(57)【要約】【課題】細胞増殖を妨げずに細胞内に所望の成分または化合物を容易に送達できるベヒクルの提供。【解決手段】表面が陽性荷電で覆われた、細胞内送達ベヒクル。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面が陽性荷電で覆われた、細胞内送達ベヒクル。
【請求項２】
細胞内に送達される目的の成分または化合物が、請求項１に記載の細胞内送達ベヒクルに充填されてなる、細胞内送達複合体。
【請求項３】
細胞内に送達される目的の成分または化合物が前記細胞内送達ベヒクルに共有結合している、請求項２に記載の細胞内送達複合体。
【請求項４】
前記化合物が、温度に応じてその特性が変化する感熱性ユニット、および該感熱性ユニットの特性変化に伴って蛍光強度または蛍光寿命が変化する蛍光性ユニットである、請求項２または３に記載の細胞内送達複合体。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞内送達複合体を含んでなる、温度感受性プローブ。
【請求項６】
細胞内の温度を測定する方法であって、
（ａ）請求項５に記載の温度感受性プローブを細胞内に導入する工程、および
（ｂ）励起光照射下、蛍光強度または蛍光寿命を測定する工程
を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞増殖を妨げずに所望の成分または化合物を細胞内に容易に送達できる細胞内送達ベヒクル、その製造方法または使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質などを細胞内に導入するにあたり、蛋白質をカチオン化することにより、効率的に導入できることが知られている（特許文献１）。また、インスリンなどのペプチド性医薬品をキトサンなどのカチオン性高分子などと共に用いると、粘膜上皮細胞に障害を与えることなく粘膜吸収促進が図られることが知られている（非特許文献１）。さらに、ポリカチオンを用いたナノ粒子によるｓｉＲＮＡの細胞への導入によるＲＮＡｉ治療の副作用の問題点とその解決手段について検討されている（非特許文献２）。さらに、最近では、温度感受性蛍光プローブとして細胞内に導入するためのカチオン性ポリマーが報告されている（特許文献２）。しかし、カチオンが上述の現象を引き起こすメカニズム、細胞に与える影響、さらにはその応用範囲については、必ずしも解明されているわけではない。
【０００３】
これら以外にも、カチオンに着目した機能開発は数多くなされている。例えば、カチオン系バイオポリマーであるキトサンとγグルタミン酸によるナノカプセルについて、周囲のｐＨに連動して膨潤／収縮する性質を見出し、その応用が検討されている（非特許文献３）。また、新型カチオン活性剤のヘアーコンディショナーへの活用の可能性（非特許文献４）や、帯電量を保持しながら低吸湿性に優れているカチオン性重合体の応用（特許文献３）などが報告されている。
【０００４】
しかしながら、これらの技術により種々のカチオン性のポリマーが与えられたとしても、細胞増殖を妨げずに細胞内に容易に導入することができ、特に、導入した細胞の細胞分裂を阻害しないポリマーを選び出すことは困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】関俊暢  薬学雑誌, vol.130(9), pp.1115-1121, 2010
【非特許文献２】Borja Ballarin-Gonzalez et.al., Advanced Drug Delivery Reviews vol., 64 p.1717-1729, 2012
【非特許文献３】Takayuki Imoto et.al., Macromol. Biosci. vol.10, pp.271-277, 2010
【非特許文献４】三田村譲嗣ら  J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn. vol.30(1), pp.84-93, 1996
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−４９２１４号公報
【特許文献２】国際公開第２０１３／０９４７４８号
【特許文献３】特開２０１１−１５７５０３号公報
【発明の概要】
【０００７】
本発明の目的は、細胞増殖を妨げずに細胞内に所望の成分または化合物を容易に送達できるベヒクル、その製造方法および使用方法を提供することにある。
【０００８】
本発明者らは、温度感受性蛍光プローブを細胞内に導入する技術を開発する過程で、細胞内に容易に導入できると共に、導入した細胞の細胞分裂を阻害しない新規なベヒクルの調製方法を見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）表面が陽性荷電で覆われた、細胞内送達ベヒクル。
（２）細胞内に送達される目的の成分または化合物が、前記（１）に記載の前記細胞内送達ベヒクルに充填されてなる、細胞内送達複合体。
（３）細胞内に送達される目的の成分または化合物が前記細胞内送達ベヒクルに共有結合している、前記（２）に記載の細胞内送達複合体。
（４）前記化合物が、温度に応じてその特性が変化する感熱性ユニット、および該感熱性ユニットの特性変化に伴って蛍光強度または蛍光寿命が変化する蛍光性ユニットである、前記（２）または（３）に記載の細胞内送達複合体。
（５）前記（４）に記載の細胞内送達複合体を含んでなる、温度感受性プローブ。
（６）細胞内の温度を測定する方法であって、
（ａ）前記（５）に記載の温度感受性プローブを細胞内に導入する工程、および
（ｂ）励起光照射下、蛍光強度または蛍光寿命を測定する工程
を含んでなる、方法。
【００１０】
本発明は、マイクロインジェクション等の複雑な操作を必要とせず、所望の成分または化合物を容易に細胞に導入することができる点で有利である。また、導入されたベヒクルが細胞の細胞増殖を妨げない点で有利である。さらに、本発明のベヒクルを利用すれば、所望の成分または化合物を、細胞増殖を妨げずに、容易に細胞内に送達できる点で有利である。さらに、本明細書の実施例では、細胞に導入された本発明のベヒクルが細胞の分化を妨げないという利点を有することも確認されている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】化合物２ｂのＴＥＭによる観察結果を示した一例である。
【図２】化合物３ｄのＴＥＭによる観察結果を示した一例である。
【図３】化合物ＥＦ０４３のＴＥＭによる観察結果を示した一例である。
【図４】化合物Ｌｉｎ４０とＬｉｎ４１（黒丸：Ｌｉｎ４０、白丸：Ｌｉｎ４１）の１５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中での蛍光強度（Ｌｉｎ４０：５６９ｎｍ、Ｌｉｎ４１：５７１ｎｍ）の感熱応答性試験結果（０．００５ｗ／ｖ％、励起波長４５０ｎｍ）の一例である（ｎ＝３）。
【図５】ＥＦ０４３，ＮＮ−ＡＰ４、Ｌｉｎ４０、Ｌｉｎ４１、ｋ４０をそれぞれ５％グルコース溶液中でヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞と混合（３７℃、１０分）し、顕微鏡で観察（励起光：４７３ｎｍ、蛍光：５００ｎｍ〜６００ｎｍ）を行った写真の一例である。
【図６】ＥＦ０４３，ＮＮ−ＡＰ４、Ｌｉｎ４０を導入したＨｅＬａ細胞を使って、２４時間後のプローブが入った細胞数をカウントし、増殖率を評価した一例である（ｎ＝３）。
【図７】褐色脂肪細胞に分化誘導直後にカチオン性ゲル型温度プローブＥＦ０４３を導入し、その後、さらに培養を３日間続け、成熟した状態になった褐色脂肪細胞を顕微鏡下で観察した結果の一例である。
【図８】ＥＦ０４３を５％グルコース溶液中でＭＯＬＴ−４ （ヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞）と混合（３７℃、１０分）し、顕微鏡で観察（励起光：４７３ｎｍ、蛍光：５００ｎｍ〜６００ｎｍ）を行った写真の一例（左）とＭＯＬＴ−４細胞中のＥＦ０４３の蛍光強度の感熱応答性試験の結果の一例（右）（ｎ＝３）である。
【図９】ＭＯＬＴ−４ （ヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞）細胞中のＥＦ０４３の蛍光寿命（Ｅｘ：４０５ｎｍ、Ｅｍ：５６５ｎｍ）の感熱応答性試験の結果（ｎ＝３）の一例である。
【図１０】図９のグラフから算出した温度分解能の結果の一例である。
【図１１】フルオレセインおよびローダミンＢを包含したＰＥＧ型のカチオン性ゲルのＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト由来胎児腎細胞）細胞への導入効率を蛍光分子単独の場合と比較した結果（ｎ＝３）の一例である。
【発明の具体的説明】
【００１２】
１．定義
本発明において「ベヒクル」（ｖｅｈｉｃｌｅ）とは、所望の成分または化合物を細胞内に送達させる媒体または担体を意味する。
【００１３】
本発明における「細胞」とは、一般的な分類である原核細胞と真核細胞の両方を含み、特にその生物の種に依らない。例えば、原核細胞は真正細菌と古細菌に分けられるが、真正細菌はその中でも放線菌門のようなグラム陽性菌とプロテオバクテリア門のようなグラム陰性菌に大きく分けられ、ペプチドグリカン層の厚みなどによって、本発明の細胞内送達ベヒクルが適用できる範囲は制限されない。また、真核細胞には、主に真核生物（原生生物、真菌、植物、動物）に属する細胞が当てはまる。例えば、一般的に分子生物学などの研究で利用され、かつ工業的にも利用される酵母は真菌に属する。また、本発明の細胞内送達ベヒクルは、浮遊細胞および接着細胞の両方において好適に用いられる。
【００１４】
本明細書において「Ｃ１−３アルキル」とは、炭素数１〜３の直鎖状、分岐鎖状、または環状のアルキル基を意味し、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、シクロプロピルが含まれる。
【００１５】
本明細書において「Ｃ１−６アルキル」とは、炭素数１〜６の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、２−メチルブチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３−エチルブチル、および２−エチルブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロプロピルメチルなどが含まれ、例えば、Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−３アルキルなども含まれる。
【００１６】
本明細書において「Ｃ１−１０アルキル」とは、炭素数１〜１０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキル基を意味し、例えば、既に定義したＣ１−６アルキルおよびＣ１−３アルキルなどが含まれる。
【００１７】
本明細書において「Ｃ１−２０アルキル」とは、炭素数１〜２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキル基を意味し、例えば、既に定義したＣ１−１０アルキル、Ｃ１−６アルキルおよびＣ１−３アルキルなどが含まれる。
【００１８】
本明細書において「Ｃ１−６アルコキシ」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルオキシ基を意味し、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓ−ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、３−メチルブトキシ、２−メチルブトキシ、１−メチルブトキシ、１−エチルプロポキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、４−メチルペントキシ、３−メチルペントキシ、２−メチルペントキシ、１−メチルペントキシ、３−エチルブトキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、シクロプロピルメチルオキシなどが含まれ、例えば、Ｃ１−４アルコキシおよびＣ１−３アルコキシなども含まれる。
【００１９】
本明細書において「アリール」とは、６〜１０員芳香族炭素環基を意味し、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチルなどが含まれる。
【００２０】
本明細書において「Ｃ７−１４アラルキル」とはアリール基を含む炭素数が７〜１４のアリールアルキル基を意味し、例えば、ベンジル、１−フェネチル、２−フェネチル、１−ナフチルメチル、２−ナフチルメチルなどが含まれる。
【００２１】
本明細書においてハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子などが挙げられる。
【００２２】
本明細書において「Ｃ１−２０アルキレン」とは、炭素数１〜２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキレン基を意味し、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレンなど、さらにＣ１−１０アルキレンおよびＣ１−６アルキレンなどが含まれる。
【００２３】
本明細書において「Ｃ３−２０アルケニレン」とは、炭素数３〜２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルケニレン基を意味し、例えば、プロペニレン、ブテニレンなど、さらにＣ３−１０アルケニレンおよびＣ３−６アルケニレンなどが含まれる。
【００２４】
本明細書において「Ｃ３−２０アルキニレン」とは、炭素数３〜２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキニレン基を意味し、例えば、プロピニレン、ブチニレンなど、さらにＣ３−１０アルキニレンおよびＣ３−６アルキニレンなどが含まれる。
【００２５】
本明細書において「Ｃ１−６アルキルチオ」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルチオ基を意味し、例えば、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、ｉ−プロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、ｓ−ブチルチオ、ｉ−ブチルチオ、ｔ−ブチルチオなどが含まれる。
【００２６】
本明細書において「Ｃ１−６アルキルスルフィニル」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルスルフィニル基を意味し、例えば、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、ｎ−プロピルスルフィニル、ｉ−プロピルスルフィニル、ｎ−ブチルスルフィニル、ｓ−ブチルスルフィニル、ｉ−ブチルスルフィニル、ｔ−ブチルスルフィニルなどが含まれる。
【００２７】
本明細書において「Ｃ１−６アルキルスルホニル」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルスルホニル基を意味し、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ｎ−プロピルスルホニル、ｉ−プロピルスルホニル、ｎ−ブチルスルホニル、ｓ−ブチルスルホニル、ｉ−ブチルスルホニル、ｔ−ブチルスルホニルなどが含まれる。
【００２８】
本明細書において「６〜１８員芳香族炭素環基」とは、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、ピレニル、インダニル、テトラリニルなどが含まれる。
【００２９】
本明細書において「５〜１８員芳香族ヘテロ環基」とは、酸素、窒素および硫黄から選択される１以上のヘテロ原子を有する芳香族ヘテロ環であり、例えば、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピリジル、インドリル、キノリル、キノキサリニル、キナゾリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾピラニル、ベンゾクロメニルなどが含まれる。
【００３０】
本明細書において「Ｃ２−６アルケニルスルホニル」とは、アルケニル部分として既に定義したＣ２−６アルケニル基を有するアルケニルスルホニル基を意味し、例えばビニルスルホニル、アリルスルホニルなどが含まれる。
【００３１】
本明細書において「Ｃ２−６アルケニルカルボニル」とは、アルケニル部分として既に定義したＣ２−６アルケニル基を有するアルケニルカルボニル基を意味し、例えばアクリロイル、メタクリロイルなどが含まれる。
【００３２】
本明細書において「Ｃ２−６アルキニルカルボニル」とは、アルキニル部分として既に定義したＣ２−６アルキニル基を有するアルキニルカルボニル基を意味し、例えばエチニルカルボニルなどが含まれる。
【００３３】
本明細書において「Ｃ１−６アルキルカルボニル」とは、基−ＣＯ（Ｃ１−６アルキル）を表し、ここで当該Ｃ１−６アルキルは既に定義したとおりである。
【００３４】
本明細書において「Ｃ１−６アルコキシカルボニル」とは、基−ＣＯ（Ｃ１−６アルコキシ）を表し、ここで当該Ｃ１−６アルコキシは既に定義したとおりである。
【００３５】
本明細書において「Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ」とは、基−ＮＨＣＯ（Ｃ１−６アルキル）を表し、ここで当該Ｃ１−６アルキルは既に定義したとおりである。
【００３６】
本明細書において「Ｃ１−６アリールカルボニルアミノ」とは、基−ＮＨＣＯ（アリール）を表し、ここで当該アリールは既に定義したとおりである。
【００３７】
本明細書における「５〜７員含窒素ヘテロ環」には、例えば、ピロール環、ピロリジン環、ピペリジン環、ホモピペリジン環、ピペラジン環、ホモピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環など飽和ヘテロ環が含まれる。
【００３８】
本明細書における「４〜８員含窒素ヘテロ環」には、例えば、ピロール環、アゼチジン環、ピロリジン環、ピペリジン環、ホモピペリジン環、ピペラジン環、ホモピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環など、および５〜７員含窒素ヘテロ環が含まれる。
【００３９】
本明細書における「２つの窒素原子を含む５〜７員ヘテロ環」には、例えば、イミダゾリジン、テトラヒドロピリミジンなどが含まれる。
【００４０】
本明細書において、アルキレンが１以上の個所においてＯが挿入されている場合、当該アルキレン鎖は主鎖中にエーテル結合を含むことになり、当該挿入は安定な構造となるために、−Ｏ−Ｏ−および−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−の構造とならないように行われることは当業者であれば容易に理解するはずである。以上のことはアルキレンへのＳの挿入においても当てはまる。
【００４１】
本明細書において、共重合体とは、各ユニットにあたるモノマーを混ぜ、重合反応をしてできた高分子鎖の集合体である。ポリマーとは、モノマーユニットが結合し連なった高分子鎖を示す。
【００４２】
本明細書において「カウンターアニオン」とは、有機化学の技術分野で有機化合物のカウンターアニオンとして通常用いられるアニオンであれば特に制限されず、例えば、ハロゲン化物アニオン（塩化物イオン、臭化物イオン、フッ化物イオン、ヨウ化物イオン）、有機酸の共役塩基（例えば酢酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン）、硝酸イオン、硫酸イオン、炭酸イオンなどが含まれる。本発明において好ましいカウンターアニオンとしては、例えば、トリフルオロメタンスルホン酸イオン、塩化物イオン、硝酸イオンなどが挙げられる。
【００４３】
なお、カウンターアニオンが２価以上である場合、それに対応する個数のイオン性官能基とイオン結合を形成することは当業者により容易に理解されるとおりである。
【００４４】
２．細胞内送達ベヒクル
本発明の細胞内送達ベヒクルとは、表面が陽性荷電で覆われた任意の形状のゲル粒子：
【化１】
2020097622.tif 000002
である。本発明の細胞内送達ベヒクルの形状は、好ましくは略楕円球形状であり、さらに好ましくは略球形状である。
【００４５】
この細胞内送達ベヒクルは所望の成分または化合物を充填し細胞内送達複合体を形成することができる。また、この細胞内送達ベヒクルに所望の成分または化合物を共有結合して細胞内送達複合体を形成することができる。細胞内送達ベヒクルおよびこれらの細胞内送達複合体は容易に細胞内に導入することができ、しかも導入した細胞の生存および増殖を妨げない。さらに、本明細書の実施例では、細胞に導入された本発明のベヒクルが細胞の分化を妨げないという利点を有することも確認されている。
【００４６】
一つの好ましい実施態様によれば、本発明の細胞内送達ベヒクルは、
【化２】
2020097622.tif 000003
の構造を有する。
【００４７】
３．細胞内送達ベヒクルの製造方法
本発明の細胞内送達ベヒクルは、例えば、２つの末端のうち少なくとも一方の末端のユニットまたはその近辺のユニットが陽性荷電を有するポリマーを作製し、これを分子間で架橋させることにより製造することができる。一つの好ましい実施態様によれば、本発明の細胞内送達ベヒクルは、カチオン性重合開始剤と、炭素−炭素二重結合を含んでなるモノマーと、架橋剤とを用いるラジカル重合反応を行うことにより製造される。
【００４８】
（１）カチオン性重合開始剤
本発明に用いられるカチオン性重合開始剤は、(a)常温で安定であり、(b)水溶性であり、(c)ラジカル重合反応を惹起させるラジカル産生能があり、(ｄ)ラジカル重合反応後の重合体の末端においても幅広いｐＨの範囲で、少なくとも中性付近で、正電荷を有するものである。
【００４９】
ここで、カチオン性重合開始剤は、細胞内において正電荷を保持するものであることが好ましい。多くの細胞内のｐＨは２〜９、さらに一般的な動物、植物および微生物の細胞であれば４〜８程度である。従って、カチオン性重合開始剤は、このｐＨの範囲内で正電荷を保持するものであることが望ましい。
【００５０】
本発明のカチオン性重合開始剤は、例えば、一般式（Ｉ）：
【化３】
2020097622.tif 000004
［式中、
Ｙは、単結合またはＣＲ８５を表し、
Ｚは、単結合またはＣＲ８６を表し、
Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８、Ｒ８５およびＲ８６は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、フェニルおよびヒドロキシからなる群から選択され、ここで前記Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニルおよびフェニルは、さらにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、フェニルおよびヒドロキシからなる群から選択される１または２個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ７２およびＲ７３は、さらに、それぞれ独立して、アダマンチル、またはＳｉ（ＯＣＨ３）２（ＣＨ３）で置換されたＣ１−６アルキルを表してもよく、  あるいは、Ｒ７５およびＲ７６、またはＲ７７およびＲ７８は、一緒になって−（ＣＨ２）３−５−を形成してもよく、
Ｒ８１、Ｒ８２、Ｒ８３、およびＲ８４は、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキルカルボニル、およびＣ１−３アルコキシからなる群から選択される置換基であり、ここで前記Ｃ１−４アルキルは一つのＣ１−３アルコキシ基で置換されていてもよく、及び
Ｒ７１およびＲ７４は、それぞれ独立して、Ｃ１−３アルキル基であり、  Ｘｆ−はカウンターアニオンである］
の化学構造を有する。
【００５１】
本発明の一つの実施態様では、式（Ｉ）のＹおよびＺは単結合を表す。
【００５２】
別の実施態様では、式（Ｉ）のＲ８１、Ｒ８２、Ｒ８３およびＲ８４は、それぞれ独立して、メチル、エチル、メチルカルボニル、イソブチル、および２−メチル−２−メトキシ−プロピルからなる群から選択される。
【００５３】
別の実施態様では、式（Ｉ）のＲ７１およびＲ７４はメチル基である。
【００５４】
別の実施態様では、式（Ｉ）のＲ７２、Ｒ７３、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８、Ｒ８５、およびＲ８６は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、フェニルおよびヒドロキシからなる群から選択される。
【００５５】
別の実施態様では、式（Ｉ）のＲ７５およびＲ７６、またはＲ７７およびＲ７８は、一緒になって−（ＣＨ２）４−を形成する。
【００５６】
本発明の好ましい実施態様によれば、式（Ｉ）のＲ７２およびＲ７３、Ｒ７５およびＲ７７、Ｒ７６およびＲ７８、Ｒ８１およびＲ８４、Ｒ８２およびＲ８３、並びにＲ７１およびＲ７４は、それぞれ同一の置換基を表し、かつ、ＹおよびＺは、同一の置換基、または共に単結合を表す。
【００５７】
本発明のカチオン性重合開始剤のさらに好ましい実施態様によれば、式（Ｉ）のＲ７１、Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ７４、Ｒ８１、Ｒ８２、Ｒ８３、およびＲ８４がメチル基であり、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、およびＲ７８が水素原子であり、ＹおよびＺが単結合である。
【００５８】
式（Ｉ）の化合物の合成法は、特に限定されないが例えば次のようにして合成することができる。
【００５９】
まず、α，α'−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）誘導体：
【化４】
2020097622.tif 000005
を適当な溶媒に溶解し、過剰量のメタノール存在下、室温で塩化水素ガスを通じることによって、活性なイミノエステル誘導体：
【化５】
2020097622.tif 000006
を得ることができる。なお、本明細書において構造式中のＭｅはメチル基を意味する。次に、当該イミノエステル誘導体に、エチレンジアミンなどのアルキレンジアミン誘導体：
【化６】
2020097622.tif 000007
を過剰量加え、撹拌することによって環状構造になった化合物：
【化７】
2020097622.tif 000008
を得ることができる。さらに、ジクロロメタンに生成物を溶解し、室温、脱酸素条件下において、２．１当量のトリフルオロエタンスルホン酸エステルＲ７1ＯＴｆもしくはＲ７４ＯＴｆを反応させることにより、Ｎアルキル化反応が起こり、式（Ｉ）に表される目的の化合物を得ることができる。
【００６０】
上記の式（Ｉ）の化合物は新規化合物であり、本発明の一つの態様をなす。
【００６１】
（２）モノマー
ラジカル重合反応の原料となるモノマーとしては、炭素−炭素二重結合を有する化合物であれば、いずれのものも使用することができる。また、その中で、所望の成分、化合物を充填し、または化学結合するにあたり適当なものを、当業者であれば適宜選択することができる。また、その中で、生体適合性や分解容易性等の観点から適当なものを、当業者であれば適宜選択することができる。さらに、その中で、ラジカル重合反応の効率、経済性、安全性等の観点から適当なものを、当業者であれば適宜選択することができる。
【００６２】
本発明の一つの実施態様では、例えば、充填する成分または化合物の分子量が１０００以下の低分子である場合には、架橋剤濃度を高くしてポアサイズを小さくしたベヒクルを選択することができる。加えて、低分子はそのベヒクルの網目から拡散で外に漏出してしまいやすいため、以下の記載のように低分子の疎水性や電荷などを利用して、ベヒクルとの相互作用を促すか、もしくは共有結合によって、ベヒクルと直接結合できるようなモノマーを選択することが望ましい。一方、分子量が比較的大きな高分子の場合は、架橋剤の濃度を適切に選択することで網目を制御することが挙げられる。
【００６３】
別の実施態様では、生体適合性を重視する場合には、ＰＥＧなどのモノマーを用いることが挙げられる。
【００６４】
別の実施態様では、充填する成分または化合物が電荷を持っている場合は、その電荷のカウンターとなるイオン性基を持ったモノマーを選択することができる。例えば、充填する成分または化合物が負電荷を持っていれば、アミン等の正電荷を持つ側鎖を有するモノマーなどが挙げられ、充填する成分または化合物が正電荷を持っていれば、カルボン酸糖等の負電荷を持つ側鎖を有するモノマーなどが挙げられる。
【００６５】
別の実施態様では、充填する成分または化合物の疎水性・親水性によっても、モノマーの選択ができる。例えば、充填する成分または化合物が疎水性の高い分子であれば、側鎖に水酸基やアミン基およびイオン性基を含まず、かつ炭素数の大きなモノマーが挙げられ、さらにその中でも、充填する成分または化合物がベンゼン環を含むような構造であれば、フェニル基を側鎖に持つようなモノマーを選択することで、相互作用により、ベヒクル内での充填成分の安定性を保つことができる。一方、充填する成分または化合物が水に溶けやすいような親水性の高い分子であれば、側鎖に水酸基やアミン基およびイオン性基を含むようなモノマーが挙げられる。
【００６６】
別の実施態様では、成分または化合物を細胞内送達ベヒクルに共有結合する場合は、アクリルアミド系のモノマーなどに目的の低分子または高分子を共有結合させた化合物を合成することで、該化合物をベヒクルのモノマーとして利用できる。
【００６７】
別の実施態様では、ｐＨに応答して、充填する成分または化合物をベヒクル外に放出するようなことを考える場合には、ｐＨに応答して化学構造が変わるようなモノマーを選択することで、ベヒクルのポアサイズや充填する成分または化合物との相互作用の強弱をコントロールできる。そのようなモノマーとして、カルボン酸やアミンを側鎖に含むようなモノマーが挙げられる。
【００６８】
別の実施態様では、温度に応答して、充填する成分または化合物をベヒクル外に放出するようなことを考える場合には、温度に応答してポリマー構造が変わるようなモノマーを選択することで、ベヒクルのポアサイズや充填する成分または化合物との相互作用の強弱をコントロールできる。そのようなモノマーとして、アクリルアミド系のモノマーが挙げられる。
【００６９】
別の実施態様では、紫外線などの光に応答して、充填する成分または化合物をベヒクル外に放出するようなことを考える場合には、ＵＶに応答してモノマーの一部分の構造が開裂するようなモノマーを選択することで、ベヒクルの構造を大きく変え、充填する成分または化合物をベヒクル外に放出することができる。そのようなモノマーとして、ＰＥＧ−ｐｈｏｔｏ―ＭＡ（Ｍｕｒａｙａｍａ，  Ｓｈｕｈｅｉ，  ｅｔ  ａｌ．  “ＮａｎｏＰＡＲＣＥＬ：  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ
ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｗｉｔｈ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｌｉｇｈｔ．”Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ４８．６７  （２０１２）：  ８３８０−８３８２．）のような光開裂性モノマーが挙げられる。
【００７０】
（３）架橋剤
ラジカル重合反応の原料となる架橋剤としては、分子中に２以上のビニル基を含むモノマーであって、架橋剤として通常使用されているものであれば特に限定されない。当該架橋剤の具体的な例としては、Ｎ，Ｎ'−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ'−エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ'−メチレンビスメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ'−エチレンビスメタクリルアミド、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレートなどが挙げられる。
【００７１】
使用する架橋剤モノマーの量は、特には限定されないが、例えば、後述する式（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のモノマーに対して、０．１〜２０モル％の量を使用することができる。
【００７２】
（４）反応条件
本発明の細胞内送達ベヒクルは、高分子合成の技術分野における通常の知識に基づいて合成することができ、例えば、ラジカル重合などによる重合体として得ることができる。
【００７３】
一般的な細胞内送達ベヒクルの製造方法は以下の通りである。
【化８】
2020097622.tif 000009
【００７４】
重合開始剤の使用量は、使用するモノマーに対して０．０１モル％以上の量であればよく、ラジカル合成が進行する濃度の範囲内で適量を選択することができる。例えば、０．１モル％以上、好ましくは１モル％以上の重合開始剤を使用することができる。
【００７５】
重合反応に使用する反応溶媒は、特に限定されないが、例として、水、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。ラジカル重合は、特に限定はされないが、例えば０〜１００℃、好ましくは５０〜７０℃の反応温度、および例えば１〜４８時間、好ましくは２〜１６時間の反応時間で行うことができる。
【００７６】
架橋剤モノマーを使用する場合の共重合反応は、当該技術分野で慣用の手法により行うことができる。
【００７７】
当該共重合反応に使用する反応溶媒としては、特に限定されないが、例えば、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム、ペンタデカン硫酸ナトリウム、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムブロマイド、Ｎ−セチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムブロマイド、トライトンＸ−１００など）を含む水を使用することができる。
【００７８】
架橋剤モノマーを使用して得られる共重合体のナノゲル（ナノサイズのゲル微粒子）のサイズは、共重合反応における撹拌効率、反応温度、界面活性剤の使用量、反応開始剤の使用量、架橋剤モノマーの使用量により調節することができる。例えば、界面活性剤および／または反応開始剤の使用量を増加させることにより、サイズが小さいナノゲルを得ることができる。得られるナノゲルのサイズは、本発明が属する当業者であれば適宜調節することができ、本発明の共重合体のナノゲルのサイズは、例えば、５〜１００ｎｍである。
【００７９】
当該共重合反応は、特に限定はされないが、例えば０〜１００℃、好ましくは５０〜７０℃の反応温度、および例えば１〜４８時間、好ましくは２〜１６時が挙げられる。
【００８０】
４．細胞内送達複合体
前記細胞内送達ベヒクルに所望の成分または化合物を充填し、またはその成分または化合物を結合させることにより、細胞内送達複合体を製造することができる。
【００８１】
（１）所望の成分または化合物が前記細胞内送達ベヒクルに充填された細胞内送達複合体の製造方法
所望の成分または化合物を細胞内送達ベヒクルに充填した細胞内送達複合体の調製は、常法に従い、以下の通り行うことができる。
【００８２】
(i)  重合反応環境下に充填させる化合物・分子をそのまま存在させて、ラジカル重合反応を起こさせる場合、例えば乳化重合などにより化合物・分子を溶解できる状態にして、化合物・分子の安定性が損なわれにくい温度や溶媒条件で重合を行えばよい。その後、遠心、透析および濾過などの操作により、充填させる化合物・分子とベヒクルを分離することで目的のベヒクルは調製できる。
【００８３】
(ii)   細胞内送達ベヒクルを充填させるべき化合物等を含んだ溶液に浸漬して吸着させる場合、充填される成分または化合物の電荷や極性に応じて、相互作用の強いモノマーを選択することで、吸着を促すことができる。撹拌処理や温度の制御により吸着量を高めることも可能である。またモノマーとして、ビオチンのような側鎖をもつものを使えば、あるいは、充填される化合物がストレプトアビジンとの融合タンパク質などになっていれば、非常に強い力でベヒクルに結合され、充填させるべき化合物が漏出されにくい安定的なベヒクルを合成することができる。
【００８４】
(iii)   細胞内送達ベヒクルを充填させるべき化合物等を含んだ溶液に浸漬して浸透させる場合、例えばpHや温度などによって、ベヒクルの構造変化が起きるようなモノマーを選択することで、浸漬時には網目構造（孔サイズ）が大きくし、浸漬浸透後に網目構造を小さくすることで、ベヒクル内に化合物（主に高分子）を閉じ込めることができる。その後、遠心、透析および濾過などの操作により、充填させる化合物・分子とベヒクルを分離することで目的のベヒクルは調製できる。
【００８５】
（２）所望の成分または化合物が前記細胞内送達ベヒクルに共有結合した細胞内送達複合体の製造方法
所望の成分または化合物を細胞内送達ベヒクルと共有結合した細胞内送達複合体の調製は、当業者に知られた常法に従い、以下の通り行うことができる。
【００８６】
(i)重合前のモノマーに所望の成分または化合物が結合したものを調製し、これをラジカル重合反応に付す場合、重合が促進されるような温度条件において、比較的容易に重合体であるベヒクルを得ることができる。その後、再沈殿や濾過、遠心、塩析などによりベヒクルを精製することができる。
【００８７】
(ii) 先に細胞内送達ベヒクルを製造し、その後所望の成分または化合物を結合させる場合、重合前のモノマーに特定の活性基を付与して、重合後に、その活性基に特異的に反応する構造をもった所望の成分または化合物とベヒクルを反応させることで、ベヒクルに共有結合で化合物を結合させることができる。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルーアミノ基の反応や、マレイミド基―チオール基の特異的な結合反応を利用することができる。
【００８８】
（３）細胞内送達ベヒクルへ充填する成分または化合物の例
本発明の細胞内送達ベヒクルに充填する所望の成分または化合物の好ましい例として、以下のものが挙げられる。
・インスリンを充填して経皮吸収の促進を図る。
・美白成分、化粧成分を充填して皮膚外皮細胞内への移行促進を図る。
・ヘアカラーリング剤としての染料を充填して、毛髪への浸透力を高める。
・毛髪に良い成分を充填したシャンプー、コンディショナーを調製し、毛髪への浸透力を高める。
・遺伝物質を充填し、細胞分裂を阻害しない特性を活かして当該遺伝物質の細胞内への効率導入を図る。
・薬物を充填して、癌細胞などの標的細胞内への効率的な薬物送達を図る。
・インクを充填してインク成分の分散安定化を図る。
【００８９】
（４）細胞内送達複合体の細胞内移行方法
本発明の細胞内送達ベヒクルを細胞に導入する際には、イオン強度の低い溶液（溶媒）に置換することが望ましい。このような溶媒としては、例えば、水（好ましくは純水）およびソルビトール水溶液、グルコース溶液などが挙げられる。細胞の種類に応じて、これらグルコース溶液などに０．４５ｍＭの塩化カルシウムを添加した溶液なども好適に用いることができる。
【００９０】
本発明に従って細胞内送達ベヒクルを細胞に導入するときの細胞内送達ベヒクル重合体の濃度は、例えば、共重合体の終濃度を０．００１〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）になるように調整し、菌体と混ぜることができる。これは微生物菌体のようなものに限らず、接着細胞などの他の細胞にもあてはまる。
【００９１】
本発明の細胞内送達複合体も、上と同様の方法で細胞内に導入することができる。
【００９２】
５．カチオン性ゲル型温度感受性プローブ
本発明の細胞内送達複合体は、温度感受性プローブにも応用することができる。その場合には、感熱性ユニット、蛍光性ユニット、カチオン性重合開始剤および架橋剤を用いた共重合反応により製造することができ、本発明の温度感受性プローブとして用いられる共重合体として得ることができる。
【００９３】
感熱性ユニットと蛍光性ユニットとの組合せは、周囲の温度に応じて何らかの特性が変化する感熱性ユニットと、その特性変化に応じて蛍光強度または蛍光寿命が変化する蛍光性ユニットとの組合せであれば、いかなるものでも使用できる。当業者であれば、細胞の種類や測定したい温度域に応じて、適切な組合せを選択することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、感熱性ユニットは、ポリマーになった場合に温度に応じてその形状や疎水性が変化するもの、例えば、下限臨界溶液温度や上限臨界溶液温度（ＬＣＳＴやＵＣＳＴ）を有する分子とされる。例えばＬＣＳＴ挙動を示す場合には、ある温度を境にそれより高い温度ではその分子内、或いは分子間の疎水結合が強まりポリマー鎖が凝集し、逆に、低い温度ではポリマー鎖が水分子を結合し水和する相転移挙動を起こす。蛍光性ユニットは、感熱性ユニットの形状変化に応じて蛍光強度または蛍光寿命が変化するものとされる。感熱性ユニットには、温度に応じた形状変化により水への溶解性が変化するものも知られており、その場合には、蛍光性ユニットとして溶媒の極性によって蛍光強度または蛍光波長または蛍光寿命が変化するソルバトクロミックの性質を持つ蛍光性ユニットを用いることができる。
【００９４】
（１）感熱性ユニットの好適な例
本発明の温度感受性プローブとして用いられる共重合体に含まれる感熱性ユニットの好適な例は、以下の式（ａ）で表される１種または２種以上のモノマーに由来する１種または２種以上の繰り返し構造である：
【化９】
2020097622.tif 000010
［式中、Ｒ１は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素原子およびＣ１−２０アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、およびアリールから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、またはＲ４およびＲ５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］。
【００９５】
（２）蛍光性ユニットの好適な例
本発明の温度感受性プローブとして用いられる共重合体に含まれる蛍光性ユニットの好適な例は、以下の式（ｂ）で表される１種または２種以上のモノマーに由来する１種または２種以上の繰り返し構造である：
【化１０】
2020097622.tif 000011
［式中、Ｒ３は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、またはＮ−Ｒ１２であり；
Ｘ３は、直接結合、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｎ（−Ｒ１３）、ＣＯＮ（−Ｒ１６）、Ｎ（−Ｒ１６）ＣＯ、Ｎ（−Ｒ１７）ＣＯＮ（−Ｒ１８）、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＮ（−Ｒ１９）ＳＯ２であり；
Ｑ２は、Ｃ１−２０アルキレン、Ｃ３−２０アルケニレン、またはＣ３−２０アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；
Ａｒは、６〜１８員芳香族炭素環基、または５〜１８員芳香族ヘテロ環基から選択され、ここで当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、含まれる環の１以上が芳香族環である縮合環を含んでいてもよく、当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基に環原子として存在する−ＣＨ２−は−Ｃ（Ｏ）−に置換されていてもよく、さらに当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、ニトロ、シアノ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、カルボキシ、ホルミル、−ＮＲ６Ｒ７、および−ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく（ここで前記Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルおよびＣ１−６アルコキシカルボニルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい）；
Ｒ６およびＲ７は、独立に、水素原子、Ｃ１−１０アルキル、アリール、Ｃ１−１０アルキルカルボニル、アリールカルボニル、Ｃ１−１０アルキルスルホニル、アリールスルホニル、カルバモイル、Ｎ−（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイル、およびＮ，Ｎ−ジ（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイルから選択され、ここで前記Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルキルカルボニル、Ｃ１−１０アルキルスルホニル、Ｎ−（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイル、およびＮ，Ｎ−ジ（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、さらに前記アリール、アリールカルボニル、およびアリールスルホニルに含まれるアリールは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；または
Ｒ６およびＲ７はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、または−Ｑ２−Ｘ３−Ａｒであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、およびＣ１−６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１３は、水素原子、またはＣ１−６アルキルであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、およびＣ１−６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１４およびＲ１５は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され；またはＲ１４およびＲ１５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し；
Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、およびＣ１−６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］
で表されるモノマーに由来する繰り返し構造である。
【００９６】
本発明の温度感受性プローブにおいては、場合によって第二の蛍光性ユニットを併用することができる。第二の蛍光性ユニットを併用する場合、これまで説明した蛍光性ユニットを「第一の蛍光性ユニット」という。
【００９７】
第二の蛍光性ユニットは、第一の蛍光性ユニットとは異なる最大蛍光波長を有するものとされる。第二の蛍光性ユニットを用いる実施態様では、本発明の温度感受性プローブを用いた温度測定において、第一の蛍光性ユニットに由来する蛍光の強度と、第二の蛍光性ユニットに由来する蛍光の強度との比を算出し、これと実際の温度とを対応させることにより、高い精度で、簡便かつ短時間に温度を測定することが可能となる。
【００９８】
第一の蛍光性ユニットおよび第二の蛍光性ユニットは、同一波長の励起光の照射によって相互に異なる最大蛍光波長の蛍光を生じるものであることが望ましい。また、第一の蛍光性ユニットの最大蛍光波長と、第二の蛍光性ユニットの最大蛍光波長との差は、２つの波長における蛍光強度を同時に測定する上で、測定器によって十分に識別される程度に離れていればよく、特に制限されないが、好ましくは５０ｎｍ以上とされる。
【００９９】
本発明の好ましい実施態様によれば、第一の蛍光性ユニットおよび第二の蛍光性ユニットのいずれか一方は、温度の上昇に応じて蛍光強度が上昇するものであり、他方は、温度の上昇に応じて蛍光強度が不変あるいは下降するものであり、望ましくは下降するものとされる。
【０１００】
式（ｃ）で表される第一の蛍光性ユニットと組み合わせられる第二の蛍光性ユニットの好適な例は、以下の式（ｃ）：
【化１１】
2020097622.tif 000012
［式中、Ｒ５５は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３およびＲ５４は、独立に、水素原子およびＣ１−６アルキルから選択され；
Ｘ４は、直接結合、フェニレン、−Ｑ4−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはＱ4である）、−Ｑ4−Ｎ（−Ｒ６１）−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはＱ4である）であり；
Ｒ６１は、水素原子およびＣ１−６アルキルから選択され；
Ｑ４は、Ｃ１−２０アルキレン、フェニレン、およびナフチレンから選択され、該フェニレンおよびナフチレンは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］
で表されるモノマーに由来する繰り返し構造とされる。
【０１０１】
（３）本発明の温度感受性プローブとして用いられる共重合体
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明に用いられる共重合体は、主鎖の少なくとも一方の末端に式（Ｉ）で表されるカチオン性重合開始剤に由来する構造と、これに続く、式（ａ）で表されるモノマーおよび式（ｂ）で表されるモノマーのそれぞれに由来する繰り返し構造を含み、さらに架橋剤による架橋構造を含む共重合体とされる。
【０１０２】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、本発明に用いられる共重合体は、式（Ｉ’）、式（Ａ）、および式（Ｂ）：
【化１２】
2020097622.tif 000013
［式中、Ｒ７１、Ｒ７２、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ８１、Ｒ８２およびＹ、Ｒ１、Ｒ４およびＲ５、ならびにＲ３、Ｘ２、Ｘ３、Ｑ２およびＡｒは、既に定義したとおりであり、ａ、およびｂは、各繰り返し単位の比を表す０より大きい数である］
で表される繰り返し単位を含み、さらに架橋剤ＭＫによる架橋構造を含む共重合体とされる。この共重合体では、ａは１００であり、ｂは、好ましくは０．０５〜２とされる。また、この共重合体では、式（Ｉ’）の構造が末端に存在することを条件として、他の繰り返し構造、つまり、式（Ａ）および式（Ｂ）の繰り返し単位ならびに架橋剤ＭＫによる架橋構造は、どのような順番で並んでいてもよい。さらに、この共重合体は、それぞれの繰り返し単位に関して、各式で表される一種または二種以上の繰り返し単位を含んでいてもよい。この共重合体は、物質そのものとして本発明の一つの態様をなす。
【０１０３】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明に用いられる共重合体は、主鎖の少なくとも一方の末端に式（Ｉ）で表されるカチオン性重合開始剤に由来する構造と、これに続く、式（ａ）で表されるモノマー、式（ｂ）で表されるモノマーおよび式（ｃ）で表されるモノマーのそれぞれに由来する繰り返し構造を含み、さらに架橋剤による架橋構造を含む共重合体とされる。
【０１０４】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、本発明に用いられる共重合体は、式（Ｉ’）、式（Ａ）、式（Ｂ）および式（Ｃ）：
【化１３】
2020097622.tif 000014
［式中、Ｒ７１、Ｒ７２、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ８１、Ｒ８２およびＹ、Ｒ１、Ｒ４およびＲ５、ならびにＲ３、Ｘ２、Ｘ３、Ｑ２およびＡｒ、ならびにＲ５５、Ｘ４、Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３およびＲ５４は、既に定義したとおりであり、ａ、ｂ、およびｃは、各繰り返し単位の比を表す０より大きい数である］
で表される繰り返し単位を含み、さらに架橋剤ＭＫによる架橋構造を含む共重合体とされる。この共重合体では、ａは１００であり、ｂは好ましくは０．０５〜２とされ、ｃは、好ましくは０．００５〜１とされる。また、この共重合体では、式（Ｉ’）の構造が末端に存在することを条件として、他の繰り返し構造、つまり、式（Ａ）、式（Ｂ）および式（Ｃ）の繰り返し単位ならびに架橋剤ＭＫによる架橋構造は、どのような順番で並んでいてもよい。さらに、この共重合体は、それぞれの繰り返し単位に関して、各式で表される一種または二種以上の繰り返し単位を含んでいてもよい。この共重合体は、物質そのものとして本発明の一つの態様をなす。
【０１０５】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記共重合体は２種以上の感熱性ユニットを含むものとされる。感熱性ユニットには様々な種類のものがあり、その種類に応じて、最も高い温度反応性を示す温度域が異なる。この実施態様では、２種以上の感熱性ユニットを組み合わせることにより、所望の温度域において共重合体の温度反応性が高くなるように調整することができる。本発明のより好ましい実施態様によれば、前記共重合体は、前記式（ａ）で表される２種以上の感熱性ユニットを含むものとされる。また、一つの実施態様では、２種類の感熱性ユニットが用いられる。例えば、動物細胞の一般的な培養温度である３５℃付近の測定では、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（ＮＮＰＡＭ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）との組み合わせを用いることが好ましい。また、酵母等の微生物の発酵をモニターする等の目的で２５℃以下の温度領域の測定が必要になる場合には、Ｎ―ｔｅｒｔ-ブチルアクリルアミド（ＮＴＢＡＭ）とＮＮＰＡＭとの組み合わせを用いることが好ましい。
【０１０６】
式（Ａ）におけるaは、感熱性ユニット全体の総和を表すものであり、２種以上の感熱性ユニットを用いた場合には、全ての感熱性ユニットの繰り返し単位数の比率の和を意味する。
【０１０７】
本発明の好ましい実施態様によれば、上述の共重合体において、Ａｒは、下式：
【化１４】
2020097622.tif 000015
により表される基から選択される芳香族炭素環基または芳香族ヘテロ環基であり、これらの基は当該環上をハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、ニトロ、シアノ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、カルボキシ、ホルミル、−ＮＲ６Ｒ７、および−ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく（ここで前記Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルおよびＣ１−６アルコキシカルボニルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい）；
Ｘ１０は、Ｏ、ＳまたはＳｅから選択され；
Ｒ８は、水素原子、Ｃ１−１０アルキル、およびアリールから選択され、当該アルキルは、
ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、さらに前記アリールは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい。
【０１０８】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、Ａｒは、下式：
【化１５】
2020097622.tif 000016
により表される基から選択される芳香族炭素環基または芳香族ヘテロ環基であり、これらの基は当該環上をハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、ニトロ、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、シアノ、ホルミル、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、カルボキシおよび−ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択される１以上の置換基により置換されていてもよい。
【０１０９】
本発明において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ５５は、好ましくは、水素原子およびメチルから選択される。
【０１１０】
式（ａ）および式（Ａ）における−ＮＲ４Ｒ５は、特には限定されないが、例えば、Ｒ４が水素原子であり、Ｒ５はＣ２−１０アルキルであってもよい。また、Ｒ４およびＲ５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成する場合、例えば、ピロリジン環、ピペリジン環、ホモピペリジン環、ピペラジン環、ホモピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環などを形成してもよい。
【０１１１】
式（ｂ）および式（Ｂ）における−Ｘ２−Ｑ２−は、好ましくは、Ｘ２は、Ｏ、ＮＨまたはＮ（Ｃ１−６アルキル）であり、Ｑ２はＣ２−１０アルキレンである。
【０１１２】
式（ｂ）および式（Ｂ）における−Ａｒは、好ましくは、下式（Ｖ）〜（ＸＩＩ）：
【化１６】
2020097622.tif 000017
［式中、Ｒ３１は水素原子、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、および−ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択され；Ｒ３２はＣ１−６アルキルであり；Ｘ１１は、Ｎ−Ｒ３３、ＯまたはＳであり；Ｒ３３は水素原子またはＣ１−６アルキルであり；Ｘ１０、Ｒ１４およびＲ１５は、既に定義したとおりである］
から選択される基である。
【０１１３】
式（Ｖ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合、ＣＯＮ（−Ｒ１６）、Ｎ（−Ｒ１６）ＣＯ、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＮ（−Ｒ１９）ＳＯ２が挙げられる。
【０１１４】
式（ＶＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、Ｎ−Ｒ１３（ここで、好ましいＲ１３としてはメチルなどのＣ１−３アルキルが挙げられる）、またはＳが挙げられる。
【０１１５】
式（ＶＩＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合、ＣＯＮ（−Ｒ１６）、Ｎ（−Ｒ１６）ＣＯ、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＮ（−Ｒ１９）ＳＯ２が挙げられる。
【０１１６】
式（ＶＩＩＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合、ＣＯＮ（−Ｒ１６）、Ｎ（−Ｒ１６）ＣＯ、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＮ（−Ｒ１９）ＳＯ２が挙げられる。
【０１１７】
式（ＩＸ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合が挙げられる。
【０１１８】
式（Ｘ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合が挙げられる。
【０１１９】
式（ＸＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、ＣＯ、ＳＯ２、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＣＯＮ（−Ｒ１６）（ここで前記ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）およびＣＯＮ（−Ｒ１６）は、それぞれ硫黄原子および炭素原子がＡｒに結合する）が挙げられる。
【０１２０】
式（ＸＩＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、ＣＯ、ＳＯ２、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＣＯＮ（−Ｒ１６）（ここで前記ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）およびＣＯＮ（−Ｒ１６）は、それぞれ硫黄原子および炭素原子がＡｒに結合する）が挙げられる。
【０１２１】
本発明において、基−Ｘ３−Ａｒは環境応答性の蛍光団として機能し、例えば、式（Ｖ）または（ＶＩＩ）の蛍光団を使用した場合は温度の上昇に伴い蛍光強度が低下する温度センサーが、式（ＶＩ）または（ＶＩＩＩ）〜（ＸＩＩ）の蛍光団を使用した場合は、温度の上昇に伴い蛍光強度も上昇する温度センサーが得られる。
【０１２２】
式（ｃ）および式（Ｃ）におけるＲ５１、Ｒ５２、Ｒ５３およびＲ５４は、好ましくは水素原子およびメチル基から独立に選択される。
【０１２３】
式（ｃ）および式（Ｃ）における好ましいＸ４は、例えば、直接結合、フェニレン、−Ｑ4−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはＱ4である）、または−Ｑ4−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはＱ4である）である。
【０１２４】
式（ｃ）および式（Ｃ）におけるＱ４は、好ましくはフェニレンとされる。
【０１２５】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、Ｒ１は、水素原子、メチルおよびエチルから選択され；Ｒ４は、ｎ−プロピル、イソプロピルおよびｔ−ブチルから選択され、Ｒ５は水素原子であり；Ｒ３は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；Ｘ２は、Ｏ、またはＮ−Ｒ１２であり；Ｘ３は、直接結合、Ｏ、Ｎ（−Ｒ１３）、ＣＯＮ（−Ｒ１６）、Ｎ（−Ｒ１６）ＣＯ、またはＮ（−Ｒ１７）ＣＯＮ（−Ｒ１８）であり；Ｑ２は、Ｃ１−２０アルキレン、Ｃ３−２０アルケニレン、またはＣ３−２０アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；Ａｒは、下式：
【化１７】
2020097622.tif 000018
により表される基から選択される芳香族炭素環基または芳香族ヘテロ環基であり、これらの基は当該環上をハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ニトロ、シアノ、−ＮＲ６Ｒ７、および−ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択される１以上の置換基により置換されており、さらに、Ｃ１−６アルキルにより置換されていてもよく；Ｘ１０は、Ｏ、ＳまたはＳｅから選択され；Ｒ８は、水素原子、Ｃ１−１０アルキル、およびアリールから選択され；Ｒ６およびＲ７は、独立に、水素原子、Ｃ１−１０アルキル、アリール、Ｃ１−１０アルキルカルボニル、アリールカルボニル、Ｃ１−１０アルキルスルホニル、アリールスルホニル、およびカルバモイルから選択され；またはＲ６およびＲ７はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ニトロ、およびハロゲン原子から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、または−Ｑ２−Ｘ３−Ａｒであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；Ｒ１３は、水素原子、またはＣ１−６アルキルであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；Ｒ１４およびＲ１５は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され；またはＲ１４およびＲ１５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成し；Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４およびＲ５５は、水素原子およびメチル基から独立して選択され；Ｘ４は、直接結合、フェニレン、−Ｑ4−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはＱ4である）、または−Ｑ4−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはＱ4である）とされ、Ｑ４はフェニレンとされる。
【０１２６】
式（Ａ）、式（Ｂ）および式（Ｃ）におけるａ、ｂ、およびｃは式中の各繰り返し単位の比を表す０より大きい数であり、特に限定されないが、例えば、aを１００とした時に、ｂは０．０１〜１０であり、具体的には０．０２〜５であり、好ましくは０．０５〜２であり、より好ましくは０．１〜１．５である。ｃは０．００１〜５であり、具体的には０．００２〜２であり、好ましくは０．００５〜１であり、より好ましくは０．０１〜１である。ｂとｃの比を表すｂ／ｃは、特に限定されないが、好ましくは０．１〜３０、より好ましくは１〜２０、さらに好ましくは３〜１０とされる。上述のように、aは感熱性ユニットの総和であり、例えば、２種類の感熱性ユニットを使う場合の感熱性ユニットの比は、ある数ｐを用いて、ｐ：a−ｐとなる。また、本発明の共重合体の大きさは、特には限定されないが、例えば１〜１０００００ｎｍ、好ましくは１〜１００００ｎｍ、より好ましくは、１〜１０００ｎｍである。
【０１２７】
本発明の共重合体は周囲の温度変化に対して非常に素早く応答し、その構造変化は数ミリ秒程度である。つまり、本発明の温度感受性蛍光プローブは、細胞内の温度変化に敏捷に応答し蛍光強度を変化させるため、顕微鏡などを用いて、細胞内の温度分布を可視化した場合には、その蛍光強度比から細胞内の各微小空間における細胞内の温度を定量することができる。
【０１２８】
本発明の共重合体を含む溶液中のｐＨや塩濃度に影響を受けずに温度測定を行うために、当該共重合体に含まれるカチオン性官能基は、広範囲のｐＨにおいてイオン性を維持するという方が望ましい。しかしながら、細胞内温度を測定するという用途に限って言えば、細胞内のｐＨは２〜９、さらに通常の状態、一般的な動物、植物、微生物細胞であればｐＨ４〜８程度である。
【０１２９】
（４）測定方法
本発明に用いられる共重合体の感熱応答性による蛍光強度の変化は、通常の蛍光強度測定方法により測定することができる。測定での励起波長および測定する蛍光波長は、特に限定はされないが、例えば、測定試料の励起スペクトルを測定した際の最大励起波長またはその付近の波長を使用することができる。また、測定する蛍光波長も特には限定されないが、例えば、ある温度で測定試料の蛍光スペクトルを測定した際の最大蛍光波長またはその付近の波長を使用することができる。
【０１３０】
本発明では、ある独立した２つの蛍光波長における蛍光強度を測定してこれらの比をとり、その蛍光強度比から温度に換算するという方法をとることもできる。この手法により、共重合体から発せられる蛍光強度が、微小空間内の共重合体の濃度や励起するレーザー強度に起因する可能性を排除し、温度と実験で得られる蛍光強度比を１対１に対応させることが可能である。これにより同一細胞での温度比較だけでなく、同一条件下に置かれた別の細胞の細胞内温度の比較も可能となる。例えば、酵母集団中における個々の細胞温度の違いを測定することにより、各酵母細胞の生理状態を把握することが可能となる。
【０１３１】
蛍光強度比の算出法は、特に限定されるものではなく、異なる波長を含んだ２つの領域の蛍光強度からその比を算出することができる。例えば、一方の領域は第一の蛍光性ユニットから生じる蛍光の最大強度を示す波長を含む２０ｎｍ程度の波長領域として蛍光強度の積分値をＳ１とし、他方の領域は第二の蛍光性ユニットから生じる蛍光の最大強度を示す波長を含む２０ｎｍ程度の波長領域として蛍光強度の積分値をＳ２とし、Ｓ１／Ｓ２を蛍光強度比としてよい。さらに、Ｓ１およびＳ２の領域は同じ幅でも異なる幅でもよい。
例えば、蛍光強度がノイズを無視できる充分な値を示せば、Ｓ１は２０ｎｍ幅の波長領域を含む一方で、Ｓ２は１ｎｍ幅の単独波長でもよい。波長の選択基準も特に限定されるものではないが、得られる蛍光強度を考慮すると、温度感受性プローブに含まれるそれぞれの蛍光性ユニットを与えるモノマー（例えば、式（ｂ）または式（ｃ）で示される蛍光モノマー）の常温（約２５℃）における水中および水中に近い極性溶媒での励起スペクトルを測定した際の最大蛍光強度を示す波長に基づいて、その周辺の波長から選択することが望ましい。
【０１３２】
実験で得られた蛍光強度比から温度を求める際には、自らが作成した検量線を使用することが可能である。具体的に、どの条件で測定した検量線を使用するかは限定されないが、例えば、細胞内を模倣した塩化カリウム溶液中での、共重合体の感熱応答性による蛍光強度の変化をプロットした曲線、共重合体を導入した細胞集団を蛍光光度計に供し、感熱応答性による蛍光強度の変化をプロットした曲線、あるいは共重合体を導入した細胞集団を蛍光顕微鏡に供し、複数の細胞での感熱応答性による蛍光強度の変化の平均値をプロットした曲線などを用いることができる。さらに具体的には、共重合体を導入した細胞集団を用いて、感熱応答性試験を行い、蛍光強度の変化をプロットする際には、細胞は代謝活動を積極的に行わないような状態、例えば、水中や資化することのできない化合物が含まれた緩衝液中に細胞を懸濁した状態で、特定の温度に一定期間保持し、外部温度と細胞内部温度が平衡状態に達したと考えられる状況下で、蛍光強度を測定する方法などが挙げられる。
【０１３３】
また、本発明に用いられる共重合体の感熱応答性による変化として、蛍光寿命を指標にすることもできる。この変化は通常の蛍光寿命測定法により測定することができる。測定での励起波長は特に限定されないが、例えば、測定試料の励起スペクトルを測定した際の最大励起波長またはその付近の波長を使用することができる。実験によって得られた蛍光減衰曲線から、測定する試料の状態に応じて、１成分近似、２成分近似などの一般的な解析手法を用いることにより、蛍光寿命値を得ることができる。
【０１３４】
本発明に用いられる共重合体の感熱応答性による蛍光寿命の変化は、一般的な蛍光寿命測定方法、例えば、単一光子計数法、位相変調法、パルスサンプリング法、励起プローブ法などの手法により測定することができる。このうち、単一光子計数法は、時間軸上の発光強度分布と光子１個の発光確率とが相関関係にあることを利用して蛍光寿命を測定する方法であり、蛍光団を５０ｐｓ〜１ｎｓ程度の非常に短い（パルス）光で励起した後、検出される光の発生時刻を測定し、励起を多数回繰り返して得られるヒストグラムを蛍光減衰曲線として指数関数の和で近似して蛍光寿命を決定する。単一光子計数法による蛍光寿命の測定は、市販されている時間相関単一光子計数法蛍光寿命測定装置およびそれに付随している測定・解析プログラムを使用して行うことができる。
【０１３５】
（５）キット
以上に説明した方法を実施するために、必要な試薬等をまとめてキットとすることができる。従って、本発明の他の態様によれば、上述の方法を用いて温度を測定するためのキットが提供され、該キットは、本発明の温度感受性プローブまたは本発明の共重合体を含んでなる。この温度測定用試薬キットは、微小空間内の温度測定、特に細胞内の温度測定に好適に使用することができる。当該試薬キットは、医学・生物学・生物工学等の研究分野、診断・治療等の医療分野において使用することができる。
【０１３６】
（６）本発明の方法およびキットの用途
本発明の方法および温度測定用キットは、様々な研究開発の分野に応用することができる。例えば、生物工学の分野では、微生物を用いた有用物質の発酵生産において、これまで正確な測定が困難であった細胞内温度を解析パラメータに加えることにより、培養条件の検討の効率化が期待される。
【０１３７】
本発明の方法および温度測定用キットは、様々な医療用途に応用することができる。例えば、本発明による温度感受性プローブを患者の組織の一部に対して使用することにより、熱産生量が多いとされているがん細胞と、そうでない正常細胞との識別を行うことも可能である。さらにそれを応用する事でより効果的な温熱治療法の開発などにも使える。あるいは、熱産生量が多い褐色脂肪細胞に本発明による温度感受性プローブを導入し、その細胞に様々な素材を添加することによる温度変化を測定することにより、褐色脂肪細胞を活性化する素材をスクリーニングすることも可能である。
【０１３８】
本発明の方法および温度測定用キットは、様々な生理現象の解明にも応用可能である。
例えば、生体外の温度を感知し、生体反応を引き起こす受容体であるＴＲＰチャネルが細胞内の温度とどのように関連しているのかを調べることで今までとは異なるアプローチでのＴＲＰチャネルの活性化が考えられる。また細胞内温度分布と細胞内外で起こる生体反応との関わりを調べる事により、局所的な温度分布が生体反応に及ぼす影響を調べる事が可能で、赤外線レーザーなどを用いた局所的な加熱による細胞のコントロールを行う事なども可能である。
【０１３９】
本発明による温度測定法および温度感受性プローブの細胞導入法は、in vitroおよびin vivoのいずれにおいても行うことができる。一つの実施態様では、これらの方法はin vitroにおいて行われる。
【０１４０】
６．まとめ
以上のように、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）表面が陽性荷電で覆われた、細胞内送達ベヒクル。
（２）以下の化学構造：
【化１８】
2020097622.tif 000019
を有する、前記（１）に記載の細胞内送達ベヒクル。
（３）カチオン性重合開始剤と、炭素−炭素二重結合を含んでなるモノマーと、架橋剤によるラジカル重合反応を行うことを特徴とする、表面が陽性荷電で覆われた細胞内送達ベヒクルの製造方法。
（４）一般式（Ｉ）：
【化１９】
2020097622.tif 000020
［式中、
Ｙは、単結合またはＣＲ８５を表し、
Ｚは、単結合またはＣＲ８６を表し、
Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８、Ｒ８５およびＲ８６は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、フェニルおよびヒドロキシからなる群から選択され、ここで前記Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニルおよびフェニルは、さらにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、フェニルおよびヒドロキシからなる群から選択される１または２個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ７２およびＲ７３は、さらに、それぞれ独立して、アダマンチル、またはＳｉ（ＯＣＨ３）２（ＣＨ３）で置換されたＣ１−６アルキルを表してもよく、  あるいは、Ｒ７５およびＲ７６、またはＲ７７およびＲ７８は、一緒になって−（ＣＨ２）３−５−を形成してもよく、
Ｒ８１、Ｒ８２、Ｒ８３、およびＲ８４は、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキルカルボニル、およびＣ１−３アルコキシからなる群から選択される置換基であり、ここで前記Ｃ１−４アルキルは一つのＣ１−３アルコキシ基で置換されていてもよく、及び
Ｒ７１およびＲ７４は、それぞれ独立して、Ｃ１−３アルキル基であり、  Ｘｆ−はカウンターアニオンである］
の化学構造を有する化合物。
（５）前記ＹおよびＺが単結合を表す、（４）に記載の化合物。
（６）前記Ｒ８１、Ｒ８２、Ｒ８３、およびＲ８４が、それぞれ独立して、メチル、エチル、メチルカルボニル、イソブチル、および２−メチル−２−メトキシ−プロピルからなる群から選択される、（４）または（５）に記載の化合物。
（７）前記Ｒ７１およびＲ７４がメチル基である、（４）〜（６）のいずれかに記載の化合物。
（８）前記Ｒ７２およびＲ７３、前記Ｒ７５およびＲ７７、前記Ｒ７６およびＲ７８、前記Ｒ８１およびＲ８４、前記Ｒ８２およびＲ８３、並びに前記Ｒ７１およびＲ７４が、それぞれ同一の置換基を表し、かつ、前記ＹおよびＺが、同一の置換基または共に単結合を表す、（４）〜（７）のいずれかに記載の化合物。
（９）Ｒ７１、Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ７４、Ｒ８１、Ｒ８２、Ｒ８３およびＲ８４がメチル基であり、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７およびＲ７８が水素原子であり、ＹおよびＺが単結合である、（４）に記載の化合物。
（１０）前記（４）〜（９）のいずれかに記載の化合物からなるカチオン性重合開始剤。
（１１）前記（１０）に記載のカチオン性重合開始剤と、炭素−炭素二重結合を含んでなるモノマーと、架橋剤によるラジカル重合反応を行うことを含んでなる、細胞内送達ベヒクルの製造方法。
（１２）前記（１１）の製造方法によって得られる細胞内送達ベヒクル。
（１３）細胞内に送達される目的の成分または化合物が、前記（１）に記載の細胞内送達ベヒクルに充填されてなる、細胞内送達複合体。
（１４）前記（１）に記載の細胞内送達ベヒクルに、細胞内に送達される目的の成分または化合物を充填することを含んでなる、細胞内送達複合体の製造方法。
（１５）細胞内に送達される目的の成分または化合物が前記細胞内送達ベヒクルに共有結合している、前記（１３）に記載の細胞内送達複合体。
（１６）前記化合物が、温度に応じてその特性が変化する感熱性ユニット、および該感熱性ユニットの特性変化に伴って蛍光強度または蛍光寿命が変化する蛍光性ユニットである、前記（１３）または（１５）に記載の細胞内送達複合体。
（１７）主鎖の少なくとも一方の末端に式（Ｉ’）で表されるカチオン性重合開始剤に由来する構造と、これに続く、式（ａ）で表されるモノマーおよび式（ｂ）で表されるモノマーのそれぞれに由来する繰り返し構造を含み、さらに架橋剤による架橋構造を含む、共重合体。
（１８）式（Ｉ’）、式（Ａ）、および式（Ｂ）で表される繰り返し単位を含み、さらに架橋剤による架橋構造を含む、共重合体。
（１９）主鎖の少なくとも一方の末端に式（Ｉ’）で表されるカチオン性重合開始剤に由来する構造と、これに続く、式（ａ）で表されるモノマー、式（ｂ）で表されるモノマーおよび式（ｃ）で表されるモノマーのそれぞれに由来する繰り返し構造を含み、さらに架橋剤による架橋構造を含む、共重合体。
（２０）式（Ｉ’）、式（Ａ）、式（Ｂ）および式（Ｃ）で表される繰り返し単位を含み、さらに架橋剤による架橋構造を含む、共重合体。
（２１）前記（１６）に記載の細胞内送達複合体、または前記（１７）〜（２０）のいずれかに記載の共重合体を含んでなる、温度感受性プローブ。
（２２）細胞内の温度を測定する方法であって、
（ａ）前記（２１）に記載の温度感受性プローブを細胞内に導入する工程、および
（ｂ）励起光照射下、蛍光強度または蛍光寿命を測定する工程
を含んでなる、方法。
（２３）細胞内の温度を測定するためのキットであって、前記（１６）に記載の細胞内送達複合体、前記（１７）〜（２０）のいずれかに記載の共重合体、または前記（２１）に記載の温度感受性プローブを含んでなる、キット。
（２４）前記（１０）に記載のカチオン性重合開始剤と、炭素−炭素二重結合を含んでなるモノマーによるラジカル重合反応を行うことを含んでなる、少なくとも一方の末端が陽性荷電を帯びたひも状ポリマーの製造方法。
（２５）主鎖の少なくとも一方の末端に式（Ｉ’）で表されるカチオン性重合開始剤に由来する構造と、これに続く、炭素−炭素二重結合を含んでなるモノマーに由来する繰り返し構造を含む共重合体からなる、少なくとも一方の末端が陽性荷電を帯びたひも状ポリマー。
（２６）前記（２４）の製造方法によって得られる、少なくとも一方の末端が陽性荷電を帯びたひも状ポリマー。
（２７）少なくとも一方の末端が陽性荷電を帯びたひも状ポリマーと陰性荷電を帯びたインク粒子からなる複合体。
【実施例】
【０１４１】
以下に実施例を示すことにより本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１４２】
試薬及びデータ測定
カチオン性重合開始剤の合成のための原料となるα，α'−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）はメタノールを用いた再結晶、感熱性ユニットであるＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）はｎ―ヘキサンを用いた再結晶により精製して用いた。その他の試薬は購入したものをさらに精製することなく使用した。
【０１４３】
１Ｈ−ＮＭＲはＢＲＵＫＥＲ  ＡＶＡＮＣＥ４００スペクトロメーター（４００ＭＨｚ）を使用して測定し、ケミカルシフトはｐｐｍで表示した。数平均分子量および重量平均分子量はＪＡＳＣＯ  ＧＰＣ  ｓｙｓｔｅｍ（ＪＡＳＣＯ  ＰＵ−２０８０ポンプ、ＪＡＳＣＯ  ＲＩ−２０３１示差屈折計、ＪＡＳＣＯ  ＣＯ−２０６０カラムオーブン、Ｓｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ  ＫＤ−８０６Ｍカラム）を使用し、ポリスチレン標準試料により得られる較正曲線を用いて算出した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、関東化学ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０Ｎ（４０−５０μｍ）を使用した。吸光度の測定には、ＪＡＳＣＯ  Ｖ−６５０紫外可視光分光光度計を使用した。ＩＲの測定には、ＳＨＩＭＡＤＺＵ
ＦＴＩＲ−８３００を用いた。質量分析は、ＪＭＳ−７００またはＢｒｕｃｋｅｒ  ｍｉｃｒＯＴＯＦ  ＩＩ  （ＥＳＩ）を用いた。ゲル粒子径は、動的光散乱法（ＤＬＳ）に基づき、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ  （Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて測定した。
【０１４４】
実施例Ａ−１：カチオン性重合開始剤の合成
【化２０】
2020097622.tif 000021
【０１４５】
α，α'−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）（２０．１ｇ、０．１２ｍｏｌ）をメタノール（ＭｅＯＨ）２０ｍＬとトルエン（Ｔｏｌ）２００ｍＬに懸濁した。この溶液に、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（２００ｇ）に濃硫酸（２６０ｍＬ）を滴下し、発生する塩化水素（ＨＣｌ）ガスを吹き込み、室温で５時間撹拌した。析出している固体をろ過し、トルエン（Ｔｏｌ）で洗い、真空乾燥することで白色固体の化合物１ａを得た（２８．３ｇ、収率７７％）。
【０１４６】
化合物１ａの１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ４）は以下の通り。
δ３．３５（ｓ．６Ｈ），１．５７（ｓ，１２Ｈ）
化合物１ａの質量分析の結果は以下の通り。
ＨＲＭＳ（ＥＩ＋）：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ［Ｃ５Ｈ１０ＮＯ］＋，１００．０７５７；ｆｏｕｎｄ，１００．０７６１
また、化合物１ａの元素分析の結果は以下の通り。
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１０Ｈ２２Ｃｌ２Ｎ４Ｏ２：Ｃ，３９．８７；Ｈ，７．３６；Ｎ，１８．６０．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，３９．１６；Ｈ，７．４１；Ｎ．１８．２５
【０１４７】
【化２１】
2020097622.tif 000022
【０１４８】
Ｎ−メチルエチレンジアミン（１２．６ｍＬ，０．１４ｍｏｌ）をメタノール（ＭｅＯＨ）６０ｍＬに加え、減圧下でトルエン（Ｔｏｌ）１００ｍＬ／メタノール（ＭｅＯＨ）６ｍＬに懸濁した化合物１ａ（１５．０ｇ，４９．７ｍｍｏｌ）を４０分かけて滴下した。減圧下（２５０Ｔｏｒｒ）、室温で３時間撹拌した後、ろ過した。ろ液量が１／２量程度になるまで溶媒を減圧留去し、デカンテーションにより上澄みを分離した。その上澄みを減圧留去し、真空乾燥することで黄色固体である化合物１ｂを得た（１３．２ｇ，収率９５％）。
【０１４９】
化合物１ｂの１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ４）は以下の通り。
δ３．６６（ｔ．４Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），３．４２（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），２．７５（ｓ，６Ｈ），１．４７（ｓ，１２Ｈ）。
化合物１ｂの１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）は以下の通り。
δ１７１．０，７２．７，５５．１，５２．３，３６．０，２５．０
化合物１ｂの質量分析の結果は以下の通り。
ＨＲＭＳ（ＥＩ＋）：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ［Ｃ７Ｈ１３Ｎ２］＋１２５．１０７３；ｆｏｕｎｄ，１２５．１０９２
また、化合物１ｂの元素分析の結果は以下の通り。
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１４Ｈ２６Ｎ６：Ｃ，６０．４０；Ｈ，９．４１；Ｎ３０．１９．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５９．７９；Ｈ９．４５；Ｎ，２９．６８．
【０１５０】
【化２２】
2020097622.tif 000023
【０１５１】
アルゴン環境下で、化合物１ｂ（２．７ｇ，９．７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）３０ｍＬに溶解し、トリフルオロメタンスルホン酸メチル（ＭｅＯＴｆ）（２．３ｍＬ，２０．３ｍｍｏｌ）を滴下した。室温で３．５時間撹拌した後、溶媒を減圧留去することで目的物であるカチオン性重合開始剤化合物１ｃを得た（５．６ｇ，収率９５％）。
【０１５２】
化合物１ｃの１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ−ｄ４）は以下の通り。
δ４．００（ｓ．８Ｈ），３．２４（ｓ，１２Ｈ）１．７３（ｓ，１２Ｈ）
化合物１ｃの１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）は以下の通り。
δ１６９．０，７４．５，５３．３，３８．４，２４．７
化合物１ｃの質量分析の結果は以下の通り。
ＨＲＭＳ（ＥＩ＋）：  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ［Ｃ７Ｈ１３Ｎ２］＋．１２５．１０７３；ｆｏｕｎｄ，１２５．１０７３
また、化合物１ｃの元素分析の結果は以下の通り。
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１８Ｈ３２Ｎ６Ｏ６Ｎ６Ｓ２：Ｃ，３５．６４；Ｈ５．３２；Ｎ，１３．８５Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，３５．３７；Ｈ５．０２；１３．５９．
【０１５３】
実施例Ａ−２：カチオン性重合開始剤1ｃを使ったポリスチレン共重合体の製造
スチレン、架橋剤としてＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（以下、ＭＢＡＭ）と界面活性剤としてヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド（以下、ＣＴＡＣ）を表１に示す量で水２５ｍＬに溶解し、３０分間アルゴンガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、表１の量のカチオン性重合開始剤化合物1ｃを添加し、メカニカルスターラーを用いて、７０℃で１時間、乳化重合を行った。室温に冷やした後、反応液に塩化ナトリウムを加え塩析をし、透析によって精製を行った。得られた重合体の収率は表１に示す。
【０１５４】
【表１】
2020097622.tif 000024
【０１５５】
得られた重合体について、ゼータ電位とＤＬＳによるゲル粒子径の測定（重合体濃度０．１％、２０℃）を行い、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によるゲル粒子径の測定（重合体濃度０．０１％で風乾後測定）を行い、表２の結果を得て、カチオン性のゲルが得られたことが確認された。なお透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で化合物２ｂを観察した結果を図１に示す。これにより、今回新たに合成したカチオン性重合開始剤化合物1ｃが重合開始剤として機能し、かつカチオン性の粒子の合成に寄与することが明らかとなった。また重合開始剤の量を増やした化合物２aの方が、２ｂと比較してゼータ電位がプラスになっており、重合開始剤の量に応じて、粒子表面のカチオン電荷量を制御できることもわかった。
【０１５６】
【表２】
2020097622.tif 000025
【０１５７】
実施例Ａ−３：カチオン性重合開始剤1ｃを使ったPEG共重合体の製造
【化２３】
2020097622.tif 000026
【０１５８】
化合物３ａを用いて共重合体３ｃを、化合物３ｂを用いて共重合体３ｄを得た。合成法は以下の通り。化合物３ａ（２０ｍｇ／ｍｌ）または化合物３ｂ（３３ｍｇ／ｍｌ）を、水（１５０μＬ）に溶かし、テトラエチルメチレンジアミン（１７ｍＭ）と化合物１ｃ（５０ｍＭ）を追加し、２０分間撹拌した。１５分間室温で静置し、反応物に水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を３５０μＬ加え、水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で透析を行い、精製し、共重合体３ｃおよび３ｄを得た。
【０１５９】
化合物３ｅ（４．２ｍＭ）、ｐ−ジビニルベンゼン（２．８ｍＭ）、界面活性剤ＣＴＡＣ（１．８２ｍＭ）を水４５ｍＬに溶解し、３０分間アルゴンガスを通じることにより溶存酸素を除去した。そこに、カチオン性重合開始剤化合物１ｃ（終濃度９．０ｍＭ）が溶解した水５ｍＬを加え、メカニカルスターラーを用いて、７０℃で乳化重合を１．５時間行った。室温に冷やした後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で透析を行い、精製し、共重合体化合物３ｆを得た（収率４．２％）。
【０１６０】
化合物３ｂ（３３ｍｇ／ｍｌ）とフルオレセイン（３３μｇ／ｍＬ）およびローダミンＢ（３３μｇ／ｍＬ）を、水（１５０μＬ）に溶かし、テトラエチルメチレンジアミン（１７ｍＭ）と化合物１ｃ（５０ｍＭ）を追加し、２０分間撹拌した。１５分間室温で静置し、反応物に水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を３５０μＬ加え、水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で透析を行い、精製し、共重合体３Ｇ（フルオレセイン包含）および３ｈ（ローダミンＢ包含）を得た。
【０１６１】
得られた重合体について、ゼータ電位とＤＬＳによるゲル粒子径を測定（２０℃）し、透過型電子顕微鏡（以下ＴＥＭ）によるゲル粒子径の測定（風乾後撮影）を行った。例として化合物３dの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を図２に示す。以下表３のような結果を得て、ＰＥＧ系のモノマーを用いた場合でもカチオン性のゲルが得られたことが確認された。
【０１６２】
【表３】
2020097622.tif 000027
【０１６３】
実施例Ａ−４：カチオン性重合開始剤1ｃを使った温度感受性共重合体の製造
【化２４】
2020097622.tif 000028
【０１６４】
共重合体の合成に必要な単量体（蛍光性ユニット）の１つであるＮ−（２−｛［７−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾチアジアゾール−４−イル］−（メチル）アミノ｝エチル）−Ｎ−メチルアクリルアミド（ＤＢＴｈＤ−ＡＡ）は、文献Ａ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１２年， 第１８巻，第９５５２ − ９５６３頁）に記載の方法に従って行った。
【０１６５】
感熱性ユニットであるＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）（１００ｍＭ）、架橋剤ＭＢＡＭ（１ｍＭ）、界面活性剤ＣＴＡＣ（１．９ｍＭ）、蛍光性ユニットであるＮ−（２−｛［７−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾチアジアゾール−４−イル］−（メチル）アミノ｝エチル）−Ｎ−メチルアクリルアミド（ＤＢＴｈＤ−ＡＡ）（１ｍＭ）、およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン（２．９ｍＭ）を水（１９ｍｌ）に溶解し、３０分間アルゴンガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、水（１ｍｌ）に溶解した化合物１ｃ（２８ｍＭ）を加え、７０℃にてメカニカルスターラーを用いて１時間乳化重合させた。室温に冷やした後、反応液に塩化ナトリウムを加え塩析をし、水で透析を行い、精製し、共重合体化合物ＥＦ０４３、７５．３ｇを得た（収率３１％）。得られたゲルを透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した結果を図３に示す。観察結果から明白なように、球状の粒子が合成されたことを確認できた。
【０１６６】
実施例Ｂ−１：新規のカチオン性重合開始剤と同一のカチオン構造をもったアクリルアミド系カチオン性ユニットの合成
【化２５】
2020097622.tif 000029
【０１６７】
塩化チオニル（ＳＯＣｌ２）（２．６５ｍＬ，３６．５ｍｍｏｌ）とトリクロロメタン（ＣＨＣｌ３）（１５．０ｍＬ）の撹拌混合物に、０℃で、アミノアルコール化合物６（２．２７ｍＬ，２９．７ｍｍｏｌ）を添加した。化合物６が完全に消失するまで、３時間の加熱還流を行った。懸濁液を室温まで冷やし、ろ過し、トリクロロメタン（ＣＨＣｌ３）でよく洗浄し、褐色固体を得た。さらにそこにアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）（２．９１ｇ，４４．７ｍｍｏｌ）と水（４０ｍＬ）を添加し、８０℃で２４時間、褐色固体が完全に反応するまで加熱した。２Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加し反応を止め、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）で３回抽出した。抽出液をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮することで、アジド化合物７を得た。
【０１６８】
ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）（１３２ｍＬ）にアジド化合物７とトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）（６．８５ｍＬ，４９．３ｍｍｏｌ）を溶かし、さらにアクリルクロライド（２．６９ｍＬ，３２．９ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を室温に温め、アジド化合物７がなくなるまで４５分撹拌した。水を添加し反応を止め、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）で３回抽出した。抽出液をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し粗生成物を得た。その後、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で精製し、黄色結晶アミド化合物８を得た（２．８７ｇ，１８．６ｍｍｏｌ，収率６３％）。
【０１６９】
化合物８のＩＲデータは以下の通り。
ＩＲ（ｎｅａｔ，ｃｍ−１）：３２７７，２９３２，２０９７，１６５７，１６２６，１５５０，１４０８，１２４５，９８５，９５７，７７２
化合物８の１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）データは以下の通り。
δ６．２９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１７．２，１．２Ｈｚ），６．０９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１７．２，１０．０Ｈｚ），５．７３（ｂｒｓ，１Ｈ），５．６６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０，１．６Ｈｚ），３．４８−３．３５（ｍ，４Ｈ），１．８５（ｔｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８，６．８Ｈｚ）
化合物８の１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）データは以下の通り。
δ１６５．７，１３０．７，１２６．６，４９．４，３７．２，２８．７
化合物８の質量分析の結果は以下の通り。
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ  Ｃ８Ｈ１３ＮＯ２（Ｍ＋Ｈ＋），１５５．０９３３；  ｆｏｕｎｄ，１５５．０９３６．
【０１７０】
【化２６】
2020097622.tif 000030
【０１７１】
パール圧力反応器に、エチレンジアミン（化合物９）（５．４２ｍＬ，８１．１ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（８．４７ｍＬ，１６２ｍｍｏｌ）、メタノール（４．３９ｍＬ）。および塩化アンモニウム（２７０ｍｇ，４．０６ｍｍｏｌ）を入れ、封をした。２００℃で４時間加熱後、反応物をろ過し、減圧下で濃縮して、イミダゾリン化合物１０を得た。
【０１７２】
無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２４３ｍＬ）にイミダゾリン化合物１０を溶かし、ｎ−ブチルリチウム（ｎ−ＢｕＬｉ）（ｎ−ヘキサン３６．７ｍＬ中、２．６５Ｍ、９７．３ｍｍｏｌ）を０℃で滴下し、室温で１時間、撹拌した。その後、ヨウ化メチル（６．５６ｍＬ，１０５ｍｍｏｌ）を０℃で滴下し、化合物１０が完全になくなるまで、１時間撹拌した。水を添加し、反応を止め、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）で３回抽出した。抽出液をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し粗生成物を得た。精製のため蒸留（５４℃／２７ｈＰａ）をし、無色油状のジメチルイミダゾリン化合物１１を得た（４．２２ｇ，４３．０ｍｍｏｌ，収率５３％）。
【０１７３】
化合物１１の分析データは、Ｙｅ，Ｇ；Ｈｅｎｒｙ，Ｗ．Ｐ；Ｃｈｅｎ，Ｃ；Ｚｈｏｕ，Ａ．；ＰｉｔｔｍａｎＪｒ．，Ｃ．Ｕ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２００９，５０，２１３５−２１３９．に示す通りであり、以下にＴＬＣから求めたＲｆ値を示す。
Ｒｆ＝０．４２（ヘキサン／ｎ−プロピルアミン＝１０／３）
【０１７４】
【化２７】
2020097622.tif 000031
【０１７５】
乾燥したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（３０．０ｍＬ）に４−ペンチン−１−オール（４−ｐｅｎｔｙｎ−１−ｏｌ）（化合物１２）（１．５３ｍＬ，１６．５ｍｍｏｌ）を溶かし、ｎ−ブチルリチウム（ｎ−ＢｕＬｉ）（ｎ−ヘキサン１３．６ｍＬ中、２．６６Ｍ、３６．２ｍｍｏｌ）を−７８℃で滴下し、２時間撹拌した。その後、クロロトリメチルシラン（ＴＭＳＣｌ）（４．８０ｍＬ，３７．９ｍｍｏｌ）を−７８℃で滴下し、室温にあたためて、化合物１２が完全になくなるまで１０時間撹拌し、反応を進めた。１Ｍ塩酸（５ｍＬ）を加え反応を止め、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）で３回抽出した。抽出液をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮することで、粗生成物アルコール化合物１３を得た。
【０１７６】
乾燥ジエチルエーテル（３２．１ｍＬ）とアセトニトリル（２２．５ｍＬ）に化合物１３、トリフェニルホスファン（ＰＰｈ３）（７．５８ｇ，２８．９ｍｍｏｌ）、イミダゾール（２．０８ｇ，３０．５ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌した。混合物に０℃でヨウ素（８．１５ｇ，３２．１ｍｍｏｌ）を添加し、化合物１３が完全に反応するまで、２時間撹拌を行った。飽和ピロ硫酸ナトリウム溶液を加えて反応を止め、ジエチルエーテルで３回抽出した。抽出液をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮することで、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ペンタン）で精製し、無色油状のヨードアルキル化合物１４を得た（３．１２ｇ，１１．６ｍｍｏｌ，収率７１％）。
【０１７７】
化合物１４の分析データは、Ｂｒａｅｓｅ，Ｓ．；Ｗｅｒｔａｌ，Ｈ．；Ｆｒａｎｋ，Ｄ．；Ｖｉｄｏｖｉｃ，Ｄ．；  ｄｅ  Ｍｅｉｊｅｒｅ，Ａ．  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００５，４１６７−４１７８．に示す通りであり、以下にＴＬＣから求めたＲｆ値を示す。
Ｒｆ＝０．２４（ペンタン）
化合物１４のＩＲデータは以下の通り。
ＩＲ（ｎｅａｔ，ｃｍ−１）：２９５８，２８９８，２１７６，１４２６，１２５０，１２２１，９０１，８４２，７６０，６９８，６３８
化合物１４の１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）データは以下の通り。
δ３．２９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．３６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．００（ｔｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８，６．８Ｈｚ），０．１５（ｓ，９Ｈ）
化合物１４の１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）データは以下の通り。
δ１０４．７，８５．７，３２．０，２０．８，４．９，０．１
化合物１４の質量分析の結果は以下の通り。
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋  ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ  Ｃ８Ｈ１６ＳｉＩ（Ｍ＋Ｈ＋），２６７．００６６；ｆｏｕｎｄ，２６７．００８７．
【０１７８】
【化２８】
2020097622.tif 000032
【０１７９】
乾燥したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１．８ｍＬ）とジエチルエーテル（２．７ｍＬ）にイミダゾリン化合物１１（３００ｍｇ，３．０６ｍｍｏｌ）を溶かし、ｎ−ブチルリチウム（ｎ−ＢｕＬｉ）（ｎ−ヘキサン，２．７６ｍＬ中、１．５５Ｍ、４．２８ｍｍｏｌ）を−２３℃で滴下し、室温にあたためて、１時間撹拌した。その後、乾燥したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（３ｍＬ）に溶かしたヨードアルキル化合物１４（９０１ｍｇ，３．３８ｍｍｏｌ）を、カヌーレを介して撹拌した混合物に０℃で添加した。室温に温め、化合物１１が完全になくなるまで１時間撹拌し、反応を進めた。水を加え反応を止め、トリクロロメタン（ＣＨＣｌ３）で３回抽出した。溶媒を減圧下で除去し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／ｎ−プロピルアミン＝５／１）で精製し、黄色油状の化合物１５を得た（３７０ｍｇ，１．５７ｍｍｏｌ，収率５１％）。
【０１８０】
化合物１５のＩＲデータは以下の通り。
ＩＲ（ｎｅａｔ，ｃｍ−１）：２９５５，２８６２，２１７２，１６１６，１４５３，１４０４，１２４９，８４３，７６０，６４０
化合物１５の１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）データは以下の通り。
δ３．６３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），３．２４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），２．７８（ｓ，３Ｈ），２．２６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．２１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．７９−１．６７（ｍ，２Ｈ），１．６０（ｔｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，７．２Ｈｚ），０．１４（ｓ，９Ｈ）
化合物１５の１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）データは以下の通り。
δ１６７．９，１０７．１，８４．６，５３．３，５１．９，３３．９，２８．４，２７．１，２５．４，１９．５，０．１
化合物１５の質量分析の結果は以下の通り。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ  Ｃ１２Ｈ２５Ｎ２Ｓｉ（Ｍ＋Ｈ＋），２３７．１７８２；ｆｏｕｎｄ，２３７．１７８９．
【０１８１】
【化２９】
2020097622.tif 000033
【０１８２】
ジクロロメタン（３．１９ｍＬ）にイミダゾリン化合物１５（１５１ｍｇ，６３９μｍｏｌ）を溶かし、室温でトリフルオロメタンスルホン酸メチル（ＭｅＯＴｆ）（１４５μＬ，１．２８ｍｍｏｌ）を添加し、３時間撹拌した。減圧下で溶媒を除き、イミダゾウリウム塩を得た。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３．０ｍＬ）にその塩を溶かし、アミド化合物８（１２０ｍｇ，７７６μｍｏｌ）、硫酸銅・五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）（３１．９ｍｇ，１２７μｍｏｌ），アスコルビン酸（４５．０ｍｇ，２５６μｍｏｌ）を添加して、６５℃で２４時間加熱した。減圧下で溶媒を除き、目的の化合物１６を得た。残渣をＯＤＳシリカゲルクロマトグラフィー（メタノール／水＝１／５ｔｏ１／２）で精製し、目的画分に水を加え、ジクロロメタンで３回洗浄した。水層部分を回収し、減圧下で濃縮し、アクリルアミド系目的化合物である褐色固体化合物１６（１４３ｍｇ，２９６μｍｏｌ，収率４６％）を得た。
【０１８３】
化合物１６のＩＲデータは以下の通り。
ＩＲ（ｎｅａｔ，ｃｍ−１）：３３５２，２９３６，１６６０，１６２４，１５５３，１４６７，１２８１，１１５７，１０３１，６３８
化合物１６の１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）データは以下の通り。
δ７．９３（ｓ，１Ｈ），７．４３（ｂｒｓ，１Ｈ），６．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ），５．６０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２，２．８Ｈｚ），４．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．９５（ｓ，４Ｈ），３．２４（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．４，６．４Ｈｚ），３．１２（ｓ，６Ｈ），２．８３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），２．５５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），２．２０（ｔｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．４，６．４Ｈｚ），１．８５（ｔｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８，６．８Ｈｚ）
化合物１６の１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）データは以下の通り。
δ１６８．４，１６６．４，１４６．１，１３１．３，１２５．８，１２３．０，４９．９，４７．５，３６．０，３４．０，２９．８，２８．４，２４．６，２４．０，２３．９
化合物１６の質量分析の結果は以下の通り。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ  Ｃ１７Ｈ２９Ｎ６Ｏ（Ｍ＋），３３３．２３９７；ｆｏｕｎｄ，３３３．２３８７．
【０１８４】
実施例Ｂ−２：新規のカチオン性重合開始剤と同一のカチオン構造をもったひも状ポリマーの合成
感熱性ユニットであるＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）、カチオンモノマーユニット化合物１６、蛍光性ユニットであるＮ−（２−｛［７−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾチアジアゾール−４−イル］−（メチル）アミノ｝エチル）−Ｎ−メチルアクリルアミド（ＤＢＴｈＤ−ＡＡ）、α，α'−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を表４の量でジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５ｍｌ）に溶解し、３０分間アルゴンガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて８時間反応させ、室温に冷やした。この溶液を、ジエチルエーテル（１００ｍｌ）に攪拌しながら注いだ。得られた結晶を濾取し、減圧乾燥させた後、さらにメタノール（ＭｅＯＨ）（１ｍＬ）に溶かして再沈殿を行った後、純水に溶かし、直径２８．６ｍｍのヴィスキングチューブ（透析用セルロースチューブ）を使用し、透析外液を１０００ｍｌとして、充分に透析を行い、精製を行った。精製品を凍結乾燥し、表題の共重合体Ｌｉｎ４０とＬｉｎ４１を淡黄色粉末として得た。収率は表４に示す。
【０１８５】
【表４】
2020097622.tif 000034
【０１８６】
Ｌｉｎ４０とＬｉｎ４１に関して共重合体の特性を評価した結果を表５に示す。またＮＭＲにより算出したＮＩＰＡＭ：カチオンモノマーユニット（化合物１６）：ＤＢＴｈＤ−ＡＡの比は、この順に
Ｌｉｎ４０      ９４．５  ：  ５．４８  ：  １．４３
Ｌｉｎ４１      ９３．０  ：  ７．０３  ：  １．４３
であった。なお、ゼータ電位測定は０．５ｗ／ｖ％水溶液を用いて、２０℃で行った。
【０１８７】
【表５】
2020097622.tif 000035
【０１８８】
実施例Ｂ−３：Ｌｉｎ４０，Ｌｉｎ４１の温度応答性試験
Ｌｉｎ４０，Ｌｉｎ４１の１５０ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ）水溶液中での温度応答性試験を以下の手順で行った。ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−６５００分光蛍光光度計を使用し、溶媒として、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＭｉｌｌｉ−Ｑ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍから得た超純水を用いて、和光純薬より購入した塩化カリウム（ＫＣｌ）を１５０ｍＭの濃度になるように溶かしたものを用いた。当実験における化合物の初期濃度は０．００５ｗ／ｖ％とし、励起波長は４５０ｎｍとした。溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ  ＥＴＣ−２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の熱電対により温度を測定した。溶液温度を１℃刻みで上昇させ、各温度における４５０〜８５０ｎｍの蛍光スペクトルを測定した。
【０１８９】
Ｌｉｎ４０およびＬｉｎ４１の５６９ｎｍおよび５７１ｎｍの蛍光強度変化をプロットした例を図４に示す。この結果より、新たに合成したカチオン性ユニット（化合物１６）を用いても、温度に応答するプローブを合成できたことがわかった。さらに、カチオン性ユニット比率を上げると、温度変化に対する蛍光強度の上昇度は小さくなることがわかった。
【０１９０】
実施例Ｂ−４：各種温度感受性プローブの合成
ＮＮ−ＡＰ４（ひも状のアクリルアミド型高分子）の合成は、文献Ａ（ＰｌｏＳ Ｏｎｅ  ２０１５年、第１０（２）巻）中のＡＰ４−ＦＰＴに記載の方法に従って行った。アニオンゲルｋ４０の合成は、文献Ｂ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１２年， 第１８巻，第９５５２ − ９５６３頁）中のＤＢＴｈＤ  ｎａｎｏｇｅｌに記載の方法に従って行った。
【０１９１】
実施例５：動物細胞（接着細胞）への温度プローブの導入
ヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞をＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ，１％ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）−ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ））が入った、プラスチックボトムディッシュ（ｉｂｉｄｉ社）に播種し、培養した。１日後、培地を５％グルコース水溶液に置換し、ＥＦ０４３，ＮＮ−ＡＰ４、Ｌｉｎ４０、Ｌｉｎ４１、ｋ４０をそれぞれ終濃度０．０５％となるように添加し、３７℃で１０分静置した。その後、プローブを取り除き、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、フェノールレッドフリー（ｐｈｅｎｏｌｒｅｄ−ｆｒｅｅ）のＤＭＥＭ培地に置換し、顕微鏡観察を行った。顕微鏡観察は、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、４０倍対物レンズ（Ｕｐｌａｎ Ａｐｏ４０ｘ  ＮＡ０．８５，  Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。
細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ  Ａｒレーザー）に照射し、５００〜６００ｎｍの蛍光画像を取得した。
【０１９２】
細胞を撮影した結果例を図５に示す。また、得られた顕微鏡写真を用いて、バックグラウンドとして細胞のないある領域の蛍光強度を差し引く画像処理を行い、未処理の細胞が持つ自家蛍光以上に蛍光シグナルが観察された細胞についてカウントすることで細胞へのプローブの導入率を算出した。結果を表６に示す。従来の重合開始剤を用いて作られた表面が負電荷を帯びた温度プローブｋ４０では導入がほとんど認められなかったが、新規のカチオン性重合開始剤を用いて合成したゲル型温度プローブＥＦ０４３を始め、カチオン性を帯びたプローブは細胞内への導入が確認できた。さらにＬｉｎ４１は細胞膜への局在が認められ、細胞内への導入量が多くなかった。
【０１９３】
【表６】
2020097622.tif 000036
【０１９４】
実施例６：プローブの毒性評価
実施例５のようにして、ＨｅＬａ細胞にＥＦ０４３，ＮＮ−ＡＰ４、Ｌｉｎ４０、Ｌｉｎ４１を導入し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、フェノールレッドフリー（ｐｈｅｎｏｌｒｅｄ−ｆｒｅｅ）のＤＭＥＭ培地に置換した。その後、非膜透過性の蛍光試薬であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を終濃度０．６７μｇ／ｍｌとなるように培地中に添加し、３７℃で３０分間処理した後、顕微鏡で観察を行った。蛍光プローブは４７３ｎｍのレーザーで励起し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は５５９ｎｍのレーザーで励起し、それぞれ４９０〜５５０ｎｍ、６５５〜７５５ｎｍの蛍光波長で観察を行った。なお、観察時のカメラの光増倍管感度やレーザー強度は、メタノールで処理した細胞を死滅した細胞のコントロールとして用いて調整を行った。
【０１９５】
顕微鏡下で温度プローブの蛍光が観察された細胞を約１００細胞選んで、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の蛍光が観察された細胞を死滅細胞として数をカウントし、１００分率を算出した。その結果、表７のような結果となった。ＥＦ０４３、Ｌｉｎ４０，ＮＮ−ＡＰ４に関しては、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による細胞毒性はほとんど見らなかったが、Ｌｉｎ４１に関しては細胞膜透過性が向上し、細胞毒性があることがわかった。つまり、ひも状高分子である温度プローブを用いた場合に、カチオン性ユニットの導入量を多くすると、細胞毒性が生じることが明らかとなった。
【０１９６】
【表７】
2020097622.tif 000037
【０１９７】
実施例７：温度プローブの構造による細胞分裂に与える影響の調査
ヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞をＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ，１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、グリッド付きのプラスチックボトムディッシュμ−Ｄｉｓｈ  ３５ｍｍ  ｇｒｉｄ−５００（ｉｂｉｄｉ社）に播種、培養した。１日後、実施例５のようにＥＦ０４３，ＮＮ−ＡＰ４、Ｌｉｎ４０の３つのプローブを導入し、フェノールレッドフリー（ｐｈｅｎｏｌｒｅｄ−ｆｒｅｅ）のＤＭＥＭ培地に置換し、顕微鏡観察を行った。顕微鏡観察は、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、４０倍対物レンズ（Ｕｐｌａｎ  Ａｐｏ４０ｘ  ＮＡ０．８５，  Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ  Ａｒレーザー）に照射し、５００〜６００ｎｍの蛍光画像を取得した
【０１９８】
特定のグリッド内の含まれる細胞のうち、蛍光プローブが導入されている細胞を実施例５の方法に従ってカウントし、３７℃、５％ＣＯ２で培養下、２４時間後の蛍光プローブが導入されている細胞を再度カウントすることで、２４時間後の細胞増殖率を算出した。
結果を図６に示す。なお、未処理の対照（Ｃｔｒｌ）では、プローブが導入されていない細胞をすべてカウントした。その結果、カチオン性ゲルであるＥＦ０４３は対照（Ｃｔｒｌ）と比較して、細胞増殖率がほとんど変わらず、ひも状の温度プローブであるＮＮ−ＡＰ４やＬｉｎ４０は細胞増殖を阻害していることがわかった。この阻害効果は含まれるカチオン性ユニットの構造の違い（ＮＮ−ＡＰ４では４級アンモニウム骨格、Ｌｉｎ４０では、１，３−ジメチル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−３−イウム骨格）に依存しない。さらに、ＥＦ０４３とＬｉｎ４０はカチオン性分子の構造が同一であることから、カチオン性構造による細胞増殖阻害効果よりも高分子の構造がひも状である場合（Ｌｉｎ４０）に細胞分裂に与える阻害効果が大きく、ゲル状である場合（ＥＦ０４３）には阻害効果がほとんどないことがわかった。またプローブが導入されている細胞が培養によって増えたことから、プローブが分裂に伴って両細胞に分配されていることが明らかとなった。
【０１９９】
実施例８：褐色脂肪細胞への分化に与える影響の調査
安楽殺したラット（Ｗｉｓｔａｒ、オス、３週齢）より褐色脂肪組織を採取し、ハサミで細かく切り、コラゲナーゼ溶液に浮遊させてスターラーで振盪しながら３０分、３７℃でインキュベートした。１００μｍセルストレーナーで未消化組織片を除き、ろ過液を遠心分離し（４００ｇ，室温，５分）、得られたペレットをＨＢＳＳ（−）に懸濁し、遠心して洗浄した。溶血バッファーに懸濁し、室温で１０分置いたのち、ＨＢＳＳ（−）を添加して遠心分離し、ペレットを増殖培地（表８）に懸濁し、４０μｍセルストレーナーに通したものをＳＶＦ懸濁液とした。ＳＶＦ懸濁液をコラーゲンコートされたガラスボトムディッシュに播種し、３７℃で培養した。１８時間後に培地を除去してＨＢＳＳ（−）で２回洗浄し、未接着細胞を除去し、再度増殖培地を添加して４日間培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。分化培地（表８）に置換して４８時間培養（３７℃、５％ＣＯ２）した後、温度感受性プローブＥＦ０４３を細胞に導入した。導入は、細胞を５％グルコースで洗浄し、５％グルコース中で終濃度０．０５ｗ／ｖ％となるようにＥＦ０４３を細胞に添加し、３７℃、１５分インキュベートした。その後、ＨＢＳＳで２回洗浄を行い、顕微鏡観察を行った。さらにＥＦ０４３を導入した細胞を脂肪滴の誘導を促す維持培地（表８）に置換し、３日間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）後に、顕微鏡観察を行った。微鏡観察は、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）により、４０倍対物レンズ（Ｕｐｌａｎ  Ａｐｏ４０ｘ  ＮＡ０．８５，  Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ  Ａｒレーザー）を照射し、５００〜６００ｎｍの蛍光画像を取得した。
【０２００】
【表８】
2020097622.tif 000038
【０２０１】
結果を図７に示す。図７左で示すように、分化培地で培養後の細胞内に温度プローブの蛍光が認められ、プローブが自発的に細胞内へ取り込まれることがわかった。さらにその細胞を維持培地で培養し、脂肪滴の形成を促すと、図７右のように、プローブの蛍光が細胞内に確認でき、かつ褐色脂肪細胞に特徴的な多胞性の脂肪滴が認められた。この結果より、カチオン性ゲル型温度プローブＥＦ０４３は細胞の分化を阻害することなく、細胞内に維持されることがわかった。
【０２０２】
実施例９：培養細胞（浮遊細胞）に対してのＥＦ０４３の蛍光強度応答
ＭＯＬＴ−４ （ヒト急性リンパ芽球性白血病(Ｔ−細胞)）をＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）を用いて、１００ｍｍディッシュにて培養した（播種１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。２日後、培養液３ｍｌを遠心分離（３００ｇ、２分）して培地を取り除き、５％グルコースで洗浄後、再度５％グルコース１ｍｌに懸濁し、ＥＦ０４３、ＮＮ−ＡＰ４、Ｌｉｎ４０をそれぞれ終濃度０．０５％となるように添加した。３７℃、１０分後、遠心分離（３００ｇ、２分）して上清を取り除き、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、非膜透過性の蛍光試薬であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を終濃度０．６７μｇ／ｍｌとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に添加し、３７℃で３０分間処理した後、顕微鏡で観察を行った。蛍光プローブは４７３ｎｍのレーザーで励起し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は５５９ｎｍのレーザーで励起し、それぞれ４９０〜５５０ｎｍ、６５５〜７５５ｎｍの蛍光波長で観察を行った。プローブが導入されているかの確認を顕微鏡観察にて行った。共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、４０倍対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察し、細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ  Ａｒレーザー）を当て、５００ｎｍから６００ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像を観察した。
【０２０３】
また、プローブＥＦ０４３が導入されたＭＯＬＴ−４細胞（ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で処理していない）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した状態でキュベットに入れ、さらにキュベット内に２ｍｍ直径の球状の攪拌子を入れた。キュベットをＪＡＳＣＯ  ＦＰ−６５００分光蛍光光度計にセットし、約８００ｒｐｍの速度で回転させ、細胞が沈むのを防ぎながら、蛍光スペクトルを測定した。励起波長は４４０ｎｍとした。溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ  ＥＴＣ−２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の熱電対により温度を測定した。溶液温度を２℃刻みで上昇させ、細胞内部の温度と外部の温度を一定にするよう温度上昇後２分静置し、各温度における蛍光強度を測定した。
【０２０４】
細胞へのプローブの導入率については、得られた顕微鏡写真を用いて、バックグラウンドとして細胞のないある領域の蛍光強度を差し引く画像処理を行い、未処理の細胞が持つ自家蛍光以上に蛍光シグナルが観察された細胞についてカウントすることで算出した。また、細胞膜の透過性を示すヨウ化プロピジウム（ＰＩ）毒性については、顕微鏡下で温度プローブの蛍光が観察された細胞を約５０―２００細胞選んで、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の蛍光が観察された細胞を死滅細胞として数をカウントした。
【０２０５】
プローブ導入率、およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）毒性の結果を表９に、温度応答性の結果を図８に示す。ＥＦ０４３はＭＯＬＴ−４細胞においても混ぜるだけで細胞内へと移行することが顕微鏡の結果より明らかとなった。またヨウ化プロピジウム（ＰＩ）毒性に関しても、用いたプローブ間で差がなく、全体として大きな毒性は認められなかった。
【０２０６】
また、細胞内のＥＦ０４３は、外部の温度変化に鋭敏に反応し、蛍光強度（蛍光波長５７０ｎｍ）を上昇させた（図８）。一般的な哺乳類細胞の生育温度である２５〜４０℃の幅広い温度領域で細胞内温度を計測できることが確認できた。
【０２０７】
【表９】
2020097622.tif 000039
【０２０８】
実施例１０：蛍光寿命変化の感熱応答試験
実施例９で作製したプローブＥＦ０４３が導入されたＭＯＬＴ−４細胞懸濁液を用いて、蛍光寿命変化の感熱性応答試験を行った。ＦｌｕｏｒｏＣｕｂｅ  ３０００Ｕ（Ｈｏｒｉｂａ  Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ）時間相関単一光子計数法蛍光寿命測定装置を使用して、励起波長は４０５ｎｍとした。溶液の励起には、ＬＥＤ（ＮａｎｏＬＥＤ−４５６，Ｈｏｒｉｂａ）を用いて、パルス繰り返し数１ＭＨｚで測定を行った。溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ  ＥＴＣ−２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の温度計によりセルホルダ内の温度を測定した。測定前に熱電対により溶液の温度が安定したことを確認した後、各温度における蛍光寿命を蛍光波長５８０ｎｍ±８ｎｍとして測定した。得られた蛍光減衰曲線を以下に示す式により近似し、２成分の蛍光寿命を得た。
【０２０９】
【数１】
2020097622.tif 000040
【０２１０】
得られた蛍光寿命から、以下に示す式を用いて各温度における平均蛍光寿命を算出した。
【数２】
2020097622.tif 000041
【０２１１】
試験結果を図９に示す。高温になるにつれて平均蛍光寿命が延長し、温度の変化に鋭敏に反応して平均蛍光寿命が変化することが確認された。
【０２１２】
実施例１１：温度分解能の評価
実施例１０の結果のように、温度（Ｔ）を横軸に蛍光寿命（τ）を縦軸に取った場合を想定する。∂を微小量、δを誤差とした場合、次のような関係が成り立つ。
【０２１３】
【数３】
2020097622.tif 000042
【０２１４】
つまり何℃の温度差を検出できるかを示す温度分解能δＴは、
【数４】
2020097622.tif 000043
と示される。ここで、∂が微小量を表すことから、
【数５】
2020097622.tif 000044
は温度（Ｔ）を横軸に蛍光寿命（τ）を縦軸に取ったグラフの曲線の接線の傾きを示している。δは誤差を表しているので、δτは蛍光寿命の誤差である。ここでは標準偏差を誤差値として用いた。
【０２１５】
つまり、（温度分解能）＝（温度（Ｔ）を横軸に蛍光寿命（τ）を縦軸に取ったグラフの曲線の接線の傾きの逆数）×（蛍光寿命の誤差）として算出することができる。
【０２１６】
実施例１０の結果である図９について温度分解能を評価した結果、図１０のようになった。ＥＦ０４３に関しては、０．２℃程度の温度分解能があり、非常に定量性が高いことがわかった。
【０２１７】
実施例１２：ＰＥＧ系ゲルを用いた細胞への応用
ヒト由来胎児腎細胞ＨＥＫ２９３ＴをＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ，１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、３５ｍｍガラスボトムディッシュにて培養した（播種１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）。１日後、培地を５％グルコースに置換し、蛍光色素の最終濃度を合わせるようにして、化合物３Ｇおよびフルオレセイン（１μｇ／ｍｌ）、または化合物３ＧおよびローダミンＢ（０．５μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１５分静置した。その後、プローブおよび蛍光色素を取り除き、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、フェノールレッドフリー（ｐｈｅｎｏｌｒｅｄ−ｆｒｅｅ）のＤＭＥＭ培地に置換し、顕微鏡観察を行った。顕微鏡観察は、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。フルオレセインは４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ  Ａｒレーザー）で、ローダミンＢは５５９ｎｍのレーザーで励起し、観察を行った。取得した像から２０個程度の細胞を選択し、細胞内の平均シグナルを算出し、比較を行った。
【０２１８】
結果を図１１に示す。蛍光色素をカチオン性のゲルに包埋させた場合の方が、蛍光色素単独の場合よりも細胞に導入される量が多いことがわかった。この現象は分子としてマイナス電荷を帯びているフルオレセインと分子としてプラス電荷を帯びているローダミンＢの両方で認められたことから、包埋する分子の性質にあまり影響を受けずに細胞内への取り込みを促進していることが示唆された。別の言い方をすれば、今回のカチオン性ゲルは、低分子を始めとした分子の、細胞内デリバリー技術としても利用できることがわかった。
【図１】
2020097622.tif 000045
【図２】
2020097622.tif 000046
【図３】
2020097622.tif 000047
【図４】
2020097622.tif 000048
【図５】
2020097622.tif 000049
【図６】
2020097622.tif 000050
【図７】
2020097622.tif 000051
【図８】
2020097622.tif 000052
【図９】
2020097622.tif 000053
【図１０】
2020097622.tif 000054
【図１１】
2020097622.tif 000055
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月18日(2020.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル粒子を製造する方法であって、
一般式（Ｉ）：
【化１】
2020097622.tif 000056
［式中、
Ｙは、単結合またはＣＲ８５を表し、
Ｚは、単結合またはＣＲ８６を表し、
Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８、Ｒ８５およびＲ８６は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、フェニルおよびヒドロキシからなる群から選択され、ここで前記Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニルおよびフェニルは、さらにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、フェニルおよびヒドロキシからなる群から選択される１または２個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ７２およびＲ７３は、さらに、それぞれ独立して、アダマンチル、またはＳｉ（ＯＣＨ３）２（ＣＨ３）で置換されたＣ１−６アルキルを表してもよく、
あるいは、Ｒ７５およびＲ７６、またはＲ７７およびＲ７８は、一緒になって−（ＣＨ２）３−５−を形成してもよく、
Ｒ８１、Ｒ８２、Ｒ８３、およびＲ８４は、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキルカルボニル、およびＣ１−３アルコキシからなる群から選択される置換基であり、ここで前記Ｃ１−４アルキルは一つのＣ１−３アルコキシ基で置換されていてもよく、及び
Ｒ７１およびＲ７４は、それぞれ独立して、Ｃ１−３アルキル基であり、
Ｘｆ−はカウンターアニオンである］
の化学構造を有するカチオン性重合開始剤と、炭素−炭素二重結合を含んでなるモノマーと、架橋剤によるラジカル重合反応を行うことを含んでなる、方法。
【請求項２】
前記ＹおよびＺが単結合を表す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｒ８１、Ｒ８２、Ｒ８３、およびＲ８４が、それぞれ独立して、メチル、エチル、メチルカルボニル、イソブチル、および２−メチル−２−メトキシ−プロピルからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｒ７１およびＲ７４がメチル基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｒ７２およびＲ７３、前記Ｒ７５およびＲ７７、前記Ｒ７６およびＲ７８、前記Ｒ８１およびＲ８４、前記Ｒ８２およびＲ８３、並びに前記Ｒ７１およびＲ７４が、それぞれ同一の置換基を表し、かつ、前記ＹおよびＺが、同一の置換基または共に単結合を表す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ７１、Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ７４、Ｒ８１、Ｒ８２、Ｒ８３およびＲ８４がメチル基であり、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７およびＲ７８が水素原子であり、ＹおよびＺが単結合である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって得られる、ゲル粒子。
【請求項８】
少なくとも一方の末端が陽性荷電を帯びたひも状ポリマーを製造する方法であって、
一般式（Ｉ）：
【化２】
2020097622.tif 000057
［式中、Ｙ、Ｚ、Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ７７、Ｒ７８、Ｒ８１、Ｒ８２、Ｒ８３、Ｒ８４、Ｒ７１、Ｒ７４、およびＸｆ−は、請求項１〜６のいずれか一項で定義された通りである。］
の化学構造を有するカチオン性重合開始剤と、炭素−炭素二重結合を含んでなるモノマーによるラジカル重合反応を行うことを含んでなる、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法によって得られる、少なくとも一方の末端が陽性荷電を帯びたひも状ポリマー。
【請求項１０】
主鎖の少なくとも一方の末端に式（Ｉ’）：
【化３】
2020097622.tif 000058
［式中、Ｙ、Ｒ７２、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ８１、Ｒ８２、およびＲ７１は、請求項１〜６のいずれか一項で定義された通りである。］
で表されるカチオン性重合開始剤に由来する構造と、これに続く、炭素−炭素二重結合を含んでなるモノマーに由来する繰り返し構造を含む共重合体からなる、少なくとも一方の末端が陽性荷電を帯びたひも状ポリマー。
【請求項１１】
主鎖の少なくとも一方の末端に式（Ｉ’）：
【化４】
2020097622.tif 000059
［式中、Ｙ、Ｒ７２、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ８１、Ｒ８２、およびＲ７１は、請求項１〜６のいずれか一項で定義された通りである。］
で表されるカチオン性重合開始剤に由来する構造と、これに続く、式（ａ）で表されるモノマーおよび式（ｂ）で表されるモノマー：
【化５】
2020097622.tif 000060
［式中、
Ｒ１は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素原子およびＣ１−２０アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、およびアリールから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、
またはＲ４およびＲ５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］；
【化６】
2020097622.tif 000061
［式中、
Ｒ３は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、またはＮ−Ｒ１２であり；
Ｘ３は、直接結合、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｎ（−Ｒ１３）、ＣＯＮ（−Ｒ１６）、Ｎ（−Ｒ１６）ＣＯ、Ｎ（−Ｒ１７）ＣＯＮ（−Ｒ１８）、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＮ（−Ｒ１９）ＳＯ２であり；
Ｑ２は、Ｃ１−２０アルキレン、Ｃ３−２０アルケニレン、またはＣ３−２０アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；
Ａｒは、６〜１８員芳香族炭素環基、または５〜１８員芳香族ヘテロ環基から選択され、ここで当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、含まれる環の１以上が芳香族環である縮合環を含んでいてもよく、当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基に環原子として存在する−ＣＨ２−は−Ｃ（Ｏ）−に置換されていてもよく、さらに当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、ニトロ、シアノ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、カルボキシ、ホルミル、−ＮＲ６Ｒ７、および−ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく（ここで前記Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルおよびＣ１−６アルコキシカルボニルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい）；
Ｒ６およびＲ７は、独立に、水素原子、Ｃ１−１０アルキル、アリール、Ｃ１−１０アルキルカルボニル、アリールカルボニル、Ｃ１−１０アルキルスルホニル、アリールスルホニル、カルバモイル、Ｎ−（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイル、およびＮ，Ｎ−ジ（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイルから選択され、ここで前記Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルキルカルボニル、Ｃ１−１０アルキルスルホニル、Ｎ−（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイル、およびＮ，Ｎ−ジ（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、さらに前記アリール、アリールカルボニル、およびアリールスルホニルに含まれるアリールは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；または
Ｒ６およびＲ７はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、または−Ｑ２−Ｘ３−Ａｒであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、およびＣ１−６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１３は、水素原子、またはＣ１−６アルキルであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、およびＣ１−６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１４およびＲ１５は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され；またはＲ１４およびＲ１５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し；
Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、およびＣ１−６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］
のそれぞれに由来する繰り返し構造を含んでなり、さらに架橋剤による架橋構造を含んでなる、共重合体。
【請求項１２】
式（Ｉ’）、式（Ａ）、および式（Ｂ）：
【化７】
2020097622.tif 000062
［式中、Ｙ、Ｒ７２、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ８１、Ｒ８２、およびＲ７１は、請求項１〜６のいずれか一項で定義された通りである。］；
【化８】
2020097622.tif 000063
［式中、Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、請求項１１で定義された通りである。］；
【化９】
2020097622.tif 000064
［式中、Ｒ３、Ｘ２、Ｘ３、Ｑ２およびＡｒは、請求項１１で定義された通りである。］
で表される繰り返し単位を含んでなり、さらに架橋剤による架橋構造を含んでなる、共重合体。
【請求項１３】
主鎖の少なくとも一方の末端に式（Ｉ’）：
【化１０】
2020097622.tif 000065
［式中、Ｙ、Ｒ７２、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ８１、Ｒ８２、およびＲ７１は、請求項１〜６のいずれか一項で定義された通りである。］
で表されるカチオン性重合開始剤に由来する構造と、これに続く、式（ａ）で表されるモノマー、式（ｂ）で表されるモノマーおよび式（ｃ）で表されるモノマー：
【化１１】
2020097622.tif 000066
［式中、Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、請求項１１で定義された通りである。］；
【化１２】
2020097622.tif 000067
［式中、Ｒ３、Ｘ２、Ｘ３、Ｑ２およびＡｒは、請求項１１で定義された通りである。］；
【化１３】
2020097622.tif 000068
［式中、
Ｒ５５は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３およびＲ５４は、独立に、水素原子およびＣ１−６アルキルから選択され；
Ｘ４は、直接結合、フェニレン、−Ｑ4−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはＱ4である）、−Ｑ4−Ｎ（−Ｒ６１）−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはＱ4である）であり；
Ｒ６１は、水素原子およびＣ１−６アルキルから選択され；
Ｑ４は、Ｃ１−２０アルキレン、フェニレン、およびナフチレンから選択され、該フェニレンおよびナフチレンは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい。］
のそれぞれに由来する繰り返し構造を含んでなり、さらに架橋剤による架橋構造を含んでなる、共重合体。
【請求項１４】
式（Ｉ’）、式（Ａ）、式（Ｂ）および式（Ｃ）：
【化１４】
2020097622.tif 000069
［式中、Ｙ、Ｒ７２、Ｒ７５、Ｒ７６、Ｒ８１、Ｒ８２、およびＲ７１は、請求項１〜６のいずれか一項で定義された通りである。］
【化１５】
2020097622.tif 000070
［式中、Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、請求項１１で定義された通りである。］；
【化１６】
2020097622.tif 000071
［式中、Ｒ３、Ｘ２、Ｘ３、Ｑ２およびＡｒは、請求項１１で定義された通りである。］；
【化１７】
2020097622.tif 000072
［式中、Ｒ５５、Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４およびＸ４は、請求項１３で定義された通りである。］
で表される繰り返し単位を含んでなり、さらに架橋剤による架橋構造を含んでなる、共重合体。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の共重合体を含んでなる、温度感受性プローブ。
【請求項１６】
細胞内の温度を測定する方法であって、
（ａ）請求項１５に記載の温度感受性プローブを細胞内に導入する工程、および
（ｂ）励起光照射下、蛍光強度または蛍光寿命を測定する工程
を含んでなる、方法。
【請求項１７】
細胞内の温度を測定するためのキットであって、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の共重合体、または請求項１５に記載の温度感受性プローブを含んでなる、キット。