(57)【要約】【課題】共通の軽鎖を含むヒトエピトープ結合タンパク質を作製するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件を操作することには依拠せず、その代わりに、より生物学的に理にかなっている手法を使用する組成物および方法を提供する。【解決手段】ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変ドメインを発現する遺伝子改変マウスであって、限定された軽鎖可変レパートリーを有するマウス；親和性成熟したヒト重鎖可変ドメインの多様なレパートリーと結合し、共に発現するヒト軽鎖可変ドメインを生成するための生物系；免疫グロブリン可変ドメインを含む結合タンパク質を作製するための方法であって、限定された免疫グロブリン軽鎖レパートリーを有するマウスを、目的の抗原を用いて免疫するステップ、および、マウスの免疫グロブリン可変領域遺伝子配列を、目的の抗原に特異的に結合する結合タンパク質に使用するステップを含む方法、が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１３日に出願された米国特許出願第１３／７９８，４５５号の利益を、米国特許法§１１９（ｅ）の下で請求し、この出願は、その全体が参照によって本明細書により組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願では、２０１４年３月１３日に「２０１０７９４−０５５０＿ＳＴ２５」という名称のａｓｃｉｉ．ｔｘｔファイルとして電子形式で提出された配列表に言及する。この．ｔｘｔファイルは２０１４年３月１１日に作成されたものであり、サイズは３３ｋｂである。
【０００３】
多様なヒト可変／マウス定常重鎖と結合した共通のヒト可変／マウス定常軽鎖を有する抗体を発現する遺伝子改変マウスが提供される。マウスのＢ細胞のヒト可変領域遺伝子配列からヒト二重特異性抗体を作製するための方法が提供される。
【背景技術】
【０００４】
抗体は、一般には、ホモ二量体重鎖成分を含み、各重鎖単量体は同一の軽鎖と結合している。治療用抗体としてはヘテロ二量体重鎖成分を有する抗体（例えば二重特異性抗体）が望ましい。しかし、二重特異性抗体の重鎖のそれぞれと十分に結合することができる適切な軽鎖成分を有する二重特異性抗体を作製することには問題があることが判明している。
【０００５】
１つの手法では、全ての軽鎖可変ドメインに関する使用統計値を調査し、ヒト抗体において最も頻繁に使用される軽鎖を同定し、その軽鎖をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて特異性が異なる２種の重鎖と対合させることによって軽鎖を選択することができる。
【０００６】
別の手法では、ファージディスプレイライブラリー（例えば、ヒト軽鎖可変領域配列を含むファージディスプレイライブラリー、例えば、ヒトｓｃＦｖライブラリー）における軽鎖配列を観察し、最も一般的に使用される軽鎖可変領域をライブラリーから選択することによって軽鎖を選択することができる。次いで、その軽鎖を２種の異なる目的の重鎖に対して試験することができる。
【０００７】
別の手法では、目的の重鎖の両方の重鎖可変配列をプローブとして使用して軽鎖可変配列のファージディスプレイライブラリーをアッセイすることによって軽鎖を選択することができる。重鎖可変配列の両方と結合する軽鎖をそれらの重鎖に対する軽鎖として選択することができる。
【０００８】
別の手法では、候補軽鎖を重鎖のコグネイト軽鎖とアライメントし、両方の重鎖のコグネイト軽鎖に共通する配列特性により密接にマッチするように軽鎖に改変を行う。免疫原性の機会を最小化する必要がある場合、改変により、既知のヒト軽鎖配列に存在する配列がもたらされ、その結果、タンパク質プロセシングにより免疫原性の可能性を評価するための当技術分野で公知のパラメータおよび方法（すなわち、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏアッセイならびにウェットアッセイ）に基づいて、Ｔ細胞エピトープが生じる可能性が低くなることが好ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の手法は全て、いくつもの先験的な制約、例えば、配列同一性、特定の予め選択された重鎖と結合する能力などを包含するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法に依拠する。当技術分野において、共通の軽鎖を含むヒトエピトープ結合タンパク質を作製するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件を操作することには依拠せず、その代わりに、より生物学的に理にかなっている手法を使用する組成物および方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変ドメインを発現する遺伝子改変マウスであって、限定された軽鎖可変レパートリーを有するマウスが提供される。親和性成熟したヒト重鎖可変ドメインの多様なレパートリーと結合し、共に発現するヒト軽鎖可変ドメインを生成するための生物系が提供される。免疫グロブリン可変ドメインを含む結合タンパク質を作製するための方法であって、限定された免疫グロブリン軽鎖レパートリーを有するマウスを、目的の抗原を用いて免疫するステップ、および、マウスの免疫グロブリン可変領域遺伝子配列を、目的の抗原に特異的に結合する結合タンパク質に使用するステップを含む方法が提供される。方法は、多重特異性抗原結合タンパク質の作製において使用するために適したヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを作製するための方法を含む。
【００１１】
再構成されていないヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントのレパートリーに由来する適切な親和性成熟したヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを選択する遺伝子操作されたマウスであって、親和性成熟したヒト重鎖可変ドメインが、１つのヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントに由来する単一のヒト軽鎖可変ドメインと結合し、共に発現するマウスが提供される。２つのヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントの選択を示す遺伝子操作されたマウスも提供される。種々の態様では、１つまたは２つの遺伝子セグメントはヒトＶκ１−３９およびヒトＶκ３−２０を含む。
【００１２】
ヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントの限定されたレパートリーからヒト軽鎖可変ドメインの限定されたレパートリーまたは単一のヒト軽鎖可変ドメインを発現する遺伝子操作されたマウスが提供される。一部の実施形態では、提供されるマウスは、再構成されて単一の軽鎖を発現する（または２つの軽鎖のいずれかもしくはその両方を発現する）再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子（または２つの再構成された軽鎖可変領域遺伝子）を形成する単一の再構成されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント（または２つのヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント）を含むように遺伝子操作されている。再構成されたヒト軽鎖可変ドメインは、マウスにより選択された複数の親和性成熟したヒト重鎖と対合させることができ、重鎖可変領域は異なるエピトープに特異的に結合する。
【００１３】
ヒト軽鎖可変領域配列の限定されたレパートリーからヒト軽鎖可変ドメインの限定されたレパートリーまたは単一のヒト軽鎖可変ドメインを発現する遺伝子操作されたマウスが提供される。一部の実施形態では、提供されるマウスは、単一の軽鎖の可変領域を発現する（または２つの可変領域のいずれかもしくはその両方を発現する）単一のＶ／Ｊヒト軽鎖配列（または２つのＶ／Ｊ配列）を含むように遺伝子操作されている。可変配列を含む軽鎖は、マウスによりクローン選択された複数の親和性成熟したヒト重鎖と対合させることができ、重鎖可変領域は異なるエピトープに特異的に結合する。
【００１４】
一態様では、ヒトＪ遺伝子セグメント（１つまたは複数のＪＬセグメントから選択される）と共に再構成することが可能であり、免疫グロブリン軽鎖のヒトＶＬドメインをコードする単一のヒト免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）領域遺伝子セグメントを含む遺伝子改変マウスが提供される。別の態様では、それぞれが、ヒトＪ遺伝子セグメント（１つまたは複数のＪＬセグメントから選択される）と共に再構成することが可能であり、免疫グロブリン軽鎖のヒトＶＬドメインをコードする２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む遺伝子改変マウスが提供される。一部の実施形態では、２つのヒトＶＬ遺伝子セグメントはマウスのゲノム内で並列している。一部の実施形態では、２つのヒトＶＬ遺伝子セグメントはマウスのゲノム内の異なる遺伝子座に存在する（例えば、第１の軽鎖対立遺伝子に第１のヒトＶＬセグメント、および第２の軽鎖対立遺伝子に第２のヒトＶＬセグメントを含み、第１のヒトＶＬセグメントと第２のヒトＶＬセグメントが同一ではないヘテロ接合体）。一部の実施形態では、２つのヒトＶＬ遺伝子セグメントはヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである。一実施形態では、ヒトＪＬ遺伝子セグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、およびこれらの対での組合せからなる群から選択される。種々の実施形態では、提供される遺伝子操作されたマウスは、内因性ＶＬ遺伝子セグメントを含有する免疫グロブリン軽鎖を発現することができない。例えば、一部の実施形態では、提供される遺伝子操作されたマウスは、内因性ＶＬ遺伝子セグメントの一部または全部が不活化され、かつ／または除去される遺伝子改変を含有する。
【００１５】
一実施形態では、単一のヒトＶＬ遺伝子セグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、およびＪκ５から選択されるヒトＪＬ遺伝子セグメントに作動可能に連結しており、単一のヒトＶＬ遺伝子セグメントは、軽鎖可変領域遺伝子をコードする配列が形成されるように１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントのいずれかと共に再構成することが可能である。
【００１６】
一実施形態では、提供される遺伝子改変マウスは、免疫グロブリン軽鎖遺伝子が形成されるように再構成することが可能な内因性マウスＶＬ遺伝子セグメントを含まない免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含み、ＶＬ遺伝子座は、軽鎖遺伝子のＶＬ領域をコードするように再構成することが可能な単一のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含有する。特定の実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、提供される遺伝子改変マウスは、免疫グロブリン軽鎖遺伝子が形成されるように再構成することが可能な内因性マウスＶＬ遺伝子セグメントを含まないＶＬ遺伝子座を含み、ＶＬ遺伝子座は、軽鎖遺伝子のＶＬ領域をコードするように再構成することが可能な２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む。いくつかのある特定の実施形態では、２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメント、ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部のある特定の実施形態では、２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントはヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子セグメントである。
【００１７】
一態様では、免疫グロブリン軽鎖のヒトＶＬドメインをコードする単一の再構成された（Ｖ／Ｊ）ヒト免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）領域（すなわち、ＶＬ／ＪＬ領域）を含む遺伝子改変マウスが提供される。別の態様では、マウスは、免疫グロブリン軽鎖のヒトＶＬドメインをコードすることができる２つ以下の再構成されたヒトＶＬ領域を含む。
【００１８】
一実施形態では、ＶＬ領域は、再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊ配列または再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊ配列である。一実施形態では、再構成されたＶＬ／ＪＬ配列のヒトＪＬセグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、およびＪκ５から選択される。特定の実施形態では、ＶＬ領域は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列である。特定の実施形態では、マウスはヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列の両方を有する。
【００１９】
一実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトまたはマウスリーダー配列に作動可能に連結している。一実施形態では、リーダー配列はマウスリーダー配列である。特定の実施形態では、マウスリーダー配列はマウスＶκ３−７リーダー配列である。特定の実施形態では、リーダー配列は、再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントに作動可能に連結している。特定の実施形態では、リーダー配列は、再構成されたヒトＶＬ／ＪＬ配列に作動可能に連結している。
【００２０】
一実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントは、免疫グロブリンプロモーター配列に作動可能に連結している。一実施形態では、プロモーター配列はヒトプロモーター配列である。特定の実施形態では、ヒト免疫グロブリンプロモーターはヒトＶκ３−１５プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントに作動可能に連結している。特定の実施形態では、プロモーターは、再構成されたヒトＶＬ／ＪＬ配列に作動可能に連結している。
【００２１】
一実施形態では、軽鎖遺伝子座は、５’側（ＶＬ遺伝子セグメントの転写方向に対して）がヒト免疫グロブリンプロモーターに隣接し、３’側が、ヒトＪセグメントと共に再構成されたヒトＶＬ遺伝子セグメントに隣接するリーダー配列を含み、内因性マウス軽鎖定常領域（ＣＬ）を含むリバースキメラ軽鎖のＶＬドメインをコードする。特定の実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントはマウスＶκ遺伝子座にあり、マウスＣＬはマウスＣκである。
【００２２】
一実施形態では、軽鎖遺伝子座は、５’側（ＶＬ遺伝子セグメントの転写方向に対して）がヒト免疫グロブリンプロモーターに隣接し、３’側が再構成されたヒトＶＬ領域（ＶＬ／ＪＬ配列）に隣接するリーダー配列を含み、内因性マウス軽鎖定常領域（ＣＬ）を含むリバースキメラ軽鎖のＶＬドメインをコードする。特定の実施形態では、再構成されたヒトＶＬ／ＪＬ配列はマウスカッパ（κ）遺伝子座にあり、マウスＣＬはマウスＣκである。
【００２３】
一実施形態では、改変マウスのＶＬ遺伝子座はκ軽鎖遺伝子座であり、κ軽鎖遺伝子座は、マウスκイントロンエンハンサー、マウスκ３’エンハンサーまたはイントロンエンハンサーと３’エンハンサーの両方を含む。
【００２４】
一実施形態では、マウスは、非機能的な免疫グロブリンラムダ（λ）軽鎖遺伝子座を含む。特定の実施形態では、λ軽鎖遺伝子座は、遺伝子座の１つまたは複数の配列の欠失を含み、１つまたは複数の欠失により、λ軽鎖遺伝子座は、再構成して軽鎖遺伝子を形成することができない。別の実施形態では、λ軽鎖遺伝子座のＶＬ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てが欠失している。
【００２５】
一実施形態では、マウスにより、ヒトＶＬ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異したＶＬドメインを含む軽鎖が作製される。一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶＬ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異したＶＬドメイン、およびマウスＣκ領域を含む。一実施形態では、マウスはλ軽鎖を発現しない。
【００２６】
一実施形態では、遺伝子改変マウスは、ヒトＶＬ領域配列を体細胞超変異させることができる。特定の実施形態では、マウスは、再構成可能であり、ＶＬドメインをコードするヒトＶＬ遺伝子セグメントに由来する再構成された免疫グロブリン軽鎖遺伝子を含む細胞を含み、再構成された免疫グロブリン軽鎖遺伝子は、体細胞変異したＶＬドメインを含む。
【００２７】
一実施形態では、マウスは、マウスＣκと連結した、体細胞変異したヒトＶＬドメインを含む軽鎖を発現する細胞を含み、軽鎖はヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異したＶＨドメインを含む重鎖と結合しており、重鎖はマウス重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。特定の実施形態では、重鎖は、マウスＣＨ１、マウスヒンジ、マウスＣＨ２、およびマウスＣＨ３を含む。特定の実施形態では、重鎖は、ヒトＣＨ１、ヒンジ、マウスＣＨ２、およびマウスＣＨ３を含む。
【００２８】
一実施形態では、マウスは、内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントでの置き換えを含み、ヒトＶＨ遺伝子セグメントはマウスＣＨ領域遺伝子に作動可能に連結しており、その結果、マウスは、ヒトＶＨ遺伝子セグメントを再構成し、ヒトＶＨドメインおよびマウスＣＨを含むリバースキメラ免疫グロブリン重鎖を発現する。一実施形態では、再構成されていないマウスＶＨ遺伝子セグメントの９０−１００％が少なくとも１つの再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントで置き換えられている。特定の実施形態では、内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てが少なくとも１つの再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントで置き換えられている。一実施形態では、置き換えは、少なくとも１９個、少なくとも３９個または少なくとも８０個または８１個の再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントによるものである。一実施形態では、置き換えは、少なくとも１２個の機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも２５個の機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントまたは少なくとも４３個の機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントによるものである。一実施形態では、マウスは、マウスＤＨおよびＪＨセグメントの全ての、少なくとも１つの再構成されていないヒトＤＨセグメントおよび少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＨセグメントでの置き換えを含む。一実施形態では、少なくとも１つの再構成されていないヒトＤＨセグメントは、１−１、Ｄ１−７、１−２６、２−８、２−１５、３−３、３−１０、３−１６、３−２２、５−５、５−１２、６−６、６−１３、７−２７、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＨセグメントは、１、２、３、４、５、６、およびこれらの組合せから選択される。特定の実施形態では、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、１−２、１−８、１−２４、１−６９、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、３−５３、４−３１、４−３９、４−５９、５−５１、６−１ヒトＶＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される。
【００２９】
一実施形態では、マウスは、目的の抗原に特異的に結合する結合タンパク質を発現するＢ細胞を含み、結合タンパク質はヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成またはヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来する軽鎖を含み、細胞は１−６９、２−５、３−１３、３−２３、３−３０、３−３３、３−５３、４−３９、４−５９、および５−５１遺伝子セグメントから選択されるヒトＶＨ遺伝子セグメントの再構成に由来する再構成された免疫グロブリン重鎖遺伝子を含む。一実施形態では、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、１、２、３、４、５、および６から選択されるヒト重鎖ＪＨ遺伝子セグメントと共に再構成される。一実施形態では、１つまたは複数のヒトＶＨおよびＪＨ遺伝子セグメントは、１−１、１−７、１−２６、２−８、２−１５、３−３、３−１０、３−１６、３−２２、５−５、５−１２、６−６、６−１３、および７−２７から選択されるヒトＤＨ遺伝子セグメントと共に再構成される。特定の実施形態では、軽鎖遺伝子は、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つまたはそれ超の体細胞超変異を有する。
【００３０】
一実施形態では、マウスは、２−５／６−６／１、２−５／３−２２／１、３−１３／６−６／５、３−２３／２−８／４、３−２３／３−３／４、３−２３／３−１０／４、３−２３／６−６／４、３−２３／７−２７／４、３−３０／１−１／４、３−３０／１−７／４、３−３０／３−３／３、３−３０／３−３／４、３−３０／３−２２／５、３−３０／５−５／２、３−３０／５−１２／４、３−３０／６−６／１、３−３０／６−６／３、３−３０／６−６／４、３−３０／６−６／５、３−３０／６−１３／４、３−３０／７−２７／４、３−３０／７−２７／５、３−３０／７−２７／６、３−３３／１−７／４、３−３３／２−１５／４、４−３９／１−２６／３、４−５９／３−１６／３、４−５９／３−１６／４、４−５９／３−２２／３、５−５１／３−１６／６、５−５１／５−５／３、５−５１／６−１３／５、３−５３／１−１／４、１−６９／６−６／５、および１−６９／６−１３／４から選択されるＶＨ／ＤＨ／ＪＨ領域を含む再構成された免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列を含むＢ細胞を含む。特定の実施形態では、Ｂ細胞は、マウス重鎖定常領域と融合したヒト免疫グロブリン重鎖可変領域、およびマウス軽鎖定常領域と融合したヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む結合タンパク質を発現する。
【００３１】
一実施形態では、再構成されたヒトＶＬ領域はヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列であり、マウスは、（ｉ）マウスＣＨ、および（ｉｉ）１−２、１−８、１−２４、１−６９、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、３−５３、４−３１、４−３９、４−５９、５−５１、６−１ヒトＶＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択されるヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異したヒトＶＨドメインを含むリバースキメラ重鎖と結合した、（ｉ）ヒトＶＬ／ＪＬ配列に由来するＶＬドメイン、および（ｉｉ）マウスＣＬを含むリバースキメラ軽鎖を発現する。一実施形態では、マウスは、体細胞変異した軽鎖を発現する。一実施形態では、ＣＬはマウスＣκである。特定の実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、２−５、３−１３、３−２３、３−３０、４−５９、５−５１、および１−６９遺伝子セグメントから選択される。特定の実施形態では、体細胞変異したヒトＶＨドメインは、１−１、１−７、２−８、３−３、３−１０、３−１６、３−２２、５−５、５−１２、６−６、６−１３、および７−２７から選択されるＤＨセグメントに由来する配列を含む。特定の実施形態では、体細胞変異したヒトＶＨドメインは、１、２、３、４、５、および６から選択されるＪＨセグメントに由来する配列を含む。特定の実施形態では、体細胞変異したヒトＶＨドメインは、２−５／６−６／１、２−５／３−２２／１、３−１３／６−６／５、３−２３／２−８／４、３−２３／３−３／４、３−２３／３−１０／４、３−２３／６−６／４、３−２３／７−２７／４、３−３０／１−１／４、３−３０／１−７／４、３−３０／３−３／４、３−３０／３−２２／５、３−３０／５−５／２、３−３０／５−１２／４、３−３０／６−６／１、３−３０／６−６／３、３−３０／６−６／４、３−３０／６−６／５、３−３０／６−１３／４、３−３０／７−２７／４、３−３０／７−２７／５、３−３０／７−２７／６、４−５９／３−１６／３、４−５９／３−１６／４、４−５９／３−２２／３、５−５１／５−５／３、１−６９／６−６／５、および１−６９／６−１３／４から選択される再構成されたヒトＶＨ／ＤＨ／ＪＨ配列によりコードされる。
【００３２】
一実施形態では、再構成されたヒトＶＬ領域はヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列であり、マウスは、（ｉ）マウスＣＨ、および（ｉｉ）１−２、１−８、１−２４、１−６９、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、３−５３、４−３１、４−３９、４−５９、５−５１、６−１ヒトＶＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択されるヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異したヒトＶＨを含むリバースキメラ重鎖と結合した、（ｉ）再構成されたヒトＶＬ／ＪＬ配列に由来するＶＬドメイン、および（ｉｉ）マウスＣＬを含むリバースキメラ軽鎖を発現する。一実施形態では、マウスは、体細胞変異した軽鎖を発現する。一実施形態では、ＣＬはマウスＣκである。特定の実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、３−３０、３−３３、３−５３、４−３９、および５−５１遺伝子セグメントから選択される。特定の実施形態では、体細胞変異したヒトＶＨドメインは、１−１、１−７、１−２６、２−１５、３−３、３−１６、および６−１３から選択されるＤＨセグメントに由来する配列を含む。特定の実施形態では、体細胞変異したヒトＶＨドメインは、３、４、５、および６から選択されるＪＨセグメントに由来する配列を含む。特定の実施形態では、体細胞変異したヒトＶＨドメインは、３−３０／１−１／４、３−３０／３−３／３、３−３３／１−７／４、３−３３／２−１５／４、４−３９／１−２６／３、５−５１／３−１６／６、５−５１／６−１３／５、および３−５３／１−１／４から選択される再構成されたヒトＶＨ／ＤＨ／ＪＨ配列によりコードされる。
【００３３】
一実施形態では、マウスは、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列および再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列の両方を含み、マウスは、（ｉ）マウスＣＨ、および（ｉｉ）１−２、１−８、１−２４、１−６９、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、３−５３、４−３１、４−３９、４−５９、５−５１、６−１ヒトＶＨ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択されるヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異したヒトＶＨを含むリバースキメラ重鎖と結合した（ｉ）ヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列に由来するＶＬドメインおよび（ｉｉ）マウスＣＬを含むリバースキメラ軽鎖を発現する。一実施形態では、マウスは、体細胞変異した軽鎖を発現する。一実施形態では、ＣＬはマウスＣκである。
【００３４】
一実施形態では、内因性の再構成されていないマウスＶＨ遺伝子セグメントの９０−１００％が少なくとも１つの再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントで置き換えられている。特定の実施形態では、内因性の再構成されていないマウスＶＨ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てが少なくとも１つの再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントで置き換えられている。一実施形態では、置き換えは、少なくとも１８個、少なくとも３９個、少なくとも８０個または８１個の再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントによるものである。一実施形態では、置き換えは、少なくとも１２個の機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも２５個の機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントまたは少なくとも４３個の再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントによるものである。
【００３５】
一実施形態では、遺伝子改変マウスはＣ５７ＢＬ系統であり、特定の実施形態では、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択される。特定の実施形態では、遺伝子改変マウスは、上述の１２９系統と上述のＣ５７ＢＬ／６系統との混合である。別の特定の実施形態では、マウスは、上述の１２９系統の混合または上述のＢＬ／６系統の混合である。特定の実施形態では、混合の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。
【００３６】
一実施形態では、マウスは、マウスＣκおよび再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列に由来する体細胞変異したヒトＶＬドメインを含む軽鎖、ならびにマウスＣＨおよび１−２、１−８、１−２４、１−６９、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、３−５３、４−３１、４−３９、４−５９、５−５１、および６−１ヒトＶＨ遺伝子セグメントから選択されるヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異したヒトＶＨドメインを含む重鎖を含むリバースキメラ抗体を発現し、マウスは完全マウス抗体を発現せず、完全ヒト抗体も発現しない。一実施形態では、マウスは、内因性マウスκ軽鎖遺伝子セグメントの、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列での置き換えを含み、内因性マウスＶＨ遺伝子セグメンの全てまたは実質的に全ての、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの完全なまたは実質的に完全なレパートリーでの置き換えを含むκ軽鎖遺伝子座を含む。
【００３７】
一態様では、本明細書に記載のマウスに由来する抗原特異的抗体の集団であって、抗体がヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成またはヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来する軽鎖遺伝子を含み、抗体が、１−２、１−３、１−８、１−１８、１−２４、１−４６、１−５８、１−６９、２−５、２−２６、２−７０、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−１６、３−２０、３−２１、３−２３、３−３０、３−３３、３−４３、３−４８、３−５３、３−６４、３−７２、３−７３、４−３１、４−３４、４−３９、４−５９、５−５１、および６−１ヒトＶＨ遺伝子セグメントから選択されるヒトＶＨ遺伝子セグメントの再構成に由来する再構成された免疫グロブリン重鎖遺伝子を含む抗体の集団が提供される。一実施形態では、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、１、２、３、４、５、および６から選択されるヒト重鎖ＪＨ遺伝子セグメントと共に再構成される。特定の実施形態では、軽鎖は、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つまたはそれ超の体細胞超変異を有する。
【００３８】
一実施形態では、軽鎖は、１つ、２つ、３つまたは４つの体細胞超変異を有する。一実施形態では、軽鎖遺伝子は１つまたは２つの変異を有する。種々の実施形態では、軽鎖遺伝子は、その配列にそって多数の変異を受けることができる。
【００３９】
一実施形態では、軽鎖が、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成に由来し、軽鎖は少なくとも１つまたは４つ以下の体細胞超変異を有する。一実施形態では、軽鎖は少なくとも２つの体細胞超変異を含む。一実施形態では、軽鎖は少なくとも３つの体細胞超変異を含む。一実施形態では、軽鎖は少なくとも４つの体細胞超変異を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのそのような体細胞超変異は軽鎖の１つまたは複数のフレームワーク領域（ＦＷ）に存在する。特定の実施形態では、少なくとも１つのそのような体細胞超変異は軽鎖の１つまたは複数の相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）決定領域（ＣＤＲ）に存在する。特定の実施形態では、少なくとも１つのそのような体細胞超変異は軽鎖の１つもしくは複数のＦＷおよび／または１つもしくは複数のＣＤＲに存在する。種々の実施形態では、フレームワーク領域は、フレームワーク１（ＦＷ１）、フレームワーク２（ＦＷ２）、フレームワーク３（ＦＷ３）、および／またはその組合せから選択される。種々の実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、および／またはその組合せから選択される。
【００４０】
一実施形態では、重鎖は１つもしくは複数のＦＷまたは１つもしくは複数のＣＤＲに少なくとも１つの変異を含む。一実施形態では、重鎖は１つまたは複数のＦＷおよび１つまたは複数のＣＤＲに少なくとも１つの変異を含む。一実施形態では、重鎖は１つまたは複数のＦＷおよび１つまたは複数のＣＤＲに少なくとも２つの変異を含む。一実施形態では、重鎖は１つまたは複数のＦＷおよび１つまたは複数のＣＤＲに少なくとも３つの変異を含む。一実施形態では、重鎖は１つまたは複数のＦＷおよび１つまたは複数のＣＤＲに少なくとも４つの変異を含む。一実施形態では、重鎖は１つまたは複数のＦＷおよび１つまたは複数のＣＤＲに少なくとも５つまたは５つ超の変異を含み、特定の実施形態では、重鎖は２つのＦＷに少なくとも５つまたは５つ超の変異を含み、特定の実施形態では、重鎖は１つのＦＷおよび１つのＣＤＲに少なくとも５つまたは５つ超の変異を含む。
【００４１】
一実施形態では、軽鎖はヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成に由来し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５由来の軽鎖の約９％がＦＷ１に存在する少なくとも１つの変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも９％がＦＷ１に存在する１つの変異を含む。一実施形態では、軽鎖はヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成に由来し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５由来の軽鎖の約２５％がＣＤＲ１に存在する少なくとも１つまたは２つ以下の変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも１９％がＣＤＲ１に存在する１つの変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも５％がＣＤＲ１に存在する２つの変異を有する。
【００４２】
一実施形態では、軽鎖はヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成に由来し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５由来の軽鎖の約２０％がＦＷ２に存在する少なくとも１つまたは３つ以下の変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも１７％がＦＷ２に存在する１つの変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも１％がＦＷ２に存在する２つの変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも１％がＦＷ２に存在する３つの変異を有する。
【００４３】
一実施形態では、軽鎖はヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成に由来し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５由来の軽鎖の約１０％がＣＤＲ２に存在する少なくとも１つまたは２つ以下の変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも１０％がＣＤＲ２に存在する１つの変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも１％がＣＤＲ２に存在する２つの変異を有する。
【００４４】
一実施形態では、軽鎖はヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成に由来し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５由来の軽鎖の約２９％がＦＷ３に存在する少なくとも１つまたは４つ以下の変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも２１％がＦＷ３に存在する１つの変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも５％がＦＷ３に存在する２つの変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも２％がＦＷ３に存在する３つの変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも２％がＦＷ３に存在する４つの変異を有する。
【００４５】
一実施形態では、軽鎖はヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成に由来し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５由来の軽鎖の約３７％がＣＤＲ３に存在する少なくとも１つまたは４つ以下の変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも２７％がＣＤＲ３に存在する１つの変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも８％がＣＤＲ３に存在する２つの変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも１％がＣＤＲ３に存在する３つの変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも１％がＣＤＲ３に存在する４つの変異を有する。
【００４６】
一実施形態では、本明細書に記載のマウスに由来する抗原特異的抗体の集団であって、抗体がヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成に由来する軽鎖を含み、Ｖκ１−３９／Ｊκ５由来の軽鎖の約９％がＦＷ１に存在する１つまたは複数の変異を有し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５由来の軽鎖の約２５％がＣＤＲ１に存在する１つまたは複数の変異を有し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５由来の軽鎖の約２０％がＦＷ２に存在する１つまたは複数の変異を有し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５由来の軽鎖の約１０％がＣＤＲ２に存在する１つまたは複数の変異を有し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５由来の軽鎖の約２９％がＦＷ３に存在する１つまたは複数の変異を有し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５由来の軽鎖の約３７％がＣＤＲ３に存在する１つまたは複数の変異を有する抗体の集団が提供される。
【００４７】
一実施形態では、軽鎖はヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成に由来し、重鎖の約３５％がＦＷ１に存在する少なくとも１つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも２５％がＦＷ１に存在する１つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも９％がＦＷ１に存在する２つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも１％がＦＷ１に存在する３つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも１％がＦＷ１に存在する５つ超の変異を有する。
【００４８】
一実施形態では、軽鎖はヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成に由来し、重鎖の約９２％がＣＤＲ１に存在する少なくとも１つまたは４つ以下の変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも９２％がＣＤＲ１に存在する少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも２６％がＣＤＲ１に存在する１つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも４４％がＣＤＲ１に存在する２つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも１９％がＣＤＲ１に存在する３つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも３％がＣＤＲ１に存在する４つの変異を有する。
【００４９】
一実施形態では、軽鎖はヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成に由来し、重鎖の約６６％がＦＷ２に存在する少なくとも１つまたは３つ以下の変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも６６％がＦＷ２に存在する少なくとも１つ、少なくとも２つまたは少なくとも３つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも３５％がＦＷ２に存在する１つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも２３％がＦＷ２に存在する２つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも８％がＦＷ２に存在する３つの変異を有する。
【００５０】
一実施形態では、軽鎖はヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成に由来し、重鎖の約７０％がＣＤＲ２に存在する少なくとも１つまたは４つ以下の変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも７０％がＣＤＲ２に存在する少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つの変異を有し、一実施形態では、少なくとも３４％がＣＤＲ２に存在する１つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも２０％がＣＤＲ２に存在する２つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも１２％がＣＤＲ２に存在する３つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも５％がＣＤＲ２に存在する４つの変異を有する。
【００５１】
一実施形態では、軽鎖はヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成に由来し、重鎖の約９１％がＦＷ３に存在する少なくとも１つまたは５つまでまたはそれ超の変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも９１％がＦＷ３に存在する少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つまたはそれ超の変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも１９％がＦＷ３に存在する１つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも３３％がＦＷ３に存在する２つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも２２％がＦＷ３に存在する３つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも１１％がＦＷ３に存在する４つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも７％がＦＷ３に存在する５つまたはそれ超の変異を有する。
【００５２】
一実施形態では、軽鎖はヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成に由来し、重鎖の約６３％がＣＤＲ３に存在する少なくとも１つまたは２つ以下の変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも６３％がＣＤＲ３に存在する１つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも５４％がＣＤＲ３に存在する１つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも９％がＣＤＲ３に存在する２つの変異を有する。
【００５３】
一実施形態では、本明細書に記載のマウスに由来する抗原特異的抗体の集団であって、抗体がヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成に由来する軽鎖を含み、重鎖の少なくとも３５％がＦＷ１に存在する１つまたは複数の変異を有し、重鎖の約９２％がＣＤＲ１に存在する１つまたは複数の変異を有し、重鎖の約６６％がＦＷ２に存在する１つまたは複数の変異を有し、重鎖の約７０％がＣＤＲ２に存在する１つまたは複数の変異を有し、重鎖の約９１％がＦＷ３に存在する１つまたは複数の変異を有し、重鎖の約６３％がＣＤＲ３に存在する１つまたは複数の変異を有する抗体の集団が提供される。
【００５４】
一実施形態では、軽鎖はヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来し、軽鎖遺伝子は少なくとも１つまたは２つ以下の体細胞超変異を有し、一実施形態では、軽鎖遺伝子は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたはそれ超の体細胞超変異を有する。特定の実施形態では、変異は、軽鎖の１つまたは複数のフレームワーク領域に存在する。特定の実施形態では、変異は、軽鎖の１つまたは複数のＣＤＲ領域に存在する。特定の実施形態では、変異は、軽鎖の１つまたは複数のフレームワーク領域および／または１つまたは複数のＣＤＲ領域に存在する。種々の実施形態では、フレームワーク領域は、フレームワーク１（ＦＷ１）、フレームワーク２（ＦＷ２）、フレームワーク３（ＦＷ３）、および／またはその組合せから選択される。
【００５５】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１由来の軽鎖の約１０％がＦＷ１に存在する少なくとも１つの変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも１０％がＦＷ１に１つの変異を有する。
【００５６】
一実施形態では、軽鎖はヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１由来の軽鎖の約５３％がＣＤＲ１に存在する少なくとも１つまたは２つ以下の変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも２７％がＣＤＲ１に１つまたは複数の変異を有し、一実施形態では、軽鎖の約５４％がＣＤＲ１に存在する１つまたは２つの変異を有する。
【００５７】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１由来の軽鎖の約６％がＦＷ２に存在する少なくとも１つまたは２つ以下の変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも６％がＦＷ２に存在する少なくとも１つの変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも３％がＦＷ２に存在する１つの変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも３％がＦＷ２に存在する２つの変異を有する。
【００５８】
一実施形態では、軽鎖はヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１由来の軽鎖の少なくとも約３％がＣＤＲ２に存在する少なくとも１つの変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも３％がＣＤＲ２に１つの変異を有する。
【００５９】
一実施形態では、軽鎖はヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１由来の軽鎖の約１７％またはそれ超がＦＷ３に存在する少なくとも１つまたは２つ以下の変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも２０％がＦＷ３に存在する１つの変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも１７％がＦＷ３に存在する２つの変異を有する。
【００６０】
一実施形態では、軽鎖はヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１由来の軽鎖の少なくとも４３％がＣＤＲ３に存在する少なくとも１つの変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも４３％がＣＤＲ３に１つの変異を有する。
【００６１】
一実施形態では、本明細書に記載のマウスに由来する抗原特異的抗体の集団であって、抗体がヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来する軽鎖を含み、Ｖκ３−２０／Ｊκ１由来の軽鎖の約１０％が少なくとも存在する１つまたは複数の変異を有し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１由来の軽鎖の約５３％がＣＤＲ１に存在する１つまたは複数の変異を有し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１由来の軽鎖の約６％がＦＷ２に存在する１つまたは複数の変異を有し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１由来の軽鎖の約３％がＣＤＲ２に存在する１つまたは複数の変異を有し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１由来の軽鎖の約３７％がＦＷ３に存在する１つまたは複数の変異を有し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１由来の軽鎖の約４３％がＣＤＲ３に存在する１つまたは複数の変異を有する抗体の集団が提供される。
【００６２】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来し、重鎖の約４３％がＦＷ１に存在する少なくとも１つまたは２つ以下の変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも４１％がＦＷ１に存在する少なくとも１つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の約４１％がＦＷ１に存在する１つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の約２％がＦＷ１に存在する２つの変異を有する。
【００６３】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来し、重鎖の約９２％がＣＤＲ１に存在する少なくとも１つまたは４つ以下の変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも４３％がＣＤＲ１に存在する少なくとも１つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも２５％がＣＤＲ１に存在する少なくとも２つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも１５％がＣＤＲ１に存在する少なくとも３つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも１０％がＣＤＲ１に存在する４つまたはそれ超の変異を有する。
【００６４】
一実施形態では、軽鎖はヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来し、重鎖の約４６％がＦＷ２に存在する少なくとも１つまたは３つ以下の変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも３４％がＦＷ２に存在する少なくとも１つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも１０％がＦＷ２に存在する２つまたはそれ超の変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも２％がＦＷ２に存在する３つまたはそれ超の変異を有する。
【００６５】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来し、重鎖の約８４％がＣＤＲ２に存在する少なくとも１つまたは５つまでまたは５つ超の変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも３９％がＣＤＲ２に存在する１つまたは複数の変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも１８％がＣＤＲ２に存在する２つまたはそれ超の変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも２１％がＣＤＲ２に存在する３つまたはそれ超の変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも３％がＣＤＲ２に存在する４つまたはそれ超の変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも２％がＣＤＲ２に存在する５つまたはそれ超の変異を有する。
【００６６】
一実施形態では、軽鎖はヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来し、重鎖の約９２％がＦＷ３に存在する少なくとも１つまたは５つまでまたは５つ超の変異を有し、一実施形態では、軽鎖の少なくとも２１％がＦＷ３に存在する少なくとも１つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも２０％がＦＷ３に存在する少なくとも２つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも１３％がＦＷ３に存在する少なくとも３つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも２０％がＦＷ３に少なくとも４つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の少なくとも１８％がＦＷ３に少なくとも５つの変異を有する。
【００６７】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来し、重鎖の約７％がＣＤＲ３に存在する少なくとも１つの変異を有し、一実施形態では、重鎖の約７％がＣＤＲ３に１つの変異を有する。
【００６８】
一実施形態では、本明細書に記載のマウスに由来する抗原特異的抗体の集団であって、抗体がヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来する軽鎖を含み、重鎖の約４３％がＦＷ１に存在する１つまたは複数の変異を有し、重鎖の約９２％がＣＤＲ１に存在する１つまたは複数の変異を有し、重鎖の約４６％がＦＷ２に存在する１つまたは複数の変異を有し、重鎖の約８４％がＣＤＲ２に存在する１つまたは複数の変異を有し、重鎖の約９２％がＦＷ３に存在する１つまたは複数の変異を有し、重鎖の約７％がＣＤＲ３に存在する１つまたは複数の変異を有する抗体の集団が提供される。
【００６９】
一態様では、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列から免疫グロブリン軽鎖を発現するマウスであって、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列がマウスの生殖系列に存在し、免疫グロブリン軽鎖がヒト可変配列を含むマウスが提供される。一実施形態では、マウスの生殖系列は、再構成された軽鎖配列を含むマウスのＢ細胞の全てに存在する全ての非代替軽鎖配列と同じＶセグメントおよび同じＪセグメントに由来する再構成された免疫グロブリン軽鎖配列を含む。
【００７０】
一実施形態では、マウスの生殖系列は、機能的な再構成されていない免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメントを欠く。一実施形態では、マウスの生殖系列は、機能的な再構成されていない免疫グロブリン軽鎖Ｊ遺伝子セグメントを欠く。
【００７１】
一実施形態では、マウスの生殖系列は、１つ以下、２つ以下または３つ以下の再構成された（Ｖ／Ｊ）軽鎖配列を含む。
【００７２】
一実施形態では、再構成されたＶ／Ｊ配列はκ軽鎖配列を含む。特定の実施形態では、κ軽鎖配列はヒトκ軽鎖配列である。特定の実施形態では、κ軽鎖配列は、ヒトＶκ１−３９／Ｊ配列、ヒトＶκ３−２０／Ｊ配列、およびこれらの組合せから選択される。特定の実施形態では、κ軽鎖配列はヒトＶκ１−３９／Ｊκ５配列である。特定の実施形態では、κ軽鎖配列はヒトＶκ３−２０／Ｊκ１配列である。
【００７３】
一実施形態では、マウスは、その生殖系列内に、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列に対して５’側のマウスκイントロンエンハンサー、マウスκ３’エンハンサー、およびこれらの組合せから選択される配列をさらに含む。
【００７４】
一実施形態では、マウスは、再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントを含み、前記ＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントは、再構成して重鎖定常遺伝子配列に作動可能に連結した免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列を形成することができる。一実施形態では、マウスは、複数のヒトＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態では、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、内因性マウスＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントをヒトＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントに置き換えている。特定の実施形態では、マウスは、機能的なマウスＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全ての、機能的なヒトＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てでの置き換えを含む。
【００７５】
一実施形態では、マウスは、マウス定常配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。一実施形態では、マウスは、ヒト定常配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
【００７６】
一実施形態では、マウスは、ＣＨ１配列、ヒンジ配列、ＣＨ２配列、ＣＨ３配列、およびこれらの組合せから選択されるマウス配列を含む免疫グロブリン重鎖を発現する。
【００７７】
一実施形態では、マウスは、ＣＨ１配列、ヒンジ配列、ＣＨ２配列、ＣＨ３配列、およびこれらの組合せから選択されるヒト配列を含む免疫グロブリン重鎖を発現する。
【００７８】
一実施形態では、マウスの生殖系列内の再構成された免疫グロブリン軽鎖配列は、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。特定の実施形態では、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座において、マウス軽鎖Ｖ配列およびＪ配列の全てまたは実質的に全てをマウスの生殖系列内の再構成された免疫グロブリン軽鎖配列に置き換えている。
【００７９】
一態様では、単一のヒトＶ遺伝子セグメントおよび単一のヒトＪ遺伝子セグメントから生成される再構成された軽鎖遺伝子を含む非代替軽鎖配列を含む各Ｂ細胞によって特徴付けられるＢ細胞集団を含むマウスであって、マウスの生殖系列内の軽鎖可変配列のみが単一のヒトＶセグメントおよび単一のヒトＪセグメントから生成される再構成された配列であり、再構成された軽鎖遺伝子を含む各Ｂ細胞はコグネイトヒト重鎖可変ドメインをコードする遺伝子をさらに含み、再構成された軽鎖遺伝子は少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つの体細胞超変異を含むマウスが提供される。
【００８０】
一部の実施形態では、成熟Ｂ細胞集団が、各成熟Ｂ細胞が表面上に非代替軽鎖配列を含み、その配列が２つのヒトＶＬ遺伝子セグメントのうちの１つおよび５つ以下のヒトＪＬ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成によって生成する再構成された軽鎖遺伝子を含むという点で特徴付けられるマウスであって、マウスの生殖系列内の軽鎖可変配列（ＶＬＪＬ配列）のみが２つのヒトＶＬ遺伝子セグメントのうちの１つおよび５つ以下のヒトＪＬ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成によって生成する再構成された配列であり、再構成された軽鎖遺伝子を含む各Ｂ細胞がコグネイトヒト重鎖可変ドメインをコードする遺伝子をさらに含み、再構成された軽鎖遺伝子が少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは５つまたはそれ超の体細胞超変異を含むマウスが提供される。一部の実施形態では、再構成された軽鎖遺伝子は、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの体細胞超変異を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のマウスは目的の抗原を用いて免疫されており、一部の実施形態では、成熟Ｂ細胞集団は目的の抗原に結合するＢ細胞が富化されている。
【００８１】
一部の実施形態では、成熟Ｂ細胞集団が、各成熟Ｂ細胞が表面上に非代替軽鎖配列を含み、その配列が２つのヒトＶＬ遺伝子セグメントのうちの１つおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のヒトＪＬ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成によって生成する再構成された軽鎖遺伝子を含という点で特徴付けられるマウスであって、ＶＬ遺伝子セグメントが、同一ではない２つのＶＬ遺伝子セグメントから本質的になり、ＶＬ遺伝子座が、２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のヒトＪＬ遺伝子セグメントを含み、再構成された軽鎖遺伝子を含む各Ｂ細胞が、コグネイトヒト重鎖可変ドメインをコードする遺伝子をさらに含み、再構成された軽鎖遺伝子が、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは５つまたはそれ超の体細胞超変異を含むマウスが提供される。一部の実施形態では、再構成された軽鎖遺伝子は、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの体細胞超変異を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のマウスは目的の抗原を用いて免疫されており、一部の実施形態では、成熟Ｂ細胞集団は目的の抗原に結合するＢ細胞が富化されている。
【００８２】
一態様では、本明細書に記載のマウスに由来する多能性細胞、人工多能性細胞または全能性細胞が提供される。特定の実施形態では、細胞はマウス胚性幹（ＥＳ）細胞である。
【００８３】
一態様では、本明細書に記載のマウスに由来する組織が提供される。一実施形態では、組織は、本明細書に記載のマウスの脾臓、リンパ節または骨髄に由来する。
【００８４】
一態様では、本明細書に記載のマウスに由来する核が提供される。一実施形態では、核は、Ｂ細胞ではない二倍体細胞に由来する。
【００８５】
一態様では、本明細書に記載のマウスから単離されたマウス細胞が提供される。一実施形態では、細胞はＥＳ細胞である。一実施形態では、細胞はリンパ球である。一実施形態では、リンパ球はＢ細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、ヒト遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含むキメラ重鎖、および再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊ配列、再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊ配列、またはこれらの組合せに由来する軽鎖を発現し、重鎖可変ドメインはマウス定常領域と融合しており、軽鎖可変ドメインはマウスまたはヒト定常領域と融合している。
【００８６】
一態様では、本明細書に記載のマウスのＢ細胞を用いて作製されたハイブリドーマが提供される。特定の実施形態では、Ｂ細胞は目的のエピトープを含む免疫原を用いて免疫した本明細書に記載のマウス由来のものであり、Ｂ細胞は目的のエピトープに結合する結合タンパク質を発現し、結合タンパク質は体細胞変異したヒトＶＨドメインおよびマウスＣＨを有し、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１に由来するヒトＶＬドメインおよびマウスＣＬを有する。
【００８７】
一態様では、本明細書に記載のマウスに由来するドナーＥＳ細胞を含むマウス胚が提供される。
【００８８】
一態様では、ベクターの５’および３’マウス相同性アームの配列に関して、転写方向に５’から３’へ、５’マウス相同性アーム、ヒトまたはマウス免疫グロブリンプロモーター、ヒトまたはマウスリーダー配列、および再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択されるヒトＶＬ領域、および３’マウス相同性アームを含むターゲティングベクターが提供される。一実施形態では、５’および３’相同性アームにより、マウスＣκ遺伝子に対して５’側の近位に存在するエンハンサー配列に関して５’側の配列にベクターがターゲティングされる。一実施形態では、プロモーターは、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントプロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターはヒトＶκ３−１５プロモーターである。一実施形態では、リーダー配列はマウスリーダー配列である。特定の実施形態では、マウスリーダー配列はマウスＶκ３−７リーダー配列である。
【００８９】
一態様では、上記の通りであるが、５’マウス相同性アームの代わりに、ヒトまたはマウスプロモーターの５’側に部位特異的リコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ）が隣接し、３’マウス相同性アームの代わりに、ヒトＶＬ領域の３’側にＳＲＲＳが隣接するターゲティングベクターが提供される。
【００９０】
一態様では、リバースキメラ抗体が本明細書に記載のマウスから作製され、リバースキメラ抗体は、ヒトＶＬおよびマウスＣＬを含む軽鎖、およびヒトＶＨおよびマウスＣＨを含む重鎖を含む。
【００９１】
一態様では、抗体を作製するための方法であって、単一細胞において、（ａ）ヒトＣＨ遺伝子配列と融合した、本明細書に記載の免疫したマウスの第１のＶＨ遺伝子配列、（ｂ）ヒトＣＬ遺伝子配列と融合した、本明細書に記載の免疫したマウスのＶＬ遺伝子配列を発現させるステップ、および、（ｃ）細胞を、完全ヒト抗体が発現するのに十分な条件下で維持し、抗体を単離するステップを含む方法が提供される。一実施形態では、細胞は、ヒトＣＨ遺伝子配列と融合した、本明細書に記載の第２の免疫したマウスの第２のＶＨ遺伝子配列を含み、第１のＶＨ遺伝子配列は第１のエピトープを認識するＶＨドメインをコードし、第２のＶＨ遺伝子配列は第２のエピトープを認識するＶＨドメインをコードし、第１のエピトープと第２のエピトープは同一ではない。
【００９２】
一態様では、エピトープ結合タンパク質を作製するための方法であって、本明細書に記載のマウスを、目的のエピトープを含む免疫原に曝露するステップ、マウスを、マウスが目的のエピトープに特異的に結合する免疫グロブリン分子を生成するのに十分な条件下で維持するステップ、および目的のエピトープに特異的に結合する免疫グロブリン分子を単離するステップを含み、エピトープ結合タンパク質が、マウスＣＬおよび再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１由来のヒトＶＬを含む軽鎖と結合した体細胞変異したヒトＶＨおよびマウスＣＨを含む重鎖を含む方法が提供される。
【００９３】
一態様では、第１のエピトープを認識するエピトープ結合タンパク質を発現する細胞であって、（ａ）ヒトヌクレオチド配列であって、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常ドメインｃＤＮＡ配列（例えば、ヒトκ定常ドメインＤＮＡ配列）と（直接またはリンカーを通じて）融合しており、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１に由来するヒトＶＬドメインをコードする、ヒトヌクレオチド配列；および（ｂ）第１のヒトＶＨヌクレオチド配列であって、ヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインｃＤＮＡ配列と（直接またはリンカーを通じて）融合しており、第１のヒトＶＨヌクレオチド配列に由来するヒトＶＨドメインをコードする、第１のヒトＶＨヌクレオチド配列、を含む細胞が提供される。一実施形態では、エピトープ結合タンパク質は、第１のエピトープに、１０−６Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満または１０−１２Ｍ未満の解離定数で結合する。
【００９４】
一実施形態では、細胞は、第２のヒトＶＨドメインをコードする第２のヒトヌクレオチド配列を含み、第２のヒト配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインｃＤＮＡ配列と融合しており（直接またはリンカーを通じて）、第２のヒトＶＨドメインは第１のエピトープを特異的には認識せず（例えば、例えば、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍまたはそれ超の解離定数を示す）、エピトープ結合タンパク質は第１のエピトープおよび第２のエピトープを認識し、第１の免疫グロブリン重鎖および第２の免疫グロブリン重鎖はそれぞれ（ａ）の同一の軽鎖と結合している。
【００９５】
一実施形態では、第２のＶＨドメインは、第２のエピトープに、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満または１０−１２Ｍ未満の解離定数で結合する。
【００９６】
一実施形態では、エピトープ結合タンパク質はヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択される再構成されたヒトＶＬ領域に由来する同一の軽鎖とそれぞれ結合した第１の免疫グロブリン重鎖および第２の免疫グロブリン重鎖を含み、第１の免疫グロブリン重鎖は第１のエピトープに、ナノモル濃度からピコモル濃度の範囲の解離定数で結合し、第２の免疫グロブリン重鎖は第２のエピトープに、ナノモル濃度からピコモル濃度の範囲の解離定数で結合し、第１のエピトープおよび第２のエピトープは同一ではなく、第１の免疫グロブリン重鎖は第２のエピトープに結合しないまたは第２のエピトープにマイクロモル濃度の範囲よりも弱い（例えば、ミリモル濃度範囲の）解離定数で結合し、第２の免疫グロブリン重鎖は第１のエピトープに結合しないまたは第１のエピトープにマイクロモル濃度の範囲よりも弱い（例えば、ミリモル濃度範囲の）解離定数で結合し、第１の免疫グロブリン重鎖のＶＬ、ＶＨのうちの１つまたは複数、および第２の免疫グロブリン重鎖のＶＨが体細胞変異したものである。
【００９７】
一実施形態では、第１の免疫グロブリン重鎖はプロテインＡ結合残基を含み、第２の免疫グロブリン重鎖はプロテインＡ結合残基を欠く。
【００９８】
一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、およびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。
【００９９】
一態様では、ヒトＶＨおよびマウス重鎖定常ドメイン、ヒトＶＬおよびマウス軽鎖定常ドメインを含むリバースキメラ抗体であって、本明細書に記載のマウスを、エピトープを含む免疫原を用いて免疫するステップを含むプロセスによって作製され、また、マウスを免疫した免疫原のエピトープに特異的に結合するリバースキメラ抗体が提供される。一実施形態では、ＶＬドメインは体細胞変異したものである。一実施形態では、ＶＨドメインは体細胞変異したものである。一実施形態では、ＶＬドメインとＶＨドメインはどちらも体細胞変異したものである。一実施形態では、ＶＬはマウスＣκドメインに連結している。
【０１００】
一態様では、マウスであって、内因性マウス重鎖遺伝子座における全てまたは実質的に全てのマウスＶＨ遺伝子セグメントのヒトＶＨ遺伝子セグメントでの置き換え；全てのマウス軽鎖遺伝子セグメントの、再構成されたＶκ１−３９／Ｊおよび再構成されたＶκ３−２０／Ｊまたはこれらの組合せから選択される１つ以下または２つの再構成されたヒト軽鎖ＶＬ／ＪＬ配列での置き換えを含み、ヒト重鎖可変遺伝子セグメントがマウス定常遺伝子に連結しており、再構成されたヒト軽鎖配列がヒトまたはマウス定常遺伝子に連結しているマウスが提供される。
【０１０１】
一部の実施形態では、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、全てまたは実質的に全てのマウス免疫グロブリンＶＨ遺伝子セグメントをえるヒト免疫グロブリンＶＨ遺伝子セグメント；全てのマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントを置き換える２つ以下の再構成されていないヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）の再構成されていないヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントまたは５つのヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントを含むマウスであって、ヒト免疫グロブリンＶＨ遺伝子セグメントがマウス免疫グロブリン定数遺伝子に連結しており、再構成されていないヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントおよびヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントがヒトまたは非ヒト免疫グロブリン定数遺伝子に連結しているマウスが提供される。一部の実施形態では、非ヒト定数遺伝子はマウス免疫グロブリン定数遺伝子である。一部の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン定数遺伝子はラット免疫グロブリン定数遺伝子である。
【０１０２】
一態様では、マウスＥＳ細胞は、全てまたは実質的に全てのマウス重鎖可変遺伝子セグメントのヒト重鎖可変遺伝子セグメントでの置き換え、および１つ以下または２つの再構成されたヒト軽鎖ＶＬ／ＪＬ配列を含み、ヒト重鎖可変遺伝子セグメントはマウス免疫グロブリン重鎖定常遺伝子に連結しており、再構成されたヒト軽鎖ＶＬ／ＪＬ配列はマウスまたはヒト免疫グロブリン軽鎖定常遺伝子に連結している。特定の実施形態では、軽鎖定常遺伝子はマウス定常遺伝子である。
【０１０３】
一部の実施形態では、全てまたは実質的に全てのマウス免疫グロブリンＶＨ遺伝子セグメントの、ヒト免疫グロブリンＶＨ遺伝子セグメントおよび２つ以下の再構成されていないヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）の再構成されていないヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントでの置き換えを含むマウスＥＳ細胞であって、ヒト免疫グロブリンＶＨ遺伝子セグメントがマウス免疫グロブリン重鎖定常遺伝子に連結しており、再構成されていないヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントおよびヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントが非ヒトまたはヒト免疫グロブリン軽鎖定常遺伝子に連結しているマウスＥＳ細胞が提供される。一部のある特定の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常遺伝子はマウス免疫グロブリン定数遺伝子である。一部のある特定の実施形態では、マウスは、５つの再構成されていない免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントを含む。
【０１０４】
一部の実施形態では、構造が図１９の参照構造の軽鎖遺伝子座とは、少なくとも１つ、一部の実施形態では全てのマウスＶＬ遺伝子セグメントが１つのヒトＶＬ遺伝子セグメントまたは２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントで置き換えられているという点で異なる軽鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。一部の実施形態では、マウスのヒトＶＬ遺伝子セグメントは、抗体の免疫グロブリンＶＬドメインをコードするように２つまたはそれ超のヒトＪＬ遺伝子セグメントのうちの１つへと再構成することが可能である。一部の実施形態では、本明細書に記載のマウスの軽鎖遺伝子座のヒトＶＬ遺伝子セグメント（複数可）は、２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のヒトＪＬ遺伝子セグメントに作動可能に連結している。
【０１０５】
一部の実施形態では、構造が図１９の参照構造の軽鎖遺伝子座とは、内因性ＶＬ遺伝子セグメントをコードする再構成前のヌクレオチド配列を含有しないという点で異なる軽鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。一部の実施形態では、構造が図１９の参照構造の軽鎖遺伝子座とは、内因性ＪＬ遺伝子セグメントをコードする再構成前のヌクレオチド配列を含有しないという点で異なる軽鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。一部の実施形態では、構造が図１９の参照構造の軽鎖遺伝子座とは、内因性ＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントをコードする再構成前のヌクレオチドを含有しないという点で異なる軽鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。
【０１０６】
一部の実施形態では、構造が図１９の参照構造の軽鎖遺伝子座とは、内因性ＶＬ遺伝子セグメントをコードする再構成後のヌクレオチド配列を含有しないという点で異なる軽鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。一部の実施形態では、構造が図１９の参照構造の軽鎖遺伝子座とは、内因性ＪＬ遺伝子セグメントをコードする再構成後のヌクレオチド配列を含有しないという点で異なる軽鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。一部の実施形態では、構造が図１９の参照構造の軽鎖遺伝子座とは、内因性ＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントをコードする再構成後のヌクレオチド配列を含有しないという点で異なる軽鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。
【０１０７】
一部の実施形態では、構造が図１９の参照構造の軽鎖遺伝子座とは、再構成前の２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のヒトＪＬ遺伝子セグメントを含有するという点で異なる軽鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。一部の実施形態では、構造が図１９の参照構造の軽鎖遺伝子座とは、再構成前の２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪＬ遺伝子セグメントを含有するという点で異なる軽鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。
【０１０８】
一部の実施形態では、構造が図１９の参照構造の軽鎖遺伝子座とは、再構成後の２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび５つまたはそれ未満（例えば、５つ、４つ、３つ、２つまたは１つ）のヒトＪＬ遺伝子セグメントを含有するという点で異なる軽鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。一部の実施形態では、構造が図１９の参照構造の軽鎖遺伝子座とは、再構成後の２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのヒトＪＬ遺伝子セグメントを含有するという点で異なる軽鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。
【０１０９】
一部の実施形態では、構造が図１９の参照構造の軽鎖遺伝子座とは、再構成後の１つのヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび５つまたはそれ未満（例えば、５つ、４つ、３つ、２つまたは１つ）のヒトＪＬ遺伝子セグメントを含有するという点で異なる軽鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。一部の実施形態では、構造が図１９の参照構造の軽鎖遺伝子座とは、再構成後の１つのヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのヒトＪＬ遺伝子セグメントを含有するという点で異なる軽鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。
【０１１０】
種々の実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよびヒトＪＬ遺伝子セグメントはヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントである。種々の実施形態では、ヒトＶκセグメントは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントから選択される。一部の実施形態では、ヒトＶκセグメントはヒトＶκ１−３９およびヒトＶκ３−２０である。一部の実施形態では、ヒトＪκセグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される。一部の実施形態では、ヒトＪκ遺伝子セグメントはヒトＪκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、およびＪκ５である。
【０１１１】
一部の実施形態では、構造が図１９の参照構造の軽鎖遺伝子座とは、再構成前の図１、図２、図３または図９の構造の軽鎖遺伝子座と実質的に同じ構造を含有するという点で異なる軽鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。一部の実施形態では、構造が再構成前の図１、図２、図３または図９の構造と同一である軽鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。
【０１１２】
一態様では、本明細書に記載のマウスにより作製される抗原結合タンパク質が提供される。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、マウス定常領域と融合したヒト免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来するヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、当該軽鎖定常領域はマウス定常領域である。
【０１１３】
一態様では、本明細書に記載のマウス由来の免疫グロブリン可変領域遺伝子配列から生じる完全ヒト抗原結合タンパク質であって、本明細書に記載のマウスの配列に由来するヒト可変領域を含む完全ヒト重鎖、およびＶκ１−３９またはＶκ３−２０を含む完全ヒト軽鎖を含む抗原結合タンパク質が提供される。一実施形態では、軽鎖可変領域は、１つ〜５つの体細胞変異を含む。一実施形態では、軽鎖可変領域は、マウスのＢ細胞において重鎖可変領域と対合させているコグネイト軽鎖可変領域である。
【０１１４】
一実施形態では、完全ヒト抗原結合タンパク質は第１の重鎖および第２の重鎖を含み、第１の重鎖および第２の重鎖は、それぞれ独立に、本明細書に記載のマウスに由来する同一でない可変領域を含み、第１の重鎖および第２の重鎖のそれぞれがＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来するヒト軽鎖と結合して宿主細胞から発現する。一実施形態では、第１の重鎖は第１の抗原の第１のエピトープに特異的に結合する第１の重鎖可変領域を含み、第２の重鎖は第２の抗原の第２のエピトープに特異的に結合する第２の重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、第１の抗原と第２の抗原は異なる。特定の実施形態では、第１の抗原と第２の抗原は同じであり、第１のエピトープと第２のエピトープは同一ではなく、特定の実施形態では、第１のエピトープに結合タンパク質の第１の分子が結合することにより第２のエピトープへの結合タンパク質の第２の分子の結合は遮断されない。
【０１１５】
一態様では、本明細書に記載のマウスのヒト免疫グロブリン配列に由来する完全ヒト結合タンパク質は、第１の免疫グロブリン重鎖および第２の免疫グロブリン重鎖を含み、第１の免疫グロブリン重鎖は第２の免疫グロブリン重鎖の可変領域と同一ではない第１の可変領域を含み、また、第１の免疫グロブリン重鎖は野生型プロテインＡ結合決定基を含み、第２の重鎖は野生型プロテインＡ結合決定基を欠く。一実施形態では、第１の免疫グロブリン重鎖は単離条件下でプロテインＡに結合し、第２の免疫グロブリン重鎖はプロテインＡに結合しないまたは第１の免疫グロブリン重鎖が単離条件下でプロテインＡに結合するよりも少なくとも１０分の１、１００分の１または１０００分の１の弱さでプロテインＡに結合する。特定の実施形態では、第１の重鎖および第２の重鎖はＩｇＧ１アイソタイプであり、第２の重鎖は９５Ｒ（ＥＵ４３５Ｒ）、９６Ｆ（ＥＵ４３６Ｆ）、およびこれらの組合せから選択される改変を含み、第１の重鎖はそのような改変を欠く。
【０１１６】
一態様では、二重特異性抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、本明細書に記載の第１のマウスを第１のエピトープを含む目的の第１の抗原に曝露するステップ、本明細書に記載の第２のマウスを第２のエピトープを含む目的の第２の抗原に曝露するステップ、第１および第２のマウスにそれぞれ目的の抗原に対する免疫応答を開始させるステップ、第１のマウスにおいて目的の第１の抗原の第１のエピトープに結合する第１のヒト重鎖可変領域を同定するステップ、第２のマウスにおいて目的の第２の抗原の第２のエピトープに結合する第２のヒト重鎖可変領域を同定するステップ、目的の第１の抗原の第１のエピトープに結合する第１の重鎖をコードする第１の完全ヒト重鎖遺伝子を作製するステップ、目的の第２の抗原の第２のエピトープに結合する第２の重鎖をコードする第２の完全ヒト重鎖遺伝子を作製するステップ、第１の重鎖および第２の重鎖をヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する単一の完全ヒト軽鎖を発現する細胞において発現させて二重特異性抗原結合タンパク質を形成するステップ、および二重特異性抗原結合タンパク質を単離するステップを含む方法が提供される。
【０１１７】
一実施形態では、第１の抗原および第２の抗原は同一ではない。
【０１１８】
一実施形態では、第１の抗原および第２の抗原は同一であり、第１のエピトープと第２のエピトープは同一ではない。一実施形態では、第１の重鎖可変領域が第１のエピトープに結合することにより第２の重鎖可変領域の第２のエピトープへの結合は遮断されない。
【０１１９】
一実施形態では、ヒト軽鎖は、第１の重鎖と対合させている場合には第１の抗原の第１のエピトープに特異的に結合し、第２の重鎖と対合させている場合には第２の抗原の第２のエピトープに特異的に結合する。
【０１２０】
一実施形態では、第１の抗原は可溶性抗原および細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原）から選択され、第２の抗原は細胞表面受容体を含む。特定の実施形態では、細胞表面受容体は免疫グロブリン受容体である。特定の実施形態では、免疫グロブリン受容体はＦｃ受容体である。一実施形態では、第１の抗原と第２の抗原は同じ細胞表面受容体であり、第１の重鎖が第１のエピトープに結合することにより第２の重鎖の第２のエピトープへの結合は遮断されない。
【０１２１】
一実施形態では、軽鎖の軽鎖可変ドメインは２つ〜５つの体細胞変異を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、第１の免疫したマウスまたは第２の免疫したマウスのＢ細胞において第１の重鎖可変ドメインまたは第２の重鎖可変ドメインのいずれかと共に発現する体細胞変異したコグネイト軽鎖である。一実施形態では、細胞の軽鎖は生殖系列配列を含む。
【０１２２】
一実施形態では、第１の完全ヒト重鎖はプロテインＡに対するその親和性を低下させるアミノ酸の改変を有し、第２の完全ヒト重鎖はプロテインＡに対するその親和性を低下させる改変を含まない。
【０１２３】
一態様では、第１および第２の抗原に特異的に結合する二重特異性抗体を調製する方法であって、（ａ）第１の抗原に対して特異的である第１のヒト重鎖可変（ＶＨ）ドメインをコードする第１の核酸配列を同定するステップ；（ｂ）第２の抗原に対して特異的である第２のヒト重鎖可変（ＶＨ）ドメインをコードする第２の核酸配列を同定するステップ；（ｃ）（ａ）のＶＨ領域と対合させている場合には第１の抗原に特異的に結合し、（ｂ）のＶＨ領域と対合させている場合には第２の抗原に特異的に結合するヒト軽鎖可変（ＶＬ）領域をコードする第３の核酸配列をもたらすステップ；（ｄ）第１の核酸配列、第２の核酸配列、および第３の核酸配列を含む宿主細胞を培養して、第１のヒトＶＨ領域および第２のヒトＶＨ領域およびヒトＶＬ領域を発現させて二重特異性抗体を形成するステップ；ならびに（ｄ）前記二重特異性抗体を回収するステップを含む方法が提供される。種々の態様では、第１および第２の抗原は互いに異なる。種々の態様では、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、マウスの生殖系列内にある再構成された免疫グロブリン軽鎖配列からヒト免疫グロブリンＶＬ領域を発現する免疫したマウスから単離される。
【０１２４】
一実施形態では、ヒトＶＬ領域は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む再構成されたヒト軽鎖配列に由来する。特定の実施形態では、再構成されたヒト軽鎖配列は生殖系列配列である（すなわち、Ｖ遺伝子セグメント配列内に体細胞超変異を含まない）。
【０１２５】
一実施形態では、第３の核酸配列は、マウスの生殖系列内の再構成された免疫グロブリン軽鎖配列からヒト免疫グロブリンＶＬ領域を発現するマウスから単離される。一実施形態では、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列はヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態では、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列はヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントを含む。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンＶＬ領域は改変された内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から発現する。
【０１２６】
一実施形態では、第１および第２の抗原は１つの分子上に存在する。一実施形態では、第１および第２の抗原は異なる分子上に存在する。種々の実施形態では、第１または第２の核酸配列は、コードされる重鎖のプロテインＡに対するその親和性を低下させる改変を含む。
【０１２７】
一実施形態では、第１の核酸配列または第２の核酸配列は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ５−５１、およびＶＨ６−１から選択されるヒト重鎖遺伝子セグメントを含む再構成されたヒト重鎖可変領域配列を含む。特定の実施形態では、重鎖遺伝子セグメントはＶＨ２−５、ＶＨ３−２３またはＶＨ３−３０である。
【０１２８】
一態様では、第１および第２の抗原に特異的に結合する二重特異性抗体を調製する方法であって、（ａ）第１の抗原に対して特異的である第１のヒト重鎖可変（ＶＨ）ドメインをコードする第１の核酸配列を同定するステップ；（ｂ）第２の抗原に対して特異的である第２のヒト重鎖可変（ＶＨ）ドメインをコードする第２の核酸配列を同定するステップ；（ｃ）（ａ）のＶＨ領域と対合させている場合には第１の抗原に特異的に結合し、（ｂ）のＶＨ領域と対合させている場合には第２の抗原に特異的に結合するヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来するヒト軽鎖可変（ＶＬ）領域をコードする第３の核酸配列をもたらすステップ；（ｄ）第１の核酸配列、第２の核酸配列、および第３の核酸配列を含む宿主細胞を培養して、第１のヒトＶＨ領域および第２のヒトＶＨ領域およびヒトＶＬ領域を発現させて二重特異性抗体を形成するステップ；ならびに（ｄ）前記二重特異性抗体を回収するステップを含む方法が提供される。種々の態様では、第１の抗原と第２の抗原は互いに異なる。種々の態様では、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する再構成された免疫グロブリン配列由来のヒト免疫グロブリンＶＬ領域を発現する免疫したマウスから第１の核酸配列および第２の核酸配列を単離し、また、当該再構成されたヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはＶκ３−３０遺伝子セグメントはマウスの生殖系列内にある。
【０１２９】
一実施形態では、第３の核酸配列は生殖系列配列である（すなわち、Ｖ遺伝子セグメント配列内に体細胞超変異を含まない）。一実施形態では、第３の核酸配列は、マウスの生殖系列内の再構成された免疫グロブリン軽鎖配列からヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来するヒト免疫グロブリンＶＬ領域を発現するマウスから単離される。特定の実施形態では、第３の核酸配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）および／またはフレームワーク領域（ＦＷＲ）内に２つ〜５つの体細胞超変異を含む。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンＶＬ領域は改変された内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から発現する。
【０１３０】
一実施形態では、第１および第２の抗原は１つの分子上に存在する。一実施形態では、第１および第２の抗原は異なる分子上に存在する。一実施形態では、第１または第２の核酸配列は、コードされる重鎖のプロテインＡに対するその親和性を低下させる改変を含む。
【０１３１】
一実施形態では、第１の核酸配列または第２の核酸配列は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ５−５１、およびＶＨ６−１から選択されるヒト重鎖遺伝子セグメントを含む再構成されたヒト重鎖可変領域配列を含む。特定の実施形態では、重鎖遺伝子セグメントはＶＨ２−５、ＶＨ３−２３またはＶＨ３−３０である。
【０１３２】
一態様では、二重特異性抗体を作製するための方法であって、本明細書に記載のマウスを目的の抗原に曝露するステップ、マウスに目的の抗原に対する免疫応答を開始させるステップ、目的の抗原の第１のエピトープに結合する第１のヒト重鎖可変領域を同定するステップ、目的の抗原の第２のエピトープに結合する第２のヒト重鎖可変領域を同定するステップ、目的の抗原の第１のエピトープに結合する第１の重鎖をコードする第１の完全ヒト重鎖遺伝子を作製するステップ、目的の抗原の第２のエピトープに結合する第２の重鎖をコードする第２の完全ヒト重鎖遺伝子を作製するステップ、第１の重鎖および第２の重鎖をヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する単一の完全ヒト軽鎖を発現する細胞において発現させて二重特異性抗体を形成するステップ、および二重特異性抗原結合タンパク質を単離するステップを含む方法が提供される。
【０１３３】
一実施形態では、第１のエピトープと第２のエピトープは同一ではない。一実施形態では、第１の重鎖可変領域が第１のエピトープに結合することにより第２の重鎖可変領域の第２のエピトープへの結合は遮断されない。一実施形態では、第１の重鎖および第２の重鎖は、第１のエピトープと第２のエピトープに同時に結合することができる。
【０１３４】
一実施形態では、二重特異性抗体は第１のエピトープと第２のエピトープに同時に結合する。一実施形態では、二重特異性抗体は第１のエピトープと第２のエピトープにそれぞれ独立に結合する。
【０１３５】
一実施形態では、二重特異性抗体の抗原に対する結合応答は第１の重鎖可変領域の抗原に対する結合応答の約２倍高い。一実施形態では、二重特異性抗体の抗原に対する結合応答は第２の重鎖可変領域の抗原に対する結合応答の約２倍高い。一実施形態では、二重特異性抗体の抗原に対する結合応答は第１の重鎖可変領域および／または第２の重鎖可変領域の抗原に対する結合応答とほぼ同じであるまたはほぼ等しい。
【０１３６】
一実施形態では、抗原は、可溶性抗原、細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原）および細胞表面受容体から選択される。特定の実施形態では、細胞表面受容体は免疫グロブリン受容体である。特定の実施形態では、免疫グロブリン受容体はＦｃ受容体である。
【０１３７】
一実施形態では、軽鎖の軽鎖可変ドメインは２つ〜５つの体細胞変異を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、第１の重鎖可変ドメインまたは第２の重鎖可変ドメインのいずれかとともに、免疫したマウスのＢ細胞において発現する体細胞変異したコグネイト軽鎖である。
【０１３８】
一実施形態では、第１の完全ヒト重鎖はプロテインＡに対するその親和性を低下させるアミノ酸の改変を有し、第２の完全ヒト重鎖はプロテインＡに対するその親和性を低下させる改変を含まない。
【０１３９】
種々の実施形態では、二重特異性抗体を作製するための方法は、二重特異性抗体の各重鎖可変領域との対合に共通の軽鎖を使用することにより増強される。種々の実施形態では、本明細書に記載の共通の軽鎖を使用することにより、元のコグネイト軽鎖を使用することと比較して、二重特異性を欠く不適切な種の免疫グロブリンの数が減少する。種々の実施形態では、共通の軽鎖を含む単一特異性抗体から二重特異性抗体の重鎖可変領域を同定する。種々の実施形態では、二重特異性抗体の重鎖可変領域は、ヒト重鎖とコグネイトである限定されたヒト軽鎖レパートリーまたは単一のヒト軽鎖を発現するように予め操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）マウスＢ細胞内にｉｎ  ｖｉｖｏで再構成されたヒト重鎖可変遺伝子セグメントを含み、目的の抗原での曝露に応答して、可能性のあるヒト軽鎖可変領域の１つまたは２つのうちの１つとコグネイトである複数のヒト重鎖可変領域を含有するキメラ抗体レパートリーを生じ、当該キメラ抗体が目的の抗原に特異的である。
【０１４０】
種々の態様では、二重特異性抗体を調製する方法であって、二重特異性抗体が、１）第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドであって、該第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが二量体を形成することを可能にする多量体形成ドメイン（例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン）をそれぞれが含み、多量体形成ドメインにより第１のポリペプチドと第２のポリペプチドの間の安定な相互作用が促進され、多量体形成ドメインのうちの一方がプロテインＡに対するその親和性を低下させるアミノ酸の改変を有し、他方の多量体形成ドメインが当該改変を欠く第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド、２）第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのそれぞれの結合ドメインであって、各結合ドメインが可変重鎖および可変軽鎖を含み、第１のポリペプチドの可変軽鎖および第２のポリペプチドの可変軽鎖が共通のアミノ酸配列を有し、共通の配列がポリペプチドのそれぞれの元の軽鎖に対して少なくとも８０％の、少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％および最も好ましくは１００％の配列同一性を有する結合ドメインを含む方法が提供される。種々の実施形態では、可変軽鎖は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する。種々の実施形態では、可変軽鎖は再構成されたヒト軽鎖配列である。種々の実施形態では、可変軽鎖は本明細書に記載のマウスから単離される。
【０１４１】
種々の実施形態では、方法は、（ｉ）第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および共通の軽鎖をコードする核酸を含む宿主細胞を培養するステップであって、当該核酸を発現させるステップ；および（ｉｉ）二重特異性抗体を宿主細胞培養物から回収するステップを含み、一実施形態では、第１のポリペプチドをコードする核酸または第２のポリペプチドをコードする核酸はプロテインＡに対するその親和性を低下させるアミノ酸の改変を有する。一実施形態では、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および共通の軽鎖をコードする核酸は単一のベクターまたは別々のベクターに存在する。一実施形態では、前述の段落に従って、宿主細胞を使用して二重特異性抗体を作製する。
【０１４２】
一態様では、二重特異性抗体を調製する方法であって、（ａ）本明細書に記載のマウスから単離された第１のヒト重鎖可変領域をコードする第１の核酸を選択するステップ；（ｂ）本明細書に記載の同じまたは別のマウスから単離された第２のヒト重鎖可変領域をコードする第２の核酸を選択するステップ；（ｃ）本明細書に記載のマウスから単離されたまたは本明細書に記載の再構成されたヒト軽鎖可変領域に由来するヒト軽鎖可変領域をコードする第３の核酸をもたらすステップ；（ｃ）第１の核酸、第２の核酸および第３の核酸を宿主細胞に導入し、第１の核酸、第２の核酸および第３の核酸の発現が起こるように宿主細胞を培養するステップ；ならびに（ｄ）形成された二重特異性抗体を細胞培養物から回収するステップを含む方法が提供される。
【０１４３】
一実施形態では、第１のヒト重鎖可変領域および第２のヒト重鎖可変領域は体細胞変異したものである。特定の実施形態では、第１のヒト重鎖可変領域および第２のヒト重鎖可変領域は、それぞれ独立に、１−２、１−３、１−８、１−１８、１−２４、１−４６、１−５８、１−６９、２−５、２−２６、２−７０、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−１６、３−２０、３−２１、３−２３、３−３０、３−３３、３−４３、３−４８、３−５３、３−６４、３−７２、３−７３、４−３１、４−３４、４−３９、４−５９、５−５１、および６−１ヒトＶＨ遺伝子セグメントから選択される再構成されたヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する。一実施形態では、第１のヒト重鎖可変領域および第２のヒト重鎖可変領域は、それぞれ独立に、２−５、３−３０および３−２３から選択される再構成されたヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する。一実施形態では、第１のヒト重鎖可変領域はヒトＶＨ２−５遺伝子セグメントに由来し、第２のヒト重鎖可変領域はヒトＶＨ３−３０遺伝子セグメントに由来する。一実施形態では、第１のヒト重鎖可変領域はヒトＶＨ３−３０遺伝子セグメントに由来し、第２のヒト重鎖可変領域はヒトＶＨ３−２３遺伝子セグメントに由来する。一実施形態では、第１のヒト重鎖可変領域はヒトＶＨ３−２３遺伝子セグメントに由来し、第２のヒト重鎖可変領域はヒトＶＨ３−３０遺伝子セグメントに由来する。
【０１４４】
一実施形態では、第１の核酸または第２の核酸をステップ（ｃ）の前に、プロテインＡに対する親和性が低下するように改変する。
【０１４５】
一実施形態では、第３の核酸は、本明細書に記載のマウスから単離される。一実施形態では、第３の核酸は２つ〜５つの体細胞変異を含む。一実施形態では、第３の核酸は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントに由来するヒト軽鎖可変領域をコードする。一実施形態では、第３の核酸は、ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来するヒト軽鎖可変領域をコードする。
【０１４６】
一実施形態では、第３の核酸は、再構成されたヒト軽鎖可変領域に由来する。一実施形態では、再構成されたヒト軽鎖可変領域は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する配列を含む。一実施形態では、再構成されたヒト軽鎖可変領域は、生殖系列ヒトＶκ１−３９配列を含む（すなわち、Ｖ遺伝子セグメント配列内に体細胞超変異を含まない）。一実施形態では、再構成されたヒト軽鎖可変領域は、生殖系列ヒトＶκ３−２０配列を含む。
【０１４７】
種々の実施形態では、生殖系列内に再構成ヒト軽鎖配列を欠く改変マウスに由来する可変ドメインを含む第１のヒト重鎖が組み入れられる二重特異性抗体を調製する方法であって、第１のヒト重鎖を、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する再構成されたヒト軽鎖可変領域を含むコグネイトヒト軽鎖と対合させる方法が提供される。種々の実施形態では、第１のヒト重鎖とは特異性が異なる第２のヒト重鎖を本明細書に記載の免疫したマウスから同定する。２種の重鎖および共通の軽鎖をコードする核酸を、前述の段落に記載の通り、３つの鎖全ての発現が起こるように宿主細胞に導入し、二重特異性抗体を細胞培養物から回収する。
【０１４８】
一実施形態では、マウスを、第１のヒト重鎖可変ドメインを生成するために使用したものと同じ抗原を用いて免疫する。一実施形態では、マウスを、第１のヒト重鎖可変ドメインを生成するために使用したものとは異なる抗原を用いて免疫する。
【０１４９】
一態様では、二重特異性抗体をコードする核酸および当該核酸を含む宿主細胞を含めた、二重特異性抗体を作製するために単一のヒト軽鎖と対合させることができるヒト重鎖を選択する方法が提供される。
【０１５０】
一態様では、細胞培養物中の所望の二重特異性抗体の量を単一特異性抗体などの望ましくない産物を上回って増加させる方法であって、二重特異性抗体の重鎖の１つを、プロテインＡに対する親和性が低下するように改変する方法が提供される。
【０１５１】
一態様では、単離された宿主細胞であって、（ａ）第１の抗原に結合する第１のヒト重鎖可変領域をコードする第１の核酸配列であって、マウスの生殖系列内の再構成された免疫グロブリン軽鎖配列からヒト免疫グロブリンＶＬ領域を発現する、第１の抗原を用いて免疫したマウスから単離された第１の核酸配列；（ｂ）第２の抗原に結合する第２のヒト重鎖可変領域をコードする第２の核酸配列であって、マウスの生殖系列内の再構成された免疫グロブリン軽鎖配列からヒト免疫グロブリンＶＬ領域を発現する、第２の抗原を用いて免疫したマウスから単離された第２の核酸配列；（ｃ）（ａ）の重鎖可変領域と対合させている場合には第１の抗原に特異的に結合し、（ｂ）の重鎖可変領域と対合させている場合には第２の抗原に特異的に結合するヒト軽鎖可変領域をコードする第３の核酸配列を含む宿主細胞が提供される。
【０１５２】
種々の態様では、第１および第２の抗原は互いに異なる。種々の態様では、第１、第２および第３の核酸配列の発現により、第１および第２の抗原に特異的に結合する二重特異性抗体の形成がもたらされる。
【０１５３】
一実施形態では、ヒトＶＬ領域は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む再構成されたヒト軽鎖配列に由来する。特定の実施形態では、再構成されたヒト軽鎖配列は生殖系列配列である（すなわち、可変ドメイン内に体細胞超変異を含まない）。一実施形態では、第３の核酸配列は再構成された免疫グロブリン軽鎖配列からヒト免疫グロブリンＶＬ領域を発現するマウスから単離され、当該再構成されたヒト軽鎖配列はマウスの生殖系列に存在する。一実施形態では、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態では、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントは、相補性決定領域（ＣＤＲ）またはフレームワーク領域（ＦＷＲ）内に少なくとも１つの体細胞超変異を含む。特定の実施形態では、第１、第２および第３の核酸配列は、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列からヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来するヒト免疫グロブリンＶＬ領域を発現するマウスから単離され、当該再構成された免疫グロブリン軽鎖配列はマウスの生殖系列に存在する。
【０１５４】
種々の実施形態では、マウスは、再構成して免疫グロブリン軽鎖を形成することが可能な内因性軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含有しない。
【０１５５】
一実施形態では、ヒト免疫グロブリンＶＬ領域は改変された内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から発現する。一実施形態では、第１および第２の抗原は１つの分子上に存在する。一実施形態では、第１および第２の抗原は異なる分子上に存在する。一実施形態では、第１または第２の核酸配列は、コードされる重鎖のプロテインＡに対する親和性を低下させる改変を含む。
【０１５６】
一実施形態では、第１または第２の核酸配列は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ５−５１、およびＶＨ６−１から選択されるヒト重鎖遺伝子セグメントを含む再構成されたヒト重鎖可変領域配列を含む。特定の実施形態では、重鎖遺伝子セグメントはＶＨ２−５、ＶＨ３−２３またはＶＨ３−３０である。
【０１５７】
一態様では、本発明に従って作製されたヒト重鎖可変ドメインを含む抗体または二重特異性抗体が提供される。別の態様では、完全ヒト抗体または完全ヒト二重特異性抗体を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用が提供される。
【０１５８】
一態様では、本明細書に記載の遺伝子改変マウス、胚または細胞は、内因性調節または制御エレメント、例えば、マウスκイントロンエンハンサー、マウスκ３’エンハンサーまたはイントロンエンハンサーと３’エンハンサーの両方を保持するκ軽鎖遺伝子座を含み、調節または制御エレメントにより、κ軽鎖遺伝子座の発現された配列の体細胞変異および親和性成熟が容易になる。
【０１５９】
一態様では、１つ以下または２つ以下の再構成されたまたは再構成されていない免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン軽鎖を有することによって特徴付けられるＢ細胞集団を含むマウスであって、免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントの野生型相補物を含むマウスとほぼ同じκ：λ軽鎖比を示すマウスが提供される。
【０１６０】
一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖は、１つ以下または２つ以下の再構成された免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントに由来する。特定の実施形態では、軽鎖は、１つ以下の再構成された免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントに由来する。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖は２つの再構成されていない免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントのうちの１つおよび１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントのうちの１つから生成される。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖は２つの再構成されていない免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントのうちの１つおよび１つの免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントから生成される。
【０１６１】
一態様では、１つ以下または２つ以下のヒトＶκ／Ｊκ配列に由来する免疫グロブリン軽鎖を発現する本明細書に記載のマウスであって、全てまたは実質的に全ての内因性マウス重鎖可変領域遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントでの置き換えを含み、また、（ａ）λ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現するＣＤ１９＋Ｂ細胞の（ｂ）κ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現するＣＤ１９＋Ｂ細胞に対する比が約１〜約２０であるマウスが提供される。
【０１６２】
一実施形態では、マウスはヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列に由来する単一のκ軽鎖を発現し、λ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現するＣＤ１９＋Ｂ細胞の、κ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現するＣＤ１９＋Ｂ細胞に対する比は約１〜約２０であり、一実施形態では、当該比は約１〜少なくとも約６６であり、特定の実施形態では、当該比は約１〜６６である。
【０１６３】
一実施形態では、マウスはヒトＶκ３−２０Ｊκ５配列に由来する単一のκ軽鎖を発現し、λ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現するＣＤ１９＋Ｂ細胞の、κ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現するＣＤ１９＋Ｂ細胞に対する比は約１〜約２０であり、一実施形態では、当該比は約１〜約２１である。特定の実施形態では、当該比は１〜２０または１〜２１である。
【０１６４】
一部の実施形態では、本発明は、配列が２つのヒトＶκ遺伝子セグメントのうちの１つの、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのヒトＪκ遺伝子セグメントとの再構成によって実現される配列と同一である免疫グロブリン軽鎖を発現するマウスを提供する。
【０１６５】
一部の実施形態では、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントのうちの１つおよび１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成により生成する免疫グロブリン軽鎖を発現するマウスであって、全てまたは実質的に全ての内因性免疫グロブリンＶＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒト免疫グロブリンＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のＤＨ遺伝子セグメント、および１つまたは複数のＪＨ遺伝子セグメントでの置き換えを含み、（ａ）λ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現する骨髄中のＢ細胞の、（ｂ）κ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現する骨髄中のＢ細胞に対する比が約１〜約１５であるマウスが提供される。一部の実施形態では、再構成にはヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントが含まれる。一部の実施形態では、再構成にはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントが含まれる。一部の実施形態では、内因性免疫グロブリンＶＨ遺伝子セグメントの置き換えは内因性免疫グロブリンＶＨ遺伝子座に存在する。一部の実施形態では、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントは内因性免疫グロブリンＶκ遺伝子座に存在し、一部の実施形態では、全てまたは実質的に全てのマウス免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントを２つのヒトＶκ遺伝子セグメントに置き換えている。一部の実施形態では、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントは内因性免疫グロブリンＶκ遺伝子座に存在し、一部の実施形態では、全てまたは実質的に全てのマウス免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントおよびＪκ遺伝子セグメントを２つのヒトＶκ遺伝子セグメントに置き換えている。種々の実施形態では、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントは、２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントに作動可能に連結している。
【０１６６】
一部の実施形態では、本発明のマウスは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成によって生成する軽鎖を発現し、λ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現する骨髄中の未成熟Ｂ細胞の、κ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現する未成熟Ｂ細胞に対する比は約１〜約１３である。
【０１６７】
一部の実施形態では、本発明のマウスは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成によって生成する軽鎖を発現し、λ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現する骨髄中の成熟Ｂ細胞の、κ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現する未成熟Ｂ細胞に対する比は約１〜約７である。
【０１６８】
一部の実施形態では、本発明のマウスは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成によって生成する軽鎖を発現し、例えば、細胞約２．５×１０４個、３．０×１０４個、３．５×１０４個、４．０×１０４個、４．５×１０４個、５．０×１０４個、５．５×１０４個、６．０×１０４個、６．５×１０４個、７．０×１０４個、７．５×１０４個、８．０×１０４個、８．５×１０４個、９．０×１０４個、９．５×１０４個、１．０×１０５個または１．５×１０５個を含めた、細胞約２．５×１０４〜約１．５×１０５個の範囲内のプロＢ細胞集団を骨髄中に有し、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．８８×１０４個のプロＢ細胞集団を骨髄中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約６．４２×１０４個のプロＢ細胞集団を骨髄中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約９．１６×１０４個のプロＢ細胞集団を骨髄中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．１９×１０５個のプロＢ細胞集団を骨髄中に含む。本明細書に記載の遺伝子改変マウスの骨髄中の例示的なプロＢ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ４３、ｃ−ｋｉｔおよび／またはその組合せの発現（例えば、ＣＤ１９＋、ＣＤ４３＋、ｃ−ｋｉｔ＋）によって特徴付けられる。
【０１６９】
一部の実施形態では、本発明のマウスは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成によって生成する軽鎖を発現し、例えば、細胞約１．０×１０６個、１．１×１０６個、１．２×１０６個、１．３×１０６個、１．４×１０６個、１．５×１０６個、１．６×１０６個、１．７×１０６個、１．８×１０６個、１．９×１０６個または２．０×１０６個を含めた、細胞約１×１０６〜約２×１０６個の範囲内のプレＢ細胞集団を骨髄中に有し、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．２５×１０６個のプレＢ細胞集団を骨髄中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．４６×１０６個のプレＢ細胞集団を骨髄中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．６４×１０６個のプレＢ細胞集団を骨髄中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．０３×１０６個のプレＢ細胞集団を骨髄中に含む。本明細書に記載の遺伝子改変マウスの骨髄中の例示的なプレＢ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ４３、ｃ−ｋｉｔおよび／またはその組合せの発現（例えば、ＣＤ１９＋、ＣＤ４３−、ｃ−ｋｉｔ−）によって特徴付けられる。
【０１７０】
一部の実施形態では、本発明のマウスは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成によって生成する軽鎖を発現し、例えば、細胞約５．０×１０５個、５．１×１０５個、５．２×１０５個、５．３×１０５個、５．４×１０５個、５．５×１０５個、５．６×１０５個、５．７×１０５個、５．８×１０５個、５．９×１０５個、６．０×１０５個、６．１×１０５個、６．２×１０５個、６．３×１０５個、６．４×１０５個、６．５×１０５個、６．６×１０５個、６．７×１０５個、６．８×１０５個、６．９×１０５個または７．０×１０５個を含めた、細胞約５×１０５〜約７×１０５個の範囲内の未成熟Ｂ細胞集団を骨髄中に有し、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約５．３３×１０５個の未成熟Ｂ細胞集団を骨髄中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約５．８０×１０５個の未成熟Ｂ細胞集団を骨髄中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約５．９２×１０５個の未成熟Ｂ細胞集団を骨髄中に含み、一部の実施形態では、マウスは、細胞約６．６７×１０５個の未成熟Ｂ細胞集団を骨髄中に含む。本明細書に記載の遺伝子改変マウスの骨髄中の例示的な未成熟Ｂ細胞は、ＩｇＭ、Ｂ２２０および／またはその組合せの発現（例えば、ＩｇＭ＋、Ｂ２２０ｉｎｔ）によって特徴付けられる。
【０１７１】
一部の実施形態では、本発明のマウスは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成によって生成する軽鎖を発現し、例えば、細胞約３．０×１０４個、３．５×１０４個、４．０×１０４個、４．５×１０４個、５．０×１０４個、５．５×１０４個、６．０×１０４個、６．５×１０４個、７．０×１０４個、７．５×１０４個、８．０×１０４個、８．５×１０４個、９．０×１０４個、９．５×１０４個、１．０×１０５個または１．５×１０５個を含めた、細胞約３×１０４〜約１．５×１０５個の範囲内の成熟Ｂ細胞集団を骨髄中に有し、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約３．１１×１０４個の成熟Ｂ細胞集団を骨髄中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．０９×１０５個の成熟Ｂ細胞集団を骨髄中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．１６×１０５個の成熟Ｂ細胞集団を骨髄中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．４４×１０５個の成熟Ｂ細胞集団を骨髄中に含む。本明細書に記載の遺伝子改変マウスの骨髄中の例示的な成熟Ｂ細胞は、ＩｇＭ、Ｂ２２０および／またはその組合せの発現（例えば、ＩｇＭ＋、Ｂ２２０ｈｉ）によって特徴付けられる。
【０１７２】
一部の実施形態では、本発明のマウスは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成によって生成する軽鎖を発現し、例えば、細胞約１．０×１０６個、１．１×１０６個、１．２×１０６個、１．３×１０６個、１．４×１０６個、１．５×１０６個、１．６×１０６個、１．７×１０６個、１．８×１０６個、１．９×１０６個、２．０×１０６個、２．１×１０６個、２．２×１０６個、２．３×１０６個、２．４×１０６個、２．５×１０６個、２．６×１０６個、２．７×１０６個、２．８×１０６個、２．９×１０６個または２．０×１０６個を含めた、細胞約１×１０６〜約３×１０６個の範囲内の総Ｂ細胞集団を骨髄中に有し、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．５９×１０６個の総Ｂ細胞集団を骨髄中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．７５×１０６個の総Ｂ細胞集団を骨髄中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．１３×１０６個の総Ｂ細胞集団を骨髄中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．５５×１０６個の総Ｂ細胞集団を骨髄中に含む。本明細書に記載の遺伝子改変マウスの骨髄中の例示的な総Ｂ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ２０および／またはその組合せの発現（例えば、ＣＤ１９＋）によって特徴付けられる。
【０１７３】
一態様では、単一の再構成されたκ軽鎖を発現する遺伝子改変マウスであって、機能的なλ軽鎖遺伝子座を含み、同じ単一の再構成されたκ軽鎖に由来するκ軽鎖を発現するＩｇκ＋細胞を含むＢ細胞集団を発現するマウスが提供される。一実施形態では、マウスにおけるＩｇκ＋Ｉｇλ＋Ｂ細胞のパーセントは野生型マウスにおけるものとほぼ同じである。特定の実施形態では、マウスにおけるＩｇκ＋Ｉｇλ＋Ｂ細胞のパーセントは約２〜約６パーセントである。特定の実施形態では、単一の再構成されたκ軽鎖がＶκ１−３９Ｊκ５配列に由来する場合のマウスにおけるＩｇκ＋Ｉｇλ＋Ｂ細胞のパーセントは約２〜約３であり、特定の実施形態では、当該パーセントは約２．６である。特定の実施形態では、単一の再構成されたκ軽鎖がＶκ３−２０Ｊκ１配列に由来する場合のマウスにおけるＩｇκ＋Ｉｇλ＋Ｂ細胞のパーセントは約４〜約８であり、特定の実施形態では、当該パーセントは約６である。
【０１７４】
一部の実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリンＶκ／Ｊκ配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する遺伝子改変マウスであって、機能的な免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座を含み、約１〜約８であり、一部の実施形態では約１〜約５であるＩｇλ＋Ｂ細胞のＩｇκ＋Ｂ細胞に対する比を含む脾性Ｂ細胞集団を含むマウスが提供される。一部の実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリンＶκ／Ｊκ配列は、２つのヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントのうちの１つおよび１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのヒト免疫グロブリンＪκ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成によって生成する。一部の実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリンＶκ／Ｊκ配列は、ヒト免疫グロブリンＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびＪκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、およびこれらの組合せから選択されるヒト免疫グロブリンＪκ遺伝子セグメントの再構成によって生成する。一部の実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリンＶκ／Ｊκ配列は、ヒト免疫グロブリンＶκ３−２０遺伝子セグメントおよびＪκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、およびこれらの組合せから選択されるヒト免疫グロブリンＪκ遺伝子セグメントの再構成によって生成する。
【０１７５】
一部の実施形態では、本発明のマウスは、例えば、細胞約２．０×１０６個、２．５×１０６個、３．０×１０６個、３．５×１０６個、４．０×１０６個、４．５×１０６個、５．０×１０６個、５．５×１０６個、６．０×１０６個、６．５×１０６個または７．０×１０６個を含めた、細胞約２×１０６個〜約７×１０６個の範囲内のＣＤ１９＋脾性Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．７４×１０６個のＣＤ１９＋脾性Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約４．３０×１０６個のＣＤ１９＋脾性Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約５．５３×１０６個のＣＤ１９＋脾性Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約６．１８×１０６個のＣＤ１９＋脾性Ｂ細胞集団を含む。
【０１７６】
一部の実施形態では、本発明のマウスは、例えば、細胞約１．０×１０６個、１．５×１０６個、２．０×１０６個、２．５×１０６個、３．０×１０６個、３．５×１０６個、４．０×１０６個を含めた、細胞約１×１０６〜約４×１０６個の範囲内のＣＤ１９＋、ＩｇＤｈｉ、ＩｇＭｌｏ脾性Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、約１．３０×１０６個のＣＤ１９＋、ＩｇＤｈｉ、ＩｇＭｌｏ脾性Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．１３×１０６個のＣＤ１９＋、ＩｇＤｈｉ、ＩｇＭｌｏ脾性Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約３．１５×１０６個のＣＤ１９＋、ＩｇＤｈｉ、ＩｇＭｌｏ脾性Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約３．９３×１０６個のＣＤ１９＋、ＩｇＤｈｉ、ＩｇＭｌｏ脾性Ｂ細胞集団を含む。
【０１７７】
一部の実施形態では、本発明のマウスは、例えば、細胞約９．０×１０５個、９．２５×１０５個、９．５×１０５個、９．７５×１０５個、１．０×１０６個、１．２５×１０６個、１．５０×１０６個、１．７５×１０６個、２．０×１０６個を含めた、細胞約９×１０５個〜約２×１０６個の範囲内のＣＤ１９＋、ＩｇＤｌｏ、ＩｇＭｈｉ脾性Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、約９．５２×１０５個のＣＤ１９＋、ＩｇＤｌｏ、ＩｇＭｈｉ脾性Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．２３×１０６個のＣＤ１９＋、ＩｇＤｌｏ、ＩｇＭｈｉ脾性Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．４０×１０６個のＣＤ１９＋、ＩｇＤｌｏ、ＩｇＭｈｉ脾性Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．４２×１０６個のＣＤ１９＋、ＩｇＤｌｏ、ＩｇＭｈｉ脾性Ｂ細胞集団を含む。
【０１７８】
一部の実施形態では、遺伝子改変マウスであって、２つの再構成されていないヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）の再構成されていないヒトＪκ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、免疫グロブリンκ軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントの野生型相補物を含むマウスとほぼ同じ移行（例えば、Ｔ１、Ｔ２およびＴ３）Ｂ細胞集団を含む末梢脾性Ｂ細胞集団を含む遺伝子改変マウスが提供される。本明細書に記載の遺伝子改変マウスの脾臓中の例示的な移行Ｂ細胞集団（例えば、Ｔ１、Ｔ２およびＴ３）は、ＩｇＭ、ＣＤ２３、ＣＤ９３、Ｂ２２０および／またはその組合せの発現によって特徴付けられる。
【０１７９】
一部の実施形態では、本発明のマウスは、例えば、約２．０×１０６個、２．５×１０６個、３．０×１０６個、３．５×１０６個、４．０×１０６個、４．５×１０６個、５．０×１０６個、５．５×１０６個、６．０×１０６個、６．５×１０６個または７．０×１０６個を含めた、細胞約２×１０６個〜約７×１０６個の範囲内のＴ１  Ｂ細胞集団（例えば、ＣＤ９３＋、Ｂ２２０＋、ＩｇＭｈｉ、ＣＤ２３−）を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．１６×１０６個のＴ１  Ｂ細胞集団を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約３．６３×１０６個のＴ１  Ｂ細胞集団を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、約３．９１×１０６個のＴ１  Ｂ細胞集団を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約６．８３×１０６個のＴ１  Ｂ細胞集団を脾臓中に含む。
【０１８０】
一部の実施形態では、本発明のマウスは、例えば、約１．０×１０６個、１．５×１０６個、２．０×１０６個、２．５×１０６個、３．０×１０６個、３．５×１０６個、４．０×１０６個、４．５×１０６個、５．０×１０６個、５．５×１０６個、６．０×１０６個、６．５×１０６個または７．０×１０６個を含めた、細胞約１×１０６個〜約７×１０６個の範囲内のＴ２  Ｂ細胞集団（例えば、ＣＤ９３＋、Ｂ２２０＋、ＩｇＭｈｉ、ＣＤ２３＋）を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．３０×１０６個のＴ２  Ｂ細胞集団を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．４６×１０６個のＴ２  Ｂ細胞集団を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、約３．２４×１０６個のＴ２  Ｂ細胞集団を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約６．５２×１０６個のＴ２  Ｂ細胞集団を脾臓中に含む。
【０１８１】
一部の実施形態では、本発明のマウスは、例えば、約１．０×１０６個、１．５×１０６個、２．０×１０６個、２．５×１０６個、３．０×１０６個、３．５×１０６個または４．０×１０６個を含めた、細胞約１×１０６個〜約４×１０６個の範囲内のＴ３  Ｂ細胞集団（例えば、ＣＤ９３＋、Ｂ２２０＋、ＩｇＭｌｏ、ＣＤ２３＋）を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．０８×１０６個のＴ３  Ｂ細胞集団を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．３５×１０６個のＴ３  Ｂ細胞集団を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、約３．３７×１０６個のＴ３  Ｂ細胞集団を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約３．６３×１０６個のＴ１  Ｂ細胞集団を脾臓中に含む。
【０１８２】
一部の実施形態では、遺伝子改変マウスであって、２つの再構成されていないヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントおよび１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの再構成されていないヒト免疫グロブリンＪκ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントおよびＪκ遺伝子セグメントの野生型相補物を含むマウスとほぼ同じである辺縁帯および辺縁帯前駆Ｂ細胞集団（ｍａｒｇｉｎａｌ  ｚｏｎｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を含む末梢脾性Ｂ細胞集団を含む遺伝子改変マウスが提供される。本明細書に記載の遺伝子改変マウスの脾臓中の例示的な辺縁帯Ｂ細胞集団は、ＩｇＭ、ＣＤ２１／３５、ＣＤ２３、ＣＤ９３、Ｂ２２０および／またはその組合せの発現によって特徴付けられる。
【０１８３】
一部の実施形態では、本発明のマウスは、例えば、細胞約１．０×１０６個、１．５×１０６個、２．０×１０６個、２．５×１０６個または３．０×１０６個を含めた、細胞約１×１０６個〜約３×１０６個の範囲内の辺縁帯Ｂ細胞集団（例えば、ＣＤ９３−、Ｂ２２０＋、ＩｇＭｈｉ、ＣＤ２１／３５ｈｉ、ＣＤ２３−）を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．４７×１０６個の辺縁帯Ｂ細胞集団を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．４９×１０６個の辺縁帯Ｂ細胞集団を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．２６×１０６個の辺縁帯Ｂ細胞集団を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．３３×１０６個の辺縁帯Ｂ細胞集団を脾臓中に含む。
【０１８４】
一部の実施形態では、遺伝子改変マウスであって、２つの再構成されていないヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントおよび１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの再構成されていないヒト免疫グロブリンＪκ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントおよびＪκ遺伝子セグメントの野生型相補物を含むマウスとほぼ同じである濾胞（例えば、ＦＯ−ＩおよびＦＯ−ＩＩ）Ｂ細胞集団（複数可）を含む末梢脾性Ｂ細胞集団を含む遺伝子改変マウスが提供される。本明細書に記載の遺伝子改変マウスの脾臓中の例示的な濾胞Ｂ細胞集団（例えば、ＦＯ−ＩおよびＦＯ−ＩＩ）は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＣＤ２１／３５、ＣＤ９３、Ｂ２２０および／またはその組合せの発現によって特徴付けられる。
【０１８５】
一部の実施形態では、本発明のマウスは、例えば、細胞約３．０×１０６個、３．５×１０６個、４．０×１０６個、４．５×１０６個、５．０×１０６個、５．５×１０６個、６．０×１０６個、６．５×１０６個、７．０×１０６個、７．５×１０６個、８．０×１０６個、８．５×１０６個、９．０×１０６個、９．５×１０６個、１．０×１０７個または１．５×１０７個を含めた、細胞約３×１０６個〜約１．５×１０７個の範囲内の濾胞１型Ｂ細胞集団（例えば、ＣＤ９３−、Ｂ２２０＋、ＣＤ２１／３５ｉｎｔ、ＩｇＭｌｏ、ＩｇＤｈｉ）を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約３．５７×１０６個の濾胞１型Ｂ細胞集団を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約６．３１×１０６個の濾胞１型Ｂ細胞集団を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約９．４２×１０６個の濾胞１型Ｂ細胞集団を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．１４×１０７個の濾胞１型Ｂ細胞集団を脾臓中に含む。
【０１８６】
一部の実施形態では、本発明のマウスは、例えば、細胞１．０×１０６個、１．２５×１０６個、１．５×１０６個、１．７５×１０６個または２．０×１０６個を含めた、細胞約１×１０６個〜約２×１０６個の範囲内の濾胞２型Ｂ細胞集団（例えば、ＣＤ９３−、Ｂ２２０＋、ＣＤ２１／３５ｉｎｔ、ＩｇＭｉｎｔ、ＩｇＤｈｉ）を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．１４×１０６個の濾胞２型Ｂ細胞集団を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．４５×１０６個の濾胞２型Ｂ細胞集団を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、約１．８０×１０６個の濾胞２型Ｂ細胞集団を脾臓中に含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．０６×１０６個の濾胞２型Ｂ細胞集団を脾臓中に含む。
【０１８７】
一態様では、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントに由来する単一の再構成されたκ軽鎖を発現し、単一の再構成されたκ軽鎖配列に由来する単一のκ軽鎖を含むＢ細胞集団を発現し、体細胞超変異に対して抵抗性にされていない遺伝子改変マウスが提供される。一実施形態では、マウスのＢ細胞において発現されるκ軽鎖の少なくとも９０％が少なくとも１つ〜約５つの体細胞超変異を示す。
【０１８８】
一態様では、１つ以下または２つ以下の再構成されたκ軽鎖配列に由来する単一のκ軽鎖を発現するように改変された遺伝子改変マウスであって、野生型マウスによって示されるκ軽鎖の使用の、またはκ軽鎖遺伝子セグメントの野生型レパートリーを含む同じ系統のマウスによって示されるκ軽鎖の使用の約２倍もしくはそれ超、少なくとも約３倍もしくはそれ超または少なくとも約４倍もしくはそれ超のκ軽鎖の使用を示すマウスが提供される。特定の実施形態では、マウスは、１つ以下の再構成されたκ軽鎖配列から単一のκ軽鎖を発現する。その他の特定の実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列はＶκ１−３９Ｊκ５配列およびＶκ３−２０Ｊκ１配列から選択される。一実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列はＶκ１−３９Ｊκ５配列である。一実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列はＶκ３−２０Ｊκ１配列である。
【０１８９】
一態様では、１つ以下または２つ以下の再構成されたκ軽鎖配列に由来する単一のκ軽鎖を発現する遺伝子改変マウスであって、完全なまたは実質的に完全なヒトκ軽鎖遺伝子座を有するマウスによって示される同じκ軽鎖の使用の約１００倍またはそれ超、少なくとも約２００倍またはそれ超、少なくとも約３００倍またはそれ超、少なくとも約４００倍またはそれ超、少なくとも約５００倍またはそれ超、少なくとも約６００倍またはそれ超、少なくとも約７００倍またはそれ超、少なくとも約８００倍またはそれ超、少なくとも約９００倍またはそれ超、少なくとも約１０００倍またはそれ超のκ軽鎖の使用を示すマウスが提供される。特定の実施形態では、完全なまたは実質的に完全なヒトκ軽鎖遺伝子座を有するマウスは、機能的な再構成されていないマウスκ軽鎖配列を欠く。特定の実施形態では、マウスは、１つ以下の再構成されたκ軽鎖配列から単一のκ軽鎖を発現する。一実施形態では、マウスは、再構成されたκ軽鎖配列の１つのコピー（例えば、ヘテロ接合体）を含む。一実施形態では、マウスは、再構成されたκ軽鎖配列の２つのコピーを含む（例えば、ホモ接合体）。その他の特定の実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列はＶκ１−３９Ｊκ５配列およびＶκ３−２０Ｊκ１配列から選択される。一実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列はＶκ１−３９Ｊκ５配列である。一実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列はＶκ３−２０Ｊκ１配列である。
【０１９０】
一態様では、１つ以下または２つ以下の再構成された軽鎖配列に由来する単一の軽鎖を発現する遺伝子改変マウスであって、該マウスにおける軽鎖が、完全なまたは実質的に完全な軽鎖遺伝子座を有するマウスによって示される同じ再構成された軽鎖の発現の少なくとも１０倍〜約１，０００倍、１００倍〜約１，０００倍、２００倍〜約１，０００倍、３００倍〜約１，０００倍、４００倍〜約１，０００倍、５００倍〜約１，０００倍、６００倍〜約１，０００倍、７００倍〜約１，０００倍、８００倍〜約１，０００倍または９００倍〜約１，０００倍高い発現のレベルを示す遺伝子改変マウスが提供される。一実施形態では、軽鎖はヒト配列を含む。特定の実施形態では、ヒト配列はκ配列である。一実施形態では、ヒト配列はλ配列である。一実施形態では、軽鎖は完全ヒト軽鎖である。
【０１９１】
一実施形態では、発現レベルは、転写された軽鎖配列のｍＲＮＡを定量し、それを完全なまたは実質的に完全な軽鎖遺伝子座を有するマウスの転写された軽鎖配列と比較することによって特徴付けられる。
【０１９２】
一態様では、１つ以下または２つ以下の再構成されたκ軽鎖配列に由来する単一のκ軽鎖を発現する遺伝子改変マウスであって、抗原を用いて免疫されると、同じ抗原を用いて免疫した野生型マウスに匹敵する血清力価を示すマウスが提供される。特定の実施形態では、マウスは、１つ以下の再構成されたκ軽鎖配列から単一のκ軽鎖を発現する。一実施形態では、血清力価は総免疫グロブリンとして特徴付けられる。特定の実施形態では、血清力価はＩｇＭ特異的力価として特徴付けられる。特定の実施形態では、血清力価はＩｇＧ特異的力価として特徴付けられる。その他の特定の実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列はＶκ１−３９Ｊκ５配列およびＶκ３−２０Ｊκ１配列から選択される。一実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列はＶκ１−３９Ｊκ５配列である。一実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列はＶκ３−２０Ｊκ１配列である。
【０１９３】
一態様では、抗原特異的抗体の集団を発現する遺伝子改変マウスであって、抗原特異的抗体の集団の免疫グロブリン軽鎖の全てが同じ単一のヒトＶＬ遺伝子セグメントに由来するヒト軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、免疫グロブリン重鎖が複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントのうちの１つに由来するヒト重鎖可変（ＶＨ）領域を含むマウスが提供される。
【０１９４】
種々の実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ５−５１、およびＶＨ６−１から選択される。
【０１９５】
種々の実施形態では、同じ単一のヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントから選択される。種々の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖の全てが、Ｊκ遺伝子セグメントおよびＪλ遺伝子セグメントから選択されるヒト軽鎖Ｊ（ＪＬ）遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態では、ヒトＪＬ遺伝子セグメントは、ヒトＪκ１遺伝子セグメントおよびヒトＪκ５遺伝子セグメントから選択される。種々の実施形態では、マウスは、マウス免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメント、マウス免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される配列を欠く。種々の実施形態では、ヒトＶＬ領域は、ヒト、マウス、またはラット免疫グロブリン軽鎖定常（ＣＬ）領域に作動可能に連結している。特定の実施形態では、ヒトＶＬ領域はマウスＣκ領域に作動可能に連結している。特定の実施形態では、ヒトＶＬ領域はラットＣκ領域に作動可能に連結している。
【０１９６】
種々の実施形態では、ヒトＶＬ領域は、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から発現する。種々の実施形態では、ヒトＶＨ領域は、ヒト、マウス、またはラット免疫グロブリン重鎖定常（ＣＨ）領域に作動可能に連結している。種々の実施形態では、（ＣＨ）領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、および／またはその組合せから選択されるヒト配列を含む。種々の実施形態では、ヒトＶＨ領域は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現する。
【０１９７】
一態様では、単一の軽鎖と結合した複数の免疫グロブリン重鎖を発現する遺伝子改変マウスが提供される。一実施形態では、重鎖はヒト配列を含む。種々の実施形態では、ヒト配列は、可変配列、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、単一の軽鎖はヒト配列を含む。種々の実施形態では、ヒト配列は、可変配列、定常配列、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、マウスは、機能しない内因性免疫グロブリン遺伝子座を含み、導入遺伝子または染色体外エピソームから重鎖および／または軽鎖を発現する。一実施形態では、マウスは、内因性マウス遺伝子座において一部もしくは全ての内因性マウス重鎖遺伝子セグメント（すなわち、Ｖ、Ｄ、Ｊ）、および／または一部もしくは全ての内因性マウス重鎖定常配列（例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、またはこれらの組合せ）、および／または一部もしくは全ての内因性マウス軽鎖配列（例えば、Ｖ、Ｊ、定常、またはこれらの組合せ）の、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン配列での置き換えを含む。
【０１９８】
一態様では、同じ軽鎖を有する抗体の作製に適したマウスであって、該マウスにおいて作製する全てまたは実質的に全ての抗体が同じ軽鎖とともに発現するマウスが提供される。一実施形態では、軽鎖は内因性軽鎖遺伝子座から発現する。
【０１９９】
一態様では、ヒト抗体のための軽鎖を作製するための方法であって、本明細書に記載のマウスから軽鎖配列および重鎖配列を得るステップ、およびヒト抗体の作製において当該軽鎖配列および重鎖配列を使用するステップを含む方法が提供される。一実施形態では、ヒト抗体は二重特異性抗体である。
【０２００】
一態様では、本明細書に記載の操作された軽鎖と共に目的の抗原と結合することができるヒト重鎖可変ドメインを同定するための方法であって、抗原に結合することができる第１の抗体に由来する重鎖可変ドメインをもたらすステップ、重鎖可変ドメインを生殖系列軽鎖配列と再対合させ（ｒｅｐａｉｒｉｎｇ）、細胞をトランスフェクトし、したがって、それぞれが発現して第２の抗体を形成するステップ、第２の抗体を抗原に曝露するステップ、および第２の抗体の抗原への結合を測定するステップを含む方法が提供される。
【０２０１】
一実施形態では、第１の抗体の軽鎖はヒトＶκ１−３９配列を含む。一実施形態では、第１の抗体の軽鎖はヒトＶκ３−２０配列を含む。一実施形態では、生殖系列軽鎖配列はヒトＶκ１−３９配列またはヒトＶκ３−２０配列を含む。種々の実施形態では、第２の抗体の抗原への結合を第１の抗体の抗原への結合との比較によって決定する。
【０２０２】
別段の指定がある場合または文脈から明らかである場合を除き、本明細書に記載されている実施形態および態様はいずれも互いと併せて使用することができる。以下の記載を精査することで他の実施形態が当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】図１は、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントをヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子領域で置き換えるためのターゲティング戦略を例示する図である。
【０２０４】
【図２】図２は、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントをヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子領域で置き換えるためのターゲティング戦略を例示する図である。
【０２０５】
【図３】図３は、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントをヒトＶｐｒｅＢ／Ｊλ５遺伝子領域で置き換えるためのターゲティング戦略を例示する図である。
【０２０６】
【図４】図４は、野生型マウス（ＷＴ）、操作された再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域についてホモ接合性のマウス（Ｖκ１−３９Ｊκ５ＨＯ）および操作された再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域についてホモ接合性のマウス（Ｖκ３−２０Ｊκ１ＨＯ）についての、末梢血由来のＣＤ１９＋Ｂ細胞のパーセント（ｙ軸）を示すグラフである。
【０２０７】
【図５Ａ】図５Ａは、内因性ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメント（Ｈκ）での置き換えについてホモ接合性のマウス、野生型マウス（ＷＴ）、および操作された再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域についてヘテロ接合性のマウス（Ｖκ１−３９Ｊκ５ＨＥＴ）における、操作された再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域の接合部に特異的なプローブ（Ｖκ１−３９Ｊκ５接合部プローブ）およびヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントに特異的なプローブ（Ｖκ１−３９プローブ）を使用した定量的ＰＣＲアッセイでのＶκ１−３９由来軽鎖の相対的なｍＲＮＡの発現（ｙ軸）を示すグラフである。シグナルはマウスＣκの発現に対して正規化されている。Ｎ．Ｄ．：検出されず。
【０２０８】
【図５Ｂ】図５Ｂは、内因性ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメント（Ｈκ）での置き換えについてホモ接合性のマウス、野生型マウス（ＷＴ）、および操作された再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域についてホモ接合性のマウス（Ｖκ１−３９Ｊκ５ＨＯ）における、操作された再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域の接合部に特異的なプローブ（Ｖκ１−３９Ｊκ５接合部プローブ）およびヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントに特異的なプローブ（Ｖκ１−３９プローブ）を使用した定量的ＰＣＲアッセイでのＶκ１−３９由来軽鎖の相対的なｍＲＮＡの発現（ｙ軸）を示す図である。シグナルはマウスＣκの発現に対して正規化されている。
【０２０９】
【図５Ｃ】図５Ｃは、内因性ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントのヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメント（Ｈκ）での置き換えについてホモ接合性のマウス、野生型マウス（ＷＴ）、ならびに操作された再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域についてヘテロ接合性（ＨＥＴ）のマウスおよびホモ接合性（ＨＯ）のマウスにおける、操作された再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域の接合部に特異的なプローブ（Ｖκ３−２０Ｊκ１接合部プローブ）およびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに特異的なプローブ（Ｖκ３−２０プローブ）を使用した定量的ＰＣＲアッセイでのＶκ３−２０由来の軽鎖の相対的なｍＲＮＡの発現（ｙ軸）を示すグラフである。シグナルはマウスＣκの発現に対して正規化されている。
【０２１０】
【図６Ａ】図６Ａは、β−ガラクトシダーゼを用いて免疫した、野生型マウス（ＷＴ；Ｎ＝２）および操作された再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域についてホモ接合性のマウス（Ｖκ１−３９Ｊκ５ＨＯ；Ｎ＝２）におけるＩｇＭ力価（左側）およびＩｇＧ力価（右側）を示すグラフである。
【０２１１】
【図６Ｂ】図６Ｂは、β−ガラクトシダーゼを用いて免疫した、野生型マウス（ＷＴ；Ｎ＝５）および操作された再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域についてホモ接合性のマウス（Ｖκ３−２０Ｊκ１ＨＯ；Ｎ＝５）における総免疫グロブリン（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ）力価を示すグラフである。
【０２１２】
【図７Ａ】図７Ａは、単一特異性抗体（親−１および親−２）ならびに各親単一特異性抗体由来の重鎖可変領域から構築された二重特異性抗体（二重特異性）の概略図である。二重特異性抗体における共通の軽鎖可変領域（濃くしてある）が示されている。
【０２１３】
【図７Ｂ】図７Ｂは、２つの親モノクローナル抗体（親−１および親−２）の目的の抗原に対する結合特性、ならびに各単一特異性親抗体由来の重鎖可変領域を共通の軽鎖と対合させることで構築された二重特異性抗体の結合特性についての概略図である。目的の抗原の２つの別個のエピトープに別々に（左下）または同時に（右下）結合する二重特異性抗体の能力が示されている。
【０２１４】
【図８】図８は、３００ｎＭの二重特異性抗体（濃い棒）および単一特異性抗体（斜線の入った棒および灰色の棒）の、捕捉された単量体抗原Ｅ表面への結合のＢＩＡＣＯＲＥ（商標）単位（ＲＵ）で示す棒グラフである。モノクローナル親−１抗体（Ｐ１  Ａｂ）、モノクローナル親−２（Ｐ２  Ａｂ）および二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）が示されている。
【０２１５】
【図９】図９は、２つの遺伝子改変内因性免疫グロブリン軽鎖（例えば、κ軽鎖）遺伝子座を示す図である。上の遺伝子座（ＤＬＣ−５Ｊ）は、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含有する操作されたヒトＤＮＡ断片（斜線の入った線）を含有する。下の遺伝子座（ＤＬＣ−１Ｊ）は、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含有する操作されたヒトＤＮＡ断片（斜線の入った線）を含有する。各遺伝子座は、再構成して、内因性軽鎖定常領域（例えば、Ｃκ）に作動可能に連結したヒトＶκ領域を形成することができる。免疫グロブリンプロモーター（遺伝子座の上の矢印）、リーダーエクソン（黒塗りの矢印）、および２つのヒトＶκ遺伝子セグメント（白抜きの矢印）、それら全部の上流（５’）に隣接する（ｆｌａｎｋｅｄ）Ｆｒｔ組換え部位を含有するネオマイシンカセットが示されている。ヒト遺伝子セグメント（ＶκおよびＪκ）のそれぞれを用いて操作された組換えシグナル配列が各遺伝子セグメントに近接した白抜きの楕円により示されている。
【０２１６】
【図１０Ａ】図１０Ａの上のパネルは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）由来の、Ｂ細胞およびＴ細胞（それぞれＣＤ１９＋およびＣＤ３＋）について染色した骨髄の代表的な等高線図を示す。下のパネルは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）由来の、ＣＤ１９＋についてゲーティングし、ｃｋｉｔ＋およびＣＤ４３＋について染色した骨髄の代表的な等高線図を示す。下のパネルの等高線図にはプロＢ細胞およびプレＢ細胞が示されている。
【０２１７】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）の大腿骨から採取した骨髄中のプロＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４３＋ｃｋｉｔ＋）およびプレＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４３−ｃｋｉｔ−）の数を示すグラフである。
【０２１８】
【図１１Ａ】図１１Ａは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）由来の、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）およびＢ２２０について染色したシングレットについてゲーティングした骨髄の代表的な等高線図を示す。未成熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞およびプロ／プレＢ細胞が等高線図のそれぞれに示されている。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）の大腿骨から単離した骨髄中のＢ細胞（ＣＤ１９＋）、未成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）および成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）の総数を示すグラフである。
【０２１９】
【図１２Ａ】図１２Ａは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）由来の、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）およびＢ２２０について染色したシングレットについてゲーティングした骨髄の代表的な等高線図を示す。未成熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞およびプロ／プレＢ細胞が等高線図のそれぞれに示されている。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）の大腿骨から単離した、ＩｇλおよびＩｇκ発現について染色した未成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）および成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）についてゲーティングした骨髄の代表的な等高線図を示す。
【０２２０】
【図１３Ａ】図１３Ａの上のパネルは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）由来の、シングレットについてゲーティングし、Ｂ細胞およびＴ細胞（それぞれＣＤ１９＋およびＣＤ３＋）について染色した脾細胞の代表的な等高線図を示す。下のパネルは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）由来の、ＣＤ１９＋についてゲーティングし、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）および免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）について染色した脾細胞の代表的な等高線図を示す。成熟Ｂ細胞（ＷＴについて５４、ＤＬＣ−５Ｊについて５６．９）および移行Ｂ細胞（ＷＴについて２３．６、ＤＬＣ−５Ｊについて２５．６）が等高線図のそれぞれに示されている。
【０２２１】
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）から採取した脾臓中のＣＤ１９＋Ｂ細胞、移行Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭｈｉＩｇＤｌｏ）および成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭｌｏＩｇＤｈｉ）の総数を示すグラフである。
【０２２２】
【図１４Ａ】図１４Ａは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）由来の、ＣＤ１９＋についてゲーティングしたＩｇλ＋およびＩｇκ＋脾細胞の代表的な等高線図を示す。
【０２２３】
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）から採取した脾臓中のＢ細胞（ＣＤ１９＋）、Ｉｇκ＋Ｂ細胞（ＣＤ１９＋Ｉｇκ＋）およびＩｇλ＋Ｂ細胞（ＣＤ１９＋Ｉｇλ＋）の総数を示すグラフである。
【０２２４】
【図１５Ａ】図１５Ａは、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウスにおける末梢Ｂ細胞発生を示す図を示す。第１（左端）の等高線図はＣＤ１９＋についてゲーティングしたＣＤ９３＋およびＢ２２０＋脾細胞を示し、これにより、未成熟Ｂ細胞（３９．６）および成熟Ｂ細胞（５７．８）が示されている。第２（中央上）の等高線図は未成熟Ｂ細胞におけるＩｇＭ＋およびＣＤ２３＋発現を示し、これにより、Ｔ１  Ｂ細胞集団（３３．７；ＩｇＤ−ＩｇＭ＋ＣＤ２１ｌｏＣＤ２３−）、Ｔ２  Ｂ細胞集団（２１．２；ＩｇＤｈｉＩｇＭｈｉＣＤ２１ｍｉｄＣＤ２３＋）およびＴ３  Ｂ細胞集団（２９．１）が示されている。第３（中央下）の等高線図は成熟Ｂ細胞のＣＤ２１＋（ＣＤ３５＋）およびＩｇＭ＋発現を示し、これにより、辺縁帯Ｂ細胞を生じる小集団（１４．８）および濾胞（ＦＯ）Ｂ細胞を生じる第２の集団（７０．５）が示されている。第４（右上）の等高線図は成熟Ｂ細胞におけるＢ２２０＋およびＣＤ２３＋発現を示し、これにより、辺縁帯Ｂ細胞集団（９０．５；ＭＺ）および辺縁帯前駆Ｂ細胞集団（７．３；ＩｇＭｈｉＩｇＤｈｉＣＤ２１ｈｉＣＤ２３＋）が示されている。第５（右下）の等高線図は成熟Ｂ細胞におけるＩｇＤ＋およびＩｇＭ＋発現を示し、これにより、ＦＯ−Ｉ  Ｂ細胞集団（７９．０；ＩｇＤｈｉＩｇＭｌｏＣＤ２１ｍｉｄＣＤ２３＋）およびＦＯ−ＩＩ  Ｂ細胞集団（１５．１；ＩｇＤｈｉＩｇＭｈｉＣＤ２１ｍｉｄＣＤ２３＋）が示されている。各ゲーティングされた領域内の細胞の百分率が示されている。
【０２２５】
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、野生型マウスにおける末梢Ｂ細胞発生を示す図を示す。第１（左端）の等高線図はＣＤ１９＋についてゲーティングしたＣＤ９３＋およびＢ２２０＋脾細胞を示し、これにより、未成熟Ｂ細胞（３１．１）および成熟Ｂ細胞（６４．４）が示されている。第２（中央上）の等高線図は未成熟Ｂ細胞におけるＩｇＭ＋およびＣＤ２３＋発現を示し、これにより、Ｔ１  Ｂ細胞集団（２８．５；ＩｇＤ−ＩｇＭ＋ＣＤ２１ｌｏＣＤ２３−）、Ｔ２  Ｂ細胞集団（２８．７；ＩｇＤｈｉＩｇＭｈｉＣＤ２１ｍｉｄＣＤ２３＋）およびＴ３  Ｂ細胞集団（３０．７）が示されている。第３（中央下）の等高線図は成熟Ｂ細胞のＣＤ２１＋（ＣＤ３５＋）およびＩｇＭ＋発現を示し、これにより、辺縁帯Ｂ細胞を生じる小集団（７．６９）および濾胞（ＦＯ）Ｂ細胞を生じる第２の集団（７８．５）が示されている。第４（右上）の等高線図は成熟Ｂ細胞におけるＢ２２０＋およびＣＤ２３＋発現を示し、これにより、辺縁帯Ｂ細胞集団（７９．９；ＭＺ）および辺縁帯前駆Ｂ細胞集団（１９．４；ＩｇＭｈｉＩｇＤｈｉＣＤ２１ｈｉＣＤ２３＋）が示されている。第５（右下）の等高線図は成熟Ｂ細胞におけるＩｇＤ＋およびＩｇＭ＋発現を示し、これにより、ＦＯ−Ｉ  Ｂ細胞集団（８３．６；ＩｇＤｈｉＩｇＭｌｏＣＤ２１ｍｉｄＣＤ２３＋）およびＦＯ−ＩＩ  Ｂ細胞集団（１３．１；ＩｇＤｈｉＩｇＭｈｉＣＤ２１ｍｉｄＣＤ２３＋）が示されている。各ゲーティングされた領域内の細胞の百分率が示されている。
【０２２６】
【図１６】図１６は、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）から採取した脾臓中の移行Ｂ細胞集団、辺縁帯Ｂ細胞集団および濾胞Ｂ細胞集団の総数を示すグラフである。
【０２２７】
【図１７】図１７は、内因性ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメント（Ｈκ）での置き換えについてホモ接合性のマウス、野生型マウス（ＷＴ）、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）および２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−１Ｊ）における、Ｖκ３−２０遺伝子セグメントまたはＶκ１−３９遺伝子セグメントに特異的なプローブを使用した定量的ＰＣＲアッセイでの骨髄におけるＶκ３−２０由来軽鎖およびＶκ１−３９由来軽鎖の相対的なｍＲＮＡの発現（ｙ軸）を示すグラフである。シグナルはマウスＣκの発現に対して正規化されている。ＮＤ：検出されず。
【０２２８】
【図１８】図１８は、内因性ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメント（Ｈκ）での置き換えについてホモ接合性のマウス、野生型マウス（ＷＴ）、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）および２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−１Ｊ）における、Ｖκ３−２０遺伝子セグメントまたはＶκ１−３９遺伝子セグメントに特異的なプローブを使用した定量的ＰＣＲアッセイでの脾臓全体におけるＶκ３−２０由来軽鎖およびＶκ１−３９由来軽鎖の相対的なｍＲＮＡの発現（ｙ軸）を示すグラフである。シグナルはマウスＣκの発現に対して正規化されている。ＮＤ：検出されず。
【０２２９】
【図１９】図１９は、マウスにおける免疫グロブリンκ軽鎖対立遺伝子のＶ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントの組換えおよび再構成前（上）および再構成後（下）の軽鎖遺伝子座の構造の概略図を示す。示されているそのような再構成は、いくつかの可能性のある再構成事象のうちの１つのみである。
【発明を実施するための形態】
【０２３０】
記載されている特定の方法および実験条件は変動するので、本発明はそのような方法および条件に限定されない。本発明の範囲は特許請求の範囲によって定義されるので、本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態を記載するためだけのものであり、限定的なものではないことも理解される。
【０２３１】
別段の定義のない限り、本明細書で使用される用語および句は全て、それに反することが明示されているまたはこの用語もしくは句が使用される文脈から明らかである場合を除き、当技術分野においてその用語および句に与えられる意味を包含する。本明細書に記載の方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、特定の方法および材料がここに記載されている。言及されている刊行物は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３２】
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ジスルフィド結合によって相互接続した２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖の４つのポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は重鎖可変（ＶＨ）領域および重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は軽鎖可変（ＶＬ）領域および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存的な領域が間に入る相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含み、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と省略することができ、軽鎖ＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と省略することができる。「高親和性」抗体という用語は、その標的エピトープに対して約１０−９Ｍまたはそれ未満（例えば、約１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍまたは約１×１０−１２Ｍ）のＫＤを有する抗体を指す。一実施形態では、ＫＤは表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって測定され、別の実施形態では、ＫＤはＥＬＩＳＡによって測定される。
【０２３３】
「二重特異性抗体」という句は、２つまたはそれ超のエピトープに選択的に結合することができる抗体を指す。二重特異性抗体は、２種の異なるモノクローナル抗体の断片を含み（図７Ａ）、一般には、２種の異なるモノクローナル抗体に由来する２つの同一でない重鎖を含み、各重鎖が、２種の異なる分子上の異なるエピトープ（例えば、２種の異なる免疫原上の異なるエピトープ；図７Ｂ、左下を参照されたい）または同じ分子上の異なるエピトープ（例えば、同じ免疫原上の異なるエピトープ；図７Ｂ、右下を参照されたい）のいずれかに特異的に結合する。二重特異性抗体が２種の異なるエピトープ（第１のエピトープおよび第２のエピトープ）に選択的に結合することができる場合、第１の重鎖の第１のエピトープに対する親和性は、一般に、第１の重鎖の第２のエピトープに対する親和性よりも少なくとも１桁〜２桁または３桁または４桁またはそれ超の桁低く、逆もまた同じである。二重特異性抗体が特異的に結合するエピトープは同じ標的上にあっても異なる標的上にあってもよい（例えば、同じタンパク質にあってもまたは異なるタンパク質にあってもよい；図７Ｂを参照されたい）。例示的な二重特異性抗体としては、腫瘍抗原に特異的な第１の重鎖および細胞傷害性マーカー、例えば、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩなど）またはＴ細胞マーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８など）に特異的な第２の重鎖を有するものが挙げられる。さらに、第２の重鎖可変領域は異なる所望の特異性を有する重鎖可変領域で置換することができる。例えば、二重特異性抗体は、腫瘍抗原に特異的な第１の重鎖および毒素に特異的な第２の重鎖でを対合させ、それにより、毒素（例えば、サポリン、ビンカアルカロイドなど）を腫瘍細胞に送達することができる。他の例示的な二重特異性抗体としては、活性化受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃαＲＩ、Ｔ細胞受容体など）に特異的な第１の重鎖および阻害性受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＢ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７２、ＣＤ３００ａなど）に特異的な第２の重鎖を有するものが挙げられる。細胞活性化に関連する治療的状態（例えば、アレルギーおよび喘息）に対してそのような二重特異性抗体を構築することができる。二重特異性抗体は、例えば、同じ免疫原または異なる免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製することができる（図７Ｂ）。例えば、同じ免疫原または異なる免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列を同じ重鎖定常領域または異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列と融合することができ、そのような配列を、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞において発現させることができる。典型的な二重特異性抗体は、それぞれが３種の重鎖ＣＤＲ、その後に（Ｎ末端からＣ末端へ）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有する２種の重鎖、ならびに、免疫グロブリン軽鎖であって、エピトープ結合特異性は付与しないが各重鎖と結合することができるか、または各重鎖と結合することができ、かつ重鎖エピトープ結合領域が結合するエピトープのうちの１つまたは複数に��合することができるか、または各重鎖と結合することができ、かつ重鎖の一方または両方がエピトープの一方または両方に結合することを可能にする免疫グロブリン軽鎖を有する。
【０２３４】
「細胞」という用語は、組換え核酸配列を発現させるために適した任意の細胞を包含する。細胞としては、原核生物および真核生物の細胞（単一細胞または複数の細胞）、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．の株など）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞または例えばハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合物が挙げられる。一部の実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。一部の実施形態では、細胞は真核生物の細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ  ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および上述の細胞に由来する細胞株。一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含む、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）である。
【０２３５】
「相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）決定領域」という句または「ＣＤＲ」という用語は、通常（すなわち、野生型動物において）免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域内の２つのフレームワーク領域間に見られる生物体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を包含する。ＣＤＲは、例えば、生殖系列配列または再構成された配列もしくは再構成されていない配列によって、および、例えば、ナイーブなＢ細胞もしくはＴ細胞または成熟Ｂ細胞もしくはＴ細胞によってコードされ得る。ＣＤＲは、体細胞変異され得（例えば、動物の生殖系列においてコードされる配列と異なる）、ヒト化され得、かつ／またはアミノ酸の置換、付加または欠失によって改変され得る。一部の場合では（例えば、ＣＤＲ３に関して）、ＣＤＲは、連続していない（例えば、再構成されていない核酸配列内では）が、Ｂ細胞核酸配列内では、例えば、配列のスプライシングまたは連結の結果として（例えば、重鎖ＣＤＲ３が形成されるＶ−Ｄ−Ｊ組換え）連続している２つまたはそれ超の配列（例えば、生殖系列配列）によりコードされ得る。
【０２３６】
「保存的」という用語は、保存的アミノ酸置換を記載するために使用される場合、アミノ酸残基の、化学的性質（例えば、電荷または疎水性）が類似した側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基での置換を含む。一般に、保存的アミノ酸置換により、タンパク質の目的の機能的性質、例えば、可変領域の、標的エピトープに所望の親和性で特異的に結合する能力は実質的に変化しない。化学的性質が類似した側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、脂肪族側鎖、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；脂肪族ヒドロキシル側鎖、例えば、セリンおよびトレオニン；アミドを含有する側鎖、例えば、アスパラギンおよびグルタミン；芳香族側鎖、例えば、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；塩基性側鎖、例えば、リシン、アルギニン、およびヒスチジン；酸性側鎖、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに、硫黄を含有する側鎖、例えば、システインおよびメチオニンが挙げられる。保存的アミノ酸置換群としては、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リシン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが挙げられる。一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えばアラニンスキャニング変異誘発で使用されるように、タンパク質内の任意のネイティブな残基のアラニンでの置換であってよい。一部の実施形態では、保存的置換は、本明細書によって参照により組み込まれるGonnetら（（１９９２年）Exhaustive  Matching  of  the  Entire  Protein  Sequence  Database、Science  ２５６巻：１４４３〜４５頁）に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有するように成される。一部の実施形態では、置換は、置換がＰＡＭ２５０対数尤度行列において負ではない値を有する、中程度に保存的な置換である。
【０２３７】
一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖または重鎖の残基の位置は１つまたは複数の保存的アミノ酸置換によって異なる。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖またはその機能性断片（例えば、例えばＢ細胞からの発現および分泌を可能にする断片）の残基の位置は、本明細書においてアミノ酸配列が列挙されている軽鎖と同一ではないが、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換によって異なる。
【０２３８】
「エピトープ結合タンパク質」という句は、少なくとも１つのＣＤＲを有し、エピトープを選択的に認識することができる、例えば、エピトープと約１マイクロモル濃度またはそれ未満（例えば、約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍまたは約１×１０−１２ＭのＫＤ）のＫＤで結合することができるタンパク質を包含する。治療用エピトープ結合タンパク質（例えば、治療用抗体）にはナノモル濃度範囲またはピコモル濃度範囲のＫＤが必要であることが多い。
【０２３９】
「機能性断片」という句は、発現させ、分泌させることができ、エピトープにマイクロモル濃度範囲、ナノモル濃度範囲またはピコモル濃度範囲のＫＤで特異的に結合するエピトープ結合タンパク質の断片を包含する。特異的な認識とは、少なくともマイクロモル濃度範囲、ナノモル濃度範囲またはピコモル濃度範囲のＫＤを有することを含む。
【０２４０】
「生殖系列」という用語は、体細胞変異していない細胞、例えば、体細胞変異していないＢ細胞またはプレＢ細胞または造血細胞内の免疫グロブリン核酸配列への言及を包含する。
【０２４１】
「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」という句は、任意の生物体由来の免疫グロブリン重鎖定常領域配列を包含する。重鎖可変ドメインは、別段の指定がない限り３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのＦＲ領域を含む。重鎖の断片はＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにこれらの組合せを含む。典型的な重鎖は、可変ドメインの後に（Ｎ末端からＣ末端へ）、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能性断片は、エピトープを特異的に認識する（例えば、マイクロモル濃度範囲、ナノモル濃度範囲またはピコモル濃度範囲のＫＤでエピトープを認識する）ことができ、細胞から発現させ、分泌させることができ、かつ少なくとも１つのＣＤＲを含む断片を含む。
【０２４２】
「同一性」という用語は、配列に関連して使用される場合、ヌクレオチド配列同一性および／またはアミノ酸配列同一性を測定するために使用することができる当技術分野で公知のいくつもの異なるアルゴリズムによって決定される同一性を包含する。本明細書に記載の一部の実施形態では、オープンギャップペナルティ１０．０、伸長ギャップペナルティ０．１を使用したＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）アライメントを使用し、Ｇｏｎｎｅｔ類似度行列（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｉｎｃ．、２００８年）を使用して同一性を決定する。配列の同一性に関して比較される配列の長さは特定の配列に左右されるが、軽鎖定常ドメインの場合では、当該長さは、自己会合して標準的な軽鎖定常ドメインを形成することができる、例えば、ベータ鎖を含む２つのベータシートを形成することができ、ヒトまたはマウスの少なくとも１つのＣＨ１ドメインと相互作用することができる、軽鎖定常ドメインにフォールディングされるのに十分な長さの配列を含有するべきである。ＣＨ１ドメインの場合では、配列の長さは、ベータ鎖を含む２つのベータシートを形成することができ、マウスまたはヒトの少なくとも１つの軽鎖定常ドメインと相互作用することができるＣＨ１ドメインにフォールディングされるのに十分な長さの配列を含有するべきである。
【０２４３】
「免疫グロブリン分子」という句は、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖を含む。重鎖は同一であっても異なってもよく、軽鎖は同一であっても異なってもよい。
【０２４４】
「軽鎖」という句は、任意の生物体由来の免疫グロブリン軽鎖配列を包含し、別段の指定がない限り、ヒトκ軽鎖およびλ軽鎖およびＶｐｒｅＢ、ならびに代替軽鎖を包含する。軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは、別段の指定がない限り、一般には、３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。一般に、全長の軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端までに、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含むＶＬドメイン、および軽鎖定常ドメインを含む。軽鎖は、例えば、それらが出現するエピトープ結合タンパク質が選択的に結合した第１のエピトープにも第２のエピトープにも選択的には結合しないものを包含する。軽鎖は、それらが出現するエピトープ結合タンパク質が選択的に結合した１つまたは複数のエピトープに結合し、それらを認識するもの、または重鎖が当該エピトープに結合し、それらを認識することを補助するものも包含する。共通の軽鎖とは、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列に由来するものであり、体細胞変異した（例えば、親和性成熟した）バージョンを包含する。
【０２４５】
「マイクロモル濃度範囲」という句は１〜９９９マイクロモル濃度を意味するものとし、「ナノモル濃度範囲」という句は１〜９９９ナノモル濃度を意味するものとし、「ピコモル濃度範囲」という句は１〜９９９ピコモル濃度を意味するものとする。
【０２４６】
「体細胞変異した」という句は、クラススイッチしたＢ細胞内の免疫グロブリン可変領域（例えば、重鎖可変ドメインまたは重鎖ＣＤＲ配列もしくはＦＲ配列を含む）の核酸配列がクラススイッチ前のＢ細胞内の核酸配列と同一ではない、クラススイッチを受けたＢ細胞由来の核酸配列、例えば、クラススイッチを受けていないＢ細胞とクラススイッチを受けたＢ細胞の間のＣＤＲまたはフレームワーク核酸配列の差異などへの言及を包含する。「体細胞変異した」とは、Ｂ細胞内の親和性成熟していない対応する免疫グロブリン可変領域配列（すなわち、生殖系列細胞のゲノム内の配列）と同一ではない親和性成熟したＢ細胞由来の核酸配列への言及を包含する。「体細胞変異した」という句は、Ｂ細胞を目的のエピトープに曝露した後のＢ細胞由来の免疫グロブリン可変領域核酸配列への言及も包含し、当該核酸配列は、Ｂ細胞を目的のエピトープに曝露する前の対応する核酸配列とは異なる。「体細胞変異した」という句は、ヒト免疫グロブリン可変領域核酸配列を有する動物、例えばマウスにおいて免疫原による攻撃に応答して生成し、そのような動物において本質的に作用する選択プロセスによりもたらされる抗体由来の配列を指す。
【０２４７】
「再構成されていない」という用語は、核酸配列に関しては、動物細胞の生殖系列内に存在する核酸配列を包含する。
【０２４８】
「可変ドメイン」という句は、Ｎ末端からＣ末端へ（別段の指定のない限り）、以下のアミノ酸領域：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４を順に含む免疫グロブリン軽鎖または重鎖（所望の通り改変されたもの）のアミノ酸配列を包含する。
【０２４９】
ユニバーサル軽鎖（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）
有用な多重特異性エピトープ結合タンパク質、例えば二重特異性抗体を作製するための以前の試みは、共通のパラダイムが頻繁に共有される様々な問題：ヘテロ二量体の二重特異性ヒト免疫グロブリンを対合させるための適切な形式を合理的に操作するため、または試行錯誤を通じて操作するための配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける選択または処理によって妨げられている。残念ながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける操作手法（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈ）の全てではないにしろ大多数では、全ての場合、個々の分子に適するほとんどその場限りの調整（ｆｉｘ）がもたらされる。他方では、複雑な生物体を使用して、ヒト治療薬をもたらすことができる適切な対合を選択するためのｉｎ  ｖｉｖｏにおける方法は実現されていない。
【０２５０】
マウスゲノムにランダムに挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子座、可変領域および定常領域を含有するマウスは当技術分野で公知である。そのようなマウスの最初の系統は、限られた数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含有するものであった。特に、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントを含有する少数の系統は、１つ、３つまたは４つのヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントおよび５つのヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントを含有するものであった（Taylorら、１９９２年、Nucleic  Acids  Research  ２０巻（２３号）：６２８７〜６２９５頁；Fishwildら、１９９６年、Nature  Biotechnology１４巻：８４５〜８５１頁；Lonbergら、１９９４年、Nature３６８巻：８５６〜８５９頁；Greenら、１９９４年、NatureGenetics７巻：１３〜２１頁；GreenおよびJakobovits１９９８年、J.Exp.Med.１８８巻（３号）：４８３〜４９５頁；Green１９９９年、J.Immunol.Methods２３１巻：１１〜２３頁）。ほんの少数のヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントを、マウスゲノムにランダムに挿入された完全ヒト導入遺伝子の一部として含有するこれらのマウスでは、Ｂ細胞数の減少、Ｂ細胞発生の障害および他の免疫不全が実証された。Ｂ細胞でのヒトＣκの表面発現によって検出されるヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子の発現は、野生型と比較して、内因性κ軽鎖よりも低かった。驚いたことに、本発明は、マウスが内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座において１つまたは２つのヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントを含有するように操作されている場合に関してはＢ細胞数および発生がほぼ野生型であるマウスを提供する（例えば、実施例２および実施例１４、表３、表２５および表２６、ならびに図４、図１０Ａ−１８）。さらに、一部の実施形態では、本発明によって提供されるマウスは、抗原に応答して、ヒトＶＨドメインおよびＶＬドメインを含有するいくつかの高親和性リバースキメラ抗体を生成することができ、ＶＬドメインはそれぞれ、２つの可能性のあるヒトＶＬ遺伝子セグメントのうちの１つおよび５つの可能性のあるヒトＪＬ遺伝子セグメントのうちの１つを含有する（例えば、実施例５−１０、実施例１２、および実施例１４を参照されたい）。したがって、ヒト免疫グロブリン軽鎖ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）（すなわち、限られた数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメント）を用いて操作された予備系統の（ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｓｔｒａｉｎ）マウスとは対照的に、限られた数のヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメント（１つまたは２つ）、および一部の実施形態では２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントを含有する、現在提供される操作されたマウスは、驚いたことに、正常なＢ細胞数、正常な免疫グロブリン軽鎖発現、および正常なＢ細胞発生を示す。さらに、そのような提供されるマウスは、限定された免疫グロブリン軽鎖レパートリーの結果として、複数の抗原に対するロバストな免疫応答を開始する能力の低下も障害も示すことがない。したがって、２つ以下の再構成されていないヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメント−または２つ以下の再構成されたヒトＶＬＪＬセグメント−を含むヒト化ＶＬ遺伝子座を含み、数に関して野生型のＢ細胞集団を示し、野生型Ｂ細胞発生を示すマウスが提供される。
【０２５１】
一般に、ネイティブなマウスの配列は、ヒト治療用配列の良好な供給源ではないことが多い。少なくともその理由のため、共通のヒト軽鎖と対合させるマウス重鎖免疫グロブリン可変領域の生成の実用的な有用性が限定される。さらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける操作の試み（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｅｆｆｏｒｔ）は、エピトープ特異性および親和性を保持することを望みながらマウス重鎖可変配列をヒト化する一方で共通のヒト軽鎖とカップリングする能力を維持しようとし、不確実な結果が伴う試行錯誤プロセスに費やされる。そのようなプロセスの最後に、最終産物は特異性および親和性の一部を維持し、共通の軽鎖と結合する可能性があるが、ヒトにおける最終的な免疫原性が恐らくきわめて大きなリスクのままになる。
【０２５２】
したがって、ヒト治療薬を作製するために適したマウスは、内因性マウス重鎖可変領域遺伝子セグメントの代わりに、ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントの適切に大きなレパートリーを含む。ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントは、内因性マウス重鎖定常ドメインと共に再構成し、組み換えて、リバースキメラ重鎖（すなわち、ヒト可変ドメインおよびマウス定常領域を含む重鎖）を形成することができるものであるべきである。重鎖はクラススイッチおよび体細胞超変異可能であるべきである。それにより、重鎖可変ドメインの適切に大きなレパートリーをマウスが利用して、ヒト軽鎖可変領域の限定されたレパートリーと結合することができるものを選択することが可能になる。
【０２５３】
複数の重鎖に対する共通の軽鎖を選択するマウスは実用的な有用性を有する。種々の実施形態では、共通の軽鎖のみを発現することができるマウスにおいて発現する抗体は、同一のまたは実質的に同一の軽鎖と結合し、共に発現することができる重鎖を有する。これは、二重特異性抗体の作製において特に有用である。例えば、そのようなマウスを第１の免疫原で免疫して、第１のエピトープに特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞を生成することができる。当該マウス（または遺伝学的に同じマウス）を第２の免疫原で免疫して、第２のエピトープに特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞を生成することができる。可変重鎖領域をＢ細胞からクローニングし、同じ重鎖定常領域および同じ可変軽鎖領域（例えば、共通軽鎖）と共に細胞において発現させて、二重特異性抗体を作製することができ、当該二重特異性抗体の重鎖成分は、可変軽鎖（または共通軽鎖）成分と結合し、共に発現するようにマウスにより選択されたものである。
【０２５４】
本発明者らは、重鎖であって、その可変領域が生殖系列配列から離れた、例えば、親和性成熟したまたは体細胞変異した可変領域である重鎖を含めた、重鎖のある程度多様なファミリーと適切に対合する免疫グロブリン軽鎖を生成するためにマウスを操作した。種々の実施形態では、体細胞変異を含むヒト重鎖可変ドメインがヒト軽鎖可変ドメインに対合させ、それによって、ヒト治療薬として使用するために適した親和性の高い結合タンパク質への経路を可能にするマウスを作り出した。
【０２５５】
遺伝子操作されたマウスは、生物体内での抗体選択の長く複雑なプロセスを通じて、ヒト重鎖可変ドメインの多様なコレクションと限られた数のヒト軽鎖選択肢の対合における生物学的に適切な選択を行う。これを実現するために、マウスを、限られた数のヒト軽鎖可変ドメイン選択肢を多様性の大きなヒト重鎖可変ドメイン選択肢と併せて提示するように操作する。免疫原を用いて攻撃すると、マウスは免疫原に対する抗体を発生させるために、主にまたはもっぱらそのレパートリーにおける数または軽鎖選択肢によって限定されるそのレパートリーにおける解の数を最大にする。種々の実施形態では、これは、マウスに、それにもかかわらず、特に体細胞変異したヒト重鎖可変ドメインを含めた比較的様々なヒト重鎖可変ドメインと適合する軽鎖可変ドメインの適切かつ適合する体細胞変異を実現させる。
【０２５６】
軽鎖選択肢の限定されたレパートリーを実現するために、マウスを、ネイティブなマウス軽鎖可変ドメインを作製または再構成するその能力が非機能的または実質的に非機能的になるように操作する。これは、例えば、マウスの軽鎖可変領域遺伝子セグメントを欠失させることによって実現することができる。次いで、内因性マウス遺伝子座を、外因性ヒト可変領域遺伝子セグメントが内因性マウス軽鎖定常領域遺伝子と組み合わさり、再構成されたリバースキメラ軽鎖遺伝子（ヒト可変、マウス定常）が形成されるように、内因性マウス軽鎖定常ドメインに作動可能に連結した選択された外因性の適切なヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントによって改変することができる。種々の実施形態では、軽鎖可変領域は、体細胞変異可能である。種々の実施形態では、軽鎖可変領域の体細胞変異を獲得する能力を最大にするために、マウス内に適切なエンハンサー（複数可）を保持する。例えば、内因性マウスκ軽鎖遺伝子セグメントをヒトκ軽鎖遺伝子セグメントで置き換えるためのマウスκ軽鎖遺伝子座の改変では、マウスκイントロンエンハンサーおよびマウスκ３’エンハンサーを機能的に維持するまたは破壊しない。
【０２５７】
リバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）軽鎖の限定されたレパートリーとリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）重鎖の多様性を結びつけて発現する遺伝子操作されたマウスが提供される。種々の実施形態では、内因性マウスκ軽鎖遺伝子セグメントは欠失しており、内因性マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結した単一の（または２つの）再構成されたヒト軽鎖領域で置き換えられている。複数の実施形態では、再構成されたヒト軽鎖領域の体細胞超変異を最大にするために、マウスκイントロンエンハンサーおよびマウスκ３’エンハンサーを維持する。種々の実施形態では、マウスはまた、非機能的なλ軽鎖遺伝子座またはλ軽鎖遺伝子座の欠失または当該遺伝子座がλ軽鎖を作製できなくなる欠失も含む。
【０２５８】
種々の実施形態において、内因性マウス軽鎖ＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントを欠き、マウス定常領域に作動可能に連結した、再構成されたヒト軽鎖可変領域、一実施形態では再構成されたヒトＶＬ／ＪＬ配列を含む軽鎖可変領域遺伝子座を含む遺伝子操作されたマウスであって、遺伝子座が体細胞超変異を受けることができ、また、マウス定常領域と連結したヒトＶＬ／ＪＬ配列を含む軽鎖を発現するマウスが提供される。したがって、種々の実施形態では、遺伝子座は、マウスκ３’エンハンサーを含み、これは、体細胞超変異の正常なまたは野生型レベルと相関する。
【０２５９】
１つまたは２つの軽鎖が、例えば１つ〜５つの体細胞変異を含むヒト軽鎖可変領域を含む実施形態を含めた種々の実施形態では、遺伝子操作されたマウスは、目的の抗原を用いて免疫すると、１つまたは２つの再構成された軽鎖とともに発現し、該軽鎖とともに機能する、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の再構成の多様性を示すＢ細胞を生成する。種々の実施形態では、そのように発現したヒト軽鎖は、マウスにおいて発現する任意のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域と結合し、それとともに発現することができる。
【０２６０】
本明細書に記載の制限された免疫グロブリン軽鎖レパートリー（例えば、単一のヒトＶＬ遺伝子セグメントまたは２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメント、および、１つのヒトＪＬ遺伝子セグメントまたは必要に応じて２つまたはそれ超のヒトＪＬ遺伝子セグメント）を含む遺伝子操作されたマウスに加えて、本明細書では、単一のヒトＶＬ遺伝子セグメントまたは２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む他の遺伝子改変非ヒト動物も提供される。一部の実施形態では、そのような非ヒト動物は、再構成されたヒトＶＬＪＬ配列で構成される単一の再構成されたヒトＶＬ領域を含む。一部の実施形態では、そのような非ヒト動物は、２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む。種々の実施形態では、ヒト遺伝子セグメントは、非ヒト軽鎖定常領域、例えば、マウスラット軽鎖定常領域に作動可能に連結している。
【０２６１】
そのような非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌ウシ、雄ウシ、バッファロー）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）からなる群から選択することができる。適切な遺伝子改変可能なＥＳ細胞が容易に入手可能ではない非ヒト動物については、本明細書に記載の遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製するために他の方法が使用される。そのような方法は、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変し、改変されたゲノムを、核移植を使用して適切な細胞、例えば卵母細胞に移入し、改変された細胞（例えば、改変された卵母細胞）を非ヒト動物において適切な条件下で熟させて（ｇｅｓｔａｔｉｎｇ）胚を形成することを含む。
【０２６２】
一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は哺乳動物である。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、例えばＤｉｐｏｄｏｉｄｅａ上科またはＭｕｒｏｉｄｅａ上科の小さな哺乳動物である。一部の実施形態では、本発明の遺伝子改変動物はげっ歯類である。一部の実施形態では、本発明のげっ歯類は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。一部の実施形態では、本発明のげっ歯類は、Ｍｕｒｏｉｄｅａ上科から選択される。一部の実施形態では、本発明の遺伝子改変動物は、Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ（例えばマウス様ハムスター（ｍｏｕｓｅ−ｌｉｋｅ  ｈａｍｓｔｅｒ））、Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ（例えば、ハムスター、新世界ラットおよび新世界マウス（Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄ  ｒａｔｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｅ）、ハタネズミ）、Ｍｕｒｉｄａｅ（真性マウスおよび真性ラット（ｔｒｕｅ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｒａｔｓ）、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ（キノボリマウス（ｃｌｉｍｂｉｎｇ  ｍｉｃｅ）、イワマウス（ｒｏｃｋ  ｍｉｃｅ）、オジロハムスターモドキ（ｗｉｔｈ−ｔａｉｌｅｄ  ｒａｔ）、マダガスカルラットおよびマダガスカルマウス（Ｍａｌａｇａｓｙ  ｒａｔｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｅ））、Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ（例えば、トゲヤマネ）、およびＳｐａｌａｃｉｄａｅ（例えば、デバネズミ（molerates）、タケネズミ、およびモグラネズミ）から選択される科の動物に由来する。一部のある特定の実施形態では、本発明の遺伝子改変げっ歯類は、真性マウスまたは真性ラット（Ｍｕｒｉｄａｅ科）、アレチネズミ、トゲマウス、およびタテガミネズミから選択される。一部のある特定の実施形態では、本発明の遺伝子改変マウスはＭｕｒｉｄａｅ科のメンバーに由来する。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物はげっ歯類である。一部のある特定の実施形態では、本発明のげっ歯類は、マウスおよびラットから選択される。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物はマウスである。
【０２６３】
一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスであるげっ歯類である。一部のある特定の実施形態では、本発明のマウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される１２９系統である（例えば、Festingら、１９９９年、MammalianGenome１０巻：８３６頁；Auerbachら、２０００年、Biotechniques２９巻（５号）：１０２４〜１０２８頁、１０３０頁、１０３２頁を参照されたい）。一部のある特定の実施形態では、本発明の遺伝子改変マウスは、上述の１２９系統と上述のＣ５７ＢＬ／６系統の混合である。一部のある特定の実施形態では、本発明のマウスは、上述の１２９系統の混合または上述のＢＬ／６系統の混合である。一部のある特定の実施形態では、本明細書に記載の混合の１２９系統は１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。一部の実施形態では、本発明のマウスはＢＡＬＢ系統、例えばＢＡＬＢ／ｃ系統である。一部の実施形態では、本発明のマウスはＢＡＬＢ系統と別の上述の系統の混合である。
【０２６４】
一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物はラットである。一部のある特定の実施形態では、本発明のラットはＷｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから選択される。一部のある特定の実施形態では、本明細書に記載のラット系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される２つまたはそれ超の系統の混合である。
【０２６５】
２つ以上のエピトープに結合するエピトープ結合タンパク質
本明細書に記載の組成物および方法を使用して、２つ以上のエピトープに高親和性で結合する結合タンパク質、例えば二重特異性抗体を作製することができる。本発明の利点としては、重鎖免疫グロブリン鎖であって、そのそれぞれが単一の軽鎖と結合する、適切に高い結合性（例えば、親和性成熟した）の重鎖免疫グロブリン鎖を選択できることが挙げられる。
【０２６６】
組換え細胞培養物から二重特異性抗体断片を作製させるためのいくつかの技法が報告されている。しかし、二重特異性結合タンパク質の合成および発現には、２種の異なる重鎖と結合し、共に発現することができる適切な軽鎖の同定に関連する問題に一部起因し、単離の問題に一部起因する問題がある。種々の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法により、成分の安定性／相互作用を増大させることによって従来の免疫グロブリン構造を維持するために特別な改変（複数可）を必要としない全長の二重特異性抗体の利点がもたらされる（図７Ａ）。種々の実施形態では、そのような改変（複数可）は煩雑であり、二重特異性抗体技術の開発、およびヒト疾患の処置におけるそれらの潜在的使用の障害となることが判明している。したがって、種々の実施形態では、複数の特異性という性質が付加された天然の免疫グロブリン構造（すなわち、全長のもの）をもたらすことにより、全長の二重特異性抗体が以前の二重特異性断片には欠けていたそれらの重大なエフェクター機能を維持し、より長い半減期という重要な薬物動態パラメータが実証される治療薬をさらにもたらす。
【０２６７】
本明細書に記載の方法および組成物により、遺伝子改変マウスが、他の点では天然のプロセスにより、体細胞変異した（例えば、親和性成熟した）重鎖を含めた２種以上の重鎖と結合し、共に発現することができる適切な軽鎖を選択することが可能になる。リバースキメラ重鎖（すなわち、ヒト可変およびマウス定常）を有する親和性成熟した抗体を発現する本明細書に記載の免疫したマウスの適切なＢ細胞由来のヒトＶＬおよびＶＨ配列を同定し、発現ベクターに適切なヒト定常領域遺伝子配列（例えば、ヒトＩｇＧ１）と共にインフレームでクローニングすることができる。そのような構築物を２つ調製することができ、各構築物は、異なるエピトープに結合するヒト重鎖可変ドメインをコードする。生殖系列配列内のまたは配列が体細胞変異したＢ細胞由来のヒトＶＬのうちの１つ（例えば、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１）を適切なヒト定常領域遺伝子（例えば、ヒトκ定数遺伝子）とインフレームで融合することができる。これらの３つの完全ヒト重鎖構築物および軽鎖構築物を、発現させるために適切な細胞に配置することができる。当該細胞は２つの主要な種：同一の軽鎖を伴うホモ二量体重鎖、および同一の軽鎖を伴うヘテロ二量体重鎖を発現する。これらの主要な種の容易な分離を可能にするために、重鎖の１つを改変してプロテインＡ結合決定基を除き、それによりホモ二量体結合タンパク質のヘテロ二量体結合タンパク質からの示差的親和性をもたらす。この問題に対処する組成物および方法は、本明細書よって参照により組み込まれる、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１として公開された２０１０年６月２５日提出のＵＳＳＮ１２／８３２，８３８、表題「Ｒｅａｄｉｌｙ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｏｒｍａｔ」に記載されている。
【０２６８】
一態様では、本明細書に記載のエピトープ結合タンパク質であって、ヒトＶＬおよびＶＨ配列が目的のエピトープを含む抗原を用いて免疫した本明細書に記載のマウスに由来するタンパク質が提供される。
【０２６９】
一実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むエピトープ結合タンパク質であって、第１のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へ、第１のエピトープに選択的に結合する第１のエピトープ結合領域、その後に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第１のＣＨ３領域を含む定常領域を含み、第２のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へ、第２のエピトープに選択的に結合する第２のエピトープ結合領域、その後に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第２のＣＨ３領域を含む定常領域を含み、第２のＣＨ３領域が、第２のＣＨ３ドメインのプロテインＡへの結合性を低下させるまたは消失させる改変を含むタンパク質が提供される。
【０２７０】
一実施形態では、第２のＣＨ３領域は、Ｈ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるとＨ４３５Ｒ）を含む。別の実施形態では、第２のＣＨ３領域は、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴ；ＥＵによるとＹ４３６Ｆ）をさらに含む。
【０２７１】
一実施形態では、第２のＣＨ３領域は改変されたヒトＩｇＧ１に由来し、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるとＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される改変をさらに含む。
【０２７２】
一実施形態では、第２のＣＨ３領域は改変されたヒトＩｇＧ２に由来し、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるとＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される改変をさらに含む。
【０２７３】
一実施形態では、第２のＣＨ３領域は改変されたヒトＩｇＧ４に由来し、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるとＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される改変をさらに含む。
【０２７４】
２つ以上のエピトープに結合するエピトープ結合タンパク質を作製するための１つの方法は、本発明による第１のマウスを、目的の第１のエピトープを含む抗原を用いて免疫することであり、当該マウスは軽鎖の再構成および形成が可能な内因性マウスＶＬを含有しない内因性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座を含み、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座は、マウス内因性軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結した単一の再構成されたヒトＶＬ領域であり、再構成されたヒトＶＬ領域は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択され、内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントは、全体的にまたは部分的にヒトＶＨ遺伝子セグメントで置き換えられており、その結果、マウスにより作製される免疫グロブリン重鎖は、もっぱらまたは実質的に、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを含む重鎖である。免疫されると、そのようなマウスは、２つのヒト軽鎖可変ドメインのうちの１つのみ（例えば、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１のうちの１つ）を含むリバースキメラ抗体を作製する。Ｂ細胞が目的のエピトープに結合するＶＨをコードすることが同定されたら、ＶＨ（および、必要に応じてＶＬ）のヌクレオチド配列を取得し（例えば、ＰＣＲによる）、発現構築物へと適切なヒト免疫グロブリン定常ドメインとインフレームでクローニングすることができる。このプロセスを繰り返して、第２のエピトープに結合する第２のＶＨドメインを同定することができ、第２のＶＨ遺伝子配列を取得し、発現ベクターへと第２の適切な免疫グロブリン定常ドメインにインフレームでクローニングすることができる。第１の免疫グロブリン定常ドメインと第２の免疫グロブリン定常ドメインは同アイソタイプであっても異なるアイソタイプであってもよく、免疫グロブリン定常ドメインのうちの一方は、本明細書またはＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載の通り改変されていてよく（しかし他方は改変されていない）、エピトープ結合タンパク質は、例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載の通り、適切な細胞において発現させ、プロテインＡに対するホモ二量体エピトープ結合タンパク質と比較したその示差的親和性に基づいて単離することができる。
【０２７５】
一実施形態では、二重特異性エピトープ結合タンパク質を作製するための方法であって、本明細書に記載のマウス由来の第１の親和性成熟（例えば、１つまたは複数の体細胞超変異を含む）ヒトＶＨヌクレオチド配列（ＶＨ１）を同定するステップ、本明細書に記載のマウス由来の第２の親和性成熟（例えば、１つまたは複数の体細胞超変異を含む）ヒトＶＨヌクレオチド配列（ＶＨ２）を同定するステップ、重鎖１（ＨＣ１）を形成するためにＶＨ１をＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載のプロテインＡ決定基改変を欠くヒト重鎖とインフレームでクローニングするステップ、重鎖２（ＨＣ２）を形成するためにＶＨ２をＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載のプロテインＡ決定基を含むヒト重鎖とインフレームでクローニングするステップ、ＨＣ１を含む発現ベクターおよびＨＣ２を含む同じまたは異なる発現ベクターを細胞に導入するステップであって、当該細胞が、ヒト軽鎖定常ドメインと融合したヒトＶκ１−３９／ヒトＪκ５またはヒトＶκ３−２０／ヒトＪκ１を含むヒト免疫グロブリン軽鎖も発現し、それにより、細胞がＶＨ１によりコードされるＶＨドメインおよびＶＨ２によりコードされるＶＨドメインを含む二重特異性エピトープ結合タンパク質を発現するステップ、ならびに、二重特異性エピトープ結合タンパク質を、単一特異性ホモ二量体エピトープ結合タンパク質と比較した、プロテインＡに結合する示差的能力に基づいて単離するステップを含む方法が提供される。特定の実施形態では、ＨＣ１はＩｇＧ１であり、ＨＣ２は、改変Ｈ９５Ｒ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるとＨ４３５Ｒ）を含み、改変Ｙ９６Ｆ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるとＹ４３６Ｆ）をさらに含むＩｇＧ１である。一実施形態では、ＶＨ１によりコードされるＶＨドメイン、ＶＨ２によりコードされるＶＨドメインまたはその両方が体細胞変異したものである。
【０２７６】
共通ヒトＶＬと共に発現するヒトＶＨ遺伝子
４種の異なる抗原に対して生じた親和性成熟した抗体由来の種々のヒト可変領域を、それらのコグネイト軽鎖またはヒトＶκ１−３９／Ｊκ５、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１またはヒトＶｐｒｅＢ／Ｊλ５から選択されるヒト軽鎖の少なくとも１つのいずれかと共に発現させた（実施例１を参照されたい）。抗原のそれぞれに対する抗体について、異なる遺伝子ファミリー由来の体細胞変異した高親和性重鎖は再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域およびＶκ３−２０Ｊκ１領域と首尾よく対合し、重鎖および軽鎖を発現している細胞から分泌された。Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１については、以下のヒトＶＨ遺伝子ファミリーに由来するＶＨドメインが好都合に発現した：１−２、１−８、１−２４、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、４−３１、４−３９、４−５９、５−５１、および６−１。したがって、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１の一方または両方由来のヒトＶＬドメインの限定されたレパートリーを発現するように操作されたマウスは、マウスＶＨ遺伝子セグメントをヒトＶＨ遺伝子セグメントで置き換えるように改変されたＶＨ遺伝子座から体細胞変異したヒトＶＨドメインの多様な集団を生成する。
【０２７７】
単一の再構成された軽鎖（例えば、Ｖκ１−３９／ＪまたはＶκ３−２０／Ｊ）と結合したリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）免疫グロブリン重鎖を発現するように遺伝子操作されたマウスは、目的の抗原を用いて免疫すると、ヒトＶＨ再構成の多様性を含み、抗原特異的抗体であって、抗原とそのリガンドの結合を遮断するそれらの能力に関して、および抗原のバリアントに結合するそれらの能力に関して多様な性質を有する高親和性の抗原特異的抗体の多様性を発現するＢ細胞を生成した（実施例５から１０を参照されたい）。
【０２７８】
したがって、本明細書に記載のマウスおよび方法は、再構成の多様性から生じる体細胞変異したヒト重鎖可変ドメイン、多種多様な親和性を示し（ほぼナノモル濃度またはそれ未満のＫＤを示すことを含む）、多種多様な特異性を示す（同じ抗原の異なるエピトープへの結合を含む）体細胞変異したヒト重鎖可変ドメイン、および同じまたは実質的に同じヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域と結合し、共に発現する体細胞変異したヒト重鎖可変ドメインを含めたヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインの作製および選択において有用である。
【０２７９】
共通の軽鎖を有する完全ヒト二重特異性抗体
種々の実施形態における第１のステップとして、それぞれヒト重鎖可変ドメイン（および二重特異性抗体を形成する任意のさらなる核酸配列）をコードする第１の核酸配列および第２の核酸配列を、例えば、異なるエピトープに結合できること（図７Ａおよび図７Ｂを参照されたい）、異なる親和性を有することなどのような所望の特性を有する親モノクローナル抗体から選択する。通常、ヒト重鎖可変ドメインをコードする核酸配列は本明細書に記載の通り免疫したマウスから単離し、ヒトへの投与に適するようにヒト重鎖定常領域との融合を可能にする。二重特異性抗体にさらなる機能性を付加する変異を導入することによって行うことができる配列（複数可）へのさらなる改変を実現することができ、その改変としては、例えば、血清半減期を増加させること（例えば、Ｕ．Ｓ．７，２１７，７９７を参照されたい）および／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性を高めること（例えば、Ｕ．Ｓ．６，７３７，０５６を参照されたい）が挙げられる。抗体の定常領域への変異の導入は当技術分野で公知である。さらに、二重特異性抗体の一部は組換えによって細胞培養物中で作製させることができ、当該分子の他の部分（複数可）は上記の技法によって作製することができる。
【０２８０】
抗体を産生するためのいくつかの技法が記載されている。例えば、種々の実施形態では、本明細書に記載のマウスにおいてキメラ抗体を産生させる。免疫したマウスのＢ細胞から抗体を直接単離することができ（例えば、Ｕ．Ｓ．２００７／０２８０９４５Ａ１を参照されたい）、かつ／または免疫したマウスのＢ細胞を使用してハイブリドーマを作製することができる（KohlerおよびMilstein、１９７５年、Nature２５６巻：４９５〜４９７頁）。本明細書に記載のマウス由来の抗体（ヒト重鎖および／または軽鎖）をコードするＤＮＡは、従来の技法を使用して容易に単離し、配列決定することができる。本明細書に記載のマウスに由来するハイブリドーマおよび／またはＢ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。ＤＮＡを単離したら、それを発現ベクターに配置することができ、次いでそれを、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインのコード配列でマウス配列を置換することによって改変することもできる。
【０２８１】
種々の実施形態では、ＤＮＡを単離し、所望の特異性／親和性を有する第１のヒト重鎖可変ドメインおよび第２のヒト重鎖可変ドメインをコードする第１の核酸配列および第２の核酸配列、ならびに、ヒト軽鎖ドメイン（再構成された生殖系列配列または本明細書に記載のマウスから単離された軽鎖配列）をコードする第３の核酸配列を選択した後、当技術分野において広範に利用可能な組換え技法を使用して、これらの分子をコードする３つの核酸配列を発現させて二重特異性抗体を形成する。多くの場合、選択される発現系は、哺乳動物細胞発現ベクターおよび宿主を伴い、したがって、二重特異性抗体は適切にグリコシル化される（例えば、グリコシル化された抗体ドメインを含む二重特異性抗体の場合）。しかし、当該分子は原核生物発現系においても産生され得る。通常、宿主細胞は単一のベクターまたは独立したベクター上の第１のヒト重鎖可変ドメイン、第２のヒト重鎖可変ドメイン、ヒト軽鎖ドメインの両者をコードするＤＮＡで形質転換される。しかし、第１のヒト重鎖可変ドメイン、第２のヒト重鎖可変ドメイン、およびヒト軽鎖ドメイン（二重特異性抗体成分）を独立した発現系で発現させ、発現したポリペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏでカップリングすることが可能である。種々の実施形態では、ヒト軽鎖ドメインは生殖系列配列を含む。種々の実施形態では、ヒト軽鎖ドメインは、軽鎖ドメインの軽鎖可変配列に対して１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下または５つ以下の体細胞超変異を含む。
【０２８２】
種々の実施形態では、２種の重鎖および単一のヒト軽鎖をコードする核酸（複数可）（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を、さらにクローニングし（ＤＮＡの増幅）、かつ／または発現させるために、複製可能なベクターに挿入する。多くのベクターが利用可能であり、一般に、それらは、これだけに限定されないが、以下のうちの１つまたは複数を含む：シグナル配列、複製開始点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。各成分は、個別にまたは宿主細胞の選択もしくは実験的に決定される他の基準に基づいて選択することができる。各成分のいくつかの例が当技術分野で公知である。
【０２８３】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物体によって認識され、また、二重特異性抗体の成分のそれぞれまたは全てをコードする核酸配列に作動可能に連結しているプロモーターを含有する。種々の潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターは周知である。これらのプロモーターは、供給源のＤＮＡからプロモーターを制限酵素消化により取り出し、単離されたプロモーター配列をベクターに挿入することによって二重特異性抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。
【０２８４】
真核生物宿主細胞（酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞または他の多細胞生物体由来の有核細胞）に使用する発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有してよい。そのような配列は、一般に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域、時には３’非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、二重特異性抗体成分をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。種々の実施形態のための適切な発現ベクターとしては、二重特異性抗体をコードするＤＮＡの、哺乳動物細胞における一過性発現をもたらすものが挙げられる。一般に、一過性発現には、宿主細胞において効率的に複製することができ、その結果、宿主細胞に発現ベクターの多くのコピーが蓄積し、今度は、発現ベクターによりコードされる所望のポリペプチドが高レベルで合成されるような発現ベクターの使用が関与する。適切な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性発現系により、クローニングされたＤＮＡによりコードされるポリペプチドの都合のよい明確な同定、ならびに第１のヒト重鎖可変ドメインまたは第２のヒト重鎖可変ドメインのホモ二量体を有する親抗体と比較して、所望の結合特異性／親和性または所望のゲル移動特性を有する二重特異性抗体の迅速なスクリーニングが可能になる。
【０２８５】
種々の実施形態では、二重特異性抗体の成分をコードするＤＮＡを上記の所望のベクター（複数可）に集合させたら、それらを、発現させ回収するために適切な宿主細胞に導入する。宿主細胞のトランスフェクトは、選択された宿主細胞に適した当技術分野で公知の標準の技法（例えば、電気穿孔、核微量注入、インタクトな細胞との細菌プロトプラスト融合、またはポリカチオン、例えば、ポリブレン、ポリオルニチンなど）を使用して実現することができる。
【０２８６】
種々の実施形態では、成分を含有する発現ベクターに最も適し、二重特異性抗体種の最も効率的かつ好都合な産生を可能にする宿主細胞を選択する。発現のための例示的な宿主細胞としては、原核生物および真核生物の細胞（単一細胞または複数の細胞）、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．などの株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞または例えばハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合物が挙げられる。種々の実施形態では、細胞は、ヒト細胞、サル細胞、類人猿細胞、ハムスター細胞、ラット細胞またはマウス細胞である。種々の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ  ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および上述の細胞に由来する細胞株から選択される真核細胞である。種々の実施形態では、細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含む、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）である。
【０２８７】
二重特異性抗体を産生させるために使用する哺乳動物宿主細胞は、種々の培地で培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が宿主細胞の培養に適している。培地には、必要な場合、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標））、微量元素（通常マイクロモル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー供給源を補充することができる。当業者に公知の通り任意の他の補充物質も適切な濃度で含めることができる。種々の実施形態では、培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、発現させるために選択した宿主細胞で以前に使用されたものであり、これは当業者には明らかである。
【０２８８】
種々の実施形態では、二重特異性抗体を培養培地から分泌ポリペプチドとして回収するが、分泌シグナルを伴わずに直接産生された場合には宿主細胞溶解物から回収することもできる。二重特異性抗体が膜に結合している場合には、適切な界面活性剤溶液（例えば、トリトン−Ｘ１００）を使用して膜から放出させることができる。本明細書に記載の二重特異性抗体は第１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインおよび第２の免疫グロブリンＣＨ３ドメインの使用を伴い、第１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインと第２の免疫グロブリンＣＨ３ドメインは少なくとも１つのアミノ酸により互いに異なり、少なくとも１つのアミノ酸の差異により、二重特異性抗体のプロテインＡに対する結合性が、アミノ酸の差異を欠く二重特異性抗体と比較して低下することが好ましい（Ｕ．Ｓ．２０１０／０３３１５２７Ａ１参照；参照により本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、第１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインはプロテインＡに結合し、第２の免疫グロブリンＣＨ３ドメインは、プロテインＡ結合性を低下または消滅させる変異、例えばＨ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるとＨ４３５Ｒ）を含有する。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるとＹ４３６Ｆ）をさらに含んでよい。第２のＣＨ３内に見いだすことができるさらなる改変としては、ＩｇＧ１抗体の場合には、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるとＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合には、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるとＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）；ならびにＩｇＧ４抗体の場合では、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるとＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）が挙げられる。上記の二重特異性抗体形式の変動が本発明の範囲内で意図されている。
【０２８９】
二重特異性抗体の二重性（すなわち、１つのポリペプチドの異なるエピトープに特異的であってもよく、２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有してもよい、図７Ｂを参照されたい；例えば、Tuttら、１９９１年、J.Immunol.１４７巻：６０〜６９頁；Kuferら、２００４年、TrendsBiotechnol.２２巻：２３８〜２４４頁も参照されたい）に起因して、二重特異性抗体には、治療への適用に対する多くの有用な利点がある。例えば、二重特異性抗体は、再指向細胞傷害性（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）のため（例えば、腫瘍細胞を死滅させるため）、ワクチンアジュバントとして、血栓溶解剤をクロットに送達するため、酵素により活性化されるプロドラッグを標的部位（例えば、腫瘍）において変換させるため、感染症を処置するため、免疫複合体を細胞表面受容体にターゲティングするため、または免疫毒素を腫瘍細胞に送達するために使用することができる。
【０２９０】
本明細書に記載の二重特異性抗体は、酵素イムノアッセイ、２部位イムノアッセイ、種々の疾患（例えばがん）のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫診断、競合結合アッセイ、直接サンドイッチアッセイ、間接サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイなどの、いくつかの治療的および非治療的ならびに／または診断的アッセイ方法において使用することもできる。二重特異性抗体に関する他の使用は、当業者には明らかである。
【０２９１】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作製し使用するかを当業者に説明するために提供され、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定するものではない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関しては正確さを確実にするための試みが行われているが、いくらかの実験的な誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の指定のない限り、部分は重量による部分であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏で示されており、圧力は大気または大気付近の圧力である。
【実施例】
【０２９２】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作製し使用するかを当業者に説明するために提供され、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定するものではない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関しては正確さを確実にするための試みが行われているが、いくらかの実験的な誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の指定のない限り、温度は摂氏で示されており、圧力は大気または大気付近の圧力であり、部分は重量による部分であり、分子量は平均分子量である。
【０２９３】
（実施例１）
選択されたヒトＶＬと結合するヒトＶＨ領域の同定
単一の再構成されたヒト生殖系列軽鎖を抗原特異的ヒト抗体由来のヒト重鎖と共発現させることができるかどうかを決定するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系を構築した。
【０２９４】
遺伝子改変マウスにおいてヒト抗体を生成するための方法は公知である（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）を参照されたい）。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、内因性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に連結したヒト重鎖可変領域およびヒト軽鎖可変領域を含むゲノムを有し、その結果、抗原による刺激に応答してヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を産生する遺伝子改変マウスの生成を伴う。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにより産生される抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡは完全ヒトである。最初に、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体を単離する。下記の通り、抗体を特徴付け、親和性、選択性、エピトープなどを含めた望ましい特性について選択する。マウス定常領域を所望のヒト定常領域で置き換えて、非ＩｇＭアイソタイプ、例えば、野生型または改変されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含有する完全ヒト抗体を生成する。選択する定常領域は、特定の使用に応じて変動してよいが、可変領域には高親和性抗原結合特性および標的特異性特性が存在する。
【０２９５】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを、血管新生を促進する増殖因子（抗原Ｃ）を用いて免疫し、抗原特異的なヒト抗体を単離し、当技術分野において認められている標準の技法を使用してＶ遺伝子使用について配列決定した。選択された抗体をヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域にクローニングし、３種のヒト軽鎖：（１）ヒトκ定常領域と連結したコグネイトκ軽鎖、（２）ヒトκ定常領域と連結した再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５、または（３）ヒトκ定常領域と連結した再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１のうちの１つと対合させるために６９種の重鎖を選択した。各重鎖および軽鎖対を、標準の技法を使用してＣＨＯ−Ｋ１細胞に共トランスフェクトした。上清中の抗体の存在をＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗ヒトＩｇＧによって検出した。各重鎖／軽鎖対について抗体価（ｎｇ／ｍｌ）を決定し、異なる再構成された生殖系列軽鎖での力価を親抗体分子（すなわち、コグネイト軽鎖と対合させた重鎖）で得られた力価と比較し、ネイティブな力価に対するパーセントを算出した（表１）。ＶＨ：重鎖可変遺伝子。ＮＤ：現行の実験条件下では発現は検出されず。
【表１−１】
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【表１−２】
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【０２９６】
同様の実験において、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを、いくつかの異なる抗原を用いて免疫し、選択された抗原特異的なヒト抗体の重鎖を、異なる再構成されたヒト生殖系列軽鎖（上記の通り）と対合するそれらの能力について試験した。本実験で使用した抗原は、コレステロール恒常性に関与する酵素（抗原Ａ）、グルコース恒常性の調節に関与する血清ホルモン（抗原Ｂ）、血管新生を促進する増殖因子（抗原Ｃ）および細胞表面受容体（抗原Ｄ）を含むものであった。各免疫群のマウスから抗原特異的抗体を単離し、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をクローニングし、配列決定した。重鎖および軽鎖の配列からＶ遺伝子使用を決定し、選択された重鎖を、それらのコグネイト軽鎖または再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域のいずれかと対合させた。各重鎖／軽鎖対をＣＨＯ−Ｋ１細胞に共トランスフェクトし、上清中の抗体の存在をＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗ヒトＩｇＧによって検出した。各重鎖／軽鎖対合について抗体価（μｇ／ｍｌ）を決定し、異なる再構成されたヒト生殖系列軽鎖での力価を親抗体分子（すなわち、コグネイト軽鎖と対合させた重鎖）で得られた力価と比較し、ネイティブな力価に対するパーセントを算出した（表２）。ＶＨ：重鎖可変遺伝子。Ｖκ：κ軽鎖可変遺伝子。ＮＤ：現行の実験条件下では発現は検出されず。
【表２】
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【０２９７】
これらの実験から得られた結果により、異なる遺伝子ファミリー由来の体細胞変異した高親和性重鎖が、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域およびＶκ３−２０Ｊκ１領域と対合して、正常な抗体分子として細胞から分泌され得ることが実証される。表１に示されている通り、抗体価は、親抗体のコグネイト軽鎖と比較して、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖と対合させた場合には重鎖の約６１％（６９種のうち４２種）で上昇し、再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖と対合させた場合には重鎖の約２９％（６９種のうち２０種）で上昇した。重鎖の約２０％（６９種のうち１４種）については、再構成されたヒト生殖系列軽鎖の両方とも親抗体のコグネイト軽鎖と比較して発現の増加が付与された。表２に示されている通り、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域により、親抗体のコグネイト軽鎖と比較して、様々な異なるクラスの抗原に特異的ないくつかの重鎖の発現の増加が付与された。重鎖の約３５％（１５種／４３種）については、抗体価が親抗体のコグネイト軽鎖と比較して２倍超上昇した。２種の重鎖（３１５および３１６）については、上昇は親抗体と比較して１０倍を超えた。親抗体のコグネイト軽鎖と比較して発現の増加を示した全ての重鎖の中で、ファミリー３（ＶＨ３）重鎖は他の重鎖可変領域遺伝子ファミリーと比較して過剰発現する。これにより、ヒトＶＨ３重鎖の、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５軽鎖およびＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖と対合することとの好都合な関係が実証される。
【０２９８】
（実施例２）
再構成されたヒト生殖系列軽鎖遺伝子座の生成
ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびValenzuelaら（２００３年）High-throughput  engineering  of  the  mouse  genome  coupled  with  high-resolution  expression  analysis、Nature  Biotech.２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照されたい）を使用して種々の再構成されたヒト生殖系列軽鎖ターゲティングベクターを作製して、マウスゲノム細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローン３０２ｇ１２および２５４ｍ０４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を改変した。これらの２種のＢＡＣクローンを使用して、ゲノム構築物を、単一の再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域を含有するように操作し、内因性κ可変遺伝子セグメントおよび内因性連結遺伝子セグメントが欠失するように予め改変した内因性κ軽鎖遺伝子座に挿入した。
【０２９９】
再構成されたヒト生殖系列軽鎖ターゲティングベクターの構築。
当技術分野において認められている標準の分子生物学技法を使用して３種の異なる再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域を作製した。これらの３種の領域を構築するために使用したヒト可変遺伝子セグメントは、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列、再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列および再構成されたヒトＶｐｒｅＢＪλ５配列を含むものであった。
【０３００】
マウスＶκ３−７遺伝子のエクソン１（リーダーペプチドをコードする）およびイントロン１を含有するＤＮＡセグメントをデノボＤＮＡ合成（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって作製した。５’非翻訳領域の一部から天然に存在するＢｌｐＩ制限酵素部位までを含めた。ヒトＶκ１−３９遺伝子およびヒトＶκ３−２０遺伝子のエクソンをヒトゲノムＢＡＣライブラリーからＰＣＲ増幅した。フォワードプライマーはマウスＶκ３−７遺伝子のイントロン１のスプライスアクセプター部位を含有する５’伸長を有した。ヒトＶκ１−３９配列のＰＣＲのために使用したリバースプライマーはヒトＪκ５をコードする伸長を含むものであり、ヒトＶκ３−２０配列のＰＣＲのために使用したリバースプライマーはヒトＪκ１をコードする伸長を含むものであった。ヒトＶｐｒｅＢＪλ５配列をデノボＤＮＡ合成（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって作製した。スプライスドナー部位を含むヒトＪκ−Ｃκイントロンの一部をプラスミドｐＢＳ−２９６−ＨＡ１８−ＰＩＳｃｅＩからＰＣＲ増幅した。フォワードＰＣＲプライマーはヒトＪκ５配列、Ｊκ１配列またはＪλ５配列のいずれかの一部をコードする伸長を含むものであった。リバースプライマーはイントロンに予め操作されたＰＩ−ＳｃｅＩ部位を含むものであった。
【０３０１】
マウスＶκ３−７エクソン１／イントロン１、ヒト可変軽鎖エクソン、およびヒトＪκ−Ｃκイントロン断片をオーバーラップ伸長ＰＣＲによってつなぎ合わせ、ＢｌｐＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩを用いて消化し、ヒトＶκ３−１５可変遺伝子セグメント由来のプロモーターを含有するプラスミドｐＢＳ−２９６−ＨＡ１８−ＰＩＳｃｅＩへとライゲーションした。プラスミドｐＢＳ−２９６−ＨＡ１８−ＰＩＳｃｅＩ内のｌｏｘｅｄハイグロマイシンカセットをＮｏｔＩ部位およびＡｓｃＩ部位で挟まれたＦＲＴｅｄハイグロマイシンカセットで置き換えた。このプラスミドのＮｏｔＩ／ＰＩ−ＳｃｅＩ断片を、マウスＪκ−Ｃκイントロン、マウスＣκエクソン、およびマウスκ遺伝子座の下流の約７５ｋｂのゲノム配列の一部を含有する改変マウスＢＡＣ  ２５４ｍ０４へとライゲーションし、これによりマウスＥＳ細胞における相同組換えのための３’相同性アームをもたらした。次いで、このＢＡＣのＮｏｔＩ／ＡｓｃＩ断片を、マウスＥＳ細胞における相同組換えのために、ＦＲＴｅｄネオマイシンカセットおよび内因性κ遺伝子座の上流の約２３ｋｂのゲノム配列を含有する改変マウスＢＡＣ  ３０２ｇ１２へとライゲーションした。
【０３０２】
再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５ターゲティングベクター（図１）。
操作された軽鎖挿入物の５’末端および３’末端に、ターゲティングベクターへのクローニングのための制限酵素部位を導入した：５’末端にＡｓｃＩ部位および３’末端にＰＩ−ＳｃｅＩ部位。５’ＡｓｃＩ部位から３’ＰＩ−ＳｃｅＩ部位内で、ターゲティング構築物は、５’から３’へ、マウスＢＡＣクローン３０２ｇ１２から得た内因性マウスκ軽鎖遺伝子座に対して５’側の５’相同性アーム含有配列、ＦＲＴｅｄネオマイシン耐性遺伝子、ヒトＶκ３−１５プロモーターを含むゲノム配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのリーダー配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのイントロン配列、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域のオープンリーディングフレーム、ヒトＪκ−Ｃκイントロンの一部を含有するゲノム配列、およびマウスＢＡＣクローン２５４ｍ０４から得た内因性マウスＪκ５遺伝子セグメントの３’側の３’相同性アーム含有配列を含んだ（図１、中央）。内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の上流および最も３’側のＪκ遺伝子セグメント（例えば、内因性３’エンハンサー）の下流の遺伝子および／または配列はターゲティング構築物によって改変しなかった（図１参照）。操作されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子座の配列が配列番号１に示されている。
【０３０３】
再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域のＢＡＣ  ＤＮＡへの標的化挿入を、再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域内の配列に位置するプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって確認した。簡単に述べると、マウスＶκ３−７リーダー配列に対して３’側のイントロン配列を、プライマーＵＬＣ−ｍ１Ｆ（ＡＧＧＴＧＡＧＧＧＴ  ＡＣＡＧＡＴＡＡＧＴ  ＧＴＴＡＴＧＡＧ；配列番号２）およびＵＬＣ−ｍ１Ｒ（ＴＧＡＣＡＡＡＴＧＣ  ＣＣＴＡＡＴＴＡＴＡ  ＧＴＧＡＴＣＡ；配列番号３）を用いて確認した。再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域のオープンリーディングフレームを、プライマー１６３３−ｈ２Ｆ（ＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡ  ＧＡＧＣＡＴＴＡＧＣ  Ａ；配列番号４）および１６３３−ｈ２Ｒ（ＴＧＣＡＡＡＣＴＧＧ  ＡＴＧＣＡＧＣＡＴＡ  Ｇ；配列番号５）を用いて確認した。ネオマイシンカセットを、プライマーｎｅｏＦ（ＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧ  ＣＴＡＴＴＣＧＧＣ；配列番号６）およびｎｅｏＲ（ＧＡＡＣＡＣＧＧＣＧ  ＧＣＡＴＣＡＧ；配列番号７）を用いて確認した。次いで、標的ＢＡＣ  ＤＮＡを使用して、マウスＥＳ細胞に電気穿孔し、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域を発現するキメラマウスを生成するための改変ＥＳ細胞を作製した。
【０３０４】
陽性ＥＳ細胞クローンを、内因性遺伝子座に挿入された操作されたＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域に特異的なプローブを使用したＴＡＱＭＡＮ（商標）スクリーニングおよび核型分析によって確認した。簡単に述べると、ネオマイシンマーカー遺伝子内に結合するプローブｎｅｏＰ（ＴＧＧＧＣＡＣＡＡＣ  ＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧ  ＣＴＧ；配列番号８）、マウスＶκ３−７リーダー配列に対して３’側のイントロン配列内に結合するプローブＵＬＣ−ｍ１Ｐ（ＣＣＡＴＴＡＴＧＡＴ  ＧＣＴＣＣＡＴＧＣＣ  ＴＣＴＣＴＧＴＴＣ；配列番号９）、および再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５オープンリーディングフレーム内に結合するプローブ１６３３ｈ２Ｐ（ＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡ  ＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡ  ＧＣＣＣＣＴ；配列番号１０）。次いで、陽性ＥＳ細胞クローンを使用して雌マウスに移植して、生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域を発現する同腹仔を生じさせた。
【０３０５】
あるいは、ターゲティング構築物により導入されたＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域を有するＥＳ細胞にＦＬＰを発現する構築物をトランスフェクトする。必要に応じて、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウスと掛け合わせることによってネオマイシンカセットを除去する（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）。必要に応じて、ネオマイシンカセットはマウス内に保持される。
【０３０６】
再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１ターゲティングベクター（図２）。
同様に、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１領域を発現する、操作された軽鎖遺伝子座を、５’から３’へ、マウスＢＡＣクローン３０２ｇ１２から得た内因性マウスκ軽鎖遺伝子座に対して５’側の５’相同性アーム含有配列、ＦＲＴｅｄネオマイシン耐性遺伝子、ヒトＶκ３−１５プロモーターを含むゲノム配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのリーダー配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのイントロン配列、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１領域のオープンリーディングフレーム、ヒトＪκ−Ｃκイントロンの一部を含有するゲノム配列、およびマウスＢＡＣクローン２５４ｍ０４から得た内因性マウスＪκ５遺伝子セグメントの３’側の３’相同性アーム含有配列を含むターゲティング構築物を使用して作製した（図２、中央）。操作されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子座の配列が配列番号１１に示されている。
【０３０７】
再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１領域のＢＡＣ  ＤＮＡへの標的化挿入を、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域内の配列に位置するプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって確認した。簡単に述べると、マウスＶκ３−７リーダー配列に対して３’側のイントロン配列を、プライマーＵＬＣ−ｍ１Ｆ（配列番号２）およびＵＬＣ−ｍ１Ｒ（配列番号３）を用いて確認した。再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１領域のオープンリーディングフレームを、プライマー１６３５−ｈ２Ｆ（ＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣ  ＣＴＧＴＣＴＴＴＧ；配列番号１２）および１６３５−ｈ２Ｒ（ＡＡＧＴＡＧＣＴＧＣ  ＴＧＣＴＡＡＣＡＣＴ  ＣＴＧＡＣＴ；配列番号１３）を用いて確認した。ネオマイシンカセットを、プライマーｎｅｏＦ（配列番号６）およびｎｅｏＲ（配列番号７）を用いて確認した。次いで、標的ＢＡＣ  ＤＮＡを使用して、マウスＥＳ細胞に電気穿孔し、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖を発現するキメラマウスを生成するための改変ＥＳ細胞を作製した。
【０３０８】
陽性ＥＳ細胞クローンを、内因性κ軽鎖遺伝子座に挿入された操作されたＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域に特異的なプローブを使用したＴＡＱＭＡＮ（商標）スクリーニングおよび核型分析によって確認した。簡単に述べると、ネオマイシンマーカー遺伝子内に結合するプローブｎｅｏＰ（配列番号８）、マウスＶκ３−７リーダー配列内に結合するプローブＵＬＣ−ｍ１Ｐ（配列番号９）、およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１オープンリーディングフレーム内に結合するプローブ１６３５ｈ２Ｐ（ＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣ  ＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣ  ＡＧＧＧ；配列番号１４）。次いで、陽性ＥＳ細胞クローンを使用して雌マウスに移植した。ヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域を発現する同腹仔。
【０３０９】
あるいは、ターゲティング構築物により導入されたＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、ヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域を有するＥＳ細胞にＦＬＰを発現する構築物をトランスフェクトすることができる。必要に応じて、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウスと掛け合わせることによってネオマイシンカセットを除去することができる（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）。必要に応じて、ネオマイシンカセットはマウス内に保持される。
【０３１０】
再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５ターゲティングベクター（図３）。
同様に、再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５領域を発現する、操作された軽鎖遺伝子座を、５’から３’へ、マウスＢＡＣクローン３０２ｇ１２から得た内因性マウスκ軽鎖遺伝子座に対して５’側の５’相同性アーム含有配列、ＦＲＴｅｄネオマイシン耐性遺伝子、ヒトＶκ３−１５プロモーターを含むゲノム配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのリーダー配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのイントロン配列、再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５領域のオープンリーディングフレーム、ヒトＪκ−Ｃκイントロンの一部を含有するゲノム配列、およびマウスＢＡＣクローン２５４ｍ０４から得た内因性マウスＪκ５遺伝子セグメントの３’側の３’相同性アーム含有配列を含むターゲティング構築物を使用して作製した（図３、中央）。操作されたヒトＶｐｒｅＢＪλ５遺伝子座の配列が配列番号１５に示されている。
【０３１１】
再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５領域のＢＡＣ  ＤＮＡへの標的化挿入を、再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５領域軽鎖領域内の配列に位置するプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって確認した。簡単に述べると、マウスＶκ３−７リーダー配列に対して３’側のイントロン配列を、プライマーＵＬＣ−ｍ１Ｆ（配列番号２）およびＵＬＣ−ｍ１Ｒ（配列番号３）を用いて確認した。再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５領域のオープンリーディングフレームを、プライマー１６１６−ｈ１Ｆ（ＴＧＴＣＣＴＣＧＧＣ  ＣＣＴＴＧＧＡ；配列番号１６）および１６１６−ｈ１Ｒ（ＣＣＧＡＴＧＴＣＡＴ  ＧＧＴＣＧＴＴＣＣＴ；配列番号１７）を用いて確認した。ネオマイシンカセットを、プライマーｎｅｏＦ（配列番号６）およびｎｅｏＲ（配列番号７）を用いて確認した。次いで、標的ＢＡＣ  ＤＮＡを使用して、マウスＥＳ細胞に電気穿孔し、再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５軽鎖を発現するキメラマウスを生成するための改変ＥＳ細胞を作製した。
【０３１２】
陽性ＥＳ細胞クローンを、内因性κ軽鎖遺伝子座に挿入された操作されたＶｐｒｅＢＪλ５軽鎖領域に特異的なプローブを使用したＴＡＱＭＡＮ（商標）スクリーニングおよび核型分析によって確認する。簡単に述べると、ネオマイシンマーカー遺伝子内に結合するプローブｎｅｏＰ（配列番号８）、マウスＩｇＶκ３−７リーダー配列内に結合するプローブＵＬＣ−ｍ１Ｐ（配列番号９）、およびヒトＶｐｒｅＢＪλ５オープンリーディングフレーム内に結合するプローブ１６１６ｈ１Ｐ（ＡＣＡＡＴＣＣＧＣＣ  ＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣ  ＣＣＴ；配列番号１８）。次いで、陽性ＥＳ細胞クローンを使用して雌マウスに移植して、生殖系列軽鎖領域を発現する同腹仔を生じさせる。
【０３１３】
あるいは、ターゲティング構築物により導入されたＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５軽鎖領域を有するＥＳ細胞にＦＬＰを発現する構築物をトランスフェクトする。必要に応じて、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウスと掛け合わせることによってネオマイシンカセットを除去する（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）。必要に応じて、ネオマイシンカセットはマウス内に保持される。
【０３１４】
（実施例３）
単一の再構成されたヒト軽鎖を発現するマウスの生成
上記の標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号、およびPoueymirouら（２００７年）F0  generation  mice  that  are  essentially  fully  derived  from  the  donor  gene-targeted  ES  cells  allowing  immediate  phenotypic  analyses  Nature  Biotech.２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい）によって８細胞期マウス胚に導入した。操作されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域、Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域またはＶｐｒｅＢＪλ５軽鎖領域をそれぞれ独立に有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を、対立遺伝子アッセイ（Valenzuelaら、上記）の改変を使用した遺伝子型決定によって同定し、それにより独特の再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域の存在を検出する。
【０３１５】
仔の遺伝子型決定を行い、独特の再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域についてヘテロ接合性またはホモ接合性の仔を、再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域の発現を特徴付けるために選択する。
【０３１６】
フローサイトメトリー。
共通軽鎖マウスの正常な抗体レパートリーにおける再構成されたヒト軽鎖領域の発現を、共通軽鎖マウスの脾細胞および末梢血における免疫グロブリンκおよびλ発現を分析することにより検証した。野生型マウス（ｎ＝５）、Ｖκ１−３９Ｊκ５共通軽鎖ヘテロ接合体マウス（ｎ＝３）、Ｖκ１−３９Ｊκ５共通軽鎖ホモ接合体マウス（ｎ＝３）、Ｖκ３−２０Ｊκ１共通軽鎖ヘテロ接合体マウス（ｎ＝２）、およびＶκ３−２０Ｊκ１共通軽鎖ホモ接合体マウス（ｎ＝２）から採取した脾臓および末梢血から、標準の方法を使用して細胞懸濁物を作製し、蛍光標識された抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を使用してＣＤ１９＋、Ｉｇλ＋およびＩｇκ＋で染色した。
【０３１７】
簡単に述べると、細胞１×１０６個を、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン２．４Ｇ２、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）と共に氷上で１０分インキュベートし、その後、以下の抗体カクテルを用いて氷上で３０分標識した：ＡＰＣとコンジュゲートした抗マウスＣＤ１９（クローン１Ｄ３、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５とコンジュゲートした抗マウスＣＤ３（クローン１７Ａ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣとコンジュゲートした抗マウスＩｇκ（クローン１８７．１、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、ＰＥとコンジュゲートした抗マウスＩｇλ（クローンＲＭＬ−４２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。染色後、細胞を洗浄し、２％ホルムアルデヒド中に固定した。ＬＳＲＩＩフローサイトメーターでデータの取得を実施し、ＦｌｏｗＪｏを用いて分析した。ゲーティング：総Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ３−）、Ｉｇκ＋Ｂ細胞（Ｉｇκ＋Ｉｇλ−ＣＤ１９＋ＣＤ３−）、Ｉｇλ＋Ｂ細胞（Ｉｇκ−Ｉｇλ＋ＣＤ１９＋ＣＤ３−）。血液試料および脾細胞試料から収集したデータにより同様の結果が実証された。表３には、Ｉｇλ＋、Ｉｇκ＋またはＩｇλ＋Ｉｇκ＋である各群からの代表的なマウス１匹の末梢血由来のＣＤ１９＋Ｂ細胞における陽性の割合が示されている。野生型マウス（ＷＴ）およびＶκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１共通軽鎖のいずれかについてホモ接合性のマウス由来の末梢血中のＣＤ１９＋Ｂ細胞のパーセントが図４に示されている。
【表３】
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【０３１８】
共通軽鎖発現。
各共通軽鎖（Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１）の発現を、ヘテロ接合性マウスおよびホモ接合性マウスにおいて定量的ＰＣＲアッセイ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（商標））を使用して解析した。
【０３１９】
簡単に述べると、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、野生型マウス、マウス重鎖およびκ軽鎖可変領域遺伝子座の、対応するヒト重鎖およびκ軽鎖可変領域遺伝子座（Ｈκ）での置き換えについてホモ接合性のマウス、ならびに各再構成されたヒト軽鎖領域（Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１）についてホモ接合性のマウスおよびヘテロ接合性のマウスの脾臓からｍｏｕｓｅ  ＣＤ１９  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を製造業者の仕様書に従って使用して精製した。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の仕様書に従って使用してＣＤ１９＋Ｂ細胞から全ＲＮＡを精製し、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  ｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＲＮＡを取り出した。Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して２００ｎｇのｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、生じたｃＤＮＡを、Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて増幅した。全ての反応を、プライマーおよび（１）両方の共通軽鎖についてのＶκ−Ｊκ接合部、（２）単独のＶκ遺伝子（すなわち、Ｖκ１−３９およびＶκ３−２０）、ならびに（３）マウスＣκ領域にわたるＴａｑｍａｎ  ＭＧＢプローブを使用したＡＢＩ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。表４には、このアッセイに使用したプライマーおよびプローブの配列が示されている。相対的な発現をマウスＣκ領域の発現に対して正規化した。結果が図５Ａ、図５Ｂおよび図５Ｃに示されている。
【表４】
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【０３２０】
抗原特異的共通軽鎖抗体。
内因性マウスκ軽鎖遺伝子座にＶκ１−３９Ｊκ５共通軽鎖またはＶκ３−２０Ｊκ１共通軽鎖のいずれかを有する共通軽鎖マウスを、β−ガラクトシダーゼを用いて免疫し、抗体価を測定した。
【０３２１】
簡単に述べると、β−ガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）をｔｉｔｅｒｍａｘ  ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ）中に製造業者の指示通り乳化した。野生型（ｎ＝７）、Ｖκ１−３９Ｊκ５共通軽鎖ホモ接合体（ｎ＝２）およびＶκ３−２０Ｊκ１共通軽鎖ホモ接合体（ｎ＝５）を、１００μｇのβ−ガラクトシダーゼ／Ｔｉｔｅｒｍａｘを皮下注射することによって免疫した。マウスに５０μｇのβ−ガラクトシダーゼ／Ｔｉｔｅｒｍａｘを３週間離して２回皮下注射することによって追加刺激を行った。２回目の追加刺激後、麻酔したマウスから後眼窩採血を使用して製造業者の指示通り血清分離チューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に血液を採取した。抗β−ガラクトシダーゼＩｇＭ抗体または抗β−ガラクトシダーゼＩｇＧ抗体を測定するために、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、１μｇ／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼを用いて４℃で一晩コーティングした。過剰の抗原を洗い流した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングした。血清の段階希釈物をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした後、洗浄した。次いで、プレートを、ＨＲＰとコンジュゲートした抗ＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）または抗ＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に室温で１時間インキュベートした。さらに洗浄した後、プレートを、ＴＭＢ基質（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて発色させた。１Ｎの硫酸を用いて反応を停止させ、Ｖｉｃｔｏｒ  Ｘ５  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用してＯＤ４５０を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてデータを解析し、シグナルを、バックグラウンドを２倍上回る血清の希釈度として算出した。結果が図６Ａおよび図６Ｂに示されている。
【０３２２】
この実施例に示されているように、Ｖκ１−３９Ｊκ５共通軽鎖マウスおよびＶκ３−２０Ｊκ１共通軽鎖マウスの脾臓区画と末梢区画のどちらにおいてもκ／λＢ細胞の比が野生型パターンに近いことが実証された（表３および図４）。しかし、ＶｐｒｅＢＪλ５共通軽鎖マウスでは、末梢Ｂ細胞がより少なく、その約１−２％が操作されたヒト軽鎖領域を発現することが実証された（データは示していない）。内因性κ軽鎖遺伝子座からのＶκ１−３９Ｊκ５再構成ヒト軽鎖およびＶκ３−２０Ｊκ１再構成ヒト軽鎖の発現レベルは、マウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントでの完全な置き換えを含有する内因性κ軽鎖遺伝子座と比較して上昇した（図５Ａ、図５Ｂおよび図５Ｃ）。ＶｐｒｅＢＪλ５再構成ヒト軽鎖領域の発現レベルは、ヘテロ接合性マウスとホモ接合性マウスのどちらにおいても内因性κ軽鎖遺伝子座からの同様の高い発現が実証された（データは示していない）。これにより、マウスλ、κまたは両方の内因性軽鎖遺伝子座との直接競合において、単一の再構成されたヒトＶＬ／ＪＬ配列により、内因性κ軽鎖遺伝子座からの野生型レベル発現よりも良好な収量を得ることができ、正常な脾性Ｂ細胞および血液Ｂ細胞の発生頻度が生じることが実証される。さらに、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列のいずれかを有する操作されたκ軽鎖遺伝子座が存在することはマウスにより十分に許容され、免疫応答の体液性成分中の軽鎖レパートリーの実質的な部分を表すことにより、野生型の様式で機能するようである（図６Ａおよび図６Ｂ）。
【０３２３】
（実施例４）
単一の再構成されたヒト生殖系列軽鎖を発現するマウスの掛け合わせ
この実施例では、本明細書に記載の共通軽鎖マウスの任意の１つと掛け合わせて、複数の遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を有する複数の遺伝子改変マウス系統を作製することができるいくつかの他の遺伝子改変マウス系統が記載されている。
【０３２４】
内因性Ｉｇλノックアウト（ＫＯ）。
操作された軽鎖遺伝子座の使用を最適化するために、再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域のうちの１つを有するマウスを、内因性λ軽鎖遺伝子座に欠失を含有する別のマウスと掛け合わせる。このように、実施例２に記載の通り、得られた後代は、それらの唯一の軽鎖として、再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域を発現する。掛け合わせは、当技術分野において認められている標準の技法によって実施する、あるいは、商業的なブリーダー（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって実施される。操作された、軽鎖遺伝子座および内因性λ軽鎖遺伝子座の欠失を有するマウス系統を、独特の軽鎖領域の存在および内因性マウスλ軽鎖の非存在についてスクリーニングする。
【０３２５】
ヒト化内因性重鎖遺伝子座。
操作された、ヒト生殖系列軽鎖遺伝子座を有するマウスを、内因性マウス重鎖可変遺伝子遺伝子座の、ヒト重鎖可変遺伝子遺伝子座での置き換えを含有するマウス（ＵＳ６，５９６，５４１を参照されたい；ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）と掛け合わせる。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、内因性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に連結したヒト重鎖可変領域を含むゲノムを含み、その結果、マウスは、抗原による刺激に応答して、ヒト重鎖可変領域およびマウス重鎖定常領域を含む抗体を産生する。抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、ヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に連結する。次いで、ＤＮＡを、抗体の完全ヒト重鎖を発現することができる細胞において発現させる。
【０３２６】
内因性マウスＶＨ遺伝子座の、ヒトＶＨ遺伝子座での置き換えおよび内因性κ軽鎖遺伝子座における単一の再構成されたヒト生殖系列ＶＬを有するマウスを得る。目的の抗原を用いて免疫すると、体細胞変異した重鎖（ヒトＶＨおよびマウスＣＨ）を単一のヒト軽鎖（ヒトＶＬおよびマウスＣＬ）と共に含有するリバースキメラ抗体が得られる。当該抗体を発現するＢ細胞のＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列を同定し、適切な発現系においてＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列をヒトＣＨおよびＣＬヌクレオチド配列と融合することによって完全ヒト抗体を作製する。
【０３２７】
（実施例５）
ヒト重鎖および再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域を発現するマウスからの抗体の生成
操作されたヒト軽鎖領域を含有するマウスと他の内因性Ｉｇ遺伝子座の改変および欠失を含有する種々の所望の系統と掛け合わせた後（実施例４に記載の通り）、選択されたマウスを、目的の抗原を用いて免疫することができる。
【０３２８】
一般に、単一の再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域のうちの１つを含有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに抗原を用いた攻撃を行い、リンパ系細胞（例えば、Ｂ細胞）を動物の血清から回収する。リンパ系細胞を骨髄腫細胞株と融合して不死ハイブリドーマ細胞株を調製し、そのようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択して、免疫に使用する抗原に特異的な、ヒト重鎖可変および再構成されたヒト生殖系列軽鎖を含有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定する。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、望ましいアイソタイプの重鎖および軽鎖の定常領域と連結する。内因性マウス配列および内因性遺伝子座に存在する任意のさらなるシス作用性エレメントの存在に起因して、各抗体の単一の軽鎖は体細胞変異し得る。これにより、単一の軽鎖配列および多様な重鎖配列を含む抗原特異的レパートリーにさらなる多様性が付加される。その後、生じたクローニングされた抗体配列をＣＨＯ細胞などの細胞において発現させる。あるいは、抗原特異的キメラ抗体または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを抗原特異的リンパ球から直接同定する。
【０３２９】
最初に、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体を単離する。上記の通り、抗体を特徴付け、親和性、選択性、エピトープなどを含めた望ましい特性について選択する。マウス定常領域を所望のヒト定常領域で置き換えて、体細胞変異したヒト重鎖および本発明の再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域に由来する単一の軽鎖を含有する完全ヒト抗体を生成する。適切なヒト定常領域としては、例えば、野生型または改変されたＩｇＧ１またはＩｇＧ４が挙げられる。
【０３３０】
内因性マウス重鎖遺伝子座の、ヒトＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントでの置き換え、ならびに内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の、操作された生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５ヒト軽鎖領域または操作された生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１ヒト軽鎖領域（上記）のいずれかでの置き換えを含有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの別のコホートを、ヒト細胞表面受容体タンパク質（抗原Ｅ）で免疫した。抗原Ｅを直接マウスの後足蹠に３−４日毎に６回の連続した注射で投与する。注射前に、２〜３マイクログラムの抗原Ｅを１０μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド（カタログ番号ｔｌｒｌ−ｍｏｄｎ−ＯＤＮ１８２６  オリゴヌクレオチド；ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）および２５μｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（リン酸アルミニウムゲルアジュバント、カタログ番号Ｈ−７１６３９−２５０；Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ、Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）と混合する。合計６回の注射を与えた後、最終的な抗原記憶（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃａｌｌ）を与え、その３−５日後に屠殺する。４回目および６回目の注射の後に採血し、抗体免疫応答を標準の抗原特異的イムノアッセイによってモニターする。
【０３３１】
所望の免疫応答が実現されたら、脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合してそれらの生存能力を保存し、ハイブリドーマ細胞株を形成する。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択して、抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体を産生する細胞株を同定する。この技法を使用して、いくつかの抗抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体（すなわち、ヒト重鎖可変ドメイン、同じヒト軽鎖可変ドメイン、およびマウス定常ドメインを有する抗体）を得る。
【０３３２】
あるいは、その全体が参照により明確に本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．２００７／０２８０９４５Ａ１に記載の通り、骨髄腫細胞との融合を伴わずに抗原陽性Ｂ細胞から直接、抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体を単離する。この方法を使用して、いくつかの完全ヒト抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体（すなわち、ヒト重鎖可変ドメイン、操作されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖または操作されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域のいずれか、およびヒト定常ドメインを有する抗体）を得た。
【０３３３】
この実施例の方法に従って生成される例示的な抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体の生物学的性質は、下記の節に詳しく記載されている。
【０３３４】
（実施例６）
抗原特異的共通軽鎖抗体における重鎖遺伝子セグメントの使用
産生されるヒト抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体の構造を解析するために、重鎖抗体可変領域をコードする核酸をクローニングし、配列決定した。抗体の核酸配列および予測されるアミノ酸配列から、操作されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖または操作されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域のいずれかを含有する免疫したＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスから得た、選択された共通軽鎖抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）について遺伝子使用を同定した。結果が表５および表６に示されており、これにより、ヒトＶκ１−３９由来の軽鎖またはヒトＶκ３−２０由来の軽鎖のいずれかのみから軽鎖を発現するマウスを使用した場合、本発明によるマウスが、種々の再構成に起因して種々のヒト重鎖遺伝子セグメントから抗原特異的共通軽鎖抗体を生成することが実証される。２、３、４、および５ファミリーのヒトＶＨ遺伝子セグメントを種々のヒトＤＨセグメントおよびヒトＪＨセグメントと共に再構成して抗原特異的抗体をもたらす。
【表５−１】
2020182490.tif 000007
【表５−２】
2020182490.tif 000008
【表６】
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【０３３５】
（実施例７）
ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）アッセイによる抗原特異的共通軽鎖抗体の遮断能の決定
抗原Ｅに対して生じたヒト共通軽鎖抗体９８種を、抗原Ｅの天然のリガンド（リガンドＹ）の，抗原Ｅへの結合を遮断するそれらの能力についてビーズに基づくアッセイで試験した。
【０３３６】
抗原Ｅの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を２つのｍｙｃエピトープタグおよび６×ヒスチジンタグとコンジュゲートし（抗原Ｅ−ｍｍＨ）、ＭＥＳ緩衝液中２０μｇ／ｍＬの濃度でカルボキシル化ミクロスフェアにアミン−カップリングした。混合物を室温で２時間インキュベートし、その後、１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０を用いてビーズを非活性化し、その後、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄した。次いで、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）を用いてビーズをブロッキングした。９６ウェルフィルタープレートにおいて、抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体を含有する上清を緩衝液中１：１５に希釈した。抗体上清と同じ培地成分を有する偽上清を含有する陰性対照を調製した。抗原Ｅで標識したビーズを上清に加え、４℃で一晩インキュベートした。ビオチン化リガンドＹタンパク質を、最終濃度０．０６ｎＭまで加え、室温で２時間インキュベートした。抗原Ｅ−ｍｙｃ−ｍｙｃ−６Ｈｉｓで標識したビーズに結合したビオチン化リガンドＹの検出を、ストレプトアビジンとコンジュゲートしたＲ−フィコエリトリン（Ｍｏｓｓ  Ｉｎｃ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＭＤ）を用いて行い、その後、ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）フローサイトメトリーに基づく分析機器で測定した。リガンドＹを伴わない試料のバックグラウンド平均蛍光強度（ＭＦＩ）を全ての試料から引いた。パーセント遮断を、各試料についてバックグラウンドを引いたＭＦＩを、調整した陰性対照値で割り、１００を掛け、得られた値を１００から引くことによって算出した。
【０３３７】
同様の実験において、同じ９８種の、抗原Ｅに対して生じたヒト共通軽鎖抗体を、リガンドＹで標識したビーズへの抗原Ｅの結合を遮断するそれらの能力について試験した。
【０３３８】
簡単に述べると、リガンドＹをＭＥＳ緩衝液中に希釈した２０μｇ／ｍＬの濃度でカルボキシル化ミクロスフェアにアミン−カップリングした。混合し室温で２時間インキュベートし、その後、１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８を用いてビーズを非活性化し、次いで、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄した。次いで、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）を用いてビーズをブロッキングした。９６ウェルフィルタープレートで、抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体を含有する上清を緩衝液中１：１５に希釈した。抗体上清と同じ培地成分を有する偽上清を含有する陰性対照を調製した。ビオチン化抗原Ｅ−ｍｍＨを０．４２ｎＭの最終濃度まで加え、４℃で一晩インキュベートした。次いで、リガンドＹで標識したビーズを抗体／抗原Ｅ混合物に加え、室温で２時間インキュベートした。リガンドＹ−ビーズに結合したビオチン化抗原Ｅ−ｍｍＨの検出をストレプトアビジンとコンジュゲートしたＲ−フィコエリトリン（Ｍｏｓｓ  Ｉｎｃ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＭＤ）を用いて行い、その後、ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）フローサイトメトリーに基づく分析機器で測定した。抗原Ｅ含まない試料のバックグラウンド平均蛍光強度（ＭＦＩ）を全ての試料から引いた。パーセント遮断を、各試料についてバックグラウンドを引いたＭＦＩを、調整した陰性対照値で割り、１００を掛け、得られた値を１００から引くことによって算出した。
【０３３９】
表７および表８には、両方のＬＵＭＩＮＥＸ（商標）アッセイにおいて試験した抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体９８種全てについてのパーセント遮断が示されている。ＮＤ：現行の実験条件では決定されず。
【表７−１】
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【表７−２】
2020182490.tif 000011
【表８】
2020182490.tif 000012
【０３４０】
上記の第１のＬＵＭＩＮＥＸ（商標）実験において、Ｖκ１−３９Ｊκ５操作軽鎖（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）を含有する共通軽鎖抗体８０種を、抗原Ｅで標識したビーズへのリガンドＹの結合を遮断するそれらの能力について試験した。これらの８０種の共通軽鎖抗体のうち、６８種で＞５０％遮断が実証され、１２種で＜５０％遮断が実証された（６種が２５−５０％遮断および６種が＜２５％遮断）。Ｖκ３−２０Ｊκ１操作軽鎖を含有する共通軽鎖抗体１８種については、抗原Ｅで標識したビーズへのリガンドＹの結合に関して、１２種で＞５０％遮断が実証され、６種で＜５０％遮断が実証された（３種が２５−５０％遮断および３種が＜２５％遮断）。
【０３４１】
上記の第２のＬＵＭＩＮＥＸ（商標）実験において、同じ８０種の、Ｖκ１−３９Ｊκ５操作軽鎖を含有する共通軽鎖抗体を、リガンドＹで標識したビーズへの抗原Ｅの結合を遮断するそれらの能力について試験した。これらの８０種の共通軽鎖抗体のうち、３６種で＞５０％遮断が実証され、４４種で＜５０％遮断が実証された（２７種が２５−５０％遮断および１７種が＜２５％遮断）。Ｖκ３−２０Ｊκ１操作軽鎖を含有する共通軽鎖抗体１８種については、リガンドＹで標識したビーズへの抗原Ｅの結合に関して、１種で＞５０％遮断が実証され、１７種で＜５０％遮断が実証された（５種が２５−５０％遮断および１２種が＜２５％遮断）。
【０３４２】
表７および表８のデータにより、表５および表６に記載されている再構成により、リガンドＹとそのコグネイト受容体である抗原Ｅの結合を種々の程度の有効性で遮断する抗抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体が生成されることが確立され、これは、抗原Ｅに関してエピトープ特異性が重複している抗体および重複していない抗体を含む表５および表６の抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体と一致する。
【０３４３】
（実施例８）
ＥＬＩＳＡによる抗原特異的共通軽鎖抗体の遮断能の決定
抗原Ｅに対して生じたヒト共通軽鎖抗体を、リガンドＹをコーティングした表面への抗原Ｅの結合を遮断するそれらの能力についてＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。
【０３４４】
リガンドＹをＰＢＳで２μｇ／ｍＬの濃度に希釈して９６ウェルプレート上にコーティングし、一晩インキュベートし、その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで４回洗浄した。次いで、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）を用いて室温で１時間、プレートをブロッキングした。別のプレートにおいて、抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体を含有する上清を緩衝液中１：１０に希釈した。同じ抗体の成分を含む偽上清を陰性対照として使用した。抗原Ｅ−ｍｍＨ（上記）を、０．１５０ｎＭの最終濃度まで加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、抗体／抗原Ｅ−ｍｍＨ混合物を、リガンドＹを含有するプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。リガンドＹと結合した抗原Ｅ−ｍｍＨの検出を、抗ペンタ−Ｈｉｓ抗体とコンジュゲートした西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて行い、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用し硫酸により中和する標準の比色定量応答によって発色させた。吸光度をＯＤ４５０において０．１秒にわたって読み取った。抗原Ｅを含まない試料のバックグラウンド吸光度を全ての試料から引いた。パーセント遮断を、各試料についてバックグラウンドを引いたＭＦＩを、調整した陰性対照値で割り、１００を掛け、得られた値を１００から引くことによって算出した。
【０３４５】
表９および表１０には、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体９８種全てについてのパーセント遮断が示されている。ＮＤ：現行の実験条件では決定されず。
【表９】
2020182490.tif 000013
【表１０】
2020182490.tif 000014
【０３４６】
この実施例に記載の通り、Ｖκ１−３９Ｊκ５操作軽鎖を含有する共通軽鎖抗体８０種の、リガンドＹをコーティングした表面への抗原Ｅの結合を遮断するそれらの能力について試験し、２２種で＞５０％遮断が実証され、５８種で＜５０％遮断が実証された（２０種が２５−５０％遮断および３８種が＜２５％遮断）。Ｖκ３−２０Ｊκ１操作軽鎖を含有する共通軽鎖抗体１８種については、リガンドＹをコーティングした表面への抗原Ｅの結合に関して、１種で＞５０％遮断が実証され、１７種で＜５０％遮断が実証された（５種が２５−５０％遮断および１２種が＜２５％遮断）。
【０３４７】
これらの結果は、抗原Ｅに関してエピトープ特異性が重複している抗体および重複していない抗体を含む抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体プールとも一致する。
【０３４８】
（実施例９）
抗原特異的共通軽鎖抗体についてのＢＩＡＣＯＲＥ（商標）親和性決定
選択された抗体上清についての平衡解離定数（ＫＤ）を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）によって決定した。ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）をランニング緩衝液および試料緩衝液の両方として使用して、２５℃で全てのデータを得た。抗体を、粗上清試料から、標準のアミンカップリング化学を使用して高密度の抗ヒトＦｃ抗体で予め誘導体化したＣＭ５センサーチップ表面に捕捉した。捕捉ステップの間に、上清を抗ヒトＦｃ表面にわたって毎分３μＬの流速で合計３分間注入した。捕捉ステップの後に、ランニング緩衝液または濃度１００ｎＭの分析物のいずれかを、毎分３５μＬの流速で２分間注入した。捕捉された抗体からの抗原の解離を６分間モニターした。１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５を簡単に注入することによって捕捉された抗体を取り出した。全てのセンサーグラムを、分析物センサーグラムから緩衝液の注入由来のセンサーグラムを引き、それにより、捕捉表面からの抗体の解離によって引き起こされるアーチファクトを除くことによって２重参照した。ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ２．１を使用した質量伝達を用いて各抗体についての結合データを１：１結合モデルに対してフィッティングした。結果が表１１および表１２に示されている。
【表１１】
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【表１２】
2020182490.tif 000016
【０３４９】
表５および表６に示されている再構成を含む共通軽鎖抗体の結合親和性は変動し、ほぼ全てがナノモル濃度範囲のＫＤを示す。親和性データは、高親和性であり、クローン選択されたものであり、体細胞変異したものである、表５および表６に記載されている再構成された可変ドメインのコンビナトリアル結合によって生じる共通軽鎖抗体と一致する。以前示されたデータと併せて、表５および表６に記載されている共通軽鎖抗体は、抗原Ｅ上の１種または複数種のエピトープに対する特異性を示す多様な高親和性抗体のコレクションを含む。
【０３５０】
（実施例１０）
ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）アッセイによる抗原特異的共通軽鎖抗体の結合特異性の決定
選択された抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体を、ヒトタンパク質とはアミノ酸残基のおよそ１０％が異なるカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）オルソログを含めた抗原ＥのＥＣＤおよび抗原Ｅ  ＥＣＤバリアント（Ｍｆ抗原Ｅ）；ＥＣＤのＣ末端から最後の１０アミノ酸を欠く抗原Ｅの欠失変異体（抗原Ｅ−ΔＣＴ）；ならびにリガンドＹとの相互作用が推測される位置にアラニン置換を含有する２つの変異体（抗原Ｅ−Ａｌａ１および抗原Ｅ−Ａｌａ２）に結合するそれらの能力について試験した。抗原Ｅタンパク質をＣＨＯ細胞において産生させ、それぞれがｍｙｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｃ末端タグを含有した。
【０３５１】
結合試験のために、培養培地１ｍＬから、抗原Ｅ  ＥＣＤタンパク質またはバリアントタンパク質（上記）を、抗ｍｙｃモノクローナル抗体（ＭＡｂ  ９Ｅ１０、ハイブリドーマ細胞株ＣＲＬ−１７２９（商標）；ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を共有結合によってコーティングしたミクロスフェア（ＬＵＭＩＮＥＸ（商標））ビーズ１×１０６個と共に室温で２時間インキュベートすることによって捕捉した。次いで、ビーズを使用する前にＰＢＳで洗浄した。抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体を含有する上清を緩衝液中１：４に希釈し、９６ウェルフィルタープレートに加えた。抗体を含まない偽上清を陰性対照として使用した。次いで、捕捉された抗原Ｅタンパク質を含有するビーズを抗体試料に加え（ウェル当たりビーズ３０００個）、４℃で一晩インキュベートした。翌日、試料ビーズを洗浄し、結合した共通軽鎖抗体を、Ｒ−フィコエリトリンとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて検出した。ビーズ（各抗原Ｅタンパク質に結合する各抗体試料についておよそ１００個のビーズを計数した）の蛍光強度を、ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）フローサイトメトリーに基づく分析機器を用いて測定し、ビーズ／抗体相互作用当たり少なくとも１００個の計数したビーズについての蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を記録した。結果が表１３および表１４に示されている。
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１４】
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【０３５２】
抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体上清は、抗原Ｅ−ＥＣＤに連結したビーズに対して高い特異的結合を示した。これらのビーズについて、陰性対照である偽上清では、抗原Ｅ−ＥＣＤビーズ試料と合わせると無視できるシグナル（＜１０のＭＦＩ）がもたらされたが、抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体を含有する上清では、強い結合シグナル（抗体上清９８種について２６２７の平均ＭＦＩ；抗体試料９８種のうち９１種についてＭＦＩ＞５００）が示された。
【０３５３】
選択された抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体の、抗原ＥのＥＣＤ上の異なるエピトープを同定する能力の尺度として、バリアントへの抗体の相対的な結合を決定した。ネイティブな抗原Ｅ−ＥＣＤ結合試験のために抗原Ｅバリアント４種全てを上記のとおり、抗ｍｙｃ  ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）ビーズに捕捉し、相対的な結合比（ＭＦＩバリアント／ＭＦＩ抗原Ｅ−ＥＣＤ）を決定した。表１２および表１３に示されている試験した共通軽鎖抗体上清９８種について、比の平均（ＭＦＩバリアント／ＭＦＩ抗原Ｅ−ＥＣＤ）は各バリアントで異なり、これはビーズへのタンパク質の異なる捕捉量を反映する可能性がある（比の平均は抗原Ｅ−ΔＣＴ、抗原Ｅ−Ａｌａ１、抗原Ｅ−Ａｌａ２、およびＭｆ抗原Ｅについてそれぞれ０．６１、２．９、２．０、および１．０であった）。各タンパク質バリアントについて、試験した共通軽鎖抗体９８種のサブセットについての結合は、結合の著しい低下を示し、これにより、所与のバリアントを特徴付ける変異に対する感受性が示された。例えば、共通軽鎖抗体試料のうち１９種は、Ｍｆ抗原Ｅに＜８％のＭＦＩバリアント／ＭＦＩ抗原Ｅ−ＥＣＤで結合した。この群の多くが高度または中程度に高い親和性抗体（５種でＫＤ＜５ｎＭ、１５種でＫＤ＜５０ｎＭ）を含むので、この群のシグナルが低いことは、親和性が低いことではなく、ネイティブな抗原Ｅ−ＥＣＤと所与のバリアントの間の配列（エピトープ）差異に対する感受性に起因する可能性がある。
【０３５４】
これらのデータにより、表５および表６に記載されている共通軽鎖抗体が、抗原Ｅ上の２種以上のエピトープを特異的に認識する抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体の多様な群を表すことが確立される。
【０３５５】
（実施例１１）
共通軽鎖抗体における軽鎖シャッフリング
選択された抗原特異的共通軽鎖抗体の重鎖を、重鎖を生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５操作軽鎖または生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１操作軽鎖のいずれかと再対合させた（実施例１に記載の通り）後の抗原Ｅへの結合について試験した。
【０３５６】
簡単に述べると、抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体（Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１）の重鎖２４７種に、生殖系列Ｖκ１−３９操作軽鎖または生殖系列Ｖκ３−２０操作軽鎖のいずれかをトランスフェクトし、ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）アッセイによって抗原Ｅへの結合について再スクリーニングした（実施例７および実施例１０に記載の通り）。抗原Ｅへの結合をＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって確認した（実施例９に記載の通り）。結果が表１５に示されている。
【０３５７】
この実施例に示されている通り、抗原Ｅに特異的な共通軽鎖抗体２８種が、軽鎖の生殖系列形態と再対合した場合に抗原Ｅに結合することができた。
【表１５】
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【０３５８】
（実施例１２）
共通軽鎖抗体における重鎖遺伝子使用および体細胞超変異の発生頻度
ＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１およびＵＳ７，１０５，３４８）において生じた抗体の重鎖配列および軽鎖配列（＞６０００）を、抗体鎖の重鎖遺伝子セグメントの使用および体細胞超変異の発生頻度を比較するために操作された軽鎖マウス（上記）を使用する多抗原免疫スキームによって得られる共通軽鎖抗体の重鎖配列および軽鎖配列（＞６００）と共にまとめた。
【０３５９】
重鎖遺伝子使用。
ヒト細胞表面受容体（抗原Ｅ）、２種のヒト細胞表面糖タンパク質のヘテロ二量体（抗原Ｆ）、ヒトサイトカイン受容体（抗原Ｇ）およびヒト腫瘍分化抗原（抗原Ｈ）を用いて免疫した、内因性マウス重鎖遺伝子座のヒトＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントでの置き換えおよび内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の操作された生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５ヒト軽鎖領域または操作された生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１ヒト軽鎖領域のいずれかでの置き換えを含有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（実施例２に記載の通り）から得た重鎖配列および軽鎖配列を、重鎖遺伝子セグメントの使用について分析し、ＶＨおよびＪＨ遺伝子セグメントを記録した。結果が表１６−１８に示されている。表１６−１８中の百分率は丸めた値を表し、足し合わせたときに１００％と等しくならない場合があり得る。
【０３６０】
表１６には、ＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来の抗体（ＶＩ）、コグネイトＶκ１−３９軽鎖を有するＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来の抗体（ＶＩ−Ｖκ１−３９）、Ｖκ１−３９操作軽鎖マウス由来の抗体（Ｖκ１−３９）、コグネイトＶκ３−２０軽鎖を有するＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来の抗体（ＶＩ−Ｖκ３−２０）、およびＶκ３−２０操作軽鎖マウス由来の抗体（Ｖκ３−２０）についてのパーセント重鎖ファミリー使用が示されている。表１７には、ＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来の抗体（ＶＩ）、コグネイトＶκ１−３９軽鎖を有するＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来の抗体（ＶＩ−Ｖκ１−３９）、Ｖκ１−３９操作軽鎖マウス由来の抗体（Ｖκ１−３９）、コグネイトＶκ３−２０軽鎖を有するＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来の抗体（ＶＩ−Ｖκ３−２０）、およびＶκ３−２０操作軽鎖マウス由来の抗体（Ｖκ３−２０）についてのパーセントＶＨおよびＪＨ遺伝子使用が示されている。表１８には、各免疫群（抗原Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ）からのＶκ１−３９操作軽鎖マウス（Ｖκ１−３９マウス）由来の抗体についてのパーセントＶＨ遺伝子使用、ならびに選択された免疫群（抗原ＥおよびＧ）からのＶκ３−２０操作軽鎖マウス（Ｖκ３−２０マウス）由来の抗体についてのパーセントＶＨ遺伝子使用が示されている。
【０３６１】
この実施例に示されているように、Ｖκ１−３９Ｊκ５−操作軽鎖マウスにおいて試験した抗原についての重鎖遺伝子使用はＶＨファミリーＩＩＩサブグループ（ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３およびＶＨ３−４８）が優勢であることによって特徴付けられた。注目すべき他のＶＨファミリーサブグループの使用はＶＨ１−１８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ４−５９およびＶＨ６−１の使用によって特徴付けられた。Ｖκ３−２０Ｊκ１操作軽鎖マウスにおいて試験した抗原については、重鎖遺伝子使用はＶＨファミリーＩＩＩ、ＶＨファミリーＩＶおよびＶＨファミリーＶサブグループ（ＶＨ３−１１、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９およびＶＨ５−５１）が優勢であることによって特徴付けられた。注目すべき他のＶＨファミリーサブグループの使用はＶＨ１−１８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−７０およびＶＨ６−１の使用によって特徴付けられた。
【０３６２】
体細胞超変異の発生頻度。
ＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスおよびに操作された軽鎖マウス（上記）において生じた抗体由来の重鎖および軽鎖を、各重鎖および／または軽鎖について実証された重鎖および軽鎖の遺伝子使用に応じて生殖系列配列に対してアライメントした。各配列の重鎖と軽鎖の両方についての各フレームワーク領域（ＦＷ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸の変化を算出した。結果が表１９−２２に示されている。表２１−２４中の百分率は丸めた値を表し、足し合わせたときに１００％と等しくならない場合があり得る。
【０３６３】
表１９には、ＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来の抗体の重鎖、Ｖκ１−３９操作軽鎖マウス（Ｖκ１−３９マウス）由来の抗体の重鎖およびＶκ３−２０操作軽鎖マウス（Ｖκ３−２０マウス）由来の抗体の重鎖の各ＦＷ領域およびＣＤＲ領域において観察されたアミノ酸（ＡＡ）変化の数が示されている。表２０には、ＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来の抗体の軽鎖、Ｖκ１−３９操作マウス（Ｖκ１−３９マウス）由来の抗体の軽鎖およびＶκ３−２０操作マウス（Ｖκ３−２０マウス）由来の抗体の軽鎖の各ＦＷ領域およびＣＤＲ領域において観察されたアミノ酸（ＡＡ）変化の数が示されている。表２１には、選択された免疫群（抗原Ｅ、ＦおよびＨ）についてのＶκ１−３９操作軽鎖マウス（Ｖκ１−３９マウス）由来の抗体の重鎖の各ＦＷ領域およびＣＤＲ領域において観察されたアミノ酸（ＡＡ）変化の数が示されている。表２２には、選択された免疫群（抗原ＥおよびＧ）についてのＶκ３−２０操作軽鎖マウス（Ｖκ３−２０マウス）由来の抗体の重鎖の各ＦＷ領域およびＣＤＲ領域において観察されたアミノ酸（ＡＡ）変化の数が示されている。
【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【０３６４】
（実施例１３）
ユニバーサル軽鎖を有する二重特異性抗体の結合親和性
選択された単一特異性抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体（実施例５に記載）のクローニングされたヒト重鎖可変領域から当技術分野で公知の標準の組換えＤＮＡ技法を使用して完全ヒト二重特異性抗体を構築した。表２３には、選択された親単一特異性抗体由来のヒト重鎖（ＨＣ−１およびＨＣ−２）の対合が示されており、各対を、各二重特異性抗体を構築するために生殖系列再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊκ１軽鎖と共に使用した。
【０３６５】
二重特異性抗抗原Ｅ抗体または親単一特異性抗抗原Ｅ抗体の、抗原Ｅの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）２０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーアッセイを使用して決定した。ＥＤＣ−ＮＨＳ化学を使用して抗ｃ−ｍｙｃ特異的モノクローナル抗体（クローン＃９Ｅ１０）で誘導体化されたＣＭ５  ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）センサー表面を使用してＣ末端ｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグを付けた抗原ＥのＥＣＤ（抗原Ｅ−ｍｍｈ）を捕捉した。およそ１９０ＲＵの抗原Ｅ−ｍｍｈがＢＩＡＣＯＲＥ（商標）センサー表面上に捕捉され、その後、３００ｎＭ濃度および５０ｎＭ濃度の異なる二重特異性抗抗原Ｅ抗体または親単一特異性抗抗原Ｅ抗体を毎分５０μｌの流速で注入した。この実験は２５℃、ＨＢＳＴランニング緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０）中で実施した。３００ｎＭ濃度で抗原Ｅ−ｍｍｈ表面に結合した抗体の量を、抗体注入の終了前に３秒間記録し、プロットした。
【０３６６】
表２４および図８には各二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）および単一特異性親抗体（ＰＡｂ−１、ＰＡｂ−２）について観察された結合応答（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）単位；ＲＵ）が記載されている。各抗体を飽和条件下で同一の抗原Ｅ−ｍｍｈ表面にわたって注入したので、結合応答は抗原捕捉表面に結合した各抗体についての結合化学量論を反映する。
【０３６７】
この実施例において示されている通り、各二重特異性抗体について観察された結合応答は、各親単一特異性抗体についての結合応答のおよそ２倍であり（表２４および図８）、これにより、二重特異性抗体であって、抗原特異的モノクローナル抗体の重鎖および共通軽鎖を使用した、該二重特異性抗体分子の各Ｆａｂアームが細胞表面受容体（抗原Ｅ；図７Ｂ、左下を参照されたい）の細胞外ドメイン上の別個のエピトープに同時に結合する、二重特異性抗体の機能的構築が実証された。
【表２３】
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【表２４】
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【０３６８】
（実施例１４）
２つのヒト軽鎖を発現するマウスの生成および分析
実施例２に記載されている方法を使用して、２つのヒトＶκ遺伝子セグメント（例えば、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント）を含有する２つのさらなる操作された軽鎖遺伝子座を構築した（図９）。１つの操作された軽鎖遺伝子座は、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを、再構成されていない立体配置（ＤＬＣ−５Ｊ）で含有した。第２の操作された軽鎖遺伝子座は、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つのヒトＪκ遺伝子セグメントを、再構成されていない立体配置（ＤＬＣ−１Ｊ）で含有した。２つのさらなる操作された軽鎖遺伝子座のそれぞれについて、ヒト遺伝子セグメントは３’に組換えシグナル配列が隣接し、Ｂ細胞においてヒト遺伝子セグメントのｉｎ  ｖｉｖｏ再構成が可能になった。
【０３６９】
マウス配列（すなわち、内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の上流および下流の配列）に作動可能に連結した操作された軽鎖遺伝子座のそれぞれを別々に含有する改変されたＢＡＣ  ＤＮＡクローンを、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントを含有する各操作された軽鎖遺伝子座内の配列に位置するプライマーを使用したＰＣＲによって確認し、その後、ＥＳ細胞に電気穿孔により導入して、２つのヒトＶκ遺伝子セグメント（上記）のいずれかを発現するマウスを作製した。上記の操作された軽鎖遺伝子座のいずれかを含有する陽性ＥＳ細胞クローンを、操作された軽鎖遺伝子座（上記のとおり）に特異的なプローブを使用したＴＡＱＭＡＮ（商標）スクリーニングおよび核型分析によって確認した。次いで、確認されたＥＳ細胞クローンを使用して雌マウスに移植して、本明細書では二重軽鎖（ＤＬＣ）マウスと称される、マウスＣκドメインと融合したヒト軽鎖可変ドメインを発現する同腹仔を生じさせた。
【０３７０】
あるいは、ターゲティング構築物により導入されたＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、操作された軽鎖遺伝子座を有するＥＳ細胞にＦＬＰを発現する構築物をトランスフェクトすることができる。必要に応じて、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウスと掛け合わせることによってネオマイシンカセットを除去する（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）。必要に応じて、ネオマイシンカセットはマウス内に保持される。
【０３７１】
フローサイトメトリー
ＤＬＣマウスにおけるＢ細胞集団およびＢ細胞発生を脾細胞調製物および骨髄調製物のフローサイトメトリー分析によって検証した。２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ｎ＝４）、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ｎ＝４）、および野生型マウス（ｎ＝４）からの細胞懸濁物を、標準の方法（上記）を使用して作製し、蛍光標識された抗体で染色した（実施例３に記載の通り）。
【０３７２】
簡単に述べると、細胞１×１０６個を、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン２．４Ｇ２、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）と共に氷上で１０分インキュベートし、その後、以下の抗体カクテルを用いて氷上で３０分にわたって標識した：ＡＰＣ−Ｈ７とコンジュゲートした抗マウスＣＤ１９（クローン１Ｄ３、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅとコンジュゲートした抗マウスＣＤ３（クローン１７Ａ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣとコンジュゲートした抗マウスＩｇκ（クローン１８７．１、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）または抗マウスＣＤ４３（クローン１Ｂ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥとコンジュゲートした抗マウスＩｇλ（クローンＲＭＬ−４２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）または抗マウスｃ−ｋｉｔ（クローン２Ｂ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５とコンジュゲートした抗マウスＩｇＤ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ−Ｃｙ７とコンジュゲートした抗マウスＩｇＭ（クローンＩＩ／４１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣとコンジュゲートした抗マウスＢ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。染色後、細胞を洗浄し、２％ホルムアルデヒド中に固定した。ＬＳＲＩＩフローサイトメーターでデータの取得を実施し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて分析した。ゲーティング：総Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ３−）、Ｉｇκ＋Ｂ細胞（Ｉｇκ＋Ｉｇλ−ＣＤ１９＋ＣＤ３−）、Ｉｇλ＋Ｂ細胞（Ｉｇκ−Ｉｇλ＋ＣＤ１９＋ＣＤ３−）。骨髄区画についての結果が図１０Ａ−図１２Ｂに示されている。脾臓区画についての結果が図１３Ａ−図１６に示されている。
【０３７３】
この実施例において示されている通り、ＤＬＣ−５Ｊマウスでは脾臓区画および骨髄区画内で正常なＢ細胞集団が実証される（図１０Ａ−１６）。ＤＬＣ−５Ｊマウスでは、骨髄区画内に野生型同腹仔において観察されたものと実質的に同じである未成熟Ｂ細胞集団、成熟Ｂ細胞集団およびプレ／プロＢ細胞集団が実証された。実際、ＤＬＣ−５Ｊ遺伝子座は、内因性λ軽鎖遺伝子座と競合して、野生型マウスにおいて観察されたものと実質的に同じであるκ：λ比をもたらすことができた（図１４Ｂ）。また、ＤＬＣ−５Ｊマウスでは、Ｂ細胞が脾臓区画内の種々の段階（例えば、未成熟、成熟、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、辺縁帯前駆体、辺縁帯、濾胞−Ｉ、濾胞−ＩＩなど）による進行が、野生型マウスにおいて観察されたものと実質的に同じ様式で起こるので、正常な末梢Ｂ細胞発生が実証される（図１５Ａ−１６）。対照的に、ＤＬＣ−１Ｊマウスでは、操作されたκ軽鎖と比較してＢ細胞の総数の減少およびλ軽鎖の使用の増加が実証された（データは示していない）。
【０３７４】
二重軽鎖発現
ホモ接合性のマウスにおいて両方のヒトＶκ遺伝子セグメントの発現を実施例３に従って定量的ＰＣＲアッセイを使用して解析した。簡単に述べると、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を野生型マウス、マウス重鎖およびκ軽鎖可変遺伝子座の、対応するヒト重鎖およびκ軽鎖可変領域遺伝子座（Ｈκ）での置き換えについてホモ接合性のマウス、ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメント（ＤＬＣ−５Ｊ）または１つのヒトＪκ遺伝子セグメント（ＤＬＣ−１Ｊ）のいずれかを含有する、操作されたκ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウスの骨髄および脾臓全体から精製した。相対的な発現をマウスＣκ領域の発現に対して正規化した（マウス群当たりｎ＝３〜５）。結果が図１７および図１８に示されている。
【０３７５】
再構成されたヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントまたはヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントを含有する軽鎖の発現はＤＬＣ−５ＪマウスおよびＤＬＣ−１Ｊマウスの骨髄および脾臓のどちらでも検出された（図１７および図１８）。骨髄区画では、ＤＬＣマウスの両方の系統におけるヒトＶκ３−２０由来軽鎖およびヒトＶκ１−３９由来軽鎖の両方の発現が、マウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの、対応するヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメント（Ｈκ；図１７）での置き換えを含むマウスと比較して有意に高かった。ヒトＶκ３−２０由来軽鎖の発現は、Ｈκマウスにおける発現の約６倍（ＤＬＣ−５Ｊ）〜１５倍（ＤＬＣ−１Ｊ）高いことが観察された。ＤＬＣ−１Ｊマウスでは、骨髄区画においてＤＬＣ−５Ｊマウスよりも約２倍高いヒトＶκ３−２０由来軽鎖の発現が実証された。ヒトＶκ１−３９由来軽鎖の発現はＨκマウスにおける発現の約６倍（ＤＬＣ−５Ｊ）〜１３倍（ＤＬＣ−１Ｊ）高いことが観察された。ＤＬＣ−１Ｊマウスでは、骨髄区画においてＤＬＣ−５Ｊマウスよりも約２倍高いヒトＶκ１−３９由来軽鎖の発現が実証された。
【０３７６】
脾臓区画では、ＤＬＣマウスの両方の系統におけるヒトＶκ３−２０由来軽鎖およびヒトＶκ１−３９由来軽鎖の両方の発現がＨκマウスと比較して有意に高かった（図１８）。ヒトＶκ３−２０由来軽鎖の発現は、Ｈκマウスにおける発現の約４倍（ＤＬＣ−５Ｊ）および８倍（ＤＬＣ−１Ｊ）高いことが観察された。ＤＬＣ−１Ｊマウスでは、脾臓区画においてＤＬＣ−５Ｊマウスよりも約２倍高いヒトＶκ３−２０由来軽鎖の発現が実証された。ヒトＶκ１−３９由来軽鎖の発現はＨκマウスにおける発現の約４倍（ＤＬＣ−５Ｊ）〜５倍（ＤＬＣ−１Ｊ）高いことが観察された。ＤＬＣ−１Ｊマウスでは、脾臓区画においてＤＬＣ−５Ｊマウスと比較して同様のヒトＶκ１−３９由来軽鎖の発現が実証された。
【０３７７】
ＤＬＣ−５ＪマウスにおけるヒトＶＬ／ＪＬ使用。
２つの再構成されていないヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つの再構成されていないヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）を、脾性Ｂ細胞におけるヒトＶκ／Ｊκ遺伝子セグメントの使用について逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって分析した。
【０３７８】
簡単に述べると、ホモ接合性ＤＬＣ−５Ｊマウス（ｎ＝３）および野生型マウス（ｎ＝２）から脾臓を採取し、すりガラススライドを使用して１０％熱失活ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ）１０ｍＬ中にメッシュで濾して単一細胞懸濁物を作製した。遠心分離機（１２００ｒｐｍで５分）を用いて脾細胞をペレット化し、赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液（ＧＩＢＣＯ）５ｍＬに３分にわたって溶解させた。脾細胞をＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で希釈し、０．７μｍの細胞濾過器を用いて濾過し、再度遠心分離して細胞をペレット化し、その後それを１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させた。
【０３７９】
ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の仕様書に従って使用してペレット化した脾細胞からＲＮＡを単離した。脾細胞ＲＮＡに対して、マウスＣκ遺伝子に特異的なプライマーを用いて５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の急速増幅）システムを製造業者の仕様書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した。マウスＣκ遺伝子に特異的なプライマーは、３’ｍＩｇκＣ  ＲＡＣＥ１（ＡＡＧＡＡＧＣＡＣＡ  ＣＧＡＣＴＧＡＧＧＣ  ＡＣ；配列番号３４）およびｍＩｇκＣ３’−１（ＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴ  ＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡ  ＴＧＧＡ；配列番号３５）であった。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ｖｅｃｔｏｒ（ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ベクター内のクローニング部位に隣接する位置に配置されるＭ１３フォワードプライマー（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ  ＧＧＣＣＡＧ；配列番号３６）およびＭ１３リバースプライマー（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧ  ＣＴＡＴＧＡＣ；配列番号３７）を用いて配列決定した。各脾臓試料由来の１０クローンについて配列決定した。配列をＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ参照ディレクトリーセットからのマウスおよびヒト免疫グロブリンセットと比較してＶκ／Ｊκ使用を決定した。表２５には、各脾細胞試料由来のＲＴ−ＰＣＲクローンにおいて観察された選択されたクローンについてのＶκ／Ｊκ組合せが示されている。表２６には、ＤＬＣ−５Ｊホモ接合性マウス由来の選択されたＲＴ−ＰＣＲクローンのヒトＶκ／ヒトＪκ接合部およびヒトＪκ／マウスＣκ接合部のアミノ酸配列が示されている。小文字は可変領域のアミノ酸配列の変異または組換えの間にＮおよび／もしくはＰ付加によって生じる非鋳型付加を示す。
【０３８０】
この実施例において示されている通り、マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結した２つの再構成されていないヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つの再構成されていないヒトＪκ遺伝子セグメント（ＤＬＣ−５Ｊ）についてホモ接合性のマウスは、両方のヒトＶκ遺伝子セグメントを複数のヒトＪκ遺伝子セグメントと生産的に組換えて、限定された免疫グロブリン軽鎖レパートリーを産生することができる。表２５に示されているＤＬＣ−５Ｊホモ接合性のマウスにおける再構成の中で、Ｖκ１−３９／Ｊκ２（１）、Ｖκ１−３９／Ｊκ３（１）、Ｖκ３−２０／Ｊκ１（７）、Ｖκ３−２０／Ｊκ２（４）およびＶκ３−２０／Ｊκ３（１）について独特のヒトＶκ／Ｊκ再構成が観察された。さらに、そのような独特の再構成では、発生の間のヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの変異および／または組換えのいずれかによって生じる軽鎖のＣＤＲ３領域内の独特のアミノ酸の存在（表２６）による接合部の多様性が実証された。全ての再構成でマウスＣκへの機能的なリードスルーが示された（表２６）。
【０３８１】
総合すると、これらのデータにより、どちらも再構成することが可能な（例えば、１つまたは複数、一部の実施形態では５つまでのヒトＪＬ遺伝子セグメントと）２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントの選択を提示するように操作されており、免疫グロブリン軽鎖のヒトＶＬドメインをコードするマウスが、全ての態様においてほぼ野生型であるＢ細胞数および発生を有することが実証される。そのようなマウスは、コレクション内に存在する２つの可能性のあるヒトＶＬ遺伝子セグメントのうちの１つを有する免疫グロブリン軽鎖を有する抗体のコレクションを産生する。この抗体のコレクションは抗原による攻撃に応答してマウスによって産生され、リバースキメラ（ヒト可変／マウス定常）重鎖の多様性と関連する。
【表２５】
2020182490.tif 000030
【表２６】
2020182490.tif 000031
（項目１）
マウスであって、
マウスまたはラット軽鎖定常領域に作動可能に連結した２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超のヒトＪＬ遺伝子セグメント；ならびに
非ヒト定常領域に作動可能に連結した１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメント
を含み、
該ヒト遺伝子セグメントが、再構成することが可能であって、抗体のヒト可変ドメインをコードしており、
さらに、該マウスが、免疫グロブリン軽鎖が形成されるように再構成することが可能な内因性ＶＬ遺伝子セグメントを含まない、マウス。
（項目２）
前記軽鎖定常領域がラットＣκ領域である、項目１に記載のマウス。
（項目３）
前記軽鎖定常領域がマウスＣκ領域である、項目１に記載のマウス。
（項目４）
２つのヒトＶＬ遺伝子セグメントが前記マウスまたはラット軽鎖定常領域に作動可能に連結している、項目１から３のいずれか一項に記載のマウス。
（項目５）
２つから５つまでのヒトＪＬ遺伝子セグメントが前記マウスまたはラット軽鎖定常領域に作動可能に連結している、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目６）
５つのヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目７）
前記５つのヒトＪＬ遺伝子セグメントが、ヒトＪκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４およびＪκ５である、項目６に記載のマウス。
（項目８）
前記２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメント、ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント、またはこれらの組合せから選択される、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目９）
前記２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目１０）
前記２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超のヒトＪＬ遺伝子セグメントが、内因性軽鎖遺伝子座に存在する、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目１１）
前記１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントが、マウス定常領域に作動可能に連結している、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目１２）
機能的なλ軽鎖遺伝子座を含む、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目１３）
非機能的なλ軽鎖遺伝子座を含む、項目１から１１のいずれか一項に記載のマウス。
（項目１４）
マウスまたはラット軽鎖定常領域に作動可能に連結した前記２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超のヒトＪＬ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである２つのヒトＶκセグメント、ならびにヒトＪκ１、Ｊκ２Ｊκ３、Ｊκ４およびＪκ５を順番に含む遺伝子座に存在する、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目１５）
図９のＤＬＣＪ−５Ｊ遺伝子座を含む、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目１６）
骨髄中に、ＣＤ１９＋、ＣＤ４３＋、ｃ−ｋｉｔ＋発現によって特徴付けられる細胞約２．５×１０４個〜約１．５×１０５個の範囲内のプロＢ細胞集団を含む、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目１７）
骨髄中に、ＣＤ１９＋、ＣＤ４３−、ｃ−ｋｉｔ−発現によって特徴付けられる細胞約１×１０６個〜約２×１０６個の範囲内のプレＢ細胞集団を含む、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目１８）
骨髄中に、ＩｇＭ＋、Ｂ２２０ｉｎｔ発現によって特徴付けられる細胞約５×１０５個〜約７×１０５個の範囲内の未成熟Ｂ細胞集団を含む、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目１９）
骨髄中に、ＩｇＭ＋、Ｂ２２０ｈｉ発現によって特徴付けられる細胞約３×１０４個〜約１．５×１０５個の範囲内の成熟Ｂ細胞集団を含む、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目２０）
骨髄中に、細胞約１×１０６個〜約３×１０６個の範囲内の総ＣＤ１９＋Ｂ細胞集団を含む、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目２１）
細胞約２×１０６個〜約７×１０６個の範囲内のＣＤ１９＋脾性Ｂ細胞集団を含む、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目２２）
細胞約１×１０６個〜約４×１０６個の範囲内のＣＤ１９＋、ＩｇＤｈｉ、ＩｇＭｌｏ脾性Ｂ細胞集団を含む、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目２３）
細胞約９×１０５個〜約２×１０６個の範囲内のＣＤ１９＋、ＩｇＤｌｏ、ＩｇＭｈｉ脾性Ｂ細胞集団を含む、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目２４）
ＣＤ９３＋Ｂ２２０＋ＩｇＭｈｉＣＤ２３−発現によって特徴付けられる細胞約２×１０６個〜約７×１０６個の範囲内の移行Ｔ１脾性Ｂ細胞集団を含む、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目２５）
ＣＤ９３＋Ｂ２２０＋ＩｇＭｈｉＣＤ２３＋発現によって特徴付けられる細胞約１×１０６個〜約７×１０６個の範囲内の移行Ｔ２脾性Ｂ細胞集団を含む、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目２６）
ＣＤ９３＋Ｂ２２０＋ＩｇＭｌｏＣＤ２３＋発現によって特徴付けられる細胞約１×１０６個〜約４×１０６個の範囲内の移行Ｔ３脾性Ｂ細胞集団を含む、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目２７）
ＣＤ９３−Ｂ２２０＋ＩｇＭｈｉＣＤ２１／３５ｈｉＣＤ２３−発現によって特徴付けられる細胞約１×１０６個〜約３×１０６個の範囲内の辺縁帯脾性Ｂ細胞集団を含む、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目２８）
ＣＤ９３−Ｂ２２０＋ＣＤ２１／３５ｉｎｔＩｇＭｌｏＩｇＤｈｉ発現によって特徴付けられる細胞約３×１０６個〜約１．５×１０７個の範囲内の濾胞１型（ＦＯ−Ｉ）脾性Ｂ細胞集団を含む、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目２９）
ＣＤ９３−Ｂ２２０＋ＣＤ２１／３５ｉｎｔＩｇＭｉｎｔＩｇＤｈｉ発現によって特徴付けられる細胞約１×１０６個〜約２×１０６個の範囲内の濾胞２型（ＦＯ−ＩＩ）脾性Ｂ細胞集団を含む、前記項目のいずれか一項に記載のマウス。
（項目３０）
前記項目のいずれか一項に記載のマウスの単離された細胞。
（項目３１）
胚性幹（ＥＳ）細胞である、項目３０に記載の細胞。
（項目３２）
項目３１に記載のＥＳ細胞を含むマウス胚。
（項目３３）
Ｂ細胞である、項目３０に記載の細胞。
（項目３４）
項目３３に記載のＢ細胞を用いて作製されたハイブリドーマ。
（項目３５）
抗体を生成するため、またはヒト重鎖可変領域をコードする核酸配列を同定するための、項目１から２９のいずれか一項に記載のマウスの使用。
（項目３６）
目的の抗原に結合する抗体を作製するための方法であって、
項目１から２９のいずれか一項に記載のマウスを、目的の抗原を用いて免疫するステップ、
該マウスから免疫グロブリン可変領域遺伝子配列を得るステップ、および
該免疫グロブリン可変領域遺伝子配列を使用して、該抗原に結合する抗体を産生させるステップ
を含む方法。
（項目３７）
単一細胞において、
（ａ）免疫された項目１から２９のいずれか一項に記載のマウスの第１のＶＨ遺伝子配列であって、ヒトＣＨ遺伝子配列と融合した第１のＶＨ遺伝子配列；および
（ｂ）ヒトＣＬ遺伝子配列と融合したＶＬ遺伝子配列
を発現させるステップ、
該細胞を、完全ヒト抗体を発現するのに十分な条件下で維持するステップ；ならびに
該抗体を該細胞から単離するステップ
をさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記細胞が免疫された項目１から２９のいずれか一項に記載のマウスの第２のＶＨ遺伝子配列を含み、該ＶＨ遺伝子配列がヒトＣＨ遺伝子配列と融合しており、前記第１のＶＨ遺伝子配列が第１のエピトープを認識するＶＨドメインをコードし、該第２のＶＨ遺伝子配列が第２のエピトープを認識するＶＨドメインをコードし、該第１のエピトープおよび該第２のエピトープが同一ではなく、該第１のＶＨドメインおよび該第２のＶＨドメインが前記ＶＬ遺伝子配列によりコードされるＶＬドメインと相互作用する、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
ヒト二重特異性抗体の作製における、項目１から２９のいずれか一項に記載のマウスの使用。
（項目４０）
ヒト二重特異性抗体を作製するための方法であって、項目１から２９のいずれか一項に記載のマウスを免疫するステップ、および該マウス由来のＢ細胞のヒト可変領域遺伝子配列を使用して該二重特異性抗体を作製するステップを含む方法。
（項目４１）
（ａ）項目１から２９のいずれか一項に記載のマウスのクローン選択されたリンパ球を同定するステップであって、該マウスが免疫され、目的の抗原に対する免疫応答を生じるようにされており、該リンパ球が該目的の抗原に特異的に結合する抗体を発現するステップ；
（ｂ）該リンパ球または該抗体から、該目的の抗原に特異的に結合するヒト重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を得るステップ；および
（ｃ）（ｃ）のヌクレオチド配列を二重特異性抗体の作製に使用するステップ
を含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
１回目に第１のヒト重鎖可変領域配列を生成するために目的の第１の抗原に対してステップ（ａ）から（ｃ）までを実施し、２回目に第２のヒト重鎖可変領域配列を生成するために目的の第２の抗原に対してステップ（ａ）から（ｃ）までを実施し、該第１のヒト重鎖可変領域配列が第１のヒト重鎖定常領域と融合して発現して第１のヒト重鎖を形成し、該第２のヒト重鎖可変領域配列が第２のヒト重鎖定常領域と融合して発現して第２のヒト重鎖を形成し、該第１のヒト重鎖および該第２のヒト重鎖がＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはＶκ３−２０遺伝子セグメントから発現した単一のヒト軽鎖の存在下で発現する、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
（ａ）
−第１の免疫原を用いて免疫された項目１から２９のいずれか一項に記載のマウス；および
−第２の免疫原を用いて免疫された同じマウス、または遺伝学的には同じである異なるマウス
由来のＢ細胞から可変重鎖領域をクローニングするステップ、
（ｂ）細胞において、同じ前記重鎖定常領域および同じ前記軽鎖とともに（ａ）の可変重鎖領域を発現させて二重特異性抗体を作製するステップ
を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記第１のヒト重鎖が、前記第１のヒト重鎖のプロテインＡに対する親和性を消失させるまたは実質的に低下させる改変を含み、前記第２のヒト重鎖がプロテインＡに結合する能力を保持し、該第１のヒト重鎖のプロテインＡに対する親和性を消失させるまたは実質的に低下させる改変が、９５Ｒ（ＥＵ４３５Ｒ）、９６Ｆ（ＥＵ４３６Ｆ）、およびこれらの組合せから選択される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン遺伝子セグメントを選択するための、項目１から２９のいずれか一項に記載のマウスの使用。
（項目４６）
免疫されている、項目１から２９のいずれか一項に記載のマウス。
（項目４７）
抗体を産生する方法であって、項目１から２９のいずれか一項に記載のマウスを、抗原を用いて免疫するステップ、および結果として生ずる、該マウスにより該抗原に対して産生された抗体から重鎖可変領域アミノ酸配列またはコードするヌクレオチド配列を得るステップ、および該重鎖可変領域アミノ酸配列または核酸配列を抗体の作製に利用するステップを含む方法。
（項目４８）
（ａ）前記マウスを免疫した前記抗原の異なるエピトープに対する２種の異なる抗体から前記重鎖可変領域アミノ酸配列またはコードするヌクレオチド配列を同定するステップ；または
（ｂ）項目１から２９のいずれか一項に記載のマウスと同じマウス、またはさらなるマウスを、異なる抗原を用いて免疫し、次いで、該第２の抗原に特異的である、該マウスによって産生された抗体から重鎖可変領域配列アミノ酸配列またはコードするヌクレオチド配列を同定するステップを含み、
該２種の異なる重鎖可変領域を使用して二重特異性抗体を生成するステップをさらに含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記抗体または２つの抗体から軽鎖可変領域配列も同定するステップをさらに含む、項目４７または４８に記載の方法。
（項目５０）
項目４９に記載の方法であって、該方法によって産生された抗体において同定された１つまたは複数の軽鎖重鎖可変領域も使用することを含む、方法。
（項目Ａ１）
マウスであって、
免疫グロブリン軽鎖定常領域に作動可能に連結した２つのヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超のヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントであって、ここで、該２つのヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントであり、該２つまたはそれ超のヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントが、ヒトＪκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、およびＪκ５からなる群から選択される、２つのヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超のヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメント；ならびに
非ヒト免疫グロブリン定常領域に作動可能に連結した１つまたは複数のヒト免疫グロブリンＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒト免疫グロブリンＤＨ遺伝子セグメント、および１つまたは複数のヒト免疫グロブリンＪＨ遺伝子セグメント
を含み、
該ヒト遺伝子セグメントが、再構成することが可能であって、抗体のヒト可変ドメインをコードしており、さらに、該マウスが、免疫グロブリン軽鎖が形成されるように再構成することが可能な内因性免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントを含まない、マウス。
（項目Ａ２）
前記２つのヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超のヒトＪＬ遺伝子セグメントが、マウスまたはラット免疫グロブリン軽鎖定常領域に作動可能に連結される、項目Ａ１に記載のマウス
（項目Ａ３）
前記軽鎖定常領域がラットＣκ領域である、項目Ａ２に記載のマウス。
（項目Ａ４）
前記軽鎖定常領域がマウスＣκ領域である、項目Ａ２に記載のマウス。
（項目Ａ５）
５つのヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ６）
前記５つのヒトＪＬ遺伝子セグメントが、ヒトＪκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４およびＪκ５である、項目Ａ５に記載のマウス。
（項目Ａ７）
前記２つのヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超のヒトＪＬ遺伝子セグメントが、内因性軽鎖遺伝子座に存在する、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ８）
前記１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントが、マウス定常領域に作動可能に連結している、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ９）
機能的なλ軽鎖遺伝子座を含む、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ１０）
非機能的なλ軽鎖遺伝子座を含む、項目Ａ１からＡ８のいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ１１）
マウスまたはラット軽鎖定常領域に作動可能に連結した前記２つのヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超のヒトＪＬ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである２つのヒトＶκセグメント、ならびにヒトＪκ１、Ｊκ２Ｊκ３、Ｊκ４およびＪκ５を順番に含む遺伝子座に存在する、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ１２）
図９のＤＬＣＪ−５Ｊ遺伝子座を含む、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ１３）
骨髄中に、ＣＤ１９＋、ＣＤ４３＋、ｃ−ｋｉｔ＋発現によって特徴付けられる細胞約２．５×１０４個〜約１．５×１０５個の範囲内のプロＢ細胞集団を含む、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ１４）
骨髄中に、ＣＤ１９＋、ＣＤ４３−、ｃ−ｋｉｔ−発現によって特徴付けられる細胞約１×１０６個〜約２×１０６個の範囲内のプレＢ細胞集団を含む、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ１５）
骨髄中に、ＩｇＭ＋、Ｂ２２０ｉｎｔ発現によって特徴付けられる細胞約５×１０５個〜約７×１０５個の範囲内の未成熟Ｂ細胞集団を含む、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ１６）
骨髄中に、ＩｇＭ＋、Ｂ２２０ｈｉ発現によって特徴付けられる細胞約３×１０４個〜約１．５×１０５個の範囲内の成熟Ｂ細胞集団を含む、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ１７）
骨髄中に、細胞約１×１０６個〜約３×１０６個の範囲内の総ＣＤ１９＋Ｂ細胞集団を含む、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ１８）
細胞約２×１０６個〜約７×１０６個の範囲内のＣＤ１９＋脾性Ｂ細胞集団を含む、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ１９）
細胞約１×１０６個〜約４×１０６個の範囲内のＣＤ１９＋、ＩｇＤｈｉ、ＩｇＭｌｏ脾性Ｂ細胞集団を含む、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ２０）
細胞約９×１０５個〜約２×１０６個の範囲内のＣＤ１９＋、ＩｇＤｌｏ、ＩｇＭｈｉ脾性Ｂ細胞集団を含む、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ２１）
ＣＤ９３＋Ｂ２２０＋ＩｇＭｈｉＣＤ２３−発現によって特徴付けられる細胞約２×１０６個〜約７×１０６個の範囲内の移行Ｔ１脾性Ｂ細胞集団を含む、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ２２）
ＣＤ９３＋Ｂ２２０＋ＩｇＭｈｉＣＤ２３＋発現によって特徴付けられる細胞約１×１０６個〜約７×１０６個の範囲内の移行Ｔ２脾性Ｂ細胞集団を含む、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ２３）
ＣＤ９３＋Ｂ２２０＋ＩｇＭｌｏＣＤ２３＋発現によって特徴付けられる細胞約１×１０６個〜約４×１０６個の範囲内の移行Ｔ３脾性Ｂ細胞集団を含む、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ２４）
ＣＤ９３−Ｂ２２０＋ＩｇＭｈｉＣＤ２１／３５ｈｉＣＤ２３−発現によって特徴付けられる細胞約１×１０６個〜約３×１０６個の範囲内の辺縁帯脾性Ｂ細胞集団を含む、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ２５）
ＣＤ９３−Ｂ２２０＋ＣＤ２１／３５ｉｎｔＩｇＭｌｏＩｇＤｈｉ発現によって特徴付けられる細胞約３×１０６個〜約１．５×１０７個の範囲内の濾胞１型（ＦＯ−Ｉ）脾性Ｂ細胞集団を含む、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ２６）
ＣＤ９３−Ｂ２２０＋ＣＤ２１／３５ｉｎｔＩｇＭｉｎｔＩｇＤｈｉ発現によって特徴付けられる細胞約１×１０６個〜約２×１０６個の範囲内の濾胞２型（ＦＯ−ＩＩ）脾性Ｂ細胞集団を含む、前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ２７）
前記項目Ａのいずれか一項に記載のマウスの単離された細胞。
（項目Ａ２８）
胚性幹（ＥＳ）細胞である、項目Ａ２７に記載の細胞。
（項目Ａ２９）
項目Ａ２８に記載のＥＳ細胞を含むマウス胚。
（項目Ａ３０）
Ｂ細胞である、項目Ａ２７に記載の細胞。
（項目Ａ３１）
項目Ａ３０に記載のＢ細胞を用いて作製されたハイブリドーマ。
（項目Ａ３２）
抗体を生成するため、またはヒト免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする核酸配列を同定するための、項目Ａ１からＡ２６のいずれか一項に記載のマウスの使用。
（項目Ａ３３）
目的の抗原に結合する抗体を作製するための方法であって、
項目Ａ１からＡ２６のいずれか一項に記載のマウスを、目的の抗原を用いて免疫するステップ、
該マウスから免疫グロブリン可変領域遺伝子配列を得るステップ、および
該免疫グロブリン可変領域遺伝子配列を使用して、該抗原に結合する抗体を産生させるステップ
を含む方法。
（項目Ａ３４）
単一細胞において、
（ａ）免疫された項目Ａ１からＡ２６のいずれか一項に記載のマウスの第１のＶＨ遺伝子配列であって、ヒトＣＨ遺伝子配列と融合した第１のＶＨ遺伝子配列；および
（ｂ）ヒトＣＬ遺伝子配列と融合したＶＬ遺伝子配列
を発現させるステップ、
該細胞を、完全ヒト抗体を発現するのに十分な条件下で維持するステップ；ならびに
該抗体を該細胞から単離するステップ
をさらに含む、項目Ａ３３に記載の方法。
（項目Ａ３５）
前記細胞が免疫された項目Ａ１からＡ２６のいずれか一項に記載のマウスの第２のＶＨ遺伝子配列を含み、該ＶＨ遺伝子配列がヒトＣＨ遺伝子配列と融合しており、前記第１のＶＨ遺伝子配列が第１のエピトープを認識するＶＨドメインをコードし、該第２のＶＨ遺伝子配列が第２のエピトープを認識するＶＨドメインをコードし、該第１のエピトープおよび該第２のエピトープが同一ではなく、該第１のＶＨドメインおよび該第２のＶＨドメインが前記ＶＬ遺伝子配列によりコードされるＶＬドメインと相互作用する、項目Ａ３４に記載の方法。
（項目Ａ３６）
ヒト二重特異性抗体の作製における、項目Ａ１からＡ２６のいずれか一項に記載のマウスの使用。
（項目Ａ３７）
ヒト二重特異性抗体を作製するための方法であって、項目Ａ１からＡ２６のいずれか一項に記載のマウスを免疫するステップ、および該マウス由来のＢ細胞のヒト可変領域遺伝子配列を使用して該二重特異性抗体を作製するステップを含む方法。
（項目Ａ３８）
（ａ）項目Ａ１からＡ２６のいずれか一項に記載のマウスのクローン選択されたリンパ球を同定するステップであって、該マウスが免疫され、目的の抗原に対する免疫応答を生じるようにされており、該リンパ球が該目的の抗原に特異的に結合する抗体を発現するステップ；
（ｂ）該リンパ球または該抗体から、該目的の抗原に特異的に結合するヒト重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を得るステップ；および
（ｃ）（ｃ）のヌクレオチド配列を二重特異性抗体の作製に使用するステップ
を含む、項目Ａ３７に記載の方法。
（項目Ａ３９）
１回目に第１のヒト重鎖可変領域配列を生成するために目的の第１の抗原に対してステップ（ａ）から（ｃ）までを実施し、２回目に第２のヒト重鎖可変領域配列を生成するために目的の第２の抗原に対してステップ（ａ）から（ｃ）までを実施し、該第１のヒト重鎖可変領域配列が第１のヒト重鎖定常領域と融合して発現して第１のヒト重鎖を形成し、該第２のヒト重鎖可変領域配列が第２のヒト重鎖定常領域と融合して発現して第２のヒト重鎖を形成し、該第１のヒト重鎖および該第２のヒト重鎖がＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはＶκ３−２０遺伝子セグメントから発現した単一のヒト軽鎖の存在下で発現する、項目Ａ３８に記載の方法。
（項目Ａ４０）
（ａ）
−第１の免疫原を用いて免疫された項目Ａ１からＡ２６のいずれか一項に記載のマウス；および
−第２の免疫原を用いて免疫された同じマウス、または遺伝学的には同じである異なるマウス
由来のＢ細胞から可変重鎖領域をクローニングするステップ、
（ｂ）細胞において、同じ前記重鎖定常領域および同じ前記軽鎖とともに（ａ）の可変重鎖領域を発現させて二重特異性抗体を作製するステップ
を含む、項目Ａ３９に記載の方法。
（項目Ａ４１）
前記第１のヒト重鎖が、前記第１のヒト重鎖のプロテインＡに対する親和性を消失させるまたは実質的に低下させる改変を含み、前記第２のヒト重鎖がプロテインＡに結合する能力を保持し、該第１のヒト重鎖のプロテインＡに対する親和性を消失させるまたは実質的に低下させる改変が、９５Ｒ（ＥＵ４３５Ｒ）、９６Ｆ（ＥＵ４３６Ｆ）、およびこれらの組合せから選択される、項目Ａ４０に記載の方法。
（項目Ａ４２）
ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン遺伝子セグメントを選択するための、項目Ａ１からＡ２６のいずれか一項に記載のマウスの使用。
（項目Ａ４３）
免疫されている、項目Ａ１からＡ２６のいずれか一項に記載のマウス。
（項目Ａ４４）
抗体を産生する方法であって、項目Ａ１からＡ２６のいずれか一項に記載のマウスを、抗原を用いて免疫するステップ、および結果として生ずる、該マウスにより該抗原に対して産生された抗体から重鎖可変領域アミノ酸配列またはコードするヌクレオチド配列を得るステップ、および該重鎖可変領域アミノ酸配列または核酸配列を抗体の作製に利用するステップを含む方法。
（項目Ａ４５）
（ａ）前記マウスを免疫した前記抗原の異なるエピトープに対する２種の異なる抗体から前記重鎖可変領域アミノ酸配列またはコードするヌクレオチド配列を同定するステップ；または
（ｂ）項目Ａ１からＡ２６のいずれか一項に記載のマウスと同じマウス、またはさらなるマウスを、異なる抗原を用いて免疫し、次いで、該第２の抗原に特異的である、該マウスによって産生された抗体から重鎖可変領域配列アミノ酸配列またはコードするヌクレオチド配列を同定するステップを含み、
該２種の異なる重鎖可変領域を使用して二重特異性抗体を生成するステップをさらに含む、項目Ａ４４に記載の方法。
（項目Ａ４６）
前記抗体または２つの抗体から軽鎖可変領域配列も同定するステップをさらに含む、項目Ａ４４またはＡ４５に記載の方法。
（項目Ａ４７）
項目Ａ４６に記載の方法であって、該方法によって産生された抗体において同定された１つまたは複数の軽鎖重鎖可変領域も使用することを含む、方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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