(57)【要約】【課題】白血球動員をブロックするペプチドおよび使用方法を提供すること。【解決手段】白血球動員をブロックするにあたって有効な、配列番号１を含む新規なペプチドおよびその改変物が開示される。開示されるペプチドは、白血球動員と関連する疾患を処置するために、例えば、肝臓および肺への固形腫瘍の転移を阻害するために、ならびに敗血症を処置するために有用である。白血球動員をブロックする能力を有する化合物のスクリーニング法もまた、開示される。配列番号１を含む単離されたペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物もまた提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、２０１４年２月１３日に出願した米国出願第６１／９３９，５６１号の利益を主張する。この出願の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、白血球動員をブロックし得るペプチド、ならびに患者において腫瘍転移を阻害するためおよび敗血症を処置するためのその使用に関する。より具体的には、本発明は、肝臓および肺における腫瘍転移を阻害するためのこのようなペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
腫瘍は、身体の多くの異なる部分に拡がる能力を有するが、器官および組織の特定のセットに優先的にコロニー形成し（Ｐａｇｅｔ  Ｓ  （１９８９）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ  ８（２）：９８−１０１）、多くの臨床例が所見としてある（Ｃｈｉａｎｇ  ＡＣ  ＆  Ｍａｓｓａｇｕｅ  Ｊ  （２００８）  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５９（２６）：２８１４−２８２３；  Ｎｇｕｙｅｎ  ＤＸ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ９（４）：２７４−２８４）。例えば、ブドウ膜黒色腫を有する患者のうちの５０％は、最初の診断の１０〜１５年後には肝転移を発生させる（Ｂａｋａｌｉａｎ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４（４）：９５１−９５６；  Ｓａｔｏ  Ｔ  （２０１０）  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３７（２）：１２７−１３８）。乳がんは、骨、肺、肝臓および脳に転移しやすい傾向があり（Ｃｈｉａｎｇ  ＡＣ  ＆  Ｍａｓｓａｇｕｅ  Ｊ  （２００８）  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５９（２６）：２８１４−２８２３；  Ｎｇｕｙｅｎ  ＤＸ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ９（４）：２７４−２８４）、前立腺がんは、ほぼ例外なく骨に転移し（Ｓｃｈａｒｆｆｅｔｔｅｒ−Ｋｏｃｈａｎｅｋ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８８（１）：１１９−１３１）、結腸直腸がんおよび膵臓がんは、肝臓に転移する傾向がある（Ｈｅｓｓ  ＫＲ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｃａｎｃｅｒ  １０６（７）：１６２４−１６３３；  Ｊｏｎｅｓ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５（１１）：４２８３−４２８８）。その一方で、軟部組織肉腫は、主に肺へと拡がる（Ｒｏｂｅｒｇｅ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）
Ｃｕｒｒ  Ｏｎｃｏｌ  １７（６）：１８−２２）。まとめると、これら研究は、特定のがんの局所領域的管理の現実の必要性、特定の器官内での腫瘍細胞および宿主微小環境の考慮を要する必要性を強調している。これら所見は、ある種の腫瘍（「種子」）が、特定の器官（「土壌」）に特異的親和性を有し、「種子」と「土壌」との間の適合性がその部位における腫瘍細胞の最終的な運命を決定するというＰａｇｅｔ博士の独創的な仮説を強固にする。この前提は、特定の器官部位の腫瘍細胞コロニー形成が成功するのかまたは失敗するのかを決定するためには、「種子」の最終目的地に、適応免疫系および自然免疫系の浸潤細胞が必要であるというアイディアを織り込むことへと拡げられ得る。
【０００４】
転移プロセスには明確な一連のステージがある：１）腫瘍細胞が原発性腫瘍塊から出て、リンパ系もしくは血管系のいずれかによって循環へと入る、２）循環内でがん細胞が生き残る、３）血管系内で最初に拘束される、４）血管外遊出、５）微小環境内での宿主細胞の寄与を要する微小転移の確立、および６）マクロ転移（macrometastasｅs）へのさらなる成長（これは、異組織微小環境の適応を要する）。
【０００５】
インビボ選択、遺伝的アプローチおよび薬理学的アプローチの組み合わせを使用して、肝臓に非常に転移しやすい傾向がある乳がん、膵臓がんおよび結腸直腸がんの改変体（ｖａｒｉａｎｔ）を、同定した（（Ｄｕ  ＹＣ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８（４０）：１６７５３−１６７５８；  Ｂｅｍｍｏ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（８）：ｅ１１９８１；  Ｔａｂａｒｉｅｓ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３０（１１）：１３１８−１３２８；  Ｔａｂａｒｉｅｓ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．；  Ｋａｎｇ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３（６）：５３７−５４９）。これら改変体は、特有の遺伝子発現シグナチャーおよび親腫瘍細胞より特異的な標的器官選択性を示す（Ｍｉｎｎ  ＡＪ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  ４３６（７０５０）：５１８−５２４；  Ｂｏｓ  ＰＤ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｎａｔｕｒｅ  ４５９（７２４９）：１００５−１００９；  Ｌａｎｄｅｍａｉｎｅ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８（１５）：６０９２−６０９９；  Ｍｉｎｎ  ＡＪ，
ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１５（１）：４４−５５；  Ｚｈａｎｇ  ＸＨ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １６（１）：６７−７８；  Ｍａｓｓａｇｕｅ  Ｊ  （２００７）  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５６（３）：２９４−２９７）。これら器官特異的特徴は、各器官の血管系が特有の細胞表面アドレスもしくは「郵便番号」を有するという所見（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｅ  （２００４）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ３２（Ｐｔ３）：３９７−４０２；  Ｔｅｅｓａｌｕ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ５０３：３５−５６）と対になって、がん細胞が特異的動員機構に基づいてそれらの転移環境に「適応」し得るという興味をそそる可能性を高める。
【０００６】
従って、必要とされるものは、転移標的器官（例えば、肝臓および肺）へと供給する管への血中の腫瘍細胞の付着をブロックして、これら器官への腫瘍転移を防止もしくは阻害し得る組成物である。また、必要とされるものは、敗血症（例えば、細菌性敗血症）を含む、白血球動員と関連した他の疾患を処置するために有効な組成物である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐａｇｅｔ  Ｓ  （１９８９）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ  ８（２）：９８−１０１
【非特許文献２】Ｃｈｉａｎｇ  ＡＣ  ＆  Ｍａｓｓａｇｕｅ  Ｊ  （２００８）  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５９（２６）：２８１４−２８２３
【非特許文献３】Ｎｇｕｙｅｎ  ＤＸ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ９（４）：２７４−２８４
【非特許文献４】Ｂａｋａｌｉａｎ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４（４）：９５１−９５６
【非特許文献５】Ｓａｔｏ  Ｔ  （２０１０）  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３７（２）：１２７−１３８
【非特許文献６】Ｓｃｈａｒｆｆｅｔｔｅｒ−Ｋｏｃｈａｎｅｋ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８８（１）：１１９−１３１
【非特許文献７】Ｈｅｓｓ  ＫＲ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｃａｎｃｅｒ  １０６（７）：１６２４−１６３３
【非特許文献８】Ｊｏｎｅｓ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５（１１）：４２８３−４２８８
【非特許文献９】Ｒｏｂｅｒｇｅ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｃｕｒｒ  Ｏｎｃｏｌ  １７（６）：１８−２２
【非特許文献１０】Ｄｕ  ＹＣ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８（４０）：１６７５３−１６７５８
【非特許文献１１】Ｂｅｍｍｏ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（８）：ｅ１１９８１
【非特許文献１２】Ｔａｂａｒｉｅｓ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３０（１１）：１３１８−１３２８
【非特許文献１３】Ｋａｎｇ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３（６）：５３７−５４９
【非特許文献１４】Ｍｉｎｎ  ＡＪ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  ４３６（７０５０）：５１８−５２４
【非特許文献１５】Ｂｏｓ  ＰＤ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｎａｔｕｒｅ  ４５９（７２４９）：１００５−１００９
【非特許文献１６】Ｌａｎｄｅｍａｉｎｅ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８（１５）：６０９２−６０９９
【非特許文献１７】Ｍｉｎｎ  ＡＪ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１５（１）：４４−５５
【非特許文献１８】Ｚｈａｎｇ  ＸＨ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １６（１）：６７−７８
【非特許文献１９】Ｍａｓｓａｇｕｅ  Ｊ  （２００７）  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５６（３）：２９４−２９７
【非特許文献２０】Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｅ  （２００４）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ３２（Ｐｔ３）：３９７−４０２
【非特許文献２１】Ｔｅｅｓａｌｕ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ５０３：３５−５６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
白血球動員をブロックする能力を有するペプチドを含む組成物、およびその薬学的製剤が提供される。腫瘍転移を低減する、および敗血症（特に、細菌性敗血症）を処置する方法もまた、提供される。
【０００９】
本発明は、第１の局面において、配列ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１（ＬＳＡＬＴペプチド）として同定される）を含む単離されたペプチドを包含する。
【００１０】
1つの実施形態では、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ
配列のＮ末端およびＣ末端において、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸残基をさらに含む。
【００１１】
1つの実施形態では、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ
配列のＮ末端もしくはＣ末端において、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸残基をさらに含む。
【００１２】
1つの実施形態では、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、ｐｅｇ化、アセチル化、グリコシル
化、ビオチン化、または１個もしくはそれより多くのＤ−アミノ酸および／もしくは非天然アミノ酸での置換によって改変されている。
【００１３】
1つの実施形態では、上記ＬＳＡＬＴペプチドもしくはさらなる残基は、１個もしくは
それより多くの改変されたアミノ酸残基もしくはアミノ酸アナログを含む。
【００１４】
1つの実施形態では、上記改変されたアミノ酸残基は、メチル化、アミド化、アセチル化、および／もしくは他の化学基での置換によって改変されている。
【００１５】
1つの実施形態では、上記アミノ酸アナログは、β−アラニン、ノルバリン、ノルロイ
シン、４−アミノ酪酸、オルニチン（orithine）、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、シクロヘキシルアラニン、２−アミノイソ酪酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、フェニルグリシン、ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジンから選択される。
【００１６】
第２の局面において、上記ＬＳＡＬＴペプチドもしくはその改変体は、ファージウイルス中の挿入物として、または短いペプチドとして含まれ得る。
【００１７】
第３の局面において、上記ＬＳＡＬＴペプチドおよび／もしくはその改変体、ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物が提供される。
【００１８】
一実施形態において、上記キャリアは、水、生理食塩水（saline）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、血清含有溶液、ハンクス溶液、油、エステルおよびグリコールから選択される。
【００１９】
一実施形態において、上記薬学的組成物は、非経口投与に適している。
【００２０】
一実施形態において、上記薬学的組成物は、静脈内投与に適している。
【００２１】
第４の局面において、本発明は、配列ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１として同定される）を含む単離されたペプチドの薬学的有効量を患者に投与することによる、患者における白血球動員媒介性疾患を阻害する方法を包含する。
【００２２】
一実施形態において、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ配列のＮ末端およびＣ末端において１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸残基をさらに含む。
【００２３】
一実施形態において、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ配列のＮ末端もしくはＣ末端において１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸残基をさらに含む。
【００２４】
一実施形態において、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、ｐｅｇ化、アセチル化、グリコシル化、ビオチン化、または１個もしくはそれより多くのＤ−アミノ酸および／もしくは非天然アミノ酸での置換によって改変されている。
【００２５】
一実施形態において、上記ＬＳＡＬＴペプチドもしくはさらなる残基は、１個もしくはそれより多くの改変されたアミノ酸残基もしくはアミノ酸アナログを含む。
【００２６】
一実施形態において、上記改変されたアミノ酸残基は、メチル化、アミド化、アセチル化、および／もしくは他の化学基での置換によって改変されている。
【００２７】
一実施形態において、上記アミノ酸アナログは、β−アラニン、ノルバリン、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、オルニチン（orithine）、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、シクロヘキシルアラニン、２−アミノイソ酪酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、フェニルグリシン、ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジンから選択される。
【００２８】
一実施形態において、上記単離されたペプチドもしくはその改変体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの間の投与量で投与される。
【００２９】
一実施形態において、上記白血球動員媒介性疾患は、腫瘍転移である。
【００３０】
一実施形態において、上記単離されたペプチドは、処置の非存在下での腫瘍転移と比較して、腫瘍転移を低減する。
【００３１】
一実施形態において、本発明は、配列ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１として同定される）を含む単離されたペプチドの薬学的有効量を患者に投与することによる、患者における肝臓もしくは肺への腫瘍転移を阻害する方法を包含する。
【００３２】
一実施形態において、上記単離されたペプチドもしくはその改変体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの間の投与量で投与される。
【００３３】
一実施形態において、上記白血球動員媒介性疾患は、敗血症である。
【００３４】
一実施形態において、上記敗血症は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物の感染によって引き起こされた。
【００３５】
一実施形態において、上記敗血症は、細菌性敗血症である。  
【００３６】
一実施形態において、本発明は、配列ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１として同定される）を含む単離されたペプチドもしくはその改変体の薬学的有効量を患者に投与する工程を包含する、患者における細菌性敗血症の症状を処置する方法を包含する。
【００３７】
一実施形態において、上記単離されたペプチドもしくはその改変体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの間の投与量で投与される。
【００３８】
一実施形態において、上記単離されたペプチドもしくはその改変体は、細菌性敗血症の症状が低減もしくは改善されるまで投与される。
【００３９】
第５の局面において、本発明は、患者の血管系において白血球動員をブロックするために有効な化合物を同定する方法を包含し、該方法は、
（ａ）試験化合物のライブラリーを、配列番号２〜１６からなる群より選択される配列を有する標的ペプチドに結合するそれらの能力に関してスクリーニングする工程；
（ｂ）選択的結合親和性を示す化合物を選択する工程；
（ｃ）該化合物を、白血球動員阻害活性に関して試験する工程、および
（ｄ）化合物が白血球動員を阻害する場合、該化合物を選択する工程、
を包含する方法。
【００４０】
一実施形態において、上記血管系は、肺血管系もしくは肝臓血管系である。
【００４１】
一実施形態において、上記方法は、
（ｅ）上記化合物を、固形腫瘍を有する動物において腫瘍転移を阻害するその能力に関してさらに試験する工程；および
（ｆ）該化合物が工程（ｅ）において腫瘍転移を阻害する場合、該化合物を選択する工程
をさらに包含する。
【００４２】
一実施形態において、上記方法は、
（ｅ）上記化合物を、肺もしくは肝臓に転移することが既知の固形腫瘍を有する動物において、肺および肝臓への腫瘍転移を阻害するその能力に関してさらに試験する工程；ならびに
（ｆ）該化合物が工程（ｅ）において腫瘍転移を阻害する場合、該化合物を選択する工程
をさらに包含する。
【００４３】
一実施形態において、上記方法は、
（ｅ）前記化合物を、患者における細菌性敗血症を処置するその能力についてさらに試験する工程；および
（ｆ）該化合物が工程（ｅ）において敗血症を処置する場合、該化合物を選択する工程をさらに包含する。
【００４４】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明を添付の図面と共に読めばより完全に明らかになる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
配列番号１を含む、単離されたペプチド。
（項目２）
ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ配列のＮ末端およびＣ末端において、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸残基をさらに含む、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目３）
ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ配列のＮ末端もしくはＣ末端において、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸残基をさらに含む、項目１に記載の単離されたペプチド。（項目４）
前記ペプチドは、ｐｅｇ化、アセチル化、グリコシル化、ビオチン化、または１個もしくはそれより多くのＤ−アミノ酸および／もしくは非天然アミノ酸での置換によって改変されている、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目５）
前記ペプチドもしくはさらなるアミノ酸残基は、１個もしくはそれより多くの改変されたアミノ酸残基もしくはアミノ酸アナログを含む、項目１に記載の単離されたペプチド。（項目６）
前記改変されたアミノ酸残基は、メチル化、アミド化、アセチル化、および／もしくは他の化学基での置換によって改変されている、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目７）
前記アミノ酸アナログは、β−アラニン、ノルバリン、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、オルニチン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、シクロヘキシルアラニン、２−アミノイソ酪酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、フェニルグリシン、ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジンから選択される、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目８）
ファージウイルスと連絡状態にある、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目９）
配列番号１を含む単離されたペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目１０）
前記キャリアは、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、血清含有溶液、ハンクス溶液、油、エステルおよびグリコールから選択される、項目９に記載の薬学的組成物。
（項目１１）
前記薬学的組成物は、非経口投与に適している、項目９に記載の薬学的組成物。
（項目１２）
前記薬学的組成物は、静脈内投与に適している、項目９に記載の薬学的組成物。
（項目１３）
患者における白血球動員媒介性疾患を阻害する方法であって、配列番号１として同定される配列ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬを含む薬学的有効量の単離されたペプチドを該患者に投与することによる、方法。
（項目１４）
前記単離されたペプチドは、ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ配列のＮ末端およびＣ末端において１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸残基をさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記単離されたペプチドは、ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ配列のＮ末端もしくはＣ末端において１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸残基をさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記単離されたペプチドは、ｐｅｇ化、アセチル化、グリコシル化、ビオチン化、または１個もしくはそれより多くのＤ−アミノ酸および／もしくは非天然アミノ酸での置換によって改変されている、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記単離されたペプチドもしくはさらなる残基は、１個もしくはそれより多くの改変されたアミノ酸残基もしくはアミノ酸アナログを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
前記改変されたアミノ酸残基は、メチル化、アミド化、アセチル化、および／もしくは他の化学基での置換によって改変されている、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
前記アミノ酸アナログは、β−アラニン、ノルバリン、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、オルニチン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、シクロヘキシルアラニン、２−アミノイソ酪酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、フェニルグリシン、ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジンから選択される、項目１３に記載の方法。
（項目２０）
前記単離されたペプチドもしくはその改変体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの間の投与量で投与される、項目１３に記載の方法。
（項目２１）
前記白血球動員媒介性疾患は、腫瘍転移である、項目１３に記載の方法。
（項目２２）
前記単離されたペプチドは、処置の非存在下での腫瘍転移と比較して、腫瘍転移を低減する、項目１３に記載の方法。
（項目２３）
前記単離されたペプチドの投与は、前記患者における肝臓もしくは肺への腫瘍転移を阻害する、項目１３に記載の方法。
（項目２４）
前記単離されたペプチドもしくはその改変体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの間の投与量で投与される、項目１３に記載の方法。
（項目２５）
前記白血球動員媒介性疾患は、敗血症である、項目１３に記載の方法。
（項目２６）
前記敗血症は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物の感染によって引き起こされる、項目１３に記載の方法。
（項目２７）
前記敗血症は、細菌性敗血症である、項目１３に記載の方法。
（項目２８）
前記単離されたペプチドの投与は、前記患者における細菌性敗血症の少なくとも１つの症状を処置する、項目１３に記載の方法。
（項目２９）
前記単離されたペプチドもしくはその改変体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの間の投与量で投与される、項目１３に記載の方法。
（項目３０）
前記単離されたペプチドもしくはその改変体は、細菌性敗血症の症状が低減されるかもしくは改善されるまで投与される、項目１３に記載の方法。
（項目３１）
患者の血管系において白血球動員をブロックするために有効な化合物を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）試験化合物のライブラリーを、配列番号２〜１６からなる群より選択される配列を有する標的ペプチドに結合するそれらの能力に関してスクリーニングする工程；
（ｂ）選択的結合親和性を示す化合物を選択する工程；
（ｃ）該化合物を、白血球動員阻害活性に関して試験する工程、および
（ｄ）化合物が白血球動員を阻害する場合、該化合物を選択する工程、
を包含する方法。
（項目３２）
前記血管系は、肺血管系もしくは肝臓血管系である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
（ｅ）前記化合物を、固形腫瘍を有する動物において腫瘍転移を阻害するその能力に関してさらに試験する工程；および
（ｆ）該化合物が工程（ｅ）において腫瘍転移を阻害する場合、該化合物を選択する工程
をさらに包含する、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
（ｅ）前記化合物を、肺もしくは肝臓に転移することが既知の固形腫瘍を有する動物において、肺および肝臓への腫瘍転移を阻害するその能力に関してさらに試験する工程；ならびに
（ｆ）該化合物が工程（ｅ）において腫瘍転移を阻害する場合、該化合物を選択する工程
をさらに包含する、項目３１に記載の方法。
（項目３５）
（ｅ）前記化合物を、患者における細菌性敗血症を処置するその能力についてさらに試験する工程；および
（ｆ）該化合物が工程（ｅ）において敗血症を処置する場合、該化合物を選択する工程をさらに包含する、項目３１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、好中球特異的Ｔ７ファージディスプレイライブラリーの生成、ならびにインビボ選択、ならびに肝臓および肺へとホーミングするペプチドの単離を図示する模式図である；
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、４回のインビボ選択後の肝臓および他の器官へのＴ７Ｌｉファージライブラリーの分布（２Ａ）；および３回のインビボ選択後の肺および他の組織へのＴ７Ｌｕファージライブラリーの分布（２Ｂ）のプロットである。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、肝臓への選択されていないおよび肝臓特異的ファージディスプレイサブクローンの群のホーミング（３Ａ）ならびに肝臓、肺、および腎臓組織へのＴ７ＮＬｉ、Ｔ７Ｎｌｕ、および２−２／２−３ファージサブクローンのホーミング（３Ｂ）を示す棒グラフである。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ＬＰＳ予備処置ありおよびなしの正常マウスおよびＴＬＲ４（−／−）マウス（４Ａ）、ならびに正常マウスおよびＭｙＤ８８ノックアウトマウス（４Ｂ）における肝臓、肺、および腎臓に捕捉されたファージの量をプロットする。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、未処置またはＴ７ＮＬｉもしくはＴ７ＮＬｕライブラリーファージで処置されたＣ５７マウスにおいて測定された循環好中球数（５Ａ）、ならびに同じ処置条件下のＣ５７マウスの白血球ローリングフラックス（５Ｂ）のプロットである。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、後類洞細静脈における接着（６Ａ）および未処置またはＴ７ＮＬｉもしくはＴ７ＮＬｕライブラリーファージで処置したＣ５７マウスにおける灌流％のプロットである。
【図７】図７は、白血球ミエロペルオキシダーゼによって測定した場合の、肺における白血球の動員に対するＴ７ＮＬｉおよびＴ７ＮＬｕライブラリーの影響を示す。
【図８】図８は、３種のファージ群である、Ｔ７Ｎ  Ｌｕｎｇ  ｆｒｏｍ  Ｌｕｎｇ、Ｔ７Ｎ  Ｌｕｎｇ  ｆｒｏｍ  Ｌｉｖｅｒ、およびＬｕ−１（ｐｏｌｙＡ）がマウス肝臓において好中球接着をブロックする能力を比較する。
【図９】図９は、Ｐｏｌｙ  Ａファージ、Ｕｂｅ２ｎ（ＬＳＡＬＴ）ファージ、およびＬＰＳのみの投与後のマウス肝類洞における好中球接着を比較する。
【図１０】図１０ａおよび１０ｂは、第１のモデルに従って、ＬＳＡＬＴがどのように腫瘍転移を阻害するかを示す。
【図１１】図１１ａおよび１１ｂは、第２のモデルに従って、ＬＳＡＬＴがどのように腫瘍転移を阻害するかを示す。
【図１２】図１２は、４Ｔ１マウス乳がん細胞の脾臓内注射をコントロールファージもしくはＬＳＡＬＴ発現ファージ（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｈａｇｅ  ｏｆ  ＬＳＡＬＴ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｐｈａｇｅ）の存在下もしくは非存在下で行い、表面乳腺腫瘍転移の数を、注射後４週間の肝臓において評価した研究からのデータを示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｆは、５０μＭもしくは５００μＭ  ＬＳＡＬＴペプチドの事前の注射ありもしくはなしで、ルシフェラーゼを発現する１×１０６  ７０Ｗヒト黒色腫細胞を尾静脈を介して注射したマウスの肺組織における腫瘍負荷（１３Ａ−１３Ｃ）、ならびに５０μＭもしくは５００μＭ  ＬＳＡＬＴペプチドのマウスへの（ＬＳＡＬＴ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｃｅ）事前の注射ありもしくはなしで、ルシフェラーゼを発現する１×１０６  ７０Ｗヒト黒色腫細胞を尾静脈を介して注射したマウスにおいて目に見える黒色の肺結節を有する肺の代表的画像（１３Ｄ−１３Ｆ）を示す。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｄは、ＬＳＡＬＴでの予備処置あり（１４Ｂ）およびなし（１４Ａ）で、ルシフェラーゼを発現するヒト黒色腫細胞を尾静脈を介して注射したマウスの肺のＸｅｎｏｇｅｎ画像；ならびに図１３Ａおよび１３Ｂに関して記載されるとおりに処置し、そして抗Ｌｙ６Ｇ／ＧＲＩ抗体を使用する好中球除去の存在下（１４Ｄ）および非存在下（１４Ｃ）で注射したマウスの肺のＸｅｎｏｇｅｎ画像を示す。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、動物の尾静脈にルシフェラーゼを安定して発現する５×１０５  １４３Ｂヒト骨肉腫細胞を注射した後の、マウス肺における転移性病変の数の減少に対するＬＳＡＬＴペプチドの影響を示す。代表的組織切片（１５Ａ）は、転移性病変の減少を示す。同様に、５つの不連続組織切片において、右肺および左肺の全ての肺葉に関する転移性病変の数の定量を１５Ｂでグラフとして示す。
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、動物の尾静脈にルシフェラーゼを安定して発現する５×１０５  １４３Ｂヒト骨肉腫細胞を注射した後のマウス肝臓における転移負荷の低減に対するＬＳＡＬＴペプチドの影響を示す。注射後３週間の動物の代表的バイオルミネッセンス画像（１６Ａ）は、バイオルミネッセンスの減少を示す。これら動物における転移負荷を示すためのルシフェラーゼ活性の定量を、図１６Ｂにグラフとして示す。
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、敗血症のマウスモデルにおいてＬＳＡＬＴペプチドの効果を示す。類洞における好中球接着を、コントロール−バクテリオファージ／ＬＰＳ、ＬＳＡＬＴ−バクテリオファージ／ＬＰＳ、およびＬＰＳのみの存在下で評価した（図１７Ａ）。ＬＳＡＬＴ−バクテリオファージの注射は、ＬＰＳ誘発性急性炎症に対して保護効果を有した（５匹のマウスのうち４匹において）（図１７Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
（発明の詳細な説明）
【００４７】
（定義）
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」とは、その最も広い意味において、ポリペプチド鎖へと組みこまれ得る任意の化合物および／もしくは物質をいう。用語「アミノ酸」はまた、「アミノ酸残基」と交換可能に使用され、遊離アミノ酸および／もしくはペプチドのアミノ酸残基を指し得る。この用語が遊離アミノ酸を指すかもしくはペプチドの残基を指すかは、この用語が使用される状況から明らかである。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「標準的アミノ酸」とは、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、システイン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、セリン、チロシン、スレオニン、トリプトファンおよびバリンから選択され、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸の両方を包含し、その両方が天然においてペプチドに組み込まれる、天然に存在するペプチドにおいて一般に見出される２０個の標準的アミノ酸のうちのいずれかをいう。「非標準的」もしくは「非従来型（ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）アミノ酸」とは、合成して調製されているか天然の供給源から得られているかに関わらず、上記標準的アミノ酸以外の任意のアミノ酸をいう。本明細書で使用される場合、「合成もしくは非天然のアミノ酸」とは、塩、アミノ酸誘導体（例えば、アミド）、および／もしくは置換が挙げられるが、これらに限定されない化学的に改変されたアミノ酸を包含する。
【００４９】
（Ｉ．ペプチド）
本発明は、白血球動員を減少させ、従って、白血球動員媒介性疾患（例えば、腫瘍転移および敗血症）を処置するために有用性を有する天然に存在しないペプチドの発見に基づく。白血球動員を減少させ得るこのペプチドの改変体および改変された実施形態もまた、提供される。
【００５０】
バイアスのないコンビナトリアルファージインビボバイオパニングアプローチ（ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｈａｇｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈ）を使用して、炎症促進刺激で処置した動物の肝臓および肺に位置し、白血球動員をブロックする特異的ペプチドをディスプレイするファージを単離した。このファージおよびその相当するディスプレイされたペプチド（Ｎ−ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（ＬＳＡＬＴといわれ、本明細書で配列番号１として同定される））はまた、腫瘍細胞株を注射した動物の肝臓もしくは肺における腫瘍負荷を劇的に低減することが見出された。上記ペプチドはまた、敗血症のマウスモデルにおいて肝臓への好中球動員を低減させた。
【００５１】
上記ＬＳＡＬＴペプチド、ならびにその改変体および改変されたバージョンは、本明細書に記載される。これらペプチドを含む薬学的組成物もまた記載される。
【００５２】
いくつかの実施形態において、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、プロテアーゼ耐性、血清安定性および／もしくはバイオアベイラビリティーを増大させるために、１もしくはそれより多くの改変を含む。いくつかの実施形態において、上記改変は、ｐｅｇ化、アセチル化、グリコシル化、ビオチン化、Ｄ−アミノ酸および／もしくは非天然アミノ酸での置換、ならびに／または上記ペプチドの環化から選択される。
【００５３】
ある種の実施形態において、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、１個もしくはそれより多くのＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、および／もしくは非標準的アミノ酸を含む。ある種の実施形態において、上記アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ−−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−−ＣＯＯＨを有する。ある種の実施形態において、上記アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。ある種の実施形態において、上記アミノ酸は、合成のもしくは非天然のアミノ酸（例えば、α，α−二置換されたアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸）である；いくつかの実施形態において、上記アミノ酸は、ｄ−アミノ酸である；ある種の実施形態において、上記アミノ酸は、１−アミノ酸である。
【００５４】
一実施形態において、上記ペプチドは、ペプチドにおけるカルボキシ末端および／もしくはアミノ末端のアミノ酸を含め、アミノ酸を含むか、またはメチル化、アミド化、アセチル化、および／もしくはペプチドの活性に有害に影響を及ぼすことなく、その循環半減期を変化させ得る他の化学基での置換によって改変され得る。非従来型のもしくは非天然のアミノ酸の例としては、シトルリン、オルニチン（ornithine）、ノルロイシン、ノル
バリン、４−（Ｅ）−ブテニル−４（Ｒ）−メチル−Ｎ−メチルスレオニン（ＭｅＢｍｔ）、Ｎ−メチル−ロイシン（ＭｅＬｅｕ）、アミノイソ酪酸、スタチン、およびＮ−メチル−アラニン（ＭｅＡｌａ）が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与し得る。
【００５５】
別段定義されなければ、本明細書で使用される科学用語および技術用語ならびに命名法は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、細胞培養、感染、分子生物学方法などの手順は、当該分野で使用される一般的な方法である。このような標準的技術は、以下のような参照マニュアル中に見出され得る：例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００１；およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．，  ２００１など。
【００５６】
ペプチドは、インビトロで生物学的活性を誘発するにあたって有効であり得る一方で、インビボでのそれらの有効性は、プロテアーゼの存在によって低減され得る。血清プロテアーゼは、特異的基質要件を有する。上記基質は、切断には、Ｌ−アミノ酸およびペプチド結合の両方を有していなければならない。さらに、エキソペプチダーゼ（これは、血清中のプロテアーゼ活性の最も顕著な構成要素を表す）は、通常、ペプチドの最初のペプチド結合に対して作用し、遊離Ｎ末端を要する（Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １０：１２６８−１２７３  （１９９３））。このことに鑑みて、ペプチドの改変されたバージョンを使用することは、しばしば有利である。上記改変されたペプチドは、ＬＳＡＬＴの所望の生物学的活性を付与する元のＬ−アミノ酸ペプチドの構造的特徴を保持するが、有利なことには、プロテアーゼおよび／もしくはエキソペプチダーゼによる切断を容易には受けない。
【００５７】
コンセンサス配列のうちの１個またはそれより多くのアミノ酸を同じタイプのＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）で体系的に置換することは、より安定なペプチドを生成するために使用され得る。従って、本発明のペプチド誘導体もしくはペプチド摸倣物は、順方向もしくは逆方向のいずれにしても、全てＬ、全てＤもしくはＤ、Ｌの混合のペプチドであり得る。Ｎ末端もしくはＣ末端のＤ−アミノ酸の存在は、ペプチドのインビボ安定性を増大させる。なぜならペプチダーゼは、Ｄ−アミノ酸を基質として利用できないからである（Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １０：１２６８−１２７３  （１９９３））。逆Ｄペプチド（ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｄ−ｐｅｐｔｉｄｅ）は、Ｌ−アミノ酸を含むペプチドと比較して逆の配列で配置されたＤ−アミノ酸を含むペプチドである。従って、Ｌ−アミノ酸ペプチドのＣ末端残基が上記Ｄ−アミノ酸ペプチドのＮ末端になる、など。逆Ｄペプチドは、同じ二次コンホメーション、従って、上記Ｌ−アミノ酸ペプチドと類似の活性を保持するが、インビトロおよびインビボにおいて酵素分解に対してより抵抗性であるので、元のペプチドより大きな治療効力を有し得る（Ｂｒａｄｙ  ａｎｄ  Ｄｏｄｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：６９２−６９３  （１９９４）；  Ｊａｍｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：７４４−７４６  （１９９４））。同様に、逆のＬペプチドは、親ペプチドのＣ末端が逆ＬペプチドのＮ末端の場所をとるようになる標準的方法を使用して生成され得る。重要な二次構造を有しないＬ−アミノ酸ペプチド（例えば、短いペプチド）の逆Ｌペプチドは、上記Ｌ−アミノ酸ペプチドの側鎖の同じ間隔およびコンホメーションを保持するので、しばしば元のＬ−アミノ酸ペプチドと類似の活性を有することが予期される。さらに、逆ペプチドは、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸の組み合わせを含み得る。アミノ酸の間の間隔および側鎖のコンホメーションは保持され得、元のＬ−アミノ酸ペプチドと類似の活性を生じ得る。
【００５８】
一実施形態において、上記ペプチドは、ペプチド末端に化学基を付加することによってペプチドのＮ末端もしくはＣ末端の残基に作用するペプチダーゼに対する抵抗性を付与するように化学的に修飾され、その結果、上記改変されたペプチドは、もはや上記ペプチダーゼの基質ではない。一実施形態において、１つのこのような化学修飾は、上記ペプチドのいずれかの末端もしくは両末端におけるグリコシル化である。他の実施形態において、血清安定性を増強する化学修飾としては、１〜２０個の炭素の低級アルキルからなるＮ末端アルキル基（例えば、アセチル基）の付加、および／またはＣ末端のアミド基もしくは置換されたアミド基の付加が挙げられるが、これらに限定されない。特に、本発明は、Ｎ末端アセチル基および／もしくはＣ末端アミド基を有するペプチドからなる改変されたペプチドを含む。
【００５９】
一実施形態において、上記ペプチドにおいて、非天然アミノ酸の代わりにある種の天然に存在するアミノ酸を使用することは、タンパク質分解に対する抵抗性を付与する。このような置換は、例えば、生物学的活性に影響を及ぼすことなく、Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に対する抵抗性を付与し得る。天然に存在しないアミノ酸の例としては、α，α−二置換されたアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、β−アミノ酸、およびβ−メチルアミノ酸が挙げられる。本発明において有用なアミノ酸アナログとしては、β−アラニン、ノルバリン、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、オルニチン（ｏｒｉｔｈｉｎｅ）、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、シクロヘキシルアラニン、２−アミノイソ酪酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、フェニルグリシン、ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジンおよび他の非従来型のアミノ酸が挙げられ得るが、これらに限定されない。さらに、天然に存在しないアミノ酸を有するペプチドの合成は、当該分野で公知である。
【００６０】
種々の実施形態において、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、Ｃ末端、Ｎ末端もしくはＣ末端およびＮ末端の両方において、アミノ酸残基もしくはアナログをさらに含む。好ましくは、上記ＬＳＡＬＴペプチドのうちの活性保有配列は、これらさらなるアミノ酸の付加によっては認識できるほど影響を受けない。
【００６１】
一実施形態において、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、上記ＬＳＡＬＴペプチドのＮ末端およびＣ末端において、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸残基をさらに含む。
【００６２】
別の実施形態において、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、上記ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ配列のＮ末端において、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸残基をさらに含む。
【００６３】
別の実施形態において、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、上記ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ配列のＣ末端において、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸残基をさらに含む。
【００６４】
種々の実施形態において、上記ペプチドは、XLSALTPSPSWLKYKAL、XXLSALTPSPSWLKYKAL
、XXXLSALTPSPSWLKYKAL、XXXXLSALTPSPSWLKYKAL、もしくはXXXXLSALTPSPSWLKYKALから選
択され、ここでＸは、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、またはここでＸは、本明細書で記載されかつ当業者に公知であるとおりの非従来型のアミノ酸もしくはアミノ酸アナログである。
【００６５】
種々の実施形態において、上記ペプチドは、LSALTPSPSWLKYKALX、LSALTPSPSWLKYKALXX
、LSALTPSPSWLKYKALXXX、LSALTPSPSWLKYKALXXXX、もしくはLSALTPSPSWLKYKALXXXXから選
択され、ここでＸは、任意の天然に存在するアミノ酸であるかまたはここでＸは、本明細書で記載されかつ当業者に公知であるとおりの非従来型のアミノ酸もしくはアミノ酸アナログである。
【００６６】
種々の実施形態において、上記ペプチドは、XLSALTPSPSWLKYKALX、XLSALTPSPSWLKYKALXX
、XLSALTPSPSWLKYKALXXX、XLSALTPSPSWLKYKALXXXX、XLSALTPSPSWLKYKALXXXXX、XXLSALTPSPSWLKYKALX、XXLSALTPSPSWLKYKAXX、XXLSALTPSPSWLKYKALXXX、XXLSALTPSPSWLKYKALXXXX、XXLSALTPSPSWLKYKALXXXXX、XXXLSALTPSPSWLKYKALX、XXXLSALTPSPSWLKYKALXX、XXXLSALTPSPSWLKYKALXXX、XXXLSALTPSPSWLKYKALXXXX、XXXLSALTPSPSWLKYKALXXXXX、XXXXLSALTPSPSWLKYKALX、XXXXLSALTPSPSWLKYKALXX、XXXXLSALTPSPSWLKYKALXXX  XXXXLSALTPSPSWLKYKALXXXX、XXXXLSALTPSPSWLKYKALXXXXX、XXXXXLSALTPSPSWLKYKALX、XXXXXLSALTPSPSWLKYKALXX、XXXXXLSALTPSPSWLKYKALXXX  XXXXXLSALTPSPSWLKYKALXXXX、もしくはXXXXXLSALTPSPSWLKYKALXXXXXから選択され、ここでＸは、任意の天然に存在するアミノ酸であるかまたはここでＸは、本明細書で記載されかつ当業者に公知であるとおりの非従来型のアミノ酸もしくはアミノ酸アナログである。
【００６７】
ペプチドアナログは、テンプレートペプチドのものに類似の特性を有する非ペプチド薬物として、製薬業で一般に使用される。上記非ペプチド化合物は、「ペプチド摸倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」もしくはペプチド摸倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）といわれる（Ｆａｕｃｈｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ５４：２８３−２８７  （１９８６）；  Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３０：１２２９−１２３９  （１９８７））。ペプチド摸倣物は、治療上有用なペプチドに構造的に関連し、等価なもしくは増強された治療効果もしくは予防効果を生じさせるために使用され得る。一般に、ペプチド摸倣物は、天然に存在するレセプター結合ポリペプチドのような模範ペプチド（ｐａｒａｄｉｇｍ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）（すなわち、生物学的もしくは薬理学的な活性を有するポリペプチド）に構造的に類似であるが、当該分野で周知の方法によって、、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＨ２ＳＯ−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、−−ＣＯＣＨ２−−などのような結合によって必要に応じて置換された１個もしくはそれより多くのペプチド結合を有する（Ｓｐａｔｏｌａ，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ，  １（３）：２６７  （１９８３）；  Ｓｐａｔｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．
Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ３８：１２４３−１２４９  （１９８６）；  Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｒｅｓ．  １４：１７７−１８５  （１９７９）；およびＷｅｉｎｓｔｅｉｎ．  Ｂ．，  １９８３，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｄｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ，）。このようなペプチド摸倣物は、より経済的な生成、より大きな化学的安定性、増強された薬理学的特性（例えば、半減期、吸収、有効性、効率など）、低下した抗原性などが挙げられる、天然に存在するポリペプチドを超える顕著な利点を有し得る。
【００６８】
薬学的に受容可能な塩は、毒性副作用なしに、親ペプチドの所望の生物学的活性を保持する。用語「薬学的に受容可能な塩」とは、本明細書で使用される場合、非毒性であることが公知でありかつ薬学の文献中で一般に使用されている塩をいう。このような塩を形成するために使用される代表的な無機酸としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、次リン酸などが挙げられる。有機酸（例えば、脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換されたアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸およびヒドロキシアルカン二酸、芳香族の酸、脂肪族かつ芳香族のスルホン酸）に由来する塩もまた、使用され得る。このような薬学的に受容可能な塩としては、以下が挙げられる：アセテート、フェニルアセテート、トリフルオロアセテート、アクリレート、アスコルベート、ベンゾエート、クロロベンゾエート、ジニトロベンゾエート、ヒドロキシベンゾエート、メトキシベンゾエート、メチルベンゾエート、ｏ−アセトキシベンゾエート、ナフタレン−２−ベンゾエート、ブロミド、イソブチレート、フェニルブチレート、β−ヒドロキシブチレート、クロリド、シンナメート、シトレート、ホルメート、フマレート、グリコレート、ヘプタノエート、ラクテート、マレエート、ヒドロキシマレエート、マロネート、メシレート、ニトレート、オキサレート、フタレート、ホスフェート、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタホスフェート、ピロホスフェート、プロピオネート、フェニルプロピオネート、サリチレート、スクシネート、スルフェート、ビスルフェート、ピロスルフェート、スルファイト、ビスルファイト、スルホネート、ベンゼンスルホネート、ｐ−ブロモフェニルスルホネート、クロロベンゼンスルホネート、エタンスルホネート、２−ヒドロキシエタンスルホネート、メタンスルホネート、ナフタレン−１−スルホネート、ナフタレン−２−スルホネート、ｐ−トルエンスルホネート、キシレンスルホネート、タータレートなど。
【００６９】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ（１つの、ある）」、「ａｎ（１つの、ある）」および「ｔｈｅ（上記、この、その）」は、文脈がそうでないことを明らかに示さなければ、それらが言及する用語の複数形をも具体的に包含する。例えば、「ペプチド」への言及は、ペプチドの混合物を包含する。
【００７０】
（ＩＩ．薬学的製剤および医薬）
別の局面において、本明細書で記載されるペプチド、ならびにその改変体および改変は、治療的使用のための薬学的製剤として提供される。一実施形態において、上記薬学的製剤は、配列ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１として同定され、本明細書で「ＬＳＡＬＴ」と示される）を含む単離されたペプチドを含む。別の実施形態において、上記薬学的製剤は、ファージウイルス中の挿入物として含まれる単離されたペプチドを含み、そして／または上記ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ配列のＮ末端および／もしくはＣ末端において１、２、３、４、５個のさらなるアミノ酸残基をさらに含み得る。
【００７１】
代表的送達レジメンとしては、経口、非経口（皮下、筋肉内および静脈内注射を含む）、直腸、口内（舌下を含む）、経皮、吸入、眼および鼻内が挙げられる。一実施形態において、ペプチドの送達は、放出制御注射用製剤（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ
ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の皮下注射を必要とする。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるペプチドおよび／もしくはタンパク質は、皮下、鼻内および吸入投与のために有用である。
【００７２】
正確な用量および組成物の選択ならびに最も適切な送達レジメンは、とりわけ、選択されるペプチドの薬理学的特性、処置される状態の性質および重症度、ならびにレシピエントの身体状態および精神的な鋭敏さによって影響を受ける。さらに、投与経路は、吸収される物質の格差のある量を生じる。異なる経路を介するペプチドの投与のバイオアベイラビリティーは、特に変わりやすく、１％未満からほぼ１００％までの量が認められる。代表的には、静脈内、腹腔内もしくは皮下注射以外の経路からのバイオアベイラビリティーは、５０％以下である。
【００７３】
本発明の方法に従って、本発明の本明細書で記載されるとおりのＬＳＡＬＴペプチドは、本明細書で記載されるように、被験体に単独で（例えば、精製されたペプチドもしくは化合物として）、または（例えば、上記疾患の処置のための医薬の製造において）組成物もしくは医薬の構成要素として投与され得る。上記組成物は、薬学的組成物を調製するために、生理学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤とともに製剤化され得る。上記キャリアおよび組成物は、滅菌され得る。上記製剤は、投与様式、例えば、静脈内もしくは皮下投与に適しているべきである。組成物を製剤化する方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
１７．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，
（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｅｄｉｔｏｒ）（１９８９）を参照のこと）。
【００７４】
適切な薬学的に受容可能なキャリアとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアガム、植物性油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（例えば、ラクトース、アミロースもしくはデンプン）、糖（例えば、マンニトール、スクロースなど）、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、芳香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、ならびにこれらの組み合わせ。上記薬学的調製物は、所望であれば、上記活性化合物と有害に反応もせず、それらの活性に干渉もしない補助剤（例えば、滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝化剤、着色および／もしくは芳香性物質など）と混合され得る。好ましい実施形態において、静脈内投与に適した水溶性キャリアが使用される。
【００７５】
上記組成物もしくは医薬はまた、所望であれば、微量の湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤を含み得る。上記組成物は、液体溶液、懸濁物、エマルジョン、徐放性製剤、もしくは散剤であり得る。上記組成物はまた、坐剤として、旧来の結合剤およびキャリア（例えば、トリグリセリド）とともに製剤化され得る。
【００７６】
上記組成物もしくは医薬は、ヒトへの投与に適合された薬学的組成物として慣用的な手順に従って製剤化され得る。例えば、好ましい実施形態において、静脈内投与のための組成物は、代表的には、無菌等張性水性緩衝液中の液剤である。必要な場合には、上記組成物はまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を軽減するための局所麻酔剤を含み得る。一般に、成分は、単位投与形態において、例えば、活性薬剤の品質のしるしである密封シール容器（例えば、アンプルもしくはサシェ）中の乾いた乾いた凍結乾燥散剤もしくは無水濃縮物として別個にかもしくは一緒に混合してかのいずれかで供給される。上記組成物が注入によって投与される予定である場合、それは、無菌の製薬グレードの水、生理食塩水もしくはデキストロース／水を含む注入ボトルを用いて分与され得る。上記組成物が注射によって投与される場合、上記成分が投与前に混合され得るように、注射用無菌水もしくは生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【００７７】
いくつかの実施形態において、上記薬学的組成物は、液体キャリア（例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、血清含有溶液、ハンクス溶液、他の水性の生理学的平衡溶液、油、エステルおよびグリコールが挙げられるが、これらに限定されない）を含む。
【００７８】
本明細書で記載されるとおりのＬＳＡＬＴペプチドは、中性もしくは塩形態として製剤化され得る。上述のように、薬学的に受容可能な塩は、遊離アミノ基を用いて形成されるもの（例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもの）、および遊離カルボキシル基を用いて形成されるもの（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもの）を含む。
【００７９】
本発明の薬学的製剤は、ＬＳＡＬＴペプチドを活性成分として含み、ＬＳＡＬＴペプチドは、周知の方法および薬学的組成物に従って、賦形剤と混合され得るか、賦形剤によって希釈され得るか、またはカプセル、サシェ、紙もしくは他の容器の形態にあり得るキャリア内に封入され得る。上記組成物は、ペプチド投与に適した任意の経路（非経口、静脈内、皮下、もしくは筋肉内投与が挙げられる）によって投与され得る。代表的には、上記ペプチドは、滅菌注射用溶液の中に、０．５〜２ｍｌもしくはそれ未満の必要とされる用量を提供するために十分な濃度で、溶解されるかもしくは懸濁される。非経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、１種もしくはそれより多くの薬学的に受容可能な滅菌等張性水性溶液もしくは非水性溶液、分散物、懸濁物もしくはエマルジョン、または使用直前に滅菌注射用液剤もしくは分散物（これは、抗酸化剤、緩衝化剤、上記製剤を意図されたレシピエントの血液と等張性にする溶質または懸濁剤もしくは濃化剤を含み得る）へと再構成され得る滅菌散剤と組み合わせて、本発明の１種もしくはそれより多くの化合物を含む。
【００８０】
注射用デポー形態は、生分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド）中に薬物の微小被包されたマトリクスを形成することによって作製される。薬物  対  ポリマーの比および使用される特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出の速度が制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤はまた、上記薬物を、身体組織と適合性であるリポソームもしくはマイクロエマルジョンの中に捕捉することによって調製される。上記注射用物質は、例えば、細菌保持フィルタを通して濾過することによって滅菌され得る。
【００８１】
上記薬学的組成物は、単位用量もしくは複数用量密封容器、例えば、アンプルおよびバイアルにおいて呈示され得、使用直前に無菌液体キャリア（例えば、注射用水）の添加のみを要する凍結乾燥状態で貯蔵され得る。即席の注射溶液および懸濁物は、上記で記載されるタイプの無菌の散剤、粒剤および錠剤から調製され得る。
【００８２】
（ＩＩＩ．キット）
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書で記載されるＬＳＡＬＴペプチドもしくは薬学的組成物、ならびにその再構成（凍結乾燥されている場合）および／もしくは使用についての説明を含むキットまたは他の製造物品をさらに提供する。キットもしくは他の製造物品は、容器、シリンジ、バイアルおよび（例えば、皮下、もしくは吸入による）投与に有用な任意の他の物品、デバイスもしくは装置を含み得る。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ（例えば、充填済みシリンジ）、アンプル、カートリッジ、レザバ、もしくはリオ−ジェクト（ｌｙｏ−ｊｅｃｔ）が挙げられる。上記容器は、種々の材料（例えば、ガラスもしくはプラスチック）から形成され得る。いくつかの実施形態において、上記容器は、充填済みシリンジである。適切な充填済みシリンジとしては、焼成シリコーン被覆（ｂａｋｅｄ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｃｏａｔｉｎｇ）付きのホウケイ酸ガラスシリンジ、スプレーされたシリコーン付きのホウケイ酸ガラスシリンジ、もしくはシリコーンなしのプラスチック樹脂シリンジが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
代表的には、上記容器は、製剤、ならびに再構成および／もしくは使用についての指示を示し得る上記容器上のもしくは上記容器に関連づけられたラベルを保持し得る。例えば、上記ラベルは、上記製剤が上記で記載されるとおりの濃度へと再構成されることを示し得る。上記ラベルは、上記製剤が例えば、皮下投与に有用であるかもしくは皮下投与が意図されていることをさらに示し得る。いくつかの実施形態において、上記容器は、ＬＳＡＬＴペプチドを含む安定な製剤の単一用量を含み得る。種々の実施形態において、上記安定な製剤の単一用量は、約１５ｍｌ、約１０ｍｌ、約５．０ｍｌ、約４．０ｍｌ、約３．５ｍｌ、約３．０ｍｌ、約２．５ｍｌ、約２．０ｍｌ、約１．５ｍｌ、約１．０ｍｌ、もしくは約０．５ｍｌ未満の容積で存在する。あるいは、上記製剤を保持する容器は、上記製剤の反復投与（例えば、２〜６回の投与）を可能にする、複数回使用バイアルであり得る。キットもしくは他の製造物品は、適切な希釈剤（例えば、ＢＷＦＩ、生理食塩水、緩衝化生理食塩水）を含む第２の容器をさらに含み得る。上記希釈剤および上記製剤を混合する際に、その再構成された製剤における最終タンパク質濃度は、一般に、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌ（例えば、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌ）である。キットもしくは他の製造物品は、商業的観点およびユーザー観点からみて望ましい他の物質（他の緩衝化剤、希釈剤、フィルタ、ニードル、シリンジ、および使用説明付きのパッケージ挿入物が挙げられる）をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、キットもしくは他の製造物品は、自己投与についての説明を含み得る。
【００８４】
（ＩＶ．投与量）
医薬として使用される場合、本発明のペプチドは、薬学的組成物の形態で投与され、これら薬学的組成物は、本発明のさらなる実施形態を表す。これら化合物は、種々の経路（経口、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、および鼻内、または気管内点滴（ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ  ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）もしくはエアゾール吸入を介するものが挙げられる）によって投与され得る。
【００８５】
本発明のペプチドは、（例えば、肝臓への）腫瘍転移をブロックもしくは阻害するにあたって有用であり、投与様式は、化合物の適用によって定義され、最適用量を見出すための臨床試験の慣用的方法によって決定され得る。
【００８６】
一実施形態において、上記投与量は、活性ペプチドが約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの間、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの間、もしくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの間である。
【００８７】
他の実施形態において、上記投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの間、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの間、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの間、もしくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの間である。
【００８８】
他の実施形態において、上記投与量は、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの間、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、もしくは約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０．０ｍｇ／ｋｇである。
【００８９】
他の実施形態において、上記投与量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの間、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの間、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇの間、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの間、約５．０ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの間、約５．０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの間、約５．０ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇの間、約５．０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの間、約１０．０ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの間、約１０．０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの間、約１０．０ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇの間、もしくは約１０．０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの間である。
【００９０】
別の実施形態において、上記投与量は、約５０μＭ〜約５００μＭの間である
【００９１】
しかし、実際投与される上記ペプチドの量が、関連する状況（処置される予定の状態、選択される投与経路、投与される実際の化合物、個々の患者の年齢、体重、および応答、患者の症状の重症度などが挙げられる）に鑑みて、医師によって決定されることは、理解される。
【００９２】
種々の実施形態において、本明細書で記載されるペプチドおよび／もしくはタンパク質、またはその塩は、１日あたり体重１ｋｇあたり約０．００１〜約２０ｍｇの間、１日あたり体重１ｋｇあたり約０．０１〜約１０ｍｇの間、１日あたり体重１ｋｇあたり約０．１〜約１０００μｇの間、もしくは１日あたり体重１ｋｇあたり約０．１〜約１００μｇの間の量で投与される。投与経路は、変動する。例えば、本明細書で記載されるペプチドおよび／もしくはタンパク質、またはその塩は、１日あたり体重１ｋｇあたり約０．１〜約１０００μｇの間、もしくは１日あたり体重１ｋｇあたり約０．１〜約１００μｇの間の量で、皮下注射によって投与される。例示によれば、５０ｋｇのヒト女性被験体に関しては、活性成分の一日用量は、約５〜約５０００μｇ、もしくは皮下注射によって約５〜約５０００μｇである。投与経路、化合物の有効性、薬物動態プロフィールおよび観察される適用可能なバイオアベイラビリティー、ならびに活性薬剤および処置される疾患に依存して、種々の用量が必要とされる。投与が吸入による代替の実施形態において、その一日用量は、１０００〜約２０，０００μｇ、１日に２回である。他の哺乳動物（例えば、ウマ、イヌ、およびウシ）では、より高い用量が必要とされ得る。この投与量は、最も有効な結果を達成するために必要な通り、１回の投与によって、複数回の投与によって、または放出制御を介して、従来の薬学的組成物の中で送達され得る。
【００９３】
（Ｖ．製造方法）
本明細書で記載されるＬＳＡＬＴペプチドもしくは誘導体は、当業者に公知のペプチド合成の任意の方法（合成技術（例えば、全面的固相合成、部分的固相合成、フラグメント縮合、古典的液相合成（classical  solution  synthesis）、ネイティブケミカルライゲーション）および組換え技術が挙げられる）によって得られ得る。例えば、上記ペプチドもしくはペプチド誘導体は、固相ペプチド合成（これは、簡潔には、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基を樹脂（例えば、ベンズヒドリルアミン樹脂、クロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂）へとカップリングし、Ｎ−α保護アミノ酸を順次付加することからなる）によって得られ得る。上記保護基は、当該分野で公知の任意のこのような基であり得る。各新たなアミノ酸を成長中の鎖に付加する前に、その鎖に付加された前のアミノ酸の保護基が除去される。このような固相合成は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５：  ２１４９  （１９６４）；  Ｖａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１３：１３９４−１３９７  （１９８１）によって、米国特許第４，３０５，８７２号および同第４，３１６，８９１号において、Ｂｏｄｏｎｓｋｙ
ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｄ．  （Ｌｏｎｄｏｎ），  ３８：１５９７  （１９６６）；ならびにＬｕｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」  Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ２１．１１，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｄｅｓ．  Ｔｈｉｅｍｅ，  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，  ７１３−８０９  （２００５）の中で総説された技術によるＰｉｅｔｔａ  ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍ．
６５０  （１９７０）によって開示されている。適切な樹脂へのアミノ酸のカップリングはまた、当該分野で周知であり、米国特許第４，２４４，９４６号に開示されている（Ｈｏｕｖｅｒ−Ｗｅｙｌ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｖｏｌ  Ｅ２２ａ．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ，  Ｍｕｒｒａｙ  Ｇｏｏｄｍａｎ，  Ｅｄｉｔｏｒ−ｉｎ−Ｃｈｉｅｆ，  Ｔｈｉｅｍｅ．  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００２の中で総説されている）。
【００９４】
上記ＬＳＡＬＴペプチドの調製の任意のプロセスの間に、関係する分子のうちのいずれかの上の感受性反応性基を保護することは、望ましいことであり得る。これは、従来の保護基（例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｔ．  Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ  ＆  Ｐ．  Ｇ．  Ｍ．  Ｗｕｔｓ，  １９９１，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ；およびＰｅｐｔｉｄｅｓ：  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｂｙ  Ｓｅｗａｌｄ  ａｎｄ  Ｊａｋｕｂｋｅ，  ２００２，  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，  Ｗｈｅｉｎｈｅｉｍ  ｐ．  １４２の中で記載されるもの）によって達成され得る。例えば、αアミノ保護基としては、アシルタイプ保護基（例えば、トリフルオロアセチル、ホルミル、アセチル）、脂肪族ウレタン保護基（例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、シクロヘキシルオキシカルボニル）、芳香族ウレタンタイプ保護基（例えば、フルオレニル−９−メトキシ−カルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、Ｃｂｚ誘導体）およびアルキルタイプ保護基（例えば、トリフェニルメチル、ベンジル）が挙げられる。アミノ酸側鎖保護基としては、ベンジル（ＴｈｒおよびＳｅｒに関して）、Ｃｂｚ（Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、メチルエチル、シクロヘキシル（Ａｓｐ、Ｈｉｓ）、Ｂｏｃ（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ）などが挙げられる。上記保護基は、当該分野で公知の方法を使用して、都合の良いその後の段階で除去され得る。
【００９５】
さらに、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、有機相の中で保護基を伴ってＦＭＯＣプロトコルに従って合成され得る。望ましくは、上記ペプチドは、Ｃ１８クロマトグラフィーカラムにおいて１０−６０％のアセトニトリル勾配で溶離される高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で、収率７０％で精製される。ペプチドの分子量は、質量分析法（Ｆｉｅｌｄｓ，  Ｇ．  Ｂ．  「Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」
Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．  Ｖｏｌ．  ２８９，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９７の中で総説される）によって確認され得る。
【００９６】
あるいは、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、例えば、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を使用して組換え系で調製され得る。ポリペプチドが、その同じポリペプチド内で上記の改変のうちの１つより多くを含み得ることは、理解される。
【００９７】
（ＶＩ．ＬＳＡＬＴペプチドの特徴付け）
上記ＬＳＡＬＴペプチドは天然に存在しないものの、上記ＬＳＡＬＴペプチドのＢＬＡＳＴ分析から、上記ペプチドが以下に対する類似性を有することが見出された：ダブルコルチン（double  cortin）；フィブリン−２；−Ｆｅｒｍｔ３；−テトラスパンニン１８；−ｓｈｒｏｏｍ３；−ソーティングネキシン８；−ＦＧＦＲ−３；−プロトジェニンホモログ；−ミオメシン３；および−ｐｒｄｍ１６。
【００９８】
ＬＳＡＬＴファージがニトロセルロース上に固定され、コンビナトリアルＭ１３ファージライブラリーに対してバイオパニングされた場合、以下のペプチドを上記ＬＳＡＬＴと特異的に結合するペプチドとして単離した。これらペプチドは、ＬＳＡＬＴペプチド、その改変体および改変の作用に関する潜在的標的を提供する。
【００９９】
【表１】
2020055873.tif 000002
【０１００】
以下で考慮されるように、これらペプチドのうちの全ては、化合物、例えば、肝臓もしくは肺への腫瘍転移を阻害する目的で、および敗血症の処置の目的で、肝臓もしくは肺における好中球動員をブロックするにあたって治療上有効であるペプチド化合物に関する潜在的標的である。
【０１０１】
（ＶＩＩ．スクリーニング法）
従って、本発明の一局面によれば、患者の血管系における白血球動員をブロックするために有効な化合物を同定するための方法が提供される。上記方法は、試験化合物のライブラリーを、配列番号２〜１６からなる群より選択される配列を有する標的ペプチドに結合するそれらの能力に関してスクリーニングする工程を包含する。上記ライブラリーにおける標的ペプチドのうちの１つへの選択的結合親和性（例えば、ランダム配列ペプチドに対して結合親和性が少なくとも１０〜１００倍の増大）を示すライブラリー化合物に関して、上記化合物は、以下で詳述される方法に従って、白血球動員を阻害するその能力に関してさらに試験されている。白血球動員をブロックすることが示される試験化合物は、次いで、さらなる化合物の試験および開発のためのリード化合物として同定される。
【０１０２】
一実施形態において、本発明は、患者の血管系における白血球動員をブロックするために有効な化合物を同定する方法を提供し、上記方法は、（ａ）試験化合物のライブラリーを、配列番号２〜１６からなる群より選択される配列を有する標的ペプチドに結合するそれらの能力についてスクリーニングする工程；（ｂ）選択的結合親和性を示す化合物を選択する工程；（ｃ）上記化合物を白血球動員阻害活性について試験する工程、および（ｄ）化合物が白血球動員を阻害する場合に、化合物を選択する工程を包含する。
【０１０３】
一実施形態において、上記血管系は、肺血管系もしくは肝臓血管系である。
【０１０４】
一実施形態において、上記方法は、（ｅ）上記化合物を、固形腫瘍を有する動物における腫瘍転移を阻害するその能力についてさらに試験する工程；および（ｆ）上記化合物が工程（ｅ）において腫瘍転移を阻害する場合、上記化合物を選択する工程をさらに包含する。
【０１０５】
一実施形態において、上記方法は、（ｅ）上記化合物を、肺もしくは肝臓に転移することが公知の固形腫瘍を有する動物における肺および肝臓への腫瘍転移を阻害するその能力についてさらに試験する工程；ならびに（ｆ）上記化合物が工程（ｅ）において腫瘍転移を阻害する場合、上記化合物を選択する工程をさらに包含する。
【０１０６】
一実施形態において、上記方法は、（ｅ）上記化合物を、患者における細菌性敗血症を処置するその能力についてさらに試験する工程；および（ｆ）上記化合物が工程（ｅ）において敗血症を処置する場合に、上記化合物を選択する工程をさらに包含する。
【０１０７】
一実施形態において、上記方法における工程（ａ）は、試験化合物のライブラリーを、配列番号２〜７からなる群より選択される配列を有する標的ペプチドに結合するそれらの能力についてスクリーニングする工程を包含する。
【０１０８】
別の実施形態において、工程（ａ）は、試験化合物のライブラリーを、配列番号８〜１６からなる群より選択される配列を有する標的ペプチドに結合するそれらの能力についてスクリーニングする工程を包含する。
【０１０９】
（ＶＩＩＩ．ＬＳＡＬＴ作用機構）
いかなる特定の機構によっても拘束されることは意図しないが、ＬＳＡＬＴが肝臓および肺の類洞への好中球動員をブロックする能力は、図１０および図１１に図示される２つの作用機構のうちの１つによって起こり得ると考えられる。モデル１（図１０）は、標的血管系における内皮へのがん細胞の結合を媒介する好中球（例えば、白血球）によって共有される特異的接着分子を有するがん細胞（図中のｃｃ）、および内皮層を通っての上記がん細胞の管外遊出を示す。この因子へとＬＳＡＬＴが結合すると、内皮へのがん細胞の結合および／もしくは標的組織（例えば、肝臓）への管外遊出が抑制される。
【０１１０】
第２のモデルは、図１１に示されるように、がん細胞が内皮に結合するが、標的器官へ管外遊出する能力を提供するために白血球を要することを提唱する。このモデルにおけるＬＳＡＬＴペプチドは、がん細胞の近位への白血球の動員をブロックするか、または白血球とがん細胞との相互作用をブロックすることによって、機能する。
【０１１１】
これら２つのモデルは、相互に排他的ではなく、両方の統合を要するより複雑なモデルが、想起され得る。いかなる特定の機構によっても拘束されず、かつ単離されたファージおよびその相当するディスプレイされたペプチドが内因性白血球の動員を阻害し得るという観察ならびに腫瘍細胞転移の２つの異なるモデル（マウスおよびヒトの両方）に基づくと、上記ＬＳＡＬＴペプチドが、より早期の転移ステージ、具体的には、血管系内のがん細胞の最初の拘束／動員および／または周囲の組織へのそれらの管外遊出に干渉することはありそうである。
【０１１２】
（ＩＸ．処置方法）
本明細書で使用される場合、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、疾患もしくは状態を阻害すること、すなわち、その発生またはその少なくとも１つの臨床症状もしくは潜在的（ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ）症状を停止または低減することをいう。「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、疾患もしくは状態を軽減すること、すなわち、疾患もしくは状態、またはその臨床症状もしくは潜在的症状のうちの少なくとも１つの後退を引き起こすことをさらにいう。処置される予定の患者への利益は、統計的に有意であるか、または上記患者および／もしくはその医師に少なくとも気づかれるかのいずれかである。
【０１１３】
一局面において、本発明は、患者における白血球動員媒介性疾患を阻害する方法であって、配列ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１として同定される）を含む単離されたペプチドの薬学的有効量を該患者に投与することによる、方法を包含する。
【０１１４】
一実施形態において、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ配列のＮ末端およびＣ末端において、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸残基をさらに含む。
【０１１５】
一実施形態において、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ配列のＮ末端もしくはＣ末端において、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸残基をさらに含む。
【０１１６】
種々の実施形態において、上記ペプチドは、XLSALTPSPSWLKYKAL、XXLSALTPSPSWLKYKAL
、XXXLSALTPSPSWLKYKAL、XXXXLSALTPSPSWLKYKAL、もしくはXXXXLSALTPSPSWLKYKALから選
択され、ここでＸは、任意の天然に存在するアミノ酸であるかまたはここでＸは、本明細書で記載されかつ当業者に公知のとおりの非従来型のアミノ酸もしくはアミノ酸アナログである。
【０１１７】
種々の実施形態において、上記ペプチドは、LSALTPSPSWLKYKALX、LSALTPSPSWLKYKALXX
、LSALTPSPSWLKYKALXXX、LSALTPSPSWLKYKALXXXX、もしくはLSALTPSPSWLKYKALXXXXから選
択され、ここでＸは、任意の天然に存在するアミノ酸であるかまたはここでＸは、本明細書で記載されかつ当業者に公知のとおりの非従来型のアミノ酸もしくはアミノ酸アナログである。
【０１１８】
種々の実施形態において、上記ペプチドは、XLSALTPSPSWLKYKALX、XLSALTPSPSWLKYKALXX、XLSALTPSPSWLKYKALXXX、XLSALTPSPSWLKYKALXXXX、XLSALTPSPSWLKYKALXXXXX、XXLSALTPSPSWLKYKALX、XXLSALTPSPSWLKYKAXX、XXLSALTPSPSWLKYKALXXX、XXLSALTPSPSWLKYKALXXXX
、XXLSALTPSPSWLKYKALXXXXX、XXXLSALTPSPSWLKYKALX、XXXLSALTPSPSWLKYKALXX、XXXLSALTPSPSWLKYKALXXX、XXXLSALTPSPSWLKYKALXXXX、XXXLSALTPSPSWLKYKALXXXXX、XXXXLSALTPSPSWLKYKALX、XXXXLSALTPSPSWLKYKALXX、XXXXLSALTPSPSWLKYKALXXX  XXXXLSALTPSPSWLKYKALXXXX、XXXXLSALTPSPSWLKYKALXXXXX、XXXXXLSALTPSPSWLKYKALX、XXXXXLSALTPSPSWLKYKALXX
、XXXXXLSALTPSPSWLKYKALXXX  XXXXXLSALTPSPSWLKYKALXXXX、もしくはXXXXXLSALTPSPSWLKYKALXXXXXから選択され、ここでＸは、任意の天然に存在するアミノ酸であるかまたはこ
こでＸは、本明細書で記載されかつ当業者に公知のとおりの非従来型のアミノ酸もしくはアミノ酸アナログである。
【０１１９】
一実施形態において、上記ペプチドは、ｐｅｇ化、アセチル化、グリコシル化、ビオチン化、または１個もしくはそれより多くのＤ−アミノ酸および／もしくは非天然アミノ酸での置換によって改変されている。
【０１２０】
一実施形態において、上記ペプチドもしくはさらなる残基は、１個もしくはそれより多くの改変されたアミノ酸残基もしくはアミノ酸アナログを含む。
【０１２１】
一実施形態において、上記改変されたアミノ酸残基は、メチル化、アミド化、アセチル化、および／もしくは他の化学基での置換によって改変される。
【０１２２】
一実施形態において、上記アミノ酸アナログは、β−アラニン、ノルバリン、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、オルニチン（orithine）、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、シクロヘキシルアラニン、２−アミノイソ酪酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、フェニルグリシン、ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジンから選択される。
【０１２３】
一実施形態において、上記単離されたペプチドもしくはその改変体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの間の投与量で投与される。
【０１２４】
一局面において、上記白血球動員媒介性疾患は、腫瘍転移である。
【０１２５】
一実施形態において、上記単離されたペプチドは、処置の非存在下での腫瘍転移と比較して、腫瘍転移を低減する。
【０１２６】
一実施形態において、本発明は、患者における肝臓もしくは肺への腫瘍転移を阻害する方法であって、配列ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１として同定される）を含む単離されたペプチドの薬学的有効量を該患者に投与する工程による、方法を包含する。
【０１２７】
一実施形態において、上記単離されたペプチドもしくはその改変体は、約０．  ０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの間の投与量で投与される。
【０１２８】
上記ペプチドは、肝臓もしくは肺へ転移する可能性を有する固形腫瘍を有する被験体に投与される。上記ペプチドは、好ましくは、１週間あたり少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回、上記の治療用量で投与され、上記処置は、上記固形腫瘍自体が例えば、外科的切除および放射線療法の組み合わせによって、効果的に処置されるまで、維持され得る。
【０１２９】
図１２は、４Ｔ１マウス乳がん細胞の脾臓内注射を、コントロールファージもしくはＬＳＡＬＴ発現ファージ（ｃｏｎｔｒｏｌ  pｈａｇｅ  ｏｆ  LSALT  expressing  phage
）の存在下もしくは非存在下で行い、表面乳腺腫瘍転移の数を、注射後４週間で肝臓において評価した研究のデータを示す。認められるように、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、肝類洞組織に存在する好中球の数を有意に低減した。
【０１３０】
１つの処置研究において、ルシフェラーゼを発現する、１×１０６  ７０Ｗ  １×１０６ヒト黒色腫細胞を、５０μＭもしくは５００μＭ  ＬＳＡＬＴペプチドの事前の注射ありもしくはなしで、尾静脈を介して注射した。注射後４週間で、動物を屠殺し、肺を取り出し、腫瘍負荷（図１３Ａ〜１３Ｆ）について評価したか、またはＸｅｎｏｇｅｎ光放射システムを使用して画像化した（図１４Ａ〜１４Ｄ）。図１３Ａ〜１３Ｃは、肺の代表画像を示し、目に見える黒色の肺結節が起こる頻度は、ＬＳＡＬＴの最高用量を受けた動物において最も少ない。図１３Ａ〜１３Ｃは、ヒトヌクレオリンで染色し（茶色）かつトルイジン（toludine）ブルーで対比染色した凍結肺切片を示し（上段）、図１３Ｄ〜１３Ｆは、肺における腫瘍負荷を実証するメラニンを発現する腫瘍細胞（茶色）を有する切除した肺を示し、最高レベルのＬＳＡＬＴを示す組織は、最も少ない腫瘍負荷を示す。
【０１３１】
動物を、抗Ｌｙ６Ｇ／ＧＲ１を使用する好中球除去の非存在下もしくは存在下で上記のとおり処置し、上記動物を、Ｘｅｎｏｇｅｎ光システムで画像化した。図１４Ａおよび１４Ｂで認められ得るように、ＬＳＡＬＴの量が徐々に増すことにより、腫瘍負荷は徐々に低下し、同じ結果が、上記動物を好中球除去について予備処置した場合にも認められた（図１４Ｃおよび１４Ｄ）。
【０１３２】
一局面において、上記白血球動員媒介性疾患は、敗血症である。
【０１３３】
一実施形態において、上記敗血症は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物の感染によって引き起こされた。
【０１３４】
一実施形態において、上記敗血症は、細菌性敗血症である。
【０１３５】
一実施形態において、本発明は、患者における細菌性敗血症の症状を処置する方法を包含し、上記方法は、上記患者に、配列ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１として同定される）を含む単離されたペプチドもしくはその改変体の薬学的有効量を投与する工程を包含する。
【０１３６】
一実施形態において、上記単離されたペプチドもしくはその改変体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの間の投与量で投与される。
【０１３７】
一実施形態において、上記単離されたペプチドもしくはその改変体は、細菌性敗血症の症状が低減もしくは改善されるまで投与される。
【０１３８】
別の局面において、本発明は、配列ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１として同定される）を含む単離されたペプチドの薬学的有効量を上記患者に投与する工程による、細菌性敗血症を処置する方法を包含する。上記のように、上記ペプチドは、１６マーペプチド、上記ペプチドの一方もしくは両方の末端に０〜５個のさらなるアミノ酸残基を含む１６〜２６マーペプチド、または挿入物として上記ＬＳＡＬＴペプチドを含むファージ粒子であり得る。上記ペプチドは、細菌性敗血症を有する被験体に投与される。処置は、好ましくは、上記細菌感染が処置されかつ敗血症のリスクが過ぎ去ってしまうまで、上記の用量での、１日に１回の投与である。
【０１３９】
（Ｘ．投与経路）
本明細書で記載されるとおりのＬＳＡＬＴペプチド（または本明細書で記載されるとおりのＬＳＡＬＴペプチドを含む組成物もしくは医薬）は、任意の適切な経路によって投与され得る。いくつかの実施形態において、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、非経口投与される。いくつかの実施形態において、上記非経口投与は、静脈内、皮内、吸入、経皮（局所(topical)）、眼内、筋肉内、皮下、筋肉内、および／もしくは経粘膜の投与から選択され
る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるとおりのＬＳＡＬＴペプチドは、皮下投与される。本明細書で使用される場合、用語「皮下組織」とは、皮膚の直下にある緩く不規則な結合組織の層として定義される。例えば、上記皮下投与は、大腿部領域、腹部領域、臀部領域、もしくは肩甲骨領域が挙げられるが、これらに限定されない領域へと組成物を注射することによって行われ得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるとおりのＬＳＡＬＴペプチドは、静脈内投与される。他の実施形態において、本明細書で記載されるとおりのＬＳＡＬＴペプチドは、標的組織（例えば、心臓もしくは筋肉（例えば、筋肉内）、腫瘍（腫瘍内）、神経系（例えば、脳への直接注射；脳室内；髄腔内））への直接投与によって投与される。あるいは、本明細書で記載されるとおりのＬＳＡＬＴペプチド（または本明細書で記載されるとおりのＬＳＡＬＴペプチドを含む組成物もしくは医薬）は、吸入によって、非経口的に、皮内に、経皮的に、もしくは経粘膜的に（例えば、経口でもしくは鼻に）投与され得る。所望であれば、１より多くの経路が同時に使用されてもよい。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるとおりのＬＳＡＬＴペプチドは、経口投与される。いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）ＬＳＡＬＴペプチド、（ｂ）少なくとも１種の薬学的に受容可能なｐＨ低下剤、（ｃ）上記ＬＳＡＬＴペプチドのバイオアベイラビリティーを促進するために有効な少なくとも１種の吸収増強剤、および（ｄ）保護的ビヒクルを含む、経口投与のための本明細書で記載されるとおりのＬＳＡＬＴペプチドの固体投与形態を提供する。いくつかの実施形態において、上記固体投与形態は、カプセル剤もしくは錠剤である。経口製剤を作製するための種々の方法および成分が、当該分野で公知であり、当業者が、本明細書においておよび／もしくは２０１４年２月１３日出願の米国仮特許出願第６１／６１／９３９，５６１号（その開示はこれによりその全体が援用される）に記載されるように、これら方法および成分のうちのどれが本発明と適合性であるかを決定し得ると予測される。このような方法および成分はまた、本発明の範囲内であると企図される。
【０１４１】
（ＸＩ．投与スケジュール）
種々の実施形態は、種々の投与レジメンを含み得る。いくつかの実施形態において、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、連続注入を介して投与される。いくつかの実施形態において、上記連続注入は、静脈内である。他の実施形態において、上記連続注入は、皮下である。代わりにもしくはさらに、いくつかの実施形態において、上記ＬＳＡＬＴペプチドは、２ヶ月に１回、１ヶ月に１回、１ヶ月に２回、３週間に１回、２週間に１回、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、毎日、１日に２回、もしくは臨床的に望ましい別の投与スケジュールで投与される。単一の被験体のための投与レジメンは、固定した間隔である必要はないが、上記被験体の必要に応じて、時間を経て変動してもよい。
【０１４２】
（ＸＩＩ．スクリーニング法）
第３の局面において、本発明は、患者の血管系における白血球動員をブロックするために有効な化合物を同定するための方法を包含する。
【０１４３】
一実施形態において、上記血管系は、上記患者の肺もしくは肝臓のものである。
【０１４４】
一実施形態において、上記方法は、（ａ）試験化合物のライブラリーを、配列番号２〜１６からなる群より選択される配列を有する標的ペプチドに結合するそれらの能力についてスクリーニングする工程；（ｂ）上記ライブラリー中の標的ペプチドのうちの１種への選択的結合親和性を示すライブラリー化合物について；該化合物を、肺もしくは肝臓に転移することが既知の固形腫瘍を有する動物において、肺もしくは肝臓への腫瘍転移を阻害するその能力についてさらに試験する工程；ならびに（ｃ）該化合物が工程（ｂ）において腫瘍転移を阻害する場合、該化合物を選択する工程を包含する。
【０１４５】
一実施形態において、上記方法は、患者における肺もしくは肝臓への腫瘍転移を阻害するために有効な化合物を同定するための使用を包含し、上記方法は、工程（ｂ）において、上記化合物を、肺および肝臓に転移することが公知の固形腫瘍を有する動物において肺および肝臓への腫瘍転移を阻害するその能力について試験する工程をさらに包含する。
【０１４６】
一実施形態において、上記方法は、患者における細菌性敗血症を処置するために有効な化合物を同定するための使用を包含し、上記方法は、工程（ｂ）において、上記化合物を、動物モデルにおける敗血症を処置するその能力について試験する工程をさらに包含する。
【０１４７】
本明細書で言及される全ての刊行物および特許出願は、各独立した刊行物もしくは特許出願が参考として援用されると具体的にかつ個々に示されるのと同程度まで、本明細書に参考として援用される。
【実施例】
【０１４８】
実施例１：Ｔ７  肝臓および肺ファージディスプレイライブラリーの調製
図１は、好中球特異的Ｔ７ファージディスプレイライブラリーの調製における工程を図示する。例示的方法において、好中球を、公知の手順に従って、４０匹のＣ５６黒色マウスから単離した。ＲＮＡをその好中球から抽出し、ＯｒｉｅｎｔＥｘｐｒｅｓｓｃＤＮＡキット（Ｎｏｖａｇｅｎ（米国特許第５，６２９，１７９号））を使用してｃＤＮＡへと変換した。上記好中球由来ｃＤＮＡを、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｈａｇｅ−Ｄｉｓｐｌａｙ
Ｓｙｓｔｅｍ（米国特許第５２２３４０９号；同第５４０３４８４号；同第５５７１６９８号；同第５７６６９０５号）においてコートタンパク質遺伝子へと融合し、そのＤＮＡを、ファージ粒子へとパッケージし、Ｔ７Ｎと呼ぶライブラリーを作った。次いで、上記ライブラリーをバックグラウンド細胞と混合し、そして結合されていないファージを保持する、３つの順次の工程によって、「バックグラウンド細胞」、すなわち、刺激されていない胎児マウス内皮細胞に結合したファージを上記ライブラリーから除去した。
【０１４９】
好中球特異的ファージを選択するために、Ｃ５７黒色マウスに、抗Ｇｒ１を注射して、該マウスから好中球を取り出した。２４時間後、上記マウスに、０．５ｍｇ／ｋｇ  リポポリサッカリド（ＬＰＳ）のＩＰ注射、すなわち、血管の内皮裏打ち上で接着分子のアップレギュレーションを引き起こす炎症刺激を与えた。これら接着分子は、血流から好中球を動員する。３．５時間後、上記マウスをケタミンの６５％用量で麻酔し、２０分後に、上記マウスに、５×１０９ｐｆｕのライブラリーファージを尾静脈によって注射し、上記ファージを１０分間循環させた。次いで、上記動物を１５ｍＬのＰＢＳで灌流し、左を通じてポンプ輸送し、心臓をなお拍動させながら右心房を通じて排液させて、血管系の中の結合されていないファージを除去した。
【０１５０】
肺、肝臓、心臓、腎臓、脳および脚の筋肉を採取し、各器官を、１ｍＬ  １０ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳ中で切り刻んで、ダウンス型ホモジナイザーにかけ、最終器官調製物のうちの１μＬを、プラーク力価測定のためにプレートした。細菌ファージ宿主を有する１０ｍＬ  ＬＢを、肝臓および肺の器官調製物の残りに添加して、これら器官に優先的にホーミングするファージを回収した。
【０１５１】
肝臓ライブラリー（Ｔ７ＮＬｉ）を、４回のインビボ選択を通じて採取したが、肺ライブラリー（Ｔ７ＮＬｕ）は、３回しか経なかった。なぜなら図２Ａおよび２Ｂで認められるように、肺にホーミングするファージの富化はさらなる選択で認められなかったからである。Ｔ７ＮＬｉライブラリーおよびＴ７ＮＬｕライブラリーの両方ともが、肝臓への結合に関して高度に選択的であったが、肺組織についてはどちらも高度に選択的ではなかった。
【０１５２】
上記Ｔ７ＮＬｉライブラリーに由来する１０プラークを２群、および元の選択されていない（Ｔ７Ｎ）ライブラリーに由来する１０プラークを２群（サブクローン１−１／１−１０および２−１／２−１０）合わせ、増幅させ、次いで、肝臓へのホーミングについてチェックした。その結果を図３Ａに示す。サブクローンの選択された群は、肝臓への顕著な選択的なホーミングを示した。上記Ｔ７ＮＬｉ、Ｔ７ＮＬｕ、ならびに上記からのサブクローン２−２（ＫＫＫＫＫＫＳＷＲＰＰＸＲＮ、配列番号１７）およびサブクローン２−８（Ｋ２０ＸＷＸＸＰＰＸＫＦＦＳＰＸ、配列番号１８）の５０：５０混合物もまた、肝臓、肺および腎臓組織を標的とするそれらの能力について試験した。その結果を図３Ｂに示す。図２Ａおよび２Ｂに示される結果と一致して、Ｔ７ＮＬｉライブラリーおよびＴ７ＮＬｕライブラリーの両方が、肝臓組織への結合について高度に選択的であった。
【０１５３】
実施例２：免疫レセプター変異を有するマウスの肝臓へのＴ７肝臓ファージの結合
上記選択されたＴ７ＮＬｉ群の各々に由来する１０ライブラリーファージの中の挿入物を、配列決定した。これらのうちの１つ（サブクローン２−２（ＫＫＫＫＫＫＳＷＲＰＰＸＲＮ、配列番号１７と称される）を、代表的肝臓ホーミングファージとして選択した。上記ファージを、処置されていないか、またはファージ注射の４時間前にＬＰＳで処置されたかのいずれかである、正常マウスおよびＴＬＲ４（−／−）マウスへと注射した。ＴＬＲ４（−／−）マウスは、Ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）（強力な免疫応答を活性化するために必要な重大な炎症促進性サイトカインの放出を誘発するレセプター）が欠損している。上記研究の結果（図４Ａにプロットされる）は、ＬＰＳ刺激ＴＬＲ４（−／−）動物の肝臓への上記２−２  Ｔ７ＮＬｉサブクローンの有意により高い結合を示し、このことは、ＴＬＲ４の非存在下で、他のレセプターがＬＰＳによってアップレギュレートされることを示す。それらは、先天性免疫に関与するので、上記データが示唆するように、上記アップレギュレートされたレセプターは、肝臓標的化ファージに結合し得る。
【０１５４】
Ｔ７ＮＬｉに由来する上記２−２サブクローンの能力もまた、正常（Ｃ５７）マウスおよびＭｙＤ８８（−／−）マウスにおいて調査した。上記Ｍｙｄ８８欠損対立遺伝子は、骨髄分化一次応答遺伝子８８遺伝子座のエキソン３の欠失をコードする。Ｍｙｄ８８欠損は、多くの免疫系異常、ならびに造血系、分子シグナル伝達、およびアポトーシスの異常と関連する。正常マウスおよびＭｙＤ８８（−／−）マウスの肝臓、肺、および腎臓への上記２−２クローン結合のレベルを、図４Ｂに示す。その結果から明らかなように、ＭｙＤ８８マウスは、上記２−２サブクローンによって認識されるレセプターもしくは他の結合タンパク質を過剰生成する。
【０１５５】
実施例３：選択されたペプチドでの肝臓への好中球動員のブロック
次の研究は、上記Ｔ７ＮＬｉライブラリーに由来する種々のペプチドが肝臓における好中球動員をブロックする能力を試験した。これら研究において、肝臓を、生体顕微鏡法によって画像化し、肝臓血管系を通る好中球の流れのリアルタイム観察を可能にした。試験したファージペプチドは、（１）完全Ｔ７ＮＬｕライブラリー（３×選択）、（２）完全Ｔ７ＮＬｉライブラリー（４×選択）および（３）上記からのサブクローン２−２および２−８の５０：５０混合物であった。
【０１５６】
各研究において、Ｃ５７マウスに、上記ファージの尾静脈注射を与え、５分後に、上記動物を麻酔し、肝臓をビデオ記録した（ここで上記マウスは、未処置であったか、またはファージ注射の４時間前に、０．５ｍｇ／ｋｇ  ＬＰＳ  ＩＰを与えたかのいずれかであった）。上記器官を、灌流なしでその後採取した。選択された器官におけるホーミングをチェックしたところ、先の結果と一致していた：３種全てのファージサンプルは、肝臓において選択され濃縮された。驚くべきことに、上記Ｔ７ＮＬｕライブラリーは、Ｔ７ＮＬｉライブラリーが示すよりも、肝臓へのより高い結合レベルを示した。
【０１５７】
生体顕微鏡法による肝臓への好中球動員のビデオ分析において、以下のパラメーターを測定した：
後類洞細静脈におけるローリング速度；
ローリングフラックス（類洞と交差して描かれた線を１分間に越える好中球の数）
類洞後細静脈の１００μｍセグメントの中に接着した好中球の数
１視野にある類洞の中に接着した好中球の数；および
類洞の灌流％−肝臓損傷の尺度。
【０１５８】
図５Ａは、末梢血中の、すなわち、肺にも肝臓にも動員されなかった好中球の数を示す。ＬＰＳ単独は、循環する好中球の実質的低下を引き起こした。このことは、肺および肝臓による動員の増大を示唆する。この効果は、ＬＰＳおよび上記ＴＮ７Ｌｕライブラリーの両方を受容する動物では大いに排除された。
【０１５９】
ローリングフラックス測定（図５Ｂに示される）は、ＴＮ７ＬｉライブラリーおよびＴＮ７Ｌｕライブラリーの両方が肝類洞内の好中球のフローを有意に低下させることを示し、このことは、類洞における動員が、より少ないことを示す。
【０１６０】
類洞後細静脈への好中球の接着の増大（図６Ａに示される）は、上記ＴＮ７Ｌｉライブラリー、Ｔ７ＮＬｕライブラリーの両方に存在するＬＰＳ（細菌宿主中で上記ファージを増殖させることによる混入物）によって引き起こされる可能性が最も高い。このことは、上記マウスに投与されるＬＰＳの量が意図されるより高く、使用されるファージの調製物に依存して変化したことを示す。これは、上記ファージが類洞において動員を阻害する能力が、ＬＰＳのより高い用量によって妨害されないことを示唆する。
【０１６１】
灌流パーセントは、どの程度多くの血流が肝臓に存在するかの尺度である。好中球動員は灌流を減少させ、肝臓損傷を生じる。上記Ｔ７ＮＬｕライブラリーは、ＬＰＳの適用にも拘わらず、肝臓の灌流を有意に改善した（図６Ｂ）。このことは、肝臓への好中球関連損傷に対する実質的な保護を示す。
【０１６２】
実施例４：肺への好中球動員の評価
肺に対する生体画像化（ｉｎｔｒａｖｉｔａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ）は利用可能でなかったので、肺への好中球動員の評価を、肺組織に存在するミエロペルオキシダーゼ（好中球酵素）を測定することによって行った。図７中のデータから認められるように、上記２つのファージライブラリーを用いても、好中球のいかなる減少もないようである。この観察された増大は、上記ファージ調製物に存在する余分のＬＰＳに起因し得る。
【０１６３】
実施例５：好中球動員をブロックするために有効なファージクローンの選択
上記Ｔ７ＮＬｕライブラリーを注射したマウスからの肺および肝臓をホモジナイズし、それらの中のファージを回収し、２つの新しいライブラリーを作った：
Ｔ７Ｎ  Ｌｕｎｇ  →Ｌｕｎｇ
Ｔ７Ｎ  Ｌｕｎｇ  →Ｌｉｖｅｒ
【０１６４】
これらを、好中球動員をブロックするそれらの能力について試験した。その結果を図８に示す。１回の肝臓選択を経た肺選択ファージは、肝類洞の内皮への好中球の接着を特異的に阻害するにあたって有効なファージを含むようであった。単一のファージクローンを、これらライブラリーの各々からランダムに拾い上げ、配列決定のために増殖させて、公知のヒト遺伝子に由来する配列を同定しようと試みた。上記クローンのうちの４つを、以下として同定した：（１）遺伝子Ｕｂｅ２ｎのアウトオブフレーム生成物（ｏｕｔ  ｏｆ
ｆｒａｍｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ）；（２）クラスリンの遺伝子のアウトオブフレーム生成物；および（３）ヘモグロビン（Ｈｅｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）の遺伝子のアウトオブフレーム生成物。
【０１６５】
別の２４個のプラークを、再増幅し、再プレートし、再配列決定したところ、その配列は、以下の公知のヒト遺伝子と一致した：Ｍｋｒｎ１（８個のサブクローン）；スペルミジンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ；Ｓ１００ａ９（２個のサブクローン）；Ｕｂｅ２ｎ（２個のサブクローン）；Ｎｇｐ（３個のサブクローン）；；Ｒｐ１３４；Ｃｈｒｍ
１７；Ｌｉｌｒｂ３；Ｄｎａｊａ２；Ｈｂｂ−ｂ１；Ｈｂａ−ａ１（２個のサブクローン）。
【０１６６】
Ｕｂｅ２ｎは、元は、肝類洞において好中球接着をブロックした群の中にあるので、それを、アラニンアミノ酸（Ａ−Ｓｔｏｐ）のみを示したファージおよびＬＰＳ単独に対して試験した。図９は、これら３つの処置での肝臓への相対的好中球結合を示す。この研究から、Ｕｂｅ２ｎのアウトオブフレーム配列によってコードされるペプチドを、ＬＰＳによって誘発される炎症後に、肝類洞への好中球の接着を阻害し得るファージサブクローンとして同定した。その翻訳されたペプチドは、「ＬＳＡＬＴ」ペプチドとも本明細書で示される、配列ＬＳＡＬＴＰＳＰＳＷＬＫＹＫＡＬ（配列番号１）を有する。
【０１６７】
実施例６：転移のマウスモデルにおける１４３Ｂヒト骨肉腫細胞の転移に対するペプチド効力の評価
ルシフェラーゼを安定して発現する５×１０５  １４３Ｂヒト骨肉腫細胞を、ＰＢＳもしくはＬＳＡＬＴペプチドのＩＶ送達の５分後に、動物の尾静脈へと注射した。動物を３週間後に屠殺した。次いで、肺を採取し、ホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋した。図１５Ａは、動物の右肺の肺葉の代表的組織切片を示す。転移性病変を、ヒト１４３Ｂ骨肉腫細胞を抗ヒトヌクレオリンで染色することによって可視化した（茶色）。図１５Ｂは、５つの非連続組織切片中の右肺および左肺の全ての肺葉についての転移性病変の数の定量を示すグラフを提供する。ＰＢＳ  ｎ＝４。ＬＳＡＬＴペプチド  ｎ＝６。
【０１６８】
類似のモデルにおいて、ルシフェラーゼを安定して発現する５×１０５  １４３Ｂヒト骨肉腫細胞を、ＰＢＳもしくはＬＳＡＬＴペプチドのＩＶ送達の５分後に、動物の尾静脈へと注射した。動物を、バイオルミネッセンス画像化（Ｘｅｎｏｇｅｎ，  ＩＶＩＳ  ２００）を使用して１週間に１回画像化した。
【０１６９】
図１６Ａは、注射後３週間での動物のバイオルミネッセンス画像を示す（３０秒間の露出時間）。図１６Ｂは、Ａの動物におけるルシフェラーゼ活性（転移負荷）の定量を示すグラフを提供する。ＰＢＳ  ｎ＝４。ＬＳＡＬＴペプチド  ｎ＝６。
【０１７０】
これら結果は、上記ＬＳＡＬＴペプチドもまた、肝臓への骨肉腫細胞系列の転移性の拡がりをブロックすることを示す。これは、いったん転移性になってしまえば、この疾患は非常に攻撃的であり、肺が優先して転移される器官であるので、特異的に密接に関係がある。
【０１７１】
実施例７：敗血症に対するペプチド効力の評価
敗血症の中毒モデル（ｉｎｔｏｘｉｃａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ）を使用して、敗血症に対するペプチド効力を評価した。中毒モデルにおいて、マウスを、非感染性の炎症促進性化合物（例えば、ＬＰＳもしくは死んだ細菌）でチャレンジした。本研究において、Ａｎｄｏｎｅｇｕｉ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００９  Ｊｕｌ；１１９（７）：１９２１−３０；およびＹｉｐｐ  ＢＧ，  ｅｔ  ａｌ，．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００２  Ｍａｙ  １；１６８（９）：４６５０−８に倣うプロトコルを使用した。
【０１７２】
簡潔には、Ｅ．  Ｃｏｌｉから単離した精製ＬＰＳを使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）においてエンドトキシン中毒症応答を開始した。マウスに、ＬＰＳエンドトキシンの致死量を含むＬＳＡＬＴバクテリオファージを注射した。
【０１７３】
上記動物が苦痛の徴候を示し始めた時に、上記動物を安楽死させることによって屠殺した。この群において処置した全てのマウス（５匹のうちの５匹）は、敗血症応答に起因して屠殺されなければならなかった。類洞における好中球接着を、コントロール−バクテリオファージ／ＬＰＳ、ＬＳＡＬＴ−バクテリオファージ／ＬＰＳ、およびＬＰＳのみの存在下で評価したところ、上記ＬＳＡＬＴ−バクテリオファージが保護効果を示した（図１７Ａ）。上記ＬＳＡＬＴ−バクテリオファージを注射したマウスは、コントロールと比較して、上記ＬＳＡＬＴ−バクテリオファージの保護効果を示した。１匹の動物を除く全ては、この投与に生き残った（５匹のうちの１匹）（図１７Ｂ）。
【０１７４】
種々の変化および改変がどのようにして、以下の特許請求の範囲において具現化されるとおり、本発明から逸脱することなく行われ得るかは、認識される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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