(57)【要約】      （修正有）【課題】向上された臍帯由来付着型幹細胞、その製造方法及びその用途の提供。【解決手段】下記（ａ）ないし（ｅ）から選択される１以上の特性を有する臍帯由来付着型幹細胞。ａ）ＣＯＬ１Ａ１、ＩＧＦＢＰ４、ＴＡＧＬＮ、ＳＴＣ１、ＬＲＲＣ１７及びＩＬ３３からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに多く発現されること、ｂ）ＣＣＮＤ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＲＮＰ及びＣＹＰ１Ｂ１からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに少なく発現されること、ｃ）継代培養する間、付着型線維芽細胞の形態を維持すること、ｄ）脂肪細胞、骨細胞または軟骨細胞への分化能；及びｅ）ＣＤ２００＋、Ｔｒａ−１−６０−、ＣＤ３−、ＣＤ１ａ−、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ１６−、ＣＤ８６−、ＣＤ８ａ−、ＣＤ４０−、ＣＤ１４１＋、ＣＤ６１＋、ＣＤ８７＋、ＭＩＣＡ／Ｂ−及びＳＳＥＡ４＋からなる群から選択される１以上の表面抗原特性。【選択図】図４Ａ
2020072725.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）ないし（ｅ）から選択される１以上の特性を有する向上された臍帯由来付着型幹細胞：
ａ）ＣＯＬ１Ａ１、ＩＧＦＢＰ４、ＴＡＧＬＮ、ＳＴＣ１、ＬＲＲＣ１７及びＩＬ３３からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに多く発現されること；
ｂ）ＣＣＮＤ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＲＮＰ及びＣＹＰ１Ｂ１からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに少なく発現されること；
ｃ）継代培養する間、付着型線維芽細胞の形態を維持すること；
ｄ）脂肪細胞、骨細胞または軟骨細胞への分化能；及び
ｅ）ＣＤ２００＋、Ｔｒａ−１−６０−、ＣＤ３−、ＣＤ１ａ−、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ１６−、ＣＤ８６−、ＣＤ８ａ−、ＣＤ４０−、ＣＤ１４１＋、ＣＤ６１＋、ＣＤ８７＋、ＭＩＣＡ／Ｂ−及びＳＳＥＡ４＋からなる群から選択される１以上の表面抗原特性。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、向上された臍帯由来付着型幹細胞、その製造方法及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞治療剤は、細胞と組織との機能を復元するために、細胞を体外で増殖したり選別したりするような方法で細胞の特性を変化させ、特定疾患の予防または治療の目的に使用される医薬品であり、最近、難治性疾患及び再生医学において脚光を浴びている分野である。分化程度により、体細胞治療剤及び幹細胞治療剤に分けることができ、幹細胞治療剤は、胚芽幹細胞及び成体幹細胞に分けることができる。
【０００３】
今のところ、成体幹細胞研究は、ほとんど骨髄（bone marrow）においてなされており、一部では、脂肪組織（adipose tissue）あるいは臍帯血（cord blood）において、幹細胞を分離して培養して投与する方式からなっている。しかし、骨髄及び脂肪組織細胞は、浸襲的な方法によって採取され、壮年期や老年期の患者から分離した幹細胞の場合、分化能及び増殖力が低下する。また、臍帯血の場合、採取が容易であるが、臍帯血内幹細胞の含量が少ない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
臍帯（ＵＣ：umbilical cord）は、骨髄または脂肪由来細胞とは異なり、すでに身体から分離された組織から抽出するので、非浸襲的であり、抽出工程も容易である。また、胚芽由来幹細胞とは異なり、倫理的側面でも自由である。従って、最近、難治性または再生医学の有用な材料として脚光を浴びており、原始細胞として、増殖能と分化能とを同時に満足させることができ、臓器再生だけではなく、臓器特性に適するように、分化後に使用されるという長所を有する。ただし、臍帯内部に多種の細胞が存在する組織であるので、治療剤として最適の細胞を探し出す研究と、均一な細胞集団として、分離または抽出することができる細胞の新たな特性を究明する研究が必要であるという実情である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様は、向上された臍帯由来付着型幹細胞、またはその細胞集団を提供することである。
【０００６】
他の態様は、分離された臍帯を培養容器に付着させて培養する段階と、前記培養された臍帯に分離酵素を接触させ、向上された臍帯由来付着型幹細胞を分離する段階と、前記分離された向上された臍帯由来付着型幹細胞を線維芽細胞成長因子−４（ＦＧＦ−４）及びヘパリンを含む培地で継代培養する段階と、を含む向上された臍帯由来付着型幹細胞を製造する方法を提供することである。
【０００７】
他の態様は、前記向上された臍帯由来付着型幹細胞、その細胞集団、またはその培養液を有効成分として含む薬学的組成物を提供することである。
【０００８】
一態様は、向上された臍帯由来付着型幹細胞を提供する。
【０００９】
前記向上された臍帯由来付着型幹細胞は、下記（ａ）ないし（ｅ）から選択される１以上の特性を有するものでもある：
ａ）ＣＯＬ１Ａ１、ＩＧＦＢＰ４、ＴＡＧＬＮ、ＳＴＣ１、ＬＲＲＣ１７及びＩＬ３３からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに多く発現されること；
ｂ）ＣＣＮＤ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＲＮＰ、及びＣＹＰ１Ｂ１からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに少なく発現されること；
ｃ）継代培養する間、付着型線維芽細胞の形態を維持すること；
ｄ）脂肪細胞、骨細胞または軟骨細胞への分化能；及び
ｅ）ＣＤ２００＋、Ｔｒａ−１−６０−、ＣＤ３−、ＣＤ１ａ−、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ１６−、ＣＤ８６−、ＣＤ８ａ−、ＣＤ４０−、ＣＤ１４１＋、ＣＤ６１＋、ＣＤ８７＋、ＭＩＣＡ／Ｂ−及びＳＳＥＡ４＋からなる群から選択される１以上の表面抗原特性。
【００１０】
前記向上された臍帯由来付着型幹細胞は、下記（ｆ）ないし（ｉ）から選択される１以上の特性をさらに有するものでもある：
ｆ）Ｓ１００Ａ１０、ＢＮＩＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＤＰＹＤ及びＳＣＡＲＡ３からなる群から選択される１以上が、正常酸素条件での培養に比べ、さらに多く発現されること；
ｇ）ＩＬ８、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＤＬＣ１、ＣＴＨＲＣ１及びＣＰＡ４からなる群から選択される１以上が、正常酸素条件での培養に比べ、さらに少なく発現されること；
ｈ）ＳＮＣＡ、ＤＳＧ２、ＮＲＰ２及びＰＬＡＴからなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに多く発現されること；
ｉ）ＴＰＭＴ、ＮＡＧＫ及びＡＮＸＡ４からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに少なく発現されること。
【００１１】
前記向上された臍帯由来付着型幹細胞は、前記ｅ）の表面抗原特性が、追加して、Ｏｃｔ４−またはＮａｎｏｇ−でもある。また、前記ｅ）の表面抗原特性のうちＣＤ６１＋は、低酸素条件で過発現する表面抗原特性でもある。
【発明の効果】
【００１２】
一態様による向上された臍帯由来付着型幹細胞によれば、抗炎症効果、血管再生効果または神経再生効果があり、多様な疾病の治療または予防のための薬学的組成物または細胞治療剤に有用に使用される。
【００１３】
他の態様による向上された臍帯由来付着型幹細胞の製造方法によれば、臍帯組織からの幹細胞の純度、収得率及び増殖率を上昇させることができる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞分離において、分離酵素前後の細胞形態を示す図面である。
【図１Ｂ】一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞分離において、分離酵素の処理時期による細胞形態を示した図面である：Ｇ１：Ｃｏｌ Ｉ処理群、Ｇ２：組織付着後のＣｏｌ Ｉ処理群。
【図２Ａ】一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞培養において、低酸素条件及び正常酸素条件による比較を分析した図面である：３％：低酸素分圧（３％ Ｏ２）、２１％：正常酸素分圧（２１％ Ｏ２）。
【図２Ｂ】一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞培養において、低酸素条件及び正常酸素条件による比較を分析した図面である：３％：低酸素分圧（３％ Ｏ２）、２１％：正常酸素分圧（２１％ Ｏ２）。
【図２Ｃ】一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞培養において、低酸素条件及び正常酸素条件による比較を分析した図面である：３％：低酸素分圧（３％ Ｏ２）、２１％：正常酸素分圧（２１％ Ｏ２）。
【図２Ｄ】一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞培養において、低酸素条件及び正常酸素条件による比較を分析した図面である：３％：低酸素分圧（３％ Ｏ２）、２１％：正常酸素分圧（２１％ Ｏ２）。
【図３】一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞の遺伝的安定性について、核型分析を行った結果を示した図面である。
【図４Ａ】一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞の表面タンパク質を分析した結果を示した図面である。
【図４Ｂ】一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞の表面タンパク質を分析した結果を示した図面である。
【図５】一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞の多分化能を分析した結果を示した図面である。
【図６】一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞のタンパク質発現を比較分析した結果を示した図面である。
【図７Ａ】一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞の抗炎症効果を分析した結果を示した図面である。
【図７Ｂ】一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞の血管再生効果を分析した結果を示した図面である。
【図７Ｃ】一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞の神経再生効果を分析した結果を示した図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一態様は、向上された臍帯由来付着型幹細胞を提供する。
【００１６】
前記向上された臍帯由来付着型幹細胞は、下記（ａ）ないし（ｅ）から選択される１以上の特性を有するものでもある：
ａ）ＣＯＬ１Ａ１、ＩＧＦＢＰ４、ＴＡＧＬＮ、ＳＴＣ１、ＬＲＲＣ１７及びＩＬ３３からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに多く発現されること；
ｂ）ＣＣＮＤ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＲＮＰ、及びＣＹＰ１Ｂ１からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに少なく発現されること；
ｃ）継代培養する間、付着型線維芽細胞の形態を維持すること；
ｄ）脂肪細胞、骨細胞または軟骨細胞への分化能；及び
ｅ）ＣＤ２００＋、Ｔｒａ−１−６０−、ＣＤ３−、ＣＤ１ａ−、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ１６−、ＣＤ８６−、ＣＤ８ａ−、ＣＤ４０−、ＣＤ１４１＋、ＣＤ６１＋、ＣＤ８７＋、ＭＩＣＡ／Ｂ−及びＳＳＥＡ４＋からなる群から選択される１以上の表面抗原特性。
【００１７】
前記向上された臍帯由来付着型幹細胞は、下記（ｆ）ないし（ｉ）から選択される１以上の特性をさらに有するものでもある：
ｆ）Ｓ１００Ａ１０、ＢＮＩＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＤＰＹＤ及びＳＣＡＲＡ３からなる群から選択される１以上が、正常酸素条件での培養に比べ、さらに多く発現されること；
ｇ）ＩＬ８、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＤＬＣ１、ＣＴＨＲＣ１及びＣＰＡ４からなる群から選択される１以上が、正常酸素条件での培養に比べ、さらに少なく発現されること；
ｈ）ＳＮＣＡ、ＤＳＧ２、ＮＲＰ２及びＰＬＡＴからなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに多く発現されること；
ｉ）ＴＰＭＴ、ＮＡＧＫ及びＡＮＸＡ４からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに少なく発現されること。
【００１８】
前記向上された臍帯由来付着型幹細胞は、前記ｅ）の表面抗原特性が、追加して、Ｏｃｔ４−またはＮａｎｏｇ−でもある。また、前記ｅ）の表面抗原特性のうちＣＤ６１＋は、低酸素条件で過発現する表面抗原特性でもある。
【００１９】
本明細書において、用語「臍帯（umbilical cord）」は、哺乳類の胎児が胎盤で成長することができるように、母体と腹とを連結する紐状を意味し、一般的に、ワルトンゼリーで取り囲まれた３本の血管、すなわち、２本の臍動脈と１本の臍静脈とから構成された組織を意味する。従って、本明細書において、「向上された臍帯由来付着型幹細胞（enhanced umbilical cord adherent stem cells）」または「臍帯由来付着型幹細胞（umbilical cord adherent stem cells）」は、臍帯、または臍帯のワルトンゼリー（Wharton’s Jelly）組織に由来し、多様な組織細胞に分化することができる能力、及び培養容器表面に付着して育つ特性を有する細胞を意味する。
【００２０】
本明細書で提供される向上された臍帯由来付着型幹細胞は、細胞表面に発現される細胞標識子に対して、ＣＤ２００、ＣＤ１４１、ＣＤ６１、ＣＤ８７またはＳＳＥＡ４の陽性表面マーカーを、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または約９９％発現し、幹細胞標識子であるＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｔｒａ−１−６０、ＣＤ３、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ８６、ＣＤ８ａ、ＭＩＣＡ／ＢまたはＣＤ４０の陰性マーカーを、およそ少なくとも７０％以下、少なくとも６０％以下、少なくとも５０％以下、少なくとも４０％以下、少なくとも３０％以下、少なくとも２０％以下、少なくとも１０％以下、少なくとも５％以下、または少なくとも１％以下に発現するものでもある。本発明において、用語「陽性」は、幹細胞標識と係わり、その標識が基準になる他の非幹細胞と比較したとき、さらに多量、またはさらに高濃度で存在するということを意味する。すなわち、細胞は、ある標識が細胞の内部または表面に存在するために、その標識を利用し、その細胞を１以上の他の細胞類型と区別することができれば、その標識に対して陽性になる。また、細胞が背景値よりさらに大きい値でもって、信号、例えば、細胞測定装置の信号を出すことができるほどの量で、その標識を有しているということを意味する。例えば、細胞を、ＣＤ２００に特異的な抗体として検出することができるように標識することができ、該抗体からの信号が、対照群（例えば、背景値）より検出可能にさらに大きければ、その細胞は、「ＣＤ２００＋」である。本発明において、用語「陰性」は、特定細胞表面標識に特異的な抗体を使用しても、背景値に比べ、その標識を検出することができないということを意味する。例えば、ＣＤ３に特異的な抗体で細胞を検出可能に標識することができなければ、その細胞は、「ＣＤ３−」である。
【００２１】
前記免疫学的特性は、本発明が属する技術分野に公知の一般的な方法によって決定することができる。例えば、流細胞分析、免疫組織化学染色またはＲＴ−ＰＣＲなど多様な方法が利用される。
【００２２】
一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞は、ＣＯＬ１Ａ１、ＩＧＦＢＰ４、ＴＡＧＬＮ、ＳＴＣ１、ＬＲＲＣ１７及びＩＬ３３からなる群から選択される１以上の遺伝子またはタンパク質を、骨髄由来幹細胞に比べ、さらに多く発現することができる。具体的には、前記細胞において、ＣＯＬ１Ａ１、ＩＧＦＢＰ４、ＴＡＧＬＮ、ＳＴＣ１、ＬＲＲＣ１７及びＩＬ３３からなる群から選択される２以上、または３以上の遺伝子またはタンパク質、またはさらに具体的には、全ての遺伝子またはタンパク質が、骨髄由来幹細胞に比べ、さらに多く発現されるのである。前記骨髄由来幹細胞に比べ、一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞において、さらに多く発現される遺伝子は、Ｓ１００Ａ１０、ＳＱＳＴＭ１、ＤＳＴＮ、ＤＣＮ、ＰＨＧＤＨ、ＦＢＬＮ１、ＭＦＧＥ８、ＨＬＡ−Ａ、ＶＡＳＮまたはＫＩＡＡ１１９９をさらに含んでもよい。前記遺伝子は、向上された臍帯由来付着型幹細胞との関連性について、報告されたところがない。一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞は、骨髄由来幹細胞に比べ、前述の遺伝子に対して、２倍以上の発現量差を示すことができる。前述の発現レベルの差は、例えば、ｍＲＮＡレベルにおいて、遺伝子の発現量を比較したものでもある。また、前記発現レベル差は、例えば、マイクロアレイ分析によるものでもある。
【００２３】
また、一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞は、ＣＣＮＤ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＲＮＰ及びＣＹＰ１Ｂ１からなる群から選択される１以上の遺伝子またはタンパク質を、骨髄由来幹細胞に比べ、さらに少なく発現することができる。具体的には、前記細胞において、ＣＣＮＤ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＲＮＰ及びＣＹＰ１Ｂ１からなる群から選択される２以上、または３以上の遺伝子またはタンパク質、またはさらに具体的には、全ての遺伝子またはタンパク質が、骨髄由来幹細胞に比べ、さらに少なく発現されることができる。前記骨髄由来幹細胞に比べ、一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞において、さらに少なく発現される遺伝子またはタンパク質は、ＭＴＡ２Ａ、ＴＭ４ＳＦ１、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ及びＮＭＥ１を含んでもよい。前記遺伝子またはタンパク質は、向上された臍帯由来付着型幹細胞との関連性について、報告されたところがない。一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞は、骨髄由来幹細胞に比べ、前述の遺伝子またはタンパク質に対して、２倍以上の発現量差を示すことができる。前述の発現レベルの差は、例えば、ｍＲＮＡレベルでの遺伝子の発現量を比較したものでもある。また、前記発現レベル差は、例えば、マイクロアレイ分析によるものでもある。
【００２４】
また、前記向上された臍帯由来付着型幹細胞は、継代培養する線維芽細胞の形態を有することができる。一具体例において、前記細胞は、試験管内で成長するために、表面への付着を必要とする細胞の性質を有するものでもあり、紡錘形の線維芽細胞の特異的形態を示すことができる
【００２５】
他の具体例において、前記向上された臍帯由来付着型幹細胞は、コロニー形成能を有するものでもある。前記細胞は、正常酸素条件での培養に比べ、高いコロニー形成能を有するものでもある。
【００２６】
また、前記向上された臍帯由来付着型幹細胞は、脂肪細胞、骨細胞または軟骨細胞などに分化することができる。前記細胞は、例えば、脂肪細胞分化、軟骨細胞分化、骨芽細胞分化、造血細胞分化、筋細胞分化、血管細胞分化、神経細胞分化、肝細胞分化を始めとする特定細胞系統によって分化するようにも誘導される。
【００２７】
用語「分化（differentiation）」は、細胞が分裂増殖して成長する間、互いに構造や機能が特殊化する現象、すなわち、生物の細胞、組織などが、それぞれに与えられたところを遂行するために、形態や機能が変わっていくことをいう。特定細胞類型での分化測定は、当該分野に周知の方法によって遂行され、公知の方法を介して、特定細胞において分化を誘導することができる。また、前記分化は、流細胞分析または免疫細胞化学のような技法を使用し、細胞表面標識（例えば、組織特異的または細胞標識特異的な抗体において、細胞を染色する）及び形態変化を測定しながら、光学顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用し、細胞形態を調査したり、ＰＣＲ及び遺伝子発現プロファイルのような、当該分野に周知の技法を使用し、遺伝子発現上の変化を測定するしたりすることによっても確認される。
【００２８】
また、前記向上された臍帯由来付着型幹細胞は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−３、ＶＥＧＦ、ＧＲＯ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ１２（Ｐ７０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＦＮα２、ＭＤＣ、ｓＩＬ−２Ｒａ、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｆｌｔ−３ｌｉｇａｎｄ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ１ｂ、ＲＡＮＴＥ、フラクタルカイン（Fractalkine）、ＩＰ−１０、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１ＳＲ、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦＢＰ３、またはそれらの組み合わせのタンパク質を分泌することができる。また、例えば、前記細胞は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−３、ＶＥＧＦ及びＧＲＯからなる群から選択されるタンパク質のうち、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、または全てのタンパク質を分泌することができる。
【００２９】
また、前記向上された臍帯由来付着型幹細胞は、正常酸素培養条件に比べ、低酸素培養条件で培養された細胞において、Ｓ１００Ａ１０、ＢＮＩＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＤＣＮ、ＰＧＭ１、ＰＦＫＦＢ３、ＬＯＣ６４４７７４、ＭＭＥ、ＭＩＲ１９７８、ＳＬＣ２Ａ３、ＢＨＬＨＢ２、ＢＮＩＰ３Ｌ、ＩＧＦＢＰ５、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＤＰＹＤ及びＳＣＡＲＡ３からなる群から選択される１以上の遺伝子またはタンパク質の発現レベルが上昇するものでもある。具体的には、低酸素培養条件で培養された向上された臍帯由来付着型幹細胞は、正常酸素培養条件で培養された向上された臍帯由来付着型幹細胞より、Ｓ１００Ａ１０、ＢＮＩＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＤＣＮ、ＰＧＭ１、ＰＦＫＦＢ３、ＬＯＣ６４４７７４、ＭＭＥ、ＭＩＲ１９７８、ＳＬＣ２Ａ３、ＢＨＬＨＢ２、ＢＮＩＰ３Ｌ、ＩＧＦＢＰ５、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＤＰＹＤ及びＳＣＡＲＡ３からなる群から選択される２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、または全ての遺伝子またはタンパク質の発現レベルが上昇する。前記遺伝子またはタンパク質は、向上された臍帯由来付着型幹細胞との関連性について、報告されたところがない。前記発現レベルの差は、２倍以上でもある。前述の発現レベルの差は、例えば、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルでの遺伝子及びタンパク質の発現量を比較したものでもある。また、前記発現レベル差は、例えば、マイクロアレイ分析及びプロテオミクス分析によるものでもある。
【００３０】
また、前記向上された臍帯由来付着型幹細胞は、正常酸素培養条件に比べ、低酸素培養条件で培養された細胞において、ＩＬ８、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＱＯ１、ＤＬＣ１、ＣＴＨＲＣ１及びＣＰＡ４からなる群から選択される１以上の遺伝子またはタンパク質の発現レベルが低下するものでもある。具体的には、低酸素培養条件で培養された向上された臍帯由来付着型幹細胞は、正常酸素培養条件で培養された向上された臍帯由来付着型幹細胞より、ＩＬ８、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＱＯ１、ＤＬＣ１、ＣＴＨＲＣ１及びＣＰＡ４からなる群から選択される２以上、３以上、または全ての遺伝子またはタンパク質の発現レベルが低下する。前記遺伝子またはタンパク質は、向上された臍帯由来付着型幹細胞との関連性について、報告されたところがない。前記発現レベルの差は、２倍以上でもある。前述の発現レベルの差は、例えば、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルでの遺伝子及びタンパク質の発現量を比較したものでもある。また、前記発現レベル差は、例えば、マイクロアレイ分析及びプロテオミクス分析によるものでもある。
【００３１】
他の態様は、向上された臍帯由来付着型幹細胞集団を提供するものである。
【００３２】
前記臍帯由来付着型幹細胞については、前述の通りである。
【００３３】
他の態様は、分離された臍帯を培養容器に付着させて培養する段階と、前記培養された臍帯に分離酵素を接触させ、向上された臍帯由来付着型幹細胞を分離する段階と、前記分離された向上された臍帯由来付着型幹細胞を線維芽細胞成長因子−４（ＦＧＦ−４）及びヘパリンを含む培地で継代培養する段階と、を含む向上された臍帯由来付着型幹細胞を製造する方法を提供する。
【００３４】
前記臍帯は、健康な産婦（例えば、ＨＩＶ陰性、ＨＣＶ陰性、ＨＢＶ陰性である産婦）から、出産後に分離された胎盤を使用することができる。すなわち、前記「分離された臍帯」とは、産婦の母体から出産後に分離される臍帯を意味する。前記分離された臍帯は、分離された後、迅速に滅菌された容器及び氷に入れて保管される。
【００３５】
前記臍帯を胎盤から分離して収得する方法は、例えば、分離された胎盤から臍帯を分離する段階、前記分離された臍帯の外部血液を除去する段階、前記血液が除去された臍帯の動脈と静脈とを除去する段階、及び／または前記動脈と静脈とが除去された血液を、一定サイズ（例えば、１ないし２０ｍｍ）に細切りする段階を含んでもよい。前記血液の除去は、例えば、Ｃａ／Ｍｇ free ＤＰＢＳまたはゲンタマイシン含有Ｃａ／Ｍｇ free ＤＰＢＳを使用することができる。
【００３６】
次に、前記細切りされた臍帯（例えば、分離された臍帯）から幹細胞を分離する段階が遂行される。前記向上された臍帯由来付着型幹細胞を分離する段階は、前記分離された臍帯を培養容器に付着させ、５ないし２０日、例えば、１０ないし２０日、例えば、１０ないし１５日培養する段階、前記培養された臍帯組織から細胞が伸び出ることを確認する段階、及び／または臍帯組織に分離酵素を処理する段階を含んでもよい。
【００３７】
前記分離酵素は、コラゲナーゼを含んでもよい。前記コラゲナーゼは、コラーゲンのペプチド結合を破壊する酵素を意味し、コラゲナーゼタイプＩ、同タイプＩＩ、同タイプＩＩＩ、同タイプＩＶ、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。前記分離酵素は、５ないし３０Ｕ／ｍｌ、例えば、５ないし２５Ｕ／ｍｌ、１０ないし２５Ｕ／ｍｌ、または２０Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼを含んでもよい。また、前記分離酵素は、トリプシン（trypsin）、及び／またはディスパーゼ（Dispase）を含んでもよく、また、前記分離酵素を含む溶液は、コラゲナーゼ、トリプシン及び／またはディスパーゼを含む水、塩水（saline）、例えば、ＨＢＳＳ（Hank’s Balanced Salt Solution）を含んでもよい。また、分離酵素の処理時間は、例えば、１時間ないし２０時間、２時間ないし１０時間、４時間ないし９時間、または５時間ないし６時間でもある。
【００３８】
一具体例において、前記組織と分離酵素との反応は、振盪を行って反応がなされ、前記振盪は、約２０ないし４０℃、約３０ないし４０℃、または３５ないし４０℃、例えば、３７℃でなさ、約５ないし６０分間、または１０ないし３０分間なされ、また、例えば、１０ないし３０分間２回を行うことができる。
【００３９】
さらには、前記組織と分離酵素との反応後、分離酵素を不活性化にするための過程を、追加して遂行することができ、例えば、ＦＢＳを添加し、前記酵素反応を停止させることができる。また、酵素反応液から、組織細胞、例えば、向上された臍帯由来付着型幹細胞を分離する方法は、通常の当業界に公知の方法によって遂行することができ、例えば、遠心分離された後、細胞濾過器（strainer）を使用して細胞を分離することができる。
【００４０】
本明細書において、用語、「向上された臍帯由来付着型幹細胞の分離」は、処理していない哺乳類臍帯において、幹細胞と正常に結び付けられている細胞の、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％を除去することを意味する。一臓器で得た幹細胞を含む細胞群は、処理していない状態のその臓器において、その幹細胞と正常に結び付けられている他の細胞が、全体細胞の５０％未満であるとき、「分離」されているということができる。
【００４１】
次に、前記分離された向上された臍帯由来付着型幹細胞をＰ０にして継代培養する段階を含んでもよい。
【００４２】
前記継代培養する段階は、継代培養のための細胞移植前、動物由来成分がない（ＡＣＦ：animal component free）組み換え酵素の処理をさらに含むものでもある。本明細書において、用語「動物由来成分がない（ＡＣＦ）酵素」は、非動物起源であり、それは、酵素が動物供給源から精製されていないことを意味する。前記動物由来成分のない酵素は、組み換え起源でもあり、例えば、細菌、酵母または植物起源でもある。組み換え起源の酵素は、その生産のために、微生物、例えば、細菌、ウイルス、酵母、植物などの使用を含む組み換えＤＮＡ技術で生産される任意の酵素を意味する。前記酵素は、動物由来成分がない組み換えトリプシンでもあり、例えば、とうもろこし内で生産された組み換えトリプシンでもある。前記動物由来成分がない組み換えトリプシンは、商業的に購入可能であり、例えば、ＴｒｙｐＬＥＴＭ Select（GIBCO Invitrogen）、ＴｒｙｐＬＥＴＭ Express（GIBCO Invitrogen）、ＴｒｙｐＺｅａｎＴＭ（Sigma Aldrich）またはRecombinant Trypsin SolutionＴＭ（Biological Industries）でもある。
【００４３】
前記継代培養する段階は、幹細胞培養培地、例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−４：fibroblast growth factor−４）及びヘパリンが添加された培地において培養する段階を含む。前記培地において、ＦＧＦ−４は、約１０ｎｇ／ｍｌないし約４０ｎｇ／ｍｌ、または約２０ｎｇ／ｍｌないし約３０ｍｇ／ｍｌの濃度に添加され、例えば、２５ｎｇ／ｍｌでもある。前記培地において、ヘパリンは、約０．５μｇ／ｍｌないし２μｇ／ｍｌ、または０．５μｇ／ｍｌないし１．５μｇ／ｍｌの濃度に添加され、例えば、１μｇ／ｍｌでもある。前記培地は、例えば、牛胎児血清及び抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなど）を追加して含んでもよい。一具体例において、１０％の牛胎児血清、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１μｇ／ｍｌのヘパリン、及び２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−４が添加されたＣＳ−ＣＭ培地が使用される。前記継代培養は、約２０ないし４０℃、約３０ないし４０℃、または３５ないし４０℃、例えば、３７℃で行われ、各継代ごとの培養時間は、例えば、２ないし７日、または３ないし５日でもある。
【００４４】
一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞の製造方法において、前記継代培養の継代数は、特別に制限されるものではなく、所望の増殖細胞の数により、適切に継代数を選択することができる。典型的には、少なくとも、１継代以上、１０継代以上でもあり、例えば、１ないし２０継代、３ないし１５継代遂行することにより、臨床的に必要な数の累積増殖細胞を得ることができる。
【００４５】
また、継代培養時にも、前述のように、動物由来成分がない組み換え酵素の処理を追加して行うことができる。すなわち、それぞれ継代培養する段階ごとに、次の段階に細胞を継代する前、動物由来成分がない組み換え酵素を処理し、細胞を収去することにより、細胞の純度を高めることができる。例えば、Ｐ１からＰ２に移る段階において、Ｐ２のために、細胞移植前に動物由来成分がない組み換え酵素を処理することができる。
【００４６】
前記継代培養する段階は、正常酸素条件である２１％に比べ、低い低酸素条件で継代培養するものでもある。用語「低酸素（hypoxia）」は、一般的な正常酸素条件である酸素分圧２１％に比べ、低い酸素分圧状態を意味する。前記低酸素条件は、１ないし１５％、１ないし１２％、１ないし１０％、または１ないし５％の酸素分圧を有する状態でもあり、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％でもある。
【００４７】
一具体例において、低酸素条件での継代培養時、正常酸素条件に比べ、Ｓ１００Ａ１０、ＢＮＩＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＤＣＮ、ＰＧＭ１、ＰＦＫＦＢ３、ＬＯＣ６４４７７４、ＭＭＥ、ＭＩＲ１９７８、ＳＬＣ２Ａ３、ＢＨＬＨＢ２、ＢＮＩＰ３Ｌ、ＩＧＦＢＰ５、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＤＰＹＤ及びＳＣＡＲＡ３からなる群から選択されたいずれか１以上の発現が増大したり、ＩＬ８、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＱＯ１、ＤＬＣ１、ＣＴＨＲＣ１及びＣＰＡ４からなる群から選択されたいずれか１以上の発現が低減したりしたものである。
【００４８】
前記製造方法によって製造された向上された臍帯由来付着型幹細胞は、前述のような特性を有し、例えば、前記製造された向上された臍帯由来付着型幹細胞は、下記（ａ）ないし（ｅ）から選択される１以上の特性を有するものでもある：
ａ）ＣＯＬ１Ａ１、ＩＧＦＢＰ４、ＴＡＧＬＮ、ＳＴＣ１、ＬＲＲＣ１７及びＩＬ３３からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに多く発現されること；
ｂ）ＣＣＮＤ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＲＮＰ及びＣＹＰ１Ｂ１からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに少なく発現されること；
ｃ）継代培養する間、付着型線維芽細胞の形態を維持すること；
ｄ）脂肪細胞、骨細胞または軟骨細胞への分化能；及び
ｅ）ＣＤ２００＋、Ｔｒａ−１−６０−、ＣＤ３−、ＣＤ１ａ−、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ１６−、ＣＤ８６−、ＣＤ８ａ−、ＣＤ４０−、ＣＤ１４１＋、ＣＤ６１＋、ＣＤ８７＋、ＭＩＣＡ／Ｂ−及びＳＳＥＡ４＋からなる群から選択される１以上の表面抗原特性。
【００４９】
前記向上された臍帯由来付着型幹細胞は、下記（ｆ）ないし（ｉ）から選択される１以上の特性をさらに有するものでもある：
ｆ）Ｓ１００Ａ１０、ＢＮＩＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＤＰＹＤ及びＳＣＡＲＡ３からなる群から選択される１以上が、正常酸素条件での培養に比べ、さらに多く発現されること；
ｇ）ＩＬ８、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＤＬＣ１、ＣＴＨＲＣ１及びＣＰＡ４からなる群から選択される１以上が、正常酸素条件での培養に比べ、さらに少なく発現されること；
ｈ）ＳＮＣＡ、ＤＳＧ２、ＮＲＰ２及びＰＬＡＴからなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに多く発現されること；
ｉ）ＴＰＭＴ、ＮＡＧＫ及びＡＮＸＡ４からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに少なく発現されること。
【００５０】
前記向上された臍帯由来付着型幹細胞は、前記ｅ）の表面抗原特性が、追加して、Ｏｃｔ４−またはＮａｎｏｇ−でもある。また、前記ｅ）の表面抗原特性のうちＣＤ６１＋は、低酸素条件で発現する表面抗原特性でもある。
【００５１】
他の態様は、前記向上された臍帯由来付着型幹細胞、その細胞集団、またはその培養液を有効成分として含む細胞治療剤、薬学的組成物または製剤を提供するものである。
【００５２】
さらに他の態様は、細胞治療剤、薬学的組成物または製剤の製造に使用するための前記向上された臍帯由来付着型幹細胞、その細胞集団、またはその培養液の使用を提供する。
【００５３】
例えば、下記（ａ）ないし（ｅ）から選択される１以上の特性を有する向上された臍帯由来付着型幹細胞、その細胞集団を含む細胞治療剤、薬学的組成物、または製剤を提供することができる：
ａ）ＣＯＬ１Ａ１、ＩＧＦＢＰ４、ＴＡＧＬＮ、ＳＴＣ１、ＬＲＲＣ１７及びＩＬ３３からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに多く発現されること；
ｂ）ＣＣＮＤ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＲＮＰ及びＣＹＰ１Ｂ１からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに少なく発現されること；
ｃ）継代培養する間、付着型線維芽細胞の形態を維持すること；
ｄ）脂肪細胞、骨細胞または軟骨細胞への分化能；及び
ｅ）ＣＤ２００＋、Ｔｒａ−１−６０−、ＣＤ３−、ＣＤ１ａ−、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ１６−、ＣＤ８６−、ＣＤ８ａ−、ＣＤ４０−、ＣＤ１４１＋、ＣＤ６１＋、ＣＤ８７＋、ＭＩＣＡ／Ｂ−及びＳＳＥＡ４＋からなる群から選択される１以上の表面抗原特性。
【００５４】
前記向上された臍帯由来付着型幹細胞は、下記（ｆ）ないし（ｉ）から選択される１以上の特性をさらに有するものでもある：
ｆ）Ｓ１００Ａ１０、ＢＮＩＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＤＰＹＤ及びＳＣＡＲＡ３からなる群から選択される１以上が、正常酸素条件での培養に比べ、さらに多く発現されること；
ｇ）ＩＬ８、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＤＬＣ１、ＣＴＨＲＣ１及びＣＰＡ４からなる群から選択される１以上が、正常酸素条件での培養に比べ、さらに少なく発現されること；
ｈ）ＳＮＣＡ、ＤＳＧ２、ＮＲＰ２及びＰＬＡＴからなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに多く発現されること；
ｉ）ＴＰＭＴ、ＮＡＧＫ及びＡＮＸＡ４からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに少なく発現されること。
【００５５】
また、前記態様は、前記向上された臍帯由来付着型幹細胞の培養液を含む薬学的組成物を含む。また、例えば、前記向上された臍帯由来付着型幹細胞、その細胞集団、またはその培養液を有効成分として含む炎症性疾患、虚血性疾患、及び／または神経退行性疾患の治療または予防のための薬学的組成物を提供する。
【００５６】
また、他の態様は、疾病、例えば、炎症性疾患、虚血性疾患及び／または神経退行性疾患の治療または予防に使用するための医薬の製造に使用するための前記向上された臍帯由来付着型幹細胞、その細胞集団、またはその培養液の使用を提供する。
【００５７】
さらに他の態様は、有効成分の前記向上された臍帯由来付着型幹細胞、その細胞集団、またはその培養液を、それを必要とする個体に投与する段階を含む疾病、例えば、炎症性疾患、虚血性疾患及び／または神経退行性疾患を治療または予防する方法を提供する。
【００５８】
前記向上された臍帯由来付着型幹細胞については、前述の通りである。
【００５９】
一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞は、前述のように、疾患治療に有利なタンパク質（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−３、ＶＥＧＦまたはＧＲＯ）を分泌し、損傷された組織での移動能が顕著であるだけではなく、抗炎症、血管再生、神経再生の効果を有するので、炎症性疾患、虚血性疾患及び／または神経退行性疾患を含む多様な疾患の予防または治療のための細胞治療剤または薬学的組成物に有用に使用される。
【００６０】
前記疾患の例は、炎症性疾患、虚血性疾患及び／または神経退行性疾患を含んでもよい。前記炎症性疾患の例は、気管支炎、胃炎、動脈硬化症、関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ：inflammatory bowel disease）、肝炎、胆嚢炎、真菌性感染症、胃潰瘍、喘息、アトピー性皮膚炎、腱炎または腎臓炎を含んでもよい。前記虚血性疾患の例は、虚血性脳卒中、心筋梗塞、虚血性心臓疾患、虚血性脳疾患、虚血性心不全、虚血性腸炎、虚血性血管疾患、虚血性眼疾患、虚血性網膜症、虚血性緑内障、虚血性腎不全または虚血性下肢疾患を含んでもよい。本明細書において、「虚血性脳卒中（ischemic stroke）」または「脳卒中（stroke）」は、脳血流減少が一定時間以上持続し、脳組織または細胞の懐死によって発生する疾病を意味し、「脳梗塞（cerebral infarction）」と互換的にも使用される。
【００６１】
前記神経退行性疾患の例は、脊髄損傷、多発性硬化症、アルツハイマー病（Alzheimer’s disease）、前頭側頭葉痴呆（frontotemporal dementia）、進行性核上麻痺（progressive supranuclear palsy）、皮質基底核変性（corticobasal degeneration）、ピック病（Pick’s disease）、または拳闘選手痴呆（ＤＰ：dementia pugilistica）を含んでもよい。
【００６２】
一具体例による細胞治療剤または薬学的組成物の投与量は、向上された臍帯由来付着型幹細胞を基準に、１．０Ｘ１０３ないし１．０Ｘ１０１０細胞／ｋｇ（体重）または個体、または１．０Ｘ１０７ないし１．０Ｘ１０８細胞／ｋｇ（体重）または個体でもある。ただし、該投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢・体重・性別・病的状態・飲食物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方され、当業者であるならば、そのような要因を考慮し、投与量を適切に調節することができる。投与回数は、１回、または臨床的に容認可能な副作用の範囲内で、２回以上が可能であり、投与部位についても、１ヵ所または２ヵ所以上に投与することができる。ヒト以外の動物についても、ｋｇ当たりまたは個体当たり、ヒトと同一投与量で施すか、あるいは、例えば、目的とする動物とヒトとの器官（心臓など）の容積比（例えば、平均値）などにより、前述の投与量を換算した量を投与することができる。一具体例による治療の対象動物としては、ヒト及びそれ以外の目的とする哺乳動物を例として挙げることができ、具体的には、ヒト、猿、マウス、ラット、兎、羊、牛、犬、馬、豚などが含まれる。
【００６３】
一具体例による細胞治療剤または薬学的組成物は、有効成分として、前記向上された臍帯由来付着型幹細胞と薬学的に許容可能な担体及び／または添加物を含んでもよい。例えば、滅菌水、生理食塩水、慣用の緩衝剤（リン酸、クエン酸、それ以外の有機酸など）、安定剤、塩、酸化防止剤（アスコルビン酸など）、界面活性剤、懸濁液剤、等張化剤または保存剤などを含んでもよい。局所投与のために、生体高分子（biopolymer）などの有機物、ヒドロキシアパタイトなどの無機物、具体的には、コラーゲンマトリックス、ボリ乳酸の重合体または共重合体、ポリエチレングリコールの重合体または共重合体、及びその化学的誘導体などと組み合わせることも望ましい。一具体例による細胞治療剤または薬学的組成物が、注射に適当な剤形に調剤される場合には、細胞集合体が、薬学的に許容可能な担体内に溶解されているか、あるいは溶解されている溶液状態で凍結されたものでもある。
【００６４】
一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞は、身体の組織または器官が、目的とする細胞群集、例えば、幹細胞または由来細胞群集の生着、移植または注入により、強化、治療または代替される多様な種類の治療プロトコルにも使用される。前記向上された臍帯由来付着型幹細胞は、存在する組織を代替または強化させ、新たになるか、あるいは変化された組織にしたり、生物学的組織または構造と結合させたりすることができる。また、典型的には、臍帯以外の他の組織由来幹細胞が使用される治療プロトコルにおいて、幹細胞が本明細書の向上された臍帯由来付着型幹細胞でも代替される。
【００６５】
一具体例による細胞治療剤または薬学的組成物は、その投与方法や剤形により、必要な場合、懸濁液剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、還元剤、酸化防止剤などを適切に含んでもよい。前述のところに例示されたものなどを含め、本発明に適する薬学的に許容される担体及び製剤は、文献［Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th ed．, 1995］に詳細に記載されている。
【００６６】
一具体例による細胞治療剤または薬学的組成物は、当該発明が属する技術分野において当業者が容易に実施することができる方法により、薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、あるいは多容量容器内に込めて製造される。このとき、該剤形は、油性媒質中または水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、あるいは粉末、顆粒、錠剤またはカプセルの形態でもある。また、該細胞治療剤は、注射用剤形にも剤形化される。その場合、剤形化するための公知の一般的成分が利用され、一般的な方法によっても剤形化される。
【００６７】
本発明は以下の実施形態を包含する：
［１］下記（ａ）ないし（ｅ）から選択される１以上の特性を有する向上された臍帯由来付着型幹細胞：
（ａ）ＣＯＬ１Ａ１、ＩＧＦＢＰ４、ＴＡＧＬＮ、ＳＴＣ１、ＬＲＲＣ１７及びＩＬ３３からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに多く発現されること；  （ｂ）ＣＣＮＤ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＲＮＰ及びＣＹＰ１Ｂ１からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに少なく発現されること；
（ｃ）継代培養する間、付着型線維芽細胞の形態を維持すること；
（ｄ）脂肪細胞、骨細胞または軟骨細胞への分化能；及び
（ｅ）ＣＤ２００＋、Ｔｒａ−１−６０−、ＣＤ３−、ＣＤ１ａ−、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ１６−、ＣＤ８６−、ＣＤ８ａ−、ＣＤ４０−、ＣＤ１４１＋、ＣＤ６１＋、ＣＤ８７＋、ＭＩＣＡ／Ｂ−及びＳＳＥＡ４＋からなる群から選択される１以上の表面抗原特性。［２］前記向上された臍帯由来付着型幹細胞は、下記（ｆ）ないし（ｉ）から選択される１以上の特性をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の細胞：
（ｆ）Ｓ１００Ａ１０、ＢＮＩＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＤＰＹＤ及びＳＣＡＲＡ３からなる群から選択される１以上が、正常酸素条件での培養に比べ、さらに多く発現されること；
（ｇ）ＩＬ８、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＤＬＣ１、ＣＴＨＲＣ１及びＣＰＡ４からなる群から選択される１以上が、正常酸素条件での培養に比べ、さらに少なく発現されること；
（ｈ）ＳＮＣＡ、ＤＳＧ２、ＮＲＰ２及びＰＬＡＴからなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに多く発現されること；
（ｉ）ＴＰＭＴ、ＮＡＧＫ及びＡＮＸＡ４からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに少なく発現されること。
［３］（ａ）及び（ｂ）の特性は、マイクロアレイ分析により、骨髄幹細胞に比べ、２倍以上の発現量に差を示すことを特徴とする実施形態１に記載の細胞。
［４］低酸素条件で培養した（ｆ）及び（ｇ）の特性は、マイクロアレイ分析及びプロテオミクスにより、正常酸素条件に比べ、２倍以上の発現量に差を示すことを特徴とする実施形態２に記載の細胞。
［５］前記細胞は、コロニー形成能を有することを特徴とする実施形態１に記載の細胞。［６］前記細胞は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−３、ＶＥＧＦ、ＧＲＯ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ１２（Ｐ７０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＦＮα２、ＭＤＣ、ｓＩＬ−２Ｒａ、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｆｌｔ−３ｌｉｇａｎｄ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ１ｂ、ＲＡＮＴＥ、フラクタルカイン、ＩＰ−１０、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１ＳＲ、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦＢＰ３、またはそれらの組み合わせのタンパク質を分泌することを特徴とする実施形態１に記載の細胞。
［７］前記細胞は、哺乳動物臍帯のワルトンゼリー組織由来であることを特徴とする実施形態１に記載の細胞。
［８］分離された臍帯を培養容器に付着させて培養する段階と、
前記培養された臍帯に分離酵素を接触させ、向上された臍帯由来付着型幹細胞を分離する段階と、
前記分離された向上された臍帯由来付着型幹細胞を線維芽細胞成長因子−４（ＦＧＦ−４）及びヘパリンを含む培地で継代培養する段階と、を含む向上された臍帯由来付着型幹細胞を製造する方法。
［９］前記継代培養する段階は、継代培養のための細胞移植前、動物由来成分がない（ＡＣＦ）組み換え酵素の処理をさらに含むことを特徴とする実施形態８に記載の方法。
［１０］前記継代培養する段階は、正常酸素条件である２１％に比べ、低い低酸素条件で継代培養することを特徴とする実施形態８に記載の方法。
［１１］前記向上された臍帯由来付着型幹細胞は、下記（ａ）ないし（ｅ）から選択される１以上の特性を有することを特徴とする実施形態８に記載の方法：
（ａ）ＣＯＬ１Ａ１、ＩＧＦＢＰ４、ＴＡＧＬＮ、ＳＴＣ１、ＬＲＲＣ１７及びＩＬ３３からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに多く発現されること；  （ｂ）ＣＣＮＤ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＲＮＰ及びＣＹＰ１Ｂ１からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに少なく発現されること；
（ｃ）継代培養する間、付着型線維芽細胞の形態を維持すること；
（ｄ）脂肪細胞、骨細胞または軟骨細胞への分化能；及び
（ｅ）ＣＤ２００＋、Ｔｒａ−１−６０−、ＣＤ３−、ＣＤ１ａ−、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ１６−、ＣＤ８６−、ＣＤ８ａ−、ＣＤ４０−、ＣＤ１４１＋、ＣＤ６１＋、ＣＤ８７＋、ＭＩＣＡ／Ｂ−及びＳＳＥＡ４＋からなる群から選択される１以上の表面抗原特性。［１２］前記継代培養は、３ないし１５継代まで行うことを特徴とする実施形態８に記載の方法。
［１３］前記分離酵素は、コラゲナーゼであることを特徴とする実施形態８に記載の方法。
［１４］実施形態１に記載の向上された臍帯由来付着型幹細胞、その細胞集団、またはその培養液を有効成分として含む製剤。
［１５］実施形態１に記載の向上された臍帯由来付着型幹細胞、その細胞集団、またはその培養液を有効成分として含む炎症性疾患の治療または予防のための薬学的組成物。
［１６］前記炎症性疾患は、気管支炎、胃炎、動脈硬化症、関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、肝炎、胆嚢炎、真菌性感染症、胃潰瘍、喘息、アトピー性皮膚炎、腱炎及び腎臓炎からなる群から選択されることを特徴とする実施形態１５に記載の薬学的組成物。
［１７］実施形態１の向上された臍帯由来付着型幹細胞、その細胞集団、またはその培養液を有効成分として含む虚血性疾患治療または予防のための薬学的組成物。
［１８］前記虚血性疾患は、虚血性脳卒中、心筋梗塞、虚血性心臓疾患、虚血性脳疾患、虚血性心不全、虚血性腸炎、虚血性血管疾患、虚血性眼疾患、虚血性網膜症、虚血性緑内障、虚血性腎不全及び虚血性下肢疾患からなる群から選択されることを特徴とする実施形態１７に記載の薬学的組成物。
［１９］実施形態１に記載の向上された臍帯由来付着型幹細胞、その細胞集団、またはその培養液を有効成分として含む神経退行性疾患の治療または予防のための薬学的組成物。［２０］前記神経退行性疾患は、脊髄損傷、多発性硬化症、アルツハイマー病、前頭側頭葉痴呆、進行性核上麻痺、皮質基底核変性、ピック病及び拳闘選手痴呆（ＤＰ）からなる群から選択されることを特徴とする実施形態１９に記載の薬学的組成物。
［２１］炎症性疾患、虚血性疾患または神経退行性疾患の治療または予防に使用するための医薬の製造に使用するための実施形態１に記載の向上された臍帯由来付着型幹細胞、その細胞集団、またはその培養液の使用。
［２２］有効成分の実施形態１に記載の向上された臍帯由来付着型幹細胞、その細胞集団、またはその培養液を、それを必要とする個体に投与する段階を含む炎症性疾患、虚血性疾患または神経退行性疾患を治療または予防する方法。
以下、本発明について、実施例によってさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例によって制限されるものではない。
【実施例】
【００６８】
実施例１：向上された臍帯由来付着型幹細胞の製造、その特性分析、並びに抗炎症、神経再生及び血管再生に係わる効果分析
１．向上された臍帯由来付着型幹細胞の製造及び培養方法による比較分析
（１．１）向上された臍帯由来付着型幹細胞の分離及び培養１
正常に分娩した健康な産婦から、事前に十分な説明に基づいた同意（informed consent）を受け、正常胎盤分娩時に収集された胎盤組織から臍帯を分離した。分離された臍帯を、Ｃａ／Ｍｇ free ＤＰＢＳで、２ないし５回洗浄して血液を除去した。その後、外部羊膜は剥がさず、動脈２本及び静脈１本を除去した後、１ないし５ｍｍほどの大きさに臍帯を切った。その後、前記臍帯を培養容器に付着させ、１０ないし１５日培養を行い、前記培養された組織から細胞が伸び出るところを確認した後、５ないし６時間、２００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼＩを処理し、向上された臍帯由来付着型幹細胞を分離した。前記コラゲナーゼＩの処理前、後で臍帯付着した組織から細胞が伸び出るところを確認するために、光学顕微鏡下で、４０ｘ，１００ｘ倍率で細胞形態を確認し、その結果を図１Ａに示した。
【００６９】
図１Ａは、一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞分離において、分離酵素前後の細胞形態を示す図面である。
【００７０】
図１Ａに示されるように、分離酵素であるコラゲナーゼＩの処理後、均質した（homogeneous）細胞形態を示すということが分かる。
【００７１】
その後、前記分離された細胞をＰ０にし、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ４、１μｇ／ｍｌヘパリン、１０％ ＦＢＳが含有されたＭＥＭ alpha ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＣＳ−ＣＭ培地）で、３７℃、低酸素培養条件（Ｏ２ ３％）下で培養した。その後、３ないし４日ごとにＣＳ−ＣＭ培地を交換し、フラスコ底に付いていない細胞を除去し、初継代において、動物由来成分がない（ＡＣＦ）組み換え酵素であるInvitrogen社のＴｒｙｐＬＥを３７℃インキュベーターで、短期間（３分）処理して継代培養した。
【００７２】
（１．２）向上された臍帯由来付着型幹細胞の分離及び培養２
前記（１．１）において、コラゲナーゼＩの処理を、臍帯を培養容器に付着する前に行ったことのみを除いては、前記（１．１）と同一方法により、向上された臍帯由来付着型幹細胞を分離及び培養した。
【００７３】
（１．３）向上された臍帯由来付着型幹細胞の分離及び培養３
前記（１．１）で分離された幹細胞に対して、正常酸素条件（Ｏ２ ２１％）で遂行したことのみを除いては、前記（１．１）と同一方法により、向上された臍帯由来付着型幹細胞を分離及び培養した。
【００７４】
（１．４）分離酵素処理時期による比較分析
前記（１．１）及び（１．２）で分離された幹細胞の細胞回収率を比較するために、前記（１．２）で分離された幹細胞群、及び（１．１）で分離された幹細胞群を、それぞれＧ１及びＧ２と命名し、分離された細胞の形態を、光学顕微鏡下で、４０ｘ，１００ｘ倍率で細胞形態確認を行い、その結果を図１Ｂに示した。
【００７５】
図１Ｂは、一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞分離において、分離酵素の処理時期による細胞形態を示した図面である。
【００７６】
また、前記Ｇ１及びＧ２の組織重量、分離酵素処理後の細胞数、及び細胞数（Ｐ０）を比較した。
【表１】
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【００７７】
前述の図１Ｂ及び表１に示されているように、分離酵素を、臍帯培養前に処理した場合、細石状がほとんどを占め、増殖が遅く、細胞収率が低いが、分離酵素を、臍帯培養後に処理した場合、均質細胞の形態が示され、増殖が迅速であり、細胞収率が高いということを確認することができる。
【００７８】
（１．５）低酸素条件及び正常酸素条件による比較分析
前記（１．１）の低酸素条件、及び（１．２）の正常酸素条件において、１ないし２０回継代培養（Ｐ１ないしＰ２０）された付着型細胞の成長曲線及び倍化時間などを比較するために、それぞれ同数の細胞を６ウェルプレートに接種し、プレート底面積の７０〜８０％を占めるとき、細胞を収集した。その後、１０μｌの検体と、トリパンブルー試薬１０μｌとを混ぜたもの１０μｌを、血球計算機の一方測定部に注入した。自動細胞計数機を利用して細胞数を測定した。このとき、時間も共に記録し、倍加時間（doubling timeを計算した。該倍化時間は、細胞数が２倍になる時間であり、総細胞数と、それを測定した時間とを利用して計算し、その結果を図２Ａ及び図２Ｂに示した。
【００７９】
また、細胞のコロニー形成能を分析するために、１００ｍｍ培養ディッシュに、ディッシュ当たり１５０個の細胞を塗布した。その後、１２ｍｌ培養培地で、１０ないし１４日培養した後、顕微鏡下で、細胞コロニー形成有無を確認した。次に、ＤＰＢＳで洗浄した後、グルタルアルデヒドとクリスタルバイオレットとの混合溶液を、細胞があるディッシュに２ないし３ｍｌ添加し、３０分間染色を行った。滅菌水で注意して洗浄し、顕微鏡下でコロニー個数をカウントし、平均値で数値化して結果を分析し、その結果を図２Ｃに示した。
【００８０】
また、細胞の損傷された組織での移動能を分析するために、トランズウェルフィルターの上側面に、０．１％ゼラチンを、３７℃で１時間コーティングした。５ｘ１０５個の細胞を、１００μｌの血清フリー培地に浮遊させ、トランズウェル挿入部の上側チャンバーに添加した。添加前、血清フリー培地で、一晩欠乏（starvation）させた。下側チャンバーにケモスタット因子が入っている培地（ＣＳ−ＣＭ）を６００μｌ添加した。その後、培養器で一晩細胞を培養した。フィルターの上側面を、コールドＰＢＳで注意深く洗浄した後、綿棒を使用し、フィルターの上側面に残っている細胞を除去した。トランズウェルフィルターは、解剖用メスで切り、ギムザ染色を施し、下側面を上にし、スライドガラスにおいて装着させた。移動された細胞は、光学顕微鏡を利用し、染色された細胞数をカウントし、その結果を図２Ｄに示した。
【００８１】
図２Ａないし図２Ｄは、一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞培養において、低酸素条件及び正常酸素条件による比較を分析した図面である。
【００８２】
図２Ａ及び図２Ｂに示されているように、低酸素条件において細胞は、倍加時間の短縮により、増殖率が高くなるということが分かる。また、図２Ｃに示されているように、コロニー形成個数が約２倍増加し、図２Ｄに示されているように、細胞の損傷された組織での移動能が約１．６倍ほど向上するということを確認することができる。
【００８３】
２．向上された臍帯由来付着型幹細胞の特性分析
（２．１）向上された臍帯由来付着型幹細胞の遺伝的安定性分析
前記（１．１）及び（１．３）で製造した向上された臍帯由来付着型幹細胞の遺伝的安定性を分析するために、ＧＴＧ−Banding分析法を遂行した。
【００８４】
具体的には、Ｐ７及びＰ１４の細胞から、プロメガＤＮＡ抽出キット（Promega ＤＮＡ Extraction Kit）を利用して、ＤＮＡを抽出して試料として使用した。イルミナヒューマンオムニ１−クォッドチップ（Illumina Human Omni １−Quad Chip）を利用し、ｉＳＣＡＮ(登録商標)スキャナーを使用して測定した。まず、４００ｎｇの各ＤＮＡ試料は、全体ゲノム増幅（whole genome amplification）方法で増幅し、化学的な方法でランダムに切片にし、２−プロパノール沈澱法で精製を行った後、チップは、ＤＮＡ試料を入れる前、緩衝溶液で前処理されたチップに、ＤＮＡ試料を加えた。その後、約１６時間インキュベーションを行った後、染色、対立遺伝子特異的プライマー拡張（ＡＳＰＥ：allele specific primer extension）、混成化（hybridization）、標的除去（target removal、及び洗浄を行った。その後、イルミナアイスキャン（IlluminaiScan）でスキャニングを行い、ゲノムスタジオソフトウェア（GenomeStudio(登録商標) software）を使用してデータを分析し、その結果を図３に示した。
【００８５】
図３は、一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞の遺伝的安定性について、核型分析を行った結果を示した図面である。
【００８６】
図３に示されているように、一具体例による製造方法によって製造された向上された臍帯由来付着型幹細胞は、Ｐ１４まで遺伝的変異が起きていないということが分かる。
【００８７】
（２．２）向上された臍帯由来付着型幹細胞の表面タンパク質分析
前記（１．１）で製造した向上された臍帯由来付着型幹細胞の表面タンパク質分析のために、流細胞分析及び免疫蛍光染色分析を行った。
【００８８】
具体的には、流細胞分析のために、細胞は、ＤＰＢＳを使用して洗浄した後、２％ ＦＢＳが含有されたＤＰＢＳに入れ、Ｔｒａ−１−６０，ＣＤ３，ＣＤ１ａ，ＣＤ１１ｃ，ＣＤ１６，ＣＤ１４，ＣＤ８６，ＣＤ８ａ，ＣＤ１９，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ２００，ＣＤ１４１，ＣＤ６１，ＣＤ８７，ＭＩＣＡ／Ｂ，ＳＳＥＡ４マーカーを、アイスで２０分間反応させた。その後、流細胞分析機（ＦＡＣＳ Calibur，Becton Bickinson）を介して表面抗原を分析し、その結果を図４Ａに示した。
【００８９】
胚芽幹細胞マーカーであるＯｃｔ４とＮａｎｏｇとの発現を確認するために、免疫蛍光染色を行った。まず、細胞をＤＰＢＳで３回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドを培養容器にそれぞれ入れ、常温で１０分間固定させた。固定が終わった細胞を、ＤＰＢＳで３回洗浄した。次に、０．２％ Triton Ｘ−１００溶液を入れ、常温で１０分間浸透させた後、ＤＰＢＳで３回洗浄した。１０％正常ゴート血清（normal goat serum）を入れ、常温で３０分間ブロッキングし、一次抗体（Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ）を入れて光遮断した後、４℃で一晩反応させた。その後、ＤＰＢＳで３回洗浄した後、二次抗体を入れ、常温で１時間反応させた。最後に、ＤＰＢＳで３回洗浄した後、蛍光顕微鏡下で観察し、その結果を図４Ｂに示した。
【００９０】
図４Ａ及び図４Ｂは、一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞の表面タンパク質を分析した結果を示した図面である。
【００９１】
図４Ａに示されているように、一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞は、ＣＤ２００、ＣＤ１４１、ＣＤ６１、ＣＤ８７ＳＳＥＡ４に選択的に陽性を示す細胞であり、ＴＲＡ−１、ＣＤ３、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ８６、ＣＤ８ａ、ＣＤ４０、ＭＩＣＡ／Ｂに選択的に陰性を示す細胞であり、さらには、ＣＤ６１は、低酸素条件において、選択的に陽性を示す細胞である。また、図４Ｂに示されているように、一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞は、胚芽幹細胞特異的マーカーであるＯｃｔ４，Ｎａｎｏｇタンパク質は、発現していないということが分かる。
【００９２】
（２．３）向上された臍帯由来付着型幹細胞の分化能分析
（２．３．１）脂肪細胞分化能分析
向上された臍帯由来付着型幹細胞の脂肪細胞分化能分析は、下記の方法で行った。
【００９３】
前記（１．１）及び（１．３）で製造した向上された臍帯由来付着型幹細胞を、脂肪形成分化培地（Adipogenesis Differentiation Media）（StemPro(登録商標) Adipogenesis Differentiation Kit，Life Technology）に入れ、２週間、３日間隔で培地を交換しながら培養した。その後、培養液を除去し、Ｃａ／Ｍｇ free ＤＰＢＳで洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドを入れ、常温で１５分間反応させた。６０％イソプロパノールを入れて洗浄した後、オイルレッドＯ（Oil Red Ｏ）を入れて１０分間反応させた後、精製水で洗浄した後、顕微鏡下で脂肪細胞を観察し、その結果を図５に示した。
【００９４】
（２．３．２）骨細胞分化能分析
向上された臍帯由来付着型幹細胞の骨細胞分化能分析は、下記の方法で行った。
【００９５】
前記（１．１）及び（１．３）で製造した向上された臍帯由来付着型幹細胞を、骨形成分化培地（Osteogenesis Differentiation Media）（StemPro(登録商標) Osteogenesis DifferentiationKit、Life Technology）に入れ、２週間、３日間隔で培地を交換しながら培養した。その後、培養液を除去し、Ｃａ／Ｍｇ free ＤＰＢＳで洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドを入れ、常温で１５分間反応させた。反応が終われば、精製水を入れて洗浄した後、１％硝酸銀溶液（silver nitrate solution）を入れ、常温で５分間反応させた後、精製水で洗浄した後、５％チオ硫酸ナトリウム溶液（sodium thiosulfate solution）を入れ、常温で５分間反応させた。次に、精製水で洗浄した後、０．１％ヌクレアファストレッド溶液（Nuclear Fast Red solution）を入れ、常温で５分間反応させた。その後、精製水で洗浄し、顕微鏡下でカルシウム蓄積サンプルを分析し、その結果を図５に示した。
【００９６】
（２．３．３）軟骨細胞分化能分析
向上された臍帯由来付着型幹細胞の軟骨細胞分化能分析は、下記の方法で行った。
【００９７】
前記（１．１）及び（１．３）で製造した向上された臍帯由来付着型幹細胞を、１５ｍｌチューブに２ｘ１０５個入れ、１，５００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上層液を除去して細胞のみを残し、軟骨形成分化培地（Chondrogenesis Differentiation Media）（StemPro(登録商標) Chondrogenesis Differentiation Kit，Life Technology）を入れ、ふたを緩く閉めた状態で、３週間、３日間隔で培地を交換しながら培養した。細胞塊を、パラフィンブロック（paraffin block）にした後、セルに作った後で切断し、アルシアンブルー（Alcian blue）染色を行った。その後、光学顕微鏡で、青色に染色された軟骨細胞を分析し、その結果を図５に示した。
【００９８】
図５は、一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞の多分化能を分析した結果を示した図面である。
【００９９】
図５に示されているように、脂肪細胞分化能分析結果において、水玉のように見える多様な物質（脂肪）が赤色で確認されていることが分かる。また、骨細胞分化能分析結果において、桃色背景に黒い茶色に沈着されたパーティクルカルシウム塊が確認されることが分かる。また、軟骨細胞分化能分析結果において、軟骨細胞に分化されれば、軟骨の堅固さと弾力性とを示す糖蛋白質が分泌され、その部分が青色で示されるということを確認することができる。前述の結果により、前記（１．１）及び（１．３）による方法によって製造された一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞に分化され、多分化能があるということが分かる。
【０１００】
（２．４）向上された臍帯由来付着型幹細胞の分泌タンパク質分析プロファイリング及び定量的分析
前記（１．１）で製造した向上された臍帯由来付着型幹細胞の分泌タンパク質を分析するために、マルチプレックスビード分析（multiplex bead analysis）（MILLIPLEX Human Cytokine／Chemokine Panel １，Merck Millipore，Billerica，Ｍａ、米国）を行った。
【０１０１】
具体的には、前記向上された臍帯由来付着型幹細胞を２４時間培養した培養液を、抗体コーティング捕獲ビード（antibody-coated capture beads）と共に、室温で２時間インキュベーションして洗浄した。その後、前記ビードを、ビオチンラベル抗ヒトサイトカイン（biotin-labeled anti-human cytokine）及びケモカイン抗体（chemokine antibody）と共に１時間インキュベーションし、ストレプタビジンフィコエリスリン（streptavidin phycoerythrin）で３０分間インキュベーションした。最後に、前記ビードを洗浄して定量分析するために、Luminex ２００プログラムを利用し、分泌タンパク質発現量を分析し、その結果を表２に示した。
【表２】
2020072725.tif 000004
【０１０２】
前記表２に示されているように、一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＶＥＧＦ、ＧＲＯ、ＩＧＦ−１ＳＲ、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦＢＰ３などを分泌するということが分かる。
【０１０３】
（２．５）向上された臍帯由来付着型幹細胞の遺伝子発現分析
前記（１．１）で製造された向上された臍帯由来付着型幹細胞の遺伝子発現を分析し、骨髄幹細胞と比較して分析した。
【０１０４】
具体的には、骨髄幹細胞との比較時、向上された臍帯由来付着型幹細胞で特異的に発現する遺伝子を分析するために、向上された臍帯由来付着型幹細胞と骨髄幹細胞とからＲＮＡを抽出した後、ラベリング及び精製を行った。ラベルされたｃＤＮＡを、イルミナ発現ビードチップ（Illumina Expression BeadChip）に混成化して結果を導き出し、データを統計処理した後、下記表３及び図６に示した。
【表３】
2020072725.tif 000005
【０１０５】
前記表３及び図６に示されているように、ＣＯＬ１Ａ１、ＩＧＦＢＰ４、ＴＡＧＬＮ、Ｓ１００Ａ１０、ＳＱＳＴＭ１、ＤＳＴＮ、ＤＣＮ、ＰＨＧＤＨ、ＦＢＬＮ１、ＭＦＧＥ８、ＨＬＡ−Ａ、ＶＡＳＮ、ＫＩＡＡ１１９９、ＳＴＣ１、ＬＲＲＣ１７、ＩＬ３３、ＳＮＣＡ、ＤＳＧ２、ＮＲＰ２、ＰＬＡＴは、向上された臍帯由来付着型幹細胞で多く発現され、ＣＣＮＤ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＲＮＰ、ＭＴ２Ａ、ＴＭ４ＳＦ１、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ、ＮＭＥ１、ＣＸＣＬ６、ＮＴＳＲ１、ＰＴＧＳ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＴＰＭＴ、ＮＡＧＫ、ＡＮＸＡ４は、向上された臍帯由来付着型幹細胞において、骨髄幹細胞に比べ、低く発現するということが分かる。
【０１０６】
前記遺伝子のうち増加遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１は、アルファ−１タイプＩコラーゲンとして、軟骨を含んだ結合組織のコラーゲンで発現すると知られている。ただし、前記遺伝子は、向上された臍帯由来付着型幹細胞との関連性について、報告されたところがない。
【０１０７】
前記遺伝子のうち増加遺伝子であるＩＧＦＢＰ４は、インシュリン類似成長因子結合タンパク質として、多様な癌細胞を抑制するタンパク質として知られている。ＩＧＦＢＰ４は、臍帯血の血清から検出されるという報告があるが、前記遺伝子は、向上された臍帯由来付着型幹細胞との関連性について、報告されたところがない。
【０１０８】
前記遺伝子のうち増加遺伝子であるＴＡＧＬＮは、線維芽細胞（fibroblast）と平滑筋（smoothmuscle）とで発現する遺伝子であり、その機能は、まだ明らかにされていない。骨髄幹細胞で発現が報告されたが、前記遺伝子は、向上された臍帯由来付着型幹細胞との関連性について、報告されたところがない。
【０１０９】
前記遺伝子のうち減少遺伝子であるＣＣＮＤ１は、サイクリンＤ１（Cyclin Ｄ１）として、ＣＣＮＤ１が過発現すれば、Ｇ１において、Ｓ基として細胞周期を迅速に進め、細胞成長を促進する。主に、癌細胞で多く発現すると報告されている。臍帯血幹細胞は、ＣＣＮＤ１が減少し、Ｃ６神経膠種増殖を抑制するという報告がある。しかし、前記遺伝子は、向上された臍帯由来付着型幹細胞との関連性について、報告されたところがない。
【０１１０】
前記遺伝子のうち減少遺伝子であるＳＥＲＰＩＮＥ１は、内皮プラスミノーゲン活性化抑制剤（endothelial plasminogen activator inhibitor）として知られており、組織プラスミノーゲン活性化（tissue plasminogen activator）（ｔＰＡ）の抑制剤として機能をすると知られている。ただし、前記遺伝子は、向上された臍帯由来付着型幹細胞との関連性について、報告されたところがない。
【０１１１】
前記遺伝子のうち減少遺伝子であるＰＲＮＰは、主要プリオンタンパク質（major prion protein）（ＣＤ２３０）として、神経系だけではなく、多様な組織で発現すると知られている。ＰＲＮＰ遺伝子に異常が発生する場合、神経系疾患をもたらすと報告されている。ただし、前記遺伝子は、向上された臍帯由来付着型幹細胞との関連性について、報告されたところがない。
【０１１２】
また、前記（１．１）及び（１．３）で製造された向上された臍帯由来付着型幹細胞の遺伝子発現を、前述のところと同一方法によって比較分析し、その結果を下記表４及び図６に示した。
【表４】
2020072725.tif 000006
【０１１３】
前記表４及び図６から分かるように、Ｓ１００Ａ１０、ＢＮＩＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＤＣＮ、ＰＧＭ１、ＰＦＫＦＢ３、ＬＯＣ６４４７７４、ＭＭＥ、ＭＩＲ１９７８、ＰＧＫ１、ＳＬＣ２Ａ３、ＢＨＬＨＢ２、ＢＮＩＰ３Ｌ、ＩＧＦＢＰ５、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＤＰＹＤ及びＳＣＡＲＡ３は、低酸素条件下で培養した向上された臍帯由来付着型幹細胞で高く発現され、ＩＬ８、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＱＯ１、ＤＬＣ１、ＣＴＨＲＣ１及びＣＰＡ４は、正常酸素条件下に比べ、低酸素条件下で培養した向上された臍帯由来付着型幹細胞で低く発現されるということが分かる。
【０１１４】
前記遺伝子のうち増加遺伝子であるＳ１００Ａ１０は、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１０として、細胞周期と分化とを調節する。また、エキソサイトーシスとエンドサイトーシスとの機能を行うと知られている。骨髄幹細胞が骨に分化されるとき、高く発現するタンパク質のうち一つとして研究されているが、前記遺伝子は、向上された臍帯由来付着型幹細胞との関連性について、報告されたところがない。
【０１１５】
前記遺伝子のうち増加遺伝子であるＢＮＩＰ３は、ＵＣＢ−ＭＳＣ（臍帯血由来幹細胞）とＵＣＢ−ＭＮＣ（臍帯血由来血液細胞）とのｍＲＮＡレベルでの遺伝子発現を比較したとき、ＵＣＢ−ＭＳＣにおいて増加された遺伝子として知られている。また、低酸素条件下で羊水幹細胞を収集した後、ｍＲＮＡマイクロアレイ分析を行った結果、ＢＮＩＰ３遺伝子は、低酸素条件において、有意味的に増加した遺伝子として知られているが、前記遺伝子は、向上された臍帯由来付着型幹細胞との関連性について、報告されたところがない。
【０１１６】
前記遺伝子のうち増加遺伝子であるＩＧＦＢＰ５は、インシュリン類似成長因子結合タンパク質（insulin-like growth factor binding protein）５として、発生過程（development）において役割を果たし、細胞外空間に位置する。骨髄幹細胞において、ＩＧＦＢＰ５遺伝子が発現するということは報告されているが、前記遺伝子は、向上された臍帯由来付着型幹細胞との関連性について、報告されたところがない。
【０１１７】
前記遺伝子のうち減少遺伝子であるＩＬ８は、炎症環境に露出されるとき、食細胞（phagocytes）と間葉系細胞（mesenchymal cell）とで分泌され、走化性を誘導する好中球を活性化させると報告された。しかし、前記遺伝子は、向上された臍帯由来付着型幹細胞との関連性について、報告されたところがない。
【０１１８】
前記遺伝子のうち減少遺伝子であるＡＬＤＨ１Ａ１は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（aldehyde dehydrogenase）１ファミリー、メンバーＡ１として、アルコール代謝の主要酸化経路を担当する酵素である。前記遺伝子は、向上された臍帯由来付着型幹細胞との関連性について、報告されたところがない。
【０１１９】
３．向上された臍帯由来付着型幹細胞の抗炎症、血管再生及び神経再生に係わる効果分析（３．１）向上された臍帯由来付着型幹細胞の抗炎症効果分析
前記（１．１）で製造された向上された臍帯由来付着型幹細胞の抗炎症効果を分析するために、ＰＢＭＣ増殖抑制能、及び活性化されたＰＢＭＣから分泌されたＩＬ−１０を分析した。
【０１２０】
具体的には、ＰＢＭＣ増殖抑制能分析は、次のように遂行した。まず、前記向上された臍帯由来付着型幹細胞を、濃度別に２４ウェルプレートに接種した後、２４時間培養した。その後、ＣＦＳＥで染色されたＰＢＭＣにＰＨＡを添加して刺激させ、前記向上された臍帯由来付着型幹細胞と５日間共培養した。その後、トランズウェル使用有無により、向上された臍帯由来付着型幹細胞が分泌するサイトカインによる炎症抑制であるか、あるいは直接に細胞同士当接して示される炎症抑制であるかということを区分し、その結果を図７Ａに示した。
【０１２１】
また、活性化されたＰＢＭＣから分泌されたＩＬ−１０分析のために、前述のところにおいて、５時間目と５日間目との共培養後の上の上層液（conditioned medium）を収集し、ヒトＩＬ−１０ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Systems）を利用し、ＩＬ−１０分泌量を測定し、その結果を図７Ａに示した。
【０１２２】
図７Ａは、一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞の抗炎症効果を分析した結果を示した図面である。
【０１２３】
図７Ａに示されているように、一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞は、対照群に対比し、ＰＢＭＣの増殖能が抑制されるということを確認することができる。また、向上された臍帯由来付着型幹細胞：ＰＢＭＣの比率が１：１０である場合、間接的な共培養において、最大約３０．５１±１．７４％の増殖抑制能が示されるということを確認することができる。また、活性化されたＰＢＭＣから分泌されたＩＬ−１０分析結果において、活性化されたＰＢＭＣは、抗炎症サイトカイン（ＩＬ−１０）を分泌し、向上された臍帯由来付着型幹細胞は、ＰＢＭＣがＩＬ−１０分泌を増加させる役割を行うということが分かる。
【０１２４】
前述の結果から、一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞は、炎症性疾患の治療に有用に使用されるということが分かる。
【０１２５】
（３．２）向上された臍帯由来付着型幹細胞の血管再生効果分析
前記（１．１）で製造された向上された臍帯由来付着型幹細胞の血管再生効果を分析するために、血管内皮細胞増殖分析を行った。
【０１２６】
具体的には、ＥＢＭ−２と、向上された臍帯由来付着型幹細胞の培養液（conditioned medium）とを収集してサンプルを準備した。その後、９６ウェルプレートに、血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を接種し、１日ほど増殖させたとき、ＥＢＭ−２と、向上された臍帯由来付着型幹細胞の培養液とをそれぞれ分注し、４日間培養した。Ｃｙｔｏ ＸＴＭ Cell viability assay kit（ＷＳＴ−１）試薬を、前記培地の１０％ずつ添加した後、２〜３時間インキュベーターで反応させた。その後、マイクロリーダー（Microreader）を利用して４５０ｎｍで測定し、内皮細胞の増殖率を分析し、その結果を図７Ｂに示した。
【０１２７】
図７Ｂは、一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞の血管再生効果を分析した結果を示した図面である。
【０１２８】
図７Ｂに示されているように、ＥＢＭ−２培地で培養した血管細胞の増殖能が１００％であるとき、向上された臍帯由来付着型幹細胞の培養液（conditioned medium）で培養された血管細胞は、１７２±１５．２２％増殖するということを確認することができる。
【０１２９】
前述の結果から、一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞は、血管再生効果があるということを確認することができる。
【０１３０】
（３．３）向上された臍帯由来付着型幹細胞の神経再生効果分析
前記（１．１）で製造された向上された臍帯由来付着型幹細胞の神経再生効果を分析するために、神経細胞増殖分析を行った。
【０１３１】
具体的には、ＭＥＭと、向上された臍帯由来付着型幹細胞の培養液（conditioned medium）とを収集してサンプルを準備した。その後、９６ウェルプレートに、神経細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）を接種し、１日ほど増殖させたとき、ＭＥＭと、向上された臍帯由来付着型幹細胞の培養液とをそれぞれ分注し、４日間培養した。Ｃｙｔｏ ＸＴＭ Cell viability assay kit（ＷＳＴ−１）試薬を培地の１０％ずつ添加した後、２〜３時間インキュベーターで反応させた。マイクロリーダー（Microreader）を利用して４５０ｎｍで測定して神経細胞の増殖率を分析し、その結果を図７Ｃに示した。
【０１３２】
図７Ｃは、一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞の神経再生効果を分析した結果を示した図面である。
【０１３３】
図７Ｃに示されているように、ＭＥＭ培地で培養した神経細胞増殖能が１００％であるとき、向上された臍帯由来付着型幹細胞の培養液（conditioned medium）で培養された神経細胞は、３０２±１５．９７％増殖するということが分かる。
【０１３４】
前述の結果から、一具体例による向上された臍帯由来付着型幹細胞は、神経再生効果があるということを確認することができる。
【図１Ａ】
2020072725.tif 000007
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
2020072725.tif 000011
【図２Ｄ】
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【図３】
2020072725.tif 000013
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2020072725.tif 000015
【図５】
2020072725.tif 000016
【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月10日(2020.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）ないし（ｅ）の特性を有する臍帯由来付着型幹細胞：
（ａ）ＣＯＬ１Ａ１、ＩＧＦＢＰ４、ＴＡＧＬＮ、ＳＴＣ１、ＬＲＲＣ１７及びＩＬ３３からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに多く発現されること；
（ｂ）ＴＰＭＴ、ＮＡＧＫ、ＡＮＸＡ４、ＣＣＮＤ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＲＮＰ及びＣＹＰ１Ｂ１からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに少なく発現されること；
（ｃ）継代培養する間、付着型線維芽細胞の形態を維持すること；
（ｄ）脂肪細胞、骨細胞または軟骨細胞への分化能；及び
（ｅ）Ｏｃｔ４−、ＣＤ２００＋、Ｔｒａ−１−６０−、ＣＤ３−、ＣＤ１ａ−、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ１６−、ＣＤ８６−、ＣＤ８ａ−、ＣＤ４０−、及びＣＤ１４１＋の抗原特性。
【請求項２】
前記臍帯由来付着型幹細胞は、下記（ｆ）ないし（ｈ）から選択される１以上の特性をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の細胞：
（ｆ）Ｓ１００Ａ１０、ＢＮＩＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＤＰＹＤ及びＳＣＡＲＡ３からなる群から選択される１以上が、正常酸素条件での培養に比べ、さらに多く発現されること；
（ｇ）ＩＬ８、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＤＬＣ１、ＣＴＨＲＣ１及びＣＰＡ４からなる群から選択される１以上が、正常酸素条件での培養に比べ、さらに少なく発現されること；
（ｈ）ＳＮＣＡ、ＤＳＧ２、ＮＲＰ２及びＰＬＡＴからなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに多く発現されること。
【請求項３】
（ａ）及び（ｂ）の特性は、マイクロアレイ分析により、骨髄幹細胞に比べ、２倍以上の発現量に差を示すことを特徴とする請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
低酸素条件で培養した（ｆ）及び（ｇ）の特性は、マイクロアレイ分析又はプロテオミクスにより、正常酸素条件に比べ、２倍以上の発現量に差を示すことを特徴とする請求項２に記載の細胞。
【請求項５】
前記細胞は、コロニー形成能を有することを特徴とする請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
前記細胞は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−３、ＶＥＧＦ、ＧＲＯ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ１２（Ｐ７０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＦＮα２、ＭＤＣ、ｓＩＬ−２Ｒａ、エオタキシン、Ｆｌｔ−３リガンド、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ１ｂ、ＲＡＮＴＥ、フラクタルカイン、ＩＰ−１０、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１ＳＲ、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦＢＰ３、またはそれらの組み合わせのタンパク質を分泌することを特徴とする請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
前記細胞は、哺乳動物臍帯のワルトンゼリー組織由来であることを特徴とする請求項１に記載の細胞。
【請求項８】
分離された臍帯を培養容器に付着させて培養する段階と、
前記培養された臍帯に分離酵素を接触させ、臍帯由来付着型幹細胞を分離する段階と、
前記分離された臍帯由来付着型幹細胞を線維芽細胞成長因子−４（ＦＧＦ−４）及びヘパリンを含む培地で継代培養する段階と、
を含む臍帯由来付着型幹細胞を製造する方法であって、
前記臍帯由来付着型幹細胞は、下記（ａ）ないし（ｅ）の特性：
（ａ）ＣＯＬ１Ａ１、ＩＧＦＢＰ４、ＴＡＧＬＮ、ＳＴＣ１、ＬＲＲＣ１７及びＩＬ３３からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに多く発現されること；
（ｂ）ＴＰＭＴ、ＮＡＧＫ、ＡＮＸＡ４、ＣＣＮＤ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＲＮＰ及びＣＹＰ１Ｂ１からなる群から選択される１以上が、骨髄幹細胞に比べ、さらに少なく発現されること；
（ｃ）継代培養する間、付着型線維芽細胞の形態を維持すること；
（ｄ）脂肪細胞、骨細胞または軟骨細胞への分化能；及び
（ｅ）Ｏｃｔ４−、ＣＤ２００＋、Ｔｒａ−１−６０−、ＣＤ３−、ＣＤ１ａ−、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ１６−、ＣＤ８６−、ＣＤ８ａ−、ＣＤ４０−、及びＣＤ１４１＋の抗原特性
を有することを特徴とする、方法。
【請求項９】
前記継代培養する段階は、継代培養のための細胞移植前、動物由来成分がない（ＡＣＦ）組み換え酵素の処理をさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記継代培養する段階は、正常酸素条件である２１％に比べ、低い低酸素条件で継代培養することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記継代培養は、３ないし１５継代まで行うことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記分離酵素は、コラゲナーゼであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の臍帯由来付着型幹細胞、その細胞集団、またはその培養液を有効成分として含む製剤。
【請求項１４】
請求項１に記載の臍帯由来付着型幹細胞、その細胞集団、またはその培養液を有効成分として含む炎症性疾患の治療または予防のための薬学的組成物。
【請求項１５】
前記炎症性疾患は、気管支炎、胃炎、動脈硬化症、関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、肝炎、胆嚢炎、真菌性感染症、胃潰瘍、喘息、アトピー性皮膚炎、腱炎及び腎臓炎からなる群から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載の臍帯由来付着型幹細胞、その細胞集団、またはその培養液を有効成分として含む虚血性疾患の治療または予防のための薬学的組成物。
【請求項１７】
前記虚血性疾患は、虚血性脳卒中、心筋梗塞、虚血性心臓疾患、虚血性脳疾患、虚血性心不全、虚血性腸炎、虚血性血管疾患、虚血性眼疾患、虚血性網膜症、虚血性緑内障、虚血性腎不全及び虚血性下肢疾患からなる群から選択されることを特徴とする請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の臍帯由来付着型幹細胞、その細胞集団、またはその培養液を有効成分として含む神経退行性疾患の治療または予防のための薬学的組成物。
【請求項１９】
前記神経退行性疾患は、脊髄損傷、多発性硬化症、アルツハイマー病、前頭側頭葉痴呆、進行性核上麻痺、皮質基底核変性、ピック病及び拳闘選手痴呆（ＤＰ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
炎症性疾患、虚血性疾患または神経退行性疾患の治療または予防に使用するための医薬の製造における請求項１に記載の臍帯由来付着型幹細胞、その細胞集団、またはその培養液の使用。