(57)【要約】【課題】改善されたＴ細胞組成物を提供すること。【解決手段】本発明は、改善されたＴ細胞組成物およびＴ細胞を製造するための方法を提供する。より詳細には、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで改善された生存、増大および持続性を有する養子Ｔ細胞免疫療法をもたらすＴ細胞製造方法を提供する。一局面では、Ｔ細胞を製造するための方法が提供され、この方法は、（ａ）Ｔ細胞の集団を活性化し、Ｔ細胞の上記集団を刺激して、増殖させるステップであって、上記活性化および刺激ステップがＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で行われる、ステップと、（ｂ）上記Ｔ細胞に、工学的に作製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むウイルスベクターを用いて形質導入を行うステップと、（ｃ）形質導入された上記Ｔ細胞を培養して増殖させるステップとを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞を製造するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏの方法であって、
（ａ）Ｔ細胞の集団を活性化し、Ｔ細胞の前記集団を刺激して、増殖させるステップと、
（ｂ）前記Ｔ細胞に、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを用いて形質導入を行うステップと、
（ｃ）形質導入された前記Ｔ細胞を培養して増殖させるステップと
を含み、ステップａ）〜ｃ）が、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤の存在下で行われ、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で行われるステップａ）〜ｃ）に従って製造されたＴ細胞において、Ｔ細胞の分化が、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤の非存在下で行われるステップａ）〜ｃ）に従って製造されたＴ細胞におけるＴ細胞の分化と比較して減少される、方法。
【請求項２】
（ａ）Ｔ細胞の供給源が末梢血単核細胞である、
（ｂ）前記Ｔ細胞の活性化が、前記Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体またはそのＣＤ３結合性断片と接触させることを含む、または
（ｃ）前記Ｔ細胞の刺激が、前記Ｔ細胞を抗ＣＤ２８抗体もしくはそのＣＤ２８結合性断片、Ｂ７−１もしくはそのＣＤ２８結合性断片、またはＢ７−２もしくはそのＣＤ２８結合性断片と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲが、以下：
（ａ）抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合性断片を含む細胞外ドメインと、
（ｂ）ＣＤ８αまたはＣＤ２８膜貫通ドメインと、
（ｃ）ＣＤ２８またはＣＤ１３７（４１ＢＢ）共刺激ドメインと、
（ｄ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと
を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲが、以下：
（ａ）抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合性断片を含む細胞外ドメインと、
（ｂ）ＣＤ８α膜貫通ドメインと、
（ｃ）ＣＤ１３７（４１ＢＢ）共刺激ドメインと、
（ｄ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと
を含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体またはその抗原結合性断片が、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲが、ヒンジ領域ポリペプチドをさらに含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒンジ領域ポリペプチドが、ＩｇＧ１ヒンジドメインまたはＣＤ８αヒンジドメインを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲが、シグナルペプチドをさらに含む、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記シグナルペプチドが、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチドまたはＣＤ８αシグナルポリペプチドを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）前記ＰＩ３Ｋ阻害剤が、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２およびＧＤＣ−０９４１からなる群より選択される汎ＰＩ３Ｋ阻害剤である、
（ｂ）前記ＰＩ３Ｋ阻害剤が、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ−２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ−１０１およびＩＰＩ−１４５からなる群より選択される選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤である、または
（ｃ）前記ＰＩ３Ｋ阻害剤が、ＺＳＴＫ４７４である、
請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲを含むレンチウイルスベクターを含む免疫エフェクター細胞の集団であって、前記免疫エフェクター細胞が、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で増殖するように活性化および刺激されており、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で行われる活性化および刺激が、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤の非存在下で活性化および刺激された免疫エフェクター細胞の集団と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２またはＣＤ１２７のうち１種または複数の発現を増加させ、かつ、前記免疫エフェクター細胞の集団におけるＣＤ５７またはＫＬＲＧ１の発現を減少させ、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤が、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ＧＤＣ−０９４１、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ−２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ−１０１、ＩＰＩ−１４５およびＺＳＴＫ４７４からなる群より選択される、集団。
【請求項１２】
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含む、請求項１１に記載の免疫エフェクター細胞の集団。
【請求項１３】
請求項１１に記載の免疫エフェクター細胞の集団と、生理学的に許容される賦形剤とを含む組成物。
【請求項１４】
血液学的悪性疾患の処置を必要とする被験体における血液学的悪性疾患の処置に使用するための、治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ａｍｏｕｎｔ）の請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記血液学的悪性疾患が、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）からなる群より選択されるＢ細胞悪性疾患である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＭＭが、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫からなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＮＨＬが、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫からなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法１１９条（ｅ）の下で２０１４年６月６日に出願された米国仮特許出願第６２／００８，９５７号の利益を主張し、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、改善されたＴ細胞組成物およびＴ細胞を製造するための方法に関する。より詳細には、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで改善された生存、増大および持続性を有する養子Ｔ細胞免疫療法をもたらすＴ細胞製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
養子免疫療法は、疾患に対する療法のためにＴリンパ球を被験体に移入することである。養子免疫療法は、がん、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患および免疫不全症を含めた多種多様な疾患を処置する潜在性をまだ実現していない。しかし、養子免疫療法戦略の全てではないが大多数は、臨床的に有効な治療用量のＴ細胞を生成するために、Ｔ細胞活性化および増大ステップを必要とする。工学的に作製されたＴ細胞を含めた治療用量のＴ細胞を生成するための現行の技術は、煩わしいＴ細胞製造プロセスによって未だ限定されている。例えば、Ｔ細胞増大は、多くの場合、治療的に意義のあるＴ細胞数を達成するために、労働集約的で高価なクローニングおよび／または複数ラウンドの活性化／増大を必要とする。加えて、既存のＴ細胞活性化／増大方法は、通常、実質的なＴ細胞分化を伴い、通例、短命な生存を含めた短命な効果ならびに移入されたＴ細胞の持続性の欠如およびｉｎ  ｖｉｖｏ増大の欠如をもたらす。したがって、既存のＴ細胞製造プロセスは、エフェクター免疫細胞機能の消耗および喪失を起こしやすい、質の低いＴ細胞産物を生じさせる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在まで、工学的に作製されたＴ細胞の養子免疫療法の臨床有効性は、患者への注入後の不十分なＴ細胞増大および持続性によって限定されている。したがって、そのような療法は、広範にわたる臨床使用には適さない。よって、Ｔ細胞製造、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏで生存、増大および持続する治療用Ｔ細胞組成物の改善に対する、根強く満たされていない必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、一般に、持続性かつ能力ある抗腫瘍性Ｔ細胞組成物を含む養子Ｔ細胞免疫療法およびこれを作製する方法を提供する。
【０００６】
本発明は、改善されたＴ細胞組成物およびＴ細胞を製造するための方法に関する。より詳細には、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで改善された生存、増大および持続性をもたらすＴ細胞製造方法に関する。
【０００７】
種々の実施形態では、Ｔ細胞を製造するための方法であって、（ａ）被験体からＴ細胞、例えば、腫瘍浸潤細胞傷害性Ｔリンパ球（ＴＩＬ）の集団を単離するステップと、（ｂ）Ｔ細胞の集団を活性化し、Ｔ細胞の集団を刺激して、増殖させるステップであって、活性化および刺激ステップがＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で行われるステップと、（ｃ）Ｔ細胞を培養して増殖させるステップとを含み、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で行われる活性化および刺激ステップの結果として、Ｔ細胞の増殖が、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の非存在下で活性化および刺激されたＴ細胞の増殖と比較して維持される、方法が提供される。
【０００８】
種々の実施形態では、Ｔ細胞を製造するための方法であって、（ａ）Ｔ細胞の集団を活性化し、Ｔ細胞の集団を刺激して、増殖させるステップであって、活性化および刺激ステップがＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で行われるステップと、（ｂ）Ｔ細胞に、工学的に作製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むウイルスベクターを用いて形質導入を行うステップと、（ｃ）形質導入されたＴ細胞を培養して増殖させるステップとを含み、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で行われる活性化および刺激ステップの結果として、形質導入されたＴ細胞の増殖が、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の非存在下で活性化および刺激された、形質導入されたＴ細胞の増殖と比較して維持される、方法が提供される。
【０００９】
特定の実施形態では、本明細書において意図されている方法は、Ｔ細胞の供給源として末梢血単核細胞を単離するステップを含む。
【００１０】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体またはそのＣＤ３結合性断片と接触させることを含む。
【００１１】
追加的な実施形態では、Ｔ細胞の刺激は、Ｔ細胞を抗ＣＤ２８抗体もしくはそのＣＤ２８結合性断片、Ｂ７−１もしくはそのＣＤ２８結合性断片、またはＢ７−２もしくはそのＣＤ２８結合性断片と接触させることを含む。
【００１２】
一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞増殖の前にウイルスベクターを用いて形質導入される。
【００１３】
ある特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞増殖の後にウイルスベクターを用いて形質導入される。
【００１４】
特定の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターである。
【００１５】
さらなる実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００１６】
他の特定の実施形態では、細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。
【００１７】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＰＶ、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、およびＶＥＧＦＲ２からなる群より選択される抗原に結合する細胞外ドメイン；ＣＤ８α；ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＰＤ１、およびＣＤ１５２からなる群より選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン；ＣＤ２８、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、およびＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）からなる群より選択される１種または複数種の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【００１８】
追加的な実施形態では、細胞外ドメインは、抗原に結合する抗体または抗原結合性断片を含む。
【００１９】
ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αまたはＣＤ２８に由来する。
【００２０】
さらなる実施形態では、１種または複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４およびＣＤ１３７からなる群より選択される。
【００２１】
追加的な実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジ領域ポリペプチドを含む。
【００２２】
特定の実施形態では、ヒンジ領域ポリペプチドは、ＩｇＧ１またはＣＤ８αのヒンジ領域を含む。
【００２３】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、シグナルペプチドを含む。
【００２４】
一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチドまたはＣＤ８αシグナルポリペプチドを含む。
【００２５】
一部の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ＧＤＣ−０９４１、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ−２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ−１０１、ＩＰＩ−１４５、ＭＫ−２２０６、ＧＳＫ６９０６９３、ＧＤＣ−００６８、Ａ−６７４５６３、ＣＣＴ１２８９３０、ＡＺＤ８０５５、ＩＮＫ１２８、ラパマイシン、ＰＦ−０４６９１５０２、エベロリムス、ＢＩ−Ｄ１８７０、Ｈ８９、ＰＦ−４７０８６７１、ＦＭＫ、ＡＴ７８６７、ＮＵ７４４１、ＰＩ−１０３、ＮＵ７０２６、ＰＩＫ−７５、ＺＳＴＫ４７４およびＰＰ−１２１からなる群より選択される。
【００２６】
特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２およびＧＤＣ−０９４１からなる群より選択される汎ＰＩ３Ｋ阻害剤である。
【００２７】
他の特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ−２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ−１０１およびＩＰＩ−１４５からなる群より選択される選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤である。
【００２８】
他の特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＺＳＴＫ４７４である。
【００２９】
特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＭＫ−２２０６、ＧＳＫ６９０６９３およびＧＤＣ−００６８からなる群より選択される汎ＡＫＴ阻害剤である。
【００３０】
追加的な実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、選択的ＡＫＴ１阻害剤Ａ−６７４５６３である。
【００３１】
ある特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、選択的ＡＫＴ２阻害剤ＣＣＴ１２８９３０である。
【００３２】
ある特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＡＫＴのＤＮＡ−ＰＫ活性化を阻害する。
【００３３】
さらなる実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＡＫＴのＰＤＫ−１活性化を阻害する。
【００３４】
特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＡＫＴのｍＴＯＲＣ２活性化を阻害する。
【００３５】
追加的な実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＡＫＴのＨＳＰ活性化を阻害する。
【００３６】
他の特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＡＺＤ８０５５、ＩＮＫ１２８およびラパマイシンからなる群より選択される汎ｍＴＯＲ阻害剤である。
【００３７】
ある特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＰＦ−０４６９１５０２およびエベロリムスからなる群より選択される選択的ｍＴＯＲＣ１阻害剤である。
【００３８】
特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＢＩ−Ｄ１８７０、Ｈ８９、ＰＦ−４７０８６７１、ＦＭＫおよびＡＴ７８６７からなる群より選択されるｓ６キナーゼ阻害剤である。
【００３９】
特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＮＵ７４４１、ＰＩ−１０３、ＮＵ７０２６、ＰＩＫ−７５およびＰＰ−１２１からなる群より選択されるＤＮＡ−ＰＫ阻害剤である。
【００４０】
一部の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で活性化および刺激されたＴ細胞の集団は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の非存在下で活性化および刺激されたＴ細胞の集団と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２およびＣＤ１２７からなる群より選択される１種または複数のマーカーを発現する増加した数のＴ細胞を有する。
【００４１】
さらなる実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で活性化および刺激されたＴ細胞の集団は、ＣＤ５７もＫＬＲＧ１も発現しない、またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の非存在下で活性化および刺激されたＴ細胞の集団と比較して少ないＣＤ５７もしくはＫＬＲＧ１を発現する。
【００４２】
種々の実施形態では、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現する再刺激されたＴ細胞の増殖を維持し、分化を減少させるための方法であって、（ａ）工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを含む増殖させたＴ細胞の集団の全体または一部を、抗ＣＤ３抗体またはそのＣＤ３結合性断片およびＴ細胞の表面上のＣＤ２８アクセサリー分子を刺激する抗ＣＤ２８抗体またはそのＣＤ２８結合性断片と接触させて、それにより、活性化されたＴ細胞を再刺激して増殖させるステップを含み、再刺激されたＴ細胞が、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の非存在下で刺激または再刺激されたＴ細胞の増殖と比較して、維持された増殖および減少された分化を有する、方法が提供される。
【００４３】
特定の実施形態では、細胞は、工学的に作製されたＴＣＲを含む。
【００４４】
ある特定の実施形態では、細胞は、ＣＡＲを含む。
【００４５】
他の特定の実施形態では、細胞は、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲをコードするウイルスベクターを含む。
【００４６】
追加的な実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターである。
【００４７】
追加的な実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００４８】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、およびＶＥＧＦＲ２からなる群より選択される抗原に結合する細胞外ドメイン；ＣＤ８α；ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＰＤ１、およびＣＤ１５２からなる群より選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン；ＣＤ２８、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、およびＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）からなる群より選択される１種または複数種の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【００４９】
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、抗原に結合する抗体または抗原結合性断片を含む。
【００５０】
ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αまたはＣＤ２８に由来する。
【００５１】
さらなる実施形態では、１種または複数種の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群より選択される。
【００５２】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジ領域ポリペプチドを含む。
【００５３】
さらなる実施形態では、ヒンジ領域ポリペプチドは、ＩｇＧ１またはＣＤ８αのヒンジ領域を含む。
【００５４】
追加的な実施形態では、ＣＡＲは、シグナルペプチドを含む。
【００５５】
他の特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチドまたはＣＤ８αシグナルポリペプチドを含む。
【００５６】
特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ＧＤＣ−０９４１、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ−２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ−１０１、ＩＰＩ−１４５、ＭＫ−２２０６、ＧＳＫ６９０６９３、ＧＤＣ−００６８、Ａ−６７４５６３、ＣＣＴ１２８９３０、ＡＺＤ８０５５、ＩＮＫ１２８、ラパマイシン、ＰＦ−０４６９１５０２、エベロリムス、ＢＩ−Ｄ１８７０、Ｈ８９、ＰＦ−４７０８６７１、ＦＭＫ、ＡＴ７８６７、ＮＵ７４４１、ＰＩ−１０３、ＮＵ７０２６、ＰＩＫ−７５、ＺＳＴＫ４７４およびＰＰ−１２１からなる群より選択される。
【００５７】
さらなる実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２およびＧＤＣ−０９４１からなる群より選択される汎ＰＩ３Ｋ阻害剤である。
【００５８】
他の特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ−２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ−１０１およびＩＰＩ−１４５からなる群より選択される選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤である。
【００５９】
他の特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＺＳＴＫ４７４である。
【００６０】
ある特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＭＫ−２２０６、ＧＳＫ６９０６９３およびＧＤＣ−００６８からなる群より選択される汎ＡＫＴ阻害剤である。
【００６１】
特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、選択的ＡＫＴ１阻害剤Ａ−６７４５６３である。
【００６２】
追加的な実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、選択的ＡＫＴ２阻害剤ＣＣＴ１２８９３０である。
【００６３】
一部の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＡＫＴのＤＮＡ−ＰＫ活性化を阻害する。
【００６４】
特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＡＫＴのＰＤＫ−１活性化を阻害する。
【００６５】
ある特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＡＫＴのｍＴＯＲＣ２活性化を阻害する。
【００６６】
特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＡＫＴのＨＳＰ活性化を阻害する。
【００６７】
さらなる実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＡＺＤ８０５５、ＩＮＫ１２８およびラパマイシンからなる群より選択される汎ｍＴＯＲ阻害剤である。
【００６８】
追加的な実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＰＦ−０４６９１５０２およびエベロリムスからなる群より選択される選択的ｍＴＯＲＣ１阻害剤である。
【００６９】
一部の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＢＩ−Ｄ１８７０、Ｈ８９、ＰＦ−４７０８６７１、ＦＭＫおよびＡＴ７８６７からなる群より選択されるｓ６キナーゼ阻害剤である。
【００７０】
他の特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＮＵ７４４１、ＰＩ−１０３、ＮＵ７０２６、ＰＩＫ−７５およびＰＰ−１２１からなる群より選択されるＤＮＡ−ＰＫ阻害剤である。
【００７１】
特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で再刺激された活性化されたＴ細胞の集団は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の非存在下で活性化および刺激されたＴ細胞の集団と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２およびＣＤ１２７からなる群より選択される１種または複数のマーカーを発現する増加した数のＴ細胞を有する。
【００７２】
追加的な実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で再刺激された活性化されたＴ細胞の集団は、ＣＤ５７もＫＬＲＧ１も発現しない、またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の非存在下で活性化および刺激されたＴ細胞の集団と比較して少ないＣＤ５７もしくはＫＬＲＧ１を発現する。
【００７３】
種々の実施形態では、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを含むベクターを含むＴ細胞の集団であって、細胞が、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で増殖するように活性化および刺激されている、集団が提供される。
【００７４】
種々の特定の実施形態では、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを含むベクターを含むＴ細胞の集団であって、細胞が、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で増殖するように活性化および刺激されており、増殖させた免疫エフェクター細胞の集団の全体または一部を、抗ＣＤ３抗体またはそのＣＤ３結合性断片、および免疫エフェクター細胞の表面上のＣＤ２８アクセサリー分子を刺激する抗ＣＤ２８抗体またはそのＣＤ２８結合性断片と接触させることにより再刺激されている、集団が提供される。
【００７５】
ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。
【００７６】
一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＴＩＬである。
【００７７】
種々の実施形態では、本明細書において意図されている免疫エフェクター細胞の集団と、生理学的に許容される賦形剤とを含む組成物が提供される。
【００７８】
種々のある特定の実施形態では、それを必要とする被験体においてがんを処置する方法であって、被験体に治療有効量の本明細書において意図されているＴ細胞組成物を投与するステップを含む方法が提供される。
【００７９】
特定の実施形態では、がんは、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、前立腺がん、肝臓がん、腎がん、膵がん、肺がん、胆管がん、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜がん、食道がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部がん、甲状腺髄様癌、卵巣がん、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫および膀胱がん（ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）からなる群より選択される。
【００８０】
一実施形態では、がんは、ウイルス感染、例えば、ＣＭＶ、ＨＰＶまたはＥＢＶによる感染を伴うまたはこれに起因する。
追加的な実施形態では、がんは、膵がんであり、細胞外結合性ドメインは、ＰＳＣＡまたはＭＵＣ１のエピトープに結合する。
一部の実施形態では、がんは、膀胱がん（ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）であり、細胞外結合性ドメインは、ＰＳＣＡまたはＭＵＣ１のエピトープに結合する。
【００８１】
さらなる実施形態では、がんは、多形神経膠芽腫であり、細胞外結合性ドメインは、ＥＰＨＡ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＣＳＰＧ４のエピトープに結合する。
【００８２】
特定の実施形態では、がんは、肺がんであり、細胞外結合性ドメインは、ＰＳＣＡまたはＧＤ２のエピトープに結合する。
【００８３】
ある特定の実施形態では、がんは、乳がんであり、細胞外結合性ドメインは、ＣＳＰＧ４またはＨＥＲ２のエピトープに結合する。
【００８４】
追加的な実施形態では、がんは、黒色腫であり、細胞外結合性ドメインは、ＣＳＰＧ４またはＧＤ２のエピトープに結合する。
【００８５】
特定の実施形態では、がんは、Ｂ細胞悪性疾患であり、結合性ドメインは、ＢＣＭＡのエピトープに結合する。
【００８６】
種々の実施形態では、それを必要とする被験体において血液学的悪性疾患を処置する方法であって、被験体に治療有効（ｅｆｆｅｃｔ）量の本明細書において意図されているＴ細胞組成物を投与するステップを含む方法が提供される。
【００８７】
ある特定の実施形態では、血液学的悪性疾患は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）からなる群より選択されるＢ細胞悪性疾患である。
【００８８】
特定の実施形態では、ＭＭは、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫からなる群より選択される。
【００８９】
ある特定の実施形態では、ＮＨＬは、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫からなる群より選択される。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
Ｔ細胞を製造するための方法であって、
（ａ）Ｔ細胞の集団を活性化し、Ｔ細胞の前記集団を刺激して、増殖させるステップであって、前記活性化および刺激ステップがＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で行われる、ステップと、
（ｂ）前記Ｔ細胞に、工学的に作製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むウイルスベクターを用いて形質導入を行うステップと、
（ｃ）形質導入された前記Ｔ細胞を培養して増殖させるステップと
を含み、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤の存在下で行われる前記活性化および刺激ステップの結果として、形質導入された前記Ｔ細胞の増殖が、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤の非存在下で活性化および刺激された、形質導入されたＴ細胞の増殖と比較して維持される、方法。
（項目２）
Ｔ細胞の供給源として末梢血単核細胞を単離するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記Ｔ細胞の活性化が、前記Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体またはそのＣＤ３結合性断片と接触させることを含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記Ｔ細胞の刺激が、前記Ｔ細胞を抗ＣＤ２８抗体もしくはそのＣＤ２８結合性断片、Ｂ７−１もしくはそのＣＤ２８結合性断片、またはＢ７−２もしくはそのＣＤ２８結合性断片と接触させることを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記細胞が、Ｔ細胞増殖の前に前記ウイルスベクターを用いて形質導入される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記細胞が、Ｔ細胞増殖の後に前記ウイルスベクターを用いて形質導入される、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、項目１から６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、項目１から７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、項目１から８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記ＣＡＲが、以下：
ａ）アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソセリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭおよびＶＥＧＦＲ２からなる群より選択される抗原に結合する細胞外ドメインと、
ｂ）ＣＤ８α；ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＰＤ−１およびＣＤ１５２からなる群より選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメインと、
ｃ）ＣＤ２８、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）およびＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）からなる群より選択される１種または複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、
ｄ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと
を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記細胞外ドメインが、前記抗原に結合する抗体または抗原結合性断片を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８αまたはＣＤ２８に由来する、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
１種または複数の前記共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３４およびＣＤ１３７からなる群より選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
ヒンジ領域ポリペプチドをさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１５）
前記ヒンジ領域ポリペプチドが、ＩｇＧ１またはＣＤ８αのヒンジ領域を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
シグナルペプチドをさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１７）
前記シグナルペプチドが、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチドまたはＣＤ８αシグナルポリペプチドを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ＧＤＣ−０９４１、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ−２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ−１０１、ＩＰＩ−１４５、ＭＫ−２２０６、ＧＳＫ６９０６９３、ＧＤＣ−００６８、Ａ−６７４５６３、ＣＣＴ１２８９３０、ＡＺＤ８０５５、ＩＮＫ１２８、ラパマイシン、ＰＦ−０４６９１５０２、エベロリムス、ＢＩ−Ｄ１８７０、Ｈ８９、ＰＦ−４７０８６７１、ＦＭＫ、ＡＴ７８６７、ＮＵ７４４１、ＰＩ−１０３、ＮＵ７０２６、ＰＩＫ−７５、ＺＳＴＫ４７４およびＰＰ−１２１からなる群より選択される、項目１から１７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２およびＧＤＣ−０９４１からなる群より選択される汎ＰＩ３Ｋ阻害剤である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ−２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ−１０１およびＩＰＩ−１４５からなる群より選択される選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤である、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＰＩ３−Ｋ阻害剤ＺＳＴＫ４７４である、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＭＫ−２２０６、ＧＳＫ６９０６９３およびＧＤＣ−００６８からなる群より選択される汎ＡＫＴ阻害剤である、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、選択的ＡＫＴ１阻害剤Ａ−６７４５６３である、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、選択的ＡＫＴ２阻害剤ＣＣＴ１２８９３０である、項目１８に記載の方法。
（項目２５）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＡＫＴのＤＮＡ−ＰＫ活性化を阻害する、項目１８に記載の方法。
（項目２６）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＡＫＴのＰＤＫ−１活性化を阻害する、項目１８に記載の方法。
（項目２７）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＡＫＴのｍＴＯＲＣ２活性化を阻害する、項目１８に記載の方法。
（項目２８）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＡＫＴのＨＳＰ活性化を阻害する、項目１８に記載の方法。
（項目２９）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＡＺＤ８０５５、ＩＮＫ１２８およびラパマイシンからなる群より選択される汎ｍＴＯＲ阻害剤である、項目１８に記載の方法。
（項目３０）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＰＦ−０４６９１５０２およびエベロリムスからなる群より選択される選択的ｍＴＯＲＣ１阻害剤である、項目１８に記載の方法。
（項目３１）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＢＩ−Ｄ１８７０、Ｈ８９、ＰＦ−４７０８６７１、ＦＭＫおよびＡＴ７８６７からなる群より選択されるｓ６キナーゼ阻害剤である、項目１８に記載の方法。
（項目３２）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＮＵ７４４１、ＰＩ−１０３、ＮＵ７０２６、ＰＩＫ−７５およびＰＰ−１２１からなる群より選択されるＤＮＡ−ＰＫ阻害剤である、項目１８に記載の方法。
（項目３３）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で活性化および刺激されたＴ細胞の前記集団が、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤の非存在下で活性化および刺激されたＴ細胞の集団と比較して増加した数の、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２およびＣＤ１２７からなる群より選択される１種または複数のマーカーを発現するＴ細胞を有する、項目１から３２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で活性化および刺激されたＴ細胞の前記集団が、ＣＤ５７もＫＬＲＧ１も発現しない、またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤の非存在下で活性化および刺激されたＴ細胞の集団と比較して少ないＣＤ５７もしくはＫＬＲＧ１を発現する、項目３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現する再刺激されたＴ細胞の増殖を維持し、分化を減少させるための方法であって、
（ａ）工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを含む増殖させたＴ細胞の集団の全体または一部を、抗ＣＤ３抗体またはそのＣＤ３結合性断片および前記Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８アクセサリー分子を刺激する抗ＣＤ２８抗体またはそのＣＤ２８結合性断片と接触させて、それにより、活性化された前記Ｔ細胞を再刺激して増殖させるステップを含み、
再刺激された前記Ｔ細胞が、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の非存在下で刺激または再刺激されたＴ細胞の増殖と比較して、維持された増殖および減少された分化を有する、方法。
（項目３６）
前記細胞が、工学的に作製されたＴＣＲを含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記細胞が、ＣＡＲを含む、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記細胞が、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲをコードするウイルスベクターを含む、項目３５から３７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記ＣＡＲが、以下：
ａ）アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、’グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、およびＶＥＧＦＲ２からなる群より選択される抗原に結合する細胞外ドメイン；
ｂ）ＣＤ８α；ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＰＤ１、およびＣＤ１５２からなる群より選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン；
ｃ）ＣＤ２８、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、およびＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）からなる群より選択される１種または複数種の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに
ｄ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン
を含む、項目３７から４０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記細胞外ドメインが、前記抗原に結合する抗体または抗原結合性断片を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８αまたはＣＤ２８に由来する、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
１種または複数種の前記共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群より選択される、項目４１に記載の方法。
（項目４５）
ヒンジ領域ポリペプチドをさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４６）
前記ヒンジ領域ポリペプチドが、ＩｇＧ１またはＣＤ８αのヒンジ領域を含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
シグナルペプチドをさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４８）
前記シグナルペプチドが、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチドまたはＣＤ８αシグナルポリペプチドを含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ＧＤＣ−０９４１、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ−２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ−１０１、ＩＰＩ−１４５、ＭＫ−２２０６、ＧＳＫ６９０６９３、ＧＤＣ−００６８、Ａ−６７４５６３、ＣＣＴ１２８９３０、ＡＺＤ８０５５、ＩＮＫ１２８、ラパマイシン、ＰＦ−０４６９１５０２、エベロリムス、ＢＩ−Ｄ１８７０、Ｈ８９、ＰＦ−４７０８６７１、ＦＭＫ、ＡＴ７８６７、ＮＵ７４４１、ＰＩ−１０３、ＮＵ７０２６、ＰＩＫ−７５、ＺＳＴＫ４７４およびＰＰ−１２１からなる群より選択される、項目３５から４８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２およびＧＤＣ−０９４１からなる群より選択される汎ＰＩ３Ｋ阻害剤である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ−２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ−１０１およびＩＰＩ−１４５からなる群より選択される選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤である、項目４９に記載の方法。
（項目５２）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＰＩ３−Ｋ阻害剤ＺＳＴＫ４７４である、項目４９に記載の方法。
（項目５３）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＭＫ−２２０６、ＧＳＫ６９０６９３およびＧＤＣ−００６８からなる群より選択される汎ＡＫＴ阻害剤である、項目４９に記載の方法。
（項目５４）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、選択的ＡＫＴ１阻害剤Ａ−６７４５６３である、項目４９に記載の方法。
（項目５５）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、選択的ＡＫＴ２阻害剤ＣＣＴ１２８９３０である、項目４９に記載の方法。
（項目５６）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＡＫＴのＤＮＡ−ＰＫ活性化を阻害する、項目４９に記載の方法。
（項目５７）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＡＫＴのＰＤＫ−１活性化を阻害する、項目４９に記載の方法。
（項目５８）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＡＫＴのｍＴＯＲＣ２活性化を阻害する、項目４９に記載の方法。
（項目５９）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＡＫＴのＨＳＰ活性化を阻害する、項目４９に記載の方法。
（項目６０）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＡＺＤ８０５５、ＩＮＫ１２８およびラパマイシンからなる群より選択される汎ｍＴＯＲ阻害剤である、項目４９に記載の方法。
（項目６１）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＰＦ−０４６９１５０２およびエベロリムスからなる群より選択される選択的ｍＴＯＲＣ１阻害剤である、項目４９に記載の方法。
（項目６２）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＢＩ−Ｄ１８７０、Ｈ８９、ＰＦ−４７０８６７１、ＦＭＫおよびＡＴ７８６７からなる群より選択されるｓ６キナーゼ阻害剤である、項目４９に記載の方法。
（項目６３）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤が、ＮＵ７４４１、ＰＩ−１０３、ＮＵ７０２６、ＰＩＫ−７５およびＰＰ−１２１からなる群より選択されるＤＮＡ−ＰＫ阻害剤である、項目４９に記載の方法。
（項目６４）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で再刺激された、活性化されたＴ細胞の前記集団が、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤の非存在下で活性化および刺激されたＴ細胞の集団と比較して増加した数の、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２およびＣＤ１２７からなる群より選択される１種または複数のマーカーを発現するＴ細胞を有する、項目３５から６３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で再刺激された、活性化されたＴ細胞の前記集団が、ＣＤ５７もＫＬＲＧ１も発現しない、またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の前記阻害剤の非存在下で活性化および刺激されたＴ細胞の集団と比較して少ないＣＤ５７もしくはＫＬＲＧ１を発現する、項目６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを含むベクターを含むＴ細胞の集団であって、前記細胞が、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で増殖するように活性化および刺激されている、集団。
（項目６７）
工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを含むベクターを含むＴ細胞の集団であって、前記細胞が、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤の存在下で増殖するように活性化および刺激されており、増殖させた免疫エフェクター細胞の集団の全体または一部を、抗ＣＤ３抗体またはそのＣＤ３結合性断片および前記免疫エフェクター細胞の表面上のＣＤ２８アクセサリー分子を刺激する抗ＣＤ２８抗体またはそのＣＤ２８結合性断片と接触させることにより再刺激されている、集団。
（項目６８）
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞を含む、項目６６または項目６７に記載の免疫エフェクター細胞の集団。
（項目６９）
項目６６または６７に記載の免疫エフェクター細胞の集団と、生理学的に許容される賦形剤とを含む組成物。
（項目７０）
がんの処置を必要とする被験体においてがんを処置する方法であって、前記被験体に治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ａｍｏｕｎｔ）の項目６９に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目７１）
前記がんが、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、前立腺がん、肝臓がん、腎がん、膵がん、肺がん、胆管がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、甲状腺髄様癌、卵巣がん、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫および膀胱がん（ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）からなる群より選択される、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記がんが、膵がんであり、細胞外結合性ドメインが、ＰＳＣＡまたはＭＵＣ１のエピトープに結合する、項目７０に記載の方法。
（項目７３）
前記がんが、膀胱がん（ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）であり、細胞外結合性ドメインが、ＰＳＣＡまたはＭＵＣ１のエピトープに結合する、項目７０に記載の方法。
（項目７４）
前記がんが、多形神経膠芽腫であり、細胞外結合性ドメインが、ＥＰＨＡ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＣＳＰＧ４のエピトープに結合する、項目７０に記載の方法。
（項目７５）
前記がんが、肺がんであり、細胞外結合性ドメインが、ＰＳＣＡまたはＧＤ２のエピトープに結合する、項目７０に記載の方法。
（項目７６）
前記がんが、乳がんであり、細胞外結合性ドメインが、ＣＳＰＧ４またはＨＥＲ２のエピトープに結合する、項目７０に記載の方法。
（項目７７）
前記がんが、黒色腫であり、細胞外結合性ドメインが、ＣＳＰＧ４またはＧＤ２のエピトープに結合する、項目７０に記載の方法。
（項目７８）
前記がんが、Ｂ細胞悪性疾患であり、結合性ドメインが、ＢＣＭＡのエピトープに結合する、項目７０に記載の方法。
（項目７９）
血液学的悪性疾患の処置を必要とする被験体において血液学的悪性疾患を処置する方法であって、前記被験体に治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ａｍｏｕｎｔ）の項目６９に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目８０）
前記血液学的悪性疾患が、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）からなる群より選択されるＢ細胞悪性疾患である、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記ＭＭが、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫からなる群より選択される、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記ＮＨＬが、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫からなる群より選択される、項目８０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、ＡＫＴ阻害剤で処理したＴ細胞におけるＴ細胞増殖の維持の代表例を示す。Ｔ細胞を種々の濃度のＡＫＴ阻害剤、ＭＫ−２２０６７と共に最大７日間培養した。最も右のパネルは、６種の正常ドナーＰＢＭＣ試料から開始したＴ細胞培養物由来のパーセント分裂Ｔ細胞を示す。最も右のパネルにおける各記号は、用量設定された（ｔｉｔｒａｔｅｄ）ＭＫ−２２０６用量と並行して行われた特有の培養を表す。最も左のパネルは、これらの実験の代表例を示す。Ａ）ＭＫ−２２０６と共に３日間培養した後に、Ｔ細胞増殖は、処理なし対照と比較してごく僅かに減少した。Ｂ）ＭＫ−２２０６と共に７日間培養した後に、Ｔ細胞増殖は、処理なし対照と比較して実質的に差がなかった。
【００９１】
【図２】図２は、ＡＫＴ阻害剤で処理したＴ細胞のＣＤ６２Ｌ発現の代表例を示す。Ｔ細胞を種々の濃度のＡＫＴ阻害剤、ＭＫ−２２０６７と共に最大７日間培養した。最も右のパネルは、６種の正常ドナーＰＢＭＣ試料から開始したＴ細胞培養物由来のパーセントＣＤ６２Ｌ発現Ｔ細胞を示す。最も右のパネルにおける各記号は、用量設定されたＭＫ−２２０６用量と並行して行われた特有の培養を表す。最も左のパネルは、これらの実験の代表例を示す。Ａ）ＭＫ−２２０６と共に３日間培養した後に、ＭＫ−２２０６処理Ｔ細胞におけるＣＤ６２Ｌ発現は、処理なし対照と比較して実質的に差がなかった。Ｂ）７日間培養した後に、ＭＫ−２２０６処理Ｔ細胞は、処理なし対照と比較して有意により高いレベルのＣＤ６２Ｌ発現を示した。
【００９２】
【図３】図３は、ＭＫ−２２０６、ＴＣＮまたはＺＳＴＫ４７４との培養の終わりにフローサイトメトリーによって評価された、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＤ６２Ｌの発現を示す。ＭＫ−２２０６およびＺＳＴＫ４７４は、ＩＬ−２単独またはＴＣＮで処理したＣＡＲ  Ｔ細胞培養物と比較して、有意により高いＣＤ６２Ｌ発現を有した。
【００９３】
【図４】図４は、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５、ＭＫ−２２０６、ＺＳＴ７４７またはＴＣＮと共に培養した抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置したマウスにおける多発性骨髄腫腫瘍の平均腫瘍体積を示す。ＩＬ−７およびＩＬ−１５、ＭＫ−２２０６またはＺＳＴ７４７と共に培養した抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、標準ＩＬ−２と共に培養した抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、同様のレベルの抗腫瘍活性を示した。ＴＣＮと共に培養した抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗腫瘍応答を示さなかった。
【００９４】
【図５】図５は、Ｄａｕｄｉ腫瘍モデルにおける、ＩＬ−２、ＩＬ−７／１５、ＭＫ−２２０６、ＴＣＮまたはＺＳＴＫ４７４で処理した抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。Ｄａｕｄｉ腫瘍進行は、ＩＬ−２またはＩＬ７／１５培養された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞による処置後に影響されなかった。ＭＫ−２２０６またはＺＳＴ４７４のいずれかと共に培養した抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、完全な腫瘍退縮を引き起こした。
【００９５】
【図６】図６は、１００ｍｍ３ＲＰＭＩ−８２２６腫瘍を完全に退縮した、ＩＬ−２、ＭＫ−２２０６またはＺＳＴＫ４７４培養された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した動物における、ＺＳＴＫ４７４培養された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性を示す。１３日後に、反対側の側腹部にＲＰＭＩ−８２２６を動物に再負荷した。ＩＬ−２培養されたＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した動物は、腫瘍過成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を防止することができなかった。ＺＳＴＫ４７４培養された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した動物はいずれも、腫瘍生着（ｔｕｍｏｒ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）の証拠が全くなかった。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
Ａ．概要
本発明は、一般に、Ｔ細胞組成物を製造するための改善された方法に関する。いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、本明細書において意図されている本発明の方法は、分化からＴ細胞増殖を切り離して、優れた特性、例えば、当技術分野における既存のＴ細胞組成物と比較して、付随する分化減少と共に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける増加した生存、増大および持続性を有するＴ細胞を産生する。よって、本明細書において意図されているＴ細胞組成物は、分化を殆ど伴わない複数ラウンドの増大が可能な、若いまたはナイーブＴ細胞集団の特徴を有する能力あるＴ細胞を含む。さらに、増大させた細胞は、その後に分化し、免疫エフェクター細胞機能をもたらすことができる。
【００９７】
種々の実施形態では、Ｔ細胞増大中にＴ細胞増殖を維持または最小限で低下させ、Ｔ細胞分化を低下、減少または軽減する、Ｔ細胞を製造するための方法が提供される。特定の好ましい実施形態では、工学的に作製されたＴ細胞組成物は、Ｔ細胞養子免疫療法の有効性をさらに増加させることができる、本明細書において意図されている方法によって製造される。本明細書において意図されている製造されたＴ細胞組成物は、これらに限定されないが、がん、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患および免疫不全症を含めた多数の状態の処置または予防において有用である。いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、本発明者は、Ｔ細胞における細胞シグナル伝達経路であって、がん細胞における増殖に通常関連する経路のモジュレーションが、細胞シグナル伝達経路がモジュレートされていないＴ細胞と比較して、Ｔ細胞増大中に、Ｔ細胞増殖の実質的な維持またはごくわずかな低下およびＴ細胞分化の減少をもたらすことを驚くべきことに、また、予期せずに発見した。
【００９８】
一実施形態では、工学的に作製されたＴ細胞を製造する方法は、Ｔ細胞を細胞におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を阻害する薬剤と接触させるステップを含む。細胞は、活性化および増大の前、最中および／または後に接触させることができる。工学的に作製されたＴ細胞組成物は、分化の実質的な増加を伴うことなく複数ラウンドの増大を受けることができるように、十分なＴ細胞効力を保持する。
【００９９】
したがって、本明細書において意図されている方法および組成物は、既存の養子細胞免疫療法と比較して画期的な改善を表す。
【０１００】
本発明の実施には、特にそれに反する指示がなければ、当技術分野の技術の範囲内に入る化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技法、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を使用し、その多くを例示目的で以下に記載する。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００８年７月更新）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ巻＆ＩＩ巻（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５年）；Ａｎａｎｄ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９８年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｑ．  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．  Ｍ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．  Ｈ．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．  Ｍ．  ＳｈｅｖａｃｈおよびＷ．  Ｓｔｒｏｂｅｒ編、１９９１年）；Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；ならびにＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの学術誌内のモノグラフを参照されたい。
【０１０１】
本明細書において引用された全ての刊行物、特許および特許出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
Ｂ．定義
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、組成物、方法および材料の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。本発明の目的に関して、次の用語を以下に定義する。
【０１０３】
「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」という冠詞は、本明細書では、その冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つ超（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「ａｎ（１つの）要素」とは、１つの要素または１つ超の要素を意味する。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、参照数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％と同程度変動する数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。特定の実施形態では、数値の前の「約」または「およそ」という用語は、プラスまたはマイナス１５％、１０％、５％、または１％の範囲の値を示す。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、参照数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さの８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ超である数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態では、「実質的に同じ」とは、参照数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さとほぼ同じである影響、例えば、生理的影響を生じる数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。
【０１０６】
本明細書全体を通して、文脈がそうでないことを要しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、規定されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を含むが、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群は排除されないことを意味するものと理解されたい。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という句に続くいかなるものも含み、かつそれに限定されることを意味する。したがって、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という句は、列挙されている要素が必要または必須であること、および他の要素は存在してはならないことを示す。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、その句の後に列挙されている要素をいずれも含み、かつ、列挙されている要素に関して本開示に明記されている活性または作用に干渉も寄与もしない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という句は、列挙されている要素が必要または必須であるが、他の要素は任意選択ではなく、それらが、列挙されている要素の活性または作用に影響を及ぼすか否かに応じて、存在してよいまたは存在してはならないことを示す。
【０１０７】
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加的な実施形態」または「さらなる実施形態」またはこれらの組合せへの言及は、実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に包含されることを意味する。したがって、本明細書全体を通して種々の箇所における前述の句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態について言及しているのではない。さらに、１つまたは複数の実施形態において、特定の特徴、構造、または特性を任意の適切な様式で組み合わせることができる。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、用語「Ｔ細胞製造」もしくは「Ｔ細胞を製造する方法」または同等の用語は、Ｔ細胞の治療用組成物を産生するプロセスを指し、この製造方法は、次のステップのうち１種もしくは複数または全てを含むことができる：採取、刺激、活性化および増大。
【０１０９】
用語「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、当技術分野で認識されており、胸腺細胞、ナイーブＴリンパ球、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球または活性化されたＴリンパ球を含むものとする。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＩＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞または任意の他のＴ細胞のサブセットであり得る。特定の実施形態での使用に適したＴ細胞の他の例示的な集団は、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞を含む。
【０１１０】
「能力あるＴ細胞」および「若いＴ細胞」は、特定の実施形態では互換的に使用されており、Ｔ細胞が増殖および付随する分化減少をすることができるＴ細胞表現型を指す。特定の実施形態では、若いＴ細胞は、「ナイーブＴ細胞」の表現型を有する。種々の実施形態では、本明細書において意図されている製造方法は、若いＴ細胞；Ｔ細胞増殖が、Ｔ細胞刺激、活性化および増大中にＴ細胞分化から切り離された細胞を産生する。いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、意図されている組成物および方法により製造された能力あるＴ細胞は、養子移入後に、より優れた抗腫瘍性有効性を保持する。特定の実施形態では、若いＴ細胞は、次の生物学的マーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２およびＣＤ１２７のうち１種もしくは複数または全てを含む。一実施形態では、若いＴ細胞は、次の生物学的マーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２およびＣＤ１２７のうち１種もしくは複数または全てを含み、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３およびＬＡＧ３の発現を欠如する。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、細胞の対称または非対称分裂のいずれかの細胞分裂の増加を指す。特定の実施形態では、「増殖」とは、Ｔ細胞の対称または非対称分裂を指す。「増殖の増加」は、処理された試料中の細胞の数が処理されていない試料中の細胞と比較して増加している場合に起こる。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、用語「分化」は、細胞の効力もしくは増殖を減少させるまたは細胞をより発生的に制限された状態へと移動させる方法を指す。特定の実施形態では、分化したＴ細胞は、免疫エフェクター細胞機能を獲得する。
【０１１３】
「免疫エフェクター細胞」は、１種または複数のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞死滅活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導）を有する免疫系の任意の細胞である。本明細書において意図されている例示的な免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、特に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＴＩＬおよびヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）である。
【０１１４】
「改変Ｔ細胞」とは、本明細書において意図されている工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを導入することによって改変されたＴ細胞を指す。改変Ｔ細胞とは、遺伝子改変および非遺伝子改変（例えば、エピソームまたは染色体外）の両方を含む。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「遺伝子工学的に作製された」または「遺伝子改変された」という用語は、細胞内の全遺伝物質に余分の遺伝物質をＤＮＡまたはＲＮＡの形態で付加することを指す。
【０１１６】
「遺伝子改変細胞」、「改変細胞」、および「向け直された（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）細胞」という用語は、互換的に使用される。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「遺伝子療法」という用語は、遺伝子の発現を回復させる、補正する、または改変する、あるいは治療用ポリペプチド、例えば、ＴＣＲもしくはＣＡＲおよび／または１種もしくは複数種のサイトカインを発現させる目的で、細胞内の全遺伝物質に余分の遺伝物質をＤＮＡまたはＲＮＡの形態で導入することを指す。特定の実施形態では、Ｔ細胞を、細胞のゲノムを改変することなく、例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するエピソームベクターを細胞に導入することにより、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように改変する。
【０１１８】
「ｅｘ  ｖｉｖｏ」という用語は、一般に、生物体の外側で行われる行為、例えば、天然の条件の変更が最小であることが好ましい、生物体の外側の人工的な環境において生組織内または生組織上で行われる実験または測定などを指す。特定の実施形態では、「ｅｘ  ｖｉｖｏ」手順は、生物体から取得し、通常は滅菌条件下で、一般には数時間または最大約２４時間であるが状況に応じて最大４８または７２時間を含む時間にわたって実験装置内で培養または調節した生細胞または組織を伴う。ある特定の実施形態では、そのような組織または細胞を収集し、凍結させ、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける処理のために後で解凍することができる。生細胞または組織を使用して数日よりも長く続く組織培養実験または手順は、一般には「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」とみなされるが、ある特定の実施形態では、この用語は、ｅｘ  ｖｉｖｏと互換的に使用することができる。
【０１１９】
「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、一般に、生物体の内側で行われる行為、例えば、細胞の自己再生および細胞の増大などを指す。一実施形態では、「ｉｎ  ｖｉｖｏにおける増大」という用語は、細胞集団の数をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて増加できることを指す。
【０１２０】
「刺激」という用語は、これに限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナルトランスダクションを含めたシグナルトランスダクション事象が媒介される、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンドの結合によって誘導される一次応答を指す。
【０１２１】
「刺激分子」とは、同族刺激性リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を指す。
【０１２２】
「刺激性リガンド」は、本明細書で使用される場合、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に存在する場合、Ｔ細胞上の同族結合パートナー（本明細書において、「刺激分子」と称される）と特異的に結合し、それにより、これらに限定されないが、活性化、免疫応答の開始、増殖などを含めた、Ｔ細胞による一次応答を媒介することができるリガンドを意味する。刺激性リガンドとして、これらに限定されないが、ＣＤ３リガンド、例えば、抗ＣＤ３抗体ならびにＣＤ２リガンド、例えば、抗ＣＤ２抗体およびペプチド、例えば、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶペプチドが挙げられる。
【０１２３】
「活性化」という用語は、検出可能な細胞増殖を誘導するように十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す。特定の実施形態では、活性化は、誘導性サイトカイン産生、および検出可能なエフェクター機能にも関連し得る。「活性化Ｔ細胞」という用語はとりわけ、増殖しているＴ細胞を指す。ＴＣＲ単独を通じて生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、１つまたは複数の二次または共刺激シグナルも必要である。したがって、Ｔ細胞の活性化は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を通じた一次刺激シグナルおよび１つまたは複数の二次共刺激シグナルを含む。共刺激は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を通じた、またはＣＤ２を通じた刺激などの一次活性化シグナルを受けたＴ細胞による増殖および／またはサイトカイン産生によって証明することができる。
【０１２４】
「共刺激シグナル」とは、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わさって、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生、および／または特定の分子（例えばＣＤ２８）の上方制御もしくは下方制御を導くシグナルを指す。
【０１２５】
「共刺激リガンド」は、共刺激分子に結合する分子を指す。共刺激リガンドは、可溶性であり得るか、または表面上に提示され得る。「共刺激分子」は、共刺激リガンド（例えば、抗ＣＤ２８抗体）と特異的に結合するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。
【０１２６】
「自己由来」とは、本明細書で使用される場合、同じ被験体に由来する細胞を指す。
【０１２７】
「同種異系」とは、本明細書で使用される場合、比較される細胞とは遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。
【０１２８】
「同系」とは、本明細書で使用される場合、比較される細胞と遺伝的に同一である異なる被験体の細胞を指す。
【０１２９】
「異種」は、本明細書で使用される場合、比較される細胞とは異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態では、本発明の細胞は、同種異系である。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、用語「個体」および「被験体」は、多くの場合、互換的に使用され、遺伝子療法ベクター、細胞ベースの治療薬および本明細書の他の箇所に開示されている方法により処置することができるがんの症状を示す任意の動物を指す。適切な被験体（例えば、患者）は、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギまたはモルモットなど）、農場動物および家畜動物またはペット（例えば、ネコまたはイヌなど）を含む。非ヒト霊長類、および好ましくはヒト患者が含まれる。典型的な被験体は、がんを有する、がんであると診断された、またはがんを有するリスクがあるヒト患者を含む。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、本明細書の他の箇所で開示されている遺伝子療法ベクター、細胞に基づく治療薬、および方法を用いて処置することができる特定の適応症と診断された被験体を指す。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「処置」または「処置すること」は、疾患または病的状態の症状または病態に対するあらゆる有益なまたは望ましい効果を含み、処置されている疾患または状態、例えば、がんの１種または複数の測定可能なマーカーの最小の低下さえも含むことができる。処置は、場合によって、疾患もしくは状態の症状の低下もしくは好転または疾患もしくは状態の進行の遅延のいずれかを伴い得る。「処置」は、疾患もしくは状態またはその関連する症状の完全な根絶または治癒を必ずしも示さない。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」および「予防された（ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ）」、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」などの同様の単語は、疾患または状態、例えばがんの出現または再発を予防する、阻害する、またはその可能性を低下させる手法を示す。当該用語は、疾患もしくは状態の発症もしくは再発を遅延させること、または疾患もしくは状態の症状の出現もしくは再発を遅延させることも指す。本明細書で使用される場合、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」および同様の単語は、疾患または状態の強度、影響、症状および／または負荷を、疾患または状態の発症または再発の前に低減することも包含する。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「量」という用語は、有益なまたは所望の、臨床結果を含めた予防または治療結果を達成するための、遺伝子改変された治療用細胞、例えばＴ細胞の「有効量（ａｎ  ａｍｏｕｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」または「有効量（ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」を指す。
【０１３５】
「予防有効量」とは、所望の予防結果を達成するのに有効な、遺伝子改変された治療用細胞の量を指す。必ずではないが、一般には、予防用量は被験体に疾患の前またはより早い段階で使用されるので、予防有効量は、治療有効量よりも少ない。
【０１３６】
遺伝子改変された治療用細胞の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体における所望の応答を引き出すＴ細胞の能力などの因子に応じて変動し得る。治療有効量は、ウイルスまたは形質導入された治療用細胞のあらゆる毒性の影響または有害な影響よりも治療的に有益な影響が上回る量でもある。「治療有効量」という用語は、被験体（例えば、患者）を「処置する」のに有効である量を包含する。治療量が示されている場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、医師が、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および患者（被験体）の状態の個々の差異を考慮して決定することができる。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、一般に、異常な細胞が制御されずに分裂し、近くの組織に浸潤し得る、疾患または状態のクラスに関する。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「悪性」という用語は、腫瘍細胞の群が、制御されていない成長（すなわち、正常な限界を超えた分裂）、浸潤（すなわち、近接組織への侵入およびその破壊）、ならびに転移（すなわち、リンパ液または血液を介した、体内の他の場所への拡散）のうちの１つまたは複数を示すがんを指す。本明細書で使用される場合、「転移する」という用語は、がんが体の一部分から別の部分に拡散することを指す。拡散した細胞によって形成される腫瘍は、「転移性腫瘍」または「転移」と称される。転移性腫瘍は、元の（原発）腫瘍における細胞と同様の細胞を含有する。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、「良性」または「非悪性」という用語は、大きく成長する可能性があるが、体の他の部分には拡散しない腫瘍を指す。良性腫瘍は自己限定的であり、一般には浸潤も転移もしない。
【０１４０】
「がん細胞」または「腫瘍細胞」とは、癌性増殖物または組織の個々の細胞を指す。腫瘍とは、一般に、細胞の異常な成長によって形成される腫脹または病変を指し、これは、良性、前悪性、または悪性であり得る。大多数のがんは腫瘍を形成するが、いくつか、例えば、白血病は、腫瘍を必ずしも形成しない。腫瘍を形成するがんに関して、がん（細胞）および腫瘍（細胞）という用語は、互換的に使用される。個体内の腫瘍の量は、腫瘍の数、体積、または重量として測定することができる「腫瘍量（ｔｕｍｏｒ  ｂｕｒｄｅｎ）」である。
【０１４１】
「感染症」とは、人から人へまたは生物体から生物体へ伝染する可能性があり、微生物因子によって引き起こされる疾患（例えば、感冒）を指す。感染症は当技術分野で公知であり、それらとして、例えば、肝炎、性行為感染症（例えば、クラミジア、淋病）、結核、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ジフテリア、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、コレラ、およびインフルエンザが挙げられる。
【０１４２】
「自己免疫疾患」とは、体が、自身の組織のある構成要素に対する免疫原性（すなわち、免疫系）応答を生じる疾患を指す。言い換えれば、免疫系は体内のある組織または系を「自己」と認識する能力を失い、あたかもそれを外来であるかのように標的とし、攻撃する。自己免疫疾患は、主に１つの器官が影響を受けるもの（例えば、溶血性貧血および抗免疫甲状腺炎）と、自己免疫疾患プロセスが多くの組織を通じて拡散するもの（例えば、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｎｅｍａｔｏｓｕｓ））に分類することができる。例えば、多発性硬化症は、脳および脊髄の神経線維を囲む鞘を攻撃するＴ細胞によって引き起こされると考えられている。その結果、協調喪失、衰弱、および霧視が生じる。自己免疫疾患は、当技術分野で公知であり、例えば、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ループス、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、溶血性貧血、抗免疫甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬などが挙げられる。
【０１４３】
「免疫不全症」とは、疾患によってまたは化学物質の投与によって免疫系が損なわれた患者の状態を意味する。この状態により、当該系が、外来物質に対する防御に必要な血液細胞の数および型が欠損したものになる。免疫不全症状態または疾患は当技術分野で公知であり、それらとして、例えば、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）、ＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全症）、選択的ＩｇＡ欠損症、分類不能型免疫不全症、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、慢性肉芽腫性疾患、高ＩｇＭ症候群、および糖尿病が挙げられる。
【０１４４】
「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」または「促進する（ｐｒｏｍｏｔｅ）」または「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」または「増大させる（ｅｘｐａｎｄ）」とは、一般に、本明細書において意図されている組成物の、ビヒクルまたは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより大きな生理応答（すなわち、下流の効果）を生じさせる、引き出す、または引き起こす能力を指す。測定可能な生理応答としてはとりわけ、当技術分野における理解および本明細書における説明から明らかである、Ｔ細胞増大、活性化、持続の増加、および／またはがん細胞死滅能力の増加を挙げることができる。「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」または「増強された（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」量とは、一般には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照組成物によって生じる応答の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍またはそれ超（例えば、５００倍、１０００倍）（中間の１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍などを含める）である増加を含み得る。
【０１４５】
「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」または「低減する（ｌｏｗｅｒ）」または「減る（ｌｅｓｓｅｎ）」または「低下する（ｒｅｄｕｃｅ）」または「軽減する（ａｂａｔｅ）」とは、一般に、本明細書において意図されている組成物の、ビヒクルまたは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより小さな生理応答（すなわち、下流の効果）を生じさせる、引き出す、または引き起こす能力を指す。「減少した（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」または「低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」量とは、一般には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、対照組成物によって生じる応答（参照応答）、または特定の細胞系列における応答の１．１分の１、１．２分の１、１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１５分の１、２０分の１、３０分の１またはそれ未満（例えば、５００分の１、１０００分の１）（中間の１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１などを含める）である減少を含み得る。
【０１４６】
「維持する（ｍａｉｎｔａｉｎ）」または「保存する（ｐｒｅｓｅｒｖｅ）」または「維持（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）」または「変化なし（ｎｏ  ｃｈａｎｇｅ）」または「実質的な変化なし（ｎｏ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｃｈａｎｇｅ）」または「実質的な減少なし（ｎｏ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｄｅｃｒｅａｓｅ）」とは、一般に、本明細書において意図されている組成物の、ビヒクル、対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答、または特定の細胞系列における応答と比較してより小さな、細胞における生理応答（すなわち、下流の効果）を生じさせる、引き出す、または引き起こす能力を指す。同等の応答とは、参照応答と有意に異ならないまたは測定可能なほど異ならない応答である。
【０１４７】
「特異的な結合親和性」または「特異的に結合する」または「特異的に結合した」または「特異的な結合」または「特異的に標的とする」という用語は、本明細書で使用される場合、１つの分子が別の分子にバックグラウンド結合よりも高い結合親和性で結合することを記載するものである。結合性ドメイン（または結合性ドメインを含むＣＡＲまたは結合性ドメインを含有する融合タンパク質）は、例えば、約１０５Ｍ−１を超えるまたはそれと同等の親和性またはＫａ（すなわち、単位１／Ｍの特定の結合相互作用の平衡会合定数）で標的分子に結合するまたはそれと会合する場合、標的分子に「特異的に結合する」。ある特定の実施形態では、結合性ドメイン（またはその融合タンパク質）は、約１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、または１０１３Ｍ−１を超えるまたはそれと同等のＫａで標的に結合する。「高親和性」結合性ドメイン（またはその単鎖融合タンパク質）とは、Ｋａが少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、またはそれ超である結合性ドメインを指す。
【０１４８】
あるいは、親和性は、単位Ｍの、特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）と定義することができる（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍまたはそれ未満）。本開示による結合性ドメインポリペプチドおよびＣＡＲタンパク質の親和性は、従来の技法を使用して、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）によって、または結合会合、または標識したリガンドを使用した置換アッセイによって、または、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから入手可能なＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００などの表面プラズモン共鳴デバイス、またはそれぞれＣｏｒｎｉｎｇおよびＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから入手可能なＥＰＩＣ  ｓｙｓｔｅｍもしくはＥｎＳｐｉｒｅなどの光学バイオセンサー技術を使用して、容易に決定することができる（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（１９４９年）Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１巻：６６０頁；および米国特許第５，２８３，１７３号；同第５，４６８，６１４号、または等価物も参照されたい）。
【０１４９】
一実施形態では、特異的な結合の親和性は、バックグラウンド結合の約２倍、バックグラウンド結合の約５倍、バックグラウンド結合の約１０倍、バックグラウンド結合の約２０倍、バックグラウンド結合の約５０倍、バックグラウンド結合の約１００倍、またはバックグラウンド結合の約１０００倍またはそれ超である。
【０１５０】
「抗原（Ａｇ）」とは、動物に注射または吸収される組成物（例えば、腫瘍に特異的なタンパク質を含むものなど）を含めた、動物における抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することが可能な化合物、組成物、または物質を指す。抗原は、開示されている抗原などの異種抗原によって誘導されるものを含めた、特定の体液性または細胞性免疫の産物と反応する。「標的抗原」または「目的の標的抗原」とは、本明細書において意図されているＣＡＲの結合性ドメインが結合するように設計されている抗原である。
【０１５１】
「エピトープ」または「抗原決定基」とは、結合剤が結合する抗原の領域を指す。
【０１５２】
「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、本明細書で使用される場合、細胞環境からの、および、細胞の他の構成成分との関連からのペプチドまたはポリペプチド分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ単離および／または精製を指す、すなわち、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏ物質と有意に関連していない。同様に、「単離された細胞」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ組織または器官から得られた、細胞外マトリックスを実質的に含まない細胞を指す。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態でこれと隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、ある断片に通常近接する配列から除去されたＤＮＡ断片を指す。「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に存在しない、人の手によって作製された、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えＤＮＡまたは他のポリヌクレオチドも指す。
【０１５４】
Ｃ．Ｔ細胞製造方法
本明細書において意図されている方法によって製造されるＴ細胞は、改善された養子免疫療法組成物をもたらす。いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、本明細書において意図されている方法によって製造されるＴ細胞組成物が、分化の相対的な非存在下での増加された生存、増大、およびｉｎ  ｖｉｖｏでの持続性を含む優れた特性が染み込んでいることが考えられる。一実施形態では、Ｔ細胞を製造する方法は、細胞をＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路をモジュレートする１種または複数の薬剤と接触させるステップを含む。種々の実施形態では、Ｔ細胞を任意の供給源から得て、製造プロセスの活性化および／または増大期中に、薬剤と接触させることができる。その結果得られるＴ細胞組成物は、次のバイオマーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２およびＣＤ１２７の１種または複数を増殖および発現する能力を有する発生的に能力あるＴ細胞が豊富である。
【０１５５】
一実施形態では、維持されたレベルの増殖および減少した分化を含む改変されたＴ細胞が製造される。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞を刺激して、１種または複数の刺激シグナルおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路の阻害剤である薬剤の存在下で活性化させ、増殖させることにより製造される。
【０１５６】
次いで、Ｔ細胞は、１種または複数の工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように改変することができる。一実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞に、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを含むウイルスベクターを用いて形質導入を行うことにより改変される。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路の阻害剤の存在下での刺激および活性化の前に改変される。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路の阻害剤の存在下での刺激および活性化後に改変される。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路の阻害剤の存在下での刺激および活性化から１２時間、２４時間、３６時間または４８時間以内に改変される。
【０１５７】
Ｔ細胞が活性化された後に、細胞は、増殖するよう培養される。Ｔ細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれを超えるラウンドの増大により、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７日間、少なくとも２週間、少なくとも１、２、３、４、５もしくは６ヶ月間またはそれを超えて培養することができる。
【０１５８】
種々の実施形態では、Ｔ細胞組成物は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の１種または複数の阻害剤の存在下で製造される。この阻害剤は、この経路における１種もしくは複数の活性または単一の活性を標的とすることができる。いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、製造プロセスの刺激、活性化および／または増大期中にＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の１種または複数の阻害剤によるＴ細胞の処理またはこれらとＴ細胞の接触が、若いＴ細胞を優先的に増加させ、それにより、優れた治療用Ｔ細胞組成物を産生することが意図される。
【０１５９】
特定の実施形態では、工学的に作製されたＴ細胞受容体を発現するＴ細胞の増殖を増加させるための方法が提供される。そのような方法は、例えば、被験体からＴ細胞の供給源を採取するステップと、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現させるためのＴ細胞の改変である、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の１種または複数の阻害剤の存在下でＴ細胞を刺激および活性化するステップと、培養においてＴ細胞を増大させるステップとを含むことができる。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、次のバイオマーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２およびＣＤ１２７の１種または複数の発現のために濃縮されたＴ細胞の集団を産生するための方法が提供される。関連する実施形態では、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２およびＣＤ１２７を発現し、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３およびＬＡＧ３を発現しないまたは低レベルのそれらのものを発現するＴ細胞を増加させるための方法が提供される。本明細書の他の箇所に論じられている通り、若いＴ細胞バイオマーカーの発現レベルは、より分化したＴ細胞または免疫エフェクター細胞集団におけるこのようなマーカーの発現レベルと比べてのものである。
【０１６１】
一実施形態では、本明細書において意図されているＴ細胞製造方法におけるＴ細胞の供給源として末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が使用される。ＰＢＭＣは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋であり得、例えば、単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞など、他の単核細胞を含むことができるＴリンパ球の不均一集団を形成する。本明細書において意図されている工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、ヒトドナーＴ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞の集団に導入することができる。発現ベクターを保有する成功裏に形質導入されたＴ細胞は、フローサイトメトリーを使用して選別して、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離し、次いで抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体ならびにＩＬ−２、ＩＬ−７および／またはＩＬ−１５または本明細書の他の箇所に記載されている当技術分野で公知の任意の他の方法を使用した細胞活性化に加えて、さらに繁殖させて、改変Ｔ細胞の数を増加させることができる。
【０１６２】
本明細書において意図されている製造方法は、ヒト被験体における使用のための貯蔵および／または調製のための改変Ｔ細胞の凍結保存をさらに含むことができる。細胞が、解凍後に生存可能であり続けるように、Ｔ細胞が凍結保存される。必要に応じて、凍結保存され形質転換された免疫エフェクター細胞を解凍し、成長させ、より多くのこのような細胞のために増大させることができる。本明細書で使用される場合、「凍結保存」は、例えば（典型的には）７７Ｋまたは−１９６℃（液体窒素の沸点）など、氷点下（ｓｕｂ−ｚｅｒｏ）の温度まで冷却することによる細胞の保存を指す。氷点下の温度において、凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）が頻繁に使用されて、保存されている細胞が低温における凍結または室温への加温により損傷を受けることを防止する。凍結保存剤および最適冷却速度は、細胞傷害から保護することができる。使用することができる凍結保護剤として、これらに限定されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ＬｏｖｅｌｏｃｋおよびＢｉｓｈｏｐ、Ｎａｔｕｒｅ、１９５９年；１８３巻：１３９４〜１３９５頁；Ａｓｈｗｏｏｄ−Ｓｍｉｔｈ、Ｎａｔｕｒｅ、１９６１年；１９０巻：１２０４〜１２０５頁）、グリセロール、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ）（Ｒｉｎｆｒｅｔ、Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、１９６０年；８５巻：５７６頁）およびポリエチレングリコール（ＳｌｏｖｉｔｅｒおよびＲａｖｄｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９６２年；１９６巻：４８頁）が挙げられる。好ましい冷却速度は、１°〜３℃／分である。少なくとも２時間後、Ｔ細胞は、−８０℃の温度に達し、例えば長期低温貯蔵容器中など、永久貯蔵のために液体窒素（−１９６℃）中に直接的に置くことができる。
【０１６３】
１．Ｔ細胞
本発明は、改善されたＴ細胞組成物の製造を意図する。Ｔ細胞は、自己由来／自原性（「自己」）または非自己由来（「非自己」、例えば、同種異系、同系または異種）であってもよい。好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、哺乳動物被験体から得られる。より好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、霊長類被験体から得られる。最も好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、ヒト被験体から得られる。
【０１６４】
Ｔ細胞は、これらに限定されないが、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含めた、いくつかの供給源から得ることができる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、沈降、例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離など、当業者に公知の任意の数の技法を使用して、被験体から収集された血液の単位から得ることができる。一実施形態では、個体の循環血由来の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球および血小板を含むリンパ球を含有する。一実施形態では、アフェレーシスによって収集した細胞を、血漿画分を除去するため、およびその後の加工のために適切な緩衝液または培地中に細胞を入れるために洗浄することができる。細胞は、ＰＢＳで、またはカルシウム、マグネシウムおよび他の全てではないが大多数の二価カチオンを欠く別の適切な溶液で洗浄することができる。当業者によって認められる通り、洗浄ステップは、例えば、半自動フロースルー遠心分離機の使用によるなど、当業者に公知の方法によって達成することができる。例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅなど。洗浄後に、細胞は、様々な生体適合性緩衝液または緩衝液を含むもしくは含まない他の食塩溶液に再懸濁することができる。ある特定の実施形態では、細胞が直接的に再懸濁された培養培地におけるアフェレーシス試料の望ましくない構成成分を除去することができる。
【０１６５】
特定の実施形態では、Ｔ細胞、例えば、ＰＢＭＣを含む細胞の集団は、本明細書において意図されている製造方法において使用される。他の実施形態では、Ｔ細胞の単離または精製された集団は、本明細書において意図されている製造方法において使用される。細胞は、赤血球を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離により単球を枯渇させることにより、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離することができる。一部の実施形態では、ＰＢＭＣの単離後に、活性化、増大および／または遺伝子改変の前または後のいずれかで、細胞傷害性およびヘルパーＴリンパ球の両方を、ナイーブ、メモリーおよびエフェクターＴ細胞亜集団へと選別することができる。
【０１６６】
次のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２、ＣＤ１２７およびＨＬＡ−ＤＲの１種または複数を発現するＴ細胞の特異的な亜集団は、正または負の選択技法によってさらに単離することができる。一実施形態では、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２およびＣＤ１２７からなる群より選択されるマーカーの１種または複数を発現するＴ細胞の特異的な亜集団は、正または負の選択技法によってさらに単離される。種々の実施形態では、製造されたＴ細胞組成物は、次のマーカー：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３およびＬＡＧ３の１種または複数を発現しないまたは実質的に発現しない。
【０１６７】
一実施形態では、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２およびＣＤ１２７からなる群より選択されるマーカーの１種または複数の発現は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ阻害剤なしで活性化および増大させたＴ細胞の集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍またはそれ超に増加する。
【０１６８】
一実施形態では、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３およびＬＡＧ３からなる群より選択されるマーカーの１種または複数の発現は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ阻害剤により活性化および増大させたＴ細胞の集団と比較して、１．５分の１以下、２分の１以下、３分の１以下、４分の１以下、５分の１以下、６分の１以下、７分の１以下、８分の１以下、９分の１以下、１０分の１以下、２５分の１以下またはそれ未満に減少する。
【０１６９】
一実施形態では、本明細書において意図されている製造方法は、ナイーブまたは発生的に能力あるＴ細胞の１種または複数のマーカーを含むＴ細胞の数を増加させる。いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、本発明者らは、１種または複数のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ阻害剤によるＴ細胞を含む細胞の集団の処理が、Ｔ細胞増殖および分化シグナルを切り離し、それにより、発生的に能力あるＴ細胞の増大の増加をもたらし、既存のＴ細胞療法よりも頑強かつ効果的な養子免疫療法を提供すると考える。
【０１７０】
本明細書において意図されている方法を使用して製造されるＴ細胞において増加されるナイーブまたは発生的に能力あるＴ細胞のマーカーの実例として、これらに限定されないが、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ９５、ＣＤ１２２およびＣＤ１２７が挙げられる。特定の実施形態では、ナイーブＴ細胞は、次のマーカー：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３およびＬＡＧ３の１種または複数を発現しないまたは実質的に発現しない。
【０１７１】
Ｔ細胞に関して、本明細書において意図されている種々の増大方法論に起因するＴ細胞集団は、用いられる条件に依存して様々な特異的表現型特性を有することができる。種々の実施形態では、増大させたＴ細胞集団は、次の表現型マーカー：ＣＣＲ７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ９５、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７およびＨＬＡ−ＤＲの１種または複数を含む。
【０１７２】
一実施形態では、このような表現型マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２およびＣＤ１２７のうち１種もしくは複数または全ての増強された発現を含む。特定の実施形態では、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２およびＣＤ１２７を含むナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられるＣＤ８＋Ｔリンパ球が増大する。
【０１７３】
特定の実施形態では、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２およびＣＤ１２７を含むセントラルメモリーＴ細胞の表現型マーカーの発現ならびにグランザイムＢに関して陰性によって特徴付けられるＴ細胞が増大する。一部の実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、ＣＤ６２Ｌを含むナイーブＣＤ４＋細胞の表現型マーカーの発現ならびにＣＤ４５ＲＡおよび／またはＣＤ４５ＲＯの発現に関して陰性によって特徴付けられるＣＤ４＋Ｔリンパ球が増大する。一部の実施形態では、ＣＤ６２Ｌを含むセントラルメモリーＣＤ４＋細胞の表現型マーカーの発現およびＣＤ４５ＲＯ陽性によって特徴付けられるＣＤ４＋細胞。一部の実施形態では、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性およびＣＤ４５ＲＯ陰性である。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、個体から単離され、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるさらなる操作なしで改変される。次いで、このような細胞を個体に直接的に再投与することができる。さらなる実施形態では、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように遺伝子改変される前に、Ｔ細胞をまず活性化および刺激して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させる。この点について、Ｔ細胞は、遺伝子改変（すなわち、本明細書において意図されている工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクト）される前および／または後に培養することができる。
【０１７６】
２．活性化および増大
Ｔ細胞組成物の十分な治療用量を達成するために、Ｔ細胞は多くの場合、１または複数ラウンドの刺激、活性化および／または増大に供される。Ｔ細胞は、例えば、これらのそれぞれがその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；および同第６，８６７，０４１号に記載されている方法を使用して、一般に活性化および増大させることができる。工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞は、Ｔ細胞が改変される前および／または後に活性化および増大させることができる。加えて、Ｔ細胞は、活性化および／または増大の前、最中および／または後に、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路をモジュレートする１種または複数の薬剤と接触させることができる。一実施形態では、本明細書において意図されている方法によって製造されたＴ細胞は、そのそれぞれが、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路をモジュレートする１種または複数の薬剤を含むことができる、１、２、３、４もしくは５またはそれを超えるラウンドの活性化および増大を受ける。
【０１７７】
一実施形態では、共刺激リガンドは、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に提示され、これは、Ｔ細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それにより、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によってもたらされる一次シグナルに加えて、所望のＴ細胞応答を媒介するシグナルをもたらす。適切な共刺激リガンドとして、これらに限定されないが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドが挙げられる。
【０１７８】
特定の実施形態では、共刺激リガンドは、これらに限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、１ＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含めたＴ細胞上に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む。
【０１７９】
適切な共刺激リガンドは、可溶性形態で提供され得るまたはＡＰＣもしくはａＡＰＣ上に発現され得る標的抗原をさらに含み、これは、改変Ｔ細胞上に発現される工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲに結合する。
【０１８０】
種々の実施形態では、本明細書において意図されているＴ細胞を製造するための方法は、Ｔ細胞を含む細胞の集団を活性化するステップと、Ｔ細胞の集団を増大させるステップとを含む。Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によるまたはＣＤ２表面タンパク質の刺激を介した一次刺激シグナルを提供し、アクセサリー分子、例えば、ＣＤ２８による二次共刺激シグナルを提供することにより達成することができる。
【０１８１】
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、Ｔ細胞を適切なＣＤ３結合剤、例えば、ＣＤ３リガンドまたは抗ＣＤ３モノクローナル抗体と接触させることにより刺激することができる。ＣＤ３抗体の実例として、これらに限定されないが、ＯＫＴ３、Ｇ１９−４、ＢＣ３および６４．１が挙げられる。
【０１８２】
別の実施形態では、ＣＤ２結合剤を使用して、Ｔ細胞に一次刺激シグナルを提供することができる。ＣＤ２結合剤の実例として、これらに限定されないが、ＣＤ２リガンドおよび抗ＣＤ２抗体、例えば、Ｔ１１．１またはＴ１１．２抗体と組み合わせたＴ１１．３抗体（Ｍｅｕｅｒ，  Ｓ．  Ｃ．ら（１９８４年）Ｃｅｌｌ  ３６巻：８９７〜９０６頁）および９−１抗体と組み合わせた９．６抗体（ＴＩ  １．１と同じエピトープを認識する）（Ｙａｎｇ，  Ｓ．  Ｙ．ら（１９８６年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７巻：１０９７〜１１００頁）が挙げられる。上述の抗体のいずれかと同じエピトープに結合する他の抗体を使用することもできる。追加的な抗体または抗体の組合せは、本明細書の他の箇所に開示されている標準技法によって調製および同定することができる。
【０１８３】
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によりまたはＣＤ２を介して提供される一次刺激シグナルに加えて、Ｔ細胞応答の誘導は、第２の共刺激シグナルを必要とする。特定の実施形態では、ＣＤ２８結合剤を使用して、共刺激シグナルを提供することができる。ＣＤ２８結合剤の実例として、これらに限定されないが、天然ＣＤ２８リガンド、例えば、ＣＤ２８の天然リガンド（例えば、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）など、タンパク質のＢ７ファミリーのメンバー）；ならびにＣＤ２８分子を架橋することができる抗ＣＤ２８モノクローナル抗体またはその断片、例えば、モノクローナル抗体９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８、ＫＯＬＴ−２、１５Ｅ８、２４８．２３．２およびＥＸ５．３Ｄ１０が挙げられる。
【０１８４】
一実施形態では、一次刺激シグナルをもたらす分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２を通じて刺激をもたらす分子と共刺激分子を同じ表面にカップリングさせる。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、刺激シグナルをもたらす結合剤と共刺激シグナルをもたらす結合剤は細胞の表面に局在している。これは、細胞に、細胞表面上に発現するのに適した形態の結合剤をコードする核酸をトランスフェクトまたは形質導入することによって、あるいは、結合剤を細胞表面にカップリングさせることによって達成することができる。
【０１８６】
別の実施形態では、一次刺激シグナルをもたらす分子、例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２を通じて刺激をもたらす分子と共刺激分子を抗原提示細胞上にディスプレイさせる。
【０１８７】
一実施形態では、一次刺激シグナルをもたらす分子、例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２を通じて刺激をもたらす分子と共刺激分子を別々の表面上にもたらす。
【０１８８】
ある特定の実施形態では、刺激シグナルをもたらす結合剤と共刺激シグナルをもたらす結合剤の一方は可溶性であり（溶液中にもたらされる）、他の薬剤（複数可）は１つまたは複数の表面上にもたらされる。
【０１８９】
特定の実施形態では、刺激シグナルをもたらす結合剤と共刺激シグナルをもたらす結合剤はどちらも可溶性の形態でもたらされる（溶液中にもたらされる）。
【０１９０】
種々の実施形態では、本明細書において意図されているＴ細胞を製造するための方法は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体によりＴ細胞を活性化するステップを含む。
【０１９１】
本明細書において意図されている方法によって製造されるＴ細胞組成物は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路を阻害する１種または複数の薬剤の存在下で活性化および／または増大させたＴ細胞を含む。工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞は、Ｔ細胞が改変される前および／または後に活性化および増大させることができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞の集団は、活性化され、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように改変され、次いで増大のために培養される。
【０１９２】
一実施形態では、本明細書において意図されている方法によって製造されたＴ細胞は、高い増殖能および自己再生する能力を示すマーカーを発現するが、Ｔ細胞分化のマーカーを発現しないまたは実質的に検出不能なマーカーを発現する、増加した数のＴ細胞を含む。このようなＴ細胞は、頑強な様式で繰り返し活性化および増大させ、それにより、改善された治療用Ｔ細胞組成物を提供することができる。
【０１９３】
一実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路を阻害する１種または複数の薬剤の存在下で活性化および増大させたＴ細胞の集団は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ阻害剤なしで活性化および増大させたＴ細胞の集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍またはそれ超に増大する。
【０１９４】
一実施形態では、若いＴ細胞のマーカーの発現によって特徴付けられるＴ細胞の集団は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路を阻害する１種または複数の薬剤の存在下で活性化および増大され、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ阻害剤なしで活性化および増大させたＴ細胞の集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍またはそれ超に増大する。
【０１９５】
一実施形態では、本明細書において意図されている方法によって活性化されたＴ細胞の増大は、数時間（約３時間）から約７日間から約２８日間またはその間のいずれかの時間的整数値の間、Ｔ細胞を含む細胞の集団を培養することをさらに含む。別の実施形態では、Ｔ細胞組成物は、１４日間培養することができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、約２１日間培養される。別の実施形態では、Ｔ細胞組成物は、約２〜３日間培養される。Ｔ細胞の培養時間が、６０日間またはそれを超えることができるように、数サイクルの刺激／活性化／増大が望ましい場合もある。
【０１９６】
特定の実施形態では、Ｔ細胞培養に適切な条件は、適切な培地（例えば、基礎培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ  １５（Ｌｏｎｚａ））、ならびにこれらに限定されないが、血清（例えば、ウシ胎仔またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは当業者に公知の細胞の成長に適した任意の他の添加物を含めた、増殖および生存度に必要な１種または複数の因子を含む。
【０１９７】
細胞培養培地のさらなる実例として、これらに限定されないが、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが添加された、無血清であるかまたは適量の血清（または血漿）もしくはホルモンの定義済みのセット、ならびに／もしくはＴ細胞の成長および増大に十分な量のサイトカイン（複数可）を補充した、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｃｌｉｃｋｓ、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられる。
【０１９８】
Ｔ細胞増大のための他の添加物の実例として、これらに限定されないが、界面活性剤、ｐｉａｓｍａｎａｔｅ、ＨＥＰＥＳなどのｐＨ緩衝液ならびにＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールなどの還元剤が挙げられる。
【０１９９】
抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養物のみに含まれ、被験体に注入するための細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件下で、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気プラス５％ＣＯ２）下に維持される。
【０２００】
特定の実施形態では、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−７および／またはＩＬ−１５など、適切なサイトカインを含有する培養培地において、ビーズまたは他の表面に一般に付着された抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体など、刺激剤および共刺激剤と接触させられる。
【０２０１】
他の実施形態では、人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）は、様々な共刺激分子およびサイトカインの安定的な発現および分泌を導くようＫ５６２、Ｕ９３７、７２１．２２１、Ｔ２およびＣ１Ｒ細胞を工学的に作製することにより作製される。特定の実施形態では、Ｋ３２またはＵ３２  ａＡＰＣは、ＡＡＰＣ細胞表面における１種または複数の抗体に基づく刺激分子の提示を導くように使用される。Ｔ細胞の集団は、これらに限定されないが、ＣＤ１３７Ｌ（４−１ＢＢＬ）、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）および／またはＣＤ８０またはＣＤ８６を含めた、様々な共刺激分子を発現するａＡＰＣによって増大させることができる。最後に、ａＡＰＣは、遺伝子改変されたＴ細胞を増大させ、ＣＤ８  Ｔ細胞におけるＣＤ２８発現を維持するための効率的なプラットフォームを提供する。ＷＯ０３／０５７１７１およびＵＳ２００３／０１４７８６９に提供されるａＡＰＣは、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０２】
３．薬剤
種々の実施形態では、Ｔ細胞を細胞におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路をモジュレートする薬剤と接触させるステップを含む、未分化または発生的に能力あるＴ細胞を増大させる、Ｔ細胞を製造するための方法が提供される。細胞は、活性化および増大の前、最中および／または後に接触させることができる。Ｔ細胞組成物は、分化の実質的な増加を伴わずに複数ラウンドの増大を受けることができるように、十分なＴ細胞効力を保持する。
【０２０３】
本明細書で使用される場合、用語「モジュレート」、「モジュレーター」もしくは「モジュレート剤」または同等の用語は、細胞シグナル伝達経路に変化を誘発する薬剤の能力を指す。モジュレーターは、経路構成成分の量、活性を増加もしくは減少させることができる、または細胞シグナル伝達経路の所望の効果もしくはアウトプットを増加もしくは減少させることができる。一実施形態では、モジュレーターは、阻害剤である。別の実施形態では、モジュレーターは、活性化因子である。
【０２０４】
「薬剤」は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路のモジュレーションにおいて使用される化合物、小分子、例えば、有機小分子、核酸、ポリペプチド、またはその断片、アイソフォーム、バリアント、アナログもしくは誘導体を指す。
【０２０５】
「小分子」は、約５ｋＤ未満、約４ｋＤ未満、約３ｋＤ未満、約２ｋＤ未満、約１ｋＤ未満または約．５ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指す。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣薬（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、ペプトイド、炭水化物、脂質、それらの構成成分または他の有機もしくは無機分子を含むことができる。真菌、細菌または藻類抽出物など、化学的および／または生物学的混合物のライブラリーは、当技術分野で公知であり、本発明のアッセイのいずれかによりスクリーニングすることができる。分子ライブラリーの合成のための方法の例は、（Ｃａｒｅｌｌら、１９９４ａ年；Ｃａｒｅｌｌら、１９９４ｂ年；Ｃｈｏら、１９９３年；ＤｅＷｉｔｔら、１９９３年；Ｇａｌｌｏｐら、１９９４年；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、１９９４年）に見出すことができる。
【０２０６】
「アナログ」は、本発明の所望の活性を有する化合物、ヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドまたは化合物と同様または同一の活性または機能（複数可）を保持するが、好ましい実施形態の配列または構造と同様または同一である配列または構造を含む必要が必ずしもない、小型有機化合物、ヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドを指す。
【０２０７】
「誘導体」は、アミノ酸残基置換、欠失もしくは付加の導入によって変更された親タンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む化合物、タンパク質もしくはポリペプチド、またはヌクレオチド置換もしくは欠失、付加もしくは変異の導入のいずれかにより改変された核酸もしくはヌクレオチドのいずれかを指す。誘導体核酸、ヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドは、親ポリペプチドと同様または同一の機能を保持する。
【０２０８】
種々の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路をモジュレートする薬剤は、経路の構成成分を活性化する。「活性化因子」または「アゴニスト」は、ＰＩ３Ｋ、ＡｋｔまたはｍＴＯＲ（またはｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２複合体）の１種または複数の活性を阻害する分子を限定することなく含む、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路における分子の１種または複数の活性を促進、増加または誘導する薬剤を指す。
【０２０９】
種々の実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路をモジュレートする薬剤は、経路の構成成分を阻害する。「阻害剤」または「アンタゴニスト」は、ＰＩ３Ｋ、ＡｋｔまたはｍＴＯＲ（またはｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２複合体）を限定することなく含む、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路における分子の１種または複数の活性を阻害、減少または低下させる薬剤を指す。一実施形態では、阻害剤は、二重分子阻害剤である。一実施形態では、阻害剤は、ｍＴＯＲＣ１または関連する複合体など、タンパク質複合体の形成を防止する。特定の実施形態では、阻害剤は、同じもしくは実質的に同様の活性を有する分子のクラスを阻害することができる（汎阻害剤）、または分子の活性を特異的に阻害することができる（選択的または特異的な阻害剤）。阻害は、不可逆的であっても可逆的であってもよい。
【０２１０】
一実施形態では、阻害剤は、少なくとも１ｎＭ、少なくとも２ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも５０μＭまたは少なくとも１００μＭのＩＣ５０を有する。ＩＣ５０決定は、当技術分野で公知の任意の従来の技法を使用して達成することができる。例えば、ＩＣ５０は、ある範囲の濃度の研究中の阻害剤の存在下で所与の酵素の活性を測定することにより決定することができる。次いで、酵素活性の実験により得られる値を、使用されている阻害剤濃度に対しプロットする。５０％酵素活性（あらゆる阻害剤の非存在下での活性と比較して）を示す阻害剤の濃度を、「ＩＣ５０」値とする。類似して、他の阻害濃度は、活性の適切な決定により定義することができる。
【０２１１】
種々の実施形態では、Ｔ細胞は、少なくとも１ｎＭ、少なくとも２ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも１００μＭまたは少なくとも１Ｍの濃度のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の１種または複数のモジュレーターと、接触または処理または培養される。
【０２１２】
特定の実施形態では、Ｔ細胞は、少なくとも１２時間、１８時間、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７日間、少なくとも２週間、少なくとも１、２、３、４、５もしくは６ヶ月間またはそれを超えて、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれを超えるラウンドの増大により、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の１種または複数のモジュレーターと接触または処理または培養することができる。
【０２１３】
ａ．ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路
ラパマイシンのホスファチジル−イノシトール−３キナーゼ／Ａｋｔ／哺乳動物標的（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ）経路は、細胞増殖、分化、代謝および生存と増殖因子シグナル伝達を統合するためのルート（ｃｏｎｄｕｉｔ）として働く。ＰＩ３Ｋは、高度に保存された細胞内脂質キナーゼのファミリーである。クラスＩＡ  ＰＩ３Ｋは、直接的に、またはアダプター分子のインスリン受容体基質ファミリーとの相互作用により、増殖因子受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）によって活性化される。この活性は、セリン／スレオニンキナーゼＡｋｔの調節因子である、ホスファチジル−イノシトール−３，４，５−三リン酸（ｔｒｉｓｐｈｏｓｐａｔｅ）（ＰＩＰ３）の産生をもたらす。ｍＴＯＲは、別個の活性を与える異なる結合パートナーによりそれぞれ特徴付けられる、２個の別個の複合体を介した正準ＰＩ３Ｋ経路により作用する。ｍＴＯＲＣ１（ＰＲＡＳ４０、ｒａｐｔｏｒおよびｍＬＳＴ８／ＧｂＬとの複合体におけるｍＴＯＲ）は、タンパク質翻訳、細胞成長、増殖および生存と増殖因子シグナルを関連付ける、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達の下流エフェクターとして作用する。ｍＴＯＲＣ２（ｒｉｃｔｏｒ、ｍＳＩＮ１、ｐｒｏｔｏｒおよびｍＬＳＴ８との複合体におけるｍＴＯＲ）は、Ａｋｔの上流活性化因子として作用する。
【０２１４】
ＰＩ３Ｋの増殖因子受容体媒介性活性化により、Ａｋｔは、そのプレクストリン相同性ドメインとＰＩＰ３との相互作用により膜にリクルートされ、したがって、その活性化ループを露出し、構成的に活性を有するホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ１（ＰＤＫ１）によるスレオニン３０８（Ｔｈｒ３０８）におけるリン酸化を可能にする。最大活性化のため、Ａｋｔは、そのＣ末端疎水性モチーフのセリン４７３（Ｓｅｒ４７３）が、ｍＴＯＲＣ２によってもリン酸化される。ＤＮＡ−ＰＫおよびＨＳＰも、Ａｋｔ活性の調節において重要であると示されてきた。Ａｋｔは、ＴＳＣ２の阻害性リン酸化によりｍＴＯＲＣ１を活性化し、ＴＳＣ２はＴＳＣ１と共に、ｍＴＯＲＣ１の正の調節因子であるＲｈｅｂ  ＧＴＰａｓｅを阻害することにより、ｍＴＯＲＣ１を負に調節する。ｍＴＯＲＣ１は、２種の十分に定義された基質、ｐ７０Ｓ６Ｋ（以後、Ｓ６Ｋ１と称される）および４Ｅ−ＢＰ１を有し、これら両者共に、タンパク質合成を決定的に調節する。したがって、ｍＴＯＲＣ１は、タンパク質翻訳および細胞増殖と増殖因子シグナル伝達を関連付ける、ＰＩ３Ｋの重要な下流エフェクターである。
【０２１５】
ｂ．ｍＴＯＲ阻害剤
用語「ｍＴＯＲ阻害剤」または「ｍＴＯＲを阻害する薬剤」は、例えば、その基質（例えば、ｐ７０Ｓ６キナーゼ１、４Ｅ−ＢＰ１、ＡＫＴ／ＰＫＢおよびｅＥＦ２）のうち少なくとも１種におけるセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性など、ｍＴＯＲタンパク質の少なくとも１種の活性を阻害する核酸、ペプチド、化合物または有機小分子を指す。ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２またはｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両方に直接的に結合し、これを阻害することができる。
【０２１６】
ｍＴＯＲＣ１および／またはｍＴＯＲＣ２活性の阻害は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路のシグナル伝達の低下によって決定することができる。多種多様な読み出し情報（ｒｅａｄｏｕｔ）を利用して、このようなシグナル伝達経路のアウトプットの低下を確立することができる。一部の非限定的な例示的な読み出し情報は、（１）これらに限定されないが、５４７３およびＴ３０８を含めた残基におけるＡｋｔのリン酸化の減少；（２）例えば、これらに限定されないが、Ｆｏｘ０１／Ｏ３ａ  Ｔ２４／３２、ＧＳＫ３ａ／β；Ｓ２１／９およびＴＳＣ２  Ｔ１４６２を含めたＡｋｔ基質のリン酸化の低下によって証明されるＡｋｔの活性化の減少；（３）これらに限定されないが、リボソームＳ６  Ｓ２４０／２４４、７０Ｓ６Ｋ  Ｔ３８９および４ＥＢＰ１  Ｔ３７／４６を含めたｍＴＯＲの下流のシグナル伝達分子のリン酸化の減少；ならびに（４）がん性細胞の増殖の阻害を含む。
【０２１７】
一実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、活性部位阻害剤である。これらは、ｍＴＯＲのＡＴＰ結合部位（ＡＴＰ結合ポケットとも称される）に結合し、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両方の触媒活性を阻害するｍＴＯＲ阻害剤である。本明細書において意図されているＴ細胞製造方法における使用に適した活性部位阻害剤の１クラスは、ＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲの両方を標的とし、これらを直接的に阻害する二重特異性阻害剤である。二重特異性阻害剤は、ｍＴＯＲおよびＰＩ３ＫのＡＴＰ結合部位の両方に結合する。このような阻害剤の実例として、これらに限定されないが、イミダゾキナゾリン、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、ＰＩ−１０３（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ＳＦ１１２６（Ｓｅｍａｆｏｒｅ）、ＢＧＴ２２６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ７６５（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）およびＮＶＰ−ＢＥＺ２３５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が挙げられる。
【０２１８】
本明細書において意図されている方法における使用に適したｍＴＯＲ活性部位阻害剤の別のクラスは、１種または複数のＩ型ホスファチジル（ｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌ）イノシトール３−キナーゼ、例えば、ＰＩ３キナーゼα、β、γまたはδと比べて、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２活性を選択的に阻害する。このような活性部位阻害剤は、ＰＩ３ＫではなくｍＴＯＲの活性部位に結合する。このような阻害剤の実例として、これらに限定されないが、ピラゾロピリミジン、Ｔｏｒｉｎ１（ＧｕｅｒｔｉｎおよびＳａｂａｔｉｎｉ）、ＰＰ２４２（２−（４−アミノ−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−５−オール）、ＰＰ３０、Ｋｕ−００６３７９４、ＷＡＹ−６００（Ｗｙｅｔｈ）、ＷＡＹ−６８７（Ｗｙｅｔｈ）、ＷＡＹ−３５４（Ｗｙｅｔｈ）およびＡＺＤ８０５５（Ｌｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ、８巻、６２７〜６４４頁、２００９年）が挙げられる。Ｉ
【０２１９】
一実施形態では、選択的ｍＴＯＲ阻害剤は、１、２、３種もしくはそれを超えるＩ型ＰＩ３−キナーゼまたは全てのＩ型ＰＩ３−キナーゼに関する阻害剤のＩＣ５０の１０分の１以下、２０分の１以下、５０分の１以下、１００分の１以下、１０００分の１以下またはそれ未満である、ｍＴＯＲＣ１および／またはｍＴＯＲＣ２に関する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を示す薬剤を指す。
【０２２０】
本発明における使用のためのｍＴＯＲ阻害剤の別のクラスは、本明細書において、「ラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）」と称される。本明細書で使用される場合、用語「ラパログ」は、ｍＴＯＲ  ＦＲＢドメイン（ＦＫＢＰラパマイシン結合性ドメイン）に特異的に結合し、ラパマイシンと構造的に関連し、ｍＴＯＲ阻害特性を保持する化合物を指す。用語、ラパログは、ラパマイシンを除外する。ラパログは、ラパマイシンのエステル、エーテル、オキシム、ヒドラゾンおよびヒドロキシルアミン、ならびにラパマイシンコア構造における官能基が、例えば、還元または酸化によって改変された化合物を含む。このような化合物の薬学的に許容される塩も、ラパマイシン誘導体であるとみなされる。本明細書において意図されている方法における使用に適したラパログの実例は、テムシロリムス（ＣＣ１７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、デフォロリムス（ＡＰ２３５７３）、ＡＺＤ８０５５（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）およびＯＳＩ−０２７（ＯＳＩ）を限定することなく含む。
【０２２１】
一実施形態では、薬剤は、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシン（シロリムス）である。
【０２２２】
特定の実施形態では、本発明における使用のための例示的なｍＴＯＲ阻害剤は、約２００ｎＭまたはそれ未満、好ましくは約１００ｎｍまたはそれ未満、さらにより好ましくは約６０ｎＭまたはそれ未満、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、１μＭまたはそれ未満のＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）で、ｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２またはｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両方のいずれかを阻害する。一態様では、本発明における使用のためのｍＴＯＲ阻害剤は、約２ｎＭ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、さらにより好ましくは約２ｎＭ〜約１５ｎＭのＩＣ５０で、ｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２またはｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両方のいずれかを阻害する。
【０２２３】
一実施形態では、例示的なｍＴＯＲ阻害剤は、約２００ｎＭまたはそれ未満、好ましくは約１００ｎｍまたはそれ未満、さらにより好ましくは約６０ｎＭまたはそれ未満、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、１μＭまたはそれ未満のＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）で、ＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲＣ１もしくはｍＴＯＲＣ２のいずれかまたはｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２およびＰＩ３Ｋの両方を阻害する。一態様では、本発明における使用のためのｍＴＯＲ阻害剤は、約２ｎＭ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、さらにより好ましくは約２ｎＭ〜約１５ｎＭのＩＣ５０で、ＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲＣ１もしくはｍＴＯＲＣ２またはｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２およびＰＩ３Ｋの両方を阻害する。
【０２２４】
本明細書において意図されている特定の実施形態での使用に適したｍＴＯＲ阻害剤のさらなる実例として、これらに限定されないが、ＡＺＤ８０５５、ＩＮＫ１２８、ラパマイシン、ＰＦ−０４６９１５０２およびエベロリムスが挙げられる。
【０２２５】
ｍＴＯＲは、ウエスタンブロッティングにおけるホスホ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）特異的抗体によって測定される通り、生理学的基質タンパク質、ｐ７０  Ｓ６リボソームタンパク質キナーゼＩ（ｐ７０Ｓ６Ｋ１）およびｅＩＦ４Ｅ結合タンパク質１（４ＥＢＰ１）に向けた頑強かつ特異的な触媒活性を実証することが示された。
【０２２６】
一実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＢＩ−Ｄ１８７０、Ｈ８９、ＰＦ−４７０８６７１、ＦＭＫおよびＡＴ７８６７からなる群より選択されるｓ６キナーゼ阻害剤である。
【０２２７】
ｃ．ＰＩ３Ｋ阻害剤
本明細書で使用される場合、用語「ＰＩ３Ｋ阻害剤」は、ＰＩ３Ｋに結合し、その少なくとも１種の活性を阻害する核酸、ペプチド、化合物または有機小分子を指す。ＰＩ３Ｋタンパク質は、３つのクラス、クラス１  ＰＩ３Ｋ、クラス２  ＰＩ３Ｋおよびクラス３  ＰＩ３Ｋに分けることができる。クラス１  ＰＩ３Ｋは、４種のｐ１１０触媒サブユニット（ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δおよびｐ１１０γ）のうち１種および調節性サブユニットの２種のファミリーのうち１種からなるヘテロ二量体として存在する。本発明のＰＩ３Ｋ阻害剤は、好ましくは、クラス１  ＰＩ３Ｋ阻害剤を標的とする。一実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、クラス１  ＰＩ３Ｋ阻害剤の１種または複数のアイソフォームに対する選択性（すなわち、ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δおよびｐ１１０γ、またはｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δおよびｐ１１０γのうち１種もしくは複数に対する選択性）を示すであろう。別の態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、アイソフォーム選択性を示さず、「汎ＰＩ３Ｋ阻害剤」とみなされるであろう。一実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ触媒ドメインへの結合に関してＡＴＰと競合するであろう。
【０２２８】
ある特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、例えば、ＰＩ３Ｋと共にＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路における追加的なタンパク質を標的とすることができる。特定の実施形態では、ｍＴＯＲおよびＰＩ３Ｋの両方を標的とするＰＩ３Ｋ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤またはＰＩ３Ｋ阻害剤のいずれかと称することができる。ＰＩ３Ｋのみを標的とするＰＩ３Ｋ阻害剤は、選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤と称することができる。一実施形態では、選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ｍＴＯＲおよび／または経路における他のタンパク質に関する阻害剤のＩＣ５０の１０分の１以下、２０分の１以下、３０分の１以下、５０分の１以下、１００分の１以下、１０００分の１以下またはそれ未満である、ＰＩ３Ｋに関する５０％阻害濃度を示す薬剤を指すものと理解することができる。
【０２２９】
特定の実施形態では、例示的なＰＩ３Ｋ阻害剤は、約２００ｎＭまたはそれ未満、好ましくは約１００ｎｍまたはそれ未満、さらにより好ましくは約６０ｎＭまたはそれ未満、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、１μＭまたはそれ未満のＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）でＰＩ３Ｋを阻害する。一実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、約２ｎＭ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、さらにより好ましくは約２ｎＭ〜約１５ｎＭのＩＣ５０でＰＩ３Ｋを阻害する。
【０２３０】
本明細書において意図されているＴ細胞製造方法における使用に適したＰＩ３Ｋ阻害剤の実例として、これらに限定されないが、ＢＫＭ１２０（クラス１  ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ１４７（クラス１  ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、（汎ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）およびＰＸ−８６６（クラス１  ＰＩ３Ｋ阻害剤；ｐ１１０α、ｐ１１０βおよびｐ１１０γアイソフォーム、Ｏｎｃｏｔｈｙｒｅｏｎ）が挙げられる。
【０２３１】
選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤の他の実例として、これらに限定されないが、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ−２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ−１０１、ＺＳＴＫ４７４およびＩＰＩ−１４５が挙げられる。
【０２３２】
汎ＰＩ３Ｋ阻害剤のさらなる実例として、これらに限定されないが、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ＧＳＫ１０５９６１５およびＧＤＣ−０９４１が挙げられる。
【０２３３】
ｄ．ＡＫＴ阻害剤
本明細書で使用される場合、用語「ＡＫＴ阻害剤」は、ＡＫＴの少なくとも１種の活性を阻害する核酸、ペプチド、化合物または有機小分子を指す。ＡＫＴ阻害剤は、脂質に基づく阻害剤（例えば、ＡＫＴが原形質膜に局在化するのを防止する、ＡＫＴのプレクストリン相同性ドメインを標的とする阻害剤）、ＡＴＰ競合的阻害剤およびアロステリック阻害剤を含むいくつかのクラスにグループ化することができる。一実施形態では、ＡＫＴ阻害剤は、ＡＫＴ触媒部位に結合することにより作用する。特定の実施形態では、Ａｋｔ阻害剤は、ｍＴＯＲなど、下流ＡＫＴ標的のリン酸化を阻害することにより作用する。別の実施形態では、ＡＫＴ活性は、例えば、ＡＫＴのＤＮＡ−ＰＫ活性化、ＡＫＴのＰＤＫ−１活性化および／またはＡｋｔのｍＴＯＲＣ２活性化を阻害することにより、Ａｋｔを活性化するためのインプットシグナルを阻害することにより阻害される。
【０２３４】
ＡＫＴ阻害剤は、全３種のＡＫＴアイソフォーム、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３を標的とすることができる、またはアイソフォーム選択的となり、ＡＫＴアイソフォームのうち１もしくは２種のみを標的とすることができる。一実施形態では、ＡＫＴ阻害剤は、ＡＫＴと共に、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路における追加的なタンパク質を標的とすることができる。ＡＫＴのみを標的とするＡＫＴ阻害剤は、選択的ＡＫＴ阻害剤と称することができる。一実施形態では、選択的ＡＫＴ阻害剤は、経路における他のタンパク質に関する阻害剤のＩＣ５０の１０分の１以下、２０分の１以下、３０分の１以下、５０分の１以下、１００分の１以下、１０００分の１以下またはそれ未満である、ＡＫＴに関する５０％阻害濃度を示す薬剤を指すものと理解することができる。
【０２３５】
特定の実施形態では、例示的なＡＫＴ阻害剤は、約２００ｎＭまたはそれ未満、好ましくは約１００ｎｍまたはそれ未満、さらにより好ましくは約６０ｎＭまたはそれ未満、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、１μＭまたはそれ未満のＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）でＡＫＴを阻害する。一実施形態では、ＡＫＴは、約２ｎＭ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、さらにより好ましくは約２ｎＭ〜約１５ｎＭのＩＣ５０でＡＫＴを阻害する。
【０２３６】
オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）に基づく抗体−薬物コンジュゲートと組み合わせた使用のためのＡＫＴ阻害剤の実例として、例えば、ペリフォシン（Ｋｅｒｙｘ）、ＭＫ２２０６（Ｍｅｒｃｋ）、ＶＱＤ−００２（ＶｉｏＱｕｅｓｔ）、ＸＬ４１８（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＧＳＫ６９０６９３、ＧＤＣ−００６８およびＰＸ３１６（ＰＲＯＬＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられる。
【０２３７】
選択的Ａｋｔ１阻害剤の非限定的な実例は、Ａ−６７４５６３である。
【０２３８】
選択的Ａｋｔ２阻害剤の非限定的な実例は、ＣＣＴ１２８９３０である。
【０２３９】
特定の実施形態では、Ａｋｔ阻害剤は、ＡｋｔのＤＮＡ−ＰＫ活性化、ＡｋｔのＰＤＫ−１活性化、ＡｋｔのｍＴＯＲＣ２活性化またはＡｋｔのＨＳＰ活性化を阻害する。
【０２４０】
ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤の実例として、これらに限定されないが、ＮＵ７４４１、ＰＩ−１０３、ＮＵ７０２６、ＰＩＫ−７５およびＰＰ−１２１が挙げられる。
【０２４１】
Ｄ．工学的に作製されたＴ細胞受容体およびキメラ抗原受容体
意図されるＴ細胞製造方法は、改変Ｔ細胞の分化の付随する増加を伴わない、高親和性Ｔ細胞受容体（工学的に作製されたＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されたＴ細胞の増大に特に有用である。一実施形態では、Ｔ細胞は、１種または複数の工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように遺伝子改変される。本明細書で使用される場合、本明細書において意図されている工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞は、「抗原特異的に向け直されたＴ細胞」と称することができる。
【０２４２】
１．工学的に作製されたＴＣＲ
天然に存在するＴ細胞受容体は、α−サブユニットとβ−サブユニットの２つのサブユニットを含み、そのそれぞれが、各Ｔ細胞のゲノムにおける組換え事象によって生じる独特のタンパク質である。ＴＣＲのライブラリーを、特定の標的抗原に対するそれらの選択性についてスクリーニングすることができる。このように、標的抗原に対して高いアビディティおよび反応性を有する天然ＴＣＲを選択し、クローニングし、その後、養子免疫療法のために使用するＴ細胞の集団に導入することができる。
【０２４３】
一実施形態では、Ｔ細胞を、標的抗原を発現する腫瘍細胞に対する特異性をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有するＴＣＲのサブユニットをコードするポリヌクレオチドを導入することによって改変する。特定の実施形態では、サブユニットが、トランスフェクトされると、標的細胞に向かい、免疫学的に関連するサイトカインシグナル伝達に関与する能力をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を保持する限り、サブユニットは天然に存在するサブユニットと比較して１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または改変を有する。工学的に作製されたＴＣＲは、関連性のある腫瘍関連ペプチドをディスプレイする標的細胞にも高いアビディティで結合することが好ましく、場合によって、関連性のあるペプチドを提示する標的細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの効率的な死滅を媒介する。
【０２４４】
工学的に作製されたＴＣＲをコードする核酸は、Ｔ細胞の（天然に存在する）染色体におけるそれらの天然の状況から単離されていることが好ましく、本明細書の他の箇所に記載されている適切なベクターに組み入れることができる。核酸およびこれらを含むベクターの両方は、細胞に有用に移入することができ、この細胞はＴ細胞であることが好ましい。次いで、改変Ｔ細胞は、形質導入された核酸（単数または複数）によってコードされるＴＣＲの１種または複数の鎖（好ましくは、２種の鎖）を発現することができる。好ましい実施形態では、工学的に作製されたＴＣＲは、特定のＴＣＲを通常発現しないＴ細胞に導入されるため、外因性ＴＣＲである。工学的に作製されたＴＣＲの本質的な側面は、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）または同様の免疫学的構成成分によって提示される腫瘍抗原に対する高いアビディティを有することである。工学的に作製されたＴＣＲとは対照的に、ＣＡＲは、ＭＨＣ非依存的様式で標的抗原に結合するように工学的に作製される。
【０２４５】
本発明の核酸によりコードされるタンパク質は、本発明のＴＣＲのα−鎖またはβ−鎖のアミノ末端またはカルボキシル末端部分に付着させた追加的なポリペプチドと、当該付着させた追加的なポリペプチドがα−鎖またはβ−鎖の機能的なＴ細胞受容体を形成する能力およびＭＨＣ依存性抗原認識に干渉しない限りは、共に発現させることができる。
【０２４６】
本明細書において意図されている工学的に作製されたＴＣＲによって認識される抗原としては、これに限定されないが、血液学的がんと固形腫瘍のどちらの抗原も含めた、がん抗原が挙げられる。例示的な抗原としては、これらに限定されないが、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、Ｄ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡＡ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、およびＶＥＧＦＲ２が挙げられる。
【０２４７】
２．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本明細書において意図されているＴ細胞製造方法は、Ｔ細胞を、本明細書において意図されている１つまたは複数のＣＡＲを発現するように改変するステップを含む。種々の実施形態では、本発明は、腫瘍細胞に対する細胞傷害性を向け直すＣＡＲを発現するように設計されたベクターを用いて遺伝子工学的に作製されたＴ細胞を提供する。ＣＡＲは、標的抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体に基づく特異性とＴ細胞受容体活性化細胞内ドメインを組み合わせて、特異的な抗腫瘍細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成する分子である。本明細書で使用される場合、「キメラ」という用語は、異なる起源由来の異なるタンパク質またはＤＮＡの部分で構成されていることを記載するものである。
【０２４８】
本明細書において意図されているＣＡＲは、特異的な標的抗原に結合する細胞外ドメイン（結合性ドメインまたは抗原特異的結合性ドメインとも称される）、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲの主要な特性は、免疫エフェクター細胞特異性を向け直し、それにより、増殖、サイトカイン産生、食作用またはモノクローナル抗体、可溶性リガンドもしくは細胞特異的共受容体の細胞特異的標的化能力を活用して標的抗原発現細胞の細胞死を主要組織適合性（ＭＨＣ）非依存的に媒介することが可能な分子の産生を誘発する能力である。
【０２４９】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソセリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭおよびＶＥＧＦＲ２からなる群より選択される標的抗原に特異的に結合する、これらに限定されないが、抗体もしくはその抗原結合性断片、係留されたリガンドまたは共受容体の細胞外ドメインを含めた細胞外結合性ドメイン；１種または複数のヒンジドメインまたはスペーサードメイン；これらに限定されないが、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ−１およびＣＤ１５２由来の膜貫通ドメインを含めた膜貫通ドメイン；これらに限定されないが、ＣＤ２８、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）およびＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）由来の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含めた１種または複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＣＤ３ζまたはＦｃＲγ由来の一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０２５０】
ａ．結合性ドメイン
特定の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、腫瘍細胞上に発現される、標的ポリペプチド、例えば、標的抗原に特異的に結合する細胞外結合性ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「結合性ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合性ドメイン」、「抗原特異的結合性ドメイン」、および「細胞外抗原特異的結合性ドメイン」という用語は、互換的に使用され、目的の標的抗原に特異的に結合する能力を有するＣＡＲを提供する。結合性ドメインは、生体分子（例えば、細胞表面受容体または腫瘍タンパク質、脂質、多糖、または他の細胞表面標的分子、またはその構成成分）を特異的に認識し、それに結合する能力を有する任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドを含み得る。結合性ドメインは、任意の天然に存在する、合成の、半合成の、または組換えによって作製された、目的の生体分子の結合パートナーを含む。
【０２５１】
特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合性ドメインは、抗体またはその抗原結合性断片を含む。「抗体」とは、免疫細胞によって認識されるものなどの抗原決定基を含有するペプチド、脂質、多糖、または核酸などの標的抗原のエピトープを特異的に認識し、それに結合する、少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドである結合剤を指す。抗体はその抗原結合性断片を含む。この用語は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体など）およびその抗原結合性断片などの遺伝子工学的に作製された形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４年〜１９９５年（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，  Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９７年も参照されたい。
【０２５２】
特定の実施形態では、標的抗原は、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、またはＶＥＧＦＲ２ポリペプチドのエピトープである。
【０２５３】
軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも称される３つの超可変領域が間に存在する「フレームワーク」領域を含有する。ＣＤＲは、例えば、Ｋａｂａｔら（Ｗｕ，  ＴＴおよびＫａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １３２巻（２号）：２１１〜５０頁、（１９７０年）；Ｂｏｒｄｅｎ，  Ｐ．およびＫａｂａｔ  Ｅ．  Ａ．、ＰＮＡＳ、８４巻：２４４０〜２４４３頁（１９８７年）；（これによって参照により組み込まれるＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９９１年を参照されたい）による配列によって、または、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｉｔｈｉａ，  Ｃ．およびＬｅｓｋ，  Ａ．Ｍ．、Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９６巻（４号）：９０１〜９１７頁（１９８７年）、Ｃｈｏｉｔｈｉａ、Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻：８７７〜８８３頁（１９８９年））による構造によってなど、従来の方法によって定義または同定することができる。
【０２５４】
異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、ヒトなどの種の中で比較的保存されている。構成要素である軽鎖および重鎖の組み合わせたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域はＣＤＲを３次元空間内に位置付け、整列させるのに役立つ。ＣＤＲは、主に、抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは、一般には、Ｎ末端から開始して逐次的に番号が付され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称され、また、一般には、特定のＣＤＲが位置する鎖によって同定される。したがって、抗体の重鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と称され、抗体の軽鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３と称される。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は異なるＣＤＲを有する。ＣＤＲは抗体間で変動するが、抗原結合に直接関与するのはＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置である。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と称される。
【０２５５】
「ＶＨ」または「ＶＨ」への言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書に開示されている他の抗体断片のものを含めた、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」または「ＶＬ」への言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書に開示されている他の抗体断片のものを含めた、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
【０２５６】
「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一のクローンによって、または単一の抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生される抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって、例えば、骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞の融合によるハイブリッドの抗体形成細胞を作出することにより産生される。モノクローナル抗体はヒト化モノクローナル抗体を含む。
【０２５７】
「キメラ抗体」は、１つの種、例えばヒトなどに由来するフレームワーク残基と、別の種、例えばマウスなどに由来するＣＤＲ（一般に、抗原結合を付与する）を有する。特定の好ましい実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、キメラ抗体またはその抗原結合性断片である抗原特異的結合性ドメインを含む。
【０２５８】
ある特定の好ましい実施形態では、抗体は、腫瘍細胞上の表面タンパク質に特異的に結合するヒト化抗体（例えば、ヒト化モノクローナル抗体など）である。「ヒト化」抗体は、ヒトフレームワーク領域と非ヒト（例えば、マウス、ラット、または合成）免疫グロブリン由来の１つまたは複数のＣＤＲとを含む免疫グロブリンである。ヒト化抗体は、遺伝子工学によって構築することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい）。
【０２５９】
特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合性ドメインは、これらに限定されないが、ラクダＩｇ（ラクダ科動物抗体（ＶＨＨ））、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ））を含めた、抗体またはその抗原結合性断片を含む。
【０２６０】
「ラクダＩｇ」または「ラクダ科動物ＶＨＨ」とは、本明細書で使用される場合、重鎖抗体の最小の公知の抗原結合単位を指す（Ｋｏｃｈ−Ｎｏｌｔｅら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、２１巻：３４９０〜３４９８頁（２００７年））。「重鎖抗体」または「ラクダ科動物抗体」とは、ＶＨドメインを２つ含有し、軽鎖を含有しない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１巻：２５〜３８頁（１９９９年）；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号）。
【０２６１】
「ＩｇＮＡＲ」または「免疫グロブリン新抗原受容体（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」とは、１つの可変新抗原受容体（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＶＮＡＲ）ドメインおよび５つの定常新抗原受容体（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＣＮＡＲ）ドメインのホモ二量体からなるサメ免疫レパートリーに由来する抗体のクラスを指す。
【０２６２】
抗体のパパイン消化により、それぞれが単一の抗原結合性部位を有する、「Ｆａｂ」断片と称される２つの同一の抗原結合性断片と、容易に結晶化できることが名称に反映されている、残りの「Ｆｃ」断片が生じる。Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、Ｆａｂ断片とは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含めた数個の残基が付加されていることによって異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離のチオール基を有するＦａｂ’に対する名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として作製された。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
【０２６３】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合性部位を含有する最小の抗体断片である。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインを、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合により連結することができ、したがって、軽鎖および重鎖が、二本鎖Ｆｖ種におけるものと類似した「二量体」構造に会合し得る。
【０２６４】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合性部位を有する抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖内で接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対形成が可能になるには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、強制的に別の鎖の相補的なドメインと対形成し、２つの抗原結合性部位が創出される。ダイアボディは二価または二特異性であってよい。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９巻：１２９〜１３４頁（２００３年）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）においてより詳細に記載されている。トリアボディおよびテトラボディもＨｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９巻：１２９〜１３４頁（２００３年）に記載されている。
【０２６５】
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」または「ナノボディ」とは、抗体重鎖の可変領域（ＶＨドメイン）または抗体軽鎖の可変領域（ＶＬドメイン）からなる抗体断片を指す（Ｈｏｌｔ，  Ｌ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１巻（１１号）：４８４〜４９０頁）。
【０２６６】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内にいずれかの方向で存在する（例えば、ＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ）。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それにより、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖの概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｅｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４年）、２６９〜３１５頁を参照されたい。
【０２６７】
好ましい実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、がん細胞上で発現される抗原に結合するｓｃＦｖ（マウス、ヒトまたはヒト化ｓｃＦｖ）である抗原特異的結合性ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、’グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、およびＶＥＧＦＲ２に結合する。
【０２６８】
ｂ．リンカー
ある特定の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、分子の適切な間隔およびコンフォメーションのために付加される、種々のドメイン間、例えば、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にリンカー残基を含んでよい。本明細書において意図されているＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つまたはそれ超のリンカーを含み得る。特定の実施形態では、リンカーの長さは、約１〜約２５アミノ酸、約５〜約２０アミノ酸、または約１０〜約２０アミノ酸、または間に入る任意のアミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ超のアミノ酸長である。
【０２６９】
リンカーの実例としては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ；グリシン−セリンポリマー（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎ（式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４、または５の整数である）；グリシン−アラニンポリマー；アラニン−セリンポリマー；および当技術分野で公知の他の柔軟なリンカーが挙げられる。グリシンおよびグリシン−セリンポリマーは、比較的構造化されておらず、したがって、本明細書に記載のＣＡＲなどの融合タンパク質のドメイン間の中性テザーとして機能することが可能であり得る。グリシンはアラニンに対してさえ、それよりも有意に多くｐｈｉ−ｐｓｉ空間に近づき、また、側鎖が長い残基よりも制限がはるかに少ない（Ｓｃｈｅｒａｇａ、Ｒｅｖ．  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  １１１７３〜１４２頁（１９９２年）を参照されたい）。特定の実施形態では、ＣＡＲの設計には、全体的にまたは部分的に柔軟であるリンカーを含めることができ、したがって、リンカーは、所望のＣＡＲ構造をもたらすために、柔軟なリンカーならびにより柔軟性の低い構造を付与する１つまたは複数の部分を含んでよいことが当業者には認識されよう。
【０２７０】
他の例示的なリンカーとしては、これらに限定されないが、以下のアミノ酸配列：ＧＧＧ；ＤＧＧＧＳ（配列番号１）；ＴＧＥＫＰ（配列番号２）（例えば、Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ  ５５２５〜５５３０頁（１９９７年）を参照されたい）；ＧＧＲＲ（配列番号３）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、１９９５年、上記）；（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、＝１、２、３、４または５）（配列番号４）（Ｋｉｍら、ＰＮＡＳ  ９３巻、１１５６〜１１６０頁（１９９６年）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号５）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９９０年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８７巻：１０６６〜１０７０頁）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号６）（Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２巻：４２３〜４２６頁）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号７）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号８）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号９）；ＬＲＱＫｄ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号１０）が挙げられる。あるいは、柔軟なリンカーは、ＤＮＡ結合性部位とペプチド自体の両方をモデリングすることが可能なコンピュータプログラムを使用して（ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、ＰＮＡＳ  ９０巻：２２５６〜２２６０頁（１９９３年）、ＰＮＡＳ  ９１巻：１１０９９〜１１１０３頁（１９９４年）、またはファージディスプレイ法によって合理的に設計することができる。
【０２７１】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、可変領域連結配列をさらに含むｓｃＦＶを含む。「可変領域連結配列」とは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を接続し、２つのサブ結合性ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能をもたらすアミノ酸配列であり、したがって、結果生じるポリペプチドは、同じ軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対する特異的な結合親和性を保持する。一実施形態では、可変領域連結配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ超のアミノ酸長である。特定の実施形態では、可変領域連結配列は、グリシン−セリンポリマー（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎ（式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４、または５の整数である）を含む。別の実施形態では、可変領域連結配列は、（Ｇ４Ｓ）３アミノ酸リンカーを含む。
【０２７２】
ｃ．スペーサードメイン
特定の実施形態では、ＣＡＲの結合性ドメインの後ろに、１つまたは複数の「スペーサードメイン」が続き、これは、抗原結合性ドメインをエフェクター細胞表面から離して適切な細胞間接触、抗原結合および活性化を可能にする領域を指す（Ｐａｔｅｌら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９９年；６巻：４１２〜４１９頁）。スペーサードメインは、天然、合成、半合成、または組換え供給源のいずれかに由来するものであってもよい。ある特定の実施形態では、スペーサードメインは、これらに限定されないが、１つまたは複数の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２およびＣＨ３を含めた、免疫グロブリンの部分である。スペーサードメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでよい。
【０２７３】
一実施形態では、スペーサードメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３を含む。
【０２７４】
ｄ．ヒンジドメイン
ＣＡＲの結合性ドメインの後ろには、一般に、１つまたは複数の「ヒンジドメイン」が続き、これは、抗原結合性ドメインをエフェクター細胞表面から離して位置づけ適切な細胞間接触、抗原結合および活性化を可能にすることにおいて役割を果たす。ＣＡＲは、一般に、結合性ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）の間に１つまたは複数のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え供給源のいずれかに由来するものであってもよい。ヒンジドメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでよい。
【０２７５】
本明細書に記載のＣＡＲでの使用に適した例示的なヒンジドメインとしては、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８およびＣＤ７などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が挙げられ、これは、これらの分子由来の野生型ヒンジ領域であってもよく、変更することもできる。別の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。
【０２７６】
ｅ．膜貫通（ＴＭ）ドメイン
「膜貫通ドメイン」は、細胞外結合性部分と細胞内シグナル伝達ドメインを融合し、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞の原形質膜に係留する、ＣＡＲの部分である。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成、または組換え供給源のいずれかに由来するものであってもよい。
【０２７７】
例示的なＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２およびＣＤ１５４に由来する（すなわち、少なくともその膜貫通領域（複数可）を含む）ものであってもよい。
【０２７８】
一実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメインを含む。別の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメイン、ならびに、ＣＡＲのＴＭドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸の間の長さであることが好ましい短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーを含む。グリシン−セリンリンカーは、特に適切なリンカーをもたらす。
【０２７９】
ｆ．細胞内シグナル伝達ドメイン
特定の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、標的抗原への有効なＣＡＲ結合のメッセージを免疫エフェクター細胞の内部に伝達して、エフェクター細胞機能、例えば、ＣＡＲと結合した標的細胞への細胞傷害性因子の放出、または細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合に伴って引き出される他の細胞応答を含めた、活性化、サイトカイン産生、増殖および細胞傷害活性を引き出すことに関与するＣＡＲの部分を指す。
【０２８０】
「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含めた補助もしくは活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞を、特殊機能を行うように誘導するタンパク質の部分を指す。通常は、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分を使用する範囲内で、そのような短縮された部分を、エフェクター機能シグナルを伝達する限りは、ドメイン全体の代わりに使用することができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮された部分を包含するものとする。
【０２８１】
ＴＣＲ単独によって生成されるシグナルはＴ細胞の完全な活性化に不十分であること、および二次または共刺激シグナルも必要であることが公知である。したがって、Ｔ細胞の活性化は、２つの別個のクラスの細胞内シグナル伝達ドメイン：ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）によって抗原依存的一次活性化を開始する一次シグナル伝達ドメインと、抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルをもたらす共刺激シグナル伝達ドメインとによって媒介されるということができる。好ましい実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、１つまたは複数の「共刺激シグナル伝達ドメイン」および「一次シグナル伝達ドメイン」を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０２８２】
一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激性に、または阻害性に調節する。刺激性に作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）またはＩＴＡＭとして公知であるシグナル伝達モチーフを含有してよい。
【０２８３】
本発明において特に使用される、一次シグナル伝達ドメインを含有するＩＴＡＭの実例としては、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。特定の好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインおよび１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内一次シグナル伝達および共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序でタンデムに膜貫通ドメインのカルボキシル末端と連結することができる。
【０２８４】
本明細書において意図されているＣＡＲは、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性および増大を増強するための１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。
【０２８５】
そのような共刺激分子の実例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＴＬＡ４、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、ＬＣＫ３、ＳＬＡＭ、ＤＡＰ１０、ＬＡＧ３、ＨＶＥＭおよびＮＫＤ２Ｃ、およびＣＤ８３が挙げられる。一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインからなる群より選択される１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０２８６】
一実施形態では、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、またはＶＥＧＦＲ２ポリペプチドに結合するｓｃＦｖ；ＣＤ８α；ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１、およびＣＤ１５２からなる群より選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン；ならびに、ＣＤ２８、ＣＤ５４、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、およびＣＤ２７８からなる群より選択される１つまたは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０２８７】
別の実施形態では、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、またはＶＥＧＦＲ２に結合するｓｃＦｖ；ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３およびＣＤ８α、およびＣＤ８αからなる群より選択されるヒンジドメイン；ＣＤ８α；ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ−１、およびＣＤ１５２からなる群より選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン；ならびに、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群より選択される１つまたは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０２８８】
さらに別の実施形態では、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、またはＶＥＧＦＲ２ポリペプチドに結合する、リンカーをさらに含むｓｃＦｖ；ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３およびＣＤ８α、およびＣＤ８αからなる群より選択されるヒンジドメイン；ＣＤ８α；ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ−１、およびＣＤ１５２からなる群より選択されるポリペプチドに由来するＴＭドメインと、ＴＭドメインをＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに連結する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸の間の長さであることが好ましい短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーとを含む膜貫通ドメイン；ならびに、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群より選択される１つまたは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０２８９】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、およびＶＥＧＦＲ２ポリペプチドに結合するｓｃＦｖ；ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメイン；約３アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメイン；ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群より選択される１つまたは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０２９０】
Ｅ．ポリペプチド
本発明は、一部には、工学的に作製されたＴＣＲおよびＣＡＲポリペプチドおよびその断片、これを含む細胞および組成物、ならびにポリペプチドを発現するベクターを意図する。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」および「タンパク質」は、反対のことが記されていない限り、互換的に使用され、従来の意味に従う、すなわち、アミノ酸の配列として使用される。ポリペプチドは、特定の長さに限定されない、例えば、全長タンパク質配列または全長タンパク質の断片を含むことができ、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などと共に、天然に存在するものと天然に存在しないものの両方の当技術分野で公知の他の修飾を含むことができる。種々の実施形態では、本明細書において意図されているポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（またはリーダー）配列を含み、この配列は、翻訳と同時に（ｃｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）または翻訳後に、タンパク質の移入を導く。本明細書に開示されている有用な適切なシグナル配列の実例として、これらに限定されないが、ＩｇＧ１重鎖シグナル配列およびＣＤ８αシグナル配列が挙げられる。ポリペプチドは、様々な周知の組換えおよび／または合成技法のいずれかを使用して調製することができる。本明細書において意図されているポリペプチドは、本開示のＣＡＲ、または本明細書において意図されているポリペプチドの１個もしくは複数のアミノ酸からの欠失、それらへの付加および／もしくはそれらの置換を有する配列を特に包含する。
【０２９１】
ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を包含する。ポリペプチドバリアントは、天然に存在するポリペプチドと、１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入の点で異なり得る。そのようなバリアントは、天然に存在するものであってもよく、例えば上記のポリペプチド配列のうちの１つまたは複数を修飾することによって合成により生成することもできる。例えば、特定の実施形態では、１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入を導入することにより、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲの結合親和性および／または他の生物学的性質を改善することが望ましい場合がある。好ましくは、本発明のポリペプチドは、それに対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％のアミノ酸の同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２９２】
ポリペプチドは、「ポリペプチド断片」を包含する。ポリペプチド断片とは、天然に存在するまたは組換えによって作製されたポリペプチドのアミノ末端における欠失、カルボキシル末端における欠失、および／または内部の欠失もしくは置換を有する、単量体であっても多量体であってもよいポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約５００アミノ酸長のアミノ酸の鎖を含んでよい。ある特定の実施形態では、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸長であることが理解されよう。
【０２９３】
ポリペプチドは、ポリペプチド（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）の合成、精製もしくは同定を容易にするため、または固体支持体へのポリペプチドの結合を増強するために、インフレームで融合することもでき、リンカーまたは他の配列とコンジュゲートすることもできる。
【０２９４】
上記の通り、本発明のポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、短縮および挿入を含む種々の仕方で変更することができる。このような操作のための方法は、当技術分野で一般に公知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡにおける変異により調製することができる。変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．８２巻：４８８〜４９２頁）、Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５４巻：３６７〜３８２頁）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，  Ｊ．  Ｄ．ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第４版、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．、１９８７年）およびこれらの中に引用されている参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８年）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出すことができる。
【０２９５】
ある特定の実施形態では、バリアントは保存的置換を含有する。「保存的置換」とは、あるアミノ酸により同様の性質を有する別のアミノ酸が置換されているものであり、したがって、ポリペプチドの二次構造およびハイドロパシー的性質は実質的に変化しないことがペプチド化学の当業者には予想されよう。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造に改変を行っても、望ましい特性を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能分子をまだ得ることができる。
【０２９６】
ポリペプチドバリアントは、グリコシル化された形態、他の分子との集合的コンジュゲート、および無関係の化学的部分（例えば、ペグ化分子）との共有結合コンジュゲートをさらに含む。共有結合バリアントは、当技術分野で公知の通り、アミノ酸の鎖内またはＮ末端もしくはＣ末端の残基に見いだされる基に官能基を連結することによって調製することができる。バリアントとしては、対立遺伝子バリアント、種バリアント、および変異タンパク質も挙げられる。タンパク質の機能活性に影響を及ぼさない領域の短縮または欠失もバリアントである。
【０２９７】
一実施形態では、２種またはそれ超のポリペプチドの発現が望まれる場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列を、本明細書の他の箇所で論じられているＩＲＥＳ配列によって分離することができる。別の実施形態では、２種またはそれ超のポリペプチドを、１つまたは複数の自己切断性ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現させることができる。
【０２９８】
本発明のポリペプチドは、融合ポリペプチドを包含する。好ましい実施形態では、融合ポリペプチドおよび融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質とは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個またはそれ超のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。融合ポリペプチドは、一般には、Ｃ末端とＮ末端を連結したものであるが、Ｃ末端とＣ末端、Ｎ末端とＮ末端、またはＮ末端とＣ末端を連結することもできる。融合タンパク質のポリペプチドは任意の順序であっても指定の順序であってもよい。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質は、融合ポリペプチドの所望の転写活性が保存される限りは、保存的に改変されたバリアント、多型バリアント、対立遺伝子、変異体、部分配列、および種間ホモログも包含し得る。融合ポリペプチドは、化学的な合成方法によって、または２つの部分間の化学結合によって作製することもでき、一般に、他の標準の技法を使用して調製することもできる。融合ポリペプチドを含むライゲーションされたＤＮＡ配列は、本明細書の他の箇所で論じられている適切な転写または翻訳制御エレメントに作動可能に連結している。
【０２９９】
一実施形態では、融合パートナーは、ネイティブな組換えタンパク質よりも高収量でのタンパク質の発現を補助する配列（発現エンハンサー）を含む。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解度が増加するように、またはタンパク質を所望の細胞内区画にターゲティングすることが可能になるように、または融合タンパク質の細胞膜を通る輸送が容易になるように、選択することができる。
【０３００】
融合ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドドメインのそれぞれの間にポリペプチド切断シグナルをさらに含んでよい。さらに、ポリペプチド部位を任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。例示的なポリペプチド切断シグナルは、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、希な制限酵素認識部位、自己切断性リボザイム認識部位）、および自己切断性ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位を含む（ｄｅＦｅｌｉｐｅおよびＲｙａｎ、２００４年、Ｔｒａｆｆｉｃ、５巻（８号）；６１６〜２６頁を参照されたい）。
【０３０１】
適切なプロテアーゼ切断部位および自己切断性ペプチドは当業者に公知である（例えば、Ｒｙａｎら、１９９７年、Ｊ．  Ｇｅｎｅｒ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８巻、６９９〜７２２頁；Ｓｃｙｍｃｚａｋら（２００４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ５巻、５８９〜５９４頁を参照されたい）。例示的なプロテアーゼ切断部位としては、これらに限定されないが、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＲＮＡ−２にコードされるプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロ球状ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子およびエンテロキナーゼの切断部位が挙げられる。一実施形態では、切断ストリンジェンシーが高いことに起因して、ＴＥＶ（タバコエッチ病ウイルス）プロテアーゼ切断部位、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号１１）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１２）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号１３）（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表す）（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧの間またはＱとＳの間で起こる）が好ましい。
【０３０２】
特定の実施形態では、自己切断性ペプチドは、ポティウイルスおよびカルジオウイルス２Ａペプチド、ＦＭＤＶ（口蹄疫ウイルス）、ウマ鼻炎Ａウイルス、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルスおよびブタテッショウウイルスから得られるポリペプチド配列を含む。
【０３０３】
ある特定の実施形態では、自己切断性ポリペプチド部位は、２Ａまたは２Ａ様部位、配列またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、２００１年、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８２巻：１０２７〜１０４１頁）。
【０３０４】
Ｆ．ポリヌクレオチド
特定の実施形態では、本明細書において意図されている１種または複数の工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）または組換えＤＮＡを指す。ポリヌクレオチドは、一本および二本鎖ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている参照配列（例えば、配列表を参照）のいずれかに対し少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはバリアントを含み、典型的には、この場合、バリアントは、参照配列の少なくとも１種の生物学的活性を維持する。種々の例示的な実施形態では、本発明は、一部には、発現ベクター、ウイルスベクターおよび移入プラスミドを構成するポリヌクレオチドならびにこれを含む組成物および細胞を意図する。
【０３０５】
特定の実施形態では、本発明により、少なくとも約５個、１０個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、５００個、１０００個、１２５０個、１５００個、１７５０個、または２０００個またはそれ超の本発明のポリペプチドの連続したアミノ酸残基、ならびに全ての中間の長さの本発明のポリペプチドの連続したアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドが提供される。「中間の長さ」とは、この文脈において、引用された値の間の任意の長さ、例えば、６、７、８、９など；１０１、１０２、１０３など；１５１、１５２、１５３など；２０１、２０２、２０３などを意味することが容易に理解されよう。
【０３０６】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列に対して実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または下で定義されているストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、参照ポリヌクレオチドと比較して、１つまたは複数のヌクレオチドが付加されているもしくは欠失している、または異なるヌクレオチドで置き換えられているポリヌクレオチドを包含する。この点について、参照ポリヌクレオチドに対して変異、付加、欠失および置換を含めたある特定の変更を行うことができ、それにより、変更されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することは当技術分野においてよく理解されている。
【０３０７】
「配列同一性」または、例えば、「と５０％同一の配列」を含む記述は、本明細書で使用される場合、比較のウインドウにわたって、配列がヌクレオチドごとまたはアミノ酸ごとに同一である程度を指す。したがって、「配列同一性の百分率」は、最適にアラインされた２つの配列を比較のウインドウにわたって比較し、両方の配列に同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を得ることによって算出することができる。本明細書に記載の参照配列のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが包含され、一般には、その場合、ポリペプチドバリアントは参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を維持する。
【０３０８】
２つまたはそれ超のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列の関係を記載するために使用される用語として、「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」、および「実質的な同一性」が挙げられる。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて長さが少なくとも１２単量体単位であるが、１５〜１８単量体単位の頻度が高く、多くの場合には、少なくとも２５単量体単位である。２つのポリヌクレオチドはそれぞれ（１）２つのポリヌクレオチド間で類似した配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（２）２つのポリヌクレオチド間で多岐にわたる配列を含み得るので、２つ（またはそれ超）のポリヌクレオチド間の配列の比較は、一般には、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウインドウ」にわたって比較して、同定し、配列類似性の局所的な領域を比較することによって実施される。「比較ウインドウ」とは、配列を、２つの配列を最適にアラインした後に、同じ数の連続した位置の参照配列と比較する、少なくとも６カ所、通常は約５０〜約１００カ所、より通常は約１００〜約１５０カ所の連続した位置の概念的なセグメントを指す。比較ウインドウは、２つの配列を最適にアラインするために、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して約２０％またはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでよい。比較ウインドウをアラインするための配列の最適なアラインメントは、アルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ））のコンピュータによる実行によって、または選択された種々の方法のいずれかによって生成される検査および最良のアラインメント（すなわち、比較ウインドウにわたって最も高い百分率相同性がもたらされる）によって行うことができる。例として、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３８９頁により開示されているプログラムのＢＬＡＳＴファミリーに対して参照を行うこともできる。配列解析に関する詳細な論述は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ、１９９４〜１９９８年、１５章のＵｎｉｔ  １９．３に見いだすことができる。
【０３０９】
本発明のポリヌクレオチドは、それ自体のコード配列の長さにかかわらず、本明細書の他の箇所で開示されているまたは当技術分野で公知のプロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、および自己切断性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のＤＮＡ配列と組み合わせることができ、したがって、それらの全体の長さは相当に変動し得る。したがって、ほぼどんな長さのポリヌクレオチド断片でも使用することができ、全長は調製の容易さおよび意図された組換えＤＮＡプロトコールでの使用により限定されることが好ましいことが意図されている。
【０３１０】
ポリヌクレオチドは、当技術分野において公知であり、利用可能である種々の十分に確立された技法のいずれかを使用して調製し、操作し、かつ／または発現させることができる。所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適切なベクターに挿入することができる。ベクターの例は、プラスミド、自己複製配列、および転移因子である。追加の例示的なベクターとしては、限定することなく、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、たとえば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）、ラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例としては、限定することなく、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。発現ベクターの例は、哺乳動物細胞において発現させるためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）；哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介性遺伝子導入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。特定の実施形態では、本明細書に開示されているキメラタンパク質のコード配列を、哺乳動物細胞においてキメラタンパク質を発現させるためにそのような発現ベクターにライゲーションすることができる。
【０３１１】
発現ベクター内に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、宿主細胞のタンパク質と相互作用して転写および翻訳を行うベクターの非翻訳（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）領域−複製起点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャイン・ダルガーノ配列またはコザック配列）イントロン、ポリアデニル化配列、５’および３’非翻訳（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）領域である。そのようなエレメントは、それらの強度および特異性が変動し得る。利用するベクター系および宿主に応じて、遍在プロモーターおよび誘導性プロモーターを含めた、多くの適切な転写および翻訳エレメントを使用することができる。
【０３１２】
特定の実施形態では、これらに限定されないが、発現ベクターおよびウイルスベクターを含めた、本発明の実施において使用するためのベクターは、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの外因性、内因性、または異種性制御配列を含む。「内因性」制御配列とは、ゲノム内で所与の遺伝子に天然に連結した制御配列である。「外因性」制御配列とは、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技法）によって遺伝子の近位に配置された制御配列であり、したがって、その遺伝子の転写が連結したエンハンサー／プロモーターによって導かれる。「異種性」制御配列とは、遺伝子操作される細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。
【０３１３】
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチドを惹起および転写する。特定の実施形態では、哺乳動物細胞において作動可能なプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域および／または転写開始から７０〜８０塩基上流に見いだされる別の配列、ＣＮＣＡＡＴ領域（Ｎは任意のヌクレオチドであってよい）を含む。
【０３１４】
「エンハンサー」という用語は、転写の増強をもたらすことが可能な配列を含み、一部の場合には、別の制御配列に対する方向とは独立して機能し得るＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサーエレメントと協同的にまたは相加的に機能し得る。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方をもたらすことが可能な配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。
【０３１５】
「作動可能に連結した」という用語は、記載されている構成成分が、それらの意図された様式で機能することが可能になる関係にある近位を指す。一実施形態では、この用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的のポリヌクレオチドの機能的な連結を指し、ここで、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を導く。
【０３１６】
本明細書で使用される場合、「構成的発現制御配列」という用語は、作動可能に連結した配列の転写を絶え間なくまたは連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、多種多様な細胞および組織型における発現を可能にする「遍在」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよく、それぞれ制限された種類の細胞および組織型における発現を可能にする「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系列特異的」または「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよい。
【０３１７】
本発明の特定の実施形態において使用するのに適した例示的な遍在発現制御配列としては、これらに限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルスシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５、およびＰ１１プロモーター、伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５巻、１４７７〜１４８２頁（２００７年））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合性部位置換（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ６９巻（２号）：７４８〜５５頁（１９９５年））が挙げられる。
【０３１８】
特定の実施形態では、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを含むポリヌクレオチドを、Ｔ細胞における安定かつ長期にわたる発現をもたらすプロモーターから、Ｔ細胞を、標的抗原を発現する細胞に向け直すために十分なレベルで発現させることが望ましい場合がある。好ましい実施形態では、プロモーターは、ＥＦ１αプロモーターまたはＭＮＤプロモーターである。
【０３１９】
本明細書で使用される場合、「条件的発現」とは、これらに限定されないが、誘導性発現；抑制可能な発現；特定の生理的状態、生物学的状態、または疾患状態を有する細胞または組織における発現などを含めた、任意の型の条件的発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織に特異的な発現を排除するものではない。本発明のある特定の実施形態は、目的のポリヌクレオチドの条件的発現を提供し、例えば、細胞、組織、生物体などを、ポリヌクレオチドの発現が引き起こされる処理もしくは条件、または目的のポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドの発現の増加もしくは減少が引き起こされる処理もしくは条件に供することによって発現を制御する。
【０３２０】
誘導性プロモーター／系の実例としては、これらに限定されないが、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体（対応するホルモンを用いた処理によって誘導可能）をコードする遺伝子に対するプロモーターなどのステロイド誘導性プロモーター、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター（種々の重金属を用いた処理によって誘導可能）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストンにより調節可能な系（Ｓｉｒｉｎら、２００３年、Ｇｅｎｅ、３２３巻：６７頁）、クメート（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節系などが挙げられる。
【０３２１】
条件的発現は、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによって達成することもできる。本発明のある特定の実施形態によると、ベクターは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えのための少なくとも１つ（一般には、２つ）の部位を含む。本明細書で使用される場合、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、１つまたは複数の組換え部位（例えば、２、３、４、５、７、１０、１２、１５、２０、３０、５０など）が関与する組換え反応に関与する、除去的（ｅｘｃｉｓｉｖｅ）または統合的なタンパク質、酵素、補因子または関連タンパク質を含み、これは、野生型タンパク質であってもよく（Ｌａｎｄｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３巻：６９９〜７０７頁（１９９３年））、その変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含有する融合タンパク質）、断片、およびバリアントであってもよい。本発明の特定の実施形態における使用に適したリコンビナーゼの実例としては、これらに限定されないが、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３レソルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、およびＰａｒＡが挙げられる。
【０３２２】
Ｇ．ウイルスベクター
特定の実施形態では、本明細書において意図されている工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲをコードするレトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターにより、細胞（例えば、Ｔ細胞）を形質導入する。形質導入されたＴ細胞は、安定的、長期かつ持続性のＴ細胞応答を誘発する。
【０３２３】
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖状二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合によって組み込むＲＮＡウイルスを指す。特定の実施形態における使用に適した例示的なレトロウイルスとしては、これらに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））およびレンチウイルスが挙げられる。
【０３２４】
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスのある群（または属）を指す。例示的なレンチウイルスとしては、これらに限定されないが、：ＨＩＶ（ヒト免疫不全症ウイルス；ＨＩＶ  １型およびＨＩＶ  ２型を含む）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全症ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。一実施形態では、ＨＩＶに基づくベクターの骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列エレメント）が好ましい。
【０３２５】
「ベクター」という用語は、本明細書では、別の核酸分子を移行させるまたは運搬することが可能な核酸分子を指すために使用される。移行される核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結される、例えば、それに挿入される。ベクターは、細胞における自律複製を導く配列を含んでもよく、宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。有用なベクターとしては、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、およびウイルスベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、例えば、複製欠損性レトロウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。
【０３２６】
当業者には明らかになる通り、「ウイルスベクター」という用語は、一般には核酸分子の移行もしくは細胞のゲノム内への組み込みを容易にするウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、導入プラスミド）、または、核酸移行を媒介するウイルス粒子のいずれかを指すために広く使用されている。ウイルス粒子は、一般には、核酸（複数可）に加えて、種々のウイルス構成成分および時には宿主細胞構成成分も含む。
【０３２７】
ウイルスベクターという用語は、核酸を細胞内に移行することが可能なウイルスもしくはウイルス粒子、または移行される核酸自体のいずれかを指し得る。ウイルスベクターおよび導入プラスミドは、主にウイルスに由来する構造的かつ／または機能的な遺伝エレメントを含有する。「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する構造的かつ機能的な遺伝エレメントまたはその一部を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲを含めた、構造的かつ機能的な遺伝エレメントまたはその一部を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「ハイブリッドベクター」という用語は、レトロウイルス、例えばレンチウイルス配列とレンチウイルスものではないウイルス配列の両方を含有するベクター、ＬＴＲまたは他の核酸を指す。一実施形態では、ハイブリッドベクターとは、逆転写、複製、組み込みおよび／またはパッケージングのための、レトロウイルス、例えばレンチウイルス配列を含むベクターまたは導入プラスミドを指す。
【０３２８】
特定の実施形態では、「レンチウイルスベクター」、「レンチウイルス発現ベクター」という用語は、レンチウイルス導入プラスミドおよび／または感染性レンチウイルス粒子を指すために使用することができる。本明細書において、例えばクローニング部位、プロモーター、調節エレメント、異種核酸などのエレメントに言及する場合、これらのエレメントの配列は、本発明のレンチウイルス粒子ではＲＮＡ形態で存在し、本発明のＤＮＡプラスミドではＤＮＡ形態で存在することが理解されるべきである。
【０３２９】
プロウイルスの各末端には、「長い末端反復」または「ＬＴＲ」と称される構造がある。「長い末端反復（ＬＴＲ）」という用語は、レトロウイルスＤＮＡの末端に位置する、それらの天然配列に関しては直接反復配列であり、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域を含有する、塩基対のドメインを指す。ＬＴＲは、一般に、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、促進、開始および遺伝子転写物のポリアデニル化）のため、およびウイルス複製のための基本的な機能をもたらす。ＬＴＲは、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナルならびにウイルスゲノムの複製および組み込みのために必要な配列を含めた多数の調節シグナルを含有する。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５と称される３つの領域に分けられる。Ｕ３領域は、エンハンサーおよびプロモーターエレメントを含有する。Ｕ５領域は、プライマー結合性部位とＲ領域の間の配列であり、ポリアデニル化配列を含有する。Ｒ（反復）領域は、Ｕ３領域とＵ５領域に挟まれている。ＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域で構成され、ウイルスゲノムの５’末端と３’末端の両方に見られる。５’ＬＴＲには、ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合性部位）およびウイルスＲＮＡの、粒子への効率的なパッケージングに必要な配列（プシー部位）が隣接している。
【０３３０】
本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスＲＮＡのウイルスカプシドまたは粒子への挿入に必要である、レトロウイルスゲノム内に位置する配列を指す。例えば、Ｃｌｅｖｅｒら、１９９５年、Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６９巻、４号；２１０１〜２１０９頁を参照されたい。いくつかのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのカプシド形成に必要な最小のパッケージングシグナル（プシー［Ψ］配列とも称される）を使用する。したがって、本明細書で使用される場合、「パッケージング配列」、「パッケージングシグナル」、「プシー」という用語および「Ψ」という記号は、ウイルス粒子形成の間のレトロウイルスＲＮＡ鎖のカプシド形成に必要な非コード配列への言及に使用されている。
【０３３１】
種々の実施形態では、ベクターは、改変された５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲを含む。ＬＴＲのいずれかまたは両方が、これらに限定されないが、１つまたは複数の欠失、挿入、または置換を含めた、１つまたは複数の改変を含んでよい。３’ＬＴＲの改変は、多くの場合、レンチウイルスまたはレトロウイルス系の安全性を改善するために、ウイルスを複製欠損性にすることによって行われる。本明細書で使用される場合、「複製欠損性」という用語は、完全な、有効な複製を行うことができず、したがって、感染性ビリオンが産生されないウイルス（例えば、複製欠損性レンチウイルス後代）を指す。「複製コンピテント」という用語は、複製することが可能であり、したがって、ウイルスのウイルス複製が感染性ビリオンを産生可能である野生型ウイルスまたは変異体ウイルス（例えば、複製コンピテントレンチウイルス後代）を指す。
【０３３２】
「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターとは、最初のラウンドのウイルス複製を超えてのウイルス転写を防止するために、Ｕ３領域として公知の右側（３’）ＬＴＲエンハンサー−プロモーター領域が改変された（例えば、欠失または置換によって）複製欠損性ベクター、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを指す。これは、右側（３’）ＬＴＲ  Ｕ３領域がウイルス複製の間に左側（５’）ＬＴＲ  Ｕ３領域の鋳型として使用され、したがって、ウイルス転写物はＵ３エンハンサー−プロモーターなしでは作られないことに起因する。本発明のさらなる実施形態では、Ｕ５領域が、例えば理想的なポリ（Ａ）配列で置き換えられるように、３’ＬＴＲを改変する。３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、または３’ＬＴＲと５’ＬＴＲの両方に対する改変などのＬＴＲに対する改変も本発明に包含されることに留意するべきである。
【０３３３】
５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターで置き換えて、ウイルス粒子の産生の間にウイルスゲノムの転写を駆動することにより、追加的な安全性の増強が提供される。使用することができる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルスシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最初期の）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。典型的なプロモーターは、Ｔａｔ非依存的に高レベルの転写を駆動することができる。この置き換えにより、ウイルス産生系に完全なＵ３配列が存在しなくなるので、複製コンピテントウイルスを生成する組換えの可能性が低下する。ある特定の実施形態では、異種プロモーターは、ウイルスゲノムが転写される様式の制御における追加的な利点を有する。例えば、異種プロモーターは、誘導性であってよく、したがって、ウイルスゲノムの全部または一部の転写は、誘導因子が存在する場合にのみ起こる。誘導因子としては、これらに限定されないが、１つまたは複数の化学化合物または宿主細胞を培養する温度またはｐＨなどの生理的条件が挙げられる。
【０３３４】
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＴＡＲエレメントを含む。「ＴＡＲ」という用語は、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）ＬＴＲのＲ領域に位置する「トランス活性化応答」遺伝エレメントを指す。このエレメントは、レンチウイルストランス活性化因子（ｔａｔ）遺伝エレメントと相互作用してウイルス複製を増強する。しかし、このエレメントは、５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターで置き換える実施形態では必要ない。
【０３３５】
「Ｒ領域」とは、キャップ形成基の開始（すなわち、転写の開始）で始まり、ポリＡトラクトが始まる直前で終わる、レトロウイルスＬＴＲ内の領域を指す。Ｒ領域は、Ｕ３領域とＵ５領域に挟まれているとも定義される。Ｒ領域は、逆転写の間に新生ＤＮＡのゲノムの一方の末端から他方の末端への移行を可能にする役割を果たす。
【０３３６】
本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰエレメント」という用語は、その配列に、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の中心ポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）および中心終結配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。適切なＦＬＡＰエレメントは、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕら、２０００年、Ｃｅｌｌ、１０１巻：１７３頁に記載されている。ＨＩＶ−１逆転写の間、中心ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）におけるプラス鎖ＤＮＡの中心的な開始および中心終結配列（ＣＴＳ）における中心的な終結により、三本鎖ＤＮＡ構造：ＨＩＶ−１中心ＤＮＡフラップの形成が導かれる。いかなる理論に縛られることも望むものではないが、ＤＮＡフラップは、レンチウイルスゲノム核内移行のシス活性決定因子として作用し得、かつ／またはウイルスの力価を増大させ得る。特定の実施形態では、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターの骨格は、ベクター内の目的の異種遺伝子の上流または下流の１つまたは複数のＦＬＡＰエレメントを含む。例えば、特定の実施形態では、導入プラスミドはＦＬＡＰエレメントを含む。一実施形態では、本発明のベクターは、ＨＩＶ−１から単離されたＦＬＡＰエレメントを含む。
【０３３７】
一実施形態では、レトロウイルスまたはレンチウイルス移入ベクターは、１つまたは複数の移出エレメントを含む。「移出エレメント」という用語は、ＲＮＡ転写物の細胞の核から細胞質への輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントを指す。ＲＮＡ移出エレメントの例としては、これらに限定されないが、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎら、１９９１年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５巻：１０５３頁；およびＣｕｌｌｅｎら、１９９１年、Ｃｅｌｌ  ５８巻：４２３頁を参照されたい）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられる。一般に、ＲＮＡ移出エレメントは、遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、また、１つまたは多数のコピーとして挿入することができる。
【０３３８】
特定の実施形態では、ウイルスベクター内の異種配列の発現を、転写後調節エレメント、効率的なポリアデニル化部位、および場合によって、転写終結シグナルをベクターに組み入れることによって増加させる。種々の転写後調節エレメント、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９９年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７３巻：２８８６頁）；Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、５巻：３８６４頁）などは、異種核酸のタンパク質での発現を増加させることができる（Ｌｉｕら、１９９５年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、９巻：１７６６頁）。特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後調節エレメントを含む。
【０３３９】
特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後調節エレメントを欠くまたはそれを含まない。なぜなら、一部の場合には、これらのエレメントが、細胞形質転換のリスクを上昇させ、かつ／または、ｍＲＮＡ転写物の量を実質的にもしくは有意に増加させないまたはｍＲＮＡ安定性を増加させないからである。したがって、一部の実施形態では、本発明のベクターは、追加的な安全策として、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを欠くまたはそれを含まない。
【０３４０】
異種核酸転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を導くエレメントは、異種遺伝子発現を増加させる。転写終結シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見いだされる。特定の実施形態では、ベクターは、発現させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’側にポリアデニル化配列を含む。「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を導くＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’末端にポリＡ尾部を付加することによってｍＲＮＡ安定性を促進し、したがって、翻訳効率の上昇に寄与することができる。ポリＡ尾部を欠く転写物は不安定であり、迅速に分解されるので、組換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。本発明のベクターに使用することができるポリＡシグナルの実例としては、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、または当技術分野で公知の別の適切な異種性もしくは内因性ポリＡ配列が挙げられる。
【０３４１】
種々の実施形態では、本発明のベクターは、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含む。ベクターは１つまたは複数のＬＴＲを有してよく、いずれのＬＴＲも、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失などの１つまたは複数の修飾を含む。ベクターは、形質導入効率を上昇させるための１つまたは複数のアクセサリーエレメント（例えば、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、ウイルスパッケージングを増加させるための１つまたは複数のアクセサリーエレメント（例えば、プシー（Ψ）パッケージングシグナル、ＲＲＥ）、および／または治療用遺伝子の発現を増加させる他のエレメント（例えば、ポリ（Ａ）配列）をさらに含んでよく、場合によって、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含んでよい。多くの他の異なる実施形態を既存の本発明の実施形態から適合させることができることが当業者には理解されよう。
【０３４２】
「宿主細胞」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドを用いてトランスフェクト、感染、または形質導入を行った細胞を含む。宿主細胞は、パッケージング細胞、産生細胞、およびウイルスベクターを感染させた細胞を含み得る。特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターを感染させた宿主細胞を、療法を必要とする被験体に投与する。ある特定の実施形態では、「標的細胞」という用語は、宿主細胞と互換的に使用され、トランスフェクト、感染、または形質導入を行った所望の細胞型の細胞を指す。好ましい実施形態では、標的細胞は、Ｔ細胞である。
【０３４３】
妥当なウイルス力価を達成するためには、多くの場合、大規模なウイルス粒子産生が必要である。ウイルス粒子は、ウイルス構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、またはｎｅｆ遺伝子または他のレトロウイルス遺伝子を含むパッケージング細胞株に移入ベクターをトランスフェクトすることによって産生される。
【０３４４】
本明細書で使用される場合、「パッケージングベクター」という用語は、パッケージングシグナルを欠き、１種、２種、３種、４種またはそれ超のウイルス構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターまたはウイルスベクターを指す。一般には、パッケージング細胞にパッケージングベクターを含め、トランスフェクション、形質導入または感染によって細胞に導入する。トランスフェクション、形質導入または感染のための方法は当業者に周知である。本発明のレトロウイルス／レンチウイルス移入ベクターをパッケージング細胞株にトランスフェクション、形質導入または感染によって導入して、産生細胞または細胞株を生成することができる。本発明のパッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔を含めた標準の方法によってヒト細胞または細胞株に導入することができる。一部の実施形態では、パッケージングベクターを、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン、チミジンキナーゼ、ＤＨＦＲ、ＧｌｎシンテターゼまたはＡＤＡなどの優性選択可能マーカーと一緒に細胞に導入し、その後、適切な薬物の存在下で選択し、クローンを単離する。選択可能マーカー遺伝子を、パッケージングベクターによりコードされる遺伝子と、例えば、ＩＲＥＳまたは自己切断性ウイルスペプチドによって物理的に連結することができる。
【０３４５】
ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）は、細胞株から生成される組換えレトロウイルスによって最終的に感染および形質転換することができる宿主細胞の範囲を決定する。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶおよびＥＩＶなどのレンチウイルスの場合では、ｅｎｖタンパク質は、ｇｐ４１およびｇｐ１２０を含む。本発明のパッケージング細胞によって発現されるウイルスｅｎｖタンパク質は、以前記載されている通り、ウイルスｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子とは別のベクター上にコードされることが好ましい。
【０３４６】
本発明において使用することができるレトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の実例としては、これらに限定されないが、ＭＬＶエンベロープ、１０Ａ１エンベロープ、ＢＡＥＶ、ＦｅＬＶ−Ｂ、ＲＤ１１４、ＳＳＡＶ、エボラ、センダイ、ＦＰＶ（家禽ペストウイルス）、およびインフルエンザウイルスエンベロープが挙げられる。同様に、ＲＮＡウイルス（例えば、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、ＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅのＲＮＡウイルスファミリー）に由来するエンベロープ、ならびにＤＮＡウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ、およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅのファミリー）に由来するエンベロープをコードする遺伝子を利用することができる。代表例としては、ＦｅＬＶ、ＶＥＥ、ＨＦＶＷ、ＷＤＳＶ、ＳＦＶ、狂犬病、ＡＬＶ、ＢＩＶ、ＢＬＶ、ＥＢＶ、ＣＡＥＶ、ＳＮＶ、ＣｈＴＬＶ、ＳＴＬＶ、ＭＰＭＶ、ＳＭＲＶ、ＲＡＶ、ＦｕＳＶ、ＭＨ２、ＡＥＶ、ＡＭＶ、ＣＴ１０、およびＥＩＡＶが挙げられる。
【０３４７】
他の実施形態では、本発明のウイルスをシュードタイピングするためのエンベロープタンパク質として、これらに限定されないが、以下のウイルスのいずれかが挙げられる：Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２およびＨ５Ｎ１（トリインフルエンザ）などのＡ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス群の任意のウイルス、腸内アデノウイルス、パルボウイルス、デング熱ウイルス、サル痘、モノネガウイルス目、リッサウイルス、例えば、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス（Ｌａｇｏｓ  ｂａｔ  ｖｉｒｕｓ）、モコラウイルス（Ｍｏｋｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）、ドゥベンヘイジウイルス（Ｄｕｖｅｎｈａｇｅ  ｖｉｒｕｓ）、ヨーロッパコウモリウイルス１＆２およびオーストラリアコウモリウイルスなど、エフェメロウイルス、ベシクロウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型および８型、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス、アレナウイルス、例えば、アルゼンチン出血熱ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄｉａｅ、例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ハンタウイルス、腎症候群を伴う出血熱を引き起こすウイルス、リフトバレー熱ウイルス、エボラ出血熱およびマールブルグ出血熱を含めたＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（フィロウイルス）、キャサヌール森林病（Ｋａｙｓａｎｕｒ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎を引き起こすウイルスを含めたＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、ならびにＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、例えば、ヘンドラウイルスおよびニバーウイルス、大痘瘡および小痘瘡（天然痘）、アルファウイルス、例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、西ナイルウイルス、任意の脳炎を引き起こすウイルス。
【０３４８】
一実施形態では、本発明は、組換えレトロウイルス、例えば、ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質を用いてシュードタイピングされたレンチウイルスを産生するパッケージング細胞を提供する。
【０３４９】
「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、本明細書で使用される場合、ウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特性を有する別のウイルスのエンベロープタンパク質で置換されたウイルスを指す。例えば、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によりコードされる）は通常ウイルスをＣＤ４＋提示細胞にターゲティングするので、ＨＩＶを水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質でシュードタイピングし、それにより、ＨＩＶをより広い範囲の細胞に感染させることを可能にすることができる。本発明の好ましい実施形態では、レンチウイルスエンベロープタンパク質をＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングする。一実施形態では、本発明は、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質を用いてシュードタイピングした組換えレトロウイルス、例えば、レンチウイルスを産生するパッケージング細胞を提供する。
【０３５０】
本明細書で使用される場合、「パッケージング細胞株」という用語は、パッケージングシグナルを含有しないが、ウイルス粒子の正しいパッケージングに必要なウイルス構造タンパク質および複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を安定にまたは一過性に発現する細胞株に関して使用される。本発明のパッケージング細胞を調製するために、任意の適切な細胞株を使用することができる。一般に、細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、パッケージング細胞株を作製するために使用する細胞は、ヒト細胞である。使用することができる適切な細胞株としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ  １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ−２細胞、ＢＯＳＣ  ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ  １細胞、ＢＳＣ  ４０細胞、ＢＭＴ  １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ−５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、および２１１Ａ細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、パッケージング細胞は、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、またはＡ５４９細胞である。
【０３５１】
本明細書で使用される場合、「産生細胞株」という用語は、パッケージング細胞株およびパッケージングシグナルを含む移入ベクター構築物を含む、組換えレトロウイルス粒子を産生することができる細胞株を指す。感染性ウイルス粒子およびウイルスストック溶液の作製は、従来の技法を使用して行うことができる。ウイルスストック溶液を調製する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｙ．  Ｓｏｎｅｏｋａら（１９９５年）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３巻：６２８〜６３３頁、およびＮ．  Ｒ．  Ｌａｎｄａｕら（１９９２年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６巻：５１１０〜５１１３頁によって例示されている。感染性ウイルス粒子は、従来の技法を使用してパッケージング細胞から収集することができる。例えば、感染性粒子は、当技術分野で公知の通り、細胞溶解、または細胞培養物の上清の収集により収集することができる。場合によって、所望であれば、収集されたウイルス粒子を精製することができる。適切な精製技法は、当業者に周知である。
【０３５２】
遺伝子（複数可）または他のポリヌクレオチド配列を、トランスフェクションではなく、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用してウイルス感染によって送達することは、「形質導入」と称される。一実施形態では、レトロウイルスベクターを、感染およびプロウイルスの組み込みによって細胞に形質導入する。ある特定の実施形態では、標的細胞、例えば、Ｔ細胞は、ウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用した感染によって細胞に送達された遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む場合、「形質導入」されている。特定の実施形態では、形質導入された細胞は、細胞のゲノム内に、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターによって送達された１つまたは複数の遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む。
【０３５３】
特定の実施形態では、１つまたは複数のポリペプチドを発現する本発明のウイルスベクターを用いて形質導入を行った宿主細胞を、Ｂ細胞悪性疾患を処置および／または予防するために被験体に投与する。本発明のある特定の実施形態に従って利用することができる、遺伝子療法におけるウイルスベクターの使用に関する他の方法は、例えば、Ｋａｙ，  Ｍ．  Ａ．（１９９７年）Ｃｈｅｓｔ  １１１巻（補遺６号）：１３８Ｓ〜１４２Ｓ頁；Ｆｅｒｒｙ，  Ｎ．およびＨｅａｒｄ，  Ｊ．  Ｍ．（１９９８年）Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ９巻：１９７５〜８１頁；Ｓｈｉｒａｔｏｒｙ，  Ｙ．ら（１９９９年）Ｌｉｖｅｒ  １９巻：２６５〜７４頁；Ｏｋａ，  Ｋ．ら（２０００年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｌｉｐｉｄｏｌ．  １１巻：１７９〜８６頁；Ｔｈｕｌｅ，  Ｐ．  Ｍ．およびＬｉｕ，  Ｊ．  Ｍ．（２０００年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７巻：１７４４〜５２頁；Ｙａｎｇ，  Ｎ．  Ｓ．（１９９２年）Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２巻：３３５〜５６頁；Ａｌｔ，  Ｍ．（１９９５年）Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．  ２３巻：７４６〜５８頁；Ｂｒｏｄｙ，  Ｓ．  Ｌ．およびＣｒｙｓｔａｌ，  Ｒ．  Ｇ．（１９９４年）Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７１６巻：９０〜１０１頁；Ｓｔｒａｙｅｒ，  Ｄ．  Ｓ．（１９９９年）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．  Ｄｒｕｇｓ  ８巻：２１５９〜２１７２頁；Ｓｍｉｔｈ−Ａｒｉｃａ，  Ｊ．  Ｒ．およびＢａｒｔｌｅｔｔ，  Ｊ．  Ｓ．（２００１年）Ｃｕｒｒ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  Ｒｅｐ．  ３巻：４３〜４９頁；およびＬｅｅ，  Ｈ．  Ｃ．ら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８巻：４８３〜８頁に見いだすことができる。
【０３５４】
Ｈ．組成物および製剤
本明細書において意図されている組成物は、本明細書において意図されている１つまたは複数のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、およびＴ細胞組成物を含み得る。組成物としては、これに限定されないが、薬学的組成物が挙げられる。「薬学的組成物」とは、細胞または動物に、単独で、または療法の１つまたは複数の他のモダリティと組み合わせて投与するために、薬学的に許容されるまたは生理的に許容される溶液に製剤化された組成物を指す。所望であれば、本発明の組成物は、他の薬剤、例えば、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、小分子、化学療法薬、プロドラッグ、薬物、抗体、または他の種々の薬学的に活性な薬剤などとも組み合わせて投与することができることも理解されよう。同様に組成物に含めることができる他の構成成分には、追加の薬剤が意図された療法を送達する組成物の能力に悪影響を及ぼさないものであれば、事実上制限はない。
【０３５５】
「薬学的に許容される」という句は、本明細書では、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、妥当な損益比に見合う化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために使用される。
【０３５６】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤」としては、限定することなく、米国食品医薬品局により、ヒトまたは家畜動物における使用に関して許容されるとして認可を受けている任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、甘味剤、希釈剤、防腐剤、色素／着色剤、香味増強剤（ｆｌａｖｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）、溶媒、界面活性剤、または乳化剤が挙げられる。例示的な薬学的に許容される担体としては、これらに限定されないが、糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロースなど；デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなど；トラガント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバター、ろう、動物性および植物性脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油など；グリコール、例えば、プロピレングリコールなど；ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど；エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；アルギン酸；発熱物質不含水；等張性の食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；および薬学的製剤に使用される任意の他の適合する物質が挙げられる。
【０３５７】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、本明細書において意図されている方法によって製造されたある量の改変Ｔ細胞を含む。好ましい実施形態では、薬学的Ｔ細胞組成物は、次のマーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２およびＣＤ１２７のうち１種もしくは複数または全てを有する能力あるＴ細胞を含む。
【０３５８】
一般に、本明細書において意図されている方法によって製造されたＴ細胞を含む薬学的組成物は、体重１ｋｇ当たり細胞１０２〜１０１０個、体重１ｋｇ当たり細胞１０５〜１０９個、体重１ｋｇ当たり細胞１０５〜１０８個、体重１ｋｇ当たり細胞１０５〜１０７個、体重１ｋｇ当たり細胞１０７〜１０９個または体重１ｋｇ当たり細胞１０７〜１０８個（これらの範囲内のあらゆる整数値を含む）の投与量で投与することができることが記述され得る。細胞の数は、組成物に含まれる細胞型と同様に、組成物の意図された最終的な使用に左右される。本明細書に提供される使用に関して、細胞は、一般に、１リットルまたはそれ未満の体積であり、５００ｍＬまたはそれ未満、さらには２５０ｍＬまたは１００ｍＬまたはそれ未満であってよい。したがって、所望の細胞の密度は、典型的には、１ｍｌ当たり細胞１０６個超であり、一般に、１ｍｌ当たり細胞１０７個超、一般に、１ｍｌ当たり細胞１０８個またはそれ超である。免疫細胞の臨床的に意義がある数は、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１または１０１２個の細胞に累積的に等しいまたはこれを超える、多数の注入に配分することができる。本発明の一部の態様では、特に、注入された細胞は全て、特定の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に向け直されるため、１０６／キログラム（患者当たり１０６〜１０１１）の範囲内のより少ない数の細胞を投与することができる。工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞は、これらの範囲内の投与量で複数回投与することができる。細胞は、療法を受ける患者にとって同種異系、同系、異種または自己由来であってもよい。所望であれば、処置は、注入されたＴ細胞の生着および機能を増強させるために、本明細書に記載されているマイトジェン（例えば、ＰＨＡ）またはリンホカイン、サイトカインおよび／またはケモカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１８およびＴＮＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１αなど）の投与を含むこともできる。
【０３５９】
一般に、本明細書に記載の通り活性化し増大させた細胞を含む組成物を、免疫無防備状態である個体において生じる疾患の処置および予防において利用することができる。具体的には、本明細書において意図されている方法によって製造される改変Ｔ細胞を含む組成物が、がんの処置において使用されている。本発明の改変Ｔ細胞は、単独で、あるいは、担体、希釈剤、賦形剤と、ならびに／または、ＩＬ−２、ＩＬ−７、および／もしくはＩＬ−１５または他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の構成成分と組み合わせた医薬組成物として投与することができる。特定の実施形態では、本明細書において意図されている薬学的組成物は、ある量の遺伝子改変Ｔ細胞を、１種または複数種の薬学的にまたは生理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含む。
【０３６０】
本明細書において意図されている改変Ｔ細胞を含む薬学的組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；グリシンなどのポリペプチドまたはアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤をさらに含んでよい。本発明の組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内または筋肉内投与用に製剤化することが好ましい。
【０３６１】
液体の薬学的組成物は、溶液か、懸濁物か、または他の同様の形態であるかにかかわらず、以下のうちの１つまたは複数を含んでよい：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩溶液、好ましくは生理的食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒体としての機能を果たし得る合成モノグリセリドまたはジグリセリドなどの不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸、クエン酸またはリン酸などの緩衝液、および、張度を調整するための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースなど。非経口的調製物は、ガラスまたはプラスチックでできたアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入することができる。注射用薬学的組成物は、滅菌されていることが好ましい。
【０３６２】
特定の実施形態では、本明細書において意図されている組成物は、有効量の増大させた改変Ｔ細胞組成物を、単独で、または１種または複数種の治療剤と組み合わせて含む。したがって、Ｔ細胞組成物は、単独で、または、例えば放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光ダイナミック療法などの他の公知のがん処置と組み合わせて投与することができる。組成物は、抗生物質と組み合わせて投与することもできる。そのような治療剤は、特定のがんなどの本明細書に記載の特定の疾患状態に対する標準の処置として当技術分野において許容され得る。意図されている例示的な治療剤としては、サイトカイン、増殖因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症薬、化学療法薬、放射線療法薬、治療用抗体、または他の活性な薬剤および補助的な薬剤が挙げられる。
【０３６３】
ある特定の実施形態では、本明細書において意図されているＴ細胞を含む組成物は、多くの化学療法剤と併せて投与することができる。化学療法剤の実例としては、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチルオロメラミンレジュメ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ  ｒｅｓｕｍｅ）を含めたエチレンイミンおよびメチルアメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルホルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ）およびドセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｍｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）などのレチノイン酸誘導体；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）；エスペラミシン；カペシタビン；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含めた抗エストロゲン；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体などもこの定義に含まれる。
【０３６４】
種々の他の治療剤は、本明細書に記載の組成物と併せて使用することができる。一実施形態では、Ｔ細胞を含む組成物を抗炎症剤と共に投与する。抗炎症剤または抗炎症薬としては、これらに限定されないが、ステロイドおよびグルココルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含む）、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬、シクロホスファミドおよびミコフェノーレートを含めた非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられる。
【０３６５】
他の例示的なＮＳＡＩＤは、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ＶＩＯＸＸ（登録商標）（ロフェコキシブ）およびＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（セレコキシブ）、およびシアリレートなどのＣｏｘ−２阻害剤からなる群より選択される。例示的な鎮痛薬は、アセトアミノフェン、オキシコドン、トラマドールまたは塩酸プロポキシフェンからなる群より選択される。例示的なグルココルチコイドは、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、またはプレドニゾンからなる群より選択される。例示的な生物学的反応修飾物質としては、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ５など）を対象とする分子、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））およびインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））などのサイトカイン阻害剤、ケモカイン阻害剤および接着分子阻害剤が挙げられる。生物学的反応修飾物質としては、モノクローナル抗体ならびに組換え型の分子が挙げられる。例示的なＤＭＡＲＤとしては、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、Ｇｏｌｄ（経口用（オーラノフィン）および筋肉内用）およびミノサイクリンが挙げられる。
【０３６６】
本明細書において意図されているＣＡＲで改変されたＴ細胞と組み合わせるのに適した治療用抗体の実例としては、これらに限定されないが、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフツズマブ（ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）、アレムツズマブ、アルツモマブ（ａｌｔｕｍｏｍａｂ）、アマツキシマブ、アナツモマブ（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ）、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベバシズマブ、ビバツズマブ（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ）、シクツムマブ（ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、クリバツズマブ（ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、コナツムマブ（ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、ダラツムマブ、ドロジツマブ（ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）、デュリゴツマブ（ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、デュシジツマブ（ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、デツモマブ（ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、ダセツズマブ（ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ）、ダロツズマブ（ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エクロメキシマブ（ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エロツズマブ、エンシツキシマブ（ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ（ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ファーレツズマブ（ｆａｒｉｅｔｕｚｕｍａｂ）、フィクラツズマブ（ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）、フィギツムマブ、フランボツマブ（ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）、フツキシマブ（ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、ガニツマブ（ｇａｎｉｔｕｍａｂ）、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ（ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、グレムバツムマブ（ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）、イブリツモマブ、イゴボマブ（ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イムガツズマブ（ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、インダツキシマブ（ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ）、イノツズマブ、インテツムマブ（ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イピリムマブ、イラツムマブ（ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ（ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ）、ルカツムマブ（ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ（ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、モキセツモマブ（ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ）、ナルナツマブ（ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ（ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、ノフェツモマブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）、オカラツズマブ（ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ、オララツマブ（ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オナルツズマブ（ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、オポルツズマブ（ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ）、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ（ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、パトリツマブ（ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ペルツズマブ、ピンツモマブ（ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、プリツムマブ（ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、ラコツモマブ（ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）、ラドレツマブ（ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ（ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、サツモマブ（ｓａｔｕｍｏｍａｂ）、シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シルツキシマブ、シムツズマブ（ｓｉｍｔｕｚｕｍａｂ）、ソリトマブ（ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、タカツズマブ（ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ）、タプリツモマブ（ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ）、テナツモマブ（ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、テプロツムマブ（ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）、ティガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ（ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ）、ウブリツキシマブ（ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、ベルツズマブ、ボルセツズマブ（ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ）、ボツムマブ（ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ザルツムマブ、ＣＣ４９および３Ｆ８が挙げられる。
【０３６７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物をサイトカインと併せて投与する。「サイトカイン」とは、本明細書で使用される場合、１つの細胞集団により放出され、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用するタンパク質に対する一般的な用語を意味する。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、ケモカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝臓増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−アルファおよび腫瘍壊死因子−ベータ；ミュラー阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−ベータなどの神経増殖因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータなどの形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉおよびインスリン様増殖因子−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導性因子；インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、およびインターフェロン−ガンマなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのインターロイキン（ＩＬ）、ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含めた他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で使用される場合、サイトカインという用語は、天然の供給源または組換え細胞培養物に由来するタンパク質、およびネイティブな配列のサイトカインの生物活性のある等価物を包含する。
【０３６８】
Ｉ．標的細胞および抗原
本発明は、一部には、標的細胞、例えば、腫瘍またはがん細胞に向け直された遺伝子改変された、細胞上の標的抗原に結合する結合性ドメインを有する工学的に作製されたＴ細胞受容体またはＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞を意図する。がん細胞は、血液およびリンパ系を介して身体の他の部分に拡散する可能性もある。がんにはいくつかの主要な型が存在する。癌腫は、皮膚または内臓を裏打ちするもしくは覆う組織において生じるがんである。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管または他の結合組織もしくは支持組織において生じるがんである。白血病は、骨髄などの血液形成組織において開始し、多数の異常な血液細胞の産生および血液への侵入を引き起こすがんである。リンパ腫および多発性骨髄腫は、免疫系の細胞において生じるがんである。中枢神経系がんは、脳および脊髄の組織において生じるがんである。
【０３６９】
一実施形態では、標的細胞は、抗原、例えば、他の正常な（所望の）細胞の表面上では実質的に見いだされない標的抗原を発現する。一実施形態では、標的細胞は、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、ニューロン、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、グリア細胞、脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ）、骨細胞、軟骨細胞、膵島細胞、ＣＮＳ細胞、ＰＮＳ細胞、肝臓細胞、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｓｅ  ｃｅｌｌ）、腎細胞、肺細胞、皮膚細胞、卵巣細胞、濾胞細胞、上皮細胞、免疫細胞、または内皮細胞である。
【０３７０】
ある特定の実施形態では、標的細胞は膵組織、神経組織、心臓組織、骨髄、筋組織、骨組織、皮膚組織、肝臓組織、毛包、血管組織、脂肪組織、肺組織、および腎臓組織の一部である。
【０３７１】
特定の実施形態では、標的細胞は、腫瘍細胞である。別の特定の実施形態では、標的細胞は、がんを有する患者の細胞などの、がん細胞である。開示されている方法を用いて死滅させることができる例示的な細胞としては、以下の腫瘍の細胞が挙げられる：液性腫瘍、例えば、急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、および骨髄芽球性白血病、前骨髄球性（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病など）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病など）を含めた白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病など。
【０３７２】
別の実施形態では、細胞は、肉腫および癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、肺がん、結腸直腸がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌（例えば、膵臓、結腸、卵巣、肺、乳房、胃、前立腺、子宮頸部（ｃｅｒｖｉｘ）、または食道の腺癌）、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、膀胱癌、ＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫など）などの固形腫瘍細胞である。
【０３７３】
一実施形態では、がんは、請求項１に記載の方法では、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、前立腺がん、肝臓がん、腎がん、膵がん、肺がん、胆管がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、甲状腺髄様癌、卵巣がん、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫および膀胱がんからなる群より選択される。
【０３７４】
一実施形態では、標的細胞は、肝臓、膵臓、肺、乳房、膀胱、脳、骨、甲状腺、腎臓、皮膚、および造血系の悪性細胞である。別の実施形態では、標的細胞は、肝臓がん、膵がん、肺がん、乳がん、膀胱がん（ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、脳がん、骨がん、甲状腺がん、腎臓がん、皮膚がん、または血液学的がんの細胞である。
【０３７５】
一実施形態では、標的細胞は、細胞、例えば、これらに限定されないが、ＣＭＶ、ＨＰＶおよびＥＢＶを含めたウイルスによって感染したがん細胞である。
【０３７６】
一実施形態では、標的抗原は、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＰＶ、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、またはＶＥＧＦＲ２のエピトープである。
【０３７７】
Ｊ．治療方法
本明細書において意図されている方法によって製造される改変Ｔ細胞は、限定することなく、がん、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全症を含めた種々の状態の処置において使用するための改善された養子免疫療法をもたらす。特定の実施形態では、本明細書において意図されている工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを用いて初代Ｔ細胞を遺伝子改変することにより、初代Ｔ細胞の特異性を腫瘍またはがん細胞に向け直す。一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞を、標的抗原を発現するがん細胞を標的とする工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように改変し、改変Ｔ細胞を、それを必要とするレシピエントに注入する細胞療法の一種を含む。注入された細胞は、レシピエント内の腫瘍細胞を死滅させることができる。抗体療法とは異なり、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲで改変されたＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで複製することが可能であり、したがって、持続したがん療法をもたらすことができる長期持続に寄与する。
【０３７８】
一実施形態では、本発明の工学的に作製されたＴＣＲおよびＣＡＲ  Ｔ細胞は、頑強なｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞増大を行うことができ、また、長時間にわたって持続することができる。別の実施形態では、本発明の工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲ  Ｔ細胞は、再活性化してあらゆる追加的な腫瘍形成または成長を阻害することが可能な特異的なメモリーＴ細胞に進化する。
【０３７９】
特定の実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含むベクターを用いて遺伝子改変された免疫エフェクター細胞を含む組成物を、限定することなく、肝臓がん、膵がん、肺がん、乳がん、膀胱がん（ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、脳がん、骨がん、甲状腺がん、腎臓がん、または皮膚がんを含めた固形腫瘍またはがんの処置に使用する。
【０３８０】
特定の実施形態では、ＰＳＣＡまたはＭＵＣ１のエピトープに結合する抗原特異的結合性ドメインを含む工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含むベクターを用いて遺伝子改変された免疫エフェクター細胞を含む組成物を、これらに限定されないが、膵臓、膀胱、および肺を含めた種々のがんの処置に使用する。
【０３８１】
特定の実施形態では、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含むベクターを用いて遺伝子改変された免疫エフェクター細胞を含む組成物を、急性白血病（例えば、ＡＬＬ、ＡＭＬ、および骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病）、慢性白血病（例えば、ＣＬＬ、ＳＬＬ、ＣＭＬ、ＨＣＬ）を含めた白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および重鎖病を含めた液性腫瘍の処置に使用する。
【０３８２】
特定の実施形態では、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含むベクターを用いて遺伝子改変された免疫エフェクター細胞を含む組成物を、これらに限定されないが、多発性骨髄腫（ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含めたＢ細胞悪性疾患の処置に使用する。
【０３８３】
多発性骨髄腫は、成熟形質細胞形態のＢ細胞悪性疾患であり、これらの型の細胞の単一のクローンの腫瘍性形質転換を特徴とする。これらの形質細胞は、ＢＭにおいて増殖し、近接する骨、および時には血液に浸潤し得る。多発性骨髄腫のバリアント形態としては、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫が挙げられる（例えば、Ｂｒａｕｎｗａｌｄら（編）、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１５版（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  ２００１年）を参照されたい）。
【０３８４】
非ホジキンリンパ腫は、リンパ球（白血球）のがんの大きな群を包含する。非ホジキンリンパ腫は、あらゆる年齢で生じ得、多くの場合、正常よりも大きいリンパ節、発熱、および体重減少を特徴とする。非ホジキンリンパ腫には多くの異なる型が存在する。例えば、非ホジキンリンパ腫は、侵襲性（成長が早い）型と無痛性（成長が遅い）型に分けることができる。非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞およびＴ細胞に由来し得るが、本明細書で使用される場合、「非ホジキンリンパ腫」および「Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫」という用語は、互換的に使用される。Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）としては、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫が挙げられる。骨髄または幹細胞移植後に生じるリンパ腫は、通常はＢ細胞非ホジキンリンパ腫である。
【０３８５】
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）は、Ｂリンパ球またはＢ細胞と称される未成熟白血球のゆっくりとした増加を引き起こす無痛性（成長が遅い）がんである。がん細胞は血液および骨髄を通じて拡散し、リンパ節または肝臓および脾臓などの他の器官にも影響を及ぼす可能性がある。ＣＬＬは、最終的には骨髄不全を引き起こす。時には、当該疾患の後期には、当該疾患は小リンパ球性リンパ腫と称される。
【０３８６】
特定の実施形態では、本明細書において意図されている改変Ｔ細胞またはそれを含む組成物の治療有効量を、それを必要とする患者に、単独で、または１種もしくは複数種の治療剤と組み合わせて投与するステップを含む方法が提供される。ある特定の実施形態では、本発明の細胞を、がんが発生するリスクがある患者の処置に使用する。したがって、本発明は、がんを処置または予防するための方法であって、それを必要とする被験体に本発明の改変Ｔ細胞の治療有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【０３８７】
一実施形態では、それを必要とする被験体においてがんを処置する方法は、本明細書において意図されている遺伝子改変免疫エフェクター細胞を含む組成物の有効量、例えば、治療有効量を投与するステップを含む。投与の数量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の型および重症度などの因子によって決定されるが、適切な投与量は、臨床試験によって決定することができる。
【０３８８】
一実施形態では、被験体に投与される組成物におけるＴ細胞の量は、少なくとも０．１×１０５個の細胞、少なくとも０．５×１０５個の細胞、少なくとも１×１０５個の細胞、少なくとも５×１０５個の細胞、少なくとも１×１０６個の細胞、少なくとも０．５×１０７個の細胞、少なくとも１×１０７個の細胞、少なくとも０．５×１０８個の細胞、少なくとも１×１０８個の細胞、少なくとも０．５×１０９個の細胞、少なくとも１×１０９個の細胞、少なくとも２×１０９個の細胞、少なくとも３×１０９個の細胞、少なくとも４×１０９個の細胞、少なくとも５×１０９個の細胞または少なくとも１×１０１０個の細胞である。特定の実施形態では、約１×１０７個のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約１×１０９個のＣＡＲ  Ｔ細胞、約２×１０７個のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約０．９×１０９個のＣＡＲ  Ｔ細胞、約３×１０７個のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約０．８×１０９個のＣＡＲ  Ｔ細胞、約４×１０７個のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約０．７×１０９個のＣＡＲ  Ｔ細胞、約５×１０７個のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約０．６×１０９個のＣＡＲ  Ｔ細胞または約５×１０７個のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約０．５×１０９個のＣＡＲ  Ｔ細胞が、被験体に投与される。
【０３８９】
一実施形態では、被験体に投与される組成物におけるＴ細胞の量は、体重１ｋｇ当たり細胞少なくとも０．１×１０４個、体重１ｋｇ当たり細胞少なくとも０．５×１０４個、体重１ｋｇ当たり細胞少なくとも１×１０４個、体重１ｋｇ当たり細胞少なくとも５×１０４個、体重１ｋｇ当たり細胞少なくとも１×１０５個、体重１ｋｇ当たり細胞少なくとも０．５×１０６個、体重１ｋｇ当たり細胞少なくとも１×１０６個、体重１ｋｇ当たり細胞少なくとも０．５×１０７個、体重１ｋｇ当たり細胞少なくとも１×１０７個、体重１ｋｇ当たり細胞少なくとも０．５×１０８個、体重１ｋｇ当たり細胞少なくとも１×１０８個、体重１ｋｇ当たり細胞少なくとも２×１０８個、体重１ｋｇ当たり細胞少なくとも３×１０８個、体重１ｋｇ当たり細胞少なくとも４×１０８個、体重１ｋｇ当たり細胞少なくとも５×１０８個または体重１ｋｇ当たり細胞少なくとも１×１０９個である。特定の実施形態では、体重１ｋｇ当たりＣＡＲ  Ｔ細胞約１×１０６個〜体重１ｋｇ当たりＣＡＲ  Ｔ細胞約１×１０８個、体重１ｋｇ当たりＣＡＲ  Ｔ細胞約２×１０６個〜体重１ｋｇ当たりＣＡＲ  Ｔ細胞約０．９×１０８個、体重１ｋｇ当たりＣＡＲ  Ｔ細胞約３×１０６個〜体重１ｋｇ当たりＣＡＲ  Ｔ細胞約０．８×１０８個、体重１ｋｇ当たりＣＡＲ  Ｔ細胞約４×１０６個〜体重１ｋｇ当たりＣＡＲ  Ｔ細胞約０．７×１０８個、体重１ｋｇ当たりＣＡＲ  Ｔ細胞約５×１０６個〜体重１ｋｇ当たりＣＡＲ  Ｔ細胞約０．６×１０８個または体重１ｋｇ当たりＣＡＲ  Ｔ細胞約５×１０６個〜体重１ｋｇ当たりＣＡＲ  Ｔ細胞約０．５×１０８個が、被験体に投与される。
【０３９０】
所望の療法をもたらすために、本発明の組成物の複数回投与が必要になる場合があることが当業者には認識されよう。例えば、組成物を、１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、１年、２年、５年、１０年、またはそれ超の期間にわたって１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０またはそれ超の回数、投与することができる。
【０３９１】
ある特定の実施形態では、活性化Ｔ細胞を被験体に投与し、その後、再採血し（またはアフェレーシスを実施し）、その血液から本発明に従ってＴ細胞を活性化し、患者にこれらの活性化し増大させたＴ細胞を再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回行うことができる。ある特定の実施形態では、１０ｃｃから４００ｃｃまでの採血からＴ細胞を活性化することができる。ある特定の実施形態では、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、１００ｃｃ、１５０ｃｃ、２００ｃｃ、２５０ｃｃ、３００ｃｃ、３５０ｃｃ、または４００ｃｃまたはそれ超の採血からＴ細胞を活性化する。理論に縛られずに、この複数の採血／複数の再注入プロトコールを使用することは、ある特定のＴ細胞の集団を選択するのに役立ち得る。
【０３９２】
本明細書において意図されている組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、埋め込みまたは移植によるものを含めた任意の都合のよい様式で行うことができる。好ましい実施形態では、組成物を非経口的に投与する。「非経口投与」および「非経口的に投与する」という句は、本明細書で使用される場合、経腸および局所投与以外の投与形式、通常は注射によるものを指し、限定することなく、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内への注射および注入が挙げられる。一実施形態では、本明細書において意図されている組成物を、被験体に、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射することによって投与する。
【０３９３】
一実施形態では、それを必要とする被験体に、被験体におけるがんに対する細胞性免疫応答を増加させるために有効量の組成物を投与する。免疫応答は、感染細胞を死滅させることが可能な細胞傷害性Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞によって媒介される細胞性免疫応答、およびヘルパーＴ細胞応答を含み得る。Ｂ細胞を活性化し、したがって、抗体産生を導くことが可能なヘルパーＴ細胞によって主に媒介される体液性免疫応答も誘導することができる。本発明の組成物によって誘導される免疫応答の型を分析するために様々な技法を使用することができ、それらは当技術分野で十分に記載されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａｄａ  Ｍ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄａｖｉｄ  Ｈ．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ  Ｍ．  Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ編（２００１年）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．。
【０３９４】
Ｔ細胞媒介性死滅の場合では、ＣＡＲ−リガンド結合により、Ｔ細胞へのＣＡＲシグナル伝達が開始され、それにより、種々の機構によって標的細胞のアポトーシスを誘導することができるタンパク質を産生または放出するようにＴ細胞を誘導する種々のＴ細胞シグナル伝達経路が活性化される。これらのＴ細胞媒介性機構としては（これらに限定されないが）、細胞内細胞傷害性顆粒のＴ細胞から標的細胞への移行、標的細胞の死滅を直接（または他のキラーエフェクター細胞の動員によって間接的に）誘導することが可能な炎症促進性サイトカインのＴ細胞による分泌、および、標的細胞上のそれらの同族の細胞死受容体（例えば、Ｆａｓ）に結合した後、標的細胞のアポトーシスを誘導する、Ｔ細胞表面上の細胞死受容体リガンド（例えば、ＦａｓＬ）の上方制御が挙げられる。
【０３９５】
一実施形態では、本発明は、がんと診断された被験体を処置する方法であって、被験体から免疫エフェクター細胞を取り出すステップと、前記免疫エフェクター細胞を本明細書において意図されている工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを用いて遺伝子改変するステップと、それにより、改変免疫エフェクター細胞の集団を作製するステップと、改変免疫エフェクター細胞の集団を同じ被験体に投与するステップとを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、免疫エフェクター細胞はＴ細胞を含む。
【０３９６】
ある特定の実施形態では、本発明は、被験体内の標的細胞集団に対する、免疫エフェクター細胞に媒介される免疫モジュレーター応答を刺激するための方法であって、被験体に、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲ分子をコードする核酸構築物を発現する免疫エフェクター細胞集団を投与するステップを含む方法も提供する。
【０３９７】
本明細書に記載の細胞組成物を投与するための方法は、被験体において工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲのいずれかを直接発現するｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝子改変された免疫エフェクター細胞の再導入、または、被験体に導入されると、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現する成熟免疫エフェクター細胞に分化する、免疫エフェクター細胞の遺伝子改変された前駆体の再導入をもたらすために有効な任意の方法を含む。１つの方法は、末梢血Ｔ細胞に、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて本発明による核酸構築物を用いて形質導入を行い、形質導入された細胞を被験体に戻すステップを含む。
【０３９８】
本明細書において引用されている刊行物、特許出願、および発行された特許は全て、個々の刊行物、特許出願、または発行された特許のそれぞれが参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたものと同じく参照により本明細書に組み込まれる。
【０３９９】
前述の発明は、明瞭な理解のために図解および実施例により少し詳細に記載されているが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の主旨または範囲から逸脱することなく、それらに対してある特定の変化および改変を成すことができることが当業者には容易に明らかになろう。以下の実施例は、単に例示として提供され、限定としては提供されない。基本的に同様の結果を得るために変化または改変することができる種々の重大でないパラメータは当業者には容易に認識されよう。
【実施例】
【０４００】
（実施例１）
ＡＫＴ阻害剤と共に培養したＴ細胞の増殖
本実験の目的は、Ｔ細胞増殖に対するＡｋｔ阻害剤の効果を決定することであった。Ｔ細胞分裂を測定することにより、Ｔ細胞増殖に対するＭＫ−２２０６（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）の影響を評価した。
【０４０１】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｔ細胞を含有する不均一な細胞集団である。正常ドナーからＰＢＭＣを採取し、その強度が細胞分裂毎に２倍に漸進的に希釈される、蛍光色素（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（登録商標）Ｖｉｏｌｅｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で標識した。標識されたＰＢＭＣは、Ｔ細胞増大のための細胞の供給源として使用した。ＩＬ−２（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を含有する培地においてＣＤ３およびＣＤ２８抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）と共に標識ＰＢＭＣを培養することにより、Ｔ細胞を活性化および増大させた。
【０４０２】
０日目におけるＴ培養物への０．０２５μＭ、０．０７４μＭ、０．２２２μＭ、０．６７μＭまたは２．０μＭ  ＭＫ−２２０６の添加後に、フローサイトメトリーによりＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ希釈を評価することにより、細胞分裂に対するＭＫ−２２０６の影響をアッセイした。ＩＬ−２およびＭＫ−２２０６を含有する新鮮なＸＶＩＶＯ−１５に基づく培養培地を、２〜３日毎に合計７日間、Ｔ細胞培養物に添加して、Ｔ細胞を過成長および増大させた。ＭＫ−２２０６処理は、培養開始３日後に、Ｔ細胞分裂を実質的に減少させなかった（図１Ａ）。加えて、ＭＫ−２２０６の存在下で７日間培養したＴ細胞は、ビヒクルまたは無処理対照と比較して、Ｔ細胞分裂における統計的な有意差を示さなかった（図１Ｂ）。全７日目培養物においてペアワイズｔ検定を行った；（各濃度のＭＫ−２２０６は、０μＭ  ＭＫ−２２０６と比較した：培養物は、ｐ≦０．０５レベルにおいて統計的に異ならなかった）。
【０４０３】
（実施例２）
ＭＫ−２２０６で処理したＴ細胞におけるＣＤ６２Ｌ発現
本実験の目的は、Ｔ細胞効力のためのＴ細胞マーカーに対するＡｋｔ阻害剤の効果を決定することであった。実施例１で製造されたＴ細胞培養物におけるＣＤ６２Ｌ発現を測定することにより、Ｔ細胞効力に対するＭＫ−２２０６（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）の影響を評価した。
【０４０４】
マウスモデルは、ＣＤ６２Ｌ発現が、能力あるＴ細胞；養子移入後により優れた抗腫瘍有効性を有するＴ細胞を同定することを示した。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＬ−２と共に培養したＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ発現を低下させ、したがって、腫瘍特異的Ｔ細胞の抗腫瘍効力低下と相関することが示された。驚くべきことに、本発明者は、ＡＫＴ阻害剤ＭＫ−２２０６が、７日間の培養後に、ＩＬ−２の存在下で、検査した全濃度のＭＫ−２２０６においてＣＤ６２Ｌ発現を有意に増加させることを発見した。図２。全７日目培養物において、ペアワイズＴ検定を行った（各濃度のＭＫ−２２０６は、０μＭ  ＭＫ−２２０６と比較した：＊ｐ＜．０５、＊＊ｐ＜．０１）。
【０４０５】
（実施例３）
ＭＫ−２２０６またはＺＳＴＫ４７４で処理したＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＤ６２Ｌ発現
ＭＫ−２２０６またはリン酸トリシリビン（ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）−ＴＣＮ（ＡＫＴ阻害剤）またはＺＳＴＫ４７４（ＰＩ３Ｋ阻害剤）のいずれかと共にＣＡＲ  Ｔ細胞を培養した。これらの実験セットにおいて、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的なＣＡＲ  Ｔ細胞を使用した。大規模臨床製造プロセスに対し直接的に拡張可能なシステムを使用して、ＣＡＲ  Ｔ細胞培養を行った。簡潔に説明すると、静止した（ｓｔａｔｉｃ）フラスコ内で、ＩＬ−２（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）ならびにＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を含有する培地において、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養した。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードする２×１０８形質導入単位のレンチウイルスを、培養開始から１日後に添加した。合計１０日間の培養において、ＩＬ−２および最適化された用量の阻害剤を含有する新鮮培地を添加することにより、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を対数期に維持した。培養の終わりに、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を表現型に関して調べた。
【０４０６】
培養の終わりにフローサイトメトリーにより、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＤ６２Ｌの発現を評価した。ＰＥにコンジュゲートされた組換えヒトＢＣＭＡ−ＩｇＧ  Ｆｃを使用して、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を特異的に同定した。ＣＤ６２Ｌに特異的な抗体を使用した共染色により、ＣＤ６２Ｌ発現を決定した。ＩＬ−２およびＭＫ２２０６と共に培養した、３種の正常ドナー由来の抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−２単独による培養と比較して、有意により高いＣＤ６２Ｌ発現を有した。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現させるためのレンチウイルス形質導入は、ＭＫ２２０６に起因する改善された表現型を低下させなかった。ＴＣＮではなく、培養中にＺＳＴ４７４を使用して、同様の改善が観察された（図３）。
【０４０７】
（実施例４）
ＭＫ−２２０６またはＺＳＴＫ４７４で処理したＣＡＲ  Ｔ細胞は、改善された治療活性を示す
実施例３に記載されている通りにＭＫ−２２０６、ＴＣＮまたはＺＳＴＫ４７４で処理した抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を検査して、ＣＤ６２Ｌ発現増加が、抗腫瘍活性増加に関連したかどうかを評価した。ＩＬ−２と、ＭＫ２２０６、ＴＣＮまたはＺＳＴＫ４７４のいずれかとの培養後に、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞を生成した。ＣＡＲ  Ｔ細胞のアリコートは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の治療有効性を改善することが以前に実証された用量のＩＬ−７およびＩＬ−１５を補充した培地においても培養した。１００ｍｍ３皮下多発性骨髄腫腫瘍（ＲＰＭＩ−８２２６）を有する動物に、等しいＣＡＲ  Ｔ細胞用量（１×１０６ＣＡＲ陽性細胞）を注入した。
【０４０８】
ＩＬ−２と共に培養した抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、完全腫瘍退縮を引き起こすのに十分であった。ＩＬ−７と、ＩＬ−１５、ＭＫ−２２０６またはＺＳＴ７４７と共に培養した抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、この多発性骨髄腫動物モデルにおける標準ＩＬ−２と共に培養した抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、同様のレベルの抗腫瘍活性を示した。対照的に、ＴＣＮと共に培養した抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、いかなる抗腫瘍応答も完全に消失させた。これらの実験の結果を図４に示す。
【０４０９】
（実施例５）
Ｍｋ−２２０６またはＺＳＴＫ４７４で処理したＣＡＲ  Ｔ細胞は、侵襲性腫瘍モデルにおける改善された治療活性を示す
より侵襲性で処置が困難な腫瘍モデルを使用して、ＩＬ−２、ＭＫ−２２０６、ＴＣＮ、ＺＳＴＫ４７４、ＩＬ７／１５またはビヒクルで処理したＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性を確認した。Ｄａｕｄｉ腫瘍細胞は、低レベルのＢＣＭＡタンパク質を発現し、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を使用して有効に処置することができる。Ｄａｕｄｉ腫瘍進行は、ＩＬ−２またはＩＬ７／１５培養抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞による処置後に影響されなかった。際だったことに、ＭＫ−２２０６またはＺＳＴ４７４のいずれかと共に培養した抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、完全な腫瘍退縮を引き起こした。これらの実験の結果を図５に示す。
【０４１０】
（実施例６）
ＭＫ−２２０６またはＺＳＴＫ４７４で処理したＣＡＲ  Ｔ細胞は、改善された持続性を示す
ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した患者における臨床データは、持続性が、客観的な腫瘍応答に関連することを示唆する。完全な退縮を有するマウスにおいて腫瘍を再負荷することにより、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性を評価した。完全に退縮した１００ｍｍ３ＲＰＭＩ−８２２６腫瘍を有した、ＩＬ−２、ＭＫ−２２０６またはＺＳＴＫ４７４培養抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した動物に、１３日間後に、反対側の側腹部にＲＰＭＩ−８２２６を再負荷した。ＩＬ−２培養ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した動物は、腫瘍過成長を防止することができなかった。対照的に、ＺＳＴＫ４７４培養抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した動物はいずれも、腫瘍生着のいかなる証拠もなかった。これらのデータは、治療活性を有する抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＺＳＴＫ４７４培養抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ
Ｔ細胞において持続することを示す。これらの実験の結果を図６に示す。
【０４１１】
一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を本明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではなく、全ての可能性のある実施形態を、そのような特許請求の範囲に権利が与えられる等価物の全範囲と共に包含すると解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示により限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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