(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト間葉系幹細胞の品質評価方法、ヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法、増殖の早いヒト間葉系幹細胞の細胞集団、並びに、増殖の早いヒト間葉系幹細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体を得ること。【解決手段】ヒト間葉系幹細胞の品質評価方法は、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、増殖の早いヒト間葉系幹細胞を分離、選別及び培養し、同分離、選別及び培養した細胞集団においてＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞の存在比率を定量して各細胞集団の合否判定を行う、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト間葉系幹細胞の品質評価方法であって、
ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、増殖の早いヒト間葉系幹細胞を分離、選別及び培養し、
同分離、選別及び培養した細胞集団においてＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞の存在比率を定量して各細胞集団の合否判定を行うヒト間葉系幹細胞の品質評価方法。
【請求項２】
抗Ｒｏｒ２モノクロナール抗体または抗Ｆｚｄ５モノクロナール抗体を用いてＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞を定量する請求項１に記載のヒト間葉系幹細胞の品質評価方法。
【請求項３】
定量的ＰＣＲを用いてＲｏｒ２のｍＲＮＡを発現している細胞を定量する請求項２に記載のヒト間葉系幹細胞の品質評価方法。
【請求項４】
免疫染色によりＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞を定量する請求項２に記載のヒト間葉系幹細胞の品質評価方法。
【請求項５】
ヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法であって、
ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、増殖の早いヒト間葉系幹細胞を分離、選別及び培養し、
同分離、選別及び培養した細胞集団においてＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞の存在比率を定量して各細胞集団の合否判定を行い、合格の細胞集団のみを選別するヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法。
【請求項６】
抗Ｒｏｒ２モノクロナール抗体または抗Ｆｚｄ５モノクロナール抗体を用いてＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞を定量する請求項５に記載のヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法。
【請求項７】
定量的ＰＣＲを用いてＲｏｒ２のｍＲＮＡを発現している細胞を定量する請求項６に記載のヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法。
【請求項８】
免疫染色によりＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞を定量する請求項６に記載のヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法。
【請求項９】
前記増殖の早いヒト間葉系幹細胞として分離、選別及び培養する工程が、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、抗ＬＮＧＦＲモノクロナール抗体および抗Ｔｈｙ１モノクロナール抗体で染色した細胞をフローサイトメトリー（以下、「ＦＣＭ」）で解析し、ＬＮＧＦＲ Ｔｈｙ１共陽性細胞をセルソーティングする工程を含んでいる請求項５に記載のヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法。
【請求項１０】
前記増殖の早いヒト間葉系幹細胞として分離、選別及び培養する工程が、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、抗Ｒｏｒ２モノクロナール抗体で染色した細胞をＦＣＭで解析し、Ｒｏｒ２陽性細胞をセルソーティングする工程を含んでいる請求項５に記載のヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法。
【請求項１１】
骨髄、その他の各組織由来細胞から直接前記細胞集団を調製する工程を包含する請求項９または１０記載のヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法。
【請求項１２】
骨髄、その他の各組織由来細胞を付着培養することにより、前記細胞集団を調製する工程を包含する請求項１０記載のヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法。
【請求項１３】
前記セルソーティングする工程が、培養プレートのウェルに陽性の各細胞を播種するものであり、その後さらに、培養によりコンフルエントとなったウェルの細胞を分離及び選別する工程を包含する請求項９または１０記載のヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法。
【請求項１４】
ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、増殖の早いヒト間葉系幹細胞を分離、選別及び培養し、
同分離、選別及び培養した細胞集団においてＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞の存在比率を定量して各細胞集団の合否判定を行い、合格の細胞集団のみを選別した増殖の早いヒト間葉系幹細胞の細胞集団。
【請求項１５】
ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、抗ＬＮＧＦＲモノクロナール抗体および抗Ｔｈｙ１モノクロナール抗体で染色した細胞をＦＣＭで解析し、ＬＮＧＦＲ Ｔｈｙ１共陽性細胞をセルソーティングし、培養プレートのウェルに同共陽性の各細胞を播種し、培養によりコンフルエントとなったウェルの細胞を分離及び選別した後、前記定量を行うことにより得られた請求項１４記載の増殖の早いヒト間葉系幹細胞の細胞集団。
【請求項１６】
ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、抗Ｒｏｒ２モノクロナール抗体で染色した細胞をＦＣＭで解析し、Ｒｏｒ２陽性細胞をセルソーティングし、培養プレートのウェルに同陽性の各細胞を播種し、培養によりコンフルエントとなったウェルの細胞を分離及び選別した後、前記定量を行うことにより得られた請求項１４記載の増殖の早いヒト間葉系幹細胞の細胞集団。
【請求項１７】
抗Ｒｏｒ２モノクローナル抗体である増殖の早いヒト間葉系幹細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項１８】
クローン名が７Ｃ９である請求項１７記載の増殖の早いヒト間葉系幹細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項１９】
抗Ｆｚｄ５モノクローナル抗体である増殖の早いヒト間葉系幹細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項２０】
クローン名が６Ｆ５である請求項１９記載の増殖の早いヒト間葉系幹細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト間葉系幹細胞の品質評価方法、ヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法、増殖の早いヒト間葉系幹細胞の細胞集団、並びに、増殖の早いヒト間葉系幹細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞 （Mesenchymal Stem Cells ： ＭＳＣ） は細胞採取に伴う倫理的問題が少なく、骨・軟骨・脂肪などへの多様な分化能を持つことから、造血幹細胞に次いで臨床応用が盛んに行われている体性幹細胞の一つである。後述する比較的簡単な手技により分離できることから、主に試験管内で軟骨・骨などへ分化誘導後に局所へ移植するなど、バイオマテリアルの材料として広く用いられている。
ヒト間葉系幹細胞の分離培養方法としては、非特許文献１で報告されている培養法が一般的に用いられる。しかし従来法で得た細胞集団には劣化した（分化・増殖・遊走能を失った）夾雑細胞が多数混入しており、この夾雑物が本来はポテンシャルを持つはずの細胞に影響し、さらなる品質の劣化をまねく要因となる。
かかる従来の実情に鑑みて、増殖能・分化能・遊走能が従来よりも優れたヒト間葉系幹細胞の分離培養方法を確立した（非特許文献２、３、特許文献１）。これらの非特許文献２、３及び特許文献１によれば、CD271（ＬＮＧＦＲ）とCD90（Ｔｈｙ１）に対する抗体を用い、ヒト骨髄、胎盤絨毛膜、脂肪組織、末梢血、歯髄などよりＬＮＧＦＲ Ｔｈｙ１共陽性細胞を選別することでヒト間葉系幹細胞を濃縮することができる。
【０００３】
また選別したＬＮＧＦＲ Ｔｈｙ１共陽性細胞を単一細胞（クローン）培養し、増殖が速いロット（ＲＥＣ: Rapidly Expanding Clone）を選択することで、増殖能・分化能・遊走能にすぐれた高純度ヒト間葉系幹細胞を得ることが可能となった。
同方法で得た高純度ヒト間葉系幹細胞（ＲＥＣ）は従来法で得た間葉系幹細胞と比較し、増殖能・分化能・遊走能全てが１０００倍以上の能力を持っていた。
上記ヒト間葉系幹細胞の分離培養方法の特徴によれば、単一細胞培養を行うことで夾雑細胞を含まない条件が形成され、細胞品質を維持した拡大培養が可能となる。特に遊走能を保持しているため、経静脈内投与が可能となり、骨・軟骨形成不全症等の重篤な全身性疾患への応用が期待できるようになった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−６０８４０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Pittenger, M.F., Mackay, A.M., Beck, S.C., Jaiswal, R.K., Douglas, R., Mosca, J.D., Moorman, M.A., Simonetti, D.W., Craig, S., and Marshak, D.R. (1999). Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284, 143-147.
【非特許文献２】Mabuchi Y, Morikawa S, Harada S, Niibe K, Suzuki S, Renault-Mihara F, Houlihan DD, Akazawa C, Okano H, Matsuzaki Y. (2013). LNGFR+THY-1+VCAM-1hi+ Cells Reveal Functionally Distinct Subpopulations in Mesenchymal Stem Cells. Stem Cell Reports 1, 152-165.
【非特許文献３】CGHアレイデータ  Gene Expression Omnibus (GEO) (accession number: GSE34484)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
不死化細胞株とは異なり、ＲＥＣといえども継代培養を長期に繰り返すことによる細胞品質の劣化は避けられないが、現時点では品質劣化の明確な指標が存在しない。
【０００７】
本発明では、ヒト間葉系幹細胞の品質評価方法、ヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法、増殖の早いヒト間葉系幹細胞の細胞集団、並びに、増殖の早いヒト間葉系幹細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供することを目的とする。
【０００８】
また、ＲＥＣとそれ以外の劣化したクローン（ＭＥＣ: Moderately Expanding Clone, ＳＥＣ: Slowly Expanding Clone）とで遺伝子発現解析を行い、ＲＥＣ特異的遺伝子を選別した。さらに特異的遺伝子が発現する蛋白を認識する新規モノクローナル抗体の作製を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明に係るヒト間葉系幹細胞の品質評価方法の特徴は、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、増殖の早いヒト間葉系幹細胞を分離、選別及び培養し、同分離、選別及び培養した細胞集団においてＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞（の存在比率）を定量して各細胞集団の合否判定を行うことにある。同構成によれば、Ｒｏｒ２またはＦｚｄ５は、単独発現によりＲＥＣであるか否かを判定でき、培養細胞も利用可能であるため、判定をより簡便に行うことができる。なお、ＬＮＧＦＲは培養細胞ではＲＥＣであっても発現せず、Ｔｈｙ１は単独ではＲＥＣ判定不能である。
【００１０】
上記構成において、抗Ｒｏｒ２モノクローナル抗体または抗Ｆｚｄ５モノクローナル抗体を用いてＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞を定量するとよい。この場合、定量的ＰＣＲを用いてＲｏｒ２のｍＲＮＡ発現を定量してもよいし、免疫染色によりＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞を定量してもよい。ただしＲｏｒ２は細胞外発現であるため、ＦＭＣの適用が容易であるが、Ｆｚｄ５は細胞内発現であるため、免疫染色の目視評価等が適切である。
【００１１】
一方、上記目的を達成するため、ヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法の特徴は、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、増殖の早いヒト間葉系幹細胞を分離、選別及び培養し、同分離、選別及び培養した細胞集団においてＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞（の存在比率）を定量して各細胞集団の合否判定を行い、合格の細胞集団のみを選別することにある。
【００１２】
同構成において、抗Ｒｏｒ２モノクローナル抗体または抗Ｆｚｄ５モノクローナル抗体を用いてＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞を定量するとよい。ここで、定量的ＰＣＲを用いてＲｏｒ２のｍＲＮＡを発現している細胞を定量してもよいし、免疫染色によりＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞を定量してもよい。
【００１３】
また、前記増殖の早いヒト間葉系幹細胞として分離、選別及び培養する工程が、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、抗ＬＮＧＦＲモノクローナル抗体および抗Ｔｈｙ１モノクローナル抗体で染色した細胞をフローサイトメトリー（以下、「ＦＣＭ」）で解析し、ＬＮＧＦＲ Ｔｈｙ１共陽性細胞をセルソーティングする工程を含んでいてもよい。これに限らず、前記増殖の早いヒト間葉系幹細胞として分離、選別及び培養する工程が、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、抗Ｒｏｒ２モノクローナル抗体で染色した細胞をＦＣＭで解析し、Ｒｏｒ２陽性細胞をセルソーティングする工程を含んでいてもよい。
【００１４】
さらに、上記各方法において、骨髄を始めとする各組織由来細胞から直接前記細胞集団を調製する工程を包含してもよい。一方、Ｒｏｒ２陽性細胞をセルソーティングする工程を含む方法では、骨髄をはじめとする組織由来細胞を付着培養することにより、前記細胞集団を調製する工程を包含してもよい。ＲＥＣの培養細胞はＬＮＧＦＲ陽性とならない一方、Ｒｏｒ２陽性となるからである。
【００１５】
上記方法において、前記セルソーティングする工程が、培養プレートのウェルに陽性の各細胞を播種するものであり、その後さらに、培養によりコンフルエントとなったウェルの細胞を分離及び選別する工程を包含させてもよい。
【００１６】
上記目的を達成するため、増殖の早いヒト間葉系幹細胞の細胞集団の特徴は、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、増殖の早いヒト間葉系幹細胞を分離、選別及び培養し、同分離、選別及び培養した細胞集団においてＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞（の存在比率）を定量して各細胞集団の合否判定を行い、合格の細胞集団のみを選別することにある。
【００１７】
同特徴において、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、抗ＬＮＧＦＲモノクローナル抗体および抗Ｔｈｙ１モノクローナル抗体で染色した細胞をＦＣＭで解析し、ＬＮＧＦＲ Ｔｈｙ１共陽性細胞をセルソーティングし、培養プレートのウェルに同共陽性の各細胞を播種し、培養によりコンフルエントとなったウェルの細胞を分離及び選別した後、前記定量を行ってもよい。
【００１８】
一方、同特徴において、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、抗Ｒｏｒ２モノクローナル抗体で染色した細胞をＦＣＭで解析し、Ｒｏｒ２陽性細胞をセルソーティングし、培養プレートのウェルに同陽性の各細胞を播種し、培養によりコンフルエントとなったウェルの細胞を分離及び選別した後、前記定量を行ってもよい。
【００１９】
上記本発明に係る目的を達成するため、本発明に係る新規なモノクローナル抗体は、抗Ｒｏｒ２モノクローナル抗体であり、クローン名が７Ｃ９である。また、本発明に係る他の新規なモノクローナル抗体は、抗Ｆｚｄ５モノクローナル抗体であり、クローン名が６Ｆ５である。
【発明の効果】
【００２０】
特定した２つの遺伝子（Ｆｚｄ５, Ｒｏｒ２：詳細は後述）がコードする蛋白の発現はＲＥＣに特異的であり、品質が劣化した細胞集団では発現が認められない。またＲＥＣの未分化状態維持に必須の遺伝子であり、１）発現阻害により細胞性能の劣化が誘導される、２）遺伝子の強制発現により未分化状態が延長する、などの結果から単なるバイオマーカーではなく、細胞機能に密接に関与し、細胞性能を担保する有効な指標である。
【００２１】
このように、本発明によれば、ヒト間葉系幹細胞の品質評価方法、ヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法、増殖の早いヒト間葉系幹細胞の細胞集団、並びに、増殖の早いヒト間葉系幹細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供することが可能となった。
【００２２】
本発明の他の目的、構成及び効果については、以下の発明の実施の形態の項から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】高品質間葉系幹細胞（ＲＥＣ）の選別、分離、培養及び品質評価工程を示す図である。
【図２】ＲＥＣ, ＭＥＣ, ＳＥＣを様々なパラメータで比較した結果である。
【図３】Ｒｏｒ２, Ｆｚｄ５がＲＥＣ特異的に発現することを示す図とグラフである。
【図４】Ｆｚｄ５の阻害がＲＥＣの細胞性質の劣化を誘導することを示す図とグラフである。
【図５】Ｆｚｄ５の強制発現がＲＥＣの未分化性を誘導することを示す写真とグラフである。
【図６】新規に作製した抗Ｆｚｄ５モノクローナル抗体の染色性を示す写真とグラフである。
【図７】新規に作製した抗Ｒｏｒ２モノクローナル抗体の染色性を示す写真と図である。
【図８】ＲＥＣ特異的抗体を用いた、培養ＭＳＣの品質評価を行う模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、図面を参照しながら、ＲＥＣの選択、分離及び培養の工程の概要について説明し、続いて、各工程の趣旨と詳細について説明する。本発明では、工程１でＲＥＣの選択、分離及び培養を行い、工程２で培養されたＲＥＣの評価を行う。工程の組み合わせを表１に例示するが、「プロセス評価欄」で「不可」とされているもの以外は実施しうる。以下、プロセス番号Ｐ１，Ｐ２のものをまず例示する。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
［工程１］  図１に単クローン培養法によるＲＥＣ分離工程を例示する。
１）ヒト骨髄（または脂肪・胎盤絨毛膜）より単核細胞を調製し、骨髄単核細胞を抗ＬＮＧＦＲ、抗Ｔｈｙ１で染色する（ＬＮＧＦＲ Ｔｈｙ１共陽性細胞をＬＴ細胞とする。）。
２）フローサイトメトリー（ＦＣＭ、セルソータ）を用い、ＬＮＧＦＲ陽性・Ｔｈｙ１陽性細胞を９６穴培養プレートにクローンソート（１ウェルに細胞１個ずつ播種すること、表１で「単一」と表記）を行う。
なお、抗ＣＤ１０６モノクローナル抗体を加え、ＬＮＧＦＲ陽性・Ｔｈｙ１陽性かつＣＤ１０６強陽性の細胞をクローンソートしてもよい。
３）単一細胞培養２週間後に培養プレートを顕微鏡下で撮影し、コンフレントになったウェルを選別し、各ウェルに含まれる細胞をＲＥＣ（Rapidly Expanding Cells）とする。遅れて増殖しているウェルＭＥＣ/ＳＥＣ（Moderately/Slowly Expanding Cells）は破棄する。
４）ＲＥＣとして選別した各ウェルから細胞をウェル毎に別々に回収する。１ウェルから回収したＲＥＣを１ロットとする。
【００２７】
［工程２］  図１に、さらにＲＥＣマーカー（抗Ｒｏｒ２・抗Ｆｚｄ５）による培養細胞の評価を示す。
１）９６穴プレートから回収したＲＥＣを各ウェル毎に培養皿または培養フラスコに移入し、コンフレントになるまで培養する（拡大培養）。
２）拡大培養後、全ロットから付着増殖した細胞を回収し、各ロットの一部 (１−３×１０3個程度)の細胞をとりわけて、ＲＥＣマーカー（抗Ｒｏｒ２・抗Ｆｚｄ５）に対するモノクローナル抗体で単一染色を行う。
３）ＲＥＣマーカー陽性細胞をフローサイトメトリーで解析し、回収細胞におけるＲＥＣマーカー陽性細胞の比率を求める（定量的ＰＣＲを用いてＲｏｒ２のｍＲＮＡ発現を定量してもよいし、顕微鏡により同比率をマニュアルにより求めてもよい）。
４）上記陽性比率が一定値（例えば６５％）以上のロット（細胞集団）を合格とする。
５）合格ロットの細胞を凍結バイアルに封入し液体窒素中で保存する。
６）凍結細胞したものを高品質ヒト間葉系幹細胞（製品）とする。
７）ユーザーはバイアルに入った細胞を融解後、培養皿またはフラスコ上で拡大培養を行うことで、最終的に１×１０10以上の高純度間葉系幹細胞を安定して使用することが可能である。
【００２８】
上記において、ＬＴ細胞をクローンソーティングする代わりに、Ｒｏｒ２陽性細胞をクローンソーティングしてもよい（表１、Ｐ６，７）。また、ＬＴ細胞、Ｒｏｒ２陽性細胞を選定し、９６穴培養プレートの各ウェルに複数個播種してもよい（表１で「複数」と表記、Ｐ５，９，１４）が、この場合は、クローンソートよりも純度が低下する。なお、コンフレントとは培養容器表面の９０％以上を培養細胞が覆っている状態である。また、セミコンフレントとは培養容器表面の７０−８０％を培養細胞が覆っている状態である。使用する培養器具のサイズおよび種類は細胞の増殖速度に応じ適宜変更可能である。
【００２９】
上記実施形態では、骨髄を始めとする各組織由来細胞から直接前記細胞集団を調製したが、Ｒｏｒ２陽性細胞でソーティングする場合は、骨髄をはじめとする組織由来細胞を付着培養することにより、前記細胞集団を調製してもよい（表１、Ｐ１０−１５、「付着培養細胞」と表記）。この場合、骨髄単核細胞を１０−２０％血清+ｂＦＧＦ添加培地（３７℃、１−５％ ＣＯ2）上に播種して約２週間培養し、培養後に出現する繊維芽細胞様の付着細胞（ＣＦＵ−Ｆ）を回収する。細胞集団を調製する工程は、骨髄をコラゲナーゼで処理する工程を包含してもよい。また、同工程は、Ｇ−ＣＳＦ投与後の末梢血から細胞集団を調製するようにしてもよい。
【００３０】
なお、出荷前の評価（工程２の２），３））は必ずしも必要ではなく、表１プロセスＰ１５の如く、付着培養細胞を利用し、Ｒｏｒ２陽性のものをＦＭＣでソーティングにより分離し、必要に応じて拡大培養し、これを［工程２］の５）以降の処理により出荷してもよい。
【００３１】
ここで、図２を参照しながら、ＲＥＣとＭＥＣ/ＳＥＣの細胞性能を比較する。ＲＥＣ, ＭＥＣ, ＳＥＣの細胞性能を様々なパラメータで比較した結果を示す。
同図Ａは、ヒト骨髄単核細胞をＬＮＧＦＲおよびＴｈｙ１に対する抗体で染色後、FCM解析を行った結果である。楕円で囲まれた部分がＬＴ細胞である。
同図Ｂは、ＬＴ細胞を９６穴プレートに単一細胞分離（クローンソート）することの模式図である。
同図Ｃは、単一細胞培養後の細胞数を定期的に計測した結果を示すグラフである。ＲＥＣはＭＥＣ/ＳＥＣと比較し増殖速度が速く、約２週間で０．５−１×１０4個まで増殖する。０．５−１×１０4個は９６穴プレートのウェルがコンフレントになる数である。
同図Ｄは、ＲＥＣ・ＭＥＣ・ＳＥＣを骨・脂肪へ分化誘導した後、骨・脂肪細胞に特異的な遺伝子発現を定量PCRにて計測した結果を示す。ＲＥＣはＭＥＣ, ＳＥＣと比較し、特に脂肪分化能が高いことが示された。
同図Ｅは、ＲＥＣ・ＭＥＣ・ＳＥＣを再度９６穴プレートにクローンソート後、２次コロニーを形成したウェルの数を比較した結果のグラフである。２次コロニーの形成は未分化状態の目安とされる自己複製能の指標である。ＲＥＣの約３３％が２次コロニーを形成するのに対し、ＭＥＣ/ＳＥＣはごく僅かなコロニーしか形成されない。
同図Ｆは、Luc（ルシフェラーゼ）遺伝子発現ベクターを導入した以下の細胞集団、ＷＢＭ（通常法で得たＭＳＣ、ＷＢＭはWhole Bone Marrowの略称である）、ＲＥＣ、ＭＥＣ/ＳＥＣ、および陰性対照群としてルシフェラーゼで標識していないＷＢＭ（Luc(-) Cultured MSC）をそれぞれ免疫不全マウスに対し経静脈的に投与後に、Lucの基質であるルシフェリンを腹腔内投与し、ルシフェラーゼの発光を体外から検出できる装置（IVIS）を用いて、移植２４時間後に観察した結果を示す。上段）グラフは各マウスにおけるLuc発光量を数値化し、ＷＢＭ ・ＭＳＣ移植した群を１００％とした時の他の細胞を移植したマウスの発光比率（％）をプロットしたものである。下段）画像は各群のレシピエントマウスにおけるLucの発光をイメージ化したものである。いずれの結果からも、ＲＥＣを移植したマウスは肺での発光量が極端に低いことから、ＲＥＣは肺毛細血管にほとんどトラップされないのに対し、ＭＥＣ/ＳＥＣはＷＢＭ（通常上で得た培養ＭＳＣ）とほぼ同等に補足され、肺中にとどまっていることがわかる。
以上の結果を総合すると、ＲＥＣは増殖能・分化能・遊走能ともに優れた細胞集団であり、特に後述する難治疾患への全身投与が可能という点で、新鮮骨髄中のＭＳＣに匹敵する遊走性を維持していることがポイントとなる。
【００３２】
以上を含め、発明者らの実験によれば、ＲＥＣは通常ＭＳＣと比較し以下の特徴を持つ。
１．形態的に極めて均一な細胞集団である
２．細胞老化が見られない
３．分裂速度が早く、未分化性を維持したまま培養増幅が可能
４．分化能が高く骨・脂肪へ分化させやすい細胞集団
５．遊走能を維持している
ＲＥＣはヒトＭＳＣのうち最も未分化な細胞集団であり、骨髄中のＭＳＣに最も近い性質を持つ。またＭＥＣ/ＳＥＣあるいは通常法で得たＭＳＣと比較し、高い分化・増殖・遊走能にすぐれた、新鮮かつ変異の少ない、細胞性能が保証された細胞集団である。
【００３３】
続いて、図３を参照しながら、未分化ＭＳＣ（ＲＥＣ）特異的遺伝子Ｒｏｒ２,Ｆｚｄ５の同定について説明する。
ＲＥＣ，ＭＥＣ，ＳＥＣそれぞれで発現する遺伝子の発現レベルをDNAアレイ法により比較し、Wnt（ウイント）受容体の一つであるＦｚｄ５およびその共受容体であるＲｏｒ２がＲＥＣ特異的であることを確認した。
同図Ａは、ＲＥＣ，ＭＥＣ，ＳＥＣそれぞれにおける定量的PCRによるＲｏｒ２ ｍＲＮＡの発現比較である。
同図ＢはＲＥＣ，ＭＥＣ，ＳＥＣそれぞれにおける定量的PCRによるＦｚｄ５ ｍＲＮＡの発現比較である。
同図Ｃはウエスタンブロッティング法によるＦｚｄ５蛋白発現の比較である。
同図Ｄは、蛍光免疫染色法によるＦｚｄ５蛋白の細胞内局在比較写真である。
以上、複数の解析方法で評価した結果、Ｆｚｄ５とＲｏｒ２の発現はＲＥＣ特異的であることが確認できた。従ってＦｚｄ５およびＲｏｒ２それぞれの発現を検出し定量化すれば、ＲＥＣの細胞品質評価の指標として有効と考えられる。また、新規に作製した抗Ｆｚｄ５モノクローナル抗体と抗Ｒｏｒ２モノクローナル抗体は、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング、蛍光免疫染色いずれの手法においても対象とするタンパク抗原の検出と定量化が可能である。
【００３４】
次に、図４を参照しながら、Ｆｚｄ５のloss of functionによる細胞老化誘導について検討する。
RNAインタフェレース法は対象とするｍＲＮＡに対し相補的な配列を持つ短いRNA（shRNA）を細胞内に導入し、対象とするｍＲＮＡを破壊することで目的遺伝子の機能を調べる手法である。Ｆｚｄ５に対し相補的な配列を持つshRNA（shFZD5）によりＦｚｄ５ ｍＲＮＡを破壊した場合のＲＥＣの細胞性質を対照群（shCTRL：Ｆｚｄ５に対し相補的ではないランダム配列のshRNA）と比較した一連の実験結果を示す。
同図Ａは、shFZD5またはshCTRLをそれぞれＲＥＣに導入した後、Ｆｚｄ５ のｍＲＮＡ量を定量的PCR法にて定量化したグラフである。対照群（shCTRL、ショートヘアピンコントロール）におけるＦｚｄ５ ｍＲＮＡ量を１００とした場合、shFZD5を強制発現したＲＥＣではＦｚｄ５のｍＲＮＡ量が約４０％に低下していた。
同図Ｂは、shFZD5またはshCTRLをそれぞれＲＥＣに導入した後、対照群の細胞数を１とした時のshFZD5強制発現群の細胞数を縦軸、shRNA導入後の日数を横軸にプロットしたグラフである。shFZD5を発現したＲＥＣは対照群と比較し、細胞数の急激な減少が認められ、Rzd5の阻害により増殖能の低下が誘導されることが示唆された。
同図Ｃは、shFZD5またはshCTRLをそれぞれＲＥＣに導入後、脂肪細胞へ分化誘導し、培養１４日目にOil-Red-Oで脂肪滴を染色した画像である。対照群と比較しＦｚｄ５を阻害すると脂肪分化能の低下が認められた。
同図Ｄは、細胞老化の指標であるSA-β-gal活性は基質であるX-galを加えると青色に染色され検出できる。shFZD5またはshCTRLをそれぞれＲＥＣに導入後、x-gal染色を行った画像および各細胞集団におけるSA-β-gal活性を持つ細胞頻度をプロットしたグラフを示す。
同図Ｅは、細胞老化の指標であるp16（INK4a）のｍＲＮＡ量を定量的PCR法により定量化したグラフである。対照群を１００とした場合、shFZD5導入ＲＥＣにおけるp16 ｍＲＮＡ量は約３００であり、Ｆｚｄ５の発現阻害により細胞老化が誘導されることが示された。
同図Ｆは、shFZD5またはshCTRLをそれぞれＲＥＣに導入後、各細胞集団に対し抗F-actin抗体にて細胞内染色を行いStress Fiberの形成を観察した画像、および同細胞集団それぞれに含まれる各細胞の面積（細胞サイズ）の平均値をプロットしたグラフを示す。
以上の結果から、ＲＥＣにおけるＦｚｄ５の機能を阻害することにより、増殖能の低下、分化能の低下、細胞老化の誘導、Stress fiber形成による遊走性の低下と細胞サイズの増大が誘導され、ＭＥＣ/ＳＥＣと同じ性状に変化することから、Ｆｚｄ５は単なるバイオマーカーではなく、ＲＥＣの細胞性能の維持を担保する機能分子と考えられる。
【００３５】
次に、図５を参照しながら、Ｆｚｄ５の gain of functionによる長期増殖能維持について考察する。
Ｆｚｄ５の全長cDNAをＲＥＣに強制発現することでＦｚｄ５ ｍＲＮＡを恒常的に発現させたことによる細胞機能への影響を確認した。発現ベクターはＦｚｄ５ cDNAと蛍光蛋白GFP（Green Fluorescent Protein、緑色蛍光タンパク質）がタンデムに連なっており、Ｆｚｄ５遺伝子導入細胞はGFPを同時に発現しているため蛍光顕微鏡を用いて導入した遺伝子の発現が確認できる。
同図Ａは、蛍光顕微鏡によるGFP発現細胞の形態観察写真である。Ｆｚｄ５ cDNAとGFPを導入した細胞集団（Ｆｚｄ５）とGFP遺伝子のみを導入した対照群（CTRL）の遺伝子導入後２８日目の細胞形態を撮影した画像である。
対照群では図中矢印で示した細胞老化の特徴であるサイズの大きい多極性細胞が多数出現しているのに対し、Ｆｚｄ５発現ＲＥＣはほぼ全てが細胞質の小さい双極性の形態を維持していた。
同図Ｂは、対照群の細胞数を１とした時のＦｚｄ５発現ＲＥＣの細胞数を縦軸、遺伝子導入後の日数を横軸にプロットしたグラフである。対照群と比較し、Ｆｚｄ５を強制的に発現させたＲＥＣでは増殖能が長期的に維持されていた。
以上の結果から、Ｆｚｄ５を介したWntシグナル刺激により、未分化性を維持した状態で長期的な培養増幅が可能になることが見込まれる。
【００３６】
続いて、図６を参照しながら、ヒトＦｚｄ５に対する新規モノクローナル抗体の作製について説明する。
ヒトＦｚｄ５抗原の細胞外領域を免疫原とし、ホストマウスを免疫後、常法に従いハイブリドーマを作製し、Ｆｚｄ５遺伝子を発現させたBa/F3細胞でスクリーニングを行うことで、新規の抗Ｆｚｄ５モノクローナル抗体（クローン名：６Ｆ５）を得た。
本抗体を用い様々な手法でＦｚｄ５蛋白が検出できるか否かの確認を行った。
同図Ａは、Ｆｚｄ５の細胞外領域を強制発現させたBa/F3細胞に対し、Biotin標識した６Ｆ５抗体で染色後、ストレプトアビジン（SAV）-PEで蛍光標識しフローサイトメトリーで解析を行い、PEの蛍光強度を横軸にプロットしたヒストグラムを示す。図中のグレーで示したヒストグラムは一次抗体としてアイソタイプコントロールを加えた陰性コントロール、白抜きのヒストグラムは６Ｆ５で染色したサンプルのPE蛍光強度である。図中の横バーで示した領域がＦｚｄ５陽性細胞領域であり、数値は陽性率（％）を表す。
同図Ｂは、ＲＥＣの異なる３クローンより細胞内蛋白を調製し、６Ｆ５を一次抗体としてＦｚｄ５蛋白を検出したウエスタンブロッティングの結果を示す。陰性コントロールとして、サル腎臓由来の細胞株COS7より調製した細胞内蛋白を用いた。
同図Ｃは、ＲＥＣ細胞に対し６Ｆ５-Biotinを一次抗体として染色後、ストレプトアビジン（SAV）-Alexa555にて蛍光ラベル後に蛍光顕微鏡で観察、撮影した画像である。抗Ｆｚｄ５抗体（６Ｆ５）はフローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング、蛍光免疫染色の全てに利用可能であった。
【００３７】
次に、図７を参照しながら、ヒトＲｏｒ２抗原に対する新規モノクローナル抗体の作製について説明する。
ヒトＲｏｒ２抗原を免疫原とし、新規に抗Ｒｏｒ２抗体（クローン名：７Ｃ９）を作製した。同クローンを用い、
同図ＡはＲＥＣに対し、１次抗体として７Ｃ９-Biotinで染色後、SAV-PEで蛍光ラベルし、フローサイトメトリーを用いてPE蛍光の検出を行った結果を示す。１次抗体としてアイソタイプコントロール抗体を加えたサンプルを陰性コントロールとする。縦軸にFITC蛍光（染色していないため全て陰性）、横軸にPE蛍光をプロットした２次元ドットプロットである。陰性コントロール群ではPE蛍光を発する細胞がほぼ含まれない領域（図中の台形で囲まれた部分：０．０１１％）がClone７Ｃ９で染色したサンプルにおいてPE蛍光を発現している細胞集団（６９．３％）であった。
同図Ｂは、ＲＥＣに対し７Ｃ９-Biotinを１次抗体として免疫染色を行い、Streptavidin-Alexa488で蛍光標識後にＲｏｒ２蛋白の発現を蛍光顕微鏡にて観察・撮影した画像である。ＲＥＣの大部分がＲｏｒ２蛋白を発現していることが確認された。
同図Ｃは、新鮮骨髄細胞に対しＬＮＧＦＲ-APC, Ｔｈｙ１-FITC, Ｒｏｒ２-PE（それぞれの抗原に対するモノクローナル抗体）による３重染色を行い、フローサイトメトリー解析を行った結果を示す。左はＬＮＧＦＲの発現を縦軸に、Ｔｈｙ１の発現を横軸にプロットした図であり、四角枠で囲まれた部分はヒトＭＳＣが高頻度に含まれるＬＮＧＦＲ Ｔｈｙ１共陽性細胞集団である。右２つの図はＬＮＧＦＲ Ｔｈｙ１共陽性細胞集団のみを抽出後、横軸を細胞の大きさの指標であるFSC、縦軸にSAV-PEで標識した抗Ｒｏｒ２-Biotin抗体（７Ｃ９）のPE蛍光をプロットした図である。四角枠で囲まれた部分は陰性コントロールを元に設定したＲｏｒ２陽性領域であり、数値は陽性率（％）を表す。Clone７Ｃ９を用いた場合、ＬＮＧＦＲ Ｔｈｙ１共陽性細胞の９２．３％がＲｏｒ２陽性であり、ＬＮＧＦＲ Ｔｈｙ１に代わるMCSの選別マーカーとして用いることが可能である。
新規に作製した抗Ｒｏｒ２モノクローナル抗体を用いることで、フローサイトメトリー及び蛍光免疫染色によりＲｏｒ２蛋白の検出と定量化が可能である（図７Ａ，Ｂ）。
さらに新規に作製した抗Ｒｏｒ２は骨髄中に含まれるＭＳＣのマーカーとしても利用可能である（図７Ｃ）。
【００３８】
次に、図８を参照しながら、抗Ｒｏｒ２抗体または抗Ｆｚｄ５抗体を用いた、細胞品質の評価手順について説明する。
通常法である付着培養を行ったヒトＭＳＣ（または継代培養を行ったＲＥＣ）を回収し、ＲＥＣ特異的なモノクローナル抗体（抗Ｒｏｒ２抗体または抗Ｆｚｄ５抗体）で染色する。
フローサイトメトリーにて陽性細胞の頻度（含有％）を計測する。その代わりに、蛍光顕微鏡下で陽性細胞の頻度（含有％）を計測してもよい。これらの計測により、その細胞集団にどれだけのＲＥＣが含まれているかを定量化することができるため、対象とするＭＳＣがどの程度の分化・増殖・遊走能を持つか、細胞品質を評価することが可能である。発明者らの実験によれば、ＲＥＣのＲｏｒ２陽性率は５ロットで７２％±８．９％であった。よって、例えば、最低値である６３％以上や、６５％以上を合否判定の基準値としてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明によれば、全身性疾患への治療に利用することができるヒト間葉系幹細胞を効率良く分離培養する技術を提供すること、および得られた細胞集団が移植に適しているか、薬効性を示すかの基準となる品質評価を行うことが可能になった。  
新規に作製した高純度間葉系幹細胞に特化した染色性を示すモノクローナル抗体のうち、細胞分離に適した候補はナノ磁気微粒子と結合させることによって、間葉系幹細胞分離用試薬として製品化できる。また、分離した間葉系幹細胞の品質を検定するための細胞評価用の試薬として、蛍光物質結合抗体、細胞染色用試薬が実用化できる。
間葉系幹細胞は、従来行われてきたバイオマテリアルの材料として、あるいはその多分化能を生かし、重症筋無力症、慢性リウマチ症等への投与、さらには脊髄損傷、心・血管、慢性肝不全を始めとする重度の疾患治療に対する細胞治療を行う際に組織の場（ニッシェ）を整える支持細胞として共移植するなど、様々な応用が期待される。特に、遊走性を維持しているＲＥＣを用いることにより、これまで治療法が存在しなかった低フォスファターゼ症をはじめとする全身性骨・軟骨疾患等の代謝性疾患、GVHDの治療など経静脈的に投与する必要のある全ての疾患に適用すれば、これまでにない治療効果が見込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月15日(2019.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
本発明によれば、全身性疾患への治療に利用することができるヒト間葉系幹細胞を効率良く分離培養する技術を提供すること、および得られた細胞集団が移植に適しているか、薬効性を示すかの基準となる品質評価を行うことが可能になった。
新規に作製した高純度間葉系幹細胞に特化した染色性を示すモノクローナル抗体のうち、細胞分離に適した候補はナノ磁気微粒子と結合させることによって、間葉系幹細胞分離用試薬として製品化できる。また、分離した間葉系幹細胞の品質を検定するための細胞評価用の試薬として、蛍光物質結合抗体、細胞染色用試薬が実用化できる。
間葉系幹細胞は、従来行われてきたバイオマテリアルの材料として、あるいはその多分化能を生かし、重症筋無力症、慢性リウマチ症等への投与、さらには脊髄損傷、心・血管、慢性肝不全を始めとする重度の疾患治療に対する細胞治療を行う際に組織の場（ニッシェ）を整える支持細胞として共移植するなど、様々な応用が期待される。特に、遊走性を維持しているＲＥＣを用いることにより、これまで治療法が存在しなかった低フォスファターゼ症をはじめとする全身性骨・軟骨疾患等の代謝性疾患、GVHDの治療など経静脈的に投与する必要のある全ての疾患に適用すれば、これまでにない治療効果が見込まれる。
本発明は以下を提供する。
［１］ヒト間葉系幹細胞の品質評価方法であって、
ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、増殖の早いヒト間葉系幹細胞を分離、選別及び培養し、
同分離、選別及び培養した細胞集団においてＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞の存在比率を定量して各細胞集団の合否判定を行うヒト間葉系幹細胞の品質評価方法。
［２］抗Ｒｏｒ２モノクロナール抗体または抗Ｆｚｄ５モノクロナール抗体を用いてＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞を定量する上記［１］に記載のヒト間葉系幹細胞の品質評価方法。
［３］定量的ＰＣＲを用いてＲｏｒ２のｍＲＮＡを発現している細胞を定量する上記［２］に記載のヒト間葉系幹細胞の品質評価方法。
［４］免疫染色によりＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞を定量する上記［２］に記載のヒト間葉系幹細胞の品質評価方法。
［５］ヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法であって、
ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、増殖の早いヒト間葉系幹細胞を分離、選別及び培養し、
同分離、選別及び培養した細胞集団においてＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞の存在比率を定量して各細胞集団の合否判定を行い、合格の細胞集団のみを選別するヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法。
［６］抗Ｒｏｒ２モノクロナール抗体または抗Ｆｚｄ５モノクロナール抗体を用いてＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞を定量する上記［５］に記載のヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法。
［７］定量的ＰＣＲを用いてＲｏｒ２のｍＲＮＡを発現している細胞を定量する上記［６］に記載のヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法。
［８］免疫染色によりＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞を定量する上記［６］に記載のヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法。
［９］前記増殖の早いヒト間葉系幹細胞として分離、選別及び培養する工程が、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、抗ＬＮＧＦＲモノクロナール抗体および抗Ｔｈｙ１モノクロナール抗体で染色した細胞をフローサイトメトリー（以下、「ＦＣＭ」）で解析し、ＬＮＧＦＲ Ｔｈｙ１共陽性細胞をセルソーティングする工程を含んでいる上記［５］に記載のヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法。
［１０］前記増殖の早いヒト間葉系幹細胞として分離、選別及び培養する工程が、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、抗Ｒｏｒ２モノクロナール抗体で染色した細胞をＦＣＭで解析し、Ｒｏｒ２陽性細胞をセルソーティングする工程を含んでいる上記［５］に記載のヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法。
［１１］骨髄、その他の各組織由来細胞から直接前記細胞集団を調製する工程を包含する上記［９］または［１０］記載のヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法。
［１２］骨髄、その他の各組織由来細胞を付着培養することにより、前記細胞集団を調製する工程を包含する上記［１０］記載のヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法。
［１３］前記セルソーティングする工程が、培養プレートのウェルに陽性の各細胞を播種するものであり、その後さらに、培養によりコンフルエントとなったウェルの細胞を分離及び選別する工程を包含する上記［９］または［１０］記載のヒト間葉系幹細胞の分離、選別及び培養方法。
［１４］ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、増殖の早いヒト間葉系幹細胞を分離、選別及び培養し、
同分離、選別及び培養した細胞集団においてＲｏｒ２またはＦｚｄ５を発現している細胞の存在比率を定量して各細胞集団の合否判定を行い、合格の細胞集団のみを選別した増殖の早いヒト間葉系幹細胞の細胞集団。
［１５］ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、抗ＬＮＧＦＲモノクロナール抗体および抗Ｔｈｙ１モノクロナール抗体で染色した細胞をＦＣＭで解析し、ＬＮＧＦＲ  Ｔｈｙ１共陽性細胞をセルソーティングし、培養プレートのウェルに同共陽性の各細胞を播種し、培養によりコンフルエントとなったウェルの細胞を分離及び選別した後、前記定量を行うことにより得られた上記［１４］記載の増殖の早いヒト間葉系幹細胞の細胞集団。
［１６］ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、抗Ｒｏｒ２モノクロナール抗体で染色した細胞をＦＣＭで解析し、Ｒｏｒ２陽性細胞をセルソーティングし、培養プレートのウェルに同陽性の各細胞を播種し、培養によりコンフルエントとなったウェルの細胞を分離及び選別した後、前記定量を行うことにより得られた上記［１４］記載の増殖の早いヒト間葉系幹細胞の細胞集団。
［１７］抗Ｒｏｒ２モノクローナル抗体である増殖の早いヒト間葉系幹細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体。
［１８］クローン名が７Ｃ９である上記［１７］記載の増殖の早いヒト間葉系幹細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体。
［１９］抗Ｆｚｄ５モノクローナル抗体である増殖の早いヒト間葉系幹細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体。
［２０］クローン名が６Ｆ５である上記［１９］記載の増殖の早いヒト間葉系幹細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体。