(57)【要約】      （修正有）【課題】広範なパラミクソウイルスに対して交差中和する抗体またはその抗原結合フラグメント、該抗体または該フラグメントを含む医薬組成物、および該抗体および該フラグメントと結合するポリペプチドの提供。【解決手段】一実施形態において、ＲＳＶおよびＭＰＶに対し高い血清抗体価を示す提供者の末梢血単核細胞より得られたＲＳＶおよびＭＰＶの両方を交差中和するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体をコードする核酸を用いて調製された該抗体および抗体フラグメント、該抗体および抗体フラグメントを含む医薬組成物、および該抗体および抗体フラグメントと結合するポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する、単離された抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ＲＳＶおよびＭＰＶの融合前のＦタンパク質に特異的に結合し、かつＲＳＶおよびＭＰＶの融合後のＦタンパク質に特異的に結合しない、単離された抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
グループＡおよびグループＢの両方のＭＰＶならびにグループＡおよびグループＢの両方のＲＳＶの感染を中和する、請求項１または２に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
ＭＰＶのサブグループＡ１、Ａ２、Ｂ１およびＢ２の感染を中和する、請求項１または２に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する、請求項２に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
抗原部位Ｉ、抗原部位ＩＩまたは抗原部位ＩＶと重複する部位においてＲＳＶのＦタンパク質と結合しない、請求項１または２に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
配列番号６４〜６９のいずれか１つで規定されるアミノ酸配列を含む、ＲＳＶ、ＭＰＶまたはＰＶＭのＦタンパク質のアミノ末端部の保存領域と結合する、請求項１または２に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
ＲＳＶ、ＭＰＶまたはＰＶＭを５０％中和するために必要な、上記抗体、またはその抗体結合フラグメントの濃度が５００ｎｇ／ｍｌ以下である、請求項１または２に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
配列番号１〜６、１９〜２３、３５、３９〜４２、および５３〜５４のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む、請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
配列番号１または配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；配列番号２、配列番号２０または配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および配列番号３、配列番号２１、配列番号４０または配列番号５３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５、配列２２または配列番号４１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号６、配列番号２３、配列番号３５、配列番号４２または配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
ＣＤＲＨ１について配列番号１、ＣＤＲＨ２について配列番号２、およびＣＤＲＨ３について配列番号３；ＣＤＲＨ１について配列番号１、ＣＤＲＨ２について配列番号３９、およびＣＤＲＨ３について配列番号４０；ＣＤＲＨ１について配列番号１９、ＣＤＲＨ２について配列番号２０、およびＣＤＲＨ３について配列番号２１；またはＣＤＲＨ１について配列番号１、ＣＤＲＨ２について配列番号３９、およびＣＤＲＨ３について配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１０もしくは１１に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
ＣＤＲＨ１について配列番号４、ＣＤＲＨ２について配列番号５、およびＣＤＲＨ３について配列番号３５；ＣＤＲＨ１について配列番号４、ＣＤＲＨ２について配列番号５、およびＣＤＲＨ３について配列番号６；ＣＤＲＨ１について配列番号４、ＣＤＲＨ２について配列番号４１、およびＣＤＲＨ３について配列番号４２；ＣＤＲＨ１について配列番号４ＣＤＲＨ２について、配列番号２２、およびＣＤＲＨ３について配列番号２３；またはＣＤＲＨ１について配列番号４、ＣＤＲＨ２について配列番号４１、およびＣＤＲＨ３について配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１０、１１もしくは１２に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
（ｉ）配列番号１、配列番号２および配列番号３でそれぞれ規定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに、配列番号４、配列番号５および配列番号３５でそれぞれ規定される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；（ｉｉ）配列番号１、配列番号２および配列番号３でそれぞれ規定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに、配列番号４、配列番号５および配列番号６でそれぞれ規定される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；（ｉｉｉ）配列番号１、配列番号３９および配列番号４０でそれぞれ規定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに、配列番号４、配列番号４１および配列番号４２でそれぞれ規定される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；（ｉｖ）配列番号１、配列番号３９および配列番号４０でそれぞれ規定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに、配列番号４、配列番号５および配列番号６でそれぞれ規定される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；（ｖ）配列番号１、配列番号２および配列番号３でそれぞれ規定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに、配列番号４、配列番号４１および配列番号４２でそれぞれ規定される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；（ｖｉ）配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１でそれぞれ規定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに、配列番号４、配列番号２２および配列番号２３でそれぞれ規定される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；（ｖｉｉ）配列番号１、配列番号３９および配列番号５３でそれぞれ規定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに、配列番号４、配列番号４１および配列番号５４でそれぞれ規定される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；（ｖｉｉｉ）配列番号１、配列番号３９および配列番号５３でそれぞれ規定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに、配列番号４、配列番２２および配列番号２３でそれぞれ規定される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；または（ｉｘ）配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１でそれぞれ規定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに、配列番号４、配列番号４１および配列番号５４でそれぞれ規定される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する、単離された抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
配列番号１３、１７、２９、３３、４９および５１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
配列番号１４、３０、３７、５０または６０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
上記抗体が、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する抗体、またはＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和するその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
上記抗体が、ＨＭＢ３２１０変異体３、ＨＭＢ３２１０変異体１、ＨＭＢ３２１０変異体２、ＨＭＢ３２１０変異体４、ＨＭＢ３２１０変異体５、ＨＭＢ３２１０変異体６、ＨＭＢ２４３０変異体１、ＨＭＢ２４３０変異体２、ＨＭＢ２４３０変異体３、ＨＭＢ２４３０変異体４、もしくはＨＭＢ２４３０変異体５である請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
上記抗体が、ヒト抗体、モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、精製された抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖである請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体と同一のエピトープに結合する、ＲＳＶおよびＭＰＶの両方の感染を中和する、抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
ＲＳＶもしくはＭＰＶまたはＲＳＶおよびＭＰＶの両方の感染の治療または弱毒化のための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸分子。
【請求項２３】
上記ポリヌクレオチド配列は、配列番号７〜１２、１５、１６、１８、２４〜２８、３１〜３２、３４、３６、３８、４３〜４８、５１〜５２、５５〜５８および６１〜６２のいずれか１つの核酸配列と少なくとも７５％の同一性を有する、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項２５】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントを発現している、または請求項２４に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項２６】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと結合するエピトープを含む、単離または精製された免疫原性ポリペプチド。
【請求項２７】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項２２もしくは２３に記載の核酸、請求項２４に記載のベクター、請求項２５に記載の細胞、または請求項２６に記載の免疫原性ポリペプチド、および薬学的に許容可能な希釈剤または担体を含む、医薬組成物。
【請求項２８】
第１の抗体またはその抗原結合フラグメント、および第２の抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、当該第１の抗体は請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体であり、当該第２の抗体はＲＳＶもしくはＭＰＶまたはＲＳＶおよびＭＰＶの両方の感染を中和する、医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項２２もしくは２３に記載の核酸、請求項２４に記載のベクター、請求項２５に記載の細胞、請求項２６に記載の免疫原性ポリペプチド、または請求項２７もしくは２８に記載の医薬組成物の、（ｉ）ＲＳＶもしくはＭＰＶまたはＲＳＶおよびＭＰＶの両方の感染の治療もしくは弱毒化のための薬物の製造における、（ｉｉ）ワクチンにおける、または（ｉｉｉ）ＲＳＶもしくはＭＰＶ感染の診断における、使用。
【請求項３０】
抗ＲＳＶまたは抗ＭＰＶワクチンの質を、当該ワクチンの抗原が正しいコンフォメーションにおいて特定のエピトープを含むことを確認することによってモニタリングするための、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの、使用。
【請求項３１】
治療上の有効量の請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを、それを必要とする被験体に対して投与することを含む、ＲＳＶもしくはＭＰＶ感染を低減する、またはＲＳＶもしくはＭＰＶ感染のリスクを低下させる方法。
【請求項３２】
（ｉ）治療における使用、（ｉｉ）ＲＳＶもしくはＭＰＶまたはＲＳＶおよびＭＰＶの両方の感染の治療もしくは弱毒化のための薬物の製造における使用、（ｉｉｉ）ワクチンとしての使用、または（ｉｖ）ＲＳＶもしくはＭＰＶまたはＲＳＶおよびＭＰＶの両方の感染を中和することができるリガンドのスクリーニングにおける使用のための、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと特異的に結合するエピトープを含む、単離または精製された免疫原性ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、本明細書に記載されているように、それらの全文において、それらの開示物が参照によって援用されている、２０１２年３月２０日に出願された米国仮出願第６１／６１３，１９７号および２０１２年６月４日に出願された米国仮出願第６１／６５５，３１０号の利益を主張する。
【０００２】
マウスの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）およびマウスのメタニューモウイルス（ＭＰＶ）およびマウスの肺炎ウイルスは、標的集団を共有し、新生児および免疫無防備状態の患者において主要な健康問題を示す、パラミクソウイルスのファミリーに属する一般的な風邪ウイルスである。
【０００３】
ＲＳＶは、世界中で幼児および成人における急性の呼吸器疾患の主要要因である。ＲＳＶ感染を有する小児の０．５〜３．２％は入院治療を必要とし（hompson, W.W. et al., 2003, JAMA: The Journal of the American Medical Association 289:179-186）、小児の５％〜１０％は、小児期において後に喘鳴および喘息様の症状の素因となるという事実またはそのように信じられている、長期の重篤な感染を有する。ＲＳＶに対する免疫性は短寿命で出現するため、再感染は頻発する（Ogra, 2003, Paediatric Respiratory Reviews 5 Suppl A:S119-126）。
【０００４】
ヒトＭＰＶは２００１年に最初に単離され、今では幼児および成人の急性呼吸器疾患の２番目に主要な要因であると認識されている；ヒトＭＶＰは、２歳までの幼児の５０％以上および５歳までのほとんど全ての小児に感染すると見積もられている。ＭＰＶは入院している幼児における呼吸器疾患のおよそ５〜１５％を占めている（Alto, 2004, The Journal of the American Board of Family Practice / American Board of Family Practice17:466-469; Williams et al., 2004, N Engl J Med 350:443-450）。ＭＰＶの感染は、未熟児の慢性の肺疾患、鬱血性心不全および免疫不全のリスクにさらされている幼児の疾患の主要な要点である（Martino et al., 2005, Biology of Blood and Marrow Transplantation: Journal of the American Society for Blood and Marrow Transplantation 11:781-796）。
【０００５】
ＭＰＶとＲＳＶとの同時感染は、一般的な罹患率および、重複した冬の感染症であり得る。相乗作用的な病理がこれらの２つのウイルス間で生じるかどうかは明らかではないが、特に重篤な呼吸器疾患を導く増悪がＭＰＶおよびＲＳＶの同時感染した数人の小児において観察された（Greensill, 2003, Emerging Infectious Diseases 9:372）。
【０００６】
ニューモウイルスサブファミリーのニューモウイルス族に属するＲＳＶ、およびニューモウイルスサブファミリーのメタニューモウイルス族に属するＮＰＶは、ＮＰＶはＲＳＶにおいて見いだされる非構造遺伝子の、ＮＳ１およびＮＳ２を欠損しているが、それらの遺伝学的な構造においていくらかの類似性を有しており、ＲＳＶおよびＭＰＶのエンベロープは３つのウイルス的にコードされた膜貫通表面糖タンパク質：主要な接着タンパク質Ｇ、融合タンパク質Ｆおよび疎水性のＳＨ小タンパク質を含んでいる。ＲＳＶおよびＭＰＶのエンベロープは機能的に類似しているタンパク質を含んでいるが、ＲＳＶとＭＰＶとは３３％のアミノ酸同一性しか共有していないということに、注意することが重要である。さらに、ＲＳＶまたはＭＰＶのいずれに対する抗血清も、両方のウイルスを交差中和せず（Wyde et al., 2003, Antiviral Research 60:51-59）、今のところＲＳＶトＭＰＶの両方を交差中和することができるモノクローナル抗体は単離されていない。
【０００７】
ＲＳＶおよびＭＰＶのＦ糖タンパク質は、ウイルス粒子エンベロープと宿主細胞の原形質膜との融合によるウイルスの侵入に関する。感染後期において、細胞表面に発現したＦタンパク質は、隣接する細胞との融合を仲介して、合胞体を形成する（Collins et al., 1984 PNAS 81:7683-7687）。両方の場合において、タンパク質分解性の切断によって形成され、アミノ酸の疎水性の伸長を含んでいる、ＦサブユニットのＮ末端は、融合ペプチドと呼ばれ、標的の膜へ直接挿入し、融合を開始する。標的細胞に結合およびその後の活性化後、準安定のＦタンパク質は、標的細胞膜への融合タンパク質の挿入を生じさせる一連の構造的な再構成を経て、次にウイルスの膜と細胞膜とが並置するように形成する安定なヘリックス束を形成する。これらの構造変化は、安定な融合後Ｆタンパク質の形成を導く。
【０００８】
ＲＳＶまたはＭＰＶの感染に対するワクチンは、現在利用可能ではない。１９６０年代に試験された、ホルマリン不活性化ＲＳＶワクチンおよびアラムアジュバントのＲＳＶワクチン（ＦＩ−ＲＳＶ）は、高い入院率および死亡率をも生じる、高熱および重傷な肺炎を導く天然のＲＳＶ感染を伴う、進行した疾患に対して幼児をかかりやすくすることが見出された（Fulginiti et al., 1969, American Journal of Epidemiology 89:435-448; Kapikian et al., 1969, American Journal of Epidemiology 89:405-421; Kim et al., 1969, American Journal of Epidemiology 89:422-434）。同様に、ホルマリン不活性化ＭＰＶワクチンは、若いカニクイザルにおいて免疫仲介性の亢進した疾患を示した（de Swart et al., 2007, Vaccine 25:8518-8528）。さらに、リバビリンなどの抗ウイルス療法は、ＲＳＶまたはＭＰＶの感染において有効であることが証明されなかった。
【０００９】
ＲＳＶウイルスに対する防御における血清抗体の役割に対する証拠は、疫学的研究ならびに動物研究から明らかになった。幼児において、母系伝達性抗原の力価は、重篤な疾患への耐性に関連し（Glezen et al., 1981, The Journal of Pediatrics 98:708-715）、成人において、より低い呼吸器関連性の罹患率および重症度は、高レベルの血清ＲＳＶ中和抗体の存在下で低減される（McIntosh et al., 1978, The Journal of Infectious Diseases 138:24-32）。モノクローナル抗体であるパリビズマブ（Synagis）は、未熟新生児においてＲＳＶ感染の予防のために登録されている。しかし、パリビズマブは、ＲＳＶ感染を予防することにおいて、常に効果的ではなく、治療的に有効ではない。さらに、パリビズマブの存在下で、肺の長期化したＲＳＶの複製は、動物において、耐性のウイルスの株の出現を伴う（Zhao and Sullender, 2005, Journal of Virology 79:3962-3968）。現在、ＭＰＶ感染の処置又は予防のためのモノクローナル抗体は存在しない。
【００１０】
ＲＳＶ感染の最も重症な形態のための、良好に作用する動物モデルの欠如は、ＲＳＶとＭＰＶとが宿主の制限されたニューモウイルスの病原体であるいう事実に関係している。ＲＳＶおよびＭＰＶの感染の治療のための新規な薬剤の開発は、全ての症状とヒトの疾患の重症度を反復することが可能な動物モデルの欠如によって妨害されている。実際、ＲＳＶおよびＭＶＰは天然のマウスの病原体ではなく、限定された最小限度に徴候のみを誘導し、強力な、非生理学的なウイルスの接種への反応における一次感染を迅速に食い止めた。マウスの肺炎ウイルス（ＰＶＭ）は、ヒトおよびウシのＲＳＶの、いくつかのファミリー、サブファミリーおよび属（Pneumovirus）に属する、天然の齧歯目ニューモウイルスの病原体である。ＰＶＭのＦタンパク質は、ヒトＲＳＶのＦタンパク質と４０％のアミノ酸同一性しか共有していないが、ＲＳＶ中に存在しているがＰＶＭ中に存在していない、Ｍ２−Ｌの重複の除外を伴う同一の遺伝学的な組織を有している。天然のマウスの病原体のＰＶＭによる感染は、ヒトの幼児において生じるような、もっとも重症な形態のＲＳＶの徴候および症状の多くを再現する。ＰＶＭ感染は、肺不全および死を導く強力な炎症反応を伴う迅速なウイルスの複製によって特徴づけられる（Rosemberg and Domachowske, 2008, Immunology Letter 118:6-12）。したがって、マウスにおけるＰＶＭの感染は、ヒトのＲＳＶおよびＭＰＶの重篤な感染の、もっとも関連した動物モデルであると考えられる。
【００１１】
ＭＰＶ感染の予防的な処置およびＲＳＶおよびＭＰＶ感染に対するワクチンの欠如、並びにパリビズマブの治療無効果は、これらの顕著なヒトの病原体に対する新規な予防剤および治療剤の必要性を強調する。高い罹患率および同時感染の可能性を考えれば、ＲＳＶおよびＭＰＶの感染の両方を予防ならびに処置または弱毒化することが可能な単一の薬剤を有すること、および当該モデルにおいて、当該薬剤を試験するための、動物モデルを有することが非常に望ましい。したがって、広範なパラミクソウイルス（例えば、少なくともＲＳＶおよびＭＰＶ、並びに好ましくはＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭ）に対する防御をする、広範に交差中和する抗体の必要性がある。
〔発明の概要〕
本発明は、部分的には、本発明の抗体が結合するポリペプチドに加え、ＲＳＶ、ＭＰＶ、およびＰＶＭ感染を中和する、広範に中和する抗体の発見に基づく。それゆえ、本発明のある局面において、本発明は単離された、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を交差中和する抗体、例えばモノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒトモノクローナル抗体、変異抗体、または抗原結合フラグメントを含む。
【００１２】
本発明の一実施形態において、本発明はＲＳＶおよびＭＰＶの両方を中和する単離された抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明の他の実施形態において、本発明はＲＳＶ，ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する単離された抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む。
【００１３】
本発明の他の実施形態において、本発明はＲＳＶの融合前Ｆタンパク質と特異的に結合し、ＲＳＶの融合後Ｆタンパク質とは結合しない単離された抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明のさらなる実施形態において、本発明はＲＳＶおよびＭＰＶの融合前Ｆタンパク質と特異的に結合し、ＲＳＶおよびＭＰＶの融合後Ｆタンパク質とは結合しない単離された抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明のさらなる実施例において、本発明はＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの融合前Ｆタンパク質と特異的に結合し、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの融合後Ｆタンパク質とは結合しない単離された抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む。
【００１４】
本発明の他の実施形態において、本発明は少なくとも１つの、配列番号１〜６、１９〜２３、３５、３９〜４２、または５３〜５４のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭを中和する抗体を含む。
【００１５】
本発明の他の実施形態において、本発明は、抗体、またはその抗原結合フラグメントを含んでおり、当該抗体は、配列番号１または配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号２、配列番号２０または配列番号３９のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ２；および配列番号３、配列番号２１、配列番号４０または配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む。本発明の他の実施形態において、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５、配列番号２２または配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号６、配列番号２３、配列番号３５、配列番号４２または配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体、またはその抗原結合フラグメントを含んでおり、当該抗体は、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭを中和する。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態において、本発明は、（ｉ）それぞれ配列番号１、配列番号２、および配列番号３で示される、重鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号４、配列番号５および配列番号３５で示される軽鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；（ｉｉ）それぞれ配列番号１、配列番号２、および配列番号３で示される、重鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号４、配列番号５、および配列番号６で示される、軽鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１、配列番号３９および配列番号４０で示される、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号４、配列番号４１および配列番号４２で示される、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；（ｉｖ）それぞれ配列番号１、配列番号３９および配列番号４０で示される、重鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号４、配列番号５および配列番号６で示される、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；（ｖ）それぞれ配列番号１、配列番号２、および配列番号３で示される、重鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号４、４１および４２で示される、軽鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、抗体、またはその抗原結合フラグメントを含んでおり、当該抗体は、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態において、本発明は、（ｉ）それぞれ配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１で示される、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号４、配列番号２２および配列番号２３で示される、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；（ｉｉ）それぞれ配列番号１、配列番号３９および配列番号５３で示される、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号４、配列番号２２および配列番号２３で示される、軽鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；または（ｉｖ）それぞれ配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１で示される、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号４、配列番号４１および配列番号５４で示される、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、抗体、またはその抗原結合フラグメントを含んでおり、当該抗体は、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態において、本発明は、抗体、またはその抗原結合フラグメントを含んでおり、当該抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と；または配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と；または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と；または配列番号４９のアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変領域と、配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と；または配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と；または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５０のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖可変領域とを含み、当該抗体は、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態において、本発明は、重鎖可変領域が配列番号２９のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号３０のアミノ酸配列を含む；または重鎖可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号３０のアミノ酸配列を含む；または重鎖可変領域が配列番号５９のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号６０のアミノ酸配列を含む；または重鎖可変領域が配列番号５９のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号３０のアミノ酸配列を含む；重鎖可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号６０のアミノ酸配列を含む、抗体、またはその抗原結合フラグメントを含んでおり、当該抗体は、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する。
【００２０】
本発明はさらに、ＨＭＢ３２１０（もしくは３２１０）またはＨＭＢ２４３０（もしくは２４３０）と本明細書で記載されている抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。他の実施形態において、本発明は、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する抗体またはその抗体結合フラグメントを含んでおり、当該抗体またはそのフラグメントは、ＨＭＢ３２１０またはＨＭＢ２４３０を生産する不死化Ｂ細胞によって発現される。
【００２１】
他の局面において、本発明は、本発明の抗体および抗体のフラグメントをコードしているポリヌクレオチドを含む核酸分子を含む。さらなるほかの局面において、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターを含んでいる。また、本発明は本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを発現する細胞を含む。さらなる局面において、本発明は、単離または精製された、本発明の抗体または抗原結合フラグメントと結合するエピトープを含む免疫原性ポリペプチドを含む。
【００２２】
本発明はさらに、本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、本発明の核酸分子、本発明の核酸分子を含むベクター、本発明の抗体もしくは抗体フラグメントを発現する細胞、または本発明の免疫原性ポリペプチド、および薬学的に許容可能な賦形剤または担体を含む医薬組成物を含む。また、本発明は、第１の抗体またはその抗原結合フラグメント、および第２の抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、第１の抗体が本発明の抗体であり、第２の抗体がＲＳＶもしくはＭＰＶの感染、またはＲＳＶおよびＭＰＶの両方の感染、またはＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの３つ全ての感染を中和する抗体またはその抗原結合フラグメントである医薬組成物を含む。
【００２３】
（ｉ）ＲＳＶまたはＭＰＶまたはＲＳＶおよびＭＰＶの両方の同時感染の処置、または弱毒化のための医薬の製造における、（ｉｉ）ワクチンにおける、または（ｉｉｉ）ＲＳＶおよび／またはＭＰＶウイルス感染の診断における、本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、本発明の核酸分子、本発明の核酸分子を含むベクター、本発明の抗体もしくは抗体フラグメントを発現する細胞、本発明の抗体もしくは抗体フラグメントと結合するエピトープを含む、単離もしくは精製された免疫原性ポリペプチド、または本発明の医薬組成物の使用もまた、本発明の範囲内であることが意図される。加えて、上記ワクチンの抗原が、特定のエピトープを正しい立体構造で含んでいることを確認することによって、ＲＳＶまたはＭＰＶ、またはＲＳＶおよびＭＰＶの両方に対するワクチンの質をモニタリングするための本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントの使用もまた、本発明の範囲内であることが意図される。
【００２４】
他の観点から見ると、本発明は、治療有効量の、本発明の抗体または抗原結合抗体フラグメントをそれを必要とする被検体に投与することを含んでいる、ＲＳＶおよびＭＰＶ感染の治療および弱毒化、またはＲＳＶおよびＭＰＶ感染のリスクを低下させる方法を含む。
【００２５】
さらなる局面において、本発明は、（ｉ）治療において、（ｉｉ）ＲＳＶに感染またはＭＰＶの幹線またはＲＳＶおよびＭＰＶ両方の感染を治療もしくは弱毒化するための医薬の製造において、（ｉｉｉ）ワクチンとして、または（ｉｖ）ＲＳＶの感染またはＭＰＶの感染またはＲＳＶおよびＭＰＶ両方の感染を中和することが可能なリガンドのスクリーニングにおいて使用するための、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントと特異的に結合するポリペプチドを含む。
〔図面の簡単な説明〕
図１は、インビトロでのＲＳＶまたはＭＰＶウイルス感染を中和する能力についての、７人の提供者（Ｄｏｎ．１〜７）から得られたＥＢＶ不死化記憶Ｂ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の、スクリーニング結果を示す。
【００２６】
図２は、モノクローナル抗体であるＨＭＢ２４３０、ＨＭＢ３２１０、２３４ｍＡｂおよびパリビズマブによる、ＲＳＶおよびＭＰＶの中和の結果を示す。
【００２７】
図３は、ＥＬＩＳＡにより測定された、モノクローナル抗体である、モタビズマブ、２３４ｍＡｂ、ＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０による、ＲＳＶのＦタンパク質または破傷風毒素タンパク質との結合を示す。
【００２８】
図４は、大過剰の表示された標識されていない抗体の存在下でのＲＳＶ感染Ｈｅｐ−２細胞への標識されたモノクローナル抗体の、結合を示す。
【００２９】
図５は、ウェスタンブロット解析によって測定された、還元条件または非還元条件下での、ＲＳＶ−Ｈｅｐ−２感染細胞の溶解物から得たＲＳＶ  Ｆタンパク質への、モノクローナル抗体であるＨＭＢ２４３０、ＨＭＢ３２１０、２３４ｍＡｂ、およびモタビズマブの結合を示す。
【００３０】
図６は、ウェスタンブロット解析によって測定された、還元条件または非還元条件下での、ＭＰＶ−ＬＬＣ−ＭＫ２感染細胞のライセートから得られたＭＰＶ  Ｆタンパク質への、モノクローナル抗体であるＨＭＢ３２１０および２３４ｍＡｂの結合を示す。
【００３１】
図７は、モノクローナル抗体であるＨＭＢ２４３０、ＨＭＢ３２１０、２３４ｍＡｂおよびパリビズマブによる、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株およびＰＺ−ＭＡＲＭ６単離物の、中和の結果を示す。
【００３２】
図８は、Ｎ−グリコシダーゼであるＰＮＧ−アーゼＦのＨＭＢ３２１０ｖ２の、存在下（＋）または非存在下（−）でのインキュベートを伴う、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる解析結果を示す。黒のボックスで強調されているのは、グリコシル化されたＨＭＢ３２１０軽鎖の小断片である。
【００３３】
図９は、モノクローナル抗体であるＨＭＢ３２１０ｖ２およびＨＭＢ３２１０ｖ３による、ＭＰＶ  Ｉ−ＰＶ  ０３／０１−６６２１およびＲＳＶ  Ａ２の中和の結果を示す。
【００３４】
図１０は、モノクローナル抗体である、ＨＭＢ３２１０ｖ２およびＨＭＢ３２１０ｖ３による、ＭＰＶおよびＲＳＶ株のパネルの中和の結果を示す。
【００３５】
図１１は、ＨＭＢ３２１０およびＨＭＢ２４３０モノクローナル抗体の生殖細胞系変異体による、ＭＰＶ  Ｉ−ＰＶ  ０３／０１−６６２１およびＲＳＶ  Ａ２の中和の結果を示す。
【００３６】
図１２は、ＨＭＢ３２１０またはパリビズマブと共にインキュベートあり、またはなしのＲＳＶ  Ｆ融合後組み換えタンパク質の、サイズ排除クロマトグラフィー解析の結果を示す。
【００３７】
図１３は、ＨＭＢ３２１０またはパリビズマブと共にインキュベートありまたはなしのＲＳＶ  Ｆ融合前組み換えタンパク質の、サイズ除外クロマトグラフィー解析の結果を示す。
【００３８】
図１４は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質および融合後ＲＳＶ  Ｆタンパク質へのＨＭＢ３２１０またはパリビズマブ（ＰＶＺ）の結合を示す。
【００３９】
図１５は、ヒトモノクローナル抗体であるＨＭＢ３２１０およびＤ２５による、ウイルスの中和およびウイルスの拡散の阻害を示す。
【００４０】
図１６は、ＲＳＶまたはＭＰＶ感染におけるＨＭＢ３２１０ｖ３およびパリビズマブの予防有効性を示す。
【００４１】
図１７は、ＲＳＶに感染したＳＴＡＴ１欠乏マウスにおける、ＨＭＢ３２１０の治療有効性を示す。
【００４２】
図１８は、致死量のＰＶＭに感染したマウスにおけるＨＭＢ３２１０の予防有効性および治療有効性を示す。
【００４３】
図１９は、致死的なＰＶＭ感染後、３、４または５日における、ＨＭＢ３２１０ｖ３で処置されたマウスにおける、肺のウイルス力価の増加における阻害を示す。
【００４４】
図２０は、致死量のＰＶＭに感染したマウスにおける、野生型ＦｃまたはＬＡＬＡ突然変異を有するＨＭＢ３２１０ｖ３変異体の、予防有効性および治療有効性を示す。
【００４５】
図２１は、パラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）と比較した、ＲＳＶ、ＢＲＳＶ、ＰＶＭおよびＭＰＶの配列における、ＨＭＢ３２１０によって認識されるＹＬＳＡＬＲペプチドが、高い保存性を強調するアラインメントを示す。
【００４６】
図２２は、ＹＬＳＡＬＲペプチドおよび隣接するパリビズマブ（ＰＶＺ）サイトの位置を示す、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質のモデル、ならびに、融合前および融合後のＲＳＶ
Ｆタンパク質の立体構造における、ＰＶＺおよびＨＭＢ３２１０ｖ３サイトの再構成を示す。
【００４７】
図２３は、３６４ＲＳＶ、１６２ＭＰＶ、８ＢＲＳＶおよび５ＰＶＭ株における、ＨＭＢ３２１０コアエピトープの高度な保存を示す。
【００４８】
図２４は、ＨＭＢ３２１０のさまざまな重鎖および軽鎖の変異体に対する配列を示す。
【００４９】
図２５は、ＨＭＢ２４３０のさまざまな重鎖および軽鎖の変異体に対する配列を示す。〔発明を実施するための形態〕
本発明は、部分的には、ＲＳＶおよびＭＰＶの両方、またはＲＳＶと、ＭＰＶとＰＶＭとを共に交差中和する抗体ならびに本発明の抗体が結合するエピトープの発見および単離に基づく。前記抗体は、１種類のみまたは数種類の抗体が、ＲＳＶおよびＭＰＶの両方、またはＲＳＶとＭＰＶとＰＶＭとを中和するために必要とされるため、好ましいものである。さらに、交差中和する抗体は、ＲＳＶおよび／またはＭＰＶ感染の処置のための、抗体を含む医薬の生産コストを低減するため、高い力価で製造される。さらに、当該抗体によって認識されるエピトープは、ＲＳＶおよびＭＰＶの両方に対する幅広い防御を誘導可能なワクチンの一部であり得る。
【００５０】
本発明の抗体は、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭを交差中和、本発明のある実施形態において、例えば疾患の処置、ワクチンの開発等に関するものであるが、本開示は、ＲＳＶおよびＭＰＶのみを参照している。これらのウイルスはヒト病原体であるが、ＰＶＭはマウス病原体であるためである。本明細書で使用されるとき、“ＲＳＶおよびＭＰＶの両方”および“ＲＳＶと、ＭＰＶとＰＶＭ”という用語は文脈に基づき、相互交換可能に使用される。
【００５１】
従って、ある局面において、本発明は、ＲＳＶおよびＭＰＶの両方またはＲＳＶとＭＰＶとＰＶＭとを中和する、単離された抗体、抗体の変異体、およびその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、ＲＳＶはヒトＲＳＶである。他の実施形態において、ＲＳＶはウシＲＳＶである。本発明の抗体はヒトＲＳＶ（ｈＲＳＶ）およびウシＲＳＶ（ｂＲＳＶ）の両方を中和する。他の実施形態において、ＭＰＶはヒトＭＰＶである。
【００５２】
ある実施形態において、本発明は、グループＡおよびグループＢの両方のＲＳＶの感染を中和する、単離された抗体、もしくはその抗原結合フラグメントを提供する。他の実施形態において、本発明は、グループＡおよびグループＢの両方のＭＰＶの感染を中和する、単離された抗体、もしくはその抗原結合フラグメントを提供する。さらなる実施形態において、本発明は、グループＡおよびグループＢの両方のＲＳＶ感染、並びにグループＡおよびグループＢの両方のＭＰＶ感染を中和する、単離された抗体、もしくはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００５３】
以前に述べたように、ＲＳＶ、ＭＰＶ、およびＰＶＭは、遺伝子構造にある類似性を有する。Ｇタンパク質およびＦタンパク質のアミノ酸配列は、ＲＳＶおよびＭＰＶの両方においてＡグループおよびＢグループに分類される；ＭＰＶはさらに、４つのサブグループ：Ａ１、Ａ２、Ｂ１およびＢ２に分類される：ＰＶＭはグループまたはサブグループに分類されない。ＲＳＶ、ＭＰＶまたはＰＶＭのＦタンパク質は、Ｎ末端開裂シグナルペプチドおよびＣ末端付近のメンブレンアンカーを有する、タイプＩ膜貫通型表面タンパク質である。ＲＳＶおよびＭＰＶのＦタンパク質は、ホモ三量体に会合し、開裂によって活性化する、不活性のＦ０前駆体として合成される。Ｆタンパク質は３つのドメイン（ＤＩからＤＩＩＩ）、融合タンパク質（ＦＰ）および３つの７アミノ酸繰り返し領域（ＨＲ−Ａ、ＨＲ−ＢおよびＨＲ−Ｃ）により形成される。ＲＳＶおよびＭＰＶのＦ糖タンパク質は、ウイルス粒子のエンベロープと宿主細胞の原形質膜との融合によるウイルスの侵入を誘導する。両方の場合において、タンパク質分解性の開裂によって作られ、融合ペプチドを含むＦサブユニットのＮ末端は、対象の膜に直接挿入され、融合を開始する。標的細胞への結合、および続く活性化の後、準安定化した融合前Ｆタンパク質は、一連の構造的な再構成を経て、標的の細胞膜への融合タンパク質の挿入が生じ、その後、ウイルスおよび標的細胞の膜を並置するように安定化したヘリックス束が形成される。これらの構造変化は、安定した融合後Ｆタンパク質形成を導く。感染の後期において、感染した細胞の細胞表面に発現したＦタンパク質は、巨大な合胞体を形成し、隣接した感染していない細胞との融合を仲介することができる。
【００５４】
パリビズマブおよびモタビズマブのエピトープは、融合後ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗原サイトＩＩ（サイトＡとも呼ばれる）に位置付けられ、残基２５５−２７５により形成される。ＭＡＢ１９および１０１Ｆは、残基４２２−４３８で形成される、融合後のＲＳＶ  Ｆタンパク質の抗原サイトＩＶ（サイトＣとも呼ばれる）を標的としている。ＭＡＢ１９は臨床試験において試験されているが、有意な有効性を示していない(Johnson et al.， 1999, The Journal of Infectious Diseases 180:35-40; Meissner et al., 1999, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43:1183-1188)。
【００５５】
有効であるためには、抗体は、ウイルスの侵入を遮断するのに適切な形態である融合前Ｆタンパク質を認識するべきであり、好ましくは、誘引物として作用し得豊富に存在し、それゆえ抗体を消費し、有効性を低減させる、融合後Ｆタンパク質を認識しない。現在までに、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質を認識するがＲＳＶ融合後Ｆタンパク質を認識しない抗体は単離されていない。
【００５６】
本発明のある実施形態において、本発明は、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質と特異的に結合し、ＲＳＶ融合後Ｆタンパク質とは結合しない単離された抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む。他の実施形態において、本発明は、ＲＳＶおよびＭＰＶの融合前Ｆタンパク質と特異的に結合し、ＲＳＶおよびＭＰＶの融合後Ｆタンパク質とは結合しない単離された抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む。他の実施形態において、本発明は、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの融合前Ｆタンパク質と特異的に結合し、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの融合後Ｆタンパク質とは結合しない抗体を提供する。
【００５７】
本発明はＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭのＦタンパク質と結合する抗体を提供する。ＲＳＶ、またはＭＰＶおよびＰＶＭの間には、それぞれおよそ３３％から４０％のアミノ酸配列同一性があるに過ぎないという事実にもかかわらず、本発明の抗体はＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭのＦタンパク質に存在する共通のエピトープを認識する。このエピトープは従来公知の抗体（例えばパリビズマブ、モタビズマブ、ｍＡｂ  １０１Ｆ等）により認識されるものとは異なる。本発明の抗体は、例えば抗原サイトＩＩ（モタビズマブおよびパリビズマブにより認識される）にも、抗原サイトＩＶ（ｍＡｂ  １０１Ｆにより認識される）にも、抗原サイトＩ（ｍＡｂ  １３１−Ａと結合する）にも結合しない。本発明の抗体により認識されるＲＳＶ  Ｆタンパク質のエピトープもまた、ＲＳＶにのみ特異的な抗体であるｍＡｂ  Ｄ２５により認識されるものとは異なる。加えて、ＭＰＶ  Ｆタンパク質における、本発明の抗体により認識されるエピトープは、ｍＡｂ  ２３４（ＲＳＶ  Ｆタンパク質における抗原サイトＩＩに相当する、ＭＰＶ  Ｆタンパク質のエピトープを認識する）により認識されるものとは異なる。一般に、本発明の抗体は高次構造エピトープを認識する。ある実施形態において、高次構造エピトープは、非還元状態においてのみ存在する。他の実施形態において、高次構造はＦタンパク質のアミノ酸残基のジスルフィド結合の存在に依存する。
【００５８】
本明細書において示されるように、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは数種類の異なる株のＲＳＶおよびＭＰＶの両方と特異的に結合し、ＲＳＶおよびＭＰＶの両方を中和する。さらに、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、グループＡおよびグループＢの両方のＲＳＶ、並びに対応する全てのＭＰＶサブグループ（すなわちＡ１、Ａ２、Ｂ１およびＢ２）を含む、グループＡおよびグループＢ両方のＭＰＶと特異的に結合し、交差中和する。
【００５９】
本発明の抗体および抗原結合フラグメントは、高い中和能力を有する。ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの５０％中和に要求される本発明の抗体の濃度は、例えば約５００ｎｇ／ｍＬ以下である。ある実施形態において、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの５０％中和に要求される本発明の抗体の濃度は、約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０または５０ｎｇ／ｍＬ以下である。これはＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの５０％中和に、低濃度の抗体しか要求されないということを意味する。特異性および有効性は当業者に既知の標準的なアッセイにより測定できる。
【００６０】
本発明の抗体は、ヒト抗体、モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、組み換え抗体、または精製された抗体であり得る。本発明はまた、本発明の抗体のフラグメント、特に、抗体の抗原結合活性を保っているフラグメントを提供する。当該フラグメントは、１本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖが挙げられるが、それらに限定されない。請求項を含む明細書のある個所において、抗原結合フラグメント、抗体フラグメント、抗体の変異体変異体および／または抗体の派生物について明確に言及できているが、“抗体”または“本発明の抗体”という用語はすべての分野の抗体、すなわち明確に抗原結合フラグメント、抗体フラグメント、変異体抗体の変異体および／または抗体の派生物を含むことが理解される。
【００６１】
それぞれ重鎖が３つのＣＤＲを含み、軽鎖が３つのＣＤＲを含む、本発明の数種類の抗体の重鎖および軽鎖の配列が決定された。ＣＤＲアミノ酸の位置はＩＭＧＴナンバリングシステムにより定義された。本発明の抗体のＣＤＲ、重鎖、軽鎖の配列並びにＣＤＲ、重鎖、軽鎖をコードしている核酸分子の配列は配列リストにおいて開示されている。抗体の重鎖のＣＤＲはそれぞれＣＤＲＨ１（またはＨＣＤＲ１）、ＣＤＲＨ２（またはＨＣＤＲ２）およびＣＤＲＨ３（またはＨＣＤＲ３）と呼ばれる。同様に、抗体の軽鎖のＣＤＲはそれぞれＣＤＲＬ１（またはＬＣＤＲ１）、ＣＤＲＬ２（またはＬＣＤＲ２）およびＣＤＲＬ３（またはＬＣＤＲ３）と呼ばれる。表１は本発明の例示的な抗体の、重鎖および軽鎖の６つのＣＤＲのアミノ酸の配列番号を示す。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
ある実施形態において、本発明の抗体または抗体フラグメントは、配列番号１−６、１９−２３、３５、３９−４２または５３−５４のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲを、少なくとも１つ有する。抗体３２１０および抗体２４３０の変異体のＣＤＲは、それぞれ図２４および図２５に規定される（ＣＤＲは太字で強調されている）。
【００６４】
他の実施形態において、本発明は、３２１０変異体１、３２１０変異体２、３２１０変異体３、３２１０変異体４、３２１０変異体５、３２１０変異体６、２４３０変異体１、２４３０変異体２、２４３０変異体３、２４３０変異体４または２４３０変異体５に由来する、１つ以上（すなわち１、２または３個すべて）の重鎖ＣＤＲを含む抗体または抗原結合フラグメントを提供する。
【００６５】
さらなる実施形態において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１もしくは配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列番号２、配列番号２０もしくは配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、または配列番号３、配列番号２１、配列番号４０もしくは配列番号５３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む。特定の実施形態において、本明細書に規定される抗体または抗体フラグメントは、（ｉ）ＣＤＲＨ１に対する配列番号１のアミノ酸配列、ＣＤＲＨ２に対する配列番号２のアミノ酸配列および、ＣＤＲＨ３に対する配列番号３のアミノ酸配列、（ｉｉ）ＣＤＲＨ３に含む配列番号１のアミノ酸配列、ＣＤＲＨ２に対する配列番号３９のアミノ酸配列、ＣＤＲＨ３に対する配列番号４０のアミノ酸配列、（ｉｉｉ）ＣＤＲＨ１に対する配列番号１９のアミノ酸配列、ＣＤＲＨ２に対する配列番号２０のアミノ酸配列およびＣＤＲＨ３に対する配列番号２１のアミノ酸配列または（ｉｖ）ＣＤＲＨ１に対する配列番号１のアミノ酸配列、ＣＤＲＨ２に対する配列番号３９のアミノ酸配列、およびＣＤＲＨ３に対する配列番号５３のアミノ酸配列を含んでいる、重鎖を含む。
【００６６】
また、提供されているのは、３２１０変異体１、３２１０変異体２、３２１０変異体３、３２１０変異体４、３２１０変異体５、３２１０変異体６、２４３０変異体１、２４３０変異体２、２４３０変異体３、２４３０変異体４または２４３０変異体５に由来する、１つ以上（すなわち１、２または３個すべて）の軽鎖ＣＤＲを含む抗体または抗原結合フラグメントである。ある実施形態において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列番号５、２２または４１の軽鎖ＣＤＲ；およびアミノ酸配列番号６、２３、３５、４２または５４の軽鎖ＣＤＲを含む。ある実施形態において、本明細書に規定される抗体または抗体フラグメントは、（ｉ）ＣＤＲＬ１に対する配列番号４のアミノ酸配列、ＣＤＲＬ２に対する配列番号５のアミノ酸配列、およびＣＤＲＬ３に対する配列番号６のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列、ＣＤＲＬ２に対する配列番号５のアミノ酸配列、配列番号３９のアミノ酸配列、（ｉｉｉ）ＣＤＲＬ１に対する配列番号４のアミノ酸配列、ＣＤＲＬ２に対する配列番号４１のアミノ酸配列、およびＣＤＲＬ３に対する配列番号４２のアミノ酸配列、（ｉｖ）ＣＤＲＬ１に対する配列番号４のアミノ酸配列、ＣＤＲＬ２に対する配列番号４１のアミノ酸配列、およびＣＤＲＬ３に対する配列番号５４のアミノ酸配列、または（ｖ）ＣＤＲＬ１に対する配列番号４のアミノ酸配列、ＣＤＲＬ２に対する配列番号４１のアミノ酸配列、およびＣＤＲＬ３に対する配列番号５４のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖を含む。
【００６７】
ある実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、表１に記載の３２１０抗体変異体１のＣＤＲ全てを含み、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する。他の実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、表１に記載の３２１０抗体変異体２のＣＤＲ全てを含み、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する。他の実施形態において、表１に記載の３２１０抗体変異体３のＣＤＲ全てを含み、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する。他の実施形態において、表１に記載の３２１０抗体変異体４のＣＤＲ全てを含み、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する。他の実施形態において、表１に記載の３２１０抗体変異体５のＣＤＲ全てを含み、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する。他の実施形態において、表１に記載の３２１０抗体変異体６のＣＤＲ全てを含み、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する。
【００６８】
さらなる実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、表１に記載の２４３０抗体変異体１のＣＤＲ全てを含み、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する。他の実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、表１に記載の２４３０抗体変異体２のＣＤＲ全てを含み、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する。他の実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、表１に記載の２４３０抗体変異体３のＣＤＲ全てを含み、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する。他の実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、表１に記載の２４３０抗体変異体４のＣＤＲ全てを含み、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する。他の実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、表１に記載の２４３０抗体変異体５のＣＤＲ全てを含み、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する。
【００６９】
本発明の例示的な抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）に対するアミノ酸配列、並びにそれらをコードする核酸配列を表２に記載した。
【００７０】
【表２】
2020182464.tif 000003
【００７１】
ある実施形態において、本発明の抗体または抗体フラグメントは、配列番号１３、１７、２９、３３、４９または５９で示される配列のいずれかと、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。他の実施形態においては、本発明の抗体または抗体フラグメントは、配列番号１４、３０、３７、５０または６０で示される配列のいずれかと、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。さらなる他の実施形態においては、本発明の抗体または抗体フラグメントは、図２４および２５に規定される配列と、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含む。
【００７２】
本発明の他の実施形態においては、本発明は、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する抗体または抗原結合フラグメントであって、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むもの；または、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むもの；または、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むもの；または、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むもの；または、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むもの；または、配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むもの；または、配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むもの；または、配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むもの；または、配列番号のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むもの；または、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むもの、を包含する。
【００７３】
本発明のさらなる他の実施形態においては、本発明は、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する抗体または抗原結合フラグメントであって、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むもの；または、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むもの；または、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むもの；または、配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むもの；または、配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むもの；または、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むもの、を包含する。
【００７４】
本発明の抗体の例示には、ＨＭＢ３２１０変異体１、ＨＭＢ３２１０変異体２、ＨＭＢ３２１０変異体３、ＨＭＢ３２１０変異体４、ＨＭＢ３２１０変異体５、ＨＭＢ３２１０変異体６、ＨＭＢ２４３０変異体１、ＨＭＢ２４３０変異体２、ＨＭＢ２４３０変異体３、ＨＭＢ２４３０変異体４またはＨＭＢ２４３０変異体５が含まれるが、それらのみに限定されない。
【００７５】
本発明はさらに、本発明の抗体もしくは抗原結合フラグメントと同じエピトープに結合する抗体、もしくはその抗原結合フラグメント、または本発明の抗体もしくは抗原結合フラグメントと競合する抗体を含む。
【００７６】
表１および表２から分かるように、開示された抗体のＣＤＲ、重鎖および軽鎖は、組み替えることにより、結合および中和の能力を保った新たな抗体を提供することができる。本発明の抗体はそれゆえ、表１に規定されるＣＤＲ、または表２に規定される重鎖および軽鎖のあらゆる組合せを含む、抗体および抗原結合フラグメントを含む。
【００７７】
本発明の抗体は、本発明の抗体の１つ以上のＣＤＲと、同一のエピトープに対する他の抗体の１つ以上のＣＤＲとを含む、ハイブリッド抗体分子をも含む。ある実施形態においては、前記のハイブリッド抗体は、本発明の抗体のＣＤＲ３つと、同一のエピトープに対する他の抗体のＣＤＲ３つとを含む。代表的なハイブリッド抗体は、（ｉ）本発明の抗体に由来する３つの軽鎖ＣＤＲと、同一のエピトープに対する他の抗体に由来する３つの重鎖ＣＤＲとを含む、または（ｉｉ）本発明の抗体に由来する３つの重鎖ＣＤＲと、同一のエピトープに対する他の抗体に由来する３つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【００７８】
変異体抗体もまた本発明の範囲に含まれる。それゆえ、本出願に記載の変異体配列もまた本発明の範囲に含まれる。前記変異体は、免疫反応の間にインビボで、または、不死化Ｂ細胞クローンの培養においてインビトロで、体細胞変異により生じた天然変異体を含む。あるいは、変異体は遺伝子コードの縮重により出現したり、または転写もしくは翻訳のエラーにより生産されたりすることもある。
【００７９】
改善した親和性および／または改善した有効性を持つ抗体配列の変異体は、当業者に既知の方法を用いて入手することができ、本発明の範囲に含まれる。例えば、より改善した親和性を持つ抗体を得るために、アミノ酸の置換が使用されることがある。あるいは、ヌクレオチド配列のコドン最適化が、抗体生産のための発現システムにおいて、翻訳の効率を向上させるのに使用されることもある。さらに、本発明のいずれかの核酸配列に定方向進化法を適用することによって、抗体の特異性または中和活性の点で最適化された配列を含むポリヌクレオチドをもまた、本発明の範囲に含まれる。
【００８０】
ある実施形態においては、変異体抗体配列は、本願に記載の配列と７０％またはそれより多い（すなわち７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれより多い）アミノ酸配列同一性を有する。ある実施形態においては、上記配列の同一性は、参照配列（すなわち本願に記載の配列）の全長に対して計算される。ある実施形態においては、ここに記載の百分率同一性は、ＮＣＢＩ(the National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)のデフォルトパラメーターを使用し、BLAST version 2.1.3を使用して決定した[Blosum 62 matrix; gap open penalty=11 and gap extension penalty=1]。
【００８１】
他の観点から見ると、本発明は、本発明の抗体の軽鎖および重鎖、およびＣＤＲの全部または一部をコードする核酸配列をも含む。ここに規定されているのは、本発明の代表的な抗体の軽鎖および重鎖、およびＣＤＲの全部または一部をコードする核酸配列である。表２は、本発明の幾つかの実施例の抗体の、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする核酸配列の配列番号を規定する。表３は、本発明の代表的な抗体のＣＤＲをコードする核酸配列の配列番号を規定する。遺伝子暗号の冗長性のため、これらの核酸配列の変異体には同一のアミノ酸配列をコードするものが存在する。
【００８２】
【表３】
2020182464.tif 000004
【００８３】
一実施形態において、本発明に係る核酸配列は、本発明の抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含む。別の実施形態において、本発明の核酸配列は、本発明の抗体の重鎖または軽鎖ＣＤＲをコードする核酸の配列を有する。例えば、本発明に係る核酸配列は、配列番号７〜１２、１５、１６、１８、２４〜２８、３１〜３２、３４、３６、３８、４３〜４８、５１〜５２、５５〜５８、または６１〜６２の核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。
【００８４】
さらに別の実施形態において、本発明に係る核酸配列は、図２４および２５に規定される本発明の抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含む。
【００８５】
さらに本発明の範囲に含まれるのは、本発明に係る核酸配列を含むベクター（例えば、発現ベクター）である。そのようなベクターにより形質移入された細胞もまた、本発明の範囲に含まれる。そのような細胞の例として、真核細胞（例えば、酵母細胞、動物細胞または植物細胞）が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、細胞は哺乳類の細胞（例えば、ヒト、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＮＳ０、ミエローマまたはハイブリドーマ細胞）である。
【００８６】
本発明はまた、本発明の抗体または抗原結合フラグメントと結合することができるエピトープに結合するモノクローナル抗体に関する。
【００８７】
モノクローナルおよび組み換え抗体は、それらが対象としている個々のポリペプチドまたは他の抗原の同定および精製において特に有用である。本発明の抗体は、イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）における試薬として使用できるという、さらなる有用性がある。これらの応用において、当該抗体は分析的に検出可能な試薬（放射性同位体、蛍光分子または酵素等）で標識され得る。
【００８８】
本発明の抗体は、治療部位への輸送のための薬物に結合させる、または目的の細胞（例えば、ＲＳＶもしくはＭＰＶ、またはＲＳＶおよびＭＰＶの両方に感染した細胞）を含む部位のイメージングを容易にするために、検出可能な標識と結合させることができる。抗体を薬物および検出可能な標識と結合させる方法は、当該技術分野において、検出可能な標識を用いてイメージングを行う方法と同様、よく知られている。標識された抗体は、様々な標識を使用することで、様々なアッセイに用いられ得る。本発明の抗体と目的のエピトープ（エピトープまたはＲＳＶもしくはＭＰＶまたは両方）との間の抗体抗原複合物の形成の検出は、検出可能なラベルを当該抗体に付加することによって容易にすることができる。適切な検出手段としては、放射性核種、酵素、補酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素、酵素基質またはコファクター、酵素阻害剤、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、および染料等の標識の使用が挙げられる。適切な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプタビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが挙げられ；適切な発光物質の例は、ルミノールであり；適切な生物発光物質の例としては、ルシフェエラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。このような標識された剤は、様々な公知のアッセイ（ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、および蛍光イムノアッセイ等（例えば、米国特許第３，７６６，１６２号；米国特許第３，７９１，９３２号；米国特許第３，８１７，８３７号；および米国特許第４，２３３，４０２号を参照））において使用され得る。
【００８９】
本発明に係る抗体は、治療用物質の一部分（サイトトキシン、治療薬、または放射性金属イオンもしくは放射性同位体等）と共役されていてもよい。放射性同位体の例としては、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｐｄ−１０９、Ｔｃ−９９、Ｉｎ−１１１等が挙げられるが、これらに限定されない。上記抗体共役物は、所定の生物学的反応を変更するために使用され得る；薬物の部分は古典的な化学治療剤に限定して構成されるわけではない。例えば、薬物の部分は所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素等の毒素が挙げられる。
【００９０】
そのような治療薬の一部分を抗体に共役させる技術は公知である。例えば、Arnon et al. (1985) “Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-256；ed. Hellstrom et al. (1987) “Antibodies for Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2d ed; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-653；Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in CancerTherapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. pp. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italy, 1985)
；“Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies for Cancer Detectionand Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), pp. 303-316；およびThorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62:119-158を参照のこと。
【００９１】
あるいは、抗体またはその抗体フラグメントは、第２の抗体またはその抗体フラグメントに共役され、米国特許第４，６７６，９８０号に記載の抗体ヘテロ共役体を形成することができる。さらに、標識と本発明の抗体と間でリンカーを用いてもよい（例えば、米国特許第４，８３１，１７５号）。抗体およびその抗原結合フラグメントは、放射性のヨウ素、インジウム、イットリウム、または当該技術分野において公知の他の放射性粒子で直接標識されていてもよい（例えば、米国特許５，５９５，７２１号）。治療は、同時に、または順番に投与された、共役した抗体および共役していない抗体による治療の組合せからなってもよい（例えば、国際公開第ＷＯ００／５２０３１号；国際公開第ＷＯ００／５２４７３号）。
【００９２】
本発明の抗体はまた、固体担体に付着されてもよい。さらに、本発明の抗体またはその機能的抗体フラグメントは、ポリマーに共有結合されることで化学的に改変され、例えば循環半減期が延長される。ポリマーおよびそれをペプチドに結合させる方法の例は、米国特許第４，７６６，１０６号；米国特許第４，１７９，３３７号；米国特許第４，４９５，２８５号および米国特許第４，６０９，５４６号に示されている。いくつかの実施形態において、ポリマーはポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択され得る。ＰＥＧは室温で水に可溶であり、Ｒ（Ｏ−−ＣＨ２−−ＣＨ２）ｎ Ｏ−−Ｒという一般式で表される（Ｒは水素、またはアルキル基もしくはアルカノール基等の保護基であり得る）。一実施形態において、当該保護基は炭素数１〜８であり得る。さらなる実施形態において、当該保護基はメチル基である。記号ｎは正の整数である。一実施形態において、ｎは１〜１０００である。別の実施形態において、ｎは２〜５００である。一実施形態において、ＰＥＧの平均分子量は１，０００〜４０，０００である。さらなる実施形態において、ＰＥＧの平均分子量は２，０００から２０，０００である。さらなる実施形態において、ＰＥＧの平均分子量は３，０００から１２，０００である。一実施形態において、ＰＥＧは少なくとも１つのヒドロキシ基を有する。別の実施形態において、ＰＥＧは末端ヒドロキシ基を有する。さらに別の実施形態において、活性化されて阻害剤の遊離アミノ基と反応するのは末端ヒドロキシ基である。しかしながら、反応基の種類および量は、本発明の共有結合したＰＥＧ／抗体を得るため変えてもよいことが理解されるであろう。
【００９３】
水溶性ポリオキシエチル化ポリオールも本発明において有用である。水溶性ポリオキシエチル化ポリオールとしては、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）等が挙げられる。一実施形態において、ＰＯＧが使用される。いかなる理論にも拘束されることはないが、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格は、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドにおいて、天然に（例えば、動物およびヒトにおいて）生じる骨格と同じであるので、この分枝は体内において必ずしも異物とは認識されない。いくつかの実施形態において、ＰＯＧの分子量はＰＥＧと同じ範囲である。循環半減期を延長するために使用され得る別のドラッグデリバリーシステムは、リポソームである。リポソームデリバリーシステムを調製する方法は当業者に公知である。他のドラッグデリバリーシステムが当該技術分野において公知であり、例えば、Poznansky et al. (1980)およびPoznansky (1984)に記載されている。
【００９４】
本発明の抗体は精製された形態で提供され得る。典型的には、抗体は、実質的に他のポリペプチドを含まない（例えば、９０％（重量パーセント）未満、通常では６０％未満、より通常では５０％未満が他のポリペプチドからなる）組成物中に存在する。
【００９５】
本発明の抗体は、非ヒト（または異種）宿主（例えば、マウス）において免疫原性であり得る。特には、当該抗体は、非ヒト宿主において免疫原性であるが、ヒト宿主においては免疫原性でないイディオトープを有し得る。ヒトに対して使用される本発明の抗体は、マウス、ヤギ、ウサギ、ラット、非霊長類の哺乳類等の宿主からは容易に単離できず、また一般的にはヒト化により、またはトランスジェニックマウス（xeno-mice）から得ることができない。
【００９６】
本発明の抗体はあらゆるアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、すなわちα、γ、またはμ重鎖）であり得るが、一般的にはＩｇＧである。ＩｇＧアイソタイプの範囲において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のサブクラスであり得る。本発明の抗体はκまたはλ軽鎖を有し得る。
【００９７】
[抗体の作製]
本発明に係る抗体は、当該技術分野において公知のいかなる方法でも作製され得る。例えば、ハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法論はよく知られている（Kohler, G. and Milstein, C,. 1975; Kozbar et al. 1983）。一実施形態においては、国際公開第ＷＯ２００４／０７６６７７号に記載された代替的なＥＢＶ不死化法が使用される。
【００９８】
国際公開第ＷＯ２００４／０７６６７７号に記載された方法を用いて、本発明の抗体を産生するＢ細胞を、ＥＢＶおよびポリクローナルＢ細胞アクチベーターによって形質転換し得る。形質転換のステップの間に、効率をさらに向上させるために、細胞成長および分化のさらなる刺激物質が任意に加えられてもよい。これらの刺激物質はＩＬ−２およびＩＬ−５等のサイトカインであり得る。一局面において、不死化のステップの間に、不死化の効率をさらに向上させるために、ＩＬ−２が加えられるが、その使用は必須ではない。これらの方法を用いて作製された不死化Ｂ細胞は、その後当該技術分野において公知の方法を用いて培養され、そこから抗体が単離される。
【００９９】
国際公開第ＷＯ２０１０／０４６７７５号に記載された方法を用いて、プラズマ細胞を、限られた数においてまたは単一のプラズマ細胞として、マイクロウェルカルチャープレート上で培養することができる。抗体はプラズマ細胞の培養物から単離することができる。さらに、当該技術分野において公知の方法を用いて、プラズマ細胞の培養物から、ＲＮＡの抽出およびＰＣＲを行うことができる。抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域をＲＴ−ＰＣＲによって増幅して、シークエンシングし、発現ベクターにクローニングすることができ、その後当該ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはその他の宿主細胞へ形質移入する。発現ベクターにおける核酸のクローニング、宿主細胞の形質移入、形質移入された宿主細胞の培養および産生された抗体の単離は、当該技術分野において公知のいかなる方法を用いても行うことができる。
【０１００】
必要があれば、ろ過、遠心分離、およびＨＰＬＣまたはアフィニティクロマトグラフィー等の様々なクロマトグラフィー法を用いて、抗体をさらに精製してもよい。抗体（例えば、モノクローナル抗体）を精製する技術（製薬グレードの抗体を作製する技術が挙げられる）は、当該技術分野においてよく知られている。
【０１０１】
本発明の抗体のフラグメントは、酵素（例えば、ペプシンまたはパパイン）による消化、および／または化学的還元によるジスルフィド結合の開裂を包含する方法によって抗体から得ることができる。あるいは、抗体のフラグメントは、重鎖または軽鎖の配列の一部のクローニングおよび発現によって得ることができる。抗体“フラグメント”としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、およびＦｖフラグメントが挙げられる。本発明は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖に由来する１本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）も包含する。例えば、本発明は、本発明の抗体に由来するＣＤＲを含むｓｃＦＶを包含する。同様に、重鎖または軽鎖の単量体および二量体、単一ドメイン重鎖抗体、単一ドメイン軽鎖抗体、並びに単鎖抗体（例えば、重鎖および軽鎖の可変領域がペプチドリンカーで連結された単鎖Ｆｖ）が包含される。
【０１０２】
本発明の抗体フラグメントは、一価または多価の相互作用を与え、上記の様々な構造に含まれていてもよい。例えば、ｓｃＦｖ分子は、三価の“三重特異性抗体”または四価の “四重特異性抗体”を作るために合成され得る。ｓｃＦｖ分子は、結果として二価のミニ
抗体となるＦｃ領域を含んでいてもよい。加えて、本発明の配列は、多選択性の分子の構成要素であり得、当該多選択性の分子は、本発明の配列が本発明のエピトープを標的とし、分子の他の領域が他の標的に結合する。典型的な分子としては、二重特異性のＦａｂ２、三重特異性のＦａｂ３、二重特異性のｓｃＦｖ、および二重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない（Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136）。
【０１０３】
分子生物学の標準的な技術が、本発明の抗体および抗体フラグメントをコードするＤＮＡ配列を準備するために使用され得る。所望のＤＮＡ配列は、完全に、または部分的に、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して合成され得る。部位特異的突然変異およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術が必要に応じて使用され得る。
【０１０４】
任意の適切な宿主細胞／ベクター系が、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列の発現に使用され得る。細菌（例えば大腸菌）および他の微生物系が、抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、特にはＦｖフラグメントおよび単鎖抗体フラグメント（例えば単鎖Ｆｖｓ））の発現に、部分的に使用され得る。真核細胞（例えば動物）宿主細胞発現系が、完全な抗体分子を包含するより大きな抗体分子の作製に使用され得る。適切な動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＮＳ０、ミエローマまたはハイブリドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
本発明はまた、本発明の核酸をコードするベクターを含む宿主細胞を、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現に適した条件下で培養すること、および、抗体分子を単離することを含む、本発明に係る抗体分子を作製する方法を提供する。
【０１０６】
抗体分子は、重鎖または軽鎖のポリペプチドをコードする配列のみを宿主細胞の形質移入に使用する必要がある場合には、重鎖または軽鎖のポリペプチドのみを含み得る。重鎖および軽鎖の両方を含む産物の作製では、細胞株は２種類のベクター（軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクター、および、重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクター）によって形質移入され得る。
【０１０７】
あるいは、本発明に係る抗体は、（ｉ）宿主細胞において本発明に係る核酸配列を発現させること、および（ｉｉ）発現した抗体産物を単離することによって作製され得る。さらに、上記方法は、（ｉｉｉ）単離された抗体を精製することを含み得る。
【０１０８】
形質転換されたＢ細胞および培養されたプラズマ細胞は、所望の特異性または機能の抗体を作製するものについてスクリーニングされ得る。
【０１０９】
スクリーニングのステップは、任意のイムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）、組織または細胞（形質移入された細胞を包含する）の染色、中和アッセイ、または所望の特異性または機能を同定するための、当該技術分野において公知の多数の他の方法の１つを用いて行われる。アッセイは、１つ以上の抗原の単純な認識に基づいて、または、さらに所望の機能（例えば、単に抗原と結合する抗体ではなく中和抗体を選択する、標的細胞の特性（例えば、シグナルカスケード、形態、生育速度、他の細胞に影響を与える能力、他の細胞または他の試薬または環境変化による影響に対する反応、分化の状態等）を変化させることができる抗体を選択する）に基づいて選択され得る。
【０１１０】
個々の形質転換されたＢ細胞クローンは、次いで、形質転換された陽性Ｂ細胞培養物から作製され得る。個々のクローンを陽性の細胞の混合物から分離するためのクローニングのステップは、限界希釈法、顕微操作、細胞選別による単一細胞沈着（single cell deposition）、または当該技術分野において公知の別の方法を用いて行われ得る。
【０１１１】
培養されたプラズマ細胞由来の核酸は、当該技術分野において公知の方法を用いて、単離され、クローニングされ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または他の既知の宿主細胞において発現され得る。
【０１１２】
本発明の不死化Ｂ細胞クローンまたは形質移入された宿主細胞は、様々な使い道（例えば、モノクローナル抗体の供給源として、または目的のモノクローナル抗体をコードする核酸（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）の供給源として、または研究のため等）において使用することができる。
【０１１３】
本発明は、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの感染を中和する抗体を産生する、不死化された記憶Ｂ細胞または形質移入された宿主細胞を含む組成物を提供する。
【０１１４】
本発明の不死化Ｂ細胞クローンまたは培養されたプラズマ細胞は、後に続く組み換え体の発現のための抗体遺伝子のクローニングのための核酸の供給源としても使用され得る。組み換え体の供給源からの発現は、薬学的な目的においては、例えば安定性、信頼性、培養の容易性等の理由から、Ｂ細胞またはハイブリドーマからの発現よりも一般的である。
【０１１５】
それゆえ、本発明は、（ｉ）１つ以上の核酸（例えば、重鎖および／または軽鎖のｍＲＮＡ）を、目的の抗体をコードするＢ細胞クローンまたは培養されたプラズマ細胞から得るステップ；（ｉｉ）発現ベクターに当該核酸を挿入するステップ、および（ｉｉｉ）宿主細胞において目的の抗体を発現させるために、宿主細胞に当該ベクターを形質移入するステップを含む、組み換え細胞を調製する方法を提供する。
【０１１６】
同様に、本発明は、（ｉ）目的の抗体をコードするＢ細胞または培養されたプラズマ細胞からの核酸のシークエンシング；および（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた配列情報を用いて、宿主細胞において目的の抗体を発現させるために宿主細胞に挿入するための核酸を調製するステップを含む、組み換え細胞を調製する方法を提供する。当該核酸は、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）の間において、制限酵素サイトを導入するために、ならびに／またはコドン使用頻度を変更するために、ならびに／または転写および／もしくは翻訳調節配列を最適化するために操作され得るが、必ずしもそうする必要はない。
【０１１７】
本発明はまた、目的の抗体をコードする１つ以上の核酸を宿主細胞に形質移入するステップを含み、当該核酸が本発明の不死化Ｂ細胞クローンまたは培養されたプラズマ細胞に由来する核酸である、形質移入された宿主細胞を調製する方法を提供する。それゆえ、まず核酸を調製する工程、次いでそれを宿主細胞の形質移入のために使用する工程は、別の時間に、別の人間が、別の場所（例えば別の国）において行うことができる。
【０１１８】
本発明のこれらの組み換え細胞は、次いで、発現および培養のために使用することができる。これらの細胞は、大規模な薬剤生産のための抗体発現に特に有用である。これらの細胞はまた、医薬組成物の有効成分としても使用することができる。任意の培養技術（静置培養、ローラーボトル培養、腹水、中空糸型バイオリアクターカートリッジ、モジュラーミニ発酵槽、攪拌タンク、マイクロキャリア培養、セラミックコア攪拌等が挙げられるが、これらに限定されない）を使用することができる。
【０１１９】
Ｂ細胞またはプラズマ細胞からの免疫グロブリン遺伝子の取得およびシークエンシングの方法は、当該技術分野において公知である（例えば、Kuby Immunology, 4th edition、2000 の第４章を参照）。
【０１２０】
形質移入された宿主細胞は、酵母細胞および動物細胞、特には哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ヒト細胞（ＰＥＲ．Ｃ６またはＨＫＢ−１１細胞等）、ミエローマ細胞）、並びに植物細胞を含む真核細胞であり得る。好ましい発現宿主は、本発明の抗体をグリコシル化する（特に、それ自体はヒトに対して免疫原性でない炭水化物骨格によって）ことができる。一実施形態においては、形質移入された宿主細胞は、無血清培地中で生育することが可能であってもよい。さらなる実施形態においては、形質移入された宿主細胞は、動物由来産物が存在しない培地中で生育することが可能であってもよい。形質移入された宿主細胞はまた、細胞株を得るために培養されてもよい。
【０１２１】
本発明はまた、（ｉ）本発明に係る不死化Ｂ細胞クローンを調製する、またはプラズマ細胞を培養するステップ；（ｉｉ）目的の抗体をコードする核酸を当該Ｂ細胞クローンまたは培養されたプラズマ細胞から得るステップを含む、目的の抗体をコードする１つ以上の核酸分子（例えば、重鎖および軽鎖の遺伝子）を調製する方法を提供する。さらに、本発明は、（ｉ）本発明に係る不死化Ｂ細胞クローンを調製する、またはプラズマ細胞を培養するステップ；（ｉｉ）目的の抗体をコードするＢ細胞クローンまたは培養されたプラズマ細胞由来の核酸のシークエンシングを行うステップを含む、目的の抗体をコードする核酸配列を得る方法を提供する。
【０１２２】
本発明はまた、本発明の形質移入されたＢ細胞クローンまたは培養されたプラズマ細胞から得られた核酸を得るステップを含む、目的の抗体をコードする核酸分子を調製する方法を提供する。それゆえ、まずＢ細胞クローンまたは培養されたプラズマ細胞を得る工程、および次いでＢ細胞クローンまたは培養されたプラズマ細胞から核酸を得る工程は、別の時間に、別の人間が、別の場所（例えば別の国）において行うことができる。
【０１２３】
本発明は、（ｉ）目的の抗体を発現する、選択されたＢ細胞クローンまたは培養されたプラズマ細胞からの１つ以上の核酸（例えば重鎖および軽鎖の遺伝子）を得る、および／またはシークエンシングするステップ；（ｉｉ）発現ベクターを調製するために、核酸を挿入するまたは核酸配列を用いるステップ；（ｉｉｉ）目的の抗体を発現することができる宿主細胞に形質移入するステップ；（ｉｖ）目的の抗体が発現する条件下で、形質移入された宿主細胞を培養または継代培養するステップ；および、任意で、（ｖ）目的の抗体を精製するステップを含む、抗体（例えば、薬学的使用のための）を調製する方法を提供する。
【０１２４】
本発明はまた、目的の抗体が発現する条件下で、形質移入された宿主細胞集団を培養または継代培養することで用意された形質移入された宿主細胞の母集団を培養または継代培養するステップ、および、任意で、目的の抗体を精製するステップ段階を含み、当該形質移入された宿主細胞集団は、（ｉ）上述のとおりに調製されたＢ細胞クローンまたは培養されたプラズマ細胞によって産生される、選択された目的の抗体をコードする核酸を用意すること、（ｉｉ）当該核酸を発現ベクターに挿入すること、（ｉｉｉ）当該ベクターを目的の抗体を発現することができる宿主細胞に形質移入すること、および（ｉｖ）目的の抗体を産生するために挿入された核酸を含む形質移入された宿主細胞を培養または継代培養することによって調製されたものである、抗体を調製する方法を提供する。それゆえ、まず組み換え宿主細胞を調製する工程、および次いでそれを培養して抗体を発現させる工程は、別の時間に、別の人間が、別の場所（例えば別の国）において行うことができる。
【０１２５】
[エピトープ]
上述のように、本発明の抗体は、それらの結合するエピトープをマッピングするために用いられ得る。発明者らは、融合前Ｆタンパク質に見いだされるが、融合後Ｆタンパク質には見いだされない、エピトープに関する本願発明の中和抗体を発見した。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に結合し、ＲＳＶ融合後Ｆタンパク質には結合しない。他の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＲＳＶおよびＭＰＶの融合前Ｆタンパク質に結合し、ＲＳＶおよびＭＰＶの融合後Ｆタンパク質には結合しない。さらに他の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの融合前Ｆタンパク質に結合するが、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭの融合後Ｆタンパク質には結合しない。
【０１２６】
本願発明の抗体に対するエピトープは直鎖状である（連続している）、または立体構造である（連続していない）。一実施形態において、本願発明の抗体および抗体断片は、立体構造のエピトープに結合する。他の実施形態において、立体構造のエピトープは、非還元状態下でのみ存在する。いかなる理論に結びつくことなく、本発明の抗体によって結合される立体構造のエピトープは、Ｆタンパク質におけるアミノ酸残基間のジスルフィド結合の存在に依存する。
【０１２７】
他の実施形態において、本発明の抗体が結合するエピトープは、ＲＳＶ融合後Ｆタンパク質において定義されている、抗原サイトＩ、抗原サイトＩＩ、抗原サイトＩＶおよびＭＰＶのＦタンパク質において対応しているサイトとは異なっている。さらに他の実施形態において、本発明の抗体および本発明の抗原結合フラグメントは、ＲＳＶのＦタンパク質への結合について、パリビズマブ、モタビズマブ、ｍＡｂ  １０１Ｆ、ｍＡｂ  １３１-２ＡまたはｍＡｂ  Ｄ２５とも交差競合せず、ＭＰＶのＦタンパク質への結合について、ｍＡｂ  ２３４とも交差競合しない。
【０１２８】
他の実施形態において、本発明の抗体が結合するための領域は、ＳＡＶＳＫＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴ（配列番号６３）にわたる残基であるＲＳＶのＦタンパク質のＮ末端部分に位置しているポリぺプチドを含んでいる。このポリペプチドにおける中心部分は、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭ間で高く保存されており、（ｘｌ）部分におけるアミノ酸はＬ，ＦまたはＫであり得るがこれらに限定されず、（ｘ２）部分におけるアミノ酸はＡまたはＶであり得るがこれらの限定されない、Ｙ（ｘ１）Ｓ（ｘ２）ＬＲＴＧＷの残基によって形成されている。
【０１２９】
本発明の抗体に対するポリペプチドの変異体の例はＹＬＳＡＬＲＴＧＷ（配列番号６４）、ＹＬＳＶＬＲＴＧＷ（配列番号６５）、ＹＦＳＡＬＲＴＧＷ（配列番号６６）、ＹＦＳＶＬＲＴＧＷ（配列番号６７）、ＹＫＳＡＬＲＴＧＷ（配列番号６８）およびＹＫＳＶＬＲＴＧＷ（配列番号６９）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３０】
本発明の抗体に結合するポリペプチドは多くの使用を有し得る。精製された形態か、合成の形態における、ポリペプチドおよびそのポリペプチド変異体は、免疫反応を上昇させるため（すなわち、ワクチンとして、又は他の使用のための抗体の生成のため）または抗エピトープまたはそのミモトープと免疫反応する抗体の血清をスクリーニングするために用いられ得る。一実施形態において、当該ポリペプチド又はポリペプチド変異体、または当該ポリペプチド又はポリペプチド変異体を含んでいる抗原は、本発明において記載されているものと同じ品質の抗体を含んでいる免疫反応を上昇させるためのワクチンとして用いられ得る。また、本発明の抗体およびその抗体フラグメントはワクチンの品質をモニタリングする方法に用いられる。特に、抗体は、ワクチンにおける抗原が、正しい立体構造において正しい免疫原性のエピトープを含んでいることを確認するために用いられ得る。また、例えば、上記ワクチンの抗原が正しい立体構造において特定のエピトープを含んでいることを確認することによって、ＲＳＶまたはＭＰＶまたはＲＳＶおよびＭＰＶの両方に対するワクチンの品質をモニタリングするための、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントの使用は、本願発明の範囲内であることが意図される。
【０１３１】
本発明の抗体に結合するポリペプチドは上記ポリペプチドに結合するリガンドのスクリーニングにおいて有効である。当該リガンド（抗体（ラクダ、サメおよび他の種由来のものが挙げられる）、抗体のフラグメント、ペプチド、ファージディスプレイ技術産物、アプタマー、アドネクチンまたは他のウイルスタンパク質もしくは細胞タンパク質のフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない）は、エピトープを阻害し、それによって感染を妨げ得る。当該リガンドは本発明の範囲に包含される。
【０１３２】
[薬学組成物]
本発明は、本発明の抗体もしくは抗体フラグメント；当該抗体もしくは当該フラグメントをコードしている核酸；当該核酸をコードしているベクター；または本発明の抗体もしくは抗原結合フラグメントによって認識されるポリペプチドを含む、医薬組成物を提供する。また、医薬組成物は薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含み得る。担体または賦形剤は投与を容易にし得るが、それ自身は組成物を受容する個体に有害な抗体の生成を誘導するものではない。有毒性でないだけではなく、好適な担体は大きな、ゆっくりと代謝された巨大分子（タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体のアミノ酸、アミノ酸共重合体および不活性なウイルス粒子など）であり得る。
【０１３３】
薬学的に許容可能な塩は例えば無機酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、および硫酸塩など）、または有機酸の塩（酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、および安息香酸塩など）が用いられ得る。
【０１３４】
治療組成物中の薬学的に許容可能な塩はさらに液体（水、生理的食塩水、グリセロールおよびエタノール）を含んでいる。さらに補助剤（湿潤剤、乳化剤またはｐＨ緩衝剤など）が当該組成物に存在し得る。当該担体は被験体によって摂取されるための、錠剤、丸剤、糖衣錠、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤および懸濁剤として医薬組成物を調合させることを可能にする。
【０１３５】
本発明の範囲は、投与のいくつかの形態において存在する組成物であり；当該形態としては非経口投与（例えば、注射または注入（例えば大量瞬時投与または連続注入））のための好適な形態が挙げられるがこれらに限定されない。生成物が注射または注入される場合、油性又は水性のビヒクルにおける懸濁液、溶液または乳液の形態で与えられ得、調合剤（懸濁剤、安定化剤および／または分散剤）を含み得る。あるいは、抗体分子は、適切な滅菌液を用いた使用の前の再構成のために、乾燥形態であり得る。
【０１３６】
いったん調合されると、本発明の組成物は、被験体に直接投与され得る。一実施形態において組成物は哺乳類（例えばヒトの被験体）への投与のために適用される。
【０１３７】
本発明の医薬組成物は任意の数の経路（経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、腹膜内、
鞘内、心（脳）室内（intraventricular）、経皮、経皮膚、局所、皮下、鼻腔内、経腸、舌下、膣内、または直腸の経路が挙げられるがこれらに限定されない）。ハイポスプレーもまた、本発明の医薬組成物を投与するために用いられ得る。典型的に治療組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれとしても注射可能なように調製され得る。注射の前の液体のビヒクル中の溶液または懸濁液に、好適な固体の形態が調製され得る。
【０１３８】
組成物の直接的な送達は一般的に皮下、腹膜内、静脈内、筋肉内の注射によって達成されるか、組織の間質性の空間に送達される。組成物は、病変に投与され得る。投与処置は単回投与の計画または複数回投与の計画であり得る。公知の抗体ベースの医薬は投与の回数に関連する指示（例えば、毎日、毎週、毎月送達されるべきかどうかなど）を提供する。また、回数および用量は症状の重症度に依存し得る。
【０１３９】
本発明の組成物は、種々の形態において調製され得る。例えば、組成物は液体の溶液または懸濁液のいずれかとして、注射可能薬物として調製され得る。注射の前の液体ビヒクル中の溶液または懸濁液に好適な固体の形が調製され得る（防腐剤を含んでいる滅菌水を用いて再構成するための、凍結乾燥組成物（例えば、Synagis（登録商標）およびHerceptin（登録商標）など））。組成物は、例えば、軟膏、クレームまたは粉末として局所投与のために調製され得る。組成物は例えば、錠剤またはカプセル剤として、スプレー剤として、またはシロップ剤（任意で風味をつけた）として経口投与のために調製され得る。組成物は例えば細粉末またはスプレーを用いて、吸入剤としての肺投与のために調製され得る。組成物は坐剤または膣坐剤として調製され得る。組成物は例えば滴剤として鼻、耳、または目の投与のために調製され得る。組成物は、組み合わせられた組成物が被験体への投与の直前に再構成されるように設計された、キットの形態であり得る。例えば、凍結乾燥された抗体が滅菌水または滅菌緩衝液を備えたキットの形態において提供され得る。
【０１４０】
組成物中の活性成分は、抗体分子、抗体フラグメントまたはその変異体およびその派生物であると理解される。よって、胃腸管において分解を受けやすい。したがって、もし組成物が胃腸管を用いた経路によって投与される場合は、組成物は、分解から抗体を保護するが胃腸管から吸収されたら抗体を遊離する薬剤を含んでいる必要がある。
【０１４１】
薬学的に許容可能な担体の初めから終わりまでの記載は、Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN: 068330647において利用可能である。
【０１４２】
本発明の薬学組成物は、一般的に５．５〜８．５のｐＨを有しており、いくつかの実施形態において、これは、６〜８であり得、他の実施形態において、約７であり得る。ｐＨは、緩衝液の使用によって維持され得る。組成物は滅菌されており、および／またはピロゲンフリーであり得る。組成物はヒトに対して等張性であり得る。一実施形態において、本発明の医薬組成物は、空気遮断封止容器に供給されている。
【０１４３】
医薬組成物は、有効量の、本発明の抗体および／または本発明の抗体に結合するエピトープを含んでいるポリペプチドを含んでいる。すなわち、有効量は、所望の疾患もしくは健康状態を処置する、緩解する、弱毒化するもしくは予防する、または検出可能な治療効果を示すのに十分な量である。また、治療効果としては、病原性の作用強度または身体的な症状における、低減または弱毒化を含んでいる。任意の特定の被験体のための正確な有効量は、大きさ、体重、および健康、健康状態の性質および程度、ならびに投与のために選択される療法または療法の組み合わせに依存する。所定の状況のための有効量は定常的な実験によって決定され、臨床医の判断の範疇である。本発明の目的のために、有効用量は、一般的に、投与される個体において約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇまたは約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの本発明の組成物である。公知の抗体ベースの医薬は、この点において、指示を提供する。例えば、Herceptin（登録商標）は、体重あたり４ｍｇ／ｋｇの初回導入用量および体重あたり２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量で、２１ｍｇ／ｍｌの溶液の静脈内の注入によって投与され；Rituxan（登録商標）は毎週３７５ｍｇ／ｍ２で投与されるなどである。
【０１４４】
一実施形態において、組成物は、1つ以上（例えば２つ、３つ等）の本発明の抗体を含んでおり、さらなる治療効果または相乗作用の治療効果をもたらす。他の実施形態において、組成物は1つ以上（例えば２つ、３つ等）の本発明の抗体、およびＲＳＶ、ＭＰＶまたはＲＳＶおよびＭＰＶの両方に対するさらなる抗体を含み得る。さらに本発明の抗体の、他の病原体（例えば、インフルエンザＡまたはインフルエンザＢウイルス）に特異的な抗体を伴う投与は、本発明の範囲内である。本発明の抗体は、ＲＳＶ又はＭＰＶ以外の病原体に特異的な抗体と組み合わせて／同時にまたは別々の時間のいずれか投与され得る。
【０１４５】
他の実施形態において、本発明は２つ以上の抗体を含んでいる医薬組成物を提供し、ここで、第１の抗体は、本明細書に記載されている本発明の抗体であり、第２の抗体は、ＲＳＶ、ＭＰＶ、もしくはＲＳＶおよびＭＰＶの両方、または当該医薬組成物を投与される被験体に同時感染し得る異なる病原体に特異的である。
【０１４６】
ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭに特異的であり、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭを中和する本発明の抗体の例としては、ＨＭＢ３２１０変異体３、ＨＭＢ３２１０変異体１、ＨＭＢ３２１０変異体２、ＨＭＢ３２１０変異体４、ＨＭＢ３２１０変異体５、ＨＭＢ３２１０変異体６、ＨＭＢ２４３０変異体１、ＨＭＢ２４３０変異体２、ＨＭＢ２４３０変異体３、ＨＭＢ２４３０変異体４またはＨＭＢ２４３０変異体５が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４７】
一実施形態において、本発明は、ＨＭＢ３２１０変異体１の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容可能な担体を含んでいる薬学組成物を提供する。他の実施形態において、本発明は、ＨＭＢ３２１０変異体２の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容可能な担体を含んでいる薬学組成物を提供する。他の実施形態において、本発明は、ＨＭＢ３２１０変異体３の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容可能な担体を含んでいる薬学組成物を提供する。他の実施形態において、本発明は、ＨＭＢ３２１０変異体４の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容可能な担体を含んでいる薬学組成物を提供する。他の実施形態において、本発明は、ＨＭＢ３２１０変異体５の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容可能な担体を含んでいる薬学組成物を提供する。他の実施形態において、本発明は、ＨＭＢ３２１０変異体６の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容可能な担体を含んでいる薬学組成物を提供する。
【０１４８】
さらに他の実施形態において、本発明は、ＨＭＢ２４３０変異体１の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容可能な担体を含んでいる薬学組成物を提供する。他の実施形態において、本発明は、ＨＭＢ２４３０変異体２の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容可能な担体を含んでいる薬学組成物を提供する。他の実施形態において、本発明は、ＨＭＢ２４３０変異体３の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容可能な担体を含んでいる薬学組成物を提供する。他の実施形態において、本発明は、ＨＭＢ２４３０変異体４の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容可能な担体を含んでいる薬学組成物を提供する。他の実施形態において、本発明は、ＨＭＢ２４３０変異体５の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容可能な担体を含んでいる薬学組成物を提供する。
【０１４９】
本発明の抗体は、他の療法（例えば、化学療法の化合物とともに、放射線療法とともに、等）と共に（組み合わせてか別々のいずれかで）投与される。一実施形態において、治療化合物としてはTamiflu（登録商標）などの抗ウイルス化合物が挙げられる。そのような併用療法は、単独で投与された場合に個々の治療薬に対する治療効果におけるさらなる改善または相乗作用的な改善を提供する。“相乗作用”という用語は、それぞれ個々の活性剤の個々の効果の合計よりも大きい２つ以上の活性剤の組合せられた効果を説明するために用いられる。したがって、２つ以上の薬剤の組合せられた効果が活性または過程の“相乗作用的な阻害”を生じさせる場合、活性または過程の阻害は、それぞれ個々の活性剤の個々の効果の合計よりも大きいことを意図している。“相乗作用的な治療効果”という用語は、治療効果（任意の数のパラメータによって測定される）がそれぞれ個々の治療で観察される個々の治療効果の合計より大きい、２つ以上の治療の組み合わせで観察される治療効果を指す。
【０１５０】
抗体は以前に反応を示さなかった（すなわち、ＲＳＶまたはＭＰＶ感染に対する処置に無反応性であることを示した）被験体に投与され得る。当該処置としては抗ウイルス剤を用いた以前の処置が挙げられる。これは例えば、ＲＳＶ、ＭＰＶまたはＲＳＶおよびＭＰＶの両方の抗ウイルス耐性株を用いた感染のためであり得る。
【０１５１】
一実施形態において、本発明の組成物は、本発明の抗体を含み得、当該抗体は、組成物の総タンパク質の少なくとも５０重量％（例えば、６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９５重量％、９７重量％、９８重量％、９９重量％またはそれ以上）を占め得る。当該組成物において、抗体は精製された形態である。
【０１５２】
本発明は、（ｉ）本発明の抗体を調製する工程；および（ｉｉ）精製された抗体を１つ以上の薬学的に許容可能な担体と混合する工程：を包含する医薬組成物の調製方法を提供する。
【０１５３】
他の実施形態において、医薬組成物の調製方法は、抗体を１つ以上の薬学的に許容可能な担体と混合する工程を包含しており、ここで、当該抗体は本発明の形質転換したＢ細胞または培養した形質細胞から得られたモノクローナル抗体である。したがって、最初のモノクローナル抗体を得る工程および続いて医薬を調製する工程のための手順は、異なる場所における（例えば異なる国における）異なる人々によって非常に異なる時間に時間に行われ得る。
【０１５４】
治療目的のために送達される抗体またはＢ細胞のための選択肢として、被験体に、Ｂ細胞または培養した形質細胞由来の対象のモノクローナル抗体（またはその活性フラグメント）をコードする核酸（典型的にＤＮＡ）を送達し、結果として、核酸がインサイチュで被験体中で発現され、所望の治療効果を生じ得る。好適な遺伝子治療および核酸送達ベクターは、当技術分野で既知である。
【０１５５】
本発明の組成物は、免疫原性の組成物であり得、いくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントによって認識されるエピトープを含む抗原を含んでいるワクチン組成物であり得る。本発明に係るワクチンは、予防性（すなわち、感染を防ぐ）か治療性（すなわち感染を処置または緩解する）であり得る。
【０１５６】
組成物は、複数回用量の形態において包装される場合、抗生物質を含み得る。それらは界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０などのＴｗｅｅｎ（ポリソルベート））を含み得る。界面活性剤は一般的に低レベル（例えば０．０１％未満）で存在する。また、組成物は、張度を与えるためにナトリウム塩（例えば塩化ナトリウム）を包含し得る。１０±２ｍｇ／ｍｌの濃度のＮａＣｌは一般的である。
【０１５７】
さらに、組成物は、特に、それらが凍結乾燥されている場合、または凍結乾燥された物質から再構成された物質を含んでいる場合に、糖アルコール（例えばマンニトール）または二糖類（例えばスクロースまたはトレハロース）を、例えば１５〜３０ｍｇ／ｍｌ（例えば、２５ｍｇ／ｍｌ）含み得る。凍結乾燥のための組成物のｐＨは、凍結乾燥の前に、５〜８、または５，５〜７、またはおよそ６．１に調整され得る。
【０１５８】
本発明の組成物は、１つ以上の免疫調節剤を含み得る。一実施形態において、１つ以上の免疫調節剤はアジュバントを含んでいる。
【０１５９】
本発明のエピトープの組成物は、ＲＳＶおよびＭＰＶの感染に効果的に対処するために、細胞を介した免疫反応ならびに体液の免疫反応の両方を誘発し得る。この免疫反応は長期持続する（例えば中和する）抗体、ならびにＲＳＶまたはＭＰＶまたはＲＳＶおよびＭＰＶの両方の曝露に反応して素早く反応し得る細胞仲介性の免疫性を誘導し得る。
【０１６０】
[医療および使用]
本発明の抗体および抗体フラグメントまたはその派生物および変異体は、ＲＳＶもしくはＭＰＶの感染またはＲＳＶおよびＭＰＶの両方の同時感染の処置のため；ＲＳＶもしくはＭＰＶの感染、またはＲＳＶおよびＭＰＶの両方の同時感染の予防のため；またはＲＳＶまたはＭＰＶの幹線の診断のために用いられ得る。
【０１６１】
診断方法は、抗体または抗体フラグメントをサンプルと接触させることを包含し得る。当該サンプルは、例えば、鼻道、副鼻腔洞、唾液腺、肺、肝臓、膵臓、腎臓、耳、目、胎盤、消化管、心臓、卵巣、脳下垂体、副腎、甲状腺、脳または皮膚から得られる組織サンプルであり得る。また、診断方法は、抗原／抗体複合体の検出を包含し得る。
【０１６２】
したがって、本発明は、（ｉ）本発明に係る抗体、抗体フラグメントまたはその変異体および派生物（ｉｉ）本発明に係る不死化したＢ細胞のクローン、（ｉｉｉ）本発明の抗体に結合可能なエピトープまたは（ｉｖ）治療における使用のための本発明の抗体に結合するエピトープに結合可能な、リガンドであって、好ましくは抗体を提供する。
【０１６３】
また、本発明は、本発明に係る抗体、抗体フラグメントもしくはその変異体および派生物、または本発明の抗体に結合するエピトープに結合可能なリガンドであって好ましくは抗体を、被験体に投与する工程を包含している、被験体の処置方法を提供する。一実施形態において、当該方法は、被験体における低減したＲＳＶまたはＭＰＶ感染を生じる。他の実施形態において、当該方法は、被験体におけるＲＳＶ感染またはＭＰＶ感染を、予防するか、リスクを低減するか、または遅延させる。
【０１６４】
また、本発明は、（ｉ）本発明に係る抗体、抗体フラグメントまたはその変異体および派生物（ｉｉ）本発明に係る不死化したＢ細胞のクローン、（ｉｉｉ）本発明の抗体に結合可能なエピトープ（ｉｖ）治療における使用のための本発明の抗体に結合可能なエピトープに結合する、リガンドであって、好ましくは抗体または（ｖ）（ｉ）ＲＳＶの感染またはＭＰＶの感染またはＲＳＶおよびＭＰＶの両方による感染の処置または弱毒化のための医薬の製造、（ｉｉ）ワクチン、または（ｉｉｉ）ＲＳＶおよびＭＰＶの感染の診断における、本発明の医薬組成物を提供する。
【０１６５】
本発明は、ＲＳＶおよびＭＰＶ感染の予防または処置のための医薬としての使用のための本発明の組成物を提供する。また、被験体の処置および／または被験体における診断のための医薬の製造において、本発明の抗体、および／または、当該抗体が結合するエピトープを含んでいる、タンパク質の使用を提供する。また、本発明の組成物を被験体に投与する工程を包含している、被験体を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒトである。治療的な処置の有効性を確認する一つの方法は、本発明の組成物の投与後の疾患の症状をモニタリングすることを包含している。処置は単回用量の計画または複数回用量の計画であり得る。
【０１６６】
一実施形態において、本発明に係る、抗体、抗体フラグメント、不死化したＢ細胞クローン、エピトープまたは組成物は、当該処置を必要とする被験体に投与される。かかる被験体としては、特に、ＲＳＶまたはＭＰＶ感染のリスクがあるものまたはＲＳＶまたはＭＰＶ感染を受けやすいもの（例えば、免疫無防備状態の被験体が挙げられる）が挙げられるがこれらに限定されない。また、本発明の抗体または抗体フラグメントは受動免疫化または活性化ワクチン接種において用いられ得る。
【０１６７】
また、本発明に記載されている抗体およびそのフラグメントは、ＲＳＶまたはＭＰＶ感染の診断のためのキットにおいて用いられ得る。さらに、本発明の抗体に結合可能なエピトープは、防御的な抗ＲＳＶまたは抗ＭＰＶ抗体の存在を検出することによって、ワクチン接種処置の有効性をモニタリングするためのキットにおいて用いられ得る。また、本発明に記載されている、抗体、抗体フラグメント、またはその変異体および派生物は、所望の免疫原性と有するワクチンの製造をモニタリングするためのキットにおいて用いられ得る。
【０１６８】
また、本発明は（ｉ）治療における（ｉｉ）ＲＳＶの感染またはＭＰＶの感染またはＲＳＶおよびＭＰＶの両方の感染の処置または弱毒化のための医薬の製造における（ｉｉｉ）ワクチンとしての、または（ｉｖ）ＲＳＶの感染またはＭＰＶの感染またはＲＳＶおよびＭＰＶの両方の感染を中和することが可能なリガンドのスクリーニングにおける、使用のための、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合するエピトープを提供する。
【０１６９】
また、本発明は、モノクローナル抗体を１つ以上の薬学的に許容可能な担体と混合する工程を包含している、医薬の調製方法であって、当該モノクローナル抗体は本発明のトランスフェクトされた宿主細胞から得られたモノクローナル抗体である。よって、最初にモノクローナル抗体を得る工程（例えばそれを発現させることおよび／またはそれを精製すること）および続いてそれを（複数の）薬学的な担体と混合することは異なる場所における（例えば異なる国における）異なる人々によって非常に異なる時間に行われ得る。
【０１７０】
本発明の形質転換したＢ細胞または培養した形質細胞を用いて開始して、培養、継代培養、クローニング、サブクローニング、シークエンシング、核酸調製などの種々の工程は、それぞれの工程において任意の最適化（例えば親和性成熟化または最適化）を伴って、形質転換したＢ細胞または培養した形質細胞によって発現された抗体を不滅化するために行われ得る。本発明は、当該方法中で用いられ、調製される、すべての細胞、核酸、ベクター、配列、抗体を包含している。
【０１７１】
すべてのこれらの方法において、宿主の発現に用いられる核酸は、特定の核酸配列を挿入、欠失、または改変させるために操作され得る。当該操作由来の改変としては、制限酵素部位を導入するため、コドンの使用を修正するため、転写および／または翻訳の制御配列を付加するまたは最適化するための改変が挙げられるがこれらに限定されない。また、コードされるアミノ酸を改変させるために核酸を改変させることが可能である。例えば、抗体のアミノ酸配列への、１つ以上（例えば、１、２、４、５、６、７、８、９、１０等）のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を導入することが有効であり得る。当該点変異は、作用因子の機能、抗原結合親和性、翻訳後修飾、免疫原性などを改変することができ、共有結合基（例えば標識）の付加のためのアミノ酸の導入をすることができるか、タグを導入することができる（例えば精製の目的のための）。変異は特定の部位に導入され得るか、選択（例えば分子進化）を伴って、ランダムに導入され得る。
【０１７２】
例えば、本発明の抗体の、任意のＣＤＲ領域、重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードしている１つ以上の核酸は、ランダムに、または指向的に変異されて、コードされたアミノ酸において異なる特性を導入する。当該変化は、最初の変化は維持され、他のヌクレオチドの部位における新しい変化が導入された、不活性化の工程の結果であり得る。さらに、独立した工程において実現される変化は組み合わせられ得る。コードされたアミノ酸に導入される異なる特性としては、向上した親和性が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７３】
[一般原則]
本明細書に用いられるとき、“抗原結合フラグメント”“フラグメント”および“抗体フラグメント”という用語は抗体の抗原結合活性を維持している本発明の抗体の任意のフラグメントを指すために相互交換可能に用いられる。抗体の例としては、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、本明細書で用いられる“抗体”という用語は、抗体とその抗原結合フラグメントの両方を含んでいる。
【０１７４】
本明細書に用いられるとき、“中和抗体”は、中和するすなわち、宿主において感染を開始するおよび／または不滅化するための病原体の能力を妨害、阻害、低減、遅らせることができるものである。“中和抗体”および“中和する抗体”または“中和する（複数の）抗体”は本明細書に相互交換可能に用いられる。これらの抗体は、本明細書に記載されている、診断の手段として、または生成の手段として、活性ワクチン接種との関連において適切な調合物において、予防剤または治療剤として、単独でまたは組み合わせにおいて用いられ得る。
【０１７５】
“含んでいる”という用語は“包含している”ならびに“構成している”を包含している。例えば、Ｘを“含んでいる”組成物は排他的にＸからなるか、更なる何かを含み得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１７６】
“実質的に”という語は、“完全に”を排除しない。例えば、Ｙから“実質的にフリー”である組成物は完全にＹからフリーであり得る。必要な場合、“実質的に”という語は、本発明の定義から除外され得る。
【０１７７】
“約”という用語は、数値ｘに関して、例えば、ｘ±５％、またはｘ±７％、またはｘ±１０％、または、ｘ±１２％、またはｘ±１５％またはｘ±２０％を意味する。
【０１７８】
本明細書において用いられる“疾患”という用語は、“障害”および“健康状態”（医学的状態としての）という用語と一般的に同義であって相互交換可能に用いられ、当該用語において、ヒトまたは動物の体の異常な状態すべてを反映する、または正常な機能が損なわれているその部分の１つを反映しており一般的に症候および症状を区別することによって明示され、低減した生存期間または低下した生存の質を有するヒトまたは動物の要因となる。
【０１７９】
本明細書に用いられる被験体または患者の“処置”は、予防、防御、弱毒化、緩解および治療を含むことを意図する。“被験体”または“患者”という用語は、ヒトを含むすべての哺乳類を意味するために本明細書において相互交換可能に用いられる。被験体の例としては、ヒト、ウシ、犬、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、およびウサギが挙げられる。一実施形態において、患者はヒトである。
〔実施例〕
本発明の例示的な実施形態は、以下の実施例において供される。以下の実施例は、実例として、かつ、当業者が本発明を使用するに際し助けとなるという目的のためのみに提示されている。この実施例は、いかなる方法によっても本発明の範囲を制限することを意図していない。
【０１８０】
[実施例１：ＲＳＶおよびＭＰＶの両方を交差中和することができるヒト記憶Ｂ細胞由来のモノクローナル抗体の単離および同定]
１２５人の血液提供者のコーホートから、ＲＳＶおよびＭＰＶに対し高い血清抗体価を示す７人を選択した。凍結保存された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）からＣＤ２２＋ＩｇＧ＋Ｂ細胞をソートし、エプスタイン・バールウイルス、および、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド２００６、および、フィーダー細胞として、放射線照射された同種異系のＰＢＭＣｓを用いて、ウェルあたり３から５細胞の割合で不死化した。培養上清を１４日後に採取し、Ｈｅｐ−２細胞へのＲＳＶのＡ２株の感染、または、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞へのＭＰＶ  Ａ１  Ｉ−ＰＶ−０３/０１−６６２１株の感染に基づくマイクロ中和アッセイを用いて、中和抗体の存在を解析した。それぞれ６日または８日培養したＨｅｐ−２標的細胞またはＬＬＣ−ＭＫ２標的細胞の添加に先立ち、上清の原液を、５０−１００  ＴＣＩＤ５０のウイルスと共に１時間室温で培養した。培養物に対してＷＳＴ−１試薬（ロシュ）を添加し３〜４時間おき、分光光度計を用いて生存している細胞を検出した。
【０１８１】
３つの独立した実験から、ＭＰＶを中和する３６のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）（図１、左パネル）が単離され、５つの独立した実験から、ＲＳＶを中和する１３６のｍＡｂｓ（図１、右パネル）が単離された。次いで、単離されたｍＡｂｓがＭＰＶおよびＲＳＶの両方を中和することが可能かを調べるため、二次的なスクリーニングが行われた。この戦略を用いて、同一のドナー（Ｄｏｎ．５）から得られた２つの抗体が、ＲＳＶおよびＭＰＶを交差中和することが判明した。(i)一次的なスクリーニングでＲＳＶの中和に基づき選択されたＨＭＢ２４３０、および、(ii) 一次的なスクリーニングでＭＰＶの中和に基づき選択されたＨＭＢ３２１０、である。
【０１８２】
ＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０のＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子をＩｇＧ１発現ベクターにクローン化し、２９３フリースタイル細胞（２９３Ｆ）への一過性導入により組み換えｍＡｂｓを生産した。遺伝子導入された細胞の上清を１０日間の培養の後に回収し、ＩｇＧを、プロテインＡクロマトグラフィーでアフィニティ精製した。ＩＭＧＴデータベースを用いて行ったホモロジー解析によると、前述の２つのｍＡｂｓは、ほとんどのＶ遺伝子断片およびＪ遺伝子断片（ＩＧＨＶ３−２１＊０１、ＩＧＨＪ４＊０２、ＩＧＬＶ１−４０＊０１およびＩＧＬＪ１＊０１）を共有していたが、Ｎ領域（ＨＭＢ２４３０のＤ３−１０＊０１，およびＨＭＢ３２１０のＤ５−２４＊０１）でのＩＧＨＤ用法（usage）および体細胞変異のパターンにおいて異なっており、両者はクローン的に関連していないと考えられる。
【０１８３】
ＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を、１００  ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）のウイルスを用いた上記マイクロ中和試験を使用して決定した。ＩＣ５０の値は、可変傾斜を持つ４パラメーター非線形回帰にフィットする中和曲線の補間によって計算した。解析結果を図２および表４に示す。
【０１８４】
【表４】
2020182464.tif 000005
【０１８５】
［実施例２：ＲＳＶおよびＭＰＶの全グループおよび全サブグループに対する反応性の範囲］
ＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０の反応性の範囲を評価するため、以下に示すＲＳＶ株およびＭＰＶ株を用いて得たＨｅｐ−２  ＲＳＶ感染細胞またはＬＬＣ−ＭＫ２  ＭＰＶ感染細胞に対する結合性に関して、精製されたｍＡｂｓをＦＡＣＳによって試験した。ＲＳＶ株およびＭＰＶ株：ＲＳＶ  Ａ２（Ａ、１９６１、オーストラリア；Ａ／Ａ２／６１）、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ（Ａ、メリーランド、アメリカ、１９５６；Ａ／Ｌｏｎｇ／５６）、ＲＳＶ  Ｒａｎｄａｌｌ（Ａ、シカゴ  アメリカ、１９５８；Ａ／Ｒａｎｄａｌｌ／５８）、ＲＳＶ  ９３２０（Ｂ、マサチューセッツ  アメリカ、１９７７；Ｂ／９３２０／７７）、ＷＶ／１４６１７／８５（Ｂ、ハンチントン  ウエストヴァージニア、１９８５；Ｂ／１４６１７／８５）、１８５３７（Ｂ、ワシントン・コロンビア特別区  アメリカ、１９６２；Ｂ／１８５３７／６２）、ＭＰＶ  Ｉ−ＰＶ−０３／０１−６６２１（Ａ１、パヴィーア  イタリア、２００１；Ａ１／６６２１／０１）、ＭＰＶ  Ｉ−ＰＶ−０２／０６−８９３８（Ａ２、パヴィーア  イタリア、２００６；Ａ２／８９３８／０６）、Ｉ−ＰＶ−０３／０４−４７０２（Ｂ１、パヴィーア  イタリア、２００４；Ｂ１／４７０２／０４）およびＩ−ＰＶ−０２／０４−３８１７（Ｂ２、パヴィーア  イタリア、２００４；Ｂ２／３８１７／０４）。並行して、３種類の前述のｍＡｂｓを試験した：（ｉ）モタビズマブ（ＲＳＶ特異的）；（ｉｉ）ｍＡｂｓ２３４（ＭＰＶ特異的）；および（ｉｉｉ）ＦＯ３２（インフルエンザＡ特異的。ネガティブコントロールとして使用）。全てのｍＡｂｓは１０μｇ／ｍＬの濃度で、感染細胞および非感染細胞に対する結合性の観点で試験された。ＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０は、既知のＲＳＶおよびＭＰＶのグループおよびサブグループを代表する株である試験された６種類のＲＳＶ株全ておよび４種類のＭＰＶ株全てと反応した（表５）。対照的に、モタビズマブは試験された６種類のＲＳＶ株全てと反応したが、試験された４種類のＭＰＶ株のいずれとも反応しなかった。反対に、２３４ｍＡｂｓは試験された４種類のＭＰＶ株全てと反応したが、試験された６種類のＭＰＶ株のいずれとも反応しなかった。
【０１８６】
【表５】
2020182464.tif 000006
【０１８７】
[実施例３：ＥＬＩＳＡおよび導入細胞の染色に基づいた、組み換えＦタンパク質に対するＲＳＶおよびＭＰＶの結合］
ＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０により認識される、ＲＳＶおよびＭＰＶウイルスの標的抗原を同定するため、一過性導入された２９３Ｆ細胞から生産されたＲＳＶ(Ａ２株）のホモ３量体可溶Ｆタンパク質との結合能について、モタビズマブおよびｍＡｂ２３４と並行して、上述の２種類のｍＡｂｓを解析した。図３に示すように、ＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０は、ＥＬＩＳＡによってＲＳＶのＦタンパク質と特異的に反応し、モタビズマブと比較して明らかに異なる結合プロファイルを示した。加えて、ＨＭ２４３０およびＨＭＢ３２１０は、ＲＳＶ(Ａ２株）もしくはＭＰＶ（ＮＬ／１／９９  Ｂ１株）のＦタンパク質の全長をコードしている哺乳類発現ベクターを一過性導入された２９３Ｆ細胞を、その細胞内的に染色し（表６）、ＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０が、ＲＳＶのＦタンパク質およびＭＰＶのＦタンパク質に共通して存在するエピトープを認識することを示唆した。この発見は、ＲＳＶのＦタンパク質およびＭＰＶのＦタンパク質に、３３〜３５％のアミノ酸配列同一性があるのみであることを考慮すると、特に際立ったものである。予想された通り、パリビズマブおよびモタビズマブは、ＲＳＶのＦタンパク質を発現している細胞と結合したが、ＭＰＶのＦタンパク質を発現している細胞とは結合しなかった（表６）。反対に、２３４ｍＡｂは、ＭＰＶのＦタンパク質を発現している細胞と結合したが、ＲＳＶのＦタンパク質を発現している細胞とは結合しなかった（表６）。
【０１８８】
【表６】
2020182464.tif 000007
【０１８９】
[実施例４：阻害結合アッセイを用いた、ＲＳＶ感染細胞のエピトープマッピング]
ＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０によって認識されるＦタンパク質のエピトープに関する識見を深めるため、ＲＳＶ  Ａ２株を感染させたＨｅｐ−２細胞を用いて結合阻害アッセイを行った。以下に名前を示す、ＲＳＶのＦタンパク質に特異的なｍＡｂｓは購入されたか、または遺伝子合成によって製造した：（ｉ）モタビズマブ（抗原サイトＩＩに特異的）；（ｉｉ）１０１Ｆ（抗原サイトＩＶに特異的）；（ｉｉｉ）Ｄ２５（特異性が不特定）；（ｉｖ）１３１−２ａ（抗原サイトＩに特異的）。前記ｍＡｂｓはビオチンで標識され、最大量の７０〜８０％の結合を達成するのに必要な、ｍＡｂｓの至適濃度を決定するため、Ｈｅｐ−２感染細胞に対する結合試験が行われた。その後、ビオチンで標識されたｍＡｂｓは、ＲＳＶのＡ２株感染細胞を、５０倍量の同種または異種の非標識化ｍＡｂｓとともに前培養することによって、その結合（蛍光体とコンジュゲートしているストレプトアビジンを用いて計測）が阻害されるかを評価するためのプローブとして使用された。
予想された通り、ビオチンで標識されたＨＭＢ２４３０の結合は、非標識化ＨＭＢ２４３０と共に上記細胞を前培養することによって阻害されたが、同様に非標識化ＨＭＢ３２１０によっても、その結合は、部分的に阻害された(図４）。対照的に、試験された他の全てのビオチン標識化ｍＡｂｓは、ＨＭＢ２４３０もしくはＨＭＢ３２１０のいずれとの前培養によっても阻害を受けなかった（図４）。これらの結果をまとめると、ＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０は、Ｆタンパク質上にある、ＲＳＶとＭＰＶとの間で共通しかつ互いに部分的に重複するエピトープを認識すること、またこれらのエピトープはＦタンパク質の抗原サイトＩＩ（モタビズマブおよびパリビズマブにより認識）、抗原サイトＩＶ（ｍＡｂ  １０１Ｆにより認識）、および抗原サイトＩ（ｍＡｂ  １３１−２Ａにより認識）とは異なることを示す。加えて、ＲＳＶのＦタンパク質上に存在する、ｍＡｂｓＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０により認識されるエピトープは、ｍＡｂ  Ｄ２５により認識される未知のエピトープと異なる。
【０１９０】
［実施例５：還元状態および非還元状態における、ＲＳＶおよびＭＰＶのＦタンパク質に対するモノクローナル抗体の反応性］
ＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０が、ＲＳＶのＦタンパク質およびＭＰＶのＦタンパク質の両方を認識するという発見をさらに確認するため、これらの２つのｍＡｂｓに関して、ＲＳＶおよびＭＰＶのＦタンパク質をウエスタンブロットにおいて染色する能力を試験した。Ｈｅｐ−２細胞をＲＳＶに感染させ、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞をＭＰＶに感染させ、緩和な界面活性剤に溶解し、還元状態および非還元状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに泳動させた。タンパク質はＰＶＤＦメンブレンに転写され、ＨＭＢ２４３０、ＨＭＢ３２１０、モタビズマブ、および２３４  ｍＡｂのいずれかと共に培養した。ｍＡｂの結合は抗ヒトＨＲＰ結合抗体をＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔと併用して検出した。ＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０は、非還元状態において、ＲＳＶに感染した細胞由来（図５）およびＭＰＶに感染した細胞由来（図６）のＦタンパク質に結合した。ＭＰＶ特異的なｍＡｂ  ２３４（ＲＳＶのＦタンパク質の抗原サイトＩＩに相当する、ＭＰＶのＦタンパク質上のエピトープを認識する）は、非還元状態においてＭＰＶのＦタンパク質に結合するが、ＲＳＶのＦタンパク質には結合しなかった。対照的に、ＲＳＶ特異的なｍＡｂであるモビズマブは、還元状態と非還元状態の両方においてＲＳＶのＦタンパク質と結合し、主として線状エピトープを認識することが裏付けられた。これらの結果は、モタビズマブおよびパリビズマブと異なり、ＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０は、ＲＳＶのＦタンパク質およびＭＰＶのＦタンパク質内のアミノ酸残基間のジスルフィド結合の存在に依存する、コンフォメーショナルエピトープを認識することを示唆する。
【０１９１】
［実施例６：ＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０によるＲＳＶおよびＭＰＶの全てのグループおよびサブグループの中和］
精製されたＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０ｍＡｂｓの、ＲＳＶに感染したＨｅｐ−２、または、ＭＰＶに感染したＬＬＣ−ＭＫ２細胞を中和する能力を試験した。以下のＲＳＶおよびＭＰＶ株を試験した。：ＲＳＶ  Ａ２（Ａ、１９６１、オーストラリア；Ａ／Ａ２／６１）、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ（Ａ、メリーランド、アメリカ、１９５６；Ａ／Ｌｏｎｇ／５６）、ＲＳＶ  Ｒａｎｄａｌｌ（Ａ、シカゴ  アメリカ、１９５８；Ａ／Ｒａｎｄａｌｌ／５８）、ＲＳＶ  ９３２０（Ｂ、マサチューセッツ  アメリカ、１９７７；Ｂ／９３２０／７７）、ＷＶ／１４６１７／８５（Ｂ、ハンチントン  ウエストヴァージニア、１９８５；Ｂ／１４６１７／８５）、１８５３７（Ｂ、ワシントン・コロンビア特別区  アメリカ、１９６２；Ｂ／１８５３７／６２）、ＲＳＶ  ９７２７／２００９（Ｂ、パヴィーア  イタリア、２００９；Ｂ／９７２７／０９）、ＲＳＶ  ９７３６／２００９（Ｂ、パヴィーア  イタリア、２００９；Ｂ／９７３６／０９）、ＲＳＶ  ９８４７／２００９（Ｂ、パヴィーア  イタリア、２００９；Ｂ／９８４７／０９）、ＭＰＶ  Ｉ−ＰＶ−０３／０１−６６２１（Ａ１、パヴィーア  イタリア、２００１；Ａ１／６６２１／０１）、ＭＰＶ  Ｉ−ＰＶ−０２／０６−８９３８（Ａ２、パヴィーア  イタリア、２００６；Ａ２／８９３８／０６）、Ｉ−ＰＶ−０２／０６−８９０８（Ａ２、パヴィーア  イタリア、２００６；Ａ２／８９０８／０６）、Ｉ−ＰＶ−０２／０６−８９０９（Ａ２、パヴィーア  イタリア、２００６；Ａ２／８９０９／０６）、Ｉ−ＰＶ−０３／０４−４７０２（Ｂ１、パヴィーア  イタリア、２００４；Ｂ１／４７０２／０４）およびＩ−ＰＶ−０２／０４−３８１７（Ｂ２、パヴィーア  イタリア、２００４；Ｂ２／３８１７／０４）。
【０１９２】
同じ実験において、ＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０を、パリビズマブ（ＲＳＶ特異的）および２３４ｍＡｂ（ＭＰＶ特異的）と比較した。ＨＭＢ３２１０は、既知のＲＳＶおよびＭＰＶのグループおよびサブグループを代表する株である、試験された全ての１１種類のＲＳＶ株および６種類のＭＰＶ株を中和した（表７）。ＨＭＢ２４３０は、試験された１１種類のＲＳＶ株全ておよびＭＰＶ  Ａ１およびＡ２株全てを中和したが、試験されたＭＰＶ  Ｂ１およびＢ２株を中和しなかった。予想された通り、パリビズマブは、試験された１１種類全てのＲＳＶを中和したが、６種類のＭＰＶのいずれも中和しなかった。一方、２３４  ｍＡｂは、試験された６種類全てのＭＰＶを中和したが、１１種類のＲＳＶのいずれも中和しなかった。
【０１９３】
ＨＭＢ３２１０およびＨＭＢ２４３０は、試験された１１種類全てのＲＳＶ株を非常によく中和する（それぞれＩＣ５０の平均値は０．０７０μｇ／ｍＬおよび０．１３３μｇ／ｍＬ）。この値は、平均して、パリビズマブのＩＣ５０（０．２８４μｇ／ｍＬ）の５．４倍および２．４倍高い。ＨＭＢ３２１０は、試験された６種類全てのＭＰＶ株を非常によく中和し（ＩＣ５０の平均値０．１３３μｇ／ｍＬ）、その値は、平均して、２３４のＩＣ５０（０．０４６μｇ／ｍＬ）の１．７倍低い。
【０１９４】
【表７】
2020182464.tif 000008
【０１９５】
[実施例７：ＲＳＶウイルスおよびＭＰＶウイルスのエスケープミュータントの選択の欠如]
ＨＭＢ３２１０、パリビズマブおよび２３４  ｍＡｂの、ＲＳＶもしくはＭＰＶのモノクローナル抗体抵抗性ミュータント（ＭＡＲＭｓ）を選択する能力をインビトロで試験した。何回かの試みにも関わらず、ＨＭＢ３２１０は、３２ｘ  １０ｅ６  ＲＳＶ  Ａ／Ｌｏｎｇ／５８  ＴＣＩＤ５０および１６ｘ  １０ｅ６  ＭＰＶ  Ａ１／６６２１／０１  ＴＣＩＤ５０に対して試験した場合に、ＲＳＶおよびＭＰＶのＭＡＲＭｓを選択できなかった。対照的に、パリビズマブは、高い頻度でＭＡＲＭｓを選択した（１６ｘ−１０ｅ６
ＲＳＶ  Ａ／Ｌｏｎｇ／５８  ＴＣＩＤ５０の１回のインプットから、計８５の独立したパリビズマブＭＡＲＭｓを単離し、これは１８５０００ＴＣＩＤ５０につき１の頻度に相当する）。同一の実験条件において、ｍＡｂ  ２３４はＭＰＶ  ＭＡＲＭｓを１つも選択しなかった。２３４  ｍＡｂのＭＡＲＭｓを単離することの困難さは、少数のＭＡＲＭｓを単離するために高いレベルのウイルスが必要であることを示したUlbrandt et alによる報告（Ｊ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌ  ２００８）と一致する。エスケープしたウイルスは、単離ＮＬ／１／９９  ＭＰＶ  Ｂ１を用いてＫ２４２Ｎ変異にマッピングされた。独立したパリビズマブＭＡＲＭｓ（ＰＺ−ＭＡＲＭｓ）が収集され、そのうちの１０のＦタンパク質が完全に配列解析された（表８）。ＰＺ−ＭＡＲＭ２、ＰＺ−ＭＡＲＭ３、ＰＺ−ＭＡＲＭ４、ＰＺ−ＭＡＲＭ５、ＰＺ−ＭＡＲＭ６、ＰＺ−ＭＡＲＭ８およびＰＺ−ＭＡＲＭ１０は、同じ２つのアミノ酸変異（Ｐ１０１Ｓ／Ｋ２７２Ｔ）を共有していた；ＰＺ−ＭＡＲＭ１も、同じ位置に２つのアミノ酸変異を有していたが異なるアミノ酸変異であった（Ｐ１０１Ｓ／Ｋ２７２Ｑ）；ＰＺ−ＭＡＲＭ７もまた、位置２７２に、１つのアミノ酸変異（Ｋ２７２Ｎ）を有していた；そして、ＰＺ−ＭＡＲＭ９は、他のＰＺ−ＭＡＲＭｓと共通のアミノ酸変異、および２６２の位置におけるユニークな変異（Ｐ１０１Ｓ／Ｎ２６２Ｙ）を有していた。この領域（ヌクレオチド位置８２７および８２８）における点突然変異は既に記述されており（Zhao et al. Virology 2004)、この変異は位置２７２における２つの異なるアミノ酸変異（Ｋ２７２ＱおよびＫ２７２Ｍ）をもたらすものであった。最初の突然変異（すなわちＫ２７２Ｑ）は、本明細書に記載されるＰＺ−ＭＡＲＭ１にも存在した。これらの点突然変異を保有するウイルスは、コットンラットにおいて、パリビズマブの感染予防効果に対し完全な耐性を有し（Zhao et al. Virology 2004)、他の変異を伴っている同じ変異が、予防的にパリビズマブで処置された、ＲＳＶに感染した免疫抑制コットンラットにおいて記述された。
【０１９６】
ＨＭＢ３２１０、ＨＭＢ２４３０およびパリビズマブの、ＨＥＰ−２細胞のＰＺ−ＭＡＲＭ６感染を中和する能力を試験した。パリビズマブがＰＺ−ＭＡＲＭ６を中和しなかったのに対し、ＨＭＢ３２１０およびＨＭＢ２４３０は、このウイルスを、対応する野生型ウイルスで観察されたのと同等のレベルで非常によく中和した（図７）。
【０１９７】
まとめると、これらの結果は、ＨＭＢ３２１０およびＨＭＢ２４３０はインビトロでＲＳＶおよびＭＰＶのＭＡＲＭを選択しなかったということを示した。これらの結果は、ＨＭＢ３２１０およびＨＭＢ２４３０に認識される標的エピトープは極度に保存されているために、抗体結合を無効化するような変異は、極度にまれであるか、ウイルスとしての適性喪失と関連するものである、という見解と合致している。
【０１９８】
【表８】
2020182464.tif 000009
【０１９９】
[実施例８：ＬＣＤＲ３のグリコシル化サイトの除去は、ＨＭＢ３２１０の活性に影響しない。]
ＨＭＢ３２１０の軽鎖可変部は、Ｎ−グリコシル化モチーフ（ＮｘＳ／Ｔ、ｘはプロリン以外のいかなるアミノ酸でもあり得る）をＬＣＤＲ３の１１３位（ＩＭＧＴ番号）に有する。１１３位のアスパラギン（Ｎ１１３）が、ジャームライン配列に存在するセリンと置き換えられている。可変領域におけるグリコシル化モチーフの存在は、抗体の活性にポジティブもしくはネガティブな影響を与える可能性があり、また抗体の不均一性の原因と認識されている。ＨＭＢ３２１０の軽鎖におけるグリカンの存在は、Ｎ−グリコシダーゼであるＰＮＧ−アーゼＦの存在下および非存在下における培養に続き行った、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて評価した（図８）。この解析により、少数の軽鎖が、実際にグリコシル化されていることが示された。そしてＮ１１３残基を取り除いて、対応するジャームラインがコードするセリン残基に戻した。並行して、軽鎖のフレームワーク−１領域（Ｐ７Ｔ）におけるもう１つの体細胞変異も同様に、ジャームラインがコードする７位のプロリン残基（対応するＩＧＬＶ１−４０＊０２遺伝子におけるＩＭＧＴ番号で示す）に戻すため、取り除かれた。ＨＭＢ３２１０重鎖ＶＨ．２（配列番号１７）およびＨＭＢ３２１０軽鎖ＶＬ．３によって構成されるＨＭＢ３２１０の新しい変異体（ＨＭＢ３２１０ｖ３と命名された）が生産され、ＨＭＢ３２１０ｖ２（ＨＭＢ３２１０重鎖ＶＨ．２（配列番号１７）および配列番号１４に示す軽鎖ＶＬによって構成される）とともに、ＲＳＶ  Ａ２株およびＭＰＶ  Ｉ−ＰＶ  ０３／０１−６６２１株を中和する能力を試験した。この変異体（ＨＭＢ３２１０ｖ３）は、試験したＲＳＶ株およびＭＰＶ株の両方に対するわずかに改善された中和能力を示し（図９）、すなわち、軽鎖のグリコシル化サイトの除去は、ＲＳＶおよびＭＰＶ上の標的エピトープに対する結合に影響を与えないことが示される。２種類の抗体は、その後並行してＲＳＶおよびＭＰＶ一群に対して試験され、試験された全てのウイルスに対し同等の活性を有することを示した（図１０）。結論を述べると、ＨＭＢ３２１０ｖ３は可変軽鎖においてグリコシル化されておらず、またジャームラインの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子と比較して全体でほとんど変異が無く、重鎖において８つのアミノ酸のみに体細胞変異を有し、軽鎖において４つのアミノ酸のみに体細胞変異を有していた：Ｓ５８Ａ（ＨＣＤＲ２）、１６５Ｓ（ＨＣＤＲ２）、Ｙ６６Ｄ（ＨＦＲ３）、Ｖ７１Ａ（ＨＦＲ３）、Ｎ８５Ｔ（ＨＦＲ３）、Ｙ８８Ｆ（ＨＦＲ３）、Ｖ１０１Ｉ（ＨＦＲ３）、Ｙ１０３Ｆ（ＨＦＲ３）、Ｇ５６Ｄ（ＬＣＤＲ２）、Ｓ６５Ｎ（ＬＣＤＲ２）、Ｇ７８Ａ（ＬＦＲ３）およびＳ１０９Ｒ（ＬＣＤＲ３）（全ての位置はＩＭＧＴ番号で示されている）。
【０２００】
[実施例９：ＨＭＢ３２１０およびＨＭＢ２４３０のＭＰＶに対する交差反応性は、体細胞変異に依存する。]
ＲＳＶおよびＭＰＶに対するＨＭＢ３２１０およびＨＭＢ２４３０の交差反応性における体細胞変異の役割についての見識を得るため、両方のｍＡｂのジャームラインバージョンを合成し、ＲＳＶ  Ａ２株およびＭＰＶ  Ｉ−ＰＶ  ０３／０１−６６２１株を中和する能力を試験した。ＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０の両方のジャームラインｍＡｂ（それぞれＨＭＢ２４３０−ＧＬおよびＨＭＢ３２１０−ＧＬ）は、ＨＭＢ２４３０−ＧＬの場合はＶＨ．３およびＶＬ．２から、ＨＭＢ３２１０−ＧＬの場合はＶＨ．３およびＶＬ．４から成る。ジャームラインの形態のｍＡｂは両方とも、元の体細胞変異したＨＭＢ３２１０およびＨＭＢ２４３０で観察されたのと同等のレベルで、ＲＳＶを効果的に中和した（図１１）。しかしながら、ＨＭＢ３２１０−ＧＬおよびＨＭＢ２４３０−ＧＬはＭＰＶを中和せず、それゆえＭＰＶの中和には体細胞変異が不可欠であることを示している。重鎖もしくは軽鎖の両方の体細胞変異がＭＰＶの中和に関与しているかをさらに理解するため、これらの重鎖もしくは軽鎖のいずれかを、ジャームラインの構成において有する抗体を生産した：ＶＨ．３およびＶＬにより作られるＨＭＢ２４３０−ＶＨＧＬ−ＶＬＳＭ；ＶＨ．２およびＶＬ．２により作られるＨＭＢ２４３０−ＶＨＳＭ−ＶＬＧＬ；ＶＨ．３およびＶＬにより作られるＨＭＢ３２１０−ＶＨＧＬ−ＶＬＳＭ；およびＶＨ．２およびＶＬ．４により作られるＨＭＢ３２１０−ＶＨＳＭ−ＶＬＧＬ。ＨＭＢ３２１０の重鎖の体細胞変異の除去は、ＲＳＶもしくはＭＰＶウイルスの中和に影響を与えなかった。その一方、ＨＭＢ２４３０の重鎖の体細胞変異を除去すると、ＲＳＶの中和力は維持されたが、ＭＰＶの中和に影響を与えた。ＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０の軽鎖の体細胞変異の除去は、ＭＰＶの中和力を失わせたが、ＲＳＶの中和には影響を与えなかった（図１１）。まとめると、これらの発見は、ＨＭＢ３２１０およびＨＭＢ２４３０は最初にＲＳＶによって選択され、次いで、体細胞変異の蓄積を通じてＭＰＶに対する交差活性を発達させたことを示唆している。全体でわずか３か所の軽鎖ＣＤＲの体細胞変異が、ＲＳＶ特異的ジャームライン抗体がＭＰＶ交差活性を獲得した理由である。注目すべきは、ＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０（クローン的関係は無い）は、ＬＣＤＲ３における、１０９位のＳからＲへの体細胞変異を共有していることである。
【０２０１】
[実施例１０：融合前および融合後のＦタンパク質配座の、ＨＭＢ３２１０による認識]
Ｃ末端ヒスチジンタグを伴ったＲＳＶ  Ｆの２６〜１３６および１４７〜５１２の残基（ＲＳＶ  Ａ２株の融合ペプチドのないＦエクトドメインに対応する）をコードするＤＮＡ構築物がコドン最適化され、合成された。組み換えＦは、Ｓｆ２１細胞内でバキュロウイルス発現ベクターを用いて発現され、上清からニッケルアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製された。類似の構築物は、既に融合後Ｆタンパク質の結晶構造を解明するために、他者に使用されている（Swanson et al. PNAS 2011 and McLellan et al. J Viol 2011）。タンパク質は、非還元状態においてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析され、約６５〜７０ｋＤａのバンドを示した。また、ＳＥＣによってＳ２００カラムで解析されたとき、“融合後”ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、三量体Ｆタンパク質の分子量に相当する、見かけ上約１５０ｋＤａの分子量を示す一つの対称ピークとして溶出し、ヒトＩｇＧ１抗体の溶出体積と重なり合った。“融合後”Ｆタンパク質は、ＨＭＢ３２１０もしくはパリビズマブのいずれかともに培養され、その２つの混合物がＳ２００カラムにかけられた。 “融合後”Ｆタンパク質とパリビズマブとの培養物は、Ｆタンパク質単独の場合と比較して溶出ピークの位置がより低い溶出体積側に移動しており（見かけＭＷが３００ｋＤａに相当する）、既に報告されたとおりパリビズマブが“融合後”Ｆタンパク質と結合されていることを示している。注目すべきは、ＨＭＢ３２１０および“融合後”Ｆタンパク質の培養物は溶出体積の移動が起こらなかったことである（図１２）。ＨＭＢ３２１０と“融合後”Ｆタンパク質とが独立した物質として溶出するという事実は、ＨＭＢ３２１０はパリビズマブとは異なり、“融合後”Ｆタンパク質と結合しないことを示す。
【０２０２】
Magro et. al. PNAS 2012で採用された戦略に従い、アミノ酸４残基（Ｌ４８１、Ｄ４８９、Ｓ５０９およびＤ５１０）をシステインに置換し、かつ、フューリン（ｆｕｒｉｎｅ）切断部位を除去するため、２つのＦタンパク質切断部位における塩基性アミノ酸９残基（Ｒ１０６、Ｒ１０８、Ｒ１０９、Ｋ１３１、Ｋ１３２、Ｒ１３３、Ｋ１３４、Ｒ１３５およびＲ１３６）をＮ残基に置換することで、安定化された形態の完全長の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が合成された。Ｆタンパク質の配列は、精製を容易にするため、膜貫通領域の後ろで、かつＧＦＰおよびＣ末端６−ヒスチジンタグの前へＴＥＶ切断部位を挿入することによって、さらに修飾された。導入された４つのシステインは、ＰＩＶ−５融合前Ｆの構造に従い、単量体間のジスルフィド結合の形成はＦタンパク質が融合前配座のときにのみ可能だが、融合後の構造に再び折りたたまれたときには不可能であり、そのため融合前Ｆタンパク質の安定化が可能になる位置に決定された。安定化された融合前Ｆタンパク質は、追加されたシステインがジスルフィド結合していない分子をある割合で含むので、Magro et. al.により異種性と説明される。ここで説明されたＦタンパク質の構造はバキュロウイルス発現ベクターを用いてＳｆ２１細胞で生産され、緩和な界面活性剤で細胞膜から可溶化され、ニッケルアフィニティおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製された。精製された融合前Ｆタンパク質はＳ２００カラムでＳＥＣにより分析され、三量体Ｆタンパク質の分子量に相当する、見かけ上約１５０ｋＤａの分子量を示す一つの対称ピークとして溶出し、ヒトＩｇＧ１抗体の溶出体積と重なり合った。融合前Ｆタンパク質とパリビズマブとの培養によって、その溶出ピークは、融合前Ｆタンパク質単独の場合より溶出体積の低いほうへ（見かけの分子量約３００ｋＤａに相当）移動し、さらに大きな凝集体の形成に関与する可能性のある、カラムの排除体積（void volume)に溶出する、分子量の大きな複合体の形成も誘導する。同様の溶出体積の変化は、ＨＭＢ３２１０ｖ２を融合前タンパク質と培養した場合にも観察された（図１３）。これらの結果は、パリビズマブは、融合前および融合後両方の形態のＦタンパク質と結合する一方、ＨＭＢ３２１０は選択的に融合前の形態のＦタンパク質を認識することを示唆する。２つのＦタンパク質（融合前および融合後の形態）は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によっても試験された。パリビズマブは、同様の親和性で、融合前および融合後の両方のＦタンパク質と結合した一方、ＨＭＢ３２１０ｖ３は、融合前Ｆタンパク質と高い親和性で（パリビズマブのＫｄが２ｎＭであるのに対し、定数Ｋｄが０．１ｎＭ）選択的に結合する（図１４）。
【０２０３】
[実施例１１：ＨＭＢ３２１０ｖ３は、２つの動物パラミクソウイルスとしての、ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）およびマウスネウモニアウイルス（ＰＶＭ）を交差中和する。
【０２０４】
ＨＭＢ３２１０の反応性の範囲も同様に、２種類の異なる動物パラミクソウイルスで評価した：Ｆタンパク質に関して、ＲＳＶとのアミノ酸同一性がそれぞれ８１％および４０％ある、ＢＲＳＶおよびＰＶＭの２種類のウイルスである。ＨＭＢ３２１０は、ＰＶＭ１５株およびＢＲＳＶ  ＲＢ９４株を中和する能力を試験され、それぞれＩＣ５０値１００ｎｇ／ｍＬおよび１０ｎｇ／ｍＬでウイルスに対し有効性を示した。これらの結果は、ヒトパラミクソウイルスであるＲＳＶおよびＭＰＶに加え、ＨＭＢ３２１０は、パラミクソウイルス科に属する他の２種類のウイルスに対しても有効であることを示す。
【０２０５】
[実施例１２：ＨＭＢ３２１０を用いたウイルス拡散の阻止]
我々は、ＨＭＢ３２１０およびＲＳＶ特異的抗体Ｄ２５の、中和活性とは異なる抗ＲＳＶ抗体の特性として報告されている、細胞間のウイルス拡散を防ぐ能力を測定した。我々は、ＨＥＰ−２細胞をＲＳＶ  ＡもしくはＢ株に感染させ、２０時間後に異なる濃度の抗体を加え、３日目にシンシチアの形成を試験することで、５０％抗体ウイルス拡散阻止濃度（ＩＳ５０と定義した）を決定した。両方の抗体ともより高い濃度であれば、ウイルス拡散を阻止することができた。興味深いことに、このアッセイにおいて、ＨＭＢ３２１０はより強力な中和抗体であるＤ２５と同等のＩＳ５０を示した（図１５）。
【０２０６】
[実施例１３：ＨＭＢ３２１０の、ＲＳＶ、ＭＰＶおよびＰＶＭに対する予防および治療上の有効性]
ＲＳＶマウスモデルにおいて、ＨＭＢ３２１０はパリビズマブよりも、肺におけるＲＳＶの力価を低減することに関して平均で５〜１０倍強力であり、０．１２ｍｇ／ｋｇかそれ以下の濃度で有効であった（図１６ａ）。ＭＰＶマウスモデルにおいても同等に有効であった（図１６ｂ）。ＨＭＢ３２１０の治療における可能性を試験するため、我々はＳＴＡＴ１欠損マウスをＲＳＶに感染させ、ＨＭＢ３２１０を感染後の第１、２もしくは３日に投与した。ウイルスの複製が低いことによるこのモデルの限界にもかかわらず、ＨＭＢ３２１０は全ての時点で治療上の有効性を示し、肺におけるウイルスの力価および炎症性サイトカインを低減した（図１７）。
【０２０７】
ＨＭＢ３２１０をより適切な、急性下気道感染の動物モデルで試験するため、我々は,ＨＭＢ３２１０のＰＶＭに対する交差反応性を利用した。ＰＶＭは、マウスにおいて非常に低い接種量で致命的な病気を起こし、ヒトの重篤なＲＳＶおよびＭＰＶ感染の特徴を再現するウイルスである。予防の設定においては、ＨＭＢ３２１０は、０．１２ｍｇ／ｋｇでマウスを死から保護し、０．６ｍｇ／ｋｇで体重減少から保護した（図１８ａ）。加えて治療の設定においては、感染後３日以内に３０ｍｇ／ｋｇ投与したとき、および５ｍｇ／ｋｇ投与したときの両方においてマウスを死から保護し、第４日もしくは第５日に３０ｍｇ／ｋｇ投与したときには著しい保護を与えた（図１８ｂ〜ｄ）。この系において、以前に説明されたように（Bonvill et al. 2004, journal of Virology 78:7984-7989)、ヒトの治療において唯一の認可された標準治療であるリバビリンは無効であった。重要なことに、ＨＮＢ３２１０の治療的送達は、肺におけるウイルスＲＮＡのさらなる増加を効果的に阻止した（図１９）。インビボでのエフェクター機構の役割に焦点を当てるため、ＩｇＧ１  ＨＭＢ３２１０を、補体およびＦｃレセプター結合を欠く変異体（ＨＭＢ３２１０−ＬＡＬＡ）と比較した。２種類の抗体は、インビトロでの中和活性を比較され、同等と示された。予防の設定における制限量を投与されたとき（０．１２ｍｇ／ｋｇ）、ＨＭＢ３２１０−ＬＡＬＡの活性は大きな減少を示した（図２０ａ）。対照的に、治療の設定において使用したとき、ＨＭＢ３２１０−ＬＡＬＡは試験された全ての用量においてＨＭＢ３２１０と同等の効果があった（図２０ｂ）。リバビリンが有効ではない、ＰＶＭ感染モデルにおけるＨＭＢ３２１０の治療上の有効性は、複数の因子、たとえば強力な中和性および拡散阻止活性、融合前タンパク質の選択的な認識でもって、デコイとして働く大量の融合後タンパク質により抗体が消費されないようにする、およびエスケープミュータントを選択しないこと、の組み合わせによるものである。驚くべきことに、ＰＶＭマウスモデルにおけるＨＭＢ３２１０の治療上の有効性にはエフェクターの機能は必要なく、このことはインビボの抗体の活性は主としてウイルスの中和およびウイルス拡散の阻止に依存することを示唆している。
【０２０８】
[実施例１４：ＨＭＢ３２１０は、融合後Ｆタンパク質においては接近できない、高度に保存された融合前Ｆタンパク質のベータストランドに結合する。]
ＨＭＢ３２１０によって認識されるエピトープを同定するため、ヒトＲＳＶウイルスのＦタンパク質の全体の配列をカバーする７０９５個の構造ペプチドのライブラリーでスクリーニングを行った。実施例５に示される実験は、ＨＭＢ３２１０が、ウエスタンブロットにおいて、非還元状態で、ＲＳＶおよびＭＰＶのＦタンパク質と反応することを示し、このことはＨＭＢ３２１０の標的が、その構造が陰イオン界面活性剤であるＳＤＳの存在下で安定であるエピトープであることを示唆する（図５および図６）。ライブラリーのスクリーニングの手法により、Ｆ２のＮ末端領域における、残基ＳＡＶＳＫＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴ（配列番号６３）にわたる推定上のＨＭＢ３２１０エピトープを同定した。この領域の中心の配列であるＹＬＳＡＬＲＴＧＷ（配列番号６４）は、ＲＳＶ、ＭＰＶ、ＢＲＳＶおよびＰＭＶ間で高度に保存されており（図２１）、変異体ＹＬＳＶＬＲＴＧＷ（配列番号６５）、ＹＦＳＡＬＲＴＧＷ（配列番号６６）、ＹＦＳＶＬＲＴＧＷ（配列番号６７）、ＹＫＳＡＬＲＴＧＷ（配列番号６８）およびＹＫＳＶＬＲＴＧＷ（配列番号６９）もまたＨＭＢ３２１０により認識される。この配列は、融合後ＲＳＶ  Ｆタンパク質においては表面に露出していないが、ＰＩＶ５  Ｆタンパク質（Yin, et al., 2006, Nature 439;38-44)の構造に基づき作られたＲＳＶ融合前Ｆタンパク質モデルにおいては、パリビズマブの標的であるループ領域に近接した、露出したベータストランドに位置していると予想される（図２２）。このマッピングは、実施例１０で示された、ＨＭＢ３２１０の融合前Ｆタンパク質への特異性と一致する。このエピトープはパリビズマブにより認識されるものと近いが、異なるものであり、３６４ＨＲＳＶ、１６２ＨＭＰＶ、８ＢＲＳＶおよび５ＰＶＭ株（図２３）を含む５５１株のウイルスの間で高度に保存されているＹＬＳＶＬＲＴＧＷ配列に集中している。
【０２０９】
【表９】
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【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１】図１は、インビトロでのＲＳＶまたはＭＰＶウイルス感染を中和する能力についての、７人の提供者（Ｄｏｎ．１〜７）から得られたＥＢＶ不死化記憶Ｂ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の、スクリーニング結果を示す。
【図２】図２は、モノクローナル抗体であるＨＭＢ２４３０、ＨＭＢ３２１０、２３４ｍＡｂおよびパリビズマブによる、ＲＳＶおよびＭＰＶの中和の結果を示す。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡにより測定された、モノクローナル抗体である、モタビズマブ、２３４ｍＡｂ、ＨＭＢ２４３０およびＨＭＢ３２１０による、ＲＳＶのＦタンパク質または破傷風毒素タンパク質との結合を示す。
【図４】図４は、大過剰の表示された標識されていない抗体の存在下でのＲＳＶ感染Ｈｅｐ−２細胞への標識されたモノクローナル抗体の、結合を示す。
【図５】図５は、ウェスタンブロット解析によって測定された、還元条件または非還元条件下での、ＲＳＶ−Ｈｅｐ−２感染細胞の溶解物から得たＲＳＶ  Ｆタンパク質への、モノクローナル抗体であるＨＭＢ２４３０、ＨＭＢ３２１０、２３４ｍＡｂ、およびモタビズマブの結合を示す。
【図６】図６は、ウェスタンブロット解析によって測定された、還元条件または非還元条件下での、ＭＰＶ−ＬＬＣ−ＭＫ２感染細胞のライセートから得られたＭＰＶ  Ｆタンパク質への、モノクローナル抗体であるＨＭＢ３２１０および２３４ｍＡｂの結合を示す。
【図７】図７は、モノクローナル抗体であるＨＭＢ２４３０、ＨＭＢ３２１０、２３４ｍＡｂおよびパリビズマブによる、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株およびＰＺ−ＭＡＲＭ６単離物の、中和の結果を示す。
【図８】図８は、Ｎ−グリコシダーゼであるＰＮＧ−アーゼＦのＨＭＢ３２１０ｖ２の、存在下（＋）または非存在下（−）でのインキュベートを伴う、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる解析結果を示す。黒のボックスで強調されているのは、グリコシル化されたＨＭＢ３２１０軽鎖の小断片である。
【図９】図９は、モノクローナル抗体であるＨＭＢ３２１０ｖ２およびＨＭＢ３２１０ｖ３による、ＭＰＶ  Ｉ−ＰＶ  ０３／０１−６６２１およびＲＳＶ  Ａ２の中和の結果を示す。
【図１０】図１０は、モノクローナル抗体である、ＨＭＢ３２１０ｖ２およびＨＭＢ３２１０ｖ３による、ＭＰＶおよびＲＳＶ株のパネルの中和の結果を示す。
【図１１】図１１は、ＨＭＢ３２１０およびＨＭＢ２４３０モノクローナル抗体の生殖細胞系変異体による、ＭＰＶ  Ｉ−ＰＶ  ０３／０１−６６２１およびＲＳＶ  Ａ２の中和の結果を示す。
【図１２】図１２は、ＨＭＢ３２１０またはパリビズマブと共にインキュベートあり、またはなしのＲＳＶ  Ｆ融合後組み換えタンパク質の、サイズ排除クロマトグラフィー解析の結果を示す。
【図１３】図１３は、ＨＭＢ３２１０またはパリビズマブと共にインキュベートありまたはなしのＲＳＶ  Ｆ融合前組み換えタンパク質の、サイズ除外クロマトグラフィー解析の結果を示す。
【図１４】図１４は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質および融合後ＲＳＶ  Ｆタンパク質へのＨＭＢ３２１０またはパリビズマブ（ＰＶＺ）の結合を示す。
【図１５】図１５は、ヒトモノクローナル抗体であるＨＭＢ３２１０およびＤ２５による、ウイルスの中和およびウイルスの拡散の阻害を示す。
【図１６】図１６は、ＲＳＶまたはＭＰＶ感染におけるＨＭＢ３２１０ｖ３およびパリビズマブの予防有効性を示す。
【図１７】図１７は、ＲＳＶに感染したＳＴＡＴ１欠乏マウスにおける、ＨＭＢ３２１０の治療有効性を示す。
【図１８】図１８は、致死量のＰＶＭに感染したマウスにおけるＨＭＢ３２１０の予防有効性および治療有効性を示す。
【図１９】図１９は、致死的なＰＶＭ感染後、３、４または５日における、ＨＭＢ３２１０ｖ３で処置されたマウスにおける、肺のウイルス力価の増加における阻害を示す。
【図２０】図２０は、致死量のＰＶＭに感染したマウスにおける、野生型ＦｃまたはＬＡＬＡ突然変異を有するＨＭＢ３２１０ｖ３変異体の、予防有効性および治療有効性を示す。
【図２１】図２１は、パラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）と比較した、ＲＳＶ、ＢＲＳＶ、ＰＶＭおよびＭＰＶの配列における、ＨＭＢ３２１０によって認識されるＹＬＳＡＬＲペプチドが、高い保存性を強調するアラインメントを示す。
【図２２】図２２は、ＹＬＳＡＬＲペプチドおよび隣接するパリビズマブ（ＰＶＺ）サイトの位置を示す、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質のモデル、ならびに、融合前および融合後のＲＳＶ  Ｆタンパク質の立体構造における、ＰＶＺおよびＨＭＢ３２１０ｖ３サイトの再構成を示す。
【図２３】図２３は、３６４ＲＳＶ、１６２ＭＰＶ、８ＢＲＳＶおよび５ＰＶＭ株における、ＨＭＢ３２１０コアエピトープの高度な保存を示す。
【図２４】図２４は、ＨＭＢ３２１０のさまざまな重鎖および軽鎖の変異体に対する配列を示す。
【図２４Ｂ】図２４は、ＨＭＢ３２１０のさまざまな重鎖および軽鎖の変異体に対する配列を示す。
【図２４Ｃ】図２４は、ＨＭＢ３２１０のさまざまな重鎖および軽鎖の変異体に対する配列を示す。
【図２５】図２５は、ＨＭＢ２４３０のさまざまな重鎖および軽鎖の変異体に対する配列を示す。
【図２５Ｂ】図２５は、ＨＭＢ２４３０のさまざまな重鎖および軽鎖の変異体に対する配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５】
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【図２５Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月20日(2020.7.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＳＶの融合前のＦタンパク質に特異的に結合し、かつＲＳＶの融合後のＦタンパク質に特異的に結合しない、
（ｉ）配列番号１、配列番号３９、および配列番号４０でそれぞれ規定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号４、配列番号４１、および配列番号４２でそれぞれ規定される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列；（ｉｉ）配列番号１、配列番号２、および配列番号３でそれぞれ規定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号４、配列番号４１、および配列番号４２でそれぞれ規定される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列；（ｉｉｉ）配列番号１、配列番号３９、および配列番号５３でそれぞれ規定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号４、配列番号４１、および配列番号５４でそれぞれ規定される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列；（ｉｖ）配列番号１、配列番号３９、および配列番号５３でそれぞれ規定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号４、配列番号２２、および配列番号２３でそれぞれ規定される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列；または（ｖ）配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１でそれぞれ規定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号４、配列番号４１、および配列番号５４でそれぞれ規定される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列；を含む、
単離された抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
グループＡおよびグループＢの両方のＲＳＶの感染を中和する、請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
抗原部位Ｉ、抗原部位ＩＩまたは抗原部位ＩＶと重複する部位においてＲＳＶのＦタンパク質と結合しない、請求項１または２に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
配列番号６４〜６９のいずれか１つで規定されるアミノ酸配列を含む、ＲＳＶのＦタンパク質のアミノ末端部の保存領域のそれぞれと結合する、請求項１から３のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
ＲＳＶを５０％中和するために必要な、上記抗体、またはその抗体結合フラグメントの濃度が５００ｎｇ／ｍｌ以下である、請求項１から４のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
配列番号１７、３３、４９または５９のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
配列番号３０、５０または６０のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、
上記抗体は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、
ＲＳＶの融合前のＦタンパク質に特異的に結合し、かつＲＳＶの融合後のＦタンパク質に特異的に結合しない、抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
上記抗体が、ヒト抗体、モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、精製された抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖである請求項１から８のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
ＲＳＶの感染の治療または弱毒化のための、請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸分子。
【請求項１２】
上記ポリヌクレオチド配列は、配列番号７〜１０、２４〜２８、４３〜４８および５５〜５８のいずれか１つの核酸配列と少なくとも７５％の同一性を有する、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１４】
請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントを発現している、または請求項１３に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１５】
請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項１１もしくは１２に記載の核酸、請求項１３に記載のベクター、または、請求項１４に記載の細胞、および薬学的に許容可能な希釈剤または担体を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
第１の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび第２の抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、当該第１の抗体は請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体であり、当該第２の抗体はＲＳＶもしくはＭＰＶまたはＲＳＶおよびＭＰＶの両方の感染を中和する、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項１１もしくは１２に記載の核酸、請求項１３に記載のベクター、請求項１４に記載の細胞、または請求項１５もしくは１６に記載の医薬組成物の、（ｉ）ＲＳＶ感染の治療もしくは弱毒化のための薬物の製造における、または、（ｉｉ）ワクチンの製造における、使用。
【請求項１８】
治療上の有効量の請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、それを必要とする被験体において、ＲＳＶ感染を低減するまたはＲＳＶ感染のリスクを低下させる、医薬組成物。