(57)【要約】      （修正有）【課題】ｐＫａｌ関連疾病の治療薬の提供。【解決手段】カリクレイン結合薬、ブラジキニンＢ２受容体拮抗薬、または血漿プロテアーゼＣ１インヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）置換薬。対象は、捕捉試薬に結合する機能的Ｃ１−ＩＮＨのレベルが基準値よりも低下しており、捕捉試薬は、ｉ）活性型第ＸＩＩ因子もしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片、ｉｉ）活性型カリクレインもしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片、またはｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の組み合わせを含み、対象は、対象のＣ１−ＩＮＨを含む検体を、基材上に固定化されている捕捉試薬と接触させることと、捕捉試薬に結合する機能的Ｃ１−ＩＮＨのレベルを前記検体において測定することと、によって特定される、治療薬。【選択図】図４Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＫａｌ関連疾病を有する対象の治療に使用するための治療薬であって、
前記治療薬は、カリクレイン結合薬、ブラジキニンＢ２受容体拮抗薬、または血漿プロテアーゼＣ１インヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）置換薬であり、
前記対象は、捕捉試薬に結合する機能的Ｃ１−ＩＮＨのレベルが基準値よりも低下しており、
前記捕捉試薬は、
ｉ）活性型第ＸＩＩ因子もしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片、
ｉｉ）活性型カリクレインもしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片、または
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の組み合わせ
を含み、
前記対象は、前記対象のＣ１−ＩＮＨを含む検体を、基材上に固定化されている前記捕捉試薬と接触させることと、前記捕捉試薬に結合する機能的Ｃ１−ＩＮＨのレベルを前記検体において測定することと、によって特定される、
治療薬。
【請求項２】
前記ｐＫａｌ関連疾病が、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）である、請求項１に記載の治療薬。
【請求項３】
前記対象が、ヒトのＨＡＥ患者である、請求項１に記載の治療薬。
【請求項４】
前記治療薬が、ＤＸ−８８、ＤＸ−２９３０、またはＥＰＩＫＡＬ−２である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項５】
前記対象は、前記治療薬との併用療法としての第２の治療によって処置され、
前記第２の治療は、前記治療薬の投与よりも前に、前記治療薬の投与の後に、あるいは前記治療薬の投与と同時に、投与され、
任意選択で、前記第２の治療は、１種以上のカリクレインインヒビター、ブラジキニンＢ２受容体拮抗薬、または血漿プロテアーゼＣ１インヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）置換薬であってもよい、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項６】
前記捕捉試薬に結合する機能的Ｃ１−ＩＮＨのレベルが、Ｃ１−ＩＮＨに結合する検出薬を用いて測定され、
任意選択で、前記検出薬は、Ｃ１−ＩＮＨに結合する抗体であってもよい、
請求項１に記載の治療薬。
【請求項７】
前記捕捉試薬に結合するＣ１−ＩＮＨのレベルが、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により測定される、請求項６に記載の治療薬。
【請求項８】
前記検体が、血液検体または血漿検体である、１〜７のいずれか１項に記載の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年１月２０日出願の米国仮出願第６１／７５４，６００号の出願日の利益を主張する。同参照出願の全体が参照によりここに組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）は、血液循環における主要なブラジキニン生成酵素である。ｐＫａｌの活性化は、この接触系（ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ）を介して生じ、これが遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）に関連する疾患に関係している。ブラジキニンは、痛み、炎症、浮腫、および血管新生の重要な媒介物質である。
【０００３】
血漿プロテアーゼＣ１インヒビター（Ｃ１−インヒビターまたはＣ１−ＩＮＨとしても知られる）は、セルピンサブファミリーに属するプロテアーゼインヒビターである。その主な機能は、補体系を抑制し、自然活性化を阻止することにある。Ｉ型およびＩＩ型の遺伝性血管性浮腫は、ブラジキニンの過産生を引き起こすＣ１−ＩＮＨの遺伝的な欠乏症により生じる。
【発明の概要】
【０００４】
現在利用されている、Ｃ１−ＩＮＨを調べる診断アッセイは、活性化されたＣ１、すなわち補体系の抑制を使用する。本開示は、ＰＫａｌ、ＦＸＩＩ、またはその両方、すなわち、ＰＫａｌ関連のシグナル経路の抑制を使用する新たな診断アッセイの開発に基づく。驚くべきことに、本明細書に記載の診断アッセイは、対照患者と、Ｉ型およびＩＩ型ＨＡＥに罹患している患者とを１００％区別することに成功している。
【０００５】
よって、本開示の一態様は、（ａ）血漿プロテアーゼＣ１インヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）を含有する検体を捕捉試薬と接触させることと、（ｂ）捕捉試薬と結合した検体中のＣ１−ＩＮＨレベルを測定することとを含む方法を特徴とする。捕捉試薬は、ｉ）活性型第ＸＩＩ因子もしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片、ｉｉ）活性型血漿カリクレインもしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片、またはｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の組み合わせを含む。例えば、捕捉試薬は、活性型第ＸＩＩ因子、活性型血漿カリクレイン、またはその組み合わせであってよい。本明細書に記載のアッセイで使用される捕捉試薬のうちいずれかは、基材に固定化され得る。
【０００６】
一部の実施形態において、捕捉薬に結合したＣ１−ＩＮＨレベルは、Ｃ１−ＩＮＨに結合する検出薬、例えば、Ｃ１−ＩＮＨに結合する抗体を用いて測定される。一部の実施形態において、捕捉薬に結合したＣ１−ＩＮＨレベルは、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）により測定される。
【０００７】
Ｃ１−ＩＮＨを含有する検体（例えば、血液検体または血漿検体）は、対象から得ることができる。一部の実施形態において、対象は、ｐＫａｌ関連疾病の症状を有し、ｐＫａｌ関連疾病は、浮腫、腫脹の再発発作；全体または大部分が末梢にある腫脹；蕁麻疹；感染症の確証がない発赤、痛み、および腫脹；または非ヒスタミン関連浮腫であってよい。他の例において、対象は、抗ヒスタミン療法、コルチコステロイド療法またはその両方に耐性を有する。さらに他の例において、検体を収集した際、対象には、ｐＫａｌ関連疾病の症状がない、ｐＫａｌ関連疾病の症状の病歴がない、またはｐＫａｌ関連疾病の病歴がない。
【０００８】
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法は、検体中の捕捉試薬に結合するＣ１−ＩＮＨレベルが基準値と比較して、減少した場合に、対象が、ｐＫａｌ関連疾病のおそれがあるかまたはｐＫａｌ関連疾病に罹患していると判断することをさらに含む。ｐＫａｌ関連疾病は、ヒスタミン依存性突発血管性浮腫（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ）、関節リウマチ、クローン病、狼瘡、アルツハイマー病、敗血症性ショック、熱傷、脳虚血再灌流傷害、脳浮腫、糖尿病網膜症、糖尿病腎症、黄斑浮腫、血管炎、動脈または静脈血栓症、補助人工心臓またはステントに関連する血栓症、血栓症、血栓塞栓症、および不安定狭心症を伴う冠動脈疾患を伴うヘパリン起因性血小板減少症、浮腫、眼疾患、痛風、炎症性腸疾患、口腔粘膜炎、神経因性疼痛、炎症性疼痛、脊柱管狭窄症変性脊椎疾患（ｓｐｉｎａｌ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ−ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｓｐｉｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、術後腸閉塞、大動脈瘤、変形性関節症、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）、静脈血栓症、脳卒中、頭部外傷または腫瘍周辺脳浮腫、敗血症、急性中大脳動脈（ＭＣＡ）虚血（脳卒中）、再狭窄、全身性エリテマトーデス腎炎、自己免疫疾患、炎症性疾患、心血管疾患、神経疾患、タンパク質のミスフォールディングに関連する疾患、血管新生に関連する疾患、高血圧性腎症および糖尿病腎症、アレルギー性呼吸器疾患、もしくは組織損傷であってよい。一部の実施形態において、ｐＫａｌ関連疾病は、ＨＡＥである。
【０００９】
対象がｐＫａｌ関連疾病（例えば、ＨＡＥ）のおそれがあるかまたはｐＫａｌ関連疾病に罹患していると判断された場合、本明細書に記載の方法は、有効量の治療薬を対象に投与することをさらに含んでよく、上記治療薬は、カリクレイン結合薬、ブラジキニンＢ２受容体拮抗薬、およびＣ１−ＩＮＨ置換薬からなる群より選択される。一部の例において、治療薬は、ＤＸ−８８、ＤＸ−２９３０、またはＥＰＩＫＡＬ−２である。
【００１０】
本開示の別の態様は、ｐＫａｌ関連疾病（例えば、ＨＡＥ）に罹患している対象（例えば、ヒト患者）を治療するための方法であって、上記方法は、カリクレイン結合薬、ブラジキニンＢ２受容体拮抗薬、またはＣ１−ＩＮＨ置換薬である有効量の治療薬を対象に投与することを含むことを特徴とする。この方法により治療される対象は、基準値と比較して、捕捉試薬に結合可能なＣ１−ＩＮＨレベルが減少していた。捕捉試薬は、ｉ）活性化第ＸＩＩ因子もしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片、ｉｉ）活性型カリクレインもしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片、またはｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の組み合わせを含む。対象のＣ１−ＩＮＨレベルは、本明細書に記載のアッセイ法のうちいずれかにより決定することができる。
【００１１】
一部の実施形態において、治療薬は、ＤＸ−８８、ＤＸ−２９３０、またはＥＰＩＫＡＬ−２である。
【００１２】
また、ｐＫａｌ関連疾病（例えば、ＨＡＥ）を患い、捕捉試薬と結合可能なＣ１−ＩＮＨレベルが基準値よりも低下した対象（例えば、ヒト患者）の治療に使用するための医薬組成物も本開示の範囲に包含される。医薬組成物は、疾病を治療する治療薬を含み、上記治療薬は、カリクレイン結合薬、ブラジキニンＢ２受容体拮抗薬、またはＣ１−ＩＮＨ置換薬、およびそれらの薬学的に許容可能な担体であってよい。また、本開示は、ＨＡＥ等のＰＫａｌ関連疾病の治療に使用される、薬品を製造する際の、本明細書に記載の医薬組成物の使用をも提供する。別の態様において、本開示は、捕捉試薬と結合可能な血漿プロテアーゼＣ１インヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）を検出するキットを提供する。同キットは、
ａ）ｉ）活性型第ＸＩＩ因子もしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片、
ｉｉ）活性型カリクレインもしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片、または
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の組み合わせ
を含む捕捉試薬と、
ｂ）Ｃ１−ＩＮＨに結合する検出試薬と
任意にｃ）Ｃ１−ＩＮＨと
を含む。
【００１３】
一部の実施形態において、ＦＸＩＩａ、活性型ＰＫａｌ、またはその組み合わせであってよい捕捉試薬が基材に固定化されている。一部の実施形態において、検出試薬は、抗Ｃ１−ＩＮＨ抗体である。
【００１４】
さらに、本開示は、対象（例えば、ヒトＨＡＥ患者）のｐＫａｌ関連疾病の治療を評価するための方法であって、（ａ）治療の前後、または治療中に、対象から収集した検体中の血漿カリクレイン、第ＸＩＩ因子、またはその両方を抑制可能な血漿プロテアーゼＣ１インヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）レベルを測定することと、（ｂ）Ｃ１−ＩＮＨレベルに基づき、治療の有効性を評価することとを含み、治療後、または治療期間にわたる、Ｃ１−ＩＮＨレベルの増加は、対象において治療が有効であることを示す方法を提供する。
【００１５】
一部の実施形態において、治療は、カリクレイン結合薬、ブラジキニンＢ２受容体拮抗薬、またはＣ１−ＩＮＨ置換薬を含む。例えば、治療は、ＤＸ−８８、ＤＸ−２９３０、またはＥＰＩＫＡＬ−２を含む。あるいは、またさらに、対象から収集された検体は、血液検体または血漿検体である。
【００１６】
一部の実施形態において、Ｃ１−ＩＮＨレベルは、本明細書に記載のアッセイ法により測定することができる。例えば、Ｃ１−ＩＮＨレベルは、（ａ）対象から収集された検体を（例えば、基材に固定化された）捕捉試薬と接触させることと、（ｂ）ｉ）活性型第ＸＩＩ因子もしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片、ｉｉ）活性型血漿カリクレインもしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片、またはｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の組み合わせを含んでよい捕捉試薬に結合した検体中のＣ１−ＩＮＨレベルを測定することとを含む過程により測定することができる。一部の例において、捕捉試薬は、活性型第ＸＩＩ因子、活性型血漿カリクレイン、またはその組み合わせを含む。本明細書に記載のアッセイのうちいくつかにおいて、Ｃ１−ＩＮＨレベルは、Ｃ１−ＩＮＨに結合する検出薬、例えば、Ｃ１−ＩＮＨに結合する抗体を使用して測定することができる。一部の例において、Ｃ１−ＩＮＨレベルは、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）により測定される。
【００１７】
以下の実施形態も、本開示の範囲に包含される。
【００１８】
本開示は、対象、例えば、ｐＫａｌ関連疾病またはブラジキニン関連疾病のおそれがあるかまたはそれらに苦しむ（例えば、それらに罹患している）対象を評価（例えば、判断）する方法を提供する。本発明の方法は、評価および治療に有用な血漿カリクレイン関連血管性浮腫（ＫＭＡ）、またはｐＫａｌに関連する他の疾患に罹患している患者の分析を可能にする。
【００１９】
本発明の実施形態は、患者、例えば、血漿カリクレイにより生成されるブラジキニンにより生じる浮腫に苦しむ患者の特定および治療における、バイオマーカーおよびその使用を提供する。本明細書に開示される方法、組成物および装置は、多くの手段で有用である。例えば、ｐＫａｌマーカーレベルを使用して、段階的な接触系の活性化を判断することができる。最初のスクリーニングに続き、例えば、疾患の前臨床モデルにおいて、血漿カリクレインインヒビター（例えば、ＤＸ−８８、ＥＰＩ−ＫＡＬ２、またはＤＸ−２９３０）を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの検査を行った。本明細書に開示されるマーカーは、薬力学的なバイオマーカーとして、あるいは、カリクレインインヒビターへの対称の反応を監視するためにも使用することができる。本明細書に開示されるマーカーは、コンパニオン診断に使用し、血漿カリクレインに関連する疾患を治療することができ、ｐＫａｌ関連疾病またはブラジキニン関連疾病、例えば、ＨＡＥ、非ヒスタミン依存性突発血管性浮腫（ｎｏｎ−ｈｉｓｔａｍｉｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ）、関節リウマチ、クローン病、狼瘡、アルツハイマー病、敗血症性ショック、熱傷、脳虚血再灌流傷害、脳浮腫、糖尿病網膜症、糖尿病腎症、黄斑浮腫、血管炎、補助人工心臓に関連する血栓症、血栓症、血栓塞栓症、および不安定狭心症を伴う冠動脈疾患を伴うヘパリン起因性血小板減少症の予防的治療の間の用量を管理することができる。
【００２０】
一態様において、本発明は、対象、例えば、ｐＫａｌ関連疾病、ブラジキニン関連疾病、例えば、抗ヒスタミン耐性浮腫またはＨＡＥのおそれがある対象を評価するための方法であって、ａ）対象組織、例えば、血液、血漿、または涙を含む検体を得ることと、ｂ）上記検体を、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて、１種以上の捕捉試薬と、Ｃ１−ＩＮＨと上記１種以上の捕捉試薬との複合体の形成に十分な条件下で、接触させることであって、上記捕捉試薬は、ｉ）活性型第ＸＩＩ因子もしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片を含む成分、またはｉｉ）活性型カリクレインもしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片を含む部分、の一方または両方を含み、ｃ）ＣＩ−ＩＮＨがその捕捉試薬と結合するレベルを評価することとを含む方法を提供する。
【００２１】
一部の実施形態において、当該評価することは、決定したＣＩ−ＩＮＨが上記捕捉試薬と結合するレベルを基準値と比較することを含み、所定の基準に適合するレベル、例えば、基準値以下である場合、ｐＫａｌインヒビターによる治療の影響を受けやすい疾病を示す。基準値は、例えば、ｐＫａｌ関連疾病を患っていないヒト、例えば、ＨＡＥまたは本明細書に記載の他の疾病を患っていない、またはそのような疾病の症状の病歴がないヒトにおけるレベルであってよい。
【００２２】
一部の実施形態において、ｐＫａｌ関連疾病は、ＨＡＥ、非ヒスタミン依存性突発血管性浮腫、関節リウマチ、クローン病、狼瘡、アルツハイマー病、敗血症性ショック、熱傷、脳虚血再灌流傷害、脳浮腫、糖尿病網膜症、糖尿病腎症、黄斑浮腫、血管炎、動脈または静脈血栓症、補助人工心臓またはステントに関連する血栓症、血栓症、血栓塞栓症、および不安定狭心症を伴う冠動脈疾患を伴うヘパリン起因性血小板減少症、浮腫、眼疾患、痛風、炎症性腸疾患、口腔粘膜炎、神経因性疼痛、炎症性疼痛、脊柱管狭窄症変性脊椎疾患、術後腸閉塞、大動脈瘤、変形性関節症、遺伝性血管性浮腫、静脈血栓症、脳卒中、頭部外傷または腫瘍周辺脳浮腫、敗血症、急性中大脳動脈（ＭＣＡ）虚血（脳卒中）、再狭窄（例えば、血管形成術後）、全身性エリテマトーデス腎炎、自己免疫疾患、炎症性疾患、心血管疾患、神経疾患、タンパク質のミスフォールディングに関連する疾患、血管新生に関連する疾患、高血圧性腎症および糖尿病腎症、アレルギー性呼吸器疾患（例えば、アナフィラキシー、喘息、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、持続性鼻炎）、および組織損傷（例えば、熱傷または化学損傷）から選択される。
【００２３】
一部の実施形態において、上記対象は、ｐＫａｌ関連疾病への罹患性を評価される。特定の実施形態において、上記対象は、ｐＫａｌ関連疾病、例えば、浮腫の症状、例えば、それらと同じ症状を有する。特定の実施形態において、上記対象は、不要なｐＫａｌの活性化を特徴とする疾病の症状があり、上記対象は、抗抗ヒスタミン療法またはコルチコステロイド療法を施されており、症状は、それらに耐性を有する。一部の実施形態において、上記対象は、腫脹の再発発作、全てまたは大部分が末梢にある腫脹（例えば、対象に著しい腹部および気道の腫脹がない）、蕁麻疹、感染症の確証がない発赤、痛み、および腫脹、抗ヒスタミン療法またはコルチコステロイド療法への反応がない、または非ヒスタミン関連浮腫があるといった症状および特徴のうち１つ以上または全てがある。
【００２４】
一部の実施形態において、上記対象は、持続的または繰り返し発生する浮腫があり、抗ヒスタミン療法およびステロイド療法の一方または両方に反応がない。
【００２５】
一部の実施形態において、対象は、ｐＫａｌ関連疾病、例えば、ＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤ、またはＩＢＳの病歴がない。一部の実施形態において、対象は、ｐＫａｌ関連疾病、例えば、ＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤ、またはＩＢＳの病歴がある。一部の実施形態において、対象は、ＨＡＥの病歴がない。一部の実施形態において、対象は、ＨＡＥの病歴がある。一部の実施形態において、ＩＡＥの病歴がない。一部の実施形態において、対象は、ＩＡＥの病歴がある。一部の実施形態において、対象は、ＩＢＤまたはＩＢＳの病歴がある。一部の実施形態において、対象は、ヒスタミン関連疾病、例えば、食物アレルギーの病歴がない。一部の実施形態において、対象は、ｐＫａｌ関連疾病、例えば、ＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤ、またはＩＢＳの病歴がなく、ヒスタミン関連疾病、例えば、食物アレルギーの病歴がない。一部の実施形態において、対象は、ｐＫａｌ関連疾病、例えば、ＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤ、またはＩＢＳの病歴がなく、ヒスタミン関連疾病、例えば、食物アレルギーの病歴がある。一部の実施形態において、対象は、ｐＫａｌ関連疾病、例えば、ＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤ、またはＩＢＳの病歴があり、ヒスタミン関連疾病、食物アレルギーの病歴がある。一部の実施形態において、対象は、ｐＫａｌ関連疾病、例えば、ＨＡＥ、ＩＡＥ、ＩＢＤ、またはＩＢＳの病歴があり、ヒスタミン関連疾病、例えば、食物アレルギーの病歴がある。
【００２６】
特定の実施形態において、上記対象は、血管性浮腫の病歴がある。特定の実施形態において、上記対象は、血管性浮腫の病歴がない。特定の実施形態において、上記対象は、ｐＫａｌ関連疾病またはブラジキニン関連疾病、例えば、浮腫に特徴的な症状に苦しんでいない。特定の実施形態において、上記対象は、その組織を対象の身体から取り除いた際に、血管性浮腫の発症を経験している。
【００２７】
一部の実施形態において、上記１種以上の捕捉試薬は、基材に配置される。特定の実施形態において、基材は、不溶性基材である。一部の実施形態において、上記１種以上の捕捉試薬は、活性型第ＸＩＩ因子、またはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片を含む。特定の実施形態において、上記１種以上の捕捉試薬は、活性型カリクレイン、またはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片を含む。特定の実施形態において、上記１種以上の捕捉試薬は、活性型第ＸＩＩ因子またはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片および活性型カリクレインまたはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片を含む。
【００２８】
一部の実施形態において、上記方法は、活性化Ｃ１、例えば、Ｃ１ｓへのＣ１−ＩＮＨの結合を評価することを含まない。
【００２９】
一部の実施形態において、上記１種以上の捕捉試薬は、その基材に配置された第２の特異的結合成分と共に複合体を形成する第１の特異的結合成分を含む。特定の実施形態において、上記第１および第２の結合成分は、ビオチンおよびアビジンから選択される。
【００３０】
一部の実施形態において、上記方法は、例えば、その評価において、その複合体と検出試薬の結合、例えば、複合体化したＣ１ＩＮＨ、例えば高Ｃ１ＩＮＨ抗体に結合する検出試薬を評価することを含み、例えば、検出試薬は、Ｃ１ＩＮＨと捕捉試薬との複合体を形成する前または後に、Ｃ１ＩＮＨと結合することができる。特定の実施形態において、方法は、Ｃ１ＩＮＨと検出試薬との複合体を形成するのに十分な条件下で検出試薬を供給することを含む。一部の実施形態において、上記Ｃ１−ＩＮＨは、捕捉試薬で複合体化される。特定の実施形態において、上記方法は、検出試薬、Ｃ１−ＩＮＨ、および捕捉試薬を含む複合体を形成することを含み、上記検出試薬は、Ｃ１−ＩＮＨで複合体化され、上記ＣＩ−ＩＮＨは、捕捉試薬で複合体化される。
【００３１】
一部の実施形態において、捕捉試薬は、活性型第ＸＩＩ因子、またはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片を含む成分を含む。一部の実施形態において、捕捉試薬は、活性型カリクレイン、またはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片を含む成分を含む。一部の実施形態において、捕捉試薬は、ｉ）活性型第ＸＩＩ因子もしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片を含む成分、またはｉｉ）活性型カリクレインまたはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片を含む成分のうち、１つまたは両方を含む。特定の実施形態において、捕捉試薬は、活性型第ＸＩＩ因子またはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片を含む成分を含む。特定の実施形態において、捕捉試薬は、活性型カリクレインまたはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片を含む成分を含む。特定の実施形態において、捕捉試薬は、活性型第ＸＩＩ因子またはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片を含む成分、および活性型第ＸＩＩ因子またはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片を含む成分の両方を含む。
【００３２】
一部の実施形態において、捕捉試薬は、その複合体を基材と結合する成分をさらに含む。特定の実施形態において、上記成分は、第１および第２の結合パートナーを含み、一方は、上記捕捉試薬に結合され、他方は、上記基材に結合される。
【００３３】
一部の実施形態において、同方法は、本明細書において開示される治療薬をその対象に投与することをさらに含む。特定の実施形態において、上記治療薬は、カリクレイン結合薬、ブラジキニンＢ２受容体拮抗薬、またはＣ１−ＩＮＨ置換薬から選択される。特定の実施形態において、上記治療薬は、ＤＸ−８８を含む。特定の実施形態において、上記治療薬は、ＤＸ−２９３０を含む。特定の実施形態において、上記治療薬は、ＥＰＩＫＡＬ−２を含む。一部の実施形態において、方法は、第２の療法を施すことをさらに含む。
【００３４】
一部の実施形態において、同方法は、上記対象がＨＡＥに罹患しているかどうかを決定することを含む。
【００３５】
別の態様において、本発明は、ＨＡＥ型について対象を評価するための方法であって、（ｉ）本明細書に開示される方法により、対象のＣ１−ＩＮＨ機能についての値を得ること（例えば、捕捉試薬に結合する検体中のＣ１−ＩＮＨレベルを測定すること）と、（ｉｉ）総Ｃ１−ＩＮＨタンパク質レベルについての値を得ること（例えば、総Ｃ１−ＩＮＨレベルを測定すること）とを含み、（ｉ）により得られたＣ１−ＩＮＨ機能についての値が、予め選択された基準に適合する場合（例えば、基準値以下の場合）、（ｉｉ）により得られたＣ１−ＩＮＨタンパク質レベルについての値が、予め選択された基準に適合する場合（例えば、基準値以上の場合）、対象を、ＩＩ型ＨＡＥに罹患していると分類する、方法を提供する。一部の実施形態において、（ｉ）および（ｉｉ）のうち少なくとも１つは、直接的に得られる。
【００３６】
別の態様において、本発明は、対象を治療するための方法であって、本明細書に開示される方法による作成されたその対象の評価およびそれに対する反応性を得ることと、上記患者の療法を選択すること、または上記患者に対し療法を施すこととを含む方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、本明細書に開示される治療薬を上記対象に投与することをさらに含む。特定の実施形態において、上記治療薬は、カリクレイン結合薬、ブラジキニンＢ２受容体拮抗薬、またはＣ１−ＩＮＨ置換薬から選択される。特定の実施形態において、上記治療薬は、ＤＸ−８８を含む。特定の実施形態において、上記治療薬は、ＤＸ−２９３０を含む。特定の実施形態において、上記治療薬は、ＥＰＩＫＡＬ−２を含む。
【００３７】
別の態様において、本発明は、対象を治療するための方法であって、本明細書に開示される方法により評価されている対象および対象に対する反応性を提供することと、上記患者の療法を選択すること、または上記患者へ療法を施すこととを含む方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、本明細書に開示される治療薬を、上記対象に投与することをさらに含む。特定の実施形態において、上記治療薬は、カリクレイン結合薬、ブラジキニンＢ２受容体拮抗薬、またはＣ１−ＩＮＨ置換薬から選択される。特定の実施形態において、上記治療薬は、ＤＸ−８８を含む。特定の実施形態において、上記治療薬は、ＤＸ−２９３０を含む。特定の実施形態において、上記治療薬は、ＥＰＩＫＡＬ−２を含む。
【００３８】
更に別の態様において、本発明は、任意に、Ｃ１−ＩＨＮで複合体化され、任意に検出試薬で複合体化された、本明細書に記載の捕捉試薬を含む反応混合物を提供する。実施形態において、反応混合物は、対象の血漿を含む。一部の実施形態において、検体の複合体化されていない要素は、例えば、洗浄により、除去されている。
【００３９】
更に別の態様において、本発明は、本明細書に記載の１つ以上の捕捉薬、例えば、ｉ）活性型第ＸＩＩ因子もしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片を含む成分、またはｉｉ）活性型カリクレインもしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片を含む成分の一方または両方、を含む基材を提供する。一部の実施形態において、上記基材は、個別に位置を特定可能な領域に配置される、成分ｉおよびｉｉを含む。
【００４０】
また別の態様において、本発明は、本明細書に開示される捕捉試薬の少なくとも１つおよび実施形態によっては両方を配置する基材を含む装置を提供する。実施形態において、第１の捕捉試薬は、第１の領域に配置され、第２の捕捉試薬は、上記基材の第２の領域、例えば、異なるウェルに配置される。
【００４１】
別の態様において、本発明は、任意に基材に配置される、本明細書に記載の捕捉試薬の一方または両方、検出試薬、例えば、抗Ｃ１−ＩＮＨ抗体、および標準物質、例えばＣ１−ＩＮＨのうち１つ以上を含むキットを提供する。
【００４２】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明で明らかとなる、本発明の他の特徴、目的および利点は、明細書および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであるだろう。
【００４３】
以下に列挙される文献はもちろん、本願全体にわたって引用される、学術文献、登録特許、公開または非公開特許出願を含む全ての引用文献の内容は、本明細書で言及される目的または主題のため、その全体が参照により、例示的に本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ＥＬＩＳＡによるカリクレイン−Ｃ１−ＩＮＨ複合体形成の例示的な検出を示す図であり、左から右の順に、正常対照、Ｉ型ＨＡＥ、ＩＩ型ＨＡＥおよびＩＩＩ型ＨＡＥ患者の血漿検体をそれぞれ示す。
【図２】ＥＬＩＳＡによる活性化第ＸＩＩ因子−Ｃ１−ＩＮＨ複合体形成の例示的な検出を示す図であり、左から右の順に、正常対照、Ｉ型ＨＡＥ、ＩＩ型ＨＡＥおよびＩＩＩ型ＨＡＥ患者の血漿検体をそれぞれ示す。
【図３】ＥＬＩＳＡアッセイを介する、ＦＸＩＩａの抑制に基づき、Ｃ１−ＩＮＨレベルを測定する例示的な方法を示す概略図である。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃは、対照検体およびＨＡＥ検体における例示的な機能的ＥＬＩＳＡからのデータを示すグラフである。図４Ａは、Ｃ１ｓの抑制に基づき、Ｃ１−ＩＮＨを測定する、市販の機能的ＥＬＩＳＡからのデータを示す。
【図４Ｂ】カリクレインの抑制に基づき、Ｃ１−ＩＮＨを測定する、例示的な機能的ＥＬＩＳＡからのデータを示す。
【図４Ｃ】ＦＸＩＩの抑制に基づき、Ｃ１−ＩＮＨを測定する、例示的な機能的ＥＬＩＳＡからのデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
血漿カリクレイン（ＰＫａｌ）は、接触系のセリンプロテアーゼ成分であり、血液の循環における主要なブラジキニン生成酵素である。接触系は、外部のもしくは負に荷電した表面に晒され、第ＸＩＩａ因子（活性型第ＸＩＩ因子またはＦＸＩＩ）により、または内皮細胞表面でプロピルカルボキシペプチダーゼより、のいずれかで活性化される（Ｓａｉｎｚ  Ｉ．Ｍ．ら「Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ９８」，７７−８３，２００７）。血漿カリクレインの活性化は、第ＸＩＩ因子のフィードバック活性を介して、内因性凝固を促進し、炎症誘発性ノナペプチドブラジキニンの生成を介した炎症を強める。血液の循環における主要なキニノゲナーゼとして、血漿カリクレインは、血管系におけるブラジキニンの生成に大きく関わっている。Ｃ１−インヒビタータンパク質（Ｃ１−ＩＮＨ）の遺伝的欠乏は、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）を導く。ＨＡＥに罹患している患者は、未知の誘因により突然引き起こされることがある痛みのある浮腫の突然の発症に苦しむ（Ｚｕｒａｗ  Ｂ．Ｌ．ら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５９，１０２７−１０３６，２００８）。動物モデルにおける薬物の使用および遺伝学的研究により、血漿カリクレイン−キニンシステム（血漿ＫＫＳ）は、様々な疾患に関係している。
【００４６】
遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）、Ｉ型およびＩＩ型は、四肢、顔、胃腸管または上気道における腫脹を特徴とする常染色体優性遺伝疾患である（１）。２〜５日後、および適切に治療されていない場合の発症、特に咽頭の腫脹は、致命的となり得る。これが、可変の症状を伴う稀な疾病（１：２０，０００〜１：５０，０００人に影響がある）、診断を誤ることがある。ＨＡＥは、通常、Ｃ１−ＩＮＨ遺伝子におけるヘテロ接合変異により生じ、タンパク質レベルの減少（Ｉ型ＨＡＥ、症例数の８５％）または機能の低下（ＩＩ型ＨＡＥ、１５％）を引き起こす（２）。Ｉ型ＨＡＥにおいて、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質レベルは、低下し、機能レベルは、それに比例して低いが、ＩＩ型ＨＡＥにおいては、タンパク質レベルは、正常または上昇するが、機能レベルは低い。従って、ＨＡＥの診断を確認するためだけでなく、それだけでは診断できないＩＩ型疾患を診断するために、機能的アッセイが必要である。
【００４７】
Ｃ１  ＩＮＨは、補体の活性化タンパク質、凝固、およびキニン形成カスケードを抑制するセリンプロテアーゼ酵素である。Ｃ１−ＩＮＨの機能的レベルを評価するため、現在利用可能なアッセイは、化学発色法または複合体ＥＬＩＳＡ法のいずれかを利用して、Ｃ１−ＩＮＨによる補体カスケードのＣ１の抑制を測定する。化学発色法が、一般的に、好ましいと考えられるが（３）、両方法には限界がある。複合体ＥＬＩＳＡの陰性的中率が６２％しかない一方、化学発色法は、時折、偽陽性を示す可能性が高い。
【００４８】
当該技術分野において公知の、複合体ＥＬＩＳＡおよび化学発色法の両方の限界は、それらアッセイが、ＨＡＥ等のＰＫａｌ関連疾患の発生ではなく、補体カスケードの酵素におけるＣ１−ＩＮＨの活性を測定することである。実際、機能不全のＣ１−ＩＮＨは、キニン形成カスケードにおいて正常な活性を有すると報告されており、従って、血管性浮腫は生じないが、Ｃ１の抑制はできず、Ｃ１は、異常に活性化し、Ｃ４は枯渇する（７）。従って、現在利用可能技術では、キニン形成カスケードを抑制する（例えば、ＰＫａｌおよび／またはＦＸＩＩａを抑制する）機能があるＣ１−ＩＮＨレベルを測定することができない。
【００４９】
本開示は、Ｉ型およびＩＩ型ＨＡＥの診断のため、ＥＬＩＳＡ方法論を採用して、活性化第ＸＩＩ因子または血漿カリクレインのいずれかの抑制に基づき、機能的Ｃ１−ＩＮＨを測定する新規のアッセイの開発に基づく。これらアッセイは、特にＰＫａｌシグナル伝達回路に関係する疾患／疾病との生理的関連性を有し、そのため、当技術分野において既知の方法を超えて大きく進歩したものであるであろう。
【００５０】
本明細書は、ＰＫａｌおよび／またはＦＸＩＩ（例えば、活性型タンパク質）の抑制に基づき、Ｃ１−ＩＮＨレベルを測定する新規のアッセイ法、およびアッセイ法を実行するキットを記載する。本明細書は、そのようなアッセイ法を、ＨＡＥ等のＰＫａｌに関連する疾患／疾病に罹患している、またはそれらのおそれがある患者の診断、または疾患／疾病の治療の評価への適用をも記載する。
【００５１】
定義
便宜上、本発明の更なる説明の前に、明細書、実施例、添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語を以下に定義する。他の用語は、明細書で用いた際に定義する。
【００５２】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明確に異なる指示がある場合を除き、複数表示（ｐｌｕｒａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）を含む。
【００５３】
本明細書において使用される場合、物理的実体または値を「直接的に得ること」または「間接的に得ること」により、「得る」または「得ること」は、物理的実体または値、例えば、数値の取得所持を指す。「直接的に得る」とは、物理的実体または値を取得する過程を実行すること（例えば、本明細書でこの用語を定義する場合、検体でアッセイまたは試験を行うこと、または「検体を分析すること」）を意味する。「間接的に得る」とは、別の団体または情報源（例えば、物理的実体または値を直接的に得た第３者の研究所）から、物理的実体または値を受け取ることを指す。物理的実体を直接的に得ることは、物質、例えば、開始物質における物理的変化を含む、過程、例えば、検体を分析すること、を実行することを含む。例示的な変化としては、２つ以上の開始物質から物理的実体を作製することと、物質をせん断または断片化することと、物質を分離または精製することと、２つ以上の個別の実体を合わせ混合物にすることと、共有結合または非共有結合を破壊または形成することを含む化学反応を行うこととを含む。値を直接的に得ることとしては、検体または別の物質における物理的変化を含む過程を実施すること、例えば、物質、例えば、検体、分析物、または試薬における物理的変化を含む分析過程（本明細書において、「物理分析」とも呼ぶことがある）を実施することと、分析法、例えば、物質、例えば、分析物もしくは断片、またはその他の誘導体を別の物質から分離または精製すること、分析物もしくは断片、またはその他の誘導体を別の物質、例えば、バッファ、溶媒、または反応物質と合わせること、または、例えば、分析物の第１および第２の原子間の共有結合または非共有結合を破壊または形成することにより、または試薬もしくは断片、またはその他の誘導体の構造を変化させること、例えば、試薬の第１および第２の原子間の共有結合または非共有結合を破壊または形成することにより、分析物もしくは断片、またはその他の誘導体の構造を変化させることのうち、１つ以上を含む方法を実施することとを含む。
【００５４】
本明細書において使用される場合、検体を「分析すること」は、検体または別の物質、例えば、開始物質における物理的変化を要する過程を実施することを含む。例示的な変化としては、２つ以上の開始物質から物理的実体を作製することと、物質をせん断もしくは断片化することと、物質を分離もしくは精製することと、２つ以上の個別の実体を合わせ混合物とすることと、共有結合もしくは非共有結合を破壊もしくは形成することを含む化学反応を実施することとを含む。検体を分析することは、物質、例えば、検体、分析物、または試薬における物理的変化を含む分析過程（本明細書において、「物理分析」とも呼ぶことがある）を実施すること、分析法、例えば、物質、例えば、分析物もしくは断片、またはその他の誘導体を別の物質から分離または精製すること、分析物もしくは断片、またはその他の誘導体を別の物質、例えば、バッファ、溶媒、または反応物質と合わせること、または、例えば、分析物の第１および第２の原子間の共有結合または非共有結合を破壊または形成することにより、または試薬もしくは断片、またはその他の誘導体の構造を変化させること、例えば、試薬の第１および第２の原子間の共有結合または非共有結合を破壊または形成することにより、分析物もしくは断片、またはその他の誘導体の構造を変化させることのうち、１つ以上を含む方法を実施することとを含む。
【００５５】
用語「アゴニスト」は、本明細書において使用される場合、タンパク質の生理活性を模倣または上方制御する（例えば、増強するまたは補充する）薬剤を指す意味を持つ。アゴニストは、野生型タンパク質または野生型タンパク質の少なくとも１つの生理活性を有するその誘導体であってよい。アゴニストは、タンパク質の少なくとも１つの生理活性を増加させる化合物であってもよい。アゴニストは、別の分子、例えば、ターゲットペプチドまたは核酸とのポリペプチドの相互作用を増加させる化合物であってもよい。
【００５６】
用語「拮抗薬（アンタゴニスト）」は、本明細書において使用される場合、タンパク質の少なくとも１つの生理活性を下方制御（例えば、抑止または抑制）する薬剤を指す意味を持つ。拮抗薬は、タンパク質と別の分子、例えば、ターゲットペプチドまたは酵素基質との間の相互作用を抑制または減少させる化合物であってよい。拮抗薬は、発現し存在するタンパク質の量を減少または抑制する化合物であってもよい。通常、タンパク質または遺伝子を抑制するとは、タンパク質または遺伝子の発現またはその活性を、少なくとも１０％またはそれ以上、例えば、２０％、３０％、４０％、または５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上低下させること、または、本明細書に記載の、または当技術分野において認知されている、１つ以上の方法で測定した場合に、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上、発現またはその活性が減少することを指す。
【００５７】
本明細書において使用される場合、「結合親和性」は、見かけの会合定数またはＫａを指す。Ｋａは、解離定数（Ｋｄ）の逆数である。結合タンパク質は、例えば、特定のターゲット分子に対し、少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０および１０１１Ｍ−１の結合親和性を有していてもよい。第２ターゲットに対して、第１ターゲットへのタンパク質の結合親和性が高いことは、第２ターゲットに結合するＫａ（または数値Ｋｄ）よりも、第１ターゲットに結合するＫａが大きい（または数値Ｋｄが小さい）ことを示し得る。このような場合、結合タンパク質は、第２ターゲット（例えば、第２の立体構造の同様なタンパク質もしくはその模態、または第２のタンパク質）に対し、第１ターゲット（例えば、第１の立体構造のタンパク質またはその模態）への特異性を有する。結合親和性の相違（例えば、特異性または他の比較）は、は、少なくとも、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３７．５倍、５０倍、７０倍、８０倍、９１倍、１００倍、５００倍、１０００倍、または１０５倍であってよい。
【００５８】
結合親和性は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、表面プラズモン共鳴、または分光（例えば、蛍光アッセイを用いて）を含む様々な方法により決定することができる。結合親和性を評価する例示的な条件は、ＴＲＩＳ−バッファ（ｐＨ７．５で、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２）中であることである。それら技術は、結合タンパク質（またはターゲット）濃度の機能として、拘束結合タンパク質（ｂｏｕｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）または自由結合タンパク質（ｆｒｅｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の濃度を測定するために使用することができる。結合拘束結合タンパク質（［Ｂｏｕｎｄ］）の濃度は、自由結合タンパク質（［Ｆｒｅｅ］）の濃度、およびターゲットにおける結合タンパク質の結合部位の濃度と関連し、ここで、（Ｎ）は、以下の式
［Ｂｏｕｎｄ］＝Ｎ・［Ｆｒｅｅ］／（（１／Ｋａ）＋［Ｆｒｅｅ］）
のように、ターゲット分子に対する結合部位の数である。
【００５９】
必ずしもＫａを正確に決定することはできないが、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析法等の方法を用いて決定される、Ｋａに比例する親和性の量的な測定を得ることは十分であるため、親和性が高い、例えば２倍高いかどうかを決定する等、比較のために使用され、例えば、機能的アッセイ、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおける活性、親和性を量的に測定するまたは親和性を推定することができる。
【００６０】
用語「結合タンパク質」は、ターゲット分子と相互に作用することができるタンパク質を指す。この用語は、「リガンド」とほぼ同義に用いられる。「血漿カリクレイン結合タンパク質」は、血漿カリクレインと相互に作用（例えば、結合）することができるタンパク質を指し、特に、優先的または特異的に、血漿カリクレインと相互に作用および／または血漿カリクレインを抑制するタンパク質を含む。同一の条件下で、タンパク質がない場合の血漿カリクレインの活性と比較して、血漿カリクレインの活性の減少が生じた場合に、タンパク質は、血漿カリクレインを抑制する。一部の実施形態において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、抗体である。
【００６１】
用語「捕捉試薬」は、そのリガンドと特異的に結合する成分を指す。
【００６２】
本明細書において使用される場合、用語「複合体」または「複合体形成」は、互いに特異的親和性を有する要素間の複合体を指す。
【００６３】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のグループは当技術分野において定義されている。それらグループは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギングルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００６４】
バイオポリマーのモチーフ配列は、アミノ酸を変位させることができる位置を含んでよい。例えば、このような状況において、記号「Ｘ」は、一般的に、例えば、システイン以外のアミノ酸を指すなどの別段の定めがない限り、任意のアミノ酸（例えば、２０個の天然アミノ酸のうちいずれか）を指す。他の許容されたアミノ酸は、例えば、括弧およびスラッシュを用いて示されてもよい。例えば、「（Ａ／Ｗ／Ｆ／Ｎ／Ｑ）」は、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、アスパラギン、およびグルタミンが、特定の位置において許容されることを意味する。
【００６５】
本明細書において使用される場合、「検出試薬」は、検出される成分に結合する成分を指す。通常、それは、シグナル、例えば、蛍光を生じるかまたは測定可能な化合物を生成する。
【００６６】
「エピトープ」は、結合タンパク質（例えば、Ｆａｂまたは完全長抗体等の抗体）により結合されるターゲット化合物の部位を指す。ターゲット化合物がタンパク質である場合、部位は、アミノ酸成分を全成分とする、タンパク質の化学的に変化したアミノ酸（例えば、グルコシル部分）を全成分とする、または、その組み合わせを成分とする。重複するエピトープは、少なくとも１つの共通のアミノ酸残基、グリコシル基、リン酸基、硫酸基、または他の分子的特徴を含む。
【００６７】
第１の結合タンパク質（例えば、抗体）が、第２の結合タンパク質が結合するターゲット化合物の同一の部位に結合する、または第２の結合タンパク質が結合する部位と重複する部位（例えば、アミノ酸配列に関して、または他の分子的特徴（例えば、グリコシル基、リン酸基、または硫酸基）に関して、例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の重複）に結合する場合、第１の結合タンパク質（例えば、抗体）は、第２の結合タンパク質（例えば、抗体）と、「同一のエピトープに結合する」。
【００６８】
そのエピトープとの第１の結合タンパク質の結合が、そのエピトープと結合する第２の結合タンパク質の量を減少させる場合（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれ以上）、第１の結合タンパク質（例えば、抗体）は、第２の結合タンパク質（例えば、抗体）と「結合を競合する」。競合は、直接的（例えば、第１の結合タンパク質が、第２の結合タンパク質と同一または重複するエピトープに結合する）、または間接的（例えば、そのエピトープとの第１の結合タンパク質の結合が、そのエピトープと結合する第２の結合タンパク質の機能を減少させる、ターゲット化合物における立体構造の変化を生じる）であってよい。
【００６９】
本明細書において使用される場合、「機能的な」生体分子は、特徴となる特性および／または活性を表す形態の生体分子である。
【００７０】
２つの配列間の「相同性」または「配列同一性」（これら用語は、本明細書においてほとんど同じ意味で使用される）の計算は、以下のように行われる。配列は、最適な比較（例えば、差が、第１および第２のアミノ酸のうち一方または両方にもたらされ得る、または最適な配置のための核酸配列および非相同配列を比較のため無視することができる）のために、配置される。最適な配置は、ギャップペナルティが１２、ギャップエクステンドペナルティが４およびフレームシフトギャップペナルティが５のＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスであるＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを用いて最良のスコアとして決定される。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。そして、第１配列の位置が第２配列において対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、その位置における分子は同一である（本明細書において使用される場合、アミノ酸またはヌクレオチドの「同一性」は、アミノ酸またはヌクレオチドの「相同性」と同義である）。２つの配列間の同一性の割合は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【００７１】
好ましい実施形態において、比較のため、配置された基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、またさらに好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、または１００％である。例えば、基準配列は、免疫グロブリン可変ドメイン配列の長さであってよい。
【００７２】
本明細書において使用される場合、用語「低ストリンジェント、中ストリンジェント、高ストリンジェント、超高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を述べる。ハイブリダイゼーション反応を行う指針は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６にある。水性および非水性の方法は、その文献に記載され、いずれも使用することができる。本発明に関係する特定のハイブリダイゼーション条件は、（１）約４５℃で、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続いて少なくとも５０℃、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回の洗浄（洗浄温度は、低ストリンジェントな条件において５５℃まで上げることができる）の低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、（２）約４５℃で、６ＸＳＳＣ、続いて６０℃、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回以上の洗浄の中ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、（３）約４５℃で、６ＸＳＳＣ、続いて、６５℃、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回以上の洗浄の高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、および（４）６５℃で、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、続いて、６５℃、０．２ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳで１回以上の洗浄の超高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件がある。超高ストリンジェンシー条件（４）は、好ましい条件であり、別段の定めがない限り、使用されるべき条件である。本開示は、低、中、高、または超高ストリンジェントに、本明細書に記載の核酸またはその補体、例えば、本明細書に記載の結合タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズされる核酸を含む。核酸は、基準となる核酸の長さと同じ長さまたは、それらのｍ３０、２０、または１０％以内であってよい。核酸は、本明細書に記載の免疫グロブリン可変ドメイン配列をコードする領域に対応し得る。
【００７３】
「単離された組成物」は、単離された組成物を得ることができる天然検体のうち少なくとも９０％の少なくとも１つの成分から除去される組成物を指す。人工的または自然に生成される組成物は、対象となる種の種または数が質量基準で、純度が少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９２％、９５％、９８％または９９％である場合、特定の純度の組成物であってよい。
【００７４】
本明細書において使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、多細胞生物内ではなく、例えば、テストチューブまたは反応容器中、細胞培養等、人工的な環境下で生じる現象を指す。
【００７５】
本明細書において使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、ヒトまたはヒト以外の動物等、多細胞生物内で生じる現象を指す。
【００７６】
「単離された組成物」は、単離された組成物を得ることができる天然検体のうち少なくとも９０％の少なくとも１つの成分から除去される組成物を指す。人工的または自然に生成される組成物は、対象となる種の種または数が質量基準で、純度が少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９２％、９５％、９８％または９９％である場合、特定の純度の組成物であってよい。
【００７７】
「単離された」タンパク質は、単離されたタンパク質を得ることができる天然検体のうち少なくとも９０％の少なくとも１つの成分から除去される組成物を指す。タンパク質は、対象となる種の種または数が質量基準で、純度が少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９２％、９５％、９８％または９９％である場合、少なくとも特定の純度であってよい。
【００７８】
用語「カリクレイン」（例えば、血漿カリクレイン）は、ペプチダーゼ（タンパク質のペプチド結合を切断する酵素）、セリンプロテアーゼファミリーのサブグループを指す。血漿カリクレインは、キニノーゲンを切断し、強力な前炎症性ペプチドであるキニンを生成する。
【００７９】
用語「カリクレインインヒビター」は、カリクレインを抑制する任意の薬剤または分子を指す。例えば、ＤＸ−８８（本明細書においては、「ＰＥＰ−１」ともいう）は、協力（Ｋｉ＜１ｎＭ）であり、血漿カリクレインの特異的なインヒビター（ＮＰ＿０００８８３）である（例えば、国際公報第９５／２１６０１号、または国際公報２００３／１０３４７５号も参照）。
【００８０】
本明細書において使用される場合、用語「ＤＸ−２９２２」は、用語「Ｘ１０１−Ａ０１」と同じ意味で使用される。この抗体の様々な変種を以下に記載する。
【００８１】
【表１】
2020097606.tif 000003
【００８２】
本明細書で使用される場合、用語「ＤＸ−２９３０」は、用語「Ｘ１２４−Ｇ０１」と同じ意味で使用される。この抗体の他の変種を以下に記載する。
【００８３】
【表２】
2020097606.tif 000004
【００８４】
用語「調節剤」は、調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）を生じさせることが可能な、ポリペプチド、核酸、巨大分子、複合体、分子、小分子、化合物、または種等（自然に存在するまたは自然に存在しない）、バクテリア、植物、真菌、または動物細胞もしくは組織等の生物学的物質から作られる抽出物を指す。調節剤は、アッセイに加えることにより、（直接または間接的な）インヒビターまたは活性化物質としての機能特性の潜在的な活性、生物学的活性またはプロセス、またはそれらの組み合わせ（例えば、アゴニスト、パーシャルアンタゴニスト、パーシャルアゴニスト、インバースアゴニスト、アンタゴニスト、抗菌物質、および微生物感染または増殖のインヒビター等）を評価され得る。そのようなアッセイにおいて、多くの調整剤は、一度スクリーニングされ得る。調製剤の活性は、既知であっても、未知であっても、部分的に既知であってもよい。
【００８５】
「非必須」アミノ酸残基は、「必須」アミノ酸残基を変化させ、活性を十分に失いつつ、生物学的活性をなくすことなく、より好ましくは、生物学的活性を実質的に変化させることなく、結合薬、例えば、抗体の野生型配列から変更することができる残基である。
【００８６】
対象の方法により治療される「患者」、「対象」または「宿主」（それら用語は同じ意味で使用される）は、ヒトまたはヒト以外の動物のいずれかを意味し得る、一部の実施形態において、対象は、カリクレイン関連疾病、例えば、ブラジキニン関連疾病、例えば、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）、非ヒスタミン依存性突発血管性浮腫、関節リウマチ、クローン病、狼瘡、アルツハイマー病、敗血症性ショック、熱傷、脳虚血再灌流傷害、脳浮腫、糖尿病網膜症、糖尿病腎症、黄斑浮腫、血管炎、動脈または静脈血栓症、補助人工心臓またはステントに関連する血栓症、血栓症、血栓塞栓症、および不安定狭心症を伴う冠動脈疾患を伴うヘパリン起因性血小板減少症、浮腫、眼疾患、痛風、炎症性腸疾患、口腔粘膜炎、神経因性疼痛、炎症性疼痛、脊柱管狭窄症変性脊椎疾患、術後腸閉塞、大動脈瘤、変形性関節症、遺伝性血管性浮腫、静脈血栓症、脳卒中、頭部外傷または腫瘍周辺脳浮腫、敗血症、急性中大脳動脈（ＭＣＡ）虚血（脳卒中）、再狭窄（例えば、血管形成術後）、全身性エリテマトーデス腎炎、自己免疫疾患、炎症性疾患、心血管疾患、神経疾患、タンパク質のミスフォールディングに関連する疾患、血管新生に関連する疾患、高血圧性腎症および糖尿病腎症、アレルギー性呼吸器疾患（例えば、アナフィラキシー、喘息、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、持続性鼻炎）および組織損傷（例えば、熱傷または化学損傷）の疑いまたはおそれがある。
【００８７】
用語「プレカリクレイン」および「血漿プレカリクレイン」は、本明細書において同じ意味で使用され、プレカリクレインとしても知られる、活性型血漿カリクレインの酵素前駆体を指す。
【００８８】
用語  対象における疾患を「防ぐこと」または「防ぐ」は、薬学的治療、例えば、疾患の少なくとも１つの症状を防ぐような、つまり、望まれない状態（例えば、宿主動物の疾患または他の望まれない様子）の臨床症状の前に投与され、その結果、望まれない状態の進行から宿主を保護する薬の投与を対象に施すことを指す。また、疾患を「防ぐこと」は、「予防」または「予防治療」とも呼ぶことがある。
【００８９】
本明細書において使用される場合、用語「実質的に同一（または実質的に相同）」は、第１および第２のアミノ酸または核酸配列が、同様の活性、例えば、結合活性、結合能、または生物学的活性を有する（それらを有するタンパク質をエンコードする）ような、第２のアミノ酸または核酸配列と同一または等価な（例えば、アミノ酸置換を保つ、同様の側鎖を有する）非常に多くのアミノ酸残基またはヌクレオチドを含有する第１アミノ酸または核酸配列を指すとして本明細書において使用される。抗体の場合、第２の抗体は、同一の特異性を有し、同一の抗原に対して、少なくとも５０％、少なくとも２５％、または少なくとも１０％の親和性を有する。
【００９０】
本明細書に開示される配列と同様のまたは相同的な（例えば、少なくとも約８５％の配列同一性）配列も、本願の一部である。一部の実施形態において、配列同一性は、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であってよい。
【００９１】
また、核酸セグメントが、選択的ハイブリダイゼーション条件（例えば、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で、ストランドの補体にハイブリダイズされる場合、かなりの同一性がある。
【００９２】
バイオポリマーのモチーフ配列は、アミノ酸を変位させることができる位置を含んでよい。例えば、このような状況において、記号「Ｘ」は、一般的に、例えば、システイン以外のアミノ酸を指すなどの別段の定めがない限り、任意のアミノ酸（例えば、２０個の天然アミノ酸のうちいずれか）を指す。他の許容されたアミノ酸は、例えば、括弧およびスラッシュを用いて示されてもよい。例えば、「（Ａ／Ｗ／Ｆ／Ｎ／Ｑ）」は、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、アスパラギン、およびグルタミンが特定の位置において許容されることを意味する。
【００９３】
統計的有意性は、当技術分野において既知の任意の方法により決定することができる。例示的な統計試験としては、スチューデントのｔ検定、マン・ホイットニーのＵ検定、およびウィルコクソンのノンパラメトリック統計的検定を含む。例えば、２つの状態間の区別可能な質的または量的な違いを定義する用語「導く」「阻害する」「増強する」「上昇する」「増加する」または「低下する」等は、２つの状態間の違い、例えば、統計学的に有意な違いを指してもよい。
【００９４】
本明細書において使用される場合、「検体」は、対象からの、組織、例えば血液、血漿、またはタンパク質を含む組成物を指す。検体は、後に処理された、例えば、部分的に精製された保存された形態同様、対象から採取し最初の未処理の検体も両方を含む。例示的な検体としては、血液、血漿、涙、または粘液を含む。一部の実施形態において、検体は、血液または血漿である。
【００９５】
好ましくは、「治療有効用量」は、測定可能なパラメータ、例えば血漿カリクレイン活性を、統計学的に有意な量、または未治療の対象に対して、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、またさらい好ましくは少なくとも約８０％、に調整する。測定可能なパラメータ、例えば、疾患に関連するパラメータを調整する化合物の性能は、ヒトの疾病または状態における効能が予測可能な動物モデルシステムにおいて、評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにてパラメータを調整する化合物の性能を実験することにより評価することができる。
【００９６】
対象において疾患（または状態）を「治療すること」または疾患に罹患している対象を「治療すること」は、薬学的治療、例えば、疾患の少なくとも１つの症状を治癒する、緩和する、または軽減させるような薬の投与を対象に施すことを指す。
【００９７】
用語  対象における疾患を「防ぐこと」は、薬学的治療、例えば、疾患の少なくとも１つの症状を防ぐような、つまり、望まれない状態（例えば、宿主動物の疾患または他の望まれない様子）の臨床症状の前に投与され、その結果、望まれない状態の進行から宿主を保護する薬の投与を対象に施すことを指す。また、疾患を「防ぐこと」は、「予防」または「予防処置」とも呼ぶことがある。
【００９８】
「予防有効量」は、所望な予防的結果を得るために、必要な用量および時間で、有効な量を指す。通常、予防有効量は、疾患前または疾患の早い段階で対象に使用されるため、予防有効量は、治療有効量よりも少なくなるであろう。
【００９９】
アルファベットまたは数字の見出しを含み、見出しは、異なる指示がない限りは、理解および読解を容易にすることを目的としているに過ぎず、時間的順序や、優先順位を課されてはいない。
【０１００】
ＰＫａｌおよび／またはＦＸＩＩの阻害に基づき、Ｃ１−ＩＮＨを測定するアッセイ法またはキット
活性カリクレインおよび／または活性ＦＸＩＩに結合し、阻害するＣ１−ＩＮＨの性能に基づき、機能的Ｃ１−ＩＮＨレベルを測定する方法およびキットを本明細書において提供する。当該方法は、本明細書に記載の捕捉試薬と、Ｃ１−ＩＮＨを含有する検体を接触させ、捕捉試薬に結合するものにおけるＣ１−ＩＮＨレベルを測定することにより、行ってもよい。一部の実施形態において、総Ｃ１−ＩＮＨレベル（例えば、Ｃ１−ＩＮＨが本明細書に記載の捕捉試薬に結合するかどうかは別として、検体中のＣ１−ＩＮＨタンパク質レベル）も測定される。
【０１０１】
血漿プロテアーゼＣ１インヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）は、一般的に、補体の活性化（例えば、Ｃ１の補体におけるＣ１ｒおよびＣ１ｓプロテアーゼの阻害）、血液凝固、線溶、およびキニンの産生を含む様々な生理学的経路を調整する重要な役割を担う。Ｃ１−ＩＮＨは、第ＸＩＩａ因子、第ＸＩＩｆ因子、およびカリクレインと結合および阻害する。Ｃ１−ＩＮＨは、タンパク質のセルピンスーパーファミリーの一因であり、２ドメイン構造を有する。Ｃ１−ＩＮＨのＣ末端セルピンドメインは、タンパク質の阻害活性を提供する。ヒトＣ１−ＩＮＨの例示的なアミノ酸配列を以下に示す（寄託番号：ＮＰ＿００００５３．２）
【０１０２】
【表３】
2020097606.tif 000005
【０１０３】
「活性」または「機能的」Ｃ１−ＩＮＨは、成熟型を含む、天然由来のＣ１−ＩＮＨと必ずしも同一ではないが、同様の生物活性および／または免疫活性を保持するＣ１−ＩＮＨポリペプチドまたはＣ１−ＩＮＨポリペプチド断片を指す。一部の実施形態において、活性または機能的Ｃ１−ＩＮＨは、第ＸＩＩａ因子、第ＸＩＩｆ因子、またはカリクレインのうち１つ以上と結合することで、ＦＸＩＩａおよび／またはＰＫａｌの活性を抑制し、キニン形成過程を調整するＣ１−ＩＮＨポリペプチドまたはＣ１−ＩＮＨポリペプチド断片である。
【０１０４】
一部の実施形態において、本明細書に記載のアッセイ方法で検査される検体は、生体検体、例えば、本明細書に記載の対象から得られた生体検体、例えば血液検体または血漿検体等の体液検体である。例えば、適切なＣ１−ＩＮＨタンパク質は、生体組織検体（例えば、血液、血漿、涙、粘液）、組織抽出物または調剤、または多細胞生物（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏの処置）から直接得られた固形組織において提供され得る。従って、他のもののうち、本発明によるアッセイは、診断またはバイオマーカー測定のため、ヒトまたは他の多細胞生物に内在するＣ１−ＩＮＨを監視または特徴付けるために使用することができる。
【０１０５】
Ａ．アッセイ形式
本明細書に記載のアッセイ方法は、本明細書に記載の捕捉試薬と結合するＣ１−ＩＮＨレベルの評価（例えば、測定）を可能にする。捕捉試薬と結合するＣ１−ＩＮＨレベル（例えば、量）は、本明細書に記載のアッセイおよび／または当技術分野において既知のアッセイを用いて測定することができる。捕捉試薬と結合するＣ１−ＩＮＨレベルを査定するために使用することができるアッセイは、限定するものではないが、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定、電気化学発光に基づく検出アッセイおよびそれらに関連する技術等の免疫測定法を含む。これら例示的なアッセイ法を実施する方法は、当技術分野において既知であり、市販されている（例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（現行版、Ｗｉｌｅｙ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ）参照）。
【０１０６】
一部の実施形態において、捕捉試薬と結合するＣ１−ＩＮＨレベルは、ＥＬＩＳＡを用いて決定される。ＥＬＩＳＡは、当技術分野において既知である（例えば、Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｒ（２００９）．「Ｔｈｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ．」（第２版  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｌｅｑｕｉｎ  Ｒ（２００５））参照）。「Ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＥＩＡ）／ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）」（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５１（１２）：２４１５−８））および例示的なＥＬＩＳＡは、本明細書に記載される。ＥＬＩＳＡを実施するキットも、当技術分野において既知であり、市販されている（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社やＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＥＬＩＳＡキット参照）。
【０１０７】
一部の実施形態において、本発明のアッセイは、シングルアッセイ形式を含む低スループットプラットフォームで行われる。例えば、低スループットプラットフォームは、診断またはバイオマーカー測定のため、生体検体（例えば、生体組織、組織抽出物）におけるＣ１−ＩＮＨ活性レベルを測定するために使用してもよい。
【０１０８】
一部の実施形態において、本発明のアッセイは、高スループットプラットフォームにおいて行うことができる。一部の実施形態において、マルチウェルプレート、例えば、２４個、４８個、９６個、３８４個またはそれ以上の数のウェルプレートは、高スループットアッセイに使用されてもよい。それぞれのアッセイは、各ウェルで並行して行うことができる。そのため、一般的には、マルチウェルを並行に測定し、アッセイのスループットを向上させるため、プレートリーダーを使用することが望ましい。一部の実施形態において、マルチウェル（例えば、４個、１６個、２４個、４８個、９６個、３８４個またはそれ以上のウェル）を並行に撮像することができるプレートリーダーはこのプラットフォームのために使用することができる。例えば、市販のプレートリーダー（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社（マサチューセッツ州ウォルサム）から市販されているｐｌａｔｅ：：ｖｉｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用してもよい。このプレートリーダーは、動的な蛍光分析を可能とする。ｐｌａｔｅ：：ｖｉｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍは、集光効率が高く、９６個のウェルを並行して分析するために設計された特別な光学系を有する。別の、適切な並行プレートリーダーとしては、限定するものではないが、ＳＡＦＩＲＥ（Ｔｅｃａｎ社（カリフォルニア州サンノゼ））、ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡ（登録商標、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社（カリフォルニア州ユニオンシティ））、ＦＤＳＳ７０００（Ｈａｍａｍａｔｓｕ社（ニュージャージー州ブリッジウォーター））、およびＣｅｌｌＬｕｘ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社（マサチューセッツ州ウォルサム））を含む。一部の実施形態において、本発明の高スループットスクリーニングアッセイは、自動化される（例えば、ロボットアッセイを適用される）。
【０１０９】
Ｂ．捕捉試薬
本明細書に記載のアッセイ法で使用される捕捉試薬は、キニン形成カスケードを抑制する機能、例えば、ＰＫａｌ、ＦＸＩＩ、またはその両方を抑制する機能のあるＣ１−ＩＮで補体を形成することができる。一部の実施形態において、捕捉試薬は、活性型第ＸＩＩ因子もしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片を含む成分、または活性型カリクレインもしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片を含む成分のうち一方または両方を含んでもよい。一部の実施形態において、本発明の捕捉試薬は、天然資源から単離および／または精製される。一部の実施形態において、本発明の捕捉試薬は、組み換えまたは合成により生成される。一部の実施形態において、捕捉試薬は、基材、例えば、不溶性基材に配置（例えば、それらと結合）される。捕捉試薬は、共有結合または非共有結合により基材と結合してもよい。捕捉試薬は、基材と直接結合してもよいし、基材と間接的に、例えばリンカーを介して結合してもよい。リンカーの例としては、限定するものではないが、炭素含有鎖、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、核酸、単糖単位、ビオチン−アビジンおよびペプチドを含む。一部の実施形態において、基材は、１つ以上のウェルを含む容器、例えばマイクロタイタープレートである。活性型第ＸＩＩ因子またはカリクレインのＣ１−ＩＮＨ結合断片は、完全長の捕捉試薬の断片を生成し、断片がＣ１−ＩＮＨと結合するかどうかと決定することにより作製することができる。
【０１１０】
一部の実施形態において、捕捉試薬は、第１の特異的結合成分、例えばビオチンまたはアビジンを含み、基材、例えば、不溶性基材に配置（例えば、それと結合）される第２の結合成分、例えば、ビオチンまたはアビジンと複合体を形成する。
【０１１１】
一部の実施形態において、捕捉試薬は、血漿カリクレインもしくはその機能的断片、ＦＸＩＩもしくはその機能的断片、またはそれらの組み合わせを含んでよい。
【０１１２】
（ｉ）血漿カリクレイン
血漿カリクレインは、接触系（Ｓａｉｎｚ  Ｉ．Ｍら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ９８，７７−８３，２００７）のセリンプロテアーゼ成分である。接触系は、外部のもしくは負に荷電した表面に晒され、第ＸＩＩａ因子により、または内皮細胞表面でプロピルカルボキシペプチダーゼにより、のいずれかで活性化される（Ｓａｉｎｚ  Ｉ．Ｍ．ら、ｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ９８，７７−８３，２００７）。血漿カリクレインの活性化は、第ＸＩＩ因子のフィードバック活性を介して、内因性凝固を促進し、炎症誘発性ノナペプチドブラジキニンの生成を介した炎症を強める。血液の循環における主要なキニノゲナーゼとして、血漿カリクレインは、血管系におけるブラジキニンの生成に大きく関わっている。
【０１１３】
例示的な血漿カリクレイン配列としては、ヒト、マウスまたはラットの血漿カリクレインアミノ酸配列を含んでよく、その配列は、それら配列、例えば、以下に示す配列のもののうちの１つと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一部の実施形態において、血漿カリクレインは、天然から単離される。一部の実施形態において、血漿カリクレインは、組み換え法または合成法により生成される。
【０１１４】
ヒト血漿カリクレインの例示的な配列を以下に示す（寄託番号：ＮＰ＿０００８８３．２）。ヒト血漿カリクレイン（８６ｋＤａ）は、ヒト血漿から精製され、第ＸＩＩａ因子で活性化された。第ＸＩＩａ因子は、１つの部位（Ａｒｇ３７１−Ｉｌｅ３７２の間、以下の配列において、「／」で標識された切断部位）で、ポリペプチド配列を切断し、活性血漿カリクレインを生成することによりプレカリクレインを活性化し、それは、約５２ｋＤａの重鎖および約３４ｋＤａの触媒ドメインの２つの二硫化物結合ポリペプチドからなる［Ｃｏｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍａｉｅｒ，（１９９７）「Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  Ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ，Ｐｒｏｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ，Ａｎｔｉａｄｈｅｓｉｖｅ，ａｎｄ  Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ」Ｂｌｏｏｄ，９０，３８１９−３８４３］。
【０１１５】
【表４】
2020097606.tif 000006
【０１１６】
ヒト、マウス、およびラットのプレカリクレインアミノ酸配列、およびそれらをコードするｍＲＮＡ配列を以下に示す。プレカリクレインの配列は、活性血漿カリクレインが２つの鎖を生じる１つの位置（「／」で示される）で切断される単一のポリペプチド鎖を有すること以外は、血漿カリクレインと同一である。以下に示す配列は、シグナル配列を含む完全な配列である。発現細胞からの分泌において、シグナル配列が除去されることが予想される。
【０１１７】
【表５】
2020097606.tif 000007
【０１１８】
【表６】
2020097606.tif 000008
【０１１９】
【表７】
2020097606.tif 000009
【０１２０】
「活性」または「機能的」血漿カリクレインは、成熟型を含む、天然由来の血漿カリクレインと必ずしも同一ではないが、同様の生物活性および／または免疫活性を保持する血漿カリクレインポリペプチドまたは血漿カリクレインポリペプチド断片を指す。一部の実施形態において、活性または機能的血漿カリクレインは、Ｃ１−ＩＮＨと結合する血漿カリクレインポリペプチドまたは血漿カリクレインポリペプチド断片である。
【０１２１】
（ｉｉ）第ＸＩＩ因子
第ＸＩＩ因子は、血液凝固の抑制、線溶、ならびにブラジキニンおよびアンギオテンシンの生成に関係する血清グリコプロテインである。プレカリクレインは、第ＸＩＩ因子により切断され、カリクレインを形成し、その後、第ＸＩＩ因子を活性化し、第ＸＩＩａ因子および第ＸＩＩ因子断片（第ＸＩＩｆ因子）を形成こととなる（「Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｓ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩａ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃｏｎｔａｃｔ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ」Ｍａｃｑｕａｒｒｉｅら、Ｂｌｏｏｄ  １１７：４１３４−４１４１  ２０１１）。Ｃ１インヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）は、第ＸＩＩａ因子および第ＸＩＩｆ因子の両方の重要な血漿インヒビターであるとして、示されている（「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｏｎ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩａ  ｂｙ  Ｃ１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」Ｐｉｘｌｅｙら、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２５６（２）：４９０−８  １９８７）。
【０１２２】
活性型第ＸＩＩａ因子と共に、ヒト第ＸＩＩ因子の前駆タンパク質配列およびｍＲＮＡ配列を以下に示す（寄託番号：ＮＭ＿０００５０５．３およびＮＰ＿０００４９６．２）。
【０１２３】
【表８】
2020097606.tif 000010
【０１２４】
「活性」または「機能的」第ＸＩＩ因子は、成熟型を含む、天然由来の第ＸＩＩ因子と必ずしも同一ではないが、同様の生物活性および／または免疫活性を保持する第ＸＩＩ因子ポリペプチドまたは第ＸＩＩ因子ポリペプチド断片を指す。一部の実施形態において、活性または機能的第ＸＩＩ因子は、Ｃ１−ＩＮＨと結合する第ＸＩＩ因子ポリペプチドまたは第ＸＩＩ因子ポリペプチド断片である。一部の実施形態において、活性または機能的第ＸＩＩ因子は、Ｃ１−ＩＮＨと結合する第ＸＩＩａ因子ポリペプチドまたは第ＸＩＩａ因子ポリペプチド断片である。一部の実施形態において、活性または機能的第ＸＩＩ因子は、Ｃ１−ＩＮＨと結合する第ＸＩＩｆ因子ポリペプチドまたは第ＸＩＩｆ因子ポリペプチド断片である。
【０１２５】
Ｃ．検出薬
本発明の方法は、捕捉試薬、例えば、本明細書に開示される捕捉試薬とＣ１−ＩＮＨとの間の複合体形成の検出を可能とする。複合体の検出は、任意の利用可能な方法、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）により行うことができる。例えば、一部の実施形態において、Ｃ１−ＩＮＨとの抗体が使用される。一部の実施形態において、二次抗体、例えば抗Ｃ１−ＩＮＨ抗体が使用される。１つ以上の抗体は、検出成分と結合してもよい。一部の実施形態において、検出成分は、蛍光体であるか、または蛍光体を含む。本明細書において使用される場合、用語「蛍光体（「蛍光ラベル」または「蛍光色素」とも呼ぶ）は、所定の励起波長において光エネルギーを吸収し、異なる波長の光エネルギーを発散する成分を指す。一部の実施形態において、検出成分は、酵素であるか、または酵素を含む。一部の実施形態において、酵素は、色素のない基質から染色された生成物を生成するもの（例えば、β−ガラクトシダーゼ）である。
【０１２６】
本明細書において使用される場合、用語「測定すること」もしくは「測定」、またあるいは「検出すること」もしくは「検出」は、物質の質的濃度レベルの導出を含む、検体中の物質の存在、有無、分量、または量（有効量であってもよい）を査定すること、またあるいは、対象の値または分類を評価することを意味する。
【０１２７】
一部の実施形態において、試験は、基材、例えば反応容器に、例えば、捕捉薬が基材と結合するような条件下で、例えばＥＬＩＳＡを使用して、捕捉薬を添加することにより行われる。検体、例えば対象からの組織検体、例えば、血液、血漿または涙は、捕捉薬を含む基材（例えば反応容器）に添加されてもよい。任意に存在する捕捉薬結合分子は、固定化捕捉薬分子と結合してもよい。抗体または抗体−検出薬抱合体は、反応混合物に添加されてもよい。抱合体の抗体部分は、予め結合した任意の抗原分子（例えば、Ｃ１−ＩＮＨ）と結合し、抗体−抗原−抗体の「サンドウィッチ」を生じる。未結合の抱合体を洗い流した後、検出を助けるために基質溶液が添加されてもよい。例えば、設定された間隔後、反応を停止してもよく（例えば、１Ｎ  ＮａＯＨを添加することにより）、形成され、染色された生成物の濃度を分光光度計で測定してもよい。色素の強度は、結合した抗原の濃度に比例する。
【０１２８】
（ｉ）抗体
抗体は、本発明の方法において使用されてもよい。一部の実施形態において、捕捉薬は、抗体であるか、または抗体を含む。一部の実施形態において、検出薬は、抗体であるか、または抗体を含む。一部の実施形態において、ｐＫａｌ関連疾病Ｍまたはブラジキニン関連疾病の治療のための治療用組成物は、抗体であるか、または抗体を含む。
【０１２９】
一部の実施形態において、抗体は、標的抗原またはエピトープ、例えばＣ１−ＩＮＨと特異的に結合する。抗原またはエピトープと「特異的に結合する」抗体とは、当該技術分野において公知の用語であり、そのような特異的な結合を判断する方法も、当該技術分野において公知である。抗体は、別のターゲットとの場合よりも、より頻繁に、より素早く、より長期で、および／またはより大きな親和性をもって、特定の標的抗原と反応するまたはそれに結合する場合に、関連特異的な結合を表すと言われる。抗体は、他の基質と結合する場合よりも、より大きな親和性および結合力、より素早く、および／またはより長期で結合する場合に、標的抗原またはエピトープと「特異的に結合する」。例えば、抗原（例えば、Ｃ１−ＩＮＨ）またはそれらの抗原エピトープと特異的に（または優先的に）結合する抗体は、他の抗原または同じ抗原における他のエピトープと結合する場合よりも、より大きな親和性および結合力、より素早く、および／またはより長期で当該標的抗原と結合する抗体である。第１標的抗原に特異的に結合する抗体が、第２標的抗原と特異的にまたは優先的に結合してもよいし、しなくてもよいことも本定義を読むことにより理解されるであろう。このように、「特異的な結合」または「優先的な結合」は、独占的な結合を必ずしも必要としない（それらを含んでいてもよいが）。必ずしもそうではないが、一般的に、結合の意味するところは、優先的結合である。一部の実施形態において、標的抗原またはそのエピトープに「特異的に結合する」抗体は、他の抗原または同じ抗原における他のエピトープに結合しない。
【０１３０】
一部の実施形態において、本明細書に記載の抗体は、標的抗原または抗原エピトープ（例えば、Ｃ１−ＩＮＨ）への適切な結合親和性を有する。本明細書において使用される場合、「結合親和性」は、見かけの会合定数またはＫＡを指す。ＫＡは、解離定数の逆数（ＫＤ）である。本明細書に記載の抗体は、少なくとも１０〜５Ｍ、１０〜６、１０〜７Ｍ、１０〜８Ｍ、１０〜９Ｍ、１０〜１０Ｍまたはそれ以下の結合親和性（ＫＤ）を有する。結合親和性が高まると、対応して、ＫＤは減少する。第２抗原に対して、第１抗原の抗体の結合親和性が高いことは、第２抗原に結合するＫＡ（または数値ＫＤ）よりも、第１抗原に結合するＫＡが高い（または数値ＫＤが小さい）ことを指し得る。このような場合、抗体は、第２抗原に対して、第１抗原への特異性を有する、結合親和性の違い（例えば、特異性または他の比較）は、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３７．５倍、５０倍、７０倍、８０倍、９１倍、１００倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍、または１０５倍であってよい。
【０１３１】
結合親和性（または結合特異性）は、本明細書に記載の様々な方法により決定することができる。
【０１３２】
本明細書において使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列のうちの少なくとも１つを含むタンパク質を指す。例えば、高体は、重鎖（Ｈ）可変領域（本明細書において略してＶＨ）および、軽鎖（Ｌ）可変領域（本明細書において略して、ＶＬ）を含んでよい。別の例としては、抗体は、２つの重鎖（Ｈ）可変領域と２つの軽鎖（Ｌ）可変領域とを含む。用語「抗体」は、完全な抗体だけでなく、抗体の抗原結合断片（例えば、単鎖抗体、ＦａｂおよびｓＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、およびドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（ｄｅ  Ｗｉｌｄｔら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６；２６（３）：６２９−３９．））を包括する。抗体は、構造的特徴ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（そのサブタイプも含む）．を有し得る。抗体は、任意の原料由来であってよいが、霊長類（ヒトおよびヒト以外の霊長類）および霊長類化物が好ましい。
【０１３３】
ＶＨおよびＶＬ領域は、さらに、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性の領域に細分することができ、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と呼ばれるより保存された領域で散在する。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、正確に定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃら、（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７参照、ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋも参照）。Ｋａｂａｔの定義は本明細書において使用される。通常、ＶＨおよびＶＬは、それぞれ、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、アミノ末端から炭素末端に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で配置される。
【０１３４】
抗体のＶＨまたはＶＬ鎖は、さらに、重鎖または軽鎖定常領域の全てまたは一部を含み、これにより、それぞれ、免疫グロブリン重鎖または軽鎖を形成する。一実施形態において、抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖の四量体であり、免疫グロブリン重鎖および軽鎖は、例えば、ジスルフィド結合により、互いに結合される。ＩｇＧｓにおいて、重鎖定常領域は、２つの免疫グロブリンドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、ＣＬドメインを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互に作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、通常、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む、抗体の宿主組織または因子との結合を媒介する。免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ型またはラムダ型のものであってもよい。一実施形態において、抗体は、グリコシル化される。抗体は、抗体依存の細胞毒性および／または補体関連の細胞毒性の機能を有し得る。
【０１３５】
抗体の１つ以上の領域は、ヒトまたは実質的にヒトであってよい。例えば、１つ以上の可変領域は、ヒトまたは実質的にヒトであってよい。例えば、１つ以上のＣＤＲは、ヒト、例えば、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３であってよい。各軽鎖ＣＤＲは、ヒトであってよい。ＨＣ  ＣＤＲ３は、ヒトであってよい。１つ以上のフレームワーク領域は、ヒト、例えば、ＨＣまたはＬＣのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４であってよい。例えば、Ｆｃ領域は、ヒトであってよい。一実施形態において、全てのフレームワーク領域は、ヒトであり、例えばヒト体細胞、例えば、免疫グロブリンを産生する造血細胞または非造血細胞により生成される抗体のフレームワーク配列を有する。一実施形態において、ヒト配列は、生殖細胞系配列であり、例えば、生殖細胞系核酸がコードする。一実施形態において、選択されたＦａｂのフレームワーク（ＦＲ）残基は、最も類似した霊長類生殖細胞系遺伝子、特にヒト生殖細胞系遺伝子における対応する残基のアミノ酸型に変換することができる。１つ以上の定常領域は、ヒトまたは実質的にヒトであってよい。例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％の免疫グロブリン可変ドメイン、定常領域、定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬ１）、または前抗体は、ヒトまたは実質的にヒトであってよい。
【０１３６】
抗体の全てまたは一部は、免疫グロブリン遺伝子またはそのセグメントがコードし得る。例示的なヒト免疫グロブリン遺伝子は、多くの免疫グロブリン加減領域遺伝子以外にも、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、エプシロン、およびミューの定常領域遺伝子を含む。完全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５  ＫＤａまたは約２１４個のアミノ酸）は、ＮＨ２末端における可変領域遺伝子（約１１０個のアミノ酸）およびＣＯＯＨ末端におけるカッパまたはラムダ定常領域がコードする。完全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０ＫＤａまたは約４４６個のアミノ酸）は、可変領域遺伝子（約１１６個のアミノ酸）、および前述した他の定常領域遺伝子のうち１つ例えば、ガンマ（約３３０個のアミノ酸をコードする）が同様にコードする。ＨＣ  ＣＤＲ３が、約３個のアミノ酸残基から、３５個を超えるアミノ酸残基まで変化するため、ヒトＨＣの長さは、かなり変化する。
【０１３７】
完全長抗体の用語「抗原結合断片」は、目的となるターゲットに特異的に結合する能力を保持した完全長抗体の１つ以上の断片を指す。完全長抗体の用語「抗原結合断片」に含まれる結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂ断片を含む２価断片であるＦ（ａｂ′）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）単一群の抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）ａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、および（ｖｉ）機能性を保持する単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、個別の遺伝子によりコードされるが、それらは、組み換え法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として既知の１価の分子を形成するために１組にされる、単一タンパク質鎖として、それらを作製することが可能な合成リンカーにより、組み合わせることができる。例えば、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第４，９４６，７７８号、および米国特許第４，８８１，１７５号、Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６、およびＨｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照。
【０１３８】
抗体断片は、当業者にとって既知の従来の技術を含む任意の適切な技術を使用して得ることができる。用語「単独特異性のある抗体（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、特定のターゲット、例えばエピトープへの単結合特異性および親和性を表す抗体を指す。この用語は、抗体が生成される方法に関係なく、単一分子組成物の抗体またはその断片の調合剤を指すとして本明細書で使用される、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」を含む。
【０１３９】
本明細書において使用される場合、「ヒト化」免疫グロブリン可変領域は、免疫グロブリン可変領域が、正常なヒトの免疫反応を誘発しないような多くのヒトフレームワークアミノ酸位置を含むように修飾される免疫グロブリン可変領域を指す。「ヒト化」免疫グロブリンの記載は、例えば、米国特許第６，４０７，２１３号および米国特許第５，６９３，７６２号に記載されている。
【０１４０】
阻害定数（Ｋｉ）は、阻害能の測定を提供し、酵素活性を半分に低下させる必要があるインヒビターの濃度であり、酵素または基質の濃度に依存しない。見かけのＫｉ（Ｋｉ，ａｐｐ）は、反応の範囲（例えば、酵素活性）において、異なる濃度のインヒビター（例えば、インヒビター結合タンパク質）の阻害効果を測定することにより異なる基質濃度において得ることができ、インヒビター濃度関数として、擬１次速度定数の変化をモリソン式（式１）に合わせることにより見かけのＫｉ値の推定値を得る。Ｋｉは、基質濃度に対する、Ｋｉ，ａｐｐのプロットの線形回帰分析から抽出されたｙ切片から得られる。
【０１４１】
【数１】
2020097606.tif 000011
【０１４２】
Ｄ．キット
本開示は、ＰＫａｌおよび／またはＦＸＩＩを阻害する機能のあるＣ１−ＩＮＨを評価するために使用するキットも提供する。そのようなキットは、（ａ）本明細書に記載の捕捉試薬、および（ｂ）こちらも本明細書に記載の、Ｃ１−ＩＮＨと結合する検出試薬、例えば、抗Ｃ１−ＩＮＨ抗体、ならびに、場合によっては（ｃ）Ｃ１−ＩＮＨを含んでよい。一部の実施形態において、捕捉試薬は、（ｉ）活性型第ＸＩＩ因子もしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片、（ｉｉ）活性型カリクレインもしくはそのＣ１−ＩＮＨ結合断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む。一部の実施形態において、捕捉試薬は、マイクロプレート等の基材に固定化される。
【０１４３】
一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載の方法のうちいずれかに従い使用する使用説明書を含んでよい。含まれる使用説明書は、ヒト患者から収集された生体検体であってよい検体中の機能的Ｃ１−ＩＮＨレベルを測定するキットに含有される成分を使用する方法についての記載を含んでよい。
【０１４４】
キットの使用に関する使用説明書は、一般に、各成分の量、および本明細書に記載のアッセイ方法を行うために適切な条件についての情報を含む。キットの成分は、単位用量、大量放送（例えば、多回投与容器）、またはサブユニット用量であってもよい。本発明のキットに提供される使用説明書は、通常、ラベルまたは包装内容物に書かれた使用説明書であるが、機械が解読可能な使用説明書（例えば、磁気または光記憶ディスクで行われる使用説明書）であってもよい。
【０１４５】
ラベルまたは包装内容物は、キットがＰＫａｌおよび／またはＦＸＩＩの阻害に基づき、機能的Ｃ１−ＩＮＨレベルを評価するために使用されることを指示する。使用説明書は、本明細書に記載の方法のうちいずれかを実施するために提供され得る。
【０１４６】
本発明のキットは、適切に包装される。適切な梱包は、限定するものではないが、バイアル、ボトル、ジャー、およびフレキシブル包装等（例えば、密封されたマイラーまたはビニール袋）を含む。また、吸入器、鼻噴投与装置（例えば、アトマライザー）またはミニポンプ等の注入器等の特定の装置との組み合わせで使用される包装も、考えられる。キットは、滅菌アクセスポート（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）を有する。容器は、滅菌アクセスポート（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）を有する。
【０１４７】
キットは、バッファなどの別の成分および解釈情報を任意に提供してもよい。通常、キットは、容器と、容器にまたは容器に関連しやラベルまたは包装内容物を含む。一部の実施形態において、本開示は、上記のキットの内容を含む製造物の物品を提供する。
【０１４８】
疾患診断および予後におけるアッセイ法の適用
本明細書に記載のアッセイ法およびキットは、疾患の評価、例えば、疾患の診断および予後に適用することができる。評価が、本明細書に記載の疾患、例えば、ＨＡＥ（Ｉ型および／またはＩＩ型ＨＡＥ）等のｐＫａｌ関連疾病のおそれがあるかまたはそれに罹患している対象を判断することを含んでもよい。評価は、疾患の治療を監視すること、例えば、ＨＡＥ（Ｉ型および／またはＩＩ型ＨＡＥ）等のｐＫａｌ関連疾病の治療の有効性を評価することも、含んでもよい。
【０１４９】
Ａ．診断
一部の実施形態において、アッセイ法およびキットは、候補となる対象（例えば、ＨＡＥ等のＰＫａｌ関連疾病に罹患している疑いのあるヒト患者）から収集された生体検体（例えば、血液検体または血漿検体）におけるＣ１−ＩＮＨレベルを決定するために行われる。その後、Ｃ１−ＩＮＨレベルは、基準値と比較され、対象が、ＰＫａｌ関連疾病に罹患しているまたはＰＫａｌ関連疾病の疑いがあるかどうかを決定する。基準値は、本明細書に記載の捕捉試薬（例えば、ｐＫａｌまたはＦＸＩＩ）と結合可能なＣ１−ＩＮＨの対照レベルであってよい。一部の実施形態において、対照レベルは、好ましくは、候補となる対象と同一の種である健康な対象または健康な対象の集団から得られた検体（例えば、血液または血漿検体）等の捕捉試薬と結合可能な対照検体におけるＣ１−ＩＮＨレベルである。本明細書において使用される場合、健康な対象は、Ｃ１−ＩＮＨレベルが測定された時点で、明らかに標的疾患（例えば、ＨＡＥ等のＰＫａｌ関連疾病）でない、または疾患の病歴がない対象である。
【０１５０】
対照レベルは、所定のレベルであってもよい。そのような所定のレベルは、標的疾患を患っていないまたは標的疾患の疑いがない対象の集団における（捕捉試薬と結合可能な）機能的Ｃ１−ＩＮＨレベルを表し得る。また、ｐＫａｌインヒビターによる治療の恩恵を得る可能性がないかもしれない対象の集団における機能的Ｃ１−ＩＮＨレベルをも表す。
【０１５１】
所定のレベルは、様々な形態を取ることができる。例えば、中央値または平均値等のシングルカットオフ値であってもよい。一部の実施形態において、そのような所定のレベルは、一方のとある群は、標的疾患に罹患していることが知られており、別のとある群は、標的疾患を患っていないことが知られているというような比較群に基づき、確立されてもよい。あるいは、所定のレベルは、範囲、例えば、所定の割合内で、対照集団における機能的Ｃ１−ＩＮＨレベルを表す範囲であってもよい。
【０１５２】
本明細書に記載の標的レベルは、通例の技術により決定することができる。一部の例において、対照レベルは、本明細書にも記載の対照検体において、従来の方法（例えば、試験検体において、捕捉試薬と結合可能なＣ１−ＩＮＨレベルを得る本明細書に記載のものと同じアッセイ）を行うことにより得ることができる。他の例において、Ｃ１−ＩＮＨレベルは、対照集団のメンバーから得ることができ、結果は、例えばコンピュータプログラムによって分析することができ、対照集団におけるＣ１−ＩＮＨレベルを表す対照レベル（所定のレベル）を得る。
【０１５３】
候補となる対象から得られた検体における捕捉試薬と結合可能なＣ１−ＩＮＨレベルを、本明細書に記載の基準値と比較することにより、候補となる対象がＰＫａｌ関連疾患（例えば、ＨＡＥ）に罹患しているまたはその疑いがあるかどうかを決定することができる。例えば、候補となる対象の捕捉試薬と結合するＣ１−ＩＮＨレベルが、基準値から外れている（例えば、基準値よりも低下している）場合、候補となる対象は、疾患、例えばＨＡＥに罹患しているまたはその疑いがあると判断されてもよい。
【０１５４】
本明細書において使用される場合、「高いレベルまたは基準値を上回るレベル」は、捕捉試薬と結合するＣ１−ＩＮＨレベルが、所定の閾値または対照検体において捕捉試薬と結合するＣ１−ＩＮＨのレベル等の基準値よりも高いことを意味する。対照レベルは、本明細書において詳説する。捕捉試薬と結合するＣ１−ＩＮＨレベルが高いとは、基準値よりも、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上上回るＣ１−ＩＮＨレベルを含む。捕捉試薬と結合するＣ１−ＩＮＨ  レベルが高いことは、現象が、ゼロ状態（例えば、検体において捕捉試薬と結合するＣ１−ＩＮＨがない、または検出されない）からゼロでない状態（例えば、検体において捕捉試薬と結合するＣ１−ＩＮＨがいくらかある、または検出可能である）まで増加することをも含む。
【０１５５】
本明細書において使用される場合、「低いレベルまたは基準値以下のレベル」は、捕捉試薬と結合するＣ１−ＩＮＨレベルが、所定の閾値または対照検体における捕捉試薬と結合するＣ１−ＩＮＨ等の基準値よりも低いことを意味する。対照レベルは、本明細書において詳説する。捕捉試薬と結合するＣ１−ＩＮＨレベルが低いことは、基準値よりも、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以下、下回るＣ１−ＩＮＨレベルを含む。Ｃ１−ＩＮＨレベルが低いことは、現象が、ゼロでない状態（例えば、検体において捕捉試薬と結合するＣ１−ＩＮＨがいくらかある、または検出可能である）からゼロ状態（例えば、検体において捕捉試薬と結合するＣ１−ＩＮＨがない、または検出されない）まで低下することも含む。
【０１５６】
一部の実施形態において、候補となる対象は、ｐＫａｌ関連疾病、例えば、ＨＡＥなどの本明細書において開示されるものの症状を有するヒト患者である。例えば、対象は、浮腫、全体または大部分が末梢にある腫脹；蕁麻疹；感染症の確証がない発赤、痛みおよび腫脹；非ヒスタミン関連浮腫、腫脹の再発発作、またはその組み合わせに罹患している。他の実施形態において、対象は、検体が収集された時点でｐＫａｌ関連疾病の症状がない、ｐＫａｌ関連疾病の症状の病歴がない、またはＨＡＥ等のｐＫａｌ関連疾病の病歴がない。さらに他の実施形態において、対象は、抗ヒスタミン療法、コルチコステロイド療法、またはその両方に耐性を有する。
【０１５７】
一部の実施形態において、血漿カリクレイン活性に関する疾患または状態は、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）である。遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）は、「クインケ浮腫」、「Ｃ１エステラーゼインヒビター欠乏症（Ｃ１  ｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）」、「Ｃ１インヒビター欠乏症（Ｃ１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）」、および遺伝性血管神経症性浮腫（ＨＡＮＥ）としても知られる。ＨＡＥは、例えば、手足、顔、性器、消化管、および気道に影響し得る重度の腫脹の再発（血管性浮腫）を特徴とする。ＨＡＥの症状は、例えば、腕、脚、唇、目、舌、および／または喉の腫脹；喉の腫れや突然の嗄声を伴い得る閉塞気道；明確な原因のない、繰り返し発症する腹部痙攣；および／または重症な、または腹部痙攣、嘔吐、脱水、下痢、痛み、および／またはショックを導き得る腸の腫れこのＨＡＥに罹患している個人の約３分の１では、発作中にかゆみのない発疹と呼ばれる有縁性紅斑が進行している。
【０１５８】
気道の腫脹は、生命を脅かすことがあり、一部の患者を死亡させる。死亡率は、１５〜３３％と推定される。ＨＡＥによる救急診療は、年間約１５，０００〜３０，０００件ある。
【０１５９】
外傷やストレス、例えば、歯科治療、病気（例えば、風邪やインフルエンザなどのウイルス性疾患）、月経および手術は、血管性浮腫の発作を誘発することがある。ＨＡＥの急性発作を防ぐため、患者は、以前に発作の原因となった特定の刺激を避けようとすることができる。しかし、多くの場合、既知の誘因なしに発作は起こる。通常、ＨＡＥの症状は、まず、小児期に現れ、思春期に悪化する。平均的に、未治療の個人は、１または２週間おきに発作があり、多くの発症は、３〜４日間続く（ｇｈｒ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ／ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ−ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ）。発作の頻度および期間は、同じ家族でも遺伝性血管性浮腫の患者間で大きく変化する。
【０１６０】
Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型で知られる３つの種類のＨＡＥがある。ＨＡＥは、５０，０００人に影響を及ぼし、うち、Ｉ型は全体の約８５％を占め、ＩＩ型は全体の約１５％を占め、ＩＩＩ型は、極めて稀である。ＩＩＩ型は、最も新たに報告された形態であり、以前は女性にのみ起こると考えられていたが、男性患者がいる家族も同定されている。一部の実施形態において、本明細書に記載のアッセイ法は、Ｉ型ＨＡＥまたはＩＩ型ＨＡＥの診断に適用することができる例については以下を参照のこと。
【０１６１】
ＨＡＥは、常染色体優性パターンで遺伝し、患者は、１人の患者である親からの変異が遺伝されることがある。遺伝子における新たな変異も生じることがあり、そのため、ＨＡＥは、その家族に疾病の病歴がない人にも起こり得る。全体の２０〜２５％が、新たな自然突然変異によるものと推定される。
【０１６２】
ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子の変異は、Ｉ型およびＩＩ型の遺伝性血管性浮腫を引き起こす。ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子は、炎症制御に重要なＣ１インヒビタータンパク質を産生するための指示を与える。Ｃ１インヒビターは、炎症を促進する特定のタンパク質を阻害する。Ｉ型遺伝性血管性浮腫を引き起こす変異は、血液中のＣ１インヒビターレベルを減少させる。一方、ＩＩ型を引き起こす変異により、異常な機能として、Ｃ１インヒビターが産生される。機能的Ｃ１インヒビターレベルが適切でないと、過剰な量のブラジキニンが生成される。ブラジキニンは、血管壁を通る体細胞内への流体の洩れを増加させることにより炎症を促進する。体組織における流体の過剰な蓄積は、Ｉ型およびＩＩ型遺伝性血管性浮腫の患者で見られる腫脹の発症を引き起こす。
【０１６３】
Ｆ１２遺伝子における変異は、一部の場合のＩＩＩ型遺伝性血管性浮腫と関連する。Ｆ１２遺伝子は第ＸＩＩ凝固因子を産生する指示を与える。血液凝固（凝固）における重要な役割に加えて、第ＸＩＩ因子は、炎症の重要な刺激因子でもあり、ブラジキニンの産生に関係する。Ｆ１２遺伝子における特定の変異により、活性の増加を伴う、第ＸＩＩ因子の産生が起こる。結果として、ブラジキニンがより生成され、血管壁は、よりもろくなり、腫脹の発症を導く。他の場合のＩＩＩ型遺伝性血管性浮腫の原因は、知られていない。１つ以上の未だ特定されていない遺伝子における変異が、この場合の疾病に関係し得る。
【０１６４】
ＨＡＥは、アレルギーや他の病状に起因する血管性浮腫の他の形態と同様に存在することができるが、原因や治療の点で大きく異なる。遺伝性血管性浮腫が、アレルギーと誤診された場合、最も一般的には、通常ＨＡＥに効果がないヒスタミン薬、ステロイド、および／またはエピネフリンで治療されるが、エピネフリンは、生命を脅かす反応に使用され得る。また、誤診は、腹部腫脹に罹患している患者への不必要な診査手術にもつながり、一部のＨＡＥ患者において、腹痛が、誤って心身症と診断されている。
【０１６５】
ＨＡＥの症状は、例えば、質問紙、例えば、患者、臨床医、または家族により完成された質問紙を用いて、査定することができる。そのような質問紙は、当技術分野において既知であり、例えば、視覚的アナログスケールを含む。例えば、ＭｃＭｉｌｌａｎ，Ｃ．Ｖ．ら、Ｐａｔｉｅｎｔ．２０１２；５（２）：１１３−２６参照。
【０１６６】
血漿カリクレイン活性に関連する他の例示的な疾患または状態としては、非ヒスタミン依存性突発血管性浮腫、関節リウマチ、クローン病、狼瘡、アルツハイマー病、敗血症性ショック、熱傷、脳虚血再灌流傷害、脳浮腫、糖尿病網膜症、糖尿病腎症、黄斑浮腫、血管炎、動脈または静脈血栓症、補助人工心臓またはステントに関連する血栓症、血栓症、血栓塞栓症、および不安定狭心症を伴う冠動脈疾患を伴うヘパリン起因性血小板減少症、浮腫、眼疾患、痛風、炎症性腸疾患、口腔粘膜炎、神経因性疼痛、炎症性疼痛、脊柱管狭窄症変性脊椎疾患、術後腸閉塞、大動脈瘤、変形性関節症、遺伝性血管性浮腫、静脈血栓症、脳卒中、頭部外傷または腫瘍周辺脳浮腫、敗血症、急性中大脳動脈（ＭＣＡ）虚血（脳卒中）、再狭窄（例えば、血管形成術後）、全身性エリテマトーデス腎炎、自己免疫疾患、炎症性疾患、心血管疾患、神経疾患、タンパク質のミスフォールディングに関連する疾患、血管新生に関連する疾患、高血圧性腎症および糖尿病腎症、アレルギー性呼吸器疾患（例えば、アナフィラキシー、喘息、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、持続性鼻炎）、および組織損傷（例えば、熱傷または化学損傷）を含む。
【０１６７】
ＰＫａｌ関連疾病に罹患しているか、またはその疑いがあると同定された対象は、本明細書に記載されるもののような治療を受けることができる。
【０１６８】
Ｂ．治療有効性の評価
本明細書に記載のアッセイ法は、ＰＫａｌ関連疾病（例えば、ＨＡＥ）の治療の有効性の評価にも適用することができる。例えば、複数の生体サンプル（例えば、血液または血漿検体）は、治療前および治療後または治療間のいずれかで治療を行う対象から収集することができる。（ＰＫａｌおよび／またはＦＸＩＩを抑制可能な）機能的Ｃ１−ＩＮＨレベルは、本明細書に記載のアッセイ法のうちいずれかにより測定することができる。機能的Ｃ１−ＩＮＨレベルが、治療後または治療期間にわたって増加する（以前に収集したものと比較して、後に収集された検体における機能的Ｃ１−ＩＮＨレベルが同一または増加する）場合、治療が有効であることを示している。一部の例において、治療は、本明細書に記載のカリクレイン結合薬、本明細書に記載のブラジキニンＢ２受容体拮抗薬、または本明細書に記載のＣ１−ＩＮＨ置換薬等の治療薬を含む。治療薬の例としては、限定するものではないが、ＤＸ−２９３０またはＤＸ８８を含む。
【０１６９】
対象が治療に反応しないと判断された場合、判断された対象に対し、治療薬をより多くの腹用量および／または高頻度で投与する。一部の実施形態において、治療薬の服用量または服用頻度は、治療に反応するかまたはさらなる治療の必要がないと判断された対象において、維持、低下、または中止される。あるいは、異なる治療は、第１の治療に反応しないと判明した対象に対し適用され得る。
【０１７０】
治療
ＨＡＥ等のＰＫａｌ関連疾病に罹患しているまたはその疑いがある対象を治療するための方法も、本明細書に記載される。対象は、基準値（例えば、本明細書に記載するもの）と比較して、（ＰＫａｌまたはＦＸＩＩを阻害可能な）機能的Ｃ１−ＩＮＨレベルが低下することがあり、それは本明細書に記載のアッセイ法のいずれかにより決定することができる。
【０１７１】
ＰＫａｌ関連疾病またはブラジキニン関連疾病の疑いがあるかまたはそれに苦しむ（例えば、この疾患を有する）対象は、任意の適切な治療薬で治療されてもよい。一部の実施形態において、本発明の方法は、アッセイのアウトプットに基づき、対象の治療を選択することを含む。本発明のアッセイは、検体に存在する機能的Ｃ１−ＩＮＨとブラジキニン経路の活性化成分、例えば、他のもののうち、血漿カリクレイン、第ＸＩＩａ因子、および第ＸＩＩａ因子との間の相互作用の検出を可能にする。そのような相互作用のレベルが低いことは、検体における機能的Ｃ１−ＩＮＨのレベルが低いことを示す。一部の実施形態において、例えば、カリクレイン結合薬、例えば、Ｃ１−ＩＮＨ置換治療薬での治療は、対照検体または基準と比較して、機能的ＣＩ−ＩＮＨが、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下の検体の対象のために選択される
【０１７２】
一部の実施形態において、方法は、アッセイのアウトプットに基づき、対象への投与のために、治療薬、例えば本明細書に記載のカリクレイン結合薬  、例えば本明細書に記載のブラジキニンＢ２受容体拮抗薬、例えば本明細書に記載のＣ１−ＩＮＨ置換薬を選択または投与するうち一方または両方を含む。
【０１７３】
一部の実施形態において、血漿カリクレイン結合タンパク質またはポリペプチドは、対象に投与される。一部の実施形態において、カリクレイン結合薬は、カリクレインインヒビター、例えば、ペプチド、小分子インヒビター、カリクレイン抗体、またはその断片である。一部の実施形態において、ブラジキニンＢ２受容体拮抗薬は、対象に投与される。一部の実施形態において、Ｃ１−ＩＮＨ置換治療薬は、対象に投与される。
【０１７４】
治療薬、例えばカリクレインインヒビター、例えば、ブラジキニンＢ２受容体拮抗薬、例えばＣ１−ＩＮＨ置換薬は、血漿カリクレインおよび／またはブラジキニン活性に関する疾患または状態の治療のための併用療法の一部として別の両方と共に投与されてもよい。例えば、カリクレインインヒビター、ブラジキニンＢ２受容体拮抗薬、またはＣ１−ＩＮＨ置換薬のうち１つ以上と別の両方と共にある併用療法は、複数の異なる構成で提供されてもよい。第１薬は、他の両方の投与の前または後に投与されてもよい。一部の状況において、第１剤および別の両方（例えば、治療薬）は、同時または非常に近い時間的間隔（例えば、同一の治療セッション間等、注入の間の時間間隔が短い）で投与される。第１薬および別の両方は、より長い時間的間隔で投与されてもよい。
【０１７５】
血漿カリクレイン結合薬
血漿カリクレイン結合薬（例えば結合タンパク質、例えばポリペプチド、例えばインヒビターポリペプチド、例えば抗体、例えばインヒビター抗体、または他の結合薬、例えば小分子）は、様々な疾患および状態、例えば、血漿カリクレイン活性に関する疾患および状態に有用な治療薬である。例えば、一部の実施形態において、血漿カリクレイン活性に関する疾患または状態は、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）である。一部の実施形態において、血漿カリクレイン結合タンパク質またはポリペプチドは、ｐＫａｌ関連疾病またはブラジキニン関連疾病の疑いがあるか、またはそれに苦しむ患者に投与される。
【０１７６】
多くの有用なカリクレイン（組織カリクレインおよび／または血漿カリクレインのいずれか）のたんぱく質インヒビターは、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含む。本明細書において使用される場合、「Ｋｕｎｉｔｚドメイン」は、少なくとも２つ、好ましくは３つの二硫化物を含有する少なくとも５１個のアミノ酸を有するポリペプチドドメインである。第１および第６番目のシステイン、第２および第４番目、ならびに第３および第５番目のシステインが、ジスルフィド結合を形成し（例えば、５８個のアミノ酸を有するＫｕｎｉｔｚドメインにおいて、以下に提供するＢＰＴＩ相同配列の数で、システインは、アミノ酸  ５、１４、３０、３８、５１、および５５に対応する位置に存在することがあり、二硫化物は、５および５５、１４および３８、３０および５１の位置で形成され得る）、または、２つの二硫化物が存在する場合、それらは、そのシステインの対応するサブセット刊で形成され得るように、ドメインは、折り畳まれる。それぞれのシステイン間の空間は、以下に提供するＢＰＴＩ相同配列の符号で、５〜５５、１４〜３８、および３０〜５１に対応する位置間の間隔の、７、５、４、３、２、１または０個のアミノ酸内であってよい。ＢＰＴＩ配列は、任意の一般的なＫｕｎｉｔｚドメインにおける特定の位置を指す基準として使用することができる。ＢＰＴＩと着目したＫｕｎｉｔｚドメインとの比較は、配置したシステインの数が最大化される最良に適した配置を特定することにより行うことができる。
【０１７７】
ＢＰＴＩのＫｕｎｉｔｚドメインの３Ｄ構造（高解像度）は、既知である。Ｘ線構造のうちの１つは、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに、「６ＰＴＩ」として蓄積される。一部のＢＰＴＩホモローグの  ３Ｄ構造（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔら、（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（７）：５９１−５９８；Ｈｙｎｅｓら、（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９：１００１８−１００２２）は、既知である。少なくとも８１のＫｕｎｉｔｚドメイン配列は、既知である。既知のヒトホモローグは、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）としても知られるＬＡＣＩの３つのＫｕｎｉｔｚドメイン（Ｗｕｎら、（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６３（１３）：６００１−６００４；Ｇｉｒａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ，３３８：５１８−２０；Ｎｏｖｏｔｎｙら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２６４（３１）：１８８３２−１８８３７）、インター−α−トリプシンインヒビター、ＡＰＰ−Ｉの２つのＫｕｎｉｔｚドメイン（Ｋｉｄｏら、（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２６３（３４）：１８１０４−１８１０７）、コラーゲン由来のＫｕｎｉｔｚドメイン、ＴＦＰＩ−２の３つのＫｕｎｉｔｚドメイン（Ｓｐｒｅｃｈｅｒら、（１９９４）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９１：３３５３−３３５７）、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １のＫｕｎｉｔｚドメイン、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ２のＫｕｎｉｔｚドメイン、および米国特許公報第２００４−０１５２６３３号に記載されているＫｕｎｉｔｚドメインを含む。ＬＡＣＩは、３つのＫｕｎｉｔｚドメインを含有する、分子量３９ｋＤａのヒト血清ホスホグリコプロテイン（ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、表１のアミノ酸配列）である。
【０１７８】
【表９】
2020097606.tif 000012
【０１７９】
上記Ｋｕｎｉｔｚドメインは、ＬＡＣＩ−Ｋ１（残基  ５０〜１０７）、ＬＡＣＩ−Ｋ２（残基１２１〜１７８）、およびＬＡＣＩ−Ｋ３（２１３〜２７０）としても知られる。ＬＡＣＩのｃＤＮＡ配列は、Ｗｕｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，２６３（１３）：６００１−６００４）に報告される。Ｇｉｒａｒｄら（Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３３８：５１８−２０）は、３つのＫｕｎｉｔｚドメインそれぞれのＰ１残基が変化したという変異についての研究を報告する。Ｆ．ＶＩＩａが組織因子およびＬＡＣＩ−Ｋ２インヒビターに複合体化された場合のＬＡＣＩ−Ｋ１  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ（Ｆ．ＶＩＩａ）は、第Ｘａ因子を抑制する。
【０１８０】
例示的なＫｕｎｉｔｚドメインを含有するタンパク質は、括弧内にＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ寄託番号を付して、以下のものを含む。
【０１８１】
【表１０】
2020097606.tif 000013
【０１８２】
様々な方法が、配列データベースからＫｕｎｉｔｚドメインを特定するために使用され得る。例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインの既知のアミノ酸配列、コンセンサス配列、またはモチーフ（例えば、ＰｒｏＳｉｔｅモチーフ）は、例えば、ＢＬＡＳＴを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベース（国立バイオテクノロジー情報センター、国立衛生研究所メリーランド州ベセスダ）に対して、ＨＭＭ（隠れマルコフモデル）のＰｆａｍデータベース）（例えば、Ｐｆａｍ  サーチングのデフォルトパラメータを使用して）、ＳＭＡＲＴデータベースに対して、またはＰｒｏＤｏｍデータベースに対して、探索することができる。例えば、Ｐｆａｍ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ９のＰｆａｍ寄託番号ＰＦ０００１４は、多くのＫｕｎｉｔｚドメインおよびＫｕｎｉｔｚドメインを特定するＨＭＭを提供する。Ｐｆａｍデータベースの説明は、Ｓｏｎｈａｍｍｅｒら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２８（３）：４０５−４２０において見ることができ、ＨＭＭの詳細な説明は、例えば、Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：１４６−１５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：４３５５−４３５８；Ｋｒｏｇｈら、（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：１５０１−１５３１；およびＳｔｕｌｔｚら、（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２：３０５−３１４において見ることができる。ＨＭＭのＳＭＡＲＴデータベース（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ，ＥＭＢＬ，ドイツハイデルベルク州）は、Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９９８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：５８５７、およびＳｃｈｕｌｔｚら、（２０００）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８：２３１に記載されている。ＳＭＡＲＴデータベースは、ＨＭＭｅｒ２サーチプログラムの隠れマルコフモデルを用いてプロファイルされることにより特定されるドメインを含有する（Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎら、（１９９８）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）。また、データベースは、注釈を付け監視される。ＰｒｏＤｏｍタンパク質ドメインデータベースは、相同性のあるドメインの自動編集からなる（Ｃｏｒｐｅｔら、（１９９９），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２６３−２６７）。現行の「ＰｒｏＤｏｍは、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ  ３８の再帰的なＰＳＩ−ＢＬＡＳＴサーチ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｇｏｕｚｙら、（１９９９）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：３３３−３４０．）およびＴＲＥＭＢＬタンパク質データベースを用いて、構築される。データベースは、自動的に各ドメインの一致する配列を生じさせる。Ｐｒｏｓｉｔｅは、モチーフとしてＫｕｎｉｔｚドメインを列挙し、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質を特定する。例えば、Ｆａｌｑｕｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒ��ｓ．３０：２３５−２３８（２００２）参照。
【０１８３】
Ｋｕｎｉｔｚドメインは、主として、２つのループ領域（「結合ループ」）にあるアミノ酸を用いて、標的プロテアーゼと作用する。第１のループ領域は、おおよそ、ＢＰＴＩのアミノ酸１３〜２０に対応する残基間にある。第２のループ領域は、おおよそ、ＢＰＴＩのアミノ酸３１−３９に対応する残基間にある。Ｋｕｎｉｔｚドメインの例示的なライブラリは、第１および／または第２ループ領域において、１つ以上のアミノ酸を変化させる。カリクレインで作用するＫｕｎｉｔｚドメインをスクリーニングする場合、または親和性を改善した変種を選択する場合に変化する特定の有用な位置は、ＢＰＴＩ配列に対して、位置  １３、１５、１６、１７、１８、１９、３１、３２、３４、および３９を含む。それら位置の少なくとも一部は、標的プロテアーゼと略接触していると予想される。他の位置、例えば、３Ｄ構造において前述の位置に隣接する位置を変化させることも有用である。
【０１８４】
Ｋｕｎｉｔｚドメインの「フレームワーク領域」は、特に、第１および第２結合ループ領域（すなわち、ほぼ、ＢＰＴＩのアミノ酸１３−２０および３１−３９）．を除いて、Ｋｕｎｉｔｚドメインの一部である残基のものと定義される。逆に、結合ループにない残基は、より広い範囲のアミノ酸置換（例えば、保存的および／または非保存的置換）を許容することができる。
【０１８５】
一実施形態において、それらＫｕｎｉｔｚドメインは、ヒトリポタンパク質関連凝固インヒビター（ＬＡＣＩ）タンパク質のＫｕｎｉｔｚドメイン１を含むループ構造の変種体である。ＬＡＣＩは、パラダイムＫｕｎｉｔｚドメインである、周知の、３つの内部のペプチドループ構造を含有する（Ｇｉｒａｒｄ，Ｔ．ら、１９８９．Ｎａｔｕｒｅ，３３８：５１８−５２０）。本明細書に記載のＬＡＣＩのＫｕｎｉｔｚドメイン１の変種は、スクリーニングされ、単離されており、強い親和性と特異性を持ってカリクレインと結合する（例えば、米国特許第５，７９５，８６５号、および米国特許第  ６，０５７，２８７号）。それら方法は、他のＫｕｎｉｔｚドメインフレームワークにも適用でき、カリクレイン、例えば、血漿カリクレインと作用する他のＫｕｎｉｔｚドメインを得ることができる。カリクレインの機能の有用な調節剤は、通常、カリクレイン結合および抑制アッセイを使用して決定されるように、カリクレインと結合および／またはそれを抑制する。
【０１８６】
一部の態様において、カリクレイン結合薬（例えば結合タンパク質、例えばポリペプチド、例えば、インヒビターポリペプチド、例えば抗体、例えば、インヒビター抗体、または他の結合薬、例えば小分子）は、活性型血漿カリクレインと結合する。一部の実施形態において、カリクレイン結合薬は、血漿カリクレイン、例えば、ヒト血漿カリクレインおよび／またはネズミ科血漿カリクレインと結合しそれを阻害する。
【０１８７】
血漿カリクレイン結合タンパク質は、完全長（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）であってよいか、または抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、またはｓｃＦｖ断片）のみを含んでよい。結合タンパク質は、２つの重鎖免疫グロブリンおよび２つの軽鎖免疫グロブリンを含んでよいか、または単鎖抗体であってよい。血漿カリクレイン結合タンパク質は、ヒト化、ＣＤＲ移植された、キメラの、非免疫化された、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された抗体等の組み換えタンパク質あってよく、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の定常領域を任意に含んでもよい。一実施形態において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、モノクローナル抗体である。
【０１８８】
一部の実施形態において、カリクレイン結合タンパク質は、血漿カリクレイン、例えば、ヒト血漿カリクレインおよび／またはネズミ科カリクレインと結合およびそれを阻害する。例示的な血漿カリクレイン結合タンパク質としては、米国特許公報第２０１２０２０１７５６号に開示され、その全体の内容が本明細書に参照により組み込まれる。一部の実施形態において、カリクレイン結合タンパク質は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書において、ＤＸ−２９２２ともいう）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書において、ＤＸ−２９３０ともいう）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４からなる群から選択される抗体の軽鎖および／または重鎖を有する抗体（例えば、ヒト抗体）である。一部の実施形態において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、Ｍ１６２−Ａ０４、Ｍ１６０−Ｇ１２、Ｍ１４２−Ｈ０８、Ｘ６３−Ｇ０６、Ｘ１０１−Ａ０１（本明細書において、ＤＸ−２９２２ともいう）、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ８１−Ｂ０１、Ｘ６７−Ｄ０３、Ｘ６７−Ｇ０４、Ｘ１１５−Ｂ０７、Ｘ１１５−Ｄ０５、Ｘ１１５−Ｅ０９、Ｘ１１５−Ｈ０６、Ｘ１１５−Ａ０３、Ｘ１１５−Ｄ０１、Ｘ１１５−Ｆ０２、Ｘ１２４−Ｇ０１（本明細書において、ＤＸ−２９３０ともいう）、Ｘ１１５−Ｇ０４、Ｍ２９−Ｄ０９、Ｍ１４５−Ｄ１１、Ｍ０６−Ｄ０９およびＭ３５−Ｇ０４と同一のエピトープと競合またはそれらに結合する。一部の実施形態において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、ＤＸ−２９３０である。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２０１２０２０１７５６号も参照のこと。
【０１８９】
ＤＸ−２９３０の重鎖および軽鎖可変領域配列を以下に示す。
【０１９０】
【表１１】
2020097606.tif 000014
【０１９１】
一部の態様において、カリクレイン結合ポリペプチド（例えば、インヒビターポリペプチド）は、活性型血漿カリクレインと結合する。例示的なポリペプチド血漿カリクレイン薬は、米国特許第５，７９５，８６５号、米国特許第５，９９４，１２５号、米国特許第６，０５７，２８７号、米国特許第６，３３３，４０２号、米国特許第７，６２８，９８３、および米国特許第８，２８３，３２１号、米国特許第７，０６４，１０７号、米国特許第７，２７６，４８０号、米国特許第７，８５１，４４２号、米国特許第８，１２４，５８６号、米国特許第７，８１１，９９１、ならびに米国特許公報第２０１１００８６８０１号に開示され、そのそれぞれの内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態において、カリクレイン結合ポリペプチドは、ＤＸ−８８（天然由来でないインヒビター、「ＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標、エカランチド）としても知られる、配列番号１１）である。一部の実施形態において、カリクレインインヒビターは、配列番号１１のアミノ酸３−６０の約５８個のアミノ酸配列、または配列番号１１の６０個のアミノ酸配列を有するＤＸ−８８ポリペプチドを含むまたはそれからなる。
【０１９２】
【表１２】
2020097606.tif 000015
【０１９３】
一部の実施形態において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、５８の残基アミノ酸配列（配列番号１１の残基３−６０）を有し、残基３４にあるＩｌｅをＳｅｒに、残基３９にあるＧｌｕをＧｌｙにアミノ酸置換した天然由来でないカリクレインインヒビターである、ＥＰＩＫＡＬ−２（配列番号１２）である。ＥＰＩＫＡＬ−２の配列を以下に示す。
【０１９４】
【表１３】
2020097606.tif 000016
【０１９５】
一部の実施形態において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、本明細書に記載の結合タンパク質と、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有し得る。一部の実施形態において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、ＨＣおよび／ＬＣフレームワーク領域（例えば、ＨＣおよび／またはＬＣ  ＦＲ１、２、３、および／または４）において、本明細書に記載の結合タンパク質と、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有し得る。一部の実施形態において、血漿カリクレイン結合タンパク質は、定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および／またはＣＬ１）において、本明細書に記載の結合タンパク質と、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有し得る。
【０１９６】
ブラジキニンＢ２受容体拮抗薬
一部の実施形態において、ブラジキニンＢ２受容体拮抗薬は、対象に投与される。例示的なブラジキニンＢ２受容体拮抗薬としては、天然ブラジキニンのブラジキニンＢ２受容体との結合を阻害する、１０個のアミノ酸を含有するペプチド模倣薬である、Ｉｎｃａｔｉｂａｎｔ（Ｆｉｒａｚｙｒ（登録商標））を含む。
【０１９７】
Ｃ１−ＩＮＨ置換薬
一部の実施形態において、Ｃ１−ＩＮＨ置換薬は、対象に投与される。例示的なＣ１−ＩＮＨ置換薬は、市販されており、例えば、精製されたヒト低温殺菌ナノ濾過Ｃ１−ＩＮＨ濃縮物である、Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）を含む。
【０１９８】
他のＨＡＥ治療薬とともにＣ１インヒビター治療薬は、Ｋａｐｌａｎ，Ａ．Ｐ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１０，１２６（５）：９１８−９２５に記載されている。
【０１９９】
ＨＡＥ発作の急を要する治療は、可能な限り素早く浮腫の進行を停止させるために提供される。静脈内投与される、ドナーの血液からのＣ１インヒビター濃縮物は、１つの緊急治療であるが、この治療は多くの国で利用できない。Ｃ１インヒビター濃縮物が利用できない緊急の状況において、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）は、Ｃ１インヒビターを含有するため、代替物として使用することができる。
【０２００】
ヒト血液由来の精製されたＣ１インヒビターは、欧州において、１９７９年から使用されている。今や、いくつかのＣ１インヒビター治療は、米国で利用可能であり、今や、２つのＣ１インヒビター生成物が、カナダにおいて利用可能である。低温殺菌されたＢｅｒｉｎｅｒｔ  Ｐ（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）は、２００９年に急性発作用として、Ｆ．Ｄ．Ａ．に承認された。ナノ濾過されたＣｉｎｒｙｚｅ（ＶｉｒｏＰｈａｒｍａ）は、２００８年に、予防用として、Ｆ．Ｄ．Ａ．に承認された。Ｒｈｕｃｉｎ（Ｐｈａｒｍｉｎｇ）は、ヒト血液媒介性病原体による感染症の伝播の危険を有していない開発中の組み換えＣ１インヒビターである。
【０２０１】
急性ＨＡＥ発作の治療は、痛みの軽減のための薬品および／またはＩＶ流体含んでよいも含んでよい。
【０２０２】
他の治療方式は、Ｃ１インヒビターの合成を刺激するか、またはＣ１インヒビターの消費を低下させることができる。ダナゾール等のアンドロゲン薬は、Ｃ１インヒビターの産生を刺激することにより、発作の頻度および重症度を低下させることができる。
【０２０３】
ヘリコバクター・ピロリは、腹部の発作を誘発することがある。ヘリコバクター・ピロリを治療する抗生物質は、腹痛発作（ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｔｔａｃｋ）を減少させる。
【０２０４】
新たな治療は、接触カスケードを攻撃する。エカランチド（ＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）、ＤＸ−８８、Ｄｙａｘ）は、血漿カリクレインを抑制し、米国において承認されている。イカチバント（ＦＩＲＡＺＹＲ（登録商標、Ｓｈｉｒｅ）は、ブラジキニンＢ２受容体を抑制し、欧州および米国において承認されている。
【０２０５】
ＨＡＥの診断は、例えば、家族の病歴および／または血液検査に依存し得る。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型ＨＡＥに関連する研究所の発見は、例えば、Ｋａｐｌａｎ，Ａ．Ｐ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１０，１２６（５）：９１８−９２５に記載されている。Ｉ型ＨＡＥにおいて、Ｃ１インヒビターレベルは、Ｃ４レベルのように減少し、一方、Ｃ１ｑレベルは、正常である。ＩＩ型ＨＡＥにおいて、Ｃ１インヒビターレベルは、正常か上昇するが、Ｃ１インヒビターの機能は、異常である。Ｃ４レベルは、減少し、Ｃ１ｑレベルは正常である。ＩＩＩ型において、Ｃ１インヒビター、Ｃ４、およびＣ１ｑレベルは、全て正常であってよい。
【０２０６】
他のＨＡＥ治療薬とともにＣ１インヒビター治療薬は、Ｋａｐｌａｎ，Ａ．Ｐ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１０，１２６（５）：９１８−９２５に記載されている。
【０２０７】
ＨＡＥの例示的な治療は、以下に提供される。ＨＡＥ発作の急を要する治療は、可能な限り素早く浮腫の進行を停止させるために提供される。静脈内投与される、ドナーの血液からのＣ１インヒビター濃縮物は、１つの緊急治療であるが、この治療は多くの国で利用できない。Ｃ１インヒビター濃縮物が利用できない緊急の状況において、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）は、Ｃ１インヒビターを含有するため、代替物として使用することができる。
【０２０８】
ヒト血液由来の精製されたＣ１インヒビターは、欧州において、１９７９年から使用されている。今や、いくつかのＣ１インヒビター治療は、米国で利用可能であり、今や、２つのＣ１インヒビター生成物が、カナダにおいて利用可能である。低温殺菌されたＢｅｒｉｎｅｒｔ  Ｐ（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）は、２００９年に急性発作用として、Ｆ．Ｄ．Ａ．に承認された。ナノ濾過されたＣｉｎｒｙｚｅ（ＶｉｒｏＰｈａｒｍａ）は、２００８年に、予防用として、Ｆ．Ｄ．Ａ．に承認された。Ｒｈｕｃｉｎ（Ｐｈａｒｍｉｎｇ）は、ヒト血液媒介性病原体による感染症の伝播の危険を有していない開発中の組み換えＣ１インヒビターである。
【０２０９】
急性ＨＡＥ発作の治療は、痛みの軽減のための薬品および／またはＩＶ流体含んでよいも含んでよい。
【０２１０】
他の治療方式は、Ｃ１インヒビターの合成を刺激するか、またはＣ１インヒビターの消費を低下させることができる。ダナゾール等のアンドロゲン薬は、Ｃ１インヒビターの産生を刺激することにより、発作の頻度および重症度を低下させることができる。
【０２１１】
ヘリコバクター・ピロリは、腹部の発作を誘発することがある。ヘリコバクター・ピロリを治療する抗生物質は、腹痛発作（ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｔｔａｃｋ）を減少させる。
【０２１２】
新たな治療は、接触カスケードを攻撃する。エカランチド（ＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）、ＤＸ−８８、Ｄｙａｘ）は、血漿カリクレインを抑制し、米国において承認されている。イカチバント（ＦＩＲＡＺＹＲ（登録商標、Ｓｈｉｒｅ）は、ブラジキニンＢ２受容体を抑制し、欧州および米国において承認されている。
【０２１３】
ＨＡＥの診断は、例えば、家族の病歴および／または血液検査に依存し得る。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型ＨＡＥに関連する研究所の発見は、例えば、Ｋａｐｌａｎ，Ａ．Ｐ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１０，１２６（５）：９１８−９２５に記載されている。Ｉ型ＨＡＥにおいて、Ｃ１インヒビターレベルは、Ｃ４レベルのように減少し、一方、Ｃ１ｑレベルは、正常である。ＩＩ型ＨＡＥにおいて、Ｃ１インヒビターレベルは、正常か上昇するが、Ｃ１インヒビターの機能は、異常である。Ｃ４レベルは、減少し、Ｃ１ｑレベルは正常である。ＩＩＩ型において、Ｃ１インヒビター、Ｃ４、およびＣ１ｑレベルは、全て正常であってよい。
【０２１４】
以下の実施例は、さらなる説明を提供するものであり、限定ではない。
【０２１５】
実施例
実施例１．血漿における機能的Ｃｌ−ＩＮＨの定量のための活性化第ＸＩＩ因子  および／または血漿カリクレインを用いた複合体ＥＬＩＳＡ
Ｃ１インヒビター、Ｃ１−ＩＮＨの機能異常が、ＩＩ型遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）に存在し、それがインヒビターを無効にすることが実証されている。Ｉ型ＨＡＥは、総Ｃ１−ＩＮＨタンパク質レベルが低い。ＩＩＩ型ＨＡＥは、正常なレベルのＣ１−ＩＮＨに関連している（「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ：Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｃ１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．」  Ｋａｐｌａｎ，Ａ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２６（５）：９１８−２５  ２０１０）。Ｃ１−ＩＮＨは、第ＸＩＩａ因子、第ＸＩＩ因子断片（ＸＩＩｆ）、カリクレイン、およびプラスミンを抑制する。Ｃ１−ＩＮＨの機能がない場合、重篤な血管性浮腫を引き起こす、ブラジキニン形成カスケードの著しい活性化が起こる。Ｉ型ＨＡＥは、一般的に、総Ｃ１−ＩＮＨレベルを減少させることを特徴とする。ＩＩ型ＨＡＥは、一般的に、正常なＣ１−ＩＮＨレベルを増加させることを特徴とするが、Ｃ１−ＩＮＨレベルの機能は以上である。ＩＩＩ型ＨＡＥを起こす機構は、十分には分かっていないが、ＩＩＩ型ＨＡＥは、主に、女性患者について記載されている。
【０２１６】
遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）は、補体の活性化第１成分の、アッセイ（Ｃ１インヒビターの機能的アッセイ）、例えば、化学発色法またはＥＬＩＳＡ法を使用して、診断することができる。一部の場合、Ｃ１ＩＮＨのＣ１ｓ捕捉に基づくアッセイが、使用される。現在の化学発色ＨＡＥ診断アッセイは、一般的に、好ましいと考えられているが、両方法には限界がある。複合体ＥＬＩＳＡの陰性的中率が６２％しかない一方、化学発色法は、時折、偽陽性を示す可能性が高い。さらに、現在の化学発色法の理論限界は、補体の活性化第１成分におけるＣ１−ＩＮのインヒビター活性は、ＨＡＥ疾患の病因とほとんど関係がない点にある。
【０２１７】
本発明者らは、血管性浮腫の発生時に、Ｃ１インヒビターの病原的役割に直接関係する、ブラジキニン形成経路におけるインヒビターとしての、Ｃ１インヒビターの機能を検出する方法論を開発している。本発明のアッセイは、活性化第ＸＩＩ因子および血漿カリクレインを抑制し、ブラジキニンの過産生を生じ、続いて血管性浮腫を生じさせる、Ｃ１−ＩＮＨの能力または能力の欠如の分析を可能にする。本実施例は、活性化第ＸＩＩ因子、血漿カリクレイン、またはその両方のいずれかの抑制を試験するための、複合体ＥＬＩＳＡによる機能的Ｃ１−ＩＮＨのアッセイについて記載する。これらアッセイは、Ｉ型およびＩＩ型ＨＡＥへの優れた感度を有する。
【０２１８】
本発明者らの手法は、活性酵素をビオチン化し、それをアビジンコーティングプレートに結合させ、血漿（対照用の正常、未知のものとしての推定ＨＡＥ血漿）でインキュベートし、酵素−Ｃ１−ＩＮＨ複合体を測定することである。本発明者らは、結合Ｃ１−ＩＮＨを検出するため、アルカリホスファターゼに標識を付したＣ１−ＩＮＨへの抗体を採用した。Ｃ１−ＩＮＨの定量のため、血漿の代わりに、バッファにおいて、既知の量のＣ１−ＩＮＨを代わりに用いることにより、標準曲線を作成した。重要なことに、他の種類の血管性浮腫（例えば、ＩＩＩ型ＨＡＥ）が、活性化第ＸＩＩ因子またはカリクレインではなく、Ｃ１ｓを抑制する変異Ｃ１−ＩＮＨを有する場合、診断に、現在利用可能なアッセイのいずれかを採用できなかったために、本発明のアッセイは、異常性を検出することができるであろう。例え、Ｃ１−ＩＮＨが異常であったとしても、約５％の患者において、Ｃ４レベルは正常である。ＩＩ型において、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質レベルが正常であるため、本発明の機能的アッセイは、診断のために重要である。本発明の方法は、特に、このような状況に有用であるであろう。図１および図２は、診断の容易さを検証するため、２つの正常対照を用いて、Ｉ型およびＩＩ型ＨＡＥを比較する。機能的Ｃ１−ＩＮＨは、ブラジキニン形成酵素に基づき、ＩＩＩ型ＨＡＥに罹患している患者において測定されることはなく、本発明者らは、それが正常（〜４０％）であることを検証する。
【０２１９】
Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢプレートで、４℃で一晩、コーティングバッファ（１００μｌ）中で、５μｇ／ｍｌのアビジンを用いてコーティングした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（２００μｌ／回）を用いて３回洗浄した。続いて、ＰＢＳ中の２００μｌ  １％ＢＳＡを添加し、未使用部位を保護した。プレートを、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（２００μｌ／回）を用いて３回洗浄した。プレートに、２５μｌ標準物質または検体、２５μｌビオチン化第ＸＩＩ１因子および／またはビオチン化カリクレイン（１μｇ／ｍｌ）、および５０μｌ結合バッファを添加した。プレートを混合し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（２００μｌ／回）を用いて３回洗浄した。Ｃ１−ＩＮＨとのポリクローナル抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（２００μｌ／回）を用いて３回洗浄した。アルカリホスファターゼ抱合二次抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（２００μｌ／回）を用いて３回洗浄した。色素発現用基質を添加し、室温で１０分間インキュベートした。４５０ｎｍにおける光学濃度を読み、標準曲線を用いて計算を行った。
【０２２０】
図１および図２に示すように、複合体ＥＬＩＳＡアッセイは、正常対照と比較して、機能的Ｃ１−ＩＮＨの低いＩ型およびＩＩ型ＨＡＥ患者を正確に特定した。アッセイの開発における検討事項の１つとしては、ブラジキニン形成に必須な酵素に基づき、機能的Ｃ１−ＩＮＨを定量するアッセイを採用することに利点があることである。アッセイは、活性型第ＸＩＩ因子（第ＸＩＩａ因子もしくは第ＸＩＩｆ因子）、または血漿カリクレインのうち１つを採用してもよい。Ｃ１−ＩＮＨの他、第ＸＩＩａ因子は、血漿における他の優れたインヒビターを有していない。Ｃ１−ＩＮＨによる抑制に加えて、血漿カリクレインは、α２マイクログロブリンによっても抑制される。とは言え、Ｃ１−ＩＮＨにより抑制されるカリクレインの分画（〜６０％）のみが検出されるため、Ｃ１−ＩＮＨと、第ＸＩＩａ因子またはカリクレインのいずれかとの間の機能的相互作用を検出する複合体ＥＬＩＳＡアッセイは、十分に機能した。
【０２２１】
実施例２．活性化第ＸＩＩ因子および／または血漿カリクレインの抑制に基づく、遺伝性血管性浮腫の診断アッセイ
方法
患者および検体収集：ＨＡＥの診断は、（市販のアッセイを用いて）Ｃ１−ＩＮＨタンパク質および／または機能的レベルの低さといった臨床症状により確認される。４２人のＨＡＥ患者および２３の健康な対照由来のクエン酸血漿を、新たに収集した血液の、４℃、２０００ｒｐｍで、１０分間の遠心分離により分離した。全てのサンブルをすぐに分取し、−８０℃で保存した。検体を全ての参加拠点（オーデンセ、デンマーク、ブダペスト、ハンガリー）で同様に取り扱い、ドライアイス上で一晩輸送した。手順は、倫理委員会（Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）およびデータ保護局（Ｄａｔａ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ）によって、両参加拠点において、承認された。
【０２２２】
精製されたヒト第ＸＩＩａ因子およびカリクレインをＥｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（インディアナ州サウスベンド）から得、ビオリン標識試薬をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（イリノイ州ロックフォード）から得、全ての試薬をＳｉｇｍａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ（ミズーリ州セントルイス）から得た。
【０２２３】
タンパク質のビオチン標識：タンパク質を製造業者の推奨に従い、ビオチン化した。簡潔に記載すると、１ｍｇのタンパク質（カリクレインまたは第ＸＩＩ因子）を０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させた。約２７μｌの新たに調製した１０ｍＭ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンをタンパク質溶液に添加し、氷上で２時間インキュベートした。過剰な未反応および加水分解ビオチンを、スピン脱塩カラムを用いて除去した。タンパク質のラベリングをＥＬＩＳＡで確認し、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（８）で決定した。
【０２２４】
血漿中のＣ１−ＩＮＨの定量分析のためのＥＬＩＳＡ：Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢプレートを５μｇ／ｍｌ  Ｃ１−ＩＮＨとのポリクローナル抗体でコーティングした。ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで保護した後、検体および標準物質を添加し、室温で１時間インキュベートした。結合Ｃ１−ＩＮＨをＣ１−ＩＮＨとのアルカリホスファターゼ抱合モノクローナル抗体で探索し、続いて、５−ブロモ−４−クロロインドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を用いて色素を発現させた。
【０２２５】
カリクレインおよび第ＸＩＩ因子の抑制に基づく、血漿における機能的Ｃ１−ＩＮＨの定量：Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢプレートをコーティングバッファ（１００μｌ）中で、５μｇ／ｍｌのアビジンを用いて、４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（２００μｌ／回）を用いて３回洗浄した。続いて、ＰＢＳ中、２００μｌの１％ＢＳＡを添加し、未使用の部位を保護した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（２００μｌ／回）を用いて３回洗浄した。検体または標準物質をビオチン化タンパク質（２５μｌ標準物質または検体、２５μｌビオチン化第ＸＩＩ因子またはビオチン化カリクレイン（１μｇ／ｍｌ）、および５０μｌ結合バッファ）と共に、プレートに添加し、混合し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（２００μｌ／回）を用いて、再度３回洗浄し、Ｃ１−ＩＮＨとのポリクローナル抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、アルカリホスファターゼ抱合二次抗体を添加し、室温で１時間インキュベートし、続いて、ホスファターゼ基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴを用いて色素を発現させた。４５０ｎｍにおける光学濃度を読み、標準曲線を用いて、計算を行った。方法は、図１に、過程毎にまとめられる。
【０２２６】
補体の抑制に基づく機能的ＥＬＩＳＡ：機能的Ｃ１−ＩＮＨレベルを測定するため、ＥＬＩＳＡキットを．Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。このアッセイは、活性化Ｃ１ｓを抑制する血漿Ｃ１−ＩＮＨの能力に基づく（複合体ＥＬＩＳＡ）。製造業者の手順に従って、アッセイを行った。
【０２２７】
結果
Ｃ１ｓ抑制によりＨＡＥの診断：正常対照の２３個の検体およびＩ型またはＩＩ型ＨＡＥのいずれかに罹患している患者の４２個の検体を現在市販されているアッセイ（複合体ＥＬＩＳＡ）を用いて検査した。アッセイの判断によると、「正常」は、６８〜１００％Ｃ１−ＩＮＨ、一方、「異常」は、６７％以下であった。使用説明書は、それらが疑わしいと思われるため、４１％と６７％との間の検体を繰り返すべきと支持したが、繰り返した値が、それら２つの図内にある場合には、異常であると報告した。標準物質を、一定の割合の正常として供給した、すなわち標準物質は、０％、２３％、４４％、６６％および８８％であり、未知のものは、曲線から外れて読み取られた。正常対照検体は、８０％〜１００％の間を変化する一方、ＨＡＥ検体は、０〜８１％の間を変化した。ＨＡＥ検体の平均標準偏差は、３８±１７％であった。本アッセイを使用する２つのＨＡＥ患者における診断は、失敗した。
【０２２８】
カリクレインまたは第ＸＩＩａ因子の抑制によりＨＡＥの診断：ｍｇ／ｍｌの複合体形成として表される血漿カリクレインの抑制または第ＸＩＩａ因子の抑制を採用した結果を図４Ｂおよび４Ｃにそれぞれ示し、図中、正常対照は、Ｉ型およびＩＩ型ＨＡＥに罹患している患者から得られた検体と比較された。μｇ／ｍでの第ＸＩＩａ因子−Ｃ１−ＩＮＨの平均標準偏差は、正常では、６３．１＋１２．４、ならびに、Ｉ型およびＩＩ型ＨＡＥでは、６．１＋５．４であった。Ｉ型およびＩＩ型ＨＡＥと正常対照とを比較する「Ｐ」値は、＜０．０００１であった。カリクレイン−Ｃ１−ＩＮＨ複合体のアッセイにより得られた結果は、ＨＡＥおよび対照群との間の重複がなく、著しく類似した。
【０２２９】
本明細書における結果は、カリクレインまたは第ＸＩＩａ因子の抑制に基づくアッセイが、検査したＩ型およびＩＩ型ＨＡＥ患者を正確に判定したことを示し、正常対照と比べて、機能的Ｃ１−ＩＮＨレベルが低いことを示した（図３および４）。従って、本明細書に記載されるアッセイ法は、機能的Ｃ１−ＩＮＨレベルを決定し、ＰＫａｌおよび／またはＦＸＩＩを抑制する機能があるＣ１−ＩＮＨレベルに基づきＰＫａｌ関連疾患（例えば、ＨＡＥ）に罹患している患者を特定する上で、従来の方法と比較して、非常に高感度である。
【０２３０】
本明細書で使用される手法は、活性酵素をビオチン化し、それをアビジンコーティングプレートに結合させ、血漿（対照用の正常、未知のものとしての推定ＨＡＥ血漿）でインキュベートし、酵素−Ｃ１−ＩＮＨ複合体を測定することである。本発明者らは、結合Ｃ１−ＩＮＨの検出のため、アルカリホスファターゼに標識を付したＣ１−ＩＮＨへの抗体を使用した。Ｃ１−ＩＮＨの定量のため、血漿の代わりに、バッファにおいて、既知の量のＣ１−ＩＮＨを代わりに用いることにより、標準曲線を作成した。さらに、他の種類の血管性浮腫（例えば、ＩＩＩ型ＨＡＥ）が、活性化第ＸＩＩ因子またはカリクレインではなく、Ｃ１ｓを抑制する変異Ｃ１−ＩＮＨを有する場合、診断に、現在利用可能なアッセイのいずれかを採用できなかったために、この異常性は、本方法を用いて検出することができるであろう。両アッセイが、Ｃ１ｓの抑制よりも機能障害性のＣ１−ＩＮＨの検出により高感度であるようであるため、本明細書に記載のアッセイは、Ｉ型およびＩＩ型ＨＡＥの診断のための現在市販の方法に取って代わる可能性があり、他の方法論を採用して、曖昧な結果を得た場合に患者を評価するためにも使用することができるであろう。約５％の患者は、Ｃ１−ＩＮＨが異常でも無症候性時にはＣ４レベルが正常であり、ＩＩ型ＨＡＥ患者では、タンパク質レベルが、通常は正常であるかまたは高いため、診断は機能的アッセイに依存するであろう。本明細書に記載のアッセイは、特に、このような状況で有用であろう。要するに、診断が、血管性浮腫に直接関係する機能的評価によって作られるため、Ｉ型およびＩＩ型ＨＡＥの診断は、ブラジキニン形成カスケードの酵素を抑制することによって確認することができる。
【０２３１】
【表１４】
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【０２３２】
他の実施形態
本明細書に開示される特徴は全て、任意に組に組み合わされてもよい。本明細書に開示される特徴は、それぞれ、同一、均等、または同様の目的に供する別の特徴に置換されてもよい。従って、明示的に別段の定めがある場合を除き、開示した特徴は、単に、それぞれ、等価または同様の特徴の総称的な系列のうちの一例である。
【０２３３】
前述の記載から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更例および変形例を想到し、それを様々な用法および状態に適合させることができる。従って、他の実施形態も、特許請求の範囲に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【配列表】
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