(57)【要約】      （修正有）【課題】損傷部位又は手術介入部位で骨形成を促進する又は骨破壊を低減するための医薬組成物の提供。【解決手段】ＯＧＦＲアンタゴニスト、並びに、骨の形成又は成長を促進するための他の薬剤との組み合わせから成る医薬組成物。ここで、ＯＧＦＲアンタゴニストは、ナロキソン、ナルトレキソン、ナロルフィン、ナロキソナジン、レバロルファン、ナルメフェン、シプロジム、シクロルファン、シクラゾシン、オキシロルファン、ＬＹ１１３８７８、ＭＲ２２６６、ジプレノルフィン、ＷＩＮ４４，４４１−３、ナルトリンドール及びノルビナルトルフィミンから選択されるオキシモルフォン誘導体であって、前記医薬組成物は損傷部位又は手術介入部位に局所投与されることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
損傷部位または手術介入部位で骨形成を促進するまたは骨破壊を低減するための方法であって、骨形成を促進するまたは骨破壊を低減するのに有効な量のＯＧＦＲアンタゴニストを投与する工程を含む前記方法。
【請求項２】
骨中の局所損傷部位または手術介入部位への間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の動員を促進して治癒を促進するための方法であって、骨分解を阻害しながら骨形成を促進するのに有効な量のＯＧＦＲアンタゴニストを投与する工程を含む前記方法。
【請求項３】
ＯＧＦＲアンタゴニストは、ナロキソン、ナルトレキソン、それらの機能性誘導体、またはそれらの組合せである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＯＧＦＲアンタゴニストは、ＯＧＦＲの発現を阻害するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ナロキソン、ナルトレキソン、それらの機能性誘導体、またはそれらの組合せは、損傷部位または手術介入部位に局所投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ナロキソン、ナルトレキソン、それらの機能性誘導体、またはそれらの組合せは、担体と共に投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記担体は、コラーゲンスポンジ、粉末状コラーゲン、またはコラーゲンベースのゼラチンハイドロゲルの形態のコラーゲンベースの担体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
担体はアルブミンベースの担体である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
担体は親水性ハイドロゲルベースの担体である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
担体は手術用インプラントまたは手術用インプラント送達システムである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
担体はβ型リン酸三カルシウム、セメント、または無機質除去した骨マトリックスで構成される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
担体はＰＧＡ／ＰＬＧＡ球体で構成される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
ナロキソン、ナルトレキソン、それらの機能性誘導体、またはそれらの組合せは、骨の形成または成長を促進するための少なくとも１つの他の活性剤と組合せて投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
損傷は骨折を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記手術介入は、骨折の手術修復、脊椎癒合において骨を生成するための手術手順、および整形外科用インプラントまたはハードウェアと隣接骨の一体化を促進するための手術手順から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によってその全容が本明細書に組み入れられる２０１４年５月３０日に出願された米国仮出願第６２／００５，３５９号の優先権を主張するものである。
【０００２】
配列表の参照による組み入れ
２０１５年５月１１日に作製されＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で米国特許商標庁に提出された、２ＫＢの３０８７８＿ＳＥＱ．ｔｘｔという名称のＡＳＣＩＩテキストファイル形式での配列表は、参照によって本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
骨の形成と分解は、骨形成を担う骨芽細胞と骨再吸収を担う破骨細胞の間の、増殖因子シグナル伝達によって厳密に制御される。骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による分解の連動は、連動膨張因子として同定された増殖因子の一覧と共に近年高度な研究の主題となっている。骨形成と骨再吸収の連動には、その各々の先代細胞の動員と平行して骨芽細胞と破骨細胞の動員が必要である。骨芽細胞は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に由来し、一方で破骨細胞は骨髄系統の一部である単球に由来するが、しかしながら、どのようにしてＭＳＣまたは単球が、それらの骨髄中ニッチから新骨形成部位に移動するかは依然知られていない。骨形成の空間的および時間的制御に関する現在の理解は、ＭＳＣはそれらの骨髄中ニッチから骨内膜表面に移動し、そこでＭＳＣが新骨を生成する骨芽細胞に分化することを示す。平行して、単球もそれらの骨髄中ニッチから骨内膜表面に移動し、そこでそれらは、骨再吸収する破骨細胞に後に分化する。骨形成を制御することが知られている増殖因子には、ＴＧＦβ−、ＢＭＰ−、および標準的Ｗｎｔ−リガンドがある。単球系前駆細胞からの破骨細胞形成と骨再吸収は、ＭＳＣＦ、ＯＰＧおよびＲＡＮＫ−リガンドの発現を介して制御される。平行して、破骨細胞活性もＴＧＦβ−、ＢＭＰ−、および非標準的Ｗｎｔ−リガンドの発現によって制御される。しかしながら、ＴＧＦβ−、ＢＭＰ−、およびＷｎｔ−リガンドを含めた組織パターン形成に関与する多くの発生増殖因子は、骨の形成と再吸収を促進する。健康な骨の維持には、骨が連続的に作られ破壊される一定した再形成が必要である。
【０００４】
骨へのインプラントの導入は、骨髄系統に由来し骨またはインプラント材料の分解に貢献できるマクロファージの活性によって部分的に仲介される炎症促進応答を誘導する、生化学的カスケード反応をもたらす。現在、インプラントおよびインプラント材料は、最適に骨伝導し最大の骨−インプラント一体化を促進しながら、マクロファージ応答を最小にするように選択されている。あるいは、自己移植片とインプラントの導入または失活骨組織移植片（自己移植片）の使用が、骨一体化を増すための手段としてインプラントの材料性と共に利用されているが、しかしながら、これらの手法には問題があることが多かった。材料は自己編制的と自己構築的の両方であるように設計されることが理想的である。
【０００５】
整形外科的外傷手術手順中または通常の脊椎癒合手順中に利用されるアジュバント療法手法としての骨作製は、整形外科手術における継続的課題である。具体的には、これらのアジュバント骨作製療法は、骨の治癒時間の短縮と平行して、手術介入部位での健康な骨の成長を増進しようと努める。最近数十年で、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含めた骨形成能力がある様々な増殖因子を使用する幾つかの試みが行われている。残念ながら、骨作製を目的とするＢＭＰベースの療法には、患者、特にＸ線照射療法を受けるまたは新生未検出腫瘍を有する可能性がある患者における腫瘍形成のリスクもある。さらに、ＢＭＰベースの療法は進行性腫瘍を有する患者では使用できず、これらの患者が手術介入中に骨形
成を増進する療法から大いに恩恵を被る可能性があるので、このことは非常に残念である。
【０００６】
骨折障害治癒は、整形外科手術および骨治癒において重大な課題を示し続けている。５〜２０％もの高い骨折後偽関節率が報告されている。偽関節を発症した患者の治療に関連する罹患とコストは相当なものになる可能性がある。毎年発生する６２０万の骨折の約１０％には治癒難点がある。骨治癒の促進を手助けするための様々な選択肢が存在するが、有効性は証明されていない。腸骨稜の移植骨片が依然としてゴールドスタンタードであると考えられているが、採取部位の同時罹患に関して重大な問題がある。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を含めた増殖因子ベースの療法は細胞培養試験において初期の成功を示しているが、しかしながら、それらの有効性は臨床用途において依然証明されていない。骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２）およびＢＭＰ７などの他の選択肢が、骨幹骨折を伴う骨折治癒の促進において成功があったことが示されている。しかしながら、感染増加、腫瘍増殖のリスクの増大、および局所骨溶解のリスクの増大を含むＢＭＰの使用に関連したリスクが存在する。ＢＭＰを含む治療剤に関連した多くのリスクは、他の病状を有する患者のためのＢＭＰの使用も妨げる。
【０００７】
脊椎癒合、骨折治癒および骨折後偽関節の管理などの複雑な整形外科的問題を処理する場合、腫瘍増殖の可能性を増大させずに整形外科手術中のアジュバント療法として骨形成を増大する療法能力は現在、市販の生物学的製剤の限界である。
【０００８】
整形外科的外傷手術の分野では、特に大欠陥および偽関節がある開放骨折では、自己／同種異系移植骨片が主な治療の選択肢である。しかしながら、骨形成を達成するためのゴールドスタンタードとして使用される自己採取移植骨片には、感染およびドナー部位疼痛のリスクがある。他の同種異系移植骨片の代替物は、単独で使用したとき乏しい治癒を示している。これらの移植骨片の選択肢を使用して癒合を達成するとき、脊椎手術に関して同じ制約がある。
【０００９】
供給死体由来の皮質骨と海綿骨は、空間を充填するのに役立ち、重要な骨誘導能力を失わずに主として骨伝導性である。したがって、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦおよびＢＭＰなどの生物学的製剤は治癒または脊椎癒合の速度を増大させるために使用され、それらの適用は治療のコストに加算される。しかしながら、これらの生物学的製剤療法は、固有の容認できない腫瘍リスクを示す一定範囲の細胞表現型における発生中の増殖を刺激する。
【００１０】
無機質除去した骨マトリックスおよびリン酸カルシウム代替物は骨治癒促進において高い有効性は示しておらず、さらに製造コストのためにそれに伴う相当なコストがある。
【００１１】
組換えＢＭＰ２（ｒｈＢＭＰ２）は、小型（１５ｍｇ／ｃｍ３インプラントで４．２ｍｇのＢＭＰ２および２×コラーゲンスポンジ）、中型（１５ｍｇ／ｃｍ３インプラントで８．４ｍｇのＢＭＰ２および４×コラーゲンスポンジ）、大型（１５ｍｇ／ｃｍ３インプラントで１２ｍｇのＢＭＰ２および６×コラーゲンスポンジ）、および大型−ＩＩ（１５ｍｇ／ｃｍ３インプラントで１２ｍｇのＢＭＰ２および１×コラーゲンスポンジ）で流通販売されＩＮＦＵＳＥとして知られる、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃによって開発された市販のインプラントである。全サイズのＩＮＦＵＳＥインプラントが脊椎および上顎顔面用途に認められており、一方で大型−ＩＩインプラントのみが骨折用に認められている。ＩＮＦＵＳＥインプラントは、滅菌生理食塩水で粉末状ＢＭＰ２を戻し、次いでＢＭＰ２−生理食塩水溶液をコラーゲンスポンジに加えることによって投与し、その後インプラントは手術介入中に局所に送達される。
【００１２】
組換えＢＭＰ７（ｒｈＢＭＰ７またはＯＰ１）は、ＯＰ１として知られ現在Ｏｌｙｍｐｕｓによって所有される、Ｓｔｒｙｋｅｒによって開発された市販のインプラントである。ＯＰ１インプラントは、ＯＰ１−パテ（粉末状ウシ軟骨および３．３ｍｇのＢＭＰ７を含有する２０ｍＬ）またはＯＰ１−インプラント（１ｇの粉末状ウシ軟骨および３．３ｍｇのＢＭＰ７）として流通販売されている。ＯＰ１−パテは脊椎癒合手術用に認められており、一方ＯＰ１−インプラントは骨折治療および骨折後偽関節手術用に認められている。ＯＰ１−パテまたはＯＰ１−インプラントは、最初に滅菌生理食塩水で粉末状ＢＭＰ７を戻し、次いでＢＭＰ７−生理食塩水溶液をコラーゲンインプラントに加えることによって投与し、その後インプラントは手術介入中に局所に送達される。
【００１３】
オピオイド増殖因子受容体（ＯＧＦＲまたはξ−オピオイド受容体）は、標準的μ−、κ−およびδ−オピオイド受容体（それぞれＯＰＲＭ、ＯＰＲＫおよびＯＰＲＤ）と構造相同性を共有しておらず、標準的オピオイド受容体より低い効率で天然オピオイドリガンドと結合する、非標準的な核周囲のオピオイド受容体である。オピオイド増殖因子（ＯＧＦまたはｍｅｔ−５エンケファリン；ｍｅｔ５）はＯＧＦＲの天然リガンドである。Ｍｅｔ５はプロホルモンであるプロエンケファリン（ＰＥＮＫ）、および低い程度でプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）に由来し、これらは最初にプロホルモン転換酵素（ＰＣＳＫ１およびＰＣＳＫ２）次いでカルボキシペプチダーゼＥまたはＤ（ＣＰＥまたはＣＰＤ、エンケファリン転換酵素）により還元されてｍｅｔ５−エンケファリンの５コピーを形成する。以前の研究は骨芽細胞と先代骨細胞におけるｍｅｔ５の発現を確認した（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。さらに、Ｋｕｉｓらは末梢血および脾臓の単球におけるｍｅｔ５を確認した（非特許文献５）。それにもかかわらず、これらの研究者達は、骨髄系統の間葉細胞におけるＯＧＦＲシグナル伝達に関する機能有意性を確認することはできなかった。非特許文献３は、骨および関節組織中のｍｅｔ５の存在を開示する。しかしながら、ｍｅｔ５と骨形成の間に実証可能な関係はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｒｏｓｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ８８（９）：３７０５〜９頁、１９９１年
【非特許文献２】Ｒｏｓｅｎら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．１３（１０）：１５１５〜２０頁、１９９８年
【非特許文献３】Ｅｌｈａｓｓａｎら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．１３（１）：８８〜９５頁、１９９８年
【非特許文献４】Ｃｈｅｎｇら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．２０（１）３１９〜２７頁、２００９年
【非特許文献５】Ｋｕｉｓら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．８８（３）８１７〜２４頁、１９９１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
オピオイド増殖因子シグナル伝達の阻害は骨形成を促進するおよび／または骨破壊を低減することが、本明細書において確認されている。何らかの特定の理論によって縛られずに、オピオイド増殖因子受容体（ＯＧＦＲ）を介したオピオイド増殖因子シグナル伝達の阻害は、骨形成を促進するおよび／または骨破壊を低減するのに有効であると考えられる。骨形成が望まれる部位に直接オピオイド増殖因子（ＯＧＦＲ）シグナル伝達経路の阻害剤を局所投与することにより、オピオイド増殖因子シグナル伝達の阻害が動物中の骨形成を促進することが、本明細書において実証されている。骨形成が望まれる部位へのオピオイド増殖因子シグナル伝達経路の阻害剤の直接投与が、骨芽細胞になるためのＭＳＣの分化を促進し単球の破骨細胞への分化を妨げるのに必要とされ、これが骨損傷部位または手
術部位で無機質化の増大と骨形成の増大をもたらすことも実証されている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
したがって本発明は、骨形成が望まれる部位に骨形成を促進するおよび／または骨破壊を低減するのに有効な量のオピオイド増殖因子受容体のアンタゴニストを直接、それを必要とする動物に投与することによって、骨形成を促進または骨破壊を低減するための方法を対象とする。
【００１７】
一態様では、本発明の方法中で利用するＯＧＦＲアンタゴニストは、ＯＧＦＲとオピオイド増殖因子の結合を遮断する。
【００１８】
幾つかの実施形態では、ＯＧＦＲとオピオイド増殖因子（ｍｅｔ５）の結合を遮断するＯＧＦＲアンタゴニストは、ナロキソンまたはその機能性誘導体、ナルトレキソンまたはその機能性誘導体、またはこれらの組合せである。
【００１９】
他の実施形態では、ＯＧＦＲアンタゴニストはオキシモルフォンに由来しＯＧＦＲと結合し、ナロキソン、ナルトレキソン、ナロルフィン、ナロキソナジン、レバロルファン、ナルメフェン、シプロジム、シクロルファン、シクラゾシン、オキシロルファン、ＬＹ１１３８７８、ＭＲ２２６６、ジプレノルフィン、ＷＩＮ４４，４４１−３、ナルトリンドールまたはノルビナルトルフィミンを含む。
【００２０】
さらに他の実施形態では、ＯＧＦＲアンタゴニストは、トランス−３，４−ジメチル−４−フェニルピペリジンに由来しＯＧＦＲと結合し、ＬＹ９９３３５、ＬＹ２５５０６、ＬＹ１１７４１３、またはＬＹ２５５５８２を含む。
【００２１】
幾つかの実施形態では、ＯＧＦＲアンタゴニストは、ｍｅｔ５−エンケファリンまたはｌｅｕ−エンケファリンペプチドに由来しＯＧＦＲと結合し、ＯＧＦＲを標的化するための手段として以下のアミノ酸配列、ｍｅｔ５−エンケファリン由来の配列に関してＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ（配列番号１）、またはｌｅｕ−エンケファリンペプチド由来の配列に関してＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（配列番号２）を少なくとも含む。
【００２２】
さらに他の実施形態では、ＯＧＦＲアンタゴニストは、ペプチドアンタゴニストＩＣＩ１７４８６４（Ｎ，Ｎ−ジアリル−Ｔｙｒ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ、配列番号３、Ａｉｂ＝アミノイソ酪酸）、またはソマトスタチンアナログＣＴＰ（Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｅｎ−Ｔｈｒ−ＮＨ２、配列番号４）に由来する。
【００２３】
別の態様では、本発明の方法中で利用するＯＧＦＲアンタゴニストは、ＯＧＦＲ内に見られる核局在配列、２５１ＱＳＡＬＤＹＦＭＦＡＶＲＣＲＨＱＲＲＱＬＶＨＦＡＷＥＨＦＲＰＲＣＫＦＶＷＧＰＱＤＫＬＲＲＦＫＰＳＳＬ（配列番号５）を妨害する分子である。
【００２４】
さらに別の態様では、本発明の方法中で利用するＯＧＦＲアンタゴニストは、ＯＧＦＲ遺伝子を対象としＯＧＦＲ遺伝子発現を妨害する際に有効な低分子ヘアピン（ｓｈ）−ＲＮＡまたは低分子干渉（ｓｉ）−ＲＮＡである。
【００２５】
別の態様では、本開示は、骨中の局所損傷部位または手術介入部位への間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の動員を促進して、破骨細胞誘導型骨分解（または再吸収）を阻害しながら治癒を促進するための方法を提供する。この方法は、骨分解を阻害しながら骨形成を促進するための、一定量のＯＧＦＲアンタゴニストの投与に基づく。損傷は例えば骨折、または手
術介入である可能性がある。幾つかの実施形態では、損傷部位または手術介入部位にＯＧＦＲアンタゴニストを局所投与する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｉは、（Ａ）骨形成誘導培地への１μＭ〜１ｍＭの間のナロキソンの添加が、骨芽細胞になるよう誘導したＭＳＣ培養物において無機質蓄積を大幅に増大したことを示す図である（赤色染色）。骨形成誘導培地への１μｍ〜１ｍｍの間のナルトレキソンの添加も、ナロキソンより低い程度ではあったが無機質を増大させた。（Ｂ）δオピオイド受容体（ＯＰＲＤ）遺伝子発現は、骨芽細胞（＊＝ｐ＜０．００１）と破骨細胞（＊＝ｐ＜０．００８４）において大幅に低下したが、一方で（Ｃ）一方オピオイド増殖因子受容体（ＯＧＦＲ）遺伝子発現は、骨芽細胞（＊＝ｐ＜０．０２）と破骨細胞（＊＝ｐ＜０．０００１）において有意に増大したことを示す図である。（Ｄ）ＯＧＦＲ−リガンド、ｍｅｔ５−エンケファリン（ｍｅｔ５）が、プロエンケファリン（ＰＥＮＫ）として知られる高分子前駆体タンパク質に由来することを示す図である。５μＭまたは５０μＭのｍｅｔ５の添加が培養物中の無機質形成に影響を与えることはなかった。（Ｅ）重要なことに、骨形成誘導培地への５μＭのｍｅｔ５（ＰＥＮＫ）への添加は無機質蓄積に影響を与えることはなかったが、一方５０μｍのｍｅｔ５は無機質蓄積を若干減少させたことを示す図である。しかしながら、１ｍＭのナロキソンを５μＭまたは５０μＭのｍｅｔ５と共に骨形成誘導培地に加えると、ナロキソン治療剤はｍｅｔ５の抗骨形成効果をなくすことができた。（Ｆ）骨形成誘導培地への添加が、対照培養物と比較して無機質形成をもたらしたことを示す図である。ＢＭＰ２は対照と比較して無機質形成を増大させ、一方ナロキソン（１ｍＭ）の１回治療（１回投薬）およびナロキソンの２回治療（２回投薬）は無機質形成を増大させた（赤色染色）。各培地交換時のナロキソンを用いた治療（連続投薬）は無機質形成を抑制した。（Ｇ）ＭＳＣ培養物へのナロキソンの添加は、７２時間と１２０時間で細胞数を減少させたことを示す図である（＊＝ｐ＜０．０１７）。（Ｈ）単球培養物へのナロキソンの添加も細胞数を有意に減らしたことを示す図である（＊＝ｐ＜０．０００１）。（Ｉ）破骨細胞になるよう培養した単球は、対照破骨細胞培養物と比較して、ｍｅｔ５を用いた治療によって影響を受けなかったことを示す図である（ＴＲＡＰ染色は紫色で示す）。１μＭのナロキソンまたは１μＭのナルトレキソンの添加によって破骨細胞数が有意に減少することはなかったが、一方１ｍＭのナロキソンまたは１ｍＭのナルトレキソンの添加によって破骨細胞数は大幅に減少した。
【図１−２】図１−１の続き。
【図１−３】図１−２の続き。
【図２】図２Ａ〜２Ｅは、（Ａ）ＯＧＦＲｓｈＲＮＡでトランスフェクトしたＭＳＣは有意に低いＯＧＦＲ遺伝子発現を示し（＊＝ｐ＜０．００８５）、これは核および細胞質タンパク質溶解物におけるＯＧＦＲの減少（Ｂ）で立証されたことを示す図である。（Ｃ）さらに、ＯＧＦＲ欠損ＭＳＣでは、ＳＭＡＤ１遺伝子発現が対照ＭＳＣおよびＧＦＰトランスフェクト対照培養物ではより有意に増大したことを示す図である（＊＝ｐ＜０．０００８）。（Ｄ）ＩＤ１遺伝子発現も、対照ＭＳＣおよびＧＦＰトランスフェクト対照培養物と比較して、ＯＧＦＲ欠損ＭＳＣにおいて増大したことを示す図である（＊＝ｐ＜０．０２１７）。（Ｅ）骨芽細胞特異的タンパク質オステオカルシン（ＯＣＮ）も、対照培養物およびＧＦＰトランスフェクト対照と比較して、骨芽細胞になるよう誘導したＯＧＦＲ欠損ＭＳＣにおいて有意に増大したことを示す図である（＊＝ｐ＜０．０２１５）。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｇは、（Ａ）１ｍＭのナロキソン治療剤の添加によって、対照ＰＢＳまたはｍｅｔ５治療欠陥と比較して、片側皮質欠陥において１．５３倍骨塊（Ｂｖ／Ｔｖ）が増大したことを示す図である（＊＝ｐ＜０．００１）。（Ｂ）対照、ナロキソンまたはｍｅｔ５治療群欠陥のμＣＴイメージの図である。（Ｃ）骨塊（Ｂｖ／Ｔｖ）の増加と小柱数（ＴｂＮ）の１．２倍の増大が平行したことを示す図である（＊＝ｐ＜０．０４７）。（Ｄ）手術対照群（Ｓ×対照）における片側皮質欠陥の手術時投与は、対照非手術群と比較して（全体積によって補正した骨体積）Ｂｖ／Ｔｖを増大させ、これは欠陥内に蓄積した骨塊に相当することを示す図である（＊＝ｐ＜０．０３４）。ウシコラーゲンインプラントとＰＢＳまたはｍｅｔ５で治療した欠陥は手術対照と違わなかった。しかしながら、ＰＢＳ治療群（＊＝ｐ＜０．００２１）とｍｅｔ５治療群（＊＝ｐ＜０．０００９）の両方が非手術対照群と比較して有意に増大した。ＢＭＰ２、ナルトレキソンまたはナロキソンで治療した欠陥は非手術対照群と比較していずれも増大した（＊＝ｐ＜０．０００１）。ＢＭＰ２、ナルトレキソンおよびナロキソン治療群は、手術対照群（Ｘ＝ｐ＜０．０００５）、ＰＢＳ治療群（＃＝ｐ＜０．０１２４）およびｍｅｔ５治療群（＋＝ｐ＜０．０１１）と比較したとき有意に増大した。ＢＭＰ２治療群のＢｖ／Ｔｖはナルトレキソン治療群と異ならず、一方ナロキソン治療群のＢｖ／Ｔｖは有意に増大した（０＝ｐ＜０．０３５）。（Ｅ）小柱の厚さ（ＴｂＴｈ）は手術対照（Ｓ×対照）群、ｍｅｔ５治療群、ＢＭＰ２治療群、ナルトレキソン治療群およびナロキソン治療群において増大したことを示す図である（＊＝ｐ＜０．０４）。ナロキソン治療群におけるＴｂＴｈのみが、ＢＭＰ２治療群またはナルトレキソン治療群より大きかった（＊＊＝ｐ＜０．０００２）。（Ｆ）コラーゲンインプラントが、ＳＨＡＭ手術対照と比較して腰椎脊柱における骨形成を増大させたことを示す図である。しかしながら、ＢＭＰ２＋コラーゲンまたはナロキソン＋コラーゲンインプラントは、コラーゲンインプラント単独より骨形成を増大させた。（Ｇ）コラーゲンインプラントおよびナロキソン＋コラーゲンインプラントに関する腰椎骨癒合塊のμＣＴイメージの図である。
【図３−２】図３−１の続き。
【図３−３】図３−２の続き。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、（Ａ）ＯＧＦＲ遺伝子発現が、骨芽細胞（＊＝ｐ＜０．０１８）、骨腫瘍細胞のＲＤＥＳユーイング肉腫（＊＝ｐ＜０．００１４）、骨腫瘍細胞のＨｓ８２２ｔユーイング肉腫（＊＝ｐ＜０．０００１）、骨腫瘍細胞のＨｓ８６３ｔユーイング肉腫（＊＝ｐ＜０．０３９）およびＳａＯＳ２骨肉腫腫瘍細胞（＊＝ｐ＜０．０５）において確認されたことを示す図である。（Ｂ）１ｍＭのナロキソンまたは１ｍＭのナルトレキソンのいずれかの添加後７２時間で、ＳａＯＳ２骨肉腫細胞の数が対照培養物と比較して有意に減少したことを示す図である（＊＝ｐ＜０．０００１）。ＯＧＦＲリガンド、ｍｅｔ５が細胞数に対して影響を与えることはなかった。（Ｃ）Ｈｓ８２２ｔユーイング肉腫の骨腫瘍細胞系が培養中接着した状態であることを示す図である。１ｍＭ用量のナルトレキソンの添加後７２時間で、Ｈｓ８２２ｔユーイング肉腫の骨腫瘍細胞の数は対照培養物と比較して減少した（＊＝ｐ＜０．００２５）。ナロキソンがＨｓ８２２ｔ腫瘍細胞の数に対して影響を与えることはなかった。対照的に、５０ｍＭのｍｅｔ５の添加はＨｓ８２２ｔ腫瘍細胞数の有意な増大をもたらした（Ｘ＝ｐ＜０．０３）。（Ｄ）ＲＤＥＳユーイング肉腫の骨腫瘍細胞が培養中緩く接着した状態であることを示す図である。１ｍＭ用量のナロキソンまたは１ｍＭ用量のナルトレキソンのいずれかの添加後７２時間で、ＲＤＥＳユーイング肉腫の骨腫瘍細胞の数は対照培養物と比較して有意に減少した（＊＝ｐ＜０．０００５）。ｍｅｔ５の添加がＲＤＥＳ腫瘍細胞の数に対して影響を与えることはなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
ナロキソンまたはナルトレキソンは破骨細胞数を減らしながら骨形成を増大することが、本明細書において実証されている。骨形成の増大は、ウシコラーゲン担体有りまたは無しでの片側皮質欠陥の手術誘導後、またはウシコラーゲン担体を使用した後外側方脊椎骨突起の癒合後にマイクロ−ＣＴを使用し測定され、培養および骨形成中に観察される無機質形成によってサポートされる。手術モデルは多量のアルブミンを含有する損傷をもたらし、これによりナロキソンとナルトレキソンを封鎖し、それによってこれらＯＧＦＲアンタゴニストの長期利用をサポートすることができる。
【００２８】
一態様では、本発明は、骨形成を促進するおよび／または骨破壊を低減するための方法を提供する。この方法は、骨中の損傷部位または手術介入部位に一定量のＯＧＦＲアンタ
ゴニストを投与する工程を含む。
【００２９】
本明細書で使用する「手術介入」は、骨折を修復するための手術手順、背骨癒合（例えば脊椎癒合）のために使用される手術手順、または例えば全身関節形成術中のインプラントの一体化、骨折修復中に使用される骨用スクリュー、腱または靭帯を固定するために使用される骨用スクリュー、または整形外科手術部位を機械的に安定させるよう設計された任意の整形外科用ハードウェアを含めた手術手順を含む。
【００３０】
ＯＧＦＲアンタゴニスト
「ＯＧＦＲアンタゴニスト」によって、少なくとも１つのＯＧＦＲ仲介生物活性を阻害する、抑制する、またはその中断を引き起こす任意の分子を意味する。
【００３１】
幾つかの実施形態では、ＯＧＦＲアンタゴニストは、ＯＧＦＲ結合アンタゴニスト、すなわちＯＧＦＲとｍｅｔ５−リガンド（ＯＧＦ）の相互作用または結合に干渉する、それを遮断する、または他の場合それを妨げる分子である。ＯＧＦＲ結合アンタゴニストは２形式で働くことができる。第一にＯＧＦＲアンタゴニストは、ＯＧＦＲとｍｅｔ５−リガンドの結合により他で誘導される可能性がある下流シグナル伝達を誘発せずに、核膜の表面上でのＯＧＦＲとの結合に関してｍｅｔ５−リガンドと競合し、それによってＯＧＦＲとｍｅｔ５−リガンドの結合に干渉する、それを遮断する、または他の場合それを妨げることができる。あるいは、ＯＧＦＲ結合アンタゴニストは、十分なアフィニティーと特異性でＰＥＮＫもしくはｍｅｔ５−リガンドと結合、またはそれを封鎖し、ＯＧＦＲとｍｅｔ５−リガンドの結合に実質的に干渉する、それを遮断する、または他の場合それを妨げ、それによって少なくとも１つのＯＧＦＲ仲介生物活性を阻害する、抑制する、またはその中断を引き起こすことができる。一般的に言うと、ＯＧＦＲ結合アンタゴニストは高分子（例えば抗体）または低分子（例えば、１５ｋＤ、１２ｋＤ、１０ｋＤもしくはさらに８ｋＤ未満の分子量の化合物）であってよく、ポリペプチド、核酸、または合成低分子化合物であってよい。ＯＧＦＲ結合アンタゴニストは、当業者によって容易に選択される任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより確認することができる。例えばＯＧＦＲアンタゴニストは、米国特許第５，８８２，９４４号、米国特許第６，００７，９８６号、または米国特許第６，２７０，９７９号中に記載された方法を使用して確認することができる。
【００３２】
一実施形態では、ＯＧＦＲ結合アンタゴニストは、ナロキソンまたはその機能性誘導体、ナルトレキソンまたはその機能性誘導体、またはそれらの組合せである。
【００３３】
本明細書で使用する「機能性誘導体」は、原型分子と構造的および機能的に類似した（例えば、ＯＧＦＲアンタゴニストとしてナルトレキソンもしくはナロキソンの機能を維持する）誘導体またはアナログを指す。ナロキソンおよびナルトレキソンアナログは、Ｍａｒｃｈ  Ｊ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版（１９８５）中に記載された手順などの標準的合成手順を使用して合成することができる。ナルトレキソンおよびナロキソン機能性誘導体の例には塩型、例えばナロキソン塩酸塩二水和物またはナルトレキソン塩酸塩がある。本発明の方法中で使用するのに適したナルトレキソンおよびナロキソン機能性誘導体の他の例には、例えば米国特許出願公開第２００７／０１９７５７３号Ａ１、米国特許第６，７１３，４８８号中に開示されたナルトレキソンおよびナロキソンアナログがある。
【００３４】
別の実施形態では、ＯＧＦＲ結合アンタゴニストはオキシモルフォンに由来しＯＧＦＲと結合し、ナロキソン、ナルトレキソン、ナロルフィン、ナロキソナジン、レバロルファン、ナルメフェン、シプロジム、シクロルファン、シクラゾシン、オキシロルファン、ＬＹ１１３８７８、ＭＲ２２６６、ジプレノルフィン、ＷＩＮ４４，４４１−３、ナルトリンドールまたはノルビナルトルフィミンを含む。
【００３５】
さらに別の実施形態では、ＯＧＦＲ結合アンタゴニストはトランス−３，４−ジメチル−４−フェニルピペリジンに由来しＯＧＦＲと結合し、ＬＹ９９３３５、ＬＹ２５５０６、ＬＹ１１７４１３、またはＬＹ２５５５８２を含む。
【００３６】
別の実施形態では、ＯＧＦＲ結合アンタゴニストはｍｅｔ５−エンケファリンまたはｌｅｕ−エンケファリンペプチドに由来しＯＧＦＲと結合し、ＯＧＦＲを標的化するための手段として以下のアミノ酸配列、ｍｅｔ５−エンケファリン由来の配列に関してＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ（配列番号１）、またはｌｅｕ−エンケファリン由来の配列に関してＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（配列番号２）を少なくとも含む。
【００３７】
さらに別の実施形態では、ＯＧＦＲ結合アンタゴニストはペプチドアンタゴニストＩＣＩ１７４８６４（Ｎ，Ｎ−ジアリル−Ｔｙｒ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ、配列番号３、Ａｉｂ＝アミノイソ酪酸）、またはソマトスタチンアナログＣＴＰ（Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｅｎ−Ｔｈｒ−ＮＨ２、配列番号４）に由来する。
【００３８】
他の実施形態では、ＯＧＦＲ結合アンタゴニストの代わりにＯＧＦＲアンタゴニストが、ＯＧＦＲ内に見られる核局在配列、２５１ＱＳＡＬＤＹＦＭＦＡＶＲＣＲＨＱＲＲＱＬＶＨＦＡＷＥＨＦＲＰＲＣＫＦＶＷＧＰＱＤＫＬＲＲＦＫＰＳＳＬ（配列番号５）を妨害する分子である。
【００３９】
さらに他の実施形態では、本発明の方法中で利用するＯＧＦＲアンタゴニストは、ＯＧＦＲ遺伝子を対象としＯＧＦＲ遺伝子発現を妨害する際に有効な低分子ヘアピン（ｓｈ）−ＲＮＡまたは低分子干渉（ｓｉ）−ＲＮＡである。
【００４０】
本明細書に記載されるＯＧＦＲアンタゴニストは個別または組合せで投与することができる。適切な組合せには、例えばナロキソンとナルトレキソン、別のＯＧＦＲ結合アンタゴニストまたは別のＯＧＦＲアンタゴニストと組合せたナロキソンおよび／またはナルトレキソンがある。
【００４１】
ＯＧＦＲアンタゴニストと他の活性剤の組合せ
本明細書に記載されるＯＧＦＲアンタゴニストは、ＳＭＡＤシグナル伝達を介して骨の形成または成長を促進しＯＧＦＲアンタゴニストと相乗作用することができる、１つまたはそれ以上の他の活性剤と組合せて投与することができる。このような活性剤の例には、ＳＭＡＤ１／５／８シグナル伝達を制御することができるＢＭＰ分子（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ６およびＢＭＰ−７）があるが、これらだけには限られない。ＭＳＣプールを拡大することができ、したがってＯＧＦＲアンタゴニストにより制御される可能性があるＴＧＦβ分子。ＴＧＦβシグナル伝達を低減するＬＹ２１０９７６１を含めたＴＧＦβ阻害剤は、阻害剤ＳＭＡＤ（ＳＭＡＤ６およびＳＭＡＤ７）のシグナル伝達を減少させ、したがってＢＭＰシグナル伝達をアンタゴナイズし骨形成を低減する。例えば、コラーゲンインプラントに、本発明の方法中で使用するのに望ましいＢＭＰ分子、ＴＧＦβ分子またはＴＧＦβ阻害剤分子、およびＯＧＦＲアンタゴニストを注入することができる。
【００４２】
本明細書に記載されるＯＧＦＲアンタゴニストは、骨の形成または成長を促進する１つまたはそれ以上の他の活性剤と組合せて投与することができる。このような活性剤の例には、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦα、およびサイトカインなどの１つまたはそれ以上の増殖因子、間葉系幹細胞、軟骨細胞、および骨髄細胞などの細胞
があるが、これらだけには限られない。例えば、コラーゲンインプラントに、本発明の方法中で使用するのに望ましいＶＥＧＦ分子などの増殖因子とＯＧＦＲアンタゴニストの両方を注入することができる。ＯＧＦＲアンタゴニストを癌患者の治療において化学療法剤と組合せて投与し、その患者における骨の形成または成長を促進することもできる。
【００４３】
送達システム／担体
本明細書に記載されるＯＧＦＲアンタゴニストを、担体有りまたは無しで局所に投与して、骨折修復を加速するまたは脊椎骨の癒合を促進することができる。幾つかの実施形態では、ＯＧＦＲアンタゴニストを投与用の担体と組合せる、またはその中に封入する。
【００４４】
適切な担体はビーズ、ミクロスフェアまたはナノ粒子の型であってよく、天然および／または合成生体適合性ポリマーで構成されていてよい。適切な生体適合性ポリマーの例には、ヒアルロン酸、コラーゲン、リン酸三カルシウム、コンドロイチン硫酸、ポリブチレート、ポリラクチド、ポリグリコリド、およびラクチド／グリコリドコポリマー、およびこれらの混合物またはコポリマーがある。適切な担体は、非ポリマー系、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、アミノ酸、ステロールなどの脂質など、ハイドロゲル徐放系、シラスティック系、ペプチドベース系、インプラントなども含む。
【００４５】
一実施形態では、担体は吸湿性のコラーゲンベースの担体（例えば、コラーゲンスポンジ、コラーゲン足場、粉末状コラーゲン、またはコラーゲンベースのゼラチンハイドロゲル）である。
【００４６】
別の実施形態では、担体は、親水性ハイドロゲルベースの担体（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸）であり、これは、その中に注入されたＯＧＦＲアンタゴニスト（例えば、ナロキソンまたはナルトレキソンまたはそれらの機能性誘導体）を所定期間にわたり放出することを可能にする。
【００４７】
さらに別の実施形態では、担体は、ＩＡドメインとＩＩＡドメインの間の界面に位置するナロキソン／モルフィン結合部位を維持する、および／またはナロキソンまたはナルトレキソンまたはそれらの機能性誘導体などのＯＧＦＲアンタゴニストと結合しＯＧＦＲアンタゴニストの徐放を可能にするトリプトファン（Ｔｒｐ）−２１４周辺のナロキソン結合部位を維持する、アルブミン、アルブミンの誘導体または断片である。
【００４８】
さらに別の実施形態では、例えば、ナロキソンまたはナルトレキソンまたはそれらの機能性誘導体などのＯＧＦＲアンタゴニストと結合しＯＧＦＲアンタゴニストの徐放を可能にする、メチルセルロース、インサートゲル。
【００４９】
さらなる実施形態では、担体はウシコラーゲンインプラントである。ＯＧＦＲアンタゴニスト、例えばナロキソンまたはナルトレキソンまたはそれらの機能性誘導体を、ウシコラーゲンスポンジ、粉末状ウシコラーゲン、またはコラーゲンベースのゼラチン構築物と共に供給されるＩＮＦＵＳＥ（ＢＭＰ２）またはＯＰ１−パテまたはＯＰ１−インプラントと同様の形式で、ウシコラーゲンインプラントと組合せることができる。ナロキソン、ナルトレキソンまたはそれらの機能性誘導体の投与は、滅菌生理食塩水で粉末状ナロキソンまたはナルトレキソンまたはそれらの機能性誘導体を戻し、次いでＯＧＦＲアンタゴニスト−生理食塩水溶液をコラーゲンインプラントに加えることによって行うことができ、その後インプラントは手術介入部位に局所送達することができる。
【００５０】
さらに別の実施形態では、担体は、例えば、ケージ、スクリュー、ロッド、プレート、拡張型ケージ、アンカー（金属ベース、合成または生分解性アンカー）から選択される手術用インプラント、または手術用インプラント送達システムである。
【００５１】
さらなる実施形態では、担体は、チップまたは粉末の形態のβ型リン酸三カルシウム、セメント（ポリメチルメタクリレートまたは「ＰＭＭＡ」）、または例えばパテ、ペースト、ボート、もしくは注射用製剤の形態の無機質除去した骨マトリックス足場で構成される。
【００５２】
別の実施形態では、担体はＰＧＡ（ポリグリコール酸）−ＰＬＧＡ（ポリ乳酸グリコール酸）球体で構成され、これはＯＧＦＲアンタゴニストを封入し即時型、遅延型または持続型放出をもたらすことができる。
【００５３】
別の実施形態では、担体は、皮質海綿質同種移植片、皮質用チップおよび構造同種移植片などの同種移植片である。
【００５４】
別の態様では、本開示は、骨中の局所損傷部位または手術介入部位への間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の動員を促進して、破骨細胞誘導型骨分解（または再吸収）を阻害しながら治癒を促進するための方法を提供する。この方法は、骨分解を阻害しながら骨形成を促進するための、一定量の本明細書に記載するＯＧＦＲアンタゴニスト（例えば、ナロキソンまたはナルトレキソンまたはそれらの機能性誘導体）の投与に基づく。
【００５５】
さらに別の態様では、本開示は、本明細書に記載するＯＧＦＲアンタゴニスト（例えば、ナロキソンまたはナルトレキソンまたはそれらの機能性誘導体）の投与に基づき骨壊死または放射線骨壊死を治療する方法を提供する。
【００５６】
幾つかの実施形態では、本開示は適切な用量範囲を提供し、その用量範囲で、ナロキソン（４００ｎｇ／ｍＬ（１μＭ）〜４００μｇ／ｍＬ（１ｍＭ））および／またはナルトレキソン（３７８ｎｇ／ｍＬ（１μＭ）〜３７８μｇ／ｍＬ（１ｍＭ））を、１μＭ〜１ｍＭの間の範囲で破骨細胞形成の低減によって骨形成を増大するおよび／または骨分解を低減するのに有効な用量で投与する。ナロキソンの具体的な用量は、これらの用量が１μＭ〜１ｍＭの間の範囲である限り、例えば４００ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、または前述用量のいずれかの間の量であってよい。これらの用量は１回投与または複数回投与で送達することができる。有効である正確なナロキソンの合計量は、損傷の程度または手術用途および使用する担体に依存する。例えば、４００μｇ／ｍＬナロキソン−生理食塩水溶液、または４００μｇ／ｃｍ３ナロキソン−生理食塩水溶液に等しい任意の同等用量が、寸法２ｃｍ×２ｃｍ×０．２５ｃｍの寸法または１ｃｍ３のナロキソンまたはその機能性誘導体（例えば、１ｍＭのナロキソン−生理食塩水溶液を注入したコラーゲン）を有する各コラーゲンインプラントに関して勧められ、それを損傷部位または局所手術部位に投与して手術領域内の相当な骨形成および破骨細胞数の抑制をもたらすことができる。ナルトレキソンの具体的な用量は、例えば３７８ｎｇ／ｍＬ、７５６ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、３７８μｇ／ｍＬ、または前述用量のいずれかの間の量であってよい。有効である正確なナルトレキソンの合計量は、損傷の程度または手術用途および使用する担体に依存する。例えば、３７８μｇ／ｍＬナルトレキソン−生理食塩水溶液、または３７８μｇ／ｃｍ３ナルトレキソン−生理食塩水溶液に等しい任意の同等用量が、寸法２ｃｍ×２ｃｍ×０．２５ｃｍの寸法または１ｃｍ３のナルトレキソンまたはその機能性誘導体（例えば、１ｍＭのナルトレキソン−生理食塩水溶液を注入したコラーゲン）を有する各コラーゲンインプラントに関して必要とされ、それを損傷部位または局所手術部位に投与して手術領域内の相当な骨形成および破骨細胞数の抑制をもたらすことができる。
【００５７】
本明細書の記載事項を以下の実施例によってさらに例示し、これらは決して限定的なも
のとして解釈すべきではない。（本出願全体を通じて引用した参照文献、交付特許、および公開特許出願を含む）引用した全ての参照文献の内容は、参照によって本明細書に明確に組み入れられる。
【実施例１】
【００５８】
オピオイドアンタゴニストは骨の形成と再吸収を制御する
方法：ヒト骨髄を、ＩＲＢ認証試験の一部として、選択的主要近位大腿全周臀部関節形成術または選択的主要遠位大腿全周膝部関節形成術のいずれかを施した承認済み成人患者から回収した（ｎ＝６、平均年齢６５才）。ヒトＭＳＣは回収した各完全骨髄吸引物由来の細胞の接着性分画に由来し、一方で単球集団は骨髄の非接着性分画から回収した。単球分画は、１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトマクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ；Ｗｙｅｔｈ）と共に継代培養によって富化させた。以下に記載した平行実験では、３週齢（ｎ＝１０）および１６週齢（ｎ＝２０）のオスのマウスから大腿骨を回収し、次いで以下の事項に従い大腿骨から骨髄を取り出した。近位端および遠位端大腿骨の除去後２１ゲージニードルを大腿骨髄腔中に挿入した。次いで媒体を近位端大腿骨に注意深く通し、それによって骨から骨髄を押し出した。最後に、１８ゲージニードルを使用して骨髄ペレットを機械的に解離させ、次いで７０μｍメッシュフィルターに通した。これらの完全骨髄吸引物を使用して破骨細胞を作製した。細胞は１０％ウシ胎児血清（ｖ／ｖ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＰＳＧ；Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）中に維持した。組換えヒトネトリン−リガンド（ＮＴＮ１およびＮＴＮ４）をＰＢＳ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中に希釈した。管轄ＩＡＣＵＣ委員会はこの実験中に記載した全ての動物実験を承認した。
【００５９】
遺伝子発現解析：ヒト骨髄由来のＭＳＣ、骨芽細胞および脂肪細胞を遺伝子発現の変化に関してアッセイした。平行して、ヒト単球由来の破骨細胞も骨髄遺伝子発現の変化に関してアッセイした。遺伝子データは、少なくとも３患者から回収した、２つの独立に作製したサンプルから誘導した。ｍＲＮＡはＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ｃＤＮＡはｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して合成した。遺伝子発現は、Ｆａｓｔ  Ｐｌｕｓ  ＥｖａＧｒｅｅｎマスター混合物（Ｂｉｏｔｉｕｍ）と混合した１００ｎｇのｃＤＮＡを使用して、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用し解析した。それぞれの実験では、ＧＡＰＤＨを対照として用いて、陰性対照は鋳型を含有せず、化学合成したＧＡＰＤＨ配列（０、１、１０および１００フェトグラム；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の連続希釈を使用して標準曲線を作製した。遺伝子発現は、ソフトウェアＬｉｎＲｅｇＰＣＲ（ｖ２０１３．０）を使用して蛍光−交差閾値曲線の線形部分から各プライマーの有効性（Ｅ）と開始遺伝子産物濃度（Ｎ０）を計算する、Ｐｆａｆｆｌの方法を使用して評価した。対照遺伝子ＧＡＰＤＨが標準曲線の範囲内にありプライマー有効性（Ｅ）がＥ＞＝１．８であると計算したとき、実験は有効であると考えた。融解曲線解析を使用して一遺伝子産物の存在を確認し、産物の大きさは遺伝子産物ゲル電気泳動を使用して確認した。
【００６０】
ウエスタンブロット解析によるタンパク質発現：ヒトＭＳＣ、骨芽細胞および破骨細胞を、２ｍＭのヨードアセトアミド、２ｍＭのベンズアミジン塩酸塩、０．１ｍＭのエチルマレイミド、１％のＰＭＳＦおよびＨａｌｔプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する氷冷ＲＩＰＡバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶かした。タンパク質溶解物は、３患者サンプルから作製した少なくとも２つの複製から解析した。全てのタンパク質は、製造者の説明書に従いＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してアッセイした。サンプルはＰａｇｅ  Ｒｕｌｅｒ  Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ  ＮＩＲタンパク質ラダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含む１０〜２０％Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉ
ｃｉｎｅ  Ｐｒｅｃａｓｔゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上に載せ（２０μｇ／ウエル）、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。５％ノンファットミルクおよびＯＧＦＲ一次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用しブロッキングした膜上でＯＧＦＲを確認した。アクチン（１：５００）およびδ−チューブリンを充填対照として用いた。Ｃｌａｒｉｔｙ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＥＣＬ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と共にＨＲＰ結合マイクロポリマー結合二次抗体（ＩｍｍＰｒｅｓｓキット、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を使用して、抗体を検出した。マウス脳タンパク質溶解物（ｍＢ）は陽性発現対照として使用した。
【００６１】
骨形成：ＭＳＣにおける骨形成能力を、化学的に誘導した無機質形成によりアッセイした。少なくとも３人のヒト患者由来のＭＳＣをウエルあたり５×１０３細胞で接種し、放置し融合状態にして骨形成誘導培地への添加前に組み込んだ。骨形成誘導培地は、２５μｇ／ｍＬのアスコルビン酸−２−リン酸（Ｓｉｇｍａ）、１００ｎＭのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）を補充した２０％ＦＣＳ（ｖ／ｖ）および１％ＰＳＧを含有するＤＭＥＭからなっており、β−グリセロホスフェート（ＢＧＰ；Ｓｉｇｍａ）：５ｍＭのＢＧＰで１回培地交換、１０ｍＭのＢＧＰで１回培地交換および２０ｍＭのＢＧＰで１回培地交換の以下の用量レジメンであった。Ｍｅｔ５−リガンド（０、［５μＭ］２．８７、または［５０μＭ］２８．７μｇ；Ｓｉｇｍａ）、ナロキソン（０、４００ｆｇ、４００ｐｇ、４００ｎｇ、４００μｇ；Ｓｉｇｍａ）、ナルトレキソン（０、３７８ｆｇ、３７８ｐｇ、３７８ｎｇ、３７８μｇ；Ｓｉｇｍａ）を、以下のように１）１回、骨形成誘導培地への第１回添加、２）２回、骨形成誘導培地への第１回および第２回添加、および３）それぞれの誘導後培地の交換で加える。陽性対照ウエルは、骨形成誘導培地への第１回添加で、２５ｎｇの組換えヒトＢＭＰ２／ＢＭＰ７−リガンド（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて処理した。無機質結節の出現後、細胞を７０％氷冷ＥｔＯＨ（Ｓｉｇｍａ）で固定し、次いで４０ｍＭのアリザリンレッド−Ｓ（ｐＨ４．２、Ｓｉｇｍａ）を使用して染色した。骨形成実験は各患者に関して少なくとも２回繰り返した。
【００６２】
細胞数のアッセイ：１ｍＭのナロキソンまたは１ｍＭのナルトレキソンの添加後、生存細胞数をＭＴＴアッセイで決定した。７２時間後と１２０時間後に、ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）、Ｓｉｇｍａ）を各ウエルに加え、２時間インキュベートし、その後細胞は５００μｌのＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）で溶かした。ＭＴＴは５７０ｎｍで測定し、細胞増殖に対する療法の影響は、未処置ウエルからの平均値に対して処置ウエルを標準化することにより決定した。細胞数の変化倍率＝１００＊［処置細胞の光学濃度／平均対照の光学濃度］。
【００６３】
ＴＲＡＰ染色および破骨細胞数のアッセイ：破骨細胞はヒト単球の富化集団、またはマウスの非富化完全骨髄吸引物のいずれかに由来した。３つのヒト患者骨髄サンプルを、３週齢（ｎ＝１０）のマウス骨髄から回収したサンプルと平行してアッセイした。単球分画を刺激し、ｍｅｔ５−リガンド（［５μＭ］２．８７、または［５０μＭ］２８．７μｇ；Ｓｉｇｍａ）、ナロキソン（４００ｎｇもしくは４００μｇ；Ｓｉｇｍａ）またはナルトレキソン（３７８ｎｇもしくは３７８μｇ；Ｓｉｇｍａ）の存在下で、２５ｎｇ／ｍＬのＭＣＳＦおよび２５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトまたはマウスＲＡＮＫ−リガンド（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に１×１０６個の細胞を培養することにより破骨細胞状態にした。破骨細胞は酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ；Ｓｉｇｍａ、白血球酸性ホスファターゼキット３８７−Ａ）で染色し、細胞がＴＲＡＰ陽性染色され少なくとも３個の核を有していたとき計数した。破骨細胞数の推定値は、Ｃａｖａｌｉｅｒｉサンプリングおよびフラクショネーター技法の変形によって得た。
【００６４】
ＯＧＦ受容体のｓｈＲＮＡノックダウン：ＯＧＦ受容体の活性を、市販のネオゲニンｓｈＲＮＡレンチウイルスを使用し、または対照としてＧＦＰレンチウイルス（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＭＳＣをトランスフェクトすることにより阻害した。次いでＭＳＣを誘導して骨芽細胞状態にし、その後ＢＭＰ標的遺伝子（ＩＤ１、ＩＤ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＭＡＤ８／９およびオステオカルシン（ＯＣＮ））に関してアッセイした。
【００６５】
片側皮質欠陥モデル：オスの３週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（治療群あたりｎ＝５）に、片側皮質欠陥の作製後、ｍｅｔ５、ナロキソンまたはナルトレキソンを注射した。簡単に言うと、小さな切れ目（約３ｍｍ）を、脛骨隆線上の脛骨粗面直下、脛骨の内側に位置する膝関節の直下に作製した。若年動物では、骨端板をはっきりと見ることができ、錐先はこの地点の約１ｍｍ下に置いた。この錐先によって、直径３００μｍ×深さ１ｍｍの寸法を有する片側皮質欠陥が生じた。３３ゲージブラントチップニードルを有するＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｎｅｕｒｏｓ  ＲＮ１０μＬシリンジを使用して、１秒あたり約０．１μＬより早くない速度で片側皮質欠陥に直接、生理食塩水に再懸濁した２μＬのｍｅｔ５（２８．７μｇ）、ナロキソン（４００μｇ）またはナルトレキソン（３７８μｇ）を注入した。左脚脛骨は対側性手術対照として用いて、試験中動物には片側皮質欠陥を施し、２μＬの生理食塩水を注入した。マウスは手術後５日で安楽死させ、後脚を回収し、脛骨は免疫蛍光、ＴＲＡＰ染色およびＯＴＣ関連骨成長用に固定した。
【００６６】
片側皮質欠陥モデルへのオピオイドアンタゴニスト含有コラーゲンインプラントの移植：オスの５週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（合計２５匹の全動物に関して治療群あたりｎ＝５）をこの試験において使用した。治療群は、以下の１）ＰＢＳ＋コラーゲンスポンジ、２）ｍｅｔ５＋コラーゲンスポンジ、３）ＢＭＰ２＋コラーゲンスポンジ、４）ナルトレキソン＋コラーゲンスポンジ、５）ナロキソン＋コラーゲンスポンジからなっていた。脛骨隆線上の脛骨粗面直下、脛骨の内側に位置する膝関節の直下に作製した小さな切れ目（約３ｍｍ）によって、片側皮質欠陥を手術により施した。５週齢のオスのマウスでは、骨端板をはっきりと見ることができ、錐先はこの地点の約１ｍｍ下に置いた。この錐先によって、直径３００μｍ×深さ１ｍｍの寸法を有する片側皮質欠陥が生じた。ウシコラーゲンスポンジインプラント（Ｄｕｒａｆｏｒｍ）を調製し（約１ｍｍ×１ｍｍ）、次いでＰＢＳ、５０μＭ（２８．７μｇ、１０μＬ中）、ｍｅｔ−５エンケファリン（ｍｅｔ５）、２５ｎｇのＢＭＰ２、１ｍＭのナルトレキソン（３７８μｇ、１０μＬ中）または１ｍＭのナロキソン（４００μｇ、１０μＬ中）に浸した（各治療群に関してｎ＝５、合計２５匹の動物）。片側皮質欠陥を、コラーゲンスポンジインプラントを与えなかった別群のマウスに施した（ｎ＝５；片側皮質欠陥の手術対照）。平行して、別群の動物を非手術対照として用いた。マウスは手術後７日で安楽死させ、後脚を回収し、脛骨はマイクロ−ＣＴ（μＣＴ）解析用に調製した。
【００６７】
ラットのＬ５−Ｌ６脊椎の後外側方脊椎癒合：２０匹の、オスの１ヶ月齢の骨格的に成熟したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、Ｌ５−Ｌ６脊椎で両側腰椎後外側方脊椎癒合を施した。治療群は、以下の１）擬似手術対照、２）コラーゲンスポンジインプラント、３）ＢＭＰ２＋コラーゲンスポンジインプラント、４）ナロキソン＋コラーゲンスポンジインプラントからなっていた。滅菌条件下で、Ｌ５−Ｌ６脊椎を中心に２ｃｍ長の後方正中線の切れ目を入れた。筋肉分離手法を小関節の後方に使用して、特定脊椎の横突起を露出させた。高速１ｍｍ回転切削器具を使用しＬ５−Ｌ６脊椎の横突起を剥皮した。インプラントを調製し、脊椎周辺筋肉床の両側、横突起の間に移植した。ウシコラーゲンスポンジインプラントを調製し（約１ｃｍ×１ｃｍ）、次いでＰＢＳ、２５ｎｇのＢＭＰ２、１ｍＭのナロキソン（４００μｇ、１０μＬ中）に浸した。動物は２ヶ月で安楽死させ（合計ｎ＝２０ラットに関して治療群あたり時間地点あたりｎ＝５ラット）、脊椎はマイクロ−ＣＴ（μＣＴ）解析用に回収し調製した。
【００６８】
片側皮質欠陥のマイクロＣＴ解析：脛骨の高解像度画像をμＣＴ画像システム（μＣＴ４０；Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いて得た。脛骨は４５ｋｅＶおよび１２μｍの等方性ボクセルサイズでスキャンした。解析領域は軸部分から選択して、骨内膜皮質壁によって境界付けられた片側皮質欠陥全体を含めた。体積補正骨体積（骨体積／全体積；Ｂｖ／Ｔｖ）、小柱の数（ＴｂＮ）および小柱の厚さ（ＴｂＴｈ）を、Ｓｃａｎｃｏソフトウェアを使用して計算した。
【００６９】
統計解析：Ｐｒｉｓｍ統計ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用してデータを解析した。平均および標準偏差を計算した。ｐ＜０．０５に設定した有意性で多重比較のＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ事後比較を使用し、一元配置分散分析法によりデータを解析した。
【００７０】
結果：
ナロキソンおよびナルトレキソンは、破骨細胞数を減らしながら骨芽細胞へのＭＳＣの分化および無機質形成を増大した：骨形成誘導培地への１μＭ〜１ｍＭの間のナロキソンの添加は、骨芽細胞になるよう誘導したＭＳＣ培養物において無機質蓄積を大幅に増大した（赤色染色）（図１Ａ）。骨形成誘導培地への１μｍ〜１ｍｍの間のナルトレキソンの添加も、ナロキソンより低い程度ではあったが無機質を増大させた（図１Ａ）。δオピオイド受容体（ＯＰＲＤ）遺伝子発現はＭＳＣにおいて最大であり、骨芽細胞（ｐ＜０．００７４）と破骨細胞（ｐ＜０．００８４）において有意に低下した（図１Ｂ）。ＯＧＦＲ遺伝子発現は、ＭＳＣ培養物と比較して骨芽細胞（ｐ＜０．０１１）と破骨細胞（ｐ＜０．０００１）において増大した（図１Ｃ）。Ｍｅｔ５（ＰＥＮＫ）遺伝子発現はＭＳＣと骨芽細胞の間で違わなかったが、しかしながら、ＰＥＮＫ遺伝子発現は破骨細胞では有意に低下した（ｐ＜０．００１８）（図１Ｄ）。骨形成誘導培地への５μＭのｍｅｔ５（ＰＥＮＫ）への添加が無機質蓄積に影響を与えることはなかったが、一方５０μｍのｍｅｔ５は無機質蓄積を若干減少させた（図１Ｅ）。しかしながら、１ｍＭのナロキソンを５μＭまたは５０μＭのｍｅｔ５と共に骨形成誘導培地に加えると、ナロキソン治療剤はｍｅｔ５の抗骨形成効果をなくすことができた（図１Ｅ）。μ−オピオイド受容体、κ−オピオイド受容体、ｍｅｔ５前駆体ＰＯＭＣおよびＣＰＡ１酵素遺伝子発現は決して観察されなかった。ＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ２、ＣＰＤおよびＣＰＥ遺伝子発現はＭＳＣ、骨芽細胞および破骨細胞において観察されたが、互いに有意に異なることはなかった。（例えば各培地交換時の）連続ナロキソン投薬を若干減らしながらの、単一「パルス」用量のナロキソン（１ｍＭ）または初回「パルス」投薬７２時間後の二重「パルス」用量のナロキソン（１ｍＭ）の添加は無機質形成の相当な増大をもたらした（図１Ｆ）。さらに本発明者らは、１ｍＭのナロキソンの添加は、７２時間（ｐ＜０．０１７７）と１２０時間（ｐ＜０．０００１）でＭＳＣ増殖を抑制したが、停止させることはなかったことを発見した（図１Ｇ）。同様にナロキソンは単球培養物の増殖を減らした（ｐ＜０．０００１）（図１Ｈ）。破骨細胞になるよう培養した単球は、対照破骨細胞培養物と比較して、ｍｅｔ５を用いた治療によって影響を受けなかった（ＴＲＡＰ染色は紫色で示す）（図１Ｉ）。１μＭのナロキソンまたは１μＭのナルトレキソンの添加によって破骨細胞数が有意に減少することはなかったが、一方１ｍＭのナロキソンまたは１ｍＭのナルトレキソンの添加によって破骨細胞数は大幅に減少した（図１Ｉ）。
【００７１】
ＯＧＦＲ発現の消失は、オステオカルシン発現の増大と平行して、骨形成に必須の転写制御因子の発現の増大をもたらした。ＯＧＦＲｓｈＲＮＡでトランスフェクトしたＭＳＣは有意に低いＯＧＦＲ遺伝子発現を示し（ｐ＜０．００８５）（図２Ａ）、これは核および細胞質タンパク質溶解物におけるＯＧＦＲの減少で立証された（図２Ｂ）。さらに、ＯＧＦＲ欠損ＭＳＣでは、ＳＭＡＤ１遺伝子発現が対照ＭＳＣおよびＧＦＰトランスフェクト対照培養物ではより有意に増大した（ｐ＜０．０００８）（図２Ｃ）。ＩＤ１遺伝子発現も、対照ＭＳＣおよびＧＦＰトランスフェクト対照培養物と比較して、ＯＧＦＲ欠損ＭＳＣにおいて増大した（ｐ＜０．０２１７）（図２Ｄ）。骨芽細胞特異的タンパク質オス
テオカルシン（ＯＣＮ）も、対照培養物およびＧＦＰトランスフェクト対照と比較して、骨芽細胞になるよう誘導したＯＧＦＲ欠損ＭＳＣにおいて有意に増大した（ｐ＜０．０２１５）（図２Ｅ）。
【００７２】
ナロキソンまたはナルトレキソンを用いた治療は動物モデルにおける手術欠陥での骨形成を増大させた。片側皮質欠陥をマウス脛骨に手術により施し、次いでそれらをナロキソン（１ｍＭ）またはｍｅｔ５（５０μＭ）で治療した。ナロキソンは骨治癒を増大したが、一方ｍｅｔ５は無影響であった（図３Ａおよび３Ｂ）。ナロキソン治療は１．５３倍骨塊（Ｂｖ／Ｔｖ）を増大した（ｐ＜０．００１）（図３Ａ）。本発明者らが測定した骨塊の増加は、小柱数（ＴｂＮ）の１．２倍の増大によって誘導された（ｐ＜０．０４７）（図３Ｃ）。手術適用後７日で、Ｂｖ／Ｔｖにより測定した片側皮質欠陥の骨折治癒は、非手術対照と比較し手術対照群（Ｓ×対照）において２５．６％増大した（ｐ＜０．０３４）（図３Ｄ）。コラーゲンインプラントと組合せてＰＢＳまたはｍｅｔ５で治療した欠陥は、骨折治癒に関して手術対照群と有意に違わなかった。しかしながら、コラーゲンインプラントと組合せたＰＢＳまたはｍｅｔ５治療は非手術対照群より約３７％の増大をもたらし、手術対照群と非手術対照群の間で観察された違いと一致した（ｐ＜０．００３）（図３Ｄ）。ＢＭＰ２およびコラーゲンインプラントでの欠陥の治療はＰＢＳ治療群と比較して３２．４％のＢｖ／Ｔｖ増大をもたらし、手術対照群と比較して５５．６％の増大をもたらした（それぞれｐ＜０．０１２４とｐ＜０．００５）（図３Ｄ）。ＢＭＰ２治療群とナルトレキソン治療群の間に有意な差はなかった。ナルトレキソンおよびコラーゲンインプラントでの欠陥の治療はＰＢＳ治療群と比較して３９．２％のＢｖ／Ｔｖ増大をもたらし、手術対照群と比較して６３．５％の増大をもたらした（それぞれｐ＜０．００４３とｐ＜０．０００１）（図３Ｄ）。最後に、ナロキソンおよびコラーゲンインプラントで治療した欠陥ではＰＢＳ治療欠陥と比較して５６．５％のＢｖ／Ｔｖ増大があり、手術対照群と比較して８３．８％の増大があった（ｐ＜０．０００１）（図３Ｄ）。さらに、ナロキソン治療によりＢＭＰ２治療群と比較して欠陥のＢｖ／Ｔｖが１８．２％増大した（ｐ＜０．０３５）（図３Ｄ）。小柱の厚さはＢｖ／Ｔｖと関係がある構造パラメーターであり、これは対象領域内の骨塊と関係がある。小柱の厚さは、対照非手術群と比較して、手術対照（ｐ＜０．０３２）、ｍｅｔ５（ｐ＜０．０３９）、ＢＭＰ２（ｐ＜０．０２５）、ナルトレキソン（ｐ＜０．０２５）およびナロキソン（ｐ＜０．００１）群では欠陥内で有意に増大した（図３Ｅ）。ナロキソンを用いた欠陥の治療によって、他の全ての治療群と比較して約３７％小柱の厚さが増大した（ｐ＜０．００１）（図３Ｅ）。さらに、欠陥のナロキソン治療で観察したＢｖ／Ｔｖの増大は、主に小柱の厚さの増大によって誘導されたようであり、一方ＢＭＰ２またはナルトレキソンでの治療は小柱の数と小柱の厚さの両方によってＢｖ／Ｔｖが増大した。後外側方腰椎脊柱へのナロキソン注入コラーゲンインプラントの添加は、コラーゲン移植脊椎または対照擬似手術群と比較してＢｖ／Ｔｖの相当な増大をもたらした（図３Ｆおよび３Ｇ）。
【実施例２】
【００７３】
肉腫細胞におけるＯＧＦＲ遺伝子発現にもかかわらず、ＯＧＦＲアンタゴニストが肉腫腫瘍の増殖を刺激することはない
方法：ヒト骨髄を、ＩＲＢ認証試験の一部として、選択的主要近位大腿全周臀部関節形成術または選択的主要遠位大腿全周膝部関節形成術のいずれかを施した承認済み成人患者から回収した（ｎ＝６、平均年齢６５才）。ヒトＭＳＣは完全骨髄吸引物の接着性分画に由来した。ユーイング肉腫腫瘍細胞（ＲＤＥＳ、Ｈｓ８２２およびＨｓ８６３）ならびにＳａＯＳ２骨肉腫腫瘍細胞はＡＴＣＣから得た。細胞は１０％ウシ胎児血清（ｖ／ｖ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＰＳＧ；Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）中に維持した。
【００７４】
遺伝子発現解析：ヒト骨髄由来のＭＳＣ、骨芽細胞および脂肪細胞を遺伝子発現の変化
に関してアッセイした。平行して、ヒト単球由来の破骨細胞も骨髄遺伝子発現の変化に関してアッセイした。遺伝子データは、少なくとも３患者から回収した、２つの独立に作製したサンプルから誘導した。ｍＲＮＡはＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ｃＤＮＡはｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して合成した。遺伝子発現は、Ｆａｓｔ  Ｐｌｕｓ  ＥｖａＧｒｅｅｎマスター混合物（Ｂｉｏｔｉｕｍ）と混合した１００ｎｇのｃＤＮＡを使用して、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用し解析した。それぞれの実験では、ＧＡＰＤＨを対照として用いて、陰性対照は鋳型を含有せず、化学合成したＧＡＰＤＨ配列（０、１、１０および１００フェムトグラム；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の連続希釈を使用して標準曲線を作製した。遺伝子発現は、ソフトウェアＬｉｎＲｅｇＰＣＲ（ｖ２０１３．０）を使用して蛍光−交差閾値曲線の線形部分から各プライマーの有効性（Ｅ）と開始遺伝子産物濃度（Ｎ０）を計算する、Ｐｆａｆｆｌの方法を使用して評価した。対照遺伝子ＧＡＰＤＨが標準曲線の範囲内にありプライマー有効性（Ｅ）がＥ＞＝１．８であると計算したとき、実験は有効であると考えた。融解曲線解析を使用して一遺伝子産物の存在を確認し、産物の大きさは遺伝子産物ゲル電気泳動を使用して確認した。
【００７５】
細胞数のアッセイ：１ｍＭのナロキソンまたは１ｍＭのナルトレキソンの添加後、生存細胞数をＭＴＴアッセイで決定した。７２時間後と１２０時間後に、ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）、Ｓｉｇｍａ）を各ウエルに加え、２時間インキュベートし、その後細胞は５００μｌのＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）で溶かした。ＭＴＴは５７０ｎｍで測定し、細胞増殖に対する療法の影響は、未処置ウエルからの平均値に対して処置ウエルを標準化することにより決定した。細胞数の変化倍率＝１００＊［処置細胞の光学濃度／平均対照の光学濃度］。
【００７６】
統計解析：Ｐｒｉｓｍ統計ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用してデータを解析した。平均および標準偏差を計算した。ｐ＜０．０５に設定した有意性で多重比較のＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ事後比較を使用し、一元または二元配置分散分析法によりデータを解析した。
【００７７】
結果：
骨肉腫およびユーイング肉腫腫瘍細胞はＯＧＦＲを発現し、ナロキソンおよびナルトレキソンは腫瘍増殖を阻害する。ＯＧＦＲ遺伝子発現が、骨芽細胞（ｐ＜０．０１８）、骨腫瘍細胞のＲＤＥＳユーイング肉腫（ｐ＜０．００１４）、骨腫瘍細胞のＨｓ８２２ｔユーイング肉腫（ｐ＜０．０００１）、骨腫瘍細胞のＨｓ８６３ｔユーイング肉腫（ｐ＜０．０３９）およびＳａＯＳ２骨肉腫腫瘍細胞（ｐ＜０．０５）において観察された（図４Ａ）。１ｍＭのナロキソンまたは１ｍＭのナルトレキソンのいずれかの添加後７２時間で、ＳａＯＳ２骨肉腫細胞の数が対照培養物と比較して有意に減少した（ｐ＜０．０００１）。ＯＧＦＲリガンド、ｍｅｔ５が細胞数に対して影響を与えることはなかった（図４Ｂ）。Ｈｓ８２２ｔユーイング肉腫の骨腫瘍細胞系は培養中接着した状態であった。１ｍＭ用量のナルトレキソンの添加後７２時間で、Ｈｓ８２２ｔユーイング肉腫の骨腫瘍細胞の数は対照培養物と比較して減少した（ｐ＜０．００２５）。ナロキソンがＨｓ８２２ｔ腫瘍細胞の数に対して影響を与えることはなかった。対照的に、５０μＭのｍｅｔ５の添加はＨｓ８２２ｔ腫瘍細胞数の有意な増大をもたらした（ｐ＜０．０３）（図４Ｃ）。ＲＤＥＳユーイング肉腫の骨腫瘍細胞は培養中緩く接着した状態であった。１ｍＭ用量のナロキソンまたは１ｍＭ用量のナルトレキソンのいずれかの添加後７２時間で、ＲＤＥＳユーイング肉腫の骨腫瘍細胞の数は対照培養物と比較して有意に減少した（ｐ＜０．０００５）。ｍｅｔ５の添加がＲＤＥＳ腫瘍細胞の数に対して影響を与えることはなかった（図４Ｄ）。
【００７８】
実施例１および２からの結果の要約：
ナロキソンおよびナルトレキソンは、破骨細胞数の減少を介して骨形成を増大し骨再吸収（破壊）を低減する。
【００７９】
ナロキソンまたはナルトレキソン注入コラーゲンインプラントは、片側皮質欠陥または癒合腰椎脊椎骨において骨形成を増大させた。
【００８０】
ＯＧＦＲの存在下にもかかわらず、ナロキソンまたはナルトレキソンが肉腫腫瘍細胞増殖を増大させることはなかった。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月20日(2020.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
損傷部位または手術介入部位で骨形成を促進するまたは骨破壊を低減するための医薬組成物であって、骨形成を促進するまたは骨破壊を低減するのに有効な量のＯＧＦＲアンタゴニストを投与する工程を含み、ここで、ＯＧＦＲアンタゴニストは、ナロキソン、ナルトレキソン、ナロルフィン、ナロキソナジン、レバロルファン、ナルメフェン、シプロジム、シクロルファン、シクラゾシン、オキシロルファン、ＬＹ１１３８７８、ＭＲ２２６６、ジプレノルフィン、ＷＩＮ４４，４４１−３、ナルトリンドールおよびノルビナルトルフィミン、それらの塩、またはそれらの組合せから選択されるオキシモルフォン誘導体であって、ここで、前記医薬組成物は損傷部位または手術介入部位に局所投与され、ＯＧＦＲアンタゴニストまたはそれらの組合せは、担体と共に投与され、および／または、骨の形成または成長を促進するための少なくとも１つの他の活性剤と組合せて投与される、前記医薬組成物。
【請求項２】
骨中の局所損傷部位または手術介入部位への間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の動員を促進して治癒を促進するための医薬組成物であって、骨分解を阻害しながら骨形成を促進するのに有効な量のＯＧＦＲアンタゴニストを投与する工程を含み、ここで、前記医薬組成物は損傷部位または手術介入部位に局所投与され、ＯＧＦＲアンタゴニストまたはそれらの組合せは、担体と共に投与され、および／または、骨の形成または成長を促進するための少なくとも１つの他の活性剤と組合せて投与される、前記医薬組成物。
【請求項３】
前記担体は、コラーゲンスポンジ、粉末状コラーゲン、またはコラーゲンベースのゼラチンハイドロゲルの形態のコラーゲンベースの担体である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
担体はアルブミンベースの担体である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
担体は親水性ハイドロゲルベースの担体である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
担体は手術用インプラントまたは手術用インプラント送達システムである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
担体はβ型リン酸三カルシウム、セメント、または無機質除去した骨マトリックスで構成される、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項８】
担体はＰＧＡ／ＰＬＧＡ球体で構成される、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項９】
損傷は骨折を含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記手術介入は、骨折の手術修復、脊椎癒合において骨を生成するための手術手順、および整形外科用インプラントまたはハードウェアと隣接骨の一体化を促進するための手術手順から選択される、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
2020097619000001.pdf