(57)【要約】      （修正有）【課題】２つ以上の非発光性（例えば、実質的に非発光性）ペプチド及び／またはポリペプチド単位から生物発光複合体を構築するための組成物及び方法の提供。【解決手段】特定の配列を持つ別の相補的な非発光性ペプチドとの構造的相補性によって生物発光活性が付与される非発光性ポリペプチドを提供する。生物学的過程は、分子、高分子、及び分子複合体間の共有結合的及び非共有結合的な相互作用に依存する。研究、臨床、及び他の実用的用途のためにそのような過程を理解し、それらを操作する技術及び化合物を開発するために、これらの相互作用を検出及び監視するためのツールを用意しておくことが必要である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが配列番号４４０からなるポリペプチドと接触すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成されることを特徴とする、ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが配列番号４４０からなる前記ポリペプチドと会合すると、基質の存在下で、前記検出可能な生物発光シグナルが生成される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列番号２のペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、前記形質が、配列番号４４０からなる前記ポリペプチドに対する親和性、発現、細胞内溶解性、細胞内安定性、及び、配列番号４４０からなる前記ポリペプチドと組み合わせたときの生物発光活性から選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が、表１のペプチドから選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸配列が、合成であるか、非天然のアミノ酸を含有するか、またはペプチド模倣体である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載のペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする、核酸。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドと、第１の相互作用ポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドであって、前記第１の相互作用ポリペプチドが、前記第１の相互作用ポリペプチドと第２の相互作用ポリペプチドとが接触すると前記第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されていることを特徴とする、融合ポリペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載の融合ポリペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする、核酸。
【請求項９】
（ａ）請求項７に記載の融合ポリペプチドと、
（ｂ）第２の融合ポリペプチドと
を含む生物発光複合体であって、前記第２の融合ポリペプチドが、
（ｉ）前記第２の相互作用ポリペプチドと、
（ｉｉ）配列番号２と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドと会合すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルを放出する相補性ポリペプチドとを含み、
前記第１の融合ポリペプチドと前記第２の融合ポリペプチドとが会合し、
配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドと前記相補性ポリペプチドとが会合することを特徴とする、生物発光複合体。
【請求項１０】
配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが配列番号２からなるペプチドと接触すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成されることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、配列番号４４０のポリペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、前記形質が、配列番号２からなる前記ペプチドに対する親和性、発現、細胞内溶解性、細胞内安定性、及び、配列番号２からなる前記ペプチドと組み合わせた時の生物発光活性から選択される、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記アミノ酸配列が、表２のポリペプチド配列のうちの１つから選択される、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが配列番号２からなる前記ペプチドと会合すると、基質の存在下で、前記検出可能な生物発光シグナルが生成される、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記アミノ酸配列が、合成であるか、非天然のアミノ酸を含有するか、またはペプチド模倣体である、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１０に記載のポリペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする、核酸。
【請求項１６】
請求項１０に記載のポリペプチドと、第１の相互作用ポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドであって、前記第１の相互作用ポリペプチドが、前記第１の相互作用ポリペプチドと第２の相互作用ポリペプチドとが接触すると前記第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されていることを特徴とする、融合ポリペプチド。
【請求項１７】
（ａ）請求項１６に記載の融合ポリペプチドと、
（ｂ）第２の融合ポリペプチドと
を含む生物発光複合体であって、前記第２の融合ポリペプチドが、
ｉ）前記第２の相互作用ポリペプチドと、
ｉｉ）２つの間に会合が形成された時に、配列番号２と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドに、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルを放出させる相補性ペプチドとを含み、
前記第１の融合ポリペプチドと前記第２の融合ポリペプチドとが会合し、
配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドと前記相補性ポリペプチドとが会合することを特徴とする、生物発光複合体。
【請求項１８】
（ａ）配列番号２と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するペプチドアミノ酸配列を含むペプチドと、
（ｂ）配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するポリペプチドアミノ酸配列を含むポリペプチドと
を含む生物発光複合体であって、検出可能な発光を示すことを特徴とする、生物発光複合体。
【請求項１９】
前記ペプチドアミノ酸配列と前記ポリペプチドアミノ酸配列とが会合する、請求項１８に記載の生物発光複合体。
【請求項２０】
前記ペプチドアミノ酸配列が、表１のペプチド配列から選択される、請求項１８に記載の生物発光複合体。
【請求項２１】
前記ポリペプチドアミノ酸配列が、表２のポリペプチド配列から選択される、請求項１８に記載の生物発光複合体。
【請求項２２】
前記ペプチドアミノ酸配列が、第２の相互作用要素と会合している第１の相互作用要素に付着している、請求項１９に記載の生物発光複合体。
【請求項２３】
前記ポリペプチドアミノ酸配列が、前記第２の相互作用要素に付着している、請求項２２に記載の生物発光複合体。
【請求項２４】
前記ポリペプチドアミノ酸配列及びペプチドアミノ酸配列は、前記第１及び第２の相互作用要素の会合の非存在下では会合することができない、請求項２３に記載の生物発光複合体。
【請求項２５】
（ａ）既存のタンパク質の断片ではない第１のアミノ酸配列と、
（ｂ）既存のタンパク質の断片ではない第２のアミノ酸配列と
を含む生物発光複合体であって、
前記生物発光複合体が、検出可能な発光を示し、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列とが会合し、前記生物発光複合体が、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列とが会合すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルを放出することを特徴とする、生物発光複合体。
【請求項２６】
（ｃ）相互作用対の第１のメンバーを含む第３のアミノ酸配列であって、前記第１のアミノ酸配列に共有結合される、第３のアミノ酸配列と、
（ｄ）相互作用対の第２のメンバーを含む第４のアミノ酸配列であって、前記第２のアミノ酸配列に共有結合される、第４のアミノ酸配列と
をさらに含む、請求項２５に記載の生物発光複合体。
【請求項２７】
前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間の非共有結合相互作用は、前記相互作用対の前記第１のメンバーと前記第２のメンバーとの間の非共有結合相互作用が存在しない場合、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列とを会合させるのに十分ではない、請求項２６に記載の生物発光複合体。
【請求項２８】
第１のポリペプチド鎖は、前記第１のアミノ酸配列及び前記第３のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、前記第２のアミノ酸配列及び前記第４のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の生物発光複合体。
【請求項２９】
前記第１のポリペプチド鎖及び前記第２のポリペプチド鎖が、細胞内で発現される、請求項２８に記載の生物発光複合体。
【請求項３０】
（ａ）非発光性対と、
（ｂ）相互作用対と
を含む生物発光複合体であって、
前記非発光性対の各非発光性要素が、既存のタンパク質の断片ではなく、
前記相互作用対の各相互作用要素が、前記非発光性対の前記非発光性要素の１つに共有結合されることを特徴とする、生物発光複合体。
【請求項３１】
第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の安定な相互作用の検出方法であって、
（ａ）前記第１のアミノ酸配列を第３のアミノ酸配列に付着させ、かつ前記第２のアミノ酸配列を第４のアミノ酸配列に付着させる工程であって、前記第３及び第４のアミノ酸配列が、既存のタンパク質の断片ではなく、前記第３及び第４のアミノ酸配列の安定な複合体は、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルを放出し、前記第３及び第４のアミノ酸配列の間の非共有結合相互作用は、追加の安定化力及び／または凝集力の非存在下で前記第３及び第４のアミノ酸配列の複合体を形成するには十分ではなく、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間の安定な相互作用は、前記第３及び第４のアミノ酸配列の安定な複合体を生成するためのっ前記追加の安定化力及び／または凝集力を提供する工程と、
（ｂ）前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間の安定な相互作用が起こることを可能にする条件で、工程（ａ）の前記第１、第２、第３、及び第４のアミノ酸配列を配置する工程と、
（ｃ）基質の存在下での前記第３及び第４のアミノ酸配列の前記安定な複合体によって、基質の存在下で放出された前記生物発光シグナルを検出する工程であって、前記生物発光シグナルの検出が、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間の安定な相互作用を示す工程と
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項３２】
前記第１のアミノ酸配列を前記第３のアミノ酸配列に、かつ前記第２のアミノ酸配列を前記第４のアミノ酸配列に付着させる工程が、前記第１のアミノ酸配列及び前記第３のアミノ酸配列を含む第１の融合タンパク質を形成する工程と、前記第２のアミノ酸配列及び前記第４のアミノ酸配列を含む第２の融合タンパク質を形成する工程とを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の融合タンパク質及び前記第２の融合タンパク質が、それぞれ、前記第１及び第３のアミノ酸配列の間と前記第２及び第４のアミノ酸配列の間とに、リンカーをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の融合タンパク質が、前記第１及び第３のアミノ酸配列をコードする第１の核酸配列から発現され、前記第２の融合タンパク質が、前記第２及び第４のアミノ酸配列をコードする第２の核酸配列から発現される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
単一のベクターは、前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列が、別個のベクター上に存在する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ａ）及び（ｂ）が、前記第１及び第２の融合タンパク質を細胞内で発現させる工程を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
非発光性対の最適化方法であって、
（ａ）３つ以上の関連するタンパク質の配列を整列させる工程と、
（ｂ）前記関連するタンパク質のコンセンサス配列を決定する工程と、
（ｃ）３つ以上のタンパク質に関連するタンパク質の第１及び第２の断片を提供する工程であって、前記断片は、個別には実質的に非発光性であるが、前記断片が安定に相互作用すると発光を示す工程と、
（ｄ）前記第１及び第２の断片を各々１ヶ所以上の位置で突然変異させる工程であって、前記突然変異が、前記断片の配列をコンセンサス配列の対応する部分により類似するように変更し、前記突然変異が、既存のタンパク質の断片ではない非発光性対を生じさせる工程と、
（ｅ）前記非発光性対を、会合していない場合の発光の非存在と、前記非発光性対が安定に会合した場合の発光とについて試験する工程と
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項３９】
前記非発光性対が、前記第１及び第２の断片と比較して１つ以上の形質の増強を示し、前記形質が、再構成の親和性の増加、再構成の親和性の減少、発現の増強、細胞内溶解性の増加、細胞内安定性の増加、及び再構成された発光の強度の増加から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが配列番号２からなるペプチドと接触すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、ポリペプチドと、（ｂ）前記ポリペプチド及び配列番号２からなるペプチドによって生成される生物発光複合体のための基質とを備えることを特徴とする、検出試薬。
【請求項４１】
（ａ）配列番号２と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが配列番号４４０からなるポリペプチドと接触すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、ペプチドと、（ｂ）前記ペプチド及び配列番号４４０からなるポリペプチドによって生成される生物発光複合体のための基質とを備えることを特徴とする、検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９１，５４９号に対する優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
２つ以上の非発光性（例えば、実質的に非発光性）ペプチド及び／またはポリペプチド単位から生物発光複合体を構築するための組成物及び方法が本明細書に提供される。具体的には、別の相補的な非発光性ペプチドとの構造的相補性によって非発光性ポリペプチドに生物発光活性が付与される。
【背景技術】
【０００３】
生物学的過程は、分子、高分子、及び分子複合体間の共有結合的及び非共有結合的な相互作用に依存する。研究、臨床、及び他の実用的用途のためにそのような過程を理解し、それらを操作する技術及び化合物を開発するために、これらの相互作用を検出及び監視するためのツールを用意しておくことが必要である。特に、生理的条件下における（例えば、タンパク質の相互作用を監視するための正常な発現レベルでの）これらの相互作用の研究は、高い感度を必要とする。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、相補的な非発光性アミノ酸鎖（例えば、既存のタンパク質の断片ではない実質的に非発光性のペプチド及び／またはポリペプチド）を含む組成物、その複合体、ならびに、非発光性アミノ酸鎖（例えば、ペプチド及び／またはポリペプチド）が会合すると任意選択的に検出可能な生物発光シグナルを発生させる方法に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、一緒に合わせると、集合して生物発光複合体を構築する２つ以上の非発光性または実質的に非発光性のペプチド及び／またはポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、一対の実質的に非発光性のペプチド及び／またはポリペプチド単位が集合して生物発光複合体を構築する。他の実施形態において、３つ以上の実質的に非発光性のペプチド及び／またはポリペプチド単位が集合して生物発光複合体（例えば、三元複合体、三次複合体等）を構築する。分子実体（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、小分子（例えば、小分子ライブラリ））間の相互作用を別様に非発光性（例えば、実質的に非発光性）のアミノ酸鎖の生物発光複合体の形成と相関させることによって、そのような相互作用を検出するための技術が本明細書に提供される。
【０００５】
いくつかの実施形態において、構築された対は、適切な基質の化学反応を触媒して高エネルギー状態とし、光が放射される。いくつかの実施形態において、生物発光複合体は、基質（例えば、セレンテラジン、フリマジン等）の存在下で発光を示す。
【０００６】
本明細書に記載の実施形態は、生物発光複合体を形成する相補的な非発光性アミノ酸鎖について主に記載及び言及するが、本発明の技術は、他の検出可能な属性（例えば、他の酵素活性、フルオロフォアの形成、発色団の形成等）にも等しく適用できることに留意されたい。発光に関連する本明細書に記載の実施形態は、特定の検出可能な活性（例えば、酵素活性）を別個に欠く、相補的な、実質的に非酵素的に活性なアミノ酸鎖（例えば、既存のタンパク質の断片ではないペプチド及び／もしくはポリペプチド）、またはポリペプチドの実質的に非酵素的に活性なサブユニット、その複合体、及び相補的な、実質的に非酵素的に活性なアミノ酸鎖（例えば、ペプチド及び／もしくはポリペプチド）と会合すると検出可能な活性（例えば、酵素活性）を引き起こす方法に適用されると見なされるべきである。さらに、非発光性ペプチド及び／またはポリペプチドに言及する本明細書に記載の実施形態は、いくつかの実施形態において、実質的に非発光性のペプチド及び／またはポリペプチドに適用される。
【０００７】
本発明はさらに、一対の非発光性ペプチド／ポリペプチドの相互作用を対象となる分子の相互作用（例えば、一過性の会合、安定な会合、複合体形成等）と関連付けることによって、対象となる分子間の分子相互作用を検出するためのアッセイを対象とする。そのような実施形態において、一対の非発光性要素が、対象となる分子に繋ぎ止められ（例えば、融合され）、対象となる分子の分子相互作用によって生物発光複合体の構築がもたらされる。対象となる分子が十分に安定な相互作用に関与する場合、生物発光複合体が形成し、生物発光シグナルが発生する。対象となる分子が十分に安定な相互作用に関与できない場合、生物発光複合体は形成しないかまたは弱く形成するのみであり、生物発光シグナルは検出不能であるかまたは実質的に減少する（例えば、実質的に検出不能、本質的に検出不能等）。いくつかの実施形態において、検出可能な生物発光シグナルの大きさは、対象となる分子間の分子相互作用の量、強度、好ましさ、及び／または安定性に比例（例えば、正比例）する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号２と１００％未満（例えば、２０％．．．３０％．．．４０％．．．５０％．．．６０％．．．７０％．．．８０％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドを提供し、ペプチドが配列番号４４０からなるポリペプチドと接触すると、検出可能な生物発光シグナルが生成される。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号２と１００％未満かつ４０％超（例えば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドを提供し、ペプチドが配列番号４４０からなるポリペプチドと接触すると、検出可能な生物発光シグナルが生成される。いくつかの実施形態において、ペプチドが配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超（例えば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）の配列同一性を有するポリペプチドと接触すると、検出可能な生物発光シグナルが生成される。特定の実施形態において、ペプチドが配列番号４４０を含むかまたはそれからなるポリペプチドまたはその一部と会合すると、検出可能な生物発光シグナルが生成されるかまたは実質的に増加する。好ましい実施形態において、ペプチドは、配列番号２のペプチドと比較して１つ以上の形質の変化（例えば、増強）を示し、形質は、配列番号４４０からなるポリペプチドと組み合わせた時の、配列番号４４０からなるポリペプチドに対する親和性、発現、細胞内溶解性、細胞内安定性、及び生物発光活性から選択される。これらの配列に限定されないが、ペプチドアミノ酸配列は、配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５のアミノ酸配列から選択されてもよい。いくつかの実施形態において、（ａ）前述のペプチドと、（ｂ）第１の相互作用ポリペプチドと第２の相互作用ポリペプチドとが接触すると、第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成する第１の相互作用ポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドが提供される。特定の実施形態において、（ａ）前述の第１の融合ポリペプチドと、（ｂ）（ｉ）第２の相互作用ポリペプチド、ならびに（ｉｉ）配列番号２と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドと会合した場合に、検出可能な生物発光シグナルを放出する相補性ポリペプチドを含む第２の融合ポリペプチドと、を含む生物発光複合体が提供され、第１の融合ポリペプチドと第２の融合ポリペプチドが会合し、配列番号２と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドと相補性ポリペプチドが会合する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号４４０と１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ポリペプチドが配列番号２からなるペプチドと接触すると、検出可能な生物発光シグナルが生成される。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超（例えば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ポリペプチドが配列番号２からなるペプチドと接触すると、検出可能な生物発光シグナルが生成される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドが配列番号２と１００％未満かつ４０％超（例えば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）の配列同一性を有するペプチドと接触すると、検出可能な生物発光シグナルが生成される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号４４０のペプチドと比較して１つ以上の形質の変化（例えば、増強）を示し、形質は、配列番号２からなるペプチドと組み合わせた時の、配列番号２からなるペプチドに対する親和性、発現、細胞内溶解性、細胞内安定性、及び生物発光活性から選択される。これらの配列に限定されないが、ポリペプチドアミノ酸配列は、配列番号４４１〜２１５６のアミノ酸配列のうちの１つから選択されてもよい。いくつかの実施形態において、ポリペプチドが配列番号２からなるペプチドと会合すると、検出可能な生物発光シグナルが生成される。いくつかの実施形態において、（ａ）前述のポリペプチドと、（ｂ）第１の相互作用ポリペプチドと第２の相互作用ポリペプチドとが接触すると、第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成する第１の相互作用ポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドが提供される。特定の実施形態において、（ａ）前述の第１の融合ポリペプチドと、（ｂ）（ｉ）第２の相互作用ポリペプチド、及び（ｉｉ）２つの間に会合が形成された時に、配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超（例えば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドに検出可能な生物発光シグナルを放出させる相補性ペプチドを含む第２の融合ポリペプチドと、を含む生物発光複合体が提供され、第１の融合ポリペプチドと第２の融合ポリペプチドとが会合し、配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超（例えば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドと相補性ペプチドとが会合する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載のペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質等のうちのいずれかをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、オリゴヌクレオチド、ベクター等を提供する。いくつかの実施形態において、配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５（非発光性ペプチドをコードする）ならびに／または配列番号４４１〜２１５６（非発光性ポリペプチドをコードする）の核酸配列のうちの１つを含むかまたはそれからなる核酸が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５ならびに／または配列番号４４１〜２１５６のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列が提供される。
【００１１】
特定の実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号２と１００％未満の配列同一性（例えば、＞９９％、＜９５％、＜９０％、＜８０％、＜７０％、＜６０％、＜５０％等）を有するペプチドアミノ酸配列を含むペプチドと、（ｂ）配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超（例えば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）の配列同一性を有するポリペプチドアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含む生物発光複合体を提供し、生物発光複合体は、検出可能な発光を示す。特定の実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号２と１００％未満かつ４０％超（例えば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）の配列同一性を有するペプチドアミノ酸配列を含むペプチドと、（ｂ）配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超（例えば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）の配列同一性を有するポリペプチドアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含む生物発光複合体を提供し、生物発光複合体は、検出可能な発光を示す。特定の配列に限定されないが、いくつかの実施形態において、ペプチドアミノ酸配列は、配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５に提供されるアミノ酸配列のうちの１つから選択される。
【００１２】
種々の実施形態において、（ａ）既存のタンパク質の断片ではない第１のアミノ酸配列と、（ｂ）既存のタンパク質の断片ではない第２のアミノ酸配列とを含む生物発光複合体が提供され、生物発光複合体は、検出可能な発光を示し、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列とが会合する。いくつかのそのような生物発光複合体は、（ｃ）相互作用対の第１のメンバーを含む第３のアミノ酸配列であって、第１のアミノ酸配列に共有結合される第３のアミノ酸配列と、（ｄ）相互作用対の第２のメンバーを含む第４のアミノ酸配列であって、第２のアミノ酸配列に共有結合される第４のアミノ酸配列とをさらに含む。特定の実施形態において、相互作用対の第１のメンバーと第２のメンバーとの相互作用が存在しない場合、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との相互作用（例えば、非共有結合的な相互作用（例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス引力、疎水性相互作用等）、共有結合的な相互作用（例えば、ジスルフィド結合）等）は、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列とを著しく会合させない。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、第１のアミノ酸配列及び第３のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、第２のアミノ酸配列及び第４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖は、細胞内で発現される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）各非発光性要素が既存のタンパク質の断片ではない一対の非発光性要素と、（ｂ）相互作用対の各相互作用要素が非発光性要素の一方に共有結合される相互作用対とを含む生物発光複合体を提供する。
【００１４】
本明細書に記載の種々の実施形態は、例えば、（ａ）第１のアミノ酸配列を第３のアミノ酸配列に付着させ、第２のアミノ酸配列を第４のアミノ酸配列に付着させるステップであって、第３及び第４のアミノ酸配列は、既存のタンパク質の断片ではなく、第３及び第４のアミノ酸配列の複合体は、検出可能な生物発光シグナル（例えば、それぞれ、ポリペプチド鎖と比較して実質的に増加した生物発光）を放出し、第３及び第４のアミノ酸配列の間の相互作用（例えば、非共有結合的）は、さらなる安定化及び／または凝集条件の非存在下で第３及び第４のアミノ酸配列の複合体を形成するには不十分であるかまたは弱く形成するのみであり、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との相互作用は、第３及び第４のアミノ酸配列の複合体を生成するためのさらなる安定化及び／または凝集力を提供する、ステップと；（ｂ）第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との相互作用が起こることを可能にする条件で、ステップ（ａ）の第１、第２、第３、及び第４のアミノ酸配列を配置するステップと；（ｃ）第３及び第４のアミノ酸配列の複合体によって放出された生物発光シグナルを検出するステップであって、生物発光シグナルの検出は、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との相互作用を示唆する、ステップと、を含む、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との相互作用を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態において、第１のアミノ酸配列を第３のアミノ酸配列に、及び第２のアミノ酸配列を第４のアミノ酸配列に付着させることは、第１のアミノ酸配列及び第３のアミノ酸配列を含む第１の融合タンパク質を形成することと、第２のアミノ酸配列及び第４のアミノ酸配列を含む第２の融合タンパク質を形成することを含む。いくつかの実施形態において、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質は、それぞれ、前記第１及び第３のアミノ酸配列の間と、前記第２及び第４のアミノ酸配列の間にリンカーをさらに含む。特定の実施形態において、第１の融合タンパク質は、第１及び第３のアミノ酸配列をコードする第１の核酸配列から発現され、第２の融合タンパク質は、第２及び第４のアミノ酸配列をコードする第２の核酸配列から発現される。いくつかの実施形態において、単一のベクターは、第１の核酸配列及び第２の核酸配列を含む。他の実施形態において、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、別個のベクター上に存在する。特定の実施形態において、（ａ）「付着させる」及び（ｂ）「配置する」ステップは、細胞内で第１及び第２の融合タンパク質を発現させることを含む。
【００１５】
一対の非発光性要素を形成、生成、作製、及び／または最適化する方法であって、（ａ）３つ以上の関連するタンパク質の配列を整列させることと、（ｂ）関連するタンパク質のコンセンサス配列を決定することと、（ｃ）３つ以上のタンパク質に関連するタンパク質の第１及び第２の断片を提供すること（または、３つ以上のタンパク質のうちの１つの第１及び第２の断片を提供すること）であって、断片は、個別には実質的に非発光性であるが、断片が相互作用すると発光を示す、提供することと、（ｄ）第１及び第２の断片を各々１ヶ所以上の位置で突然変異させることであって、突然変異は、断片の配列をコンセンサス配列の対応する部分により類似するように変更する（例えば、突然変異は、既存のタンパク質の断片ではない一対の非発光性要素を生じさせる）、突然変異させることと、（ｅ）会合していない場合の発光の非存在（例えば、本質的な非存在、実質的な非存在等）について、及び非発光性対が会合して生物発光複合体になった場合の発光について一対の非発光性要素を試験することと、を含む方法が提供される。そのようなプロセスの例は、実施例１〜５に記載される。いくつかの実施形態において、非発光性要素は、第１及び第２の断片と比較して１つ以上の形質の増強を示し、形質は、再構成の親和性の増加、再構成の親和性の減少、発現の増強、細胞内溶解性の増加、細胞内安定性の増加、及び再構成された発光の強度の増加から選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ポリペプチドが配列番号２からなるペプチドと接触すると検出可能な生物発光シグナルが生成される、ポリペプチドと、（ｂ）ポリペプチド及び配列番号２からなるペプチドによって生成される生物発光複合体のための基質と、を含む検出試薬を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号２と１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、ペプチドが配列番号４４０からなるポリペプチドと接触すると、検出可能な生物発光シグナルが生成される、ペプチドと、（ｂ）ペプチド及び配列番号４４０からなるポリペプチドによって生成される生物発光複合体のための基質と、を含む検出試薬を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号２と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、ペプチドが配列番号４４０からなるポリペプチドと接触すると、検出可能な生物発光シグナルが生成される、ペプチドと、（ｂ）ペプチド及び配列番号４４０からなるポリペプチドによって生成される生物発光複合体のための基質と、を含む検出試薬を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＧＶＴＧＷＲＬＣＫＲＩＳＡ（配列番号２３６）ペプチドの種々の変異体が、配列番号４４０との相補性から生じる発光に及ぼす影響を表すグラフを示す。
【図２】配列番号４４０ポリペプチドの種々の変異体が、ＧＶＴＧＷＲＬＣＫＲＩＳＡ（配列番号２３６）またはＧＶＴＧＷＲＬＦＫＲＩＳＡ（配列番号１０８）ペプチドとの相補性から生じる発光に及ぼす影響を表すグラフを示す。
【図３】図３Ａは、グリシンからアラニンへの単一の置換を含有する各非発光性ポリペプチド（ＮＬｐｏｌｙ）変異体において検出された発光（ＲＬＵ）を示す。図３Ｂは、野生型と比較した発光の増加倍数を示す。
【図４】図４Ａは、グリシンからアラニンへの置換の複合物を含有する各ＮＬｐｏｌｙ変異体において検出された発光（ＲＬＵ）を示す。図４Ｂは、野生型と比較した発光の増加倍数を示す。
【図５】ＨＴ−ＮＬペプチド融合体において検出された発光（ＲＬＵ）を表すグラフを示す。
【図６】ＨＴ−ＮＬｐｅｐ融合体において検出された発光（ＲＬＵ）を表すグラフを示す。
【図７】ＮＬペプチド−ＨＴ融合体において検出された発光（ＲＬＵ）を表すグラフを示す。
【図８】非発光性ペプチド（ＮＬｐｅｐ）の凍結融解サイクル後に発光複合体によって発生した発光（ＲＬＵ）を示す。
【図９】濃度を正規化したペプチドの活性、及び相対濃度を決定するために使用したＴＭＲゲルを示す。
【図１０】ＮＬｐｅｐ５３の存在下（上）及び相補性ペプチドの非存在下（下）における、ＮＬｐｏｌｙ−５Ａ２の残基Ｒ１１の種々の変異体の発光のグラフを示す。
【図１１】ＮＬｐｅｐ５３の存在下（上）及び相補性ペプチドの非存在下（下）における、ＮＬｐｏｌｙ  ５Ａ２の残基Ａ１５の種々の変異体の発光のグラフを示す。
【図１２】ＮＬｐｅｐ５３の存在下（上）及び相補性ペプチドの非存在下（下）における、ＮＬｐｏｌｙ  ５Ａ２の残基Ｌ１８の種々の変異体の発光のグラフを示す。
【図１３】ＮＬｐｅｐ５３の存在下（上）及び相補性ペプチドの非存在下（下）における、ＮＬｐｏｌｙ  ５Ａ２の残基Ｆ３１の種々の変異体の発光のグラフを示す。
【図１４】ＮＬｐｅｐ５３の存在下（上）及び相補性ペプチドの非存在下（下）における、ＮＬｐｏｌｙ  ５Ａ２の残基Ｖ５８の種々の変異体の発光のグラフを示す。
【図１５】ＮＬｐｅｐ５３の存在下（上）及び相補性ペプチドの非存在下（下）における、ＮＬｐｏｌｙ  ５Ａ２の残基Ａ６７の種々の変異体の発光のグラフを示す。
【図１６】ＮＬｐｅｐ５３の存在下（上）及び相補性ペプチドの非存在下（下）における、ＮＬｐｏｌｙ  ５Ａ２の残基Ｍ１０６の種々の変異体の発光のグラフを示す。
【図１７】ＮＬｐｅｐ５３の存在下（上）及び相補性ペプチドの非存在下（下）における、ＮＬｐｏｌｙ  ５Ａ２の残基Ｌ１４９の種々の変異体の発光のグラフを示す。
【図１８】ＮＬｐｅｐ５３の存在下（上）及び相補性ペプチドの非存在下（下）における、ＮＬｐｏｌｙ  ５Ａ２の残基Ｖ１５７の種々の変異体の発光のグラフを示す。
【図１９】ＮＬｐｅｐ−ＨＴ融合体の発光のグラフを示す。
【図２０】ＮＬｐｅｐ−ＨＴ融合体の発光のグラフ、及びそれらの相対的発現レベルを示すＴＭＲゲルを示す。
【図２１】ＮＬｐｅｐ−ＨＴ融合体の発光のグラフを示す。
【図２２】種々のＮＬｐｅｐの存在下におけるＮＬｐｏｌｙ５Ａ２（上）及びＮＬｐｏｌｙ５Ａ２＋Ｒ１１Ｅ（下）の発光のグラフを示す。
【図２３】ＮＬｐｅｐ−ＨＴ融合体の発光のグラフを示す。
【図２４】ＮＬｐｅｐ５３を用いた場合（上）及び相補性ペプチドを用いない場合（下）のＮＬｐｏｌｙ１〜１３の発光のグラフを示す。
【図２５】ＮＡＮＯＧＬＯまたはＤＭＥＭ緩衝液及びフリマジンまたはセレンテラジン基質とともにＮＬｐｅｐ５３を用いた場合の種々のＮＬｐｏｌｙの発光のグラフを示す。
【図２６】種々のＮＬｐｏｌｙ及びＮＬｐｅｐ５３について、フリマジン対セレンテラジンの比率が存在する場合に発光を比較したグラフを示す。
【図２７】種々のＮＬｐｏｌｙ及びＮＬｐｅｐ５３について、フリマジン対セレンテラジンの比率が存在する場合に発光を比較したグラフを示す。
【図２８】ＨＥＫ２９３細胞ライセート中の種々のＮＬｐｏｌｙ及びＮＬｐｅｐ５３について、フリマジン及びセレンテラジンの存在下で発光を比較したグラフを示す。
【図２９】フリマジンを含むＤＭＥＭ緩衝液中のＮＬｐｏｌｙ及びＮＬｐｅｐ対の種々の組み合わせの発光のグラフを示す。
【図３０】フリマジンを含むＤＭＥＭ緩衝液中のＮＬｐｏｌｙ及びＮＬｐｅｐ対の種々の組み合わせのシグナル／バックグラウンド発光のグラフを示す。
【図３１】フリマジンまたはセレンテラジンのいずれかを基質と使用して、ＮＬｐｅｐ６９を用いた場合の種々のＮＬｐｏｌｙ変異体の発光及び基質特異性のグラフを示す。
【図３２】フリマジンまたはセレンテラジンのいずれかを基質と使用して、溶解性（下のグラフ）または生細胞（上のグラフ）条件下のいずれかで、ＮＬｐｅｐ６９を用いた場合の種々のＮＬｐｏｌｙ変異体の発光及び基質特異性の比較を示す。
【図３３】フリマジンまたはセレンテラジンのいずれかを基質と使用して、溶解性（下のグラフ）または生細胞（上のグラフ）条件下のいずれかで、ＮＬｐｅｐ７８を用いた場合のＮＬｐｏｌｙ変異体の発光及び基質特異性の比較を示す。
【図３４】フリマジンまたはセレンテラジンのいずれかを基質と使用して、溶解性（下のグラフ）または生細胞（上のグラフ）条件下のいずれかで、ＮＬｐｅｐ７９を用いた場合の種々のＮＬｐｏｌｙ変異体の発光及び基質特異性の比較を示す。
【図３５】種々のＮＬｐｏｌｙの存在下におけるＮＬｐｅｐ７８−ＨＴ（上）及びＮＬｐｅｐ７９−ＨＴ（下）融合体の発光のグラフを示す。
【図３６】ＮＬｐｅｐの非存在下における種々のＮＬｐｏｌｙの発光のグラフを示す。
【図３７】フリマジンまたはセレンテラジン基質のいずれかを用いて、種々のＮＬｐｏｌｙの存在下でＮＬｐｅｐ７８−ＨＴ（上）及びＮＬｐｅｐ７９−ＨＴ（下）融合体の発光のグラフを示す。
【図３８】ＣＨＯ及びＨｅＬａ細胞中で発現させた種々のＮＬｐｏｌｙを用いたＮＬｐｅｐ７８−ＨＴの発光のグラフを示す。
【図３９】ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、及びＣＨＯ細胞ライセート中で発現させたホタルルシフェラーゼに融合したＮＬｐｏｌｙからの元の発光及び正規化した発光のグラフを示す。
【図４０】ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、及びＣＨＯ細胞ライセート中で発現させたコメツキムシ赤色ルシフェラーゼに融合したＮＬｐｏｌｙからの元の発光及び正規化した発光のグラフを示す。
【図４１】ＮＬｐｏｌｙ野生型または５Ｐのいずれかを使用した生細胞における相補性の発光のグラフを示す。
【図４２】種々のＮＬｐｏｌｙを用いたＮＬｐｅｐ７８−ＨＴ融合体（上）及びＮＬｐｅｐ７９−ＨＴ融合体（下）の無細胞相補性の発光のグラフを示す。
【図４３】ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、及びＣＨＯ細胞ライセート中で発現させたＮＬｐｅｐ及びＮＬｐｏｌｙの種々の組み合わせについて結合親和性のグラフを示す。
【図４４】ＰＢＳまたはＮＡＮＯＧＬＯ緩衝液中のＮＬｐｅｐ及びＮＬｐｏｌｙの種々の組み合わせについて結合親和性のグラフを示す。
【図４５】ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、またはＣＨＯ細胞ライセート中で発現させたＮＬｐｏｌｙ５ＰとＮＬｐｅｐ９またはＮＬｐｅｐ５３との結合親和性のグラフを示す。
【図４６】ＮＬｐｅｐの非存在下における様々な量のＮＬｐｏｌｙの発光のグラフを示す。
【図４７】種々のＮＬｐｏｌｙ変異体のバックグラウンド発光のグラフを示す。
【図４８】種々のＮＬｐｏｌｙ変異体のバックグラウンド発光のグラフを示す。
【図４９】いくつかのＮＬｐｏｌｙ変異体の全ライセート及び可溶性断片のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図５０】（ａ）ＮＬｐｏｌｙ変異体の全ライセート及び可溶性断片のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、ならびに（ｂ）ＮＬｐｏｌｙ変異体のバックグラウンド発光を示す。
【図５１】１０ｎｍ（右）または１００ｎＭ（左）のＮＬｐｅｐ７８で相補した場合に、いくつかのＮＬｐｏｌｙ変異体によって生成される発光のグラフを示す。
【図５２】種々のＮＬｐｏｌｙ変異体の大腸菌ライセートにおけるバックグラウンド発光を表すグラフを示す。
【図５３】ＮＬｐｅｐ７８で相補された種々のＮＬｐｏｌｙ変異体の大腸菌ライセートにおける発光を表すグラフを示す。
【図５４】ＮＬｐｅｐ７９で相補された種々のＮＬｐｏｌｙ変異体の大腸菌ライセートにおける発光を表すグラフを示す。
【図５５】ＮＬｐｅｐ７８またはＮＬｐｅｐ７９で相補され、ＮＬｐｏｌｙ５Ｐに対して正規化された、種々のＮＬｐｏｌｙ変異体のシグナル対バックグラウンドのグラフを示す。
【図５６】種々のＮＬｐｏｌｙ変異体のバックグラウンド、ＮＬｐｅｐ７９（右）もしくはＮＬｐｅｐ７８（左）による発光、及びシグナル対ノイズ比を表すグラフを示す。
【図５７】種々のＮＬｐｏｌｙ５Ｐ変異体の全ライセート及び可溶性断片のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図５８】（Ａ）ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びＮＬｐｏｌｙ  Ｉ１０７Ｌの全ライセート及び可溶性断片の量、（Ｂ）ＮＬｐｅｐを用いない場合、またはＮＬｐｅｐ７８もしくはＮＬｐｅｐ７９を用いた場合にＮＬｐｏｌｙ５ＰまたはＮＬｐｏｌｙ  Ｉ１０７Ｌによって発生した発光、及び（Ｃ）ＮＬｐｏｌｙ５Ｐと比較して改善されたＮＬｐｏｌｙ  Ｉ１０７Ｌのシグナル対バックグラウンドを示す。
【図５９】（Ａ）相補性ペプチドを用いない場合、（Ｂ）ＮＬｐｅｐ７８−ＨＴを用いた場合、及び（Ｃ）ＮＬｐｅｐ７９−ＨＴを用いた場合の、種々のＮＬｐｏｌｙ変異体の発光のグラフを示す。
【図６０】（Ａ）相補性ペプチドを用いない場合、（Ｂ）ＮＬｐｅｐ７８−ＨＴを用いた場合、及び（Ｃ）ＮＬｐｅｐ７９−ＨＴを用いた場合の、種々のＮＬｐｏｌｙ変異体の発光のグラフを示す。
【図６１】（Ａ）相補性ペプチドを用いない場合、（Ｂ）ＮＬｐｅｐ７８−ＨＴを用いた場合、及び（Ｃ）ＮＬｐｅｐ７９−ＨＴを用いた場合の、種々のＮＬｐｏｌｙ変異体の発光のグラフを示す。
【図６２】（Ａ）相補性ペプチドを用いない場合、（Ｂ）ＮＬｐｅｐ７８−ＨＴを用いた場合、及び（Ｃ）ＮＬｐｅｐ７９−ＨＴを用いた場合の、種々のＮＬｐｏｌｙ変異体の発光のグラフを示す。
【図６３】伸長ＮＬｐｏｌｙ変異体（Ｃ末端にアミノ酸を付加）と短縮ＮＬｐｅｐ（Ｎ末端のアミノ酸を欠失）との結合親和性を示す。
【図６４】種々のＮＬｐｏｌｙ変異体とＮＬｐｅｐ７８との結合親和性のグラフを示す。
【図６５】哺乳動物細胞（ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、及びＨｅＬａ）で発現させた５Ｐに対するＮＬｐｅｐ８０及びＮＬｐｅｐ８７の結合及びＶｍａｘを示す。
【図６６】大腸菌で発現させたＮＬｐｏｌｙ５Ｐに対するＮＬｐｅｐ８０及びＮＬｐｅｐ８７の結合及びＶｍａｘを示す。
【図６７】短縮ＮＬｐｏｌｙ及び伸長ＮＬｐｅｐの発光のグラフを示す。
【図６８】種々の相補性ＮＬｐｅｐによるＨｅＬａライセート中のＮＬｐｏｌｙ５ＰのＫｄ及びＶｍａｘを示す。
【図６９】いくつかのＮＬｐｏｌｙ変異体とＮＬｐｅｐ８１との結合親和性のグラフを示す。
【図７０】いくつかのＮＬｐｏｌｙ変異体とＮＬｐｅｐ８２との結合親和性のグラフを示す。
【図７１】いくつかのＮＬｐｏｌｙ変異体とＮＬｐｅｐ７８との結合親和性のグラフを示す。
【図７２】ＮＬｐｅｐ７８を用いた場合のいくつかのＮＬｐｏｌｙ変異体のミカエリス定数のグラフを示す。
【図７３】２つのＮＬｐｅｐ及びＮＬｐｏｌｙ５Ｐ−Ｂ９の三次相補性による発光のグラフを示す。
【図７４】ＮＬｐｅｐ８８−ＨＴを用いた場合のＮＬｐｏｌｙ５Ｐの滴定の発光のグラフを示す。
【図７５】ＨａｌｏＴａｇ（ＨＴ）を有する種々のＮＬｐｅｐ融合体の細胞内局在化の画像を示す。
【図７６】ＮＬｐｏｌｙ（野生型）及びＮＬｐｏｌｙ（５Ｐ）の細胞内局在化の画像を示す。
【図７７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離及びＰＶＤＦ膜への移動後に、ＮＬＰｅｐとコンジュゲートした対象となるタンパク質を相補性によって検出する能力を示す。
【図７８】ＮＬｐｏｌｙ５Ｐと比較して種々のＮＬｐｏｌｙ変異体からの相対的発光シグナルのグラフを示す（ＮＬｐｅｐの非存在下）。
【図７９】ＮＬｐｏｌｙ５Ｐと比較して種々のＮＬｐｏｌｙからのバックグラウンドに対する相対的発光シグナルのグラフを示す（ＮＬｐｅｐの非存在下）。
【図８０】ＮＬｐｅｐ７８の１つまたは２つのいずれかの反復単位からなるＮＬｐｅｐの解離定数を比較している。
【図８１】ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２とＮＬｐｅｐ８６との親和性を示す。
【図８２】ＮＬｐｅｐを用いない場合、ＮＬｐｅｐ７８、及びＮＬｐｅｐ７９を用いた場合のＮＬｐｏｌｙ変異体からの発光のグラフを示す。
【図８３−９０】ＮＬｐｅｐの９６個の変異体を用いた場合のＮＬｐｏｌｙ５Ａ２、５Ｐ、８Ｓ、及び１１Ｓの解離定数及びＶｍａｘ値を示す。
【図９１】ＮＬｐｏｌｙ変異体の全ライセート及び同じライセートの可溶画分のタンパク質ゲルの画像を示す。
【図９２】ＮＬｐｏｌｙ変異体の全ライセート及び同じライセートの可溶画分のタンパク質ゲルの画像、ならびに同じ変異体の解離定数を含む表を示す。
【図９３】ＮＬｐｅｐ７９を用いた場合のＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及び１１Ｓの基質特異性を示しており、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓが５Ｐよりもフリマジンに対する優れた特異性を有することを示している。
【図９４】ＮＬｐｅｐ７８への結合によるＮＬｐｏｌｙ８Ｓの親和性精製に従うタンパク質ゲルの画像を示す。
【図９５】ＮＬｐｏｌｙ  ＷＴまたは１１ＳとＮＬｐｅｐＷＴ、７８、または７９との結合の会合速度定数及び解離速度定数の表を含む。
【図９６】ＮＬｐｏｌｙ／ＮＬｐｅｐの種々の対のＫｍ値を示す。
【図９７】フリマジンの亜飽和及び飽和濃度におけるＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＮＬｐｅｐ７９の解離定数を比較している。
【図９８】ＮＬｐｅｐＷＴ、７８、及び７９を用いた場合のＮＬｐｏｌｙ５Ａ２のＫｍ値を比較している。
【図９９】ＮＬｐｅｐの非存在下で進化過程における種々の段階からのＮＬｐｏｌｙの発光を示す。
【図１００】進化過程にわたって大腸菌由来ＮＬｐｏｌｙからの発光の改善を示しており、全体として約１０5の改善（ＮＬｐｏｌｙＷＴ：ＮＬｐｅｐＷＴからＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ：ＮＬｐｅｐ８０）が見られた。
【図１０１】進化過程にわたってＨｅＬａで発現させたＮＬｐｏｌｙからの発光の改善を示しており、全体として約１０5の改善（ＮＬｐｏｌｙＷＴ：ＮＬｐｅｐＷＴからＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ：ＮＬｐｅｐ８０）が見られた。
【図１０２】進化過程にわたってＨＥＫ２９３で発現させたＮＬｐｏｌｙからの発光の改善を示しており、全体として約１０4の改善が見られた（ＮＬｐｏｌｙＷＴ：ＮＬｐｅｐＷＴからＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ：ＮＬｐｅｐ８０）。
【図１０３】解離定数を示し、結合親和性におけるＮＬｐｏｌｙＷＴ：ＮＬｐｅｐＷＴからＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ：ＮＬｐｅｐ８６への約１０4倍の改善を示している。
【図１０４】進化過程の種々の段階からのＮＬｐｏｌｙ変異体の全ライセート及び同じライセートの可溶画分のタンパク質ゲルの画像を示す。
【図１０５】ＮＬｐｅｐの非存在下ならびにＮＬｐｅｐ７８及びＮＬｐｅｐ７９の存在下における種々のＮＬｐｏｌｙの発光を示す。
【図１０６】ＮＬｐｅｐの非存在下ならびにＮＬｐｅｐ７８及びＮＬｐｅｐ７９の存在下における種々のＮＬｐｏｌｙの発光を示す。
【図１０７】ＮＬｐｅｐの非存在下ならびにＮＬｐｅｐ７８及びＮＬｐｅｐ７９の存在下における種々のＮＬｐｏｌｙの発光を示す。
【図１０８】ラパマイシンまたはビヒクルで１５分処理した後の、ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びＮＬｐｅｐ８０／８７に融合した異なる組み合わせのＦＲＢ及びＦＫＢＰを発現する細胞によって発生した発光の比較を示す。誘導倍数は、ビヒクルを用いて発生したシグナルと比較して、ラパマイシンの存在下で発生したシグナルを指す。
【図１０９】ラパマイシンまたはビヒクルで６０分処理した後の、ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びＮＬｐｅｐ８０／８７に融合した異なる組み合わせのＦＲＢ及びＦＫＢＰを発現する細胞によって発生した発光の比較を示す。
【図１１０】ラパマイシンまたはビヒクルで１２０分処理した後の、ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びＮＬｐｅｐ８０／８７に融合した異なる組み合わせのＦＲＢ及びＦＫＢＰを発現する細胞によって発生した発光の比較を示す。
【図１１１】ラパマイシンまたはビヒクルで１２０分処理した後の、ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びＮＬｐｅｐ８０／８７に融合した異なる組み合わせのＦＲＢ及びＦＫＢＰを発現する細胞によって発生した発光の比較を示す。ＮＬｐｏｌｙ／ＮＬｐｅｐに融合したＦＲＢ及びＦＫＢＰの８つ全ての可能な組み合わせを試験し、より少ない全ＤＮＡを使用した。
【図１１２】結合パートナーの非存在下で発現させたＦＲＢまたはＦＫＢＰ融合体によって発生した発光の比較を示す。
【図１１３】様々な量のＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／８７ＤＮＡでトランスフェクトした細胞によって発生した発光の比較を示す。
【図１１４】結合パートナーの非存在下で様々な量のＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５ＰまたはＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／８７ＤＮＡでトランスフェクトした細胞によって発生した発光の比較を示す。
【図１１５】様々な量のＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／８７ＤＮＡでトランスフェクトした細胞によって発生した発光の比較を示す。この実施例は、より少ないレベルのＤＮＡが使用されたという点で図１１３とは異なる。
【図１１６】結合パートナーの非存在下で様々な量のＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５ＰまたはＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／８７ＤＮＡでトランスフェクトした細胞によって発生した発光の比較を示す。これは、より少ないレベルのＤＮＡが使用されたという点で図１１４とは異なる。
【図１１７】異なる長さの時間ラパマイシンで処理した後に、様々な量のＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０ＤＮＡでトランスフェクトした細胞によって発生した発光の比較を示す。
【図１１８】異なる長さの時間ラパマイシンで処理した後に、様々な量のＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８７ＤＮＡでトランスフェクトした細胞によって発生した発光の比較を示す。
【図１１９】異なる組み合わせのＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／８７／９５／９６／９７を発現する細胞によって発生した発光の比較を示す。アッセイは、２日間及び３日間形式の両方で行われた。
【図１２０】異なる組み合わせのＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／８７／９５／９６／９７を発現する細胞によって発生した発光の比較を示す。アッセイは、２日間及び３日間形式の両方で行われた。
【図１２１】異なる組み合わせのＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２またはＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１／１０４／１０５／１０６／１０７／１０８／１０９／１１０を発現する細胞によって発生した発光の比較を示す。
【図１２２】異なる組み合わせのＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２またはＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８７／９６／９８／９９／１００／１０１／１０２／１０３でトランスフェクトした細胞によって発生した発光の比較を示す。
【図１２３】異なるレベルのＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８７／１０１／１０２／１０７ＤＮＡでトランスフェクトした細胞によって発生した発光の比較を示す。
【図１２４】異なるレベルのＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８７／１０１／１０２／１０７ＤＮＡでトランスフェクトした細胞によって発生した発光の比較を示す。
【図１２５】ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５及びＰＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／８７ＤＮＡを発現する細胞の発光を示すラパマイシン用量反応曲線を示す。
【図１２６】ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２またはＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８７／１０１ＤＮＡを発現する細胞の発光を示すラパマイシン用量反応曲線を示す。
【図１２７】ＦＲＢ−１１Ｓ及びＦＫＢＰ−１０１を発現する細胞によって生成され、基質  ＰＢＩ−４３７７またはフリマジンで処理された発光の比較を示す。
【図１２８】ラパマイシンの存在下または非存在下で行われた、ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／５Ａ２及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８７／１０１を発現する細胞のラパマイシンによる経時変化を示す（ラパマイシンは手動で加えた）。
【図１２９】ラパマイシンの存在下または非存在下で行われた、ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／５Ａ２及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８７／１０１を発現する細胞のラパマイシンによる経時変化を示す（ラパマイシンは注入器によって加えた）。
【図１３０】２つの異なる発光測定器上で測定されたＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１によって発生した発光を示す。
【図１３１】ラパマイシン処理後の種々の時点においてＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１を発現する細胞の発光を示す画像を提供する。
【図１３２】ラパマイシン処理後の種々の時点においてＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１を発現する個々の細胞によって生成されるシグナルのＩｍａｇｅ  Ｊによる定量を示すグラフを提供する。
【図１３３】ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１を発現する異なる細胞株における発光の比較を示す。
【図１３４】ラパマイシン競合阻害剤ＦＫ５０６で処理した後に、ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１を発現する細胞によって発生した発光の比較を示す。
【図１３５】ラパマイシン競合阻害剤ＦＫ５０６で処理した後に、ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１を発現する細胞によって発生した発光（左側）、及びＦＫ５０６で処理した後に残った発光の割合（右側）を示す。
【図１３６】Ｖ２ＲアゴニストＡＶＰの存在下または非存在下で、異なる組み合わせのＶ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２またはＶ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ８７／１０１−ＡＲＲＢ２でトランスフェクトした細胞によって発生した発光を示す。
【図１３７】ＡＶＰで処理した後に、Ｖ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ８７／１０１−ＡＲＲＢ２でトランスフェクトした細胞によって発生した発光を示すＡＶＰ処理の経時変化を示す（ＡＶＰは手動で加えた）。
【図１３８】ＡＶＰで処理した後に、異なる組み合わせのＶ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２またはＶ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ８７／１０１−ＡＲＲＢ２でトランスフェクトした細胞によって発生した発光を示すＡＶＰ処理の経時変化を示す（ＡＶＰは注入器によって加えた）。
【図１３９】ＡＶＰで処理した後に、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ１０１に融合された異なる構成のＶ２Ｒ及びＡＲＲＢ２を発現する細胞によって発生した発光を示す、３７℃でのＡＶＰ処理の経時変化を示す。
【図１４０】Ｖ２Ｒ−ＮＬｐｅｐ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ１０１−ＡＲＲＢ２を発現する異なる細胞株における発光の比較を示す。
【図１４１】ＡＶＰ処理後の種々の時点においてＶ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ１０１−ＡＲＲＢ２を発現する細胞の発光を示す６０Ｘ画像を示す。
【図１４２】ＡＶＰ処理後の種々の時点においてＶ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ１０１−ＡＲＲＢ２を発現する細胞の発光を示す１５０Ｘ画像を示す。
【図１４３】ＮＬｐｏｌｙ変異体の全ライセート及び同じライセートの可溶画分のタンパク質ゲルの画像を示す。
【図１４４】ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ、ならびにＮＬｐｏｌｙ５Ｐの３１、４６、７５、７６、及び９３位における突然変異の組み合わせについて解離定数を示す。
【図１４５】ＮＬｐｅｐ及びアミノペプチダーゼを使用した翻訳後修飾酵素の活性検出のトランスフェラーゼに関する例を示す。
【図１４６】ＮＬｐｅｐ及びメチル特異的抗体を使用した翻訳後修飾酵素の活性検出のヒドロラーゼに関する例を示す。
【図１４７】ＴＭＲにコンジュゲートされたＮＬｐｅｐＷＴまたはＮＬｐｅｐＷＴのいずれかで相補したＮＬｐｏｌｙ  ＷＴの波長走査を含む。
【図１４８】ＨａｌｏＴａｇ（ＮＬ−ＨＴ）に融合されたＮａｎｏＬｕｃ、及び４つの付加アミノ酸（ＤＥＶＤ）を有するＮＬＰｅｐＷＴで相補され、非クロロＴＯＭ（ＮＣＴ）にコンジュゲートされたＮＬｐｏｌｙ  ５Ａ２の波長走査を含む。
【図１４９】ＮＬｐｏｌｙ及びＮＬｐｅｐによるエネルギー移動を、相互作用する３つの分子を測定するためにも使用することができる概略的な三次相互作用を示している。略図中、ＮＬｐｏｌｙで標識されたＧＰＣＲとＮＬｐｅｐで標識されたＧＰＣＲ相互作用タンパク質とが相互作用すると、生物発光複合体を形成する。これにより二成分相互作用の測定が可能となる。エネルギー移動に適した蛍光部分を担持する小分子ＧＰＣＲリガンドがこの系と相互作用すると、エネルギー移動が起こる。したがって、二成分タンパク質−タンパク質相互作用及び薬物−タンパク質−タンパク質の三元相互作用は、同じ実験で測定することができる。
【図１５０】融合パートナー（ＨａｌｏＴａｇ）のＮ末端またはＣ末端における、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓの合成ＮＬＰｅｐ７８及びＮＬＰｅｐ７８への結合親和性のグラフ及び表を示す。
【図１５１】融合パートナー（ＨａｌｏＴａｇ）のＮ末端またはＣ末端における、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓの合成ＮＬＰｅｐ７９及びＮＬＰｅｐ７９への結合親和性のグラフ及び表を示す。
【図１５２】ＮＬＰｅｐ８６またはＰＢＩ−４８７７を用いた場合のＮＬｐｏｌｙ１１Ｓの正規化した蛍光強度を表すグラフを示す。
【図１５３】ＮＬＰｅｐ８６またはＰＢＩ−５４３４を用いた場合のＮＬｐｏｌｙ１１Ｓの正規化した蛍光強度を表すグラフを示す。
【図１５４】ＮＬＰｅｐ８６またはＰＢＩ−５４３６を用いた場合のＮＬｐｏｌｙ１１Ｓの正規化した蛍光強度を表すグラフを示す。
【図１５５】ＮＬｐｏｌｙ１１ＳとＮＬｐｅｐ８６、７８、９９、１０１、１０４、１２８、及び１１４との複合体の親和性緩衝液におけるフリマジン結合親和性を示すグラフを示す。
【図１５６】ＮＬｐｏｌｙ１１ＳとＮＬｐｅｐ８６、７８、９９、１０１、１０４、１２８、及び１１４との複合体のＮａｎｏＧｌｏアッセイ緩衝液におけるフリマジン結合親和性を示すグラフを示す。
【図１５７】フリマジン基質の濃度の増加に伴う親和性（ＮＬｐｏｌｙ１５６／ＮＬＰｅｐ１及びＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＮＬＰｅｐ１）の変化を表すグラフを示す。
【図１５８】ＮＬＰｅｐ１の濃度の増加に伴う親和性（ＮＬｐｏｌｙ１５６／ＮＬＰｅｐ１、及びＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＮＬＰｅｐ１）の変化を表すグラフを示す。
【図１５９】ＮＬＰｅｐ１を用いた場合のＮＬＰｏｌｙ１５６、ＮＬＰｏｌｙ１１Ｓ、及びＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）のＶｍａｘ及びＢｍａｘを表すグラフを示す。
【図１６０】ＮＬＰｏｌｙ１１ＳならびにＮＬＰｅｐ８６、７８、７９、９９、１０１、１０４、１１４、１２８及び野生型について、ＮＬＰｅｐ濃度の関数としてのＲＬＵを表すグラフを示す。
【図１６１】全長ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼと比較して、ＮＬＰｏｌｙ１５６及びＮＬＰｏｌｙ１１ＳのＨＥＫ２９３Ｔ細胞における発現レベルを表すウェスタンブロットを示す。
【図１６２】非融合タンパク質として、またはＮＬＰｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬＰｅｐ１１４に融合した場合のβ−ラクタマーゼＳＭＥ及びその阻害剤ＢＬＩＰＹ５０Ａの親和性の比較を表すグラフを示す。
【図１６３】異なる組み合わせのＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１／１１１−１３６を発現する細胞によって生成される発光の比較を示す。
【図１６４】異なる組み合わせのＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１ＳならびにＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１１４及び１３７−１４３を発現する細胞によって生成される発光の比較を示す。
【図１６５】ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ７８／７９／９９／１０１／１０４／１１４／１２８を発現する細胞のラパマイシン用量反応曲線を示す。
【図１６６】ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−７８／７９／９９／１０１／１０４／１１４／１２８を発現する細胞のラパマイシン競合阻害剤ＦＫ５０６に対する応答を示す。
【図１６７】異なる比率のＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１１４でトランスフェクトした細胞によって発生した発光の比較を示す。
【図１６８】異なる配向及び異なるリンカーの長さでＦＲＢ／ＦＫＢＰのＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＮＬｐｅｐ１１４融合体を発現する細胞によって発生した発光の比較を示す。
【図１６９】ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１１４または分割ホタル相補性シグナルのラパマイシンによる（Ａ）用量特異的及び（Ｂ）時間特異的な阻害を表すグラフを示す。
【図１７０】ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１１４または分割ホタル相補性シグナルのＦＫ５０６による（Ａ）用量特異的及び（Ｂ）時間特異的な誘導を表すグラフを示す。
【図１７１】等しいレベルのトランスフェクトしたＤＮＡにおけるＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１１４及びＦＫＢＰ−Ｆｌｕｃ（３９４−５４４）の同様の発現レベルを表すウェスタンブロットを示す。
【図１７２】ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ−ＢＲＤ４及びヒストンＨ３．３−ＮＬｐｅｐ１１４の相互作用のＩＢＥＴ−１５１による（Ａ）用量特異的及び（Ｂ）時間特異的な阻害を表すグラフを示す。
【図１７３】ＢＲＡＦ阻害剤ＧＤＣ０８７９に応じたＲＡＳ／ＣＲＡＦ、ＢＲＡＦ／ＢＲＡＦ、及びＣＲＡＦ／ＢＲＡＦ二量体形成における用量依存性の増加を表すグラフを示す。
【図１７４】ＮＬｐｏｌｙ１１ＳならびにＮＬｐｅｐ８６、野生型、及びＮＬｐｅｐ１１４について、ＮＬＰｅｐ濃度の関数としてのＲＬＵを表すグラフを示す。
【図１７５】発光性対の高親和性ペプチドを細胞内タンパク質タグとして用い、発光性対のポリペプチドを検出試薬として用いたアッセイの略を示す。
【図１７６】ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＭＬｐｅｐ８６の親和性の線形範囲を示すグラフを示す。
【図１７７】１１Ｓを用いて高親和性ＮＬＰｅｐでタグ付けされたタンパク質を検出する感度を表す画像を示す。また、この図は、ＮＬＰｅｐ／ＮＬＰｏｌｙを用いた検出と、蛍光標識したＨａｌｏＴａｇを用いた検出とを比較している。
【図１７８】ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓの安定性を示すグラフを示す。
【図１７９】ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ７８の親和性の線形範囲を示すグラフを示す。
【図１８０】ＮＬｐｅｐ配列の概要を示す。高親和性（自然発生）ペプチドは、高い親和性でＮＬｐｏｌｙ１１Ｓに結合するペプチド（ＮＬｐｅｐ）である。暗色／消光ペプチドは、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓによって生成されるかまたは検出される光のレベルを低下させることができるペプチド（ＮＬｐｅｐ）である。
【図１８１】ＬＳＰ及びＳＳＰ（すなわち、ＮＬｐｏｌｙ及びＮＬｐｅｐ）を一緒に合わせて生物発光シグナルを生成する構造的相補性の概念の略図を示す（パネルＡ、Ｂ）。タンパク質相互作用（すなわち、Ｘ及びＹ）が破壊されると、ＬＳＰとＳＳＰとが離れ、発光の低下がもたらされる（パネルＣ）。
【図１８２Ａ】図１８２Ａは、ＸとＹとの間でタンパク質相互作用が起こった場合のシグナルのロス、及びＸとＹとの間で相互作用が破壊された場合のシグナルのゲインの、構造的相補性を操作するための２つの選択肢（Ａ、Ｂ）を示す。選択肢Ａは、分子間の構造相補性を表す。選択肢Ｂは、分子内の構造相補性を表す。
【図１８２Ｂ】図１８２Ｂは、分子内の構造相補性に適している可能性がある遺伝子構築物のリストを示す。
【図１８３】（Ａ）種々の暗ペプチドＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ１１４の結合の阻害、ならびに（Ｂ）Ｌｙｓ−１６２及びＧｌｎ−１６２ペプチドによる用量依存的阻害を示す。
【図１８４】Ａは、Ｑ−１６２及びＡ−１６２による阻害が用量依存的であることを示している。パネルＢは、Ａ−１６２の用量依存性が最良でもわずかである一方で、Ｑ−１６２は、それ自体でシグナルを用量依存的な様式で生成することを示している。
【図１８５】ＣＰ  Ｎｌｕｃを用いた場合の暗ペプチドの用量反応を表すグラフを示す。
【図１８６】ＣＰ  Ｎｌｕｃを用いた場合の暗ペプチドの経時変化を表すグラフである。
【図１８７】ラパマイシンの存在下及び非存在下で、ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ単独で、及びＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１ＳとＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１１４との間で発生した発光の暗ペプチドによる用量依存的阻害を示す。
【図１８８】ラパマイシンの存在下及び非存在下でＦＲＢ−ＮａｎｏＬｕｃ（３１１）またはＮａｎｏＬｕｃ−ＦＲＢ（３０７）のいずれかによって発生した発光の暗ペプチドによる用量依存的阻害を示す（ＲＬＵ）。
【図１８９】ラパマイシンの存在下及び非存在下でＦＲＢ−ＮａｎｏＬｕｃ（３１１）またはＮａｎｏＬｕｃ−ＦＲＢ（３０７）のいずれかによって発生した発光の暗ペプチドによる用量依存的阻害を示す（暗ペプチドのない対照に対して正規化；１００％）。
【図１９０】暗ペプチドは、ＦＫＢＰに融合されると、低親和性（１１４）及び高親和性（８０）ペプチドの両方（またＦＫＢＰ融合体）と競合することができ、その結果として生細胞中で生成され、検出されている全体的な発光を低下させる。
【図１９１】Ｆｌｕｃの細胞内レベルについてＦｌｕｃ及びＮＬｐｅｐ８６に基づくアッセイ間でのシグナルの比較を示す。
【図１９２】Ｎｐｏｌｙ１１Ｓを相補する際のタンデム連結ＮＬｐｅｐの有用性を表すグラフを示す。
【図１９３】ＮＬｐｏｌｙ及びＮＬｐｅｐ成分は、レポータータンパク質ＦｌｕｃＰの細胞内分解に干渉しないことを表すグラフを示す。
【図１９４】細胞外プロテアーゼ活性アッセイを表す略図を示す。
【図１９５】ＰｒｏＮＬｐｅｐを使用して酵素の活性を測定するためのアッセイの略図を示す。
【図１９６】細胞内部移行を媒介する抗体、タンパク質、ペプチド、またはトランスポーターをスクリーニングするためのアッセイの略図を示す。
【図１９７】翻訳後修飾トランスフェラーゼアッセイの略図を示す。
【図１９８】翻訳後修飾ヒドロラーゼアッセイの略図を示す。
【図１９９】翻訳後修飾アッセイにおいてチロシンキナーゼＳＲＣの活性をバックグラウンドと比較して発光と相関させるグラフを示す。
【図２００】１２個の合成ペプチドを用いた場合の３つの異なる形態のＮＬｐｏｌｙ１１Ｓの自発的な相補性を表すグラフを示す。
【図２０１】別個の結合部分Ａ及びＢを有するＮＬｐｅｐ及びＮＬｐｏｌｙの融合体を用いた均一系イムノアッセイ形式の略図を示す。
【図２０２】（Ａ）ＧＷＡＬＦＫＫ及びダブシル−ＧＷＡＬＦＫＫと複合体を形成すると、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓからのバックグラウンド発光が減少すること、（Ｂ）ＮＬｐｅｐ８６は、ＧＷＡＬＦＫＫ及びダブシル−ＧＷＡＬＦＫＫの存在下でＮＬｐｏｌｙ１１Ｓと複合体を形成することを表すグラフを示す。
【図２０３】（Ａ）ＶＴＧＷＡＬＦＥＥＩＬ（Ｔｒｐ  １１ｍｅｒ）及びＶＴＧＹＡＬＦＥＥＩＬ（Ｔｙｒ  １１ｍｅｒ）は、バックグラウンドを上回る発光を誘導すること（ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ単独、ペプチドなしの対照）、各々のＮ末端ダブシル形態がこのシグナルの著しい消光を提供すること、及び（Ｂ）ＮＬｐｅｐ８６は、Ｔｒｐ  １１ｍｅｒ及びＴｙｒ  １１ｍｅｒのダブシル形態の存在下でＮＬｐｏｌｙ１１Ｓと複合体を形成することを表すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
本明細書において使用される場合、「実質的に」という用語は、列挙される特徴、パラメータ、及び／または値を正確に達成する必要はないが、例えば、許容誤差、測定誤差、測定精度限界、及び当該技術分野で既知の他の因子を含む逸脱または偏差が、提供することを意図した特徴の効果を妨げない量で起こり得ることを意味する。実質的に存在しない特徴または特性（例えば、実質的に非発光性）は、重要な特徴（例えば、生物発光タンパク質または生物発光複合体の発光強度）のノイズ内、バックグラウンドの下、使用されるアッセイの検出能力の下、または少数（例えば、＜１％、＜０．１％、＜０．０１％、＜０．００１％、＜０．００００１％、＜０．０００００１％、＜０．００００００１％）である特性であり得る。
【００１９】
本明細書において使用される場合、「生物発光」という用語は、酵素、タンパク質、タンパク質複合体、もしくは他の生体分子（例えば、生物発光複合体）によって触媒されるかまたは可能にされる化学反応による光の生成及び放出を指す。典型的な実施形態において、生物発光実体（例えば、生物発光タンパク質または生物発光複合体）の基質が、生物発光実体によって不安定な形態に変換される：基質はその後、光を放出する。
【００２０】
本明細書において使用される場合、「相補性」という用語は、ハイブリダイズすること、二量体形成すること、または別様に互いに複合体を形成することが可能な２つ以上の構造的要素（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸、小分子等）の特徴を指す。例えば、「相補性ペプチド及びポリペプチド」は、集合して複合体を形成することが可能である。相補性要素は、（例えば、相互作用要素から）複合体を形成するために、例えば、相補性に適した立体構造で要素を配置する、相補性要素を共局在化する、相補性のための相互作用エネルギーを低下させる等の補助を必要とし得る。
【００２１】
本明細書において使用される場合、「複合体」という用語は、互いと直接的及び／または間接的に接触する分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド等）の集合体または凝集体を指す。一態様において、「接触」またはより具体的には「直接的な接触」は、２つ以上の分子が十分に近接しているため、ファンデルワールス引力、水素結合、イオン結合、及び疎水性相互作用等の非共有結合的な引力相互作用が分子の相互作用を支配することを意味する。そのような態様において、分子（例えば、ペプチド及びポリペプチド）の複合体はアッセイ条件下で形成されるため、（例えば、その構成分子の非凝集または非複合化状態と比較して）複合体が熱力学的に好ましい。本明細書において使用される場合、「複合体」という用語は、別途記載のない限り、２つ以上の分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、またはその組み合わせ）の集合体を指す。
【００２２】
本明細書において使用される場合、「非発光性」という用語は、可視スペクトルにおいて（例えば、基質の存在下で）検出可能な量の光を放出しない特徴を示す実体（例えば、ペプチド、ポリペプチド、複合体、タンパク質等）を指す。例えば、実体は、所与のアッセイにおいて検出可能な発光を示さない場合に非発光性であると称されてもよい。本明細書において使用される場合、「非発光性」という用語は、「実質的に非発光性」という用語と同義である。例えば、非発光性ポリペプチド（ＮＬｐｏｌｙ）は、実質的に非発光性であり、例えば、ＮＬｐｏｌｙとその非発光性の相補性ペプチドとの複合体と比較して１０倍以上（例えば、１００倍、２００倍、５００倍、１×１０3倍、１×１０4倍、１×１０5倍、１×１０6倍、１×１０7倍等）の発光の減少を示す。いくつかの実施形態において、任意の光の放射が特定のアッセイに干渉するバックグラウンドを生じないよう十分小さい場合、実体は「非発光性」である。
【００２３】
本明細書において使用される場合、「非発光性ペプチド」（例えば、ＮＬｐｅｐ）及び「非発光性ポリペプチド」（例えば、ＮＬｐｏｌｙ）という用語は、標準条件（例えば、生理的条件、アッセイ条件等）下で典型的な機器（例えば、ルミノメーター等）を用いて重要なシグナル（例えば、発光複合体）と比較した場合に、（例えば、基質の存在下で）実質的に発光を示さないか、またはノイズより低い量、もしくは１０倍以上（例えば、１００倍、２００倍、５００倍、１×１０3倍、１×１０4倍、１×１０5倍、１×１０6倍、１×１０7倍等）の量を示すペプチド及びポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、そのような非発光性ペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載の基準に従って集合し、生物発光複合体を形成する。本明細書において使用される場合、「非発光性要素」は、非発光性ペプチドまたは非発光性ポリペプチドである。「生物発光複合体」という用語は、２つ以上の非発光性ペプチド及び／または非発光性ポリペプチドが集合した複合体を指す。生物発光複合体は、生物発光複合体の基質の変換を触媒するかまたは可能にして不安定な形態とする：基質はその後光を放出する。複合体化されていない場合、生物発光複合体を形成する２つの非発光性要素は、「非発光性対」と称されてもよい。生物発光複合体が、３つ以上の非発光性ペプチド及び／または非発光性ポリペプチドによって形成される場合、生物発光複合体の複合体化されていない構成成分は、「非発光性基」と称されてもよい。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「相互作用要素」という用語は、一対の非発光性要素または非発光性基を合わせて生物発光複合体を形成する際に補助となる部分を指す。典型的な実施形態において、一対の相互作用要素（「相互作用対」としても知られる）を、一対の非発光性要素（例えば、非発光性ペプチド／ポリペプチド対）に付着させ、２つの相互作用要素間の引力相互作用が生物発光複合体の形成を促進する：本発明は、そのような機序に限定されるものではなく、本発明を実施するためにその機序を理解することは必要ない。相互作用要素は、任意の適切な機序（例えば、非発光性対／基を近接させる、非発光性対／基を安定な相互作用のために適切な立体構造で配置する、複合体形成のための活性化エネルギーを減少させる、それらの組み合わせ等）によって生物発光複合体の形成を促進してもよい。相互作用要素は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、小分子、補助因子、核酸、脂質、炭水化物、抗体等であり得る。相互作用対は、２つの同じ相互作用要素（すなわち、同種の対）または２つの異なる相互作用要素（すなわち、異種の対）からなってもよい。同種の対の場合、相互作用要素は、同じ種類の部分（例えば、ポリペプチド）であってもよいか、または２つの異なる種類の部分（例えば、ポリペプチド及び小分子）であってもよい。相互作用対による複合体形成が調べられるいくつかの実施形態において、相互作用対は、「標的対」または「対象となる対」と称されてもよく、個々の相互作用要素は、「標的要素」（例えば、「標的ペプチド」、「標的ポリペプチド」等）または「対象となる要素」（例えば、「対象となるペプチド」、「対象となるポリペプチド」等）と称される。
【００２５】
本明細書において使用される場合、「既存のタンパク質」という用語は、特定の事象または日付の前に物理的に存在していたアミノ酸配列を指す。「既存のタンパク質の断片ではないペプチド」は、ペプチドの設計及び／または合成の前に物理的に存在していた（例えば、合成のまたは天然に存在する）タンパク質の断片または部分配列ではない短いアミノ酸鎖である。
【００２６】
本明細書において使用される場合、「断片」という用語は、より大きな全実体（例えば、タンパク質、ポリペプチド、酵素等）の切除もしくは「断片化」から生じるペプチドもしくはポリペプチド、またはそれらと同じ配列を有するように調製されたペプチドもしくはポリペプチドを指す。したがって、断片は、それが作製及び／または設計される全実体（例えば、タンパク質、ポリペプチド、酵素等）の部分配列である。既存の全タンパク質の部分配列ではないペプチドまたはポリペプチドは、断片ではない（例えば、既存のタンパク質の断片ではない）。「既存の生物発光タンパク質の断片ではない」ペプチドまたはポリペプチドは、（１）ペプチドまたはポリペプチドの設計及び／また合成前に物理的に存在しており、（２）かなりの生物発光活性を示すタンパク質（例えば、天然または合成）の部分配列ではないアミノ酸鎖である。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「部分配列」という用語は、別のより大きなペプチドまたはポリペプチドと１００％の配列同一性を有するペプチドまたはポリペプチドを指す。部分配列は、より大きなアミノ酸鎖の一部との完全な配列一致である。
【００２８】
本明細書において使用される場合、「配列同一性」という用語は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸等）がモノマーサブユニットの同じ配列組成を有する程度を指す。「配列類似性」という用語は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸等）が類似するポリマー配列を有する程度を指す。例えば、類似するアミノ酸は、同じ生物物理学的特徴を共有し、例えば、酸性（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び非荷電極性（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）等のファミリーに分類することができるアミノ酸である。「配列同一性パーセント」（または「配列類似性パーセント」）は、（１）比較ウィンドウにわたって最適にアラインされた２つの配列を比較し（例えば、より長い配列の長さ、より短い配列の長さ、指定されたウィンドウ）、（２）同一の（または類似する）モノマーを含有する（例えば、両方の配列に同じアミノ酸が生じる、両方の配列に類似するアミノ酸が生じる）位置の数を決定して一致する位置の数を得、（３）一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し（例えば、より長い配列の長さ、より短い配列の長さ、指定されたウィンドウ）、（４）その結果に１００を乗じて配列同一性パーセントまたは配列類似性パーセントを得ることによって計算される。例えば、ペプチドＡ及びＢが、どちらも２０アミノ酸長であり、１つの位置を除いて同一のアミノ酸を有する場合、ペプチドＡとペプチドＢとは９５％の配列同一性を有する。非同一位置にあるアミノ酸が同じ生物物理学的特徴を共有する場合（例えば、どちらも酸性である）、ペプチドＡとペプチドＢとは１００％の配列類似性を有する。別の例として、ペプチドＣが２０アミノ酸長であり、ペプチドＤが１５アミノ酸長であり、ペプチドＤの１５個のアミノ酸のうち１４個がペプチドＣの一部のアミノ酸と同一である場合、ペプチドＣとＤとは７０％の配列同一性を有するが、ペプチドＤは、ペプチドＣの最適な比較ウィンドウと９３．３％の配列同一性を有する。本明細書において「配列同一性パーセント」（または「配列類似性パーセント」）を計算する目的のために、整列させた配列中のいずれのギャップもその位置のミスマッチとして扱われる。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「生理的条件」という用語は、生細胞と適合性があるあらゆる条件、例えば、温度、ｐＨ、塩分、化学組成等の所定の水性条件を包含する。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「試料」という用語は広義な意味で使用される。ある意味では、この用語は、任意の源から得られる検体または培養液、ならびに生物試料及び環境試料を含むことを意味する。生物試料は、動物（ヒトを含む）から得られてもよく、液体、固体、組織、及び気体を包含する。生物試料は、血漿、血清等の血液製剤を含む。試料はまた、細胞ライセート、または本明細書に記載のペプチド及び／もしくはポリペプチドの精製された形態を指してもよい。細胞ライセートは、溶解剤で溶解した細胞、またはウサギ網状赤血球もしくはコムギ胚芽ライセート等のライセートを含んでもよい。試料はまた、無細胞発現系を含んでもよい。環境試料は、表面物質、土、水、結晶、及び工業試料等の環境物質を含む。しかしながら、このような例は、本発明に適用可能な試料の種類を限定すると解釈されるべきではない。
【００３１】
本明細書において使用される場合、別途指定のない限り、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は、ペプチドアミド結合（−−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−−）によって主鎖を介して結合された２つ以上のアミノ酸のポリマー化合物を指す。「ペプチド」という用語は、典型的には短いアミノ酸ポリマー（例えば、２５個よりも少ないアミノ酸を有する鎖）を指し、一方、「ポリペプチド」という用語は、典型的にはより長いアミノ酸ポリマー（例えば、２５個より多くのアミノ酸を有する鎖）を指す。
【００３２】
詳細な説明
特に、生理的条件下及び／または生理的発現レベルでのタンパク質の相互作用の研究は、高い感度を必要とする。本明細書に記載の特定の実施形態において、小分子、核酸、他のタンパク質等とのタンパク質の相互作用は、集合して、検出可能なシグナル（例えば、発光）を生成することが可能な生物発光複合体を形成する２つの非発光性要素の会合に基づいて検出される。生物発光複合体の形成は、監視されるタンパク質の相互作用に依存する。
【００３３】
２つ以上の非発光性ペプチド及び／またはポリペプチド単位（例えば、非発光性対）から生物発光複合体を構築するための組成物及び方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、非発光性ペプチド及び／またはポリペプチド単位は、既存のタンパク質の断片ではない（例えば、既知のポリペプチド配列の相補的配列ではない）。具体的には、非発光性ペプチドとの構造的相補性によって非発光性ポリペプチドに生物発光活性が付与される。
【００３４】
いくつかの実施形態において、分子相互作用を検出及び監視する際に使用される非発光性対（例えば、タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ、タンパク質−ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−ＤＮＡ、タンパク質−小分子、ＲＮＡ−小分子等）が本明細書に提供される。また、種々の生物発光複合体（例えば、高い親和性／高い発光性の対、中程度の親和性／高い発光性の対、低い親和性／中程度の発光性の対等）が形成すると変動性の親和性及び発光を有する、交換可能な非発光性要素（例えば、ペプチド及びポリペプチド）の相補性パネルが本明細書に提供される。異なる組み合わせの非発光性要素を利用することにより、低い〜高い親和性、発光、及び他の変動性の特徴に及ぶ種々の対を含む適応性のある系（ｓｙｓｔｅｍ）を提供する。この適応性は、対象となる特定の分子（複数可）に合うように分子相互作用の検出／監視を微調整することを可能にし、監視することができる分子相互作用の範囲を非常に高いまたは低い親和性の相互作用を含むように拡張する。さらに、非発光性対（または基）及び非発光性対（または基）のパネルが開発及び試験される方法が本明細書に提供される。
【００３５】
いくつかの実施形態において、非発光性対のペプチド／ポリペプチドメンバー間の相互作用だけでは、生物発光複合体を形成し、その結果生じる生物発光シグナルを生成するには不十分である。しかしながら、相互作用要素を非発光性対の各ペプチド／ポリペプチドメンバーに付着させた場合、（例えば、相互作用複合体を形成するための）相互作用対の相互作用が生物発光複合体の形成を促進する。そのような実施形態において、生物発光複合体からの生物発光シグナル（または基質の存在下でそのようなシグナルを生成する能力）は、相互作用複合体の形成のためのレポーターとして機能する。相互作用複合体が形成されると、次いで生物発光複合体が形成され、生物発光シグナルが（例えば、基質の存在下で）検出される／測定される／監視される。相互作用複合体が形成できない場合（例えば、好ましくない条件のため、相互作用要素間の不安定な相互作用のため、不適合な相互作用要素のため）、生物発光複合体は形成せず、生物発光シグナルは生成されない。
【００３６】
特定の実施形態において、相互作用対は、２つの対象となる分子（例えば、対象となるタンパク質）を含む。例えば、非発光性対の各１つを別のメンバーに繋ぎ止めることによって、２つの対象となる分子の相互作用を検出するためのアッセイを行うことができる。対象となる分子が相互作用する場合（例えば、一過性に相互作用する、安定に相互作用する等）、非発光性対が適切な立体構造で近接させられ、生物発光複合体が形成される（かつ、（基質の存在下で）生物発光シグナルが生成される／検出される）。対象となる分子間に相互作用が存在しない場合（例えば、複合体形成が見られない、一過性の相互作用でさえも認められない等）、非発光性対は十分に相互作用せず、生物発光シグナルは生成されないか、または弱く生成されるのみである。そのような実施形態は、阻害剤が複合体形成に及ぼす影響、突然変異が複合体形成に及ぼす影響、条件（例えば、温度、ｐＨ等）が複合体形成に及ぼす影響、小分子（例えば、潜在的に治療的である）と標的分子との相互作用等を調べるために使用することができる。
【００３７】
異なる非発光性対は、生物発光複合体の形成をもたらすために、相互作用複合体の異なる強度、期間、及びまたは安定性を必要とし得る。いくつかの実施形態において、検出可能な生物発光シグナルを生成するために安定な相互作用複合体が必要とされる。他の実施形態において、たとえ弱いまたは一過性の相互作用複合体であっても、生物発光複合体の形成をもたらす。いくつかの実施形態において、相互作用複合体の強度または程度は、その結果生じる生物発光シグナルの強度に正比例する。いくつかの非発光性対は、高いミリモル濃度の解離定数（例えば、Ｋd＞１００ｍＭ）を有する相互作用複合体と組み合わされた場合に、検出可能なシグナルを生成する。他の非発光性対は、検出可能なシグナルを有する生物発光複合体を生成するために、低いミリモル濃度（例えば、Ｋd＜１００ｍＭ）、マイクロモル濃度（例えば、Ｋd＜１ｍＭ）、ナノモル濃度（例えば、Ｋd＜１μＭ）、またはさらにはピコモル濃度（例えば、Ｋd＜１ｎＭ）の解離定数を有する相互作用対を必要とする。
【００３８】
いくつかの実施形態において、非発光性ペプチド／ポリペプチドのうちの１つ以上が既存のタンパク質の断片ではない。いくつかの実施形態において、非発光性ペプチド／ポリペプチドのうちの１つ以上が、既存の生物発光タンパク質の断片ではない。いくつかの実施形態において、非発光性ペプチド／ポリペプチドのいずれも／どれも、既存のタンパク質の断片ではない。いくつかの実施形態において、非発光性ペプチド／ポリペプチドのいずれも／どれも、既存の生物発光タンパク質の断片ではない。いくつかの実施形態において、集合して生物発光複合体を形成する非発光性ペプチドも非発光性ポリペプチドも、既存のタンパク質の断片ではない。いくつかの実施形態において、本発明の実施形態に使用される非発光性要素は、既存のタンパク質の部分配列ではない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載において使用される非発光性対は、既存のタンパク質の相補性部分配列を含まない。
【００３９】
いくつかの実施形態において、非発光性ペプチド／ポリペプチドは、単独で実質的に非発光性である。特定の実施形態において、適切な条件（例えば、生理的条件）に置かれると、非発光性ペプチド／ポリペプチドは、相互作用して生物発光複合体を形成し、基質の存在下で生物発光シグナルを生成する。他の実施形態において、１つ以上の相互作用要素（例えば、構成非発光性ペプチド及び非発光性ポリペプチドに付着した相補性相互作用要素）の付加なしには、非発光性ペプチド／ポリペプチドは、生物発光複合体を形成することができないか、または複合体を弱く形成するのみである。そのような実施形態において、非発光性ペプチド／ポリペプチドは、互いの存在下のみでは実質的に非発光性であるが、相互作用要素によって凝集させるか、会合させるか、配向させるか、または別様に合わせると、著しい検出可能な発光を生成する。いくつかの実施形態において、１つ以上の相互作用要素（例えば、構成ペプチド及びポリペプチドに付着した相補性相互作用要素）の付加なしには、集合して生物発光複合体を構築するペプチド及び／またはポリペプチドは、互いの存在下では低レベルの発光を生成するが、相互作用要素によって凝集させるか、会合させるか、配向させるか、または別様に合わせると、検出可能な発光が著しく増加する。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物及び方法は、１つ以上の相互作用要素を含む。典型的な実施形態において、相互作用要素は、集合して生物発光複合体を構築するためにペプチド及び／またはポリペプチドに付着させる部分（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、小分子、核酸、脂質、炭水化物等）である。相互作用要素は、一方または両方の非発光性要素と相互作用する、非発光性要素において立体構造変化を誘導する、別の相互作用要素（例えば、他の非発光性要素に付着した相互作用要素）と相互作用する、非発光性要素を近接させる、適切な相互作用のために非発光性要素を配向する等を含む任意の適切な機序によって生物発光複合体の形成を促進する。
【００４１】
いくつかの実施形態において、１つ以上の相互作用要が非発光性要素を含有する溶液に加えられるが、非発光性要素には付着しない。そのような実施形態において、相互作用要素（複数可）は、非発光性要素と相互作用して、生物発光複合体の形成を誘導するか、または生物発光複合体の形成に適した条件を作り出す。他の実施形態において、単一の相互作用要素を非発光性対のメンバーに付着させる。そのような実施形態において、単独の相互作用要素が非発光性要素の一方または両方と相互作用して生物発光複合体の形成に好ましい相互作用を生み出す。本発明の典型的な実施形態において、１つの相互作用要素を非発光性対の各メンバーに付着させる。相互作用要素間の好ましい相互作用は、非発光性要素間の相互作用を促進する。相互作用対は、安定に相互作用してもよいか、一過性に相互作用してもよいか、複合体を形成してもよい等である。相互作用対の相互作用は、限定されないが、非発光性対メンバーを近接させる、相互作用から非発光性対メンバーを適切に配向する、非発光性対の相互作用に対して作用する共有結合力を減少させる等を含む任意の適切な機序によって非発光性要素の相互作用（及び生物発光複合体の形成）を促進する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、相互作用対は、会合した非発光性対の相互作用を促進する任意の２つの化学部分を含む。相互作用対は、例えば、２つの相補性核酸、二量体形成が可能な２つのポリペプチド（例えば、ホモ二量体、ヘテロ二量体等）、タンパク質とリガンド、タンパク質と小分子、抗体とエピトープ、小分子の反応対等からなってもよい。任意の適切な相互作用分子の対が、相互作用対として使用され得る。
【００４３】
いくつかの実施形態において、相互作用対は、２つの対象となる分子（例えば、対象となるタンパク質）または標的分子を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物及び方法は、一対の標的分子間の相互作用を調べるための有用なアッセイ（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、動物全身等）を提供する。
【００４４】
特定の実施形態において、各々が非発光性要素の一方に付着した一対の相互作用要素は、互いと相互作用し、それによって生物発光複合体の形成を促進する。いくつかの実施形態において、リガンド、基質、補助因子、または付加的相互作用要素（例えば、非発光性要素に付着していない）の存在は、相互作用要素間の相互作用を誘導するために必要であり、生物発光複合体の形成を促進する。いくつかの実施形態において、生物発光複合体からのシグナルの検出は、リガンド、基質、補助因子、もしくは付加的相互作用要素の存在、または相互作用要素との相互作用を可能にする条件を示唆する。
【００４５】
いくつかの実施形態において、一対の相互作用要素及び一対の非発光性要素は全て、単一のアミノ酸鎖に存在する（例えば、（相互作用要素１）−ＮＬｐｅｐ−（相互作用要素２）−ＮＬｐｏｌｙ、ＮＬｐｏｌｙ−（相互作用要素１）−ＮＬｐｅｐ−−（相互作用要素２）、ＮＬｐｏｌｙ−（相互作用要素１）−（相互作用要素２）−ＮＬｐｅｐ等）。一対の相互作用要素及び一対の非発光性要素が全て単一のアミノ酸鎖に存在するいくつかの実施形態において、リガンド、基質、補助因子、または付加的相互作用要素は、相互作用対が相互作用複合体を形成し、生物発光複合体の形成を促進するために必要である。
【００４６】
特定の実施形態において、相互作用要素及び非発光性要素は、付着、融合、連結、接続等される。典型的な実施形態において、第１の非発光性要素と第１の相互作用要素とを互いに付着させ、第２の非発光性要素と第２の相互作用要素とを互いに付着させる。シグナル要素と相互作用要素との付着は、任意の適切な機序、化学、リンカー等によって達成されてもよい。相互作用及び非発光性要素は、典型的には共有結合的接続によって付着されるが、２つの要素の非共有結合的な連結もまた提供される。いくつかの実施形態において、シグナル要素と相互作用要素とは直接接続され、他の実施形態において、それらはリンカーによって接続される。
【００４７】
相互作用要素がペプチドまたはポリペプチドであるいくつかの実施形態において、シグナル要素及び相互作用要素は、単一のアミノ酸鎖内に含有される。いくつかの実施形態において、単一のアミノ酸鎖は、非発光性要素及び相互作用要素を含むか、それらからなるか、または本質的にそれらからなる。いくつかの実施形態において、単一のアミノ酸鎖は、非発光性要素、相互作用要素、ならびに任意選択的に１つ以上のＮ末端配列、Ｃ末端配列、調節要素（例えば、プロモーター、翻訳開始部位等）、及びリンカー配列を含むか、それらからなるか、または本質的にそれらからなる。いくつかの実施形態において、シグナル要素及び相互作用要素は、融合ポリペプチド内に含有される。シグナル要素と相互作用要素（及び融合に含まれる任意の他のアミノ酸セグメント）とは別個に発現させてもよいが、他の実施形態において、相互作用配列及びシグナル配列の両方を含むかまたはそれらからなる融合タンパク質が発現される。
【００４８】
いくつかの実施形態において、第１の非発光性要素及び第１の相互作用要素を含む第１の融合タンパク質、ならびに第２の非発光性要素及び第２の相互作用要素を含む第２の融合タンパク質を、同じ細胞内で発現させる。そのような実施形態において、第１及び第２の融合タンパク質が細胞から精製及び／もしくは単離されるか、または融合タンパク質の相互作用が細胞内でアッセイされる。他の実施形態において、シグナル検出のために、第１及び第２の融合タンパク質を別個の細胞内で発現させ、組み合わせる（例えば、精製及び／もしくは単離の後、または細胞もしくは細胞の一部の融合の後、または１つの細胞から別の細胞に融合タンパク質を移動することにより、または１つ以上の融合タンパク質を細胞外培地に分泌することにより）。いくつかの実施形態において、１つ以上の融合タンパク質を、細胞ライセート（例えば、ウサギ網状赤血球ライセート）または無細胞系で発現させる。いくつかの実施形態において、１つ以上の融合タンパク質を、ウイルスまたは他の細胞の病原体のゲノムから発現させる。
【００４９】
特定の実施形態において、本発明のペプチド、ポリペプチド、融合ポリペプチド、融合タンパク質等をコードする核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ベクター等が提供される。そのような核酸及びベクターは、発現、形質転換、トランスフェクション、注入等に使用されてもよい。
【００５０】
いくつかの実施形態において、非発光性要素及び相互作用要素は、リンカーによって接続される。いくつかの実施形態において、リンカーは、シグナル要素と相互作用要素とを接続する一方で、該要素間に所望の量の空間／距離を提供する。いくつかの実施形態において、リンカーは、シグナル要素及び相互作用要素の両方が、それらのそれぞれの対（例えば、非発光性対及び相互作用対）を同時に形成することを可能にする。いくつかの実施形態において、リンカーは、非発光性対の相互作用の形成を促進する際に相互作用要素の補助となる。いくつかの実施形態において、相互作用対が形成されると、各非発光性要素をそれらのそれぞれの相互作用要素に接続するリンカーが、非発光性要素を適切な距離及び立体構造に位置付け、生物発光複合体を形成する。いくつかの実施形態において、相互作用要素及び非発光性要素は、リンカーによって近接して保持される（例えば、＜４モノマー単位）。いくつかの実施形態において、リンカーは、シグナル要素と相互作用要素との間に所望の量の距離を提供する（例えば、１、２、３、４、５、６…１０…２０、またはそれ以上のモノマー単位）（例えば、シグナル要素と相互作用要素との間の望ましくない相互作用を防止するため、立体的考察のため、相互作用複合体が形成された時に非発光性要素の適切な配向を可能にするため、相互作用複合体から非発光性要素への複合体形成の伝播を可能にするため等）。特定の実施形態において、リンカーは、シグナル要素と相互作用要素との間に適切な付着化学を提供する。リンカーはまた、シグナル要素及び相互作用要素を作製する合成プロセスを改善し得る（例えば、それらが単一の単位として合成されることを可能にする、２つの要素の合成後の接続を可能にする等）。
【００５１】
いくつかの実施形態において、リンカーは、非発光性要素を相互作用要素に連結する、接続する、または繋ぎ止めることができる任意の適切な化学部分である。いくつかの実施形態において、リンカーは、１つ以上の反復または非反復モノマー単位のポリマーである（例えば、核酸、アミノ酸、炭素含有ポリマー、炭素鎖等）。非発光性要素及び相互作用要素が融合タンパク質の一部である場合、リンカー（存在する場合）は、典型的にはアミノ酸鎖である。非発光性要素及び相互作用要素が、個々の要素の発現後に一緒に繋ぎ止められる場合、リンカーは、それぞれ、シグナル要素及び相互作用要素上の官能基と反応する官能（または反応）基をいずれかの末端に有する任意の化学部分を含んでもよい。シグナル要素と相互作用要素とを繋ぎ止めることができる任意の適切な部分が、リンカーとして使用され得る。
【００５２】
多種多様なリンカーが使用され得る。いくつかの実施形態において、リンカーは単一の共有結合である。いくつかの実施形態において、リンカーは、１〜２０個の非水素原子（例えば、Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｏ、及びＳ）を有する直鎖または分岐鎖、環状または複素環、飽和または不飽和の構造を含み、アルキル、エーテル、チオエーテル、イミン、カルボン酸、アミン、エステル、カルボキシアミド、スルホンアミド、ヒドラジド結合、及び芳香族または複素環式芳香族結合の任意の組み合わせからなる。いくつかの実施形態において、リンカーは、２０個の非水素原子より長い（例えば、２１個の非水素原子、２５個の非水素原子、３０個の非水素原子、４０個の非水素原子、５０個の非水素原子、１００個の非水素原子等）。いくつかの実施形態において、リンカーは、Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｏ、及びＳの群から選択される（水素原子に加えて）１〜５０個の非水素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の非水素原子）を含む。
【００５３】
本発明は、利用可能なリンカーの種類によって限定されない。シグナル要素と相互作用要素とは、直接連結されるか（例えば、単一の共有結合からなるリンカー）、または適切なリンカーを介して連結されるかのいずれかである。本発明は、いずれか特定のリンカー基に限定されない。様々なリンカー基が企図され、適切なリンカーは、限定されないが、アルキル基、メチレン炭素鎖、エーテル、ポリエーテル、アルキルアミドリンカー、ペプチドリンカー、修飾ペプチドリンカー、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）リンカー、ストレプトアビジン−ビオチンまたはアビジン−ビオチンリンカー、ポリアミノ酸（例えば、ポリリジン）、官能化ＰＥＧ、多糖類、グリコサミノグリカン、樹状ポリマー（ＷＯ９３／０６８６８及びＴｏｍａｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．のＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２９：１３８−１７５（１９９０）：参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、ＰＥＧ−キレート剤ポリマー（Ｗ９４／０８６２９、ＷＯ９４／０９０５６、及びＷＯ９６／２６７５４：参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、オリゴヌクレオチドリンカー、リン脂質誘導体、アルケニル鎖、アルキニル鎖、ジスルフィド、またはこれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、切断可能（例えば、酵素的に（例えば、ＴＥＶプロテアーゼ部位）、化学的、光誘導性等である。
【００５４】
いくつかの実施形態において、既存のルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、トゲオキヒオドシエビルシフェラーゼ、米国特許出願公開第２０１０／０２８１５５２号及び米国特許出願公開第２０１２／０１７４２４２号（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるような高感度トゲオキヒオドシエビルシフェラーゼ、）の任意の部分と１００％未満の配列同一性及び／または類似性を有する、実質的に非発光性のペプチド及びポリペプチドが提供される。本発明の特定の実施形態は、配列番号２１５７（例えば、完全なＮＡＮＯＬＵＣ配列）の全部または一部（例えば、ペプチドの場合、８個以上のアミノ酸、約２５個未満のアミノ酸）と１００％未満の配列同一性を有する非発光性ペプチド及びポリペプチドの生物発光複合体の形成に関与する。本発明の特定の実施形態は、配列番号２１５７（例えば、完全なＮＡＮＯＬＵＣ配列）の全部または一部（例えば、ペプチドの場合、８個以上のアミノ酸、約２５個未満のアミノ酸）と１００％未満ではあるが４０％超（例えば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）の配列同一性を有する非発光性ペプチド及びポリペプチドの生物発光複合体の形成に関与する。いくつかの実施形態において、配列番号２１５７の一部（例えば、ペプチドの場合、８個以上のアミノ酸、約２５個未満のアミノ酸）と１００％未満の配列類似性を有する非発光性ペプチド及びポリペプチド（例えば、相互作用して生物発光複合体を形成するペプチド及びポリペプチド）が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号２１５７の一部（例えば、ペプチドの場合、８個以上のアミノ酸、約２５個未満のアミノ酸）と１００％未満ではあるが４０％超（例えば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）の配列類似性を有する非発光性ペプチド及びポリペプチド（例えば、相互作用して生物発光複合体を形成するペプチド及びポリペプチド）が提供される。配列番号２１５７の約２５個のアミノ酸またはそれよりも小さい部分と１００％未満の配列同一性及び／または類似性を有する非発光性ペプチドが提供され、配列番号２１５７の別の部分と１００％未満ではあるが４０％超（例えば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）の配列同一性及び／または類似性を有するポリペプチドと（例えば、相互作用対によって安定化された）適切な条件下で組み合わせると、そのようなペプチドは生物発光複合体を形成する。配列番号２１５７の約２５個のアミノ酸またはそれよりも小さい部分と１００％未満の配列同一性及び／または類似性を有する非発光性ペプチドが提供され、配列番号２１５７の別の部分と１００％未満ではあるが４０％超（例えば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）の配列同一性及び／または類似性を有するポリペプチドと（例えば、相互作用対によって安定化された）適切な条件下で組み合わせると、そのようなペプチドは生物発光複合体を形成する。配列番号２１５７の約２５個のアミノ酸またはそれよりも小さい部分と１００％未満ではあるが４０％超（例えば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）の配列同一性及び／または類似性を有する非発光性ペプチドが提供され、配列番号２１５７の別の部分と１００％未満ではあるが４０％超（例えば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）の配列同一性及び／または類似性を有するポリペプチドと（例えば、相互作用対によって安定化された）適切な条件下で組み合わせると、そのようなペプチドは生物発光複合体を形成する。同様に、配列番号２１５７の一部と１００％未満ではあるが４０％超（例えば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）の配列同一性または類似性を有する非発光性ポリペプチドが提供され、配列番号２１５７の別の部分と１００％未満ではあるが任意選択的に４０％超（例えば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）の配列同一性及び／または類似性を有するペプチドと（例えば、相互作用対によって安定化された）適切な条件下で組み合わせると、そのようなポリペプチドは生物発光複合体を形成する。いくつかの実施形態において、配列番号２と１００未満の配列同一性または類似性を有する非発光性ペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、配列番号２と１００％未満ではあるが４０％超（例えば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）の配列同一性または類似性を有する非発光性ペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、配列番号４４０と１００未満の配列同一性または類似性を有する非発光性ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、配列番号４４０と１００％未満ではあるが４０％超（例えば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）の配列同一性または類似性を有する非発光性ポリペプチドが提供される。
【００５５】
いくつかの実施形態において、本発明の実施形態に使用される非発光性ペプチドは、ＧＶＴＧＷＲＬＣＫＲＩＳＡ（配列番号２３６）に対する１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本発明は、表１のアミノ酸配列、及び／または表１の核酸配列（表１のペプチド配列をコードする）を含む核酸のうちの１つ以上を含むペプチドを提供する。
表１．ペプチド配列
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【００５６】
特定の実施形態において、表１のペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＧＶＴＧＷＲＬＣＫＲＩＳＡ（配列番号２３６）及び／または表１に列挙されるペプチドのうちのいずれかとの単一のアミノ酸の相違を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＧＶＴＧＷＲＬＣＫＲＩＳＡ（配列番号２３６）及び／または表１に列挙されるペプチドのうちのいずれかとの２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）のアミノ酸の相違を含む。いくつかの実施形態において、配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５のアミノ酸配列のうちの１つを含むペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、１つ以上の付加、置換、及び／または欠失を含む、配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５のアミノ酸配列のうちの１つを含むペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはその一部は、配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５のアミノ酸配列のうちの１つ以上と７０％超の配列同一性（例えば、７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）を含む。いくつかの実施形態において、配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５の配列をコードする核酸のうちの１つを含む核酸が提供される。いくつかの実施形態において、１つ以上の付加、置換、及び／または欠失を含む、配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５の核酸配列のうちの１つを含む核酸が提供される。いくつかの実施形態において、核酸またはその一部は、配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５の核酸配列のうちの１つ以上と７０％超の配列同一性（例えば、７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）を含む。いくつかの実施形態において、配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５のアミノ酸配列のうちの１つをコードする核酸が提供される。いくつかの実施形態において、１つ以上の付加、置換、及び／または欠失を含む、配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５のアミノ酸配列のうちの１つをコードする核酸が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５のアミノ酸配列のうちの１つ以上と７０％超の配列同一性（例えば、７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）を有するアミノ酸をコードする核酸が提供される。
【００５７】
特定の実施形態において、表１の核酸が提供される。いくつかの実施形態において、表１のペプチドをコードする核酸が提供される。いくつかの実施形態において、本発明の核酸は、ＭＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡ（配列番号２）及び／または表１に列挙されるペプチドのうちのいずれかとの単一のアミノ酸の相違を含むペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、核酸は、ＭＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡ（配列番号２）及び／または表１に列挙されるペプチドのうちのいずれかとの２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）のアミノ酸の相違を含むペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、表１の核酸のうちの１つの配列を含む核酸が提供される。いくつかの実施形態において、１つ以上の付加、置換、及び／または欠失を含む、表１の核酸のうちの１つの配列を含む核酸が提供される。いくつかの実施形態において、核酸またはその一部は、表１の核酸のうちの１つ以上と７０％超の配列同一性（例えば、７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本発明の実施形態に使用される非発光性ポリペプチドは、配列番号４４０に対する１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本発明は、表２のアミノ酸配列、及び／または表２の核酸配列（表２のポリペプチド配列をコードする）を含む核酸のうちの１つ以上を含むポリペプチドを提供する
表２．ポリペプチド配列
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【００５９】
表２のポリペプチド及びコード核酸配列（配列番号４４１〜１２９８）は全て、Ｎ末端のＭｅｔ残基（アミノ酸）またはＡＴＧ開始コドン（核酸）を含有する。いくつかの実施形態において、表２のポリペプチド及びコード核酸配列は、Ｎ末端のＭｅｔ残基またはＡＴＧ開始コドン（配列番号１２９９〜２１５６）を含まずに提供される。
【００６０】
特定の実施形態において、配列番号４４１〜２１５６のアミノ酸ポリマーのうちの１つのポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号４４０との単一のアミノ酸の相違を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号４４０及び／または配列番号４４１〜２１５６のアミノ酸ポリマーのうちのいずれかとの２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０…３５…４０…４５…５０、またはそれ以上）のアミノ酸の相違を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の付加、置換、及び／または欠失を含む、配列番号４４１〜２１５６のアミノ酸ポリマーのうちの１つ配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドまたはその一部は、配列番号４４１〜２１５６のアミノ酸ポリマーのうちの１つ以上と７０％超の配列同一性（例えば、＞７１％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９１％、＞９２％、＞９３％、＞９４％、＞９５％、＞９６％、＞９７％、＞９８％、または＞９９％）を含む。
【００６１】
特定の実施形態において、表２の核酸が提供される。いくつかの実施形態において、表２のポリペプチドをコードする核酸が提供される。いくつかの実施形態において、本発明の核酸は、配列番号４４０及び／または配列番号４４１〜２１５６のアミノ酸ポリマーのうちのいずれかとの単一のアミノ酸の相違を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号４４０及び／または表２に列挙されるポリペプチドのうちのいずれかとの２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０…３５…４０…４５…５０、またはそれ以上）のアミノ酸の相違を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、配列番号４４１〜２１５６の核酸ポリマーのうちの１つの配列を含む核酸が提供される。いくつかの実施形態において、１つ以上の付加、置換、及び／または欠失を含む、配列番号４４１〜２１５６の核酸ポリマーのうちの１つの配列を含む核酸が提供される。いくつかの実施形態において、核酸またはその一部は、配列番号４４１〜２１５６の核酸ポリマーのうちの１つ以上と７０％超の配列同一性（例えば、＞７１％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９１％、＞９２％、＞９３％、＞９４％、＞９５％、＞９６％、＞９７％、＞９８％、または＞９９％）を含む。いくつかの実施形態において、核酸またはその一部は、配列番号４４１〜２１５６のアミノ酸ポリマーのうちの１つ以上と７０％超の配列同一性（例えば、＞７１％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９１％、＞９２％、＞９３％、＞９４％、＞９５％、＞９６％、＞９７％、＞９８％、または＞９９％）を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、配列番号４４１〜２１５６のポリペプチドのうちの１つをコードする核酸が提供される。いくつかの実施形態において、１つ以上の付加、置換、及び／または欠失を含む、配列番号４４１〜２１５６のポリペプチドのうちの１つをコードする核酸が提供される。
【００６２】
いくつかの実施形態において、非発光性ペプチドもしくはポリペプチド及び／または相互作用要素は、合成ペプチド、１つ以上の非天然アミノ酸を含有するペプチド、ペプチド模倣体、コンジュゲート合成ペプチド（例えば、官能基（例えば、フルオロフォア、発光基質等）にコンジュゲートされる）を含む。
【００６３】
本発明は、基礎研究、医学研究、分子診断学等を含む様々な分野で有用な組成物及び方法を提供する。本明細書に記載の試薬及びアッセイは、いずれか特定の用途に限定されるものではなく、いずれの有用な用途も本発明の範囲内であると見なされるべきであり、以下は、本明細書において請求される発明を利用した例示的なアッセイ、キット、分野、実験設定等である。
【００６４】
本発明の実施形態を利用する典型的な用途は、タンパク質の二量体形成（例えば、ヘテロ二量体、ホモ二量体）、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＲＮＡ相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用、核酸ハイブリダイゼーション、タンパク質−小分子相互作用、または分子実体のいずれか他の組み合わせの監視／検出に関与する。対象となる第１の実体は、非発光性対の第１のメンバーに付着され、対象となる第２の実体は、非発光性対の第２のメンバーに付着される。検出可能なシグナルが特定のアッセイ条件下で生成される場合、第１及び第２の実体の相互作用が推測される。そのようなアッセイは、任意の適切な条件下（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、動物全身等）で分子相互作用を監視するのに有用であり、例えば、創薬、分子経路の解明、複合体集合の態様における平衡または動態の研究、ハイスループットスクリーニング、近接センサー等に使用される。
【００６５】
いくつかの実施形態において、既知の特徴（例えば、スペクトル特性、対の相互親和性）を有する非発光性対が、対象となる相互作用対の親和性を解明するためまたは相互作用を理解するために使用される。他の実施形態において、非発光性対の特徴（例えば、スペクトル特性、対の相互親和性）を決定するために、十分に特徴付けられた相互作用対が使用される。
【００６６】
本明細書に記載の実施形態は、薬剤スクリーニング及び／または薬剤開発に使用され得る。例えば、対象となる標的タンパク質（例えば、治療タンパク質）と小分子薬または小分子ライブラリ全体との相互作用は、１つ以上の適切な条件（例えば、生理的条件、疾患条件等）下で監視される。他の実施形態において、２つの実体（例えば、受容体及びリガンド、タンパク質−タンパク質等）間の相互作用を増強または阻害する小分子薬または小分子ライブラリ全体の能力がアッセイされる。いくつかの実施形態において、何万もの異なる分子の標的への結合の検出を可能にするか、またはそれらの分子が他の実体の結合に及ぼす影響を調べるために、薬剤スクリーニング用途がハイスループット形式で実行される。
【００６７】
いくつかの実施形態において、本発明は、生体（例えば、細菌、酵母、真核生物、哺乳動物、霊長類、ヒト等）及び／または細胞内の分子相互作用の検出を提供する。いくつかの実施形態において、シグナル及び相互作用（標的）ポリペプチドを含む融合タンパク質を細胞または全生物において同時発現させ、シグナルを検出して相互作用複合体の形成と相関させる。いくつかの実施形態において、細胞を一過性に及び／もしくは安定に形質転換するか、または非発光性要素（複数可）、相互作用要素（複数可）、融合タンパク質（例えば、シグナル要素及び相互作用要素を含む）等をコードするベクター（複数可）でトランスフェクトする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のアッセイを実行するために必要な融合タンパク質をコードするトランスジェニック生物が作製される。他の実施形態において、全生物にベクターが注入される。いくつかの実施形態において、トランスジェニック動物または細胞（例えば、融合タンパク質を発現する）は、それが濃縮する細胞内区画及び／または組織内で複合体を形成する、ＮＬペプチド配列に繋ぎ止められた（例えば、コンジュゲートまたは遺伝的に融合された）小分子または生物製剤の体内分布を監視するために使用される。
【００６８】
いくつかの実施形態において、発光複合体のペプチド（例えば、非発光性ペプチド）部分が、（例えば、細胞内で）タンパク質タグとして用いられる。そのような実施形態において、発光複合体のポリペプチド（例えば、非発光性ポリペプチド）部分（例えば、非発光性ペプチドと発光複合体を形成することができる）は、非発光性ペプチドでタグ付けされたタンパク質の存在を検出／定量するために、（例えば、試薬の一部として）細胞に適用される。例えば、対象となるタンパク質は、高親和性ＮＬｐｅｐ（例えば、ＮＬｐｅｐ８６）に融合される。次いで、ＮＬｐｅｐを対象となる細胞にトランスフェクトし、次いで、ＮａｎｏＧｌｏ＋ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓを含有する試薬を細胞＋培地に加え、発光を検出する。このアッセイスキームは、図１７５に示される。いくつかの実施形態において、小さいサイズのペプチドがタンパク質のタグ付けに使用される。いくつかの実施形態において、そのような系において使用される非発光性ポリペプチドは、（例えば、フリマジン基質の存在下で）適切な緩衝液中に長時間存在するのに十分に安定である。特定の実施形態において、非発光性ポリペプチドは、（例えば、たとえフリマジン基質の存在下であっても）相補性ペプチドの非存在下では最小限の検出可能な発光を有するのみである。いくつかの実施形態において、タンパク質のタグ付けに必要な基準を満たすように最適化された緩衝液条件が用いられる。高親和性の自然発生ポリペプチド及びペプチドは、そのような系において有用であり、例えば、イムノアッセイ、ウイルス粒子の検出、生細胞におけるタンパク質動態の研究等において有用性を有する。いくつかの実施形態において、そのような系は、極度に小さいタンパク質タグ（例えば、１１アミノ酸）を提供し、高感度検出、安定性（例えば、特に変性条件下で）、及び／または広いダイナミックレンジを提供する。
【００６９】
本明細書に提供される組成物及び方法、ならびにそれらに基づく任意の技法または技術は、様々な用途及び分野において使用される：例示的な用途の非限定的なリストを以下に記す：
・抗体を使用しないウェスタンブロット：例えば、対象となるタンパク質を（例えば、遺伝子操作によって）非発光性ペプチドに融合し、任意の適切な手段によって発現させる。タンパク質を（例えば、ＰＡＧＥによって）分離し、膜に移す。次いで、相補性の非発光性ポリペプチドで膜を洗浄し（例えば、発光複合体を形成させる）、膜の上にフリマジン（ＰＢＩ−３９３９）を載せた状態でイメージャー（例えば、ＣＣＤカメラを用いる）上に配置し、対象となるタンパク質を（例えば、発光複合体の発光によって）検出する。
・「ＬｕｃＣｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」：例えば、対象となるタンパク質を、非発光性ペプチドまたはポリペプチドに融合して発現させ、次いで、免疫細胞化学に類似する様式で相補性の非発光性ポリペプチドまたはペプチドを用いて検出する。
・タンパク質局在化アッセイ：例えば、非発光性ポリペプチドまたはポリペプチドに（例えば、遺伝子操作によって）局在化シグナルを付加し、細胞内で発現させる（例えば、付加した核局在化シグナルが、核における非発光性ポリペプチドの発現をもたらす）。相補性の非発光性ペプチドまたはポリペプチドを（例えば、遺伝子操作によって）対象となるタンパク質に融合し、非発光性ポリペプチドまたはペプチドを含む細胞内で発現させる。対象となるタンパク質が、シグナルが局在する非発光性ポリペプチドと同じ細胞内区画（例えば、核）に局在する場合、発光が生成される。
・タンパク質安定性アッセイ：例えば、対象となるタンパク質を（例えば、遺伝子操作によって）非発光性ペプチドまたはポリペプチドに融合し、１つ以上の対象となる条件下でインキュベートする。相補性の非発光性ポリペプチドまたはペプチドを（例えば、種々の時点で）付加し、発光を用いて対象となるタンパク質の量を定量する（例えば、安定性の代わり）。
・タンパク質の検出／定量：例えば、対象となるタンパク質を（例えば、遺伝子操作によって）非発光性ペプチドまたはポリペプチドに融合し、任意の方法によって発現させる及び／または操作する。次いで、相補性の非発光性ポリペプチドまたはペプチドを付加し、対象となるタンパク質を検出及び／または定量する。
・タンパク質の精製：例えば、対象となるタンパク質を（例えば、遺伝子操作によって）非発光性ペプチドまたはポリペプチドに融合し、任意の方法によって発現させる。タンパク質の混合物を（例えば、ビーズ上、カラム上、チップ上等に）固定化した相補性の非発光性ポリペプチドまたはペプチドに通過させ、適切な緩衝液で洗浄し、（例えば、高いイオン強度または低いｐＨの緩衝液で）溶出する。相補性の非発光性ペプチドまたはポリペプチドの発光を活性化しない非発光性ペプチドまたはポリペプチドの変異形態を、対象となるタンパク質を溶出するために使用することができる。
・プルダウン：例えば、固定化した相補性の非発光性ポリペプチドを用いて、（例えば、遺伝子操作によって）非発光性ペプチドに融合された対象となるタンパク質（及び相互作用するタンパク質）を単離する
・Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）内部移行アッセイ：例えば、非発光性ペプチドまたはポリペプチドを（例えば、遺伝子操作によって）対象となるＧＰＣＲに融合し、細胞の表面上で発現させる。相補性の非発光性ポリペプチドまたはペプチドを細胞の培地に付加し、細胞表面上のＧＰＣＲを検出するために使用する。ＧＰＣＲの内部移行を刺激するためにリガンドを付加すると発光の減少が観察される。
・細胞生存率に関する膜完全性アッセイ：例えば、非発光性ポリペプチドを発現する細胞の細胞膜が損なわれると、非発光性ペプチドが膜に進入し（例えば、さもなければ細胞膜を通過できないペプチド）、それによって発光複合体を形成し、発光を生じる。
・５−ヒドロキシメチルシトシンの検出：例えば、システインを非発光性ペプチドに付加し、ＤＮＡ及びメチルトランスフェラーゼとともにインキュベートする。メチルトランスフェラーゼは、５−ヒドロキシメチル化されたシトシン残基のみへのチオール（システイン）の付加を触媒する。次いで、取り込まれなかったペプチドをＤＮＡから分離し（可能性のある任意の方法を使用）、非発光性ポリペプチドを付加し、ＤＮＡにコンジュゲートしたペプチドを検出する。
・ホルミルシトシンの検出：例えば、上記５−ヒドロキシメチルシトシンの検出と同様に、この検出方法は、ホルミルシトシンに対して特異的な反応性を示す化学を使用する。
・ウイルスの取り込み：非発光性ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸をウイルスゲノムに取り込み、相補性の非発光性ポリペプチドまたはペプチドを標的細胞において構成的に発現させる。標的細胞が感染し、非発光性ペプチドが発現すると、生物発光複合体が形成し、（例えば、基質の存在下で）シグナルが検出される。
・タンパク質の化学標識：非発光性ペプチドを反応基（例えば、ビオチン、サクシニミジルエステル、マレイミド等）に融合するかまたは繋ぎ止める。対象となるタンパク質（例えば、抗体）への反応基の結合によって、対象となるタンパク質に非発光性ペプチドでタグ付けする。ペプチドは小さいため、対象となるタンパク質の機能性に影響を与えない。相補性の非発光性ポリペプチドを系に付加し、ポリペプチドがペプチドに結合すると発光複合体が生成される。
・プロテアーゼアッセイ：例えば、対象となるプロテアーゼによって認識されるペプチド配列を、ＮＬＰｏｌｙに曝露された時に生物発光を回避する様式でＮＬＰｅｐに結合させることができる。これを行うための方法は、プロテアーゼ認識配列に消光剤を付加すること、または相補性が妨げられるようにプロテアーゼ認識部位をＮＬＰｅｐに結合することを含む。プロテアーゼが認識部位を切断するように活性されると、ＮＬＰｅｐを相補して発光を放出するＮＬＰｏｌｙの能力が回復するため、この系は、高感度プロテアーゼアッセイである。
・ＲＮＡの検出
・生体分子リンカーの特徴付け：例えば、抗体等の生体分子に付着したリンカーは、対象となるリンカーを介してＮＬＰｅｐを該分子に付着させることによって、一連の条件下でその安定性について評価することができる。経時的に、ＮＬＰｏｌｙ及びフリマジンの付加、ならびに発生した生物発光の定量により、リンカーの分解による遊離ＮＬＰｅｐの生成を監視することができる。
・突然変異アッセイ：例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで導入した点突然変異、フレームシフト突然変異等は、相補性対からのシグナルのゲインまたはシグナルのロスをもたらす。このようなアッセイは、例えば、変異原性について化合物を試験するために使用することができる。
・ペプチド阻害剤の標的結合：ペプチド系阻害剤の標的結合を監視するための低親和性ＮＬｐｅｐコンジュゲートペプチド（細胞内で発現させた）の使用。ＮＬｐｏｌｙを対象となる標的に繋ぎ止める。結合によって、発光複合体からのシグナルの低下がもたらされる。
・シグナル獲得型プロテアーゼバイオセンサー：ＮＬｐｏｌｙと暗ペプチドＮＬｐｅｐ（低親和性）との間でプロテアーゼ切断部位を発現させる。切断によって暗ペプチドが放出され、高親和性ＮＬｐｅｐがＮＬｐｏｌｙを相補することができる。
・機能獲得型プロテアーゼアッセイ：プロテアーゼ（例えば、カスパーゼ、ＡＤＡＭ等）の全長基質の切断部位近位でＮＬｐｅｐの配列を遺伝子操作する。基質がインタクトなままであり、ペプチドが「埋没」されている限り、ペプチドは立体的に隔絶された状態に留まる。遺伝子操作したプロテアーゼ基質及びＮＬｐｏｌｙ（例えば、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ）の両方を、標的細胞株に同時トランスフェクトする。プロテアーゼ活性を誘導するとルシフェラーゼ活性が誘導され、基質の切断及び断片の一方のＮまたはＣ末端上におけるアクチベータペプチドの曝露を引き起こす。この原則は、立体構造変化及び／またはタンパク質の修飾を検出するために拡張される。
・組換え細胞内抗体を使用した細胞内分析物の定量：抗体断片をＮＬｐｏｌｙまたはＮＬｐｅｐの融合体として細胞内で発現させる。相補性サブユニットを対象となる分析物に遺伝的に融合する。分析物が存在する場合、抗体が結合し、発光複合体が形成される。この用途は、細胞内抗体がリン酸化された（またはさもなければ、修飾特異的Ａｂによって結合された）場合に分析物に結合する、細胞内ＰＴＭ（例えば、リン酸化）バイオセンサーに拡張される。
本発明の組成物及び方法の上記用途は、限定的ではなく、なおも本発明の範囲内でありながら任意の適切な様式で変更され得る。
【００７０】
本発明はまた、非発光性対／群及びそれから形成する生物発光複合体の設計及び／または最適化のための方法も提供する。本明細書に記載の実施形態と一致する非発光性対／基、及び／またはそのパネルの設計のための任意の適切な方法が、本発明の範囲内である。
【００７１】
特定の実施形態において、非発光性対／基は、個別には発光を欠き、会合すると発光を示すように新規に設計される。そのような実施形態において、非発光性要素間の相互作用の強度は、生物発光複合体の形成を促進するために相互作用要素の非存在下で生物発光シグナルを生成するには不十分である。
【００７２】
他の実施形態において、非発光性要素及び／または非発光性対は、例えば、生物発光タンパク質（例えば、配列番号２１５７）を開始点として用いて、合理的に設計される。例えば、そのような方法は、（ａ）３つ以上の関連するタンパク質の配列を整列させることと、（ｂ）関連するタンパク質のコンセンサス配列を決定することと、（ｃ）コンセンサス配列が決定されたタンパク質に関連する生物発光タンパク質の第１及び第２の断片を提供することであって、断片は、個別には実質的に非発光性であるが、断片が相互作用すると発光を示す、提供することと、（ｄ）第１及び第２の断片を各々１ヶ所以上の位置で（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ等）突然変異させることであって、前記突然変異は、断片の配列をコンセンサス配列の対応する部分により類似するように変更し、突然変異は、既存のタンパク質の断片ではない非発光性対を生じさせる、突然変異させることと、（ｅ）会合していない場合の発光の非存在、及び非発光性対が会合した場合の発光について非発光性対を試験することと、を含んでもよい。他の実施形態において、コンセンサス配列を決定する際に使用されるタンパク質のうちの１つの第１及び第２の断片が、提供され、突然変異され、及び試験される。
【００７３】
いくつかの実施形態において、発光性対のペプチドは、「暗ペプチド」、すなわち、その補体（例えば、ＮＬｐｏｌｙ）（例えば、低いまたは高い親和性を有する）に結合するが、最小限の発光を生成するかまたは全く発光を生成しないペプチドである（図１８０〜１８２を参照）。いくつかの実施形態において、高親和性暗ペプチドは、逆相補、または阻害剤を測定するためのシグナル獲得型アッセイに使用される。いくつかの実施形態において、低親和性暗ペプチドは、高親和性ペプチドタグ（例えば、ＮＬｐｅｐ８６）の検出用試薬中のＮＬｐｏｌｙ１１Ｓのバックグラウンドを低下させるために使用される。例示的な暗ペプチドを図１８０に提供する。
【００７４】
いくつかの実施形態において、発光性対のペプチドは、「消光ペプチド」、すなわち、消光剤部分（例えば、ＤＡＢ）を含有するペプチドであり、消光剤がＮＬｐｏｌｙ単独（例えば、相補性ＮＬｐｅｐとは関係なく生成されるシグナル）及びＮＬｐｏｌｙ−ＮＬｐｅｐ複合体（例えば、複合体形成の結果として生成されるシグナル）の両方によって生成される光／エネルギーを吸収する。例示的な暗色消光ペプチドは、適切な吸収スペクトルを有し、ＤＡＢ−１６１（ＤＡＢ−ＧＷＲＬＦＫＫ）、ＤＡＢ−１６２（ＤＡＢ−ＧＷＡＬＦＫＫ）、ＤＡＢ−１６３（ＤＡＢ−ＶＴＧＷＡＬＦＥＥＩＬ）、ＤＡＢ−１６４（ＤＡＢ−ＶＴＧＹＡＬＦＱＥＩＬ）、ＤＡＢ−１６５（ＤＡＢ−ＶＴＧＹＡＬＦＥＱＩＬ）、及びＤＡＢ−１６６（ＤＡＢ−ＶＴＧＹＡＬＦＥＥＩＬ）を含み、ＤＡＢ＝ダブシル（４７５ｎｍ消光剤）＋ｄＰＥＧ４スペーサーである。
【００７５】
いくつかの実施形態において、上記方法は、設計及び／または非発光性対の最適化に限定されない。個別では所与の機能性（例えば、酵素活性）を欠くが、会合するとそのような機能性を示す要素の対を生成するために同じステップが行われる。そのようないずれの場合においても、非発光性対要素間の相互作用の強度は、突然変異によって、生物発光複合体の形成を促進する相互作用要素の非存在下で機能性をもたらすには不十分であることを確実にするように変更することができる。
【実施例】
【００７６】
実験
実施例１
ペプチドの作製
ペプチド構築物を３つの方法のうちの１つによって作製した：５’リン酸化オリゴヌクレオチドのアニーリングの後にｐＦ４Ａｇ−Ｂａｒｎａｓｅ−ＨＡＬＯＴＡＧベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＳｇｆＩ及びＸｈｏＩで切断）もしくはｐＦＮ１８Ａ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＳｇｆＩ及びＸｂａＩで切断）へのライゲーション、ＡｇｉｌｅｎｔのＱｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉキットを使用した部位特異的変異誘発、またはＧｅｎｅ  Ｄｙｎａｍｉｃｓへのクローニングの外部委託。
【００７７】
実施例２
ペプチドの調製
ペプチドをコードするプラスミドで形質転換したＫＲＸE大腸菌細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の単一コロニーを２〜５ｍｌのＬＢ培養液に接種することにより、実施例１で作製したペプチドを分析のために調製し、３７℃で一晩増殖させた。次いで、一晩培養液（１０ｍｌ）を１ＬのＬＢ中に希釈し、３７℃で３時間増殖させた。次いで、１Ｌの培養液に１０ｍｌの２０％ラムノースを加えることによって培養液を誘導し、２５℃で１８時間誘導した。
【００７８】
誘導後、８００ｍｌの各培養液を４℃で３０分間、５０００ｘｇで回転させた。次いで、得られたペレットを、８０ｍｌのペプチド溶解緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、１ｍｌ／ｍｌリゾチーム、及び０．０３Ｕ／μｌのＲＱ１ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））中に再懸濁し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、溶解した細胞をドライアイス上で１５分間凍結させ、次いで室温浴で１５分間融解した。次いで、細胞を４℃で３０分間、３５００ｘｇで回転させた。上清を１０ｍｌの試料中にアリコートし、５０μｌの１アリコートを１．５ｍｌ試験管に入れた。
【００７９】
５０μｌの試料に、４５０μｌのＨ2Ｏ及び１６７μｌの４×ＳＤＳ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｄｙｅを加え、試料を９５℃で５分間インキュベートした。加熱後、５μｌの各試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに（３系列）負荷し、製造者のプロトコルに従ってゲルを泳動し、染色した。次いで、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｓｃａｎｎｅｒ（励起５３２ｎｍ、放出５８０ｎｍ、ＰＭＴ感度４００Ｖ）上でゲルを走査した。得られたバンドは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（５．２）ソフトウェアを使用して定量した。３つの反復実験強度の各々を平均化し、ＮＬｐｅｐ５３−ＨＴの平均強度を１２×濃度として定義した。他の全てのペプチドの濃度をＰｅｐ５３−ＨＴと比較した。
【００８０】
実施例３
ペプチドの分析
実施例１〜２で作製した全てのペプチドは、ペプチド配列：ＧＶＴＧＷＲＬＣＫＲＩＳＡ（配列番号２３６）に対する単一の突然変異を含有していた。全てのペプチドをＨＡＬＯＴＡＧタンパク質（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に融合した。「ＨＴ−ＮＬｐｅｐ」として特定されるペプチドは、ペプチドがＨＡＬＯＴＡＧタンパク質のＣ末端に位置することを示す。この場合、ペプチドをコードする遺伝子は、終止コドンを含むが、翻訳を開始するためのメチオニンは含まない。「ＮＬｐｅｐ−ＨＴ」として特定されるペプチドは、ペプチドがＨＡＬＯＴＡＧタンパク質のＮ末端に位置することを示す。この場合、ペプチドは、翻訳を開始するためのメチオニンを含むが、終止コドンは含まない。
【００８１】
ペプチドが発光を活性化する能力を決定するために、ＫＲＸ大腸菌細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の個々のコロニーを実施例１からのペプチドをコードするプラスミドで形質転換し、２００μｌの最少培地（１×Ｍ９塩、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ2、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１ｍＭチアミンＨＣｌ、１％ゼラチン、０．２％グリセロール、及び１００μｌ／ｍｌアンピシリン）に接種し、３７℃で一晩増殖させた。ペプチドに加えて、ＮａｎｏＬｕｃの残基１〜１５６の野生型（ＷＴ）断片を発現するＫＲＸ大腸菌細胞の培養液を増殖させた。全てのペプチド及びＷＴ断片を、少なくとも３つの別個の培養液に接種した。
【００８２】
１回目に一晩増殖させた後、１０μｌの培養液を１９０μｌの新しい最少培地中に希釈し、再び３７℃で一晩増殖させた。
【００８３】
２回目に一晩増殖させた後、１０μｌの培養液を１９０μｌの自己誘導培地（最少培地＋５％グルコース及び２％ラムノース）中に希釈した。次いで、培養液を２５℃で約１８時間誘導した。
【００８４】
誘導後、小さいペプチド変異体の培養液を活性についてアッセイした。ＷＴ  １−１５６断片を含有する培養液をプールし、１０ｍｌの２×Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．３×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ、及び１ｍｇ／ｍｌリゾチーム）と混合し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、３０μｌの溶解ＷＴ  １−１５６培養液を白色の丸底９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３３５５）のウェルにアリコートした。アッセイプレートのウェルに、２０μｌのペプチド培養液を加え、プレートを室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、５０μｌのＮＡＮＯＧＬＯ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加え、試料を室温で１０分間インキュベートした。ＧＬＯＭＡＸルミノメーター上で０．５秒の積分で発光を測定した。
【００８５】
結果（表３及び図１を参照）は、野生型非発光性ポリペプチドによる相補後に発光を変化させた（例えば、増加させた、減少させた）ペプチドにおける種々の突然変異（配列番号１と比較して）を示している。発光の増加は、非発光性ペプチドと非発光性ポリペプチドとの親和性、ペプチドの発現、細胞内溶解性、細胞内安定性、及び生物発光活性の５つの主要要因のうちの１つ（または組み合わせ）から生じると考えられ、これらのいずれも有益である。しかしながら、本発明は、いずれか特定の作用機序に限定されるものではなく、本発明を実施するために作用機序を理解することは必要ではない。
表３
2020097597.tif 000048
2020097597.tif 000049
【００８６】
実施例４
非発光性ポリペプチドの作製
ｐＦ４Ａｇ−ＮａｎｏＬｕｃ１−１５６（ＷＴ  １−１５６）を鋳型として用いて、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  のＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用してエラープローンＰＣＲ（ｅｐＰＣＲ）を行った。得られたＰＣＲ産物をＳｇｆＩ及びＸｂａＩで消化し、Ｔ７及びＣＭＶプロモーターを含有する市販のｐＦ４Ａベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の形態であるｐＦ４Ａｇ−Ｂａｒｎａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にライゲートし、大腸菌リボソーム−結合部位を含有するように修飾した。４２℃の熱ショックによりＫＲＸ大腸菌細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中に形質転換した後、個々のコロニーを用いて透明な平底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３３７０）に２００μｌの培養液を接種した。
【００８７】
実施例５
非発光性ポリペプチドの分析
実施例４で作製した非発光性ポリペプチド変異体の発光を決定するために、実施例４からの非発光性ポリペプチド変異体のうちの１つを含有するプラスミドで形質転換したＫＲＸ大腸菌細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の個々のコロニーを、実施例３で用いた手順に従って増殖させた。細菌培養液も実施例３で用いた手順に従って誘導した。
【００８８】
各非発光性ポリペプチド変異体誘導培養液をアッセイするために、３０μｌのアッセイ溶解緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．３×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））、０．００６Ｕ／μｌのＲＱ１  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、及びペプチド断片ＧＶＴＧＷＲＬＣＫＲＩＳＡ（配列番号１８）またはＧＶＴＧＷＲＬＦＫＲＩＳＡ（配列番号１０６）のいずれかを含有する１×ペプチド溶液（ペプチドの相対濃度は、実施例２で説明したように決定し、決定された相対濃度から、ペプチドを溶解緩衝液中１×に希釈した）を９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３３５５）のウェルにアリコートした。アッセイプレートのウェルに、誘導した非発光性ポリペプチド変異体培養液２０μｌを加え、プレートを室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、５０μｌのＮＡＮＯＧＬＯ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加え、試料を室温で１０分間インキュベートした。ＧＬＯＭＡＸルミノメーター上で０．５秒の積分で発光を測定した。
【００８９】
結果（表４及び図２）は、２つの異なるペプチドで相補されると非発光性ポリペプチドの発光を改善する多数の点突然変異を示している。ペプチドにおける突然変異と同様に、非発光性ポリペプチドにおけるこれらの突然変異は、種々の要因から生じると考えられ、それらは皆、全体として系にとって有益である。
表４
2020097597.tif 000050
*表４中の単位はＲＬＵ（突然変異）／ＲＬＵ（ＷＴ）である。
【００９０】
実施例６
非発光性ポリペプチドにおけるグリシンからアラニンへの置換
以下の実施例では、改善された（例えば、より大きな発光シグナルの）非発光性ポリペプチドを提供するためにアラニンに置換することができる非発光性ポリペプチド中のグリシン残基を同定した。置換は、単独で（図３を参照）、または複合的に（図２）行われた。グリシンからアラニンへの置換を含有する非発光性ポリペプチドを、実施例１に記載されるように生成した。
【００９１】
各単一の変異体コロニーを、２００μｌの最少培地（１×Ｍ９塩、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ2、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１ｍＭチアミンＨＣｌ、１％ゼラチン、０．２％グリセロール、及び１×アンピシリン）に接種し、３７℃で２０時間振盪しながらインキュベートした。次いで、１０μｌの培養液を１９０μｌの新しい最少培地に加え、再び３７℃で２０時間振盪しながらインキュベートした。次いで、１０μｌの第２の培養液を１９０μｌの自己誘導培地（最少培地＋５％グルコース＋２％ラムノース）に加え、２５℃で１８時間振盪しながらインキュベートし、非発光性ポリペプチドを発現させた。
【００９２】
各変異体培養液をアッセイするために、３０μｌのアッセイ溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、０．３×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））、及び非発光性ペプチド（ＮＬｐｅｐ９−ＨＴの１：１０希釈液（ＮＬｐｅｐ９は配列番号１７及び１８；ＨＴはＨａｌｏＴａｇ大腸菌清澄化ライセート）を含有する０．００６Ｕ／μｌのＲＱ１  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を加えた。試料を室温で１０分間振盪し、次いで、５０μｌのＮＡＮＯＧＬＯ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加えた。試料を室温で１０分間インキュベートし、ＧＬＯＭＡＸルミノメーター上で０．５秒の積分で発光を測定した。
【００９３】
ＮＬｐｅｐ９−ＨＴ大腸菌清澄化ライセートを作製するために、５ｍｌのＬＢにＮＬｐｅｐ９−ＨＴの単一大腸菌コロニーを接種し、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、５００μｌの一晩培養液を５０ｍｌのＬＢ中に希釈し、３７℃で３時間インキュベートした。５００μｌの２０％ラムノースを加え、２５℃で１８時間インキュベートした。発現培養液を３０００ｘｇで３０分間遠心分離し、細胞ペレットを５ｍｌのペプチド溶解緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．１×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、及び０．３Ｕ／μｌのＲＱ１  ＤＮａｓｅ）中に再懸濁し、室温で１０分間インキュベートした。溶解した試料をドライアイス上に１５分間静置し、室温の水浴で融解し、３５００ｘｇで３０分間遠心分離した。上清は清澄化ライセートであった。
【００９４】
図３及び４は、突然変異が発光に及ぼす影響を示す。
【００９５】
実施例７
非発光性ペプチドの突然変異
以下の実施例では、他の脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）に対するアライメントに基づいて非発光性ペプチド中に突然変異を作製し、活性を保持する／向上させる突然変異を同定する（ＮＬｐｅｐ２、４、及び５等）、または突然変異がその位置で許容される可能性が低いことを立証する（ＮＬｐｅｐ３等）高い確率（ＦＡＢＰにおける頻度）に基づいて選択した。ＮＬｐｅｐ１〜５は、単一の突然変異を含有し（表１を参照）、ＮＬｐｅｐ６〜９は、ＮＬｐｅｐ２、４、及び５における突然変異の複合セットである（表１を参照）。実施例１に記載されるように変異体を作製した。
【００９６】
各変異体コロニーを２００μｌの最少培地に接種し、３７℃で２０時間振盪しながらインキュベートした。次いで、１０μｌの培養液を１９０μｌの新しい最少培地に加え、再び３７℃で２０時間振盪しながらインキュベートした。次いで、１０μｌの第２の培養液を１９０μｌの自己誘導培地に加え、２５℃で１８時間振盪しながらインキュベートし、非発光性ペプチド変異体を発現させた。
【００９７】
各変異体培養液をアッセイするために、３０μｌのアッセイ溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、０．３×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））、及び非発光性ポリペプチド（１：１０希釈の野生型非発光性ポリペプチド大腸菌清澄化ライセート）を含有する０．００６Ｕ／μｌのＲＱ１  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を加えた。試料を室温で１０分間振盪し、次いで、５０μｌのＮＡＮＯＧＬＯ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加えた。試料を室温で１０分間インキュベートし、ＧＬＯＭＡＸルミノメーター上で０．５秒の積分で発光を測定した。図１は、各非発光性ペプチド変異体において検出された発光（ＲＬＵ）を示す。この結果は、発光を大幅に損失することなく突然変異に耐えることができる種々の位置、及び発光を改善する数個の特異的な突然変異を示している。
【００９８】
実施例８
融合タグの配向が発光に及ぼす影響
以下の例では、Ｎ末端またはＣ末端ＨａｌｏＴａｇタンパク質を有する非発光性ペプチドによって生成される発光を比較した。
【００９９】
各ペプチド−ＨＴ融合体の単一コロニーを、実施例７で用いた手順に従って増殖させた。細菌培養液も実施例７で用いた手順に従って誘導した。実施例７で用いた手順に従って発光をアッセイし、検出した。図６及び７は、各ペプチド−ＨＴ融合体において検出された発光（ＲＬＵ）を示す。この結果は、ＮＬｐｅｐ１と同様の発光を生成する突然変異の組み合わせを示している。
【０１００】
実施例９
複数の凍結融解サイクルが非発光性ペプチドに及ぼす影響
１ｍｌのＮＬｐｅｐ９−ＨＴをドライアイス上で５分間凍結させ、次いで室温の水浴で５分間融解した。次いで、アッセイのために６０μｌを除去した。次いで、凍結融解手順をさらに１０回繰り返した。各凍結融解サイクルの後、アッセイのために６０μｌを除去した。
【０１０１】
アッセイするために、２０μｌの各凍結融解試料を３０μｌの配列番号２と混合し、室温で１０分間インキュベートした。５０μｌのＮＡＮＯＧＬＯ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを加え、試料を室温で１０分間インキュベートした。ＧＬＯＭＡＸルミノメーター上で０．５秒の積分で発光を測定した。その結果は、図８に示され、活性（発光）を損失することなく、ＮＬｐｅｐを複数の凍結融解サイクルに供することができることを示している。
【０１０２】
実施例１０
非発光性ペプチドにおける突然変異の識別
以下の実施例では、発光を変化させる（例えば、発光の変化は、結合親和性の変化から生じ得る）突然変異から発現を変化させる突然変異を識別するために、ＴＭＲゲル分析を用いて非発光性ペプチド変異体の濃度を正規化した。
【０１０３】
５ｍｌのＬＢに単一の変異体ペプチドコロニーを接種し、３７℃で２０時間振盪しながらインキュベートした。５０μｌの一晩培養液を５ｍｌの新しいＬＢ中に希釈し、３７℃で３時間振盪しながらインキュベートした。次いで、５０μｌの２０％ラムノースを加え、２５℃で１８時間振盪しながら誘導した。
【０１０４】
ＴＭＲゲル分析のために、７９μｌの各誘導培養液を１０μｌの１０×Ｆａｓｔ  Ｂｒｅａｋ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＨＡＬＯＴＡＧ  ＴＭＲリガンド（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）非発光性ポリペプチドの１０μｌの１：１００希釈液、及び１０μｌのＲＱ１  ＤＮａｓｅと混合し、室温で１０分間インキュベートした。３３．３μｌの４×ＳＤＳ負荷緩衝液を加え、試料を９５℃で５分間インキュベートした。１５μｌの各試料をＳＤＳゲルに負荷し、製造者の指示に従って泳動させた。次いで、Ｔｙｐｈｏｏｎ上でゲルを走査した。各培養液をＴＭＲゲルの強度に基づいて希釈し、濃度を正規化した。次いで、２０μｌの各希釈培養液を、非発光性ポリペプチド（１：１０希釈の配列番号２大腸菌清澄化ライセート）を含有する３０μｌのアッセイ溶解緩衝液と混合し、室温で１０分間振盪しながらインキュベートした。５０μｌのＮＡＮＯＧＬＯ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを加え、試料を室温で１０分間インキュベートした。ＧＬＯＭＡＸルミノメーター上で０．５秒の積分で発光を測定した（図９を参照）。
【０１０５】
実施例１１
非発光性ポリペプチドにおける部位飽和
以下の実施例では、野生型非発光性ポリペプチドにおけるランダム突然変異のライブラリをスクリーニングすることにより、１１、１５、１８、３１、５８、６７、１０６、１４９、及び１５７位を該当する部位として同定した。これらの位置にある２０個全てのアミノ酸（５Ａ２変異体における他の突然変異を検証するために実施例６で作製した５Ａ２非発光性変異体（配列番号５３９及び５４０）に構築）を比較して、その位置における最適なアミノ酸を決定した。変異体非発光性ポリペプチドを実施例１で以前に記載したように作製した。各非発光性ポリペプチド変異体の単一コロニーを実施例６で用いた手順に従って増殖させた。細菌培養液も実施例６で用いた手順に従って誘導した。ＮＬｐｅｐ５３大腸菌清澄化ライセートを１：１１．８５の希釈で使用したことを除いて、実施例６で用いた手順に従って発光をアッセイし、検出した。図１０〜１８は、ＮＬｐｅｐを用いた場合及び用いない場合に、突然変異が発光を生成する能力に及ぼす影響を示している。
【０１０６】
実施例１２
非発光性ペプチドにおける第１のアミノ酸としてシステイン対プロリンの比較
以下の実施例では、非発光性ペプチドにおける第１のアミノ酸（必要なメチオニンの後）としてシステインまたはプロリンの使用の比較を行った。変異体非発光性ペプチドを実施例１で以前に記載したように作製した。各非発光性ポリペプチド変異体の単一コロニーを実施例７で用いた手順に従って増殖させた。細菌培養液も実施例７で用いた手順に従って誘導した。実施例７で用いた手順に従って発光をアッセイし、検出した。図１９は、システイン及びプロリンのどちらもＮＬｐｅｐの第１のアミノ酸として使用することができ、発光を生成することを示している。
【０１０７】
実施例１３
非発光性ペプチドに最適な突然変異の複合セットの同定
以下の実施例では、非発光性ペプチドに最適な突然変異の複合セット（複数可）を同定した。変異体非発光性ペプチドを実施例１で以前に記載したように作製した。
１）非発光性ペプチド複合変異体ＮＬｐｅｐ５３、ＮＬｐｅｐ６６、ＮＬｐｅｐ６７、及びＮＬｐｅｐ６８の場合、実施例１０で用いた手順に従ってそれぞれの単一コロニーを増殖させた。細菌培養液も実施例１０で用いた手順に従って誘導した。実施例１０で用いた手順に従ってＴＭＲゲル分析及び発光をアッセイし、検出した。図２０の結果は、複数の突然変異を含有するＮＬｐｅｐの発光及び大腸菌発現を示している。
２）非発光性ペプチド複合変異体ＮＬｐｅｐ５３及びＮＬｐｅｐ６６〜７４の場合、実施例７で用いた手順に従ってそれぞれの単一コロニーを増殖させた。細菌培養液も実施例７で用いた手順に従って誘導した。実施例７で用いた手順に従って発光をアッセイし、検出した。図２１の結果は、複数の突然変異を含有するＮＬｐｅｐの発光を示している。
３）非発光性ペプチド複合変異体ＮＬｐｅｐ５３及びＮＬｐｅｐ６６〜７６の場合、実施例７で用いた手順に従ってそれぞれの単一コロニーを増殖させた。細菌培養液も実施例７で用いた手順に従って誘導した。非発光性ポリペプチドが５Ａ２または５Ａ２＋Ｒ１１Ｅ（１：１０希釈の大腸菌清澄化ライセート）であったことを除いて、実施例７で用いた手順に従って発光をアッセイし、検出した。図２２の結果は、５Ａ２または５Ａ２＋Ｒ１１Ｅを有する複数の突然変異を含有するＮＬｐｅｐの発光を示している。これらの結果はまた、ＮＬｐｏｌｙ突然変異Ｒ１１Ｅが９番目の残基としてＥを含有するＮＬｐｅｐ（ＮＬｐｅｐ７２、７５、及び７６）で相補された場合に、より低い発光を示している。
４）非発光性ペプチド複合変異体ＮＬｐｅｐ１、ＮＬｐｅｐ６９、ＮＬｐｅｐ７８、及びＮＬｐｅｐ７９の場合、実施例７で用いた手順に従ってそれぞれの単一コロニーを増殖させた。細菌培養液も実施例７で用いた手順に従って誘導した。非発光性ポリペプチドがＷＴ（１：１０希釈の大腸菌清澄化ライセート）であったことを除いて、実施例７で用いた手順に従って発光をアッセイし、検出した。図２３の結果は、複数の突然変異を含有するＮＬｐｅｐの発光を示している。
【０１０８】
実施例１４
複合非発光性ポリペプチド変異体
以下の実施例では、最適な複合セットを同定するために、ライブラリスクリーニングからの９個の突然変異を組み合わせて複合クローンとし（ＮＬｐｏｌｙ１、配列番号９４１、９４２）、次いで、突然変異のうちの１つを元のアミノ酸（ＮＬｐｏｌｙ２〜１０、配列番号９４３〜９６０）に先祖返りさせた。ＮＬｐｏｌｙ１〜１０の以前の結果に基づいて、ＮＬｐｏｌｙ１１〜１３（配列番号９６１〜９６６）を同じ目的のために設計及び試験した。変異体ＮＬｐｏｌｙを実施例１で以前に記載したように作製した。各非発光性ポリペプチド変異体の単一コロニーを実施例６で用いた手順に従って増殖させた。細菌培養液も実施例６で用いた手順に従って誘導した。ＮＬｐｅｐ５３大腸菌清澄化ライセートを１：１１．８５の希釈で使用したことを除いて、実施例６で用いた手順に従って発光をアッセイし、検出した。
【０１０９】
図２４は、複数の突然変異を含有するＮＬｐｏｌｙの発光を示している。
【０１１０】
実施例１５
非発光性ポリペプチド変異体の基質特異性
以下の実施例では、非発光性ポリペプチド変異体の基質特異性について調査する。発光複合体から発生した発光は、種々の非発光性ポリペプチド変異体、基質としてのフリマジンまたはセレンテラジンのいずれか、及び種々の非発光性ペプチドから形成された。
【０１１１】
ＨＥＫ２９３細胞を、０．５ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（５０，０００／ウェル）を含む２４ウェルプレートのウェルに１００，０００細胞／ｍｌでプレートした。３７℃の５％ＣＯ2インキュベータ内で細胞を一晩インキュベートした。各非発光性ポリペプチド変異体の発現のためのＤＮＡを２系列でトランスフェクトした。非発光性ポリペプチド変異体を含有する１ｕｇのプラスミドＤＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合して最終体積を５２μｌとした。３．３μｌのＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加え、試料を室温で１５分間インキュベートした。２５μｌの各試料混合物を２つのウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ内で一晩インキュベートした。一晩インキュベーションした後、増殖培地を除去し、０．５ｍｌのＤＭＥＭ（フェノールレッド不含）＋０．１％Ｐｒｉｏｎｅｘを加えた。次いで、ドライアイス上で細胞を凍結させ（どれくらい長く）、発光を検出する前に融解した。
【０１１２】
図２５〜２６において、ＮＬｐｅｐ５３大腸菌清澄化ライセートを１：１０の希釈で使用し、ＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ緩衝液またはＤＭＥＭのいずれか中のフリマジンまたはセレンテラジンのいずれかを使用したことを除いて、実施例６で用いた手順に従って発光をアッセイし、検出した。このデータは、基質としてのフリマジンまたはセレンテラジンのいずれかを含むＮＡＮＯＧＬＯ及びＤＭＥＭ中のＮＬｐｏｌｙの発光を示している。これは、ＮＡＮＯＧＬＯ及びＤＭＥＭの両方におけるＮＬｐｏｌｙの基質特異性（フリマジン対セレンテラジン）を示唆している。
【０１１３】
図２７では、種々の非発光性ペプチド（ＮＬｐｅｐ１、ＮＬｐｅｐ９、ＮＬｐｅｐ４８、ＮＬｐｅｐ５３、ＮＬｐｅｐ６９、またはＮＬｐｅｐ７６）からの大腸菌清澄化ライセートを１：１０の希釈で使用したことを除いて、実施例６で用いた手順に従って発光をアッセイし、検出した。さらに、いずれかのＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ緩衝液中にフリマジンまたはセレンテラジンのいずれかを使用した。このデータは、ＮＬｐｏｌｙ／ＮＬｐｅｐ対の基質特異性を示している。
【０１１４】
図２８において、ＤＭＥＭ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に、ＮＬｐｅｐ５３−ＨＴ融合体を１：１０で、非発光性ポリペプチドライセートを１：１０で別々に希釈することによって発光をアッセイし、検出した。次いで、２０μｌの非発光性ペプチド及び２０μｌの非発光性ポリペプチドを組み合わせ、室温で１０分間インキュベートした。次いで、１００ｕＭフリマジンを含むＮａｎｏＧｌｏ  Ｂｕｆｆｅｒまたは０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ及び２０ｕＭフリマジンを含むＤＭＥＭ４０μｌを試料に加え、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で発光を検出した。このデータは、ＨＥＫ２９３細胞で発現されるＮＬｐｏｌｙの基質特異性を示している。
【０１１５】
図２９では、ＤＭＥＭ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に、ＮＬｐｅｐ１−ＨＴ、ＮＬｐｅｐ５３−ＨＴ、ＮＬｐｅｐ６９−ＨＴ、またはＮＬｐｅｐ７６−ＨＴ融合体を１：１０で、非発光性ポリペプチドライセートを１：１０で別々に希釈することによって発光をアッセイし、検出した。次いで、２０μｌの非発光性ペプチド及び２０μｌの非発光性ポリペプチドを組み合わせ、室温で１０分間インキュベートした。次いで、１００ｕＭフリマジンを含むＮａｎｏＧｌｏ緩衝液または０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ及び２０ｕＭフリマジンを含むＤＭＥＭ４０μｌを試料に加え、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で発光を検出した。このデータは、哺乳動物細胞で発現させ、種々のＮＬｐｅｐでアッセイしたＮＬｐｏｌｙの発光を示している。
【０１１６】
実施例１６
フリマジンまたはセレンテラジンを用いた場合の非発光性ポリペプチド変異体のシグナル対バックグラウンド
以下の実施例では、非発光性ポリペプチド変異体のシグナル対バックグラウンドを調べる。種々の非発光性ポリペプチド変異体から発生した発光を、フリマジンまたはセレンテラジンのいずれかを基質として使用して、種々の非発光性ペプチドを用いて測定した。
【０１１７】
ＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルプレートのウェルに１００μｌのＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中１５，０００細胞／ウェルでプレートした。３７℃の５％ＣＯ2インキュベータ内で細胞を一晩インキュベートした。ＯｐｔｉＭｅｍ中３１μｌの最終体積となるように、非発光性ポリペプチド変異体及び非発光性ペプチド変異体プラスミドの発現のためのプラスミドＤＮＡをそれぞれ０．６６ｕｇ加えることにより、トランスフェクション複合体を調製した。２μｌのＦｕｇｅｎｅ  ＨＤを各トランスフェクション複合体に加え、室温で１５分間インキュベートした。各ペプチド／ポリペプチドの組み合わせに対して、５μｌのトランスフェクション複合体を６ウェルの９６ウェルプレートに加え、３７℃のＣＯ2インキュベータ内で一晩増殖させた。一晩インキュベーションした後、増殖培地を除去し、２０ｕＭセレンテラジンまたは２０ｕＭフリマジンのいずれかを含有するＣＯ2非依存性培地と交換した。試料を３７℃で１０分間インキュベートし、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ＋上で１時間にわたり３７℃で動態を測定した。図３０は、哺乳動物細胞でＮＬｐｏｌｙを発現させた場合の種々のＮＬｐｏｌｙ／ＮＬｐｅｐ対の基質特異性を示している。
【０１１８】
実施例１７
発光及び基質特異性
以下の実施例では、ＮＬｐｅｐ６９を用いて、フリマジンまたはセレンテラジンのいずれかを基質として使用して、種々の非発光性ポリペプチド変異体の発光及び基質特異性を調べる。
【０１１９】
ＣＨＯ細胞を９６ウェルプレートのウェルに１００μｌのＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中２０，０００細胞／ウェルでプレートした。３７℃の５％ＣＯ2インキュベータ内で細胞を一晩インキュベートした。ＯｐｔｉＭｅｍ中３１μｌの最終体積となるように、非発光性ポリペプチド変異体及び非発光性ペプチド変異体プラスミドの発現のためのプラスミドＤＮＡをそれぞれ０．６６ｕｇ加えることにより、トランスフェクション複合体を調製した。２μｌのＦｕｇｅｎｅ  ＨＤを各トランスフェクション複合体に加え、室温で１５分間インキュベートした。各ペプチド／ポリペプチドの組み合わせに対して、５μｌのトランスフェクション複合体を６ウェルの９６ウェルプレートに加え、３７℃のＣＯ2インキュベータ内で一晩増殖させた。一晩インキュベーションした後、増殖培地を除去し、２０ｕＭセレンテラジンまたは２０ｕＭフリマジンのいずれかを含有するＣＯ2非依存性培地と交換した。試料を３７℃で１０分間インキュベートし、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ＋上で１時間にわたり３７℃で動態を測定した。図３１は、ＮＬｐｏｌｙを哺乳動物細胞でＮＬｐｅｐ６９と同時発現させた場合の基質特異性を示す。
【０１２０】
実施例１８
生細胞条件と溶解条件の間の発光及び基質特異性
以下の実施形態では、フリマジンまたはセレンテラジンのいずれかを基質として使用して、溶解条件または生細胞条件のいずれかの下で、ＮＬｐｅｐ６９、ＮＬｐｅｐ７８、またはＮＬｐｅｐ７９を用いて種々の非発光性ポリペプチド変異体の発光及び基質特異性を調べる。
【０１２１】
ＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルプレートのウェルに１００μｌのＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中１５，０００細胞／ウェルでプレートした。３７℃の５％ＣＯ2インキュベータ内で細胞を一晩インキュベートした。ＯｐｔｉＭｅｍ中３１μｌの最終体積となるように、非発光性ポリペプチド変異体及び非発光性ペプチド変異体プラスミドの発現のためのプラスミドＤＮＡをそれぞれ０．６６ｕｇ加えることにより、トランスフェクション複合体を調製した。２μｌのＦｕｇｅｎｅ  ＨＤを各トランスフェクション複合体に加え、室温で１５分間インキュベートした。各ＮＬｐｏｌｙ−ＮＬｐｅｐの組み合わせに対して、５μｌのトランスフェクション複合体を６ウェルの９６ウェルプレートに加え、３７℃のＣＯ２インキュベータ内で一晩増殖させた。一晩インキュベーションした後、増殖培地を除去し、２０ｕＭセレンテラジンまたは２０ｕＭフリマジンのいずれかを含有するＣＯ２-非依存性培地と交換した。試料を３７℃で１０分間インキュベートし、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ＋上で１時間にわたり３７℃で動態を測定した。図３２〜３４は、生細胞または溶解形式で、哺乳動物細胞でＮＬｐｅｐ６９、７８、または７９と同時発現させたＮＬｐｏｌｙの基質特異性を示す。
【０１２２】
実施例１９
大腸菌で発現させた非発光性ポリペプチド変異体の比較
各非発光性ポリペプチドの単一コロニーを実施例７で用いた手順に従って増殖させた。細菌培養液も実施例７で用いた手順に従って誘導した。１：１，０００希釈のＮＬｐｅｐ７８−ＨＴまたはＮＬｐｅｐ７９−ＨＴを使用したことを除いて、実施例７で用いた手順に従って発光をアッセイし、検出した。図３５は、大腸菌で発現させ、ＮＬｐｅｐ７８または７９でアッセイしたＮＬｐｏｌｙの発光を示している。
【０１２３】
実施例２０
相補的な非発光性ペプチドを用いずに、非発光性ポリペプチドクローンが発光を生成する能力
各非発光性ポリペプチドの単一コロニーを実施例７で用いた手順に従って増殖させた。細菌培養液も実施例７で用いた手順に従って誘導した。アッセイ緩衝液に非発光性ペプチドを加えなかったことを除いて、実施例７で用いた手順に従って発光をアッセイし、検出した。図３６は、大腸菌で発現させ、ＮＬｐｅｐの非存在下でアッセイしたＮＬｐｏｌｙの発光を示している。
【０１２４】
実施例２１
大腸菌で発現させた非発光性ポリペプチド変異体の基質特異性
各非発光性ポリペプチドの単一コロニーを実施例７で用いた手順に従って増殖させた。細菌培養液も実施例７で用いた手順に従って誘導した。フリマジンまたはセレンテラジンのいずれかをＮＡＮＯＧＬＯ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒと混合したことを除いて、実施例で用いた手順に従って発光をアッセイし、検出した。図３７は、大腸菌で発現させ、ＮＬｐｅｐ７８または７９でアッセイしたＮＬｐｏｌｙの基質特異性を示している。
【０１２５】
実施例２２
ＮＬｐｅｐ７８による非発光性ポリペプチド変異体の発光の改善
ＮＬｐｅｐ７８−ＨＴを用いた場合の非発光性ポリペプチド変異体の相補性をＣＨＯ及びＨｅＬａ細胞において実証した。
【０１２６】
２４ウェルプレートのウェル中、ＣＨＯ及びＨｅＬａ細胞（ＣＨＯ：トランスフェクションの前日に１００，０００個をプレート；Ｈｅｌａ：トランスフェクションの前日に５０，０００個をプレート）を、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤを使用して５ｎｇの非発光性ポリペプチド変異体５Ａ２もしくは５Ｐまたは野生型非発光性ポリペプチドでトランスフェクトし、３７℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベーションした後、培地をフェノールレッド不含ＤＭＥＭと交換し、−８０℃で３０分間細胞を凍結させた。次いで、細胞を融解し、１．５ｍｌ試験管に移した。次いで、細胞ライセートをフェノールレッド不含ＤＭＥＭ中に１：１０で希釈し、２０μｌをＮＬｐｅｐ７８（フェノールレッド不含ＤＭＥＭ中に１：１，０００で希釈したＮＬｐｅｐ７８−ＨＴ７大腸菌ライセート）と混合し、室温で１０分間振盪した。４０μｌのフェノールレッド不含ＤＭＥＭ及び２０ｕＭフリマジンを加え、ＧｌｏＭａｘ上で０．５秒の積分で発光を測定した。図３８は、哺乳動物細胞で発現させ、ＮＬｐｅｐ７８でアッセイしたＮＬｐｏｌｙの発光を示している。
【０１２７】
実施例２３
非発光性ポリペプチド融合体、及び非発光性ポリペプチド濃度の正規化
例えば、発現、溶解性、及び／または安定性において、どれくらいの利益が、非発光性ポリペプチドの濃度及び融合非発光性ポリペプチドとしての相補性に起因するかの洞察を提供するために、ホタルルシフェラーゼ（図３９）またはコメツキムシ赤色ルシフェラーゼ（図４０）のいずれかに融合した非発光性ポリペプチドからの元の発光及び正規化した発光の比較を行った。
【０１２８】
実施例２２の手順に従って、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、またはＣＨＯ細胞を５ｎｇの５Ｐ  ＮＬｐｏｌｙ−ホタルルシフェラーゼ融合体、５Ｐ  ＮＬｐｏｌｙ−コメツキムシルシフェラーゼ融合体、野生型５Ｐ−ホタルルシフェラーゼ融合体、または野生型５Ｐ−コメツキムシルシフェラーゼ融合体でトランスフェクトした。ライセートも実施例２２に従って調製した。次いで、細胞ライセートをフェノールレッド不含ＤＭＥＭ中に１：１０で希釈し、２０μｌをＮＬｐｅｐ７８（フェノールレッド不含ＤＭＥＭ中に１：１，００で希釈；大腸菌ライセート）と混合し、室温で１０分間振盪した。２０ｕＭフリマジンまたはＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む４０μｌのＮａｎｏＧｌｏを加え、ＧｌｏＭａｘ上で０．５秒の積分で発光を測定した。図３９及び４０は、哺乳動物細胞で発現させ、ＮＬｐｅｐ７８でアッセイした５Ｐ対ＷＴ  ＮＬｐｏｌｙの特異的活性を示している。
【０１２９】
実施例２４
生細胞における相補性
この実施例は、野生型または５Ｐ  ＮＬｐｏｌｙのいずれかを使用して、生細胞における相補性を実証する。９６ウェルプレートのウェルにプレートしたＨｅＬａ細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤを使用して０．５ｎｇの野生型または５Ｐ非発光性ポリペプチドプラスミドＤＮＡでトランスフェクトし、３７℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベーションした後、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤを使用して０．５ｎｇのＮＬｐｅｐ７８−ＨＴプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクトし、３７℃で３時間インキュベートした。次いで、培地をＣＯ2非依存性培地＋０．１％  ＦＢＳ及び２０ｕＭ  ＰＢＩ−４３７７と交換し、ＧｌｏＭａｘ上で０．５秒の積分で発光を測定した。図４１は、５ＰまたはＷＴ  ＮＬｐｏｌｙとＮＬｐｅｐ７８との間の生細胞相補性を示している。
【０１３０】
実施例２５
生細胞抽出物における相補性
生細胞抽出物における相補性を実証するために、０．５ｕｇのＮＬｐｅｐ７８−ＨＴ及び０．５ｕｇの非発光性ポリペプチド変異体プラスミドＤＮＡを、ＴＮＴウサギ網状赤血球ライセートマスターミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と混合し、３０℃で１時間インキュベートした。２５μｌの無細胞発現抽出物を２５μｌのＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ試薬と混合し、室温で１０分間インキュベートした。ＧｌｏＭａｘ上で０．５秒の積分で発光を測定した。図４２は、無細胞形式で発現させた相補性ＮＬｐｏｌｙ／ＮＬｐｅｐ対からの発光を示している。
【０１３１】
実施例２６
合成非発光性ペプチドを用いた場合の、哺乳動物細胞で発現させた非発光性ポリペプチドの結合親和性
非発光性ポリペプチド及び非発光性ペプチド対間の結合親和性を実証するために、以前に記載したようにＨｅｌａ、ＨＥＫ２９３、及びＣＨＯ細胞から非発光性ポリペプチドライセートを調製し、ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に１：１０で希釈した。ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に非発光性ペプチド（合成）の４倍濃縮物を作製した。２０μｌの非発光性ポリペプチドライセートを２０μｌの非発光性ペプチドと混合し、室温で１０分間振盪した。フリマジンを含む４０μｌのＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ＲｅａｇｅｎｔまたはＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘを加え、室温で１０分間振盪した。ＧｌｏＭａｘ上で０．５秒の積分で発光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ、１サイト特異的結合を使用してＫｄ値を決定した。図４３及び４４は、種々の緩衝液条件下で測定した解離定数を示す（相補性にＰＢＳ、次いで検出にＮａｎｏＧｌｏ、相補性及び検出にＰＢＳ、相補性及び検出にＮａｎｏＧｌｏ）。
【０１３２】
実施例２７
非発光性ペプチド変異体においてシステインをフェニルアラニンに突然変異させた場合の結合親和性の改善
ペプチドの８番目の残基に突然変異させたシステインを有する非発光性ペプチド変異体において改善された結合親和性を実証するために、以前に記載したようにＨｅｌａ、ＨＥＫ２９３、及びＣＨＯ細胞からの非発光性ポリペプチド変異体ライセートを調製し、ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に１：１０で希釈した。ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ＋１０ｍＭ  ＤＴＴ中に非発光性ペプチド（ＮＬｐｅｐ）の４倍濃縮物を作製した。２０μｌの非発光性ポリペプチドライセートを２０μｌの非発光性ペプチドと混合し、室温で１０分間振盪した。４０μｌのＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを加え、室温で１０分間振盪した。ＧｌｏＭａｘ上で０．５秒の積分で発光を測定した。図４５は、ＮＬｐｅｐ  Ｃ８Ｆ突然変異が５Ｐに対する結合親和性を著しく改善することを示している。
【０１３３】
実施例２８
非発光性ペプチドを用いない場合のＨｅＬａ細胞におけるポリペプチド変異体の検出可能な発光
非発光性ペプチドを用いない場合の非発光性ポリペプチドにおける発光を実証するため、９６ウェルプレートのウェル中でＨｅＬａ細胞（トランスフェクションの前日に１０，０００個をプレート）を、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤを使用して様々な量の非発光性ポリペプチド＋ｐＧＥＭ−３ｚｆ  Ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡでトランスフェクトして総量５０ｎｇとし、３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、培地をＣＯ2非依存性培地＋０．１％  ＦＢＳ＋２０ｕＭフリマジンと交換し、３７℃で１０分間インキュベートし、ＧｌｏＭａｘ上で０．５秒の積分で発光を測定した。図４６は、種々の量のプラスミドＤＮＡでトランスフェクションした後の、ＮＬｐｅｐを用いない場合の生ＨｅＬａ細胞におけるＮＬｐｏｌｙ  ＷＴまたは５Ｐの発光を示している。
【０１３４】
実施例２９
さらなる非発光性ポリペプチド変異体の作製
さらなる非発光性ポリペプチド変異体：Ｉｌｅ−１１（残基１１のＩｌｅ）、Ｖａｌ−１１、Ｔｙｒ−１１、Ｇｌｕ−１１、Ｇｌｕ−１５７、Ｐｒｏ−１５７、Ａｓｐ−１５７、Ｓｅｒ−１５７、Ｍｅｔ−１４９、Ｌｅｕ−１０６、ＮＬｐｏｌｙ１１、及びＮＬｐｏｌｙ１２を以下に記載するように作製し、それらの発現を分析した。５Ａ２非発光性ポリペプチドのバックグラウンドにおいてさらなる非発光性ポリペプチド変異体を作製した。
【０１３５】
各さらなる非発光性ポリペプチド変異体の新しい個々のコロニー（ＫＲＸ）を採取し、ＬＢ＋アンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）中３０℃で一晩増殖させ、次いでＬＢ＋アンピシリン中に１：１００で希釈し、３７℃で２．５時間増殖させた（ＯＤ６００〜０．５）。最終濃度が０．２％になるようにラムノースを加え、細胞を３系列で分割し、２５℃で約一晩（約１８時間）増殖させた。０．５Ｘ  Ｆａｓｔ  Ｂｒｅａｋを使用して周囲温度で３０分間細胞を溶解し、ドライアイス上で瞬間凍結させ、−２０℃で保存した。１０Ｋで１５分間４℃で遠心分離することにより可溶画分を調製した。Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ−５００ルミノメーター上で試料を発光についてアッセイした。
【０１３６】
図４９は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した各非発光性ポリペプチド変異体の全ライセート及び可溶性断片を示す。このデータは、さらなる非発光性ポリペプチド変異体の発現、溶解性、及び安定性に関する情報を提供する。さらなる非発光性ポリペプチド変異体の大多数が野生型よりも多くのタンパク質（総タンパク質及び可溶性タンパク質）を生成したが、多くの場合、その差はわずかである。ＮＬｐｏｌｙ１１及びＮＬｐｏｌｙ１２の発現の改善はより顕著であった。
【０１３７】
実施例３０
さらなる非発光性ポリペプチド変異体のバックグラウンド発光
実施例２９で作製したさらなる非発光性ポリペプチド変異体のバックグラウンド発光を、２５μｌの非発光性ポリペプチド変異体ライセートを２５μｌのＤＭＥＭとともに室温で１０分間インキュベートすることにより測定した。次いで、５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを加え、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５００上で５分及び３０分に発光を測定した。ＮＬｐｅｐ５３（Ｐｅｐ  ５３）単独及びＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ）単独を対照として用いた。図４７は、さらなる非発光性ポリペプチド変異体の大多数がバックグラウンド発光の上昇を示したことを示している。
【０１３８】
実施例３１
相補後のさらなる非発光性ポリペプチド変異体の発光
２５μｌの非発光性ポリペプチド変異体ライセートを２５μｌのＮＬｐｅｐ−５３とともに室温で１０分間インキュベートすることにより、実施例２８で作製したさらなる非発光性ポリペプチド変異体の発光を測定した。次いで、５０μｌをＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを加え、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５００上で５分及び３０分に発光を測定した。ＮＬｐｅｐ５３（Ｐｅｐ  ５３）単独及びＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ）単独を対照として用いた。図４８は、非発光性ポリペプチド変異体Ｖａｌ−１１、Ｇｌｕ−１１、Ｇｌｕ−１５７、Ｐｒｏ−１５７、Ａｓｐ−１５７、Ｓｅｒ−１５７、及びＭｅｔ−１４９が、親５Ａ２よりも著しく多くの発光を生成したことを示している。
【０１３９】
実施例３２
非発光性ペプチドの非存在下における非発光性ポリペプチドのバックグラウンド発光の増加と、可溶画分中のタンパク質の量との間の相関
非発光性ポリペプチド変異体３Ｐ、３Ｅ、５Ｐ、５Ｅ、６Ｐ、及び６Ｅの個々のコロニーを採取し、ＬＢ＋アンピシリン中３０℃で一晩増殖させ、ＬＢ＋アンピシリン中に１：１００で希釈し、３７℃で２．５時間増殖させた（ＯＤ６００〜０．５）。最終濃度が０．２％になるようにラムノースを加え、細胞を３系列で分割し、２５℃で一晩（約１８時間）増殖させた。０．５Ｘ  Ｆａｓｔ  Ｂｒｅａｋを使用して周囲温度で３０分間細胞を溶解し、ドライアイス上で瞬間凍結させ、−２０℃で保存した。迅速に融解し、１０Ｋで１５分間４℃で遠心分離することにより可溶画分を調製した。Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ−５００ルミノメーター上で試料を発光についてアッセイした。図５０Ａは、各非発光性ポリペプチド変異体の全ライセート及び可溶性断片を示す。図５０Ｂは、各非発光性ポリペプチド変異体のバックグラウンド発光を示す。図５１は、ＬＢ培地中で１０または１００ｎＭのＮＬｐｅｐ７８（ＮＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳＮ）で相補した場合に、各非発光性ポリペプチド変異体を用いて生成した発光を示す。
【０１４０】
実施例３３
非発光性ポリペプチドの伸長及び欠失
５ＰのＣ末端における残基ＶＡＴ、ＡＡ、ＶＴＧ、ＶＴ、ＶＴＧＷＲ、ＶＴＧＷ、Ｖ、Ａ、ＶＡ、ＧＧ、ＡＴ、ＧＴＡ、ＡＴＧ、もしくはＧＴの付加、または１〜７つの残基の欠失のいずれかによって、非発光性ポリペプチド変異体５ＰをＣ末端で伸長した：例えば、Ｄ１＝１つの残基の欠失、Ｄ２＝２つの残基の欠失等。大腸菌ライセートにおけるバックグラウンド発光（図５２）及びＮＬｐｅｐ７８による相補後に発生した発光（図５３；ＮＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳＮ）またはＮＬｐｅｐ７９（図５４；ＮＶＴＧＹＲＬＦＫＫＩＳＮ）を測定した。図５５は、非発光性ポリペプチド５Ｐ変異体のシグナル対バックグラウンドを示す。図５６は、発光の結果の培養を提供する。図５７は、各非発光性ポリペプチド５Ｐ変異体中の全ライセート及び可溶性断片の量を示す。
【０１４１】
実施例３４
５Ｐ及びＩ１０７Ｌ非発光性ポリペプチド変異体の比較
図５８は、５Ｐ及びＩ１０７Ｌの全ライセート及び可溶性断片の量（Ａ）、非発光性ペプチドを用いない場合、またはＮＬｐｅｐ７８もしくはＮＬｐｅｐ７９を用いた場合に５ＰもしくはＩ１０７Ｌによって発生した発光（Ｂ）、及び５Ｐよりも改善されたＩ１０７Ｌのシグナル対バックグラウンド（Ｃ）を示している。
【０１４２】
実施例３５
５Ｐ非発光性ポリペプチド変異体の作製
５Ｐ非発光性ポリペプチド変異体におけるランダム突然変異のスクリーニングで同定された突然変異を以前に記載したように作製した。各単一の５Ｐ非発光性ポリペプチド変異体コロニーを２００μｌの最少培地に接種し、３７℃で２０時間振盪しながらインキュベートした。次いで、１０μｌの培養液を１９０μｌの新しい最少培地に加え、３７℃で２０時間振盪しながら再びインキュベートした。次いで、１０μｌの第２の培養液を１９０μｌの自己誘導培地（最少培地＋５％グルコース＋２％ラムノース）に加え、２５℃で１８時間振盪しながらインキュベートし、非発光性ポリペプチド変異体を発現させた。１０μｌの５Ｐ非発光性ポリペプチド変異体の発現培養液をＮＬｐｅｐ７８−ＨＴ（１：３８６希釈）またはＮＬｐｅｐ７９−ＨＴ（１：１，０００希釈）を含有する４０μｌのアッセイ溶解緩衝液に加え、室温で１０分間振盪した。１００ｕＭセレンテラジンを含有する５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを加え、室温で１０分間振盪した。ＧｌｏＭａｘ上で０．５秒の積分で発光を測定した。図５９〜６２Ａは、バックグラウンド発光を示し、図５９〜６２Ｂ及びＣは、ＮＬｐｅｐ７８またはＮＬｐｅｐ７９による相補後に発生した発光を示す。
【０１４３】
実施例３６
伸長型非発光性ポリペプチド変異体と欠失型非発光性ペプチドとの結合親和性
伸長型非発光性ポリペプチド変異体（すなわち、Ｃ末端に付加されたアミノ酸を含有する）と欠失型非発光性ペプチド（すなわち、Ｎ末端のアミノ酸が欠失した）との結合親和性。
【０１４４】
以前に記載したように調製された非発光性ポリペプチド５Ｐ／＋Ｖ／＋ＶＴ／＋ＶＴＧを発現する大腸菌のライセートをＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中１：２０００で希釈した。２５μｌの希釈したライセートを、２５μｌのＮＬｐｅｐ７８、ＮＬｐｅｐ８０、ＮＬｐｅｐ８１、またはＮＬｐｅｐ８２（希釈緩衝液中０〜５００ｎＭに希釈）とともに室温で５分間インキュベートした。ＮａｎｏＧｌｏ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒで１Ｘに希釈した５０μｌのフリマジンを各試料に加え、室温で１０分間インキュベートした。ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。図６３は、Ｃ末端に付加されたアミノ酸を有するＮＬｐｏｌｙとＮ末端からアミノ酸を欠失させたＮＬｐｅｐとの結合親和性を示している。
【０１４５】
実施例３７
大腸菌で発現させた非発光性ポリペプチドと合成非発光性ペプチドとの結合親和性
非発光性ポリペプチドＬＢライセートを調製し、ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に１：１００で希釈した。ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中にＮＬｐｅｐ７８の２倍希釈液を作製した。２５μｌの希釈した非発光性ポリペプチドライセートを非発光性ペプチドの各希釈液２５μｌと混合し、周囲温度で３分間インキュベートした。５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを加え、室温で５分間インキュベートし、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ＋上で発光を測定した。図６４は、１サイト特異的結合を使用して算出したＫｄ値を示す。
【０１４６】
実施例３８
哺乳動物細胞中で発現させた５Ｐ非発光性ポリペプチドとＮＬｐｅｐ８０またはＮＬｐｅｐ８７との結合親和性
ＮＬｐｏｌｙ  ５Ｐを発現するＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、またはＨｅＬａ細胞のライセートを希釈緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％Ｐｒｉｏｎｅｘ）中に１：１０００で希釈した。２５μｌの希釈ライセートを、２５μｌのＮＬｐｅｐ８０／８７（希釈緩衝液中で０〜５μＭに希釈）とともに室温で５分間インキュベートした。５０μｌのフリマジン（ＮａｎｏＧｌｏ緩衝液で１Ｘに希釈）を各ウェルに加え、プレートを室温で１０分間インキュベートした。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を読み取った（図６５）。
【０１４７】
実施例３９
大腸菌中で発現させた５Ｐ非発光性ポリペプチドとＮＬｐｅｐ８０またはＮＬｐｅｐ８７との結合親和性
ＮＬｐｏｌｙ  ５Ｐを発現する大腸菌のライセートを希釈緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％Ｐｒｉｏｎｅｘ）中に１：２０００で希釈した。２５μｌの希釈ライセートを、２５μｌのＮＬｐｅｐ８０／８７（希釈緩衝液中で０〜５μＭに希釈）とともに室温で５分間インキュベートした。５０μｌのフリマジン（ＮａｎｏＧｌｏ緩衝液で１Ｘに希釈）を各ウェルに加え、プレートを室温で１０分間インキュベートした。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を読み取った（図６６）。
【０１４８】
実施例４０
欠失非発光性ポリペプチドと伸長型非発光性ペプチドとの間の相補性
欠失非発光性ポリペプチド（すなわち、Ｃ末端からアミノ酸を欠失させた）と、伸長型非発光性ペプチド（すなわち、Ｎ末端にアミノ酸を付加した）との相補を行った。実施例６で以前に記載したようにＮＬｐｅｐ−ＨＴ大腸菌清澄化ライセートを調製した。ＨａｌｏＴａｇ融合を介してＮＬｐｅｐ−ＨＴの量を定量した。端的に述べると、１０μｌの清澄化ライセートを１０μｌのＨａｌｏＴａｇ−ＴＭＲリガンド（１：１００に希釈）及び８０μｌの水と混合し、室温で１０分間インキュベートした。３３．３μｌの４×ＳＤＳ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを加え、９５℃で５分間インキュベートした。１５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、Ｔｙｐｈｏｏｎ上で画像化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからの強度に基づいて、非発光性ペプチドをＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ非発光性ペプチドに希釈して当量濃度とした。次いで、非発光性ポリペプチドライセートをＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に１：１００で希釈した。２０μｌの希釈した非発光性ポリペプチドを２０μｌの希釈した非発光性ペプチドと混合し、室温で１０分間振盪した。４０μｌのＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを加え、室温で１０分間振盪した。ＧｌｏＭａｘ上で０．５秒の積分を用いて発光を測定した。図６７は、Ｃ末端からアミノ酸を除去したＮＬｐｏｌｙと、Ｎ末端にアミノ酸を有するＮＬｐｅｐの発光を示している。
【０１４９】
実施例４１
ＨｅＬａ細胞で発現させた５Ｐ非発光性ポリペプチドとＮＬｐｅｐ７８または切断ＮＬｐｅｐ７８（ＮＬｐｅｐ８０−８７）との結合親和性
以前に記載したように５Ｐ非発光性ポリペプチドライセートをＨｅＬａ細胞から調製し、ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に１：１０で希釈調製した。非発光性ペプチド（合成ペプチド；ペプチド２．０（Ｖｉｒｇｉｎｉａ）による；５、１０、または２０ｍｇスケールのいずれかで作製；アセチル化及びアミド化によって末端をブロックし、正味ペプチド含有量の分析によって確認）の４倍濃縮物（予備滴定実験で範囲を決定）をＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に調製した。２０μｌの５Ｐ非発光性ポリペプチドを２０μｌの非発光性ペプチドと混合し、室温で１０分間振盪した。４０μｌのＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを加え、室温で１０分間振盪した。ＧｌｏＭａｘ上で０．５秒の積分で発光を測定した。図６８は、５ＰとＮＬｐｅｐ７８の切断型との結合親和性及び対応する発光を示している。Ｎ末端、Ｃ末端から１つのアミノ酸が除去された時、または各末端から１つのアミノ酸が除去された時に結合親和性が増加する。いずれかの末端から１つ以上のアミノ酸を除去することにより親和性が低下するが、必ずしもＶｍａｘを同じ程度低下させるとは限らない。
【０１５０】
実施例４２
伸長型非発光性ポリペプチドと切断非発光性ペプチドとの結合親和性
伸長型非発光性ポリペプチド（すなわち、Ｃ末端に２つの余分なアミノ酸を有するポリペプチド）と切断非発光性ペプチド（すなわち、Ｎ末端から２つのアミノ酸を除去したペプチド（ＮＬｐｅｐ８１））との結合親和性を決定した。
【０１５１】
非発光性ポリペプチドライセートを以前に記載したように調製し、ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に１：１００で希釈調製した。ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中にＮＬｐｅｐ８１（合成ペプチド；ペプチド２．０（Ｖｉｒｇｉｎｉａ）による；５、１０、または２０ｍｇスケールのいずれかで作製；アセチル化及びアミド化によって末端をブロックし、正味ペプチド含有量の分析によって確認）の２倍希釈液を調製した。２５μｌの非発光性ポリペプチドを２５μｌの各非発光性ペプチド希釈液と混合し、室温で３分間振盪した。５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ試薬を加え、室温で５分間振盪した。ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分で発光を測定した。図６９は、１サイト特異的結合を使用して算出したＫｄ値を示す。
【０１５２】
実施例４３
伸長型非発光性ポリペプチドと節間非発光性ペプチドとの結合親和性
伸長型非発光性ポリペプチド（すなわち、Ｃ末端に３つの余分なアミノ酸を有するポリペプチド）と切断非発光性ペプチド（すなわち、Ｎ末端から３つのアミノ酸を除去したペプチド（ＮＬｐｅｐ８２））との結合親和性を決定した。
【０１５３】
非発光性ポリペプチドライセートを調製し、ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に１：１００で希釈調製した。ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中にＮＬｐｅｐ８２（合成ペプチド；ペプチド２．０（Ｖｉｒｇｉｎｉａ）による；５、１０、または２０ｍｇスケールのいずれかで作製；アセチル化及びアミド化によって末端をブロックし、正味ペプチド含有量の分析によって確認）の２倍希釈液を調製した。２５μｌの非発光性ポリペプチドを２５μｌの各非発光性ペプチド希釈液と混合し、室温で３分間振盪した。５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ試薬を加え、室温で５分間振盪した。ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分で発光を測定した。図７０は、１サイト特異的結合を使用して得たＫｄ値を示す。
【０１５４】
実施例４４
大腸菌で発現させた非発光性ポリペプチドクローンと合成ＮＬｐｅｐ７８との結合親和性  非発光性ポリペプチド変異体をＭ９最少培地で増殖させた。個々のコロニーを接種し、３７℃で一晩増殖させた。試料をＭ９最少培地中に１：２０で希釈し、３７℃で一晩増殖させた。試料をＭ９誘導培地中に再び１：２０で希釈し、２５℃で一晩増殖させた。試料をプールし、１００μｌのプールした細胞を４００μｌのＰＬＢ溶解緩衝液で溶解し、室温で１０分間インキュベートした。ライセートをＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に１：１００で希釈した。ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に合成ＮＬｐｅｐ７８の２倍希釈液を作製した。２５μｌの非発光性ポリペプチド希釈液を２５μｌの各非発光性ペプチド希釈液と混合し、室温で３分間インキュベートした。５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを加え、室温で５分間インキュベートし、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ＋上で発光を読み取った。図７１は、１サイト特異的結合を使用して得たＫｄ値を示す。
【０１５５】
実施例４５
突然変異がＫｍに及ぼす影響の決定
実施例１１からの希釈したプールライセートを使用して、２５μｌの非発光性ポリペプチド希釈ライセート（ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中１：１００）を各試料につき２５μｌの５００ｎＭ  ＮＬｐｅｐ７８と混合し、室温で５分間インキュベートした。ＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ中にフリマジンの２倍希釈液を調製し、５０μｌの非発光性ペプチド及び非発光性ポリペプチド試料を５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ／フリマジン希釈液と混合した。インキュベーションの５分後に、室温で発光を測定した。図７２は、ミカエリスメンテンを使用して得た算出Ｋｍを示す。
【０１５６】
実施例４６
３つの成分の相補性の証明
２つのＮＬｐｅｐとＮＬｐｏｌｙ５Ｐ非発光性ポリペプチドを使用した三次相補性を実証する。ＮＬｐｏｌｙ  ５Ｐ−Ｂ９（残基１４７−１５７を欠失させた５Ｐ）及びＮＬｐｅｐ  Ｂ９−ＨＴ（ＨＴ７のＮ末端にＭｅｔ＋残基１４７−１５７が融合）ライセートを調製した。
【０１５７】
Ａ）ＮＬｐｅｐ７８を用いたＮＬｐｏｌｙ  ５Ｐ−Ｂ９＋ＮＬｐｏｌｙ  Ｂ９の滴定
ＮＬｐｏｌｙ  ５Ｐ−Ｂ９＋ＮＬｐｏｌｙ  Ｂ９をＮＬｐｅｐ７８を用いて滴定した。２０μｌの５Ｐ−Ｂ９（未希釈）を２０μｌのペプチドＢ９−ＨＴ（未希釈）と混合した。ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中にＮＬｐｅｐ７８の希釈液（合成ペプチド、最高濃度＝１００ｕＭ）を作製した。２０μｌのＮＬｐｅｐ７８を４０μｌの５Ｐ−Ｂ９＋ペプチドＢ９−ＨＴ混合物に加え、室温で１０分間振盪した。６０μｌのＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを加え、室温で１０分間振盪した。ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分で発光を測定した。
【０１５８】
Ｂ）ＮＬｐｅｐＢ９−ＨＴを用いたＮＬｐｏｌｙ  ５Ｐ−Ｂ９＋ＮＬｐｅｐ７８の滴定
２０μｌのＮＬｐｏｌｙ  ５Ｐ−Ｂ９（未希釈）を２０μｌのＮＬｐｅｐ７８（１００ｕＭ）と混合した。ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中にペプチドＢ９−ＨＴ（最高濃度＝未希釈）の希釈液を作製した。２０μｌのペプチドＢ９−ＨＴを４０μｌの５Ｐ−Ｂ９＋ＮＬｐｅｐ７８混合物に加え、室温で１０分間振盪した。６０μｌのＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを加え、室温で１０分間振盪した。ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分で発光を測定した。
【０１５９】
図７３は、２つの異なるＮＬｐｅｐ及び切断ＮＬｐｏｌｙからなる三元系の実現可能性を示している。３つ全ての成分が、他の２つがないと非発光性であるため、この系は、各ＮＬｐｅｐを（合成的にまたは遺伝子操作で）結合部分及び高濃度で使用される切断ＮＬｐｏｌｙに融合して、結合部分間に相互作用が存在する場合にのみ光を生成するように、または３つの成分の各々を結合部分に融合し、三元複合体が形成した場合にのみ光を生成するように構成することができる。
【０１６０】
実施例４７
ＮＬｐｅｐ８８を用いた場合の相補性（６番目の残基としてアルギニンの代わりにグリシン含むＮＬｐｅｐ７８）
ＮＬｐｅｐ８８−ＨＴ及び５Ｐ大腸菌清澄化ライセートを以前に記載したように調製した。ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中にＮＬｐｅｐ８８−ＨＴライセートの段階希釈液を作製した。２０μｌの５Ｐライセートを２０μｌのＮＬｐｅｐ８８−ＨＴライセートと混合し、室温で１０分間振盪した。４０μｌのＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを加え、室温で１０分間振盪した。ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分で発光を測定した。図７４は、ＮＬｐｅｐの６番目の位置におけるアルギニン残基の重要性を示している。低濃度のＮＬｐｅｐ８８では５Ｐ単独を超える発光の増加は見られないが、高濃度のＮＬｐｅｐは発光を増加させたことから、触媒的に損なわれた複合体を示唆するものであって、５ＰとＮＬｐｅｐ８８との相互作用の欠落を示唆するものではない。
【０１６１】
実施例４８
ＨａｌｏＴａｇへのＮ末端融合体としてのＮＬｐｅｐ７８及び７９の細胞内局在化
Ｕ２ＯＳ細胞をプレートし、３７℃で一晩放置して回収した。次いで、ＨａｌｏＴａｇ単独のＤＮＡ構築物またはＨａｌｏＴａｇ−ＮａｎｏＬｕｃペプチドＤＮＡ構築物で細胞をトランスフェクトした（全てＣＭＶプロモーターの制御下）：ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して担体ＤＮＡ（ｐＳＩ）でＰ１−ＨＴ、Ｐ７８−ＨＴ、またはＰ７９−ＨＴを１：１０に希釈し、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、製造者の標準的な迅速標識プロトコルによりＨａｌｏＴａｇ−ＴＭＲリガンドで細胞を標識し、画像化した。図７５は、ＮＬｐｅｐ７８及び７９がＨａｌｏＴａｇタンパク質の細胞内局在化を変化させないことを示している。
【０１６２】
実施例４９
非発光性ポリペプチド（ＷＴ及び５Ｐ）の細胞内局在化
Ｕ２ＯＳをプレートし、３７℃で一晩放置して回収した。細胞は、非トランスフェクション対照として維持するか、またはＮａｎｏＬｕｃ  ＤＮＡ構築物でトランスフェクトするかのいずれかとした：ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して担体ＤＮＡ（ｐＳＩ）でＦＬ、ＮＬｐｏｌｙ（野生型）、またはＮＬｐｏｌｙ（５Ｐ）を１：１０に希釈し、室温で２４時間インキュベートした。細胞を固定し、続いてＩＣＣのために処理した。ＩＣＣは、１：５０００のＧＳ（ＰＲＯ）一次抗体を４℃で一晩使用し、続いて、Ａｌｅｘａ４８８ヤギ抗ウサギ二次抗体を使用して行った。図７６は、ＮＬｐｏｌｙ  ＷＴ及びＮＬｐｏｌｙ  ５Ｐの両方が細胞内で均一に局在化したことを示している。
【０１６３】
実施例５０
非発光性ポリペプチドは、対象となるタンパク質にコンジュゲートされた非発光性ペプチドを容易にかつ迅速に検出できることの証明
９９μｌのＮＬｐｅｐ５３−ＨＴ大腸菌清澄化ライセートを２４．７５μｌの４×ＳＤＳ負荷緩衝液と混合した。ライセート−負荷緩衝液混合物の１：１０の段階希釈液を作製し、９５℃で５分間インキュベートした。１５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した。ゲルが完成した後、ｉＢｌｏｔを使用してＰＶＤＦに移し、室温の１０ｍＬのＮＬｐｏｌｙ  Ｌ１４９Ｍ大腸菌清澄化ライセートで３０分間洗浄した。次いで、ＬＡＳ４０００イメージャー上に膜を配置し、２ｍＬのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを加えた。６０秒の曝露を行った（図７７）。
【０１６４】
実施例５１
５Ｐに関連する非発光性ポリペプチドの位置３１、４６、１０８、１４４、及び１５７における部位飽和
下の表５による部位でＮＬｐｏｌｙ５Ｐ（ｐＦ４Ａｇベクターバックグラウンド）に単一のアミノ酸変化を有する変異体を構築した。実際には、天然残基は、全部で９５個の変異体の１９個の代替アミノ酸の各々と異なっていた。
表５
2020097597.tif 000051
【０１６５】
個々のコロニーをＬＢ＋ａｍｐ中で増殖させ、３０℃で一晩インキュベートした。５Ｐ対照も含まれていた。一晩培養液を用いて新しいＬＢ＋ａｍｐ（１：１００）に接種し、これらの培養液を３７℃で２時間４５分増殖させた。ラムノースを０．２％まで加え、増殖させる／誘導するために２５℃で一晩培養液を放置した。１８時間の誘導後、０．５ＸＦａｓｔＢｒｅａｋを使用して（周囲温度で３０分）細胞を溶解し、ドライアイス上で瞬間凍結させ、−２０℃で保存した。迅速に融解した後、Ｐｅｐ８７（ＮＬｐｅｐ８７としても知られる）の非存在下及び存在下で試料をアッセイした。
【０１６６】
（−）ペプチド反応の場合、３０ｕＬのライセートを３０ｕＬのＰＢＳ（ｐＨ７．５）とともに１０分間インキュベートし、次いで、６０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加えた。５分後に発光を測定した。（＋）ペプチド反応の場合、３０ｕＬのライセートを３０ｕＬの８ｎＭ  Ｐｅｐ８７とともにインキュベートした。１０分後、６０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ試薬を加え、５分で発光を測定した。
【０１６７】
（−）ペプチド試料の発光（ＲＬＵ）データを５Ｐ対照の読み取り値に対して正規化し、これらの結果を図７８に提示する。（＋）ペプチド試料の発光（ＲＬＵ）データも５Ｐに対して正規化したが、次いで、シグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ；図７９）を表すために図７６の値に対しても正規化した。
【０１６８】
実施例５２
タンパク質の精製／プルダウンのためのＮＬｐｏｌｙとＮＬｐｅｐとの間の高親和性の使用
ＭＡＧＮＥＨＡＬＯＴＡＧビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｇ７２８Ａ）を以下のように平衡化した。
ａ）１ｍＬのビーズを約３０秒間磁石の上に静置し、緩衝液を除去した；ｂ）ビーズを磁石から除去し、１ｍＬのＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に再懸濁し、室温で５分間振盪した；ｃ）ステップａ）及びｂ）をさらに２回繰り返した。１ｍＬのＮＬｐｅｐ７８−ＨＴ清澄化ライセート中にビーズを再懸濁することによってＮＬｐｅｐ７８−ＨａｌｏＴａｇ（大腸菌清澄化ライセート）をＭＡＧＮＥＨＡＬＯＴＡＧビーズに結合させ、室温で１時間振盪し、約３０秒間磁石の上に静置した。ライセート（素通り画分）を除去し、分析のために保存した。１．５ｍＬの８Ｓライセート中にビーズを再懸濁することによって、ＮＬｐｏｌｙ  ８Ｓ（大腸菌清澄化ライセート）を上記ステップからのＮＬｐｅｐ７８結合−ＭａｇｎｅＨａｌｏＴａｇビーズに結合させ、室温で１時間振盪し、約３０秒間磁石の上に静置した。ライセート（素通り画分）を除去し、分析のために保存した。１ｍＬのＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中にビーズを再懸濁し、室温で５分間振盪し、約３０秒間磁石の上に静置し、ＰＢＳ（洗浄）を除去した。ビーズをさらに３回洗浄した。
【０１６９】
結合したペプチド／ポリペプチドを溶出するために、５００ｕＬの１×ＳＤＳ緩衝液中にビーズを再懸濁し、室温で５分間振盪した。次いで、ビーズを約３０秒間磁石の上に静置した；ＳＤＳ緩衝液（溶出）を除去し、分析のために保存した。溶出をさらに１回繰り返した。
【０１７０】
次いで、試料をゲルによって分析した。３７．５ｕＬの試料（溶出を除く）を１２．５ｕＬの４×ＳＤＳ緩衝液と混合し、９５℃で５分間インキュベートした。５ｕＬをＮｏｖｅｘ  ４−２０％  Ｔｒｉｓ−グリシンゲルに負荷し、約１８０Ｖで約５０分間泳動させた。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎでゲルを染色し、ＬＡＳ４０００イメージャー上で画像化した。
【０１７１】
図９４は、ＮＬｐｏｌｙとＮＬｐｅｐとの親和性が大腸菌ライセートからの精製を可能にするのに十分であることを示している。ＮＬｐｏｌｙ８Ｓが大腸菌ライセートから精製されるため、ＮＬｐｏｌｙ８Ｓ（または本明細書に記載の他の変異体）に融合したタンパク質も同様の様式で精製することができると予想することは理にかなっている。この実施例では、ＮＬｐｅｐは固定化され、ＮＬｐｏｌｙを精製するために使用されるが、ＮＬｐｏｌｙを固定化した場合にも同様の結果を予想することも理にかなっている。
【０１７２】
実施例５３
ＮＬｐｏｌｙ／ＮＬｐｅｐ結合の動態
合成ＮＬｐｅｐの２倍濃縮物を作製し、ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中で２．７倍に９回希釈した（１０の濃度）。アッセイに用いた最終濃度は３０ｕＭ〜３．９ｎＭであった。ＷＴ  ＮＬｐｏｌｙ（大腸菌清澄化ライセート；１：１０，０００）または１１Ｓ（１：１０，０００，０００）をＮａｎｏＧｌｏ＋１００ｕＭフラマジン（Ｆｚ）中に希釈した。５０ｕＬのＮＬｐｅｐを白色９６ウェルアッセイプレートのウェルに入れた。ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ＋機器上の注入器を使用して５０ｕＬのＮＬｐｏｌｙ／ＮａｎｏＧｌｏ／Ｆｚをウェルに注入し、５分にわたって３秒毎に発光を測定した。
Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してデータを
2020097597.tif 000052
に適合させることによりｋobsを得た。次いで、ｋon及びｋoffを
2020097597.tif 000053
に適合させた。図９５は、ＮＬｐｏｌｙとＮＬｐｅｐとの結合の会合速度定数及び解離速度定数を示している。
【０１７３】
実施例５４
ＮＬｐｏｌｙ／ＮＬｐｅｐ基質親和性
ＮＬｐｏｌｙを以下のようにＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に希釈した：ＷＴ：１：１０5、５Ｐ：１：１０7、及び１１Ｓ：１：１０8。ＮＬｐｅｐを以下のようにＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に希釈した：ＷＴ  ＮＬｐｏｌｙ試験の場合は３０ｕＭ、またはＮＬｐｏｌｙ  ５Ｐ及び１１Ｓ試験の場合は３ｕＭ。５０ｕＬのＮＬｐｏｌｙ／ＮＬｐｅｐを室温で５分インキュベートし、５０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ＋Ｆｚ（１００ｕＭ〜１．２ｕＭの範囲、２Ｘ）を加え、室温で１０分間インキュベートした。ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ＋上で０．５秒の積分で発光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ、ミカエリスメンテンの最良適合値を用いてＫｍを得た。図９６は、種々のＮＬｐｏｌｙ／ＮＬｐｅｐ対のＫｍ値を示す。
【０１７４】
実施例５５
ＮＬｐｏｌｙ／ＮＬｐｅｐ親和性に対する基質の影響
１１Ｓ（大腸菌清澄化ライセート）をＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に１：１０7で希釈した。合成ＮＬｐｅｐ７９を８００ｎＭから０．３９ｎＭ（２Ｘ）に段階希釈した（１：２）。次いで、２０ｕＬの１１Ｓ＋２０ｕＬのＮＬｐｅｐ７９を混合し、室温で５分間インキュベートした。４０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ＋５ｕＭまたは５０ｕＭ  Ｆｚを加え、室温でさらに５分間インキュベートした。ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ＋上で０．５秒の積分で発光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｐｒｉｓｍ、１サイト特異的結合の値を用いてＫｄを得た。図９７は、飽和濃度のフリマジンが１１ＳとＮＬｐｅｐ７９との親和性を増加させることを示している。
【０１７５】
実施例５６
ＮＬｐｏｌｙ  ５Ａ２：ＮＬｐｅｐのＫｍ
ＮＬｐｏｌｙ  ５Ａ２をＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に１：１０5で希釈した。ＮＬｐｅｐ（ＷＴ、ＮＬｐｅｐ  ７８またはＮＬｐｅｐ７９）をＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中３０ｕＭに希釈した。５０ｕＬのＮＬｐｏｌｙ／ＮＬｐｅｐを室温で５分インキュベートし、５０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ＋Ｆｚ（１００ｕＭ〜１．２ｕＭの範囲、２Ｘ）を加え、室温で１０分間インキュベートした。ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ＋上で０．５秒の積分で発光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ、ミカエリスメンテンの最良適合値を用いてＫｍを得た。図９８は、ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２、ならびにＮＬｐｅｐ  ＷＴ、７８、及び７９のＫｍ値を示す。
【０１７６】
実施例５７
ＮＬｐｅｐを用いない場合のＮＬｐｏｌｙの発光
ＮＬｐｏｌｙ  ＷＴ、５Ａ２、５Ｐ、８Ｓ、及び１１Ｓについて以前に記載したように大腸菌清澄化ライセートを調製した。５０ｕＬの各ライセートを５０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ  ＋Ｆｚと混合し、室温で５分間インキュベートした。ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ＋上で０．５秒の積分で発光を測定した。図９９は、ＮＬｐｏｌｙがＮＬｐｅｐの非存在下で発光を生成する能力が、進化過程を通して次第に増加し、１１Ｓの場合にはＷＴ  ＮＬｐｏｌｙよりも約５００倍高い発光をもたらしたことを示している。
【０１７７】
実施例５８
進化過程を通した大腸菌における発光の改善
ＷＴ、５Ａ２、５Ｐ、８Ｓ、または１１Ｓの単一ＮＬｐｏｌｙコロニーを２００ｕＬの最少培地に接種し、振盪機上で２０時間３７℃で増殖させた。１０ｕＬの一晩培養液を１９０ｕＬの新しい最少培地中に希釈し、振盪機上で２０時間３７℃で増殖させた。１０ｕＬのこの一晩培養液を１９０ｕＬの自己誘導培地（以前に記載した）中に希釈し、振盪機上で１８時間２５℃で増殖させた。自己誘導培養液を５０倍（１９６ｕＬのアッセイ溶解緩衝液中４ｕＬ）に希釈し、１０ｕＬの発現培養液をＮＬｐｅｐ（合成；１ｎＭ；ＷＴ、ＮＬｐｅｐ７８、ＮＬ７９またはＮＬｐｅｐ８０）を含有する４０ｕＬのアッセイ溶解緩衝液に加え、室温で１０分間振盪した。５０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ＋Ｆｚを加え、室温で５分間試料を振盪した。ＧｌｏＭａｘルミノメーター上で０．５秒の積分で発光を測定した。図１００は、進化過程にわたって大腸菌由来ＮＬｐｏｌｙからの発光の改善を示しており、全体として約１０5の改善が見られた（ＮＬｐｏｌｙＷＴ：ＮＬｐｅｐＷＴからＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ：ＮＬｐｅｐ８０）。
【０１７８】
実施例５９
進化過程を通したＨｅＬａ細胞における発光の改善
ＮＬｐｏｌｙ  ＷＴ、５Ａ２、５Ｐ、８Ｓ、または１１Ｓを発現する５０ｎｇのプラスミドＤＮＡを１２ウェルプレートのウェル中でＦｕｇｅｎｅ  ＨＤを使用してＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。次いで、細胞を３７℃／５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。培地を５００ｕＬのフェノールレッド不含ＤＭＥＭと交換し、−８０℃で＞３０分超細胞を凍結させた。細胞を融解し、１．５ｍｌ試験管に移した。ＮＬｐｅｐ  ＷＴ、ＮＬｐｅｐ７８、ＮＬｐｅｐ７９、またはＮＬｐｅｐ８０（合成）をＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中１０ｎＭに希釈し、２５ｕｌを２５ｕＬの各ＮＬｐｏｌｙ細胞ライセートと混合した。試料を室温で１０分間振盪し、次いで５０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ＋１００ｕＭ  Ｆｚを加え、室温で５分間インキュベートした。ＧｌｏＭａｘルミノメーター上で０．５秒の積分で発光を測定した。図１０１は、進化過程にわたってＨｅＬａで発現させたＮＬｐｏｌｙからの発光の改善を示しており、全体として約１０5の改善が見られた（ＮＬｐｏｌｙＷＴ：ＮＬｐｅｐＷＴからＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ：ＮＬｐｅｐ８０）。
【０１７９】
実施例６０
進化過程を通したＨＥＫ２９３細胞における発光の改善
ＮＬｐｏｌｙ  ＷＴ、５Ａ２、５Ｐ、８Ｓ、または１１Ｓを発現する５０ｎｇのプラスミドＤＮＡを１２ウェルプレートのウェル中でＦｕｇｅｎｅ  ＨＤを使用してＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。次いで、細胞を３７℃／５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。培地を５００ｕＬのフェノールレッド不含ＤＭＥＭと交換し、−８０℃で＞３０分超細胞を凍結させた。細胞を融解し、１．５ｍｌ試験管に移した。ＮＬｐｅｐ  ＷＴ、ＮＬｐｅｐ７８、ＮＬｐｅｐ７９、またはＮＬｐｅｐ  ８０（合成）をＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中１０ｎＭに希釈し、２５ｕｌを２５ｕＬの各ＮＬｐｏｌｙ細胞ライセートと混合した。試料を室温で１０分間振盪し、次いで５０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ＋１００ｕＭ  Ｆｚを加え、室温で５分間インキュベートした。発光ＧｌｏＭａｘルミノメーター上で０．５秒の積分で発光を測定した。図１０２は、進化過程にわたってＨＥＫ２９３で発現させたＮＬｐｏｌｙからの発光の改善を示しており、全体として約１０4の改善が見られた（ＮＬｐｏｌｙＷＴ：ＮＬｐｅｐＷＴからＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ：ＮＬｐｅｐ８０）。
【０１８０】
実施例６１
進化過程を通した結合親和性の改善
ＮＬｐｏｌｙ  ＷＴ、５Ａ２、５Ｐ、８Ｓ、または１１Ｓ（大腸菌清澄化ライセート）を以下のようにＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に希釈した：ＷＴ  １：１０4;５Ａ２  １：１０５；５Ｐ  １：１０6；８Ｓ  １：１０7；及び１１Ｓ  １：１０7。ＮＬｐｅｐＷＴ、ＮＬｐｅｐ７８、ＮＬｐｅｐ７９、またはＮＬｐｅｐ８０（合成）をＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中４倍濃度に希釈した。２５ｕＬのＮＬｐｏｌｙを２５ｕＬのＮＬｐｅｐと混合し、室温で１０分間インキュベートした。５０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ＋１００ｕＭ  Ｆｚを加え、室温で５分間インキュベートした。ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ＋上で０．５秒の積分で発光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ、１サイト特異的結合の最良適合値を用いてＫｄを決定した。図１０３は、野生型と比べて１０4倍改善された試験した変異体の親和性（出発親和性：ＮＬｐｏｌｙＷＴ：ＮＬｐｅｐＷＴ、Ｋｄ〜１０ｕＭ）であるＫd＜１ｎＭ（ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ：ＮＬｐｅｐ８６またはＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ：ＮＬｐｅｐ８０）を示している。
【０１８１】
実施例６２
ＮＬｐｏｌｙの発光
単一のＮＬｐｏｌｙ変異体コロニーを２００ｕＬの最少培地に接種し、振盪機上で２０時間３７℃で増殖させた。１０ｕＬの一晩培養液を１９０ｕＬの新しい最少培地中に希釈し、振盪機上で２０時間３７℃で増殖させた。次いで、１０ｕＬのこの一晩培養液を１９０ｕＬの自己誘導培地（以前に記載した）中に希釈し、振盪機上で１８時間２５℃で増殖させた。１０ｕＬのこの発現培養液を、ＮＬｐｅｐまたはＮＬｐｅｐ７８−ＨＴ（１：３，８６０希釈）またはＮＬｐｅｐ７９−ＨＴ（１：１０，０００希釈）を含まない４０ｕＬのアッセイ溶解緩衝液（以前に記載した）と混合し、室温で１０分間振盪した。５０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ＋Ｆｚを加え、室温で１０分間再び振盪した。ＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーター上で０．５秒の積分で発光を測定した。図１０５〜１０７は、ＮＬｐｅｐの非存在下における種々のＮＬｐｏｌｙの発光を示す。
【０１８２】
実施例６３
ＮＬｐｏｌｙ変異体の溶解性
単一のＮＬｐｏｌｙ変異体コロニー（図１４３を参照）を５ｍＬのＬＢ培養液に接種し、振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。一晩培養液を新しいＬＢ中に１：１００で希釈し、振盪しながら３７℃で３時間インキュベートした。培養液にラムノースを０．２％まで加え、振盪しながら２５℃で一晩インキュベートした。９００ｕｌのこれらの一晩培養液を１００ｕＬの１０Ｘ  ＦａｓｔＢｒｅａｋ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。各培養液から７５ｕＬアリコート（合計）を除去し、分析のために保存した。卓上微量遠心機にて４℃で１５分間、各試料からの残りの培養液を１４，０００×ｒｐｍで遠心分離した。各試料から上清（可溶性）の７５ｕＬアリコートを除去し、分析のために保存した。２５ｕＬの４×ＳＤＳ緩衝液を保存したアリコートに加え、９５℃で５分間インキュベートした。５ｕｌの各試料を４〜２０％トリス−グリシンＳＤＳゲルに負荷し、約１９０Ｖで約５０分間泳動した。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎでゲルを染色し、ＬＡＳ４０００上で画像化した。図１４３は、ＮＬｐｏｌｙ変異体の全ライセート及び同じライセートの可溶画分のタンパク質ゲルを示す。
【０１８３】
実施例６４
解離定数
ＮＬｐｏｌｙ変異体ライセート（図１４４を参照；以前に記載したように調製した）をＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に１：１０で希釈した。ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中にＮＬｐｅｐ７８（合成ＮＬｐｅｐ７８）の４倍濃縮物を作製した。２０ｕＬのＮＬｐｏｌｙ変異体ライセートを２０ｕＬのＮＬｐｅｐと混合し、室温で１０分間振盪した。４０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ／Ｆｚを加え、室温で１０分間振盪した。ＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーター上で０．５秒の積分で発光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ、１サイト特異的結合の最良適合値を用いてＫｄを決定した。図１４４は、種々のＮＬｐｏｌｙを用いた場合のＮＬｐｅｐ７８の解離定数を示している。
【０１８４】
実施例６５
ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びＮＬｐｅｐ８０／８７に融合した異なる組み合わせのＦＲＢ及びＦＫＢＰを発現する細胞によって発生した発光の比較
１：４のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（４００，０００個）に、ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及び／またはＮＬｐｅｐ８０／８７のＮまたはＣ末端融合体を発現する１μｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰまたは１μｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢでリバーストランスフェクションを行った。トランスフェクション後２４時間で細胞をトリプシン処理し、不透明９６ウェルアッセイプレートにウェル当たり１０，０００細胞の密度で再度プレートした。プレートから２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、フェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩ中で１５、６０、または１２０分間、２０ｎＭラパマイシンを用いてまたは用いずにインキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭ中に２０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まない１０μＭフリマジン基質を各ウェルに直接加え、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。図１０８（１５分誘導）、１０９（６０分誘導）、及び１１０（１２０分誘導）は、誘導における全体的な増加を経時的に示しており、ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びＮＬｐｅｐ８０の組み合わせが最も多くの発光を生成した。個々の成分は、シグナルに最小限寄与する。
【０１８５】
実施例６６
ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びＮＬｐｅｐ８０／８７に融合した異なる組み合わせのＦＲＢ及びＦＫＢＰを発現する細胞によって発生した発光の比較
実施例６５と類似しているが、この実施例では、ＮＬｐｏｌｙ／ＮＬｐｅｐに融合したＦＲＢ及びＦＫＢＰの８つ全ての可能な組み合わせを試験し、より少ない全ＤＮＡを使用した。１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（４００，０００個）に、全部で０．００１μｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及び０．００１μｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／ＮＬｐｅｐ８７でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを１μｇとした。トランスフェクション後２４時間で、不透明９６ウェルアッセイプレートに１０，０００個の細胞を再度プレートし、さらに２４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、０または５０ｎＭラパマイシンを含むフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩ中で２時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭ中に０または５０ｎＭラパマイシンを含む１０μＭフリマジン基質（細胞上の最終濃度）を各ウェルに直接加え、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。図１１１は、ＮＬｐｅｐ８０の組み合わせが最も高い発光を生成したこと、及び全ての構造がラパマイシン処理に反応したことを示している。
【０１８６】
実施例６７
結合パートナーの非存在化で発現させたＦＲＢまたはＦＫＢＰ融合体によって発生した発光の比較
１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（４００，０００個）に、全部で０．００１μｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５ＰまたはｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／ＮＬｐｅｐ８７でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを１μｇとした。トランスフェクション後２４時間で、不透明９６ウェルアッセイプレートに１０，０００個の細胞を再度プレートし、さらに２４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、０または５０ｎＭラパマイシンを含むフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩ中で２時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭ中に０または５０ｎＭラパマイシンを含む１０μＭフリマジン基質（細胞上の最終濃度）を各ウェルに直接加え、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。図１１２は、個々の成分が、ラパマイシン処理に反応しない低い基本レベルの発光を生成することを示している。
【０１８７】
実施例６８
様々な量のＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／８７ＤＮＡでトランスフェクトした細胞によって発生した発光の比較
１対４のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ（４００，０００個）細胞に、全部で２、０．２、０．０２、または０．００２μｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを２μｇとした。トランスフェクション後２４時間で、不透明９６ウェルアッセイプレートに１０，０００個の細胞を再度プレートし、さらに２４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、２０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まないフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩ中で２時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭ中に２０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まない１０μＭフリマジン基質（細胞上の最終濃度）を各ウェルに直接加え、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。図１１３は、より少ないＤＮＡを用いたトランスフェクションは、全体的な発光を低下させるが、誘導倍数は増加させることを示している。
【０１８８】
実施例６９
結合パートナーの非存在下で様々な量のＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５ＰまたはＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／８７ＤＮＡでトランスフェクトした細胞によって発生した発光の比較
１対４のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（４００，０００個）に、全部で２、０．２、０．０２、または０．００２μｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５ＰまたはｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを２μｇとした。トランスフェクション後２４時間で、不透明９６ウェルアッセイプレートに１０，０００個の細胞を再度プレートし、さらに２４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、２０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まないフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩ中で２時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭ中に２０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まない１０μＭフリマジン基質（細胞上の最終濃度）を各ウェルに直接加え、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。図１１４は、より少ないＤＮＡレベルは、個々の成分でトランスフェクトした細胞の全体的な発光を変化させないことを示している。
【０１８９】
実施例７０
様々な量のＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／８７ＤＮＡでトランスフェクトした細胞によって発生した発光の比較
１対４のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（４００，０００個）に、全部で０．２、０．０２、０．００２、または０．０００２μｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／ＮＬｐｅｐ８７でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを２μｇとした。トランスフェクション後２４時間で、不透明９６ウェルアッセイプレートに１０，０００個の細胞を再度プレートし、さらに２４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、５０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まないフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩ中で２時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭ中に５０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まない１０μＭフリマジン基質（細胞上の最終濃度）を各ウェルに直接加え、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。図１１５は、実施例６９及び７１で決定されるように、バックグラウンドを上回る発光を示し、２．５ｐｇまで低下したＤＮＡレベルでラパマイシン誘導を達成できることを示している。
【０１９０】
実施例７１
結合パートナーの非存在下で様々な量のＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５ＰまたはＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／８７ＤＮＡでトランスフェクトした細胞によって発生した発光の比較
１対４のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（４００，０００個）に、全部で０．２、０．０２、０．００２、または０．０００２μｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５ＰまたはｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／ＮＬｐｅｐ８７でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを２μｇとした。トランスフェクション後２４時間で、不透明９６ウェルアッセイプレートに１０，０００個の細胞を再度プレートし、さらに２４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、５０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まないフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩ中で２時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭ中に５０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まない１０μＭフリマジン基質（細胞上の最終濃度）を各ウェルに直接加え、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。図１１６は、少ないＤＮＡが使用された場合に、個々の成分によって発生した発光に著しい変化が見られなかったことを示している。
【０１９１】
実施例７２
異なる長さの時間ラパマイシンで処理した後に、様々な量のＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０またはＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８７ＤＮＡでトランスフェクトした細胞によって発生した発光の比較
１対４のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（４００，０００個）に、全部で２、０．２、０．０２、または０．００２μｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０またはＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８７でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを２μｇとした。トランスフェクション後２４時間で、不透明９６ウェルアッセイプレートに１０，０００個の細胞を再度プレートし、さらに２４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、２０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まないフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩ中で５／１５／３０／６０／１２０分間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭ中に２０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まない１０μＭフリマジン基質（細胞上の最終濃度）を各ウェルに直接加え、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。図１１７及び１１８は、少ないＤＮＡを用いた場合の発光の低下、及び経時的なラパマイシン誘導の増加を示している。
【０１９２】
実施例７３
異なる組み合わせのＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５ＰまたはＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／８７／９５／９６／９７を発現する細胞によって発生した発光の比較
この実施例では、２日間及び３日間形式の両方でアッセイを行った。２日間アッセイの場合、不透明９６ウェルアッセイプレート内で、１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、２０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、全部で０．１ｎｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５ＰまたはＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／８７／９５／９６／９７でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを１μｇとした。トランスフェクション後２４時間で細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、５０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まないフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩ中で２時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭＩ中に５０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まない１０μＭフリマジン基質（細胞上の最終濃度）を各ウェルに直接加え、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。
【０１９３】
３日間アッセイの場合、１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、４００，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、全部で０．００２μｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／８７／９５／９６／９７でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを１μｇとした。トランスフェクション後２４時間で、不透明９６ウェルアッセイプレートに１０，０００個の細胞を再度プレートし、さらに２４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、５０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まないフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩ中で２時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭＩ中に５０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まない１０μＭフリマジン基質（細胞上の最終濃度）を各ウェルに直接加え、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。図１１９及び１２０は、２日間及び３日間アッセイの両方において同様のレベルの発光を示している。ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２を用いて行われたアッセイは、ＮＬｐｏｌｙ５Ｐと比較して高いラパマイシン誘導を示し、ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２及びＮＬｐｅｐ９６を用いて行われたアッセイは、試験した全ての組み合わせで最も高いラパマイシン誘導を示した。
【０１９４】
実施例７３
異なる組み合わせのＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２またはＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１／１０４／１０５／１０６／１０７／１０８／１０９／１１０を発現する細胞によって発生した発光の比較
不透明９６ウェルアッセイプレート内で、１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００個）に、全部で０．１ｎｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２／１１Ｓ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１／１０４／１０５／１０６／１０７／１０８／１０９／１１０でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを１μｇとした。トランスフェクション後２４時間で細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、５０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まないフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩ中で２時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭＩ中に５０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まない１０μＭフリマジン基質（細胞上の最終濃度）を各ウェルに直接加え、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。図１２１は、試験を行った組み合わせのうち、ＮＬｐｅｐ１０１及びＮＬｐｏｌｙ１１Ｓが、最も高いラパマイシン誘導及び最も強力なラパマイシン特異的発光シグナルのうちの１つを示したことを示している。
【０１９５】
実施例７４
異なる組み合わせのＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２またはＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８７／９６／９８／９９／１００／１０１／１０２／１０３でトランスフェクトした細胞によって発生した発光の比較
不透明９６ウェルアッセイプレート内で、１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００個）に、全部で０．１ｎｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２／１１Ｓ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８７／９６／９８／９９／１００／１０１／１０２／１０３でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを１μｇとした。トランスフェクション後２４時間で細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、５０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まないフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩ中で２時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭＩ中に５０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まない１０μＭフリマジン基質（細胞上の最終濃度）を各ウェルに直接加え、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。図１２２は、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ１０１の組み合わせが、高いレベルの特異的発光を維持しながら、最も高い誘導をもたらすことを示している。
【０１９６】
実施例７５
異なるレベルのＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８７／１０１／１０２／１０７ＤＮＡでトランスフェクトした細胞によって発生した発光の比較
不透明９６ウェルアッセイプレート内で、１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００個）に、全部で０．０１、０．１、１、または１０ｎｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８７／１０１／１０２／１０７でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを１μｇとした。トランスフェクション後２４時間で細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、５０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まないフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩ中で１．５時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭＩ中に５０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まない１０μＭフリマジン基質（細胞上の最終濃度）を各ウェルに直接加え、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。図１２３は、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ１０１が、試験した全てのＤＮＡレベルの未処理の試料において全体的に最も低い発光をもたらすこと、及びこの組み合わせが、ラパマイシン処理した試料において比較的高いレベルの発光を維持することを示している。
【０１９７】
実施例７６
異なるレベルのＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８７／１０１／１０２／１０７ＤＮＡでトランスフェクトした細胞によって発生した発光の比較
不透明９６ウェルアッセイプレート内で、１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００個）に、全部で０．０１、０．１、１、または１０ｎｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８７／１０１／１０２／１０７でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを１μｇとした。トランスフェクション後２４時間で細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、５０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まないフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩ中で１．５時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭＩ中に５０ｎＭラパマイシンを含むかまたは含まない１０μＭフリマジン基質（細胞上の最終濃度）を各ウェルに直接加え、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。図１２４は、ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２が、未処理の試料において、実施例７５に示されるＮＬｐｏｌｙ１１Ｓよりも高い発光を生成することを示している。
【０１９８】
実施例７７
ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／８７ＤＮＡを発現する細胞の発光を示すラパマイシン用量反応曲線
１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（４００，０００個）に、全部で０．００１μｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及び０．００１μｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０／ＮＬｐｅｐ８７でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを１μｇとした。トランスフェクション後２４時間で、不透明９６ウェルアッセイプレートに１０，０００個の細胞を再度プレートし、さらに２４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、０〜５００ｎＭラパマイシンを含むフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩ中で２時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭ中に０〜５００ｎＭラパマイシンを含む１０μＭフリマジン基質（細胞上の最終濃度）を各ウェルに直接加え、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．００を用いてＫｄを算出した。図１２５は、発光のラパマイシン特異的増加を示す。
【０１９９】
実施例７８
ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８７／１０１ＤＮＡを発現する細胞の発光を示すラパマイシン用量反応曲線
不透明９６ウェルアッセイプレート内で、１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００個）に、全部で０．１ｎｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２／１１Ｓ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８７／１０１でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを１μｇとした。トランスフェクション後２４時間で細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、０〜１μＭラパマイシンを含むフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩ中で１．５時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭＩ中に０〜１μＭラパマイシンを含む１０μＭフリマジン基質（細胞上の最終濃度）を各ウェルに直接加え、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。図１２６は、ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２／ＮＬｐｅｐ１０１及びＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＮＬｐｅｐ１０１の組み合わせを用いた場合のラパマイシンに対するシグモイド用量反応を示している。ＮＬｐｅｐ８７を含む組み合わせは、ラパマイシンを用いると発光の増加を示すが、収集データポイントはシグモイド曲線からさらに逸脱している。
【０２００】
実施例７９
ＦＲＢ−１１Ｓ及びＦＫＢＰ−１０１を発現する、基質ＰＢＩ−４３７７またはフリマジンで処理した細胞によって発生した発光の比較
不透明９６ウェルアッセイプレート内で、１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００個）に、全部で０．１／１／１０ｎｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを１μｇとした。トランスフェクション後２４時間で細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、０または５０ｎＭラパマイシンを含むフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩ中で１．５時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭ中に０または５０ｎＭラパマイシンを含む１０μＭフリマジンまたはＰＢＩ−４３７７基質（細胞上の最終濃度）を各ウェルに直接加え、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。図１２７は、フリマジン基質と比較して、ＰＢＩ−４３７７基質を用いた場合の発光及び誘導倍数の増加を示している。
【０２０１】
実施例８０
ラパマイシンの存在下または非存在下で生じたＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／５Ａ２及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８７／１０１を発現する細胞の経時変化
不透明９６ウェルアッセイプレート内で、１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００個）に、全部で０．１ｎｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／５Ａ２及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８７／１０１でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを１μｇとした。トランスフェクション後２４時間で細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、０または５０ｎＭラパマイシン及び１０μＭフリマジンを含むフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩを、手動でまたは器具による注入により加えた。ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で速やかに発光を測定した。図１２８及び１２９は、試験を行った全ての組み合わせのうち、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ１０１が、０時点で最も低い発光を有し、発光がより速く一定となり、最大ダイナミックレンジを有することを示している。
【０２０２】
実施例８１
２つの異なる機器で測定されたＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１によって発生した発光
不透明９６ウェルアッセイプレート内で、１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００個）に、全部で０．１ｎｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを１μｇとした。トランスフェクション後２４時間で細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、０または５０ｎＭラパマイシン及び１０μＭフリマジンを含むフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩを２０分間加えた。０または５０ｎＭラパマイシンを含むＯｐｔｉＭＥＭＩ中の１０μＭフリマジン（細胞上の最終濃度）を加え、さらに５分間インキュベートした。ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で、またＶａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ上で４５０ｎＭのバンドパスフィルターを用いて、速やかに発光を測定した。図１３０は、異なる機器上でＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１のラパマイシン特異的誘導を測定できることを示している。
【０２０３】
実施例８２
ラパマイシン処理後の種々の時点でＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１を発現する細胞の発光を示す画像
１対４のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨｅＬａ細胞（５００，０００個）に、１μｇのｐＦ４  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及び１μｇのｐＦ４  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１でリバーストランスフェクションを行った。３５ｍｍガラス底培養皿（ＭａｔＴｅｋ番号ｐ３５ｇｃ−１．５−１４−Ｃ）内で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間で細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、ＯｐｔｉＭＥＭ中の１０μＭフリマジンで５分間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭ中の５０ｎＭラパマイシンを細胞に加え、ＬＶ２００を用いて、合計２０分間１０秒間隔で発光画像を獲得した。機器は３７℃、対物レンズは６０Ｘ、ゲインは２００、露出は６００ｍｓであった。図１３１は、ラパマイシンで処理した後にＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１を発現する細胞において、細胞の発光の増加を検出できることを示している。
【０２０４】
実施例８３
ラパマイシン処理後の種々の時点でＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１を発現する個々の細胞によって生成されるシグナルの定量
１対４のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨｅＬａ細胞（５００，０００個）に、１μｇのｐＦ４  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及び１μｇのｐＦ４  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１でリバーストランスフェクションを行った。３５ｍｍガラス底培養皿（ＭａｔＴｅｋ  番号ｐ３５ｇｃ−１．５−１４−Ｃ）内で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間で細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、ＯｐｔｉＭＥＭ中の１０μＭフリマジンで５分間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭ中の５０ｎＭラパマイシンを細胞に加え、ＬＶ２００を用いて、合計２０分間１０秒間隔で発光画像を獲得した。機器は３７℃、対物レンズは６０Ｘ、ゲインは２００、露出は６００ｍｓであった。全期間にわたって、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して視野内のあらゆる細胞のシグナル強度を分析した。図１３２は、個々の細胞によって生成されるシグナルを測定できること、及び各細胞によるシグナルの増加は、図１２８及び１２９に示される９６ウェルプレートアッセイで観察された増加と平行していることを示している。
【０２０５】
実施例８４
ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１を発現する異なる細胞株における発光の比較
不透明９６ウェルアッセイプレート内で、１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ、またはＵ２−ＯＳ細胞（２０，０００個）に、全部で０．１ｎｇ  ｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを１μｇとした。トランスフェクション後２４時間で細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、０または５０ｎＭラパマイシン及び１０μＭフリマジンを含むフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩを２０分間加えた。０または５０ｎＭラパマイシンを含むＯｐｔｉＭＥＭＩ中の１０μＭフリマジン（細胞上の最終濃度）を加え、さらに５分間インキュベートした。ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で速やかに発光を測定した。図１３３は、ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１でトランスフェクトした３つの異なる細胞株において、ラパマイシンの非存在下及び存在下で発生した同様のレベルの発光を示す。
【０２０６】
実施例８５
ラパマイシン競合阻害剤ＦＫ５０６で処理した後に、ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１を発現する細胞によって発生した発光の比較
不透明９６ウェルアッセイプレート内で、１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００個）に、全部で０．１ｎｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを１μｇとした。トランスフェクション後２４時間で細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、０または２０ｎＭラパマイシンを含むフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩを２０分間加えた。ＯｐｔｉＭＥＭ中のＦＫ５０６阻害剤を最終濃度５μＭで細胞に加え、３または５時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭ中のフリマジンを加え、細胞上の最終濃度を１０μＭとした。ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で速やかに発光を測定した。図１３４は、競合阻害剤ＦＫ５０６で処理した後にラパマイシンで誘導された発光の低下を示す。
【０２０７】
実施例８６
ラパマイシン競合阻害剤ＦＫ５０６で処理した後に、ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１を発現する細胞によって発生した発光
不透明９６ウェルアッセイプレート内で、１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００個）に、全部で０．１ｎｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１０１でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを１μｇとした。トランスフェクション後２４時間で細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、０または２０ｎＭラパマイシンを含むフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩを２．５時間加えた。ＯｐｔｉＭＥＭ中のＦＫ５０６阻害剤を、１０μＭのＯｐｔｉＭＥＭ中０、１、または１０μＭの最終濃度で注入器を介して細胞に加えた。３７℃に設定されたＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で、０．５秒の積分時間で１０分毎に４時間発光を測定した。図１３５は、２００秒までに、ＦＫ５０６阻害剤が、未処理細胞のレベル付近まで発光を低下させることができることを示す。
【０２０８】
実施例８７
Ｖ２ＲアゴニストＡＶＰの存在下または非存在下で異なる組み合わせのＶ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２またはＶ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ８７／１０１−ＡＲＲＢ２でトランスフェクトした細胞によって発生した発光
不透明９６ウェルアッセイプレート内で、１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００個）に、全部で０．１、１、または１０ｎｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  Ｖ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＡＲＲＢ２−ＮＬｐｅｐ８７／１０１でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを１μｇとした。トランスフェクション後２４時間で細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、０または１μＭ  ＡＶＰ及び１０μＭフリマジンを含むフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩを２５分間加えた。次いで、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。図１３６は、Ｖ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ１０１が発光において最も高いＡＶＰ特異的増加をもたらすことを示している。ＮＬｐｅｐ８７との組み合わせは、ＡＶＰに対して著しい反応を示さない。
【０２０９】
実施例８８
ＡＶＰで処理した後にＶ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２またはＶ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ８７／１０１−ＡＲＲＢ２でトランスフェクトした細胞によって発生した発光を示す経時変化
不透明９６ウェルアッセイプレート内で、１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００個）に、全部で０．１もしくは１ｎｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  Ｖ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓまたは１ｎｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  Ｖ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＡＲＲＢ２−ＮＬｐｅｐ８７／１０１でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを１μｇとした。トランスフェクション後２４時間で細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、０または１μＭ  ＡＶＰ及び１０μＭフリマジンを含むフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩを、手動で（図１３７）または器具による注入により（図１３８）加えた。次いで、室温で（図１３７及び１３８）または３７℃で（図１３９）、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で５分毎に２５分間発光を測定した。図１３７及び１３８は、Ｖ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ１０１−ＡＲＲＢ２について、ＡＶＰで誘導された発光の時間依存性増加（６００秒でピークに達し始める）を示す。Ｖ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ５Ａ２及びＮＬｐｅｐ８７の組み合わせは、経時的に著しい発光の増加を示さない。図１３９は、３７℃で、試験を行った全てのＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ１０１の組み合わせが、平均して２００秒のＡＶＰで誘導された発光の時間依存性増加を示すことを示している。
【０２１０】
実施例８９
Ｖ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ１０１−ＡＲＲＢ２を発現する異なる細胞株における発光の比較
不透明９６ウェルアッセイプレート内で、１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ、またはＵ２−ＯＳ細胞（２０，０００個）に、全部で１ｎｇのｐＦ４Ａ  Ａｇ  Ｖ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＡＲＲＢ２−ＮＬｐｅｐ８７／１０１でリバーストランスフェクションを行った。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを加え、各トランスフェクションにおいて全ＤＮＡを１μｇとした。トランスフェクション後２４時間で細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、０または１μＭ  ＡＶＰを含むフェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭＩを２０分間加えた。次いで、ＯｐｔｉＭＥＭ中のフリマジンを加えて細胞上の最終濃度を１０μＭとし、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ上で０．５秒の積分時間で発光を測定した。
【０２１１】
図１４０は、ＡＶＰの存在下及び非存在下でＶ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ１０１−ＡＲＲＢ２を発現する３つの異なる細胞株における同様の発光レベルを示している。
【０２１２】
実施例９０
ＡＶＰ処理後の種々の時点でＶ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ１０１−ＡＲＲＢ２を発現する細胞の発光
１対４のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比でＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを使用して、ＨｅＬａ細胞（５００，０００個）に、１μｇのｐＦ４  Ａｇ  Ｖ２Ｒ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及び１μｇのｐＦ４  Ａｇ  ＡＲＲＢ２−ＮＬｐｅｐ１０１でリバーストランスフェクションを行った。３５ｍｍガラス底培養皿（ＭａｔＴｅｋ番号ｐ３５ｇｃ−１．５−１４−Ｃ）内で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間で細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、ＯｐｔｉＭＥＭ中の１０μＭフリマジンで５分間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭ中の１μＭ  ＡＶＰを細胞に加え、ＬＶ２００を用いて、合計３０分間１５秒間隔で発光画像を獲得した。機器は３７℃、対物レンズは６０Ｘまたは１５０Ｘ、ゲインは６００、露出は１ｓまたは２ｓであった。図１４１及び１４２は、画像処理により、ＡＶＰで処理した後の個々の細胞における発光の増加及び斑点の形成を検出できることを示している。
【０２１３】
実施例９１
ＮＬｐｅｐの解離定数
ＮＬｐｏｌｙ  ５ＰE大腸菌清澄化ライセート（以前に記載したように調製した）をＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に１：１，０００で希釈した。ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中にＮＬｐｅｐ７８−ＨＴ（以前に記載したように調製した大腸菌清澄化ライセート）の４倍濃縮物を作製した。２０ｕＬのＮＬｐｏｌｙ  ５Ｐを２０ｕＬのＮＬｐｅｐ７８と混合し、室温で１０分間振盪した。４０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ／Ｆｚを加え、室温で１０分間振盪した。ＧｌｏＭａｘルミノメーター上で０．５秒の積分で発光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ、１サイト特異的結合の最良適合値を用いてＫｄを決定した。図８０は、ＮＬｐｅｐ７８の１つまたは２つのいずれかの反復単位からなるＮＬｐｅｐについて解離定数を比較している。
【０２１４】
実施例９２
ＮＬｐｏｌｙ  ５Ａ２とＮＬｐｅｐ８６との親和性
ＮＬｐｏｌｙ  ５Ａ２ライセート（ＣＨＯ細胞をトランスフェクトした後に以前に記載したように調製した）をＰＢ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に１：１０で希釈した。ＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中にＮＬｐｅｐ８６（合成ＮＬｐｅｐ）の４倍濃縮物を作製した。２０ｕＬのＮＬｐｏｌｙを２０ｕＬのＮＬｐｅｐと混合し、室温で１０分間振盪した。４０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ／Ｆｚを加え、室温で１０分間振盪した。ＧｌｏＭａｘ  ルミノメーター上で０．５秒の積分で発光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ、１サイト特異的結合の最良適合値を用いてＫｄを決定した。図８１は、ＮＬｐｏｌｙ  ５Ａ２とＮＬｐｅｐ８６との親和性を示している。
【０２１５】
実施例９３
ＮＬｐｏｌｙ変異体の発光
種々のＮＬｐｏｌｙの単一コロニーを２００ｕＬの最少培地に個別に接種し、振盪機上で２０時間３７℃で増殖させた。１０ｕＬの一晩培養液を１９０ｕＬの新しい最少培地中に希釈し、振盪機上で２０時間３７℃で増殖させた。１０ｕＬのこの一晩培養液を１９０ｕＬの自己誘導培地（以前に記載した）中に希釈し、振盪機上で１８時間２５℃で増殖させた。１０ｕＬの発現培養液を、ＮＬｐｅｐを含まないか、またはＮＬｐｅｐ７８−ＨＴ（１：３，８６０希釈）もしくはＮＬｐｅｐ７９−ＨＴ（１：１０，０００希釈）を含む４０ｕＬのアッセイ溶解緩衝液（以前に記載した）と混合した。混合物を室温で１０分間振盪し、５０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ＋Ｆｚを加え、室温で１０分間再び振盪した。ＧｌｏＭａｘ  ルミノメーター上で０．５秒の積分で発光を測定した。図８２は、ＮＬｐｅｐを用いない場合、またはＮＬｐｅｐ７８もしくはＮＬｐｅｐ７９を用いた場合のＮＬｐｏｌｙ変異体からの発光を示す。この結果は、ＮＬｐｏｌｙ変異体１１Ｓ（１２Ｓ−５１）が、他の変異体と比べて発光を改善したことを示している。
【０２１６】
実施例９４
ＮＬｐｅｐの９６個の変異体を用いた場合のＮＬｐｏｌｙの解離定数及びＶｍａｘ値
ＮＬｐｅｐをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅによるアレイ形式で合成した（アセチル化によってＮ末端を、及びアミド化によってＣ末端をブロックしたペプチド；アレイ内のペプチドを約１ｍｇスケールで合成した）（表６）。各ペプチドを３つの個別のプレート内で凍結乾燥した。ペプチドの３つのプレートのうちの１つからの各ウェルを１００ｕＬのナノ純水に溶解し、Ａ２６０を測定し、各ペプチドの吸光係数を用いて濃度を算出するために使用した。次いで、ペプチドの純度に基づいて濃度を調整し、ナノ純水を加えて７５０ｕＭの最終濃度を得た。
【０２１７】
ペプチドをＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中１２．６６ｕＭ（４Ｘ）に希釈し、次いで、０．５ｌｏｇ段階で７回段階希釈を行った（合計８つの濃度）（３．１６２倍希釈）。ＮＬｐｏｌｙ  ５Ｐ、８Ｓ、５Ａ２、または１１Ｓを以下のようにＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘに希釈した：５Ｐ  １：２，０００；８Ｓ  １：１０，０００；１１Ｓ  １：１５０，０００、５Ａ２  １：１，０００。２５ｕＬの各ＮＬｐｅｐ＋２５ｕＬの各ＮＬｐｏｌｙを混合し、室温で３０分間インキュベートした。５０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ＋１００ｕＭ  Ｆｚを加え、室温で３０分間インキュベートした。ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ＋上で０．５秒の積分で発光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ、１サイト特異的結合の最良適合値を用いてＫｄ／Ｖｍａｘを決定した。図８３〜９０は、９６個の変異体ＮＬｐｅｐを用いた場合のＮＬｐｏｌｙからの解離定数及びＶｍａｘ値を示す。この結果は、Ｖｍａｘを損失することなく、より低い結合親和性を示すＮＬｐｅｐにおける特異的突然変異を示唆している。
表６．ペプチドアレイ１
2020097597.tif 000054
2020097597.tif 000055
2020097597.tif 000056
【０２１８】
実施例９５
ＮＬｐｏｌｙ変異体の溶解性
単一のＮＬｐｏｌｙ５Ａ２、１２Ｓ、１１Ｓ、１２Ｓ−７５、１２Ｓ−１０７、または５Ｐ−Ｂ９コロニーを５ｍＬのＬＢ培養液に接種し、振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。一晩培養液を新しいＬＢ中に１：１００で希釈し、振盪しながら３７℃で３時間インキュベートした。培養液にラムノースを０．２％まで加え、振盪しながら２５℃で一晩インキュベートした。９００ｕｌのこれらの一晩培養液を１００ｕＬの１０Ｘ  ＦａｓｔＢｒｅａｋ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。各培養液から７５ｕＬアリコート（合計）を除去し、分析のために保存した。卓上微量遠心機にて４℃で１５分間、各試料からの残りの培養液を１４，０００×ｒｐｍで遠心分離した。各試料から上清（可溶性）の７５ｕＬアリコートを除去し、分析のために保存した。２５ｕＬの４×ＳＤＳ緩衝液を保存したアリコートに加え、９５℃で５分間インキュベートした。５ｕｌの各試料を４〜２０％トリス−グリシンＳＤＳゲルに負荷し、約１９０Ｖで約５０分間泳動した。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎでゲルを染色し、ＬＡＳ４０００上で画像化した。
図９１は、ＮＬｐｏｌｙ変異体の全ライセート及び同じライセートの可溶画分のタンパク質ゲルを示す。５Ａ２を例外として、全ての変異体が可溶画分中でＮＬｐｏｌｙの割合を示した。
【０２１９】
実施例９６
ＮＬｐｏｌｙ変異体の溶解性及び解離定数
単一のＮＬｐｏｌｙコロニー（図９２に列挙）を５ｍＬのＬＢ培養液に接種し、振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。一晩培養液を新しいＬＢ中に１：１００で希釈し、振盪しながら３７℃で３時間インキュベートした。培養液にラムノースを０．２％まで加え、振盪しながら２５℃で一晩インキュベートした。９００ｕｌのこれらの一晩培養液を１００ｕＬの１０Ｘ  ＦａｓｔＢｒｅａｋ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。各培養液から７５ｕＬアリコート（合計）を除去し、分析のために保存した。卓上微量遠心機にて４℃で１５分間、各試料からの残りの培養液を１４，０００×ｒｐｍで遠心分離した。各試料から上清（可溶性）の７５ｕＬアリコートを除去し、分析のために保存した。２５ｕＬの４×ＳＤＳ緩衝液を保存したアリコートに加え、９５℃で５分間インキュベートした。５ｕｌの各試料を４〜２０％トリス−グリシンＳＤＳゲルに負荷し、約１９０Ｖで約５０分間泳動した。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎでゲルを染色し、ＬＡＳ４０００上で画像化した。図９２は、ＮＬｐｏｌｙ変異体の全ライセート及び同じライセートの可溶画分のタンパク質ゲル、ならびに同じ変異体の解離定数を含む表を示す。
【０２２０】
実施例９７
ＮＬｐｅｐ７９を用いた場合のＮＬｐｏｌｙ５Ｐ及び１１Ｓの基質特異性
ＮＬｐｏｌｙ５Ｐまたは１１Ｓのために大腸菌清澄化ライセートを以前に記載したように調製した。次いで、ＮＬｐｏｌｙライセートをＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に１０倍の段階希釈を行った。２５ｕＬのＮＬｐｏｌｙ及び２５ｕＬの合成ＮＬｐｅｐ７９（４００ｎＭ、４Ｘ）を混合し、室温で１０分間インキュベートした。５０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ＋１００ｕＭ  Ｆｚを加え、室温で１０分間インキュベートし、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ＋上で０．５秒の積分で発光を測定した。図９３は、ＮＬｐｅｐ７９を用いた場合の５Ｐ及び１１Ｓの基質特異性を示しており、１１Ｓが５Ｐよりもフリマジンに対する優れた特異性を有することを示している。
【０２２１】
実施例９８
進化の種々の段階からのＮＬｐｏｌｙ変異体の溶解性
単一のＮＬｐｏｌｙ  ＷＴ、５Ａ２、５Ｐ、８Ｓ、または１１Ｓコロニーを５ｍＬのＬＢ培養液に接種し、振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。一晩培養液を新しいＬＢ中に１：１００で希釈し、振盪しながら３７℃で３時間インキュベートした。培養液にラムノースを０．２％まで加え、振盪しながら２５℃で一晩インキュベートした。９００ｕｌのこれらの一晩培養液を１００ｕＬの１０Ｘ  ＦａｓｔＢｒｅａｋ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。各培養液から７５ｕＬアリコート（合計）を除去し、分析のために保存した。卓上微量遠心機にて４℃で１５分間、各試料からの残りの培養液を１４，０００×ｒｐｍで遠心分離した。各試料から上清（可溶性）の７５ｕＬアリコートを除去し、分析のために保存した。２５ｕＬの４×ＳＤＳ緩衝液を保存したアリコートに加え、９５℃で５分間インキュベートした。５μｌの各試料を４〜２０％トリス−グリシンＳＤＳゲルに負荷し、約１９０Ｖで約５０分間泳動した。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎでゲルを染色し、ＬＡＳ４０００上で画像化した。図１０４は、進化過程の種々の段階からのＮＬｐｏｌｙ変異体の全ライセート及び同じライセートの可溶画分のタンパク質ゲルを示す。これらの結果は、進化過程においてＮＬｐｏｌｙの溶解性が劇的に増加したことを示している。
【０２２２】
実施例９９
タンパク質の化学標識
本発明の非発光性ペプチド（ＮＬｐｅｐ）は、タンパク質を化学的に標識するために使用することができる。本発明のＮＬｐｅｐは、反応基、例えば、ビオチン、サクシニミジルエステル、マレイミド等を含有するように合成することができ、タンパク質、例えば、抗体に付着させる（例えば、コンジュゲート、連結、標識等）ことができる。ＮＬｐｅｐで標識されたタンパク質、例えば、ＮＬｐｅｐ−抗体は、次いで、様々な用途、例えば、ＥＬＩＳＡに使用することができる。ＮＬｐｅｐで標識されたタンパク質、例えば、ＮＬｐｅｐ−抗体の、その標的／結合パートナーとの相互作用／結合は、本発明のＮＬｐｏｌｙ及びＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）アッセイ試薬を加えることによって検出される。ＮＬｐｅｐで標識されたタンパク質とＮＬｐｏｌｙとの相互作用によって生成される発光は、ＮＬで標識されたタンパク質とその標的／結合パートナーとの相互作用と相関するであろう。この概念は、複数のＮＬｐｅｐが単一のタンパク質分子に付着することを可能にし、それによって、シグナル増幅を引き起こす複数のＮＬｐｅｐで標識されたタンパク質／ＮＬｐｏｌｙの相互作用をもたらす。
【０２２３】
実施例１００
ウェスタンブロットによるＨａｌｏＴａｇ−ＮＬｐｅｐを用いた翻訳後タンパク質修飾の検出
いくつかのタンパク質は、ＡＭＰ化またはＡＤＰリボシル化によって翻訳後修飾することができる。ＡＭＰ化では、ＡＴＰをドナー分子として用いたリン酸ジエステル結合によって、ＡＭＰが標的タンパク質に付加される。同様に、ＡＤＰリボシル化では、ＮＡＤ＋をドナー分子として用いたリン酸ジエステル結合によって、ＡＤＰ−リボース部分が標的タンパク質に付加される。ＡＴＰ及びＮＡＤ＋の両方のＮ６位は、修飾後事象に影響を及ぼすことなく、リンカーにタグ付けするために使用できることが示されている。ＡＭＰ化またはＡＤＰリボシル化反応を行うためにＮ６修飾クロロアルカン−ＡＴＰまたは−ＮＡＤ＋が使用される場合、標的タンパク質は、クロロアルカン−ＡＴＰまたは−ＮＡＤ＋を含有するように修飾される。
【０２２４】
Ｎ６修飾ＡＴＰ／ＮＡＤは、ゲル内蛍光に基づく検出系を開発するために、クリックケミストリーと組み合わせて用いられてきた。ウェスタンブロットの技法によるこれらの翻訳後修飾の検出は、抗体を必要とするが、特異的ではないかまたは利用可能ではないことが多い。代替の手法は、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）技術の特性をＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（ＮＬ）の高い発光と組み合わせることであってもよい。細胞ライセートまたは精製タンパク質のいずれかを使用して、クロロアルカン−ＡＴＰ（ＡＭＰ化用）またはクロロアルカン−ＮＡＤ＋（ＡＤＰリボシル化用）で標的タンパク質を翻訳後修飾すると、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、ＰＶＤＦ膜に移すことができる。ブロックした後、ブロットをＨａｌｏＴａｇ−ＮＬｐｅｐとともにインキュベートすることができる。ＨａｌｏＴａｇは、翻訳後修飾されたタンパク質に結合する。次のステップでは、生物発光を検出するためにＮＬｐｏｌｙ及びフリマジンをブロットに加えることができる。この検出方法は、ウェスタンブロットの検出のための化学発光に基づく手法の代替である。化学発光に基づく手法は、ＨａｌｏＴａｇ−タンパク質Ｇ融合体のインキュベーションを（一次として）含んでもよく、次のステップでは、ＥＣＬ反応の後、ＨＲＰに連結されたいずれの二次抗体が使用されてもよい。
【０２２５】
実施例１０１
翻訳後修飾アッセイ
タンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、生物学的制御の全ての態様の中心となる。ＰＴＭは、官能基をタンパク質に共有結合的に付加することによってプロテオームの多様な機能を増幅する。これらの修飾は、リン酸化、メチル化、アセチル化、グリコシル化、ユビキチン化、ニトロシル化、脂質化を含み、正常な細胞生物学及び病態形成の多くの態様に影響する。より具体的には、ヒストンに関連するＰＴＭが大変重要である。ヒストンタンパク質のエピジェネティックな共有結合的修飾は、遺伝子転写制御及び細胞活性に強い影響を及ぼす。翻訳後修飾酵素の例として、限定されないが、キナーゼ／ホスファターゼ、メチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）／脱メチル化酵素（ＨＤＭＴ）、アセチルトランスフェラーゼ／ヒストン脱アセチル化酵素、グリコシルトランスフェラーゼ／グルカナーゼ、及びＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼが挙げられる。正常の生理的条件下で、ＰＴＭ酵素の制御は厳重に規制されている。しかしながら、病的条件下では、これらの酵素活性は調節不全となり得、これらの酵素によって支配される細胞内ネットワークの破壊は、癌及び炎症を含む多くの疾患を引き起こす。
【０２２６】
本発明のＮＬｐｅｐに連結された特異的なペプチド基質への共有結合基転移（例えば、ホスホリル、アセチル）における変化を監視することによって、ＰＴＭ酵素の活性を決定するために本発明の非発光性ペプチド（ＮＬｐｅｐ）及び非発光性ポリペプチド（ＮＬｐｏｌｙ）を使用することができる。ＮＬｐｅｐは、ペプチド合成によって小さなＰＴＭ酵素特異的ペプチドに連結され、ＰＴＭ酵素の基質として使用される。
【０２２７】
Ａ）ＰＴＭトランスフェラーゼアッセイ（ＨＡＴ）
ＰＴＭ酵素反応が起こると、アミノペプチダーゼを用いて未修飾ペプチド（ＮＬｐｅｐ；対照）を分解することができる。アミノペプチダーゼ活性はＰＴＭによって影響を受けることが知られているため、修飾（アセチル化）ペプチド（ＮＬｐｅｐ−ＰＴＭ酵素基質）は、非常に緩徐な速度で分解されるか、または全く分解されない。アミノペプチダーゼ反応が終了すると、フリマジンを含有するＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）アッセイ試薬とともにＮＬｐｏｌｙが加えられる。ＮＬｐｅｐ及びＮＬｐｏｌｙの相互作用を介してＰＴＭが起こった試料から発光が生成される。ＰＴＭが起こらない場合、ＮＬｐｅｐは分解され、ＮＬｐｅｐとＮＬｐｏｌｙとの間に相互作用は起こらないため、発光は生成されない。この概念は、図１９７において一般的なトランスフェラーゼ酵素について、また図１４５においてＨ３Ｋ４／９アセチルトランスフェラーゼについて例示されている。
【０２２８】
本発明のＮＬｐｅｐに連結されたヒストンペプチド基質、及びアセチルまたはメチル基ドナーとしてＡｃｅｔｙｌ−ＣｏＡまたはＳＡＭを使用して、最適な酵素反応条件下で反応が行われる。アミノペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼの混合物を含有する緩衝液が、全ての未修飾基質を特異的に分解するために加えられる。本発明のＮＬｐｏｌｙ及びアミノペプチダーゼ阻害剤を含有する緩衝液が加えられる。ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）アッセイ試薬が加えられ、発光が検出される。発生した発光は、存在する分解されていないＮＬｐｅｐの量に比例し、したがってメチル化またはアセチル化された基質の量と相関しており、それによってメチルトランスフェラーゼまたはアセチルトランスフェラーゼ活性の量を示唆する。このアッセイは、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、ニトロシル化、及び脂質化等のＰＴＭにも適用することができる。
【０２２９】
Ｂ）ＰＴＭヒドロラーゼアッセイ（ＨＤＭＴ）
Ａ）に類似する概念をヒストン脱メチル化酵素（ＨＤＭＴ）に用いることができる。しかしながら、アミノペプチダーゼの代わりに、ＰＴＭ特異的抗体を使用して活性阻害を生じることができる。本発明のＮＬｐｅｐは、ペプチド合成によって小さなメチル化ペプチドに連結することができ、ヒドロラーゼの基質として使用することができる。ヒドロラーゼ反応が終了してから、抗メチル抗体を反応に加えることができる。この抗体は、メチル化ペプチド（対照）に特異的に結合する。ＨＤＭＴによって生成されるペプチド生成物は、抗体に結合しない。次いで、本発明のＮＬｐｏｌｙを加えることができる。抗体がＮＬｐｅｐ及びＮＬｐｏｌｙの相互作用に干渉しない場合、発光は生成されない。脱メチル化酵素によるＰＴＭの加水分解が起こる場合、ＮＬｐｅｐ及びＮＬｐｏｌｙが相互作用し、発光が生成される。この概念は、図１９８において一般的なヒドロラーゼ酵素の概念について、また図１４６において、Ｈ３Ｋ４／９脱メチル化酵素について例示されている。
【０２３０】
未修飾基質のアミノペプチダーゼ分解の概念は、ヒドロラーゼアッセイにも用いることができるが、但し、シグナルのゲインではなくシグナルアッセイのロスになる。反応は、本発明のＮＬｐｅｐに連結された修飾（メチル化またはアセチル化）ヒストンペプチド基質を使用して、最適な酵素反応条件下で行われる。メチル基またはアセチル基を認識することができる抗体を含有する緩衝液が加えられる。本発明のＮＬｐｏｌｙを含有する緩衝液が加えられる。ＮＬｐｏｌｙは、抗体に結合していないＮＬｐｅｐと相互作用する。ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）アッセイ試薬が加えられ、発光が検出される。発生した発光は、抗体に結合していないＮＬｐｅｐの量に比例し、したがって脱メチル化または脱アセチル化された基質の量と相関しており、それによって脱メチル化酵素または脱アセチル化酵素活性の量を示唆する。両方のヒドロラーゼアッセイの概念は、ホスファターゼ、グルカナーゼ、及びデユビキチナーゼ等のＰＴＭヒドロラーゼにも適用することができる。
【０２３１】
これらの概念の別の形態において、ペプチド−ＮＬｐｅｐ上でのＰＴＭによる導入または加水分解は、単独で、ＮＬｐｅｐとＮＬｐｏｌｙとの相互作用を低下するかまたは増強するのに十分であり、したがって、アミノペプチダーゼまたは抗体を必要とせずに発光シグナルを低下または増加させる。
【０２３２】
本発明の方法は、以下のＮＬｐｅｐ−ＳＲＣ基質ペプチドを使用して代表的なトランスフェラーゼであるチロシンキナーゼＳＲＣをアッセイするために使用された：ＹＩＹＧＡＦＫＲＲＧＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡ。ＳＲＣ酵素を１５０μＭ  ＡＴＰ及び２．５μＭ  ＮＬｐｅｐ−Ｓｒｃ基質の存在下で１０μｌの反応緩衝液Ａ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ７．５、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）に滴定し、２３℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、１０μｌのアミノ−ペプチダーゼＭ（ＡＰＭ）試薬（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ７．５、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ及び５０ｍＵ  ＡＰＭ）を加え、軌道振盪機上で２分間混合し、次いで、３７℃で２時間インキュベートした。試料に、３０μｌのＮＬｐｏｌｙ試薬を加え、試料を室温でインキュベートした。ＮＬｐｏｌｙ試薬は、ＮＬｐｏｌｙ断片及びアミノペプチダーゼ阻害剤を含有していた。３０分後、５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）アッセイ試薬を加え、３分後にルミノメーター上で発光を記録した。ＳＲＣキナーゼ酵素活性の増加は、バックグラウンドを上回る発光の増加と相関していることが分かった（図１９９）。ＳＲＣが存在しない場合にバックグラウンド活性のみが見られたことから、非リン酸化ＮＬｐｅｐ−ＳＲＣ基質ペプチドが消化され、その結果としてＮＬｐｏｌｙ断片による光の生成がもたらされず、したがってキナーゼ等のトランスフェラーゼ酵素の活性を監視するための本発明の方法の使用が実証される。
【０２３３】
実施例１０２
哺乳動物細胞、細胞ライセート、または臨床試料における対象となる特異的ＲＮＡ（非コードＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の検出
本発明の非発光性ペプチド（ＮＬｐｅｐ）及び非発光性ポリペプチド（ＮＬｐｏｌｙ）は、遺伝子操作した配列特異性によってＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）に繋ぎ止めることができる。ＲＢＤの特異性は、ＲＢＤの塩基特異性を付与する特有のアミノ酸を変化させることにより正確に変更することができる。そのようなＲＢＤの一例は、ヒトｐｕｍｉｌｉｏドメイン（本明細書においてＰＵＭと称される）である。ＰＵＭのＲＮＡ認識コードはかなり十分に確立されている。ＰＵＭは、８つのタンデムリピートからなる（各リピートは、折り畳んで、αへリックスからなる密集したドメインになる３４個のアミノ酸からなる）。各リピートの中心からの保存されたアミノ酸は、ＲＮＡ認識配列（８つの塩基からなる）内の個々の塩基と特異的に接触する。ＰＵＭの配列特異性は、ＲＮＡ認識配列内の塩基認識に関与する（部位特異的変異誘発によって）保存されたアミノ酸を変化させることにより正確に変更することができる。細胞内の特異的ＲＮＡの検出のために、標的ＲＮＡに対してカスタマイズされた配列特異性を有するＰＵＭドメイン（ＰＵＭ１及びＰＵＭ２）を本発明のＮＬｐｅｐ及びＮＬｐｏｌｙに繋ぎ止めることができ（例えば、遺伝子操作による遺伝的融合タンパク質）、哺乳動物細胞で発現させることができる。ＰＵＭ１及びＰＵＭ２は、標的ＲＮＡ中の互いに近接する（数個の塩基対によって分離され、実験的に決定される）８つのヌクレオチド配列を認識するように設計される。ＰＵＭ１及びＰＵＭ２とそれらの標的配列との最適な相互作用は、ＰＵＭと非発光性ペプチド及び非発光性ポリペプチドとを分離する柔軟なリンカーを導入することによって保証される（リンカーの配列及び長さは実験的に決定される）。ＰＵＭ１及びＰＵＭ２とそれらの標的配列への結合は、ＮＬｐｅｐ及びＮＬｐｏｌｙを、我々の特定のアッセイ条件下で生物発光シグナルを生成することができる機能的複合体の形成をもたらす配向において近接させる。複合体を構成するＮＬｐｅｐ及びＮＬｐｏｌｙ対の不安定な相互作用のために、機能的生物発光複合体は、ＲＮＡ標的の非存在下では生成されない。
【０２３４】
臨床試料中のＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出するためにも、同様のストラテジーを使用することができる。カスタマイズされたＲＮＡ特異性を有するＮＬｐｅｐ−ＰＵＭ融合タンパク質は、適切なタンパク質発現系（大腸菌または哺乳動物タンパク質発現系等）から発現させることができ、また精製することができる。精製された成分は、適切な基質及び生物発光シグナルを発生させるためのアッセイ成分とともに生物試料に加えることができる。
【０２３５】
実施例１０３
臨床試料または哺乳動物細胞ライセートにおける特異的ＲＮＡ（非コードＲＮＡまたはｍＲＮＡ）のＤＮＡオリゴに基づく検出
本発明の非発光性ペプチド（ＮＬｐｅｐ）及び非発光性ポリペプチド（ＮＬｐｏｌｙ）は、適切なリンカー（アミノ酸またはヌクレオチド）を用いて標的ＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドに付着することができる。ＤＮＡオリゴとそれらの標的ＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションが、アッセイ条件下における生物発光シグナルの生成に最適な理想的な立体構造でＮＬｐｅｐ及びＮＬｐｏｌｙを近接させる場合にのみ、生物発光複合体の機能的集合が起こる。検出はまた、２つのＮＬｐｅｐ及び第３のＮＬｐｏｌｙを含む３つの成分からなる相補性系を通して達成することもできる。例えば、２つのＮＬｐｅｐ−ＤＮＡコンジュゲートは、標的ＲＮＡと混合される。生物発光複合体の機能的集合は、続いて第３のＮＬｐｏｌｙを付加することによって達成される。したがって、検出可能なシグナルが、臨床試料または細胞ライセートを使用する特定のアッセイ条件下で生成される場合、そのような試料中の標的ＲＮＡの存在が推測される。そのようなアッセイは、感染病原体（ウイルスＲＮＡ）由来のＲＮＡ及び特異的ＲＮＡバイオマーカー（種々の形態の癌、肝疾患、及び心疾患等の多くの病状と関連付けられる）を検出するために有用であり、多くの病状の診断及び予後への新しい手段を提供し得る。
【０２３６】
実施例１０４
Ｉｎ−ｖｉｖｏ画像化
抗体、ペプチド、及びタンパク質を含む生物工学に由来する生成物（生物製剤）は、治療剤として大いに有望である。小分子薬とは異なり、生物製剤は、二次及び三次構造を含む大きな分子であり、翻訳後修飾を含有することが多い。生物製剤の内部移行、細胞内輸送、体内分布、薬物動態及び薬動力学（ＰＫ／ＰＤ）、免疫原性等は、小分子薬とは著しく異なり、これらの抗体をｉｎ  ｖｉｖｏで「追跡する」ための新しいツールの必要性が存在する。酵素レポーター（ＨＲＰ、ルシフェラーゼ等）または小さな蛍光タグを用いた従来の化学標識は、生物製剤の治療的価値を著しく変化させる可能性があり、生物製剤を使用したｉｎ  ｖｉｖｏ画像化には理想的ではない。ＰＥＴに基づく画像の放射性同位元素標識も都合がよくない。
【０２３７】
本明細書に記載のＮＬｐｏｌｙ及びＮＬｐｅｐは、生物製剤のｉｎ  ｖｉｖｏ画像化に新規ソリューションを提供する。ＮＬｐｅｐは、いずれの合成ステップも伴わずに、生物学的治療薬に遺伝的にコードされ得る。遺伝的コード化により、生体分子当たりのペプチドの量及びその位置を正確に制御することができ、その治療的価値に対するいずれのゆらぎも最小限に抑える。画像化のために、ＮＬｐｏｌｙを、基質、例えば、フリマジンとともに、動物に注入することができる。ＮＬｐｅｐ−生物製剤及びＮＬｐｏｌｙが相互作用すると、発光が生成される。代替として、ＮＬｐｏｌｙを発現するトランスジェニック動物をモデル系として使用することもできる。
【０２３８】
実施例１０５
ＢＲＥＴ用途
この概念は、基本的に、一体化した３つの部分を測定する。ＮＬｐｏｌｙ及び／またはＮＬｐｅｐのうちの２つが複合体を形成し、蛍光性または生物発光性のいずれかである第３の部分がエネルギー移動要素を提供する。形成された複合体が生物発光性である場合、生物発光及びエネルギー移動（すなわち、ＢＲＥＴ）の両方を測定することができる。形成された複合体が蛍光性である場合、第３の要素が生物発光分子であればエネルギー移動の規模を測定することができる。
【０２３９】
Ａ）この実施例は、ＮＬｐｅｐに結合した蛍光色素を示す。代替として、蛍光タンパク質を融合してもよい：例えば、ＮＬｐｏｌｙまたはＮＬｐｅｐとの融合タンパク質（遺伝子構築物から作製）。
ＮＬｐｏｌｙ  ＷＴの大腸菌清澄化ライセートを以前に記載したように調製した。４０ｕＬのＮＬｐｏｌｙ  ＷＴライセートを１０ｕＬのＰＢＩ−４７３０（ＮＬｐｅｐ１）またはＰＢＩ−４８７７（ＮＬｐｅｐ１−ＴＭＲ）と混合し、室温で１０分間インキュベートした。５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中の５０ｕＬの１００ｕＭフリマジンを加え、室温で３０分間インキュベートした。ＴＥＣＡＮ  Ｍ１０００上で４００〜７００ｎｍにわたって発光を測定した。
【０２４０】
図１４７は、ＮＬＰｏｌｙ／ＮＬＰｅｐ複合体（ドナー）からＴＭＲ（アクセプター）への非常に効率のよいエネルギー移動、及び放出される光の波長の対応する赤方偏移を示している。
【０２４１】
Ｂ）この実施例は、小分子の濃度または酵素活性の検出等の検出におけるＢＲＥＴの使用を示している。エネルギーの移動は距離に強く依存するため、エネルギー移動の規模は、系の立体構造に関連することが多い。例えば、カルシウムをキレート化するポリペプチドの挿入を用いて、エネルギー移動の修飾によるカルシウム濃度を測定することができる。
【０２４２】
上記のようにセンサーの立体構造変化を引き起こすことによって、または蛍光部分からのセンサーの切断によって、距離も変化させる酵素は、本明細書に記載の系によって測定することができる。蛍光部分に結合したＮＬｐｏｌｙまたはＮＬｐｅｐは、ＮＬｐｏｌｙ及びＮＬｐｅｐが相互作用した時にエネルギー移動をもたらす。これの一例は、ＮＬｐｅｐがＤＥＶＤリンカー（カスパーゼ−３切断部位）を介して蛍光ＴＯＭ色素にコンジュゲートされるように作製されたペプチドセンサーである。ＮＬｐｏｌｙに曝露されるとエネルギー移動が観察される。カスパーゼ−３に曝露されると、エネルギー移動が排除されるが、４６０ｎｍの発光は残る。
【０２４３】
ＮＬｐｏｌｙ  ５Ａ２及びＮＬ−ＨＴ（ＨａｌｏＴａｇに融合したＮａｎｏＬｕｃ）を精製した。２０ｕＬの８ｐＭ  ＮＬ−ＨＴを２０ｕＬの１００ｎＭ  ＰＢＩ−３７８１と混合し（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／６８２，５８９号を参照のこと）、室温で１０分間インキュベートした。４０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ＋１００ｕＭフリマジンを加え、ＴＥＣＡＮ  Ｍ１０００上で３００〜８００ｎｍにわたって発光を測定した。
【０２４４】
２０ｕＬの３３ｎｇ／ｕＬ  ＮＬｐｏｌｙ  ５Ａ２を２０ｕＬの約５００ｕＭのＰＢＩ−５０７４（ＴＯＭ−ＮＣＴ−ＮＬｐｅｐ）と混合した。４０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ＋１００ｕＭフリマジンを加え、ＴＥＣＡＮ  Ｍ１０００上で３００〜８００ｎｍにわたって発光を測定した。
【０２４５】
図１４８は、ＮＬＰｏｌｙ／ＮＬＰｅｐ複合体（ドナー）からＴＯＭ色素（アクセプター）へのエネルギー移動、及び放出される光の波長の対応する赤方偏移を示している。
【０２４６】
Ｃ）三元相互作用
ＮＬｐｏｌｙ及びＮＬｐｅｐによるエネルギー移動は、相互作用する３つの分子を測定するためにも使用することができる。一例は、ＮＬｐｏｌｙで標識されたＧＰＣＲ、及びＮＬｐｅｐで標識されたＧＰＣＲ相互作用タンパク質であり、これらが相互作用すると生物発光複合体を形成する。これにより二成分相互作用の測定が可能となる。エネルギー移動に適した蛍光部分を担持する小分子ＧＰＣＲリガンドがこの系と相互作用すると、エネルギー移動が起こる。したがって、二成分タンパク質−タンパク質相互作用及び薬物−タンパク質−タンパク質の三元相互作用は、同じ実験で測定することができる。また、蛍光部分のみが、タンパク質対と相互作用した時にシグナルを引き起こすことができ、不活性タンパク質と相互作用するリガンドからのあらゆるシグナルを除去する（図１４９）。
【０２４７】
実施例１０６
６−テトラメチルローダミン−ＰＥＧ３−ＮＨ2：
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の６−テトラメチルローダミンサクシジミジルエステルの溶液（０．２５ｇ、０．５ｍｍｏｌ）に、１−Ｂｏｃ−４，７，１０−トリオキサトリデカン−１，１３−ジアミン（０．１５ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を加え、その後ジイソプロピルエチルアミン（０．２５ｍＬ、１．４ｍｍｏｌ）を加えた。１６時間撹拌した後、ＨＰＬＣにより反応を分析して６−テトラメチルローダミンサクシジミルエステルが完全に消費されたことを確認した。反応物をピンク色の膜に濃縮し、トリイソプロピルシラン（０．２ｍＬ）及びトリフルオロ酢酸（４ｍＬ）の組み合わせに溶解した。ピンク色の溶液を２時間撹拌し、その後、分析ＨＰＬＣによって出発材料が完全に消費されたことを確認した。反応物を乾燥するまで濃縮し、粗６−テトラメチルローダミン−ＰＥＧ３−ＮＨ２をピンク色の膜として得た。
【０２４８】
Ｈ−ＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡ−ＰＥＧ−ＴＭＲ（ＰＢＩ−４８７７）：
2020097597.tif 000057
Ｆｍｏｃ技術を用いた標準的な固相ペプチド合成によって完全に保護されたペプチドＢｏｃ−ＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡ樹脂を合成し、次いで、ジクロロ酢酸を使用して樹脂から切断し、完全に保護されたペプチドを白色固体として遊離させた。ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中の６−テトラメチルローダミン−ＰＥＧ３−ＮＨ２の溶液（０．０５ｇ、０．０８ｍｍｏｌ）に、このＢｏｃ−ＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡ−ＯＨ（０．２ｇ、０．０７ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシアザベンゾトリアゾール（１１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド（１５ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（０．２８ｍＬ、０．１６ｍｍｏｌ）を加えた。３０分間撹拌した後、反応物を濃縮し、得られた粗生成物をＣＨ2Ｃｌ2と水に分割し、層を分離し、有機層を水及び鹹水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。得られたピンク色の固体をトリイソプロピルシラン（０．２ｍＬ）及びトリフルオロ酢酸（４ｍＬ）の組み合わせに溶解した。３時間撹拌した後、反応物を濃縮し、得られたピンク色の膜を、０．１％水性ＴＦＡ中のＡＣＮの勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＰＢＩ  ４８７７をピンク色の粉末として得た：ＭＳ（Ｍ＋）計算値２０８８．５、実測値２０８９．１。
【０２４９】
ＴＯＭ−ＤＥＶＤＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡ−ＯＨ（ＰＢＩ−５０７４）：
2020097597.tif 000058
Ｆｍｏｃ技術を用いた標準的な固相ペプチド合成によって完全に保護されたペプチドＨ−ＤＥＶＤＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡ樹脂を合成した。まだ樹脂上にあるうちに、６−ＴＯＭ（ＰＢＩ−３７３９）サクシジミジルエステルの溶液を加え、遊離Ｎ末端と反応させた。次いで、ペプチドを樹脂から切断し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて完全に脱保護化し、青色の固体を得た。０．１％水性ＴＦＡ中のＡＣＮの勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより固体を精製し、ＰＢＩ  ５０７４を青色の粉末として得た：ＭＳ（Ｍ＋Ｚ／２）計算値１２３８．９、実測値１２３８．８。
【０２５０】
実施例１０７
合成、Ｎ末端融合、及びＣ末端融合ＮＬＰｅｐ７８間における相補性の比較
大腸菌ライセートをＨａｌｏＴａｇ−ＴＭＲ（登録商標）リガンドで標識することにより、ＧＳＴ−ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合体（ＧＳＴ−ＨＴ）を対照として用いてＮＬｐｅｐ７８−ＨａｌｏＴａｇ（７８−ＨＴ）及びＨａｌｏＴａｇ−ＮＬＰｅｐ７８（ＨＴ−７８）の融合体を定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｔｙｐｈｏｏｎ上で走査した。次いで、ＧＳＴ−ＨＴ標準物質の既知の濃度を用いて標準曲線を作成し、７８−ＨＴ及びＨＴ−７８のバンド強度を用いてそれらの濃度を決定した。
【０２５１】
ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓを含有する大腸菌ライセートをＰＢＳ  ｐＨ７＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に１：１０7で希釈した。ＰＢＳ  ｐＨ７＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に、７８−ＨＴ、ＨＴ−７８、及び合成ＮＬｐｅｐ７８の段階希釈液を作製した。２０ｕＬのＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及び２０ｕＬのＮＬＰｅｐのうちの１つを混合し、周囲温度で５分間インキュベートした。４０ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）＋１００ｕＭ  Ｆｚを加え、試料を周囲温度で５分間インキュベートした。ＧｌｏｍａｘＭｕｌｔｉ＋上で０．５秒の積分を用いて発光を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して１サイト特異的結合にデータを適合させ、Ｂｍａｘ及びＫｄを決定した。
【０２５２】
結果（図１５０）は、融合パートナー（ＨａｌｏＴａｇ）のＮ末端またはＣ末端における、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓの合成ＮＬＰｅｐ７８及びＮＬＰｅｐ７８への結合を比較している。結合親和性は著しく変化しないことが分かったが、ＮＬＰｅｐ７８がＣ末端にある時にＢｍａｘが低下した。
【０２５３】
実施例１０８
合成、Ｎ末端融合、及びＣ末端融合ＮＬＰｅｐ７９間における相補性比較
ＮＬｐｅｐ７９−ＨａｌｏＴａｇ（７９−ＨＴ）及びＨａｌｏＴａｇ−ＮＬＰｅｐ７９（ＨＴ−７９）の融合体を、ＧＳＴ−ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合体（ＧＳＴ−ＨＴ）を対照として用いて、大腸菌ライセートをＨａｌｏＴａｇ−ＴＭＲ（登録商標）リガンドで標識することによって定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｔｙｐｈｏｏｎにより走査した。標準曲線を次いで、既知の濃度のＧＳＴ−ＨＴ標準物を使用して作成し、７９−ＨＴ及びＨＴ−７９の帯強度を使用してそれらの濃度を決定した。
【０２５４】
ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓを含有する大腸菌ライセートを、ＰＢＳ  ｐＨ７＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に１：１０7希釈した。７９−ＨＴ、ＨＴ−７９、及び合成ＮＬｐｅｐ７９の段階希釈をＰＢＳ  ｐＨ７＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中で行った。２０μＬ  ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及び２０μＬのＮＬＰｅｐのうちの１つを混合し、周囲温度で５分間インキュベートした。４０μＬ  ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）＋１００μＭ  Ｆｚを添加し、試料を周囲温度で５分間インキュベートする。発光をＧｌｏｍａｘＭｕｌｔｉ＋により、０．５秒の積分を使用して測定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して１サイト特異的結合に適合させて、Ｂｍａｘ及びＫｄを決定した。
【０２５５】
結果（図１５１）は、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓの、合成ＮＬＰｅｐ７９ならびに融合パートナー（ＨａｌｏＴａｇ）のＮ末端またはＣ末端におけるＮＬＰｅｐ７９への結合を比較する。結合親和性は著しく変化することが見出されなかったが、ＢｍａｘはＮＬＰｅｐ７９がＣ末端にあったときに低減された。
【０２５６】
実施例１０９
ＰＢＩ−４８７７（ＮＬＰｅｐ１−フルオロフォア）と比較したＮＬＰｅｐ８６とのＮＬｐｏｌｙ１１Ｓのスペクトル走査
精製ＮＬｐｏｌｙ１１ＳをＰＢＳ  ｐＨ７＋０．０１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ＋１ｍＭ  ＤＴＴ中、１ｎＭに希釈した。ＮＬＰｅｐ８６またはＰＢＩ−４８７７をＰＢＳ  ｐＨ７＋０．０１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ＋１ｍＭ  ＤＴＴ中、４０μＭに希釈した。２５μＬ  ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及び２５μＬ  ＮＬＰｅｐ８６またはＰＢＩ−４８７７を混合し、次いで周囲温度で１０分間インキュベートした。５０μＬ緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７＋０．０１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ＋１ｍＭ  ＤＴＴ）＋１００μＭ  Ｆｚを次いで添加した。発光をＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００により次のように測定した：３００〜８００ｎｍ、５ｎｍ毎、帯域幅１０ｎｍ、ゲイン１２７、積分０．５秒、ｚポジション２２，０００ｕｍ。
【０２５７】
結果は、ＮＬＰｅｐが蛍光色素等の小分子に複合され、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓとの相互作用を保持して発光をもたらし得ることを実証する（図１５２）。それはまた、効率的なエネルギー移動及び発光スペクトルを変化させる能力も実証する。
【０２５８】
実施例１１０
ＰＢＩ−５４３４（フルオロフォア−ＮＬＰｅｐ１）と比較したＮＬＰｅｐ８６とのＮＬｐｏｌｙ１１Ｓのスペクトル走査
精製ＮＬｐｏｌｙ１１ＳをＰＢＳ  ｐＨ７＋０．０１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ＋１ｍＭ  ＤＴＴ中、１ｎＭに希釈した。ＮＬＰｅｐ８６またはＰＢＩ−５４３４をＰＢＳ  ｐＨ７＋０．０１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ＋１ｍＭ  ＤＴＴ中、４０μＭに希釈した。２５μＬ  ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及び２５μＬ  ＮＬＰｅｐ８６またはＰＢＩ−５４３４を混合し、次いで周囲温度で１０分間インキュベートした。５０μＬ緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７＋０．０１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ＋１ｍＭ  ＤＴＴ）＋１００μＭ  Ｆｚを次いで添加した。発光をＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００により次のように測定した：３００〜８００ｎｍ、５ｎｍ毎、帯域幅１０ｎｍ、ゲイン１２７、積分０．５秒、ｚポジション２２，０００ｕｍ。
【０２５９】
結果は、ＮＬＰｅｐが蛍光色素等の小分子に複合され、１１Ｓとの相互作用を保持して発光をもたらし得ることを実証する（図１５３）。これはまた、実施例１０９におけるＰＢＩ−４８７７での結果と合わせて、複合化に使用される末端及び／またはリンカー長がエネルギー移動に著しく影響を及ぼし得ることも示唆する。
【０２６０】
実施例１１１
ＰＢＩ−５４３６（フルオロフォア−ＮＬＰｅｐ１）と比較したＮＬＰｅｐ８６とのＮＬｐｏｌｙ１１Ｓのスペクトル走査
精製ＮＬｐｏｌｙ１１ＳをＰＢＳ  ｐＨ７＋０．０１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ＋１ｍＭ  ＤＴＴ中、１ｎＭに希釈した。ＮＬＰｅｐ８６またはＰＢＩ−５４３６をＰＢＳ  ｐＨ７＋０．０１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ＋１ｍＭ  ＤＴＴ中、４０μＭに希釈した。２５μＬ  ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及び２５μＬ  ＮＬＰｅｐ８６またはＰＢＩ−５４３６を混合し、次いで周囲温度で１０分間インキュベートした。５０μＬ緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７＋０．０１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ＋１ｍＭ  ＤＴＴ）＋１００μＭ  Ｆｚを次いで添加した。発光をＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００により次のように測定した：３００〜８００ｎｍ、５ｎｍ毎、帯域幅１０ｎｍ、ゲイン１２７、積分０．５秒、ｚポジション２２，０００ｕｍ。
【０２６１】
結果は、ＮＬＰｅｐが蛍光色素等の小分子に複合され、１１Ｓとの相互作用を保持して発光をもたらし得ることを実証する（図１５４）。それはまた、効率的なエネルギー移動及び発光スペクトルを変化させる能力も実証する。
【０２６２】
実施例１１２
親和性緩衝液中の種々のＮＬＰｅｐとの１１ＳについてのＫｍ値の比較
精製ＮＬｐｏｌｙ１１ＳをＰＢＳ  ｐＨ７＋０．０１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ＋１ｍＭ  ＤＴＴ＋０．００５％  Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（親和性緩衝液）またはＮａｎｏＧｌｏアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中、４０ｐＭに希釈した。ＮＬＰｅｐ（ＮＬｐｅｐ８６、７８、９９、１０１、１０４、１２８、及び１１４）を親和性緩衝液またはＮａｎｏＧｌｏアッセイ試薬中、４００μＭに（ＮＬＰｅｐを１ｍＭに）希釈した。３００μＬ  ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及び３００μＬのＮＬＰｅｐを混合し、周囲温度で３０分間インキュベートした。５０μｌを次いで白色の９６ウェルプレートのウェルに添加した。５０μｌ親和性緩衝液＋２×Ｆｚ（１２．５μＭ、２倍希釈を７回）または５０μｌＮａｎｏＧｌｏ＋２×Ｆｚ（１００μＭ、２倍希釈を７回）を各ウェルに添加し、発光をＧｌｏｍａｘ  Ｍｕｌｔｉ＋により、０．５秒の積分を使用して測定した。Ｋｍを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、ミカエリスメンテンを使用して決定した。
【０２６３】
結果は、親和性緩衝液（図１５５）またはＮａｎｏＧｌｏアッセイ緩衝液（図１５６）中の、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓと種々のＮＬＰｅｐとの間の複合体への基質結合を実証する。決定されるＫｍ値は、示されるＮＬＰｅｐでは著しく変動しない。
【０２６４】
実施例１１３
種々の濃度のフリマジンでのＮＬｐｏｌｙ１１ＳへのＮＬＰｅｐ１結合親和性
精製ＮＬｐｏｌｙ１５６及びＮＬｐｏｌｙ１１Ｓを、親和性緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７＋０．０１％プリオネックス＋１ｍＭ  ＤＴＴ＋０．００５％テルギトール）中、４０ｐＭにする。合成ＮＬＰｅｐ１（ＷＴ）を親和性緩衝液中、ＮＬｐｏｌｙ１５６に対しては５６０μＭ、またはＮＬｐｏｌｙ１１Ｓに対しては８０μＭに希釈し、次いで３倍段階希釈して８つの濃度を作製した。３５０μＬ  ＮＬＰｅｐ１及び３５０μＬ  ＮＬＰｏｌｙ１５６または１１Ｓを混合し、次いで周囲温度で３０分間インキュベートした。５０μＬを次いで、白色の９６ウェルアッセイプレートのウェル中にアリコートした。Ｆｚを親和性緩衝液に添加して４０、２０、１０、５、２．５、及び１．２５μＭにし、５０μＬ  Ｆｚ／親和性緩衝液を各ウェルに添加し、周囲温度で２分間インキュベートした。発光をＧｌｏｍａｘ  Ｍｕｌｔｉ＋により、０．５秒の積分を用いて測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ及び１サイト特異的結合を使用して、各濃度のＦｚでのＫｄを算出した。
【０２６５】
結果（図１５７）は、Ｆｚの濃度が増加するにつれての親和性（ＮＬＰｏｌｙ／ＮＬＰｅｐ）の変化を示す。
【０２６６】
実施例１１４
種々の濃度のＮＬＰｅｐ１でのＮＬｐｏｌｙ１５６／ＮＬＰｅｐ１及びＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＮＬＰｅｐ１についてのフリマジンＫｍ値
精製ＮＬｐｏｌｙ１５６及びＮＬｐｏｌｙ１１Ｓを親和性緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７＋０．０１％プリオネックス＋１ｍＭ  ＤＴＴ＋０．００５％テルギトール）中、４０ｐＭに希釈した。合成ＮＬＰｅｐ１（ＷＴ）を親和性緩衝液中、ＮＬｐｏｌｙ１５６に対しては５６０μＭ、またはＮＬｐｏｌｙ１１Ｓに対しては８０μＭに希釈し、次いで３倍段階希釈して８つの濃度を作製した。５０μＬを次いで、白色の９６ウェルアッセイプレートのウェル中にアリコートした。Ｆｚを親和性緩衝液に添加して４０、２０、１０、５、２．５、及び１．２５μＭにし、５０μＬ  Ｆｚ／親和性緩衝液を各ウェルに添加し、周囲温度で２分間インキュベートした。発光をＧｌｏｍａｘ  Ｍｕｌｔｉ＋により、０．５秒の積分を用いて測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ及び１サイト特異的結合を使用して、各濃度のＮＬＰｅｐ１でのＫｄを算出した。
【０２６７】
結果（図１５８）は、ＮＬＰｅｐ１の濃度が増加するにつれての親和性（ＮＬＰｏｌｙ／ＮＬＰｅｐ）の変化を示す。
【０２６８】
実施例１１５
ＮＬＰｏｌｙ１５６／ＮＬＰｅｐ１、ＮＬＰｏｌｙ１１Ｓ／ＮＬＰｅｐ１、及びＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼについての最大活性の比較
精製ＮＬＰｏｌｙ１５６、ＮＬＰｏｌｙ１１Ｓ、またはＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）を親和性緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７＋０．０１％プリオネックス＋１ｍＭ  ＤＴＴ＋０．００５％テルギトール）中、４０ｐＭに希釈した。合成ＮＬＰｅｐ１（ＷＴ）を親和性緩衝液中、ＮＬＰｏｌｙ１５６に対しては５６０μＭ、またはＮＬＰｏｌｙ１１Ｓに対しては８０μＭに希釈し、次いで３倍段階希釈して８つの濃度を作製した。３５０μＬ  ＮＬＰｅｐ１（または親和性緩衝液）及び３５０μＬ  ＮＬＰｏｌｙ（またはＮｌｕｃ）を混合し、次いで周囲温度で３０分間インキュベートした。５０μＬを次いで、白色の９６ウェルアッセイプレートのウェル中にアリコートした。Ｆｚを親和性緩衝液に添加して４０、２０、１０、５、２．５、及び１．２５μＭにし、５０μＬ  Ｆｚ／親和性緩衝液を各ウェルに添加し、周囲温度で２分間インキュベートした。発光をＧｌｏｍａｘ  Ｍｕｌｔｉ＋により、０．５秒の積分を用いて測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ及びミカエリスメンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ）の等式を使用して、各濃度のＮＬＰｅｐでのＶｍａｘを算出した（各濃度のＮＬＰｅｐ１で算出されたＶｍａｘ値を１サイト特異的結合へ入力してＢｍａｘを算出）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ及び１サイト特異的結合を使用して、各濃度のＦｚでのＢｍａｘを算出した（各濃度のＦｚで算出されたＢｍａｘ値をミカエリスメンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ）の等式へ入力してＶｍａｘを算出）。
【０２６９】
結果（図１５９）は、ＮＬＰｅｐ１によって活性化されたときのＮＬＰｏｌｙ１５６またはＮＬＰｏｌｙ１１Ｓの最大活性対ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼの最大活性を実証する。
【０２７０】
実施例１１６
種々のＮＬＰｅｐとのＮＬｐｏｌｙ１１Ｓの滴定からもたらされる発光値
精製ＮＬＰｏｌｙ１１ＳをＰＢＳ  ｐＨ７＋０．０１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ＋１ｍＭ  ＤＴＴ＋０．００５％  Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（親和性緩衝液）中、４０ｐＭに希釈した。合成ＮＬＰｅｐ（ＮＬＰｅｐ８６、７８、７９、９９、１０１、１０４、１１４、１２８、または野生型）を親和性緩衝液中、次のように希釈した：ＮＬＰｅｐ８６＝６０ｎＭ、ＮＬＰｅｐ７８＝２８０ｎＭ、ＮＬＰｅｐ７９＝８００ｎＭ、ＮＬＰｅｐ９９＝４μＭ、ＮＬＰｅｐ１０１＝３４μＭ、ＮＬＰｅｐ１０４＝２０μＭ、ＮＬＰｅｐ１２８＝４μＭ、ＮＬＰｅｐ１１４＝４．４８ｍＭ、及びＮＬＰｅｐＷＴ＝２０μＭ。２５μＬ  ＮＬＰｏｌｙ１１Ｓ及び２５μＬの１つのＮＬＰｅｐを混合し、次いで周囲温度で３０分間インキュベートした。５０μｌ親和性緩衝液＋２０μＭ  Ｆｚを次いで各混合物に添加し、発光をＧｌｏｍａｘＭｕｌｔｉ＋により、０．５秒の積分を使用して測定した。Ｂｍａｘ及びＫｄ値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ及び１サイト特異的結合を使用して決定した。
【０２７１】
結果（図１６０）は、ＮＬＰｏｌｙ１１Ｓ及び種々のＮＬＰｅｐを使用しての約１００，０００倍範囲の親和性を実証する。Ｂｍａｘの最小損失が高親和性ＮＬＰｅｐと低親和性ＮＬＰｅｐとの間で観察された。
【０２７２】
実施例１１７
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中へのトランスフェクション後のＮＬＰｏｌｙ１５６、ＮＬＰｏｌｙ１１Ｓ、及びＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼのウェスタンブロット
１日目、２ｎｇ  ＮＬＰｏｌｙ１５６、ＮＬＰｏｌｙ１１Ｓ、またはＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）ＤＮＡと、１ｕｇ  ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）キャリアＤＮＡ、４ｕｌ  Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、及びフェノールレッドフリーＯｐｔｉＭＥＭ（１００ｕｌまで）とのトランスフェクション混合物を作製し、室温で１０分間インキュベートした。トランスフェクション混合物を次いで、６ウェルプレートの１つのウェルに移し、２ｍｌのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４００，０００細胞／ｍｌ（総計８００，０００細胞）で添加した。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。
【０２７３】
２日目、細胞をフェノールレッドフリーＤＭＥＭで洗浄し、５００μＬフェノールレッドフリーＤＭＥＭを各ウェルに添加し、細胞を−７０℃で少なくとも３０分間凍結させた。細胞を次いで融解させ、５００μＬを微量遠心管に移し、２０μｌを８０μＬの１．２５ｘ  ＳＤＳ負荷緩衝液と混合し、９５℃で５分間インキュベートした。１０ｕｌをＭＥＳ泳動緩衝液と共に１０％ビス−トリスＮｕＰＡＧＥゲル上に負荷した。タンパク質を、ｉＢｌｏｔを使用してＰＶＤＦに移し、膜をメタノール中で洗浄した。膜を次いでＴＢＳＴ＋５％  ＢＳＡ中、周囲温度で１時間でブロッキングし、ＴＢＳＴ中で３回洗浄し、次いで１０ｍＬ  ＴＢＳＴ＋２μＬウサギ抗Ｎｌｕｃポリクローナル抗体＋２μＬウサギ抗β−アクチンポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ番号ａｂ８２２７）と共に、４℃で一晩インキュベートした。
【０２７４】
３日目、膜をＴＢＳＴ中で３回洗浄し、１０ｍＬ  ＴＢＳＴ＋２μＬ抗ウサギＨＲＰ複合抗体と共に周囲温度で１時間インキュベートし、再びＴＢＳＴで３回洗浄し、１２ｍＬ  ＥＣＬウェスタンブロッティング基質と共に１分間インキュベートした。化学発光をＬＡＳ  ４０００  Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔで画像化した。
【０２７５】
結果（図１６１）は、完全長ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼと比較したＮＬＰｏｌｙの発現レベルを示す。ＮＬＰｏｌｙ１５６は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）ほどには発現しないが、一方でＮＬＰｏｌｙ１１Ｓは、Ｎｌｕｃと同様に発現する。
【０２７６】
実施例１１８
ＮＬＰｏｌｙ１１Ｓ／ＮＬＰｅｐ１１４親和性がβ−ラクタマーゼ（ＳＭＥ）とβ−ラクタマーゼ阻害性タンパク質（ＢＬＩＰ）との間の相互作用に及ぼす影響の決定、ならびに１１Ｓ／１１４及びβ−ラクタマーゼ活性を通して測定された親和性値間の比較
タンパク質精製
ｐＦ１Ｋ−シグナル−６Ｈ−ＳＭＥ、ｐＦ１Ｋ−シグナル−６Ｈ−ＳＭＥ−１１Ｓ、ｐＦ１Ｋ−シグナル−６Ｈ−ＢＬＩＰＹ５０Ａ、及びｐＦ１Ｋ−シグナル−６Ｈ−ＢＬＩＰｙ５０Ａ−１１４（大腸菌中の組換えタンパク質のＴ７プロモーターベースの発現のためのＰｒｏｍｅｇａ  Ｆｌｅｘｉベクター、シグナルはＳＭＥまたはＢＬＩＰいずれかのための天然シグナルペプチドを指す）を、２５℃で１８〜２０時間ラムノースで誘導してＫＲＸ細胞の周辺質中で発現させた。細胞をペレット状にし、Ｂ−Ｐｅｒ溶解試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、１／５０培養体積）中に再懸濁させ、周囲温度で１５分間インキュベートした。ライセートを次いで１．５倍体積の２０ｍＭトリスｐＨ８＋５００ｍＭ  ＮａＣｌの添加によって希釈し、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を清浄な管に移し、１ｍＬ  ＲＱ１  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を添加し、１２，０００×ｇで１０分間再び遠心分離した。上清をＨｉｓＴＡＬＯＮカラムＣｌｏｎｔｅｃｈ）上で２５ｍＭトリスｐＨ８及び５００ｍＭ  ＮａＣｌ負荷緩衝液と共に精製し、２５ｍＭトリスｐＨ８、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び５０ｍＭイミダゾールで溶出した。溶出したタンパク質を２５ｍＭトリスｐＨ７．５及び２５ｍＭ  ＮａＣｌ中に透析し、ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で２５ｍＭトリスｐＨ７．５及び２５ｍＭ  ＮａＣｌ負荷緩衝液と共に精製し、２５ｍＭトリスｐＨ７．５及び１２５ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。イオン強度を１５０ｍＭ  ＮａＣｌの最終濃度に調整し、ＶｉｖａＳｐｉｎ濃縮機を使用して濃縮した。
【０２７７】
アッセイ
ＢＬＩＰＹ５０Ａ及びＢＬＩＰＹ５０Ａ−１１４を親和性緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７  ０．０１％プリオネックス  ０．００５％テルギトール  １ｍＭ  ＤＴＴ）中、３１２．５ｎＭに希釈し、次いで１．５倍段階希釈した。ＳＭＥ及びＳＭＥ−１１Ｓを親和性緩衝液中、０．２ｎＭに希釈した。１１．１１μＬ  ＳＭＥ及び８８．８９μＬ  ＢＬＩＰを混合し、次いで周囲温度で２時間インキュベートした。９０μＬの混合物を、１０μＬの１００μＭ  ニトロセフィン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、親和性緩衝液中）を含む透明９６ウェルプレートに移した。９０μＬのＳＭＥ−１１Ｓ／ＢＬＩＰＹ５０Ａ−１１４を、１０μＬの１００μＭ  Ｆｚ（親和性緩衝液中）を含む白色９６ウェルプレートに移した。吸光度（ニトロセフィン）を４８６ｎｍで１５秒毎に、３０分間にわたって測定し、発光（Ｆｚ）を２分毎に、３０分間にわたって測定した。
【０２７８】
ニトロセフィンについて、初速度を、Ｅｘｃｅｌを使用して適合させた。初速度対ＢＬＩＰ濃度をプロットした。Ｋｉを、Ｅ＿Ｆｒｅｅ＝［Ｅ］−（Ｅ＿０］＋［Ｉ＿０］＋Ｋ＿ａｐｐ−√（（［Ｅ＿０］＋［Ｉ＿０］＋Ｋ＿ａｐｐ）＾２−（４［Ｅ＿０］［Ｉ＿０］）））／２及びＫ＿ａｐｐ＝Ｋ＿ｉ（１＋（［Ｓ］）／Ｋ＿Ｍ）を使用して適合
Ｆｚについては、Ｋｄを、ＲＬＵ＝（Ｂｍａｘ×［ＢＬＩＰ−１１４］）／（［ＢＬＩＰ−１１４］＋Ｋ＿Ｄ）を使用して適合させた。
【０２７９】
結果（図１６２）は、融合していないタンパク質としてのタンパク質相互作用（β−ラクタマーゼ  ＳＭＥ及びその阻害剤ＢＬＩＰＹ５０Ａ）の親和性を、ＮＬＰｏｌｙ及びＮＬＰｅｐがそれらに融合されるときの親和性と比較し、ＮＬＰｏｌｙ１１ＳとＮＬＰｅｐ１１４との間の親和性がＳＭＥ／ＢＬＩＰＹ５０Ａ相互作用に対する増加した見かけの親和性をもたらさないことを実証する。これはまた、タンパク質相互作用についての平衡結合定数を測定するためのＮＬＰｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬＰｅｐ１１４の使用、ならびにＮＬＰｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬＰｅｐ１１４を通して測定された親和性が、標的タンパク質（ＳＭＥ）の活性によって測定される親和性と一致していることも実証する。
【０２８０】
実施例１１９
ＦＲＢ−ＮＬＰｏｌｙ１１ＳとＦＫＢＰ−ＮＬＰｅｐ１０１及び１１１〜１３６との異なる組み合わせを発現する細胞によって発生した発光の比較
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００）を、総計１ｎｇ  ｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−  ＮＬｐｅｐ１０１または１１１−１３６プラスミドＤＮＡで、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比で使用して、不透明な９６ウェルアッセイプレートのウェル中にリバーストランスフェクトした。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを添加して、各トランスフェクションにおける総ＤＮＡを１μｇにした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで５０ｎＭラパマイシンを含むまたは含まないフェノールレッドフリーＯｐｔｉＭＥＭＩ中で１．５時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭＩ中の５０ｎＭラパマイシンを含むまたは含まない１０μＭフリマジン基質（最終濃度）を各ウェルに直接添加し、室温で５分間インキュベートした。発光を次いでＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉにより、０．５秒の積分時間を用いて読み取った。
【０２８１】
図１６３は、試験した組み合わせのうち、ＮＬｐｅｐ１１４とのＮＬｐｏｌｙ１１Ｓが最も大きいラパマイシン誘導、及び最も強力なラパマイシン特異的発光シグナルのうちの１つを示すことを実証する。
【０２８２】
実施例１２０
ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１ＳとＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１１４及び１３７〜１４３との異なる組み合わせを発現する細胞によって発生した発光の比較
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００）を、総計１ｎｇ  ｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１１４または１３７〜１４３プラスミドＤＮＡで、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比で使用して、不透明な９６ウェルアッセイプレートのウェル中にリバーストランスフェクトした。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを添加して、各トランスフェクションにおける総ＤＮＡを１μｇにした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで５０ｎＭラパマイシンを含むまたは含まないフェノールレッドフリーＯｐｔｉＭＥＭＩ中で１．５時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭＩ中の５０ｎＭラパマイシンを含むまたは含まない１０μＭフリマジン基質（最終濃度）を各ウェルに直接添加し、室温で５分間インキュベートした。発光を次いでＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉにより、０．５秒の積分時間を用いて読み取った。
【０２８３】
図１６４は、試験した組み合わせのうち、ＮＬｐｅｐ１１４とのＮＬｐｏｌｙ１１Ｓが最も大きいラパマイシン誘導、及び最も強力なラパマイシン特異的発光シグナルのうちの１つを示すことを実証する。
【０２８４】
実施例１２１
ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ７８／７９／９９／１０１／１０４／１１４／１２８を発現する細胞のラパマイシン用量反応曲線
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００）を、総計０．１ｎｇ  ｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ７８／７９／９９／１０１／１０４／１２８プラスミドＤＮＡで、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比で使用して、不透明な９６ウェルアッセイプレートのウェル中にリバーストランスフェクトした。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを添加して、各トランスフェクションにおける総ＤＮＡを１μｇにした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで０〜３００ｎＭラパマイシンを含むフェノールレッドフリーＯｐｔｉＭＥＭＩ中で１．５時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭＩ中の０〜３００ｎＭラパマイシンを含む１０μＭフリマジン基質（最終濃度）を各ウェルに直接添加し、室温で５分間インキュベートした。発光を次いでＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉにより、０．５秒の積分時間を用いて読み取った。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して、データをシグモイド曲線に適合させ、ＥＣ５０値を算出した。
【０２８５】
図１６５は、ＮＬｐｅｐ７８／７９／９９／１０１／１０４／１１４／１２８とのＮＬｐｏｌｙ１１Ｓについてのラパマイシンに対するシグモイド用量反応を示す。プロットした組み合わせのうち、ＮＬｐｅｐ１１４とのＮＬｐｏｌｙ１１Ｓが最も大きい動的範囲を示す。
【０２８６】
実施例１２２
ラパマイシン競合阻害剤ＦＫ５０６に対するＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−７８／７９／９９／１０１／１０４／１１４／１２８を発現する細胞の反応
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００）を、総計０．１ｎｇ  ｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ７８／７９／９９／１０１／１０４／１１４／１２８プラスミドＤＮＡで、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比で使用して、不透明な９６ウェルアッセイプレートのウェル中にリバーストランスフェクトした。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを添加して、各トランスフェクションにおける総ＤＮＡを１μｇにした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで１０ｎＭラパマイシンを含むフェノールレッドフリーＯｐｔｉＭＥＭＩを２時間添加した。ＯｐｔｉＭＥＭ中のＦＫ５０６阻害剤を０〜５０μＭの最終濃度で細胞に添加し、３時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭ中のフリマジンを細胞に添加して、細胞上１０μＭの最終濃度にした。発光をＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉにより、０．５秒の積分時間を用いて即座に読み取った。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して、データをシグモイド曲線に適合させ、ＩＣ５０値を算出した。
【０２８７】
図１６６は、ラパマイシン競合阻害剤ＦＫ５０６による、ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−７８／７９／９９／１０１／１０４／１１４／１２８のラパマイシン誘導性シグナルの用量依存的減少を実証する。
【０２８８】
実施例１２３
異なる比でのＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１１４でトランスフェクトされた細胞によって発生した発光の比較
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００）を、１ｎｇ  ｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及び０．０１、０．１、１、１０、または１００ｎｇ  ｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１１４プラスミドＤＮＡで、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを１対８のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比で使用して、不透明な９６ウェルアッセイプレートのウェル中にリバーストランスフェクトした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００）もまた、１ｎｇ  ｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１１４及び０．０１、０．１、１、１０、または１００ｎｇ  ｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓによりリバーストランスフェクトした。両状況において、ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを添加して、各トランスフェクションにおける総ＤＮＡを１μｇにした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで５０ｎＭラパマイシンを含むまたは含まないフェノールレッドフリーＯｐｔｉＭＥＭＩ中で１．５時間インキュベートした。ＯｐｔｉＭＥＭＩ中の５０ｎＭラパマイシンを含むまたは含まない１０μＭフリマジン基質（最終濃度）を各ウェルに直接添加し、室温で５分間インキュベートした。発光を次いでＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉにより、０．５秒の積分時間を用いて読み取った。
【０２８９】
図１６７は、１：１のＤＮＡ比が最も大きいラパマイシン誘導を生じさせたが、試験した全てのＤＮＡ比で著しい誘導が観察されたことを実証する。
【０２９０】
実施例１２４
異なる配向にあり、異なるリンカー長を有する、ＦＲＢ／ＦＫＢＰのＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＮＬｐｅｐ１１４融合体を発現する細胞によって発生した発光の比較
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００）を、ＦＲＢまたはＦＫＢＰとのｐＦ４Ａｇ  ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びｐＦ４Ａｇ  ＮＬｐｅｐ１１４のＮ末端及びＣ末端融合体の組み合わせを発現するベクターにより、９６ウェルプレートのウェル中にトランスフェクトした。これらの構築物において、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＮＬｐｅｐ１１４を、４、１０、または１５セリン／グリシンリンカーのいずれかと共にそれらの融合パートナーから分離した。０．１ｎｇ  ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ１１４  ＤＮＡを、１ウェル当たり１対８のＤＮＡ対ＦｕｇｅｎｅＨＤ比でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いでＯｐｔｉＭＥＭＩ中５０ｎＭラパマイシンを含むまたは含まないフェノールレッドフリーＯｐｔｉＭＥＭＩ中で２時間インキュベートした。１０μＭフリマジン基質を次いで添加し、続く室温で５分間のインキュベーションを行い、プレートを、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉを使用して０．５秒の積分時間を用いて読み取った。
【０２９１】
図１６８は、融合体の配向またはリンカー長に関わらず、ＲＬＵのラパマイシン特異的増加を例示する。
【０２９２】
実施例１２５
ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１１４及びスプリットホタル相補系によって生成されるラパマイシン用量反応曲線及び時間経過の比較
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（８００，０００）を、総計２０ｎｇ  ｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１１４または７５０ｎｇ  ｐＦ４Ａ  Ａｇ  Ｎ−Ｆｌｕｃ（１−３９８）−ＦＲＢ及びＦＫＢＰ−Ｃ−Ｆｌｕｃ（３９４−５４４）で、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを１対４のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比で使用して、６ウェルアッセイプレートのウェル中にトランスフェクトした。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを添加して、各トランスフェクションにおける総ＤＮＡを１μｇにした。トランスフェクションの２４時間後、２０，０００個の細胞を不透明な９６ウェルアッセイプレートのウェル中に再度プレートし、さらに２４時間インキュベートした。
【０２９３】
用量反応実験のために（図１６９Ａ）、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＮＬｐｅｐ１１４発現細胞をフェノールレッドフリーＯｐｔｉＭＥＭＩ中の０〜１μＭラパマイシンで３時間処理し、次いで１０μＭフリマジンと共に５分間インキュベートした後、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉにより発光を記録した。Ｎ−Ｆｌｕｃ（１−３９８）／Ｃ−Ｆｌｕｃ（３９４−５４４）を発現する細胞を、フェノールレッドフリー中、０〜１μＭラパマイシンと共に２時間インキュベートし、続いて４ｍＭ  Ｄ−ルシフェリンの存在下でさらなる１時間のインキュベーションを行ってから、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉにより発光を記録した。
【０２９４】
時間経過実験のために（図１６９Ｂ）、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＮＬｐｅｐ１１４発現細胞を、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ注入器を介して添加したフェノールレッドフリーＯｐｔｉＭＥＭＩ中の０または５０ｎＭラパマイシンで処理し、発光を即座に測定した。Ｎ−Ｆｌｕ（１−３９８）／Ｃ−Ｆｌｕ（３９４−５４４）を発現する細胞を、フェノールレッドフリーＯｐｔｉＭＥＭＩ中の４  ｍＭ  Ｄ−ルシフェリンで１時間処理し、続いて注入器を介した０または５０ｎＭラパマイシンの注入、及びＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉによる発光の測定を行った。曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェアを使用して適合させた。図１６９Ａ〜Ｂは、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＮＬｐｅｐ１１４及びスプリットホタル相補系の両方がラパマイシン依存的様態で反応して、シグモイド用量反応曲線及び同様のＥＣ５０値を生成することを実証する。ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＮＬｐｅｐ１１４系は、より高速の会合反応速度及びより高い最大シグナルを示す。
【０２９５】
実施例１２６
ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１１４及びスプリットホタル相補系によって生成されたＦＫ５０６の用量反応曲線及び時間経過の比較
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（８００，０００）を、総計２０ｎｇ  ｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びｐＦ４Ａ  Ａｇ  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１１４または７５０ｎｇ  ｐＦ４Ａ  Ａｇ  Ｎ−Ｆｌｕｃ（１−３９８）−ＦＲＢ及びＦＫＢＰ−Ｃ−Ｆｌｕｃ（３９４−５４４）で、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを１対４のＤＮＡ対ＦｕＧＥＮＥ比で使用して、６ウェルアッセイプレートのウェル中にトランスフェクトした。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを添加して、各トランスフェクションにおける総ＤＮＡを１μｇにした。トランスフェクションの２４時間後、２０，０００個の細胞を不透明な９６ウェルアッセイプレートのウェル中に再度プレートし、さらに２４時間インキュベートした。細胞を次いで、フェノールレッドフリーＯｐｔｉＭＥＭＩ中の０または２０ｎＭラパマイシンで３時間処理した。
【０２９６】
ＦＫ５０６用量反応実験（図１７０Ａ）のために、細胞をフェノールレッドフリーＯｐｔｉＭＥＭＩ中の０〜１００μＭ  ＦＫ５０６阻害剤と共に５時間インキュベートし、１０μＭフリマジンで処理し、次いでＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉで、０．５秒の積分時間を用いた発光モードで読み取った。時間経過実験のために（図１７０Ｂ）、細胞を、１０μＭフリマジンを含有するフェノールレッドフリーＯｐｔｉＭＥＭＩ中の１０μＭ  ＦＫ５０６で処理し、発光をＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉで即座に読み取った。
【０２９７】
図１７０Ａ〜Ｂは、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＮＬｐｅｐ１１４及びスプリットホタル相補系が、ＦＫ５０６阻害剤での処理後に光出力の用量依存的減少を示すことを実証する。ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＮＬｐｅｐ１１４系におけるシグナルの損失は、スプリットホタル系よりも、より早期の時点で開始し、より迅速であり、かつより完全である。
【０２９８】
実施例１２７
ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１１４及びＦＫＢＰ−Ｆｌｕｃ（３９４〜５４４）の発現レベルを示すウェスタンブロット
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２００，０００）を、０〜３０ｎｇのｐＦ４Ａｇ  ＮＬｐｅｐ１１４−ＦＫＢＰまたはｐＦ４Ａｇ  ＦＫＢＰ−Ｆｌｕｃ（３９４−５４４）ＤＮＡで、ＦｕｇｅｎｅＨＤを１対８のＤＮＡ対Ｆｕｇｅｎｅ比で使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を１Ｘ  ＳＤＳゲル負荷緩衝液で採取した。試料を４〜１０％トリス−ＨＣｌ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。膜をＴＢＳＴ中の５％  ＢＳＡ中で１時間ブロッキングし、次いで抗ＦＫＢＰ（Ａｂｃａｍ番号ａｂ２９１８）と共に一晩インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ複合ロバ抗ウサギＩｇＧとの二次抗体インキュベーションを１時間行い、次いでブロットを、ＥＣＬウェスタンブロッティング基質（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及びＩｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＬＡＳ  ４０００系を使用して展開した。
【０２９９】
図１７１は、等レベルのトランスフェクトＤＮＡでのＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１１４及びＦＫＢＰ−Ｆｌｕｃ（３９４〜５４４）の同様の発現レベルを実証する。
【０３００】
実施例１２８
ＩＢＥＴ−１５１によるＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ−ＢＲＤ４及びヒストンＨ３．３−ＮＬｐｅｐ１１４相互作用の用量及び時間特異的阻害
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００）を、１０ｎｇのｐＦ４Ａｇ  ヒストンＨ３．３−ＮＬｐｅｐ１１４及びＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓで、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤを１対８のＤＮＡ対Ｆｕｇｅｎｅ比で使用して、９６ウェルの白色アッセイプレートのウェル中にトランスフェクトした。
【０３０１】
用量反応実験のために（図１７２Ａ）、細胞をフェノールレッドフリーＯｐｔｉＭＥＭＩ中の０〜１０μＭ  ＩＢＥＴ−１５１  で３７℃で４時間処理し、次いで１０μＭフリマジンで５分間処理した後、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉで発光を読み取った。
【０３０２】
時間経過実験のために（図１７２Ｂ）、細胞を１０μＭフリマジンと共に５分間プレインキュベートし、０〜５００ｎＭ  ＩＢＥＴ−１５１で処理し、５分毎の発光測定のためにＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ中に即座に配置した。
【０３０３】
図１７２Ａ〜Ｂは、文献報告と一致して、ＢＲＤ４阻害剤ＩＢＥＴ−１５１で処理した際に、発光の用量依存的低下が処理の３時間以内に生じることを実証する。
【０３０４】
実施例１２９
ＧＤＣ０８７９に反応したＲＡＳ／ＣＲＡＦ、ＢＲＡＦ／ＢＲＡＦ、及びＣＲＡＦ／ＢＲＡＦの二量体化
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００）を、ｐＦ４Ａｇ  ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ−ＢＲＡＦ、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ−ＣＲＡＦ、ＮＬｐｅｐ１１４−ＫＲＡＳ、またはＮＬｐｅｐ１１４−ＢＲＡＦの組み合わせで、１ウェル当たり総計０．１ｎｇのＤＮＡ及びＦｕｇｅｎｅ  ＨＤを１対４の比で使用して、９６ウェルアッセイプレートのウェル中に共トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をフェノールレッドフリーＯｐｔｉＭＥＭＩ中、０〜１０μＭのＢＲＡＦ阻害剤ＧＤＣ０８７９で４時間処理した。フェノールレッドフリーＯｐｔｉＭＥＭＩ中のフリマジン基質を１０μＭに添加し、発光を０．５秒の積分時間に設定したＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉで即座に読み取った。
【０３０５】
図１７３は、ＢＲＡＦ阻害剤ＧＤＣ０８７９に反応したＲＡＳ／ＣＲＡＦ、ＢＲＡＦ／ＢＲＡＦ、及びＣＲＡＦ／ＢＲＡＦの二量体化の用量依存的増加を実証する。
【０３０６】
実施例１３０
１２個の合成ペプチド（図１８０）を、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓの３つの異なるバージョン（すなわち１１Ｓ、１１Ｓ−アミノ酸１５７、１１Ｓ−アミノ酸１５６及び１５７）を構造的に相補するそれらの能力について検査した。ＮＬｐｏｌｙの原液をＮａｎｏＧｌｏ試薬中３５ｎＭにし、ＮＬｐｅｐの原液をＰＢＳ  ｐＨ７．２中１２．５ｎＭにした。等体積を混合し、試料を発光についてＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５００リーダー（１００ミリ秒積分時間；１０分時点）により測定した（図２００）。
【０３０７】
実施例１３１
自発的に相互作用するペプチドＮＬｐｅｐ８６
精製ＮＬＰｏｌｙ１１ＳをＰＢＳ  ｐＨ７＋０．０１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ＋１ｍＭ  ＤＴＴ＋０．００５％  Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（親和性緩衝液）中、４０ｐＭに希釈した。合成ＮＬＰｅｐ（ＮＬＰｅｐ８６、ＷＴ、１１４）を親和性緩衝液中、次のように希釈した：ＮＬＰｅｐ８６  ＝  ６０ｎＭ、ＮＬＰｅｐ１１４＝４．４８ｍＭ及びＮＬＰｅｐＷＴ＝２０μＭ。２５μＬ  ＮＬＰｏｌｙ１１Ｓ及び２５μＬ  ＮＬＰｅｐを混合し、次いで周囲温度で３０分間インキュベートした。５０μｌ親和性緩衝液＋２０μＭ  Ｆｚを次いで各混合物に添加し、発光をＧｌｏｍａｘＭｕｌｔｉ＋により、０．５秒の積分を使用して測定した。Ｂｍａｘ及びＫｄ値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ及び１サイト特異的結合を使用して決定した。
【０３０８】
図１７４は、ＮＬＰｏｌｙ１１Ｓ及び種々のＮＬＰｅｐを使用しての約１００，０００倍範囲の親和性を実証する。Ｐｅｐ８６は、（ＬＳＰ１１Ｓと）自発的に相互作用するペプチドの一例であり、Ｐｅｐ１１４が参照のために低親和性相互作用ペプチドとして示される。
【０３０９】
実施例１３２
インビトロでの高親和性ペプチドの滴定
精製ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ（ＨａｌｏＴａｇ精製／大腸菌発現、ｐＦＮ１８Ｋ）及び合成ペプチドＮＬｐｅｐ８６（ペプチド２．０から得た）を、線形動的範囲で、Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ緩衝液中の３３ｎＭ  ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓを使用して、３．３ｆＭ〜１００ｎＭ高親和性ＮＬｐｅｐ８６に対して滴定した。３０ｋＤａタンパク質について、これは１０ｆｇのＬＯＤに相当する。
【０３１０】
図１７６は、広範な線形範囲及びフェムトモル（ｆｅｍｐｔａｍｏｌａｒ）濃度の高親和性ペプチドタグ（ＮＬｐｅｐ８６）を検出する能力を実証する。これは、最も高感度ウェスタンブロット（ＷＢ）＋増強化学発光（ＥＣＬ）キットに匹敵する。
【０３１１】
実施例１３３
ＮＬｐｏｌｙ及びＮＬｐｅｐのウェスタンブロット様有用性
ＨａｌｏＴａｇ（ＨＴ７）−ＮＬｐｅｐ  ８０（８０）またはＮＬｐｅｐ８０−ＨａｌｏＴａｇ（ＨＴ７）の滴定をＳＤＳ  ｐａｇｅゲルにより実行した。ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質を、ＨａｌｏＴａｇ−ＴＭＲリガンド（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、Ｔｙｐｈｏｏｎ走査機により画像化した。試料を膜に移し、ＰＢＳ  ｐＨ７＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ＋ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ（１：１，０００希釈した大腸菌ライセート）を使用して、膜にブロットした。ＮａｎｏＧｌｏ／Ｆｚを次いで膜に添加し、それをＩｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔにより画像化した。
【０３１２】
図１７７は、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓを使用して高親和性ＮＬＰｅｐでタグされたタンパク質を検出する感度を実証する。図１７７はまた、ＮＬＰｅｐ／ＮＬＰｏｌｙを使用した検出を、蛍光標識されたＨａｌｏＴａｇを使用した検出と比較する。
【０３１３】
実施例１３４
ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ試薬の安定性
１００ｎＭ  ＮＬｐｏｌｙ１１ＳをＮａｎｏＧｌｏアッセイ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）＋１００μＭフリマジン中でインキュベートし、等量の希釈ＮＬｐｅｐ８６を用いてアッセイした。対照として、ＮａｎｏＧｌｏアッセイ緩衝液＋１００μＭフリマジンを使用して、等体積の希釈ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をアッセイした。
【０３１４】
結果（図１７８）は、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ試薬（Ｆｚを含有する）が商用のＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）アッセイ試薬（これもまたＦｚを含有する）と比較して同様の安定性を有することを実証する。
【０３１５】
実施例１３５
高親和性ＮＬｐｅｐ７８−ＨＴ７融合体についてのＤＮＡの滴定
ＨＥＫ２９３細胞（２００，０００／ｍｌ）を、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質（ＨＴ７）に融合された、高親和性ペプチドＮＬｐｅｐ７８からのＤＮＡ（１００ｎｇで開始）の１０倍希釈液で、リバーストランスフェクトした。１００μｌの各トランスフェクションを３系列で９６ウェルプレートのウェル中にプレートした。トランスフェクションの２４時間後、１００ｎＭ  ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及び１００μｌフリマジンを含有する１００μｌＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）アッセイ緩衝液を添加し、混合した。発光を試薬添加の１０分後にＧｌｏＭａｘルミノメーターにより測定した。
【０３１６】
結果（図１７９）は、実施例１３１／図２７と同様の広範な線形範囲を実証する。これは本質的に、この実施例が哺乳類細胞内で組換えで発現されたペプチド（ＨａｌｏＴａｇに融合）を使用することを除いて、実施例１３１で行われた実験と同様の実験である。
【０３１７】
実施例１３６
予備結果（アレイペプチド）
図１８３Ａにおいて、５０ｎＭ  ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓを７．５μＭ  ＮＬｐｅｐ１１４及び３７．５μＭ暗ペプチド（ＤＰ）候補（Ｑ−１６２、Ａ−１６２、Ｋ−１６２、またはＥ−１６２）と混合した。ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を添加し、５分間インキュベートした。発光を検出した。
図１８３Ｂにおいて、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７＋０．０１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ＋１ｍＭ  ＤＴＴ＋０．００５％  Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）中の５０ｎＭ  ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓを、（これもまたアッセイ緩衝液中の）７．５μＭ  ＮＬｐｅｐ１１４、及び（これもまたアッセイ緩衝液中の）可変量の暗ペプチド（ＤＰ）候補Ｑ−１６２またはＫ−１６２と混合した。ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を添加し、５分間インキュベートした。発光をＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５００リーダーにより検出し、１００ミリ秒の積分時間、５分時点を使用した。
【０３１８】
パネルＡは、ペプチド候補（７．５μＭで）の各々が、より少ない生物発光によって示されるように、ＮＬｐｏｌｙ１１ＳとＮＬｐｅｐ１１４とのとの間の結合を阻害し得ることを示す。これらの「暗」ペプチドが幾らかの発光を発生することは確かであり、故にペプチドが全くない場合と比較してシグナルが増加することに留意されたい。
【０３１９】
パネルＢは、Ｌｙｓ−１６２及びＧｌｎ−１６２ペプチドでは、阻害が用量依存的であることを示す。
【０３２０】
実施例１３７
高純度（＞９５％）暗ペプチド
図１８４Ａにおいて、５ｎＭ  ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓを５００ｎＭ  ＮＬｐｅｐ１１４及び可変量の暗ペプチド（ＤＰ）候補Ｑ−１６２またはＡ−１６２（ｎ＝３）と混合した。ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を添加し、５分間インキュベートした。発光を検出した。
【０３２１】
図１８４Ｂにおいて、アッセイ緩衝液中の５ｎＭ  ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓを、アッセイ緩衝液中の可変量の暗ペプチド（ＤＰ）候補Ｑ−１６２またはＡ−１６２（ＮＬｐｅｐ１１４なし）（ｎ＝３）と混合した。ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を添加し、５分間インキュベートした。発光を検出した。
【０３２２】
結果（図１８４Ａ及びＢ）は、実施例１３５からの結果を立証するが、ここではペプチドがより純粋であることからより信頼性が高い。これらの結果はまた、試験した暗ペプチド変異形のうちＡｌａペプチドが阻害剤として最も強力であることを示唆する。
【０３２３】
実施例１３８
暗ペプチドによる円順列変異ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼの阻害
「高親和性／低活性」ＮＬｐｅｐ（別名暗ペプチド）が、円順列変異Ｎｌｕｃ（ＣＰ  Ｎｌｕｃ）の関連において、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）残基１〜１５６及び１５７〜１６９の間の分子内相互作用（すなわち、タンパク質折り畳み）と競合し得るかどうかを決定するために。
2020097597.tif 000059
【０３２４】
組換えＣＰ  Ｎｌｕｃを大腸菌５倍濃縮ライセート（Ｔ７−プロモーター、一晩発現）の可溶性画分として調製した。アッセイ緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７／０．０１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ／１ｍＭ  ＤＴＴ／０．００５％  Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）中のＣＰ  Ｎｌｕｃの１０，０００倍希釈を使用した。合成由来の暗ペプチドをこれもまたアッセイ緩衝液中で、様々な濃度にわたって調製した。反応を３０μＬのＣＰ  ＮＬｕｃ及び６０μＬの暗ペプチドを使用して設定し、９０μＬ  ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を添加することによってアッセイした。発光をＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５００リーダー（１００ミリ秒の積分）により測定した（５分間）。暗ペプチド試料について３回の反復実験を使用した。緩衝液対照（ペプチド原液からの酢酸）について２回の反復実験を使用した。
【０３２５】
図１８５は、暗ペプチドのＣＰ  Ｎｌｕｃとの用量−反応を実証する。図１８６は、暗ペプチド（５６μＭペプチド）のＣＰ  Ｎｌｕｃとの時間経過を実証する。
【０３２６】
結果は、双方の暗ペプチド、特にＡｌａ１６２バージョンがＣＰ  Ｎｌｕｃによる発光の発生を大幅に阻害可能であることを示す（Ａｌａ１６２＞２ｌｏｇ、Ｇｌｎ１６２＞１ｌｏｇ）。これは、ＣＰ  Ｎｌｕｃアプローチが逆相補性に対する有用性を有することを示す。
【０３２７】
実施例１３９
細胞内の暗ペプチド
この実施例において、次の構築物を使用した：
−４つの暗ペプチドベクター：ｐＦ４Ａｇ＋ＦＫＢＰ−暗ペプチドＡｌａ−１６２、Ｌｅｕ−１６２、Ｇｌｎ−１６２及びＶａｌ−１６２
−２つの非暗ペプチドベクター：ｐＦｃ５Ｋ２  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ１１４（低親和性ペプチド）及びｐＦｃ５Ｋ２  ＦＫＢＰ−ＮＬｐｅｐ８０（高親和性ペプチド）
−１つのＮＬｐｏｌｙベクター：ｐＦｃ５Ｋ２  ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ
全ての構築物が哺乳類細胞発現のためのＣＭＶプロモーターを包含した。全ての融合構築物が１０ａａ  Ｇｌｙ−Ｓｅｒ可動性リンカーを含有した。
【０３２８】
暗ペプチド構築物Ａｌａ−１６２（Ａ）、Ｌｅｕ−１６２（Ｌ）、Ｇｌｎ−１６２（Ｑ）、及びＶａｌ−１６２（Ｖ）の段階希釈をＯｐｔｉＭｅｍ中に作製し、さらにキャリアＤＮＡ（ｐＧＥＭ−３Ｚ）を含有させた。
【０３２９】
ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓのみを含有するトランスフェクションのためには、２０μｌの希釈した暗ペプチドを２０μｌＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ、６０μｌ  ＯｐｔｉＭｅｍ、及び８μＬ  Ｆｕｇｅｎｅと混合した。ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮＬｐｅｐ１１４またはＮＬｐｅｐ８０を含有するトランスフェクションのためには、２０μｌの希釈した暗ペプチドを２０μｌ  ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ（１０ｎｇ／ｕｌ）、２０μｌ  ＮＬｐｅｐ１１４またはＮＬｐｅｐ８０（１０ｎｇ／ｕｌ）、４０μｌ  ＯｐｔｉＭｅｍ、及び８ｕｌ  Ｆｕｇｅｎｅと混合した。全てを室温で１５分間インキュベートした。３系列での５μｌの各トランスフェクションを、２つの９６ウェルプレート（１つはラパマイシンを加え、１つはラパマイシンを含まない）のウェルに添加した。ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中、２００，０００細胞／ｍｌでの１００μｌのＨＥＫ２９３Ｔを次いでウェルに添加し、トランスフェクトした細胞を３７℃で一晩インキュベートした。
【０３３０】
培地を次いで細胞から除去し、細胞を２００μｌ  ＤＰＢＳで洗浄した。５０μｌの５０ｎＭラパマイシンを添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。５ｍｌフェノールレッドフリーＯｐｔｉＭＥＭＩ＋５０ｎＭラパマイシン中、２０μｌの５ｍＭフリマジンを希釈し、５０μｌを細胞に直接添加し、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ＋中で５分間インキュベートした。発光をＧｌｏＭａｘにより測定した。
【０３３１】
図１８７は、暗ペプチドが、ＦＫＢＰに融合されるとき、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ（すなわち、ＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ）のバックグラウンドシグナルを低減し得ることを実証する。まとめると、図１８８〜１９０は、暗ペプチドが、ＦＫＢＰに融合されるとき、１）完全長ＮａｎｏＬｕｃ（すなわち、ＦＲＢ−ＮａｎｏＬｕｃまたはＮａｎｏＬｕｃ−ＦＲＢ）の折り畳みと競合し、また２）低親和性ペプチド及び高親和性ペプチド（またＦＫＢＰ融合体）の両方と、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ（すなわちＦＲＢ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ）への結合に対して競合し、結果として、生細胞内で生成され、検出されている総計の発光を低減し得ることを実証する。
【０３３２】
実施例１４０
ウイルス学適用
ウイルス力価の測定を可能にすることに加えて、自発的に相互作用するＮＬｐｅｐはまた、ウイルス（例えば、インフルエンザ）の再集合を研究することを可能にする。ウイルスの再集合は、二重感染、例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２（Ｈはヘマグルチニンであり、Ｎはノイラミニダーゼである）トリ、ヒト、ブタ、ニワトリ（ブタにおいて最も一般的）からの、新たな「ハイブリッド」ウイルスの形成を指す。
【０３３３】
そのセグメント化された性質により、インフルエンザゲノムは、１つを超えるウイルスに感染した宿主細胞内で容易にシャッフリングされ得る。細胞が異なる種からのインフルエンザウイルスに感染すると、再集合により、通常はトリに感染する株からの遺伝子及び通常はヒトに感染する株からの遺伝子を含有する子孫ウイルスがもたらされ得、ほとんどの宿主内で見られることのなかった新たな株の創出につながる。その上、少なくとも１６個の異なるサブタイプ及び９個の異なるノイラミニダーゼサブタイプが特徴付けられていることから、カプシドタンパク質の多くの異なる組み合わせが可能である。これらのサブタイプのうち、ヘマグルチニンの３つのサブタイプ（Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３）及びノイラミニダーゼの２つのサブタイプ（Ｎ１及びＮ２）が、ヒト集団において持続的な流行病を引き起こしてきた。トリは、全てのインフルエンザＡサブタイプの宿主であり、新たなＨＡサブタイプがヒトに導入される元となる保有宿主である（Ｐａｌｅｓｅ，２００４）。
【０３３４】
再集合を検出するための本系の適用は、自発的に相互作用するＮＬｐｅｐの２つの構成要素が異なるウイルス粒子中に投入されるか、または細胞内の大きな構成要素及びウイルス内の小さな構成要素、ならびに両要素の存在（例えば、細胞内に存在している）が発光によって検出されるということである。
【０３３５】
実施例１４１
プロテアソームによって分解されるタンパク質のエピトープＴａｇとしての自発的に相互作用するＮＬｐｅｐ８６の使用の検証
本発明の実施形態の開発中に、プロテアソームによって分解されるタンパク質の発現レベルを監視するためのタグとしてのＮＬｐｅｐ８６の使用を検証するために、実験を行った。これを行うために、ＮＬｐｅｐ８６を、１つ以上のＰＥＳＴ配列、ＣＬ１配列、またはユビキチン配列（ｐＢＣ２１、２２、２４〜２９）のいずれかに同様に融合されたホタルルシフェラーゼ変異形に融合した。これらの構築物の各々は、突然変異体ＣＭＶプロモーター（ｄ１ＣＭＶ）からの発現に続いて、様々な度合でプロテアソーム媒介性代謝回転を経ることが予想される。
【０３３６】
タグなしのホタルルシフェラーゼまたはＰＥＳＴ配列に融合されたタグなしのホタルルシフェラーゼを発現する構築物ｐＢＣ２１、２２、２４〜２９及び対照構築物（ＡＴＧ０８２及びＡＴＧ０８３）を、１００μＬのＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳを使用した９６ウェルプレート中、１ウェル当たり１０，０００細胞でプレートしたＨＥＬＡ細胞中に一過性でトランスフェクトした。翌日、１０μＬのトランスフェクション混合物（９２０μｌ  ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ＋５μｇのそれぞれの構築物＋１５μｌ  Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ）を各ウェルにつき添加し、細胞を３７℃で４８時間、５％  ＣＯ２を含有するインキュベータ内でインキュベートさせた。タンパク質発現レベルを各構築物のための反復実験のウェル中で、ホタルルシフェラーゼ活性を検出することによって、またはＮＬｐｏｌｙ１１Ｓを含有する検出試薬（精製ＮＬｐｏｌｙ１１ＳをＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）に添加）を添加することによって、定量した。各場合においてＮＬｐｅｐ８６シグナルとＦｌｕｃシグナルとの間で良好な相関が観察されたことから、ＮＬｐｅｐ８６検出を使用して、プロテアソームによって分解されるタンパク質の融合タンパク質発現レベルを監視できることが示唆される。
ＢＣ２１  ＭＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ−ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ−Ｆｌｕｃ（高親和性）
ＢＣ２２  ＭＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ−ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ−ＦｌｕｃＰ（高親和性）
ＢＣ２４  ｐＦＣ１５Ａ／ＭＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ−ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ−Ｆｌｕｃ−ＣＬ１
ＢＣ２５  ＭＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ−ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ−Ｆｌｕｃ−ＰＥＳＴ１２ｏｐｔ（高親和性）
ＢＣ２６  ＭＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ−ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ−Ｆｌｕｃ−ＣＰ（高親和性）
ＢＣ２７  ＵＢＱ  Ｇ７６Ｖ−ＶＧＫＬＧＲＱＤＰ−Ｆｌｕｃ（ＥＤＡＫＮＩＫＫ．．）−ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ−ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ（高親和性）
ＢＣ２８  ＵＢＱ−ＲＧＫＬＧＲＱＤＰ−Ｆｌｕｃ（ＥＤＡＫＮＩＫＫ．．）−ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ−ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ（高親和性）
ＢＣ２９  ＵＢＱ−ＬＧＫＬＧＲＱＤＰ−Ｆｌｕｃ（ＥＤＡＫＮＩＫＫ．．）−ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ−ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ（高親和性）
ＡＴＧ０８３  Ｄ１  ＦｌｕｃＰ、ｐＦ４Ａｇ  ＣＭＶ  Ｌｕｃ２−ＰＥＳＴ
ＡＴＧ０８２  Ｄ１Ｆｌｕｃ、ｐＦ４Ａｇ  ＣＭＶ  Ｌｕｃ２
４８時間のインキュベーション後、１００μＬ  ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）ＮＬｐｅｐ１１Ｓ試薬（５０ｍｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）アッセイ試薬中、９０μｌのＮＬｐｏｌｙ１１Ｓを各ウェルに添加し、振盪しながら３分間インキュベートした。発光を次いでＧｌｏＭａｘルミノメーター（０．５秒／ウェル）により読み取った。
【０３３７】
図１９１における結果は、Ｆｌｕｃ及びＮＬｐｅｐ８６からのシグナルが相対輝度に関して互いを反映するように見え、同様のＲＬＵを有することを実証する。ＢＣ２１、ＢＣ２５、及びＢＣ２９は、ＢＣ系列のうち最も輝度の高い構築物であり、この実験において最も輝度の高いように見え、ＢＣ２４、２６、及び２７は最も輝度が低く、これは操作された不安定化から予測される。
【０３３８】
実施例１４２
この実施例は、既知のペプチドを、同じまたは異なる相補性ＮＬｐｅｐ及びＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ（例えば、ＮＬｐｅｐ７８（２Ｘ））間のリンカーとして使用できることを実証する。
【０３３９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０，０００）を、２０μＬのＮＬｐｅｐ７８−ＨａｌｏＴａｇ（ＨＴ）またはＮＬｐｅｐ７８（２ｘ）−ＨＴ  ＤＮＡ、８０μＬのフェノール不含Ｏｐｉｍｅｘ、及び８μＬのＦｕｇｅｎｅＨＤを含有する混合物でトランスフェクションした。細胞を３７℃で一晩増殖させ、２４時間時点で、３３ｎＭの精製ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓを含有するＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用してアッセイした。
【０３４０】
結果（図１９２）は、タンデム結合ペプチドを使用できること、及びそれがリンカーとして十分であり得ることを実証する。
【０３４１】
実施例１４３
ＨＥＫ２９３Ｔライセート中の野生型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ残基１〜１５６、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ、及びＮａｎｏＬｕｃの特異的活性の比較
各クローンをｐＦＮ２１Ａ  ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ＣＭＶ  Ｆｌｅｘｉ（登録商標）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ２８２１）に挿入し、ライセートを次のように調製した：２００，０００細胞／ｍｌの濃度に希釈した３ｍｌ  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（総計６００，０００細胞）を６ウェルプレートの各ウェル中にプレートし、３７℃で一晩、ＣＯ2インキュベータ中で増殖させた。翌日、各ＤＮＡのトランスフェクション複合体を、６．６μｇのＤＮＡ、３１０μｌの最終体積にしたＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １１０５８−０２１）、及び２０μｌのＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ２３１ａ）を組み合わせることによって調製した。トランスフェクション複合体を２０分間インキュベートし、次いで１５０μｌの各複合体を２系列で細胞に添加した。細胞を３７℃で一晩、ＣＯ2インキュベータ中で増殖させた。翌日、細胞をＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １４１９０−１４４）で細胞洗浄し、１ｍｌの新鮮なＤＰＢＳを添加した。細胞を凍結して溶解させ、次いで試験のために融解させた。２系列のトランスフェクション反応ライセートを組み合わせた。
【０３４２】
各試料についてのタンパク質発現のレベルを定量するために、各試料をＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ＴＭＲリガンド（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で次のように標識した：ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ＴＭＲリガンド（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ８２５１）を水中で０．０５ｍＭの濃度に１：１００希釈した；１００μｌの各ライセートを２μｌの希釈したＴＭＲリガンドと混合し、室温で３０分間インキュベートした；２０μｌのＳＤＳ負荷色素を添加し、試料を９５℃まで５分間加熱した。１０μｌ及び２０μｌの各試料をポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４〜１５％  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）トリス−ＨＣｌゲル番号３４５−００３０）上に負荷し、２００Ｖで１時間泳動させ、次いでＩｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ（商標）ＬＡＳ  ４０００（ＧＥ）を使用して定量した。ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）の両方が、１〜１５６よりもおよそ４倍高く発現した。
【０３４３】
野生型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ  １５７〜１６９ペプチドと組み合わせた野生型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ１〜１５６及びＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ（２成分タンパク質）に対してＮｌｕｃ（完全長酵素）の特異的活性を比較するために、基質滴定を試料の全てに対して実行したが、２成分試料については基質滴定を複数のペプチド濃度で実行した。この形式を使用して、ＮｌｕｃについてのＶｍａｘ値、ならびにＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及び野生型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ１〜１５６についてのＶｍａｘ値及びＢｍａｘ値の両方を算出することが可能であった。３つの別個の実験を、この形式を使用して実行し、Ｖｍａｘ値及びＢｍａｘ値をＮａｎｏＬｕｃのＶｍａｘに対して正規化した。相対特異的活性（Ｖｍａｘ及びＢｍａｘの平均として算出）をＮａｎｏＬｕｃに対して正規化する。
2020097597.tif 000060
【０３４４】
実施例１４４
ＮＬｐｏｌｙ及びＮＬｐｅｐがＦｌｕｃＰの細胞内半減期に及ぼす影響
ＮＬｐｏｌｙ１１ＳまたはＮＬｐｅｐ１１４のいずれかをＬｕｃ２−ＰＥＳＴに付加することが、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）処理後のシグナル減衰によって測定した細胞内半減期を変化させるかどうかを決定するため。
【０３４５】
１日目：Ｈｅｌａ細胞を６ウェルプレートにプレートする３ｍｌの細胞（２００，０００／ｍｌ）を２つの６ウェルプレートにプレートする。一晩増殖させる。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ。
【０３４６】
ＦｌｕｃＰ、野生型１５７〜１６９  ＦｌｕｃＰ、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ、ＮＬｐｅｐ１１４  ＦｌｕｃＰ、及びｐＢＣ２２を含有する構築物（全てｐＦ４Ａｇ  Ｄ１−ＣＭＶ）をＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトした。簡潔に述べると、３３μｌのＤＮＡ（３．３ｕｇ）を１２２μｌのＯｐｔｉＭｅｍに添加し、混合し、９．９μｌのＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤを添加した。トランスフェクション混合物を次いで室温で２０分間インキュベートし、１５０μｌを細胞に添加した。一晩のインキュベーション後、細胞を１０，０００細胞／ウェルで再度プレートし、再び一晩インキュベートした。
【０３４７】
インキュベーション後、増殖培地を除去し、０．４ｍＭシクロヘキシミド（ＣＨＸ）または対照（ＤＭＳＯ）のいずれかと交換した。各時点で、ＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ試薬を添加し、室温で３分間インキュベートし、発光をＴｅｃａｎ  ＧＥＮｉｏｓ  Ｐｒｏルミノメーターにより測定した。
【０３４８】
図１９３は、試験したＮＬｐｏｌｙまたはＮＬｐｅｐ構成要素のいずれも、レポーター酵素（ＦｌｕｃＰ）の正常な細胞内分解を妨害しなかったことを実証する。
【０３４９】
実施例１４５
細胞外プロテアーゼ活性アッセイ
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞外プロテアーゼ（例えばカスパーゼ）活性のためのアッセイを提供する。プロテアーゼ（例えばカスパーゼ）により消光部分を除去してから初めて、ＮＬｐｏｌｙ、例えば、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓでアクセスされて活性ルシフェラーゼに再び折り畳まれ得る、消光ペプチドが提供される（例えば、ＮＬｐｅｐ８６等の高親和性ペプチド）（図１９４）。ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ及びフリマジンを試薬としてアッセイに導入し、次いで試料を生物発光について測定する。
【０３５０】
実施例１４６
内側に結合したＰｒｏ−基（イソペプチド及びグリコシル化アミノ酸）
ＰｒｏＮＬｐｅｐの使用を介して酵素の活性を測定するためのアッセイを提供する。このＰｒｏＮＬｐｅｐの構成は、内部アミノ酸のうちの１つがＮＬｐｏｌｙに対するペプチドの相補性を阻止する基に複合された、ＮＬｐｅｐである。このＰｒｏＮＬｐｅｐがブロッキング基を除去する酵素（例えば、ＷＥＨＤの場合はカスパーゼ１またはセリングリコシドの場合はグリコシダーゼ）に遭遇すると、ＮＬｐｏｌｙを相補するＮＬｐｅｐの能力は復元される（図１９５）。フリマジンの存在下で、これは、目的とする酵素の活性に比例した光の生成をもたらす。各酵素切断がルシフェラーゼの形成をもたらすため、低濃度の酵素をアッセイすることに対するこの系の感度は、高いことが予想される。
【０３５１】
実施例１４７
リンカー評価
抗体からの積み荷の放出を測定するアッセイを提供する。ＮＬｐｅｐは、抗体、タンパク質、ペプチド、またはトランスポーター認識部分に、それがＮＬｐｏｌｙと会合してルシフェラーゼを形成するのを阻止する様態で結合される。細胞の内部移行等の刺激時に、抗体、タンパク質、ペプチド、またはトランスポーター認識部分と、ＮＬｐｅｐとの間のリンカーが切断され、細胞内の還元電位に起因して、ＮＬｐｅｐが放出される（図１９６）。ＮＬｐｅｐは今やＮＬｐｏｌｙと相補してルシフェラーゼを形成することができ、発生する光はリンカーの切断に比例することになる。これは、抗体薬物複合体からの細胞傷害性薬物送達の代用である、抗体からの化合物の放出を測定する系を提供する。リンカーは、細胞内プロテアーゼまたはｐＨ感受性を介して等、当該技術分野で既知の任意の様態を介して切断することができる。再び、ルシフェラーゼは、あらゆる切断を介して発生させられるため、これは切断をアッセイするための感受性がある方法であることが予想される。
【０３５２】
実施例１４８
病変細胞を標的としそれを破壊するための抗体の使用は、大きな治療有望性を示してきており、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と呼ばれるプロセスを介して生じる。ＡＤＣＣ活性を監視する多くの方法が存在し、これには、異なる細胞型の架橋、またはエフェクター細胞内で発現される特異的ルシフェラーゼレポーターを用いた遺伝子転写の監視が含まれる。ＡＤＣＣの作用機構に対する可能性のある代替の読み出しは、治療抗体の、細胞表面上で提示されたそれらの標的抗原または受容体への結合後に誘導または妨害される、特異的なタンパク質対タンパク質相互作用の監視にある。いくつかの実施形態において、特異的なタンパク質対タンパク質相互作用は、他の方法によって必要とされる時間と対比した分の時間枠で読み出しを提供する、本発明の系を使用して監視される。
【０３５３】
実施例１４９
イムノアッセイ
本発明の実施形態は、例えば、図２０１に描写される、均一系イムノアッセイに使用され、この図においてＮＬｐｅｐ及びＮＬｐｏｌｙは結合部分（例えば、Ａ及びＢ）に融合される。結合部分Ａ及びＢは、標的特異的アッセイとして、またはイムノアッセイに使用するためのより一般化された試薬として利用され得る、いくつかの異なるイムノアッセイ形式を構成する多くの異なる構成要素を含んでもよい。結合部分は、標的の存在下で初めて近接するようになり、故に、ＮＬｐｅｐ及びＮＬｐｏｌｙを近接させることにより、基質添加時に発光の生成がもたらされる。表７は、結合部分の例を列挙する（Ｍｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｔ．２０１２  Ｍａｒ  ７；１３７（５）：１０８５−９．、
【０３５４】
Ｓｔａｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．ＡＣＳ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０  Ｏｃｔ  １５；５（１０）：９４３−５２．、Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３  Ａｕｇ；２７９（１−２）：２０９−１８．Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９６  Ｄｅｃ；１４（１３）：１７１４−８．、Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００７  Ａｕｇ  １５；７９（１６）：６１９３−２００．、Ｋｏｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００４  Ａｐｒ  １５；３２７（２）：２４１−６．、Ｓｈｉｒａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００９  Ｓｅｐ；２５（９）：１０９５−１００．（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる））。
表７．
2020097597.tif 000061
2020097597.tif 000062
結合部分がタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、またはタンパク質ＡもしくはＧのドメインからなる、いくつかの実施形態において、イムノアッセイ系は、標的を含有する試料の添加前にＮＬｐｏｌｙ及びＮＬｐｅｐ融合体を利用して抗体と複合体形成する。抗体は、タンパク質Ａ及びＧに自然に非共有結合性で結合する。抗体と融合体との間の共有結合の導入を複合体形成ステップに導入する。ＮＬｐｅｐ／ＮＬｐｏｌｙ−タンパク質Ａ／Ｇ／ドメイン融合体の結合部分は、種々の形式で抗体に複合体化することができ、例えば以下の通りである：
・タンパク質が複合体内に存在するかどうかを決定するために、２つの異なるタンパク質を標的とする２つの異なる特異的抗体と個々に、
・単一標的特異的ポリクローナル抗体と一緒に、
・一次抗体（例えば、標的特異的マウスＩｇＧ）と共にプレインキュベートした試料に結合する二次抗体（例えば、ウサギ抗マウスＩｇＧ）と一緒に、ならびに
・同じ標的タンパク質上の２つの異なるエピトープを標的とする２つの抗体と個々に。
【０３５５】
表７に記載されるように、いくつかの実施形態において、結合部分は、標的特異的抗体、標的特異的抗体のドメイン、標的リガンドに結合する受容体ドメイン、または抗体、抗体ドメイン、及び標的受容体ドメインの組み合わせである。
【０３５６】
いくつかの実施形態において、標的は、血液、血漿、尿、血清、細胞ライセート、細胞（初代または細胞株）、細胞培養上清、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄液、組織生検試料、化学化合物等を含むが、これらに限定されない試料中で監視される。
【０３５７】
方法は、タンパク質、小分子及び化合物、ハプテン、ペプチド、ホルモン、ヘテロ二量体タンパク質−タンパク質相互作用、細胞表面抗原、受容体とリガンドとの間の相互作用、複合体中のタンパク質、ウイルス及びウイルス構成成分、細菌、毒素、合成及び天然薬物、ステロイド、カテコールアミン、エイコサノイド、タンパク質リン酸化事象等を含むが、これらに限定されない標的の分析を説明する。
【０３５８】
適用には、臨床疾患監視、診断、治療薬監視のための標的の検出または定量、生物学的研究、製薬、食物／飲料／香料産業における化合物検出及び監視、ウイルスクレード特定等が含まれるが、これらに限定されない。
【０３５９】
追加の適用には、標的とその受容体との相互作用を妨害することが可能な分子の高処理スクリーニング、故に結果としてシグナル損失アッセイが含まれる。イムノアッセイにおいてＮＬｐｅｐ／ＮＬｐｏｌｙを使用するためのいくつかの提案された形式が存在する。いくつかの実施形態において、これらは均一に行われ、キットとして、別個の診断及び研究キット構成要素として、または個々のアッセイにカスタマイズ可能な独立型の試薬として、供給される。
【０３６０】
他の実施形態において、ＮＬｐｅｐ／ＮＬｐｏｌｙを利用する均一系イムノアッセイは、ＨｉｔＨｕｎｔｅｒまたはＣＥＤＩＡ技術の変形形態を利用する（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００５  Ｊａｎ  １；３３６（１）：１０２−７．、Ｇｏｌｌａ  ａｎｄ  Ｓｅｅｔｈａｌａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．２００２  Ｄｅｃ；７（６）：５１５−２５．（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる））。かかるアッセイにおいて、構成要素には以下が含まれる：標的特異的抗体、ＮＬｐｏｌｙ、ＮＬｐｅｐ−組換え標的融合体、及び基質。ＮＬｐｏｌｙ及びＮＬｐｅｐ−組換え標的融合体は、ＮＬｐｅｐが標的特異的抗体に結合していないときに発光複合体を形成する。試験試料をアッセイ構成要素に添加すると、試験試料中に存在する標的が抗体上でＮＬｐｅｐ−組換え標的融合体と競合することになるため、発光の量は、試験試料中の標的濃度に正比例する（例えば、シグナル獲得は標的の存在を示す）。
【０３６１】
実施例１５０
自発的相補性におけるＮＬｐｏｌｙ１１Ｓの例となる構成
ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓの種々の構成が、自発的相補性アッセイまたは系において使用され得る。かかる構成には、以下が含まれ得る：Ｃ末端における欠失（例えば、バックグラウンド発光を低減するための）、Ｎ末端及び／またはＣ末端付加物（例えば、それらがＨｉｓまたはＨａｌｏＴａｇによって精製されるかに基づく）等。例えば、ＨａｌｏＴａｇによって残される付加物は、それがＮ末端タグであるとき、ＳＤＮＩＡＩである。例となる構成には、以下が含まれる：ＳＤＮＡＩＡ−１１Ｓ（ＨａｌｏＴａｇ精製）；ＳＤＮ−１１Ｓ；ＳＤＮＡＩＡ−１１Ｓ、Ｃ末端における単一欠失を伴う；ＳＤＮ−１１Ｓ、Ｃ末端における単一欠失を伴う；ＳＤＮＡＩＡ−１１Ｓ、Ｃ末端における二重欠失を伴う；ＳＤＮ−１１Ｓ、Ｃ末端における二重欠失を伴う；ＳＤＮＡＩＡ−１１Ｓ、Ｃ末端における三重欠失を伴う；ＳＤＮ−１１Ｓ、Ｃ末端における三重欠失を伴う；６Ｈｉｓ−ＡＩＡ−１１Ｓ；６Ｈｉｓ−１１Ｓ；６Ｈｉｓ−ＡＩＡ−１１Ｓ  Ｃ末端における単一欠失を伴う；６Ｈｉｓ−１１Ｓ  Ｃ末端における単一欠失を伴う；６Ｈｉｓ−ＡＩＡ−１１Ｓ  Ｃ末端における二重欠失を伴う；６Ｈｉｓ−１１Ｓ  Ｃ末端における二重欠失を伴う；６Ｈｉｓ−ＡＩＡ−１１Ｓ  Ｃ末端における三重欠失を伴う；６Ｈｉｓ−１１Ｓ  Ｃ末端における三重欠失を伴う；１１Ｓ−６Ｈｉｓ；１１Ｓ−６Ｈｉｓ、Ｃ末端１１Ｓ残基を削除；１１Ｓ−６Ｈｉｓ、最後の２つのＣ末端１１Ｓ残基を削除；１１Ｓ−６Ｈｉｓ、最後の３つのＣ末端１１Ｓ残基を削除；１１Ｓ−ＨＴ７、Ｃ末端１１Ｓ残基を削除；１１Ｓ−ＨＴ７、最後の２つのＣ末端１１Ｓ残基を削除；１１Ｓ−ＨＴ７、最後の３つのＣ末端１１Ｓ残基を削除；６Ｈｉｓ−ＨＴ７−ＡＩＡ−１１Ｓ；６Ｈｉｓ−ＨＴ７−１１Ｓ；６Ｈｉｓ−ＡＩＡ−ＨＴ７−１１Ｓ（単一、二重、三重１１Ｓ  Ｃ末端欠失を伴う）；６Ｈｉｓ−ＨＴ７−１１Ｓ（単一、二重、三重１１Ｓ  Ｃ末端欠失を伴う）；１１Ｓ−ＨＴ７−６Ｈｉｓ；１１Ｓ−ＨＴ７−６Ｈｉｓ（単一、二重、三重１１Ｓ  Ｃ末端欠失を伴う）；及び三元１１Ｓ。
【０３６２】
実施例１５１
２成分相補性に対するタンパク質相互作用の研究
本明細書に記載される２成分相補系を使用して、多種多様なタンパク質相互作用を分析した（表８を参照されたい）。
表８．２成分相補性に対するタンパク質相互作用の研究
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【０３６３】
実施例１５２
ＮＬｐｅｐの１０８個の変異形とのＮＬｐｏｌｙについての解離定数及びＢｍａｘ値（アレイ番号２）
ＮＬｐｅｐをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅによるアレイ形式で合成した（ペプチドをＮ末端にてアセチル化によって、及びＣ末端にてアミド化によってブロッキング、アレイ中のペプチドを約２ｍｇ規模で合成した）（表９）。各ペプチドを２つの別個のプレート中で凍結乾燥させた。ペプチドのプレートのうちの１つからの各ウェルを１００μＬナノ純水中に溶解させ、Ａ２６０を測定し、それを使用して、各ペプチドの吸光係数を用いて濃度を算出した。濃度を次いでペプチドの純度に基づいて調整し、ナノ純水を添加して８００μＭの最終濃度を得た。
表９．ペプチドアレイ２配列
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【０３６４】
ペプチドをＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中、４００μＭ（４Ｘ）に希釈し、次いで０．５ｌｏｇステップ（３．１６２倍希釈）において７回、段階希釈した（総計８つの濃度）。ＮＬｐｏｌｙ  １１ＳをＰＢＳ＋０．１％  Ｐｒｉｏｎｅｘ中に、１：１０＾６希釈した。２５μＬの各ＮＬｐｅｐ＋２５μＬ  ＮＬｐｏｌｙ  １１Ｓを混合し、室温で３０分間インキュベートした。５０μＬ  ＮａｎｏＧｌｏ＋１００μＭ  Ｆｚを添加し、室温で３０分間インキュベートした。発光をＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ＋により、０．５秒の積分を用いて測定した。Ｋｄ／Ｂｍａｘを、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ、１サイト特異的結合、最良適合値を使用して決定した。表１０は、ＮＬｐｏｌｙ  １１Ｓ及び示されるＮＬＰｅｐについての解離定数及びＢｍａｘ値を示す。結果は、突然変異がＮＬｐｏｌｙ  １１Ｓへの結合及び複合体の発光を生成する能力に及ぼす影響を示す。
表１０
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【０３６５】
実施例１５３
ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓからのバックグラウンドシグナルを低減するための暗ペプチド及び消光ペプチド
ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓの精製試料をＮａｎｏＧｌｏ試薬中に希釈して、２μＭの最終濃度を得た。Ｐｅｐ８６は、高親和性の発光原性ペプチドであり、これを使用してＮＬｐｏｌｙ１１Ｓの最大シグナルを誘導した。Ｐｅｐ８６を使用液用にＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、１  ｎＭで調製した。暗ペプチド及び消光ペプチド（図１８０）をＰＢＳ  ｐＨ７．２または１５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３のいずれかの中で、１ｍＭ（またはそれ未満）まで溶解させ、等体積でＮａｎｏＧｌｏ／ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓに添加し、次いで試料をＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５００リーダーにより、５分時点を使用して読み取った。
【０３６６】
図２０２Ａは、ＧＷＡＬＦＫＫ及びＤａｂｃｙｌ−ＧＷＡＬＦＫＫの両方が、任意の他の発光原性ペプチドの不在下で、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓによって発生したバックグラウンド発光を低減することを示す。図２０２Ｂは、Ｐｅｐ８６が、ＧＷＡＬＦＫＫ及びＤａｂｃｙｌ−ＧＷＡＬＦＫＫの存在下であっても発光を誘導可能であることを示す。
【０３６７】
図２０３Ａは、ＶＴＧＷＡＬＦＥＥＩＬ（Ｔｒｐ  １１ｍｅｒ）及びＶＴＧＹＡＬＦＥＥＩＬ（Ｔｙｒ  １１ｍｅｒ）がバックグラウンド（ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ単独、ペプチドなしの対照）を上回る発光を誘導するが、各々のＮ末端Ｄａｂｃｙｌバージョンがこのシグナルの著しい消光を提供することを示す。図２０３Ｂは、Ｐｅｐ８６が、Ｔｒｐ  １１ｍｅｒ及びＴｙｒ  １１ｍｅｒのＤａｂｃｙｌバージョンの存在下であっても発光を誘導可能であることを示す。
【０３６８】
上記の明細書で言及される全ての刊行物及び特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法及び系の種々の修正形態及び変形形態が、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者に明らかとなろう。本発明は具体的な実施形態に関連して記載されたが、特許請求される本発明がかかる具体的な実施形態に不当に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際、当業者に明白である、本発明を実施するための記載の様式の種々の修正形態は、本発明の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０】
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【図１２１】
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【図１２２】
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【図１２４】
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【図１２６】
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【図１２７】
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【図１２８】
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【図１２９】
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【図１３０】
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【図１３１】
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【図１３２】
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【図１４０】
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【図１４１】
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【図１７０】
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【図１７１】
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【図１７８】
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【図１７９】
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【図１８０】
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【図１８１】
2020097597.tif 000250
【図１８２Ａ】
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【図１８２Ｂ】
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【図１８３】
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【図１８４】
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【図１８５】
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【図１８６】
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【図１８７】
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【図１８８】
2020097597.tif 000258
【図１８９】
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【図１９０】
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【図１９１】
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【図１９２】
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【図１９３】
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【図１９４】
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【図１９５】
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【図１９６】
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【図１９７】
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【図１９８】
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【図１９９】
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【図２００】
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【図２０１】
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【図２０２】
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【図２０３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月28日(2020.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３〜４３８または２１６２〜２３６５の核酸配列またはアミノ酸配列でコードされるまたは表されるペプチドの１種と９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが配列番号４４０からなるポリペプチドと接触すると、フリマジン基質の存在下で生成される生物発光シグナルが、前記ペプチド及びフリマジン基質だけによって生成される生物発光シグナルと比較して実質的に増加し、かつ前記アミノ酸配列が、天然に存在するタンパク質またはその断片ではないことを特徴とする、ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが配列番号４４０からなる前記ポリペプチドと会合すると、前記生物発光シグナルが、実質的に増加する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列番号２のペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、前記形質が、配列番号４４０からなる前記ポリペプチドに対する親和性、発現、細胞内溶解性、細胞内安定性、及び、配列番号４４０からなる前記ポリペプチドと組み合わせたときの生物発光活性から選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が、表１のペプチドから選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸配列が、合成であるか、非天然のアミノ酸を含有するか、またはペプチド模倣体である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載のペプチドと、第１の相互作用ポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドであって、前記第１の相互作用ポリペプチドが、前記第１の相互作用ポリペプチドと第２の相互作用ポリペプチドとが接触すると前記第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されていることを特徴とする、融合ポリペプチド。
【請求項７】
（ａ）請求項６に記載の融合ポリペプチドと、
（ｂ）第２の融合ポリペプチドと
を含む生物発光複合体であって、前記第２の融合ポリペプチドが、
（ｉ）前記第２の相互作用ポリペプチドと、
（ｉｉ）配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドと会合すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルを放出する相補性ポリペプチドとを含み、
請求項６に記載の融合ポリペプチドと前記第２の融合ポリペプチドとが会合し、
配列番号３〜４３８または２１６２〜２３６５の核酸配列またはアミノ酸配列でコードされるまたは表されるペプチドの１種と９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドと前記相補性ポリペプチドとが会合することを特徴とする、生物発光複合体。
【請求項８】
（ａ）配列番号３〜４３８または２１６２〜２３６５の核酸配列またはアミノ酸配列でコードされるまたは表されるペプチドの１種と９０％の同一性を有するペプチドアミノ酸配列を含むペプチドと、
（ｂ）配列番号４４０と４０％超であるが９５％以下の配列同一性を有するポリペプチドアミノ酸配列を含むポリペプチドと
の非共有結合会合を含む生物発光複合体であって、
前記ペプチドアミノ酸配列が、天然に存在するタンパク質またはその断片ではなく、
前記ポリペプチドアミノ酸配列が、天然に存在するタンパク質またはその断片ではなく、
前記生物発光複合体が、検出可能な発光を示し、
前記生物発光複合体が、フリマジン基質の存在下で、前記ペプチドまたは前記ポリペプチドのいずれか一方だけが前記フリマジン基質の存在下にある場合と比較して実質的に増加した発光を生成することを特徴とする、生物発光複合体。
【請求項９】
前記ペプチドアミノ酸配列が、表１のペプチド配列から選択される、請求項８に記載の生物発光複合体。
【請求項１０】
前記ポリペプチドアミノ酸配列が、表２のポリペプチド配列から選択される、請求項８に記載の生物発光複合体。
【請求項１１】
前記ペプチドアミノ酸配列が、第２の相互作用要素と会合している第１の相互作用要素に付着している、請求項８に記載の生物発光複合体。
【請求項１２】
前記ポリペプチドアミノ酸配列が、前記第２の相互作用要素に付着している、請求項１１に記載の生物発光複合体。
【請求項１３】
前記ポリペプチドアミノ酸配列及びペプチドアミノ酸配列は、前記第１及び第２の相互作用要素の会合の非存在下では実質的に非発光性である、請求項１２に記載の生物発光複合体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６８】
上記の明細書で言及される全ての刊行物及び特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法及び系の種々の修正形態及び変形形態が、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者に明らかとなろう。本発明は具体的な実施形態に関連して記載されたが、特許請求される本発明がかかる具体的な実施形態に不当に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際、当業者に明白である、本発明を実施するための記載の様式の種々の修正形態は、本発明の範囲内にあることが意図される。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕配列番号２と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが配列番号４４０からなるポリペプチドと接触すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成されることを特徴とする、ペプチド。
〔２〕前記ペプチドが配列番号４４０からなる前記ポリペプチドと会合すると、基質の存在下で、前記検出可能な生物発光シグナルが生成される、前記〔１〕に記載のペプチド。
〔３〕前記ペプチドが、配列番号２のペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、前記形質が、配列番号４４０からなる前記ポリペプチドに対する親和性、発現、細胞内溶解性、細胞内安定性、及び、配列番号４４０からなる前記ポリペプチドと組み合わせたときの生物発光活性から選択される、前記〔１〕に記載のペプチド。
〔４〕前記アミノ酸配列が、表１のペプチドから選択される、前記〔１〕に記載のペプチド。
〔５〕前記アミノ酸配列が、合成であるか、非天然のアミノ酸を含有するか、またはペプチド模倣体である、前記〔１〕に記載のペプチド。
〔６〕前記〔１〕に記載のペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする、核酸。
〔７〕前記〔１〕に記載のペプチドと、第１の相互作用ポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドであって、前記第１の相互作用ポリペプチドが、前記第１の相互作用ポリペプチドと第２の相互作用ポリペプチドとが接触すると前記第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されていることを特徴とする、融合ポリペプチド。
〔８〕前記〔７〕に記載の融合ポリペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする、核酸。
〔９〕
（ａ）前記〔７〕に記載の融合ポリペプチドと、
（ｂ）第２の融合ポリペプチドと
を含む生物発光複合体であって、前記第２の融合ポリペプチドが、
（ｉ）前記第２の相互作用ポリペプチドと、
（ｉｉ）配列番号２と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドと会合すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルを放出する相補性ポリペプチドとを含み、
前記第１の融合ポリペプチドと前記第２の融合ポリペプチドとが会合し、
配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドと前記相補性ポリペプチドとが会合することを特徴とする、生物発光複合体。
〔１０〕配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが配列番号２からなるペプチドと接触すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成されることを特徴とする、ポリペプチド。
〔１１〕前記ポリペプチドが、配列番号４４０のポリペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、前記形質が、配列番号２からなる前記ペプチドに対する親和性、発現、細胞内溶解性、細胞内安定性、及び、配列番号２からなる前記ペプチドと組み合わせた時の生物発光活性から選択される、前記〔９〕に記載のポリペプチド。
〔１２〕前記アミノ酸配列が、表２のポリペプチド配列のうちの１つから選択される、前記〔１０〕に記載のポリペプチド。
〔１３〕前記ポリペプチドが配列番号２からなる前記ペプチドと会合すると、基質の存在下で、前記検出可能な生物発光シグナルが生成される、前記〔１０〕に記載のポリペプチド。
〔１４〕前記アミノ酸配列が、合成であるか、非天然のアミノ酸を含有するか、またはペプチド模倣体である、前記〔１０〕に記載のポリペプチド。
〔１５〕前記〔１０〕に記載のポリペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする、核酸。
〔１６〕前記〔１０〕に記載のポリペプチドと、第１の相互作用ポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドであって、前記第１の相互作用ポリペプチドが、前記第１の相互作用ポリペプチドと第２の相互作用ポリペプチドとが接触すると前記第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されていることを特徴とする、融合ポリペプチド。
〔１７〕
（ａ）前記〔１６〕に記載の融合ポリペプチドと、
（ｂ）第２の融合ポリペプチドと
を含む生物発光複合体であって、前記第２の融合ポリペプチドが、
ｉ）前記第２の相互作用ポリペプチドと、
ｉｉ）２つの間に会合が形成された時に、配列番号２と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドに、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルを放出させる相補性ペプチドとを含み、
前記第１の融合ポリペプチドと前記第２の融合ポリペプチドとが会合し、
配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドと前記相補性ポリペプチドとが会合することを特徴とする、生物発光複合体。
〔１８〕
（ａ）配列番号２と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するペプチドアミノ酸配列を含むペプチドと、
（ｂ）配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するポリペプチドアミノ酸配列を含むポリペプチドと
を含む生物発光複合体であって、検出可能な発光を示すことを特徴とする、生物発光複合体。
〔１９〕前記ペプチドアミノ酸配列と前記ポリペプチドアミノ酸配列とが会合する、前記〔１８〕に記載の生物発光複合体。
〔２０〕前記ペプチドアミノ酸配列が、表１のペプチド配列から選択される、前記〔１８〕に記載の生物発光複合体。
〔２１〕前記ポリペプチドアミノ酸配列が、表２のポリペプチド配列から選択される、前記〔１８〕に記載の生物発光複合体。
〔２２〕前記ペプチドアミノ酸配列が、第２の相互作用要素と会合している第１の相互作用要素に付着している、前記〔１９〕に記載の生物発光複合体。
〔２３〕前記ポリペプチドアミノ酸配列が、前記第２の相互作用要素に付着している、前記〔２２〕に記載の生物発光複合体。
〔２４〕前記ポリペプチドアミノ酸配列及びペプチドアミノ酸配列は、前記第１及び第２の相互作用要素の会合の非存在下では会合することができない、前記〔２３〕に記載の生物発光複合体。
〔２５〕
（ａ）既存のタンパク質の断片ではない第１のアミノ酸配列と、
（ｂ）既存のタンパク質の断片ではない第２のアミノ酸配列と
を含む生物発光複合体であって、
前記生物発光複合体が、検出可能な発光を示し、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列とが会合し、前記生物発光複合体が、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列とが会合すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルを放出することを特徴とする、生物発光複合体。
〔２６〕
（ｃ）相互作用対の第１のメンバーを含む第３のアミノ酸配列であって、前記第１のアミノ酸配列に共有結合される、第３のアミノ酸配列と、
（ｄ）相互作用対の第２のメンバーを含む第４のアミノ酸配列であって、前記第２のアミノ酸配列に共有結合される、第４のアミノ酸配列と
をさらに含む、前記〔２５〕に記載の生物発光複合体。
〔２７〕前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間の非共有結合相互作用は、前記相互作用対の前記第１のメンバーと前記第２のメンバーとの間の非共有結合相互作用が存在しない場合、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列とを会合させるのに十分ではない、前記〔２６〕に記載の生物発光複合体。
〔２８〕第１のポリペプチド鎖は、前記第１のアミノ酸配列及び前記第３のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、前記第２のアミノ酸配列及び前記第４のアミノ酸配列を含む、前記〔２６〕に記載の生物発光複合体。
〔２９〕前記第１のポリペプチド鎖及び前記第２のポリペプチド鎖が、細胞内で発現される、前記〔２８〕に記載の生物発光複合体。
〔３０〕
（ａ）非発光性対と、
（ｂ）相互作用対と
を含む生物発光複合体であって、
前記非発光性対の各非発光性要素が、既存のタンパク質の断片ではなく、
前記相互作用対の各相互作用要素が、前記非発光性対の前記非発光性要素の１つに共有結合されることを特徴とする、生物発光複合体。
〔３１〕第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の安定な相互作用の検出方法であって、
（ａ）前記第１のアミノ酸配列を第３のアミノ酸配列に付着させ、かつ前記第２のアミノ酸配列を第４のアミノ酸配列に付着させる工程であって、前記第３及び第４のアミノ酸配列が、既存のタンパク質の断片ではなく、前記第３及び第４のアミノ酸配列の安定な複合体は、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルを放出し、前記第３及び第４のアミノ酸配列の間の非共有結合相互作用は、追加の安定化力及び／または凝集力の非存在下で前記第３及び第４のアミノ酸配列の複合体を形成するには十分ではなく、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間の安定な相互作用は、前記第３及び第４のアミノ酸配列の安定な複合体を生成するためのっ前記追加の安定化力及び／または凝集力を提供する工程と、
（ｂ）前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間の安定な相互作用が起こることを可能にする条件で、工程（ａ）の前記第１、第２、第３、及び第４のアミノ酸配列を配置する工程と、
（ｃ）基質の存在下での前記第３及び第４のアミノ酸配列の前記安定な複合体によって、基質の存在下で放出された前記生物発光シグナルを検出する工程であって、前記生物発光シグナルの検出が、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間の安定な相互作用を示す工程と
を含むことを特徴とする、方法。
〔３２〕前記第１のアミノ酸配列を前記第３のアミノ酸配列に、かつ前記第２のアミノ酸配列を前記第４のアミノ酸配列に付着させる工程が、前記第１のアミノ酸配列及び前記第３のアミノ酸配列を含む第１の融合タンパク質を形成する工程と、前記第２のアミノ酸配列及び前記第４のアミノ酸配列を含む第２の融合タンパク質を形成する工程とを含む、前記〔３１〕に記載の方法。
〔３３〕前記第１の融合タンパク質及び前記第２の融合タンパク質が、それぞれ、前記第１及び第３のアミノ酸配列の間と前記第２及び第４のアミノ酸配列の間とに、リンカーをさらに含む、前記〔３２〕に記載の方法。
〔３４〕前記第１の融合タンパク質が、前記第１及び第３のアミノ酸配列をコードする第１の核酸配列から発現され、前記第２の融合タンパク質が、前記第２及び第４のアミノ酸配列をコードする第２の核酸配列から発現される、前記〔３２〕に記載の方法。
〔３５〕単一のベクターは、前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列を含む、前記〔３４〕に記載の方法。
〔３６〕前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列が、別個のベクター上に存在する、前記〔３４〕に記載の方法。
〔３７〕工程（ａ）及び（ｂ）が、前記第１及び第２の融合タンパク質を細胞内で発現させる工程を含む、前記〔３４〕に記載の方法。
〔３８〕非発光性対の最適化方法であって、
（ａ）３つ以上の関連するタンパク質の配列を整列させる工程と、
（ｂ）前記関連するタンパク質のコンセンサス配列を決定する工程と、
（ｃ）３つ以上のタンパク質に関連するタンパク質の第１及び第２の断片を提供する工程であって、前記断片は、個別には実質的に非発光性であるが、前記断片が安定に相互作用すると発光を示す工程と、
（ｄ）前記第１及び第２の断片を各々１ヶ所以上の位置で突然変異させる工程であって、前記突然変異が、前記断片の配列をコンセンサス配列の対応する部分により類似するように変更し、前記突然変異が、既存のタンパク質の断片ではない非発光性対を生じさせる工程と、
（ｅ）前記非発光性対を、会合していない場合の発光の非存在と、前記非発光性対が安定に会合した場合の発光とについて試験する工程と
を含むことを特徴とする、方法。
〔３９〕前記非発光性対が、前記第１及び第２の断片と比較して１つ以上の形質の増強を示し、前記形質が、再構成の親和性の増加、再構成の親和性の減少、発現の増強、細胞内溶解性の増加、細胞内安定性の増加、及び再構成された発光の強度の増加から選択される、前記〔３８〕に記載の方法。
〔４０〕（ａ）配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが配列番号２からなるペプチドと接触すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、ポリペプチドと、（ｂ）前記ポリペプチド及び配列番号２からなるペプチドによって生成される生物発光複合体のための基質とを備えることを特徴とする、検出試薬。
〔４１〕（ａ）配列番号２と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが配列番号４４０からなるポリペプチドと接触すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、ペプチドと、（ｂ）前記ペプチド及び配列番号４４０からなるポリペプチドによって生成される生物発光複合体のための基質とを備えることを特徴とする、検出試薬。
【外国語明細書】
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