(57)【要約】      （修正有）【課題】特に有用な物質特性を示す特定の属性（例えば、ペプチド同一性、ペプチド濃度、ｐＨ、塩同一性および／または濃度など）を有する、ペプチド組成物（例えば、自己組織化ペプチド）の提供。【解決手段】ＩＥＩＫ１３組成物であって、少なくとも０．２５％の濃度でＩＥＩＫ１３ペプチドを含み；組成物は、約２．５〜約４．０の範囲内のｐＨを有する、ＩＥＩＫ１３組成物。また、特定のコンテキストで有用な特定のペプチド組成物を選択および／または製剤化するための技術も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＥＩＫ１３組成物であって、
少なくとも０．２５％の濃度でＩＥＩＫ１３ペプチドを含み；
組成物は、約２．５〜約４．０の範囲内のｐＨを有する、
ＩＥＩＫ１３組成物。
【請求項２】
請求項１の組成物であって、
組成物が溶液である、
組成物。
【請求項３】
請求項１の組成物であって、
組成物がゲルである、
組成物。
【請求項４】
請求項１の組成物であって、
前記組成物は、約０．０００１Ｍ〜約０．１Ｍの範囲内のイオン強度を有する、
組成物。
【請求項５】
請求項４の組成物であって、
前記イオン強度は、一般的な塩類により調節／付与され、
前記一般的な塩類は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、およびＣａＳＯ４からなる群より選択される、
組成物。
【請求項６】
請求項４の組成物であって、
前記イオン強度は、一般的な塩類により付与され、
前記一般的な塩類は、カチオンを形成する１つまたは複数の塩およびアニオンを形成する１つまたは複数の塩からなり、
前記のカチオンを形成する塩は、アンモニウム、カルシウム、鉄、マグネシウム、カリウム、ピリジニウム、第４級アンモニウム、およびナトリウムからなる群より選択され、
前記のアニオンを形成する塩は、アセテート、カーボネート、クロライド、シトレート、シアニド、フロリド、ニトレート、ニトライト、およびホスフェートからなる群より選択される、
組成物。
【請求項７】
請求項１の組成物であって、
前記組成物は、１ｒａｄ／ｓｅｃの振動数および１Ｐａの振動応力で約１００〜約１００００Ｐａの範囲内の貯蔵弾性率を有する、
組成物。
【請求項８】
請求項１の組成物であって、
前記組成物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫化ナトリウム、またはＤＭＥＭで緩衝される、
組成物。
【請求項９】
請求項１の組成物であって、
前記ＩＥＩＫ１３ペプチドは、３％未満の濃度で存在し、および／または、
前記組成物は、約３．０〜約４．０の範囲内のｐＨを有する、
組成物。
【請求項１０】
請求項９の組成物であって、
組成物は、１ｒａｄ／ｓｅｃの振動数および１Ｐａの振動応力で、５００Ｐａを超える貯蔵弾性率を示すゲルである、
組成物。
【請求項１１】
請求項１の組成物であって、
前記組成物は、前記組成物のｐＨが調節されるように、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、または硫化ナトリウムで緩衝される、
組成物。
【請求項１２】
液体ペプチド組成物であって、
約６〜約２０個の範囲内のアミノ酸の長さおよび交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸のアミノ酸配列を有するペプチドを含み、
組成物は、以下の点で特徴付けられる：
室温で約１Ｐａ・ｓ〜約５００，０００Ｐａ・ｓの範囲内の粘度を有し、
１ｒａｄ／ｓｅｃの振動数および１Ｐａの振動応力で、約１〜約５０００Ｐａの範囲内の貯蔵弾性率を有し、
約２．５〜約４．０の範囲内のｐＨまたはおよび／または約０．０００１Ｍ〜約１．５Ｍの範囲内のイオン強度に曝露／維持された場合に、約０〜約３０ｓの時間内、ゲルを形成する、
液体ペプチド組成物。
【請求項１３】
請求項１２の組成物であって、
水性組成物である、
組成物。
【請求項１４】
請求項１２の組成物であって、
前記ペプチドは、ＲＡＤＡ１６を含む、
組成物。
【請求項１５】
請求項１２の組成物であって、
前記ペプチドは、ＩＥＩＫ１３を含む、
組成物。
【請求項１６】
請求項１２の組成物であって、
前記ペプチドは、ＫＬＤ１２を含む、
組成物。
【請求項１７】
請求項１２の組成物であって、
前記イオン強度は、一般的な塩類により付与され、
前記一般的な塩類は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、およびＣａＳＯ４からなる群より選択される、
組成物。
【請求項１８】
請求項１２の組成物であって、
前記イオン強度は、一般的な塩類により付与され、
前記一般的な塩類は、カチオンを形成する１つまたは複数の塩およびアニオンを形成する１つまたは複数の塩からなり、
前記のカチオンを形成する塩は、アンモニウム、カルシウム、鉄、マグネシウム、カリウム、ピリジニウム、第４級アンモニウム、およびナトリウムからなる群より選択され、
前記のアニオンを形成する塩は、アセテート、カーボネート、クロライド、シトレート、シアニド、フロリド、ニトレート、ニトライト、およびホスフェートからなる群より選択される、
組成物。
【請求項１９】
請求項１２の組成物であって、
前記組成物は、前記組成物のｐＨが調節されるように、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、または硫化ナトリウムで緩衝される、
組成物。
【請求項２０】
特定のインビボ部位への適用のためのペプチド組成物を選択するステップを含む方法であって、
前記方法は、
前記ペプチド組成物に関する、貯蔵弾性率、粘度、ゲル化時間、剪断減粘性特性、およびペプチドナノファイバー再組織化時間からなる群より選択される、１つまたは複数のパラメーターを決定するステップ；および
前記の決定された１つまたは複数のパラメーターを、前記の特定のインビボ部位への適用に適切であると決定された特性のセットと比較するステップ；および
前記比較に照らして前記ペプチド組成物を選択するステップ；および
前記部位に、前記の選択されたペプチド組成物を投与するステップ、
を含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１４年３月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／９５０，５２９号の、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）の下での利益を主張し、その出願は、その全体で参照により本明細書に援用される。
【０００２】
［配列リスト］
本出願は、「２００４８３７−００４６＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ｔｘｔ」というａｓｃｉｉ．ｔｘｔファイルとして電子的形態で提出された配列リストを参照する。ｔｘｔファイルは、２０１５年３月９日に作られ、１ｋｂのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
ゲル構造に自己組織化する能力を有するペプチド剤は、治療および研究のコンテキストにおいて多種多様の用途を有する。そのようなペプチド剤の１つである、例えば、アルギニン、アラニン、およびアスパラギン酸の繰り返し配列を有する合成の１６−アミノ酸ポリペプチド（すなわち、ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ［配列番号１］であり、「ＲＡＤＡ１６」としても知られる）は、３−Ｄ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから商品名ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）、およびＰｕｒａＭａｔｒｉｘ  ＧＭＰ（登録商標）として市販され、細胞培養、薬物輸送、促進的な軟骨および骨の成長、および、ＣＮＳ、軟組織、および心筋の再生を含む広範な実験および臨床用途において、さらに、マトリックス、足場、または、１つまたは複数の検出可能な薬剤、生物学的活性剤、細胞、および／または細胞成分と関連し得るテダーとして、有用性が示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本開示は、とりわけ、特定のペプチド組成物（具体的には、自己組織化ペプチド剤の特定の組成物）、およびそれに関する技術を提供する。一部の実施態様では、そのような組成物は、溶液であってよく、または含んでよい。一部の実施態様では、そのような組成物は、ゲルであってよく、または含んでよい。一部の実施態様では、そのような組成物は、固形（例えば、乾燥／凍結乾燥された）ペプチドであってよく、または含んでよい。
【０００５】
例えば、本開示は、特定のペプチド組成物（すなわち、特定の濃度、イオン強度、ｐＨ、粘度および／または他の特性を有するペプチド組成物）が、有用および／または驚くべき属性（例えば、ゲル化または自己組織化カイネティクス［例えば、ゲル化速度および／またはペプチド自己組織化の速度および可逆性］、剛性［例えば、貯蔵弾性率により評価される］、および／または他の機械的特性）を有することを示す。一部の実施態様では、本開示は、特定のコンテキスト（例えば、特定のインビボまたはインビトロ適用）における、特定のそのような組成物の特定の有用性を示す。
【０００６】
とりわけ、本開示は、特定のコンテキストまたは適用において有用な特定のペプチド組成物の選択、設計、および／または製剤化を可能にするガイドラインを提供する。
【０００７】
本開示は、特定のカチオンおよびアニオンが自己組織化ペプチド剤と相互作用する程度、さらに、どのようにして、そのような相互作用が、ペプチド組成物の特定の物質（例えば、レオロジー）特性を変更する（例えば、機械的剛性および／または粘度を増大させる）ことができるのかを確立する。またさらに、本開示は、どのようにして、そのような相互作用が、とりわけ、変形（例えば、機械的摂動または他の崩壊）に曝した後の、ゲル化カイネティクス、ゲル化状態の復元（例えば、ゲル化および／またはゲル特性の復元のタイミングおよび／または程度）に影響し得るかを、確立する。
【０００８】
本明細書に記載の試験は、特定の既存の自己組織化ペプチド技術での様々な問題の原因を特定し、さらに、ペプチド組成物技術の特定の適用に特有の、特に有用および／または必要な属性および／または特性を定義する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一部の実施態様では、提供される組成物に含まれるペプチドは、自己組織化ペプチドである。一部の実施態様では、提供される組成物に含まれるペプチドは、両親媒性ペプチドである。一部の実施態様では、提供される組成物に含まれるペプチドは、少なくとも一続き（例えば、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個などのアミノ酸）の交互の親水性および疎水性アミノ酸により特徴付けられるアミノ酸配列を有する。一部の実施態様では、提供される組成物に含まれるペプチドは、１つまたは複数の繰り返しのＡｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ（ＲＡＤＡ）を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施態様では、提供される組成物に含まれるペプチドは、配列Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ（ＫＬＤＬ）の繰り返し単位を含む、またはからなる、アミノ酸配列を有する。一部の実施態様では、提供される組成物に含まれるペプチドは、配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ（ＩＥＩＫ）の繰り返し単位を含む、またはからなる、アミノ酸配列を有する。一部の実施態様では、ペプチドは、ＩＥＩＫ１３、ＫＬＤ１２、またはＲＡＤＡ１６であり得る。一部の実施態様では、これらのペプチドの組成物は、異なる（例えば、より低い）ｐＨレベル、および／またはイオン強度を有する適切な参照組成物と比較して、増強された特性を有し得る。
【００１０】
より穏やかなｐＨレベルでのペプチド組成物は、より剛性のレオロジー特性を有し得て、より幅広い範囲の適用にそれらを適切にさせる。また、４．０より上への環境ｐＨの変化は、ペプチド組成物によるゲル化カイネティクスに有利な影響も及ぼし得る。一部の実施態様では、ｐＨの上昇は、ペプチド組成物が体内に置かれた場合に生じ得る生理学的ｐＨであり得る。
【００１１】
１つまたは複数の態様によれば、制限されないがＩＥＩＫ１３、ＫＬＤ１２、およびＲＡＤＡ１６を含む特定のペプチド組成物のレオロジー特性は、増大したイオン強度を維持することにより増強され得る。一部の実施態様では、イオン強度は、臨界イオン強度よりも低くてよい。一部の実施態様では、ペプチド組成物は、純水ではなく塩類を含む水中に溶解され得る。一部の実施態様では、イオン強度は、それらの臨界イオン強度よりも低くてよい。
【００１２】
一部の実施態様では、イオン強度の増大は、ペプチド組成物に対して、剛性および／またはゲル化カイネティクスを有利な影響し得て、より幅広い範囲の適用にそれらを適切にさせる。一部の実施態様では、イオン強度の増大は、ペプチド組成物が体内に置かれた場合に生じ得る生理学的イオン強度であり得る。
【００１３】
１つまたは複数の態様によれば、制限されないがＩＥＩＫ１３、ＫＬＤ１２、およびＲＡＤＡ１６を含む特定のペプチド組成物の特性は、それらのｐＨレベルを約３．５またはそれ未満、同時に、それらの塩濃度を、それらの臨界イオン強度レベル未満（すなわち沈殿なし）に維持することにより、増強され得る。
【００１４】
１つまたは複数の態様によれば、自己組織化ペプチド（例えば、ＩＥＩＫ１３、ＫＬＤ１２、およびＲＡＤＡ１６）は、外観、ｐＨレベル、イオン強度レベル、ゲル化カイネティクス、レオロジー特性、およびペプチド製剤を様々な適用に最適化する細胞生存率を含む、特性の観点から特徴付けられ得る。ＩＥＩＫ１３およびＫＬＤ１２は、基礎的なゲル化特性および他の特徴の観点から、ＲＡＤＡ１６と同様のペプチド組成物として特徴付けられ得る。
【００１５】
一部の実施態様では、ペプチドは、約６〜約２０個の範囲内のアミノ酸の長さおよび疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸の交互のアミノ酸配列を有し得る。
【００１６】
一部の実施態様では、ペプチド組成物は、溶液、ゲル、または任意のそれらの組み合わせであり得る。
【００１７】
一部の実施態様では、ペプチド組成物は、少なくとも０．０５％の濃度であってよい。一部の実施態様では、ペプチド組成物は、３％未満の濃度で存在し得る。
【００１８】
一部の実施態様では、ペプチド組成物は、約２．５〜約４．０の範囲内または約３．０〜約４．０の範囲内のｐＨを有し得る。一部の実施態様では、ペプチド組成物のｐＨは水酸化ナトリウムまたは、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫化ナトリウム、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、およびＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）からなる群より選択される溶液により達成され得る。
【００１９】
一部の実施態様では、ペプチド組成物のイオン強度は、約０．０００１Ｍ〜約１．５Ｍであり得る。一部の実施態様では、ペプチド組成物のイオン強度は、一般的な塩類、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＣａＳＯ４、ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、１０×）を混合することにより調節され得る。一部の実施態様では、ペプチド組成物のイオン強度は、一般的な塩類を混合することにより調節され得て、ここで、１つまたは複数の一般的な塩類は、カチオンを形成する１つまたは複数の塩およびアニオンを形成する１つまたは複数の塩からなり、カチオンを形成する塩は、アンモニウム、カルシウム、鉄、マグネシウム、カリウム、ピリジニウム、第４級アンモニウム、およびナトリウムからなる群より選択され、アニオンを形成する塩は、アセテート、カーボネート、クロライド、シトレート、シアニド、フロリド（ｆｌｏｒｉｄｅ）、ニトレート、ニトライト、およびホスフェートからなる群より選択される。
【００２０】
一部の実施態様では、ペプチド組成物は、約１〜約１００００Ｐａ・Ｓの範囲内の粘度を有し得る。一部の実施態様では、ペプチド組成物は、約５０〜約２５００Ｐａの範囲内の貯蔵弾性率を有し得る。
【００２１】
一部の実施態様では、特定のインビボ部位に対する適用のためのペプチド組成物を選択する方法は、ペプチド組成物に関する、貯蔵弾性率、粘度、ゲル化時間、復元の時間および／または程度などからなる群より選択される１つまたは複数のパラメーターを決定するステップ、決定されたパラメーターを様々な適用に関する仕様と比較するステップ、比較に照らしてペプチド組成物を選択するステップ；および、選択されたペプチド組成物を部位に投与するステップを含み得る。
【００２２】
一部の特定の実施態様では、本開示は、例えば、約６〜約２０個の範囲内のアミノ酸の長さおよび交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸のアミノ酸配列を有するペプチドを含み得て、以下の点で特徴付けられ得る、液体ペプチド組成物を提供する。（ｉ）室温で、約１Ｐａ・ｓ〜約５００，０００Ｐａ・ｓの範囲内の粘度を有し；（ｉｉ）１ｒａｄ／ｓｅｃの振動数および１Ｐａの振動応力で、約１〜約５０００Ｐａの範囲内の貯蔵弾性率を有する；および／または、（ｉｉｉ）約２．５〜約４．０の範囲内のｐＨまたはおよび／または約０．０００１Ｍ〜約１．５Ｍの範囲内のイオン強度に曝露／維持された場合に、約０〜約３０ｓの時間、ゲルを形成する。一部の実施態様では、そのような組成物は、水性組成物である。
【００２３】
また、一部の特定の実施態様では、本開示は、ある特定のコンテキストでの使用に特に適切なペプチド組成物を、設計、選択、およびまたは生産する方法を提供する。一部のそのような実施態様では、ある特定のコンテキストは、特定のインビボ部位に対する適用であり、または含む。一部の実施態様では、そのような提供される方法は、例えば：（ｉ）貯蔵弾性率、粘度、ゲル化時間、剪断減粘性特性、ペプチドナノファイバー再組織化時間からなる群より選択される１つまたは複数のパラメーター、および／または、特定のインビボ部位への適用に適切な本明細書に記載の１つまたは複数の他のパラメーターを、決定するステップ；および（ｉｉ）本明細書に提供されるガイドラインに従って、そのようなパラメーターにより特徴付けられるペプチド組成物を、設計、選択、および／または生産するステップ、を含み得る。
【００２４】
これに代え又はこれに加えて、一部の特定の実施態様では、本開示は、例えば特定のインビボ部位に投与するための、特定のペプチド組成物を選択する方法を提供し；例示的なそのような方法は、（ｉ）貯蔵弾性率、粘度、ゲル化時間、剪断減粘性特性、ペプチドナノファイバー再組織化時間からなる群より選択される１つまたは複数のパラメーター、および／または、ペプチド組成物に関して本明細書に記載の１つまたは複数の他のパラメーターを、決定するステップ；（ｉｉ）決定された１つまたは複数のパラメーターを、特定のインビボ部位への適用に適切であると決定された特性のセットと比較するステップ；（ｉｉｉ）比較に照らしてペプチド組成物を選択するステップ；および（ｉｖ）部位に、選択したペプチド組成物を投与するステップ、を含み得る。
【００２５】
本発明の目的および特徴は、以下に記載の図面、および特許請求の範囲を参照して、より良く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＰＢＳ緩衝液における、ペプチド組成物の例示的なゲル形成を示す。ＲＡＤＡ１６、ＩＥＩＫ１３、およびＫＬＤ１２を、０．５％、１．０％、１．５％、２．０％および２．５％の異なる濃度でプレーティングした。ＲＡＤＡ１６、ＩＥＩＫ１３、およびＫＬＤは、全ての濃度でゲル化した。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、ＲＡＤＡ１６の例示的なレオロジー特性を示す。図２Ａは、１Ｐａおよび１０ｒａｄ／ｓで実施した応力スイープ試験を示す。図２Ｂは、測定した貯蔵弾性率をＲＡＤＡ１６濃度の関数として示す。ＲＡＤＡ１６組成物の貯蔵弾性率は、それらの濃度と直線相関を有し得る。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、ＩＥＩＫ１３の例示的なレオロジー特性を示す。図３Ａは、１Ｐａおよび１０ｒａｄ／ｓで実施した応力スイープ試験を示す。図３Ｂは、測定した貯蔵弾性率をＩＥＩＫ濃度の関数として示す。ＩＥＩＫ１３組成物の貯蔵弾性率は、それらの濃度と直線相関を有し得る。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、ＫＬＤ１２の例示的なレオロジー特性を示す。図４Ａは、１Ｐａおよび１０ｒａｄ／ｓで実施した応力スイープ試験を示す。図４Ｂは、測定した貯蔵弾性率をＫＬＤ１２濃度の関数として示す。ＫＬＤ１２組成物の貯蔵弾性率は、それらの濃度と直線相関を有し得る。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、１％ペプチド組成物に対する、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）処理の効果を示す棒グラフである。図５Ａは、ペプチド組成物に対するＤＭＥＭ処理の前後の貯蔵弾性率データ（１Ｐａおよび１０ｒａｄ／ｓで実施した）を示す。図５Ｂは、ＤＭＥＭ処理後の貯蔵弾性率の増加倍率を示す。
【図６】図６Ａは、ＲＡＤＡ１６およびＤＭＥＭの混合物（１：１容量比）の写真である。混合物は、粘性が低く、混濁していた。図６Ｂは、遠心分離後の混合物を示す。ＲＡＤＡ１６（すなわち、遠心分離菅の底の半透明の蓄積物）は混合物から沈殿した。
【図７】図７は、ｐＨ２〜３、および生理学的ｐＨ（ＤＭＥＭ）における、ＲＡＤＡ１６、ＫＬＤ１２、およびＩＥＩＫ１３組成物のナノ構造を示す。ＤＭＥＭ処理は、剛性の組成物を形成し得るが、ＤＭＥＭの混合は、ペプチドを沈殿させ得る。
【図８】図８は、ｐＨ＝２．０および３．４における、１％  ＫＬＤ１２組成物の例示的な応力スイープ試験（１０ｒａｄ／ｓ）を示す。
【図９】図９は、ｐＨ＝２．１および３．７における、１％  ＩＥＩＫ１３組成物の例示的な応力スイープ試験（１０ｒａｄ／ｓ）を示す。
【図１０】図１０は、ｐＨ＝２．５および３．４における、１％  ＲＡＤＡ１６組成物の例示的な応力スイープ試験（１０ｒａｄ／ｓ）を示す。ペプチド組成物の貯蔵弾性率は、ｐＨの上昇に伴い増大した。
【図１１】図１１Ａおよび図１１Ｂは、１ＰａでのＲＡＤＡ１６の例示的な振動数スイープ試験を示す。図１１Ａは、ｐＨ２．５および３．４における、１％  ＲＡＤＡ１６の測定である。図１１Ｂは、ｐＨ２．５および３．４における、２．５％  ＲＡＤＡ１６の測定である。
【図１２】図１２は、ｐＨ３．２、３．４、３．６および４．０における、２．５％  ＲＡＤＡ１６の写真である。組成物は、ｐＨレベルが約３．５であるときは透明であり、ｐＨ＝３．６でわずかに混濁した。組成物は、ｐＨ＝４．０で沈殿した。
【図１３】図１３は、剪断応力有りまたは無しの、異なるｐＨレベルにおける、ＲＡＤＡ１６、ＫＬＤ１２、およびＩＥＩＫ１３のナノ構造および／または再組織化を示す。優勢の相互作用は、ｐＨおよび剪断応力により決定され得る。
【図１４】図１４〜１６は、それぞれ、選択された濃度における、ＲＡＤＡ１６、ＩＥＩＫおよびＫＬＤの細胞生存率（ｍＭＳＣ）を示す。＊は、細胞生存率が、左隣のカラムにおける細胞生存率よりも有意に低いことを意味する（ｐ値＜０．０５）。＃は、細胞生存率が、左隣のカラムにおいて、細胞生存率よりも有意に高いことを意味する（ｐ値＜０．０５）。
【図１５】図１４〜１６は、それぞれ、選択された濃度における、ＲＡＤＡ１６、ＩＥＩＫおよびＫＬＤの細胞生存率（ｍＭＳＣ）を示す。＊は、細胞生存率が、左隣のカラムにおける細胞生存率よりも有意に低いことを意味する（ｐ値＜０．０５）。＃は、細胞生存率が、左隣のカラムにおいて、細胞生存率よりも有意に高いことを意味する（ｐ値＜０．０５）。
【図１６】図１４〜１６は、それぞれ、選択された濃度における、ＲＡＤＡ１６、ＩＥＩＫおよびＫＬＤの細胞生存率（ｍＭＳＣ）を示す。＊は、細胞生存率が、左隣のカラムにおける細胞生存率よりも有意に低いことを意味する（ｐ値＜０．０５）。＃は、細胞生存率が、左隣のカラムにおいて、細胞生存率よりも有意に高いことを意味する（ｐ値＜０．０５）。
【図１７】図１７Ａは、ＩＥＩＫ１３の構造を示す。図１７Ｂは、ＤＭＥＭ処理前後のＩＥＩＫ１３のＳＥＭ画像を示す。ＤＭＥＭ処理後のＩＥＩＫ１３ファイバーは、ＤＭＥＭ処理前のファイバーよりも厚くあり得る。
【図１８】図１８は、２．５％  ＲＡＤＡ１６のレオロジー特性に対するｐＨの効果を示す、貯蔵弾性率の棒グラフである。貯蔵弾性率は１ｒａｄ／ｓで測定した。
【図１９】図１９は、１．５％  ＩＥＩＫ１３のレオロジー特性に対するｐＨの効果を示す、貯蔵弾性率の棒グラフである。貯蔵弾性率は１ｒａｄ／ｓで測定した。
【図２０】図２０Ａは、ｐＨ＝２．１、３．０、３．３および３．５における、１％  ＩＥＩＫ１３の例示的な流動粘度試験を示す。図２０Ｂは、０．００３  ｌ／ｓｅｃの剪断速度での、例示的な粘度測定の棒グラフである。
【図２１】図２１Ａ、図２１Ｂ、図２１Ｃおよび図２１Ｄは、それぞれ、ｐＨ＝２．１、３．０、３．３、および３．５において、１％  ＩＥＩＫ１３に対して高剪断応力を適用後の、時間の関数としての、貯蔵弾性率測定を示す。横線は、１％  ＩＥＩＫ１３の元の貯蔵弾性率を示す。
【図２２】図２２Ａおよび図２２Ｂは、ｐＨ２．２および３．４における、ＲＡＤＡ１６濃度の関数としての、貯蔵弾性率の棒グラフである。図２２Ａは、ＤＭＥＭ処理前の測定である。図２２Ｂは、ＤＭＥＭ処理後の測定である。
【図２３】図２３Ａおよび図２３Ｂは、ｐＨ２．３および３．４における、ＩＥＩＫ濃度の関数としての、貯蔵弾性率の棒グラフである。図２３Ａは、ＤＭＥＭ処理前の測定である。図２３Ｂは、ＤＭＥＭ処理後の測定である。
【図２４】図２４は、時間の関数としての貯蔵弾性率測定を示す。図２４は、ｐＨ２．２、２．６、２．８、３．１および３．４における、２．５％  ＲＡＤＡ１６データを含む。時間スイープ試験を、１ｒａｄ／ｓｅｃおよび１Ｐａ（２０ｍｍのプレートおよび５００μｍのギャップ距離）で実施した。時間スイープ試験の間、時間＝０において、測定プレートの周りのチャンバーにＤＭＥＭを加えてペプチドを浸した。
【図２５】図２５は、時間の関数としての貯蔵弾性率測定を示す。図２５は、ｐＨ２．３、２．６、２．９および３．２における、１．５％  ＩＥＩＫ１３データを含む。時間スイープ試験を、１ｒａｄ／ｓｅｃおよび１Ｐａ（２０ｍｍのプレートおよび５００μｍのギャップ距離）で実施した。時間スイープ試験の間、時間＝０において、測定プレートの周りのチャンバーにＤＭＥＭを加えてペプチドを浸した。
【図２６】図２６は、低塩条件または高塩条件（すなわち臨界イオン強度よりも上）における、ペプチドのナノ構造および／または再組織化を示す。塩溶液の適用方法（処理または混合）は、ナノ構造を変化させ得る。塩溶液によるペプチドの処理は剛性のゲルを形成し得るが、ペプチドへの塩溶液の混合は、相分離を引き起こし得る。
【図２７】図２７は、１Ｐａでの、１ｒａｄ／ｓ〜１０ｒａｄ／ｓの例示的な振動数スイープ試験を示す。図２７は、ＮａＣｌ溶液（０．２Ｍイオン強度）を含む、または含まない、１％  ＫＬＤ１２の測定である。
【図２８】図２８は、１Ｐａでの、１ｒａｄ／ｓ〜１０ｒａｄ／ｓの例示的な振動数スイープ試験を示す。図２８は、ＮａＣｌ溶液（０．０２Ｍイオン強度）を含む、または含まない、１％  ＩＥＩＫ１３の測定である。
【図２９】図２９は、１Ｐａでの、１ｒａｄ／ｓ〜１０ｒａｄ／ｓの例示的な振動数スイープ試験を示す。図２９は、ＮａＣｌ溶液（０．７Ｍイオン強度）を含む、または含まない、１％  ＲＡＤＡ１６の測定である。
【図３０】図３０は、１ｒａｄ／ｓにおける、貯蔵弾性率の棒グラフである。１．０％  ＲＡＤＡ１６を、０〜１．０Ｍの異なるイオン強度のＮａＣｌに曝した。
【図３１】図３１は、１ｒａｄ／ｓにおける、貯蔵弾性率の棒グラフである。１．０％  ＩＥＩＫ１３を、０〜０．０４Ｍの異なるイオン強度のＮａＣｌに曝した。
【図３２】図３２Ａは、０、０．０１および０．０２ＭのＮａＣｌイオン強度における、１％  ＩＥＩＫ１３の流動粘度試験を示す。図３２Ｂは、０．００３  ｌ／ｓｅｃの剪断速度での粘度の棒グラフである。
【図３３】図３３Ａ、図３３Ｂおよび図３３Ｃは、それぞれ、０、０．０１、および０．０２のＮａＣｌイオン強度での１％  ＩＥＩＫ１３に対して高剪断応力を適用した後の、時間の関数としての貯蔵弾性率測定を示す。横線は、それぞれの１％  ＩＥＩＫ１３組成物の元の貯蔵弾性率を示す。
【図３４】図３４は、ＤＭＥＭ処理前または後の、ＮａＣｌイオン強度の関数としての、１Ｐａにおける１％  ＲＡＤＡ１６の例示的な貯蔵弾性率を示す。
【図３５】図３５は、ＤＭＥＭ処理前または後の、ＮａＣｌイオン強度の関数としての、１Ｐａにおける１％  ＩＥＩＫ１３の例示的な貯蔵弾性率を示す。
【図３６】図３６は、選択された塩類（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、およびＣａＣｌ２）を有する１％  ＲＡＤＡ１６の例示的な貯蔵弾性率を示す。＊は、Ｇ’が、コントロール（塩なし）よりも有意に高いことを表わす（Ｐ＜０．０５）。＃は、Ｇ’が、０．１５ＭのＮａＣｌイオン強度を有する１％  ＲＡＤＡ１６よりも有意に低いことを表わす（Ｐ＜０．０５）。
【図３７】図３７は、ＤＭＥＭ処理後の、選択された塩類（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、およびＣａＣｌ２）を含む１％  ＲＡＤＡ１６の例示的な貯蔵弾性率を示す。＊は、Ｇ’が、コントロール（塩なし、ＤＭＥＭ処理後）よりも有意に高いことを表わす（Ｐ＜０．０５）。
【図３８】図３８は、生理食塩水バッファー処理後の、１．５％  ＩＥＩＫ１３、１．５％  ＫＬＤ１２、および２．５％  ＲＡＤＡ１６に関する、時間の関数としての例示的な貯蔵弾性率測定を示す。時間スイープ試験は、１ｒａｄ／ｓｅｃおよび１Ｐａ（２０ｍｍのプレートおよび５００μｍのギャップ距離）で実施した。時間スイープ試験の間、時間＝０において、測定プレートの周りのチャンバーに生理食塩水バッファーを加えてペプチドを浸した。
【図３９】図３９は、特定のイオン強度における、ＲＡＤＡ１６、ＫＬＤ１２、およびＩＥＩＫ１３のナノ構造および／または再組織化を示す。高剪断応力は、ナノ構造および／または再組織化を変化させ得る。
【図４０】図４０は、１ｒａｄ／ｓｅｃにおける、２．５％  ＲＡＤＡ１６の貯蔵弾性率を示す。ＮａＣｌの添加およびｐＨの上昇は、２．５％  ＲＡＤＡ１６の貯蔵弾性率を増大させた。
【図４１】図４１Ａ、図４１Ｂ、図４１Ｃおよび図４１Ｄは、実施例４および７に記載の異なる塩類および／または塩濃度を有するペプチド組成物の調製に使用されるステップを示す。当業者は、同様のストラテジーを使用して、例えば、異なるｐＨ、ペプチド濃度などを有するペプチド組成物を分析することができることを理解するであろう。図４１Ａでは、ガラスバイアルを用いてペプチドパウダーを配置した。図４１Ｂでは、ペプチドパウダーを、最初に、最終容量の選択画分において脱イオン水中に溶解させ；所望により、ボルテックスおよび／または超音波処理を使用して、完全な可溶化を達成または確実にした。図４１Ｃでは、用いた脱イオン水の容量に対して量および濃度依存して、濃縮塩溶液を上部に添加した。図４１Ｄでは、例えばボルテックスにより溶液を混合した。
【図４２】図４２Ａ、図４２Ｂ、図４２Ｃ、図４２Ｄ、図４２Ｅ、図４２Ｆおよび図４２Ｇは、それぞれ、０．５％  ＲＡＤＡ１６と、０、０．００５、０．０５、０．１２５、０．２５０、０．５００および１Ｍ  ＣａＣｌ２との、混合物の正立および倒立の写真である。図４２Ｅは、最適および完全な機能性ゲルを示す。図４２Ｆは、半機能性ゲルを示す。図４２Ｇは、非機能性ゲルを示す。
【図４３】図４３は、０．１２５、０．２５０、および０．５００Ｍの濃度でＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびＣａＣｌ２と混合した、０．５％  ＲＡＤＡ１６の貯蔵弾性率測定を示す。
【図４４】図４４は、２．５％  ＲＡＤＡ１６および０．１２５Ｍ  ＣａＣｌ２を含む２．５％  ＲＡＤＡ１６の貯蔵弾性率測定を示す。
【図４５】図４５Ａおよび図４５Ｂは、機械的摂動後の、０．１２５、０．２５０、および０．５００Ｍを含むＲＡＤＡ１６の貯蔵弾性率測定を示す。＊は、コントロールサンプルおよび摂動サンプルが、有意に異なることを表わす。
【図４６】図４６は、時間の関数としての、ＣａＣｌ２およびＣａＳＯ４で処理された２．５％  ＲＡＤＡ１６の貯蔵弾性率測定である。
【図４７】図４７Ａは、ＩＥＩＫ１３およびインジゴカルミンを含むＩＥＩＫ１３の例示的なレオロジーデータである。図４７Ｂは、ＩＥＩＫ１３およびインジゴカルミンを含むＩＥＩＫ１３の剛性を示す。図４７Ｃは、ＲＡＤＡ１６およびリンガー液を含むＲＡＤＡ１６の剛性を示す。図４７Ｄは、リンガー液を含むＲＡＤＡ１６の倒立させた写真である。図４６Ｅは、ＩＥＩＫ１３およびインジゴカルミンを含むＩＥＩＫ１３の倒立させた写真である。図４７Ｆは、インジゴカルミンを含む、シリンジ内に入れたＩＥＩＫ１３の写真である。
【図４８】図４８は、２．５％  ＲＡＤＡ１６およびＮａＣｌを含む２．５％  ＲＡＤＡ１６のグラフであり、肺の破裂圧力の増大を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
定義
本明細書において用いられる用語「薬剤」は、例えば、ポリペプチド、核酸、糖類、脂質、小分子、金属、またはそれらの組み合わせを含む、任意の化学クラスの化合物または物質を指し得る。一部の実施態様では、薬剤は、天然に見られ、および／または天然から得られるという点で、天然物であり、または含む。一部の実施態様では、薬剤は、人の手の動作を通して設計され、改変され、および／または生産され、および／または、天然に見られないという点で、人工である１つまたは複数の物質であり、または含む。一部の実施態様では、薬剤は、分離されまたは純粋な形態で使用され得て；一部の実施態様では、薬剤は、粗製形態で使用され得る。一部の実施態様では、潜在的な薬剤は、コレクションまたはライブラリーとして提供され、例えば、スクリーニングしてそれらの中の活性の薬剤が同定または特徴付けられ得る。本発明により使用され得る薬剤の一部の特定の実施態様は、小分子、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム）、ペプチド、ペプチド模倣物などを含む。一部の実施態様では、薬剤は、ポリマーであり、または含む。一部の実施態様では、薬剤はポリマーではなく、および／または、いかなるポリマーも実質的に存在しない。一部の実施態様では、薬剤は、少なくとも１つのポリマー部分を含む。一部の実施態様では、薬剤は、いかなるポリマー部分もなく、または実質的に存在しない。
【００２８】
本明細書において用いられる用語「アミノ酸」は、その最も広い意味において、例えば１つまたは複数のペプチド結合の形成を通してポリペプチド鎖に取り込むことのできる、任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施態様では、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。一部の実施態様では、アミノ酸は天然起源のアミノ酸である。一部の実施態様では、アミノ酸は合成アミノ酸であり；一部の実施態様では、アミノ酸はＤ−アミノ酸であり；一部の実施態様では、アミノ酸はＬ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然起源ペプチドに一般に見られる任意の２０の標準的なＬ−アミノ酸を指す。「非標準アミノ酸」は、合成的に調製されるか、または天然起源から得られるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。一部の実施態様では、ポリペプチド内のアミノ酸（カルボキシ−および／またはアミノ−末端アミノ酸を含む）は、上記の一般構造と比較して構造上の改変を含んでよい。例えば、一部の実施態様では、アミノ酸は、一般構造と比較して、メチル化、アミド化、アセチル化、および／または置換により改変されてよい。一部の実施態様では、そのような改変は、それ以外では同一の改変されていないアミノ酸を含むものと比較して、例えば、改変されたアミノ酸を含むポリペプチドの循環半減期を変更し得る。一部の実施態様では、そのような改変は、それ以外では同一の改変されていないアミノ酸を含むものと比較して、改変されたアミノ酸を含むポリペプチドの関連のある活性を著しく変更しない。文脈から明らかであるように、一部の実施態様では、用語「アミノ酸」は、フリーのアミノ酸を指すために用いられ；一部の実施態様では、それは、ポリペプチドのアミノ酸残基を指すために用いられる。
【００２９】
本明細書において用いられる用語「およそ」または「約」は、１つまたは複数の目的の値に適用されて、記載された参照値と似た値を指す。特定の実施態様では、用語「およそ」または「約」は、別段の記載がされ、または文脈からそれ以外が明らかでない限り、記載された参照値の、いずれかの方向に（よりも大きい、または、よりも小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲内に入る値の範囲を指す（そのような数字が、あり得る値の１００％を超える場合を除く）。
【００３０】
２つの事象または物質は、その用語が本明細書において用いられる場合、一方の存在、レベルおよび／または形態が、他方のものと相関する場合に、互いに「関係がある」。例えば、特定物質（例えば、ポリペプチド、遺伝子シグネチャ、代謝物など）は、その存在、レベルおよび／または形態が、（例えば、関連のある集団にわたって）疾患、障害、または状態の発生率および／または感受性と相関する場合に、特定の疾患、障害、または状態と関係があると考えられる。一部の実施態様では、２以上の物質は、それらが、互いに物理的に近接して存在および／または留まるように、直接的または間接的に相互作用する場合に、互いに物理的に「関係がある」。一部の実施態様では、互いに物理的に関係がある２以上の物質は、互いに共有結合していて；一部の実施態様では、互いに物理的に関係がある２以上の物質は、互いに共有結合していないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気作用、およびそれらの組み合わせにより、非共有的に関係がある。
【００３１】
用語「同等」は、本明細書において、得られた結果または観察された現象の比較を可能にするのに十分に互いに似た２つの（またはそれよりも多い）セットの状態、状況、個体または集団を記載するために用いられる。一部の実施態様では、同等のセットの状態、状況、個体、または集団は、複数の実質的に同一の特性および１または少数の異なる特性により、特徴付けられる。当業者は、状況、個体、または集団のセットは、十分な数およびタイプの実質的に同一の特性により特徴付けられる場合に、互いに同等であると理解し、異なるセットの状況、個体、または集団の下またはそこで得られた結果または観察された現象の違いは、異なるこれらの特性における多様性に起因し、または兆候であるという合理的な結論を正当化する。当業者は、本明細書で用いられる相対的な言語（例えば、増強した、活性化された、低下した、阻害された、など）は、典型的に、同等の条件下で行なわれた比較を指すことを理解するであろう。）
【００３２】
本明細書に記載の特定の方法論は、「決定」するステップを含む。本明細書を読んだ当業者は、そのような「決定」するステップは、本明細書において明示的に言及される特定の技術などを含む、当業者に利用可能な任意の様々な技術の使用を介して利用または達成することができることを理解するであろう。一部の実施態様では、決定するステップは、物理的サンプルの操作を含む。一部の実施態様では、決定するステップは、例えば、関連のある分析を行なうために適用されるコンピューターまたは他の処理装置を利用する、データまたは情報の考察および／または操作を含む。一部の実施態様では、決定するステップは、関連のある情報および／または物質をソースから受け取るステップを含む。一部の実施態様では、決定するステップは、サンプルまたは物質の１つまたは複数の特性を、同等の参照と比較するステップを含む。
【００３３】
本明細書において用いられる用語「ゲル」は、レオロジー特性が、溶液、固体などから区別される粘弾性物質を指す。一部の実施態様では、組成物は、その貯蔵弾性率（Ｇ’）がその弾性率（Ｇ’’）よりも大きい場合に、ゲルであると考えられる。一部の実施態様では、組成物は、溶液中に化学的または物理的な架橋ネットワーク（粘性溶液中の絡まった分子から区別される）が存在する場合に、ゲルであると考えられる。
【００３４】
本明細書において用いられる用語「インビトロ」は、多細胞生物内ではなく、例えば、試験チューブまたは反応槽中、細胞培養中などの人工的環境中で生じる事象を指す。
【００３５】
本明細書において用いられる用語「インビボ」は、ヒトおよび非ヒト動物のような多細胞生物内で生じる事象を指す。細胞に基づく系の文脈において、その用語は、（例えば、インビトロ系とは逆に）生細胞内で生じる事象を指すために用いられ得る。
【００３６】
本明細書において用いられる用語「ペプチド」は、典型的に相対的に短い、例えば、約１００個未満のアミノ酸、約５０個未満のアミノ酸、２０個未満のアミノ酸、または１０個未満のアミノ酸の長さを有するポリペプチドを指す。
【００３７】
本明細書において用いられる用語「ポリペプチド」は、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。一部の実施態様では、ポリペプチドは、天然に生じるアミノ酸配列を有する。一部の実施態様では、ポリペプチドは、天然に生じないアミノ酸配列を有する。一部の実施態様では、ポリペプチドは、人の手の動作を通じて設計および／または生産されたという点で改変されたアミノ酸配列を有する。一部の実施態様では、ポリペプチドは、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、または両方を含んでよく、またはからなってよい。一部の実施態様では、ポリペプチドは、天然のアミノ酸のみ、または非天然のアミノ酸のみを含んでよく、またはからなってよい。一部の実施態様では、ポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、または両方を含んでよい。一部の実施態様では、ポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸のみを含んでよい。一部の実施態様では、ポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸のみを含んでよい。一部の実施態様では、ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドのＮ−末端、ポリペプチドのＣ−末端、またはそれらの任意の組み合わせにおいて、１つまたは複数のアミノ酸側鎖に修飾または付加された、１つまたは複数のペンダント基または他の修飾を含んでよい。一部の実施態様では、そのようなペンダント基または修飾は、アセチル化、アミド化、脂質化、メチル化、ペグ化などからなる群より選択されてよく、それらの組み合わせを含む。一部の実施態様では、ポリペプチドは環状であってよく、および／または、環状部分を含んでよい。一部の実施態様では、ポリペプチドは環状ではなく、および／または、いかなる環状部分も含まない。一部の実施態様では、ポリペプチドは直鎖である。一部の実施態様では、ポリペプチドは、ステープルポリペプチドであってよく、または含んでよい。一部の実施態様では、用語「ポリペプチド」は、参照ポリペプチドの名称、活性、または構造に付け加えられ得て；そのような場合は、関連のある活性または構造を共有するポリペプチドを指すために本明細書において用いられ、したがって、ポリペプチドの同一のクラスまたはファミリーのメンバーであると考えることができる。そのようなクラスそれぞれに関して、本明細書は、アミノ酸配列および／または機能が公知であるクラス内の例示的なポリペプチドを提供し、および／または、当業者は知っていて；一部の実施態様では、そのような例示的なポリペプチドは、ポリペプチドクラスまたはファミリーに関する参照ポリペプチドである。一部の実施態様では、ポリペプチドクラスまたはファミリーのメンバーは、クラスの参照ポリペプチドと；一部の実施態様では、クラス内の全てのポリペプチドと）、有意な配列相同性または同一性を示し、共通の配列モチーフ（例えば、特徴的な配列因子）を共有し、および／または、（一部の実施態様では同等のレベル、または所定の範囲内で）共通の活性を共有する。例えば、一部の実施態様では、メンバーポリペプチドは、少なくとも約３０〜４０％、および、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上よりも高いことが多い、参照ポリペプチドとの配列相同性または同一性の全体的な度合を示し、および／または、９０％または実に９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％よりも高いことが多い、非常に高い配列同一性を示す少なくとも１つの領域（例えば、一部の実施態様では、特徴的な配列因子であり得る、または含み得る、保存領域）を含む。そのような保存領域は、通常、少なくとも３〜４個、２０個までであることが多い、またはそれよりも多い、アミノ酸を含み；一部の実施態様では、保存領域は、少なくとも１つの一続きの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれよりも多い連続アミノ酸を含む。一部の実施態様では、有用なポリペプチドは、親ポリペプチドのフラグメントを含んでよく、またはからなってよい。一部の実施態様では、有用なポリペプチドは、複数のフラグメントを含んでよく、またはからなってよく、そのそれぞれは、目的のポリペプチドがその親ポリペプチドの誘導体であるように、目的のポリペプチド内に見られるのとは互いに対して異なる空間的配置で同一の親ポリペプチド内に見られる（例えば、親内で直接結合しているフラグメントは、目的のポリペプチド内で空間的に離れていてよく、または逆も同様であり、および／または、フラグメントは、親内とは異なる順番で目的のポリペプチド内に存在してよい）。
【００３８】
本明細書において用いられる用語「参照」は、それに対して比較が行われる標準またはコントロールを記載する。例えば、一部の実施態様では、目的の薬剤、動物、個体、集団、サンプル、配列または値は、参照またはコントロールの薬剤、動物、個体、集団、サンプル、配列または値と比較される。一部の実施態様では、参照またはコントロールは、目的の試験または決定と実質的に同時に、試験および／または決定される。一部の実施態様では、参照またはコントロールは、歴史的な参照またはコントロールであり、場合により、有形的表現媒体で具体化される。典型的に、当業者により理解されるように、参照またはコントロールは、評価中のものと同等の条件または状況下で決定され、または特徴付けられる。当業者は、十分な類似性が存在する場合に、特定のあり得る参照またはコントロールへの依存および／または比較を正当化することを理解するであろう。
【００３９】
用語「自己組織化」は、本明細書において、例えば、それらを含む溶液（例えば、水溶液）が、ゲル特性を発達させるように、適切な条件下で構造に自然に自己会合することができる特定のポリペプチドに関して用いられる。一部の実施態様では、組成物内の個々の自己組織化ポリペプチドの間および中の相互作用は、組成物がゲル状態と溶液状態の間を可逆的に移行し得るように、可逆的である。一部の実施態様では、自己組織化（および／または逆組織化）は、１つまたは複数の環境的トリガー（例えば、ｐＨ、温度、イオン強度、モル浸透圧濃度、浸透圧、適用される圧力、適用される剪断応力などの１つまたは複数の変化）に応答性である。一部の実施態様では、自己組織化ポリペプチドの組成物は、ポリペプチドが組織化した状態である場合の、検出可能なβシート構造により特徴付けられる。
【００４０】
［特定の実施態様の詳細な説明］
１つまたは複数の実施態様によれば、本発明は、同一のペプチドの他の製剤と比較して、高められた有用性および改善された性能を与え得る、特定のペプチドの製剤を提供する。一部の実施態様では、開示される製剤は、例えば、様々な研究および／または臨床適用と関連する、これまでに満たされなかった要求を対処し得る、異なるまたは独特の特性を提供し得る。一部の実施態様では、提供されるペプチド製剤の特定の望ましい特性は、ペプチドの標準または参照の製剤と比較して製剤のｐＨレベルを上昇させることにより、および／または、標準または参照の製剤中の塩のタイプおよび／または量と比較して１つまたは複数の塩類を製剤に添加することによって、提供される。一部の実施態様では、提供される製剤は、本明細書に記載の標準または参照の製剤と比較した、より安定なヒドロゲル形成、および／または他の属性により特徴付けられる。
【００４１】
ペプチド
１つまたは複数の実施態様によれば、ペプチド組成物は、約６〜約２００個のアミノ酸残基を有する両親媒性ポリペプチドを含み得る。特定の実施態様では、少なくとも約７個のアミノ酸の長さを有し得る。特定の実施態様では、ポリペプチドは、約７〜約１７個のアミノ酸の長さを有し得る。特定の実施態様では、ポリペプチドは、少なくとも８個のアミノ酸、少なくとも約１２個のアミノ酸、または少なくとも約１６個のアミノ酸の長さを有し得る。
【００４２】
一部の実施態様では、当分野で理解されるように、両親媒性ポリペプチドは、その配列が、親水性アミノ酸および疎水性アミノ酸の両方を含むものである。一部の実施態様では、そのような親水性アミノ酸および疎水性アミノ酸は、ペプチドが、交互の親水性および疎水性アミノ酸のアミノ酸配列を有するように、交互に結合し得る。一部の実施態様では、本開示による使用のためのポリペプチドは、配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ（ＲＡＤＡ）の繰り返し単位を含む、またはからなる、アミノ酸配列を有する。一部の実施態様では、本開示による使用のためのポリペプチドは、配列Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ（ＫＬＤＬ）の繰り返し単位を含む、またはからなる、アミノ酸配列を有する。一部の実施態様では、本開示による使用のためのポリペプチドは、配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ（ＩＥＩＫ）の繰り返し単位を含む、またはからなる、アミノ酸配列を有する。
【００４３】
一部の実施態様では、本開示による使用のためのペプチドは、特定の条件下の水溶液中で、一般に自己組織化であり得て、および／または、βシート構造を示し得る。
【００４４】
一部の実施態様では、本開示による使用のためのペプチドは、アミノ酸配列：Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ（すなわち、ＲＡＤＡ１６、ａｋａ［ＲＡＤＡ］４；配列番号１）を有する。一部の実施態様では、本開示による使用のためのペプチドは、アミノ酸配列：Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ（すなわち、ＫＬＤＬ１２、ａｋａ［ＫＬＤＬ］）３  ａｋａ  ＫＬＤ１２；配列番号２）を有する。本開示による使用のためのペプチドは、アミノ酸配列：Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ（すなわち、ＩＥＩＫ１３、ａｋａ（ＩＥＩＫ）３Ｉ；配列番号３）を有する。
【００４５】
本明細書を読む当業者は、任意の様々な他のペプチドが、本発明の実施において代わりに用いられ得ることを理解するであろう。一部の実施態様では、例えば、公開された米国特許出願ＵＳ２００９／０１１１７３４  Ａ１、公開された米国特許出願ＵＳ２００８／００３２９３４  Ａ１、公開された米国特許出願ＵＳ２０１４／００３８９０９  Ａ１、発行された米国特許ＵＳ７，８４６８９１  Ｂ２、発行された米国特許ＵＳ７，７１３９２３  Ｂ２、発行された米国特許ＵＳ５６７０４８３  Ｂ２に記載の１つまたは複数のペプチド、その関連のある内容は、参照により本明細書中に援用される。
【００４６】
一部の実施態様では、本発明による使用のためのペプチドは、以下の式の１つにより表される配列を含む、またはからなる、アミノ酸配列を有する：
（（ＸＹ）ｌ−（ＺＹ）ｍ）ｎ・・・式（ａ）
（（ＹＸ）ｌ−（ＹＺ）ｍ）ｎ・・・式（ｂ）
（（ＺＹ）ｌ−（ＸＹ）ｍ）ｎ・・・式（ｃ）
（（ＹＺ）ｌ−（ＹＸ）ｍ）ｎ・・・式（ｄ）
ここで、Ｘは酸性アミノ酸を表わし、Ｙは疎水性アミノ酸を表わし、および、Ｚは塩基性アミノ酸を表わし、ｌ、ｍおよびｎは、全て整数である（ｎ（ｌ＋ｍ）＜２００）（１≦ｎ≦１００））。
【００４７】
組成物
一部の実施態様では、本開示によるペプチド組成物は、特定のレオロジーおよび／または光学的特性により特徴付けられ得る。一部の実施態様では、そのようなレオロジー特性は、ゲル化カイネティクス、可逆的な組織化特性、貯蔵弾性率、粘度などの１つまたは複数を含み得る。一部の実施態様では、１つまたは複数のレオロジー特性は、試験および／または決定（例えば、測定）され得て；一部の実施態様では、１つまたは複数のレオロジー特性は、目視観察により評価され得る。
【００４８】
一部の実施態様では、関連のある光学的特性は、透明性の度合い、光学的透明度などの１つまたは複数を含み得る。一部の実施態様では、１つまたは複数の光学的特性は、試験および／または決定（例えば、測定）され得て；一部の実施態様では、１つまたは複数の光学的特性は、目視観察により評価され得る。一部の実施態様では、特定の組成物の光学的透明度は、透明、わずかに混濁、または混濁として記載され得る。一部の実施態様では、提供される組成物は、透明である。
【００４９】
一部の実施態様では、提供される組成物は、特定のレベルの剛性により特徴付けられる。一部の実施態様では、剛性は、貯蔵弾性率の決定により評価される。当業者に理解されるように、一般に、貯蔵弾性率および剛性は正の相関を有し；すなわち、より高い貯蔵弾性率は、より高い剛性と相関する。
【００５０】
一部の実施態様では、提供される組成物は、特定のゲル化特性（例えば、特定の期間内のゲル化の特定の度合い）により特徴付けられる。一部の実施態様では、提供される組成物は、約１０秒〜約４８時間の範囲の期間内の実質的に完全なゲル化により特徴付けられる。
【００５１】
一部の実施態様では、提供される組成物は、ゲル化および／または他の物質の復元の特定の度合いおよび／またはレオロジー特性により特徴付けられる。例えば、一部の実施態様では、ゲル化されている提供される組成物を崩壊に供した場合に、それらは、特定の期間内（例えば、約１０秒〜約４８時間の範囲内）に、機械的および／またはレオロジー特性が元のゲルのものと合理的に同等であるゲルに再ゲル化する能力を示す。
【００５２】
一部の実施態様では、提供される組成物は、細胞増殖および／または生存率をサポートする能力により特徴付けられる。
【００５３】
一部の実施態様では、本明細書において記載および／または使用されるペプチド組成物の１つまたは複数の物質（例えば、レオロジー）特性は、例えば、ペプチド同一性（例えば、アミノ酸配列、疎水性の度合いなど）、ペプチド濃度、ｐＨ、イオン強度（例えば、塩濃度）、イオン同一性など、およびそれらの組み合わせにより、決定され得る。
【００５４】
ペプチド濃度
１つまたは複数の実施態様によれば、本明細書に記載のペプチド組成物のレオロジー特性は、ペプチド濃度の選択により調整され得る。本開示は、ペプチド濃度の選択および／または調節を通して、例えば、組成物の特定の適用または使用に特に好ましくあり得る、特定の所望の特性を有するペプチド組成物の選択および／または生産を可能にするパラメーターを定義する。
【００５５】
例えば、本開示は、とりわけ、多くのペプチド、組成物に関して、剛性は、ペプチド濃度に伴って実質的に直線的に増大することを示す。さらに、本明細書に記載のように、特定のペプチド組成物は、臨界応力レベルを超える剪断減粘性特性を示した。さらに、本開示は、特定のペプチド濃度において達成されるレオロジー特性が、ペプチドの同一性に依存して変化し得ることを示す。例えば、１．５％  ＫＬＤ１２の貯蔵弾性率は、２．５％  ＲＡＤＡ１６のものと同様であることが見いだされた。１％  ＩＥＩＫ１３の貯蔵弾性率は、２．５％  ＫＬＤ１２のものと同様であり、２．５％  ＲＡＤＡ１６のものよりも高いことが見いだされた。概して、本実施例で試験された組成物の中でのレオロジー強度の順番は、ＩＥＩＫ１３＞ＫＬＤ１２＞ＲＡＤＡ１６であり、ＩＥＩＫ１３の組成物は、ＫＬＤ１２の組成物よりも大きなレオロジー強度を示し、同様に、ＲＡＤＡ１６の組成物よりも大きなレオロジー強度を示した（各場合において、ペプチド濃度が同一である場合）。
【００５６】
一部の実施態様では、本発明による使用のためのペプチド組成物中のペプチド濃度は、少なくとも０．０５％、少なくとも０．２５％、少なくとも０．５％、少なくとも０．７５％、少なくとも１．０％またはそれよりも多い。一部の実施態様では、本発明により使用のためのペプチド組成物中のペプチド濃度は、５％未満、４．５％未満、４％未満、３．５％未満、３％未満、またはそれよりも少ない。一部の実施態様では、本発明による使用のためのペプチド組成物中のペプチド濃度は、約０．５％と約３％との間の範囲内である。一部の実施態様では、本発明による使用のためのペプチド組成物中のペプチド濃度は、約０．５％と約２．５％との間の範囲内である。一部の実施態様では、本発明による使用のためのペプチド組成物中のペプチド濃度は、約１％と約３％との間の範囲内である。一部の実施態様では、本発明による使用のためのペプチド組成物中のペプチド濃度は、約１％と約２．５％との間の範囲内である。一部の実施態様では、本発明による使用のためのペプチド組成物中のペプチド濃度は、約０．５％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、またはそれよりも高い。ペプチドがＲＡＤＡ１６である場合の一部の特定の実施態様では、本発明のペプチド組成物中のペプチド濃度は、約０．０５％〜約１０％の範囲内である。
【００５７】
ペプチドがＫＬＤ１２である場合の一部の特定の実施態様では、本発明のペプチド組成物中のペプチド濃度は、約０．０５％〜約１０％の範囲内である。
【００５８】
ペプチドがＩＥＩＫ１３である場合の一部の特定の実施態様では、本発明のペプチド組成物中のペプチド濃度は、約０．０５％〜約１０％の範囲内である。
【００５９】
ｐＨ
本開示は、とりわけ、ｐＨがペプチド組成物の特性に影響を与え得ることを示す。本明細書に記載のように、ペプチド組成物のｐＨの最適化は、ペプチド組成物を様々な臨床適用に用いることができるように、機械的強度を改善し得る。本開示における実施例３は、特定の具体的な実施態様の詳細を示す。
【００６０】
１つまたは複数の実施態様によれば、提供されるペプチド組成物は、関連のあるペプチドのｐＩおよび／またはペプチドが水に可溶化される場合に得られるもののｐＩよりも高い（例えば、有意に高い）ｐＨを有し得る。一部の実施態様では、ペプチド組成物の特性は、ｐＨにより調整され得る。例えば、一部の実施態様では、約２．５〜約４．０の範囲内のｐＨでは、ペプチド組成物の剛性および／または粘度は、適切な参照組成物（例えば、水中同一濃度における同一ペプチド）のものと比較して増大し得る。
【００６１】
一部の実施態様では、ペプチド組成物は、ペプチドおよび溶媒、典型的には水性溶媒を含み得て、ｐＨは、塩基または酸などのｐＨ調節剤を介して調節され得る。一部の実施態様では、ペプチド組成物は、ペプチドおよびバッファーを含む。
【００６２】
一部の実施態様では、ｐＨが調節されたペプチド組成物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫化ナトリウム、ＤＭＥＭおよび／またはＰＢＳの１つまたは複数を含み得る。
【００６３】
一部の実施態様では、自動滴定デバイスをｐＨ調節のために実行し得る。
【００６４】
一部の実施態様では、提供される組成物は、関連のあるペプチドのｐＩよりも高い（例えば、実質的に高い）ｐＨを有し、および／または維持される。一部の実施態様では、提供される組成物は、同一濃度での同一ペプチドの水溶液のものよりも高い（例えば、実質的に高い）ｐＨを有する、および／または維持する。一部の実施態様では、提供される組成物は、組成物が混濁している、または混濁するｐＨよりも低いｐＨを有し、および／または維持される。
【００６５】
一部の実施態様では、提供される組成物は、約２．５〜４．０のｐＨまたはそれよりも高いｐＨにより特徴付けられ；一部の実施態様では、提供される組成物は、生理学的ｐＨにより近いｐＨにより特徴付けられる。一部の実施態様では、提供される組成物は、約３．０〜４．０の範囲内のｐＨを有する。一部の実施態様では、提供される組成物は、約２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５の、またはそれより上の、またはそれよりも高いｐＨを有する。一部の実施態様では、提供される組成物は、約４．３、約４．２、約４．１、約４．０、約３９．、約３．７、約３．６、約３．５、約３．４の、またはそれより下の、またはそれよりも低いｐＨを有する。
【００６６】
一部の実施態様では、本明細書に記載の上昇したｐＨの組成物（すなわち、約２．５またはそれより上のｐＨを有する組成物）は、適切な参照組成物（例えば、同一濃度で、場合により同一の塩類を有するがｐＨが異なる、同一ペプチドの同等の組成物）と比較して、より大きなレオロジー剛性および／または改善したゲル化特性により特徴付けられる。一部の実施態様では、上昇したｐＨの組成物は、より低いｐＨの対応する参照組成物よりも幅広い範囲の適用において有用である。
【００６７】
本開示は特に、一部の実施態様において、上昇したｐＨ３．５またはそれ未満において、ＩＥＩＫ１３組成物の剛性は有意に増大し得て、一方で、ＲＡＤＡ１６およびＫＬＤ１２組成物の剛性は増大し得ないことを示す。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まずに、本開示は、ｐＨ３．５またはそれ未満でのペプチド組成物の異なる挙動が、ＲＡＤＡ１６およびＫＬＤ１２のアスパラギン酸（Ｄ）のｐＫａ（ｐＫａ＝３．７１）、および、ＩＥＩＫ１３のグルタミン酸（Ｅ）（ｐＫａ＝４．１５）に関連する可能性があることを提案する。
【００６８】
ｐＨがアスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）のｐＫａよりも高い場合、ペプチド鎖中の酸性基は、ほとんど負に帯電している。負帯電基は、ペプチド鎖内の正帯電基（すなわち、ＲＡＤＡ１６のアルギニン（Ｒ）、および、ＩＥＩＫ１３およびＫＬＤ１２のリジン（Ｋ））との、分子内または分子間の、引き合う電荷間相互作用を誘導し、ナノファイバー（すなわち透明の粘性組成物）を形成するよりむしろ、半透明または不透明のより大きな凝集体を形成し（すなわち、その曇り点よりも上）、相分離の可能性を与える。
【００６９】
ｐＨが、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）のｐＫａよりも低いがそのｐＫａに近い場合、より集合した負帯電基は、正の基との、より強い引き合う電荷間相互作用を誘導し得る。組成物は、剛性が増大するように、ナノファイバーの形状を維持し得る。
【００７０】
約３．５のｐＨを有する、ある特定の例示的なペプチド組成物を表２に示す。本明細書において「上昇したｐＨの組成物」と考えられるそのような組成物は、様々な適用において、改善された性能（例えば、実施例を含む本明細書に記載の、関連のある参照組成物のような、それ以外は同等の、より低いｐＨの組成物との比較）を提供し得る。ペプチド組成物の機械的強度および多能性は、上昇したｐＨにより増強され得る。
【００７１】
【表１】
2020055836.tif 000002
【００７２】
１つまたは複数の実施態様によれば、ｐＨは、ゲル化カイネティクス（例えば、ゲル化を開始する応答時間）に影響を与え得る。ゲル化カイネティクスに対するｐＨの効果を評価して、本明細書に記載のペプチド組成物に関する最適ｐＨを特定し得る。
【００７３】
一部の実施態様では、ペプチド組成物は、より高いｐＨにおいて、より速くゲル化し得る。例えば、本明細書に記載のように、ｐＨ調節をしないＩＥＩＫ１３組成物は、即時の貯蔵弾性率の増大を示し、一方で、ｐＨ調節をしない（ｐＨ２．２）ＲＡＤＡ１６組成物は、最初の１３秒間、貯蔵弾性率の増大を示さない。ｐＨ調節をすると、ＩＥＩＫ１３およびＲＡＤＡ１６は両方とも、図２４および図２５に示すように、迅速なゲル化に起因して即時の貯蔵弾性率の増大を示す。
【００７４】
イオン強度
本開示は、イオン強度が、ペプチド組成物のレオロジー特性を変化させ得ることを示す。ペプチド組成物のイオン強度の増大は、一般に、様々な臨床適用に関する機械的特性を改善し得る。例えば、本明細書に記載のように、ペプチド組成物の特性に対するイオン強度の効果を評価して、本明細書に記載のペプチド組成物に関する最適イオン強度を特定し得る。
【００７５】
一部の実施態様では、約０．０００１Ｍ〜約１．５Ｍの範囲内のイオン強度において、ペプチド組成物の剛性、粘度、および／またはゲル化カイネティクスは、増大し得る。一部の実施態様では、ペプチド組成物は、イオン強度により調整され得る。
【００７６】
１つまたは複数の実施態様によれば、ペプチド組成物のイオン強度は、制限されないがＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２およびＣａＳＯ４を含む、一般的な塩類の１つまたは複数により調節され得る。一般的な塩類は、カチオンおよびアニオンからなる。一部の実施態様では、カチオンは、アンモニウム、カルシウム、鉄、マグネシウム、カリウム、ピリジニウム、第４級アンモニウム、およびナトリウムを含む群より選択され得る。一部の実施態様では、アニオンは、アセテート、カーボネート、クロライド、シトレート、シアニド、フロリド、ニトレート、およびホスフェートを含む群より選択され得る。
【００７７】
１つまたは複数の実施態様によれば、イオン強度が最適レベル（例えば、最高剛性）に近づいたときに、１または複数の塩または塩溶液の添加を注意深く制御し得る。一部の実施態様では、イオン強度が所望よりも高い場合、純水を添加し得る。１または複数の塩または塩溶液の添加を制御して、その浸透圧を、その適用に応じて低張、等張または高張に調節し得る。
【００７８】
一部の実施態様では、例として、特定のペプチド組成物のイオン強度を調節するために、特定の塩緩衝液、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２およびＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、１０×）を添加し得る。
【００７９】
一部の実施態様では、提供される組成物は、１または複数の塩類を含み、その同一性および／または濃度は、臨界イオン強度（それより下ではペプチドの物質沈殿が見られる）に組成物を維持する。一部の実施態様では、物質沈殿は、液体組成物が混濁している（例えば、目視検査により評価される）場合に生じていると考えられる。したがって、一部の実施態様では、提供される組成物は混濁しておらず、および、混濁していてそれ以外は同等（例えば、同一濃度の同一ペプチド）の組成物よりも低いイオン強度を有する。
【００８０】
一部の実施態様では、提供される組成物は、適切な参照組成物（例えば、同一の濃度およびｐＨの同一ペプチドの組成物だが、異なる塩または異なる濃度の同一塩を有する）のものと比較して、上昇したイオン強度により特徴付けられる。一部の実施態様では、提供される組成物は、生理学的強度に近い、または生理学的強度でのイオン強度により特徴付けられる。一部の実施態様では、本明細書に記載の組成物は、異なるイオン強度の適切な参照組成物と比較して、より大きなレオロジー剛性および／または改善されたゲル化特性により特徴付けられる。一部の実施態様では、提供される組成物は、異なる（例えば、より低い）イオン強度の対応する参照組成物よりも幅広い範囲の適用での使用に適切である。
【００８１】
ある特定の実施態様によれば、塩溶液中にＩＥＩＫ１３、ＫＬＤ１２、またはＲＡＤＡ１６を含むペプチド組成物が提供され、その組成物は、水中に溶解された関連のあるペプチドの参照組成物とは異なるイオン強度を有し、その参照組成物と比較して１つまたは複数の改善された物質（例えば、レオロジー）特性を示す。一部の実施態様では、提供される組成物は、関連のある参照組成物よりも剛性である。一部の実施態様では、提供される組成物は、参照組成物と比較して上昇したイオン強度を有するが、なお、それらの塩臨界点よりも低いイオン強度を有する。
【００８２】
【表２】
2020055836.tif 000003
【００８３】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望まずに、本開示は、増大したイオン強度を有するペプチド組成物の特性が、ペプチドの溶解度に関連し得ることを提案する。ｐＨレベル約２〜４における自己組織化ペプチドの溶解度は、透明で均質のペプチド組成物を作るのに十分ほぼ高い。ペプチド鎖の周りのイオン強度の増大は、ペプチドの溶解度を低下させる。組成物が混濁するようにペプチドの溶解度が低い場合、この状態は臨界点と呼ばれ得る。増大したイオン強度がその臨界点よりも低いがそれに近い場合、ペプチドは、より強い疎水性の相互作用を誘導し得て、剛性が増大する。ペプチド溶解度がその臨界点よりも下に低下した場合は（すなわち高イオン強度）、ペプチド組成物は半透明または不透明であり得て（すなわち、その曇り点よりも上）、沈殿し得る（すなわち相分離）。ペプチドは、透明で粘性の溶液を生成するナノファイバーを形成し得ない。ランダムの疎水性の相互作用は、塩析効果に起因する高イオン強度において自己組織化ナノファイバーを生成する疎水性相互作用よりも優勢であり得る。ランダムの分子内および／または分子間の凝集体は、相分離を引き起こし得る。
【００８４】
１つまたは複数の実施態様によれば、臨界イオン強度は、塩およびペプチド同一性に応じて変化し得る。溶解度と塩濃度との間の関係は、以下のコーエンの等式により表わすことができる：
ｌｏｇ  Ｓ＝Ｂ−ＫＩ
Ｓがペプチドの溶解度である場合、Ｂはペプチドに特異的な定数であり、Ｋは塩に特異的な定数であり、Ｉは塩のイオン強度である。Ｂは、ｐＨ、および温度と相関する。ＫはｐＨと相関する。
【００８５】
一部の実施態様では、ペプチドの溶解度は、温度およびｐＨが定数（すなわちＢが定数）の場合、塩析定数Ｋおよびイオン強度Ｉにより左右され得る。より高いＫおよびＩは、より低いペプチド溶解度をもたらす。一定のｐＨおよび温度では、Ｋは、塩類中のイオン同一性により決定される。概して、４つの塩類の中の定数Ｋの順番は、ＮａＣｌ＞ＫＣｌ＞ＭｇＣｌ２＝ＣａＣｌ２である。
【００８６】
１つまたは複数の実施態様によれば、ペプチドの溶解度は、アミノ酸配列（例えば、ペプチド中の親水性および疎水性アミノ酸残基の組成）により決定され得る。相対的に高い疎水性アミノ酸含有量を有するペプチド（例えばＩＥＩＫ１３）は、典型的に、水性溶媒中に難溶解性である。そのようなペプチドは、自己組織化ペプチド鎖の間の強い疎水性相互作用により特徴付けられることが多く、高い剛性をもたらす。本明細書に示されるように、そのようなペプチドの組成物は、少量の塩の添加により、劇的な剛性の増大を示し得る。対照的に、相対的に低い疎水性アミノ酸含有量を有するペプチド（例えばＲＡＤＡ１６）は、水性溶媒への溶解度が高い。これらのペプチドは、典型的に、自己組織化ペプチド間の疎水性相互作用が弱く、低い剛性をもたらす。そのようなペプチドの組成物の剛性は、大量の塩を添加してさえ、それほど増大しない。このモデルと一致して、本開示は、相対的な疎水性と並行する３つの特定の例示されたペプチドの中の臨界イオン強度（例えば組成物が混濁するとき）の順番を示す：ＲＡＤＡ１６（０．９〜１．２Ｍ）＞ＫＬＤ１２（０．３〜０．４Ｍ）＞ＩＥＩＫ１３（０．０３〜０．０４Ｍ）。
【００８７】
１つまたは複数の実施態様によれば、ペプチド組成物のイオン強度は、そのゲル化カイネティクスに影響を与え得る。一部の実施態様では、上昇したイオン強度は、ペプチド組成物のゲル化を促進し得る。ゲル化に必要なイオン強度は、塩および／またはペプチド同一性に依存し得る。例えば、ＲＡＤＡ１６、ＫＬＤ１２、およびＩＥＩＫ１３ペプチドが生理食塩水バッファー（すなわち０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、等張体液と同等）に曝された場合、ＩＥＩＫ１３のゲル化のみ開始した。ＲＡＤＡ１６およびＫＬＤ１２は、ゲル化を示さず、または無視できるほどであった。これらの知見は、上昇したイオン強度に伴うペプチドの溶解度の低下を反映し得る。ＩＥＩＫ１３は、上述のＲＡＤＡ１６およびＫＬＤ１２よりもイオン強度に感受性である。
【００８８】
一部の実施態様では、ペプチド組成物のイオン強度は、例えば、混合および／または撹拌処理が、（典型的に疎水性）ペプチド間相互作用に起因する最初に形成された集合体（例えばナノファイバー）を崩壊させた後の、その復元特性に影響を与え得る。
【００８９】
組み合わせたｐＨおよび塩の効果
本開示は、ｐＨおよびイオン強度の同時の調節（例えば、生理学的条件への曝露による）が、ペプチド組成物のレオロジー特性を変更することができることを示す。例えば、本明細書に記載のように、提供されるペプチド組成物において細胞培養培地を含むことに起因する増大したｐＨレベルおよびイオン強度は、そのような組成物の様々な特性（例えば、レオロジー特性）に影響を与えることができる。
【００９０】
一部の実施態様では、ペプチド組成物の剛性、粘度および／またはゲル化カイネティクスは、生理学的条件下で増大し得る。一部の実施態様では、ペプチド組成物の特性は、ｐＨおよびイオン強度の組み合わせにより調整され得る。
【００９１】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望まずに、本開示は、ペプチド組成物の剛性：疎水性相互作用および電荷間相互作用に関連する２つ主な分子間相互作用が存在することを提案する。
【００９２】
第一に、疎水性相互作用および反発静電気相互作用は、低ｐＨでのβシートナノファイバーの形成を通して粘性溶液を形成するための主な駆動力である。これらの相互作用は、アスパラギン酸およびグルタミン酸のほとんどが負電荷なくプロトン化され、アルギニンおよびリジンのほとんどが正に帯電している場合に、低ｐＨにおいて重大であると予測される。ペプチド分子は自己組織化して、疎水性相互作用に起因してナノファイバーを形成し、一方でナノファイバーの表面は、ペプチド分子間の反発静電気相互作用に起因して水和される。
【００９３】
一部の実施態様では、約２〜約３のｐＨレベル周辺でのペプチド組成物の剛性は、それらの疎水性と主に相関するはずである。ＩＥＩＫ１３は、７個のイソロイシン基（強い疎水性基）を有し、ＫＬＤ１２は、６個のロイシン基（強い疎水性基）を有し、ＲＡＤＡ１６は、８個のアラニン基（弱い疎水性基）を有する。ＩＥＩＫ１３は、同一のｐＨおよび濃度において、ＫＬＤ１２およびＲＡＤＡ１６よりも高い貯蔵弾性率を有する。
【００９４】
図１７Ｂに示すように、水溶液中のＩＥＩＫ１３分子が模擬的体液（例えば、ＤＭＥＭ）で処理された場合、それらの繊維構造はより厚くなる。より厚い繊維構造は、隣接するナノファイバー間の生理学的ｐＨおよび浸透圧での増大した疎水性相互作用に起因して生じ得る。
【００９５】
疎水性相互作用は、水性環境においてナノファイバー形成を誘導し得て、粘性組成物を生成する。高剪断応力の適用後（すなわち粘度および剛性の低下）、ペプチドはナノファイバーを再形成してそれらの特性を復元することもできる。したがって、ペプチドは、ｐＨ２〜３においてチキソトロピック特性を示す。ペプチド組成物は、適用された剪断応力が取り除かれた時点で、それらの元の特性をゆっくり復元する。
【００９６】
第二に、引き合う電荷間相互作用は、生理学的条件において既存の疎水性相互作用と同時に生じ得る。ペプチド分子周辺のｐＨが酸性から中性に変化する場合、既存の疎水性相互作用は崩壊し得ない。負帯電基および正帯電基は、図７に示されるように、ペプチド組成物がより剛性であり得るように、さらなる引き合う電荷間の分子間相互作用を誘導する。
【００９７】
しかしながら、生理学的条件におけるペプチド集合体（ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）が高剪断応力に曝される場合、ペプチド集合体はペプチド凝集体に崩壊する。図７に示すように、これは不可逆のプロセスである。
【００９８】
例えば、０．５ｍＬのＤＭＥＭを、０．５ｍＬの２％  ＲＡＤＡ１６と数回ピペッティングにより混合した場合、ＲＡＤＡ１６は、透明で粘性のペプチド集合体を形成しなかった（すなわち混濁した粘性が低いエマルション）。混合物を２５００ｒｐｍで５分間遠心分離した場合、混濁したＲＡＤＡ１６の相分離が混合物から沈殿した。この場合、ペプチド集合体（すなわち、初め、疎水性相互作用を介して形成された）は、混合プロセス中、崩壊される可能性があった。引き合う電荷間相互作用が疎水性相互作用よりも優勢であった。それは、ランダムの分子内および分子間凝集体の形成を誘導する。相分離を図７に示す。
【００９９】
１つまたは複数の実施態様によれば、ＩＥＩＫ１３、ＫＬＤ１２、またはＲＡＤＡ１６は、塩バッファー（例えばＮａＣｌ）に溶解され得て、それらのｐＨは、アルカリ塩バッファー（例えばＮａＯＨ）により上昇され得る。それらの塩イオン強度は、それらの塩臨界点より下であり得る。それらのｐＨは約２．５〜約４．０であり得る。組成物は、同一濃度での同一ペプチドの適切な参照組成物と比較して、増大された剛性および粘度を有し得る。
【０１００】
一部の実施態様では、生理学的条件（例えば、上昇したｐＨおよび塩イオン強度）は、ペプチド組成物のゲル化を促進し得る。生理学的条件下でのＩＥＩＫ１３の促進されたゲル化は、２つの駆動力、すなわち増大されたｐＨおよびイオン強度と関連し得る。生理学的条件下でのＲＡＤＡ１６の促進されたゲル化は、ただ１つの駆動力、すなわち増大したｐＨを有し得る。一部の実施態様では、体液でのペプチド組成物の促進されたゲル化は、一般に、その機能および様々な臨床適用に対する応答時間を改善し得る。
【０１０１】
細胞適合性
１つまたは複数の実施態様によれば、提供されるペプチド組成物は、一般に、高い細胞生存率と関連する。
【０１０２】
一部の実施態様では、ＫＬＤ１２およびＩＥＩＫ１３は、ＲＡＤＡ１６と比較して同様またはより高い細胞生存率を有し得る。これらのペプチド組成物の中の全般的な細胞生存率の順番は、ＫＬＤ１２＞ＩＥＩＫ１３＞ＲＡＤＡ１６であった。一部の実施態様では、ペプチド組成物は、それらの濃度が約０．７５％またはそれ未満である場合、８０％よりも高い細胞生存率を有し得る。一部の実施態様では、ペプチド濃度が０．７５％よりも高い場合、細胞生存率は低減し得る。
【０１０３】
形状
［一部の実施態様では、本発明によるペプチド組成物は、乾燥粉末、溶液、ゲル（例えば、ヒドロゲル）、またはそれらの任意の組み合わせの形状である。
【０１０４】
一部の実施態様では、乾燥粉末組成物は、ペプチドを適切な量で含み、選択された容量の溶媒（例えば、水性溶媒、場合により１つまたは複数の塩類および／または１つまたは複数のｐＨ調節剤を含む）の添加の際に所望の濃度の溶液をもたらす。一部の実施態様では、乾燥粉末組成物は、適切なタイプおよび相対的量の塩およびペプチドを含み、選択された容量の溶媒（例えば、水性溶媒、場合により１つまたは複数のさらなる塩類および／または１つまたは複数のｐＨ調節剤を含む）の添加の際に、本明細書に記載の所望のペプチド濃度およびイオン強度の溶液をもたらす。一部の実施態様では、乾燥粉末組成物は、適切なタイプおよび相対的量のｐＨ調節剤およびペプチドを含み、選択された容量の溶媒（例えば、水性溶媒、場合により１つまたは複数の塩類および／または１つまたは複数のさらなるｐＨ調節剤を含む）の添加の際に、本明細書に記載の所望のペプチド濃度およびｐＨの溶液をもたらす。一部の実施態様では、乾燥粉末組成物は、適切なタイプおよび相対的量のｐＨ調節剤、塩、およびペプチドを含み、選択された容量の溶媒（例えば、水性溶媒、場合により１つまたは複数のさらなる塩類および／または１つまたは複数のさらなるｐＨ調節剤を含む）の添加の際に、本明細書に記載の所望のペプチド濃度、ｐＨ、および／またはイオン強度の溶液をもたらす。
【０１０５】
一部の実施態様では、提供される組成物は、容器（例えば、シリンジ、バイアル、ウェルなど）に収納される。一部の実施態様では、容器は、容量表示を含むという点で、目盛り付きの容器である。一部の実施態様では、容器は、カニューレまたはシリンジのような送達デバイスへの接続に適している。一部の実施態様では、容器は、シールを除去せずに流動可能な（例えば、液体）物質の添加および／または除去を可能にする様式（例えば、侵入可能なカバリング）で、密封されている。
【０１０６】
適用
一部の実施態様では、本開示は、特定の適用での使用のためのペプチド組成物を選択するためのシステムを提供する。ペプチド同一性、ペプチド濃度、ｐＨ、塩同一性および／または塩濃度の効果は、本明細書に記載のように、特性（したがって、特定の適用のための特定のペプチド組成物の有用性）に影響を与えることができる。
【０１０７】
２、３であるが例を提供すると、一般に、より高い剛性を有するペプチド組成物は、止血、組織プラグ、抗癒着、または特定の組織再生により特徴付けられる適用に、より適している。より迅速なゲル化時間を有するペプチド組成物は、特定の組織プラグの適用（例えば、約１分〜約１時間よりも少ないゲル化時間が典型的に必要または好ましい、止血、組織プラグ、抗癒着、または薬物輸送、血管プラグなど）に、特に適し得る。より迅速な復元時間を有するペプチド組成物は、止血、組織プラグ、または血管プラグに、特に適し得る。
【０１０８】
本明細書に示されるように、例えば、細胞足場、液体移動のバリア、止血剤、空隙充填剤として、およびそれよりも多くを含む、様々なインビボおよびインビトロのコンテキストにおいて、極めて有用である自己組織化ペプチド組成物が提供される。本明細書に記載の異なるそのような組成物は、異なるコンテキストにおいて、より有用であり得る。
【０１０９】
例えば、外科的処置中のペプチド組成物（例えば、止血剤として）の投与に関するコンテキストは、組成物が、外科的部位への投与に適切な期間、実質的に液体のままであり、その後、迅速にゲル化して、安定した、好ましくは透明で相対的に剛性のゲルを形成することを可能にする、ゲル化カイネティクスにより恩恵を受け得る（それにより外科的操作を容易に進めることができる）。
【０１１０】
具体例を提供すると、本明細書に記載のように、一部の実施態様では、ＩＥＩＫ１３組成物は、例えば特定の剛性および迅速なゲル化を必要とする、様々な生体医学的適用において、特に有用であり得る。本開示は、特定のＩＥＩＫ１３組成物が、高剪断応力の適用後の迅速な復元速度（例えば最も迅速な自己組織化）および／または相対的に高い剛性により特徴付けられることを示す。また、本開示は、特定のＩＥＩＫ１３組成物が、生理学的培地と接触した場合に、特に有用な（例えば、高い）剛性を示し得ることを示す。
【０１１１】
また、本開示は、例えば、高い最終的な剛性とともに簡単な注入が必要な場合に、特定のＫＬＤ１２組成物が特に有用であり得ることを示す。一部の実施態様では、ＫＬＤ１２の自己組織化ナノファイバーは、高剪断応力により逆組織化し得て、それからゆっくり元に組織化する。
【０１１２】
また、本開示は、特定のＫＬＤ１２組成物は、高い細胞生存率が必要である場合に特に有用であり得ることも示す。一部の実施態様では、ＫＬＤ１２の濃度が増大されて、特定の適用に必要な剛性を有し得る。
【実施例】
【０１１３】
実施例１：特定の参照ペプチド組成物の光学的透明度
本実施例は、示されたペプチドが水に溶解された、特定の参照ペプチド組成物の光学的透明度および相安定性（すなわち相分離の不存在）を示す。一部の実施態様では、提供されるペプチド組成物の光学的透明度（および／または相安定性）は、そのような参照組成物のものと比較して評価される。一部の実施態様では、特定の濃度での特定のペプチドの提供される組成物は、水に溶解された同一組成での同一ペプチドの参照組成物のものと少なくとも同じくらい良好の光学的透明度および／または相安定性を示す。
【０１１４】
表１に関して見ることができるように、様々なペプチド濃度にわたって光学的透明度（および相安定性も）を示す様々な参照ペプチド組成物を調製した。特に、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％またはそれよりも高い濃度のペプチド組成物は、透明な光学的特性および相分離の不存在を示した。
【０１１５】
【表３】
2020055836.tif 000004
【０１１６】
実施例２：濃度の関数としてのペプチド組成物のレオロジー特性
本実施例は、特定のペプチド組成物のレオロジー特性に対するペプチド濃度の効果を示す。一部の実施態様では、レオロジー特性は、ペプチド濃度との直線相関を有し得る。
【０１１７】
一部の実施態様では、特定の所望の剛性を有するペプチド組成物は、数学的モデル（すなわち、弾性率トレンドライン等式（ｍｏｄｕｌｕｓ  ｔｒｅｎｄ−ｌｉｎｅ  ｅｑｕａｔｉｏｎ））を用いて決定される特定のペプチド濃度を有するように製剤化され得る。ペプチド組成物の製剤化チャートは、例えば下記の表３Ａに示すように、脱イオン水におけるそれらの濃度を、それらの特有の貯蔵弾性率に対して関連付け得る。そのようなチャートから、当業者は、製剤化される組成物が所望の剛性を有するように特定のペプチドおよび適切なペプチド濃度を選択することによって、所望のレオロジー特性を有するペプチド組成物を製剤化し得る。
【０１１８】
例えば、本明細書に記載のように、一般に、ＲＡＤＡ１６、ＫＬＤ１２、またはＩＥＩＫ１３ペプチドを含むペプチド組成物のレオロジー強度の順番は、ＩＥＩＫ１３＞ＫＬＤ１２＞ＲＡＤＡ１６と示される。
【０１１９】
【表４】
2020055836.tif 000005
【０１２０】
本実施例は、４０ｍｍプレートを備えるレオメータ（ＡＲ５００，ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いた、選択された濃度での特定のペプチド組成物の様々なレオロジー特性の測定をさらに示す。ペプチド組成物（７００μＬ）をレオメータプレート上に置き、過剰な組成物をキムワイプで優しく取り除いた。３７℃での２分の緩和時間の後に測定を行なった。３００μｍの測定幾何学的ギャップで置かれたプレートを用いて、貯蔵弾性率、損失弾性率、および粘度（η’）を３７℃で測定し、応力スイープ試験を、０．１Ｐａ〜１０００Ｐａの振動応力、１０ｒａｄ／ｓの角振動数で行なった。
【０１２１】
結果をＲＡＤＡ１６、ＩＥＩＫ１３、およびＫＬＤ１２に関して図２〜図４に示す。図２〜図４に示すように、振動応力が約１０〜２００Ｐａ未満の場合、ペプチド組成物は、ほぼプラトーの弾性率を示した。それらは全て、特定の降状振動応力（ｙｉｅｌｄ  ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ  ｓｔｒｅｓｓ）において、劇的な弾性率の低下を有した。少なくとも、約１％〜約２．５％の試験された濃度範囲内では、ペプチド組成物は、濃度の増大に伴い貯蔵弾性率の直線増加を示した（直線トレンドラインのＲ２は、０．９７１〜０．９９２の間である）。特定のペプチド組成物は、臨界応力レベルを超える剪断減粘性特性を示した。
【０１２２】
本実施例において試験された、様々なペプチド組成物に関して決定されたレオロジー結果を、表３に示す。見ることができるように、１．５％  ＫＬＤ１２の貯蔵弾性率は、２．５％  ＲＡＤＡ１６のものと同様であることが分かった。１％  ＩＥＩＫ１３の貯蔵弾性率は、２．５％  ＫＬＤ１２のものと同様であり、２．５％  ＲＡＤＡ１６のものよりも高いことが分かった。概して、ここで試験された組成物の間のレオロジー強度の順番は、ＩＥＩＫ１３＞ＫＬＤ１２＞ＲＡＤＡ１６であった。
【０１２３】
【表５】
2020055836.tif 000006
【０１２４】
実施例３：ｐＨの関数としてのペプチド組成物のレオロジー特性
本実施例は、特定のペプチド組成物のレオロジー特性に対する、ｐＨの効果を示す。一部の実施態様では、ｐＨは、ペプチド組成物の剛性、粘度、および／または復元時間に影響を与えるコントロールパラメーターであり得る。
【０１２５】
以下の表２は、示されたペプチドが示された濃度において水に可溶化される、参照組成物に関して見られるｐＨ濃度を示す。
【０１２６】
【表６】
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【０１２７】
本実施例では、例えば、２ｍＬの２．５％ペプチド組成物に０．１Ｎ  ＮａＯＨを添加することにより、ペプチド組成物のｐＨレベルを調節した。調節された組成物のｐＨおよび外観を観察した。ｐＨレベルが所望のレベルよりも高い場合は、酸性塩を添加した。
【０１２８】
結果を表５に示す。とりわけ、ｐＨ上昇（すなわち、約３．５まで、またはそれ未満）は、ＲＡＤＡ１６、ＩＥＩＫ１３、およびＫＬＤ１２組成物の透明色を変化させず、一方で、それらの見かけ上の剛性は増大した。特定の組成物では、ペプチド組成物のｐＨレベルが３．５よりも高い場合（ＲＡＤＡ１６およびＫＬＤ１２）または３．７よりも高い場合（ＩＥＩＫ１３）、ペプチド組成物は相分離し始めた（すなわち混濁する）。一部の実施態様では、提供されるペプチド組成物は、約３．０〜約３．７（具体的にはＩＥＩＫ３に関して）、または約３．０〜約３．５（具体的にはＲＡＤＡ１６および／またはＫＬＤ１２に関して）の範囲内のｐＨを有する。
【０１２９】
【表７】
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【０１３０】
特定のペプチド組成物のレオロジー特性を、それらのｐＨレベルを３．４（ＲＡＤＡ１６およびＫＬＤ１２）または３．７（ＩＥＩＫ１３）に調節する前および後に観察した。４０ｍｍプレートを備えるレオメータ（ＡＲ５００，ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、ペプチドのレオロジー特性を評価した。具体的には、ペプチド組成物（７００μＬ）をレオメータプレート上に置き、過剰な組成物をキムワイプで優しく取り除いた。３７℃での２分の緩和時間の後に測定を行なった。応力スイープ試験の結果を、図８〜図１１に示す。上昇したｐＨにおけるＲＡＤＡ１６、ＫＬＤ１２およびＩＥＩＫ１３組成物は、２．５（ＲＡＤＡ１６）、２．０（ＫＬＤ１２）、および２．１（ＩＥＩＫ１３）におけるものよりも剛性だった。
【０１３１】
選択されたｐＨレベルにおける特定のペプチド組成物の貯蔵弾性率を、２０ｍｍプレートを備えるレオメータ（ＤＨＲ−１，ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて評価した。ＲＡＤＡ１６およびＩＥＩＫ１３組成物の貯蔵弾性率は、３．４までのｐＨ上昇に伴い増大した。試験されたペプチド組成物に関して決定された貯蔵弾性率を、ＲＡＤＡ１６について図１８およびＩＥＩＫ１３について図１９にそれぞれ示す。
【０１３２】
選択されたｐＨレベルにおける１％  ＩＥＩＫ１３組成物の粘度を、２０ｍｍプレートを備えるレオメータ（ＤＨＲ−１，ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて評価した。ＩＥＩＫ１３組成物の粘度は、３．５までのｐＨ上昇に伴い増大した。ＩＥＩＫ１３組成物は、典型的な剪断減粘性特性を示した。結果を図２０Ａおよび図２０Ｂに示す。
【０１３３】
１％  ＩＥＩＫ１３組成物に高剪断応力を適用後に、選択されたｐＨにおいてレオロジー特性の復元時間を評価した。１０００  １／ｓｅｃの剪断速度をサンプルに１分間適用後に、ＤＨＲ−１レオメータ―（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、１％  ＩＥＩＫ１３の貯蔵弾性率の変化を、１ｒａｄ／ｓ、１Ｐａで測定した。選択されたｐＨにおけるＩＥＩＫ１３組成物は、典型的なチキソトロピック挙動を示した。これは、それらのレオロジー特性がゆっくり復元したことを意味する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まずに、レオロジー特性の復元時間は、ペプチド分子の再組織化が組成物において再び自己関連性（例えば、ナノファイバー）を形成するのに必要な時間を表わすことを我々は提案する。１％  ＩＥＩＫ１３コントロール組成物（ｐＨ２．３）の完全な再組織化時間は１２時間まで、またはそれより少なく、一方で、ｐＨが上昇したＩＥＩＫ１３組成物のものは６〜１０分であった。ＩＥＩＫ１３に関して、代表的な結果を図２１Ａ〜図２１Ｄに示す。
【０１３４】
実施例４：イオン強度の関数としての、ペプチド組成物のレオロジー特性
本実施例は、特定のペプチド組成物のレオロジー特性に対する、イオン強度の効果を示す。一部の実施態様では、イオン強度は、ペプチド組成物の剛性、粘度、および／または復元時間のコントロールパラメーターであり得る。
【０１３５】
選択された塩類（例えばＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２）を含むＲＡＤＡ１６、ＫＬＤ１２、およびＩＥＩＫ１３組成物の目視観察を、表７〜表９に要約する。特定のイオン強度におけるペプチド組成物は透明であり、より低いイオン強度におけるものより高い剛性を示した。ＲＡＤＡ１６に関しては（表７）、およそ０．８５〜１．１５Ｍの範囲内のイオン強度（塩同一性に依存）は、ＲＡＤＡ１６組成物の不透明性をそれほど変化させなかった。ＫＬＤ１２に関しては（表８）、およそ０．２５〜０．３５Ｍの範囲内のイオン強度（塩同一性に依存）は、ＫＬＤ１２組成物の不透明性をそれほど変化させなかった。ＩＥＩＫ１３に関しては（表９）、およそ０．０２５〜０．０３５Ｍの範囲内のイオン強度（塩同一性に依存）は、ＩＥＩＫ１３組成物の不透明性をそれほど変化させなかった。ＲＡＤＡ１６、ＫＬＤ１２およびＩＥＩＫ１３組成物の見かけ上の剛性は、イオン強度の増大に伴い増大した。
【０１３６】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望まずに、我々は、レオロジー特性の増大は、それぞれの塩の塩析定数（Ｋ）に関連し得ることを提案する。ＲＡＤＡ１６に関するＮａＣｌの定数Ｋは、他の塩類よりも高くあり得る。ＮａＣｌを含むＲＡＤＡ１６組成物のレオロジー特性は、ＫＣｌおよびＣａＣｌ２を含むものよりもわずかに高かった。
【０１３７】
【表８】
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【表９】
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【０１３８】
【表１０】
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【０１３９】
【表１１】
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【０１４０】
臨界イオン強度を、表７〜表９に記録された目視観察から決定した。ペプチド組成物のイオン強度が、０．９Ｍ（ＲＡＤＡ１６）、０．３Ｍ（ＫＬＤ１２）または０．０３Ｍ（ＩＥＩＫ１３）より高い場合、ペプチド組成物は相分離し始めた。０．９Ｍ、０．３Ｍおよび０．０３Ｍは、それぞれ、ＲＡＤＡ１６、ＫＤＬ１２およびＩＥＩＫ１３に関する臨界イオン強度を表わし得る。
【０１４１】
図２７〜図２９は、イオン強度が臨界イオン強度よりもわずかに低い場合の、２０ｍｍプレートを備えるレオメータ（ＤＨＲ−１，ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて測定したレオロジー特性を示す。ＲＡＤＡ１６、ＫＤＬ１２およびＩＥＩＫ１３のイオン強度は、測定に関して、それぞれ、０．７Ｍ、０．２Ｍおよび０．０２Ｍであった。ＲＡＤＡ１６、ＫＬＤ１２およびＩＥＩＫ１３組成物のレオロジー特性は、ＮａＣｌを用いてそれらのイオン強度レベルを０．７Ｍ（ＲＡＤＡ１６）、０．２Ｍ（ＫＬＤ１２）または０．０２Ｍ（ＩＥＩＫ１３）に調節した後、より高かった。
【０１４２】
選択されたイオン強度におけるペプチド組成物のレオロジー特性を、２０ｍｍプレートを備えるレオメータ（ＤＨＲ−１，ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて測定した。１％  ＲＡＤＡ１６組成物のレオロジー特性は、０．７Ｍまでのイオン強度調節により増大し、一方で、０．７Ｍよりも高いイオン強度では低減した。１％  ＩＥＩＫ１３組成物のレオロジー特性は、０．０３Ｍまでのイオン強度調節により増大し、一方で、０．０３Ｍよりも高いイオン強度では低減した。結果は、選択された塩イオン強度におけるペプチド組成物の目視検査とよく一致した。結果を、図３０（ＲＡＤＡ１６）および図３１（ＩＥＩＫ１３）に示す。
【０１４３】
選択されたイオン強度レベルにおけるペプチド組成物の粘度を評価した。ＩＥＩＫ１３組成物の粘度は、イオン強度の増大に伴い増大した。１％  ＩＥＩＫ１３組成物は、典型的な剪断減粘性特性を示した。１％  ＩＥＩＫ１３組成物の粘度を、２０ｍｍプレートを備えるレオメータ（ＤＨＲ−１，ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて評価した。結果を、ＩＥＩＫ１３に関して図３２Ａおよび図３２Ｂに示す。
【０１４４】
選択されたイオン強度における１％  ＩＥＩＫ１３組成物に高剪断応力を適用した後に、レオロジー特性の復元時間を評価した。ＤＨＲ−１レオメータ（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、１０００  １／ｓｅｃの剪断速度をサンプルに１分間適用後、時間スイープ試験（１ｒａｄ／ｓ、１Ｐａ）により、１％  ＩＥＩＫ１３の貯蔵弾性率の変化を測定した。選択されたイオン強度におけるＩＥＩＫ１３組成物は、典型的なチキソトロピック挙動を示し、それらのレオロジー特性をゆっくり復元した。レオロジー特性の復元時間は、ナノファイバーを再び形成するペプチド分子の再組織化に基づく。塩を添加しない１％  ＩＥＩＫ１３コントロール組成物の完全な再組織化時間は、１２時間まで、またはそれよりも少なく、一方で、ＮａＣｌ  ０．０１Ｍおよび０．０２Ｍを含むＩＥＩＫ１３組成物のものは、１分〜３分未満だった。ＩＥＩＫ１３に関して、結果を図３３Ａ〜図３３Ｃに示す。
【０１４５】
実施例５：ｐＨおよびイオン強度の両方の関数としての、ペプチド組成物のレオロジー特性
本実施例は、増大したｐＨおよびイオン強度における、ペプチド組成物のレオロジー特性を示す。具体的には、本実施例は、特定のペプチド組成物のレオロジー特性に対する、細胞培養培地のような生理学的培地の効果を示す。
【０１４６】
ＩＥＩＫ１３、ＫＬＤ１２、およびＲＡＤＡ１６組成物のレオロジー特性に対する、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ｐＨ７．４）の効果を、４０ｍｍプレートを備えるレオメータ（ＡＲ５００，ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて評価した。ＤＭＥＭは、６．４ｇ／ＬのＮａＣｌ、３．４ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３（炭酸水素ナトリウム）、少量の他の塩類、様々なアミノ酸類、および４．５ｇ／Ｌのグルコースを含む、細胞培養培地である。ＤＭＥＭのｐＨは７．２±０．２であり、浸透圧は３３５±３０ｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏである。ＤＭＥＭは、ヒト生理学的流体（例えば血液）に近い。
【０１４７】
ＤＭＥＭ溶液と混合する前に、１％のペプチド組成物を、４℃で少なくとも４８時間維持した。実験を実施するために、１ｍＬのペプチド組成物を穏やかにピペッティングして、レオメータのプレート上に置いた。２ｍＬのＤＭＥＭ溶液を、ペプチド組成物の周りに穏やかに添加した。ペプチド組成物をＤＭＥＭで２分間処理し、それから、培地を取り除き、プレートを、４５０μｍ付近の測定幾何学的ギャップで置いた。２分の緩和後に、３７℃で測定を行なった。振動数試験を、１Ｐａの振動応力で、１ｒａｄ／ｓ〜１００ｒａｄ／ｓで行なった。
【０１４８】
１％ペプチド組成物のレオロジー特性を、２分間のＤＭＥＭ処理の前後に測定した；結果を図５Ａに示す。ＤＭＥＭ処理後の貯蔵弾性率の増加倍率を図５Ｂに示す。見ることができるように、ペプチド組成物は、ＤＭＥＭ処理後に、貯蔵弾性率の大きな増加を示した。ＤＭＥＭ処理後の、ＲＡＤＡ１６、ＫＬＤ１２、およびＩＥＩＫ１３の間の倍率の違いは、ＤＭＥＭ処理前のものと比較して、相対的に小さかった。同様に、より剛性のペプチド組成物（例えば、ＩＥＩＫ１３）は、ＤＭＥＭ処理後、より低い剛性のペプチド組成物（例えば、ＲＡＤＡ１６）よりも、貯蔵弾性率のより低い増加倍率を示した。ＤＭＥＭ処理後、臨界的な分子間相互作用が増大した。それは、最終的な剛性を決定し得る。
【０１４９】
ＤＨＲ−１レオメータ（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、選択された濃度におけるペプチド組成物のレオロジー特性を、ＤＭＥＭ処理の前後に測定した。１ｒａｄ／ｓｅｃ〜１０ｒａｄ／ｓｅｃで、１Ｐａで振動数スイープ試験を行ない、グラフ内の貯蔵弾性率は１ｒａｄ／ｓｅｃであった。ＲＡＤＡ１６およびＩＥＩＫ１３組成物のレオロジー特性は、ＤＭＥＭ処理および／またはｐＨ上昇に伴い増大した。結果をそれぞれ、ＲＡＤＡ１６に関して図２２Ａおよび図２２Ｂ、および、ＩＥＩＫに関して図２３Ａおよび図２３Ｂに示す。
【０１５０】
ＤＨＲ−１レオメータ（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、選択されたイオン強度におけるペプチド組成物のレオロジー特性を、ＤＭＥＭ処理後１０分に評価した。振動数スイープ試験を、１ｒａｄ／ｓｅｃ〜１０ｒａｄ／ｓｅｃで、１Ｐａで実施し、１ｒａｄ／ｓｅｃにおける貯蔵弾性率をデータに選択した。ＲＡＤＡ１６組成物のレオロジー特性は、０．７Ｍまでのイオン強度調節により増大し、一方でそれらは、０．７Ｍまたはそれよりも高い場合は低下した。０．９Ｍまたはそれよりも高いＮａＣｌのイオン強度では、ＲＡＤＡ１６組成物は混濁した。ＲＡＤＡ１６のレオロジー特性は、ＤＭＥＭ処理により変化しなかった（例えばゲル化なし）。しかしながら、ＩＥＩＫ１３組成物のレオロジー特性は、選択されたイオン強度におけるＤＭＥＭ処理により増大した。結果を図３４〜図３５に示す。
【０１５１】
ＩＥＩＫ１３、ＫＬＤ１２、およびＲＡＤＡ１６を塩バッファー（例えばＮａＣｌ）に溶解させて、アルカリ塩バッファー（例えばＮａＯＨ）を用いて調節された上昇したｐＨレベルで維持した。組成物は、それらのｐＨレベル約２．５〜４．０、および、それらの臨界点よりも低いイオン強度を有した。ＲＡＤＡ１６、ＫＬＤ１３およびＩＥＩＫ１３に関して、ペプチド組成物は、ｐＨ３．４（ＮａＯＨを用いて調節）において、０．９％  ＮａＣｌ（すなわち０．１５Ｍのイオン強度）でもなお透明であった。ｐＨ３．４における０．９％  ＮａＣｌを含むＲＡＤＡ１６のレオロジー特性は、ＲＡＤＡ１６コントロール（すなわち、イオン強度およびｐＨ上昇なし）および０．９％  ＮａＣｌを含むＲＡＤＡ１６（ｐＨ上昇なし）のものよりも剛性であった。結果を図４０に示す。
【０１５２】
図１に示すように、コンゴレッドアッセイを行なって、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液（ｐＨ７．４）におけるペプチド組成物のゲル形成を決定した。選択された濃度における各ゲルの１００μｌを、ガラススライド上にプレーティングした。３０秒後、５００μｌの１％コンゴレッド溶液を組成物アリコートのそれぞれの周りおよび上部に添加し、それから、試験の前に過剰のコンゴレッド溶液を拭き取った。ＲＡＤＡ１６、ＩＥＩＫ１３、およびＫＬＤ１２を、０．５％、１．０％、１．５％、２．０％および２．５％の選択された濃度でプレーティングした。各濃度におけるゲル化の成功または失敗を、目視観察で決定した。ＲＡＤＡ１６、ＩＥＩＫ１３、およびＫＬＤは、全ての濃度でゲル化した。
【０１５３】
実施例６：細胞生存率
本実施例は、細胞生存率をサポートする特定のペプチド組成物の能力を示す。一部の実施態様では、提供されるペプチド組成物は、それらが高い細胞生存率（特に、適切な参照組成物と比較して）をサポートするという点で特徴付けられる。
【０１５４】
細胞生存率（細胞毒性）アッセイを行なって、本明細書に記載のＩＥＩＫ１３、ＫＬＤ１２およびＲＡＤＡ１６組成物による、Ｃ５７  ＢＬ／６マウス間葉系幹細胞（ｍＭＳＣ）の生存率を測定した。ｍＭＳＣは、ヒドロゲル組織培養系において頻繁に用いられる細胞株である。ペプチド組成物を２．５％の濃度で調製し、それから、スクロースで１．５％、１．２５％、１．０％、０．７５％、および０．５０％の濃度に希釈した。スクロースの最終濃度は１０％であった。細胞を洗浄し、５百万細胞／ｍｌの最終濃度まで、１０％スクロースに再懸濁した。細胞を遠心分離して、上清を除去した。１０％スクロースを用いてペプチド組成物に細胞を再懸濁した。プロトコルは、それから、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）の使用ガイドライン（ＢＤ／Ｃｏｒｎｉｎｇウェブサイト）に記載のとおりに、プレーティングドロップ（ｐｌａｔｉｎｇ  ｄｒｏｐ）培養およびその後の分離を続けた。ＲＡＤＡ１６、ＩＥＩＫ１３、およびＫＬＤ１２に関して、それぞれ結果を図１４〜図１６に示す。
【０１５５】
０．５％におけるＩＥＩＫ１３およびＫＬＤ１２組成物での細胞生存率は、０．２５％におけるものと同様であった。０．５％におけるＲＡＤＡ１６組成物での細胞生存率は、０．２５％におけるものよりも有意に高い。しかしながら、ペプチドの濃度が０．７５％を超えた場合、細胞生存率は有意に低下した。ＫＬＤ１２およびＩＥＩＫ１３組成物は、０．２５％〜１．５％の範囲内の全ての試験された濃度において、ＲＡＤＡ１６と比較して同様またはより高い細胞生存率を示した。これらのペプチド組成物の間の全般的な細胞生存率の順番は、ＫＬＤ１２＞ＩＥＩＫ１３＞ＲＡＤＡ１６であった。０．７５％またはそれよりも低い濃度を有する試験されたペプチド組成物は、８０％よりも高い細胞生存率を示した。
【０１５６】
実施例７：異なる塩類を含むＲＡＤＡ１６組成物のレオロジー特性
本実施例は、とりわけ、ゲル可逆性をなお維持しながら（例えば、ゲル形成、および、機械的摂動後のその機械的完全性を、損なわない）、自己組織化ペプチドゲルの調整された機械的増強を達成した試験を示す。また、これらの示された試験は、様々な自己組織化ペプチド、中でもとりわけ、ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ（またはＲＡＤＡ−１６）と組み合わせた、選択された濃度におけるカチオンおよびアニオンの混合を介した、ゲル化カイネティクスの調整も達成した。
【０１５７】
本実施例は、特に本明細書と関連させて考慮すると、ペプチド組成物が、特定の適用に特に有用である物質および／またはレオロジー特性を有するように、具体的に製剤化されるのを可能にする、パラメーターが定義されていることを確実にする。例えば、本明細書に記載の技術は、シーラント（例えば、増強した剛性を必要とし得て、またはそれから恩恵を受け得る）、潤滑剤（例えば、増強したカイネティクスを必要とし得て、またはそれから恩恵を受け得る）、薬剤混合物（例えば、可逆性および増強したカイネティクスを必要とし得て、またはそれから恩恵を受け得る）、注射液（例えば、可逆性を要求し得て、またはそれから恩恵を受け得る）などとして、良好に機能するように特に適合される、自己組織化ペプチド組成物の調製を可能にする。これに代え又はこれに加えて、本明細書に記載の技術は、有用なペプチド組成物および／またはそれらを含むデバイスの操作および／または製造を一般に助けることができる、ペプチド組成物の調製および／またはそれらに含まれ、または適用されるパラメーターの選択を可能にする。
【０１５８】
例えば、本明細書に示されるように、自己組織化ペプチド組成物に含まれるカチオンのタイプ（例えば、Ｎａ、Ｋ、およびＣａ）および／または濃度を体系的に調整することにより、可逆性およびゲル化カイネティクスをなお維持しながら機械的強度（すなわち剛性）を調節することができる。これに代え又はこれに加えて、アニオンのタイプ（例えば、Ｃｌ、ＳＯ４、ＰＯ４）および／または濃度を体系的に調整することにより、可逆性を維持しながらゲル化カイネティクスを調整することができる。
【０１５９】
本実施例に示されるように、一部の実施態様では（具体的には、ＲＡＤＡ１６ペプチドを利用する実施態様では）、Ｃａは、ＮａおよびＫと比較して、ペプチドゲルにおいて、より増強された剛性を可能にする。加えて、一部の実施態様では（具体的には、ＲＡＤＡ１６ペプチドを利用する実施態様では）、Ｃｌは、ＳＯ４と比較して、ペプチドゲルにおいて、より迅速なゲル化カイネティクスを可能にする。さらに、一部の実施態様では（具体的には、ＲＡＤＡ１６ペプチドを利用する実施態様では）、ＣａＣｌ２は、≧０．１２５および＜０．５００Ｍの濃度における可逆的ゲルを最適に機械的に増強するのを可能にする。本実施例で報告される特定の試験では、濃度≧０．５００Ｍは、特定のゲルの機械的特性を損ない、または、それらを、ゲル化後の機械的摂動に使用不可にさせる。
【０１６０】
一般に、本実施例において報告される知見は、様々な塩類および塩濃度の使用を通して、剛性、ゲル化カイネティクス、およびゲル化の可逆性などの属性は、ペプチドの濃度、ペプチドの同一性（例えば、アミノ酸配列）、カチオン／アニオンの濃度、カチオン／アニオンの同一性などのようなパラメーターの選択により決定することができることを示す。カチオンおよびアニオンの両方が、独立および組み合わせて、属性に影響を与えることができることが見いだされている。本実施例を含む、本開示により提供される技術は、例えば特定の適用または状況に適切であり得る、所望の属性（例えば性能特性）に従って、ペプチド混合物を適合させるシステムを提供する。
【０１６１】
本実施例は、具体的には、ある特定のタイプのカチオンおよび／またはアニオン、および／またはそれらの濃度は／所望の有益な効果を有することを示し；とりわけ、本実施例は、そのようなアニオン／カチオンおよび例示されたコンテキストに関する濃度を定義し、さらに、他のケース（例えば、他のペプチドなど）に関して当業者が同様に行なうことを可能にするフレームアークを提供する。
【０１６２】
本実施例は、特に、および驚くべきことに、自己組織化ペプチドの有用な組成物を提供するための現在のストラテジーでの問題を特定する。すなわち、自己組織化の能力は、イオン性塩による攻撃に利用可能な帯電基の量に依存性であり、ペプチドの浸透能であることが理論化されている［Ｐ．Ｃｈｅｎ．（２００５）．“Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｉｏｎｉｃ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ａ  ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ．”Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ］。しかしながら、本実施例は、少なくとも一部の場合において、ペプチドは塩濃度により比例的に影響を受けず、したがって、機械的特性および可逆性は直線的に増加せず、速度依存性でないことを証明する。
【０１６３】
図４１Ａ〜図４１Ｄは、ペプチド溶解を追うため、および、特定のアニオンおよび／またはカチオン、および／またはそれらの濃度の、特定のＲＡＤＡ１６組成物に対する効果を評価するために用いられる、プロトコルを示す。示されるように、バイアル中のペプチドパウダーは、ボルテックスおよび超音波処理により、脱イオン水に溶解された。本実施例で使用された特定のペプチド組成物は、ＲＡＤＡ１６の１％組成物であり、２×塩溶液と１：１比で混合されて、０．５％  ＲＡＤＡ１６の終濃度および所望のモル濃度の塩を得た。
【０１６４】
塩濃度試験
図４１Ａ〜図４１Ｄに示されるプロトコルに従って、異なる濃度のＣａＣｌ２を含むＲＡＤＡ１６の０．５％溶液を調製した。混合した溶液は、約２４時間の緩和期間、休憩（ｓｉｔ）させた。それから、ゲル特性を評価することができるようにバイアルを上下逆にした。組成物が、それを含むバイアルを逆さにしたときに完全に所定の位置に留まった場合は、組成物は完全に機能性ゲルと考えられた。それを含むバイアルを逆さにしたときに、組成物の半分よりも多くが所定の位置に留まった場合は、半機能性ゲルと考えられた。反転の際に、組成物の半分よりも多く、および、特に、組成物の実質的に全てがそれを含むバイアルの逆末端に落ちた場合、非機能性ゲルと考えられた。
【０１６５】
図４２Ａ〜図４２Ｇは、得られた結果の写真を示し、具体的には、様々な濃度のＣａＣｌ２のそれぞれ関する正立および倒立のバイアルを示す。見ることができるように、これらの０．５％  ＲＡＤＡ１６組成物に関して、０．２５０Ｍ  ＣａＣｌ２では完全な機能性ゲルが形成され（パネルＥ）、０．５００Ｍ  ＣａＣｌ２では半機能性ゲルが形成され（パネルＦ）、および、１Ｍ  ＣａＣｌ２では非機能性ゲルが形成された（パネルＧ）。
【０１６６】
カチオン選択試験
図４１Ａ〜図４１Ｄに示すプロトコルに従って、０．００５、０．０５、０．１２５、０．２５、０．５、および１ＭのＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびＣａＣｌ２を含むＲＡＤＡ１６の０．５％溶液を調製した。アニオン、クロライド（Ｃｌ−）を同一に維持して、カチオン、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、およびカルシウム（Ｃａ２＋）の効果を観察した。結果を図４３に示し、塩溶液のカチオンの変更が、生じる組成物の粘弾性特性および剛性にどのように影響を与えるかに関する基礎的な理解を提供する。
【０１６７】
機械的強度試験
図４１Ａ〜図４１Ｄに示すプロトコルに従って、２．５％  ＲＡＤＡ１６および塩の添加なし、または、２．５％  ＲＡＤＡ１６および０．１２５Ｍ  ＣａＣｌ２の、いずれかを含むペプチド組成物の剛性を分析した。結果を図４４に示し、生じる組成物の粘性特性の基礎的な理解を提供する。見ることができるように、カチオン溶液が混合された場合、２つの溶液の間に剛性の著しい増大が存在する。
【０１６８】
可逆性試験
図４１Ａ〜図４１Ｄに示すプロトコルに従って、０．１２５、０．２５、または０．５ＭのＣａＣｌ２と混合した０．５％  ＲＡＤＡ１６の溶液を調製した。組成物を、それらの構造が完全に破壊される（例えばランダム化される）ように、ボルテックスおよび超音波処理を介した機械的応力に供した。破壊された組成物を、それから、室温に４８時間おき、自己組織化が起きるのを可能にした。図４５Ａおよび図４５Ｂは、この試験による結果を示し、ペプチド組成物の基礎的な粘弾性特性を明らかにし、０．１２５または０．２５ＭのＣａＣｌ２を含む場合、組成物における任意の構造の摂動後でさえ、可逆性を維持することができることを示す。対照的に、０．５Ｍ  ＣａＣｌ２を含む組成物は、崩壊後、劇的により低い剛性を示す（劇的に低下した、構造を回復させる能力を反映する）。
【０１６９】
同等物
当業者は、せいぜいルーチンの実験を用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施態様に対する多くの同等物を認識し、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に制限されることを意図しないが、むしろ、以下の特許請求の範囲に示される。
［参考文献］
[1] P. Chen. (2005). “Self-assembly of ionic-complementary peptides: a physicochemical viewpoint.” Colloids and Surfaces. 
[2] Mishra A., et al. (2013). “Influence of metal salts on the hydrogelation properties of ultrashort aliphatic peptides.” RSC Advances. 
[3] Shuguang, Z., et al. (1999). “Peptide self-assembly in functional polymer science and 
Engineering.” Reactive and Functional Polymers. 
[4] Yanlian, Y., et al. (2009). “Designer self-assembling peptide nanomaterials.” Nano Today. 
[5] Zhaoyang, Y., et al. (2008). “Temperature and pH effects on biophysical and morphological properties of self-assembling peptide RADA16-I.” Journal of Peptide Science. 
【図１】
2020055836.tif 000013
【図２Ａ】
2020055836.tif 000014
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２Ａ】
2020055836.tif 000044
【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
2020055836.tif 000050
【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2020055836.tif 000054
【図３１】
2020055836.tif 000055
【図３２Ａ】
2020055836.tif 000056
【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
2020055836.tif 000058
【図３３Ｂ】
2020055836.tif 000059
【図３３Ｃ】
2020055836.tif 000060
【図３４】
2020055836.tif 000061
【図３５】
2020055836.tif 000062
【図３６】
2020055836.tif 000063
【図３７】
2020055836.tif 000064
【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ−Ｇ】
2020055836.tif 000069
【図４３】
2020055836.tif 000070
【図４４】
2020055836.tif 000071
【図４５Ａ】
2020055836.tif 000072
【図４５Ｂ】
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【図４６】
2020055836.tif 000074
【図４７Ａ】
2020055836.tif 000075
【図４７Ｂ】
2020055836.tif 000076
【図４７Ｃ】
2020055836.tif 000077
【図４７Ｄ−Ｆ】
2020055836.tif 000078
【図４８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月24日(2019.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月16日(2020.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体ペプチド組成物であって、
約６〜約２０個の範囲内のアミノ酸の長さおよび交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸のアミノ酸配列を有するペプチドを含み、ここで前記ペプチドは、ＲＡＤＡ１６またはＫＬＤ１２を含み、前記組成物は、以下の点で特徴付けられる：
室温で１Ｐａ・ｓ〜５００，０００Ｐａ・ｓの範囲内の粘度を有し；
１ｒａｄ／ｓｅｃの振動数および１Ｐａの振動応力で、１〜５０００Ｐａの範囲内の貯蔵弾性率を有し；
２．５〜４．０の範囲内のｐＨまたはおよび／または０．０００１Ｍ〜１．５Ｍの範囲内のイオン強度に曝露／維持された場合に、０〜３０ｓの時間内、ゲルを形成し；
ｐＨが、３．０〜３．５の範囲内に維持される、
液体ペプチド組成物。
【請求項２】
請求項１の組成物であって、
水性組成物である、
組成物。
【請求項３】
請求項１の組成物であって、
前記イオン強度は、塩類により付与される、
組成物。
【請求項４】
請求項３の組成物であって、
前記塩類は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、およびＣａＳＯ４からなる群より選択される、
組成物。
【請求項５】
請求項３の組成物であって、
前記塩類は、カチオンを形成する１つまたは複数の塩およびアニオンを形成する１つまたは複数の塩からなる、
組成物。
【請求項６】
請求項５の組成物であって、
前記のカチオンを形成する塩は、アンモニウム、カルシウム、鉄、マグネシウム、カリウム、ピリジニウム、第４級アンモニウム、およびナトリウムからなる群より選択される、
組成物。
【請求項７】
請求項５の組成物であって、
前記のアニオンを形成する塩は、アセテート、カーボネート、クロライド、シトレート、シアニド、フロリド、ニトレート、ニトライト、およびホスフェートからなる群より選択される、
組成物。
【請求項８】
請求項１の組成物であって、
前記組成物は、前記組成物のｐＨが調節されるように、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、または硫化ナトリウムで緩衝される、
組成物。
【外国語明細書】
2020055836000001.pdf
2020055836000002.pdf
2020055836000003.pdf
2020055836000004.pdf