(57)【要約】      （修正有）【課題】ｍｉＲ−１２４を調節して、哺乳動物の栄養膜幹細胞から分化細胞への分化を誘導することを含む、哺乳動物の栄養膜幹細胞を分化させる方法の提供。【解決手段】（ｉ）インスリン、（ｉｉ）ベータトロフィンタンパク質またはベータトロフィンｍＲＮＡ、および（ｉｉｉ）Ｃ−ペプチドを発現する、単離された膵臓前駆細胞。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉＲ−１２４を調節して、哺乳動物の栄養膜幹細胞から分化細胞への分化を誘導することを含む、哺乳動物の栄養膜幹細胞を分化させる方法。
【請求項２】
哺乳動物の栄養膜幹細胞が、ヒト栄養膜幹細胞（ｈＴＳ細胞）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物の栄養膜幹細胞が、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、または類人猿由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
分化細胞が、前駆細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
分化細胞が、膵臓前駆細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
分化細胞が、多能性幹細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
分化細胞が、内胚葉前駆細胞、中胚葉前駆細胞、または外胚葉前駆細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
分化細胞が、胚体内胚葉の前駆細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
分化細胞が、膵臓の内胚葉前駆細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
分化細胞が、多能性前駆細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
分化細胞が、少能性前駆細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
分化細胞が、単分化能、二分化能、または三分化能を有する前駆細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
分化細胞が、内分泌前駆細胞、外分泌前駆細胞、または管前駆細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
分化細胞が、内分泌前駆細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
分化細胞が、ベータ細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
分化細胞が、インスリン産生細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
調節により、ｍｉＲ−１２４が活性化される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ｍｉＲ−１２４が、時空的に胚体内胚葉の段階で活性化される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ｍｉＲ−１２４が、胚体内胚葉の段階で約１時間〜約８時間活性化される、請求項１８
に記載の方法。
【請求項２０】
調節により、ｍｉＲ−１２４発現が上昇する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
調節により、ｍｉＲ−１２４が非活性化される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
調節により、ｍｉＲ−１２４発現が減少する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
調節が、哺乳動物の栄養膜幹細胞を、１種またはそれより多くの物質と接触させることを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
１種またはそれより多くの物質が、タンパク質またはステロイドホルモンを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
タンパク質またはステロイドホルモンが、増殖因子を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
増殖因子が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＦＧＦが、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、またはＦＧＦ１０である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＦＧＦが、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ｂＦＧＦの濃度が、約１００ｎｇ／ｍＬ以下である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ｂＦＧＦの濃度が、約１〜約１００ｎｇ／ｍＬである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ｂＦＧＦの濃度が、約１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、５０〜７０、８０〜９０、または９０〜１００ｎｇ／ｍＬである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ｂＦＧＦの濃度が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、または９０ｎｇ／ｍＬである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ｂＦＧＦの濃度が、約１０ｎｇ／ｍＬである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
１種またはそれより多くの物質が、抗酸化剤または還元剤をさらに含む、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
抗酸化剤または還元剤が、２−メルカプトエタノールである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
２−メルカプトエタノールの濃度が、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
２−メルカプトエタノールの濃度が、約０．１〜約１０ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
２−メルカプトエタノールの濃度が、約０．１〜１、１〜２、２〜３、３〜４、４〜５、５〜６、６〜７、７〜８、８〜９、または９〜１０ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
２−メルカプトエタノールの濃度が、約０．２、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
２−メルカプトエタノールの濃度が、約１ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
１種またはそれより多くの物質が、ビタミンをさらに含む、請求項２４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ビタミンが、ニコチンアミドである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ニコチンアミドの濃度が、約１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ニコチンアミドの濃度が、約１〜約１００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ニコチンアミドの濃度が、約１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、５０−７０，８０〜９０、または９０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ニコチンアミドの濃度が、約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ニコチンアミドの濃度が、約１０ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
１種またはそれより多くの物質が、ＣＡＭＰ反応性要素結合タンパク質１（ＣＲＥＢ１）の活性または発現レベルを制御する、請求項２３に記載の方法。
【請求項４９】
１種またはそれより多くの物質が、ＣＲＥＢ１のリン酸化を制御する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
１種またはそれより多くの物質が、ビタミンの代謝産物を含む、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
ビタミンの代謝産物が、レチノイン酸である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
１種またはそれより多くの物質が、ＣＲＥＢ１結合タンパク質を含む、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５３】
１種またはそれより多くの物質が、ｍｉｘｌ１、Ｃｄｘ２、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１７、Ｆｏｘａ２、またはＧＳＫ３βを含む１種またはそれより多くの因子を制御する、請求項２
３〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
１種またはそれより多くの物質が、外因性ｍｉＲ−１２４前駆体または外因性抗ｍｉＲ−１２４を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項５５】
哺乳動物の栄養膜幹細胞が、外因性ｍｉＲ−１２４前駆体または外因性抗ｍｉＲ−１２４でトランスフェクトされている、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ｍｉＲ−１２４のプロモーターのＴＧＡＣＧＴＣＡ（配列番号１５８）のシス調節エレメント（ＣＲＥ）が調節される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ｍｉＲ−１２４が、ｍｉＲ−１２４ａ、ｍｉＲ−１２４ｂ、ｍｉＲ−１２４ｃ、ｍｉＲ−１２４ｄ、またはｍｉＲ−１２４ｅである、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
ｍｉＲ−１２４が、ｍｉＲ−１２４ａである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ｍｉＲ−１２４ａが、ヒトｍｉＲ−１２４ａ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４ａ）である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４ａが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−５ｐ（配列番号１：ＣＧＵＧＵＵＣＡＣＡＧＣＧＧＡＣＣＵＵＧＡＵ）またはそれらのフラグメントである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４ａが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（配列番号２：ＵＡＡＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣＣ）またはそれらのフラグメントである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
ｍｉＲ−１２４が、表１および表２から選択される配列またはそれらのフラグメントを含む、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
哺乳動物の栄養膜幹細胞が、調節開始から１日以内に分化細胞に分化する、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
請求項１〜６３のいずれか一項により単離された分化細胞。
【請求項６５】
Ｆｏｘａ２、Ｐｄｘ１、Ｎｇｎ３、Ｐｔｆ１ａ、Ｎｋｘ６．１、またはそれらのあらゆる組み合わせを含む１種またはそれより多くの転写因子を発現する、単離された前駆細胞。
【請求項６６】
単離された前駆細胞が、誘導多能性幹細胞から得られたものである、請求項６５に記載の単離された前駆細胞。
【請求項６７】
単離された前駆細胞が、哺乳動物の栄養膜幹細胞から得られたものである、請求項６５に記載の単離された前駆細胞。
【請求項６８】
哺乳動物の栄養膜幹細胞が、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、類人猿、またはヒト由来である、請求項６７に記載の単離された前駆細胞。
【請求項６９】
単離された前駆細胞が、ｈＴＳ細胞から得られたものである、請求項６５に記載の単離
された前駆細胞。
【請求項７０】
単離された前駆細胞が、膵臓前駆細胞である、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の単離された前駆細胞。
【請求項７１】
単離された前駆細胞が、内胚葉前駆細胞、中胚葉前駆細胞、または外胚葉前駆細胞である、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の単離された前駆細胞。
【請求項７２】
単離された前駆細胞が、胚体内胚葉の前駆細胞である、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の単離された前駆細胞。
【請求項７３】
単離された前駆細胞が、膵臓の内胚葉前駆細胞である、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の単離された前駆細胞。
【請求項７４】
単離された前駆細胞が、多能性前駆細胞である、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の単離された前駆細胞。
【請求項７５】
単離された前駆細胞が、少能性前駆細胞である、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の単離された前駆細胞。
【請求項７６】
単離された前駆細胞が、単分化能、二分化能、または三分化能を有する前駆細胞である、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の単離された前駆細胞。
【請求項７７】
単離された前駆細胞が、内分泌前駆細胞、外分泌前駆細胞、または管前駆細胞である、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の単離された前駆細胞。
【請求項７８】
単離された前駆細胞が、内分泌前駆細胞である、請求項７７に記載の単離された前駆細胞。
【請求項７９】
単離された前駆細胞が、ベータ細胞である、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の単離された前駆細胞。
【請求項８０】
単離された前駆細胞が、インスリン産生細胞である、請求項６５〜７９のいずれか一項に記載の単離された前駆細胞。
【請求項８１】
ベータトロフィン、ベータトロフィンのｍＲＮＡ、Ｃ−ペプチド、またはインスリンを発現する単離された前駆細胞であって、単離された前駆細胞が、哺乳動物の栄養膜幹細胞から分化したものである、上記前駆細胞。
【請求項８２】
単離された前駆細胞が、ヒト細胞である、請求項６５〜８１のいずれか一項に記載の単離された前駆細胞。
【請求項８３】
単離された前駆細胞が、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、または類人猿由来である、請求項６５〜８１のいずれか一項に記載の単離された前駆細胞。
【請求項８４】
単離された前駆細胞が、正常核型を有する、請求項６５〜８２のいずれか一項に記載の単離された前駆細胞。
【請求項８５】
単離された前駆細胞が、１種またはそれより多くの免疫特権を有するという特徴を示す
、請求項６５〜８４のいずれか一項に記載の単離された前駆細胞。
【請求項８６】
１種またはそれより多くの免疫特権を有するという特徴が、低いＣＤ３３発現もしくはＣＤ１３３発現またはそれらの非存在を含む、請求項８５に記載の単離された前駆細胞。
【請求項８７】
疾患の処置に使用するための物質をスクリーニングする方法であって：
ａ）請求項６５〜８６のいずれか一項に記載の単離された前駆細胞を、物質と接触させること；および
ｂ）単離された前駆細胞における転写物またはタンパク質のうち少なくとも１つのレベルの変化を検出すること
を含む、上記方法。
【請求項８８】
単離された前駆細胞における転写物またはタンパク質のうち少なくとも１つのレベルが、物質と接触していない対応する単離された前駆細胞と比較して減少している、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
単離された前駆細胞における転写またはタンパク質のうち少なくとも１つのレベルが、物質と接触していない対応する単離された前駆細胞と比較して増加している、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
疾患が、インスリン障害である、請求項８７〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
疾患が、糖尿病である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
疾患が、１型糖尿病である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
疾患が、２型糖尿病である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
単離された前駆細胞が、膵臓前駆細胞である、請求項８７〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
細胞の細胞調節のための物質をスクリーニングする方法であって、該方法は：
ａ）請求項６５〜８６のいずれか一項に記載の単離された前駆細胞を、物質と接触させること；
ｂ）物質との接触に起因する、単離された前駆細胞における表現型または代謝の変化を決定すること；および
ｃ）該変化と細胞調節とを関連付けること
を含む、上記方法。
【請求項９６】
細胞の細胞毒性に関して物質をスクリーニングする方法であって、該方法は：
ａ）請求項６５〜８６のいずれか一項に記載の単離された前駆細胞を、物質と接触させること；
ｂ）物質との接触に起因する、単離された前駆細胞における表現型または代謝の変化を決定すること；および
ｃ）該変化と細胞毒性とを関連付けること
を含む、上記方法。
【請求項９７】
物質が、薬物である、請求項９５または９６に記載の方法。
【請求項９８】
物質が、ホルモン、ステロイド、または抗体もしくはそれらのフラグメントである、請
求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
物質が、化学物質である、請求項９５または９６に記載の方法。
【請求項１００】
物質が、培地に添加される、請求項９５〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
変化が、単離された前駆細胞の成長である、請求項９５〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
変化が、単離された前駆細胞によるマーカーまたは受容体の発現である、請求項９５〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
単離された前駆細胞が、膵臓前駆細胞である、請求項９５〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
請求項６５〜８６のいずれか一項に記載の単離された前駆細胞を、必要とする哺乳動物に投与することを含む、必要とする哺乳動物における疾患の処置方法。
【請求項１０５】
単離された前駆細胞が、免疫特権を有する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
免疫特権が、低いＣＤ３３発現もしくはＣＤ１３３発現またはそれらの非存在を含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
疾患が、インスリン障害である、請求項１０４〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
疾患が、糖尿病である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
疾患が、１型糖尿病または２型糖尿病である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
必要とする哺乳動物が、糖尿病に関連する１つまたはそれより多くの症状を有する、請求項１０４〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
１つまたはそれより多くの症状が、多尿症（頻尿）、多渇症（喉の渇きの増加）、多食症（空腹感の増加）、体重減少、霧視、痒み、末梢神経疾患、再発性膣感染症、疲労、創傷またはただれの治癒の遅さ、およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群より選択される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
必要とする哺乳動物が、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、または類人猿である、請求項１０４〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
必要とする哺乳動物が、ヒトである、請求項１０４〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
投与が、注射または埋め込みを含む、請求項１０４〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
単離された前駆細胞が、膵臓前駆細胞である、請求項１０４〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
哺乳動物の栄養膜幹細胞を、１種またはそれより多くの物質と接触させて、ｍｉＲ−１
２４を活性化させること、それによりグルコース刺激に応答してインスリンを分泌する前駆細胞を生産することを含む、インスリンの生産方法。
【請求項１１７】
ベータトロフィンタンパク質またはベータトロフィンのｍＲＮＡの生産方法であって、哺乳動物の栄養膜幹細胞を、１種またはそれより多くの物質と接触させて、ｍｉＲ−１２４を活性化させること、それによりベータトロフィンタンパク質またはベータトロフィンのｍＲＮＡを生産する前駆細胞を生産することを含む、上記方法。
【請求項１１８】
ベータトロフィンタンパク質またはベータトロフィンのｍＲＮＡが、誘導後の約１２〜２８時間に生産される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
ベータトロフィンタンパク質またはベータトロフィンのｍＲＮＡが、誘導後の約１２〜１６、１６〜２０、２０〜２４、または２４〜２８時間に生産される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前駆細胞が、Ｃ−ペプチドまたはインスリンを生産する、請求項１１７〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前駆細胞が、膵臓前駆細胞である、請求項１１６〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
哺乳動物の栄養膜幹細胞が、ｈＴＳ細胞である、請求項１１６〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
哺乳動物の栄養膜幹細胞が、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、または類人猿由来である、請求項１１６〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
ｍｉＲ−１２４が、時空的に胚体内胚葉の段階で活性化される、請求項１１６〜１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
ｍｉＲ−１２４が、胚体内胚葉の段階で約１時間〜約８時間活性化される、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２６】
ｍｉＲ−１２４の活性化が、ｍｉＲ−１２４発現の上昇を含む、請求項１１６〜１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
１種またはそれより多くの物質が、タンパク質またはステロイドホルモンを含む、請求項１１６〜１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
タンパク質またはステロイドホルモンが、増殖因子を含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
増殖因子が、ＦＧＦである、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
ＦＧＦが、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、またはＦＧＦ１０である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
ＦＧＦが、ｂＦＧＦである、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
ｂＦＧＦの濃度が、約１００ｎｇ／ｍＬ以下である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
ｂＦＧＦの濃度が、約１〜約１００ｎｇ／ｍＬである、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
ｂＦＧＦの濃度が、約１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、５０−７０，８０〜９０、または９０〜１００ｎｇ／ｍＬである、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
ｂＦＧＦの濃度が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、または９０ｎｇ／ｍＬである、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
ｂＦＧＦの濃度が、約１０ｎｇ／ｍＬである、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
１種またはそれより多くの物質が、抗酸化剤または還元剤をさらに含む、請求項１２７〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
抗酸化剤または還元剤が、２−メルカプトエタノールである、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
２−メルカプトエタノールの濃度が、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
２−メルカプトエタノールの濃度が、約０．１〜約１０ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
２−メルカプトエタノールの濃度が、約０．１〜１、１〜２、２〜３、３〜４、４〜５、５〜６、６〜７、７〜８、８〜９、または９〜１０ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
２−メルカプトエタノールの濃度が、約０．２、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
２−メルカプトエタノールの濃度が、約１ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
１種またはそれより多くの物質が、ビタミンをさらに含む、請求項１２７〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
ビタミンが、ニコチンアミドである、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
ニコチンアミドの濃度が、約１００ｍｍｏｌ／Ｌまたはそれ未満である、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
ニコチンアミドの濃度が、約１〜約１００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
ニコチンアミドの濃度が、約１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、５０−７０，８０〜９０、または９０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
ニコチンアミドの濃度が、約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
ニコチンアミドの濃度が、約１０ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
１種またはそれより多くの物質が、ＣＡＭＰ反応性要素結合タンパク質１（ＣＲＥＢ１）の活性または発現レベルを制御する、請求項１１６〜１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５２】
１種またはそれより多くの物質が、ＣＲＥＢ１のリン酸化を制御する、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
１種またはそれより多くの物質が、ビタミンの代謝産物を含む、請求項１５１または１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
ビタミンの代謝産物が、レチノイン酸である、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
１種またはそれより多くの物質が、ＣＲＥＢ１結合タンパク質を含む、請求項１５１または１５２に記載の方法。
【請求項１５６】
１種またはそれより多くの物質が、ｍｉｘｌ１、Ｃｄｘ２、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１７、Ｆｏｘａ２、およびＧＳＫ３βからなる群より選択される１種またはそれより多くの因子を制御する、請求項１１６〜１５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５７】
ｍｉＲ−１２４が、ｍｉＲ−１２４ａ、ｍｉＲ−１２４ｂ、ｍｉＲ−１２４ｃ、ｍｉＲ−１２４ｄ、またはｍｉＲ−１２４ｅである、請求項１１６〜１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５８】
ｍｉＲ−１２４が、ｍｉＲ−１２４ａである、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
ｍｉＲ−１２４ａが、ヒトｍｉＲ−１２４ａ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４ａ）である、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４が、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−５ｐ（配列番号１：ＣＧＵＧＵＵＣＡＣＡＧＣＧＧＡＣＣＵＵＧＡＵ）またはそのフラグメントである、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４が、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（配列番号２：ＵＡＡＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣＣ）またはそのフラグメントである、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６２】
ｍｉＲ−１２４が、表１および表２から選択される配列またはそのフラグメントを含む、請求項１１６〜１５６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
[0001]本出願は、２０１２年１１月３０日付けで出願された米国仮出願第６１／７３２，１６２号および２０１３年９月１２日付けで出願された米国仮出願第６１／８７７，１５６号の利益を主張し、これらはいずれも参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表
[0002]本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表（参照によりその全体が組み入れられる）を含む。２０１３年１１月２５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名称は44980-703601_SL.txtであり、そのサイズは２６，９１９バイトである。
【背景技術】
【０００３】
[0003]原腸胚形成中、外胚葉細胞は、原始線条から内中胚葉を生じさせ、それに続いて胚体内胚葉（ＤＥ：definitiveendoderm）を包含する３つの胚葉を生じさせる。ＤＥが原始内胚葉に分化すると、腹側および背側膵芽から膵臓が形成される。先進的なヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞の調査から、１型糖尿病処置のために、ＤＥを特殊化することによってグルコースを感知しインスリンを分泌するβ細胞を作り出すという展望が扇動されてきた。しかしながら、現行のｈＥＳ細胞アプローチは、時間がかかり複雑である。
【０００４】
参照による組み入れ
[0004]本明細書に記載された全ての公報、特許、および特許出願は、それぞれ個々の公報、特許、または特許出願が参照により組み入れられるように具体的に且つ個別に提示されたのと同じ程度に参照により組み入れられる。本明細書に記載の用語と組み入れられた参考文献に記載の用語との間で不一致がある場合、本明細書に記載の用語を優先させる。
【発明の概要】
【０００５】
[0005]発明の簡単な要約で示される本発明の実施態様は、単に例示目的で記載されたものであり、本明細書において開示された選択的な実施態様の大要を提供するにすぎない。発明の簡単な要約は、例示的および選択的なものであり、いずれの特許請求の範囲も限定せず、本明細書で開示または考慮された発明の実施態様の全範囲を提供するものではなく、さらに、本開示または全ての特許請求された発明の実施態様の範囲を制限したりまたは狭めたりするものとして解釈されないこととする。
【０００６】
[0006]多くの形態の１つにおいて、ｍｉＲ−１２４を調節して、哺乳動物の栄養膜幹細胞から分化細胞への分化を誘導することを含む、哺乳動物の栄養膜幹細胞を分化させる方法がここに提供される。一例において、哺乳動物の栄養膜幹細胞は、ヒト栄養膜幹（ｈＴＳ）細胞である。一例において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、またはリス）、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、類人猿（例えば、チンパンジー、ゴリラ、またはオランウータン）、またはヒト由来である。一例において、分化細胞は、前駆細胞であり、例えば膵臓前駆細胞である。一例において、分化細胞は、多能性幹細胞である。一例において、分化細胞は、内胚葉前駆細胞、中胚葉前駆細胞、または外胚葉前駆細胞である。一例において、分化細胞は、胚体内胚葉の前駆細胞である。一例において、分化細胞は、膵臓の内胚葉前駆細胞である。一例において、分化細胞は、多能性前駆細胞である。一例において、分化細胞は、少能性前駆細胞である。一例において、分化細胞は、単分化能、二分化能、または三分化能を有する前駆細胞である。一例において、分化細胞は、内分泌前駆細胞、外分泌前駆細胞、または管前駆細胞（duct progenitor cell）であり、例えば内
分泌前駆細胞である。一例において、分化細胞は、ベータ細胞である。一例において、分化細胞は、インスリン産生細胞である。１種またはそれより多くの分化細胞が、本明細書で開示されたあらゆる方法で使用できる。いくつかの実施態様において、上記調節により、ｍｉＲ−１２４が活性化される。一例において、上記調節により、ｍｉＲ−１２４が、時空的に胚体内胚葉の段階で例えば約１時間〜約８時間活性化される。一例において、上記調節により、ｍｉＲ−１２４発現が上昇する。一例において、上記調節により、ｍｉＲ−１２４が非活性化される。一例において、上記調節により、ｍｉＲ−１２４発現が減少する。一例において、上記調節は、哺乳動物の栄養膜幹細胞を、１種またはそれより多くの物質、例えばタンパク質またはステロイドホルモンと接触させることを含む。一例において、１種またはそれより多くの物質は、増殖因子、例えば線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む。一例において、ＦＧＦは、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、またはＦＧＦ１０である。一例において、１種またはそれより多くの物質は、ＦＧＦ２（塩基性線維芽細胞増殖因子、ｂＦＧＦ）を含む。一例において、本明細書に記載のｂＦＧＦの濃度は、約１００ｎｇ／ｍＬ以下であり、例えば約１〜約１００ｎｇ／ｍＬである。一例において、本明細書に記載のｂＦＧＦの濃度は、約１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、５０〜７０、８０〜９０、または９０〜１００ｎｇ／ｍＬである。一例において、本明細書に記載のｂＦＧＦの濃度は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、または９０ｎｇ／ｍＬである。一例において、１種またはそれより多くの物質は、抗酸化剤または還元剤、例えば２−メルカプトエタノールをさらに含む。一例において、２−メルカプトエタノールの濃度は、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、例えば約０．１〜約１０ｍｍｏｌ／Ｌである。一例において、２−メルカプトエタノールの濃度は、約０．１〜１、１〜２、２〜３、３〜４、４〜５、５〜６、６〜７、７〜８、８〜９、または９〜１０ｍｍｏｌ／Ｌである。一例において、２−メルカプトエタノールの濃度は、約０．２、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍｍｏｌ／Ｌである。一例において、１種またはそれより多くの物質は、ビタミン、例えばニコチンアミドをさらに含む。一例において、ニコチンアミドの濃度は、約１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、例えば約１〜約１００ｍｍｏｌ／Ｌである。一例において、ニコチンアミドの濃度は、約１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、５０〜７０、８０〜９０、または９０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。一例において、ニコチンアミドの濃度は、約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍｍｏｌ／Ｌである。一例において、上記調節は、哺乳動物の栄養膜幹細胞を、ｂＦＧＦ、２−メルカプトエタノール、およびニコチンアミドと接触させることを含む。一例において、１種またはそれより多くの物質は、ＣＡＭＰ反応性要素結合タンパク質１（ＣＲＥＢ１）の活性または発現レベルを制御する。一例において、１種またはそれより多くの物質は、ＣＲＥＢ１のリン酸化を制御する。一例において、１種またはそれより多くの物質は、ビタミンの代謝産物、例えばレチノイン酸を含む。一例において、１種またはそれより多くの物質は、ＣＲＥＢ１結合タンパク質を含む。一例において、１種またはそれより多くの物質は、ｍｉｘｌ１、Ｃｄｘ２、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１７、Ｆｏｘａ２、またはＧＳＫ３βを含む１種またはそれより多くの因子を制御する。一例において、１種またはそれより多くの物質は、外因性ｍｉＲ−１２４前駆体または外因性抗ｍｉＲ−１２４を含む。一例において、哺乳動物の栄養膜幹細胞は、外因性ｍｉＲ−１２４前駆体または外因性抗ｍｉＲ−１２４でトランスフェクトされている。一例において、ｍｉＲ−１２４のプロモーターのＴＧＡＣＧＴＣＡ（配列番号１５８）のシス調節エレメント（ＣＲＥ）が調節される。一例において、ｍｉＲ−１２４は、ｍｉＲ−１２４ａ、ｍｉＲ−１２４ｂ、ｍｉＲ−１２４ｃ、ｍｉＲ−１２４ｄ、またはｍｉＲ−１２４ｅである。一例において、ｍｉＲ−１２４は、ｍｉＲ−１２４ａ、例えばヒトｍｉＲ−１２４ａ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４ａ）である。一例において、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−５ｐ（配列番号１：ＣＧＵＧＵＵ
ＣＡＣＡＧＣＧＧＡＣＣＵＵＧＡＵ）またはそれらのフラグメントである。一例において、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（配列番号２：ＵＡＡＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣＣ）またはそれらのフラグメントである。一例において、ｍｉＲ−１２４は、表１および表２から選択される配列またはそれらのフラグメントを含む。一例において、哺乳動物の栄養膜幹細胞は、調節開始から１日以内に分化細胞に分化する。
【０００７】
[0007]一形態において、本明細書に記載の１つまたはそれより多くの方法からの、１つまたはそれより多くのから単離された分化細胞がここに提供される。一例において、単離された分化細胞は、ヒト細胞である。一例において、単離された分化細胞は、正常核型を有する。一例において、単離された分化細胞は、１種またはそれより多くの免疫特権を有するという特徴を示し、例えば低いＣＤ３３発現および／もしくはＣＤ１３３発現またはそれらの非存在を示す。本明細書で開示された１種またはそれより多くの単離された分化細胞は、本明細書で開示されたあらゆる方法で使用できる。
【０００８】
[0008]別の形態において、Ｆｏｘａ２、Ｐｄｘ１、Ｎｇｎ３、Ｐｔｆ１ａ、Ｎｋｘ６．１、またはそれらのあらゆる組み合わせを含む１種またはそれより多くの転写因子を発現する、単離された前駆細胞がここに提供される。一例において、単離された前駆細胞は、誘導多能性幹細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、哺乳動物の栄養膜幹細胞、例えばｈＴＳ細胞から誘導される。一例において、単離された前駆細胞は、膵臓前駆細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、内胚葉前駆細胞、中胚葉前駆細胞、または外胚葉前駆細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、胚体内胚葉の前駆細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、膵臓の内胚葉前駆細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、多能性前駆細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、少能性前駆細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、単分化能、二分化能、または三分化能を有する前駆細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、内分泌前駆細胞、外分泌前駆細胞、または管前駆細胞であり、例えば内分泌前駆細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、ベータ細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、インスリン産生細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、リス）、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、類人猿（例えば、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン）、またはヒト由来である。一例において、単離された前駆細胞は、ヒト細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、正常核型を有する。一例において、単離された前駆細胞は、１種またはそれより多くの免疫特権を有するという特徴を示し、例えば低いＣＤ３３発現および／もしくはＣＤ１３３発現またはそれらの非存在を示す。本明細書で開示された単離された前駆細胞は、本明細書で開示されたあらゆる方法で使用できる。
【０００９】
[0009]他の形態において、ベータトロフィン、ベータトロフィンのｍＲＮＡ、Ｃ−ペプチド、またはインスリンを発現する単離された前駆細胞がここに提供され、ここで単離された該前駆細胞は、哺乳動物の栄養膜幹細胞から分化したものである。一例において、単離された前駆細胞は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、リス）、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、類人猿（例えば、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン）、またはヒト由来である。一例において、単離された前駆細胞は、膵臓前駆細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、ヒト細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、正常核型を有する。一例において、単離された前駆細胞は、１種またはそれより多くの免疫特権を有するという特徴を示し、例えば低いＣＤ３３発現および／もしくはＣＤ１３３発現またはそれらの非存在を示す。本明細書で開示された１種またはそれより多くの単離された前駆細胞は、本明細書で開示されたあらゆる方法で使用できる。
【００１０】
[0010]一例において、本明細書に記載の単離された前駆細胞は、インスリン産生細胞である。本明細書に記載の１種またはそれより多くの単離された前駆細胞は、本明細書で開示されたあらゆる方法で使用できる。
【００１１】
[0011]一例において、本明細書に記載の分化細胞は、インスリン産生細胞である。本明細書に記載の１種またはそれより多くの分化細胞は、本明細書で開示されたあらゆる方法で使用できる。
【００１２】
[0012]一形態において、疾患の処置または予防に使用するための物質をスクリーニングする方法がここに提供され、本方法は：ａ）本明細書に記載の少なくとも１種の単離された前駆細胞を、物質と接触させること；およびｂ）単離された前駆細胞における転写またはタンパク質のうち少なくとも１つのレベルの変化を検出することを含む。一例において、単離された前駆細胞における転写またはタンパク質のうち少なくとも１つのレベルは、物質と接触していない対応する単離された前駆細胞と比較して減少している。一例において、単離された前駆細胞における転写またはタンパク質のうち少なくとも１つのレベルは、物質と接触していない対応する単離された前駆細胞と比較して増加している。一例において、疾患は、インスリン障害である。一例において、疾患は、糖尿病であり、例えば、１型糖尿病または２型糖尿病である。
【００１３】
[0013]一形態において、細胞毒性または細胞の調節のための物質をスクリーニングする方法がここに提供され、該方法は：ａ）本明細書に記載の少なくとも１種の単離された前駆細胞を、物質と接触させること；ｂ）物質との接触に起因する、単離された前駆細胞における表現型および／または代謝の変化を決定すること；およびｃ）該変化と細胞毒性または調節とを関連付けることを含む。一例において、該細胞は、インスリン産生細胞である。一例において、物質は、薬物である。一例において、物質は、化学物質である。一例において、物質は、抗体またはそれらのフラグメントである。一例において、物質は、培地に添加される。一例において、本方法は、単離された前駆細胞の成長に対する物質の作用を決定することを含む。一例において、本方法は、物質が、単離された前駆細胞によるマーカーまたは受容体の発現に影響を与えるかどうかを決定することを含む。いくつかの実施態様において、単離された前駆細胞は、膵臓前駆細胞である。
【００１４】
[0014]一形態において、必要とする哺乳動物における疾患の処置または予防方法がここに提供され、本方法は、本明細書に記載の単離された前駆細胞を、必要とする哺乳動物に投与することを含む。一例において、単離された前駆細胞は、免疫特権を有する。一例において、単離された前駆細胞は、低いレベルのＣＤ３３発現および／またはＣＤ１３３発現を示す。一例において、投与は、注射、埋め込み、または外科的操作を含む。一例において、疾患は、インスリン障害である。一例において、疾患は、糖尿病であり、例えば、１型糖尿病または２型糖尿病である。一例において、必要とする哺乳動物は、マウス、ラット、ブタ、イヌ、サル、オランウータン、類人猿、またはヒトである。一例において、必要とする哺乳動物は、糖尿病に関連する１つまたはそれより多くの症状、例えば、多尿症（頻尿）、多渇症（喉の渇きの増加）、多食症（空腹感の増加）、体重減少、霧視、痒み、末梢神経疾患、再発性膣感染症、疲労、創傷またはただれの治癒の遅さ、およびそれらのあらゆる組み合わせを有する。いくつかの実施態様において、単離された前駆細胞は、膵臓前駆細胞である。
【００１５】
[0015]一形態において、インスリンの生産方法がここに提供され、本方法は、哺乳動物の栄養膜幹細胞を、１種またはそれより多くの物質と接触させて、ｍｉＲ−１２４を活性化させること、それによりグルコース刺激に応答してインスリンを分泌する単離された前駆細胞を生産することを含む。他の形態において、ベータトロフィンタンパク質および／またはベータトロフィンのｍＲＮＡの生産方法がここに提供され、本方法は、哺乳動物の
栄養膜幹細胞を、１種またはそれより多くの物質と接触させて、ｍｉＲ−１２４を活性化させること、それによりベータトロフィンタンパク質および／またはベータトロフィンのｍＲＮＡを生産する膵臓前駆細胞を生産することを含む。一例において、ベータトロフィンタンパク質またはベータトロフィンのｍＲＮＡは、誘導後の約１２〜２８時間に生産され、例えば、誘導後の約１２〜１６、１６〜２０、２０〜２４、または２４〜２８時間に生産される。一例において、単離された前駆細胞は、膵臓前駆細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、Ｃ−ペプチドおよび／またはインスリンを生産する。いくつかの実施態様において、哺乳動物の栄養膜幹細胞は、ｈＴＳ細胞である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞は、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、または類人猿由来である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるげっ歯類は、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、またはリスである。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の類人猿は、チンパンジー、ゴリラ、またはオランウータンである。いくつかの実施態様において、ｍｉＲ−１２４が、時空的に胚体内胚葉の段階で活性化され、例えば胚体内胚葉の段階で約１時間〜約８時間活性化される。いくつかの実施態様において、ｍｉＲ−１２４の発現は、上昇する。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの物質は、タンパク質またはステロイドホルモン、例えば増殖因子を含む。いくつかの実施態様において、増殖因子は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）であり、例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、またはＦＧＦ１０である。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの物質は、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）を含む。いくつかの実施態様において、ｂＦＧＦは、約１００ｎｇ／ｍＬ以下であり、例えば約１〜約１００ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様において、本明細書で使用されるｂＦＧＦの濃度は、約１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、５０〜７０、８０〜９０、または９０〜１００ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様において、本明細書で使用されるｂＦＧＦの濃度は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、または９０ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様において、ｂＦＧＦは、約１０ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの物質は、抗酸化剤または還元剤（例えば、２−メルカプトエタノール）をさらに含む。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの物質は、ビタミン（例えばニコチンアミド）をさらに含む。いくつかの実施態様において、哺乳動物の栄養膜幹細胞を、ｂＦＧＦ、２−メルカプトエタノール、およびニコチンアミドと接触させる。いくつかの実施態様において、２−メルカプトエタノールの濃度は、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、例えば約０．１〜約１０ｍｍｏｌ／Ｌである。いくつかの実施態様において、２−メルカプトエタノールの濃度は、約０．１〜１、１〜２、２〜３、３〜４、４〜５、５〜６、６〜７、７〜８、８〜９、または９〜１０ｍｍｏｌ／Ｌである。いくつかの実施態様において、２−メルカプトエタノールの濃度は、約０．２、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍｍｏｌ／Ｌである。いくつかの実施態様において、２−メルカプトエタノールは、約１ｍｍｏｌ／Ｌである。いくつかの実施態様において、ニコチンアミドの濃度は、約１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、例えば約１〜約１００ｍｍｏｌ／Ｌである。いくつかの実施態様において、ニコチンアミドの濃度は、約１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、５０〜７０、８０〜９０、または９０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。いくつかの実施態様において、ニコチンアミドの濃度は、約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍｍｏｌ／Ｌである。いくつかの実施態様において、ニコチンアミドは、約１０ｍｍｏｌ／Ｌである。いくつかの実施態様において、哺乳動物の栄養膜幹細胞を、１種またはそれより多くの物質と接触させて、ＣＡＭＰ反応性要素結合タンパク質１（ＣＲＥＢ１）の活性または発現レベル、例えばＣＲＥＢ１のリン酸化を制御する。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの物質は、ビタミンの代謝産物、例えばレ
チノイン酸を含む。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの物質は、ＣＲＥＢ１結合タンパク質を含む。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの物質は、ｍｉｘｌ１、Ｃｄｘ２、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１７、Ｆｏｘａ２、およびＧＳＫ３βからなる群より選択される１種またはそれより多くの因子を制御する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のｍｉＲ−１２４は、ｍｉＲ−１２４ａ、ｍｉＲ−１２４ｂ、ｍｉＲ−１２４ｃ、ｍｉＲ−１２４ｄ、またはｍｉＲ−１２４ｅ、例えば、ｍｉＲ−１２４ａである。いくつかの実施態様において、ｍｉＲ−１２４ａは、ヒトｍｉＲ−１２４ａ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４ａ）、例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−５ｐ（配列番号１：ＣＧＵＧＵＵＣＡＣＡＧＣＧＧＡＣＣＵＵＧＡＵ）もしくはｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（配列番号２：ＵＡＡＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣＣ）またはそれらのフラグメントである。いくつかの実施態様において、ｍｉＲ−１２４は、表１および表２から選択される配列、またはそれらのフラグメントを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、ｈＴＳ細胞から膵臓前駆体への経路を例示するグラフのセットである。図１Ａは、ｈＴＳ細胞分化から膵臓前駆体までの間の膵臓発生に関連する転写因子の時間経過プロファイルを示す。データを平均±ＳＤとして表し、ｎ＝３回の独立した実験、★ｐ＜０．０５（ｔ検定）であった。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＤＥ形成中のＭｉｘｌ１強度の変化を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、内中胚葉が２つの細胞集団に分離することを示し、そのうち一方の細胞集団は中胚葉に関するＰｄｘ１＋Ｍｉｘｌ１＋を発現し、他方の細胞集団は内胚葉に関するＰｄｘ１＋Ｍｉｘｌ１−を発現する。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、膵臓分化における多能性転写因子の動的プロファイルを示すグラフのセットである。図２Ａは、発生段階依存的な細胞期それぞれにおける固有の多能性転写因子の推移を示す。データを平均±ＳＤとして表し、ｎ＝３回の独立した実験、★ｐ＜０．０５（ｔ検定）であった。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＤＥの推移中におけるＭｉｘｌ１、Ｃｄｘ２、およびＯｃｔ４の免疫蛍光画像を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｏｃｔ４の免疫蛍光画像をＤＥ段階の代表的なマーカーと共に示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｍは、ｍｉＲ−１２４ａの生物発生および多面的な機能を例示するグラフのセットである。図３Ａは、ＤＥ形成およびベータトロフィン活性化の制御に関するメカニズム的な図説である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、経時的に観察されたｍｉＲ−１２４ａとｐ−ＣＲＥＢ１発現との相関を示し、さらに活性なＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＣＲＥＢ１シグナル伝達経路はｍｉＲ−１２４ａの様々な部位を標的とすることを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ｑＰＣＲアッセイによるｐ−ＣＲＥＢ１とｍｉＲ−１２４ａとの並行発現と、ｑＰＣＲを用いてＣＲＥＢ１  ＣｈＩＰから定量した、ＣＲＥＢ１−結合部位１（ａｃｇｃｃｇｔｃａｔｔ、配列番号１４８）および部位２（ｇｇｔｇａｃｇｔｃａｇｃ、配列番号１４９）を含有するｍｉＲ−１２４−２のプロモーター領域、ならびにＣＲＥＢ１−結合部位（ｇｇｔｇａｃｇｔｃａｃｃ、配列番号１５０）を含有するｍｉＲ−１２４−３のプロモーター領域とを示す。
【図３Ｄ】図３Ｄ〜３Ｆは、ルシフェラーゼレポーターアッセイ用のプラスミドの構築を示す。図３Ｄは、ｍｉＲ−１２４ａを標的とするコンセンサス結合部位Ｓｍａｄ４（１）（５’−ｇｕｕｕｇｕｃｃａｇｕｇｃｃｕｕｕ−３’、配列番号１５１）およびＳｍａｄ４（２）（５’−ａｕｃｃａｇａａｕｕｇｃｃｕｕａ−３’、配列番号１５２）を含有するＳｍａｄ４の３’ＵＴＲのｐＧＬ４．５１−Ｌｕｃレポーターコンストラクト（３から５方向で示した配列番号２）を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４ａを標的とするＣｄｘ２の３’ＵＴＲ（５’−ｇｇｇａｇｕａｕｕｕｇａａｃａｃａ−３’、配列番号１５３）のｐＧＬ４．５１−Ｌｕｃ  レポーターコンストラクト（５’−ｃｇｕｇｕｕｃａｃａｇｃｇｇａｃｃ−３’、配列番号１５４、これは、配列番号１のフラグメントである）を示す。
【図３Ｆ】図３Ｆは、ｍｉＲ−１２４ａを標的とするＧＳＫ３βの３’ＵＴＲ（５’−ｇｕｕｕｇｇａｇｕｇｃｃｕｕｃ−３’、配列番号１５５）のｐＧＬ４．５１−Ｌｕｃレポーターコンストラクト（５’−ｕａａｇｇｃａｃｇｃｇｇｕｇａ−３’、配列番号１５６、これは、配列番号２のフラグメントである）を示す。データを平均±ＳＤとして表し、ｎ＝５、★ｐ＜０．０５（ｔ検定）であった。陽性対照として、非特異的なｓｈＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を使用した。陰性対照として、空のベクターを使用した。
【図３Ｇ】図３Ｇは、誘導後のＳｍａｄ４、Ｍｉｘｌ１、Ｃｄｘ２、ＧＳＫ３β、およびＯｃｔ４発現に対する、ｍｉＲ１２４ａまたは抗ｍｉＲ−１２４ａのトランスフェクト前の作用を示す。
【図３Ｈ】図３Ｈは、４時間でＯｃｔ４標的化遺伝子Ｓｏｘ１７がＳｏｘ１７（矢印）を生産することを示す。インプット：陽性対照、ＩｇＧ：陰性対照。
【図３Ｉ】図３Ｉは、ＣｈＩＰアッセイにおいてβ−カテニン標的化遺伝子Ｆｏｘａ２（ｃｃｔｇｔｔｔｇｔｔｔｔａｇｔｔ、配列番号１５７）が見たところＦｏｘａ２（矢印）を生産する（４時間）ことを示す。インプット：陽性対照、ＩｇＧ：陰性対照。
【図３Ｊ】図３Ｊ〜Ｍは、ベータトロフィンの合成および制御を示す。図３Ｊは、ＣｈＩＰアッセイにより、Ｆｏｘａ２は遺伝子Ｃ１９ｏｒｆ８０を標的化してベータトロフィン（矢印）を生産することを示す。
【図３Ｋ】図３Ｋは、ｑＰＣＲ分析から、１６時間でベータトロフィンのｍＲＮＡが一過性の上昇を示したこと（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼに標準化）を示す。
【図３Ｌ】図３Ｌは、ベータトロフィン、Ｃ−ペプチド、およびインスリン間の並列的な相関を示すウェスタンブロッティングデータのセットである。データを平均±ＳＤとして表し、ｎ＝３、★ｐ＜０．０５（ｔ検定）であった。
【図３Ｍ】図３Ｍは、免疫蛍光により、２４時間誘導後のベータトロフィンとインスリンとの共発現を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｅは、ｈＴＳ細胞から得られた膵臓前駆体の特徴を示すグラフのセットである。図４Ａ〜４Ｃは、インビトロでの機能的なグルコース刺激試験を示す。図４Ａは、ＥＬＩＳＡアッセイにより、これらの細胞は、免疫反応性インスリンを産出するのに高いグルコース濃度（１５ｍＭ、灰色の柱）を要することを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、コンピューター−顕微鏡−ビデオシステム（オリンパス、ＩＸ−８１、ＤＰ３０、ＭＩＵ−ＩＢＣ−ＩＦ−２）で記録した形態学的な変化および陽性ＤＴＺ染色を示す代表的な画像の抜粋のセットである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、それぞれラジオイムノアッセイにより、高グルコース（２５ｍＭ）刺激により、Ｃ−ペプチドを７．６ｎｇ／時間／細胞１０６個で（上のラインで示される）、インスリンを３９３．８μＩＵ／時間／細胞１０６個で（下のラインで示される）が生産されたことを示す。データは、曲線下面積によって測定され、平均±ＳＤとして表し、ｎ＝５であった。★ｐ＜０．０５（ｔ検定）。
【図４Ｄ】図４Ｄは、高グルコース刺激後のブドウのような細胞塊を示す超微細構造の顕微鏡写真のセットである。中央の画像における白色の矢印：デスモソーム結合。下の矢印：β−インスリン顆粒（β−Ｇ）。２つの上の矢印：α−グルカゴン顆粒（α−Ｇ）。Ｎ：細胞核。Ｉｍ−Ｇ：未成熟の顆粒。Ｍ：ミトコンドリア。ＲＥＲ：粗面小胞体。バーのスケール：１μｍ。
【図４Ｅ】図４Ｅは、ｈＴＳ細胞においてｂＦＧＦ誘導の２４時間後における膵臓前駆体マーカーの免疫蛍光染色を示す。対照染色は示していない。
【図５】図５は、免疫蛍光アッセイによって測定された、ｂＦＧＦ、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、およびニコチンアミドなどの様々な因子の組み合わせによるｈＴＳ細胞からのインスリン発現細胞誘導の有効性を示す棒グラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、インスリンとＮｇｎ３との共発現によるｈＴＳ細胞からのインスリン発現細胞の生産に対するｂＦＧＦの用量−作用を示すＴｉｓｓｕｅＱｕｅｓｔ分析画像のセットである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図６Ａに記載のデータの３連での決定における平均±ＳＤの代表的な棒グラフである。
【図７】図７は、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）がインスリンとグルカゴンとの共発現によるインスリン発現細胞と類似のパーセンテージを達成したことを示すＴｉｓｓｕｅＱｕｅｓｔ分析画像である。
【図８】図８は、経時的な様々な細胞プロセス中の転写因子レベルにおける動的パターンを例示する代表的な免疫ブロッティングアッセイからの画像のセットである。破線のボックスは、ＤＥの状況を示す。対照としてβ−アクチンを使用した。データを平均±Ｓ．Ｄとして示す。ｎ＝３、★ｐ＜０．０５。
【図９】図９は、ｂＦＧＦによって誘導された細胞プロセスにおける多能性転写因子（Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｃｄｘ２、およびＯｃｔ４）間の負の自己調節的なフィードバックループを例示する略図である。
【図１０】図１０は、Ｃｄｘ２（左）とＯｃｔ４（右）との相互の阻害関係を示すフローサイトメトリー画像のセットである。対照として非特異的なｓｈＲＮＡを使用した。
【図１１】図１１は、Ｃｄｘ２のノックダウンはＯｃｔ４を上方制御したことを示すウェスタンブロット画像のセットである。対照として、非特異的なｓｈＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を使用した。ローディング対照として、β−アクチンを使用した。
【図１２】図１２は、Ｏｃｔ４のノックダウンはＮａｎｏｇ（左）を上方制御し、逆もまた同様であったこと（右）を示すフローサイトメトリー画像のセットである。
【図１３】図１３は、ＮａｎｏｇのノックダウンはＳｏｘ２を上方制御し（右）、逆もまた同様であった（左）ことを示すフローサイトメトリー画像のセットである。
【図１４】図１４は、多能性転写因子間の相互の抑制の自己調節ループを例示するスキームである。
【図１５】図１５は、ＦＧＦＲ阻害剤（ＰＤ１６６８６６）が、ｂＦＧＦによって誘導されたＰＩ３Ｋをブロックしたことを示すウェスタンブロッティング画像のセットである。ローディング対照として、β−アクチンを使用した。
【図１６】図１６は、ＡｋｔがＣＲＥＢ１と直接的に相互作用したことを示すＩＰアッセイのデータである。
【図１７】図１７は、ＰＩ３ＫのｓｉＲＮＡがＰＩ３Ｋおよびｐ−Ａｋｔの発現を阻害したことを示すウェスタンブロッティング画像のセットである。対照として、非特異的なｓｈＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を使用した。ローディング対照として、β−アクチンを使用した。
【図１８】図１８は、Ａｋｔサブユニットに対するｓｉＲＮＡがｂＦＧＦによって誘導されたｐ−Ａｋｔおよびｐ−ＣＲＥＢ１の発現を阻したことを示すウェスタンブロッティング画像のセットである。対照として、非特異的なｓｈＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を使用した。ローディング対照として、β−アクチンを使用した。
【図１９】図１９は、アッセイの実験準備のためにｍｉＲ−１２４ａまたは抗ｍｉＲ−１２４ａのｃＤＮＡを含有するプラスミドをｈＴＳ細胞にトランスフェクトした際の相対的なｍｉＲ−１２４ａ発現を示す棒グラフである。データを平均±ＳＤとして表し、ｎ＝５であった。
【図２０】図２０は、ｂＦＧＦ単独で誘導されたｈＴＳ細胞と、ｂＦＧＦによって誘導された、ＣＲＥＢ１のｓｈＲＮＡでトランスフェクトされたｈＴＳ細胞との相対的なｍｉＲ−１２４ａ発現を示す棒グラフである。対照として非特異的なｓｈＲＮＡを使用した。データを平均±ＳＤとして表し、ｎ＝３、★ｐ＜０．０５であった。
【図２１】図２１は、ｂＦＧＦによって誘導されたＭｉｘｌ１の抑制が、Ｓｍａｄ４のｓｈＲＮＡｓを使用することによって阻害されたことを示すウェスタンブロッティング画像のセットである。対照として、非特異的なｓｈＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を使用した。ローディング対照として、β−アクチンを使用した。
【図２２】図２２は、Ｏｃｔ４のｓｈＲＮＡｓを使用することによって、ｂＦＧＦによって誘導されたＯｃｔ４およびＳｏｘ１７発現が阻害されたことを示すウェスタンブロッティング画像のセットである。対照として、非特異的なｓｈＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を使用した。ローディング対照として、β−アクチンを使用した。
【図２３】図２３は、ｂＦＧＦ誘導から１〜４時間における阻害性のＧＳＫ３βが、同じ期間でβ−カテニン蓄積を引き起こしたことを示すウェスタンブロッティング画像のセットである。ローディング対照として、β−アクチンを使用した。
【図２４】図２４は、Ｆｏｘａ２に対するｓｈＲＮＡの存在時にｂＦＧＦによって誘導されたＦｏｘａ２発現が弱められたことを示すウェスタンブロッティング画像のセットである。対照として、非特異的なｓｈＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を使用した。ローディング対照として、β−アクチンを使用した。
【図２５】図２５は、ｂＦＧＦ誘導後の２４時間にわたるベータトロフィン、Ｃ−ペプチド、およびインスリン間の発現における動的相関を示すウェスタンブロッティング画像のセットである。２８時間には、ベータトロフィンレベルは低下する傾向を示したが、Ｃ−ペプチドおよびインスリンのレベルはより高いレベルを保った。ローディング対照として、β−アクチンを使用した。
【図２６】図２６は、ｂＦＧＦから誘導された膵臓前駆体におけるベータトロフィン（明るいドット）とインスリン（暗いドット）との共発現を示す免疫細胞化学画像のセットである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
[0042]１またはそれより多くの発明の実施態様の詳細を、添付の図面、特許請求の範囲、および本明細書に記載の説明に示す。本明細書において開示され考察された本発明の実施態様の他の特徴、目的、および利点は、明確に除外されない限りあらゆる他の実施態様と組み合わせることができる。
【００１８】
[0043]用語「調節する」および「調節」は、例えば細胞成長または分化などの細胞の活性における増加もしくは減少、刺激、阻害、干渉、または妨害を、直接的または間接的のいずれかによって誘導すること、またはそれらの誘導を指し、例えば、哺乳動物の栄養膜幹細胞が例えば膵臓前駆体などの分化細胞になるように誘導すること、またはその誘導を指す。
【００１９】
[0044]用語「物質」は、細胞成長および分化、例えば哺乳動物の栄養膜幹細胞の分化に使用するための化合物、例えば、生体分子または化学物質を指す。物質の例としては、これらに限定されないが、増殖因子（例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ））、抗酸化剤／還元剤（例えば２−メルカプトエタノール）、ビタミン（例えばニコチンアミド）およびそれらの代謝産物（例えばレチノイン酸）、核酸（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ、例えばマイクロＲＮＡ）、ホルモン、ペプチド、ならびにタンパク質（例えばＣＲＥＢ１結合タンパク質）が挙げられる。増殖因子の例としては、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、およびＦＧＦ１０が挙げられる。抗酸化剤のさらなる例としては、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、およびトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）が挙げられる。ビタミンの例としては、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９、またはＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、およびビタミンＫが挙げられる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の物質は、ＣＡＭＰ反応性要素結合タンパク質１（ＣＲＥＢ１）の活性または発現レベル、例えばＣＲＥＢ１のリン酸化を制御する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の物質は、ｍｉＲ１２４を活性化する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の物質は、１種またはそれより多くの転写因子を制御し、例えばｍｉｘ１、Ｃｄｘ２、Ｏｃｔ４
、Ｓｏｘ１７、Ｆｏｘａ２、またはＧＳＫ３βを制御する。
【００２０】
[0045]用語「薬物」は、治療および／または診断および／または予防目的での有用性を有する化合物、例えば、治療、診断または予防的化合物を包含することが意図される。治療化合物としては、例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、血管新生阻害剤、鎮痛薬、麻酔薬、ステロイド性および非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）などの抗炎症剤、コルチコステロイド、抗ヒスタミン剤、散瞳薬、抗腫瘍薬、免疫抑制剤、抗アレルギー剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ組織阻害剤（ＴＩＭＰ）、阻害剤またはアンタゴニストまたはイントラセプター（intraceptor）、受容体アンタゴニス
ト、ＲＮＡアプタマー、抗体またはそれらのフラグメント、ヒドロキサム酸および大環状の抗スクシネートヒドロキサメート誘導体（macrocyclic anti-succinate hydroxamate derivative）、核酸、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ワクチン、ＤＮＡ結合（副溝）化合物、
ホルモン、ビタミン、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドおよびペプチド様治療剤が挙げられる。診断化合物としては、例えば、疾患、状態、症候群またはそれらの症状の診断において有用な色素、造影剤、蛍光剤、放射性同位体（例えばＰ−３２、Ｔｃ−９９、Ｆ−１８、Ｉ−１３１）などが挙げられる。予防的化合物とは、疾患、状態、症候群または症状が検出される前に投与される治療化合物である。
【００２１】
[0046]本明細書で使用される場合、「含有する」、「含有すること」、「包含する」、「包含すること」などの非限定的な用語は、特に他の指定がない限り、「含む」を意味する。
【００２２】
[0047]本明細書に記載のいくつかの実施態様では、数値範囲が検討されている。数値範囲が提供される場合、その範囲は、範囲の端点を包含する。数値範囲は、全ての値とその中に含まれる部分範囲を、それらが全て明確に書き出されたものとして包含する。
【００２３】
[0048]用語「約」は、本明細書で使用される場合、±１５%を意味する。例えば、用語
「約１０」は、８.５〜１１.５を包含する。
【００２４】
[0049]冠詞「a」または「an」は、本明細書で使用される場合、明確にそうではないこ
とが規定されない限り、１つまたはそれより多くを意味する。
【００２５】
[0050]「ベクター」は、組換えＤＮＡまたはＲＮＡコンストラクトを指し、例えば、適切な宿主細胞に導入されるとここで説明される細胞の改変を引き起こすプラスミド、ファージ、組換えウイルス、または他のベクターを指す。適切な発現ベクターは当業界における通常の技術を有するものに周知であり、例えば真核および／または原核細胞で複製可能なもの、ならびにエピソームのままのものまたは宿主細胞ゲノムに統合されるものが挙げられる。
【００２６】
[0051]ベクターの構築は、すでに説明されている技術を使用して達成でき、例えばSambrookら、1989で説明されているような技術を使用して達成できる。いくつかの実施態様において、単離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、切断され、目的に応じて加工され、プラスミドを生成するのに望ましい形態で再びライゲートされる。必要に応じて、構築されたプラスミド中の正しい配列を確認するための分析は、あらゆる好適な方法を使用して行われる。発現ベクターを構築する、インビトロで転写物を調製する、宿主細胞にＤＮＡを導入する、および遺伝子発現および機能を評価するために分析を行うための好適な方法は公知である。遺伝子の存在、増幅、および／または発現は、サンプル中で直接的に測定され、例えば、従来のサザンブロッティング、ｍＲＮＡ転写を定量するためのノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、またはここで提供される配列をベースとすることができる適切に標識されたプローブを使用したイン
サイチュハイブリダイゼーションによって測定される。
【００２７】
[0052]例えば「トランスフェクト」、「形質転換」などの用語は、本明細書で使用される場合、核酸を機能的な形態で細胞または生物に移動させることを示すことが意図される。このような用語は、核酸を細胞に移動させる様々な手段を包含し、例えばＣａＰ０４でのトランスフェクト、エレクトロポレーション、ウイルス導入、リポフェクション、リポソームを使用した送達、および／または他の運搬手段などが挙げられる。
【００２８】
[0053]細胞は、親和性技術によって、またはセルソーティング（例えば蛍光活性化セルソーティング）によってソートでき、この場合細胞は、好適な標識、例えばアンチセンス核酸分子もしくは免疫グロブリンもしくはその一部にコンジュゲートしたフルオロフォア、または本質的に蛍光を発するタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もしくはそれらの変異体で標識される。「ソーティング（ソート）」は、本明細書で使用される場合、第二の細胞型から第一の細胞型を少なくとも部分的に物理的に分離することを指す。
【００２９】
[0054]用語「処置すること」、「処置」などは、望ましい薬理学的および／または生理学的な作用を得ることを指す場合があり、例えば、障害を部分的または完全に治癒させること、および／または障害の原因と考えられる負の作用を元に戻すこと、および／または障害を安定化すること、および／または障害の進行を遅延させること、および／または障害の軽減をもたらすことを指す場合がある。
【００３０】
[0055]処置が必要な領域への幹細胞の投与（例えば移植）は、例えば、これらに限定されないが、外科手術中の局所注入、注射、カテーテルの使用、またはインプラントの使用によって達成してもよく、前記インプラントは、多孔質、非多孔質、またはゲル状材料から作製されたものでもよく、例えばシラスティック膜などの膜、または繊維等である。
【００３１】
[0056]組成物を哺乳動物に「移植すること」は、哺乳動物の体に組成物を導入することを指す場合がある。導入される組成物は「移植物」であり、哺乳動物は「レシピエント」である。移植物とレシピエントは、同系であってもよいし、同種異系であってもよいし、または異種であってもよい。さらに移植は、自家移植であってもよい。
【００３２】
[0057]「有効量」は、意図する目的を達成するのに十分な治療剤の量であってもよい。例えば、ｈＴＳ細胞の数を増加させる因子の有効量は、場合によって、インビボまたはインビトロにおいて幹細胞数の増加を引き起こすのに十分な量である。神経変性疾患または状態を処置または改善するための組成物の有効量は、神経変性疾患または状態の症状を低下させたりまたは除去したりするのに十分な組成物の量である。所定の治療剤の有効量は、物質の性質、投与経路、治療剤を受ける動物のサイズおよび種、ならびに投与目的などの要素に応じて変動すると予想される。
【００３３】
[0058]２−メルカプトエタノール（またβ−メルカプトエタノール、ＢＭＥ、２ＢＭＥ、２−ＭＥまたはβ−ｍｅｔ）は、式ＨＯＣＨ２ＣＨ２ＳＨを有する化合物である。
【００３４】
[0059]ニコチンアミドは、ナイアシンアミドおよびニコチン酸アミドとしても知られており、これは、ニコチン酸のアミド（ビタミンＢ３／ナイアシン）であり、式Ｃ６Ｈ６Ｎ２Ｏを有する。
【００３５】
[0060]いくつかの実施態様において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞は、げっ歯類（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、またはリス）、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、類人猿（例えばチンパンジー、ゴリラ、または
オランウータン）、またはヒト由来である。
【００３６】
[0061]いくつかの実施態様において、本明細書に記載される哺乳動物は、げっ歯類（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、またはリス）、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、類人猿（例えばチンパンジー、ゴリラ、またはオランウータン）、またはヒトである。
【００３７】
[0062]いくつかの実施態様において、胚形成において、膵臓の発生は、さらなる分化のためには胚体内胚葉（ＤＥ）の主要な誘導を必要とする。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、多くのレベルで作動して、分化プロセス全体にわたり細胞の移行のタイミングを制御する。本発明の多くの形態の１つは、ｍｉＲ−１２４によって導かれたＤＥの特殊化を介して哺乳動物の栄養膜幹細胞を膵臓前駆体に分化させるためにＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）を使用することである。本発明の他の形態は、ｍｉＲ−１２４の調節を介した膵臓分化中のβ細胞増殖のためにベータトロフィンを促進することである。本発明の他の形態は、哺乳動物の栄養膜幹細胞から分化した、インスリンを分泌する膵臓前駆体を提供することである。
【００３８】
[0063]いくつかの実施態様では、哺乳動物の栄養膜幹細胞において、ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）は、胚体内胚葉（ＤＥ）形成を介したインスリンを分泌する膵臓前駆体への分化を１日で効率的に誘導する。
【００３９】
[0064]いくつかの実施態様において、ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）は、ＦＧＦＲ１／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＣＲＥＢ１経路を介してマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）−１２４の時空的な上昇を活性化することにより、１）Ｓｍａｄ４を阻害し、結果としてＤＥ形成のためにＭｉｘｌ１を抑制する、および２）Ｃｄｘ２を阻害し、それに続いてＤＥ制御のための自己調節的なフィードバックループを介してＯｃｔ４を相互に活性化するという２つの機能を発揮する。その後ＤＥは、原始消化管への移行を介して多能性の膵臓前駆体に分化する。発生段階依存的な細胞プロセスのそれぞれは、主として分化中の固有の多能性転写因子によって制御される。
【００４０】
[0065]いくつかの実施態様において、哺乳動物の栄養膜幹細胞から得られた膵臓前駆体はグルコース感受性であり、インビトロおよび／またはインビボにおいて免疫反応性Ｃ−ペプチドおよびインスリンを分泌する。
【００４１】
[0066]いくつかの実施態様において、ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）誘導は、哺乳動物の栄養膜幹細胞において膵臓前駆体の分化を指示するｍｉＲＮＡ−１２４ａの活性化を効率的に促進する。
【００４２】
[0067]いくつかの実施態様において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞は、糖尿病患者における細胞ベースの療法や薬物毒性スクリーニングのための再生可能な幹細胞源である。
【００４３】
[0068]いくつかの実施態様において、ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）は、哺乳動物の栄養膜幹細胞（例えばｈＴＳ細胞）を膵臓前駆体に効率的に分化させることを可能にすることから、１型ＤＭ患者での細胞ベースの療法のためのインスリンを分泌する膵臓前駆体の生成における再生可能な幹細胞源であることの根拠が提示される。
【００４４】
[0069]いくつかの実施態様において、１）哺乳動物の栄養膜幹細胞は、マルチウェルプレートでの評価に必要な十分な数の生産が容易であること；２）細胞の遺伝子型および表現型が安定であること；３）膵臓の分化および増殖が、ＤＥの特殊化によって特徴付けら
れ明確化されること；４）単一の誘導物質および単純な培地による条件は、毒性スクリーニングにおける評価を容易にすること；および５）インスリンを分泌するベータ細胞分化を達成するのに極めて短時間、例えば１日しか要さず、これは経済的に要件を満たしていることから、哺乳動物の栄養膜幹細胞は、膵臓疾患関連の薬物スクリーニングにとって主要な利点をもたらす。
【００４５】
[0070]一例において、１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子（例えばｂＦＧＦ）で哺乳動物の栄養膜幹細胞を処置することにより、集団中およそ１０％のインスリン産生細胞が得られ、これらの細胞は、膵臓前駆体関連マーカーおよびランゲルハンス島の構成要素を発現する。細胞プロセス中、ｍｉＲＮＡ−１２４は、効率的にＣｄｘ２およびＳｍａｄ４ならびにその下流エフェクターであるＭｉｘｌ１を抑制して、ＤＥ形成および膵臓前駆体への分化を指示する。このような細胞は、グルコース刺激によるインスリン分泌が可能である。
【００４６】
[0071]いくつかの実施態様において、ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）は、ＲＴＫを介してＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を活性化しＣＲＥＢ１をリン酸化する。ＣＲＥＢ１−ｐは一時的にｍｉＲ−１２４のプロモーターを標的とする。一例において、ｍｉＲ−１２４は、ａ）ＤＥ形成のためにＳｍａｄ４およびＭｉｘｉｌ１を抑制する；およびｂ）Ｃｄｘ２を抑制し、続いてＤＥ制御のためにＯｃｔ４を活性化するという２つの方式で機能する。一例において、ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）は、内中胚葉、ＤＥ、および原始消化管を介した細胞プロセスを誘導して、哺乳動物の栄養膜幹細胞において機能的な膵臓前駆体を１日で形成する。
【００４７】
[0072]いくつかの実施態様において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞は、ヒト栄養膜幹細胞（ｈＴＳ細胞）である。
【００４８】
[0073]またｍｉＲ−１２４ａは、ｍｉＲ−１２４ａ、ｍｉｒ−１２４ａ、マイクロＲＮＡ−１２４ａ、ｍｉＲＮＡ−１２４ａ、ｍｉＲ−１２４、ｍｉｒ−１２４、マイクロＲＮＡ−１２４、またはｍｉＲＮＡ−１２４としても知られている。
【００４９】
[0074]ｍｉＲ−１２４の場合、対象のコード配列としては、これらに限定されないが、例えばｍｉＲ−１２４の前駆体をコードする配列が挙げられ、このようなコード配列の例は、ＢＢＳＲＣからの資金提供を受けてマンチェスター大学の生命科学部（Faculty of Life Sciences）で主催され維持されているｍｉＲＢａｓｅデータベースで報告されている。所与のベクターは、要求に応じて、単一のコード配列またはコード配列の複数の反復を包含していてもよい。
【００５０】
[0075]またｍｉＲ−１２４の前駆体は、ｍｉＲＢａｓｅデータベースで見出すこともでき、例えば、以下の通りである。
＞ｈｓａ−ｍｉｒ−１２４−１  ＭＩ００００４４３
ＡＧＧＣＣＵＣＵＣＵＣＵＣＣＧＵＧＵＵＣＡＣＡＧＣＧＧＡＣＣＵＵＧＡＵＵＵＡＡＡＵＧＵＣＣＡＵＡＣＡＡＵＵＡＡＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣＣＡＡＧＡＡＵＧＧＧＧＣＵＧ（配列番号３）
＞ｈｓａ−ｍｉｒ−１２４−２  ＭＩ００００４４４
ＡＵＣＡＡＧＡＵＵＡＧＡＧＧＣＵＣＵＧＣＵＣＵＣＣＧＵＧＵＵＣＡＣＡＧＣＧＧＡＣＣＵＵＧＡＵＵＵＡＡＵＧＵＣＡＵＡＣＡＡＵＵＡＡＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣＣＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＵＡＣＧＧＣＵＧＣＡＣＵＵＧＡＡ（配列番号１４６）
＞ｈｓａ−ｍｉｒ−１２４−３  ＭＩ００００４４５
ＵＧＡＧＧＧＣＣＣＣＵＣＵＧＣＧＵＧＵＵＣＡＣＡＧＣＧＧＡＣＣＵＵＧＡＵＵＵＡＡＵＧＵＣＵＡＵＡＣＡＡＵＵＡＡＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣＣＡＡＧＡＧＡＧＧ
ＣＧＣＣＵＣＣ（配列番号１４７）。
【００５１】
[0076]本明細書に記載のｍｉＲ−１２４の核酸配列は、あらゆるｍｉＲ−１２４ファミリーメンバー、例えば本発明の図面、表１、および表２に記載のファミリーメンバー、例えば、ハエ（ＭＩ００００３７３）、線虫（ＭＩ００００３０２）、マウス（ＭＩ００００１５０）、およびヒト（ＭＩ００００４４３）で同定されたもの、またはｍｉＲＢａｓｅ：マンチェスター大学（英国）によるマイクロＲＮＡデータベースで見出されるファミリーメンバーの核酸配列のセグメントまたは全長を包含し得る。いくつかの実施態様において、抗ｍｉＲ−１２４は、ｍｉＲ−１２４配列のあらゆる相補体の配列、例えばｍｉＲＺＩＰ１２４を有していてもよい。いくつかの実施態様において、抗ｍｉＲ−１２４は、例えばシステム・バイオサイエンス（System Biosciences）によって生産された、ｍｉＲＺｉｐ（商標）レンチウイルスベースマイクロＲＮＡノックダウン法を使用して調製される。
【００５２】
【表１−１】
2020182498.tif 000003
【００５３】
【表１−２】
2020182498.tif 000004
【００５４】
【表１−３】
2020182498.tif 000005
【００５５】
【表２】
2020182498.tif 000006
【００５６】
【表３】
2020182498.tif 000007
【００５７】
哺乳動物の栄養膜幹細胞
[0077]いくつかの実施態様において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞は、げっ歯類（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、リス）、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、類人猿（例えばチンパンジー、ゴリラ、オランウータン）、またはヒト由来である。一例において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞は、霊長類、例えば、サル、類人猿、ヒト由来ではない。他の例において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞は、霊長類、例えば、サル、類人猿、ヒト由来である。他の例において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞は、ヒトであるか、またはヒト化されている。
【００５８】
[0078]本明細書に記載の哺乳動物の栄養膜幹細胞は、１種またはそれより多くの分化細胞に分化させるために誘導されてもよい。一例において、分化細胞は、前駆細胞であり、例えば膵臓前駆細胞である。一例において、分化細胞は、多能性幹細胞である。一例において、分化細胞は、内胚葉前駆細胞、中胚葉前駆細胞、または外胚葉前駆細胞である。一例において、分化細胞は、胚体内胚葉の前駆細胞である。一例において、分化細胞は、膵臓の内胚葉前駆細胞である。一例において、分化細胞は、多能性前駆細胞である。一例において、分化細胞は、少能性前駆細胞である。一例において、分化細胞は、単分化能、二分化能、または三分化能を有する前駆細胞である。一例において、分化細胞は、内分泌前駆細胞、外分泌前駆細胞、または管前駆細胞であり、例えば内分泌前駆細胞である。一例において、分化細胞は、ベータ細胞である。一例において、分化細胞は、インスリン産生細胞である。１種またはそれより多くの分化細胞が、本明細書で開示されたあらゆる方法で使用できる。
【００５９】
[0079]一形態において、本明細書に記載の１つまたはそれより多くの方法からの、１つまたはそれより多くのから単離された分化細胞がここに提供される。一例において、単離された分化細胞は、ヒト細胞である。一例において、単離された分化細胞は、正常核型を有する。一例において、単離された分化細胞は、１種またはそれより多くの免疫特権を有するという特徴を示し、例えば低いＣＤ３３発現および／もしくはＣＤ１３３発現またはそれらの非存在を示す。本明細書で開示された１種またはそれより多くの単離された分化細胞は、本明細書で開示されたあらゆる方法で使用できる。
【００６０】
[0080]他の形態において、Ｆｏｘａ２、Ｐｄｘ１、Ｎｇｎ３、Ｐｔｆ１ａ、Ｎｋｘ６．１、またはそれらのあらゆる組み合わせを含む１種またはそれより多くの転写因子を発現する、単離された前駆細胞がここに提供される。一例において、単離された前駆細胞は、Ｆｏｘａ２、Ｐｄｘ１、Ｎｇｎ３、Ｐｔｆ１ａ、Ｎｋｘ６．１のうち２、３、または４種の転写因子を発現する。一例において、単離された前駆細胞は、Ｆｏｘａ２、Ｐｄｘ１、
Ｎｇｎ３、Ｐｔｆ１ａ、およびＮｋｘ６．１を発現する。一例において、単離された前駆細胞は、誘導多能性幹細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、哺乳動物の栄養膜幹細胞、例えばｈＴＳ細胞から誘導される。一例において、単離された前駆細胞は、膵臓前駆細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、内胚葉前駆細胞、中胚葉前駆細胞、または外胚葉前駆細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、胚体内胚葉の前駆細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、膵臓の内胚葉前駆細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、多能性前駆細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、少能性前駆細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、単分化能、二分化能、または三分化能を有する前駆細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、内分泌前駆細胞、外分泌前駆細胞、または管前駆細胞であり、例えば内分泌前駆細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、ベータ細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、インスリン産生細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、げっ歯類（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、リス）、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、類人猿（例えばチンパンジー、ゴリラ、オランウータン）、またはヒト由来である。一例において、単離された前駆細胞は、ヒト細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、正常核型を有する。一例において、単離された前駆細胞は、１種またはそれより多くの免疫特権を有するという特徴を示し、例えば低いＣＤ３３発現および／もしくはＣＤ１３３発現またはそれらの非存在を示す。本明細書で開示された単離された前駆細胞は、本明細書で開示されたあらゆる方法で使用できる。
【００６１】
[0081]他の形態において、ベータトロフィン、ベータトロフィンのｍＲＮＡ、Ｃ−ペプチド、およびインスリンを発現する単離された前駆細胞がここに提供され、ここで単離された該前駆細胞は、哺乳動物の栄養膜幹細胞から分化したものである。一例において、単離された前駆細胞は、げっ歯類（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、リス）、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、類人猿（例えばチンパンジー、ゴリラ、オランウータン）、またはヒト由来である。一例において、単離された前駆細胞は、膵臓前駆細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、ヒト細胞である。一例において、単離された前駆細胞は、正常核型を有する。一例において、単離された前駆細胞は、１種またはそれより多くの免疫特権を有するという特徴を示し、例えば低いＣＤ３３発現および／もしくはＣＤ１３３発現またはそれらの非存在を示す。本明細書で開示された１種またはそれより多くの単離された前駆細胞は、本明細書で開示されたあらゆる方法で使用できる。
【００６２】
[0082]一例において、本明細書に記載の単離された前駆細胞は、インスリン産生細胞である。本明細書に記載の１種またはそれより多くの単離された前駆細胞は、本明細書で開示されたあらゆる方法で使用できる。
【００６３】
[0083]一例において、本明細書に記載の分化細胞は、インスリン産生細胞である。本明細書に記載の１種またはそれより多くの分化細胞は、本明細書で開示されたあらゆる方法で使用できる。
【００６４】
ヒト栄養膜幹細胞
[0084]ヒトファロピウス管は、女性における受精部位であり、さらに子宮外妊娠の一般的な部位でもあり、そこで、内部細胞塊（ＩＣＭ）と栄養外胚葉との区別や、分化全能性から主要な後成的変化を伴う多能性への切り替えなどの数種の生物学的事象が起こる。これらの観察は、ファロピウス管が、着床前期で胚盤胞関連幹細胞を回収するための貯蔵庫であるニッチとして役立つことの裏付けになる。先進工業国において子宮外妊娠は全ての妊娠の１〜２％を占めており、発展途上国ではそれよりもっと多い。ヒト胚幹細胞（ｈＥＳ細胞）および胎児脳組織の供給が不足していることを考慮した上で、前駆細胞を生成するためにほとんど利用できないｈＥＳ細胞の代用として、子宮外妊娠から得られたヒト栄
養膜幹細胞（ｈＴＳ細胞）を使用することがここで説明される。
【００６５】
[0085]いくつかの実施態様において、子宮外妊娠から得られたｈＴＳ細胞は、ヒト胚の破壊に関与しない。他の例において、子宮外妊娠から得られたｈＴＳ細胞は、生存可能なヒト胚の破壊に関与しない。他の例において、ｈＴＳ細胞は、生存不可能な子宮外妊娠に関連する栄養膜組織から誘導される。他の例において、子宮外妊娠は、救うことができない。他の例において、子宮外妊娠は、生存可能なヒト胚を生じないと予想される。他の例において、子宮外妊娠は、母親の生命を脅かす。他の例において、子宮外妊娠は、卵管、腹腔、卵巣または頸管妊娠である。
【００６６】
[0086]いくつかの実施態様において、胚盤胞の発達中、ＩＣＭの接触それ自体またはそれにより生じた拡散可能な「誘導物質」が、極栄養外胚葉における高速の細胞増殖を引き起こし、胚盤胞段階全体にわたり細胞を壁の領域に移動させ、これは、ＩＣＭから栄養外胚葉を区別した後でさえも継続する可能性がある。ＩＣＭの上を覆う壁の栄養外胚葉細胞は、ＩＣＭの「細胞記憶」を保持することが可能である。通常は、着床開始時に、ＩＣＭと向かい合った壁細胞は、子宮内膜からの物理的な制約のために分割をやめる。しかしながら、ファロピウス管にはこのような制約がないため、結果として極栄養外胚葉細胞の継続的な分割が起こり、成長が停止した子宮外妊娠の胚盤胞において胚体外外胚葉（ＥｘＥ）が形成される。いくつかの実施態様において、ＥｘＥから得られたＴＳ細胞は、ＩＣＭから分泌された線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）とその受容体である線維芽細胞増殖因子受容体２（Ｆｇｆｒ２）との相互作用に応じて、増殖状況下で少なくとも４日の期間存在する。他の例において、ＥｘＥから得られたＴＳ細胞は、増殖状況下で、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、少なくとも１８日、少なくとも１９日、少なくとも２０日の期間存在する。臨床的な介入が起こるまで、これらの細胞プロセスは、着床前胚において無限の数のｈＴＳ細胞を生産でき、このような細胞は、ＩＣＭ関連遺伝子の発現を反映したＩＣＭからの細胞記憶を保持する。
【００６７】
[0087]ここに記載される一形態は、ｈＴＳ細胞とＰＤＭＳ細胞との間の全体的な遺伝子比較のためにＧｅｎｅＣｈｉｐのヒトゲノムＵ１３３プラス２．０  ＧｅｎｅＣｈｉｐを照合するためにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標）プラットフォームを使用した、ｈＴＳ細胞と胎盤から得られた間充織幹（ＰＤＭＳ）細胞との区別を説明する。いくつかの実施態様において、ｈＴＳ細胞は、ＰＤＭＳ細胞における遺伝子発現よりも、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、または約７５％少ない遺伝子発現を示した。他の例において、ｈＴＳ細胞は、ＰＤＭＳ細胞における遺伝子（３，７３０種の遺伝子）よりも約４０％少ない合計２，１４０種の遺伝子（変化倍数＞２倍）を示した。いくつかの実施態様において、ｈＴＳ細胞の遺伝子の強度分布は、ＰＤＭＳ細胞の遺伝子の強度分布とは異なる均一なパターンを表示した。他の例において、ｈＴＳ細胞は、着床前の段階における栄養膜細胞層の異なるグループを表しており、そのためｈＴＳ細胞は、内部細胞塊（ＩＣＭ）および／または栄養外胚葉の分子ポートレートを有する。他の例において、ｈＴＳ細胞は、ｈＥＳ細胞の多能性および自己再生の特徴と類似した多能性および自己再生の特徴を示す。
【００６８】
哺乳動物の栄養膜幹細胞を得て単離する方法
[0088]いくつかの実施態様において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞（例えばｈＴＳ細胞）は、臍帯、羊水、羊膜、ホウォートンゼリー、絨毛膜絨毛、胎盤、または子宮外妊娠から単離してもよい。
【００６９】
[0089]一例において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞（例えばｈＴＳ細胞）は、羊水穿刺生検または羊水から単離してもよい。一例において、羊水穿刺は、妊娠中の胎児を取り囲む羊水の少量のサンプルを得るのに使用される手法であってもよい。一例において、羊水穿刺は、染色体異常のリスクが高い妊娠１５週目から２０週目の間の女性、例えば、分娩時に３５歳より高齢の女性、または異常な母体血清（血液）のスクリーニング試験で染色体異常または神経管欠損の高いリスクが提示された女性になされてもよい。一例において、針、例えば長く薄い中空の針を、超音波ガイドと共に腹腔を通って子宮および羊膜嚢に穿刺するのに使用してもよい。予め決められた量、例えば１オンスの羊水をシリンジに引き出してもよい。
【００７０】
[0090]他の例において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞（例えばｈＴＳ細胞）は、着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）中に、例えば体外受精（ＩＶＦ）などの生殖療法と併用して、分割球生検から得てもよい。一例において、本明細書に記載の細胞は、胚盤胞を生検する方法によって生産されてもよく、ここで胚盤胞の残部を移植して、妊娠とその後の生児出生をもたらし、胚盤胞から例えば透明帯を取り出し、次いで胚盤胞を生検する。
【００７１】
[0091]他の例において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞（例えばｈＴＳ細胞）は、出生前の絨毛膜絨毛サンプリング（ＣＶＳ；chorionic villus sampling）に
よって得ることができる。一例において、ＣＶＳは、染色体異常および所定の他の遺伝学的問題に関する診断を行うために胎盤から組織サンプルを得ることを含む出生前診断であってもよい。一例において、ＣＶＳは、妊娠１０週目から１２週目の間に行うことができる。一例において、ＣＶＳ手法は経頸管的であり、例えば子宮頸を通って胎盤にカテーテルを挿入して組織サンプルを得る。一例において、ＣＶＳ手法は経腹壁的であり、例えば腹腔および子宮を通して胎盤に針を挿入して、組織サンプルを得る。
【００７２】
[0092]一例において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞（例えばｈＴＳ細胞）は、臨月妊娠後に胎盤生検から得ることができる。一例において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞（例えばｈＴＳ細胞）は、経膣分娩または帝王切開による分娩後に胎盤から単離してもよい。
【００７３】
[0093]いくつかの実施態様において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞（例えばｈＴＳ細胞）は、最初の３半期の絨毛膜絨毛サンプリング（例えば８＋３から１２＋０週の在胎期間）または帝王切開術による分娩からの満期胎盤から単離してもよい。絨毛膜組織は、細かく刻んだ、および／または酵素消化した（例えば０．０５％トリプシンＥＤＴＡで、例えば２０分）羊膜から分離してもよい。その後細胞を遠心分離し（例えば１５００ｒｐｍで、例えば５分）、計数し、および／または培地（例えばダルベッコ改変イーグル培地＋１０％ウシ胎児血清）中で再度平板培養する（例えば１ｃｍ２あたり１０４個の細胞）。一例において、単離された細胞は、プラスチックに付着した状態であってもよい。一例において、細胞は、４〜８回継代して使用してもよい。
【００７４】
[0094]一例において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞（例えばｈＴＳ細胞）は、以下の手法に従って満期（例えば妊娠３８〜４０週間）胎盤から単離してもよい。胎盤から臍帯血を自然に排出させ、次いでこれを慎重に解剖する。回収した組織断片を数回洗浄し（例えばリン酸緩衝食塩水中で）、次いで細かく刻み（例えば機械的に）、酵素消化する（例えば０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを使用）。その後ホモジネートを遠心分離でペレット化し、完全培地（例えば１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および／または１００ｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されたダルベッコ改変イーグル培地）に懸濁する。好適な条件下で、例えば３７℃、水飽和した雰囲気および５％Ｃ
Ｏ２で、細胞培養を維持する。培地を、例えば週１回から２回、定期的に交換する。細胞が望ましいレベルの密集度、例えば８０％より高い密集度に達したら、例えば０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて細胞を回収し、例えば１：３の希釈率で再度平板培養する。
【００７５】
[0095]他の例において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞（例えばｈＴＳ細胞）は、分娩後、以下に示されるような手法に従ってヒト胎盤から単離してもよい。羊膜から柔毛膜を引きはがすことにより柔毛膜を分離する。子宮脱落膜組織をばらばらにして（例えば機械的に）、洗浄し（例えばダルベッコリン酸緩衝食塩水中で）、その後、小片（例えば約２×２ｃｍ）に切断する。柔毛膜を小片に細断して、酵素処理し（例えば０．５％トリプシン−ＥＤＴＡ、例えば５分）、続いてコラゲナーゼＩで消化する（例えば０．３％で、３７℃のインキュベーター中で、２０〜３０分）。次いで分離した細胞を収集し、セルストレーナー（例えば１００μｍ）を通過させる。ろ過した細胞を遠心分離（例えば２，５００ｒｐｍで、例えば５分）で収集する。細胞を培地（例えば１０％ウシ胎児血清および／または１％ペニシリン−ストレプトマイシンが補充されたα−改変最小必須培地）に再懸濁し、好適な条件下で（例えば３７℃および／または５％ＣＯ２で）、容器中で、例えばＴ２５フラスコ中で培養する。絨毛膜ＭＳＣが望ましいレベルの密集度、例えば７０％の密集度に達するまで、培地を定期的に、例えば３日毎に換える。
【００７６】
[0096]他の例において、哺乳動物の栄養膜幹細胞（例えばｈＴＳ細胞）を得る方法もここに提供され、本方法は、（ａ）子宮外妊娠（例えば妊娠４〜６週、５〜７週、または６〜８週）のファロピウス管で胎芽を得ること；および（ｂ）胎芽の絨毛栄養膜から幹細胞を得ることを含む。いくつかの実施態様において、胎芽は、未破裂の子宮外妊娠から得ることができる。いくつかの実施態様において、未破裂の子宮外妊娠は、受精後６週未満の段階であってもよい。絨毛栄養膜は、栄養膜細胞層を含んでいてもよい。
【００７７】
[0097]他の例において、胚性の絨毛膜絨毛は、子宮外妊娠した女性（例えば在胎期間：５〜７週間）の未破裂の着床前胚のファロピウス管から得ることができる。小さい絨毛組織は、を好適な培地（例えば無血清α−ＭＥＭ）中で十分細かく刻み、顕微鏡下で確認し、トリプシン処理（例えば０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡで）を続いて所定期間（例えば１５分間）行い、培地（例えば１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ）を添加して反応を止めてもよい。付着細胞を得て、好適な条件（例えば馴化α−ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、および１％ペニシリン−ストレプトマイシン中、３７℃、５％ＣＯ２）で培養してもよい。２回継代後、市販のキット（例えばダコ（Dako）、カリフォルニア州カーピンテリア）で測定した場合、ｈＣＧのレベルは検出不可能になる可能性がある。
【００７８】
哺乳動物の栄養膜幹細胞の分化方法
[0098]多くの形態のうち１つにおいて、ｍｉＲ−１２４を調節して、哺乳動物の栄養膜幹細胞から分化細胞への分化を誘導することを含む、哺乳動物の栄養膜幹細胞を分化させる方法がここに提供される。一例において、哺乳動物の栄養膜幹細胞は、ヒト栄養膜幹（ｈＴＳ）細胞である。一例において、分化細胞は、多能性幹細胞である。一例において、分化細胞は、前駆細胞であり、例えば膵臓前駆細胞である。一例において、分化細胞は、内胚葉前駆細胞、中胚葉前駆細胞、または外胚葉前駆細胞であり、例えば胚体内胚葉前駆細胞である。一例において、分化細胞は、膵臓の内胚葉前駆細胞である。一例において、分化細胞は、多能性前駆細胞である。一例において、分化細胞は、少能性前駆細胞である。一例において、分化細胞は、単分化能、二分化能、または三分化能を有する前駆細胞である。一例において、分化細胞は、内分泌前駆細胞、外分泌前駆細胞、または管前駆細胞であり、例えば内分泌前駆細胞である。一例において、分化細胞は、ベータ細胞である。一例において、分化細胞は、インスリン産生細胞である。１種またはそれより多くの分化細胞が、本明細書で開示されたあらゆる方法で使用できる。
【００７９】
[0099]いくつかの実施態様において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞は、げっ歯類（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、リス）、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、類人猿（例えばチンパンジー、ゴリラ、オランウータン）、またはヒト由来である。
【００８０】
[00100]いくつかの実施態様において、上記調節により、ｍｉＲ−１２４が活性化され
る。一例において、上記調節により、ｍｉＲ−１２４が、時空的に胚体内胚葉の段階で例えば約１時間〜約８時間活性化される。一例において、上記調節により、ｍｉＲ−１２４発現が上昇する。一例において、上記調節により、ｍｉＲ−１２４が非活性化される。一例において、上記調節により、ｍｉＲ−１２４発現が減少する。一例において、上記調節は、哺乳動物の栄養膜幹細胞を、１種またはそれより多くの物質、例えばタンパク質またはステロイドホルモンと接触させることを含む。一例において、１種またはそれより多くの物質は、増殖因子、例えば線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む。一例において、ＦＧＦは、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、またはＦＧＦ１０のうちの１種またはそれより多くである。一例において、１種またはそれより多くの物質は、ＦＧＦ２（塩基性線維芽細胞増殖因子、ｂＦＧＦ）を含む。一例において、上記調節は、哺乳動物の栄養膜幹細胞を、約２００ｎｇ／ｍＬ以下、例えば１００〜２００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）と接触させることを含む。一例において、上記調節は、哺乳動物の栄養膜幹細胞を、約１００ｎｇ／ｍＬ以下のＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）、例えば約０．１〜１ｎｇ／ｍＬ；または約１〜約１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）と接触させることを含む。一例において、本明細書で使用されるＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）の濃度は、約０．１〜１、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、５０〜７０、８０〜９０、または９０〜１００ｎｇ／ｍＬである。一例において、本明細書で使用されるＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）の濃度は、約０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、または９０ｎｇ／ｍＬである。一例において、１種またはそれより多くの物質は、抗酸化剤または還元剤（例えば２−メルカプトエタノール）をさらに含む。一例において、１種またはそれより多くの物質は、ビタミン（例えばニコチンアミド）をさらに含む。一例において、上記調節は、哺乳動物の栄養膜幹細胞を、ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）、２−メルカプトエタノール、およびニコチンアミドと接触させることを含む。一例において、抗酸化剤／還元剤（例えば２−メルカプトエタノール）の濃度は、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、例えば約０．１〜約１０ｍｍｏｌ／Ｌである。一例において、抗酸化剤／還元剤（例えば２−メルカプトエタノール）の濃度は、約０．１〜１、１〜２、２〜３、３〜４、４〜５、５〜６、６〜７、７〜８、８〜９、または９〜１０ｍｍｏｌ／Ｌである。一例において、抗酸化剤／還元剤（例えば２−メルカプトエタノール）の濃度は、約０．２、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍｍｏｌ／Ｌである。一例において、抗酸化剤／還元剤（例えば２−メルカプトエタノール）の濃度は、約１ｍｍｏｌ／Ｌである。一例において、ビタミン（例えばニコチンアミド）の濃度は、約１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、例えば約１〜約１００ｍｍｏｌ／Ｌである。一例において、ビタミン（例えばニコチンアミド）の濃度は、約１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、５０〜７０、８０〜９０、または９０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。一例において、ビタミン（例えばニコチンアミド）の濃度は、約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍｍｏｌ／Ｌである。一例において、ビタミン（例えばニコチンアミド）の濃度は、約１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００８１】
[00101]一例において、上記調節は、哺乳動物の栄養膜幹細胞を、１種またはそれより
多くの物質と接触させて、ＣＡＭＰ反応性要素結合タンパク質１（ＣＲＥＢ１）の活性または発現レベルを制御することを含む。一例において、１種またはそれより多くの物質は、ＣＲＥＢ１のリン酸化を制御する。一例において、１種またはそれより多くの物質は、ビタミンの代謝産物、例えばレチノイン酸を含む。一例において、１種またはそれより多くの物質は、ＣＲＥＢ１結合タンパク質を含む。一例において、１種またはそれより多くの物質は、ｍｉｘｌ１、Ｃｄｘ２、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１７、Ｆｏｘａ２、またはＧＳＫ３βを含む１種またはそれより多くの因子を制御する。
【００８２】
[00102]一例において、１種またはそれより多くの物質は、外因性ｍｉＲ−１２４前駆
体または外因性抗ｍｉＲ−１２４を含む。一例において、哺乳動物の栄養膜幹細胞は、外因性ｍｉＲ−１２４前駆体または外因性抗ｍｉＲ−１２４でトランスフェクトされている。一例において、ｍｉＲ−１２４のプロモーターのＴＧＡＣＧＴＣＡ（配列番号１５８）のシス調節エレメント（ＣＲＥ）が調節される。
【００８３】
[00103]いくつかの実施態様において、ｍｉＲ−１２４は、ｍｉＲ−１２４ａ、ｍｉＲ
−１２４ｂ、ｍｉＲ−１２４ｃ、ｍｉＲ−１２４ｄ、またはｍｉＲ−１２４ｅである。一例において、ｍｉＲ−１２４は、ｍｉＲ−１２４ａ、例えばヒトｍｉＲ−１２４ａ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４ａ）である。一例において、ｍｉＲ−１２４ａは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−５ｐ（配列番号１：ＣＧＵＧＵＵＣＡＣＡＧＣＧＧＡＣＣＵＵＧＡＵ）またはそれらのフラグメントである。一例において、ｍｉＲ−１２４ａは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（配列番号２：ＵＡＡＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣＣ）またはそれらのフラグメントである。一例において、ｍｉＲ−１２４は、表１、表２、および図面から選択される配列、またはそれらのフラグメントを含む。
【００８４】
[00104]一例において、哺乳動物の栄養膜幹細胞は、調節開始から１日以内に分化細胞
に分化する。
【００８５】
[00105]いくつかの実施態様において、哺乳動物の栄養膜幹細胞の分化の誘導は、未分
化の哺乳動物の栄養膜幹細胞を、増殖因子（例えばｂＦＧＦ）を含む培地中で、分化を誘導するのに十分な条件下で（例えば１２、２４、４８、７６、または９６時間）培養することを含む。培地は、血清（例えばＦＢＳ）、炭水化物（例えばグルコース）、抗酸化剤／還元剤（例えばβ−メルカプトエタノール）、および／またはビタミン（例えばニコチンアミド）をさらに含んでいてもよい。分化細胞の収量が測定され、例えば、膵臓前駆体のインジケーターとしてインスリン＋／Ｎｇｎ３＋細胞またはインスリン＋／グルカゴン＋細胞が測定される。一例において、例えばウェスタンブロット分析で示されるように、ＦＢＳおよびインスリンのレベルは、ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）誘導中、正の相関を有する。
【００８６】
[00106]いくつかの実施態様において、細胞誘導の際（例えばｂＦＧＦによる）、例え
ば４、８、１６、２４、３２、４０、または４８時間での時間経過分析を行い、転写因子のレベルをモニターして、細胞分化進行の連鎖的な段階を確認することもできる。いくつかの実施態様において、下降するＭｉｘｌ１ならびに高レベルのＴおよびＧｓｃは、哺乳動物の栄養膜幹細胞から内中胚葉への移行を示す可能性がある。いくつかの実施態様において、分化の各段階において優勢な多能性転写因子としては、内中胚葉に関してはＣｄｘ２、ＤＥに関してはＯｃｔ４もしくはＮａｎｏｇ、原始消化管内胚葉に関してはＣｄｘ２もしくはＮａｎｏｇ、または膵臓前駆体に関してはＳｏｘ２が挙げられる。いくつかの実施態様において、ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）は、ＤＥ段階時におけるＯｃｔ４、Ｓｏｘ１７、またはＦｏｘａ２の上方制御、ただしＳｍａｄ４またはＭｉｘｌ１の下方制御を介したｍｉＲ−１２４ａの多面的な機能を誘導する。
【００８７】
[00107]いくつかの実施態様において、細胞分化中、標的分化細胞に特徴的なタンパク
質またはホルモンのレベルも、時間経過分析で、例えば４、８、１６、２４、３２、４０、または４８時間で測定される。例えば、ベータトロフィン、Ｃ−ペプチド、およびインスリンは、例えばｑＰＣＲ分析で、膵臓前駆体生産に関して測定される。
【００８８】
[00108]いくつかの実施態様において、増殖因子は、本明細書において、哺乳動物の栄
養膜幹細胞の分化を誘導するのに使用される。一例において、増殖因子は、ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である。いくつかの実施態様において、増殖因子の有効量は、約１００ｎｇ／ｍｌ以下であり、例えば、約１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｎｇ／ｍＬである。一例において、哺乳動物の栄養膜幹細胞は、ｈＴＳ細胞である。
【００８９】
[00109]いくつかの実施態様において、哺乳動物の栄養膜幹細胞を分化させるための本
明細書に記載の培地は、第一の物質と相乗作用して内中胚葉方向に分化を誘導する第二の物質の有効量をさらに含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、第一および第二の物質は、異なる増殖因子である。いくつかの実施態様において、第一の物質は、第二の物質の前に培地に添加される。いくつかの実施態様において、第二の物質は、第一の物質の前に培地に添加される。一例において、第一の物質は、ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）である。いくつかの実施態様において、第二の物質は、ＢＭＰ、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ７、またはＢＭＰ４であり、これは第一の物質の前または後に添加される。いくつかの実施態様において、ＢＭＰの有効量は、約１００ｎｇ／ｍｌ以下であり、例えば、約１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｎｇ／ｍＬである。一例において、哺乳動物の栄養膜幹細胞は、ｈＴＳ細胞である。
【００９０】
[00110]いくつかの実施態様において、哺乳動物（例えばヒト）の栄養膜幹細胞を分化
させるための本明細書に記載の培地は、フィーダー細胞を含んでいてもよい。フィーダー細胞は、別のタイプの細胞と共培養して第二のタイプの細胞が成長できる環境を提供する１つのタイプの細胞である。
【００９１】
[00111]いくつかの実施態様において、本明細書で使用される培地は、フィーダー細胞
非含有か、または本質的に非含有である。
【００９２】
[00112]いくつかの実施態様において、ＧＳＫ−３阻害剤を使用して、哺乳動物（例え
ばヒト）の栄養膜幹細胞の分化が誘導される。
【００９３】
医薬組成物および投与
[00113]いくつかの実施態様において、本明細書に記載の分化細胞を含む組成物がここ
に提供される。一例において、本組成物は、緩衝溶液または製薬上許容できるキャリアーをさらに含み、これは、哺乳動物の栄養膜幹細胞（例えばｈＴＳ細胞）の生物活性を維持するために提供される。緩衝溶液としては、これらに限定されないが、例えば食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、またはＦＢＳ（ウシ胎児血清）緩衝液が挙げられる。
【００９４】
[00114]いくつかの実施態様において、本明細書に記載の組成物は、治療化合物をさら
に含む。治療化合物としては、これらに限定されないが、例えば、化学物質または抗体もしくはそれらのフラグメントが挙げられる。
【００９５】
[00115]いくつかの実施態様において、本明細書に記載の組成物は、注射、移植または
外科的操作によって投与されてもよい。
【００９６】
[00116]いくつかの実施態様において、患者は、哺乳動物である。いくつかの実施態様
において、本明細書に記載される哺乳動物は、げっ歯類（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、またはリス）、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、類人猿（例えばチンパンジー、ゴリラ、またはオランウータン）、またはヒトである。一例において、患者は、ヒトである。
【００９７】
[00117]いくつかの実施態様において、上記で説明したような哺乳動物の栄養膜幹細胞
（例えばｈＴＳ細胞）または分化細胞を含む、糖尿病を処置または予防するための組成物がここに提供される。一例において、哺乳動物の栄養膜幹細胞（例えばｈＴＳ細胞）は、子宮外妊娠の胎芽から得られる。糖尿病は、１型糖尿病、２型糖尿病、または成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）である。
【００９８】
[00118]いくつかの実施態様において、哺乳動物の栄養膜幹細胞（例えばｈＴＳ細胞）
または分化細胞を含む、神経系疾患を処置または予防するための組成物がここに提供される。一例において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞は、子宮外妊娠の胎芽から得られる。神経系疾患は、神経変性疾患である。神経変性疾患は、対象の中枢神経系における細胞死に起因するニューロンの進行性消失を特徴とするあらゆる状態を指す場合がある。一例において、神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多系統萎縮症、レヴィー小体認知症、末梢感覚神経障害または脊髄損傷である。一例において、神経変性疾患は、パーキンソン病である。
【００９９】
[00119]ここで説明される単離された幹細胞の調製物の投与様式としては、これらに限
定されないが、全身静脈注射および意図した活性部位への直接的な注射が挙げられる。このような調製物は、あらゆる便利な経路で、例えば点滴またはボーラス注射によって投与されてもよく、他の生物活性物質と共に投与されてもよい。一例において、投与は、全身投与、局所投与である。
【０１００】
[00120]いくつかの実施態様において、幹細胞調製物または組成物は、ヒトなどの哺乳
動物への静脈内投与に適した医薬組成物として製剤化される。一例において、静脈内投与用組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、本組成物はさらに、注射部位におけるあらゆる痛みを改善するために局所麻酔剤も包含する。本組成物を点滴で投与しようとする場合、それらを医薬品グレードの滅菌された水または食塩水を含有する点滴ボトルで分配してもよい。本組成物が注射で投与される場合、投与前に成分が混合されるように、滅菌された注射用水または食塩水のアンプルが提供されてもよい。
【０１０１】
[00121]いくつかの実施態様において、好適な医薬組成物は、幹細胞前駆体の治療有効
量と、薬学的に許容されるキャリアーまたは賦形剤とを含む。このようなキャリアーとしては、これらに限定されないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１０２】
[00122]いくつかの実施態様において、単離された幹細胞は、細胞を特定の組織に標的
化するのに好適な送達系によって標的化部位（例えば膵臓、脳、脊髄または他のあらゆる神経損傷および／もしくは変性部位）に送達される。例えば、上記細胞は、標的化部位における細胞の遅延放出を可能にする運搬手段に封入される。運搬手段は、特定の組織に特異的に標的化されるように改変される。標的化された送達系の表面は、様々な方法で改変される。リポソームで標的化される送達系のケースでは、リポソームの脂質二重層に脂質基を取り入れることにより、リポソームの二重層と安定に会合した状態で標的リガンドを維持している。
【０１０３】
[00123]他の例では、コロイド分散系が使用される。コロイド分散系は、高分子複合体
、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに脂質ベースの系、例えば水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームなどを包含する。
【０１０４】
[00124]いくつかの実施態様において、ここで説明される幹細胞の投与は、任意選択で
、（１）注射される細胞量を増加または減少させること；（２）注射回数変化させること；（３）細胞の送達方法を変化させること；または（４）例えば細胞を遺伝学的に加工することによって、またはインビトロでの細胞培養により細胞の源を変更することによって、個体ごとに加工してもよい。
【０１０５】
[00125]いくつかの実施態様において、幹細胞調製物は、レシピエントにおける細胞の
生着を促進するのに有効な量で使用される。投与は、医師の裁量で、最適な有効性および薬理学的な投与が達成されるように調整される。
【０１０６】
スクリーニング方法
[00126]疾患の処置または予防に使用するための化合物をスクリーニングする方法がこ
こに提供される。一例において、本方法は、単離された哺乳動物の栄養膜幹細胞またはそれらの分化細胞を、前記化合物と接触させることを含む。他の例において、本方法は、哺乳動物の栄養膜幹細胞または分化細胞における遺伝子、転写またはタンパク質のうち少なくとも１つの活性の変化を検出することをさらに含む。他の例において、本方法は、哺乳動物の栄養膜幹細胞または分化細胞における転写またはタンパク質のうち少なくとも１つのレベルの変化を検出することをさらに含む。他の例において、本方法は、哺乳動物の栄養膜幹細胞または分化細胞における遺伝子、転写またはタンパク質のうち少なくとも１つの活性の変化を検出することを含む。いくつかの実施態様において、疾患は、インスリン障害に関連し、例えば糖尿病に関連する。いくつかの実施態様において、哺乳動物の栄養膜幹細胞は、ｈＴＳ細胞である。いくつかの実施態様において、分化細胞は、膵臓前駆細胞である。いくつかの実施態様において、分化細胞は、インスリン産生細胞である。
【０１０７】
[00127]ここに提供される一例において、細胞における変化を調節する能力に関して化
合物をスクリーニングする方法を説明する。他の例において、本方法は、単離された哺乳動物の栄養膜幹細胞（例えばｈＴＳ細胞）を、化合物と接触させること、ならびに哺乳動物の栄養膜幹細胞の成長および分化の誘導を検出することを含む。一例において、本方法は、本明細書に記載の分化細胞（例えば前駆細胞）を、化合物と接触させること、および細胞増殖または細胞の機能における変化を検出することを含む。いくつかの実施態様において、単離された前駆細胞は、膵臓前駆細胞である。いくつかの実施態様において、単離された前駆細胞は、インスリン産生細胞である。
【０１０８】
[00128]いくつかの実施態様において、膵臓細胞の機能（例えばベータ細胞の機能）を
調節するその能力に関して化合物をスクリーニングする方法がここに提供され、本方法は、化合物を、本明細書に記載の膵臓前駆細胞または分化細胞と組み合わせること、該細胞におけるあらゆる表現型または代謝の変化を決定すること、および該変化と、インスリン、グルカゴン、またはベータトロフィンの分泌を調節する該化合物の能力とを関連付けることを含む。
【０１０９】
[00129]また、細胞の細胞毒性に関して化合物をスクリーニングする方法もここに提供
され、本方法は、本明細書に記載の分化細胞を該化合物と接触させることを含む。他の例において、本方法は、化合物との接触に起因する該細胞におけるあらゆる表現型または代謝の変化を決定すること、および該変化と、細胞毒性または他のあらゆる細胞の機能または生化学の変化とを関連付けることをさらに含む。他の例において、治療化合物、毒素、
または可能性のある分化の調節因子のスクリーニングが促進される。これらの物質（例えば治療化合物、毒素、または可能性のある調節因子）は、培地に添加してもよい。
【０１１０】
[00130]また、増殖因子、分化因子、および治療化合物をスクリーニングする方法もこ
こに提供される。一例において、哺乳動物の栄養膜幹細胞は、培養中の哺乳動物の栄養膜幹細胞または分化細胞の特徴に影響を与える因子（例えば小分子の薬物、ペプチド、ポリヌクレオチド、など）または条件（例えば培養条件または操作）に関してスクリーニングするのに使用される。一例において、このシステムは、試験化合物によるフィーダー細胞の不安定化によって引き起こされる副次的な作用によって複雑化することがないという利点を有する。他の例において、成長に影響を与える物質が試験される。他の例において、培養物から馴化培地を引き抜いて、より単純な培地で交換する。他の例において、次いで異なるウェルを、馴化培地の成分を置き換えるための候補である可溶性因子の異なるカクテルで処置する。処置した細胞が、馴化培地中と同様に最適に申し分なく維持されて増殖する場合、各混合物の有効性が決定される。試験プロトコールに従って細胞を処置し、次いで処置した細胞が特定の系の分化細胞の機能的または表現型の特徴を発生させているかどうかを決定することによって、可能性のある分化因子または条件を試験してもよい。いくつかの実施態様において、哺乳動物の栄養膜幹細胞は、ｈＴＳ細胞である。
【０１１１】
[00131]いくつかの実施態様において、本明細書に記載の哺乳動物の栄養膜幹細胞（例
えばｈＴＳ細胞）は、可能性のある細胞分化の調節因子をスクリーニングするのに使用される。一例において、細胞分化は、膵臓分化である。例えば、細胞分化の調節因子をスクリーニングするための１つのアッセイにおいて、哺乳動物の栄養膜幹細胞を、状況上必要に応じて、血清非含有、低密度条件下で、ＬＩＦの存在または非存在下で、調節因子の存在下で、およびＲＡの存在または非存在下で培養してもよいし、分化に対する作用を検出してもよい。他の例において、ここで説明されるスクリーニング方法は、細胞の発生に関連する条件を研究して、可能性のある治療薬または矯正薬または条件の調節因子に関してスクリーニングするのに使用できる。例えば、一例において、正常な哺乳動物の栄養膜幹細胞の発生は、上記条件を有する細胞の発生と比較される。いくつかの実施態様において、哺乳動物の栄養膜幹細胞は、ｈＴＳ細胞である。
【０１１２】
[00132]いくつかの実施態様において、哺乳動物の栄養膜幹細胞（例えばｈＴＳ細胞）
から得られた異なる細胞集団間で、遺伝子およびタンパク質発現を比較して、分化の過程で上方制御または下方制御された因子を同定して特徴付けることや、影響を受けた遺伝子のヌクレオチドのコピーを生産することに使用してもよい。
【０１１３】
[00133]いくつかの実施態様において、フィーダー非含有の哺乳動物の栄養膜幹細胞の
培養物はまた、薬物調査において医薬化合物を試験するのにも使用できる。候補医薬化合物の活性の評価は一般的に、本明細書に記載の分化細胞を候補化合物と組み合わせること、結果生じたあらゆる変化を決定すること、次いで該化合物の作用と観察された変化とを関連付けることを含む。他の例において、化合物が、例えば、所定の細胞型に対して薬理効果を有するように設計されているか、または化合物が、他所で予期せぬ副作用をもたらす作用を有するように設計されているかのいずれかの理由により、スクリーニングがなされる。他の例において、（同時または連続的のいずれかで細胞と組み合わせることによって）２種またはそれより多くの薬物を組み合わせた状態で試験することにより、可能性のある薬物−薬物相互作用が検出される。他の例において、化合物は、最初のうちは可能性のある毒性に関してスクリーニングされる。他の例において、細胞毒性は、細胞の生存能力、生存、形態学、所定のマーカー、受容体または酵素の発現または放出、ＤＮＡの合成または修理に対する作用によって決定される。いくつかの実施態様において、哺乳動物の栄養膜幹細胞は、ｈＴＳ細胞である。
【０１１４】
疾患の処置
[00134]一形態において、必要とする哺乳動物における疾患の処置または予防方法がこ
こに提供され、本方法は、本明細書に記載の細胞（例えば単離された前駆細胞）を、必要とする哺乳動物に投与することを含む。一例において、該細胞は、免疫特権を有する。一例において、該細胞は、低いレベルのＣＤ３３発現および／またはＣＤ１３３発現を示す。一例において、投与は、注射、埋め込み、または外科的操作を含む。一例において、疾患は、インスリン障害である。一例において、疾患は、糖尿病であり、例えば、１型糖尿病または２型糖尿病である。一例において、必要とする哺乳動物は、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、または類人猿である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるげっ歯類は、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、またはリスである。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の類人猿は、チンパンジー、ゴリラ、またはオランウータンである。一例において、必要とする哺乳動物は、糖尿病に関連する１つまたはそれより多くの症状、例えば、多尿症（頻尿）、多渇症（喉の渇きの増加）、多食症（空腹感の増加）、体重減少、霧視、痒み、末梢神経疾患、再発性膣感染症、疲労、創傷またはただれの治癒の遅さ、およびそれらのあらゆる組み合わせを有する。
【０１１５】
[00135]一形態において、疾患または状態を処置または予防する方法がここに提供され
、本方法は、必要とする対象に、本明細書で開示された対象の方法を使用して調製された、単離された哺乳動物の栄養膜幹細胞または分化細胞の有効量を投与することを含む。一例において、疾患は、免疫不全疾患、神経系疾患、造血に関する疾患、癌、または糖尿病である。
【０１１６】
[00136]いくつかの実施態様において、例えば、本明細書に記載の単離された哺乳動物
の栄養膜幹細胞または分化細胞を用いて、糖尿病患者を処置するためのインスリンを分泌する細胞を生成する方法がここに提供される。
【０１１７】
[00137]いくつかの実施態様において、本明細書に記載の糖尿病は、炭水化物（例えば
グルコース）の生産および利用におけるあらゆる代謝障害、またはあらゆるインスリン障害を指す場合がある。
【０１１８】
[00138]いくつかの実施態様において、糖尿病患者は、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠
糖尿病、または成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）に罹っている。１型糖尿病、またはインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の場合、患者は、グルコース利用を制御するホルモンであるインスリンをほとんど生産しない。２型糖尿病、またはインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の場合、患者は、筋肉、肝臓および脂肪組織である主要なインスリン感受性組織において、糖尿病ではないが、グルコースおよび脂質代謝でのインスリン刺激作用に耐性が生じた対象と比較して同じかまたはより上昇した血漿インスリンレベルを有することが多く、その血漿インスリンレベルは、上昇したものの、著しいインスリン耐性を克服するには不十分である。妊娠糖尿病（または妊娠糖尿病、ＧＤＭ）は、これまでに糖尿病と診断されたことがない女性が妊娠中に高い血糖値を示す状態であり得る。成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）は、成人において１型糖尿病が発症している状態であり得る。
【０１１９】
[00139]いくつかの実施態様において、本明細書に記載の細胞、組成物、および方法は
、糖尿病（例えば糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性血管症および細小血管症）、高血糖症、肥満症、脂質障害（例えば脂質代謝異常、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬ、高ＬＤＬ、代謝症候群（脂質異常症）、全身および肺の緊張亢進、心臓血管疾患（例えば心筋梗塞、心臓肥大症および心不全後の心筋繊維化、動脈硬化症）、腎疾患（例えば糸球体硬化症、腎硬化症、腎炎、腎症、電解質
の排出障害）、および／または線維症および炎症過程（例えば肝硬変、肺線維症、線維化性膵臓炎、リウマチおよび関節症、クローン病、慢性気管支炎、放射線線維症、硬化性皮膚炎、嚢胞性線維症、瘢痕化、アルツハイマー病）の処置または予防に使用できる。また本明細書に記載の細胞、組成物、および方法はさらに、癌、腫瘍細胞および腫瘍転移の成長を阻害することもでき、したがって腫瘍療法に好適である。
【０１２０】
[00140]いくつかの実施態様において、本明細書に記載の細胞、組成物、および方法は
、２型糖尿病もしくは耐糖能異常を有するか、または糖尿病の家族歴と以下の条件：脂質代謝異常、高血圧、高尿酸血症、凝血促進状態（pro-coagulant state）、アテローム性
動脈硬化症、および体幹部肥満のうち少なくとも１つとを有する対象におけるインスリン抵抗性症候群の処置に使用できる。
【０１２１】
[00141]いくつかの実施態様において、本明細書に記載の細胞、組成物、および方法は
、代謝症候群（Ｘ症候群、または血糖上昇、高血圧、肥満症、脂質代謝異常）、高血糖症、インスリン過剰血症、耐糖能異常、空腹時血糖、インスリン耐性、肥満症、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患、脳血管障害、末梢血管疾患、狼瘡、多嚢胞卵巣症候群、発癌現象、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病黄斑浮腫、および過形成などの１種またはそれより多くの糖尿病関連の障害を処置または予防することに使用できる。
【０１２２】
[00142]いくつかの実施態様において、本明細書に記載の細胞、組成物、および方法は
、（１）高血糖症、（２）低い耐糖能、（３）インスリン耐性、（４）肥満症、（５）脂肪疾患、（６）脂質代謝異常、（７）高脂血症、（８）高トリグリセリド血症、（９）高コレステロール血症、（１０）低ＨＤＬレベル、（１１）高ＬＤＬレベル、（１２）アテローム性動脈硬化症およびその続発症、（１３）血管再狭窄、（１４）過敏性腸症候群、（１５）クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、（１６）他の炎症状態、（１７）膵臓炎、（１８）腹部脂胖症、（１９）神経変性疾患、（２０）網膜疾患、（２１）腎症、（２２）ニューロパシー、（２３）Ｘ症候群、（２４）卵巣アンドロゲン過剰症（多嚢胞性卵巣症候群）、ならびにインスリン耐性が構成要件である他の障害などの１種またはそれより多くの疾患、障害および条件を処置または予防することに使用できる。
【０１２３】
[00143]いくつかの実施態様において、本明細書に記載の細胞、組成物、および方法は
、例えば心臓血管疾患（ＣＶＤ）を処置または予防するための高脂血症治療剤と組み合わせて使用してもよい。高脂血症治療剤の例としては、コレステロール合成阻害剤であるスタチン化合物（例えばセリバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチン、イタバスタチンまたはそれらの塩など）、トリグリセリドを低下させる作用を有するスクアレンシンターゼ阻害剤またはフィブラート化合物（例えばベザフィブラート、クロフィブラート、シンフィブラート、クリノフィブラート）などが挙げられる。
【０１２４】
[00144]いくつかの実施態様において、本明細書に記載の細胞、組成物、および方法は
、例えば高インスリンレベルによって引き起こされる異常な血管の成長および腎臓でのナトリウム貯留を処置または予防するための血圧降下剤と組み合わせて使用してもよく、それにより高血圧が緩和される。血圧降下剤の例としては、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（例えばカプトプリル、エナラプリル、デラプリル）、アンギオテンシンＩＩアンタゴニスト（例えばカンデサルタンシレキセチル、ロサルタン、エプロサルタン、バルサルタン（valsantan）、テルミサルタン（termisartan）、イルベサルタン、タソサルタン）、カルシウムアンタゴニスト（例えばマニジピン、ニフェジピン、ニカルジビン、アムロジピン、エホニジピン）、およびクロニジンが挙げられる。
【０１２５】
[00145]いくつかの実施態様において、本明細書に記載の細胞、組成物、および方法は
、例えば抗肥満剤と組み合わせて使用してもよい。抗肥満剤の例としては、中枢神経系に作用する抗肥満薬（例えばデクスフェンフルラミン、フェンフルラミン、フェンテルミン、シブトラミン、アンフェプラモン（anfepramon）、デキサンフェタミン、マチンドール、フェニルプロパノールアミン、クロベンゾレックス）、膵リパーゼ阻害剤（例えばオーリスタット）、ベータ−３アゴニスト（例えばＣＬ−３  １６２４３、ＳＲ−５８６１  １−Ａ、ＵＬ−ＴＧ−３０７、ＳＢ−２２６５５２、ＡＪ−９６７７、ＢＭＳ−１９６０８５、ＡＺ−４０１４０）、食欲抑制ペプチド（例えばレプチン、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）およびコレシストキニンアゴニスト（例えばリンチトリプト（lintitript）、ＦＰＬ−１  ５８４９）が挙げられる。
【０１２６】
[00146]いくつかの実施態様において、栄養膜幹細胞またはそれらの分化細胞の有効量
を患者に投与することを含む、神経変性疾患を処置する方法がここに提供される。哺乳動物の栄養膜幹細胞は、子宮外妊娠のファロピウス管における栄養膜の絨毛から得られる。一例において、神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病または化学物質によって誘導されたニューロン損傷である。
【０１２７】
[00147]いくつかの実施態様において、障害を処置する方法がここに提供され、ここで
本方法は、ニューロンの純粋集団、または本明細書に記載の方法によって生成した特定の神経幹細胞集団の複合体を、必要とする患者に移植することを含む。一例において、患者は、神経疾患と診断されている。他の例において、患者は、神経精神疾患と診断されている。他の例において、患者は、神経変性障害と診断されている。他の例において、ニューロンの純粋集団は、ドーパミン作動性ニューロンを含む。
【０１２８】
[00148]一例において、疾患は、神経疾患である。他の例において、疾患は、神経変性
疾患または障害である。神経障害の非限定的な例としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、レヴィー小体病、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、認知症、統合失調症、麻痺、多発性硬化症、脊髄損傷、脳損傷（例えば卒中）、脳神経障害、末梢感覚神経障害、てんかん、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、アルパース病、小脳／脊髄小脳変性症、バッテン病、大脳皮質基底核変性症、ベル麻痺、ギヤン−バレー症候群、ピック病、および自閉症が挙げられる。
【０１２９】
[00149]いくつかの実施態様において、ここで説明される方法は、神経疾患または障害
の症状を改良または改善するのに使用できる。神経疾患または障害に関連する症状の非限定的な例としては、震え、歩行障害、位置異常歩行、認知症、過剰な膨張（浮腫）、筋衰弱、下肢萎縮、運動障害（舞踏病）、筋硬直、身体運動の緩慢化（運動緩慢）、身体運動の喪失（無動症）、健忘、認知（知能）機能障害、認識の喪失（失認）、意思決定や計画などの機能障害、片側顔面麻痺、感覚欠損、しびれ、刺痛、四肢における痛みを伴う感覚異常、衰弱、脳神経の麻痺、発話困難、眼球運動、視野欠損、失明、出血、滲出物、近位筋の衰弱、ジスキネジア、四肢筋の緊張異常、筋緊張の減少、協調運動不能、指指試験または指鼻試験における誤った提示、測定障害、ホームズ−スチュワート現象、不完全または完全な全身麻痺、視神経炎、多視症、眼振などの眼球運動障害、痙性麻痺、有痛性強直性痙攣、レルミット症候群、運動失調、言語障害、膀胱直腸障害、起立性低血圧、運動機能の減少、夜尿症、低い言語化能、不良な睡眠パターン、睡眠障害、食欲障害、体重変化、精神運動性激越または遅滞、活動力の減少、無力感または過剰なもしくは不適切な罪悪感、思考または集中困難、死を繰り返し考えることまたは自殺念慮もしくは自殺企図、恐怖心、不安、短気、憂鬱または強迫観念的な反芻思考、体の健康状態に関する過剰な心配、パニック発作、および恐怖症が挙げられる。
【０１３０】
[00150]いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法は、癌を処置または予防
することに使用でき、ここで癌は、癌腫である。癌腫はさらに、腺癌または絨毛癌である。一例において、絨毛癌は、悪性シンシチオームである。
【０１３１】
インスリン、Ｃ-ペプチド、ベータトロフィンタンパク質、および ベータトロフィンのｍＲＮＡの生産
[00151]一形態において、インスリンの生産方法がここに提供され、本方法は、哺乳動
物の栄養膜幹細胞を、１種またはそれより多くの物質と接触させて、ｍｉＲ−１２４を活性化させること、それによりグルコース刺激に応答してインスリンを分泌する前駆細胞を生産することを含む。他の形態において、ベータトロフィンタンパク質および／またはベータトロフィンのｍＲＮＡの生産方法がここに提供され、本方法は、哺乳動物の栄養膜幹細胞を、１種またはそれより多くの物質と接触させて、ｍｉＲ−１２４を活性化させること、それによりベータトロフィンタンパク質および／またはベータトロフィンのｍＲＮＡを生産する膵臓前駆細胞を生産することを含む。一例において、ベータトロフィンタンパク質またはベータトロフィンのｍＲＮＡは、誘導後の約１２〜２８時間に生産され、例えば、誘導後の約１２〜１６、１６〜２０、２０〜２４、または２４〜２８時間に生産される。一例において、前駆細胞は、膵臓前駆細胞である。一例において、前駆細胞は、Ｃ−ペプチドおよび／またはインスリンを生産する。
【０１３２】
[00152]いくつかの実施態様において、哺乳動物の栄養膜幹細胞は、ｈＴＳ細胞である
。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞は、げっ歯類（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、またはリス）、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、または類人猿（例えばチンパンジー、ゴリラ、またはオランウータン）由来である。
【０１３３】
[00153]いくつかの実施態様において、ｍｉＲ−１２４が、時空的に胚体内胚葉の段階
で活性化され、例えば胚体内胚葉の段階で約１時間〜約８時間活性化される。いくつかの実施態様において、ｍｉＲ−１２４の発現は、上昇する。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの物質は、タンパク質またはステロイドホルモン、例えば増殖因子を含む。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの物質は、ＦＧＦを含み、例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、またはＦＧＦ１０を含む。いくつかの実施態様において、ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）は、約２００ｎｇ／ｍＬ以下であり、例えば１００〜２００ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様において、ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）は、約１００ｎｇ／ｍＬ以下であり、例えば、約０．１〜１ｎｇ／ｍＬ；または約１〜約１００ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様において、本明細書で使用されるＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）の濃度は、約０．１〜１、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、５０〜７０、８０〜９０、または９０〜１００ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様において、本明細書で使用されるＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）の濃度は、約０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、または９０ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様において、ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）は、約１０ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの物質は、抗酸化剤または還元剤（例えば２−メルカプトエタノール）をさらに含む。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの物質は、ビタミン（例えばニコチンアミド）をさらに含む。いくつかの実施態様において、哺乳動物の栄養膜幹細胞を、ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）、２−メルカプトエタノール、およびニコチンアミドと接触させる。いくつかの実施態様において、抗酸化剤または還元剤（例えば２−メルカプトエタノール）の濃度は、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、例えば約０．１〜約１０ｍｍｏｌ／Ｌである。いくつかの実施態様において、抗
酸化剤または還元剤（例えば２−メルカプトエタノール）の濃度は、約０．１〜１、１〜２、２〜３、３〜４、４〜５、５〜６、６〜７、７〜８、８〜９、または９〜１０ｍｍｏｌ／Ｌである。いくつかの実施態様において、抗酸化剤または還元剤（例えば２−メルカプトエタノール）の濃度は、約０．２、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍｍｏｌ／Ｌである。いくつかの実施態様において、抗酸化剤または還元剤（例えば２−メルカプトエタノール）の濃度は、約１ｍｍｏｌ／Ｌである。いくつかの実施態様において、ビタミン（例えばニコチンアミド）の濃度は、約１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、例えば約１〜約１００ｍｍｏｌ／Ｌである。いくつかの実施態様において、ビタミン（例えばニコチンアミド）の濃度は、約１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、５０〜７０、８０〜９０、または９０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。いくつかの実施態様において、ビタミン（例えばニコチンアミド）の濃度は、約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍｍｏｌ／Ｌである。いくつかの実施態様において、ビタミン（例えばニコチンアミド）の濃度は、約１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【０１３４】
[00154]いくつかの実施態様において、哺乳動物の栄養膜幹細胞を、１種またはそれよ
り多くの物質と接触させて、ＣＡＭＰ反応性要素結合タンパク質１（ＣＲＥＢ１）の活性または発現レベル、例えばＣＲＥＢ１のリン酸化を制御する。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの物質は、ビタミンの代謝産物、例えばレチノイン酸を含む。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの物質は、ＣＲＥＢ１結合タンパク質を含む。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの物質は、ｍｉｘｌ１、Ｃｄｘ２、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１７、Ｆｏｘａ２、およびＧＳＫ３βからなる群より選択される１種またはそれより多くの因子を制御する。
【０１３５】
[00155]いくつかの実施態様において、本明細書に記載のｍｉＲ−１２４は、ｍｉＲ−
１２４ａ、ｍｉＲ−１２４ｂ、ｍｉＲ−１２４ｃ、ｍｉＲ−１２４ｄ、またはｍｉＲ−１２４ｅ、例えばｍｉＲ−１２４ａである。いくつかの実施態様において、ｍｉＲ−１２４ａは、ヒトｍｉＲ−１２４ａ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４ａ）、例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−５ｐ（配列番号１：ＣＧＵＧＵＵＣＡＣＡＧＣＧＧＡＣＣＵＵＧＡＵ）もしくはｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ（配列番号２：ＵＡＡＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣＣ）またはそれらのフラグメントである。いくつかの実施態様において、ｍｉＲ−１２４は、表１、表２、および図面から選択される配列、またはそれらのフラグメントを含む。
【０１３６】
再生医療研究および療法
[00156]いくつかの実施態様において、本明細書に記載の哺乳動物の栄養膜幹細胞（例
えばｈＴＳ細胞）またはそれらの分化細胞は、臓器および／または組織の成長および／または生成に使用できる。一例において、哺乳動物の栄養膜幹細胞は、足場なしで、または足場（例えば天然組織の足場、または生分解性材料で作製された足場）上に、臓器または組織またはそれらの構築物を生成させるのに使用できる。一例において、本明細書に記載の生物学的足場における材料は、ヒドロゲル、例えば、Ｉ型コラーゲン、コラーゲン／フィブリン、フィブリン、エクストラセル（Extracel）（商標）ヒドロゲル、エクストラセル（商標）ＵＶ、チラミン置換ヒアルロン酸（ＴＳ−ＮａＨｙ）−コーゲル（Corgel）（商標）、メチルセルロース−ヒアルロナン（ＭＣ−ＨＡ）、キトサン、キトサン／コラーゲン、アルギネート、アルギネート／ゼラチン、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、またはそれらのあらゆる組み合わせ）であってもよい。一例において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞は、３Ｄ細胞バイオプリンティング技術で臓器および／または組織を生成するのに使用できる。３Ｄ細胞バイオプリンティング技術としては、米国特許出願公開公報第２０１３００１７５６４号、２０１２／０１９００７８号、２０１２／０１１６５６８号、２０１１／０２５０６８８号、２０１１／０１３６１６２号、および２００９／０２６３８４９号で開示されたものが挙げられる。一例にお
いて、３Ｄ細胞バイオプリンティング技術は、高い細胞生存率および／または多能性の維持が可能であり、および／または均一サイズの回転楕円体の生産が可能である。一例において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞は、膵臓組織を生成するのに使用できる。一例において、本明細書に記載される哺乳動物の栄養膜幹細胞は、機能的な膵臓を生成するのに使用できる。いくつかの実施態様において、哺乳動物の栄養膜幹細胞は、ｈＴＳ細胞である。
【実施例】
【０１３７】
[00157]以下の実施例は非限定的であり、本発明の様々な形態および特徴の一例を示し
たにすぎない。
【０１３８】
実施例１
ｈＴＳ細胞の単離
[00158]この実験は、高雄医学大学病院（Kaohsiung Medical University Hospital）のヒト対象研究に関する施設内倫理審査委員会および倫理委員会（Institutional Review Board on Human Subjects Research and Ethics Committees）によって承認された。イン
フォームドコンセントを受けたドナーから、子宮外妊娠由来ｈＴＳ細胞を得た。ヒト対象研究に関する施設内倫理審査委員会および倫理委員会によって承認された子宮外妊娠した女性（在胎期間：５〜７週間）における未破裂の着床前胚のファロピウス管から、胚性の絨毛膜絨毛を得た。無血清α−ＭＥＭ（シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）、ミズ
ーリ州セントルイス）中で小さい絨毛組織を十分細かく刻み、顕微鏡下で確認し、続いて０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（シグマ−アルドリッチ）で１５分トリプシン処理し、α−ＭＥＭ含有１０％ＦＢＳを添加することによって反応を止めた。付着細胞を得て、馴化α−ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、および１％ペニシリン−ストレプトマイシン中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。２回継代させた後、市販のキット（ダコ、カリフォルニア州カーピンテリア）ではｈＣＧのレベルを測定できなくなった。
【０１３９】
実施例２
インビトロでのｍｉＲ−１２４ａを調節することによるｈＴＳ細胞から膵臓前駆体への分化
[00159]５．５ｍＭグルコース、１ｍｍｏｌ／Ｌのβ−メルカプトエタノール（ＭＥ）
、１０ｍｍｏｌ／Ｌニコチンアミド、２０％ＦＢＳ、および１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有するα−ＭＥＭ培地の組み合わせは、集団中で２．１％および１．９％のインスリン陽性細胞を出現させた他の組み合わせと比較して、１１．２％の最大の免疫反応性を示すインスリン陽性を生成した（図５）。ｂＦＧＦ誘導は、様々なレベルのｂＦＧＦ（すなわち、１０、２０、４０、および８０ｎｇ／ｍｌ）およびＦＢＳ（すなわち、無血清、１％、５％、１０％、および２０％）を使用した。結果から、様々な用量のｂＦＧＦにより、それぞれ８．６％、２．２％、および０．６％のインスリン＋／Ｎｇｎ３＋細胞が生じたことが示された（図６）。インジケーターとして免疫反応性インスリン＋／グルカゴン＋細胞（８．５％）を使用したところ、類似の結果が達成された（図７）。インスリン＋グルカゴン＋発現細胞の総細胞数は、１，２３２個の細胞であった。インスリン＋Ｎｇｎ３＋発現細胞の総細胞数は、５０２個の細胞（１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ）、７１２個の細胞（２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ）、４８５個の細胞（４０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ）、および５７１個の細胞（８０ｎｇ／ｍｌ）であった。ウェスタンブロット分析から、ｂＦＧＦ誘導中におけるＦＢＳとインスリンレベルとの正の相関が示された。
【０１４０】
[00160]ｂＦＧＦ誘導時、時間経過分析から転写因子の動的プロファイルが解明され、
膵臓発生のカスケード的な段階が確認された（図１Ａおよび図８）。誘導初期において、内中胚葉関連タンパク質であるＭｉｘ様１ホメオボックスタンパク質（Ｍｉｘｌ１）が誘導後の１５分で上昇した。ブラキュリ（Brachyury）（Ｔ）またはグースコイド（Gooseco
id）（Ｇｓｃ）の上昇と併せて、発生期の内中胚葉を移動させる段階が証拠により示唆された。Ｍｉｘｌ１は１時間で低下したが、ＴおよびＧｓｃは高レベルで維持されたことから、初期のｈＴＳ細胞から内中胚葉への移行が示された。
【０１４１】
[00161]１〜８時間の期間、Ｍｉｘｌ１レベルが４時間で最低点に落ち、８時間で元の
レベルに戻った。この結果は、原腸胚形成中、内胚葉の細胞が静止したままであることの原因である可能性がある。１〜４時間におけるＭｉｘｌ１強度の変化（図１Ｂ）は、内中胚葉の２つの細胞集団への分離を引き起こし、そのうち一方の細胞集団は中胚葉に関するＰｄｘ１＋Ｍｉｘｌ１＋を発現し、他方の細胞集団は内胚葉に関するＰｄｘ１＋Ｍｉｘｌ１−を発現した（図１Ｃ）。Ｍｉｘｌ１のｍＲＮＡ発現は中胚葉に限定され、内胚葉では存在しなかった。ＳＲＹホメオボックス１７（Ｓｏｘ１７）、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（Ｆｏｘａ２）、および膵臓および十二指腸のホメオボックス１（Ｐｄｘ１）の上方制御により、著しい展望成長が認められた。Ｓｏｘ１７は、肝臓ではなくＰｄｘ１＋腹側膵およびＳｏｘ１７＋胆管原基への分離を開始させるのに必要である。Ｆｏｘａ２およびＰｄｘ１の共発現は、異なる膵臓細胞サブタイプへの分化を強化した。Ｐｄｘ１の過剰発現は膵臓への特殊化を決定付けるが、分化後期でさえもインスリン生産を誘導しなかった。
【０１４２】
[00162]８〜１６時間の期間、前腸膵臓内胚葉のマーカーであるＳＲＹホメオボックス
９（Ｓｏｘ９）およびＰｄｘ１が上昇した。Ｓｏｘ９は、多能性膵臓前駆体を維持した。一方で、Ｐｄｘ１を遺伝学的に除去すると、消化管の器官形成中に膵臓、仙骨胃、および十二指腸の欠損が起こった。前腸膵臓内胚葉段階への分化が証拠から示唆された。
【０１４３】
[00163]１６〜２４時間の期間、ニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）およびＮｋｘ６ホメオ
ボックス１（Ｎｋｘ６．１）のレベルは高レベルを維持したが、Ｔ、Ｓｏｘ１７、Ｆｏｘａ２、Ｐｄｘ１、Ｓｏｘ９、およびＰｔｆ１ａのレベルは徐々に低下し、膵臓前駆体への細胞分化を導いた。Ｐｄｘ１はＮｇｎ３を制御することにより、内胚葉細胞を内分泌細胞に変化させ、間充織でのグルカゴンおよびソマトスタチンの発現を介して膵島を形成した。Ｎｋｘ６．１の上昇は、β細胞の増殖を増加させた。まとめると、これらの結果から、ｂＦＧＦは、２４時間で、ＤＥ形成および原始消化管内胚葉を介して膵臓前駆体へのｈＴＳ細胞分化を誘導したことが示された。
【０１４４】
[00164]図２Ａおよび図９は、時間経過分析におけるＣｄｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ
、およびＳｏｘ２の動的プロファイルを示す。分化の各段階において優勢な多能性転写因子としては、内中胚葉に関してはＣｄｘ２、ＤＥに関してはＯｃｔ４およびＮａｎｏｇ、原始消化管内胚葉に関してはＣｄｘ２およびＮａｎｏｇ、ならびに膵臓前駆体に関してはＳｏｘ２が挙げられる。免疫細胞化学的研究から、ｈＥＳ細胞における発見に一致する細胞移行（図２Ｂ、図１４）中の相互の負の自己調節的なフィードバックループ（図１０〜１３）が示された。図２Ｃは、４時間で、Ｏｃｔ４が、Ｓｏｘ１７、Ｆｏｘａ２、Ｐｄｘ１、およびＧｓｃと共に免疫細胞化学的に過剰発現することを示しており、それによりＤＥ段階におけるＯｃｔ４が確認された。これらの結果から、多能性転写因子の固有の相互作用と、膵臓分化中の細胞運命を決定する表現型の変化とが示唆された。
【０１４５】
[00165]図３Ａは、ｍｉＲ−１２４ａを介したＤＥへの特殊化への分子経路を例示する
。免疫ブロッティングアッセイから、ｂＦＧＦが、ＦＧＦＲ１を介してＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路およびその下流のエフェクターｃＡＭＰ反応要素−結合タンパク質１（ＣＲＥＢ１）を活性化したことが明らかになった（図１５〜１８）。ｍｉＲ−１２４ａとｐ−ＣＲＥＢ１発現との相関を経時的に観察したところ（図３Ｂ）、ＣＲＥＢ１がｍｉＲ−１２４ａの生産を促進したことが示唆された（図３Ｃ、図１９〜２０）。これらの結果から、ｂＦＧＦが、ＣＲＥＢ１のリン酸化を介したｍｉＲ−１２４ａの生物発生を誘導したことが示唆
された。
【０１４６】
[00166]ｍｉＲＮＡｓは、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内のｍＲＮＡ配列を標的にし
て、翻訳を阻害する、および／またはＲＮＡ分解を引き起こす遺伝子の転写後調節因子である。配列分析およびルシフェラーゼレポーターアッセイによれば、ｍｉＲ−１２４ａは、Ｓｍａｄ４（図３Ｄ）、Ｃｄｘ２（図３Ｅ）、およびＧＳＫ３β（図３Ｆ）を阻害した。これらの結果は、ｍｉＲ−１２４ａおよび抗ｍｉＲ−１２４ａを事前にトランスフェクトしたことに起因することが証拠から確認された（図３Ｇ）。報告と一致して、Ｓｍａｄ４のノックダウンはＭｉｘｌ１を抑制したが（図２１）、これは、ＤＥ移行中にＭｉｘｌ１の下方制御が起こったことの説明になる。次いでＣｄｘ２の阻害によりＯｃｔ４の活性化が促進された。クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイから、Ｏｃｔ４は、Ｓｏｘ１７発現のために（図２２）Ｓｏｘ１７のプロモーター（図３Ｈ）を標的化したことが明らかになった。続いて、１〜４時間におけるＧＳＫ３βの阻害は、細胞質中でのβ−カテニンの安定化および蓄積をもたらした（図２３）。β−カテニンの核移行は、Ｆｏｘａ２発現（図８）のために遺伝子Ｆｏｘａ２（図３Ｉ）を標的としていた。これまでにｍｉＲ−１２４ａはβ細胞株でＦｏｘａ２を制御することが報告されている。この目的を達成するために、ｂＦＧＦは、ＤＥ段階における、Ｓｍａｄ４およびＭｉｘｌ１の下方制御ではなくＯｃｔ４、Ｓｏｘ１７、およびＦｏｘａ２の上方制御を介したｍｉＲ−１２４ａの多面的な機能を誘導した。
【０１４７】
[00167]タンパク質ホルモンであるベータトロフィンは、主として肝臓で発現され、高
速の膵β細胞の増殖を機能的に誘導する。Ｆｏｘａ２は、遺伝子Ｃ１９ｏｒｆ８０のプロモーターを標的とし、１２時間でベータトロフィンを生産した（図３Ｊ、図２４）。ｑＰＣＲ分析から、時空的に最初の１２時間でベータトロフィンのｍＲＮＡが上昇し、１６時間で約１００％のピークになり、その後２４時間まで下降したことが解明された（図３Ｋ）。２０〜２８時間の間に、原始消化管内胚葉および膵臓前駆体の両方の段階にわたりベータトロフィン、Ｃ−ペプチド、およびインスリンの並行発現が観察された（図３Ｌ、図２５）。免疫細胞化学的に、ｈＴＳ細胞から得られた膵臓前駆体は、ベータトロフィンとインスリンとを共に発現した（図３Ｍ、図２６）。いずれの特定の理論に縛られたり、またはそれにこだわったりするつもりはないが、膵臓発生中にベータトロフィンは膵臓前駆体の増殖も調節する可能性があると考えられる。
【０１４８】
実施例３
ｈＴＳ細胞から得られた膵臓前駆体はグルコース刺激に応答してインスリンを分泌した
[00168]膵臓前駆体は、培地に免疫反応性インスリンを分泌することによりグルコース
レベルをモニターしていた（図４Ａ）。興味深いことに、β細胞に特異的な染色法である陽性ジチゾン（ＤＴＺ）染色を用いたところ、急速な細胞凝集が３Ｄブドウ状細胞塊を形成することが証拠から示される。高グルコースが放出されたら、細胞塊は、線維芽細胞様の形状に再び戻り始める（図４Ｂ）。コンピューター−顕微鏡−ビデオシステムで細胞プロセスを記録した。
【０１４９】
[00169]ラジオイムノアッセイでは、高グルコース（２５ｍＭ）刺激に応答して、免疫
反応性のＣ−ペプチドおよびインスリンレベルの両方の有意な上昇が測定された（図４Ｃ）。ＤＴＺ陽性細胞塊の超微細構造研究から、膵臓のαおよびβ細胞のものを模擬した、核の比率に対して大きい細胞質、細胞間の架橋（デスモソーム結合）、豊富なミトコンドリア、未成熟果粒、および分泌果粒を有する円形の細胞の存在が明らかになった（図４Ｄ）。
【０１５０】
[00170]ｈＴＳ細胞から得られた膵臓前駆細胞は、Ｓｏｘ２、Ｎｋｘ６．１、Ｐｔｆ１
ａ、Ｎｇｎ３、Ｐｄｘ１、Ｓｏｘ９、ベータトロフィン、加えてインスリン（β細胞）、
ソマトスタチン（δ細胞）、グルカゴン（α細胞）、膵臓ポリペプチド（ＰＰ細胞）、グルコース代謝輸送体Ｇｌｕｔ２、および触媒酵素のアミラーゼなどの内分泌成分などの様々なマーカーを免疫細胞化学的に発現した（図４Ｅ）。膵臓前駆体が存在すること、膵臓前駆体がＣ−ペプチドおよびインスリンを発現することによりグルコース刺激試験に正に応答したことが全ての証拠から示された。
【０１５１】
実施例２〜３で説明した実験の材料および方法
[00171]細胞培養および分化
[00172]未分化のｈＴＳ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＳＡＦＣバイオサイ
エンス（SAFC Biosciences））が補充されたα−ＭＥＭ（ギブコ（Gibco））中で維持し
た。２〜３日毎に１：３〜１：６の分割比で培養物を手作業で継代させた。２０％ＦＢＳ、１ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭニコチンアミドおよび１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有する馴化α−ＭＥＭ培地により、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間かけて膵臓前駆体の分化を実行した。分化レジメンは、図５〜７で示したような実験的な経験によって決定された。系統の発生段階依存的な分化は、これまでに述べられたような様々な細胞マーカーを参考にしてなされた（M. Borowiak、Rev. Diabet. Stud. 7
、93〜104（2010）；K. A. D’Amourら、Nat. Biotech. 23、1534〜1541（2005）；E. Kroonら、Nat. Biotech、26、443〜452（2008））。異なるアッセイに関して示された時間
で細胞を回収した。
【０１５２】
[00173]試薬
[00174]ＤＴＺ（メルクＫＧａＡ（Merck KGaA）、ダルムシュタット、ドイツ）、ｂＦ
ＧＦ（シグマ（Sigma））、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テキサス
レッド５９４（インビトロジェン（Invitrogen））、デイライト（DyLight）４８８−、
デイライト５９４−（サーモ・サイエンティフィック（Thermo Scientific））、フィコ
エリトリン（ＰＥ）結合二次抗体（ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch）、メリーランド州ボルチモア）。ｓｈＲＮＡは、台湾の国立ＲＮＡｉコア施設中央研究院（National RNAi Core Facility, Academia Sinica）から購入した。
【０１５３】
[00175]ウェスタンブロット
[00176]このアッセイ法はこれまでに説明されている（T. T. Y. Leeら、PLoS ONE 7、e52491（2012））。
簡単に言えば、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（ロシュ（Roche））が補充さ
れたＲＩＰＡ溶解溶液（ミリポア（Millipore）、マサチューセッツ州ビレリカ）に細胞
を回収した。３０μｇの溶解産物をポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ＰＤＶＦメンブレン（ミリポア）上へのエレクトロブロッティングを行った。ＰＢＳ中の５％乾燥脱脂乳で室温で１時間ブロックした後、一次抗体を使用して標的タンパク質を検出した。全てのメンブレンを化学発光剤（ミリポア）と共にインキュベートし、ＣｈｅｍｉＤｏｃ
ＸＲＳシステム（バイオ−ラッド（Bio-Rad））で画像を捕捉した。表Ｓ１に使用され
た抗体を列挙した。ＡｌｐｈａＥａｓｅＦＣ（バージョン４．０．０）でデータを分析した。
【０１５４】
[00177]免疫蛍光法
[00178]細胞培養を載せたスライドを９５％（ｖ／ｖ）エタノール中で室温で３０分固
定し、ＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキング緩衝液である０．１％（ｗｔ／ｖ）トリトンＸ−１００（シグマ）および５％（ｖ／ｖ）正常ロバ血清（ミリポア）を含有するＰＢＳで６０分インキュベートした。一次および二次抗体をブロッキング緩衝液で希釈した。最初のものを４℃で（２４時間）または室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ中の特異的一次抗体とインキュベートした後、適切なフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、インビトロジェン）またはアレクサフルオロ（Alexa Fluor）蛍光体４８８、５９４、
６４７（インビトロジェン）またはデイライト４８８、５９４（バイオレジェンド（BioLegend））結合二次抗体を室温で１時間かけて添加した。４’，６−ジアミジノ−２−フ
ェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色によって、細胞核（５分）細胞を顕微鏡観察した。それに続いて室温で二次抗体（１時間）とインキュベートして洗浄した後、スライドを５０％グリセロールと共にマウントした。これまでに述べられたようにして、共焦点レーザー顕微鏡検査法（ＬＳＭ７００；ツァイス（Zeiss）Ｚ１またはオリンパス（Olympus）フルオビュー（FluoView）１０００共焦点レーザー顕微鏡）またはＴｉｓｓｕｅＦＡＸＳシステム（TissueQnostics GmbH、ウィーン、オーストリア）で画像を捕捉し、Ｔｉｓｓｕｅ
Ｑｕｅｓｔソフトウェアでデータを分析した（T. T. Y. Leeら、PLoS ONE 7, e52491（2012））。
【０１５５】
[00179]ＴａｑＭａｎ  ｍｉＲＮＡおよび定量リアルタイムＰＣＲアッセイ
[00180]ＤＮＡアーゼＩオンカラムダイジェスチョン（キアゲン（Qiagen）、カリフォ
ルニア州バレンシア）を製造元のプロトコールに従って使用して、ＴＲＩＺＯＬ試薬（インビトロジェン）でｈＴＳ細胞からＲＮＡを３連または５連のサンプルで単離した。ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（バイオ−ラッド）での逆転写には、トータルＲＮＡ（５００ｎｇ）を使用した。反応１回毎に４０分の１のｃＤＮＡならびに４００ｎＭフォワードおよびリバースプライマーを使用して、ＰＣＲを２連で実行した。ｍｉＲＮＡステム−ループｑＰＣＲのために、製造元の説明書（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems））に従ってシングルチューブのＴａｑＭａｎ  ｍｉＲＮＡアッセイを使用した。テンプレートなし対照およびＲＴマイナス対照を包含する全てのＲＴ反応を、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ９７００サーモサイクラー（アプライド・バイオシステムズ）で実行した。テンプレートなし対照を包含する比較用のリアルタイムＰＣＲを、ｍｉＲ−１２４またはＲＮＵ６Ｂに特異的なプライマー（アプライド・バイオシステムズ）を使用して３連または５連で行った。Ｕ６  ｓｎＲＮＡ（ＲＮＵ６Ｂ；アプライド・バイオシステムズ）を内因性対照として活用した。ＳＤＳ２．２．２ソフトウェア（アプライド・バイオシステムズ）を使用して相対的な発現を計算し、これを比較ΔＣｔ分析に使用した。ベータトロフィンのｍＲＮＡに使用されたプライマー配列は、プライマー１、フォワード：５’−ａｃａｔｃｔｃｃｃｔｃｃｃｃａｇａｃｔｃ−３’（配列番号１２２）およびリバース：５’−ｔｇｃｔｃｔｇｔｇｃｔｃａｇａａｇｔｇｇ−３’（配列番号１２３）；プライマー２：フォワード：５’−ｃｔｇｔｃｇｇｃｔｇａｇｇｇｔｔｔｃｃａｔ−３’（配列番号１２４）およびリバース：５’−ｇａｇｔｃｔｇｇｇｇａｇｇｇａｇａｔｇｔ−３’（配列番号１２５）であった。
【０１５６】
[00181]免疫沈降（ＩＰ）アッセイ
ｂＦＧＦ処置したｈＴＳ細胞の細胞溶解産物を収集した。プロテインＧ−アガロース（ミニポア（Minipore））と３０分インキュベートすることによって、総タンパク質（１００μｇ）を、（表Ｓ１に）列挙した特異的一次抗体で一晩処置した。プロテインＧ−アガロースビーズで２時間処置した後、サンプルをＲＩＰＡ溶解緩衝液（ミニポア）で３回洗浄し、続いてタンパク質ローディング色素を添加し、５分沸騰させた。サンプルを８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、免疫ブロッティング分析で処理した。
【０１５７】
[00182]クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ
[00183]ＣｈＩＰアッセイキット（ミリポア）を製造元の説明書通りに使用することに
よってＣｈＩＰアッセイを行った。簡単に言えば、免疫沈降したＤＮＡフラグメントをｈＴＳ細胞（１×１０６）から抽出し、抗体の抗ＣＲＥＢ１もしくは抗Ｏｃｔ４または抗β-カテニンをこれまでに述べられたようにして使用した（T. T. Y. Leeら、PLoS ONE 7、e52491（2012））。特異的なプライマーは、ｍｉＲ-１２４ａまたはＳｏｘ１７またはＦｏｘａ２のプロモーター領域における保存された結合部位を増幅するために使用され、以下に列挙した通りである：
[00184]ｍｉＲ１２４−２のプロモーターに関しては：フォワード、５’−ｔｃｔｇｃ
ｇｇｃｔｃｔｔｔｇｇｔｔｔｃａ−３’（配列番号１２６）、およびリバース、５’−ｔｃｔｇｃｃｔｔｃａｇｃａｃａａｇａｇｇ−３’（配列番号１２７）；およびフォワード、５’−ｇｃｇｇｃｔｃｔｔｔｇｇｔｔｔｃａａｇｇ−３’（配列番号１２８）；リバース、５’−ｃｔｇｃｃｔｔｃａｇｃａｃａａｇａｇｇａ−３’（配列番号１２９）であり；ｍｉＲ１２４−３のプロモーターに関しては：５’−ｃｃｃｇｃａｇｔｔｃｔｃａａｇｇａｃａｃ−３’（配列番号１３０）、およびリバース、５’−ａｇａａｇｇｇａｇｃｃａｇｇｃａａｇｔｃ−３’（配列番号１３１）であり；Ｓｏｘ１７のプロモーターに関しては：５’−ｔｔｇｔａｇａｔｔｇｃｔｃｔｃｔｃｔｃｃｔｃｃ−３’（配列番号１３２）、およびリバース、５’−ｇｔｇａａｇｃｃｔｔｇｇｃｔａｇｇｇｇ−３’（配列番号１３３）であり；Ｆｏｘａ２のプロモーターに関しては：５’−ｃｃｃａｔｃａｔｔｇａｔｔｃｃｔｇｇａｔ−３’（配列番号１３４）、およびリバース、５’−ｔｔｇｇｇａｇｇｃｔｇａｇａｔｔｔｇｔｃ−３’（配列番号１３５）であり；ベータトロフィンのプロモーターに関しては：５’−ｇｔｃａｇｃｃｃｔｃｃｃｔｇａｃｔｇａｔ−３’（配列番号１３６）、およびリバース、５’−ｃａｔｇｔｇｇａｔｔｔｃｃａｇｃｃｔｇｃ−３’（配列番号１３７）であった。
【０１５８】
[00185]デュアル−ルシフェラーゼアッセイ
[00186]ルシフェラーゼ−３’ＵＴＲレポータープラスミドを調製するために、増幅し
た３’ＵＴＲフラグメントをｈＴＳ細胞のゲノムＤＮＡ抽出物から増幅した。３’ＵＴＲ
ＰＣＲフラグメントを、ＰｓｉＩおよびＭｆｅＩ（サーモ・サイエンティフィック、イリノイ州ロックフォード）を使用して、ｐＧＬ４．５１ベクター（プロメガ（Promega）
、ウィスコンシン州マディソン）のルシフェラーゼ遺伝子下流にクローニングした。以下に、３’ＵＴＲレポーターコンストラクト用のプライマーを列挙した：
[00187]Ｃｄｘ２の３’ＵＴＲに関しては：フォワード、５’−ａａａｔｔａｔａａｇ
ｃｔｇｔｔｔｇｇｇｔｔｇｔｔｇｇｔｃｔ−３’（配列番号１３８）およびリバース、５’−ａａａｃａａｔｔｇｃｃｃｃｃａｔａａｔｔｔｃｔｇａｃｔｇｃ−３’（配列番号１３９）であり；Ｓｍａｄ４の３’ＵＴＲの領域１に関しては：フォワード、５’−ａａａｔｔａｔａａｃｔｃｃｃａａａｇｔｇｃｔｇｇｇａｔｔａ−３’（配列番号１４０）およびリバース、５’−ａａａｃａａｔｔｇｃｔｇｃａｃｔｇｔｔｃａｃａｇｇａｇｇａ−３（配列番号１４１）であり；Ｓｍａｄ４の３’ＵＴＲの領域２に関しては：フォワード、５’−ａａａｔｔａｔａａｃａｇｔｔｇｔｃｃｃａｇｔｇｃｔｇｃｔａ−３’（配列番号１４２）およびリバース、５’−ａａａｃａａｔｔｇａｔｇａｃｔｔｇｃｃｃａａａｇｇｔｃａｃ−３’（配列番号１４３）であり；ＧＳＫ３βの３’ＵＴＲに関しては：フォワード、５’−ａａａｔｔａｔａａｃｃｃａｃａａｃｔｇｇｇｇｔａａａａｇａ−３’（配列番号１４４）およびリバース、５’−ａａａｃａａｔｔｇｃｔｇｔｇｇａａｇｇｇｇｃａａａｇａｔａ−３’（配列番号１４５）である。
【０１５９】
[00188]デュアルルシフェラーゼアッセイのために、ｐＧＬ４．７４ウミシイタケルシ
フェラーゼプラスミド（５００ｎｇ；プロメガ）、および非特異的な対照であるｍｉＲＮＡ（３０ｐｍｏｌ）またはｍｉＲ−１２４ａ前駆体（３０ｐｍｏｌ；システム・バイオサイエンス、カリフォルニア州マウンテンビュー）でコトランスフェクトしたホタルルシフェラーゼレポーター（５００ｎｇ）または３’ＵＴＲをまったく含まない空のベクターを、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＬＴ１トランスフェクト試薬（ミルス・バイオＬＬＣ（Mirus Bio LLC）、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用してｈＴＳ細胞（各ウェル
中１．５×１０４個の細胞）にコトランスフェクトした。トランスフェクト後に（３６時間）、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（プロメガ）およびチェントロ（Centro）ＬＢ９６０マイクロプレートルミノメーター（ベルトールド・テクノロジー（Berthold Technologies）、バート・ヴィルトバート、ドイツ）によってルシフェラー
ゼ活性を分析した。評価のために、まずウミシイタケルシフェラーゼの値をホタルルシフ
ェラーゼ活性に標準化し、さらに各３’ＵＴＲレポーターの計算された活性を対照ベクターの活性に標準化した。データを平均±ＳＤとして表し、ｎ＝８、ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。細胞溶解緩衝液で調製された全細胞抽出物を、Ｃｄｘ２、Ｓｍａｄ４、ＧＳＫ３β、およびβ−アクチン抗体を用いた免疫ブロッティングで処理した。
【０１６０】
[00189]ｍｉＲ−１２４ａ前駆体または抗ｍｉＲ−１２４ａのトランスフェクト
[00190]ｍｉＲ−１２４ａ前駆体および抗ｍｉＲ−１２４ａをシステム・バイオサイエ
ンスから購入した。簡単に言えば、１２ウェルの培養皿で、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１トランスフェクション試薬（ミルス、ウィスコンシン州マディソン）を使用して、ｍｉＲ−１２４ａ前駆体（６０ｐｍｏｌ）または抗ｍｉＲ−１２４ａ（６０ｐｍｏｌ）をｈＴＳ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトの３６時間後にｍｉＲ−１２４ａを定量するためにトータルＲＮＡを使用した。
【０１６１】
[00191]Ｃ−ペプチドおよびインスリンのラジオイムノアッセイ
[00192]グルコース刺激試験において、ｂＦＧＦ処置後、８０％密集度の細胞上のα−
ＭＥＭ培地（５ｍｌ）に高グルコース（２５ｍＭ）を添加した。異なる時間（５、１０、２０、３０、６０および１２０分間）で培地を収集した。収集した培地を凍結乾燥器（バーチス（VirTis）、ペンシルベニア州ワーミンスター）で凍結乾燥し、ラジオイムノアッセイ用滅菌水（４００μｌ）を加えて元に戻した。培地中のＣ−ペプチドおよびインスリンレベルを、それぞれＣ−ＰＥＰ  ＩＩ−ＲＩＡ−ＣＴ（ＤＩＡソース・イムノアッセイＳ．Ａ．（DIAsource ImmunoAssays S.A.）、ベルギー）およびコート−Ａ−カウント（Coat-A-Count）インスリン（ジーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス社（Siemens Healthcare Diagnostics Inc.）、カリフォルニア州ロサンジェルス）によって決定した。ｎ＝５、ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。
【０１６２】
[00193]フローサイトメトリー
[00194]Ｃｄｘ２またはＯｃｔ４またはＳｏｘ２またはＮａｎｏｇに対して非特異的な
ｓｈＲＮＡまたはｓｈＲＮＡでトランスフェクトした後、細胞（細胞５×１０６個／ｍｌ）を特異的一次抗体（表Ｓ１で列挙された）と共に３０分インキュベートした。適切な蛍光色素結合一次抗体と調整された希釈度で４℃で１時間インキュベートすることによって、サンプルを洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、続いてセルストレーナーキャップを有するポリスチレンの丸底チューブ（ＢＤファルコン（BD Falcon））に通過させ、その後フローサ
イトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ、ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences）、カリフォルニア州サンノゼ）を行った。セル−クエスト（Cell-Quest）ソフトウェア（ＢＤバイオサイエンス）を用いてデータを分析した。
【０１６３】
[00195]透過型電子顕微鏡観察
[00196]高グルコース刺激後、培養皿上のｈＴＳ細胞から得られた膵島様細胞塊をウォ
ルフラム製ニードルで切り離した。透過型電子顕微鏡観察のために、３％ｗｔ／ｖｏｌホルムアルデヒド、１．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルタルアルデヒドおよび２．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロースを含有する０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で、室温で１時間および４℃で一晩、細胞の凝集塊を固定した。１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＯｓＯ４を含有するパラディ（Palade）の固定剤中で４℃でオスミウム酸染色する２時間前および後にサンプルをカコジル酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、タンニン酸で処置し、酢酸ウラニルで染色し、一連の濃度勾配を有するエタノール溶液で脱水し、ＴＡＢＢエポキシ樹脂（アガー・サイエンティフィック社（Agar Scientific Ltd.））中に埋め込んだ。超薄切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、ＪＥＭ−２０００ＥＸＩＩ（ＪＥＯＬ、東京）を使用して試験した。小胞顆粒のイメージングは、これまでに述べられものを参考にした（K. A. D’Amourら、Nat. Biotech. 23、1534〜1541（2005））。
【０１６４】
[00197]統計的分析
[00198]全ての実験を３連で行い、２回または指定された通りに繰り返した。ウェスタ
ンブロット、ｑＰＣＲ、ルシフェラーゼアッセイ、およびフローサイトメトリーから得られたデータをスチューデントのｔ検定で計算した。ｐ値＜０．０５を統計学的に有意とみなした。
【０１６５】
【表４】
2020182498.tif 000008
【０１６６】
【表５】
2020182498.tif 000009
【０１６７】
[00200]本明細書で開示された１つまたはそれより多くの実施態様、例、または形態は
、本明細書で開示されたあらゆる他の実施態様、例、または形態と適宜組み合わせることができる。
【０１６８】
[00201]本明細書においていくつかの実施態様を示し説明したが、このような実施態様
は、単なる一例として提供されたにすぎない。本発明から逸脱することなく多数の改変型、変化、および置換を作り出すことができる。本発明の実施にあたり本明細書で説明した本発明の実施態様の様々な代替物を採用してもよいことが理解されるものとする。
【図１Ａ】
2020182498.tif 000010
【図１Ｂ】
2020182498.tif 000011
【図１Ｃ】
2020182498.tif 000012
【図２Ａ】
2020182498.tif 000013
【図２Ｂ】
2020182498.tif 000014
【図２Ｃ】
2020182498.tif 000015
【図３Ａ】
2020182498.tif 000016
【図３Ｂ】
2020182498.tif 000017
【図３Ｃ】
2020182498.tif 000018
【図３Ｄ】
2020182498.tif 000019
【図３Ｅ】
2020182498.tif 000020
【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
2020182498.tif 000037
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
2020182498000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月3日(2020.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）インスリン、（ｉｉ）ベータトロフィンタンパク質またはベータトロフィンｍＲＮＡ、および（ｉｉｉ）Ｃ−ペプチドを発現する、単離された膵臓前駆細胞。
【請求項２】
単離された膵臓前駆細胞が、ヒト細胞である、請求項１に記載の単離された膵臓前駆細胞。
【請求項３】
単離された膵臓前駆細胞が、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、または類人猿の細胞である、請求項１に記載の単離された膵臓前駆細胞。
【請求項４】
単離された膵臓前駆細胞が、インスリンおよびグルカゴンを発現する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された膵臓前駆細胞。
【請求項５】
単離された膵臓前駆細胞が、Ｎｇｎ３をさらに発現する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された膵臓前駆細胞。
【請求項６】
単離された膵臓前駆細胞が、インスリンおよびＮｇｎ３を発現する、請求項５に記載の単離された膵臓前駆細胞。
【請求項７】
疾患の治療を必要とする哺乳動物における疾患の治療に使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された膵臓前駆細胞。
【請求項８】
疾患が、インスリン障害である、請求項７に記載の使用のための単離された膵臓前駆細胞。
【請求項９】
疾患が、糖尿病である、請求項７に記載の使用のための単離された膵臓前駆細胞。
【請求項１０】
疾患が、１型糖尿病である、請求項７に記載の使用のための単離された膵臓前駆細胞。
【請求項１１】
疾患が、２型糖尿病である、請求項７に記載の使用のための単離された膵臓前駆細胞。
【請求項１２】
疾患の治療を必要とする哺乳動物が、糖尿病に関連する１つまたはそれより多くの症状を有する、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の使用のための単離された膵臓前駆細胞。
【請求項１３】
１つまたはそれより多くの症状が、多尿症（頻尿）、多渇症（喉の渇きの増加）、多食症（空腹感の増加）、体重減少、霧視、痒み、末梢神経疾患、再発性膣感染症、疲労、創傷またはただれの治癒の遅さ、およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群より選択される、請求項１２に記載の使用のための単離された膵臓前駆細胞。
【請求項１４】
疾患の治療を必要とする哺乳動物が、ヒトである、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の使用のための単離された膵臓前駆細胞。
【請求項１５】
疾患の処置に有用な物質のスクリーニングに使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された膵臓前駆細胞。
【請求項１６】
細胞の細胞調節または細胞毒性の決定に有用な物質のスクリーニングに使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された膵臓前駆細胞。