(57)【要約】【課題】酸化的または酵素的に修飾された合成セクレトグロビンを含む組成物を提供することである。【解決手段】純粋なタンパク質をインビトロで化学的に修飾することにより、組換えヒトＣＣ１０タンパク質の新規組成物が生成された。化学的に修飾されたｒｈＣＣ１０のアイソフォームを含有するいくつかの新規合成調製物が、活性酸素種および活性窒素種を利用するプロセスにより生成された。これらの調製物は、非修飾タンパク質と比較して増強されるかまたは変化した生物学的特性で特徴付けられる、ｒｈＣＣ１０の新規アイソフォームを含有する。新規アイソフォームを含有する調製物は、血液または尿由来の天然のＣＣ１０タンパク質の天然に存在するアイソフォームを同定し、特徴付け、最終的に、患者疾患状態を判定するための新規のＣＣ１０に基づくバイオマーカーを測定するための標準として用いられ得る。これらの調製物はまた、非修飾タンパク質で有効に治療されない、呼吸器の状態、自己免疫の状態、炎症の状態、および他の医学的状態を治療するために用いられ得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の修飾アミノ酸を有する化学的または酵素的に酸化された合成セクレトグロビンを含む、組成物。
【請求項２】
前記化学的または酵素的に酸化された合成セクレトグロビンが、１つ以上のメチオニンスルホキシドを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記化学的または酵素的に酸化された合成セクレトグロビンが、１つ以上のニトロチロシン、クロロチロシン、またはジチロシンを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記化学的または酵素的に酸化された合成セクレトグロビンが、１つ以上のシステイングルタチオレートまたはＨＮＥ−システインを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記化学的または酵素的に酸化された合成セクレトグロビンが、１つ以上のカルボニル基を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記化学的または酵素的に酸化された合成セクレトグロビンが、１つ以上のヒドロキシプロリンまたはピロリドンを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記化学的または酵素的に酸化された合成セクレトグロビンが、１つ以上のα−アミノアジピン酸セミアルデヒド、クロラミン、ＭＤＡ−Ｌｙｓ、ＨＮＥ−Ｌｙｓ、アクロレイン−Ｌｙｓ、カルボキシメチルリシン、またはｐＨＡ−Ｌｙｓを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記化学的または酵素的に酸化された合成セクレトグロビンが、１つ以上の２−アミノ−３−ケト酪酸、クロラミン、ヒドロキシトリプトファン、ニトロトリプトファン、キヌレニン、バリン若しくはロイシンペルオキシド、シュウ酸若しくはピルビン酸、ヒドロキシフェニルアラニン、２−オキソヒスチジンまたはＨＮＥ−Ｈｉｓを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記化学的または酵素的に酸化された合成セクレトグロビンが、グルタミンまたはリシン残基に結合した１つ以上の標識、化学物質、脂質、またはペプチドを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
１つ以上の修飾アミノ酸を有する化学的または酵素的に酸化された合成ＣＣ１０を含む、組成物。
【請求項１１】
前記化学的または酵素的に酸化された合成ＣＣ１０が、１つ以上のメチオニンスルホキシドを有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記化学的または酵素的に酸化された合成ＣＣ１０が、１つ以上のニトロチロシン、クロロチロシン、またはジチロシンを有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記化学的または酵素的に酸化された合成ＣＣ１０が、１つ以上のシステイングルタチオレートまたはＨＮＥ−システインを有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記化学的または酵素的に酸化された合成ＣＣ１０が、１つ以上のカルボニル基を有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記化学的または酵素的に酸化された合成ＣＣ１０が、１つ以上のヒドロキシプロリンまたはピロリドンを有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
前記化学的または酵素的に酸化された合成ＣＣ１０が、１つ以上のヒドロキシプロリンまたはピロリドンを有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
前記化学的または酵素的に酸化された合成ＣＣ１０が、１つ以上のα−アミノアジピン酸セミアルデヒド、クロラミン、ＭＤＡ−Ｌｙｓ、ＨＮＥ−Ｌｙｓ、アクロレイン−Ｌｙｓ、カルボキシメチルリシン、またはｐＨＡ−Ｌｙｓを有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
前記化学的または酵素的に酸化された合成ＣＣ１０が、１つ以上の２−アミノ−３−ケト酪酸、クロラミン、バリン若しくはロイシンペルオキシド、シュウ酸若しくはピルビン酸、またはヒドロキシフェニルアラニンを有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１９】
前記化学的または酵素的に酸化された合成ＣＣ１０が、グルタミンまたはリシン残基に結合した１つ以上の標識、化学物質、脂質、またはペプチドを有する、請求項１０に記載の組成物。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、非修飾バージョンと比較して変化した特性または増強された特性を有する、合成セクレトグロビンの化学的または酵素的に修飾された調製物に関する。より詳細には、活性酸素種（ROS）、活性窒素種（RNS）、酵素により触媒される修飾、例えば、ミエロペルオキシダーゼおよび過酸化水素、またはトランスグルタミナーゼにより触媒される修飾を用いた組換えヒトセクレトグロビンタンパク質の修飾に関する。本発明は更に、修飾セクレトグロビンの新規アイソフォームの特性決定、セクレトグロビンを修飾する最適化プロセス、およびセクレトグロビンアイソフォームの単離に関する。本明細書の用語「アイソフォーム」は、１つ以上の化学的に修飾されたアミノ酸を含有する、少なくとも６０アミノ酸長の未変化のモノマーを含有する、セクレトグロビンまたはＣＣ１０モノマー、ダイマー、または他のマルチマー複合体を指す。本発明は、１つ以上のアミノ酸の化学修飾または酵素修飾による、セクレトグロビンの生物学的活性の変化、構造上の配置の変更、または生化学的特性の変更に更に関する。本発明は、ＲＯＳ、ＲＮＳ、および酵素により触媒されるアミノ酸修飾での化学修飾を通じて、ｒｈＣＣ１０の抗ウイルス活性を増強することに更に関する。本発明は、ＲＯＳ、ＲＮＳ、および酵素により触媒されるアミノ酸修飾での化学修飾を通じて、ｒｈＣＣ１０による好中球遊走の阻害を増強することに更に関する。
【背景技術】
【０００２】
セクレトグロビンは、ジスルフィドダイマー、テトラマーおよびより高級のマルチマーを形成する４つのヘリックス束モノマーを含む、構造上関連するタンパク質のファミリーである。８つの公知のヒトセクレトグロビンが存在し（図１）、クララ細胞１０ｋＤａタンパク質（CC10）は、ウテログロビン、クララ細胞１６ｋＤａタンパク質（CC16）、クララ細胞分泌タンパク質（CCSP）、ブラストキニン、尿タンパク質１、およびセクレトグロビン１Ａ１（SCGB1A1）としても知られ、最も大量であり、ファミリーの周知のメンバーである。セクレトグロビンおよびＣＣ１０は、全ての脊椎動物に存在すると考えられる。ＣＣ１０について知られていることに基づき、セクレトグロビンは、免疫応答を制御する際に役割を果たすと考えられているが、ＣＣ１０を含むこれらのタンパク質の生理的役割および特定のメカニズムは未知のままである。
【０００３】
哺乳動物におけるＣＣ１０の主要な供給源は、肺上皮および気管上皮、特に、非線毛性細気管支気道上皮細胞（主に、クララ細胞）であり、成人の肺の細胞外液中の最も大量の局所産生されたタンパク質である。ＣＣ１０は、鼻の上皮でも分泌される。ＣＣ１０は、血清および尿にも存在し、肺の供給源に大部分由来する。ＣＣ１０は、生殖組織（子宮、精嚢）、外分泌腺（前立腺、乳腺、膵臓）、内分泌腺（甲状腺、下垂体、副腎、および卵巣）により、並びに胸腺および脾臓によっても産生される（Mukherjee, 1999、Mukherjee, 2007）。ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトＣＣ１０の主要な回収可能な形態は、ホモダイマーであり、等電点４．７〜４．８を有する２つの同一の７０アミノ酸モノマーを含む。その分子量は１５．８ｋＤａであるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で見かけの分子量１０〜１２ｋＤａに移動する。天然のホモダイマーにおいて、モノマーは、一方のＮ末端がもう一方のＣ末端に隣接して逆平行配置で配列され、一方のモノマーのＣｙｓ３ともう一方のモノマーのＣｙｓ６９の間の２つのジスルフィド結合により結び付けられる（Mukherjee, 1999）。
【０００４】
タンパク質のアミノ酸残基を修飾する多くの化学プロセスおよび酵素プロセスが存在する。セクレトグロビンは、哺乳動物細胞における分泌プロセスの不可欠な部分である、Ｎ末端シグナルペプチドの切断を受ける。しかし、これらは、グリコシル化されないか、または脂質付加されないことが知られている。しかしながら、セクレトグロビンは、細胞外環境では、炎症反応中に全ての他のタンパク質に影響する同一のプロセスを受ける。天然のＣＣ１０は、ｉｎ  ｖｉｖｏで化学的に修飾され、天然のＣＣ１０の新規形態は、患者試料で同定されており、正常なヒト由来の試料中には存在しない（Lindhal, 1999、Ramsay, 2001、Ariaz-Martinez, 2012）。新規形態は、進行中または急性炎症により特徴付けられる呼吸状態を有する患者由来の気道ライニング流体（ALF）試料でのみ同定されたので、修飾は、炎症プロセスにより引き起こされると推定される。ＣＣ１０への修飾は、炎症反応により生じた活性酸素種との反応の結果であると推測されるが、修飾の性質は現在分かっていない。更に、天然のＣＣ１０への酸化修飾は、その抗炎症活性および免疫調節機能を障害し、これにより、呼吸促迫症を経験する未熟児での慢性肺疾患の発症に関与する、タンパク質に対する損傷を表すと思われる（Ramsay, 2001）。
【０００５】
合成ＣＣ１０タンパク質は、組換え法または化学合成法により作製され得る（Barnes, 1996、Mantile, 1993、Nicolas, 2005）。ＣＣ１０は、セクレトグロビンとまとめて呼ばれる構造上関連するタンパク質のファミリーの最も周知のメンバーである（Klug, 2000）。８つのヒトセクレトグロビンの成熟型分泌配列のアミノ酸配列を図１に示す。Ｎ末端は、共通シグナルペプチド切断部位に基づく予測であり、天然のタンパク質のＮ末端の配列決定により確認されてはいない。全てのセクレトグロビンは、保存された４つのヘリックス束二次構造を共有し、それ故に、同様の生理学的機能を媒介すると一般的に考えられる。
【０００６】
活性酸素種（ROS）および活性窒素種（RNS）は、加齢および疾患と関連する慢性炎症プロセスの一部として、または感染症および他の急性侵襲、例えば、煙吸引と闘うための重篤な炎症反応の結果として生じる。タンパク質酸化をｉｎ  ｖｉｖｏで媒介する、従来のＲＯＳおよびＲＮＳ化学的試薬は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、Ｆｅ２＋、Ｃｕ１＋、グルタチオン、ＨＯＣｌ、ＨＯＢｒ、１Ｏ２、およびＯＮＯＯ-を含む。ＲＯＳおよびＲＮＳは、ミエロペルオキシダーゼ、キサンチン酸化酵素、およびＰ−４５０酵素などの酵素活性並びに活性化食細胞の酸化的バースト活性の結果として、ｉｎ  ｖｉｖｏで合成されるか、または放出され得る。過酸化脂質、例えば、４−ヒドロキシ−２−トランス−ノネナール（HNE）、（MDA）、およびアクロレインは、同じく高度に反応性であり、タンパク質との付加物を形成することができる、ＲＯＳおよびＲＮＳの脂質との反応の産物である。オゾンおよび紫外線、並びにＯ２の存在下でのγ線照射およびミトコンドリアの電子伝達系漏れ(electron transport chain leakage)も、タンパク質酸化を引き起こす。
【０００７】
ＲＯＳおよびＲＮＳは、核酸、脂質（膜および界面活性剤のリン脂質を含む）、およびタンパク質を含む本質的な生物学的成分を、病原体と宿主の両方で破壊し、最初の感染症または炎症反応の他の原因より生命を危うくし得る重大な組織損傷をしばしば引き起こす、無差別な化学反応剤である。例えば、急性呼吸促迫症候群（ARDS）は、感染症を引き起こす病原体が抗菌剤を用いて制御された後でさえ、ＲＯＳおよびＲＮＳの放出を生じ、肺機能を損なう肺の組織損傷に起因する４０〜６０％の死亡率を典型的には有する、急性肺感染症（肺炎）によりしばしば引き起こされる。
【０００８】
いくつかの種類の酸化タンパク質修飾が存在し、そのうち最も一般的なものは、システイン（Cys）間のジスルフィド結合、Ｓ−チオレーション、およびメチオニン（Met）スルホキシドが形成される、硫黄酸化である。タンパク質カルボニル基も、アミノ酸側鎖が、アルデヒドおよびケトン、特に、リシン（Lys）、アルギニン（Arg）、およびプロリン（Pro）に変換される、一般的な酸化修飾である。脂肪族アミノ酸は、そのヒドロ（ペルオ）キシ誘導体に変換されてもよい。クロラミンおよび脱アミノが生じてもよい。特定のアミノ酸が他のアミノ酸に、例えば、ヒスチジン（His）がアスパラギン（Asn）に変換されてもよく、一方、他のものが、脂質過酸化反応付加物、アミノ酸酸化付加物（例えば、ｐ−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド）、およびグリコシド化付加物（例えば、カルボキシメチルリシン）を形成してもよい。ＲＯＳおよびＲＮＳへの曝露の結果として、肉眼的なタンパク質レベルで、架橋結合、凝集、およびペプチド結合切断が生じることがある。
【０００９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでＲＯＳおよびＲＮＳによりいくつかの生理的酸化産物に修飾される１２種のアミノ酸を表１に示す。一般的に、アミノ酸のシステイン（Cys）およびメチオニン（Met）は、酸化の影響を最も受けやすく、他のアミノ酸の酸化とは異なり、ＭｅｔおよびＣｙｓの酸化は可逆である（メチオニンスルホキシド還元酵素およびグルタチオンおよびチオレドキシン酸化還元系）（Stadtman, 2002）。
【００１０】
【表１】
2020055833.tif 000002
【００１１】
セクレトグロビンの修飾はまた、ＭＰＯなどの酵素により生成されたＲＯＳおよびＲＮＳの下流作用によってのみでなく、トランスグルタミナーゼ酵素（TG）によって、酵素的に媒介されてもよい。ＴＧは天然に遍在し、微生物から哺乳動物までの全ての形態の生命で見られる。ＴＧは、細胞外基質合成、好中球および単球接着および運動、受容体エンドサイトーシス、飲作用、抗原取り込みおよび処理、血液凝固、Ｇ−タンパク質シグナル伝達、並びにアポトーシスを含む、哺乳動物におけるいくつかの細胞間プロセスおよび細胞内プロセスに必須である（Lorand, 2003にて概説される）。ＴＧは、少なくとも１つの主要な酵素活性、１つのタンパク質のグルタミン残基がアシル供与体として役立ち、第２のタンパク質のリシン残基がアシル受容体として役立つ、古典的なトランスグルタミナーゼ活性を媒介する、多機能酵素である。ＴＧは、タンパク質の脱アミド化およびエステル化、並びにシステイン残基間のジスルフィド結合の生成および転位も媒介する。これらの活性のうち、エネルギーを必要とするものはなく、唯一の必須の補助因子はカルシウムである。
【００１２】
トランスグルタミナーゼは、炎症および免疫、詳細には、ＴＧ２または組織トランスグルタミナーゼにおいて重要な役割を果たす。トランスグルタミナーゼは主として細胞質に存在するが、酵素の一部は細胞表面の膜と結合しており、フィブロネクチンの共受容体であることが知られている。ＴＧは、膜の特定の脂質部分にタンパク質を架橋結合させて、これにより、皮膚の構造タンパク質の足場に脂質バリアが生成されることを可能にすることが示されている（Lesort, 2000、Nemes, 1999）。より最近、ウイルス感染におけるＴＧの新たに生じた役割が認知された（Jeon, 2006にて概説される）。細胞内ＴＧ２は、通常、不活性化状態で存在し、ウイルス感染から生じた酸化ストレスおよびカルシウム動員により活性化される。活性化細胞内ＴＧ２は、ウイルスタンパク質の直接的修飾／不活性化、並びにウイルスの侵入、複製、アセンブリー、または輸送に必要な細胞のタンパク質の修飾を介して、その抗ウイルス活性を媒介する。ＣＣ１０は、ＴＧ２の基質であることが既に示されている（Mukherjee, 1988）。ＣＣ１０は、他のＣＣ１０分子にＴＧ２により架橋結合されて、共有結合したマルチマーおよび凝集物を形成し、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびウエスタンブロットにて観察される。しかしながら、ＣＣ１０または他のセクレトグロビンの他のＴＧにより媒介された反応産物で特性決定されたものはない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
前述のものは、本発明により達成される目的の非限定的なリストを提供する。
【００１４】
本発明の主な目的は、酸化的または酵素的に修飾された合成セクレトグロビン（組換え的または化学的方法により作製されたかには関わらない）を含む、組成物である。
【００１５】
本発明の更なる目的は、酸化的または酵素的に修飾された合成ＣＣ１０（組換え的または化学的方法により作製されたかには関わらない）を含む、組成物である。
【００１６】
本発明の更なる目的は、酸化的または酵素的に修飾された合成ＳＣＧＢ３Ａ２（組換え的または化学的方法により作製されたかには関わらない）を含む、組成物である。
【００１７】
本発明の更なる目的は、酸化的または酵素的に修飾された合成ＳＣＧＢ３Ａ１（組換え的または化学的方法により作製されたかには関わらない）を含む、組成物である。
【００１８】
本発明の更なる目的は、酸化的または酵素的に修飾された合成ＳＣＧＢ２Ａ１（組換え的または化学的方法により作製されたかには関わらない）を含む、組成物である。
【００１９】
本発明の更なる目的は、酸化的または酵素的に修飾された合成ＳＣＧＢ２Ａ２（組換え的または化学的方法により作製されたかには関わらない）を含む、組成物である。
【００２０】
本発明の更なる目的は、酸化的または酵素的に修飾された合成ＳＣＧＢ１Ｄ１（組換え的または化学的方法により作製されたかには関わらない）を含む、組成物である。
【００２１】
本発明の更なる目的は、酸化的または酵素的に修飾された合成ＳＣＧＢ１Ｄ２（組換え的または化学的方法により作製されたかには関わらない）を含む、組成物である。
【００２２】
本発明の更なる目的は、酸化的または酵素的に修飾された合成ＳＣＧＢ１Ｄ４（組換え的または化学的方法により作製されたかには関わらない）を含む、組成物である。
【００２３】
本発明の更なる目的は、１つ以上のメチオニンスルホキシドを含有する修飾された合成セクレトグロビンを含む、組成物である。
【００２４】
本発明の更なる目的は、１つ以上のシステイングルタチオレートを含有する修飾された合成セクレトグロビンを含む、組成物である。
【００２５】
本発明の更なる目的は、１つ以上のＨＮＥ−システインを含有する修飾された合成セクレトグロビンを含む、組成物である。
【００２６】
本発明の更なる目的は、１つ以上のニトロチロシンを含有する修飾された合成セクレトグロビンを含む、組成物である。
【００２７】
本発明の更なる目的は、１つ以上のジ−チロシンを含有する修飾された合成セクレトグロビンを含む、組成物である。
【００２８】
本発明の更なる目的は、１つ以上のカルボニル基を含有する修飾された合成セクレトグロビンを含む、組成物である。
【００２９】
本発明の更なる目的は、メチオニンスルホキシド、ニトロチロシン、またはジチロシンからなる群より選択される２つ以上の修飾アミノ酸の組合せを含有する修飾された合成セクレトグロビンを含む、組成物である。
【００３０】
本発明の更なる目的は、１つ以上のクロロチロシンを含有する修飾された合成セクレトグロビンを含む、組成物である。
【００３１】
本発明の更なる目的は、１つ以上のヒドロキシプロリン、ピロリドン、またはグルタミン酸セミアルデヒドを含有する修飾された合成セクレトグロビンを含む、組成物である。
【００３２】
本発明の更なる目的は、１つ以上の２−アミノ−３−ケト酪酸を含有する修飾された合成セクレトグロビンを含む、組成物である。
【００３３】
本発明の更なる目的は、１つ以上のクロラミンを含有する修飾された合成セクレトグロビンを含む、組成物である。
【００３４】
本発明の更なる目的は、１つ以上のα−アミノアジピン酸セミアルデヒド、クロラミン、ＭＤＡ−Ｌｙｓ、ＨＮＥ−Ｌｙｓ、アクロレイン−Ｌｙｓ、カルボキシメチルリシン、またはｐＨＡ−Ｌｙｓを含有する修飾された合成セクレトグロビンを含む、組成物である。
【００３５】
本発明の更なる目的は、１つ以上のヒドロキシトリプトファン、ニトロトリプトファン、またはキヌレニンを含有する修飾された合成セクレトグロビンを含む、組成物である。
【００３６】
本発明の更なる目的は、１つ以上のバリンまたはロイシンペルオキシドを含有する修飾された合成セクレトグロビンを含む、組成物である。
【００３７】
本発明の更なる目的は、１つ以上のシュウ酸またはピルビン酸を含有する修飾された合成セクレトグロビンを含む、組成物である。
【００３８】
本発明の更なる目的は、１つ以上のヒドロキシフェニルアラニンを含有する修飾された合成セクレトグロビンを含む、組成物である。
【００３９】
本発明の更なる目的は、１つ以上のグルタミン酸セミアルデヒドを含有する修飾された合成セクレトグロビンを含む、組成物である。
【００４０】
本発明の更なる目的は、１つ以上の２−オキソヒスチジンまたはＨＮＥ−Ｈｉｓを含有する修飾された合成セクレトグロビンを含む、組成物である。
【００４１】
本発明の更なる目的は、非修飾合成セクレトグロビンと酸化的または酵素的に修飾合成セクレトグロビンの組合せを含有する、組成物であり、ここで、非修飾調製物と修飾調製物は、同一のセクレトグロビンである。
【００４２】
本発明の更なる目的は、非修飾合成セクレトグロビンと酸化的または酵素的に修飾合成セクレトグロビンの組合せを含有する、組成物であり、ここで、非修飾調製物と修飾調製物は、同一のセクレトグロビンではない。
【００４３】
本発明の更なる目的は、２つ以上の酸化的または酵素的に修飾された合成セクレトグロビンの組合せを含有する、組成物であり、ここで、非修飾調製物と修飾調製物は、同一のセクレトグロビンである。
【００４４】
本発明の更なる目的は、２つ以上の酸化的または酵素的に修飾された合成セクレトグロビンの組合せを含有する、組成物であり、ここで、非修飾調製物と修飾調製物は、同一のセクレトグロビンではない。
【００４５】
本発明の更なる目的は、１つ以上の非修飾合成セクレトグロビンと１つ以上の酸化的または酵素的に修飾合成セクレトグロビンの組合せを含有する、組成物であり、ここで、非修飾調製物と修飾調製物は、同一のセクレトグロビンである。
【００４６】
本発明の更なる目的は、１つ以上の非修飾合成セクレトグロビンと１つ以上の酸化的または酵素的に修飾合成セクレトグロビンの組合せを含有する、組成物であり、ここで、非修飾調製物と修飾調製物は、同一のセクレトグロビンではない。
【００４７】
本発明の第２の目的は、治療剤として用いられ得る修飾された合成セクレトグロビンを含有する、医薬組成物である。
【００４８】
本発明の更なる目的は、治療剤として用いられ得る２つ以上の修飾された合成セクレトグロビンの組合せを含有する、医薬組成物である。
【００４９】
本発明の更なる目的は、治療剤として用いられ得る非修飾合成セクレトグロビンと修飾合成セクレトグロビンの組合せを含有する、医薬組成物である。
【００５０】
修飾された合成セクレトグロビンを炎症状態またはウイルス感染症を有する患者に投与することが、本発明の更なる目的である。
【００５１】
修飾された合成セクレトグロビンを、呼吸器系疾患若しくは状態、自己免疫疾患若しくは状態、線維化状態、代謝性疾患、感染性疾患、または任意の急性若しくは慢性炎症状態若しくは疾患を有する患者に投与することが、本発明の更なる目的である。
【００５２】
修飾された合成セクレトグロビンを、投与すべき修飾合成セクレトグロビンに対応する天然のセクレトグロビンアイソフォームの不足により特徴付けられる任意の状態を有する患者に投与することが、本発明の更なる目的である。
【００５３】
修飾された合成セクレトグロビンを投与して、基礎にある慢性疾患または状態を有する患者における基礎にある状態の重度の悪化を治療または予防することが、本発明の更なる目的である。
【００５４】
修飾された合成ＣＣ１０を炎症状態またはウイルス感染症を有する患者に投与することが、本発明の更なる目的である。
【００５５】
修飾された合成ＣＣ１０を、呼吸器系疾患若しくは状態、自己免疫疾患若しくは状態、線維化状態、代謝性疾患、感染性疾患、または任意の急性若しくは慢性炎症状態若しくは疾患を有する患者に投与することが、本発明の更なる目的である。
【００５６】
修飾された合成ＣＣ１０を、投与すべき修飾合成ＣＣ１０に対応する天然のＣＣ１０アイソフォームの不足により特徴付けられる任意の状態を有する患者に投与することが、本発明の更なる目的である。
【００５７】
修飾された合成ＣＣ１０を投与して、基礎にある慢性疾患または状態を有する患者における基礎にある状態の重度な悪化を治療または予防することが、本発明の更なる目的である。
【００５８】
患者試料を評価するための診断アッセイを開発するために用いられ得る修飾された合成セクレトグロビンを用いることが、本発明の別の目的である。
【００５９】
修飾された合成セクレトグロビンを、患者試料を評価するための診断アッセイで用いられ得る標準として用いることが、本発明の更なる目的である。
【００６０】
患者試料を評価するための診断アッセイを開発するために用いられ得る修飾合成ＣＣ１０を用いることが、本発明の更なる目的である。
【００６１】
修飾された合成ＣＣ１０を、患者試料を評価するための診断アッセイで用いられ得る標準として用いることが、本発明の更なる目的である。
【００６２】
修飾された合成セクレトグロビンを、生物学的供給源、例えば、血液、尿、または組織由来の修飾天然セクレトグロビンの精製を可能にする標準として用いることが、本発明の更なる目的である。
【００６３】
修飾された合成セクレトグロビンを、生物学的供給源、例えば、血液、尿、または組織由来の修飾天然セクレトグロビンを精製するためのプロセスの開発を可能にする標準として用いることが、本発明の更なる目的である。
【００６４】
修飾された合成セクレトグロビンを、生物学的供給源、例えば、血液、尿、または組織由来の修飾天然セクレトグロビンを精製するためのプロセスをモニターするための標準として用いることが、本発明の更なる目的である。
【００６５】
修飾された合成セクレトグロビンを、生物学的供給源、例えば、血液、尿、または組織から精製された、修飾天然セクレトグロビンの質を制御するための標準として用いることが、本発明の更なる目的である。
【００６６】
本発明の更なる目的は、化学的酸化を用いて、非修飾合成セクレトグロビンを修飾合成セクレトグロビンに変換する、プロセスである。
【００６７】
本発明の更なる目的は、活性酸素種（ROS）を用いて、非修飾合成セクレトグロビンを修飾合成セクレトグロビンに変換する、プロセスである。
【００６８】
本発明の更なる目的は、活性窒素種（RNS）を用いて、非修飾合成セクレトグロビンを修飾合成セクレトグロビンに変換する、プロセスである。
【００６９】
本発明の更なる目的は、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）を用いて、非修飾合成セクレトグロビンを修飾合成セクレトグロビンに変換する、プロセスである。
【００７０】
本発明の更なる目的は、次亜塩素酸塩（ＨＯＣｌ）を用いて、非修飾合成セクレトグロビンを修飾合成セクレトグロビンに変換する、プロセスである。
【００７１】
本発明の更なる目的は、メタクロロ過安息香酸（mCPBA）を用いて、非修飾合成セクレトグロビンを修飾合成セクレトグロビンに変換する、プロセスである。
【００７２】
本発明の更なる目的は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を用いて、非修飾合成セクレトグロビンを修飾合成セクレトグロビンに変換する、プロセスである。
【００７３】
本発明の更なる目的は、酵素を用いて、非修飾合成セクレトグロビンを修飾合成セクレトグロビンに変換する、プロセスである。
【００７４】
本発明の更なる目的は、ミエロペルオキシダーゼを用いて、非修飾合成セクレトグロビンを修飾合成セクレトグロビンに変換する、プロセスである。
【００７５】
本発明の更なる目的は、トランスグルタミナーゼを用いて、非修飾合成セクレトグロビンを修飾合成セクレトグロビンに変換する、プロセスである。
【００７６】
本発明の更なる目的は、トランスグルタミナーゼを用いて、標識、化学物質、脂質、またはペプチド部分を非修飾合成セクレトグロビンに結合させる、プロセスである。
【課題を解決するための手段】
【００７７】
本発明は、非修飾バージョンと比較して生物学的特性または生化学的特性を変化させるかまたは増強するための、合成セクレトグロビンの化学修飾および／または酵素修飾に関する。化学試薬、例えば、活性酸素種（ROS）、および活性窒素種（RNS）、または酵素、例えば、ミエロペルオキシダーゼまたはトランスグルタミナーゼを用いて、アミノ酸修飾が達成される。脂質および他の部分のセクレトグロビンへの付加は、ＴＧによっても媒介される。本発明は、アミノ酸修飾を達成するための化学物質または酵素により媒介されるプロセスの最適化、並びに修飾セクレトグロビンの混合物の生化学的および物理的特徴付け、および個々のセクレトグロビンアイソフォームの単離および特徴付けに更に関する。用語「アイソフォーム」は、本明細書で、セクレトグロビンモノマー、ダイマー、または少なくとも６０アミノ酸長のモノマー単位を含有する他のマルチマー複合体を指すが、好ましくは、図１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％同一であり、１つ以上の化学的に修飾されたアミノ酸を含有する全長モノマーを指す。ウイルスの複製の阻害、および好中球走化性の阻害を含むが、これに限定されない、生物学的特性は、化学的に修飾されたセクレトグロビン混合物およびアイソフォームにて変化または増強され得る。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】セクレトグロビンのアミノ酸配列の図である。８つのヒトセクレトグロビンのモノマー形態のアミノ酸配列が示される。全ての配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋから取得され、翻訳産物のシグナルペプチドは、それぞれのモノマーの予測されるＮ末端を示すために取り除かれた。全てのセクレトグロビンは、保存された４つのヘリックス束二次構造を共有し、ホモダイマー、ヘテロダイマー、テトラマー、および多量のマルチマーを形成する。
【図２】ＮａＯＣｌと反応したｒｈＣＣ１０のＨＰＬＣパターンの図である。非修飾ｒｈＣＣ１０および増加量のＮａＯＣｌ酸化剤の当量と反応させたｒｈＣＣ１０の調製物は、Ｃ−１８カラムを用いた逆層ＨＰＬＣにより分析される。矢印は、反応混合物中の非修飾ｒｈＣＣ１０ピークを指す。示されるそれぞれのＨＰＬＣ実行について、タンパク質約２５ｍｃｇが添加された。
【図３】ｒｈＣＣ１０  ＮａＯＣｌ反応物のＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。１０〜２０％トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが用いられた。増加量のＮａＯＣｌで修飾されたｒｈＣＣ１０の調製物；それぞれのレーンについて、酸化剤の当量数が示される。それぞれタンパク質約５ｍｃｇを含有する全ての試料は、ゲル添加に先立ち、ＳＤＳ添加液中の１ｍＭ  ＤＴＴで還元され、６５℃まで１５分間加熱された。
【図４】ｒｈＣＣ１０  ＮａＯＣｌ反応物の等電点電気泳動（IEF）の図である。ＩＥＦゲルは、ｐＨ範囲３〜７をカバーした。増加量のＮａＯＣｌで修飾されたｒｈＣＣ１０の調製物；それぞれのレーンについて、酸化剤の当量数が示される。全ての試料は、タンパク質約２５ｍｃｇを含有する。試料は、ゲル添加に先立ち、還元されず、ＳＤＳに曝露されるか、または加熱された。
【図５】抗ｒｈＣＣ１０抗体を用いたｒｈＣＣ１０  ＮａＯＣｌ反応物のＩＥＦゲルのウエスタンブロットの図である。ＩＥＦゲルは、ｐＨ範囲３〜７をカバーし、ＰＶＤＦメンブレンにブロットされ、次に、タンパク質Ａで精製された、非修飾ｒｈＣＣ１０を抗原として用いて調製されたウサギポリクローナル抗体でプローブされた。ＮａＯＣｌ反応条件で修飾されたｒｈＣＣ１０の調製物は、レーンの記載に示される。全ての試料は、タンパク質約２５ｍｃｇを含有する。試料は、ゲル添加に先立ち、還元されず、ＳＤＳに曝露されるか、または加熱された。
【図６】抗ＤＮＰ抗体を用いた、ＤＮＰＨで処理されたｒｈＣＣ１０  ＮａＯＣｌ反応物のウエスタンブロットの図である。１０〜２０％トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、修飾ｒｈＣＣ１０調製物にて実行された。ＮａＯＣｌ反応産物は、ＭＰＯおよびｍＣＰＢＡ反応産物と並行して実行された。ゲルはＰＶＤＦにブロットされ、次に、ウサギポリクローナル抗ＤＮＰ抗体（市販）でプローブされた。試料は、添加に先立ち、還元されないが、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ添加液と混合され、６５℃まで１５分間加熱された。非修飾ｒｈＣＣ１０、並びにＭＰＯおよびｍＣＰＢＡ反応産物は、用いられた条件下で、抗体により認識されなかった。ＮａＯＣｌ反応産物のみが、検出可能なＤＮＰを含有し、これは、これらの調製物におけるカルボニル基の存在を示していた。
【図７】ｍＣＰＢＡ酸化産物のＨＰＬＣ分析の図である。非修飾ｒｈＣＣ１０および増加した当量数のｍＣＰＢＡ酸化剤と反応させたｒｈＣＣ１０の調製物が、Ｃ−１８カラムを用いた逆層ＨＰＬＣにより分析された。矢印は、反応混合物中の非修飾ｒｈＣＣ１０ピークを指す。示されたそれぞれのＨＰＬＣ実行について、それぞれの試料中のタンパク質約２５ｍｃｇが添加された。
【図８】ｒｈＣＣ１０  ｍＣＰＢＡ反応物の等電点電気泳動の図である。ＩＥＦゲルは、ｐＨ範囲３〜７をカバーした。増加量のｍＣＰＢＡで修飾されたｒｈＣＣ１０の調製物；それぞれのレーンについて、酸化剤の当量数が示され、２点の異なる温度が試験された。全ての試料は、タンパク質約２５ｍｃｇを含有する。試料は、ゲル添加に先立ち、還元されず、ＳＤＳに曝露されるか、または加熱された。
【図９】抗ｒｈＣＣ１０抗体を用いた、ｒｈＣＣ１０  ｍＣＰＢＡ反応物のＩＥＦゲルのウエスタンブロットの図である。ＩＥＦゲルは、ｐＨ範囲３〜７をカバーし、ＰＶＤＦメンブレンにブロットされ、次に、タンパク質Ａで精製された、ｒｈＣＣ１０に対して生じたウサギポリクローナル抗体でプローブされた。増加量のｍＣＰＢＡで修飾されたｒｈＣＣ１０の調製物；それぞれのレーンについて、酸化剤の当量数が示され、２点の異なる温度が試験された。全ての試料は、タンパク質約２５ｍｃｇを含有する。試料は、ゲル添加に先立ち、還元されず、ＳＤＳに曝露されるか、または加熱された。
【図１０】更なる条件のｒｈＣＣ１０  ｍＣＰＢＡ反応物の等電点電気泳動の図である。ＩＥＦゲルは、ｐＨ範囲３〜７をカバーした。ＣａＣｌ２の存在下、およびはるかに多い酸化剤当量数の比較を含む、更なる条件下でのｍＣＰＢＡで修飾されたｒｈＣＣ１０の調製物。全ての試料は、タンパク質約２５ｍｃｇを含有する。試料は、ゲル添加に先立ち、還元されず、ＳＤＳに曝露されるか、または加熱された。
【図１１】ｍＣＰＢＡ反応産物、ＣＣ１０アイソフォームの精製および質量スペクトル分析の図である。Ｃ−１８  ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて、ｍＣＢＰＡ反応混合物由来の異なるピークとして表される、８つの個々のＣＣ１０アイソフォームのそれぞれを分離させた。この実施例において、３番のピークが回収され、純度を推定するためにＨＰＬＣにて再実行され、次に、質量スペクトル分析（エレクトロスプレーイオン化方法）にかけられた。矢印は、この実施例で精製されたピークを指す。全ての試料は、タンパク質約２５ｍｃｇを含有する。ＥＳＩ−ＭＳ分析の結果は、パネルＤに示される。
【図１２】ＭＰＯ−Ｈ２Ｏ２反応の最適化、ＣａＣｌ２の作用の図である。反応をモニターするために、２ｍＭ  ＣａＣｌ２あり、またはなしでのＭＰＯ−Ｈ２Ｏ２反応がＣ−１８  ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて比較された。全ての反応は、暗所で、クエン酸緩衝液中、ｐＨ５．０、５０酸化剤当量のＨ２Ｏ２を用いて、３７℃で合計６０分間行われた。矢印は、非修飾ｒｈＣＣ１０に対応するピークを指す。全ての試料は、タンパク質約２５ｍｃｇを含有する。
【図１３】ＭＰＯ−Ｈ２Ｏ２酸化産物のＨＰＬＣ分析の図である。２ｍＭ  ＣａＣｌ２とのＭＰＯ−Ｈ２Ｏ２反応は、Ｃ−１８  ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて、増加量のＭＰＯおよびＨ２Ｏ２でモニターされた。全ての反応は、暗所で、クエン酸緩衝液中、ｐＨ５．０、５０酸化剤当量のＨ２Ｏ２を用いて、３７℃で合計３０分間行われた。矢印は、非修飾ｒｈＣＣ１０に対応するピークを指す。全ての試料は、タンパク質約２５ｍｃｇを含有する。
【図１４】ｒｈＣＣ１０  ＭＰＯおよびＨ２Ｏ２反応物の等電点電気泳動の図である。ＩＥＦゲルは、ｐＨ範囲３〜７をカバーした。増加量のＭＰＯで修飾されたｒｈＣＣ１０の調製物。全ての反応は、暗所で、クエン酸緩衝液中、ｐＨ５．０、５０酸化剤当量のＨ２Ｏ２を用いて、３７℃で１時間または２４時間行われた。全ての試料は、タンパク質約２５ｍｃｇを含有する。試料は、ゲル添加に先立ち、還元されず、ＳＤＳに曝露されるか、または加熱された。
【図１５】抗ｒｈＣＣ１０抗体を用いたｒｈＣＣ１０  ＭＰＯおよびＨ２Ｏ２反応物のＩＥＦゲルのウエスタンブロットの図である。ＩＥＦゲルは、ｐＨ範囲３〜７をカバーし、ＰＶＤＦメンブレンにブロットされ、次に、タンパク質Ａで精製された、ｒｈＣＣ１０に対して生じたウサギポリクローナル抗体でプローブされた。増加量のＭＰＯで修飾されたｒｈＣＣ１０の調製物。全ての反応は、暗所で、クエン酸緩衝液中、ｐＨ５．０、５０酸化剤当量のＨ２Ｏ２を用いて、３７℃で１時間または２４時間行われた。全ての試料は、タンパク質約２５ｍｃｇを含有する。試料は、ゲル添加に先立ち、還元されず、ＳＤＳに曝露されるか、または加熱された。
【図１６】ＭＰＯ−Ｈ２Ｏ２反応由来のＣＣ１０アイソフォームの精製および質量スペクトル分析の図である。Ｃ−１８  ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて、ＭＰＯ−Ｈ２Ｏ２反応混合物由来の異なるピークとして表され、９〜１７の番号を付けられた、８つの個々のＣＣ１０アイソフォームのそれぞれを分離させた。この実施例において、１０番のピークが回収され、純度を推定するためにＨＰＬＣにて再実行され、次に、質量スペクトル分析（エレクトロスプレーイオン化方法）にかけられた。矢印は、この実施例で精製されたピークを指す。全ての試料は、タンパク質約２５ｍｃｇを含有する。ＥＳＩ−ＭＳ分析の結果は、パネルＤに示される。
【図１７】ペルオキシ亜硝酸酸化産物のＨＰＬＣ分析の図である。ｒｈＣＣ１０のペルオキシ亜硝酸との反応は、Ｃ−１８  ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて、増加数の酸化剤当量でモニターされた。反応は、水中、室温、暗所で１時間行われた。矢印は、非修飾ｒｈＣＣ１０に対応するピークを指す。全ての試料は、タンパク質約２５ｍｃｇを含有する。
【図１８】ｒｈＣＣ１０のペルオキシ亜硝酸により媒介される酸化に対するｐＨおよびＣａＣｌ２の作用の図である。ＣａＣｌ２の存在下および不存下、並びに異なるｐＨでのｒｈＣＣ１０のペルオキシ亜硝酸との反応は、Ｃ−１８  ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて、増加数の当量数の酸化剤でモニターされた。反応は、酸化剤１０当量を用いて、室温、暗所で１時間行われた。矢印は、非修飾ｒｈＣＣ１０に対応するピークを指す。全ての試料は、タンパク質約２５ｍｃｇを含有する。
【図１９】ペルオキシ亜硝酸反応産物のウエスタンブロット分析の図である。１０〜２０％トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、修飾ｒｈＣＣ１０調製物にて実行された。ゲルはＰＶＤＦにブロットされ、次に、ウサギポリクローナル抗ニトロチロシン抗体（市販）でプローブされた。タンパク質１０ｍｃｇを含有する試料は、添加に先立ち、還元されないが、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ添加液と混合され、６５℃まで１５分間加熱された。非修飾ｒｈＣＣ１０は、抗体により認識されなかった。
【図２０】ｒｈＣＣ１０タンパク質で検出された、ＲＯＳおよびＲＮＳのセクレトグロビン反応産物の図である。ｒｈＣＣ１０で観察された酸化修飾反応産物；酸素のメチオニンへの付加、ニトロ基のチロシンへの付加、ＤＮＰＨとの反応性の高いカルボニル基の形成の概要図。
【図２１】トランスグルタミナーゼによるｒｈＣＣ１０の修飾の図である。ＴＧ２および４．５ｍＭカルシウムを、２つの異なるビオチン化アミン化合物と一緒に用いた、ｒｈＣＣ１０のｉｎ ｖｉｔｒｏ反応のウエスタンブロット。反応は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中、ｐＨ８．０、１．５ｍＭ  ＤＴＴで、ＴＧ２酵素５マイクロ単位を用いて、３７℃で６０分間行われた。反応は、１０〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥトリシンゲルにて実行され、ＰＶＤＦメンブレンにブロットされ、ビオチンを認識するストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体でプローブされた。全てのレーンは、ジスルフィド結合を取り除くための還元剤を含有する。
【図２２】修飾ｒｈＣＣ１０による、ウイルスの複製の増強された阻害の図である。２つの株のインフルエンザによる感染ありおよびなし、並びに１ｍｇ／ｍｌの非修飾ｒｈＣＣ１０および修飾ｒｈＣＣ１０の存在下での細胞の生存を示すニュートラルレッドアッセイ。
【図２３】修飾ｒｈＣＣ１０による好中球走化性の増強された阻害の図である。１００ｍｃｇ／ｍｌの非修飾ｒｈＣＣ１０（CC10-A）、ＮａＯＣｌで修飾されたｒｈＣＣ１０（CC10-B）、およびｍＣＢＰＡで修飾されたｒｈＣＣ１０（CC10-C）の存在下で分化させた、遊走し分化したＰＬＢ−９８５細胞の蛍光測定値。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
ＲＯＳ、ＲＮＳ、および酵素活性、例えば、ＭＰＯおよびＴＧ２によるセクレトグロビンの修飾は、詳細に研究されていない。先行する報告は、天然のＣＣ１０が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、呼吸促迫症における急性炎症反応中に修飾され、抗ＣＣ１０抗体との交差反応性、および非修飾ＣＣ１０（ｐＩ約４．８）と異なる等電点によりこれまでに同定され、生物学的体液試料中の優勢形態である、新規アイソフォームを生じることを示唆する。ＣＣ１０は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組織トランスグルタミナーゼの基質であることも報告されている。マルチマーを安定化させ、中心の疎水性空洞へのアクセスを制御する際のＣｙｓ残基の役割以外に、任意のセクレトグロビン中の任意のアミノ酸の酸化の公知の生理学的役割はない。Ｃｙｓ残基およびＭｅｔ残基の可逆的酸化は、ＣＣ１０および他のセクレトグロビンが、有害なＲＯＳを局所環境から除去することができ、これにより、炎症反応中に組織を温存する、保護的生理機序であると、本発明者らは考えている。セクレトグロビン中のＣｙｓ残基およびＭｅｔ残基の酸化状態は、生化学的特性および生物学的特性に影響するが、機能の喪失を生じるタンパク質損傷を表さず、むしろ酸化されたセクレトグロビンの特性および機能が調節されると、本発明者らは更に考えている。同様に、他のセクレトグロビンアミノ酸、例えば、チロシン、リシン、グルタミン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、アルギニン、スレオニン、プロリン、ヒスチジン、およびトリプトファンの酸化修飾および／または酵素修飾は、タンパク質損傷を表さないが、むしろ異なる活性または増強された活性を可能にする生化学的特性および生物学的特性を調節する。
【００８０】
公知の、特定のＲＯＳ、ＲＮＳ、およびＭＰＯにより媒介されるアミノ酸修飾の大部分は、タンパク質損傷および機能の喪失と関連する。酸化されたタンパク質の蓄積は、疾患および加齢プロセスと関連する（Berlett and Stadtman, 1997）。しかしながら、可逆的酸化の認知は、タンパク質機能を修飾する制御機序として登場し、タンパク質を不活性化する損傷の形態であるだけではない。全ての８つのヒトセクレトグロビンは、Ｎ末端およびＣ末端の保存されたシステイン間のジスルフィド結合が、ホモダイマーおよびヘテロダイマー、テトラマー、並びにより多量のマルチマーを安定化する、天然で酸化された状態に典型的に存在すると考えられているＣｙｓ残基を含有する。セクレトグロビン、詳細には、呼吸性セクレトグロビン、ＣＣ１０、ＳＣＧＢ３Ａ１、およびＳＣＧＢ３Ａ２中の全てのシステインは、酸化、および分子間または分子内ジスルフィド結合の形成の影響を潜在的に受けやすい。ＣＣ１０中のＮ末端のＣｙｓとＣ末端のＣｙｓの間のジスルフィド結合は、そうでなければダイマーをモノマーに分離する条件、例えば、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で、ホモダイマーを確かに安定化する。同様に、ＳＣＧＢ３Ａ２の内部のＣｙｓ（図１に示される配列のCys60）は、ホモダイマーをｉｎ ｖｉｔｒｏで安定化する。ＣＣ１０またはＳＣＧＢ３Ａ２のダイマー対モノマーまたは他のマルチマーに帰する機能性は特にない。しかしながら、ＣＣ１０とＳＣＧＢ３Ａ２の両方が、酸化剤を必要とすることなく、自発的にｉｎ ｖｉｔｒｏでホモダイマーを形成するので、ダイマー以外の形態の生化学的特性または生物学的活性の違いを評価することは可能ではなかった。これらのホモダイマーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで非常に安定であるが、任意の所定の水性環境におけるモノマーとダイマーの間の平衡が存在し、ダイマーに対してより高い割合のモノマーおよび／またはテトラマーに有利である緩衝液の条件を変更することが可能である。ダイマーは、ヒトおよび動物に投与された最初の形態であるにも関わらず、多数の還元可能な形態および還元不可能な形態が、生物学的体液から回収され得る（Antico, 2006）。生理的に、肺におけるｉｎ  ｖｉｖｏグルタチオン酸化還元系は、呼吸性セクレトグロビン、および肺で見られ得る他のセクレトグロビン中のジスルフィド結合の可逆的酸化を恐らく媒介する。
【００８１】
ＣＣ１０の生理学的役割は、中心の疎水性空洞に取り込まれ、結合し、これにより、局所組織環境から取り除かれ得る毒性またはそうでなければ有害な疎水性部分の除去であると提案されている（Peter, 1992、Hard, 1995、Umland, 1992、1994）。それぞれのＣＣ１０ダイマー中のモノマー成分のＣｙｓ残基（Cys3とCys69）間のジスルフィド結合は、疎水性部分が中心の疎水性空洞に入り、次に、それをここにトラップすることを可能にするジスルフィド結合を形成し、壊すためのＣｙｓ残基の可逆的酸化により開き、閉じるゲートの様に振る舞うと考えられる。いくつかの研究は、ダイマー内部での推定ｉｎ  ｖｉｖｏＣＣ１０リガンドの強力な結合、例えば、ポリ塩化ビフェニルとプロゲステロン、および特定の残基、例えば、Ｐｈｅ６およびＴｙｒ２１が、リガンド結合を安定化させることが報告されている（Callebaut, 2000）。
【００８２】
全てのセクレトグロビンは、酸化および酵素アミノ酸修飾の影響を受けやすいアミノ酸を有意な割合で含有する。ＣＣ１０のそれぞれ７０アミノ酸モノマーは、表１に挙げられた、ＲＯＳおよびＲＮＳが関与する生理学的プロセスにより酸化され得る合計４２個のアミノ酸（７０個の中から、＞５０％）を含有しており、多数のＲＯＳおよびＲＮＳ反応産物、ａｋａアイソフォームの可能性を開く。ＴＧはまた、セクレトグロビンを他のタンパク質に架橋するだけでなく、そのグルタミン、リシン、およびシステイン残基を介して脂質または他の部分をセクレトグロビンに結合させるために用いられ得る。以下の実施例で説明される通り、これはｒｈＣＣ１０での場合であることを、本発明者らはここで見出し、ここで、酸化修飾および酵素修飾により、単離され、特性決定し得る複数のアイソフォームが生じる。酸化修飾ｒｈＣＣ１０を含有する調製物はウイルスの複製および好中球走化性の阻害の増強も媒介し、既存の非修飾ＣＣ１０薬物調製物に対する有意な改善を表す。更に、生物学的試料に含有されるか、またはこれから単離されるＣＣ１０アイソフォームを判定するための標準としての、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの修飾ｒｈＣＣ１０調製物の使用は、慢性疾患および急性状態における肺の状態のバイオマーカーとしての天然のＣＣ１０アイソフォームの評価を可能にする。従って、酸化または酵素アミノ酸修飾の不存下で、セクレトグロビンは、特定の細胞種に対する作用を有し得ないが、修飾が、細胞表面受容体、細胞シグナル分子、脂質、リガンド、構造タンパク質、または他の細胞間成分若しくは細胞外成分への結合を可能にするか、または無効にするので、修飾後に異なる作用を有する。それ故、セクレトグロビンの生化学的特性および生物学的特性に対する酸化および／または酵素アミノ酸修飾の作用は、非修飾調製物を用いては従来可能でなかった、薬理作用を媒介する際の修飾セクレトグロビンの使用、並びに癌、呼吸器系疾患、自己免疫疾患、急性または慢性感染症、アレルギー、代謝性疾患、心血管疾患、血液障害、および煙、化学的汚染物質、毒物または他の侵襲への曝露を有する患者を含むが、これらに限定されない、様々な患者における疾患状態のバイオマーカーとして、天然のセクレトグロビンの新規アイソフォームを評価するための標準としての使用の新規可能性を広げる。
【実施例】
【００８３】
実施例１．ＲＯＳ、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）によるｒｈＣＣ１０の化学修飾
ＮａＯＣｌ（９．２μＬ、水中の０．０５％溶液、６２．１ｎｍｏｌ、５当量）を、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４または純粋な水中のタンパク質（０．２ｍｇ、１２．４２ｎｍｏｌ）の溶液に加えること、少しの間混合すること、および氷上で１５分間、暗所でインキュベーションすることにより、それぞれの反応を約４℃（氷上）で開始した（全容積０．２ｍＬ）。Ｌ−メチオニン（９．３μＬ、水中の１０ｍＭ、９３．１５ｎｍｏｌ）を加えることにより、反応をクエンチし、次に、２０分間インキュベーションし、室温まで温めた。
【００８４】
１〜１００の範囲の酸化剤の当量数（「酸化剤当量」）を用いて、いくつかの反応を行った。ｒｈＣＣ１０の酸化をＨＰＬＣを用いてモニターし、ここで、図２に示す通り、新規の修飾したアイソフォームは、新規ＨＰＬＣピークとして出現し、修飾していないｒｈＣＣ１０より早く溶出した。反応物をＳｐｅｅｄｖａｃにより濃縮し、次に、水に再懸濁した。それぞれの試料約２５μｇを、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００システムのＨＰＬＣカラム（VYDAC Polymeric C18カラム３００Å、５μｍ、２．１ｍｍ×２５０ｍｍ、カタログ番号２１８ＴＰ５２）に、以下の通りの移動層、Ａ、水、Ｂ、９５％アセトニトリルおよび５％水（共に、０．１％ＴＦＡを含有する）を用いて、流速０．３ｍＬ／分で注入した。２１４ｎｍでのＵＶ吸収により、出力をモニターした。
【００８５】
ＮａＯＣｌの酸化剤当量数が増加するにつれ、ｒｈＣＣ１０アイソフォームの数並びにピークの高さが増大し、これは、反応が進行するにつれ、それぞれのアイソフォームの量が増大することを示した。酸化剤２０当量で、ＨＰＬＣは、修飾していないｒｈＣＣ１０の本質的に全てが消失し、修飾したアイソフォームのみが残ることを示す。図３に示す通り、還元条件下でのこれらの調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、予測したモノマータンパク質（６ｋＤａ）を示したが、ダイマー（約１２ｋＤａ）、テトラマー（約２４ｋＤａ）、ヘキサマー（約３２ｋＤａ）、およびより多量のマルチマーのバンドが残っていることも示した。これは、ＣＣ１０により形成したテトラマーの第１の報告であり、トランスグルタミナーゼ活性の不存下での還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件に安定である。モノマーの存在および優勢は、ｒｈＣＣ１０のアミノ酸配列が大部分未変化であることを示す。１００の酸化剤当量でさえ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のかすかなＣＣ１０モノマー、ダイマー、テトラマー、およびより多量のマルチマーバンドが存在するが、高い酸化剤当量ではタンパク質の大部分が消失し、破壊されるようである。
【００８６】
修飾ｒｈＣＣ１０および非修飾ｒｈＣＣ１０のＣ−１８カラムとの相互作用は、タンパク質とクロマトグラフィー樹脂の間の疎水性相互作用を反映する。修飾アイソフォームは、非修飾ｒｈＣＣ１０より早く溶出し、これは、修飾タンパク質の表面のアミノ酸残基が、非修飾タンパク質より疎水性でないことを示している。表面疎水性パターンの変化は、表面電荷の変化と恐らく対応し、そしてこれを等電点により測定し得る。図４に示す通り、ｐＨ３〜７の等電点電気泳動ゲルを用いた等電点電気泳動により、試料を分析した。４．５未満のより酸性のアイソフォームへのｐIの進行性のシフトが存在する。２当量および５当量との反応においてｐＩ約５．５のバンドも存在し、これは、２０当量で見えなくなり、反応中間体を表し得る。図５に示す通り、ＩＥＦゲルのウエスタンブロットによるこれらの反応物の分析は、４．５未満の全ての酸性ＮａＯＣｌアイソフォームが、ウサギポリクローナル抗ｒｈＣＣ１０抗体により認識されるが、テトラマーは、ポリクローナル抗ｒｈＣＣ１０抗体により認識されないことを示す。
【００８７】
反応性のカルボニル基の検出により、ｒｈＣＣ１０の化学反応および修飾の程度を推定し得る。図６に示す通り、カルボニル基を、ジニトロフェニルヒドラゾン基（DNP）を加える２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（DNPH）で標識すること、次に、反応産物を抗ＤＮＰ抗体を用いたウエスタンブロットにより分析することにより、ＲＯＳと反応したｒｈＣＣ１０試料におけるカルボニル基の存在を検出し得る。修飾していないＣＣ１０中のモノマーおよびテトラマーのベースラインシグナル（レーン８）が存在し、そしてこれは、反応に用いたＲＯＳの種類に関わらず、全ての他の試料で超過する。それ故、全てのＲＯＳ反応は、カルボニル基を含有するいくつかの種を生じた。修飾していないダイマー、およびＭＰＯおよびｍＣＰＢＡで修飾した調製物中のダイマーは、反応性を示さず、バックグラウンドを阻害さえした（レーン２、３、および８におけるダイマー位置の「ゴーストバンド」を参照）。ＮａＯＣｌ反応においてｒｈＣＣ１０濃度と緩衝液の組合せ作用であるように思われる。レーン４におけるシグナル強度は、レーン５より１０倍を超えて高く、現在のタンパク質において２倍の差により予測したもの以上である。これは、反応を水中で行うとき、より高いｒｈＣＣ１０濃度が、低い濃度より広範な反応をもたらすことを示唆する。レーン４および７におけるシグナル強度は、レーン７が半分のタンパク質を含有するにも関わらず、同等であり、これは、反応が、水中より１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中でより効率的であることを示している。同量のタンパク質が存在するにも関わらず、レーン６におけるシグナル強度は、レーン７におけるものよりずっと低い。これらの知見は、緩衝液の存在下で、ｒｈＣＣ１０濃度がより低いとき、ＮａＯＣｌ反応がより効率的であることを示している。それ故、反応効率に対するｒｈＣＣ１０濃度の作用は、水中対緩衝液中で反対である。これらの差は、ＮａＯＣｌでのｒｈＣＣ１０の化学修飾のプロセスをどのように最適化するかを説明する。例えば、ＣＣ１０のＮａＯＣｌにより媒介される化学修飾の最適化プロセスは、低い強度のリン酸緩衝液の存在下、中性ｐＨでのより低濃度のｒｈＣＣ１０の使用に関係するだろう。
【００８８】
実施例２：ＲＯＳ、ｍＣＰＢＡによるｒｈＣＣ１０の化学修飾
メタクロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）（６．２１μＬ、水中の２ｍＭ、１２．４２ｎｍｏｌ、２当量）を一度で水中のタンパク質（０．１ｍｇ、６．２１ｎｍｏｌ）の溶液に２４℃で加えること、および１５分間、暗所で、時々撹拌しながらインキュベーションすることにより、それぞれの反応を約２４℃（室温）で開始した（全容積０．２ｍＬ）。Ｌ−メチオニン（１．８μＬ、水中の１０ｍＭ、１８．６ｎｍｏｌ）の添加により、反応を停止させ、２４℃で２０分間インキュベーションした。２〜１００の範囲にあるｍＣＰＢＡの酸化剤当量を用いて、いくつかの反応を行った。
【００８９】
ＨＰＬＣを用いて、ｒｈＣＣ１０の酸化をモニターした。反応物をＳｐｅｅｄｖａｃにて濃縮し、次に、水に再懸濁した。ＮａＯＣｌ反応と同様に、それぞれの試料約２５μｇをＨＰＬＣに注入した。図７に示す通り、新規の修飾したアイソフォームが新規ＨＰＬＣピークとして出現し、修飾していないｒｈＣＣ１０より早く溶出した。図８に示す、ｍＣＰＢＡ反応物の等電点電気泳動により、ｐI４．５〜５．２の範囲（４．６、４．７、４．９、５．１、５．２）の新規アイソフォーム、５．３（約５．５、約５．８）より上の２つのアイソフォーム、および４．５未満（約４．３）の１つのアイソフォームの集団を含む、複数の新規アイソフォームを生成したことが明らかになった。これらの更なる８つのバンドは、ｐI４．８の多数のバンド、および約４．６５での少数のバンドを有する元々の修飾していないｒｈＣＣ１０と異なった。反応の最適化における重要なパラメーターは温度である。反応温度、４℃対２１℃は、生成物、またはそれぞれの生成物の見かけの割合に影響しなかった。図９に示す、ＩＥＦゲルのウエスタンブロットは、これらのアイソフォームの大部分は、ｒｈＣＣ１０に対して生じたウサギポリクローナル抗体により認識されることを示した。しかしながら、ＮａＯＣｌ反応により生成したテトラマー形態と同様に、ｐI４．３のバンドは、抗ｒｈＣＣ１０抗体により認識されず、これは、ｍＣＰＢＡ１０当量を用いたとき、タンパク質の構造が劇的に変化することを示唆している。４．８の主要な免疫反応性のバンド下のアイソフォームも、ＩＥＦゲルにおける染色強度に基づき予測されるものより、小さいシグナルを示した。反応条件の更なる分析は、ＣａＣｌ２の存在が、ｍＣＰＢＡによるｒｈＣＣ１０の修飾を防ぎ得ること（図１０、レーン２）、ｍＣＰＢＡ１００当量が、より酸性のアイソフォーム（ｐI４．０、４．３、４．５、レーン４）のみを残して、元々の修飾していないタンパク質の全てを完全に除去すること、および反応をあまりに長く実行した場合、ｒｈＣＣ１０を壊すこと（レーン３）を示した。
【００９０】
図１１に示す通り、ｍＣＰＢＡ反応で生成したＣＣ１０アイソフォームを更に特徴付けるために、８つの別々の主要なＨＰＬＣピーク（１〜８と番号を付けられた）のそれぞれのタンパク質試料を回収し、Ｓｐｅｅｄｖａｃを用いて濃縮し、１つのピーク、例えば、ピーク３を表すための繰返しＨＰＬＣにより検証した。次に、試料を、それぞれのアイソフォームの分子量を得るためのエレクトロスプレー質量分析（ESI-MS）により分析した。表２は、個々のＨＰＬＣピークに含有されるアイソフォームのＭＳ分析の結果を示す。全てのＣＣ１０アイソフォームは、修飾していない形態より大きな分子量（MW）を有し、ＭＷ１６，１１０ダルトン（Da）を有する。酸素の添加により１６Ｄａが加わった。ｍＣＰＢＡ反応は、他のアミノ酸を修飾する前に、メチオニン残基を酸化した。８つのうち５つのピークの平均質量を、１６の倍数により増大させる（例えば、ピーク２、４、５、６、および８）ので、これは明らかである。ピーク３は、１６の倍数でさえ増大せず、このピークは、酸素の平均数が５．２５であるか、または酸素の単純な添加より複雑な修飾を表し得るダイマーを含む。ピーク１および７は、使用可能な質量スペクトルを生じなかった。
【００９１】
【表２】
2020055833.tif 000003
【００９２】
実施例３：ＲＯＳ、ミエロペルオキシダーゼ酵素（MPO）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）によるｒｈＣＣ１０の化学修飾
ＨＰＬＣを用いて、ＭＰＯおよびＨ２Ｏ２によるｒｈＣＣ１０の修飾をモニターした。任意のＣＣ１０修飾が観察される前に、ｒｈＣＣ１０のＭＰＯ−Ｈ２Ｏ２との反応は、広範な最適化を必要とした。リン酸緩衝食塩水（PBS）、ｐＨ７．４中、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の不存下で行った最初の反応は不成功であった。新規ＨＰＬＣピークの数および高さの非常にわずかな増大が、リン酸緩衝液中、中性ｐＨ、増加量のＭＰＯおよびＨ２Ｏ２で達成された。しかしながら、図１２に示す通り、クエン酸緩衝液を用いてｐＨを５まで下げること、およびＣａＣｌ２の添加は、新規ＨＰＬＣピークとして検出可能なＣＣ１０反応産物を劇的に増大した。カルシウムを加え、ｐＨを最適化したら、ＭＰＯおよびＨ２Ｏ２酸化剤当量の量を再度最適化し、純粋なＭＰＯ濃度およびＨ２Ｏ２濃度を示す再生成可能なＨＰＬＣピークパターン、および時間依存性のピーク発達を観察した。簡単に言うと、２ｍＭ  ＣａＣｌ２中のタンパク質（０．１ｍｇ、６．２１ｎｍｏｌ）の溶液、および１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５）を、３７℃で３０分間インキュベーションした。ＭＰＯ（２．５μＬ、水中の１０μｇ／ｍＬ、２５ｎｇ）およびＨ２Ｏ２（１．５５μＬ、水中の１００ｍＭ、１５５．２５ｎｍｏｌ、２５当量）を加えることにより、反応を３７℃で開始し、３７℃で３０分間、暗所で時々撹拌しながらインキュベーションした。ＭＰＯ（２５ｎｇ）およびＨ２Ｏ２（１．５５μＬ）溶液の別のアリコートを加え、同じ温度で更に３０分間、撹拌しながらインキュベーションした（全容積０．２ｍＬ）。Ｌ−メチオニン（４．６６μＬ、水中の０．１Ｍ、０．４６６μｍｏｌ）の添加により、反応を停止させ、３７℃で３０分間インキュベーションした。ＮａＯＣｌおよびｍＣＰＢＡ反応と同様に、反応物をＳｐｅｅｄｖａｃにて典型的に濃縮し、次に、水に再懸濁し、それぞれの試料約２５μｇをＨＰＬＣに注入した。図１３に示す通り、修飾したアイソフォームは、新規ＨＰＬＣピークとして出現し、修飾していないｒｈＣＣ１０より早く溶出する。
【００９３】
図１４に示す、ＭＰＯおよびＨ２Ｏ２反応物の等電点電気泳動は、５．５のアイソフォームおよび４．７未満の１つ以上のアイソフォームを含む、変化した等電点を有する２つのアイソフォームのみを生成したことを明らかにした。修飾していないＣＣ１０は、ＩＥＦゲルにおいて４．８の多数のバンドおよび４．７の少数のバンドとして時に出現する（それぞれ、恐らくダイマーおよびモノマー）。少数のバンドを失わないように、ゲルに、それぞれの調製物２５ｍｃｇを添加した。それ故、ＨＰＬＣにより観察した複数のピーク（ｎ＝８）は、ＩＥＦ上の新規バンド数（ｎ≧２）と一致しない。これは、ＨＰＬＣにより疎水性相互作用に基づき分離した、顕著には、少なくとも６つのアイソフォームが、修飾していないＣＣ１０と同一の表面電荷を保持することを示す。図１５に示す、同一のＩＥＦゲルのウエスタンブロットは、これらのｐI４．８のアイソフォームが、修飾していないｒｈＣＣ１０に対して生じたウサギポリクローナル抗体により認識されることを示した。
【００９４】
図１６に示す通り、ＭＰＯ−Ｈ２Ｏ２反応で生成したＣＣ１０アイソフォームを更に特徴付けるために、８つの主要な分離可能なＨＰＬＣピーク（９〜１７の番号を付けられた）のそれぞれのタンパク質試料を回収し、Ｓｐｅｅｄｖａｃを用いて濃縮し、１つのピーク、例えば、ピーク１０を表すための繰返しＨＰＬＣにより検証した。次に、試料をエレクトロスプレー質量分析（ESI-MS）により分析して、それぞれのアイソフォームについての分子量を得た。表３は、ＭＳ分析の結果を示す。全てのＣＣ１０アイソフォームは、ＭＷ１６，１１０ダルトン（Da）を有する、修飾していない形態より大きい分子量（MW）を有していた。ｍＣＰＢＡアイソフォームとは対照的に、ＭＰＯ−Ｈ２Ｏ２アイソフォームはいずれも、１６の倍数である分子量の増大（例えば、酸素の簡単な添加）を示さなかった。試験した条件下での修飾は、酸素、塩素、または他の付加物の添加、並びにカルボニル基の形成のいくつかの組合せを含み得る。
【００９５】
【表３】
2020055833.tif 000004
【００９６】
実施例４：ＲＮＳ、ペルオキシ亜硝酸によるｒｈＣＣ１０の化学修飾
ＨＰＬＣを用いて、ペルオキシ亜硝酸によるｒｈＣＣ１０の修飾をモニターした。市販ペルオキシ亜硝酸試薬（１０〜１００当量）をタンパク質０．１ｍｇに加えること（全反応容積０．２ｍＬ）、簡単に撹拌すること、および１時間、暗所でインキュベーションすることにより、それぞれの反応を約２３℃（室温）で開始した。反応物をＳｐｅｅｄｖａｃにて典型的に濃縮し、次に、水に再懸濁し、他の反応と同様に、それぞれの試料約２５μｇをＨＰＬＣに注入した。図１７に示す通り、修飾したアイソフォームは、新規ＨＰＬＣピークとして出現し、修飾していないｒｈＣＣ１０より早く、および遅くの両方で溶出した。修飾していないＣＣ１０と同一の保持時間で溶出するピークに加えて、１０当量を用いて４つの新たな主要なピークが明らかである。２０当量を超える使用は、ピークの喪失を生じ、修飾していないＣＣ１０より若干早く溶出するポイントで中心にある、長い隆起に広がる。この広範な隆起パターンは、膨大な数の修飾およびアイソフォームが生成されることを示す。ＨＰＬＣピークの分解の喪失を仮定すると、１０当量が更なる実験で用いる最大値であった。図１８に示す通り、３〜６の範囲のｐＨ（１０ｍＭクエン酸緩衝液）で、２ｍＭ  ＣａＣｌ２あり、およびなしで、更なる最適化を行った。ＭＰＯ−Ｈ２Ｏ２およびｍＣＰＢＡと対照的に、カルシウムおよびｐＨが、反応に対して有意な作用を有する場合、ペルオキシ亜硝酸反応産物への明らかな影響はなかった。
【００９７】
それぞれのＣＣ１０モノマーは１つのチロシンを含有し、これらの結果が示すものは、ＲＮＳの存在下でのニトロ化の影響を受けやすい。ペルオキシ亜硝酸との反応が進むにつれ、分子間の結合は、ジチロシン複合体を異なるモノマー中に形成し得る。図１９のＳＤＳ−ＰＡＧＥのウエスタンブロットにより示される通り、ペルオキシ亜硝酸反応により生成されたアイソフォームは、より巨大な共有結合した複合体を有する大部分未変化のＣＣ１０であった。ＣＣ１０ペルオキシ亜硝酸反応を、非還元条件下、１〜１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥトリシンゲルにて実行し、ＰＶＤＦメンブレンにブロットし、４％無脂肪乳でブロッキングし、ウサギポリクローナル抗ニトロチロシン抗体でプローブした。ブロットは、免疫反応性のＣＣ１０ダイマー、テトラマー、およびより大きい分子量の複合体の「スメア」を示し、これは、ＣＣ１０モノマー中のチロシン残基が、修飾の影響を受けやすいことを証明している。チロシンのニトロ化は、ダイマーまたはテトラマー安定性を壊さない。このパターンは、チロシンニトロ化が、ジチロシンとジスルフィド結合の両方により一緒に恐らく結合した、巨大な複合体の形成を好むが、ジ−チロシン形成の不存下では簡単なジスルフィド結合の転位（rearrangement）により達成される、熱力学的に好ましいマルチマーの異なるセットは生成しないことを更に示す。
【００９８】
実施例５：トランスグルタミナーゼによるＣＣ１０の修飾
ＣＣ１０は、組織トランスグルタミナーゼ（別名： TG2）のｉｎ ｖｉｔｒｏ基質であることが示され（Manjunath, 1984）、それ自体、および他のタンパク質にグルタミン残基およびリシン残基を介して架橋結合する。アシル供与体／アミン受容体としてのウテログロビン中のグルタミンの有効性の決定を、２つの異なるモノアミン基に結合したビオチンを用いて行った。精製したモルモット肝臓トランスグルタミナーゼおよびモノアミン−ビオチン試薬、５−（ビオチンアミド）ペンチルアミンおよび（＋）−ビオチニル−３，６−ジオキサオクタンジアミンを、販売元から購入した。２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中、１．５ｍＭ  ＤＴＴで反応を行った。適応可能な場合、ＣａＣｌ２を終濃度４．５ｍＭで用いた。カルシウムは、グルタミン残基とリシン残基との架橋結合に必要なＴＧ補助因子である。カルシウムおよび還元剤の不存下で、ＴＧ２は、還元剤で還元され得るマルチマーの「ラダー」の形成をもたらす、ＣＣ１０中のジスルフィド結合の転位を媒介する（示していない）。対象のタンパク質およびアミンを、緩衝液中、カルシウムありまたはなしで、アッセイ容積０．１ｍＬに合わせた。試料を、３７℃で３０分間プレインキュベーションし、その後、トランスグルタミナーゼを添加した。終濃度５０ｍＭのＥＤＴＡを、試料にカルシウムなしで加え、これは陰性対照の役割を果たす。プレインキュベーション後、トランスグルタミナーゼ５μＵをそれぞれの試験管に加え、反応を３７℃で６０分間進めた。６０分後、ＥＤＴＡ（５０ｍＭ）を、カルシウムを含有する試験管に加えて、反応を止めた。ＳＤＳ試料緩衝液１００μＬおよび還元剤（１ｍＭ  ＤＴＴ）をそれぞれの反応に加え、次に、９５℃で１０分間加熱し、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて分離させた。ゲルを、ＰＶＤＦメンブレンにブロットした。５％  ＢＳＡ（２マイクロンのメンブレンを通して濾過した）を用いて、室温で１時間、ブロッキングを行った。インキュベーション間に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．４％）で洗浄を行った。ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体とインキュベーションすることにより、標識したタンパク質のビオチン基を検出した。図２１に示す通り、比色分析試薬（NBT/BCIP）で可視化を行った。結果は、ＣＣ１０中のグルタミンおよびリシンが、ＴＧ２反応のアシル供与体とアシル受容体の両方であることを示す。反応はカルシウム依存性であり、キレート剤でのカルシウムの除去により無効にされる。高分子量のバンドは、１つの複合体当たり少なくとも１つのグルタミン−アミンビオチンアミンと架橋結合したＣＣ１０を表す（１つのモノマーをビオチンタグで標識し、かつ少なくとも１つの他のモノマーに架橋結合させるように）ので、還元可能でない高分子量のバンドは、ＣＣ１０が少なくとも２つの反応性のグルタミンとリシン対を含有することを示す。これは、１級アミン基を含有する部分、例えば、標識、化学物質、脂質、およびペプチドをｒｈＣＣ１０にＴＧ２を用いてカルシウムおよび還元剤の存在下で加え得る一方、スルフィドリル基を含有する他の部分をｒｈＣＣ１０にＴＧを用いて還元剤の不存下で加え得ることも説明する。
【００９９】
実施例６：修飾していないｒｈＣＣ１０と比較した、修飾したｒｈＣＣ１０によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのインフルエンザの複製の増強された阻害
ｒｈＣＣ１０の活性に対する修飾の作用を決定するために、ｒｈＣＣ１０反応物の等しいアリコートをＮａＯＣｌ、ｍＣＰＢＡ、ＭＰＯおよびＨ２Ｏ２、およびペルオキシ亜硝酸と合わせることにより、修飾したｒｈＣＣ１０の１つの統合を作製した。それぞれの反応物由来の全てのＨＰＬＣピークを統合で表す。修飾したｒｈＣＣ１０調製物および修飾していないｒｈＣＣ１０調製物を、利用可能な試料で可能な最高濃度で、ＭＥＭ溶液中８つの半対数希釈液に希釈した。それぞれの希釈液を、８０〜１００％コンフルエントなＭＤＣＫ細胞を有する９６ウェルプレートの５ウェルに加えた。それぞれの希釈液の３つのウェルをウイルス（H1H1またはH5N1）で感染させ、２つのウェルを毒性対照として未感染のまま残した。それぞれのウイルスについての感染効率（MOI）は、０．１〜１．０の間である。培地は、１０Ｕ／ｍＬトリプシンを有するＭＥＭ溶液であった。処理していないウイルス対照ウェルが最大細胞変性効果（CPE）に達した後、次に、プレートをニュートラルレッド染料で約２時間染色し、次に、上清の染料をウェルから取り除き、取り込まれた染料を、５０：５０のＳｏｒｅｎｓｅｎクエン酸緩衝液／エタノールに抽出し、次に、５４０ｎｍでの光学濃度を分光光度計で読み取った。ニュートラルレッド染料を生細胞に取り込ませ、ウイルス感染後に残る細胞の測定値として用いた。結果を図２２に示す。驚くべきことに、修飾したｒｈＣＣ１０調製物は、通常、酸化タンパク質修飾の結果である機能の喪失よりむしろ、２つの株のインフルエンザに対して増強された抗ウイルス活性を示した。
【０１００】
実施例７：修飾していないｒｈＣＣ１０と比較して、修飾したｒｈＣＣ１０によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの好中球走化性の増強された阻害
ヒトＰＬＢ−９８５細胞は、本質的に成熟ヒト好中球にｉｎ ｖｉｔｒｏで分化し得る未成熟の骨髄性白血病細胞株である（Pedruzzi, 2002）。次に、分化したＰＬＢ−９８５細胞を、好中球機能アッセイ、例えば、ｆＭＬＰを含む、様々な刺激に応答した走化性において、抹消血液から単離した実際のヒト好中球の代替として用い得る。ｆＭＬＰは、細菌のみにより産生されるホルミル化ペプチド（Met、Leu、Pro）であり、ｆＭＬＰの供給源に対する濃度勾配に沿って、好中球の遊走を含む、強力な抗炎症反応を誘発する、身体に対する細菌の過剰成長のシグナルである。修飾していないｒｈＣＣ１０と修飾したｒｈＣＣ１０の両方を、このモデルにおいて分化したＰＬＢ−９８５（dPLB-985）の阻害剤として評価した。
【０１０１】
１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃、加湿雰囲気、５％ＣＯ２にて、細胞を成長させた。それぞれの実験の前に、成熟好中球表現型への分化を誘導するために、３００μΜジブチリル環状ＡＭＰを添加した培地にて３日間、ＰＬＢ−９８５細胞を培養した。１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０（RPMI/FBS）（フェノールレッドを含まない）に１０７細胞／ｍｌで、分化したＰＬＢ−９８５細胞を再懸濁した。５μｇ／ｍｌカルセイン−アセトキシメチルエステルと、３７℃で３０分間、暗所で、一定に撹拌しながら、細胞をプレインキュベーションした。次に、細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ／ＦＢＳに２×１０６細胞／ｍｌに再懸濁した。ｄＰＬＢ−９８５細胞を、１００ｍｃｇ／ｍｌ  ｒｈＣＣ１０調製物と、３７℃で６０分間、またはＰＢＳ（５０％）とインキュベーションした。９６ウェルのＣｈｅｍｏＴＸ使い捨て走化性システム（Neuro Probe）を用いて、細胞遊走をモニターした。１０-８ＭのｆＭＬＰ３２μｌで、下のチャンバーのプレートのウェルを充填した。ポリカーボネートフィルター（３μΜ）をプレート上につけ、ｄＰＬＢ−９８５細胞（３０μｌ、６０，０００細胞／ウェル）をフィルター上に置き、３７℃で１２０分間、５％ＣＯ２の存在下、暗所で遊走させた。フィルターをティッシュで優しく拭うことにより、遊走しなかった細胞を取り除いた。
【０１０２】
それぞれ、４８５および５３０ｎｍの励起波長および放出波長を用いて、マイクロプレート蛍光リーダーでフィルター中の細胞の蛍光を測定した。ボトムチャンバーに置くことにより、既知の数のｄＰＬＢ−９８５からの蛍光を得て、標準曲線を作成した（図２３、パネルＢ）。図２３は、修飾していないｒｈＣＣ１０（CC10-A）は、ｆＭＬＰに応答して好中球遊走をわずかに阻害する一方、ＮａＯＣｌにより修飾したｒｈＣＣ１０（CC10-B）とｍＣＰＢＡにより修飾したｒｈＣＣ１０（CC10-C）は共に、好中球遊走を有意に高い程度まで阻害することを示す。これらの反応が、より頻繁には酸化修飾の結果である、機能のより典型的な喪失を引き起こすよりむしろ、ｒｈＣＣ１０活性を増強することを発見したことは、驚くべきことであった。
【０１０３】
定義
セクレトグロビン。保存された４つのヘリックス束モチーフを有し、大きさが約５０〜１００のアミノ酸長の範囲にある、ＣＣ１０ファミリーにおけるヒトおよび非ヒトタンパク質を含む、一種のタンパク質。ヒトセクレトグロビンは図１に示される。
【０１０４】
合成セクレトグロビン。化学的プロセスまたは組換えプロセスにより作製され、天然の供給源から単離されない、セクレトグロビン。
【０１０５】
非修飾セクレトグロビンタンパク質。ホモダイマーおよびヘテロダイマーにおいてシステイン残基間の自然発生するジスルフィド結合以外に化学的または酵素的に修飾アミノ酸残基を含有しない、セクレトグロビンモノマー、ダイマー、または他のマルチマー。
【０１０６】
非修飾ＣＣ１０タンパク質。システイン残基間のジスルフィド結合以外に、化学的または酵素的に修飾アミノ酸残基を含有しない、ＣＣ１０モノマー、ダイマー、または他のマルチマー。
【０１０７】
修飾されたセクレトグロビン（又は修飾セクレトグロビン）。１つ以上の化学的または酵素的に修飾アミノ酸残基を含有する、セクレトグロビンモノマー、ダイマー、または他のマルチマー。
【０１０８】
修飾された合成セクレトグロビン（又は修飾合成セクレトグロビン）。１つ以上の化学的または酵素的に修飾アミノ酸残基を含有する、合成セクレトグロビンモノマー、ダイマー、または他のマルチマー。
【０１０９】
修飾されたＣＣ１０（又は修飾ＣＣ１０）。１つ以上の化学的または酵素的に修飾アミノ酸残基を含有する、ＣＣ１０モノマー、ダイマー、または他のマルチマー。
【０１１０】
修飾された組換えヒトＣＣ１０（又は修飾組換えヒトＣＣ１０）。組換えＤＮＡ方法により作製され、１つ以上の化学的または酵素的に修飾アミノ酸残基を含有する、ＣＣ１０モノマー。
【０１１１】
修飾された合成ＣＣ１０（又は修飾合成ＣＣ１０）。１つ以上の化学的または酵素的に修飾アミノ酸残基を含有する、組換えＤＮＡ的または化学的ペプチド合成方法のいずれかにより作製された、ＣＣ１０モノマー。
【０１１２】
修飾アミノ酸残基。側鎖が、タンパク質の翻訳完了の際に本来存在する形態から修飾されている、タンパク質中のアミノ酸。タンパク質において見られる２０種の天然の非修飾アミノ酸の化学構造は、任意の生化学の教科書で見られ得る。
【０１１３】
カルボニル基。アミノ酸側鎖のアルデヒド基またはケトン基。
【０１１４】
略語
ＣＣ１０。クララ細胞１０ｋＤａタンパク質；ＣＣ１６、ＣＣＳＰ、ウテログロビン、尿タンパク質１とも呼ばれる。
ＳＣＧＢ。セクレトグロビン。
ＲＮＳ。活性窒素種。
ＲＯＳ。活性酸素種。
ＭＰＯ。ミエロペルオキシダーゼ酵素。
ｉＮＯＳ。細胞内一酸化窒素合成酵素。
ｍＣＰＢＡ。メタクロロ過安息香酸。
ＤＮＰ。２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン。
ＤＮＰＨ。２，４−ジニトロフェニルヒドラジン。
ＨＮＥ。４−ヒドロキシ−２−ｔｒａｎｓ−ノネナール（ＨＮＥ）、脂質過酸化産物。
ＭＤＡ。マロンジアルデヒド。
【０１１５】
本発明は、最も実際的かつ好ましい実施態様であると現在考えられるものに関連して記載される一方、本発明は、開示された実施態様に制限されないことではなく、対照的に、添付の請求項の精神および範囲内に含まれる、種々の改変および均等なアレンジメントをカバーすることが意図されていると理解されよう。
【図１】
2020055833.tif 000005
【図２】
2020055833.tif 000006
【図３】
2020055833.tif 000007
【図４】
2020055833.tif 000008
【図５】
2020055833.tif 000009
【図６】
2020055833.tif 000010
【図７】
2020055833.tif 000011
【図８】
2020055833.tif 000012
【図９】
2020055833.tif 000013
【図１０】
2020055833.tif 000014
【図１１】
2020055833.tif 000015
【図１２】
2020055833.tif 000016
【図１３】
2020055833.tif 000017
【図１４】
2020055833.tif 000018
【図１５】
2020055833.tif 000019
【図１６】
2020055833.tif 000020
【図１７】
2020055833.tif 000021
【図１８】
2020055833.tif 000022
【図１９】
2020055833.tif 000023
【図２０】
2020055833.tif 000024
【図２１】
2020055833.tif 000025
【図２２】
2020055833.tif 000026
【図２３】
2020055833.tif 000027
【配列表】
2020055833000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月26日(2019.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＯＳおよび／またはＲＮＳへの暴露によって生じる修飾アミノ酸を１つ以上有する、化学的または酵素的に酸化された合成セクレトグロビンを含む、組成物であって、その対応する天然のセクレトグロビンと比較して、炎症性白血球の走化性の抑制が増強されている、組成物。
【請求項２】
前記化学的または酵素的に酸化された合成セクレトグロビンが、１つ以上の２−アミノ−３−ケト酪酸、クロラミン、ヒドロキシトリプトファン、ニトロトリプトファン、キヌレニン、バリン若しくはロイシンペルオキシド、シュウ酸若しくはピルビン酸、ヒドロキシフェニルアラニン、または２−オキソヒスチジン若しくはＨＮＥ−Ｈｉｓを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記セクレトグロビンが、ＣＣ１０である、請求項１または２に記載の組成物。
【外国語明細書】
2020055833000001.pdf