８５】
エキソソーム
超遠心分離で精製したエキソソームにおいて、質量分析により2572種のタンパク質を同定した。初期段階（2週目）のIntegra培養物からエキソソームを単離した。2572種全てのタンパク質の遺伝子名及び対応するSWISSPROTアクセッション番号（括弧内）を表18に（遺伝子名のアルファベット順に）列挙し、最も多量に存在する100種のタンパク質を表19に、量が減少する順に列挙する。特徴的なエキソソームマーカーCD9、CD81及びAlix（PDCD6IPとしても知られる）は、最も多量に存在する100種のタンパク質中に存在する。
【表１８】
2020072718.tif 000071
2020072718.tif 000072
2020072718.tif 000073
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2020072718.tif 000084
2020072718.tif 000085
【０２８６】
【表１９】
2020072718.tif 000086
2020072718.tif 000087
2020072718.tif 000088
【０２８７】
微小胞
初期段階（2週目）のIntegra培養物から単離し、10,000×gでの遠心分離で精製した微小胞において、質量分析により2940種のタンパク質を同定した。2940種全てのタンパク質の遺伝子名及び対応するSWISSPROTアクセッション番号（括弧内）を表20に（遺伝子名のアルファベット順に）列挙し、最も多量に存在する100種のタンパク質を表21に、量が減少する順に列挙する。
【表２０】
2020072718.tif 000089
2020072718.tif 000090
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2020072718.tif 000098
2020072718.tif 000099
2020072718.tif 000100
2020072718.tif 000101
2020072718.tif 000102
2020072718.tif 000103
2020072718.tif 000104
2020072718.tif 000105
【０２８８】
【表２１】
2020072718.tif 000106
2020072718.tif 000107
2020072718.tif 000108
【０２８９】
プロテオームデータの考察
CD63（MLA1及びTSPAN30としても知られる）、TSG101（ESCRT-I複合体サブユニットTSG101としても知られる）、CD109（150kDaのTGF-ベータ-1-結合タンパク質としても知られる）及びthy-1（CD90としても知られる）をエキソソーム及び微小胞の両方で検出した。
【０２９０】
他のテトラスパミンも検出した。即ちエキソソーム画分でテトラスパミン-4、-5、-6、-9及び14を検出し、微小胞でテトラスパミン-6及び-14を検出した。
【０２９１】
CD133（AC133、プロミニン-1、PROM1、PROML1及びMSTP061としても知られる）をエキソソームで検出したが、微小胞では検出しなかった。
【０２９２】
CD53（MOX44及びTSPAN25としても知られる）、CD82（KAI1、SAR2、ST6及びTSPAN27としても知られる）、CD37（TSPAN26としても知られる）並びにCD40リガンド（CD40LG、CD40L及びTNFSF5としても知られる）をエキソソーム又は微小胞では検出しなかった。
【０２９３】
ネスチン、GFAP及びチューブリンベータ-3鎖（TUBB3としても知られる）をエキソソーム画分及び微小胞画分の両方で検出し、両方の画分における上位100種のタンパク質内ではチューブリンベータ-3鎖が特に顕著であった。Sox2、DCX、GALC、GDNF及びIDOを検出しなかった。
【０２９４】
セレクチン及びTNFRI（TNF受容体1、TNFRSF1A、TNFAR及びTNFR1としても知られる）を検出しなかった。
【０２９５】
インテグリンアルファ-2、-3、-4、-5、-6、-7、-V並びにインテグリンベータ-1、-4及び-8をエキソソーム画分及び微小胞画分の両方で検出した。インテグリンベータ-3及び-5を微小胞のみで検出した。
【０２９６】
MHCクラスI抗原（例えばHLA_A1、HLA-A2及びHLA-B27）をエキソソーム及び微小胞の両方で検出した。
【０２９７】
細胞接着分子（例えばCADM1、CADM4、ICAM1、JAM3、L1CAM、NCAM）をエキソソーム及び微小胞の両方で検出した。
【０２９８】
細胞骨格タンパク質（例えばアクチン、ビメンチン、ケラチン、カテニン、ジストログリカン（dystroglucan）、神経フィラメントポリペプチド、微小管結合タンパク質、チューブリン、デスモプラキン（desmoplaktin）、プレクチン、プラコフィリン、セプチン、スペクトリン、タリン、ビンキュリン及びザイキシン）をエキソソーム画分及び微小胞画分の両方で検出した。
【０２９９】
GTPアーゼ、クラスリン、シャペロン、熱ショックタンパク質（例えばHsp90、Hsp70）、スプライシング因子、翻訳因子、アネキシン及び増殖因子（例えばTGF-ベータ）をエキソーム及び微小胞の両方で検出した。
【０３００】
ガレクチン-3、TIMP-1、トロンボスポンジン-1（thrombosponding-1）、EGF受容体及びCSKをエキソソーム及び微小胞の両方で検出した。
【０３０１】
図18では、エキソソームからのプロテオームデータと微小胞からのプロテオームデータとが比較されている。図18Aには、2週目のIntegra培養システムから単離した各微粒子集団中の特有のタンパク質の数が図示されている。図18Bでは、2週目のIntegraシステムから単離された各微粒子集団において同定したタンパク質と関連する生物学的プロセスが比較されている。エキソソームで同定したタンパク質が関連する生物学的プロセスと、微小胞で同定したタンパク質が関連する生物学的プロセスとは極めて類似する。
【０３０２】
ビオチン代謝に関連するタンパク質はエキソソーム中にのみ見られたが、トリプトファンの生合成及びタウリン/アルファ-リノレン酸代謝に関与するタンパク質を微小胞中でのみ同定した。
【０３０３】
図18Cでは、CTX0E03のプロテオームと、Lai他2012で開示されている間葉系幹細胞エキソソームのプロテオームとが比較されており、Lai他2012では、間葉系幹細胞から放出されたエキソソームにおいて合計857種のタンパク質を同定した。
【０３０４】
図18Dでは、MSC由来のエキソソーム（Lim 2012）において同定したタンパク質と関連する生物学的プロセスと、本発明の神経幹細胞由来のエキソソームと関連する生物学的プロセスとが比較されている。MSC由来のエキソソームのみと関連することが分かった3種の生物学的プロセスは、（有意性の低下順に）喘息；フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンの生合成；そして原発性免疫不全である。神経幹細胞由来のエキソソームのみと関連することが分かった30種の生物学的プロセスを図19に示し、同定した最も有意な生物学的機能はRNAポリメラーゼに関する。
【０３０５】
MSC由来のエキソソーム及びNSC由来のエキソソームの両方に共通する197種の生物学的プロセスの更なる比較により、MSCエキソソームと比較した場合、NSCエキソソームはRNA分解、リボソーム及びスプライセオソームに関与するプロセスを特に多く含有することが明らかになる。
【０３０６】
上記の比較により、（Lim他2012により特性決定されたように）NSC由来のエキソソームとMSC由来のエキソソームとの間に多くの有意な差があることが示される。Limのグループによって同定されたエキソソームには非常に少ない/存在しないことと比較して、NSCエキソソームに存在することを同定した4つの最も有意な生物学的相違全てが、遺伝物質の産生、充填、機能及び分解、即ちRNAポリメラーゼ、RNA分解、リボソーム及びスプライセオソームに関連するタンパク質を含む。
【０３０７】
［実施例14］
微粒子のサイズ分布
NanoSight分析を行い、1週、2週、3週、4週、5週及び6週にわたりIntegra Cellineシステム中で培養したCTX0E03細胞から単離した微小胞（「mv1」〜「mv6」）及びエキソソーム（「exo1」〜「exo6」）の粒子サイズ（粒径）及び濃度を決定した。全ての結果は5回の反復測定に基づく。
【０３０８】
ナノ粒子トラッキング分析（NTA）を使用して粒子サイズ分布を測定した。NTAでは溶液中での粒子の動きが検出され、この動きが粒子サイズと関連付けられる。全てのサンプルに関して、モード粒子サイズ及び中央粒子サイズを算出した。最小の小胞を捕捉するために最も感度の高いカメラ設定を使用してエキソソームサンプルを分析した。より大きな小胞の過剰曝露を防止するために低い感度のカメラ設定を使用して微小胞サンプルを分析した。その結果、サンプル中のより小さな小胞の一部を検出しなかった。より小さな小胞がMVサンプル中に存在したが、質量の観点からは該小胞がサンプルに占める割合は小さい。
【０３０９】
Exo1の一部を膜特異的蛍光色素（CellMask(商標)）で標識し、NTA分析とCellMask(商標)標識とを組み合わせることにより、NTAで検出した事象が膜小胞に対応することを確認した（データは示さず）。
【０３１０】
結果を以下の表22及び図17に示す。
【０３１１】
エキソソームでは6週目でサイズの低下が、即ちモードの約110nmから約70nmへの低下が、又は中央値の約130nmから約75nmへの低下が見られる。全体的なサイズ範囲は70nm〜150nmであり、当分野で説明されている他の細胞型由来のエキソソームのサイズと一致する。6週にわたる細胞の培養後にエキソソームのサイズが約70nmの直径に低下するという観測は、実施例8及び図6で報告した6週にわたり多区画のバイオリアクタで培養したCTX0E03細胞から単離したエキソソームの効果の増強と相関する。
【０３１２】
また、図17に示すように、微小胞及びエキソソームの濃度も6週の期間にわたり低下し、その期間に観測した効果の向上をおおむね反映していることにも留意されたい。
【０３１３】
予想したように、微小胞はより大きく、モード径は約150nm〜200nmであり、又は中央径は約180nm〜350nmである。
【表２２】
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【０３１４】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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