(57)【要約】【課題】有核細胞の回収率を向上させることができる有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法を提供する。【解決手段】本発明のフィルターは、有核細胞の濾過用フィルターであって、金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、複数の貫通孔が形成されており、前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さい。このような構成により、有核細胞を含む液体から有核細胞を分離し、有核細胞の回収率を向上させることができる。【選択図】図２
2020072752.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有核細胞の濾過方法であって、
複数の正方形の貫通孔が形成されており、前記貫通孔の大きさの変動係数は４０％以下であって、有核細胞の核の大きさより小さい、フィルターを準備するステップ、
前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップ、
を含む、濾過方法。
【請求項２】
前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、０．０６以上である、請求項１に記載の濾過方法。
【請求項３】
前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、０．０７以上である、請求項１又は２に記載の濾過方法。
【請求項４】
前記フィルターは、金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、
前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位が０．０３Ｖより貴である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の濾過方法。
【請求項５】
前記フィルターは、金、銀、銅、白金、ニッケル、パラジウム、これらの合金及びこれらの酸化物からなる群から選択された少なくとも１つを含有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の濾過方法。
【請求項６】
前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップは、生細胞と死細胞とを分離するステップを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の濾過方法。
【請求項７】
前記液体は、前記有核細胞の少なくとも一部が浮遊した状態であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の濾過方法。
【請求項８】
有核細胞の濾過用フィルターを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
前記フィルターにおいては、複数の正方形の貫通孔が形成されており、前記貫通孔の大きさの変動係数は４０％以下であって、有核細胞の核の大きさより小さい、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、赤血球と有核細胞と血小板とを含んでなる液体から、細胞捕捉フィルター材を用いて単核細胞と血小板とを濃縮する方法が開示されている。特許文献１の細胞捕捉フィルター材は、有核細胞と血小板とを捕捉し、赤血球のような不要な細胞を通過させている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−２８４８６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の細胞捕捉フィルター材では、有核細胞の回収率の向上といった点で、未だ改善の余地がある。
【０００５】
本発明は、有核細胞の回収率を向上させることができる有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様のフィルターは、
有核細胞の濾過用フィルターであって、
金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、
複数の貫通孔が形成されており、
前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さい。
【０００７】
本発明の一態様の濾過方法は、
有核細胞の濾過方法であって、
金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、複数の貫通孔が形成されており、前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さいフィルターを準備するステップ、
前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップ、
を含む。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、有核細胞の回収率を向上させることができる有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明に係る実施の形態１のフィルターの概略構成図である。
【図２】本発明に係る実施の形態１のフィルターの一部の拡大斜視図である。
【図３】図２のフィルターの一部を厚み方向から見た概略図である。
【図４】本発明に係る実施の形態１のフィルターに支持基材を設けた概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（本発明に至った経緯）
特許文献１では、不織布で構成される細胞捕捉フィルター材を用いて、有核細胞と血小板とを捕捉し、赤血球のような不要な細胞を通過させることによって、血液から単核細胞を分離している。しかしながら、特許文献１の細胞捕捉フィルターでは、単核細胞の回収率が７４％程度であり、捕捉対象である細胞の回収率の向上といった点で未だ改善の余地がある。
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究したところ、金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とするフィルターを用いて、有核細胞を含む液体に対して濾過を行うことによって、捕捉対象である有核細胞の回収率を向上させることができることを見出し、本発明に至った。
【００１２】
本発明の一態様のフィルターは、
有核細胞の濾過用フィルターであって、
金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、
複数の貫通孔が形成されており、
前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さい。
【００１３】
このような構成により、有核細胞の回収率を向上させることができる。
【００１４】
前記フィルターにおいて、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、０．６４以下であってもよい。
【００１５】
このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
【００１６】
前記フィルターにおいて、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、０．０６以上であってもよい。
【００１７】
このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
【００１８】
前記フィルターにおいて、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、０．０７以上であってもよい。
【００１９】
このような構成により、濾過時間を短縮すると共に、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
【００２０】
前記フィルターにおいて、前記有核細胞を含む液体が接触する側に平滑な主面を有していてもよい。
【００２１】
このような構成により、フィルター部の主面で捕捉した有核細胞を容易に回収することができる。
【００２２】
前記フィルターにおいて、前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位が０．０３Ｖより貴であってもよい。
【００２３】
このような構成により、フィルターの成分である金属又は金属酸化物が有核細胞を含む液体中に溶出することを防止することができる。
【００２４】
前記フィルターにおいて、前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、金、銀、銅、白金、ニッケル、パラジウム、これらの合金及びこれらの酸化物からなる群から選択された少なくとも１つを含有していてもよい。
【００２５】
このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
【００２６】
本発明の一態様の濾過方法は、
有核細胞の濾過方法であって、
金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、複数の貫通孔が形成されており、前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さいフィルターを準備するステップ、
前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップ、
を含む。
【００２７】
このような構成により、有核細胞の回収率を向上させることができる。
【００２８】
前記濾過方法において、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、０．６４以下であってもよい。
【００２９】
このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
【００３０】
前記濾過方法において、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、０．０６以上であってもよい。
【００３１】
このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
【００３２】
前記濾過方法において、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、０．０７以上であってもよい。
【００３３】
このような構成により、濾過時間を短縮すると共に、有核細胞の回収率をより更に向上させることができる。
【００３４】
前記濾過方法において、前記フィルターは、前記有核細胞を含む液体が接触する側に平滑な主面を有していてもよい。
【００３５】
このような構成により、フィルターの主面で捕捉した有核細胞を容易に回収することができる。
【００３６】
前記濾過方法において、前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位が０．０３Ｖより貴であってもよい。
【００３７】
このような構成により、フィルターの成分である金属又は金属酸化物が有核細胞を含む液体中に溶出することを防止することができる。
【００３８】
前記濾過方法において、前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、金、銀、銅、白金、ニッケル、パラジウム、これらの合金及びこれらの酸化物からなる群から選択された少なくとも１つを含有していてもよい。
【００３９】
このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
【００４０】
前記濾過方法において、前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップは、生細胞と死細胞とを分離するステップを含んでもよい。
【００４１】
このような構成により、生細胞と死細胞とを分離することができる。
【００４２】
以下、本発明に係る実施の形態１について、添付の図面を参照しながら説明する。また、各図においては、説明を容易なものとするため、各要素を誇張して示している。
【００４３】
（実施の形態１）
［フィルターの構成］
図１は、本発明に係る実施の形態１のフィルター１０の概略構成図である。図２は、本発明に係る実施の形態１におけるフィルター１０の一部の拡大斜視図である。図１及び図２中のＸ、Ｙ、Ｚ方向は、それぞれフィルター１０の縦方向、横方向、厚み方向を示している。図１に示すように、フィルター１０は、フィルター部１１と、フィルター部１１の外周に設けられた枠部１５とを備える。図２に示すように、フィルター１０は、互いに対向する第１主面ＰＳ１と第２主面ＰＳ２とを有している。フィルター部１１は、第１主面ＰＳ１と第２主面ＰＳ２とを貫通する複数の貫通孔１２が形成されたフィルター基体部１４を備える。貫通孔１２の内接円の直径は、有核細胞の核の大きさより小さくなるように設計されている。
【００４４】
フィルター１０は、有核細胞を含む液体（細胞懸濁液）をフィルター部１１に通過させることによって、有核細胞を濾過するものである。
【００４５】
本明細書において、「有核細胞」とは、核小体と細胞質とが核膜によって隔てられている細胞である。
【００４６】
＜材質＞
フィルター１０の基体部分を形成するフィルター基体部１４を構成する材料は、金属及び／又は金属酸化物を主成分としている。フィルター基体部１４は、例えば、金、銀、銅、白金、ニッケル、パラジウム、これらの合金及びこれらの酸化物であってもよい。
【００４７】
フィルター１０の最表層は、細胞懸濁液へ溶出しにくい金属及び／又は金属酸化物で構成されていてもよい。例えば、フィルター１０の最表層が、リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位が０．０３Ｖより貴である金属で覆われている場合、フィルター１０を構成する材料が、細胞懸濁液へ溶出することを抑制することができる。これにより、細胞へのストレスを低減することができる。あるいは、フィルター１０の最表層は、親水性の材料で構成されていてもよい。例えば、水系の細胞懸濁液を処理する場合に、処理時間を短縮することができるため、細胞へのストレスを低減することができる。
【００４８】
＜外形＞
フィルター１０の外形は、例えば、円形、長方形、又は楕円形である。実施の形態１では、フィルター１０の外形は、略円形である。フィルター１０の外形を略円形にすることによって、フィルター１０の主面（例えば、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１）に対して流体を均一に流すことができる。なお、本明細書において、「略円形」とは、短径の長さに対する長径の長さの比が１．０以上１．２以下であることをいう。
【００４９】
＜フィルター部＞
フィルター部１１は、複数の貫通孔１２が形成された板状構造体である。フィルター部１１の形状は、例えば、円形、長方形、楕円形である。実施の形態１では、フィルター部１１の形状は、略円形である。フィルター部１１の形状を略円形にすることによって、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１に対して流体を均一に流すことができる。
【００５０】
図３は、フィルター部１１の一部を厚み方向（Ｚ方向）から見た概略図である。図３に示すように、複数の貫通孔１２は、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１及び第２主面ＰＳ２上に周期的に配置されている。具体的には、複数の貫通孔１２は、フィルター部１１においてマトリクス状に等間隔で設けられている。
【００５１】
実施の形態１では、貫通孔１２は、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１側、即ちＺ方向から見て、正方形の形状を有する。なお、貫通孔１２は、Ｚ方向から見た形状が正方形に限定されず、例えば長方形、円形、又は楕円などの形状であってもよい。
【００５２】
実施の形態１では、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１に対して垂直な面に投影した貫通孔１２の形状（断面形状）は、長方形である。具体的には、貫通孔１２の断面形状は、フィルター１０の半径方向の一辺の長さがフィルター１０の厚み方向の一辺の長さより長い長方形である。なお、貫通孔１２の断面形状は、長方形に限定されず、例えば、平行四辺形又は台形等のテーパー形状であってもよいし、対称形状であってもよいし、非対称形状であってもよい。
【００５３】
実施の形態１では、複数の貫通孔１２は、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１側（Ｚ方向）から見て正方形の各辺と平行な２つの配列方向、即ち図３中のＸ方向とＹ方向に等しい間隔で設けられている。このように、複数の貫通孔１２を正方格子配列で設けることによって、開口率を高めることが可能であり、フィルター１０に対する流体の通過抵抗を低減することができる。このような構成により、処理時間を短くし、細胞へのストレスを低減することができる。また、複数の貫通孔１２の配列の対称性が向上するため、フィルターの観察が容易になる。
【００５４】
なお、複数の貫通孔１２の配列は、正方格子配列に限定されず、例えば、準周期配列、又は周期配列であってもよい。周期配列の例としては、方形配列であれば、２つの配列方向の間隔が等しくない長方形配列でもよく、三角格子配列又は正三角格子配列などであってもよい。なお、貫通孔１２は、フィルター部１１に複数設けられていればよく、配列は限定されない。
【００５５】
貫通孔１２の間隔は、分離する細胞の種類（大きさ、形態、性質、弾性）又は量に応じて適宜設計されるものである。ここで、貫通孔１２の間隔とは、図３に示すように、貫通孔１２をフィルター部１１の第１主面ＰＳ１側から見て、任意の貫通孔１２の中心と隣接する貫通孔１２の中心との距離ｂを意味する。周期配列の構造体の場合、貫通孔１２の間隔ｂは、例えば、貫通孔１２の一辺ｄの１倍より大きく１０倍以下であり、好ましくは貫通孔１２の一辺ｄの３倍以下である。あるいは、例えば、フィルター部１１の開口率は、１０％以上であり、好ましくは開口率は、２５％以上である。このような構成により、フィルター部１１に対する流体の通過抵抗を低減することができる。そのため、処理時間を短くすることができ、細胞へのストレスを低減することができる。なお、開口率とは、（貫通孔１２が占める面積）／（貫通孔１２が空いていないと仮定したときの第１主面ＰＳ１の投影面積）で計算される。
【００５６】
貫通孔１２の内接円の直径は、有核細胞の核の大きさより小さくなるように設計されている。本明細書では、「貫通孔１２の内接円」とは、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１側から見て、貫通孔１２内に描ける円のうち直径が最も大きい円、即ち貫通孔１２を構成するフィルター部１１の内壁に接する円のうち直径が最も大きい円を意味する。言い換えると、「貫通孔１２の内接円」とは、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１側から見て、貫通孔１２の開口を画定する少なくとも２点に接する円のうち直径が最も大きい円を意味する。また、本明細書では、「有核細胞の核の大きさ」とは、有核細胞を液中に配置して顕微鏡で観察し、有核細胞の核の外周の任意の２つの点を結んだ線のうち、最長なものを有核細胞の核の長さとした場合、１００個の有核細胞の核の長さの平均値を意味する。
【００５７】
貫通孔１２の寸法は、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合が、０．６４以下であることが好ましい。また、有核細胞の核の大きさに対する貫通孔１２の内接円の直径の割合は、０．０６以上であることが好ましい。より好ましくは、有核細胞の核の大きさに対する貫通孔１２の内接円の直径の割合が、０．０７以上である。
【００５８】
複数の貫通孔１２の寸法は、略同一に設計されている。同じ形状の複数の貫通孔１２を周期配列した構成である場合、複数の貫通孔１２の大きさにおける標準偏差は小さい方が好ましい。具体的には、貫通孔１２の一辺ｄの測長を行い、１００個の貫通孔１２の一辺ｄの平均値と標準偏差とから変動係数を求めた場合、変動係数は４０％以下が好ましい。
【００５９】
フィルター部１１の厚みは、貫通孔１２の大きさ（一辺ｄ）の０．１倍より大きく１００倍以下が好ましい。より好ましくは、フィルター部１１の厚みは、貫通孔１２の大きさ（一辺ｄ）の０．５倍より大きく１０倍以下である。このような構成により、流体に対するフィルター１０の抵抗を低減することができ、処理時間を短くすることができる。その結果、細胞へのストレスを低減することができる。
【００６０】
フィルター部１１の表面（第１主面ＰＳ１）の算術平均粗さは、有核細胞の核の大きさよりも小さいことが好ましい。このような構成により、フィルター部１１の表面（第１主面ＰＳ１）への細胞の付着が低減され、細胞の回収率を高くすることができる。なお、算術平均粗さの測定は、株式会社アルバック製の触針式表面形状測定機ＤＥＫＴＡＫ１５０（登録商標）を用い、フィルター部１１の表面のうち５個所の測定値の平均値をフィルター部１１の算術平均粗さとした。
【００６１】
フィルター部１１において、有核細胞を含む液体が接触する第１主面ＰＳ１は、平滑に形成されていてもよい。具体的には、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１は、凹凸がなく均一な平面で形成されていてもよい。言い換えると、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１上の複数の貫通孔１２の開口が同一平面上に形成されている。また、フィルター部１１のうち貫通孔１２が形成されていない部分であるフィルター基体部１４は、繋がっており、一体に形成されている。このような構成により、フィルター部１１の表面（第１主面ＰＳ１）への細胞の付着が低減され、捕捉した有核細胞を容易に回収することができる。
【００６２】
フィルター部１１の貫通孔１２は、第１主面ＰＳ１側の開口と第２主面ＰＳ２側の開口とが連続した壁面を通じて連通している。具体的には、貫通孔１２は、第１主面ＰＳ１側の開口が第２主面ＰＳ２側の開口に投影可能に設けられている。即ち、フィルター部１１を第１主面ＰＳ１側から見た場合に、貫通孔１２は、第１主面ＰＳ１側の開口が第２主面ＰＳ２側の開口と重なるように設けられている。実施の形態１において、貫通孔１２は、その内壁が第１主面ＰＳ１及び第２主面ＰＳ２に対して垂直となるように設けられている。
【００６３】
＜枠部＞
枠部１５は、フィルター部１１の外周に設けられており、フィルター部１１に比べて単位面積当たりの貫通孔１２の数が少ない部分である。枠部１５における貫通孔１２の数は、フィルター部１１における貫通孔１２の数の１％以下である。枠部１５の厚みは、フィルター部１１の厚みよりも厚くてもよい。このような構成により、フィルター１０の機械強度を高めることができる。
【００６４】
フィルター１０を装置に接続して使用する場合、枠部１５は、フィルター１０と装置とを接続する接続部として機能してもよい。また、枠部１５には、フィルターの情報（貫通孔１２の寸法など）を表示してもよい。
【００６５】
枠部１５は、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１側から見て、リング状に形成されている。フィルター１０を第１主面ＰＳ１側から見て、枠部１５の中心は、フィルター部１１の中心と一致する。即ち、枠部１５は、フィルターと同心円上に形成されている。
【００６６】
フィルター１０は、取り扱いやすさ及びシステムとの接合のしやすさの観点から、治具に固定されて使用されてもよい。治具は、例えば、ガンマ滅菌可能な材料で構成することができる。治具は、例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリスチレン、シリコンゴム、ＡＢＳ樹脂、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリスルフォン、天然ゴム、ラテックス、ウレタンゴム、シリコンゴム、エチレン酢酸ビニル、ポリエステル類、エポキシ類、フェノール類、シリカ、アルミナ、金、白金、ニッケル、ステンレス、チタン、などを含む材料で形成されていてもよい。このような材料で治具を構成することにより、細胞へのストレスを低減することができる。
【００６７】
［濾過方法］
フィルター１０を用いた濾過方法について説明する。
【００６８】
まず、フィルター１０を準備する。この工程では、例えば、フィルター１０が、装置に取り付けられる。具体的には、フィルター１０の枠部１５を挟持することによって、フィルター１０を装置に取り付ける。
【００６９】
次に、細胞懸濁液をフィルター１０に通過させる。本明細書において、「細胞懸濁液」とは、有核細胞を含む流体である。多くの場合、有核細胞を含む流体は、液体である。液体としては、例えば、アミノ酸、タンパク質、血清、などを含んだ培養溶液、リン酸緩衝生理食塩水、又は水である。細胞懸濁液には、細胞と流体の他に、樹脂製粒子などの非生物由来物質、骨片又は肉片などの組織の一部、死細胞などを含んでいてもよい。
【００７０】
このように、有核細胞を含む液体をフィルター部１１に通過させることによって、液体から有核細胞を分離する。実施の形態１では、フィルター部１１の貫通孔１２の内接円の直径は、有核細胞の核の大きさよりも小さく設計されている。このため、有核細胞は、貫通孔１２を通過せずに、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１上に捕捉される。
【００７１】
細胞懸濁液をフィルター１０に通過させる方法としては、例えば、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１に対して略鉛直上方から重力を利用して細胞懸濁液を通過させる方法がある。この他に、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１に細胞懸濁液を接触させた上で細胞懸濁液に圧力を加えて通過させる方法（押圧）、又はフィルター部１１の第１主面ＰＳ１に細胞懸濁液を接触させて、第２主面ＰＳ２から吸引して細胞懸濁液を通過させる方法（吸引）などがある。なお、有核細胞を含む液体をフィルター部１１に通過させる工程においては、細胞にストレスをなるべく与えないことが好ましい。例えば、圧力を加える場合、有核細胞が変形しない程度の圧力とすることが好ましい。より好ましくは、圧力を加えずに、液体の自重により、液体をフィルター部１１に通過させることである。あるいは、フィルター部１１の開口率を高めることによって処理時間を短縮し、有核細胞にストレスがかかっている時間を少なくすることが好ましい。
【００７２】
また、液体中に有核細胞が浮遊した状態で細胞懸濁液をフィルター１０に通過させてもよい。液体中に浮遊した有核細胞は、ほぼ球形状となるため、捕捉対象である有核細胞の回収率を向上させることができる。即ち、捕捉したい有核細胞の寸法精度を向上させることができる。
【００７３】
また、フィルター１０に複数回通過させることによって、捕捉対象である有核細胞の寸法精度を高めることができる。
【００７４】
フィルター１０を用いた濾過方法において、例えば、濾過用容器を用いて、濾過を行ってもよい。濾過用容器は、例えば、外形１４ｍｍ、内径６ｍｍ、高さ５５ｍｍの円筒形状の容器であり、底部にフィルター１０を取り付けることができる。なお、濾過容器は、これに限定されず、様々な形状及び寸法の容器を使用してもよい。
【００７５】
［フィルターの製造方法］
フィルター１０の代表的な製造方法について説明する。フィルター１０は、以下の工程により製造される。
【００７６】
＜給電膜の形成＞
スパッタ装置を用いて、シリコン基板の上面にＣｕの給電膜を形成する。この給電膜は、後述するフィルター１０のフィルター基体部１４を形成するときの給電源となる。このとき、シリコン基板と給電膜との接着性確保を目的としてＴｉ等の中間層を形成してもよい。
【００７７】
Ｃｕの給電膜を形成する条件は、以下の通りである。
スパッタリングガス：アルゴンガス
スパッタリング装置の真空度：５．０×１０−４Ｐａ
印加電力：ＤＣ５００Ｗ
スパッタ時間：Ｃｕ膜形成時／２７分
Ｔｉ膜形成時／３分５秒
【００７８】
＜レジスト像の形成＞
シリコン基板の上面に形成された給電膜上にレジスト像を形成する。
スピンコーター等を用いて、シリコン基板の上面に形成された給電膜上に所定の膜厚のレジスト膜を形成する。次に、所定のパターンが形成されたフォトマスクを介してレジストを露光し、現像処理することによりレジスト像を形成する。
【００７９】
レジスト膜塗布の条件は、以下の通りである。
レジスト剤：ノボラック系樹脂＋有機溶剤
スピンコーターの回転数：１１３０ｒｐｍ
レジスト膜厚：２μｍ
スピンコーターにて上記レジスト剤をシリコン基板上面に塗布した後に窒素雰囲気下で１３０℃にて溶剤を揮発させた後に冷却することで、レジスト膜を形成する。
【００８０】
波長３６５ｎｍを含んだエネルギー密度２５００Ｊ／ｍ２の光線を０．２５秒間照射して、レジスト剤を露光する。
【００８１】
露光部分をアルカリ性溶液に接触させて現像処理する。
【００８２】
＜フィルター基体部の形成＞
レジスト像の開口部にフィルター基体部１４を形成する。先に形成した給電膜を給電源として、電解めっき法を用いて、ニッケルめっき膜からなるフィルター基体部１４を形成する。
【００８３】
フィルター基体部１４の形成の条件は、以下の通りである。
前処理：希硫酸に６０秒浸漬させることで給電膜の表面を活性化する。
めっき液：スルファミン酸ニッケルめっき液  液温５５℃  ｐＨ＝４．０
めっき速度：０．５μｍ／ｍｉｎ
めっき：揺動させながら、電解めっきを行う。
【００８４】
＜レジストの溶解及び剥離＞
フィルター基体部１４にアセトン溶液中で１５分間超音波をかけることによって、レジスト膜を溶解させて、レジストを剥離する。
【００８５】
＜支持基材の形成＞
フィルター１０を用いて濾過を行うに際し、必要に応じてフィルター１０に支持基材を設けてもよい。このようにすることで、濾過中にフィルター１０が破損することを防止できる。支持基材は以下の工程により作製される。なお、支持基材は、後述する図４において、符号「１３」で示される部材に相当する。
【００８６】
フィルター１０の基体が形成されたシリコン基板の上面に再度、感光性レジストを塗布してレジスト膜を形成した後に、フォトマスクを介してレジストを露光し、現像処理することによりレジスト像を形成する。このとき、レジスト像がフィルター１０の基体を複数またぐように露光、現像処理を行う。なお、レジスト像がフィルター１０の基体をまたいでいる部分は、フィルター１０の完成後に、フィルター１０の開口部となる。つまり、レジスト像がまたぐフィルター１０の基体の数は、フィルター１０に求められる開口率に応じて適宜決定される。
【００８７】
レジスト像の開口部にフィルター基体部１４を形成する。先に形成した給電膜を給電源として、電解めっき法を用いて、ニッケルめっき膜からなる支持基材を形成する。なお、支持基材の幅は、フィルター１０に求められる強度に応じて適宜決定される。
【００８８】
支持基材にアセトン溶液中で１５分間超音波をかけることによって、レジスト膜を溶解させることで、レジストを剥離する。
【００８９】
＜給電膜の除去＞
給電膜を除去し、シリコン基板から、フィルター基体部１４及び支持基材を分離することで有核細胞の濾過用のフィルター１０が完成する。
【００９０】
給電膜の除去は、６０％の過酸化水素水と酢酸と純水を１：１：２０の混合比で作製した水溶液に、２５℃の環境下で４８時間浸漬することによって行う。
【００９１】
［効果］
実施の形態１に係るフィルター１０によれば、以下の効果を奏することができる。
【００９２】
フィルター１０は、金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分としている。また、フィルター１０は、複数の貫通孔１２が形成されたフィルター部１１を備えている。このような構成により、フィルター部１１の貫通孔１２が変形しにくく、捕捉対象である有核細胞を捕捉し、有核細胞の回収率を向上させることができる。
【００９３】
貫通孔１２の内接円の直径は、有核細胞の核の大きさより小さくなるように設計されている。このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
【００９４】
フィルター部１１の第１主面ＰＳ１は、平滑に形成されている。このような構成により、第１主面ＰＳ１で捕捉した有核細胞を容易にフィルター部１１から分離させることができるため、回収が簡単になる。
【００９５】
また、フィルター１０を用いた濾過方法では、有核細胞を含む液体をフィルター１０に通過させることによって、捕捉対象である有核細胞を確実に捕捉することができるため、回収率を向上させることができる。
【００９６】
なお、実施の形態１では、貫通孔１２の寸法が略同一である例について説明したが、これに限定されない。例えば、貫通孔１２の寸法は、それぞれ異なっていてもよい。この場合、貫通孔１２の最大寸法は、有核細胞の核の大きさより小さく設計されていればよい。
【００９７】
実施の形態１では、フィルター１０の製造方法は、裏打ち層基体部を形成する工程を含む例を説明したが、これに限定されない。例えば、フィルター１０の製造方法は、裏打ち層基体部を形成する工程を含んでいなくてもよい。
【００９８】
実施の形態１では、有核細胞を含む液体をフィルター１０に通過させることによって、有核細胞を濾過する例について説明したが、これに限定されない。例えば、フィルター１０を用いて、生細胞と死細胞とを含む液体から、生細胞と死細胞とを分離してもよい。
【００９９】
生細胞と死細胞とを分離する方法としては、例えば、フィルター１０によってフィルター部１１の第１主面ＰＳ１上に生細胞を捕捉し、死細胞を通過させてもよい。また、フィルター１０によって、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１上に死細胞を捕捉し、生細胞を通過させてもよい。
【実施例】
【０１００】
実施の形態１に係るフィルター１０の性能評価を、実施例１−８及び比較例１を用いて行った。
【０１０１】
（１）実施例１−８と比較例１のフィルターについて
実施の形態１に係るフィルター１０について、表１に示す仕様で作製した。
【０１０２】
【表１】
2020072752.tif 000003
【０１０３】
実施例１−８及び比較例１は、外形の直径７．８ｍｍ、フィルター部１１の直径６ｍｍである。実施例１−７において、フィルター基体部１４はニッケル（Ｎｉ）であり、実施例８におけるフィルター基体部１４は金（Ａｕ）である。フィルター部１１には、第１主面ＰＳ１側から見て、正方形の貫通孔１２を正方格子配列で設けた。なお、貫通孔１２の形状が正方形であるため、表１に示すように、貫通孔１２の一辺ｄの長さと内接円の直径とは、同じ寸法になっている。
【０１０４】
図４は、支持基材１３が取り付けられたフィルター１０の概略構成を示す。図４に示すように、実施例１−６では、フィルター１０の第２主面ＰＳ２側に支持基材１３が設けられている。支持基材１３には、正方形状の複数の開口部１２ａが設けられている。支持基材１３の厚みは、１４μｍであり、開口部１３ａの一辺、即ち桟の間隔Ａは、２６０μｍであり、桟の幅Ｂは、１４μｍである。
【０１０５】
これらの実施例１−８及び比較例１のフィルターをそれぞれ濾過装置に設置し、細胞懸濁液を濾過することによって、実施例１−８及び比較例１のフィルターの性能評価を行った。
【０１０６】
（２）細胞懸濁液について
１００ｍｍディッシュを用いて、１０ｖｏｌ％のウシ胎児血清と１ｖｏｌ％のペニシリン―ストレプトマイシンとを含むＲＰＭＩ１６２０培地（Ｌ−グルタミン含有）で、白血病細胞株である浮遊細胞ＨＬ−６０を５日間培養した。
【０１０７】
１００ｍｍディッシュから培養液の一部を、ピペッティングにより１５ｍＬの遠沈管に移した。次に、培養液が入った遠沈管に対して、回転数１０００ｒｐｍで、３分間の遠心分離を行った後、上清を除去した。次いで、リン酸緩衝生理食塩水を添加し、細胞懸濁液を生成した。なお、細胞懸濁液の細胞濃度が１０５個／ｍＬになるようにリン酸緩衝生理食塩水の添加量を調整した。
【０１０８】
３０μＬの細胞懸濁液と、１５μＬの蛍光試薬ＤＡＰＩと、をマイクロチューブにて混合して細胞を染色し、染色した細胞懸濁液（細胞染色液）を遮光下にて３７℃で２０分間インキュベートした。その後、スライドガラスの上に細胞染色液１０μＬを滴下し、カバーガラスを重ね、波長３４５ｎｍの励起光源を使用し、４５５ｎｍを中心とするバンドパスフィルターを通して、蛍光顕微鏡により蛍光観察を行った。青紫色に発色した核のサイズを測定したところ、ＨＬ−６０の核の大きさは直径で７．０μｍであった。
【０１０９】
１００ｍｍディッシュ中の培養液の一部に対して、ピペッティングにより細胞を分散させた後、マイクロピペットを使用して１０μＬ取り出し、細胞数計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ製自動セルカウンター、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）  ＩＩ  ＦＬ）で細胞濃度、生存率、細胞の大きさの平均値を測定した。その結果、細胞濃度は５×１０５個／ｍＬ、活性のある細胞（ＨＬ−６０）の大きさの平均値は１３．４μｍ、生存率は９０％であった。具体的には、細胞懸濁液と０．４％のトリパンブルー溶液を１：１の体積割合で混合して細胞膜を青色に染色し、細胞懸濁液とトリパンブルー溶液との混合液１０μＬを細胞計数スライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ製Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄｅ）に滴下して、細胞の形態を観察した。細胞計数では、染色された細胞膜をマーカーとする画像解析によって、細胞の個数（濃度）、細胞の大きさの平均値、生存率をそれぞれ求めた。
【０１１０】
１００ｍｍディッシュ中の培養液に対して、さらにＲＰＭＩ１６２０培地を任意の比率で混合することにより、以下のＨＬ−６０細胞懸濁液を作製した。
活性のある細胞（ＨＬ−６０）の濃度・・・３．０６×１０５個／ｍＬ
液量・・・１ｍＬ  
【０１１１】
なお、室温下のクリーンベンチ内に４時間放置した１００ｍｍディッシュ中の培養液について、上述の方法で細胞の生存率を測定した結果、生存率が８１％に低下した。このことは、細胞を室温で、長時間放置することによって活性が低下することを意味している。
【０１１２】
（３）濾過方法について
濾過装置に取り付けられた実施例１−８及び比較例１のフィルターにおいて、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１に細胞懸濁液を接触させた状態で、第２主面ＰＳ２側から細胞懸濁液を吸引することによって、細胞懸濁液の濾過を行った。操作条件としては、２ｋＰａの圧力で吸引を行った。
【０１１３】
（４）評価結果について
表２に評価結果について示す。
【０１１４】
【表２】
2020072752.tif 000004
【０１１５】
実施例１−８においては、細胞（ＨＬ−６０）の回収率が１００％であった。これに対し、比較例１では、細胞の回収率が６７．６％であった。比較例１では、貫通孔１２の内接円の直径が７．２μｍであるため、細胞（ＨＬ−６０）の核の大きさ７．０μｍよりも大きい。このため、細胞が貫通孔１２を通過してしまったと考えられる。一方、実施例１−８においては、貫通孔１２の内接円の直径は、０．４μｍ以上４．５μｍ以下であり、細胞の核の大きさよりも小さい。このため、実施例１−８では、比較例１と比べて、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１で細胞を多く捕捉することができたと考えられる。なお、本明細書において、「回収率」とは、フィルターの第１主面ＰＳ１上に捕捉した細胞に対する投入した活性のある細胞数の割合を意味し、（投入した活性のある細胞数−通過液に含まれる活性細胞の数）／（投入した活性のある細胞数）で計算した。なお、表２において、実施例１−７及び比較例１の評価と、実施例８の評価とは、異なる日に行ったため、活性のある細胞（ＨＬ−６０）の濃度が異なっているが、評価の結果に影響はない。
【０１１６】
なお、通過液に含まれる活性細胞の数は、ピペッティングにより通過液中の細胞を分散させた後にマイクロピペットを使用して１０μＬの通過液を１０検体取り出し、細胞数計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ製自動セルカウンター、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）  ＩＩ  ＦＬ）にて、上記検体中の細胞の数を計測した。
【０１１７】
このように、貫通孔１２の内接円の直径を、細胞核の大きさよりも小さく設計することで、より多くの細胞を捕捉することができ、回収率を向上させることができる。この理由としては、細胞核を取り囲む細胞質は変形しやすく、細胞核は変形しにくい点にある。
【０１１８】
比較例１のように、貫通孔１２の内接円の直径が細胞核の大きさよりも大きい場合、たとえ貫通孔１２の内接円の直径が細胞の大きさよりも小さくても、細胞質が変形することで細胞がフィルター１０を通過してしまうことがある。
【０１１９】
一方、実施例１−８のように、貫通孔１２の内接円の直径を細胞核より小さく設計している場合、細胞核は変形しにくいため、比較例１と比べて、細胞をフィルター１０上で捕捉しやすい。
【０１２０】
また、フィルター１０が金属製である点も細胞の回収率の向上に寄与している。金属から成るフィルター１０を使用することで、フィルター１０の貫通孔１２自体の変形量は、メンブレンなどの樹脂性のフィルターと比べて少なくなる。このため、フィルター１０では、更に細胞を捕捉しやすくなっている。
【０１２１】
表２に示すように、細胞の回収率を向上させるために、細胞の核の大きさ（Ｙ）に対する貫通孔１２の内接円の直径（Ｘ）の割合は、０．６４以下であることが好ましい。また、細胞の核の大きさ（Ｙ）に対する貫通孔１２の内接円の直径（Ｘ）の割合は、０．０６以上であることが好ましい。
【０１２２】
また、表２に示すように、実施例１は、実施例２−７と比べて濾過時間が長くなっている。このことから、細胞の核の大きさ（Ｙ）に対する貫通孔１２の内接円の直径（Ｘ）の割合は、０．０７以上にすることによって濾過時間を短縮することができる。
【０１２３】
また、実施例１−８のフィルター部１１において貫通孔１２が設けられている部分の面積は、０．２８ｃｍ２である。処理能力（投入した細胞数／貫通孔が設けられている部分の面積）は、１．１×１０６個／ｃｍ２となる。一方、特許文献１のフィルターでは、処理能力は０．３７×１０６個／ｃｍ２である。このように、実施例１−８では、特許文献１のフィルターと比べて、処理能力が高い。
【０１２４】
また、有核細胞を濾過するに際し、細胞懸濁液への不純物混入、すなわちフィルター１０を構成する金属が細胞懸濁液へ溶出することを抑制することが好ましいことは言うまでもない。
【０１２５】
実施例１−７では、細胞（ＨＬ−６０）を濾過するに際し、ニッケル製の金属フィルターを使用しており、実施例１−７では、細胞の活性を損なわずに濾過を完了することができた。また、実施例８では、細胞（ＨＬ−６０）を濾過するに際し、Ａｕ製の金属フィルターを使用しており、実施例８においても、実施例１−７と同様に、細胞の活性を損なわずに濾過を完了することができた。
【０１２６】
ニッケルとＡｕについて、金属のイオン化傾向の指標である浸漬電位の測定を実施した。リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位を３分間測定したところ、ニッケルの浸漬電位は０．０３Ｖより貴の範囲で推移し、Ａｕの浸漬電位は、０．３Ｖより貴の範囲で推移した。つまり、同条件で測定したときに、少なくとも０．０３Ｖより貴の浸漬電位を示す金属及び／又は金属酸化物であれば、細胞の活性を損なわずに濾過が可能であると言える。
【０１２７】
また、実施例１−８では、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１上にＨＬ−６０を捕捉する一方で、リン酸緩衝生理食塩水を通過させることができた。液体の通過しやすさは、フィルターの開口率に依存するが、実施例のうち開口率が最も低いのは実施例１及び２における２３．３%である（表１参照）。つまり、本発明の金属製のフィルターの開口率が少なくとも２３．３%であれば、液体を通過させることが可能ということが言える。また、液体の通過させやすさの観点では、金属製フィルターに形成された貫通孔１２のばらつきが小さい方が好ましい。濾過処理時間が短い場合（例えば、１００秒未満）で、実施例のうち変動係数が最も大きいのは、実施例３における０．１７である。つまり、変動係数は、０．１７以下であることが好ましいといえる。
【０１２８】
（５）実施例９−１６のフィルターについて
実施の形態１に係るフィルター１０について、表３に示す仕様で作製した。
【０１２９】
【表３】
2020072752.tif 000005
【０１３０】
実施例９−１６は、外形の直径７．８ｍｍ、フィルター部１１の直径６ｍｍである。実施例９−１５において、フィルター基体部１４はニッケルであり、実施例１６において、フィルター基体部１４はＡｕである。フィルター部１１には、第１主面ＰＳ１側から見て、正方形の貫通孔１２を正方格子配列で設けた。なお、貫通孔１２の形状が正方形であるため、表３に示すように、貫通孔１２の一辺ｄの長さと内接円の直径とは、同じ寸法になっている。
【０１３１】
（６）細胞懸濁液について
以下の２種類の細胞懸濁液を作製した。
【０１３２】
（ｉ）Ｈｅｌａ懸濁液
１００ｍｍディッシュを用いて、１０ｖｏｌ％のウシ胎児血清と１ｖｏｌ％のペニシリン―ストレプトマイシンとを含むＲＰＭＩ１６２０培地（Ｌ−グルタミン含有）で、ヒト子宮頚癌由来ヒト細胞株である接着細胞Ｈｅｌａを５日間培養した。
【０１３３】
培養後、１００ｍｍディッシュから培地を吸引除去した。次に、１００ｍｍディッシュ上のＨｅｌａ細胞にリン酸緩衝生理食塩水を２ｍＬ加え、ピペッティングによりＨｅｌａ細胞の細胞培養面（細胞の表面）を洗浄した。更に、リン酸緩衝生理食塩水を１ｍＬ加え、ピペッティングによりＨｅｌａ細胞の細胞培養面の洗浄を再度行い、ＰＢＳ吸引除去した。その後、洗浄したＨｅｌａ細胞に０．２５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ液を０．８ｍＬ加え、ＣＯ２インキュベータ内で５分静置した。顕微鏡でＨｅｌａ細胞が１００ｍｍディッシュから剥離したことを確認後、１００ｍｍディッシュからピペッティングにより１５ｍＬの遠沈管に細胞懸濁液の一部を移した。更に、培地１ｍＬで１００ｍｍディッシュを洗い、細胞懸濁液の一部を遠沈管に移した。遠心分離機を用いて１，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、上清を除去した。その後、培地１ｍＬでピペッティングし、細胞を分散させた。
【０１３４】
対物ミクロメーター付き顕微鏡を用いて、倍率４０倍で細胞懸濁液の一部を拡大観察することによって、Ｈｅｌａ細胞の核の大きさを測定した。Ｈｅｌａ細胞の核の大きさは、直径１０．０μｍであった。
【０１３５】
この細胞懸濁液を、マイクロピペットを使用して１０μＬ取り出し、細胞数計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ製自動セルカウンター、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）  ＩＩ  ＦＬ）で細胞濃度、生存率、細胞の大きさの平均値を測定した。その結果、細胞濃度は７×１０６個／ｍＬ、活性のある細胞（Ｈｅｌａ）の大きさの平均値は１７．１μｍ、生存率は９５％であった。具体的には、細胞懸濁液と０．４％のトリパンブルー溶液を１：１の体積割合で混合して細胞膜を青色に染色し、細胞懸濁液とトリパンブルー溶液との混合液１０μＬを細胞計数スライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ製Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄｅ）に滴下して、細胞の形態を観察した。細胞計数では、染色された細胞膜をマーカーとする画像解析によって、細胞の個数（濃度）、細胞の大きさの平均値、生存率をそれぞれ求めた。
【０１３６】
培養したＨｅｌａ細胞を含む細胞懸濁液を、ＲＰＭＩ１６２０培地で希釈してＨｅｌａ細胞懸濁液を作製した。
【０１３７】
（ｉｉ）ｒａｓ遺伝子が導入されたＮＩＨ３Ｔ３（以下、ＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）と表記することがある）懸濁液  １００ｍｍディッシュを用いて、５ｖｏｌ％のウシ胎児血清と１ｖｏｌ％のペニシリン―ストレプトマイシンとを含むＤＭＥＭ培地（４．５ｇ/Ｌ  グルコース  Ｌ−グルタミン酸含有）で、ｒａｓ遺伝子導入したマウス胎児線維芽株接着細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）を３日間培養した。
【０１３８】
培養後、１００ｍｍディッシュから培地を吸引除去した。次に、１００ｍｍディッシュ上に残ったＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）にリン酸緩衝生理食塩水を２ｍＬ加え、ピペッティングにより細胞培養面（細胞の表面）を洗浄した。更に、リン酸緩衝生理食塩水を１ｍＬ加え、ピペッティングにより細胞培養面の洗浄を再度行い、ＰＢＳ吸引除去した。０．２５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ液を０．８ｍＬ加えＣＯ２インキュベータ内で３分静置した。顕微鏡で細胞が１００ｍｍディッシュから剥離したことを確認後、１００ｍｍディッシュからピペッティングにより細胞懸濁液の一部を１５ｍＬの遠沈管に移した。更に、培地１ｍＬで１００ｍｍディッシュを洗い、細胞懸濁液の一部を遠沈管に移した。遠心分離機を用いて１，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、上清を除去した。その後、培地１ｍＬでピペッティングし、細胞を分散させた。
【０１３９】
対物ミクロメーター付き顕微鏡を用いて、倍率４０倍で細胞懸濁液の一部を拡大観察することによって、ＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）の核の大きさを測定した。ＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）の核の大きさは、直径で１１．５μｍであった。
【０１４０】
この細胞懸濁液に対して、マイクロピペットを使用して１０μＬ取り出し、細胞数計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ製自動セルカウンター、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）  ＩＩ  ＦＬ）で細胞濃度、生存率、細胞の大きさの平均値を測定した。その結果、細胞濃度は４×１０６個／ｍＬ、活性のある細胞（ＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ））の大きさの平均値は１５．４μｍ、生存率は８９％であった。具体的には、細胞懸濁液と０．４％のトリパンブルー溶液を１：１の体積割合で混合して細胞膜を青色に染色し、細胞懸濁液とトリパンブルー溶液との混合液１０μＬを細胞計数スライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ製Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄｅ）に滴下して、細胞の形態を観察する。細胞計数では、染色された細胞膜をマーカーとする画像解析によって、細胞の個数（濃度）、細胞の大きさの平均値、生存率をそれぞれ求めた。
【０１４１】
培養したＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）を含む細胞懸濁液を、当該ＤＭＥＭ培地（４．５ｇ/Ｌ  グルコース  Ｌ−グルタミン酸含有）で希釈してＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）細胞懸濁液を作製した。
【０１４２】
また、Ｈｅｌａ細胞の核の大きさとＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）の核の大きさについて、蛍光顕微鏡を用いても測定した。具体的には、蛍光顕微鏡を用いて、倍率４０倍でこれらの細胞懸濁液の一部を拡大観察することによってＨｅｌａ細胞の核の大きさとＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）の核の大きさとを測定した。蛍光顕微鏡を用いて測定したところ、Ｈｅｌａの核の大きさは、直径で１０．０μｍであり、ＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）の核の大きさは１１．５μｍであった。
【０１４３】
また、これらの細胞懸濁液に対して、マイクロピペットを使用して１０μＬそれぞれ取り出し、細胞数計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ製自動セルカウンター、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）  ＩＩ  ＦＬ）で細胞濃度、生存率、細胞の大きさの平均値を測定した。その結果、細胞濃度はＨｅｌａが３．１７×１０５個／ｍＬ、ＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）が２．９７×１０５個／ｍＬ、活性のある細胞の大きさの平均値は、Ｈｅｌａが１７．１μｍ、ＮＩＨ３Ｔ３(ｒａｓ)が１５．４μｍ、生存率はＨｅｌａが９８%、ＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）が８９%であった。具体的には、細胞懸濁液と０．４％のトリパンブルー溶液を１：１の体積割合で混合して細胞膜を青色に染色し、細胞懸濁液とトリパンブルー溶液との混合液１０μＬを細胞計数スライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ製Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄｅ）に滴下して、細胞の形態を観察した。細胞計数では、染色された細胞膜をマーカーとする画像解析によって、細胞の個数（濃度）、細胞の大きさの平均値、生存率をそれぞれ求めた。
【０１４４】
Ｈｅｌａ細胞を含む細胞懸濁液に対して、さらにリン酸緩衝生理食塩水を任意の比率で混合することにより、以下のＨｅｌａ細胞懸濁液を作製した。
活性のある細胞（Ｈｅｌａ）の濃度・・・３．１７×１０５個／ｍＬ
液量・・・１ｍＬ
【０１４５】
ＮＩＨ３Ｔ３(ｒａｓ)を含む細胞懸濁液に対して、さらにリン酸緩衝生理食塩水を任意の比率で混合することにより、以下のＮＩＨ３Ｔ３(ｒａｓ)細胞懸濁液を作製した。
活性のある細胞（ＮＩＨ３Ｔ３(ｒａｓ)）の濃度・・・２．９７×１０５個／ｍＬ
液量・・・１ｍＬ
【０１４６】
（７）濾過方法について
濾過装置に取り付けられた実施例９−１６のフィルターにおいて、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１に細胞懸濁液を接触させた状態で、第２主面ＰＳ２側から細胞懸濁液を吸引することによって、細胞懸濁液の濾過を行った。操作条件としては、２ｋＰａの圧力で吸引を行った。
【０１４７】
（８）評価結果について
表４及び５に評価結果について示す。
【０１４８】
【表４】
2020072752.tif 000006
【０１４９】
【表５】
2020072752.tif 000007
【０１５０】
表４及び表５に示すように、実施例９−１６においては、Ｈｅｌａ、ＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）ともに回収率が１００％であった。実施例９−１６においては、貫通孔１２の内接円の直径は、０．４μｍ以上７．２μｍ以下であり、Ｈｅｌａ及びＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）における細胞の核の大きさよりも小さい。このため、実施例９−１６においても、実施例１−８と同様に、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１で細胞をより多く捕捉することができたと考えられる。
【０１５１】
また、表４及び５に示すように、実施例９は、実施例１０−１６と比べて濾過時間が長くなっている。つまり実施例１−８と同様に、細胞の核の大きさ（Ｙ）に対する貫通孔１２の内接円の直径（Ｘ）の割合は、０．０７以上にすることによって濾過時間を短縮することができる。
【０１５２】
また、実施例９−１６のフィルター部１１において貫通孔１２が設けられている部分の面積は、０．２８ｃｍ２である。処理能力（投入した細胞数／貫通孔が設けられている部分の面積）は、１．１×１０６個／ｃｍ２となる。一方、特許文献１のフィルターでは、処理能力は０．３７×１０６個／ｃｍ２である。このように、実施例１−８では、特許文献１のフィルターと比べて、処理能力が高い。
【０１５３】
また、実施例９−１５では、ニッケル製の金属フィルターを使用し、実施例１６では、Ａｕ製の金属フィルターを使用し、実施例１−８と同様に細胞の活性を損なわずに濾過を完了することができた。
【０１５４】
なお、実施例においては、細胞懸濁液中に有核細胞が１０５個／ｍＬ以上存在する比較的高い濃度の細胞懸濁液を濾過して有核細胞を捕捉する例について説明したが、フィルター１０は、細胞懸濁液中に有核細胞が数個／ｍＬ程度の極めて低濃度の細胞懸濁液を濾過した場合であっても、回収対象である有核細胞を捕捉することができる。
【０１５５】
本発明は、添付図面を参照しながら好ましい実施形態に関連して充分に記載されているが、この技術の熟練した人々にとっては種々の変形や修正は明白である。そのような変形や修正は、添付した特許請求の範囲による本発明の範囲から外れない限りにおいて、その中に含まれると理解されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【０１５６】
本発明のフィルターは、有核細胞の回収率を向上させることができるため、細胞懸濁液から有核細胞を分離する用途に有用である。
【符号の説明】
【０１５７】
１０  フィルター
１１  フィルター部
１２  貫通孔
１３  支持基材
１３ａ  開口部
１４  フィルター基体部
１５  枠部
ＰＳ１  第１主面
ＰＳ２  第２主面
【図１】
2020072752.tif 000008
【図２】
2020072752.tif 000009
【図３】
2020072752.tif 000010
【図４】
2020072752.tif 000011