(57)【要約】      （修正有）【課題】グリコシル化は、バイオ医薬品としての使用を意図する組換えタンパク質の生物学的及び生理化学的な性質に影響を及ぼし得る。組換え糖タンパク質のシアル酸部分を対象とする、より効率的で再現性を有するアッセイ方法を提供する。【解決手段】凝縮核形成光散乱検出を使用した、組換え糖タンパク質の糖鎖部分の決定方法であって、凝縮核形成光散乱検出に、ナノ量分析物検出器（ＮＱＡＤ）を使用する、方法。【選択図】図１
2020187128.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え糖タンパク質のシアル酸部分の決定方法であって、シアル酸を遊離させるために、シアリダーゼを使用して前記組換え糖タンパク質を消化することと、凝縮核形成光散乱検出を使用して前記シアル酸を定量することを含む、前記決定方法。
【請求項２】
前記定量段階の前に、前記遊離シアル酸を前記組換え糖タンパク質から分離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分離段階が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を伴う、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記凝縮核形成光散乱検出に、ナノ量分析物検出器（ＮＱＡＤ）が使用される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＰＬＣが、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記組換え糖タンパク質が、抗体、融合タンパク質、ホルモン、またはサイトカインである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記シアル酸が、Ｎ−アセチルノイラミン酸及び／またはＮ−グリコリルノイラミン酸である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
Ｎ−アセチルノイラミン酸及び／またはＮ−グリコリルノイラミン酸の量が決定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の、Ｎ−グリコリルノイラミン酸に対する比が決定される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
組換え糖タンパク質のグリカン部分の決定方法であって、グリカンを遊離させるために、グリコシダーゼを使用して前記組換え糖タンパク質を消化することと、凝縮核形成光散乱検出を使用して前記グリカンを定量することを含む、前記決定方法。
【請求項１１】
前記定量段階の前に、前記遊離グリカンを前記組換え糖タンパク質から分離することをさらに含む、請求項１０に記載の方法
【請求項１２】
前記分離段階が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を伴う、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記凝縮核形成光散乱検出に、ナノ量分析物検出器（ＮＱＡＤ）が使用される、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＨＰＬＣが、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記組換え糖タンパク質が、抗体、融合タンパク質、ホルモン、またはサイトカインである、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記グリカン部分が、１つまたは複数のシアル酸部分、Ｎ結合型のものである、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
グリカン部分の量が決定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
組換えＦｃ融合糖タンパク質のシアル酸部分の決定方法であって、シアル酸を遊離させるために、シアリダーゼを使用して前記組換えＦｃ融合糖タンパク質を消化することと、前記遊離シアル酸を前記組換えＦｃ融合糖タンパク質から分離することと、凝縮核形成光散乱検出を使用して前記シアル酸を定量することを含む、前記決定方法。
【請求項１９】
エタネルセプトのシアル酸部分の決定方法であって、シアル酸を遊離させるために、シアリダーゼを使用して前記エタネルセプトを消化することと、前記遊離シアル酸を前記エタネルセプトから分離することと、凝縮核形成光散乱検出を使用して前記シアル酸を定量することを含む、前記決定方法。
【請求項２０】
前記シアル酸が、Ｎ−アセチルノイラミン酸及び／またはＮ−グリコリルノイラミン酸である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｎ−アセチルノイラミン酸及び／またはＮ−グリコリルノイラミン酸の量が決定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の、Ｎ−グリコリルノイラミン酸に対する比が決定される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１１月１９日に出願の米国仮出願第６２／０８２，０１４号の利益を主張し、当該文献は、参照によって、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
要約
本発明は、凝縮核形成光散乱検出（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ  ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を使用した、組換え糖タンパク質の糖鎖部分の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
序論
グリコシル化は、バイオ医薬品としての使用を意図する組換えタンパク質の生物学的及び生理化学的な性質に影響を及ぼし得るものである（Ｂｙｒｎｅ，Ｄｏｎｏｈｏｅ，＆  Ｏ’Ｋｅｎｎｅｄｙ，２００７）。例えば、タンパク質のシアル酸部分は、血清中半減期において主要な役割を担っている。末端のガラクトースが露出するにつれて、アシアロ化した糖タンパク質は、肝臓のアシアロガラクトースの受容体によって、受容体媒介性のエンドサイトーシスを介して取り込まれる（Ｈｉｌｄｅｎｂｒａｎｄｔ  ＆  Ａｒｏｎｓｏｎ，１９７９）。
【０００４】
したがって、そのような生物医薬品における末端シアロ基の状態を、重要な品質特性として監視することが必要であり得る。一般に用いられる方法は、シアル酸の誘導化を含む。この方法では、酸加水分解（例えば、８Ｍの酢酸）を介してシアル酸を遊離させ、１，２−ジアミノ−４，５−メチレンジオキシベンゼン（ＤＭＢ）などの蛍光団または発色団で標識する。標識の後、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって分析する。
【０００５】
代替の手法では、酵素的（シアリダーゼ−Ａ）に遊離させたシアル酸を、高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）での分離に供した後、パルスアンペロメトリック電気化学検出（ＰＡＤ）を実施する方法を使用する。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤシステムは、Ｄｉｏｎｅｘから市販されている。
【０００６】
方法の両方が欠点を有する。前者の誘導体化手法は、本質的にばらつきが大きく、後者のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法では、分析中に生じる電極汚染に起因して、ばらつきが大きいことに悩まされる（Ｇａｎｅｓａ，Ｇｒａｎｄａ，＆  Ｍａｔｔａｌｉａｎｏ，２００３）。さらに、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法に必要な材料は高価であり、維持費用がかかる。したがって、当該技術分野では、組換え糖タンパク質のシアル酸部分を対象とする、より効率的で再現性を有するアッセイ方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｙｒｎｅ，Ｄｏｎｏｈｏｅ，＆  Ｏ’Ｋｅｎｎｅｄｙ，２００７
【非特許文献２】Ｈｉｌｄｅｎｂｒａｎｄｔ  ＆  Ａｒｏｎｓｏｎ，１９７９
【非特許文献３】Ｇａｎｅｓａ，Ｇｒａｎｄａ，＆  Ｍａｔｔａｌｉａｎｏ，２００３
【発明の概要】
【０００８】
本明細書に開示の発明は、組換え糖タンパク質の糖鎖部分の決定のための、改善された、信頼性を有する方法を提供する。本発明は、組換え糖タンパク質のシアル酸部分の決定に特に適している。本発明の一部は、水分凝縮粒子計数（ｗａｔｅｒ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ）（ＷＣＰＣ）技術を使用した、組換え糖タンパク質のシアル酸部分の決定手法の開発に基づく。ＷＣＰＣ技術は、水蒸気を使用して分析物を大きくすることで感度の最大化を可能にするものである。以下に示されるように、本発明は、組換え糖タンパク質のシアル酸部分の型の決定及び定量を可能にする。分析することになる組換え糖タンパク質は、例えば、抗体、融合タンパク質、ホルモン、サイトカイン、またはこうした分子実体のいずれかの誘導体、変異体、変異タンパク質、断片、多量体、もしくは複合体であり得る。
【０００９】
１つの態様では、本発明は、組換え糖タンパク質の糖鎖部分の決定方法を提供し、当該方法は、糖鎖を遊離させるための酵素、好ましくは、エキソグリコシダーゼを使用した組換え糖タンパク質の消化と、凝縮核形成光散乱検出を使用した糖鎖の定量と、を含む。任意選択で、定量段階の前に、組換え糖タンパク質から遊離グリカン酸が分離される。糖鎖部分には、限定はされないが、シアル酸、末端ガラクトース、Ｎ結合型糖鎖、Ｏ結合型糖鎖、及び構成糖分析の対象となる単糖が含まれる。１つの態様では、凝縮核形成光散乱検出に、ナノ量分析物検出器（Ｎａｎｏ  Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ａｎａｌｙｔｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）（ＮＱＡＤ）が使用される。
【００１０】
好ましい態様では、本発明は、組換え糖タンパク質のシアル酸部分の決定方法を提供し、方法は、シアル酸を遊離させるための、シアリダーゼを使用した組換え糖タンパク質の消化と、凝縮核形成光散乱検出を使用したシアル酸の定量と、を含む。任意選択で、定量段階の前に、組換え糖タンパク質から遊離シアル酸が分離される。１つの態様では、凝縮核形成光散乱検出に、ナノ量分析物検出器（ＮＱＡＤ）が使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラム（アイソクラティックのグラジエント条件下でトリエチルアミン／アセトニトリルを使用）でＮＡＮＡとＮＧＮＡとを分離したものを示す。
【図２Ａ】２０％のギ酸を使用した、１０ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムでのＮＡＮＡ／ＮＧＮＡのクロマトグラムを示す。
【図２Ｂ】２０％のギ酸を使用した、１０ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムでのＮＡＮＡ／ＮＧＮＡ（個別注入及び混合注入）のクロマトグラムを示す。
【図３Ａ】シアル酸（ＮＡＮＡ）標準物質の代表的なクロマトグラムを示す。
【図３Ｂ】糖タンパク質−ＡからシアリダーゼＡによって遊離したシアル酸（ＮＡＮＡ）の代表的なクロマトグラムを示す。
【図４】グラジエントの初期組成におけるＢを１５％として、１０ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムを使用したＮＡＮＡ−ＮＧＮＡのクロマトグラムを示す。
【図５】グラジエントの初期組成におけるＢを２０％として、１０ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムを使用したＮＡＮＡ／ＮＧＮＡのクロマトグラムを示す。
【図６】グラジエントの初期組成におけるＢを２５％として、１０ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムを使用したＮＡＮＡ／ＮＧＮＡのクロマトグラムを示す。
【図７】グラジエント初期のＢを２０％として、５ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラム（１００％のアセトニトリル及び１０％のギ酸を移動相Ａ及び移動相Ｂとして使用）でＮＡＮＡとＮＧＮＡとを分離したものを示す。
【図８】シアル酸（ＮＡＮＡ）較正標準物質の直線回帰プロットを示す。
【図９】ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法におけるシアル酸の直線ダイナミックレンジを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
本明細書に示されるように、本発明の１つの態様では、ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸ（商標）アミドカラムを用いるＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法を使用する、誘導化不要の糖タンパク質分析と、１，２−ジアミノ−４，５−メチレンジオキシベンゼン（ＤＭＢ）を使用してカラム導入前に誘導化を実施するＨＰＬＣ法、ならびにパルスアンペロメトリック電気化学検出を用いるＤｉｏｎｅｘに基づく高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（またはイオンクロマトグラフィー）（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）と、の相関性は十分であった。しかしながら、ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法は、誘導化段階を排除している分、ＨＰＬＣ／ＤＭＢ法と比較して効率性が高い。さらに、ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法は、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法と比較して再現性が高く、これは、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法では、分析中に生じる電極汚染に起因して、ばらつきが大きいことに悩まされるためである。全体的に見て、本発明の１つの態様として本明細書に開示されるＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法は、一般に使用されるＨＰＡＥ−ＰＡＤ法及びＨＰＬＣ／ＤＭＢ法に対する許容可能な同等性と共に、広範な直線ダイナミックレンジ、ならびに優れた精度、正確性、再現性、信頼性、及び使い勝手の良さを提供する。
【００１３】
したがって、本発明の方法は、シアル酸を生成させるための、シアリダーゼを使用した組換え糖タンパク質の消化と、その後に実施する、凝縮核形成光散乱検出を使用したシアル酸部分の量及び／または型の定量と、を含む。
【００１４】
しかしながら、本発明の方法は、シアル酸に加えて他の糖鎖部分の分析にも使用し得るものであり、他の糖鎖部分には、限定はされないが、Ｎ結合型糖鎖、末端ガラクトース、Ｏ結合型糖鎖、及び構成糖分析の対象となる単糖が含まれる。本発明の方法を使用して、検出、定量、または分析することができる他の特定の糖鎖部分の例には、限定はされないが、グルコース（Ｇｌｕ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）、フルクトース、及びスクロース、ならびにそのような部分の１つまたは複数の型が、より複合的に組み合わさったものが含まれ、複合的に組み合わさったものは、１分岐構造、２分岐構造、３分岐構造、４分岐構造、及びさらなる高次構造などである。本明細書に記載の発明の方法を使用することで、糖タンパク質の任意の数の翻訳後修飾を同様に決定及び定量することが可能であり、特に、シアル酸部分の決定及び定量が可能である。
【００１５】
凝縮核形成光散乱検出
凝縮核形成光散乱検出は、エアロゾルに基づく検出手法の一種である。試験することになる試料は、最初に噴霧されて液滴となった後、その液滴から移動相が蒸発することで、移動相より揮発性が低い化学物質が、懸濁粒子として空気中に残存する。その後、この乾燥エアロゾルは、別のチャンバーへと移され、そこで粒子上に水蒸気が凝縮することで粒子が膨潤する。膨潤した粒子は、レイザーに基づく光学センサーを使用して、個々に検出することができる。（Ｇｉｌｌｅ  ａｎｄ  Ｃｒｏｗｓｈａｗ，２００８，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｔｏｄａｙ  ｖ．１（３），ｐ．２６）。凝縮核形成光散乱検出の市販システムの１つは、Ｄｉｏｎｅｘのナノ量分析物検出器（ＮＱＡＤ（商標））である。
【００１６】
他のエアロゾルに基づく検出器とは異なり、ＮＱＡＤなどの凝縮核形成光散乱検出は、分析物の分解能及び感度を妨げ得るセンサーノイズまたはドリフトによって妨害を受けることはない。屈折率検出器及び他のエアロゾルに基づく検出器では、ベースラインが不安定になり、グラジエント実施中に応答の直線性が失われるが、一方ＮＱＡＤシステムでは、ベースラインが安定しており、直線ダイナミックレンジの幅がより広いことが示され、低ナノグラムレベルでの分析物の定量に適していることが示されている（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｌｉ，Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｇｒｏｅｂｅｒ，Ｓｚｕｃｓ，Ｄｉｃｉｎｏｓｋｉ  ＆  Ｈａｄｄａｄ，２０１１）。蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）及びＮＱＡＤは、共に安価であり、操作が容易であって、すべての型のＨＰＬＣシステムに適合する。しかしながら、定量については、ＮＱＡＤが、ＥＬＳＤと比較して、より適している。これは、ＮＱＡＤの方が、直線ダイナミックレンジが広く、感度が高いためである。
【００１７】
Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）が示したところによれば、ＵＶ発色団を有し、さまざまな物理化学的性質を有する分析物の検出限界を、グラジエント条件下で異なる移動相組成物を用い、さまざまな検出器を使用して評価した中で、ＮＱＡＤが最も高い感度を有する検出器であった。Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）は、さまざまな物理化学的性質からなる分析物を２５μｌの体積で注入し、ＮＱＡＤの検出下限（ＬＬＯＤ）が１０ｎｇ／ｍＬであり、これに次いで、ＬＬＯＤが７６ｎｇ／ｍＬであるコロナＣＡＤ（荷電化粒子検出器）、そしてＬＬＯＤが１７８ｎｇ／ｍＬであるＵＶ検出器（２００ｎｍにて）と続くことを示した。Ｏｌｓｏｖｓｋａ，Ｋａｍｅｎｉｋ  ａｎｄ  Ｃａｊｔｈａｍｌ（２００９）によって実施された研究に基づくと、マクロライド（オレアンドマイシン、エリスロマイシン、トロレアンドマイシン、クラリスロマイシン、及びロキシスロマイシン）である抗生物質（低ＵＶ吸収）を調べた際に、その検出感度は、ＵＶでの検出と比較して、ＮＱＡＤでの検出で３倍高かった。ＮＱＡＤが、発色団を有さない抗生物質の検出能力を有していることに加えて、ＮＱＡＤでは、ＬＯＤ（検出限界）レベル及びＬＯＱ（定量限界）レベルで感度が上昇したことによって、新規抗生物質の同定が可能となった（Ｏｌｓｏｖｓｋａ，Ｋａｍｅｎｉｋ  ＆  Ｃａｊｔｈａｍｌ，２００９）。
【００１８】
屈折率検出器とは異なり、通常の蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）は、グラジエントが可能であり、適切な感度が得られる。しかしながら、ＥＬＳＤの欠点の１つは、検出器の応答が、直線的というよりはむしろ指数関数的であるということである（Ｋｉｍｂａｌｌ，Ａｒｊｏ  ＆  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，２００４）。一次関数を生成するためには、ＥＬＳＤの応答データに対して、データ変換を適用しなくてはならない。Ａｌｌｔｅｃｈ  ８００  ＥＬＳＤ及びＥＬＳＤ３３００などの蒸発光散乱検出器は、データ変換を実施することで、許容可能な正確性、精度（再現性及びアッセイ内精度）、特異性、頑健性、及び安定性に加えて、優れた直線性を示した（Ｃｉｎｔｒｏｎ  ＆  Ｒｉｓｌｅｙ，２０１３）。しかしながら、ＮＱＡＤ検出器の感度は、ＥＬＳＤ８００及びＥＬＳＤ３３００と比較して、さらに５０〜１０倍高く、ＥＬＳＤ８００、ＥＬＳＤ３３００、及びＮＱＡＤの検出限界（ＬＯＤ）はそれぞれ、５０ｇ／ｍＬ、１０ｇ／ｍＬ、及び１ｇ／ｍＬであることが示された。
【００１９】
以下に示されるように、本発明の方法は、組換え糖タンパク質のシアル酸部分の同定及び定量に使用することができる。例えば、遊離したＮ−アセチルノイラミン酸及びＮ−グリコリルノイラミン酸の量及び比は、本発明の方法を使用することで容易に分離及び定量された。他の糖鎖部分（例えば、Ｎ結合型糖鎖、末端ガラクトース、Ｏ結合型糖鎖、及び構成糖分析の対象となる単糖）を同様に、決定及び定量することができる。
【００２０】
組換え糖タンパク質からのグリカン酸部分の遊離
糖鎖部分を標的として糖タンパク質から遊離させるために、任意の適切な方法を使用することができる。典型的には、そのような方法は、決定及び定量を望む糖鎖部分を切断する適切な酵素の選択を含むことになる。そのような酵素は、グリコシダーゼとして知られ、広く知られており、市販されている。例には、限定はされないが、シアリダーゼと、ＰＮＧａｓｅＦと、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、及びエンドグリコシダーゼＦ３と、エンドグリコシダーゼＨと、Ｏ結合型糖鎖を遊離させるためのＯ−グリコシダーゼと、末端ガラクトースを遊離させるためのガラクトシダーゼと、が含まれ、ＰＮＧａｓｅＦは、アスパラギン結合型である複合型、ハイブリッド型、または高マンノース型のオリゴ糖（α（１−３）−フコースのコアを含むものは除く）をすべて切断するものである。
【００２１】
本発明の方法の１つでは、組換え糖タンパク質は、シアル酸を遊離させるために、シアリダーゼで消化される。その後、遊離シアル酸は、凝縮核形成光散乱検出を使用して検出することができる。任意の数の市販シアリダーゼを使用することができる。本発明は、シアリダーゼ−Ａ（商標）（Ｐｒｏｚｙｍｅ）を使用して以下に例示され、シアリダーゼ−Ａは、α（２−３）結合型、α（２−６）結合型、α（２−８）結合型、及びα（２−９）結合型のＮ−アセチルノイラミン酸を複合糖質から遊離させるものである。しかしながら、用途、及び組換え糖タンパク質で検出されることになる特定のシアル酸部分に応じて、他のシアリダーゼを使用することもできる。
【００２２】
組換え糖タンパク質からの遊離した糖鎖の分離
組換え糖タンパク質から糖鎖部分を遊離させた後に、任意選択で、本発明の方法の検出能力の改善において、分離段階を使用することができる。遊離糖鎖部分は、任意の数の手法によって分離することができ、手法には、限定はされないが、サイズ、電荷、疎水性、またはそれらの組み合わせに基づくキャピラリー電気泳動、濾過、及び／またはクロマトグラフィーが含まれる。クロマトグラフィーは、バッチで実施するものであるか、またはカラムで実施するものであり得る。
【００２３】
定量を行う研究室において広く使用される１つの態様では、分離段階は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して実施される。ＨＰＬＣのカラムは、多様な形式、サイズ、及びクロマトグラフィー媒体におけるものが利用可能である。以下に例示されるＨＰＬＣを用いる本発明の実施形態では、遊離シアル酸部分の組換え糖タンパク質からの分離に、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）の段階を使用することができる。しかしながら、分析することになる１つまたは複数の糖鎖部分、及び糖タンパク質に応じて、他の分離段階を開発することができると理解されるべきである。負荷及び溶出の条件には、選択する用途に応じて、さまざまな緩衝液及びグラジエントを利用することができ、そうした条件は、当業者に知られている。
【００２４】
本発明の方法の使用対象となる組換え糖タンパク質
本発明の目的では、組換え糖タンパク質は、組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術などの、それによってタンパク質が翻訳後にグリコシル化される分子生物学的手法によって、タンパク質を産生するように操作された宿主細胞が産生する任意のタンパク質であると定義される。組換え糖タンパク質の糖鎖部分の状態は、決定的な品質特性であり得、治療用途（例えば、哺乳類に対する投与）を意図する組換え糖タンパク質では特にそうである。したがって、本発明の方法は、組換え糖タンパク質である治療タンパク質の製造において特定の有用性が見出されるものである。抗体、融合タンパク質、ホルモン、及びサイトカイン、ならびにそれらの誘導体、変異体、変異タンパク質、断片、多量体、及び複合体がそのようなタンパク質の例であり、以下により詳細にされるが、小数例にすぎない。
【００２５】
本発明の方法によって分析することができる組換え糖タンパク質の非限定例には、下記のタンパク質のうちの１つのすべてまたは一部と同一または実質的に類似のアミノ酸配列を含むタンパク質が含まれる：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ｆｌｔ３リガンド（ＷＯ９４／２８３９１）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、ＩＬ−２、アンジオポエチン−２（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７（５３２２）：５５−６０）、ＮＦカッパーＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ、ＷＯ０１／３６６３７）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、ＷＯ９７／０１６３３）、胸腺間質性リンパ球新生因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、豪州特許第５８８８１９号）、マスト細胞増殖因子、幹細胞増殖因子（米国特許第６，２０４，３６３号）、上皮増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、巨核球増殖分化因子、ＲＡＮＴＥＳ、ヒトフィブリノーゲン様２タンパク質（ＦＧＬ２；ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００６８２；Ｒｕｅｇｇ  ａｎｄ  Ｐｙｔｅｌａ（１９９５），Ｇｅｎｅ１６０：２５７−６２）成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、及びコンセンサスインターフェロンを含むインターフェロン（米国特許第４，６９５，６２３号及び第４，８９７４７１号）、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、シナプトタグミン様タンパク質（ＳＬＰ１〜５）、ニューロトロフィン−３、グルカゴン、インターロイキン、コロニー刺激因子、リンホトキシン−β、白血病抑制因子、ならびにオンコスタチン−Ｍ。本発明に従って分析することができる組換え糖タンパク質の説明は、例えば、Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈのすべての巻（Ａｇｇａｒｗａｌ  ａｎｄ  Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ，ｅｄｓ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，１９９８）、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭｃＫａｙ  ａｎｄ  Ｌｅｉｇｈ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３）、及びＴｈｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｖｏｌｓ．１  ａｎｄ  ２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｏｔｚｅ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，２００３）において見つけることができる。
【００２６】
さらに、本発明の方法は、上述のタンパク質のいずれかを対象とする受容体、そのような受容体もしくは上述のタンパク質のいずれかに対するアンタゴニスト、及び／またはそのような受容体もしくはアンタゴニストと実質的に類似したタンパク質、のアミノ酸配列のすべてまたは一部を含む組換え糖タンパク質から遊離した糖鎖の分析に有用である。こうした受容体及びアンタゴニストには、腫瘍壊死因子受容体の両方の形態（ＴＮＦＲであり、ｐ５５及びｐ７５と称される。米国特許第５，３９５，７６０号及び米国特許第５，６１０，２７９号）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体（Ｉ型及びＩＩ型；欧州特許第第０４６０８４６号、米国特許第４，９６８，６０７号、及び米国特許第５，７６７，０６４号）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（米国特許第６，３３７，０７２号）、ＩＬ−１アンタゴニストまたはＩＬ−１阻害剤（米国特許第５，９８１，７１３号、第６，０９６，７２８号、及び第５，０７５，２２２号）、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体（欧州特許第０３６７５６６号、及び米国特許第５，８５６，２９６号）、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１７受容体、ＩＬ−１８受容体、Ｆｃ受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Ｍ及び白血病抑制因子の受容体、ＮＦカッパーＢ活性化受容体（ＲＡＮＫ、ＷＯ０１／３６６３７及び米国特許第６，２７１，３４９号）、オステオプロテジェリン（米国特許第６，０１５，９３８号）、ＴＲＡＩＬの受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＴＲＡＩＬ受容体３、及びＴＲＡＩＬ受容体４を含む）、ならびにＦａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）などのデスドメインを含む受容体が含まれる。
【００２７】
本発明を使用して分析することができる他の組換え糖タンパク質には、分化抗原（ＣＤタンパク質と称される）もしくはそのリガンド、またはこうしたものいずれかと実質的に類似したタンパク質、のアミノ酸配列のすべてまたは一部を含むタンパク質が含まれる。そのような抗原は、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＶＩｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋｉｋｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ，１９９６）において開示されている。類似のＣＤタンパク質は、後続の研究集会において開示されている。そのような抗原の例には、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０、及びそれらに対するリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド等）が含まれる。
【００２８】
本発明の方法は、融合タンパク質である組換え糖タンパク質のシアル酸部分の分析に特に適応する。融合タンパク質は、別のタンパク質またはタンパク質ドメインに融合した上述のタンパク質のいずれかのすべてまたは一部を含み得る。特に有用な融合タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質である。そのような融合タンパク質の多くが市販されているか、または開発中である。本発明の方法を使用して分析することができる融合タンパク質の例には、限定はされないが、エタネルセプト、アフリベルセプト、リロナセプト、ベラタセプト、アバタセプト、及びアレファセプトが含まれる。
【００２９】
本発明を使用することで、酵素的に活性な組換え糖タンパク質またはそのリガンドも分析することができる。例には、下記のタンパク質もしくはそれらのリガンドのうちの１つ、またはこうしたもののうちの１つに実質的に類似したタンパク質、のすべてまたは一部を含むタンパク質が含まれる：ＴＮＦ−アルファ変換酵素を含む、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメインファミリーのメンバー、さまざまなキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、アルファ１アンチトリプシン、上述の酵素のいずれかのリガンド、ならびに多数の他の酵素及びそれらのリガンド。
【００３０】
本発明の方法を使用することで、抗体である組換えタンパク質も分析することができる。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプもしくはサブクラスの免疫グロブリンを指すか、または未変化の抗体と特異的結合で競合するその抗原結合領域を指し、別段の特定がない限り、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及びそのオリゴマーまたは抗原結合断片が含まれる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、Ｆｄ、ｄＡｂ、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）、単鎖抗体分子、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、及び標的ポリペプチドに対して特定抗原への結合性を付与するために十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドなどの、抗原結合断片または抗原結合領域を有するタンパク質も含まれる。「抗体」という用語は、限定はされないが、抗体を発現するように遺伝子導入された宿主細胞から単離された抗体などの、組換え手段によって調製、発現、創出、または単離されたものを含む。
【００３１】
抗体の例には、限定はされないが、上述のタンパク質及び／または下記の抗原を含むタンパク質のいずれか１つまたは組み合わせを認識するものが含まれるが、限定はされない：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２  ｐ３５サブユニット、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２３  ｐ１９サブユニット、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３が共有するｐ４０サブユニット、ＩＬ−２受容体サブユニット、ＩＬ−４受容体サブユニット、ＩＬ−６受容体サブユニット、ＩＬ−１３受容体サブユニット、ＩＬ−１７受容体サブユニット、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＦＧＬ２、ＰＤＧＦ−β及びその類似体（米国特許第５，２７２，０６４号及び第５，１４９，７９２号を参照のこと）、Ｂ７ＲＰ−１、Ｂ７ＲＰ−２、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ｃ−ｆｍｓ、ＥＧＦ受容体（米国特許第６，２３５，８８３号を参照のこと）、ＣＧＲＰ受容体、ＶＥＧＦ受容体、肝細胞増殖因子、プロタンパク質転換酵素サブチリシン・ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、ＦＧＦ２１、破骨細胞分化抑制因子リガンド、インターフェロンガンマ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｂリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳであり、ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ、ＴＡＬＬ−１、及びｚＴＮＦ４としても知られる。Ｄｏ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ−Ｋｉａｎｇ（２００２），Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．１３（１）：１９−２５を参照のこと）、ＢＡＦＦ受容体、ＢＣＭＡ、エイプリル（Ａｐｒｉｌ）、ＳＴ２、補体第５成分、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺癌と関連して発現する遺伝子産物）、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２、ＳＫ−１抗原、結腸癌及び／または膵癌を有する患者の血清において存在レベルが上昇する腫瘍関連エピトープ、乳房、結腸、扁平細胞、前立腺、膵臓、肺、及び／または腎臓の癌細胞及び／またはメラノーマ、神経膠腫、もしくは神経芽細胞腫の細胞に発現する癌関連のエピトープまたはタンパク質、腫瘍の壊死性コア、インテグリンアルファ４ベータ７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、ＴＳＬＰ、ＩＦＮγ、ＴＲＡＩＬ受容体１、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＴＲＡＩＬ受容体３、及びＴＲＡＩＬ受容体４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、アンジオポエチン１（Ａｎｇ１）、アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）、ロイコインテグリンアドヘシン（ｌｅｕｋｏｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｄｈｅｓｉｎ）、血小板糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、心筋ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（第ＶＩＩａ因子−組織因子の阻害剤）、ＭＨＣ  Ｉ、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリ���パ球関連抗原）、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤＬ−１）、プログラム細胞死リガンド２（ＰＤＬ−２）、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ３）、Ｆｃ−γ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ１０ベータ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、スクレロスチン、Ｌ−セレクチン、呼吸器多核体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、ならびにＳｔａｐｈｌｙｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ。本発明の方法を使用して分析することができる既知の抗体の特定例には、限定はされないが、アダリムマブ、アリロクマブ、ベバシズマブ、インフリキシマブ、アブシキシマブ、アレムツズマブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、コナツムマブ（ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、デノスマブ、デュピルマブ、エクリズマブ、ゲムツズマブ、グセルクマブ（ｇｕｓｅｌｋｕｍａｂ）、オゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブ、イキセキズマブ、イピリムマブ、チウキセタン、ラベツズマブ、レブリキズマブ、マパツズマブ、マブリリムマブ（ｍａｖｒｉｌｉｍｕｍａｂ）、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ニボルマブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ペルツズマブ、ペムブロリズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、ロモソズマブ、ロベリズマブ（ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）、リロツムマブ、チルドラキズマブ（ｔｉｌｄｒａｋｉｚｕｍａｂ）、トシリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ（ｔｒａｌｏｋｉｎｕｍａｂ）、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ウステキヌマブ、ベドリゾマブ（ｖｅｄｏｌｉｚｏｍａｂ）、ザルツムマブ、及びザノリムマブが含まれる。
【００３２】
本発明による糖タンパク質であるサイトカインの例には、限定はされないが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２  ｐ３５サブユニット、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７（限定はされないが、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、及びＩＬ−１７Ｅ（ＩＬ−２５としても知られる）の単量体、ホモ２量体、及びヘテロ２量体が含まれる）、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２３  ｐ１９サブユニット、ならびにＩＬ−１２／ＩＬ−２３が共有するｐ４０サブユニットが含まれる。
【００３３】
本発明について記載したが、下記の実施例は、例示として提供されるものであり、限定ではない。
【実施例】
【００３４】
略語
ＡＣＮ：            アセトニトリル
ＡＥＸ：            陰イオン交換クロマトグラフィー
ＣＡＤ：            荷電化粒子検出器
ＣＥＸ：            陽イオン交換クロマトグラフィー
ＣＮＬＳＤ：        凝縮核形成光散乱検出
ＤＭＢ：            １，２−ジアミノ−４，５−メチレンジオキシベンゼン
ＥＬＳＤ：          蒸発光散乱検出器
ＨＩＣ：            疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＨＩＬＩＣ：        親水性相互作用クロマトグラフィー
ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ：陰イオン交換クロマトグラフィー及びパルスアンペロメトリック電気化学検出
ＬＬＯＤ：          検出下限
ＬＯＤ：            検出限界
ＬＯＱ：            定量限界
ＮＡＮＡ：          Ｎ−アセチルノイラミン酸
Ｎｅｕ５Ａｃ        Ｎ−アセチルノイラミン酸
ＮＧＮＡ：          Ｎ−グリコリルノイラミン酸
ＮＱＡＤ：          ナノ量分析物検出器
ＰＡＤ：            パルスアンペロメトリック電気化学検出器
ＲＰ−ＨＰＬＣ：    逆相高速液体クロマトグラフィー
ＴＦＡ：            トリフルオロ酢酸
ＷＣＰＣ：          水分凝縮粒子計数
ＬＣＭＳ：          液体クロマトグラフィー−質量分析
【００３５】
方法及び材料
ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラム（５０Ｘ４．０ｍｍ、５μ）及び（１００Ｘ２．１ｍｍ、５μ）は、ＰｏｌｙＬＣから購入した。ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８カラム（４．６Ｘ２５０ｍｍ、５μ）及びＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱ分析カラム（２．０Ｘ１５０ｍｍ、３μ）は、Ｗａｔｅｒｓから購入した。Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８カラム（４．６Ｘ１００ｍｍ、２．６μ）、及び混合様式（サイズ排除／イオンクロマトグラフィー）ｓｕｇａｒカラム（８．０ｘ３００ｍｍ、６μ）はそれぞれ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ及びＳｈｏｄｅｘから購入した。陰イオン交換カラム及び陽イオン交換カラム（４．６Ｘ１５０ｍｍ、３μ）は、Ｓｅｐａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム、硫酸水素テトラデシルトリメチルアンモニウム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ｔｅｔｒａｄｅｃｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、ＮＡＮＡ，及びＮＧＮＡは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。シアリダーゼ−Ａは、Ｐｒｏｚｙｍｅから購入した。ＨＰＬＣ用のオートサンプラーバイアル、はめ込みガラス、及びバイアルキャップは、Ａｇｉｌｅｎｔから購入した。Ｎ結合型及びＯ結合型のシアル酸（ＮＡＮＡ）を含む、社内の２つの糖タンパク質（糖タンパク質Ａ及び糖タンパク質Ｂ）は、試験のモデルタンパク質として使用した。
【００３６】
実施例１
１．さまざまな化学を使用したＨＰＬＣカラムの初回スクリーニング
適切なカラムを選択することは、どのようなＨＰＬＣ法を開発するにしても非常に重要な部分である。したがって、複数のカラム化学の徹底評価を実施した。シアル酸を保持して定量するために、Ｘ−ｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８カラム、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱ  Ｃ１８カラム、及びＫｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８カラムを含む、さまざまなＲＰ−ＨＰＬＣカラムを、酸性（０．１％のＴＦＡ及び０．１％のＴＦＡ／ＡＣＮをそれぞれ、移動相Ａ及び移動相Ｂとして使用）及び中性（ｐＨ７．０の５０ｍＭのリン酸緩衝液及びＡＣＮをそれぞれ、初期移動相及び溶出移動相として使用）の移動相条件下で評価した。初期移動相としてｐＨ４．４の１０ｍＭのトリエチルアミンリン酸塩、及び溶出移動相としてアセトニトリルを使用し、中間のｐＨでも評価を実施した。すべての場合において、最初の５分間は、Ｂを５％として、グラジエントをアイソクラティックに維持し、その後、Ｂが９５％に到達するまで、１分当たり４％の増加となるように直線グラジエントを適用した。すべての場合において、流速は１ｍＬ／分とした。
【００３７】
適切なイオン対試薬を存在させてＲＰ−ＨＰＬＣ分析を実施することで、シアル酸のような、電荷を有する分析物の保持を増加させることができるため（Ｓｈａｒｍａ，Ｇｌｉｃｋ，＆  Ｖｏｕｒｏｓ，２０１２）、陽性電荷を有する陽イオン性のイオン対試薬、または陰性荷電を有する陰イオン性のイオン対物質のいずれかを、最終濃度を５ｍＭとして移動相に添加することによって、イオン対クロマトグラフィーの探索も実施した。１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム溶液を陽イオン性のイオン対試薬（Ｃａｌｈｏｕｎ  ＆  Ｋｉｎｇ．２００７）として使用し、硫酸水素テトラデシルトリメチルアンモニウムを陰イオン性のイオン対試薬（Ｒｅｍｓｂｕｒｇ，２００７）として使用した。イオン対クロマトグラフィーの分析は、Ｘ−ｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８カラムで実施し、５ｍＭのイオン対試薬を含む０．１％のＴＦＡを移動相Ａとして、５ｍＭのイオン対試薬を含む０．１％のＴＦＡ／ＡＣＮを溶出移動相Ｂとして使用した。すべての場合において、Ｂを５％から９５％とする直線グラジエントを、２０分の過程にわたって適用した。Ｉｓａｋａｕ，Ｒｏｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎｇｅｌ（２００９）によって説明されるように、Ｓｈｏｄｅｘから入手した混合様式のサイズ排除／イオンクロマトグラフィー（ＳＥＣ／ＩＥＸ）ｓｕｇａｒカラムは、５０％のメタノールを移動相として使用し、流速１ｍＬ／分のアイソクラティック様式で評価した。そのようなＳＥＣ／ＩＥＸクロマトグラフィーは、分離カラムへと単一試料を注入した後の、陰イオン及び陽イオンの同時決定に有用な手法として認識されている（Ｍｏｒｉ，Ｔａｏｄａ，Ｉｔａｂａｓｈｉ，Ｉｋｅｄｏ，＆  Ｔａｎａｋａ，２００６）。シアル酸（ＮＡＮＡ）標準物質は、濃度を１ｍｇ／ｍＬとしたものを０．０１５６ｍｇ／ｍＬまで段階希釈し、そこからそれぞれの標準物質１００μｌを注入した。
【００３８】
ＮＱＡＤ検出器は、高塩濃度では使用できないため、塩によるグラジエントの代わりに、ｐＨによるグラジエントを使用して、ＡＥＸカラム及びＣＥＸカラムを評価した。イオン交換クロマトグラフィーは、Ｓｅｐａｘから入手した陽イオンカラム及び陰イオンカラムを使用して、ｐＨグラジエント下で実施した。シアル酸（ＮＡＮＡ）のｐＫａ（２．６）は既知であるため、陰イオン交換クロマトグラフィーには、１０ｍＭのグリシン／ＨＣｌを使用して、ｐＨ２．２から開始し、ｐＨ３．６で終了するｐＨの直線グラジエントを適用し、陽イオン交換クロマトグラフィーには、１０ｍＭのグリシン／ＨＣｌを使用して、ｐＨ３．６からｐＨ２．２までの直線グラジエントを適用した。分析はすべて、ＱＵＡＮＴ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＮＱＡＤを備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００またはＡｇｉｌｅｎｔ１２００のシステムで実施した。
【００３９】
結果：
さまざまな分離手法の評価結果から、ＲＰ−ＨＰＬＣ、イオン対クロマトグラフィー、混合様式のサイズ排除／イオンクロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィー（ｐＨグラジエント様式で実施）などのクロマトグラフィー手法は、非誘導化シアル酸の定量に適していないことが示唆された。ＲＰ−ＨＰＬＣカラムの評価から得られた結果から、酸性、中性、または中間のｐＨ条件下で、高極性のシアル酸を保持させることは不可能であることが示唆された。シアル酸には、極性基（カルボニル、オキシ、カルボキシル、アミン、及び複数のヒドロキシル）が高度に濃縮されていることから、シアル酸のＲＰ−ＨＰＬＣカラムへの結合は抑制されるため、観測された現象は予想外のものではなかった。高疎水性の蛍光標識を有するシアル酸をＲＰ−ＨＰＬＣカラムで保持することは容易であるものの（Ｚａｕｎｅｒ，Ｄｅｅｌｄｅｒ  ＆  Ｗｕｈｒｅｒ，２０１１）、高極性の非誘導化シアル酸をＲＰ−ＨＰＬＣカラムで保持することは困難である。イオン対試薬を活用してシアル酸の疎水性を増加させる試みは成功しなかった。シアル酸のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を、陽イオン性及び陰イオン性のイオン対試薬を存在させて実施したが、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに対する非誘導化シアル酸の保持改善には至らなかった。試みた手法は、理論上はうまくいくはずであったものの、製造者が推奨する５ｍＭというイオン対試薬量では、適切に結合させるには不十分であり得たという事実から、負の結果がもたらされた可能性がある。公開文献に基づくと、シアル酸のような高極性分子では、イオン対試薬の量は、かなり多くあるべきである。例えば、逆相イオン対クロマトグラフィーを使用して、生体液中のシアル酸を決定するために使用された、イオン対試薬であるトリイソプロパノールアミンの水溶液は、６０ｍＭであった（Ｓｉｓｋｏｓ  ＆  Ｓｐｙｒｉｄｋ，１９９９）。イオン対試薬の量を増やすことで、探索を実施し得る。
【００４０】
混合様式のサイズ排除／イオンクロマトグラフィーｓｕｇａｒカラム（寸法８ｘ３００ｍｍ）の評価結果から、意図する用途には、方法の感度が不十分であることが示された。シアル酸標準物質の濃度が１ｍｇ／ｍＬ以下では、このカラムに１００μｌを注入しても全くピークが出現しなかった。方法の検出限界値は、所望の範囲（０．０１５〜１．０ｍｇ／ｍＬ）未満であるため、この方法を追求してさらに最適化することはしなかった。同一カラムで寸法を小さくすれば、方法の感度改善につながる可能性はある。しかしながら、寸法が小さいカラムを入手することは今のところ不可能である。上述の分析のいずれから得られたクロマトグラムも非掲載である。これは、それらのいずれにおいても、注入ピーク以外にピークが全く出現しなかったためである。
【００４１】
ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸ、ポリスルホエチルアスパルタミド（ＰｏｌｙＳｕｌｆｏｅｔｈｙｌ  ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ）、及びポリヒドロキシエチルアスパルタミド（ＰｏｌｙＨｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ）などの、官能基を有するポリコハク酸イミド誘導体の重合体構造を含む固定相は、さまざまな高極性化合物の分離に広く使用されるため、より適したものである（Ｉｋｅｇａｍｉ，Ｔｏｍｏｍａｔｓｕ，Ｔａｋｕｂｏ，Ｈｏｒｉｅ，＆  Ｔａｎａｋａ，２００８）。
【００４２】
実施例２
２．ＮＡＮＡとＮＧＮＡとの分離を目的とするＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムの評価
この評価では、両形態のシアル酸を含むタンパク質のＮＡＮＡとＮＧＮＡとを分離して定量するために、ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムを使用することの評価を実施することとした。ＲＰ−ＨＰＬＣ法は、高疎水性の蛍光標識を有するシアル酸の保持には適しているものの（Ｚａｕｎｅｒ，Ｄｅｅｌｄｅｒ  ＆  Ｗｕｈｒｅｒ，２０１１）、高極性の非誘導化シアル酸は、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムで保持することは困難である。したがって、ＨＩＬＩＣクロマトグラフィーの探索を実施した。ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸ、ポリスルホエチルアスパルタミド（ＰｏｌｙＳｕｌｆｏｅｔｈｙｌ  ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ）、及びポリヒドロキシエチルアスパルタミド（ＰｏｌｙＨｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ）などの、官能基を有するポリコハク酸イミド誘導体の重合体構造を含む固定相は、さまざまな高極性化合物の分離に使用されている（Ｉｋｅｇａｍｉ，Ｔｏｍｏｍａｔｓｕ，Ｔａｋｕｂｏ，Ｈｏｒｉｅ，＆  Ｔａｎａｋａ，２００８）。ＰｏｌｙＬＣから入手したＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラム（１００Ｘ２．１ｍｍ、３μ）を、アセトニトリルにｐＨ４．４の１０ｍＭのトリエチルアミンリン酸塩を含む移動相（８０：２０  ｖ／ｖ）を使用して、アイソクラティック条件下で評価した。１ｍｇ／ｍＬのＮＡＮＡ及びＮＧＮＡの標準物質を、最初に水で１：１０として希釈した後、２つの標準物質を１：１の比で混合してから１０μＬを注入した。ＮＡＮＡとＮＧＮＡとの混合物の注入の後に、ＮＡＮＡ及びＮＧＮＡの標準物質もそれぞれ個別に５μＬ注入した。以下に示すＮＱＡＤ設定を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００システムで分析を実施した。
ＮＱＡＤパラメーター
【表１】
2020187128.tif 000003
【００４３】
結果：
図１に示されるように、アイソクラティック条件下、ｐＨ４．４の１０ｍＭのトリエチルアミンリン酸塩を含むアセトニトリルを使用して、ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムで実施した分析では、ＮＡＮＡとＮＧＮＡとが良好に分離した。ピークの帰属は、ＮＡＮＡ及びＮＧＮＡを個別に注入することによって実施した。しかしながら、持ち越し汚染の度合いが非常に激しく（データ未掲載）、仮にＮＡＮＡに続いてＮＧＮＡを注入したのであれば、微量レベルのＮＡＮＡを含まない、きれいなＮＧＮＡのクロマトグラムを得ることが我々はできず、これは、逆も同様であった。分析ごとにばらつきが生じる持ち越し汚染の問題は、アイソクラティック法に固有のものであり、この問題によって、我々はこの方法を断念した。カラム洗浄プロコールを開発して適応させることで、持ち越し汚染の問題を解決することはできるものの、定量結果の正確性に影響を及ぼし得るものである。
【００４４】
実施例３
３．ＮＡＮＡとＮＧＮＡとの分離のためのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸ法の最適化
異なる移動相条件下での、５ｃｍ及び１０ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムの評価結果をセクション３．１〜３．４に示す。エバポレーター温度の評価結果は、セクション３．５に示す。
【００４５】
３．１  クロマトグラフィーの最適化
この実施例では、我々は、異なる移動相条件、及びＮＱＡＤのエバポレーターのさまざまな温度設定の下で、ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムの評価及び最適化を実施した。ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムは、非誘導化シアル酸の保持に関して、他のカラム化学よりも優れていたため、持ち越し汚染が生じることなく、ＮＡＮＡとＮＧＮＡとを可能な限り最良の形で分離することを達成目的とし、さらなる最適化に向けて、ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムを選択した。このセクション（セクション３．１）では、方法のクロマトグラフィーの最適化について詳細に記載するが、セクション３．２では、ＮＱＡＤのエバポレーター温度の最適化に使用する条件について記載する。評価した異なるクロマトグラフィー条件を以下に記載する。
・１０ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸカラムを用い、１００％のＡＣＮ及び１０％のギ酸を移動相として使用
・１０ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸカラムを用い、１００％のＡＣＮ及び０．１％のＴＦＡを移動相として使用
・５ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸカラムを用い、１００％のＡＣＮ及び１０％のギ酸を移動相として使用
・１０ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸを用い、ＡＣＮ及び２０％のギ酸を移動相として使用
【００４６】
ＡＣＮを初期移動相として使用し、１０ｃｍまたは５ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムを評価した。溶出移動相には、上に記載のように、ギ酸または０．１％のＴＦＡのいずれかを使用した。１ｍｇ／ｍＬのＮＡＮＡ標準物質を、水で１：１０として希釈し、０、２、４、６、８、及び１０μＬの注入を実施した。それに加えて、ＮＡＮＡ及びＮＧＮＡの標準物質を注入して（セクション２に記載のものと同一の試料調製）、方法の、ＮＡＮＡとＮＧＮＡとの分離能力を評価した。分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００システムで実施した。ＮＱＡＤパラメーターは、セクション２に記載のものと同一である。グラジエントの初期組成に使用するＢを０％〜３５％の範囲で変更することによって、複数の実験を実施した。すべての場合において、初期のＢ％は、１分間一定に保持し、その後、Ｂが９５％に到達するまで、１５分間の直線グラジエントを適用した。カラム温度は環境温度に保ち、流速は０．５ｍＬ／分で維持した。
【００４７】
結果：
評価したさまざまな初期グラジエント組成の中で、２０％の初期グラジエント組成が、ＮＡＮＡとＮＧＮＡとの分離に関して、僅かに優れているように思われる。初期グラジエント組成を１５％、２０％、及び２５％として、１０ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラム（１００％のアセトニトリル及び１０％のギ酸を移動相Ａ及び移動相Ｂとして使用）を使用してＮＡＮＡとＮＧＮＡとを分離した代表的なクロマトグラムをそれぞれ、図４、図５、及び図６に示す。
【００４８】
アイソクラティック分析（セクション１）において、以前に持ち越し汚染の問題に直面したのとは異なり、評価したいずれのグラジエント条件下においてもそのような持ち越し汚染は観測されなかった。１００％のアセトニトリル及び０．１％のトリフルオロ酢酸を移動相Ａ及び移動相Ｂとして使用して、１０ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムを評価すると、ベースラインノイズ及びピーク対称性は、望ましいものには及ばなかった。１００％のアセトニトリル及び１０％のギ酸を移動相Ａ及び移動相Ｂとして使用して、５ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムを評価した結果では、ＮＡＮＡとＮＧＮＡとの分離（図７）は、同一分析条件下で、１０ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムで達成した分離（図５）ほどは良好ではなかった。１００％のアセトニトリル及び２０％のギ酸を移動相Ａ及び移動相Ｂとして使用して、１０ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムの評価したところ、ピークの鋭さが増し、ＮＡＮＡとＮＧＮＡとの分離が僅かに良くなるという点に関して、移動相Ｂとして２０％のギ酸を使用する方が、１０％のギ酸と比較して、勝っていることが示された（図２Ａと図５との比較）。図２Ｂは、ＮＡＮＡ及びＮＧＮＡを個別に注入したクロマトグラム、ならびにそれらの混合物を注入したクロマトグラムを示す。複数濃度のＮＡＮＡ標準物質のクロマトグラムを重ね合わせて試験したところ、持ち越し汚染の問題が生じることはなかった。
【００４９】
３．２  ＮＱＡＤのエバポレーター温度の最適化
シアル酸の揮発度を最小にとどめながら、溶出液からの溶媒蒸発を最大化して、ノイズ対シグナル比の最適化を達成するために、エバポレーター温度（ＮＱＡＤの最も決定的なパラメーター）を最適化した。他の温度設定（ネブライザー温度、光学温度、凝縮核成長温度、及びコンディショナー温度）は一定であり、変わり得ないものである。エバポレーターの温度設定は、３５〜６０℃（３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、及び６０℃）の間で変更して、ノイズに対して最良シグナルを達成し得る最適なエバポレーター温度を決定した。１００％のＡＣＮ及び２０％のギ酸をそれぞれ、移動相Ａ及び移動相Ｂとして用いて、ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラム（５０Ｘ４ｍｍ、５μ）を使用して評価を実施した。エバポレーター温度を除いて、ＮＱＡＤパラメーターはすべて、実施例２に記載のものと同一とした。初期の移動相組成におけるＢを１分間２０％に維持し、その後、グラジエントを適用した。Ｂが１０分間で９５％に到達するように、Ｂを直線的に１分当たり８．３％増加させた。カラム温度は環境温度に保ち、カラム流速は１．０ｍｌ／分で維持した。
【００５０】
結果：
シグナル強度ならびにベースライノイズは、エバポレーター温度の度合いに直接的に比例するものであった。ノイズに対するシグナルの最適比を達成したエバポレーター温度は、４０℃であった。
【００５１】
実施例４
４．ＮＡＮＡの定量のための短いＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラム
ＮＧＮＡが存在しない試料におけるＮＡＮＡを定量するために、短い（５０Ｘ４．６ｍｍ、３μｍ）ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムを評価した。カラム寿命を増加させるために、２０％のギ酸の代わりに、より低いパーセントのギ酸を溶出移動相として使用した。より低いパーセントのギ酸の溶出強度は、高極性のシアル酸をＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムから溶出するには十分ではないため、新規のグラジエント手法で評価を実施した。この手法では、溶出移動相のアイソクラティック環境において、結合シアル酸が溶出するように、移動相グラジエントを初期移動相から溶出移動相へと、注入実施後すぐに切り替えた。最適な移動相組成及び流速、ならびに最良のグラジエントを決定するために評価を実施した。ＰＮＧａｓｅＦによって遊離したＮＡＮＡを、濾過前及び濾過後にＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ分析に供して、濾過の必要性を決定した。詳細な評価パラメーターをセクション４．１〜４．４に記載する。
【００５２】
より低いパーセントのギ酸を溶出移動相として、短いＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラム（５０Ｘ４．６ｍｍ、３μｍ）を評価した結果は、注入実施後すぐに、初期移動相条件から溶出移動相条件への切り替えが生じる限り、ＮＡＮＡの定量に適した結果である。このグラジエント条件下では、溶出移動相のアイソクラティック環境において、シアル酸（ＮＡＮＡ）の溶出が起きるため、安定したベースライン及び適切なピーク対称性が達成される。異なる溶出移動相、異なるグラジエント条件、及び異なる流速の分析結果が、セクション４．１〜４．３に示され、この分析結果から、グラジエント２を用いて、流速１．５ｍＬ／分で１％のギ酸を使用することで最良の結果が達成されることが示された。セクション４．３に示す結果から、ＰＮＧａｓｅＦ処理後の試料の濾過は必須ではないことが示された。シアル酸（ＮＡＮＡ）標準物質と、ＰＮＧａｓｅＦによって糖タンパク質から遊離したシアル酸（ＮＡＮＡ）と、の最適条件を使用した代表的なクロマトグラムがそれぞれ、図３Ａ及び図３Ｂに示される。ＮＡＮＡ標準物質の代表的な直線回帰プロットが、図８に示される。
【００５３】
４．１  ０．５％のギ酸と、１．０％のギ酸との比較評価
この一組の実験には、初期移動相として１００％のアセトニトリルを使用したが、溶出移動相として０．５％または１．０％のギ酸を使用した。エバポレーター温度を除いて、ＮＱＡＤパラメーターはすべて、セクション２に記載のものと同一とした。４０℃の最適化エバポレーター温度を適用した。注入の１分後に、移動相Ａ（１００％のＡＣＮ）から移動相Ｂ（１．０％のギ酸）へのグラジエント切り替えを迅速に実施した。グラジエント切り替えの後、１．０％のギ酸でアイソクラティック条件を１０分間維持した。カラム温度は環境温度に保ち、流速は１．０ｍｌ／分で維持した。
【００５４】
結果：
２つの溶出移動相（溶出移動相として０．５％及び１％のギ酸を使用）のクロマトグラムを積み重ねることによって、０．５％のギ酸と比較して、１％のギ酸で得られたクロマトグラムにおいて、より良好なピーク対称性が示された。したがって、０．５％と比較して１％のギ酸の方を選択した。
【００５５】
４．２  グラジエント１及びグラジエント２の評価
ＨＰＬＣのグラジエントを除いて、パラメーターはすべて、セクション４．１に記載のものと同一とした。１００％のＡＣＮ及び１．０％のギ酸をそれぞれ、移動相Ａ及び移動相Ｂとして使用した。１００％のＡＣＮから１．０％のギ酸へのグラジエント切り替えは、グラジエント２では１．０分以内に迅速に実施したが、グラジエント１では、グラジエント切り替えにかける時間を１．０分から０．１分へと短くした。
【００５６】
結果：
グラジエント１（０．１分で実施する、初期移動相から溶出移動相への迅速なグラジエント切り替え）から得られたクロマトグラムと、グラジエント２（１．０分で実施する、初期移動相から溶出移動相へのグラジエント切り替え）とは、お互いにあまり違いはなかった。しかしながら、保持時間が長いグラジエント２を選択した。これは、シアル酸と、システム適合性標準物質（Ｌ−グルタミン酸及びＬ−アスパラギン酸の溶出）と、の分離が、グラジエント２の方が良好なためである。
【００５７】
４．３  異なる流速の評価
１００％のアセトニトリル及び１．０％のギ酸をそれぞれ、移動相Ａ及び移動相Ｂとして使用し、セクション４．２に記載のＨＰＬＣグラジエント２を複数の流速（１．０、１．２、及び１．５ｍＬ／分）で適用した。ＮＱＡＤパラメーターはすべて、セクション４．１に記載のものと同一とした。
【００５８】
結果：
異なる流速で分析を実施することによって、１．５ｍＬ／分の流速で最良のピーク対称性が達成されることが示された。
【００５９】
４．４  濾過した試料消化物と、未濾過の試料消化物との比較評価
シアリダーゼで消化した試料を、セントリコン（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）での濾過を実施または実施せずに、注入した。セントリコンでの濾過は、妨害性のタンパク質及び他の基質成分からシアル酸（ＮＡＮＡ）を分離して取り出すことを意図したものである。分析では、以下に示す、最適化したＨＰＬＣグラジエント及びＮＱＡＤ設定を使用し、５ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムで実施した。１００％のアセトニトリル及び１．０％のギ酸をそれぞれ、移動相Ａ及び移動相Ｂとして使用した。
【表２】
2020187128.tif 000004
【表３】
2020187128.tif 000005
【００６０】
Ｓｉｇｍａから入手した凍結乾燥されたＮＡＮＡ標準物質から、２０μｌの注入当たり１〜３２ｎｍｏｌの範囲となるようにＮＡＮＡ標準物質を調製した。システム適合性標準物質を試験した。これは、機器、電子機器、分析操作、及び分析することになる試料からなる統合システムの性能妥当性を確保するためには分析手順が多く存在し、それらの中で、当該試験が不可欠な部分であるためである。各分析実施の際は、システム適合性混合物の２０μｌ注入を含めて実施した。当該混合物は、各１．０ｍｇ／ｍＬのＬ−グルタミン酸及びＬ−アスパラギン酸からなるものである。
【００６１】
結果：
クロマトグラフィーのプロファイル、ならびにＮＡＮＡのピーク応答は、濾過した試料と、未濾過の試料とで同等であった。残存するタンパク質及び他の基質成分によって、ＮＡＮＡの定量が妨害されないことが明らかであるため、分析において効率向上を達成するために、時間を要する濾過という選択肢は省くことができる。
【００６２】
実施例５
５．ＨＰＬＣ／ＨＱＡＤ法と、他のオルトゴナル法との同等性の比較評価
セクション４．２に記載のグラジエント２を使用して、流速１．５ｍＬ／分で実施する、短いカラムを使用したＨＰＬＣ法と、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法及びＨＰＬＣ／ＤＭＢ法と、を比較することで、ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法から得られる結果とどの程度良好に相関するかを決定した。
【００６３】
５．１  ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ分析、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析、及びＨＰＬＣ／ＤＭＢ分析のための試料調製：
本比較試験のために、糖タンパク質からＮＡＮＡを遊離させるために、方法特異的な手法を使用した。ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ及びＨＰＡＥＣ−ＰＡＤに使用した酵素消化条件はそれぞれ、セクション５．１．１及びセクション５．１．２に記載される。ＨＰＬＣ／ＤＭＢ法向けに実施した酸加水分解、及びその後のＤＭＢ誘導化は、セクション５．１．３に記載される。注入当たりのＮＡＮＡのピコモルを決定する計算段階は、下記に示すとおりである。
【表４】
2020187128.tif 000006
【００６４】
注入当たりのタンパク質のピコモル、ならびにＮＡＮＡのピコモル／タンパク質のピコモルを決定するために使用する式は、セクション５．１．１〜５．１．３に示されるとおりである。
【００６５】
５．１．１  ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法のための、シアリダーゼ−Ａでの試料の消化
酵素消化のために、５．０ｍｇ／ｍＬの試料１０μｌ（５０μｇ）と、１２μｌのシアリダーゼ−Ａ（Ｐｒｏｚｙｍｅ）及び４μｌの５Ｘ反応緩衝液及び４μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水と、を混合して実施した。３７℃±３℃の水浴中で試料を４時間±１５分インキュベートした。この条件は、反応時間過程を通して最適な消化条件として確立されたものである。インキュベーションの終了時点で、３０μｌの水を添加して、全体積を６０μｌとした。ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法のための、注入当たりのタンパク質のピコモルの計算には、下記の式を使用した。
５．０ｍｇ／ｍＬ＊１０μＬ＊（１μｍｏｌ／μｇでのＭＷ）＊（１０６ピコｍｏｌ／μｍｏｌ）＊（１／６０μＬ）＊２０μＬ
式中、５．０ｍｇ／ｍＬは、試料濃度であり、ＭＷは、タンパク質の分子量、６０μＬは、試料の最終体積、及び２０μＬは、注入体積である。
【００６６】
ＮＡＮＡのピコモル／タンパク質のピコモルは、セクション５．１に示される式に基づいて計算されるＮＡＮＡのピコモル／注入を、セクション５．１．１から計算されるＸ１ピコモル／注入で割ることによって決定される。
【００６７】
５．１．２  ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法のための、シアリダーゼ−Ａでの試料の消化
糖タンパク質試料からシアル酸を遊離させるために、１．０ｍｇ／ｍＬの試料１０μｌと、２μｌのシアリダーゼ−Ａ（Ｐｒｏｚｙｍｅ）及び４μｌの５Ｘ反応緩衝液及び４μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水と、を混合した。３７℃±２℃の水浴中で試料を４時間±１５分インキュベートした。この条件は、反応時間過程を通して最適な消化条件として確立されたものである。インキュベーションの終了時点で、７８０μｌの水を添加して、全体積を８００μｌとした。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法のための、注入当たりのタンパク質のピコモルの計算には、下記の式を使用した。
１．０ｍｇ／ｍＬ＊１０μＬ＊（１μｍｏｌ／μｇでのＭＷ）＊（１０６ピコｍｏｌ／μｍｏｌ）＊（１／８００μＬ）＊２０μＬ
式中、１．０ｍｇ／ｍＬは、試料濃度であり、ＭＷは、タンパク質の分子量、８００μＬは、試料の最終体積、及び２０μＬは、注入体積である。
ＮＡＮＡのピコモル／タンパク質のピコモルは、セクション５．１に示される式に基づいて計算されるＮＡＮＡのピコモル／注入を、セクション５．１．２から計算されるＸ２ピコモル／注入で割ることによって決定される。
【００６８】
５．１．３  ＨＰＬＣ／ＤＭＢ法のための酸加水分解及びＤＭＢ誘導化
糖タンパク質試料に由来するＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）は、８Ｍの酢酸での加水分解を介して遊離させた後、蛍光試薬である１，２−ジアミノ−４，５−メチレンジオキシベンゼン（ＤＭＢ）を使用して、カラム導入前に誘導化した。Ｎ−アセチルノイラミン酸は、ＤＭＢで処理すると、高度に蛍光性であるキノキサリノン誘導体を形成する（Ｌｉｎ，Ｉｎｏｕｅ  ＆  Ｉｎｏｕｅ，２０００）。ＨＰＬＣ／ＤＭＢ法のための、タンパク質のピコモルの計算には、下記の式を使用した。
【００６９】
１．０ｍｇ／ｍＬ＊１０μＬ＊（１μｍｏｌ／μｇでのＭＷ）＊（１０６ｐｍｏｌ／μｍｏｌ）＊（１／６０μＬ）＊２０μＬ
式中、１．０ｍｇ／ｍＬは、試料濃度であり、ＭＷは、タンパク質の分子量、６０μＬは、試料の最終体積、及び２０μＬは、注入体積である。
【００７０】
ＮＡＮＡのピコモル／タンパク質のピコモルは、セクション５．１に示される式に基づいて計算されるＮＡＮＡのピコモル／注入を、セクション５．１．３から計算されるＸ３ｐｍｏｌ／注入で割ることによって決定される。
【００７１】
５．２  試料分析及び同等性評価
糖タンパク質Ａ及び糖タンパク質Ｂを、ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法、及びＨＰＬＣ／ＤＭＢ法、ならびにＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法での対照比較試験に供した。ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法については、シアリダーゼ−Ａによって遊離したＮＡＮＡを、セクション４．４に記載のクロマトグラフィーパラメーター及びＮＱＡＤ設定を使用して分析した。ＨＰＬＣ／ＤＭＢ法については、蛍光検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅシステムで分析を実施した。分離には、ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅＯＤＳカラム（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用した。ＮＡＮＡとＮＧＮＡとのアイソクラティックでの分離のための移動相は、７８％の水／２１％のメタノール／０．３％のアセトニトリルからなるものを使用した。カラムの溶出物は、励起波長及び蛍光波長をそれぞれ、３７４ｎｍ及び４４８ｎｍとし、蛍光検出器を使用して監視した。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法については、シアリダーゼＡによって遊離したＮＡＮＡを、０．１Ｍの水酸化ナトリウムと、１Ｍの酢酸ナトリウムを含む０．１Ｍの水酸化ナトリウムと、をそれぞれ、移動相Ａ及び移動相Ｂとして使用して分析した。３５分間かけてＢを５％から１８％へと変化させる直線グラジエントを適用した。溶出物は、アンペロメトリック電気化学検出器（ＰＡＤ）を使用して監視した。ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法から得られたＮＡＮＡ濃度と、ＨＰＬＣ／ＤＭＢ法及びＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法から得られた結果と、を比較することで、２つのオルトゴナル法に対する、ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法の同等性を決定した。
【００７２】
結果：
ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤと、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ及びＨＰＬＣ／ＤＭＢと、の同等性の比較結果を、それぞれ以下の表１及び表２に示す。糖タンパク質−Ａのシアル酸定量には、オルトゴナル法（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ及びＨＰＬＣ／ＤＭＢ）を使用している一方で、糖タンパク質−Ｂについては、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法が利用可能な唯一の方法である。したがって、糖タンパク質−Ｂについては、ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法との比較は、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤのみに対して実施した。ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤの結果は、試験した試料について、オルトゴナル法と同等であった。
【表５】
2020187128.tif 000007
【表６】
2020187128.tif 000008
【００７３】
実施例６
６．ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムを使用したＮＡＮＡ定量アッセイの検証
セクション４．４に記載の、短いカラムを使用した方法（５ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムを使用）を、正式な方法検証に供した。短いカラムを使用したＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法（５ｃｍのＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラム使用）は、正確性、直線性、及び方法精度（再現性及び室内再現精度）の検証基準のすべてに適合した。方法のＬＯＤ及びＬＯＱはそれぞれ、０．３２ｎｍｏｌ／注入、及び０．８６ｎｍｏｌ／注入と決定した。詳細な結果は、セクション６．１〜６．４に示される。
【００７４】
６．１  ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法の正確性評価
正確性を評価するために、既知量のＮＡＮＡを、糖タンパク質−Ａへとさまざまな濃度で添加する添加試験を実施した。添加を実施した試料及び添加未実施の試料をシアリダーゼ消化した後、ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ分析に供した。添加未実施の試料から得られたＮＡＮＡ濃度を、添加を実施した試料から差し引いた後、この差分を、添加したＮＡＮＡの既知量と比較することで、実際の回収率を決定した。正確性をさらに検証するために、酵素的に消化した糖タンパク質−ＡのＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ溶出物に対して質量分析を実施した。
【００７５】
結果：
表３に示されるように、添加回収試験の結果によって、糖タンパク質−Ａに対してさまざまなレベルで添加したＮＡＮＡの回収率は、９０〜１１０％の範囲以内であることが示された。ＴＩＣによる追跡、及び対応する質量スペクトルによって、ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法から得られたＮＡＮＡのピークは純粋なものであり、ＮＡＮＡと共に同時溶出する他の妨害性の成分は存在しないことが示された。
【表７】
2020187128.tif 000009
【００７６】
６．２  直線ダイナミックレンジの評価
さまざまな濃度の一連のＮＡＮＡ標準物質を分析することによって、アッセイの直線ダイナミックレンジを決定した。
【００７７】
表４に示されるように、アッセイの直線ダイナミックレンジは、１〜３２ｎｍｏｌ／注入の範囲であると決定し、決定係数（Ｒ２）は、０．９９を超えるものであった。対応する直線回帰プロットは、図９に示される。
【表８】
2020187128.tif 000010
【００７８】
６．３  方法の精度評価
方法の精度、すなわち、所定条件下で同一の試料型の複数試料から得られる一連の測定値間における一致の近接性を、再現性及び室内再現精度という２つのレベルで評価した。
【００７９】
６．３．１  再現性
再現性またはアッセイ内精度は、短い時間間隔で、同一運転条件下で示されるものである。方法の再現性を示すために、糖タンパク質−Ａから遊離したシアル酸（ＮＡＮＡ）を６回反復注入して分析した。複数回の注入から計算した相対標準偏差と、以下に示すＨｏｒｗｉｔｚ式（Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９８２）から決定した予想成績標的と、を比較した。
ＲＳＤの％＜２（２．５−０．５ｌｏｇＣ）ＲＳＤ
式中、Ｃは、試料における分析物の濃度であり、ｍｇ／ｍＬである。
【００８０】
結果：
再現性評価から決定したＲＳＤの％は０．９６であり、これは、Ｈｏｒｗｉｔｚ式に基づいて確立された、ＲＳＤの％が４以下という成績標的以内であり、完全に満たすものであった。一連の測定値の標準偏差またはＲＳＤの％として通常表現される分析手順の精度は、表５に示される。
【表９】
2020187128.tif 000011
【００８１】
６．３．２  室内再現精度
室内再現精度は、異なる日にち、異なる分析者、異なる機器等などの、研究室内での変動として示される。室内再現精度を評価するために、２人の分析者が異なる日に分析を実施した。観測された室内再現精度と、Ｈｏｒｗｉｔｚ式から決定した予想成績標的と、を比較した。
【００８２】
結果：
室内再現精度は、２人の分析者が、２つの異なる日に、糖タンパク質−Ａを分析することによって確立した。ＲＳＤの％は、０．９５であり、これは、Ｈｏｒｗｉｔｚ式によって確立された、ＲＳＤの％が６以下という成績標的以内である。一連の測定値の分散、標準偏差、または変動係数として示される分析手順の精度は、表６に示される。
【表１０】
2020187128.tif 000012
【００８３】
６．４  ＬＯＤ／ＬＯＱの評価
ＬＯＤは、ノイズと確実に区別される可能性を有する最低の分析物濃度を説明するものであり、一方、ＬＯＱは、分析法によって確実に測定することができる最低濃度である。ＬＯＤ及びＬＯＱを推定する伝統的及び典型的な手法は、ゼロ較正用試料またはブランク試料の反復測定（通常、ｎ＝２０）と、検量線から得られた直線回帰式を使用した、ｎｍｏｌ／注入への応答の変換と、からなるものである。ＬＯＤ及びＬＯＱを決定するために、基質ブランク（水）を３０回反復分析したものと、最低濃度のシアル酸標準物質（１ナノモル／注入）を１０回反復分析したものと、を解析した。同時に分析したシアル酸標準物質から構築した検量線は、ｎｍｏｌ／注入への応答の変換を容易にするものである。
【００８４】
ＬＯＤ及びＬＯＱは、ブランクを３０回反復分析したものと、最低濃度のシアル酸標準物質（１．０ｎｍｏｌ／注入）を１０回反復分析したものと、から得られたデータから決定した。生データは、直線回帰式を使用して、ｎｍｏｌ／注入へと変換した。ＬＯＤの決定には、平均値＋３．３のＳＤを使用し、ＬＯＱの決定には、平均値＋１０のＳＤを使用した。表７に示されるとおり、３０回のブランク注入から決定した、方法のＬＯＤ及びＬＯＱはそれぞれ、０．３２ｎｍｏｌ／注入、及び０．８６ｎｍｏｌ／注入であった。最低濃度のシアル酸標準物質を１０回注入して決定した平均観測値は、０．９９ｎｍｏｌ／注入であり、この値は、１．０ｎｍｏｌ／注入の予測値以内に入るには十分であり、最低濃度の標準物質の正確性を立証するものである。最低濃度の標準物質の複数値真野RSDの％は９％であり、最低濃度の標準物質の制度を立証する者である。
【表１１】
2020187128.tif 000013
【００８５】
考察
表１の要約データに基づき、我々は、非誘導化シアル酸のＲＰ−ＨＰＬＣによる定量法をさらに追及することはしなかった。ＤＭＢ（１，２−ジアミノ−４，５−メチレンジオキシベンゼン）で誘導化したシアル酸の定量には、ＲＰ−ＨＰＬＣは一般に使用されるが、高極性の非誘導化シアル酸を、事前に何らかの形態に誘導化することなくＲＰ−ＨＰＬＣで保持することは不可能であった。表１は、非誘導化シアル酸の定量を目的とする、他の様式のカラム化学（イオン対クロマトグラフィー、イオン排除クロマトグラフィー、陽イオン及び陰イオン交換クロマトグラフィー、ならびに疎水性相互作用クロマトグラフ）の陽イオン性及び陰イオン性の用途を要約するものでもある。
【００８６】
イオン対試薬を利用することで疎水性を増加させて、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに対する非誘導化シアル酸の結合性を改善するために実施した評価は限られたものであり、成功しなかった。評価したイオン対クロマトグラフィーは限られた範囲にすぎないため、さまざまな異なる陰イオン性及び陽イオン性のイオン対試薬をさまざまな濃度で使用して結合性を改善することによって、未来の研究者はこの領域を探求することができる。
【００８７】
ＮＱＡＤ検出器は、高塩濃度では使用できないため、塩によるグラジエントで実施するＡＥＸ及びＣＥＸを追及することはしなかった。同様の理由から、疎水性相互作用クロマトグラフィーの評価からも手を引いた。
【００８８】
ｐＨグラジエントを使用した陰イオン交換クロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーの両方を評価したが、結果としては全く成功しなかった。カラム寸法が大きいことと関連して感度が不十分であるため、混合様式のイオン排除クロマトグラフィーカラムの評価は、期待できるものではない。
【００８９】
図２及び図３に示されるように、Ｘ−ｂｒｉｄｇｅカラム、及びＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸ  ＨＩＬＩＣカラムは、非誘導化シアル酸の保持に適したものである。ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムは、Ｘ−ｂｒｉｄｇｅカラムと比較して、ベースラインが相対的に良好であったため、ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムをさらなる最適化に向けて選択した。ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸアミドカラムを使用することで、２つの溶出条件下で許容可能なピーク対称性が達成された。２つの溶出条件は、（１）１０ｃｍのカラムを用いて、移動相Ａとしてアセトニトリル、及び移動相Ｂとして２０％のギ酸を使用する条件、（２）５ｃｍのカラムを用いて、移動相Ａとしてアセトニトリル、移動相Ｂとして１％のギ酸を使用する条件である。第１の選択肢は、分析物中にＮＡＮＡ及びＮＧＮＡの両方が存在する状況に、より適しており（図４）、一方で、第２の選択肢は、糖タンパク質がＮＡＮＡのみを含んでいるのであれば理想的である（図６）。
【００９０】
セントリコンでの濾過を実施または未実施の試料（シアリダーゼで消化処理した糖タンパク質）によって示されたピーク応答が同等であったことから、糖タンパク質または他の基質成分に由来する基質による妨害は問題ではないことが示唆された。したがって、タンパク質及び基質成分の除去に適用されるセントリコン濾過は、必須段階ではない。
【００９１】
表２及び表３に要約されるように、ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤから得られたシアル酸定量結果は、オルトゴナル法とよく一致するものである。オルトゴナル法に対して、ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法の結果が同等であった（表２及び表３）ことに加えて、添加回収（糖タンパク質−ＡにさまざまなレベルでＮＡＮＡを添加）試験から得られた回収率が９５〜１０５％（表４）であったことは、方法の正確性をさらに支持するものである。
【００９２】
ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法の直線範囲は、１〜３２ｎｍｏｌ／注入であり、決定係数（Ｒ）は、０．９９以上である（表５）。再現性（アッセイ内精度）及び室内再現精度から決定したＲＳＤの％は、０．９６％及び０．９５％（表６及び表７）であり、これらの値はそれぞれ、Ｈｏｒｗｉｔｚ式から確立された、ＲＳＤ４％以下及びＲＳＤ６％以下という成績標的以内に入るには十分であった。
【００９３】
ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ、ＨＰＡＥＣ／ＰＡＤ、及びＨＰＬＣ／ＤＭＢの分析実施時間はそれぞれ、３０分、３１分、及び３５分であり、分析時間は同等であるため、クロマトグラフィーの分析時間が顕著に節約されることはない。しかしながら、ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法では、費用を要し、時間を消費する誘導化段階が除かれるため、ＨＰＬＣ／ＤＭＢ法に勝る費用上の利点が得られる。
【００９４】
スケジューリングの観点から、誘導化を除くことは有利なことである。例えば、高速で減圧して試料を乾燥させるプロセスは、完了に約２時間を要することが予測される。しかしながら、これは、時によって異なり、試験の時系列に不確実性がさらに加わり得ることが多い。試料の調製時間及び分析時間は、ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤとＨＰＡＥＣ／ＰＡＤとで同等であるものの、ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤは、信頼性及び使い勝手の良さに関してＨＰＡＥＣ／ＰＡＤに勝るものである。
【００９５】
結論
タンパク質治療学においてシアル酸部分は、血清中半減期の維持において重要な役割を担っていることに加えて、生物学的及び生理化学的な性質に影響を及ぼすため、糖タンパク質におけるシアル酸の定量は、バイオ治療タンパク質の特徴づけにおいて必須となる分析段階である。本明細書に記載の、誘導化が不要なＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法は、組換えタンパク質治療学において、非誘導化シアル酸の正確な定量に有効かつ信頼性を有する手法である。タンパク質治療学から酵素的に遊離し、ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸ  ＨＩＬＩＣカラムによって分離されたシアル酸は、ナノ量分析物検出器（ＮＱＡＤ）を使用して検出及び定量することができる。シアル酸含量を正確に測定することは、多くの治療タンパク質で重大な意味を有する一方で、ＨＰＡＥＣ／ＰＡＤ及びＨＰＬＣ／ＤＭＢなどの現在用いられる手法は、さまざまな問題に直面している。ＨＰＬＣ／ＤＭＢ法では、面倒な誘導化が必要であり、一方、ＨＰＡＥＣ／ＰＡＤ法では、電極汚染及び高維持費などの問題に悩まされる。誘導化と関連するばらつきが排除されることに加えて、ＨＰＬＣ／ＮＱＡＤ法は、一般に使用されるＨＰＡＥ−ＰＡＤ法及びＨＰＬＣ／ＤＭＢ法に対する許容可能な同等性と共に、直線的なダイナミックレンジ、ならびに優れた精度、再現性、信頼性、正確性、及び使い勝手の良さを有することが示された。
【００９６】
参考文献
１．Ｂｙｒｎｅ，Ｂ．，Ｄｏｎｏｈｏｅ，Ｇ．，＆  Ｏ’Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｒ．（２００７）．Ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄｓ：ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏ−ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  １２（７／８）：３１９−３２６．
２．Ｈｉｌｄｅｎｂｒａｎｄｔ，Ｇ．，＆  Ａｒｏｎｓｏｎ，Ｎ．（１９７９）．Ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ａｓｉａｌｏ−ｇｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｅｒｆｕｓｅｄ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ５８７（３）：３７３−８０．
３．Ｇａｎｅｓａ，Ｃ．，Ｇｒａｎｄａ，Ｂ．Ｗ．，＆  Ｍａｔｔａｌｉａｎｏ，Ｒ．Ｊ．（２００３）．Ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｐＨ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  １６（６）：４４−４８．
４．Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ＪＰ；Ｌｉ  Ｊ；Ｆａｒｒｅｌｌ  Ｗ；Ｇｒｏｅｂｅｒ  Ｅ；Ｓｚｕｃｓ  Ｒ；Ｄｉｃｉｎｏｓｋｉ  Ｇ  ＆  Ｈａｄｄａｄ  ＰＲ．（２０１１）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ａｅｒｏｓｏｌ  ｄｅｔｅｃｔｏｒｓ  ｕｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ｕｌｔｒａ  ｈｉｇｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  １２８１（１２）：１４４６−５５．
５．Ｏｌｓｏｖｓｋａ  Ｊ；Ｋａｍｅｎｉｋ  Ｚ；Ｃａｊｔｈａｍｌ  Ｔ．（２００９）．Ｈｙｐｈｅｎａｔｅｄ  ｕｌｔｒａ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｎａｎｏ  Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ａｎａｌｙｔｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ＵＶ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  １２６１（３０）：５７７４−８．
６．Ｋｉｍｂａｌｌ，Ｂ．，Ａｒｊｏ，Ｗ．，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｊ．（２００４）．Ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｉｎｔ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ：Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｎｉｆｅｒ  ｎｅｅｄｌｅｓ  ｂｙ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ＆  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２７（１２）：１８３５−１８４８．
７．Ｃｉｎｔｒｏｎ，Ｊ  ＆  Ｒｉｓｌｅｙ，Ｄ．（２０１３）．Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｗｉｔｈ  ａｅｒｏｓｏｌ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｐｏｌａｒ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｌａｃｋｉｎｇ  ＵＶ  ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ７８−７９：１４−１８．
８．Ｓｈａｒｍａ，Ｖ．Ｋ．，Ｇｌｉｃｋ，Ｊ．，Ｖｏｕｒｏｓ，Ｐ．（２０１２）．Ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ  ｉｏｎ−ｐａｉｒ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｅｌｅｃｔｒｏ  ｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｂａｓｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｍｅｒｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｄｄｕｃｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ  ｃｏｌｕｍｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  １２４５（６）：６５−７４．
９．Ｃａｌｈｏｕｎ，Ａ．Ｒ．，Ｋｉｎｇ，Ａ．Ｄ．（２００７）．Ｔｈｅ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｅｔｈａｎｅ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｏｄｉｕｍ  １−ｐｅｎｔａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ，ｓｏｄｉｕｍ  １−ｈｅｘａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ，ｓｏｄｉｕｍ  １−ｈｅｐｔａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ，ａｎｄ  ｓｏｄｉｕｍ  １−ｏｃｔａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ａｔ  ２５℃．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９（２）：５０５−５１０．
１０．Ｒｅｍｓｂｕｒｇ，Ｊ．Ｗ．（２００７）．Ｍｕｌｔｉｐｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐａｉｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｉｏｎｉｃ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏ  ｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．（Ｏｒｄｅｒ  Ｎｏ．１４４７２７９，Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ａｔ  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ）．ＰｒｏＱｕｅｓｔ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｓｅｓ  ７７．
１１．Ｉｓａｋａｕ，Ｈ．，Ｒｏｂｅｒｔ，Ｍ．，＆  Ｓｈｉｎｇｅｌ，Ｋ．（２００９）．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｙｄｒｏ  ｇｅｌｓ  ｂｙ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｗｉｔｈ  ｒｅｆｒａｃｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ４９（３）：５９４−６００．
１２．Ｍｏｒｉ，Ｍ．，Ｔａｏｄａ，Ｈ．，Ｉｔａｂａｓｈｉ，Ｈ．，Ｉｋｅｄｏ，Ｍ．，＆  Ｔａｎａｋａ，Ｋ．（２００６）．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｏｎ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｔｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｐｈｏｔｏｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｏｎｉｃ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｏｎ  ａ  ｔｉｔａｎｉｕｍ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ｐｈｏｔｏ  ｃａｔａｌｙｓｔ．ＡＣＴＡ  ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＩＣＡ  １（１６）：２８−３７．
１３．Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｗ．１９８２．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｏｄｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５４：６７−７６．
１４．Ｚａｕｎｅｒ，Ｇ．，Ｄｅｅｌｄｅｒ，Ｍ．，＆  Ｗｕｈｒｅｒ，Ｍ．（２０１１）．Ａ  ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅ  ｉｎ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＩＬＩＣ）ｆｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．３２（２４）：３４５６−３４６６．
１５．Ｉｋｅｇａｍｉ，Ｔ．，Ｔｏｍｏｍａｔｓｕ，Ｋ．，Ｔａｋｕｂｏ，Ｈ．，Ｈｏｒｉｅ，Ｋ．，Ｔａｎａｋａ，Ｎ．（２００８）．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ｉｎ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  １１８４（１−２）：４７４−５０３．
１６．Ｄｕｙ，Ｓ．，Ｂｅｓｔｅｉｒｏ，Ｓ．，Ｂｅｒｒｙ，Ｌ．，Ｐｅｒｉｇａｕｄ，Ｃ．，Ｂｒｅｓｓｏｌｌｅ，Ｆ．，Ｖｉａｌ，Ｈ．Ｊ．，Ｌｅｆｅｂｖｒｅ−Ｔｏｕｒｎｉｅｒ，Ｉ．（２０１２）．Ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｌｉｐｉｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ７３９（２０）：４７−５６．
１７．Ｌｉｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｓ．，＆  Ｉｎｏｕｅ，Ｙ．（２０００）．Ａｃｉｄ−ｂａｓｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｗｉｔｈ  ｆｌｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｒｅａｇｅｎｔ，１−２−ｄｉａｍｉｎｏ−４．５−ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅ（ＤＭＢ）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２９（２）：４４７−４５１．
１８．Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｗ．（１９８２）．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｏｄｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５４（１）：６７−７６．
１９．Ｓｉｓｋｏｓ，ＰＡ．＆  Ｓｐｙｒｉｄｋ，ＭＨ．（１９９９）．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ  ｉｏｎ−ｐａｉｒ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ  ７２４（２）：２０５−１２．
【図１】
2020187128.tif 000014
【図２Ａ】
2020187128.tif 000015
【図２Ｂ】
2020187128.tif 000016
【図３Ａ】
2020187128.tif 000017
【図３Ｂ】
2020187128.tif 000018
【図４】
2020187128.tif 000019
【図５】
2020187128.tif 000020
【図６】
2020187128.tif 000021
【図７】
2020187128.tif 000022
【図８】
2020187128.tif 000023
【図９】
2020187128.tif 000024