(57)【要約】      （修正有）【課題】アゴニストまたはアンタゴニスト性を誘発する修飾されたＩｇＧ２ドメインを含む修飾された抗体の提供。【解決手段】ヒト細胞表面で発現される受容体またはリガンドに特異的に結合する修飾された抗体であって、前記受容体もしくはリガンドにより誘発された１つもしくは複数の生物学的活性、または前記リガンドとその対応する受容体との相互作用により誘発された生物学的活性を刺激し、前記抗体がヒトＩｇＧ２抗体以外であり、更にヒトＩｇＧ２以外である前記修飾された抗体の全体的又は実質的に全体的な重鎖ヒンジ及びＣＨ１ドメイン、そして場合により軽鎖定常領域が、ｈＩｇＧ２抗体の対応する全体的または実質的に全体的なヒンジ及びＣＨ１ドメイン、そして場合により軽鎖定常領域と交換されている、修飾された抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞表面で発現される受容体またはリガンドに特異的に結合する修飾された抗体であって、前記修飾された抗体が、前記受容体もしくはリガンドにより誘発された１つもしくは複数の生物学的活性、または前記リガンドとその対応する受容体との相互作用により誘発された生物学的活性を刺激し、前記抗体がヒトＩｇＧ２抗体以外であり、さらにヒトＩｇＧ２以外である前記修飾された抗体の全体的または実質的に全体的な重鎖ヒンジ及びＣＨ１ドメイン、そして場合により軽鎖定常領域が、ｈＩｇＧ２抗体の対応する全体的または実質的に全体的なヒンジ及びＣＨ１ドメイン、そして場合により軽鎖定常領域と交換されている、修飾された抗体。
【請求項２】
ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭから選択される、請求項１に記載の修飾された抗体であって、前記抗体の全体的または実質的に全体的なヒンジ及びＣＨ１ドメイン、そして場合により全体的または実質的に全体的な軽鎖定常領域が、ｈＩｇＧ２の対応する全体的または実質的に全体的な軽鎖、ならびにヒンジ及びＣＨ１ドメイン（「Ｈ２領域」または「Ｈ２ドメイン」）と交換されている、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
１２７位（ナンバリングはＫａｂａｔによる）の重鎖システイン残基及び２１４位の軽鎖システイン残基のいずれか一方または両方が、欠失されているか、または異なるアミノ酸残基に変換されて、得られた修飾された抗体のアゴニスト性が、前記システイン残基のいずれか一方または両方が不変であり他が同一の抗体よりも増強される、請求項１または２に記載の修飾された抗体。
【請求項４】
突然変異または欠失される前記修飾された抗体のＨ２領域の唯一のシステイン残基が、前記軽鎖の２１４位のシステインであり、前記修飾された抗体が、（ｉ）システイン残基がＨ２領域で欠失もしくは修飾されていない重鎖を含むか、または（ｉｉ）前記重鎖の１２７、２３２もしくは２３３位のシステイン残基の１つまたは複数が欠失もしくは突然変異されて、得られた修飾された抗体のアゴニスト性が前記欠失もしくは修飾を欠き他が同一の抗体よりも増強されている修飾された抗体を生じる、請求項１、２または３に記載の修飾された抗体。
【請求項５】
修飾されたｈＩｇＧ１またはｈＩｇＧ３である、請求項３または４に記載の修飾された抗体。
【請求項６】
ヒト免疫細胞に特異的に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項７】
前記免疫細胞として、樹状細胞、肥満細胞、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球または前述のものの任意の組み合わせが挙げられる、請求項６に記載の修飾された抗体。
【請求項８】
前記修飾が存在しなければ、抗体がアゴニスト活性を欠く、請求項１〜７のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項９】
前記修飾が存在しなければ、アゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアゴニスト活性を検出すると、抗体が前記修飾された抗体のアゴニスト活性の１０％以下を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項１０】
前記修飾が存在しなければ、アゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアゴニ
スト活性を検出すると、抗体が前記修飾された抗体のアゴニスト活性の２０％以下を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項１１】
前記修飾が存在しなければ、アゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアゴニスト活性を検出すると、抗体が前記修飾された抗体のアゴニスト活性の３０％以下を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項１２】
前記修飾が存在しなければ、アゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアゴニスト活性を検出すると、抗体が前記修飾された抗体のアゴニスト活性の４０％以下を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項１３】
前記修飾が存在しなければ、アゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアゴニスト活性を検出すると、抗体が前記修飾された抗体のアゴニスト活性の５０％以下を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項１４】
前記修飾が存在しなければ、アゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアゴニスト活性を検出すると、抗体が前記修飾された抗体のアゴニスト活性の５０〜８０％以下を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項１５】
ヒト細胞で発現された受容体またはリガンドに特異的に結合する修飾されたヒトＩｇＧ２抗体（ｈＩｇＧ２）であって、前記抗体が、前記受容体もしくはリガンドにより誘発された１つもしくは複数の生物学的活性、または前記リガンドと対応する受容体との相互作用により誘発された生物学的活性を刺激し、さらに前記修飾された抗体が、ｈＩｇＧ２の少なくとも軽鎖、ならびに重鎖領域のＣＨ１及びヒンジ（「Ｈ２領域」）を含み、１２７位（アミノ酸のナンバリングはＫａｂａｔによる）の重鎖システイン残基及び２１４位の軽鎖システイン残基から選択されるシステイン残基のいずれか一方または両方が、除去されるか、または異なるアミノ酸残基に変換されて、得られたアゴニスト抗体のアゴニスト性が、前記システイン残基の両方が不変であり他が同一の抗体よりも増強される、修飾されたヒトＩｇＧ２抗体（ｈＩｇＧ２）。
【請求項１６】
２１４位の前記修飾された抗体の軽鎖のシステイン残基が、欠失または別のアミノ酸と置換されており、前記修飾された抗体が、（ｉ）Ｈ２領域内のシステイン残基が欠失もしくは突然変異されていない重鎖を含むか、または（ｉｉ）前記修飾された抗体が、１２７、２３２もしくは２３３位のシステイン残基の少なくとも１つが欠失もしくは突然変異された重鎖を含む、請求項１５に記載の修飾された抗体。
【請求項１７】
重鎖のＨ２領域内のシステイン残基が欠失または突然変異されていない、請求項１６に記載の修飾された抗体。
【請求項１８】
重鎖内の１２７、２３２または２３３位のシステイン残基の少なくとも１つが欠失または突然変異されている、請求項１６に記載の修飾された抗体。
【請求項１９】
重鎖内の１２７、２３２または２３３位のシステイン残基の１つまたは２ついずれかの組み合わせが欠失または突然変異されている、請求項１６に記載の修飾された抗体。
【請求項２０】
前記修飾された抗体のＨ２領域が、ｈ２Ｂ立体配座である（重鎖Ｃ１２７及び軽鎖Ｃ２１４が、重鎖システイン２３２及び２３３とジスルフィド架橋を形成する）、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項２１】
除去、修飾されているか、または別のアミノ酸残基で置換されているｈＩｇＧ２重鎖Ｈ
２領域内の唯一のシステイン残基が、１２７位に重鎖システイン残基を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項２２】
軽鎖Ｈ２領域内のシステイン残基が、除去、修飾されていないか、または別のアミノ酸残基で置換されていない、請求項２１に記載の修飾された抗体。
【請求項２３】
除去、修飾されているか、または別のアミノ酸残基で置換されているｈＩｇＧ２軽鎖領域内の唯一のシステイン残基が、２１４位に軽鎖システイン残基を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項２４】
除去、修飾されているか、または別のアミノ酸残基で置換されているｈＩｇＧ２  Ｈ２領域の唯一のシステイン残基が、１２７位の重鎖システイン残基及び２１４位の軽鎖システイン残基から選択される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項２５】
軽鎖内の２１４位のシステインを置換するセリン、及び／または重鎖内の１２７位のシステイン残基を置換するセリン残基を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項２６】
修飾されたｈＩｇＧ１またはｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４抗体であって、前記ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４の全体的ヒンジ及びＣＨ１領域、そして場合により軽鎖定常領域（Ｈ２領域）が、ｈＩｇＧ２のＣＨ１領域の対応するヒンジ及び軽鎖定常領域と交換されている、修飾されたｈＩｇＧ１またはｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４抗体。
【請求項２７】
ｈＩｇＧ１である、請求項２６に記載の修飾された抗体。
【請求項２８】
前記Ｈ２領域内に１つまたは複数の修飾されたシステイン残基を場合により含む、請求項２６または２７に記載の修飾された抗体。
【請求項２９】
前記修飾された抗体のアゴニスト性に影響を及ぼさないまたは感知できる程度に影響を及ぼす（１０％以下）Ｈ２領域外のさらなる修飾を場合により含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項３０】
ヒト細胞、例えば免疫細胞の表面で発現されるＴＮＦまたはＢ７スーパーファミリーメンバーに特異的に結合する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項３１】
少なくとも１つのタイプのヒト免疫細胞で発現される受容体またはリガンドに特異的に結合する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項３２】
前記免疫細胞が、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、肥満細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、及び樹状細胞、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項３０または３１に記載の修飾された抗体。
【請求項３３】
全体的なヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ならびにヒンジ及び軽鎖定常領域を含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の上記の修飾された抗体。
【請求項３４】
ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域を欠く、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項３５】
前記抗体または融合物のアゴニスト性がＦｃγＲ非依存性である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項３６】
ＣＤ４０、ＬＴα、ＬＴβ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＴＮＦ−Ｒ、ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＧＩＴＲもしくは「グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体」、ＴＷＥＡＫ及びＦＮ１４から選択されるＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに、またはＢ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、Ｂ７−Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）、Ｂ７−Ｈ６（ＮＣＲ３ＬＧ１）、Ｂ７−Ｈ７（ＨＨＬＡ２）、ＰＤ−１（ＣＤ２７９）、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＢＴＬＡ、ＮＣＲ３、ＣＤ２８Ｈ、及びＮＫｐ３０から選択されるＢ７／ＣＤ２８ファミリーメンバーに特異的に結合する、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項３７】
前記ＴＮＦＲメンバーが４−１ＢＢ、ＣＤ４０、もしくはＣＤ２７であるか、または前記Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーメンバーがＣＴＬＡ−４もしくはＣＤ２８である、請求項３６に記載の修飾された抗体または融合タンパク質。
【請求項３８】
ＬＯＢ７．４の可変領域を含む、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれかに記載の修飾された抗体の有効量を含む医薬組成物。
【請求項４０】
他の免疫アゴニストを含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
少なくとも１種の修飾された抗体または融合タンパク質含有物（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の投与を含む治療方法であって、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の少なくとも１種の修飾された抗体または融合タンパク質または組成含有物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ)の有効量の投与を含む、治療方法。
【請求項４２】
癌、感染、アレルギー、自己免疫または炎症から選択される状態を治療するのに用いられる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ヒト細胞表面で発現される受容体またはリガンドに特異的に結合する修飾された抗体であって、前記修飾された抗体が、前記受容体もしくはリガンドにより誘発された１つもしくは複数の生物学的活性、または前記リガンドとその対応する受容体との相互作用により誘発された生物学的活性を減弱し、前記抗体が、ヒトＩｇＧ２抗体以外であり、さらにヒトＩｇＧ２以外である前記修飾された抗体の全体的または実質的に全体的なヒンジ及びＣＨ１ドメイン、そして場合により軽鎖定常領域が、ｈＩｇＧ２抗体の対応する全体的または実質的に全体的なヒンジ及びＣＨ１ドメインならびに軽鎖定常領域（「Ｈ２領域」または「Ｈ２ドメイン」）と交換され、Ｈ２領域内のシステイン残基の１つまたは複数が、場合により修飾され、前記修飾が、得られた修飾された抗体のアンタゴニスト性を増強する、修飾された抗体。
【請求項４４】
Ｃ２１４が不変であるｈＩｇＧ２定常領域及びヒト細胞で発現される所望のヒトリガンドまたは受容体に特異的な抗体の軽鎖可変領域を含む場合により修飾された軽鎖と、ｈＩｇＧ２のＣＨ１及びヒンジ領域ならびに前記軽鎖可変領域と同じヒトリガンドまたは受容体に特異的な同じ抗体の可変領域を含む修飾された重鎖と、を組み合わせることにより場合により生成される、請求項４３に記載の修飾された抗体であって、前記修飾された重鎖が、２３２、２３３、２３６及び２３９位に１つまたは複数の（任意の組み合わせの）システイン残基の欠失または置換を含む１つまたは複数の修飾を含み、そのような組み合わせが、特異的に結合して、それにより結合された特定のヒトリガンドまたは受容体により誘発される生物学的活性を減弱させるｈ２Ａ立体配座の修飾された抗体を選択的にもたら
す、請求項４３に記載の修飾された抗体。
【請求項４５】
ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭから選択される請求項４４に記載の修飾された抗体であって、前記抗体の全体的または実質的に全体的なヒンジ及びＣＨ１ドメインが、ｈＩｇＧ２の対応する全体的または実質的に全体的なヒンジ及びＣＨ１ドメイン（「Ｈ２領域」または「Ｈ２ドメイン」）と交換されている、請求項４４に記載の修飾された抗体。
【請求項４６】
２３２、２３３、２３６及び２３９位のシステイン残基から選択される前記ＩｇＧ２  Ｈ２領域に含まれる少なくとも１つのシステイン残基が、除去されるか、または異なるアミノ酸残基に変換されて、得られた修飾された抗体のアンタゴニスト性が、１つまたは複数のシステイン残基が不変であり他が同一の抗体よりも増強される、請求項４４または４５に記載の修飾された抗体。
【請求項４７】
前記修飾された抗体の軽鎖内の残基２１４のシステイン及び重鎖内の残基１２７のシステインが、欠失、修飾されておらず、または他のアミノ酸残基で置換されていない、請求項４４、４５または４６に記載の修飾された抗体。
【請求項４８】
前記抗体のＨ２領域内のシステイン修飾が、軽鎖の２１４位のシステイン及び重鎖の１２７位のシステインを介して、修飾された抗体の重鎖と軽鎖との会合に選択的に好適であるか、またはその会合をもたらす、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項４９】
前記修飾された抗体のＨ２領域が、ｈ２Ａ立体配座である、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項５０】
Ｃ２１４及びＣ１２７以外のＨ２内のシステイン残基の少なくとも１つが、セリン残基に変換されている、請求項４３〜４９のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項５１】
前記重鎖内の２３２位のシステインを置換したセリンを含む、請求項４３〜５０のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項５２】
前記重鎖内の２３３位のシステインを置換したセリンを含む、請求項４３〜５１のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項５３】
修飾されたｈＩｇＧ１またはｈＩｇＧ３である、請求項４３〜５２のいずれか１項に
記載の修飾された抗体。
【請求項５４】
ヒト免疫細胞に特異的に結合する、請求項４３〜５３のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項５５】
前記免疫細胞として、樹状細胞、肥満細胞、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球または前述のものの任意の組み合わせが挙げられる、請求項５４に記載の修飾された抗体。
【請求項５６】
前記修飾が存在しなければ、抗体がアンタゴニスト活性を欠く、請求項４３〜５５のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項５７】
前記修飾が存在しなければ、アンタゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアンタゴニスト活性を検出すると、抗体が修飾された抗体のアンタゴニスト活性の１０％以
下を有する、請求項４３〜５６のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項５８】
前記修飾が存在しなければ、アンタゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアンタゴニスト活性を検出すると、抗体が修飾された抗体のアンタゴニスト活性の２０％以下を有する、請求項４３〜５６のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項５９】
前記修飾が存在しなければ、アンタゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアンタゴニスト活性を検出すると、抗体が修飾された抗体のアンタゴニスト活性の３０％以下を有する、請求項４３〜５６のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項６０】
前記修飾が存在しなければ、アンタゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアンタゴニスト活性を検出すると、抗体が修飾された抗体のアンタゴニスト活性の４０％以下を有する、請求項４３〜５６のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項６１】
前記修飾が存在しなければ、アンタゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアンタゴニスト活性を検出すると、抗体が修飾された抗体のアンタゴニスト活性の５０％以下を有する、請求項４３〜５６のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項６２】
ヒト細胞で発現される受容体またはリガンドに特異的に結合する修飾された抗体であって、前記抗体が、前記受容体もしくはリガンドにより誘発された１つもしくは複数の生物学的活性、または前記リガンドと対応する受容体との相互作用により誘発された生物学的活性を減弱し、さらに前記アンタゴニスト抗体が、ヒトＩｇＧ２の少なくともＣＨ１及びヒンジ重鎖及び軽鎖定常領域（「Ｈ２領域」）を含み、２３２、２３３、２３６及び２３９位のシステイン残基から選択される前記ＩｇＧ２  Ｈ２領域の少なくとも１つのシステイン残基が、除去されるか、または異なるアミノ酸残基に変換されて、得られたアゴニスト抗体のアゴニスト性が、前記１つまたは複数のシステイン残基が不変であり他が同一である抗体よりも増強される、修飾された抗体。
【請求項６３】
Ｃ２１４が不変であるｈＩｇＧ２定常領域及びヒト細胞で発現される所望のヒトリガンドまたは受容体に特異的な軽鎖可変領域を含む場合により修飾された軽鎖と、ｈＩｇＧ２のＣＨ１及びヒンジ領域ならびに前記軽鎖可変領域と同じヒトリガンドまたは受容体に特異的な可変領域を含む修飾された重鎖と、を組み合わせることにより場合により生成される、請求項６２に記載の修飾された抗体であって、前記修飾された重鎖が、２３２、２３３、２３６及び２３９位に１つまたは複数の（任意の組み合わせの）システイン残基の欠失または置換を含む１つまたは複数の修飾を含み、そのような組み合わせが、特異的に結合して、それにより結合された特定のヒトリガンドまたは受容体により誘発される生物学的活性を減弱させるｈ２Ａ立体配座の修飾された抗体を選択的にもたらす、請求項６２に記載の修飾された抗体。
【請求項６４】
軽鎖の２１４位及び重鎖の１２７位のシステイン残基が、欠失、修飾されておらず、または別のアミノ酸と置換されていない、請求項６２または６３に記載の修飾された抗体。
【請求項６５】
ｈＩｇＧ２  Ｈ２領域内の１つもしくは複数のシステイン、または他のアミノ酸残基が、除去、修飾されているか、または別のアミノ酸と置換されて、ｈ２Ａ立体配座であるＨ２領域をもたらし、ここでｈ２Ａ立体配座が、ＣＨ１内の重鎖Ｃ１２７が前記軽鎖内のＣ２１４に結合し、そして場合により０、１、２、または３個のＨＣ間ジスルフィド結合が向き合ったシステイン２３２、２３３、２３６及び２３９の間に存在することを意味する、請求項４３〜６４のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項６６】
ｈＩｇＧ２  Ｈ２領域内のＣ１２７及びＣ２１４以外の前記Ｈ２領域のシステイン残基
の少なくとも１、２、３個または全てが、セリン残基に変換されており、さらにＣ１２７及びＣ２１４が、修飾されていない、請求項４３〜６５のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項６７】
重鎖内の２３２位のシステインを置換したセリン、または２３３位のシステインを置換したセリン、または２３６位のシステインを置換したセリン、または２３９位のシステインを置換したセリン、または前記修飾の２つ、３つもしくは全ての任意の組み合わせを含む、請求項４３〜６６のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項６８】
重鎖内の２３３位にシステイン残基を置換したセリンを含む、請求項４３〜６７のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項６９】
ヒト細胞表面で発現されるＴＮＦもしくはＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、またはＢ７ファミリーメンバーに特異的に結合する、請求項４３〜６８のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項７０】
ヒト免疫細胞の少なくとも１タイプに特異的に結合する、請求項４３〜６９のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項７１】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、マクロファージ、単球、ＮＫ細胞、または樹状細胞で発現される受容体またはリガンドに特異的に結合する、請求項４２〜６９のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項７２】
全体的なヒトＩｇＧ２重鎖及び軽鎖定常領域を含む、請求項４３〜７１のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項７３】
ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域を欠く、請求項４３〜７２のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項７４】
前記抗体のアンタゴニスト性が、ＦｃγＲ非依存性である、請求項４３〜７３のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項７５】
請求項４３〜７４のいずれか１項に記載の修飾された抗体であって、前記抗体または融合タンパク質が、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＬＴα、ＬＴβ、ＦＡＳＬ（ＣＤ１７８）、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３）、ＣＤ２７、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ／ＡＰＯ−２Ｌ、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＴＮＦ、ＴＮＦ−Ｒ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＧＩＴＲまたは「グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体」、ＴＷＥＡＫ及びＦＮ１４から選択されるＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに特異的に結合する、請求項４３〜７４のいずれか１項に記載の修飾された抗体。
【請求項７６】
ＴＮＦＲまたはＢ７ファミリーメンバーが、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、Ｂ７．１、Ｂ７．２、またはＣＤ７０である、請求項７５に記載の修飾された抗体。
【請求項７７】
請求項１〜７６のいずれかに記載の精製され、修飾された抗体を含む医薬または診断組成物であって、実質的に均質である、即ち前記組成物が前記抗体の任意の他の「ｈ２ａ」または「ｈ２ｂ」形態を実質的に含まない、医薬組成物または診断組成物。
【請求項７８】
前記抗体の任意の他の形態を最大０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、
９、または１０％含む、請求項７７に記載の組成物。
【請求項７９】
請求項４３〜７８のいずれか１項に記載の、修飾された抗体または融合タンパク質含有物の有効量を含む医薬組成物。
【請求項８０】
別の免疫アンタゴニストまたは他の活性剤、例えば抗体またはサイトカインを含む、請求項７７、７８または７９に記載の組成物。
【請求項８１】
少なくとも１種のアンタゴニスト抗体または融合タンパク質または組成含有物の投与を含む治療方法であって、請求項４３〜８０のいずれか１項に記載の修飾された抗体または融合タンパク質含有物または組成物の投与を含む、治療方法。
【請求項８２】
癌、アレルギー、感染性状態、自己免疫または炎症の状態から選択される病気を治療するために用いられる、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
ＬＯＢ７．４の可変領域、またはＣＤ４０、４−１ＢＢもしくはＣＤ２８に特異的な別の抗体の可変領域を含む抗体の投与を含む、請求項８２に記載の方法。癌、感染、アレルギー、自己免疫または炎症から選択される状態を治療するために用いられる、請求項７７〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
組換え宿主細胞における、前述の請求項のいずれかに記載の修飾された抗体を発現する方法。
【請求項８５】
前記修飾された抗体の軽鎖及び重鎖の発現が、誘導型または構成型プロモーターまたはプロモーター（複数）により調節される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
本発明による修飾された抗体を発現し、場合により分泌する、組換え宿主細胞。
【請求項８７】
哺乳動物、酵母、真菌、細菌または昆虫の細胞である、請求項８６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８８】
前記発現が、ヒトタンパク質の内因性グリコシル化に必要な酵素を発現するか、または前記酵素を発現するように操作されている、請求項８７に記載の組換え宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、内容が全体として参照により本明細書に取り込まれた、２０１４年３月２４日出願の英国特許出願第１４０５２６４．１号、及び２０１４年３月２５日出願の英国特許出願第１４０５２７５．７号の優先権を主張するものである。
【０００２】
分野
本出願は、一般に、ヒトＩｇＧ２（ｈ２）は、抗ＣＤ４０抗体に対して、そして４−１ＢＢ及びＣＤ２８；ならびに潜在的に他のＢ７／ＣＤ２８及びＴＮＦ／ＴＮＦＲファミリーメンバーをはじめとする他の免疫刺激性受容体への抗体に対して特有のＦｃγＲ非依存性アゴニスト活性を呈する、という発見、そしてさらにｈ２の特有のアゴニスト活性または逆にアンタゴニスト活性がヒンジ及びＣＨ１ジスルフィド結合の正確な配列に依存する、という発見に関する。それに基づき、本発明は、抗体へのアンタゴニスト性及びアゴニスト性をそれぞれ付与するために、ＩｇＧ２のヒンジ領域がより柔軟な「ｈ２Ａ」またはより集密な「ｈ２Ｂ」のいずれかの立体配座に抗体を「ロック」するように変異誘発されている、新規なアゴニスト抗体及びアンタゴニスト抗体、ならびに治療におけるそれらの使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、癌治療に改革を起こし、免疫系を利用して腫瘍を根絶し得るという確信を呼び戻している（Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉら  （２０１３）；  Ｈｏｄｉ  ＦＳら  （２０１０）；  Ｗｏｌｃｈｏｋ  ＪＤら（２０１３））。抗ＣＴＬＡ−４及び抗ＰＤ−１ｍＡｂでの結果は、Ｔ細胞免疫が転移性黒色腫及び非小細胞肺癌などの攻撃的で難治性の癌への長期持続性の防御をもたらし得るという見解を促した（Ｈｏｄｉ
ＦＳら（２０１０）；  Ｗｏｌｃｈｏｋ  ＪＤら（２０１３）；  Ｔｏｐａｌｉａｎ  ＳＬら（２０１２））。異なるｍＡｂ剤が、多様な方法でそれらの効果を仲介しており、それらの作用機序の正確な理解が、治療効果を改善するのに必要とされている。さらに、ｍＡｂアイソタイプの選択は、抗原結合の下流イベントを指揮するＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）相互作用の差に大きく起因するため重大である（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  Ｆ  ＆  Ｒａｖｅｔｃｈ  ＪＶ  （２０１２）；  Ｗｈｉｔｅ  ＡＬら（２０１３）。
【０００４】
抗ＣＤ２０を有する悪性Ｂ細胞（Ｕｃｈｉｄａ  Ｊら（２００４））、または抗ＣＴＬＡ４及び抗ＧＩＴＲを有するネズミＴ調節細胞（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＴＲら（２０１３）  Ｂｕｌｌｉａｒｄ  Ｙら（２０１３））など、細胞ターゲットの欠失を通して作用する薬剤。マウスＩｇＧ２ａ（ｍ２ａ）及びヒトＩｇＧ１（ｈ１）は、高い活性／阻害性（Ａ／Ｉ）ＦｃγＲ結合比を有するため、このタイプの薬剤に効果的である（Ｈａｍａｇｕｃｈｉ  Ｙら，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０３（３）：７４３−７５３；  Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  Ｆ  ＆  Ｒａｖｅｔｃｈ  ＪＶ  （２００５））。これに対し、免疫刺激性抗ＣＤ４０（Ｂｒａｈｍｅｒら（２０１２）；  Ｂｒｕｈｎｓら、Ｂｌｏｏｄ  １１３，  ３７１６−３７２５）またはアポトーシス促進性抗細胞死受容体（ＤＲ）４、ＤＲ５及びＦａｓ（Ｌｉ  Ｆ  ＆  Ｒａｖｅｔｃｈ  ＪＶ  （２０１２）；  Ｗｉｌｓｏｎ  ＮＳら（２０１１）．Ｘｕ  Ｙら（２００３））など、効果がアゴニスト受容体結合に依存するｍＡｂは、主に阻害性ＦｃγＲＩＩＢによる架橋に依存してその効果を発揮するようである（Ｗｈｉｔｅ  ＡＬら（２０１１）；  Ｌｉ  Ｆ  ＆  Ｒａｖｅｔｃｈ  ＪＶ  （２０１３），  Ｗｈｉｔｅら（２０１３））。このタイプの薬剤では、マウスＩｇＧ１（ｍ１）が、低いＡ／Ｉ比を有し、架橋を仲介するのに十分な親和性でＦｃγＲＩＩＢと結合するため、前臨床モデルに最適である（Ｗｈｉｔｅら（２０１１）  ；  Ｌｉ  Ｆ  ＆  Ｒａｖｅｔｃｈ  ＪＶ  （２０１１））。臨床試験におけるアゴニスト抗ＣＤ４０  ｍＡｂであるＣＰ８７０、８９３（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ  ＲＨら（２００７））は、アイソタイプに基づけばＦｃ？Ｒに結合すると予測されないヒトＩｇＧ２（ｈ２）である（Ｂｒｕｈｎｓ  Ｐら（２００９））。アゴニスト性がより低い他の２種のＣＤ４０抗体であるＣｈｉＬＯＢ７．４及びＳＧＮ４０は、両者ともｈ１である（Ａｄｖａｎｉ  Ｒら（２００９）；  Ｊｏｈｎｓｏｎら（２０１０））。加えて近年の研究で、ｈ２の定常領域が、高い刺激活性を特異的抗ヒトＣＤ２８ｍＡｂであるＴＧＮ１４１２に与えることが実証された（Ｂａｌｌ  Ｃ，  ら（２０１２））。
【０００５】
前述の事柄にもかかわらず、アゴニストｍＡｂにおいて用いられるべき最適なアイソタイプ、またはヒト治療に用いられるべき融合タンパク質について、本発明以前は明らかでなかった。特に、抗体アイソタイプがどのようにして治療抗体の治療特性、即ちそのアゴニスト性またはアンタゴニスト性に影響を及ぼし得るかについては、ほとんど理解されていない。本発明は、この必要性に取り組み、アゴニスト（及びアンタゴニスト）抗体の改善を提供し、さらにその合成の手段を提供する。例示的実施形態において、これらの抗体及び融合タンパク質、例えばＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーを標的とするものは、アゴニスト抗体もしくはアンタゴニスト抗体、または融合タンパク質が治療に望ましくなる治療適応において、有用となる。
【０００６】
概要
本発明は、アゴニスト性またはアンタゴニスト性を有する抗体を生成するための最適な抗体アイソタイプに関する理解を提供する。より具体的には本発明は、特異的突然変異を有するヒトＩｇＧ２定常領域を含む抗体であって、該特異的突然変異に応じて、これらの抗体がアゴニスト性またはアンタゴニスト性のいずれかを有する、抗体を提供する。
【０００７】
本発明は、詳細には複数のヒト共刺激受容体（ＣＤ４０、４−１ＢＢ及びＣＤ２８）に対するｍＡｂを用いてヒトＩｇＧアイソタイプの免疫調整活性を測定し、それによりヒトＩｇＧ２（ｈ２）がこれらの薬剤に対してｈ１またはヒトｈ４のいずれかよりも大きな免疫刺激活性を付与することを示し、対照的レベルのアゴニスト活性を有する異なる構成に該ｍＡｂを「ロック」し、それにより局所微小環境におけるＦｃｇＲ発現レベルに非依存的である明確な活性レベルの均質なスーパーアゴニスト治療抗体の開発をもたらすために、該免疫刺激活性がＦｃｇＲ相互作用における差に依存せず、むしろ突然変異を利用して操作され得るｈ２ヒンジ及びＣＨ１ドメイン内のジスルフィド結合の特有の構成に依存することを示す。
【０００８】
本発明は、さらに、疾患の治療または予防において受容体アゴニストまたは受容体アンタゴニストとして特異的突然変異を有するヒトＩｇＧ２定常領域を含み、そのような受容体アゴニストまたは受容体アンタゴニストが治療適用を有する、そのような抗体及び融合タンパク質の使用に関する。例示的実施形態において、該抗体は、ＣＤ４０、ＬＴα、ＬＴβ、ＦＡＳＬ  ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＴＲＡＩＬ／ＡＰＯ−２Ｌ、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＴＮＦ、ＴＮＦ−Ｒ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＧＩＴＲもしくは「グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体」、ＴＷＥＡＫ、ＦＮ１４などのＴＮＦスーパーファミリーメンバーに、またはＢ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２またはＣＤ２７３）、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、Ｂ７−Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）、Ｂ７−Ｈ６（ＮＣＲ３ＬＧ１）、Ｂ７−Ｈ７（ＨＨＬＡ２）、ＰＤ−１（ＣＤ２７９）、ＰＤ−Ｌ３、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＢＴＬＡ、ＮＣＲ３、Ｃ
Ｄ２８Ｈ、及びＮＫｐ３０などＢ７／ＣＤ２８ファミリーメンバーに、特異的に結合する。
【０００９】
発明の目的
本発明の目的は、新規な免疫アゴニストまたはアンタゴニスト、より詳細にはスーパーアゴニストを提供することである。
【００１０】
本発明のより具体的な目的は、突然変異したＩｇＧ２定常領域を含む新規な免疫アゴニストまたはアンタゴニストであって、そのような突然変異が、そのようなアゴニストまたはアンタゴニストのポリペプチド、例えばアゴニストＩｇＧ２抗体もしくはアンタゴニストＩｇＧ２抗体またはＩｇＧ２／ＩｇＧ２キメラ融合タンパク質のアゴニスト性またはアンタゴニスト性を増強する、免疫アゴニストまたはアンタゴニストを提供することである。
【００１１】
本発明の別の具体的目的は、ｈＩｇＧ２の全体的または実質的に全体的なヒンジ及びＣＨ１領域、そして場合によりｈＩｇＧ２の軽鎖定常領域が、非ヒトＩｇＧ２抗体、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭの対応する軽鎖定常領域、ヒンジ及びＣＨ１領域または領域を交換するために用いられる、ヒトＩｇＧ２アイソタイプではない修飾されたアゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体を提供することである。
【００１２】
本発明のより具体的な目的は、ヒト免疫細胞で発現される受容体またはリガンドに特異的に結合するアゴニスト抗体であって、前記抗体が、前記受容体もしくはリガンドにより誘発された１つもしくは複数の生物学的活性、または前記リガンドと受容体との相互作用により誘発された生物学的活性を刺激し、さらに前記アゴニスト抗体が、ヒトＩｇＧ２の少なくともＣＨ１及びヒンジ領域（「Ｈ２領域」）を含み、得られたアゴニスト抗体のアゴニスト性を、前記ＩｇＧ２領域の１つまたは複数のシステイン残基が不変であり他が同一の抗体よりも増強させるために、前記１つまたは複数のシステイン残基が除去されるか、または異なるアミノ酸残基に変換されている、アゴニスト抗体を提供することである。
【００１３】
本発明の別の具体的な目的は、ヒト細胞表面で発現される受容体またはリガンドに特異的に結合する修飾された抗体であって、前記修飾された抗体が、前記受容体もしくはリガンドにより誘発された１つもしくは複数の生物学的活性、または前記リガンドとその対応する受容体との相互作用により誘発された生物学的活性を刺激し、前記抗体がヒトＩｇＧ２抗体以外であり、さらにヒトＩｇＧ２以外である前記修飾された抗体の全体的または実質的に全体的なヒンジ及びＣＨ１ドメイン、そして場合により軽鎖定常領域が、ｈＩｇＧ２抗体の対応する全体的または実質的に全体的なヒンジ及びＣＨ１ドメイン（「Ｈ２領域」または「Ｈ２ドメイン」）、そして場合により軽鎖定常領域と交換されている、修飾された抗体を提供することである。
【００１４】
本発明の別の具体的目的は、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭから選択される上記の修飾された抗体であって、前記抗体の全体的または実質的に全体的なヒンジ及びＣＨ１ドメインが、ｈＩｇＧ２の対応する全体的または実質的に全体的なヒンジ及びＣＨ１ドメイン（「Ｈ２領域」または「Ｈ２ドメイン」）と交換されている、修飾された抗体を提供することである。
【００１５】
本発明の別の具体的目的は、１２７位（ナンバリングはＫａｂａｔによる）の重鎖システイン残基及び２１４位の軽鎖システイン残基のいずれか一方または両方が、欠失されているか、または異なるアミノ酸残基に変換されて、得られた修飾された抗体のアゴニスト
性が、前記システイン残基のいずれか一方または両方が不変であり他が同一の抗体よりも増強される、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００１６】
本発明の別の具体的目的は、突然変異または欠失される前記修飾された抗体のＨ２領域の唯一のシステイン残基が、該軽鎖の２１４位のシステインであり、前記修飾された抗体が、（ｉ）システイン残基がＨ２領域で欠失もしくは修飾されていない重鎖を含むか、または（ｉｉ）該重鎖の１２７、２３２もしくは２３３位のシステイン残基の１つまたは複数が欠失もしくは突然変異されて、得られた修飾された抗体のアゴニスト性が前記欠失もしくは修飾を欠き他が同一の抗体よりも増強されている修飾された抗体を生じる、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００１７】
本発明の別の具体的目的は、修飾されたｈＩｇＧ１またはｈＩｇＧ３を含む、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００１８】
本発明の別の具体的目的は、ヒト免疫細胞に特異的に結合する、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００１９】
本発明の別の具体的目的は、樹状細胞、肥満細胞、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球または前述のものの任意の組み合わせに結合する、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００２０】
本発明の別の具体的目的は、前記修飾が存在しなければ、抗体がアゴニスト活性を欠く、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００２１】
本発明の別の具体的目的は、前記修飾が存在しなければ、アゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアゴニスト活性を検出すると、抗体が修飾された抗体のアゴニスト活性の１０％以下を有する、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００２２】
本発明の別の具体的目的は、前記修飾が存在しなければ、アゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアゴニスト活性を検出すると、抗体が修飾された抗体のアゴニスト活性の２０％以下を有する、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００２３】
本発明の別の具体的目的は、前記修飾が存在しなければ、アゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアゴニスト活性を検出すると、抗体が修飾された抗体のアゴニスト活性の３０％以下を有する、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００２４】
本発明の別の具体的目的は、前記修飾が存在しなければ、アゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアゴニスト活性を検出すると、抗体が修飾された抗体のアゴニスト活性の４０％以下を有する、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００２５】
本発明の別の具体的目的は、前記修飾が存在しなければ、アゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアゴニスト活性を検出すると、抗体が修飾された抗体のアゴニスト活性の５０％以下を有する、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００２６】
本発明の別の具体的目的は、前記修飾が存在しなければ、アゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアゴニスト活性を検出すると、抗体が修飾された抗体のアゴニスト活性の５０〜８０％以下を有する、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００２７】
本発明の別の具体的目的は、前記抗体が、ヒト受容体もしくはリガンドにより誘発された１つもしくは複数の生物学的活性、または前記リガンドと対応する受容体との相互作用
により誘発された生物学的活性を刺激し、さらに前記修飾された抗体が、ｈＩｇＧ２の少なくとも軽鎖定常領域、ならびに重鎖領域のＣＨ１及びヒンジ（「Ｈ２領域」）を含み、１２７位（アミノ酸のナンバリングはＫａｂａｔによる）の重鎖システイン残基及び２１４位の軽鎖システイン残基から選択されるシステイン残基のいずれか一方または両方が、除去されるか、または異なるアミノ酸残基に変換されて、得られたアゴニスト抗体のアゴニスト性が、前記システイン残基の両方が不変であり他が同一の抗体よりも増強される、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００２８】
本発明の別の具体的目的は、２１４位の前記修飾された抗体の軽鎖のシステイン残基が、欠失または突然変異されており、前記修飾された抗体が、（ｉ）Ｈ２領域内のシステイン残基が欠失もしくは突然変異されていない重鎖を含むか、または（ｉｉ）前記修飾された抗体が、１２７、２３２もしくは２３３位のシステイン残基の少なくとも１つが欠失もしくは突然変異された重鎖を含む、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００２９】
本発明の別の具体的目的は、重鎖のＨ２領域内のシステイン残基が欠失または突然変異されていない、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００３０】
本発明の別の具体的目的は、重鎖内の１２７、２３２または２３３位のシステイン残基の少なくとも１つが欠失または突然変異されている、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００３１】
本発明の別の具体的目的は、重鎖内の１２７、２３２または２３３位のシステイン残基の１つまたは２ついずれかの組み合わせが欠失または突然変異されている、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００３２】
本発明の別の具体的目的は、該修飾された抗体のＨ２領域が、ｈ２Ｂ立体配座である、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００３３】
本発明の別の具体的目的は、除去、修飾されているか、または別のアミノ酸残基で置換されているｈＩｇＧ２重鎖Ｈ２領域内の唯一のシステイン残基が、１２７位に重鎖システイン残基を含む、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００３４】
本発明の別の具体的目的は、軽鎖領域内のシステイン残基が、除去、修飾されていないか、または別のアミノ酸残基で置換されていない、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００３５】
本発明の別の具体的目的は、除去、修飾されているか、または別のアミノ酸残基で置換されているｈＩＧ２軽鎖定常領域内の唯一のシステイン残基が、２１４位に軽鎖システイン残基を含む、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００３６】
本発明の別の具体的目的は、除去、修飾されているか、または別のアミノ酸残基で置換されているｈＩｇＧ２  Ｈ２領域の唯一のシステイン残基が、１２７位の重鎖システイン残基及び２１４位の軽鎖システイン残基から選択される、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００３７】
本発明の別の具体的目的は、軽鎖内の２１４位のシステインを置換するセリン、及び／または重鎖内の１２７位のシステイン残基を置換するセリン残基を含む、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００３８】
本発明の別の具体的目的は、ｈＩｇＧ１またはｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４アイソタイ
プの上記の修飾された抗体であって、前記ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４の全体的ヒンジ及びＣＨ１領域が、ｈＩｇＧ２の対応するヒンジ及びＣＨ１領域と交換されている、修飾された抗体を提供することである。
【００３９】
本発明の別の具体的目的は、ｈＩｇＧ１である、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００４０】
本発明の別の具体的目的は、軽鎖または重鎖Ｈ２領域内に１つまたは複数の修飾されたシステイン残基を含む、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００４１】
本発明の別の具体的目的は、該修飾された抗体のアゴニスト性に影響を及ぼさないまたは感知できる程度に影響を及ぼす（１０％以下の変化）Ｈ２領域外のさらなる修飾を含む、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００４２】
本発明の別の具体的目的は、ヒト細胞表面で発現されるＴＮＦまたはＢ７スーパーファミリーメンバー、例えばＣＤ４０、４−１ＢＢまたはＣＤ２８に特異的に結合する、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００４３】
本発明の別の具体的目的は、少なくとも１つのタイプのヒト免疫細胞で発現される受容体またはリガンドに特異的に結合する、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００４４】
本発明の別の具体的目的は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、肥満細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、及び樹状細胞、またはそれらの組み合わせから選択される免疫細胞に結合する、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００４５】
本発明の別の具体的目的は、全体的なＩｇＧ２  ＣＨ１及びヒンジ領域を含む、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００４６】
本発明の別の具体的目的は、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域を欠く、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００４７】
本発明の別の具体的目的は、前記抗体または融合物のアゴニスト性がＦｃγＲ非依存性である、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００４８】
本発明の別の具体的目的は、ＣＤ４０、ＬＴα、ＬＴβ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＴＮＦ−Ｒ、ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＧＩＴＲもしくは「グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体」、ＴＷＥＡＫ及びＦＮ１４から選択されるＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに、またはＢ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、Ｂ７−Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）、Ｂ７−Ｈ６（ＮＣＲ３ＬＧ１）、Ｂ７−Ｈ７（ＨＨＬＡ２）、ＰＤ−１（ＣＤ２７９）、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＢＴＬＡ、ＮＣＲ３、ＣＤ２８Ｈ、及びＮＫｐ３０から選択されるＢ７／ＣＤ２８ファミリーメンバーに特異的に結合する、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００４９】
本発明の別の具体的目的は、４−１ＢＢ、ＣＤ４０、もしくはＣＤ２７から選択されるＴＮＦＲメンバーに結合するか、またはＢ７／ＣＤ２８ファミリーメンバーがＣＴＬＡ−４もしくはＣＤ２８である、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００５０】
本発明の別の具体的目的は、ＬＯＢ７．４の可変領域を含む、上記の修飾された抗体を提供することである。
【００５１】
本発明の別の具体的目的は、上記の修飾された抗体の医薬的有効量を含む、そのような修飾された抗体を含む医薬組成物を提供することである。
【００５２】
本発明の別の具体的目的は、他の免疫アゴニストと一緒のそのような抗体またはそのような組成物の使用を提供することである。
【００５３】
本発明の別の具体的目的は、少なくとも１種の修飾された抗体またはそれを含む融合タンパク質の投与を含む、治療方法における上記の修飾された抗体の使用であって、前記方法が、本発明による少なくとも１種の修飾された抗体または融合タンパク質または組成含有物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の有効量の投与を含む、修飾された抗体の使用を提供することである。好ましい実施形態において、治療される状態は、癌、感染、アレルギー、自己免疫、移植、ＧＶＨＤ、または炎症から選択される。
【００５４】
本発明の別の具体的な目的は、ヒト細胞表面で発現される受容体またはリガンドに特異的に結合する修飾された抗体であって、前記修飾された抗体が、前記受容体もしくはリガンドにより誘発された１つもしくは複数の生物学的活性、または前記リガンドとその対応する受容体との相互作用により誘発された生物学的活性を減弱し、前記抗体が、ヒトＩｇＧ２抗体以外であり、さらにヒトＩｇＧ２以外である前記修飾された抗体の全体的または実質的に全体的なヒンジ及びＣＨ１ドメイン、そして場合により軽鎖定常領域が、ｈＩｇＧ２抗体の対応する全体的または実質的に全体的なヒンジ及びＣＨ１ドメイン及び軽鎖定常領域（「Ｈ２領域」または「Ｈ２ドメイン」）と交換され、Ｈ２領域内のシステイン残基の１つまたは複数が、場合により修飾され、前記修飾が、得られた修飾された抗体のアンタゴニスト性を増強する、修飾された抗体を提供することである。
【００５５】
本発明の別の具体的目的は、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭから選択される上記の修飾されたアンタゴニスト抗体であって、前記抗体の全体的または実質的に全体的なヒンジ及びＣＨ１ドメイン、そして場合により軽鎖定常領域が、ｈＩｇＧ２の対応する全体的または実質的に全体的なヒンジ及びＣＨ１ドメイン及び軽鎖定常領域（「Ｈ２領域」または「Ｈ２ドメイン」）と交換されている、修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００５６】
本発明の別の具体的な目的は、２３２、２３３、２３６及び２３９位のシステイン残基から選択される前記ＩｇＧ２  Ｈ２領域の少なくとも１つのシステイン残基が、除去されるか、または異なるアミノ酸残基に変換されて、得られた修飾された抗体のアンタゴニスト性が、１つまたは複数のシステイン残基が不変であり他は同一の抗体よりも増強される、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００５７】
本発明の別の具体的な目的は、該修飾された抗体の軽鎖内の残基２１４のシステイン及び重鎖内の残基１２７のシステインが、欠失、修飾されておらず、または他のアミノ酸残基で置換されていない、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００５８】
本発明の別の具体的な目的は、該抗体のＨ２領域内のシステイン修飾が、軽鎖の２１４位のシステイン及び重鎖の１２７位のシステインを介して、修飾された抗体の重鎖と軽鎖との会合に選択的に好適であるか、またはその会合をもたらす、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００５９】
本発明の別の具体的な目的は、該修飾された抗体のＨ２領域が、ｈ２Ａ立体配座である、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００６０】
本発明の別の具体的な目的は、Ｃ２１４及びＣ１２７以外のＨ２領域内のシステイン残基の少なくとも１つが、セリン残基に変換されている、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００６１】
本発明の別の具体的な目的は、重鎖内の２３２位のシステインを置換したセリンを含む、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００６２】
本発明の別の具体的な目的は、重鎖内の２３３位のシステインを置換したセリンを含む、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００６３】
本発明の別の具体的な目的は、修飾されたｈＩｇＧ１またはｈＩｇＧ３を含む、上記
の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００６４】
本発明の別の具体的な目的は、ヒト免疫細胞に特異的に結合する、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００６５】
本発明の別の具体的目的は、樹状細胞、肥満細胞、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球または前述のものの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つを含む免疫細胞に結合する、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００６６】
本発明の別の具体的目的は、前記修飾が存在しなければ、抗体がアンタゴニスト活性を欠く、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００６７】
本発明の別の具体的目的は、前記修飾が存在しなければ、アンタゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアンタゴニスト活性を検出すると、抗体が修飾された抗体のアンタゴニスト活性の１０％以下を有する、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００６８】
本発明の別の具体的目的は、前記修飾が存在しなければ、アンタゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアンタゴニスト活性を検出すると、抗体が修飾された抗体のアンタゴニスト活性の２０％以下を有する、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００６９】
本発明の別の具体的目的は、前記修飾が存在しなければ、アンタゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアンタゴニスト活性を検出すると、抗体が修飾された抗体のアンタゴニスト活性の３０％以下を有する、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００７０】
本発明の別の具体的目的は、前記修飾が存在しなければ、アンタゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアンタゴニスト活性を検出すると、抗体が修飾された抗体のアンタゴニスト活性の４０％以下を有する、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００７１】
本発明の別の具体的目的は、前記修飾が存在しなければ、アンタゴニズムを定量するための許容されたアッセイでアンタゴニスト活性を検出すると、抗体が修飾された抗体のアンタゴニスト活性の５０％以下を有する、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００７２】
本発明の別の具体的な目的は、ヒト細胞で発現される受容体またはリガンドに特異的に結合する、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体であって、前記抗体が、前記受容体もし
くはリガンドにより誘発された１つもしくは複数の生物学的活性、または前記リガンドと対応する受容体との相互作用により誘発された生物学的活性を減弱し、さらに前記アンタゴニスト抗体が、ヒトＩｇＧ２の少なくともＣＨ１及びヒンジ重鎖及び軽鎖定常領域（「Ｈ２領域」）を含み、２３２、２３３、２３６及び２３９位のシステイン残基から選択される前記ＩｇＧ２  Ｈ２領域の少なくとも１つのシステイン残基が、除去されるか、または異なるアミノ酸残基に変換されて、得られたアンタゴニスト抗体のアンタゴニスト性が、前記１つまたは複数のシステイン残基が不変であり他が同一である抗体よりも増強される、アンタゴニスト抗体を提供する。
【００７３】
本発明の別の具体的な目的は、軽鎖の２１４位及び重鎖の１２７位のシステイン残基が、欠失、修飾されていない、または別のアミノ酸と置換されていない、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００７４】
本発明の別の具体的な目的は、ｈＩｇＧ２  Ｈ２領域内の１つもしくは複数のシステイン、または他のアミノ酸残基が、除去、修飾されているか、または別のアミノ酸残基と置換されて、ｈ２Ａ立体配座であるＨ２領域をもたらす、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００７５】
本発明の別の具体的な目的は、ｈＩｇＧ２  Ｈ２領域内の前記システイン残基の少なくとも１つが、セリン残基に変換されている、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００７６】
本発明の別の具体的な目的は、重鎖内の２３２位にシステイン残基を置換したセリンを含む、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００７７】
本発明の別の具体的な目的は、重鎖内の２３３位にシステイン残基を置換したセリンを含む、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００７８】
本発明の別の具体的目的は、ヒト細胞表面で発現されるＴＮＦもしくはＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、またはＢ７ファミリーメンバーに特異的に結合する、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００７９】
本発明の別の具体的目的は、ヒト免疫細胞の少なくとも１タイプに特異的に結合する、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００８０】
本発明の別の具体的目的は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、マクロファージ、単球、ＮＫ細胞、または樹状細胞で発現される受容体またはリガンドに特異的に結合する、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００８１】
本発明の別の具体的目的は、全体的なヒトＩｇＧ２重鎖及び軽鎖定常領域を含む、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００８２】
本発明の別の具体的目的は、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域を欠く、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００８３】
本発明の別の具体的目的は、前記抗体のアンタゴニスト性が、ＦｃγＲ非依存性である、上記のアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００８４】
本発明の別の具体的目的は、該抗体が、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＬＴα、ＬＴβ、ＦＡＳＬ（ＣＤ１７８）、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３）、ＣＤ２７、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ／ＡＰＯ−２Ｌ、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＴＮＦ、ＴＮＦ−Ｒ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＧＩＴＲまたは「グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体」、ＴＷＥＡＫ及びＦＮ１４から選択されるＴＮＦ／Ｒスーパーファミリーメンバーに特異的に結合する、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００８５】
本発明の別の具体的目的は、ＴＮＦ／ＲまたはＢ７ファミリーメンバーが、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、Ｂ７．１、Ｂ７．２、またはＣＤ７０である、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００８６】
本発明の別の具体的目的は、本発明による修飾された抗体または融合タンパク質含有物の有効量を含む、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体を医薬組成物に提供することである。
【００８７】
本発明の別の具体的目的は、別の免疫アンタゴニストまたは別の活性剤を含み得る、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体またはその使用を、医薬組成物に提供することである。
【００８８】
本発明の別の具体的目的は、本発明による少なくとも１種のアンタゴニスト抗体または融合タンパク質または組成含有物の投与を含む、治療方法における上記の修飾されたアンタゴニスト抗体の使用であって、そのような状態として、好ましくは、癌、アレルギー、感染性疾患、自己免疫、移植、ＧＶＨＤ、または炎症の状態を挙げることができる、修飾されたアンタゴニスト抗体の使用を提供することである。
【００８９】
本発明の別の具体的目的は、例えば癌、感染、アレルギー、自己免疫または炎症などの状態を治療するのに用いられ得る、ＬＯＢ７．４の可変領域を含む抗体の投与、またはＣＤ４０、４−１ＢＢ、もしくはＣＤ２８に特異的な別の抗体の投与を含む、上記の修飾されたアンタゴニスト抗体またはその使用を提供することである。
【００９０】
本発明の別の具体的目的は、ジスルフィドシャッフリングを改変するようにヒンジ領域が修飾されている、全体的なヒトＩｇＧ２定常領域を含む、新規なＩｇＧ２アゴニスト抗体または融合タンパク質含有物を提供することである。
【００９１】
本発明の別の具体的目的は、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃまたは別のＦｃ領域を含有しない、新規なＩｇＧ２アゴニスト抗体または融合タンパク質含有物を提供することである。
【００９２】
本発明の別の具体的目的は、ヒトＩｇＧ２の全体的または実質的に全体的なヒンジ及びＣＨ１領域、そして場合によりｈＩｇＧ２の軽鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３  ＩｇＧ４、ＩｇＡまたはＩｇＭの同じドメインまたは領域を交換するために用いられ、場合により前記導入されたｈＩｇＧ２ヒンジ及び／またはｈＩｇＧ２  ＣＨ１領域及び軽鎖定常領域が、得られた修飾された抗体のアゴニスト性またはアンタゴニスト性を増強する１つまたな複数の突然変異を含み得る、新規なアンタゴニスト抗体またはアゴニスト抗体を提供することである。
【００９３】
本発明の別の具体的目的は、新規なアゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体であって、前記抗体または融合物のアゴニスト性が、ＦｃγＲ非依存性である、アゴニストまたはアンタゴニスト抗体を提供することである。
【００９４】
本発明の別の具体的目的は、ＣＤ４０、ＬＴα、ＬＴβ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＴＮＦ、ＴＮＦ−Ｒ、ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＧＩＴＲまたは「グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体」、ＴＷＥＡＫ及びＦＮ１４から選択されるＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに特異的に結合する新規なアゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体、ならびにヒト治療におけるその使用を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１Ａ】図１（ａ）〜（ｆ）は、ヒトＩｇＧ２が抗ｈＣＤ４０  ｍＡｂであるＬＯＢ７．４にＦｃγＲ非依存性アゴニスト活性を付与することを示す実験の結果を含む。
【図１Ｂ】図１（ａ）〜（ｆ）は、ヒトＩｇＧ２が抗ｈＣＤ４０  ｍＡｂであるＬＯＢ７．４にＦｃγＲ非依存性アゴニスト活性を付与することを示す実験の結果を含む。
【図１Ｃ】図１（ａ）〜（ｆ）は、ヒトＩｇＧ２が抗ｈＣＤ４０  ｍＡｂであるＬＯＢ７．４にＦｃγＲ非依存性アゴニスト活性を付与することを示す実験の結果を含む。
【図１Ｄ】図１（ａ）〜（ｆ）は、ヒトＩｇＧ２が抗ｈＣＤ４０  ｍＡｂであるＬＯＢ７．４にＦｃγＲ非依存性アゴニスト活性を付与することを示す実験の結果を含む。
【図１Ｅ】図１（ａ）〜（ｆ）は、ヒトＩｇＧ２が抗ｈＣＤ４０  ｍＡｂであるＬＯＢ７．４にＦｃγＲ非依存性アゴニスト活性を付与することを示す実験の結果を含む。
【図１Ｆ】図１（ａ）〜（ｆ）は、ヒトＩｇＧ２が抗ｈＣＤ４０  ｍＡｂであるＬＯＢ７．４にＦｃγＲ非依存性アゴニスト活性を付与することを示す実験の結果を含む。
【図２Ａ】図２（ａ）〜（ｃ）は、ヒトＩｇＧ２が別の抗ＴＮＦＲＳＦ  ｍＡｂにＦｃγＲ非依存性活性を付与することを示す実験の結果を含む。
【図２Ｂ】図２（ａ）〜（ｃ）は、ヒトＩｇＧ２が別の抗ＴＮＦＲＳＦ  ｍＡｂにＦｃγＲ非依存性活性を付与することを示す実験の結果を含む。
【図２Ｃ】図２（ａ）〜（ｃ）は、ヒトＩｇＧ２が別の抗ＴＮＦＲＳＦ  ｍＡｂにＦｃγＲ非依存性活性を付与することを示す実験の結果を含む。
【図３Ａ】図３（ａ）〜（ｄ）は、ｈ２  ＣＨ１及びヒンジ領域がＬＯＢ７．４にＦｃγＲ非依存性アゴニスト活性を付与することを示す実験の結果を含む。
【図３Ｂ】図３（ａ）〜（ｄ）は、ｈ２  ＣＨ１及びヒンジ領域がＬＯＢ７．４にＦｃγＲ非依存性アゴニスト活性を付与することを示す実験の結果を含む。
【図３Ｃ】図３（ａ）〜（ｄ）は、ｈ２  ＣＨ１及びヒンジ領域がＬＯＢ７．４にＦｃγＲ非依存性アゴニスト活性を付与することを示す実験の結果を含む。
【図３Ｄ】図３（ａ）〜（ｄ）は、ｈ２  ＣＨ１及びヒンジ領域がＬＯＢ７．４にＦｃγＲ非依存性アゴニスト活性を付与することを示す実験の結果を含む。
【図４Ａ】図４（ａ）〜（ｅ）は、ＬＯＢ７．４  ｈ２のアゴニスト活性がｈ２Ｂ立体配座を採用する能力に依存することを示す実験の結果を含む。
【図４Ｂ】図４（ａ）〜（ｅ）は、ＬＯＢ７．４  ｈ２のアゴニスト活性がｈ２Ｂ立体配座を採用する能力に依存することを示す実験の結果を含む。
【図４Ｃ】図４（ａ）〜（ｅ）は、ＬＯＢ７．４  ｈ２のアゴニスト活性がｈ２Ｂ立体配座を採用する能力に依存することを示す実験の結果を含む。
【図４Ｄ】図４（ａ）〜（ｅ）は、ＬＯＢ７．４  ｈ２のアゴニスト活性がｈ２Ｂ立体配座を採用する能力に依存することを示す実験の結果を含む。
【図４Ｅ】図４（ａ）〜（ｅ）は、ＬＯＢ７．４  ｈ２のアゴニスト活性がｈ２Ｂ立体配座を採用する能力に依存することを示す実験の結果を含む。
【図５−１】図５（ａ）〜（ｅ）は、抗マウスＣＤ４０  ｍＡｂである３／２３のアイソタイプ依存性を示す実験を含む。
【図５−２】図５（ａ）〜（ｅ）は、抗マウスＣＤ４０  ｍＡｂである３／２３のアイソタイプ依存性を示す実験を含む。
【図５−３】図５（ａ）〜（ｅ）は、抗マウスＣＤ４０  ｍＡｂである３／２３のアイソタイプ依存性を示す実験を含む。
【図６Ａ】図６（ａ）〜（ｅ）は、ＬＯＢ７．４ヒトＩｇＧ２がヒト細胞上のヒトＩｇＧ１よりも活性があり、ＦｃγＲ相互作用に非依存性であることを実証する実験の結果を含む。
【図６Ｂ】図６（ａ）〜（ｅ）は、ＬＯＢ７．４ヒトＩｇＧ２がヒト細胞上のヒトＩｇＧ１よりも活性があり、ＦｃγＲ相互作用に非依存性であることを実証する実験の結果を含む。
【図６Ｃ】図６（ａ）〜（ｅ）は、ＬＯＢ７．４ヒトＩｇＧ２がヒト細胞上のヒトＩｇＧ１よりも活性があり、ＦｃγＲ相互作用に非依存性であることを実証する実験の結果を含む。
【図６Ｄ】図６（ａ）〜（ｅ）は、ＬＯＢ７．４ヒトＩｇＧ２がヒト細胞上のヒトＩｇＧ１よりも活性があり、ＦｃγＲ相互作用に非依存性であることを実証する実験の結果を含む。
【図６Ｅ】図６（ａ）〜（ｅ）は、ＬＯＢ７．４ヒトＩｇＧ２がヒト細胞上のヒトＩｇＧ１よりも活性があり、ＦｃγＲ相互作用に非依存性であることを実証する実験の結果を含む。
【図７Ａ】図７（ａ）〜（ｄ）は、ｈ２Ａ及びｈ２Ｂのアンタゴニスト性及びアゴニスト性を実証する実験の結果を含む。
【図７Ｂ】図７（ａ）〜（ｄ）は、ｈ２Ａ及びｈ２Ｂのアンタゴニスト性及びアゴニスト性を実証する実験の結果を含む。
【図７Ｃ】図７（ａ）〜（ｄ）は、ｈ２Ａ及びｈ２Ｂのアンタゴニスト性及びアゴニスト性を実証する実験の結果を含む。
【図７Ｄ】図７（ａ）〜（ｄ）は、ｈ２Ａ及びｈ２Ｂのアンタゴニスト性及びアゴニスト性を実証する実験の結果を含む。
【図８】図８（ａ）〜（ｈ）は、抗ＣＤ４０活性に及ぼす異なるヒトアイソタイプの影響を示す実験を含む。
【図９】図９（ａ）〜（ｇ）は、図８の実験の抗ＣＤ４０活性に及ぼすアイソタイプの影響をさらに検証する対照実験を含む。
【図１０】図１０（ａ）〜（ｅ）は、ヒトＩｇＧ２のＦｃγＲ非依存性活性を示す実験データを含む。
【図１１】図１１（ａ）〜（ｆ）は、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２アゴニスト活性がＦｃγＲ非依存性であることを検証するさらなる実験データを含む。
【図１２】図１２（ａ）〜（ｅ）は、複数の受容体ターゲットに対するヒトＩｇＧ２のアンタゴニスト効果を示すデータを含む。
【図１３】図１３（ａ）及び（ｂ）は、ＣＨ１及びヒンジ領域がＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２に活性を与えることを示す実験を含む。
【図１４】ＣｈｉＬｏｂ７／４スイッチ突然変異体がＣＤ４０に同様に結合することを検証する対照実験を含む。
【図１５】図１５（ａ）〜（ｉ）は、変異誘発性が一定範囲のＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２アゴニスト形態を生成することを示す変異誘発性実験の結果を要約している。
【図１６】図１６（ａ）〜（ｇ）は、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２Ａ及びｈ２Ｂ形態の異なる活性を検証するさらなる実験データを含む。
【図１７】異なってジスルフィド結合されたｈ２アイソフォームの略図を含む（（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ２００８）により適合）。左のパネルは、ｈ２が合成された形態であると考えられるｈ２Ａの構造を示し、右のパネルのｈ２Ｂは、主な交互配列形態を示す。シャッフリングに関与するシステイン残基が、強調されている。ジスルフィド結合が、鎖間、または鎖内の黒色の線により表されている。示されたＣＥ−ＳＤＳプロファイルは、ｈ２Ａ及びｈ２Ｂ形態の分解を示すが（参照に記載）、ｈ１は、単一ピークとして分解されている。
【図１８】図１８（ａ）は、異なってジスルフィド結合されたｈ２アイソフォームの略図を含み（（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ２００８）により適合）、図１８（ｂ）は、示されたＣｈｉＬｏｂ７／４  ｍＡｂのｎｒＣＥ−ＳＤＳプロファイルを示す。ｈ２Ａ及びｈ２Ｂの位置及び１０ｋＤａ標準が、示されている。
【図１９】変異誘発性がｈ２ａ及びｈ２Ｂ形態に抗体をどのように「ロック」し得るかを略図で示している。
【図２０】同上。
【図２１】同上。
【図２２】ｈ２の変異誘発性が異なるアゴニスト及びアンタゴニストをどのように生成するかを示す実験データを含む。
【図２３】同上。
【図２４】同上。
【図２５】同上。
【図２６】ｈ２Ｂ及びｈ２Ａ形態を対比させて、それらのアゴニスト性またはアンタゴニスト性が抗原キャッピングまたはＮＦｋＢ活性化を含み得ることを示唆する実験データを含む（多量体化がＦｃγＲｘ−架橋の要求を上回る可能性を示唆する）。
【図２７】抗ＣＤ４０抗体の異なるアイソタイプ形態の免疫刺激性を示す実験データを含む。
【図２８】Ｂ細胞増殖に及ぼす抗ＣＤ４０抗体の異なるアイソタイプ形態の影響を示すＢ細胞アッセイの結果を含む。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
定義
上述のように、本発明は、広くは新規アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体、及び融合タンパク質、ならびに治療におけるそれらの製造及び使用に関するものであり、ここで、当該抗体または融合タンパク質はヒトＩｇＧ２定常ドメインを含有し、当該ドメインに、当該抗体は特定の変異を有し、それにより当該抗体または融合タンパク質は強化されたアゴニスト性若しくはアンタゴニスト性を有する。
【００９７】
本発明は、特定の方法論、プロトコール、細胞株、動物種または属、及び記載される試薬に限定されず、それら自体が変化し得ることを理解されたい。また、本明細書に用いられる専門用語は特定の実施形態を記載するという目的のためのみであり、本発明の範囲の限定を意図するものではなく、本発明は添付の請求項によってのみ限定されることを理解されたい。本明細書において、単数形の「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」とは、明確に別段の記載がない限り、複数の対象を含む。従って、たとえば「ａ  ｃｅｌｌ」という言及は、複数のかかる細胞を含み、及び「ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ」という言及は、１以上のタンパク質、及び当分野の当業者等に公知のそれらの同等物に対する言及を含む。本明細書に用いられているすべての技術的用語及び科学的用語は、明確に別段の記載がない限り、本発明が属する分野の当業者が普遍的に理解している意味と同じ意味を有する。
【００９８】
「アゴニスト」とは、受容体を組み合わされて、細胞反応を生じさせることができる化合物を指す。アゴニストは、受容体に直接結合するリガンドであってもよい。あるいは、アゴニストは、たとえば（ａ）受容体に直接結合する他の分子と複合体を形成する、または（ｂ）他の化合物が受容体に直接結合するよう、他の化合物に修飾を生じさせる、ことにより、間接的に受容体と結合してもよい。アゴニストは、特定の受容体、または受容体ファミリーのアゴニストと呼称されてもよい（たとえばＴＮＦアゴニストまたはＴＮＦＲアゴニスト）。「スーパーアゴニスト」は、ヒンジ及びＣＨ１領域のシステインに最適なアゴニスト性をもたらす変異を有するアゴニストである。
【００９９】
「アンタゴニスト」とは、たとえばＴＮＦまたはＴＮＦＲファミリー等の対象の分子と相互作用した際に、スーパーファミリーのメンバー、または他のリガンド若しくは受容体に、当該アンタゴニストの非存在下では認められる活性または機能の規模と比較し、当該分子の特定の活性または機能の規模の低下をもたらす化合物を指す。対象の特定のアンタゴニストとしては、ＩｇＧ２定常ドメインを含有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーに対して特異的な抗体及び融合タンパク質が挙げられる。
【０１００】
「抗原」とは、免疫反応の標的となることができる任意の物質を指す。抗原は、対象生物により引き起こされるたとえば細胞介在性免疫反応及び／または液性免疫反応等の標的でありうる。あるいは、抗原は、免疫細胞と接触した際の細胞性免疫反応（たとえば免疫細胞成熟、サイトカイン産生、抗体産生等）の標的であり得る。
【０１０１】
本明細書において、「ＴＮＦ／Ｒ」とは概して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ：Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ）スーパーファミリー、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ：Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）スーパーファミリーのいずれかの任意のメンバーを指す。ＴＮＦ及びＴＮＦＲスーパーファミリーとしてはたとえばＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＬＴα、ＬＴβ、ＬＴ−βＲ、ＦＡＳＬ（ＣＤ１７８）、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３）、ＣＤ２７、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ／ＡＰＯ−２Ｌ、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＴＮＦ、ＴＮＦ−Ｒ、ＴＮＦ−Ｒ２、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＧＩＴＲまたは“グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体：ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ”、ＧＩＴＲリガンド、ＲＥＬＴ、ＴＷＥＡＫ、ＦＮ１４、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＧＩＴＲ、ＴＲＯＹ、及びＲＥＬＴが挙げられる。他で記載がない限り、ＴＮＦ／Ｒアゴニスト性化合物またはアンタゴニスト性化合物という言及は、任意の薬学的に許容な形態の化合物を含みうる。
【０１０２】
「Ｂ７ファミリーのメンバー」または「Ｂ７−ＣＤ２８ファミリーのメンバー」とは、免疫シグナル伝達に関与する免疫細胞上に発現される受容体及びリガンドの大きなファミリーのメンバーを指す。Ｂ７ポリペプチドファミリーのメンバーに共通の、典型的な構造的要素は、Ｖ様Ｉｇドメイン及びＣ様Ｉｇドメインを含む細胞外ドメインを含む。シグナル配列は、全長Ｂ７ファミリーポリペプチドのＮ末端に存在し、Ｎ末端からＣ末端の順序で、Ｖ様Ｉｇドメイン、Ｃ様Ｉｇドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインと続く。Ｂ７ポリペプチドの細胞外ドメインの中に、ある重要な残基が存在する。二対の保存システイン残基であり、一対は各Ｉｇドメインにあり、ジスルフィド結合の形成及び当該ポリペプチドの三次元立体配座に関与する。Ｂ７ポリペプチドファミリーは適度に保存されており、ヒトファミリーのメンバーのＩｇドメインは互いに、及び多種由来のＢ７ファミリーのメンバーのＩｇドメインに非常に類似している。当該ファミリーは、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、及びＢ７−Ｈ１を含むサブファミリー、ならびにＢ３０．２ドメインを欠く免疫調節性Ｂ７サブファミリー及びＢ３０．２ドメインを有するブチロフィリン／ＭＯＧサブファミリーを伴うブチロフィリン（ＢＴＮ）／ＭＯＧ（ミエリン希突起神経膠細胞様）ファミリーのメンバー、を含む。Ｂ７／ＣＤ２８スーパーファミリーのメンバーとしては、例としては、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２またはＣＤ２７３）、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、Ｂ７−Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）、Ｂ７−Ｈ６（ＮＣＲ３ＬＧ１）、Ｂ７−Ｈ７（ＨＨＬＡ２）、ＰＤ−１（ＣＤ２７９）、ＰＤ−Ｌ３、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＢＴＬＡ、ＮＣＲ３、ＣＤ２８Ｈ、及びＮＫｐ３０が挙げられる。
【０１０３】
たとえばＴＮＦ若しくはＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー、または他の免疫細胞受容体等、「Ｘを伴う生物学的影響」、及び「Ｘ活性」という用語は、相互交換可能に用いられ、ならびに、たとえばＴＮＦまたはＴＮＦ／Ｒスーパーファミリーのメンバー等、アゴニストまたはアンタゴニストが特異的に相互作用する部分と関連した任意の生物学的影響を含む。
【０１０４】
本明細書において、「宿主細胞」という用語は、一般的に本発明に従う１つ以上の抗体
ポリペプチドを発現するよう操作された任意の細胞を指す。例として、これには、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、ほ乳類の細胞、たとえば昆虫等の無脊椎動物の細胞、植物の細胞、及び鳥類の細胞が含まれる。
【０１０５】
「発現ベクター」という用語は、標的宿主細胞内における外来性タンパク質の発現の操作を容易にするための要素を含有するＤＮＡベクターを指す。便宜上、形質転換のためのＤＮＡ配列及び産生の操作は、たとえば大腸菌等の細菌宿主において最初に行われ、及び通常、ベクターはかかる操作を容易にするための、細菌の複製起源及び適切な細菌選択マーカーをはじめとする配列を含む。選択マーカーは選択培養培地中で増殖した形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有したベクターで形質転換されなかった宿主細胞は当該培養培地中で生存できない。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒物に対する抵抗性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性に関する欠損を補完するタンパク質、または（ｃ）複合培地からは得ることができない重要な栄養素を供給するタンパク質、をコードする。例示的な酵母の形質転換用ベクター及び形質転換方法は、たとえば、Ｂｕｒｋｅ，Ｄ．，Ｄａｗｓｏｎ，  Ｄ．，＆  Ｓｔｅａｒｎｓ，Ｔ．（２０００）．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ａ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏｕｒｓｅ  ｍａｎｕａｌ．  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。対象の配列をコードするポリペプチドは、酵母細胞中での当該ポリペプチドの発現をもたらす転写制御配列及び翻訳制御配列に操作可能に連結されている。これらベクターの構成要素は、限定されないが、以下の１つ以上を含みうる。エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。ポリペプチド分泌のための配列としては、たとえばシグナル配列等が挙げられ得る。発現ベクターとしては酵母の複製起源は任意選択的であり、多くの場合、酵母ゲノムに組み込まれている。本発明の１つの実施形態において、対象のポリペプチドは、当該ポリペプチドに最適化された酵母２倍体細胞からの分泌をもたらすための配列に操作可能に連結、または融合されている。
【０１０６】
本明細書において、「抗体ドメイン」または「領域」とは、抗体分子の明確に異なる部分またはサブユニットを指す。ＩｇＧの場合、重鎖は「ＣＨ３」、「ＣＨ２」、「ＣＨ１」（定常部分）、及びＶＨ（可変部分）の４つのサブユニットを有する。軽鎖は、ＣＬ及びＶＬの２つのサブユニットを有する。２つのＣＨ３ユニットは直接結合される一方で、ＣＨ２ユニットはオリゴ糖により分離される。ＣＨ１ユニットは重鎖の「ヒンジ」を過ぎた位置にあり、ジスルフィド結合によりＣＬユニットに結合される。通常、「ＣＨ２ドメイン」はＥＵナンバリングシステムに従う、ＩｇＧの残基の約２３１から約３４０にわたる。ＣＨ２ドメインは他のドメインと近接して対形成していないという点でユニークである。損なわれていない天然型ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間にはむしろ２つのＮ結合型分枝炭化水素鎖が割り込んでいる。この炭化水素は、ドメイン−ドメインの対形成の代わりを務め、ＣＨ２ドメインの安定化に寄与していると推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５）。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＣ末端側に連続残基配列を含有する（すなわち、ＥＵナンバリングシステムに従う、ＩｇＧの約アミノ酸残基３４１〜約アミノ酸残基４４７まで）。
【０１０７】
「Ｆｃ領域」という用語は一般的にイムノグロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含有する二量体の複合体を指し、Ｃ末端ポリペプチド配列は、何も損なわれていない抗体をパパイン消化することにより取得可能である配列である。Ｆｃ領域は、天然型Ｆｃ配列または変異型Ｆｃ配列を含有してもよい。イムノグロブリン重鎖のＦｃ配列の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ配列は通常、約Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、または約Ｐｒｏ２３０位のアミノ酸残基からＦｃ配列のカルボキシ末端におよぶと定義され
る。イムノグロブリンのＦｃ配列は一般的にＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの２つの定常ドメインを含有し、任意選択的にＣＨ４ドメインを含有する。本明細書において、「Ｆｃポリペプチド」とは、たとえば単量体Ｆｃ等のＦｃ領域を構成するポリペプチドの１つを意味する。Ｆｃポリペプチドは、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、若しくはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭ等の任意の適切なイムノグロブリンから得てもよい。
【０１０８】
「ｈ２Ａ」立体配座という用語は、本明細書において、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ２のヒンジとＣＨ２領域を含有する変異型抗体の特定のアイソフォームを指す。ヒトＩｇＧ２は、イムノグロブリンの中で、そのＣＨ１とヒンジ領域中のジスルフィド結合を移し替える能力という点で独特である（（２５〜２８））。ｈ２の２つのアイソフォームが主流である。ｈ２Ａは、ＣＨ１中の重鎖（ＨＣ）のＣ１２７が軽鎖（ＬＣ）のＣ２１４に連結され、４つのＨＣ間ジスルフィド結合が相対するヒンジシステインの２３２、２３３、２３６及び２３９の間に存在する、柔軟で古典的なＩｇＧの立体配座を有する。
【０１０９】
本明細書において「ｈ２Ｂ」または「ｈ２Ｂ立体配座」という用語は、ＩｇＧ２、またはｈＩｇＧ２のヒンジとＣＨ２領域を含有する変異型抗体の第二の特定のアイソフォームを指す（（２５〜２８））。ｈ２Ｂは、ｈ２Ａよりも小さく、ＨＣ  Ｃ１２７及びＬＣ  Ｃ２１４は、ＨＣヒンジシステインの２３２及び２３３とジスルフィド架橋を形成する。
【０１１０】
「ＥＵインデックス」とも呼称される「Ｋａｂａｔ」または「ＥＵナンバリングスキーム」は当分野に認識され、抗体及び特にヒト抗体の特定のアミノ酸残基の指定、ならびに全抗体または抗体断片内に含まれる特定のドメインの指定に関する、広く受け入れられたシステムである。本明細書において別段の記載がない限り、アミノ酸残基のナンバリングは、ＥＵインデックスとも呼称され、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  第５番  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．，  １９９１に記載されているＥＵナンバリングシステムに従っている。
【０１１１】
「操作可能に連結される」という用語は、他の核酸配列と機能的な関係性に配置された核酸を指す。たとえば、ポリペプチドＤＮＡが、そのポリペプチド分泌に関与する前駆タンパク質として発現される場合、シグナル配列のＤＮＡが、そのポリペプチドのＤＮＡに操作可能に連結される。たとえば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に影響を与える場合、それらは操作可能にそのコード配列に連結される。一般的に、「操作可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が連続性であり、分泌性リーダーの場合には、連続性であり、及びリーディングフレーム内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続性である必要はない。連結は、便利な制限酵素部位でのライゲーションにより行われる、あるいは当分野の当業者に公知のＰＣＲ／組み換え法により行われる（Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。もしかかる部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター、またはリンカーが、従来的な方法に従い用いられる。
【０１１２】
「プロモーター」という用語は、構造遺伝子（一般的に、約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンに対し上流（５’）に位置し、それらが操作可能に連結されている特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する非翻訳配列を指す。かかるプロモーターは数種類に分けられる。誘導性プロモーター、構成的プロモーター、及び抑制性プロモーター（リプレッサーの非存在に反応し、転写レベルを上げる）である。誘導性プロモーターは、たとえば栄養素の存在若しくは非存在、または温度変化等の培養条件の何らかの変化に反応し、その制御下にあるＤＮＡから高レベルの転写を開始させ得る。
【０１１３】
プロモーター断片もまた、宿主ゲノム中の同部位への発現ベクターの相同組み換え及び組み込みのための部位として利用することができる。あるいは、選択マーカーが相同組み換えのための部位として用いられる。
【０１１４】
本明細書において、「対象のポリペプチド」という用語は、通常、アゴニスト性、またはアンタゴニスト性のヒトＩｇＧ２抗体またはヒトＩｇＧ２融合タンパク質を指す。
【０１１５】
「所望の抗体」という用語は、通常、たとえばＴＮＦまたはＴＮＦ／Ｒスーパーファミリーのメンバー等の標的に対し特異的な元の抗体または断片を指す。「抗体」という用語は、エピトープに適合し、認識する特有の形状を有する任意のポリペプチド鎖含有分子構造を含むことが意図され、１以上の非共有結合的な相互作用が当該分子構造と当該エピトープの間で複合体を安定化させる。典型的な抗体分子はイムノグロブリンであり、たとえばヒト、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、他の哺乳類、ニワトリ、他の鳥類等のあらゆる源由来の、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等のすべてのタイプのイムノグロブリンは「抗体」であるとみなされる。
【０１１６】
対象の配列をコードする抗体は、天然型配列によりコードされる抗体、ならびに遺伝子コードの縮重を理由として開示される核酸とは配列が同一ではない核酸によりコードされる抗体、及びそれらの変異体を含む。変異ポリペプチドは、アミノ酸（ａａ）置換、付加、または欠失を含みうる。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であってもよく、またはたとえばグリコシル化部位を改変するための非必須アミノ酸を排除する置換であってもよく、または機能に必須ではない１つ以上のシステイン残基の置換または欠失によるフォールディングの失敗を最小化するための置換であってもよい。変異体は、当該タンパク質の特定の領域（たとえば機能性ドメイン、触媒性アミノ酸残基等）の生物活性を保持、または増強するように設計されてもよい。また変異体は、本明細書に開示されるポリペプチドの断片、特に機能性ドメインに相当する生物学的に活性な断片（複数含む）を含有する。クローン化遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘導法は公知である。また、本発明は、タンパク質分解に対する抵抗性を改善するために、または可溶性を最適化するために、または治療剤としてより適切なものとするために、通常の分子生物学的技術を用いて改変されるポリペプチドを含む。
【０１１７】
キメラ抗体は、ある種の抗体産生細胞から得た可変軽鎖領域及び可変重鎖領域（ＶＬ及びＶＨ）と、他種由来の定常軽鎖領域及び定常重鎖領域を結合させることによる組み換え法により作製されてもよい。典型的なキメラ抗体は、主にヒトドメインを有する抗体を作製するために、げっ歯類またはウサギの可変領域と、ヒトの定常領域を使用する。かかるキメラ抗体の作製は当分野に公知であり、標準的な方法（たとえば、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第５，６２４，６５９号に記載される方法）により行われてもよい。本明細書において、組み換えキメラ抗体は、受容体もしくはリガンドのアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして機能する抗体を得るために、ヒンジ領域で改変されたヒトＩｇＧ２定常領域を含有する。
【０１１８】
ヒト化抗体は、よりヒトに似たイムノグロブリンドメインを含有するよう、及び動物由来抗体の相補性決定領域のみを組み込むよう操作されている。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の可変領域の超可変ループの配列を注意深く検証し、ヒト抗体鎖の構造に適合させることによって得られる。複雑なように見えるが、この方法は実際には容易である。たとえば、参照により本明細書に全体で援用される米国特許第６，１８７，２８７号を参照のこと。
【０１１９】
イムノグロブリン及びその断片は、たとえば化学リンカー等のエフェクター部分、たと
えば蛍光色素、酵素、毒素、基質、生物発光物質、放射性物質、化学発光部分等の検出用部分、またはたとえばストレプトアビジン、アビジン、若しくはビオチン等の特異的結合部分を加えるために翻訳後修飾がなされてもよく、本発明方法及び組成物において使用されてもよい。
【０１２０】
現在、脊椎動物の抗体の一般的構造はよく理解されている（Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．  Ｍ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９０：５（１９７１））。抗体は分子量がおよそ２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド（軽鎖）と、分子量が５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖（重鎖）からなる。この４つの鎖は、「Ｙ」構造でジスルフィド結合により連結され、この部分において軽鎖は「Ｙ」構造の口で始まる重鎖を一括りにする。「Ｙ」構造の「枝」部分はＦａｂ領域と指定され、「Ｙ」構造の幹部分はＦＣ領域と指定される。アミノ酸配列の方向性は、「Ｙ」構造の頂上のＮ末端から、各鎖の底のＣ末端へと向かう。Ｎ末端は、それを惹起した抗原に対する特異性を有する可変領域を有し、およそ１００アミノ酸の長さであり、軽鎖と重鎖の間、及び抗体ごとに若干の差異がある。
【０１２１】
可変領域は、各鎖において定常領域に連結され、定常領域は当該鎖の残りの長さの部分にわたり、抗体の特定のクラス内において、抗体の特異性（すなわち、抗体を誘導する抗原）で変化しない。イムノグロブリン分子のクラスを決定する定常領域には５つの公知の主要クラスがある（γ、μ、α、δ、及びε（ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン）重鎖定常領域に対応するＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ）。定常領域またはクラスは、補体活性化（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第二版、ｐ．４１３−４３６，Ｈｏｌｔ，Ｒｉｎｅｈａｒｔ，Ｗｉｎｓｔｏｎ（１９７６））及び他の細胞性反応（Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ１−１８，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ（１９８０）；Ｋｏｈｌ，Ｓ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４８：１８７（１９８３））をはじめとする、抗体のその後のエフェクター機能を決定する一方で、可変領域は、反応する抗原を決定する。軽鎖はκ（カッパ）またはλ（ラムダ）のいずれかに分類される。各重鎖のクラスは、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかと共に調製されうる。軽鎖および重鎖は互いに共有結合され、２つの重鎖の「しっぽ」部分は、イムノグロブリンがハイブリドーマまたはＢ細胞のいずれかにより生成される際に共有結合的ジスルフィド結合により互いに結合される。
【０１２２】
「可変領域」または「ＶＲ」という表現は、抗原への抗体の結合に直接関与する、抗体の軽鎖および重鎖の各対内のドメインを指す。各重鎖は一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）、次いで多くの定常ドメインを有する。各軽鎖は一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）、及び他方の末端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと平行に並び、軽鎖可変ドメインは重鎖可変ドメインと平行に並んでいる。
【０１２３】
「相補性決定領域」、「超可変領域」、または「ＣＤＲ」という表現は、抗体の軽鎖または重鎖の可変領域中に存在する超可変領域、または相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）のうちの１つ以上を指す（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，（１９８７）参照）。これらの表現には、Ｋａｂａｔら（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔ  Ｅ．ら、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）により定義される超可変領域、すなわち抗体の３次元構造中の超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａ
ｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６  ９０１−９１７（１９８７））を含む。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域により他の鎖由来のＣＤＲと近接して保持され、抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲ内には、抗体−抗原相互作用においてＣＤＲにより用いられる重要な接触残基となる選択性決定領域（ＳＤＲ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ）として記載される選択アミノ酸が存在する（Ｋａｓｈｍｉｒｉ，Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６：２５−３４  （２００５））。
【０１２４】
「エピトープ」または「結合部位」は、抗原結合ペプチド（たとえば抗体）が特異的に結合する抗原上の場所または領域である。タンパク質のエピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（または、エピトープの主要抗原構成要素（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）と呼ばれる）を含有してもよく，たとえば特異的抗原結合ペプチドにより効率的に阻害されるアミノ酸残基（言い換えると、特異的抗原結合ペプチドの「足跡（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）」の内にあるアミノ酸残基）等の、結合に直接は関与しない他のアミノ酸残基を含有してもよい。
【０１２５】
第一の抗体が、第二の抗体と、「実質的に」または「少なくとも部分的に」同じエピトープに結合する、という文言は、第一の抗体に対するエピトープ結合部位が、第二の抗体のエピトープ結合部位を構成する抗原上のアミノ酸残基の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上を含有することを意味する。または、第一の抗体が、第二の抗体と実質的に若しくは部分的に同じまたは重複するエピトープとは、第一及び第二の抗体が、上述のように抗原への結合において競合するということを意味する。従って、モノクローナル抗体と「実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する」という用語は、抗体が、当該抗体と「競合する」ことを意味する。
【０１２６】
対象の抗体と「同じ若しくは重複するエピトープまたは決定基に結合する」という文言は、抗体が、当該対象の抗体が特異的に結合する抗原上の少なくとも１つ、またはすべての残基に関し、当該対象の抗体と「競合する」ことを意味する。本明細書に記載されるモノクローナル抗体と実質的または原則的に同じエピトープに結合する１つ以上の抗体の同定は、抗体競合を分析することができる様々な免疫学的スクリーニング分析法のうちの任意の１つを用いて容易に決定することができる。多くのかかる分析法が、当分野の当業者により日常的に行われている（たとえば、参照により本明細書に具体的に援用される１９９７年８月２６日に発行された米国特許第５，６６０，８２７号を参照のこと）。本明細書に記載される抗体が結合するエピトープの実際の決定は、本明細書に記載されるモノクローナル抗体と同じ、若しくは実質的に同じまたは重複するエピトープに結合する抗体の特定を、全く必要としないことが理解されるであろう。
【０１２７】
「融合タンパク質」という用語は、その個々のペプチド主鎖を介して共有結合により連結される２以上のタンパク質またはその断片を含有する分子を指し、最も好ましくは、融合タンパク質は、それらタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の遺伝子発現を介して作製される。本発明において、通常、融合タンパク質は、典型的にはアゴニスト性立体配座またはアンタゴニスト性立体配座にＨ２を固定するためにヒンジ領域を変異させたＩｇＧ２定常ドメインを含有する。
【０１２８】
「イムノグロブリン融合タンパク質」という用語は、たとえばヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメインまたはそれらの一部若しくは組合せ等のイムノグロブリン定常領域の１つ以上の部分と、ポリペプチドの機能性部分（一般的に、細胞表面蛋白質の細胞外ドメインを含有する）の融合物を指す。１つの実施形態において、細胞外ドメインまたは断片が由来するポリペプチドは、ＴＮＦスーパーファミリーのリガンド及び受容体のメンバーである。当該分子のＩｇ部分は、全体が、または部分的にＩｇＧ２イムノグロブリンに由来し、潜在的に、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ等をはじ
めとする他のイムノグロブリンアイソタイプの部分を含む。イムノグロブリン融合タンパク質は、本明細書において、ヒンジ及び／またはＣＨ１領域のシステインが可変されている、または欠失しているＦｃ融合タンパク質に対するＩｇと見なされる。
【０１２９】
従って、本発明は一般的にＩｇＧ２定常領域のドメイン、好ましくはヒンジ領域に特定の変異を含有するＩｇＧ２定常領域のドメインを含有するアゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体及びイムノグロブリン融合タンパク質に関する。本発明者らは、本明細書において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法及びｉｎ  ｖｉｖｏ法の組み合わせを用いて、ヒトＩｇＧ２（ｈ２）が、抗体、特に抗ＣＤ４０抗体、ならびに４−１ＢＢ及びＣＤ２８を含む他のＴＮＦ／ＴＮＦＲ受容体に対する抗体に、ユニークなＦｃγＲ非依存性アゴニスト活性をもたらすことを示す。より具体的には、本発明者らは、以下の実施例に記載される材料と方法を用いて示す。
【０１３０】
ヒトＩｇＧ２は、ヒトＩｇＧ１よりも抗ＣＤ４０に対し、より強力なアゴニスト活性を与える
本発明より従前には、アゴニスト性ｍＡｂに関するヒトアイソタイプの正式な調査は報告されておらず、アゴニスト性ｍＡｂとして用いるのに最適なアイソタイプは知られていなかった。特に、以下に詳細に記載されているように、抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂであるＬＯＢ７．４に関する調査は驚くべきことにｈ２の固有の活性はヒンジとＣＨ１のジスルフィド結合の正確な配置に依存していることを明らかとした。ＬＯＢ７．４をより柔軟性のある「ｈ２Ａ」、またはよりコンパクトな「ｈ２Ｂ」立体配座のいずれかに「固定」するための化学的「シャッフリング」または突然変異誘導により、それぞれアンタゴニスト性及びアゴニスト性が与えられる。この方法でｈ２を操作することにより、治療用ｍＡｂ及び治療用融合タンパク質の設計に関し直接的な関係性がある免疫刺激性または免疫抑制性の特徴のいずれかを備えるポリペプチドの開発が可能となる。
【０１３１】
以下に詳細に記載されるように、本発明者らは、ｈ１またはｈ２の定常領域とともに発現した場合の、ＣＤ４０に対するｍＡｂ、ならびに共刺激性Ｔ細胞受容体であるＣＤ２８及び４−１ＢＢに対するｍＡｂの免疫刺激性の特性を比較した。すべての場合において、本発明者らは、両方のｍＡｂのＦｃとＦｃγＲの相互作用に非依存的に、ｈ２はｈ１よりもよりアゴニスト性であったことが判明した。抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂであるＬＯＢ７．４のキメラ型の分析から、活性はｈ２ヒンジにおけるジスルフィド結合の構成に依存していたことが明らかとなった。さらに特定のシステイン残基の変異によって、ｍＡｂを、アゴニスト性立体配座またはアンタゴニスト性立体配座に固定することができた。従ってこれらの結果に基づくと、ヒトＩｇＧ２は、ＦｃγＲ非依存性アゴニスト剤、ならびに不適切な免疫活性化を阻害する阻害剤の両方の選択を可能とする、ｍＡｂ機能を操作するためのユニークな機会を提供する。
【０１３２】
抗マウスＣＤ４０ｍＡｂである３／２３を用いた従前の実験から、３／２３  ｍ１は、高度にアゴニスト性であった一方、３／２３  ｍ２ａはＦｃγＲＩＩＢに対する結合における差異を理由として非アゴニスト性であったことが示された（Ｗｈｉｔｅ  ＡＬ  ら、（２０１３）、Ｗｈｉｔｅら（２０１１））。活性に対するヒトアイソタイプの影響を分析するために、本発明者らは、３／２３及び抗ヒト（ｈ）ＣＤ４０  ｍＡｂ  ＬＯＢ７．４の可変領域をｈ１及びｈ２定常領域上にクローニングし、多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析法及びｉｎ  ｖｉｖｏ分析法において、ｍ１及びｍ２ａの活性と、それらの活性を比較した。
【０１３３】
両方のｍＡｂに関し、ｈ２は、ｍ１と類似した免疫刺激性の特性を示した一方で、ｈ１及びｍ２ａは、大部分が非活性であった（図１、２及び５を参照）。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、３／２３  ｍ１、及びｈ２は、ＯＶＡに対するＡｂ及びＣＤ８Ｔ細胞応答の両方を
強力に刺激し、脾臓ＤＣを活性化し、ワクチネーション設定（ＯＶＡ発現固形ＥＧ７腫瘍）及び治療設定（ＢＣＬ１リンパ腫モデル）の両方において腫瘍発達に対する防御をもたらした一方で、３／２３  ｈ１及びｍ２ａは、防御をもたらさなかった（図５ａ〜ｅ、及び（１８））。同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＬＯＢ７．４  ｈ２は、ＬＯＢ７．４  ｈ１よりも、活性化マーカーとして多核巨細胞化（ｃｅｌｌ  ｃｌｕｍｐｉｎｇ）または細胞凝集化（ｃｅｌｌ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）、活性化マーカーのＣＤ２３の上方制御、及び３Ｈ−チミジン取り込みにより評価したところ、単離されたヒトＢ細胞の強力な活性化をもたらし、ＣＤ７０上方制御により評価したところ、単離された初期ヒトランゲルハンス細胞も活性化した（図６ａ、ｂを参照）。
【０１３４】
ＬＯＢ７．４  ｍ２ａまたはｈ１ではなく、ＬＯＢ７．４  ｍ１及びｈ２が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈＣＤ４０ＴｇマウスＢ細胞の活性化及び増殖を可能とし（図１ａ参照）、ｈＣＤ４０Ｔｇマウスにおいて、ＯＶＡに対するＡｂ及び内因性ＣＤ８Ｔ細胞反応の相当な、及び有意な上昇を刺激した（図１ｂ、ｃ）。従って、マウス及びヒト受容体に対するｍＡｂを用いた、多くのモデル系において、ｈ２定常領域は、ｈ１よりも強力なアゴニスト活性を抗ＣＤ４０に与えた。
【０１３５】
ヒトＩｇＧ２のＦｃ−、及びＦｃγＲ−非依存性の活性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、マウスＢ細胞上の唯一のＦｃγＲであるＦｃγＲＩＩＢを含むＦｃγＲに対するＬＯＢ７．４  ｈ２の親和性が低いことが確認され、このことから、ｈ２のアゴニスト活性はＦｃγＲ非依存性であったことが示唆される。これと一致して、Ｆａｂ’２を作製するためにＬＯＢ７．４  ｈ２のＦｃを除去したところ、ヒトまたはｈＣＤ４０ＴｇマウスのＢ細胞の活性化及び増殖を促進させるその能力は低下しなかった一方で、Ｆａｂ’のさらなる開裂、またはｈ１若しくはｈ１  Ｆａｂ’２の使用により、活性が阻害された（図１ｄ及びデータは示さず）。さらに、汎阻害抗ＦｃγＲＩＩ  ｍＡｂは、ヒトＢ細胞を活性化するＬＯＢ７．４  ｈ２の能力に影響を与えなかった一方で、ＦｃγＲＩＩ過剰発現架橋細胞に誘導されるＬＯＢ７．４  ｈ１の活性を阻害した（図６ｅ）。さらに、ＬＯＢ７．４  ｍ１及びｈ２の両方が、ｈＣＤ４０ＴｇＢ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性化及び増殖を促進したが、ＦｃγＲＩＩＢの遺伝的欠失は、ｍ１の活性を失わせた一方で、ｈ２は失われなかった（図１ｅ）。最後に、ｈＣＤ４０トランスジェニックＦｃγＲＩＩＢのＷＴマウスまたはＫＯマウスがＯＶＡで免疫化された際、ＣＤ８Ｔ細胞の増殖を増大させるＬＯＢ７．４  ｍ１の能力は、ＫＯ動物において８０％超まで低下した一方で、ＦｃγＲＩＩＢの消失は、ＬＯＢ７．４  ｈ２のアゴニスト活性に影響を与えなかった（図１ｆ）。
【０１３６】
ヒトＩｇＧ２は、他の共刺激性受容体に対しアゴニスト性である。
Ｈ２定常領域はまた、他の免疫刺激性ｍＡｂに対しＦｃγＲ非依存性の活性を与えた。他の抗ｈＣＤ４０ｍＡｂ特異性のキメラｈ２（現在、臨床開発中であるＳＧＮ４０（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社））は、元々はｍ１  ＳＣ２６から誘導されたものであり（２４）、多核巨細胞化（ｃｌｕｍｐｉｎｇ）、ＣＤ２３の上方制御、及び増殖により評価したところ、単離されたヒトＢ細胞を活性化した一方で、キメラｈ１は活性化しなかった（図２ａ）。さらに、元々のＳＣ２６  ｍ１、及びＳＧＮ４０−Ｓｏｔｏｎ  ｈ２の両方が、ｈＣＤ４０ＴｇマウスＢ細胞の増殖を促進した（図２ｂ）一方で、ＦｃγＲＩＩＢが遺伝的に欠失されていた場合には、ＳＧＮ４０−Ｓｏｔｏｎ  ｈ２のみが増殖を刺激した（図２ｂ）。
【０１３７】
同様の結果が、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７；本実験室で作製されたｍＡｂ）及びＣＤ２８（ＴＧＮ１４１２特許化配列に基づく）の２つのヒトＴ細胞受容体に対するｍＡｂを用いて得られた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＴ細胞増殖を促した際、両方の標的に対しｈ２はｈ１よりもアゴニスト性であった（図２ｃ）。抗ｈＣＤ２８  ｈ２  ｍＡｂは、ＦｃγＲを
発現していない精製Ｔ細胞の多核巨細胞化及び増殖をもたらしたことからも、ＦｃγＲ非依存性の作用機序が支持される（図２ｃ）。
【０１３８】
ヒトＩｇＧ２のヒンジ及びＣＨ１ドメインは、アゴニスト活性に必須である。
ｈ２のＦｃは活性に必要ではなかったため、本発明者らは、ＬＯＢ７．４  ｈ１及びｈ２のＣＨ１、またはＣＨ１とヒンジドメインの両方のいずれかが入れ替えられているキメラｍＡｂを用いて、ＣＨ１とヒンジドメインの役割に関し研究を行った（図３）。広範なｍＡｂ濃度範囲（＜１〜＞５，０００ｎｇ／ｍｌ）にわたる、ｈＣＤ４０Ｔｇ  ＷＴまたはＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯのＢ細胞の増殖を用いて活性を測定した。天然型のＬＯＢ７．４
ｈ２は両方の細胞型に著しい活性化及び増殖をもたらし、活性ピークは約２００ｎｇ／ｍｌであった一方で、ｈ１はいずれの濃度でもほとんど反応は認められなかった（図３ａ）。ＬＯＢ７．４  ｍ１は、ＦｃγＲＩＩＢ  ＷＴでは増殖を刺激したが、ＫＯ細胞では刺激せず、低濃度ではｈ２よりもかなり効果が低かった（図３ａ、下の２つのパネル）。ＣＨ１ドメインの交換を伴うｍＡｂ（ＣＨ１  １／２、及びＣＨ１  ２／１）、またはｈ１のＣＨ１とヒンジがｈ２に移されたｍＡｂ（ヒンジ１／２）は、どちらの細胞型においても活性がほとんどなかった。対照的に、ｈ２のＣＨ１とヒンジ領域をｈ１に移した場合（ヒンジ２／１）、天然型ｈ２と同様の活性が生じた（図３ｂ）。これらデータから、ｈ２のＣＨ１及びヒンジドメインの両方が、アゴニスト活性に必須であることが示唆される。
【０１３９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのデータと一致して、ＬＯＢ７．４  ｈ１及びヒンジ１／２変異体は、ｈＣＤ４０Ｔｇマウスにおいて、ＯＶＡに対するＣＤ８Ｔ細胞反応刺激がほとんど起こらなかった一方で、ＬＯＢ７．４  ｈ２及びヒンジ２／１キメラは、抗ＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖において、相当な、および有意な上昇をもたらした（図３ｃ）。
【０１４０】
ジスルフィドシャッフリングは、ｈｕＩｇＧ２アゴニスト活性に影響を与える。
ヒトＩｇＧ２は、そのＣＨ１とヒンジ領域でジスルフィド結合をシャッフリングするというその能力において、イムノグロブリンの中でもユニークである（図１７）（Ｗｐｙｃｈら、（２００８）；Ｍａｒｔｉｎｅｚら、（２００８）；Ｚｈａｎｇら、（２０１０））。ｈ２の２つのアイソフォームが優位を占めており、ｈ２Ａは柔軟性があり、古典的なＩｇＧの立体配座で、ＣＨ１の重鎖（ＨＣ）Ｃ１２７が軽鎖（ＬＣ）のＣ２１４に連結され、４つのＨＣ間ジスルフィド結合が、相対するヒンジシステインの２３２、２３３、２３６、及び２３９の間に存在する（図１７）。ｈ２Ｂは、よりコンパクトであり、ＨＣ  Ｃ１２７及びＬＣ  Ｃ２１４が、ＨＣヒンジシステイン２３２及び２３３とジスルフィド架橋を形成する（図１７）。ｈ２Ａ型とｈ２Ｂ型は、非還元キャピラリー電気泳動（ｎｒＣＥ−ＳＤＳ（２６、２９））により分析的に分離されることができ、ｈ２に対しては２つのピーク、及びｈ１に対しては１つのピークが明らかである（図１７）。
【０１４１】
キメラＬＯＢ７．４  ｍＡｂのｎｒＣＥ−ＳＤＳ分析により、ヒンジ２／１変異体のみがジスルフィド結合をシャッフリングし、２つのピークを生じさせる能力を保持していたことが明らかとなった（図３ｄ）。これは、ＨＣシステイン１２７（ＣＨ１中）、２３２または２３３（ヒンジ中）のうちのいずれか１つの変異により、ジスルフィドの再構成が阻害されるという結果と一致しており（２６、３０）、このことから、ＬＯＢ７．４  ｈ２のアゴニスト活性は、ジスルフィド結合をシャッフリングするその能力と関連していることが示唆される。
【０１４２】
ｈ２Ａ型とｈ２Ｂ型が、異なるレベルのアゴニスト活性を伴っていたかどうかを決定するために、本発明者らは、ＬＯＢ７．４を、記載されるように（２８）、変性剤と共に、または変性剤無しで、酸化還元緩衝液中においてｈ２Ａ型またはｈ２Ｂ型へと化学的に「ねじれさせた」。ｎｒＣＥ−ＳＤＳで評価したところ、酸化還元緩衝液のみでインキュベートすることにより、大部分（約７５％）がｈ２Ｂへと変化した一方で、塩酸グアニジンを添加することにより、７０％超がｈ２Ａへとねじれた（図４Ａ、左のパネル）。ねじれたｍＡｂは、ヒトＢ細胞の多核巨細胞化及び活性化、またはｈＣＤ４０ＴｇＢ細胞の増殖を生じさせるその能力により評価したところ、著しく異なる活性を伴っており（図４ａ及びデータは示さず）、ｈ２Ｂはｈ２Ａよりもかなり活性が高かった。抗マウスＣＤ４０ｍＡｂである３／２３、ｈ２を、そのＡ型及びＢ型へとねじれさせたところ、活性において同様の差異が認められた（図７ａ〜ｃ）。
【０１４３】
点変異により、ｈ２をアゴニスト性立体配座及びアンタゴニスト性立体配座に固定することができる
Ｂａｌｌａｒｄら（２６、３０）による素晴らしい研究により、ＨＣのＣ２３２またはＣ２３３の、Ｓへの変異が、ｈ２をｈ２Ａ型へと固定し、一方でＨＣ  Ｃ１２７Ｓにより、ｈ２Ｂと似た形態が生じることが示された。本発明者らは、これらの変異をＬＯＢ７．４  ｈ２へと導入し、ｈ２Ａまたはｈ２ＢへのシフトをｎｒＣＥ−ＳＤＳにより確認した（図４ｂ）。ｈＣＤ４０ＴｇＢ細胞増殖により測定したところ、ＨＣ  Ｃ２３２ＳまたはＣ２３３Ｓにより、ＬＯＢ７．４  ｈ２のアゴニスト活性が完全に失われた（ＷＴまたはＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯのいずれか。図４ｃ、青線）。対照的に、ＨＣ  Ｃ１２７Ｓは、天然型ｈ２と比較し、高濃度で、ねじれ型ｈ２Ｂとほぼ同程度の高さのレベルまで活性が上昇した（図４ｃ、下のパネル、青線）。興味深いことに、ＨＣ  Ｃ２３３Ｓ  ｈ２Ａとの共インキュベーションにより、ＬＯＢ７．４  ｈ２Ｂの活性が、特に高濃度で低下し、天然型ｈ２とほぼ同一の特徴的なベル型曲線が生じた（図４ｄ）。同様に、ＬＯＢ７．４  ＨＣ  Ｃ２３３Ｓもまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるｈＣＤ４０ＴｇＢ細胞に対するＳＧＮ４０  ｈ２のアゴニスト活性を劇的に低下させた（図７ｄ）。
【０１４４】
ＬＣ  Ｃ２１４の突然変異誘導もまた、活性の著しい変化をもたらした。ＬＣ  Ｃ２１４Ｓは、ＬＣとＨＣの間のジスルフィド結合を阻害し、それによりｎｒＣＥ−ＳＤＳ上で別々のＬＣ及びＨＣの二量体ピークが現れた（図４ｃ）。Ｈ：Ｌのジスルフィド結合が失われても、生理学的緩衝液中で２つの鎖は非共有結合により共に保持されるため、抗体結合には影響を与えないということは重要な点である。これは、ＷＴ  ＬＣまたはＬＣ  Ｃ２１４Ｓのいずれかと結合された際の、ＨＣ  Ｃ２３３ＳのＳＰＲ上のＣＤ４０に対する親和性が同一であることにより確認された（図４ｅ）。
【０１４５】
ＬＣ  Ｃ２１４ＳがＷＴ  ＨＣ、ＨＣ  Ｃ２３２ＳまたはＣ２３３Ｓと組み合わされた際に、ＨＣ二量体はｎｒＣＥ−ＳＤＳ上で単一種として泳動されたため、各場合において、一種類の立体配座であったことが示唆される。すべての場合において、ＬＣ  Ｃ２１４Ｓはアゴニスト活性を上昇させ、特徴的なＢ細胞増殖プロファイルをもたらし、ＷＴ  ＨＣと組み合わされた場合にはＣ１２７Ｓ変異体と類似したプロファイルが観察され、ＨＣ  ２３２Ｓと組み合わされた場合には、天然型ｈ２と類似したプロファイルが生じ、ＨＣ  Ｃ２３３Ｓと組み合わされた場合には、ねじれ型ｈ２Ｂと非常によく似た最大活性が認められた（図４ｃ、赤線）。これらプロファイルは再現性が高く、ｈＣＤ４０ＴｇまたはヒトＢ細胞を用いても類似していた（データは示さず）。従って、初期配列のわずかな変化が、ｈ２活性に大きな影響を与える可能性があり、このことはアゴニスト性剤及びアンタゴニスト性剤のスペクトラム操作を可能にする。
【０１４６】
ヒトＩｇＧアイソタイプ及び抗ＣＤ４０活性
アゴニスト活性に対するヒト定常領域の影響を検証するために、本発明者らは抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂであり、現在、癌患者における第１相臨床試験が行われているＣｈｉＬｏｂ７／４（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ、２０１４）を使用した。アゴニスト活性は、最初に異なるヒト定常領域上でキメラ化された際に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＢ細胞活性化及び増殖を引き起こすＣｈｉＬｏｂ７／４の能力により評価した。フローサイトメトリーにより測定
したところ、すべてのキメラは同様にＣＤ４０に結合していた（図８Ｄ）。ＳＰＲにより測定したところ、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１及びｈ２のＦａｂ’断片もまた、同じような親和性で（それぞれ、１０．０及び１０．２ｘ１０-9Ｍ）、固定ｈＣＤ４０に結合していた（図８Ｅ）。精製ヒトＢ細胞に添加された際、同種付着（多核巨細胞化）及び３Ｈチミジン取り込みにより評価したところ、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２はそれぞれＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１またはｈ４と比較し、より強力なＢ細胞活性化及び増殖を引き起こした（図８Ａ）。Ｆａｂ’の腕部分（アーム：ａｒｍ）の交換は、ｈ４の活性の欠落を説明しないことを決定づけるために、本発明者らは、安定化Ｓ２２８Ｐ変異をｈ４に導入した（Ａｎｇａｌら、１９９３）。この改変（図８Ａのｈ４＊）はｈ４の活性を変化させなかった。
【０１４７】
前臨床モデルにおいて、抗ＣＤ４０ｍＡｂの免疫刺激性効果及び治療効果は、ＣＤ８Ｔ細胞免疫の増強をもたらす、ＤＣ上の共刺激性分子のＣＤ７０の上方制御を介して調節されることができる（Ｆｒｅｎｃｈら、１９９９；  Ｆｒｅｎｃｈら、２００７；  Ｓａｎｃｈｅｚら、２００７）。ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１とｈ２の、ヒトＤＣを活性化する能力を比較するために、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで初期ヒトランゲルハンス細胞上のＣＤ７０の発現の上方制御を行うそれらの能力（図８Ｂ）、ならびにＩＦＮγにより測定される、ＥＢＶ特異的ヒトＣＤ８Ｔ細胞のランゲルハンス細胞誘導性プライミングを増強させるそれらの能力（図８Ｃ）に関し評価した。Ｂ細胞に対する効果と一致して、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２はランゲルハンス細胞のＣＤ７０発現、及びＣＤ８Ｔ細胞プライミングの両方を増強させた一方で、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１はさせなかった。
【０１４８】
ＣｈｉＬｏｂ７／４アイソタイプのｉｎ  ｖｉｖｏのアゴニスト活性を、ｈＣＤ４０Ｔｇマウス（Ａｈｏｎｅｎら、２００２）で検証した。最初のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験において、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２は、ｈＣＤ４０の発現に依存しているｈ１（図９Ｆ）よりも単離ｈＣＤ４０ＴｇマウスＢ細胞の活性化及び増殖をずっと強力に刺激していた（図８Ｄ）ことから、マウス細胞においてｈＣＤ４０はヒト細胞と同様にＣｈｉＬｏｂ７／４とのライゲーションに反応したことが確認された。ｉｎ  ｖｉｖｏのアゴニスト活性を試験するために、本発明者らは、モデル抗原のＯＶＡと共投与された場合のＣＤ８Ｔ細胞反応及びＡｂ反応を増強させるＣｈｉＬｏｂ７／４の能力を検証した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏのデータと一致して、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２は、ｈ１で観察された結果よりも非常に強力に抗ＯＶＡ  ＣＤ８Ｔ細胞増殖ならびにＡｂ反応を刺激した（図８Ｅ）。従って、一連のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法及びｉｎ  ｖｉｖｏ法の両方を使用により、ＣｈｉＬｏｂ７／４は、ｈ１またはｈ４の定常領域と比較し、ｈ２と発現された際により強力な免疫刺激活性を示した。
【０１４９】
ｈ１とｈ２のアゴニスト活性の同様な差異は、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗マウスＣＤ４０  ｍＡｂである３／２３を検証した際にも認められ、ここでも、３／２３のｈ１ではなくｈ２が、強力な抗ＯＶＡ  ＣＤ８Ｔ細胞応答及びＡｂ反応を刺激し（図８Ｆ）、脾臓ＤＣ上のＣＤ７０を上方制御していた（図９Ｇ）。重要なことは、免疫刺激能力におけるこの差異は、ＯＶＡと抗ＣＤ４０で免疫化されたマウスがＯＶＡ発現ＥＧ７腫瘍を用いてチャレンジされたワクチネーション設定（図９Ｇ）、及び確立されたＢ細胞リンパ腫を有するマウス（ＢＣＬ１リンパ腫モデル（Ｗｈｉｔｅ、２０１４））が１００μｇのｍＡｂの単回投与で治療された治療設定（図８Ｈ）の両方において、３／２３のｈ１ではなくｈ２が、腫瘍成長に対する防御をもたらしたという治療活性の差異と関連していたということである。
【０１５０】
ヒトＩｇＧ２活性は、ＦｃγＲ非依存性である。
Ｂ細胞上の主要なＦｃγＲであるＦｃγＲＩＩＢに対するｈ２の親和性は低い（Ｂｒｕｈｎｓら、２００９）ことから、架橋物質としてＦｃγＲＩＩＢを使用するアゴニスト性ｍ１（Ｗｈｉｔｅら、２０１１）と異なり、その活性はＦｃγＲ非依存性の可能性がある
。実際に、固定ｍＡｂ上に可溶性ＦｃγＲを流した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、ヒトＦｃγＲまたはマウスＦｃγＲのいずれに対しても、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２はほとんど結合しなかった（図１１Ａ及びＢ）一方で、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１は、同条件下でｈＦｃγＲＩ、ＩＩＡ、及びＩＩＩＡ、ならびにｍＦｃγＲＩ及びＩＶにはっきりと結合した（図１１Ａ及びＢ）。多くの方法から、ｈ２のＦｃγＲ非依存性の活性が確認された。第一に、同種付着及びＣＤ２３の上方制御により評価したところ、汎阻害性抗ＦｃγＲＩＩｍＡｂ（ＡＴ１０）は、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２によるヒトＢ細胞活性化を阻害することができなかった（図１０Ａ）。対照的に、ＡＴ１０は、ＦｃγＩＩ発現架橋細胞の存在下で誘導されたＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１による活性化を完全に阻害した（図１０Ａ）。
【０１５１】
第二に、ペプシン開裂を介したＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２のＦｃの除去（Ｆ（ａｂ’）２断片が生じる）は、ヒトＢ細胞の活性化及び増殖を阻害しなかった一方で、Ｆａｂ’まで減少させると活性が排除された（図１０Ｃ）。対照的に、同条件下で、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１は、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂ’として添加された際には細胞を活性化することができなかったが、過剰に添加された際には、各型はＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２による活性化を阻害した（図１０Ｂ、図１１Ｆ）。第三に、マウスＢ細胞から、これら細胞により唯一発現されているＦｃγＲであるＦｃγＲＩＩＢを遺伝的に欠失させても、広範な濃度範囲のＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２に反応したその増殖を阻害することはできなかった（図１０Ｃ）一方で、活性をＦｃγＲＩＩＢ架橋に依存しているＣｈｉＬｏｂ７／４  ｍ１（Ｗｈｉｔｅら、２０１１）の反応は消失した（図１０Ｃ）。注目すべきは、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２は、異なる濃度でＢ細胞刺激に用いられた際、特徴的な「ベル」型を示し、濃度が上昇するとともに活性が上昇する架橋依存性ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｍ１とは対照的に、非常に低い濃度で活性であったことである（図１０Ｄ）。これらの異なる曲線は、おそらく、そのアイソタイプがアゴニスト活性を与えるメカニズムの違いを反映しているものと推測され、以下にさらに検討する。
【０１５２】
ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２のＦｃγＲ非依存性の活性もまたｉｎ  ｖｉｖｏで確認された。ＣＤ４０（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，２０１１；Ｗｈｉｔｅら、２０１１；Ｗｈｉｔｅ，２０１４）、Ｆａｓ、ＤＲ４及びＤＲ５（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，２０１２；Ｗｉｌｓｏｎら、２０１１；Ｘｕら、２００３）に対するｍＡｂのアゴニスト活性の消失をもたらすことがすでに示されているＦｃγＲＩＩＢの遺伝的欠失は、野生型（ＷＴ）マウスにおいて認められたものと比較し、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２により誘導されたＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖を低下させず、一方で、予測されたとおり、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｍ１の活性はＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯにおいて消失した（図１０Ｄ）。両方のｍＡｂが、活性なＦｃγＲを有していないγ鎖ＫＯマウスにおいて、活性を保持していた（図１０Ｄ）。最後に、ＣｈｉＬｏｂ７／４は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＦ（ａｂ’）２断片として投与された際、ＣＤ８Ｔ細胞反応を安定的に刺激した一方で、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１のＦ（ａｂ’）２では反応は認められなかった（図１０Ｅ）。
【０１５３】
ヒトＩｇＧ２は、複数の標的に対しアゴニスト性である。
次に本発明者らは、臨床試験中の他のｈＣＤ４０ｍＡｂであるＳＧＮ４０、またキメラｈ１（Ａｄｖａｎｉら、２００９）の活性に対するｈ２定常領域の影響の影響を評価した。ＳＧＮ４０の可変領域は、特許配列から合成し、ｈ１とｈ２の定常領域をキメラ化し、ＳＧＮ４０−Ｓｏｔｏｎ  ｈ１及びｈ２を作製した。ＣｈｉＬｏｂ７／４と同様に、ＳＧＮ４０−Ｓｏｔｏｎ  ｈ２は、ＳＧＮ４０−Ｓｏｔｏｎ  ｈ１よりも強力なヒトＢ細胞の活性化と増殖をもたらし（図１２Ａ）、及びＳＧＮ４０−Ｓｏｔｏｎ  ｈ２に応答性のｈＣＤ４０ＴｇＢ細胞の増殖は、ＦｃγＲＩＩＢ発現に非依存性であったが、元のｍ１である、ＳＣ２６（Ｈａｎｋｓら、２００５）は依存性であった（図１２Ｂ）。さらに、ＳＧＮ４０−Ｓｏｔｏｎ  ｈ２は、ＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯマウスにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで
有意に、及び強力にＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を上昇させたが、ＳＧＮ４０−Ｓｏｔｏｎ  ｈ１は上昇させなかった（図１２Ｃ）。臨床開発中の他の２つの共刺激性受容体に対するｍＡｂであるｈ４−１ＢＢとｈＣＤ２８を用いたさらなる実験において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒトＴ細胞増殖により評価したところ、ｈ１とｈ２のアゴニスト機能において同様の差異が明らかとなった（図１２Ｄ〜Ｅ）。ｈＣＤ２８に対しては、精製Ｔ細胞を用いた。Ｔ細胞は一般的にＦｃγＲを欠いているが、同種付着を示し、抗ｈＣＤ２８  ｈ２に反応して増殖の上昇を示したことからも、ＦｃγＲ非依存性の作用機序が支持される（図１２Ｅ）。ＣｈｉＬｏｂ７／４（図８Ａ）と同様に、ｈ４の定常領域は、精製Ｔ細胞培養において、抗ｈＣＤ２８に活性を与えなかった（図１２Ｅ）。
【０１５４】
Ｈ２活性は、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１及びヒンジ領域の両方に依存する。
ｈ１及びｈ２  ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｍＡｂの可変領域は同一であり、ｈ２の活性はそのＦｃドメインに非依存性であったことから、本発明者らは、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２のＣＨ１とヒンジドメインのアゴニスト活性における役割について検証した。この目的のために、本発明者らは、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１及びｈ２のＣＨ１ドメイン単独、またはＣＨ１とヒンジドメインの両方のいずれかが入れ替えられた変異体を作製した（図１３Ａ）。ドメイン交換は、フローサイトメトリーにより評価したところ、抗原結合に影響を与えていなかった（図１４）。異なるｍＡｂの相対アゴニスト活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒトＢ細胞の活性化促進を行う能力、及びｈＣＤ４０ＴｇＢ細胞の増殖促進を行う能力により評価された（図１３Ａ）。ｈ２のＣＨ１ドメインがｈ１のＣＨ１ドメインと入れ替えられた（ＣＨ１  １／２）、またはｈ１のＣＨ１がｈ２のＣＨ１と入れ替えられた（ＣＨ１  ２／１）とき（図１３Ａ、（ｉ）と（ｉｉ））、ｍＡｂを架橋させるために高レベルのＦｃγＲＩＩＢを発現する細胞が提供された場合を除き、Ｂ細胞増殖はほとんど認められず、ヒトＢ細胞は活性化されなかった。従って、ｈ２  ＣＨ１ドメイン単独（ＣＨ１  ２／１）、またはｈ２ヒンジ領域単独（ＣＨ１  １／２）のいずれかがあっても、活性には寄与しなかった。同様に、ｈ２のＣＨ１とヒンジの両方がｈ１のＣＨ１とヒンジに入れ替えられたとき（ＣＨ１Ｈｇｅ  １／２）も、活性は見られなかった（図１３Ａ（ｉｉｉ））。しかし、ｈ１のＣＨ１とヒンジが、ｈ２のＣＨ１とヒンジに入れ替えられたとき（ＣＨ１Ｈｇｅ  ２／１）（図１３Ａ（ｉｖ））、ヒトＢ細胞の安定的な活性化、ならびにＦｃγＲＩＩＢ  ＷＴ及びＫＯの両方のｈＣＤ４０ＴｇＢ細胞の増殖が、天然型ｈ２で認められたものと同様に観察された。同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ＣＨ１Ｈｇｅ２／１は、ＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞増殖の有意な増加をもたらした一方で、ＣＨ１Ｈｇｅ１／２は不活性であった（図１３Ｂ）。これらデータから、ｈ２の独特なアゴニスト活性は、そのＣＨ１とヒンジドメインの両方を必要とすることが示される。
【０１５５】
ヒトＩｇＧ２活性は、そのジスルフィド結合の構造に依存性である。
ＩｇＧ２は、そのＣＨ１及びヒンジ領域においてジスルフィド結合を「シャッフル」し（図１８）、様々なアイソフォームを生じさせるというその能力において、ヒトＩｇＧの中でユニークな存在である（Ｄｉｌｌｏｎら、２００８；Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００８；Ｗｙｐｙｃｈら、２００８；Ｚｈａｎｇら、２０１０）。この分子は、その「ｈ２Ａ」型で合成されると考えられており、そのＣＨ１の重鎖（ＨＣ）Ｃｙｓ１２７は軽鎖（ＬＣ）のＣｙｓ２１４に連結されており、次いで、一連の中間体を経て徐々に血中でその「ｈ２Ｂ」型へと転換され（Ｌｉｕら、２００８）、その「ｈ２Ｂ」型ではＨＣ  Ｃｙｓ１２７とＬＣ  Ｃｙｓ２１４は、ＨＣヒンジ  Ｃｙｓ２３２とＣｙｓ２３３とジスルフィド結合を形成する（図１８Ａ）。重要なことは、物理化学的特性（Ｄｉｌｌｏｎら、２００８）及び電子顕微鏡（Ｒｙａｚａｎｔｓｅｖら、２０１３）からは、ｈ２Ａは古典的なＩｇＧの柔軟性のある「Ｙ」立体配座を有している一方で、ｈ２Ｂはよりコンパクトな形状をとり、Ｆａｂ’の腕部分はヒンジに近接して維持されているということである。ｈ２Ａ型及びｈ２Ｂ型は、非還元キャピラリー電気泳動（ｎｒＣＥ−ＳＤＳ；（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００８））により識別することができ、非還元キャピラリー電気泳動で、ｈ１が１つのピークであったのに対し、未分画ｈ２においては２つのピークが明らかである（図１８Ｂ）。上述のように分析されたＣｈｉＬｏｂ７／４ｍＡｂのうち、ＣＨ１Ｈｇｅ２／１のみが、ｎｒＣＥ−ＳＤＳで２つのピークを保持した（図１８Ｂ）ことから、ジスルフィドシャッフリングはアゴニスト活性にとって重要であるという本発明者らの仮説が支持される。
【０１５６】
ＣｈｉＬｏｂ７／４の異なるジスルフィド結合型は、異なるアゴニスト活性と関連しているかどうかを決定づけるために、２つの方法が行われた。１つ目は、変性剤の存在下、または非存在下での酸化還元緩衝液中でのＣｈｉＬｏｂ７／４の化学的「ねじれ」を用いて、それぞれｈ２Ａまたはｈ２Ｂを富化させた（Ｄｉｌｌｏｎら、２００８）（図１５Ａ、上のパネル）。これにより、著しく異なる活性が生じ、ねじれ型ｈ２Ａよりもねじれ型ｈ２Ｂで、ｈＣＤ４０ＴｇＢ細胞の活性化が非常に増強された（図１５Ａ）。ＣｈｉＬｏｂ７／４  ＣＨ１Ｈｇｅ２／１変異体のねじれ型（図１６Ｂ）、及び抗マウスＣＤ４０ｍＡｂ  ３／２３に対しても、ねじれ型がヒトＢ細胞に添加された場合に同様のＢ細胞活性化における差異が観察され（図１６Ａ）、３／２３  ｈ２Ｂは可溶性形態でマウスＢ細胞を活性化することができるが、ｈ２ＡはＦｃγＲＩＩＢ発現架橋細胞との共インキュベーションを必要とした（図１５Ｂ、これら細胞はｈ２を架橋することができるＦｃγＲＩＩＢを非生理学的に高レベルで発現する（Ｗｈｉｔｅら、２０１１））。ＣｈｉＬｏｂ７／４のねじれ型ｈ２Ｂはまた、全ＩｇＧ（図１５Ｄ（ｉ））として、またはＦ（ａｂ’）２断片（図１６Ｃ）としての両方で、ＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯ  Ｂ細胞を活性化することができたことから、その活性はＦｃγＲ非依存性を保持していたことが確認された。２つ目は、従前に記載されているように（Ａｌｌｅｎら、２００９、Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００８）、突然変異誘導を用いて「固定された」ｈ２Ａ様、及びｈ２Ｂ様の形態を作製した。ＣｈｉＬｏｂ７／４のＨＣ  Ｃ２３２ＳまたはＣ２３３Ｓ変異は、ｎｒＣＥ−ＳＤＳで評価したところ（図１５Ｃ（ＨＣ  Ｃ２３２Ｓ、ＨＣ  Ｃ２３３Ｓ））、広範な範囲で検証したいずれの濃度でもｈＣＤ４０ＴｇマウスＢ細胞の増殖を刺激しなかった（図１５Ｄ（ｉｉ）及び（ｉｉｉ））、均一なｈ２Ａ  ｍＡｂを生成した一方で、ｈ２Ｂ様  ＨＣ  Ｃ１２７Ｓ変異体（図１５Ｃ（ＨＣ  Ｃ１２７Ｓ））は、ＦｃγＲＩＩＢ  ＷＴ及びＫＯ細胞の両方に対し、天然型ｈ２と比較し高濃度での活性の増強を示した（図１５Ｄ（ｉｖ））。
【０１５７】
これらの統合データから、ｈ２のＦｃγＲ非依存性のアゴニスト活性は、そのヒンジ及びＣＨ１ドメインにおけるジスルフィド結合の正確な立体配座を条件とすること、及び具体的には、よりコンパクトなｈ２Ｂ型となる能力が条件となることが示唆される。ＣＤ４０のライゲーションを介した免疫活性化は、ＴＲＡＦリクルートメント及び下流の細胞内シグナル伝達の伝播を可能とするための細胞膜中の受容体クラスター化を必要とすると考えられている。この効果の多くは、ＮＦｋＢ活性化により調節されている（Ｅｌｇｕｅｔａら、２００９）。初期ｈＣＤ４０ＴｇＢ細胞（図１５Ｅ）及び形質転換されたヒトＲａｍｏｓＢ細胞（図１６Ｄ）の両方を用いた実験から、ＮＦｋＢをより強く活性化するＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２Ｂの能力が明らかにされ、それはｈ２Ａと比較し、細胞刺激後のＩｋＢリン酸化が非常に増強されることを反映している。これは、よりコンパクトなｈ２Ｂが、膜中でのＣＤ４０のクラスター化を促進させ、ＮＦｋＢシグナル伝達及び細胞活性化を生じさせるという能力と一致している。
【０１５８】
突然変異誘導は様々なＩｇＧ２アゴニスト活性を生じさせる。
さらなる実験により、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２を操作し、様々なアゴニスト活性を得ることができることが明らかとなった。ＬＣ  Ｃｙｓ２１４をＳｅｒに変異させると、ＬＣ−ＨＣジスルフィド結合が阻害され、ｎｒＣＥ−ＳＤＳで２つのピークが現れる（図１５Ｃ（ＬＣ  Ｃ２１４Ｓ））。しかし、このｍＡｂは非変性条件下では損なわれておらず、ＳＰＲ（図１５Ｆ）またはフローサイトメトリー（図１６Ｅ）により測定したところ、ＣＤ４０への結合は低下しなかった。ＬＣ  Ｃ２１４Ｓは、Ｃ１２７Ｓ変異体と同様に、ｈＣＤ４０ＴｇＢ細胞増殖の増大をもたらした（図１５Ｄ（ｉ））。しかし、ＨＣ  ２３２Ｓと併せたＬＣ  Ｃ２１４Ｓは、天然型ｈ２と類似したプロファイルを示し、高濃度では活性が大きく低下した（図１５Ｄ（ｉｉ））一方で、ＨＣ  Ｃ２３３Ｓと併せたＬＣ  Ｃ２１４Ｓは、ねじれ型ｈ２Ｂと類似した最大活性を示した（図１５Ｄ（ｉ）に対し（ｉｉｉ））。本明細書に記載されるように、天然型ＣｈｉＬｏｂ７／４（アイソフォーム混合）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＢ細胞を刺激するために用いられる際、特徴的な「ベル」型の濃度曲線を呈し、Ｂ細胞応答は高濃度では低かった（たとえば図１０Ｄ、１２Ｂ及び１５Ｄ（ｉ））。この効果は、純粋なｈ２Ｂでは大きく失われており、純粋なｈ２Ｂは高濃度でも完全に活性を維持していた（図１５Ｄ）が、ｈ２Ａとｈ２Ｂの１：１混合物では元に戻った（図１５Ｇ）。ｈ２Ａ型に対する応答が完全に失われたことを考えると、ｈ２Ａはｈ２Ｂの活性を阻害し、高濃度ではその効力を減弱させうることが示唆され、及びｈ２Ａはあるレベルのアンタゴニスト活性を有することが示唆される。最後に、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２Ａとｈ２Ｂの活性における差異がｉｎ  ｖｉｖｏにおいても再現され、ｈＣＤ４０Ｔｇ  ＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯマウスにおいて、ｈ２Ａよりもｈ２Ｂが、ＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞（図１５Ｈ）及びＯＶＡ特異的ＩｇＧ（図１５Ｉ）の両方をより強く有意に拡張させた。ｉｎ  ｖｉｖｏ活性における同様の差異は、ＣＨ１Ｈｇｅ２／１変異体のｈ２Ａ及びｈ２Ｂのねじれ型に対しても観察された（図１６Ｆ及び１６Ｇ）。結論として、本明細書のデータから、ｈ２のジスルフィド構造を操作することにより、何よりも標的組織中のＦｃγＲの存在に非依存性である、明白で多様な免疫刺激性機能を有する治療剤の製造が可能となり得ることが示される。
【０１５９】
行われた実験について、実施例においてさらに記載し、その中で用いられる材料と方法を以下に詳細に記載する。
実施例
【０１６０】
実施例１〜７において用いられた材料と方法
マウス
Ｃ５７Ｂｌ／６及びＲＡＧ-/-マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ（Ｋｅｎｔ，ＵＫ）から得た。他の遺伝的改変系統（すべてＣ５７ＢＬ／６を背景とする）は、Ｃ５７ＢＬ／６  ＦｃgＲＩＩＢ−／−、ＯＴＩ  ＴＣＲトランスジ
ェニックは、Ｄｒ．Ｍａｔｔｈｉａｓ  Ｍｅｒｋｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ（インペリアル大学、ロンドン）から得、及びヒトＣＤ４０トランスジェニック（ｈＣＤ４０  Ｔｇ）は、Ｒａｎｄｏｌｐｈ  Ｎｏｅｌｌｅ（キングズ大学、ロンドン）から得た。ヒトＣＤ４０  Ｔｇ／ＦｃγＲＩＩＢ−／−マウスは、交雑育種により得て、フローサイトメトリーにより遺伝子型を確認した。動物は当地の動物施設で繁殖及び飼育され、およそ８〜１２週齢で使用された。すべての実験は、イギリス内務省ライセンス番号ＰＰＬ３０／２４５１及びＰＰＬ３０／２９６４のもと、当地の倫理委員会のガイドラインに従い行われた。
【０１６１】
抗体及び試薬
以下のハイブリドーマを用いた。抗ヒトＣＤ２３（ＭＨＭ６）は、Ｊ  Ｇｏｒｄｏｎ（バーミンガム大学）から得た。ＦｃγＲＩＩＡ及びＩＩＢの両方に結合する抗ヒトＦｃγＲＩＩ（ＡＴ１０）（３３）、抗ヒトＣＤ４０（ＬＯＢ７．４；（２２））及び抗ヒト４−１ＢＢは、従来のハイブリドーマ法を用いて当研究室内で作製された。抗マウスＣＤ１９−ＰＥ（クローン１Ｄ３）、抗ヒトＣＤ１９−ＰＥ（クローンＲＦＢ９）は、ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ社（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）から得た。抗マウスＣＤ２３−ＰＥは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から得た。ＯＴＩ細胞染色に関しては、従前に記載したように（１２）当研究室内で作製されたＡＰＣ標識抗ＣＤ８α（クローン５３−６．７；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、及びＰＥ標識ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマーを使用した。フローサイトメトリーは、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて行われた。ニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｄｇｅ社（Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）から購入した。エンドトキシンフリーＯＶＡは、Ｐｒｏｆｏｓ  ＡＧ社（Ｒｅｇｅｎｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。
【０１６２】
キメラ抗体
様々な抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ構築物は、ＰＣＲ反応によりハイブリドーマから増幅され、またはＧｅｎｅｗｉｚ，Ｉｎｃ．により合成された。ＳＧＮ４０−Ｓｏｔｏｎ及びＴＧＮ１４１２−Ｓｏｔｏｎは、公表されている配列を用いて作製された（ＵＳ特許番号ＷＯ２００７／０７５３２６及び米国特許第７，５８５，９６０号）。可変領域は、異なる抗体のアイソタイプの定常領域を含有する発現ベクター（重鎖に対してはｐＥＥ６．４ベクター、及び軽鎖に対してはｐＥＥ１２．４ベクター、Ｌｏｎｚａ社）へとサブクローニングした。一過性産生のための２９３Ｆ細胞へのトランスフェクション、または抗体の安定的生産のためのＣＨＯ−Ｋ１細胞へのトランスフェクションの前に、重鎖ベクター及び軽鎖ベクターは共にさらにサブクローニングされた。分泌された抗体は、プロテインＡセファロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）クロマトグラフィーにより精製され、凝集塊はＳｅｐｈａｄｅｘ  ２００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を通してゲルろ過により取り除かれた。すべての調製物はＥｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳポータブルテストシステム（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により測定されたところ低エンドトキシン（＜１ｎｇ／ｍｇタンパク質）であった。
【０１６３】
免疫化及び免疫反応の評価
マウスは、個々の実験に関して詳述されるように、尾静脈注射を介して２００μＬの生理食塩水溶液で免疫化された。血清抗ＯＶＡ  Ａｂのレベルは、ＥＬＩＳＡにより測定された（３４）。一部の実験において、３ｘ１０５個の脾臓ＯＶＡ−特異的脾臓ＣＤ８（ＯＴＩ）Ｔ細胞が、免疫化の前日に尾静脈から投与された。ＯＴＩ細胞調製物は、抗ＣＤ１９−ＰＥ及び抗ＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて注射が行われる前にＢ細胞を枯渇させた。
【０１６４】
腫瘍の治療
ＯＶＡ発現腫瘍であるＥＧ７に対するワクチン化のために、Ｄ−６（６日前）にマウスに５ｘ１０４個のＯＴＩ細胞を用いて適合移植し、次いで、Ｄ−５（５日前）に０．５ｍｇのＳｉｇｍａ  ＯＶＡと１００μｇの抗ＣＤ４０ｍＡｂを投与した。マウスは、Ｄ０（０日目）に５ｘ１０５個のＥＧ７腫瘍細胞を皮下注射された。腫瘍増殖はモニターされ、人道的なエンドポイントに達したとき（腫瘍が任意の方向で１．５ｃｍを超えたとき）、マウスを殺処分した。Ｂ細胞リンパ腫（ＢＣＬ１）治療は、従前に記載されたように行われた（１８）。
【０１６５】
細胞活性化及び増殖
樹状細胞：顕微鏡検査のために、１００μｇの抗ＣＤ４０ｍＡｂの静脈内注射の２日後にＲＡＧ-/-マウスから脾臓を採取し、従前に記載されているように（１２）、切片をＣ
Ｄ７０及びＭＩＤＣ８に対して染色した。ヒトの初期のランゲルハンス細胞（ＬＣ）は従前に記載されたように（３５）単離された。簡潔に述べると、ヘルシンキガイドラインに従い、サザンプトン及びサウスウェストハンプシャー研究倫理委員会（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗｅｓｔ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）による承認とともに書面のインフォームドコンセントを得た後、健常な個人から皮膚標本を得た。表皮シートを、２０時間の酵素消化の後に分離させた（Ｄｉｓｏｐａｓｅ、２ＩＵ、Ｇｉｂｃｏ社、ＵＫ）。表皮シートから４８時間移動させた後、ＬＣを回収し、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）密度勾配（Ａｘｉｓ  Ｓｈｉｅｌ
ｄ社、Ｎｏｒｗａｙ）により、７０％超のＣＤ１ａ＋ＨＬＡＤＲ＋細胞へと富化させた。細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％、Ｓｉｇｍａ社、ＵＫ）及びＦＢＳ（１０％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＵＫ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ社、ＵＫ）中に５ｘ１０４個の細胞／ウェルで、９６ウェルＵ底プレートへと播種し、ＬＯＢ７．４ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２抗体またはアイソタイプ対照（０．００１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）と共に１８時間、刺激した。ＣＤ１ａ＋ＨＬＡＤＲ＋（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ＵＫ）ＬＣ上の活性化マーカー（ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ＵＫ）の発現は、フローサイトメトリーにより評価した。
【０１６６】
Ｂ細胞：Ｂ細胞は、磁気ネガティブ選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社またはＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて脾臓（マウス）または末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ、ヒト）から精製した。ヒトＰＢＭＣ（ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ社）は、国立血液サービス（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ））を介して匿名の健常なドナーから得た血液コーン（ｂｌｏｏｄ  ｃｏｎｅｓ）から単離された。細胞は、９６ウェルの丸底ディッシュに、１ｘ１０５細胞／ウェルで、個々の実験に関して記載されるように様々な濃度のｍＡｂと共に播種された。ヒトの細胞に関しては、組み換えヒトＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）を有する培養、及び有しない培養が用いられた。一部の例において、ヒトＦｃγＲがトランスフェクトされた１ｘ１０５個の２９３細胞もまた添加された。トランスフェクションは、従前に記載されているように行われた（Ｗｈｉｔｅ  ら、（２０１１））。活性化を評価するために、一晩インキュベートされた後、細胞は写真撮影され（ＣＣ１２ソフトイメージングシステムを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ４１顕微鏡）、活性化マーカーの発現はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により分析された。増殖は、記載されるように（Ｗｈｉｔｅら、（２０１１））、培養の５日後（マウス）または８日後（ヒト）に、［メチル−３Ｈ］チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）取り込みにより評価された。
【０１６７】
Ｔ細胞：ヒトＰＢＭＣは、２ｍＭのＣＦＳＥで標識され、次いで、２日間、記述されるように（３６）、２４ウェルプレート中、ウェル当たり１ｘ１０７個／ｍｌの細胞、１．５ｍｌを用いて高密度で前培養された。前培養された細胞を洗浄し、分析のために１ｘ１０６個／ｍｌで再懸濁された。一部の実験に関し、Ｔ細胞は、総Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて前培養されたＰＢＭＣから単離された。抗ｈ４−１ＢＢ  ｍＡｂに関しては、９６ウェルの丸底プレートのウェルを、０．０２μｇ／ｍｌのＯＫＴ３のＰＢＳ溶液を用いて４時間、コーティングを行い、次いで、２回洗浄し、１０５個のＰＢＭＣ／ウェルを５日間、５μｇ／ｍｌのｍＡｂ（最終量は１５０μｌ）と共にインキュベートした。ＣＤ４+細胞の増殖は、ＣＦＳＥ希釈のフローサイトメトリー分析により評価した。抗ＣＤ２８  ｍＡｂに関しては、１０５個の単離されたＴ細胞を、未コーティングウェル中でｍＡｂと共にインキュベートし、上述のように増殖を評価した。結果は分裂した細胞の割合としてあらわされている。
【０１６８】
表面プラズモン共鳴
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用いて、可溶性Ｆｃγ受容体と３／２３及びＬＯＢ７．４
ｍＡｂアイソタイプの間の相互作用を分析した。抗体または対照としてのＢＳＡは、メーカーの説明書に従い、標準的なアミンカップリングにより、高密度（１５，０００ＲＵ）及び低密度（１，０００ＲＵ）でＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）のフローセルに固定された。可溶性Ｆｃ受容体（ＦｃγＲＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ及びＩＩＩＢ、Ｒ  及び  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）は、流速３０μＬ／分で、ＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ）中、２００、１００、５０、２５、１２．５及び６．２５ｎＭ（５０ｎＭのポイントは二連）で、フローセルを通して注入された。可溶性Ｆｃ受容体は、５分間注入され、解離は１０分間モニターされた。対照フローセルのバックグラウンド応答は、自動的に差し引かれた。
【０１６９】
統計分析
スチューデントｔ検定（対応のない：ｕｎｐａｉｒｅｄ）は、ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて行われた。Ａｂ応答の比較に対し、データは、分析の前に対数変換された。有意差は、分析前に対数変換されたｐ＜０．０５の場合に受容された。有意差は、ｐ＜０．０５の場合に受容された。
【０１７０】
実施例１
実施例１はヒトＩｇＧ２が抗ｈＣＤ４０  ｍＡｂであるＬＯＢ７．４にＦｃγＲ非依存性アゴニスト活性を与えることを示す図１（ａ）〜（ｆ）の実験に関する。パネル（ａ）は、精製ｈＣＤ４０  Ｔｇマウス脾臓Ｂ細胞に、指定されるアイソタイプのＬＯＢ７．４
ｍＡｂを２００ｎｇ／ｍｌでインキュベートした実験結果を示す。Ｂ細胞活性化は、増殖測定として、一晩インキュベートした後の多核巨細胞化（ｃｅｌｌ  ｌｕｍｐｉｎｇ）（上）、及びＣＤ２３の上方制御（真ん中。灰色のグラフは未処置対照細胞であり、黒線は処置細胞）、及び３Ｈチミジン取り込み（下。三連サンプルの平均±ＳＥ）により評価された。７回の実験のうちの１つの実験データを示す。パネル（ｂ及びｃ）は、ｈＣＤ４０  Ｔｇマウスが、０．５ｍｇのＳｉｇｍａＯＶＡと、１００μｇの指定されたｍＡｂを用いて免疫化された結果を示す。循環ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞（ｂ）及び抗ＯＶＡ  Ａｂ（ｃ）は、それぞれ８日後及び１４日後に測定された。２つの実験の統合データを示す（ｎ＝７）。パネル（ｄ）は、（ａ）と同様に、ｈＣＤ４０Ｔｇ  Ｂ細胞が、ＬＯＢ７．４  ｈ１及びｈ２の全ＩｇＧ、Ｆａｂ’２、またはＦａｂ’断片とともに１μｇ／ｍｌで１６時間、インキュベートした後に分析された実験の結果を示す（５つの実験のうちの１つを示す）。パネル（ｅ）は、ＦｃγＲＩＩＢ＋／＋（ＷＴ）またはＦｃγＲＩＩＢ−／−（ＫＯ）のｈＣＤ４０Ｔｇ  Ｂ細胞を、指定されるＬＯＢ７．４  ｍＡｂの１μｇ．ｍｌと共にインキュベートし、（ａ）と同様に分析した実験の結果を示す。５つの実験のうちの１つの結果を示す。（ｆ）ＦｃγＲＩＩＢ＋／＋（ＷＴ）またはＦｃγＲＩＩＢ−／−のｈＣＤ４０ＴｇマウスにＯＴＩ細胞を適合移植し、次いで、１００？ｇのＳｉｇｍａ  ＯＶＡと、１００μｇの指定されるＬＯＢ７．４  ｍＡｂを用いて免疫化した。循環ＯＴＩ細胞を、５日後に計測した。値は、三連のマウスに対する平均±ＳＤである。２つの実験のうちの１つの結果を示す。
【０１７１】
実施例２
本実施例は、ヒトＩｇＧ２が他の抗ＴＮＦＲＳＦ  ｍＡｂにＦｃγＲ非依存性活性を与えることを示す図２の実験に関する。パネル（ａ）は、ヒトＢ細胞を、抗ｈＣＤ４０  ｍＡｂ  ＳＧＮ−４０−Ｓｏｔｏｎ  ｈ１またはｈ２と共にインキュベートし、図１（ａ）と同様に活性化及び増殖を評価した実験の結果を含む。パネル（ｂ）は、図１（ｅ）と同様に、２００ｎｇ／ｍｌのＳＧＮ４０  ｈ１及びｈ２、またはＳＣ２６  ｍ１（ＳＧＮ４０の元のｍＡｂ）に反応したｈＣＤ４０ＴｇのＢ細胞増殖（ＷＴまたはＦｃγＲＩＩＢ−／−）を評価した実験の結果を含む。２つの実験のうちの１つの結果を示す。パネル（ｃ）は、ＰＢＭＣ培養中のキメラｈ１及びｈ２の抗ｈ４−１ＢＢに反応したヒトＴ細胞増殖、または精製Ｔ細胞培養中の抗ｈＣＤ２８に反応したヒトＴ細胞増殖の実験の結果を含む。アイソタイプ処置対照（Ｃ）は比較のために示す。下のパネルの写真は、抗ＣＤ２８  ｈ１及びｈ２で処置された精製Ｔ細胞の写真である。
【０１７２】
実施例３
本実施例は、ｈ２  ＣＨ１及びヒンジ領域が、ＬＯＢ７．４にＦｃγＲ非依存性アゴニ
スト活性を与えることを示す図３（ａ）〜（ｄ）の実験に関する。パネル（ａ及びｂ）は、（上）（ａ）天然型、または（ｂ）ＣＨ１（ＣＨ１  １／２及びＣＨ１  ２／１）、若しくはＣＨ１及びヒンジ領域（ヒンジ１／２及びヒンジ２／１）が交換されている、ＬＯＢ７．４  ｈ１及びｈ２  ｍＡｂの概略図を含む。これらパネルの真ん中において、非刺激細胞（灰色のヒストグラム）と比較した、指定されるｍＡｂ（黒線）とともに一晩インキュベートされた後の、ヒトＢ細胞上のＣＤ２３の発現を示す。これらパネルの一番下において、ｈＣＤ４０Ｔｇ  ＦｃγＲＩＩＢ＋／＋（ＷＴ）またはＦｃγＲＩＩＢ−／−（ＫＯ）のＢ細胞増殖を、様々な濃度のキメラｍＡｂに反応した３Ｈチミジン取り込みにより評価した。（ａ）において、ＬＯＢ７．４  ｈ１、ｈ２及びｍ１に反応した増殖を比較している。（ｃ）ｈＣＤ４０ＴｇマウスにＯＴＩ細胞を適合移植し、次いで、０．５ｍｇのＳｉｇｍａ  ＯＶＡと、１００μｇのＬＯＢ７．４  ｈ１若しくはｈ２、または指定されるキメラヒンジ１／２若しくはヒンジ２／１を用いて免疫化した。反応のピーク（５日目）での循環ＯＴＩ細胞（平均±ＳＤ、ｎ＝６、２つの実験を統合）を示す。＊ｐ＜０．０５  ＊＊ｐ＜０．０１。（Ｄ）ＬＯＢ７．４  ｈ１、ｈ２及びキメラｍＡｂのＣＥ−ＳＤＳプロファイル。
【０１７３】
実施例４
本実施例は、ＬＯＢ７．４  ｈ２のアゴニスト活性が、ｈ２Ｂ立体配座をとるその能力に依存することを示す図４（ａ）〜（ｅ）の実験に関する。パネル（ａ）は、ＣＥ−ＳＤＳプロファイルを含み、ＬＯＢ７．４天然型ｈ２、またはｈ２Ａ（Ａねじれ）及びｈ２Ｂ（Ｂねじれ）の形態に化学的に歪められたｈ２に反応したｈＣＤ４０Ｔｇ  Ｂ細胞の増殖を示す。２つの実験のうちの１つの結果を示す。パネル（ｂ）は、指定された点変異を有するＬＯＢ７．４  ｍＡｂのＣＥ−ＳＤＳプロファイルを含む。ＬＣ  Ｃ２１４Ｓ変異は、ＨＣとＬＣの共有結合を阻害し、それによりこれらの形態が電気泳動上で分離される。全ＩｇＧ、ＨＣ−ＨＣ複合体（ＨＨ）、遊離ＬＣ（Ｌ）及び内部マーカー１０ｋＤａの位置を示す。パネル（ｃ）は、様々な濃度の操作されたＬＯＢ７．４  ｍＡｂに反応したＦｃγＲＩＩＢ＋／＋（ＷＴ）またはＦｃγＲＩＩＢ−／−（ＫＯ）のｈＣＤ４０ＴｇのＢ細胞の増殖を示す（少なくとも３つの実験のうちの１つの結果を示す）。パネル（ｄ）は、天然型ＬＯＢ７．４  ｈ２、ｈ２Ａ（ＨＣ  Ｃ２３３Ｓ）、ねじれ型ｈ２Ｂ、またはｈ２Ａとｈ２Ｂの１：１の混合物に反応したｈＣＤ４０ＴｇのＢ細胞の増殖を示す（６つ以上の類似実験のうちの１つのデータを示す）。パネル（ｅ）は、固定されたｈＣＤ４０に結合する、指定されたＬＯＢ７．４  ｈ２変異体のＳＰＲプロファイルを示す。使用されたｍＡｂ濃度は、１００、２０、４、０．８及び０．１６ｎＭ、ｈＣＤ４０は約８０００ＲＵであった。類似の結果が、１２００ＲＵ  ｈＣＤ４０でも得られた。
【０１７４】
実施例５
本実施例は、抗マウスＣＤ４０ｍＡｂの３／２３のアイソタイプ依存性を示す図５（ａ）〜（ｅ）の実験に関する。パネル（ａ及びｂ）は、マウスにＯＴＩ細胞を適合移植し、次いで１００μｇの指定される３／２３ｍＡｂと共に、または無し（対照）で、５００μｇのＳｉｇｍａＯＶＡまたは１００μｇのｅｎｄｏＯＶＡで免疫化した場合の実験結果を含む。（ａ）及び（ｂ）において、循環ＯＴＩ細胞及び抗ＯＶＡ  Ａｂ濃度は、それぞれ５日後及び１４日後に計測した。結果は三連のマウスで平均±ＳＤであり、５つのうちの１つの実験（ＳｉｇｍａＯＶＡ）または３つのうちの１つの実験（ｅｎｄｏＯＶＡ）を表している（＊ｐ＜０．０５  ＊＊ｐ＜０．０１）。パネル（ｃ）は、１００μｇの指定される３／２３アイソタイプを投与されたマウスの脾臓切片を、ＣＤ７０（緑色、左）及びＤＣマーカーのＭＩＤＣ８（赤、中央、右側で重ねている）で染色した実験を含む（バーは１００μｍ）。パネル（ｄ）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＯＴＩ細胞を用いて適合移植し、ＯＶＡ＋１００μｇの指定されたｍＡｂを用いて免疫化し、５日後にＥＧ７腫瘍を皮下注射でチャレンジした実験を示す。２つの実験のうちの１つの実験の５匹のマウスの群の生存曲線を示す。ｍ１及びｈ２の曲線を互いに重ねている。（ｅ）ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１ｘ１０４個のＢＣＬ１腫瘍細胞を静脈内注射した。１４日後、腫瘍が脾臓細胞全体の５〜１０％に相当したとき、指定されるようにマウスに１００μｇの３／２３  ｈ１またはｈ２またはＰＢＳ（対照）を単回静脈内投与した。２つの実験のうちの１つの実験の５匹のマウスの群の生存を示す。
【０１７５】
実施例６
本実施例は、ＬＯＢ７．４ヒトＩｇＧ２はヒト細胞に対しヒトＩｇＧ１よりも活性であること、及びＦｃγＲ相互作用に非依存性であることを示す図６（ａ）〜（ｅ）の実験に関する。パネル（ａ）は、精製ヒト末梢血Ｂ細胞を１μｇ／ｍｌのＬＯＢ７．４  ｈ１またはｈ２と共にインキュベートし、増殖は８日後に分析したことを除き、図１（ａ）と同様に細胞活性化及び細胞増殖を分析した実験を示す。１１回以上の別々の実験のうちの１つの結果を示す。パネル（ｂ）は、ランゲルハンス細胞由来のヒト皮膚を、ＬＯＢ７．４
ｈ１またはｈ２またはアイソタイプ対照ｍＡｂとともに１８時間インキュベートし、ＣＤ７０発現をフローサイトメトリーにより分析した実験を含む。（２つの実験のうちの１つの実験の結果を示す）。（＊ｐ＜０．０５  ＊＊ｐ＜０．０１）。パネル（ｃ）は、ヒトＦｃγＲに結合しているＬＯＢ７．４  ｈ１及びｈ２の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムを示す。類似した結果が、１，０００または１５，０００ＲＵで固定されたｍＡｂで得られた。パネル（ｄ）は、ＣＦＳＥ標識ヒトＢ細胞を、ＬＯＢ７．４  ｈ１またはｈ２に加え、未トランスフェクト２９３細胞（対照：Ｃｏｎ）または高レベルの指定されたヒトＦｃγＲを発現している細胞をともにインキュベートした実験を示す。Ｂ細胞の増殖は、８日後にＣＦＳＥ希釈のフローサイトメトリー分析により評価した。灰色のヒストグラムは未刺激細胞を表す。パネル（ｅ）は、単離されたヒトＢ細胞を、ＬＯＢ７．４  ｈ１またはｈ２と共に１６時間、５０倍超のＡＴ１０  Ｆａｂ’２及び／または高レベルの指定されるｈＦｃγＲＩＩＡを発現している２９３細胞の存在下、または非存在下でインキュベートした実験を示す。ＣＤ２３の発現（黒線）を、未刺激細胞（灰色のヒストグラム）と比較した。
【０１７６】
実施例７
本実施例は、ｈ２Ａ及びｈ２Ｂのアンタゴニスト性ならびにアゴニスト性を示す図７（ａ）〜（ｄ）の実験に関する。パネル（ａ）は、天然型３／２３  ｈ２、またはｈ２Ａ及びｈ２Ｂの形態に化学的に歪められたｈ２のｎｒＣＥ−ＳＤＳプロファイルを示す。パネル（ｂ）は、ＦｃγＲＩＩＢ発現架橋細胞の存在下、または非存在下で、天然型またはねじれ型３／２３  ｈ２と共にインキュベートされたマウスＢ細胞上のＣＤ２３発現の上方制御を示す。（３つの実験のうちの１つを示す）。パネル（ｃ）は、指定される濃度の３／２３  ｈ２Ａ及びｈ２Ｂに反応したマウスＢ細胞の増殖を示す。パネル（ｄ）は、ＳＧＮ４０−Ｓｏｔｏｎ  ｈ２単独、またはＬＯＢ７．４  ＨＣ  Ｃ２３３Ｓ（ｈ２Ａ）との１：１混合に反応した、ＷＴまたはＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯのいずれかのｈＣＤ４０Ｔｇ  Ｂ細胞の増殖を示す。（２つの実験のうちの１つの二連の試料の平均及び範囲を示す）。
【０１７７】
以下の方法及び材料を、実施例８〜１６に記載される実験において用いた。
【０１７８】
材料と方法
マウス
Ｃ５７Ｂl／６及びＲＡＧ−／−マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ（Ｋｅｎｔ，ＵＫ）から得た。他の遺伝的改変系統（すべてＣ５７ＢＬ／６を背景とする）は、ＦｃγＲＩＩＢ−／−（Ｂｏｒｏｓｓら、２０１１）、ＯＴＩ  ＴＣＲトランスジェニック（Ｄｒ．Ｍａｔｔｈｉａｓ  Ｍｅｒｋｅｎｓｃｈｌａｇｅｒから好意により提供、インペリアル大学、ロンドン）、及びヒトＣＤ４０トランスジェニック（ｈＣＤ４０  Ｔｇ）(Ｒａｎｄｏｌｐｈ  Ｎｏｅｌｌｅ（キングズ大学、ロンドン）（
Ａｈｏｎｅｎら、２００２）から好意により提供された)であった。ヒトＣＤ４０  Ｔｇ
／ＦｃγＲＩＩＢ−／−及びｇ鎖−／−のマウスは、交雑育種により得て、フローサイトメトリーにより遺伝子型を確認した。動物は当地の動物施設で繁殖及び飼育され、およそ８〜１２週齢で使用された。すべての実験は、イギリス内務省ライセンス番号ＰＰＬ３０／２４５１及びＰＰＬ３０／２９６４のもと、当地の倫理委員会のガイドラインに従い行われた。
【０１７９】
抗体及び試薬
以下のハイブリドーマを用いた。抗ヒトＣＤ２３（ＭＨＭ６）は、Ｊ  Ｇｏｒｄｏｎ（バーミンガム大学）から得た。抗ヒトＦｃ？ｎｔｉ−ヒトＦｃ）３（ＭＨＭ６）は、γＲＩＩＡ及びＩＩＢ（Ｇｒｅｅｎｍａｎら、１９９１）から得て、抗ヒトＦｃγＲＩＩＢ（ＫＢ６１）、抗ヒトＣＤ４０（ＣｈｉＬｏｂ  ７／４；（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ、２０１４））及び抗ヒト４−１ＢＢは、従来のハイブリドーマ法を用いて当研究室内で作製された。抗マウスＣＤ２３−ＰＥは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から得た。ＯＴＩ細胞染色に関しては、ＡＰＣ−抗マウスＣＤ８α（クローン５３−６．７；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、従前に記載したように（Ｗｈｉｔｅら、２０１１）、当研究室内で作製されたＰＥ標識ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマーを用いた。フローサイトメトリーは、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて行われた。ニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｄｇｅ社（Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）から購入した。エンドトキシンフリーＯＶＡは、Ｐｒｏｆｏｓ  ＡＧ社（Ｒｅｇｅｎｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。
【０１８０】
キメラ抗体
様々なｍＡｂの重鎖可変領域及び軽鎖（カッパ）可変領域をコードするＤＮＡ構築物は、ＰＣＲ反応によってハイブリドーマから増殖された、またはＧｅｎｅｗｉｚ，Ｉｎｃ．により合成された。抗ＣＤ４０ｍＡｂ  ＳＧＮ４０−Ｓｏｔｏｎ及び抗ＣＤ２８  ＴＧＮ−Ｓｏｔｏｎは、公表されている配列を用いて作製された（それぞれ、ＵＳ特許番号ＷＯ２００７／０７５３２６及び米国特許第７，５８５，９６０号）。ｍＡｂ精製及びクオリティコントロールの方法の詳細は、捕捉の実験手順において見出される。
【０１８１】
免疫化及び免疫反応の評価
マウスは、個々の実験に関して詳述されるように、尾静脈注射を介して２００μＬのＰＢＳ溶液で免疫化された。血清抗ＯＶＡ  Ａｂのレベルは、ＥＬＩＳＡにより測定された（Ｗｈｉｔｅら、２０１０）。一部の実験において、３ｘ１０５個の脾臓ＯＶＡ−特異的ＣＤ８（ＯＴＩ）Ｔ細胞が、免疫化の前日に尾静脈から投与された。
【０１８２】
腫瘍の治療
ＯＶＡ発現胸腺腫であるＥＧ７に対するワクチン化のために、Ｄ−６（６日前）にマウスに５ｘ１０４個のＯＴＩ細胞を用いて適合移植し、次いで、Ｄ−５（５日前）に０．５ｍｇのＳｉｇｍａ  ＯＶＡと１００ｍｇの抗ＣＤ４０ｍＡｂを投与した。マウスは、Ｄ０（０日目）に５ｘ１０５個のＥＧ７腫瘍細胞を皮下注射でチャレンジされた。腫瘍増殖はモニターされ、人道的なエンドポイントに達したとき（２つの最も大きな垂直の長さをとったときに、１５ｍｍの平均腫瘍直径）、マウスを殺処分した。Ｂ細胞リンパ腫（ＢＣＬ１）治療は、記載されたように行われた（Ｗｈｉｔｅ、２０１４）。簡潔に述べると、マウスに、０日目に１ｘ１０４個のＢＣＬ１細胞を尾静脈から接種した。１４日目（腫瘍が確立され、脾臓重量の５〜１０％に相当したとき）に、マウスは、１００μｇの抗ＣＤ４０の単回投与で治療された。
【０１８３】
細胞活性化及び増殖
樹状細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞の活性化ならびに／または増殖を評価するための単離ならびに分析の詳細は、以下に記載されている。
【０１８４】
表面プラズモン共鳴
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、以下に記載されるように可溶性Ｆｃγ受容体とＣｈｉＬｏｂ７／４  ｍＡｂアイソタイプの間の相互作用、ならびに可溶性ｍＡｂと固定ＣＤ４０の間の相互作用を分析した。
【０１８５】
統計分析
スチューデントＴ検定（対応のない：ｕｎｐａｉｒｅｄ、両側検定：ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）、及び生存分析（ログ−ランク  マンテル−コックス検定）は、ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて行われた。Ａｂ応答の比較に対し、データは、分析の前に対数変換された。一部の場合において、複数の実験から得たデータが統合された。しかし、実験間の相対的差異は同一のままであったが、しばしば絶対尺度が大きく変化することにより統合が出来なくなるため、統合は常に可能というわけではなかった。この場合、１つの代表的な実験が、図の説明において記載され、実施された実験数と共に示される。
【０１８６】
キメラ抗体の産生及びクオリティコントロール
様々な領域が、異なる抗体のアイソタイプの定常領域を含有する発現ベクター（重鎖に対してはｐＥＥ６．４ベクター、及び軽鎖に対してはｐＥＥ１２．４ベクター、Ｌｏｎｚａ社）へとサブクローニングされた。ｍＡｂの一過性産生のための２９３Ｆ細胞へのトランスフェクション、またはｍＡｂの安定的生産のためのＣＨＯ−Ｋ１細胞へのトランスフェクションの前に、重鎖ベクター及び軽鎖ベクターは共にさらにサブクローニングされた。分泌されたｍＡｂは、プロテインＡセファロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）クロマトグラフィーにより精製され、凝集塊はＳｅｐｈａｄｅｘ  ２００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を通してゲルろ過により取り除かれた（ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより示される）。すべての調製物はＥｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳポータブルテストシステム（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）により測定したところ低エンドトキシン（＜１ｎｇ／ｍｇタンパク質）であった。ｉ）１０ｍｇ／ｍｌ超のｍＡｂ濃度が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでマウスＢ細胞増殖を引き起こすために十分な量のエンドトキシンをもたらすために必要であること（図９Ａ）、ｉｉ）ヒトＢ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏでエンドトキシンに反応しない（Ｂｏｕｒｋｅら、２００３、及び図９Ｂ）が、ＣｈｉＬｏｂ７／４で活性化におけるアイソタイプ依存性の差異を示すこと、ｉｉｉ）少なくとも５０ｍｇ用量のｍＡｂ（投与された量の５００倍）が、ｉｎ  ｖｉｖｏでこのレベルまで免疫応答をブーストするための十分なエンドトキシンをもたらすために必要であること（図９Ｃ）、を理由として、混入エンドトキシンは、本実験において記載されるｍＡｂ機能の主原因とはならないはずである。
【０１８７】
フローサイトメトリー及び／またはＳＰＲを用いて、Ａｇ結合における差異を評価した。ｍＡｂ調製物の非還元変性キャピラリー電気泳動（ｎｒＣＥ−ＳＤＳ：Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）は、記載されるように（Ｇｌｅｎｎｉｅら、１９８７）Ｆａｂ’を作製するため、化学的に還元されたものを用いて行われた。プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、残りのＦｃをすべて除去した。
【０１８８】
細胞の単離、活性化及び増殖
樹状細胞：従前に記載されているように（Ｐｏｌａｋら、２０１２）、ヒトの初期ランゲルハンス細胞は単離された。簡潔に述べると、ヘルシンキガイドラインに従い、サザンプトン及びサウスウェストハンプシャー研究倫理委員会（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗｅｓｔ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃ
ｏｍｍｉｔｔｅｅ）による承認とともに書面のインフォームドコンセントを得た後、健常な個人から皮膚標本を得た。表皮シートを、２０時間の酵素消化の後に分離させた（Ｄｉｓｏｐａｓｅ、２ＩＵ、Ｇｉｂｃｏ社、ＵＫ）。表皮シートから４８時間移動させた後、ＬＣを回収し、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）密度勾配（Ａｘｉｓ  Ｓｈｉｅｌｄ社、Ｎｏｒｗａｙ）により、７０％超のＣＤ１ａ＋ＨＬＡＤＲ＋細胞へと富化させた。細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％、Ｓｉｇｍａ社、ＵＫ）及びＦＢＳ（１０％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＵＫ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ社、ＵＫ）中に５ｘ１０４個の細胞／ウェルで、９６ウェルＵ底プレートへと播種し、ＣｈｉＬｏｂ７／４ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２  ｍＡｂまたはアイソタイプ対照と共に１８時間、刺激した。ＣＤ１ａ＋ＨＬＡＤＲ＋ＬＣ上の活性化マーカー、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ７０（すべてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の発現は、フローサイトメトリーにより評価した。
【０１８９】
Ｂ細胞：Ｂ細胞は、磁気ネガティブ選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社またはＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて脾臓（マウス）または末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ、ヒト）から精製した。ヒトＰＢＭＣ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ社）は、国立血液サービス（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ））を介して匿名の健常なドナーから得た血液コーン（ｂｌｏｏｄ  ｃｏｎｅｓ）から単離された。細胞は、９６ウェルの丸底ディッシュに、１ｘ１０５細胞／ウェルで、個々の実験に関して記載されるように様々な濃度のｍＡｂと共に播種された。一部の場合において、１ｘ１０５個の２９３Ｆ細胞にヒトＦｃγＲをトランスフェクトした。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＰＡ８００  Ｐｌｕｓアナライザー、メーカーの説明書に従う。ｈ２のねじれ型を作製するために、ｍＡｂは、６ｍＭのシステインと１ｍＭのシスタミンを含有する０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０へと、２Ｍの塩酸グアニジンと共に（ｈ２Ａに対して）、または２Ｍの塩酸グアニジン無しで（ｈ２Ｂに対して）、４０℃で４日間、透析され、次いで、使用前にＰＢＳへと透析された。ペプシン消化を用いて、（Ｆａｂ’）２断片を作製し、次いでそれを化学的に還元させ、記載されるように（Ｇｌｅｎｎｉｅら、１９８７）Ｆａｂ’を生成した。プロテインＡクロマトグラフィーを用いて残りのＦｃをすべて除去した。
【０１９０】
細胞の単離、活性化及び増殖
樹状細胞：従前に記載されているように（Ｐｏｌａｋら、２０１２）、ヒトの初期ランゲルハンス細胞は単離された。簡潔に述べると、ヘルシンキガイドラインに従い、サザンプトン及びサウスウェストハンプシャー研究倫理委員会（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗｅｓｔ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）による承認とともに書面のインフォームドコンセントを得た後、健常な個人から皮膚標本を得た。表皮シートを、２０時間の酵素消化の後に分離させた（Ｄｉｓｏｐａｓｅ、２ＩＵ、Ｇｉｂｃｏ社、ＵＫ）。表皮シートから４８時間移動させた後、ＬＣを回収し、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）密度勾配（Ａｘｉｓ  Ｓｈｉｅｌｄ社、Ｎｏｒｗａｙ）により、７０％超のＣＤ１ａ＋ＨＬＡＤＲ＋細胞へと富化させた。細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％、Ｓｉｇｍａ社、ＵＫ）及びＦＢＳ（１０％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＵＫ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ社、ＵＫ）中に５ｘ１０４個の細胞／ウェルで、９６ウェルＵ底プレートへと播種し、ＣｈｉＬｏｂ７／４ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２  ｍＡｂまたはアイソタイプ対照と共に１８時間、刺激した。ＣＤ１ａ＋ＨＬＡＤＲ＋ＬＣ上の活性化マーカー、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ７０（すべてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の発現は、フローサイトメトリーにより評価した。
【０１９１】
Ｂ細胞：Ｂ細胞は、磁気ネガティブ選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社
またはＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて脾臓（マウス）または末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ、ヒト）から精製した。ヒトＰＢＭＣ（ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ社）は、国立血液サービス（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ））を介して匿名の健常なドナーから得た血液コーンから単離された。細胞は、９６ウェルの丸底ディッシュに、１ｘ１０５細胞／ウェルで、個々の実験に関して記載されるように様々な濃度のｍＡｂと共に播種された。一部の場合において、ヒトＦｃγＲをトランスフェクトした１ｘ１０５個の２９３Ｆ細胞（Ｗｈｉｔｅら、２０１１）もまた添加した。活性化を評価するために、一晩インキュベートした後、細胞を写真撮影（ＣＣ１２ソフトイメージングシステムを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ４１顕微鏡）し、活性化マーカーの発現をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により分析した。増殖は、記載されるように（Ｗｈｉｔｅら、２０１１）、培養の５日後（マウス）または８日後（ヒト）に、［メチル−３Ｈ］チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）取り込みにより評価された。
【０１９２】
Ｔ細胞：ヒトＰＢＭＣは、２ｍＭのＣＦＳＥで標識され、次いで、２日間、記述されるように（Ｒｏｍｅｒら、２０１１）、２４ウェルプレート中、ウェル当たり１ｘ１０？個／ｍｌで１．５ｍｌの細胞を用いて高密度で前培養された。前培養された細胞を洗浄し、分析のために１ｘ１０６個／ｍｌで再懸濁された。一部の実験に関し、Ｔ細胞は、総Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて前培養されたＰＢＭＣから単離された。抗ｈ４−１ＢＢ  ｍＡｂに関しては、９６ウェルの丸底プレートのウェルを、０．０２ｍｇ／ｍｌのＯＫＴ３のＰＢＳ溶液を用いて４時間、コーティングを行い、次いで、２回洗浄し、１０５個ＰＢＭＣ／ウェルを５？ＰＢＭＣ／ウェルと共に５または４時間インキュベートし、次いで。ＣＤ４+細胞の増殖は、ＣＦＳＥ希釈のフローサイトメトリー分析により評価した。抗ＣＤ２８  ｍＡｂに関しては、１０５個の単離されたＴ細胞を、未コーティングウェル中でｍＡｂと共にインキュベートし、上述のように増殖を評価した。結果は分裂細胞の割合としてあらわされている。
【０１９３】
ＥＢＶペプチド特異的ＣＤ８+ヒトＴリンパ球を活性化するために、ＥＢＶのＢＭＬＦ
−１エピトープ（ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ社、ＵＫ）に特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｔ細胞を、記載されるように（Ｐｏｌａｋら、２０１２）、ＨＬＡ−Ａ２の個人から増殖させた。ヒト初期ランゲルハンス細胞（ＬＣ）は、ＢＭＬＦ−１（ｐｒｏＧＬＣ：ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥＧＬＣＴＬＶＡＭＬ、１０μＭ）を含有する伸長ペプチドと共に６時間インキュベートされ、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１若しくはｈ２のｍＡｂ、またはアイソタイプ対照、１００ｎｇ／ｍｌで１８時間、刺激された。パルスされ、洗浄されたＬＣ（１ｘ１０４個の細胞）は、ＢＭＬＦ−１特異的Ｔ細胞（５ｘ１０４個の細胞）と共に２０時間、ＩＦＮ−γ産生に対するＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（Ｍａｂｔｅｃｈ社、Ｓｗｅｄｅｎ）中でメーカーのプロトコールに従い共培養された。スポット形成単位（ｓｆｕ）は、ＥＬＩＳｐｏｔ  ３．５リーダーを用いて計測された。
【０１９４】
表面プラズモン共鳴
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、可溶性Ｆｃγ受容体とＣｈｉＬｏｂ７／４  ｍＡｂアイソタイプの間の相対相互作用を比較した。抗体または基準としてのＢＳＡは、メーカーの説明書に従い、標準的なアミンカップリングにより、１５，０００ＲＵでＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定された。基準フローセルをコートするためのアイソタイプ対照ｍＡｂの使用は、Ｆｃの存在を理由として行われなかった。可溶性ＦｃγＲ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）は、２５℃、流速３０μＬ／分で、ＨＢＳ−ＥＰ＋ランニング緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ）中、１００ｎＭで、フローセルを通して注入された。再生は、３０秒間、１
０ｍＭのグリシン、ｐＨ２を用いて行われた。フローセル上にコートされたｍＡｂの完全性は、陽性対照（ｈＣＤ４０−Ｆｃ）及び陰性対照（ｈＯＸ４０−Ｆｃ）融合タンパク質（Ｒ ａｎｄ Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）を１００ｎＭで用いることにより確認された（図１１Ｃ）。基準フローセルのバックグラウンド応答は、自動的に差し引かれた。基準細胞への結合は、すべてのＦｃγＲに対して無視できるほど小さかった（図１１Ｄ、及びデータは示さず）。精製ＦｃγＲタンパク質それぞれの完全性は、以下のうちの少なくとも１つにより確認された。ＩｇＧアイソタイプに関し予測される結合プロファイル（Ｗｈｉｔｅら、２０１１、Ｗｈｉｔｅら、２０１１、及び本実験）。ＦｃγＲ相互作用を増強することが知られている変異Ｆｃを有するｍＡｂへの結合の増加（示さず）。固定された抗Ｆｃ？相互作用による結合（データは示さず）。ＦｃγＲの廃棄（示さず。及び図１１Ｅ）。異なる抗ＣＤ４０  ｍＡｂと固定されたｈＣＤ４０の間の相互作用の比較のための条件は、以下であった。Ｆａｂ’結合の比較に関しては、ｈＣＤ４０−Ｆｃ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）は、上述のように１０００ＲＵ、ｐＨ５で固定され、Ｆａｂ’断片は、６４０、１２８、２５．６、５．１２及び１．０２４ｎＭで通過させた（図１１Ｅ）。ＩｇＧ結合の比較に関しては、ｈＣＤ４０−Ｆｃは８０００ＲＵで固定され、ＩｇＧは１００、２０、４、０．８及び０．１６ｎＭで通過させた（図１１Ｆ）。再生は、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５を用いて３０秒間行われた。ＣＤ４０に対するＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１及びｈ２のＦａｂ’断片の親和性は、１：１結合モデルを適合したＢｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いて測定された。
【０１９５】
実施例８
本実施例は、図８（ａ）〜（ｈ）の実験に関する。これら実験は、抗ＣＤ４０活性に対する異なるヒトアイソタイプの影響を示す。（Ａ）指定されたアイソタイプのＣｈｉＬｏｂ７／４（１μｇ／ｍｌ）に反応したヒトＢ細胞の活性化を、１６時間後、同種付着（ｈｏｍｏｔｙｐｉｃ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）（上）及び３Ｈチミジン取り込みにより評価した。点は、アイソタイプ毎の２〜５回の実験由来の個々の試料を表す。（Ｂ）ヒトランゲルハンス細胞は、未処置（黒線）、またはＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１、ｈ２、またはアイソタイプ対照（ｃ）と共に１８時間、インキュベート（灰色の線）し、ＣＤ７０発現をフローサイトメトリーにより分析した。２つの実験のうちの１つを示す。（Ｃ）（Ｂ）と同様に、ＣｈｉＬｏｂ７／４で活性化されたＨＬＡ合致ヒトランゲルハンス細胞によるＢＭＬＦ−１特異的ＣＤ８+Ｔ細胞活性化のＩＦＮ−γのＥＬＩＳｐｏｔアッセイ。未パルス細胞による活性化に対して標準化された、三連での２つの実験のうちの代表的なデータ。（Ｄ）２００ｎｇ／ｍｌのＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１及びｈ２によるｈＣＤ４０Ｔｇ  Ｂ細胞の活性化を（Ａ）と同様に分析した。点は、二連で行われた３つの実験のうちの個々の試料である。（Ｅ）ｈＣＤ４０Ｔｇマウスを、１００μｇのＯＶＡと、１００μｇの指定されるＣｈｉＬｏｂ７／４  ｍＡｂと共に、または１００μｇのＯＶＡのみ（対照：Ｃｏｎ）で免疫化した。循環内因性ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、８日目に計測され、応答のピーク（左）及び抗ＯＶＡ−Ａｂのピーク（右）を、１４日目に測定した。４つの実験のうちの２つの実験の個々の動物を示す。（Ｆ）ＯＴＩ細胞を適合移植されたマウス（ｎ＝３）を、１００？ｇのエンドトキシンフリーのＯＶＡのみ（対照：Ｃｏｎ）、または１００？ｇのエンドトキシンフリーのＯＶＡと１００μｇの指定される３／２３ｍＡｂで免疫化した。循環ＯＴＩ細胞は、応答のピーク（５日目、左）及び抗ＯＶＡ  Ａｂのピーク（１４日目、右）で計測された。６回以上の実験のうちの２つの実験のデータを統合した。（Ｇ）Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝５）にＯＴＩ細胞を適合移植し、ＯＶＡと１００μｇの指定される３／２３アイソタイプを用いて免疫化し、５日後にＥＧ７腫瘍を用いて皮下注射でチャレンジした。２つの実験のうちの１つの実験の生存曲線を示す。（Ｈ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）に、ＢＣＬ１腫瘍細胞を静脈内注射でチャレンジし、１４日後（腫瘍が脾臓重量の５〜１０％に相当するとき（Ｗｈｉｔｅ、２０１４））、１００μｇの３／２３  ｈ１、ｈ２、またはＰＢＳ（対照：Ｃｏｎ）を指定されるように静脈内投与した。２つの実験のうちの１つの実験の生存曲線を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．
０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【０１９６】
実施例９
本実施例は、図８の実験の抗ＣＤ４０活性に対するアイソタイプの影響を立証する対照実験である、図９（ａ）〜（ｇ）の実験に関する。抗ＣＤ４０活性に対するアイソタイプの影響に関する対照実験。（Ａ〜Ｃ）エンドトキシンの混入は、抗ＣＤ４０活性を説明するものではない。（Ａ）ＦｃγＲＩＩＢ−／−マウスのＢ細胞を、４００ｎｇ／ｍｌの３／２３  ｍ２ａの存在下、または非存在下で、ＬＰＳの濃度を増加させながらインキュベートした。増殖は、３Ｈチミジン取り込みにより評価した（平均±ＳＥＭ  三連）。（Ｂ）ヒトＢ細胞の活性化は、示されるように、１ｍｇ／ｍｌのＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１及び／若しくはＦｃγＲＩＩＢ過剰発現架橋細胞の存在下、または非存在下で、１ｍｇ／ｍｌのＬＰＳと共に１６時間インキュベートした後のＣＤ２３の上方制御（対照（灰色）と比較した黒線）により評価された。（Ｃ）マウスは、１００ｍｇのエンドトキシンフリーのＯＶＡと、指定される用量のＬＰＳで免疫化された。循環抗ＯＶＡ  Ａｂの力価は、１４日目に測定された。（Ｄ）ヒトＣｈｉＬｏｂ７／４のアイソタイプは、同じようにＣＤ４０に結合する。精製されたｈＣＤ４０ＴｇマウスのＢ細胞を、異なる濃度の、異なるヒトアイソタイプの競合非標識ＣｈｉＬｏｂ  ｍＡｂと前もって混合された１０ｍｇ／ｍｌのＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１−ＦＩＴＣと共にインキュベートした。フローサイトメトリーを用いて、ＣｈｉＬｏｂ７／４−ＦＩＴＣ結合のレベルを測定し、最大ＭＦＩの％（競合ｍＡｂは存在していない）としてあらわされている。非標的化ヒトＩｇＧ４アイソタイプｍＡｂ（灰色の三角）は、非競合対照として含まれた。（Ｅ）ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１及びｈ２のＦａｂ’断片は、ｈＣＤ４０に対し類似した親和性を有している。ｈＣＤ４０は１０００ＲＵで固定され、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１（実線）またはｈ２（破線）のＦａｂ’断片は、６４０、１２８、２５．６及び１．０２４ｎＭでチップ上を流れた。親和性は、１：１結合モデルを適合することにより算出され、ｈ１とｈ２それぞれ、１０．０及び１０．２ｎＭであった。（Ｆ）ヒト及びマウスのＣＤ４０ｍＡｂに対するアイソタイプ対照。精製されたＷＴ（ｍＣＤ４０＋／＋）またはｈＣＤ４０Ｔｇ／ｍＣＤ４０  ＫＯ（ｍＣＤ４０−／−、ｈＣＤ４０＋／−）マウスのＢ細胞を、１ｍｇ／ｍｌの指定されるｍＡｂと共に１６時間インキュベートした。Ｂ細胞活性化は同種付着（上）及びＣＤ２３上方制御（下）により評価した。灰色のヒストグラムは未処置細胞。黒線はｍＡｂのみで処置。青線はｍＡｂとＦｃγＲＩＩＢ過剰発現架橋細胞と共にインキュベート。（Ｇ）マウス脾臓ＤＣ上のＣＤ７０のアイソタイプ特異的な上方制御。１００ｍｇの指定される３／２３アイソタイプを投与されたマウスの脾臓切片を、ＣＤ７０（緑、左）及びＤＣマーカーのＭＩＤＣ８（赤、真ん中、右側で重ねている）に対し染色した。バー＝１００ｍｍ。２つの実験のうちの１つの実験の結果を示す。
【０１９７】
実施例１０
本実施例は、ヒトＩｇＧ２のＦｃγＲ非依存性活性を示す、図１０（ａ）〜（ｅ）の実験の結果に関する。（Ａ）示されるように、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１若しくはｈ２、＋／−５０倍超過のブロッキング抗ＦｃγＲＩＩ（ＡＴ１０）Ｆ（ａｂ’）２、及び／または、ｈＦｃγＲＩＩＢ過剰発現２９３Ｆ細胞（＋／−ＦｃγＲＩＩ）によるヒトＢ細胞の活性化。ＣＤ２３発現（黒線）は、非刺激細胞（灰色のヒストグラム）と比較されている。（Ｂ）１６時間、１ｍｇ／ｍｌでのＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１及びｈ２の全ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂ’によるヒトＢ細胞の活性化（同種付着及びＣＤ２３上方制御、（上）及び増殖（下）。４つの実験のうちの１つの実験の二連の試料の平均及び範囲。（Ｃ）様々な濃度の指定されるＣｈｉＬｏｂ７／４アイソタイプを用いた、ＦｃγＲＩＩＢに対するｈＣＤ４０Ｔｇ  Ｂ細胞のＷＴまたはＫＯの増殖は、３Ｈチミジン取り込みにより測定された（４つの実験のうちの１つの実験の、二連の平均及び範囲）。（Ｄ）ＦｃγＲのＷＴ、ＦｃγＲＩＩＢのＫＯ、または共通のｇ鎖のＫＯ（活性ＦｃγＲがない）のｈＣＤ４０Ｔｇマウス（ｎ＝３〜５）に、ＯＴＩ細胞を投与し、次いで、ＯＶＡと指定されるＣｈｉＬｏｂ７／４ｍＡｂを投与した。循環ＯＴＩ細胞を、５日目に計数した。２つの実験の結果を統合。（Ｅ）ｈＣＤ４０Ｔｇ／ＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯマウスに、ＯＴＩ細胞を投与し、次いで、ＯＶＡ単独（対照）または２００ｍｇのＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１またはｈ２のＦａｂ’２を用いて、０日目（Ｄ０）に静脈内注射、次いで、１日目及び２日目に１００ｍｇのＦａｂ’２の静脈内注射で免疫化した。５日目（Ｄ５）の循環ＯＴＩ細胞を示す。マウスに１００ｍｇのｈ２  Ｆａｂ’２を単回静脈内投与した場合にも、類似の結果が得られた（示さず）。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５。
【０１９８】
実施例１１
本実施例は、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２のアゴニスト活性が、ＦｃγＲ非依存性であることを立証する、図１１（ａ）〜（ｆ）の実験に関する。（Ａ及びＢ）１００ｎＭの指定されるヒト（Ａ）及びマウス（Ｂ）のＦｃγＲの、１５，０００ＲＵで固定されたＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１またはｈ２に対する結合を示すＳＰＲプロファイル。すべてのプロファイルは、同じスケールで表されており（Ｙ軸は２５００ＲＵまで）、それにより相対結合の比較が可能となる。ＦｃγＲＩＩＡの差し込み図は、２００ＲＵのＹ軸スケールでプロットされた同じデータを示し、低レベルの結合を明らかとしている。（Ｃ）結合したｍＡｂの完全性を示すために、１００ｎＭのｈＣＤ４０タンパク質（実線）またはｈＯＸ４０タンパク質（破線）の、Ａ及びＢで用いられたフローセル上に固定されたｈ１及びｈ２ｍＡｂへの結合が測定された。（Ｄ）ｈＦｃγＲＩ及びＩＩＢの、固定ＢＳＡへのバックグラウンド結合。同様の結果が、すべてのＦｃγＲに対して得られた。このバックグラウンドは、ＡとＢのプロファイルから差し引かれた。（Ｅ）ｈＦｃγＲＩＩＢの完全性を示すために、抗ＦｃγＲＩＩＢ特異的ｍＡｂ（ＫＢ６１）を固定し、ｈＦｃγＲＩ及びＩＩＢの結合を比較した。（Ｆ）精製されたｈＣＤ４０ＴｇマウスＢ細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２  ＩｇＧ単独（左、黒いバー）と共に、または５０倍超過の指定されるＣｈｉＬｏｂ７／４  ＩｇＧ断片の存在下で、１６時間インキュベートした。ＣＤ２３発現は、２０時間後にフローサイトメトリーにより分析され（上のパネル；灰色のヒストグラムは未処置細胞、黒線はｍＡｂ処置細胞）、及び３Ｈチミジン取り込みによるＢ細胞の増殖は５日後に分析された（下のパネル。二連の試料の平均及び範囲）。２つの実験のうちの１つの実験の結果を示す。
【０１９９】
実施例１２
本実施例は、複数の受容体標的に対するヒトＩｇＧ２のアンタゴニスト性効果を示す、図１２（ａ）〜（ｅ）の実験に関する。（Ａ）ＳＧＮ４０−Ｓｏｔｏｎ  ｈ１またはｈ２を用いたヒトＢ細胞の活性化を、図８Ａのように評価し、５つの実験のうちの１つの実験を示す（二連の試料の平均及び範囲）。（Ｂ）ＳＧＮ４０  ｈ１及びｈ２、または元のＳＣ２６  ｍ１に反応したｈＣＤ４０Ｔｇ  Ｂ細胞の増殖（ＷＴまたはＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯ）（３つの実験のうちの１つの実験の、二連の平均及び範囲）。（Ｃ）ｈＣＤ４０Ｔｇ／ＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯマウス（ｎ＝５）にＯＴＩ細胞を投与し、次いで、ＯＶＡ単独で免疫化（対照：Ｃｏｎ）または１００ｍｇのＳＧＮ４０−Ｓｏｔｏｎ  ｈ１若しくはｈ２で免疫化した。循環ＯＴＩ細胞は、５日目（Ｄ５）に計数した。＊＊＊ｐ＜０．００１、２つの実験のうちの１つの実験を示す。（Ｄ及びＥ）キメラｈ１、ｈ２、若しくはｈ４の抗ｈ４−１ＢＢまたはｈＣＤ２８に反応した、総ＰＢＭＣ中のヒトＣＤ４Ｔ細胞培養（Ｃ）または精製Ｔ細胞培養（Ｄ）における活性化及び増殖。点は個々のドナーを表す。
【０２００】
実施例１３
本実施例は、ＣＨ１及びヒンジ領域が、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２に活性を付与することを示す、図１３の実験に関する。（Ａ）ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１及びｈ２（左）ならびに変異体（上）の概略図であり、変異体は、ｈ１及びｈ２のＣＨ１（（ｉ）ＣＨ１  １／２、及び（ｉｉ）ＣＨ１  ２／１）またはＣＨ１と、ヒンジ領域（（ｉｉｉ）ＣＨ１Ｈｇｅ  １／２、及び（ｉｖ）ＣＨ１Ｈｇｅ  ２／１）が交換されている。真ん中は、Ｆｃ
γＲＩＩＢ発現架橋細胞の非存在下、または存在下における、ヒトＢ細胞上のＣＤ２３の発現であり、下は、キメラｍＡｂに反応したｈＣＤ４０Ｔｇ  ＦｃγＲＩＩＢ  ＷＴまたはＫＯのＢ細胞増殖（二連の平均及び範囲）。（Ｂ）図１０Ｅと同様に測定された、指定されたｍＡｂを用いて処置されたｈＣＤ４０Ｔｇマウス（ｎ＝３）におけるＯＴＩ反応。２つの実験のデータを統合。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【０２０１】
実施例１４
本実施例は、ＣｈｉＬｏｂ７／４の交換変異体はＣＤ４０に同様に結合することを立証する、図１４の対照実験に関する。精製されたｈＣＤ４０ＴｇマウスのＢ細胞を、異なる比率の指定される非標識変異体と前もって混合されたＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１−ＦＩＴＣと共にインキュベートし、図８に示されるように分析した。
【０２０２】
実施例１５
本実施例は、突然変異誘導が、広範なＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２アゴニスト性形態を生成することを示す、図１５（ａ））〜（ｈ）の実験に関する。（Ａ）「ねじれ型の」ｈ２Ａ及びｈ２Ｂ  ＣｈｉＬｏｂ７／４に反応した、ｎｒＣＥ−ＳＤＳプロファイル（上）、及びｈＣＤ４０Ｔｇ  Ｂ細胞の増殖（３つの実験のうちの１つの実験の二連の平均及び範囲）。（Ｂ）ねじれ型３／２３  ｈ２に反応した、ｎｒＣＥ−ＳＤＳプロファイル（上）、及びＦｃγＲＩＩＢ発現架橋細胞の存在下及び非存在下でのＣＤ２３の上方制御により評価されたマウスＢ細胞の活性化（下）。３つの実験のうちの１つの実験を示す。（Ｃ）指定されるＣｈｉＬｏｂ７／４変異体のｎｒＣＥ−ＳＤＳプロファイル。全ＩｇＧ、ＨＣＨＣ複合体（ＨＨ）、フリーＬＣ（Ｌ）、及び１０ｋＤａマーカーの位置を示す。（Ｄ）ＣｈｉＬｏｂ７／４変異体に反応した、ＦｃγＲＩＩＢのＷＴまたはＫＯであるｈＣＤ４０ＴｇＢ細胞の増殖（少なくとも３つの実験のうちの１つの実験の二連の平均及び範囲）。（Ｅ）１ｍｇ／ｍｌのＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２Ａ及びｈ２Ｂを用いて指定される時間、処置され、ホスホ−Ｉｋｋａ／ｂ、ホスホＩｋＢ−ａまたはＩｋＢ−ａに特異的なＡｂでプローブされたｈＣＤ４０ＴｇマウスＢ細胞の溶解物のウェスタンブロット。抗チューブリンは、ローディング対照として用いられた。（Ｆ）８０００ＲＵで固定されたｈＣＤ４０に結合するＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２変異体のＳＰＲ（１００、２０、４、０．８及び０．１６ｎＭ）。（Ｇ）ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２、ｈ２Ａ（ＨＣ  Ｃ２３３Ｓ）、ねじれ型ｈ２Ｂ、またはｈ２Ａとｈ２Ｂの１：１混合物を用いたｈＣＤ４０ＴｇＢ細胞増殖。６回以上の実験のうちの１つの二連の平均及び範囲。（Ｈ及びＩ）ＯＶＡと１００ｍｇのＣｈｉＬｏｂ７／４  Ｃ２３３Ｓ（ｈ２Ａ）またはねじれ型ｈ２Ｂで免疫化されたｈＣＤ４０Ｔｇ  ＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯマウス（ｎ＝５）における、ＯＶＡ特異的ＯＴＩ  ＣＤ８Ｔ細胞反応（Ｈ）、及び１８日目の血清Ａｂ反応（Ｉ）。２つの実験のうちの１つの実験の結果。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【０２０３】
実施例１６
本実施例は、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２Ａ型及びｈ２Ｂ型の異なる活性をさらに立証する、図１６（ａ）〜（ｇ）の実験に関する。（Ａ）２００ｎｇ／ｍｌのＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２の天然型、「Ａ」または「Ｂ」ねじれ型と共に１６時間、インキュベートした後の、同種付着（上）、及びＣＤ２３の上方制御（下）により評価される、精製ヒトＢ細胞の活性化。（Ｂ）精製ｈＣＤ４０ＴｇＢ細胞を、指定される濃度のＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２、ＣＨ１Ｈｇｅ２／１変異体、または当該変異体のねじれ型と共にインキュベートし、図１５Ａと同様に増殖を測定した（二連試料の平均及び範囲）。（Ｃ）Ｂと同様に測定された、ｈ２Ｂねじれ型ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２のＩｇＧ、またはＦａｂ’２の濃度増加に反応した、ｈＣＤ４０ＴｇマウスＢ細胞の増殖。（Ｄ）１ｍｇ／ｍｌのＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２Ａ及びｈ２Ｂを用いて指定される時間、処置され、ホスホ−ＩＫＫａ／ｂ、ホスホＩｋＢ−ａまたはＩｋＢ−ａに特異的なＡｂでプローブされたＲａｍｏｓ細胞の溶解物のウェスタンブロット。抗チューブリンは、ローディング対照として用いられた。（Ｅ）精製ｈＣＤ４０ＴｇマウスＢ細胞は、異なる濃度の指定される非標識変異体と前もって混合されたＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１−ＦＩＴＣと共にインキュベートされ、図１３Ｄと同様に分析された。（Ｆ）及び（Ｇ）ＯＴＩ細胞を適合移植されたｈＣＤ４０Ｔｇ  ＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯマウスを、１００ｍｇのＯＶＡと、１００ｍｇのねじれ型変異体ｍＡｂを用いて、図１２と同様に免疫化した。循環ＯＴＩ細胞は、継時的に計数された（５匹／群の平均±ＳＤ）（Ｄ）、及び１８日目に計測された血清中の抗ＯＶＡ抗体（Ｅ）。２つの同様の実験のうちの１つの実験の結果を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【０２０４】
結論
近年の臨床データから、免疫刺激性ｍＡｂは、たとえば癌の治療（Ｈｏｄｉら、（２０１０）；Ｗｏｌｃｈｏｋら、（２０１３）；Ｔｏｐａｌｉａｎら、（２０１２）；Ｂｒａｈｍｅｒら、（２０１２））、及び感染症における治療剤として有用でありうることが示唆されている。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏでの治療に用いられ得るｍＡｂ及び融合タンパク質の特定は、正確な作用機序の明確な理解が必要である。数多の身体データから、現在、アイソタイプ選択が重要であり、アイソタイプ選択が、Ａｇ結合後の事象を調節する異なるＦｃγＲの相互作用を決定づけることが示されている。（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎら、（２０１２）、Ｗｈｉｔｅら、（２０１３））。選択された相互作用を増強させ、ＦｃγＲＩＩＢによるＦｃの架橋を介した治療有効性を高める手段として、すでにｍＡｂ  Ｆｃの操作が提唱されている（ｗｈｉｔｅら、（２０１３）、Ｌｉ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ（２０１２）、Ｌｉ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ（２０１３））。本明細書のデータは、むしろ、アイソタイプ依存性だが、ＦｃγＲ非依存性である機序が、活性の重要な決定因子でありうることを示すものである。
【０２０５】
多くの抗癌性ｍＡｂに対し、ＦｃγＲ結合の役割が示されている。抗ＣＤ４０の場合、ＦｃγＲＩＩＢへの結合は、ｍＡｂ架橋を条件とし、前臨床モデルにおいて活性に必須であることが本発明者らにより示されている（Ｗｈｉｔｅら、（２０１１）、Ｌｉ  ａｎｄ
Ｒａｖｅｔｃｈ（２０１１））。この機能を調節するために十分に高い親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合するヒトＩｇＧアイソタイプは無く、そのため、ヒトでの使用のための剤を開発する際に課題が生じている。また、この受容体は常にｍＡｂの標的抗原と共に局在しているわけではないため、ＦｃγＲＩＩＢ結合の必要性が制限因子となっている可能性がある。故に、ｈ２アイソタイプのｍＡｂはＦｃγＲ非依存性のアゴニスト活性を有するという本報告における証明は、標的細胞の位置に関わらずアゴニスト性を有する剤の開発を行う機会をもたらすという点で、非常に意義深いものである。
【０２０６】
ｈ２  ｍＡｂが、アゴニスト活性のために外来性の架橋を必要としないという結果は、ユニークかつ驚くべきものである。ヒトＩｇＧ２アイソタイプは、合成後にそのヒンジ及びＣＨ１ドメイン内でジスルフィド結合を再構成し、それにより明白に異なる立体配座を有するアイソフォームを生じさせるというその能力において非常に優れている（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、（２００８）；Ｄｉｌｌｏｎら、（２００８）；Ａｌｌｅｎら、（２００９））。ＩｇＧ２は、４つのＨＣ間ジスルフィド結合を有する、古典的で柔軟なＩｇＧ構造（その『Ａ』型）で合成されると考えられている。徐々に、これは一連の中間体を経由してより固くコンパクトな『Ｂ』型へと転換され、Ｂ型ではＬＣとＨＣのＣＨ１がＨＣヒンジシステインの２３２と２３３にジスルフィド結合される（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、（２００８）；Ｄｉｌｌｏｎら、（２００８）；Ａｌｌｅｎら、（２００９））。一連の遺伝子操作されたｍＡｂを用いて、本発明者らは、ＬＯＢ７．４  ｈ２のアゴニスト活性が、ヒンジのジスルフィド結合を入れ替えるその能力に依存していたことを示した。さらに、特定のシステイン、またはシステイン残基の組み合わせの変異は、アンタゴニスト性立体配座及びアゴニスト立体配座へと抗体を固定することができた。
【０２０７】
以前、研究者らが、ｈ２活性に対するジスルフィドシャッフリングの影響は限定的であり、Ｂアイソフォームは親和性が低く、有効性が低下している傾向があると報告していた。しかし、それらの場合は、活性は抗原結合、または受容体−リガンド相互作用の阻害能力について測定されていた（Ｄｉｌｌｏｎら、２００８）。本発明者らは、ＬＯＢ７．４  ｈ２のアゴニスト性形態とアンタゴニスト性形態によるＣＤ４０の結合には何も差が無いことを見出した。本発明者らは、ｈ２のより固く、コンパクトな形態は、ｈ２Ｂと同様に、膜において高密度で組織化されたＣＤ４０との複合体を形成し、それにより架橋よりもＴＲＡＦリクルートメント及び下流細胞内シグナル伝達が可能となると推測した。ｈ２Ａのような、ｈ２のより柔軟な形態の、機能を阻害する性質は、これら複合体を妨害する能力を反映している可能性があり、天然型ｈ２の活性、またはｈ２Ａ型とｈ２Ｂ型の混合物の活性を、広範な濃度範囲にわたり計測した際に認められる特徴的なベル状の曲線を説明しうるものである。異なる形態のＬＯＢ７．４  ｈ２を結晶化させ、その正確な立体配座を決定し、その作用メカニズムを解明できる可能性がある。ｈ２の定常領域はまた、他の抗ｈＣＤ４０ｍＡｂであるＳＧＮ４０、ならびに、Ｔ細胞上に発現されている共刺激性分子（４−１ＢＢ及びＣＤ２８）を指向するｍＡｂに対し、ＦｃγＲ非依存性の活性を寄与するという結果から、これは、このアイソタイプの一般的な特性である可能性が示唆される。
【０２０８】
少なくともマウスモデルにおいて、アゴニスト性の抗ＣＤ４０は、ＦｃγＲＩＩＢへの結合を必要とするという本発明者らによる発見（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，２０１１；Ｗｈｉｔｅら、２０１１）は、特に単量体としては、ヒトＩｇＧは非常に低い親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合するため、ヒトでの使用を目的とした剤を開発する場合に課題を生じさせるものである（Ｂｒｕｈｎｓら、２００９）。Ｆｃ操作によりＦｃγＲＩＩＢ相互作用を増強させ、活性を改善させることはできるが（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，２０１２；Ｌｉ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，２０１３；Ｗｈｉｔｅら、２０１３）、この方法は、ＦｃγＲＩＩＢは腫瘍の微小環境内において常に架橋に使用できるわけではなく、またＦｃγＲＩＩＢが内皮細胞に結合した際、有害事象が生じる（Ｘｕら、２００３）という事実により、限定的である。故にこの報告の、ｈ２アイソタイプのｍＡｂが、ＦｃγＲ非依存性のアゴニスト活性を有しているという結果は、標的細胞の位置に関わらずアゴニスト性である試薬剤を開発する機会をもたらすという点で有意義である。ヒトＩｇＧ２アイソタイプは、合成後にそのヒンジとＣＨ１ドメイン内のジスルフィド結合を再構成し、明白に異なる立体配座の広範なアイソフォームを生じさせるという能力においてユニークである（Ａｌｌｅｎら、２００９；Ｄｉｌｌｏｎら、２００８；Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００８；Ｗｙｐｙｃｈら、２００８）。ＩｇＧ２は、４つのＨＣ間ジスルフィド結合を有する、古典的で柔軟なＩｇＧ構造（その『Ａ』型）で合成されると考えられている。徐々に、これは一連の中間体を経てよりコンパクトな『Ｂ』型へと転換され、Ｂ型ではＬＣとＨＣのＣＨ１がＨＣヒンジシステインの２３２と２３３にジスルフィド結合される（Ａｌｌｅｎら、２００９；Ｄｉｌｌｏｎら、２００８；Ｌｉｕら、２００８；Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００８；Ｗｙｐｙｃｈら、２００８）。化学的なねじれ形成法と一連の遺伝子操作ｍＡｂの両方を用いて、本発明者らは、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２のアゴニスト活性が、ｈ２Ｂ型に適合させるその能力に依存していることを示した。さらに、特定のシステイン、またはその組み合わせの変異は、異なる強さのアゴニスト活性を有する立体配座へと、ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２を固定しうる。
【０２０９】
注目すべきは、ジスルフィドシャッフリングは、カッパ軽鎖はできるが、ラムダ軽鎖はできないということから（Ｄｉｌｌｏｎら、２００８）、選択された軽鎖は、異なる立体配座に適合させるｈ２の能力に影響を与えると考えられることである。これと一致して、本発明者らの実験で用いられたすべてのｍＡｂは、カッパ軽鎖を含有していた。さらに興味深いことに、ジスルフィド結合されたｈ２二量体の存在は、ヒトの血液において報告されている（Ｙｏｏら、２００３）。しかし、組み換えｍＡｂを用いた他研究者らの報告（
Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００８）にあるように、本発明者らは、ｎｒＣＥ−ＳＤＳで明らかとされたように、本実施例のｍＡｂ調製物のいずれにおいても二量体の証拠はなかった。
【０２１０】
ｈ２Ａ及びｈ２Ｂアイソフォームの機能的な影響を調べようと過去に試みられたが、ＦｃγＲまたはＣ１ｑ結合（Ｌｉｇｈｔｌｅら、２０１０）における差異、またはＡｇ結合における一貫性のある差異、または受容体−リガンド相互作用阻害能力における差異は明らかとされず、むしろｈ２Ｂの活性は低かった（Ｄｉｌｌｏｎら、２００８；Ｇｕｏら、２００８；Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００８）。同様に、本発明者らは、ＳＰＲまたはフローサイトメトリーにより測定した際、ＣＤ４０に対するＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ２Ａとｈ２Ｂ型の親和性の差異は全く認められなかった。ＣｈｉＬｏｂ７／４  ｈ１とｈ２  ＦａｂがＣＤ４０に対し非常に類似した親和性を有していることを考慮すると、親和性における変化が、ｈ２Ａとｈ２Ｂの全く異なる特性を説明できる可能性は非常に低いと思われる。興味深いことに、Ｌｉｕら（Ｌｉｕら、２００８）は、患者において、半減期における変化から生じたのではない、長期間にわたるＡ型からＢ型への自然な転換を示した。本明細書において、本発明者らは、受容体のクラスター化が下流の免疫活性化の開始の必須条件であることが知られている免疫共受容体に結合するｍＡｂのアゴニスト活性を評価した（Ｅｌｇｕｅｔａら、２００９）。２００６年に健常なボランティアにおいて悲惨な毒性をもたらした（Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇａｍら、２００６）抗ＣＤ２８スーパーアゴニストであるＴＧＮ１４１２をはじめとする今日までに報告されているほぼすべてのアゴニスト性ｍＡｂが活性にＦｃγＲの架橋を必要としていた（Ｂａｒｔｈｏｌｏｍａｅｕｓら、２０１４）ことから、ＦｃγＲ結合無しにかかる架橋を行うことができる抗体形式の発見は予想外であり、説明できるものではない。本発明者らは、ｈ２Ｂのアゴニスト性は、Ｆａｂ’の腕部分が下に回転し抗体のＦｃ領域に近接する独特のコンパクトな立体配座に由来すると推測している。これにより、膜平面において結合した隣接受容体の緊密な『パッキング』が可能となりうる。ｈ２Ｂの柔軟性の欠落はまた、効率的な下流シグナル伝達に都合のよい、より固い格子空間に受容体を保持し得る。この延長として、ｈ２Ａとは異なり、ｈ２Ｂは前から存在しているクラスター中の受容体を安定化させ得（Ｓｍｕｌｓｋｉら、２０１３）、一方で柔軟なｈ２Ａはこれらクラスターの分離をもたらし得る。ｈ２は細菌性多糖に反応し産生される主要なアイソタイプであることから（Ｂａｒｒｅｔｔ  ａｎｄ  Ａｙｏｕｂ，１９８６）、ｈ２Ｂを形成する能力は、これら反復性の緊密に詰め込まれたエピトープに結合する必要性に迫られた進化的反応である可能性がある。
【０２１１】
本実験で、抗ＣＤ４０  ｈ２Ａとｈ２Ｂの混合物をＢ細胞刺激に用いて、高濃度での活性低下が見られた際に観察された特徴的なベル型曲線（図１０Ｄ）は、構造的により拘束されたｈ２Ｂ型による架橋に打ち勝つ、より柔軟性のあるｈ２Ａ型の能力を反映したものであろう。おそらくこれは流動性のある細胞膜中を絶えず移動する標的分子に柔軟なｈ２Ａがより効率的に結合することによるものであろう。さらなる実験により、異なる型のｈ２の構造をより正確に測定し、それにより正確な作用機序が明らかとなるであろう。ｈ２の定常領域はまた、他の抗ｈＣＤ４０ｍＡｂであるＳＧＮ４０、ならびに他の受容体（４−１ＢＢ及びＣＤ２８）に指向するｍＡｂに対し、ＦｃγＲ非依存性の活性を与えたという結果から、これは、この限局的な立体配座の一般的な特性である可能性がある。
【０２１２】
ｈＣＤ４０Ｔｇマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ実験により、ｈ２ｍＡｂと比較し、キメラｍ１として投与した際のＣｈｉＬｏｂ７／４の異なる作用機序が明白に示された。両方の場合において、免疫刺激が観察されたが、ｍ１の活性はＦｃγＲＩＩＢ発現に依存性であった一方、ｈ２の活性はＦｃγＲ相互作用に完全に非依存性であった。これにより、たとえばＦｃγＲＩＩＢ親和性を増加させるＳＥ／ＬＦ変異（Ｃｈｕら、２００８）を含有するキメラＣＨ１Ｈｇｅ２／１等の、両方の機械的経路を同時に活用する試薬を作製することにより、活性がさらに増強される可能性が生じる。これは現在行われている研究の主
題である。さらに、本発明者らの実験においてｈ２の活性はＦｃγＲ非依存性であったが、架橋が十分に可能な親和性で細胞上に固定されたｈ２に結合しうるヒトＦｃγＲの存在により、その活性が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、特にＦｃγＲＩＩＡ１３１ＨまたはＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖを発現する患者（Ｌｕｘら、２０１３）において、影響を受ける可能性があるかどうかを決定することが重要である。
【０２１３】
重要なことは、現在のところ臨床試験において最もアゴニスト性が高い抗ＣＤ４０ｍＡｂはＣＰ８７０，８９３で、それらはｈ２であり、両方ともｈ１でありアゴニスト性が低いＣｈｉＬｏｂ７／４及びＳＧＮ４０とは異なっている。ＣＰ８７０，８９３の最大耐容投与量は、ＣｈｉＬｏｂ７／４またはＳＧＮ４０よりも少なくとも１０倍低く（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ  ａｎｄ  Ｇｌｅｎｎｉｅ、２０１３）、膵臓癌及び転移性メラノーマの患者の両方において、この剤を用いた有望な臨床データが明らかとなっている（Ｂａｊｏｒら、２０１４；  Ｂｅａｔｔｙら、２０１３）。最新の研究において、Ｒｉｃｈｍａｎ及びＶｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅは、近年、ＣＰ８７０，８９３のｉｎ  ｖｉｔｒｏのアゴニスト活性はＦｃ及びＦｃγＲの両方に非依存性であることを実証した（Ｒｉｃｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ、２０１４）。これは、ＦｃγＲ非依存性の経路が臨床設定において結果を出すことができることを示唆する点で意義深く、本発明者らの最新の発見は、ＣＰ８７０,８９３の独特の効力を説明する何らかの一要素となるであろう。
【０２１４】
提示されるデータは、アゴニスト性ｍＡｂをベースとした治療の開発に対する深い意義を有するものである。これらの考察を考慮することにより、広範な免疫受容体を指向するｍＡｂの活性及び毒性を制御するためのｈ２のジスルフィド結合構造の操作が可能となり、それによりＦｃγＲ相互作用に非依存性の新規治療剤の生物活性及びその後の開発の微調整が可能となるはずである。
【０２１５】
抗癌性免疫を刺激するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、典型的な末期悪性腫瘍の患者達の治癒的療法を提供する。しかしながらこれら剤の潜在能力すべての理解は、その作用メカニズムの詳細な理解によりもたらされる正確な操作が必要とされる。本明細書において、本発明者らは、ヒトＩｇＧ２（ｈ２）の定常領域が、臨床開発中の３つの免疫刺激性共受容体であるＣＤ４０、４−１ＢＢ、及びＣＤ２８を標的とするｍＡｂに、Ｆｃγ？−１ＢＢ及びＣＤ２８に非依存性のアゴニスト活性を提供し、受容体クラスター化及び下流細胞内シグナル伝達に必要なアゴニスト活性を提供する。この優れた活性は、ｈ２ヒンジのジスルフィド結合における固有の構造により与えられ、局所微小環境中においてＦｃγＲの発現に関わらず明確な活性を持つ改善された臨床試薬を作製するための道が開かれる。
【０２１６】
結論として、本発明者らは、本明細書において、免疫刺激性ｍＡｂは、ｈ２として発現された場合、ＦｃγＲ非依存性のアゴニスト活性を有し、その活性は、ヒンジ領域のジスルフィド結合をシャッフルするｈ２の固有の能力に依存していることを明らかとした。従って、ｈ２の使用により機能をＦｃγＲに依存せず、血清半減期が長く、細胞型または解剖学的位置に非依存性に活性である、本質的に活性な治療剤の開発が可能となる。また、データから、本明細書に記載されるようなジスルフィド結合の改変によりｈ２ｍＡｂを操作することにより、たとえばＩｇＧ２抗体またはＩｇＧ２融合タンパク質等の、それぞれたとえばＢ７／ＣＤ２８またはＴＮＦ／ＴＮＦＲファミリーのメンバーにより惹起される免疫反応等の、免疫反応を刺激または抑制するために用いることができる、アゴニスト剤またはアンタゴニスト剤のいずれかを得られることが示される。これらアゴニスト及びアンタゴニストは、たとえば癌、自己免疫疾患、感染症、アレルギー、及び炎症性状態等の多くの疾患の治療に応用が見いだされる。
【０２１７】
治療応用
本発明アゴニスト抗体及びアンタゴニスト抗体は、特定の受容体またはリガンドの効果を作動させること、または拮抗させることが、臨床的に関連がある任意の状態の治療に用いることができる。たとえば、これら抗体及び融合タンパク質は、たとえば後天性脾臓委縮症、急性前部ブドウ膜炎、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性痛風性関節炎、急性壊死性出血性白質脳炎、急性副鼻腔炎、慢性副鼻腔炎、急性化膿性髄膜炎、他の中枢神経系炎症性障害、急性の重篤な炎症、アジソン病、副腎炎、成人発症糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、成人発症特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、無ガンマグロブリン血症、無顆粒球症、脈管炎である大血管脈管炎、リウマチ性多発筋痛及び巨細胞（高安）関節炎を含む脈管炎、アレルギー状態、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、アレルギー性超過敏性疾患、アレルギー性神経炎、アレルギー反応、円形脱毛症、全頭脱毛症、アルポート症候群、肺胞炎（アレルギー性肺胞炎、線維性肺胞炎）、アルツハイマー病、アミロイドーシス、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリック病）、好酸球関連障害、好酸球増多症、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、血管拡張症、抗体介在性腎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗原−抗体複合体介在性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、アフタ、アフタ性口内炎、再生不良性貧血、不整脈、動脈硬化症、動脈硬化性障害、関節炎、関節リウマチ、任意で急性関節炎、慢性関節リウマチ、進行性慢性関節炎、変形性関節炎、回虫症、アスペルギルス腫、好酸球を含有する肉芽腫、アスペルギルス症、アスペルミオジェネス、喘息、気管支喘息、気管支の喘息及び自己免疫性喘息、毛細血管拡張性運動失調、失調性硬化症、アテローム性動脈硬化症、自閉症、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性糖尿病、自己免疫精巣炎及び卵巣炎を含む精巣ならびに卵巣の自己免疫性疾患、膠原病に伴う自己免疫性障害、自己免疫自律神経障害、自己免疫性の耳の疾患、自己免疫性の内耳の疾患（ＡＧＥＤ）、甲状腺炎である自己免疫性甲状腺炎を含む自己免疫性内分泌疾患、自己免疫性消化器症候群、自己免疫性腺機能不全、自己免疫性難聴、自己免疫性溶血、自己免疫性肝炎、自己免疫性肝臓障害、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全症、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性膵炎、自己免疫性多腺性内分泌障害、自己免疫性多腺性症候群Ｉ型、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫介在性胃腸疾患、軸索及びニューロンのニューロパチー、バロー病、ベーチェット病、良性家族性及び虚血−再かん流傷害、良性リンパ球性血管炎、ベルガー病、ＩｇＡ腎症、愛鳥家肺、失明、ベック病、閉塞性細気管支炎、気管支炎、気管支肺アスペルギルス症、バートン症候群、水疱性類天疱瘡、カプラン症候群、心筋症、心血管系虚血、キャッスルマン病、セリアック病、セリアックスプルー（グルテン腸症）、小脳変性症、脳虚血、及び血管新生を伴う疾患、シャーガス病、チャネロパチー、てんかん、ＣＮＳのチャネロパチー、網膜絡膜炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液障害、慢性活動性肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎、慢性接触性皮膚炎、慢性好酸球性肺炎、慢性疲労症候群、慢性肝炎、慢性超過敏性肺臓炎、慢性炎症性関節炎、慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性難治性炎症、慢性粘膜皮膚性カンジダ症、慢性ニューロパチー、ＩｇＭ多発性ニューロパチー、ＩｇＭ介在性ニューロパチー、慢性閉塞性気道疾患、慢性肺炎症性疾患、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）亜急性甲状腺炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、ＣＮＳ炎症性障害、ＣＮＳ脈管炎、セリアック病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、ポリープ性大腸炎、大腸炎、任意で潰瘍性大腸炎(ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、潰瘍性大腸炎（ｃｏｌｉｔｉｓ  ｕｌｃｅｒｏｓａ）、膠原線維性大腸炎、Ｔ細胞浸潤及び慢性炎症反応を含む状態、先天性心臓ブロック、先天性風疹感染、クームス陽性貧血、冠動脈疾患、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着、レイノー現象）、クローン病、クリオグロブリン血症、クッシング症候群、毛様体炎、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、虹彩毛様体炎、フックス毛様体炎、嚢胞性線維症、サイトカイン誘導性毒性、聴覚消失、変形性関節炎、脱髄性疾患、自己免疫脱髄性疾患、脱髄性ニューロパチー、デング熱、ヘルペス状皮膚炎及びアトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎を含む皮膚炎、皮膚筋炎、急性炎症性要素を伴う皮膚疾患、デビック病（視神経脊髄炎）、糖尿病性大動脈障害、糖尿病性ニューロパチー、糖尿病性網膜症、ダイアモンド・ブラックファン貧血、びまん性間質性肺線維症、拡張型心筋症、円板状狼瘡、白血球血管外漏出を含む疾患、ドレスラー症候群、デュプュイトラン拘縮、エコーウイルス感染、アレルギー性湿疹を含む湿疹、アトピー性湿疹、脳炎、任意でラスムッセン脳炎ならびに辺縁系及び／または脳幹脳炎、脳脊髄炎、アレルギー性脳脊髄炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、アレルギー性脳脊髄炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｌｌｅｒｇｉｃａ）及び実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、動脈内過形成、心内膜炎、内分泌性眼障害、子宮内膜症、心内膜心筋線維症、水晶体過敏性眼内炎（ｅｎｄｏｐｈｔｈａｌｍｉａ  ｐｈａｃｏａｎａｐｈｙｌａｃｔｉｃａ）、眼内炎、アレルギー性腸炎、好酸球増加症−筋痛症候群、好酸球性筋膜炎、流行性角結膜炎、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、上強膜、上強膜炎、エプスタイン−バールウイルス感染、持続性隆起性紅斑、多形性紅斑、癩性結節性紅斑、結節性紅斑、胎児赤芽球症、食道運動不全、本態性混合型クリオグロブリン血症、篩骨、エバンス症候群、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、農夫肺、フェブリスリウマチ、フェルティー症候群、線維筋痛症、線維性肺胞炎、フィラリア症、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、食中毒、前頭骨、胃萎縮、巨細胞関節炎（側頭関節炎）、巨細胞肝炎、巨細胞多発性筋痛、糸球体腎炎、ネフローゼ症候群を伴う、及び伴わない糸球体腎炎（ＧＮ）、慢性糸球体腎炎、急性糸球体腎炎、任意で原���性ＧＮ、グッドパスチャー症候群、痛風性関節炎、顆粒球輸血関連症候群、リンパ腫様肉芽腫症を含む肉芽腫症、多発性血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ）、肉芽腫性ブドウ膜炎、グレーブズ病、ギラン・バレー症候群、滴状乾癬、血色素尿症発作、ハーマン＝リッチ症候群、橋本病、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、ヘモクロマトーシス、溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫性溶血性貧血、溶血性貧血、血友病Ａ、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、痛覚過敏、低ガンマグロブリン血症、性腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、特発性尿崩症、特発性顔面麻痺、特発性甲状腺機能低下症、特発性ＩｇＡ腎症、特発性膜性ＧＮ、特発性膜性腎症、特発性ネフローゼ症候群、特発性肺線維症、特発性スプルー、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＥ介在性疾患、任意でアナフィラキシー及びアレルギー性及びアトピー性鼻炎、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、回腸炎レジオナリス、免疫複合体腎炎、サイトカイン及びＴ−リンパ球が介在する急性ならびに遅発性超過敏を伴う免疫反応、免疫介在性ＧＮ、成人呼吸窮迫症候群、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、感染性関節炎、抗精子抗体による不妊症、ブドウ膜全体または一部の炎症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）炎症性過剰増殖皮膚疾患、炎症性ミオパチー、インスリン依存性糖尿病（１型）、膵島炎、間質性膀胱炎、間質性肺疾患、間質性肺線維症、虹彩炎、虚血性再かん流障害、関節の炎症、若年性関節炎、若年性皮膚筋炎、若年性糖尿病、小児インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を含む若年性発症（Ｉ型）糖尿病、若年発症関節リウマチ、川崎病、乾性角結膜炎、キパノソミアシス、ランバート−イートン症候群、リーシュマニア症、ハンセン病、白血球減少症、白血球接着欠乏症、白血球破砕性脈管炎、白血球減少症、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、直鎖状ＩｇＡ皮膚炎、直鎖状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、レフラー症候群、ルポイド肝炎、狼瘡、腎炎、脳炎、小児、非腎臓、腎臓外、円板状、脱毛症の狼瘡（ＳＬＥ）、播種性紅斑性狼瘡、ライム関節炎、ライム病、リンパ球様間質性肺臓炎、マラリア、男性及び女性自己免疫性不妊症、上顎、中間型血管炎、川崎病及び結節性多発動脈炎、Ｉ型及びＩＩ型を含む膜状−、または膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）及び急速進行性ＧＮ、膜性ＧＮ（膜性腎症）、メニエール病、髄膜炎、顕微鏡的大腸炎、顕微鏡的多発性血管炎、偏頭痛、微小変化型腎症、混合結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、伝染性単核球症、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多巣性運動ニューロパチー、多発性内分泌機能不全、多臓器損傷症候群で、敗血症、外傷、出血に続発する症候群、多臓器損傷症候群、多発性硬化症（ＭＳ）、脊椎−眼ＭＳ、多発性硬化症、流行性耳下腺炎、筋障害、重症筋無力症、胸腺腫を伴う重症筋無力症、重症筋無力症、心筋炎、筋炎、ナルコレプシー、壊死性腸炎及び貫
壁性大腸炎及び自己免疫性炎症性腸疾患、壊死性、皮膚性または超過敏性脈管炎、新生児狼瘡症候群（ＮＬＥ）、ネフローゼ、ネフローゼ症候群、神経性疾患、視神経脊髄炎（デビック病）、視神経脊髄炎、神経性筋緊張病、好中球減少症、非癌性リンパ球増加症、非肉芽腫性ブドウ膜炎、非悪性胸腺腫、眼及び眼窩炎症性障害、眼瘢痕性類天疱瘡、卵巣炎、交感性眼炎、眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、眼球クローヌス、眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）及び感覚ニューロパチー、視神経炎、肉芽腫性精巣炎、変形性関節症、回帰性リウマチ、膵炎、汎血球減少症、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌が関連する小児自己免疫精神神経疾患）、傍腫瘍性小脳変性症、腫瘍随伴症候群、傍腫瘍性神経症候群を含む腫瘍随伴症候群（例えばランバート・イートン筋無力症候群、イートン・ランバート症候群）、寄生虫症、リーシュマニア、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群、毛様体扁平部炎（末梢ブドウ膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群、パルボウイルス感染、類天疱瘡、水疱性類天疱瘡及び皮膚類天疱瘡、天疱瘡、尋常性天疱瘡、紅斑性天疱瘡、落葉状天疱瘡、天疱瘡粘膜類天疱瘡、天疱瘡、消化性潰瘍、周期性四肢麻痺、末梢ニューロパチー、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血（悪性の貧血）、悪性貧血、水晶体抗原性ブドウ膜炎、肺線維症、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型、多発性関節炎慢性プリマリア、多発性軟骨炎、難治性、再発性多発性軟骨炎、多内分泌自己免疫疾患、多内分泌不全、多腺性症候群、自己免疫多腺性症候群（または多腺性内分泌障害症候群））、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性ニューロパチー、急性多発性神経根炎、開心術後症候群、後部ブドウ膜炎、自己免疫性ブドウ膜炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、連鎖球菌感染後腎炎、ワクチン接種後症候群、初老期認知症、原発性胆汁性肝硬変、原発性甲状腺機能低下症、原発性特発性粘液水腫、単クローン性Ｂ細胞リンパ球増加症を含む原発性リンパ球増加症、良性単クローン性高ガンマグロブリン血症及び意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、ＭＧＵＳ、原発性粘液水腫、原発性進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）及び再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、進行性全身性硬化症、増殖性関節炎、乾癬、プラーク性乾癬、乾癬、乾癬性関節炎、肺胞タンパク質症、肺浸潤好酸球増加症、赤芽球癆貧血、
形成不全症（ＰＲＣＡ）、赤芽球癆形成不全、化膿性、非化膿性副鼻腔炎、膿疱性乾癬及び爪の乾癬、腎盂炎、壊疽性膿皮症、ケルバン甲状腺炎、レイノー現象、反応性関節炎、習慣性流産、血圧反応の低下、反射性交感神経性ジストロフィー、難治性スプルー、ロイター病または症候群、再発性多発性軟骨炎、心筋または他の組織の再かん流傷害、再かん流傷害、呼吸窮迫症候群、むずむず脚症候群、網膜自己免疫性、後腹膜線維症、レイノー症候群、リウマチ性疾患、リウマチ熱、リウマチ、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、風疹ウイルス感染、サムプター症候群、サルコイドーシス、住血吸虫症、シュミット症候群、ＳＣＩＤ及びエプスタイン−バールウイルス関連疾患、強膜、強膜炎、肢端硬化、強皮症、全身性強皮症、硬化性胆管炎、播種性硬化症、硬化症、全身性硬化症、感音性難聴、血清反応陰性脊椎関節炎、シーハン症候群、シャルマン症候群、珪肺症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫性、蝶形骨洞炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、スティッフ・マン（スティッフ・パーソン）症候群、亜急性細菌心内膜炎（ＳＢＥ）、亜急性皮膚性紅斑性狼瘡、突発性難聴、スザック症候群、シドナム舞踏病、交感性眼炎、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ：ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、全身性紅斑性狼瘡（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｄｅｓ）、皮膚性ＳＬＥ、全身性壊死性脈管炎及びＡＮＣＡ関連血管炎、チャーグ・ストラウス血管炎，症候群（ＣＳＳ）、脊髄癆、高安動脈炎、毛細血管拡張症、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、閉塞性血栓性血管炎、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）及び自己免疫または免疫介在性血小板減少症を含む血小板減少症、慢性または急性特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）を含む特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、甲状腺中毒症、組織損傷、トローザ・ハント症候群、中毒性表皮剥離症、毒性ショック症候群、輸血反応、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、横断性脊髄炎、横断性の脊髄炎、熱帯性肺好酸球増加症、結核、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、蕁麻疹、慢性アレルギー性蕁麻疹、及び慢性自己免疫蕁麻疹を含む慢性特発性蕁麻疹、ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、網膜ブドウ膜炎、弁膜炎、血管機能不全、脈管炎、椎間体性関節炎、小水疱水疱性皮膚炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫（多発性血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ））、ウィスコット・アルドリッチ症候群、及びＸ連鎖型高ＩｇＭ症候群等の自己免疫性疾患の治療に有用でありうる。
【０２１８】
さらに、これら抗体及び融合タンパク質は、たとえばリウマチ性疾患、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎  脊椎関節症、強直性脊椎炎、反応性関節炎、ライター症候群、結晶性関節症、痛風、偽痛風、ピロリン酸カルシウム結晶沈着症、多発性硬化症、ライム病、リウマチ性多発筋痛；結合組織疾患、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群；血管炎、結節性多発動脈炎、ウェーゲナー肉芽腫、チャーグ・ストラウス症候群；外傷または虚血の結果を含む炎症状態、サルコイドーシス；アテローム性血管疾患、アテローム性動脈硬化症及び血管閉塞性疾患を含む血管疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患、心筋梗塞、脳卒中、末梢血管疾患、血管ステント再狭窄；ブドウ膜炎を含む眼疾患、角膜疾患、虹彩炎、虹彩毛様体炎、白内障、酸逆流／胸焼け、にきび、尋常性ざ瘡、アレルギー及び過敏症、アルツハイマー病、喘息、アテローム性動脈硬化症、血管閉塞性疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患、心筋梗塞、脳卒中、末梢血管疾患、血管ステント再狭窄、自己免疫性疾患、気管支炎、癌、心炎、白内障、セリアック病、慢性痛、慢性前立腺炎、肝硬変、大腸炎、結合組織疾患、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、角膜疾患、クローン病、結晶性関節症、痛風、偽痛風、ピロリン酸カルシウム結晶沈着症、認知症、皮膚炎、糖尿病、ドライアイ、湿疹、浮腫、肺気腫、線維筋痛症、胃腸炎、歯肉炎、糸球体腎炎、心疾患、肝炎、高血圧、超過敏症、炎症性腸疾患、炎症状態、外傷または虚血の結果、インスリン抵抗性、間質性膀胱炎、虹彩毛様体炎、虹彩炎、関節痛／関節炎／関節リウマチ、ライム病、メタボリックシンドローム（シンドロームＸ）、多発性硬化症、筋炎、腎炎、肥満、眼疾患、ブドウ膜炎、骨減少症、骨粗しょう症、パーキンソン病、骨盤炎症性疾患、歯周病、多発動脈炎、多発性軟骨炎、リウマチ性多発筋痛、乾癬、再かん流傷害、関節リウマチ、リウマチ性疾患、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、副鼻腔炎、シェーグレン症候群、けいれん性結腸、脊椎関節症、強直性脊椎炎、反応性関節炎、ライター症候群、全身性カンジダ症、腱炎、移植拒絶、ＵＴＩ’ｓ、膣炎、血管疾患、アテローム性血管疾患、血管炎、結節性多発動脈炎、ヴェーゲナー肉芽腫、チャーグ・ストラウス症候群及び脈管炎等の炎症性障害の治療に有用でありうる。
【０２１９】
また、本主題のアゴニスト及びアンタゴニストは、たとえば気管支の喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎ならびに花粉及び昆虫アレルギー、湿疹、アレルギー性鼻炎、枯草熱、皮膚の掻痒（蕁麻疹）ならびに食物アレルギーならびに他のアトピー性状態等のアレルギー性疾患の治療に用いられ得る。
【０２２０】
さらに、本主題のアゴニスト及びアンタゴニストは、たとえば癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病等の異なる癌を治療するために用いられ得る。かかる癌のより具体的な例としては、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞性癌、胃部癌または胃癌（消化管癌を含む）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌腫、腎臓癌または腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫及び様々なタイプの頭頸部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球細胞性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；多発性骨髄腫及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）が挙げられる。
【０２２１】
また、本発明のアゴニスト及びアンタゴニストを使用した治療に適した癌としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病またはリンパ性悪性疾患が挙げられる。かかる癌のより特定の例としては、膀胱、卵巣、メラノーマ、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞性癌、胃部癌または胃癌（消化管癌を含む）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌腫、腎癌または腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫及び様々なタイプの頭頸部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球細胞性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症を含。）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびにファコマトーセスに伴う異常な血管増殖、浮腫（たとえば脳腫瘍に付随するもの等）及びメイグス症候群が挙げられる。好ましくは、癌は、乳癌、大腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎臓細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、軟組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、中皮腫及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。癌は、初期進行性（転移性を含む）膀胱癌、卵巣癌またはメラノーマであり得る。癌は大腸癌であり得る。本発明の治療に適した癌の状態としては、骨髄由来抑制性細胞によるＶＩＳＴＡ発現が抗腫瘍反応及び抗浸潤性免疫反応を抑制する、転移性癌が挙げられる。本発明の方法は、血管新生性腫瘍の治療に特に適している。
【０２２２】
さらに本主題アゴニスト及びアンタゴニストは、たとえばウイルス感染状態、細菌感染、真菌感染状態、または寄生虫感染状態等の感染状態の治療に用いられ得る。その例としては、たとえば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、エプスタイン−バールウイルス、サイトメガロウイルス、免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ヘルペス、パピローマウイルス感染及び関連疾患、結核、マラリア、住血吸虫症、エコーウイルス感染、パルボウイルス感染、風疹ウイルス感染、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染、百日咳、インフルエンザ委、おたふく風邪、及びエプスタイン−バールウイルス関連疾患が挙げられる。
【０２２３】
本発明に従うＣＤ４０若しくはＣＤ２７のアゴニスト性またはアンタゴニスト抗体は、たとえば癌、炎症、感染症、及び自己免疫性疾患、移植、ＧＶＨＤ等の状態の治療に、及びワクチン効果促進のために特に用いられ得る。
【０２２４】
本主題抗体は、単独で用いられてもよく、または他の治療剤と併せて用いられてもよく、ここでかかる治療剤としては、他の生物製剤、またはたとえば小分子、化学療法剤、抗感染体剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、放射性核種、他の受容体アゴニスト若しくはアンタゴニスト、ホルモン調節物質、成長因子調製物質等の非生物製剤が挙げられ得る。癌、感染性状態、炎症性状態の治療に適した治療剤は当分野に公知である。適切な他の治療剤の選択は、治療される特定の状態に依存する。
【０２２５】
治療に用いられる場合、本発明の本主題アゴニスト及びアンタゴニストは、治療用投与に適した医薬組成物へと組み込まれてもよい。かかる組成物は、典型的には、有効量のアゴニスト性若しくはアンタゴニスト性の抗体または融合タンパク質、及びたとえば薬学的
に受容可能な担体等の担体を含有する。本明細書において、「薬学的に受容可能な担体」という文言は、任意の、及び全ての薬学的投与に適合する溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤等を含むことが意図される。薬学的に活性な物質に対するかかる媒質及び剤の使用は当分野に公知である。任意の従来的な媒質または剤が活性化合物に適合しない場合を除き、当該組成物中におけるそれらの使用が予期される。また、補助的な活性化合物が当該組成物に組み込まれてもよい。
【０２２６】
本発明の医薬組成物は、意図される投与経路に適合するよう処方される。投与経路の例としては、たとえば静脈内投与、皮内投与、皮下投与等の非経口投与、経口投与（たとえば吸入）、経皮投与（局所）、経粘膜投与、及び直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液としては、以下の構成要素を含み得る。たとえば注射用水等の滅菌希釈物質、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒。たとえばベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤。たとえばアスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤。たとえばエチレンジアミン四酢酸等のキレート剤。たとえば酢酸、クエン酸、またはリン酸等の緩衝剤、及びたとえば塩化ナトリウムまたはデキストロース等の等張性を調節するための剤。ｐＨは、たとえば塩酸若しくは水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調節されてもよい。非経口用調製品は、ガラス若しくはプラスチックで製造されたアンプル、ディスポーザブルシリンジ、または複数回投与用バイアルに封入されていてもよい。
【０２２７】
注射用の使用に適した医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、及び滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与に関し、適した担体としては、生理食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ社、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、当該組成物は滅菌されていなければならず、容易に注射針を通過する程度に流動性でなければならない。当該組成物は、製造条件下及び保管条件下において安定でなければならず、たとえば細菌及び真菌等の微生物の汚染作用に対し防御されていなければならない。担体は、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。たとえばレシチン等のコーティング剤の使用により適切な流動性が維持されていてもよく、分散液の場合には必要とされる粒子サイズを維持することにより適切な流動性が維持されていてもよく、界面活性剤の使用により適切な流動性が維持されていてもよい。微生物の作用の防御は、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等の様々な抗菌剤及び抗真菌剤により達成されてもよい。多くの場合において、好ましくは、たとえば糖類、たとえばマンニトール、ソルビトール等のポリアルコール類、及び塩化ナトリウム等の等張剤を組成物中に含む。当該注射用組成物の吸収遅延は、たとえばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅延させる剤を当該組成物中に含有することにより行われてもよい。
【０２２８】
滅菌注射用溶液は、必要に応じて、適切な溶媒中に、上に列記された成分のうちの１つ、または組合せと、必要とされる量の当該アゴニストまたはアンタゴニストを組み合わせ、次いでろ過滅菌を行うことにより調製されてもよい。一般的に、分散液は、塩基性分散媒及び必要とされる上述の他の成分を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことにより調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、それにより、前もって滅菌ろ過されたその溶液から、活性成分と任意の追加の所望される成分を合わせた粉末が得られる。
【０２２９】
一般的に、経口用組成物は、不活性な希釈剤または食用担体を含有する。それらはゼラチンカプセル中に封入されてもよく、または錠剤に圧縮されてもよい。経口治療投与の目
的に対しては、活性化合物は、賦形剤と組み合わされてもよく、及び錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で用いられてもよい。経口組成物はまた、口内洗浄液としての使用のための液体担体を用いて調製されてもよく、この場合、当該液体担体中の化合物は経口投与され、及び口内ですすがれ、及び吐き出される、または飲み込まれる。薬学的に適合可能な結合剤、及び／またはアジュバント材料が、組成物の一部として含まれてもよい。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等は、以下の成分、または類似の性質の化合物のうちのいずれかを含有してもよい。たとえば微結晶性セルロース、トラガカント・ゴム、またはゼラチン等の結合剤。たとえばデンプンまたはラクトース等の賦形剤。たとえばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ等の崩壊剤。たとえばステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ等の潤滑剤。たとえばコロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤。たとえばスクロースまたはサッカリン等の甘味剤。またはたとえばペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはオレンジフレーバー等の香味剤。
【０２３０】
吸入による投与に対しては、化合物は、たとえば二酸化炭素等のガスのような適切な推進剤を含有する圧縮容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレーの形態で、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で、送達される。また、経粘膜または経皮的な手段により、全身投与がなされてもよい。経粘膜投与または経皮投与に対しては、浸透されるバリアーに適した浸透剤が処方に用いられる。かかる浸透剤は一般的に当分野に公知であり、たとえば、経粘膜投与に対しては洗剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体等が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは座薬の使用を介して行われてもよい。経皮投与に対しては、活性化合物は、当分野に一般的に知られているような軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ）、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）、ゲル、またはクリームに処方されてもよい。
【０２３１】
また、化合物は、直腸送達のために、（たとえば、ココアバター及び他のグリセリド等の従来の座薬基剤を用いて）座薬の形態で、または停留浣腸の形態で調製されてもよい。１つの実施形態において、活性化合物は、移植及びマイクロカプセル化送達システムを含む、たとえば徐放製剤等の、身体からの急速な排出に対し化合物を防御する担体と共に調製される。たとえばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、及びポリ乳酸等の生体分解性で、生体適合性のあるポリマーを用いてもよい。かかる製剤の調製方法は当分野の当業者には明らかである。また、材料はＡｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入してもよく、及びＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃのリポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞を標的化したリポソームを含む）を薬学的に受容可能な担体として用いてもよい。これらは、たとえば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従い調製することができる。
【０２３２】
投与の容易さ及び投与量の均一性から、単位投与剤型で経口組成物または非経口組成物を処方することが特に好都合である。本明細書において用いられる単位投与剤型とは、治療される対象に対し、単一の投薬量として適した、物理的に別個の単位を指し、各単位は必要とされる薬学的担体と共に所望される治療効果を生み出すよう算出された既定量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与剤型に関する仕様は、当該活性化合物固有の特性、及び得られる特定の治療効果、ならびに個体の治療を目的としてかかる活性化合物の作製に関する当分野に固有の制限により決定づけられ、及び直接依存している。
【０２３３】
かかる化合物の毒性及び治療効果は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順により決定されてもよい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに使用するための投与量範囲の策定に用いることができる。かかる化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどないか、または全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される投与剤型及び利用される投与経路に依存し、この範囲内で変
化し得る。本発明方法において用いられるすべての化合物に対し、治療有効投与量は、当初、細胞培養アッセイから推定されてもよい。投与量は、細胞培養において決定されたように、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を得られるよう、動物モデルにおいて策定されてもよい。かかる情報を用いて、ヒトでの有用な用量をより正確に決定してもよい。血漿中の濃度は、たとえば高速液体クロマトグラフィーにより測定されてもよい。
【０２３４】
本明細書において定義されるように、タンパク質またはポリペプチドの治療有効量（すなわち、有効投与量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／体重ｋｇの範囲、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／体重ｋｇ、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／体重ｋｇ、及びよりさらに好ましくは約１〜１０ｍｇ／体重ｋｇ、２〜９ｍｇ／体重ｋｇ、３〜８ｍｇ／体重ｋｇ、４〜７ｍｇ／体重ｋｇ、または５〜６ｍｇ／体重ｋｇの範囲である。当業者であれば、対象を効果的に治療するために必要とされる投与量に影響をあたえる特定の因子、たとえば限定されないが疾患または障害の重篤度、従前に行われた治療、一般健康状態、及び／または対象の年齢、ならびに他の疾患の存在等を認識するであろう。さらに、タンパク質、ポリペプチド、または抗体の治療有効量を用いた対象の治療は、１回の治療、または好ましくは一連の治療を含んでもよい。
【０２３５】
参考文献
本出願に引用されるすべての参考文献の内容は、本明細書にその全体において参照により援用される。
１．Ａｄｖａｎｉ，Ｒ．，Ｆｏｒｅｒｏ−Ｔｏｒｒｅｓ，Ａ．，Ｆｕｒｍａｎ，Ｒ．Ｒ．，Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ，Ｊ．Ｄ．，Ｙｏｕｎｅｓ，Ａ．，Ｒｅｎ，Ｈ．，Ｈａｒｒｏｐ，Ｋ．，Ｗｈｉｔｉｎｇ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｄｒａｃｈｍａｎ，Ｊ．Ｇ．（２００９）．Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ４０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ  ｉｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｏｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７，４３７１−４３７７．
２．Ａｈｏｎｅｎ，Ｃ．，Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｅ．，Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｌ．Ｄ．，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｂ．，Ｌｉｎｄ，Ｅ．Ｆ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｓ．Ｓ．，Ｋｅｈｒｙ，Ｍ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｎｏｅｌｌｅ，Ｒ．Ｊ．（２００２）．Ｔｈｅ  ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６  ａｘｉｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｌｉｖｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３，４５１−４５６
３．Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｇｕｏ，Ａ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｔ．，Ｈａｎ，Ｍ．，Ｆｌｙｎｎ，Ｇ．Ｃ．，Ｗｙｐｙｃｈ，Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｙ．Ｄ．，Ｓｈｅｎ，Ｗ．Ｄ．，Ｄｉｌｌｏｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｖｅｚｉｎａ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｂａｌｌａｎｄ，Ａ．（２００９）．Ｉｎｔｅｒｃｈａｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｐｒｏｂｅｄ  ｂｙ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４８，３７５５−３７６６
４．Ａｎｇａｌ，Ｓ．，Ｋｉｎｇ，Ｄ．Ｊ．，Ｂｏｄｍｅｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｔｕｒｎｅｒ，Ａ．，Ｌａｗｓｏｎ，Ａ．Ｄ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｇ．，Ｐｅｄｌｅｙ，Ｂ．，ａｎｄ  Ａｄａｉｒ，Ｊ．Ｒ．（１９９３）．Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｂｏｌｉｓｈｅｓ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ
ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ（ＩｇＧ４）ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０，１０５−１０８．
５．Ｂａｊｏｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｘｕ，Ｘ．，Ｔｏｒｉｇｉａｎ，Ｄ．Ａ．，Ｍｉｃｋ，Ｒ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｌ．，Ｒｉｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｄｅｓｍａｒａｉｓ，Ｃ．，Ｎａｔｈａｎｓｏｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｓｃｈｕｃｈｔｅｒ，Ｌ．Ｍ．，Ｋａｌｏｓ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ，Ｒ．Ｈ．（２０１４）．Ｉｍｍｕｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａ  ９−ｙｅａｒ  ｏｎｇｏｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ＣＤ４０  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｃｔｏｍｙ  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ２，１９−２６．
６．Ｂａｌｌ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ＴＧＮ１４１２−ｌｉｋｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８９（１２）：５８３１−５８４０．
７．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ  Ａｙｏｕｂ，Ｅ．Ｍ．（１９８６）．ＩｇＧ２
ｓｕｂｃｌａｓｓ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６３，１２７−１３４．
８．Ｂａｒｔｈｏｌｏｍａｅｕｓ，Ｐ．，Ｓｅｍｍｌｅｒ，Ｌ．Ｙ．，Ｂｕｋｕｒ，Ｔ．，Ｂｏｉｓｇｕｅｒｉｎ，Ｖ．，Ｒｏｍｅｒ，Ｐ．Ｓ．，Ｔａｂａｒｅｓ，Ｐ．，Ｃｈｕｖｐｉｌｏ，Ｓ．，Ｔｙｒｓｉｎ，Ｄ．Ｙ．，Ｍａｔｓｋｅｖｉｃｈ，Ａ．，Ｈｅｎｇｅｌ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔａｃｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＣＤ３２＋  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＴＧＮ１４１２−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９２，２０９１−２０９８．
９．Ｂｅａｔｔｙ，Ｇ．Ｌ．，Ｃｈｉｏｒｅａｎ，Ｅ．Ｇ．，Ｆｉｓｈｍａｎ，Ｍ．Ｐ．，Ｓａｂｏｕｒｙ，Ｂ．，Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ，Ｕ．Ｒ．，Ｓｕｎ，Ｗ．，Ｈｕｈｎ，Ｒ．Ｄ．，Ｓｏｎｇ，Ｗ．，Ｌｉ，Ｄ．，Ｓｈａｒｐ，Ｌ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．ＣＤ４０  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｌｔｅｒ  ｔｕｍｏｒ  ｓｔｒｏｍａ  ａｎｄ  ｓｈｏｗ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３１，１６１２−１６１６．
１０．Ｂｅａｔｔｙ，Ｇ．Ｌ．，Ｔｏｒｉｇｉａｎ，Ｄ．Ａ．，Ｃｈｉｏｒｅａｎ，Ｅ．Ｇ．，Ｓａｂｏｕｒｙ，Ｂ．，Ｂｒｏｔｈｅｒｓ，Ａ．，Ａｌａｖｉ，Ａ．，Ｔｒｏｘｅｌ，Ａ．Ｂ．，Ｓｕｎ，Ｗ．，Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ，Ｕ．Ｒ．，Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ，Ｒ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｏ’Ｄｗｙｅｒ，Ｐ．Ｊ．（２０１３）．Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｇｏｎｉｓｔ  ＣＤ４０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＰ−８７０，８９３）ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９，６２８６−６２９５．
１１．Ｂｏｒｏｓｓ，Ｐ．，Ａｒａｎｄｈａｒａ，Ｖ．Ｌ．，Ｍａｒｔｉｎ−Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｊ．，Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｒａｂｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｃａｒｌｕｃｃｉ，Ｆ．，Ｆｌｉｅｒｍａｎ，Ｒ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋａａ，Ｊ．，Ｂｒｅｕｋｅｌ，Ｃ．，Ｃｌａａｓｓｅｎｓ，Ｊ．Ｗ．，Ｃａｍｐｓ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＩｇＧ，ＦｃγＲＩＩＢ，ｉｓ  ａ
ｍｏｄｉｆｉｅｒ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ．Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８７，１３０４−１３１３．
１２．Ｂｒａｈｍｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｔｙｋｏｄｉ，Ｓ．Ｓ．，Ｃｈｏｗ，Ｌ．Ｑ．，Ｈｗｕ，Ｗ．Ｊ．，Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｈｗｕ，Ｐ．，Ｄｒａｋｅ，Ｃ．Ｇ．，Ｃａｍａｃｈｏ，Ｌ．Ｈ．，Ｋａｕｈ，Ｊ．，Ｏｄｕｎｓｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１  ａｎｔｉｂｏｄｙｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６，２４５５−２４６５．
１３．Ｂｒｕｈｎｓ，Ｐ．，Ｉａｎｎａｓｃｏｌｉ，Ｂ．，Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｐ．，Ｍａ
ｎｃａｒｄｉ，Ｄ．Ａ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｎ．，Ｊｏｒｉｅｕｘ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｄａｅｒｏｎ，Ｍ．（２００９）．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ
ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｆｃγ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  １１３，３７１６−３７２５．
１４．Ｂｕｌｌｉａｒｄ，Ｙ．，Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ，Ｒ．，Ｗｉｎｄｍａｎ，Ｍ．，Ｒｕｅ，Ｓ．Ｍ．，Ｅｔｔｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．，Ｋｎｅｅ，Ｄ．Ａ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｎ．Ｓ．，Ｄｒａｎｏｆｆ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｂｒｏｇｄｏｎ，Ｊ．Ｌ．（２０１３）．Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｆｃ  γ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｔｈｅ
ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２１０，１６８５−１６９３．
１５．Ｂｕｌｌｉａｒｄ，Ｙ．，Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｄｒａｎｏｆｆ，Ｇ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｎ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｂｒｏｇｄｏｎ，Ｊ．Ｌ．（２０１４）．ＯＸ４０  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｄｅｐｌｅｔｅｓ  ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｔｒｅｇｓ  ｖｉａ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ＦｃγＲｓ，ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９２，４７５−４８０．
１６．Ｂｏｕｒｋｅ，Ｅ．，Ｂｏｓｉｓｉｏ，Ｄ．，Ｇｏｌａｙ，Ｊ．，Ｐｏｌｅｎｔａｒｕｔｔｉ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，Ａ．（２００３）．Ｔｈｅ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＬＲ９  ａｎｄ  ＴＬＲ１０  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０２，９５６−９６３．
１７．Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｆ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．Ｗ．，Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｐ．（２０１４）．Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ａｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ４０  ｍｏｎｏｃｌｏｎｃａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣｈｉＬｏｂ  ７／４  ｐｈａｓｅ  １  ｔｒｉａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ２，２２９−２４０．
１８．Ｃｈｕ，Ｓ．Ｙ．，Ｖｏｓｔｉａｒ，Ｉ．，Ｋａｒｋｉ，Ｓ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｌ．，Ｌａｚａｒ，Ｇ．Ａ．，Ｐｏｎｇ，Ｅ．，Ｊｏｙｃｅ，Ｐ．Ｆ．，Ｓｚｙｍｋｏｗｓｋｉ，Ｄ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ，Ｊ．Ｒ．（２００８）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃｏｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＤ１９  ａｎｄ  ＦｃγＲＩＩｂ  ｗｉｔｈ  Ｆｃ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４５，３９２６−３９３３．
１９．Ｃｌｙｎｅｓ，Ｒ．Ａ．，Ｔｏｗｅｒｓ，Ｔ．Ｌ．，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．（２０００）．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ６，４４３−４４６．
２０．Ｄｉｌｌｏｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｒｉｃｃｉ，Ｍ．Ｓ．，Ｖｅｚｉｎａ，Ｃ．，Ｆｌｙｎｎ，Ｇ．Ｃ．，Ｌｉｕ，Ｙ．Ｄ．，Ｒｅｈｄｅｒ，Ｄ．Ｓ．，Ｐｌａｎｔ，Ｍ．，Ｈｅｎｋｌｅ，Ｂ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｄｅｅｃｈｏｎｇｋｉｔ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２  ｓｕｂｃｌａｓｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３，１６２０６−１６２１５．
２１．Ｅｌｇｕｅｔａ，Ｒ．，Ｂｅｎｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，Ｖ．Ｃ．，
Ｗａｓｉｕｋ，Ａ．，Ｇｕｏ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｎｏｅｌｌｅ，Ｒ．Ｊ．（２００９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２２９，１５２−１７２．
２２．Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｔｕｔｔ，Ａ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．（１９９９）．ＣＤ４０  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｖｏｋｅｓ  ａ
ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｈａｔ  ｅｒａｄｉｃａｔｅｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｎｄ  ｂｙｐａｓｓｅｓ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ．Ｎａｔ
Ｍｅｄ  ５，５４８−５５３．
２３．Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，Ｔａｒａｂａｎ，Ｖ．Ｙ．，Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｇ．Ｒ．，Ｒｏｗｌｅｙ，Ｔ．Ｆ．，Ｇｒａｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．Ｗ．，Ｔｕｔｔ，Ａ．Ｌ．，Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ，Ａ．，ａｎｄ  Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．（２００７）．Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｂｙ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｎｔｉ−ＣＤ４０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ＣＤ２７  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  １０９，４８１０−４８１５．
２４．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．，ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｈ．Ｍ．，Ｗｏｒｔｈ，Ａ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９８７）．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ
ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｆ（ａｂ’  ｇａｍｍａ）２
ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｆａｂ’  ｇａｍｍａ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３９，２３６７−２３７５．
２５．Ｇｒｅｅｎｍａｎ，Ｊ．，Ｔｕｔｔ，Ａ．Ｌ．，Ｇｅｏｒｇｅ，Ａ．Ｊ．，Ｐｕｌｆｏｒｄ，Ｋ．Ａ．，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．（１９９１）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩＩ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＡＴ１０，ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ａ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｆ（ａｂ’）２  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｆｏｒ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８，１２４３−１２５４．
２６．Ｇｕｏ，Ａ．，Ｈａｎ，Ｍ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｔ．，Ｋｅｔｃｈｅｍ，Ｒ．Ｒ．，Ｎｏｖｉｃｋ，Ｓ．，Ｊｏｃｈｈｅｉｍ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｂａｌｌａｎｄ，Ａ．（２００８）．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＩｇＧ２  ｉｓｏｔｙｐｅ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２９，２５５０−２５５６．
２７．Ｈａｍａｇｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｘｉｕ，Ｙ．，Ｋｏｍｕｒａ，Ｋ．，Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｔｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．（２００６）．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｓｏｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｃγ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ＣＤ２０  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３，７４３−７５３．
２８．Ｈａｎｋｓ，Ｂ．Ａ．，Ｊｉａｎｇ，Ｊ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｒ．Ａ．，Ｓｏｎｇ，Ｗ．，Ｂａｒｒｙ，Ｍ．，Ｈｕｌｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｓｌａｗｉｎ，Ｋ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．（２００５）．Ｒｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＣＤ４０  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ−ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １１，１３０−１３７．
２９．Ｈｏｄｉ，Ｆ．Ｓ．，Ｏ’Ｄａｙ，Ｓ．Ｊ．，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｄ．Ｆ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｒ．Ｗ．，Ｓｏｓｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｈａａｎｅｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｇｏｎｚａｌ
ｅｚ，Ｒ．，Ｒｏｂｅｒｔ，Ｃ．，Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆ，Ｄ．，Ｈａｓｓｅｌ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６３，７１１−７２３．
３０．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＰＷ，Ｓｔｅｖｅ，Ｎ．Ｍ．，Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｆ．，Ｄｏｂｂｙｎ，Ｊ．，Ｈａｌｌ，Ｅ．，Ａｓｈｔｏｎ−Ｋｅｙ，Ｍ．，Ｈｏｄｇｅｓ，Ｅ．，Ｏｔｔｅｎｓｍｅｉｅｒ，Ｃ．Ｈ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．，Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．（２０１０）Ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＵＫ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｓａｆｅｔｙ，ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉ−ＣＤ４０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＭＡｂ），Ｃｈｉ  Ｌｏｂ  ７／４．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２８（Ｓｕｐｐｌ）：ａｂｓｔｒ  ２０５７．
３１．Ｋｏｈｒｔ，Ｈ．Ｅ．，Ｃｏｌｅｖａｓ，Ａ．Ｄ．，Ｈｏｕｏｔ，Ｒ．，Ｗｅｉｓｋｏｐｆ，Ｋ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｌｕｎｄ，Ｐ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ａ．，Ｓａｇｉｖ−Ｂａｒｆｉ，Ｉ．，Ｍａｒａｂｅｌｌｅ，Ａ．，Ｌｉｒａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＣＤ１３７  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２４，２６６８−２６８２．
３２．Ｋｏｈｒｔ，Ｈ．Ｅ．，Ｈｏｕｏｔ，Ｒ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｗｅｉｓｋｏｐｆ，Ｋ．，Ａｌｉｚａｄｅｈ，Ａ．Ａ．，Ｂｒｏｄｙ，Ｊ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ａ．，Ｐａｃｈｙｎｓｋｉ，Ｒ．，Ｃｚｅｒｗｉｎｓｋｉ，Ｄ．，Ｃｏｕｔｒｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．ＣＤ１３７  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  １１７，２４２３−２４３２．
３３．Ｋｏｈｒｔ，Ｈ．Ｅ．，Ｈｏｕｏｔ，Ｒ．，Ｗｅｉｓｋｏｐｆ，Ｋ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｃｈｅｅｒｅｎ，Ｆ．，Ｃｚｅｒｗｉｎｓｋｉ，Ｄ．，Ｃｏｌｅｖａｓ，Ａ．Ｄ．，Ｗｅｎｇ，Ｗ．Ｋ．，Ｃｌａｒｋｅ，Ｍ．Ｆ．，Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｒ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ＣＤ１３７−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２２，１０６６−１０７５．
３４．Ｋｕｒａｉ，Ｊ．，Ｃｈｉｋｕｍｉ，Ｈ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｙａｍａｓａｋｉ，Ａ．，Ｓａｋｏ，Ｔ．，Ｔｏｕｇｅ，Ｈ．，Ｍａｋｉｎｏ，Ｈ．，Ｔａｋａｔａ，Ｍ．，Ｍｉｙａｔａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３，１５５２−１５６１．
３５．Ｌｉ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．（２０１１）．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆｃγ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｄｒｉｖｅｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ＣＤ４０  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３，１０３０−１０３４．
３６．Ｌｉ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．（２０１２）．Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒｅｑｕｉｒｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆｃγ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０９，１０９６６−１０９７１．
３７．Ｌｉ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．（２０１３）．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉ−ＴＮＦＲ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒｅｑｕｉｒｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ＦｃγＲＩＩＢ  ｃｏｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１０，１９５０１−１９５０６
３８．Ｌｉｇｈｔｌｅ，Ｓ．，Ａｙｋｅｎｔ，Ｓ．，Ｌａｃｈｅｒ，Ｎ．，Ｍｉｔａｋｓｏｖ，Ｖ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｋ．，Ｚｏｂｅｌ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｏｌｉｐｈａｎｔ，Ｔ．（２０１０）．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒｍ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒｓ  ｂｕｔ  ｄｏ  ｎｏｔ  ａｆｆｅｃｔ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｒ  Ｃ１ｑ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｐｒｏｔ  Ｓｃｉ  １９，７５３−７６２．
３９．Ｌｉｕ，Ｙ．Ｄ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｅｎｋ，Ｊ．Ｚ．，Ｐｌａｎｔ，Ｍ．，Ｄｉｌｌｏｎ，Ｔ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｆｌｙｎｎ，Ｇ．Ｃ．（２００８）．Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３，２９２６６−２９２７２．
４０．Ｌａｗ  ＣＬ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｔｉｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ４０
ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＳＧＮ−４０．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５（１８）：８３３１−８３３８．
４１．Ｌｕｘ，Ａ．，Ｙｕ，Ｘ．，Ｓｃａｎｌａｎ，Ｃ．Ｎ．，ａｎｄ  Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．（２０１３）  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ＩｇＧ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ＦｃγＲｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９０，４３１５−４３２３．
４２．Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｔ．，Ｇｕｏ，Ａ．，Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｈａｎ，Ｍ．，Ｐａｃｅ，Ｄ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．，Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｒ．，Ｋｅｔｃｈｅｍ，Ｒ．Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｂａｌｌａｎｄ，Ａ．（２００８）．Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ２  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７，７４９６−７５０８．
４３．Ｍｏｒａｎ，Ａ．Ｅ．，Ｋｏｖａｃｓｏｖｉｃｓ−Ｂａｎｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｄ．（２０１３）．Ｔｈｅ  ＴＮＦＲｓ  ＯＸ４０，４−１ＢＢ，ａｎｄ  ＣＤ４０  ａｓ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２５，２３０−２３７．
４４．Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．（２００５）．Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇ  ｓｕｂｃｌａｓｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０，１５１０−１５１２．
４５．Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．（２０１２）．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｂａｓｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ＩｇＧ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｔｏ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２，１３−１９．
４６．Ｐｏｌａｋ  ＭＥ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＣＤ７０−ＣＤ２７  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ＣＤ８＋  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ
ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １３２（６）：１６３６−１６４４．
４７．Ｒｉｃｈｍａｎ，Ｌ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ，Ｒ．Ｈ．（２０１４）．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｆｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ＣＤ４０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ２，１９−２６．
４８．Ｒｏｍｅｒ  ＰＳ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ＰＢＭＣｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｙ  ＣＤ２８  ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ  ＴＧＮ１４１２．Ｂｌｏｏｄ  １１８（２６）：６７７２−６７８２．
４９．Ｒｙａｚａｎｔｓｅｖ，Ｓ．，Ｔｉｓｃｈｅｎｋｏ，Ｖ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｃ．，Ａｂｒａｍｏｖ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｚａｖ’ｙａｌｏｖ，Ｖ．（２０１３）．Ｔｈｒｅｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｅｌｏｍａ  ＩｇＧ２．ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ８，ｅ６４０７６．
５０．Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｐ．Ｊ．，ＭｃＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ａ．，Ｈａｌｕｓｚｃｚａｋ，Ｃ．，Ｙａｇｉｔａ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｋｅｄｌ，Ｒ．Ｍ．（２００７）．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ＴＬＲ／ＣＤ４０  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ７０  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８，１５６４−１５７２．
５１．Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｔ．Ｒ．，Ｌｉ，Ｆ．，Ｍｏｎｔａｌｖｏ−Ｏｒｔｉｚ，Ｗ．，Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ，Ｍ．Ａ．，Ｂｅｒｇｅｒｈｏｆｆ，Ｋ．，Ａｒｃｅ，Ｆ．，Ｒｏｄｄｉｅ，Ｃ．，Ｈｅｎｒｙ，Ｊ．Ｙ．，Ｙａｇｉｔａ，Ｈ．，Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｆｃ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏ−ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＴＬＡ−４  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２１０，１６９５−１７１０．
５２．Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ｘ．，ａｎｄ  Ｍｅｌｌｍａｎ，Ｉ．（２０１３）．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１，１１９２−１１９８．
５３．Ｓｍｕｌｓｋｉ，Ｃ．Ｒ．，Ｂｅｙｒａｔｈ，Ｊ．，Ｄｅｃｏｓｓａｓ，Ｍ．，Ｃｈｅｋｋａｔ，Ｎ．，Ｗｏｌｆｆ，Ｐ．，Ｅｓｔｉｅｕ−Ｇｉｏｎｎｅｔ，Ｋ．，Ｇｕｉｃｈａｒｄ，Ｇ．，Ｓｐｅｉｓｅｒ，Ｄ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｆｏｕｒｎｅｌ，Ｓ．（２０１３）．Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｄｏｍａｉｎ  １  ｏｆ  ＣＤ４０  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｅｌｆ−ａｓｓ  ｍｂｌｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８８，１０９１４−１０９２２
５４．Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ，Ｇ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｍ．Ｒ．，Ｗａｒｄ，Ｓ．，Ｂｒｅｔｔ，Ｓ．Ｊ．，Ｃａｓｔｅｌｌｏ−Ｃｏｒｔｅｓ，Ａ．，Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｍ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｐａｎｏｓｋａｌｔｓｉｓ，Ｎ．（２００６）  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｔｏｒｍ  ｉｎ  ａ  ｐｈａｓｅ  １  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ＣＤ２８  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴＧＮ１４１２．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５５，１０１８−１０２８．
５５．Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｈｏｄｉ，Ｆ．Ｓ．，Ｂｒａｈｍｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｇｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｓ．Ｎ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｃ．，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｄ．Ｆ．，Ｐｏｗｄｅｒｌｙ，Ｊ．Ｄ．，Ｃａｒｖａｊａｌ，Ｒ．Ｄ．，Ｓｏｓｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ａｔｋｉｎｓ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｓａｆｅｔｙ，ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６，２４４３−２４５４．
５６．Ｕｃｈｉｄａ，Ｊ．，Ｈａｍａｇｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｏｌｉｖｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．，Ｐｏｅ，Ｊ．Ｃ．，Ｈａａｓ，Ｋ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｔｅｄｄｅｒ，  Ｔ．Ｆ．（２００４）．Ｔｈｅ  ｉｎｎａｔｅ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｐｈａｇｏｃｙｔｅ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｄｅｐｌｅｔｅｓ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９，１６５９−１６６９．
５７．Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ，Ｒ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．，（２０１３）．Ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ＣＤ４０  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９，１０３５−１０４３．
５８．Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ  ＲＨ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＣＰ−８７０，８９３，ａ  ｎｏｖｅｌ
ＣＤ４０  ａｇｏｎｉｓｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ    Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２５（７）：８７６−８８３．
５９．Ｗｈｉｔｅ，Ａ．Ｌ．，Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，Ｂｅｅｒｓ，Ｓ．Ａ．，Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．（２０１３）．  ＦｃγＲＩＩＩＢ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉ−ＴＮＦＲ  ｍＡｂｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ６２，９４１−９４８．
６０．Ｗｈｉｔｅ，Ａ．Ｌ．，Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｒｏｇｈａｎｉａｎ，Ａ．，Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，Ｍｏｃｋｒｉｄｇｅ，Ｃ．Ｉ．，Ｔｕｔｔ，Ａ．Ｌ．，Ｄｉｘｏｎ，Ｓ．Ｖ．，Ａｊｏｎａ，Ｄ．，Ｖｅｒｂｅｅｋ，Ｊ．Ｓ．，Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＦｃγＲＩＩＢ
ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ４０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８７，１７５４−１７６３．
６１．Ｗｈｉｔｅ，Ａ．Ｌ．，Ｄｏｕ，Ｌ．，Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｔ．Ｃ．，Ｆｉｅｌｄ，Ｖ．Ｌ．，Ｍｏｃｋｒｉｄｇｅ，Ｃ．Ｉ．，Ｍｏｓｓ，Ｋ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｅ．，Ｂｕｔｔｓ，Ｃ．，Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ，Ａ．，Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．，Ｖｅｒｂｅｅｋ，Ｓ．Ｊ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．，Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｅｅｒｓ，Ｓ．Ａ．（２０１４）．ＦｃＲ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ＣＤ４０  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎ  ｂｅ  ｏｖｅｒｃｏｍｅ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９３，１８２８−１８３５．
６２．Ｗｈｉｔｅ，Ａ．Ｌ．，Ｔｕｔｔ，Ａ．Ｌ．，Ｊａｍｅｓ，Ｓ．，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｋ．Ａ．，Ｃａｓｔｒｏ，Ｆ．Ｖ．，Ｄｉｘｏｎ，Ｓ．Ｖ．，Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ，Ｊ．，Ｋｈａｎ，Ｍ．，Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ，Ａ．，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ａ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．（２０１０）．Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ１１ｃ  ｄｕｒｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｂｕｓｔ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｄｊｕｖａｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３１，１４１−１５１．
６３．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｎ．Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｂ．，Ｙａｎｇ，Ａ．，Ｌｏｅｓｅｒ，Ｓ．，Ｍａｒｓｔｅｒｓ，Ｓ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｄ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｐｉｔｔｉ，Ｒ．，Ｔｏｔｐａｌ，Ｋ．，Ｙｅｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ａｎ  Ｆｃγ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｄｒｉｖｅｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １９，１０１−１１３．
６４．Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．，Ｋｌｕｇｅｒ，Ｈ．，Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｍ．Ｋ．，Ｐｏｓｔｏｗ，Ｍ．Ａ．，Ｒｉｚｖｉ，Ｎ．Ａ．，Ｌｅｓｏｋｈｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｓｅｇ
ａｌ，Ｎ．Ｈ．，Ａｒｉｙａｎ，Ｃ．Ｅ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｒ．Ａ．，Ｒｅｅｄ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ  ｐｌｕｓ  ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６９，１２２−１３３．
６５．Ｗｙｐｙｃｈ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｍ．，Ｇｕｏ，Ａ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｔ．，Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．，Ｋｅｌｎｅｒ，Ｄ．Ｎ．，Ｆｌｙｎｎ，Ｇ．Ｃ．，Ｌｉｕ，Ｙ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３，１６１９４−１６２０５．
６６．Ｘｕ，Ｙ．，Ｓｚａｌａｉ，Ａ．Ｊ．，Ｚｈｏｕ，Ｔ．，Ｚｉｎｎ，Ｋ．Ｒ．，Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｔ．Ｒ．，Ｌｉ，Ｘ．，Ｋｏｏｐｍａｎ，Ｗ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｋｉｍｂｅｒｌｙ，Ｒ．Ｐ．（２００３）．Ｆｃ  γＲｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−Ｆａｓ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１，５６２−５６８．
６７．Ｙｏｏ，Ｅ．Ｍ．，Ｗｉｍｓ，Ｌ．Ａ．，Ｃｈａｎ，Ｌ．Ａ．，ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，（２００３）．Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２  ｃａｎ  ｆｏｒｍ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｄｉｍｅｒｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０，３１３４−３１３８．
６８．Ｚｈａｎｇ，Ｂ．，Ｈａｒｄｅｒ，Ａ．Ｇ．，Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｍａｈｅｕ，Ｌ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｃｏｃｋｒｉｌｌ，Ｓ．Ｌ．（２０１０）．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｂ−ｈｉｎｇｅ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ．  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ８２，  １０９０−１０９９．
【０２３６】
本発明及びその例示的な実施形態を記載したが、さらに本発明は以下の請求項により記載される。
【図１Ａ】
2020037577.tif 000002
【図１Ｂ】
2020037577.tif 000003
【図１Ｃ】
2020037577.tif 000004
【図１Ｄ】
2020037577.tif 000005
【図１Ｅ】
2020037577.tif 000006
【図１Ｆ】
2020037577.tif 000007
【図２Ａ】
2020037577.tif 000008
【図２Ｂ】
2020037577.tif 000009
【図２Ｃ】
2020037577.tif 000010
【図３Ａ】
2020037577.tif 000011
【図３Ｂ】
2020037577.tif 000012
【図３Ｃ】
2020037577.tif 000013
【図３Ｄ】
2020037577.tif 000014
【図４Ａ】
2020037577.tif 000015
【図４Ｂ】
2020037577.tif 000016
【図４Ｃ】
2020037577.tif 000017
【図４Ｄ】
2020037577.tif 000018
【図４Ｅ】
2020037577.tif 000019
【図５−１】
2020037577.tif 000020
【図５−２】
2020037577.tif 000021
【図５−３】
2020037577.tif 000022
【図６Ａ】
2020037577.tif 000023
【図６Ｂ】
2020037577.tif 000024
【図６Ｃ】
2020037577.tif 000025
【図６Ｄ】
2020037577.tif 000026
【図６Ｅ】
2020037577.tif 000027
【図７Ａ】
2020037577.tif 000028
【図７Ｂ】
2020037577.tif 000029
【図７Ｃ】
2020037577.tif 000030
【図７Ｄ】
2020037577.tif 000031
【図８】
2020037577.tif 000032
【図９】
2020037577.tif 000033
【図１０】
2020037577.tif 000034
【図１１】
2020037577.tif 000035
【図１２】
2020037577.tif 000036
【図１３】
2020037577.tif 000037
【図１４】
2020037577.tif 000038
【図１５】
2020037577.tif 000039
【図１６】
2020037577.tif 000040
【図１７】
2020037577.tif 000041
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【外国語明細書】
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