(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトの治療法用のヒト幹細胞を作出又は維持する真に多能性のヒトナイーブ幹細胞の成長を支持する成長因子の提供および使用方法の提供。【解決手段】ＭＵＣ１＊活性化リガンドを含む、細胞の成長、維持及びより未熟な状態への復帰の誘導用の細胞培養培地。培地は、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−ベータ又はこれらの両方を含まないことが好ましい。培地は血清を含まないことがある。培地は、インスリン、セレン、トランスフェリン、ｌ−アスコルビン酸又は非必須アミノ酸を更に含んでもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＵＣ１＊活性化リガンドを含む、細胞の成長、維持及びより未熟な状態への復帰の誘導用の細胞培養培地。
【請求項２】
前記細胞が幹細胞又は前駆体細胞である、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項３】
前記細胞が成熟細胞、体細胞又は前駆体細胞である、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項４】
前記細胞がヒトである、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項５】
ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−ベータ又はこれらの両方を含まない、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項６】
血清を含まない、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項７】
インスリン、セレン、トランスフェリン、ｌ−アスコルビン酸又は非必須アミノ酸を更に含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項８】
前記ＭＵＣ１＊リガンドがＮＭＥファミリータンパク質である、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項９】
前記ＮＭＥファミリータンパク質がＮＭＥ１である、請求項８に記載の細胞培養培地。
【請求項１０】
前記ＮＭＥ１が二量体化された２つの単量体として、又は２つのサブユニットを有する１本鎖として設計された２つの単量体として存在する、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項１１】
前記ＮＭＥファミリータンパク質がＮＭＥ７である、請求項８に記載の細胞培養培地。
【請求項１２】
前記ＮＭＥ７がおよそ２５ｋＤａ又はおよそ３０ｋＤａの分子量を有する、請求項１１に記載の細胞培養培地。
【請求項１３】
前記ＮＭＥファミリータンパク質がＮＭＥ７−ＡＢである、請求項８に記載の細胞培養培地。
【請求項１４】
前記ＮＭＥファミリータンパク質がＮＭＥ６である、請求項８に記載の細胞培養培地。
【請求項１５】
ｒｈｏ関連キナーゼの阻害剤を更に含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項１６】
ＰＩ３Ｋ又はＲＡＣ経路におけるシグナル伝達タンパク質の活性化剤を更に含み、かつｒｈｏキナーゼ阻害剤を含まない、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項１７】
ＮＭＥ１又はＮＭＥ２の発現を抑制する核酸を更に含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項１８】
他の成長因子を更に含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項１９】
前記他の成長因子がＦＧＦ−２及び／又はＴＧＦ−ベータである、請求項１８に記載の細胞培養培地。
【請求項２０】
ＮＭＥファミリータンパク質を含む細胞培養培地と細胞を接触させることを含み、幹細胞若しくは前駆体細胞の成長を刺激するか、又はより未熟な状態への細胞の復帰を誘導する方法。
【請求項２１】
前記細胞が幹細胞又は前駆体細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が体細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞がヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記培地がｂＦＧＦ、ＴＧＦ−ベータ又はこれらの両方を含まない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記培地が血清を含まない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記培地が、インスリン、セレン、トランスフェリン、ｌ−アスコルビン酸又は非必須アミノ酸を更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＮＭＥファミリータンパク質がＮＭＥ１である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＮＭＥ１が二量体化された２つの単量体として、又は２つのサブユニットを有する１本鎖として設計された２つの単量体として存在する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＮＭＥファミリータンパク質がＮＭＥ７である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＮＭＥ７がおよそ２５ｋＤａ又はおよそ３０ｋＤａの分子量を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＮＭＥファミリータンパク質がＮＭＥ７−ＡＢである、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＮＭＥファミリータンパク質がＮＭＥ６である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
インスリン、セレン、トランスフェリン、ｌ−アスコルビン酸を更に含み、ＮａＨＣＯ３を使用してｐＨが調整されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
前記培地がｒｈｏキナーゼの阻害剤を更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
前記培地がＰＩ３Ｋ又はＲＡＣ経路におけるシグナル伝達タンパク質の活性化剤を更に含み、かつｒｈｏキナーゼ阻害剤を含まない、請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
前記培地がＮＭＥ１又はＮＭＥ２の発現を抑制する核酸を更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３７】
前記培地がグアニン交換因子の阻害剤を更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３８】
前記グアニン交換因子の阻害剤が六量体形態のＮＭＥ１である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記グアニン交換因子の阻害剤がＮＭＥ１由来のペプチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記培地が他の成長因子を更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４１】
前記他の成長因子がＦＧＦ−２及び／又はＴＧＦ−ベータである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
基礎培地及び幹細胞を成長又は維持する非必須アミノ酸を加えたＮＭＥファミリータンパク質か本質的になる、細胞培養培地。
【請求項４３】
ＮＭＥファミリータンパク質から本質的になる細胞培養培地と細胞を接触させることを含み、幹細胞若しくは前駆体細胞の成長を刺激するか、又はより未熟な状態への細胞の復帰を誘導する方法。
【請求項４４】
幹細胞集団を含む組成物であって、ＮＭＥファミリータンパク質を含む無血清培養培地を更に含む、組成物。
【請求項４５】
前駆体細胞又は幹細胞に結合するリガンドの表面で幹細胞又は前駆体細胞を増殖する方法であって、ＮＭＥファミリーのタンパク質を含む培地と細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項４６】
ナイーブ幹細胞の純集団を作製する方法であって、
（ｉ）ナイーブ幹細胞の単一コロニーを得るようにＮＭＥファミリータンパク質を含む細胞培養培地と細胞を接触させることと、
（ｉｉ）ナイーブ幹細胞の前記単一コロニーを単離することと、
（ｉｉｉ）ナイーブ幹細胞の純集団を得るようにＮＭＥファミリータンパク質を含む細胞培養培地と前記コロニーを接触させることと、
を含む、方法。
【請求項４７】
工程（ｉ）において、約２５％〜６０％のナイーブ状態の細胞が得られる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
約３０％〜５０％のナイーブ状態の細胞が得られる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
工程（ｉｉｉ）において、ナイーブ幹細胞集団の純度が少なくとも約８０％である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
ナイーブ幹細胞集団の純度が少なくとも約９０％である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ナイーブ幹細胞集団の純度が少なくとも約９５％である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ナイーブ幹細胞集団の純度が少なくとも約９９％である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
人工多能性幹細胞からナイーブ幹細胞の純集団を作製する方法であって、
（ｉ）ナイーブ幹細胞の単一コロニーを得るようにＮＭＥファミリータンパク質を含む細胞培養培地と成熟細胞又は前駆体細胞を接触させることと、
（ｉｉ）ナイーブ幹細胞の前記単一コロニーを単離することと、
（ｉｉｉ）ナイーブ幹細胞の純集団を得るようにＮＭＥファミリータンパク質を含む細胞培養培地と前記コロニーを接触させることと、
を含む、方法。
【請求項５４】
工程（ｉ）において前記成熟細胞に多能性遺伝子を形質移入する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記成熟細胞又は前駆体細胞が体細胞、皮膚芽細胞又は線維芽細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
工程（ｉ）において、約２５％〜６０％のナイーブ状態の細胞が得られる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
約３０％〜５０％のナイーブ状態の細胞が得られる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
工程（ｉｉｉ）において、ナイーブ幹細胞集団の純度が少なくとも約８０％である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
ナイーブ幹細胞集団の純度が少なくとも約９０％である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ナイーブ幹細胞集団の純度が少なくとも約９５％である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ナイーブ幹細胞集団の純度が少なくとも約９９％である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ヒト胚性幹細胞株を作出する方法であって、
（ｉ）ＮＭＥファミリータンパク質を含む細胞培養培地と胚盤胞由来の細胞を接触させることと、
（ｉｉ）幹様形態を有する増殖物を単離することと、
（ｉｉｉ）ＮＭＥファミリータンパク質を含む細胞培養培地と単離された増殖物を接触させることと、
（ｉｖ）所望の核型を有し、多能性のレベル及びその細胞が多能性であることを示すナイーブ遺伝子を発現するクローンを単離することと、
を含む、方法。
【請求項６３】
前記ＮＭＥファミリーメンバーがＮＭＥ７である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＮＭＥ７がＮＭＥ７−ＡＢである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＮＭＥファミリーメンバーを含有する培地がＦＧＦを含有しない、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
細胞内でＮＭＥ１及びＮＭＥ２を抑制することを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
ヒト人工多能性幹細胞株を作出する方法であって、
（ｉ）ＮＭＥファミリータンパク質を含む細胞培養培地とドナー又は患者由来の細胞を接触させることと、
（ｉｉ）多能性遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ｃ−Ｍｙｃ又はＬＩＮ２８の発現を誘導する物質と前記細胞を接触させることと、
（ｉｉｉ）幹細胞様形態を有する細胞を単離することと、
（ｉｖ）ＮＭＥファミリータンパク質を含む細胞培養培地と単離された細胞を接触させることと、
（ｖ）所望の核型を有し、その細胞が多能性であることを示す多能性遺伝子レベルを発現するクローンを単離することと、
（ｖｉ）ＮＭＥファミリーメンバーを含む培地中でクローンを増やすことと、
を含む、方法。
【請求項６８】
前記ＮＭＥファミリーメンバーがＮＭＥ７である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＮＭＥ７がＮＭＥ７−ＡＢである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＮＭＥファミリーメンバーを含有する培地がＦＧＦを含有しない、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
細胞内でＮＭＥ１及びＮＭＥ２を抑制することを含む、請求項６７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、幹細胞成長培地に関する。また、本出願は、成熟細胞又は体細胞を誘導してより未熟な状態へと復帰させるのに使用される培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞療法には、多くの後天性疾患、遺伝性の症状及び外傷の結果の治療のみならず、治癒の可能性が期待されている。しかしながら、現在の科学的知見における数多くの隔たり、並びに幹細胞療法に対する期待が現実のものとなる前に克服されるべき技術面及び規制面の制限が存在する。１つ目の問題として、規制面での問題が挙げられる。ＦＤＡは、患者の安全性及び製品の再現性を保証するため、従来の薬品に求められるものを規範とすることが予想されるガイドラインを課すであろう。これは、幹細胞として始まるいかなる治療用細胞も、１日目から規定された定量可能な試薬を使用して、再現可能な条件下で作出される必要があることを意味する。治療用の幹細胞由来細胞の場合、これは不可能であった。ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞及びヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、両方とも慣例上、大部分が未確定の成分の複合混合物を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで増やされてきた。現在の慣例によれば、今もなお線維芽細胞フィーダー細胞層上でＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞を培養しており、通常、フィーダー細胞はマウス起源（マウス胚線維芽細胞：ＭＥＦ）であるが、ヒトフィーダー細胞も使用されている。別の種由来の細胞を使用することは、多くの人々が危険であるとしている。異なる動物種という問題に加え、フィーダー細胞層の要求は、そのシステムに再現不可能な別の層を導入することである、すなわち、幹細胞の成長には線維芽細胞フィーダー細胞により分泌される因子が必要である。これらの必要とされる因子は、同定も定量もされていない。フィーダー細胞の使用を避けるという試みにおいて、マウス肉腫細胞由来の未確定の定量不可能な因子の混合物であるマドリゲル層上で幹細胞を成長している。しかしながら、フィーダー細胞由来の馴化培地が添加された場合のみ、幹細胞はマドリゲル層上で成長することができる。したがって、マドリゲル法は細胞を作出する明確な条件を提供しない。
【０００３】
ヒト幹細胞の成長を可能とする従来既知の成長因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−２又は単にＦＧＦとも呼ばれる）である。ヒト幹細胞療法に関して予想されるＦＤＡ規則に適合し得る幹細胞成長条件を開発する試みにおいて、最近の研究論文により、動物成分を含有しないが、非常に高レベルのｂＦＧＦ（標準４ｎｇ／ｍＬに比して１００ｎｇ／ｍＬ）に加えてＴＧＦ−ベータを含有する、「Ｅ８」と呼ばれる規定培地を使用してヒト胚性幹細胞及びｉＰＳ細胞を成長し得たことが報告された。この培地及び他の全てのＦＧＦ系培地の主な問題は、「グラウンド（ground）」状態又は「ナイーブ（naive）」状態の細胞と呼ばれる真の多能性幹細胞がＦＧＦ中で不安定なことである（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。これらの報告は、ＦＧＦ又はｂＦＧＦの使用は、ヒト幹細胞をナイーブ状態から「プライムド（primed）」状態にすると結論付けている。「プライムド」は、誤った名称である。プライムド幹細胞が既に或る程度の分化を経たとしても、これは細胞を「プライムした」わけでも、又は機能的なヒト細胞への分化まで細胞を設定したわけでもない。その逆の場合もある。現在、科学研究により、全ての治療適用でないにしてもほとんどの場合、幹細胞の使用に必要とされるプライムド幹細胞は、ヒト体内においていかなる細胞へも分化することができないことが示されている（非特許文献４）。例えば、ＦＧＦにより成長された幹細胞は、パーキンソン病若しくはアルツハイマー病、又は外傷による脊髄損傷のような神経変性疾患の治療に必要とされる全てのタイプの神経細胞へと分化することができない。さらに、研究者らは、ヒト幹細胞を同調的な方法で分化させることができず、そのため、治療にはその治療法に必要とされる単一種の細胞型が欲せられるのに反して、無作為に多数の細胞型へと分化する。マウス幹細胞はナイーブ状態にあることから、研究者らがマウス幹細胞を用いて作業しているときにはこのような問題はなかった。Ｅ８培地による別の問題としては、異常に高レベルのｂＦＧＦ及びＴＧＦ−ベータが挙げられ、これは生理学的に適切でないとされていることから、これらの異常に高レベルの成長因子が予期しない別の問題を引き起こすか否かという疑問が投げ掛けられている。
【０００４】
要約すると、プライムド状態の幹細胞とナイーブ状態又はグラウンド状態の幹細胞との相違に関心を持つ最近の研究の主体は、ＦＧＦは、真の多能性ヒト幹細胞を成長させる天然の成長因子ではないと結論づけている。真の多能性状態（グラウンド状態又はナイーブ状態）にあるヒト幹細胞がＦＧＦの存在下で維持され得ないという事実は、ヒトの治療法用のヒト幹細胞を作出又は維持する真に多能性のヒトナイーブ幹細胞の成長を支持する本物の成長因子を同定及び使用する必要性が当該技術分野において存在することを示している。ナイーブ幹細胞に対する真の成長因子は、薬剤規制機関によって要求されることが予想されるものを含む、様々な培地及び培養条件において正常に機能できなければならない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J. Hanna, A. W. Cheng,K. Saha et al., Proc Natl Acad Sci U S A 107 (20), 9222 (2010)
【非特許文献２】Jacob H. Hanna,Krishanu Saha, and Rudolf Jaenisch, Cell 143 (4), 508 (2010)
【非特許文献３】J. Nichols and A. Smith, Cell Stem Cell 4 (6), 487 (2009)
【非特許文献４】FGF signaling inhibits neural induction in human embryonic stemcells.  Boris Greber, PhilippeCoulon, Miao Zhang, Soren Moritz, Stefan Frank, Arnoldo Jose, Muller-Molina, Marcos J Arauzo-Bravo, Dong Wook Han, Hans-ChristianPape and Hans R Scholer.  The EMBOJournal (2011) 30, 4874-4884
【発明の概要】
【０００６】
１つの態様では、本発明は、ＭＵＣ１＊活性化リガンドを含む、細胞の成長、維持及びより未熟な状態への復帰を誘導する細胞培養培地に関する。細胞が分化を起こすことなく増殖することが望まれる場合、細胞は幹細胞又は前駆体細胞であってもよく、又は成熟細胞若しくは前駆体細胞が多能性細胞へと誘導されることが望まれる場合、細胞は体細胞、成熟細胞若しくは前駆体細胞であってもよい。好ましくは、細胞はヒト細胞であってもよい。培地は、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−ベータ又はこれらの両方を含まないことが好ましい。さらに、別の態様では、培地は血清を含まないことがある。培地は、インスリン、セレン、トランスフェリン、ｌ−アスコルビン酸又は非必須アミノ酸を更に含んでもよい。
【０００７】
別の態様では、ＭＵＣ１＊リガンドは、ＮＭＥファミリータンパク質であってもよい。好ましくは、ＮＭＥファミリータンパク質はＮＭＥ１であってもよい。ＮＭＥ１は二量体化された２つの単量体として、又は２つのサブユニットを有する１本鎖として設計された２つの単量体として存在してもよい。代替的にはＮＭＥファミリータンパク質はＮＭＥ７又はＮＭＥ６であってもよい。
【０００８】
別の態様では、細胞培養培地は、ｒｈｏ関連キナーゼの阻害剤を含んでもよい。細胞培養培地は、グアニン交換因子の阻害剤を含んでもよい。グアニン交換因子の阻害剤は、六量体形態のＮＭＥ１であってもよく、又はＮＭＥ１由来のペプチドであってもよい。
【０００９】
更なる他の態様では、細胞培養培地は、ＦＧＦ−２又はＴＧＦ−ベータ等であるが、これらに限定されない他の成長因子を更に含んでもよい。
【００１０】
別の態様では、本発明は、ＮＭＥファミリータンパク質の細胞培養培地と細胞を接触させることを含み、幹細胞若しくは前駆体細胞の成長を刺激するか、又はより未熟な状態への細胞の復帰を誘導する方法に関する。
【００１１】
本方法では、細胞が分化を起こすことなく増殖することが望まれる場合、細胞は幹細胞又は前駆体細胞とすることができ、又は成熟細胞若しくは前駆体細胞が誘導されて多能性となることが望まれる場合、細胞は体細胞、成熟細胞若しくは前駆体細胞とすることができる。好ましくは、細胞はヒト細胞とすることができる。培地は、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−ベータ又はこれらの両方を含まないことが好ましい。さらに、別の態様では、培地は血清を含まないことがある。培地は、インスリン、セレン、トランスフェリン、ｌ−アスコルビン酸又は非必須アミノ酸を更に含むことができる。
【００１２】
好ましくは、ＮＭＥファミリータンパク質はＮＭＥ１とすることができる。ＮＭＥ１は二量体化された２つの単量体として、又は２つのサブユニットを有する１本鎖として設計された２つの単量体として存在することができる。代替的には、ＮＭＥファミリータンパク質はＮＭＥ７又はＮＭＥ６とすることができる。
【００１３】
本方法の別の態様では、細胞培養培地はｒｈｏ関連キナーゼの阻害剤を含ムチン。細胞培養培地はグアニン交換因子の阻害剤を含むことができる。グアニン交換因子の阻害剤は六量体形態のＮＭＥ１、又はＮＭＥ１由来のペプチドとすることができる。更に他の態様では、細胞培養培地はＦＧＦ−２又はＴＧＦ−ベータ等であるが、これらに限定されない他の成長因子を更に含むことができる。
【００１４】
更に別の態様では、本発明は、基礎培地及び幹細胞を成長若しくは維持する又は成熟細胞の多能性を誘導する非必須アミノ酸を加えたＮＭＥファミリータンパク質の細胞培養培地に関する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、無血清最小培地中でＮＭＥファミリータンパク質の細胞培養培地と細胞を接触させることを含み、幹細胞若しくは前駆体細胞の成長を刺激するか、又はより未熟な状態への細胞の復帰を誘導する方法に関する。
【００１６】
更に別の態様では、本発明は、幹細胞集団を含む組成物であって、ＮＭＥファミリータンパク質を含む無血清培養培地を更に含む、組成物に関する。
【００１７】
更に別の態様では、本発明は、前駆体細胞又は幹細胞に結合するリガンドの表面で幹細胞を成長する方法であって、ＮＭＥファミリーのタンパク質を含む培地と細胞を接触させることを含む、方法に関する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、ナイーブ幹細胞の純集団を作製する方法であって、（ｉ）ナイーブ幹細胞の単一コロニーを得るようにＮＭＥファミリータンパク質を含む細胞培養培地と細胞を接触させることと、（ｉｉ）ナイーブ幹細胞の単一コロニーを単離することと、（ｉｉｉ）ナイーブ幹細胞の純集団を得るようにＮＭＥファミリータンパク質を含む細胞培養培地とコロニーを接触させることと、を含む、方法に関する。上記工程（ｉ）において、約２５％〜６０％、又は約３０％〜５０％のナイーブ状態の細胞を得ることができる。上記方法の工程（ｉｉｉ）において、ナイーブ幹細胞集団の純度は少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％であり得る。
【００１９】
別の態様では、本発明は、人工多能性幹細胞からナイーブ幹細胞の純集団を作製する方法であって、（ｉ）ナイーブ幹細胞の単一コロニーを得るようにＮＭＥファミリータンパク質を含む細胞培養培地と成熟細胞又は前駆体細胞を接触させることと、（ｉｉ）ナイーブ幹細胞の単一コロニーを単離することと、（ｉｉｉ）ナイーブ幹細胞の純集団を得るようにＮＭＥファミリータンパク質を含む細胞培養培地とコロニーを接触させることと、を含む、方法に関する。工程（ｉ）において成熟細胞に多能性遺伝子を形質移入することができる。成熟細胞又は前駆体細胞は体細胞、皮膚芽細胞又は線維芽細胞であり得る。上記工程（ｉ）において、約２５％〜６０％、又は約３０％〜５０％のナイーブ状態の細胞を得ることがきる。工程（ｉｉｉ）において、ナイーブ幹細胞集団の純度が少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％である。
【００２０】
一態様では、細胞培地及び上記細胞培地の使用方法は、およそ２５ｋＤａ又はおよそ３０ｋＤａの分子量を有するＮＭＥ７を含む細胞培養培地を含むことができる。ＮＭＥ７タンパク質はＮＭＥ７−ＡＢとすることができる。細胞培養培地はｒｈｏ関連キナーゼ阻害剤又は好ましくはｒｈｏキナーゼ阻害剤の非存在下でＰＩ３Ｋ又はＲＡＣ経路におけるシグナル伝達タンパク質の活性化剤を含むことができる。或いは、細胞培養培地はＮＭＥ１又はＮＭＥ２の発現を抑制する核酸を更に含むことができる。
【００２１】
更に別の態様では、本発明は、ヒト胚性幹細胞株を作出する方法であって、（ｉ）ＮＭＥファミリータンパク質を含む細胞培養培地と胚盤胞由来の細胞を接触させることと、（ｉｉ）幹様形態を有する増殖物を単離することと、（ｉｉｉ）ＮＭＥファミリータンパク質を含む細胞培養培地と単離された増殖物を接触させることと、（ｉｖ）所望の核型を有し、多能性のレベル及びその細胞が多能性であることを示すナイーブ遺伝子を発現するクローンを単離することと、を含む、方法に関する。この方法では、ＮＭＥファミリーメンバーはＮＭＥ７とすることができる。ＮＭＥ７はＮＭＥ７−ＡＢとすることができる。ＮＭＥファミリーメンバーを含有する培地はＦＧＦを含有し得ないのが好ましい。上記細胞は細胞内でＮＭＥ１及びＮＭＥ２を抑制する工程を含むことができる。
【００２２】
別の態様では、本発明は、ヒト人工多能性幹細胞株を作出する方法であって、（ｉ）ＮＭＥファミリータンパク質を含む細胞培養培地とドナー又は患者由来の細胞を接触させることと、（ｉｉ）多能性遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ｃ−Ｍｙｃ又はＬＩＮ２８の発現を誘導する物質と細胞を接触させることと、（ｉｉｉ）幹細胞様形態を有する細胞を単離することと、（ｉｖ）ＮＭＥファミリータンパク質を含む細胞培養培地と単離された細胞を接触させることと、（ｖ）所望の核型を有し、その細胞が多能性であることを示す多能性遺伝子レベルを発現するクローンを単離することと、（ｖｉ）ＮＭＥファミリーメンバーを含む培地中でクローンを増やすことと、を含む、方法に関する。この方法では、ＮＭＥファミリーメンバーはＮＭＥ７とすることができる。ＮＭＥ７はＮＭＥ７−ＡＢとすることができる。ＮＭＥファミリーメンバーを含有する培地はＦＧＦを含有し得ないのが好ましい。上記方法は細胞内でＮＭＥ１及びＮＭＥ２を抑制する工程を含むことができる。
【００２３】
本発明は、本明細書中に与えられる以下の詳細な記載、及び単に説明として提示されるものであって本発明を限定するものでなはい、添付の図面からより完全に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】記載されるビトロネクチン表面上において、唯一の成長因子としてのＮＭ２３に加えてＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を含む最小幹細胞培地「ＭＭ」中で培養された完全にコンフルエントな未分化ヒト幹細胞の拡大写真画像を示す。
【図２】記載されるビトロネクチン表面上において、唯一の成長因子としてのＮＭ２３を含み、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を含まない最小幹細胞培地「ＭＭ」中で培養された部分的にコンフルエントな未分化ヒト幹細胞の拡大写真画像を示す。
【図３】記載されるビトロネクチン表面上において、ｂＦＧＦ、ヒトフィーダー細胞由来の５０％馴化培地、ＨＳ２７に加えてＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を含む最小幹細胞培地中で培養された完全にコンフルエントな未分化ヒト幹細胞の拡大写真画像を示す。
【図４】記載されるビトロネクチン表面上において、ｂＦＧＦ、ヒトフィーダー細胞由来の５０％馴化培地、ＨＳ２７を含み、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を含まない最小幹細胞培地中で培養された部分的にコンフルエントな未分化ヒト幹細胞の拡大写真画像を示す。
【図５】記載されるビトロネクチン表面上において、唯一の成長因子としてのＮＭ２３に加えＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を含む完全規定幹細胞培地「ＭＮ６」中で培養されたコンフルエントな未分化ヒト幹細胞の拡大写真画像を示す。
【図６】記載されるビトロネクチン表面上において、唯一の成長因子としてのＮＭ２３を含み、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を含まない完全規定幹細胞培地「ＭＮ６」中で培養された部分的にコンフルエントな未分化ヒト幹細胞の拡大写真画像を示す。
【図７】記載されるビトロネクチン表面上において、唯一の成長因子としてのＮＭ２３に加えＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を含む最小完全規定幹細胞培地「ＭＮ２」中で培養された部分的にコンフルエントな未分化ヒト幹細胞の拡大写真画像を示す。
【図８】記載されるビトロネクチン表面上において、唯一の成長因子としてのＮＭ２３を含み、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を含まない最小完全規定幹細胞培地「ＭＮ２」中で培養された付着が乏しい、分化しているヒト幹細胞の拡大写真画像を示す。
【図９】記載されるビトロネクチン表面上において、１００ｎｇ／ｍＬでｂＦＧＦ及びＴＧＦ−ベータを含み、更にＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を含むＭＮ６である、完全規定幹細胞培地「Ｅ８」中で培養された部分的にコンフルエントな未分化ヒト幹細胞の拡大写真画像を示す。
【図１０】記載されるビトロネクチン表面上において、更に１００ｎｇ／ｍＬでｂＦＧＦ及びＴＧＦ−ベータを含み、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を含まないＭＮ６である、完全規定幹細胞培地「Ｅ８」中で培養された付着に乏しい分化しているヒト幹細胞の拡大写真画像を示す。
【図１１】Ａ〜Ｄは、抗ＭＵＣ１＊抗体表面上において、いずれも唯一の成長因子としてのＮＭ２３に加えＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を含む最小幹細胞培地「ＭＭ」（Ａ、Ｃ）又はＭＮ６培地（Ｂ、Ｄ）中で培養された完全にコンフルエントな未分化ヒト幹細胞の拡大写真画像を示す。
【図１２】Ａ〜Ｄは、抗ＭＵＣ１＊抗体表面上において、いずれもＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を含む、ｍＴｅＳＲ（Ａ、Ｃ）中又はＮＭ２３を含むＭＮ６培地（Ｂ、Ｄ）中で培養された完全にコンフルエントな未分化ヒト幹細胞の拡大写真画像を示す。
【図１３】Ａ〜Ｄは、フィーダー細胞、マドリゲル、ビトロネクチン又は抗ＭＵＣ１＊でコーティングされた表面上のＮＭＥ系培地と比較した、ＦＧＦ系培地中で培養された幹細胞に関する多能性遺伝子、並びにナイーブ遺伝子及びプライムド遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ測定のグラフを示す。
【図１４】Ａ〜Ｄは、ヒト幹細胞及びがん細胞由来のＮＭＥ７がＰＳＭＧＦＲペプチドの配列を有する合成ペプチドに結合した、プルダウンアッセイのウェスタンブロットを示す。
【図１５】成長を刺激するＭＵＣ１＊受容体の二量体化であることを示す、二価又は一価の抗体濃度の関数として測定されたがん細胞成長のグラフである。ＭＵＣ１陽性乳がん細胞ＺＲ−７５−３０の成長を、二価（Ａｂ）抗ＭＵＣ１＊の添加により刺激し、一価のＦａｂの添加により阻害した。二価の抗体の添加により成長因子受容体の二量体化の指標である特徴的な釣鐘状の成長曲線を生じる。ＭＵＣ１陰性ＨＥＫ２９３細胞の成長は、二価又は一価のＦａｂ抗ＭＵＣ１＊のいずれによっても影響を受けなかった。二価の抗体が過剰に添加された場合には、２つの受容体ごとに二量体化する１つの二価抗体ではなく、各受容体に結合する１つの二価抗体が存在し、そのようにして成長を阻害する。
【図１６】野生型ＮＭ２３（ＷＴ）又は変異体ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの３つの異なる製剤のいずれかの異なる多量体化状態の特性を明らかにするＦＰＬＣトレースのオーバーレイを示す。野生型ＮＭ２３は六量体の分子量に対応する単一のピーク及びより高次の多量体に対応するショルダーを示す。リフォールディングされていない或る１つのＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ製剤（「混合」と標識される）は、二量体に対応するドミナントピーク及び四量体のより低いピークを有する。これもリフォールディングされていない別のＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ製剤（「六量体」）は、より高次の多量体のショルダーを伴う六量体の主なピークを有する。リフォールディングされたＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ製剤（二量体）は大部分が二量体を含んだ。
【図１７】Ａは、野生型タンパク質及びＳ１２０Ｇ変異体の３つの異なる製剤の多量体化状態を示す、ＮＭ２３−ＷＴ、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−混合、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体及びＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体の非還元ゲルの写真を示す。Ｂは、ＳＰＲチップ表面に付着したＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド（ＰＳＭＧＦＲ）に結合する種々のＮＭ２３多量体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定結果を示す。Ｃは、ＮＭ２３二量体のみが同起源の受容体ＭＵＣ１＊に結合することを示すナノ粒子実験の写真を示す。ＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドを金ナノ粒子上に固定化した。Ｄ〜Ｇは多能性幹細胞の成長を支持する能力について試験された種々のＮＭ２３−Ｈ１多量体を示す。
【図１８】組換えＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの３つの異なる製剤に対するＮＭ２３−ＷＴの多量体化状態を示す非変性ネイティブゲルを示す。
【図１９】Ａ）ＮＭ２３野生型（ＷＴ）及びＢ）６０％の二量体を産生したＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−「混合」製剤のＳＰＲ測定結果を示す。
【図２０】マドリゲル上における最小幹細胞培地中の８ｎＭのＮＭ２３バリアント中において（ａ、ｂ、ｄ、ｅ）、及び抗ＭＵＣ１＊抗体ＭＮ−Ｃ３でコーティングされた細胞培養プレート上（ｃ、ｆ）で培養されたヒトＥＳ細胞ＢＧＯ１ｖ／ｈＯＧ株の写真を示す。（ａ〜ｃ）バリアントはＰ９６ＳΔＣ２である。（ｄ〜ｆ）バリアントはＰ９６ＳΔＣ６である。これらのバリアントは、リフォールディングも精製もされておらず、使用前にリフォールディング又は精製を必要としないことを示す。
【図２１】ＦＰＬＣトレースにおいて示されるようにＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ（リフォールディングされた、「ＲＳ」）の大きな集団が二量体として存在し（ａ）、非還元ＰＡＧＥにより確認された（ｂ）ことを示す。ＦＰＬＣにより精製された二量体のみの画分をプールし、ヒトＥＳ細胞ＢＧＯ１ｖ／ｈＯＧ株を成長するために最小幹細胞培地において８ｎＭで使用した。（ｃ〜ｅ）マドリゲル上（ｃ、ｄ）又は抗ＭＵＣ１＊抗体ＭＮ−Ｃ３でコーティングされた細胞培養プレート上（ｅ）のいずれかにかかわらず、８ｎＭのＮＭ２３バリアント中で培養されると、多能性幹細胞を産生することを示すヒト幹細胞の写真である。
【図２２】ｍＬＩＦ又はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳのいずれかが添加されたマウスＥＳ細胞最小培地において２日間に亘り不活性化ＭＥＦフィーダー細胞層上において培養されたマウス胚性幹（ＥＳ）細胞の写真を示す。画像は、基本的な成長因子としてｍＬＩＦを含む標準マウス幹細胞培地におけるのと同様に、唯一の成長因子としてＮＭ２３二量体を使用してマウスＥＳ細胞が成長することを示す。
【図２３】ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ二量体中、ＭＥＦ上におけるｂＦＧＦ中若しくはヒト乳がん細胞中で培養されたヒト幹細胞におけるＮＭＥ１（Ａ、Ｄ）、ＮＭＥ６（Ｂ、Ｅ）又はＮＭＥ７（Ｃ、Ｆ）の存在、又はＭＵＣ１＊プルダウンアッセイにけるＮＭＥアイソフォームの存在を検出するウェスタンブロットの写真を示す。
【図２４】ＮＭＥ７に特異的な抗体によりプローブされたヒト胚性幹細胞溶解物のウェスタンブロットの写真である。
【図２５−０】（図２５）大腸菌（E. Coli）において発現されたＮＭＥ７−１（Ａ）及びＮＭＥ７−２（Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真を示す。
【図２５−１】（図２５．１）ＮＭＥ７−１及びＮＭＥ７−２発現、並びにＮＴＡ−Ｎｉカラム上での精製による非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、約４０ｋＤａの予想された分子量で僅かなタンパク質発現を示すか、又はタンパク質を発現しないことを示す。
【図２５−２】（図２５．２）ＮＴＡ−Ｎｉカラム上でのＮＭＥ７−１及びＮＭＥ７−２精製の溶出物のウェスタンブロットであり、約４０ｋＤａの予想された分子量でＮＭＥ７−１及びＮＭＥ７−２のいくらかの発現を示す。
【図２６】ＮＭＥ７−ＡＢ及びＮＭＥ７−Ａ発現、並びにＮＴＡ−Ｎｉカラム上での精製による非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、ＮＭＥ７−ＡＢについて約３０ｋＤａの予想された分子量での良好な発現を示したが（Ａ）、ＮＭＥ７−Ａについては約１４ｋＤａの予想された分子量で発現を示さなかった（Ｂ）。
【図２７】（Ａ）はＮＭＥ７−ＡＢのサイズ排除クロマトグラフィー精製の溶出プロファイルである。（Ｂ）はＮＭＥ７−ＡＢピーク画分由来の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。（Ｃ）は精製ＮＭＥ−ＡＢのサイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロファイルである。
【図２８】Ａ〜Ｄは、プレーティング１日後における組換えＮＭＥ７−ＡＢ又は組換えＮＭ２３（ＮＭＥ１）精製二量体のいずれかにおいて培養されたヒトｉＰＳ幹細胞の拡大写真である。
【図２９】Ａ〜Ｄは、プレーティング２日後における組換えＮＭＥ７−ＡＢ又は組換えＮＭ２３（ＮＭＥ１）精製二量体のいずれかにおいて培養されたヒトｉＰＳ幹細胞の拡大写真である。
【図３０】Ａ〜Ｄは、プレーティング３日後における組換えＮＭＥ７−ＡＢ又は組換えＮＭ２３（ＮＭＥ１）精製二量体のいずれかにおいて培養されたヒトｉＰＳ幹細胞の拡大写真である。
【図３１−１】Ａ〜Ｇは、ＦＧＦ系培地又はＮＭＥ系培地のいずれかにおいて多能性の誘導を経ている体細胞のグラフ及び写真を示す。Ａ〜Ｃは、多能性誘導過程の４日目及び２０日目での多能性マーカーのＲＴ−ＰＣＲ測定結果を示すグラフである。Ｄ〜Ｇは、標準ＦＧＦ培地を使用する標準的方法を使用するか、又は１つの多能性遺伝子を除外してＮＭＥ１二量体培地中で細胞を培養することにより多能性が誘導された代表的な細胞の共焦点顕微鏡画像の写真を示す。
【図３１−２】同上
【図３２】Ａ〜Ｅは、ＭＵＣ１＊抗体によってプルダウンされた種をＮＭＥ１、ＮＭＥ６及びＮＭＥ７に対する抗体でプローブする、がん細胞及び幹細胞のＭＵＣ１＊プルダウンアッセイの結果得られたウェスタンブロットを示す。
【図３３】Ａ〜Ｃは、ＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドがＳＡＭコーティングされたナノ粒子上に固定化されており、ＮＭＥタンパク質が溶液中に遊離した状態で添加される（added free in solution）ナノ粒子結合アッセイの写真を示す。ピンク色から青色への変色は、溶液中に遊離しているタンパク質が２つの異なるナノ粒子上の２つのペプチドに同時に結合し得ることを示す。
【図３４】Ａ〜Ｆは、標準ＦＧＦ培地又はＮＭＥ７培地中で成長され、その後、細胞がＸ染色体を不活性化している場合に核（赤色の点）内に凝縮されるヒストン−３を染色し、その細胞がもはや完全にナイーブではないことを示す、ＤＡＰＩ、ＯＣＴ４及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３について染色されたヒト胚性幹（ＥＳ）細胞の写真を示す。
【図３５】ＮＭＥ１（ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ二量体）培地中で成長され、その後、細胞がＸ染色体を不活性化している場合に核（赤色の点）内に凝縮されるヒストン−３を染色し、その細胞がもはや完全にナイーブではないことを示す、ＤＡＰＩ、ＯＣＴ４及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３について染色されたヒト胚性幹（ＥＳ）細胞の写真を示す。
【図３６】Ａ〜Ｈは、ＮＭＥ１（ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ二量体）培地中で成長され、その後、細胞がＸ染色体を不活性化している場合に核（赤色の点）内に凝縮されるヒストン−３を染色し、その細胞がもはや完全にナイーブではないことを示す、ＤＡＰＩ、ＯＣＴ４及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３について染色されたヒト胚性幹（ＥＳ）細胞の写真を示す。
【図３７】Ａ〜Ｄは、ＮＭＥ１（ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ二量体）培地中で成長され、その後、細胞がＸ染色体を不活性化している場合に核（赤色の点）内に凝縮されるヒストン−３を染色し、その細胞がもはや完全にナイーブではないことを示す、ＤＡＰＩ、ＯＣＴ４及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３について染色されたヒト胚性幹（ＥＳ）細胞の写真を示す。
【図３８】Ａ〜Ｈは、ＮＭＥ１（ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ二量体）培地中で成長され、その後、細胞がＸ染色体を不活性化している場合に核（赤色の点）内に凝縮されるヒストン−３を染色し、その細胞がもはや完全にナイーブではないことを示す、ＤＡＰＩ、ＯＣＴ４及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３について染色されたヒト胚性幹（ＥＳ）細胞の写真を示す。
【図３９】Ａ〜Ｈは、ＮＭＥ１（ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ二量体）培地中で成長され、その後、細胞がＸ染色体を不活性化している場合に核（赤色の点）内に凝縮されるヒストン−３を染色し、その細胞がもはや完全にナイーブではないことを示す、ＤＡＰＩ、ＯＣＴ４及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３について染色されたヒト胚性幹（ＥＳ）細胞の写真を示す。
【図４０】継代数の関数としてのＸ染色体不活性化前の細胞の割合、及び細胞がＮＭＥ１又はＮＭＥ７のいずれで培養されたかの自動計測の棒グラフを示す。
【図４１Ａ】ＮＭＥ系培地中で培養された幹細胞が約２０％のクローニング効率を有することを示した、１０００個、３０００個又は５０００個のプレーティングされた単一細胞に起因する個別のコロニーがアルカリホスファターゼによって染色されるクローニング効率アッセイに由来するヒト胚性幹細胞の写真を示す。
【図４１Ｂ】ＦＧＦ系培地中で培養された幹細胞が約１％のクローニング効率を有すること示した、１０００個、３０００個又は５０００個のプレーティングされた単一細胞に起因する個別のコロニーがアルカリホスファターゼによって染色されるクローニング効率アッセイに由来するヒト胚性幹細胞の写真を示す。
【図４１Ｃ】クローニング効率アッセイに関する細胞数の表を示す。
【図４２】抗ＭＵＣ１＊抗体（ＭＮ−Ｃ３又はＭＮ−Ｃ８）でコーティングされた６ウェル組織培養プレート上にプレーティングされ、その後、ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）の存在下又は不在下で、最小幹細胞培地（ＭＭ）又はＭＮ６と呼ばれる更なる最小培地のいずれかにおけるＮＭＥ１二量体（「ＮＭ２３−ＲＳ」）中で培養されたヒトｉＰＳ細胞の２日目の写真（４倍）を示す。
【図４３】抗ＭＵＣ１＊抗体（ＭＮ−Ｃ３又はＭＮ−Ｃ８）でコーティングされた６ウェル組織培養プレート上にプレーティングされ、その後、ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）の存在下又は不在下で、最小幹細胞培地（ＭＭ）又はＭＮ６と呼ばれる更なる最小培地のいずれかにおけるＮＭＥ１二量体（「ＮＭ２３−ＲＳ」）中で培養されたヒトｉＰＳ細胞の２日目の写真（１０倍）を示す。
【図４４】抗ＭＵＣ１＊抗体（ＭＮ−Ｃ３又はＭＮ−Ｃ８）でコーティングされた６ウェル組織培養プレート上にプレーティングされ、その後、ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）の存在下又は不在下で、最小幹細胞培地（ＭＭ）又はＭＮ６と呼ばれる更なる最小培地のいずれかにおけるＮＭＥ７中で培養されたヒトｉＰＳ細胞の２日目の写真（４倍）を示す。
【図４５】抗ＭＵＣ１＊抗体（ＭＮ−Ｃ３又はＭＮ−Ｃ８）でコーティングされた６ウェル組織培養プレート上にプレーティングされ、その後、ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）の存在下又は不在下で、最小幹細胞培地（ＭＭ）又はＭＮ６と呼ばれる更なる最小培地のいずれかにおけるＮＭＥ７中で培養されたヒトｉＰＳ細胞の２日目の写真（１０倍）を示す。
【図４６】マドリゲルでコーティングされた６ウェル組織培養プレート上にプレーティングされ、その後、ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）の存在下又は不在下で、最小幹細胞培地（ＭＭ）又はＭＮ６と呼ばれる更なる最小培地のいずれかにおけるＮＭＥ７中で培養されたヒトｉＰＳ細胞の２日目の写真（４倍）を示す。
【図４７】マドリゲルでコーティングされた６ウェル組織培養プレート上にプレーティングされ、その後、ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）の存在下又は不在下で、最小幹細胞培地（ＭＭ）又はＭＮ６と呼ばれる更なる最小培地のいずれかにおけるＮＭＥ７中で培養されたヒトｉＰＳ細胞の２日目の写真（１０倍）を示す。
【図４８】マドリゲルでコーティングされた６ウェル組織培養プレート上にプレーティングされ、その後、ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）の存在下又は不在下で、最小幹細胞培地（ＭＭ）又はＭＮ６と呼ばれる更なる最小培地のいずれかにおけるＮＭＥ７中で培養されたヒトｉＰＳ細胞の４日目の写真（１０倍）を示す。
【図４９】マドリゲルでコーティングされた６ウェル組織培養プレート上にプレーティングされ、その後、ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）の存在下又は不在下で、最小幹細胞培地（ＭＭ）又はＭＮ６と呼ばれる更なる最小培地のいずれかにおけるＮＭＥ７中で培養されたヒト胚性幹（ＥＳ）細胞の３日目の写真（１０倍）を示す。
【図５０】マドリゲルでコーティングされた６ウェル組織培養プレート上にプレーティングされ、その後、ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）の存在下又は不在下で、最小幹細胞培地（ＭＭ）又はＭＮ６と呼ばれる更なる最小培地のいずれかにおけるＮＭＥ１二量体（「ＮＭ２３−ＲＳ」）中で培養されたヒト胚性幹（ＥＳ）細胞の３日目の写真（１０倍）を示す。
【図５１】ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）の存在下又は不在下でのＦＧＦ系培地（ＭＭ又はＥ８中の標準ｂＦＧＦ）、又はＭＭ培地若しくはＭＮ６培地に添加されたＮＭＥ７中で培養されたマドリゲル上にプレーティングされた幹細胞に関する多能性遺伝子、並びにナイーブ遺伝子及びプライムド遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ測定結果のグラフを示す。
【図５２】ＭＵＣ１＊細胞外ドメイン（ＭＮ−Ｃ３）を認識する抗体でコーティングされたプラスチックウェア上にプレーティングされ、ＮＭ２３二量体（ＮＭＥ１  Ｓ１２０Ｇ二量体）又はＮＭＥ７のいずれかが添加されたＭＭ最小培地中で培養されたヒト胚性幹細胞に関するナイーブ遺伝子及びプライムド遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ測定結果のグラフを示す。
【図５３】抗ＭＵＣ１＊抗体（Ｃ３）でコーティングされたプラスチックウェア、ＭＥＦフィーダー細胞、又はマドリゲルのいずれかにプレーティングされたヒトＥＳ細胞に関する多能性遺伝子、並びにナイーブ遺伝子及びプライムド遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ測定結果のグラフを示す。ＶＩＴＡ/Ｃ３抗体表面上の細胞を、ＮＭ２３（ＮＭＥ１二量体）含む最小培地（ＭＭ）又はＮＭＥ７−ＡＢ中のいずれかで培養した。ＭＥＦ上にプレーティングされた細胞を、ＦＧＦを含むＭＭで培養した。マドリゲル上の細胞をＭＭ培地中又はＭＮ６培地中のＮＭＥ７において、ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）の存在下又は不在下で１回継代培養した。
【図５４】抗ＭＵＣ１＊抗体（Ｃ３）でコーティングされたプラスチックウェア、ＭＥＦフィーダー細胞、又はマドリゲルのいずれかにプレーティングされたヒトＥＳ細胞に関する多能性遺伝子、並びにナイーブ遺伝子及びプライムド遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ測定結果のグラフを示す。ＶＩＴＡ/Ｃ３抗体表面上の細胞を、ＮＭ２３（ＮＭＥ１二量体）を含む最小培地（ＭＭ）又はＮＭＥ７−ＡＢのいずれかで培養した。ＭＥＦ上にプレーティングされた細胞を、ＦＧＦを含むＭＭで培養した。マドリゲル上の細胞をＭＭ培地中又はＭＮ６培地中のＮＭ２３（ＮＭＥ１二量体）において、ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）の存在下又は不在下で１回継代培養した。
【図５５】Ａ〜Ｃは、幹細胞溶解物（Ａ、Ｃ）及び幹細胞馴化培地（Ｂ）中でのＮＭＥ７種の発現を示すウェスタンブロットの写真を示す。
【図５６】ヒト幹細胞におけるＮＭＥ７種に対してプローブするウェスタンブロットの写真を示し、その一部においてはＯＣＴ４、ＮＭＥ１、ＮＭＥ６又はＮＭＥ７のいずれかが抑制されていたが、ＮＭＥ７含有培地中で細胞を培養した。
【図５７】ＮＭＥ７プルダウンアッセイから得られたタンパク質をゲル上で分離し、バンドを切り出し、質量分析法で分析した、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。質量分析により、ＮＭＥ７抗体によってプルダウンされたより低分子量種（約２３ｋＤａ）もまたＮＭＥ７であったが、そのＮＭＥ７種におけるペプチド配列は全て、ＮＭＥ７のＮＤＰＫ  Ａドメインに対してマッピングされていた。
【図５８】ＮＭＥ７−ＡＢがＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドを二量体化することを示すＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイによるＨＲＰシグナルのグラフを示す。
【図５９】Ａ及びＢは、大腸菌におけるＮＭＥ６の発現及び精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
定義
ＭＵＣ１＊細胞外ドメインは、主にＰＳＭＧＦＲ配列（GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号６））により規定される。ＭＵＣ１開裂の正確な部位はそれを切り取る酵素に依存し、開裂酵素は細胞型、組織型又は細胞の発生時期に応じて変化するため、ＭＵＣ１＊細胞外ドメインの正確な配列はＮ末端において変化する場合がある。
【００２６】
１〜１０の番号が付されたＮＭＥファミリータンパク質は、それら全てが少なくとも１つのＮＤＰＫ（ヌクレオチド二リン酸キナーゼ）ドメインを有することから、一緒のグループに分類されるタンパク質である。場合によっては、ＮＤＰＫドメインは、ＡＴＰからＡＤＰへの転換を触媒し得るという点で機能的ではない。ＮＭＥタンパク質は、正式には、Ｈ１、Ｈ２のように番号が付されたＮＭ２３タンパク質として知られていた。本明細書において、ＮＭ２３及びＮＭＥの用語は置き換え可能である。本明細書において、ＮＭＥ１、ＮＭＥ２、ＮＭＥ６及びＮＭＥ７の用語は、天然タンパク質及びＮＭＥバリアントを指すのに使用される。場合によっては、これらのバリアントは、より可溶性であるか、大腸菌においてより良好に発現するか、又は天然配列のタンパク質よりも可溶性である。例えば、本明細書で使用されるＮＭＥ７は、天然タンパク質、又はバリエーションが大腸菌において可溶性で適切に折り畳まれたタンパク質の高収率の発現を可能とすることから、優れた商業上の適用を有するＮＭＥ７−ＡＢ等のバリアントを意味し得る。本明細書で言及される「ＮＭＥ１」は、「ＮＭ２３−Ｈ１」と置き換え可能である。また、本発明がＮＭＥタンパク質の正確な配列によって限定されないことが意図される。ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇとも呼ばれる変異体ＮＭＥ１−Ｓ１２０Ｇは、本出願を通して置き換え可能に使用される。二量体形成の選好性のためＳ１２０Ｇ変異体及びＰ９６Ｓ変異体が好ましいが、本明細書においてＮＭ２３二量体又はＮＭＥ１二量体と呼ばれる場合がある。
【００２７】
本明細書で言及されるＮＭＥ７は、天然ＮＭＥ７、又は収率、溶解性、若しくはＮＭＥ７をより効果的若しくは商業的により価値のあるものとする別の特徴を高めるバリアントを意味することが意図される。
【００２８】
本明細書で使用される場合、ＦＧＦ、ＦＧＦ−２又はｂＦＧＦは、線維芽細胞成長因子を指す。
【００２９】
本明細書で使用される場合、Ｒｈｏ関連キナーゼ阻害剤は、小分子、ペプチド又はタンパク質であってもよい（Rath N,Olson MF. Rho-associated kinases intumorigenesis: re-considering ROCK inhibition for cancer therapy. EMBO Rep.2012;13(10):900-8）。ｒｈｏキナーゼ阻害剤の例として、Ｙ２７６３２、ファスジルとも呼ばれるＨＡ−１０７７、Ｈ−１１５２及びチアゾビビンが挙げられる（Olson MF. Applications for ROCK kinase inhibition. Curr Opin Cell Biol.2008;20(2):242-8; WatanabeK, Ueno M, Kamiya D, et al. A ROCK inhibitor permitssurvival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol.2007;25(6):681-6; Breitenlechner C, Gassel M, Hidaka H, et al. Protein kinase Ain complex with Rho-kinase inhibitors Y-27632, Fasudil, and H-1152P: structuralbasis of selectivity. Structure. 2003;11(12):1595-607; Lin T, Ambasudhan R,Yuan X, et al. A chemical platform for improved induction of human iPSCs. NatMethods. 2009;6(11):805-8）。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤に加え、本発明は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤に代えて関連する経路の阻害剤の使用を想定する。例えば、同じ経路において、グアニン交換因子（ＧＥＦ）はＲｈｏキナーゼの上流である。ＧＥＦはＲｈｏキナーゼを活性化する。したがって、ｒｈｏキナーゼ阻害剤を使用する代わりに、本発明は、ＧＥＦ阻害剤の使用を想定する。ｒｈｏキナーゼはＧＤＰに結合されている場合に不活性状態にあることから、ＲＡＤ、ＧＥＭ及びＲｈｏＥ等の細胞中に存在するＧＤＰの量を増加する任意の物質をｒｈｏキナーゼ阻害剤の代わりに使用して、幹細胞の成長、生存及び表面への付着を補助することができる（Riento K,Guasch RM, Garg R, Jin B, Ridley AJ (2003) RhoE binds to ROCKI and inhibitsdownstream signaling. Mol Cell Biol 23: 4219-4229; Komander D, Garg R, Wan PT, Ridley AJ, Barford D (2008) Mechanismof multi-site phosphorylation from a ROCK&#8209;I:RhoE complex structure. EMBO J 27:3175-3185; Ward Y, Yap SF, Ravichandran V, MatsumuraF, Ito M, Spinelli B, Kelly K (2002) The GTP binding proteins Gem and Rad arenegative regulators of the Rho-Rho kinase pathway. J Cell Biol157: 291-302）。また、ミオシンもＲｈｏキナーゼと同じ経路に存在する。ミオシンは間接的にＲｈｏキナーゼによって活性化され、それ自身が同じ経路におけるｒｈｏキナーゼの下流である。したがって、本発明の方法によれば、ミオシン阻害剤をｒｈｏキナーゼ阻害剤に代えて使用し、幹細胞の生存を補助し、及び／又は表面への幹細胞の付着を補助することもできる。ブレビスタチンはミオシン阻害剤であり、本発明の方法に従って使用される任意のｒｈｏキナーゼ阻害剤に代えて使用することができる（Ohgushi M, Matsumura M, Eiraku M, Murakami K, Aramaki T, NishiyamaA, et al. Molecular pathway and cellstate responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stemcells. Cell Stem Cell 2010;7:225-39; Ohata H, Ishiguro T,Aihara Y, et al. Induction of the Stem-like CellRegulator CD44 by Rho Kinase Inhibition Contributes to the Maintenance of ColonCancer-Initiating Cells. Cancer Res. 2012;72(19):5101-10）。
【００３０】
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、本明細書及び他の文献においてＲＯＣｉ又はＲＯＣＫｉと略記される。具体的なｒｈｏキナーゼ阻害剤の使用は例示的なものであり、任意の他のｒｈｏキナーゼ阻害剤で置き換えることができる。
【００３１】
配列表フリーテキスト
ａ、ｇ、ｃ、ｔ以外のヌクレオチド記号の使用に関しては、ｋがｔ又はｇを表し、ｎがａ、ｃ、ｔ又はｇを表し、ｍがａ又はｃを表し、ｒがａ又はｇを表し、ｓがｃ又はｇを表し、ｗがａ又はｔを表し、ｙがｃ又はｔを表す、ＷＩＰＯ規格ＳＴ．２５、付属書２、表１に示される規約に従った。
【００３２】
mtpgtqspff llllltvltv vtgsghasst pggeketsat qrssvpsste knavsmtssvlsshspgsgs sttqgqdvtl apatepasgs aatwgqdvts vpvtrpalgs ttppahdvts apdnkpapgstappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvtsapdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgstappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvtsapdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgstappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvtsapdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgstappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts  apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgstappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvtsapdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgstappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvtsapdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvtsapdtrpapgs tappahgvts apdnrpalgs tappvhnvts asgsasgsas tlvhngtsar atttpaskstpfsipshhsd tpttlashst ktdassthhs svppltssnh stspqlstgv sffflsfhis nlqfnssledpstdyyqelq rdisemflqi ykqggflgls nikfrpgsvv vqltlafreg tinvhdvetq fnqykteaasrynltisdvs vsdvpfpfsa qsgagvpgwg iallvlvcvl valaivylia lavcqcrrkn ygqldifpardtyhpmseyp tyhthgryvp psstdrspye kvsagnggss lsytnpavaa
【００３３】
asanl（配列番号１）は、全長ＭＵＣ１受容体を記載する（ムチン１前駆体、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号:Ｐ１５９４１）。
【００３４】
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT                  （配列番号２）
【００３５】
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTA            （配列番号３）
【００３６】
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTG            （配列番号４）
【００３７】
配列番号２、配列番号３及び配列番号４は、ＭＵＣ１受容体及び切断アイソフォームを細胞膜表面に向けるためのＮ末端ＭＵＣ−１シグナル伝達配列を記載する。配列番号２、配列番号３及び配列番号４におけるバリアントにより示されるようにＣ末端において３つまでのアミノ酸残基が欠けていてもよい。
【００３８】
gtinvhdvetqfnqykteaasrynltisdvsvsdvpfpfsaqsgagvpgwgiallvlvcvlvalaivylialavcqcr
rknygqldifpardtyhpmseyptyhthgryvppsstdrspyekvsagnggsslsytnpavaaasanl（配列番号５）は、そのＮ末端にｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲを有し、全長ＭＵＣ１受容体の膜貫通配列及び細胞質配列を含む切断されたＭＵＣ１受容体アイソフォームを記載する。
【００３９】
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号６）は、ＭＵＣ１成長因子受容体（ｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲ−「ＰＳＭＧＦＲ」の例）の天然の一次配列を記載する。
【００４０】
TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号７）は、配列番号６のＮ末端の１アミノ酸欠失を有する）、ＭＵＣ１成長因子受容体（ｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲ−「ＰＳＭＧＦＲ」の例）の天然の一次配列を記載する。
【００４１】
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号８）は、安定性が高められたＭＵＣ１成長因子受容体（ｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲ−「ＰＳＭＧＦＲ」の例）の天然の一次配列の「ＳＰＹ」機能性バリアントを記載する。
【００４２】
TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号９）は、配列番号８のＣ末端の１アミノ酸欠失を有し）、安定性が高められたＭＵＣ１成長因子受容体（ｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲ−「ＰＳＭＧＦＲ」の例）の天然の一次配列の「ＳＰＹ」機能性バリアントを記載する。
【００４３】
tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagcgagtac
cccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg（配列番号１０）は、ＭＵＣ１細胞質ドメインのヌクレオチド配列を記載する。
【００４４】
CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL（配列番号１１）は、ＭＵＣ１細胞質ドメインのアミノ酸配列を記載する。
【００４５】
gagatcctgagacaatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttc
gacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggtatgttgaatacactatattcagtacattttgttaataggagagcaatgtttattttcttgatgtactttatgtatagaaaataa（配列番号１２）は、ＮＭＥ７ヌクレオチド配列を記載する（ＮＭＥ７：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッションＡＢ２０９０４９）。
【００４６】
DPETMNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLV
LIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGMLNTLYSVHFVNRRAMFIFLMYFMYRK（配列番号１３）は、ＮＭＥ７アミノ酸配列を記載する（ＮＭＥ７：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッションＡＢ２０９０４９）。
【００４７】
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatg
gccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga（配列番号１４）はＮＭ２３−Ｈ１ヌクレオチド配列を記載する（ＮＭ２３−Ｈ１：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッションＡＦ４８７３３９）。
【００４８】
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYV
DLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE（配列番号１５）はＮＭ２３−Ｈ１アミノ酸配列を記載する（ＮＭ２３−Ｈ１：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッションＡＦ４８７３３９）。
【００４９】
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatg
gccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga（配列番号１６）は、ＮＭ２３−Ｈ１  Ｓ１２０Ｇ変異体のヌクレオチド配列を記載する（ＮＭ２３−Ｈ１：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッションＡＦ４８７３３９）。
【００５０】
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYV
DLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE（配列番号１７）は、ＮＭ２３−Ｈ１  Ｓ１２０Ｇ変異体のアミノ酸配列を記載する（ＮＭ２３−Ｈ１：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッションＡＦ４８７３３９）。
【００５１】
atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaag
cgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa（配列番号１８）はＮＭ２３−Ｈ２ヌクレオチド配列を記載する（ＮＭ２３−Ｈ２：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッションＡＫ３１３４４８）。
【００５２】
MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVW
EGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELVDYKSCAHDWVYE（配列番号１９）はＮＭ２３−Ｈ２アミノ酸配列を記載する（ＮＭ２３−Ｈ２：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッションＡＫ３１３４４８）。
【００５３】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭ２３−Ｈ７−２配列：
（ＤＮＡ）
atgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga（配列番号２０）
【００５４】
（アミノ酸）
MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-（配列番号２１）
【００５５】
ヒトＮＭＥ７−Ａ：
（ＤＮＡ）
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga（配列番号２２）
【００５６】
（アミノ酸）
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-（配列番号２３）
【００５７】
ヒトＮＭＥ７−Ａ１：
（ＤＮＡ）
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga（配列番号２４）
【００５８】
（アミノ酸）
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-（配列番号２５）
【００５９】
ヒトＮＭＥ７−Ａ２：
（ＤＮＡ）
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga（配列番号２６）
【００６０】
（アミノ酸）
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-（配列番号２７）
【００６１】
ヒトＮＭＥ７−Ａ３：
（ＤＮＡ）
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga（配列番号２８）
【００６２】
（アミノ酸）
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-（配列番号２９）
【００６３】
ヒトＮＭＥ７−Ｂ：
（ＤＮＡ）
atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga（配列番号３０）
【００６４】
（アミノ酸）
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-（配列番号３１）
【００６５】
ヒトＮＭＥ７−Ｂ１：
（ＤＮＡ）
atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga（配列番号３２）
【００６６】
（アミノ酸）
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-（配列番号３３）
【００６７】
ヒトＮＭＥ７−Ｂ２：
（ＤＮＡ）
atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga（配列番号３４）
【００６８】
（アミノ酸）
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-（配列番号３５）
【００６９】
ヒトＮＭＥ７−Ｂ３：
（ＤＮＡ）
atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga（配列番号３６）
【００７０】
（アミノ酸）
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN--（配列番号３７）
【００７１】
ヒトＮＭＥ７−ＡＢ：
（ＤＮＡ）
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga（配列番号３８）
【００７２】
（アミノ酸）
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN--（配列番号３９）
【００７３】
ヒトＮＭＥ７−ＡＢ１：
（ＤＮＡ）
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga（配列番号４０）
【００７４】
（アミノ酸）
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-（配列番号４１）
【００７５】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−Ａ配列：
（ＤＮＡ）
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga（配列番号４２）
【００７６】
（アミノ酸）
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-（配列番号４３）
【００７７】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−Ａ１配列：
（ＤＮＡ）
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttacctga（配列番号４４）
【００７８】
（アミノ酸）
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-（配列番号４５）
【００７９】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−Ａ２配列：
（ＤＮＡ）
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga（配列番号４６）
【００８０】
（アミノ酸）
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-（配列番号４７）
【００８１】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−Ａ３配列：
（ＤＮＡ）
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttacctga（配列番号４８）
【００８２】
（アミノ酸）
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-（配列番号４９）
【００８３】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−Ｂ配列：
（ＤＮＡ）
atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga（配列番号５０）
【００８４】
（アミノ酸）
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-（配列番号５１）
【００８５】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−Ｂ１配列：
（ＤＮＡ）
atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga（配列番号５２）
【００８６】
（アミノ酸）
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-（配列番号５３）
【００８７】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−Ｂ２配列：
（ＤＮＡ）
atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga（配列番号５４）
【００８８】
（アミノ酸）
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-（配列番号５５）
【００８９】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−Ｂ３配列：
（ＤＮＡ）
atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga（配列番号５６）
【００９０】
（アミノ酸）
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-（配列番号５７）
【００９１】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−ＡＢ配列：
（ＤＮＡ）
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga（配列番号５８）
【００９２】
（アミノ酸）
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-（配列番号５９）
【００９３】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−ＡＢ１配列：
（ＤＮＡ）
Atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga（配列番号６０）
【００９４】
（アミノ酸）
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-（配列番号６１）
【００９５】
マウスＮＭＥ６
（ＤＮＡ）
Atgacctccatcttgcgaagtccccaagctcttcagctcacactagccctgatcaagcctgatgcagttgcccacccactgatcctggaggctgttcatcagcagattctgagcaacaagttcctcattgtacgaacgagggaactgcagtggaagctggaggactgccggaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagcggctggtggagttcatgacaagtgggccaatccgagcctatatccttgcccacaaagatgccatccaactttggaggacactgatgggacccaccagagtatttcgagcacgctatatagccccagattcaattcgtggaagtttgggcctcactgacacccgaaatactacccatggctcagactccgtggtttccgccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaggaaccccagctgcggtgtggtcctgtgcactacagtccagaggaaggtatccactgtgcagctgaaacaggaggccacaaacaacctaacaaaacctag（配列番号６２）
【００９６】
（アミノ酸）
MTSILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRTRELQWKLEDCRRFYREHEGRFFYQRLVEFMTSGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARYIAPDSIRGSLGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVHYSPEEGIHCAAETGGHKQPNKT-（配列番号６３）
【００９７】
ヒトＮＭＥ６：
（ＤＮＡ）
Atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga（配列番号６４）
【００９８】
（アミノ酸）
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-（配列番号６５）
【００９９】
ヒトＮＭＥ６  １：
（ＤＮＡ）
Atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga（配列番号６６）
【０１００】
（アミノ酸）
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-（配列番号６７）
【０１０１】
ヒトＮＭＥ６  ２：
（ＤＮＡ）
Atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga（配列番号６８）
【０１０２】
（アミノ酸）
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-（配列番号６９）
【０１０３】
ヒトＮＭＥ６  ３：
（ＤＮＡ）
Atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga（配列番号７０）
【０１０４】
（アミノ酸）
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-（配列番号７１）
【０１０５】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ６配列：
（ＤＮＡ）
Atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga（配列番号７２）
【０１０６】
（アミノ酸）
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-（配列番号７３）
【０１０７】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ６  １配列：
（ＤＮＡ）
Atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga（配列番号７４）
【０１０８】
（アミノ酸）
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-（配列番号７５）
【０１０９】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ６  ２配列：
（ＤＮＡ）
Atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga（配列番号７６）
【０１１０】
（アミノ酸）
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-（配列番号７７）
【０１１１】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ６  ３配列：
（ＤＮＡ）
Atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga（配列番号７８）
【０１１２】
（アミノ酸）
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-（配列番号７９）
【０１１３】
ＯｒｉＧｅｎｅ−ＮＭＥ７−１完全長：
（ＤＮＡ）
gacgttgtatacgactcctatagggcggccgggaattcgtcgactggatccggtaccgaggagatctgccgccgcgatcgccatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttctctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataatacgcgtacgcggccgctcgagcagaaactcatctcagaagaggatctggcagcaaatgatatcctggattacaaggatgacgacgataaggtttaa（配列番号８０）
【０１１４】
（アミノ酸）
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDNTRTRRLEQKLISEEDLAANDILDYKDDDDKV（配列番号８１）
【０１１５】
Ａｂｎｏｖａ  ＮＭＥ７−１完全長（アミノ酸）：
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN（配列番号８２）
【０１１６】
Ａｂｎｏｖａ部分ＮＭＥ７−Ｂ：
【０１１７】
（アミノ酸）
DRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKIL（配列番号８３）
【０１１８】
ヒスチジンタグ：
(ctcgag)caccaccaccaccaccactga（配列番号８４）
【０１１９】
Ｓｔｒｅｐｔ  ＩＩタグ：
(accggt)tggagccatcctcagttcgaaaagtaatga（配列番号８５）
【０１２０】
ＭＵＣ１＊のリガンド
本発明者らは、以前、ＭＵＣ１＊受容体のリガンドが成長因子として機能することができ、具体的には幹細胞及び前駆体細胞の成長因子であることを開示した。ＮＭＥファミリータンパク質（以前はＮＭ２３と呼ばれた）は、ＭＵＣ１＊のリガンドである。ＮＭＥタンパク質は、それらが全てＮＤＰＫ（ヌクレオチド二リン酸キナーゼ）ドメインを有することから、一緒のグループに分類される。発現されるか、又は集団の大部分が二量体として存在するように精製されたＮＭＥ１又はＮＭＥ２は、フィーダー細胞、それらの抽出物、血清、又は任意の他のサイトカインの不在下で胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞の成長を支持する。本明細書において、本発明者らは、ＮＭＥ７もまたＭＵＣ１＊のリガンドであり、これもまたフィーダー細胞、それらの抽出物、血清、又は任意の他のサイトカインの不在下で胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞の成長を支持することを報告する。ＮＭＥ６、ＮＭＥ１及びＮＭＥ２は全て単一のＮＤＰＫドメインを有し、同様の分子量である。ＮＭＥ７はそれらの分子量の２倍であり、２つのＮＤＰＫドメインを含有する。ＮＭＥ６は、ＮＭＥ１のように二量体として存在し得る。したがって、二量体形態のＮＭＥ１、ＮＭＥ２及びＮＭＥ６、並びにＮＭＥ７は、間葉系幹細胞、造血幹細胞、多能性幹細胞及びナイーブ状態幹細胞を含むがこれらに限定されない、幹細胞又は前駆体細胞の成長、並びに多能性の維持又は誘導に好ましいＮＭＥファミリータンパク質である。ＮＭＥ１及びＮＭＥ７が特に好まし。二量体形態のＮＭＥ１及びＮＭＥ７がより一層好ましい。本発明はタンパク質の天然形態に限定することを意図するものではない。商業上、変異、切断又は付加配列を有し得る組換えタンパク質としてタンパク質を作製してもよい。本明細書において、本発明が、発現された組換えタンパク質の収率、可溶性等を高め得る特定のバリアントに限定されることを意味するものではないことから、このＮＭＥ７バリアントを単にＮＭＥ７と呼ぶ。さらに、本発明は、１本鎖タンパク質が２つの接続された単量体を含み、各単量体が単一のＮＤＰＫ  Ａドメイン又はＢドメインからなり得る、ＮＭＥ１又はＮＭＥ６の１本鎖バリアントの使用を想定する。
【０１２１】
誘導された多能性
転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ、又はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８の組合せの強制発現により、成熟細胞の多能性状態への復帰が引き起こされることが示された（Takahashiand Yamanaka, 2006）。多能性を誘導する各転写因子は、約１２の遺伝子の転写を調節する。本発明者がＭＵＣ１関連因子であるとして同定したのは、これらのうちの一部であった。ＯＣＴ４及びＳＯＸ２はＭＵＣ１プロモーター自身に結合する。多能性タンパク質ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧはＮＭＥ７プロモーターに結合し、幹細胞の多能性に対する重要性を強調する。ＮＭ２３（ＮＭＥとしても知られる）は以前、本発明者によって、ＭＵＣ１＊の活性化リガンドとして同定された（Mahanta etal., 2008）。ＮＭＥ７はＭＵＣ１＊の活性化リガンドである。ＯＣＴ４及びＳＯＸ２はいずれも、本明細書において本発明者らがＭＵＣ１の開裂酵素であると開示する、ＭＭＰ１６のプロモーターに結合する。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２又はＮＡＮＯＧもまた、開裂酵素ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＡＤＡＭ  ＴＳＬ−１、ＡＤＡＭ  ＴＳ−４、ＡＤＡＭ−１７（ＭＵＣ１開裂酵素）、ＡＤＡＭ−ＴＳ１６、ＡＤＡＭ−１９及びＡＤＡＭ−２８に対するプロモーター部位に結合する。これらの開裂酵素の一部又は全部を上方調節し、ＭＵＣ１＊形態へのＭＵＣ１の開裂を亢進して多能性を誘導するか、又はそれを維持することができる（Boyer et al, 2005）。総合すると、主要な多能性タンパク質ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧがＮＭＥ７プロモーターに結合し、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２がＭＵＣ１プロモーターに結合してこれらの遺伝子の発現が始まることから、ＭＵＣ１＊（開裂形態）及びそのリガンドＮＭＥ７は多能性の活性化因子であることが明らかである。
【０１２２】
ＭＵＣ１の開裂形態であるＭＵＣ１＊のみを発現する胚性幹細胞を用いた本発明者らによる以前の研究成果より、その細胞外ドメインの二量体化が成長を刺激し、分化を阻害することが示された（Hikita etal., 2008）。これらの効果は、二価の抗ＭＵＣ１＊抗体（図１５）、組換えＮＭ２３、又は二量体を選好的に形成する変異体ＮＭ２３（Ｓ１２０Ｇ）のいずれかを使用してＭＵＣ１＊細胞外ドメインを二量体化することによって達成された（Kim et al.,2003）。一価の抗ＭＵＣ１＊Ｆａｂを使用することによるＭＵＣ１＊細胞外ドメインの阻害は、数時間以内でも致死的であった。
【０１２３】
ＮＭＥ１二量体のみがＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドに結合することを示す、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を行った。図１７Ａは、野生型タンパク質の多量体化状態及び３つの異なるＳ１２０Ｇ変異体の製剤を示す、ＮＭ２３−ＷＴ、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−混合、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体及びＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体の非還元ゲルの写真を示す。図１７Ｂは、ＳＰＲチップ表面に付着したＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド（ＰＳＭＧＦＲ）への４つの異なるＮＭ２３の結合能力を示す、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定のオーバーレイを示す。結果からは、ＮＭ２３のその同起源の受容体ＭＵＣ１＊への結合量は、試料中にどれ位の二量体が存在するかの関数であることが示される。ＳＰＲは、チップ−溶液インターフェースでのタンパク質質量を測定し、ＭＵＣ１＊ペプチド表面に六量体が結合すると、二量体が結合した場合より３倍強いＳＰＲシグナルを生じる。図１７Ｃは、ＮＭ２３二量体のみが同起源の受容体ＭＵＣ１＊に結合することを示す、ナノ粒子実験の写真を示す。ＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドを金ナノ粒子上に固定化した。ナノ粒子の各アリコートにＮＭ２３−ＷＴ、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体又はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体のいずれかを添加した。ＮＭ２３がナノ粒子固定化ＭＵＣ１＊ペプチドに結合すると、ナノ粒子が互いに接近して溶液をピンク色から青色へと変化させる。この実験から、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体のみがＭＵＣ１＊ペプチドに結合したことが示される。抗ＭＵＣ１＊Ｆａｂの添加は、溶液中のＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体と、ナノ粒子上のＭＵＣ１＊ペプチドとの結合を競合的に阻害した。図１７Ｄ〜図１７Ｇは、多能性幹細胞の成長を支持する能力について試験された種々のＮＭ２３多量体を示す。ヒトＥＳ（胚性幹）細胞を図１７ＤのＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体、図１７ＥのＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−六量体、図１７ＦのＮＭ２３−ＷＴ、又は図１７ＧのＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−二量体に加えてＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド（ＰＳＭＧＦＲ）のいずれかにおいて培養され、幹細胞表面上のＭＵＣ１＊受容体へのＮＭ２３二量体の結合を競合的に阻害した。（Ｇ）（Ｅ）及び（Ｆ）の順に分化の誘導（コロニーの肥厚、暗色化）が容易に観察され、ＮＭ２３−二量体−ＭＵＣ１＊相互作用の阻害が、ＭＵＣ１＊に結合しないＮＭ２３六量体中で細胞を培養した場合と同様に、分化を誘導することを示している。ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ（Ｄ）の二量体製剤のみが、未分化幹細胞の成長を支持することが可能であった。
【０１２４】
図１８は、３つの異なる組換えＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ製剤に対するＮＭ２３−ＷＴの多量体化状態を示す、非変性ネイティブゲルを示す。
【０１２５】
図１９は、Ａ）ＮＭ２３野生型（ＷＴ）及びＢ）６０％の二量体を産生したＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−「混合」製剤のＳＰＲ測定結果を示す。タンパク質を５つの異なる濃度で注入した。結果から、ＮＭ２３−ＷＴよりもＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−混合タンパク質はＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド表面に８倍多く結合したことが示される。野生型タンパク質は六量体であることから、結合した二量体の量を比較するためには、ＲＵの数値を３で割る必要がある。野生型及びＳ１２０Ｇ−二量体はいずれも結合において濃度依存性を示すが、結合した野生型六量体の量はこのシステムのノイズの範囲内に留まるほど小さい。
【０１２６】
これらの知見は、ＭＵＣ１＊が顕著な「幹細胞性」因子であることを示す。さらに、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２はＭＵＣ１遺伝子プロモーターに結合し、またその開裂酵素のプロモーターにも結合する。ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧはＮＭ２３（ＮＭＥ７）プロモーターに結合する。ＭＵＣ１＊の細胞外ドメインを遮断することはｈＥＳ細胞にとって致死的であることから、多能性遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧはＭＵＣ１のプロモーター部位、その開裂酵素及びその活性リガンドＮＭＥ７に結合し、それらのＭＵＣ１発現を誘導するということになる。既に多能性を誘導することが示さている１又は複数の遺伝子又は遺伝子産物を、ＭＵＣ１＊に対して遺伝子を形質移入すること若しくは遺伝子産物を導入すること単独で、又はその開裂酵素及び／又は活性化リガンドＮＭＥ７、ＮＭＥ−Ｈ１、ＮＭＥ−Ｈ２、又はＭＵＣ１若しくはＭＵＣ１＊のＰＳＭＧＦＲエピトープを二量体化する抗体に加えて、置き換えることができる。
【０１２７】
ＦＧＦ系培地を使用する標準プロトコル又はＮＭＥ系培地を使用する変更されたプロトコルを使用して、体細胞において多能性の誘導効率を試験する実験を行った。
【０１２８】
従来使用される標準プロトコルは、まずプラスチック上に皮膚芽細胞又は線維芽細胞（ヒト包皮線維芽細胞−新生児、「ｈＦＦｎ」：＃ＰＣ５０１Ａ−ｈＦＦ、System Biosciences、マウンテンビュー、カナダ）をプレーティングし、線維芽細胞培地（ＦＭ）中で培養し、２４時間ごとに交換する。５日後、細胞を不活性化線維芽細胞フィーダー細胞（マウス（ＭＥＦ）又はヒト（ＨＳ２７）であってもよい）でコーティングされた表面に移入する。次の２日間に亘り、細胞をＦＭ中で保持する。７日目、培地をｂＦＧＦ系培地に交換し、培地を２４時間ごとに交換する。最初のプレーティングから約２週間〜４週間後、胚性幹（ＥＳ）細胞様形態を有するコロニー（クローン）を選択し、不活性化フィーダー細胞（ＭＥＦ又はＨＳ２７）でコーティングされた新しいウェルに個別にプレーティングし、３日〜４日ごとに順次継代する。ＥＳ様細胞として成長を続けるウェルを増やし、多能性マーカーの存在を試験する。
【０１２９】
従来使用されている標準プロトコルに反し、本発明者らは、常にＮＭＥ培地（ＮＭＥ１二量体：「ＮＭ２３−ＭＭ−Ａ」）中で体細胞を培養した。さらに、本発明者らは、線維芽細胞フィーダー細胞層上、又は抗ＭＵＣ１＊抗体（Ｎ−１０  ＰＳＭＧＦＲペプチドを認識するＣ３又はＣ８）層上のいずれかに細胞をプレーティングした。ＲＴ−ＰＣＲ測定を行って、４日目（図３１Ａ）又は２０日目（図３１Ｂ）まで、様々な条件下で発現されたＯｃｔ４の量を定量化した。４日目までにＯｃｔ４の発現レベルによって測定される多能性の誘導をもたらした唯一の条件は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４（「ＯＳＫ」）（ｃ−Ｍｙｃなし）で形質移入され、最小培地（「ＭＭ」）中のＮＭＥ１二量体中において培養された線維芽細胞に対するものであった。これらの細胞について、Ｏｃｔ４の発現は出発細胞よりも１１９倍大きく、線維芽細胞培地中で代わりに培養された同一の細胞よりも２００倍近く大きかった。２０日目まで、３つの遺伝子ＯＳＫのみにより形質移入され、ＮＭ２３−ＭＭ−Ａ中で培養された細胞は、コントロールよりも１０９倍大きくＯｃｔ４を発現した。ＯＳＫＭにより形質移入され、常にＮＭ２３−ＭＭ中で培養された細胞は、線維芽細胞培地（ＦＭ）中からｂＦＧＦ培地（標準）中へと切り替えられて培養された同一の細胞よりもＯｃｔ４発現が３倍大きい一方で、ＦＭの後にＮＭ２３−ＭＭへと切り替えられて培養された細胞は、ＦＭの後にｂＦＧＦ−Ｍ中で培養された細胞よりもＯｃｔ４発現が１．３倍大きいに過ぎなかった（図３１Ｃ）。多能性マーカーＴｒａ１−６０に対する２０日目の細胞の免疫細胞化学染色は、ＮＭＥ系培地を使用する細胞において多能性誘導の主な利点を示す。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４により形質移入され、ＦＧＦが添加されていない最小培地中のＮＭＥ１二量体中で培養された細胞は、４つ全ての多能性遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ−Ｍｙｃにより形質移入され、ＦＧＦ培地中で標準プロトコルに従って培養された細胞（図３１Ｄ、図３１Ｅ）と比較して、多能性の誘導効率が大いに高められていた（図３１Ｆ、図３１Ｇ）。３つの多能性遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４により形質移入された細胞は、検出可能な多能性マーカーを有さず、幹様形態を欠いていた。
【０１３０】
好ましい実施形態では、細胞への侵入を容易にするため、多能性の誘導若しくは維持を補助するために、ＮＭ２３（ＮＭ２３−Ｈ１、ＮＭ２３−Ｈ２又はＮＭＥ７）が、それをコードする遺伝子として、タンパク質自体として、又はポリアルギニン配列（poly-argininetract）等のリーダー配列を持つタンパク質として細胞へと導入される。最近、本発明者らは、ＮＭ２３が多能性幹細胞（及びがん細胞）により分泌される場合、それはＭＵＣ１−ＭＵＣ１＊の開裂形態の活性化リガンドであり、ＭＡＰキナーゼ増殖経路を誘発することを示した。ＭＵＣ１＊のＮＭ２３刺激は、多能性ｈＥＳＣの成長を促進し、それらの分化を阻害したことが示された（Hikita etal., 2008）。また、ＮＭ２３はｃ−ＭＹＣの転写も誘導し（Dexheimerat al., 2009）、ｃ−ＭＹＣは必要ではなくなった。ＮＭ２３は、ＭＵＣ１＊成長因子受容体を活性化するためにその天然状態で添加されるか、又はＣ−ＭＹＣ発現が誘導される細胞及び核への侵入を容易にするためポリアルギニン配列と共に外因的に添加されるかのいずれかである。ＮＭ２３（ＮＭＥ）はコードする核酸として、又は細胞への侵入を容易にする修飾を伴う若しくは伴わない発現されたタンパク質として添加され得る。ＮＭＥ１又はＮＭＥ２は、天然状態で、又はＳ１２０Ｇ変異若しくはＮＭＥ７等の二量体状態を選好する変異形態で使用され得る。
【０１３１】
本発明の別の態様では、ＭＵＣ１＊の細胞外ドメイン（ＰＳＭＧＦＲ）若しくはＮＭ２３等の二量体ＭＵＣ１＊リガンドに結合する二価の抗体、又はそれらをコードする遺伝子を、多能性の誘導、多能性の誘導効率の向上、多能性の維持又は分化の阻害のためにＭＵＣ１＊発現細胞に添加する。これらのＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊相互作用タンパク質が添加される細胞は、自然発生的な細胞又は幹細胞様の特徴を誘導する遺伝子が添加されたもの、若しくは既に分化の過程に入ったものであってもよく、又は幹細胞であってもよい。
【０１３２】
多能性を誘導する遺伝子は同一又は異なるプラスミド上に導入されてもよく、プラスミドは、誘導されるレンチウイルスベクター若しくはアデノウィルスベクター、又は任意の組み込み若しくは非組み込みウイルス若しくは非ウイルスベクター、又はこれらの遺伝子の所望の細胞への導入を容易にする任意の他の系であってもよい。
【０１３３】
多くの場合、多能性誘導タンパク質の効果を、それらをコードする核酸又は遺伝子よりも、タンパク質そのものを導入することにより達成することが優先される。本発明は、天然状態又は細胞への侵入を可能とするためにポリアルギニン配列等のリーダー配列で修飾された遺伝子産物、タンパク質により置換され得る、幹様の特徴又は多能性の誘導に関して本明細書に開示される遺伝子を包含する。これらの遺伝子産物、すなわちタンパク質、又は１若しくは複数の形質移入された遺伝子の産物と相互作用する他のタンパク質を細胞に導入して、多能性又は他の幹細胞様特性を誘導又は維持する。
【０１３４】
ＮＭＥ−Ｈ１、ＮＭＥ−Ｈ２、ＮＭＥ６又はＮＭＥ−７等であるがこれらに限定されないＮＭ２３タンパク質は、多能性の誘導又は維持を亢進する。ＮＭ２３は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及び本明細書に開示される別のものを含むがこれらに限定されない、１又は複数の以前に同定された多能性因子と共に導入される。
【０１３５】
ＮＭ２３ファミリータンパク質
ＮＭ２３は、ＡＴＰからＡＤＰへの転換を触媒するヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＰＫ）ドメインの存在をこれらのタンパク質の共通性とする、タンパク質ファミリーとして存在する。ＮＭ２３は、以前は腫瘍転移因子として知られていた。最近の１０個のＮＭ２３ファミリーメンバーの同定により、現在、それらはＮＭＥタンパク質１〜１０として知られている（Boissan etal., Mol Cell Biochem (2009) 329:51-62, "The mammalian Nm23/NDPK family:from metastasis control to cilia movement,"）。
【０１３６】
科学者らは、最初にヒト白血病細胞から分化阻害因子を単離し、この因子の添加により或る特定のタイプの白血病細胞及び骨髄細胞の化学的に誘導された分化が妨げられることを示した（Okabe-Kado,1985, Cancer Research 45, 4848-4852, "Characterization of aDifferentiation-inhibitory Activity from Nondifferentiating Mouse MyeloidLeukemia Cells"）。この阻害因子は、後にＮＭＥ１（ＮＭ２３−Ｈ１）として同定された（Okabe-Kado,1992, "Identity of a differentiation inhibiting factor for mouse myeloidleukemia cells with NM23/nucleoside diphosphate kinase", Biochem BiophysRes Comm, 182 No.3 987-994）。白血病細胞は、最終分化が妨げられた血液細胞である。興味深いことに、白血病細胞の分化を阻害する能力は、その触媒ドメインとは無関係であることが示された。その酵素活性を無効にしたＮＤＰＫドメインにおける変異は、或る種の白血病細胞の分化を妨げるタンパク質の能力に影響を及ぼさなかった。しかしながら、その後数十年の科学文献により、ＮＭ２３が分化を阻害するのか、分化を促進するのか、又は全く影響を及ぼさないのかについての状況は混乱している。
【０１３７】
多くの研究論文により、ＮＭ２３が分化を誘導することを示す証拠が提供された。Rosengardet al, 1989、Dearolf et al 1993、及びTimmons etal 1993により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてショウジョウバエＮＭ２３ホモログ、ａｗｄは適切な分化に必要であることが報告された。Lakso et al 1992は、ＮＭ２３（マウスｉｎ  ｖｉｖｏ）が組織分化の開始と共に増加し、それが分化を誘導することを暗示した。Yamashiro et al 1994は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＭ２３レベルがヒト赤白血病細胞の分化の間増加することを報告した。Lombardi et al 1995は、ＮＭ２３（マウスｉｎ  ｖｉｔｒｏ）が細胞分化の開始と共に増加し、ここでもＮＭ２３が分化を誘導することを示していると結論付けた。Gervasi 1996は、ＮＭ２３の過剰発現（ラットｉｎ  ｖｉｔｒｏ）により神経分化が誘導され、アンチセンスＤＮＡによるＮＭ２３の下方調節により分化が阻害されたことを報告した。Amendola et al 1997は、ヒト神経芽細胞腫細胞におけるＮＭ２３の形質移入が分化を高めることを示した。
【０１３８】
ＮＭ２３が分化を誘導することを報告した多くの研究論文との完全な矛盾において、同じ時間枠で公開された同じ数の文献が、ＮＭ２３が分化を阻害したという正反対の事柄を報告した。Munoz-Doradoet al 1990は、ｎｄｋ（ミクソコッカス属（Myxococcus）ＮＭ２３ホモログ、ｉｎ  ｖｉｖｏ）が成長に必須であるが、発生の間下方調節することを見出し、その存在が分化を阻害するであろうことを暗示した。Okabe-Kado 1992は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて分化阻害因子（後にＮＭ２３と同じグループにより同定された）がマウス白血病の分化を阻害したことを示した。Yamashiro et al 1994は、ヒト巨核芽球の分化の間、ＮＭ２３レベルが低下し、ＮＭ２３の分化の阻害と一致することを報告した。Okabe-Kado 1995は、組換えＮＭ２３が白血病細胞株ＨＥＬ、ＫＵ８１２及びＫ５６２の赤血球分化を阻害するが、前駆体ＨＬ６０細胞、Ｕ９３７細胞又はＨＥＬ／Ｓ細胞の単球又は顆粒球分化は阻害しないことを示した。Venturelli et al 1995は、ＮＭ２３の過剰発現は、ヒト造血前駆体細胞のＧ−ＣＳＦ依存性顆粒球分化を阻害したことを報告した。Willems et al 1998は、ＮＭ２３発現が骨髄細胞由来のヒトＣＤ３４＋造血前駆体細胞が分化するにつれて減少することを見出した。２００２年において、Willems et alは、ＮＭ２３は細胞増殖に影響を及ぼさず、分化の誘導も阻害もしなかったが、ＣＤ３４＋細胞の赤血球系統への分化を歪めた（skewed）ことを示した。
【０１３９】
２０００年の総説において、Lombardiは、分化におけるＮＭ２３の役割に関連するこれら及び他の相反する結果を要約し、「細胞分化の制御におけるＮＭ２３遺伝子の役割は幅広く調査されているが、ＮＭ２３発現レベルとかかるプロセスとの機能的なつながりについては、完全に明らかにされることが待たれる。」と結論付けた。換言すれば、ＮＭ２３と分化との機能的なつながりは理解されていなかった。
【０１４０】
本発明者らは、以前、ＭＵＣ１開裂産物ＭＵＣ１＊の成長因子受容体機能が、その細胞外ドメインのリガンド誘導性二量体化により活性化され、ＭＵＣ１＊のリガンドがＮＭ２３であることを発見した。本発明者らは、それは分化を阻害し、幹細胞及び前駆体細胞の成長を支持するＮＭ２３の二量体形態であったことを更に実証した。さらに、本発明者らは、ＮＭ２３種は多能性を誘導することを発見した。本発明者らは、現在、いくつかのＮＭ２３ファミリーメンバーがこの幹細胞関連機能（stem-relatedfunction）を有することを発見した。ＮＭＥ１（ＮＭ２３−Ｈ１）は、二量体である場合のみ、幹細胞の成長を促進し、分化を阻害する。ＮＭＥ６は、ＮＭＥ１と大体同じ分子量であり、海綿（スブリテス・ドムンクラ（Suberitesdomuncula））中で二量体として存在すると報告されている（Perina etal, 2011, "Characterization of Nme6-like gene/protein from marine spongeSuberites domuncula" Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol, 384:451-460）。ＮＭＥ７（ＮＭ２３−Ｈ７）は単量体タンパク質であるが、本発明者らは、ＮＭＥ７が二量体のように機能することを発見した。ＮＭＥ７は２つのＮＤＰＫ触媒ドメインを含有し、ＮＭＥ１又はＮＭＥ６単量体のおよそ２倍の分子量であり、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞によって発現及び分泌される（図２３及び図２４を参照）。幹細胞からのＮＭＥ７及びＮＭＥ１の枯渇は、細胞の分化を引き起こした（データは示されていない）。サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにおいて、組換えＮＭＥ７（ＮＭＥ７−ＡＢ）は、２つのＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドに同時に結合し、ここでいずれのペプチドも完全なＰＳＭＧＦＲ配列であった。第１ペプチドはＣ末端システインを介してオボアルブミンに連結され、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされた。組換えＮＭＥ７の添加は、僅かなバックグラウンドを伴って、又はバックグラウンドなしに顕著に特異的な結合を生じた。その後、ＮＭＥ７を飽和するまでペプチド表面に添加した。第２ＰＳＭＧＦＲペプチドは、ヒスチジンタグ又はビオチン分子のいずれかを有していた。その後、ＨＲＰ標識化抗Ｈｉｓタグ抗体又はストレプトアビジンのいずれかを添加し、これは第２ＭＵＣ１＊ペプチドのＮＭＥ７へのロバストで濃度依存的な結合を示した。この結果は、単量体ＮＭＥ７は細胞表面上のＭＵＣ１＊を二量体化し得ることを示す。
【０１４１】
ＮＭＥ７は、分子量が約２５ｋＤａより小さなタンパク質としても存在し得る。幹細胞溶解物及び上清のプルダウンアッセイに続いて、質量分析を行った。より小さな分子量形態のＮＭＥ７は全て、そのＮＤＰＫ  Ａドメインに由来するペプチド配列を含有したが、Ｂドメイン由来のものは含有しなかった。これは、選択的スプライシングアイソフォームであるか、又は開裂産物である可能性がある。ＮＭＥ１のように、このより小さいＡドメインＮＭＥ７は二量体化し得る。
【０１４２】
ＮＭＥファミリータンパク質は、細胞及び組織発生の異なる時間に差次的に発現される。本発明者らが胚性幹細胞においてＮＭＥ６、ＮＭＥ７及びＮＭＥ１を検出したのに対し、ＮＭＥ１及びＮＭＥ２のみが成体細胞及び成体幹細胞において常に発現される。ＮＭＥ１は幹細胞の分化を阻害するよりむしろ誘導する六量体を形成することから、ＮＭＥ６及びＮＭＥ７はそれらが六量体を形成し得ないことから胚発生の初期及び真に多能性の幹細胞において発現されるということになる。
【０１４３】
幹細胞の所定密度に達した際に分化を開始したい場合、六量体の調節機能が後期段階において重要であるため、胚発生の初期段階においては成長及び分化の阻害はデフォルトであろう。本発明者らの知見を支持して、Boyer et al（Boyeret al, 2005, "Core Transcriptional Regulatory Circuitry in Human EmbryonicStem Cells", Cell, Vol. 122, 947-956）は、多能性誘導タンパク質ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧはＮＭＥ７のプロモーターに結合するが、他のＮＭＥファミリーメンバーには結合せず、それが最初に発現されるＮＭＥタンパク質であり、多能性を誘導又は維持し得るが、それを止める六量体を形成し得ないという考えと一致することを示していると報告した。また、Boyer et alは、多能性誘導タンパク質ＳＯＸ２及びＯＣＴ４がＭＵＣ１のプロモーター（ＮＭＥ７の標的受容体であり後にＭＵＣ１＊へと開裂する）に結合することも報告した。また、ＳＯＸ２及びＯＣＴ４もまたＭＵＣ１開裂酵素ＭＭＰ−１６のプロモーターに結合する。これらの多能性誘導タンパク質が重複してＭＵＣ１のプロモーター、その開裂酵素及びそのリガンドＮＭＥ７に結合するという事実は、このタンパク質のサブセットが多能性に重要であり、ＮＭＥ７は発生中の胚において最初に発現される多能性タンパク質であることを示している。ＮＭＥ７は、二量体形成を好むＮＭ２３バリアント中で培養された場合に、ヒト幹細胞により高発現される。
【０１４４】
実施例７は、ＢＧＯ１ｖヒト胚性幹細胞がＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ中か（リフォールディングされ主に二量体として存在するように精製されている）（図１６〜図１７）、抗ＭＵＣ１＊モノクローナル抗体ＭＮ−Ｃ３のコーティング上か、又はマウス線維芽細胞フィーダー細胞上においてｂＦＧＦ中で培養されるかのいずれかで成長される実験を記載する。得られた細胞のウェスタンブロットは、ＮＭＥ７がＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ二量体中で培養された幹細胞において高発現されるが（図２３第Ｉ部Ｃ−レーン１）、ｂＦＧＦ中で培養された幹細胞においては弱く発現されるに過ぎない（レーン２）ことを示す。これらの結果は、ＮＭ２３二量体中で培養された幹細胞は、ナイーブ状態とも呼ばれるより多能性の状態へと復帰するのに対し、ｂＦＧＦ中の培養幹細胞は「プライムド」状態と呼ばれるより分化した状態へと幹細胞を導くことを暗示する。研究は、プライムド状態の幹細胞は、真の多能性幹細胞が可能であるはずの全ての細胞型への分化は不可能であることを示す。
【０１４５】
Jaenisch及び同僚達は、ナイーブ状態のマーカーセット、及びプライムド状態に特徴的な第２マーカーセットを報告した（J. Hanna, A. W. Cheng, K. Saha et al., Proc Natl Acad Sci U S A 107(20), 9222 (2010), Jacob H. Hanna, Krishanu Saha, and Rudolf Jaenisch, Cell 143(4), 508 (2010)）。ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞が様々な最小培地中のＮＭＥ１二量体又はＮＭＥ７中で培養されるか、又はそれらがＦＧＦ系培地中で培養される実験を行った。幹細胞がプレーティングされる表面も変えた。その後、ＦＧＦ系培地と比べ、ＮＭＥ系培地中で培養された細胞に関してナイーブ遺伝子対プライムド遺伝子の発現レベルを測定するため、ＲＴ−ＰＣＲ測定を行った。全ての場合において、ＮＭＥ系培地はＦＧＦ系培地中で培養された細胞よりも、よりナイーブな状態の幹細胞を作出した。例えば、ＭＥＦフィーダー細胞上において最小培地（ＭＭ）中のＦＧＦ中で成長された細胞は、最小培地（ＭＭ）中のＮＭＥ１二量体中で成長された同起源の細胞（ここで、細胞を抗ＭＵＣ１＊抗体でコーティングされたプラスチックウェア上にプレーティングした）よりもプライムドマーカーがより高発現であり、ナイーブマーカーがより低発現であった。ｍＴｅＳＲと呼ばれる別のＦＧＦ系培地は、非常に高いレベルのプライムド遺伝子及びより低いレベルのナイーブ遺伝子を伴い、更に悪かった（図１３）。ＦＧＦ中で予め培養された幹細胞をＮＭＥ系培地へと移行すると、連続的な継代数に伴い、より高発現レベルのナイーブ遺伝子及びより低発現レベルのプライムド遺伝子の傾向があった。この傾向の一例については、実施例１３Ｃを参照されたい。これらの結果は、ナイーブ状態のよりストリンジェントな決定因子である核内のヒストン−３の測定結果と一致する。ヒストン−３は、プライムド幹細胞の核内において凝縮した点として検出されるが、ナイーブ幹細胞の核には検出されない。ＦＧＦで成長された細胞は１００％がプライムド状態にあり、それらの核内に凝縮したヒストン−３を有する。ＮＭＥ１二量体又はＮＭＥ７における６回目の継代までに、予めＦＧＦ中で成長された約２５％〜３０％の幹細胞がＸ染色体不活性化前である完全なナイーブ状態へと移行した。１０回目の継代までに、真にナイーブ状態にある割合が５０％〜６０％まで増加した。このいくつかの実施例については図３４〜図４０を参照されたい。これらの結果は、図２３第Ｉ部Ｃに示される知見と一致する。レーン１とレーン２を比較すると、ヒト体内で任意の細胞型へと分化可能な所望のナイーブ幹細胞においてＮＭＥ７がより多く発現されている。したがって、細胞内でのＮＭＥ７の発現を増加する戦略は、例えば、ＮＭＥ７の発現を引き起こすことが可能な核酸の導入、又はＮＭＥ７タンパク質を添加する方法であり、又は二量体形成を好むＮＭＥ１変異体若しくはバリアントは多能性を維持し、胚性幹細胞若しくは人工多能性幹細胞においてナイーブ幹細胞状態を維持し、及び／又は体細胞、皮膚芽細胞及び線維芽細胞を含むより成熟した細胞型において多能性を誘導する戦略である。これらの戦略は、ＮＭＥ７若しくはＮＭＥ１二量体形成又は二量体を模倣するバリアントに加え、１又は複数の多能性遺伝子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４又��ｃ−ｍｙｃの異所性の発現を含んでもよい。
【０１４６】
ＮＭＥ７は単一のタンパク質として存在するが、構造的には２つの単量体が含まれ、そのため二量体として機能する。ＮＭＥ７は２つのＮＤＰＫドメインを含有し、その一部分がＭＵＣ１＊成長因子受容体に結合する。また、実施例７はプルダウンアッセイと呼ばれる結合実験を記載する。この実験において、ＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドは、その後ＢＧＯ１ｖヒト胚性幹細胞由来の溶解物とインキュベートされるビーズに付着された。洗浄工程そしてビーズから解放された後、ＭＵＣ１＊ペプチドとの相互作用により捕捉された種をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、その後抗ＮＭＥ７抗体によりプローブした。図２３第ＩＩ部Ｆ）−レーン１はＮＭＥ７がＭＵＣ１＊細胞外ドメインに結合することを示す。ＮＭＥ７中の二重のＮＤＰＫドメイン部分がＭＵＣ１＊成長因子受容体に結合してそれを二量体化し、これが幹細胞及び前駆体細胞の多能性を維持し、多能性を誘導し、また分化を阻害する経路を活性化する。
【０１４７】
ＮＭＥ６は二量体として存在し、より高次の多量体の形成に抵抗を示す。ＮＭＥ６二量体はＭＵＣ１＊成長因子受容体に結合してそれを二量体化し、これが幹細胞及び前駆体細胞の多能性を維持し、多能性を誘導し、また分化を阻害する経路を活性化する。二量体形成を好むＮＭＥ１変異体及びバリアントのように、ＮＭＥ６及びＮＭＥ７はいずれもｉＰＳ細胞を含む幹細胞及び前駆体細胞の多能性の維持及び誘導、並びに分化の阻害が可能である。
【０１４８】
二量体形成を好むＮＭＥ１変異体及びバリアントのように、ＮＭＥ６及びＮＭＥ７を幹細胞（胚性又は人工多能性）又は前駆体細胞に外因的に添加して、成長を誘導するか、未分化状態に維持するか、又は分化を阻害することができる。ＮＭＥ６及びＮＭＥ７を、幹細胞又は前駆体細胞に外因的に添加して多能性を誘導することができる。さらに、二量体形成を好むＮＭＥ１変異体及びバリアント、ＮＭＥ６及び／又はＮＭＥ７、又は二量体として振る舞う１本鎖バリアントを含むそれらのバリアントをコードする核酸を細胞に導入し、より分化していない状態への細胞の復帰を誘導するか、又はより未熟な状態に細胞を維持することができる。
【０１４９】
ＮＭＥが全ての種間で高度に保存されていることから、本明細書に記載される方法はヒトＮＭＥ種に限定されることを意図するものでも、ヒト細胞による使用に限定されることを意図するものでもない。
【０１５０】
本発明の別の態様では、本発明者らは、外因性ＮＭＥ７の添加により幹細胞の成長及び多能性が完全に維持され、分化が阻害され、また多能性を誘導し得ることを発見した。ＮＭＥ７は、２つのＮＤＰＫドメインＡ及びＢを有する単量体タンパク質である。これまで、その機能は明らかにされていなかった。ＮＭＥ７は睾丸、卵巣及び脳において発現されることのみが知られていた。ＮＭＥ７は、鞭毛の運動性に関与するであろうと考えられ、或る特定の主要な残基を欠くことからＮＤＰＫ活性は有してないと考えられていた。
【０１５１】
任意の他の成長因子、フィーダー細胞又はそれらの馴化培地を欠く最小幹細胞培地中での培養物中のヒト幹細胞に、大腸菌において発現され、可溶性タンパク質として分泌されたＮＭＥ７を添加した。幹細胞を、幹細胞表面抗原を認識する抗体層への接着により、細胞培養プレート上に吸着した。この方法では、マドリゲル等の表面コーティング中に存在する成長因子及び他のサイトカインによる干渉が回避される。
【０１５２】
比較として、外因性組換えＮＭＥ７を添加する代わりに、リフォールディングされ二量体集団として精製された組換えＮＭ２３−Ｈ１（ＮＭＥ１としても知られる）を添加して同じ起源由来の幹細胞を並べて培養した（実施例９及び実施例１０、並びに図２５〜図３０を参照）。ＮＭＥ７及びＮＭ２３−Ｈ１二量体のいずれにおいても、幹細胞は分化することなく増殖した。図２７〜図３０は、高い核細胞質比を有する単一の細胞層として成長するという点で細胞が幹細胞形態を有していることを示す。さらに、免疫細胞化学及び定量的ＰＣＲは、得られた細胞のいずれもが多能性マーカーを発現したが、ＦＯＸａ２及びｍｉＲ−１４５等の分化マーカーを発現しなかったことを示した。細胞数は、ＮＭＥ７中で培養された幹細胞がＮＭ２３−Ｈ１二量体中で培養されたものよりも１．４倍多く細胞を産生したことを示した。これは、ＮＭ２３−Ｈ１アイソフォームが、二量体、四量体又は六量体（二量体のみが活性型であり六量体は分化を誘導する）として存在し得ることから、現行の技術水準に対する著しい改善である。したがって、ＮＭＥ７等の活性化するだけのＮＭＥ形態を添加することが有利である。商業上、単量体として活性であり、大腸菌において発現され、可溶性タンパク質として分泌されることから、ＮＭＥ７を産生することがより費用効率が高い。これは、変性、リフォールディング、二量体形成の誘導、及び二量体の安定な集団として単離する問題及び労力を排除する。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてより未熟な状態への細胞の復帰を誘導するため、又は体細胞において多能性を誘導するためにＮＭＥ７を外因的に添加することもできる。場合によっては、外因性ＮＭＥ７を添加しつつ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、又は遺伝子発現を抑制するための任意の他の方法を使用してＮＭ２３−Ｈ１（ＮＭＥ１）の発現を抑制することが有利な場合がある。本発明者らが実証したように、ＮＭ２３−Ｈ１（ＮＭＥ１）はその濃度が増加するにつれ四量体及び六量体を形成し、その後分化を誘導する。したがって、より成熟した状態へと細胞を分化させることが望ましい場合に、ＮＭＥ１六量体を外因的に添加するか、又はＮＭＥ１を幹細胞内で発現されるように遺伝的に誘導することは、本発明の更なる別の態様である。
【０１５３】
タンパク質発現及び精製を補助するため、いくつかのＮＭＥ７コンストラクトを作製し、試験した。コムギ胚芽細胞抽出物（分子量３６．５２ｋＤａ）を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系及びヒトＨＥＫ２９３細胞（分子量３８ｋＤａ）においてＮＭＥ７が発現され得ることが以前に報告されているが、本発明者らは、ＮＤＰＫ  Ａドメイン及びＢドメインのみを本質的に含有するより小さなコンストラクトを、高収率の可溶性タンパク質として大腸菌において発現し得ることを見出した。本発明者らは、ヒスチジンタグ又はｓｔｒｅｐタグのいずれかを有するＮＭＥ７−ＡＢを作製したが、親和性タグなしで又は任意の他の親和性タグと共に作製することができる。ＮＭＥ７−ＡＢは、以前に幹細胞の成長、多能性の維持、多能性の誘導可能性及び分化の阻害を完全に支持することが本発明者らによって示されているＮＭＥ１（ＮＭ２３−Ｈ１）二量体と同じ又はそれよりも良好に、ヒト幹細胞の多能性を促進し、分化を阻害した。本発明者らの実験は、ＮＭＥ７は経時的な六量体の形成の危険を伴うことなく、より費用効率の高い、商業的に適用可能な方法で、ＮＭＥ１二量体の代わりとなり得ることを示す。
【０１５４】
ＮＭＥファミリータンパク質は、植物を含む全ての種に亘って高度に保存されている。したがって、本発明のＮＭＥファミリーメンバー、アイソフォーム及びバリアント、特にＮＭＥ１、ＮＭＥ６及びＮＭＥ７コンストラクトの配列は、任意の種由来の配列又は異なる種由来の配列の組合せに含まれ得る（哺乳類種が好ましく、マウス種がより一層好ましく、ヒト種が最も好ましい）。かかるＮＭＥファミリーメンバー、アイソフォーム及びバリアントは、任意の種（哺乳類種が好ましく、マウス種がより一層好ましく、ヒト種が最も好ましい）における増殖（propagation）、自己複製、多能性の維持、多能性の誘導又は分化の阻害に使用され得る。
【０１５５】
二量体形態のＮＭＥ１又はＮＭＥ７もまた、ナイーブヒト幹細胞の維持のため、又はプライムド状態の幹細胞からのナイーブ幹細胞の誘導のため、又はｉＰＳ細胞の作出過程における体細胞からのナイーブ幹細胞の作製のために使用され得る。ナイーブ状態にある幹細胞は、ｂＦＧＦ含有培地中で成長された幹細胞と比べて、高発現レベルの多能性遺伝子ＯＣＴ４、ＫＬＦ２及びＮＡＮＯＧ又はＫＬＦ４、並びに低発現レベルのＦＯＸａ２、ＯＴＸ、ＬＨＸ及びＸＩＳＴを特徴とする。ナイーブ状態のより一層ストリンジェントな指標は、細胞がまだＸ染色体不活性化を経ていないことである。高レベルのＸＩＳＴは、Ｘ染色体の１つの不活性化の指標であるが、より的確な決定因子はヒストン３の免疫細胞化学染色である。Ｘ染色体の不活性化が起きた場合、ヒストン３は凝縮され、細胞の核内において個別の集団として可視化され得る。Ｘ染色体が不活性化されていない場合、ヒストン３は検出されないか、又は核全体から消失し、時に「くもり」と呼ばれる。
【０１５６】
ＮＭＥ１二量体又はＮＭＥ７中で培養された胚性幹（ＥＳ）細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞のいずれもが、ＦＧＦ中で培養された細胞と比べてＦＯＸａ２、ＯＴＸ、ＬＨＸ及びＸＩＳＴレベルが減少し、またＮＭＥ系培地中で少なくとも８〜１０継代の後に約５０％の細胞の核においてヒストン３が検出されないか又は凝縮したヒストン３を有さない幹細胞をもたらした。ＮＭＥ系培地中で６継代に亘って培養された細胞は、ナイーブ状態の特徴である、Ｘ染色体不活性化前の細胞を僅か２５％有していた。異所的な発現遺伝子に加えて、様々な生化学物質及び阻害剤で細胞を処理することによって、プライムド幹細胞をナイーブ状態へと一時的に復帰させることができた研究者ら（J. Hanna,A. W. Cheng, K. Saha et al., Proc Natl Acad Sci U S A 107 (20), 9222 (2010),Jacob H. Hanna, Krishanu Saha, and Rudolf Jaenisch, Cell 143 (4), 508 (2010)）は、１００００細胞のうち約１個がナイーブ状態であったと報告した。単一細胞クローニング技法を使用することにより、彼らはナイーブヒト幹細胞の純集団を単離することができたが、それらは不安定であり、数継代（ほとんどの場合５継代未満）しかナイーブ状態に維持することができなかった。ナイーブ状態にある幹細胞の別の指標は、高いコロニー効率を有する細胞であり、コロニー効率はプレーティングされた細胞の特定された数当たりに計測され得る個別のコロニー数として算出される。ヒト幹細胞とは異なり、ｍＬＩＦ（マウス白血病誘発因子（murineleukemia inducing factor））を含有する培地中で培養することにより容易にナイーブ状態に維持され得るマウス幹細胞のクローニング効率は約３０％である。全く対照的に、ＦＧＦ系培地中で培養されたヒト幹細胞のクローニング効率は約１％である。ＮＭＥ１二量体中で培養されたＥＳ細胞は、１８％のクローニング効率を有し、ＮＭＥ７中で培養された同じ細胞は２３％のクローニング効率を有した。しかしながら、これらはヒストン−３染色により約５０％のナイーブ状態にある細胞を有するに過ぎない細胞集団であった。したがって、その集団におけるナイーブ細胞の実際のクローニング効率は、測定された２０％の少なくとも２倍であり、マウスナイーブ幹細胞のそれを上回る、約４０％のクローニング効率である。総合すれば、これらのデータは、ＮＭＥ１又はＮＭＥ７中で培養された細胞は、プライムド状態からナイーブ状態へと復帰し、ナイーブ状態で維持されることを示している。
【０１５７】
また、本発明は、本質的に１００％多能性でありナイーブ状態にある幹細胞集団の作出へのＮＭＥ１又はＮＭＥ７の使用も想定する。単にＮＭＥ１二量体又はＮＭＥ７を含有する培地中で現在商業的に入手可能なＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を培養することによって、約５０％が完全にナイーブ状態にある細胞集団が作出される。ナイーブ幹細胞及びプライムド幹細胞の混合集団に対して、限界希釈法等の当業者に既知のクローニング技法を使用し、全てがナイーブ状態にある幹細胞集団が作出される。本発明の更に他の態様では、新たな幹細胞株が作出される。ＥＳ細胞株は、本来ナイーブな細胞をプライムド状態へと導く、ＦＧＦ中で細胞を培養することに代えて、細胞をＮＭＥ７又はＮＭＥ１を含有し、ここでＮＭＥ１タンパク質の少なくとも一部は二量体状態であり、より好ましくは少なくとも２５％のタンパク質が二量体状態であり、より一層好ましくは少なくとも５０％のタンパク質が二量体である、培地中で培養すること以外は、以前に記載された技法を使用して作出される（Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. James A. Thomson, Joseph Itskovitz-Eldor, Sander S. Shapiro, Michelle A.Waknitz, Jennifer J. Swiergiel, Vivienne S. Marshall, Jeffrey M. Jonesetal.  Science 282, 1145 (1998); DOI:10.1126/science.282.5391.1145; Isolation of Embryonic Stem (ES) Cells in MediaSupplemented with Recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF).  Shirley Pease, Paola Braghetta, J DavidGearing, Dianne Grail, and R. Lindsay Williams Developmental Biology 141,344-352 (1990)）。１つの態様では、細胞はヒト胚盤胞の内部細胞塊に由来し、ＮＭＥ７又はＮＭＥ１二量体を含有する培地中で培養される。本発明の別の態様では、皮膚芽細胞又は線維芽細胞等の体細胞は、ＮＭＥ７又はＮＭＥ１二量体を含有する培地中で培養することによって、より未熟な状態への復帰が誘導される。本発明の更なる別の実施形態では、ｉＰＳ細胞株は、１若しくは複数の多能性遺伝子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、ｃ−Ｍｙｃ若しくはＬＩＮ２８により体細胞、皮膚芽細胞又は線維芽細胞を形質移入することによるか、又はそれらの遺伝子産物、すなわちタンパク質、若しくはタンパク質の生成を引き起こす物質により細胞を処理すること、及びＮＭＥ１二量体若しくはＮＭＥ７を含有する培地の存在下でそのようにすることによって作出される。より一般的には、本発明は、ＮＭＥ１二量体又はＮＭＥ７の存在下で細胞を培養することにより、多能性状態を含むより未熟な状態へと細胞の復帰を誘導する任意の方法を使用して、より高い効率で産生されるか、ＦＧＦの使用を含む従来の方法により作出されたｉＰＳ細胞よりナイーブ状態である、新たなｉＰＳ細胞株を作出することを想定する。好ましい実施形態では、ＦＧＦの使用は除外される。別の好ましい実施形態では、ｉＰＳ細胞の作出過程を経ている細胞は線維芽細胞フィーダー細胞上に移入されない。
【０１５８】
幹細胞を成長するための表面
幹細胞又は多能性の誘導を経ている細胞が成長される表面の特性により本発明が限定されることを意図するものではない。幹細胞の成長又は多能性の誘導のため任意の好適な表面を、ＮＭＥ１、ＮＭＥ６又はＮＭＥ７を含有する培地と共に使用することができる。かかる表面としては、フィーダー細胞、マドリゲル、ハイドロゲル、インテグリン及びインテグリン誘導体、Ｅ−カドヘリン及びＥ−カドヘリン誘導体、ビトロネクチン、細胞表面受容体に対する抗体、ＭＵＣ１＊細胞外ドメインを認識する抗体、ＰＳＭＧＦＲ配列を認識する抗体、ＶＩＴＡ（商標）ブランドのプレート（ThermoFisher）、抗ＭＵＣ１＊抗体でコーティングされたＶｉｔａ（商標）等が挙げられるが、これらに限定されない。安定な二量体を形成し得るＮＭＥ１変異体及びバリアント（Ｐ９６Ｓ、Ｓ１２０Ｇ変異体及び１本鎖コンストラクト）を最小幹細胞培地（ＭＭ）に添加し、マドリゲル表面又は抗ＭＵＣ１＊抗体コーティング表面上で成長している幹細胞を増やすために使用した。幹細胞の成長及びそれらの自発的な分化に抵抗する能力は、３つ全ての培地及び両方の表面において本質的に同等であった（図２０、図２１）。一部の表面は、その上での幹細胞の成長の等価性に悪影響を及ぼす。フィーダー細胞は、プライムド状態の幹細胞を生じる未知の因子を分泌する。ビトロネクチン等のインテグリンは、細胞表面上の同起源の受容体に結合し、ナイーブ状態の幹細胞の維持に望ましい又は望ましくない、生物学的シグナルを発生する。ナイーブ状態及びプライムド状態のマーカーの測定により、ビトロネクチンの接着層に付着した幹細胞は、ＮＭＥ１二量体中で培養された場合であっても、プライムドマーカーを増加し、ナイーブマーカーの発現を減少した。好ましい実施形態では、プラスチック、生分解性、メッシュ又は固形、平坦又は粒子様であってもよい表面は、主にＰＳＭＧＦＲ配列からなるＭＵＣ１＊細胞外ドメインを認識する抗体でコーティングされる。更に好ましい実施形態では、表面はＰＳＭＧＦＲペプチドを認識する抗体でコーティングされたＶＩＴＡ（商標）ブランドのプレートである。より一層好ましい実施形態では、抗ＭＵＣ１＊抗体は、Ｎ末端の１５アミノ酸を含むＰＳＭＧＦＲペプチドのＮ末端部分を認識する。
【０１５９】
場合によっては、細胞の表面への付着を亢進するためにｒｈｏキナーゼ阻害剤を使用する。ＨＡ１００、Ｙ２７６３２及びチアゾビビン（thiazovivin）を含むがこれらに限定されない多くのｒｈｏキナーゼ阻害剤を、幹細胞の表面、特にＭＵＣ１＊抗体でコーティングされたプラスチックである表面への接着の亢進を補助するために使用することができる。現在利用可能なほとんどの幹細胞株に対して、ｒｈｏキナーゼ阻害剤を最初の２４時間〜４８時間のみ添加する。
【０１６０】
或いは、マドリゲル等の細胞ではない又は複合細胞混合物を含まない表面への接着を亢進するため、少なくとも一部の培養期間にグアニン交換因子（ＧＥＦ）の阻害剤をｒｈｏキナーゼ阻害剤に代えて培地に添加する。ＧＥＦの阻害剤は、場合によっては、抗ＭＵＣ１＊抗体でコーティングされた表面への幹細胞の付着を亢進するためにｒｈｏキナーゼ阻害剤に代えて使用される。本発明の１つの態様では、グアニン交換因子阻害剤は六量体形態のＮＭＥ１である。本発明の別の態様では、グアニン交換因子阻害剤は、ＮＭＥ１に由来するペプチドである。
【０１６１】
抗ＭＵＣ１＊抗体でコーティングされたプレート等の或る特定の表面へのプライムド幹細胞又はプライムド幹細胞とナイーブ幹細胞の混合集団の接着を最大にするため、ｒｈｏキナーゼの阻害剤又はグアニン交換因子の阻害剤が必要とされる場合がある。しかしながら、ナイーブ幹細胞の純集団は、ｒｈｏキナーゼ阻害剤又はグアニン交換因子阻害剤の使用を必要としない。本発明の１つの態様では、ナイーブ幹細胞の純集団は、ＦＧＦ又はｒｈｏキナーゼ阻害剤の不在下で培養される。
【０１６２】
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、ｒｈｏキナーゼＩ又はＩＩを阻害する物質である。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、小分子、ペプチド又はタンパク質であってもよい（Rath N, Olson MF. Rho-associated kinases in tumorigenesis:re-considering ROCK inhibition for cancer therapy. EMBO Rep. 2012;13(10):900-8.）。ｒｈｏキナーゼ阻害剤の例として、Ｙ２７６３２、ファスジルとも呼ばれるＨＡ−１０７７、Ｈ−１１５２及びチアゾビビンが挙げられる（Olson MF. Applications for ROCK kinaseinhibition. Curr Opin Cell Biol. 2008;20(2):242-8; Watanabe K, Ueno M, KamiyaD, et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stemcells. Nat Biotechnol. 2007;25(6):681-6; Breitenlechner C, Gassel M, Hidaka H,et al. Protein kinase A in complex with Rho-kinase inhibitors Y-27632, Fasudil,and H-1152P: structural basis of selectivity. Structure. 2003;11(12):1595-607;Lin T, Ambasudhan R, Yuan X, et al. A chemical platform for improved inductionof human iPSCs. Nat Methods. 2009;6(11):805-8）。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤に加え、本発明は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤に代えて関連する経路の阻害剤を使用することを想定する。例えば、同じ経路では、グアニン交換因子（ＧＥＦ）はＲｈｏキナーゼの上流である。ＧＥＦはＲｈｏキナーゼを活性化する。したがって、ｒｈｏキナーゼ阻害剤を使用する代わりに、本発明はＧＥＦ阻害剤を使用することを想定する。ｒｈｏキナーゼはＧＤＰに結合された場合、不活性状態にあることから、ＲＡＤ、ＧＥＭ及びＲｈｏＥ並びに別の物質等の細胞内に存在するＧＤＰの量を増加する任意の物質を、ｒｈｏキナーゼ阻害剤に代えて使用し、幹細胞の成長、生存及び表面への付着を補助することができる（Riento K, Guasch RM, Garg R, Jin B, Ridley AJ (2003) RhoE binds toROCKI and inhibits downstream signaling. Mol Cell Biol 23: 4219-4229; Komander D, Garg R, WanPT, Ridley AJ, Barford D (2008) Mechanism of multi-site phosphorylation from aROCK-I:RhoE complex structure. EMBO J 27: 3175-3185; Ward Y, Yap SF, Ravichandran V, Matsumura F, Ito M, Spinelli B,Kelly K (2002) The GTP binding proteins Gem and Rad are negative regulators ofthe Rho-Rho kinase pathway. J Cell Biol 157: 291-302）。また、ミオシンもＲｈｏキナーゼと同じ経路にある。ミオシンは、間接的にＲｈｏキナーゼによって活性化され、それ自身が同じ経路のｒｈｏキナーゼの下流である。したがって、本発明の方法により、ミオシン阻害剤もまたｒｈｏキナーゼ阻害剤に代えて幹細胞の生存の補助及び／又は幹細胞の表面への付着の補助に使用することができる。ブレビスタチンはミオシン阻害剤であり、本発明の方法により使用される任意のｒｈｏキナーゼ阻害剤に代えて使用することができる（Ohgushi M, Matsumura M, Eiraku M, Murakami K, Aramaki T, NishiyamaA, et al. Molecular pathway and cellstate responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stemcells. Cell Stem Cell 2010;7:225-39; Ohata H, Ishiguro T, Aihara Y, et al. Induction of the Stem-likeCell Regulator CD44 by Rho Kinase Inhibition Contributes to the Maintenance ofColon Cancer-Initiating Cells. Cancer Res. 2012;72(19):5101-10）。ｒｈｏ関連キナーゼ阻害剤の使用に対する他の代替法としては、細胞の遊走の増大を生じる任意の標的を活性化又は阻害することである。細胞の遊走を増大するＲＡＣ経路の調節因子の活性化は、ＰＩ３Ｋ、ＣＤＣ４２、ＰＡＫ、Ｎ−ＷＡＳＰ及びＲＡＣ１、並びに膜状仮足を含む。細胞内でのそれらの発現レベルを亢進する又はそれらの活性を増大する物質を、幹細胞の生存及び表面への付着を亢進するために使用する。ＲＡＣ１  ＧＴＰアーゼ発現は、幹細胞が解離されるにつれて減少し、逆にＲｈｏ関連キナーゼは増加して細胞遊走の喪失及びアポトーシスをもたらす（Ohgushi M, Matsumura M, Eiraku M, et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-inducedapoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell.2010;7(2):225-39.）。したがって、ＰＩ３ｋ又はＲＡＣ経路の阻害剤は抑制されるべきであるか、又はＲＡＣ経路の活性化因子は、幹細胞の生存及びＭＵＣ１＊等の幹細胞表面タンパク質に抗体が結合する抗体コーティング等の表面への付着を亢進するために増加されるべきである。六量体形態のＮＭＥ１及びＮＭＥ２（これもおそらくは六量体形態である）は、ＧＥＦ  Ｔｉａｍ１及びＤｂｌ−１に結合してＧＴＰアーゼＲＡＣ１及びＣＤＣ４２  ＧＴＰアーゼをそれぞれ阻害する（Ohgushi M, Matsumura M, Eiraku M, et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-inducedapoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2010;7(2):225-39; Murakami M,Meneses PI,Knight JS,Lan K,Kaul R,Verma SC,Robertson ES.Nm23-H1 modulates the activity of the guanine exchange factor Dbl-1. Int J Cancer.2008; 123:500-10; Miyamoto M,Iwashita S,Yamaguchi S,Ono Y.Role of nm23 in the regulation of cell shape and migration via Rho familyGTPase signals. Mol CellBiochem. 2009; 329:175-9）。したがって、ＮＭＥ１六量体及びＮＭＥ２六量体によって調節されるＲＡＣ及びＣＤＣ４２の阻害は、細胞遊走を減少させ、幹細胞付着及び生存を制限する。本発明者らは、ＮＭＥ７培地中での培養物中の胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞においてＮＭＥ１及びＮＭＥ２を抑制し、病的影響がないことを確認した。ＮＭＥ６又はＮＭＥ７含有培地中で培養された幹細胞及び前駆体細胞におけるＮＭＥ１及びＮＭＥ２の抑制は、幹細胞及び前駆体細胞の生存、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養用表面への付着の亢進に好ましい方法である。好ましい実施形態では、胚性幹細胞又はｉＰＳ細胞は、ＮＭＥ１及びＮＭＥ２を抑制するためＮＭＥ７及びｓｉＲＮＡを含有する培地中で培養される。好ましい実施形態では、ＮＭＥ１及びＮＭＥ２を抑制する核酸は、コレステロール部分によって誘導体化されて細胞内へと入ることが可能されたｓｉＲＮＡ（Darmicon）である。より好ましい実施形態では、幹細胞をＹ２７６３２等のｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ１）阻害剤と接触させない。
【０１６３】
或いは、ＮＭＥ１、ＮＭＥ６又はＮＭＥ７を含有する培地中で培養された幹細胞は、懸濁物中で成長される。懸濁物中での細胞の成長に関する多くの技術が当業者に既知である。幹細胞の成長用又は体細胞、皮膚芽細胞若しくは線維芽細胞等のより成熟した細胞における多能性の誘導用のＮＭＥ含有培地と関連して、ウェーブバッグ、ローラーボトル等を使用することができる。好ましい実施形態では、ＮＭＥタンパク質は二量体形態のＮＭＥ１である。より一層好ましい実施形態では、ＮＭＥタンパク質はＮＭＥ７である。
【０１６４】
ＮＭＥ１、ＮＭＥ６又はＮＭＥ７が添加される培地の特性により、本発明が限定されることを意図するものではない。ＮＭＥファミリータンパク質は、幹細胞若しくは前駆体細胞の成長に好適な任意の培地、又は多能性の誘導に好適な任意の培地に添加され得る。ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２等の基礎培地、又はノックアウト血清代替物若しくは類似物及び非必須アミノ酸を更に含む類似物が好ましい。好ましい実施形態では、基礎培地は６０％〜８０％のＤＭＥＭ様ベース及び２０％〜４０％のノックアウト血清代替物又は類似物、更に濃縮非必須アミノ酸を含有する。他の場合には、基礎培地はＤＭＥＭ様ベースに加えてインスリン、セレン及びトランスフェリンを含有する。得られる細胞がヒトにおける用途に運命づけられている場合、タンパク質成分の好ましい種はヒトである。
【０１６５】
ＭＵＣ１＊成長因子受容体のリガンド、具体的にはＮＭＥファミリータンパク質は、幹細胞及び前駆体細胞の成長及び多能性の維持を促進する。また、培地中のＭＵＣ１＊リガンドも人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の作製過程を支持し、より未熟な状態への細胞の復帰の誘導過程を支持する。さらに、ＭＵＣ１＊リガンド自体は、トランスフェリン等の他の因子の不在下でのより未熟な状態への細胞の復帰、又はＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ若しくはｃ−Ｍｙｃを含む多能性遺伝子の形質導入を誘導する。
【０１６６】
本発明者らは、以前にＭＵＣ１＊受容体のリガンドが成長因子として機能し得ることを開示した。ＭＵＣ１＊細胞外ドメインを二量体化するリガンドは、ＭＵＣ１陽性がん細胞の成長、並びにＭＵＣ１＊を発現する幹細胞及び前駆体細胞の成長をも高めることが示された。本出願は、ＮＭＥ７もまたＭＵＣ１＊成長因子受容体のリガンドであることを開示する。ＮＭＥ７は幹細胞によって分泌される。他のいかなるサイトカインも欠く基礎培地中のＮＭＥ７は、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞の成長を完全に支持する。ＮＭＥ７は、ＮＭＥ１二量体に非常によく似た方法で幹細胞の成長を促進し、多能性を維持するように機能する。集団の大部分が二量体として存在するように発現され精製されたＮＭＥ１は、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞の成長を完全に支持し、血清又は他のいかなるサイトカインも必要としない。二量体形態のＮＭＥ１及びＮＭＥ７もまた、ナイーブ状態又はグラウンド状態の幹細胞よりも更に成熟した状態の細胞において多能性を誘導する。ＦＧＦ含有培地中のヒト幹細胞の成長が「プライムド」状態の幹細胞を産生するのに対し、ＮＭＥ１二量体又はＮＭＥ７中のヒト幹細胞の成長は「ナイーブ」状態又は「グラウンド」状態と呼ばれるより初期の状態へのそれらの細胞の復帰を誘導する。最近の研究により、プライムド状態の幹細胞は、ヒト体内において、ナイーブ幹細胞のように全ての細胞型へと発生し得ないという証拠が提供されている。したがって、ナイーブ状態はヒト幹細胞の本来の状態であり、ヒト体内において任意の細胞へと発達し得るのはナイーブ幹細胞であることから、よりナイーブ状態にあるＮＭＥ１又はＮＭＥ７中で培養された幹細胞は、ヒトの治療法における用途に理想的に好適である。好ましい実施形態では、ＮＭＥ１又はＮＭＥ７中で培養された幹細胞は、あらゆるヒト幹細胞療法に使用される。
【０１６７】
本出願は、規定された異種成分不含培地の成分としてのＮＭ２３が、胚性及び人工多能性の両方を含む幹細胞の成長を支持し、更に体細胞、前駆体細胞又は幾分成熟した細胞をリプログラムして多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞とも呼ばれる）とする培地として使用され得ることを開示する。
【０１６８】
インスリン（好ましくはヒト）、セレン、トランスフェリン、ｌ−アスコルビン酸を含み、ＮａＨＣＯ３を使用してｐＨが調整された基礎培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２（又はその類似物）へのＮＭ２３の添加は、ビトロネクチンでコーティングされた表面、又は抗ＭＵＣ１＊でコーティングされた表面に細胞を付着させた場合に、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の成長を完全に支持する。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤ＨＡ１００又はＹ２７６３２の少なくとも最初の２４時間に亘る使用により、幹細胞の表面付着を著しく改善する。二量体として発現及び／又は単離され得るＮＭ２３及びＮＭ２３バリアントが特に好ましい。ＦＧＦ−２又はＴＧＦ−ベータ等の他の成長因子は、この培地中のＮＭ２３に任意に添加され得る。さらに、性能改善のため低酸素条件下で細胞を成長させてもよい。
【０１６９】
インスリン（好ましくはヒト）、セレン、トランスフェリン、ｌ−アスコルビン酸を含み、ＮａＨＣＯ３を使用してｐＨが調整された基礎培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２（又はその類似物）へのＮＭ２３の添加は、ビトロネクチンでコーティングされた表面、抗ＭＵＣ１＊でコーティングされた表面、マドリゲル及び幹細胞が付着する他の表面に細胞を付着させた場合に、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の成長を完全に支持する。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤ＨＡ１００又はＹ２７６３２の少なくとも最初の２４時間に亘る使用は、幹細胞の表面付着を著しく改善する。任意のＲｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫｉ）の添加は細胞の形状及び付着特性を変化させ、ＮＭ２３を含有する培地において使用して幹細胞、前駆細胞及び他の非付着性細胞の表面への付着を亢進することができる。ｒｈｏキナーゼ阻害剤が存在下において、細胞は、２４時間〜４８時間以内に弱い表面付着を伴う丸みを帯びた形状から多くの表面付着を伴うより扁平な形状へと移行する。以前に、生存を亢進するための幹細胞との併用についてＲｈｏキナーゼ阻害剤の使用が記載されているが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤はＮＭＥ系培地において生存を高めるのではない。この理由より、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は細胞を平坦化し、表面へのより大きな付着を形成するために使用される。
【０１７０】
ｂＦＧＦ系培地と併用のため、また生存を高めるためのｒｈｏキナーゼ阻害剤の使用が以前にも記載されている。本明細書において、本発明者らは、培地中にＮＭＥ１、ＮＭＥ６又はＮＭＥ７が使用される場合に、表面に対する付着を補助するためのＲｈｏキナーゼ阻害剤の使用を記載する。２つのＮＤＰＫドメインを有する単量体であるＮＭＥ７と同様に、二量体として発現及び／又は単離され得る、ＮＭ２３及びＮＭ２３バリアントが特に好ましい。これらのＮＤＰＫドメインは、これまで酵素活性を有することのみが知られていたが、本発明者らは、ＮＤＰＫドメイン部分がＭＵＣ１＊細胞外ドメインに結合するモチーフを含有することを発見した。
【０１７１】
図１４は、プルダウンアッセイにおいて、ヒト幹細胞由来のＮＭＥ７がＰＳＭＧＦＲペプチドの配列を有する合成ペプチドに結合したことを示す。本発明者らは、１）ＮＭＥ１二量体（六量体ではない）のみが多能性幹細胞の成長を支持する、２）ＮＭＥ１二量体（六量体ではない）はナノ粒子アッセイにおいて２以上のＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドに結合する、及び３）ＭＵＣ１＊の多能性活性及び成長因子受容体活性はその細胞外ドメインのリガンド誘導性二量体化の後に生じることを示し、すなわち、二価の抗ＭＵＣ１＊抗体は結果的に成長因子受容体機能を生じる細胞外ドメインの二量体化であることを示す抗体濃度の関数として釣鐘型の成長曲線をもたらすことを示した。
【０１７２】
また、本発明者らは、ＮＭＥ７が、多能性幹細胞の成長を支持し、分化を阻害するそれらの能力においてＮＭＥ１二量体と同様に機能することを示した。ＮＭＥ７は、ＮＤＰＫドメインを介してＭＵＣ１＊受容体の細胞外ドメインに結合し、多能性のナイーブ幹細胞の成長を促進し、分化を阻害する。具体的には、ＮＭＥ７はＭＵＣ１＊細胞外ドメインの一部であるＰＳＭＧＦＲペプチドに結合する。
【０１７３】
ＮＭＥ１としても知られるＮＭ２３−Ｈ１は、二量体形態の場合のみ、幹細胞又は前駆体細胞の成長因子として活性である。ＮＭＥ１は、濃度の関数に応じてその順に、二量体、四量体又は六量体として存在し得る。Ｃ末端欠損を伴う又は伴わないＳ１２０Ｇ又はＰ９６Ｓ等の変異は二量体形成を好み、六量体形成に幾分抵抗性であるため、幹細胞又は前駆体細胞の成長因子として好ましい。また、ＮＭＥ６は二量体として存在し、ＮＭＥ１二量体のように多能性の維持及び誘導並びに分化の阻害のための成長因子としての使用に好ましい。ＮＭＥ７は単量体であるが、その２つのＮＤＰＫドメインにより二量体のように結合し得る。プルダウンアッセイにおいて、ＮＭＥ７はＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドに結合し、少なくとも１つのＮＤＰＫドメインの一部がＭＵＣ１＊受容体に結合し、ＮＭＥ１二量体のように、結果的に分化を阻害しながら多能性の維持又は誘導を生じることを示した。サンドイッチアッセイにおいて、ＮＭＥ７は２つのＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド（ＰＳＭＧＦＲ）に同時に結合することが示され、ＮＭＥ７−ＡＢタンパク質は細胞表面上のＭＵＣ１＊を二量体化し得ることを示している。また、ＮＭＥ１はＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド及び細胞上のＭＵＣ１＊受容体にも結合する。ＮＭＥ１六量体はＭＵＣ１＊受容体には結合せず、多能性を維持又は誘導しない。成長、維持、多能性の誘導及び分化の阻害のためＮＭＥ１二量体、ＮＭＥ６二量体又はＮＭＥ７を、幹細胞又は前駆体細胞の培養に好適な多くの異なる基礎培地において使用することができる。適合性の基礎培地の組成は変化し得る。場合によっては、他の成長因子又はサイトカインをＮＭＥタンパク質と共に培地に添加してもよい。任意に、ＦＧＦ−２又はＴＧＦ−ベータ等の他の成長因子をこの培地中のＮＭ２３に加えてもよい。最も好ましい実施形態では、ＮＭＥ１二量体、ＮＭＥ６二量体又はＮＭＥ７は他の成長因子又はサイトカインを含有しない基礎培地に添加される。性能改善のため、細胞を低酸素条件下で成長させてもよい。
【０１７４】
本発明の方法は、遺伝子変異又は遺伝子補正を保有し得る細胞の特定集団の増殖を刺激する成長因子と共に細胞を提供するために作用し得る。１つの実施形態では、ＮＭＥファミリータンパク質は細胞内へと導入されるプラスミド内に含有され得る核酸配列にコードされる。ＮＭＥファミリータンパク質をコードする核酸配列は、プラスミドの一部であってもよく、又はその発現が望ましい遺伝子の配列も保有する発現ベクターであってもよい。遺伝子は補正された遺伝子であってもよく、発現される遺伝子であってもよい。また、本発明は、成長に最小の溶液のみを必要とすることから、細胞が構成的にそれ自身の成長因子を発現し、培養を単純化するように幹細胞内へとＮＭＥファミリーメンバーをコードする核酸を導入することも想定する。好ましい実施形態では、核酸は、誘導可能な又は制御可能なプロモーターを有し得る発現プラスミドである。好ましい実施形態では、ＮＭＥファミリーメンバーはＮＭＥ１、ＮＭＥ６又はＮＭＥ７である。より一層好ましい実施形態では、ＮＭＥファミリーメンバーはＮＭＥ７である。最も好ましい実施形態では、ＮＭＥファミリーはＮＭＥ７−ＡＢである。また、本発明は、患者における、患者への移植が運命づけられた細胞における、胚盤胞及び胚における、並びに体外受精に使用され得る受精卵又は未受精卵における、これらの方法の使用も包含する。
【０１７５】
本発明は、更に、その起源において胚性であっても又はより成熟した細胞から誘導されてもよい、新たな幹細胞株の作製のためのＮＭＥ系培地の使用を想定する。好ましい実施形態では、ＮＭＥ系培地は組換えＮＭＥ７を含有する最小培地である。更に好ましくは、ＮＭＥ７−ＡＢを含有する培地である。
【０１７６】
新たな幹細胞株は以下の通り樹立される：胚盤胞の内部細胞塊（inner mass）からヒト細胞を回収するか、又は胚盤胞全体を使用することができる。胚盤胞の細胞を維持し、ＮＭＥ７を含有する培地中で培養する。好ましい実施形態では、培地は他の成長因子又はサイトカインを含まない。回収された細胞を、線維芽細胞又はＭＵＣ１陽性がん細胞であってもよいフィーダー細胞層上、又は抗体層上にプレーティングしてもよい。好ましい実施形態では、抗体は抗ＭＵＣ１＊抗体である。より一層好ましくは、Ｎ−１０  ＰＳＭＧＦＲペプチドに結合する抗体である。或いは、細胞はＮＭＥ７含有培地中の懸濁液中で培養又は維持されてもよい。その後、当業者に既知の様々な技法を使用して、その後にクローニングされて望ましい核型及び望ましい遺伝子発現を有するクローンを得ることが可能な幹様細胞を単離することができる。好ましい実施形態では、ナイーブ状態であってプライム状態ではない指標である遺伝子発現を有し、更にその細胞が雌性である場合にはＸ染色体の不活性化を経ていないクローンを単離し、増殖させる。典型的な幹細胞導出法では、胚盤胞又は胚盤胞由来の細胞を表面上にプレーティングし、幹様を現すブラストの発育が観察されるまでの或る一定期間に亘り培養する。これらを回収し、成長し、望ましい特性を有するクローンを単離し、維持する。多能性マーカー並びにナイーブマーカーについて陽性であり、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ、ＬＨＸ若しくは時にはＸＩＳＴ等のプライムドマーカーの発現が低い若しく発現しない、又は核内に凝縮したヒストン−３を欠くクローンを単離するのに標準的なクローニング技法を実施する。ＮＭＥ７を含有する最小培地中でクローンを維持し、増やし、任意に抗ＭＵＣ１＊抗体層上で細胞を成長させることによってナイーブ状態を維持する。代替法では、細胞を懸濁液中で培養する。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤をＮＭＥ７含有培地に添加してもよい。好ましい実施形態では、培地はＦＧＦを含まない。
【０１７７】
マウス及びヒトにおいて、体細胞は転写因子の異所性の発現によってリプログラムされて多能性となり得ることが実証されている（Lowry etal., 2008; Maherali et al., 2007; Nakagawa et al., 2008; Okita et al., 2007;Park et al., 2008; Takahashi et al., 2006; Takahashi and Yamanaka, 2006; Werniget al., 2007; Yu et al., 2006）。人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の作出は、患者自身の皮膚細胞由来の幹細胞を使用して疾患又は加齢により生じた損傷を修復する細胞及び組織を作出するために使用され得ることから、真に個別化された再生医学の実現が大いに期待される（Yamanaka,2007; Jaenish and Young, 2008）。転写因子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ、又はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８の組合せの強制発現により、成熟細胞の多能性状態への復帰を引き起こすことが示されている。しかしながら、これらの方法は処理過程を通してＦＧＦ系培地を使用し、これはｉＰＳ作出過程を遅延するか又は改悪する可能性がある。
【０１７８】
既知の技術に対する改良は、以下の通りｉＰＳ細胞株を作出することである：ドナー又は患者に由来し得る体細胞、皮膚芽細胞又は線維芽細胞を、ＮＭＥファミリータンパク質を含有する培地中で培養する。好ましい実施形態では、ＮＭＥファミリータンパク質はＮＭＥ１二量体、ＮＭＥ６又はＮＭＥ７である。より好ましい実施形態では、ＮＭＥファミリーメンバーはＮＭＥ７であり、ＮＭＥ７−ＡＢが特に好ましい。細胞を核酸、小分子又はタンパク質で処理して、細胞内での多能性遺伝子又は多能性タンパク質のレベルを高めることができ、ここで多能性遺伝子又は遺伝子産物はＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＬＩＮ２８及びＮＭＥ７から選択される。好ましい実施形態では、出発細胞をＯｃｔ４、ＳＯＸ２及びＫｌｆ４で形質移入する。体細胞、皮膚芽細胞、線維芽細胞又は他の細胞である出発細胞を、ＮＭＥ７を大体２ｎＭ〜５０ｎＭ、より好ましくは８ｎＭ〜１６ｎＭ含有する最小培地中のプラスチックマルチウェルプレート上に最初にプレーティングする。通常通り、培地を２４時間〜２７時間ごとに交換する。細胞がプラスチックへの接着を失い始めるに従い、不活性化線維芽細胞の表面、不活性化がん細胞又は幹細胞表面タンパク質に対する抗体（抗ＭＵＣ１＊抗体が好ましい）によりコーティングされた表面等の細胞が接着する表面へと細胞を移動し得る。ＮＭＥファミリーメンバーに加え、ｒｈｏキナーゼ阻害剤を培地に添加してもよい。およそ２週間〜３週間後、幹様細胞が出現し、単離及びクローニングすることができる。望ましい核型及び遺伝子発現プロファイルを有するクローンを選択し、安定的な自己複製細胞株として増殖させる。好ましい実施形態では、ナイーブであるクローンを選択する。新たな幹細胞株を作出するこれらの方法についてはヒト細胞が好ましい。
【０１７９】
本発明の方法が有用である幹細胞又は前駆体細胞の種類により、本発明を限定することを意図するものではない。本質的にはＭＵＣ１の開裂形態（form）、すなわちＭＵＣ１＊を発現する任意の幹細胞又は前駆体細胞を本発明の培地及び方法と共に使用することができる。
【０１８０】
ＦＤＡの承諾を含む様々な理由により、治療用途に運命づけられたヒト幹細胞の成長については、完全に規定された異種成分不含培地が望ましい。本明細書における実施例及び図面により、ＮＭＥ１二量体及びＮＭＥ７は、完全に多能性のナイーブ幹細胞の成長を支持し、分化を阻害することが実証されており、これらの機能は基礎培地の成分と無関係である。実質的には、幹細胞成長に好適な任意の基礎培地で事足りるであろう。他の成長因子又はサイトカインを含有しない基礎培地が好ましい。
【０１８１】
最近、研究者らは、ヒト（human）幹細胞の成長用の規定された異種成分不含培地である、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、インスリン、セレン、トランスフェリン、ｌ−アスコルビン酸及びｐＨ調整用ＮａＨＣＯ３に加えて成長因子としてｂＦＧＦ及びＴＧＦ−ベータを含むＥ８と呼ばれる基礎培地を報告した（Chen G, Gulbranson D, Hou Z et al, "Chemically definedconditions for human iPSC derivation and culture" Nature Methods, Vol. 8.No. 5, 2011 pgs 424-431）。ｂＦＧＦ及びＴＧＦ−ベータを欠くがＮＭＥ１二量体若しくはＮＭＥ６二量体又はＮＭＥ７を含み、本発明者らが「ＭＮ６」と呼ぶこの基礎培地は、ｉＰＳ作出の間、完全にヒト及びマウス多能性幹細胞の成長を支持し、分化を阻害し、また多能性の誘導を支持することが示された。基礎培地及び非必須アミノ酸のみであるＭＮ２培地（実施例１を参照）中のＮＭＥ１二量体若しくはＮＭＥ６二量体、又はＮＭＥ７は、多能性幹細胞の成長を或る程度支持した。これらの知見より、ＮＭＥ１二量体及びＮＭＥ７はヒト幹細胞の天然の成長因子であり、幹細胞又は前駆体細胞の成長に好適な様々な培地に使用され得るという事実が強調される。Ｅ８培地と同様、ＮＭＥ１二量体及びＮＭＥ７との併用に好適な培地には、ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥ／Ｆ１２／Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ等の基礎培地、Ｌ−アスコルビン酸、セレン酸ナトリウム、インスリン、トランスフェリン及び重炭酸ナトリウム等のｐＨ調整剤が含まれる。本発明の別の態様では、ＮＭＥ１二量体又はＮＭＥ７が添加される基礎培地には、ＤＭＥ／Ｆ１２／Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ、ノックアウト血清代替物（LifeTechnologies/Invitrogen）等の血清代替物、非必須アミノ酸溶液（LifeTechnologies/Invitrogen）等のアミノ酸、及び任意にベータ−メルカプトエタノールが含まれる。これらの各基礎培地に由来する成分を含有する培地も想定される。実際、幹細胞又は前駆体細胞の成長に好適な任意の基礎培地を、幹細胞又は前駆体細胞の成長のため、プライムド状態への分化をも阻害するため、またより成熟した細胞（体細胞、皮膚芽細胞、線維芽細胞又は前駆体細胞であってもよい）における多能性の誘導のためＮＭＥ１二量体及びＮＭＥ７と共に使用することができる。
【０１８２】
様々な培地が、ＮＭＥ１二量体又はＮＭＥ７と混合された場合に、幹細胞の成長及び分化の阻害を支持した。ＮＭＥ１二量体、ＮＭＥ６二量体又はＮＭＥ７の濃度は変化し得る。１つの態様では、ＮＭＥ濃度は１ｎＭ〜１００ｎＭ（単量体の分子量ベース）。好ましい実施形態では、ＮＭＥ１二量体、ＮＭＥ６二量体又はＮＭＥ７の濃度は、２ｎＭ〜６４ｎＭである。より一層好ましい実施形態では、ＮＭＥ１二量体、ＮＭＥ６二量体又はＮＭＥ７の濃度は４ｎＭ〜３２ｎＭである。
【０１８３】
ＮＭＥ１二量体又はＮＭＥ７と８ｎＭ〜１６ｎＭで混合された場合にヒト幹細胞の成長及びマウス幹細胞の成長を完全に支持し、ヒトプライムド幹細胞をナイーブ状態へと復帰させた最小培地「ＭＭ」と呼ばれる１つの培地には、
ＤＭＥ／Ｆ１２／ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（Invitrogen＃１０５６５−０１８）４００ｍｌ、
ノックアウト血清代替物（ＫＯ−ＳＲ、Invitrogen＃  １０８２８−０２８）１００ｍｌ、
１００×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Invitrogen＃  １１１４０−０５０）５ｍｌ、及び、
β−メルカプトエタノール（５５ｍＭストック、Invitrogen＃  ２１９８５−０２３）０．９ｍｌ（０．１ｍＭ）、
が含まれた。
【０１８４】
ＮＭＥ１二量体又はＮＭＥ７が８ｎＭ〜１６ｎＭで添加された場合に同様に働く別の培地は「ＭＮ６」であり、
ＤＭＥＭ／Ｆ１２、
Ｌ−アスコルビン酸６４ｍｇ／Ｌ、
セレン酸ナトリウム１４ｕｇ／Ｌ、
インスリン１９．４ｍｇ／Ｌ、
重炭酸ナトリウム５４３ｍｇ／Ｌ、及び、
トランスフェリン１０．７ｍｇ／Ｌ、
を含んだ。
【０１８５】
８ｎＭ〜１６ｎＭで添加されたＮＭＥ１二量体又はＮＭＥ７により試験された別の培地は「ＭＮ２」であり、
ＤＭＥ／Ｆ１２／ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（Invitrogen＃１０５６５−０１８）４００ｍｌ、及び、
１００×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Invitrogen＃１１１４０−０５０）５ｍｌ、
を含んだ。
【０１８６】
「ＭＭ」又は「ＭＮ６」中のＮＭＥ１二量体及びＮＭＥ７は、ＦＧＦ含有培地「Ｅ８」又はｍＴｅＳＲと同等又はより良好にヒト幹細胞の成長を支持する。図１〜図１０に示される実験をビトロネクチンの層上に幹細胞をプレーティングすることにより実施したのに対し、図１１及び図１２の実験を抗ＭＵＣ１＊抗体の層上に幹細胞をプレーティングすることにより実施した。任意の最小培地又は規定培地中のＮＭＥ１二量体又はＮＭＥ７は、多能性を促進し、分化を阻害する。幹細胞の成長に好適な任意の表面又は基礎培地は、ＮＭＥ１、ＮＭＥ６又はＮＭＥ７における成長と適合するものであった。本発明の方法は、胚性幹細胞による使用に限定されない。ＮＭＥ１二量体又はＮＭＥ７は、マウスＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞と同様に、ヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の成長も完全に支持した。さらに、ＮＭＥ１二量体又はＮＭＥ７は、体細胞における多能性の誘導を支持し、実際にｉＰＳ作出の効率を高めた。
【０１８７】
ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の成長及び維持のためのこの規定異種成分不含培地においてＮＭ２３を使用することに加え、前駆体細胞又は皮膚芽細胞等の成熟体細胞由来のｉＰＳ細胞を作製する過程においても使用した。
【０１８８】
細胞培養培地
ＭＵＣ１＊リガンドが培地に添加されるか、又は細胞により発現されるかのいずれかである限り、任意の細胞培養物を使用してもよい。具体的には、培地に添加されるか、細胞により発現されるＮＭ２３ファミリーのタンパク質等のＭＵＣ１＊リガンドを含む最小培地が好ましい。ＤＭＥＭ／Ｆ１２、インスリン（好ましくはヒト）、セレン、トランスフェリン、ｌ−アスコルビン酸のみを含み、ＮａＨＣＯ３を使用してｐＨを調整した最小培地を作製し、本発明者らはこの培地を「ＭＮ６」と呼んだ（以下の詳細な処方を参照）。ＤＭＥ／Ｆ１２／ＧｕｌｔａＭＡＸ  Ｉ（Invitrogen＃１０５６５−０１８）４００ｍｌ及び１００×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Invitrogen＃  １１１４０−０５０）５ｍｌのみを含む別の最小培地を作製し、本発明者らはこの培地をＭＮ２と呼んだ（以下の詳細な処方を参照）。最小幹細胞培地又は「ＭＭ」と呼ばれる別の基礎培地中のＮＭＥ７、ＮＭＥ６又はＮＭＥ１（ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ）を、ＭＮ２培地並びにノックアウト血清代替物（ＫＯ−ＳＲ、Invitrogen＃  １０８２８−０２８）１００ｍｌ及びβ−メルカプトエタノール（５５ｍＭストック、Invitrogen＃  ２１９８５−０２３）０．９ｍｌ（０．１ｍＭ）に含めた。これら３つの基礎培地にＮＭＥ７、ＮＭＥ６又はＮＭＥ１（ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ）８ｎＭ〜１６ｎＭを添加した（ここで、ＮＭＥ１はリフォールディングされ、この集団が本質的に全て二量体であるように精製された）。場合によっては、Ｙ２７６３２等のＲｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）を添加した。これらの培地のいずれかにおけるＮＭＥ１、ＮＭＥ６又はＮＭＥ７の存在が多能性幹細胞の成長を促進し、分化を阻害する。
【０１８９】
Ｙ２７６３２を含む／含まない、以前に報告されているＦＧＦ−２及びＴＧＦ−ベータを含むＭＮ６の培地「Ｅ８」（G. Chen, D. R. Gulbranson, Z. Hou et al., Nat Methods 8 (5), 424 (2011)）をＮＭＥ系培地と比較した。さらに、別のコントロールとして、５０％ＭＥＦを含むＦＧＦ−２（ｂＦＧＦとも呼ばれる）馴化培地を培地として使用した。
【０１９０】
本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態による範囲に限定されない。実際、本明細書に記載される実施形態に加えて本発明の様々な修飾形態が、上記説明及び付随する図面より当業者に明らかとなるであろう。かかる修飾形態は添付の特許請求の範囲内となることが意図される。以下の実施例は、本発明を例示する目的で提示されるものであって、本発明を限定する目的で提示されるものではない。
【実施例】
【０１９１】
実施例１−培地
実施例１．１−最小幹細胞培地（「ＭＭ」）の成分（５００ｍｌ）
ＤＭＥ／Ｆ１２／ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（Invitrogen＃  １０５６５−０１８）４００ｍｌ
ノックアウト血清代替物（ＫＯ−ＳＲ、Invitrogen＃  １０８２８−０２８）１００ｍｌ
１００×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Invitrogen＃  １１１４０−０５０）５ｍｌ
β−メルカプトエタノール（５５ｍＭストック、Invitrogen＃  ２１９８５−０２３）０．９ｍｌ（０．１ｍＭ）
【０１９２】
実施例１．２−Ｅ８培地の成分
ＤＭＥＭ／Ｆ１２
Ｌ−アスコルビン酸６４ｍｇ／Ｌ
セレン酸ナトリウム１４ｕｇ／Ｌ
インスリン１９．４ｍｇ／Ｌ
重炭酸ナトリウム５４３ｍｇ／Ｌ
トランスフェリン１０．７ｍｇ／Ｌ
ＴＧＦベータ１  ２ｕｇ／Ｌ
ＦＧＦ２  １００ｕｇ／Ｌ
【０１９３】
実施例１．３−ＭＮ７の成分はＥ８培地からｂＦＧＦを除いたものである。
【０１９４】
実施例１．４−ＭＮ６培地の成分
ＤＭＥＭ／Ｆ１２
Ｌ−アスコルビン酸６４ｍｇ／Ｌ
セレン酸ナトリウム１４ｕｇ／Ｌ
インスリン１９．４ｍｇ／Ｌ
重炭酸ナトリウム５４３ｍｇ／Ｌ
トランスフェリン１０．７ｍｇ／Ｌ
【０１９５】
実施例１．５−ＭＮ２培地の成分
ＤＭＥ／Ｆ１２／ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（Invitrogen＃  １０５６５−０１８）４００ｍｌ
１００×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Invitrogen＃  １１１４０−０５０）５ｍｌ
【０１９６】
実施例１〜実施例３及び図１〜図１４は７０１２４によるものである。
【０１９７】
実施例１．６
ヒトＥＳ細胞（Ｈ９）を６ウェル細胞培養プレート上のビトロネクチン層、又は抗ＭＵＣ１＊抗体（ＭＮ−Ｃ３）層のいずれかの上にプレーティングした。各条件について、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２が存在するか、又は不在であった。少なくとも最初の２４時間でのＲｈｏキナーゼ阻害剤の存在が、細胞付着及び性能を改善したが、未分化幹細胞の成長には必ずしも必須ではなかった。
【０１９８】
結果より、二量体形態のＮＭ２３は、コントロールと同様、またＦＧＦ−２及びＴＧＦ−ベータの組合せと同様か又はより良好に、６成分規定の異種成分不含培地における多能性幹細胞の成長を完全に支持した。図１〜図１０はプレーティング後４日目の培養物中の幹細胞の写真画像である。
【０１９９】
図１１及び図１２は、抗ＭＵＣ１＊抗体（ＭＮ−Ｃ３）層上にプレーティングされたヒトＥＳ細胞（Ｈ９）を示す。起源細胞を標準プロトコルに従ってｂＦＧＦ４ｎｇ／ｍＬにてマウスフィーダー細胞（ＭＥＦ）上で５５継代に亘り予め培養した。図１１はプレーティング後４日目（Ｄ４）における抗ＭＵＣ１＊抗体表面上への第１継代（Ｐ１）の幹細胞を示し、Ａ、Ｃは最小幹細胞培地「ＭＭ」中でＮＭ２３二量体８ｎＭにて培養され、Ｂ、ＤはＭＮ６完全規定異種成分不含培地中でＮＭ２３二量体８ｎＭにて培養された。明らかなように、異なる基礎培地に基づいて得られた幹細胞の培養密度又は多能性には何らの相違もない。図１２は、プレーティング後２日目（Ｄ２）における２継代（Ｐ２）後の同じ起源細胞を示し、Ａ、ＣはｍＴｅＳＲ培地中で培養され、Ｂ、Ｄは二量体ＮＭ２３を８ｎＭ含むＭＮ６培地中で培養された。明らかなように、ＭＮ６培地中のＮＭ２３は、異なる基礎培地に基づいて得られた幹細胞の培養密度及び多能性に関してｍＴｅＳＲと同様か又はより良好に働いた。各継代について最初の４８時間のみ、全ての培地を１０ｕＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２で補填した。図１３は、抗ＭＵＣ１＊抗体表面上又はビトロネクチン上での同じ細胞であるが異なる培地中で培養された成長率を比較する。
【０２００】
リフォールディングされ、二量体として精製されたＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇに加え、Ｇ４Ｓ１を二回反復するフレキシブルリンカーにより連結された２つのＮＭ２３単量体サブユニットを含む１本鎖ＮＭ２３コンストラクト（ＮＭ２３−ＧＳ２）、及びより長いリンカーにより連結された２つのＮＭ２３単量体を含む１本鎖ＮＭ２３コンストラクト（ＮＭ２３−Ｘ４）を、天然に二量体化されたＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇと同様に検査し実施した。
【０２０１】
実施例２−ＦＧＦの不在下でＮＭＥ系培地を使用する多能性の誘導
従来使用されている標準プロトコルは、まずプラスチック上に皮膚芽細胞又は線維芽細胞（ヒト包皮線維芽細胞−新生児、「ｈＦＦｎ」：＃ＰＣ５０１Ａ−ｈＦＦ、System Biosciences、マウンテンビュー、カナダ）をプレーティングし、線維芽細胞培地（ＦＭ）中で培養し、２４時間ごとに交換する。５日後、細胞を不活性化線維芽細胞フィーダー細胞（マウス（ＭＥＦ）又はヒト（ＨＳ２７）であってもよい）でコーティングされた表面に移す。次の２日間に亘り、細胞をＦＭ中で保持する。７日目、培地をｂＦＧＦ系培地に交換し、培地を２４時間ごとに交換する。最初のプレーティングから約２週間〜４週間後、胚性幹（ＥＳ）細胞様形態を有するコロニー（クローン）を選択し、不活性化フィーダー細胞（ＭＥＦ又はＨＳ２７）でコーティングされた新しいウェルに個別にプレーティングし、３日〜４日ごとに順次継代する。ＥＳ様細胞として成長を続けるウェルを増やし、多能性マーカーの存在を試験する。
【０２０２】
従来使用されている標準プロトコルに反し、本発明者らは、常にＮＭＥ培地（ＮＭＥ１二量体：「ＮＭ２３−ＭＭ−Ａ」）中で体細胞を培養した。さらに、本発明者らは、線維芽細胞フィーダー細胞層上、又は抗ＭＵＣ１＊抗体（Ｎ−１０  ＰＳＭＧＦＲペプチドを認識するＣ３又はＣ８）層上に細胞をプレーティングした。ＲＴ−ＰＣＲ測定を行って、４日目（図３１Ａ）又は２０日目（図３１Ｂ）まで、様々な条件下で発現されたＯｃｔ４の量を定量した。４日目までにＯｃｔ４の発現レベルによって測定される多能性の誘導をもたらした唯一の条件は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４（「ＯＳＫ」）（ｃ−Ｍｙｃなし）で形質移入され、最小培地（「ＭＭ」）中のＮＭＥ１二量体において培養された線維芽細胞に対するものであった。これらの細胞について、Ｏｃｔ４は出発細胞よりも１１９倍大きく、線維芽細胞培地中で代わりに培養された同一の細胞よりも２００倍近く大きかった。２０日目までに３つの遺伝子ＯＳＫのみにより形質移入され、ＮＭ２３−ＭＭ−Ａ中で培養された細胞は、コントロールよりも１０９倍大きくＯｃｔ４を発現した。ＯＳＫＭにより形質移入され、常にＮＭ２３−ＭＭ中で培養された細胞は、線維芽細胞（ＦＭ）中からｂＦＧＦ培地（標準）中へと切り替えられて培養された同一の細胞よりもＯｃｔ４発現が３倍大きい一方で、ＦＭ中の後にＮＭ２３−ＭＭ中へと切り替えられて培養された細胞は、ＦＭ中の後にｂＦＧＦ−Ｍ中で培養された細胞よりもＯｃｔ４発現が１．３倍大きいに過ぎなかった（図３１Ｃ）。多能性マーカーＴｒａ１−６０に対する２０日目の細胞の免疫細胞化学染色により、ＮＭＥ系培地を使用した細胞における多能性誘導の主な利点が示される。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４により形質移入され、ＦＧＦが添加されていない最小培地中のＮＭＥ１二量体において培養された細胞は、４つ全ての多能性遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ−Ｍｙｃにより形質移入され、ＦＧＦ培地中で標準プロトコルに従って培養されたもの（図３１Ｄ、図３１Ｅ）と比較して、多能性の誘導効率が大いに高められていた（図３１Ｆ、図３１Ｇ）。３つの多能性遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４により形質移入された細胞は、検出可能な多能性マーカーを有さず、幹様形態を欠いていた。
【０２０３】
実施例３
この一連の実験において、本発明者らは、幹細胞及びがん細胞におけるＮＭＥ６及びＮＭＥ７の発現をプローブした。さらに、本発明者らは、ＮＭＥ７の標的としてＭＵＣ１＊を同定した。本発明者らは、まず細胞溶解物に対してウェスタンブロット分析を行い、ＮＭＥ１及びＮＭＥ７の存在又は不在を判定した。図１４Ａでは、抗ＭＵＣ１＊抗体でコーティングされた表面上においてＮＭＥ１二量体中で培養された（レーン１）、若しくはＭＥＦ上においてｂＦＧＦ中で培養された（レーン２）ＢＧＯ１ｖヒト胚性幹細胞に由来する溶解物、又はＴ４７Ｄヒト乳がん細胞溶解物（レーン３）、又は陽性コントロールとしてのＮＭＥ１−ｗｔをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、その後抗ＮＭＥ１特異的抗体によりプローブした。結果は、ＮＭＥ１が、ＮＭＥ１二量体中又はｂＦＧＦ中のいずれで培養されるかにかかわらず、ヒトＥＳ細胞、及びＴ４７Ｄがん細胞において強く発現されることを示す。図１４Ｂにおいて、同じ細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、その後抗ＮＭＥ７特異的抗体によってプローブした。結果は、ＮＭＥ７は、抗ＭＵＣ１＊抗体表面上においてＮＭＥ１二量体中で培養されたヒトＥＳ細胞において強く発現され（レーン１）、ＭＥＦ上においてｂＦＧＦ中で培養された同じＥＳ細胞において弱く発現され（レーン２）、乳がん細胞において強く発現された（レーン３）ことを示す。ＮＭＥ１が添加されたレーン４はブランクであり、ＮＭＥ７抗体がＮＭＥ１と交差反応をしないことを示している。ＮＭＥ１二量体中で培養された幹細胞においてＮＭＥ７がより大きく発現されるという事実は、本発明者らがｂＦＧＦ中で培養された細胞よりも更にナイーブ状態にあることを示す発現マーカーを示しており、プライムド細胞におけるその発現と比較してナイーブ細胞においてＮＭＥ７がより高いレベルで発現されることを意味する。
【０２０４】
ＮＭＥ７がその標的受容体としてのＭＵＣ１＊と共に成長因子として機能するかどうかを判定するため、本発明者らはプルダウンアッセイを行った。これらの実験では、合成ＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド（ヒスチジンでタグ付けされたＰＳＭＧＦＲ配列）をＮＴＡ−Ｎｉ磁気ビーズ上に固定化した。これらのビーズを、抗ＭＵＣ１＊抗体でコーティングされた表面上においてＮＭＥ１二量体中で培養された（レーン１）、若しくはＭＥＦ上においてｂＦＧＦ中で培養された（レーン２）ＢＧＯ１ｖヒト胚性幹細胞の細胞溶解物、又はＴ４７Ｄヒト乳がん細胞溶解物（レーン３）と共にインキュベートした。ビーズをすすぎ、イミダゾールの添加により捕捉されたタンパク質を解放した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、その後、抗ＮＭＥ１抗体（図１４Ｃ）又はＮＭＥ７抗体（図１４Ｄ）のいずれかによりプローブした。結果は、ＮＭＥ７がＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドに結合することを示す。これは、幹細胞及びがん細胞において、ＮＭＥ７はその２つのＮＤＰＫドメイン部分を介して、ＭＵＣ１＊細胞外ドメインを二量体化することによって多能性経路を活性化することを意味する。
【０２０５】
実施例４−タンパク質コンストラクトの作出
実施例４．１−ＮＭ２３−ＷＴ
ＮＭ２３ｗｔを以下のプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。
フォワード5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3'（配列番号８６）
リバース5'-gtggtgctcgagttcatagatccagttctga-3'（配列番号８７）
【０２０６】
その後、フラグメントを精製し、消化し（ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ）、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位の間にクローニングした。
【０２０７】
実施例４．２−ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ
ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ（商標）部位特異的突然変異誘発システム（LifeTechnologies）を使用し、製造業者の指示書に従って以下のプライマー： 5'-gcaggaacattatacatggcggtgattctg-3'（配列番号８８）及び5'-gccatgtataatgttcctgccaacttgtat-3'（配列番号８９）を使用してＮＭ２３−Ｈ１変異体Ｓ１２０Ｇ（第１２０セリンがグリシンに変異）を作製した。図１６は、リフォールディングされていないＳ１２０Ｇ変異体及びリフォールディングされたＳ１２０Ｇと野生型タンパク質の多量体化状態とを比較するＦＰＬＣトレースのオーバーレイを示す。図１７〜図１９は、二量体形態のタンパク質のみがＭＵＣ１＊（六量体ではない）に結合し、二量体のみが多能性幹細胞の成長を支持し得ることを示す。図２１は、発現されリフォールディングされたタンパク質に関する非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる特性評価及び対応するＦＰＬＣトレース、並びにヒト幹細胞の写真を示し、多能性幹細胞の成長を支持するＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの能力を示している。
【０２０８】
実施例４．３−ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓコンストラクト及び欠失コンストラクト
本発明者らは、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Agilent）を使用し、製造業者の指示書に従って以下のプライマー：5'-tcggggagaccaactctgcagactccaag-3'（配列番号９０）及び5'-cttggagtctgcagagttggtctccccga-3'（配列番号９１）を使用してＮＭ２３−Ｈ１変異体Ｐ９６Ｓ（第９６プロリンがセリンに変異）を作出した。ＰＣＲ反応に使用したテンプレートは、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位間にクローニングされたＮＭ２３野生型であった。配列確認の後、欠失コンストラクトをＰＣＲにより作出した。ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ΔＣ１を以下のプライマー：5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'（配列番号９２）及び5'-gtggtgaccggtatagatccagttctgagcaca-3'（配列番号９３）を使用して増幅した。ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ΔＣ２を以下のプライマー：5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'（配列番号９４）及び5'-gtggtgaccggtgatccagttctgagcacagct-3'（配列番号９５）を使用して増幅した。ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ΔＣ６を以下のプライマー：5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'（配列番号９６）及び5'-gtggtgaccggtagcacagctcgtgtaatctacca-3'（配列番号９７）を使用して増幅した。得られたフラグメントを精製し、消化し（ＮｄｅＩ、ＡｇｅＩ）、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ及びＡｇｅＩ制限酵素部位の間にクローニングした。オーバーラップＰＣＲ法を使用してＸｈｏＩ制限酵素部位をＡｇｅＩで置換することによって予めｐＥＴ２１ｂを修飾した。ＮＭ２３−Ｐ９６ＳをＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ間にクローニングした場合に最適な二量体形成を観察した。全ての欠失変異体について、ＮｄｅＩ及びＡｇｅＩ間にクローニングした場合に最適な二量体形成を観察した。図２０は、多能性幹細胞の成長を支持するそれらの能力を示す。
【０２０９】
実施例５−変異体及びバリアントＮＭＥ１種の発現及びリフォールディング
実施例５．１−タンパク質発現及び任意のリフォールディング／精製
ＬＢブロス（ルリアベルターニブロス）を１／１０の終夜培養物と共に接種し、３７℃にてＯＤ６００が約０．５に達するまで培養した。この時点で、イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ、GoldBiotechnology）０．４ｍＭにより組換えタンパク質発現を誘導し、５時間後に培養を停止した。遠心分離（６０００ｒｐｍで４℃にて１０分間）により細胞を回収した後、細胞ペレットをランニングバッファー：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ  ３６０ｍＭ、及びイミダゾール８０ｍＭで再懸濁した。その後、リゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ、Sigma）、ＭｇＣｌ２（０．５ｍＭ）及びＤＮＡｓｅ（０．５ｕｇ／ｍＬ、Sigma）を添加した。３７℃にて３０分間、細胞懸濁物を回転プラットフォーム（２７５ｒｐｍ）上でインキュベートし、５分間氷上で超音波処理した。不溶性細胞片を遠心分離（２００００ｒｐｍで４℃にて３０分間）により除去した。その後、清澄な溶解物をランニングバッファーで平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）に加えた。イミダゾール４２０ｍＭで補填されたランニングバッファー（６ＣＶ）でカラムからタンパク質を溶出する前に、カラムを洗浄した（８ＣＶ）。
【０２１０】
実施例５．２−後のリフォールディングのための任意のタンパク質変性
タンパク質変性のため、溶出画分をプールし、１容量のＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）１００ｍＭ及び尿素８Ｍを添加することによって変性し、この溶液を半分まで濃縮し、更に１容量のＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）１００ｍＭ及び尿素８Ｍを添加した。このサイクルを、最終尿素濃度が約７Ｍとなるまで繰り返した。その後、タンパク質を透析によってリフォールディングした。
【０２１１】
実施例６−異種間機能（Cross species function）
ＮＭ２３は、多能性コロニー形態を有するマウスＥＳ細胞の増殖を支持する。
【０２１２】
マウスＥＳ細胞（１２９／Ｓ６、EMD Millipore、ビルリカ、マサチューセッツ州）を不活性化ＭＥＦフィーダー細胞層上において組換えｍＬＩＦ（EMDMillipore）１０００Ｕ／ｍＬ（ａ、ｃ）又はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ−ＲＳ  １６ｎＭ（ｂ、ｄ）のいずれかで補填されたマウスＥＳ細胞最小培地（ｍＥＳＣ−ＭＭ）中で２日間培養し、位相差照射（phase-contrastillumination）下にて低倍率で写真撮影した。サイズバーは５００ミクロンを示す。いずれの場合も、１日目において単一細胞及び少数の細胞のみからなるコロニーは、多能性マウスＥＳ細胞に特有の明るい、明確な縁を有するより大きな多細胞の楕円形コロニーを生じさせる。ｍＥＳＣ−ＭＭは、ノックアウトＤ−ＭＥＭ基礎培地、１５％ノックアウト血清代替物、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ、１×ＯｐｔｉＭＥＭ非必須アミノ酸、Ｂ−ＭＥ  ０．１ｍＭ（Life Technologies、カールズバッド、カリフォルニア州）及び１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Lonza、アレンデール、ニュージャージー州）からなる。
【０２１３】
結果は図２２に示され、マウス幹細胞は、成長因子としてマウスＬＩＦを含むマウス幹細胞培地の場合と同様に、ＮＭ２３（ヒト）においても同じく良好に成長することを実証している。したがって、本明細書に記載されるＮＭ２３バリアントをマウス細胞系において使用することができ、またマウスＮＭ２３及びＮＭ２３バリアントをヒト細胞系において使用することもできる。
【０２１４】
実施例７
ヒト幹細胞がＮＭＥ１（Ｈ１）及びＮＭＥ２（Ｈ２）に加えてＮＭＥ６又はＮＭＥ７を発現するか否かを判定するため、本発明者らは様々なヒト幹細胞株に由来する溶解物及び上清に対してウェスタンブロット分析を行った。ヒト胚性幹細胞株ＢＧＯ１ｖ細胞を、ａ）抗ＭＵＣ１＊モノクローナル抗体ＭＮ−Ｃ３によりコーティングされた細胞培養プレート上の二量体形態のみのＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ、又はｂ）マウスフィーダー細胞（ＭＥＦ）上の４ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦのいずれかにおいて培養した。培養３日後、幹細胞を回収して溶解し、その後ＮＭＥ１、ＮＭＥ６及びＮＭＥ７の存在をプローブするための抗体を使用してウェスタンブロットにより分析した。比較のため、Ｔ４７Ｄ  ＭＵＣ１＊陽性乳がん細胞について並行して同じ分析を行った。コントロールとして、組換えＮＭ２３−Ｈ１野生型（ＮＭ２３−ｗｔ）タンパク質をゲルにロードし、これも３つの異なるＮＭＥを認識する抗体によりプローブした。留意すべきは、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ二量体及び野生型六量体の見かけの分子量がいずれも単量体の重量として現れるように、ゲルは変性ゲルであるということである。ゲルをプローブするために使用された抗体は、ＮＭＥ１対してｎｍ２３−Ｈ１（Ｃ−２０）、ＮＭＥ６に対してｎｍ２３−Ｈ６（Ｃ−１７）、及びＮＭＥ７に対してｎｍ２３−Ｈ７（Ｂ９）であった（いずれもSanta Cruz Biotechnology, Incより購入）。
【０２１５】
図２３は、６つのウェスタンブロットゲルの写真を示す。第Ｉ部、Ａ〜Ｃはゲル電気泳動により細胞溶解物が分離され、その後Ａ）ＮＭＥ１、Ｂ）ＮＭＥ６及びＣ）ＮＭＥ７に対する抗体でプローブされたウェスタンブロットを示す。各欄において、レーン１は、抗ＭＵＣ１＊モノクローナル抗体ＭＮ−Ｃ３でコーティングされた細胞培養プレート上においてＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ（二量体形態）中で培養されたＢＧＯ１ｖ幹細胞に対応する。レーン２は、ＭＥＦ上においてｂＦＧＦ中で培養されたＢＧＯ１ｖ幹細胞に対応する。レーン３は、Ｔ４７Ｄ乳がん細胞に対応する。レーン４は、精製された組換えＮＭ２３−Ｈ１野生型（ＮＭ２３−ｗｔ）に対応する。
【０２１６】
図２３（Ａ）は、抗ＭＵＣ１＊抗体表面上において二量体形態のＮＭ２３中で培養されるか（レーン１）、又はマウスフィーダー細胞（ＭＥＦ）表面上においてｂＦＧＦ中で培養されるか（レーン２）にかかわらず、ＮＭＥ１がＢＧＯ１ｖヒト胚性幹細胞に存在することを示している。また、ＮＭＥ１はヒト乳がん細胞にも存在する（レーン３）。そして、陽性コントロールであるレーン４によれば、使用された抗体は、実際にＮＭＥ１精製タンパク質を認識することが示されている。
【０２１７】
図２３（Ｂ）は、これらの抗体を使用して試験されたどの試料にもＮＭＥ６が存在しないことを示している。
【０２１８】
図２３（Ｃ）は、抗ＭＵＣ１＊表面上においてＮＭ２３（二量体）中で培養された場合（レーン１）、ＮＭＥ７はヒト幹細胞において強く発現されるが、ＭＥＦフィーダー細胞上においてｂＦＧＦ中で培養された幹細胞（レーン２）においては弱く発現されるに過ぎないことを示している。また、ＮＭＥ７はヒト乳がん細胞において強く発現されるが（レーン３）、Ｈ１アイソフォームに特異的とされているＣ−２０抗体によって認識されない。
【０２１９】
この実験の結論の１つは、ＮＭＥ７がよりナイーブな幹細胞で発現されるＮＭ２３のより初期の形態であるということである。本発明者らは、二量体形態のＮＭ２３が、しばしばナイーブ状態と呼ばれる、より多能性の状態へと幹細胞の復帰を誘導することを既に示している。本発明者ら及び他者が行った実験により、ｂＦＧＦ中での幹細胞の培養又はマウス線維芽細胞フィーダー細胞（ＭＥＦ）層上での幹細胞の培養は幹細胞を「プライムド」状態と呼ばれるより多能性の低い状態にするか、又は維持することが示された。図２３（Ｃ）を参照すれば、これらのプライムド幹細胞はより低くＮＭＥ７を発現し、ＮＭＥ７がよりナイーブな、したがって真に多能性の幹細胞状態と関連するという見解と一致する。ナイーブ状態のヒト幹細胞がより良好に機能的な成体細胞へと分化し得ることが予想されることから、ナイーブ幹細胞は研究及び治療用途に望ましい細胞である。したがって、ＮＭＥ７の発現誘導を含む戦略は、治療用途の細胞を得るために望ましい。逆に、がんにおいてＮＭＥ７の発現を低減する戦略は、抗がん療法となる。
【０２２０】
図２３（Ｄ〜Ｆ）は、どのＮＭＥがＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドに結合したのかを判定するためのプルダウンアッセイのウェスタンブロットの写真を示す。ここで、ヒスチジンでタグ付けされたＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド（GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA-HHHHHH（配列番号９８））をＮＴＡ−Ｎｉアガロースビーズに付着し、その後、図２３の第Ｉ部と同じように細胞溶解液と共にインキュベートした。４℃での１時間のインキュベーションの後、ビーズを１５０００ＲＰＭで５分間遠心分離した。上清を捨て、ビーズをＰＢＳで洗浄して非特異的結合により結合した種を除去した。イミダゾールを添加してビーズから複合体を解放した。遠心分離の後、上清をゲル電気泳動により分離し、図２３第Ｉ部のようにＮＭＥ１（Ｄ）、ＮＭＥ６（Ｅ）及びＮＭＥ７（Ｆ）に対する抗体で分析した。図２３（Ｄ）は、ＮＭ２３（二量体）中（レーン１）又はｂＦＧＦ中（レーン２）のいずれで培養されたかにかかわらず、以前本発明者らが示したように、幹細胞中のＮＭＥ１はＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドに結合することを示す。レーン３は、乳がん細胞溶解物中のＮＭＥ１もＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドに結合することを示し、レーン４はＣ−２０ＮＭＥ１特異的抗体が精製された組換え野生型ＮＭＥ１に結合することを示す。Ｅ）このゲルは、図２３の第Ｉ部においてはこれらの細胞溶解物中にないことが示されたＮＭＥ６が、ここでもＭＵＣ１＊ペプチドによってプルダウンされなかったことを示す。重要なことに、図２３（Ｆ）は、ＮＭＥ７はＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドに結合することを示している。ＮＭ２３二量体中及びＭＵＣ１＊抗体表面上で培養された幹細胞由来のＮＭＥ７は、ＭＥＦ上においてｂＦＧＦ中で培養された幹細胞よりも多量のＮＭＥ７を発現した。図２３の第Ｉ部と一致して、ＮＭＥ７はＭＵＣ１＊ペプチドに結合し、その相互作用によってアッセイにおいてプルダウンされたことが示された（レーン１）。しかしながら、ＮＭＥ７はレーン２には現れず、これはｂＦＧＦ中で培養された細胞における発現の減少による可能性がある。レーン３は、乳がん細胞において発現されたＮＭＥ７がＭＵＣ１＊に結合することを示し、レーン４は、ＮＭＥ７抗体がＮＭＥ１アイソタイプを認識しないことからタンパク質を示さない。ＮＭＥ７は２つのＭＵＣ１＊ペプチドに結合して細胞上のＭＵＣ１＊受容体を二量体化し、それにより多能性を刺激、成長し、分化を阻害する可能性がある。
【０２２１】
実施例８
ヒト幹細胞株ＢＧＯ１ｖ細胞及びＨＥＳ−３細胞のウェスタンブロット分析は、ＮＭＥ７に特異的であるとされているＮＭＥ抗体は、ＮＭＥ７（Santa Cruz Biotechnology, Incによるｎｍ２３−Ｈ７  Ｂ９）及びＮＭＥ６（Abnovaによる抗ＮＭＥ６）と同じ分子量である別の種を認識したことを示す（図２４）。
【０２２２】
実施例９
組換えＮＭＥ７の作出−第１コンストラクトを作製して、効率的に可溶性形態で発現され得る組換えＮＭＥ７を作製した。最初のアプローチは、天然ＮＭＥ７（−１）、又はＮ末端欠損を有する選択的スプライシングバリアントＮＭＥ７（−２）をコードするコンストラクトを作製することであった。場合によってコンストラクトは、精製を補助するためにヒスチジンタグ又はｓｔｒｅｐタグを有した。ＮＭＥ７−１は大腸菌中での発現が乏しく（図２５Ａ、図２５．１Ａ、図２５．２Ａ）、ＮＭＥ７−２は大腸菌において全く発現しなかった（図２５Ｂ、図２５．１Ｂ、図２５．２Ｂ）。しかしながら、標的配列が欠失した新規なコンストラクトを作製し、ＮＭＥ７は算出された分子量３１ｋＤａを有するＮＤＰＫ  Ａドメイン及びＢドメインを本質的に含んでいた。この新規なＮＭＥ７−ＡＢは大腸菌において非常に良好に発現し、可溶性タンパク質として存在した（図２６Ａ）。単一のＮＤＰＫドメインが発現されるコンストラクトＮＭＥ−Ａは、大腸菌において発現しなかった（図２６Ｂ）。ＮＭＥ７−ＡＢをＮＴＡ−Ｎｉカラム上で最初に精製し（図２７Ａ）、その後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって更に精製した（図２７Ｂ）。その後、精製されたＮＭＥ７−ＡＢタンパク質を、幹細胞の多能性の促進能力及び分化阻害能力について試験した。
【０２２３】
実施例１０
多能性を維持し、分化を阻害する能力に関する組換えＮＭＥ７の試験。ＮＭＥ７の可溶性バリアントＮＭＥ７−ＡＢを作出し、実施例９に記載されるように精製した。ヒト幹細胞（ｉＰＳ  ｃａｔ＃  ＳＣ１０１ａ−１、System Biosciences）を、製造業者の指示書によりマウス線維芽細胞フィーダー細胞層上においてｂＦＧＦ４ｎｇ／ｍＬ中で４継代に亘って成長した。その後、１２．５ｕｇ／ウェルのモノクローナル抗ＭＵＣ１＊抗体ＭＮ−Ｃ３でコーティングされた６ウェル細胞培養プレート（Ｖｉｔａ（商標）、Thermo Fisher）へとこれらの起源幹細胞をプレーティングした。細胞を、１ウェル当たり３０００００細胞の密度でプレーティングした。基礎培地は、ＤＭＥ／Ｆ１２／ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（Invitrogen＃  １０５６５−０１８）４００ｍｌ、ノックアウト血清代替物（ＫＯ−ＳＲ、Invitrogen＃  １０８２８−０２８）１００ｍｌ、１００×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Invitrogen＃  １１１４０−０５０）５ｍｌ及びβ−メルカプトエタノール（５５ｍＭストック、Invitrogen＃  ２１９８５−０２３）０．９ｍｌ（０．１ｍＭ）からなる最小幹細胞培地であった。基礎培地は任意の培地であってもよい。好ましい実施形態では、基礎培地は他の成長因子及びサイトカインを含まない。基礎培地にリフォールディングされ安定な二量体として精製されたＮＭＥ７−ＡＢ  ８ｎＭ又はＮＭ２３−Ｈ１  ８ｎＭのいずれかを添加した。培地を４８時間毎に交換し、加速された成長のため、プレーティング後３日目に回収して継代しなければならなかった。図２７〜図３０は、ＮＭ２３−Ｈ１二量体中での成長とＮＭＥ７単量体中での成長との毎日の比較を記録する。ＮＭＥ７及びＮＭ２３−Ｈ１（ＮＭＥ１）二量体は両方とも多能性を伴って成長し、１００％コンフルエントの時であっても分化しなかった。写真から明らかなように、ＮＭＥ７細胞は、ＮＭ２３−Ｈ１二量体中で成長された細胞よりも早く成長した。最初の回収での細胞数により、ＮＭＥ７中での培養がＮＭ２３−Ｈ１二量体中での培養よりも１．４倍多い細胞を産生したことが確認された。
【０２２４】
実施例１１
以下の新規なＮＭＥ６バリアント及びＮＭＥ７バリアントを設計し、作出した。
【０２２５】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭ２３−Ｈ７−２配列：
（ＤＮＡ）
atgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga（配列番号２０）
【０２２６】
（アミノ酸）
MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-（配列番号２１）
【０２２７】
ヒトＮＭＥ７−Ａ:
（ＤＮＡ）
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga（配列番号２２）
【０２２８】
（アミノ酸）
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-（配列番号２３）
【０２２９】
ヒトＮＭＥ７−Ａ１：
（ＤＮＡ）
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga（配列番号２４）
【０２３０】
（アミノ酸）
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-（配列番号２５）
【０２３１】
ヒトＮＭＥ７−Ａ２：
（ＤＮＡ）
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga（配列番号２６）
【０２３２】
（アミノ酸）
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-（配列番号２７）
【０２３３】
ヒトＮＭＥ７−Ａ３：
（ＤＮＡ）
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga（配列番号２８）
【０２３４】
（アミノ酸）
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-（配列番号２９）
【０２３５】
ヒトＮＭＥ７−Ｂ：
（ＤＮＡ）
atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga（配列番号３０）
【０２３６】
（アミノ酸）
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-（配列番号３１）
【０２３７】
ヒトＮＭＥ７−Ｂ１:
（ＤＮＡ）
atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga（配列番号３２）
【０２３８】
（アミノ酸）
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN&#8212;（配列番号３３）
【０２３９】
ヒトＮＭＥ７−Ｂ２：
（ＤＮＡ）
atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga（配列番号３４）
【０２４０】
（アミノ酸）
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-（配列番号３５）
【０２４１】
ヒトＮＭＥ７−Ｂ３：
（ＤＮＡ）
atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga（配列番号３６）
【０２４２】
（アミノ酸）
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN--（配列番号３７）
【０２４３】
ヒトＮＭＥ７−ＡＢ：
（ＤＮＡ）
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga（配列番号３８）
【０２４４】
（アミノ酸）
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN--（配列番号３９）
【０２４５】
ヒトＮＭＥ７−ＡＢ１：
（ＤＮＡ）
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga（配列番号４０）
【０２４６】
（アミノ酸）
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-（配列番号４１）
【０２４７】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−Ａ配列：
（ＤＮＡ）
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga（配列番号４２）
【０２４８】
（アミノ酸）
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-（配列番号４３）
【０２４９】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−Ａ１配列：
（ＤＮＡ）
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttacctga（配列番号４４）
【０２５０】
（アミノ酸）
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-（配列番号４５）
【０２５１】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−Ａ２配列：
（ＤＮＡ）
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga（配列番号４６）
【０２５２】
（アミノ酸）
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-（配列番号４７）
【０２５３】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−Ａ３配列：
（ＤＮＡ）
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttacctga（配列番号４８）
【０２５４】
（アミノ酸）
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-（配列番号４９）
【０２５５】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−Ｂ配列：
（ＤＮＡ）
atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga（配列番号５０）
【０２５６】
（アミノ酸）
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-（配列番号５１）
【０２５７】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−Ｂ１配列：
（ＤＮＡ）
atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga（配列番号５２）
【０２５８】
（アミノ酸）
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-（配列番号５３）
【０２５９】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−Ｂ２配列：
（ＤＮＡ）
atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga（配列番号５４）
【０２６０】
（アミノ酸）
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-（配列番号５５）
【０２６１】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−Ｂ３配列：
（ＤＮＡ）
atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga（配列番号５６）
【０２６２】
（アミノ酸）
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-（配列番号５７）
【０２６３】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−ＡＢ配列：
（ＤＮＡ）
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga（配列番号５８）
【０２６４】
（アミノ酸）
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-（配列番号５９）
【０２６５】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−ＡＢ１配列：
（ＤＮＡ）
Atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga（配列番号６０）
【０２６６】
（アミノ酸）
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-（配列番号６１）
【０２６７】
マウスＮＭＥ６
（ＤＮＡ）
Atgacctccatcttgcgaagtccccaagctcttcagctcacactagccctgatcaagcctgatgcagttgcccacccactgatcctggaggctgttcatcagcagattctgagcaacaagttcctcattgtacgaacgagggaactgcagtggaagctggaggactgccggaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagcggctggtggagttcatgacaagtgggccaatccgagcctatatccttgcccacaaagatgccatccaactttggaggacactgatgggacccaccagagtatttcgagcacgctatatagccccagattcaattcgtggaagtttgggcctcactgacacccgaaatactacccatggctcagactccgtggtttccgccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaggaaccccagctgcggtgtggtcctgtgcactacagtccagaggaaggtatccactgtgcagctgaaacaggaggccacaaacaacctaacaaaacctag（配列番号６２）
【０２６８】
（アミノ酸）
MTSILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRTRELQWKLEDCRRFYREHEGRFFYQRLVEFMTSGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARYIAPDSIRGSLGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVHYSPEEGIHCAAETGGHKQPNKT-（配列番号６３）
【０２６９】
ヒトＮＭＥ６：
（ＤＮＡ）
Atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga（配列番号６４）
【０２７０】
（アミノ酸）
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-（配列番号６５）
【０２７１】
ヒトＮＭＥ６  １：
（ＤＮＡ）
Atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga（配列番号６６）
【０２７２】
（アミノ酸）
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-（配列番号６７）
【０２７３】
ヒトＮＭＥ６  ２：
（ＤＮＡ）
Atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga（配列番号６８）
【０２７４】
（アミノ酸）
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-（配列番号６９）
【０２７５】
ヒトＮＭＥ６  ３：
（ＤＮＡ）
Atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga（配列番号７０）
【０２７６】
（アミノ酸）
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-（配列番号７１）
【０２７７】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ６配列：
（ＤＮＡ）
Atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga（配列番号７２）
【０２７８】
（アミノ酸）
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-（配列番号７３）
【０２７９】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ６  １配列：
（ＤＮＡ）
Atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga（配列番号７４）
【０２８０】
（アミノ酸）
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-（配列番号７５）
【０２８１】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ６  ２配列：
（ＤＮＡ）
Atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga（配列番号７６）
【０２８２】
（アミノ酸）
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-（配列番号７７）
【０２８３】
大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ６  ３配列：
（ＤＮＡ）
Atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga（配列番号７８）
【０２８４】
（アミノ酸）
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-（配列番号７９）
【０２８５】
ＮＭＥ６及びＮＭＥ７並びに新規バリアントは、任意の親和性タグと共に発現され得るが、以下のタグと共に発現された：
ヒスチジンタグ
(ctcgag)caccaccaccaccaccactga（配列番号８４）
Ｓｔｒｅｐｔ  ＩＩタグ
(accggt)tggagccatcctcagttcgaaaagtaatga（配列番号８５）
【０２８６】
実施例１２−ＮＭＥ６及びＮＭＥ７コンストラクト作出
実施例１２．１−大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−１配列
ＮＭＥ７  ｗｔ−ｃＤＮＡ（大腸菌における発現用に最適化されたコドン）を本発明者らの要求に応じてGenscript（ニュージャージー州）により作出した。ＮＭＥ７−１を以下のプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した：
フォワード5'-atcgatcatatgaatcactccgaacgc -3'（配列番号９８）
リバース5'-agagcctcgagattatccagaattttgaaaaagtattg -3'（配列番号９９）
【０２８７】
その後、フラグメントを精製し、消化し（ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ）、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位の間にクローニングした。
【０２８８】
実施例１２．２−大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−２配列
ＮＭＥ７−２を以下のプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した：
フォワード5'-atcgatcatatgcatgacgttaaaaatcac-3'（配列番号１００）
リバース5'-agagcctcgagattatccagaattttgaaaaagtattg -3'（配列番号１０１）
【０２８９】
その後、フラグメントを精製し、消化し（ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ）、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位の間にクローニングした。
【０２９０】
実施例１２．３−大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−Ａ配列
ＮＭＥ７−Ａを以下のプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した：
フォワード5'-atcgacatatggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatg-3'（配列番号１０２）
リバース5'-actgcctcgaggaaaaacagttccatttcacgagctgccgatg-3'（配列番号１０３）
【０２９１】
その後、フラグメントを精製し、消化し（ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ）、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位の間にクローニングした。
【０２９２】
実施例１２．４−大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ７−ＡＢ配列
ＮＭＥ７−ＡＢを以下のプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した：
フォワード5'-atcgacatatggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatg-3'（配列番号１０４）
リバース5'-agagcctcgagattatccagaattttgaaaaagtattg-3'（配列番号１０５）
【０２９３】
その後、フラグメントを精製し、消化し（ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ）、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位の間にクローニングした。タンパク質をＣ末端ヒスチジンタグと共に発現させる。
【０２９４】
ＮＭＥ７−ＡＢを以下のプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した：
フォワード5'-atcgacatatggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatg-3'（配列番号１０６）
リバース5'-agagcaccggtattatccagaattttgaaaaagtattg-3'（配列番号１０７）
【０２９５】
その後、フラグメントを精製し、消化し（ＮｄｅＩ、ＡｇｅＩ）、ＡｇｅＩに続くヒスチジンタグの前のＳｔｒｅｐ  Ｔａｇ  ＩＩ及び２つの停止コドンでＸｈｏＩを置換した、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ及びＡｇｅＩ制限酵素部位の間にクローニングした。タンパク質をＣ末端Ｓｔｒｅｐ  Ｔａｇ  ＩＩと共に発現させる。
【０２９６】
実施例１２．５−大腸菌発現用に最適化されたヒトＮＭＥ６配列
ＮＭＥ６を以下のプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した：
フォワード5'-atcgacatatgacgcaaaatctgggctcggaaatg-3'（配列番号１０８）
リバース5'-actgcctcgagtgccggacccagaccacccgtgc -3'（配列番号１０９）
【０２９７】
その後、フラグメントを精製し、消化し（ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ）、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位の間にクローニングした。タンパク質をＣ末端ヒスチジンタグと共に発現させる。
【０２９８】
ＮＭＥ６を以下のプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した：
フォワード5'-atcgacatatgacgcaaaatctgggctcggaaatg -3'（配列番号１１０）
リバース5'-actgcaccggttgccggacccagaccacccgtgcg -3'（配列番号１１１）
【０２９９】
その後、フラグメントを精製し、消化し（ＮｄｅＩ、ＡｇｅＩ）、ＡｇｅＩに続くヒスチジンタグの前のＳｔｒｅｐ  Ｔａｇ  ＩＩ及び２つの停止コドンでＸｈｏＩを置換した、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ及びＡｇｅＩ制限酵素部位の間にクローニングした。タンパク質をＣ末端Ｓｔｒｅｐ  Ｔａｇ  ＩＩと共に発現させる。
【０３００】
実施例１２．６−組換えＮＭＥ７−ＡＢの作出
ＬＢブロス（ルリアベルターニブロス）を１／１０の終夜培養物と共に接種し、３７℃にてＯＤ６００が約０．５に達するまで培養する。この時点で、イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ、GoldBiotechnology）０．４ｍＭにより組換えタンパク質発現を誘導し、５時間後に培養を停止する。遠心分離（６０００ｒｐｍで４℃にて１０分間）により細胞を回収した後、細胞ペレットをランニングバッファー：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ  ３６０ｍＭ、及びイミダゾール８０ｍＭで再懸濁する。その後、リゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ、Sigma）、ＭｇＣｌ２（０．５ｍＭ）及びＤＮＡｓｅ（０．５ｕｇ／ｍＬ、Sigma）を添加する。３７℃にて３０分間、細胞懸濁物液を回転プラットフォーム（２７５ｒｐｍ）上でインキュベートし、５分間氷上で超音波処理する。不溶性細胞片を遠心分離（２００００ｒｐｍで４℃にて３０分間）により除去する。その後、清澄な溶解物をランニングバッファーで平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）に加える。カラムを４ＣＶのランニングバッファーで洗浄し、その後イミダゾール７０ｍＭで補填されたランニングバッファー（６ＣＶ）によりカラムからタンパク質を溶出する前に、イミダゾール３０ｍＭで補填された４ＣＶのランニングバッファーで洗浄し、続いてイミダゾール４９０ｍＭで補填されたランニングバッファー（４ＣＶ）で二次溶出した。ＮＭＥ７−ＡＢをサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）「ＦＰＬＣ」により更に精製する。
【０３０１】
実施例１２．７−組換えＮＭＥ６の作出
ＬＢブロス（ルリアベルターニブロス）を１／１０の終夜培養物と共に接種し、３７℃にてＯＤ６００が約０．５に達するまで培養する。この時点で、イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ、GoldBiotechnology）により組換えタンパク質発現を誘導し、５時間後に培養を停止する。遠心分離（６０００ｒｐｍで４℃にて１０分間）により細胞を回収した後、細胞ペレットをランニングバッファー：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ  ３６０ｍＭ、及びイミダゾール８０ｍＭで再懸濁する。その後、リゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ、Sigma）、ＭｇＣｌ２（０．５ｍＭ）及びＤＮＡｓｅ（０．５ｕｇ／ｍＬ、Sigma）を添加する。３７℃にて３０分間、細胞懸濁液を回転プラットフォーム（２７５ｒｐｍ）上でインキュベートし、５分間氷上で超音波処理する。不溶性細胞片を遠心分離（２００００ｒｐｍで４℃にて３０分間）により除去する。その後、清澄な溶解物をランニングバッファーで平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）に加える。イミダゾール４２０ｍＭで補填したランニングバッファー（６ＣＶ）でカラムからタンパク質を溶出する前に、カラムを洗浄（８ＣＶ）する。ＮＭＥ６をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）「ＦＰＬＣ」により更に精製する。
【０３０２】
実施例１３−ｂＦＧＦ系培地と比較したＮＭＥ系培地中で培養された幹細胞におけるナイーブ遺伝子及びプライムド遺伝子の定量的ＰＣＲ分析
ＭＥＦフィーダー細胞上でｂＦＧＦ（Peprotech）  ４ｎｇ／ｍＬ中、又はマドリゲル上でｍＴｅＳＲ（Stem CellTechnologies）中、又は最小培地「ＭＭ」中のＮＭ２３（ＮＭＥ１  Ｓ１２０Ｇ二量体）８ｎＭ中のいずれかにおいて、指示された継代数に亘ってヒトＥＳ  Ｈ９細胞（WICELL）を培養した。ここで、細胞はＣ３抗ＭＵＣ１＊ｍａｂ  １２．５ｕｇ／ｍＬでコーティングされたＶＩＴＡ（商標）プレート（ThermoFisher）上にプレーティングされ、図１３において「ＮＭ２３／ＭＵＣ１＊Ａｂ」と略記される。Ｔｒｉｚｏｌ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Invitrogen）を使用してＲＮＡを単離し、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Invitrogen）を使用してＲａｎｄｏｍ  Ｈｅｘａｍｅｒｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｒｅｎ）によりｃＤＮＡを逆転写し、その後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００リアルタイム機器上でＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ遺伝子発見アッセイ（ＯＣＴ４  Ｐ／Ｎ  Ｈｓ００９９９６３４＿ｇＨ、Ｎａｎｏｇ  Ｐ／Ｎ  Ｈｓ０２３８７４００＿ｇ１、ＫＬＦ２  Ｐ／Ｎ  Ｈｓ００３６０４３９＿ｇ１、ＫＬＦ４  Ｐ／Ｎ  Ｈｓ００３５８８３６＿ｍ１、ＦＯＸａ２  Ｐ／Ｎ  Ｈｓ００２３２７６４＿ｍ１、ＯＴＸ２  Ｐ／Ｎ  Ｈｓ００２２２２３８＿ｍ１、ＬＨＸ２  Ｐ／Ｎ  Ｈｓ００１８０３５１＿ｍ１、ＸＩＳＴ  Ｐ／Ｎ  Ｈｓ０１０７９８２４＿ｍ１  及びＧＡＰＤＨ  Ｐ／Ｎ  ４３１０８８４Ｅ）を使用して、ＦＯＸＡ２、ＸＩＳＴ、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４遺伝子についてアッセイを行った。Ａ）ＭＥＦ上においてｂＦＧＦ中、マドリゲル上においてｍＴｅＳＲ中、又は抗ＭＵＣ１＊Ｃ３抗体上においてＮＭ２３中で細胞を培養した。各試料３連で行った。遺伝子発現をＧＡＰＤＨに対して正規化した。データをｂＦＧＦ／ＭＥＦコントロールに対する倍数変化として表す。Ｂ）Ｈ９細胞を指示された継代数に亘りマドリゲル上においてｍＴｅＳＲ中で培養し、上述のように遺伝子発現を測定する。データをｂＦＧＦ／ＭＥＦコントロールに対する倍数変化として表す。Ｃ）Ｈ９細胞を指示された継代数に亘り抗ＭＵＣ１＊Ｃ３ｍａｂ層上においてＮＭ２３（Ｈ１  Ｓ１２０Ｇ二量体）８ｎＭ中で培養し、上述のように遺伝子発現を測定する。データをｂＦＧＦ／ＭＥＦコントロールに対する倍数変化として表す。Ｄ）ＭＥＦ上においてｂＦＧＦ中で予め培養されたＨ９細胞を、ヒトビトロネクチン層上に細胞をプレーティングしたこと以外は上述のＮＭ２３、ｂＦＧＦ又はｍＴｅＳＲのいずれかにおいて１継代の間培養した。比較のため、抗ＭＵＣ１＊抗体上においてＮＭ２３中で細胞を培養した。遺伝子発現を上述のように測定する。データをｂＦＧＦ／ＭＥＦコントロールに対する倍数変化として表す。Ａ欄は、標準ＦＧＦ系培地中か、又は別のＦＧＦ系培地ｍＴｅＳＲ中のいずれかにおける培養と比較して、ＭＵＣ１＊抗体の層上においてＮＭ２３中で細胞が培養された場合に、ほとんどの多能性遺伝子（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４及びＫＬＦ２）がより高いレベルで発現されることを示す。最も著しくは、幹細胞をＦＧＦ系培地（標準又はｍＴｅＳＲ）中で培養すると、プライムドマーカーであるＦＯＸＡ２及びＸＩＳＴが顕著に高いことである。Ｂ欄は、継代数の関数とし���、ｍＴｅＳＲ中での成長が既に高められたプライムド遺伝子の発現レベルを増加する傾向がある可能性を示す。Ｃ欄は、反対に、継代数の関数として、ＭＵＣ１＊抗体上におけるＮＭ２３中の成長がプライムド（望ましくない）遺伝子の発現を減少する傾向があることを示す。Ｄ欄は、ビトロネクチン表面上での成長は、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４及びＫＬＦ２の高発現と共に、ＦＯＸＡ２及びＸＩＳＴの低発現が望ましく、これがナイーブ状態の特徴とされている、遺伝子発現シグネチャに悪い影響を与えることを示す。
【０３０３】
実施例１４−ＭＵＣ１プルダウンアッセイはＮＭＥ１、ＮＭＥ６及びＮＭＥ７がＭＵＣ１種タンパク質に結合することを示す
ＭＵＣ１＊細胞質側末端（Ａｂ−５）に対する抗体を使用するプルダウンアッセイを細胞パネルについて行った。ＭＵＣ１抗体によりプルダウンされたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、ウェスタンブロット技法を使用してＮＭＥ１、ＮＭＥ６及びＮＭＥ７に特異的な抗体によってプローブした。ＭＵＣ１＊陽性乳がん細胞株Ｔ４７Ｄ細胞（ＡＴＣＣ）、ヒト胚性幹細胞株ＢＧＯ１ｖ（LifeTechnologies）、ヒトＥＳ細胞（ＨＥＳ−３、BioTime Inc.）及びヒトｉＰＳ細胞（ＳＣ１０１Ａ−１、SystemBiosciences Inc.）Ｔ４７Ｄがん細胞をＡＴＣＣプロトコルに従って、１０％ＦＢＳ（ＶＷＲ）を含むＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ）中で成長した。全ての幹細胞を、ＮＭ２３−ＲＳ（組換えＮＭＥ１  Ｓ１２０Ｇ二量体）８ｎＭを含む最小幹細胞培地「ＭＭ」中で培養した。幹細胞を、抗ＭＵＣ１＊Ｃ３ｍａｂ  １２．５ｕｇ／ｍＬでコーティングされたプラスチックウェア上で成長した。細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液２００ｕＬを用いて氷上で１０分間溶解した。遠心分離による細胞片の除去の後、上清を免疫共沈降アッセイに使用した。ＤｙｎａｂｅａｄｓプロテインＧ（Life Technologies）に連結された、ＭＵＣ１細胞質側末端を認識するＡｂ−５抗体（抗ＭＵＣ−１  Ａｂ−５、Thermo Scientific）を使用して、ＭＵＣ１＊をプルダウンした。ビーズをＲＩＰＡ緩衝液で２回洗浄し、還元緩衝液に再懸濁した。上清試料を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、ＰＶＤＦ膜へのタンパク質の転写に供した。図３２は、その後、Ａ）抗ＮＭ２３−Ｈ１（ＮＭＥ１）抗体（Ｃ−２０、Santa CruzBiotechnology）、Ｂ）抗ＮＭＥ６（Abnova）、又はＣ）抗ＮＭ２３−Ｈ７抗体（Ｂ−９、Santa CruzBiotechnology）によりメンブレンをプローブし、Ｄ）ＮＭＥ６の染色をＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ（Pierce）を使用して増強させ、Ｅ）ＮＭＥ７の染色をＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌを使用して増強させたことを示す。各々のＨＲＰに連結された二次抗体とのインキュベーションの後、タンパク質を化学発光により検出した（図３２、Ａ〜Ｅを参照）。写真は、天然ＮＭＥ１、ＮＭＥ６及びＮＭＥ７がＭＵＣ１＊陽性乳がん細胞、ヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞に存在し、それらがＭＵＣ１＊に結合することを示す。留意すべきは、ＨＥＳ−３ペレットに存在する細胞数は他の試料に存在する細胞数よりも少なかったことである。
【０３０４】
実施例１５−組換えＮＭ２３（Ｓ１２０Ｇ変異体Ｈ１二量体）、ＮＭＥ７−ＡＢ、及び天然ＮＭＥ７は、ＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドに結合し、受容体の二量体化を誘導し得る
直径３０．０ｍｍの金ナノ粒子を、Thompson et al.（ACSAppl. Mater. Interfaces, 2011, 3 (8), pp 2979-2987）に従ってＮＴＡ−ＳＡＭ表面でコーティングした。その後、ＮＴＡ−ＳＡＭコーティング金ナノ粒子を、等容量のＮｉＳＯ４  １８０ｕＭで活性化し、室温で１０分間インキュベートし、洗浄し、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍＭに再懸濁した。その後、最終濃度０．５ｕＭで金ナノ粒子をＰＳＭＧＦＲ  Ｎ−１０ペプチド（QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAHHHHHH（配列番号１１２））で充填し、室温で１０分間インキュベートした。大腸菌により発現され、精製された組換えＮＭＥ７−ＡＢタンパク質を指示される濃度で溶液に遊離した状態で添加した。粒子固定化タンパク質が互いに結合するか、又は同時に２つの異なる粒子上の２つの異なるタンパク質に結合すると、粒子溶液がピンク色／赤色から紫色／青色に変色する。単一のペプチドへの結合は２以上の粒子を互いに近接させないため、溶液に遊離した状態で添加されたタンパク質が粒子の凝縮を生じれば、それは遊離タンパク質が同起源のペプチドを二量体化するという強力な証拠である。
【０３０５】
図３３（Ａ）は、ＰＳＭＧＦＲ  Ｎ−１０ペプチドで充填されたＮＴＡ−Ｎｉ−ＳＡＭコーティングナノ粒子を示す。ＮＭＥ７−ＡＢを指示される濃度で溶液に遊離した状態で添加した。粒子の凝縮によるピンク色から紫色／青色への溶液の変色は、粒子上のＭＵＣ１＊ペプチドと溶液中の遊離ＮＭＥ７との結合を示す。この結果は、溶液中のＮＭＥ７はＭＵＣ１＊ペプチドに対して２つの結合部位を有することを示す。抗ＭＵＣ１＊抗体のＦａｂは完全に結合を阻害し、粒子の凝縮がＭＵＣ１＊ペプチドとＮＭＥ７との特異的相互作用によるものであることを示している。（Ｂ）はより広い濃度範囲に亘り溶液に遊離した状態で添加されたＮＭＥ７−ＡＢを示す。ＮＭＥ７が同時に２つのペプチドに結合し得ることを示す粒子の凝縮が観察される。（Ｃ）は、溶液に添加された全てのタンパク質を示す。ＮＭＥ７−ＡＢはほとんど直ちに紫色に変色した。また、ＮＭ２３−ＲＳ（Ｈ１二量体）もほとんど直ちに紫色に変色し始めた。ナイーブＮＭＥ７を含有するＴ４７Ｄ乳がん細胞株溶解物もまた、著しく紫色に変色する。
【０３０６】
実施例１６−プライムド状態の特徴であるＸ染色体不活性化を示した核内でのヒストン−３の凝縮の欠如から明らかなように、ＮＭＥ１二量体又はＮＭＥ７中で培養されたヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞はナイーブ状態である
ヒトＥＳ（ＨＥＳ−３幹細胞、BioTime Inc）細胞及びｉＰＳ（ＳＣ１０１Ａ−Ｉｐｓｃ、SystemBiosciences）細胞を、ＮＭＥ１二量体（ＮＭ２３−ＲＳ）又はＮＭＥ７（ＮＭＥ７−ＡＢコンストラクト）のいずれかを含む最小培地（「ＭＭ」）中で８継代〜１０継代に亘って培養した。細胞を、ＭＵＣ１＊受容体のＰＳＭＧＦＲ配列の遠位部に結合する抗ＭＵＣ１＊モノクローナル抗体（ＭＮ−Ｃ３）１２．５ｕｇ／ｍＬでコーティングされたＶＩＴＡ（商標）プレート（ThermoFisher）上にプレーティングした。１０継代の間定期的に幹細胞試料を免疫細胞化学（ＩＣＣ）によってアッセイし、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０共焦点顕微鏡）上で分析してヒストン−３の細胞内局在を判定した。ヒストン−３が核内に凝縮すると（単一の点として現れる）、Ｘ染色体のコピーが不活性化され、その細胞はもはや純粋にグラウンド状態でもナイーブ状態でもない。幹細胞がプライムド状態からナイーブ状態へと復帰すると（全ての商業的に入手可能な幹細胞はＦＧＦ中で培養することによりプライムド状態になる）、ヒストン−３は「くもり（cloud）」や全体に亘って斑点として見られるか、検出されない。図３４Ｆは標準プロトコルに従ってＭＥＦ上においてＦＧＦ中で成長されたこと以外は同じ起源細胞に由来するコントロール細胞を示し、これらの全てが核内に凝縮したヒストン−３（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）を示し、それらの１００％全てがプライムド状態にあり、ナイーブ状態にはないことを裏付けている。逆に、ＮＭＥ７において１０継代に亘り培養された同じ起源の細胞は、凝縮したヒストン−３を有さない幹細胞のいくつかの領域を有し、それらがＸ染色体不活性化前であり、真のナイーブ状態にあることを示している（図３４Ｄ、図３４Ｅを参照、白色矢印は凝縮したヒストン−３について陰性の細胞を指す）。核内の凝縮したヒストン−３の欠如から明らかなように、これらの細胞のおよそ５０％以上がナイーブ状態にある。図３６Ａ〜図３６Ｈは、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ二量体中で培養された同じ細胞が、６継代目において僅か約２５％〜３０％のみナイーブであったことを示す。ヒストン−３染色の「くもり」が図３６Ｂ、図３６Ｆにおいてみられる一方、図３６Ｃ、図３６Ｇは凝縮したヒストン−３を欠く細胞を指す白色矢印を示す。抗ＭＵＣ１＊抗体表面上においてＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ二量体中で８継代に亘り培養されたＨＥＳ−３細胞の共焦点ＩＣＣ画像（図３７〜図３９）は、約５０％がナイーブ状態にあり、核内においてヒストン−３染色を欠いていた。
【０３０７】
実施例１７−実施例１６で得られたヒストン−３染色の共焦点画像を定量した
共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０）で採取された免疫蛍光画像を使用し、ＦＧＦ  ４ｎｇ／ｍｌ（ｐ７２）対ＮＭＥ１  ８ｎＭ（ｐ６、ｐ８、ｐ１０）対ＮＭＥ７  ８ｎＭ（ｐ１０）を含むＭＥＦ上で成長した細胞と比較して、ＨＥＳ−３幹細胞（BioTime Inc）のＸ染色体活性化状態の半定量的分析を行った。倍率２０倍での無作為の視野のうち５〜６の画像を、各成長因子について採取した。Ｏｃｔ３／４（＃  ｓｃ−５２７９、Santa Cruz）染色及び／又はＮａｎｏｇ（＃  Ｄ７３Ｇ４、Cell Signaling）染色を使用して多能性幹細胞を同定した。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３抗体（Ｘｉｓｔのマーカー；＃Ｃ３６Ｂ１１、Cell Signaling）に陽性の多能性幹細胞を、核内の明収束点（brightfocused spot）により同定した。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色に陰性の細胞は、僅かに拡散した収束していない染色を有するか、又は存在していないかのいずれかであった。画像当たりの総細胞数（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色に対して陽性及び陰性）をＩｍａｇｅ  ＪにおけるＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒマクロを使用して計測し、データをＨ３Ｋ２７ｍｅ３抗体に対して陰性の細胞（すなわち、Ｘ染色体活性化細胞）の割合として表す。
【０３０８】
実施例１８−ＭＥＦフィーダー細胞上でのＦＧＦ培地中における従来の培養と比較したＮＭＥ１二量体（８ｎＭ）又はＮＭＥ７（８ｎＭ）のいずれかにおいて培養されたヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞のクローニング効率の測定
ヒトＥＳ細胞（ＨＥＳ−３、BioTime Inc.）及びヒトｉＰＳ細胞（ＳＣ１０１Ａ−１、SystemBiosciences Inc.）を、ＮＭＥ１二量体（８ｎＭ）又はＮＭＥ７（８ｎＭ）のいずれかを含む最小培地「ＭＭ」中で少なくとも１０継代に亘り培養した。１２．５μｇ／ｍＬの「Ｃ３」又は「ＭＮ−Ｃ３」と呼ばれるモノクローナル抗ＭＵＣ１＊抗体でコーティングされたＶＩＴＡ（商標）６ウェルプレート（ThermoFisher）上に細胞をプレーティングした。細胞を以下の密度でプレーティングした：１ウェル当たり１０００細胞、３０００細胞、及び５０００細胞。コントロールとして、同数の同じ親細胞株由来の細胞をＭＥＦフィーダー細胞層上にプレーティングし、ｂＦＧＦ  ４ｎｇ／ｍＬ中で培養した。４日〜６日後、細胞を添付の指示書に従ってアルカリホスファターゼ（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｋｉｔ、Sigma-Aldrich）で染色し、各条件に対して生じた個別のコロニーの数を計測した。図４１Ａを参照。プレーティングした細胞数当たりのコロニー数及び算出されたパーセント効率を図４１Ｂに示す。ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞にかかわらず、ＮＭＥ１又はＮＭＥ７中で培養された幹細胞のクローニング効率は約２０％であった。しかしながら、これらの細胞集団のヒストン−３  ＩＣＣ分析により、１０継代まで、僅か約５０％の細胞がＸ染色体不活性化前の状態、すなわち真のナイーブ状態であることが示された。したがって、ナイーブ細胞の実際のクローニング効率は、少なくとも二倍であり約４０％である。マウスナイーブ幹細胞のクローニング効率は約３０％である。この実験において、コントロールのクローニング効率実験を、同じ細胞をＭＥＦフィーダー細胞上においてｂＦＧＦ  ４ｎｇ／ｍＬ中で培養して行い、１％のクローニング効率を得た。
【０３０９】
実施例１９−ＦＧＦ及びＴＧＦ−ベータを含まない最小培地（ＭＭ）若しくはＥ８培地、組換えヒトＮＭ２３−ＲＳ（ＮＭＥ１  Ｓ１２０Ｇ二量体）若しくはＮＭＥ７−ＡＢのいずれかを含む「ＭＮ６」のいずれかにおいて培養されたヒトｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞
ヒトｉＰＳ細胞（ＳＣ１０１Ａ−１、System BiosciencesInc.）を１２．５ｕｇ／ｍＬの抗ＭＵＣ１＊ｍａｂ、Ｃ３でコーティングされたＣＯＳＴＡＲプレート上にプレーティングし、最小培地（「ＭＭ」）又は８ｎＭのＮＭ２３−ＲＳ（ＮＭＥ１  Ｓ１２０Ｇ二量体）若しくはＮＭＥ７（ＮＭＥ７−ＡＢ）で補填されたＦＧＦ及びＴＧＦ−ベータを含まないＥ８培地（「ＭＮ６」）中で培養した。ここで、ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）も（常に）培地に添加されるか、最初の４８時間のみ添加されるか、又は添加されることがない（図４２〜図４５を参照）。図は、ＲＯＣｉの存在下において、細胞は付着し、培地交換後、より多くの付着細胞を残す延展形態（spreading morphology）を有することを示す。ＲＯＣｉの不在下でＮＭ２３−ＲＳ又はＮＭＥ７のいずれかと共に培養された細胞は、基礎培地がＭＭ最小培地ではなくＭＮ６である場合により多くの細胞付着を有する。マドリゲル上に細胞をプレーティングする以外は同じ実験を行った場合、ＲＯＣｉが存在するか否かは問題ではない（図４６〜図４８を参照）。ヒトＥＳ細胞（ＨＥＳ−３、BioTimeInc.）を使用して同じ実験を行ったところ、本質的に同じ結果が得られた（図４９〜図５０）。
【０３１０】
実施例２０−ＦＧＦ及びＴＧＦ−ベータを含まない最小培地（ＭＭ）又はＥ８培地、組換えヒトＮＭ２３−ＲＳ（ＮＭＥ１  Ｓ１２０Ｇ二量体）又はＮＭＥ７−ＡＢのいずれかを含む「ＭＮ６」のいずれかにおいて培養されたマドリゲル上のヒトｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞に関するＲＴ−ＰＣＲにより定量化されたナイーブ遺伝子及びプライムド遺伝子の発現
マドリゲル上にプレーティングされたヒトＥＳ細胞（ＨＥＳ−３、BioTimeInc.）を、ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）を含む／含まないＭＮ６培地中又はＮＭＥ７  ８ｎＭで補填されたＭＭ培地中のいずれかで培養した。比較のため、細胞をｂＦＧＦ含有Ｅ８培地中でも培養した。上記実施例１３に記載されるようにＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｅ８コントロールに対して正規化した。望ましくないプライムド状態のマーカーはＦＯＸＡ２、ＯＴＸ、ＬＨＸ及びＸＩＳＴである。望ましいナイーブ状態のマーカーは、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４及びＫＬＦ２である。図５１は、ＭＮ６／ＮＭＥ７中で培養された細胞がＥ８と比較して一部の多能性遺伝子の発現が増加し、プライムド遺伝子ＦＯＸＡ２の発現が減少していることを示す。
【０３１１】
実施例２１
ヒトＥＳ細胞（ＨＥＳ−３、BioTime Inc.）を抗ＭＵＣ１＊抗体（Ｃ３）でコーティングされたＶＩＴＡ（商標）プレート（ThermoFisher）上にプレーティングし、最小培地（ＭＭ）中の組換えヒトＮＭ２３（ＮＭＥ１  Ｓ１２０Ｇ二量体）中又はＮＭＥ７−ＡＢ中のいずれかで培養した。実施例１３に記載されるようにＲＴ−ＰＣＲを行った。望ましくないプライムド状態のマーカーはＦＯＸＡ２、ＯＴＸ、ＬＨＸ及びＸＩＳＴである。望ましいナイーブ状態のマーカーは、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４及びＫＬＦ２である。図５２に示されるように、ＮＭ２３で培養された細胞とＮＭＥ７で培養された細胞との間に本質的な相違はない。
【０３１２】
実施例２２．ＮＭＥタンパク質中対ＦＧＦ中において、ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下又は不在下における様々な表面上で培養されたヒトＥＳ細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析
ヒトＥＳ細胞（ＨＥＳ−３、BioTime Inc.）を、抗ＭＵＣ１＊抗体（Ｃ３）でコーティングされたＶＩＴＡ（商標）プレート（ThermoFisher）、ＭＥＦフィーダー細胞、又はマドリゲル上のいずれかにプレーティングした。ＶＩＴＡ/Ｃ３抗体表面上の細胞を、ＮＭ２３−Ｈ１  Ｓ１２０Ｇ二量体（ＮＭＥ１二量体）を含む最小培地（ＭＭ）中又はＮＭＥ７−ＡＢ中で３継代に亘り培養した。ＭＥＦ上にプレーティングされた細胞を、標準的な技法に従ってＦＧＦを含むＭＭ中で２３継代に亘り培養した。マドリゲル上の細胞をＭＭ培地中又はＭＮ６培地中のＮＭＥ７中で、またｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）の存在下又は不在下で１継代培養した。望ましくないプライムド状態のマーカーは、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ、ＬＨＸ及びＸＩＳＴである。望ましいナイーブ状態のマーカーは、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４及びＫＬＦ２である。図５３に示されるように、ＮＭＥ７−ＡＢ及びＮＭ２３−Ｈ１二量体に関する遺伝子発現プロファイルは、本質的に同等である。留意すべきは、ＮＭＥタンパク質中における僅か３回の継代の後、ＦＧＦ成長に起因して、細胞はまだ完全にナイーブではなく、Ｘ染色体不活性化の指標であるＸＩＳＴがなおも高い。実施例１７を参照すると、６継代目において、僅か２５％〜３０％の細胞が２つの活性なＸ染色体を有し、１０継代目においては５０％を超える細胞が真にナイーブ状態にあり、Ｘ染色体不活性化前である。図５３は、ＮＭＥで成長された細胞と比較して、一部のナイーブマーカーがより低く（ＫＬＦ２／４）、一部のプライムドマーカーがより高い（ＦＯＸＡ２）ことを示す。マドリゲル上におけるＮＭＥ７中での成長は、ＭＵＣ１＊抗体表面上での成長と比較して、ナイーブ遺伝子の減少及びプライムド遺伝子の増加を伴う遺伝子発現のシグネチャに悪影響を及ぼす。同じ実験において、マドリゲル上にプレーティングされた細胞を、ＲＯＣｉ（ｒｈｏキナーゼ阻害剤）を含む若しくは含まない、ＭＭ培地中若しくはＭＮ６培地中のＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ二量体中でも培養した（図５４）。ここでも、マドリゲル表面は遺伝子発現プロファイルにマイナスの影響を及ぼし、細胞をよりナイーブでないものにしていると考えられる。
【０３１３】
実施例２３−ＮＭＥ７の検出
実施例２３．１−胚性幹細胞及びｉＰＳ細胞におけるＮＭＥ７の検出
ヒトＥＳ細胞（ＢＧＯ１ｖ及びＨＥＳ−３）、並びにｉＰＳ細胞（ＳＣ１０１−Ａ１）をＮＭＥ系培地中で培養した。ここで、細胞を抗ＭＵＣ１＊抗体の層上にプレーティングした。ＮＭＥ７種を同定するため、細胞を回収し、プロテアーゼ阻害剤（Pierce）で補填したＲＩＰＡ緩衝液（Pierce）で溶解した。細胞溶解物（２０ｕＬ）を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲル上で電気泳動により分離し、ＰＶＤＦ膜（GE Healthcare）に転写した。３％ミルクを含有するＰＢＳ−Ｔでブロットをブロックし、その後一次抗体（抗ＮＭ２３−Ｈ７クローンＢ−９、Santa CruzBiotechnology）と共に４℃にて終夜インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、メンブレンをセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役二次抗体（ヤギ抗マウス、Pierce）と共に室温にて１時間インキュベートした。シグナルをＩｍｍｕｎ−Ｓｔａｒ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅキット（Bio-Rad）で検出した。図５５Ａ、図Ｃのウェスタンブロットは、ＮＭＥ７が約４０ｋＤａの種として存在し、同様に約２５ｋＤａ〜３０ｋＤａのより低分子量のＮＭＥ７種（選択的スプライシングアイソフォームであるか、又は開裂等の翻訳後修飾である場合がある）としても存在することを示している。
【０３１４】
さらに、ヒトｉＰＳ細胞（ＳＣ１０１−Ａ１）を上述のように培養するか、ＯＣＴ４、ＮＭＥ１、ＮＭＥ６又はＮＭＥ７を抑制するｓｉＲＮＡの存在下で培養した。図５６のウェスタンブロットは、ＯＣＴ４、ＮＭＥ６又はＮＭＥ７が抑制された場合、高分子量のバンド（約４０ｋＤａ）が消滅することを示す。しかしながら、ＮＭＥ１が抑制された場合には、そのバンドは消滅しなかった。この結果は、ＮＭＥ６、ＮＭＥ７及びＯＣＴ４が極めて重要な多能性遺伝子であるという見解と一致する。また、この結果は、高分子量形態が、その発現を調節する関連遺伝子の抑制に反応して発現される形態（開裂生成物の前に消滅する）であるという見解とも一致する。
【０３１５】
実施例２３．２−ｉＰＳ馴化培地におけるＮＭＥ７の検出
ｉＰＳ馴化培地（２０ｕＬ）を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲルのいずれかで電気泳動により分離し、ＰＶＤＦ膜（GEHealthcare）へ転写した。３％ミルクを含有するＰＢＳ−Ｔでブロットをブロックし、その後一次抗体（抗ＮＭ２３−Ｈ７クローンＢ−９、Santa CruzBiotechnology）と共に４℃にて終夜インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、メンブレンをセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役二次抗体（ヤギ抗マウス、Pierce）と共に室温にて１時間インキュベートした。シグナルをＩｍｍｕｎ−Ｓｔａｒ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅキット（Bio-Rad）で検出した。図５５Ｂのウェスタンブロットは、およそ３０ｋＤａの分子量を有する分泌されたＮＭＥ７種を示す。留意すべきは、組換え（recombinant）ＮＭＥ７−ＡＢは３３ｋＤａの分子量を有し、それ自身が同時に２つのＭＵＣ１＊ペプチドに結合することができ、また多能性幹細胞の成長を完全に支持し、多能性を誘導し、分化を阻害することである。約２５ｋＤａ〜３０ｋＤａのＮＭＥ７種は、選択的スプライシングアイソフォームであるか、又は細胞からの分泌を可能とし得る開裂等の翻訳後修飾である場合がある。
【０３１６】
実施例２３．３−ＮＭＥ７免疫沈降法及び質量分析法による分析
プルダウンアッセイをＭＵＣ１＊陽性細胞のパネルに対してＮＭＥ７特異的抗体（ＮＭ２３  Ｈ７  Ｂ９、Santa Cruz）を使用して行った。乳がん細胞（Ｔ４７Ｄ）並びにヒトＥＳ（ＢＧＯ１ｖ及びＨＥＳ−３）細胞及びｉＰＳ（ＳＣ１０１−Ａ１）細胞を標準プロトコル（Ｔ４７Ｄ）により培養するか、又は抗ＭＵＣ１＊抗体の表面上においてＮＭＥ系培地中で培養した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤（Pierce）で補填したＲＩＰＡ緩衝液（Pierce）で溶解した。細胞溶解物を１０ｕｇの組換えＮＭＥ７−ＡＢで補填し、４℃にて２時間インキュベートした。その後、ＤｙｎａｂｅａｄｓプロテインＧ（Life technologies）に連結された抗ＮＭ２３−Ｈ７（Ｂ−９、Santa CruzBiotechnology）により、４℃にて終夜、ＮＭＥ７を免疫沈降した。ビーズをＰＢＳで２回洗浄し、免疫沈降されたタンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲル上の電気泳動により分離した。タンパク質を銀染色（Pierce）により検出した。Ｔ４７Ｄ試料及びＢＧＯ１ｖ細胞からＮＭＥ７と共に共免疫沈降された約２３ｋＤａのタンパク質バンドを切り出し、質量分析により分析した（Taplin MassSpectrometry Facility, Harvard Medical School）。以下に示されるように、質量分析によって、切り出されたタンパク質バンドは全てＮＭＥ７  ＮＤＰＫ  Ａドメインに由来する配列を含有することが示された。ＮＭＥ７のＡドメイン中の下線で示される配列が質量分析により同定された。
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN（配列番号１１３）
【０３１７】
ＮＭＥ７によって免疫沈降される約３０ｋＤａのより高分子量のタンパク質バンドは、質量分析によって分析されず、開裂産物若しくは選択的スプライシングアイソフォームであり得る内因性ＮＭＥ７タンパク質か、又は細胞溶解物に添加された約３３ｋＤａのＮＭＥ７−ＡＢの可能性がある。
【０３１８】
実施例２４−ＮＭＥ７−ＡＢが同時に２つのＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドに結合することを示すＥＬＩＳＡアッセイ
Ｃ末端システインを有するＰＳＭＧＦＲペプチド（ＰＳＭＧＦＲ−Ｃｙｓ）を、Ｉｍｊｅｃｔマレイミド活性化ＢＳＡキット（Thermo Fisher）を使用してＢＳＡに共有結合により連結した。ＰＳＭＧＦＲ−Ｃｙｓ連結ＢＳＡを炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）  ０．１Ｍ中に１０ｕｇ／ｍＬまで希釈し、５０ｕＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。４℃での終夜インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、３％ＢＳＡ溶液を添加してウェル上の残りの結合部位をブロックした。室温にて１時間後、プレートをＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ＢＳＡ中に希釈したＮＭＥ７を種々の濃度で添加した。室温にて１時間後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ＢＳＡ中に希釈した抗ＮＭ２３−Ｈ７（Ｂ−９、Santa CruzBiotechnology）を１／５００希釈で添加した。室温で１時間後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ＢＳＡ中に希釈したヤギ抗マウス−ＨＲＰを１／３３３３希釈で添加した。室温にて１時間後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＡＢＴＳ溶液（Pierce）を使用して４１５ｎｍでＮＭＥ７の結合を測定した。
【０３１９】
ＥＬＩＳＡ  ＭＵＣ１＊二量体化：ＮＭＥ７結合用プロトコルを使用し、ＮＭＥ７を１１．６ｕｇ／ｍＬで使用した。
【０３２０】
室温にて１時間後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ＢＳＡ中に希釈された、ヒスチジンでタグ付けされたＰＳＭＧＦＲペプチド（ＰＳＭＧＦＲ−Ｈｉｓ）又はビオチン化ＰＳＭＧＦＲペプチド（ＰＳＭＧＦＲ−ビオチン）を種々の濃度で添加した。室温にて１時間後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ＢＳＡ中に希釈された抗ヒスチジンタグ−ＨＲＰ（Abcam）又はストレプトアビジン−ＨＲＰ（Pierce）を１／５０００の濃度で添加した。室温にて１時間後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、既に他のＰＳＭＧＦＲペプチド連結ＢＳＡに結合されているＮＭＥ７へのＰＳＭＧＦＲペプチドの結合（抗Ｈｉｓ抗体又はストレプトアビジンによりシグナル伝達（signal）し得なかった）を、ＡＢＴＳ溶液（Pierce）を使用して４１５ｎｍで測定した。
【０３２１】
実施例２５−ＮＭＥ６クローニング、発現及び精製
ＷＴ  ＮＭＥ６  ｃＤＮＡ（大腸菌での発現用に最適化されたコドン）を、本発明者らの要求に応じGenscript（ニュージャージー州）により合成した。その後、ＷＴ  ＮＭＥ６  ｃＤＮＡを以下のプライマー：5'-atcgacatatgacgcaaaatctgggctcggaaatg-3'（配列番号１１４）及び5'-actgcctcgagtgccggacccagaccacccgtgc-3'（配列番号１１５）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素（New England Biolabs）による消化の後、精製されたフラグメントを同じ制限酵素で消化されたｐＥＴ２１ｂベクター（Novagen）にクローニングした。
【０３２２】
実施例２６−ＮＭＥ６タンパク質発現／精製
ＬＢブロス（ルリアベルターニブロス）を１／１０の終夜培養物と共に接種し、３７℃にてＯＤ６００が約０．５に達するまで培養した。この時点で、イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ、GoldBiotechnology）０．４ｍＭにより組換えタンパク質発現を誘導し、５時間後に培養を停止した。遠心分離（６０００ｒｐｍで４℃にて１０分間）により細胞を回収した後、細胞ペレットをランニングバッファー：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ  ３６０ｍＭ、イミダゾール１０ｍＭ及び尿素８Ｍで再懸濁した。３７℃にて３０分間、細胞懸濁液を回転プラットフォーム（２７５ｒｐｍ）上でインキュベートし、５分間氷上で超音波処理した。不溶性細胞片を遠心分離（２００００ｒｐｍで４℃にて３０分間）により除去した。その後、清澄な溶解物をランニングバッファーで平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）に加えた。イミダゾール４２０ｍＭで補填されたランニングバッファー（８ＣＶ）によりカラムからタンパク質を溶出する前に、カラムを４ＣＶのランニングバッファーで洗浄した後、イミダゾール３０ｍＭで補填された４ＣＶのランニングバッファーで洗浄した。その後、タンパク質を透析によりリフォールディングした（図５９）。
【０３２３】
実施例２７−リフォールディングプロトコル
１．Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ、尿素４Ｍ、イミダゾール０．２ｍＭ、Ｌ−アルギニン０．４Ｍ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ及び５％グリセロールに対して終夜透析する。
２．Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ、尿素２Ｍ、イミダゾール０．２ｍＭ、Ｌ−アルギニン０．４Ｍ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ及び５％グリセロールに対して２４時間透析する。
３．Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ、尿素１Ｍ、イミダゾール０．２ｍＭ、Ｌ−アルギニン０．４Ｍ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ及び５％グリセロールに対して２４時間透析する。
４．Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ、イミダゾール０．２ｍＭ、Ｌ−アルギニン０．４Ｍ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ及び５％グリセロールに対して８時間透析する。
５．Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）  ２５ｍＭ、イミダゾール０．２ｍＭ、Ｌ−アルギニン０．１Ｍ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ及び５％グリセロールに対して終夜透析する。
６．ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、イミダゾール０．２ｍＭ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ及び５％グリセロールに対して３時間の透析を３回行う。
７．ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、イミダゾール０．２ｍＭ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ及び５％グリセロールに対して終夜透析する。
８．４℃にて３０分間リフォールディングされたタンパク質を遠心分離し（１８５００ｒｐｍ）、更なる精製のため上清を採取する。
【０３２４】
タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）により更に精製した。
【０３２５】
本明細書における全ての参照文献はその全体が引用することにより本明細書の一部とする参照によりそれら全体が援用される。
【０３２６】
部分的に引用される参考文献の一覧
【０３２７】
参考文献
Boyer L. A. etal. Cell 122, 947-956 (2005)
Dexheimer atal. Mol Cancer Ther 8(5):1363-1377 (2009)
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Zhou et al.Cell Stem Cell 4:381-384 (2009)
【０３２８】
当業者であれば、日常的な実験を使用するだけで、本明細書において具体的に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、又は確認することができるであろう。かかる均等物は特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
2020182483.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2020182483.tif 000009
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−０】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７】
2020182483.tif 000030
【図２８】
2020182483.tif 000031
【図２９】
2020182483.tif 000032
【図３０】
2020182483.tif 000033
【図３１−１】
2020182483.tif 000034
【図３１−２】
2020182483.tif 000035
【図３２】
2020182483.tif 000036
【図３３】
2020182483.tif 000037
【図３４】
2020182483.tif 000038
【図３５】
2020182483.tif 000039
【図３６】
2020182483.tif 000040
【図３７】
2020182483.tif 000041
【図３８】
2020182483.tif 000042
【図３９】
2020182483.tif 000043
【図４０】
2020182483.tif 000044
【図４１Ａ】
2020182483.tif 000045
【図４１Ｂ】
2020182483.tif 000046
【図４１Ｃ】
2020182483.tif 000047
【図４２】
2020182483.tif 000048
【図４３】
2020182483.tif 000049
【図４４】
2020182483.tif 000050
【図４５】
2020182483.tif 000051
【図４６】
2020182483.tif 000052
【図４７】
2020182483.tif 000053
【図４８】
2020182483.tif 000054
【図４９】
2020182483.tif 000055
【図５０】
2020182483.tif 000056
【図５１】
2020182483.tif 000057
【図５２】
2020182483.tif 000058
【図５３】
2020182483.tif 000059
【図５４】
2020182483.tif 000060
【図５５】
2020182483.tif 000061
【図５６】
2020182483.tif 000062
【図５７】
2020182483.tif 000063
【図５８】
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【図５９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月17日(2020.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＵＣ１＊活性化リガンドである、ＮＭＥ１二量体、ＮＭＥ６、ＮＭＥ７又はＮＭＥ７−ＡＢを含むＭＵＣ１＊細胞外ドメインの二量体化剤を含む細胞培養培地と細胞を接触させることを含み、該細胞培養培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２、インスリン、セレン、トランスフェリン、及びｌ−アスコルビン酸を培地中に含み、ｂＦＧＦおよびＴＧＦ−ベータを含まないものである、幹細胞若しくは前駆体細胞の成長を刺激するか、又はより未熟な状態への細胞の復帰を誘導する方法。