(57)【要約】【課題】催奇形性の低い新規なレチノイド化合物、及びそのレチノイド化合物を含有する医薬組成物を提供する。【解決手段】下記式（１）で表される化合物又はその塩であるレチノイド化合物、及びそのレチノイド化合物を含有する医薬組成物を提供する。式中、Ｒ１はハロゲン原子を示し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立にシリル基を示す。2020037518.tif 000019【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される化合物又はその塩。
【化１】
2020037518.tif 000018
（式中、Ｒ１はハロゲン原子を示し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立にシリル基を示す。）
【請求項２】
前記式（１）中のＲ２及びＲ３がトリメチルシリル基である請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の化合物又はその塩を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項４】
ビタミンＡ欠乏症、皮膚疾患、免疫性疾患、及び癌からなる群より選択される少なくとも１種の疾患の治療又は予防に用いられる請求項３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レチノイド化合物及びそれを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
レチノイドとは、ビタミンＡの活性本体である全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）及びそれと同等の活性を示す化合物群の総称である。より正確には、核内に存在するレチノイン酸受容体（ＲＡＲα，β，γ及びＲＸＲα，β，γ）に結合する化合物群の総称である。
【０００３】
ＡＴＲＡは、細胞の増殖及び分化を調節する作用を有しており、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）の治療薬として使用されている。また、ＡＴＲＡと同等の活性を示す多くのレチノイド化合物が合成されており（例えば、特許文献１〜３参照）、一部は実際に臨床応用されている。例えば、Ａｍ８０（一般名：タミバロテン）は、急性前骨髄球性白血病の治療薬として使用されており、タルグレチン（一般名：ベキサロテン）は、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫の治療薬として使用されており、ディフェリン（一般名：アダパレン）は、尋常性座瘡の治療薬として使用されている。
【０００４】
しかし、ＡＴＲＡは炭化水素カルボン酸からなり脂溶性が高く、過剰症になりやすい上、催奇形性を有するという問題がある。また、ＡＴＲＡ以外のレチノイド化合物についても、ＡＴＲＡと同様に催奇形性を有する。このため、催奇形性の低いレチノイド化合物の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平７−２４２５９２号公報
【特許文献２】特開平８−２８３２３８号公報
【特許文献３】特開２００８−９４７２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、催奇形性の低い新規なレチノイド化合物、及びそのレチノイド化合物を含有する医薬組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞  下記式（１）で表される化合物又はその塩。
【化１】
2020037518.tif 000002
（式中、Ｒ１はハロゲン原子を示し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立にシリル基を示す。）
【０００８】
＜２＞  前記式（１）中のＲ２及びＲ３がトリメチルシリル基である＜１＞に記載の化合物又はその塩。
【０００９】
＜３＞  ＜１＞又は＜２＞に記載の化合物又はその塩を有効成分として含有する医薬組成物。
【００１０】
＜４＞  ビタミンＡ欠乏症、皮膚疾患、免疫性疾患、及び癌からなる群より選択される少なくとも１種の疾患の治療又は予防に用いられる＜３＞に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、催奇形性の低い新規なレチノイド化合物、及びそのレチノイド化合物を含有する医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＨＬ−６０細胞を各化合物で処理したときの、未分化の細胞、単球に分化した細胞、及び好中球に分化した細胞の割合を示す図である。
【図２】ＨＬ−６０細胞を種々の濃度の各化合物で処理したときの、好中球に分化した細胞の割合を示す図である。
【図３Ａ】ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を各化合物で処理したときの神経突起伸長を顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図３Ｂ】ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞をｍＴＯＲ１阻害剤（ラパマイシン）で前処理した後、各化合物で処理したときの神経突起伸長を顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図４】ｍＴＯＲ１阻害剤（ラパマイシン）を用いて前処理を行った場合と前処理を行っていない場合とにおける神経突起長を示す図である。
【図５】ｍＴＯＲ１阻害剤（ラパマイシン）を用いて前処理を行った場合と前処理を行っていない場合とにおける、リン酸化ｍＴＯＲ（ｐ−ｍＴＯＲ）及びｍＴＯＲのウェスタンブロッティング結果を示す図である。
【図６】ｍＴＯＲ１／２阻害剤（Ｔｏｒｉｎ１）を用いて前処理を行った場合と前処理を行っていない場合とにおける神経突起長を示す図である。
【図７】ｍＴＯＲ１／２阻害剤（Ｔｏｒｉｎ１）を用いて前処理を行った場合と前処理を行っていない場合とにおける、リン酸化ｍＴＯＲ（ｐ−ｍＴＯＲ）及びｍＴＯＲのウェスタンブロッティング結果を示す図である。
【図８】ＭＡＰＫ阻害剤（Ｕ−１２６）を用いて前処理を行った場合と前処理を行っていない場合とにおける神経突起長を示す図である。
【図９】ＭＡＰＫ阻害剤（Ｕ−１２６）を用いて前処理を行った場合と前処理を行っていない場合とにおける、リン酸化ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）及びＥＲＫのウェスタンブロッティング結果を示す図である。
【図１０】ＲＡＲβアンタゴニスト（ＬＥ１３５）を用いて前処理を行った場合と前処理を行っていない場合とにおける神経突起長を示す図である。
【図１１】胎生９日の妊娠マウスに各化合物を単回経口投与したときの胎生１８日のマウス胎児の外部形態を示す図である。
【図１２Ａ】胎生９日の妊娠マウスに各化合物を単回経口投与したときの胎生１８日のマウス胎児の頭部で観察された奇形形成の例を示す図である。
【図１２Ｂ】胎生９日の妊娠マウスに各化合物を単回経口投与したときの胎生１８日のマウス胎児の肛門で観察された奇形形成の例を示す図である。
【図１２Ｃ】胎生９日の妊娠マウスに各化合物を単回経口投与したときの胎生１８日のマウス胎児の後肢で観察された奇形形成の例を示す図である。
【図１３】ＨｅｐＧ２細胞を各化合物で処理したときのＣＹＰ２６Ａ１の経時的ｍＲＮＡ発現レベルを定量ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜レチノイド化合物＞
本実施形態に係るレチノイド化合物は、下記式（１）で表される化合物又はその塩である。
【化２】
2020037518.tif 000003
（式中、Ｒ１はハロゲン原子を示し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立にシリル基を示す。）
【００１４】
上記式（１）中、Ｒ１で示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、及びヨウ素原子が挙げられ、フッ素原子及び塩素原子が好ましく、フッ素原子がより好ましい。
【００１５】
上記式（１）中、Ｒ２及びＲ３で示されるシリル基としては、例えば、−Ｓｉ（Ｒ４）３（ただし、Ｒ４はそれぞれ独立にアルキル基又はアリール基を示す。）で表される基が挙げられる。Ｒ４で示されるアルキル基の炭素数は１〜６が好ましい。また、Ｒ４で示されるアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。−Ｓｉ（Ｒ４）３で表される基の具体例としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基等が挙げられ、トリメチルシリル基が好ましい。
【００１６】
上記式（１）で表される化合物は、例えば、後述する実施例に記載の方法に従って合成することができる。なお、上記式（１）におけるＲ１〜Ｒ３以外の位置に置換基を有する化合物も同様に合成可能である。
【００１７】
本実施形態に係るレチノイド化合物が上記式（１）で表される化合物の塩である場合、塩としては、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩等）、アンモニウム塩等が挙げられる。
【００１８】
本実施形態に係るレチノイド化合物は、レチノイド活性を有しながらも、催奇形性が低いという特徴を有する。このレチノイド化合物は、後述のように医薬用途に用いることもでき、医薬以外の用途（研究用途等）に用いることもできる。
【００１９】
＜医薬組成物＞
本実施形態に係る医薬組成物は、上述した本実施形態に係るレチノイド化合物を有効成分として含有する。レチノイド化合物については上述したとおりであるため、詳細な説明を省略する。
【００２０】
本実施形態に係るレチノイド化合物は、レチノイド活性を有しながらも、催奇形性が低いという特徴を有する。このため、本実施形態に係る医薬組成物は、ビタミンＡ欠乏症、皮膚疾患、免疫性疾患、及び癌からなる群より選択される少なくとも１種の疾患の治療又は予防に有効である。言い換えれば、本実施形態に係る医薬組成物を投与することにより、ビタミンＡ欠乏症、皮膚疾患、免疫性疾患、又は癌を予防又は治療することができる。皮膚疾患としては、乾癬、角化症、座瘡、アトピー性皮膚炎等が挙げられる。免疫性疾患としては、関節リウマチ、クローン病等が挙げられる。癌としては、白血病、肝臓癌等が挙げられる。
【００２１】
なお、「予防」には、疾患の発症を防ぐことのほか、発症の時期を遅らせることも含まれる。また、「治療」には、疾患の症状を消失又は軽減させることのほか、症状の進行の度合いを抑制することも含まれる。
【００２２】
本実施形態に係る医薬組成物は、本実施形態に係るレチノイド化合物以外の成分を含有していてもよい。例えば、医薬組成物は、製剤素材として慣用の有機又は無機の担体を含有していてもよい。この担体は、固形製剤においては、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等として、液状製剤においては、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤等として配合される。また、医薬組成物は、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を含有していてもよい。
【００２３】
医薬組成物の剤形は特に制限されない。医薬組成物の剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、フィルム剤等の経口剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤、ペレット、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）、点眼剤等の非経口剤；などが挙げられる。
【００２４】
医薬組成物の投与量は、投与対象、投与経路、対象疾患、症状等に応じて適宜決定される。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】
なお、以下の実施例では、本実施形態に係るレチノイド化合物として、下記式で表される化合物Ｅ１、Ｅ２を用いた。また、比較用の化合物として、下記式で表される比較化合物Ｃ１、Ｃ２、ＡＴＲＡ（富士フイルム和光純薬（株））、９−ｃｉｓ−レチノイン酸（９−ｃｉｓ−ＲＡ；富士フイルム和光純薬（株））、Ａｍ８０（Ｃｈｅｍ  Ｓｃｅｎｅ）、及びＡＭ５８０（富士フイルム和光純薬（株））を用いた。
【００２７】
【化３】
2020037518.tif 000004
【００２８】
また、以下の実施例では、細胞として、ヒト骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０、ヒト神経芽細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２を用いた。ＨＬ−６０細胞の培養には、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌ−グルタミン、フェノールレッド含有）を使用し、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞及びＨｅｐＧ２細胞の培養には、Ｄ−ＭＥＭ培地（Ｌ−グルタミン、フェノールレッド、ピルビン酸ナトリウム含有）を使用した。各培地には、終濃度１０％のウシ胎児血清、及びペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液（ナカライテスク（株））を添加し、３７℃、５％  ＣＯ２のインキュベーター内で培養を行った。
【００２９】
＜合成例１：化合物Ｅ１の合成＞
（ステップ１）
【化４】
2020037518.tif 000005
【００３０】
エチルシクロプロピリデンアセテート（１０）（１２６ｍｇ，１ｍｍｏｌ）及びトリメチルシリルアセチレン（１１）（０．６９ｍＬ，５ｍｍｏｌ）を無水トルエン（０．５ｍＬ）に溶解し、溶液を調製した。ビス（シクロオクタジエン）ニッケル（２７．５ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）を無水トルエン（０．５ｍＬ）に溶解した暗赤色の溶液に、上記で得られた溶液をアルゴン雰囲気下、室温で５時間かけて滴下した。反応の進行をＴＬＣ及びＧＣ−ＭＳにより確認し、出発原料が消失するまで一晩撹拌した。反応溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに通した後、エバポレーターにて溶媒を除去し、さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィーに通して精製することにより、無色油状の化合物（１２ａ）（２２６ｍｇ，７０％）を得た。
【００３１】
（ステップ２）
【化５】
2020037518.tif 000006
【００３２】
化合物（１２ａ）（６４５ｍｇ，２ｍｍｏｌ）をエタノール（１．６ｍＬ）に溶解した溶液に水酸化カリウム（１．１２ｇ，２０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液に２Ｎ  塩酸を加え、溶媒を減圧留去した後、残渣に２Ｎ  塩酸を加え、水層をジクロロメタンで抽出した。有機層を集めてブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濃縮した。そして、濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに通して精製することにより、淡黄色固体状の化合物（１３ａ）及びその異性化体（１３ａ’）の混合物（３７７ｍｇ，６４％）を得た。
【００３３】
（ステップ３）
【化６】
2020037518.tif 000007
【００３４】
化合物（１５ａ）（１０ｇ，６４ｍｍｏｌ）及び二クロム酸カリウムを酢酸（１３０ｍＬ）に溶解した溶液に、濃硫酸（３５ｍＬ）を１０分間かけて加え、９０℃で３時間撹拌した。その後、反応溶液に水（４００ｍＬ）を加え、水層をジエチルエーテルで抽出した。有機層を集めてブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濃縮した。濃縮物に水（１６０ｍＬ）及び炭酸カリウム（１０ｇ，７２ｍｍｏｌ）を加え、水層をジエチルエーテル（８０ｍＬ）で２回洗浄した。洗浄後、１６Ｎ  塩酸を加えてｐＨを１に調整し、析出した固体を吸引濾過して回収することにより、淡黄色固体状の化合物（１６ａ）（７．３ｇ，６２％）を得た。
【００３５】
化合物（１６ａ）（３．０ｇ，１６ｍｍｏｌ）を無水エタノール（２９ｍＬ）に溶解した溶液に、濃硫酸（０．３ｍＬ）を加え、２４時間加熱還流した。その後、反応液を濃縮し、濃縮物にジクロロメタン及び飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機層を分離した後、水層をジクロロメタンで２回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濃縮することにより、化合物（１７ａ）（３．２ｇ，９４％）を得た。
【００３６】
化合物（１７ａ）（１．１ｇ，５．２ｍｍｏｌ）、塩化スズ（ＩＩ）二水和物（５．９ｇ，２６ｍｍｏｌ）、及び酢酸エチル（５０ｍＬ）の混合物を１時間加熱還流した。反応液を冷却した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機層を分離した後、水層を酢酸エチルで２回抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濃縮することにより、化合物（１８ａ）（０．８０ｇ，８４％）を得た。
【００３７】
（ステップ４）
【化７】
2020037518.tif 000008
【００３８】
Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．８７ｇ，４．２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（５１ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）、及び化合物（１８ａ）（０．２６ｇ，１．４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２．５ｍＬ）に溶解した溶液に、化合物（１３ａ）及びその異性化体（１３ａ’）の混合物（０．４０ｇ，１．４ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（５．８ｍＬ）に溶解した溶液を０℃で加えた。混合溶液を室温で一晩撹拌し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ジエチルエーテル）に通した後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝６／１（ｖ／ｖ））に通して精製することにより、橙色油状の化合物（１９ａａ）（０．３７ｇ，５７％）を得た。
【００３９】
化合物（１９ａａ）（０．２４ｇ，０．５２ｍｍｏｌ）をエタノール（５．２ｍＬ）に溶解した溶液に水酸化カリウム（０．５６ｇ，１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液に２Ｎ  塩酸を加え、溶媒を減圧留去した後、残渣に２Ｎ  塩酸を加え、水層をジクロロメタンで抽出した。有機層を集めてブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濃縮した。そして、濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ジクロロメタン／メタノール＝２０／１（ｖ／ｖ））に通して精製することにより、白色固体状の化合物Ｅ１（０．１ｇ，４４％）を得た。
【００４０】
化合物Ｅ１の物性値は以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．８９（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４６（ｄｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１．８Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｄｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１．８Ｈｚ，１Ｈ），６．７７（ｓ，１Ｈ），６．７２（ｓ，１Ｈ），６．５０（ｓ，１Ｈ），５．４８（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），３．３１（ｓ，２Ｈ），２．２５（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），０．２０−０．０８（ｍ，１８Ｈ）；
Ａｎａｌ．  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２２Ｈ３０ＦＮＯ３Ｓｉ２：Ｃ  ６１．２２；Ｈ  ７．０１；Ｎ  ３．２４，Ｆｏｕｎｄ：Ｃ  ６１．０５；Ｈ  ７．０３；Ｎ  ３．１５．
【００４１】
＜合成例２：化合物Ｅ２の合成＞
（ステップ１）
【化８】
2020037518.tif 000009
【００４２】
２−クロロ−４−ニトロ安息香酸（１６ｂ）（２．０ｇ，１０ｍｍｏｌ）を無水エタノール（１８ｍＬ）に溶解した溶液に濃硫酸（０．１８ｍＬ）を加え、還流条件下で撹拌した。２４時間後、溶媒を減圧留去し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加え、水層をジクロロメタンで抽出した。有機層を集めてブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濃縮することにより、黄色油状の化合物（１７ｂ）（２．１ｇ，９１％）を得た。
【００４３】
化合物（１７ｂ）（１．０ｇ，４．４ｍｍｏｌ）、塩化スズ（ＩＩ）二水和物（５．０ｇ，２６ｍｍｏｌ）、及び酢酸エチル（４２ｍＬ）の混合物を１時間加熱還流した。反応液を冷却した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機層を分離した後、水層を酢酸エチルで２回抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濃縮することにより、化合物（１８ｂ）（０．８３ｇ，９５％）を得た。
【００４４】
（ステップ２）
【化９】
2020037518.tif 000010
【００４５】
Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．７２ｇ，０．６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（７．３ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ）、及び化合物（１８ｂ）（０．０４０ｇ，０．２０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．８ｍＬ）に溶解した溶液に、化合物（１３ａ）及びその異性化体（１３ａ’）の混合物（０．０５９ｇ，０．２０ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（０．４ｍＬ）に溶解した溶液を０℃で加えた。混合溶液を室温で一晩撹拌し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ジエチルエーテル）に通した後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝６／１（ｖ／ｖ））に通して精製することにより、黄色油状の化合物（１９ａｂ）（０．０５０ｇ，５３％）を得た。
【００４６】
化合物（１９ａｂ）（０．０４５ｇ，０．０９５ｍｍｏｌ）をエタノール（１ｍＬ）に溶解した溶液に水酸化カリウム（０．１１ｇ，１．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液に２Ｎ  塩酸を加え、溶媒を減圧留去した後、残渣に２Ｎ  塩酸を加え、水層をジクロロメタンで抽出した。有機層を集めてブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濃縮した。そして、濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１／３（ｖ／ｖ））に通して精製することにより、黄色固体状の化合物Ｅ２（０．０３５ｇ，８２％）を得た。
【００４７】
化合物Ｅ２の物性値は以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．９４（ｔ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３０−７．２３（ｍ，１Ｈ），６．７２（ｓ，１Ｈ），６．７０（ｓ，１Ｈ），６．５２（ｓ，１Ｈ），５．４８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），３．３１（ｓ，２Ｈ），２．２５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），０．１９−０．１１（ｍ，１８Ｈ）．
【００４８】
＜比較合成例１：比較化合物Ｃ１の合成＞
（ステップ１）
【化１０】
2020037518.tif 000011
【００４９】
化合物（１４ｃ）（１．０ｇ，６．１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１２ｍＬ）に溶解して得られた混合物を加熱還流し、Ｎ−クロロスクシンイミド（０．８１ｇ，６．１ｍｍｏｌ）を加え、１８時間加熱還流した。溶媒を減圧留去した後、残渣にジクロロメタン（１８ｍＬ）を加え、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、水、及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濃縮した。残渣を再結晶（ヘキサン）することにより、化合物１８ｃ（１．１ｇ，９０％）を得た。
【００５０】
（ステップ２）
【化１１】
2020037518.tif 000012
【００５１】
Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．２５ｇ，１．２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（１５ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）、及び化合物（１８ｃ）（０．０８０ｇ，０．４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１．６ｍＬ）に溶解した溶液に、化合物（１３ａ）及びその異性化体（１３ａ’）の混合物（０．１２ｇ，０．４０ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（０．８ｍＬ）に溶解した溶液を０℃で加えた。混合溶液を室温で一晩撹拌し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ジエチルエーテル）に通した後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／ジエチルエーテル＝４／１（ｖ／ｖ））に通して精製することにより、黄色油状の化合物（１９ａｃ）（０．０４７ｇ，２５％）を得た。
【００５２】
化合物（１９ａｃ）（０．０４７ｇ，０．０９９ｍｍｏｌ）をエタノール（１ｍＬ）に溶解した溶液に水酸化カリウム（０．１１ｇ，２．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液に２Ｎ  塩酸を加え、溶媒を減圧留去した後、残渣に２Ｎ  塩酸を加え、水層をジクロロメタンで抽出した。有機層を集めてブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濃縮した。そして、濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１（ｖ／ｖ））に通して精製することにより、黄色固体状の比較化合物Ｃ１（０．０３６ｇ，８１％）を得た。
【００５３】
比較化合物Ｃ１の物性値は以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．５５（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．９５（ｄｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｓ，１Ｈ），６．７１（ｓ，１Ｈ），６．４３（ｓ，１Ｈ），５．５１（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），３．３８（ｓ，２Ｈ），２．２６（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），０．２０−０．０７（ｍ，１８Ｈ）；
Ａｎａｌ．  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２２Ｈ３０ＣｌＮＯ３Ｓｉ２：Ｃ  ５８．９７；Ｈ  ６．７５；Ｎ  ３．１３，Ｆｏｕｎｄ：Ｃ  ５８．８０；Ｈ  ７．０１；Ｎ  ２．８８．
【００５４】
＜比較合成例２：比較化合物Ｃ２の合成＞
（ステップ１）
【化１２】
2020037518.tif 000013
【００５５】
化合物（１２ａ）（０．７７ｇ，２．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解した溶液にトリフルオロ酢酸（０．３５ｍＬ，４．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間撹拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加え、水層をジエチルエーテルで抽出した。有機層を集めてブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濃縮した。そして、濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに通して精製することにより、無色油状の化合物（１２ｄ）（０．３９ｇ，６５％）を得た。
【００５６】
（ステップ２）
【化１３】
2020037518.tif 000014
【００５７】
化合物（１２ｄ）（０．１ｇ，０．４０ｍｍｏｌ）をエタノール（２ｍＬ）に溶解した溶液に水酸化カリウム（０．２２ｇ，４．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液に２Ｎ  塩酸を加え、溶媒を減圧留去した後、残渣に２Ｎ  塩酸を加え、水層をジクロロメタンで抽出した。有機層を集めてブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濃縮した。そして、濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに通して精製することにより、白色固体状の化合物（１３ｄ）（０．０５２ｇ，５９％）を得た。
【００５８】
Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．１４ｇ，０．７０ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（８．６ｍｇ，０．０７０ｍｍｏｌ）、及びｐ−アミノ安息香酸エチル（０．０３８ｇ，０．２３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．５ｍＬ）に溶解した溶液に、化合物（１３ｄ）（０．０５２ｇ，０．２３ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（０．９ｍＬ）に溶解した溶液を０℃で加えた。混合溶液を室温で一晩撹拌し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ジエチルエーテル）に通した後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝４／１（ｖ／ｖ））に通して精製することにより、黄色油状の化合物（１９ｆ）（０．０３０ｇ，３５％）を得た。
【００５９】
化合物（１９ｆ）（０．０８８ｇ，０．２４ｍｍｏｌ）をエタノール（２．４ｍＬ）に溶解した溶液に水酸化カリウム（０．２７ｇ，４．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液に２Ｎ  塩酸を加え、溶媒を減圧留去した後、残渣に２Ｎ  塩酸を加え、水層をジクロロメタンで抽出した。有機層を集めてブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濃縮した。そして、濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ジクロロメタン／メタノール＝３０／１（ｖ／ｖ））に通して精製することにより、淡黄色固体状の比較化合物Ｃ２（０．０５４ｇ，６６％）を得た。
【００６０】
比較化合物Ｃ２の物性値は以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．９９（ｔ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），６．７４（ｓ，１Ｈ），６．３３（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），５．６９（ｄｔ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，６．６Ｈｚ，１Ｈ），５．５２（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），３．３３（ｓ，２Ｈ），２．２３（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），０．１２（ｓ，９Ｈ）．
【００６１】
＜試験例１：好中球分化誘導能の検討＞
ＡＴＲＡはＨＬ−６０細胞に対する好中球分化誘導能を有することが知られているため、化合物Ｅ１、Ｅ２の好中球分化誘導能について検討した。比較のため、比較化合物Ｃ１、Ｃ２、ＡＴＲＡ、９−ｃｉｓ−ＲＡ、Ａｍ８０、及びＡＭ５８０の好中球分化誘導能も併せて確認した。
【００６２】
９６ウェルプレートに１．０×１０６個／ｍＬの細胞密度でＨＬ−６０細胞を播種し、各化合物を６μＭの濃度で培地に加えて４日間培養した。また、濃度による変化を確認するため、化合物Ｅ１、Ｅ２、ＡＴＲＡ、及びＡｍ８０を０．１μＭ、０．３２μＭ、１μＭ、３．２μＭ、又は１０μＭの濃度で培地に加えて４日間培養した。対照としては、各化合物の代わりにＤＭＳＯを終濃度０．１％となるように加えた。各化合物で細胞を４日間処理した後、メイギムザ染色を行い、顕微鏡観察を行った。そして、細胞１００個のうち、未分化の細胞、単球に分化した細胞、及び好中球に分化した細胞のそれぞれの割合を算出した。結果を図１、図２に示す。
【００６３】
図１に示すとおり、化合物濃度が６μＭである場合、好中球への分化率は、化合物Ｅ１では５７％、化合物Ｅ２では４３％であった。また、図２に示すとおり、化合物濃度が０．１μＭという低濃度の場合であっても、好中球への分化率は、化合物Ｅ１では３９％、化合物Ｅ２では３５％であった。
【００６４】
＜試験例２：ｍＴＯＲ１活性阻害による神経突起伸長促進作用への影響＞
ＡＴＲＡは神経細胞に対する神経突起伸長促進作用を有することが知られており、その作用は細胞内のシグナル伝達機構により制御されている。そこで、化合物Ｅ１、Ｅ２の神経突起伸長促進作用について検討するとともに、突起伸長メカニズムにｍＴＯＲ１が関与しているか否かを確認した。比較のため、比較化合物Ｃ１、Ｃ２、ＡＴＲＡ、９−ｃｉｓ−ＲＡ、及びＡＭ５８０の神経突起伸長促進作用も併せて確認した。
【００６５】
（神経突起伸長の確認）
ポリ−Ｌ−リジンコートした２４ウェルプレートに６．２５×１０４個／ｍＬの細胞密度でＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を播種し、２４時間培養した。そして、未処理群では、各化合物を６μＭの濃度で培地に加えて４日間培養した。また、ラパマイシン処理群では、ｍＴＯＲ１阻害剤であるラパマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を終濃度０．１μＭとなるように加えて３０分間前処理した後、各化合物を６μＭの濃度で培地に加えて４日間培養した。対照としては、各化合物の代わりにＤＭＳＯを終濃度０．１％となるように加えた。各化合物で細胞を４日間処理した後、顕微鏡観察を行い、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して神経突起長を測定した。未処理群及びラパマイシン処理群の顕微鏡観察結果を図３Ａ、図３Ｂに示す。図中のスケールバーは５０μｍである。また、３０個の細胞における神経突起長を測定した結果を図４に示す。
【００６６】
図３Ａ、図４に示すとおり、ＤＭＳＯでは神経突起長が１５μｍ程度であったのに対し、化合物Ｅ１、ＡＴＲＡ、９−ｃｉｓ−ＲＡ、及びＡＭ５８０では６０μｍ以上に伸長し、化合物Ｅ２では３０μｍ程度に伸長した。一方、比較化合物Ｃ１、Ｃ２では神経突起伸長は確認されなかった。また、図３Ｂ、図４に示すとおり、ラパマイシン処理群では、神経突起伸長が確認された化合物Ｅ１、Ｅ２、ＡＴＲＡ、９−ｃｉｓ−ＲＡ、及びＡＭ５８０のうち、ＡＴＲＡ以外の４種類の化合物の神経突起伸長が抑制された。
【００６７】
（ウェスタンブロッティング）
ｍＴＯＲのリン酸化による活性化がラパマイシン処理により阻害されたか否かを確認するため、ウェスタンブロッティングを行った。
【００６８】
１２ウェルプレートに２．０×１０５個／ｍＬの細胞密度でＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を播種し、２４時間培養した。そして、未処理群では、各化合物を６μＭの濃度で培地に加えて２４時間培養した。また、ラパマイシン処理群では、ラパマイシンを終濃度０．１μＭとなるように加えて３０分間前処理した後、各化合物を６μＭの濃度で培地に加えて２４時間培養した。対照としては、各化合物の代わりにＤＭＳＯを終濃度０．１％となるように加えた。
【００６９】
培養後のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞から、Ｌｙｓｉｓバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ２−ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を用いてタンパク質を抽出した後、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）によりタンパク質濃度を測定した。各サンプルにＬｙｓｉｓバッファーを加えてタンパク質濃度を合わせた後、各サンプルと１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５％  グリセロール、１％  ＳＤＳ、１５％  ２−メルカプトエタノール、５％  ＢＰＢ）とを混合し、１００℃で１０分間煮沸して泳動サンプルを調製した。
【００７０】
調製した泳動サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜をブロッキング溶液中で３０分間〜１時間振盪してブロッキングした後、ＴＢＳ−Ｔで５分間×２回洗浄した。その後、抗リン酸化ｍＴＯＲ（ｐ−ｍＴＯＲ）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２９７１Ｓ）又は抗ｍＴＯＲ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２９７２Ｓ）を５００倍希釈した一次抗体反応液中にＰＶＤＦ膜を浸漬し、室温で１時間又は４℃で一晩静置した。反応後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔで５分間×２回洗浄し、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｄａｃｏ，Ｐ０３９９）を１０００倍希釈した二次抗体反応液中にＰＶＤＦ膜を浸漬し、室温で１時間静置した。反応後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔで５分間×２回、ＴＢＳで５分間×２回洗浄した。そして、ＰＶＤＦ膜をＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて可視化した。各バンドの強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアにより定量化した。ウェスタンブロッティング結果を図５に示す。
【００７１】
図５に示すとおり、ラパマイシン処理群では、未処理群に比べてｐ−ｍＴＯＲの量が減少した。試験例２の結果から、化合物Ｅ１、Ｅ２、９−ｃｉｓ−ＲＡ、及びＡＭ５８０による突起伸長メカニズムには、ｍＴＯＲ１が関与していることが確認された。
【００７２】
＜試験例３：ｍＴＯＲ２活性阻害による神経突起伸長促進作用への影響＞
ＡＴＲＡによる神経突起伸長がラパマイシン処理によって阻害されなかったため、ＡＴＲＡによる突起伸長メカニズムにｍＴＯＲ２が関与しているか否かを確認した。比較のため、化合物Ｅ１、Ｅ２、比較化合物Ｃ１、Ｃ２、９−ｃｉｓ−ＲＡ、及びＡＭ５８０の神経突起伸長促進作用も併せて確認した。
【００７３】
（神経突起伸長の確認）
ポリ−Ｌ−リジンコートした２４ウェルプレートに６．２５×１０４個／ｍＬの細胞密度でＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を播種し、２４時間培養した。そして、未処理群では、各化合物を６μＭの濃度で培地に加えて４日間培養した。また、Ｔｏｒｉｎ１処理群では、ｍＴＯＲ１／２阻害剤であるＴｏｒｉｎ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を終濃度０．１μＭとなるように加えて１時間前処理した後、各化合物を６μＭの濃度で培地に加えて４日間培養した。対照としては、各化合物の代わりにＤＭＳＯを終濃度０．１％となるように加えた。各化合物で細胞を４日間処理した後、顕微鏡観察を行い、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して神経突起長を測定した。３０個の細胞における神経突起長を測定した結果を図６に示す。
【００７４】
図６に示すとおり、Ｔｏｒｉｎ１処理群では、ＡＴＲＡを含む５種類全ての化合物の神経突起伸長が抑制された。
【００７５】
（ウェスタンブロッティング）
ｍＴＯＲのリン酸化による活性化がＴｏｒｉｎ１処理により阻害されたか否かを確認するため、試験例２と同様にウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティング結果を図７に示す。
【００７６】
図７に示すとおり、Ｔｏｒｉｎ１処理群では、未処理群に比べてｐ−ｍＴＯＲの量が減少した。試験例３の結果から、ＡＴＲＡによる突起伸長メカニズムには、ｍＴＯＲ２が関与していることが確認された。
【００７７】
＜試験例４：ＥＲＫ活性阻害による神経突起伸長促進作用への影響＞
化合物Ｅ１、Ｅ２による突起伸長メカニズムにＥＲＫが関与しているか否かを確認した。比較のため、比較化合物Ｃ１、Ｃ２、ＡＴＲＡ、９−ｃｉｓ−ＲＡ、及びＡＭ５８０の神経突起伸長促進作用も併せて確認した。
【００７８】
（神経突起伸長の確認）
ポリ−Ｌ−リジンコートした２４ウェルプレートに６．２５×１０４個／ｍＬの細胞密度でＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を播種し、２４時間培養した。そして、未処理群では、各化合物を６μＭの濃度で培地に加えて４日間培養した。また、Ｕ０１２６処理群では、ＭＡＰＫ阻害剤であるＵ０１２６（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を終濃度１０μＭとなるように加えて３０分間前処理した後、各化合物を６μＭの濃度で培地に加えて４日間培養した。対照としては、各化合物の代わりにＤＭＳＯを終濃度０．１％となるように加えた。各化合物で細胞を４日間処理した後、顕微鏡観察を行い、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して神経突起長を測定した。３０個の細胞における神経突起長を測定した結果を図８に示す。
【００７９】
図８に示すとおり、Ｕ０１２６処理群では、化合物Ｅ１、Ｅ２、ＡＴＲＡ、９−ｃｉｓ−ＲＡ、及びＡＭ５８０の５種類の化合物の神経突起伸長が抑制された。
【００８０】
（ウェスタンブロッティング）
ＥＲＫのリン酸化による活性化がＵ０１２６処理により阻害されたか否かを確認するため、試験例２と同様にウェスタンブロッティングを行った。一次抗体としては、抗リン酸化ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，０１０２Ｓ）又は抗ＥＲＫ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４３７７Ｓ）をそれぞれ１０００倍希釈して用いた。ウェスタンブロッティング結果を図９に示す。
【００８１】
図９に示すとおり、Ｕ０１２６処理群では、未処理群に比べてｐ−ＥＲＫの量が減少した。試験例４の結果から、化合物Ｅ１、Ｅ２、ＡＴＲＡ、９−ｃｉｓ−ＲＡ、及びＡＭ５８０による突起伸長メカニズムには、ＥＲＫが関与していることが確認された。
【００８２】
＜試験例５：ＲＡＲβ活性阻害による神経突起伸長促進作用への影響＞
化合物Ｅ１、Ｅ２による突起伸長メカニズムにレチノイン酸受容体ＲＡＲβが関与しているか否かを確認した。比較のため、ＡＴＲＡ、９−ｃｉｓ−ＲＡ及びＡＭ５８０の神経突起伸長促進作用も併せて確認した。
【００８３】
ポリ−Ｌ−リジンコートした２４ウェルプレートに６．２５×１０４個／ｍＬの細胞密度でＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を播種し、２４時間培養した。そして、未処理群では、各化合物を６μＭの濃度で培地に加えて４日間培養した。また、ＬＥ１３５処理群では、ＲＡＲβアンタゴニストであるＬＥ１３５（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を終濃度１μＭとなるように加えて２４時間前処理した後、各化合物を６μＭの濃度で培地に加えて４日間培養した。対照としては、各化合物の代わりにＤＭＳＯを終濃度０．１％となるように加えた。各化合物で細胞を４日間処理した後、顕微鏡観察を行い、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して神経突起長を測定した。３０個の細胞における神経突起長を測定した結果を図１０に示す。
【００８４】
図１０に示すとおり、Ｌ１３５処理群では、化合物Ｅ１、Ｅ２、及びＡＭ５８０の３種類の化合物の神経突起伸長が抑制された。試験例５の結果から、化合物Ｅ１、Ｅ２、及びＡＭ５８０による突起伸長メカニズムには、ＲＡＲβが関与していることが確認された。
【００８５】
＜試験例６：マウス催奇形性試験＞
ＡＴＲＡは、細胞の増殖及び分化の調節により形態形成作用を示すため、生体はその量を厳密に制御している。しかし、胎生期にレチノイン酸を外部から過剰に摂取すると、ＣＹＰ２６Ａ１によるレチノイン酸の代謝を原因とするレチノイドの枯渇を引き起こす結果、催奇形性を示すことが知られている。そこで、化合物Ｅ１、Ｅ２が催奇形性を示すか否かを確認した。比較のため、ＡＴＲＡ及びＡＭ８０の催奇形性も併せて確認した。
【００８６】
雌雄のＩＣＲマウスをペアで一晩自然交配させた。翌朝にプラグを確認し、その時点で受精開始から０．５日経過したと見做し、胎生０．５日（Ｅ０．５）とした。化合物Ｅ１、Ｅ２、ＡＴＲＡ、及びＡＭ８０の各化合物をヒマワリ油で懸濁し、胎生９日（Ｅ９．０）又は胎生６．５日（Ｅ６．５）の妊娠ＩＣＲマウスに０．２７ｍｍｏｌ／ｋｇ体重の投与量で単回経口投与した。対照としては、各化合物の代わりに担体（Ｖｅｈｉｃｌｅ）であるヒマワリ油を単回経口投与した。そして、胎生１８日（Ｅ１８）で母体を帝王切開して胎児を取り出し、奇形の有無を確認した。胎生９日の妊娠マウスに各化合物を単回経口投与したときの胎生１８日のマウス胎児の外部形態を図１１に示す。
【００８７】
図１１に示すとおり、ＡＴＲＡ又はＡｍ８０を投与した場合には、対照（ヒマワリ油）に比べて頭殿長が短く、頭部が小さかった。また、尾が未発達であった。一方、化合物Ｅ１又はＥ２を投与した場合には、対照（ヒマワリ油）に比べて顕著な違いは観察されなかった。
【００８８】
マウスの頭部、肛門、及び後肢で観察された奇形形成の例を図１２Ａ〜図１２Ｃに示す。ＡＴＲＡを投与した場合には、頭部において、眼球突出、耳の未形成、小顎症が観察され（図１２Ａ）、肛門において鎖肛が観察され（図１２Ｂ）、後肢において短足、内回りの後肢が観察された（図１２Ｃ）。一方、化合物Ｅ１を投与した場合には、そのような奇形は観察されなかった。
【００８９】
胎生９日又は胎生６．５日の妊娠マウスに各化合物を単回経口投与したときの胎生１８日のマウス胎児における各成長パラメータを下記表１、表２に示す（Ｎ．Ｄ．＝Ｎｏ  Ｄｅｔｅｃｔｅｄ）。
【００９０】
【表１】
2020037518.tif 000015
【００９１】
【表２】
2020037518.tif 000016
【００９２】
表１に示すとおり、胎生９日の妊娠マウスにＡＴＲＡ又はＡｍ８０を投与した場合には、尾の欠損が顕著に観察されるとともに、耳の欠損、眼の欠損、小顎症、鎖肛も高い割合で観察された。後肢の欠損はＡＴＲＡを投与した場合のみに観察され、約３８％であった。一方、化合物Ｅ１又はＥ２を投与した場合には、奇形形成が観察されなかった。なお、ＡＴＲＡ又はＡｍ８０を投与した場合には、体重が軽い胎児、頭部が小さい胎児、頭殿長が短い胎児が観察されたが、胎児の個体差が大きかったため、有意差は認められなかった。
【００９３】
また、表２に示すとおり、胎生６．５日の妊娠マウスにＡＴＲＡ又はＡｍ８０を投与した場合には、胎児は形成されず着床痕のみが形成される着床後胚損失率が１００％となった。一方、化合物Ｅ１又はＥ２を投与した場合には、胎児の着床後胚損失は観察されなかった。
【００９４】
＜試験例７：ＣＹＰ２６Ａ１の経時的ｍＲＮＡ発現解析＞
神経突起伸長促進作用を強く示し、催奇形性を示さなかった化合物Ｅ１の代謝経路を調べるため、ＨｅｐＧ２細胞を化合物Ｅ１で処理したときのＣＹＰ２６Ａ１の経時的ｍＲＮＡ発現レベルを定量ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。比較のため、ＨｅｐＧ２細胞をＡＴＲＡで処理したときのＣＹＰ２６Ａ１の経時的ｍＲＮＡ発現レベルも併せて確認した。
【００９５】
１２ウェルプレートに１．０×１０６個／ｍＬの細胞密度でＨｅｐＧ２細胞を播種し、２４時間培養し、化合物Ｅ１又はＡＴＲＡを６μＭの濃度で培地に加えてさらに３０分間、１時間、２時間、４時間、又は８時間培養した。対照としては、化合物Ｅ１又はＡＴＲＡの代わりにＤＭＳＯを終濃度０．１％となるように加えた。
【００９６】
ＦａｓｔＧｅｎｅ  ＲＮＡ  Ｂａｓｉｃ  ｋｉｔ（日本ジェネティクス（株））を用いて培養後のＨｅｐＧ２細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡（株））を用いて全ＲＮＡの逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。その後、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（東洋紡（株））を用いたリアルタイムＰＣＲにより、ＣＹＰ２６Ａ１の遺伝子を増幅した。ＣＹＰ２６Ａ１の遺伝子増幅に際しては、９５℃で１分間の初期変性を行った後、２ステップＰＣＲとして、９５℃で１５秒間の変性反応、及び６０℃で１分間の伸長反応を４０サイクル行った。なお、ＣＹＰ２６Ａ１のｍＲＮＡ発現量は、β−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡ発現量により補正した。使用したプライマーを下記表３に示す。
【００９７】
【表３】
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【００９８】
ＣＹＰ２６Ａ１の経時的ｍＲＮＡ発現レベルを図１３に示す。図１３に示すとおり、ＨｅｐＧ２細胞にＡＴＲＡを添加した場合には、添加３０分後から８時間後までＣＹＰ２６Ａ１のｍＲＮＡ発現が経時的に上昇した。一方、ＨｅｐＧ２細胞に化合物Ｅ１を添加した場合には、ＣＹＰ２６Ａ１のｍＲＮＡ発現の顕著な上昇は観察されなかった。この結果から、化合物Ｅ１が催奇形性を示さない理由は、ＣＹＰ２６Ａ１によるＡＴＲＡの代謝を原因とするレチノイドの枯渇を引き起こさないためと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
2020037518.tif 000034
【図１３】
2020037518.tif 000035
【配列表】
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