(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞バンクの解凍復元を改善する方法の提供。【解決手段】保管のために哺乳動物細胞を凍結させる方法であって、哺乳動物細胞を含有する、緩衝溶液及び凍結保護剤を含む凍結培地に塩基を添加することにより約６．７〜約８．５のｐＨに調整し、哺乳動物細胞を凍結させることを含む方法。緩衝溶液と凍結保護剤とポリペプチドをコードする核酸を含む哺乳動物細胞とを含む、哺乳動物細胞を凍結させるための哺乳動物細胞プールであって、培地が細胞を凍結させる前に約６．７〜約８．５のｐＨを有する細胞プール、該プール中で哺乳動物細胞を凍結させることを含む方法。複数の容器を含む細胞バンクであって、各容器が、緩衝溶液及び凍結保護剤を含む凍結培地と、ポリペプチドをコードする核酸を含む哺乳動物細胞とを収容し、凍結培地が細胞を凍結させる前に約６．７〜約８．５のｐＨを有する、細胞バンク。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞バンクの解凍復元を改善する方法であって、凍結培地中でバンキングするために哺乳動物細胞を凍結させることを含み、前記凍結培地が、緩衝溶液及び凍結保護剤を含み、前記凍結培地が、凍結前に約６．７〜約８．５のｐＨを有する、方法。
【請求項２】
保管のために哺乳動物細胞を凍結させる方法であって、凍結培地中で哺乳動物細胞を凍結させることを含み、前記凍結培地が、緩衝溶液及び凍結保護剤を含み、前記凍結培地が、凍結前に約６．７〜約８．５のｐＨを有する、方法。
【請求項３】
凍結培地が、凍結前に約６．７〜約８．３、約７．２〜約７．８、または約７．５のｐＨを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
凍結培地のｐＨが、約６．７〜約８．５のｐＨに調整されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
凍結培地のｐＨが、約６．７〜約８．３または約７．２〜約７．８のｐＨに調整されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
凍結培地のｐＨが、約７．５のｐＨに調整されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
細胞が、ｐＨ調整の前及び／または後に凍結培地と組み合わされる、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
調整されたｐＨが、標的ｐＨまたは測定されたｐＨである、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
標的ｐＨが、約６．７〜約８．３である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
測定されたｐＨが、約６．７〜約８．３である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
凍結培地のｐＨを調整する前に、細胞を含有する凍結培地の初期ｐＨを測定するステップを更に含む、請求項４〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
凍結培地の調整されたｐＨを測定するステップを更に含む、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
凍結培地の測定されたｐＨが標的ｐＨ未満の場合、凍結培地の調整されたｐＨが約６．７〜約８．３になるまで、調整するステップ及び測定するステップを繰り返す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｐＨが、塩基を添加することにより調整される、請求項４〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
塩基が、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳナトリウム塩、水酸化ナトリウム、及び水酸化カリウムからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
凍結培地のｐＨが、次の式、Ｖｂａｓｅ＝Ｃｂａｓｅ＊Ｖｐ（ｐＨｔ−ｐＨｉ）に従って、凍結培地に塩基を添加することにより調整され、式中、Ｃｂａｓｅが、塩基固有の係数であり、Ｖｂａｓｅが、凍結培地に添加する塩基の体積であり、Ｖｐが、凍結培地の体積であり、ｐＨｔが、標的ｐＨであり、ｐＨｉが、初期ｐＨである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
凍結培地のｐＨが、次の式、ＶＮａ２ＣＯ３＝０．００８５Ｖｐ（ｐＨｔ−ｐＨｉ）に従って、凍結培地に炭酸ナトリウムを添加することにより調整され、式中、ＶＮａ２ＣＯ３が、凍結培地に添加する１Ｍ炭酸ナトリウムの体積であり、Ｖｐが、凍結培地の体積であり、ｐＨｔが、標的ｐＨであり、ｐＨｉが、初期ｐＨである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
標的ｐＨが、６．７〜８．３、７．２〜７．８、または７．５である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物細胞が、哺乳動物細胞が凍結培地と組み合わされる前に約６．２〜約６．６のｐＨを有する培地中にある、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
凍結保護剤が、ＤＭＳＯ、グリセロール、プロパンジオール、エチレングリコール、または糖である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
凍結保護剤が、ＤＭＳＯまたはグリセロールであり、凍結前の凍結培地中のＤＭＳＯまたはグリセロールが、約５体積％〜約１２．５体積％の濃度である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞を凍結させる前の凍結培地中のＤＭＳＯまたはグリセロールが、約５体積％〜約１０体積％の濃度である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物細胞を含有する凍結培地が、凍結前に約８％〜約２８％血中血球容積（ＰＣＶ）の細胞密度を有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
哺乳動物細胞が凍結培地と組み合わされる前の細胞収穫及び濃縮プロセスの間、細胞培養流体を冷却するステップを更に含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
細胞培養流体が、約２０℃以下の温度まで冷却される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
細胞培養流体が、約１０℃以下の温度まで冷却される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
保管のために哺乳動物細胞を凍結させる方法であって、（ａ）哺乳動物細胞を含有する凍結培地のｐＨを約６．７〜約８．５のｐＨに調整することであって、前記凍結培地が緩衝溶液及び凍結保護剤を含む、調整すること、及び（ｂ）哺乳動物細胞を凍結させることを含む、方法。
【請求項２８】
ｐＨが、約６．７〜約８．３または約７．２〜約７．８のｐＨに調整される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ｐＨが、約７．５のｐＨに調整される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
調整されたｐＨが、標的ｐＨまたは測定されたｐＨである、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
標的ｐＨが、約６．７〜約８．３である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
測定されたｐＨが、約６．７〜約８．３である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
凍結培地のｐＨを調整する前に、細胞を含有する凍結培地の初期ｐＨを測定するステップを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
凍結培地の調整されたｐＨを測定するステップを更に含む、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
凍結培地の測定されたｐＨが標的ｐＨ未満の場合、凍結培地の調整されたｐＨが約６．７〜約８．５になるまで、調整するステップ及び測定するステップを繰り返す、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ｐＨが、塩基を添加することにより調整される、請求項２７〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
塩基が、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳナトリウム塩、水酸化ナトリウム、及び水酸化カリウムからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
凍結培地のｐＨが、次の式、Ｖｂａｓｅ＝Ｃｂａｓｅ＊Ｖｐ（ｐＨｔ−ｐＨｉ）に従って、凍結培地に塩基を添加することにより調整され、式中、Ｃｂａｓｅが、塩基固有の係数であり、Ｖｂａｓｅが、凍結培地に添加する塩基の体積であり、Ｖｐが、凍結培地の体積であり、ｐＨｔが、標的ｐＨであり、ｐＨｉが、初期ｐＨである、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
凍結培地のｐＨが、次の式、ＶＮａ２ＣＯ３＝０．００８５Ｖｐ（ｐＨｔ−ｐＨｉ）に従って、凍結培地に炭酸ナトリウムを添加することにより調整され、式中、ＶＮａ２ＣＯ３が、凍結培地に添加する１Ｍ炭酸ナトリウムの体積であり、Ｖｐが、凍結培地の体積であり、ｐＨｔが、標的ｐＨであり、ｐＨｉが、初期ｐＨである、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４０】
標的ｐＨが、６．７〜８．３、７．２〜７．８、または７．５である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
哺乳動物細胞が、哺乳動物細胞が凍結培地と組み合わされる前に約６．２〜約６．６のｐＨを有する培地中にある、請求項２７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
凍結保護剤が、ＤＭＳＯ、グリセロール、プロパンジオール、エチレングリコール、または糖である、請求項２７〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
凍結保護剤が、ＤＭＳＯまたはグリセロールであり、哺乳動物細胞を含有する凍結前の凍結培地中のＤＭＳＯまたはグリセロールが、約５体積％〜約１２．５体積％の濃度である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
哺乳動物細胞を含有する、細胞を凍結させる前の凍結培地中のＤＭＳＯまたはグリセロールが、約５体積％〜約１０体積％の濃度である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
哺乳動物細胞を含有する凍結培地が、凍結前に８％〜２８％血中血球容積（ＰＣＶ）の細胞密度を有する、請求項２７〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
哺乳動物細胞が凍結培地と組み合わされる前の細胞収穫及び濃縮プロセスの間、細胞培養流体を冷却するステップを更に含む、請求項２７〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
細胞培養流体が、約２０℃以下の温度まで冷却される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
細胞培養流体が、約１０℃以下の温度まで冷却される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
保管のために哺乳動物細胞を凍結させる方法であって、（ａ）緩衝溶液及び凍結保護剤を含む凍結培地のｐＨを約６．７〜約８．５のｐＨに調整すること、（ｂ）哺乳動物細胞を前記凍結培地と組み合わせて、細胞プールを形成すること、及び（ｃ）前記細胞プール中で哺乳動物細胞を凍結させることを含む、方法。
【請求項５０】
ｐＨが、約６．７〜約８．３または約７．２〜約７．８のｐＨに調整される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ｐＨが、約７．５のｐＨに調整される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
調整されたｐＨが、標的ｐＨまたは測定されたｐＨである、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
標的ｐＨが、約６．７〜約８．３である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
測定されたｐＨが、約６．７〜約８．３である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
凍結培地の調整されたｐＨを測定するステップを更に含む、請求項４９〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
凍結培地の測定されたｐＨが標的ｐＨ未満の場合、凍結培地の調整されたｐＨが約６．７〜約８．５になるまで、調整するステップ及び測定するステップを繰り返す、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
ｐＨが、塩基を添加することにより調整される、請求項４９〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
塩基が、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳナトリウム塩、水酸化ナトリウム、及び水酸化カリウムからなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
哺乳動物細胞が、哺乳動物細胞が凍結培地と組み合わされる前に約６．２〜約６．６のｐＨを有する培地中にある、請求項４９〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
凍結保護剤が、ＤＭＳＯ、グリセロール、プロパンジオール、エチレングリコール、または糖である、請求項４９〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
凍結保護剤が、ＤＭＳＯまたはグリセロールであり、細胞プール中のＤＭＳＯまたはグリセロールが、約５体積％〜約１２．５体積％の濃度である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞プール中のＤＭＳＯまたはグリセロールが、約５体積％〜約１０体積％の濃度である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞プールが、約８％〜約２８％血中血球容積（ＰＣＶ）の細胞密度で哺乳動物細胞を含有する、請求項４９〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
哺乳動物細胞が凍結培地と組み合わされる前の細胞収穫及び濃縮プロセスの間、細胞培養流体を冷却するステップを更に含む、請求項４９〜６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
細胞培養流体が、約２０℃以下の温度まで冷却される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
細胞培養流体が、約１０℃以下の温度まで冷却される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ヒト細胞、またはハイブリドーマである、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
哺乳動物細胞が、ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
ポリペプチドが、治療用タンパク質である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
治療用タンパク質が、抗体、抗体断片、酵素、及び受容体融合タンパク質からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
緩衝溶液と、凍結保護剤と、ポリペプチドをコードする核酸を含む哺乳動物細胞とを含む、哺乳動物細胞を凍結させるための哺乳動物細胞プールであって、培地が、細胞を凍結させる前に約６．７〜約８．５のｐＨを有する、細胞プール。
【請求項７２】
哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ヒト細胞、またはハイブリドーマである、請求項７１に記載の細胞プール。
【請求項７３】
哺乳動物細胞が、ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項７１または７２に記載の細胞プール。
【請求項７４】
ポリペプチドが、治療用タンパク質である、請求項７３に記載の細胞プール。
【請求項７５】
治療用タンパク質が、抗体、抗体断片、酵素、及び受容体融合タンパク質からなる群から選択される、請求項７４に記載の細胞プール。
【請求項７６】
複数の容器を含む細胞バンクであって、各容器が、（ａ）緩衝溶液及び凍結保護剤を含む凍結培地と、（ｂ）ポリペプチドをコードする核酸を含む哺乳動物細胞とを収容し、凍結培地が、細胞を凍結させる前に約６．７〜約８．５のｐＨを有する、細胞バンク。
【請求項７７】
前記容器が、アンプルである、請求項７６に記載の細胞バンク。
【請求項７８】
哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ヒト細胞、またはハイブリドーマである、請求項７６または７７に記載の細胞バンク。
【請求項７９】
哺乳動物細胞が、ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項７６〜７８のいずれか１項に記載の細胞バンク。
【請求項８０】
前記ポリペプチドが、治療用タンパク質である、請求項７９に記載の細胞バンク。
【請求項８１】
治療用タンパク質が、抗体、抗体断片、酵素、及び受容体融合タンパク質からなる群から選択される、請求項８０に記載の細胞バンク。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年７月９日出願の米国仮出願第６２／０２２，３９２号の優先権の利益を主張し、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、バンキングするために細胞（哺乳動物細胞など）を凍結させる方法、及び細胞を凍結させるのに使用するための培地を凍結させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞バンクは、第１にバッチ／灌流細胞培養プロセスで細胞を蓄積し、次いで、バンキングするために細胞を収穫することにより生産される。本方法は、細胞蓄積、収穫及び細胞濃縮、ならびに細胞バンキングの３つの段階を伴う。収穫プロセスステップは、最終の細胞培養流体を濃縮するか、または遠心分離法を使用して細胞培養流体から細胞を抽出する役割を果たす。後の貯蔵及び充填プロセスは、長期保管のための細胞バンクアンプルを調製する役割を果たす。
【０００４】
これらの従来の方法は、選択細胞株に関して、解凍後に不均一性または不十分な生存率をもたらすことがある。凍結細胞の解凍後の高い細胞生存率に対する必要性が、細胞バンキングプロセスにとって肝要である。よって、細胞バンキングのために細胞を凍結させる改善された方法が、望ましい。バンキング後の解凍時により高い細胞生存率を可能にする、細胞を凍結させるための細胞培養培地が、有益であろう。
【０００５】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、全ての目的のために、参照することによりそれらの全体が組み込まれる。
【発明の概要】
【０００６】
一態様において、凍結培地中でバンキングするために真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞など）を凍結させることを含む、細胞バンクの解凍復元を改善する方法が本明細書で提供され、ここで、凍結培地は、緩衝溶液及び凍結保護剤を含み、凍結培地は、凍結前に約６．７〜約８．５のｐＨを有するか、または凍結前に約６．７〜約８．５のｐＨに調整されている。
【０００７】
別の態様において、凍結培地中で細胞を凍結させることを含む、保管のために真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞など）を凍結させる方法が本明細書で提供され、ここで、凍結培地は、緩衝溶液及び凍結保護剤を含み、凍結培地は、凍結前に約６．７〜約８．５のｐＨを有するか、または凍結前に約６．７〜約８．５のｐＨに調整されている。
【０００８】
上または本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、凍結培地は、凍結前に約６．７〜約８．３、約６．８〜約８．３、約６．９〜約８．３、約７．０〜約８．３、約７．１〜約８．３、約７．２〜約８．３、約７．３〜約８．３、約７．４〜約８．３、約７．５〜約８．３、約７．２〜約８．０、約７．２〜約７．８、または約７．５のｐＨを有する。
【０００９】
上または本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、凍結培地のｐＨは、約６．７〜約８．５、約６．７〜約８．３、約６．８〜約８．３、約６．９〜約８．３、約７．０〜約８．３、約７．１〜約８．３、約７．２〜約８．３、約７．３〜約８．３、約７．４〜約８．３、約７．５〜約８．３、約７．２〜約８．０、約７．２〜約７．８、または約７．５のｐＨに調整されている。上または本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）は、ｐＨ調整の前及び／または後に凍結培地と組み合わされる。いくつかの実施形態において、調整されたｐＨは、標的ｐＨまたは測定されたｐＨである。いくつかの実施形態において、標的ｐＨは、約６．７〜約８．５、または本明細書に記載されるｐＨのいずれか若しくは任意のｐＨ範囲内である。いくつかの実施形態において、測定されたｐＨは、約６．７〜約８．５、または本明細書に記載されるｐＨのいずれか若しくは任意のｐＨ範囲内である。上またはここに記載される方法のいくつかの実施形態において、本方法は、凍結培地のｐＨを調整する前に細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）を含有する凍結培地の初期ｐＨを測定するステップを更に含む。上または本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、本方法は、凍結培地の調整されたｐＨを測定するステップを更に含む。上または本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、凍結培地の測定されたｐＨが標的ｐＨ未満である場合、本方法は、凍結培地の調整されたｐＨが約６．７〜約８．５、または本明細書に記載されるｐＨのいずれか若しくは任意のｐＨ範囲内になるまで、調整するステップ及び測定するステップを繰り返すことを含む。
【００１０】
本明細書または上に記載される方法のいくつかの実施形態において、ｐＨは、塩基を添加することにより調整される。いくつかの実施形態において、塩基は、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）ナトリウム塩、水酸化ナトリウム、及び水酸化カリウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、凍結培地のｐＨは、次の式、Ｖｂａｓｅ＝Ｃｂａｓｅ＊Ｖｐ（ｐＨｔ−ｐＨｉ）に従って、凍結培地に塩基を添加することにより調整され、式中、Ｃｂａｓｅは、塩基固有の係数であり、Ｖｂａｓｅは、凍結培地に添加する塩基の体積であり、Ｖｐは、凍結培地の体積であり、ｐＨｔは、標的ｐＨであり、ｐＨｉは、初期ｐＨである。いくつかの実施形態において、凍結培地のｐＨは、次の式、ＶＮａ２ＣＯ３＝０．００８５Ｖｐ（ｐＨｔ−ｐＨｉ）に従って、凍結培地に炭酸ナトリウムを添加することにより調整され、式中、ＶＮａ２ＣＯ３は、凍結培地に添加する１Ｍ炭酸ナトリウムの体積であり、Ｖｐは、凍結培地の体積であり、ｐＨｔは、標的ｐＨであり、ｐＨｉは、初期ｐＨである。いくつかの実施形態において、標的ｐＨは、約６．７〜約８．５、約７．２〜約８．３のｐＨ、または本明細書に記載されるｐＨのいずれか若しくは任意のｐＨ範囲内である。いくつかの実施形態において、標的ｐＨは、７．５である。
【００１１】
上または本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）は、細胞が凍結培地と組み合わされる前に約６．２〜約６．６のｐＨを有する培地中にある。
【００１２】
上または本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、凍結保護剤は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、グリセロール、プロパンジオール、エチレングリコール、高分子、糖、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、凍結前の凍結培地中のＤＭＳＯまたはグリセロールは、約５体積％〜約１２．５体積％の濃度である。いくつかの実施形態において、細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）を凍結させる前の凍結培地中のＤＭＳＯまたはグリセロールは、約５体積％〜約１０体積％の濃度である。
【００１３】
上または本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）を含有する凍結培地は、凍結前に約８％〜約２８％血中血球容積（ＰＣＶ）の細胞密度を有する。
【００１４】
上または本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、本方法は、細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）が凍結培地と組み合わされる前の細胞収穫及び濃縮プロセスの間、細胞培養流体を冷却するステップを更に含む。いくつかの実施形態において、細胞培養流体は、約２０℃以下の温度まで冷却される。いくつかの実施形態において、細胞培養流体は、約１０℃以下の温度まで冷却される。
【００１５】
別の態様において、（ａ）細胞を含有する凍結培地のｐＨを約６．７〜約８．５のｐＨに調整することであって、凍結培地が、緩衝溶液及び凍結保護剤を含む、ことと、（ｂ）細胞を凍結させることと、を含む、保管のために真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞など）を凍結させる方法または細胞バンクの解凍復元を改善する方法が、本明細書で提供される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ｐＨは、約６．７〜約８．３、約６．８〜約８．３、約６．９〜約８．３、約７．０〜約８．３、約７．１〜約８．３、約７．２〜約８．３、約７．３〜約８．３、約７．４〜約８．３、約７．５〜約８．３、約７．２〜約８．０、約７．２〜約７．８、または約７．５のｐＨに調整される。いくつかの実施形態において、調整されたｐＨは、標的ｐＨまたは測定されたｐＨである。いくつかの実施形態において、標的ｐＨは、約６．７〜約８．５、または本明細書に記載されるｐＨのいずれか若しくは任意のｐＨ範囲内である。いくつかの実施形態において、標的ｐＨは、約７．５である。いくつかの実施形態において、測定されたｐＨは、約６．７〜約８．５、または本明細書に記載されるｐＨのいずれか若しくは任意のｐＨ範囲内である。
【００１７】
上または本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、本方法は、凍結培地のｐＨを調整する前に細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）を含有する凍結培地の初期ｐＨを測定するステップを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、凍結培地の調整されたｐＨを測定するステップを更に含む。いくつかの実施形態において、凍結培地の測定されたｐＨが標的ｐＨ未満である場合、本方法は、凍結培地の調整されたｐＨが約６．７〜約８．５、約７．２〜約８．３、または本明細書に記載されるｐＨのいずれか若しくは任意のｐＨ範囲内になるまで、調整するステップ及び測定するステップを繰り返すことを含む。
【００１８】
上または本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、ｐＨは、塩基を添加することにより調整される。いくつかの実施形態において、塩基は、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳナトリウム塩、水酸化ナトリウム、及び水酸化カリウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、凍結培地のｐＨは、次の式、Ｖｂａｓｅ＝Ｃｂａｓｅ＊Ｖｐ（ｐＨｔ−ｐＨｉ）に従って、凍結培地に塩基を添加することにより調整され、式中、Ｃｂａｓｅは、塩基固有の係数であり、Ｖｂａｓｅは、凍結培地に添加する塩基の体積であり、Ｖｐは、凍結培地の体積であり、ｐＨｔは、標的ｐＨであり、ｐＨｉは、初期ｐＨである。いくつかの実施形態において、凍結培地のｐＨは、次の式、ＶＮａ２ＣＯ３＝０．００８５Ｖｐ（ｐＨｔ−ｐＨｉ）に従って、凍結培地に炭酸ナトリウムを添加することにより調整され、式中、ＶＮａ２ＣＯ３は、凍結培地に添加する１Ｍ炭酸ナトリウムの体積であり、Ｖｐは、凍結培地の体積であり、ｐＨｔは、標的ｐＨであり、ｐＨｉは、初期ｐＨである。いくつかの実施形態において、標的ｐＨは、約６．７〜約８．５、または本明細書に記載されるｐＨのいずれか若しくは任意のｐＨ範囲内である。いくつかの実施形態において、標的ｐＨは、約７．５である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）は、細胞が凍結培地と組み合わされる前に約６．２〜約６．６のｐＨを有する培地中にある。
【００２０】
いくつかの実施形態において、凍結培地中の凍結保護剤は、ＤＭＳＯ、グリセロール、プロパンジオール、エチレングリコール、高分子、糖、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）を含有する凍結前の凍結培地中のＤＭＳＯまたはグリセロールは、約５体積％〜約１２．５体積％の濃度である。いくつかの実施形態において、細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）を含有する、細胞を凍結させる前の凍結培地中のＤＭＳＯまたはグリセロールは、約５体積％〜約１０体積％の濃度である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）を含有する凍結培地は、凍結前に約８％〜約２８％血中血球容積（ＰＣＶ）の細胞密度を有する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本方法は、細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）が凍結培地と組み合わされる前の細胞収穫及び濃縮プロセスの間、細胞培養流体を冷却するステップを更に含む。いくつかの実施形態において、細胞培養流体は、約２０℃以下、または約１０℃以下の温度まで冷却される。
【００２３】
別の態様において、（ａ）凍結培地のｐＨを約６．７〜約８．５のｐＨに調整することであって、凍結培地が、緩衝溶液及び凍結保護剤を含む、ことと、（ｂ）細胞を凍結培地と組み合わせて、細胞プールを形成することと、（ｃ）細胞プール中で細胞を凍結させることと、を含む、保管のために真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞など）を凍結させる方法または細胞バンクの解凍復元を改善する方法が、本明細書で提供される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ｐＨは、約６．７〜約８．３、約６．８〜約８．３、約６．９〜約８．３、約７．０〜約８．３、約７．１〜約８．３、約７．２〜約８．３、約７．３〜約８．３、約７．４〜約８．３、約７．５〜約８．３、約７．２〜約８．０、約７．２〜約７．８、または約７．５のｐＨに調整される。いくつかの実施形態において、調整されたｐＨは、標的ｐＨまたは測定されたｐＨである。いくつかの実施形態において、標的ｐＨは、約６．７〜約８．５、または本明細書に記載されるｐＨのいずれか若しくは任意のｐＨ範囲内である。いくつかの実施形態において、測定されたｐＨは、約６．７〜約８．５、または本明細書に記載されるｐＨのいずれか若しくは任意のｐＨ範囲内である。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本方法は、凍結培地の調整されたｐＨを測定するステップを更に含む。いくつかの実施形態において、凍結培地の測定されたｐＨが標的ｐＨ未満である場合、本方法は、凍結培地の調整されたｐＨが約６．７〜約８．５、または本明細書に記載されるｐＨのいずれか若しくは任意のｐＨ範囲内になるまで、調整するステップ及び測定するステップを繰り返すことを更に含む。
【００２６】
上または本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、ｐＨは、塩基を添加することにより調整される。いくつかの実施形態において、塩基は、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳナトリウム塩、水酸化ナトリウム、及び水酸化カリウムからなる群から選択される。
【００２７】
上または本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）は、細胞が凍結培地と組み合わされる前に約６．２〜約６．６のｐＨを有する培地中にある。
【００２８】
上または本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、凍結培地中の凍結保護剤は、ＤＭＳＯ、グリセロール、プロパンジオール、エチレングリコール、高分子、糖、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、細胞プール中のＤＭＳＯまたはグリセロールは、約５体積％〜約１２．５体積％、または約５体積％〜約１０体積％の濃度である。
【００２９】
上または本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、細胞プールは、約８％〜約２８％血中血球容積（ＰＣＶ）の細胞密度で細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）を含有する。
【００３０】
上または本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）が凍結培地と組み合わされる前の細胞収穫及び濃縮プロセスの間、細胞培養流体を冷却するステップを更に含む。いくつかの実施形態において、細胞培養流体は、約２０℃以下の温度まで冷却される。いくつかの実施形態において、細胞培養流体は、約１０℃以下の温度まで冷却される。
【００３１】
上または本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ヒト細胞、またはハイブリドーマなどの哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）、Ｓ２（シュナイダー２）、Ｓｆ９、及びＳｆ２１などの昆虫細胞である。上または本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）は、ポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、抗体、抗体断片、酵素、及び受容体融合タンパク質からなる群から選択される。
【００３２】
別の態様において、緩衝溶液と、凍結保護剤と、ポリペプチドをコードする核酸を含む真核生物細胞とを含む、細胞を凍結させるための真核生物細胞プール（例えば、哺乳動物細胞プール、または昆虫細胞プール）が本明細書で提供され、ここで、培地は、細胞を凍結させる前に約６．７〜約８．５または約７．２〜約８．３（または本明細書に記載されるｐＨのいずれか若しくは任意のｐＨ範囲内）のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ヒト細胞、またはハイブリドーマなどの哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）、Ｓ２（シュナイダー２）、Ｓｆ９、及びＳｆ２１などの昆虫細胞である。いくつかの実施形態において、細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）は、ポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、抗体、抗体断片、酵素、及び受容体融合タンパク質からなる群から選択される。
【００３３】
別の態様において、複数の容器を含む細胞バンクが本明細書で提供され、各容器は、（ａ）緩衝剤及び凍結保護剤を含む凍結培地と、（ｂ）ポリペプチドをコードする核酸を含む真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）とを収容し、ここで、凍結培地は、細胞を凍結させる前に約６．７〜約８．５または約７．２〜約８．３（または本明細書に記載されるｐＨのいずれか若しくは任意のｐＨ範囲内）のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、容器は、アンプルである。いくつかの実施形態において、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ヒト細胞、またはハイブリドーマなどの哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）、Ｓ２（シュナイダー２）、Ｓｆ９、及びＳｆ２１などの昆虫細胞である。いくつかの実施形態において、細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）は、ポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、抗体、抗体断片、酵素、及び受容体融合タンパク質からなる群から選択される。
【００３４】
明細書に記載される種々の実施形態の特性のうちの１つ、いくつか、または全ては、組み合わされて本発明の他の実施形態を形成しても良いことを理解されたい。本発明のこれらの態様及び他の態様は、当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】細胞バンキングプロセスの流れの例を示す。
【図２Ａ】６．６または６．３の初期ｐＨにおける、ｐＨ調整プールから生成された細胞バンクに関する、解凍過程の１日目生存率（図２Ａ）及び４日目成長（ＰＣＶ）（図２Ｂ）の結果を示す。
【図２Ｂ】６．６または６．３の初期ｐＨにおける、ｐＨ調整プールから生成された細胞バンクに関する、解凍過程の１日目生存率（図２Ａ）及び４日目成長（ＰＣＶ）（図２Ｂ）の結果を示す。
【図３Ａ−３Ｆ】各々が異なる抗体（抗体１〜９）を産生する９つのＣＨＯ細胞株に関して、バンキングｐＨに対する、解凍過程の１日目生存率（図３Ａ、３Ｃ、及び３Ｅ）、及びＰＣＶによる全体の成長率（図３Ｂ、３Ｄ、及び３Ｆ）、ならびにｐＨ標的の範囲にｐＨを調整した効果を示す。
【図４Ａ−４Ｂ】解凍過程の生存細胞密度（ＶＣＤ）または生存細胞計数（ＶＣＣ）（図４Ａ）、及び生存率（％）（図４Ｂ）の傾向を示し、これは、ｐＨ調整をしない場合に対して、ｐＨを６．３の初期プールｐＨから７．５に調整した効果を明示する。
【図５】細胞サイズを推定する間接的手段である、貯蔵プロセス中の生存血中血球容積（ＶＰＣＶ）対生存細胞計数（ＶＣＣ）の比率を示す。データは、細胞サイズにおける、凍結培地（ＦＭ）の添加及びｐＨ７．３、７．６、または８．０へのｐＨ調整の効果を示す。より大きな比率は、より大きな細胞サイズを示す。
【図６Ａ】初期ｐＨが６．４（標的６．２）または６．６（標的６．７）であるｐＨ調整プールから生成された細胞バンクに関する、ｔ０（図６Ａ）及びｔ２（２時間）（図６Ｂ）における解凍過程の全体の成長率をＰＣＶ結果により示す。
【図６Ｂ】初期ｐＨが６．４（標的６．２）または６．６（標的６．７）であるｐＨ調整プールから生成された細胞バンクに関する、ｔ０（図６Ａ）及びｔ２（２時間）（図６Ｂ）における解凍過程の全体の成長率をＰＣＶ結果により示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
凍結培地中でバンキングするために真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞など）を凍結させることを含む、細胞バンクの解凍復元を改善する方法が本明細書で提供され、ここで、凍結培地は、緩衝溶液及び凍結保護剤を含み、凍結培地は、凍結前に約６．７〜約８．５のｐＨを有する。
【００３７】
凍結培地中で細胞を凍結させることを含む、保管のために真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞など）を凍結させる方法も本明細書で提供され、ここで、凍結培地は、緩衝溶液及び凍結保護剤を含み、凍結培地は、凍結前に約６．７〜約８．５のｐＨを有する。
【００３８】
（ａ）細胞を含有する凍結培地のｐＨを約６．７〜約８．５のｐＨに調整することであって、凍結培地が、緩衝溶液及び凍結保護剤を含む、ことと、（ｂ）細胞を凍結させることと、を含む、保管のために真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞など）を凍結させる方法または細胞バンクの解凍復元を改善する方法も、本明細書で提供される。
【００３９】
（ａ）凍結培地のｐＨを約６．７〜約８．５のｐＨに調整することであって、凍結培地が、緩衝溶液及び凍結保護剤を含む、ことと、（ｂ）細胞を凍結培地と組み合わせて、細胞プールを形成することと、（ｃ）細胞プール中で細胞を凍結させることと、を含む、保管のために真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞など）を凍結させる方法または細胞バンクの解凍復元を改善する方法も、本明細書で提供される。
【００４０】
緩衝溶液と、凍結保護剤と、ポリペプチドをコードする核酸を含む真核生物細胞とを含む、真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞など）を凍結させるための真核生物細胞プールも本明細書で提供され、ここで、培地は、細胞を凍結させる前に約６．７〜約８．５のｐＨを有する。
【００４１】
複数の容器を含む細胞バンクも本明細書で提供され、各容器は、（ａ）緩衝剤及び凍結保護剤を含む凍結培地と、（ｂ）ポリペプチドをコードする核酸を含む真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞など）とを収容し、ここで、凍結培地は、細胞を凍結させる前に約６．７〜約８．５のｐＨを有する。
【００４２】
Ｉ．定義
用語「培地」及び「細胞培養培地」は、細胞を維持するために使用される溶液を指す。培地は、細胞を成長させるために使用される栄養源を更に含んでも良い。当業者により理解されるように、栄養源は、成長及び／若しくは生存のために細胞により必要とされる構成成分を含有しても良いか、または細胞成長及び／若しくは生存を補助する構成成分を含有しても良い。ビタミン、必須または非必須アミノ酸、及び微量元素は、培地構成成分の例である。
【００４３】
「基礎栄養培地」は、細胞成長及び生存にとって必要とされる基本栄養物を含む培地を指す。基礎栄養培地の例には、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）及びダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）が含まれる。
【００４４】
「化学的に定義された細胞培養培地」または「ＣＤＭ」は、例えば動物血清及び植物ペプトンなどの動物または植物に由来する産生物を含まない、特定された組成を有する培地である。当業者には理解されるであろうが、ＣＤＭは、細胞がＣＤＭと接触し、ポリペプチドをＣＤＭ中に分泌する、ポリペプチド産生のプロセスにおいて使用されても良い。よって、組成物は、ＣＤＭ及びポリペプチド産生物を含有しても良く、ポリペプチド産生物の存在がＣＤＭを化学的に未定義にすることはないことが理解される。
【００４５】
「化学的に未定義な細胞培養培地」は、その化学組成が特定され得ない培地を指し、これは、動物または植物源、例えば動物血清または植物ペプトンに由来する１つ以上の産生物を含有しても良い。当業者には理解されるであろうが、化学的に未定義な細胞培養培地は、栄養源として動物または植物に由来する産生物を含有しても良い。
【００４６】
「凍結培地」、「細胞凍結培地」、または「凍結させるための細胞培養培地」は、凍結保護剤を含有する緩衝溶液を指す。凍結培地は、凍結培地中に含有された細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）を凍結させるために使用されても良い。本明細書で使用される場合、「緩衝溶液」は、水性、等張性、ｐＨ緩衝塩類溶液を指し、それは、細胞膜の健全性を保つように働き、１つ以上の凍結保護剤のための担体として役立つ。凍結培地は、細胞培養培地中で見られる追加の構成成分も含有しても良い。緩衝剤の例には、重炭酸塩緩衝剤、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＴＥＳＴ（ＴＥＳ／ＴＲＩＳの組み合わせ）、及びそれらの組み合わせが含まれても良い。培地の例には、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）及びダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）が含まれても良い。凍結保護剤は、凍結損傷から細胞を保護し、血漿膜を横断できる「浸透」（例えば、グリセロール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、プロパンジオール、エチレングリコールなど）、または「不浸透」（例えば、高分子、糖など）として分類されても良い。
【００４７】
細胞を「培養する」ことは、細胞の生存、及び／または成長、及び／または増殖に好適な条件下で、細胞を細胞培養培地と接触させることを指す。
【００４８】
「バッチ培養」は、細胞培養のための全ての構成成分（細胞及び全ての培養栄養物を含む）が、培養プロセスの開始時点で培養器に供給される培養を指す。
【００４９】
本明細書で使用される場合、語句「供給バッチ細胞培養」は、細胞及び培養培地が、最初に培養器に供給され、培養プロセスの間、培養の停止前に周期的な細胞及び／または産生物収穫を行いながらか、または行わずに、追加の培養栄養物が、培養地に継続的にまたは離散的な増分で供給されるバッチ培養を指す。
【００５０】
「灌流培養」は、細胞が、例えば、ろ過、封入、微小担体への定着により、培養地中で抑制され、培養培地が、培養器から継続的にまたは断続的に導入及び除去される培養である。
【００５１】
「細胞バンキング」または「バンキング」は、細胞が、零度以下の温度に凍結（凍結保存）されて、酵素的／化学的反応が休止され、よって、事後の使用のために細胞を生存状態に維持するプロセスである。凍結された細胞は、事後の使用のために約０℃未満で（例えば、−２０℃、−７０℃、−８０℃、またはそれ以下で）保管されても良い。例えば、細胞は、−１９６℃で、液体窒素を含有する冷凍庫内の気相中に置かれたアンプル内に保管されても良い。
【００５２】
「培養器」は、細胞を培養するために使用される容器を指す。培養器は、細胞を培養するのに有用である限り、任意のサイズであってよい。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「力価」は、細胞培養により産生された組換え発現されたポリペプチドの総量を、所定量の培地体積で除算したものを指す。力価は典型的に、培地１ミリリットル当たりのポリペプチドのミリグラムの単位で表現される。
【００５４】
本明細書中で交換可能に使用される「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド若しくは塩基、及び／若しくはそれらのアナログ、またはＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼにより若しくは合成反応によりポリマー中に組み込まれ得る任意の基質であっても良い。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらのアナログを含んでも良い。ヌクレオチド構造に対する修飾が存在する場合、ポリマーの組織化の前または後に修飾されても良い。
【００５５】
「単離核酸」は、その通常の前後関係から外れたまたは分離された非天然、組換え、または天然配列を意味し、包含する。単離核酸分子は、自然で見られる形態または設定における以外のものである。それゆえ、単離核酸分子は、天然細胞内に存在する核酸分子と区別される。しかし、単離核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のそれとは異なる染色体上の位置にある、タンパク質を通常発現する細胞内に含有される核酸分子を含む。
【００５６】
「単離」タンパク質（例えば、単離抗体）は、その自然環境の構成成分から同定及び分離、ならびに／または復元されたものである。その自然環境の汚染物質構成成分は、タンパク質に関する研究用、診断用、または治療用使用を妨害するであろう材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含んでも良い。タンパク質の自然環境の少なくとも１つの構成成分が存在しないため、単離タンパク質は、組換え細胞内の生体内原位置でタンパク質を含む。しかし、通常、単離タンパク質は、少なくとも１つの精製ステップにより調製されるであろう。
【００５７】
「精製された」ポリペプチドは、それがその自然環境で存在するより純粋である形態で存在するように、かつ／または実験室条件下で、最初に産生、及び／または合成、及び／または増大されたときに純度が増加するポリペプチドを意味する。純度は、相対語であり、必ずしも絶対的純度を意味するとは限らない。
【００５８】
「汚染物質」は、所望のポリペプチド産生物とは異なる材料を指す。汚染物質には、宿主細胞タンパク質などの宿主細胞材料；核酸；所望のポリペプチドの変異体、断片、集合体、誘導体；別のポリペプチド；内毒素；ウイルス性汚染物質；細胞培養培地構成成分などが限定されることなく含まれる。汚染物質は、浸出タンパク質Ａなどの、精製プロセスにより導入された材料も導入しても良い。
【００５９】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書中で交換可能に使用される。ポリマーは、直鎖状または分岐状であっても良く、それは、修飾アミノ酸を含んでも良く、それは、非アミノ酸により中断されても良い。この用語は、自然にまたは介入、例えば、ジスルフィド結合形成、糖鎖付加、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識構成成分との配合などの任意の他の操作若しくは修飾により修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ならびに当技術分野で既知の他の修飾物を含有するポリペプチドも定義内に含まれる。本明細書の定義内に包含されるポリペプチドの例には、例えばレニンなどの哺乳動物タンパク質；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−アンチトリプシン；インシュリンＡ鎖；インシュリンＢ鎖；プロインシュリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体ホルモン；グルカゴン；因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、及びフォンヴィレブランド因子などの凝固因子；タンパク質Ｃなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化剤；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；腫瘍壊死因子アルファ及び腫瘍壊死因子ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（発現及び分泌される活性化通常Ｔ細胞への規制）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４などの細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子のための受容体；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ性因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、若しくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）などの神経栄養因子、またはＮＧＦ−ｂなどの神経成長因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦなどの線維芽細胞成長因子；上皮性成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含む、ＴＧＦアルファ及びＴＧＦベータなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インシュリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インシュリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、及びＣＤ２０などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロンアルファ、ベータ、及びガンマなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ��、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドディスムターゼ；Ｔ細胞受容体；膜表面タンパク質；崩壊促進因子；例えばＡＩＤＳエンベロープの一部などのウイルス性抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４、及びＶＣＡＭなどのインテグリン；ＣＡ１２５（卵巣癌抗原）またはＨＥＲ２、ＨＥＲ３、若しくはＨＥＲ４受容体などの腫瘍関連抗原；イムノアドヘシン；ならびに上で列挙されたタンパク質のいずれかの断片及び／または変異体、ならびに抗体断片を含む、例えば上で列挙されたタンパク質のいずれかを含むタンパク質に結合する抗体が含まれる。
【００６０】
本明細書の用語「抗体」は、最も広範な意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を網羅する。抗体は、ヒト、ヒト化、及び／または親和性成熟であり得る。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集合から得られる抗体を指し、すなわちその集合を含む個別の抗体が、わずかな量で存在し得る自然発生の可能性がある突然変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に指向され、非常に特異的である。さらに、異なる決定要因（エピトープ）に指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体の調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定要因に指向する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体に汚染されることなく、合成され得るという点で有利である。修飾物質「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−９７（１９７５）；Ｈｏｎｇｏら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３−２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら，：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、細菌、真核動物、または植物細胞における組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の部分または全てを有するヒト抗体または動物においてヒトの様な抗体を産生するための技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３；ＷＯ１９９６／３４０９６；ＷＯ１９９６／３３７３５；ＷＯ１９９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；及び同第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）；ならびにＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照されたい、を含む、様々な技術により作製されても良い。
【００６２】
用語「薬学的製剤」は、活性成分の生物学的活性が有効になることを許可するような形態であり、製剤が投与されるであろう対象にとって許容できないほどの毒性である追加の構成成分を含有しない調製物を指す。かかる製剤は、無菌である。
【００６３】
「薬学的に許容される」担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる用量及び濃度において、それらに曝露される細胞または哺乳動物にとって無毒なものである（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第２０版），版Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）。しばしば、生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体の例には、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／またはＴｗｅｅｎ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）などの非イオン界面活性剤が含まれる。
【００６４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明白に指示しない限り、複数形の指示物を含む。よって、例えば「化合物」を参照することは任意に、かかる化合物の２つ以上の組み合わせなどを含む。
【００６５】
本明細書に記載される本発明の態様及び実施形態は、態様及び実施形態「を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から成ること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」、及び「から本質的に成ること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を含むことが理解される。
【００６６】
本明細書で「約（ａｂｏｕｔ）」の値またはパラメータを参照することは、その値またはそれ自体のパラメータを対象とする実施形態を含む（かつ記載する）。例えば、「約（ａｂｏｕｔ）Ｘ」を参照する記述は、「Ｘ」の記述を含む。数値の範囲は、範囲を定義する数を含む。
【００６７】
本発明の態様または実施形態がマーカッシュ群または他の代替的な分類という点で記載される場合、本発明は、全体だが群の各メンバーを個別に及び主な群の全ての可能性のある下位群として列挙される全ての群だけでなく、群のメンバーのうちの１つ以上が不在である主の群も包含する。本発明はまた、特許請求される本発明における群のメンバーのいずれかのうちの１つ以上の明白な排除を想定する。
【００６８】
ＩＩ．本発明の方法及び使用
細胞凍結培地中でバンキングまたは保管するために細胞を凍結させる方法が、本明細書で提供される。細胞バンクの解凍復元を改善する方法も、本明細書で提供される。本方法は、凍結培地中で細胞を凍結させるステップを含み、ここで、凍結培地は、緩衝溶液及び凍結保護剤を含み、細胞を含有する凍結培地は、凍結前に約６．７〜約８．５または約６．７〜約８．３のｐＨを有する。本方法は、凍結培地のｐＨを、約６．７〜約８．５または約６．７〜約８．３に調整するステップを更に含んでも良い。本明細書で提供される方法は、マスター細胞バンク（ＭＣＢ）及びワーキング細胞バンク（ＷＣＢ）を調製するのに有用である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、解凍後の細胞生存率及び／または細胞成長を改善する。
【００６９】
凍結及びバンキングプロセスで使用される真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞など）は、当技術分野で既知の細胞培養及び濃縮プロトコルを伴うプロセスにより調製されても良い。本方法は、細胞バンキングの前に細胞蓄積、収穫、及び細胞濃縮を含んでも良い。細胞蓄積は、いくつかの方法により起こっても良い。一例は、細胞蓄積のためにプロセス制御されたバイオリアクターを使用しても良いが、他の方法／培養器も使用されても良い（例えば、Ｔ型フラスコ、振とうフラスコ、ローラボトル、回転器など）。収穫及び細胞濃縮は、遠心分離法により行われても良く、続いて、凍結培地中で細胞ペレットの再懸濁が行われる。別の例において、細胞は、中空繊維ろ過（ＨＦＦ）により単一のステップで収穫及び濃縮されても良い。細胞濃縮は、細胞培養流体から培地を除去するための代替的な灌流膜／デバイス（例えば、浮遊灌流膜、細胞沈降装置、連続循環式遠心分離機など）の使用によっても達成されても良い。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、収穫及び細胞濃縮プロセスまたは収穫された細胞培養流体は、約２０℃以下（例えば、約１９℃、１８℃、１７℃、１６℃、１５℃、１４℃、１３℃、１２℃、１１℃、及び１０℃以下のいずれか）の温度まで冷却される。
【００７０】
次いで、ペレット状にされた細胞または濃縮された細胞は、細胞を凍結させる前に凍結培地と組み合わされても良い。いくつかの実施形態において、ペレット状にされた細胞は、凍結培地中で再懸濁され得る。いくつかの実施形態において、細胞バンキングのために、濃縮された凍結保護剤を含有する凍結培地は、収穫及び濃縮された細胞中に添加され得るか、または収穫及び濃縮された細胞が、濃縮された凍結保護剤を含有する凍結培地中に添加され得る。凍結培地は、緩衝溶液及び凍結保護剤を含んでも良い。いくつかの実施形態において、培地中の緩衝剤は、双性イオン性緩衝剤を含んでも良い。いくつかの実施形態において、培地中の緩衝剤は、重炭酸塩緩衝剤、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝生理食塩水）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＴＥＳＴ（ＴＥＳ／ＴＲＩＳの組み合わせ）、及びそれらの組み合わせから選択される緩衝剤を含んでも良い。いくつかの実施形態において、細胞を凍結させる前の凍結培地中の緩衝剤濃度は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである。いくつかの実施形態において、細胞を凍結させる前の凍結培地は、約１０ｍＭ〜約３５ｍＭ（例えば、これらの値間の任意の濃度を含む、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、または約３５ｍＭ）の重炭酸ナトリウムを含有する。いくつかの実施形態において、細胞を凍結させる前の凍結培地は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ（例えば、これらの値間の任意の濃度を含む、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、または約５０ｍＭ）のＨＥＰＥＳを含有する。いくつかの実施形態において、細胞を凍結させる前の凍結培地は、約１０ｍＭ〜約１２ｍＭ（例えば、これらの値間の任意の濃度を含む、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、または約１２ｍＭ）のＰＢＳを含有する。いくつかの実施形態において、細胞を凍結させる前の凍結培地は、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ（例えば、これらの値間の任意の濃度を含む、約１０ｍＭ、約１２ｍＭ、約１５ｍＭ、約１８ｍＭ、または約２０ｍＭ）のＭＯＰＳを含有する。いくつかの実施形態において、細胞を凍結させる前の凍結培地は、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ（例えば、これらの値間の任意の濃度を含む、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、または約３０ｍＭ）のＴＥＳを含有する。いくつかの実施形態において、細胞を凍結させる前の凍結培地は、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ（例えば、これらの値間の任意の濃度を含む、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、または約３０ｍＭ）のＴＲＩＳを含有する。いくつかの実施形態において、細胞を凍結させる前の凍結培地は、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ（例えば、これらの値間の任意の濃度を含む、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、または約３０ｍＭ）のＴＥＳＴを含有する。いくつかの実施形態において、凍結保護剤は、浸透剤または不浸透剤である。いくつかの実施形態において、凍結保護剤は、グリセロール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、プロパンジオール、エチレングリコール、及び糖からなる群から選択される薬剤である。いくつかの実施形態において、収穫及び濃縮された細胞中に添加される凍結培地は、濃縮された凍結培地である。いくつかの実施形態において、濃縮された凍結保護剤を含有する凍結培地は、２０〜３０％（体積／体積）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはグリセロールを含有しても良い。いくつかの実施形態において、濃縮された凍結培地は、（例えば、１部の凍結培地（濃縮された凍結保護剤を含有する）の体積：３部の細胞培養流体で）収穫及び濃縮された細胞に注がれる。いくつかの実施形態において、細胞を含有する、細胞を凍結させる前の凍結培地は、約５％〜約１２．５％のＤＭＳＯまたはグリセロールを含有する。
【００７１】
いくつかの実施形態において、凍結培地は、細胞培養培地中で見られる追加の構成成分を更に含んでも良い。いくつかの実施形態において、凍結培地は、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）またはダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含有しても良い。
【００７２】
いくつかの実施形態において、細胞（哺乳動物細胞または昆虫細胞など）を凍結させるための調製方法は、凍結培地または濃縮された凍結保護剤を含有する凍結培地のｐＨを調整するステップを更に含んでも良く、ここで、ｐＨは、ペレット状にされた細胞または濃縮された細胞が凍結培地または濃縮された凍結保護剤を含有する凍結培地と組み合わされる前に、約６．７〜約８．５に調整される。いくつかの実施形態において、細胞（哺乳動物細胞または昆虫細胞など）を凍結させるための調製方法は、細胞を含有する凍結培地のｐＨを調整するステップを更に含み、ここで、凍結培地のｐＨは、約６．７〜約８．５に調整される。いくつかの実施形態において、調整されたｐＨは、標的ｐＨまたは測定されたｐＨである。
【００７３】
ある特定の実施形態において、凍結前の細胞密度は、血中血球容積（ＰＣＶ）により測定される。いくつかの実施形態において、バンキングされる細胞を含む凍結培地は、凍結前に８％〜２８％（例えば、約８％、１０％、１５％、２０％、２５％、または２８％のいずれか）ＰＣＶの細胞密度を有する。いくつかの実施形態において、凍結前の凍結培地中の細胞密度は、約２１％ＰＣＶであっても良い。
【００７４】
いくつかの実施形態において、凍結培地中の細胞は、凍結前にアンプルまたは単回使用の袋内に分配される。典型的な実施形態において、本方法は、高圧蒸気滅菌自己充填注射器を使用して、湿った氷上に置かれた高圧蒸気滅菌ガラスアンプル中に細胞懸濁液を分配することと、アンプルを封入することと、無傷試験を行うことと、速度制御された冷凍庫内でアンプルを凍結させ、次いで、長期間保管ために液体窒素冷凍庫にアンプルを移動させることと、を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態において、解凍後の細胞生存率は、本明細書に記載される方法を使用することにより改善される。いくつかの実施形態において、細胞生存率は、６．７以下のｐＨを有する凍結培地中で凍結した後、ならびに／または収穫プロセス中及び解凍中、収穫細胞培養液を冷却することなく凍結した後の細胞生存率と比較して、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８５％のいずれかの分増加される。
【００７６】
ｐＨ調整
本明細書に記載される方法に従って、（細胞を含有するか、または含有しない）凍結培地のｐＨは、例えば、培地に塩基を添加することにより調整されても良い。いくつかの実施形態において、凍結培地のｐＨは、約６．７超であるｐＨに調整される。いくつかの実施形態において、凍結培地のｐＨは、約６．７〜約８．５のｐＨ（標的ｐＨまたは測定されたｐＨ）に調整される。いくつかの実施形態において、凍結培地のｐＨは、約６．８〜約８．３、約６．９〜約８．３、約７．０〜約８．３、約７．１〜約８．３、約７．２〜約８．３、約７．３〜約８．３、約７．４〜約８．３、約７．５〜約８．３、約７．６〜約８．３、約７．７〜約８．３、または約７．８〜約８．３のｐＨに調整される。いくつかの実施形態において、凍結培地のｐＨは、約７．２〜約７．８のｐＨ（標的ｐＨまたは測定されたｐＨ）に調整される。いくつかの実施形態において、標的ｐＨまたは測定されたｐＨは、約７．２〜約８．３である。いくつかの実施形態において、標的ｐＨまたは測定されたｐＨは、約７．２〜約７．８（例えば、約７．５のｐＨ）である。いくつかの実施形態において、第１のｐＨ調整が、標的ｐＨ範囲（例えば、約７．３〜約７．７のｐＨ）になるようにｐＨを増加させる上で十分ではない場合、第２のｐＨ調整が行われる。いくつかの実施形態において、１回超のｐＨ調整が行われても良い。
【００７７】
ｐＨを調整するために添加される塩基は、当業者に周知である任意の塩基であっても良いが、典型的な実施形態において、塩基は、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳナトリウム塩、水酸化ナトリウム、または水酸化カリウムである。
【００７８】
凍結培地のｐＨは、凍結前の任意の点で測定されても良く、ｐＨは、凍結前の任意の時点で調整されても良い。いくつかの実施形態において、凍結培地のｐＨは、バンキングされる細胞との組み合わせ前に測定及び／または調整される。他の実施形態において、凍結培地のｐＨは、バンキングされる細胞との組み合わせ後に測定及び／または調整される。いくつかの実施形態において、凍結培地のｐＨは、１回超測定及び／または調整される。いくつかの実施形態において、凍結培地のｐＨは、凍結前に２回、３回、またはそれ以上、測定及び／または調整される。他の実施形態において、凍結培地のｐＨは、バンキングされる細胞との組み合わせ前後に測定及び／または調整される。いくつかの実施形態において、ｐＨは、次の等式、Ｖｂａｓｅ＝Ｃｂａｓｅ＊Ｖｐ（ｐＨｔ−ｐＨｉ）に従って調整され、式中、Ｃｂａｓｅは、塩基固有の係数であり、Ｖｂａｓｅは、凍結培地に添加する塩基の体積であり、Ｖｐは、凍結培地の体積であり、ｐＨｔは、標的ｐＨであり、ｐＨｉは、初期ｐＨである。本明細書で使用される場合、初期ｐＨは、細胞を含有する凍結培地（すなわち、それが、細胞と組み合わされた後）のｐＨであるが、ｐＨが、凍結のために調整される前である。Ｃｂａｓｅは、ｐＨ調整のために選ばれた塩基の型及び濃度に応じた固有の係数を表す。Ｃｂａｓｅ係数は、塩基の選択に応じて得ることができる。典型的な実施形態において、塩基が１Ｍ炭酸ナトリウムの場合、ｐＨ調整は、以下の式１に従って行われ、
式１：ｐＨ調整のために添加する塩基体積の計算
2020072668.tif 000002
式中、ＶＮａ２ＣＯ３は、凍結培地中に添加する１Ｍ炭酸ナトリウムの体積であり、Ｖｐは、凍結培地の体積であり、ｐＨｔは、標的ｐＨであり、ｐＨｉは、初期ｐＨである。初期ｐＨは、細胞を含有する凍結培地（すなわち、それが、細胞と組み合わされた後）のｐＨであるが、ｐＨが、凍結のために調整される前である。凍結培地の標的ｐＨは、７．２超のｐＨなどの生理的ｐＨを超えるｐＨであっても良い。いくつかの実施形態において、凍結培地の標的ｐＨは、７．２〜８．３である。いくつかの実施形態において、凍結培地の標的ｐＨは、７．２〜７．８である。いくつかの実施形態において、凍結培地の標的ｐＨは、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、及び８．３のいずれかである。
【００７９】
凍結培地のｐＨは、当技術分野で既知の方法を使用して測定され得る。例えば、培地のｐＨは、ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）４００（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）またはＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）分析装置上で測定され得る。本明細書で使用される場合、測定されたｐＨ、標的ｐＨ、調整されたｐＨ、及び初期ｐＨを含む本出願中のｐＨに対する全ての参照値は、約３７℃（例えば、３６℃〜３８℃または３５℃〜３９℃）に調整された試料温度で取られたｐＨ測定値を指す。
【００８０】
ＩＩＩ．凍結培地
本明細書で提供される細胞凍結培地は、方法（例えば、真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞など）を凍結させる方法；及び／または真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）を含む細胞バンクの解凍復元を改善する方法）及び組成（例えば、緩衝溶液、凍結保護剤、及び真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）を含む細胞プール）において用途を見出しても良い。
【００８１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される凍結培地は、緩衝溶液及び凍結保護物質を含む。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、双性イオン性緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＴＲＩＳ、及びＴＥＳＴを含む。
【００８２】
凍結培地は、ＤＭＳＯ、グリセロール、エチレングリコール、不浸透高分子、糖などの、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載される任意の凍結保護物質を含んでも良い。いくつかの実施形態において、細胞凍結培地中のＤＭＳＯまたはグリセロールの濃度は、バンキングされる細胞との組み合わせ後に、５体積％〜１２．５体積％（体積／体積）である。いくつかの実施形態において、凍結培地は、濃縮された細胞中に、濃縮された緩衝剤及び／または凍結保護物質を含有する凍結培地を添加することにより提供されても良い。いくつかの実施形態において、凍結培地濃縮凍結保護剤は、約２０％〜約３０％（体積／体積）のＤＭＳＯまたはグリセロールを含有しても良い。
【００８３】
いくつかの実施形態において、凍結培地は、細胞培養培地中で見られる追加の構成成分を更に含んでも良い。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞を培養するのに好適である、ハムＦ１０（シグマ）、最小必須培地（［ＭＥＭ］、シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）、及びダルベッコ変法イーグル培地（［ＤＭＥＭ］、シグマ）は、哺乳動物細胞を凍結させるための本明細書に記載される凍結培地中に添加されても良い。加えて、Ｈａｍ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓａｔｏ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０２：２５５（１９８０）、Ｖｉｊａｙａｓａｎｋａｒａｎら，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．，６：６０５：６１１（２００５）、Ｐａｔｋａｒら，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９３：２１７−２２９（２００２）、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、若しくは同第４，５６０，６５５号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、米国特許第再発行３０，９８５号または米国特許第５，１２２，４６９号に記載される培地のいずれも、本明細書で詳述されるように補足されるかまたは変更されても良く、全ての開示が、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００８４】
当業者には理解されるであろうが、本明細書に詳述される細胞凍結培地は、細胞培養または凍結にとって有用である他の構成成分を含んでも良い。例えば、培地は、アミノ酸（例えば、グルタミン、アルギニン、またはアスパラギン）、ビタミン（ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、またはビタミンＢ１２のうちのいずれか１つ以上のＢビタミンを含むがこれに限定されない）、遷移金属（ニッケル、鉄（例えば、第二鉄または第一鉄）、または亜鉛を含むがこれらに限定されない）、及び他の培地構成成分などの追加の構成成分を含んでも良いことが理解される。本明細書で提供される任意の培地はまた、ホルモン及び／または他の成長因子（インシュリン、トランスフェリン、または上皮性成長因子など）、イオン（ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシン及びチミジンなど）、微量元素（通常マイクロモル濃度範囲中、最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、及びグルコースまたは同等のエネルギー源に必要に応じて補助されても良い。いくつかの態様において、本明細書で提供される凍結培地は、植物または動物に由来するタンパク質を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される凍結培地は、植物または動物に由来するタンパク質を含まない。任意の他の必要な補助剤も、当業者に既知であるであろう適切な濃度で含まれても良い。
【００８５】
本明細書に記載される細胞凍結培地（細胞プール）は、バンキングされる１つ以上の細胞を更に含んでも良い。典型的な実施形態において、これらの細胞は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞である。本明細書に記載される方法において用途を見出しても良い典型的な細胞型には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ヒト細胞、及びハイブリドーマが含まれる。別の典型的な実施形態において、これらの細胞は、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）、Ｓ２（シュナイダー２）、Ｓｆ９、及びＳｆ２１などの昆虫細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ポリペプチド（例えば、治療用タンパク質）をコードする異種核酸を含む組換え細胞である。これらの細胞が、組換えプラスミドまたは他の有用な生物学的化合物を更に含んでも良い、と当業者に理解されるであろう。いくつかの実施形態において、バンキングされる細胞は、抗体、抗体断片、酵素、受容体融合タンパク質、またはそれらの断片などの治療用タンパク質及び生物学的産生物の産生にとって有用であっても良い。
【００８６】
ＩＶ．真核生物細胞及び細胞バンク
複数の容器を含む細胞バンクも本明細書で提供され、各容器は、ポリペプチドをコードする核酸（例えば、異種核酸）を含む真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞など）を含有する凍結培地を収容し、ここで、培地は、細胞を凍結させる前に約６．７〜約８．５のｐＨを有する。細胞バンクは、プレバンク、マスター細胞バンク（ＭＣＢ）、またはワーキング細胞バンク（ＷＣＢ）であっても良い。プレバンクは、ＭＣＢが調製される特異的なポリペプチドを産生する細胞を収容する凍結された（例えば、液体窒素冷凍庫中で保管される）容器（例えば、アンプル）を含んでも良い。ＭＣＢは、プレバンクの継代培養地に由来し、産生のための全ての部分配列細胞の由来となる細胞培養地を収容する凍結された（例えば、液体窒素冷凍庫中で保管される）容器（例えば、アンプル）を含んでも良い。ＭＣＢは、ｃＧＭＰに従って産生及び保管され、ポリペプチド産生物の産生のために使用されても良い。ＷＣＢは、ＭＣＢの継代培養地に由来し、細胞培養地を収容する凍結された（例えば、液体窒素冷凍庫中で保管される）容器（例えば、アンプル）を含んでも良い。ＷＣＢは、ｃＧＭＰに従って産生及び保管され、ポリペプチド産生物の産生のために使用されても良い。いくつかの実施形態において、容器は、アンプルである。
【００８７】
本明細書に記載されるように凍結培地中で凍結され得、保管され得る真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞など）は、培養され得、かつ／またはポリペプチドを産生するために有用である任意の真核生物細胞を含んでも良い。いくつかの実施形態において、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞である。ＣＨＯ細胞には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））、例えばＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−９０９６（商標）；及びＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−６１（商標）が含まれても良いが、これらに限定されない。
【００８８】
哺乳動物細胞の他の例には、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児腎臓株（懸濁培養液中で成長のためにサブクローンされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）が限定されることなく含まれる。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生にとって好適なある特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２５５−２６８を参照されたい。
【００８９】
いくつかの実施形態において、細胞は、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）、Ｓ２（シュナイダー２）、Ｓｆ９、及びＳｆ２１などの昆虫細胞株である。
【００９０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞（例えば、哺乳動物細胞、または昆虫細胞）は、ポリペプチドをコードする核酸（例えば、異種核酸）を含み、細胞は、ポリペプチドを産生するのに有用である。いくつかの実施形態において、核酸は、細胞中に導入される。当技術分野で既知の細胞中に核酸を導入するための任意の方法が、使用されても良い。例えば、細胞は、ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を含むベクトル（例えば、発現ベクター）で形質転換されても良い。いくつかの実施形態において、細胞は、安定発現株である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗体、抗体断片、酵素、及び受容体融合タンパク質からなる群から選択される。
【００９１】
ポリペプチドの例には、例えばレニンなどの哺乳動物タンパク質；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−アンチトリプシン；インシュリンＡ鎖；インシュリンＢ鎖；プロインシュリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体ホルモン；グルカゴン；因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、及びフォンヴィレブランド因子などの凝固因子；タンパク質Ｃなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化剤；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；腫瘍壊死因子アルファ及び腫瘍壊死因子ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（発現及び分泌される活性化通常Ｔ細胞への規制）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４などの細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子のための受容体；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ性因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、若しくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）などの神経栄養因子、またはＮＧＦ−ｂなどの神経成長因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦなどの線維芽細胞成長因子；上皮性成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含む、ＴＧＦアルファ及びＴＧＦベータなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インシュリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インシュリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、及びＣＤ２０などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロンアルファ、ベータ、及びガンマなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドディスムターゼ；Ｔ細胞受容体；膜表面タンパク質；崩壊促進因子；例えばＡＩＤＳエンベロープの一部などのウイルス性抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４、及びＶＣＡＭなどのインテグリン；ＣＡ１２５（卵巣癌抗原）またはＨＥＲ２、ＨＥＲ３、若しくはＨＥＲ４受容体などの腫瘍関連抗原；イムノアドヘシン；ならびに上で列挙されたタンパク質のいずれかの断片及び／または変異体、ならびに抗体断片を含む、例えば上で列挙されたタンパク質のいずれかを含むタンパク質に結合する抗体が含まれる。
【００９２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞（例えば、哺乳動物細胞、または昆虫細胞）は、抗体をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。修飾物質「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集合から得られているような抗体の特質を示し、任意の特定の方法により抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−９７（１９７５）；Ｈｏｎｇｏら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３−２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）を参照されたい、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の部分または全てを有するヒト抗体または動物においてヒトの様な抗体を産生するための技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３；ＷＯ１９９６／３４０９６；ＷＯ１９９６／３３７３５；ＷＯ１９９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；及び同第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）；ならびにＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：��５−９３（１９９５）を参照されたい、を含む、様々な技術により作製されても良い。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ライブラリー由来抗体、または多重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、それらの抗原結合断片である。抗原結合断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、及びＦｖ断片；二重特異性抗体；線状抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。Ｆａｂ断片は、重鎖及び軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ′断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端で、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含むいくつかの残基の追加により、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ′−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ′に対する本明細書中における名称である。Ｆ（ａｂ′）２抗体断片は元々、Ｆａｂ′断片の対で、それらの間にヒンジシステインを有する対として産生された。抗体断片の他の化学結合も既知である。「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含有する最小抗体断片である。「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、ポリペプチド単鎖内に存在する。概して、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓｃＦｖが抗原結合にとって所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを更に含む。ｓｃＦｖの総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈuｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  編，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。上述される抗体を精製するための方法の多くが、抗原結合抗体断片を精製するために好適に適合されても良い。
【００９３】
いくつかの実施形態において、治療用及び診断用抗体を含む細胞（例えば、哺乳動物細胞、または昆虫細胞）において核酸によりコードされる抗体。本発明の範囲内の抗体には、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））を含む抗ＨＥＲ２抗体（Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５−４２８９（１９９２）、米国特許第５，７２５，８５６号）；米国特許第５，７３６，１３７号（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））にあるようなキメラ抗ＣＤ２０「Ｃ２Ｂ８」、米国特許第５，７２１，１０８Ｂ１号にあるような２Ｈ７抗体のキメラまたはヒト化変異体、またはＴｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））などの抗ＣＤ２０抗体；抗ＩＬ−８（Ｓｔ  Ｊｏｈｎら，Ｃｈｅｓｔ，１０３：９３２（１９９３）、及び国際公開第ＷＯ９５／２３８６５号）；ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１  ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）などのヒト化及び／または親和性成熟抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体（Ｋｉｍら，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，７：５３−６４（１９９２）、１９９８年１０月１５日公開の国際公開第ＷＯ９６／３００４６号、及び同第ＷＯ９８／４５３３１号）；抗ＰＳＣＡ抗体（ＷＯ０１／４０３０９）；Ｓ２Ｃ６を含む抗ＣＤ４０抗体及びそれらのヒト化変異体（ＷＯ００／７５３４８）；抗ＣＤ１１ａ（米国特許第５，６２２，７００号、ＷＯ９８／２３７６１、Ｓｔｅｐｐｅら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｉｎｔｌ．４：３−７（１９９１）、及びＨｏｕｒｍａｎｔら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５８：３７７−３８０（１９９４））；抗ＩｇＥ（ｐｒｅｓｔａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３−２６３２（１９９３）、及び国際公開第ＷＯ９５／１９１８１号）；抗ＣＤ１８（１９９７年４月２２日発行の米国特許第５，６２２，７００号または１９９７年７月３１日公開のＷＯ９７／２６９１２にあるような）；抗ＩｇＥ（Ｅ２５、Ｅ２６、及びＥ２７を含む；１９９８年２月３日発行の米国特許第５，７１４，３３８号若しくは１９９２年２月２５日発行の米国特許第５，０９１，３１３号、１９９３年３月４日公開のＷＯ９３／０４１７３、または１９９８年６月３０日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１３４１０号、米国特許第５，７１４，３３８号）；抗Ａｐｏ−２受容体抗体（１９９８年１１月１９日公開のＷＯ９８／５１７９３）；ｃＡ２を含む抗ＴＮＦ−α抗体（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、ＣＤＰ５７１及びＭＡＫ−１９５（１９９７年９月３０日発行の米国特許第５，６７２，３４７号、Ｌｏｒｅｎｚら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６（４）：１６４６−１６５３（１９９６）、及びＤｈａｉｎａｕｔら，Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２３（９）：１４６１−１４６９（１９９５）を参照されたい）；抗組織因子（ＴＦ）（１９９４年１１月９日登録の欧州特許第０  ４２０  ９３７  Ｂ１号）；抗ヒトα４β７インテグリン（１９９８年２月１９日公開のＷＯ９８／０６２４８）；抗ＥＧＦＲ（１９９６年１２月１９日公開のＷＯ９６／４０２１０にあるようなキメラ化またはヒト化２２５抗体）；ＯＫＴ３などの抗ＣＤ３抗体（１９８５年５月７日発行の米国特許第４，５１５，８９３号）；ＣＨＩ−６２１などの抗ＣＤ２５または抗ｔａｃ抗体（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標））及び（ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標））（１９９７年１２月２日発行の米国特許第５，６９３，７６２号を参照されたい）；ｃＭ−７４１２抗体などの抗ＣＤ４抗体（Ｃｈｏｙら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ３９（１）：５２−５６（１９９６））；ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈなどの抗ＣＤ５２抗体（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３３７（１９８８））；Ｇｒａｚｉａｎｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１０）：４９９６−５００２（１９９５）にあるようなＦｃ．ガンマ．ＲＩに指向するＭ２２抗体などの抗Ｆｃ受容体抗体；ｈＭＮ−１４などの抗癌胎児抗原（ＣＥＡ）抗体（Ｓｈａｒｋｅｙら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３  Ｓｕｐｐｌ）：５９３５ｓ−５９４５ｓ（１９９５）；ｈｕＢｒＥ−３、ｈｕ−Ｍｃ３、及びＣＨＬ６を含む乳房上皮細胞に指向する抗体（Ｃｅｒｉａｎｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３）：５８５２ｓ−５８５６ｓ（１９９５）；及びＲｉｃｈｍａｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３  Ｓｕｐｐ）：５９１６ｓ−５９２０ｓ（１９９５））；Ｃ２４２などの結腸癌細胞に結合する抗体（Ｌｉｔｔｏｎら，Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１）：１−９（１９９６））；抗ＣＤ３８抗体、例えばＡＴ１３／５（Ｅｌｌｉｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（２）：９２５−９３７（１９９５））；Ｈｕ  Ｍ１９５などの抗ＣＤ３３抗体（Ｊｕｒｃｉｃら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５（２３  Ｓｕｐｐｌ）：５９０８ｓ−５９１０ｓ（１９９５）及びＣＭＡ−６７６またはＣＤＰ７７１；ＬＬ２またはＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅなどの抗ＣＤ２２抗体（Ｊｕｗｅｉｄら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５（２３  Ｓｕｐｐｌ）：５８９９ｓ−５９０７ｓ（１９９５））；１７−１Ａなどの抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標））；アブシキシマブまたはｃ７Ｅ３  Ｆａｂなどの抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））；ＭＥＤＩ−４９３などの抗ＲＳＶ抗体（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））；ＰＲＯＴＯＶＩＲ（登録商標）などの抗ＣＭＶ抗体；ＰＲＯ５４２などの抗ＨＩＶ抗体；抗ＨｅｐＢ抗体ＯＳＴＡＶＩＲ（登録商標）などの抗肝炎抗体；抗ＣＡ１２５抗体ＯｖａＲｅｘ；抗イディオタイプＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２；抗αｖβ３抗体ＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）；ｃｈ−Ｇ２５０などの抗ヒト腎細胞癌抗体；ＩＮＧ−１；抗ヒト１７−１Ａ抗体（３６２２Ｗ９４）；抗ヒト直腸結腸腫瘍抗体（Ａ３３）；ＧＤ３ガングリオシドに指向する抗ヒト黒色腫抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮細胞癌（ＳＦ−２５）；ならびにスマートＩＤ１０及び抗ＨＬＡＤＲ抗体オンコリム（Ｌｙｍ−１）などの抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体が含まれるが、これらに限定されない。本明細書において、抗体にとって好ましい標的抗原は、ＨＥＲ２受容体、ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、及びＣＤ４０である。
【００９４】
以下の実施例は、例示のために提供されるが、本発明を限定しない。
【実施例】
【００９５】
実施例１：解凍された細胞生存率における、プールｐＨ、保持温度、及び保持時間の効果
バンキングｐＨを制御するための塩基添加方法（小規模調査＃１）
最悪の事例及び典型的なプールの条件（それぞれ、初期ｐＨを６．２及び６．７を標的とする）から単一のｐＨ調整を行って解凍復元を強化する実現可能性を正確に測定するために、調査を実行した。いくつかのｐＨ調整の標的を調査して、最適なバンキングｐＨを決定した。３７℃の温度に設定したＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）４００（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）機器を使用してｐＨを測定した。同様に、等式１を使用したｐＨ計算は、３７℃の試料温度に基づく。
【００９６】
細胞を、遠心分離法によりペレット状にした。細胞プールを、使用済み培地中、１００×１０６細胞／ｍＬに細胞を再懸濁することにより各試験条件について生成した。細胞プールを、ＣＯ２／Ｏ２交換のためのガス透過性膜を用いてまたは用いずに、３７℃で攪拌して、初期ｐＨ条件にｐＨを駆動した（６．２または６．７のどちらか）。初期ｐＨ標的に到達すると、プールを＜１０℃まで迅速に冷やし、２０％（体積／体積）ＤＭＳＯ凍結培地を添加した（１：３部の細胞培養流体）。６．９、７．１、及び７．３の標的ｐＨにするための１Ｍ炭酸ナトリウムの添加に必要とされる体積を計算するために式１を使用して、ｐＨ調整を行い、疑似バンク生成前に、ｐＨの適切な増加を確認するために、最終のオフラインｐＨの測定を行った（実際のバンキングｐＨは、６．９、７．１／７．２、及び７．５であった）。
【００９７】
解凍結果は、１日目生存率において、最大６８％の飛躍的な改善（ｐＨ６．２〜７．５の調整に関して、２４％〜９２％）（図２Ａ）、及び４日目ＰＣＶにおいて、最大０．６４％の改善（ｐＨ６．２〜７．５の調整に関して、０．１７％〜０．８１％）（図２Ｂ）を示した。
式１：ｐＨ調整のために添加する塩基体積の計算
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式中、ＶＮａ２ＣＯ３＝添加する１Ｍ炭酸ナトリウムの体積、Ｖｐ＝プールの体積、
ｐＨｔ＝標的ｐＨ、ｐＨｉ＝初期ｐＨ、
バンキングｐＨを制御するための塩基添加方法（追加の小規模ｐＨ調査）
【００９８】
上述される類似手順の後に、いくつかの調査を実施して、追加の細胞株におけるｐＨ調整の効果を調査した。
【００９９】
種々の細胞型（ＤＰ１２、ＣＨＯ−Ｋ１）を網羅する合計９つのＣＨＯ細胞株を選択した。バンキングの前の数日間、細胞を、標準プロトコルに従って維持した。細胞を遠心分離法によりペレット状にし、使用済み培地中で、２８％血中血球容積（ＰＣＶ）に再懸濁することにより、およそ６０〜９０ｍＬの疑似プールを各試験条件について生成した。プールを、ＣＯ２／Ｏ２交換のためのガス透過性膜を用いてまたは用いずに、３７℃で攪拌して、初期ｐＨ条件にｐＨを駆動した（６．２または６．７のどちらか）。これらの２つの初期ｐＨの設定点を選び、中空繊維ろ過濃縮中及び濃縮後に経験する潜在的な最悪の事例及び典型的な条件をシミュレーションした。初期ｐＨ標的に到達すると、プールを＜１０℃まで迅速に冷やし、２０％（体積／体積）ＤＭＳＯ凍結培地を添加して（１：３部の細胞培養流体）、２１％の最終ＰＣＶに到達させた。ｐＨ７．０、７．３、７．６、または８．０に調整するための１Ｍ炭酸ナトリウムの添加に必要とされる体積を計算するために式１を使用した後、ｐＨ調整を行った。細胞バンク生成前に、ｐＨの適切な増加を確認するために、最終のオフラインｐＨの測定を行った。
【０１００】
全ての事例を１つのアンプルで２つ解凍し、各器中に解凍して入れた。結果は、より低いｐＨに事前に曝露された全ての細胞型が、バンキング前に７．３超のｐＨ値に調整されるときに復元できることを明示した。各細胞株は、バンキングｐＨへの異なる感度を明示した。およそ７．５のｐＨへの調整は、ほとんどの事例において、８０％超の１日目解凍生存率をもたらした（図３Ａ〜３Ｆ及び図４Ａ〜４Ｂ）。解凍後の成長率は、試験したｐＨ範囲の下限においてわずかな影響を受けた。興味深いことに、試験したｐＨ範囲の上限（８．０〜８．２付近）が、通常の生理的ｐＨより著しく大きいにもかかわらず、解凍復元に負の影響を与えなかった。
【０１０１】
高いｐＨへの長期間の曝露について、より多くの情報を得るために調査（ＣＨＯ−Ｋ１細胞型の試験）を拡大した。これらの調査は、（全ての事前の小規模試験事例に類似する）ｐＨ調整の直後（ｔ０）及び２時間後の２回目時点に（ｔ２）凍結された疑似バンクを試験した。２時間の保持の間、縮小模型プール（各事例につき、およそ１０ｍＬ）を、湿った氷中に浸されるＦａｌｃｏｎ（登録商標）管内に保持した。保持ステップにわたってわずかなｐＨ遷移があり、最大０．２ｐＨ単位の変化をもたらした。これらの調査の結果は、この調査で試験したｐＨ範囲への２時間の曝露が、影響を有さないことを示した（実施例は、図６Ａ〜６Ｂで示される）。
【０１０２】
収穫中に細胞培養流体を冷やすための方法
冷却熱交換機と組み合わせた「スローポンプ収穫」プロセスを、従来の細胞バンキングプロセス中に冷却能力を導入するために取り入れた。具体的に「スローポンプ収穫」プロセスは、従来の細胞バンキング生産実行に関して記録した収穫量を一致させるために、典型的な収穫流量をおよそ４Ｌ／分から６００ｍＬ／分に低減することを必要とした。湿った氷内に完全に浸されたサイズ１５のプラチナ硬化シリコーン管材の長さ１５′の冷却熱交換機ラインを、収穫流路中に挿入した。水を用いた疑似実行中に得られた温度傾向は、「冷やされた収穫プロセス」が、中空繊維ろ過濃縮前の最初の３０分以内におよそ１２℃まで培養温度を低減できることを明示した。１０℃におけるデータに基づいて、この冷却能力は、細胞代謝を一時的に停止させ、低ｐＨ遷移を防止する可能性がある。
【０１０３】
プロセス確認調査結果
細胞バンキングプロセス。第１にバッチ／灌流細胞培養プロセスで懸濁液適合ＣＨＯ細胞を蓄積し、次いで、バンキングするために細胞を収穫することにより細胞バンクを生産した。初期の細胞源は、ＭＣＢからであった（ＷＣＢ生成に対して）。プロセスは、細胞蓄積、収穫及び細胞濃縮、ならびに細胞バンキングの３つの段階を含んだ。細胞蓄積ステップの目的は、単一のバッチにおいて、完全サイズのＭＣＢまたはＷＣＢ（それぞれ、４２０×１ｍＬまたは１０ｍＬのアンプル）の産生のために必要とされる細胞の数を生成することであった。細胞を、初期スケールアップの間、及び振動バイオリアクタープロセスの間、選択的種系列培地中で培養した。収穫プロセスステップは、中空繊維ろ過（ＨＦＦ）により最終の細胞培養流体を、バンキングにとって必要とされる細胞密度に濃縮するのに役立った。後の貯蔵及び充填プロセスは、長期保管のための細胞バンクアンプルを調製するのに役立った。ある特定の温度範囲（約５〜１０℃）が維持されるように、貯蔵プロセスを湿った氷上で保持した。本方法のプロセスの流れは、図１で示される。
【０１０４】
収穫及び細胞濃縮プロセスを、中空繊維ろ過カートリッジを使用して実行した。オフラインｐＨ傾向は、「冷やされた収穫プロセス」が、細胞濃縮の間、およそ０．３５ｐＨ単位分の（元のプロセス及び「冷やされた」プロセスのそれぞれに関して、約６．３０から６．６６に）ｐＨの減少を低減させるのに有効であることを示した。ｐＨ調整後、冷やされた細胞バンクを早期（０分）及び後期（１２０分）の時点で創出して、細胞プール保持ｐＨの瞬間的影響を確認した。
【０１０５】
得られた細胞バンクを、初代培養における能力について評価した。細胞バンクアンプルを解凍して、連続的１：２５０希釈度（１：１０、次に１：２５）を使用してバイオリアクターよりもむしろ振とうフラスコに入れた。解凍結果は、現在のプロセス（冷やされた収穫及びｐＨ調整）が、許容される解凍能力でバンクの送達ができることの明示に成功した。一方で、元のプロセスから生成された細胞バンクは、生存率が低下したが、これらの新しい細胞バンクは、一定しており、１日目生存率において、７９．１〜８５．３％の範囲であった（およそ６５％の改善）。細胞が長時間にわたって高ｐＨで保持されたとき、反対の影響は観察されなかった。
【０１０６】
分析は、より高いｐＨに調整されたプールの細胞は、サイズにおいてより小さかった（図５）ことを示した。この観察されたサイズ移行は、より高いｐＨは、（可能性として、増加された浸透圧、または細胞収縮を可能にする強化された細胞膜弾性、またはそれらの両方による）細胞の脱水状態を引き起こすことを示し得る。
【０１０７】
結論
１日目解凍生存率に最大６５％分影響を与える、解凍後の能力にとって最も重要なバンキングｐＨを決定した。このように、低ｐＨへの細胞の曝露を軽減し、バンキングｐＨへの制御を改善するために、収穫及びバンキング手順で行われたプロセスの強化を考案した。最終的には、２つの強化を、１）収穫中に、シリコーン管材熱交換機で細胞培養流体を冷やすことと、２）ｐＨ調整ステップを使用して、７．５までバンキングｐＨを増加させることと、を含むプロセスに導入した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ−３Ｆ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月7日(2020.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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