(57)【要約】【課題】非特異的な増幅および/または望ましくない増幅産物を減少させながら核酸を増幅するための組成物、方法、及びキットの提供。【解決手段】核酸ポリメラーゼ及び二重ホットスタート反応混合物を含む組成物であって、熱安定性核酸ポリメラーゼと、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断する抗体もしくは抗体の組み合わせ、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断するオリゴヌクレオチド、上昇した温度で解離する、DNAポリメラーゼの可逆的化学修飾、より低温で活性の低下をもたらす、DNAポリメラーゼのアミノ酸修飾、超安定DNA結合ドメインおよびトポイソメラーゼを含む融合タンパク質、DNAポリメラーゼを阻害する温度依存性リガンド、より低温でプライマーを捕捉する一本鎖結合タンパク質、修飾されたプライマー、または修飾されたdNTPからなる群より選択される二重ホットスタート反応混合物を含む組成物。【選択図】図１Ａ
2020072761.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本開示は、概して、非特異的な増幅および/または望ましくない増幅産物を減少させながら核酸を増幅するための組成物、方法、およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および関連技術は、様々な適用に極めて有用である一方で、望ましくない副反応による非標的核酸の増幅は重大な問題を提起し得る。そのような副反応は、非標的核酸のミスプライミング、および/またはプライマーダイマー形成と称されることもあるプライマーオリゴマー化、ならびにこれらのプライミング人工物の後続の増幅の結果として生じ得る。これは、かなりのバックグラウンド核酸を有し、一方で標的核酸が低コピー数で存在している、核酸の混合物を用いてPCRが実施される適用においてとりわけ当てはまる（例えば、Chou et al., Nucl. Acids Res. 20:1717 (1992)（非特許文献1）を参照されたい）。非特異的に増幅された産物の生成は、非特異的にアニールしたプライマーを伸長させる周囲温度でのDNAポリメラーゼ活性に少なくとも部分的に起因している（例えば、上記のChou et al.（非特許文献1）；Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4580 (1990)（非特許文献2）を参照されたい）。したがって、周囲温度でのDNAポリメラーゼ活性の阻害は、二次的アンプリコンの生成を制御することにおいて有益である。
【０００３】
望ましくない二次的増幅産物の形成を伝えられるところによれば減少させる、いくつかの「ホットスタート」技術が記載されている。ある特定の「マニュアルホットスタート」技術によれば、混合物の温度が、非特異的なプライマーアニーリングを防止するのに十分に高くなるまで、DNAポリメラーゼ活性に不可欠な成分（例えば、二価イオンおよび/またはDNAポリメラーゼ自体）を反応混合物に添加しない（例えば、上記のChou et al.（非特許文献1）；D'Aquila et al., Nucl. Acids Res. 19:3749 (1991)（非特許文献3）を参照されたい）。より労働集約度が低い技術は、増幅反応の少なくとも1種の成分の物理的分離または可逆的不活性化を採用する。例えば、マグネシウムまたはDNAポリメラーゼを、反応温度が増大するにつれて融解するワックスビーズ内に隔離し、隔離された成分は上昇した温度でのみ放出され得る。他の技術によれば、例えばDNAポリメラーゼの可逆的化学修飾、DNAポリメラーゼへの抗体の結合、またはDNAポリメラーゼに結合するオリゴヌクレオチド分子によって、DNAポリメラーゼを可逆的に不活性化するまたは修飾する（例えば、米国特許第5,677,152号（特許文献1）および第5,338,671号（特許文献2）；ならびにDang et al., J. Mol. Biol. 264:268 (1996)（非特許文献4）を参照されたい）。上昇した反応温度で、化学修飾は逆行し、または抗体分子もしくはオリゴヌクレオチド分子は変性し、機能的DNAポリメラーゼを放出する。しかしながら、これらの技術のいくつかは、不活性化にもかかわらず、より低い反応温度でいくらかのDNAポリメラーゼ活性が検出可能であるという点において、またはそれらが、DNAポリメラーゼを十分に活性化するために高温での反応混合物の長期曝露を必要とし、これが反応混合物のいくつかの成分の永久的不活性化をもたらし得るという点において、最適には満たないように思われる。
【０００４】
ある特定のリアルタイムおよび/またはエンドポイント検出技術（例えば、Ririe et al., Anal. Biochem. 245:154 (1997)（非特許文献5）を参照されたい）を含めた、現在用いられているある特定の核酸増幅技術は、例えばSYBR（登録商標）Green I（Life Technologies, Carlsbad, CA）、しかしながらそれに限定されない核酸色素を含む増幅産物を検出しかつ/または定量化するための工程を含む。典型的に、核酸色素は、増幅産物および/またはプライマー−鋳型二重鎖の二本鎖セグメントと結び付き、かつ特定の核酸色素に特有である波長において検出可能な蛍光シグナルを発する。ある特定の増幅法は、例えば融解曲線解析としても知られるPCR後解離曲線解析、しかしながらそれに限定されない、核酸色素と結び付いた増幅産物の純度を評価するための検出工程を含む。アンプリコンの融解曲線は（中でもとりわけ）その長さおよび配列に依存するため、アンプリコンを一般的にそれらの融解曲線によって区別することができる（例えば、Zhang et al., Hepatology 36:723 (2002)（非特許文献6）を参照されたい）。反応温度はアンプリコンの融解温度を通過するため、核酸色素の蛍光をモニターすることによって、ある特定の増幅反応の間の解離曲線または融解曲線を獲得することができる。二本鎖アンプリコンの解離は、核酸色素に特有の発光波長における蛍光の突然の減少として観察される。ある特定の解離曲線解析技術によれば、融解曲線が、蛍光強度の負の微分対温度（-dF/dt対T）のプロット上で1つのピークとしてグラフで表示されることもある単一で一貫性のある融解温度を示す場合、増幅産物は「純粋」として分類される。対照的に、シングルプレックス増幅からのそのような解離曲線における複数のピークの出現は、典型的に、望ましくない副反応産物の存在を表す。そのような核酸色素に基づく増幅産物検出技術を採用する場合、しばしば、1）望ましくない副反応産物の形成を少なくとも減少させ、好ましくは解消すること、ならびに2）他の核酸の二本鎖セグメント、すなわち非増幅産物（例えば、プライマーダイマー）および/または（例えば、ミスプライミング事象による）非特異的増幅産物の変性によって生じる蛍光ピークを少なくとも減少させ、好ましくは解消することが望ましい。
【０００５】
ある特定の他の増幅技術も、中でもとりわけ、プライマー、ライゲーションプローブ、切断プローブ（cleavage probe）、プロモーター−プライマーなどの非特異的アニーリング、および後続の準最適温度での酵素活性により、望ましくない増幅産物を産出し得る。例えば、反応成分をしばしば室温で混ぜ合わせている間に、または反応組成物を所望の反応温度まで加熱している間に。これらの技術のうちの少なくともいくつかは、バックグラウンド蛍光の低下によって有益になり得る。ゆえに、1）望ましくない副反応産物の形成、および2）これらの望ましくない副反応産物から生じるバックグラウンド蛍光、を減少させかつ/または解消する組成物および方法の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第5,677,152号
【特許文献２】米国特許第5,338,671号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Chou et al., Nucl. Acids Res. 20:1717 (1992)
【非特許文献２】Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4580 (1990)
【非特許文献３】D'Aquila et al., Nucl. Acids Res. 19:3749 (1991)
【非特許文献４】Dang et al., J. Mol. Biol. 264:268 (1996)
【非特許文献５】Ririe et al., Anal. Biochem. 245:154 (1997)
【非特許文献６】Zhang et al., Hepatology 36:723 (2002)
【発明の概要】
【０００８】
概要
本教示は、当技術分野において二次的アンプリコンまたは疑似副産物と称されることもある、非特異的な増幅（例えば、蛍光）および望ましくない増幅産物を減少させながら、標的核酸を増幅するための、組成物、方法、およびキットに向けられている。
【０００９】
ある特定の態様において、核酸ポリメラーゼ、および、第一の温度（例えば、＜40℃の温度）で該核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するまたは実質的に阻害する二重ホットスタート反応混合物を含む、組成物を提供する。二重ホットスタート反応混合物は、第一の温度で核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するためにまたは実質的に阻害するために用いられる少なくとも2種の異なるホットスタート機構を含む。そのようなホットスタート機構には、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断する抗体もしくは抗体の組み合わせ、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断するオリゴヌクレオチド、上昇した温度で解離する、DNAポリメラーゼの可逆的化学修飾、より低温で活性の低下をもたらす、DNAポリメラーゼのアミノ酸修飾、超安定DNA結合ドメインおよびトポイソメラーゼを含む融合タンパク質、DNAポリメラーゼを阻害する温度依存性リガンド、より低温でプライマーを捕捉する一本鎖結合タンパク質、修飾されたプライマー、または修飾されたdNTPが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００１０】
ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、従来のホットスタート機構と比較して、非特異的核酸増幅および/または非特異的産物形成を長期間にわたって阻害する。例えば、いくつかの態様において、本二重ホットスタート反応混合物は、周囲温度で少なくとも24時間、非特異的核酸増幅および/または非特異的産物形成を阻害する。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、1種のホットスタート機構のみを有するホットスタート反応混合物と比較して、非特異的増幅および/または非特異的産物形成を約20〜100％減少させる。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、非特異的増幅および/または非特異的産物形成を約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100％減少させる。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、1種のホットスタート機構のみを有する反応混合物と比較して、非特異的産物形成を約2〜4倍低下させる。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、非特異的産物形成を約2、2.5、3、3.5、または4倍低下させる。
【００１１】
ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物が、約40℃を上回る温度で核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を実質的に阻害しないように、熱安定性核酸ポリメラーゼ、および、約40℃未満の温度で該核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するまたは実質的に阻害する該二重ホットスタート反応混合物を含む、組成物を提供する。ある特定の態様において、核酸ポリメラーゼは、DNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼであってよい。ある特定の態様において、核酸ポリメラーゼは熱安定性であってよい。
【００１２】
ある特定の態様において、核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するための方法を提供する。ある特定の態様において、これらの方法は、ポリメラーゼを二重ホットスタート反応混合物と接触させる工程であって、二重ホットスタート反応混合物が、第一の温度（例えば、＜40℃の温度）で核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するまたは実質的に阻害する、工程を伴う。ポリメラーゼ阻害は、（例えば、第一の温度を上回る温度まで、典型的には少なくとも約40℃の温度まで加熱することによって）可逆的であってよい。二重ホットスタート反応混合物は、第一の温度（例えば、周囲温度）で核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するためにまたは実質的に阻害するために用いられる、少なくとも2種の異なるホットスタート機構を含む。そのようなホットスタート機構には、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断する抗体もしくは抗体の組み合わせ、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断するオリゴヌクレオチド、上昇した温度で解離する、DNAポリメラーゼの可逆的化学修飾、より低温で活性の低下をもたらす、DNAポリメラーゼのアミノ酸修飾、超安定DNA結合ドメインおよびトポイソメラーゼを含む融合タンパク質、DNAポリメラーゼを阻害する温度依存性リガンド、より低温でプライマーを捕捉する一本鎖結合タンパク質、修飾されたプライマー、または修飾されたdNTPが含まれるが、それらに限定されるわけではない。ある特定の態様において、核酸ポリメラーゼは、DNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼであってよい。ある特定の態様において、核酸ポリメラーゼは熱安定性であってよい。
【００１３】
ある特定の態様において、核酸分子を合成するための方法を提供する。そのような方法は、鋳型核酸を、熱安定性核酸ポリメラーゼ、二重ホットスタート反応混合物、1種もしくは複数種のヌクレオシドおよび/もしくはデオキシヌクレオシド三リン酸、ならびに少なくとも1種のプライマーを含む組成物と接触させる工程であって、二重ホットスタート反応混合物が、より低温（例えば、周囲温度）で（二重ホットスタート機構を含まない反応混合物におけるポリメラーゼ活性と比較して）核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するまたは実質的に阻害する、工程、結果として生じた混合物を、ポリメラーゼ阻害を取り除くのに十分なより高い温度にする工程、ならびに鋳型核酸を重合させる工程を伴う。
【００１４】
ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物を用いた、非特異的蛍光を低下させるための方法を提供する。そのような方法によれば、二重ホットスタート反応混合物が核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を実質的に阻害するのに適した条件下で、該核酸ポリメラーゼを二重ホットスタート反応混合物と第一の温度で接触させる。結果として生じた混合物を適切な第二の温度まで加熱すると、二重ホットスタート反応混合物は、該核酸ポリメラーゼまたは核酸ポリメラーゼ活性の阻害を中止する。
【００１５】
ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、従来のホットスタート機構と比較して、非特異的核酸増幅および/または非特異的産物形成を長期間にわたって阻害する。例えば、いくつかの態様において、本二重ホットスタート反応混合物は、周囲温度で少なくとも24時間、非特異的核酸増幅および/または非特異的産物形成を阻害する。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、1種のホットスタート機構のみを有するホットスタート反応混合物と比較して、非特異的増幅および/または非特異的産物形成を約20〜100％減少させる。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、非特異的増幅および/または非特異的産物形成を約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100％減少させる。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、1種のホットスタート機構のみを有する反応混合物と比較して、非特異的産物形成を約2〜4倍低下させる。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、非特異的産物形成を約2、2.5、3、3.5、または4倍低下させる。
【００１６】
ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物を用いた、非特異的蛍光を低下させるための方法を提供する。そのような方法によれば、核酸ポリメラーゼ、二重ホットスタート反応混合物、少なくとも1種のNTPまたはdNTP、標的核酸、少なくとも1種のプライマー、および少なくとも1種の核酸結合色素を含む反応組成物を第一の温度で形成する。ある特定の態様において、少なくとも1種のプライマーはプライマー対を含む。第一の温度（例えば、周囲温度または室温などの＜40℃の温度）で、二重ホットスタート反応混合物は、核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するまたは実質的に阻害する。その後、二重ホットスタート反応混合物が核酸ポリメラーゼの活性を回復させる第二の反応温度まで、反応組成物を加熱する。反応組成物は少なくとも1回の増幅サイクルに供され、少なくとも1つのアンプリコンが生成される。アンプリコンと結び付いた核酸結合色素の蛍光により、二本鎖アンプリコンは「リアルタイム」でまたは増幅反応が完了した後に検出され得る。
【００１７】
ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、従来のホットスタート機構と比較して、非特異的核酸増幅および/または非特異的産物形成を長期間にわたって阻害する。例えば、いくつかの態様において、本二重ホットスタート反応混合物は、周囲温度で少なくとも24時間、非特異的核酸増幅および/または非特異的産物形成を阻害する。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、1種のホットスタート機構のみを有するホットスタート反応混合物と比較して、非特異的増幅および/または非特異的産物形成を約20〜100％減少させる。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、非特異的増幅および/または非特異的産物形成を約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100％減少させる。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、1種のホットスタート機構のみを有する反応混合物と比較して、非特異的産物形成を約2〜4倍低下させる。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、非特異的産物形成を約2、2.5、3、3.5、または4倍低下させる。
【００１８】
ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物を用いた、標的核酸を増幅するための方法を提供する。ある特定のそのような方法によれば、核酸ポリメラーゼ、二重ホットスタート反応混合物、少なくとも1種のNTPまたはdNTP、標的核酸、少なくとも1種のプライマー、および少なくとも1種の核酸結合色素を含む反応組成物を第一の温度で形成する。ある特定の態様において、少なくとも1種のプライマーはプライマー対を含む。第一の温度で、二重ホットスタート反応混合物は、核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するまたは実質的に阻害する。その後、二重ホットスタート反応混合物が該核酸ポリメラーゼまたは核酸ポリメラーゼ活性の阻害を中止する第二の反応温度まで、反応組成物を加熱する。反応組成物は少なくとも1回の増幅サイクルに供され、多数のアンプリコンが生成される。二本鎖アンプリコンは、アンプリコンと結び付いた核酸結合色素の蛍光により、「リアルタイム」でまたは増幅反応が完了した後に検出され得る。
【００１９】
ある特定の態様において、本方法のいくつかを実施するためのキットも提供する。ある特定の態様において、キットは二重ホットスタート反応混合物を含む。ある特定の態様において、キットは少なくとも1種の核酸ポリメラーゼをさらに含む。ある特定の態様において、キットは、少なくとも1種のプライマーもしくはプライマー対、核酸結合色素、レポータープローブ、および逆転写酵素のうちの1つまたは複数をさらに含む。
【００２０】
本教示のこれらおよび他の特長を本明細書において提供する。
[本発明1001]
(a）核酸ポリメラーゼ；および
(b）二重ホットスタート反応混合物
を含む、組成物。
[本発明1002]
核酸ポリメラーゼがDNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼである、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
核酸ポリメラーゼが熱安定性である、本発明1001の組成物。
[本発明1004]
核酸ポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、Tfi DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、およびVent（商標）DNAポリメラーゼからなる群より選択される、本発明1001の組成物。
[本発明1005]
二重ホットスタート反応混合物が少なくとも2種の異なるホットスタート機構を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1006]
少なくとも2種の異なるホットスタート機構が、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断する抗体もしくは抗体の組み合わせ、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断するオリゴヌクレオチド、上昇した温度で解離する、DNAポリメラーゼの可逆的化学修飾、より低温で活性の低下をもたらす、DNAポリメラーゼのアミノ酸修飾、超安定DNA結合ドメインおよびトポイソメラーゼを含む融合タンパク質、DNAポリメラーゼを阻害する温度依存性リガンド、より低温でプライマーを捕捉する一本鎖結合タンパク質、修飾されたプライマー、または修飾されたdNTPからなる群より選択される、本発明1005の組成物。
[本発明1007]
(a）熱安定性核酸ポリメラーゼ；および
(b）約40℃未満の温度で該ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を実質的に阻害し、約40℃を上回る温度で該ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を実質的に阻害しない、二重ホットスタート反応混合物
を含む、組成物。
[本発明1008]
核酸ポリメラーゼがDNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼである、本発明1007の組成物。
[本発明1009]
核酸ポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、Tfi DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、およびVent（商標）DNAポリメラーゼからなる群より選択される、本発明1007の組成物。
[本発明1010]
二重ホットスタート反応混合物が少なくとも2種の異なるホットスタート機構を含む、本発明1007の組成物。
[本発明1011]
少なくとも2種の異なるホットスタート機構が、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断する抗体もしくは抗体の組み合わせ、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断するオリゴヌクレオチド、上昇した温度で解離する、DNAポリメラーゼの可逆的化学修飾、より低温で活性の低下をもたらす、DNAポリメラーゼのアミノ酸修飾、超安定DNA結合ドメインおよびトポイソメラーゼを含む融合タンパク質、DNAポリメラーゼを阻害する温度依存性リガンド、より低温でプライマーを捕捉する一本鎖結合タンパク質、修飾されたプライマー、または修飾されたdNTPからなる群より選択される、本発明1010の組成物。
[本発明1012]
(a）標的核酸を、核酸ポリメラーゼ、二重ホットスタート反応混合物、少なくとも1種のプライマー、および少なくとも1種のdNTPと第一の温度で接触させ、それによって反応組成物を形成する工程；
(b）該反応組成物を第二の温度まで加熱する工程；ならびに
(c）該反応組成物中の標的核酸を増幅する工程
を含む、標的核酸を増幅するための方法。
[本発明1013]
核酸ポリメラーゼが熱安定性である、本発明1012の方法。
[本発明1014]
核酸ポリメラーゼがDNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼである、本発明1012の方法。
[本発明1015]
核酸ポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、Tfi DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、およびVent（商標）DNAポリメラーゼからなる群より選択される、本発明1012の方法。
[本発明1016]
二重ホットスタート反応混合物が少なくとも2種の異なるホットスタート機構を含む、本発明1012の方法。
[本発明1017]
少なくとも2種の異なるホットスタート機構が、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断する抗体もしくは抗体の組み合わせ、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断するオリゴヌクレオチド、上昇した温度で解離する、DNAポリメラーゼの可逆的化学修飾、より低温で活性の低下をもたらす、DNAポリメラーゼのアミノ酸修飾、超安定DNA結合ドメインおよびトポイソメラーゼを含む融合タンパク質、DNAポリメラーゼを阻害する温度依存性リガンド、より低温でプライマーを捕捉する一本鎖結合タンパク質、修飾されたプライマー、または修飾されたdNTPからなる群より選択される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
(a）核酸ポリメラーゼ；および
(b）二重ホットスタート反応混合物
を含む、キット。
[本発明1019]
少なくとも1種のプライマー、dNTP、および核酸結合色素をさらに含む、本発明1018のキット。
[本発明1020]
二重ホットスタート反応混合物が少なくとも2種の異なるホットスタート機構を含む、本発明1018のキット。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】Fast SYBR（登録商標）Green Master Mix単独（「正方形」の線）、Platinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR Master Mix単独（「十字」の線）、および1:1の比でPlatinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR Master Mixと組み合わせたFast SYBR（登録商標）Green Master Mix（「三角形」の線）の比較。室温0時間のプレインキュベーション（「T0」）におけるcDNAの増幅。
【図１Ｂ】Fast SYBR（登録商標）Green Master Mix単独（「正方形」の線）、Platinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR Master Mix単独（「十字」の線）、および1:1の比でPlatinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR Master Mixと組み合わせたFast SYBR（登録商標）Green Master Mix（「三角形」の線）の比較。T0におけるNTC（非特異的産物）の増幅。
【図１Ｃ】Fast SYBR（登録商標）Green Master Mix単独（「正方形」の線）、Platinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR Master Mix単独（「十字」の線）、および1:1の比でPlatinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR Master Mixと組み合わせたFast SYBR（登録商標）Green Master Mix（「三角形」の線）の比較。室温24時間のプレインキュベーション（「T24」）におけるcDNAの増幅。
【図１Ｄ】Fast SYBR（登録商標）Green Master Mix単独（「正方形」の線）、Platinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR Master Mix単独（「十字」の線）、および1:1の比でPlatinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR Master Mixと組み合わせたFast SYBR（登録商標）Green Master Mix（「三角形」の線）の比較。T24におけるNTCの増幅。
【図２Ａ】Fast SYBR（登録商標）Green Master MixおよびPlatinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR Master Mixを単独でまたは組み合わせて用いた核酸増幅。T0におけるA2M cDNAおよびNTCについての融解曲線解析。
【図２Ｂ】Fast SYBR（登録商標）Green Master MixおよびPlatinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR Master Mixを単独でまたは組み合わせて用いた核酸増幅。T24におけるA2M cDNAおよびNTCについての融解曲線解析。
【図２Ｃ】Fast SYBR（登録商標）Green Master MixおよびPlatinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR Master Mixを単独でまたは組み合わせて用いた核酸増幅。T0におけるCOL1A1 cDNAおよびNTCについての融解曲線解析。
【図２Ｄ】Fast SYBR（登録商標）Green Master MixおよびPlatinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR Master Mixを単独でまたは組み合わせて用いた核酸増幅。T24におけるCOL1A1 cDNAおよびNTCについての融解曲線解析。
【図２Ｅ】Fast SYBR（登録商標）Green Master MixおよびPlatinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR Master Mixを単独でまたは組み合わせて用いた核酸増幅。単独または組み合わせでの、Fast SYBR（登録商標）Green Master MixおよびPlatinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR Master Mixに関するCt平均値およびΔCtの比較。
【図２Ｆ】Fast SYBR（登録商標）Green Master MixおよびPlatinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR Master Mixを単独でまたは組み合わせて用いた核酸増幅。単独または組み合わせでの、Fast SYBR（登録商標）Green Master MixおよびPlatinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR Master Mixについての融解曲線解析。
【図３Ａ】Fast SYBR（登録商標）Green Master Mix単独（「ひし形」の線）およびFast SYBR（登録商標）Green Master MixとPlatinum（登録商標）Taq Antibodyとの組み合わせ（「十字」の線）の比較。T0におけるcDNAの増幅。
【図３Ｂ】Fast SYBR（登録商標）Green Master Mix単独（「ひし形」の線）およびFast SYBR（登録商標）Green Master MixとPlatinum（登録商標）Taq Antibodyとの組み合わせ（「十字」の線）の比較。T0におけるNTCの増幅。
【図３Ｃ】Fast SYBR（登録商標）Green Master Mix単独（「ひし形」の線）およびFast SYBR（登録商標）Green Master MixとPlatinum（登録商標）Taq Antibodyとの組み合わせ（「十字」の線）の比較。T24におけるcDNAの増幅。
【図３Ｄ】Fast SYBR（登録商標）Green Master Mix単独（「ひし形」の線）およびFast SYBR（登録商標）Green Master MixとPlatinum（登録商標）Taq Antibodyとの組み合わせ（「十字」の線）の比較。T24におけるNTCの増幅。
【図４Ａ】Fast SYBR（登録商標）Green Master MixおよびPlatinum（登録商標）Taq Antibodyを単独でまたは組み合わせて用いた核酸増幅。T0およびT24においてFast SYBR（登録商標）Green Master Mixを単独で用いた、A2Mについての融解曲線解析。
【図４Ｂ】Fast SYBR（登録商標）Green Master MixおよびPlatinum（登録商標）Taq Antibodyを単独でまたは組み合わせて用いた核酸増幅。T0およびT24においてFast SYBR（登録商標）Green Master MixとPlatinum（登録商標）Taq Antibodyとの組み合わせを用いた、A2Mについての融解曲線解析。
【図４Ｃ】Fast SYBR（登録商標）Green Master MixおよびPlatinum（登録商標）Taq Antibodyを単独でまたは組み合わせて用いた核酸増幅。単独または組み合わせでの、Fast SYBR（登録商標）Green Master MixおよびPlatinum（登録商標）Taq Antibodyについての融解曲線解析。
【図５Ａ】Power SYBR（登録商標）Green PCR Master Mix単独（「ひし形」の線）およびPower SYBR（登録商標）Green PCR MixとPlatinum（登録商標）Taq Antibodyとの組み合わせ（「十字」の線）の比較。T0におけるcDNAの増幅。
【図５Ｂ】Power SYBR（登録商標）Green PCR Master Mix単独（「ひし形」の線）およびPower SYBR（登録商標）Green PCR MixとPlatinum（登録商標）Taq Antibodyとの組み合わせ（「十字」の線）の比較。T0におけるNTCの増幅。
【図５Ｃ】Power SYBR（登録商標）Green PCR Master Mix単独（「ひし形」の線）およびPower SYBR（登録商標）Green PCR MixとPlatinum（登録商標）Taq Antibodyとの組み合わせ（「十字」の線）の比較。T24におけるcDNAの増幅。
【図５Ｄ】Power SYBR（登録商標）Green PCR Master Mix単独（「ひし形」の線）およびPower SYBR（登録商標）Green PCR MixとPlatinum（登録商標）Taq Antibodyとの組み合わせ（「十字」の線）の比較。T24におけるNTCの増幅。
【図６Ａ】Power SYBR（登録商標）Green PCR Master MixおよびPlatinum（登録商標）Taq Antibodyを単独でまたは組み合わせて用いた核酸増幅。T0およびT24においてPower SYBR（登録商標）Green PCR Master Mixを単独で用いた、A2Mについての融解曲線解析。
【図６Ｂ】Power SYBR（登録商標）Green PCR Master MixおよびPlatinum（登録商標）Taq Antibodyを単独でまたは組み合わせて用いた核酸増幅。T0およびT24においてPower SYBR（登録商標）Green PCR Master MixとPlatinum（登録商標）Taq Antibodyとの組み合わせを用いた、A2Mについての融解曲線解析。
【図６Ｃ】Power SYBR（登録商標）Green PCR Master MixおよびPlatinum（登録商標）Taq Antibodyを単独でまたは組み合わせて用いた核酸増幅。単独または組み合わせでの、Power SYBR（登録商標）Green PCR Master MixおよびPlatinum（登録商標）Taq Antibodyについての融解曲線解析。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
ある特定の態様において、核酸ポリメラーゼ、および、第一の温度（例えば、＜40℃の温度）で該核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するまたは実質的に阻害する二重ホットスタート反応混合物を含む、組成物を提供する。いくつかの態様において、二重ホットスタート反応混合物は、第一の（例えば、より低い）温度で核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するためにまたは実質的に阻害するために用いられる少なくとも2種の異なるホットスタート機構を含む。そのようなホットスタート機構には、例えば、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断する抗体もしくは抗体の組み合わせ、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断するオリゴヌクレオチド、上昇した温度で解離する、DNAポリメラーゼの可逆的化学修飾、より低温で活性の低下をもたらす、DNAポリメラーゼのアミノ酸修飾、超安定DNA結合ドメインおよびトポイソメラーゼを含む融合タンパク質、DNAポリメラーゼを阻害する温度依存性リガンド、より低温でプライマーを捕捉する一本鎖結合タンパク質、修飾されたプライマー、または修飾されたdNTPが含まれてよいが、それらに限定されるわけではない。
【００２３】
ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、従来のホットスタート機構と比較して、非特異的核酸増幅および/または非特異的産物形成を長期間にわたって阻害する。例えば、いくつかの態様において、本二重ホットスタート反応混合物は、周囲温度で少なくとも24時間、非特異的核酸増幅および/または非特異的産物形成を阻害する。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、1種のホットスタート機構のみを有するホットスタート反応混合物と比較して、非特異的増幅および/または非特異的産物形成を約20〜100％減少させる。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、非特異的増幅および/または非特異的産物形成を約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100％減少させる。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、1種のホットスタート機構のみを有する反応混合物と比較して、非特異的産物形成を約2〜4倍低下させる。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、非特異的産物形成を約2、2.5、3、3.5、または4倍低下させる。
【００２４】
ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物が、約40℃を上回る温度で核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を実質的に阻害しないように、熱安定性核酸ポリメラーゼ、および、約40℃未満の温度で該核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するまたは実質的に阻害する二重ホットスタート反応混合物を含む、組成物を提供する。ある特定の態様において、核酸ポリメラーゼは、DNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼであってよい。ある特定の態様において、核酸ポリメラーゼは熱安定性であってよい。
【００２５】
ある特定の態様において、核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するための方法を提供する。これらの方法は、ポリメラーゼを二重ホットスタート反応混合物と接触させる工程であって、二重ホットスタート反応混合物が、第一の温度（例えば、＜40℃の温度）で核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するまたは実質的に阻害する工程、を伴う。ポリメラーゼ阻害は、（例えば、少なくとも約40℃の第二の温度まで加熱することによって）可逆的であってよい。二重ホットスタート反応混合物は、第一の温度で核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するためにまたは実質的に阻害するために用いられる少なくとも2種の異なるホットスタート機構を含む。そのようなホットスタート機構には、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断する抗体もしくは抗体の組み合わせ、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断するオリゴヌクレオチド、上昇した温度で解離する、DNAポリメラーゼの可逆的化学修飾、より低温で活性の低下をもたらす、DNAポリメラーゼのアミノ酸修飾、超安定DNA結合ドメインおよびトポイソメラーゼを含む融合タンパク質、DNAポリメラーゼを阻害する温度依存性リガンド、より低温でプライマーを捕捉する一本鎖結合タンパク質、修飾されたプライマー、または修飾されたdNTPが含まれるが、それらに限定されるわけではない。ある特定の態様において、核酸ポリメラーゼは、DNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼであってよい。ある特定の態様において、核酸ポリメラーゼは熱安定性であってよい。
【００２６】
ある特定の態様において、核酸分子を合成するための方法を提供する。そのような方法は、鋳型核酸を、熱安定性核酸ポリメラーゼ、二重ホットスタート反応混合物、1種もしくは複数種のヌクレオシドおよび/もしくはデオキシヌクレオシド三リン酸、ならびに少なくとも1種のプライマーを含む組成物と接触させる工程であって、二重ホットスタート反応混合物が、第一の温度で核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するまたは実質的に阻害する工程、結果として生じた混合物をポリメラーゼ阻害を取り除くのに十分な第二の温度へ引き上げる工程、ならびに鋳型核酸を重合させる工程を伴う。いくつかの態様において、第一の温度は周囲温度（例えば、室温）である。ある特定の態様において、核酸ポリメラーゼは、DNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼであってよい。ある特定の態様において、核酸ポリメラーゼは熱安定性であってよい。
【００２７】
ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物を含む、ミスプライミング事象を防止するまたは減少させるための方法を提供する。そのような方法によれば、二重ホットスタート反応混合物が核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を実質的に阻害するのに適した条件下で、核酸ポリメラーゼを二重ホットスタート反応混合物と第一の温度で接触させる。結果として生じた混合物を適切な第二の温度まで加熱した場合に、二重ホットスタート機構はポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性を阻害するのを中止し、かつプライマー伸長が起こる。
【００２８】
ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物を含む、非特異的増幅産物形成を低下させるための方法を提供する。そのような方法によれば、標的核酸を、核酸ポリメラーゼ、二重ホットスタート反応混合物、少なくとも1種のプライマー、および少なくとも1種のdNTPと接触させる。ある特定の態様において、少なくとも1種のプライマーはプライマー対を含む。第一の温度で、二重ホットスタート反応混合物は、核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するまたは実質的に阻害する。その後、二重ホットスタート反応が核酸ポリメラーゼを阻害するのを防ぐ第二の温度まで反応組成物を加熱する。次いで、反応組成物中の標的核酸を少なくとも1回の増幅サイクルに供することができる。ある特定の態様において、核酸ポリメラーゼは熱安定性である。ある特定の他の態様において、核酸ポリメラーゼは、DNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼである。例えば、核酸ポリメラーゼは、Taq DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、Tfi DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、およびVent（商標）DNAポリメラーゼからなるがそれらに限定されない群より選択されてよい。いくつかの他の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、少なくとも2種の異なるホットスタート機構を含む。いくつかの態様において、少なくとも2種の異なるホットスタート機構は、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断する抗体もしくは抗体の組み合わせ、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断するオリゴヌクレオチド、上昇した温度で解離する、DNAポリメラーゼの可逆的化学修飾、より低温で活性の低下をもたらす、DNAポリメラーゼのアミノ酸修飾、超安定DNA結合ドメインおよびトポイソメラーゼを含む融合タンパク質、DNAポリメラーゼを阻害する温度依存性リガンド、より低温でプライマーを捕捉する一本鎖結合タンパク質、修飾されたプライマー、または修飾されたdNTPからなる群より選択されてよい。
【００２９】
ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、従来のホットスタート機構と比較して、非特異的核酸増幅および/または非特異的産物形成の阻害の増大を提供する。他の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、従来のホットスタート機構と比較して、非特異的核酸増幅および/または非特異的産物形成を長期間にわたって阻害する。例えば、いくつかの態様において、二重ホットスタート反応混合物は、周囲温度で少なくとも24時間、非特異的核酸増幅および/または非特異的産物形成を阻害する。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、1種のホットスタート機構のみを有するホットスタート反応混合物と比較して、非特異的増幅および/または非特異的産物形成を約20〜100％減少させる。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、非特異的増幅および/または非特異的産物形成を約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100％減少させる。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、1種のホットスタート機構のみを有する反応混合物と比較して、非特異的産物形成を約2〜4倍低下させる。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、非特異的産物形成を約2、2.5、3、3.5、または4倍低下させる。
【００３０】
ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物を含む、非特異的蛍光を低下させるための方法を提供する。そのような方法によれば、核酸ポリメラーゼ、二重ホットスタート反応混合物、少なくとも1種のNTPまたはdNTP、標的核酸、少なくとも1種のプライマー、および少なくとも1種の核酸結合色素を含む反応組成物を第一の温度で形成する。ある特定の態様において、少なくとも1種のプライマーはプライマー対を含む。第一の温度で、二重ホットスタート反応混合物は、核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するまたは実質的に阻害する。その後、二重ホットスタート反応混合物に核酸ポリメラーゼ活性が起こるのを可能にさせる第二の反応温度まで反応組成物を加熱する。反応組成物を少なくとも1回の増幅サイクルに供し、複数のアンプリコンが生成される。アンプリコンと結び付いた核酸結合色素の蛍光により、二本鎖アンプリコンは「リアルタイム」でまたは増幅反応が完了した後に検出され得る。
【００３１】
ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、従来のホットスタート機構と比較して、非特異的核酸増幅および/または非特異的産物形成を長期間にわたって阻害する。例えば、いくつかの態様において、本二重ホットスタート反応混合物は、周囲温度で少なくとも24時間、非特異的核酸増幅および/または非特異的産物形成を阻害する。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、1種のホットスタート機構のみを有するホットスタート反応混合物と比較して、非特異的増幅および/または非特異的産物形成を約20〜100％減少させる。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、非特異的増幅および/または非特異的産物形成を約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100％減少させる。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、1種のホットスタート機構のみを有する反応混合物と比較して、非特異的産物形成を約2〜4倍低下させる。ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物は、非特異的産物形成を約2、2.5、3、3.5、または4倍低下させる。
【００３２】
ある特定の態様において、二重ホットスタート反応混合物を用いた、標的核酸を増幅するための方法を提供する。ある特定のそのような方法によれば、核酸ポリメラーゼ、二重ホットスタート反応混合物、少なくとも1種のNTPまたはdNTP、標的核酸、少なくとも1種のプライマー、および少なくとも1種の核酸結合色素を含む反応組成物を第一の温度で形成する。ある特定の態様において、少なくとも1種のプライマーはプライマー対を含む。第一の温度で、二重ホットスタート反応混合物は、核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するまたは実質的に阻害する。その後、二重ホットスタート反応混合物に核酸ポリメラーゼまたは核酸ポリメラーゼ活性の阻害を中止させる第二の反応温度まで反応組成物を加熱する。反応組成物を少なくとも1回の増幅サイクルに供し、複数のアンプリコンが生成される。アンプリコンと結び付いた核酸結合色素の蛍光により、二本鎖アンプリコンは「リアルタイム」でまたは増幅反応が完了した後に検出され得る。
【００３３】
ある特定の態様において、本方法のいくつかを実施するためのキットも提供する。ある特定の態様において、キットは二重ホットスタート反応混合物を含む。ある特定の態様において、キットは少なくとも1種の核酸ポリメラーゼをさらに含む。ある特定の態様において、キットは、少なくとも1種のプライマーもしくはプライマー対、核酸結合色素、レポータープローブ、および逆転写酵素のうちの1つまたは複数をさらに含む。
【００３４】
本開示の主題をより明瞭かつ簡潔に記載しかつ指し示すために、以下の説明および添付の特許請求の範囲において用いられている具体的な用語に対して、以下の定義を提供する。本明細書を通して、具体的用語の例示は非限定的な例として見なされるべきである。
【００３５】
本明細書において使用するとき、別様に具体的に明記されていない限り、「１つの」または「ある」という言葉は少なくとも1つを意味する。本明細書において、別様に具体的に明記されていない限り、単数形の使用は複数形を含む。例えば、しかしながら限定としてではなく、「１つの標的核酸」は、1つを上回る数の標的核酸；例えば、1コピーまたは複数コピーの特定の標的核酸種、ならびに2種またはそれを上回る種類の異なる種の標的核酸が存在し得ることを意味する。「および/または」という用語は、斜線の前および後の用語を一緒にまたは別々に選ぶことができることを意味する。例証目的のために、しかしながら限定としてではなく、「Xおよび/またはY」は、「X」もしくは「Y」、または「X」および「Y」を意味し得る。
【００３６】
本開示において論じられている温度、濃度、時間等の前には暗黙の「約」が存在し、それによってわずかなかつ実質的でない逸脱が本明細書における本教示の範囲内にあることが解されるであろう。また、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」、「含有する（contain）」、「含有する（contains）」、「含有している（containing）」、「含む（include）」、「含む（includes）」、および「含んでいる（including）」の使用は、限定的であることを意図されない。前述の概略的説明および詳細な説明の両方は、単なる例示的かつ説明的なものであり、本教示の制限ではないことが理解されるべきである。
【００３７】
上記の明細書において具体的に言及されていない限り、種々の成分を「含む」ことを記述している上記の明細書における態様は、記述された成分「からなる」または「から本質的になる」としても企図され；種々の成分「からなる」ことを記述している本明細書における態様は、記述された成分「を含む」または「から本質的になる」としても企図され；かつ種々の成分「から本質的になる」ことを記述している本明細書における態様は、記述された成分「からなる」または「を含む」としても企図される（この互換性は、添付の特許請求の範囲におけるこれらの用語には適用されない）。
【００３８】
本明細書において用いられる節の見出しは、単なる体系化目的のためのものであり、決して所望の主題を限定するものとして解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事、書籍、および論文を含むがそれらに限定されない、本明細書において引用されるすべての文献は、いかなる目的のためにも参照によりそれらの全体として明示的に組み入れられる。組み入れられた文献のいずれかが、本明細書において定義される任意の用語と矛盾する事象では、本明細書が支配する。本教示は種々の態様と併せて記載されているが、本教示がそのような態様に限定されることは意図されない。むしろ、当業者によって解されるであろうように、本教示は種々の代替手段、修正、および同等物を包含する。
【００３９】
本明細書において用いられる「アンプリコン」および「増幅産物」という用語は、概して、増幅反応の産物を指す。アンプリコンは二本鎖または一本鎖であってよく、かつ二本鎖増幅産物を変性することによって得られる別個の成分鎖を含んでよい。ある特定の態様において、1回の増幅サイクルのアンプリコンは、後続の増幅サイクルにおいて鋳型としての役割を果たし得る。
【００４０】
「ハイブリダイズする」および「アニールする」という根本をなす言葉の変化形を含むがそれらに限定されない「アニーリング」および「ハイブリダイズすること」という用語は互換可能に用いられ、かつ二重鎖、三重鎖、またはより高次の他の構造の形成をもたらす、一方の核酸ともう一方の核酸とのヌクレオチド塩基対合相互作用を意味する。主要な相互作用は、典型的にはヌクレオチド塩基特異的であり、例えば、Watson-CrickおよびHoogsteen型水素結合によるA:T、A:U、およびG:Cである。ある特定の態様において、塩基の積層および疎水性相互作用も、二重鎖の安定性に寄与し得る。プライマーおよびプローブが相補的配列にアニールする条件は、例えばNucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, Hames and Higgins, eds., IRL Press, Washington, D.C. (1985)およびWetmur and Davidson, Mol. Biol. 31:349 (1968)に記載されているように、当技術分野において周知である。
【００４１】
一般的に、そのようなアニーリングが起こるかどうかは、中でもとりわけ、プライマーの相補的部分の長さ、ならびに標的隣接配列および/もしくはアンプリコンにおけるそれらの対応する結合部位の長さ、またはレポータープローブの対応する相補的部分の長さおよびその結合部位の長さ；pH；温度；一価および二価の陽イオンの存在；ハイブリダイズする領域におけるGおよびCヌクレオチドの比率；媒体の粘度；ならびに変性剤の存在によって影響を受ける。そのような変数は、ハイブリダイゼーションに要する時間に影響を与える。ゆえに、好ましいアニーリング条件は、特定の適用に依存する。しかしながら、そのような条件は、過度の実験なしで当業者によってルーチン的に決定され得る。好ましくは、プライマーおよび/またはプローブが、対応する標的隣接配列またはアンプリコンにおける相補的配列と選択的にハイブリダイズするのを可能にするが、第二の反応温度で反応組成物中の異なる標的核酸または非標的配列にいかなる有意な程度にもハイブリダイズするのを可能にしないアニーリング条件を選択する。
【００４２】
「選択的にハイブリダイズする」という用語およびその変化形は、適当なストリンジェンシー条件下で、所定の配列（例えば、プライマー、しかしながらそれに限定されない）が、ヌクレオチドの相補的文字列を含む第二の配列（例えば、標的隣接配列またはアンプリコンのプライマー結合部位、しかしながらそれらに限定されない）とアニールするが、非標的核酸、プローブ、または他のプライマーなどの望ましくない配列にはアニールしないことを意味する。典型的に、反応温度が特定の二本鎖配列の融解温度に向かって増大するにつれて、選択的ハイブリダイゼーションの相対量は概して増大し、かつミスプライミングは概して減少する。本明細書において、一方の配列がもう一方の配列とハイブリダイズするまたは選択的にハイブリダイズするという明記は、両方の配列の全体が互いにハイブリダイズするまたは選択的にハイブリダイズする状況、および一方または両方の配列の一部のみが、他方の配列全体または他方の配列の一部にハイブリダイズするまたは選択的にハイブリダイズする状況を包含する。
【００４３】
本明細書において使用するとき、「ストリンジェンシー」という用語は、ハイブリダイゼーションの間に存在する温度および溶媒組成、ならびに2種の相補的ヌクレオチド配列から構成される混成物が形成される後続の処理工程を定義するために用いられる。ストリンジェンシーは、2種のヌクレオチド配列間の相同性の量、必要な条件、およびそれらの配列間で形成される混成物の安定性も定義する。ストリンジェンシー条件が増大するにつれて、選択的ハイブリダイゼーションが優先され、非特異的な交差ハイブリダイゼーションは優先されない。ストリンジェンシー条件の増大は、典型的に、ミスプライミングが起こる可能性がより高いより低いストリンジェンシー条件と比べて、より高いインキュベーション温度、より低い塩濃度、および/またはより高いpHに相当する。当業者であれば、対応する標的隣接配列および/またはアンプリコンへのプライマーまたはプライマー対の選択的ハイブリダイゼーションを可能にする適当なストリンジェンシー条件は、周知の技術を用いかつ過度の実験なしでルーチン的に決定され得ることを理解する（例えば、PCR: The Basics from Background to Bench, McPherson and Moller, Bios Scientific Publishers, 2000を参照されたい）。
【００４４】
本明細書において使用するとき、ポリメラーゼ活性を「実質的に阻害する」二重ホットスタートの反応混合物または機構とは、約30％未満、約25％未満、約20％未満、より好ましくは約15％未満、約10％未満、約7.5％未満、もしくは約5％未満、最も好ましくは約5％未満、約2％未満、約1％未満、約0.5％未満、約0.25％未満のポリメラーゼ活性を提供する、またはポリメラーゼ活性を完全に欠いている反応混合物を指す。本明細書において用いられる、「実質的に阻害される」ポリメラーゼ活性とは、ホットスタート機構またはホットスタート反応混合物の存在下で、少なくとも約70％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、99.75％、100％、または＞100％阻害されるポリメラーゼ活性を指す。
【００４５】
本明細書において用いられる「またはそれらの組み合わせ」という用語は、該用語に先行する列挙された用語のすべての順列および組み合わせを指す。例えば、「A、B、C、またはそれらの組み合わせ」は、A、B、C、AB、AC、BC、またはABCのうちの少なくとも1つ、かつ特定の文脈において順序が重要である場合には、BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC、またはCABも加えたうちの少なくとも1つを含むことが意図される。この例を続けると、BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABBなど、1つまたは複数の項目または用語の反復を含有する組み合わせが明示的に含まれる。当業者であれば、文脈から別様に明らかでない限り、典型的に、任意の組み合わせでの項目または用語の数に制限はないことを理解するであろう。
【００４６】
本明細書において用いられる「変性すること」および「変性」という用語は、少なくとも1種の標的核酸を含むゲノムDNA（gDNA）フラグメント、二本鎖アンプリコン、または少なくとも1種の二本鎖セグメントを含むポリヌクレオチドを含むがそれらに限定されない二本鎖ポリヌクレオチドが、必要に応じて、2本の一本鎖ポリヌクレオチドに、または1本の一本鎖もしくは実質的に一本鎖のポリヌクレオチドに変換される任意の過程を指す。二本鎖ポリヌクレオチドを変性する工程には、例えば二本鎖ポリヌクレオチド、または2種のオリゴヌクレオチドを含む二重鎖の2本の個々の一本鎖成分を切り離す工程であるがそれに限定されない、二本鎖核酸を一本鎖または実質的に一本鎖の状態にする様々な熱的および化学的な技術が含まれるが、それらに限定されるわけではない。当業者であれば、採用される変性技術は、一般的に、それが増幅反応の後続のアニーリング工程もしくは酵素的工程、またはある特定の方法における、蛍光シグナルの検出を実質的に妨げない限り、限定的ではないことを解するであろう。
【００４７】
本明細書において使用するとき、「Tm」という用語は、融解温度に関して用いられる。融解温度とは、二本鎖核酸分子の集団が一本鎖へ半分に解離する温度である。
【００４８】
本明細書において用いられる「副溝結合因子」という用語は、時には配列特異的様式で、二本鎖DNAの副溝に適合する小分子を指す。一般的に、副溝結合因子は、三日月様の形状をとり、ゆえに二重らせんの副溝にぴったり適合し得、しばしば水に取って代わる、長く平らな分子である。副溝結合分子は、典型的に、ねじれの自由を有する結合によって接続された、例えばフラン環、ベンゼン環、またはピロール環、しかしながらそれらに限定されないいくつかの芳香環を含む。
【００４９】
本明細書において用いられる「ミスプライミング」または「ミスプライムした」とは、非標的核酸へのプライマーまたはプローブのハイブリダイゼーションを指す。当技術分野において公知であるように、（ランダムプライマーを除く）プライマーは、一般的に、標的核酸に隣接する選択配列にまたはアンプリコンのプライマー結合部位にハイブリダイズし、かつその部位から始まる直接DNA合成またはプライマー伸長を指揮するように設計される。ミスプライミングは、プライマーまたはプローブが、しばしば低いまたは減少したストリンジェンシー条件で非標的核酸にハイブリダイズし、次いで、その非標的部位からのプライマー伸長のための開始地点としての役割を果たす場合に起こり得、ある特定の望ましくない二次的増幅産物の合成を引き起こす。
【００５０】
「非特異的な」または「バックグラウンド」という用語は、蛍光に関して用いられる場合、所望のアンプリコン以外の二本鎖核酸と結び付いた核酸結合色素分子から発される検出可能なシグナルを指す。所望のアンプリコンには、いくつかの態様における、中でもとりわけ正規化および/または定量化目的のために、本教示のある特定の反応組成物に含まれ得る内部標準または対照配列を含めた、標的核酸の増幅産物が含まれる。ゆえに、しばしばミスプライミング、ミスライゲーション、および/またはプライマーダイマー形成の結果である疑似の二次的アンプリコンと核酸色素分子との結び付きによって生じる蛍光シグナルは、非特異的蛍光の1つの供給源である。
【００５１】
本明細書において用いられる「核酸結合色素」という用語は、二本鎖ポリヌクレオチドに特異的である、または一本鎖ポリヌクレオチドとよりも二本鎖ポリヌクレオチドと結び付いた場合に実質的により大きな蛍光増強を少なくとも示す蛍光分子を指す。典型的に、核酸結合色素分子は、二本鎖セグメントの塩基対の間に入り込み、しかしながら二本鎖セグメントの主溝もしくは副溝または両方において結合することによって、ポリヌクレオチドの二本鎖セグメントと結び付く。核酸結合色素の非限定的な例には、エチジウムブロマイド、DAPI、Hoechst 33258およびHoechst 33342を含むがそれらに限定されないHoechst誘導体、ランタニドキレートを含むインターカレーター（例えば、2つの蛍光四座β-ジケトン-Eu3＋キレートを保持するナフタレンジイミド誘導体（NDI-(BHHCT-Eu3＋)2）、しかしながらそれに限定されるわけではなく、例えばNojima et al., Nucl. Acids Res. Suppl. No. 1 105 (2001)を参照されたい）、ならびにSYBR（登録商標）GreenおよびPicoGreen（登録商標）などのある特定（dertain）の非対称シアニン色素が含まれる。
【００５２】
本明細書において使用するとき、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は互換可能に用いられ、かつヌクレオチド間のホスホジエステル結合による連結、またはヌクレオチド間類似体、および関連対イオン、例えばH＋、NH4＋、トリアルキルアンモニウム、Mg2＋、Na＋等によって連結された2'-デオキシリボヌクレオチド（DNA）およびリボヌクレオチド（RNA）を含むがそれらに限定されない、ヌクレオチドモノマーの一本鎖および二本鎖ポリマーを指す。ポリヌクレオチドは、完全にデオキシリボヌクレオチドから、完全にリボヌクレオチドから、またはそれらのキメラ混合物から構成されてよく、かつヌクレオチド類似体を含んでよい。ヌクレオチドモノマー単位は、ヌクレオチドおよび/またはヌクレオチド類似体を含むがそれらに限定されない、本明細書において記載されるヌクレオチドのいずれかを含んでよい。ポリヌクレオチドは、典型的に、数個のモノマー単位、例えばそれらは当技術分野においてオリゴヌクレオチドと称されることもある場合の5〜40個から、数千個のモノマーヌクレオチド単位までサイズが及ぶ。別様に表されていない限り、ポリヌクレオチド配列が表示されている場合はいつでも、ヌクレオチドは左から右に5'→3'の順序にあること、および別様に言及されていない限り、「A」はデオキシアデノシンを表し、「C」はデオキシシトシンを表し、「G」はデオキシグアノシンを表し、「T」はデオキシチミジンを表し、かつ「U」はデオキシウリジンを表すことが理解されるであろう。
【００５３】
「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドのリン酸エステル、例えば三リン酸エステルを指し、最もよく見られるエステル化の部位は、ペントースのC-5位に接着したヒドロキシル基である。
【００５４】
「ヌクレオシド」という用語は、2'-デオキシ形態および2'-ヒドロキシル形態を含めた、1'位でペントースに連結されたプリン、デアザプリン、またはピリミジンのヌクレオシド塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシン等からなる化合物を指す。ヌクレオシド塩基がプリンまたは7-デアザプリンである場合、ペントースはプリンまたはデアザプリンの9位で核酸塩基（nucleobase）に接着しており、かつ核酸塩基がピリミジン（purimidine）の場合、ペントースはピリミジンの1位で核酸塩基に接着している。
【００５５】
「類似体」という用語には、修飾された塩基部分、修飾された糖部分、および/または修飾されたリン酸エステル部分を有する合成類似体が含まれる。ホスフェート類似体には、一般的に、リン原子が＋5酸化状態にあり、かつ1個または複数個の酸素原子が非酸素部分、例えば硫黄で置き換えられている、ホスフェートの類似体が含まれる。例示的なホスフェート類似体には、関連対イオン、例えばH＋、NH4＋、Na＋を含む、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）、ホスホロアニリデート（phosphoranilidate）、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート（boronophosphate）が含まれる。例示的な塩基類似体には、2,6-ジアミノプリン、ヒポキサンチン、シュードウリジン、C-5-プロピン、イソシトシン、イソグアニン、2-チオピリミジンが含まれる。例示的な糖類似体には、2'または3'位が水素、ヒドロキシ、アルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、およびフェノキシ、アジド、アミノまたはアルキルアミノ、フルオロ、クロロ、ならびにブロモである、2'または3'修飾されたものが含まれる。
【００５６】
本明細書において使用するとき、「反応槽」という用語は、概して、その中で反応が本教示に従って起こり得る、任意の容器、チャンバー、装置、または集合体を指す。いくつかの態様において、反応槽はマイクロチューブ、例えばMicroAmp（登録商標）Opticalチューブ（Life Technologies Corp., Carslbad, CA）もしくは微小遠心チューブなどの0.2mLもしくは0.5mL反応チューブ、または分子生物学実験室での一般的実践における種類の他の容器であってよいが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、反応槽には、TaqMan（登録商標）Low Density ArrayまたはTaqMan（登録商標）Open Array Real-Time PCRプレート（両方ともLife Technologies Corp.製）を含むがそれらに限定されない、マルチウェルプレートのウェル、スライドガラス上のスポット、またはマイクロ流体装置のチャネルもしくはチャンバーが含まれる。例えば、しかしながら限定としてではなく、複数の反応槽は同じ支持体上に存在し得る。いくつかの態様において、Ion 316（商標）およびIon 318（商標）チップを含めた、例えばCaliper、Fluidigm、およびLife Technologies Corp.から入手可能なラボ・オン・チップ様装置は、開示される方法において反応槽としての役割を果たし得る。様々な反応槽が市販されている、または本教示との関連における使用のために設計され得ることが認識されるであろう。
【００５７】
本明細書において使用するとき、「ホットスタート」という用語は、概して、必須成分を反応に参加させる第二の温度（典型的に、より高温）に到達するまで、反応混合物を第一の温度（典型的に、より低温）で維持する場合に、必須の反応成分（例えば、ポリメラーゼ）の利用可能性を制限する手段を指す。ホットスタート反応は、典型的に、第一の（例えば、より低い）温度でのインキュベーション、およびそれに続く、所望の反応を起こさせる第二の（例えば、より高い）温度への上昇を伴う。ホットスタート反応の活性化は、好ましくは、プライマーの結合特異性を保証するために、増幅反応に用いられるプライマーハイブリダイゼーション（アニーリング）温度と同等またはそれよりも高い温度でのインキュベーションによって達成される。酵素活性を回復させるために必要とされるインキュベーションの長さは、反応混合物の温度およびpH、ならびに酵素の安定性に依存する。広範なインキュベーション条件を使用でき、最適な条件は各反応に対して経験的に決定され得る。一般的に、二重ホットスタート反応混合物を、第一の温度でインキュベートして核酸合成（例えば、ポリメラーゼ活性）を阻害し、次いで、取り除かれるべきまたは中止されるべき阻害のために第二の温度へ上昇させる。例示されていない核酸ポリメラーゼの再活性化に対する、または例示されていない反応混合物に対するインキュベーション条件の最適化は、本明細書において提供される手引きを受けて、ルーチン実験によって決定され得る。
【００５８】
ある特定の態様において、第一の温度は第二の温度よりも低い。いくつかの態様において、第一の温度は＜40℃である。ある特定の態様において、第一の温度は、約40℃、35℃、30℃、25℃、20℃、15℃、10℃、5℃、またはそれを下回る温度とほぼ同等またはそれ未満である。いくつかの態様において、第一の温度は周囲温度である。いくつかの他の態様において、第一の温度は室温である。いくつかの態様において、第二の温度は＞40℃である。ある特定の態様において、第一の温度は、約40℃、45℃、50℃、55℃、60、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、またはそれを上回る温度とほぼ同等またはそれよりも高い。マニュアル技術、バリア、必須の反応成分のうちの1つまたは複数の化学修飾および/または構造修飾を含むがそれらに限定されない、ホットスタート反応を実施するためのいくつかの方法が存在する。そのようなホットスタート法のための適切な反応条件は当技術分野において公知であり、かつ本明細書においておよび実施例においてさらに記載されている。
【００５９】
本明細書において使用するとき、「二重ホットスタート反応混合物」という用語は、増幅反応（例えば、PCR）における最初の変性温度のホットスタート条件に到達するまで、低温（例えば、周囲温度）での核酸ポリメラーゼによる伸長を遮断するために用いられる試薬または試薬溶液の組み合わせを指す。上昇した増幅温度で、核酸ポリメラーゼはもはや阻害されず、かつプライマー伸長を可能にする。本明細書において使用するとき、二重ホットスタート反応混合物とは、ホットスタートのための少なくとも2種の異なる機構を含む反応混合物を含むことを意味する。したがって、「二重ホットスタート反応混合物」は、2種を上回る種類のホットスタート機構を含んでよい（例えば、「三重ホットスタート反応混合物」、「四重ホットスタート反応混合物」、「五重ホットスタート反応混合物」等）。考えられるホットスタート機構には、より低温で核酸ポリメラーゼ活性を遮断しかつ上昇した温度でポリメラーゼから解離する抗体もしくは抗体の組み合わせ（例えば、Eastlund et al., LifeSci. Quarterly 2:2 (2001)、Mizuguchi et al., J. Biochem. (Tokyo) 126:762 (1999)を参照されたい）；より低温で核酸ポリメラーゼ活性を遮断しかつ上昇した温度でポリメラーゼから解離するオリゴヌクレオチド（例えば、Dang et al., J. Mol. Biol. 264:268 (1996)を参照されたい）；より低温でポリメラーゼ活性が遮断されかつ上昇した温度で修飾が逆行するもしくは解離するような、核酸ポリメラーゼの可逆的化学修飾（例えば、米国特許第5,773,258号、およびMoretti et al., Biotechniques 25:716 (1998)を参照されたい）；より低温で活性の低下をもたらす、核酸ポリメラーゼのアミノ酸変異（例えば、Kermekchiev et al., Nucl. Acids Res. 31:6139 (2003)を参照されたい）；超安定DNA結合ドメインおよびトポイソメラーゼを含む核酸ポリメラーゼ融合タンパク質（例えば、Pavlov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:13510 (2002)を参照されたい）；温度依存的様式で核酸ポリメラーゼを阻害するリガンド（例えば、Eppendorf（Hauppauge, NY）および5 PRIME（Gaithersburg, MD）製のHotMaster（商標）Taq DNA polymerase）；低温でプライマーを捕捉する一本鎖結合タンパク質（例えば、米国特許出願公報第2008/0138878号を参照されたい）；上昇した温度で無機ピロホスフェートを加水分解する熱安定性ピロホスファターゼ（例えば、米国特許出願公報第2006/0057617号を参照されたい）；ポリメラーゼ遮断タンパク質などの熱不安定性遮断因子（例えば、米国特許出願公報第2007/0009922号を参照されたい）；プライマー競合配列（例えば、Puskas et al., Genome Res. 5:309 (1995)およびVestheim et al., Front. Zool. 5:12 (2008)を参照されたい）；修飾されたプライマー構築物（例えば、Ailenberg et al., Biotechniques 29:22 (2000)およびKaboev et al., Nucl. Acids Res. 28:E94 (2000)を参照されたい）；ハイブリダイゼーション選択性を改善する修飾されたプライマー（例えば、米国特許第6,794,142号および第6,001,611号を参照されたい）；3'-5'エキソヌクレアーゼ活性によって除去可能である3'修飾を有するプライマー（例えば、米国特許出願公報第2003/0119150号および米国特許第6,482,590号を参照されたい）；UV照射によって除去可能である修飾された核酸塩基を有するプライマー（例えば、Young et al., Chem. Commun. (Camb) 28:462 (2008)を参照されたい）；熱による脱保護によって除去可能であるプライマー修���（例えば、米国特許出願公報第2003/0162199号およびLebedev et al., Nucl. Acids Res. 36:e131 (2008)を参照されたい）；または熱不安定性修飾基によるdNTPの修飾（例えば、米国特許出願公報第2003/0162199号およびKoukhareva et al., Nucl. Acids Symp. Ser. (Oxford), 259 (2008)を参照されたい）が含まれてよいが、それらに限定されるわけではない。本明細書において引用されるすべての参考文献は、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体として組み入れられる。
【００６０】
本明細書において使用するとき、「少なくとも2種の異なる機構」を含む二重ホットスタート反応混合物は、同様に機能するまたは同様の成分を用いる少なくとも2種の異なるホットスタート機構を含み得るそれらの反応混合物を包含する。例えば、二重ホットスタート反応混合物は、抗体に基づく2種の異なるホットスタート機構、またはオリゴヌクレオチドに基づく2種の異なるホットスタート機構、または抗体に基づく1種およびオリゴヌクレオチドに基づく1種のホットスタート機構、または抗体に基づく1種および化学修飾に基づく1種のホットスタート機構、または利用可能な任意のそのような組み合わせに対して設計された試薬または試薬溶液を含んでよい。
【００６１】
「レポーター基」という用語は、本明細書において広い意味で用いられ、かつ任意の識別可能なタグ、標識、または部分を指す。
【００６２】
「標的核酸」または「標的」という用語は、（典型的にミスプライミングによる疑似副反応の結果である二次的増幅産物とは対照的に、）本教示の組成物、方法、およびキットを用いて特異的に増幅されかつ/または検出される核酸配列を指す。ある特定の態様において、標的核酸は、プライマー伸長反応における鋳型としての役割を果たす。いくつかの態様において、標的核酸は増幅鋳型としての役割を果たす。いくつかの態様において、標的核酸は、核酸切断構造における鋳型鎖としての役割を果たす。ある特定の態様において、標的核酸はDNAを含み、かつゲノムDNA（gDNA）またはミトコンドリアDNA（mtDNA）中に存在している。ある特定の態様において、標的核酸には、RNA、例えばリボソームRNA（rRNA）、メッセンジャーRNA（mRNA）、トランスファーRNA(tRNA）、またはプリmiRNA、プレmiRNA、もしくはプリmiRNAおよびプレmiRNAを含むがそれらに限定されないマイクロRNA（miRNA）前駆体などのRNA分子が含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、標的核酸には、miRNA、sRNA、stRNA、snoRNA、または他のncRNAを含むがそれらに限定されない小RNA分子が含まれる。標的核酸は核酸分子の全体をなす必要はない。例えば、しかしながら限定としてではなく、大きな核酸、例えばgDNAフラグメントは、複数の異なる標的核酸を含んでよい。典型的に、標的核酸は少なくとも1つの規定された末端を有する。多くの核酸増幅反応において、核酸標的は2つの規定された末端を有する。
【００６３】
「熱安定性」という用語は、酵素に関して用いられる場合、熱による不活性化に対して耐性がある酵素（核酸ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドなど）を指す。「熱安定性」酵素は、熱処理によって不活性化され得る「熱不安定性」ポリメラーゼとは対照的である。熱不安定性タンパク質は生理的温度で不活性化され得、かつ中間熱安定性（約45℃〜約65℃で不活性化）および熱安定性（約65℃より高い温度で不活性化）として分類され得る。例えば、熱不安定性T5およびT7 DNAポリメラーゼの活性は、酵素を約90℃の温度に約30秒間曝露することによって完全に不活性化され得る。熱安定性ポリメラーゼ活性は、熱不安定性ポリメラーゼよりも熱不活性化に対してより耐性がある。しかしながら、熱安定性ポリメラーゼは、熱不活性化に対して完全に耐性がある酵素を指すことを意味するわけではなく、ゆえに、熱処理によりポリメラーゼ活性はある程度低下し得る。熱安定性ポリメラーゼは、また、典型的に、熱不安定性DNAポリメラーゼよりも高い最適温度を有する。
【００６４】
作用濃度とは、（核酸分子の増幅または消化などの）特定の機能を果たす、溶液の状態で用いられる最適濃度にあるまたはその付近にある試薬の濃度を指す。試薬の作用濃度は、（試薬が溶液の場合には）「1×濃度」または「1×溶液」の試薬としても同等に記載される。したがって、より高濃度の試薬は、作用濃度に基づいて記載されてもよい；例えば「2×濃度」または「2×溶液」の試薬は、試薬の作用濃度の2倍高い溶液の濃度として定義され；「5×濃度」または「5×溶液」は、作用濃度の5倍高いなど。
【００６５】
本明細書において使用するとき、「核酸ポリメラーゼ」とは、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素を指す。一般的に、該酵素は、核酸鋳型配列にアニールしたプライマーの3'末端から合成を開始し、かつ鋳型鎖の5'末端に向かって進行する。本明細書において用いられる「DNAポリメラーゼ」は、概して、鋳型依存的様式で、デオキシヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、および/またはある特定のヌクレオチド類似体の重合を触媒するものの添加によって、ハイブリダイズしたプライマーの5'→3'伸長を触媒し得る任意のポリペプチドを指す。例えば、プライマー伸長反応の間に核酸鋳型にアニールするプライマーの3'末端へのデオキシリボヌクレオチドの逐次的付加であるが、それに限定されるわけではない。DNAポリメラーゼの非限定的な例には、逆転写酵素を含むがそれに限定されないRNA依存性DNAポリメラーゼ、およびDNA依存性DNAポリメラーゼが含まれる。公知のDNAポリメラーゼには、例えばピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）（Pfu）DNAポリメラーゼ（Lundberg et al., 1991, Gene, 108:1）、大腸菌（E. coli）DNAポリメラーゼI（Lecomte and Doubleday, 1983, Nucleic Acids Res. 11:7505）、T7 DNAポリメラーゼ（Nordstrom et al., 1981, J. Biol. Chem. 256:3112）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）（Tth）DNAポリメラーゼ（Myers and Gelfand 1991, Biochemistry 30:7661）、バシラス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）DNAポリメラーゼ（Stenesh and McGowan, 1977, Biochim Biophys Acta 475:32）、サーモコックス・リトラリス（Thermococcus litoralis）（Tli）DNAポリメラーゼ（Vent DNAポリメラーゼとも称される、Cariello et al., 1991, Nucleic Acids Res, 19:4193）、9°Nm DNAポリメラーゼ（New England Biolabs製の製造中止になった製品）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）（Tma）DNAポリメラーゼ（Diaz and Sabino, 1998 Braz J. Med. Res, 31:1239）、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）（Taq）DNAポリメラーゼ（Chien et al., 1976, J. Bacteoriol, 127:1550）、ピュロコックス・コダカラエンシス（Pyrococcus kodakaraensis）KOD DNAポリメラーゼ（Takagi et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:4504）、JDF-3 DNAポリメラーゼ（特許出願WO 0132887）、およびピュロコックス GB-D（PGB-D）DNAポリメラーゼ（Juncosa-Ginesta et al., 1994, Biotechniques, 16:820）が含まれる。上記の酵素のいずれのポリメラーゼ活性も、当技術分野において周知の手段によって判定することができる。本発明に従って、DNAポリメラーゼ活性の1単位は、最適温度（例えば、Pfu DNAポリメラーゼに対して72℃）にて30分間で、10nモルの全dNTPのポリマー形態への組み入れを触媒する酵素の量として定義される。ある特定のDNAポリメラーゼ（例えば、ある特定の真正細菌A型DNAポリメラーゼおよびTaq DNAポリメラーゼ、しかしながらそれらに限定されない）は、構造特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含み得ることが解されるべきである。本発明の実践に適した逆転写酵素も当技術分野において周知であり、かつ多数の供給源に由来し得る。そのような酵素には、M-MLV、HIV、ASLV、ならびにそれらの変種および変異体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６６】
本明細書において使用するとき、「増幅」、「核酸増幅」、または「増幅すること」という用語は、多コピーの核酸鋳型の産生、または核酸鋳型に相補的である多コピーの核酸配列の産生を指す。該用語（「重合すること」という用語を含めて）は、（例えば、重合によって）核酸鋳型を伸長させることを指してもよい。増幅反応は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などのポリメラーゼ介在性伸長反応であってよい。しかしながら、公知の増幅反応のうちのいずれかは、本明細書において記載される使用に適している可能性がある。典型的には標的核酸の「指数関数的」増大を指す「増幅すること」という用語は、本明細書において、核酸の選択標的配列の数の直線的および指数関数的な増大の両方を記載するために用いられてよい。
【００６７】
「増幅反応混合物」および/または「マスターミックス」という用語は、標的核酸を増幅するために用いられる種々の（いくつかのまたはすべての）試薬を含む水溶液を指してよい。そのような反応を、固体支持体（例えば、アレイ）を用いて実施してもよい。ユーザーの所望どおりに、反応を単一または多重形式で実施してもよい。これらの反応は、典型的に、酵素、水性緩衝液、塩、増幅プライマー、標的核酸、およびヌクレオシド三リン酸を含む。状況に応じて、混合物は、完全または不完全な増幅反応混合物であり得る。標的核酸を増幅するために用いられる方法は、当業者に利用可能な任意のものであってよい。核酸の標的配列のコピーを増加させるための任意のインビトロ手段を利用してよい。これらには、直線的、対数的、および/または他の任意の増幅法が含まれる。本開示は、概して、核酸増幅反応としてのPCRを論じ得る一方で、本明細書において記載される改変された界面活性剤が、ポリメラーゼ介在性増幅反応（ヘリカーゼ依存性増幅（HDA）、リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（RPA）、およびローリングサークル増幅（RCA）など）、およびリガーゼ介在性増幅反応（リガーゼ検出反応（LDR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、およびそれぞれのギャップ型など）の両方、ならびにLDRおよびPCRなどの核酸増幅反応の組み合わせ（例えば、米国特許第6,797,470号を参照されたい）を含めた、他のタイプの核酸増幅反応において有効であるよう期待される。例えば、改変された界面活性剤を、例えばライゲーションプローブをPCRプライマーに対立するものとして採用する、種々のライゲーション介在性反応に用いてよい。さらなる例示的な方法には、中でもとりわけ、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR；例えば、米国特許第4,683,202号；第4,683,195号；第4,965,188号；および/または第5,035,996号を参照されたい）、等温手順（1種または複数種のRNAポリメラーゼ（例えば、PCT公報第WO 2006/081222号を参照されたい）、鎖置換（例えば、米国特許第RE39007E号を参照されたい）、プライマー分子の部分的破壊（例えば、PCT公報第WO 2006/087574号を参照されたい）を用いた）、リガーゼ連鎖反応（LCR）（例えば、Wu, et al., Genomics 4:560-569 (1990)、および/またはBarany, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193 (1991)を参照されたい）、Qβ RNAレプリカーゼシステム（例えば、PCT公報第WO 1994/016108号を参照されたい）、RNA転写に基づくシステム（例えば、TAS、3SR）、ローリングサークル増幅（RCA）（例えば、米国特許第5,854,033号；米国特許出願公報第2004/265897号；Lizardi et al. Nat. Genet. 19:225-232 (1998)；および/またはBaner et al. Nucleic Acid Res., 26:5073-5078 (1998)を参照されたい）、および鎖置換増幅（SDA）（Little, et al. Clin. Chem. 45:777-784 (1999)）が含まれる。これらのシステムは、当業者に利用可能な他の多くのシステムとともに、本明細書において記載される使用のための標的核酸を重合しかつ/または増幅することにおける使用に適している可能性がある。
【００６８】
「増幅効率」は、コピー数を判定するために定量化され得る任意の産物を指してよい（例えば、該用語は、PCRアンプリコン、LCRライゲーション産物、および/または同様の産物を指してよい）。増幅効率および/または重合効率は、キャリブレーション希釈曲線および勾配計算の判定、Hellemans et al., Genome Biology 8:R19 (2007)に記載されているqBaseソフトウェアを用いた判定、Livak and Schmittgen, Methods 25:402 (2001)によって記載されているデルタ・デルタCq（ΔΔCq）計算を用いた判定、またはPfaffl, Nucl. Acids Res. 29:e45 (2001)によって記載されている方法によるものを含むがそれらに限定されない、当技術分野において公知の種々の方法によって判定され得、それらのすべては参照によりそれらの全体として本明細書に組み入れられる。
【００６９】
一般的に、PCRの熱サイクルは、高温での最初の変性工程、続いて鋳型変性、プライマーアニーリング、およびアニールしたプライマーのポリメラーゼによる伸長を可能にするように設計された温度サイクルの反復シリーズを含む。一般的に、サンプルを最初に約95℃の温度で約2〜10分間加熱して、二本鎖DNAサンプルを変性する。次いで、各サイクルの初めに、サンプルおよび用いられる機器のタイプに応じて、サンプルを約10〜60秒間変性する。変性後、約40℃〜約60℃のより低温で約20〜60秒間、プライマーを標的DNAにアニールさせる。ポリメラーゼによるプライマーの伸長は、しばしば、約60℃〜約72℃に及ぶ温度で行われる。伸長に用いられる時間の量は、アンプリコンのサイズおよび増幅に用いられる酵素のタイプに依存し、かつルーチン実験によって容易に決定される。加えて、アニーリング工程を伸長工程と組み合わせることができ、2工程サイクルをもたらす。熱サイクルは、PCRアッセイにおけるさらなる温度シフトを含んでもよい。アッセイに用いられるサイクルの数は、用いられるプライマー、存在しているサンプルDNAの量、および熱サイクル条件を含めた多くの因子に依存する。任意のアッセイに用いられるべきサイクルの数は、ルーチン実験を用いて当業者によって容易に決定され得る。すべての増幅産物の合成を確実にするために、任意で、最後の伸長工程を熱サイクルの完了後に付加してよい。
【００７０】
開示される組成物を用いたPCRを、「標準的」PCR機器、例えばApplied Biosystems 7900HT、7500、および7300の標準的PCRシステムで、あるいは「高速」PCR機器、例えばApplied Biosystems StepOne（商標）、StepOne Plus（商標）、7500および7900HT Fast Real-time PCR system、またはViiA（商標）7もしくはQuantStudio（商標）12K Flex Real-Time PCR systemで実施することができる。
【００７１】
いくつかの態様において、本明細書において開示される組成物および方法を用いたPCR増幅のための例示的な熱サイクル条件は、以下のとおりである。
UNG工程（任意）：50℃で2分間
活性化：95℃で2分間
変性：95〜97℃で15秒間
アニーリング/伸長：60〜62℃で1分間（×最大40サイクルまで）
【００７２】
いくつかの態様において、本明細書において開示される組成物および方法を用いたPCR増幅のための例示的な熱サイクル条件は、以下のとおりである。
UNG工程（任意）：50℃で2分間
活性化：95℃で2分間
変性：95〜97℃で15秒間
アニーリング：55〜60℃で15秒間
伸長：72℃で1分間（×最大40サイクルまで）
【００７３】
いくつかの態様において、本明細書において開示される組成物を高速PCR熱サイクルに用いる。一態様において、本明細書において開示される組成物および方法を用いたPCR増幅のための高速熱サイクル条件は、以下のとおりである。
UNG工程（任意）：50℃で2分間
活性化：95℃で2分間
変性：95〜97℃で1〜3秒間
伸長：60〜62℃で20〜30秒間（×最大40サイクルまで）
【００７４】
いくつかの態様において、高速PCR熱サイクルを実施する場合、約400nMのプライマー濃度が推奨される。
【００７５】
ある特定の態様において、増幅技術は、少なくとも1回の増幅のサイクル、例えば：二本鎖核酸を変性して成分鎖に分離する工程；プライマーを標的隣接配列にまたはアンプリコンのプライマー結合部位（または必要に応じていずれかの相補体）にハイブリダイズさせる工程；およびDNAポリメラーゼを用いて鋳型依存的様式でヌクレオチドの鎖を合成する工程を含むが、それらに限定されるわけではない。サイクルを繰り返しても繰り返さなくてもよい。ある特定の態様において、増幅のサイクルは、複数の増幅サイクル、例えば20サイクル、25サイクル、30サイクル、35サイクル、40サイクル、45サイクル、または45サイクルを上回るサイクル数の増幅を含むが、それらに限定されるわけではない。
【００７６】
いくつかの態様において、増幅する工程は、GeneAmp（登録商標）PCR System 9700、9600、2700、または2400 thermocycler、QuantStudio（商標）12K Flex Real-Time PCR System、Applied Biosystems（登録商標）ViiA（商標）7 Real-Time PCR System、Applied Biosystems （登録商標）7500 Fast Real-Time PCR System、7900HT Fast Real-Time PCR System（すべてLife Technologies Corp., Carlsbad, CAから入手可能）など、しかしながらそれらに限定されない機器を用いた熱サイクルを含む。ある特定の態様において、一本鎖アンプリコンは、例えば非対称PCRまたはA-PCR、しかしながらそれらに限定されない増幅反応で生成される。
【００７７】
熱サイクル反応を実施し得、かつ特定波長の光線を発し、二本鎖核酸と結び付いた核酸結合色素分子から発される蛍光シグナルの強度を読み取り、かつ各サイクル後の蛍光の強度を提示することによって核酸結合色素を含有する反応組成物の検出を実施し得る装置が開発されている。サーマルサイクラー、光線放出体、および蛍光シグナル検出器を含む装置は、例えば米国特許第5,928,907号；第6,015,674号；および第6,174,670号に記載されており、かつABI Prism（登録商標）7700 Sequence Detection System、GeneAmp（登録商標）PCR System 9700、9600、2700、または2400 thermocycler、Applied Biosystems（登録商標）ViiA（商標）7 Real-Time PCR System、Applied Biosystems（登録商標）7500 Fast Real-Time PCR System、7900HT Fast Real-Time PCR System（すべてLife Technologies Corp., Carlsbad, CAから入手可能）などを含むが、それらに限定されるわけではない。
【００７８】
いくつかの態様において、増幅は、限定されたサイクル数の増幅（例えば、2、3、4、または5サイクルの増幅、しかしながらそれらに限定されない）が起こるプレ増幅工程、次いで結果として生じたアンプリコンを大まかに希釈し、希釈されたアンプリコンの一部を後続の増幅工程におけるさらなる増幅のサイクルに供する工程を含むがそれらに限定されない2工程反応を含む（例えば、米国特許第6,605,451号および米国特許出願公報第2004/0175733号を参照されたい）。いくつかの態様において、プレ増幅工程、後続の増幅工程、またはその両方は、二重ホットスタート反応混合物を含む。
【００７９】
ある特定の態様において、増幅反応は、複数の異なるプライマーセットを用いて、複数の異なる標的核酸および/または複数の異なる増幅産物種が同時に増幅される、マルチプレックス増幅を含む。ある特定の態様において、複数のシングルプレックスまたは低プレックス（lower-plexy）反応（例えば、2プレックス、3プレックス、4プレックス、5プレックス、または6プレックス反応、しかしながらそれらに限定されない）を含めた、マルチプレックス増幅反応およびシングルプレックス増幅反応を並行して実施する。
【００８０】
核酸を重合しかつ/または増幅するための例示的な方法には、例えばポリメラーゼ介在性伸長反応が含まれる。例えば、ポリメラーゼ介在性伸長反応はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）であってよい。他の態様において、核酸増幅反応はマルチプレックス反応である。例えば、本明細書において記載される使用に適した、核酸を重合しかつ/または増幅しかつ検出するための例示的な方法は、TaqMan（登録商標）として市販されている（例えば、米国特許第4,889,818号；第5,079,352号；第5,210,015号；第5,436,134号；第5,487,972号；第5,658,751号；第5,210,015号；第5,487,972号；第5,538,848号；第5,618,711号；第5,677,152号；第5,723,591号；第5,773,258号；第5,789,224号；第5,801,155号；第5,804,375号；第5,876,930号；第5,994,056号；第6,030,787号；第6,084, 102号；第6,127,155号；第6,171,785号；第6,214,979号；第6,258,569号；第6,814,934号；第6,821,727号；第7,141,377号；および/または第7,445,900号を参照されたく、それらのすべては参照によりそれらの全体として本明細書によって本明細書に組み入れられる）。TaqMan（登録商標）アッセイは、典型的に、5'→3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得るプライマー、および該プライマーに対して3'に標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブを用いて、標的ポリヌクレオチドに対して核酸増幅を実施することによって行われる。オリゴヌクレオチドプローブは、典型的に、検出可能な標識（例えば、蛍光レポーター分子）および該レポーター分子の蛍光を消光し得る消光分子を含む。典型的に、検出可能な標識および消光分子は、単一プローブの一部である。増幅が進行するにつれて、ポリメラーゼはプローブを消化して、検出可能な標識を消光分子から分離させる。反応の間、検出可能な標識（例えば、蛍光）をモニターし、標識の検出は核酸増幅の発生に相当する（例えば、シグナルが高ければ高いほど、増幅の量がより多い）。TaqMan（登録商標）アッセイの変化形（例えば、LNA（商標）spiked TaqMan（登録商標）アッセイ）は当技術分野において公知であり、かつ本明細書において記載される方法における使用に適しているであろう。
【００８１】
本明細書において記載される使用に適した別の例示的なシステムは、置換ハイブリダイゼーション法において二本鎖プローブを利用する（例えば、Morrison et al. Anal. Biochem., 18:231-244 (1989)；および/またはLi, et al. Nucleic Acids Res., 30(2,e5) (2002)を参照されたい）。そのような方法において、プローブは、典型的に、一方が検出可能な標識を含みかつ他方が消光分子を含む、異なる長さの2種の相補的オリゴヌクレオチドを含む。標的核酸に結合していない場合、消光体は、検出可能な標識からのシグナルを抑制する。プローブは、標的核酸と置換ハイブリダイゼーションすると検出可能になる。それぞれが異なる検出可能な標識を含有する複数のプローブを用いてよく、それによって複数の標的核酸を単一反応で照会し得る。
【００８２】
本明細書において記載される使用に適した標的核酸を重合しかつ/または増幅しかつ検出するためのさらなる例示的な方法は、一本鎖ヘアピンの形状をしたオリゴヌクレオチドプローブである「分子ビーコン」を伴う。標的配列の存在下において、プローブは開き、結合し、かつシグナル（例えば、蛍光）を発する。分子ビーコンは、典型的に、少なくとも4種の成分：1）標的配列に相補的である18〜30個のヌクレオチド領域である「ループ」；2）ループのいずれかの末端に見られ、かつ互いに相補的である2本の5〜7個のヌクレオチド「ステム」；3）5'末端における検出可能な標識；および4）プローブが閉じたループ形状にある（例えば、標的核酸に結合していない）場合、検出可能な標識がシグナル（single）を発するのを防ぐ3'末端における消光部分、を含む。ゆえに、相補的標的の存在下において、ビーコンの「ステム」部分は分離し、標的にハイブリダイズするプローブをもたらす。他のタイプの分子ビーコンも公知であり、かつ本明細書において記載される方法における使用に適している可能性がある。分子ビーコンは、様々なアッセイシステムに用いられ得る。1つのそのようなシステムは、温度サイクルなしで二本鎖DNAまでRNAを重合しかつ/または増幅するための単一工程の等温過程である、核酸配列に基づく増幅（NASBA（登録商標））である。NASBA反応は、典型的に、トリ骨髄芽球症ウイルス（AMV）、逆転写酵素（RT）、T7 RNAポリメラーゼ、RNase H、および2種のオリゴヌクレオチドプライマーを必要とする。増幅後、増幅された標的核酸は、分子ビーコンを用いて検出され得る。分子ビーコンに関する他の使用は当技術分野において公知であり、かつ本明細書において記載される方法における使用に適しているであろう。
【００８３】
Scorpions（商標）システムは、本明細書において記載される方法における使用に用いられ得る別の例示的なアッセイ形式である。Scorpions（商標）プライマーは、プライマーが、検出可能な標識（例えば、蛍光）および検出可能な標識の蛍光を消光する検出不能な消光分子とともにプローブに共有結合で連結されている、二機能性分子である。標的核酸の存在下において、検出可能な標識および消光体は分離し、検出可能な標識から発されるシグナルの増大につながる。典型的に、増幅反応に用いられるプライマーは、ヘアピンループの開始地点における「PCR遮断因子」エレメント（例えば、ヘキサエチレングリコール（HEG）モノマー（Whitcombe, et al. Nat. Biotech. 17:804-807 (1999)））とともに、5'末端にプローブエレメントを含む。プローブは、典型的に、一方の末端に検出可能な標識および他方に消光体を有する、自己相補的なステム配列を含む。最初の増幅サイクル（例えば、PCR）において、プライマーは標的にハイブリダイズし、ポリメラーゼの作用により伸長が起こる。Scorpions（商標）システムを用いて、プローブを区別するために差異的にタグ付けされ得る複数のプローブを用いることによって、点変異を検討しかつ同定し得る。例としてPCRを用いると、1回の伸長サイクルが完了した後、新しく合成された標的領域はプローブと同じ鎖に接着する。変性およびアニーリングの第二のサイクル後、プローブと標的とがハイブリダイズする。次いで、ヘアピン配列は、新しく産生されたPCR産物の一部にハイブリダイズする。これは、検出可能な標識の消光体からの分離をもたらし、かつシグナルの放出を引き起こす。そのような標識プローブに関する他の使用は当技術分野において公知であり、かつ本明細書において記載される方法における使用に適しているであろう。
【００８４】
いくつかの態様において、方法をシークエンシング反応の前にまたはそれと連動して実施する。「シークエンシング」という用語は、本明細書において広い意味で用いられ、かつ例えば標的核酸またはアンプリコン、しかしながらそれらに限定されないポリヌクレオチドの少なくとも一部における少なくともいくつかの連続ヌクレオチドの順序が同定されるのを可能にする、当技術分野において公知の任意の技術を指す。シークエンシング技術のいくつかの非限定的な例には、それらの方法の変化形を含めた、Sangerのジデオキシターミネーター法、ならびにMaxamおよびGilbertの化学的切断法；ハイブリダイゼーションによるシークエンシング；合成によるシークエンシング；ならびに制限酵素マッピングが含まれる。いくつかのシークエンシング法には、キャピラリー電気泳動およびゲル電気泳動を含めた電気泳動；マイクロアレイハイブリダイゼーションを含めた、ハイブリダイゼーションによるシークエンシング；質量分析；単一分子検出；ならびにイオン/プロトン検出が含まれる。いくつかの態様において、シークエンシングには、直接シークエンシング、二重鎖シークエンシング、サイクルシークエンシング、一塩基伸長シークエンシング（SBE）、固相シークエンシング、またはそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、シークエンシングは、例えばABI Prism（登録商標）377 DNA Sequencer、ABI Prism（登録商標）310、3100、3100-Avant、3730、もしくは3730xl Genetic Analyzer、ABI Prism（登録商標）3700 DNA Analyzer、Ion PGM（商標）sequencer、またはIon Proton（商標）sequencer（すべてLife Technologies Corp., Carlsbad, CAから入手可能）、あるいは質量分析計、しかしながらそれらに限定されない機器を用いて、シークエンシング産物を検出する工程を含む。いくつかの態様において、シークエンシングは、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、dITP、またはそれらの組み合わせを含めた、かつdNTPのジデオキシリボヌクレオチド類似体を含めたdNTPを増幅産物に組み入れる工程を含む。
【００８５】
開示される核酸増幅反応に採用され得る核酸ポリメラーゼは、例えば原核生物、真菌、ウイルス、バクテリオファージ、植物、および/または真核生物の核酸ポリメラーゼを含めた、所望の反応を行う機能を果たす任意のものであってよい。本明細書において使用するとき、「DNAポリメラーゼ」という用語は、核酸鎖を鋳型として用いて、新たに（de novo）DNA鎖を合成する酵素を指す。DNAポリメラーゼは、DNA合成のための鋳型として既存のDNAまたはRNAを用い、かつそれが読み取る鋳型鎖に沿ってデオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。新しく合成されたDNA鎖は、鋳型鎖に相補的である。DNAポリメラーゼは、新しく形成されている鎖の3'ヒドロキシル末端にのみ遊離ヌクレオチドを付加することができる。それは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（dNTP）から、成長しているオリゴヌクレオチド鎖の3'ヒドロキシル基への、ヌクレオシド一リン酸の転移を介してオリゴヌクレオチドを合成する。これは、5'→3'方向に新しい鎖の延長をもたらす。DNAポリメラーゼは、前から存在する3'-OH基にのみヌクレオチドを付加して、DNA合成反応を始めることができるため、DNAポリメラーゼは、それが第一のヌクレオチドを付加し得るプライマーを必要とする。適切なプライマーには、RNAもしくはDNAのオリゴヌクレオチド、またはそれらのキメラ（例えば、RNA/DNAキメラプライマー）が含まれてよい。DNAポリメラーゼは、天然に存在するDNAポリメラーゼ、または上記で言及した活性を有する天然酵素の変種であってよい。例えば、それには、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠いているDNAポリメラーゼ、逆転写酵素活性を有するDNAポリメラーゼ、またはエンドヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼが含まれてよい。
【００８６】
適切な核酸ポリメラーゼには、ホロ酵素、ホロ酵素の機能的部分、キメラポリメラーゼ、または核酸分子の合成をもたらし得る任意の改変されたポリメラーゼが含まれてもよい。本開示内において、DNAポリメラーゼには、ポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼ、および/またはポリヌクレオチドホスホリラーゼが含まれてもよい。ポリメラーゼの非限定的な例には、例えばT7 DNAポリメラーゼ、真核生物ミトコンドリアDNAポリメラーゼγ、原核生物DNAポリメラーゼI、II、III、IV、および/もしくはV；真核生物ポリメラーゼα、β、γ、δ、ε、η、ζ、ι、および/もしくはκ；大腸菌DNAポリメラーゼI；大腸菌DNAポリメラーゼIIIαおよび/もしくはεサブユニット；大腸菌ポリメラーゼIV、大腸菌ポリメラーゼV；T.アクアティクスDNAポリメラーゼI；B.ステアロサーモフィルスDNAポリメラーゼI；ユリアーキオータ（Euryarchaeota）ポリメラーゼ；ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）；S.セレビシエ（S. cerevisiae）ポリメラーゼ4；損傷乗り越え（translesion）合成ポリメラーゼ；逆転写酵素；ならびに/またはテロメラーゼが含まれてよい。用いられ得る適切な熱安定性DNAポリメラーゼの非限定的な例には、Taq、Tfl、Tfi、Pfu、およびVent（商標）DNAポリメラーゼ、任意の遺伝子操作されたDNAポリメラーゼ、低下したもしくはわずかな3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有する任意のもの（例えば、Superscript（商標）DNAポリメラーゼ）、および/または遺伝子操作されたDNAポリメラーゼ（例えば、（例えば、Tthにおける）活性部位変異F667YまたはF667Yの同等物を有するもの、AmpliTaq（登録商標）FS、ThermoSequenase（商標））、AmpliTaq（登録商標）Gold、Platinum（登録商標）Taq DNAポリメラーゼ、Therminator I、Therminator II、Therminator III、Therminatorγ（すべてNew England Biolabs, Beverly, MAから入手可能）、ならびに/あるいはそれらの任意の誘導体およびフラグメントが含まれる。当業者によって理解されるであろうように、他の核酸ポリメラーゼも適している可能性がある。
【００８７】
別の局面において、本開示は、関心対象の核酸配列（例えば、標的配列）を重合しかつ/または増幅するための反応混合物を提供する。いくつかの態様において、反応混合物は、検出可能な標識をさらに含んでよい。方法は、検出可能な標識を検出して、増幅された核酸を定量化するための1つまたは複数の工程を含んでもよい。本明細書において使用するとき、「検出可能な標識」という用語は、増幅の指標となる様々なシグナル分子のいずれかを指す。例えば、SYBR（登録商標）Greenおよび他のDNA結合色素は、検出可能な標識である。そのような検出可能な標識は、例えば核酸インターカレート剤または非インターカレート剤を含んでよいまたはそれらであってよい。本明細書において使用するとき、インターカレート剤とは、二本鎖核酸分子の積層された塩基対間に非共有結合的に挿入可能な作用物質または部分である。非インターカレート剤とは、二本鎖核酸分子内に挿入されないものである。核酸結合剤は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に産生し得る。シグナルは、例えば蛍光および/もしくは吸光度を用いて直接的に、または例えば核酸結合剤に接着した置換された標識部分もしくは結合リガンドなど、適切な二本鎖核酸への近接によって検出上影響を受ける任意の部分もしくはリガンドを用いて間接的に検出可能であり得る。典型的に、核酸結合剤は、二本鎖核酸に結合している場合に、その同じ剤が溶液の状態にあるまたは一本鎖核酸に結合している場合に産生されるシグナルと区別できる検出可能なシグナルを産生する必要がある。例えば、エチジウムブロマイドなどのインターカレート剤は、一本鎖DNA、RNAに結合しているまたは溶液の状態にある場合よりも、二本鎖DNA内に入り込んだ場合により強く蛍光を発する（例えば、米国特許第5,994,056号；第6,171,785号；および/または第6,814,934号を参照されたい）。同様に、アクチノマイシンDは、一本鎖核酸に結合している場合にはUV/VISスペクトルの赤色部分で蛍光を発し、かつ二本鎖核酸に結合している場合にはUV/VISスペクトルの緑色部分で蛍光を発する。また別の例では、光反応性ソラレンの4-アミノメチル-4-5',8-トリメチルソラレン（AMT）は、二本鎖DNA内に入り込むと、長波長で減少した吸収および減少した蛍光を呈することが報告されている（Johnson et al. Photochem. & Photobiol., 33:785-791 (1981)）。例えば、米国特許第4,257,774号は、蛍光インターカレーターのDNAへの直接結合を記載している（例えば、エチジウム塩、ダウノマイシン、メパクリン、およびアクリジンオレンジ、4',6-ジアミジノ-α-フェニルインドール）。非インターカレート剤（例えば、Hoechst 33258、ジスタマイシン、ネトロプシンなど、本明細書において記載される副溝結合因子）も使用に適している可能性がある。例えば、Hoechst 33258（Searle, et al. Nucl. Acids Res. 18(13):3753-3762 (1990)）は、増大する標的の量とともに蛍光の変更を呈する。副溝結合因子は、本明細書における他の箇所により詳細に記載されている。
【００８８】
他のDNA結合色素が当業者に利用可能であり、かつ単独でまたはアッセイシステムの他の作用物質および/もしくは成分と組み合わせて用いられ得る。例示的なDNA結合色素には、中でもとりわけ、例えばアクリジン（例えば、アクリジンオレンジ、アクリフラビン）、アクチノマイシンD（Jain, et al. J. Mol. Biol. 68:21 (1972)）、アントラマイシン、BOBO（商標）-1、BOBO（商標）-3、BO-PRO（商標）-1、クロモマイシン（cbromomycin）、DAPI（Kapuseinski, et al. Nucl. Acids Res. 6(112):3519 (1979)）、ダウノマイシン、ジスタマイシン（例えば、ジスタマイシンD）、米国特許第7,387,887号に記載されている色素、エリプチシン、エチジウム塩（例えば、エチジウムブロマイド）、フルオロクマリン（fluorcoumanin）、米国特許第4,257,774号に記載されている蛍光インターカレーター、GelStar（登録商標）（Cambrex Bio Science Rockland Inc., Rockland, Me.）、Hoechst 33258（Searle and Embrey, Nucl. Acids Res. 18:3753-3762 (1990)）、Hoechst 33342、ホミジウム、JO-PRO（商標）-1、LIZ色素、LO-PRO（商標）-1、メパクリン、ミトラマイシン、NED色素、ネトロプシン、4',6-ジアミジノ-α-フェニルインドール、プロフラビン、POPO（商標）-1、POPO（商標）-3、PO-PRO（商標）-1、ヨウ化プロピジウム、ルテニウム・ポリピリジル、S5、SYBR（登録商標）Gold、SYBR（登録商標）Green I（米国特許第5,436,134号および第5,658,751号）、SYBR（登録商標）Green II、SYTOX（登録商標）blue、SYTOX（登録商標）green、SYTO（登録商標）43、SYTO（登録商標）44、SYTO（登録商標）45、SYTOX（登録商標）Blue、TO-PRO（登録商標）-1、SYTO（登録商標）11、SYTO（登録商標）13、SYTO（登録商標）15、SYTO（登録商標）16、SYTO（登録商標）20、SYTO（登録商標）23、チアゾールオレンジ（Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis.）、TOTO（商標）-3、YO-PRO（登録商標）-1、およびYOYO（登録商標）-3（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR）が含まれてよい。SYBR（登録商標）Green I（例えば、米国特許第5,436,134号；第5,658,751号；および/または第6,569,927号を参照されたい）は、例えば、PCR反応をモニターするために用いられている。当業者によって理解されるであろうように、他のDNA結合色素も適している可能性がある。
【００８９】
本明細書において記載される使用のために、1種または複数種の検出可能な標識および/または消光剤を、1種または複数種のプライマーおよび/またはプローブに接着させてよい（例えば、検出可能な標識）。検出可能な標識は、遊離している場合または標的核酸の1つに結合している場合にシグナルを発し得る。検出可能な標識は、別の検出可能な標識に近接している場合にもシグナルを発し得る。検出可能な標識を消光分子とともに用いてもよく、それによって消光分子に十分に極めて近接していない場合にのみシグナルが検出可能となる。例えば、いくつかの態様において、アッセイシステムは、検出可能な標識を消光分子から解放させ得る。いくつかの検出可能な標識のいずれかを用いて、本明細書において記載される方法に用いられるプライマーおよびプローブを標識してよい。上記で言及されるように、いくつかの態様において、プライマー内に組み入れられ得るまたは増幅された標的核酸に別様に結合し得る、検出可能な標識をプローブに接着させてよい（例えば、インターカレート色素または非インターカレート色素などの検出可能な核酸結合剤）。1種を上回る種類の検出可能な標識を用いる場合、それぞれは、標識が互いに区別され得るように、または検出可能な標識が一緒になって、いずれか検出可能な標識単独によって発されないシグナルを発するように、それらのスペクトル特性が異なるべきである。例示的な検出可能な標識には、当業者に公知であろうものの中でもとりわけ、例えば蛍光色素またはフルオロフォア（fluorphore）（例えば、光によって励起されて蛍光またはリン光を発し得る化学基）、蛍光供与体色素からの蛍光シグナルを消光し得る「受容体色素」等が含まれる。適切な検出可能な標識には、例えばフルオレセイン（fluoroscein）（例えば、5-カルボキシ-2,7-ジクロロフルオレセイン；5-カルボキシフルオレセイン（5-FAM）；5-ヒドロキシトリプタミン（5-HAT）；6-JOE；6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM）；FITC；6-カルボキシ-1,4-ジクロロ-2',7'-ジクロロフルオレセイン（TET）；6-カルボキシ-1,4-ジクロロ-2',4',5',7'-テトラクロロフルオレセイン（HEX）；6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン（JOE））；Alexa fluor（登録商標）フルオロフォア（例えば、350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750）；BODIPY（登録商標）フルオロフォア（例えば、492/515、493/503、500/510、505/515、530/550、542/563、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650-X、650/665-X、665/676、FL、FL ATP、FI-セラミド、R6G SE、TMR、TMR-X抱合体、TMR-X、SE、TR、TR ATP、TR-X SE）、クマリン（例えば、7-アミノ-4-メチルクマリン、AMC、AMCA、AMCA-S、AMCA-X、ABQ、CPMメチルクマリン、クマリンファロイジン、ヒドロキシクマリン、CMFDA、メトキシクマリン）、カルセイン、カルセインAM、カルセインブルー、カルシウム色素（例えば、カルシウムクリムゾン、カルシウムグリーン、カルシウムオレンジ、カルコフロールホワイト）、カスケードブルー、カスケードイエロー；Cy（商標）色素（例えば、3、3.18、3.5、5、5.18、5.5、7）、シアンGFP、サイクリックAMPフルオロセンサー（FiCRhR）、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（例えば、GFP、EGFP）、青色蛍光タンパク質（例えば、BFP、EBFP、EBFP2、アズライト、mKalama 1）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ECFP、セルリアン、CyPet）、黄色蛍光タンパク質（例えば、YFP、シトリン、Venus、YPet）、FRET供与体/受容体ペア（例えば、フルオレセイン/テトラメチルローダミン、IAEDANS/フルオレセイン、EDANS/ダブシル（dabcyl）、フルオレセイン/フルオレセイン、BODIPY（登録商標）FL/BODIPY（登録商標）FL、フルオレセイン/QSY7およびQSY9）、LysoTracker（登録商標）およびLysoSensor（商標）（例えば、LysoTracker（登録商標）Blue DND-22、LysoTracker（登録商標）Blue-White DPX、LysoTracker（登録商標）Yellow HCK-123、LysoTracker（登録商標）Green DND-26、LysoTracker（登録商標）Red DND-99、LysoSensor（商標）Blue DND-167、LysoSensor（商標）Green DND-189、LysoSensor（商標）Green DND-153、LysoSensor（商標）Yellow/Blue DND-160、LysoSensor（商標）Yellow/Blue 10,000 MWデキストラン）、Oregon Green（例えば、488、488-X、500、514）；ローダミン（例えば、110、123、B、B 200、BB、BG、B extra、5-カルボキシテトラメチルローダミン（5-TAMRA）、5 GLD、6-カルボキシローダミン6G、リサミン、リサミンローダミンB、ファリシジン、ファロイジン、レッド、Rhod-2、ROX（6-カルボキシ-X-ローダミン）、5-ROX（カルボキシ-X-ローダミン）、スルホローダミンB can C、スルホローダミンG Extra、TAMRA（6-カルボキシテトラメチルローダミン）、テトラメチルローダミン（TRITC）、WT）、Texas Red、Texas Red-X、VIC、ならびに例えば米国特許出願公報第2009/0197254号（参照によりその全体として本明細書に組み入れられる）に記載されている他の標識が含まれてよい。当業者に公知であろうように、他の検出可能な標識を用いてもよい（例えば、米国特許出願公報第2009/0197254号（参照によりその全体として本明細書に組み入れられる）を参照されたい）。これらのシステムおよび検出可能な標識、ならびに他の多くのもののいずれかを用いて、増幅された標的核酸を検出し得る。
【００９０】
いくつかの検出可能な標識は、配列に基づくもの（本明細書において「遺伝子座特異的検出可能な標識」とも称される）、例えば5'ヌクレアーゼプローブであってよい。そのようなプローブは、1種または複数種の検出可能な標識を含んでよい。種々の検出可能な標識、例えば（本明細書において記載されるTaqMan（登録商標）プローブ（米国特許第5,538,848号（参照によりその全体として本明細書に組み入れられる）も参照されたい）種々のステム−ループ分子ビーコン（例えば、米国特許第6,103,476号および第5,925,517号、ならびにTyagi and Kramer, Nature Biotechnology 14:303-308 (1996)を参照されたい）、ステムのないまたは直鎖状のビーコン（例えば、PCT公報第WO 99/21881号；米国特許第6,485,901号）、PNA Molecular Beacons（商標）（米国特許第6,355,421号および第6,593,091号を参照されたい）、直鎖状PNAビーコン（例えば、Kubista et al., SPIE 4264:53-58 (2001)を参照されたい）、非FRETプローブ（例えば、米国特許第6,150,097号を参照されたい）、Sunrise（登録商標）/Amplifluor（登録商標）プローブ（米国特許第6,548,250号）、ステム−ループかつ二重鎖のScorpions（商標）プローブ（Solinas et al., Nucleic Acids Research 29:E96 (2001)および米国特許第6,589,743号）、バルジループプローブ（米国特許第6,590,091号）、疑似ノットプローブ（米国特許第6,589,250号）、サイクリコン（cyclicon）（米国特許第6,383,752号）、MGB Eclipse（商標）プローブ（Epoch Biosciences）、ヘアピンプローブ（米国特許第6,596,490号）、ペプチド核酸（PNA）発光プローブ（Svanvik, et al. Anal Biochem 281:26-35 (2001)）、自己会合ナノ粒子プローブ、例えば米国特許第6,485,901号；Mhlanga et al., Methods 25:463-471 (2001)；Whitcombe et al., Nature Biotechnology. 17:804-807 (1999)；Isacsson et al., Molecular Cell Probes. 14:321-328 (2000)；Svanvik et al., Anal Biochem. 281:26-35 (2000)；Wolffs et al., Biotechniques 766:769-771 (2001)；Tsourkas et al., Nucleic Acids Research. 30:4208-4215 (2002)；Riccelli et al., Nucleic Acids Research 30:4088-4093 (2002)；Zhang et al., Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 34:329-332 (2002)；Maxwell et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9606-9612 (2002)；Broude et al., Trends Biotechnol. 20:249-56 (2002)；Huang et al., Chem Res. Toxicol. 15:118-126 (2002)；およびYu et al., J. Am. Chem. Soc. 14:11155-11161 (2001)に記載されているフェロセン修飾プローブ；QuantiProbes（登録商標）（www.qiagen.com）、HyBeacons（登録商標）（French, et al. Mol. Cell. Probes 15:363-374 (2001)）、置換プローブ（Li, et al. Nucl. Acids Res. 30:e5 (2002)）、HybProbes（Cardullo, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8790-8794 (1988)）、MGB Alert（www.nanogen.com）、Q-PNA（Fiandaca, et al. Genome Res. 11:609-611 (2001)）、Plexor（登録商標）（www.Promega.com）、LUX（商標）プライマー（Nazarenko, et al. Nucleic Acids Res. 30:e37 (2002)）、DzyNAプライマー（Todd, et al. Clin. Chem. 46:625-630 (2000)）が当技術分野において公知である。検出可能な標識は、例えばblack hole quencher（Biosearch）、Iowa Black（登録商標）消光体（IDT）、QSY消光体（Molecular Probes）、ならびにダブシル（Dabsyl）およびダブシル（Dabcyl）のスルホネート/カルボキシレート消光体（Epoch）を含めた（inlcuding）、検出可能な標識の蛍光を消光する検出不能な消光部分を含んでもよい。検出可能な標識は、例えばフルオロフォアが一方のプローブ上にありかつ消光体が他方の上にある、標的上に一緒にある2種のプローブのハイブリダイゼーションによりシグナルが消光する、または標的上でのハイブリダイゼーションにより蛍光の変化を介してシグナル特徴が変更する、2種のプローブを含んでもよい。例示的なシステムには、FRET、サリチレート/DTPAリガンドシステム（例えば、Oser et al. Angew. Chem. Int. Engl. 29(10):1167 (1990)を参照されたい）、置換ハイブリダイゼーション、相同プローブ、ならびに/または欧州特許EP 070685および/もしくは米国特許第6,238,927号に記載されているアッセイが含まれてもよい。検出可能な標識には、カルボキシレート基の代わりにSO3を有する、フルオレセイン色素のスルホネート誘導体、フルオレセインのホスホロアミダイト形態、Cy5のホスホロアミダイト形態（例えば、Amershamから入手可能）が含まれてもよい。上記で引用されるすべての参考文献は、参照によりそれらの全体として本明細書によって本明細書に組み入れられる。
【００９１】
本明細書において記載される組成物および方法は、試験サンプル由来の様々な標的核酸を検出しかつ/または定量化するのに有用であり得る。標的核酸は任意の核酸であり、それに対してアッセイシステムを設計して、存在している（または存在していない）ものとして同定するもしくは検出し、かつ/または試験サンプルにおいて定量化する。そのような核酸には、例えば感染性物質（例えば、ウイルス、細菌、寄生生物等）のもの、癌、糖尿病等の疾患過程のもの、または免疫応答を測定するためのものが含まれてよい。例示的な「試験サンプル」には、生物学的サンプルなどの種々のタイプのサンプルが含まれる。例示的な生物学的サンプルには、例えば体液（例えば、血液、唾液、髄液）、組織サンプル、食物（例えば、肉）、または飲料（例えば、ミルク）製品等が含まれる。発現される核酸には、例えばその発現（またはその不足）が感染性疾患（例えば、細菌性、ウイルス性、真菌性、原虫性の感染症）または癌などの医学的状態と関連している遺伝子が含まれてよい。本明細書において記載される方法を用いて、薬学的製品、食物製品、または飲料製品における混入物（例えば、細菌、ウイルス、真菌、および/または原生動物）を検出してもよい。本明細書において記載される方法を用いて、野生型対立遺伝子の存在下における希少対立遺伝子を検出してもよい（例えば、106〜109個の野生型対立遺伝子の存在下において1個の変異体対立遺伝子）。方法は、例えば、微小残存疾患（例えば、寛解期の希少残存癌細胞、とりわけp53遺伝子または腫瘍内で以前に同定された他の腫瘍抑制遺伝子における変異）を検出するのに、かつ/または突然変異荷重（例えば、血液または尿などの正常組織に存在している特異的体細胞変異の頻度）を測定するのに有用である。
【００９２】
本明細書において記載される方法を実施するためのキットも提供する。本明細書において使用するとき、「キット」という用語は、関連成分、典型的には1種または複数種の化合物または組成物のパッケージ化されたセットを指す。キットは、サンプル由来の少なくとも1種の標的核酸を重合しかつ/もしくは増幅するためのオリゴヌクレオチドのペア、1種もしくは複数種の界面活性剤、核酸ポリメラーゼ、二重ホットスタート反応混合物、および/または検出可能な標識で標識された対応する1種もしくは複数種のプローブを含んでよい。キットは、対照反応において用いられるべき所定の標的核酸を含有するサンプルを含んでもよい。キットは、任意で、増幅反応を完了するために用いられ得る、ストック溶液、緩衝液、酵素、検出可能な標識、または検出に必要とされる試薬、チューブ、メンブレン等を含んでもよい。いくつかの態様において、複数のプライマーセットが含まれる。一態様において、キットは、例えば緩衝液（例えば、トリス）、1種もしくは複数種の塩（例えば、KCl）、グリセロール、dNTP（dA、dT、dG、dC、dU）、組換えBSA（ウシ血清アルブミン）、色素（例えば、ROXパッシブ参照色素）、1種もしくは複数種の界面活性剤、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルピロリドン（PVP）、および/またはゼラチン（例えば、魚またはウシ供給源）のうちの1つまたは複数を含んでよい。当業者によって理解されるであろう、特定のシステムおよびキットの他の態様も企図される。
【実施例】
【００９３】
異なるホットスタート機構を有する市販のマスターミックスを組み合わせかつ試験して、二重ホットスタート反応混合物の有効性を実証した。実験の設定を表1に概説する。
【００９４】
【表１】
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【００９５】
すべての反応を10μlの最終容量で2ng Universal Human Reference（UHR）（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）cDNAおよび200nMプライマー（試験した24個の標的）を用いて実施した。各反応に対して、4回の再現を実施した。室温での0時間または24時間（それぞれ、T0およびT24）のインキュベーション後、ViiA（商標）7 Real-Time PCR System（Life Technologies Corp., Carlsbad, CA）で増幅を実施した。室温でのインキュベーション後、メーカーの指示書に従って増幅を行った。簡潔には、熱サイクル条件を以下のとおりに設定した。
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【００９６】
いくつかの場合において、Power SYBR（登録商標）Green qPCR SuperMixまたはFast SYBR（登録商標）Green Master Mixを、Platinum（登録商標）Taq Antibodyとともに一晩（16〜20時間）インキュベートした。試験したすべての成分は市販されており、Life Technologies Corporationから購入された。
【００９７】
図1A〜1Dにおいて、単一または二重ホットスタート反応混合物のいずれかを用いて、24種のプライマーセットで標的核酸を増幅した。単一ホットスタート反応混合物は、Fast SYBR（登録商標）Green Master Mixを単独で（「正方形」の線）またはPlatinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR SuperMixを単独で（「十字」の線）用いた。二重ホットスタート反応混合物は、Fast SYBR（登録商標）Green Master MixおよびPlatinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR SuperMix（「三角形」の線）の1:1の組み合わせを用いた。3種すべての反応セットを、増幅前に、室温で0時間（「T0」）または24時間（「T24」）インキュベートした。アッセイの多くにおいて、2種の異なるホットスタート機構の組み合わせは、非特異的産物の形成の減少をもたらした（図1A（T0、cDNA）、1B（T0、非特異的産物（「NTC」））、1C（T24、cDNA）、および1D（T24、NTC））を参照されたい）。
【００９８】
図2A〜2Dにおいて、個々のアンプリコンを選択し、かつ融解曲線解析によって解析した。図2Aは、二重ホットスタート反応混合物が、室温で0時間後に、単一ホットスタート反応混合物（Fast SYBR（登録商標）Green Master Mix）と比較した場合には非特異的産物の形成の4倍の低下、および他方の単一ホットスタート反応混合物（Platinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR SuperMix）と比較した場合には2倍の低下を与えることを実証している。図2Bは、二重ホットスタート反応混合物が、室温で24時間のプレインキュベーション後に、単一ホットスタート反応混合物のそれぞれと比較した場合に非特異的産物の形成の2倍の低下を与えることを実証している。図2Cおよび2Dは、二重ホットスタート反応混合物が、室温で0時間のプレインキュベーションにおいて非特異的産物の少なくとも50％の低下（図2C）、および室温で24時間のプレインキュベーション後に非特異的産物の100％の低下（図2D）を与えることを示している。図2Eは、非特異的産物形成の低下に対する単一および二重ホットスタート反応混合物の効果について、増幅反応のCt平均値およびΔCt解析を比較している。図2Fは、単一および二重ホットスタート反応混合物についての融解曲線解析の比較を示しており、（NTCのΔRnシグナルの低下によって示されるように）二重ホットスタート反応混合物が、室温で0時間および24時間のプレインキュベーションの両方において、非特異的産物の形成を有意に低下させることを実証している。
【００９９】
図3A〜3Dにおいて、単一または二重ホットスタート反応混合物のいずれかを用いて、24種のプライマーセットで標的核酸を増幅した。単一ホットスタート反応混合物は、Fast SYBR（登録商標）Green Master Mixを単独で（「ひし形」の線）またはPlatinum（登録商標）Taq Antibodyと組み合わせて（「十字」の線）用いた。両方の反応セットを、増幅前に、室温で0時間（「T0」）または24時間（「T24」）インキュベートした。アッセイの多くにおいて、2種の異なるホットスタート機構の組み合わせは、非特異的産物の形成の減少をもたらした（図3A（T0、cDNA）、3B（T0、非特異的産物（「NTC」））、3C（T24、cDNA）、および3D（T24、NTC））を参照されたい）。
【０１００】
図4A〜4Dにおいて、個々のアンプリコンを選択し、かつ融解曲線解析によって解析した。図4Aは、Fast SYBR（登録商標）Green Master Mix単一ホットスタート反応混合物が、とりわけ室温で24時間のプレインキュベーション後に、非特異的産物を産生することを実証している。図4Bは、二重ホットスタート反応混合物が、T0において非特異的産物形成の75％の低下、およびT24において非特異的産物形成の100％の低下をもたらすことを実証している。図4Cは、二重ホットスタート反応混合物が、T0およびT24の両方において非特異的産物の形成を低下させること、ならびに二重ホットスタート反応混合物が、（用いた閾値に応じて）非特異的産物の形成を20〜25％低下させることを実証している。
【０１０１】
図5A〜5Dにおいて、単一または二重ホットスタート反応混合物のいずれかを用いて、24種のプライマーセットで標的核酸を増幅した。単一ホットスタート反応混合物は、Power SYBR（登録商標）Green PCR Master Mixを単独で（「ひし形」の線）またはPlatinum（登録商標）Taq Antibodyと組み合わせて（「十字」の線）用いた。両方の反応セットを、増幅前に、室温で0時間（「T0」）または24時間（「T24」）インキュベートした。アッセイの多くにおいて、2種の異なるホットスタート機構の組み合わせは、非特異的産物の形成の減少をもたらした（図5A（T0、cDNA）、5B（T0、非特異的産物（「NTC」））、5C（T24、cDNA）、および5D（T24、NTC））を参照されたい）。
【０１０２】
図6A〜6Dにおいて、個々のアンプリコンを選択し、かつ融解曲線解析によって解析した。図6Aは、Power SYBR（登録商標）Green PCR Master Mix単一ホットスタート反応混合物が、とりわけ室温で24時間のプレインキュベーション後に、非特異的産物を産生することを実証している。図6Bは、二重ホットスタート反応混合物が、24時間において非特異的産物形成の50％の低下をもたらすことを実証している。図6Cは、二重ホットスタート反応混合物が、（Ct値の下降によって示されるように）T0およびT24の両方において非特異的産物の形成を低下させること、ならびに二重ホットスタート反応混合物が、非特異的産物の形成をT0において3倍およびT24において10％低下させることを実証している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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