(57)【要約】  【課題】歯周病の予防及び／又は抑制が可能な口腔用組成物を提供すること。  【解決手段】パルミチン酸レチノールを含有する抗歯周病口腔用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルミチン酸レチノールを含有する抗歯周病口腔用組成物。
【請求項２】
パルミチン酸レチノールを０．０００１〜１質量％含有する請求項１に記載の口腔用組成物。
【請求項３】
パルミチン酸レチノールを０．０００１〜１質量％含有する口腔用組成物。
【請求項４】
パルミチン酸レチノールを１〜１００００ＩＵ含有する請求項１に記載の口腔用組成物。
【請求項５】
パルミチン酸レチノールを１〜１００００ＩＵ含有する口腔用組成物。
【請求項６】
歯肉上皮細胞間接着強化用である、請求項１〜５のいずれかに記載の口腔用組成物。
【請求項７】
さらに塩化セチルピリジニウムを含有する、請求項１〜６のいずれかに記載の口腔用組成物。
【請求項８】
塩化セチルピリジニウムを０．０１〜０．５質量％含有する、請求項７に記載の口腔用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口腔用組成物等に関し、より詳細にはパルミチン酸レチノールを含有する口腔用組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病はプラーク中の細菌と生体側の応答による相互作用により進行する。そのため、歯周病を予防するためには、物理的及び化学的除去による歯周病原細菌のコントロール、並びに宿主側の防御機能のコントロールが有効だと考えられる。
【０００３】
特に、歯周病細菌である、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐ．ｇ．菌）は歯肉上皮の細胞間接着を破壊し、病原因子が組織内に侵入する。このことは、歯周病の発症及び／又は進行につながる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１８−０９０５８５号広報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、歯周病の予防及び／又は抑制が可能な口腔用組成物を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従来、口腔ケア商品には、殺菌及び抗炎症に注目し、これらの効果を遡及する商品が多かった。一方で、歯肉上皮細胞は、歯周病菌の侵入に対して、最前線で物理的なバリアとして機能しており、歯周病の予防及び／又は抑制のために重要な役割を果たし得る。上述した通り、Ｐ．ｇ．菌が歯肉上皮の細胞間接着を破壊し、病原因子が組織内に侵入することが、歯周病の発症及び／又は進行の一因となり得ることから、歯肉上皮細胞の細胞間接着を強化することによっても、歯周病の予防及び／又は抑制が可能であると期待される。
【０００７】
そこで、本発明者らは、歯肉上皮細胞の細胞間接着を強化できる効果を奏する成分を探索した結果、パルミチン酸レチノールが当該効果を奏することを見出し、さらに改良を重ねた。
【０００８】
本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
パルミチン酸レチノールを含有する抗歯周病口腔用組成物。
項２．
パルミチン酸レチノールを０．０００１〜１質量％含有する項１に記載の口腔用組成物。
項３．
パルミチン酸レチノールを０．０００１〜１質量％含有する口腔用組成物。
項４．
パルミチン酸レチノールを１〜１００００ＩＵ含有する項１に記載の口腔用組成物。
項５．
パルミチン酸レチノールを１〜１００００ＩＵ含有する口腔用組成物。
項６．
歯肉上皮細胞間接着強化用である、項１〜５のいずれかに記載の口腔用組成物。
項７．
さらに塩化セチルピリジニウムを含有する、項１〜６のいずれかに記載の口腔用組成物。
項８．
塩化セチルピリジニウムを０．０１〜０．５質量％含有する、項７に記載の口腔用組成物。
項９．
パルミチン酸レチノールを含有する歯肉上皮細胞間接着強化剤。
【発明の効果】
【０００９】
歯肉上皮細胞の細胞間接着を強化することにより、歯周病を予防及び／又は抑制し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】各濃度のパルミチン酸レチノールにより細胞間接着破壊抑制効果が得られるかを、Ｅｐｉ４細胞間を透過するＦＩＴＣ量により検討した事件の概要を示す。
【図２】各濃度のパルミチン酸レチノールにより細胞間接着破壊抑制効果が得られるかを、Ｅｐｉ４細胞間を透過するＦＩＴＣ量により検討した結果を示す。
【図３】各種ビタミン化合物により細胞間接着破壊抑制効果が得られるかを、Ｅｐｉ４細胞間を透過するＦＩＴＣ量により検討した結果を示す。
【図４】各濃度のパルミチン酸レチノールにより細胞毒性が生じるかを、ＷＳＴ−１を用いて検討した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。本発明は、口腔用組成物、及びその用途等を好ましく包含するが、これらに限定されるわけではなく、本発明は本明細書に開示され当業者が認識できる全てを包含する。
【００１２】
本発明に包含される口腔用組成物は、パルミチン酸レチノールを含有する。本発明に包含される当該口腔用組成物を「本発明の口腔用組成物」ということがある。
【００１３】
パルミチン酸レチノールは、パルミチン酸とレチノールのエステルであり、ビタミンＡの一種である。パルミチン酸レチノールの構造式を次に示す。
【００１４】
【化１】
2020097534.tif 000002
【００１５】
本発明の口腔用組成物において、パルミチン酸レチノールは、０．０００１質量（ｗ／ｗ）％以上含有されることが好ましく、上限は特に制限されないが例えば０．０００１〜１質量％程度含有されることがより好ましい。当該範囲の下限は、例えば０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、又は０．００１質量％程度であってもよい。また当該範囲の上限は、例えば０．５、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、又は０．０１質量％程度であってもよい。また、国際単位（ＩＵ）で記載すれば、１ＩＵ以上含有されることが好ましく、上限は特に制限されないが、例えば１〜１００００ＩＵ程度含有されることがより好ましい。当該範囲の下限は、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ＩＵ程度であってもよい。また当該範囲の上限は、例えば５０００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、又は１００ＩＵ程度であってもよい。
【００１６】
また、本発明の口腔用組成物は、パルミチン酸レチノールを含有することにより、口腔内に適用された際に、歯肉上皮細胞の細胞間接着を強化する効果を奏する。このため、本発明の口腔用組成物は、歯肉上皮細胞間接着強化用として好ましく用いることができる。また、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐ．ｇ．菌）による細胞間接着破壊の抑制用としても好ましく用いることができる。さらに、このような効果を奏することから、本発明の口腔用組成物は、抗歯周病口腔用組成物として好ましく用いることができる。
【００１７】
なお、本発明の口腔用組成物は、歯肉上皮細胞の細胞間接着を強化する効果を奏することから、既にＰ．ｇ．菌に感染している口腔内において、歯周病の進行を抑制する効果のみならず、まだＰ．ｇ．菌に感染していない口腔内において、歯周病を予防する効果をも奏する。このため、Ｐ．ｇ．菌口腔内感染者の歯周病進行抑制のため、及び／又はＰ．ｇ．菌口腔内非感染者の歯周病予防のため、に好ましく用いることができる。
【００１８】
また、本発明の口腔用組成物は、さらに塩化セチルピリジニウムを含有することが好ましい。塩化セチルピリジニウムを含有する場合は、０．０１〜０．５質量％含有することが好ましい。当該下限は０．０２、０．０３、０．０４、又は０．０５質量％であってもよく、また当該上限は０．４、０．３、０．２、又は０．１質量％であってもよい。例えば、０．０２〜０．３質量％程度含有することがより好ましい。
【００１９】
なお、塩化セチルピリジニウムは、口腔用組成物分野で広く用いられる殺菌剤であり、これを含有することにより本発明の口腔用組成物は殺菌効果（特にＰ．ｇ．菌殺菌効果）をも奏することとなり、好ましい。
【００２０】
本発明の口腔用組成物は、固形組成物、液体組成物でありえる。当該口腔用組成物は、例えば医薬品、医薬部外品として用いることができる。また、本発明の口腔用組成物の形態は、特に限定するものではないが、常法に従って例えば軟膏剤、ペースト剤、パスタ剤、ジェル剤、液剤、スプレー剤、洗口液剤、液体歯磨剤、練歯磨剤、ガム剤等の形態（剤形）にすることができる。なかでも、洗口液剤、液体歯磨剤、練歯磨剤、軟膏剤、ペースト剤、液剤、ジェル剤であることが好ましい。
【００２１】
本発明の口腔用組成物は、本発明の効果を損なわない範囲で、口腔用組成物に配合し得る任意成分を単独で又は２種以上さらに含有してもよい。
【００２２】
例えば、界面活性剤として、ノニオン界面活性剤、アニオン界面活性剤または両性界面活性剤を配合することができる。具体的には、例えば、ノニオン界面活性剤としてはショ糖脂肪酸エステル、マルトース脂肪酸エステル、ラクトース脂肪酸エステル等の糖脂肪酸エステル；脂肪酸アルカノールアミド類；ソルビタン脂肪酸エステル；脂肪酸モノグリセライド；ポリオキシエチレン付加係数が８〜１０、アルキル基の炭素数が１３〜１５であるポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレン付加係数が１０〜１８、アルキル基の炭素数が９であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；セバシン酸ジエチル；ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタン等が挙げられる。アニオン界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等の硫酸エステル塩；ラウリルスルホコハク酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルスルホコハク酸ナトリウム等のスルホコハク酸塩；ココイルサルコシンナトリウム、ラウロイルメチルアラニンナトリウム等のアシルアミノ酸塩；ココイルメチルタウリンナトリウム等が挙げられる。両性イオン界面活性剤としては、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン等の酢酸ベタイン型活性剤；Ｎ−ココイル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等のイミダゾリン型活性剤；Ｎ−ラウリルジアミノエチルグリシン等のアミノ酸型活性剤等が挙げられる。これらの界面活性剤は、単独または２種以上を組み合わせて配合することができる。その配合量は、通常、組成物全量に対して０．１〜５質量％である。
【００２３】
また、香味剤として、例えば、メントール、カルボン酸、アネトール、オイゲノール、サリチル酸メチル、リモネン、オシメン、ｎ−デシルアルコール、シトロネール、α−テルピネオール、メチルアセタート、シトロネニルアセタート、メチルオイゲノール、シネオール、リナロール、エチルリナロール、チモール、スペアミント油、ペパーミント油、レモン油、オレンジ油、セージ油、ローズマリー油、珪皮油、シソ油、冬緑油、丁子油、ユーカリ油、ピメント油、ｄ−カンフル、ｄ−ボルネオール、ウイキョウ油、ケイヒ油、シンナムアルデヒド、ハッカ油、バニリン等の香料を用いることができる。これらは、単独または２種以上を組み合わせて組成物全量に対して例えば０.００１〜１．５質量％配合することができる。
【００２４】
また、甘味剤として、例えば、サッカリンナトリウム、アセスルファームカリウム、ステビオサイド、ネオヘスペリジルジヒドロカルコン、ペリラルチン、タウマチン、アスパラチルフェニルアラニルメチルエステル、ｐ−メトキシシンナミックアルデヒド等を用いることができる。これらは、組成物全量に対して例えば０.０１〜１質量％配合することができる。
【００２５】
さらに、湿潤剤として、ソルビット、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、１，３―ブチレングリコール、ポリプロピレングリコール、キシリット、マルチット、ラクチット、ポリオキシエチレングリコール等を単独または２種以上を組み合わせて配合することができる。
【００２６】
防腐剤として、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン等のパラベン類、安息香酸ナトリウム、フェノキシエタノール、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン等を配合することができる。
【００２７】
着色剤として、青色１号、黄色４号、赤色２０２号、緑３号等の法定色素、群青、強化群青、紺青等の鉱物系色素、酸化チタン等を配合してもよい。
【００２８】
ｐＨ調整剤として、クエン酸、リン酸、リンゴ酸、ピロリン酸、乳酸、酒石酸、グリセロリン酸、酢酸、硝酸、またはこれらの化学的に可能な塩や水酸化ナトリウム等を配合してもよい。これらは、組成物のｐＨが４〜８、好ましくは５〜７の範囲となるよう、単独または２種以上を組み合わせて配合することができる。ｐＨ調整剤の配合量は例えば０．０１〜２重量％であってよい。
【００２９】
本発明の口腔用組成物には、塩化セチルピリジニウムのみならず、さらに、薬効成分として酢酸ｄｌ−α−トコフェロール、コハク酸トコフェロール、またはニコチン酸トコフェロール等のビタミンＥ類、ドデシルジアミノエチルグリシン等の両性殺菌剤、トリクロサン、イソプロピルメチルフェノール、ヒノキチオール等の非イオン性殺菌剤、ラウロイルサルコシンナトリウム等のアニオン系殺菌剤、塩酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等のカチオン系殺菌剤、デキストラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ムタナーゼ、リゾチーム、溶菌酵素（リテックエンザイム）等の酵素、モノフルオロリン酸ナトリウム、モノフルオロリン酸カリウム等のアルカリ金属モノフルオロフォスフェート、フッ化ナトリウム、フッ化第一錫等のフッ化物、トラネキサム酸やイプシロンアミノカプロン酸、アルミニウムクロルヒドロキシルアラントイン、ジヒドロコレステロール、グリチルレチン酸、グリチルリチン酸、銅クロロフィリンナトリウム、グリセロフォスフェート、クロロフィル、塩化ナトリウム、カロペプタイド、アラントイン、カルバゾクロム、ヒノキチオール、硝酸カリウム、パラチニット等を、単独または２種以上を組み合わせて配合することができる。これら薬効成分は、塩化セチルピリジニウムと組み合わせて用いてもよいし、塩化セチルピリジニウムを含有しない本発明の口腔用組成物において加えられていてもよい。
【００３０】
また、基剤として、アルコール類、シリコン、アパタイト、白色ワセリン、パラフィン、流動パラフィン、マイクロクリスタリンワックス、スクワラン、プラスチベース等を添加することも可能である。 
【００３１】
また、本発明の口腔用組成物は、公知の方法または公知の方法から容易に想到する方法により調製することができる。例えば、パルミチン酸レチノール及び必要に応じてその他の成分（特に塩化セチルピリジニウム）等を適宜混合することによって調製することができる。
【００３２】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本発明は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。
【００３３】
また、上述した本発明の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本発明に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本発明には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
【００３５】
パルミチン酸レチノールによる細胞間接着破壊抑制効果の検討
歯肉上皮細胞株Ｅｐｉ４細胞をコンフルエントになるまでｔｒａｎｓｗｅｌｌ上で  培養した。ｔｒａｎｓｗｅｌｌは、インサートがウェルの中間にくるよう吊り下げ式にデザインされており、細胞透過性評価を可能とするツールである。
【００３６】
また、パルミチン酸レチノールを含有する、２．５％ＤＭＳＯ含有細胞用培地を調製した。当該調製には、市販試薬であるパルミチン酸レチノールを用い、当該試薬が培地に０．１質量％、０．０５質量％、０．０１質量％、０．００５質量％、又は０．００１質量％含有されるようにした。
【００３７】
調製した各濃度のパルミチン酸レチノール含有培地を、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上に培養したＥｐｉ４細胞（培養培地除去済み）に上面から３００μｌずつ添加し、１時間３７℃、ＣＯ２濃度５％下でインキュベートした。
【００３８】
さらに、予め培養しておいたＰ．ｇ菌（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  Ｗ８３）を１００００ｒｐｍで遠心することにより回収し、ＯＤ６００＝０．５になるよう濃度を調整した。上記インキュベート後のｔｒａｎｓｗｅｌｌ上のＥｐｉ４細胞に、調整した各濃度のＰ．ｇ．菌液１００μｌを添加し、２時間３７℃、ＣＯ２濃度５％前後下でインキュベートした。
【００３９】
なお、検討で用いたパルミチン酸レチノール試薬は、２１５０００ＩＵ／ｇであった。よって、上記０．１質量％、０．０５質量％、０．０１質量％、０．００５質量％、又は０．００１質量％は、国際単位（ＩＵ）で示せば、それぞれ２１５ＩＵ、１０７．５ＩＵ、２１．５ＩＵ、１０．７５ＩＵ、及び２．１５ＩＵである。また、パルミチン酸レチノールの国際単位（ＩＵ）を質量に換算する式は１ＩＵ＝０．５５μｇである。このため、当該パルミチン酸レチノール試薬には、２１５０００ＩＵ／ｇ×０．５５μｇ＝１１８．２５ｍｇ／ｇの濃度でパルミチン酸レチノールが含有される。さらに、市販のパルミチン酸レチノール試薬の密度は通常０．９〜０．９５ｍｇ／ｍｌであるので、１１８．２５ｍｇ／ｇ×１／０．９〜０．９５＝１２４〜１３０ｍｇ／ｍｌ程度、当該パルミチン酸レチノール試薬にはパルミチン酸レチノールが含まれていることになる。また例えば、上述した、パルミチン酸レチノール試薬が０．１質量％含有される培地を調製して行った検討においては、初期濃度は９００〜９５０×１１８．２５＝１０６．４〜１１２．３μｇ／ｍｌ程度であり、質量（ｗ／ｗ）％濃度ではおよそ０．０１０６〜０．０１１２質量％程度になる。同様に、パルミチン酸レチノール試薬が０．０５質量％、０．０１質量％、０．００５質量％、又は０．００１質量％含有される培地を調製して行った検討においては、初期濃度は０．１質量％の時の１／２、１／１０、１／２０、又は１／１００になる。また、終濃度（Ｐ．ｇ菌添加後の濃度）は、当該濃度値の３／４になる。
【００４０】
インキュベート後、培地を除去し、ＰＢＳでｗａｓｈ後、１ｍｇ／ｍｌに調整したＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ（４ｋＤａ）をｔｒａｎｓｗｅｌｌの上面から添加し、１時間３７℃でインキュベートした。ｔｒａｎｓｗｅｌｌを通過したＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎを回収し、蛍光プレートリーダー（Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＰＳ）にて蛍光強度（励起光：４９０ｎｍ、放出光：５２０ｎｍ）を測定した。パルミチン酸レチノール濃度が０ＩＵにおけるＦＩＴＣ透過量が１００％になるように換算して、各濃度のパルミチン酸レチノールを処理した際の透過率を算出した。当該透過率が低いほど、細胞間接着破壊抑制効果が高いということができる。なお、ＦＩＴＣはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒ−Ｉの略である。
【００４１】
以上の実験の概要を図１に示す。また検討結果（ＦＩＴＣ透過量から算出したＦＩＴＣ透過率）を図２に示す。なお、図２では、パルミチン酸レチノール濃度は、終濃度（ＩＵ）で表す。
【００４２】
各種ビタミンによる細胞間接着破壊抑制効果の検討
各種ビタミン化合物（具体的な化合物名を図３に示す）試薬（終濃度０．００７５％）を用いたこと、及びＯＤ６００＝０．１になるよう濃度を調整したＰ．ｇ菌培養液を用いたこと以外は、上記と同様にして、各種ビタミンに細胞間接着破壊抑制効果があるかを検討した。結果を図３に示す。各種ビタミン化合物の中でも、パルミチン酸レチノールは特に優れた細胞間接着破壊抑制効果を奏することが確認できた。
【００４３】
パルミチン酸レチノールの細胞毒性の検討
歯肉上皮細胞株Ｅｐｉ４細胞をコンフルエントになるまで９６ｗｅｌｌで培養した。
各濃度のパルミチン酸レチノールを含有する２．５％ＤＭＳＯ含有細胞用培地を添加し、３時間３７℃でインキュベートした。
【００４４】
細胞増殖活性試薬である、ＷＳＴ−１を添加し、４０分３７℃でインキュベートした。なお、ＷＳＴ−１は、下記構造式で示されるテトラゾリウム塩化合物であり、当該塩の分解により生存細胞の数を分析する増殖能力測定に用いられる。
【００４５】
【化２】
2020097534.tif 000003
【００４６】
インキュベート後、吸光プレートリーダー（ｘＭａｒｋ  マイクロプレートリーダー）にて吸光度（Ｏ．Ｄ（４５０ｎｍ））を測定した。パルミチン酸レチノール濃度が０ＩＵにおける吸光度を１００％になるように換算し、各濃度のパルミチン酸レチノールを処理した際の細胞生存率を算出した。結果を図４に示す。パルミチン酸レチノールに細胞毒性は認められなかった。
【００４７】
パルミチン酸レチノールの殺菌活性の検討
Ｐ．ｇ菌（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  Ｗ８３）をＧＡＭ培地にて培養し、Ｏ．Ｄ（６００）＝１．０に調整した。各濃度に調整した薬剤（パルミチン酸レチノール、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、又はこれらの組み合わせ）を、調整した菌液と混合し、３分間放置した。３分後、この１０倍量の、殺菌剤不活化培地（０．０７％レシチン＋０．５％Ｔｗｅｅｎ  ８０）を加え、殺菌効果を停止させ、３７℃嫌気条件下で２４時間培養した。培養後、吸光プレートリーダー（ｘＭａｒｋ  マイクロプレートリーダー）にて培地の吸光度（Ｏ．Ｄ（６００））を測定し、濁度の有無から殺菌効果を判定した。吸光度が低いほど殺菌効果が高いということができる。当該結果を表１に示す。パルミチン酸レチノールに殺菌活性は認められず、またＣＰＣの殺菌効果を阻害する効果も認められなかった。
【００４８】
【表１】
2020097534.tif 000004
【００４９】
パルミチン酸レチノールには、細胞毒性及び殺菌活性が認められないことから、上記ｔｒａｎｓｗｅｌｌを用いた検討において、パルミチン酸レチノールによりＦＩＴＣ透過率が下がったのは、Ｐ．ｇ菌が障害されたことにより細胞間接着破壊が抑制されたためではなく、Ｅｐｉ４細胞の細胞間接着が強化されたことにより細胞間接着破壊が抑制されたためであることがわかった。
【図１】
2020097534.tif 000005
【図２】
2020097534.tif 000006
【図３】
2020097534.tif 000007
【図４】
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