(57)【要約】      （修正有）【課題】筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）又は前頭側頭認知症（ＦＴＤ）を有するか又は有する可能性が高い対象を処置又は予防するための方法及び組成物の提供。【解決手段】ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的な単離抗体を含む、ＡＬＳを処置又は予防するための医薬であって、前記抗体は、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルの増加を減少又は予防する、医薬。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から得られる血液試料中の、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを決定することを含み、対照レベルと比較して上昇した１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルが、対象がＡＬＳを有するかまたはＡＬＳを発症する可能性が高いことを示す、
対象を、ＡＬＳを有するかまたはＡＬＳを発症する可能性が高いものとして同定するための方法。
【請求項２】
１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルが、アッセイを実施することにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アッセイが、免疫ベースアッセイを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
免疫ベースアッセイが、表１、２、または３に記載の配列を含む抗原に特異的な単離抗体を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
免疫ベースアッセイが、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のＣ末端に特異的な単離抗体を含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
ジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルが対照レベルと比較して上昇した場合に、対象を、ＡＬＳを有するかまたはＡＬＳを発症する可能性が高いものとして同定すること、
をさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＡＬＳを有するかまたはＡＬＳを発症する可能性が高い対象を処置すること、
をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
処置することが、対象に、リルゾール、バクロフェン、ジアゼパム、フェニトイン、トリヘキシフェニジルまたはアミトリプチリンのうちの１つまたは複数を有効量投与することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
処置することが、プラズマフェレーシスまたは骨髄移植から選択される処置を実施することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質が、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質が、２つ以上のジアミノ酸リピート含有タンパク質である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
対象の血中のポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させることまたはその増加を予防すること
を含む、ＡＬＳを有する対象を処置するための方法。
【請求項１３】
１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させることまたはその増加を予防することが、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質を対象の血液から除去することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
対象の血液からの１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質が、プラズマフェレーシスまたは骨髄移植から選択される処置を使用して除去される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
骨髄移植が、同種骨髄移植である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される１つまたは複数のジアミノ酸リピートタンパク質に特異的な単離抗体。
【請求項１７】
ジアミノ酸リピートタンパク質が、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される、請求項１６に記載の単離抗体。
【請求項１８】
単離抗体が、表１、２、または３に記載の配列の配列または断片を含む抗原に特異的である、請求項１６または１７に記載の単離抗体。
【請求項１９】
対象から得られる試料中の、５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡおよび／または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルを決定することを含み、対照レベルと比較して上昇した５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡおよび／または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルは、対象がＡＬＳを有するかまたはＡＬＳを発症する可能性が高いことを示す、
対象を、ＡＬＳを有するかまたはＡＬＳを発症する可能性が高いものとして同定するための方法。
【請求項２０】
５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡおよび／または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルが対照レベルと比較して上昇した場合に、対象を、ＡＬＳを有するかまたはＡＬＳを発症する可能性が高いものとして同定すること、
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＡＬＳを有するかまたはＡＬＳを発症する可能性が高い対象を処置すること、
をさらに含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
処置することが、対象に、リルゾール、バクロフェン、ジアゼパム、フェニトイン、トリヘキシフェニジルまたはアミトリプチリンのうちの１つまたは複数を有効量投与することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
処置することが、プラズマフェレーシスまたは骨髄移植から選択される処置を実施することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡおよび／または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルが、５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルである、
請求項１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国仮出願第６１／７８６，２５８号、２０１３年３月１４日出願の出願日の利益および米国仮出願第６１／８８３，２１９号、２０１３年９月２７日出願の出願日の利益を主張する。これらの参照された出願の両方の内容全体が、本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
連邦支援研究または開発
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により授与されたＰＯ１ＮＳ０５８９０１およびＲＯ１ＮＳ０４０３８９の下での政府援助によりなされた。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子のイントロン内のＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチド配列の伸長は、ヒトにおける筋萎縮性側索硬化症および前頭側頭認知症の両方と関連付けられる。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、急速に進行する衰弱、筋萎縮、筋痙直、発話困難（構音障害）、嚥下困難（嚥下障害）、および呼吸困難（呼吸窮迫）を特徴とする様々な病因を有する消耗性疾患である。症状の順序および速度は人によって異なるとはいえ、最終的にほとんどの対象が、歩行すること、自力でベッドから出ること、または自身の手および腕を使用することができなくなる。ＡＬＳを有する対象のほとんどが、通常は症状の発症の３年から５年以内に最終的に呼吸不全により死亡する。リルゾール（リルテック）は、ＡＬＳの唯一現在利用可能な処置であり、進行を遅らせ、生存率を限定的な範囲で増加させるのみである。前頭側頭認知症（ＦＴＤ）もまた破壊的な疾患群であり、脳の前頭葉および側頭葉の萎縮または縮化により生じる。この縮化または萎縮は、深刻な行動変化をもたらす。現在のところ、ＦＴＤの処置法は存在せず、ＦＴＤの症状を管理する限定的な薬物が存在するだけである。ＡＬＳおよび／またはＦＴＤを診断および処置するための新規方法は、ＡＬＳおよびＦＴＤ対象に大きな利益をもたらすと考えられる。
【発明の概要】
【０００４】
ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子のイントロン内のＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチド配列の伸長は、ヒトにおける筋萎縮性側索硬化症および前頭側頭認知症の両方と関連付けられる。本明細書に記載のとおり、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のイントロン内の伸長ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピート配列は、センスおよびアンチセンスの両方の方向にヘキサヌクレオチドリピートを含有するＲＮＡ転写物がもたらされるように転写されることが見出された。これらのセンスおよびアンチセンス転写物は、翻訳されてジアミノ酸リピート含有タンパク質をもたらすことが見出された。センス転写物（５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピートを含有する）は、リピート関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳を通じて翻訳され、結果としてポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、およびポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）タンパク質がもたらされることが見出された。アンチセンス転写物（５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピートを含有する）は、リピート関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳を通じて翻訳され、結果としてポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質がもたらされることが見出された。加えて、アンチセンス転写物は、ＡＴＧ開始翻訳を通じて翻訳され、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）およびＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質をもたらすことが見出された。
【０００５】
これらのジアミノ酸リピート含有タンパク質は、ＡＬＳ対象血液試料中に存在することが見出された。したがって、本開示の態様は、対象から得られる試料（たとえば血液）中のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルの検出方法に関し、この方法は、対象の試料中のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルを測定することを含む。いくつかの態様において、ジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルの検出は、ＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高い対象を同定（または診断）するかまたはその同定を補助（または診断を補助）してもよい。代わりにまたは加えて、たとえば対象の血液試料中のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルの検出は、対象をＡＬＳまたはＦＴＤの危険因子、たとえば対象のジアミノ酸リピート含有タンパク質または脳脊髄液中のタンパク質レベルの上昇を有するものとして同定（または診断）するかまたはその同定を補助（または診断を補助）してもよい。本開示の態様はまた、対象の血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルを減少または安定化させることによる、ＡＬＳまたはＦＴＤを有する対象の処置に関する。
【０００６】
加えて、アンチセンス転写物（５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピートを含有する）の発現は、対照と比較して、伸長ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピートを有する対象において大きく上昇することが見出された。Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のイントロン内の伸長ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピート配列を有する患者の脳および血液細胞における蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して、センスおよびアンチセンス転写物の凝集もまた検出可能であった。したがって、本開示の他の態様は、ヘキサヌクレオチドリピート含有転写物の検出方法に関し、この方法は、ヘキサヌクレオチドリピート含有転写物レベルを測定することおよび／またはヘキサヌクレオチドリピート含有転写物凝集の存在もしくは非存在を測定することを含む。いくつかの態様において、ヘキサヌクレオチドリピート含有転写物の検出は、対象をＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高いものとして同定（または診断）するかまたはその同定を補助（または診断を補助）してもよい。代わりにまたは加えて、たとえば対象の血液試料中のヘキサヌクレオチドリピート含有転写物の検出は、対象をＡＬＳまたはＦＴＤの危険因子、たとえば対象のジアミノ酸リピート含有タンパク質または脳脊髄液中のタンパク質レベルの上昇を有するものとして同定（または診断）するかまたはその同定を補助（または診断を補助）してもよい。
【０００７】
いくつかの態様において、本開示は、対象をＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高いものとして同定するための方法に関し、この方法は、対象から得られる血液試料中の、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを決定することを含み、対照レベルと比較して上昇した１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルは、対象がＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルは、アッセイを実施することにより決定される。いくつかの実施形態において、アッセイは、免疫ベースアッセイを含む。いくつかの実施形態において、免疫ベースアッセイは、表１、２、または３に記載の配列を含む抗原に特異的な単離抗体を含む。いくつかの実施形態において、免疫ベースアッセイは、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のＣ末端に特異的な単離抗体を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、この方法は、ジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルが対照レベルと比較して上昇した場合に、対象をＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高いものとして同定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高い対象を処置することをさらに含む。いくつかの実施形態において、処置することは、対象に、リルゾール、バクロフェン、ジアゼパム、フェニトイン、トリヘキシフェニジルまたはアミトリプチリンのうちの１つまたは複数を有効量投与することを含む。いくつかの実施形態において、処置することは、プラズマフェレーシスまたは骨髄移植から選択される処置を実施することを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質は、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質は、２つ以上のジアミノ酸リピート含有タンパク質である。
【００１０】
本開示の他の態様は、ＡＬＳまたはＦＴＤを有する対象を処置するための方法に関し、この方法は、対象の血中のポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させることまたはその増加を予防することを含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させることまたはその増加を予防することは、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質を対象の血液から除去することを含む。いくつかの実施形態において、対象の血液からの１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質は、プラズマフェレーシスまたは骨髄移植から選択される処置を使用して除去される。いくつかの実施形態において、骨髄移植は、同種骨髄移植である。
【００１１】
また別の一態様において、本開示は、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される１つまたは複数のジアミノ酸リピートタンパク質に特異的な単離抗体に関する。いくつかの実施形態において、ジアミノ酸リピートタンパク質は、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される。いくつかの実施形態において、単離抗体は、表１、２、または３に記載の配列の配列または断片を含む抗原に特異的である。
【００１２】
本開示の他の態様は、対象をＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高いものとして同定するための方法に関し、この方法は、対象から得られる血液試料中の、５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡおよび／または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルを決定することを含み、対照レベルと比較して上昇した５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡおよび／または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルは、対象がＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、このレベルは、アッセイを実施することにより決定される。いくつかの実施形態において、アッセイは、核酸ベースアッセイ、たとえばインサイチューハイブリダイゼーション（たとえば、ＦＩＳＨ）またはＲＴ−ＰＣＲ（たとえば、定量ＲＴ−ＰＣＲまたは鎖特異的定量ＲＴ−ＰＣＲ）を含む。いくつかの実施形態において、この方法は、５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡおよび／または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルが対照レベルと比較して上昇した場合に、対象をＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高いものとして同定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高い対象を処置することをさらに含む。いくつかの実施形態において、処置することは、対象に、リルゾール、バクロフェン、ジアゼパム、フェニトイン、トリヘキシフェニジルまたはアミトリプチリンのうちの１つまたは複数を有効量投与することを含む。いくつかの実施形態において、処置することは、プラズマフェレーシスまたは骨髄移植から選択される処置を実施することを含む。いくつかの実施形態において、５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡおよび／または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルは、５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルである。
【００１３】
本開示のまた他の態様は、対象をＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高いものとして同定するための方法に関し、この方法は、対象から得られる試料中の、５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有ＲＮＡおよび／または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有ＲＮＡを含有する凝集の存在または非存在を決定することを含み、５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有ＲＮＡおよび／または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有ＲＮＡの凝集の存在は、対象がＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、凝集の存在もしくは非存在または上昇したＣ９ＯＲＦ７２センスもしくはアンチセンスＲＮＡレベルは、アッセイを実施することにより決定される。いくつかの実施形態において、アッセイは、核酸ベースアッセイ、たとえば鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲまたはインサイチューハイブリダイゼーション（たとえば、ＦＩＳＨ）を含む。
【００１４】
本開示のまた他の態様は、トランスジェニックマウスに関する。いくつかの実施形態において、トランスジェニックマウスは、ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子および適宜ヒトフランキング配列を含む。いくつかの実施形態において、トランスジェニックマウスは、配列番号６３を含む。
【００１５】
これらおよび他の態様は、本明細書により詳細に記載され、非限定的な図面および実施例により例示される。
【００１６】
図面についてまず記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、転写物がＣ９ＯＲＦ７２遺伝子上でセンスおよびアンチセンス方向にもたらされること、ならびにリピート関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳タンパク質が、３つのすべてのリーディングフレームにおいてセンスおよびアンチセンスＣ９ＯＲＦ７２転写物の両方から翻訳されることを示す図である。この図はまた、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）およびＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質が、アンチセンス転写物上のＡＴＧ開始翻訳を通じて翻訳されることを示す。ＣＴ＝ｃ末端ドメインを含有すると予測されるおよび／または示される。＊＝タンパク質の末端（終止コドンによる）。Ｍ＝メチオニン。
【図２】図２Ａは、細胞内でＲＡＮ翻訳タンパク質を発現させるための発現ベクターの図である。ＣＭＶ＝サイトメガロウイルスプロモーター。６×Ｓｔｏｐ＝６つの終止コドン、各フレームに２つ。（ＧＧＧＧＣＣ）ｅｘｐ＝４、３０、６０、または１２０リピートで伸長するＧＧＧＧＣＣリピート配列。（ＧＲ）ＨＡ−（ＧＰ）Ｆｌａｇ−（ＧＡ）Ｍｙｃ＝ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、およびポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）リピートタンパク質にそれぞれ対応するＨＡ、ｆｌａｇまたはｍｙｃタグ。ＳＶ４０  ｐｏｌｙ（ａ）＝転写ターミネーターおよびポリＡシグナル。図２Ｂは、ＧＲおよびＧＰ  ＲＡＮ翻訳タンパク質が、３０、６０または１２０ＧＧＧＧＣＣリピート配列をトランスフェクトした細胞内で発現することを示すウエスタンブロットの写真である。
【図３】図３は、３０、６０または１２０ＧＧＧＧＣＣリピート配列をトランスフェクトした細胞内でＧＰ、ＧＲ、またはＧＡ  ＲＡＮタンパク質を発現する細胞の免疫蛍光染色の写真である。
【図４】図４は、ポリ（ＧＲ）およびＧＲ−ｃ末端抗原の図ならびにポリ（ＧＲ）および（ＧＲ）−ｃ末端抗体がポリ（ＧＲ）ＲＡＮタンパク質を検出することを示す免疫蛍光染色の一連の写真である。
【図５】図５は、ポリ（ＧＲ）、ポリ（ＧＰ）、およびポリ（ＧＡ）ジアミノ酸リピート含有タンパク質をＣ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳ患者が発現することを示す、Ｃ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳ患者または対照患者からの組織の一連の写真である。
【図６】図６は、ポリ（ＰＡ）およびポリ（ＰＲ）ジアミノ酸リピート含有タンパク質をＣ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳ患者が発現することを示す、Ｃ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳ患者または対照患者からの組織の一連の写真である。
【図７】図７Ａは、ＧＰリピートモチーフ（ＧＰ）または同じＧＰ−ＲＡＮタンパク質の特異Ｃ末端領域（ＧＰ−Ｃ）を認識するために生成された抗体が、２０％の患者細胞内で共局在化することを示す、免疫蛍光染色の一連の写真である。ＧＰ−ＣおよびＧＰについて染色された細胞は、ＧＰ−ＲＡＮタンパク質をセンス方向に発現し、ＧＰ染色のみを示す細胞は、アンチセンス鎖からＲＡＮ−ＧＰまたはＭｅｔ．．．ＧＰを発現する。図７Ｂは、患者細胞内のＧＰおよびＧＰ＋ＧＰ−Ｃのパーセンテージを示すグラフである。
【図８】図８は、ジアミノ酸リピート含有タンパク質がＡＬＳを有する対象の血液（ＰＢＬ）および脳（ＦＣＸ、前頭皮質）に見出されるが、対照には見出されないことを示す、ドットブロットの写真である。
【図９】図９は、ＧＰリピートタンパク質がＡＬＳを有する対象の脳（ＦＣＸ）に存在するが、対照には存在しないこと、ならびに、ＰＡリピートタンパク質がＡＬＳを有する対象の血漿および血清に存在するが、対照には存在しないことを示す、ウエスタンブロットの写真である。
【図１０】図１０は、６Ｘ  ｓｔｏｐｓ、ＣＡＧリピート領域、各ＣＡＧリピートフレームを検出するためのタグ、およびターミネーター配列を含有するＲＡＮ翻訳マウスモデルコンストラクトの概略図である。
【図１１】図１１は、ポリＧｌｎタンパク質が、図１０のコンストラクトを含有するＲＡＮ翻訳（ＲＡＮＴ）マウスの脳内に蓄積したが、対照マウスには蓄積しなかったことを示す２枚の写真を示す。
【図１２】図１２は、Ｇ２Ｃ４アンチセンス転写物が鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲにより上昇し、Ｃ９ＯＲＦ７２患者組織内にＲＮＡ凝集として蓄積することを示す、一連の概略図、グラフおよび画像である。（Ａ）Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子ならびにアンチセンス転写物ならびに鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマーおよびＲＡＣＥプライマーの相対位置の概略図。（Ｂ）Ｃ９（＋）およびＣ９（−）ＡＬＳ患者の前頭皮質からのセンス（Ｓ）およびアンチセンス（ＡＳ）転写物（イントロン１ｂおよびエクソン１にまたがる）の鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ。（Ｃ）Ｃ９（−）ＡＬＳ患者と比較して、Ｃ９（＋）において上昇したアンチセンスｍＲＮＡを示す鎖特異的ｑＲＴ−ＰＣＲ。（Ｄ）Ｃ９（−）の場合には見られなかった、Ｃ９（＋）前頭皮質および末梢血白血球（ＰＢＬ）におけるＧ２Ｃ４アンチセンスＲＮＡ凝集（矢頭印）を示す、Ｇ４Ｃ２−Ｃｙ３プローブとのインサイチューハイブリダイゼーション。ＦＣＸにおける核酸凝集を矢頭印で示す。ＦＣＸ＝前頭皮質。ＰＢＬ＝末梢血白血球。
【図１３】図１３は、アンチセンスＧ２Ｃ４伸長のＲＡＮ翻訳についてのインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での証拠および二重免疫検出方略を示す、一連の概略図、グラフおよび画像である。（Ａ〜Ｃ）（Ｇ２Ｃ４）ＥＸＰ−３Ｔコンストラクト（Ａ）のトランスフェクションから４８時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の免疫ブロット（Ｂ）およびＩＦ染色（Ｃ）。トランスフェクト細胞内の（Ｂ）ウエスタンにより検出されたＰＲおよびＧＰ伸長タンパク質ならびに（Ｃ）ＩＦにより検出されたＰＡ、ＰＲおよびＧＰ。（Ｄ）センスおよびアンチセンス転写物から翻訳された推定タンパク質の図。ＣＴ＝Ｃ末端、ｆ１〜３：リーディングフレーム１〜３。（Ｅ）α−ＰＡウサギポリクローナル抗体の検証の例の要約。５’Ｆｌａｇエピトープタグ化ＰＡタンパク質を有するコンストラクトをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＩＦ染色および対応する免疫ブロット。リピートモチーフおよびＣＴ領域に対して生成された８つの追加の抗体の追加の対照および検証については、図２２および２３を参照のこと。
【図１４−１】図１４Ａおよび１４Ｂは、Ｇ２Ｃ４ＡＳリピートのＲＡＮ翻訳および毒性研究についてインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での証拠を示す、一連の画像およびグラフである。（Ａ）α−ＰＡ、α−ＰＡ−ＣＴ、α−ＰＲ、α−ＰＲ−ＣＴ抗体でプローブされたＣ９（＋）およびＣ９（−）前頭皮質溶解物のドットブロット。（Ｂ）Ｃ９（＋）およびＣ９（−）ＡＬＳ前頭皮質溶解物の免疫ブロット。（Ｃ）α−ＰＡ、α−ＰＡ−ＣＴ、α−ＰＲ、α−ＰＲＣＴおよびα−ＧＰ抗体で検出された、Ｃ９（＋）ＡＬＳ患者からの海馬神経細胞内のＰＡ、ＰＲおよびＧＰタンパク質凝集体のＩＨＣ検出。（Ｄ）マウスα−ＧＰ（矢頭印）およびウサギα−ＧＰ−ＣＴ（矢印）を用いたＣ９（＋）海馬組織のＩＦ染色であり、センス封入体は両方の抗体につて陽性（上パネル）、アンチセンス封入体はＧＰリピート抗体のみについて陽性（下パネル）である。（Ｅ）センス（Ｓ）およびアンチセンス（ＡＳ）染色を示す、より大きな領域のＩＦ染色。（Ｆ）二重（センス）および単一（アンチセンス）標識化凝集体の定量。（Ｇ〜Ｊ）ＲＡＮおよびＰＲ毒性研究。（Ｇ）Ｇ２Ｃ４伸長コンストラクト（＋／−ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔ）ＰＲフレーム内の＋／−ＡＴＧ開始コドンおよび３’エピトープタグ。（Ｈ）（Ｇ）のコンストラクトをトランスフェクトした細胞内のＰＲおよびＧＰのレベルを示すタンパク質ブロット。トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞の（Ｉ）ＬＤＨおよび（Ｊ）ＭＴＴアッセイ。
【図１４−２】図１４Ａおよび１４Ｂは、Ｇ２Ｃ４ＡＳリピートのＲＡＮ翻訳および毒性研究についてインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での証拠を示す、一連の画像およびグラフである。（Ａ）α−ＰＡ、α−ＰＡ−ＣＴ、α−ＰＲ、α−ＰＲ−ＣＴ抗体でプローブされたＣ９（＋）およびＣ９（−）前頭皮質溶解物のドットブロット。（Ｂ）Ｃ９（＋）およびＣ９（−）ＡＬＳ前頭皮質溶解物の免疫ブロット。（Ｃ）α−ＰＡ、α−ＰＡ−ＣＴ、α−ＰＲ、α−ＰＲＣＴおよびα−ＧＰ抗体で検出された、Ｃ９（＋）ＡＬＳ患者からの海馬神経細胞内のＰＡ、ＰＲおよびＧＰタンパク質凝集体のＩＨＣ検出。（Ｄ）マウスα−ＧＰ（矢頭印）およびウサギα−ＧＰ−ＣＴ（矢印）を用いたＣ９（＋）海馬組織のＩＦ染色であり、センス封入体は両方の抗体につて陽性（上パネル）、アンチセンス封入体はＧＰリピート抗体のみについて陽性（下パネル）である。（Ｅ）センス（Ｓ）およびアンチセンス（ＡＳ）染色を示す、より大きな領域のＩＦ染色。（Ｆ）二重（センス）および単一（アンチセンス）標識化凝集体の定量。（Ｇ〜Ｊ）ＲＡＮおよびＰＲ毒性研究。（Ｇ）Ｇ２Ｃ４伸長コンストラクト（＋／−ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔ）ＰＲフレーム内の＋／−ＡＴＧ開始コドンおよび３’エピトープタグ。（Ｈ）（Ｇ）のコンストラクトをトランスフェクトした細胞内のＰＲおよびＧＰのレベルを示すタンパク質ブロット。トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞の（Ｉ）ＬＤＨおよび（Ｊ）ＭＴＴアッセイ。
【図１５Ａ】図１５Ａおよび１５Ｂは、Ｃ９ＯＲＦ７２のアンチセンスおよびセンス両方の方向のＲＡＮ翻訳についてインビボでの証拠を示す、一連の画像である。センス（α−ＧＲ、α−ＧＲ−ＣＴ、α−ＧＡ、α−ＧＰ−ＣＴ）およびアンチセンス（α−ＰＡ、α−ＰＡ−ＣＴ、α−ＰＲ、α−ＰＲ−ＣＴ）に対する抗体ならびにセンスおよびアンチセンスの両方の方向に作製されたＧＰタンパク質を認識するα−ＧＰを使用してＩＨＣにより検出された細胞質封入体。凝集体は、Ｃ９（＋）ＡＬＳ剖検組織の海馬のアンモン角（ＣＡ）および歯状回（ＤＧ）領域ならびに運動皮質（ＭＣ）の神経細胞に見出された。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび１５Ｂは、Ｃ９ＯＲＦ７２のアンチセンスおよびセンス両方の方向のＲＡＮ翻訳についてインビボでの証拠を示す、一連の画像である。センス（α−ＧＲ、α−ＧＲ−ＣＴ、α−ＧＡ、α−ＧＰ−ＣＴ）およびアンチセンス（α−ＰＡ、α−ＰＡ−ＣＴ、α−ＰＲ、α−ＰＲ−ＣＴ）に対する抗体ならびにセンスおよびアンチセンスの両方の方向に作製されたＧＰタンパク質を認識するα−ＧＰを使用してＩＨＣにより検出された細胞質封入体。凝集体は、Ｃ９（＋）ＡＬＳ剖検組織の海馬のアンモン角（ＣＡ）および歯状回（ＤＧ）領域ならびに運動皮質（ＭＣ）の神経細胞に見出された。
【図１６−１】図１６Ａおよび１６Ｂは、運動神経細胞内のクラスター化ＲＡＮタンパク質凝集体およびＲＡＮ凝集体の一連の画像である。以下における細胞質α−ＧＰ凝集体を示すＩＨＣ。すなわち、（Ａ）運動皮質の第ＩＩＩ層内。（Ｂ）運動皮質の第Ｖ層内の上位運動神経細胞。（Ｃ）脊髄内の下位運動神経細胞（Ｌ−Ｓ．Ｃ）。海馬の（Ｄ）アンモン角、ＣＡ、（Ｅ）および歯状回、ＤＧ領域内。（ＦおよびＧ）１人の患者からの前海馬台（ＰｒＳｕｂ）内の豊富なＰＡおよびＰＲ細胞質封入体を示すＩＨＣ。
【図１６−２】図１６Ａおよび１６Ｂは、運動神経細胞内のクラスター化ＲＡＮタンパク質凝集体およびＲＡＮ凝集体の一連の画像である。以下における細胞質α−ＧＰ凝集体を示すＩＨＣ。すなわち、（Ａ）運動皮質の第ＩＩＩ層内。（Ｂ）運動皮質の第Ｖ層内の上位運動神経細胞。（Ｃ）脊髄内の下位運動神経細胞（Ｌ−Ｓ．Ｃ）。海馬の（Ｄ）アンモン角、ＣＡ、（Ｅ）および歯状回、ＤＧ領域内。（ＦおよびＧ）１人の患者からの前海馬台（ＰｒＳｕｂ）内の豊富なＰＡおよびＰＲ細胞質封入体を示すＩＨＣ。
【図１７】図１７は、ＲＡＮタンパク質のクラスター化染色の一連の画像である。（Ａ）α−ＰＡ−ＣＴを用いたＩＨＣ染色の低倍率画像は、領域Ｉ〜ＩＶにおいて染色度の変動を示し（灰色点が陽性）、挿入図は高倍率画像を示す。（Ｂ）領域Ｉからの凝集体の例は、リピートおよび特異Ｃ末端エピトープに対する抗体について類似する染色で、９つすべての抗体に対する免疫活性を示す。
【図１８】図１８は、Ｃ９ＯＲＦ７２陽性ＡＬＳ／ＦＴＤ症例および対照における組織病理学的所見を要約する表である。
【図１９−１】図１９Ａ〜１９Ｆは、一連の画像およびデータセットである。（Ａ）は、Ｃ９（＋）患者および正常対照のＰＢＬのセンス（Ｓ）およびアンチセンス（ＡＳ）転写物（イントロン１にわたる）の鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ検出を示す。（Ｂ）は、５’ＲＡＣＥ産物の要約である。（Ｃ）は、細胞質ＲＮＡ凝集の一例を示す、Ｃ９（＋）症例からの前頭皮質のＦＩＳＨ染色を示す。（Ｄ）は、Ｃ９（＋）においてアンチセンス（ＡＳ）Ｇ２Ｃ４およびセンス（Ｓ）Ｇ４Ｃ２ＲＮＡ凝集の蓄積を示すが、Ｃ９（−）細胞において示さない、末梢血白血球のＦＩＳＨ染色を示す。（Ｅ）は、過量の非標識化（Ｇ４Ｃ２）４オリゴがＧ４Ｃ２−Ｃｙ３アンチセンス（ＡＳ）の標識化を阻害するが、Ｇ２Ｃ４−Ｃｙ３標識化センス凝集を阻害しないことを示す、アンチセンス凝集特異性アッセイを示す。（Ｆ）は、予想されたＤＮａｓｅ  Ｉ耐性およびＲＮａｓｅ  Ｉ感受性を示すアンチセンスＲＮＡ凝集のための追加の対照を示す。
【図１９−２】図１９Ａ〜１９Ｆは、一連の画像およびデータセットである。（Ａ）は、Ｃ９（＋）患者および正常対照のＰＢＬのセンス（Ｓ）およびアンチセンス（ＡＳ）転写物（イントロン１にわたる）の鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ検出を示す。（Ｂ）は、５’ＲＡＣＥ産物の要約である。（Ｃ）は、細胞質ＲＮＡ凝集の一例を示す、Ｃ９（＋）症例からの前頭皮質のＦＩＳＨ染色を示す。（Ｄ）は、Ｃ９（＋）においてアンチセンス（ＡＳ）Ｇ２Ｃ４およびセンス（Ｓ）Ｇ４Ｃ２ＲＮＡ凝集の蓄積を示すが、Ｃ９（−）細胞において示さない、末梢血白血球のＦＩＳＨ染色を示す。（Ｅ）は、過量の非標識化（Ｇ４Ｃ２）４オリゴがＧ４Ｃ２−Ｃｙ３アンチセンス（ＡＳ）の標識化を阻害するが、Ｇ２Ｃ４−Ｃｙ３標識化センス凝集を阻害しないことを示す、アンチセンス凝集特異性アッセイを示す。（Ｆ）は、予想されたＤＮａｓｅ  Ｉ耐性およびＲＮａｓｅ  Ｉ感受性を示すアンチセンスＲＮＡ凝集のための追加の対照を示す。
【図１９−３】図１９Ａ〜１９Ｆは、一連の画像およびデータセットである。（Ａ）は、Ｃ９（＋）患者および正常対照のＰＢＬのセンス（Ｓ）およびアンチセンス（ＡＳ）転写物（イントロン１にわたる）の鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ検出を示す。（Ｂ）は、５’ＲＡＣＥ産物の要約である。（Ｃ）は、細胞質ＲＮＡ凝集の一例を示す、Ｃ９（＋）症例からの前頭皮質のＦＩＳＨ染色を示す。（Ｄ）は、Ｃ９（＋）においてアンチセンス（ＡＳ）Ｇ２Ｃ４およびセンス（Ｓ）Ｇ４Ｃ２ＲＮＡ凝集の蓄積を示すが、Ｃ９（−）細胞において示さない、末梢血白血球のＦＩＳＨ染色を示す。（Ｅ）は、過量の非標識化（Ｇ４Ｃ２）４オリゴがＧ４Ｃ２−Ｃｙ３アンチセンス（ＡＳ）の標識化を阻害するが、Ｇ２Ｃ４−Ｃｙ３標識化センス凝集を阻害しないことを示す、アンチセンス凝集特異性アッセイを示す。（Ｆ）は、予想されたＤＮａｓｅ  Ｉ耐性およびＲＮａｓｅ  Ｉ感受性を示すアンチセンスＲＮＡ凝集のための追加の対照を示す。
【図２０】図２０は、センスＧＧＧＧＣＣリピート伸長のＲＡＮ翻訳についてのインビトロでの証拠の一連の画像である。（Ａ）は、上流の６Ｘ  Ｓｔｏｐカセットおよび各リーディングフレームに３’タグを有する、変化するＧＧＧＧＣＣリピート長を含有するコンストラクトを示す。３０、６０および１２０リピートを含有するコンストラクトをトランスフェクトした細胞内でＲＡＮ翻訳が３つすべてのフレーム（ＧＰ、ＧＲ、ＧＡ）において生じることを示す、免疫ブロット（Ｂ）および／または免疫蛍光染色（Ｃ）。
【図２１】図２１は、上から下にすべてのリーディングフレーム配列番号５７〜６２についての、センスおよびアンチセンス方向の推定タンパク質産物の概略図である。下線配列を、ポリクローナル抗体を生成するために使用した。＊＝終止コドン。
【図２２−１】図２２Ａ〜２２Ｅは、免疫蛍光およびタンパク質ブロットにより推定ポリＰＡ、ポリＰＲ、ポリＧＰタンパク質を検出するための二重抗体の検証を示す、一連の画像である。（Ａ〜Ｄ上）：内在性Ｃ末端配列を有するかまたは有しない、ＡＴＧ開始Ｎ末端エピトープタグ化（Ｖ５またはＦｌａｇ）リピートタンパク質を発現するコンストラクトの概略図。（Ａ〜Ｄ下パネル）、以下の新規開発抗体を使用した染色によるトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞内のα−Ｆｌａｇまたはα−Ｖ５染色の共局在。（Ａ）α−ＰＡまたはα−ＰＡ−ＣＴ（アンチセンス）、（Ｂ）α−ＰＲまたはα−ＰＲ−ＣＴ、（Ｃ）ウサギα−ＧＰまたはα−ＧＰ−ＣＴ（センス）、（Ｄ）マウスα−ＧＰ。類似の染色は、免疫前またはｐｃＤＮＡ３．１空ベクター対照においては見られなかった。（Ｅ）試験された７つの抗体のうち６つがまた、ウエスタンにより組換えタンパク質を検出することを示す、対応する免疫ブロット。
【図２２−２】図２２Ａ〜２２Ｅは、免疫蛍光およびタンパク質ブロットにより推定ポリＰＡ、ポリＰＲ、ポリＧＰタンパク質を検出するための二重抗体の検証を示す、一連の画像である。（Ａ〜Ｄ上）：内在性Ｃ末端配列を有するかまたは有しない、ＡＴＧ開始Ｎ末端エピトープタグ化（Ｖ５またはＦｌａｇ）リピートタンパク質を発現するコンストラクトの概略図。（Ａ〜Ｄ下パネル）、以下の新規開発抗体を使用した染色によるトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞内のα−Ｆｌａｇまたはα−Ｖ５染色の共局在。（Ａ）α−ＰＡまたはα−ＰＡ−ＣＴ（アンチセンス）、（Ｂ）α−ＰＲまたはα−ＰＲ−ＣＴ、（Ｃ）ウサギα−ＧＰまたはα−ＧＰ−ＣＴ（センス）、（Ｄ）マウスα−ＧＰ。類似の染色は、免疫前またはｐｃＤＮＡ３．１空ベクター対照においては見られなかった。（Ｅ）試験された７つの抗体のうち６つがまた、ウエスタンにより組換えタンパク質を検出することを示す、対応する免疫ブロット。
【図２３−１】図２３Ａ〜２３Ｃは、追加のセンスリピートおよびC末端ポリクローナル抗体の検証を示す一連の画像である。（Ａ、Ｂ上）：内在性Ｃ末端配列を有するＡＴＧ開始Ｎ末端Ｖ５エピトープタグ化ＧＲまたはＧＡリピートタンパク質を発現するコンストラクトの概略図。（Ａ、Ｂ下パネル）、それぞれα−ＧＲ、α−ＧＲ−ＣＴおよびα−ＧＰ−ＣＴを用いた、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞内のα−Ｖ５染色の共局在。類似する染色は、免疫前またはｐｃＤＮＡ３．１空ベクター対照において見られなかった。（Ｃ）タンパク質ブロットによるＦｌａｇ−ＧＲトランスフェクト細胞内の組換えタンパク質のα−ＧＲ検出。
【図２３−２】図２３Ａ〜２３Ｃは、追加のセンスリピートおよびC末端ポリクローナル抗体の検証を示す一連の画像である。（Ａ、Ｂ上）：内在性Ｃ末端配列を有するＡＴＧ開始Ｎ末端Ｖ５エピトープタグ化ＧＲまたはＧＡリピートタンパク質を発現するコンストラクトの概略図。（Ａ、Ｂ下パネル）、それぞれα−ＧＲ、α−ＧＲ−ＣＴおよびα−ＧＰ−ＣＴを用いた、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞内のα−Ｖ５染色の共局在。類似する染色は、免疫前またはｐｃＤＮＡ３．１空ベクター対照において見られなかった。（Ｃ）タンパク質ブロットによるＦｌａｇ−ＧＲトランスフェクト細胞内の組換えタンパク質のα−ＧＲ検出。
【図２４】図２４は、α−ＧＰ−ＣＴ、α−ＧＲ、α−ＧＲ−ＣＴおよびα−ＧＡ抗体を用いた、Ｃ９（＋）およびＣ９（−）ＡＬＳ前頭皮質からの２％可溶性溶解物の免疫ブロットの一連の画像である。
【図２５】図２５は、センスおよびアンチセンスタンパク質に対する抗体を用いた、Ｃ９（−）ＡＬＳ／ＦＴＤ海馬断面の陰性ＩＨＣ染色を示す、一連の画像である。
【図２６−１】図２６Ａ〜図２６Ｄは、ＲＡＮ翻訳およびＰＲタンパク質発現が細胞生存率に影響を及ぼすことを示す、グラフおよび一連の画像である。（Ａ）ｑＲＴ−ＰＣＲは、（−）ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔおよび（＋）ＡＴＧ−ＰＲ−３ＴコンストラクトをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で伸長転写物の発現が類似することを示す。（Ｂ〜Ｄ）空ベクター対照（ｐｃＤＮＡ３．１）と比較した（−）ＡＴＧ−ＰＲ−３ＴコンストラクトからのＲＮＡおよびＲＡＮタンパク質を発現する細胞の細胞形態の変化ならびに増加したレベルのＰＲタンパク質を発現する（＋）ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔ細胞内の悪影響を示す明視野顕微鏡画像。
【図２６−２】図２６Ａ〜図２６Ｄは、ＲＡＮ翻訳およびＰＲタンパク質発現が細胞生存率に影響を及ぼすことを示す、グラフおよび一連の画像である。（Ａ）ｑＲＴ−ＰＣＲは、（−）ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔおよび（＋）ＡＴＧ−ＰＲ−３ＴコンストラクトをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で伸長転写物の発現が類似することを示す。（Ｂ〜Ｄ）空ベクター対照（ｐｃＤＮＡ３．１）と比較した（−）ＡＴＧ−ＰＲ−３ＴコンストラクトからのＲＮＡおよびＲＡＮタンパク質を発現する細胞の細胞形態の変化ならびに増加したレベルのＰＲタンパク質を発現する（＋）ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔ細胞内の悪影響を示す明視野顕微鏡画像。
【図２６−３】図２６Ａ〜図２６Ｄは、ＲＡＮ翻訳およびＰＲタンパク質発現が細胞生存率に影響を及ぼすことを示す、グラフおよび一連の画像である。（Ａ）ｑＲＴ−ＰＣＲは、（−）ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔおよび（＋）ＡＴＧ−ＰＲ−３ＴコンストラクトをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で伸長転写物の発現が類似することを示す。（Ｂ〜Ｄ）空ベクター対照（ｐｃＤＮＡ３．１）と比較した（−）ＡＴＧ−ＰＲ−３ＴコンストラクトからのＲＮＡおよびＲＡＮタンパク質を発現する細胞の細胞形態の変化ならびに増加したレベルのＰＲタンパク質を発現する（＋）ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔ細胞内の悪影響を示す明視野顕微鏡画像。
【図２７】図２７は、ＲＴ−ＰＣＲおよびＲＡＣＥのために使用されたプライマーを記載する表である（それら１７個の配列番号は順番に、配列番号３６、３７、３９、３８、４５〜４７、４０、４８〜５６）。
【図２８】図２８は、新規センスおよびアンチセンス抗体を記載する表である（順番に、配列番号２０、２３、１９、２５、２１、２１、２２、１８）。
【図２９】図２９は、トランスジェニックマウスを製造するために使用されたＢＡＣインサートの概略図である。
【図３０】図３０は、ＧＧＧＧＣＣリピートを含有するヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を発現するトランスジェニックマウスにおけるセンスＲＮＡ凝集を示す一連の写真である。例示的な凝集を矢頭印により示す。
【図３１】図３１は、ＧＧＧＧＣＣリピートを含有するヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を発現するトランスジェニックマウスにおけるアンチセンス（ＡＳ）ＲＮＡ凝集を示す一連の写真である。例示的な凝集を矢頭印により示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
よく確立された翻訳開始規則が、遺伝子発現を理解し、疾患を引き起こす突然変異の結果を予測するための、分子生物学における基礎として使用されてきた。一般に、予測されるコーディングおよび非コーディング領域に位置するマイクロサテライト伸長突然変異（たとえば、ＣＡＧ、ＣＴＧ）は、タンパク質機能獲得もしくは喪失またはＲＮＡ機能獲得機構により疾患を引き起こすものと考えられてきた。翻訳の標準的規則はＣＴＧ・ＣＡＧリピート伸長に適用されず、ＣＡＧおよびＣＵＧ伸長転写物が、ＡＵＧ開始コドンなしに３つすべてのフレーム内でホモポリマー伸長タンパク質を発現させることが以前に報告されてきた（たとえば、T. Zu et al., Non-ATG-initiated translation directed by microsatellite expansions. PNAS 108, 260 (2011)を参照のこと）。ＡＵＧ開始コドンから独立したこの翻訳は、リピート関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳と呼ばれる。ＲＡＮ翻訳は、ヘアピン依存性であり、フレームシフトまたはＲＮＡエディティングなしに生じる。ＲＡＮ翻訳は、筋強直性ジストロフィー１型、筋強直性ジストロフィー２型、脊髄小脳失調症３型、脊髄小脳失調症８型およびハンチントン病と関連付けられるトリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、およびペンタヌクレオチドリピートから観察されてきた（ＰＣＴ公開ＷＯ／２０１０／１１５０３３を参照のこと、これは本明細書に参照により組み込まれる）。
【００１９】
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のイントロン内のＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピートの伸長は、以前から筋萎縮性側索硬化症および前頭側頭認知症の両方と関連付けられてきた。本明細書に記載のとおり、この伸長ヘキサヌクレオチドリピートは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座からセンスおよびアンチセンスの両方の方向に発現するＲＮＡ転写物内に含有されることが見出されてきた。これらのヘキサヌクレオチドリピート含有転写物はＲＡＮ翻訳を受け、結果として、ＲＮＡから読まれるヘキサヌクレオチドリピートのフレームに応じて（センス転写物上の５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’、５’−ＧＧＧＣＣＧ−３’、および５’−ＧＧＣＣＧＧ−３’、ならびにアンチセンス転写物上の５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’、５’−ＧＣＣＣＣＧ−３’、および５’−ＣＣＣＣＧＧ−３’、図１を参照のこと）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、またはポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）タンパク質がもたらされることが見出された。加えて、アンチセンス転写物は、ＡＴＧ開始翻訳を通じて翻訳され、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）およびＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質をもたらすことが見出された。これらのＲＡＮおよびＡＴＧ開始タンパク質は、本明細書においてジアミノ酸リピート含有タンパク質と呼ばれる。センスおよびアンチセンスヘキサヌクレオチドリピート含有転写物は、本明細書において、５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡ（センス）および５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡ（アンチセンス）と呼ばれる。
【００２０】
本明細書にさらに記載されるとおり、これらのジアミノ酸リピート含有タンパク質は、ＡＬＳを有する対象からの血液試料中に存在することが予想外にも見出された。加えて、アンチセンス５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡ転写物の発現は、伸長ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピート配列を含有するＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を有する対象において大きく上昇することが見出された。さらに、センスおよびアンチセンスヘキサヌクレオチドリピート伸長含有ＲＮＡ転写物の両方の凝集が、伸長ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピート配列を含有するＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を有する対象に存在することが見出された。理論または機構に束縛されることを望まないが、ＡＬＳを有する対象の血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質が時間経過とともに脳実質内に蓄積し、神経炎症性変化、ＣＮＳ機能障害、および神経細胞死をもたらすと考えられる。したがって、本開示の態様は、対象の血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルおよび／または対象からの試料中のヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡレベルを決定するための新規アッセイを提供することによる、ＡＬＳを有するかまたはＡＬＳを発症する可能性が高いものとしての対象の同定に関する。本開示の態様はまた、対象の血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルを減少または安定化させることによる、ＡＬＳまたはＦＴＤを有する対象の処置に関する。
【００２１】
ＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高い対象の同定
本開示の態様は、対象からの血液試料中の１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルに基づく、ＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高い対象の同定に関する。いくつかの実施形態において、方法は、対象から得られる血液試料中の、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを決定することを含み、対照レベルと比較して上昇した１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルは、対象がＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルは、アッセイを実施することにより決定される。非限定的なアッセイを本明細書に記載する。
【００２２】
本開示の他の態様は、対象からの試料中の５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡおよび／または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルに基づく、ＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高い対象の同定に関する。いくつかの実施形態において、ＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高い対象の同定は、対象からの試料中の５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルに基づく。試料は、たとえば、対象から得られる流体または組織試料であってもよい。いくつかの実施形態において、方法は、対象から得られる血液試料中の、５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡおよび／または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルを決定することを含み、対照レベルと比較して上昇したヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルは、対象がＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルは、アッセイを実施することにより決定される。非限定的なアッセイを本明細書に記載する。
【００２３】
本開示のまた他の態様は、対象から得られる試料中の、５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有ＲＮＡおよび／または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有ＲＮＡを含有するＲＮＡ凝集の存在または非存在に基づく、ＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高い対象の同定に関し、５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有ＲＮＡおよび／または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有ＲＮＡの凝集の存在は、対象がＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高いことを示す。本明細書において使用される５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有ＲＮＡおよび／または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有ＲＮＡの凝集は、５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有ＲＮＡおよび／または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有ＲＮＡの蓄積の面積を指し、これは核酸ベースアッセイ、たとえばＦＩＳＨを使用して検出可能でありうる。いくつかの実施形態において、凝集は、たとえば、直径０．１から２マイクロメートル、直径０．１から１．５マイクロメートル、または直径０．１から１マイクロメートルであってもよい。いくつかの実施形態において、凝集は、少なくとも直径０．１マイクロメートルであってもよい。試料は２つ以上の凝集を含有していてもよいこと、ならびに、各凝集は異なるサイズであってもよいことが認められるべきである。たとえば、１つの凝集が直径０．２マイクロメートルであってもよく、一方で第２の凝集は直径１マイクロメートルであってもよい。凝集およびかかる凝集を検出する方法の非限定的な例は、実施例３に提供される。
【００２４】
１つもしくは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベル、ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有ＲＮＡのレベル、ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有ＲＮＡの存在もしくは非存在、またはそれらの任意の組合せに基づいて対象が同定されてもよいことが理解されるべきである。いくつかの実施形態において、この方法は、ジアミノ酸リピート含有タンパク質またはヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルが対照レベルと比較して上昇した場合に、対象をＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高いものとして同定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有ＲＮＡの凝集（ｆｏｃｕｓ  ｏｒ  ｆｏｃｉ）が試料中に存在する場合に、対象をＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高いものとして同定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ジアミノ酸リピート含有タンパク質またはヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルが対照レベルと比較して減少したかまたは同じである場合に、対象をＡＬＳもしくはＦＴＤを有しないかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が低いものとして同定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ヘキサヌクレオチドリピート伸長含有ＲＮＡの凝集が試料中に存在しない場合に、対象をＡＬＳもしくはＦＴＤを有しないかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が低いものとして同定することをさらに含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、対象の１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルまたはアイデンティティが記録されてもよい。いくつかの実施形態において、記録には、対象のレベルまたはアイデンティティをコンピュータ、たとえば診療記録データベースに入力することが含まれる。
【００２６】
本開示の他の態様は、ＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高いものとして同定される対象の処置に関する。本明細書において使用される「処置する」または「処置」は、（ａ）ＡＬＳまたはＦＴＤの発症を予防するかまたは遅延させること、（ｂ）ＡＬＳまたはＦＴＤの重症度を減少させること、（ｃ）ＡＬＳまたはＦＴＤに特徴的な症状の発症を減少させるかまたは予防すること、（ｄ）ＡＬＳまたはＦＴＤ症状の悪化を予防すること、および／または（ｅ）以前にＡＬＳまたはＦＴＤの症状を示していた対象におけるＡＬＳまたはＦＴＤ症状の再発を減少させるかまたは予防することを指す。
【００２７】
いくつかの実施形態において、処置は、有効量の既知のＡＬＳ治療薬、たとえばリルゾール（リルテック、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）を、ＡＬＳを有するものとして同定される対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、処置は、有効量の既知のＦＴＤ治療薬、たとえばトラゾドン（デジレル、オレプトロ）または選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）を、ＦＴＤを有するものとして同定される対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、処置は、ＡＬＳまたはＦＴＤを有するものとして同定される対象における１つまたは複数のＡＬＳまたはＦＴＤの症状を減少させる有効量の治療薬、たとえばバクロフェン、ジアゼパム、フェニトイン、トリヘキシフェニジルおよび／またはアミトリプチリンを投与することを含む。いくつかの実施形態において、処置は、理学療法、作業療法、または言語療法のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態において、処置は、対象の血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルを減少または安定化させるための本明細書に記載の方法、たとえば骨髄移植またはプラズマフェレーシスを含む。いくつかの実施形態において、処置は、上述の処置の任意の組合せまたは本明細書に記載の任意の他の処置を含む。
【００２８】
有効量とは、医学的に所望される結果、たとえばＡＬＳまたはＦＴＤの処置を提供するのに十分な治療薬の用量である。有効量は、処置される対象の年齢および健康状態、対象におけるＡＬＳまたはＦＴＤの重症度、処置の持続期間、任意の併用療法の性質、具体的な投与経路等の保健従事者の知識および専門的意見の範囲内の要因とともに変化するであろう。
【００２９】
処置の投与は、当技術分野において知られている任意の方法により達成されてもよい（たとえば、Harrison’s Principle of Internal Medicine, McGraw Hill Inc.を参照のこと）。投与は局所または全身投与であってもよい。投与は、非経口（たとえば、静脈内、皮下、または皮内）または経口投与であってもよい。様々な投与経路のための組成物が、当技術分野においてよく知られている（たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martinを参照のこと）。用量は、対象および投与経路次第であろう。用量は、当業者により決定されうる。
【００３０】
本開示の他の態様は、ＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを有すると疑われる対象において処置に対する応答性をモニタリングするための方法に関する。いくつかの実施形態において、この方法は、第１の時点で対象から得られる血液試料中の、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質の第１のレベルを決定すること、ならびに、第２の時点で対象から得られる血液試料中の、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質の第２のレベルを決定することを含み、第１のレベルと比較して上昇したかまたは同じである第２のレベルは、対象が処置に対して無応答性であるかまたは無応答性である可能性が高いことを示し、第１のレベルと比較して減少した第２のレベルは、対象が処置に対して応答性であるかまたは応答性である可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、第１の血液試料は対象の処置前に得られ、第２の血液試料は、対象の処置中または処置後に得られる。この方法はまた、ジアミノ酸タンパク質のレベルに加えてまたはその代わりに、ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルまたはヘキサヌクレオチドリピート伸長含有ＲＮＡの凝集の存在もしくは非存在を決定することにより実施されてもよい。
【００３１】
本明細書において使用される「上昇した」は、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質またはヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルが、対照レベル、たとえば対照試料中の１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質またはヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡの所定の閾値またはレベルを超えていることを意味する。対照および対照レベルは本明細書に詳細に記載されている。上昇したレベルは、たとえば、対照レベルを１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上超えるレベルを含む。上昇したレベルはまた、現象をゼロ状態（たとえば、ジアミノ酸リピート含有タンパク質発現またはヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡ発現が存在しないかまたは検出不能である）から、非ゼロ状態（たとえば、ジアミノ酸リピート含有タンパク質発現またはヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡがある程度存在するかまたは検出可能である）まで増加させることを含む。
【００３２】
本明細書において使用される「減少した」は、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質またはヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルが、対照レベル、たとえば対照試料中の１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質またはヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡの所定の閾値またはレベルを下回ることを意味する。対照および対照レベルは本明細書に詳細に記載されている。減少したレベルは、たとえば、対照レベルを１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上下回るレベルを含む。減少したレベルはまた、現象を非ゼロ状態（たとえば、ジアミノ酸リピート含有タンパク質発現またはヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡがある程度存在するかまたは検出可能である）から、ゼロ状態（たとえば、ジアミノ酸リピート含有タンパク質発現またはヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡ発現が存在しないかまたは検出不能である）まで減少させることを含む。
【００３３】
ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡおよびジアミノ酸リピート含有タンパク質
本明細書に記載のとおり、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のイントロン内の伸長ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピート配列は、センスおよびアンチセンスの両方の方向にヘキサヌクレオチドリピートを含有するＲＮＡ転写物がもたらされるように転写されることが見出された。ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ  Ｇｅｎｅ  ＩＤは２０３２２８である。センスおよびアンチセンスヘキサヌクレオチドリピート含有転写物の両方が、ＡＵＧ開始コドンから独立した翻訳［リピート関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳］を受け、結果として、読まれるヘキサヌクレオチドリピートのフレームに応じて（センス転写物上の５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’、５’−ＧＧＧＣＣＧ−３’、および５’−ＧＧＣＣＧＧ−３’、ならびにアンチセンス転写物上の５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’、５’−ＧＣＣＣＣＧ−３’、および５’−ＣＣＣＣＧＧ−３’、図１を参照のこと）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、またはポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）ジアミノ酸リピート含有タンパク質がもたらされることが見出された。加えて、アンチセンスヘキサヌクレオチドリピート含有転写物は、ＡＴＧ開始翻訳を通じて翻訳され、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）およびＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質をもたらすことが見出された。
【００３４】
したがって、本発明の態様は、伸長ヘキサヌクレオチドリピートを含有するセンスおよびアンチセンスＲＮＡならびにそれらの使用に関する。センスＲＮＡは、５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡであり、アンチセンスＲＮＡは、５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡである。
【００３５】
５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’および５’ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡは、それぞれ式（ＧＧＧＧＣＣ）ｘまたは（ＧＧＣＣＣＣ）ｘのリピート核酸配列を含み、式中、Ｘは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２５、もしくは少なくとも３０、または１０〜１００，０００、１０〜５０，０００、１０〜５，０００、２０〜１，０００、２０〜１００，０００、２０〜５０，０００、２０〜５，０００、２０〜１，０００、２５〜１００，０００、２５〜５０，０００、２５〜５，０００、もしくは２５〜１，０００から選択される範囲であってもよい。ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡはさらに、追加のＮおよび／またはＣ末端核酸を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、Ｎ末端核酸配列は、センス転写物のためのＣ９ＯＲＦ７２のイントロン内の５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピートの上流の核酸配列またはアンチセンス転写物のためのＣ９ＯＲＦ７２のイントロン内の５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピートの上流のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端核酸配列は、センス転写物のためのＣ９ＯＲＦ７２のイントロン内の５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピートの下流のヌクレオチド配列またはアンチセンス転写物のためのＣ９ＯＲＦ７２のイントロン内の５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピートの下流のヌクレオチド配列を含む。
【００３６】
本発明の他の態様は、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質およびそれらの使用に関する。１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質は、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される。
【００３７】
センス５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡおよびアンチセンス５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡは両方ともポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質をコードする。したがって、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質は、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方から翻訳されたタンパク質を含んでいてもよい。センスおよびアンチセンス翻訳ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質のＣ末端は、多様でありうることが予測される（表１を参照のこと）。したがって、センスポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質は、表１に記載のポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）Ｃ末端配列を含んでいてもよい一方で、アンチセンスポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質は、追加のＣ末端配列を有しないリピート領域を含んでいてもよい。本明細書に記載の方法は、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方から翻訳されたポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質の使用を含んでいてもよい。本明細書に記載の抗体は、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方から翻訳されたポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質に特異的であってもよい。
【００３８】
各ジアミノ酸リピート含有タンパク質はリピートアミノ酸配列を含み、これは、式（ＹＺ）ｘのジアミノ酸リピート単位を含有し、式中、Ｘは、２〜１０，０００、５〜１０，０００、２〜５，０００、５〜５，０００、２〜１０００、５〜１０００、５〜５００、５〜３００、５〜２００、１０〜５００、１０〜３００、または１０〜２００でありうる。各ジアミノ酸リピート含有タンパク質のためのジアミノ酸リピート単位は、表１に提供される。
【００３９】
【表１】
2020055827.tif 000003
X=丸括弧内の配列のリピートの数
【００４０】
各ジアミノ酸リピート含有タンパク質は、さらに、非ジアミノ酸リピート配列を含むＮおよび／またはＣ末端アミノ酸配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、Ｎ末端アミノ酸配列は、Ｃ９ＯＲＦ７２ＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列、たとえばセンス転写物のためのＣ９ＯＲＦ７２のイントロン内の５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピートの上流のヌクレオチド配列またはアンチセンス転写物のためのＣ９ＯＲＦ７２のイントロン内の５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピートの上流のヌクレオチド配列から翻訳されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端アミノ酸配列は、Ｃ９ＯＲＦ７２ＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列、たとえばセンス転写物のためのＣ９ＯＲＦ７２のイントロン内の５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピートの下流のヌクレオチド配列またはアンチセンス転写物のためのＣ９ＯＲＦ７２のイントロン内の５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピートの下流のヌクレオチド配列から翻訳されたアミノ酸配列を含む。５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピートの下流のかかるヌクレオチド配列は、１つの終止コドンまたは複数の終止コドンに到達するまで翻訳されてもよい。
【００４１】
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子配列の一部（センスおよびアンチセンス）を下に示す。５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピートは、下線を引いて太字にしてある。５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピートの上流のヌクレオチド配列は、下線を引き太字にした配列の前にある。５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピートの下流のヌクレオチド配列は、下線を引き太字にした配列の後にある。この５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’または５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピートは、これら配列にある回数を超えて反復されうることが理解されるべきである。
【００４２】
Ｃ９ＯＲＦ７２（部分配列、センス）
【化１】
2020055827.tif 000004
【００４３】
Ｃ９ＯＲＦ７２（部分配列、アンチセンス）
【化２】
2020055827.tif 000005
【００４４】
いくつかの実施形態において、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質は、Ｎ末端メチオニンを含むＮ末端アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）タンパク質は、MQAIPPVARGESPTPSFGQRNERESKNASSSEESPRFYPRLFPAAEPQTATRQDAASSLTHSPPPAPPPPRAQAPQPQPRPGPAPGPAPTT (配列番号41)を含むＮ末端アミノ酸配列またはその断片を含み、この配列はポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）リピートアミノ酸配列のＮ末端側にある。いくつかの実施形態において、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質は、MRGKVKMRRALRRAPASTRASSRQPNPKQPPARMPPPHSPTRHRLRLRRRGRRHRNRSPAPGPPPGPPRPRP (配列番号42)、MRRALRRAPASTRASSRQPNPKQPPARMPPPHSPTRHRLRLRRRGRRHRNRSPAPGPPPGPPRPRP (配列番号43)、MPPPHSPTRHRLRLRRRGRRHRNRSPAPGPPPGPPRPRP (配列番号44)、を含むＮ末端アミノ酸配列またはその断片を含み、この配列はポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）リピートアミノ酸配列のＮ末端側にある。
【００４５】
いくつかの実施形態において、Ｃ末端アミノ酸配列は、表１に示すＣ末端アミノ酸配列または表１に示すＣ末端アミノ酸配列の断片を含む。表１のもの以外のＣ末端アミノ酸配列もまた考慮されることが理解されるべきである。
【００４６】
例示的ジアミノ酸リピート含有タンパク質は、表２に提供される配列を含んでいてもよい。
【００４７】
【表２】
2020055827.tif 000006
X=2〜10,000、5〜10,000、2〜5,000、5〜5,000、2〜1000、5〜1000、5〜500、5〜300、5〜200、10〜500、10〜300、または10〜200の間の数
【００４８】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質は、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質は、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）タンパク質、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される。
【００４９】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上、または６つ以上、７つ以上、または８つのジアミノ酸リピート含有タンパク質である。
【００５０】
対象
本開示の態様は、ＡＬＳもしくはＦＴＤを有するかまたはＡＬＳもしくはＦＴＤを発症する可能性が高い対象、たとえばヒトの同定および処置に関する。いくつかの実施形態において、対象はＡＬＳを有していてもよい。いくつかの実施形態において、対象は、１つまたは複数のＡＬＳの症状、たとえば呼吸困難、嚥下困難、筋痙攣、筋収縮、筋衰弱、麻痺、会話障害、または体重減少を有していてもよい。いくつかの実施形態において、対象はＡＬＳの症状を一切有していなくてもよい。いくつかの実施形態において、対象はＡＬＳの家族歴を有していてもよい。
【００５１】
いくつかの実施形態において、対象は前頭側頭認知症（ＦＴＤ）を有していてもよい。いくつかの実施形態において、対象は１つまたは複数のＦＴＤの症状、たとえば嗜眠、自発性喪失、脱抑制、感情移入および他の対人能力の欠如、無感情、進行性非流暢性失語、意味性認知症、過食症、強迫行動、振戦、硬直、筋痙攣、協調運動不全、嚥下困難、および筋衰弱を有していてもよい。いくつかの実施形態において、対象はＦＴＤの症状を一切有していなくてもよい。いくつかの実施形態において、対象はＦＴＤの家族歴を有していてもよい。
【００５２】
いくつかの実施形態において、対象は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子（ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：  ２０３２２８）の対立遺伝子の一方または両方内にＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピートを有していてもよい。いくつかの実施形態において、ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピートは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のプロモーターおよび／またはイントロン内にある。いくつかの実施形態において、ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピートの数は、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、５００、５，０００、１０，０００以上である。リピートの数は、当技術分野において知られている任意のアッセイを使用して、たとえば核酸ベースアッセイ、たとえばサザンブロットを使用して検出できる［たとえば、Dejesus-Hernandez et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron 72, 245 (2011)、Renton et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron 72, 257 (2011)、およびGijselink et al. A C9orf72 promoter repeat expansion in a Flanders-Belgian cohort with disorders of the frontotemporal lobar degeneration-amyotrophic lateral sclerosis spectrum: A gene identification study. Lancet Neurol. 11, 54 (2011)を参照のこと］。
【００５３】
対照および対照レベル
本開示の態様は、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質および／またはヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルの対照レベルとの比較に関する。いくつかの実施形態において、対照レベルは、健常対象または健常対象の集団から得られる試料、たとえば流体試料または組織試料中の１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質および／またはヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルである。いくつかの実施形態において、試料は血液試料である。本明細書において使用される健常対象は、一見疾患を有せず、ＡＬＳまたはＦＴＤ等の病歴を有しない対象である。いくつかの実施形態において、健常対象は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内に２５個以下のＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピートを有する対象である。
【００５４】
いくつかの実施形態において、対照レベルは、標準的検出方法（たとえば、ウエスタンブロット、ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、または免疫組織化学）を使用して、検出不能であるかまたは得られたバックグラウンド／ノイズレベルを下回る、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質および／またはヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルである。かかるレベルは、たとえば、ジアミノ酸リピート含有タンパク質および／またはヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡを含まないことがわかっている試料中の１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質および／またはヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルを測定することにより得られる。
【００５５】
本開示はまた、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質および／またはヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルを、毎回対照レベルを測定する必要のないように、所定のレベルまたは値と比較することを伴う。所定のレベルまたは値は、様々な形態をとりうる。それは、単一のカットオフ値、たとえば中央値または平均値でありうる。それは、ある定義された群がＡＬＳまたはＦＴＤを有さないことがわかっており、別の定義された群がＡＬＳまたはＦＴＤを有することがわかっている場合等、比較群に基づいて確立できる。それは、たとえば、被験集団が均等（または不均等）に複数の群、たとえば２５個以下のＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピートを有する対象、２５個〜５０個のＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピートを有する対象、および５０個以上のＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピートを有する対象に分割された場合に、一定の範囲でありうる。
【００５６】
試料
本開示の態様は、対象から得られた血液試料（たとえば、全血、血漿、または血清）中の１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを決定することに関する。血液試料は、当技術分野において知られている任意の方法により、たとえば、針または指穿刺装置を使用して得られる。血液は、本明細書に記載の方法における使用前に処理されてもよい。かかる処理には、抗凝固剤の添加、血液細胞の除去、および／または血液の冷凍が含まれる。しかしながら、他の試料、たとえば組織試料（たとえば脳組織）または他の流体試料、たとえば唾液もしくは尿を使用できることが認められるべきである。
【００５７】
本開示の他の態様は、対象から得られる試料中のヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルを決定することに関する。試料は、流体または組織試料であってもよい。いくつかの実施形態において、組織試料は脳組織である。いくつかの実施形態において、流体試料は血液（たとえば、全血、血漿、または血清）、唾液、または尿である。いくつかの実施形態において、流体試料は血液試料（たとえば、全血、血漿、または血清）である。
【００５８】
アッセイ
本開示の態様は、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質および／またはヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルまたは存在／非存在を決定するためにアッセイを実施することに関する。タンパク質およびＲＮＡを検出するための当技術分野において知られているアッセイ（たとえば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York.を参照のこと。マイクロアレイ技術は、Microarray Methods and Protocols, R. Matson, CRC Press, 2009, or Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに記載されている。）を、単独でまたは本明細書に記載のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルを測定するための手法および組成物と組み合わせて使用できる。
【００５９】
タンパク質レベルを検出するためのアッセイには、イムノアッセイ［本明細書において免疫ベース（ｉｍｍｕｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｒ  ｉｍｍｕｎｏ−ｂａｓｅｄ）アッセイとも呼ばれ、たとえば、ウエスタンブロット、免疫組織化学およびＥＬＩＳＡアッセイ］、質量分析、およびマルチプレックスビーズベースアッセイが含まれるが、これに限られるものではない。タンパク質レベル検出のためのかかるアッセイは、当技術分野においてよく知られている。タンパク質検出および定量方法の他の例には、たとえば米国特許第６９３９７２０号および第８１４８１７１号、および公開米国特許出願第２００８／０２５５７６６号に記載のマルチプレックスイムノアッセイ、ならびにたとえば公開米国特許出願第２００９／００８８３２９号に記載のタンパク質マイクロアレイが含まれ、これら文献のすべての全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【００６０】
ジアミノ酸リピート含有タンパク質のための任意の好適な結合パートナーが、ジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルの検出のために考慮される。いくつかの実施形態において、結合パートナーは、本明細書に記載のジアミノ酸リピート含有タンパク質と特異的に結合する任意の分子である。本明細書に記載の「ジアミノ酸リピート含有タンパク質と特異的に結合する」は、分子が、非ジアミノ酸リピート含有タンパク質の一部または全部よりも、ジアミノ酸リピート含有タンパク質の一部または全部と結合する可能性が高いことを意味する。
【００６１】
いくつかの実施形態において、結合パートナーは、抗体またはその抗原結合性フラグメント、たとえばＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖抗体、ＦａｂおよびｓＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄフラグメント、ｓｃＦｖ、またはｄＡｂフラグメントである。抗体およびそれらの抗原結合性フラグメントを製造するための方法は、当技術分野においてよく知られている［たとえば、Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990)、およびRoitt et al., "Immunology" (2nd Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989)、ＷＯ２００６／０４０１５３、ＷＯ２００６／１２２７８６、およびＷＯ２００３／００２６０９を参照のこと］。結合パートナーはまた、ジアミノ酸リピート含有タンパク質と特異的に結合する他のペプチド分子およびアプタマーを含む。ペプチド分子およびアプタマーを製造するための方法は、当技術分野においてよく知られている（たとえば、公開米国特許出願第２００９／００７５８３４号、米国特許第７４３５５４２、第７８０７３５１号、および第７２３９７４２号を参照のこと）。結合パートナーは、蛍光、酵素、親和性または同位体標識を含むが、これに限られない標識を含んでいてもよい。
【００６２】
いくつかの実施形態において、アッセイは、免疫ベースアッセイを含む。いくつかの実施形態において、免疫ベースアッセイは、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的な単離抗体を含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的な単離抗体は、本明細書にさらに詳細に記載されている単離抗体である。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的な単離抗体は、表１、表２または表３に記載の抗原もしくは配列、または抗原もしくは配列の断片に特異的な単離抗体である。
【００６３】
したがって、ジアミノ酸リピート含有結合パートナー（たとえば、ジアミノ酸リピート含有特異抗体）を、検出可能な成分で標識化できる。
【００６４】
ＲＮＡを検出するためのアッセイには、ハイブリダイゼーションベースアッセイ、たとえばノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ、シーケンシング技術、ＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーション（たとえば、ＦＩＳＨにおけるように試料中に存在するＲＮＡ分子とハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡプローブを使用する）、インサイチューＲＴ−ＰＣＲ（たとえば、Nuovo GJ, et al. Am J Surg Pathol. 1993, 17: 683-90; Komminoth P, et al. Pathol Res Pract. 1994, 190: 1017-25に記載のもの）、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ［たとえば、試料に由来するポリヌクレオチド配列の、アドレス付け可能な位置（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎｓ）を有する固体表面（たとえば、ガラスウェハー）、たとえばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ［Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ］に結合したオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによる］が含まれるが、これに限られるものではない。核酸結合パートナー、たとえばプローブを設計するための方法は、当技術分野においてよく知られている。いくつかの実施形態において、核酸結合パートナーは、本明細書において提供されるヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡの核酸配列の一部または全部と結合する。
【００６５】
処置
本明細書に記載のとおり、ジアミノ酸リピート含有タンパク質が、ＡＬＳを有する患者からの血液試料中に存在することが見出された。理論または機構に束縛されることを望まないが、ＡＬＳを有する対象の血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質が時間経過とともに脳実質内に蓄積し、神経炎症性変化、ＣＮＳ機能障害、および神経細胞死をもたらすと考えられる。したがって、本開示の態様は、対象の血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルを減少または安定化させることによる、ＡＬＳまたはＦＴＤを有する対象の処置に関する。
【００６６】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させることまたはその増加を予防することは、１つまたは複数（たとえば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つ）のジアミノ酸リピート含有タンパク質を対象の血液から除去することを含む。いくつかの実施形態において、対象の血液からの１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質は、プラズマフェレーシスまたは骨髄移植から選択される処置を使用して除去される。いくつかの実施形態において、対象が発現するすべてのジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させるかまたはその増加を予防することは、有利でありうる。したがって、いくつかの実施形態において、方法は、対象が発現するすべての形態のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させることまたはその増加を予防することを含む。
【００６７】
いくつかの実施形態において、対象の血液からの１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有は、造血幹細胞（ＨＳＣ）移植を使用して除去される。ＨＳＣ移植は、骨髄、末梢血、または臍帯血に通常は由来する造血幹細胞の、対象への移植である。造血幹細胞のソースは、同種（たとえば、健常対象等のドナーから）であってもよい。ＨＳＣ移植の方法は、当技術分野においてよく知られている（たとえば、Bishop MR, Pavletic SZ. Hematopoietic stem cell transplantation. In: Abeloff MD, Armitage JO, Niederhuber JE, Kastan MB, McKena WG, eds. Clinical Oncology. 4th ed. Philadelphia, Pa: Elsevier Churchill Livingstone; 2008:chap 32、およびVose JM, Pavletic SZ. Hematopoietic stem cell transplantation. In: Goldman L, Schafer AI. Cecil Medicine. 24th ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2011:chap 181を参照のこと）。
【００６８】
対象のＨＳＣ移植を準備するために、対象に存在するＨＳＣを除去または消耗させてもよく、結果として移植細胞は、対象において支配的なＨＳＣ集団となりうる。対象のＨＳＣ細胞がアポトーシスまたは細胞周期停止となるようにするため、対象におけるＨＳＣを、たとえば、化学療法、照射、または両方で対象を処置することにより消耗させてもよい。
【００６９】
同種ＨＳＣ移植において、ＨＳＣはドナーから得られる。ドナーは好ましくは健常対象、たとえば一見疾患を有せず、ＡＬＳまたはＦＴＤ等の病歴を有しない対象である。ドナーは、移植片対宿主病の危険性を減少させるために、移植を受ける対象とＨＬＡ適合性であることが好ましい。ＨＬＡ適合性は、たとえば、ＨＬＡタイピングを使用して決定できる。ＨＬＡタイピングは一般に、少なくとも８つのＨＬＡマーカー、すなわち２つのＡ、２つのＢ、２つのＣ、および２つのＤＲＢ１マーカー、ならびにまた適宜２つのＤＱマーカーの検査を伴う。ＨＬＡタイピングは、たとえば血液検査を通じて達成できる。ＨＬＡ対立遺伝子同一性は、血清学または核酸ベースアッセイを使用して決定できる。一般に、ホストとドナーとの間で４つ〜６つのマーカーの一致が好ましい。いくつかの実施形態において、ドナーは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内に２５個以下のＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピートを有する対象である。
【００７０】
ＨＳＣは、当技術分野において知られている任意の方法を使用してドナーから得られる。例示的方法には、骨髄採取および白血球除去が含まれる［たとえば、Transfusion. 2003 Feb;43(2):259-64. Leukapheresis after high-dose chemotherapy and autologous peripheral blood progenitor cell transplantation: a novel approach to harvest a second autograft. Schwella N, Braun A, Ahrens N, Rick O, Salama Aを参照のこと］。骨髄採取において、骨髄は典型的には、ドナーの一方または両方の寛骨の背部から除去される。白血球除去は、たとえば、連続フロー遠心分離または濾過を使用した、ドナーから得られる血液からのＨＳＣの分離を伴う。新しいＨＳＣの増殖を刺激し、結果としてより多くのＨＳＣが血中に存在するようにするため、増殖因子Ｇ−ＣＳＦがドナーに投与されてもよい。ＨＳＣが得られると、次に同種ＨＳＣが移植を受ける対象に投与される。当技術分野において知られている任意の好適な投与方法、たとえば中心静脈カテーテルによるものが考慮される。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ＨＳＣ移植中またはその後に、ＨＳＣ移植を受ける対象は、追加の処置および／または療法、たとえば抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、輸血および／または免疫抑制療法を受けてもよい。かかる処置および／または療法は、ＨＳＣ移植回復期間中に感染および／または移植片対宿主病を予防するのに役立ちうる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、ＨＳＣ移植は、骨髄移植である。いくつかの実施形態において、骨髄移植は、同種骨髄移植である。
【００７３】
プラズマフェレーシスは、体外で生じる医療処置（「体外処置」）であり、血液循環からの血漿（の成分）の除去、処置、および返還を指す。プラズマフェレーシスは、当技術分野においてよく知られており、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、ギラン−バレー症候群、狼瘡、および血栓性血小板減少性紫斑病を含む複数の疾患を処置するために使用されてきた（たとえば、Madore, Plasmapheresis Technical aspects and indications, Crit Care Clin 18: 375-392. 2002を参照のこと）。プラズマフェレーシス中に血液は最初に、たとえば、針または以前に埋め込まれたカテーテルを通じて体外に取り出される。次に血漿は、たとえば、血液成分分離装置を使用することにより、血液細胞から分離される。血漿分離後、血液細胞は補液と組み合わされ、対象に再投与される。補液は、疾患関連成分を除去するよう処理された分離血漿または代替血漿（血漿交換とも呼ばれる）のいずれかであってもよい。
【００７４】
血漿を血液細胞から分離するために使用される例示的処置は、以下を含む。すなわち、
１）非連続フロー遠心分離：１本の静脈内カテーテルラインが使用される。典型的には、１度に血液の１つまたは複数のバッチが除去され、遠心分離されて血漿を血液細胞から分離する。次に血液細胞は、補液と組み合わされて対象に戻される。
２）連続フロー遠心分離：２本の静脈内ラインが使用される。血漿は連続的に血液から取り出され、分離された血液細胞は、対象に戻る前に補液を結合したラインを通じて供給される。
３）血漿濾過：２本の静脈内ラインが使用され。血漿は、標準的な血液透析器具、たとえば平行板または中空繊維フィルターを使用して濾過される。分離された血液細胞は、対象に戻る前に補液を結合したラインを通じて供給される。フィルターは通常、血漿の通過を可能にする一方で細胞を保持するのに十分な直径０．２〜０．６μｍの細孔を有する。複数の膜血漿分離器が市販されている（たとえば、Ａｓａｈｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ製Ｐｌａｓｍａｆｌｏ、Ｔｏｒａｙ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ製Ｐｌａｓｍａｘ、Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ，ＵＳＡ製ＣＰＳ−１０、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  ＡＧ，Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ製Ｐｌａｓｍａｆｌｕｘ、Ｈｏｓｐａｌ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ製Ｐｒｉｓｍａ  ＴＰＥ  ２０００）。
【００７５】
分離血漿が補液として使用される場合、分離血漿はまず、分離血漿中に存在するジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させるよう処理される。いくつかの実施形態において、分離血漿中に存在するジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させることは、本明細書に記載のとおり、分離血漿をジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的な１つまたは複数の単離抗体と接触させることを含み、そのことにより分離血漿中に存在するジアミノ酸リピート含有タンパク質は、１つまたは複数の単離抗体と結合する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の単離抗体のための結合パートナーを分離血漿と接触させる。１つまたは複数の単離抗体のための結合パートナーは、たとえば、捕捉成分、たとえばビオチンもしくはストレプトアビジン、プロテインＡ、または１つもしくは複数の単離抗体に特異的な二次抗体であってもよい。かかる結合パートナーは、１つまたは複数の単離抗体が、分離血漿から除去されるのを可能にする。
【００７６】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の単離抗体は、フィルター、カラム、および／または固体支持体に結合される。かかる実施形態において、分離血漿は、フィルター、カラム、および／または固体支持体と接触させられ、そのことによりジアミノ酸リピート含有タンパク質は、フィルター、カラムおよび／または固体支持体に結合された単離抗体と結合する。
【００７７】
理論に束縛されることは望まないが、ジアミノ酸リピート含有タンパク質は血中で凝集体を形成しうると考えられる。したがって、ジアミノ酸リピート含有タンパク質は、凝集体が分離血漿から単離されるように、フィルターを使用して分離血漿から除去されてもよい。
【００７８】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質を発現する対象は、自己抗体を形成してもよい。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質に対する自己抗体は、分離血漿から除去されてもよい。自己抗体は、当技術分野において知られている任意の方法、たとえば、自己抗体を認識する結合パートナー（たとえば、固体支持体に結合されるかまたはタグに結合される）を使用して除去されてもよい。いくつかの実施形態において、結合パートナーは、本明細書に記載の１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質であってもよい。
【００７９】
血漿交換が使用される場合、対象は、代替血漿を受ける。代替血漿は、たとえば、ドナー血漿またはアルブミン溶液（たとえば、生理食塩水中５〜７０％アルブミン）であってもよい。例示的代替血漿は、５０％：５０％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）溶液中で０．９％生理食塩水と組み合わされた５％アルブミンである。血液が凝固しないように維持する薬物（たとえば、抗凝固剤、たとえばクエン酸、クエン酸デキストロースまたはヘパリン）は、処置中に対象に与えられるかまたは対象の血液と接触させられてもよい。
【００８０】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルを減少させることまたはその増加を防止することは、ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルを減少させることを含む。ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡのレベルを減少させることは、ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡを標的にする有効量の抑制性核酸分子、たとえばｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはアンチセンス核酸分子の投与を含んでいてもよい。
【００８１】
ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンス核酸分子を製造するための方法は、当技術分野においてよく知られている［たとえば、Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, (Current Edition)、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. eds., (Current Edition))、Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition)、Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition)、Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition)を参照のこと］。いくつかの実施形態において、核酸抑制因子は、標的ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡ配列の少なくとも一部を含むかもしくはそれに相当するか、または標的ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡ配列と相補的な配列の少なくとも一部を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において、処置は、対象において１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質に対する自己抗体のレベルを減少または安定化させることを含んでいてもよい。自己抗体のレベルは、当技術分野において知られている任意の方法を使用して減少または安定化させられてもよい。いくつかの実施形態において、自己抗体のレベルを減少または安定化させることは、有効量のアタシセプト、ベリムマブ、ブリシビモド、ＢＲ３−Ｆｃ、リツキシマブ、オクレリズマブ、アツムマブ（ａｔｕｍｕｍａｂ）、エプラツズマブ、コルチコステロイド（たとえば、プレドニゾン）、ミコフェノール酸、メトトレキセート、シクロホスファミド、アザチオプリン、および／またはシクロスポリンの投与を含む。いくつかの実施形態において、自己抗体のレベルを減少または安定化させることは、プラズマフェレーシスを含む。
【００８３】
抗体
本開示の態様は、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択されるジアミノ酸リピート含有タンパク質（たとえば、ＲＡＮタンパク質）に特異的な単離抗体に関する。単離抗体は、ジアミノ酸リピート含有タンパク質の領域（たとえば、リピート配列またはＣ末端）を認識するかまたはジアミノ酸リピート含有タンパク質全体を認識してもよい。
【００８４】
標的またはエピトープに「特異的に結合する」抗体は、当技術分野において理解されている用語であり、かかる特異的結合を決定する方法もまた、当技術分野において知られている。分子は、それが代替的標的よりも、頻繁に、迅速に、長時間、および／または大きな親和性で、特定の標的抗原と反応または結合する場合に、「特異的結合」を示すと言われている。抗体は、それが他の物質に結合するよりも大きな親和性、結合力で、容易に、および／または長期間結合する場合に、標的抗原と「特異的に結合する」。たとえば、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）タンパク質またはそのエピトープに特異的に結合する抗体は、それが他の抗原または同じ抗原の他のエピトープに結合するよりも大きな親和性、結合力で、容易に、および／または長期間、この標的抗原に結合する抗体である。この定義を読むことにより、たとえば、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体が、第２の標的抗原に特異的に結合してもしなくてもよいこともまた理解される。かかるものとして、「特異的結合」は、排他的結合を（それを含みうるとはいえ）必ずしも要しない。必ずではないが一般に、結合への言及は特異的結合を意味する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ジアミノ酸リピート含有タンパク質（たとえば、ＲＡＮタンパク質）との好適な結合親和性を有する。本明細書において使用される「結合親和性」は、見かけの結合定数またはＫＡを指す。ＫＡは、解離定数（ＫＤ）の逆数である。本明細書に記載の抗体は、少なくとも１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０Ｍ以下の結合親和性（ＫＤ）を有していてもよい。増加した結合親和性は、減少したＫＤに相当する。第２の標的と比較して第１の標的に対する、抗体のより高い親和性の結合は、第２の標的との結合についてのＫＡ（または数値ＫＤ）より高い第１の標的との結合についてのＫＡ（またはより小さい数値ＫＤ）により示されうる。かかる場合には、抗体は、第１の標的（たとえば、第１のコンフォメーンョンのタンパク質またはその模倣物）について第２の標的（たとえば、第２のコンフォメーションの同じタンパク質もしくはその模倣物、または第２のタンパク質）と比較して特異性を有する。結合親和性の差（たとえば、特異性または他の比較について）は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７．５、５０、７０、８０、９１、１００、５００、１０００、１０，０００または１０５倍でありうる。
【００８５】
結合親和性は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または分光法を含む様々な方法により（たとえば、蛍光アッセイを使用して）決定されうる。結合親和性を評価するための例示的条件は、たとえば、トリス緩衝液（ｐＨ７．５で５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２）中である。これらの手法は、結合された結合タンパク質の濃度を標的タンパク質の濃度の関数として測定するために使用できる。結合された結合タンパク質（［Ｂｏｕｎｄ］）の濃度は、遊離標的タンパク質（［Ｆｒｅｅ］）の濃度および結合タンパク質のための標的上の結合部位の濃度と関係付けられ、（Ｎ）は、以下の式による１標的分子当たりの結合部位の数である。すなわち、
［Ｂｏｕｎｄ］＝［Ｎ］［Ｆｒｅｅ］／（Ｋｄ＋［Ｆｒｅｅ］）
【００８６】
とはいえ、ＫＡを正確に決定することは必ずしも必要ない。なぜなら、ＫＡに比例し、したがって、たとえば、より高い親和性が２倍高いのかどうかを決定することなどの比較に使用できる、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ解析等の方法を使用して決定される親和性の定量的測定値を得ること、親和性の定性的測定を得ること、または、機能的アッセイ、たとえばインビトロまたはインビボアッセイにおける活性により、親和性の推定を得ることだけで十分であることもあるからである。
【００８７】
いくつかの実施形態において、単離抗体は、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的である。
【００８８】
いくつかの実施形態において、単離抗体は、表１に定義されるジアミノ酸リピートおよび／またはＣ末端配列またはそれらの断片を含む抗原に特異的である。いくつかの実施形態において、単離抗体は、表２に定義される配列の配列またはその断片を含む抗原に特異的である。
【００８９】
いくつかの実施形態において、単離抗体は、表３または図２８の抗原に特異的である。いくつかの実施形態において、表３の抗原は、Ｎおよび／またはＣ末端修飾を含有しない。
【００９０】
【表３】
2020055827.tif 000007
F1=リーディングフレーム1、F2=リーディングフレーム2、F3=リーディングフレーム3、AS F1=アンチセンスリーディングフレーム1、AS F2=アンチセンスリーディングフレーム2、AS F3=アンチセンスリーディングフレーム3
【００９１】
単離抗体は、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、またはそれらの抗原結合性フラグメントであってもよい。それらの抗原結合性フラグメントは、たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、ｓＦａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、ｓｃＦｖ、またはｄＡｂフラグメントを含む。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびにそれらの抗原結合性フラグメントを製造するための方法は、当技術分野においてよく知られている［たとえば、Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990)、およびRoitt et al., "Immunology" (2nd Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989)、ＷＯ２００６／０４０１５３、ＷＯ２００６／１２２７８６、およびＷＯ２００３／００２６０９を参照のこと］。また包含されるのは、組換え手段により製造される抗体、たとえばキメラ抗体（可変領域および定常領域が異なる種に由来）およびＣＤＲグラフト化抗体（相補性決定領域が異なる種に由来）であり、これらは米国特許第４，８１６，５６７号および第５，２２５，５３９号に記載されており、これら文献はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。また包含されるのは、典型的には組換え方法により製造される、ヒト化抗体であり、ヒト配列は抗体の一部または全部を含む。また含まれるのは、完全ヒト抗体、たとえば遺伝的改変マウスにおいて製造されたものである（PCT出願番号９３／１２２２７を参照のこと、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００９２】
いくつかの実施形態において、ジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的な単離抗体は、表４に列挙されたウサギポリクローナル抗体である。
【００９３】
【表４】
2020055827.tif 000008
【００９４】
抗体は、細菌細胞、たとえば、大腸菌、または真核細胞、たとえば、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞において製造できる。一実施形態において、抗体は、哺乳動物細胞において製造される。抗体またはその抗原結合性フラグメントを発現させるための哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（たとえば、Kaufman and Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601 621に記載のとおり、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用された、Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、リンパ球細胞株、たとえば、ＮＳ０骨髄腫細胞およびＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞、ならびにトランスジェニック動物、たとえば、トランスジェニック哺乳動物からの細胞が含まれる。抗体はまた、トランスジェニック動物により製造できる。たとえば、米国特許第５，８４９，９９２号は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺における抗体の発現方法を記載する。
【００９５】
本開示の単離抗体はまた、それに結合された検出可能な標識を有していてもよい。標識は、たとえば、蛍光、酵素、親和性または同位体標識であってもよい。例には、蛍光による検出のためのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、発色性基質の切断による検出を可能にする西洋ワサビペルオキシダーゼ、放射性同位体、たとえばオートラジオグラフィーによる検出のためのＩ１２５、ならびに抗原および抗原保持細胞の抗体検出および親和性精製のためのアビジン／ビオチンが含まれる。
【００９６】
本開示によりまた包含されるのは、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）タンパク質、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、本明細書に記載のジアミノ酸リピート含有タンパク質のＣ末端ペプチド、および／またはそれらの２つ以上の組合せから選択されるジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を製造するハイブリドーマ細胞株である。
【００９７】
いくつかの実施形態において、単離抗体は、ＡＬＳを有する対象から得られる単離自己抗体であり、単離自己抗体は、本明細書に記載の１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的である。
【００９８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離抗体は、緩衝液中に含有される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離抗体は、固体支持体（たとえば、プレートまたはビーズの表面）に結合される。
【００９９】
トランスジェニックマウス
別の一態様において、本開示は、ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピート配列を含むヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を含むトランスジェニックマウスに関する。いくつかの実施形態において、マウスは、ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピート配列ならびにヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の５’および３’末端上のフランキングヒト配列を含むヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、５’および３’末端上のフランキングヒト配列は、それぞれ独立に、長さが少なくとも１キロベース（ｋＢ）、少なくとも５ｋＢ、少なくとも１０ｋＢ、少なくとも２０ｋＢ、少なくとも３０ｋＢ、少なくとも４０ｋＢ、または少なくとも５０ｋＢである。いくつかの実施形態において、５’および３’末端上のフランキングヒト配列は、それぞれ独立に、ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の転写をセンスおよびアンチセンス方向にそれぞれ駆動可能なプロモーターを含む。したがって、いくつかの実施形態において、トランスジェニックマウスは、センスおよびアンチセンス転写物の両方（たとえば、本明細書に記載の５’−ＧＧＧＧＣＣ−３’および５’ＧＧＣＣＣＣ−３’ヘキサヌクレオチドリピート含有ＲＮＡ）を発現する。いくつかの実施形態において、ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子およびフランキング配列は、下の配列を含み、（ＧＧＧＧＣＣ）ｎは、ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピート配列の位置を示す。
【０１００】
Ｃｈｒ９：２７，５２７，１３７〜２７，６２５，４７０（逆相補）
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【０１０１】
いくつかの実施形態において、ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子およびフランキング配列は、たとえば、上の配列と少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である配列を含む。本明細書において使用される「パーセント配列同一性」または「パーセント同一性」または「％同一性」は、同一性分率に１００を掛けたものである。基準配列と最適にアラインされた配列の「同一性分率」は、最適アラインメントにおけるヌクレオチド一致数を、基準配列のヌクレオチド総数、たとえば基準配列全体の全長のヌクレオチド総数で割ったものである。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピート［たとえば、配列番号６３における（ＧＧＧＧＣＣ）ｎ］の数は、３００〜８００、３００〜７００、４００〜６００、または５００〜６００である。いくつかの実施形態において、ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピート［たとえば、配列番号６３における（ＧＧＧＧＣＣ）ｎ］の数は、５００〜６００である。いくつかの実施形態において、ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピート［たとえば、配列番号６３における（ＧＧＧＧＣＣ）ｎ］の数は、３００、４００、５００、６００、７００または８００である。いくつかの実施形態において、ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピート［たとえば、配列番号６３における（ＧＧＧＧＣＣ）ｎ］の数は、５００を超える。いくつかの実施形態において、トランスジェニックマウスは、ＦＶＢ、ｂａｌｂ−ＣまたはＣ５７Ｂ／６系統マウスである。いくつかの実施形態において、トランスジェニックマウスは、ＦＶＢ系統マウスである。いくつかの実施形態において、マウスは、ＡＬＳまたはＦＴＤの処置のための処置法、たとえば本明細書に記載の処置法または候補治療薬をスクリーニングするために使用できる。
【０１０３】
本明細書に記載のトランスジェニックマウスは、当技術分野において知られているかまたは本明細書、たとえば実施例４に記載されている任意の方法を使用して製造できる（たとえば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００１０１０１９９およびＷＯ２０１３０２２７１５、米国公開番号ＵＳ２０１１０１１３４９６および２００６００３１９５４も参照のこと、これら各文献は本明細書に参照により組み込まれる）。たとえば、本明細書に記載のトランスジェニックマウスは、導入遺伝子（たとえば、適宜フランキング配列を有する、ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子）をマウスの生殖系列に導入することにより製造できる。様々な発生段階の胚性標的細胞を、導入遺伝子を導入するために使用できる。胚性標的細胞の発生段階に応じて、異なる方法が使用される。本開示を実施するために使用される任意の動物の特定の系統は、概して良好な健康状態、良好な胚産生、胚における良好な前核可視性、および良好な生殖適応度について選択される。加えて、ハプロタイプは重要な因子である。たとえば、トランスジェニックマウスが製造されるとき、Ｃ５７ＢＬ／６またはＦＶＢ系統等の系統が使用されることが多い（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍｅ．）。系統はそれ自体トランスジェニックであってもよく、且つ／またはノックアウト（たとえば、部分的または完全に抑制されている１つまたは複数の遺伝子を有する動物から得られる）であってもよい。導入遺伝子コンストラクトは、単一の段階の胚に導入されてもよい。接合体が、マイクロインジェクションの好ましい標的である。遺伝子導入のための標的としての接合体の使用は、ほとんどの場合注入されたＤＮＡが第一卵割の前に宿主遺伝子に組み込まれる点において、大きな利点を有する［Brinster et al. (1985) PNAS 82:4438-4442］。通常は、受精胚は、前核が現れるまで好適な培地においてインキュベートされる。この頃には、導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、下に記載するとおり雌性または雄性前核導入されている。いくつかの種、たとえばマウスにおいて、雄性前核が好ましい。外来性遺伝物質が、卵核または接合体雌性前核により処理される前に、接合体の雄性ＤＮＡ相補体に付加されることが最も好ましい。卵核または雌性前核は、おそらくは雄性ＤＮＡのプロタミンをヒストンに置き換えることにより、雄性ＤＮＡ相補体に影響を及ぼす分子を放出し、そのことにより雌性および雄性ＤＮＡ相補体の結合を促進し、二倍体接合体を形成すると考えられている。したがって、外来性遺伝物質は、それが雌性前核の影響を受ける前に、ＤＮＡの雄性相補体またはＤＮＡの任意の他の相補体に付加されるべきである。たとえば、外来性遺伝物質は、雄性前核の形成後にできるだけ早く初期雄性前核に付加され、これは、雄性および雌性前核が十分に分離し、両方が細胞膜に近接して位置するときである。
【０１０４】
あるいは、外来性遺伝物質は、脱凝縮を受けるよう誘導された後の精子核に付加されうる。次に、外来性遺伝物質を含有する精子が卵子に付加されうるか、または脱凝縮された精子が卵子に付加され、その後できるだけ早く導入遺伝子コンストラクトが付加されうる。外来性遺伝物質の核遺伝物質への付加を可能にする任意の手法を、それが細胞、核膜、または他の存在する細胞性もしくは遺伝的構造を破壊しない限り、利用できる。胚への導入遺伝子ヌクレオチド配列の導入は、当技術分野において知られている任意の手段、たとえばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはリポフェクションにより達成されてもよい。外来性遺伝物質は、優先的には、マイクロインジェクションにより核遺伝物質内に挿入される。細胞および細胞構造のマイクロインジェクションは、当技術分野において知られており、使用されている。マウスにおいて、雄性前核は、直径およそ２０マイクロメートルのサイズに到達し、これは、１〜２ｐｌのＤＮＡ溶液の再現性のある注入を可能にする。胚への導入遺伝子ヌクレオチド配列の導入後、胚は、インビトロで様々な時間インキュベートされてもよく、または代理宿主内に再移入されてもよく、またはその両方でもよい。成熟するまでのインビトロインキュベーションは、本発明の範囲内である。常法の１つは、種に応じて、胚をインビトロで約１〜７日間インキュベートするものであり、次にそれらを代理宿主に再移入する。
【０１０５】
代理宿主のトランスジェニック仔は、任意の好適な方法により、導入遺伝子の存在および／または発現についてスクリーニングされてもよい。スクリーニングは多くの場合、導入遺伝子の少なくとも一部と相補的なプローブを使用したサザンブロットまたはノーザンブロット解析により達成される。導入遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体を使用したウエスタンブロット解析が、導入遺伝子産物の存在のスクリーニングの代替的または追加的方法として用いられてもよい。典型的には、ＤＮＡは尾部組織から調製され、サザン解析またはＰＣＲにより導入遺伝子について解析される。あるいは、導入遺伝子を最高レベルで発現すると考えられる組織または細胞が、導入遺伝子の存在および発現について、サザン解析またはＰＣＲを使用して試験されるが、任意の組織または細胞タイプをこの解析について使用できる。
【０１０６】
導入遺伝子の存在を評価するための代替または追加の方法には、好適な生化学的アッセイ、たとえば酵素および／または免疫学的アッセイ、特定のマーカーまたは酵素活性のための組織染色、フローサイトメトリー解析等が含まれるが、これに限られるものではない。血液の解析もまた、血中の導入遺伝子産物の存在を検出するため、ならびに導入遺伝子が様々なタイプの血液細胞および他の血液成分のレベルに与える影響を評価するために有用であってもよい。
【０１０７】
トランスジェニック動物の後代は、トランスジェニック動物を好適なパートナーと交配させることにより、またはトランスジェニック動物から得られる卵および／もしくは精子の体外受精により得られてもよい。パートナーとの交配が実施される場合、パートナーは、トランスジェニックおよび／またはノックアウトであってもなくてもよく、トランスジェニックである場合には、それは同じかもしくは異なる導入遺伝子、または両方を含有していてもよい。あるいは、パートナーは親系統であってもよい。体外受精が使用される場合、受精胚は、代理宿主内に移入されるかもしくはインビトロでインキュベートされるか、またはその両方であってもよい。いずれかの方法を使用して、後代が、上述の方法、または他の適切な方法を使用して導入遺伝子の存在について評価されてもよい。
【０１０８】
本開示の態様はまた、配列番号６３を含むポリヌクレオチド、たとえば細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターに関する。
【０１０９】
さらなる詳述なしに、当業者は上の記載に基づいて、本開示をその最大限の範囲まで利用すると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示的なものとして解釈されるべきであり、本開示の他の部分をいかなる仕方であっても限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての出版物が、本明細書において参照される目的または主題のため、参照により組み込まれる。
【実施例１】
【０１１０】
ＣＭＶプロモーター、ＧＧＧＧＣＣの４、３０、６０、または１２０リピートのいずれかを含有する（ＧＧＧＧＣＣ）伸長モチーフ、およびＨＡ、ＦＬＡＧ、またはＭＹＣタグを含有するコンストラクトを、細胞にトランスフェクトした（図２Ａ）。ポリ（ＧＲ）およびポリ（ＧＰ）タンパク質が、ＧＧＧＧＣＣの３０、６０または１２０リピートを含有するコンストラクトをトランスフェクトした細胞内で生成されることが、ウエスタンブロットにより示された（図２Ｂ）。ＧＧＧＧＣＣの３０、６０または１２０リピートを含有するコンストラクトをトランスフェクトした細胞内でＧＰ−ｆｌａｇ、ＧＲ−ＨＡ、およびＧＡ−Ｍｙｃタンパク質が発現することが、細胞の免疫蛍光を使用してさらに示された（図３）。これらの結果は、ＧＧＧＧＣＣリピート領域が、ＡＵＧ開始コドンから独立に翻訳を開始可能であること（リピート関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳）、ならびに、ポリ（ＧＰ）、ポリ（ＧＲ）、およびポリ（ＧＡ）リピートタンパク質が生成されることを示す。
【０１１１】
ポリ（ＧＲ）配列またはポリ（ＧＲ）リピートタンパク質のＣ末端に対する抗体が生成された。これらの抗体を使用した蛍光染色は、これらの抗体がポリ（ＧＲ）リピートタンパク質を検出可能であることを示した（図４）。
【０１１２】
ポリ（ＧＰ）配列およびポリ（ＧＡ）リピートタンパク質のＣ末端に対する抗体がさらに生成された。次に、抗ポリ（ＧＲ）、抗ポリ（ＧＰ）、および抗ポリ（ＧＡ）Ｃ末端抗体を、Ｃ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳを有する患者または対照からの脳組織の断面を染色するために使用した（図５）。
【０１１３】
次に、Ｃ９ＯＲＦ７２の転写物が、センスおよびアンチセンスの両方の方向に生成されうることが仮定された（図１を参照のこと）。これらのアンチセンス転写物がまた、アンチセンス転写物に存在する５’−ＧＧＣＣＣＣ−３’リピートからさらなるリピートタンパク質を生成するＲＡＮ翻訳を受けうることがさらに仮定された。図６に示すとおり、ポリ（ＰＡ）およびポリ（ＰＲ）タンパク質の両方が、Ｃ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳを有する患者からの脳組織試料において検出可能だったが、対照においては検出可能でなかった。これらの結果は、ジアミノ酸リピート含有タンパク質、たとえばＲＡＮタンパク質が、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座から生成するセンスおよびアンチセンス転写物の両方から生成することを示す。
【０１１４】
図７は、抗ＧＰ抗体（ＧＰ）で検出された凝集体のおよそ２０％がまた、センスＧＰタンパク質の固有のＣ末端に対する抗体（ＧＰ−Ｃ）と共局在化することを示す。罹患した脳に見られるアンチセンス転写物の増加レベルと一貫して、これらの共局在データは、ＧＰジペプチド凝集体の約８０％超がＣ９ＯＲＦ７２アンチセンス転写物から発現することを示唆する。
【０１１５】
加えて、アンチセンス転写物が、対照と比較してＡＬＳを有する対象において劇的に上昇したことが見出された（図１２）。アンチセンス転写物レベルを検出するためのｑＰＣＲアッセイのためのプライマーが、下の表に示される。
【０１１６】
【表５】
2020055827.tif 000034
【０１１７】
さらに、ジアミノ酸リピート含有タンパク質は、ＡＬＳを有する対象の血中（血清および血漿を含む）および脳に存在することが見出された（図９および図１０）が、対照対象には見出されなかった。
【実施例２】
【０１１８】
本開示のいくつかの態様によれば、血中および脳脊髄液（ＣＳＦ）中のジアミノ酸リピート含有タンパク質（たとえばＲＡＮタンパク質）蓄積は、Ｃ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳ／ＦＴＤに実質的に寄与し、プラズマフェレーシスおよび骨髄移植は疾患の進行を止めるであろう。本開示のいくつかの態様によれば、血中および循環ＣＳＦ中のジアミノ酸リピート含有タンパク質蓄積は、脳実質に浸潤し、タンパク質蓄積、神経炎症性変化、ＣＮＳ機能障害および神経細胞死をもたらす。本開示の態様は、以下に部分的に基づく。第一に、血液脳関門（ＢＢＢ）障害がＡＬＳ患者における疾患の初期の特徴であり（４、５）、より高率のＡＬＳおよび他の神経疾患が、外傷性脳損傷を有する患者に見出される（６）。いくつかの実施形態において、理論に束縛されることは望まないが、ＡＬＳは部分的には、ＡＬＳ／ＦＴＤを促進する免疫細胞および他の有害な物質のＣＮＳ侵入を可能にするＢＢＢ破壊により引き起こされる。第二に、本明細書に記載のとおり、ジアミノ酸リピート含有タンパク質が、ＡＬＳ患者血液試料において蓄積することが見出された（図８および図９）。
【０１１９】
プラズマフェレーシスおよび骨髄移植が、過去にＡＬＳのための治療戦略として試験されてきたとはいえ、これらのケースのいずれがＣ９ＯＲＦ７２陽性であったか、または処置が有効であるのに十分な程度早期であったかは明らかではない。したがって、いくつかの実施形態において、ＡＬＳ処置（たとえば、プラズマフェレーシスまたはＢＭＴ）は、対象の血中に正常レベルを超える１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質が検出されるときに開始される。
【０１２０】
Ｃ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳ患者組織および血液におけるジアミノ酸リピート含有タンパク質蓄積に関して本明細書において提示されたデータは、血中（およびおそらくまたＣＳＦ中）ジアミノ酸リピート含有タンパク質の量の減少が、Ｃ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳ患者においてＡＬＳの処置に役立ちうることを示す。本開示のいくつかの態様によれば、減少はたとえば、プラズマフェレーシスまたは骨髄移植を使用して達成されてもよい。
【０１２１】
方法
Ｃ９ＯＲＦ７２ファミリー（ＣＮＳＡ−１）からの遺伝子保持者、および、運動神経細胞疾患もしくは前頭側頭認知機能障害または両方の初期徴候を有する遺伝子陽性患者を含む通院患者について、詳細な評価が実施される。ジアミノ酸リピート含有タンパク質発現は、ＣＮＳＡファミリー試料および医院において回収された追加試料におけるリピート長と相関する。血中のジアミノ酸リピート含有タンパク質発現は、長期的に回収された試料において決定され、疾患発症および臨床的重症度と相関する。これらの方法は、Ｃ９ＯＲＦ７２陽性拡大研究対象におけるジアミノ酸リピート含有タンパク質発現を特徴付け、ジアミノ酸リピート含有タンパク質発現が一生を通じて生じるかまたは加齢とともに増加するかどうか、ならびに、ジアミノ酸リピート含有タンパク質レベルが、疾患重症度と定量的に相関するかどうかを決定することが予測される。
【０１２２】
プラズマフェレーシスは、血中およびＣＳＦ中のより低いジアミノ酸リピート含有タンパク質の量が、疾患の徴候を止めるかどうかを決定するために試験される。プラズマフェレーシスは、疾患の初期徴候を有する５人のＣ９ＯＲＦ７２陽性の個人に対して実施される。各回２リットルの正常ヒトアルブミンとの交換を伴う６回のプラズマフェレーシスを、２週間にわたり実施し、次の６カ月間、毎週１回のプラズマフェレーシスを実施する。この研究は、必要であれば延長できる。一次的な結果尺度は、Ａｐｐｅｌ  ＡＬＳ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ（ＡＡＬＳＲＳ）である。神経学的検査、発話評価、神経心理学的試験、ＡＬＳ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ（ＡＬＳＦＲＳ）、ＥＭＧ、および外側広筋の免疫組織病理学的評価のための針筋生検を含む臨床評価を、疾患進行を評価するために処置期間の直前および直後に実施する。ＲＡＮ翻訳およびＡＴＧ翻訳産物の血清の濃度およびＣＳＦレベルを評価するため、６カ月の処置期間の前後に（または適用可能であれば、延長期間後にも）、静脈穿刺および腰椎穿刺もまた実施する。
【０１２３】
モデル動物における骨髄移植が、血中および脳内のＢＭＴがジアミノ酸リピート含有タンパク質蓄積を予防するかどうかを決定するために試験される。動物の第１のコホートにおいて、脳内のタンパク質凝集体の量が減少するかどうかを試験するため、ＲＡＮＴ陽性マウスからの骨髄が除去され、野生型ドナー骨髄と置き換えられる。実験の並行セットにおいて、ＣＮＳタンパク質蓄積が造血細胞においてのみ導入遺伝子を発現する動物において生じるかどうかを試験するため、ＲＡＮＴ陰性動物に、ＲＡＮＴ陽性骨髄が移植される。処置動物の両方の群が、行動的、機能的および神経病理学的評価の組合せを使用して、野生型および未処置ＲＡＮＴ対照動物と比較される。
【０１２４】
ＲＡＮ翻訳モデルマウスが生成された。６つの終止コドン（各リーディングフレームに２つ）をＣＡＧ伸長突然変異のすぐ上流に含有し、各リーディングフレームにおける３つの別個のエピトープタグが続くコンストラクトを使用して、トランスジェニックマウスが生成された（図１０）。ＣＡＧリピートは、ポリＧｌｎ  ＲＡＮタンパク質を生成し、これは以前はヒトにおける疾患、たとえば脆弱Ｘ染色体症候群と関連付けられていた。ＲＡＮＴモデルマウスはポリＧｌｎ  ＲＡＮタンパク質をもたらし、これは、脳脊髄液に曝露されている脳内の軟膜表面下で高レベルに局在化することが見出された（図１１）。このＲＡＮＴモデルマウスは、実施例２に要約さいた研究において使用される。したがって、ポリアミノ酸リピート含有タンパク質（たとえば、モノまたはジアミノ酸リピート含有タンパク質）の検出は、ポリアミノ酸リピート含有タンパク質と関連付けられる脳障害の危険性の指標でありうる。したがって、本明細書に記載の方法は、他の神経疾患を検出または処置するために使用できる。
【実施例３】
【０１２５】
イントロダクション
これまで同定された家族性ＦＴＤおよびＡＬＳの最も一般的な原因である、ＡＬＳ／ＦＴＤの染色体９ｐ２１関連形態は、染色体９オープンリーディングフレーム７２（Ｃ９０ＲＦ７２）のイントロン１における伸長ＧＧＧＧＣＣ（Ｇ４Ｃ２）ヘキサヌクレオチドリピートにより引き起こされる（１、２）。Ｃ９ＯＲＦ７２突然変異は、家族性ＡＬＳ症例の４０％および散発性ＡＬＳ症例の７％ならびに家族性ＦＴＤ患者の２１％および散発性ＦＴＤ患者の５％に見出される（３）。Ｃ９ＯＲＦ７２伸長の発見は、かなりの興奮をもたらした。なぜならそれは、ＡＬＳおよびＦＴＤを、マイクロサテライト伸長突然変異により引き起こされる大きな疾患群と関連付けるからである（４）。
【０１２６】
従来、予測されるコーディングおよび非コーディング領域に位置するマイクロサテライト伸長突然変異は、タンパク質機能獲得もしくは喪失またはＲＮＡ機能獲得機構により疾患を引き起こすものと考えられていた（４）。タンパク質機能喪失は、Ｃ９０ＲＦ７２起因ＡＬＳ／ＦＴＤの基礎をなすと提案されてきた。なぜなら、伸長突然変異が、変異体１転写物のレベルの減少およびＣ９ＯＲＦ７２タンパク質発現の潜在的減少をもたらすからである（１、２）。加えて、Ｃ９ＯＲＦ７２  Ｇ４Ｃ２伸長突然変異はイントロンに位置するので、Ｃ９関連ＡＬＳ−ＦＴＤは、Ｇ４Ｃ２伸長ＲＮＡが核ＲＮＡ凝集における重要な細胞因子を隔離する毒性ＲＮＡ機能獲得機構の結果であるという仮説を、複数の研究が追求してきた。複数のＧ４Ｃ２ＲＮＡ結合タンパク質が同定されてきたが、これまでのところ、これらの候補のいずれかが、内在性伸長転写物に直接結合するかまたは患者細胞もしくは生検組織内で観察されるＲＮＡ凝集と共局在化することは実証されていない（５〜８）。
【０１２７】
この機構において、ヘアピン形成マイクロサテライト伸長転写物が、ＡＵＧ開始コドンなしに１つまたは複数のリーディングフレームにおいてタンパク質を発現させる（９）。近年様々な名称がこれらのＲＡＮ翻訳タンパク質に帰されてきた（たとえば、ホモポリマー性、ジペプチド、ＲＡＮＴ）一方で、混乱を防止するため、ＡＴＧ開始コドンの非存在下でマイクロサテライト伸長突然変異を通じて発現するすべてのタンパク質を、ＲＡＮタンパク質と呼ぶことが提案される。なぜなら、ＲＡＮ翻訳を受ける追加の伸長突然変異が同定されるからである。
【０１２８】
ここで、ＧＧＣＣＣＣ（Ｇ２Ｃ４）伸長を含有するＣ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳ／ＦＴＤアンチセンス転写物が、核の、そしてまれに細胞質の凝集として、患者の脳内に蓄積したことが示される。加えて、リピートモチーフおよび特異Ｃ末端領域の両方に対する新規な一群の抗体が開発され、センスおよびアンチセンスＲＡＮタンパク質の両方が、Ｃ９ＯＲＦ７２患者ＣＮＳ生検組織に蓄積することが実証された。Ｃ９ＯＲＦ７２患者脳内のアンチセンスＧ２Ｃ４ＲＮＡ凝集および３つの新規アンチセンスＲＡＮタンパク質の発見は、双方向的転写およびＲＡＮ翻訳が、Ｃ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳ／ＦＴＤの基本的な病理学的特徴であることを示唆する。
【０１２９】
結果
Ｃ９ＯＲＦ７２伸長患者におけるアンチセンスＲＮＡ凝集
アンチセンス（ＡＳ）Ｃ９ＯＲＦ７２伸長転写物がＡＳ  Ｇ２Ｃ４ＲＮＡ凝集を形成し、ＲＡＮ翻訳によりまたは短いＡＳオープンリーディングフレーム（ＡＳ−ＯＲＦ）からＡＳタンパク質を発現させるという仮説を試験するため、一連の実験が実施された。まず、イントロン１ｂ、アンチセンスＧ２Ｃ４伸長の５’、およびエクソン１ａにおけるセンスおよびアンチセンス転写物の発現を比較するために、リンカー（ｌｉｎｋｅｒｅｄ）鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ方略を使用して、Ｃ９ＯＲＦ７２アンチセンス転写物が発現することが確認された。イントロン１ｂにおけるアンチセンス鎖について、ＲＴ反応のためにＬＫ−ＡＳＯＲＦ−ＲプライマーならびにアンチセンスｃＤＮＡを特異的に増幅するＰＣＲのためにＡＳＯＲＦ−ＦおよびＬＫを使用して鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲを実施した（図１２Ａ）。同様の方略を、イントロン１ｂの同じ領域からのセンス転写物ならびにエクソン１ａにおけるセンスおよびアンチセンス転写物を増幅するために使用した。イントロン１ｂアンチセンス転写物が、Ｃ９（＋）ＡＬＳ／ＦＴＤ患者からの前頭皮質においてＲＴ−ＰＣＲにより検出されたが、Ｃ９（−）ＡＬＳ／ＦＴＤまたは正常対照からは検出されず（図１２Ｂ）、ｑＲＴ−ＰＣＲは、これらの転写物が６つのＣ９（＋）ＡＬＳ／ＦＴＤ症例の間で劇的に増加することを示す（図１２Ｃ）。対照的に、イントロン１ｂセンス転写物は、前頭皮質においてＲＴ−ＰＣＲにより検出されなかった（図１２Ｂ）。血中では、イントロン１ｂセンスおよびアンチセンス転写物の両方が検出可能であり、イントロン１ｂアンチセンス転写物の劇的なＣ９（＋）上昇は観察されなかった。５’ＲＡＣＥは、イントロン１ｂ  ＡＳ転写がＧ２Ｃ４リピートの２５１〜４５５塩基対（ｂｐ）上流の様々な部位で開始することを示した（図１２Ａ、図１９Ｂ）。対照的に、Ｇ２Ｃ４リピートの４０および９０ｂｐ３’に位置する３’ＧＳＰ１または３’ＧＳＰ２プライマーを使用した３’ＲＡＣＥは、転写物を検出しなかった。これらのデータは、ＡＳ転写物の３’末端が、アンチセンスＧ２Ｃ４リピートの１７０ｂｐ３’に位置するセンスエクソン１ａ領域と重ならないことを示した。この結果と一致して、センス転写物は、エクソン１ａと重なるプライマーを使用した鎖特異的リンカーＲＴ−ＰＣＲにより検出されたが、アンチセンス転写物は検出されなかった（図１２Ｂ）。アンチセンス転写物がＧ２Ｃ４リピート伸長を含むかどうかを決定するため、Ｃｙ３標識化（Ｇ４Ｃ２）４プローブを使用してＲＮＡ蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を実施し、推定アンチセンスＧ２Ｃ４ＲＮＡ凝集を検出する。結果は、核（図１２Ｄ）の、そしてまれに細胞質（図１９Ｃ）のＧ２Ｃ４ＲＮＡ凝集が、Ｃ９（＋）ＡＬＳ前頭皮質において蓄積するが、Ｃ９（−）ＡＬＳ前頭皮質には蓄積しないことを示した。細胞質内の凝集の検出は、アンチセンス伸長転写物が、タンパク質翻訳機構と同じ細胞内コンパートメントに見出されうることを示したのであり、おそらくそこでＲＡＮ翻訳は生じる。末梢組織におけるＲＮＡ凝集は、疾患のバイオマーカーを提供しうるので、末梢血白血球（ＰＢＬ）を検査し、Ｃ９（＋）ＰＢＬにおいてセ��スおよびアンチセンスＲＮＡ凝集の両方が検出されたが、Ｃ９（−）ＰＢＬにおいては検出されなかった（図１２Ｄ、図１９Ｄ）。ＡＳ凝集を検出するＣｙ３−Ｇ４Ｃ２プローブからのＲＮＡ−ＦＩＳＨシグナルが、過度の非標識化Ｇ４Ｃ２オリゴと競合しうるのであり、これらの凝集がＤＮａｓｅ  Ｉに耐性でありＲＮａｓｅ  Ｉ消化に感受性であることが発見された（図１９Ｅ、Ｆ）。まとめると、これはＣ９ＯＲＦ７２アンチセンス転写物がＣ９（＋）ＡＬＳにおいて前頭皮質内で上昇するが、Ｃ９（−）ＡＬＳまたは正常対照においては上昇しないことを示す。Ｃ９（＋）前頭皮質において、核の、そしてまれに細胞質のＲＮＡ凝集において、Ｇ２Ｃ４伸長突然変異を含有するアンチセンス転写物が発現し、蓄積することもまた初めて示された。加えて、センスおよびアンチセンス凝集が血中に蓄積し、容易にアクセスできる組織においてＣ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳ／ＦＴＤの潜在的バイオマーカーを提供することが示された。
【０１３０】
インビトロでのＧＧＣＣＣＣリピート伸長のＲＡＮ翻訳
アンチセンスＧ２Ｃ４伸長がＲＡＮ翻訳を受けるかどうかを試験するため、４０または７０リピートのＧ２Ｃ４伸長およびすべてのリーディングフレームにおけるタンパク質発現［たとえば、３つのフレームにおいて翻訳されたＧ２Ｃ４ＥＸＰ転写物は、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（ＧＰ）、Ｐｒｏ−Ａｌａ（ＰＡ）およびＰｒｏ−Ａｒｇ（ＰＲ）ＲＡＮタンパク質をもたらす］をモニタリングするための３つの異なるＣ末端エピトープ８タグの上流に６Ｘ  ＳＴＯＰコドンカセット（各フレームに２つの停止）を挿入することにより、ＡＴＧ開始コドンを欠いている、三重タグ化Ｇ２Ｃ４ミニ遺伝子、（Ｇ２Ｃ４）ＥＸＰ−３Ｔを生成した（図１３Ａ）。免疫ブロッティングは、２つのエピトープタグ化ＲＡＮタンパク質、ＰＲ−ＭｙｃおよびＧＰ−Ｆｌａｇを検出したが、ＰＡＨＡは検出しなかった（図１３Ｂ）。（ＰＲ）４０−および（ＰＲ）７０−３ｘＭｙｃタンパク質は、それぞれ、およそ２０および２７ｋＤａの予測サイズで移動した。対照的に、（ＧＰ）４０−および（ＧＰ）７０−３ｘＦｌａｇタンパク質は、予測サイズ（１０〜１５ｋＤａ）よりも実質的に高く、それぞれ、５０および７５ｋＤａで移動した（図１３Ｂ）。このブロット上のかすかな低い分子量バンドは、細菌培養中に見られるリピート収縮または翻訳開始位置の差異により生じうる。免疫蛍光（ＩＦ）は、アンチセンスＲＡＮタンパク質が、すべての３つのリーディングフレームにおいて発現することを示した（図１３Ｃ）。ウエスタンブロッティングでは検出されなかったＩＦによるＰＡ−ＨＡの検出は、これらコンストラクトからＲＡＮ  ＰＡ−ＨＡを発現する細胞のより低い頻度により引き起こされうる。加えて、組換えＧＰ−ｆｌａｇおよびＰＡ−ＨＡタンパク質は、細胞質に局在していた一方で、ＰＲ−Ｍｙｃタンパク質は、核および細胞質の両方に分布していた。これらの局在の差異は、このエピトープタグ化コンストラクトにおいて見出されるリピートモチーフまたはＣ末端フランキング配列の異なる特性により生じうる。一連の追加実験においてまた、３０、６０および１２０リピートを含有するセンスＧ４Ｃ２伸長コンストラクトが、ＧＰ−Ｆｌａｇ、ＧＲ−ＨＡおよびＧＡ−Ｍｙｃ  ＲＡＮタンパク質を発現させることが示された（図２０）。要約すると、これらのデータは、組換えＧ２Ｃ４およびＧ４Ｃ２伸長転写物が、６つのすべてのリーディングフレームにおいてＲＡＮタンパク質を発現させることを示した。
【０１３１】
ＲＡＮタンパク質を検出するための二重免疫学的方略
アミノ酸リピートが様々な異なるタンパク質に見出されうるので、二重免疫学的方略を使用し、本明細書に記載の予測されるリピートモチーフまたはそれらに対応する固有のＣ末端領域を認識する抗体を開発した。８つの推定Ｃ９ＯＲＦ７２  ＲＡＮタンパク質を示す概略図を、図１３Ｄおよび図２１に示す。予測されるタンパク質には、６つの推定ＲＡＮタンパク質および追加のＡＴＧ開始Ｎ末端を有する２つの推定タンパク質が含まれる。固有のＣ末端領域は、６つの予測されるリーディングフレームのうちの５つにおいて予測される。インビボでのこれらのタンパク質の蓄積について試験するため、予測されるリピートモチーフまたは利用可能な対応するＣ末端領域に対する一連のポリクローナル抗体を開発した（図１３Ｄ、図２１）。推定アンチセンスタンパク質［ウサギα−ＰＡ、α−ＰＡ−ＣＴ、α−ＰＲ、α−ＰＲ−ＣＴ、α−ＧＰ、α−ＧＰ−ＣＴ（センス）、およびマウスα−ＧＰ］について試験する抗体を生成し、それらの特異性が、ウエスタンブロットおよびＩＦ検出により、エピトープタグ化組換えタンパク質を発現するコンストラクトをトランスフェクトした細胞内で実証された（図１３Ｅ、図２２）。センス方向に発現するリピートおよびＣ末端領域を検出する追加の抗体を、図２３に特徴付ける。
【０１３２】
アンチセンスＧ２Ｃ４ＲＡＮタンパク質は脳内に蓄積する
複数のアプローチを、新規アンチセンス（ＡＳ）タンパク質がＣ９ＯＲＦ７２伸長陽性生検組織において発現するかどうかを決定するために使用した。凝集タンパク質がヒト脳から単離することが困難であるという障害を克服するため、冷凍Ｃ９（＋）およびＣ９（−）ＡＬＳ前頭皮質剖検試料上で連続的タンパク質抽出プロトコル（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）（２３）を使用した。アンチセンスＰＡおよびＰＲタンパク質を、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００不溶性物質、２％ＳＤＳ可溶性抽出物、免疫ドットブロット上のα−ＰＡ、α−ＰＡ−ＣＴ、α−ＰＲ、α−ＰＲ−ＣＴで、Ｃ９（＋）ＡＬＳ患者のサブセットから検出したが、Ｃ９（−）ＡＬＳ患者からは検出しなかった（図１４Ａ）。Ｃ９（＋）ＡＬＳ／ＦＴＤ前頭皮質におけるセンスＲＡＮタンパク質（ＧＰ、ＧＲ、ＧＡ）１０蓄積についての証拠を示す追加の免疫ドットブロットを図２４に示す。α−ＰＡ、α−ＰＲおよびα−ＧＰ抗体もまた、８％ＳＤＳを含有する試料緩衝液におけるペレットの再懸濁後に、Ｃ９（＋）ＡＬＳ前頭皮質試料からの２％ＳＤＳ不溶性画分における高分子量スミアを検出した（２３）（図３Ｂ）。１つまたは複数のバンドとして移動する組換えタンパク質について移動パターンの差異が見られ（図１３Ｂ）、患者組織抽出物において観察されたスミア（図１４Ｂ）は、患者試料および高度に不溶性の凝集体からのそれらの抽出物における、はるかに長いリピート領域によるＲＡＮタンパク質における差異を反映する。免疫組織化学（ＩＨＣ）が、次に、タンパク凝集体が、リピートモチーフに対する抗体（α−ＰＡ、α−ＰＲ、α−ＧＰ）を、ＰＡおよびＰＲリピート領域を越える予測されるＣ末端配列に対する抗体（α−ＰＡ−ＣＴおよびα−ＰＲ−ＣＴ）とともに使用して、Ｃ９（＋）ＡＬＳ／ＦＴＤ剖検組織からの海馬神経細胞の周核体において検出可能であるが、Ｃ９（−）ＡＬＳ患者または対照対象において検出可能でないことを示すために使用された（図１４Ｃ、図２５）。ＧＰリピートモチーフに対する抗体を使用する以前の研究は、センス鎖から発現すると仮定される凝集体を検出した（１０、１１）。ＧＰリピート含有タンパク質が、センスおよびアンチセンス転写物の両方から発現すると予測されることが注目される（図１３Ｄ）。センス方向に、予測されるＲＡＮ  ＧＰタンパク質は、固有のＣ末端（ＣＴ）配列を含有する。対照的に、アンチセンスＧＰタンパク質は、リピートの直後に停止コドンを有する。センスＧＰ  ＲＡＮタンパク質をアンチセンスＧＰタンパク質と識別するため、ウサギα−ＧＰ−ＣＴをセンスＧＰタンパク質のＣＴ領域を検出するために、マウスα−ＧＰをセンスおよびアンチセンスＧＰ伸長タンパク質の両方を検出するために使用して、Ｃ９（＋）ヒト海馬剖検切片上で二重標識ＩＦ実験を実施した。二重標識化は、２つのタイプの封入体を示した。すなわち、ａ）マウスα−ＧＰおよびウサギα−ＧＰ−ＣＴセンスで二重標識化された推定センス封入体ならびに、ｂ）マウスα−ＧＰで単一標識化された推定アンチセンス封入体（図１４Ｄ）。およそ１８％の封入体が、二重標識化でセンスパターンを示し、８２％  １１の封入体が、��ンチセンスパターンを示し、α−ＧＰについて陽性、α−ＧＰ−ＣＴセンスについて陰性であった（図１４Ｅ、Ｆ）。これらのデータは、リピートおよびＣ末端抗体の両方を有するタンパク質凝集体を特徴付けることの重要性を示した。まとめると、これらの結果は、不溶性、凝集体形成アンチセンスＲＡＮタンパク質が、３つのすべてのアンチセンスリーディングフレームから発現することを示す。
【０１３３】
Ｇ２Ｃ４伸長およびＲＡＮタンパク質は、細胞に対して毒性を有する
ＲＡＮ翻訳により発現するアンチセンスＧＰおよびＰＲ  ＲＡＮタンパク質に加えて、２つのアンチセンスリーディングフレームが、ＡＴＧ開始ＧＰおよびＰＲタンパク質（Ｍ−ＧＰＡＳおよびＭ−ＰＲＡＳ）の両方をもたらしうる上流ＡＴＧ開始コドンを有する（図１３Ｄ、図２１）。ＡＴＧ開始コドンの存在が、ＲＡＮ翻訳が３つすべてのリーディングフレームにおいて生じることを阻害しないことが示された（９）。したがって、アンチセンスＧＰおよびＰＲタンパク質は、ＡＵＧ開始および／またはＲＡＮ翻訳の両方により発現してもよい。ＡＴＧ開始コドンがＧ２Ｃ４伸長に関してＲＡＮタンパク質発現に対して有する効果を探究するため、ＡＴＧ開始コドンをＧ２Ｃ４リピートの前に置くことにより、追加のミニ遺伝子コンストラクトを生成した（図１４Ｇ）。ＰＲフレームを、解析のために選択した。なぜなら、ＡＴＧ開始コドンはこのリーティングフレームにおいて天然で生じるからである。ウエスタンブロッティングは、（＋）ＡＴＧ−ＰＲ−３ＴをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、（−）ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔトランスフェクト細胞と比較して、実質的により高いレベルのＰＲタンパク質を発現することを示す（図１４Ｈ）。対照的に、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロッティングは、転写物レベル（図２６Ａ）およびＲＡＮ翻訳ＧＰのレベル（図１４Ｈ）が同等であることを示した。図１３と同様に、ＲＡＮ翻訳ＰＡは、ウエスタンブロッティングにより検出可能ではなかった。次に、細胞生存率に対するこれらコンストラクトの効果を、相補性アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）検出およびメチルチアゾールテトラゾリウム（ＭＴＴ）を使用して試験した。ＬＤＨアッセイについては、（−）ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔまたは（＋）ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔコンストラクトをトランスフェクトした細胞は、ベクター対照細胞と比較して、それぞれ１．９および２．９倍の細胞死の増加を示した（ｐ＝０．００８および０．００１）。加えて、上昇したレベルのＰＲタンパク質を発現する（＋）ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔトランスフェクト細胞は、（−）ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔコンストラクトをトランスフェクトした細胞と比較して１．５倍の細胞１２死の増加を示した（ｐ＝０．０３４）。ＭＴＴアッセイは、同様の結果を示した。（−）ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔおよび＋ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔコンストラクトをトランスフェクトした細胞は、代謝的に活性な細胞の数の劇的な減少を示し、未処置細胞または空ベクター対照と比較してそれぞれ３３％（ｐ＜０．００００１）および４３％（ｐ＜０．００００１）であった（図１４Ｊ）。加えて、（＋）ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔをトランスフェクトした細胞内の上昇したＰＲ発現は、（−）ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔ細胞と比較して有意に低いレベルの代謝活性を有していた（ｐ＜０．０５）。光学顕微鏡細胞分離により、対照細胞と比較して−ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔにおける細胞形態の変化が明白であり、これらの表現型は、上昇したレベルのＰＲを発現する（＋）ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔ細胞において悪化した（図２６Ｂ〜Ｄ）。まとめると、これらのデータは、以下のことを実証した。すなわち、１）Ｇ２Ｃ４伸長突然変異は、細胞に対して毒性を有し、この毒性は、ＤＮ���、Ｇ２Ｃ４ＲＮＡおよび／またはＲＡＮ翻訳ＰＲ、ＧＰまたはＰＡタンパク質の効果により引き起こされうる、２）（＋）ＡＴＧ−ＰＲ−３Ｔコンストラクトをトランスフェクトした細胞内で発現する増加したＰＲタンパク質は、ＤＮＡ、Ｇ２Ｃ４ＲＮＡおよびＲＡＮタンパク質効果により引き起こされるレベルを超えて細胞毒性および細胞死を増加させる。したがって、ＰＲタンパク質は、本質的に細胞に対して毒性を有することが示された。
【０１３４】
６つのすべてのＲＡＮタンパク質が脳内に凝集体を形成する
センスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖の両方からの６つのすべてのＲＡＮタンパク質が、Ｃ９（＋）ＡＬＳ患者において発現するかどうかを決定するため、これらタンパク質のリピート伸長および／またはＣ末端配列に対する９つのポリクローナル抗体を使用して、パラフィン埋込み脳組織の切片上でＩＨＣ染色を実施した。Ｃ９（＋）症例において、豊富な球状および不規則的形状の神経細胞細胞質封入体（ＮＣＩ）が海馬に存在し、その大多数が歯状回およびＣＡ領域の錐体細胞内に存在した。これらＲＡＮ封入体はまた、Ｃ９（＋）運動皮質において検出された（図１５）。α−ＧＰを使用して、海馬において、運動皮質においてと同様に、ＧＰ陽性封入体がすべての検査されたＣ９（＋）症例において検出されたが、Ｃ９（−）症例または正常対照切片においては検出されなかった。１３海馬のＣＡ領域および運動皮質において、凝集体のクラスターが、Ｃ９（＋）症例において、＞２０％の神経細胞において凝集体を伴って、頻繁に見出された（図２７）。より少ない凝集体が、α−ＧＰ−ＣＴセンス抗体を使用して検出され、これは、ほとんどのＧＰ凝集体がＣ９ＯＲＦ７２アンチセンス鎖から翻訳されたことを示した二重標識化実験と一致している（図１４Ｄ〜Ｆ）。ＰＡ封入体が、６つのＣ９（＋）症例のうち４つにおける海馬および２つの運動皮質試料のうち１つに検出された（図２７）。Ｃ９（＋）症例において、ＰＡ封入体の頻度は、ＧＰ封入体と比較して、海馬および運動皮質において有意に低かったが、＞５０％の神経細胞に見出される極度に大きなＰＡ封入体を伴う高強度領域染色（ｈｉｇｈ−ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）が、１人の患者に見出された（図２７）。ＰＲ陽性封入体がまた、検査されたすべてのＣ９（＋）症例における海馬および試験された２つのＣ９（＋）症例のうちの１つにおける運動皮質に見出された。ＰＡ染色と同様に、ＰＲ封入体は、頻度は低いが、強度の高い領域染色が時折観察された。センス方向に、ＧＲ陽性封入体が、検査されたすべてのＣ９（＋）症例において、海馬および運動皮質に見出されたが、ＧＰ凝集体よりも頻度は低いようであった。ＧＡ封入体は、ＩＨＣにより小さな核周囲封入体として海馬および運動皮質において時折検出されたのみであった（図１５、図２７）。様々なタイプの凝集体の頻度の見かけ上の差異は、タンパク質コンフォメーションおよびエピトープ利用可能性の差異または異なるエピトープに対し設計されたこれら抗体の親和性の差異により生じうる。まとめると、このデータは、６つのすべてのＲＡＮタンパク質がＣ９（＋）剖検脳内に凝集体を形成することを示した。
【０１３５】
上位および下位運動神経細胞におけるＲＡＮタンパク質の封入体
ＡＬＳの中心的な特徴は、運動皮質における上位運動神経細胞および脳幹および脊髄における下位運動神経細胞の漸進的な縮退および死である。上位および下位運動神経細胞にＲＡＮタンパク質が蓄積するかどうかを試験するため、センスおよびアンチセンスの両方の方向の予測されるタンパク質に対する９つのすべての抗体を使用してＩＨＣを実施した。Ｃ９（＋）症例において、豊富なＧＰ陽性神経細胞細胞質封入体が、運動皮質のすべての層において見られ、第ＩＩＩ層の錐体神経細胞および第Ｖ層全体において頻度の高いＧＰ凝集体を伴っていた（図１６Ａ）。細胞死および萎縮が第Ｖ層の運動神経細胞の同定を困難にするとはいえ、残りの上位運動神経細胞におけるＧＰ封入体が見出された（図１６Ｂ）。加えて、ＰＡ、ＰＲ、ＧＲおよびＧＡ陽性封入体もまた、運動皮質に見出された（図１５、図２７）。脊髄切片において実施された同様の一連の実験を使用して、検査された３つすべての症例におけるＧＰ凝集体および３人のＣ９（＋）患者のうち２人における下位運動神経細胞の凝集体が検出されたが、Ｃ９（−）ＡＬＳ症例または正常対照においては検出されなかった（図１６Ｃ）。これが、運動神経細胞内のＲＡＮタンパク質蓄積の最初の報告である。上位および下位運動神経細胞の両方におけるＧＰ凝集体の発見は、Ｃ９  ＲＡＮタンパク質蓄積を、ＡＬＳにおいて選択的に脆弱な神経細胞と結び付ける。
【０１３６】
ＲＡＮタンパク質凝集体の高密度クラスター化
センスおよびアンチセンスタンパク質の両方が、Ｃ９ＯＲＦ７２剖検脳の神経細胞内に蓄積した。一般に２つのタイプの凝集パターンが観察された。すなわち、１）単離細胞質凝集体および２）約１０から５０％を超える神経細胞が陽性であった高密度クラスター化細胞質凝集体クラスター化凝集体は、ＧＰについて最も頻度が高く検出され、歯状回（ＤＧ）および海馬のＣＡ１〜４に見出された（図１６Ｄ、Ｅ）。ＤＧにおけるクラスター化ＧＰ凝集体は、ＣＡ領域の大きな細胞質凝集体よりも小さく頻度が低かった。追加のクラスター化ＧＰ凝集体が、海馬の海馬台および前海馬台において、１５運動皮質におけるのと同様に頻繁に見出された。連続切片の免疫染色は、複数のタンパク質が多くの場合同じ領域に見出されることを示した。たとえば、ＰＡ、ＰＲ、ＧＰ、ＧＡおよびＧＲタンパク質についての強度の高いクラスター化染色は、１人のＣ９（＋）患者からの連続切片において前海馬台の同じ領域に見出された（図１６Ｆ、Ｇを参照のこと）。ＰＡについての免疫染色は、いくつかの脳領域が豊富な凝集体を有する一方で、同じ切片の他の領域には相対的に変化がないことを示した。たとえば、図１７Ａは、１人の患者の単一の切片の海馬領域全体にわたるＰＡ封入体の勾配（前海馬台＞海馬台＞ＣＡ１）を示す。この患者におけるＰＡ封入体は、前海馬台（Ｉ）において数が多く（＞５０％の神経細胞）、（ＩＩ）海馬台において中程度であり、ＣＡ１海馬領域（ＩＩＩおよびＩＶ）においてはまれである。この切片に見られる限局的な領域染色と一致して、ＰＡ染色は、同じ患者から採取された海馬組織の別個のブロックからの切片においては検出されなかった。これらのデータは、ＰＡ  ＲＡＮタンパク質の発現が細胞によって可変的であること、または、パーキンソン病のモデルマウスにおいて提案されてきたように、１つの細胞内のＰＡの凝集が隣接する細胞内の凝集をトリガーすることを示す（２４）。次に、このＣ９（＋）症例からの連続切片を、リピートモチーフ（α−ＰＡ、α−ＰＲ、α−ＧＰ、α−ＧＲ）および対応するＣ末端領域（α−ＰＡ−ＣＴ、α−ＰＲ−ＣＴ、α−ＧＰ−ＣＴ、α−ＧＲ−ＣＴ、α−ＧＡ−ＣＴ）の両方に対する抗体が、前海馬台の同じ濃い染色領域（領域Ｉ）において凝集体を検出することを示すために使用した（図１７Ｂ）。これらの結果は、センスおよびアンチセンスＲＡＮタンパク質凝集体の両方が、この領域に蓄積することを示した。リピートモチーフまたは特異的Ｃ末端領域のいずれかを認識する抗体を使用した同様の凝集体の検出は、これらの抗体が、Ｇ２Ｃ４およびＧ４Ｃ２伸長転写物の両方にわたって発現するタンパク質を認識していることを確認し、Ｃ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳ／ＦＴＤにおけるＲＡＮ翻訳の生物学的影響を理解するための新規ツールを提供する。
【０１３７】
論述
Ｃ９ＯＲＦ７２におけるイントロンマイクロサテライト伸長突然変異が、一般的な形態の家族性および散発性ＡＬＳ／ＦＴＤの両方を引き起こすことの発見については、かなりの興奮があった（１、２）。この疾患について検討されている３つの主要な病理学的機構には、ハプロ不全（１、２）、ＲＮＡ機能獲得（５〜８）、およびＲＡＮ翻訳（９、１１〜１３）が含まれる。これまでのところ、この疾患の分子機構を理解しようとする努力は、センス方向のＣ９ＯＲＦ７２伸長突然変異の結果の理解にのみ焦点を当ててきた。本明細書において報告された結果は、Ｃ９ＯＲＦ７２伸長突然変異がまた、アンチセンス方向に発現することを示し、アンチセンスＲＮＡ凝集およびアンチセンスＲＡＮタンパク質がＣ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳ／ＦＴＤに寄与することを示す。本発明者らは、以下のことを初めて示す。すなわち、１）アンチセンスＣ９ＯＲＦ７２はＣ９（＋）剖検組織において上昇するが、センス転写物は上昇しない、２）アンチセンスＧ２Ｃ４伸長転写物は、Ｃ９＋脳内および血中に蓄積するＲＮＡ凝集を形成する、３）ＲＡＮ翻訳が、細胞培養においてアンチセンスＧ２Ｇ４伸長コンストラクト全体にわたり生じる、４）センスおよびアンチセンスＲＡＮタンパク質は、リピートおよびＣ末端抗体の両方に二重免疫学的アプローチを使用して、Ｃ９（＋）剖検脳内に蓄積する、５）ＲＡＮタンパク質凝集体は、上位および下位運動神経細胞に蓄積し、ＲＡＮ翻訳をＡＬＳの重要な病理学的特徴に直接結び付ける。Ｇ４Ｃ２ＲＮＡ凝集がＣ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳ／ＦＴＤ患者組織において蓄積するという初期の報告（１、２）以来、主たる仮説は、Ｇ４Ｃ２センス転写物が、ＤＭ１、ＤＭ２およびＳＣＡ８におけるＭＢＮＬタンパク質の隔離と同様に、ＲＮＡ結合タンパク質を隔離して調節不全にするというものである（４）。複数のグループが、Ｇ４Ｃ２結合タンパク質をすでに報告しており、疾患におけるそれらの潜在的役割を試験している（５〜８）。アンチセンスＧ２Ｃ４凝集がまた患者細胞内に蓄積するという発見は、Ｇ２Ｃ４アンチセンスＲＮＡおよび結合タンパク質が、役割を果たしうることを示す。加えて、Ｃ９（＋）末梢血におけるセンスおよびアンチセンス凝集の発見は、容易にアクセス可能なＣ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳ／ＦＴＤのバイオマーカーとして有用となりうる。センスおよびアンチセンス転写物の両方をモニタリングするバイオマーカーが、特に重要でありうる。なぜなら、一方の鎖の発現を減少させる処置法は、他方の鎖の発現を減少させうるからである。二重免疫学的アプローチを使用して、Ｇ２Ｃ４アンチセンス転写物が、ＲＡＮ翻訳によりおよび／または２つの短いＯＲＦ（Ｍｅｔ−ＡＳ−ＰＲおよびＭｅｔ−ＡＳ−ＧＰ）から新規アンチセンスタンパク質（ＰＡ、ＰＲ、ＧＰ）を発現させることが示された。
【０１３８】
材料および方法
ｃＤＮＡコンストラクト。上流６×Ｓｔｏｐコドンを含有するＣＣＣＧＧＧＧＣＣ（ＧＧＧＧＣＣ）２ＧＧＧＧＣＣＣ（配列番号６４）およびＣＣＣＧＧＧＧＣＣ（ＧＧＧＧＣＣ）２８ＧＧＧＧＣＣＣ（配列番号６５）断片が、合成され、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるｐＩＤＴＳｍａｒｔベクターへとクローニングされた。６×Ｓｔｏｐｓ−（ＧＧＧＧＣＣ）４−３Ｔおよび６×Ｓｔｏｐｓ−（ＧＧＧＧＣＣ）３０−３Ｔコンストラクトが、ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ断片を、三重エピトープを含有するｐｃＤＮＡ３．１ベクターへとサブクローニングすることにより生成された。ＧＧＧＧＣＣリピートのサイズを伸長させるため、ＳｍａＩ／ＸｈｏＩ断片を、ｐｃＤＮＡ−６×Ｓｔｏｐｓ−（ＧＧＧＧＣＣ）ＥＸＰ−３ＴのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ／ＸｈｏＩで平滑末端化したＰｓｐＯＭＩへとサブクローニングした。ｐｃＤＮＡ−６×Ｓｔｏｐ−３Ｔコンストラクト内のＧＧＧＧＣＣリピートの配向を逆転させるため、ＳｍａｌＩ／ＣｌａＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋へとサブクローニングし、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−（ＧＧＧＧＣＣ）ＥＸＰを生成した。ＡｆｅＩ／ＸｈｏＩ断片ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−（ＧＧＧＧＣＣ）ＥＸＰを、ｐｃＤＮＡ−６×Ｓｔｏｐ−３Ｔへとサブクローニングし、ｐｃＤＮＡ−６×Ｓｔｏｐ−（ＧＧＣＣＣＣ）ＥＸＰ−３Ｔコンストラクトを製造した。
【０１３９】
ＲＴ−ＰＣＲ。１）剖検組織における鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ：総ＲＮＡが、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＡＬＳ患者および健常対照の前頭皮質剖検組織および末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から単離される両方の鎖から転写物を検出するため、０．２５μｇの総ＲＮＡから、リンカー鎖特異的リバースプライマーを用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびに鎖特異的フォワードおよびリンカー（ＬＫ）プライマーを用いたＰＣＲを使用して、ｃＤＮＡを生成した。ＰＣＲ反応は、以下のとおり実施された。すなわち、９４℃で３分間、次に、９４℃で４５秒間、５８℃で４５秒間および７２℃で１分間を３５サイクル、続いて７２℃で６分。ＰＣＲ増幅の特異性を検証するため、バンドをクローニングしてシーケンシングした。２）２９３Ｔ細胞における毒性アッセイのためのＲＴ−ＰＣＲ：ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者のプロトコルに従って使用して、細胞からの総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびランダムヘキサマープライマーを使用して逆転写した。異なるＧ４Ｃ２−３ＸＴａｇコンストラクトの発現を、３ｘＴａｇ−Ｆｗおよび３ｘＴａｇ−Ｒｖのプライマーセットを使用してＲＴ−ＰＣＲおよびｑＰＣＲにより解析した。β−アクチン発現を、プライマーセットＡＣＴＢ３およびＡＣＴＢ４を用いて増幅される参照遺伝子として使用した。プライマー配列は、図２７に列挙される。
【０１４０】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。ＭｙＣｙｃｌｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で、ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）およびＡＳＯＲＦ鎖特異的ｃＤＮＡおよびプライマーセットを使用して、２ステップ定量ＰＣＲを実施した。ヒトベータアクチンプライマーＡＣＴＢ３およびＡＴＣＢ４を用い、オリゴｄＴ合成総ｃＤＮＡを鋳型として使用して、対照反応を実施した。２段階ＰＣＲを、三重にされた各試料ｃＤＮＡ／プライマーペアを有する光学９６ウェルプレートにおいて４０サイクル（９５℃３０秒、６０℃３０秒）実施した。最初に各実験Ｃｔ値を、それらのベータアクチンＣｔ値に標準化し、次に健常対象アンチセンスΔΔＣｔに標準化することにより、相対フォールド変化（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅｓ）を生成した。プライマー配列は、図２８に列挙される。
【０１４１】
５’および３’ｃＤＮＡ末端の急速増幅（５’および３’ＲＡＣＥ）。２人のＣ９（＋）ＡＬＳ患者および２人のＣ９（−）ＡＬＳ患者の前頭皮質剖検組織からの４μｇの総ＲＮＡを、５’および３’ＲＡＣＥのために使用した（５’ＲＡＣＥシステムおよび３’ＲＡＣＥ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。５’ＲＡＣＥにおいて、プライマーＡＳＯＲＦ  Ｒを、遺伝子特異的第１鎖ｃＤＮＡ合成のために使用し、ネスト化リバースプライマーは５’ＧＳＰ１および５’ＧＳＰ２である。３’ＲＡＣＥにおいて、ネスト化フォワードプライマーは３’ＧＳＰ１および３’ＧＳＰ２である。３’ＲＡＣＥおよび５’ＲＡＣＥ産物をゲル抽出し、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングし、シーケンシングした。プライマー配列は、図２８に列挙される。
【０１４２】
ポリクローナル抗体の産生。ポリクローナルウサギ抗体を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅにより生成し、ポリクローナルマウス抗体を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＦｌｏｒｉｄａのＩｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＩＣＢＲ）により生成した。センス鎖（ＧＧＧＧＣＣ）において、抗血清を、合成ポリ（ＧＰ）、ポリ（ＧＲ）ペプチドおよび予測されるＧＰ、ＧＲおよびＧＡ  ＲＡＮタンパク質のＣ末端領域に対して産生させた（図２１）。アンチセンス鎖（ＧＧＣＣＣＣ）において、抗血清を、合成ポリ（ＰＡ）、ポリ（ＰＲ）ペプチドおよび予測されるＰＡおよびＰＲ  ＲＡＮタンパク質のＣ末端領域に対して産生させた。アンチセンスおよびセンスタンパク質の両方に対する抗体を生成するために使用されるペプチドならびにウエスタンブロット、免疫蛍光（ＩＦ）および免疫組織化学（ＩＨＣ）のためのそれらの使用は、表Ｓ３に要約される。
【０１４３】
細胞培養およびトランスフェクション。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％胎仔ウシ血清を添加したＤＭＥＭ培地中で培養し、５％  ＣＯ２を含有する湿気のある大気中において３７℃でインキュベートした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従い使用して、ＤＮＡトランスフェクションを実施した。
【０１４４】
ヒト試料。６人のＣ９（＋）ＡＬＳ、５人のＣ９（−）ＡＬＳ対照および１人の正常対照からの試料が含まれる、生化学的および組織学的解析のための冷凍前頭皮質組織試料を、本研究において使用した。加えて、Ｃ９（＋）ＡＬＳ／ＦＴＤおよびＣ９（−）ＡＬＳ／ＦＴＤ症例ならびに正常対照からのパラフィン埋込み固定組織。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、２０００×ｇでの短い遠心分離後の新しく回収された全血の軟膜から単離した。赤血球（ＲＢＣ）を、優先的には、ＲＢＣ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して溶解し除去し、ＰＢＬを遠心分離し、ＰＢＳで一度洗浄し、スライド上で乾燥させた。本研究は、ヘルシンキ宣言を遵守して実施された。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＦｌｏｒｉｄａおよびＪｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの施設内審査委員会が本件球を認可した。筆記されたインフォームドコンセントを参加者または関係者から登録時に得た。
【０１４５】
免疫蛍光。高分子タンパク質の細胞内分布を、トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で免疫蛍光により評価した。細胞を８ウェル組織培養チャンバー上にプレートし、翌日プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で３０分間細胞を固定し、ＰＢＳ中の０．５％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中において１５分間氷上で透過処理した。細胞をＰＢＳ中の１％正常ヤギ血清中で３０分間ブロッキングした。ブロッキング後、細胞を１時間室温で、ウサギ抗Ｍｙｃ（Ａｂｃａｍ）、マウス抗ＨＡ（Ｃｏｖａｎｃｅ）、マウス抗Ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ）、ウサギ抗ＧＲおよびウサギ抗ＧＲ−ＣＴ一次抗体を、１：４００の希釈度で含有するブロッキング溶液中でインキュベートした。スライドをＰＢＳ中で３回洗浄し、１時間室温で、Ｃｙ３にコンジュゲートされたヤギ抗ウサギ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＰＡ）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートされたヤギ抗マウス二次抗体を１：２００の希釈度で含有するブロッキング溶液中でインキュベートした。スライドをＰＢＳ中で３回洗浄し、ＤＡＰＩを含有する封入剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて封入した。
【０１４６】
ＲＮＡ−ＦＩＳＨ。細胞を有するスライドを、ＰＢＳ中の４％ＰＦＡ中で１０分間固定し、前もって冷蔵した７０％エタノール中において３０分間氷上でインキュベートした。２ＸＳＳＣ中の４０％ホルムアミド中での１０分間の再水和後、スライドを、ハイブリダイゼーション溶液（４０％ホルムアミド、２ＸＳＳＣ、１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌ硫酸デキストランおよび１０ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ）を用いて１０分間５５℃でブロッキングし、次に２００ｎｇ／ｍｌ変性ＲＮＡプローブとともにハイブリダイゼーション溶液中において５５℃で２時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、スライドを２ＸＳＳＣ中の４０％ホルムアミドで３回洗浄し、ＰＢＳ中で１回簡単に洗浄した。リポフスチンの自己蛍光を、７０％エタノール中の０．２５％のスーダンブラックＢにより消光させ、スライドを、ＤＡＰＩを含有する封入剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で封入した。ＲＮＡ凝集の特異性を、ＦＩＳＨ検出前にＲＮＡｓｅ（２×ＳＳＣ中１００μｇ／ｍＬ）、ＤＮａｓｅ（ＤＮａｓｅＩ緩衝液中１Ｕ／μｌ）またはプロテアーゼＫ（２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２０ｍＭトリス中１２０μｇ／ｍＬ、ｐＨ７．５）を用いて細胞を処理することにより決定した。処理細胞を、３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回、次に２×ＳＳＣで３回洗浄した。続くＦＩＳＨ検出は、上述のとおり実施した。アンチセンス凝集特異性を、最初にスライドを１０倍過量非標識化（Ｇ４Ｃ２）４オリゴとハイブリダイズさせ、その後Ｇ４Ｃ２−ｃｙ３（アンチセンスプローブ）またはＧ２Ｃ４−ｃｙ３（センスプローブ）とハイブリダイズさせる、標準的ＦＩＳＨ検出を使用して決定した。続く処理および検出は、上述のとおり実施した。
【０１４７】
ウエスタンブロッティング。６ウェル組織培養プレートの各ウェルのトランスフェクト細胞をＰＢＳですすぎ、プロテアーゼ阻害剤カクテルを伴う３００μＬのＲＩＰＡ緩衝液中において４５分間氷上で溶解させた。２１ゲージ針を通過させることによりＤＮＡを剪断した。細胞溶解物を１６，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離し、上清を回収した。細胞溶解物のタンパク質濃度を、タンパク質アッセイ染料試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して決定した。２０マイクログラムのタンパク質を４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で分離し、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。膜を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中の５％粉乳中でブロッキングし、ブロッキング溶液中で抗Ｆｌａｇ（１：２０００）、抗Ｍｙｃ（１：１０００）、抗ＨＡ（１：１０００）、またはウサギポリクローナル抗体（１：１０００）を用いてプローブした。膜を抗ウサギまたは抗マウスＨＲＰコンジュゲート二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともにインキュベートした後に、バンドをＥＣＬプラスＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により視覚化した。患者前頭皮質剖検組織の連続抽出を以下のとおり実施した。すなわち、組織を１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍｇ／ｍｌＤＮａｓｅ  Ｉおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するＰＢＳ中で均質化し、１６，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。上清を回収した。ペレットを２％ＳＤＳ中に再懸濁させ、室温で１時間インキュベートし、次に１６，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。上清を回収し、タンパク質ブロッティングのため、２％ＳＤＳ不溶性ペレットを８％ＳＤＳ、６２．５ｍＭ  トリスＨＣｌ  ｐＨ６．８、１０％グリセロールおよび２０％  ２−メルカプトエタノール中に再懸濁させた（２５）。
【０１４８】
タンパク質スロットブロット。連続抽出からの１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００可溶性画分および２％ＳＤＳ可溶性画分をニトロセルロース膜上に、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ９６ウェル精密濾過システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて真空下で固定化した。膜をＰＢＳ−Ｔにおいて洗浄し、ウエスタンブロッティングと同じプロトコルを使用して、各ウサギポリクローナル抗体（１：２０００）を用いてブロットした。
【０１４９】
免疫組織化学。１０マイクロメートル切片を、キシレン中で脱パラフィンし、等級アルコールにより再水和し、９５〜１００％ギ酸とともに５分間インキュベートし、蒸留水を用いて１０分間洗浄した。クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０中において９０℃で３０分間切片を蒸気処理することによりＨＩＥＲを実施した。非特異的免疫グロブリンをブロッキングするため、無血清ブロック（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を３０分間適用した。ウサギポリクローナル抗体を、無血清ブロック（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）中１：５０００から１：１５，０００の希釈度で適用し、一晩４℃でインキュベートした。結合試薬（ストレプトアビジンおよび／またはアルカリホスファターゼ、Ｃｏｖａｎｃｅ）を３０分間室温で適用した。これらの切片を、３％Ｈ２Ｏ２中で１５分間インキュベートし、内在性ペルオキシダーゼ活性をブリーチした。次に、標識化試薬（ＨＲＰ、Ｃｏｖａｎｃｅ）を３０分間室温で適用した。ペルオキシダーゼ活性をＮｏｖａＲｅｄ基質（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて発達させ、切片をヘマトキシリンで対比染色した。
【０１５０】
細胞毒性アッセイ。すべてのトランスフェクション実験を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従い、６０％細胞コンフルエンスで使用して実施した。５００ｎｇの各ベクターを３５ｍｍウェル中でトランスフェクトさせた。細胞死を、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の指示に従い使用して、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞放出を測定することにより決定した。吸光度は４９０ｎｍで記録され、総ＬＤＨ放出を１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて細胞を溶解させることにより測定した。各実験において、決定は、各実験条件について五重に実施し、平均データを計算した。単一比較のために両側独立スチューデントｔ検定（ｐ＜０．０５）および複数の対になった条件が比較されるときには分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、統計学的有意性を決定した。
【０１５１】
細胞生存率アッセイ。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に９６ウェルプレート中でトランスフェクトし、トランスフェクション４２時間後に、３−（４，５−ジメチチアゾル−．２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを用いて細胞生存率を決定した。ＭＴＴを細胞培養培地に０．５ｍｇ／ｍＬ最終濃度で添加し、４５分間３７℃でインキュベートした。次に、培地除去の際に細胞を１００μＬのＤＭＳＯを用いて溶解し、吸光度を５９５ｎｍで測定した。各実験において、決定は五重に実施される。スチューデントｔ検定（ｐ＜０．０５）を使用して統計学的有意性を決定した。
【実施例４】
【０１５２】
センスおよびアンチセンス転写物の両方がＡＬＳ／ＦＴＤに寄与するという仮説を試験するためのＣ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳのＢＡＣトランスジェニックマウスモデル。
原理：センスおよびアンチセンス転写物を再現するＣ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳ／ＦＴＤモデルマウスは、この疾患のモデリングのために決定的に重要である。ＢＡＣクローンを、約８００Ｇ４Ｃ２リピートを含有するヒト患者から単離した。これらのＢＡＣクローンは、８つの樹立系統を生成するために使用した。これらのマウスはたとえば、以下の問いに答えるために有用である。すなわち、ＲＡＮタンパク質発現およびＲＮＡ機能獲得の両方がＣ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳ／ＦＴＤに寄与するのか？センスおよびアンチセンス機構の両方がＣ９ＯＲＦ７２病原性において重要であるのか？
【０１５３】
アプローチ：約８００ＧＧＧＧＣＣリピートを有する完全ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子プラスフランキング配列を含有するＢＡＣクローンを、ヒト患者から単離し、ｐＣＣ１ＢＡＣ（商標）プラスミド［Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）］内に挿入した。マウスにおける使用のために選択されたＢＡＣインサートは、第９染色体上のヒトゲノム参照配列のｂｐ２７，６２５，４７０から２７，５２７，１３７まで伸長した（図２９）。上の座標は、この患者からの余分なリピートを含まない。ＢＡＣインサートＤＮＡが、いくつかのクローン調製物において約８００リピートを含有することが見出されたが、非常に不安定だった。前核注入を実施し、８つのＦＶＢ樹立系統を生成した。２つの独立系統は伸長突然変異が確認された。マウスにおけるＢＡＣリピートサイズは、約５００リピートであるが、後代間で変化し、マウスコロニーが拡張し、追加のマウス世代が実験室において繁殖すると、サイズが伸びたり縮んだりしうる。ＢＡＣ伸長マウスは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のセンスおよびアンチセンスバージョンの両方を発現した。センスおよびアンチセンスＧＧＧＧＣＣＲＮＡ凝集が、ＧＧＧＧＣＣリピートを有するマウスに存在したが、対照マウスには存在しなかった（図３０〜図３１）。
【０１５４】
少なくとも２つの伸長および２つの対照系統が、詳細な特徴付けのために選択される。行動的特徴付けには、ロータロッド解析、握力、平均台およびオープンフィールド評価が含まれる。センスおよびアンチセンス転写物ならびにＲＡＮタンパク質の分子的特徴付けが、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ、免疫ブロット、免疫組織化学および免疫蛍光により実施される。免疫組織化学、免疫蛍光およびＦＩＳＨ研究は、ＲＮＡ凝集およびＣ９−ＲＡＮタンパク質蓄積の部位を病理学的変化と相関させるために実施される。ＣＮＳ、ＣＳＦ、筋肉、血液および他の組織におけるＲＡＮタンパク質蓄積が、発達中に様々な時点で検査される。
【０１５５】
関連性：これら研究からの結果は、ＲＡＮ翻訳がＣ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳ／ＦＴＤにおいて果たす役割のよりよい理解をもたらすであろう。加えて、これらの研究は、剖検組織においてどのタンパク質が最も頻繁に見出されるのかを決定し、個別のＲＡＮタンパク質の毒性における明白な差異を同定することにより、個別のタンパク質標的の優先順位の決定に役立つであろう。モデル細胞およびマウスからの情報はまた、様々な処置方略の有効性に関する将来の研究について教えてくれるであろう。
【０１５６】
参考文献
【表６】
2020055827.tif 000035
【表７】
2020055827.tif 000036
【表８】
2020055827.tif 000037
【０１５７】
さらなる詳述なしに、当業者は上の記載に基づいて、本開示をその最大限の範囲まで利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示的なものとして解釈されるべきであり、本開示の残りの部分をいかなる仕方であっても限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての出版物が、本明細書において参照される目的または主題のため、参照により組み込まれる。
【０１５８】
他の実施形態
本明細書に開示の特徴のすべてが、任意の組合せで組み合わせられてもよい。本明細書に開示の各特徴は、同じ、等価な、または類似の目的に資する代替的特徴により置き換えられてもよい。したがって、そうでないことが明示的に述べられない限り、開示の各特徴は包括的な一連の等価なまたは類似の特徴の一例にすぎない。
【０１５９】
上の記載から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確認でき、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本開示に様々な変更および修正を、それが様々な用途および条件に適合するように加えることができる。したがって、他の実施形態もまた特許請求の範囲内である。
【図１】
2020055827.tif 000038
【図２】
2020055827.tif 000039
【図３】
2020055827.tif 000040
【図４】
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【図５】
2020055827.tif 000042
【図６】
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【図７】
2020055827.tif 000044
【図８】
2020055827.tif 000045
【図９】
2020055827.tif 000046
【図１０】
2020055827.tif 000047
【図１１】
2020055827.tif 000048
【図１２】
2020055827.tif 000049
【図１３】
2020055827.tif 000050
【図１４−１】
2020055827.tif 000051
【図１４−２】
2020055827.tif 000052
【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５】
2020055827.tif 000069
【図２６−１】
2020055827.tif 000070
【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２７】
2020055827.tif 000073
【図２８】
2020055827.tif 000074
【図２９】
2020055827.tif 000075
【図３０】
2020055827.tif 000076
【図３１】
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【配列表】
2020055827000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月27日(2019.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的な単離抗体を含む、ＡＬＳを処置または予防するための医薬であって、前記抗体は、１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質のレベルの増加を減少または予防する、医薬。
【請求項２】
単離抗体が、表１、２、または３に記載の配列の配列または断片を含む抗原に特異的である、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
単離抗体が、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）ジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的である、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項４】
単離抗体が、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的である、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項５】
単離抗体が、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）ジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的である、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項６】
単離抗体が、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）ジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的である、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項７】
単離抗体が、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）ジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的である、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項８】
単離抗体が、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）ジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的である、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項９】
単離抗体が、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ジアミノ酸リピート含有タンパク質に特異的である、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項１０】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１から９のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１１】
１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質が、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｍｅｔ．．．ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）またはＭｅｔ．．．ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）タンパク質から選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１２】
１つまたは複数のジアミノ酸リピート含有タンパク質が、２つ以上のジアミノ酸リピート含有タンパク質である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の医薬。