(57)【要約】      （修正有）【課題】胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞集団を使用する免疫調節の方法を提供する。また、免疫調節に基づいて胎盤細胞及び細胞集団を産生及び選択する方法、並びにこのような細胞及び細胞集団を含む組成物を提供する。【解決手段】複数の免疫細胞を、複数の胎盤幹細胞と、前記胎盤幹細胞が免疫応答を検出可能に抑制するのに十分な時間接触させることを含む免疫応答抑制方法であって、前記胎盤幹細胞は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法におけるT細胞増殖を検出可能に抑制する、前記方法。【選択図】図４
2020055809.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の免疫細胞を、複数の胎盤幹細胞と、前記胎盤幹細胞が免疫応答を検出可能に抑制
するのに十分な時間接触させることを含む免疫応答抑制方法であって、前記胎盤幹細胞は
、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法におけるT細胞増殖を検出可能に抑制する、前記方
法。
【請求項２】
前記複数の胎盤幹細胞が：
CD200及びHLA-Gを発現し；
CD73、CD105及びCD200を発現し；
CD200及びOCT-4を発現し；
CD73、CD105及びHLA-Gを発現し；
CD73及びCD105を発現し、かつ前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様
体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進し
；及び／又は、
OCT-4を発現し、かつ前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の
形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進する、請求
項1記載の方法。
【請求項３】
前記複数の免疫細胞がT細胞又はNK（ナチュラルキラー）細胞である、請求項1記載の方
法。
【請求項４】
前記T細胞がCD4+T細胞である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記T細胞がCD8+T細胞である、請求項3記載の方法。
【請求項６】
前記接触がインビトロで行われる、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記接触がインビボで行われる、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記接触が哺乳動物対象で行われる、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物対象がヒト被験者である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記接触が、前記胎盤細胞を静脈内投与することを含む、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
前記接触が、前記胎盤細胞を筋肉内投与することを含む、請求項7記載の方法。
【請求項１２】
前記接触が、前記胎盤細胞を前記対象の器官に投与することを含む、請求項7記載の方
法。
【請求項１３】
前記器官が膵臓である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
加えて、抗マクロファージ炎症性タンパク質（MIP）1α又は抗-MIP-1β抗体を前記対象
に投与することを含み、前記抗体が前記対象からの血液中のMIP-1α又は抗-MIP-1βの量
の検出可能な液滴を生じさせるために十分な量で投与される、請求項8記載の方法。
【請求項１５】
前記免疫応答が移植片対宿主病である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
前記免疫応答が自己免疫疾患である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記自己免疫疾患が糖尿病、エリテマトーデス、リウマチ様関節炎又は多発性硬化症で
ある、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記複数の免疫細胞が非胎盤細胞とも接触される、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
前記非胎盤細胞がCD34+細胞を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記CD34+細胞が末梢血造血前駆細胞、臍帯血造血前駆細胞又は胎盤血造血前駆細胞で
ある、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記非胎盤細胞が間充織幹細胞を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
前記間充織幹細胞が骨髄由来間充織幹細胞である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
前記非胎盤細胞が同種移植片内に含まれる、請求項16記載の方法。
【請求項２４】
前記複数の胎盤幹細胞が1×105胎盤幹細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
前記複数の胎盤幹細胞が1×106胎盤幹細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
前記複数の胎盤幹細胞が1×107胎盤幹細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
前記複数の胎盤幹細胞が1×108胎盤幹細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２８】
胎盤細胞集団を選択する方法であって、
（a）混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法において複数の胎盤細胞をアッセイすること
；及び、
（b）前記複数の胎盤幹細胞がMLR（混合リンパ球反応）においてCD4+又はCD8+T細胞増
殖を検出可能に抑制する場合に、前記胎盤幹細胞が：
（i）基体に付着し；及び、
（ii）CD200及びHLA-Gを発現するか、又は、
CD73、CD105及びCD200を発現するか、又は、
CD200及びOCT-4を発現するか、又は、
CD73、CD105及びHLA-Gを発現するか、又は、
CD73及びCD105を発現し、かつ前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様
体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進す
るか、又は、
OCT-4を発現し、かつ前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の
形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進する、前記
複数の胎盤幹細胞を選択することを含む、前記方法。
【請求項２９】
（a）基体に付着し、（b）CD200及びHLA-Gを発現し、及び（c）MLR（混合リンパ球反応
）においてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤幹細胞を複数の細胞から選
択すること；並びにその他の細胞から前記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形成すること
；を含む、細胞集団を選択する方法。
【請求項３０】
（a）基体に付着し、（b）CD73、CD105及びCD200を発現し、及び（c）MLRにおいてCD4+
又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤幹細胞を複数の細胞から選択すること；並
びにその他の細胞から前記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形成すること；を含む、細胞
集団を選択する方法。
【請求項３１】
（a）基体に付着し、（b）CD200及びOCT-4を発現し、及び（c）MLRにおいてCD4+又はCD
8+T細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤幹細胞を複数の細胞から選択すること；並びにそ
の他の細胞から前記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形成すること；を含む、細胞集団を
選択する方法。
【請求項３２】
（a）基体に付着し、（b）CD73及びCD105を発現し、（c）胚様体様体の形成が可能な条
件下で培養されるときに胚様体様体を形成し、及び（d）MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞
増殖を検出可能に抑制する胎盤幹細胞を複数の細胞から選択すること；並びにその他の細
胞から前記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形成すること；を含む、細胞集団を選択する
方法。
【請求項３３】
（a）基体に付着し、（b）CD73、CD105、HLA-Gを発現し、及び（c）MLRにおいてCD4+又
はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤幹細胞を複数の細胞から選択すること；並び
にその他の細胞から前記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形成すること；を含む、細胞集
団を選択する方法。
【請求項３４】
（a）基体に付着し、（b）OCT-4を発現し、（c）胚様体様体の形成が可能な条件下で培
養されるときに胚様体様体を形成し、及び（d）MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検
出可能に抑制する胎盤幹細胞を複数の細胞から選択すること；並びにその他の細胞から前
記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形成すること；を含む、細胞集団を選択する方法。
【請求項３５】
前記T細胞及び前記胎盤幹細胞が、前記MLRにおいて約5：1の比で存在する、請求項28〜
34のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
前記胎盤幹細胞が羊膜、羊膜及び絨毛膜に由来する、請求項28〜34のいずれか１項記載
の方法。
【請求項３７】
前記胎盤幹細胞が、前記MLRにおける前記胎盤幹細胞の非存在下でのT細胞増殖の量と比
較して、前記MLRにおいて少なくとも50%までCD4+又はCD8+T細胞増殖を抑制する、請求項2
8〜34のいずれか1項記載の方法。
【請求項３８】
前記胎盤幹細胞が、前記MLRにおける前記胎盤幹細胞の非存在下でのT細胞増殖の量と比
較して、前記MLRにおいて少なくとも75%までCD4+又はCD8+T細胞増殖を抑制する、請求項2
8〜34のいずれか1項記載の方法。
【請求項３９】
前記胎盤幹細胞が、前記MLRにおける前記胎盤幹細胞の非存在下でのT細胞増殖の量と比
較して、前記MLRにおいて少なくとも90%までCD4+又はCD8+T細胞増殖を抑制する、請求項2
8〜34のいずれか1項記載の方法。
【請求項４０】
前記胎盤幹細胞が、前記MLRにおける前記胎盤幹細胞の非存在下でのT細胞増殖の量と比
較して、前記MLRにおいて少なくとも95%までCD4+又はCD8+T細胞増殖を抑制する、請求項2
8〜34のいずれか1項記載の方法。
【請求項４１】
前記胎盤幹細胞が、加えてナチュラルキラー（NK）細胞の活性を検出可能に抑制する、
請求項28〜34のいずれか1項記載の方法。
【請求項４２】
請求項28〜34のいずれか1項記載の方法に従って産生される単離された胎盤幹細胞集団
。
【請求項４３】
胎盤幹細胞の単離された集団であって、前記胎盤幹細胞は：
（a）基体に付着し；
（b）CD200及びHLA-Gを発現するか、又は、
CD73、CD105及びCD200を発現するか、又は、
CD200及びOCT-4を発現するか、又は、
CD73、CD105及びHLA-Gを発現するか、又は、
CD73及びCD105を発現し、かつ前記胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の
胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促
進するか、又は、
OCT-4を発現し、かつ前記胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様
体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進し；並
びに、
（c）MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制するとして同定された、前
記集団。
【請求項４４】
（a）基体に付着し、（b）CD200及びHLA-Gを発現し、及び（c）MLR（混合リンパ球反応
）においてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制するとして同定された胎盤幹細胞を
含む、単離された細胞集団。
【請求項４５】
（a）基体に付着し、（b）CD73、CD105及びCD200を発現し、及び（c）MLRにおいてCD4+
又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制するとして同定された胎盤幹細胞を含む、単離され
た細胞集団。
【請求項４６】
（a）基体に付着し、（b）CD200及びOCT-4を発現し、及び（c）MLRにおいてCD4+又はCD
8+T細胞増殖を検出可能に抑制するとして同定された胎盤幹細胞を含む、単離された細胞
集団。
【請求項４７】
（a）基体に付着し、（b）CD73及びCD105を発現し、（c）胚様体様体の形成が可能な条
件下で培養されるときに胚様体様体を形成し、及び（d）MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞
増殖を検出可能に抑制するとして同定された胎盤幹細胞を含む、単離された細胞集団。
【請求項４８】
（a）基体に付着し、（b）CD73、CD105及びHLA-Gを発現し、及び（c）MLRにおいてCD4+
又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制するとして同定された胎盤幹細胞を含む、単離され
た細胞集団。
【請求項４９】
（a）基体に付着し、（b）OCT-4を発現し、（c）胚様体様体の形成が可能な条件下で培
養されるときに胚様体様体を形成し、及び（d）MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検
出可能に抑制するとして同定された胎盤幹細胞を含む、単離された細胞集団。
【請求項５０】
請求項43〜49のいずれか１項記載の細胞集団の培養由来の上清を含む組成物。
【請求項５１】
胎盤幹細胞の培養由来の培地を含む組成物であって、前記胎盤幹細胞は、
（a）基体に付着し；
（b）CD200及びHLA-Gを発現するか、又は、
CD73、CD105及びCD200を発現するか、又は、
CD200及びOCT-4を発現するか、又は、
CD73、CD105及びHLA-Gを発現するか、又は、
CD73及びCD105を発現し、かつ前記胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の
胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促
進するか、又は、
OCT-4を発現し、かつ前記胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様
体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進し；並
びに、
（c）MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制するとして同定され、
前記胎盤幹細胞の培養は、前記培地において24時間以上培養された、前記組成物。
【請求項５２】
複数の前記胎盤幹細胞を更に含む、請求項51記載の組成物。
【請求項５３】
複数の非胎盤細胞を更に含む、請求項51記載の組成物。
【請求項５４】
前記非胎盤細胞がCD34+細胞を含む、請求項53記載の組成物。
【請求項５５】
前記CD34+細胞が末梢血造血前駆細胞、臍帯血造血前駆細胞又は胎盤血造血前駆細胞で
ある、請求項54記載の組成物。
【請求項５６】
前記非胎盤細胞が間充織幹細胞を含む、請求項53記載の組成物。
【請求項５７】
前記間充織幹細胞が骨髄由来間充織幹細胞である、請求項56記載の組成物。
【請求項５８】
抗-MIP-1α又は抗MIP-1β抗体を更に含む、請求項51記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（1. 発明の分野）
本発明は、免疫系及び抗原に対する免疫応答を調整するために胎盤幹細胞を使用する方
法を提供する。また、本発明は、免疫調節に使用するための胎盤幹細胞を含む化合物、並
びに免疫を媒介した拒絶反応を予防又は阻害するための胎盤幹細胞の投与を含む組織及び
器官を移植する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（2. 発明の背景）
ヒト幹細胞は、多様な成熟ヒト細胞系統を産生することができる全能性又は多能性の前
駆細胞である。幹細胞は、多くの（全てではない場合）組織に再び集団形成し、生理的及
び解剖的な機能性を回復するために使用することができることを証明する証拠がある。
多くの異なるタイプの哺乳動物幹細胞が特徴づけられている。例えば、Caplanらの文献
、米国特許第5,486,359号（ヒト間充織幹細胞）；Boyseらの文献、米国特許第5,004,681
号（胎児及び新生児の造血幹細胞及び前駆細胞）；Boyse らの文献、米国特許第5,192,55
3号（同じ）；Beltramiらの論文、Cell 114（6）: 763-766 （2003） （心臓幹細胞）；F
orbesらの論文、J. Pathol. 197（4）:510-518 （2002） （肝臓幹細胞）を参照されたい
。臍帯血及び臍帯血に由来する総有核細胞は、切除療法を受けた患者における造血機能を
部分的に、又は完全に回復するための移植に使用されてきた。
胎盤は、特に魅力的な幹細胞の供与源である。哺乳動物胎盤は、豊富であり、通常は医
療廃棄物として廃棄されるので、これらは、医学的に有用な幹細胞の独特の供与源である
。本発明は、このような単離された胎盤幹細胞、胎盤幹細胞の集団及び前述のものを使用
する方法を提供する。
【発明の概要】
【０００３】
（3. 発明の要旨）
本発明は、複数の胎盤幹細胞又は臍帯幹細胞、胎盤幹細胞又は臍帯幹細胞の集団、並び
に前記幹細胞を含む、及び／又は前記幹細胞によって産生される組成物を使用する免疫抑
制の方法を提供する。また、本発明は、免疫抑制特性を有する胎盤幹細胞又は臍帯幹細胞
を含む組成物を含む組成物を提供する。本発明は、それらが免疫応答を調整する能力に基
づいて選択された胎盤細胞又は臍帯幹細胞の集団、及び免疫調節特性を有する組成物を更
に提供する。
【０００４】
一つの態様において、本発明は、複数の免疫細胞を、複数の胎盤幹細胞と、前記胎盤幹
細胞が免疫応答を検出可能に抑制するのに十分な時間接触させることを含む、免疫応答を
抑制、又は減少させる方法であって、前記胎盤幹細胞は、混合リンパ球反応（MLR）アッ
セイ法におけるT細胞増殖を検出可能に抑制する、前記方法を提供する。具体的実施態様
において、前記胎盤幹細胞は：CD200及びHLA-Gを発現し；CD73、CD105及びCD200を発現し
；CD200及びOCT-4を発現し；CD73、CD105及びHLA-Gを発現し；CD73及びCD105を発現し、
かつ前記複数の幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を、前
記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進し；及び／又はOCT-4
を発現し、かつ前記複数の幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の
形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進する。別の
特定の実施態様において、前記複数の免疫細胞は、T細胞又はNK（ナチュラルキラー）細
胞である。より具体的実施態様において、前記T細胞は、CD4+T 細胞である。更に別の具
体的実施態様において、前記T細胞は、CD8+T細胞である。別の具体的実施態様において、
前記接触は、インビトロにおいて行われる。別の具体的実施態様において、前記接触は、
インビボにおいて行われる。より具体的実施態様において、前記インビボでの接触は、哺
乳動物対象、例えばヒト被験者において行われる。更に別の具体的実施態様において、前
記接触は、静脈内、筋肉内又は前記対象の器官（例えば、膵臓）内に前記胎盤細胞を投与
することを含む。免疫応答を、特にインビボにおいて抑制する方法は、（例えば、哺乳類
に）例えば抗マクロファージ炎症性タンパク質（MIP）-1α又は抗-MIP-1β抗体を前記対
象に対して投与することを含むことができ、前記抗体は、例えば前記対象からの血液中の
MIP-1α又は抗-MIP-1βの量の検出可能な低下を生じさせるために十分な量で投与される
。
【０００５】
本方法のより具体的実施態様において、CD200及びHLA-Gを発現する前記胎盤幹細胞は、
またCD73及びCD105を発現し、すなわちCD73+及びCD105+である。別の具体的実施態様にお
いて、前記胎盤細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-である。より具体的実施態様において、
前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+及びCD105+である。別の具体的実施態様
において、前記複数の胎盤幹細胞は、胎盤幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団からの
1つ以上の胚様体様体の発生を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養され
るときに促進する。
【０００６】
本方法の更に別の具体的実施態様において、CD73、CD105及びCD200を発現する前記胎盤
幹細胞は、またHLA-G+である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-
、CD38-又はCD45-である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD3
8-及びCD45-である。より具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、C
D45-及びHLA-G+である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、胎盤幹細胞を
含む単離された胎盤細胞の集団からの1つ以上の胚様体様体の発生を、前記集団が胚様体
様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進する。
【０００７】
本方法の更に別の具体的実施態様において、CD200及びOCT-4を発現する前記胎盤幹細胞
は、またCD73+及びCD105+を発現する。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は
、HLA-G+である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-又はCD
45-である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-で
ある。より具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、
CDl05+及びHLA-G+である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、胎盤幹細胞
を含む単離された胎盤細胞の集団からの1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様
体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進する。
【０００８】
更に別の具体的実施態様において、CD73、CD105及びHLA-Gを発現する前記胎盤幹細胞は
、またCD34-、CD38-又はCD45-である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は
、CD34-、CD38-及びCD45-である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、OCT
-4+である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD200+である。より具体
的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+及びCD200+であ
る。別の具体的実施態様において、前記幹細胞は、胎盤幹細胞を含む単離された胎盤細胞
の集団からの1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件
下で培養されるときに促進する。
【０００９】
更に別の特定の実施態様において、CD73及びCD105を発現し、かつ該胎盤幹細胞を含む
胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が
可能な条件下で培養されるときに促進する前記胎盤幹細胞は、またCD34-、CD38-又はCD45
-である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、OCT-4+である。別の具体的
実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD200+である。別の具体的実施態様において、前
記胎盤幹細胞は、OCT-4+、CD200+、CD34-、CD38-及びCD45-である。
【００１０】
更に別の具体的実施態様において、OCT-4を発現し、かつ該胎盤幹細胞を含む胎盤細胞
の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条
件下で培養されるときに促進する前記胎盤幹細胞は、またCD73+及びCD105+である。別の
具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-である。別の特定
の実施態様において、前記胎盤の幹細胞は、CD200+である。別の具体的実施態様において
、前記胎盤幹細胞は、CD73+、CDl05+、CD200+、CD34-、CD38-及びCD45-である。
免疫応答を減少させる、又は抑制する方法の別の具体的実施態様において、前記免疫応
答は、移植片対宿主病である。別の具体的実施態様において、前記免疫応答は、自己免疫
疾、例えば糖尿病、エリテマトーデス又はリウマチ様関節炎である。
【００１１】
本方法の別の具体的実施態様において、前記複数の免疫細胞は、また、複数の非胎盤細
胞と接触される。このような非胎盤細胞には、例えばCD34+細胞を含むことができる。よ
り具体的実施態様において、前記CD34+細胞は、末梢血造血前駆細胞、臍帯血造血前駆細
胞又は胎盤血造血前駆細胞である。別の具体的実施態様において、前記非胎盤細胞は、間
充織幹細胞を含む。より具体的実施態様において、前記間充織幹細胞は、骨髄由来間充織
幹細胞である。別の具体的実施態様において、前記非胎盤細胞は、同種移植片内に含まれ
る。
本方法は、免疫応答の検出可能な抑制を行うために必要とされる程度の胎盤幹細胞を使
用することができる。例えば、複数の免疫細胞を接触させるために使用される複数の胎盤
幹細胞には、1×105胎盤幹細胞、1×106胎盤幹細胞、1×107胎盤幹細胞又は1×108胎盤幹
細胞又はそれより多い胎盤幹細胞を含むことができる。
【００１２】
本発明は、それらが免疫応答を調整する（例えば、抑制する）能力に基づいて選択され
る、胎盤幹細胞を含む細胞集団を産生する方法を更に提供する。一つの実施態様において
、例えば、本発明は、胎盤細胞集団を選択する方法であって、（a）混合リンパ球反応（M
LR）アッセイ法において複数の胎盤細胞をアッセイすること；及び（b）前記胎盤幹細胞
が：（i）基体に付着し；及び（ii）CD200及びHLA-Gを発現するか、又はCD73、CD105及び
CD200を発現するか、又はCD200及びOCT-4を発現するか、又はCD73、CD105及びHLA-Gを発
現するか、又はCD73及びCD105を発現し、かつ前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1
つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養される
ときに促進するか、又はOCT-4を発現し、かつ前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1
つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養される
ときに促進する前記複数の胎盤幹細胞が、MLR（混合リンパ球反応）においてCD4+又はCD8
+T細胞増殖を検出可能に抑制する場合、前記複数の胎盤幹細胞を選択すること；を含む、
前記方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、複数の細胞から（a）基体に付着し、（b）CD200及びHLA-Gを発現し、
及び（c）MLR（混合リンパ球反応）においてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制す
る胎盤幹細胞を選択すること；並びにその他の細胞から前記胎盤幹細胞を単離して細胞集
団を形成すること；を含む、細胞集団を選択する方法を提供する。また、本発明は、複数
の細胞から（a）基体に付着し、（b）CD73、CD105及びCD200を発現し、及び（c）MLRにお
いてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤幹細胞を選択すること；並びにそ
の他の細胞から前記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形成すること；を含む、細胞集団を
選択する方法を提供する。また、本発明は、複数の細胞から（a）基体に付着し、（b）CD
200及びOCT-4を発現し、及び（c）MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制
する胎盤幹細胞を選択すること；並びにその他の細胞から前記胎盤幹細胞を単離して細胞
集団を形成すること；を含む、細胞集団を選択する方法を提供する。また、本発明は、複
数の細胞から（a）基体に付着し、（b）CD73及びCD105を発現し、（c）胚様体様体の形成
が可能な条件下で培養されたときに胚様体様体を形成し、及び（d）MLRにおいてCD4+又は
CD8+T細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤幹細胞を選択すること；並びにその他の細胞か
ら前記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形成すること；を含む、細胞集団を選択する方法
を提供する。また、本発明は、複数の細胞から（a）基体に付着し、（b）CD73、CD105、H
LA-Gを発現し、及び（c）MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤
幹細胞を選択すること；並びにその他の細胞から前記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形
成すること；を含む、細胞集団を選択する方法を提供する。また、本発明は、細胞複数の
細胞から（a）基体に付着し、（b）OCT-4を発現し、（c）胚様体様体の形成が可能な条件
下で培養されたときに胚様体様体を形成し、及び（d）MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞増
殖を検出可能に抑制する胎盤幹を選択すること；並びにその他の細胞から前記胎盤幹細胞
を単離して細胞集団を形成すること；を含む、細胞集団を選択する方法を提供する。
本明細書の実施態様の任意の具体的実施態様において、前記T細胞及び前記胎盤幹細胞
は、前記MLRにおいて例えば約20：1、15：1、10：1、5：1、2：2、1：1、1：2、1：5、1
：10又は1：20、好ましくは5：1の比で存在する。
【００１４】
別の具体的実施態様において、本方法には、ABC-pを発現する細胞を選択することを含
む。別の具体的実施態様において、本方法には、間充織幹細胞に特異的な少なくとも１つ
の特徴を示す細胞を選択することを含む。より具体的実施態様において、間充織幹細胞に
特異的な前記特徴は、CD29の発現、CD44の発現、CD90の発現又は前述の組み合わせの発現
である。本方法の別の具体的実施態様において、前記選択は、抗体を使用して達成される
。別の具体的実施態様において、前記選択は、フローサイトメトリーを使用して達成され
る。別の具体的実施態様において、前記選択は、磁気ビーズを使用して達成される。別の
具体的実施態様において、前記選択は、蛍光標示式細胞選別器によって達成される。上記
方法の別の具体的実施態様において、前記細胞集団が増殖される。
【００１５】
本明細書の方法に使用される胎盤幹細胞は、胎盤全体に、又は胎盤の任意の部分に由来
することができる。例えば、種々の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、主に羊膜若し
くは羊膜及び絨毛膜に、又は羊膜若しくは羊膜及び絨毛膜のみに由来し、又は胎盤の灌流
の間に収集される胎盤灌流液に由来する。具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、
前記胎盤幹細胞の非存在下における前記MLRでのT細胞増殖の量と比較して、MLRにおいて
少なくとも50%、70%、90%又は95%までCD4+又はCD8+T細胞増殖を抑制する。別の具体的実
施態様において、前記胎盤幹細胞は、加えて、ナチュラルキラー（NK）細胞の活性を検出
可能に抑制する。
【００１６】
本発明は、免疫調節性胎盤細胞集団を選択するために、本明細書に記述した方法のいず
れかによって産生される胎盤幹細胞を含む単離された細胞集団であって、このような集団
は、MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制するとして同定された細胞集団
を更に提供する。例えば、一つの実施態様において、本発明は、単離された胎盤幹細胞を
含む細胞集団であって、前記胎盤幹細胞は：（a）基体に付着し；（b）CD200及びHLA-Gを
発現するか、又はCD73、CD105及びCD200を発現するか、又はCD200及びOCT-4を発現するか
、又はCD73、CD105及びHLA-Gを発現するか、又はCD73及びCD105を発現し、かつ胎盤幹細
胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体
の形成が可能な条件下で培養されるときに促進するか、又はOCT-4を発現し、かつ胎盤幹
細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様
体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進し、このような集団は、MLRにおいてCD4
+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制するとして同定された、前記細胞集団を提供する。
【００１７】
また、本発明は、（a）基体に付着し；（b）CD200及びHLA-Gを発現し、並びに（c）MLR
においてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制するとして同定された胎盤幹細胞を含
む、単離された細胞集団を提供する。また、本発明は、（a）基体に付着し、（b）CD73、
CD105及びCD200を発現し、並びに（c）MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に
抑制するとして同定された胎盤幹細胞を含む、単離された細胞集団を提供する。また、本
発明は、（a）基体に付着し、（b）CD200及びOCT-4を発現し、並びに（c）MLRにおいてCD
4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制するとして同定された胎盤幹細胞を含む、単離さ
れた細胞集団を提供する。また、本発明は、（a）基体に付着し、（b）CD73及びCD105を
発現し、（c）胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されたときに胚様体様体を形成し
、及び（d）MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制するとして同定された
胎盤幹細胞を含む、単離された細胞集団を提供する。また、本発明は、（a）基体に付着
し、（b）CD73、CD105及びHLA-Gを発現し、及び（c）MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞増殖
を検出可能に抑制するとして同定された胎盤幹細胞を含む、単離された細胞集団を提供す
る。また、本発明は、（a）基体に付着し、（b）OCT-4を発現し、（c）胚様体様体の形成
が可能な条件下で培養されたときに胚様体様体を形成し、及び（d）MLRにおいてCD4+又は
CD8+T細胞増殖を検出可能に抑制するとして同定された胎盤幹細胞を含む、単離された細
胞集団を提供する。
【００１８】
本組成物のより具体的実施態様において、CD200及びHLA-Gを発現する前記胎盤幹細胞は
、またCD73及びCD105を発現し、すなわちCD73+及びCD105+である。別の具体的実施態様に
おいて、前記胎盤細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-である。より具体的実施態様において
、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+及びCD105+である。別の具体的実施態
様において、前記複数の胎盤幹細胞は、該胎盤幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団か
らの1つ以上の胚様体様体の発生を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養
されるときに促進する。
【００１９】
本組成物の更に別の具体的実施態様において、CD73、CD105及びCD200を発現する前記胎
盤幹細胞は、またHLA-G+である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34
-、CD38-又はCD45-である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD
38-及びCD45-である。より具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、
CD45-及びHLA-G+である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、該胎盤幹細
胞を含む単離された胎盤細胞の集団からの1つ以上の胚様体様体の発生を、前記集団が胚
様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進する。
【００２０】
本組成物の更に別の具体的実施態様において、CD200及びOCT-4を発現する前記胎盤幹細
胞は、またCD73+及びCD105+を発現する。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞
は、HLA-G+である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-又は
CD45-である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-
である。より具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+
、CDl05+及びHLA-G+である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、胎盤幹細
胞を含む単離された胎盤細胞の集団からの1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚
様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進する。
【００２１】
更に別の具体的実施態様において、CD73、CD105及びHLA-Gを発現する前記胎盤幹細胞は
、またCD34-、CD38-又はCD45-である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は
、CD34-、CD38-及びCD45-である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、OCT
-4+である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD200+である。より具体
的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+及びCD200+であ
る。別の具体的実施態様において、前記幹細胞は、該胎盤幹細胞を含む単離された胎盤細
胞の集団からの1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条
件下で培養されるときに促進する。
【００２２】
本組成物の更に別の特定の実施態様において、CD73及びCD105を発現し、かつ該胎盤幹
細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様
体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進する前記胎盤幹細胞は、またCD34-、CD3
8-又はCD45-である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、OCT-4+である。
別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD200+である。別の具体的実施態様に
おいて、前記胎盤幹細胞は、OCT-4+、CD200+、CD34-、CD38-及びCD45-である。
【００２３】
更に別の具体的実施態様において、OCT-4を発現し、かつ胎盤幹を含む胎盤細胞の集団
における1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で
培養されるときに促進する前記胎盤幹細胞は、またCD73+及びCD105+である。別の具体的
実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-である。別の特定の実施
態様において、前記胎盤の幹細胞は、CD200+である。別の具体的実施態様において、前記
胎盤幹細胞は、CD73+、CDl05+、CD200+、CD34-、CD38-及びCD45-である。
【００２４】
本発明は、免疫調節性組成物を更に提供する。一つの実施態様において、本発明は、本
明細書に記述した任意の細胞集団の培養からの上清を含む組成物を提供する。別の実施態
様において、本発明は、胎盤幹細胞の培養からの培地を含む組成物であって、前記胎盤幹
細胞は、（a）基体に付着する；（b）CD200及びHLA-Gを発現するか、又はCD73、CD105及
びCD200を発現するか、又はCD200及びOCT-4を発現するか、又はCD73、CD105及びHLA-Gを
発現するか、又はCD73及びCD105を発現し、かつ該胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団にお
ける1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養
されるときに促進するか、又は、OCT-4を発現し、かつ該胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集
団における1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下
で培養されるときに促進し；並びに（c）MLR（混合リンパ球反応）においてCD4+又はCD8+
T細胞増殖を検出可能に抑制し、前記胎盤幹細胞の培養は、前記培地において24時間以上
培養された、前記組成物を提供する。具体的実施態様において、前記組成物は、複数の前
記胎盤幹細胞を含む。別の具体的実施態様において、前記組成物は、複数の非胎盤細胞を
含む。より具体的実施態様において、前記非胎盤細胞は、CD34+細胞を含む。CD34+細胞は
、例えば末梢血造血前駆細胞、臍帯血造血前駆細胞又は胎盤血造血前駆細胞であることが
できる。別の具体的実施態様において、前記非胎盤細胞は、間充織幹細胞を含む。より具
体的実施態様において、前記間充織幹細胞は、骨髄由来の間充織幹細胞である。別の具体
的実施態様において、組成物は、抗-MIP-1α又は抗MIP-1β抗体を更に含む。
【００２５】
別の具体的実施態様において、任意の前述の組成物はマトリックスを含む。より具体的
実施態様において、前記マトリックスは、三次元足場である。更に別の具体的実施態様に
おいて、前記マトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペ
クチン、オルニチン又はビトロネクチンを含む。更に別の具体的実施態様において、マト
リックスは、羊膜又は羊膜由来生体材料である。更に別の具体的実施態様において、前記
マトリックスは、細胞外膜タンパク質を含む。更に別の具体的実施態様において、前記マ
トリックスは、合成化合物を含む。更に別の具体的実施態様において、前記マトリックス
は、生物活性化合物を含む。更に別の具体的実施態様において、前記生物活性化合物は、
成長因子、サイトカイン、抗体又は5,000ダルトン未満の有機分子である。
【００２６】
本発明は、凍結保存された幹細胞集団、例えば本明細書に記述したような、細胞集団が
免疫調節性である胎盤幹細胞を含む細胞集団を更に提供する。例えば、本発明は、混合リ
ンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞増殖を検出可能に抑制するとして同定された
CD200+、HLA-G+胎盤幹細胞の集団であって、前記細胞は凍結保存されており、かつ前記集
団は容器内に含まれている、前記胎盤幹細胞の集団を提供する。また、本発明は、混合リ
ンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞増殖を検出可能に抑制するとして同定された
CD73+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞の集団であって、前記細胞は凍結保存されており、か
つ前記集団は容器内に含まれている、前記胎盤幹細胞の集団を提供する。また、本発明は
、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞増殖を検出可能に抑制するとして同
定されたCD200+、OCT-4+胎盤幹細胞の集団であって、前記細胞は、凍結保存されており、
かつ前記集団は容器内に含まれている、前記胎盤幹細胞の集団を提供する。また、本発明
は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞増殖を検出可能に抑制するとして
同定されたCD73+、CD105+胎盤幹細胞の集団であって、前記細胞は、凍結保存されており
、かつ前記集団は、容器内に含まれており、かつ前記幹細胞は、1つ以上の胚様体様体の
形成を、胚様体様体の形成が可能な条件下で胎盤幹細胞の集団と共に培養したときに促進
する、前記胎盤幹細胞の集団を提供する。本発明は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ
法においてT細胞増殖を検出可能に抑制するとして同定されたCD73+、CD105+、HLA-G+胎盤
幹細胞の集団であって、前記細胞は、凍結保存されており、かつ前記集団は容器内に含ま
れている、前記胎盤幹細胞の集団を更に提供する。また、本発明は、混合リンパ球反応（
MLR）アッセイ法においてT細胞増殖を検出可能に抑制するとして同定されたOCT-4+胎盤幹
細胞の集団であって、前記細胞は凍結保存されており、かつ前記集団は容器内に含まれて
おり、かつ前記幹細胞は、1つ以上の胚様体様体の形成を、胚様体様体の形成が可能な条
件下で胎盤細胞の集団と共に培養したときに促進する、前記胎盤幹細胞の集団を提供する
。
【００２７】
前述の凍結保存された集団の任意の具体的実施態様において、前記容器は、バッグであ
る。種々の具体的実施態様において、前記集団は、約、少なくとも、又は多くとも1×106
個の前記幹細胞、5×106ｖ個の前記幹細胞、1×107個の前記幹細胞、5×107個の前記幹細
胞、1×108個の前記幹細胞、5×108個の前記幹細胞、1×109個の前記幹細胞、5×109個の
前記幹細胞又は1×1010個の前記幹細胞を含む。任意の前述の凍結保存された集団のその
他の具体的実施態様において、前記幹細胞は、約、少なくとも5回、10回、15回又は20回
、若しくは5回以下、10回以下、15回以下又は20回以下で継代された。任意の前述の凍結
保存された集団の別の具体的実施態様において、前記幹細胞は、前記容器内で増殖された
。
【００２８】
（3.1 定義）
本明細書に使用される「SH2」という用語は、マーカーCD105上のエピトープに結合する
抗体をいう。従って、SH2+と呼ばれる細胞は、CD105+である。
本明細書に使用される「SH3」及び「SH4」という用語は、マーカーCD73上に存在するエ
ピトープに結合する抗体をいう。従って、SH3+及び／又はSH4+と呼ばれる細胞は、CD73+
である。
【００２９】
本明細書に使用される「単離された幹細胞」という用語は、幹細胞が由来する組織、例
えば胎盤のその他の非幹細胞から実質的に分離された幹細胞を意味する。幹細胞は、幹細
胞が天然において付随する非幹細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%又は少な
くとも99%が、例えば幹細胞の収集及び／又は培養の間に幹細胞から除去される場合に、
「単離」されている。
【００３０】
本明細書に使用される「単離された細胞の集団」という用語は、細胞の集団が由来する
組織、例えば胎盤のその他の細胞から実質的に分離された細胞の集団を意味する。たとえ
ば、幹細胞の集団は、幹細胞が天然において付随する集団の少なくとも50%、60%、70%、8
0%、90%、95%又は少なくとも99%が、例えば幹細胞の集団の収集及び／又は培養の間に幹
細胞の集団から除去される場合に、「単離」されている。
【００３１】
本明細書に使用される「胎盤幹細胞」という用語は、形態、細胞表面マーカー又は初代
培養後の継代数にかかわらず、組織培養基体（例えば、組織培養プラスチック又はフィブ
ロネクチンコートした組織培養プレート）に付着する、哺乳動物胎盤に由来する幹細胞又
は前駆細胞をいう。しかし、本明細書に使用される「胎盤幹細胞」という用語は、栄養膜
をいわない。細胞は、細胞が幹細胞の少なくとも１つの性状、例えば少なくとも１つのそ
の他のタイプの細胞に分化する能力、又はその他を保持する場合に、「幹細胞」とみなさ
れる。
【００３２】
本明細書に使用される幹細胞は、そのマーカーが検出可能であるときに、特定のマーカ
ーについて「陽性」である。例えば、胎盤幹細胞は、例えばCD73がバックグランドよりも
（例えば、アイソタイプ対照と比較して）検出可能に多量に胎盤幹細胞上で検出可能であ
るために、CD73について陽性である。また、細胞は、少なくとも１つのその他の細胞タイ
プから細胞を区別するためにそのマーカーを使用することができるか、又は該細胞によっ
て提示若しくは発現されたときに細胞を選択あるいは単離するために使用することができ
るときに、マーカーについて陽性である。
【００３３】
本明細書に使用される「免疫調節」及び「免疫調節性」とは、免疫応答の検出可能な変
化を生じさせること、及び生じさせる能力を有すること、並びに免疫応答の検出可能な変
化を生じさせる能力を意味する。
本明細書に使用される「免疫抑制」及び「免疫抑制性」とは、免疫応答の検出可能な減
少を生じさせること、及び生じさせる能力を有すること、並びに免疫応答の検出可能な抑
制を生じさせる能力を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
（5. 発明の詳細な記述）
（5.1 胎盤幹細胞を使用する免疫調節）
本発明は、免疫細胞（群）を複数の胎盤幹細胞と接触させることによる調整、例えば免
疫細胞又は複数の免疫細胞の活性の調整、、例えば活性の抑制、例えば増殖の調整を提供
する。一つの実施態様において、本発明は、複数の免疫細胞を、複数の胎盤幹細胞と、前
記胎盤幹細胞が免疫応答を検出可能に抑制するのに十分な時間接触させることを含む、免
疫応答を抑制する方法であって、前記胎盤幹細胞は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ
法においてT細胞増殖を検出可能に抑制する、前記方法を提供する。
【００３５】
胎盤幹細胞は、例えば本明細書において他に記述した胎盤幹細胞である（第5.2節を参
照されたい）。免疫抑制のために使用される胎盤幹細胞は、単一の胎盤又は複数の胎盤に
由来すること、又は該胎盤から得ることができる。また、免疫抑制のために使用される胎
盤幹細胞は、単一種、例えば意図されたレシピエントの種、若しくはその機能が低減され
、若しくは抑制される免疫細胞種に由来するか、又は複数種に由来することができる。
【００３６】
本方法の文脈において「免疫細胞」は、任意の免疫系細胞、特にT細胞及びNK（ナチュ
ラルキラー）細胞を意味する。従って、本方法の種々の実施態様において、胎盤幹細胞は
、該複数の免疫細胞が、複数のT細胞（例えば、複数のCD3+T細胞、CD4+T細胞及び／又はC
D8+T細胞）及び／若しくはナチュラルキラー細胞であるか、又は該細胞を含む複数の免疫
細胞と接触される。「免疫応答」は、本方法の文脈において、通常免疫細胞によって認知
される刺激に対する免疫細胞による任意の反応、例えば抗原の存在に対する反応であるこ
とができる。種々の実施態様において、免疫応答は、輸液若しくは移植片に存在する抗原
などの外来抗原に対して、又は自己免疫疾患のように自己抗原に対して反応するT細胞（
例えば、CD3+T細胞、CD4+T細胞及び／又はCD8+T細胞）の増殖であることができる。また
、免疫応答は、移植片に含まれるT細胞の増殖であることができる。また、免疫応答は、
ナチュラルキラー（NK）細胞の任意の活性、樹状細胞の成熟又はその他であることができ
る。また、免疫応答は、免疫細胞の1つ以上のクラスの活性の局部的、組織若しくは臓器
特異的又は全身的作用であることができ、例えば、免疫応答は、移植片対宿主病、炎症、
炎症関連瘢痕組織の形成、自己免疫性状態（例えば、リウマチ様関節炎、I型糖尿病、エ
リテマトーデス、その他）などであることができる。
【００３７】
「接触すること」には、この文脈において、胎盤幹細胞及び免疫細胞を、単一容器（例
えば、培養皿、フラスコ、小びんなど）又はインビボ、例えば同じ個体（例えば、哺乳類
、例えばヒト）において一緒にさせることを包含する。好ましい実施態様において、接触
させることは、免疫細胞の免疫機能の変化が検出可能である十分な時間並びに胎盤幹細胞
及び免疫細胞の十分な数との接触である。より好ましくは、種々の実施態様において、前
記接触は、胎盤幹細胞の非存在下での免疫機能と比較して、少なくとも50%、60%、70%、8
0%、90%又は95%まで免疫機能（例えば、抗原に応答するT細胞増殖）を抑制するために十
分である。インビボの文脈におけるこのような抑制は、インビトロアッセイ法（下記を参
照されたい）において決定することができ；すなわち、インビトロアッセイ法における抑
制の程度は、レシピエント個体における特定数の胎盤幹細胞及び多数の免疫細胞に関して
、個体における抑制の程度を推定することができる。
【００３８】
本発明は、特定の実施態様において、免疫応答、又は複数の免疫細胞の1つ以上のタイ
プの活性をインビトロで調整するために、胎盤幹細胞を使用する方法を提供する。胎盤幹
細胞及び複数の免疫細胞の接触には、複数の胎盤幹細胞の少なくとも一部が複数の免疫細
胞の少なくとも一部と相互作用するように、同じ物理的空間で胎盤幹細胞と免疫細胞とを
合わせること；共通の培地を用い、分離された物理的空間において胎盤幹細胞及び免疫細
胞を維持することを含むことができ；又は胎盤幹細胞若しくは免疫細胞の1つ若しくは培
養液からの培地をその他のタイプの細胞と接触させること（例えば、胎盤幹細胞の培養液
から培地を得て、単離された免疫細胞を培地に再懸濁する）を含むことができる。具体例
としては、接触は、混合リンパ球反応（MLR）である。
【００３９】
このような接触は、例えば特定の複数の胎盤幹細胞が免疫調節性、例えば免疫抑制性に
対する程度を決定するようにデザインされた実験状況において行うことができる。このよ
うな実験状況は、例えば混合リンパ球反応（MLR）又は退行アッセイ法であることができ
る。MLR及び退行アッセイ法を行うための手順は、当該技術分野において周知である。例
えば、Schwarzの論文、「混合リンパ球反応：寛容性のためのインビトロ試験」（"The Mi
xed Lymphocyte Reaction: An In Vitro Test for Tolerance"）、J. Exp. Med. 127（5
）：879-890 （1968）；Lacerdaらの論文、「ヒトエプスタインバーウイルス（EBV）特異
的細胞傷害性リンパ球は、異種移植したC.B-17 Scid／Scidマウスにおける自己EBV誘導B
リンパ球増殖の選択的退行に優先して向かい、及び誘導する」（"Human Epstein-Barr Vi
rus （EBV）-Specific Cytotoxic T Lymphocytes Home Preferentially to and Induce S
elective Regressions of Autologous EBV-Induced B Lymphoproliferations in Xenogra
fted C.B-17 Scid/Scid Mice"））J. Exp. Med. 183：1215-1228 （1996）を参照された
い。好ましい実施態様において、複数の胎盤幹細胞が複数の免疫細胞（例えば、リンパ球
、例えばCD3+、CD4+及び／又はCD8+Tリンパ球）と接触されるMLRが行われる。
【００４０】
MLRは、複数の胎盤幹細胞の免疫抑制の能力を決定するために使用することができる。
例えば、複数の胎盤幹細胞はCD4+又はCD8+T細胞、樹状細胞（DC）及び胎盤幹細胞を約10
：1：2の比でCD4+又はCD8+T細胞、樹状細胞（DC）及び胎盤幹細胞を合わせることを含むM
LRにおいて試験することができ、T細胞を、娘細胞に分配される、例えばCFSEなどの色素
で染色し、該T細胞を約6日間増殖させる。胎盤幹細胞の存在下において6日目のT細胞増殖
が、DCの存在下及び胎盤幹細胞の非存在におけるT細胞増殖と比較して検出可能に減少さ
れる場合、前記複数の胎盤幹細胞は、免疫抑制性である。このようなMLRにおいて、胎盤
幹細胞は、解凍される、又は培養から収集される。約20,000個の胎盤幹細胞を100μlの培
地（RPMI 1640、1mM HEPES緩衝液、抗生物質、及び5%のプールしたヒト血清）に再懸濁し
、ウェルの底面に2時間付着させる。CD4+及び／又はCD8+T細胞を全末梢血単核細胞Milten
yi磁気ビーズから単離する。細胞をCFSE染色し、合計100,000個のT細胞（CD4+T細胞単独
、CD8+T細胞単独又は同量のCD4+及びCD8+T細胞）をウェルあたりに添加する。ウェルの体
積を200μlにして、MLRを進行させる。
【００４１】
従って、一つの実施態様において、本発明は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法に
おいて、複数の免疫細胞を、複数の胎盤幹細胞と、前記胎盤幹細胞が免疫応答を検出可能
に抑制するのに十分な時間接触させることを含む、免疫応答を抑制する方法を提供する。
一つの実施態様において、MLRに使用される前記胎盤幹細胞は、胎盤幹細胞のより大きな
集団からの胎盤幹細胞の試料又は一定分量を表す。
【００４２】
異なる胎盤、又は同じ胎盤の異なる組織から得られた胎盤幹細胞の集団は、免疫細胞の
活性を調整するそれらの能力が異なり得る。、例えばT細胞の活性又は増殖若しくはNK細
胞活性を抑制する前記集団の能力は異なり得る。従って、使用前に、免疫抑制に対する胎
盤幹細胞の特定の集団の能力を決定することが望ましい。このような能力は、例えばMLR
又は退行アッセイ法において胎盤幹細胞集団の試料を試験することによって決定すること
ができる。一つの実施態様において、MLRは前記試料を用いて行い、該胎盤幹細胞に起因
するアッセイ法において免疫抑制の程度を決定する。そして、この免疫抑制の程度は、試
料採取した胎盤幹細胞集団に起因し得る。従って、MLRは、免疫機能を抑制する胎盤幹細
胞の特定の集団の絶対的及び相対的能力を決定する方法として使用することができる。ML
Rのパラメーターは、より多くのデータを提供するように、又は免疫抑制する胎盤幹細胞
の試料の能力を最良に決定するように変更することができる。例えば、胎盤幹細胞による
免疫抑制は、概略的には、当該アッセイ法に存在する胎盤幹細胞の数に比例して増加する
ようであるため、MLRは、一つの実施態様において、胎盤幹細胞の2倍以上の数、例えば反
応あたり1×103、3×103、1×104及び／又は3×104個の胎盤幹細胞で行うことができる。
また、本アッセイ法におけるT細胞の数に相対的な胎盤幹細胞の数も変更することができ
る。例えば、本アッセイ法における胎盤幹細胞及びT細胞は、例えば約10：1〜約1：10、
好ましくは約1：5の任意の比で存在することができるが、相対的により多くの数の胎盤幹
細胞又はT細胞を使用することができる。
退行アッセイ法も同様の様式で使用することができる。
【００４３】
また、本発明は、インビボで、免疫応答又は1つ以上のタイプの免疫細胞の複数の活性
を調整するために胎盤幹細胞を使用する方法を提供する。胎盤幹細胞及び免疫細胞は、例
えば複数の胎盤幹細胞のレシピエントである個体において接触させることができる。接触
が個体において行われる場合、一つの実施態様において、外来性の胎盤幹細胞（すなわち
、個体に由来しない胎盤幹細胞）と、個体に対して内因性の複数の免疫細胞との間で接触
させる。具体的実施態様において、個体内の免疫細胞は、CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T
細胞及び／又はNK細胞である。
【００４４】
胎盤幹細胞を使用するこのような免疫抑制は、不適当な、若しくは望ましくない免疫応
答によって生じた、又は悪化した、又は関連した、任意の状態に関して有利であろう。胎
盤幹細胞を媒介した免疫調節、例えば免疫抑制は、例えばそれ自体の組織の1つ以上に対
する個体の免疫系によって生じる不適当な免疫応答の抑制に有用であろう。従って、種々
の実施態様において、本発明は、免疫応答を抑制する方法であって、該免疫応答が自己免
疫疾患、例えばエリテマトーデス、糖尿病、リウマチ様関節炎又は多発性硬化症である、
前記方法を提供する。
【００４５】
複数の胎盤幹細胞の、免疫細胞の1つ以上のタイプの複数との接触は、レシピエント個
体に対する1つ以上のタイプの組織の移植術又は移植の状況において、又は補助として、
インビボにおいて行うことができる。このような組織は、例えば骨髄又は血液；器官；特
定組織（例えば、皮膚移植）；複合組織同種移植片（すなわち、2つ以上の異なるタイプ
の組織を含む移植片）；などであってもよい。この点に関しては、胎盤幹細胞は、レシピ
エント個体内に、移植された組織若しくは移植片内に、又は両方に含まれる1つ以上の免
疫細胞の1つ以上の免疫応答を抑制するために使用することができる。接触は、移植術若
しくは移植の前に、間に、及び／又は後に行うことができる。例えば、胎盤幹細胞は、移
植又は移植術の時に投与することができる。また、胎盤幹細胞は、又は代わりに、移植又
は移植術の前に、例えば移植又は移植術の約1、2、3、4、5、6又は7日前に投与すること
もできる。また、胎盤幹細胞は、又は代わりに、移植又は移植術の後に、例えば移植又は
移植の約1、2、3、4、5、6又は7日後に移植又は移植術レシピエントに投与することがで
きる。好ましくは、複数の胎盤幹細胞は、レシピエント個体又は移植された組織若しくは
移植片のいずれかによる免疫応答の任意の検出可能な徴候又は症候、例えば移植片対宿主
病の検出可能な徴候又は症候又は検出可能な炎症が検出可能になる前に、複数の胎盤幹細
胞と接触される。
【００４６】
別の実施態様において、個体内での接触は、主に、外来性胎盤幹細胞及び外来性前駆細
胞又は幹細胞、例えば免疫細胞に分化する外来性前駆細胞又は幹細胞との間での接触であ
る。例えば、癌療法に対する補助として部分的又は完全な免疫破壊又は骨髄抑制を受けて
いる個体には、幹細胞又は前駆細胞の1つ以上のその他のタイプと組み合わせて胎盤幹細
胞を受けさせることができる。例えば、胎盤幹細胞は、複数のCD34+細胞、例えばCD34+造
血幹細胞と組み合わせることができる。このようなCD34+細胞は、例えば末梢血、臍帯血
、胎盤血又は骨髄などの組織源からのCD34+細胞であることができる。CD34+細胞は、この
ような組織源から単離することができ、又は組織源全体（例えば、臍帯血又は骨髄の単位
）又は組織源から部分的に精製した標品（例えば、臍帯血からの白血球）を胎盤幹細胞と
組み合わせることができる。胎盤幹細胞と臍帯血又は臍帯血由来の幹細胞との組み合わせ
は、Haririの文献、米国出願公開第2003/0180269号に記述されている。
【００４７】
胎盤幹細胞は、好ましくは、個体において免疫細胞、例えばT細胞の公知であるか又は
予想される数に関して、約10：1〜約1：10、好ましくは約1：5の比で個体に投与される。
しかし、非限定的な例において、複数の胎盤幹細胞を、約10,000：1、約1,000：1、約100
：1、約10：1、約1：1、約1：10、約1：100、約1：1,000又は約1：10,000の比で個体に投
与することができる。一般に、免疫抑制を使用させるために、レシピエントキログラムあ
たり約1×105〜約1×108個の胎盤幹細胞、好ましくはレシピエントキログラムあたり約1
×106〜約1×107個の胎盤幹を投与することができる。種々の実施態様において、個体又
は対象に投与される複数の胎盤幹細胞は、少なくとも、約、1×105、3×105、1×106、3
×106、1×107、3×107、1×108、3×108、1×109、3×109個又はそれ以下、若しくはそ
れより多い胎盤幹細胞を含む。
【００４８】
また、胎盤幹細胞は、1つ以上の第2のタイプの幹細胞、例えば骨髄由来の間充織幹細胞
と共に投与することができる。このような第2の幹細胞は、個体に対して、例えば約1：10
〜約10：1の比の胎盤幹細胞で投与することができる。
インビボにおける胎盤幹細胞及び免疫細胞の接触を促進するために、胎盤幹細胞は、胎
盤幹細胞及び免疫細胞を互いに接触させるために十分な任意の経路によって個体に投与す
ることができる。例えば、胎盤幹細胞は、個体に対して、例えば静脈内に、筋肉内に、腹
腔内に、又は器官、例えば膵臓内に直接投与することができる。インビボの投与のために
は、胎盤幹細胞を下記の第5.6.1節に記載したような医薬組成物として処方することがで
きる。
【００４９】
加えて、免疫抑制の方法には、特にインビボの状況において、1つ以上の免疫抑制剤の
添加を含むことができる。一つの実施態様において、複数の胎盤幹細胞を、個体において
インビボで複数の免疫細胞と接触させて、免疫抑制剤を含む組成物を個体に投与する。免
疫抑制剤は、当該技術分野において周知であり、例えば抗T細胞受容体抗体（モノクロー
ナル若しくはポリクローナル、又はその抗体断片若しくは誘導体）、抗IL-2受容体抗体（
例えば、バシリキシマブ（シムレクト（SIMULECT）（登録商標））又はダクリズマブ（ゼ
ナパックス（ZENAPAX）（登録商標））、抗T細胞受容体抗体（例えば、ムロモナブ-CD3）
、アザチオプリン、副腎皮質ステロイド、シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノー
ル酸モフェチル、シロリムス、カルシニューリン阻害剤などを含む。具体的実施態様にお
いて、免疫抑制剤は、マクロファージ炎症性タンパク質（MIP）-1α又はMIP-1βに対する
中和抗体である。好ましくは、抗-MIP-1α又はMIP-1β抗体は、例えば移植時に、前記個
体におけるMIP-1α及び／又はMIP-1βの量の検出可能な減少を生じさせるために十分な量
で投与される。
【００５０】
（5.2 胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞集団）
本発明の免疫抑制の方法では、（1）組織培養基体に付着し；（2）非胎盤細胞型に分化
する能力を有し；及び（3）十分な数において、免疫機能、例えば混合リンパ球反応アッ
セイ法におけるCD4+及び／又はCD8+幹細胞の増殖を検出可能に抑制する能力を有する；胎
盤幹細胞、すなわち胎盤又はその一部から得られる幹細胞を使用する。胎盤幹細胞は、血
液、例えば胎盤血又は臍帯血に由来しない。本発明の方法及び組成物に使用される胎盤幹
細胞は、個体の免疫系を抑制する能力を有し、及び個体の免疫系を抑制するそれらの能力
について選択される。
【００５１】
胎盤幹細胞は、胎児又は母性起源のいずれであることができる（すなわち、母又は胎児
の遺伝子型を有することができる）。胎盤幹細胞の集団又は胎盤幹細胞を含む細胞の集団
は、起源が胎児のみ若しくは母性のみである胎盤幹細胞を含むことができ、又は胎児及び
母性起源の両方の混合された胎盤幹細胞の集団を含むことができる。胎盤幹細胞、及び胎
盤幹細胞を含む細胞の集団は、形態、マーカー、及び下記で論議する培養特性によって同
定及び選択することができる。
【００５２】
（5.2.1 物理的及び形態学的な特徴）
本発明に使用される胎盤幹細胞は、初代培養において、又は細胞培養において培養され
たときに、組織培養基体、例えば組織培養容器表面（例えば、組織培養プラスチック）に
付着する。培養における胎盤幹細胞は、一般に、多数の細胞質プロセスを有する、線維芽
細胞様、すなわち星状の外見であることが想定され、中心細胞体から増殖する。しかし、
胎盤幹細胞は、線維芽細胞が示すよりも多数のこのようなプロセスを示すので、胎盤幹細
胞は、同じ条件下で培養された線維芽細胞から形態的に区別可能である。また、形態的に
、胎盤幹細胞は、造血幹細胞から区別可能であり、これは、一般に培養においてより丸い
か、又は丸石の形態であることが想定される。
【００５３】
（5.2.2 細胞表面、分子、及び遺伝子マーカー）
本発明の方法及び組成物に有用な胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞の集団は、幹細胞若しくは
幹細胞を含む細胞の集団を同定及び／又は単離するために使用することができる複数のマ
ーカーを発現する。本発明の胎盤幹細胞及び幹細胞集団（すなわち2つ以上の胎盤幹細胞
）は、胎盤又はその任意の部分（例えば、羊膜、絨毛膜、胎盤子葉、その他）から直接得
られた幹細胞及び幹細胞含有細胞集団を含む。また、胎盤幹細胞集団には、培養における
胎盤幹細胞の集団（すなわち2つ以上）及び容器、例えばバッグ内の集団を含む。しかし
、胎盤幹細胞は、栄養膜ではない。
【００５４】
胎盤幹細胞は、一般にマーカーCD73、CD105、CD200、HLA-G及び／又はOCT-4を発現し、
かつCD34、CD38又はCD45を発現しない。また、胎盤幹細胞は、HLA-ABC（MHC-1）及びHLA-
DRを発現し得る。これらのマーカーは、胎盤幹細胞を同定し、及びその他の幹細胞タイプ
から胎盤幹細胞を区別するために使用することができる。胎盤幹細胞は、CD73及びCD105
を発現し得るので、これらは、間充織幹細胞様の特徴を有し得る。しかし、胎盤幹細胞は
、胎児特異的マーカーのCD200及びHLA-Gを発現し得るので、これらは、CD200もHLA-Gも発
現しない間充織幹細胞、例えば骨髄由来間充織幹細胞から区別することができる。同様に
、CD34、CD38及び／又はCD45の発現の欠如により、非造血幹細胞として胎盤幹細胞を同定
する。
【００５５】
一つの実施態様において、本発明は、CD200+、HLA-G+である複数の免疫抑制性胎盤幹細
胞を含む単離された細胞集団であって、前記複数は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ
法においてT細胞増殖を検出可能に抑制する、前記細胞集団を提供する。単離された集団
の具体的実施態様において、前記幹細胞は、またCD73+及びCD105+である。別の具体的実
施態様において、前記幹細胞は、またCD34-、CD38-又はCD45-である。より具体的実施態
様において、前記幹細胞は、またCD34-、CD38-、CD45-、CD73+及びCD105+である。別の実
施態様において、前記単離された集団は、胚様体様体の形成が可能な条件下で培養された
ときに、1つ以上の胚様体様体を産生する。
【００５６】
別の実施態様において、本発明は、CD73+、CD105+、CD200+である複数の免疫抑制性胎
盤幹細胞を含む単離された細胞集団であって、前記複数は、混合リンパ球反応（MLR）ア
ッセイ法においてT細胞増殖を検出可能に抑制する、前記細胞集団を提供する。前記集団
の具体的実施態様において、前記幹細胞は、HLA-G+である。別の特定の実施態様において
、前記幹細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-である。別の具体的実施態様において、前記幹
細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-である。より具体的実施態様において、前記幹細胞は、C
D34-、CD38-、CD45-及びHLA-G+である。別の特定の実施態様において、前記細胞集団は、
胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されたときに、1つ以上の胚様体様体を産生する
。
【００５７】
また、本発明は、CD200+、OCT-4+である複数の免疫抑制性胎盤幹細胞を含む単離された
細胞集団であって、前記複数は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞増殖
を検出可能に抑制する、前記細胞集団を提供する。具体的実施態様において、前記幹細胞
は、CD73+及びCD105+である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、HLA-G+であ
る。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-である。より
具体的実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+及びHLA-
G+である。別の具体的実施態様において、集団は、胚様体様体の形成が可能な条件下で培
養されたときに、1つ以上の胚様体様体を産生する。
【００５８】
また、本発明は、CD73+、CD105+及びHLA-G+である複数の免疫抑制性胎盤幹細胞を含む
単離された細胞集団であって、前記複数は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法におい
てT細胞増殖を検出可能に抑制する、前記細胞集団を提供する。上記の複数の具体的実施
態様において、前記幹細胞は、またCD34-、CD38-又はCD45-である。別の具体的実施態様
において、前記幹細胞は、またCD34-、CD38-及びCD45-である。別の具体的実施態様にお
いて、前記幹細胞は、またOCT-4+である。別の具体的実施態様において、前記幹細胞は、
またCD200+である。より具体的実施態様において、前記幹細胞は、またCD34-、CD38-、CD
45-、OCT-4+及びCD200+である。
【００５９】
また、本発明は、CD73+、CD105+幹細胞である複数の免疫抑制性胎盤幹細胞を含む単離
された細胞集団であって、前記複数は、胚様体様体の形成が可能な条件下で1つ以上の胚
様体様体を形成し、かつ前記複数は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞
増殖を検出可能に抑制する、前記細胞集団を提供する。具体的実施態様において、前記幹
細胞は、またCD34-、CD38-又はCD45-である。別の具体的実施態様において、前記幹細胞
は、またCD34-、CD38-及びCD45-である。別の具体的実施態様において、前記幹細胞は、
またOCT-4+である。より具体的実施態様において、前記幹細胞は、またOCT-4+、CD34-、C
D38-及びCD45-である。
【００６０】
また、本発明は、OCT4+幹細胞である複数の免疫抑制性胎盤幹細胞を含む単離された細
胞集団であって、前記集団は、胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されたときに、1
つ以上の胚様体様体を形成し、かつ前記複数は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法に
おいてT細胞増殖を検出可能に抑制する細胞集団を提供する。種々の実施態様において、
前記単離された胎盤細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも4
0%、少なくとも50%、少なくとも60%の、、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90
%又は少なくとも95%は、OCT4+幹細胞である。上記集団の具体的実施態様において、前記
幹細胞は、CD73+及びCD105+である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、CD34-
、CD38-又はCD45-である。別の具体的実施態様において、前記幹細胞は、CD200+である。
より具体的実施態様において、前記幹細胞は、CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-及
びCD45-である。別の具体的実施態様において、前記集団は、増殖され、例えば少なくと
も1回、少なくとも3回、少なくとも5回、少なくとも10回、少なくとも15回又は少なくと
も20回継代されている。
【００６１】
別の実施態様において、本発明は、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、CD200+、CD
34-及びCD133-である、複数の免疫抑制性胎盤幹細胞を含む単離された細胞集団を提供す
る。
上述の胎盤幹細胞の具体的実施態様において、胎盤幹細胞は、IL-6、IL-8及び単球化学
誘引物質タンパク質（MCP-1）を恒常的に分泌する。
上述した複数の胎盤幹細胞のそれぞれは、哺乳動物胎盤から直接得られかつ単離された
胎盤幹細胞、若しくは培養され、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、1
6、18、20、25、30、又はそれより多い回数継代された胎盤幹細胞又はこれらの組み合わ
せを含む。
上記の免疫抑制性の複数の胎盤幹細胞には、約、少なくとも、1×105、5×105、1×106
、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1
011個、又はそれ以下、若しくはそれより多い胎盤幹細胞を含むことができる。
【００６２】
（5.2.3 胎盤幹細胞集団の選択及び産生）
別の実施態様において、本発明は、また、複数の胎盤細胞から複数の免疫抑制性胎盤幹
細胞を選択する方法であって、前記細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30
%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%の、、少なくとも70%、少なくとも80%
、少なくとも90%又は少なくとも95%がCD200+、HLA-G+胎盤幹細胞であり、かつ前記胎盤幹
細胞は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞増殖を検出可能に抑制する胎
盤細胞の集団を選択することを含む、前記方法を提供する。具体的実施態様において、前
記選択は、またCD73+及びCD105+である幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態
様において、前記選択は、またCD34-、CD38-又はCD45-である幹細胞を選択することを含
む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-、CD45-、CD73+及びCD
105+である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は
、胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに1つ以上の胚様体様体を形成する
複数の胎盤幹細胞を選択することを含む。
【００６３】
別の実施態様において、本発明は、また、複数の胎盤細胞から複数の免疫抑制性胎盤幹
細胞を選択する方法であって、前記細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30
%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%の、、少なくとも70%、少なくとも80%
、少なくとも90%又は少なくとも95%がCD73+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞であり、かつ前
記胎盤幹細胞は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞増殖検出可能に抑制
する複数の胎盤細胞を選択することを含む、前記方法を提供する。具体的実施態様におい
て、前記選択は、またHLA-G+である幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様に
おいて、前記選択は、またCD34-、CD38-又はCD45-である胎盤幹細胞を選択することを含
む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-及びCD45-である胎盤
幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、C
D38-、CD45-及びHLA-G+である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様に
おいて、前記選択は、加えて、胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されたときに1つ
以上の胚様体様体を産生する胎盤細胞の集団を選択することを含む。
【００６４】
別の実施態様において、本発明は、また、複数の胎盤細胞から複数の免疫抑制性胎盤幹
細胞を選択する方法であって、前記細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30
%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%の、、少なくとも70%、少なくとも80%
、少なくとも90%又は少なくとも95%がCD200+、OCT-4+胎盤幹細胞であり、かつ前記胎盤幹
細胞は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞増殖検出可能に抑制する複数
の胎盤細胞を選択することを含む、前記方法を提供する。具体的実施態様において、前記
選択は、またCD73+及びCD105+である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の特定の実施
態様において、前記選択は、またHLA-G+である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具
体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-及びCD45-である胎盤幹細胞を選
択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-、CD45
-、CD73+、CD105+及びHLA-G+である胎盤幹細胞を選択することを含む。
【００６５】
別の実施態様において、本発明は、また、複数の胎盤細胞から複数の免疫抑制性胎盤幹
細胞を選択する方法であって、前記細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30
%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%の、、少なくとも70%、少なくとも80%
、少なくとも90%又は少なくとも95%がCD73+、CD 105+及びHLA-G+胎盤幹細胞であり、かつ
前記胎盤幹細胞は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞増殖検出可能に抑
制する複数の胎盤細胞を選択することを含む、前記方法を提供する。具体的実施態様にお
いて、前記選択は、またCD34-、CD38-又はCD45-である胎盤幹細胞を選択することを含む
。別の具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-及びCD45-である胎盤幹
細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またCD200+であ
る胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またCD
34-、CD38-、CD45-、OCT-4+及びCD200+である胎盤幹細胞を選択することを含む。
【００６６】
別の実施態様において、本発明は、また、複数の胎盤細胞から複数の免疫抑制性胎盤幹
細胞を選択する方法であって、前記細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30
%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%の、、少なくとも70%、少なくとも80%
、少なくとも90%又は少なくとも95%がCD73+、CD105+胎盤幹細胞であり、かつ前記複数は
、胚様体様体の形成が可能な条件下で1つ以上の胚様体様体を形成する複数の胎盤細胞を
選択することを含む、前記方法を提供する。具体的実施態様において、前記選択は、また
CD34-、CD38-又はCD45-である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様に
おいて、前記選択は、またCD34-、CD38-及びCD45-である胎盤幹細胞を選択することを含
む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またOCT-4+である胎盤幹細胞を選択する
ことを含む。より具体的実施態様において、前記選択は、またOCT-4+、CD34-、CD38-及び
CD45-である胎盤幹細胞を選択することを含む。
【００６７】
別の実施態様において、本発明は、また、複数の胎盤細胞から複数の免疫抑制性胎盤幹
細胞を選択する方法であって、前記細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30
%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%の、、少なくとも70%、少なくとも80%
、少なくとも90%又は少なくとも95%がOCT4+幹細胞であり、かつ前記複数は、胚様体様体
の形成が可能な条件下で1つ以上の胚様体様体を形成する複数の胎盤細胞を選択すること
を含む、前記方法を提供する。具体的実施態様において、前記選択は、またCD73+及びCD1
05+である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は
、またCD34-、CD38-又はCD45-である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施
態様において、前記選択は、またCD200+である胎盤幹細胞を選択することを含む。より具
体的実施態様において、前記選択は、またCD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-及びCD4
5-である胎盤幹細胞を選択することを含む。
【００６８】
また、本発明は、免疫抑制性集団又は複数の胎盤幹細胞を産生する方法を提供する。例
えば、本発明は、任意の複数の上記の胎盤幹細胞を選択すること、及びその他の細胞、例
えばその他の胎盤細胞から複数の胎盤幹細胞を単離することを含む、細胞集団を産生する
方法を提供する。具体的実施態様において、本発明は、前記胎盤細胞が（a）基体に付着
し、（b）CD200及びHLA-Gを発現するか、又はCD73、CD105及びCD200を発現するか、又はC
D200及びOCT-4を発現するか、又はCD73、CD105及びHLA-Gを発現するか、又はCD73及びCD1
05を発現し、かつ前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成
を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進するか、又はOC
T-4を発現し、かつ前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成
を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進し；並びに（c
）MLR（混合リンパ球反応）においてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤細
胞を選択すること；並びに、その他の細胞から前記胎盤細胞を単離して細胞集団を形成す
ること；を含む細胞集団を産生する方法を提供する。
【００６９】
より具体的実施態様において、本発明は、（a）基体に付着し、（b）CD200及びHLA-Gを
発現し、及び（c）MLR（混合リンパ球反応）においてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能
に抑制する胎盤幹細胞を選択すること；並びに、その他の細胞から前記胎盤幹細胞を単離
して細胞集団を形成すること；を含む細胞集団を産生する方法を提供する。別の具体的実
施態様において、本発明は、（a）基体に付着し、（b）CD73、CD105及びCD200を発現し、
及び（c）MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤幹細胞を選択す
ること；並びに、その他の細胞から前記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形成すること；
を含む細胞集団を産生する方法を提供する。別の具体的実施態様において、本発明は、（
a）基体に付着し、（b）CD200及びOCT-4を発現し、及び（c）MLRにおいてCD4+又はCD8+T
細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤幹細胞を選択すること；並びに、その他の細胞から前
記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形成すること；を含む細胞集団を産生する方法を提供
する。別の具体的実施態様において、本発明は、（a）基体に付着し、（b）CD73及びCD10
5を発現し、（c）胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されたときに胚様体様体を形成
し、並びに（d）MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤幹細胞を
選択すること；並びに、その他の細胞から前記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形成する
こと；を含む細胞集団を産生する方法を提供する。別の具体的実施態様において、本発明
は、（a）基体に付着し、（b）CD73、CD105及びHLA-Gを発現し、及び（c）MLRにおいてCD
4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤幹細胞を選択すること；並びに、その他
の細胞から前記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形成すること；を含む細胞集団を産生す
る方法を提供する。（a）基体に付着し、（b）OCT-4を発現し、（c）胚様体様体の形成が
可能な条件下で培養されたときに胚様体様体を形成し、並びに（d）MLRにおいてCD4+又は
CD8+T細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤幹細胞を選択すること；並びに、その他の細胞
から前記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形成すること；を含む細胞集団を産生する方法
。
【００７０】
免疫抑制性胎盤幹細胞集団を産生する方法の具体的実施態様において、前記T細胞及び
前記胎盤細胞は、前記MLRにおいて約5：1の比で存在する。本方法に使用される胎盤細胞
は、胎盤全体に、又は主に羊膜に、又は羊膜及び絨毛膜に由来することができる。別の具
体的実施態様において、胎盤細胞は、前記胎盤細胞の非存在下での前記MLRにおけるT細胞
増殖の量と比較して、前記MLRにおいて少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%又
は少なくとも95%までCD4+又はCD8+T細胞増殖を抑制する。加えて、本方法は、免疫調節、
例えばその他の免疫細胞の活性、例えばナチュラルキラー（NK）細胞の活性の抑制ができ
る胎盤幹細胞集団の選択及び／又は産生を含むことができる。
【００７１】
（5.2.4 培養における増殖）
本明細書に記述した胎盤幹細胞の増殖は、任意の哺乳動物細胞についてと同様に、部分
的には増殖のために選択される特定の培地に依存する。最適条件下において、胎盤幹細胞
は、典型的には3〜5日で数が二倍になる。培養の間に、本発明の胎盤幹細胞は、培養にお
ける基体、例えば組培養織容器の表層、（例えば、組織培養ディッシュプラスチック、フ
ィブロネクチンコートしたプラスチック、その他）に付着して、単層を形成する。
【００７２】
本発明の胎盤幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団は、適切な条件下で培養されたと
きに、胚様体様体を形成する、すなわち細胞の三次元クラスターが接着性幹細胞層の上に
成長する。胚様体様体内の細胞は、最初期幹細胞と関連するマーカー、例えばOCT-4、Nan
og、SSEA3及びSSEA4を発現する。胚様体様体内の細胞は、典型的には培養基体に接着性で
はなく、本明細書に記述した胎盤幹細胞も同様であるが、培養の間に接着細胞に付着され
たままである。胚様体様体は、接着性幹細胞の非存在下で形成しないので、胚様体様体細
胞は、生存性に関して接着性胎盤幹細胞に依存的である。従って、接着性胎盤幹細胞は、
接着性胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の増殖を促進する
。理論によって拘束されることは望まないが、胚幹細胞が、細胞の支持細胞層上で増殖す
るのと同じだけ、胚様体様体の細胞も、接着性胎盤幹細胞上で増殖することが考えられる
。間充織幹細胞、例えば骨髄に由来する間充織幹細胞は、培養において胚様体様体を発生
しない。
【００７３】
（5.2.5 分化）
本発明の方法に有用な胎盤幹細胞は、異なる委任細胞系統に分化可能である。例えば、
胎盤幹細胞は、脂肪生成、軟骨形成、神経原性又は骨原性の系統の細胞に分化することが
できる。このような分化は、例えば骨髄由来間充織幹細胞を同様の細胞系統に分化するた
めの当該技術分野において公知の任意の方法によって達成することができる。
【００７４】
（5.3 胎盤幹細胞を得る方法）
（5.3.1 幹細胞収集組成物）
本発明は、胎盤幹細胞を収集及び単離する方法を更に提供する。一般に、幹細胞は、生
理的に許容し得る溶液、例えば幹細胞収集組成物を使用して、哺乳動物胎盤から得られる
。幹細胞収集組成物は、2005年12月29日に出願された「胎盤幹細胞を収集及び保存するた
めの改善された組成物、並びに該組成物を使用する方法（"Improved Composition for Co
llecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Compositio
n"）」の表題の関連した米国仮出願第60/754,969号に詳述されている。
幹細胞収集組成物は、幹細胞の収集及び／又は培養のために適した任意の生理的に許容
し得る溶液、例えば生理食塩水（例えば、リン酸塩緩衝食塩水、クレブス（Kreb's）溶液
、修正クレブス溶液、イーグル溶液、0.9% NaClなど）、培地（例えば、DMEM、H.DMEMな
ど）などを含むことができる。
【００７５】
幹細胞収集組成物は、胎盤幹細胞を保存する傾向がある、すなわち収集時から培養時に
おいて、胎盤幹細胞が死滅するのを防げ、又は胎盤幹細胞の死滅を遅延させ、死滅する細
胞の集団における胎盤幹細胞の数を減少させる、1つ以上の成分又はそのようなものを含
むことができる。このような成分は、例えば以下であることができる：アポトーシス阻害
剤（例えば、カスパーゼ阻害剤又はJNK阻害剤）；血管拡張薬（例えば、硫酸マグネシウ
ム、降圧剤、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質
刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リ
ン酸エステル、アデノシン、インドメタシン又は硫酸マグネシウム、ホスホジエステラー
ゼ阻害剤など）；壊死阻害剤（例えば、2-（1Hインドール-3-イル）-3-ペンチルアミノ-
マレイミド、ピロリジンジチオカルバマート又はクロナゼパム）；TNF-α阻害剤；及び／
又は酸素含有パーフルオロカーボン（例えば、パーフルオロオクチルブロミド、パーフル
オロデシルブロミドなど）。
【００７６】
幹細胞収集組成物は、1つ以上の組織分解酵素、例えばメタロプロテアーゼ、セリンプ
ロテアーゼ、中性プロテアーゼ、RNase若しくはDNase又はそのようなものを含むことがで
きる。このような酵素には、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼI、II、III、又はIV、
ヒストリチクス菌由来コラゲナーゼなど）；ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ
、トリプシン、リベラーゼ（LIBERASE）、ヒアルロニダーゼなどを含むが、限定されない
。
【００７７】
幹細胞収集組成物は、抗生物質の殺菌的又は細菌静的に有効な量を含むことができる。
特定の非限定的な実施態様において、抗生物質は、マクロライド（例えば、トブラマイシ
ン）、セファロスポリン（例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプ
ロジル（cefprozil）、セファクロル、セフィキシム又はセファドロキシル）、クラリス
ロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン（例えば、ペニシリンV）又はキノロン（例
えば、オフロキサシン、シプロフロキサシン又はノルフロキサシン（norfloxacin））、
テトラサイクリン、ストレプトマイシン、その他である。具体的実施態様において、抗生
物質は、グラム（+）及び／又はグラム（-）細菌、例えば緑膿菌（Pseudomonas aerugino
sa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）その他に対して活性である。
【００７８】
また、幹細胞収集組成物は、以下の化合物の1つ以上を含むことができる：アデノシン
（約1mM〜約50mM）；D-グルコース（約20mM〜約100mM）；マグネシウムイオン（約1mM〜
約50mM）；一つの実施態様において、内皮完全性及び細胞生存能を維持するために十分な
量で存在する20,000ダルトンよりも大きな分子量の巨大分子（例えば、25g/l〜約100g/l
又は約40g/l〜約60g/lで存在する、合成又は天然に存在するコロイド、デキストラン又は
ポリエチレングリコールなどの多糖体）；抗酸化剤（例えば、約25μM〜約100μMで存在
する、ブチルヒドロキシアニゾール、ブチルヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミ
ンC又はビタミンE）；還元剤（例えば、約0.1mM〜約5mMで存在するN-アセチルシステイン
）；細胞内へのカルシウム流入防止薬（例えば、約2μM〜約25μMで存在するベラパミル
）；ニトログリセリン（例えば、約0.05g/l〜約0.2g/L）；一つの実施態様において、残
留する血液の凝固を防止するのを補助するために十分な量で存在する、抗凝固薬（例えば
、約1000単位/l〜約100,000単位/lの濃度で存在するヘパリン又はヒルジン）；又はアミ
ロライド含有化合物（例えば、約1.0μM〜約5μMで存在するアミロライド、エチルイソプ
ロピル、アミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド又はイソブ
チルアミロライド）。
【００７９】
（5.3.2 胎盤の収集及び取扱い）
一般に、ヒト胎盤は、出生後にその娩出直後に回収される。好ましい実施態様において
、胎盤は、インフォームドコンセント後に、及び患者の完全な病歴を得て胎盤と関連させ
た後に、患者から回収される。好ましくは、病歴は、分娩後も続ける。このような病歴を
使用して、その後の胎盤又はそこから収集される幹細胞の使用を調整した。例えば、病歴
を考慮して、胎盤と関連する乳児のための個人化された医薬のために、又は乳児の親、同
胞若しくはその他の親類のために、ヒト胎盤幹細胞を使用することができる。
【００８０】
胎盤幹細胞の回復の前に、臍帯血及び胎盤血が除去される。特定の実施態様において、
分娩後に、胎盤の臍帯血が回収される。胎盤は、従来の臍帯血回収過程に供することがで
きる。典型的には、針又はカニューレが使用され、重力を用いて、胎盤を失血させる（例
えば、Andersonの文献、米国特許第5,372,581号；Hesselらの文献、米国特許第5,415,665
号を参照されたい）。針又はカニューレは、通常臍静脈に置かれ、胎盤を穏やかにマッサ
ージして、胎盤から臍帯血を排出するのを補助することができる。このような臍帯血回収
は、商業的に、例えばLifeBank社、Cedar Knolls, N.J., ViaCord, Cord Blood Registry
and Cryocellで行ってもよい。好ましくは、胎盤は、臍帯血回復の間の組織破壊を最小
化するために、更なる操作を伴わずに重力で排出される。
【００８１】
典型的には、胎盤は、例えば灌流又は組織解離による臍帯血の回収及び幹細胞の収集の
ために、分娩又は出産室から別の場所、例えば研究室まで輸送される。胎盤は、好ましく
は、例えば胎盤を無菌の熱的に絶縁された輸送装置（20〜28℃の間に胎盤の温度を維持す
る）に、無菌のジップ-ロックプラスチック袋内にクランプした近位臍帯と共に置き、次
いでこれを断熱された容器に置くことによって輸送される。別の実施態様において、胎盤
は、実質的に2005年9月19日に出願された係属中の米国特許出願第11/230,760号に記載さ
れているような臍帯血収集キットで輸送される。好ましくは、胎盤は、分娩の4〜24時間
後に研究室に送達される。特定の実施態様において、近位臍帯は、臍帯血回収の前に胎盤
の盤への挿入の好ましくは4〜5cm（センチメートル）以内に固定される。その他の実施態
様において、近位臍帯は、臍帯血回収後に、しかし胎盤のさらなる処理前に固定される。
【００８２】
胎盤は、幹細胞収集の前に、無菌条件下で、及び室温又は5〜25℃（摂氏）の温度のい
ずれかにて貯蔵することができる。胎盤は、48時間より長い期間の間、及び好ましくは任
意の残留する臍帯血を除去するために胎盤を灌流する前の4〜24時間の期間の間、貯蔵し
てもよい。胎盤は、好ましくは抗凝血溶液中に5〜25℃（摂氏）の温度にて貯蔵される。
適切な抗凝血溶液は、当該技術分野において周知である。例えば、ヘパリン又はワルファ
リンナトリウムの溶液を使用することができる。好ましい実施態様において、抗凝血溶液
は、ヘパリンの溶液（例えば、1%w/wの1：1000溶液）を含む。失血させた胎盤は、胎盤幹
細胞を収集する前に、好ましくは36時間以下の間貯蔵される。
【００８３】
例えば、哺乳動物胎盤又はその部分は、一旦上記の通りに一般に収集、及び調製される
と、任意の当該技術分野において公知の様式で処理治療することができ、例えば灌流し、
又は崩壊させ、例えば1つ以上の組織崩壊酵素で消化して、幹細胞を得ることができる。
【００８４】
（5.3.3 胎盤組織の物理的破壊及び酵素消化）
一つの実施態様において、幹細胞は、器官の物理的破壊、例えば酵素消化によって哺乳
動物胎盤から収集される。例えば、胎盤又はその一部は、例えば粉砕し、剪断し、刻み、
さいの目に切り、細断し、侵して柔らかくするなどしてもよいが、その一方で、本発明の
幹細胞収集組成物と接触させて、その後に組織を1つ以上の酵素で消化させる。また、胎
盤又はその一部は、物理的に崩壊させ、及び1つ以上の酵素で消化し、次いで生じる材料
を本発明の幹細胞収集組成物に浸漬又は混合してもよい。任意の物理的破壊方法を使用す
ることができるが、例えばトリパンブルー排除によって決定すると、本破壊方法により、
生存可能な前記器官の細胞の複数、より好ましくは大部分及びより好ましくは少なくとも
60%、70%、80%、90%、95%、98%又は99%を残すことを条件とする。
【００８５】
胎盤は、物理的破壊及び／又は酵素消化、並びに幹細胞回収の前に成分に解剖すること
ができる。例えば、胎盤幹細胞は、羊膜、絨毛膜、胎盤子葉又は任意のこれらの組み合わ
せから得ることができる。好ましくは、胎盤幹細胞は、羊膜及び絨毛膜を含む胎盤組織か
ら得られる。典型的には、胎盤幹細胞は、胎盤組織の小さなブロック、例えば約1、2、3
、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500
、600、700、800、900又は約1000立方ミリメートルの体積である胎盤組織のブロックの破
壊によって得ることができる。
【００８６】
好ましい幹細胞収集組成物は、1つ以上の組織破壊的酵素（類）を含む。好ましくは、
酵素消化には、酵素の組み合わせ、例えばマトリックスメタロプロテアーゼと中性プロテ
アーゼとの組み合わせ、例えばコラゲナーゼとディスパーゼとの組み合わせを使用する。
一つの実施態様において、胎盤組織の酵素消化は、コラゲナーゼ、ディスパーゼ及びヒア
ルロニダーゼの組み合わせ又はリベラーセ（LIBERASE）（Boehringer Mannheim社、India
napolis, Ind.）及びヒアルロニダーゼの組み合わせなどの、マトリックスメタロプロテ
アーゼ、中性プロテアーゼ及びヒアルロン酸の消化のための粘液溶解酵素の組み合わせを
使用する。胎盤組織を崩壊させるために使用することができるその他の酵素には、パパイ
ン、デオキシリボヌクレアーゼや、トリプシン、キモトリプシン又はエラスターゼなどの
セリンプロテアーゼを含む。セリンプロテアーゼは、血清中のα2ミクログロブリンによ
って阻害され得るので、従って、消化のために使用する培地は、通常無血清である。EDTA
及びDNaseは、一般に細胞回収の効率を上昇させるための酵素消化手順に使用される。消
化産物は、好ましくは、粘稠性消化産物内に幹細胞が補足されるのを回避するために、希
釈される。
【００８７】
任意の組織消化酵素の組み合わせを使用することができる。組織消化酵素のための典型
的な濃度は、例えばコラゲナーゼ I及びコラゲナーゼIVについて50〜200U/ml、ディスパ
ーゼについて1〜10U/ml、並びにエラスターゼについて10〜100U/mlを含む。プロテアーゼ
は、組み合わせて、すなわち同じ消化反応において2つ以上プロテアーゼを使用すること
、又は胎盤幹細胞を遊離するために連続して使用することができる。例えば、一つの実施
態様おいて、胎盤又はその一部は、最初に適切な量のコラゲナーゼIで2mg/mlにて30分間
消化し、続いてトリプシン、0.25%で37℃にて10分間消化する。セリンプロテアーゼは、
好ましくはその他の酵素の使用に続いて連続して使用される。
【００８８】
別の実施態様において、組織は、幹細胞の単離の前に、幹細胞を含む幹細胞収集組成物
に、又は組織を崩壊させる及び／若しくは消化する溶液に、幹細胞収集組成物と共に、キ
レート剤、例えばエチレングリコールビス（2-アミノエチルエーテル）-N,N,N'N'-4酢酸
（EGTA）又はエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を添加することによって更に崩壊させるこ
とができる。
胎盤全体又は胎盤の一部が胎児及び母性の両方の細胞を含む場合（例えば、胎盤の一部
が絨毛膜又は子葉を含む場合）、収集される胎盤幹細胞には、胎児及び母性の供与源に由
来する胎盤幹細胞の混合物を含むであろうことが認識されるであろう。母親細胞（例えば
、羊膜）を全く含まないか、又はごくわずかな数含む胎盤の一部の場合、収集される胎盤
幹細胞には、ほぼ胎児の胎盤幹細胞だけを含むであろう。
【００８９】
（5.3.4 胎盤灌流）
また、胎盤幹細胞は、哺乳動物胎盤の灌流によって得ることができる。幹細胞を得るた
めに哺乳動物胎盤を灌流する方法は、例えばHaririの文献、米国出願公開第2002/0123 14
1号に、及び2005年12月29日に出願された「胎盤幹細胞を収集及び保存するための改善さ
れた組成物、並びに該組成物を使用する方法（"Improved Composition for Collecting a
nd Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition"）」の表
題の関連した米国仮出願第60/754,969号に開示されている。
【００９０】
胎盤幹細胞は、灌流、例えば灌流溶液として幹細胞収集組成物を使用して、例えば胎盤
脈管構造を通すことによって収集することができる。一つの実施態様において、哺乳動物
胎盤は、臍帯動脈及び臍静脈の一方又は両方を通して灌流溶液を通すことによって灌流さ
れる。胎盤を通る灌流溶液の流れは、例えば胎盤内への重力流を使用して達成してもよい
。好ましくは、灌流溶液は、ポンプ、例えばペリスタル型ポンプを使用して強制的に胎盤
を通す。臍静脈は、例えば、無菌の管などの無菌の連結装置に接続されているカニューレ
、例えばテフロン（登録商標）又はプラスチックカニューレでカニューレ処置することが
できる。無菌の連結装置は、灌流マニホルドに接続される。
【００９１】
灌流の準備において、胎盤は、好ましくは、臍帯動脈及び臍静脈が胎盤の最も高い位置
に位置するように向ける（例えば、懸濁する）。胎盤は、胎盤の脈管構造を通して、又は
胎盤の脈管構造及び周囲組織を通して、灌流液体、例えば本発明の幹細胞収集組成物を通
すことによって灌流することができる。一つの実施態様において、臍帯動脈及び臍静脈は
、柔軟なコネクタを介して灌流溶液の貯蔵所に接続されたピペットに同時に接続される。
灌流溶液を臍静脈及び動脈に通す。灌流溶液は、血管壁から胎盤の周囲組織に滲出させ、
及び／又は血管壁を通過させ、妊娠の間に母の子宮に付着させた胎盤の表面から適切な開
放容器に収集する。また、灌流溶液は、臍帯開口部を介して導入して、母性の子宮壁との
界面である胎盤壁の開口部から流出又は浸出させてもよい。別の実施態様において、灌流
溶液は、臍静脈を通過させて、臍帯動脈から収集されるか、又は臍帯動脈を通過させて、
臍静脈から収集される。
【００９２】
一つの実施態様において、近位臍帯を灌流の間に固定し、より好ましくは胎盤の盤への
臍帯の挿入の4〜5cm（センチメートル）以内に固定される。
【００９３】
失血処理の間の哺乳動物胎盤からの灌流液体の最初の収集では、一般に臍帯血及び／又
は胎盤血の残留赤血球で着色している。灌流が進行するにつれて、灌流液体は無色になり
、残留臍帯血細胞が胎盤から洗い流される。一般に、最初に胎盤を失血させるためには、
30〜100ml（ミリリットル）の灌流液が適切であるが、観察される結果に応じて、より多
くの、又はより少ない灌流液体を使用してもよい。
【００９４】
胎盤幹細胞を収集するために使用される灌流液体の体積は、収集される幹細胞の数、胎
盤のサイズ、単一の胎盤から行われる収集の数などに応じて変化させてもよい。種々の実
施態様において、灌流液体の体積は、50ml〜5000ml、50ml〜4000ml、50ml〜3000ml、100m
L〜2000ml、250ml〜2000ml、500ml〜2000ml又は750ml〜2000mlであってもよい。典型的に
は、胎盤は、失血に続いて700〜800mlの灌流液体で灌流される。
【００９５】
胎盤は、数時間又は数日の期間にわたって複数回灌流することができる。胎盤が複数回
灌流される場合、これを無菌条件下で入れ物又はその他の適切な容器内で維持し、又は培
養して、幹細胞収集組成物又は標準的な灌流溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水（「PBS」
）などの通常の生理食塩溶液）で、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウ
ム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン）の有無において、及び／又は抗菌剤（例えば、
β-メルカプトエタノール（0.1mM）；ストレプトマイシン（例えば、40〜100μg/mlで）
、ペニシリン（例えば、40U/mlで）、アンフォテリシンB（例えば、0.5μg/mlにて）など
の抗生物質）の有無において灌流してもよい。一つの実施態様において、単離された胎盤
は、胎盤が灌流及び灌流液の収集の前に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、1
4、15、16、17、18、19、20、21、22、23若しくは24時間、又は2若しくは3日又はそれよ
り長い日数の間維持又は培養されるように、灌流液を収集することなくしばらくの間維持
又は培養される。灌流された胎盤は、1以上の更なる時間、例えば1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間又はそれより
長い時間の間維持して、例えば700〜800mlの灌流液体で二度目に灌流することができる。
胎盤は、例えば1、2、3、4、5又は6時間毎に一回、1、2、3、4、5又はそれより多い回数
灌流することができる。好ましい実施態様において、胎盤の灌流及び灌流溶液、例えば幹
細胞収集組成物の収集は、回収された有核細胞の数が100細胞/mlを下回って低下するまで
繰り返される。異なる時点の灌流液を更に個々に処理して、細胞、例えば幹細胞の時間依
存的な集団を回収することができる。また、異なる時点からの灌流液をプールすることが
できる。
【００９６】
任意の理論によって拘束されることは望まないが、失血及び十分な時間の胎盤の灌流後
、胎盤幹細胞は、失血及び灌流された胎盤の微小循環に移動すると考えられ、そこで、本
発明の方法に従って、好ましくは灌流によって収集容器内を洗浄することによってこれら
を収集する。単離された胎盤の灌流は、残留臍帯血を除去するだけでなく、酸素を含む適
切な栄養素を胎盤に提供するのにも役に立つ。胎盤は、好ましくは抗血液凝固剤を添加す
ることなく、残留臍帯血細胞を除去するために使用される同様の溶液で培養及び灌流して
もよい。
【００９７】
本発明の方法に従った灌流により、前記溶液で灌流されていない、及びさもなければ幹
細胞を得るための処理（例えば、組織破壊、例えば酵素消化による）がされていない哺乳
動物胎盤から得られる数よりも有意に多くの胎盤幹細胞の収集をもたらす。この文脈にお
いて、「有意に多い」とは、少なくとも10%多いことを意味する。例えば、本発明の方法
に従った灌流により、胎盤又はその一部が培養された培地から得られる胎盤幹細胞の数よ
りも有意に多い胎盤幹細胞を生じる。
【００９８】
幹細胞は、1つ以上のプロテアーゼ又はその他の組織破壊酵素を含む溶液での灌流によ
って胎盤から単離することができる。具体的実施態様において、胎盤又はその一部（例え
ば、羊膜、羊膜及び絨毛膜、胎盤小葉若しくは子葉、又は前述の任意の組み合わせ）を25
〜37℃にさせ、200mlの培地中で1つ以上の組織破壊酵素と共に30分間インキュベートする
。灌流液からの細胞を収集し、4℃にして、5mM EDTA、2mM ジチオスレイトール及び2mM 
β-メルカプトエタノールを含む冷却阻害剤混合物で洗浄する。幹細胞を数分後に本発明
の冷却（例えば、4℃）幹細胞収集組成物で洗浄する。
【００９９】
パン（pan）法を使用する灌流（これにより、灌流液が胎盤の母側から滲出した後に収
集される）により、胎児及び母性の細胞の混合物を生じることが、認識されるであろう。
その結果、本方法によって収集された細胞には、胎児及び母性の両方の起源の胎盤幹細胞
の混合された集団を含む。対照的に、単に胎盤の脈管構造だけを通す灌流（これにより、
灌流液体が1つ又は2つの胎盤の血管を通過し、単に残りの血管を通って収集される）では
、ほとんど胎児起源の胎盤幹細胞の集団のみの収集となる。
【０１００】
（5.3.5 胎盤幹細胞の単離、分取及び特性付け）
哺乳動物胎盤からの幹細胞は、灌流又は酵素消化によって得られるかどうかにかかわら
ず、最初にフィコール勾配遠心分離によってその他の細胞から精製すること（すなわち、
他の細胞から単離すること）ができる。このような遠心分離では、遠心分離速度などに関
して、任意の標準的なプロトコルに従うことができる。一つの実施態様において、例えば
、胎盤から収集される細胞は、5000×gにて室温で15分間の遠心分離によって灌流液から
回収され、これにより、例えば細胞を混入する細片及び血小板から分離する。別の実施態
様において、胎盤灌流液を約200mlまで濃縮し、穏やかにフィコール上に層にして、約110
0×gで22℃にて20分間遠心分離し、細胞の低密度界面層を更なる処理のために収集する。
【０１０１】
細胞ペレットを新鮮な幹細胞収集組成物又は幹細胞維持のために適した培地、例えば2U
/mlヘパリン及び2mM EDTA（GibcoBRL社、NY）を含むIMDM無血清培地に再懸濁することが
できる。総単核細胞分画は、例えば製造業者の推奨された手順に従ってLymphoprep（Nyco
med Pharma社、Oslo、Norway）を使用して単離することができる。
本明細書に使用される、胎盤幹細胞を「単離すること」とは、幹細胞が通常無処置の哺
乳動物胎盤において付随する細胞の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%
、95%又は99%を除去することを意味する。器官からの幹細胞は、幹細胞が通常無処置の器
官において付随している細胞の50%未満を含む細胞の集団にそれが存在するときに、「単
離されて」いる。
【０１０２】
灌流又は消化によって得られた胎盤細胞は、例えば、更に又は最初に、例えば0.2%のED
TA（Sigma社, St. Louis MO）を含む0.05%のトリプシンの溶液を使用する差動的トリプシ
ン処理によって単離することができる。胎盤幹細胞は、典型的には約5分以内にプラスチ
ック表面から剥離するが、その他の接着集団は、典型的には20〜30分以上のインキュベー
ションが必要であるので、差動的トリプシン処理が可能である。剥離された胎盤幹細胞は
、トリプシン処理及び例えばトリプシン中和溶液（TNS、Cambrex社）を使用して、トリプ
シン中和後に収集することができる。接着細胞の単離の一つの実施態様において例えば、
約5〜10×106細胞の一定分量を、いくつかのT-75フラスコ、好ましくはフィブロネクチン
コートしたT75フラスコのそれぞれに置く。このような実施態様において、細胞を市販の
間充織幹細胞増殖培地（MSCGM）（Cambrex社）と共に培養して、組織培養インキュベータ
ー（37℃、5%のCO2）に置くことができる。10〜15日後、非接着細胞をPBSで洗浄すること
によってフラスコから除去する。次いで、PBSをMSCGMによって置き換える。フラスコは、
好ましくは種々の接着細胞タイプの存在について、及び特に線維芽細胞様細胞のクラスタ
ーの同定及び増殖について、毎日調べる。
【０１０３】
哺乳動物胎盤から収集される細胞の数及びタイプは、例えばフローサイトメトリー、細
胞選別、免疫細胞化学（例えば、組織特異的な又は細胞-マーカー特異的抗体での染色）
蛍光標示式細胞分取器（FACS）、磁気標示式細胞分取器（MACS）などの標準的な細胞検出
技術を使用して形態及び細胞表面マーカーの変化を測定することによって、光学顕微鏡観
察又は共焦点顕微鏡観察を使用する細胞の形態の検査によって、並びに／又はPCR及び遺
伝子発現プロファイリングなどの当該技術分野における周知技術を使用して遺伝子発現の
変化を測定することによって、モニターすることができる。これらの技術を使用して、1
つ以上の特定のマーカーについて陽性である細胞を同定することもできる。例えばCD34に
対する抗体を使用して、上記の技術を使用し、細胞がCD34の検出可能な量を含むかどうか
を決定することができ；その場合は、細胞はCD34+である。同様に、細胞がRT-PCRによっ
て検出可能なほど十分なOCT-4 RNAを産生するか、又は成人細胞よりも有意に多いOCT-4RN
Aの場合、細胞はOCT-4+である。細胞表面マーカー（例えば、CD34などのCDマーカー）に
対する抗体及びOCT-4などの幹細胞特異的遺伝子の配列は、当該技術分野において周知で
ある。
【０１０４】
胎盤細胞、特にフィコール分離、差動的接着又は両方の組み合わせによって単離された
細胞は、蛍光標示式細胞分取器（FACS）を使用して分取してもよい。蛍光標示式細胞分取
（FACS）は、粒子の蛍光特性に基づいて、細胞を含む粒子を分離するための周知の方法で
ある（Kamarchの文献, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165）。個々の粒子における蛍
光部分のレーザー励起により、わずかな電荷が生じ、混合物から正及び負の粒子の電磁分
離が可能となる。一つの実施態様において、細胞表面マーカー特異的抗体又はリガンドを
異なる蛍光標識で標識する。細胞を、細胞選別機を通して処理し、使用した抗体に対して
これらが結合する能力に基づいて細胞を分離することができる。FACS分取された粒子は、
分離及びクローニングを促進するために、96ウェル又は384ウェルプレートの個々のウェ
ルに直接入れてもよい。
【０１０５】
一つの分取スキームにおいて、胎盤からの幹細胞は、マーカーCD34、CD38、CD44、CD45
、CD73、CD105、OCT-4及び／又はHLA-Gの発現に基づいて分取される。これは、培養にお
けるこれらの接着特性に基づいて幹細胞を選択するための手順と合わせて達成することが
できる。例えば、接着選択幹は、マーカー発現に基づいて分取の前又は後に達成すること
ができる。一つの実施態様において、例えば、細胞を最初にこれらのCD34の発現に基づい
て分取し；CD34-細胞を保持して、CD200+HLA-G+細胞を他の全てのCD34細胞から分離する
。別の実施態様において、胎盤からの細胞は、これらのマーカーCD200及び／又はHLA-Gの
発現に基づいており；例えば、これらのマーカーのいずれかを示す細胞を更に使用するた
めに単離する。例えば、CD200及び／又はHLA-Gを発現する細胞を、具体的実施態様におい
て、これらのCD73及び／若しくはCD105の発現、抗体SH2、SH3若しくはSH4によって認識さ
れるエピトープ、又はCD34、CD38若しくはCD45の発現の欠如に基づいて更に分取すること
ができる。例えば、一つの実施態様において、胎盤細胞をCD200、HLA-G、CD73、CD105、C
D34、CD38及びCD45の発現、又はその欠如よって分取して、CD200+、HLA-G+、CD73+、CD10
5+、CD34-、CD38-及びCD45-である胎盤細胞を更なる使用のためにその他の胎盤細胞から
単離する。
【０１０６】
別の実施態様において、細胞を分離するために磁気ビーズを使用することができる。
細胞は、磁気標示式細胞分取（MACS）技術（粒子を、これらが磁気ビーズ（0.5〜100μm
直径）に結合する能力に基づいて分離するための方法）を使用して分取してもよい。特定
の細胞表面分子又はハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合性付加を含む種々の有用
な修飾を磁気微粒子に対して行うことができる。次いで、ビーズを細胞と混合して結合さ
せる。次いで、細胞を、磁場を通過させ、特異的細胞表面マーカーを有する細胞を分離す
る。一つの実施態様において、次いでこれらの細胞を単離して、更なる細胞表面マーカー
に対する抗体に結合させた磁気ビーズと再び混合することができる。細胞を再び磁場を通
過させ、両抗体に結合した細胞を単離する。次いで、このような細胞をクローン単離のた
めのマイクロタイターディッシュなどの別々のディッシュに希釈することができる。
【０１０７】
また、胎盤幹細胞は、細胞形態及び増殖特性に基づいて特徴づけること、及び／又は分
取することができる。例えば、胎盤幹細胞は、例えば培養において線維芽細胞様外見を有
するとして特徴づけること、及び／又は線維芽細胞様外見に基づいて選択することができ
る。また、胎盤幹細胞は、これらが胚様体様体を形成する能力を有するとして特徴づける
こと、及び／又はこれらが胚様体様体を形成する能力に基づいて選択することができる。
一つの実施態様において、例えば、形状が線維芽細胞様であり、CD73及びCD105を発現し
、培養において1つ以上の胚様体様体を産生する胎盤細胞を、その他の胎盤細胞から単離
する。別の実施態様において、培養において1つ以上の胚様体様体を産生するOCT-4+胎盤
細胞をその他の胎盤細胞から単離する。
【０１０８】
別の実施態様において、胎盤幹細胞は、コロニー形成単位アッセイ法によって同定する
こと、及び特徴づけることができる。Mesen Cult（商標）培地（Stem Cell Technologies
社、Vancouver British Columbia）などのコロニー形成単位アッセイ法は、当該技術分野
において一般に公知である。
胎盤幹細胞は、トリパンブルー排除アッセイ法、フルオレセイン二酢酸摂取アッセイ法
、ヨウ化プロピジウム摂取アッセイ法（生存度を評価するため）；及びチミジン摂取アッ
セイ法、MTT細胞増殖アッセイ法（増殖を評価するため）などの当該技術分野において公
知の標準的な技術を使用して、生存度、増殖能及び寿命を評価することができる。寿命は
、増殖させた培養における集団倍加の最大数を決定することによるなど、当該技術分野に
おいて周知方法によって決定してもよい。
【０１０９】
また、胎盤幹細胞は、当該技術分野において公知のその他の技術、例えば所望の細胞選
択的増殖（ポジティブ選択）、望まれない細胞の選択的破壊（ネガティブ選択）；混合集
団における差動的細胞被凝集性に基づいた、例えばダイズ凝集素での分離；凍結融解法；
濾過；従来遠心分離及びゾーン遠心分離；遠心溶出法（カウンタ-ストリーミング遠心分
離）；単位重力分離；向流分配；電気泳動法；その他を使用して他の胎盤細胞から分離す
ることもできる。
【０１１０】
（5.4 胎盤幹細胞の培養）
（5.4.1培地）
単離された胎盤幹細胞、若しくは胎盤幹細胞集団、又は胎盤幹細胞を培養する細胞若し
くは胎盤組織を使用して、細胞培養を開始又は播種することができる。細胞は、一般にコ
ーティングしてない無菌の組織培養容器へ移すか、又はラミニン、コラーゲン（例えば、
天然又は変性型）、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン及び細胞
外膜タンパク質（例えば、マトリゲル（Matrigel）（BD Discovery Labware社, Bedford,
Mass.））などの細胞外基質又はリガンドでコートされている無菌の組織培養容器へ移す
。
【０１１１】
胎盤幹細胞は、幹細胞の培養のために許容し得るものとして当該技術分野において認識
される任意の培地において、及び任意の条件下で培養することができる。好ましくは、培
地には、血清を含む。胎盤幹細胞は、例えばITS（インスリン-トランスフェリン-セレン
）、LA+BSA（リノール酸-ウシ血清アルブミン）、デキストロース、L-アスコルビン酸、P
DGF、EGF、IGF-1及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むDMEM-LG（ダルベッコ修正基
本培地、低グルコース）／MCDB 201（ヒヨコ線維芽細胞基礎培地）；10%ウシ胎児血清（F
BS）を含むDMEM-HG（高グルコース）；15% FBSを含むDMEM-HG；10% FBS、10% ウマ血清及
びヒドロコルチゾンを含むIMDM（イサコフ修正ダルベッコ培地）；10% FBS、EGF及びヘパ
リンを含むM199；10% FBS、GlutaMAX（商標）及びゲンタマイシンを含むα-MEM（最小基
本培地）；10% FBS、GlutaMAX（商標）及びゲンタマイシンを含むDMEM；などにおいて培
養することができる。好ましい培地は、2%のFBS、ITS、LA+BSA、デキストロース、L-アス
コルビン酸、PDGF、EGF及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むDMEM-LG/MCDB-201で
ある。
【０１１２】
胎盤幹細胞を培養するために使用することができるその他の培地には、DMEM（高又は低
グルコース）、イーグル基本培地、ハム（Ham's）F10培地（F10）、ハムF-12培地（F12）
イサコフ修正ダルベッコ培地、間充織幹細胞増殖培地（MSCGM）、リーボビッツ（Liebovi
tz's）L-15培地、MCDB、DMIEM/F12、RPMI 1640、アドバンスドDMEM（Gibco社）、DMEM/MC
DB2O1（Sigma社）及びCELL-GRO FREEを含む。
【０１１３】
培地は、例えば、以下を含む1つ以上の成分と組み合わせて補充することができる：血
清（例えば、ウシ胎児血清（FBS）、好ましくは約2〜15%（v/v）；ウマ科（ウマ）血清（
ES）；ヒト血清（HS））；β-メルカプトエタノール（BME）、好ましくは約0.001%（v/v
）；1つ以上の成長因子、例えば血小板由来成長因子（PDGF）、上皮細胞成長因子（EGF）
、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、インスリン様成長因子-1（IGF-1）、白血病抑制
因子（LIF）、血管内皮成長因子（VEGF）及びエリスロポエチン（EPO）；L-バリンを含む
アミノ酸；並びに、例えばペニシリンG、硫酸ストレプトマイシン、アンフォテリシンB、
ゲンタマイシン及びニスタチンなどの微生物汚染を制御するための1つ以上の抗生物質の
及び／又は抗真菌薬。
【０１１４】
（5.4.2 胎盤幹細胞の伸展及び増殖）
一旦、単離された胎盤幹細胞又は幹細胞の単離された集団（例えば、幹細胞又は幹細胞
の集団がインビボにおいて通常付随する胎盤細胞の少なくとも50%から分離された幹細胞
又は幹細胞の集団）が単離されたら、幹細胞又は幹細胞の集団をインビトロで増殖及び伸
展させることができる。例えば、胎盤幹細胞の集団は、組織培養容器、例えばディッシュ
、フラスコ、マルチウェルプレート又はその他において、幹細胞が70〜90%コンフルエン
スに増殖するために十分な時間、すなわち幹細胞及びそれらの子孫が組織培養容器の培養
表面領域の70〜90%を占めるまで、培養することができる。
【０１１５】
胎盤幹細胞は、細胞増殖が可能な密度で培養容器に播種することができる。例えば、細
胞は、低密度（例えば、約1,000〜約5,000細胞／cm2）から高密度（例えば、約50,000以
上の細胞／cm2）で播種してもよい。好ましい実施態様において、細胞は、空気中約0〜約
5容量パーセントのCO2にて培養される。一部の好ましい実施態様において、細胞は、空気
中約2〜約25パーセントのO2にて、好ましくは空気中約5〜約20パーセントのO2にて培養さ
れる。細胞は、好ましくは約25℃〜約40℃、好ましくは37℃にて培養される。細胞は、好
ましくはインキュベーターにおいて培養される。培地は、静置か、又は例えばバイオリア
クターを使用して撹拌される。胎盤幹細胞は、好ましくは低酸化ストレス下で培養される
（例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、N-アセチルシ
ステイン、又はその他の添加を伴う）。
【０１１６】
一旦70%〜90%のコンフルエンスが得られたら、細胞を継代してもよい。例えば、細胞は
、当該技術分野において周知の技術を使用して、酵素処理して、例えばトリプシン処理し
て、組織培養表面からこれらを分離することができる。ピペット操作によって細胞を除去
して細胞を計数後、約20,000〜100,000個の幹細胞、好ましくは約50,000個の幹細胞を新
鮮な培地を含む新たな培養容器に継代する。典型的には、新たな培地は、幹細胞が除去さ
れた培地と同じタイプである。本発明は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1
2、14、16、18又は20回又はそれより多く継代された胎盤幹細胞の集団を包含する。
【０１１７】
（5.4.3 胎盤幹細胞集団）
本発明は、胎盤幹細胞の集団を提供する。胎盤幹細胞集団は、1つ以上の胎盤から直接
に単離することができる；すなわち、胎盤幹細胞集団は、灌流液から得られ、若しくは灌
流液内に含まれ、消化物（すなわち、胎盤又はその一部の酵素消化によって得られた細胞
のコレクション）から得られ、若しくは消化物内に含まれる胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の
集団であることができる。また、本発明の単離された胎盤幹細胞を培養し、及び増殖させ
て、胎盤幹細胞集団を産生することもできる。また、胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団を
培養し、及び増殖させて、胎盤幹細胞集団を産生することができる。
本発明の胎盤幹細胞集団には、胎盤幹細胞、例えば本明細書に記述したような胎盤幹細
胞を含む。種々の実施態様において、単離された胎盤幹細胞集団における細胞の少なくと
も10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%又は99%が胎盤幹細胞である。す
なわち、胎盤幹細胞集団は、例えば1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、
90%程度の非幹細胞を含むことができる。
【０１１８】
本発明は、例えば酵素消化又は灌流に由来するかどうかにかかわらず、特定のマーカー
及び／又は特定の培養若しくは形態的特徴を発現する胎盤幹細胞を選択することによって
単離された胎盤幹細胞集団を産生する方法を提供する。一つの実施態様において、例えば
、本発明は、（a）基体に付着し、及び（b）CD200及びHLA-Gを発現する胎盤細胞を選択す
ること；並びに前記細胞をその他の細胞から単離して細胞集団を形成すること；を含む細
胞集団を産生する方法を提供する。別の実施態様において、細胞集団を産生する方法は、
（a）基体に付着し、及び（b）CD73、CD105及びCD200を発現する胎盤細胞を選択すること
；並びに前記細胞をその他の細胞から単離して細胞集団を形成すること；を含む。別の実
施態様において、細胞集団を産生する方法は、（a）基体に付着し、及び（b）CD200及びO
CT-4を発現する胎盤細胞を選択すること；並びに前記細胞をその他の細胞から単離して細
胞集団を形成すること；を含む。別の実施態様において、細胞集団を産生する方法は、（
a）基体に付着し、（b）CD73及びCD105を発現し、及び（c）前記幹細胞を含む胎盤細胞の
集団における1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件
下で培養されるときに促進する胎盤細胞を選択すること；並びに前記細胞をその他の細胞
から単離して細胞集団を形成すること；を含む。別の実施態様において、細胞集団を産生
する方法は、（a）基体に付着し、及び（b）CD73、CD105及びHLA-Gを発現する胎盤細胞を
選択すること；並びに前記細胞をその他の細胞から単離して細胞集団を形成すること；を
含む。別の実施態様において、細胞集団を産生する方法は、（a）基体に付着し、（b）OC
T-4を発現し、及び（c）前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体
の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進する胎盤
細胞を選択すること；並びに前記細胞をその他の細胞から単離して細胞集団を形成するこ
と；を含む。任意の上記の実施態様において、本方法は、加えて、ABC-p（胎盤特異的ABC
輸送体タンパク質；例えばAllikmetsらの論文、Cancer Res. 58（23）：5337-9（1998）
を参照されたい）を発現する胎盤細胞を選択することを含むことができる。また、本方法
は、例えば間充織幹細胞に特異的な少なくとも１つの特徴、例えばCD29の発現、CD44の発
現、CD90の発現又は前述の組み合わせの発現を示す細胞を選択することを含むことができ
る。
【０１１９】
上記実施態様において、基体は、細胞、例えば胎盤幹細胞の培養及び／又は選択を達成
することができる任意の表面であることができる。典型的には、基体は、プラスチック、
例えば組織培養ディッシュ又はマルチウェルプレートプラスチックである。組織培養プラ
スチックは、生体分子で、例えばラミニン又はフィブロネクチンでコートすることができ
る。
細胞、例えば胎盤幹細胞は、細胞選択の技術分野において公知の任意の手段によって胎
盤幹細胞集団について選択することができる。例えば、細胞は、例えばフローサイトメト
リー又はFACSで、1つ以上の細胞表面マーカーに対する抗体又は抗体群を使用して選択す
ることができる。選択は、磁気ビーズと組み合わせて抗体を使用して達成することができ
る。特定の幹細胞関連マーカーに対して特異的である抗体は、当該技術分野において公知
である。例えば、OCT-4（Abcam社、Cambridge、MA）、CD200（Abcam社）、HLA-G（Abcam
社）、CD73（BD Biosciences Pharmingen社, San Diego Ca）、CD105（Abcam社；BioDesi
gn International社, Saco, ME）、その他に対する抗体。また、その他のマーカーに対す
る抗体も市販されており、例えばCD34、CD38及びCD45は、例えばStemCell Technologies
社又はBioDesign International社から入手可能である。
単離された胎盤幹細胞集団は、幹細胞ではない胎盤細胞又は胎盤細胞ではない細胞を含
むことができる。
【０１２０】
単離された胎盤幹細胞集団は、非幹細胞又は非胎盤細胞の1つ以上の集団と組み合わせ
ることができる。例えば、胎盤幹細胞の単離された集団は、血液（例えば、胎盤血又は臍
帯血）、血液由来幹細胞（例えば、胎盤血又は臍帯血に由来する幹細胞）、血液由来有核
細胞の集団、骨髄由来間葉細胞、骨由来幹細胞集団、未精製骨髄、成体（体細胞）幹細胞
、組織内に含まれる幹細胞の集団、培養された幹細胞、完全に分化した細胞の集団（例え
ば、軟骨細胞、線維芽細胞、羊水細胞、骨芽細胞、筋細胞、心臓細胞など）、その他と組
み合わせることができる。単離された胎盤幹細胞集団における細胞は、それぞれの集団に
おける総有核細胞の数に比較して、約100,000,000：1、50,000,000：1、20,000,000：1、
10,000, 000：1、5,000,000：1、 2,000,000：1、1,000,000：1、 500,000：1、200,000
：1、100, 000：1、50,000：1、20,000：1、10,000：1、5,000：1、2,000：1、1,000：1
、500：1, 200：1、100：1、50：1、20：1、10：1、5：1、2：1、1：1；1：2；1：5；1：
10；1：100；1：200；1：500；1：1,000；1：2,000；1：5,000；1：10,000；1：20,000；
1：50,000；1：100,000；1：500,000；1：1,000,000；1：2,000,000；1：5,000,000；1：
10,000,000；1：20,000,000；1：50,000,000；又は約1：100,000,000の比で、別のタイプ
の複数の細胞と組み合わせることができる。単離された胎盤幹細胞集団における細胞は、
同様に複数の細胞型の複数の細胞と組み合わせることができる。
一つにおいて、単離された胎盤幹細胞の集団は、複数の造血幹細胞と組み合わせられる
。このような造血幹細胞は、例えば未処理の胎盤、臍帯血又は末梢血内に；胎盤血、臍帯
血又は末梢血からの総有核細胞に；胎盤血、臍帯血又は末梢血からの単離されたCD34+細
胞の集団に；未処理の骨髄に；骨髄からの総有核細胞に；骨髄からのCD34+細胞の単離さ
れた集団に、又はその他に含まれ得る。
【０１２１】
（5.5 胎盤幹細胞の保存）
胎盤幹細胞は、保存すること、すなわち長期貯蔵を可能にする条件又は例えばアポトー
シス若しくは壊死による細胞死を阻害する条件の下に置くことができる。
胎盤幹細胞は、2005年12月25日に出願された「胎盤幹細胞を収集及び保存するための改
善された組成物、並びに該組成物を使用する方法（"Improved Composition for Collecti
ng and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition"）」
の表題の関連した米国仮出願第60/754,969号に記載されているように、例えばアポトーシ
ス阻害剤、壊死阻害剤及び／又は酸素含有パーフルオロカーボンを含む組成物を使用して
保存することができる。一つの実施態様において、本発明は、幹細胞の集団を保存する方
法であって、前記幹細胞の集団をアポトーシスの阻害剤及び酸素含有パーフルオロカーボ
ンを含む幹細胞収集組成物と接触することを含み、前記アポトーシスの阻害剤は、アポト
ーシスの阻害剤と接触しない幹細胞の集団と比較して、幹細胞の集団におけるアポトーシ
スを減少させ、又は防止するために十分な量及び時間で存在する、前記方法を提供する。
具体的実施態様において、前記アポトーシスの阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。別の
具体的実施態様において、前記アポトーシスの阻害剤は、JNK阻害剤である。より具体的
実施態様において、前記JNK阻害剤は、前記幹細胞の分化又は増殖を調整しない。別の実
施態様において、前記幹細胞収集組成物は、前記アポトーシスの阻害剤及び前記酸素含有
パーフルオロカーボンを別々の相に含む。別の実施態様において、前記幹細胞収集組成物
は、前記アポトーシスの阻害剤及び前記酸素含有パーフルオロカーボンを乳剤中に含む。
別の実施態様において、幹細胞収集組成物は、加えて、乳化剤、例えばレシチンを含む。
別の実施態様において、前記アポトーシス阻害剤及び前記パーフルオロカーボンは、幹細
胞を接触させる時に、約0℃〜約25℃の間である。更に別の具体的実施態様において、前
記アポトーシス阻害剤及び前記パーフルオロカーボンは、幹細胞を接触させる時に、約2
℃〜10℃の間又は約2℃〜約5℃の間である。更に別の具体的実施態様において、前記接触
は、前記幹細胞の集団の輸送の間に行われる。更に別の具体的実施態様において、前記接
触は、前記幹細胞の集団の凍結融解の間に行われる。
【０１２２】
別の実施態様において、本発明は、胎盤幹細胞の集団を保存する方法であって、前記幹
細胞の集団をアポトーシスの阻害剤及び器官保存化合物と接触させることを含み、前記ア
ポトーシスの阻害剤は、アポトーシスの阻害剤と接触しない幹細胞の集団と比較して、幹
細胞の集団におけるアポトーシスを減少させ、又は防止するために十分な量及び時間で存
在する、前記方法を提供する。具体的実施態様において、器官保存化合物は、UW溶液（米
国特許第4,798,824に記述されており；ViaSpanとしても知られ；Southardらの論文、Tran
splantation 49（2）：251-257（1990）も参照されたい）又は米国特許第5,552,267号に
記述された溶液である。別の実施態様において、前記器官保存化合物は、ヒドロキシエチ
ル澱粉、ラクトビオ酸（lactobionic acid）、ラフィノース又はこれらの組み合わせであ
る。別の実施態様において、幹細胞収集組成物は、加えて、酸素含有パーフルオロカーボ
ンを二相で、又は乳剤としてのいずれかで含む。
【０１２３】
本方法の別の実施態様において、胎盤幹細胞は、灌流の間にアポトーシス阻害剤及び酸
素含有パーフルオロカーボン、器官保存化合物又はこれらの組み合わせを含む幹細胞収集
組成物と接触される。別の実施態様において、前記幹細胞は、組織破壊、例えば酵素消化
の過程の間に接触される。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、灌流による収集後、又
は組織破壊、例えば酵素消化による収集後に前記幹細胞収集化合物と接触される。
【０１２４】
典型的には、胎盤細胞の収集、濃縮及び単離の間に、低酸素及び機械的ストレスによる
細胞ストレスを最小にするか、又は除去することが好ましい。従って、本方法の別の実施
態様において、幹細胞又は幹細胞の集団は、収集、濃縮又は単離の間に、前記保存の間の
6時間未満の間、正常な血液酸素濃度未満である酸素の濃度である酸素圧低下状態に曝露
される。より具体的実施態様において、前記幹細胞の集団は、前記保存の間に、2時間未
満の間、前記酸素圧低下状態に曝露される。更に別の具体的実施態様において、前記幹細
胞の集団は、収集、濃縮又は単離の間に、1時間未満又は30分未満の間、前記酸素圧低下
状態に曝露されるか、又は酸素圧低下状態に曝露されない。別の具体的実施態様において
、前記幹細胞の集団は、収集、濃縮又は単離の間にずり応力に曝露されない。
【０１２５】
本発明の胎盤幹細胞は、例えば小さな容器、例えばアンプル内の凍結保存培地に凍結保
存することができる。適切な凍結保存培地は、例えば増殖培地又は細胞凍結培地、例えば
市販の細胞凍結培地、例えばC2695、C2639又はC6039（Sigma社）を含む培地を含むが、限
定されない。凍結保存培地は、好ましくはDMSO（ジメチルスルホキシド）を、例えば約10
%（v/v）の濃度にて含む。凍結保存培地は、更なる薬剤、例えばメチルセルロース及び／
又はグリセロールを含んでいてもよい。胎盤幹細胞は好ましくは、凍結保存の間に約1℃
／分にて冷却される。好ましい凍結保存温度は、約-80℃〜約-180℃、好ましくは約-125
℃〜約-140℃である。凍結保存された細胞は、使用のために解凍する前に、液体窒素へ移
すことができる。一部の実施態様において、例えば、一旦アンプルが約-90℃に到達した
ならば、これらを液体窒素貯槽領域に移す。凍結保存された細胞は、約25℃〜約40℃の温
度にて、好ましくは約37℃の温度に解凍される。
【０１２６】
（5.6胎盤幹細胞の使用）
（5.6.1胎盤幹細胞を含む組成物）
本発明の免疫抑制の方法には、胎盤幹細胞又はそこからの生体分子を含む組成物を使用
することができる。同様に、本発明の複数の胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞の集団は、例えば
研究又は治療に使用するための任意の生理的に許容され、若しくは医学的に許容し得る化
合物、組成物又は装置と組み合わせることができる。
【０１２７】
（5.6.1.1 凍結保存された胎盤幹細胞）
本発明の免疫抑制性胎盤幹細胞集団は、保存すること、例えばあとで使用するために凍
結保存することができる。細胞、例えば幹細胞の凍結保存のための方法は、当該技術分野
において周知である。胎盤幹細胞集団は、個体に容易に投与可能な形態に調製することが
できる。例えば、本発明は、医療用に適した容器内に含まれる胎盤幹細胞集団を提供する
。このような容器は、例えば無菌のプラスチック袋、フラスコ、ジャー又は胎盤幹細胞集
団を容易に分配することができるその他の容器であることができる。例えば、容器は、血
液バッグ又はレシピエントに対する液体の静脈内投与のために適した医学的に許容し得る
その他のプラスチックバッグであることができる。容器は、好ましくは合わせた幹細胞集
団を凍結保存できるものである。
凍結保存された免疫抑制性胎盤幹細胞集団は、単一のドナーに、又は複数のドナーに由
来する胎盤幹細胞を含むことができる。胎盤幹細胞集団は、意図されたレシピエントに完
全にHLA一致又は部分的若しくは完全にHLAミスマッチし得る。
【０１２８】
従って、一つの実施態様において、本発明は、容器内に免疫抑制性胎盤幹細胞集団を含
む組成物を提供する。具体的実施態様において、幹細胞集団は、凍結保存されている。別
の具体的実施態様において、容器は、バッグ、フラスコ又はジャーである。より具体的実
施態様において、前記バッグは、無菌のプラスチック袋である。より具体的実施態様にお
いて、前記バッグは、前記胎盤幹細胞集団を静脈内投与させ、又は促進するために適して
いる。バッグは、投与前に、又は間に、相互接続されて胎盤幹細胞と1つ以上のその他の
溶液、例えば薬物の混合が可能な複数の穴又はコンパートメントを含むことができる。別
の具体的実施態様において、組成物は、合わせた幹細胞集団の凍結保存を促進する1つ以
上の化合物を含む。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞集団は、生理的に許容
し得る水溶液内に含まれる。より具体的実施態様において、前記生理的に許容し得る水性
溶液は、0.9% NaCl溶液である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞集団は、
前記幹細胞集団のレシピエントに対してHLA一致である胎盤細胞を含む。別の具体的実施
態様において、前記合わせた幹細胞集団は、前記幹細胞集団のレシピエントに対して少な
くとも部分的にHLAミスマッチである胎盤細胞を含む。別の具体的実施態様において、前
記胎盤幹細胞は、複数のドナーに由来する。
【０１２９】
（5.6.1.2 医薬組成物）
免疫抑制性の胎盤幹細胞の集団又は胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、インビボでの使用
のための医薬組成物に処方することができる。このような医薬組成物には、医薬として許
容し得る担体、例えば生理食塩水又はインビボでの投与のためのその他の承認された生理
的に許容し得る溶液中に、胎盤幹細胞の集団又は胎盤幹細胞を含む細胞の集団を含む。本
発明の医薬組成物は、本明細書において他に記述した、任意の胎盤幹細胞集団又は胎盤幹
細胞タイプを含むことができる。医薬組成物は、胎児、母性又は胎児及び母性の両方の胎
盤幹細胞を含むことができる。本発明の医薬組成物は、単一の個体若しくは胎盤から、又
は複数の個体若しくは胎盤から得られた胎盤幹細胞を更に含むことができる。
【０１３０】
本発明の医薬組成物は、任意の免疫抑制性の数の胎盤幹細胞を含むことができる。例え
ば、胎盤幹細胞の単一の単位投与量には、種々の実施態様において、約、少なくとも、1
×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1
×1010、5×1010、1×1011以上個、又はそれ以下、若しくはそれより多い胎盤幹細胞を含
むことができる。
本発明の医薬組成物は、50%生細胞以上を含む（すなわち、集団における細胞の少なく
とも50%は、機能的又は生きている）細胞の集団を含む。好ましくは、集団における細胞
の少なくとも60%は、生存可能である。より好ましくは、医薬組成物における集団の細胞
の少なくとも70%、80%、90%、95%又は99%は、生存可能である。
本発明の医薬組成物は、例えば移植を促進する1つ以上の化合物（例えば、抗T細胞受容
体抗体、免疫抑制薬又はその他）；アルブミン、デキストラン４０、ゼラチン、ヒドロキ
シエチル澱粉、その他などの安定剤を含むことができる。
【０１３１】
（5.6.1.3 胎盤幹細胞条件培地）
本発明の胎盤幹細胞は、免疫抑制性である条件培地、すなわち免疫細胞の1つ以上のタ
イプの複数に対して検出可能な免疫抑制効果を有する幹細胞によって分泌され、又は排出
される1つ以上の生体分子を含む培地を産生するために使用することができる。種々の実
施態様において、条件培地には、胎盤幹細胞を少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、1
0、11、12、13、14日以上培養した培地を含む。その他の実施態様において、条件培地に
は、胎盤幹細胞を少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%コンフルエンス又はま
で100%コンフルエンスまで培養した培地を含む。このような条件培地は、胎盤幹細胞の別
の集団又は別の種類の幹細胞の培養を補助するために使用することができる。別の実施態
様において、条件培地には、胎盤幹細胞を成体細胞タイプに分化した培地を含む。別の実
施態様において、本発明の条件培地には、胎盤幹細胞及び非胎盤幹細胞を培養した培地を
含む。
【０１３２】
従って、一つの実施態様において、本発明は、胎盤幹細胞の培養液からの培地を含む組
成物であって、前記胎盤幹細胞は、（a）基体に付着し；（b）CD200及びHLA-Gを発現する
か、又はCD73、CD105及びCD200を発現するか、又はCD200及びOCT-4を発現するか、又はCD
73、CD105及びHLA-Gを発現するか、又はCD73及びCD105を発現し、かつ胎盤幹細胞を含む
胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が
可能な条件下で培養されるときに促進するか、又はOCT-4を発現し、かつ胎盤幹細胞を含
む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成
が可能な条件下で培養されるときに促進し；並びに（c）MLR（混合リンパ球反応）におい
てCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制し、前記胎盤幹細胞の培養は、前記培地にお
いて24時間以上培養された、前記組成物を提供する。具体的実施態様において、組成物は
、複数の前記胎盤幹細胞を更に含む。別の具体的実施態様において、組成物は、複数の非
胎盤細胞を含む。より具体的実施態様において、前記非胎盤細胞は、CD34+細胞、例えば
末梢血造血前駆細胞、臍帯血造血前駆細胞又は胎盤血造血前駆細胞などの造血前駆細胞を
含む。また、非胎盤細胞は、間充織幹細胞、例えば骨髄由来間充織幹細胞などのその他の
幹細胞を含むこともできる。非胎盤細胞は、成体細胞又は株化細胞の1つ以上のタイプで
あることができる。別の具体的実施態様において、組成物には、抗増殖剤、例えば抗-MIP
-1α又は抗-MIP-1β抗体を含む。
【０１３３】
（5.6.1.4 胎盤幹細胞を含むマトリックス）
本発明は、胎盤幹細胞の免疫抑制性集団を含むマトリックス、ヒドロゲル、足場及びそ
の他を更に含む。
本発明の胎盤幹細胞は、天然のマトリックス、例えば羊膜材料などの胎盤生体材料上に
播種することができる。このような羊膜材料は、例えば哺乳動物胎盤から直接解剖された
羊膜；固定したか、又は熱処理した羊膜、実質的に乾燥した（すなわち20%未満のH2O）羊
膜、柔毛膜、実質的に乾燥した柔毛膜、実質的に乾燥した羊膜及び絨毛膜、その他である
ことができる。胎盤幹細胞を播種することができる好ましい胎盤生体材料は、Haririの文
献、米国出願公開番号2004/0048796に記述されている。
【０１３４】
本発明の胎盤幹細胞は、例えば注射のために適したヒドロゲル溶液に懸濁することがで
きる。このような組成物のために適したヒドロゲルには、RAD16などの自己集合ペプチド
を含む。一つの実施態様において、細胞を含むヒドロゲル溶液を、例えば型において硬化
させて、移植のためにその中に分散させた細胞を有するマトリックスを形成することがで
きる。また、このようなマトリックスにおける胎盤幹細胞は、細胞が移植前に有糸分裂で
増殖されるように培養することができる。ヒドロゲルは、例えば共有結合、イオン結合又
は水素結合を介して架橋されて三次元開放格子構造を生成し、これが水分子を補足してゲ
ルを形成する有機ポリマー（天然又は合成）である。ヒドロゲル形成材料は、アルギン酸
及びその塩などの多糖体、ペプチド、ポリホスファジン及びポリアクリラート（これらは
イオンによって架橋される）又はポリエチレンオキシド-ポリプロピレングリコールブロ
ック共重合体などのブロック重合体（それぞれ温度又はpHによって架橋される）を含む。
一部の実施態様において、本発明のヒドロゲル又はマトリックスは、生体分解性である。
【０１３５】
本発明の一部の実施態様において、製剤には、インサイチューで重合可能なゲル（例え
ば、米国特許出願刊行物2002/0022676；Ansethらの論文、J. Control Release, 78（1-3
）:
199-209 （2002）;Wangらの論文、Biornaterials, 24（22）:3969-80 （2003）を参照さ
れたい）を含む。
一部の実施態様において、重合体は、水、緩衝塩溶液又は水性アルコール溶液などの水
性溶液に少なくとも部分的に可溶性であって、荷電側鎖を有するか、若しくはその一価の
イオン性塩である。陽イオンと反応することができる酸性側鎖を有する重合体の例は、ポ
リ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタク
リル酸との共重合体、ポリ（酢酸ビニル）及びスルホン化ポリスチレンなどのスルホン化
された重合体である。また、アクリル酸又はメタクリル酸とビニルエーテル単量体又は重
合体との反応によって生じた酸性側鎖を有する共重合体を使用することができる。酸性基
の例は、カルボン酸基、スルホン酸基及びハロゲン化された（好ましくは、フッ素化され
た）アルコール基、フェノール性OH基及び酸性OH基である。
【０１３６】
本発明の胎盤幹細胞又はその共培養は、三次元フレームワーク又は足場上に播種するこ
と、及びインビボに移植することができる。このようなフレームワークは、任意の1つ以
上の成長因子、細胞、薬物又は組織形成を刺激するか、若しくはさもなければ本発明の実
施を増強するか、若しくは改善するその他の成分と組み合わせて移植することができる。
本発明に使用することができる足場の例には、不織マット、多孔性発泡体又は自己構築
ペプチドを含む。不織マットは、グリコール酸及び乳酸の合成の吸収性共重合体で構成さ
れた線維を使用して形成することができる（例えば、PGA/PLA）（VICRYL, Ethicon社、So
merville, N.J.）。発砲体は、例えばポリ（ε-カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸
）（PCL／PGA）共重合体で構成され、凍結乾燥又は凍結乾燥（例えば、米国特許第6,355,
699号を参照されたい）などの過程によって形成され、足場としても使用することができ
る。
【０１３７】
また、本発明の胎盤幹細胞は、モノリン酸、ジリン酸、トリリン酸、α-トリリン酸、
β-トリリン酸及びテトラリン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイ
ト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、マグネシウ
ムリカルシウムホスフェート、バイオガラス（BIOGLASS）（登録商標）などの生物学的に
活性なガラス及びこれらの混合物を含むが、限定されない生理的に許容し得るセラミック
材料上に播種すること、又はこれらと接触させることができる。現在市販の多孔性生体適
合性セラミック材料には、サージボーン（SURGIBONE）（登録商標）（CanMedica 社., Ca
nada）、エンドボン（ENDOBON）（登録商標）（Merck Biomaterial France社, France）
、セロス（CEROS）（登録商標）（Mathys, AG社, Bettlach, Switzerland）及びヒーロス
（HEALOS）（商標）（DePuy, 社, Raynham, MA）及びビトス（VITOSS）（登録商標）、ラ
コス（RHAKOSS）（商標）及びコルトス（CORTOSS）（登録商標）（Orthovita社, Malvern
, Pa.）などのミネラル化コラーゲン骨移植製品を含む。フレームワークは、天然及び／
又は合成材料の混合物、混合又は複合体であることができる。
別の実施態様において、胎盤幹細胞は、例えばPGA、PLA、PCL共重合体若しくは混合物
などの生体吸収性材料又はヒアルロン酸から作製されるマルチフィラメント糸で構成する
ことができるフェルト上へ播種又は接触させることができる。
【０１３８】
本発明の胎盤幹細胞は、別の実施態様において、複雑な構造であってもよい発泡体足場
上へ播種することができる。このような発泡体足場は、修復、置換、又は増大される本体
の一部の特異的な構造のものなど、有用な形状に成形することができる。一部の実施態様
において、フレームワークは、細胞接着性を増強するために、本発明の細胞の接種より前
に、例えば0.1M 酢酸で処理し、続いてポリリジン、PBS及び／又はコラーゲン中でインキ
ュベーションする。マトリックスの外面は、マトリックスを血漿コーティングすること、
又は1つ以上のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質
、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸塩、コンドロイチン-4-サルフェート、
コンドロイチン-6-サルフェート、デルマタンサルフェート、ケラチンサルフェートなど
）、細胞マトリックス及び／又はゼラチン、アルギナート、寒天、アガロース及び植物ゴ
ム質、その他などの、しかし限定されないその他の材料の添加などにより、細胞の接着又
は成長及び分組織化を改善するために修飾してもよい。  
【０１３９】
一部の実施態様において、足場には、それに非血栓形成性を与える材料を含み、又はそ
れに非血栓形成性を与える材料で処理される。また、これらの処理及び材料は、内皮増殖
、遊走及び細胞外基質沈着を促進し、及び持続し得る。これらの材料及び処理の例には、
ラミニン及びIV型コラーゲンなどの基底膜タンパク質などの天然の材料、EPTFEなどの合
成材料、並びにパースパン（PURSPAN）（商標）（The Polymer Technology Group社、Ber
keley, Calif.）などのセグメント型ポリウレタンウレアシリコーン含むが、限定されな
い。また、足場には、ヘパリンなどの抗血栓薬を含むことができ；また、足場は、胎盤幹
細胞を播種する前に、表面電荷を変化させるために処理（例えば、血漿でのコーティング
）することができる。
【０１４０】
（5.6.2 不死化された胎盤幹細胞系）
哺乳動物胎盤細胞は、成長促進タンパク質の産生及び／又は活性を外部因子によって調
節可能であるように、成長促進遺伝子、すなわち適切な条件下でトランスフェクト細胞の
増殖を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含む任意の適切なベクターでのトランス
フェクションによって条件つきで不死化することができる。好ましい実施態様において、
成長促進遺伝子は、v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40ラージT抗原、ポリオーマラージT抗
原、E1aアデノウイルス又はヒト乳頭腫ウイルスのE7タンパク質などの、しかし限定され
ない発癌遺伝子である。
【０１４１】
成長促進タンパク質の外部制御は、外部から調節可能なプロモーター、例えばその活性
を、例えばトランスフェクト細胞の温度又は細胞と接触する培地の組成を修飾することに
よって制御することができるプロモーターの制御下に成長促進遺伝子を置くことによって
達成することができる。一つの実施態様において、テトラサイクリン（tet）で制御され
る遺伝子発現系を使用することができる（Gossenらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:5547-5551, 1992; Hoshimaruらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1518-1523,
1996を参照されたい）。tetの非存在下では、このベクター内のtetで制御されるトラン
ス活性化因子（tTA）は、tetオペレーター配列に融合されたヒトサイトメガロウイルス由
来の最小プロモーターであるphCMV*-1からの転写を強く活性化する。tTAは、大腸菌（Esc
herichia coli）のトランスポゾン-10由来tet耐性オペロンのリプレッサー（tetR）と単
純ヘルペスウイルスのVP16の酸性ドメインとの融合タンパク質である。tetの低く無毒な
濃度（例えば、0.01〜1.0μg/ml）では、tTAによるトランス活性化をほぼ完全に消滅させ
る。
【０１４２】
一つの実施態様において、ベクターは、選択可能なマーカー、例えば薬物耐性を与える
タンパク質をコードする遺伝子を更に含む。細菌ネオマイシン耐性遺伝子（neoR）は、本
発明に使用してもよい１つのそのようなマーカーである。neoRを有する細胞は、例えば増
殖培地に対する100〜200μg/mL G4 18の添加などの当業者に公知の手段によって選択して
もよい。
トランスフェクションは、レトロウイルスの感染を含むが、限定されない任意の当業者
に公知の種々の手段によって達成することができる。一般に、細胞培養は、ベクターのた
めの産生株化細胞から収集される条件培地とN2補充を含むDMEM／F12との混合物と共にイ
ンキュベーションすることによってトランスフェクトしてもよい。例えば、上記の通りに
調製された胎盤細胞培養を、例えば5日後に、インビトロにて、1体積の条件培地及び2体
積のN2補充を含むDMEM／F12における約20時間のインキュベーションによって感染させて
もよい。次いで、選択可能なマーカーを有するトランスフェクト細胞を上記の通りに選択
してもよい。
【０１４３】
トランスフェクション後、培養物を、増殖可能な表面上に継代して、例えば24時間の間
に細胞の少なくとも30%を二倍にさせる。好ましくは、基体は、ポリオルニチン／ラミニ
ン基体であり、ポリオルニチン（10μg/ml）及び／若しくはラミニン（10μg/mL）、ポリ
リジン／ラミニン基体又はフィブロネクチンで処理した表面でコートされた組織培養プラ
スチックからなる。次いで、培養物には、増殖培地を3〜4日毎に供給し、これには、1つ
以上の増殖増強因子を補充しても、又はしなくてもよい。増殖増強因子は、培養物が50%
未満コンフルエントである増殖培地に添加してもよい。
【０１４４】
条件つきで不死化した胎盤幹細胞株は、80〜95%コンフルエントなときに、トリプシン
処理などにより、標準的な技術を使用して継代することができる。、一部の実施態様にお
いて、およそ第20継代まで選択を維持すること（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含む
細胞に対するG418の添加による）が有益である。また、細胞は、長期貯蔵のために液体窒
素中で凍結させていてもよい。
クローン株化細胞は、上記の通りに調製した条件つきで不死化されたヒト胎盤幹細胞株
から単離することができる。一般に、このようなクローン株化細胞は、限外希釈によるか
、又はクローニング環を使用するなど、標準的技術を使用して単離して、増殖させてもよ
い。クローン株化細胞は、一般に上記の通りに供給して、継代してもよい。
【０１４５】
条件つきで不死化させたヒト胎盤幹細胞株は、クローンであってもよいが、必要性はな
く、一般に分化を促進する培養条件下で、成長促進タンパク質の産生及び／又は活性を抑
制することによって、分化するように誘導してもよい。例えば、成長促進タンパク質をコ
ードする遺伝子が、外部から調節可能なプロモーターの制御下である場合、条件、例えば
培地の温度又は組成を修正して、成長促進遺伝子の転写を抑制してもよい。上で議論した
テトラサイクリンで制御される遺伝子発現系については、テトラサイクリンを添加して成
長促進遺伝子の転写を抑制することにより、分化を達成することができる。一般に、分化
を開始するためには、1μg/mlの4〜5日間のテトラサイクリンで十分である。更に分化を
促進するために、更なる薬剤を増殖培地に含めてもよい。
【０１４６】
（5.6.3 アッセイ法）
本発明のための胎盤幹細胞を使用して、幹細胞増殖、増大及び／又は分化に対する培養
条件、環境要因、分子（例えば、生体分子、小無機分子など）及びその他のものの影響を
、このような条件に曝露されない胎盤幹細胞と比較して決定するためにアッセイ法するこ
とができる。
好ましい実施態様において、本発明の胎盤幹細胞は、分子との接触による増殖、増大又
は分化の変化についてアッセイされる。一つの実施態様において、例えば、本発明は、複
数の胎盤幹細胞の増殖を調整する化合物を同定する方法であって、前記複数の幹細胞を、
増殖が可能な条件下で前記化合物と接触させることを含み、前記化合物が前記化合物と接
触されない複数の幹細胞と比較して、前記複数の幹細胞の増殖の検出可能な変化を生じさ
せる場合、前記化合物は胎盤幹細胞の増殖を調整する化合物として同定される、前記方法
を提供する。具体的実施態様において、前記化合物は、増殖の阻害剤として同定される。
別の具体的実施態様において、前記化合物は、増殖のエンハンサーとして同定される。
【０１４７】
別の実施態様において、本発明は、複数の胎盤幹細胞の増殖を調整する化合物を同定す
る方法であって、前記複数の幹細胞を、増殖が可能な条件下で前記化合物と接触させるこ
とを含み、前記化合物が前記化合物と接触されない複数の幹細胞と比較して、前記複数の
幹細胞の増殖に検出可能な変化を生じさせる場合、前記化合物は胎盤幹細胞の増殖を調整
する化合物として同定される、前記方法を提供する。具体的実施態様において、前記化合
物は、増殖の阻害剤として同定される。別の具体的実施態様において、前記化合物は、増
殖のエンハンサーとして同定される。
【０１４８】
別の実施態様において、本発明は、胎盤幹細胞の分化を調整する化合物を同定する方法
であって、前記幹細胞を、分化が可能な条件下で前記化合物と接触させることを含み、前
記化合物が前記化合物と接触しない幹細胞と比較して、前記幹細胞の分化に検出可能な変
化を生じさせる場合、前記化合物は、胎盤幹細胞の増殖を調整する化合物として同定され
る、前記方法を提供する。具体的実施態様において、前記化合物は、分化の阻害剤として
同定される。別の具体的実施態様において、前記化合物は、分化のエンハンサーとして同
定される。
【０１４９】
（5.6.4 胎盤幹細胞バンク）
分娩後の胎盤からの幹細胞を多数の異なる方法で培養して、胎盤幹細胞のロットのセッ
ト、例えば個体に投与可能な用量のセットを作製することができる。このようなロットは
、例えば胎盤の灌流液からの幹細胞から、又は酵素消化された胎盤の組織から得ることが
できる。複数の胎盤から得られる胎盤幹細胞のロットのセットは、例えば長期貯蔵のため
に胎盤幹細胞のバンクにおいて置くことができる。一般に、接着性幹細胞を胎盤材料の初
期培養から得て、種培養物を形成し、これを一定条件下で増殖させて、およそ倍加と同等
の数から細胞の集団を形成させる。ロットは、好ましくは単一の胎盤の組織に由来するが
、複数の胎盤の組織に由来することもできる。
【０１５０】
一つの実施態様において、幹細胞ロットは、以下の通りに得られる。胎盤組織を最初に
、例えば細かく切り刻むことによって崩壊させて、適切な酵素、例えばコラゲナーゼで消
化する（第5.2.3節、上記を参照されたい）。胎盤の組織は、好ましくは単一の胎盤から
の、例えば羊膜全体、絨毛膜全体又は両方を含むことができるが、羊膜又は漿膜の一部の
みを含むこともできる。消化された組織を例えば約1〜3週間、好ましくは約2週間培養す
る。
非接着細胞の除去の後、形成する高密度コロニーを、例えばトリプシン処理によって収集
する。これらの細胞を収集し、都合のよい培地の体積に再懸濁して、継代0の細胞として
定義した。
【０１５１】
次いで、継代0の細胞を、増殖培養に播種するために使用する。増殖培養は、別々の細
胞培養装置、例えばNUNC（商標）による細胞工場（Cell Factory）の任意の設備であるこ
とができる。継代0培養の細胞は、例えば1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×
103、7×103、8×103、9×103、1×104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×
104、8×104、9×104、10×104個の幹細胞で、増殖培地を播種するように、任意の程度に
細分することができる。好ましくは、約2×104〜約3×104個の継代0細胞が、それぞれの
増殖培養に播種するために使用される。増殖培養の数は、継代0細胞の数に依存し得るし
、幹細胞が得られる特定の胎盤に応じて、数にがより多くても、又はより少なくてもよい
。
【０１５２】
増殖培養は、培養における細胞の密度が特定の値、例えば、約1×105細胞/cm2に到達す
るまで培養される。細胞は、この時点で収集し、及び凍結保存するか、又は上記の通りの
新たな増殖培養において継代することができる。細胞は、使用前に、例えば2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、l9又は20回継代することができる。
集団倍加の累積数の記録は、好ましくは増殖培養の間維持される。継代0培養からの細胞
は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、
36、38若しくは40回の倍加、又は60回までの倍加用に増殖させることができる。しかし、
好ましくは、集団倍加の数は、細胞の集団を個々の用量に分ける前に、約15〜約30回の間
、好ましくは約20回倍加である。細胞は、増殖工程の全体にわたって連続して培養するこ
とができ、又は増殖の間の1つ以上の点にて凍結することができる。
【０１５３】
個々の用量のために使用される細胞は、あとで使用するために凍結させること、例えば
凍結保存することができる。個々の用量は、例えば1mlあたり約1,000,000〜約100,000,00
0個の細胞を含むことができ、合計で約106〜約109個の間の細胞を含むことができる。
本方法の具体的実施態様において、継代0細胞は、およそ4回の倍加用間培養され、次い
で第1の細胞バンクに凍結させる。第1の細胞バンクからの細胞を凍結し、第2の細胞バン
クを播種するために使用し、その細胞を更に約8回の倍加用に増殖させる。この段階で細
胞を収集して、凍結し、新たな増殖培養を播種するために使用して、これを更に約8回の
倍加用に進行させて、約20回の細胞倍加の累積数にする。継代の中間地点の細胞は、その
後の増殖培養に使用するために、1mlあたり約100,000〜約10,000,000個の細胞、好ましく
は1mlあたり約1,000,000個の細胞の単位で凍結される。約20回の倍加の細胞は、幹細胞含
有組成物を投与又は作製するのに使用するために、1mlあたり約1,000,000〜約100,000,00
0細胞の間の個々の用量で凍結させることができる。
【０１５４】
好ましい実施態様において、胎盤が得られるドナー（例えば、母）は、少なくとも１つ
の病原体について試験される。母が、試験された病原体について陽性反応を示す場合、該
胎盤から全てのロットを廃棄する。このような試験は、継代0細胞の確立の前後又は増殖
培養の間を含む胎盤幹細胞ロットの産生の間にいつでも行うことができる。存在が試験さ
れる病原体には、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、B型肝炎、ヒト免疫不全症ウイ
ルス（I型及びII型）、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、その他を含むことが
できるが、限定されない。
【０１５５】
（5.6.5 多発性硬化症の治療）
別の態様において、本発明は、多発性硬化症又は多発性硬化症に関連した症候を有する
個体を治療する方法であって、個体に対して複数の胎盤幹細胞を、個体における免疫応答
を検出可能に調節する、例えば抑制するために十分な量及び十分な時間で投与することを
含む、前記方法を提供する。
【０１５６】
多発性硬化症（MS）は、中枢神経系の慢性の、再発性の炎症性疾患である。本疾患は、
CNS及びPNS軸索を囲む髄鞘、オリゴデンドロサイト及び神経細胞それ自体に傷害を生じる
。本疾患は、細胞の接着分子及び炎症誘発性サイトカインの影響の下で、増殖して、血液
脳関門を越えて、CNSに入る自己反応性T細胞、特にCD4+T細胞によって媒介される。MSの
症候には、肢の感覚障害、視覚神経機能障害、錐体路機能障害、膀胱機能障害、腸機能障
害、性機能障害、運動失調及び複視を含む。
【０１５７】
4つの異なるタイプのMS又はMSの臨床経過が同定されている。最初に、再発性／鎮静性M
S（RRMS）は、数日〜数週の期間にわたって急性的に現れる神経性の機能障害の自己制御
発作、続いて、時には不完全な、数月にわたる回復段階によって特徴づけられる。第2の
タイプの、二次進行性MS（SPMS）は、RRMSとして開始するが、臨床経過が急性発作とは無
関係な機能で着実に悪化することによって特徴づけられるようになる。第3の一次進行性M
S（PPMS）は、急性の発作を伴わずに発病から機能の着実な減退によって特徴づけられる
。また、第4のタイプの進行性／再発性のMS（PRMS）も進行性の経過で開始し、進行性の
機能の減退と重なった不定期の発作を伴う。
【０１５８】
MSを有する人は、一般に運動性技術評価を使用して、任意にMRIで評価される。例えば
、１つの運動性評価技術である、拡大能力障害状態スケール（the expanded disability 
status scale）では、以下の通りに、罹患者の能力の段階的にスコアする：
0.0  正常な神経学的検査
1.0  障害なし、1つのFSの最小の徴候
1.5  障害なし、複数のFSの最小の徴候
2.0  1つのFS の最小の障害
2.5  1つのFSの軽度の障害又は2つのFSの最小の障害
3.0  1つのFSの中等度の障害又は3つ若しくは4つのFSの軽度の障害。十分に移動
3.5  十分に移動できるが、1つのFSの中等度障害及びいくつかのその他の最小の障害を
伴う
4.0  補助を伴わずに十分に移動、自分のことは自分でできる、相対的に重篤な障害に
もかかわらず、1日につき約12時間活動している；約500メートル介助なしに、又は休まず
にに歩くことができる
4.5  補助を伴わずに十分に移動、1日の多くは活動している、丸一日働くことができる
、さもなければ完全な活動にいくらかの制限を有するか、最小限の介助を必要とするであ
ろう；相対的に重篤な障害によって特徴づけられる；約300メートル介助なしに、又は休
まずに歩くことができる
5.0  約200メートル介助なしに、又は休まずに移動；丸１日の活動（特別な準備がなく
ても丸１日働く）を障害するほどの重篤な障害
5.5  約100メートル介助なしに、又は休まずに移動；丸１日の活動を妨げるほど重篤な
障害
6.0  休憩を伴い又は伴わずに約100メートル歩くために、断続的又は片側の特定の補助
（杖、松葉杖、装具）が必要
6.5  休憩を伴い又は伴わずに約20メートル歩くために、特定の両側の補助（杖、松葉
杖、装具）が必要
7.0  補助を伴ってもおよそ5メートルを越えて歩くことができない、本質的に車椅子に
制限される；標準的な車椅子において自分で回転して、単独で移動する；1日につき約12
時間車椅子で活動している
7.5  数歩以上進むことができない；車椅子に制限される；移動の際の補助が必要であ
ろう；自分で回転するが、標準的な車椅子において丸一日続けることができない；動力付
車椅子が必要であろう
8.0  本質的にベッド若しくは椅子に制限されるか、又は車椅子で巡回だが、1日の大半
はベッド自体の外にいるであろう；多くのセルフケア機能を持つ；一般に、腕の使用は有
効
8.5  本質的に1日の大半はベッドに制限される；腕の使用はいくらか有効で、いくらか
のセルフケア機能を持つ
9.0  ベッドに制限される；なおもコミュニケーションをとり、食べることができる
9.5  全くどうすることもできないベッド患者；事実上コミュニケーションをとること
や、食べて／嚥下することができない
10.0  MSによる死。
【０１５９】
上記評価法において、「FS」は、錐体、小脳、脳幹、感覚、腸及び膀胱、視覚、大脳及
びその他の系を含む8つの測定される機能的な系をいう。
Scripps神経評価スケール、移動インデックス及び多発性硬化症機能合成得点（MSFC）
を含むその他の、同様の評価法が公知である。
また、MSの進行度は、罹患率の測定によっても評価した。
また、MSの進行度は、磁気共鳴映像法によっても評価し、これにより、MSと関連した神
経病変（例えば、新たな病変、増強病変又は独特の活発な病変の組み合わせ）を検出する
ことができる。
【０１６０】
従って、一つの実施態様において、本発明は、MSを有する個体、及び例えばMSと診断さ
れた個体を治療する方法であって、個体に複数の胎盤幹細胞を投与することを含み、前記
胎盤幹細胞はオリゴデンドロサイトへ分化し得る、例えば該個体内でオリゴデンドロサイ
トへ分化する、前記方法を提供する。具体的実施態様において、投与することにより、個
体におけるMSの1つ以上の症候を検出可能に改善する。より具体的実施態様において、症
候は、例えば肢の感覚障害、視覚神経機能障害、錐体路機能障害、膀胱機能障害、腸機能
障害、性的機能不全、運動失調又は複視の1つ以上である。別の具体的実施態様において
、前記投与により、少なくとも半分の時点のEDSSスケールでの改善を示す。別の具体的実
施態様において、前記投与により、少なくとも１つの時点のEDSSスケールでの改善を生じ
る。別の具体的実施態様において、前記投与により、少なくとも2つの時点のEDSSスケー
ルでの改善を生じる。その他の具体的実施態様において、前記投与により、多発性硬化症
評価スケールでの、又はMRIでの検出可能な改善を生じる。
【０１６１】
MSは、その他の治療薬、例えば免疫調節薬又は免疫抑制薬、例えばIFNβ-1a及びIFN-1b
を含むインターフェロンβ（IFNβ）；グリアトリアマー（gliatriamer）アセテート（コ
パキソン（Copaxone））；シクロホスファミド；メトトレキセート；アザチオプリン（イ
ムラン（Imuran））；クラドリビン（ロイスタチン（Leustatin））；シクロスポリン；
ミトキサントロン；その他で治療されてきた。また、MSは、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH
）、メチルプレドニゾロン、デキサメサゾン、その他を含む糖質コルチコイドなどの抗炎
症薬治療薬で治療されてきた。また、MSは、静脈免疫グロブリン、血漿交換法又はスルフ
ァサラジンなどのその他のタイプの治療薬で治療されてきた。
【０１６２】
従って、本発明は、MSを有する個体、例えばMSを有すると診断された個体の治療であっ
て、該個体に複数の胎盤幹細胞及び1以上の治療剤を投与することを含み、前記投与は該
個体におけるMSの1つ以上の症候を検出可能に改善し、並びに前記胎盤幹細胞はオリゴデ
ンドロサイトへ分化し得る、例えば該個体内でオリゴデンドロサイトへ分化する、前記治
療を更に提供する。一つの実施態様において、治療薬は、糖質コルチコイドである。具体
的実施態様において、糖質コルチコイドは、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、メチルプレ
ドニゾロン又はデキサメサゾンである。別の実施態様において、治療薬は、免疫調節薬又
は免疫抑制薬である。種々の具体的実施態様において、免疫調節薬又は免疫抑制薬は、IF
Nβ-1a、IFN-1b、グリアトリアマーアセテート、シクロホスファミド、メトトレキセート
、アザチオプリン、クラドリビン、シクロスポリン又はミトキサントロンである。その他
の実施態様において、治療薬は、静脈免疫グロブリン、血漿交換又はスルファサラジンで
ある。別の実施態様において、個体には、前述の治療薬の任意の組み合わせが投与される
。
【０１６３】
MSを有する個体、例えばMSと診断された個体は、疾患の進行の間の任意の時点で、複数
の胎盤幹細胞及び任意に1つ以上の治療薬で治療することができる。例えば、個体は、診
断の直後に、又は診断の1、2、3、4、5、6日以内に、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、1
0、15、20、25、30、35、40、45、50週以上の内に、又は診断後1、2、3、4、5、6、7、8
、9、10年以上の内に治療することができる。個体は、疾患の臨床経過の間に一回又は複
数回治療することができる。個体は、適切な場合、急性発作の間に、緩解の間に、又は慢
性退行期の間に治療することができる。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、分娩後、
緩解の状態を維持し、又は妊娠中に経験した再発の発生を減少させるために、MSを有する
女性に投与される。
【０１６４】
一つの実施態様において、個体には、約300,000,000個の胎盤幹細胞の用量が投与され
る。しかし、投薬量は、個体の身体特徴、例えば重量に応じて変更することができ、用量
あたり1,000,000〜10,000,000,000個の胎盤幹細胞、好ましくは用量あたり10,000,000〜1
,000,000,000個の間又は用量あたり100,000,000,000〜50,000,000個の胎盤幹細胞の範囲
であり得る。投与は、好ましくは静脈内であるが、生細胞の投与のための任意の当該技術
分野において承認された経路によることができる。一つの実施態様において、胎盤幹細胞
は、細胞バンクからのものである。
【実施例】
【０１６５】
（6.実施例）
（6.1 実施例1：胎盤幹細胞の培養）
胎盤幹細胞は、灌流によって、又は物理的破壊、例えば酵素消化によって、いずれかで
分娩後の哺乳動物胎盤から得る。細胞は、60% DMEM-LG（Gibco社）、40% MCDB-201（Sigm
a社）、2% ウシ胎児血清（FCS）（Hyclone Laboratories社）、1×インスリン-トランス
フェリン-セレン（ITS）、1×レノレン酸-ウシ血清アルブミン（LA-BSA）、10-9 M デキ
サメサゾン（Sigma社）、10-4M アスコルビン酸2-ホスフェート（Sigma社）、上皮細胞成
長因子（EGF）10ng/ml（R&D systems社）、血小板由来成長因子（PDGF-BB）10ng/ml（R&D
systems社）及び100U ペニシリン/1000U ストレプトマイシンを含む培養液中で培養する
。
【０１６６】
細胞を培養する培養フラスコは、以下の通りに調製する。T75フラスコを、フラスコに5
ng/ml ヒトFN（Sigma F0895）を含む5ml PBSを添加することによって、フィブロネクチン
（FN）でコートする。FN溶液を含むフラスコを37℃にて30分間放置する。次いで、FN溶液
を細胞培養の前に除去する。処理後に、フラスコを乾燥させる必要はない。或いは、フラ
スコを一晩又はより長く4℃にてFN溶液と接触させたままにして；培養前に、フラスコを
暖めて、FN溶液を除去する。
【０１６７】
（灌流によって単離された胎盤幹細胞）
胎盤灌流液からの胎盤幹細胞の培養は、以下の通りに確立する。フィコール勾配からの
細胞を上のように調製したFNコートしたT75フラスコに、50〜100×106細胞/フラスコにて
15mlの培地中に播種する。典型的には、5〜10個のフラスコに播種する。フラスコを37℃
にて12〜18時間インキュベートし、接着細胞を接着させる。10mlの暖かいPBSをそれぞれ
のフラスコに添加し、懸濁液中の細胞を除去し、穏やかに混合する。次いで、15mlの培地
を除去し、15mlの新鮮な培地と置き換える。全ての培地を、培養の開始の3〜4日後に交換
する。その後の培地交換は、培地の50%又は7.5mlが除去されている間に行う。
約12日目に開始して、培養を顕微鏡下で点検し、接着細胞コロニーの増殖を調べる。細
胞培養がおよそ80%コンフルエントになるときに、典型的には培養の開始後13〜18日の間
に、接着細胞をトリプシン消化によって収集する。これらの初代培養から収集した細胞を
継代0（ゼロ）と命名する。
【０１６８】
（物理的破壊及び酵素消化によって単離された胎盤幹細胞）
胎盤幹細胞培養物は、以下の通りに消化された胎盤組織から確立する。灌流した胎盤を
、母側を上にして無菌の紙シートの上に置く。胎盤の母側の表層のおよそ0.5cmを刃で掻
爬し、その刃を使用して、およそ1×2×1cm程度の胎盤組織ブロックを除去する。次いで
、この胎盤組織を、およそ1mm3の小片に細かく切り刻む。これらの小片を50ml ファルコ
ンチューブに収集し、コラゲナーゼIA（2 mg/ml、Sigma社）、続いてトリプシン-EDTA（0
.25%、Gibco BRL社）で水浴において37℃にて10分間消化する。生じる溶液を室温にて10
分間400gにて遠心分離し、消化溶液を除去する。沈殿をおよそ10倍体積のPBSで再懸濁し
（例えば、5mlのペレットを45mlのPBSで再懸濁する）、チューブを室温にて10分間400gに
て遠心分離する。組織／細胞ペレットを130mlの培養液に再懸濁し、細胞をフィブロネク
チンコートしたT-75フラスコあたり13mlにて播種する。細胞を5% CO2で加湿された空気中
で37℃にてインキュベートする。胎盤幹細胞をこの段階で任意に凍結保存する。
【０１６９】
（胎盤幹細胞の継代培養及び増殖）
凍結保存された細胞を37℃水浴において急速に解凍する。胎盤幹細胞を、10mlの暖かい
培地で凍結用バイアルから直ちに除去し、15mlの無菌チューブへ移す。細胞を室温にて10
分間400gにて遠心分離する。細胞をピペット操作によって10 mlの暖かい培地に穏やかに
再懸濁し、生細胞数をトリパンブルー排除によって決定する。次いで、細胞を、上のよう
に調製したFNコートしたフラスコに1cm2あたり約6000〜7000細胞にて播種する（およそT-
75フラスコあたりおよそ5×105細胞）。細胞を37℃にて5% CO2及び90%の湿度にてインキ
ュベートする。細胞が、75〜85%コンフルエンシーに達したときに、消費された培地の全
てを無菌的にフラスコから除去して、廃棄する。3mlの0.25% トリプシンEDTA（w/v）溶液
を添加して細胞層をカバーし、細胞を37℃、5% CO2及び90%の湿度にて5分間インキュベー
トする。フラスコを1、2度軽くたたき、細胞の剥離を促進する。一旦、＞95%の細胞が丸
くなって剥離したら、7mlの暖かい培養液をそれぞれのT-75フラスコに添加し、溶液を細
胞層表面上で数回ピペット操作することによって分散させる。
【０１７０】
上記の様に細胞を計数し、生存率を決定した後に、細胞を室温にて5分間1000rpmにて遠
心分離する。1つのT-75フラスコからの細胞ペレットを培養液で穏やかに再懸濁し、2つの
FNコートしたT-75フラスコ上へ細胞を均一にまくことにより、細胞を継代する。
上の方法を使用して、CD105、CD117、CD33、CD73、CD29、CD44、CD10、CD90及びCD133
マーカーを発現する接着性胎盤幹細胞の集団が同定される。この細胞の集団は、CD34又は
CD45を発現しなかった。これらの胎盤幹細胞の全ての培養ではないが、いくつかは、HLA-
ABC及び/又はHLA-DRを発現した。
【０１７１】
（6.2 実施例2：胎盤構造物からの胎盤幹細胞の単離）
（6.2.1 材料および方法）
（6.2.1.1 関心対象の表現型の単離）
胎盤細胞の5つの異なった集団を正常な満期妊娠の胎盤から得た。全てのドナーは、研
究目的のために彼女らの胎盤を使用するのための完全な書面による同意を提供した。5つ
の細胞の集団：（1）胎盤の灌流液（胎盤脈管構造の灌流から）；及び（2）羊膜、（3）
絨毛膜、（4）羊膜-絨毛膜プレート、並びに（5）酵素消化による臍帯細胞からの胎盤細
胞を調べた。種々の組織を無菌のPBS（Gibco-Invitrogen 社、Carlsbad、CA）で清潔にし
、別々の無菌のペトリ皿の上に置いた。種々の組織を無菌の外科用小刀を使用して細かく
切り刻み、50mlのファルコン円錐型チューブに置いた。細かく切り刻まれた組織を37℃の
水浴で20分間、1×コラゲナーゼ（Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO）で消化し、遠心分
離し、次いで37℃の水浴で10分間、0.25%のトリプシン-EDTA（Gibco-Invitrogen 社）で
消化した。種々の組織を消化後に遠心分離して、無菌のPBS（Gibco-Invitrogen 社）で、
一度リンスした。次いで、再構成した細胞を、2回、すなわち100μmの細胞ストレイナー1
回および30μmの分離フィルターで1回濾過し、任意の残留細胞外基質又は細胞細片を除去
した。
【０１７２】
（6.2.1.2 細胞生存率評価及び細胞数）
手動のトリパンブルー排除法を消化後に行い、細胞数を算出して、細胞生存率を評価し
た。細胞を1：1の比でトリパンブルー色素（Sigma-Aldrich社）と混合し、細胞を血球計
算板上で読んだ。
（6.2.1.3 細胞表面マーカーの特徴付け）
HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+であった細胞を特徴付けのために選択した。この表現型
を有する細胞を2つのBecton-Dickinsonフローサイトメーター、FACS Calibur及びFACS Ar
ia（Becton-Dickinson社、San Jose、CA、USA）によって同定し、定量化し、特徴付けた
。種々の胎盤細胞を1000000個の細胞あたり約10μlの抗体の比で、振盪機上で室温にて30
分間染色した。以下の抗ヒト抗体を使用した：フルオレセインイソチオシアネート（FITC
）結合抗HLA-G（Serotec社、Raleigh、NC）、CD10（BD Immunocytometry社、San Jose、C
a）、CD44（BD Biosciences Pharmingen社、San Jose、Ca）及びCD 105（R&D Systems社
、Minneapolis、MN）モノクローナル抗体；フィコエリトリン（PE）結合抗CD44、CD200、
CD117及びCD13（BD Biosciences Pharmingen社）モノクローナル抗体；フィコエリトリン
-Cy5（PE Cy5）結合ストレプトアビジン及び抗CD 117（BD Biosciences Pharmingen社）
モノクローナル抗体；フィコエリトリン-Cy7（PE Cy7）結合抗CD33及びCD10（BD Bioscie
nces社）モノクローナル抗体；アロフィコシアニン（APC）結合ストレプトアビジン及び
抗CD38（BD Biosciences Pharminge社n）モノクローナル抗体；及びビオチン化したCD90
（BD Biosciences Pharmingen社）。インキュベーション後、細胞を1回リンスして、結合
していない抗体を除去し、4℃にて4% パラホルムアルデヒド（USB社、Cleveland、OH）で
一晩固定した。次の日、細胞を2回リンスして、30μmの分離フィルターを通して濾過し、
フローサイトメーター（群）で流した。
抗マウスIgG抗体（BD Biosciences Pharmingen社）で染色した試料をネガティブ対照と
して使用して、フォト増倍管チューブ（PMT）を調整するために使用した。抗ヒト抗体で
単一染色した試料をポジティブ対照として使用して、スペクトルの重複/補正を調整する
ために使用した。
【０１７３】
（6.2.1.4 細胞の分取及び培養）
1セットの胎盤細胞（灌流液、羊膜又は絨毛膜から）を7-アミノ-アクチノマイシンD（7
AAD；BD Biosciences Pharmingen社）及び関心対象の表現型に特異的なモノクローナル抗
体で染色した。細胞を1000000個の細胞あたり10μlの抗体の比で、攪拌機上で室温にて30
分間染色した。次いで、これらの細胞をBD FACS Ariaにて関心対象の表現型を発現する生
細胞についてポジティブに分取して、培養液中のプレートにまいた。分取した（関心対象
の集団）及び「全ての」（分取していない）胎盤細胞集団を、比較のためにプレートにま
いた。細胞をフィブロネクチン（Sigma-Aldrich社）コートした96ウェルプレート上に、
表1に収載した細胞密度（細胞/cm2）にてまいた。細胞密度、及び細胞型が二重又は三重
にプレートにまかれたかどうかは、関心対象の表現型を発現する細胞の数によって決定し
、管理した。
【表１】
2020055809.tif 000003
【０１７４】
完全培地（60% DMEM-LG（Gibco社）及び40% MCDB-201（Sigma社）；2% ウシ胎児血清（
FCS）（Hyclone Laboratories）；1×インスリン-トランスフェリン-セレン（ITS）；1×
レノレン酸-ウシ血清アルブミン（LA-BSA）；10-9 M デキサメサゾン（Sigma社）；10-4 
M アスコルビン酸2-ホスフェート（Sigma社）；上皮細胞成長因子l0ng/ml（R&D systems
社）、血小板由来成長因子（PDGF-BB）l0ng/ml（R&D systems社））を96ウェルプレート
のそれぞれのウェルに添加し、プレートを5% CO2/37℃インキュベーターにおいた。7日目
に、100μlの完全培地をそれぞれのウェルに添加した。96ウェルプレートを約2週間モニ
ターし、培養の最終評価を12日目に完了した。
【０１７５】
（6.2.1.5 データ解析）
FACSCaliburデータを標準的なゲーティング技術を使用してFlowJo（Tree star社）で解
析した。BD FACS Ariaデータは、FACSDivaソフトウェア（Becton Dickinson社）を使用し
て解析した。FACS Ariaデータは、二重項を最小化するための二重項識別ゲーティング、
並びに標準的なゲーティング技術を使用して解析した。全ての結果は、Microsoft Excel
で編集し、全ての値は、本明細書において、平均±標準偏差（数、標準誤差）として表し
てある。
【０１７６】
（6.2.2 結果）
（6.2.2.1 細胞生存率）
消化後の生存率は、手動トリパンブルー除去法を使用して評価した（図1）。消化した
組織（羊膜、絨毛膜又は羊膜-絨毛膜プレートから）の大部分から得られる細胞の平均生
存率は、約70%であった。羊膜からの細胞は、74.35%±10.31%（n=6、SEM=4.21）の平均生
存率を有し、絨毛膜は、78.18%±12.65%（n=4、SEM=6.32）の平均生存率を有し、羊膜-絨
毛膜プレートは、69.05%±10.80%（n=4、SEM=5.40）の平均生存率を有し、臍帯は、63.30
%±20.13%（n=4、SEM=10.06）の平均生存率を有した。灌流からの細胞は、消化を受けな
かったが、最高の平均生存率89.98±6.39%（n=5、SEM=2.86）を保持した。
【０１７７】
（6.2.2.2 細胞の定量化）
胎盤に由来する細胞の5つの異なる集団を解析して、HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+細胞
の数を決定した。BD FACSCaliburデータの解析から、羊膜、灌流液及び絨毛膜がこれらの
細胞の最大の総数、それぞれ30.72±21.80細胞（n=4、SEM=10.90）、26.92±22.56細胞（
n=3、SEM=13.02）及び18.39±6.44細胞（n=2、SEM=4.55）を含んだことが観察された（デ
ータ示さず）。羊膜-絨毛膜プレート及び臍帯は、関心対象の表現型を発現する細胞の最
少の総数、それぞれ4.72±4.16細胞（n=3、SEM=2.40）及び3.94±2.58細胞（n=3、SEM=1.
49）を含んだ（データ示さず）。
【０１７８】
同様に、関心対象の表現型を発現する総細胞の割合を解析したときに、羊膜及び胎盤の
灌流液が、この表現型を発現する細胞の最も高い割合を含んだことが観察された（それぞ
れ、0.0319%±0.0202%（n=4、SEM=0.0101）及び0.0269%±0.0226%（n=3、SEM=0.0 130）
（図2）。臍帯は、関心対象の表現型を発現する少数の細胞を含んだが（図2）、それは関
心対象の表現型を発現する細胞で3番目に高い割合、0.020±0.0226%（n=3、SEM=0.0131）
を含んだ（図2）。絨毛膜及び羊膜-絨毛膜プレートは、関心対象の表現型を発現する細胞
の最低の割合、それぞれ0.0184±0.0064%（n=2、SEM=0.0046）及び0.0177±0.0173%（n=3
、SEM=0.010）を含んだ（図2）。
【０１７９】
BD FACSCalibur解析の結果と一致して、BD FACS Ariaデータもまた、羊膜、灌流液及び
絨毛膜が残りの供与源よりも高いHLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+細胞数を提供することを
同定した。羊膜、灌流液及び絨毛膜の中で、関心対象の表現型を発現する細胞の平均総数
は、それぞれ126.47±55.61細胞（n=15、SEM=14.36）、81.65±34.64細胞（n=20、SEM=7.
75）及び51.47±32.41細胞（n=15、SEM=8.37）であった（データ示さず）。羊膜-絨毛膜
プレート及び臍帯は、関心対象の表現型を発現する細胞の最少の総数、それぞれ44.89±3
7.43細胞（n=9、SEM=12.48）及び11.00±4.03細胞（n=9、SEM=1.34）を含んだ（データ示
さず）。
【０１８０】
BD FACS Ariaデータは、B及びA細胞供与源がHLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+細胞の最も
高い割合、それぞれ0.1523±0. 0227%（n=15、SEM=0.0059）及び0.0929±0.0419%（n=20
、SEM=0.0094）を含んだことを明らかにした（図3）。D細胞供与源は、関心対象の表現型
を発現する細胞で3番目に高い割合、0.0632±0.0333%（n=9、SEM=0.0111）を含んだ（図3
）。C及びE細胞供与源は、それぞれ関心対象の表現型を発現する細胞の最低の割合、0.06
23±0.0249%（n=15、SEM=0.0064）及び0.0457±0.0055%（n=9、SEM=0.0018）を含んだ（
図3）。
HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+細胞をそれぞれの細胞供与源から同定して定量化した後
、その細胞を更に解析して、これらの細胞表面マーカーHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38
、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200及びCD105の発現について特徴付けた。
【０１８１】
（6.2.2.3 胎盤灌流液由来細胞）
灌流液由来細胞は、一貫してHLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、C
D105及びCD13について陽性であった（図4）。灌流液由来細胞のためのそれぞれのマーカ
ーの平均発現は、以下であった：37.15%±38.55%（n=4、SEM=19.28）の細胞は、HLA-Gを
発現した；36.37%±21.98%（n=7、SEM=8.31）の細胞は、CD33を発現した；39.39%±39.91
%（n=4、SEM=19.96）の細胞は、CD117を発現した；54.97%±33.08%（n=4、SEM=16.54）の
細胞は、CD10を発現した；36.79%±11.42%（n=4、SEM=5.71）の細胞は、CD44を発現した
；41.83%±19.42%（n=3、SEM=11.21）の細胞は、CD200を発現した；74.25%±26.74%（n=3
、SEM=15.44）の細胞は、CD90を発現した；35.10%±23.10%（n=3、SEM=13.34）の細胞は
、CD38を発現した；22.87%±6.87%（n=3、SEM=3.97）の細胞は、CD105を発現した；及び2
5.49%±9.84%（n=3、SEM=5.68）の細胞は、CD13を発現した。
【０１８２】
（6.2.2.4 羊膜由来細胞）
羊膜由来細胞は、一貫してHLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、CD1
05及びCD13に陽性であった（図5）。羊膜由来についてのそれぞれのマーカーの平均発現
は、以下であった：57.27%±41.11%（n=3、SEM=23.73）の細胞は、HLA-Gを発現した；16.
23%±15.81%（n=6、SEM=6.46）の細胞は、CD33を発現した；62.32%±37.89%（n=3、SEM=2
1.87）の細胞は、CD117を発現した；9.71%±13.73%（n=3、SEM=7.92）の細胞は、CD10を
発現した；27.03%±22.65%（n=3、SEM=13.08）の細胞は、CD44を発現した；6.42%±0.88%
（n=2、SEM=0.62）の細胞は、CD200を発現した；57.61%±22.10%（n=2、SEM=15.63）の細
胞は、CD90を発現した；63.76%±4.40%（n=2、SEM=3.11）の細胞は、CD38を発現した；20
.27%±5.88%（n=2、SEM=4.16）の細胞は、CD105を発現した；及び54.37%±13.29%（n=2、
SEM=9.40）の細胞は、CD13を発現した。
【０１８３】
（6.2.2.5 絨毛膜由来細胞）
絨毛膜由来細胞は、一貫してHLA-G、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38及びCD13
について陽性であるが、一方、CD33及びCD105の発現は、変化した（図6）。絨毛膜細胞に
ついてのそれぞれのマーカーの平均発現は、以下であった：53.25%±32.87%（n=3、SEM=1
8.98）の細胞は、HLA-Gを発現した；15.44%±11.17%（n=6、SEM=4.56）の細胞は、CD33を
発現した；70.76%±11.87%（n=3、SEM=6.86）の細胞は、CD117を発現した；35.84%±25.9
6%（n=3、SEM=14.99）の細胞は、CD10を発現した；28.76%±6.09%（n=3、SEM=3.52）の細
胞は、CD44を発現した；29.20%±9.47%（n=2、SEM=6.70）の細胞は、CD200を発現した；5
4.88%±0.17%（n=2、SEM=0.12）の細胞は、CD90を発現した；68.63%±44.37%（n=2、SEM=
31.37）の細胞は、CD38を発現した；23.81%±33.67%（n=2、SEM=23.81）の細胞は、CD105
を発現した；及び53.16%±62.70%（n=2、SEM=44.34）の細胞は、CD13を発現した。
【０１８４】
（6.2.2.6 羊膜-絨毛膜プレート胎盤細胞）
羊膜-絨毛膜プレートからの細胞は、一貫してHLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200
、CD90、CD38、CD105、及びCD13について陽性であるが、一方、CD33及びCD105の発現は、
変化した（図7）。羊膜-絨毛膜プレート由来細胞についてのそれぞれのマーカーの平均発
現は、以下であった：78.52%±13.13%（n=2、SEM=9.29）の細胞は、HLA-Gを発現した；38
.33%±15.74%（n=5、SEM=7.04）の細胞は、CD33を発現した；69.56%±26.41%（n=2、SEM=
18.67）の細胞は、CD117を発現した；42.44%±53.12%（n=2、SEM=37.56）の細胞は、CD10
を発現した；32.47%±31.78%（n=2、SEM=22.47）の細胞は、CD44を発現した；5.56%（n=1
）の細胞は、CD200を発現した；83.33%（n=1）の細胞は、CD90を発現した；83.52%（n=1
）の細胞は、CD38を発現した；7.25%（n=1）の細胞は、CD105を発現した；及び81.16%（n
=1）の細胞は、CD13を発現した。
【０１８５】
（6.2.2.7 臍帯由来細胞）
臍帯由来細胞は、一貫してHLA-G、CD33、CD90、CD38、CD105及びCD13について陽性であ
るが、一方、CD117、CD10、CD44及びCD200の発現は、変化した（図8）。臍帯由来細胞に
ついてのそれぞれのマーカーの平均発現は、以下であった：62.50%±53.03%（n=2、SEM=3
7.50）の細胞は、HLA-Gを発現した；25.67%±11.28%（n=5、SEM=5.04）の細胞は、CD33を
発現した；44.45%±62.85%（n=2、SEM=44.45）の細胞は、CD117を発現した；8.33%±11.7
9%（n=2、SEM=8.33）の細胞は、CD10を発現した；21.43%±30.30%（n=2、SEM=21.43）の
細胞は、CD44を発現した；0.0%（n=1）の細胞は、CD200を発現した；81.25%（n=1）の細
胞は、CD90を発現した；64.29%（n=1）の細胞は、CD38を発現した；6.25%（n=1）の細胞
は、CD105を発現した；及び50.0%（n=1）の細胞は、CD13を発現した。
全てのマーカー発現平均の概要を図9に示してある。
【０１８６】
（6.2.2.8 BD FACS Aria分取報告）
HLA ABC、CD45、CD34及びCD133の最大の割合を発現した胎盤細胞の3つの異なる集団（
灌流液、羊膜及び絨毛膜に由来する細胞）を7AAD及びこれらのマーカーの抗体で染色した
。3つの集団は、関心対象の表現型を発現する生細胞について陽性に分取した。BD FACS A
ria分取の結果を表2に収載してある。
【表２】
2020055809.tif 000004
【０１８７】
陽性に分取した細胞（「分取」）の3つの異なる集団及びこれらに対応する非分取細胞
をプレートにまき、培養の結果を12日目に評価した（表3）。分取された灌流液由来細胞
を40,600/cm2の細胞密度にてプレートにまくと、小さな、丸い、非接着細胞を生じた。分
取しなかった灌流液に由来細胞の3つのセットからの2つは、それぞれ40,600/cm2の細胞密
度にてプレートにまくと、ウェルの周辺あたりに位置するいくつかの接着細胞と共に、大
部分は小さな、丸い、非接着細胞を生じた。分取しなかった灌流液由来細胞は、93,800/c
m2の細胞密度にてプレートにまくと、ウェルの周辺あたりに位置するいくつかの接着細胞
と共に、大部分は小さな、丸い、非接着細胞を生じた。
【０１８８】
分取した羊膜由来細胞は、6,300/cm2の細胞密度にてプレートにまくと、小さな、丸い
、非接着細胞を生じた。分取していない羊膜由来細胞は、62,500/cm2の細胞密度にてプレ
ートにまくと、小さな、丸い、非接着細胞を生じた。
分取した絨毛膜由来細胞は、6,300/cm2の細胞密度にてプレートにまくと、小さな、丸
い、非接着細胞を生じた。分取していない絨毛膜由来細胞は、6,300/cm2の細胞密度にて
プレートにまくと、小さな、丸い、非接着細胞を生じた。分取していない絨毛膜由来細胞
は、62,500/cm2の細胞密度にてプレートにまくと、小さな、丸い、非接着細胞を生じた。
【０１８９】
（6.3 実施例3：胎盤幹細胞の分化）
接着性胎盤幹細胞は、いくつかの異なる細胞系統に分化した。接着性胎盤幹細胞は、羊
膜、絨毛膜、胎盤の子葉又は任意のこれらの組み合わせを含む胎盤内の解剖学的部位から
の組織の物理的破壊によって胎盤から単離して、臍帯幹細胞は、臍帯組織の物理的破壊に
よって得た。
胎盤幹細胞及び臍帯幹細胞を、低濃度のウシ胎児血清及び限定された成長因子を含む培
地において確立した。フローサイトメトリー解析は、胎盤幹細胞が典型的には、70%以上
の割合にてCD200+CD105+CD73+CD34+CD45-の表現型を表すことを示した。胎盤幹細胞は、
脂肪細胞、軟骨細胞及び骨細胞系統に分化することが見いだされた。
【０１９０】
IBMX、インスリン、デキサメサゾン及びインドメタシンを含む誘導培地において、胎盤
幹細胞は、3〜5週において脂肪を伴った脂肪細胞に変化した。骨原性誘導培養条件下で、
胎盤幹細胞は、骨小瘤を形成し、これらの細胞外基質に石灰沈着を有することが見いださ
れた。PDACの軟骨形成分化は、マイクロペレットにおいて行い、組織凝集体におけるグリ
コサミノグリカンの形成によって確認した。
【０１９１】
（6.4 実施例4：胎盤幹細胞を使用する免疫調節）
胎盤幹細胞は、T細胞及びナチュラルキラー細胞の増殖の抑制を含む免疫調節効果を有
する。以下の実験では、胎盤幹細胞が、刺激に対するT細胞の反応を調節する能力がある
ことを2つのアッセイ法、すなわち混合リンパ球反応アッセイ法及び退行アッセイ法で証
明する。
（6.4.1 混合リンパ球反応アッセイ法）
MLRは、標的集団に対するエフェクター集団の反応を測定する。エフェクターは、リン
パ球又はCD8+T細胞若しくはNK細胞などの精製された亜集団であることができる。標的集
団は、同種間の照射を受けたPBMC又は本研究と同様に、成熟DCのいずれかである。応答集
団は、総T細胞の20%と見積もられるアロ特異的な細胞からなる。修飾された胎盤幹細胞の
MLRは、反応において胎盤幹細胞を使用する。
【０１９２】
胎盤幹細胞を96ウェルプレートのウェルにまき、エフェクター集団を添加した。胎盤幹
細胞及び5（6）-カルボキシフルオレセインジアセタートN-スクシンイミジルエステル（C
FSE）で染色したエフェクターを、標的である成熟DCを添加する前に、24時間プレインキ
ュベートした。6日後、上清及び非接着細胞を収集した。上清をLuminexビーズ解析により
解析し、細胞をフローサイトメトリーによって解析した。
古典的に、MLRは、CD8+及びCD4+T細胞コンパートメントにおける増殖反応を生する。2
つの同種間のドナーは、以前に決して互いに遭遇していないので、この反応は、ナイーブ
T細胞反応である。CD4+T細胞及びCD8+T細胞の両者は、標準的なMLRにおいて勢いよく増殖
した。胎盤幹細胞をMLRに添加したとき、CFSE低応答細胞の割合によって測定されるCD4及
びCD8T細胞増殖は、低下した。
【０１９３】
MLR（PMLR）に対する胎盤幹細胞を添加する効果を、図3A及び3B（PMLRトレース）、並
びに図4において見ることができる。結果は、CD4+若しくはCD8+T細胞のみを個々に使用さ
れたかどうか、又は同量のCD4+T細胞及びCD8+T細胞を共に使用したかどうかにかかわらず
、同様であった。羊膜-絨毛膜又は臍帯間質から得られる胎盤幹細胞は、同程度にMLRを抑
制し、抑制における相違は、CD4+T細胞及とCD8+T細胞との間に見られなかった。これは、
また全T細胞反応についてもあてはまった。
別のMLRを、CD4+T細胞、CD8+T細胞又はCD4+とCD8+T細胞との両方、及び同種間の樹状細
胞（DC）を使用して行った。胎盤幹細胞をMLRに添加し、T細胞の増殖の程度を、対照とし
て胎盤幹細胞のないMLRを使用して評価した。
【０１９４】
CD4+及びCD8+T細胞及びCD14+単球は、Miltenyi MACSカラム及びビーズを使用して製造
業者の説明書に従って使用し、バフィーコートから単離した。樹状細胞を1% ドナー血漿
、IL-4及びGM-CSFを補ったRPMI 1640における単球の6日培養、並びにIL-1β、TNF-α及び
IL-6を補ったRPMI 1640における2日培養によって得た。10：1のT：DC比の同種間T細胞及
びDCをインキュベートして、古典的な6日目のMLRを産生した。T細胞の増殖は、アッセイ
に加える前にCFSE（カルボキシフルオレセインジアセタート、スクシンイミジルエステル
）でT細胞を染色することによって評価した。CSFEを使用して、娘細胞集団の中の染料の
希釈を測定することによって増殖の程度を評価する。
【０１９５】
このアッセイに、胎盤幹細胞（PSC）を10：1：2のT：DC：PSC比にて添加した。反応を9
6ウェルプレートに、5%のプールしたヒト血清（R5）を補った200μLの最終体積のRPMI 16
40中に準備した。6日後に、非接着細胞を簡単に再懸濁して、RPMIで洗浄した5mLチューブ
に移し、CD4及びCD8抗体で染色した。CD4及びCD8コンパートメントの増殖をBD FACS Cali
burにて評価した。
（胎盤幹細胞）胎盤幹細胞を上記の実施例1及び2に記載されているように得た。胎盤幹
細胞を以下の胎盤組織から得た：羊膜（AM）又は羊膜/絨毛膜（AC）。臍帯幹細胞を臍帯
（UC）の消化から得た。線維芽細胞（FB）及び骨髄由来間充織の幹細胞（MSC）を対照と
して添加した。
【０１９６】
（結果）胎盤幹細胞をMLRに添加すると、T細胞増殖は、低下する（図10）。図10におい
て反映される実験に使用した胎盤幹細胞は、61665と命名した1つの胎盤に由来した。試験
した全ての胎盤幹細胞について、両方ではなくCD4+及びCD8+T細胞のいずれかを使用した
ときに、CD4+コンパートメントは、CD8+コンパートメントよりも大きな程度に抑制された
（図10A）。AM及びUC胎盤幹細胞によるCD4+活性化の抑制は、概略的に、MSCによって媒介
される抑制と同等であり、約60%〜75%の抑制であった。MLRをCD4+及びCD8+T細胞の両方を
使用して実行したとき、胎盤幹細胞は、CD8+コンパートメントよりもはるかに大きな程度
にCD4+コンパートメントの増殖を抑制した（図10B）。特に、AM胎盤幹細胞によるCD4+T細
胞増殖抑制は、90%に近づき、MSCによって示される抑制を上回った。これらの2つのコン
パートメント間の抑制における相違は、AM及びAC胎盤幹細胞において最も顕著であった。
【０１９７】
異なるドナーからの胎盤幹細胞は、異なる程度にMLRにおけるT細胞増殖を抑制する（図
11）。65450と命名された異なる胎盤からの胎盤幹細胞は、胎盤61665からの胎盤幹細胞と
は異なり、MLRにおけるCD4+及びCD8+T細胞増殖を抑制した。著しいことに、胎盤65450か
らのAC及びUC PSCは、80%〜95%までT細胞増殖を抑制し、MSCによるこのアッセイ法におけ
る抑制を上回った。しかし、胎盤65450からのAC胎盤幹細胞は、認識できる程度にT細胞増
殖を抑制しなかった（図10AにおけるAM胎盤幹細胞抑制と比較する）。
また、胎盤幹細胞は、MLRにおけるナチュラルキラー（NK）細胞の活性を抑制した。
【０１９８】
（6.4.2 退行アッセイ法）
胎盤幹細胞は、退行アッセイ法において、エプスタインバーウイルス（EBV）抗原を発
現するB細胞系に対するT細胞反応を抑制することが示された。退行アッセイ法は、EBVで
形質転換されたB細胞のMHCクラスI及びIIに対するEBV抗原ペプチドの提示によってもたら
されるエフェクターT細胞メカニズムを測定するリコールアッセイ法である。本アッセイ
法は、T細胞を、人工的に作製された形質転換されたB細胞系である同じドナーからのリン
パ芽球状株化細胞（LCL）と混合することによって行われる。LCLは、9つのエプスタイン
バーウイルス抗原を発現し、これがこれらの間である範囲の順応性T及びB細胞反応を誘発
するが、古典的な退行アッセイ法では、T細胞エフェクターメカニズムだけが測定される
。退行アッセイ法は、LCLが活性化されたB細胞マーカーCD23を発現するという点で、天然
に存在する病原体に感染した標的に対する細胞障害性を測定する便利な方法を提供する。
従って、CD23を発現する細胞の細胞数は、アッセイ法において生存するLCLの数の測定値
である。
【０１９９】
古典的な17日の退行アッセイ法では、図5における最初のバーのクラスターで見られる
ものと同様の結果を与えた。CD23+細胞は、これらの全てがCD4+及びCD8+T細胞によって死
滅したため、検出されなかった。胎盤幹細胞の添加によって、次の第2のバーのクラスタ
ーで見られるように、CD23+細胞の生存が増強された。理論によって拘束されることは望
まないが、2つの説明を、観察された効果のために与えることができる。T細胞が死に、後
に自由に増殖するLCLが残されたか、又は胎盤幹細胞は、主にLCLの寿命を増加させ、T細
胞に対する効果をより少ないものにした。
【０２００】
別の退行アッセイ法では、T細胞及び樹状細胞を研究室ドナーから得た。エプスタイン
バーウイルスで形質転換されたB株化細胞LCLは、末梢血単核細胞（PBMC）を溶解性EBV株
からの上清、B95.8及びサイクロスポリンAと共に2週間インキュベートすることによって
得た。LCLは、9つのEBV抗原を発現した。成長するLCL株を、10%ウシ胎児血清を補ったRPM
I 1640において維持する。退行アッセイ法は、10：1のT：LCL比でCD4+又はCD8+T細胞を自
己LCLと混合することによって行った。アッセイ法は、96ウェルプレートにおいて5%のプ
ールしたヒト血清（R5）を補った200μLのRPMI 1640中で行った。このアッセイに胎盤幹
細胞を10：1：2のT：LCL：PSC比で添加する。アッセイは、6、10又は17日間実行した。
【０２０１】
6日の退行アッセイ法を、CSFE標識したT細胞を使用して行った。胎盤65450からの胎盤
幹細胞は、退行アッセイ法においてT細胞増殖を約65%〜約97%まで抑制し、MLRにおけるこ
れらのPSCについての結果に対応する結果であった（図12）。また、胎盤65450からのUC及
びAC系は、有意にT細胞増殖を抑制し、一方で、65450 AM PSCは、増殖を抑制しなかった
。
別の実験において、ナチュラルキラー細胞は、同様にMLR及び退行アッセイ法において
抑制されたことが決定された。NK細胞は、MLR又は退行アッセイ法が50U/ml IL-2を含んで
実行されたときに、抑制効果が約45%であった（約40%〜約65%の範囲、SEM 5%）。
【０２０２】
（胎盤幹細胞は、免疫原性ではない）任意のドナー又は任意の胎盤の解剖学的部位から
の胎盤幹細胞に対して観察されるバックグラウンドのT細胞増殖は、5%を超えなかった。
（細胞間の接触の必要性）退行アッセイ法における細胞毒性及びMLRにおけるアロ認識
は、両方とも、標的とエフェクター細胞との間のTCR（T細胞受容体）：MHC相互作用に依
存する。胎盤幹細胞を媒介した抑制における細胞間の接触のための必要性を、トランスウ
ェルアッセイ法を使用して評価した。本アッセイ法では、T細胞及び胎盤幹細胞が膜によ
って分離される、MLRを行った。図13に示したように、MLRに使用される胎盤幹細胞の数が
多いほど、抑制の減少は、より多くなり、特に高い密度では、胎盤幹細胞（UC）がT細胞
増殖を抑制するためにT細胞との有意な接触を必要とすることを示している。
【０２０３】
別のアッセイ法により、胎盤幹細胞によるT細胞の免疫抑制が、少なくとも部分的に可
溶性因子を含むようであることを確認した。胎盤幹細胞を媒介した免疫抑制が、細胞間接
触に依存的であるかどうかを決定するために、胎盤幹細胞を可溶性因子のみの通過が可能
な膜の底面のインサートに置くトランスウェルアッセイ法を行った。ウェルの床にて、ML
R又はT細胞は、単独で胎盤幹細胞から分離された。観察された効果が胎盤幹細胞の相対量
に依存したかどうかを決定するために、幹細胞をT細胞及びDCに異なる相対密度にて添加
した。臍帯胎盤幹細胞がMLRから分離されたとき、抑制性の効果は部分的に消失した。胎
盤幹細胞を図4に使用したのと同様の密度にて使用されたときに、MLR抑制は、CD4+T細胞
については75%及びCD8+T細胞については85%消失した（図7、図8）。抑制効果は、ちょう
ど胎盤幹細胞の1/4用量を使用したときに（UC OP 25）なおも66%であり、12,500 UCの胎
盤幹細胞を添加したときに、バックグラウンドレベルに落ちた。インサートを使用した分
離での抑制の変化は、観察されなかった（図7）。25,000胎盤幹細胞では、なおも活発な
抑制効果にもかかわらず、インサートの導入時の抑制において最小の相対落下が観察され
た（図8）。
【０２０４】
（6.5 実施例5：胎盤幹細胞の免疫抑制の接触依存性は、骨髄由来間充織幹細胞のもの
とは異なる）
免疫調節における接触依存の程度を決定するための実験において、臍帯幹細胞は、免疫
調節のための細胞間接触について、骨髄由来幹細胞のものとは顕著に異なった必要性を示
した。特に、胎盤幹細胞は、特により高い胎盤又は間充織幹細胞数では、免疫調節をもた
らすためにより細胞間接触に依存した。
【０２０５】
骨髄由来幹細胞（BMSC）及び臍帯幹細胞（UC）は、混合白血球反応アッセイ法（MLR）
におけるT細胞に対する接着細胞の比率に依存して、細胞間の接触に関して異なる必要性
を有する。トランスウェル実験では、胎盤幹細胞がMLRにおいてT細胞及び樹状細胞（DC）
から分離される、抑制は、2つのタイプの接着細胞間で変化した。図15は、オープンウェ
ル及びトランスウェルからの結果を並べて示してある。およそ100,000又は75,000個のUC
若しくはBMSCをオープンウェル形式で使用したときも、同様の抑制が観察された。しかし
、トランスウェル形式では、UCは、BMSCが行うよりも少ない程度にMLRを抑制し、これら
のより高い胎盤幹細胞/T細胞比率におけるより大きな接触依存性を示している。より低い
T細胞に対する胎盤細胞比率が使用されたときは、胎盤幹細胞は、細胞に対してより抑制
性の細胞であった。
抑制データから、接触依存の程度を算出した。図16は、UC及びBMSC MLRの接触依存性を
示す。骨髄由来細胞は、UCよりも高いBM/T細胞比率にてより少ない接触依存性である。言
い換えると、UC胎盤幹細胞及びBMSCは、重要な作用パラメーターである細胞間接触につい
ての必要性に関して異なった挙動をする。
【０２０６】
調節性T細胞（Treg）は、BMSCを媒介したT細胞抑制のために必要である。Aggarwal & P
ittengerの文献、「ヒト間充織幹細胞は、同種間の免疫細胞反応を調整する（"Human Mes
enchymal Stem Cells Modulate Allogeneic Immune Cell Responses"）」、Blood 105（4
）：1815-1822 （2004）を参照されたい。CD4+CD25+ Tregを健康なドナー末梢血単核細胞
（PBMC）から枯渇させて、退行アッセイ法を、自己EBV（エプスタインバーウイルス）形
質転換細胞を使用して行った。UCをいくつかの条件に添加した。図17で分かるように、Tr
egが存在するか否かにかかわらず、退行アッセイ法における胎盤幹細胞を媒介したT細胞
反応の抑制に相違はない。従って、T調節性T細胞は、報告によれば、BMSCを媒介したT細
胞の抑制に必要であるものの、一方で、T調節性細胞は、胎盤幹細胞を媒介した免疫抑制
において役割を果たしていないようである。
【０２０７】
MLRを行って、胎盤幹細胞によって抑制されるMLRからT細胞を採取し、かつ新鮮な樹状
細胞を添加した。T細胞を増殖の間に娘細胞に同等に分配されるCFSEで染色した。CFSEHi
細胞は、増殖しなかったT細胞である（例えば、図17のパネルにおける最も左のピーク）
。この集団を、染色されたT細胞をFACS Ariaで分取することによって得た。これらの細胞
を新鮮な樹状細胞と共に第2のMLRに使用した。図18で分かるように、以前に抑制された細
胞は、DCに対してよく増殖したので、持続的な抑制は観察されなかった。CFSELo細胞（す
なわち娘細胞）は、これらの細胞がその後にそれ自体増殖したので、抑制の原因となてい
たであろう可能性は低い。CFSEHi集団は、このDCドナーに対して増殖しなかったであろう
非-アロ-特異的細胞、並びに胎盤幹細胞によって抑制されるT細胞で構成される。一旦胎
盤幹細胞が除去されると、抑制された細胞は、増殖した。
【０２０８】
MLRは、上清のおよそ10%がBMSC MLRからの上清によって置換されると、BMSCによって抑
制される。それに対して、上清が胎盤幹細胞を含むMLRからの上清によって置換されると
きには、さらに培地の75%が置換されたときでも、T細胞増殖の変化が観察されなかった（
図19）。
【０２０９】
DC又は静止T細胞は、MLRを始める前に胎盤幹細胞と種々の総時間のインキュベーション
による影響を受ける可能性がある。これは、アッセイ法を始める前に異なる長さの時間、
胎盤幹細胞又はBMSCをT細胞（図20A）若しくはDC（図20B）と共にインキュベートするこ
とによって試験した。T細胞及び胎盤幹細胞をプレインキュベートしても、抑制性表現型
があまり変化しない（図20A）。しかし、BMSC T細胞の抑制は、DC/PDACのプレインキュベ
ーションの長さに依存して変化する。図20Bに示したように、BMSCによる抑制は、DCがT細
胞の1日後に添加されるときに、最も強力である。しかし、DCがT細胞と同時に添加される
ときに、非常に低い抑制が見られる。DCをBMSCと共により長くインキュベートすることに
より、この抑制の喪失を逆転させることができる。2日間のプレインキュベーションでは
、抑制は、DCがT細胞の1日後（+1日）に添加される場合のシナリオに近くなる。胎盤幹細
胞を媒介した抑制では、同様の傾向は観察されない。
【０２１０】
（6.6 実施例6：MLR及び退行アッセイ法における胎盤幹細胞及び臍帯幹細胞のサイトカ
インプロフィール）
臍帯後部細胞（UC）及び羊膜絨毛膜プレート（AC）からの胎盤幹細胞は、MLR培地にあ
る種のサイトカインを分泌することが決定された。
一部のアッセイでは、サイトカインアレイを使用して、上清におけるサイトカイン及び
ケモカインのレベルを測定した。いくつかの因子が上清に分泌されることが見いだされ、
MLR及び退行アッセイ法に最も関連するものは、マクロファージ炎症性タンパク質（MIP）
-1α及びMIP-1βであった。これらの化学誘引物質は両方とも、T細胞を引きつけ、ヒト免
疫不全症ウイルス（HIV）感染に応答してCD8+T細胞によって分泌される。MLRにおいてア
ッセイしたときに、これらの化学誘引物質の分泌は、MLRの胎盤幹細胞及びMSC抑制と逆相
関した（図14）。胎盤幹細胞もMSCも、MIP-lα及びMIP-1βを分泌しなかった。
【０２１１】
別の研究において、MCP-1及びIL-6の分泌において相関が見いだされ、その両方ともが
、重要な免疫制御因子である（図9及び図10；図4と比較する）。胎盤幹細胞単独では、IL
-6又はMCP-1を分泌しなかったが、UC及びAC株（両方とも退行アッセイ法においてMLR及び
T細胞増殖を抑制する）（図4）は、MCP-1及びIL-6を分泌する（図9及び図10）。IL-6は、
主に炎症誘発性作用と関連しているが（例えばKishimotoらの論文、Annu. Rev. Immunol.
23：1-21 （2005）を参照されたい）、これは、また、マウスにおける肝障害の間の保護
的役割など、その他の機能を有する（例えばKleinらの論文、J. Clin. Invest. 115：860
-869（2005）。
【０２１２】
別の研究において、MLR又は退行アッセイ法に使用されるACをサイトカイン分泌につい
て解析した。6日目の幹細胞培養、幹細胞MLR又は幹細胞退行アッセイ法からの上清におい
て、サイトカインをLuminex systemで測定した。MLRは、幹細胞、樹状細胞（DC）及びT細
胞を2/1/10の比で含んだ。エプスタインバーウイルス（EBV）退行アッセイ法には、2：1
：10のTS：幹細胞：T比にて幹細胞、EBV腫瘍細胞（Ts）及びT細胞を含んだ。
【０２１３】
IL-6（11ng/ml）及びIL-8（16ng/ml）のレベルは、幹細胞単独培養、MLR及び退行アッ
セイ法において、一定のままであることが見いだされた。MCP-1の濃度は、幹細胞単独培
養、並びに非抑制性対照接着細胞MLR及び退行アッセイ法において約2ng/mlであることが
決定されたが、抑制性幹細胞MLR及び幹細胞退行アッセイ法では、約10ng/mlへ増加した。
これらの値は、MCP-1について記録した血清レベル内に入る。
【０２１４】
インターロイキン-2（IL-2）は、T細胞生存因子であり、かつCD4+CD25+T調節性細胞の
ための必須因子である。このT細胞サブセットは、AC幹細胞によるT細胞抑制のために必要
とされないが、IL-2レベルは、AC幹細胞によるMLR抑制の間に一貫して減少する。AC幹細
胞の非存在下でのMLR上清には、約35pg/mlのIL-2を含んだが、AC幹細胞を含んだMLRでは
、440pg/mlまでのIL-2を含んだ。
【０２１５】
IL-2濃度は、抑制と相関した。例えば、85%の抑制を示すCD4+T細胞MLRは、330pg/mlのI
L-2を含み、85%の抑制を示すCD8+T細胞MLRは、AC幹細胞を使用し、66pg/mlのIL-2を含ん
だ。これらの結果は、従来より免疫応答の刺激体として公知のIL-2及びMCP-1が、免疫抑
制において役割を果たし得ることを示している。
【０２１６】
均等物：
本発明は、本明細書に記述された具体的実施態様による範囲に限定されない。実際に、
記述したものに加えて本発明の種々の改変が、前述の明細書及び添付の図面から当業者に
明らかになるであろう。このような改変は、添付の請求の範囲内に入ることが意図される
。
種々の刊行物、特許及び特許出願が、本明細書に引用されており、これらの開示は、そ
の全体が引用として組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２１７】
【図１】灌流（A）、羊膜（B）、絨毛膜（C）若しくは羊膜-絨毛膜プレート（D）又は臍帯幹細胞（E）からの胎盤幹細胞の生存度。X軸上の数は、幹細胞が得られた胎盤を示す。
【図２】FACSCaliburによって決定される灌流（A）、羊膜（B）、絨毛膜（C）若しくは羊膜-絨毛膜プレート（D）又は臍帯幹細胞（E）からのパーセントHLA  ABC-/CD45-/CD34-/CDl33+細胞。X軸上の数は、幹細胞が得られた胎盤を示す。
【図３】FACS Ariaによって決定される灌流（A）、羊膜（B）、絨毛膜（C）若しくは羊膜-絨毛膜プレート（D）又は臍帯幹細胞（E）からのパーセントHLA ABC-/CD45-/CD34-/CDl33+細胞。X軸上の数は、幹細胞が得られた胎盤を示す。
【図４】胎盤の灌流液に由来する幹細胞におけるHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200発現。
【図５】羊膜に由来する幹細胞におけるHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200発現。
【０２１８】
【図６】絨毛膜に由来する幹細胞におけるHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200発現。
【図７】羊膜-絨毛膜プレートに由来する幹細胞におけるHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200発現。
【図８】臍帯に由来する幹細胞におけるHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200発現。
【図９】灌流（A）、羊膜（B）、絨毛膜（C）、羊膜-絨毛膜プレート（D）又は臍帯（E）に由来する幹細胞におけるHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD 117、CD200発現の平均発現。
【０２１９】
【図１０】図10A及び10B：混合リンパ球反応（MLR）は、ナイーブ免疫応答のためのモデルであり、胎盤幹細胞によって阻害される。ゲートで閉じた「生きている」及びCD8+及びCD4+T細胞ゲートから、カルボキシフルオレッセインスクシンイミジルエステル（CFSE）低細胞の割合をモニターした（それぞれ、図10A及び10B）。この割合は、MLRの6日後（図10C及び10D、MLRトレース）及び胎盤幹細胞の添加で増加し、本効果は、CD8+及びCD4+T細胞コンパートメントの両方において逆転した（図10C及び10D、MLRトレース）。
【図１１】羊膜絨毛膜プレート（AC）及び臍帯間質（UC）からの胎盤由来幹細胞は、アロ-MLRを抑制する。MLRは、CD4+T細胞、CD8+T細胞又は同量のCD4+及びCD8+T細胞のいずれかで行う。横軸：増殖のパーセント抑制。
【０２２０】
【図１２】胎盤幹細胞及び臍帯幹細胞は、アロ-MLRを阻害する。丸底96ウェルプレートウェルにおける6日のアッセイ法。胎盤細胞：T細胞：樹状細胞=約1：10：1。幹細胞は、羊膜-絨毛膜（AC）、羊膜（AM）又は臍帯（UC）から得た。FB =線維芽細胞。BM=骨髄由来間充織幹細胞。
【図１３】異なるドナーからの胎盤幹細胞は、異なる程度にアロ-MLRを抑制する。図では、61665及び63450を示す2つの胎盤のドナーからの胎盤幹細胞によるMLRの抑制を比較する。63450胎盤由来の幹細胞は、61665胎盤由来の幹細胞よりも優れた度合いでMLRを抑制するように見える。
【０２２１】
【図１４】17日の退行アッセイ法及び修正した胎盤幹細胞退行アッセイ法。x軸は、当該アッセイに添加した胎盤幹細胞の数を表す。生存するCD23+LCL（リンパ芽球状株化細胞、人工的に作製した形質転換B株化細胞）の数は、Y軸で測定される。
【図１５】6日の退行アッセイ法におけるT細胞増殖の胎盤幹細胞抑制。退行アッセイ法は、CFSE染色したT細胞を使用することにより準備した。6日後に、T細胞増殖を評価した。羊膜-絨毛膜（AC）、臍帯（UC）、羊膜（AM）又は骨髄（BM）からの幹細胞によるT細胞増殖の相対的抑制を示してある。
【０２２２】
【図１６】胎盤細胞をT細胞から分離するが、培地の交換ができるMLRにおけるトランスウェルインサートの導入に対する抑制の割合の変化。反応あたり25,000、50,000、75,000又は100,000個の臍帯幹細胞は、高力価で抑制を達成するために、相対的に高い抑制の程度及び相対的に高い程度での細胞間接触についてのを必要性を示す。
【図１７】12,500（UC OP／TW 12.5）〜100,000（UC OP／TW 100）にて添加した臍帯間質幹細胞（UC）は、膜（TW）により、又はMLR（OP）と接触してNLRから分離した。同数のCD4+T細胞及びCD8+T細胞を使用し、MLR（% CFSE低=89%）の抑制割合を算出した。
【０２２３】
【図１８】細胞接触依存に対する胎盤幹細胞用量と細胞との関係は、線形ではない。インサートの導入に対するMLR抑制の変化は、図17に示した値から算出される。
【図１９】胎盤幹細胞及びBMSCによるT細胞反応の差動的抑制。PDAC又はBMSCによって与えられる抑制の程度は、70%を超えるCFSELOゲートのMLR T細胞の割合を接着細胞MLRの割合と比較して算出した。MLRは、接着細胞（トランスウェル）から分離して、又はオープンウェル（オープン）のいずれかで行った。X軸は、500,000個のT細胞及び50,000個のDCに添加した接着細胞の数を数千で示する。T細胞に対する接着細胞の比は、1：5〜1：40にわたる。
【０２２４】
【図２０】胎盤幹細胞及び骨髄由来幹細胞免疫抑制のための差動的細胞間接触の必要性。図15に示した抑制データから、接着細胞／T細胞比に対する接触依存性を算出して、示した（n=3、UC以外：n=2）。
【図２１】T調節性細胞は、PDAC T細胞抑制のために必要とされない。退行アッセイ法は、PBMC全体（赤及び青グラフ）又はT調節性細胞を枯渇させたPBMC（緑のグラフ）を使用して行い、両方をCFSE染色し、いくつかの条件（青及び緑のグラフ）にUC PDACを添加した。N=1。
【図２２】CFSEHi細胞は二次MLRにおいて増殖する。PDAC MLRから、CFSE染色された細胞を使用して、CFSEHi T細胞をFACS Aliaで単離した。細胞をMLRに使用した。N=1。
【０２２５】
【図２３】抑制された幹細胞MLRからの上清は、75%の置換にてMLRを抑制しない。UC（PUC）、AC（PAC）及びBMSC（PBM）MLRを行い、全てが50%を超えてMLRを抑制した。実験からの上清を使用して、新鮮なMLRのために使用した200μlの培地のうちの10〜150μlを置換した。また、対照として、T細胞及びAC（T／AC）からの培地又はT細胞及び骨髄由来幹細胞（T／BM）の同時培養を同様に使用した（N=2）。
【図２４】図24A、24B：T細胞及び接着細胞をプレインキュベートしてもMLR抑制に影響しない。2人のドナーからのT細胞を2つの独立した実験に使用した。成熟DC（A）又はCFSE染色されたCD3+T細胞（B）を臍帯幹細胞（UC）又は骨髄由来幹細胞と共にDC（0日目、A）又はCFSE+CD3+T細胞（B、これによりMLRを始める）を添加する前に示した日数の間インキュベートした。次いで、接着細胞MLRを通常通りに6日間進行した。N=2。
【図２５】図25A、25B：A. MLRにおけるMIP-1α及びMIP-1β分泌、並びに胎盤幹細胞又は骨髄由来幹細胞でのMLRは、MLR抑制と逆相関する。B：同じ実験からのT細胞及びNK細胞CFSEデータ。上清を図14Bに示したMLRから収集して、MIP-1α及びMIP-1βについて解析した。B：MLRは、記述したように行い、平均して、55%（Ｔ細胞）の又は83%（ＮＫ細胞）のCFSE低細胞が観察された。幹細胞添加の抑制効果を算出した。N=2（NK部分：N=1）。
【０２２６】
【図２６】修正退行アッセイ法及びMLR上清において、MCP-1を測定した。MLR及び退行アッセイ法の胎盤幹細胞抑制は、化学誘引物質によるMCP-1の分泌と相関する。AC：羊膜-絨毛膜プレートからの幹細胞。UC：臍帯からの幹細胞。明るいバー：MLRアッセイ法結果。暗いバー：退行アッセイ法結果。Y軸：アッセイ法溶液におけるMCP-1のpg。
【図２７】修正MLR及び退行アッセイ法の上清におけるIL-6測定。MLR及び退行アッセイ法の胎盤幹細胞抑制は、IL-6分泌と相関する。AC：羊膜-絨毛膜プレートからの幹細胞。UC：臍帯からの幹細胞。明るいバー：MLRアッセイ法結果。暗いバー：退行アッセイ法結果。Y軸：アッセイ法溶液におけるIL-6のpg。
【図１】
2020055809.tif 000005
【図２】
2020055809.tif 000006
【図３】
2020055809.tif 000007
【図４】
2020055809.tif 000008
【図５】
2020055809.tif 000009
【図６】
2020055809.tif 000010
【図７】
2020055809.tif 000011
【図８】
2020055809.tif 000012
【図９】
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【図１０】
2020055809.tif 000014
【図１１】
2020055809.tif 000015
【図１２】
2020055809.tif 000016
【図１３】
2020055809.tif 000017
【図１４】
2020055809.tif 000018
【図１５】
2020055809.tif 000019
【図１６】
2020055809.tif 000020
【図１７】
2020055809.tif 000021
【図１８】
2020055809.tif 000022
【図１９】
2020055809.tif 000023
【図２０】
2020055809.tif 000024
【図２１】
2020055809.tif 000025
【図２２】
2020055809.tif 000026
【図２３】
2020055809.tif 000027
【図２４】
2020055809.tif 000028
【図２５】
2020055809.tif 000029
【図２６】
2020055809.tif 000030
【図２７】
2020055809.tif 000031
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月19日(2019.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に実質的に記載された、新規な物、方法及び製造方法。
【外国語明細書】
2020055809000001.pdf