(57)【要約】      （修正有）【課題】新規ストレプトコッカス菌株及びこれを用いた連鎖球菌病予防用ワクチンを提供する。【解決手段】新規ストレプトコッカス菌株、不活性化されたストレプトコッカスパラウベリス菌株を含む魚類の連鎖球菌病予防用不活性化ワクチン、その製造方法及び投与方法。【効果】魚類、特に養殖ヒラメの連鎖球菌病を効果的に予防して連鎖球菌病による魚類の斃死を顕著に低減できる。したがって、魚類の生産性増大はもとより、抗生剤使用による費用を節減させることができる。また、魚類の細菌性疾病を予防できるワクチンを使用することによって、抗生剤を使用しない健康な魚類の生産を可能にして養殖業の発展に貢献し、魚類消費を大きく向上させることができる。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
連鎖球菌病に感染したヒラメから分離されたストレプトコッカスパラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）ＫＣＴＣ  １３８００ＢＰ菌株。
【請求項２】
連鎖球菌病に感染したヒラメから分離されたストレプトコッカスパラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）ＫＣＴＣ  １３８０１ＢＰ菌株。
【請求項３】
連鎖球菌病に感染したヒラメから分離されたストレプトコッカスパラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）ＫＣＴＣ  １３８０２ＢＰ菌株。
【請求項４】
連鎖球菌病に感染したヒラメから分離されたストレプトコッカスパラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）ＫＣＴＣ  １３８０３ＢＰ菌株。
【請求項５】
不活性化されたストレプトコッカスパラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）ＫＣＴＣ  １３８００ＢＰ菌株、ＫＣＴＣ  １３８０１ＢＰ菌株、ＫＣＴＣ  １３８０２ＢＰ菌株及びＫＣＴＣ  １３８０３ＢＰ菌株からなる群から選ばれるいずれか一つ以上の菌株を抗原として含む連鎖球菌病予防用不活性化ワクチン。
【請求項６】
前記ワクチンは、ＫＣＴＣ  １３８０２ＢＰ菌株及びＫＣＴＣ  １３８０３ＢＰ菌株が１：１の比率で混合されることを特徴とする、請求項５に記載の連鎖球菌病予防用不活性化ワクチン。
【請求項７】
前記ワクチンは、ＫＣＴＣ  １３８００ＢＰ菌株、ＫＣＴＣ  １３８０２ＢＰ菌株及びＫＣＴＣ  １３８０３ＢＰ菌株が１：１：１の比率で混合されることを特徴とする、請求項５に記載の連鎖球菌病予防用不活性化ワクチン。
【請求項８】
前記ワクチンの抗原濃度は、０．５〜３０ｍｇ／ｆｉｓｈであることを特徴とする、請求項５に記載の連鎖球菌病予防用不活性化ワクチン。
【請求項９】
連鎖球菌病に感染したヒラメから分離されたストレプトコッカスパラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）ＫＣＴＣ  １３８００ＢＰ菌株、ＫＣＴＣ  １３８０１ＢＰ菌株、ＫＣＴＣ  １３８０２ＢＰ菌株及びＫＣＴＣ  １３８０３ＢＰ菌株からなる群から選ばれるいずれか一つ以上の菌株をホルマリンで不活性化させてワクチンを得る段階を含むことを特徴とする連鎖球菌病予防用不活性化ワクチンの製造方法。
【請求項１０】
請求項５のワクチンを魚類に投与することを含む、魚類を免疫する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ストレプトコッカス菌株及びこれを用いた連鎖球菌病予防用ワクチンに関し、より詳細には、新規ストレプトコッカス菌株、不活性化されたストレプトコッカスパラウベリス菌株を含む魚類の連鎖球菌病予防用不活性化ワクチン、その製造方法及び投与方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
連鎖球菌病（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ）は天然及び養殖の淡水魚及び海産魚の敗血症を誘発する疾病である。海産魚類であるブリ（Ｙｅｌｌｏｗｔａｉｌ；Ｓｅｒｉｏｌａｅ  ｓｐｐ．）、ウナギ（Ｅｅｌ；Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）を含めて全世界の様々な魚種に感染されて疾病を誘発する。ストレプトコッカスパラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）、ストレプトコッカスイニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｉａｅ）、ストレプトコッカスアガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカスディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）種は、国と地域を問わず魚類に発生して深刻な被害を与えている。
【０００３】
２０１４年度世界水産物生産量は１億９，５７２万トンであった。そのうち漁獲生産量は９，４６３万トンであり、ここ数年間類似の漁獲生産量を示しているが、養殖生産量は１億１０９万トンで年毎増え、２０２５年では１億２００万トンとなり、２０１３〜２０１５年比で３９％増加すると予想されている（ＦＡＯ）。２０１７年の韓国魚類養殖生産量は８６，３８７トンであり、魚種別生産量はヒラメが４１，２０７トン（全生産量の４７．７％）で、同年生産金額もヒラメが５，８４５億ウォン（５７．９％）を記録し、ヒラメが韓国の代表魚類養殖品種であることが分かる（漁業生産統計、統計庁、２０１８）。ヒラメは、韓国海洋水産部が推進する水産分野の１０代輸出戦略品目として指定されたもので、現在、養殖水産物戦略品目育成研究開発事業で推進されている付加価値の高い品種である。
【０００４】
養殖ヒラメの疾病による被害は、年間生産量の３０％に至る年間１．２万余トン程度と推定され、２０１８年に養殖ヒラメの斃死を最も誘発した疾病として、寄生虫性疾病であるスクーチカ病（４４．５％）、やつれ症（１２％）、ウイルス性出血性敗血症（１６．６％）、細菌性疾病である連鎖球菌病（９．７％）が確認されている（養殖生物斃死動向調査及び活魚輸送用消毒装置効果検証研究、国立水産科学院研究用役、２０１８）。最近韓国でヒラメに最も多発する疾病として寄生虫性疾病であるスクーチカ病（６１％）、ウイルス性出血性敗血症（１０．６％）、Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓによって発生する連鎖球菌病（９．８％）が報告されている（養殖場斃死現況及び斃死体処理方案研究、２０１４−２０１６、国立水産科学院）。ヒラメ養殖で問題となる連鎖球菌はＳ．ｉｎｉａｅ，Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓとして知られており、２００３年〜２００５年にジェジュ地域の養殖ヒラメから分離された連鎖球菌を同定した結果、Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  ５４％、Ｓ．ｉｎｉａｅ  ４６％の比率で分離された。しかし、２０００年代後半から現在まで病めるヒラメにおいてＳ．ｉｎｉａｅの比率が低くなり、最近ではほとんど分離されておらず、たいていＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓが分離されている実情である。
【０００５】
養殖魚類の病原体検出率は毎年増加しつつあり、現在ヒラメに商用化されている連鎖球菌（Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）ワクチンの普及にもかかわらず、当該疾病が依然として発生しており、現ワクチン抗原の改良が必要な実情である。抗生・抗菌剤の誤・乱用による薬剤耐性菌及び多剤耐性菌の出現によって治療効能が減少しているため、疾病が発生した後に化学療法剤で治療することは益々難しくなると見られ、疾病を事前予防できるワクチンの開発が必要である。実際に韓国ではヒラメに対するＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓのワクチンが２００９年から商業化して普及されているが、ワクチン普及後にもＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓは依然として発生している（水産生物疾病特性研究、２０１２−２０１７）。一般に、ヒラメに最も高い斃死を誘発するスクーチカ病は稚魚期に発生するが、連鎖球菌病は中間育成魚、成魚などに発生し、より大きい経済的な被害をもたらしている。最近に養殖ヒラメに発生した疾病による斃死原因分析によると、細菌性疾病による斃死が１３％で、そのうち連鎖球菌病による斃死が６７．１％と最も高かった。
【０００６】
韓国ではＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ不活化ワクチン、組換えタンパク質ワクチン、弱毒化ワクチンなどの様々な研究が着実に進行しているが、現在、他の細菌病原体と混合ワクチンの形態で製作された不活化ワクチンが商用化して販売されているだけである（６社の９個製品）。スペインでタルボット対象にＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓを抗原とするＨｉｐｒａ社のＩＣＴＨＩＯＶＡＣ(R)−ＳＴＲ不活化注射ワクチンが開発されて販売されているが、韓国ではＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓに対する単独ワクチンは販売されていない。魚類養殖産業の特性上、低費用の魚類ワクチンの開発は必須であり、色々な細菌病原体を一度に予防可能な混合ワクチンが商用化されているが、実際に混合ワクチン使用後のワクチン効果に対する調査はわずかな実情である。ヒラメではＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓによる連鎖球菌病がワクチン普及以後にも発生しており、現在商用化されたワクチンの効能に対する検証が必要である。
【０００７】
ヒトに対するインフルエンザーワクチンやポリオワクチンのように同種の多数の型、すなわち、インフルエンザーではＡ１型、Ａ２型、Ｂ型、ポリオではＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型を混ぜて作るワクチンを多価ワクチン（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ）という。このような病原体は抗原型がいくつかに分けられているので、別々に含まれているワクチン（単価ワクチン）で予防接種した場合、疾病類型がワクチンと全く異なる類型で発生すると役に立たず、多価ワクチンを活用しているわけである。ヒトに肺炎を誘発する連鎖球菌であるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは様々な血清型があるが、これを全て予防できる２３価多価被膜多糖類ワクチンが使用されている（ソン・ジュンヨン、ジョン・ヒジン、２０１４、肺炎球菌ワクチン、Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ  ５７（９）、７８０−７８８）。
【０００８】
そこで、本発明者らは、ヒラメに疾病を誘発するＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓに対してＭＬＳＴ（Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  ｓｑｑｕｅｃｎｅ  ｔｙｐｉｎｇ）方法を用いて分子力学及び血清型調査を実施し、韓国で発生するヒラメ連鎖球菌Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓワクチンに適する菌株を選定するための基礎資料を確保し、それぞれの血清型別単価ワクチンを製作して交差ワクチン効能を評価した。また、交差ワクチン効能評価結果に基づいてＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ多価ワクチン開発のために、血清型の異なるＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ菌株を混合してワクチン効能を評価し、本発明を完成した。
【０００９】
この背景技術部分に記載された上記の情報は、単に本発明の背景に対する理解を向上させるためのもので、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者にとって既に知られた先行技術を形成する情報を含まなくてもよい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、連鎖球菌病に感染したヒラメから分離されたストレプトコッカスパラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）菌株を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、不活性化されたストレプトコッカスパラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）菌株を抗原として含む連鎖球菌病予防用不活性化ワクチンを提供することにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、連鎖球菌病に感染したヒラメから分離されたストレプトコッカスパラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）菌株をホルマリンで不活性化させてワクチンを得る段階を含むことを特徴とする連鎖球菌病予防用不活性化ワクチンの製造方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記ワクチンを魚類に投与することを含む、魚類を免疫する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の目的を達成するために、本発明は、連鎖球菌病に感染したヒラメから分離されたストレプトコッカスパラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）ＫＣＴＣ  １３８００ＢＰ菌株、ＫＣＴＣ  １３８０１ＢＰ菌株、ＫＣＴＣ  １３８０２ＢＰ菌株及びＫＣＴＣ  １３８０３ＢＰ菌株を提供する。
【００１４】
本発明はまた、不活性化されたストレプトコッカスパラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）ＫＣＴＣ  １３８００ＢＰ菌株、ＫＣＴＣ  １３８０１ＢＰ菌株、ＫＣＴＣ  １３８０２ＢＰ菌株又はＫＣＴＣ  １３８０３ＢＰ菌株を抗原として含む連鎖球菌病予防用不活性化ワクチンを提供する。
【００１５】
本発明はまた、連鎖球菌病に感染したヒラメから分離されたストレプトコッカスパラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）ＫＣＴＣ  １３８００ＢＰ菌株、ＫＣＴＣ  １３８０１ＢＰ菌株、ＫＣＴＣ  １３８０２ＢＰ菌株又はＫＣＴＣ  １３８０３ＢＰ菌株をホルマリンで不活性化させてワクチンを得る段階を含むことを特徴とする連鎖球菌病予防用不活性化ワクチンの製造方法を提供する。
本発明はまた、前記ワクチンを魚類に投与することを含む、魚類を免疫する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、魚類、特に養殖ヒラメの連鎖球菌病を効果的に予防し、連鎖球菌病による魚類の斃死を顕著に低減できる効果を奏する。したがって、魚類の生産性増大はもとより、抗生剤使用による費用も節減することができる。また、本発明は、魚類の細菌性疾病を予防できるワクチンを使用することによって、抗生剤を使用しない健康な魚類の生産を可能にして養殖業の発展に貢献し、魚類消費を大きく向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓの６４個菌株の遺伝子５種［ＤＮＡ  ｇｙｒａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｂ（ｇｙｒＢ）、Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍ−ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓｉｍＡ）、ａｕｔｏｌｙｓｉｎ、ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ｗｚｅ）］に対する塩基配列（約４，１２０ｂｐ）の系統樹分析結果を示す図である。
【図２】Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ血清型分析を示すもので、図２（Ａ）はスライド凝集反応（Ｉ：陽性反応、ＩＩ：陰性反応）、図２（Ｂ）はマイクロタイター（Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）凝集反応を示す図である。
【図３】韓国の２００２年〜２０１７年Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ菌の血清型分布を示すグラフである。
【図４】韓国の２００２年〜２０１７年Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ菌の地域別、分離年度別分離比率を示す図である。
【図５】韓国で販売されているＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ抗原を含む不活化ワクチンの血清型ＰＣＲ（ｓｅｒｏｔｙｐｅ−ＰＣＲ）結果を示す図である。
【図６】Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓの７個菌株の人工感染後、ヒラメの累積斃死量を示すグラフである。
【図７】Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓの４個菌株の濃度別ヒラメの累積斃死量を示すグラフである。
【図８】ヒラメのＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓワクチン接種及び人工感染実験日程を図式化した図である。
【図９】Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ多価ワクチン接種２週後、抗体測定結果を示すグラフである。
【図１０】Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ多価ワクチン接種１週後、内部臓器の病理組織検査結果である。
【図１１】Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ多価ワクチン接種２週後、内部臓器の病理組織検査結果である。
【図１２】Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ多価ワクチン接種３週後、内部臓器の病理組織検査結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
特に定義されない限り、本明細書で使われた技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使われた命名法は、この技術分野で周知且つ通常のものである。
【００１９】
本発明の一実施例において、連鎖球菌病に感染したヒラメから分離されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  １９ＦＢＳＰａ０００３（ＰＲ５）菌株、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  ＦＰ２３３１菌株、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  ＦＰａ４３６５菌株及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  ＦＰａ４８７０菌株を不活性化させた後、これを抗原として含むワクチンを魚類に接種した結果、全てのワクチン接種区で低い斃死率を示し、血清型別交差ワクチン効能もあることを確認した。また、前記異なる血清型別抗原を含む多価ワクチンの場合、単一血清型ワクチンに比べてワクチン効能がより増加することを確認した。
【００２０】
したがって、本発明は一観点において、連鎖球菌病に感染したヒラメから分離されたストレプトコッカスパラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）ＫＣＴＣ  １３８００ＢＰ菌株に関する。
【００２１】
本発明は他の観点において、連鎖球菌病に感染したヒラメから分離されたストレプトコッカスパラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）ＫＣＴＣ  １３８０１ＢＰ菌株に関する。
【００２２】
本発明はさらに他の観点において、連鎖球菌病に感染したヒラメから分離されたストレプトコッカスパラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）ＫＣＴＣ  １３８０２ＢＰ菌株に関する。
【００２３】
本発明はさらに他の観点において、連鎖球菌病に感染したヒラメから分離されたストレプトコッカスパラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）ＫＣＴＣ  １３８０３ＢＰ菌株に関する。
【００２４】
本発明において、前記ＫＣＴＣ  １３８００ＢＰ菌株は、韓国生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）に２０１９年１月３０日付で寄託されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  １９ＦＢＳＰａ０００３菌株であり、本明細書で１９ＦＢＳＰａ０００３はＰＲ５と同じ菌株を意味する。
【００２５】
本発明において、前記ＫＣＴＣ  １３８０１ＢＰ菌株は、韓国生物資源センターに２０１９年１月３０日付で寄託されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  ＦＰ２３３１菌株であり、前記ＫＣＴＣ  １３８０２ＢＰ菌株は、韓国生物資源センターに２０１９年１月３０日付で寄託されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  ＦＰａ４３６５菌株であり、前記ＫＣＴＣ  １３８０３ＢＰ菌株は韓国生物資源センターに２０１９年１月３０日付で寄託されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  ＦＰａ４８７０菌株である。
【００２６】
本発明は、さらに他の観点において、不活性化されたストレプトコッカスパラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）ＫＣＴＣ  １３８００ＢＰ菌株、ＫＣＴＣ  １３８０１ＢＰ菌株、ＫＣＴＣ  １３８０２ＢＰ菌株及びＫＣＴＣ  １３８０３ＢＰ菌株で構成された群から選ばれるいずれか一つ以上の菌株を抗原として含む連鎖球菌病予防用不活性化ワクチンに関する。
【００２７】
本発明において、前記ワクチンは、ＫＣＴＣ  １３８０２ＢＰ菌株及びＫＣＴＣ  １３８０３ＢＰ菌株が１：１の比率で混合されることを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【００２８】
本発明において、前記ワクチンは、ＫＣＴＣ  １３８００ＢＰ菌株、ＫＣＴＣ  １３８０２ＢＰ菌株及びＫＣＴＣ  １３８０３ＢＰ菌株が１：１：１の比率で混合されることを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【００２９】
本発明において、前記ワクチンの抗原濃度は、０．５〜３０ｍｇ／ｆｉｓｈであることを特徴とし得る。好ましくは、１〜３ｍｇ／ｆｉｓｈであることを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【００３０】
本発明の一実施例において、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  １９ＦＢＳＰａ０００３（ＰＲ５）菌株、ＦＰ２３３１菌株、ＦＰａ４３６５菌株又はＦＰａ４８７０菌株を含むワクチン接種後、抗原種類別（血清型Ｉａ〜ＩＩ）に血清の抗体価を測定した結果、いずれも対照区（ＰＢＳ）に比して有意に高い抗体価を形成した。各ワクチン区は同一血清型の抗原で抗体価を測定する場合、最も高い抗体価を示した。
【００３１】
また、Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ血清型Ｉａ＋Ｉｃワクチン区とＩａ＋Ｉｂ＋Ｉｃワクチン区で人工感染すれば、対照区に比して高い生存率を示し、Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ単一血清型ワクチン区に比しても高い相対生存率を示した。
【００３２】
本発明で用語“ワクチン”とは、感染疾患を予防するための免疫のために用いられる抗原を指し、弱毒化させた微生物又はウイルスで製造され、特定感染症に対して人工的に免疫原性を獲得するために弱化又は死滅させた病原微生物を個体内に投与することを意味する。ワクチンによって刺激を受けると、個体内の免疫システムが働いて抗体を生成し、その感受性を維持するが、再感染がおきると、短時間内に抗体を効果的に生成することによって疾患を克服することができる。
【００３３】
前記不活性化ワクチンは、当該技術分野に公知の方法を用いて製造でき、例えば、当該技術分野に知られた不活性化剤を用いて製造することができる。好ましくは、ホルマリン処理によって不活性化させることを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【００３４】
本発明に係る混合不活性化ワクチンは、補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）をさらに含むことができる。前記補助剤は、当該技術分野に周知である如何なるものも使用可能であり、好ましくは、モンタナイド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ３５又はＧｅｌ０１が使用できる。
【００３５】
また、安定化剤又は添加剤として、糖類やアミノ酸類、鉱物油、植物油、明礬、リン酸アルミニウム、ベントナイト、シリカ、ムラミルジペプチド（ｍｕｒａｍｙｌ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ）誘導体、チモシン、インターロイキンなどが使用されてもよい。
【００３６】
本発明において、前記ワクチンは、適当な容積の、例えば約１０〜５００ｍｌ体積のバイアルにワクチン液を分注した後、密封して使用することができる。このようなワクチンは、液状の他に、分けて注入したのち凍結乾燥して乾燥製剤として使用されてもよい。前記乾燥製剤は、使用直前に添加した減菌液で乾燥物質を完全に再溶解して使用してもよい。
【００３７】
本発明において、前記混合不活性化ワクチンは、感染の危険性がある任意の年齢の魚類に使用することができる。これに制限されるものではないが、稚魚を含む中間育成魚、成魚に使用可能である。
【００３８】
本発明は、さらに他の観点において、連鎖球菌病に感染したヒラメから分離されたストレプトコッカスパラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）ＫＣＴＣ  １３８００ＢＰ菌株、ＫＣＴＣ  １３８０１ＢＰ菌株、ＫＣＴＣ  １３８０２ＢＰ菌株及びＫＣＴＣ  １３８０３ＢＰ菌株で構成された群から選ばれるいずれか一つ以上の菌株をホルマリンで不活性化させてワクチンを得る段階を含むことを特徴とする、連鎖球菌病予防用不活性化ワクチンの製造方法に関する。
【００３９】
本発明において、前記ワクチンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  ＫＣＴＣ  １３８００ＢＰ菌株、ＫＣＴＣ  １３８０１ＢＰ菌株、ＫＣＴＣ  １３８０２ＢＰ菌株又はＫＣＴＣ  １３８０３ＢＰ菌株を培養して不活性化させた後、濃度を調節して製造する。本発明の一実施例において、凍結保存されたＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓの４個菌株を培養し、培養された菌液に３７％（ｖ／ｖ）ホルマリン（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を各培養液の０．５％（ｖ／ｖ）となるように添加し、撹拌培養器で１５０ｒｐｍ、２０℃で２４時間不活化した。不活化が確認された菌液を遠心分離した後、滅菌生理食塩水で洗浄した後、菌体を回収し、最終的に湿菌体の重さを測定して実験区によって濃度を異ならせてワクチンを製造した。
【００４０】
本発明は、さらに他の観点において、前記連鎖球菌病予防用不活性化ワクチンを魚類に投与することを含む、魚類を免疫する方法に関する。
【００４１】
本発明において、前記ワクチンを魚類の腹腔に注射することを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【００４２】
本発明において、前記魚類は、感染の危険性があるヒラメなどの魚類を含むが、これに制限されるものではない。
【００４３】
本発明の一実施例において、４種のＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓワクチン処理後、それぞれの血清型に対する人工感染試験を行った結果、ワクチンを接種していない対照区に比べて全ワクチン接種区で低い斃死率を示し、血清型別交差ワクチン効能もあることを確認した。また、Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ血清型Ｉａ〜Ｉｃを含む多価ワクチン接種区の場合、単一血清型ワクチン接種区に比して高いワクチン効能を示すことを確認した。
【００４４】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。それらの実施例は単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がそれらの実施例によって制限されると解釈されないことは当業界で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【００４５】
実施例１：連鎖球菌Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓの分離及び同定
【００４６】
国立水産科学院病理研究科で保存していた２００２年〜２０１７年韓国の病める養殖ヒラメから分離されたＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ菌株１９９個から、分離年度及び地域別に代表菌株６４個を選定して分析に使用した。
【００４７】
菌株を、１％ＮａＣｌを添加したトリプティックソイ寒天培地（ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ａｇａｒ）（ＴＳＡ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）又はブレインハートインフュージョン寒天培地（ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ａｇａｒ）（ＢＨＩＡ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）に塗抹した後、２５℃で２４時間培養して菌の性状を確認し、これを継代培養して表現型、血清型、遺伝学的分析などを行った。
分析した菌株の分離地域及び年度を表１に示す。
【００４８】
【表１】
2020182455.tif 000003
【００４９】
実施例２：Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓの表現型分析
【００５０】
生化学的特性を分析するために、Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ菌株を、１％  ＮａＣｌが添加されたＢＨＩＡ培地で２５℃、２４時間培養した。ＡＰＩ  ２０ｓｔｒｅｐキット（ＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ，Ｆｒａｎｃｅ）とＡＰＩ  ＺＹＭキット（ＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ，Ｆｒａｎｃｅ）実験方法は、純粋培養された菌集落をメーカーの方法に従ってストリップに接種培養して試験した。
【００５１】
Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ菌株６４個のＡＰＩ  ２０ｓｔｒｅｐ、ＡＰＩ  ｚｙｍキット分析の結果、調べた全菌株は非運動性のグラム陽性球菌（ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｃｃｉ）で、カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）、オキシダーゼ（ｏｘｉｄａｓｅ）陰性と確認された（表２）。
【００５２】
【表２】
2020182455.tif 000004
【００５３】
PA: alkaline phospatase, AD: arginine dihydrorase, RI: ribose acidification, MA: mannitol acidification, SO: sorbitol acidification, LA: lactose acidification, TR: trehalose acidification, IN: inulin acidification, AM: starch acidification, 2: alkaline phospatase, 3: esterase(C4), 4: esterase lipase(C8), 5: lipase(C14), 7: valine arylamidase, 8: crystine arylamidase, 10: α-chymotrypsin, 11: acid phosphatase, 14: β-galactosidase, 16: α-glucosidase.
【００５４】
ＡＰＩ  ２０ｓｔｒｅｐ生化学的特性を分析した結果、全菌株は、ＶＰ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ａｃｅｔｏｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、ＨＩＰ（ｈｉｐｐｕｒａｔｅ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）、ＥＳＣ（β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）、ＰＹＲＡ（ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｙｌ  ａｒｙｌａｍｉｄａｓｅ）、ＬＡＰ（ｌｅｕｃｉｎｅ  ａｒｙｌａｍｉｄａｓｅ）陽性、αＧＡＬ（α−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）、βＧＵＲ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）、ＡＲＡ（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＲＡＦ（Ｒａｆｆｉｎｏｓｅ  ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＧＬＹＧ（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）陰性反応を示した（表３）。
【００５５】
【表３】
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2020182455.tif 000006
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【００５６】
ＡＰＩ  ｚｙｍキット生化学的特性を分析した結果、全菌株は、ｌｅｕｃｉｎｅ  ａｃｒｙｌａｍｉｄａｓｅ、Ｎａｐｈｔｏｌ−ＡＳ−ＢＩ−ｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ陽性、ｔｙｐｓｉｎ、β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ、β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ、β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ、Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ、α−ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ、α−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ陰性反応を示した（表４）。
【００５７】
【表４】
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2020182455.tif 000009
【００５８】
実施例３：Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓの遺伝型分析
実施例３−１：プライマー作製及び遺伝子塩基配列分析
遺伝的特性分析のために、各分離菌株を、１％ＮａＣｌが添加されたＢＨＩＢ培地で２４時間培養した後、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離、上澄液を除去して細菌ペレットを作製した。細菌ペレットは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用いてＤＮＡを抽出した。Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｇｒｏＥＬ，ｇｙｒＢは、既に報告されたプライマーを使用し、Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  ＫＣＴＣ  １１５３７（Ｎｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）及びＫＣＴＣ  １１９８０（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）ゲノムから、抗原性・病原性に関連すると推定される遺伝子６種（ｃａｐｓｕｌｅ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ４種、ａｕｔｏｌｙｓｉｎ  １種、Ｍ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １種）を選定して、特異的に増幅できるプライマーを作製して分析した（表５）。
【００５９】
【表５】
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【００６０】
前記表５で、塩基配列はＩＵＰＡＣヌクレオチドコード（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｍｂｉｇｕｉｔｙ  ｃｏｄｅ）で表示し、ＲはＡ又はＧ、ｉ（配列目録にはＳと表記）はＩｎｏｓｉｎｅ、ＨはＡ、Ｃ又はＴを意味する。Ｎはａｎｙ  ｂａｓｅ、ＹはＣ又はＴ、ＷはＡ又はＴを意味する。
【００６１】
作製したプライマーでＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物は、ＥｔＢｒが含まれた１．５％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ）（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）を用いて電気泳動した後、ＵＶトランスルミネーター（ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ）（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）を用いてバンド（ｂａｎｄ）を確認し、塩基配列を分析した（表６〜表１４）。
【００６２】
【表６】
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【００６３】
【表７】
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【００６４】
【表８】
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【００６５】
【表９】
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【００６６】
【表１０】
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【００６７】
【表１１】
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【００６８】
【表１２】
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【００６９】
【表１３】
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【００７０】
【表１４】
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【００７１】
遺伝子塩基配列分析は、ＭＥＧＡ６プログラムとＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．８．０（ＳＤＣ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｊａｐａｎ）を使用し、決定された各塩基配列はＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で提供するＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用いて、既存に報告されたＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ菌株の遺伝子及び本実施例で分析した菌株の遺伝子を比較分析した。Ｂｌａｓｔ検索の塩基配列情報に基づいてＢｉｏｅｄｉｔ  Ｖｅｒ．７．２．１を使用して多重アラインメント（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を実施し、ＭＥＧＡ６プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｇａｓｏｆｔｗａｒｅ．ｎｅｔ；Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を使用した近隣結合分析（ＮＪ；ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ，１，０００  ｒｏｕｎｄｓ  ｏｆ  ｂｏｏｓｔｒａｐ）によって各塩基配列間遺伝的距離と系統図（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒｅｅ）を作成した（図１）。
【００７２】
実施例３−２：遺伝型分析結果
ヒラメから分離された菌株６４個の１６Ｓ  ｒＲＮＡ分析の結果、Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓと確認され、同じ塩基配列と確認された。Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ菌株６４個に対するＭＬＳＴ（ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｙｐｉｎｇ）分析を行った。Ｓｏａ（Ｓｕｇａｒ  Ｏ−ａｃｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＢ（Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子は、一部菌株では増幅がなかった。分析した６４個菌株において１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ｇｒｏＥＬ遺伝子はいずれも塩基配列が同一であり、菌株ごとに塩基配列が異なるｇｙｒＢ及び抗原性・病原性関連遺伝子４種のみに対してＭＬＳＴ分析を行った。ヒラメから分離されるＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ菌株６４個は、大きく２つのＭＬＳＴ遺伝型に区別されるが、ＭＬＳＴ−１グループの３６個菌株、ＭＬＳＴ−２グループの２８個菌株と確認された（図１）。菌株別遺伝型分析結果は、下表１５に示す。
【００７３】
【表１５】
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ＣＰＢ及びＳＯＡ項目で‘−’は、ＰＣＲ増幅されなかったことを示す。
【００７４】
実施例４：Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓの血清型分析
実施例４−１：血清型分析方法
スライド凝集反応で血清型を分析したが、参照菌株（Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ｉ  ＦＰａ４１６４及びＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ｏ２  Ｓ５３）に対するウサギ抗血清を作製し、分析に使用した。スライドガラスにＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓに対する２種のウサギ抗血清をそれぞれ７０μＬずつ落とし、ヒラメ由来Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ菌株６４個をＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｎｏ．６  ｓｔａｎｄａｒｄで滅菌生理食塩水に懸濁した菌液を各１０μＬ落としてよく混ぜて３０秒以内に凝集形成の有無を確認した（図２（Ａ））。凝集は、暗い背景でスライドを側面から観察し、対照群は、菌を懸濁しなかった滅菌生理食塩水を使用した。
【００７５】
Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓの血清型Ｉの亜血清型（ｓｕｂｓｅｒｏｔｙｐｅ）を区分するためにマイクロタイター凝集反応によってＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ菌株６４個の血清型分析を試みた（図２（Ｂ））。Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ遺伝型と表現型の特性が異なる４の菌株ＤＫ１４、ＤＷ１、ＦＰａ４８７０、ＦＰ４７４３に対するウサギ抗血清を作製し、Ｋａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）の方法でマイクロタイター凝集反応を用いた亜血清型分類（ｓｕｂ−ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ）を行った。９６ウェルプレートにウサギ抗血清をＰＢＳで２倍ずつ順次に希釈した後、４種のＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  ＦＫＣ懸濁液（２ｍｇ／ｍＬ  ＰＢＳ）を同一容量２５μｌずつ添加して混合し、４℃でＯ／Ｎインキュベーションした後、凝集抗体価を測定した。抗血清の交差吸収テスト（ｃｒｏｓｓ−ａｂｓｏｒｂｅｄ  ｔｅｓｔ）のために、吸収抗血清を作製し（Ｋａｎａｉ  ａｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｆｉｓｈ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ５０（２）、７５−８０）、吸収抗血清は凝集抗体価４未満と作製した。Ｔｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）の方法によってＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓに対する血清型分類ＰＣＲ（ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ  ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲプライマーの塩基配列は、前記表２に示した通りである。
【００７６】
実施例４−２：血清型分析結果
スライド凝集反応結果、Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ菌株は、血清型Ｉの５８個菌株、血清型ＩＩの４個菌株、型別できない血清型（ｕｎｔｙｐａｂｌｅ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ）の２個菌株と確認された。６４個菌株の血清型分類ＰＣＲ結果は、前記表１５の通りである。
【００７７】
Ｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓの４菌株ＤＫ１４、ＤＷ１、ＦＰａ４８７０、ＦＰ４７４３に対するウサギ抗血清を作製してマイクロタイター凝集反応によって亜血清型分類を行った結果、血清型Ｉの５８個菌株はａｎｔｉ−ＤＫ１４、ａｎｔｉ−ＤＷ１、ａｎｔｉ−ＦＰａ４８７０抗血清と凝集反応を示すが、凝集価は抗血清種類によって異なり、血清型Ｉ内に亜血清型（ｓｕｂｓｅｒｏｔｙｐｅ）が存在することが示唆された。凝集価によってＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓの血清型Ｉの亜血清型分類をした結果、Ｉａ  ２５個菌株、Ｉｂ  ２５個菌株、Ｉｃ  ８個菌株、Ｎｏｎ−ｔｙｐｅａｂｌｅ  ２個菌株と確認された（表１６）。
【００７８】
【表１６】
2020182455.tif 000037
【００７９】
Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓの血清型Ｉで亜血清型の分類のためにａｎｉｔ−ＤＫ１４、ａｎｔｉ−ＤＷ１、ａｎｔｉ−ＦＰａ４８７０抗血清を交差凝集素吸収方法で菌株別吸収抗血清（ａｂｓｏｒｂｅｄ−ａｎｔｉｓｅｒｕｍ）を作製し、再び凝集価を測定した。交差凝集素吸収方法で分析した結果、血清型Ｉで３つの亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）が存在し、亜血清型Ｉｃ型の場合、Ｉａ型に比べてＩｂ型で高い凝集価を示した（表１７）。
【００８０】
【表１７】
2020182455.tif 000038
【００８１】
血清型Ｉｂの菌株はいずれもＭＬＳＴ−２グループに含まれ、血清型ＩＩ及びＩａはＭＬＳＴ−１グループに含まれ、血清型Ｉｃは遺伝型と相関性がなかった（図１）。
【００８２】
Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ分離地域による血清型（遺伝型）分布を分析した結果、分離地域による特定血清型が確認されず、分離地域に関係なく様々な血清型が確認された（表１８、図３及び図４）。
【００８３】
【表１８】
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【００８４】
Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ分離年度による血清型分布を分析した結果、２０１０年以前には血清型Ｉｂが優点的であったが、２０１０年以後には血清型Ｉａ（ＭＬＳＴ−１グループ）が持続的に分離されており、最近では血清型Ｉｃ分離率が増加したことを確認した（表１９）。
【００８５】
【表１９】
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【００８６】
特に、血清型ＩａとＩｃの場合、２００９年にＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓのヒラメワクチンが商用化されて以来、分離比率が増加することが確認された。これは、商用化されたワクチンの効果がないというよりは、ワクチンの使用によるＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓの血清型の変化によるものと推定される（図３及び図４）。
【００８７】
実施例５：市販商業用ワクチンの血清型調査
２０１８年韓国で販売されているヒラメＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ抗原を含む不活化ワクチン７種を購入した。遠心分離してＰｒｏｍｅｇａ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）でＤＮＡを抽出した後、血清型ＰＣＲ（ｓｅｒｏｔｙｐｅ−ＰＣＲ）（Ｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）で血清型を分析した。ＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物は、ＥｔＢｒが含まれた１．５％アガロースゲル（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）を用いて電気泳動した後、ＵＶトランスルミネーター（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）を用いてバンド（ｂａｎｄ）を確認した。
その結果、いずれも血清型Ｉｂ及び血清型Ｉｂ＋ＩＩと確認された（図５及び表２０）。
【００８８】
【表２０】
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【００８９】
実施例６：Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓの病原性分析
血清型が異なる代表菌株７個（ＦＰａ４８７０、ＦＰ４７４３、ＦＰ２３３１、ＦＰａ４３６５、ＰＲ５（１９ＦＢＳＰａ０００３）、ＤＫ１４、ＤＷ）を選定し、ヒラメ（１６．５±０．７ｃｍ）に１０６ｃｆｕ／ｆｉｓｈ濃度で人工感染実験（水温２３±１℃、皮下注射法、試験区当たり１０匹）を行った。皮下注射を用いた人工感染実験はＭｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｆｉｓｈ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，４５（１）、３７−４２の方法で行った。
【００９０】
１次感染実験で血清型別に比較的高い斃死率を示したＰＲ５、ＦＰａ４３６５、ＦＰａ４８７０、ＦＰ２３３１菌株で２次感染実験を行った（図６）。４個菌株をヒラメ（１１．６±０．５ｃｍ）に１０５〜１０１０ｃｆｕ／ｆｉｓｈ人工感染（水温２５±０．５℃、皮下注射法）させた後、２週間の累積斃死率を測定した。その結果、Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓの血清型Ｉに含まれるＦＰａ４３６５（Ｉａ）、ＰＲ５（Ｉｂ）、ＦＰａ４８７０（Ｉｃ）はいずれもヒラメに高い病原性を示した（図７）。血清型ＩＩのＦＰ２３３１（ＩＩ）菌株を１０１０ｃｆｕ／ｆｉｓｈでヒラメに皮下注射したが、高濃度でもヒラメには斃死が発生しなかったので、ＦＰ２３３１菌株はヒラメに病原性がないか低いと判断される。最終的に、血清型Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ菌株は１０８ｃｆｕ／ｆｉｓｈ、血清型ＩＩは１０１０ｃｆｕ／ｆｉｓｈの濃度をワクチン効能検証のための人工感染濃度として設定した。
【００９１】
実施例７：血清型間Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓワクチンの効能分析
実施例７−１：ワクチン作製及び効能分析方法
Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ血清型Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、ＩＩ菌株（ＦＰａ４８７０、ＦＰ２３３１、ＦＰａ４３６５、ＰＲ５（１９ＦＢＳＰａ０００３））にホルマリンを処理した不活化ワクチン（ＦＫＣ）を作製してヒラメに腹腔接種（１ｍｇ／ｆｉｓｈ）し、対照区はＰＢＳを腹腔注射した。
【００９２】
凍結保存されたＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ菌株４個を、１．５％（ｖ／ｖ）ＮａＣｌが添加されたＢＨＩＡ培地で３０℃温度で２４時間培養した。培養された平板培地の集落を、無菌的に１．５％ＮａＣｌが添加されたＢＨＩＢに接種後、撹拌培養器（ＪＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）で１５０ｒｐｍ、３０℃温度で４８時間培養した。培養された菌液に３７％（ｖ／ｖ）ホルマリン（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を各培養液の０．５％（ｖ／ｖ）になるように添加して撹拌培養器で１５０ｒｐｍ、２０℃で２４時間不活化した。培養菌の不活化をＢＨＩＡ（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）で最終確認した。不活化が確認された菌液を１２，０００ＲＣＦで遠心分離した後、滅菌生理食塩水で３回洗浄して菌体を回収し、最終的に湿菌体重量を測定して実験区によって濃度を異ならせて懸濁した。ワクチン接種２週後に尾部静脈から血液を採取し、ＥＬＩＳＡ法で抗体価を測定した。ＥＬＩＳＡ法を用いた抗体価調査方法で９６ウェルプレートにＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  ＦＫＣを１０μｇ／ｗｅｌｌの濃度になるように調節して分注し、４℃で一晩おいてプレート底に抗原を付着させた。Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ血清型別ＥＬＩＳＡ値を測定するために４つの異なる血清型のＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓのＦＫＣを作製し、各血清に対する抗体価を調べた。３％スキムミルクを用いて室温で１時間ブロッキングを行い、１次抗体でヒラメ血清と腸粘液を１０倍希釈して分注した後１時間反応させる。その後、ＰＢＳＴを用いて３回洗浄した後、２次抗体はＡｎｔｉ−Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｆｌｏｕｎｄｅｒ  ＩｇＭ  Ｍａｂを１：１０００に希釈して分注した後、１時間３７℃で反応させる。洗浄後、ＡＰ結合抗マウスＩｇＧ（ＡＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ）（ｗｈｏｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を１：１０００に希釈して分注した後３７℃で１時間反応させ、洗浄した後、基質（ＰＮＰＰ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加して２０分後、４０５ｎｍで吸光度を確認した。ワクチン接種４週後にそれぞれのワクチン接種区に血清型Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、ＩＩ菌株でそれぞれ人工感染実験し、３週間累積斃死率を測定した（図８）。相対生存率は下記のように計算した。
相対生存率（％）＝｛１−（試験区の累積斃死率／対照区の累積斃死率）｝×１００
【００９３】
実施例７−２：血清型別ワクチンの効能及び交差ワクチン効能分析
血清型別ワクチン接種２週後に採血して抗原種類別（血清型Ｉａ〜ＩＩ）に血清の抗体価を測定した結果、対照区と比較していずれも有意に高い抗体価を形成し、各ワクチン区は同一血清型の抗原で抗体価を測定したとき、最も高い抗体価を示した（表２１）。
【００９４】
【表２１】
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【００９５】
ヒラメに対する４つの血清型の異なるＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓワクチン処理後、各血清型に対する人工感染試験を行った結果、ワクチンを接種していない対照区に比べて全ワクチン接種区で低い斃死率を示した（表２２）。
【００９６】
【表２２】
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【００９７】
血清型間交差ワクチン効能を対照区と比較した相対生存率を比較した結果、全試験区で同一血清型のワクチン接種後に同一血清型の菌株を人工感染したとき、最も高かい相対生存率を示した（表２３）。血清型ＩｂとＩｃは相互間の交差ワクチン効能反応が高いこと（相対生存率：７３．９〜８２．５％）が確認されたが、ＩａとＩｂ、Ｉｃとは比較的低い交差ワクチン効能（相対生存率：０〜３０．８％）を示した（表２３）。
【００９８】
【表２３】
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【００９９】
実施例８：Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ多価ワクチンの効能分析
実施例８−１：多価ワクチン作製及び効能分析方法
Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ血清型ＩＩはヒラメに対する病原性がなく、最近ヒラメ養殖場では分離されていないので、多価ワクチン開発のためのワクチン対象菌株から除外した。Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓの３つの血清型（血清型Ｉａ（ＦＰａ４３６５）、血清型Ｉｂ（ＰＲ５）、血清型Ｉｃ（ＦＰａ４８７０））菌株をホルマリン処理した不活化ワクチン（ＦＫＣ）を作製して実験を行った。
【０１００】
凍結保存されたＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ菌株を、１．５％（ｖ／ｖ）ＮａＣｌが添加されたＢＨＩＡ培地で３０℃、２４時間培養した。培養された平板培地の集落を無菌的に１．５％ＮａＣｌが添加されたＢＨＩＢに接種後、撹拌培養器（ＪＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）で１５０ｒｐｍ、３０℃、４８時間培養した。培養された菌液に３７％（ｖ／ｖ）ホルマリン（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を各培養液の０．５％（ｖ／ｖ）となるように添加し、撹拌培養器で１５０ｒｐｍ、２０℃で２４時間不活化した。培養菌の不活化をＢＨＩＡ（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）で最終確認した。不活化が確認された菌液を１２，０００ＲＣＦで遠心分離した後、滅菌生理食塩水で３回洗浄した後に菌体を回収し、最終的に湿菌体重量を測定して実験区によって濃度を異ならせて懸濁した。各Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ血清型別不活化単独ワクチン研究結果から血清型ＩｂとＩｃは相互交差ワクチン効能があると確認され、表２４の抗原組合せ及び濃度でヒラメ（平均全長：１５．０５±０．９ｃｍ、平均体重：２６．７±４．７４ｇ）に腹腔注射方法でワクチンを接種した。実験区当たり総８０匹のヒラメを実験に使用した。
【０１０１】
【表２４】
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【０１０２】
ワクチン接種して２週後に尾部静脈から血液を採血（ｎ＝１０）し、ＥＬＩＳＡ法でＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓに対する抗体価を測定した。ＥＬＩＳＡ法を用いた抗体価調査方法で９６ウェルプレートにＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  ＦＫＣを１０μｇ／ｗｅｌｌの濃度となるように調節して分注し、４℃一晩おいてプレート底に抗原を付着させた。Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ血清型別ＥＬＩＳＡ値を測定するために、３つの異なる血清型のＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓのＦＫＣを作製し、各血清に対する抗体価を調べた。３％スキムミルクを用いて室温で１時間ブロッキングを行い、１次抗体でヒラメ血清と腸粘液を１０倍希釈して分注した後１時間反応させた。その後、ＰＢＳＴを用いて３回洗浄した後、２次抗体はＡｎｔｉ−Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｆｌｏｕｎｄｅｒ  ＩｇＭ  Ｍａｂを１：１０００に希釈して分注した後、１時間３７℃で反応させた。洗浄後、ＡＰ結合抗マウスＩｇＧ（ＡＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ）（ｗｈｏｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を１：１０００に希釈して分注した後３７℃で１時間反応させ、洗浄した後、基質（ＰＮＰＰ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加して２０分後、４０５ｎｍで吸光度を確認した。ワクチン接種２週後に抗体価を測定した結果、対照区では抗体価が確認されず、Ｉａ＋Ｉｃ区及びＩａ＋Ｉｂ＋Ｉｃ区で対照区に比して有意に高い抗体価を形成した（表２５、図９）。
【０１０３】
【表２５】
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【０１０４】
実施例８−２：多価ワクチンの効能分析
ワクチン接種３週後にＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  Ｉａ  ＦＰａ４３６５（５．２×１０８ｃｆｕ／ｆｉｓｈ）、Ｉｂ  ＰＲ５（７×１０８ｃｆｕ／ｆｉｓｈ）、Ｉｃ  ＦＰａ４８７０（１．４×１０８ｃｆｕ／ｆｉｓｈ）の３つの菌株で水温２６〜２７℃を維持しながら人工感染実験を行い、３週間斃死率を確認した（表２６）。
【０１０５】
【表２６】
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【０１０６】
Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ血清型Ｉａ＋Ｉｃワクチン区とＩａ＋Ｉｂ＋Ｉｃワクチン区に３つの異なる血清型のＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓで人工感染すると、対照区に比して高い生存率を示し、また、表２３のＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ単一血清型Ｉａ及びＩｂワクチン区と比して高い相対生存率を示した（表２７）。
【０１０７】
【表２７】
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【０１０８】
例えば、Ｉａ単一血清型ワクチン接種後、Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  Ｉａ血清型のＦＰａ４３６５菌株で人工感染すると、対照区と比較して５５．６％の相対生存率を示したが、Ｉａ＋Ｉｃワクチン区とＩａ＋Ｉｂ＋Ｉｃ区にＦＰａ４３６５菌株で人工感染すると、対照区と比較して９３．４％及び６６．７％の相対生存率を示した。また、Ｉｃ単一血清型ワクチン接種後にＳ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  Ｉｃ血清型のＦＰａ４８７０菌株で人工感染すると、対照区と比較して７５．１％の相対生存率を示したが、Ｉａ＋Ｉｃワクチン区とＩａ＋Ｉｂ＋Ｉｃ区にＦＰａ４３６５菌株で人工感染すると、対照区と比較して５０％及び３０％の相対生存率を示し、Ｉｃ単一血清型ワクチンに比べて低い効能を示した。血清型を混合した多価ワクチン間のワクチン効能比較では、Ｉａ＋Ｉｃワクチン区はＩａ＋Ｉｂ＋Ｉｃワクチン区に比べて、３つの全ての血清型の菌株において高い相対生存率を示し、また、Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓに対する特異抗体価は、Ｉａ＋Ｉｂ＋Ｉｃワクチン区がＩａ＋Ｉｃワクチン区に比べて高い抗体価を示した。
【０１０９】
実施例９：Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ多価ワクチンの安定性分析
実施例９−１：多価ワクチン安定性分析方法
多価ワクチン安全性調査のために、ヒラメ（平均全長：１５．８３±１．０４ｃｍ、平均体重：２７．２±４．７５ｇ）にワクチン効能調査時に使用した抗原濃度の２倍、５倍、１０倍濃度で腹腔に注射接種して安全性を評価した（表２８）。腹腔接種後３週までの斃死率を確認したが、毎週、ヒラメの尾部静脈から採血して（ｎ＝５）、血液生化学的性状及び病理組織学的検査によって安全性を確認した。血液性状は、自動血液分析機を用いてグルコース、ＡＬＴ、ＡＳＴ及び総タンパクの濃度を測定し、病理組織学的調査は、腎臓、脾臓、肝などを中性ホルマリンに固定後、常法によって調査した。
【０１１０】
【表２８】
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【０１１１】
実施例９−２：多価ワクチンの安定性分析結果
Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ  Ｉａ＋Ｉｃワクチン区、Ｉａ＋Ｉｂ＋Ｉｃワクチン区の抗原量を２倍、５倍、１０倍の高農度でワクチンを注射して３週間、全実験区で斃死が発生しなかった。血液生化学的性状（ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＧＬＵ、ＴＰ）は、全ワクチン接種区でワクチン接種後１週、２週、３週において対照区と有意の差が見られず、投与濃度はヒラメに安全なものと確認された（Ｐ＞０．０５、表２９）。
【０１１２】
【表２９】
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【０１１３】
多価ワクチン接種後の病理組織学的検査の結果、ワクチン区と対照区の肝、腎臓及び脾臓の病理組織学的検査で差が見られず、多価ワクチンはヒラメに安全なものと確認された（図１０〜図１２）。
【０１１４】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付する請求項とそれらの等価物によって定義されるだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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