(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト又はヒト及びカニクイザルにおいて速いクリアランスを有する危険性が増加した治療剤を同定するための選択方法及びそのような治療剤のクリアランスを減少させる方法を提供する。【解決手段】本発明は、バキュロウイルス粒子（ＢＶ）に治療薬を接触させ、ＢＶへの治療薬の結合のレベルを測定し、結合のレベルに基づいて治療薬についてＢＶスコアを計算する工程を含む、治療候補のオフターゲット結合を検出するための方法で、治療薬が、カニクイザル、ヒト又はカニクイザルにおいて望ましいクリアランス速度を有するかどうかを予測する方法である。このアッセイは、とりわけ、適切な薬剤を得る確率を高めるために、抗体リード・ジェネレーション又は最適化中に使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バキュロウイルス粒子（ＢＶ）に治療薬を接触させ、ＢＶへの治療薬の結合のレベルを測定し、結合のレベルに基づいて治療薬についてＢＶスコアを計算する工程を含む、治療薬が、カニクイザル、ヒト又はカニクイザルにおいて望ましいクリアランス速度を有するかどうかを予測する方法であって、所定の閾値を超えるＢＶスコアが高速なクリアランス速度の可能性の増加の指標であり、所定の閾値未満のＢＶスコアが望ましいクリアランス速度の可能性の増加の指標である、方法。
【請求項２】
治療薬への結合の前にＢＶがマイクロタイタープレートに結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
治療薬が検出薬で標識される、請求項１又は２の何れか一項に記載の方法。
【請求項４】
検出薬を含む第二の薬剤を治療薬に結合させる工程を更に含む、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
検出薬からのシグナルが測定される、請求項３又は４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
ヒトにおいて、１０ｍＬ／Ｋｇ／日を超えるクリアランスに相関するＢＶスコアは高速なクリアランス速度と見なされる、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＢＶスコアの所定の閾値が５である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
治療薬がポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
治療薬が抗体又はイムノアドヘシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
最初の二工程がＥＬＩＳＡアッセイに組み込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
治療薬が望ましいクリアランス速度を有するかどうかを決定するためのキットであって、該キットが、バキュロウイルス粒子及びヒト抗体に結合する抗体を含む、キット。
【請求項１２】
キットがマイクロタイタープレートを更に含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
ヒト抗体に結合する抗体は、ヒト抗体のＦｃ領域に結合する、請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
ＢＶが、固体支持体に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
個体支持体がマイクロタイタープレートである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
バキュロウイルス粒子の非存在下での治療薬の結合が、正規化に使用するための値を導出するために測定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
界面活性剤が任意の工程で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
治療薬が望ましいクリアランス速度を有するかどうかを決定するためのキットであって、該キットが、バキュロウイルス粒子及びＥＬＩＳＡアッセイにおけるインストラクションを含む、キット。
【請求項１９】
ヒトにおける望ましいクリアランス速度を有する治療薬を選択すること及び宿主細胞中で治療薬を発現する工程を含む、治療薬を作製する方法。
【請求項２０】
宿主細胞により発現される治療薬を回収する工程を更に含む方法。
【請求項２１】
治療薬の選択は、請求項１に記載の方法により達成される、請求項１９又は請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１２年５月２３日に出願された米国仮出願第６１／６５０，９６４号の利益を主張し、該出願は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、ヒト又はヒト及びカニクイザルにおいて速いクリアランスを有する危険性が増加した治療剤を同定するための選択方法及びそのような治療剤のクリアランスを減少させる方法に関する。  
【背景技術】
【０００３】
ヒト又はヒト化モノクローナル抗体は、ヒト疾患のための治療剤として広く成功している。３０を超える抗体が、様々な障害の治療用にＦＤＡの承認を受けており、数百以上が現在臨床開発段階にある１。抗体治療薬により達成することができる優れた選択性と高い効力に加えて、薬物としての抗体の成功はそれらの通常の長い循環半減期から非常に恩恵を受けている。血液からの遅いクリアランスは、低頻度の投薬により実現されるべき所望の薬物濃度を可能にする。抗体医薬は通常、静脈内注入又は皮下注射によって投与され、低頻度の投与は、患者の服薬順守、従って臨床的利益を向上させる。
【０００４】
抗体は、複数のメカニズム−流体相エンドサイトーシス後の細胞内異化作用（非特異的クリアランス）、抗原媒介クリアランス４によって、及び場合によっては抗治療抗体（ＡＴＡ）の形成に起因して全身循環から除去することができる。抗体が細胞に結合した抗原に結合する際に一般に観察される抗原媒介性クリアランスは、抗体の低濃度で最も顕著であり、通常は、抗体の投与量を増加させることにより飽和させることができる。ＡＴＡは、投与後４−７日に現れ、迅速に排除することができる免疫複合体の形成を含むことが観察されており、時には抗体の血漿濃度−時間プロファイルの非定型形状から容易に検出することができる。
【０００５】
抗体の除去は、ＦｃＲｎ依存性リサイクル機構を介して遅延される。抗体はエンドサイトーシス経路を通過する時に、ｐＨ＜６でＦｃＲｎに結合することができる。ＦｃＲｎへの結合は、異化作用からＩｇＧを保護し、頂端細胞表面への回帰を促進し、そこで血液のｐＨ（＞７）で急速に放出され得る。これらの特徴は、ヒトにおいて、ヒト又はヒト化抗体の６−３２日の半減期をもたらす(Keizer, R.J., Huitema, A.D.R., Schellens, J.H.M., Beijnen, J.H. 治療用モノクローナル抗体の臨床薬物動態（Clinical Pharmacokinetics of Therapeutic Monoclonal Antibodies）Clinical Pharmacokinetics 49, 493-507 (2010)）。１２のＩｇＧ１抗体による薬物動態学的データに基づいて、ヒトにおいて〜２−６ｍＬ／ｋｇ／日の範囲を持つＡ３．９±１．２（ＳＤ）ｍＬ／ｋｇ／日のクリアランスの平均値が決定された(Deng, R.ら、非臨床データからの治療用抗体のヒトの薬物動態の投影：私たちは何を学んだ？（Projecting human pharmacokinetics of therapeutic antibodies from nonclinical data: What have we learned?） mAbs 3, 61-66 (2011))。同様に、カニクイザルにおけるこれらの抗体の研究により、６．５±２．９（ＳＤ）ｍＬ／ｋｇ／日の平均クリアランスを得た。ｐＨ６．０でＦｃＲｎへの結合を増加させるための抗体Ｆｃ領域の操作は、カニクイザル及びマウスにおいて潜在的治療抗体の半減期を増加させることができる (Dall'Acqua, W.F., Kiener, P.A. & Wu, H. 新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合の増強ために操作されたヒトＩｇＧ１の性質（Properties of human IgG1s engineered for enhanced binding to the neonatal Fc receptor (FcRn)）。The Journal of biological chemistry 281, 23514-23524 (2006); Hinton, P.R.ら、長い血清半減期を有する操作されたヒトのＩｇＧ１抗体(An Engineered Human IgG1 Antibody with Longer Serum Half-Life). J Immunol 176, 346-356 (2006); Yeung, Y.A.ら、ヒト新生児Ｆｃ受容体へのヒトＩｇＧ１の親和性を操作する：霊長類における薬物動態に関する親和性改善の影響(Engineering human IgG1 affinity to human neonatal Fc receptor: impact of affinity improvement on pharmacokinetics in primates). J Immunol 182, 7663-7671 (2009); Zalevsky, J.ら、拡張された抗体半減期はインビボ活性を改善する(Enhanced antibody half-life improves in vivo activity). Nature biotechnology 28, 157-159 (2010))。
【０００６】
ヒトで予想される投与計画を理解し、潜在的な毒性を評価するために、関連する非ヒト種の潜在的な治療用抗体の前臨床試験が必要である。ヒト及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の間の標的抗原の高い配列相同性、及びＦｃＲｎ受容体をリサイクルするための類似の結合親和性を考慮すると(Dall'Acqua, Kiener & Wu, supra)、カニクイザルは、前臨床薬物動態学（ＰＫ）及び毒物学研究のための好適な種である。これまでに、我々は、ヒトにおいて決定された治療用ＩｇＧ１抗体の非特異的クリアランスは、一般にカニクイザルにおいて測定されたものの約半分であることを示している(Deng, R. et al., supra)８。
【０００７】
予想されるクリアランスより速くするための一つの潜在的なメカニズムは、オフターゲット結合である１３−１６。高度に特異的なオフターゲット結合が時には同定されそして排除することができるものの１４、最も頻繁なオフターゲット結合は未知の起源のものであり、用量の増加により飽和させることは困難である。抗体のインビボにおける吸収、分布、代謝、及び排出メカニズム又はインビボでの薬物動態学的挙動を評価し予測するためのインビトロ系は、まだ確立されていない。我々は、インビボで速いクリアランスを示す可能性が高い抗体を同定するために有用であろう非特異的結合のインビトロアッセイを開発しようとした。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ヒト及びカニクイザルで測定された抗体クリアランス値の相関を示すグラフである（ρ＝０．７４、ｎ＝１６）。我々の分析では、あらゆる標的依存性クリアランスを飽和させると考えられる抗体用量を選択した。実線はカニクイザルクリアランスの対数に対するヒトのクリアランスの対数の線形回帰適合である。示される大半の抗体において、ヒトのクリアランスは対応するカニクイザルクリアランスより約２倍遅い。対照的に、抗ＮＲＰ１では、ヒトでのクリアランス（９．２ｍＬ／ｋｇ／日）は、カニクイザルにおけるクリアランス（４．３ｍＬ／ｋｇ／日）よりも約２倍速い。
【図２】図２は、カニクイザルにおける抗体（ｎ＝５２）のクリアランス値を示すグラフである。幾何学的平均値は、報告されたクリアランスに対する任意の特定のクリアランスの寄与は無視できると仮定された投与群から示されている。４つの試験を除き、平均値は３以上の動物からのものである。ヒト化（丸）、ヒト（四角）、合成ヒトファージ由来（三角）、及びキメラ（ダイヤモンド）抗体が示されている。黒の記号は、ラムダ軽鎖を有する抗体を示し、他の全てはカッパ軽鎖を有する。ヒンジ安定化変異体Ｓ２２８Ｐを有するＩｇＧ４アイソタイプ抗体は「Ｘ」でマークされ、他の全ては、ＩｇＧ１アイソタイプである。幾何学的形状内にある水平線はアフコシル化抗体を示している。ＡＡｓｎ２９７のＡｌａによる置換を介して得られる非グリコシル化抗体は、幾何学的形状内の丸印で示される。ＦｃガンマＲ結合を調節するためのＦｃのアミノ酸置換を有する抗体は、幾何学的形状内の縦線で示される。
【図３】図３は、ヒト化抗体及びファージディスプレイライブラリーに由来する合成ヒト抗体の、カニクイザルにおけるクリアランス値の比較を示す箱ひげ図である。キメラ抗体（ｎ＝１）及び非ファージ源からのヒト抗体（ｎ＝３）は、そのデータセットが非常に小さい大きさであるため、示されていない。プロットは箱ひげ図によって重ね合わせた個々のデータ値を示している。箱ひげ図の四角形は、第一四分位（２５パーセンタイル）と第３四分位（７５パーセンタイル）との間の四分位範囲（ＩＱＲ）を示しており；箱ひげ図の四角形内のより厚い水平線は中央値（５０パーセンタイル）である。箱ひげ図下部のウィスカーは、下位四分位点の１．５ ＩＱＲ内になお存在する最低データ値に延び、そして上部ウィスカーは上位四分位点の１．５ ＩＱＲ内の最高データ値に及ぶ。
【図４】図４は、カニクイザルにおける抗体クリアランスとカニクイザルＦｃＲｎに対する結合親和性（ＫＤ、ｐＨ５．８）との間の関係を示している。図２で定義したシンボルが使用される。ｎＭでの解離定数（ＫＤ）は、Yeung et al., 2010に記載されるようにＳＰＲデータの定常状態分析から決定された。使用される記号は、図２と同じである。
【図５】図５は、正規化されたＢＶ ＥＬＩＳＡスコアによる、Ａ）カニクイザル及びＢ）ヒトにおける抗体クリアランス値の関連を示す。ＢＶ ＥＬＩＳＡスコア＞５は、カニクイザルにおける高速クリアランスのリスクの増加と関連している（ρ＝０．５３、ｎ＝４５）。ＢＶスコアは、６回の測定の平均値から算出し；各測定は、同一アッセイプレート上の非被覆ウェルについて観察されたシグナルで割ることにより正規化した。ＢＶスコア＜５を有する抗体のうち、１２％は、カニクイザルにおけるクリアランス＞１０ｍＬの／ｋｇ／日を有し、一方、クリアランスはＢＶスコア＞５を有する抗体の７５％で１０ｍＬ／ｋｇ／日超えている。オッズ比の最大尤度推定値は１９．５である（フィッシャーの直接確率検定、９５％信頼区間（３．３、１６５．７））。信頼区間は、ＢＶ＞５においてより高速クリアランスの可能性の３．３から１６６倍の増加を示唆しており；１を含まない間隔は、統計的有意性を意味する。ＢＶ ＥＬＩＳＡスコア＞５は、ヒトにおける高速クリアランスのリスクの増加と関連している（ρ＝０．８３、ｎ＝１６）。
【図６−８】図６−８は、ＨＩＣによって測定されるＡ）ｐＩ、Ｂ）疎水性、及びＣ）Ｆｖドメインについて計算される電荷に関して、カニクイザルおける抗体クリアランスと抗体との間の関係をそれぞれ示している。
【図９】図９は、カニクイザルクリアランスとＢＶ ＥＬＩＳＡスコアが相関していることを示している。
【図１０】図１０は、カニクイザルクリアランスと正規化されたＢＶのスコアとの間の相関が、ＨＩＩＩ及びカッパ１フレームワークを有し、ＣＤＲが異なる試験したＩｇＧ１抗体とバーニア位置の間に存続することを示している。
【図１１】図１１は、ヒトのクリアランスとＢＶ ＥＬＩＳＡスコアの間の相関は、抗ＮＲＰ−１抗体においてさえも存続することを示している。
【図１２】図１２は、高速クリアランスのリスクを軽減するための可能なスクリーニングカスケードを示している。
【０００９】
詳細な説明
本明細書では、治療薬の結合のオフターゲット結合を評価するために有用であるバキュロウイルス（ＢＶ）粒子への結合の検出に基づくアッセイを記述する。このアッセイは、とりわけ、適切な薬剤を得る確率を高めるために、抗体リード・ジェネレーション又は最適化中に使用することができる。
【００１０】
本発明のアッセイにおける抗体の大きなパネルを試験し、そしてカニクイザルにおいて、かつ可能な場合ヒトにおいて同一抗体の薬物動態データによる試験結果を分析することにより、我々は、再利用ＦｃＲｎ受容体との相互作用の変化は、これらの抗体について観測が期待されるクリアランスよりも速いクリアランスを説明していないと判断した。我々は、他者によって報告されるように、クリアランスは、インタクトな抗体の等電点（ｐＩ）又は疎水性と関連していることを見いださなかった。我々は、オフターゲット結合は、ほとんどの場合、そのようなオフターゲットは同定されていない、多くの抗体の高速クリアランスを説明すると信じる。非ヒト霊長類及びヒトでの薬物動態学的研究を実施することは、時間がかかり、かつ高価である。この発明の前に、潜在的なオフターゲット結合の寄与を予測することは困難であって、生体内でそのような薬物動態学的研究を実施する前に薬物動態プロファイルを予測した。我々は、用いるのが簡単であり、かつ適切な薬物動態学的特性を有する可能性が高い治療候補を選択すること及び非ヒト霊長類及びヒトで不十分な薬物動態学的特性を有する可能性が高い治療候補を除外することを支援ために使用することができる、安価で、よりハイスループットなインビトロのアッセイを開発した。
【００１１】
本発明は、以下の定義及び実施例を使用する参照によってのみ詳細に説明される。本明細書で言及されるような特許及び刊行物は、そのような特許及び刊行物に開示すべての配列を含み、参照により明示的に援用される。
【００１２】
「治療薬」は、疾患の治療に有用であり得る薬剤を意味する。一実施態様において、治療薬は、一以上のポリペプチド配列を含む。別の実施態様において、治療薬は、抗体の配列を含む。別の実施態様において、治療薬はイムノコンジュゲートである。
【００１３】
本明細書で使用する「ＢＶ」とは、バキュロウイルス粒子を指す。
【００１４】
本明細書で使用する「ＢＶスコア」とは、バキュロウイルス粒子への治療薬の結合のレベルを測定する複数（二以上）の結合アッセイからの値の平均値から算出した値を指す。
【００１５】
「正規化されたＢＶスコア」とは、ＢＶスコアを指し、ここでは、各結合アッセイからの値は平均値を計算する前に正規化されている。一実施態様において、正規化は、ＢＶとの各結合アッセイからの値を、非処置（即ち、ＢＶなし）のアッセイで観察値により除算することにより達成される。一例において、ＢＶとの各結合アッセイのＯＤ値は、非被覆ウェルについて観察されたＯＤ値の平均値で除算される。
【００１６】
「リスクの増加」又は「可能性の増加」とは、事象が発生する大きな可能性を指す
【００１７】
「高速クリアランス」は、ヒト又はカニクイザルにおける薬剤のクリアランス速度を指す。一実施態様において、速いクリアランス速度とは、１０ｍＬ／ｋｇ／日を超える任意の速度である。別の実施態様において、速いクリアランス速度とは、１２ｍＬ／ｋｇ／日を超える任意の速度である。
【００１８】
「望ましいクリアランス」は、ヒト又はカニクイザルにおける薬剤の望ましいクリアランス速度を指す。一実施態様において、望ましいクリアランス速度は、８．５ｍＬ／ｋｇ／日又はそれ以下であるものである。別の実施態様において、望ましいクリアランス速度は、１２ｍＬ／ｋｇ／日又はそれ以下であるものである。
【００１９】
本明細書において用いる場合、用語「イムノアドヘシン」は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を兼備する抗体様分子を示す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００２０】
「融合タンパク質」及び「融合ポリペプチド」は、部分の各々が異なる特性を有するポリペプチドにおいて、互いに共有結合した２つの部分を有するポリペプチドを意味する。特性は生物学的特性、例えばインビトロ又はインビボでの活性であってよい。また特性は、単に化学的又は物理学的特性、例えば標的分子への結合性、反応の触媒性等であってよい。その部分は単一のペプチド結合によって直接連結され、又は一以上のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを介して連結され得る。一般的に、その部分とリンカーは互いにリーディングフレーム内に存在し得る。
【００２１】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００２２】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００２３】
参照抗体として「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体、逆に競合アッセイにおいて５０％以上、その抗体のその抗原への結合をブロックするその参照抗体を指す。典型的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
【００２４】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種から由来する抗体を指す。
【００２５】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ，及びＩｇＭがあり、これらのうちの幾つかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２へとさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００２６】
本明細書で用いられる「細胞傷害性薬物」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死又は破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬物は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）：化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；成長阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など；抗生物質；小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）；及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含する。
【００２７】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００２８】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
【００２９】
用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００３０】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメインで構成される：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００３１】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００３２】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。
【００３３】
「イムノコンジュゲート」は、一以上の異種分子にコンジュゲートした抗体であり、限定されないが、細胞傷害性薬物又は検出薬を含む。
【００３４】
「検出する」という用語は、物質の存在又は非存在を決定すること又は物質の量を定量することを含むことを意図する。従って、その用語は、定性的及び定量的測定のための本発明の材料、組成物、及び方法の使用を指す。
【００３５】
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。所定の実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
【００３６】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上又は９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【００３７】
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００３８】
「抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
【００３９】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味し、即ち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００４０】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
【００４１】
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
【００４２】
用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
【００４３】
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
【００４４】
「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
【００４５】
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する(treat)」又は「治療している(treating)」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【００４６】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindtら、Kuby Immunology, 第６版， W.H. Freeman and Co., ９１頁 (2007)を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
【００４７】
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【００４８】
更なる態様にて、以下のセクション１−７で説明されるように、上記実施態様のいずれかに記載の抗ＰＣＳＫ９抗体は、単独又は組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる。
【００４９】
１．抗体親和性
所定の実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）。
【００５０】
一実施態様において、以下のアッセイにより説明されるように、Ｋｄは、目的の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。非標識抗原の滴定系列の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例としてChen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照）。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート(Thermo Scientific)を、５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート(Nunc #269620)に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する（例えば、Prestaら、(1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。ついで目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間（例えばおよそ６５時間）かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０ ＴＭ；Packard）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ ＴＭγ計測器(Packard)にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。
【００５１】
他の実施態様に従って、〜１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫｄを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、BIAcore Inc.）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) （ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、 Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ ＴＭ分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【００５２】
２．抗体断片
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、 Hudsonら、Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【００５３】
ダイアボディは２価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
【００５４】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である (Domantis, Inc., Waltham, MA; 例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１を参照）。
【００５５】
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌やファージ）による生産を含む。
【００５６】
３．キメラ及びヒト化抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【００５７】
所定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、例えば抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。
【００５８】
ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号及び第７，０８７，４０９号； Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）； Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （「リサーフェシング」を記述）； Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。
【００５９】
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Simsら、J. Immunol. 151:2296 (1993)）；軽鎖又は重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及びPrestaら、J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）；及びＦＲライブラリースクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及びRosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照）を含む。
【００６０】
４．ヒト抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で周知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
【００６１】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つ又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している、米国特許第６，０７５，１８１号及び６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）も参照のこと。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変される可能性がある。
【００６２】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ細胞株が記載されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) （ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
【００６３】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に説明される。
【００６４】
５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性又は活性（複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboomら、in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004);及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
【００６５】
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブなレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、ナイーブなライブラリーはまた、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の未転位Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、２００５／０１１９４５５号、２００５／０２６６０００号、２００７／０１１７１２６号、２００７／０１６０５９８号、２００７／０２３７７６４号、２００７／０２９２９３６号及び２００９／０００２３６０を含む。
【００６６】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書でヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。
【００６７】
６．多重特異性抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つは［［ＰＲＯ］］に対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。ある実施態様において、二重特異性抗体は、［［ＰＲＯ］］の２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまた［［ＰＲＯ］］を発現する細胞に対して細胞傷害性薬物を局在化させるために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【００６８】
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照）及び「ノブ・イン・ホール（knob-in-hole）」工学（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４，６７６，９８０号；及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）；２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照）；二重特異性抗体フラグメントを作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）；及び、例えばTuttら、J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
【００６９】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照）。
【００７０】
本明細書中の抗体又は断片はまた、［［ＰＲＯ］］並びにその他の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用(Dual Acting) ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。
【００７１】
７．抗体変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
【００７２】
ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
ある実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。保存的置換は、表１の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
【００７３】
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【００７４】
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００７５】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【００７６】
置換変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性を減少）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【００７７】
改変（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboomら、in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、又はモデリングを用いて、特異的に同定され得る。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
【００７８】
所定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で生じる可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個又は３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
【００７９】
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【００８０】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【００８１】
ｂ）グリコシル化変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成又は削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
【００８２】
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えばWrightら、TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は、一定の改善された特性を有する抗体変異体を作成するために行われ得る。
【００８３】
一実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％であり得る。
【００８４】
フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着しているすべての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流又は下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させた可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号(Presta, L.)；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「非フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazakiら、J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnukiら、Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。フコース非修飾抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripkaら、Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号Ａ１、Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２号Ａ１、Adamsら、具体的には実施例１１）、及びノックアウト細胞株、アルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnukiら、Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
【００８５】
抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を更に備えている。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairettら）；米国特許第６，６０２，６８４号（Umanaら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umanaら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Patelら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）に記載されている。
【００８６】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある実施態様において、１つ又は複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
【００８７】
ある実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Hellstrom, I.ら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照）及びHellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；第５，８２１，３３７号（例えば、Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照）に説明される。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Promega, Madison, WI）を参照。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代わりとして、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynesら、PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。また、ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定は、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照）。
【００８８】
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」 Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【００８９】
ＦｃＲへの結合を改善又は減少させた特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)）。
【００９０】
所定の実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。
【００９１】
幾つかの実施態様において、改変された（即ち、改善され又は減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされ、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogieら、J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に説明される。
【００９２】
増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号 (Hinton et al.)に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一つ又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一以上の置換、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【００９３】
Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては、Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【００９４】
ｄ）システイン操作抗体変異体
ある実施態様において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、一以上の以下の残基がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Kabatの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【００９５】
ｅ）抗体誘導体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手される追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性に起因して製造における利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であってよい。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が限定された条件下で治療に使用されるのか等を含む考慮に基づいて決定することができる。
【００９６】
別の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体と非タンパク質部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
【００９７】
組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号で説明したように、組換えの方法及び組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む一以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、及び必要に応じて、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【００９８】
抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
【００９９】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で産生することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号及び第５，８４０，５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照。）発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。
【０１００】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。
【０１０１】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
【０１０２】
植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
【０１０３】
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株(Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。
【０１０４】
以下の実験の開示において、以下の略語が適用される；ｅｑ（当量）；Ｍ（モル）；μＭ（マイクロモル）；Ｎ（ノーマル）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｋｇ（キログラム）；μｇ（マイクロモル）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（摂氏）；ｈ（時間）；ｍｉｎ（分）；ｓｅｃ（秒）；ｍｓｅｃ（ミリ秒）；Ｃｉ（キュリー）ｍＣｉ（ミリキュリー）；μＣｉ（マイクロキュリー）；ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）；Ｔｓ（トシル）；Ｂｎ（ベンジル）；Ｐｈ（フェニル）；Ｍｓ（メシル）；Ｅｔ（エチル），Ｍｅ（メチル）。
【実施例】
【０１０５】
本発明は以下の実施例に更に詳細に記載されるが、これらは特許請求される本発明の範囲を限定することを意図のものではない。添付図面は、本発明の明細書と説明の不可欠な部分と見なされることが意図される。全ての参考文献は、本明細書に記載されている全てにおいて、参照により援用される。以下の実施例は、説明するために提供されるが、請求項に記載の発明を限定するものではない。
【０１０６】
この出願は、具体的にはHotzelら、(2012), “A Strategy for Risk Mitigation of Antibodies with Fast Clearance", mAbs 4:6, 1-8を含む本明細書で引用した特許出願及び特許及び刊行物を参照によりその全体を援用する。
【０１０７】
実施例１：
カニクイザルにおけるクリアランスの決定
この実施例では、非ヒト霊長類における抗体のクリアランスを決定するために使用される標準的な方法を示す。
【０１０８】
抗体の薬物動態は、カニクイザルにおいて、治療用抗体の単回用量又は複数回用量を静脈内投与した後に決定した。血清試料を種々の時点で採取した血液から調製し、抗体濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。ほとんどの場合、ＥＬＩＳＡは、コーティングされた抗原を用いた捕獲と続く抗ヒトＦｃ抗体による検出からなる。抗体２６のＥＬＩＳＡアッセイは、捕獲のために抗イディオタイプ抗体を使用した。抗体１４、１７、２４、３３及び４４は、血清濃度の測定のために抗ヒトＦｃサンドイッチＥＬＩＳＡを使用した。時間プロファイルに対する血清濃度は、総クリアランスを算出するために、非コンパートメント分析を用いて分析した（Deng, R.ら、Pharmacokinetics of humanized monoclonal anti-tumor necrosis factor-{alpha} antibody and its neonatal Fc receptor variants in mice and cynomolgus monkeys. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 38, 600-605 (2010)）。各抗体について試験した最高用量でのクリアランスは、非特異的クリアランスとして報告され、総クリアランスに対する特異的クリアランスの寄与は無視できると仮定した。
【０１０９】
以前に利用可能なものよりもわずかに大きなデータセットを使用して(Deng, R.ら、Projecting human pharmacokinetics of therapeutic antibodies from nonclinical data: What have we learned? mAbs 3, 61-66 (2011))、我々は、カニクイザル及びヒトにおいて測定されたクリアランス値の間に強い相関関係を確認している（図１、スピアマンの相関係数（ρ）＝０．７４）。ヒトで測定されたクリアランスはカニクイザルにおいて測定されたクリアランスより約２倍遅いとする単純なスケーリングガイドラインが得られ、異常値として抗ＮＲＰ１抗体を含む。
【０１１０】
実施例２：
ＦｃＲｎの親和性の決定
次の例では、平衡解離定数（ＫＤ）をどのように決定することができるかを詳述する。  固定化抗体へのカニクイザルＦｃＲｎの結合についての平衡解離定数（ＫＤ）は、ビアコア（登録商標）４０００装置(GE Healthcare)による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定から決定した。前述のようにカニクイザルＦｃＲｎのを調製した(Yeung, Y.A.ら、Engineering human IgG1 affinity to human neonatal Fc receptor: impact of affinity improvement on pharmacokinetics in primates. J Immunol 182, 7663-7671 (2009))。シリーズＳセンサーチップがドッキングされ、標準化され、製造業者によって供給されたプロトコルを使用して、水力学的アドレッシングのために調製された。４つのフローセルの各々の全５スポットはアミンカップリングのために、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液（０．２ＭのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）及び０．０５ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）に１０分間の曝露により活性化された。抗体は、２μｇ／ｍｌの抗体及び１０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５）を含む溶液への７分間の曝露により、スポット１、２、４及び５に結合された。未反応部位はその後、１Ｍのエタノールアミンへの全ての５スポットの７分間の曝露を通じてブロックした。この形式では、スポット３は基準セルであり、４つの異なる抗体がフローセルごとに結合され、センサーチップあたり合計１６となる。カップリング密度は、抗体の２００〜１０００ＲＵの範囲であった。別々の実験では、計算されたＫＤは、この範囲のカップリング密度では変化しなかったことが示された（データ非表示）。１０μＭから０．０４μＭの濃度で２倍刻みで変化させたカニクイザルＦｃＲｎの一連の溶液は、２５ｍＭのＭＥＳ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ５．８を含むランニングバッファー中で調製した。センサーグラムは、３０μＬ／分の流速でのセンサーチップ上で、これらの溶液及びバッファーのみのコントロールの６０μＬの注入について収集した。測定温度は２５℃で、解離は１８０秒間モニターされ、次いで結合したままの任意ＦｃＲｎは、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ８を含む溶液３０μＬを注入することにより溶出された。解離定数は、ビアコア４０００評価ソフトウェア１．０を使用して定常状態の親和性解析から計算した。
【０１１１】
実施例３：
ＥＬＩＳＡ用抗原の作製
この例では、本明細書に記載のアッセイで使用するためのマイクロタイタープレートをコーティングするために使用される基質の作製が記載されている。
【０１１２】
バキュロウイルス粒子は、無血清ＥＳＦ９２１培地の６００ｍｌ中で１．８×１０９のＳｆ９昆虫細胞に、緑色蛍光タンパク質を発現する組換えAutographa californica nucleopolyhedrovirus(Bac-to-Bac, Invitrogen)を約１の感染の多重度で感染させることにより得た(Expression systems, Davis, CA)。感染した培養物は、撹拌（２００ｒｐｍ）の下、２７℃で４０時間インキュベートし回収し、そして細胞を１０分間、５０００×ｇでの遠心分離によって除去した。上清中のウイルスを、４℃で４時間、２５０００×ｇの遠心分離によりペレット化し、ＰＢＳ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）中に再懸濁し、ＰＢＳ中３５％（ｗ／ｖ）のスクロースクッションの４ｍｌの上に積層され、４℃で１時間、３０，０００ｒｐｍでＳＷ４０Ｔｉローター(Beckman)中で遠心分離した。破片を含む上清を捨て、ウイルスペレットを穏やかにＰＢＳで１回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)を含むＰＢＳ１．２ｍｌ中に再懸濁し、４℃で最大４ヶ月間保存した。
【０１１３】
粗製のＳｆ９細胞膜画分を、非感染細胞から得た。無血清ＥＳＦ培地中で増殖させた総数２×１０８の非感染Ｓｆ９細胞をＰＢＳで１回洗浄し、氷冷溶解緩衝液（１ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル）４ｍｌ中に再懸濁した。細胞はダウンスホモジナイザーに移して、ゆるくフィットした乳棒の８ストロークで砕いた。０．５Ｍのスクロースを含む溶解緩衝液を更に４ｍｌ溶解細胞に添加し、細胞をぴったりフィットした乳棒の８ストロークで砕いた。溶解物を４℃で５００×ｇで１０分間遠心分離し、ミトコンドリア、核及び粗い破片を除去した。上清を新しいチューブに移し、４℃で２０分間２５０００×ｇで遠心分離した。ペレットを溶解緩衝液で１回洗浄し、ぴったりフィットした乳棒でダウンスホモジナイザーを使用して、同じ緩衝液５ｍｌ中に再懸濁した。大きな破片を４℃で５００×ｇの遠心分離によって除去した。
【０１１４】
実施例４：
ＥＬＩＳＡアッセイ
抗原（例えば、バキュロウイルス粒子）を３８４ウェルのＥＬＩＳＡプレート(Nunc Maxisorp)に、各ウェルに、５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．６中の１％バキュロウイルス懸濁液２５μｌを添加することにより、固定化し、粒子を４℃で一晩、プレートに吸着させた。ウェルをブロッキング緩衝液（０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）５０μｌで室温で１時間ブロックした。ＰＢＳでプレートを３回洗浄した後、精製した抗体はブロッキング緩衝液で段階希釈し。２５μｌをＥＬＩＳＡウェルに二連で添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで６回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Jackson)にコンジュゲートした１０ｎｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃガンマ断片特異的）２５μｌを各ウェルに加えた。プレートは、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳ中で６回洗浄し、ＴＭＢ基質２５μｌを各ウェルに加えた。反応は、１５分後に各ウェルに１Ｍリン酸を２５μｌ添加することによって停止され、吸光度を４５０ｎｍで読み取り、６２０ｎｍで参照された。ＢＶスコアは、非被覆ウェルについて観察された平均シグナルで除算することにより各々が正規化されていた６つの光学密度測定の平均から計算した。Ｓｆ９細胞膜によるアッセイにおいて、バキュロウイルス粒子の代わりにＥＬＩＳＡプレートを被覆するため粗製膜の２％懸濁液を使用した。界面活性剤は、任意の段階でバッファーに添加されなかった。
【０１１５】
実施例５：
ＦＡＣＳ分析
ＨＥＫ２９３細胞を、ＤＭＥＭ−１０％ウシ胎児血清中に５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、１００μｌ／ウェルでＵ底９６ウェルプレートに分注した。ＰＢＳ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で希釈したＩｇＧの等量（３０〜５０ｎＭの最終濃度）を細胞に添加し、４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を、氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲート(Jackson Immunoresearch)又は抗ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８(Molecular Probes)コンジュゲートと共に４℃で３０分間インキュベートし、氷冷したＰＢＳで２回洗浄し、０．１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で固定した。細胞は、ハイスループットサンプラーを装備したＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター(BD Biosciences)で分析した。
【０１１６】
実施例６：
統計的分析
全ての統計分析は、Ｒを用いて行った(R Development Core Team (2011)。Ｒ：統計計算のための言語と環境。統計コンピューティングのためのＲ財団、ウィーン、オーストリア。ISBN 3-900051-07-0,R-project[dot]org）で、オンラインで入手可能。．図５の説明に記載のようにオッズ比を使用して急速及び低速でクリアする抗体を正しく同定することにおけるＢＶスコアの性能の評価は、ＢＶのビニング閾値＝５を決定するために使用される同じデータセットを用いて行ったので楽観的である。５分割交差検定及びＢＶスコア閾値を決定する回帰モデリングを使用する１０ｍＬ／ｋｇ／日のクリアランス閾値に対してインビトロアッセイの有用性のより保守的な評価が得られた；このアプローチは、１４．１のより控えめなオッズ比推定値を与えた（９５％信頼区間（２．４，１１３．３））。
【０１１７】
実施例７：
サルのクリアランスからのヒトのクリアランスの予測的スケーリング
以前に利用可能な８つよりもわずかに大きいデータセットを使用して、我々は、カニクイザル及びヒトにおいて測定されたクリアランス値の間に強い相関関係を確認している（図１、スピアマンの相関係数（ρ）＝０．７４）。ヒトで測定されたクリアランスはカニクイザルにおいて測定されたクリアランスより約２倍遅いとする単純なスケーリングガイドラインが得られ、異常値として抗ＮＲＰ１抗体を含む。
【０１１８】
実施例８：
治療用抗体のパネルのためのカニクイザルにおける構造変異体とクリアランスの特徴付け
前臨床開発の通常の過程において、カニクイザルにおける薬物動態データが、５２のヒト化及びヒト抗体用に収集された。これらの抗体の優勢なアイソタイプは、ＩｇＧ１、カッパ（ｎ＝４６）である。この抗体パネルはまた４つのＩｇＧ１、ラムダ、及び２つのＩｇＧ４、カッパ抗体を含む。ＩｇＧ４抗体は、Ｓ２２８Ｐヒンジ安定化置換を組み込んでいる１７。５２抗体のうち５つは、エフェクター機能を低減するためにアグリコシル化(aglycosylated)され、１つはＡＤＣＣ活性を増加させるためにアフコシル化され、及び３つはＦｃガンマＲ結合を切断又は増加させるＦｃのアミノ酸置換を有する。これらの抗体の可変ドメインは、ヒト化（ｎ＝３２）、合成ヒト抗体ファージライブラリー１８由来（ｎ＝１６）、ヒト（ｎ＝３）、又はマウス（ｎ＝１；リツキシマブ）の何れかである。これらの抗体は、広範囲のクリアランス値を示し（図２）、１５（２９％）の抗体が１０ｍＬ／ｋｇ／日より速いクリアランスを有する。
【０１１９】
速いクリアランスは合成ライブラリーの抗体と関連しているという仮説を検討した。合成ヒト抗体ファージライブラリーに由来する抗体を選択し、インビトロ選択を介して最適化された１８。これらの大半は、必要な親和性及び効力を達成するためにそれらの相補性決定領域（ＣＤＲ）におけるアミノ酸の変化を介する親和性成熟を必要とした。ヒト化抗体の多くは、親和性又は化学的安定性を改善の何れかのために、げっ歯類配列に対してＣＤＲ置換を有するが、一般に、ヒト化抗体は、インビトロでの最適化にはほとんど供されていない。インビトロ選択に対する懸念は、インビトロで行うことができる負の選択がインビボで生じ得るよりも広範囲ではないので、それが誤ってオフターゲット相互作用を生じ得ることである。それにもかかわらず、ヒト化抗体と合成ライブラリーに由来する抗体との比較は、クリアランス値の重複範囲を示している（図３）。クリアランス値の中央値は、ヒト化抗体では６．５ｍＬ／ｋｇ／日であり、合成ファージライブラリー由来のヒト抗体では９．０ｍＬ／ｋｇ／日である。これらのデータは、合成ライブラリー抗体と速いクリアランスとの関連性についての証拠を提供していない（Ｐ＝０．２８、ウィルコクソン検定）。
【０１２０】
実施例９：
カニクイザルへの結合親和性
ＦｃＲｎ結合における変化が観察されたクリアランス値の範囲を説明することができるかどうかを試験するために、我々は、ｐＨ５．８で精製したカニクイザルのＦｃＲｎに対するこれらの抗体の結合についてのＫＤ値を決定するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いた。ＩｇＧ−ＦｃＲｎ結合は比較的弱い相互作用であることから、我々は、結合定数を決定するために、以前に説明した定常状態のアプローチ１１を使用した。２：１のＦｃＲｎ：ＩｇＧ相互作用から生じる結合活性効果は、分析用に利用可能である各々の抗体（ｎ＝４４）を固定することによって回避された。この方法で決定されたＫＤ値は、約２５０ｎＭから１５００ｎＭの範囲であった。各抗体は、アミノ基を介するランダムなカップリングを用いて別々に固定化し、センサーチップ表面上の配向に付随する不確実性を有するため、ＫＤ値の範囲は予想外ではなかった。ペルツズマブのＫＤの複数回（ｎ＝７）の測定では、９４０±１４０（Ｓ．Ｄ．）ｎＭの平均値を示した。我々は、ＦｃＲｎの親和性を増加させることが知られたＦｃ変異体の結合作用（データ非表示）を再現できたので、本測定方法は、ＦｃＲｎの親和性の変化を検出することができる１９。幾つかの抗体について観察された速いクリアランスは、カニクイザルＦｃＲｎに対する低ｐＨ結合親和性の改変に起因するものではない（図４）。実際に、ほぼ同一のＦｃＲｎ結合親和性を持つ複数の抗体の比較では、クリアランスの値に約３０倍の値域を与えた。別々の実験（データ非表示）では、ｐＨ７．４でこれらの抗体からのカニクイザルのＦｃＲｎの解離速度は高速であり、試験されたパネル全体で同等であることを示した。これらの実験は、観察された高速クリアランスについての説明として、幾つかの抗体のリサイクル経路の変化を除外することは不十分であるが、ｐＨ５．８での結合親和性又は中性ｐＨでの解離動態における有意な変化が高速クリアランスに大きな役割を果たしているという可能性は低いように見える。
【０１２１】
実施例１０：
高速のクリアランスのリスク軽減のためのインビトロアッセイの開発
少数の抗体について観察された高速クリアランスは、特異的１４，１５又は非特異的１３、１６オフターゲット結合に関連している。抗体の産生及び最適化の最中に、我々のパネル中の抗体のほとんどを、密接に関連する抗原ホモログへの結合の欠如についてスクリーニングした。加えて、ファージディスプレイを介して由来する抗体の多くは、非特異的結合の濃縮を防ぐために添加剤の存在下で選択した２０。Ｗｕら１３によって示されるように、限られた種の抗原によるＥＬＩＳＡによるスクリーニングは、インビボでの挙動に影響し得る特異的又は非特異的オフターゲット結合の種類を検出できない場合がある。従って、我々は、高速クリアランスを示す可能性が高い候補抗体を同定するために有用なインビトロアッセイを開発しようとした。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗原として特異的膜結合型標的を有するインタクトなＢＶ粒子を用いる実験の過程で２１、我々は、幾つかの抗体は、標的を発現しないバキュロウイルス粒子に結合することを述べた。これらの抗体の多くはまた、ＦＡＣＳにより、非発現性ヒト２９３細胞に非特異的に結合することが示された（データ非表示）。しかし、２９３細胞上の幾つかの同族抗原の発現は、非特異的結合から特異的結合を区別することを困難にした。
【０１２２】
図２のパネルから選択された１５の抗体の試験セットに対する初回スクリーニングは、高速にクリアする抗体は、バキュロウイルス（ＢＶ）ＥＬＩＳＡに非特異的に結合したことを示唆した。その後、４５抗体の大きな群をアッセイで試験した。かなりのばらつきがあるものの、インビトロアッセイにおいて、より高いスコアは、カニクイザルにおける高速クリアランスと関連している（図５）。「高速」クリアランスの閾値＞１０ｍＬ／ｋｇ／日及び正規化されたＢＶスコア＞５は、これらのデータを定量化するために有用である。１０ｍＬ／ｋｇ／日のクリアランス値は、サルにおいて１２のヒトＩｇＧ１抗体について決定された平均値からの１標準偏差（６．５±２．９）以上である。これらの閾値により、９つの抗体が、サルで高速クリアランスを有するものとして正しく同定され（「真の陽性」）、３つだけが「偽陽性」−正規化されたＢＶのスコア＞５を示すクリアランススコア＜１０ｍＬ／ｋｇ／日を有する抗体−であった。４つの抗体は、１０ｍＬ／ｋｇ／日よりも大きなクリアランス及びＢＶスコア＜５を有する、「偽陰性」である。残りの２９の抗体は、「真の陰性」として正しく同定される。
【０１２３】
データセット（ｎ＝１６）は小さいが、ヒトにおける高速クリアランスのリスクの増加はまた、高いＢＶスコアと関連している（図５（ｂ）、スピアマンのρ＝０．８３）。５ｍＬ／ｋｇ／日よりも高速なクリアランスを有する５つの抗体がアッセイで正しく同定されている。注目すべきは、カニクイザルにおいてクリアランス＜１０ｍＬ／ｋｇ／日を有する抗ＮＲＰ１抗体は、ＢＶのＥＬＩＳＡにおけるヒトクリアランスについて真の陽性として検出される。ヒトでクリアランス＞５ｍＬ／ｋｇ／日、カニクイザルでクリアランス＞１０ｍＬ／ｋｇ／日を有する一抗体は、本アッセイで同定されていない。残りの１０の抗体は、ヒトにおいて遅いクリアランスを有するとして正しく分類された。
【０１２４】
我々は、抗体４７の更なる操作を通じて、候補選択の補助を支援するために、ＢＶ ＥＬＩＳＡが将来を見越して使用することができるかどうかを試験した。これは、親和性改善のため、及び潜在的な配列のライアビリィティ(sequence liabilities)を除去するための両方のために、ＣＤＲ中にアミノ酸の変化を有するヒト化抗体である。カニクイザルは、抗体４７の非標的結合性種である。再現可能な組織染色は、サルでは抗体４７によって観察されなかったが、カニクイザルにおいては２０．２ｍＬ／ｋｇ／日のクリアランスが、この抗体について決定された。２つの親和性成熟の変化及び重鎖ＣＤＲの一方の潜在的なＮ結合型グリコシル化部位を除去するアミノ酸変化を保持した抗体４７の変異体（抗体４７ｂ）は、ＢＶ ＥＬＩＳＡにおいて結合の低下を示した（表２）。抗体４７ｃは潜在的なＮ結合型グリコシル化部位を除去するアミノ酸変化のみを保持し、また、ＢＶ結合を減少させていた。別の実験では、抗体４７のＢＶ結合に対する大きな寄与は、潜在的なＡｓｐ−Ｇｌｙ異性化部位を除去するためのＶＬ−Ｄ２７ｃＳ改変によって行われることが示された。抗体４７ｂと４７ｃは、カニクイザルにおける抗体４７と比較してより遅いクリアランスを持っていた（表２）。
【０１２５】
実施例１１：
抗体のこのパネルについて測定されたカニクイザルにおけるクリアランス値の広範な分布、並びに１５の抗体で観察された高速クリアランス（＞１０ｍＬ／ｋｇ／日）は予想外であった。５２の抗体のうち４０が同一のヒトＩｇＧ１のＦｃ配列を有しているため、より高速なクリアランスはＦｃＲｎとの相互作用の変化とは関連されないことが予想された。実際、ｐＨ５．８でのＦｃＲｎ結合について測定されたＫＤは７倍の値域にわたって変化するが、これはクリアランス値の傾向とは関連していない。ｐＨ５．８でのＦｃＲｎの親和性の比較的大きな増加がクリアランスの緩やかな改善へと導くとすれば１９、ここで測定されるＦｃＲｎの親和性の僅かな相違がクリアランスに影響を与えないことは驚くべきことではない。試験した抗体の全ては、中性ｐＨで、ＦｃＲｎから同等の迅速な放出を示した。Ｗａｎｇらによって報告された結果とは対照的に２２、我々は、中性ｐＨでのＦｃＲｎの解離動態において抗体のＦａｂ部分への影響とクリアランスとの間の関連を検出していない。我々の研究は、結合に対する結合活性効果を最小にするために、より大きな抗体のパネルとＳＰＲ実験の異なる配向を使用した。
【０１２６】
我々のパネル中で抗体間の最大の差異は、可変ドメイン、とりわけＣＤＲであることを考えると、これらのドメインの組成物の違いは、クリアランスの挙動のばらつきに寄与する可能性がある。他のグループは、標的抗原に対する結合親和性の差異に関連していないＣＤＲ配列の変化に関連付けられるクリアランスの影響を観察した１３、１６。我々は、クリアランスは、インタクトな抗体の等電点（ｐＩ）又は疎水性と関連していることを見いださなかった（付録の図１Ａ、Ｂ）。Igawaらは２３、以前に、カニクイザルにおけるヒトＩｇＧ１抗体のクリアランスは、より低いｐＩをもたらす可変領域の変化によって低減することができることを示した。この効果は、有意な抗原依存性クリアランスが作動している用量で観察された。そのメカニズムは、非ＦｃＲｎ依存性であると推定された。抗体の大きなパネルの比較のために、半減期がＦｃＲｎ依存性で、クリアランス速度がｐＩに依存しない用量で収集された薬物動態データを用いた。この結論への注意点は、この分析において抗体の大部分はｐＩ値が比較的狭い範囲に集中しており（７．５〜９．５）、よってより広範囲のｐＩを試験した場合に、ある傾向が恐らく観察されるであろうということである。加えて、我々は、クリアランスは抗体のＦｖに対して計算される全電荷と相関していないことを見いだしている（付録の図１Ｃ）。従って、高速クリアランスをもたらす抗体の物理化学的性質は、配列比較のみからは容易には認識されず、より詳細な構造−機能解析を必要とする場合がある。
【０１２７】
本明細書において、我々は、非特異的結合の単純なアッセイを、ヒトとカニクイザルの両方で高速なクリアランスを有するというリスクが増加した抗体を同定するために使用することができることを示す。このアッセイは、バキュロウイルス感染昆虫細胞から調製されたウイルス粒子への抗体の結合に基づいて、単純なＥＬＩＳＡ形式を用い、ハイスループット様式で適用することができる。薬物動態データは、哺乳動物種で決定されるため、哺乳類細胞への非特異的結合に基づくアッセイは、高速クリアランスとの強い相関を示すことが期待されている可能性がある。予備的結果は、ＦＡＣＳにより検出されるヒト２９３細胞への非特異的結合と高速クリアランスとの間の相関を示したが、抗体のこのコレクションの同族抗原の多くが２９３細胞に発現しているので、このアッセイの広範な適用は除外された。我々が開発したＢＶ ＥＬＩＳＡアッセイは、この標的−発現の制限を受けない。両方のアッセイを用いて評価することができる抗体について、非特異的結合における同様の傾向が観察される（データ非表示）。出芽バキュロウイルスビリオンは、感染した細胞表面を模倣する安定なナノ粒子であり、リン脂質、炭水化物、糖タンパク質、細胞外マトリックス及び核酸の複合混合物並びにウイルスキャプシドを提示する２４、２５。抗原は、恐らく、タンパク質、膜及び核酸を含む一部の昆虫細胞の破片をも含んでいる。治療用抗体の特異的標的を欠く一方でヒト細胞及び組織と同じ全体的な生化学的複雑さを維持するその混合物は、異なる種の相互作用、例えば異なる抗体における疎水性対静電相互作用を検出することができるため、非特異的結合アッセイにおいて利点を有している。カニクイザルにおける抗体クリアランスとＢＶ粒子への結合との関連への重要な注意点は、抗体４７以外で、ＢＶ−粒子の結合を系統的に変化させた設計実験よりもむしろ通常の前臨床開発を通して収集されたデータに基づいた観察である。クリアランス値は、可変ＰＫアッセイタイプを使用して、広範に可変させる用量レベルによる別々の研究から得られた。しかし、評価を行うために十分なデータが利用可能であった場合、カニクイザルにおける高速クリアランス及びＢＶ結合との間の関連性は、用量レベル、アッセイのタイプ及び抗体源及び標的タイプにわたって持続することが見いだされた。
【０１２８】
高速クリアランスのリスクは、抗体を操作するの間の非特異的結合の導入を最小限に抑えるためのアッセイを用いることによって低減することができる。抗体４７において、電荷の減少及び疎水性の増加の両方が、ＢＶ粒子への非特異的結合の増加と関連していた。非特異的結合が減少した変異体は、より遅いクリアランスを持っていた。ＢＶのＥＬＩＳＡは、特定のオフターゲット効果の信頼性のあるアッセイであるとは期待されていない。例えば、以前マウスにおいて、補体タンパク質１４への意図せぬ特異的に結合に起因する高速クリアランスを有することが示されたヒト化抗体は、ＢＶ粒子への検出可能な結合を有しない（図示せず）。我々の経験では、特異的なオフターゲット効果は、より広範なオフターゲット結合を有する抗体よりも一般的ではない。更に、特異的オフターゲット効果は、通常、高速クリアランスのメカニズムの研究を介して同定することができる。
【０１２９】
ＢＶ粒子のＥＬＩＳＡは、カニクイザルにおいて急速なクリアランスを有し、偽陽性は少数である、全てではないがほとんどの抗体を検出する。従って、そのアッセイは、ＮＨＰ ＰＫ実験で試験する必要がある治療用抗体の数を減らすためのスクリーニングツールとして、及びカニクイザルにおいてクリアランスを一貫して予測するアッセイとして考慮されるべきである。小さいがゼロでない偽陽性の割合が許容可能であるように、ターゲットに対して同様の効力を持つ複数の候補が利用可能な場合、このアッセイは、高速クリアランスのリスクを最小限にするための費用効率が高いツールである。偽陰性結果の根拠を同定することができた場合、ＢＶのＥＬＩＳＡアッセイを高めることができる。哺乳動物細胞からの膜に比べて、昆虫細胞膜のリン脂質組成物は、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、及びホスファチジルエタノールアミンに富み、酸性リン脂質ホスファチジルセリン、コレステロール、グリコ−及びスフィンゴ脂質の量が少ない２４。これらの抗体のより高速なクリアランスが、哺乳動物の膜上の酸性リン脂質への結合に関連している場合、中性リン脂質の量が多いことは、アッセイでの偽陰性を説明し得る。４つの偽陰性抗体のうち２つは、Ｆｖのドメインに対して計算される高い正味の正電荷を持っている。ＢＶ粒子のリン脂質組成物は、増殖条件又は細胞株の違いを通じて操作することができるかどうかを、非特異的結合アッセイの正確さの改善を同時に伴って、探求することは興味深いであろう。これらの研究は、許容可能な薬物動態学的挙動を維持するために、抗体操作の間に回避されるべき特徴を更に明らかにすることができる。
【０１３０】
実施例１２：
抗体クリアランスの最適化
この実施例において、我々は、更なる操作を通じて、候補選択の補助を支援するために、ＢＶ ＥＬＩＳＡが将来を見越して使用することができるかどうかを試験した。
【０１３１】
抗体４７は、親和性改善のため、及び潜在的な配列のライアビリィティ(sequence liabilities)を除去するための両方のために、ＣＤＲ中にアミノ酸の変化を有するヒト化抗体である。カニクイザルは、抗体４７の非標的結合性種である。再現可能な組織染色は、サルでは抗体４７によって観察されなかったが、カニクイザルにおいては２０．２ｍＬ／ｋｇ／日のクリアランスが、この抗体について決定された。２つの親和性成熟の変化及び重鎖ＣＤＲの一方の潜在的なＮ結合型グリコシル化部位を除去するアミノ酸変化を保持した抗体４７の変異体（抗体４７ｂ）は、ＢＶ ＥＬＩＳＡにおいて結合の低下を示した（表１）。抗体４７ｃは潜在的なＮ結合型グリコシル化部位を除去するアミノ酸変化のみを保持し、また、ＢＶ結合を減少させていた。別の実験では、抗体４７のＢＶ結合に対する大きな寄与は、潜在的なＡｓｐ−Ｇｌｙ異性化部位を除去するための改変によって行われることが示された。抗体４７ｂと４７ｃは、カニクイザルにおける抗体４７と比較してより遅いクリアランスを持っていた（表１）。
【０１３２】
従って、このアッセイは、クリアランスの迅速な評価として使用することができ、親抗体に比べてクリアランスが低下した臨床的に関連する抗体の開発に役立つ。
【０１３３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月27日(2019.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
従って、このアッセイは、クリアランスの迅速な評価として使用することができ、親抗体に比べてクリアランスが低下した臨床的に関連する抗体の開発に役立つ。
＜本発明の更なる実施態様＞
［実施態様１］
バキュロウイルス粒子（ＢＶ）に治療薬を接触させ、ＢＶへの治療薬の結合のレベルを測定し、結合のレベルに基づいて治療薬についてＢＶスコアを計算する工程を含む、治療薬が、カニクイザル、ヒト又はカニクイザルにおいて望ましいクリアランス速度を有するかどうかを予測する方法であって、所定の閾値を超えるＢＶスコアが高速なクリアランス速度の可能性の増加の指標であり、所定の閾値未満のＢＶスコアが望ましいクリアランス速度の可能性の増加の指標である、方法。 
［実施態様２］ 
治療薬への結合の前にＢＶがマイクロタイタープレートに結合される、実施態様１に記載の方法。 
［実施態様３］ 
治療薬が検出薬で標識される、実施態様１又は２の何れか一に記載の方法。 
［実施態様４］ 
検出薬を含む第二の薬剤を治療薬に結合させる工程を更に含む、実施態様１から３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様５］ 
検出薬からのシグナルが測定される、実施態様３又は４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様６］ 
ヒトにおいて、１０ｍＬ／Ｋｇ／日を超えるクリアランスに相関するＢＶスコアは高速なクリアランス速度と見なされる、実施態様１から５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７］ 
ＢＶスコアの所定の閾値が５である、実施態様６に記載の方法。 
［実施態様８］ 
治療薬がポリペプチドを含む、実施態様１に記載の方法。 
［実施態様９］ 
治療薬が抗体又はイムノアドヘシンを含む、実施態様１に記載の方法。 
［実施態様１０］ 
最初の二工程がＥＬＩＳＡアッセイに組み込まれる、実施態様１に記載の方法。 
［実施態様１１］ 
治療薬が望ましいクリアランス速度を有するかどうかを決定するためのキットであって、該キットが、バキュロウイルス粒子及びヒト抗体に結合する抗体を含む、キット。 
［実施態様１２］ 
キットがマイクロタイタープレートを更に含む、実施態様１１に記載のキット。 
［実施態様１３］ 
ヒト抗体に結合する抗体は、ヒト抗体のＦｃ領域に結合する、実施態様１１に記載のキット。 
［実施態様１４］ 
ＢＶが、固体支持体に結合される、実施態様１に記載の方法。 
［実施態様１５］ 
個体支持体がマイクロタイタープレートである、実施態様１４に記載の方法。 
［実施態様１６］ 
バキュロウイルス粒子の非存在下での治療薬の結合が、正規化に使用するための値を導出するために測定される、実施態様１５に記載の方法。 
［実施態様１７］ 
界面活性剤が任意の工程で存在する、実施態様１に記載の方法。 
［実施態様１８］ 
治療薬が望ましいクリアランス速度を有するかどうかを決定するためのキットであって、該キットが、バキュロウイルス粒子及びＥＬＩＳＡアッセイにおけるインストラクションを含む、キット。 
［実施態様１９］ 
ヒトにおける望ましいクリアランス速度を有する治療薬を選択すること及び宿主細胞中で治療薬を発現する工程を含む、治療薬を作製する方法。 
［実施態様２０］ 
宿主細胞により発現される治療薬を回収する工程を更に含む方法。 
［実施態様２１］ 
治療薬の選択は、実施態様１に記載の方法により達成される、実施態様１９又は実施態様２０に記載の方法。
【外国語明細書】
2020072666000001.pdf