(57)【要約】      （修正有）【課題】アテローム動脈硬化症を治療または予防するための方法の提供。【解決手段】哺乳動物にＴＭＡＯ産生剤を投与するステップを含み、該ＴＭＡＯ産生剤が、摂取または注射されたとき該哺乳動物の体内でＴＭＡＯを形成する化合物を含み、該ＴＭＡＯ産生剤が、哺乳動物の血液中のＴＭＡＯレベルを上昇させるために薬学的に有効な量で該哺乳動物に投与される方法。ＴＭＡＯ産生剤の薬学的に有効な量の投与はトリメチルアミンＮ−オキシドレベルを上昇させ、動脈病変を低減させる。【選択図】図７
2020196735.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動脈（artherio）病変を治療するための方法であって、
哺乳動物にＴＭＡＯ産生剤を投与するステップを含み、該ＴＭＡＯ産生剤が、摂取または注射されたとき該哺乳動物の体内でＴＭＡＯを形成する化合物を含み、該ＴＭＡＯ産生剤が、哺乳動物の血液中のＴＭＡＯレベルを上昇させるために薬学的に有効な量で該哺乳動物に投与される方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤の定期的投与中に該哺乳動物の血液中のＴＭＡＯのレベルを測定するステップをさらに含む方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、該血液中のＴＭＡＯの量を増加または減少させるために、該血液中の測定されたＴＭＡＯのレベルに基づいて該哺乳動物に投与されるＴＭＡＯ産生剤の量を調整するステップをさらに含む方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤が、カルニチン、例えば、Ｌ−カルニチンまたはＤ−カルニチンを含む方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤がコリンを含む方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤がベタインを含む方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤が、カルニチン、コリンおよびベタインからなる群から選択される少なくとも２種のＴＭＡＯ産生剤の混合物を含む方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤がＴＭＡＯ前駆体を含む方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤がＴＭＡＯ類似体を含む方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤が該哺乳動物によって摂取される方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤が該哺乳動物に注射される方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤が、アテローム動脈硬化症、またはアテローム動脈硬化症に関連するかもしくはアテローム動脈硬化症によって媒介される障害、に罹患しているかまたは発症するリスクがある哺乳動物に投与される方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤が末梢血管疾患に罹患している哺乳動物に投与される方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤が、５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約７０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約１００ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約１５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約２００ｍｇ／ｋｇより多い、例えば２５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約３００ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約３５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約４００ｍｇ／ｋｇより多い用量で該哺乳動物に投与される方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤が該哺乳動物に１
日１回または２回投与される方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法であって、該哺乳動物がヒト患者を含む方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法であって、該哺乳動物がネコまたはイヌを含む方法。
【請求項１８】
アテローム動脈硬化症、またはアテローム動脈硬化症に関連するかもしくはアテローム動脈硬化症によって媒介される障害、に罹患している哺乳動物を治療するためのシステムまたはキットであって、
複数投与量のＴＭＡＯ産生剤であって、該ＴＭＡＯ産生剤は、摂取または注射されたときにトリメチルアミンに化学的に転換する化合物を含み、各投与量が該哺乳動物の血液中でＴＭＡＯレベルを上昇させるのに十分なものである複数投与量；及び
該哺乳動物から採取した血液試料中のＴＭＡＯレベルの測定を促進する物品；
を含むシステムまたはキット。
【請求項１９】
請求項１８に記載のシステムまたはキットであって、該ＴＭＡＯ産生剤がカルニチンを含むシステムまたはキット。
【請求項２０】
請求項１８に記載のシステムまたはキットであって、該ＴＭＡＯ産生剤がコリンを含むシステムまたはキット。
【請求項２１】
請求項１８に記載のシステムまたはキットであって、該ＴＭＡＯ産生剤がベタインを含むシステムまたはキット。
【請求項２２】
請求項１８、１９、２０または２１に記載のシステムまたはキットであって、該ＴＭＡＯの各投与量が、治療される哺乳動物に基づき、１５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約２００ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約２５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約３００ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約３５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約４００ｍｇ／ｋｇより多いシステムまたはキット。
【請求項２３】
請求項１８〜２２のいずれかに記載のシステムまたはキットであって、該物品が、血液中のＴＭＡＯレベルを判定または解釈するのに使用される情報資料または教示資料を含むシステムまたはキット。
【請求項２４】
請求項１８〜２３のいずれかに記載のシステムまたはキットであって、該物品が採血デバイスを含むシステムまたはキット。
【請求項２５】
請求項１８〜２３のいずれかに記載のシステムまたはキットであって、該物品がＴＭＡＯアッセイデバイスを含むシステムまたはキット。
【請求項２６】
血漿試料中の、ＴＭＡＯ、ＴＭＡＯ前駆体またはＴＭＡＯ類似体を含む分析対象物レベルを検出する方法であって、
既知だが変動する濃度の非標識分析対象物と既知の固定濃度の同位体標識分析対象物とを含む少なくとも２つの作業用標準混合物を生成し；
該作業用標準混合物を分析して、分析対象物の濃度の、該非標識分析対象物の分析の該同位体標識分析対象物との比較、に対する相関関係を創出し；
血漿試料、水、および既知の固定濃度の該同位体標識分析対象物を含む少なくとも１つの血漿試料溶液を生成し；
血漿ブランク、水、およびと既知の固定濃度の該同位体標識分析対象物を含む血漿ブラ
ンク溶液を生成し；
血漿ブランク、既知の変動する濃度の該非標識分析対象物、および既知の固定濃度の該同位体標識分析対象物を含む、少なくとも１つ添加（spiked）血漿試料を生成し；
該血漿試料溶液、該血漿ブランク溶液、および該少なくとも１つの添加血漿試料を分析し、該血漿試料中の分析対象物の分析を、該同位体標識内部標準物質と基準と比較することによって、該血漿試料溶液中の分析対象物の濃度を決定する
ことを含む方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、該作業用標準混合物、血漿試料溶液、血漿ブランク溶液、および該少なくとも１つの添加血漿試料が、液体クロマトグラフィー／質量分析を使用して分析される方法。
【請求項２８】
請求項２６又は２７に記載の方法であって、添加血漿試料が各作業用標準混合物に対応して生成される方法。
【請求項２９】
請求項２６、２７または２８に記載の方法であって、約４〜約８の作業用標準混合物が生成される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
[0001]本出願は、２０１５年２月６日に出願した米国特許仮出願第６２／１１２，９４５号に基づくものであり、また該仮出願の優先権を主張するものであり、該仮出願は、参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
[0002]心疾患および心血管疾患は、男性および女性両方の主な死亡原因であり続けている。１つの心血管疾患は、アテローム動脈硬化症である。アテローム動脈硬化症は、動脈壁内の脂質および他の血液誘導体の沈着またはプラークを特徴とする。この疾患に起因して、脂肪で充満した白血球の蓄積に主として起因して、動脈壁が肥厚しうる。アテローム動脈硬化症は、概して動脈の硬化に関連する。この疾患は、体内のすべての動脈、特に大動脈および冠動脈を冒しうる。
【０００３】
[0003]アテローム動脈硬化性プラークは、大動脈などの大きい動脈の内皮に内在する脂肪線条として始まる。脂肪線条は、コレステロールおよびトリグリセリドを含む、生細胞と死細胞両方を含有しうる。他の場合、脂肪線条またはプラークは石灰化されることがあり、その結果、カルシウムおよび他の結晶化物質に変わる。プラークの特に石灰化形態での発生は、動脈壁の弾性を低下させうる。壁の硬化は、ゆくゆくは血圧を上昇させ、最終的には血流を減少させうる。プラークは、破裂すると、血管閉塞、虚血および心臓事象に至ることがある。
【０００４】
[0004]アテローム動脈硬化症の原因は完全には分かっていない。炎症およびある特定のコレステロールの高い血中レベルがアテローム動脈硬化症をもたらしうると考えられている。具体的には、コレステロール中心部を包囲するリポタンパク質の外縁部からなる微視的粒子である、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール粒子の高い血中レベルは、アテローム動脈硬化症が進行する傾向を増大させる。ＬＤＬ粒子は、内皮細胞層の機能が損なわれると動脈壁に沈着すると考えられている。ＬＤＬ粒子はまた、内皮細胞を越えて血管の内層に入り、炎症性因子の作用のもとでＬＤＬはｏｘ−ＬＤＬに酸化されうる。酸化形態が出現すると、より多くの白血球がその領域に遊走し、動脈壁内に透過する。これらの白血球は、その後、マクロファージに変換しうる。
【０００５】
[0005]マクロファージの形成は、体内の免疫応答を生じさせることがある。より多くの白血球が前記領域にもたらされ、酸化されたＬＤＬ粒子を吸収して泡沫細胞を形成する。さらなる泡沫細胞が形成すると、動脈は狭窄されうる。場合によっては、泡沫細胞は死滅し、脂肪線条およびプラークを形成する。これらは、ゆくゆくは破裂し、虚血および心臓事象に至ることがある。
【０００６】
[0006]これまでに、アテローム動脈硬化症、およびアテローム動脈硬化症に関連するかまたはアテローム動脈硬化症によって媒介される病状、を治療および予防するために、様々な方法が提案されてきた。例えば、アテローム動脈硬化症を予防する１つの一般的な方法は、食生活を変えることである。当業者は、ＬＤＬ形成コレステロールが少ない食生活を提唱してきた。
【０００７】
[0007]食生活を変えることに加えて、様々な他の医薬製品が提唱されてきた。これらの製品の大部分は、ＬＤＬおよびコレステロール低下を目的にしたものである。例えば、スタチンは、ＬＤＬコレステロールを低下させるために患者に投与されてきた。フィブラー
ト系薬剤として公知の別の薬物群は、トリグリセリドレベルを低下させるために使用される。他の提唱薬物としては、ナイアシン、ゼチーア、胆汁酸封鎖剤、および植物ステロールが挙げられる。これらの薬物の大部分は、血液中のコレステロールレベルを低下させることに向けたものである。
【０００８】
[0008]ＣＥＴＰ（コレステリルエステル転送タンパク質）は、ＨＤＬ（高密度リポタンパク質）または「善玉コレステロール」をアテローム生成促進性ＬＤＬに変換する酵素である。この酵素は、新薬開発の標的にもされてきた。その阻害は、より高いＨＤＬレベル、およびより低いＬＤＬレベルをもたらす。
【０００９】
[0009]しかし、アテローム動脈硬化症は、今もなお、重大な健康の驚異であり続けている。したがって、アテローム動脈硬化症の疾患進行を治療および予防または緩徐化するための、より良い、より信頼できる手段の必要性は認識されている。特に、動脈病変（athero lesion）を治療する、低減させる、その形成を予防する、および／またはその形成を阻害する上で、コレステロールを低下させるのとは異なる作用機序を有する、より新しい医薬製品が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
[0010]一般に、本開示は、アテローム動脈硬化症を治療するための方法に向けられている。本開示は、アテローム動脈硬化症を治療するためのシステムまたはキットにも向けられている。本開示の方法、システムまたはキットは、アテローム動脈硬化症に関連するかまたはアテローム動脈硬化症によって媒介されるか、またはアテローム動脈硬化症を発症するリスクがある他の障害を治療するためにも使用することができる。
【００１１】
[0011]一実施形態において、本開示は、アテローム動脈硬化症または関連疾患の結果として発症しうる動脈病変を治療するための方法に向けられている。この方法は、哺乳動物、特にヒト患者にＴＭＡＯ産生剤を投与するステップを含む。ＴＭＡＯ産生剤は、トリメチルアミンおよび／もしくはトリメチルアミンＮ−オキシドを含む、または摂取もしくは注射されたときに化学的にトリメチルアミンおよび／もしくはトリメチルアミンＮ−オキシドに転換し、その後、ＴＭＡＯに転換する化合物を含む。ＴＭＡＯ産生剤は、哺乳動物の血液中のトリメチルアミンＮ−オキシドレベルを上昇させるのに十分な薬学的に有効な量で、哺乳動物に投与される。可能性のあるＴＭＡＯ様分子を直接摂取または注射することもでき、そのような分子が同様の効果を示すこともある。
【００１２】
[0012]本発明者らは、体内のトリメチルアミンＮ−オキシドレベルを上昇させることで動脈病変の出現を有意にかつ劇的に低減させることができることを発見した。
[0013]本開示に従って、ＴＭＡＯ産生剤は、Ｄ−カルニチンまたはＬ−カルニチンを含みうる。代替実施形態では、ＴＭＡＯ産生剤は、コリンを含みうる。さらに別の実施形態では、ＴＭＡＯ産生剤は、ベタインを含みうる。使用することができるベタインには、ベタイン塩、ベタインのカルボン酸誘導体、および／またはベタイン／アミノ酸が含まれる。さらに別の実施形態では、ＴＭＡＯ産生剤は、ＴＭＡＯ産生剤の組合せを含みうる。例えば、組成物は、カルニチン、コリンおよびベタインからなる群から選択される少なくとも２種のＴＭＡＯ産生剤の混合物を含みうる。
【００１３】
[0014]一実施形態では、ＴＭＡＯ産生剤の哺乳動物への投与中に哺乳動物の血液中のトリメチルアミンＮ−オキシドのレベルが測定される。測定されたレベルに基づいて、哺乳動物に投与するＴＭＡＯ産生剤の量を増加させることができる。単に例示を目的として、一実施形態では、ＴＭＡＯ産生剤を、哺乳動物の種および個々の患者に依存して血液中のＴＭＡＯレベルが約０．１ｐｐｍより高くなるように、例えば約０．１２ｐｐｍより高く
なるように、例えば０．１５ｐｐｍより高くなるように、哺乳動物に投与することができる。
【００１４】
[0015]ＴＭＡＯ産生剤の投薬量は、治療される哺乳動物、および患者の状態を含む、非常に多数の因子に依存して変わりうる。一実施形態では、各投与量は、約１５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約２００ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約２５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約３００ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約３５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約４００ｍｇ／ｋｇより多いＴＭＡＯ産生剤でありうる。別の実施形態では、比較的少量のＴＭＡＯ産生剤が哺乳動物に投与される。例えば、各投与量は、７〜１５０ｍｇ／ｋｇの、例えば、４０〜１５０ｍｇ／ｋｇの、例えば約５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約７０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約１００ｍｇ／ｋｇより多いＴＭＡＯ産生剤でありうる。この投与量は、一般に、約１，０００ｍｇ／ｋｇ未満、例えば約９００ｍｇ／ｋｇ未満、例えば約８００ｍｇ／ｋｇ未満、例えば約７００ｍｇ／ｋｇ未満、例えば約６００ｍｇ／ｋｇ未満のＴＭＡＯ産生剤である。化合物の発生中に効力を示す用量を長期間にわたって定期的に患者に与えることができる。一実施形態では、１日に１〜２用量を哺乳動物に投与することができる。
【００１５】
[0016]一実施形態では、本開示に従って治療される哺乳動物または患者は、アテローム動脈硬化症、またはアテローム動脈硬化症に関連するかもしくはアテローム動脈硬化症よって媒介される障害、に罹患しているかまたは発症するリスクがある患者である。例えば、患者は、末梢血管疾患を有することがある。
【００１６】
[0017]本開示は、アテローム動脈硬化症を治療または予防するためのシステムまたはキットにも関する。このシステムまたはキットは、哺乳動物または患者から採取した血液試料中のトリメチルアミンＮ−オキシドレベルの測定を促進する物品と共にＴＭＡＯ産生剤を含む。この物品は、例えば、血液中のトリメチルアミンＮ−オキシドのレベルを判定または分析するための教示資料および／または説明資料を含むことができる。この物品は、例えば、患者からの血液試料の採取を促進する任意のデバイスを含むこともできる。さらに別の実施形態では、この物品は、トリメチルアミンＮ−オキシドレベルを判定するためのアッセイデバイスを含むことができる。
【００１７】
[0018]本開示は、血漿試料中の分析対象物レベルを決定するための方法であって、分析対象物がＴＭＡＯ、ＴＭＡＯ前駆体またはＴＭＡＯ類似体である、方法にも向けられている。一実施形態では、この方法は、既知だが変動する濃度の非標識分析対象物と既知の固定した濃度の同位体標識分析対象物とを含む少なくとも２つの作業用標準混合物を生成するステップ；高速液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）と多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用して前記作業用標準混合物を分析するステップ；同位体標識分析対象物への非標識分析対象物の応答の分析の比較に基づいて非標識分析対象物の濃度を示すための基準または相関を作成するステップ；血漿試料と、水と、既知の固定した濃度の同位体標識分析対象物とを含む少なくとも１つの血漿試料溶液を生成するステップ；血漿ブランクと、既知の変動する濃度の非標識分析対象物と、既知の固定した濃度の同位体標識分析対象物とを含む少なくとも１つの添加血漿試料を生成するステップ；高速液体クロマトグラフィー−質量分析と多重反応モニタリングを使用して前記血漿溶液を分析するステップ；および血漿試料中の前記非標識分析対象物の同位体標識分析対象物への応答を前記基準と比較することによって前記血漿試料溶液中の前記分析対象物の濃度を決定するステップを含む。
【００１８】
[0019]例えば、一実施形態では、２つ以上の作業用標準混合物を使用して、血漿試料溶液中の分析対象物の濃度の決定に使用するための標準曲線を作成することができる。別の実施形態では、添加血漿試料が、対応する作業用標準物質ごとに調製される。
【００１９】
[0020]本開示の他の特徴および態様を下でより詳細に論じる。
[0021]本明細書の残部で、付随する図への言及を含めて、本開示の十分なかつ可能な開示を、より詳細に述べる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】下記の実施例と併用するための大動脈根およびｅｎ−ｆａｃｅ大動脈の位置を図示する略図である。
【図２】下の実施例で得た結果のグラフ表示の図である。
【図３】下の実施例で得た結果のグラフ表示の図である。
【図４】下の実施例で得た結果のグラフ表示の図である。
【図５】下の実施例で得た結果のグラフ表示の図である。
【図６】下の実施例で得た結果のグラフ表示の図である。
【図７】下の実施例で得た結果のグラフ表示の図である。
【図８】下記の実施例と併用するためのアテローム動脈硬化症進行のステージを図示する略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義
[0022]本明細書で用いるアテローム動脈硬化症は、動脈壁の内部へのアテローム性プラークの蓄積に起因する動脈の硬化および／または狭小化を特徴とする状態を指す。アテローム性プラークは、次の３つの構成要素に分けられる（１）動脈内腔の最も近くのマクロファージからなる、大きいプラークの中心部への柔軟な鱗状の物質の結節状蓄積である、アテローム、（２）コレステロール結晶の下にある領域、（３）より進行した病変の外側基部での石灰化。アテローム動脈硬化症の兆候としては、例えば、動脈内でのプラークの発生、それらの石灰化（その程度をＳｕｄａｎ  ＩＶ染色によって判定することができる）、または動脈内での泡沫細胞の発生が挙げられる。動脈の狭小化は、冠動脈形成術、超高速ＣＴ、または超音波によって判定することができる。アテローム動脈硬化症疾患を診断するために、指標としてのアテローム動脈硬化症疾患バイオマーカー、例えば、ＬＤＬ−ｃ、ＨＤＬ−ｃ  ＣＲＰなどを探すことができる。
【００２２】
[0023]薬学的に有効な量または治療に有効な量は、特定の状態もしくは障害を、または特定の状態もしくは障害の特定の症状を、治療、減弱、改善、除去または予防する化合物の量を意味する。
【００２３】
[0024]本明細書で用いるＴＭＡＯ産生剤は、ＴＭＡＯ自体、ＴＭＡＯ類似体、ＴＭＡＯ前駆体、ＴＭＡＯ類似体、ＴＭＡＯ様分子、ＴＭＡ、ならびに単独で、または肝臓酵素などの酵素と共に、消化管内の細菌によってトリメチルアミンおよび／またはトリメチルアミンＮ−オキシドに転換することができる任意の化合物を指す。
【００２４】
[0025]本明細書で用いる、カルニチン、コリンまたはベタインは、その誘導体および塩を含む。例えば、カルニチンは、Ｄ−カルニチンおよび／またはＬ−カルニチン、ならびにそれらの変形体を含み、該変形体は、例えば、Ｌ−カルニチン塩基、Ｌ−カルニチンＨＣＬ、Ｌ−酒石酸Ｌ−カルニチン、フマル酸Ｌ−カルニチン、プロプリニアル（ｐｒｏｐｒｉｎｉａｌ）Ｌ−カルニチン、ＧＰＬＣグリシンプロプリナール（ｐｒｏｐｒｉｎａｌｅ）Ｌ−カルニチン、他のカルニチン誘導体などを含む。
【００２５】
[0026]本明細書で用いる哺乳動物は、アテローム動脈硬化症、またはアテローム動脈硬化症型の疾患もしくは病気を経験しうる任意の哺乳動物を含み、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヒト、ブタおよび他の哺乳動物を含む。
詳細な説明
[0027]本開示が、例示的な実施形態の説明に過ぎず、本開示のより広い態様の限定することを目的とするものでないことは、当業者には理解されるはずである。
【００２６】
[0028]一般に、本開示は、アテローム動脈硬化症を治療または予防するための方法に向けられている。本開示は、アテローム動脈硬化症によって媒介されるまたはアテローム動脈硬化症に関連する障害を治療または予防することにも向けられている。一実施形態では、本開示の方法は、アテローム動脈硬化症の結果として生じうる動脈病変を治療することに向けられている。
【００２７】
[0029]本開示に従ってアテローム動脈硬化症を治療もしくは予防するおよび／または動脈病変を予防するために、ＴＭＡＯ産生剤は、哺乳動物の血液中のトリメチルアミンＮ−オキシドレベルを上昇させる薬学的に有効な量で哺乳動物に投与される。ＴＭＡＯ産生剤は、トリメチルアミンＮ−オキシドを含む化合物、または体内で化学的にトリメチルアミンＮ−オキシドに転換する化合物である。例えば、一実施形態では、消化管内細菌の存在に起因して消化管内でトリメチルアミンを産生するＴＭＡＯ産生剤が使用される。その後、トリメチルアミンは、血液に吸収され、肝臓でトリメチルアミンＮ−オキシドに転換される。例えば、肝臓内で、トリメチルアミンは、トリメチルアミンＮ−オキシドを産生する１種または複数の酵素と接触しうる。前記酵素は、例えば、フラビン含有モノオキシゲナーゼ（ＦＭＯ）を含みうる。例えば、多くの酵素のうちの１つ、ＦＭＯ３は、ヒトの肝臓の小胞体内に位置する肝臓酵素である。
【００２８】
[0030]様々な異なるＴＭＡＯ産生剤を本開示に従って使用することができる。例えば、ＴＭＡＯ産生剤は、体内のトリメチルアミンＮ−オキシドレベルを上昇させることができる任意の好適な化合物を含むことができる。ＴＭＡＯ産生剤の特定の例としては、カルニチン、ベタインおよび／またはコリンが挙げられる。一実施形態では、少なくとも２種のＴＭＡＯ産生剤の混合物を使用することができる。
【００２９】
[0031]使用することができるカルニチンの例としては、Ｌ−カルニチンおよび／またはＤ−カルニチンが挙げられる。Ｌ−カルニチンは、リシンおよびメチオニンから生合成することができる第四級アミンである。Ｌ−カルニチンが、ミトコンドリア膜を介した移動を促進することによって長鎖脂肪酸のベータ−酸化を促進することは、公知である。その一方で、Ｄ−カルニチンが同じ酸化的作用を有することは知られていない。しかし、両方のカルニチンは、トリメチルアミンＮ−オキシドレベルを上昇させることができると考えられており、したがって、両方とも本開示に従って使用することができる。
【００３０】
[0032]これまで、Ｌ−カルニチンは、脂質低下剤として使用するための他の化合物と共に、栄養補給剤として使用されてきた。例えば、参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ公開公報第ＷＯ０３／０９９８５４号は、カルニチンとフィトステロールとを含む脂質低下組成物に向けられている。しかし、本開示で使用するカルニチンは、トリメチルアミンＮ−オキシドレベルを上昇させるために使用され、上記公開公報において開示されたものとは異なる機序のもとで動作する。
【００３１】
[0033]カルニチンに加えて、ＴＭＡＯ産生剤は、ベタインも含むことができる。前記ベタインは、ベタイン塩、ベタインのカルボン酸誘導体、および／またはベタイン／アミノ酸複合体もしくは化合物を含むことができる。哺乳動物による消費に対して安全であり、哺乳動物におけるトリメチルアミンＮ−オキシドレベルを上昇させる、任意の好適なベタインを使用することができる。本開示に従って使用することができるベタインの例としては、トリメチルグリシン（標準ベタイン）、塩酸ベタイン、クエン酸二水素ベタイン（クエン酸ベタイン）、ベタイン一水和物、アスパラギン酸ベタインナトリウム、ベタイン−
グリコシアミン、ガンマ−ブチロベタイン、プロリン−ブタン、グルタミン酸ベタイン、コカミジルプロピルベタイン、またはこれらの混合物が挙げられる。
【００３２】
[0034]本開示の別の実施形態では、ＴＭＡＯ産生剤は、コリン化合物を含む。一般に、哺乳動物による消費に対して安全であり、哺乳動物におけるトリメチルアミンＮ−オキシドレベルを上昇させることができる、任意の好適なコリン化合物を使用することができる。
【００３３】
[0035]図７は、５ステージを経るアテローム動脈硬化症の進行を示す。ステージＩは、アテローム動脈硬化性プラークのない正常な動脈を示すが、ステージＩＩは、動脈内腔の最も近くの脂質蓄積マクロファージからなる大きいプラークの中心部に柔軟な鱗状の物質が結節状蓄積を形成する、早期アテロームを示す。このステージでは、プラークは、脂質に富むコアを有する。この早期アテロームは、より小さい脂質プールと厚い線維性被膜と保たれた内腔とを有する「安定化された」プラークで発生しうるが、そのアテロームが「不安定プラーク」に発達することもある。ステージＩＩＩが示すように、「不安定プラーク」では、脂質に富むコアが成長し続け、炎症細胞が蓄積し、細胞外マトリックスが分解し始め、その結果、薄い線維性被膜の形成に至る。この薄い線維性被膜が乱されると、プラークはステージＩＶで示されるよう破裂し、血栓形成物質を血液中に放出しうる。この破裂は、血栓形成につながる可能性があり得、血栓形成は、血管の長時間の閉塞により、急性心筋梗塞をもたらしうる。ステージＶでは、この破裂後、創傷治癒応答が起こることがあり、その結果、線維性内膜および狭い内腔をもたらす。
【００３４】
[0036]ＴＭＡＯ産生剤の使用によって哺乳動物におけるトリメチルアミンＮ−オキシドレベルを上昇させることにより、アテローム動脈硬化症および他の関連疾患を治療および／または予防することができる。トリメチルアミンＮ−オキシドレベルの上昇が動脈病変および特に大動脈病変を低減させることを発見した。公知ではないが、トリメチルアミンＮ−オキシドにはアテローム動脈硬化症発症に対して保護効果があるようである。病変が発生し始めると、体内のトリメチルアミンＮ−オキシドレベル上昇が代償機序として作用するようである。ＴＭＡＯ産生剤の消費の増加は、大動脈組織の脂質含有量および血漿レベルに対して有意な影響を及ぼさず、ならびに泡沫細胞形成に対して有意な影響を及ぼさないと考えられる。それ故、公知ではないが、トリメチルアミンＮ−オキシドレベル上昇の結果としての病変の減少は、アテローム動脈硬化症発症の後期に起こると考えられる。例えば、トリメチルアミンＮ−オキシドレベル上昇は、病変の退縮における作用因子として役立つことができる。
【００３５】
[0037]この発見は、体内のトリメチルアミンＮ−オキシドの存在に関するよくある誤解であると考えられることに鑑みて、特に驚くべきものである。例えば、アテローム動脈硬化症を治療または予防するのではなく、当業者は、トリメチルアミンＮ−オキシドが実際にアテローム動脈硬化症を発症させることを指摘してきた。例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔらによる「Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ−Ｎ−Ｏｘｉｄｅ，Ａ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｅｘｈｉｂｉｔｓ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」と題する論文は、トリメチルアミンＮ−オキシドがアテローム動脈硬化症と強く関連している代謝産物として同定されることを述べている。この文献によると、トリメチルアミンＮ−オキシドは、一つには、マクロファージ内のコレステロール蓄積を、恐らく、マクロファージによる修飾リポタンパク質の取り込みに関与するスカベンジャー受容体を誘導して泡沫細胞形成に寄与することにより、促進することによって、アテローム動脈硬化症の発症に寄与するようである。他の研究も、この関連性に基づいて、トリメチルアミンＮ−オキシドが心疾患の発症を促進すると結論づけている。したがって、アテローム動脈硬化症を治療または予防するための患者へのＴＭＡＯ産生剤の投与は、予想外の驚くべき発見である。
【００３６】
[0038]本開示に従って、ＴＭＡＯ産生剤を、任意の好適な投与経路を使用して任意の好適な形態で任意の哺乳動物に投与することができる。例えば、ＴＭＡＯ産生剤を単独でまたは食品組成物と併用で経口投与することができる。一実施形態では、ＴＭＡＯ産生剤は、栄養補助剤、食品、飲料、機能性食品組成物の一部であることもあり、または医薬品として存在することもある。
【００３７】
[0039]アテローム動脈硬化症または関連疾患を治療するために任意の哺乳動物にＴＭＡＯ産生剤を投与することができる。既にアテローム動脈硬化症に罹患しているまたはアテローム動脈硬化症に関連するいずれかの障害に既に罹患している哺乳動物にも、ＴＭＡＯ産生剤を投与することができる。詳細には、動脈病変の形成を被る、または被っている可能性がある任意の哺乳動物に、ＴＭＡＯ産生剤を投与することができる。本開示の方法は、冠動脈障害、血管障害、動脈瘤、動脈疾患などを治療するために使用することができる。
【００３８】
[0040]本開示に従って治療される患者は、本方法からの恩恵に浴することができるあらゆる哺乳動物を含むことができる。例えば、哺乳動物は、イヌ、ネコまたはウマであってもよい。患者は、ウシまたはブタであってもよい。一実施形態では、患者はヒトである。
【００３９】
[0041]本開示に従って哺乳動物に投与されるＴＭＡＯ産生剤の量は、様々な因子および状況に依存して変わることがある。例えば、量は、患者の食生活および代謝、患者の年齢、患者が血管疾患またはアテローム動脈硬化症に現在罹患しているかどうかなどに依存しうる。一実施形態では、ＴＭＡＯ産生剤は、約４０ｍｇ／ｋｇ（体重１ｋｇ当りのＴＭＡＯ産生剤のｍｇ）〜約１，０００ｍｇ／ｋｇの用量で哺乳動物に投与される。例えば、ＴＭＡＯ産生剤を約４０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約６０ｍｇ／ｋｇより多い用量で哺乳動物に投与することができる。多くの患者にとって、多い量のほうがトリメチルアミンＮ−オキシドレベルを所望のレベルに増加させることができる。例えば、一実施形態では、ＴＭＡＯ産生剤は、約１５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約１７０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約２００ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約２２０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約２５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約３００ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約３５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約４００ｍｇ／ｋｇより多い用量で哺乳動物に投与される。一般に、ＴＭＡＯ産生剤は、約１，０００ｍｇ／ｋｇ未満、例えば約９００ｍｇ／ｋｇ未満、例えば約８００ｍｇ／ｋｇ未満の量で哺乳動物に投与される。
【００４０】
[0042]ＴＭＡＯ産生剤を定期的な間隔で、例えば１日１回または２回、哺乳動物に投与することができる。他の実施形態では、ＴＭＡＯ産生剤を１週間に少なくとも１〜３日、例えば少なくとも２〜４回、哺乳動物に投与することができる。１つの特定の実施形態では、ＴＭＡＯ産生剤は、毎日患者に投与される。例えば、上記の投与量は、ＴＭＡＯ産生剤が１日１回より多く投与される場合であっても１日当りの用量を指すことがある。
【００４１】
[0043]一実施形態では、ＴＭＡＯ産生剤の定期的投与中にトリメチルアミンＮ−オキシドレベルが測定される。このようにして、血液中の所望のトリメチルアミンＮ−オキシドレベルへの到達に基づいて哺乳動物に投与するＴＭＡＯ産生剤の量を調整することができる。
【００４２】
[0044]上で説明したように、ＴＭＡＯ産生剤をサプリメントとして、および／または食品組成物と共に、哺乳動物に投与することができる。一実施形態では、ＴＭＡＯ産生剤を、許容される担体または賦形剤を含有する医薬組成物の形態で哺乳動物に投与することができる。例えば、薬学的に許容される担体は、体内のトリメチルアミンＮ−オキシドレベルを上昇させるＴＭＡＯ産生剤の能力に干渉しないあらゆる組成物を含むことができる。そのような担体には、溶媒、分散媒、コーティングなどが含まれてよい。ＴＭＡＯ産生剤と配合することができる特定の材料としては、水、食塩水、ポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、植物油などが挙げられる。ＴＭＡＯ産生剤と配合することができる他の成分としては、生分解性ポリマー、例えばラクチドなどが挙げられる。
【００４３】
[0045]一般に、ＴＭＡＯ産生剤は、哺乳動物に経口投与される。しかし、一般に、トリメチルアミンＮ−オキシドレベルを上昇させることができる任意の好適な形態でＴＭＡＯ産生剤を哺乳動物に投与することができる。例えば、鼻腔内、胃内、注射などのような他の経路を使用してＴＭＡＯ産生剤を投与することもできる。
【００４４】
[0046]一実施形態では、ＴＭＡＯ産生剤は、キットまたはシステムの形態で患者または介護者に提供される。例えば、哺乳動物から採取した血液試料中のトリメチルアミンＮ−オキシドレベルの測定を促進する物品と共にＴＭＡＯ産生剤を提供することができる。物品は、例えば、血液中のトリメチルアミンＮ−オキシドレベルを判定または解釈するのに使用される情報資料または教示資料を含むことができる。物品は、採血デバイスを含むこともできる。さらに別の実施形態では、物品は、トリメチルアミンＮ−オキシドアッセイデバイスを含むことができる。
【００４５】
[0047]以下の実施例を参照して本開示をよりよく理解することができる。
【実施例】
【００４６】
[0048]本発明をさらに例証するために、しかし本発明の範囲を限定するためにではなく、以下の実施例を提供する。本発明の他の変形は、当業者には直ぐに分かるであろうし、添付の特許請求の範囲によって包含される。
【実施例１】
【００４７】
[0049]アテローム動脈硬化症のマウスモデルにおいて血清脂質プロファイルおよびアテローム動脈硬化症の進行に基づいてＬ−カルニチンおよびＦＭＡＯ阻害剤メチマゾールの治療効果を観察した。雄で６〜７週齢のＡｐｏＥ  ＫＯマウスにｉｎ  ｖｉｖｏでＡＡＶ−ＣＥＴＰをトランスフェクトした。感染の２週間後、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して血漿におけるＣＥＴＰ発現を検証し、マウスを西洋（高脂肪）食で飼育した。
【００４８】
[0050]マウスを、初期総コレステロールと検証ＣＥＴＰ発現のマッチングに基づいていくつかの群に分類した：１．ｄＨ２Ｏの投与を受ける対照群。２．Ｌ−カルニチンの高用量投与（３５．２ｍｇ／ｍＬ  ｄＨ２Ｏ）を受ける群。３．Ｌ−カルニチンの低用量投与（８．７ｍｇ／ｍＬ  ｄＨ２Ｏ）を受ける群。４．Ｌ−カルニチンの高用量投与（３５．２ｍｇ／ｍＬ  ｄＨ２Ｏ）およびメチマゾールの投与（１．５ｍｇ／ｍＬ  ｄＨ２Ｏ）を受ける群。５．メチマゾールの投与（１．５ｍｇ／ｍＬ  ｄＨ２Ｏ）を受ける群。
【００４９】
[0051]マウスが１０週齢に達したら投薬を開始し、１２週間継続した。薬物を強制経口投与によって１日１回投与した。動物の体重を週１回測定した。この研究中に治療群間で体重の統計的に有意な変化は観察されなかった（図２）。
【００５０】
[0052]液体クロマトグラフィー−質量分析法を使用して、血漿中のＬ−カルニチンおよびＴＭＡＯの濃度を測定した。異なる技法による重みを用いて重水素標識Ｌ−カルニチン標準原液を調製した。Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの約５ｍｇのｄ９−Ｌ−カルニチンを１０ｍＬメスフラスコに、秤量漏斗または秤量紙によって加え、水：メタノール＝１：１を使用して試料を溶解した。２５±２ｍｇのｄ
９−トリメチルアミンＮ−オキシド参照標準物質を正確に秤量し、この試料を２５ｍＬメスフラスコに移し、約１５ｍＬの水：メタノール＝１：１を加え、溶解するまでボルテックスすることによって、重水素標識ＴＭＡＯ標準原液を調製した。その後、フラスコの容積を水：メタノール＝１：１で満たした。
【００５１】
[0053]１０ｍＬの水／メタノール中の５ｍｇのｄ９−Ｌ−カルニチンと、２５ｍＬの水／メタノール中の２５ｍｇのｄ９−ＴＭＡＯを使用して、重水素標識Ｌ−カルニチンおよび重水素標識ＴＭＡＯの標準原液を調製した。これらの標準原液を使用して、２００μＬのｄ９−Ｌ−カルニチン標準原液および１０μＬのｄ９−ＴＭＡＯを５０ｍＬメスフラスコに加え、容積にアセトニトリルを加え、十分に混合することによって、内部標準物質を調製した。
【００５２】
[0054]その後、較正標準物質を調製した。Ｌ−カルニチン標準原液を製造するために、２５±２ｍｇのＬ−カルニチン参照標準物質を１０ｍＬメスフラスコに移し、おおよそ７ｍＬの水：メタノール＝１：１を加えた。この溶液を溶解するまでボルテックスし、水：メタノール＝１：１で容積を満たした。トリメチルアミンＮ−オキシド標準原液を製造するために、２５±２ｍｇのＬ−カルニチン参照標準物質を２５ｍＬメスフラスコに移し、１５ｍＬの水：メタノール＝１：１を加えた。この溶液を溶解するまでボルテックスし、水：メタノール＝１：１で容積を満たした。その後、これらの標準原液を使用して、４８０μＬのＬ−カルニチン標準原液および１００μＬのトリメチルアミンＮ−オキシドを１０ｍＬフラスコにピペットで移し、容積に水：メタノール＝１：１を加え、十分に混合することによって、中間標準物質を調製した。
【００５３】
[0055]作業用標準物質は、希釈剤として水を使用して表１に従って調製した。各標準物質について、指定量の中間標準物質を別個の１０ｍＬメスフラスコにピペットで移し、７ｍＬの水を加えた。この溶液を溶解するまでボルテックスし、水で容積を満たした。
【００５４】
【表１】
2020196735.tif 000003
【００５５】
[0056]作業用較正標準物質は、２．５ｍＬの作業用標準溶液、２．５ｍＬの水、および５ｍＬの内部標準溶液をピペットでフラスコに移し、十分に混合することによって調製した。
【００５６】
[0057]血漿試料溶液も調製した。血漿試料溶液については、先ず５０μＬのマウス血漿試料、次いで５０μＬの水を２ｍＬ遠心管に加え、十分に混合した。次に、１００μＬの内部標準溶液を遠心管に加え、キャップをしっかり締めた後、２分間ボルテックスした。その後、この混合物を遠心分離した。添加回収率および添加血漿試料調製のための血漿ブランク溶液を同様に調製した。血漿ブランク溶液については、５０μＬのマウス血漿ブランク、次いで５０μＬの水をピペットで２ｍＬ遠心管に移し、十分に混合し、その後、１
００μＬの内部標準溶液をピペットで移した。この混合物を２分間ボルテックスし、次いで遠心分離した。添加血漿試料調製のために、５０μＬのマウス血漿ブランク、次いで５０μＬのＬ−カルニチンおよびトリメチルアミンＮ−オキシド作業用標準物質を２ｍＬの遠心管に加えた。この溶液を十分に混合し、次いで１００μＬの内部標準溶液を管に加えた。キャップをしっかり締めた後、この混合物を２分間ボルテックスし、次いで遠心分離した。各試料について、上部上清を分析用に採取した。
【００５７】
[0058]下の表２および３の明細に従って高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析を使用して試料を分析した。
【００５８】
【表２】
2020196735.tif 000004
【００５９】
【表３】
2020196735.tif 000005
【００６０】
[0059]対応する内部標準物質へのＬ−カルニチン／ＴＭＡＯの応答（ピーク面積の比）に対して濃度をプロットすることにより、標準較正曲線を作成した。各血漿試料について、試料中における内部標準物質に対するＬ−カルニチン／ＴＭＡＯの応答を標準較正曲線と比較して、Ｌ−カルニチン／ＴＭＡＯの濃度を決定した。較正範囲内で達成される線形応答は、Ｌ−カルニチンについては０．９９４５、およびトリメチルアミンＮ−オキシドについては０．９９９４の相関係数計算値を有した。一般回帰を使用して検出限界および定量限界も決定した。検出限界および定量限界の計算値は、それぞれ、Ｌ−カルニチンについては０．３および０．１１μｇ／ｍＬ、ならびにトリメチルアミンＮ−オキシドについては０．０３および０．１０μｇ／ｍＬであった。Ｌ−カルニチンおよびトリメチルアミンＮ−オキシドの分析に対するこの方法の特異度も得た。Ｌ−カルニチンおよびトリメチルアミンＮ−オキシドは、３．８および４．４分のそれぞれの滞留時間で完全に分解された。２つの異なるレベルのＬ−カルニチンおよびトリメチルアミンＮ−オキシドを含有する試料の回収率分析からこの方法の精度を決定した。レベル１は、１．２μｇ／ｍＬのＬ−カルニチンおよび０．１μｇ／ｍＬのトリメチルアミンＮ−オキシドを含有し、レベル２は、３μｇ／ｍＬのＬ−カルニチンおよび０．２５μｇ／ｍＬのトリメチルアミンＮ−オキシドを含有した。添加試料からのＬ−カルニチンおよびトリメチルアミンＮ−オキシドの回収率は、それぞれ、９５．６±０．０４％（ｎ＝５）および９６．４±０．０３％（ｎ＝５）であった。
【００６１】
[0060]高用量（３５２ｍｇ／ｋｇ）のＬ−カルニチンおよび低用量（８７ｍｇ／ｋｇ）のＬ−カルニチンで処置したマウスは、対照ビヒクルと比較して血漿中のＬ−カルニチンの濃度の有意な上昇を示した（図３）。メチマゾール（１５ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスは、対照ビヒクルと比較してＬ−カルニチンの濃度の有意な低下を有することが証明された（図３）。高用量（３５２ｍｇ／ｋｇ）Ｌ−カルニチン処置、および高用量（３５２ｍｇ／ｋｇ）Ｌ−カルニチンとメチマゾールの併用処置は、両方とも、ビヒクル対照中のＴＭＡＯの濃度と比較してＴＭＡＯの濃度の統計的に有意な上昇を示した（図４）。ＴＭＡＯ測定値は、対象間の高い相互変差（ｉｎｔｅｒ−ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）を示した。
【００６２】
[0061]胸部大動脈および大動脈根の洞上行大動脈移行部に存在する病変の量を測定することによって、アテローム動脈硬化症進行に対するＬ−カルニチンおよび／またはメチマゾールでの処置の効果を判定した。１２週間の処置後、マウスを屠殺し、それらの組織を分析のために除去した。ｅｎ−ｆａｃｅ胸部大動脈を単離し、存在する脂肪のトリミングおよび４８〜７２時間のホルマリンでの大動脈の固定によって分析用に調製した。形態計測ｅｎ  ｆａｃｅ分析のために、大動脈を適切に並べ、黒色マトリックス上にピンで留め、脂質結合染料Ｓｕｄａｎ  ＩＶで染色して、病変が存在する胸部大動脈のパーセンテージを決定した。Ｎｉｋｏｎコンピュータ画像解析システムを使用して、病変面積率（ｓｕｒｆａｃｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）について血管を撮像した。ｅｎ  ｆａｃｅ分析は、Ｌ−カルニチンおよび／またはメチマゾールでの処置後に胸部大動脈に存在するプラークの量の有意な変化を明示しなかった（図５）。しかし、０．１ｐｐｍより低いＴＭＡＯレベルに対して０．１ｐｐｍより高いＴＭＡＯレベルで胸部大動脈の病変面積パーセントの有意な減少が観察された（図６）。
【００６３】
[0062]大動脈根に存在するプラークの量を測定するために、大動脈の残部からおおよそ５ｍｍの上行大動脈を切断し、心尖を除去し、残りの心臓を付随の大動脈部と共にＯＣＴ培地に入れ、それをドライアイス／２−メチルブタン浴で凍結させることによって、大動脈洞を分析用に調製した。図１は、洞上行大動脈移行部１２の下に位置する大動脈根１０を示す。上行大動脈で始まって、心室腔に達するまで大動脈洞から長さ１０μｍ（１０μＭ  ｉｎ  ｌｅｎｇｔｈ）の切片を切断した。次いで、それらの大動脈洞切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、Ｎｉｋｏｎコンピュータ画像解析システムを使用して５ステップレベルで撮像した。Ｌ−カルニチンまたはメチマゾール処置を受けたすべてのマウスは、大動脈根におけるプラークの量の小さいが有意な低減を示した（図７）。
【００６４】
本発明は、下記の態様も包含する。
態様１
動脈（artherio）病変を治療するための方法であって、
哺乳動物にＴＭＡＯ産生剤を投与するステップを含み、該ＴＭＡＯ産生剤が、摂取または注射されたとき該哺乳動物の体内でＴＭＡＯを形成する化合物を含み、該ＴＭＡＯ産生剤が、哺乳動物の血液中のＴＭＡＯレベルを上昇させるために薬学的に有効な量で該哺乳動物に投与される方法。
態様２
態様１に記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤の定期的投与中に該哺乳動物の血液中のＴＭＡＯのレベルをモニターするステップをさらに含む方法。
態様３
態様２に記載の方法であって、該血液中のＴＭＡＯの量を増加または減少させるために、該血液中のモニターされたＴＭＡＯのレベルに基づいて該哺乳動物に投与されるＴＭＡＯ産生剤の量を調整するステップをさらに含む方法。
態様４
態様１に記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤が、カルニチン、例えば、Ｌ−カルニチンまたはＤ−カルニチンを含む方法。
態様５
態様１に記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤がコリンを含む方法。
態様６
態様１に記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤がベタインを含む方法。
態様７
態様１に記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤が、カルニチン、コリンおよびベタインからなる群から選択される少なくとも２種のＴＭＡＯ産生剤の混合物を含む方法。
態様８
態様１に記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤がＴＭＡＯ前駆体を含む方法。
態様９
態様１に記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤がＴＭＡＯ類似体を含む方法。
態様１０
態様１〜９のいずれかに記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤が該哺乳動物によって摂取される方法。
態様１１
態様１〜１０のいずれかに記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤が該哺乳動物に注射される方法。
態様１２
態様１〜１１のいずれかに記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤が、アテローム動脈硬化症、またはアテローム動脈硬化症に関連するかもしくはアテローム動脈硬化症によって媒介される障害、に罹患しているかまたは発症するリスクがある哺乳動物に投与される方法。
態様１３
態様１〜１２のいずれかに記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤が末梢血管疾患に罹患している哺乳動物に投与される方法。
態様１４
態様１〜１３のいずれかに記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤が、５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約７０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約１００ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約１５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約２００ｍｇ／ｋｇより多い、例えば２５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約３００ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約３５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約４００ｍｇ／ｋｇより多い用量で該哺乳動物に投与される方法。
態様１５
態様１〜１４のいずれかに記載の方法であって、該ＴＭＡＯ産生剤が該哺乳動物に１日１回または２回投与される方法。
態様１６
態様１〜１５のいずれかに記載の方法であって、該哺乳動物がヒト患者を含む方法。
態様１７
態様１〜１６のいずれかに記載の方法であって、該哺乳動物がネコまたはイヌを含む方法。
態様１８
アテローム動脈硬化症、またはアテローム動脈硬化症に関連するかもしくはアテローム動脈硬化症によって媒介される障害、に罹患している哺乳動物を治療するためのシステムまたはキットであって、
複数投与量のＴＭＡＯ産生剤であって、該ＴＭＡＯ産生剤は、摂取または注射されたときにトリメチルアミンに化学的に転換する化合物を含み、各投与量が該哺乳動物の血液中でＴＭＡＯレベルを上昇させるのに十分なものである複数投与量；及び
該哺乳動物から採取した血液試料中のＴＭＡＯレベルのモニターを促進する物品；
を含むシステムまたはキット。
態様１９
態様１８に記載のシステムまたはキットであって、該ＴＭＡＯ産生剤がカルニチンを含むシステムまたはキット。
態様２０
態様１８に記載のシステムまたはキットであって、該ＴＭＡＯ産生剤がコリンを含むシステムまたはキット。
態様２１
態様１８に記載のシステムまたはキットであって、該ＴＭＡＯ産生剤がベタインを含むシステムまたはキット。
態様２２
態様１８、１９、２０または２１に記載のシステムまたはキットであって、該ＴＭＡＯの各投与量が、治療される哺乳動物に基づき、１５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約２００ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約２５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約３００ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約３５０ｍｇ／ｋｇより多い、例えば約４００ｍｇ／ｋｇより多いシステムまたはキット。
態様２３
態様１８〜２２のいずれかに記載のシステムまたはキットであって、該物品が、血液中のＴＭＡＯレベルを判定または解釈するのに使用される情報資料または教示資料を含むシステムまたはキット。
態様２４
態様１８〜２３のいずれかに記載のシステムまたはキットであって、該物品が採血デバイスを含むシステムまたはキット。
態様２５
態様１８〜２３のいずれかに記載のシステムまたはキットであって、該物品がＴＭＡＯアッセイデバイスを含むシステムまたはキット。
態様２６
血漿試料中の、ＴＭＡＯ、ＴＭＡＯ前駆体またはＴＭＡＯ類似体を含む分析対象物レベルを検出する方法であって、
既知だが変動する濃度の非標識分析対象物と既知の固定濃度の同位体標識分析対象物とを含む少なくとも２つの作業用標準混合物を生成し；
該作業用標準混合物を分析して、分析対象物の濃度の、該非標識分析対象物の分析の該同位体標識分析対象物との比較、に対する相関関係を創出し；
血漿試料、水、および既知の固定濃度の該同位体標識分析対象物を含む少なくとも１つの血漿試料溶液を生成し；
血漿ブランク、水、およびと既知の固定濃度の該同位体標識分析対象物を含む血漿ブランク溶液を生成し；
血漿ブランク、既知の変動する濃度の該非標識分析対象物、および既知の固定濃度の該同位体標識分析対象物を含む、少なくとも１つ添加（spiked）血漿試料を生成し；
該血漿試料溶液、該血漿ブランク溶液、および該少なくとも１つの添加血漿試料を分析し、該血漿試料中の分析対象物の分析を、該同位体標識内部標準物質と基準と比較することによって、該血漿試料溶液中の分析対象物の濃度を決定する
ことを含む方法。
態様２７
態様２６に記載の方法であって、該作業用標準混合物、血漿試料溶液、血漿ブランク溶液、および該少なくとも１つの添加血漿試料が、液体クロマトグラフィー／質量分析を使用して分析される方法。
態様２８
態様２６又は２７に記載の方法であって、添加血漿試料が各作業用標準混合物に対応して生成される方法。
態様２９
態様２６、２７または２８に記載の方法であって、約４〜約８の作業用標準混合物が生成される方法。
[0063]添付の特許請求の範囲により詳細に記載する本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明のこれらおよび他の修飾形態および変形形態を当業者は実施することができる。加えて、様々な実施形態の態様を全体的にも、部分的にも交換することができることを理解されたい。さらに、上述の説明が、例としてのものに過ぎず、そのような添付の特許請求の範囲にさらに記載するように本発明を限定することを意図したものではないことは、当業者には理解されるであろう。 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月16日(2020.9.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胸部大動脈病変を治療するための医薬であって、
ＴＭＡＯ産生剤を含み、該ＴＭＡＯ産生剤が、摂取または注射されたとき該哺乳動物の体内でＴＭＡＯを形成する化合物を含み、該ＴＭＡＯ産生剤が、該哺乳動物の血液中のＴＭＡＯレベルを０．１ｐｐｍ以上生じるのに十分な量で該哺乳動物に投与される医薬であって、
該ＴＭＡＯ産生剤が、カルニチン、コリン、ベタイン、またはそれらの組合せを含み、該カルニチンが、Ｌ−カルニチン、またはＤ−カルニチンを含み、該ベタインが、ベタイン塩、ベタインのカルボン酸誘導体、若しくは、ベタイン／アミノ酸複合体若しくは化合物、または、それらの組み合わせを含む、医薬。
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月17日(2020.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動脈（artherio）病変を治療するための方法であって、
哺乳動物にＴＭＡＯ産生剤を投与するステップを含み、該ＴＭＡＯ産生剤が、摂取または注射されたとき該哺乳動物の体内でＴＭＡＯを形成する化合物を含み、該ＴＭＡＯ産生剤が、哺乳動物の血液中のＴＭＡＯレベルを上昇させるために薬学的に有効な量で該哺乳動物に投与される方法。
【外国語明細書】
2020196735000001.pdf