(57)【要約】【課題】男性の受精能状態を決定するための方法および試験キットを提供すること。【解決手段】本開示は、男性の受精能状態を決定するための方法を提供する。本方法は、誘導された精子の受精能獲得後のＧＭ１局在パターンを決定するステップと、種々のパターンの百分率、特に、［（ＡＡ＋ＡＰＭ）／ＧＭ１局在パターンの総数］の比を特定するステップと、誘導された受精能獲得に応答したある特定のＧＭ１局在パターンの百分率が変化するかどうかを決定するステップとを含む。誘導された受精能獲得に応答したある特定のパターンの局在パターンの百分率の変化に基づき、単独でまたは他の精子の属性性状と組み合わせて、男性の受精能状態を特定することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年２月１７日に出願された米国仮出願第６２／２９６，４２０号、２０１６年４月１４日に出願された米国仮出願第６２／３２２，２５２号、２０１６年４月２８日に出願された米国仮出願第６２／３２８，８９０号（これらの各々は、その全体が援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、一般に、男性の受精能の分野、より詳細には、誘導された精子の受精能獲得後のＧＭ１ガングリオシドの分布パターンに基づいて、男性の受精能状態を決定することに関する。
【背景技術】
【０００３】
米国では、カップルのうちの１０％が不妊に関して医療機関の予約をしており、不妊の４０％は男性に関連するものである。世界的には、このことにより、７３００万人を超える不妊カップルが存在すると解釈される。典型的な男性のリプロダクティブヘルス検査では、精子の数、外観、および運動性が評価される。残念ながら、不妊男性の半数の精子は、これらの記述的基準に対する正常なパラメータに合致し、自然受胎と子宮内受精法（ＩＵＩ）などの生殖補助技術の両方において繰り返し失敗した後、「突発性不妊」を有すると特定されるにすぎない。それぞれの失敗したサイクルは、カップルに多大な身体的、感情的、かつ経済的犠牲を払わせ、米国の医療制度では毎年５０億ドルを超えるコストがかかるため、精子の機能についての実用的試験についての多大な需要が存在する。精子の機能に関するデータによって、医師は、妊娠する最善の機会を患者に与える生殖補助技術へと自身の患者を導くことが可能となる。
【０００４】
女性の生殖管へ入ると、精子は、すぐに卵子と受精できる訳ではない。むしろ、精子は、「受精能獲得」として公知の機能的成熟の過程を経なければならない。この過程は、精子の細胞膜内における特異的変化、すなわち、受精能獲得のための刺激への曝露に応答したガングリオシドＧＭ１の分布パターンの変化を有することによる、特異的刺激に応答する精子の能力に依拠する。
【０００５】
種々のＧＭ１局在パターンが特定されており、受精能獲得または非受精能獲得と関連している。特に、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンは、ウシおよびヒトの精子の受精能獲得と関連している。精子の受精能獲得は、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）値として定量的に表すことができ、この値は、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）Ｓｐｅｒｍ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ（「Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）Ｔｅｓｔ」または「Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ」）によって得られ、（［先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンの数＋先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンの数］／標識されたＧＭ１局在パターンの総数）として定義され、ここで、各局在パターンの数が測定され、次いで、最終的には百分率スコアに変換される。ＡＰＭのＧＭ１局在パターンおよびＡＡのＧＭ１局在パターンに加えて、他の標識された局在パターンには、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、中間（ＩＮＴＥＲ）のＧＭ１局在パターン、先体後方細胞膜（ＰＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、先体頂部／先体後方（ＡＡ／ＰＡ）のＧＭ１局在パターン、赤道セグメント（ＥＳ）のＧＭ１局在パターン、および散在性（ＤＩＦＦ）のＧＭ１局在パターンが含まれた（Ｔｒａｖｉｓら、「Ｉｍｐａｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｓｅｍｅｎ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ、１９５巻（４号）、ｅ９０９頁（２０１６年））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｒａｖｉｓら、「Ｉｍｐａｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｓｅｍｅｎ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ（２０１６年）１９５巻（４号）、ｅ９０９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施形態では、本明細書で開示されているのは、男性の受精能状態を決定するための方法およびキットである。一実施形態では、本開示は、誘導されたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得に応答したある特定のＧＭ１局在パターンの数の変化に基づいて、男性の受精能状態を特定するための方法について記載している。一実施形態では、ＧＭ１局在パターンは、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンである。
【０００８】
本明細書で開示されている実施形態は、男性の受精能状態を決定するための方法である。一実施形態では、本方法は、以下のステップを含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子細胞の試料を、蛍光標識で処理する。１つまたは複数の受精能を獲得した蛍光画像を得、画像は、蛍光標識されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子細胞と関連する１つまたは複数のＧＭ１局在パターンを示す。先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、それぞれ、受精能獲得蛍光画像においてそれぞれ示された、受精能を獲得した状態に割り当て、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得していない状態に割り当てる。［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率を決定するために、受精能獲得蛍光画像で示された、蛍光標識されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子細胞に対するＡＡのＧＭ１局在パターン、ＡＰＭのＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを含むＧＭ１局在パターンの数を測定する。一実施形態では、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率と関連する受精能の閾値が決定され、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率は、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；基準平均百分率の２標準偏差下である百分率未満であると不妊であることを示す。標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率を、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較する。受精能の閾値を、この比較に基づいて特定する。
【０００９】
別の実施形態では、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率と関連する受精能の閾値が決定され、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率は、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと通常の男性の受精能を示し；基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であると異常な男性の不妊を示す。標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率は、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較される。受精能の閾値は、この比較に基づいて特定される。
【００１０】
本明細書で開示されている別の実施形態は、男性の受精能状態を決定するための方法である。一実施形態では、本方法は、男性に由来する精子試料の第１の部分を非受精能獲得条件に曝露して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料を得るステップと；精子試料の第２の部分を受精能獲得条件に曝露して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を得るステップと；ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、少なくとも１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間または２４時間、固定剤で固定するステップと；固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、ＧＭ１局在パターンのための標識分子で処理するステップであって、標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記標識されたＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料に対する標識されたＧＭ１局在パターンを、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する標識されたＧＭ１局在パターンと比較するステップと；比較に基づいて、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得した状態に割り当て、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得していない状態に割り当てるステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対して、特定され、標識されたＧＭ１局在パターンに基づいて、男性の受精能状態を特徴付けるステップとを含む。一実施形態では、特徴付けるステップは、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率に関連する受精能の閾値を決定するステップであって、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率が、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；基準平均百分率の２標準偏差下より大きいと不妊であることを示す、ステップを含む。標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在��ターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率は、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較される。受精能の閾値は、この比較に基づいて特定される。
【００１１】
別の実施形態では、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率と関連する受精能の閾値が決定され、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率は、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと通常の男性の受精能を示し；基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であると異常な男性の不妊を示す。標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率は、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較される。受精能の閾値は、この比較に基づいて特定される。
【００１２】
一実施形態では、曝露するステップの前に、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用し、精液の粘度を低下させるために使用される種々の試薬から選択された、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精液試料を処理して、精液の粘度を低下させる。このような一部の実施形態では、膜に損傷を与える試薬として、（ｉ）プロテアーゼ、（ｉｉ）ヌクレアーゼ、（ｉｉｉ）粘液溶解剤、（ｉｖ）リパーゼ、（ｖ）エステラーゼ、および（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼが潜在的に挙げられる場合がある。一部の実施形態では、特定するステップは、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が実質的に一定となるまで繰り返される。このような一実施形態では、特定するステップの後、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子に対するＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が標識された細胞の総数の５％未満、３％未満となるか、または標識された細胞の総数の１％〜５％、２〜５％の範囲となるまで、その数を決定するステップが実施される。このような別の実施形態では、特定するステップが実施された後、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子に対するＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が標識された細胞の総数の２５％、２０％、１５％もしくは１０％未満となるか、または標識された細胞の総数の２％〜２５％、２％〜２０％、２〜１５％、２〜１０％、２〜５％の範囲となるまで、その数が決定される。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージまたは１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍまたは１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。
【００１３】
このような別の実施形態では、特徴付けるステップは、所定数の、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと；所定数の、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料に対する標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップとをさらに含む。
【００１４】
本明細書で開示されている一実施形態では、本方法は、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子の比を、公知の受精能状態を有する、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子の比と比較するステップと、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子の比を、公知の受精能状態を有する、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子の比と比較するステップとをさらに含む。
【００１５】
本明細書で開示されているさらに別の実施形態は、男性の受精能状態を決定するための方法である。一実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非受精能獲得条件に曝露され、少なくとも１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間または２４時間、固定剤で固定され、かつＧＭ１局在パターンのための標識分子で処理された、男性に由来する精子試料の第１の部分を得るステップであって、標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと；ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露され、固定剤で固定され、かつＧＭ１局在パターンのための標識分子で処理された精子試料の第２の部分を得るステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記標識されたＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料に対する標識されたＧＭ１局在パターンを、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する標識されたＧＭ１局在パターンと比較するステップと；比較に基づいて、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得した状態に割り当て、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得していない状態に割り当てるステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対して、特定され、標識されたＧＭ１局在パターンに基づいて、男性の受精能状態を特徴付けるステップとを含む。このような一実施形態では、特徴付けるステップは、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率に関連する受精能の閾値を決定するステップであって、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率が、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；基準平均百分率の２標準偏差下である百分率未満であると不妊であることを示す、ステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率を、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較するステップ���；受精能の閾値を、この比較に基づいて特定するステップとを含む。
【００１６】
別の実施形態では、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率と関連する受精能の閾値が決定され、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率は、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと通常の男性の受精能を示し；基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であると異常な不妊を示す。標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率は、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較される。受精能の閾値は、この比較に基づいて特定される。
【００１７】
一部の実施形態では、特定するステップは、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が実質的に一定となるまで繰り返される。このような一実施形態では、特定するステップの後、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子に対するＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が、標識された細胞の総数の５％未満、３％未満となるか、または標識された細胞の総数の１％〜５％、２〜５％の範囲となるまで、その数を決定するステップが実施される。このような別の実施形態では、特定するステップの後、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子に対するＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が標識された細胞の総数の２５％、２０％、１５％もしくは１０％未満となるか、または標識された細胞の総数の２％〜２５％、２％〜２０％、２〜１５％、２〜１０％、２〜５％の範囲となるまで、その数を決定するステップが実施される。
【００１８】
このような方法の一実施形態では、本方法は、所定数の、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対するＧＭ１局在パターンそれぞれの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップとをさらに含む。
【００１９】
別の実施形態では、特徴付けるステップは、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料の比を、公知の受精能状態を有する男性に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子のＧＭ１局在パターンの比と比較するステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料の比を、公知の受精能状態を有する男性に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子のＧＭ１局在パターンの比と比較するステップとをさらに含む。
【００２０】
本明細書で開示されているさらにまた別の実施形態は、男性の受精能状態を決定するための方法である。一実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、男性に由来する精子試料を受精能獲得条件に曝露するステップと；受精能を獲得した精子試料を、少なくとも１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間または２４時間、固定剤で固定するステップと；固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、ＧＭ１局在パターンのための標識分子で処理するステップであって、標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと；標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記標識されたＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得した状態に割り当て、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび他の全ての標識されたＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得していない状態に割り当てるステップと；男性の受精能状態を特徴付けるステップとを含む。一実施形態では、特徴付けるステップは、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率に関連する受精能の閾値を決定するステップであって、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率が、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；基準平均百分率の２標準偏差下未満であると不妊であることを示す、ステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率を、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較するステップと；受精能の閾値を、この比較に基づいて特定するステップとを含む。
【００２１】
別の実施形態では、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率と関連する受精能の閾値が決定され、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率は、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと通常の男性の受精能を示し；基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であると異常な男性の不妊を示す。標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率は、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較される。受精能の閾値は、この比較に基づいて特定される。
【００２２】
一実施形態では、曝露するステップの前に、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用し、精液の粘度を低下させるために使用される種々の試薬から選択された、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精液試料を処理して、精液の粘度を低下させる。一部の実施形態では、膜に損傷を与える試薬は、（ｉ）プロテアーゼ、（ｉｉ）ヌクレアーゼ、（ｉｉｉ）粘液溶解剤、（ｉｖ）リパーゼ、（ｖ）エステラーゼ、および（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼからなる群より潜在的に選択され得る。一部の実施形態では、特定するステップは、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が実質的に一定となるまで繰り返される。このような一実施形態では、特定するステップの後、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子に対するＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が標識された細胞の総数の５％未満、３％未満となるか、または標識された細胞の総数の１％〜５％、２〜５％の範囲となるまで、その数を決定するステップが実施される。このような別の実施形態では、特定するステップの後、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子に対するＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が標識された細胞の総数の２５％、２０％、１５％もしくは１０％未満となるか、または標識された細胞の総数の２％〜２５％、２％〜２０％、２〜１５％、２〜１０％、２〜５％の範囲となるまで、その数を決定するステップが実施される。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージまたは１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍまたは１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。
【００２３】
このような方法の一実施形態では、本方法は、ＧＭ１局在パターンの比を、公知の受精能状態を有する男性に対するＧＭ１局在パターンの比と比較するステップをさらに含む。このような一実施形態では、比較するステップは、所定数の、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと、標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップとを含む。
【００２４】
本明細書に開示されている別の実施形態は、男性の受精能状態を決定するための方法である。一実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露され、少なくとも１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間または２４時間、固定剤で固定され、かつＧＭ１局在パターンのための標識分子で染色された、男性に由来する精子試料の第１の部分を得るステップであって、標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記ＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得した状態に割り当て、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得していない状態に割り当てるステップと；男性の受精能状態を特徴付けるステップとを含む。一部の実施形態では、特徴付けるステップは、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率に関連する受精能の閾値を決定するステップであって、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率が、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；基準平均百分率の２標準偏差下である百分率未満であると不妊であることを示す、ステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率を、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較するステップと；受精能の閾値を、この比較に基づいて特定するステップとを含む。
【００２５】
別の実施形態では、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率と関連する受精能の閾値が決定され、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率は、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと通常の男性の受精能を示し；基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であると異常な男性の不妊を示す。標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率は、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較される。受精能の閾値は、この比較に基づいて特定される。
【００２６】
一部の実施形態では、特定するステップは、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が実質的に一定となるまで繰り返される。このような一実施形態では、特定するステップの後、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子に対するＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が標識された細胞の総数の５％未満、３％未満となるか、または標識された細胞の総数の１％〜５％、２〜５％の範囲となるまで、その数を決定するステップが実施される。このような別の実施形態では、特定するステップの後、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子に対するＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が標識された細胞の総数の２５％、２０％、１５％もしくは１０％未満となるか、または標識された細胞の総数の２％〜２５％、２％〜２０％、２〜１５％、２〜１０％、２〜５％の範囲となるまで、その数を決定するステップが実施される。
【００２７】
このような方法の一実施形態では、本方法は、ＧＭ１局在パターンの比を、公知の受精能状態を有する男性に対するＧＭ１局在パターンの比と比較するステップをさらに含む。このような一実施形態では、比較するステップは、所定数の、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと、標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップとを含む。
【００２８】
本明細書で開示されている別の実施形態は、男性の受精能状態を決定するための方法である。一実施形態では、本方法は、精子試料を得るステップであって、精子試料の少なくとも一部が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子を得るためにｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露され、少なくとも１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間または２４時間、固定剤に曝露され、かつＧＭ１に対して染色されている、ステップと；精子試料の１つまたは複数の精液パラメータに対する値を得るステップと；１つまたは複数の標識されたＧＭ１局在パターンに基づいて、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを決定するステップであって、前記標識されたＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体後方細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；決定されたＣＡＰ−Ｓｃｏｒｅおよび１つまたは複数の得られた精液パラメータに基づいて、男性の受精能指数（ＭＦＩ）値を計算するステップとを含む。一実施形態では、精子試料の１つまたは複数の精液パラメータは、元の精子試料の体積、精子濃度、精子の運動性、および精子の形態からなる群より選択される。一部の実施形態では、特定するステップは、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が実質的に一定となるまで繰り返される。
【００２９】
このような一実施形態では、特定するステップの後、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子に対するＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が標識された細胞の総数の５％未満、３％未満となるか、または標識された細胞の総数の１％〜５％、２〜５％の範囲となるまで、その数を決定するステップが実施される。このような別の実施形態では、特定するステップの後、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子に対するＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が標識された細胞の総数の２５％、２０％、１５％もしくは１０％未満となるか、または標識された細胞の総数の２％〜２５％、２％〜２０％、２〜１５％、２〜１０％、２〜５％の範囲となるまで、その数を決定するステップが実施される。
【００３０】
本明細書に記載されている方法の種々の実施形態では、２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンは、ＡＡのＧＭ１局在パターン、ＡＰＭのＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、中間（ＩＮＴＥＲ）のＧＭ１局在パターン、先体後方細胞膜（ＰＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、先体頂部／先体後方（ＡＡ／ＰＡ）のＧＭ１局在パターン、赤道セグメント（ＥＳ）のＧＭ１局在パターン、および散在性（ＤＩＦＦ）のＧＭ１局在パターンを含む。
【００３１】
一実施形態では、精子試料の第１の部分を非受精能獲得条件に曝露するステップと精子試料の第２の部分を受精能獲得条件に曝露するステップとは同時に起こる。
【００３２】
一実施形態では、男性の受精能状態を特定するためのキットが本明細書で開示され、受精能を獲得した精子の１つまたは複数のＧＭ１局在パターンと受精能を獲得していない精子の１つまたは複数のＧＭ１局在パターンとを示す図であって、前記の受精能を獲得した精子のＧＭ１局在パターンと受精能を獲得していない精子のＧＭ１局在パターンが公知の受精能状態を反映する、図と；精子膜のせん断を妨げるのに十分な直径サイズのオリフィスを有するワイドオリフィスピペットと；受精能獲得培地、非受精能獲得培地、固定剤組成物、ＧＭ１局在パターンを決定するための標識試薬のうちの１つまたは複数とを含み、但し、固定剤組成物は精子膜に損傷を与えず、受精能獲得培地および非受精能獲得培地は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで精子細胞に適用される場合、図に反映されるように、受精能を獲得した精子を示すＧＭ１局在パターンおよび受精能を獲得していない精子を示すパターンを生じる。一実施形態では、キットは、精子膜に損傷を与えるのを避けるために精子の取り扱いのための指示を含有する。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージまたは１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍまたは１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。
【００３３】
本明細書に記載されているある特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件は、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出メディエーターのうちの１つまたは複数への曝露を含む。一部の実施形態では、ステロール流出メディエーターは、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎仔臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質、またはリポソームである。一実施形態では、ステロール流出メディエーターは、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンである。
【００３４】
一実施形態では、非受精能獲得条件は、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出メディエーターのうちの１つまたは複数への曝露の欠如を含む。
【００３５】
本明細書に記載されているある特定の実施形態では、固定剤はアルデヒド固定剤である。一実施形態では、固定剤は、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはそれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、ＧＭ１に対する親和性分子は、蛍光標識されたコレラ毒素ｂサブユニットである。
【００３６】
前述の概要、ならびに男性の受精能状態を決定するための方法およびキットの実施形態についての以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読まれる場合によりよく理解されるものとなる。しかしながら、本発明が、示された正確な配置および手段に限定されるものではないことが理解されるべきである。
【００３７】
図においては、以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、非受精能獲得条件または受精能獲得条件下での、正常なヒトの精子および不妊男性に由来する精子における、ＩＮＴＥＲ、ＡＰＭ、ＡＡ、ＰＡＰＭ、ＡＡ／ＰＡ、ＥＳおよびＤＩＦＦのＧＭ１局在パターンを示す。
【００３９】
【図２】図２Ａは、非受精能獲得条件下での、正常なヒトの精子における、ＩＮＴＥＲ、ＡＰＭ、ＡＡ、ＰＡＰＭ、ＡＡ／ＰＡ、ＥＳおよびＤＩＦＦのＧＭ１局在パターンの相対分布を示す。図２Ｂは、受精能獲得条件下での、正常なヒトの精子における、ＩＮＴＥＲ、ＡＰＭ、ＡＡ、ＰＡＰＭ、ＡＡ／ＰＡ、ＥＳおよびＤＩＦＦのＧＭ１局在パターンの相対分布を示す。図２Ｃは、受精能獲得条件下での、不妊男性に由来するヒトの精子における、ＩＮＴＥＲ、ＡＰＭ、ＡＡ、ＰＡＰＭ、ＡＡ／ＰＡ、ＥＳおよびＤＩＦＦのＧＭ１局在パターンの相対分布を示す。
【００４０】
【図３】図３は、受精能獲得条件および非受精能獲得条件下での、正常な男性の群に対するヒトの精子および不妊男性の群に対するヒトの精子におけるインキュベーション時間の関数としてのＡＰＭとＡＡの局在パターンを併せた相対数、ならびに男性の各群に対する臨床転帰（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ）を示す。
【００４１】
【図４】図４は、受精能獲得を促進する刺激を与えてインキュベートした公知の受精能を有するドナーの精子における、ＡＡおよびＡＰＭの局在パターンの百分率を示す。
【００４２】
【図５】図５は、低受精能／不妊を疑われるドナーから得た精子におけるＡＡおよびＡＰＭの局在パターンの百分率と、受精能を有する男性の統計的閾値との比較を示す。
【００４３】
【図６】図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、および６Ｄは、受精能獲得条件下での、不妊男性に由来する精子におけるＧＭ１のＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
添付の図面を参照して、本発明の種々の実施形態が、以下にさらに十分に記載されている。本発明の一部であるが全てではない実施形態が示されている。実際に、本発明の種々の実施形態は、多くの異なる形態で具体化することができ、明確に記載された実施形態に限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の少なくとも一部の図面および記載は、本発明を明確に理解するために適切な要素に焦点を当てて簡略化されており、一方、明確化のために、当業者が認識する他の要素を削除することはまた、本発明の一部を構成する場合があることが理解されるべきである。しかし、このような要素は、当技術分野において周知であり、本発明をよりよく理解することを必ずしも容易にしないため、このような要素についての記載は、本明細書において提供されない。
【００４５】
本明細書で特定される参考文献はいずれも、その全体が参照により組み込まれる。
【００４６】
本明細書で具体的に示されていなければ、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、１つの要素に限定されないが、代わりに、「少なくとも１つの」を意味するものとして読まれるべきである。
【００４７】
「約」は、言及された値の＋および−１０％の範囲を意味するものと理解される。しかし、ある値に言及して「約」を使用することは、言及された値単独の可能性を除外するものではない。例えば、「約１時間」は、「５４分」、「１時間」、および「６６分」を十分にサポートするものと理解される。
【００４８】
本開示は、ある特定のＧＭ１局在パターンが、男性の受精能状態に関する情報を提供できるという知見に基づいている。ＧＭ１局在パターンの決定は、米国特許第７，１６０，６７６号、同第７，６７０，７６３号、および同第８，３６７，３１３号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、男性の受精能状態の決定のための方法およびキットを提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得刺激への曝露の際のある特定のＧＭ１局在パターンの百分率の変化に基づいている。他の実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得刺激への曝露の際のＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの百分率の変化に特に基づいている。
【００４９】
一実施形態では、本明細書で開示されているのは、男性の受精能状態を決定するための方法である。一実施形態では、本方法は、ある個体に由来する精子試料をｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非受精能獲得条件に供するステップと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露した際のある特定のＧＭ１局在パターンの百分率の変化を決定するステップと、変化のレベルに基づいて、受精能状態を特定するステップとを含む。
【００５０】
用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した」精子とは、受精能獲得のプロセスを促進する条件下でインキュベートされた精子を指す。一実施形態では、受精能獲得条件は、培地中に、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロールアクセプター、例えば、血清アルブミンまたはシクロデキストリンのうちの１つまたは複数の存在を含む。一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件は、培地中の重炭酸イオンおよびカルシウムイオンの存在、ならびにステロールアクセプターの存在を含む。一実施形態では、ステロールアクセプターはステロール流出メディエーターである。受精能を獲得した精子は、先体エキソサイトーシスを起こす能力を獲得しており、過剰に活性化されたパターンの運動性を獲得している。用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない」精子は、受精能獲得のための上述の刺激のうちの１つまたは複数と共にインキュベートされていない精子を指す。一実施形態では、非受精能獲得条件は、受精能獲得条件の非存在を含む。別の実施形態では、非受精能獲得条件は、受精能獲得のために必要とされる刺激のうちの１つまたは複数の非存在を含む。受精能を獲得していない精子は、透明帯、透明帯由来の可溶化タンパク質、またはプロゲステロンなどの生理的リガンドによって誘発される先体エキソサイトーシスを起こさない。さらに、非受精能獲得条件下でインキュベートされた精子は、過剰に活性化された運動性も実証しない。
【００５１】
一実施形態では、受精能獲得は、重炭酸イオンおよびカルシウムイオンなどの外部刺激、ならびにステロール流出メディエーター、例えば、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、リポソームなどへの曝露によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘発されてもよい。ある特定の実施形態では、ＧＭ１局在パターンの識別可能な変化は、精子がｉｎ  ｖｉｔｒｏでこれらの刺激のうちの１つまたは複数に曝露される場合に観察される。
【００５２】
一実施形態では、採取後、精液試料は、典型的には、以下：液化、洗浄、および／または濃縮のうちの１つまたは複数を含む、いくつかの方法で処理される。一部の実施形態では、液化は、室温でまたは３７℃で（または、それらの間の任意の温度で）、様々な期間（典型的には１５〜２０分間であるが、１０〜６０分間の範囲）試料を液化させることを伴う。液化は、それにより、精漿を、ゲルから、より流体／液体のコンシステンシーに変換するプロセスである。精漿は、典型的には、いかなる操作も行わずに液化するが、特に粘性の試料を用いる場合、またはプロセスの促進、もしくは全ての試料が取り扱われる一貫した液化プロトコルの作製が望まれる場合、個々は、液化を達成するために試料を操作する場合がある。ある特定の実施形態では、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用することによって、精液試料を操作して、精液の粘度を低下させる。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージまたは１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍまたは１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。ある特定の実施形態では、精子膜に損傷を与えない種々の試薬を添加することによって液化を達成することもできる。避けなければならない試薬は、精子膜に損傷を与えるものである。精子は、遠心分離と再懸濁によって洗浄され、精液分析に供され、および／または以下を含む１つまたは複数の選択プロセスに供され得る：上層への積層、および密度勾配による遠心分離；上層への積層、および密度勾配による遠心分離、その後の精子濃縮画分の採取、その後の再懸濁と洗浄；上層への積層、および密度勾配による遠心分離、その後の精子濃縮画分の採取、および、その上層へのより密度の低い培地（その中へ運動性精子が泳ぎ上がる）の重層；または試料の上層へのより密度の低い培地の重層、および運動性精子をその中へ泳ぎ上がらせること。
【００５３】
最初の処理後、精子をカウントすることができ、次いで、所定数の精子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非受精能獲得またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得培地を含有する容器（例えば、チューブ）の中に入れて、所望の最終濃度を達成することができる。一実施形態では、精子の典型的な最終濃度は、１ｍｌ当たり１，０００，０００個である（最終濃度範囲は、１ｍｌ当たり２５０，０００個〜１ｍｌ当たり２５０，０００，０００個まで変化し得る）。
【００５４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非受精能獲得条件およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件下で、精子をインキュベートするための基本培地は、ヒト卵管液（ｔｕｂａｌ  ｆｌｕｉｄ）（ＨＴＦ）、修正ヒト卵管液（ｍＨＴＦ）、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地、修正Ｗｈｉｔｔｅｎ培地、ＫＳＯＭ、リン酸緩衝食塩水、ＨＥＰＥＳ−緩衝食塩水、トリス−緩衝食塩水、ハムＦ−１０、タイロード培地、修正タイロード培地、ＴＥＳ−トリス（ＴＥＳＴ）−ヨーク緩衝液、またはＢｉｇｇｅｒｓ、ＷｈｉｔｔｅｎおよびＷｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ（ＢＷＷ）培地などが挙げられるが、これらに限定されない生理緩衝液であってもよい。基本培地は、生存率を高めるため、または、受精能獲得を誘発するのを助けるために十分な濃度で、それに添加されるタンパク質または他の因子（胎仔臍帯血清限外濾過液、プラスマネート（Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ）、卵黄、スキムミルク、アルブミン、リポタンパク質、または脂肪酸結合タンパク質を含む）の１つまたは複数の規定のまたは複合の供給源を有していてもよい。受精能獲得のための典型的な刺激には、以下のうちの１つまたは複数が含まれる：重炭酸塩（典型的には２０〜２５ｍＭで、５〜５０ｍＭの範囲で）、カルシウム（典型的には１〜２ｍＭで、０．１〜１０ｍＭの範囲で）、および／またはシクロデキストリン（典型的には１〜３ｍＭで、０．１〜２０ｍＭの範囲で）。シクロデキストリンは、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンおよび／またはメチル−β−シクロデキストリンを含んでもよい。インキュベーション温度は典型的には３７℃（３０℃〜３８℃の範囲）であり、インキュベーション時間は典型的には１〜４時間（３０分〜１８時間の範囲）であるが、ベースラインの試料は、インキュベーション期間の開始時（「時間ゼロ」）に得ることができる。
【００５５】
一実施形態では、ＧＭ１のパターンを作成するために、精子は、標準基本培地（例えば、リン酸緩衝食塩水、修正Ｗｈｉｔｔｅｎ培地、または他の同様の培地）で洗浄され、その上に検出可能な標識を有するＧＭ１に対する標識分子と共にインキュベートされる。ＧＭ１は、エピトープとしての機能を果たすことができる細胞外糖残基を有するので、細胞を固定し、透過処理することなく、可視化できる。しかしながら、細胞の固定は、パターン形成に寄与しつつ、より良い検体の保存をもたらし、可視化を容易にし（遊泳精子中のパターンの識別と比較して）、より長い可視化時間を可能とする。精子の組織学的研究のために公知の種々の固定剤は、当業者の能力の範囲内である。適切な固定剤として、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ブアン固定剤、およびカコジル酸ナトリウム、塩化カルシウム、ピクリン酸、タンニン酸などを含む固定剤が含まれる。一実施形態では、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはそれらの組み合わせが使用される。
【００５６】
固定条件は、約０．０１％〜約１％（重量／体積）のパラホルムアルデヒドが典型的に使用されるが、約０．００４％（重量／体積）のパラホルムアルデヒド〜約４％（重量／体積）のパラホルムアルデヒドの範囲であり得る。一実施形態では、約０．００５％（重量／体積）のパラホルムアルデヒド〜約１％（重量／体積）のパラホルムアルデヒドが使用され得る。一実施形態では、リン酸緩衝食塩水中の、約４％のパラホルムアルデヒド（重量／体積）、約０．１％のグルタルアルデヒド（重量／体積）および約５ｍＭのＣａＣｌ２を使用することができる。
【００５７】
精子試料が固定剤中に固定される時間は変化してもよい。一実施形態では、精子試料は、約５時間またはそれより短い時間、固定剤中で固定される。一実施形態では、精子試料は、約５時間より長い間、固定剤中で固定される。別の実施形態では、精子試料は、約０．５時間、約１時間、約１．５時間、約２時間、約２．５時間、約３時間、約３．５時間、約４時間、約４．５時間、約５時間、約５．５時間、約６時間、約６．５時間、約７時間、約７．５時間、約８時間、約８．５時間、約９時間、約９．５時間、約１０時間、約１０．５時間、約１１時間、約１１．５時間、約１２時間、約１２．５時間、約１３時間、約１３．５時間、約１４時間、約１４．５時間、約１５時間、約１５．５時間、約１６時間、約１６．５時間、約１７時間、約１７．５時間、約１８時間、約１８．５時間、約１９時間、約１９．５時間、約２０時間、約２０．５時間、約２１時間、約２１．５時間、約２２時間、約２２．５時間、約２３時間、約２３．５時間、約２４時間、約２４．５時間、約２５時間、約２５．５時間、約２６時間、約２６．５時間、約２７時間、約２７．５時間、約２８時間、約２８．５時間、約２９時間、約２９．５時間、約３０、または先述の時間から決定され得る任意の範囲（例えば、約２６時間〜約２８時間、または約３時間〜約５時間）、固定剤中で固定される。
【００５８】
生存または固定精子中のＧＭ１局在パターンは、標識結合技術を使用することによって得ることができる。ＧＭ１ガングリオシドに特異的な親和性を有する分子を使用することができる。標識分子は、検出可能標識（例えば、フルオロフォア）に直接連結されることができ、または、その上に検出可能な標識を有する第２の標識分子によって検出されてもよい。例えば、コレラ毒素ｂサブユニットは、ＧＭ１に特異的に結合することが公知である。それゆえ、標識された（例えば、蛍光標識された）コレラ毒素ｂサブユニットを、ＧＭ１の分布パターンを得るために使用することができる。一実施形態では、フルオロフォアに連結されたコレラ毒素ｂサブユニットの最終濃度は、約１０μｇ／ｍｌ〜約１５μｇ／ｍｌである。別の実施形態では、フルオロフォアに連結されたコレラ毒素ｂサブユニットの最終濃度は、約０．１μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌである。あるいは、ＧＭ１に対する標識化抗体を使用することができる。さらに別の代替案では、コレラ毒素ｂサブユニットに対する標識化抗体を、ＧＭ１染色のパターンを可視化するために使用することができる。さらに別の代替案では、ＧＭ１に直接結合する一次抗体またはコレラ毒素ｂサブユニットに結合する一次抗体のいずれかに結合する標識化二次抗体を使用することができる。本明細書で使用される用語「ＧＭ１染色」または「ＧＭ１の染色」または「標識」または関連する用語は、ＧＭ１への標識された親和性分子の結合によって、細胞上または細胞内で観察される染色を意味する。例えば、蛍光タグ付き／標識化コレラ毒素ｂサブユニットが、ＧＭ１の局在に対して使用される場合、シグナルまたは染色はコレラ毒素ｂサブユニットに由来するが、ＧＭ１の位置を示すものである。用語「シグナル」および「染色」および「標識」は、互換的に使用される。検出可能な標識とは、検出可能なシグナルを生じる能力があるものである。そのような標識として、放射性核種、酵素、蛍光剤または発色団が挙げられる。精子中のＧＭ１分布の標識化（または染色）および可視化は、標準技術によって実行される。コレラ毒素のｂサブユニット以外の標識分子も使用することができる。これらには、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体が含まれる。ＧＭ１ガングリオシドに特異的な抗体は、通常の免疫化プロトコルによって生成でき、または市場で購入することができる（例えば、Ｍａｔｒｅｙａ，Ｉｎｃ．、Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ、ＰＡ）。抗体は、ＧＭ１に対して産生されてもよく、または、ＧＭ１分子の関連エピトープのペプチド模倣体を使用して生成することができる。ペプチド模倣体の特定と生成は、当業者に周知である。さらに、コレラ毒素へｂサブユニットの結合は、小分子によって模倣されてもよい。所定の試薬への類似した結合特性を有する小分子の特定は、当業者に周知である。
【００５９】
ヒト精子に対して、精子がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件下にある場合、８つの異なる局在パターン（詳細は実施例１を参照のこと）が観察された。これらのパターンは、ＩＮＴＥＲ、ＡＰＭ、ＡＡ、ＰＡＰＭ、ＡＡ／ＰＡ、ＥＳ、ＤＩＦＦ、およびＬｉｎｅｄ  Ｃｅｌｌと指定されている。ＩＮＴＥＲ、ＡＰＭ、ＡＡ、ＰＡＰＭ、ＡＡ／ＰＡ、ＥＳ、およびＤＩＦＦのパターンを図１に示し、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌのパターンを図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、および６Ｄに示し、それぞれについてさらに以下に説明する：
・ＩＮＴＥＲ：大部分の蛍光が赤道セグメントの周りのバンド内にあり、先体を覆う細胞膜内に一部のシグナルがある。通常、シグナルに勾配があり、赤道セグメントで最も大きく、以後、先端に向けて次第に小さくなる。赤道セグメントにわたるバンド内で、精子頭部の縁でシグナル強度の増加がしばしば見られる。
・ＡＰＭ（先体細胞膜）：ＩＮＴＥＲと比較して、このパターンでは赤道シグナルと頂端（ａｐｉｃａｌ  ｔｉｐ）に向かうシグナルの間の差異がより小さい。すなわち、先体を覆っている細胞膜内のシグナルがより均一に分配されている。ＡＰＭシグナルは、先端部に向かって頂端に動く明るい赤道ＩＮＴＥＲバンドから観察されるか、または、ＡＰＭシグナルは、先端部に向けてさらに立ち上がり、より小さい領域内で見られる可能性がある（ＡＰＭシグナルがＡＡとの連続体であるかのように）。
・ＡＡ（先体頂部）：このパターンでは、蛍光は頂端に向けてますます濃くなり、明るさが増し、シグナルを有する面積が低減する。
・ＰＡＰＭ（先体後方細胞膜）：シグナルはもっぱら先体後方の細胞膜内にある。
・ＡＡ／ＰＡ（先体頂部／先体後方）：シグナルは先体を覆う細胞膜内と、先体後方細胞膜内の両方で見られる。シグナルは赤道セグメントには見られない。
・ＥＳ（赤道セグメント）：明るいシグナルが、赤道セグメントにのみ見られる。明るいシグナルは、赤道領域にわたる精子頭部の肥厚を伴うかもしれない。
・ＤＩＦＦ（散在性）：散在したシグナルが、全精子頭部にわたって見られる。
・Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ：シグナルが、先体後方領域の頂部および先体を覆う細胞膜ならびに赤道セグメントの底部（すなわち、先体後方／赤道バンド）に見られる。シグナルは赤道セグメントのまわりには見られない。
【００６０】
用語「ＧＭ１局在パターン」は、「パターン」または「局在パターン」と互換的に使用される。
【００６１】
図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、および６Ｄは、受精能獲得条件下での不妊男性に由来する精子におけるＧＭ１のＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンを示す。具体的には、図６Ａは、先体後方／赤道バンドおよび先体を覆う細胞膜にシグナルが均一に分布するＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンを示す。図６Ｂは、先体を覆う細胞膜のシグナルが、先体後方／赤道バンドのシグナルより明るいＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンを示す。図６Ｃおよび６Ｄは、先体を覆う細胞膜のシグナルより明るい先体後方／赤道バンドのシグナルを示す。
【００６２】
ＩＮＴＥＲ、ＡＡ、ＡＰＭのパターン、およびこれらのパターンの組み合わせが、正常な精子膜構造、したがって受精能を有する生存精子と正に相関する一方、ＰＡＰＭ、ＡＡ／ＰＡ、ＥＳ、ＤＩＦＦ、およびＬｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌのパターンは、生存率、正常な膜構造および受精能と正に相関しないことが観察された。非受精能獲得条件下でインキュベートされた場合、正常な膜構造を有する生存精子の大部分は、ＩＮＴＥＲのパターンを示し、このパターンは標識の大部分が赤道セグメントの近くに存在すること、残りが先体を覆う細胞膜に広がって存在することを特徴とする。さらに、受精能獲得のための刺激に曝露すると、ＡＰＭおよびＡＡのパターンの数は増加する。ＡＰＭのパターンは、先体を覆う細胞膜内でより均一なシグナルを示す一方、ＡＡのパターンは精子頭部の吻側部、先体頂部でシグナル強度の増加、および赤道セグメントに向けて尾側に向かうシグナルの低減を示す。不妊個体に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能を獲得しない条件下でインキュベートされた精子は、正常個体に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能を獲得しない条件下でインキュベートされた精子のＧＭ１局在パターンと類似するＧＭ１局在パターンを有する。
【００６３】
一実施形態では、男性の受精能状態を決定するための方法が、本明細書で開示される。一実施形態では、本方法は、男性に由来する精子試料の第１の部分を非受精能獲得条件に曝露して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料を得るステップと；精子試料の第２の部分を受精能獲得条件に曝露して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を得るステップと；ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、少なくとも１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間または２４時間、固定剤で固定するステップと、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、ＧＭ１局在パターンのための標識分子で処理するステップであって、標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記標識されたＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料に対する標識されたＧＭ１局在パターンを、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する標識されたＧＭ１局在パターンと比較するステップと；比較に基づいて、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得した状態に割り当て、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得していない状態に割り当てるステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対して、特定され、標識されたＧＭ１局在パターンに基づいて、男性の受精能状態を特徴付けるステップとを含む。一実施形態では、特徴付けるステップは、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率に関連する受精能の閾値を決定するステップであって、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率が、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；基準平均百分率の２標準偏差下である百分率未満であると不妊であることを示す、ステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局��パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率を、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較するステップと；受精能の閾値を、この比較に基づいて特定するステップとを含む。
【００６４】
別の実施形態では、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率と関連する受精能の閾値が決定され、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率は、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと通常の男性の受精能を示し；基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であると異常な男性の不妊を示す。標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率は、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較される。受精能の閾値は、この比較に基づいて特定される。
【００６５】
一実施形態では、曝露するステップの前に、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用し、精液の粘度を低下させるために使用される種々の試薬から選択された、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精液試料を処理して、精液の粘度を低下させる。一部の実施形態では、膜に損傷を与える試薬は、（ｉ）プロテアーゼ、（ｉｉ）ヌクレアーゼ、（ｉｉｉ）粘液溶解剤、（ｉｖ）リパーゼ、（ｖ）エステラーゼ、および（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼからなる群より選択される。一部の実施形態では、特定するステップは、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が実質的に一定となるまで繰り返される。このような一実施形態では、特定するステップの後、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子に対するＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が標識された細胞の総数の５％未満、３％未満となるか、または標識された細胞の総数の１％〜５％、２〜５％の範囲となるまで、その数を決定するステップが実施される。このような別の実施形態では、特定するステップの後、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子に対するＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が標識された細胞の総数の２５％、２０％、１５％もしくは１０％未満となるか、または標識された細胞の総数の２％〜２５％、２％〜２０％、２〜１５％、２〜１０％、２〜５％の範囲となるまで、その数を決定するステップが実施される。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージまたは１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍまたは１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。
【００６６】
このような一実施形態では、特徴付けるステップは、所定数の、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと；所定数の、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料に対する標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップとを含んでもよい。
【００６７】
このような一実施形態では、本方法は、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子の比を、公知の受精能状態を有する、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子の比と比較するステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子の比を、公知の受精能状態を有する、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子の比と比較するステップとをさらに含んでもよい。
【００６８】
一実施形態では、男性の受精能状態を決定するための方法が、本明細書で開示される。一実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非受精能獲得条件に曝露され、少なくとも１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間または２４時間、固定剤で固定され、かつＧＭ１局在パターンのための標識分子で処理された、男性に由来する精子試料の第１の部分を得るステップであって、標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと；ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露され、固定剤で固定され、かつＧＭ１局在パターンのための標識分子で処理された精子試料の第２の部分を得るステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記標識されたＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料に対する標識されたＧＭ１局在パターンを、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する標識されたＧＭ１局在パターンと比較するステップと；比較に基づいて、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得した状態に割り当て、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得していない状態に割り当てるステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対して、特定され、標識されたＧＭ１局在パターンに基づいて、男性の受精能状態を特徴付けるステップとを含む。一実施形態では、特徴付けるステップは、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率に関連する受精能の閾値を決定するステップであって、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率が、以下に対応する：基準平均百分率の標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；基準平均百分率の２標準偏差下である百分率未満であると不妊であることを示す、ステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率を、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較するステップと；受精能の閾値を、この���較に基づいて特定するステップとを含む。
【００６９】
別の実施形態では、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率と関連する受精能の閾値が決定され、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率は、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと通常の男性の受精能を示し；基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であると異常な男性の不妊を示す。標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率は、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較される。受精能の閾値は、この比較に基づいて特定される。
【００７０】
一部の実施形態では、特定するステップは、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が実質的に一定となるまで繰り返される。このような一実施形態では、特定するステップの後、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子に対するＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が標識された細胞の総数の５％未満、３％未満となるか、または標識された細胞の総数の１％〜５％、２〜５％の範囲となるまで、その数を決定するステップが実施される。このような別の実施形態では、特定するステップの後、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子に対するＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が標識された細胞の総数の２５％、２０％、１５％もしくは１０％未満となるか、または標識された細胞の総数の２％〜２５％、２％〜２０％、２〜１５％、２〜１０％、２〜５％の範囲となるまで、その数を決定するステップが実施される。
【００７１】
このような方法の一実施形態では、本方法は、所定数の、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料のそれぞれに対するＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップとをさらに含む。
【００７２】
このような一実施形態では、特徴付けるステップは、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料の比を、公知の受精能状態を有する男性に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子のＧＭ１局在パターンの比と比較するステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料の比を、公知の受精能状態を有する男性に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子のＧＭ１局在パターンの比と比較するステップとをさらに含んでもよい。
【００７３】
一実施形態では、男性の受精能状態を決定するための方法が、本明細書で開示される。一実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、男性に由来する精子試料を受精能獲得条件に曝露するステップと；受精能を獲得した精子試料を少なくとも１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間または２４時間、固定剤で固定するステップと；固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、ＧＭ１局在パターンのための標識分子で処理するステップであって、標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと；標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記標識されたＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得した状態に割り当て、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得していない状態に割り当てるステップと；男性の受精能状態を特徴付けるステップとを含む。一実施形態では、特徴付けるステップは、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率に関連する受精能の閾値を決定するステップであって、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率が、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；基準平均百分率の２標準偏差下である百分率未満であると不妊であることを示す、ステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率を、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較するステップと；受精能の閾値を、この比較に基づいて特定するステップとを含む。
【００７４】
別の実施形態では、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率と関連する受精能の閾値が決定され、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率は、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと正常な男性の受精能を示し；基準平均百分率の１標準偏差下未満であると異常な男性不妊を示す。標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率は、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較される。受精能の閾値は、この比較に基づいて特定される。
【００７５】
一実施形態では、曝露するステップの前に、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用し、精液の粘度を低下させるために使用される種々の試薬から選択された、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精液試料を処理して、精液の粘度を低下させる。一部の実施形態では、膜に損傷を与える試薬は、（ｉ）プロテアーゼ、（ｉｉ）ヌクレアーゼ、（ｉｉｉ）粘液溶解剤、（ｉｖ）リパーゼ、（ｖ）エステラーゼ、および（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼからなる群より選択される。一部の実施形態では、特定するステップは、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が実質的に一定となるまで繰り返される。このような一実施形態では、特定するステップの後、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子に対するＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が標識された細胞の総数の５％未満、３％未満となるか、または標識された細胞の総数の１％〜５％、２〜５％の範囲となるまで、その数を決定するステップが実施される。このような別の実施形態では、特定するステップの後、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子に対するＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が標識された細胞の総数の２５％、２０％、１５％もしくは１０％未満となるか、または標識された細胞の総数の２％〜２５％、２％〜２０％、２〜１５％、２〜１０％、２〜５％の範囲となるまで、その数を決定するステップが実施される。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージまたは１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍまたは１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。
【００７６】
このような方法の一実施形態では、本方法は、ＧＭ１局在パターンの比を、公知の受精能状態を有する男性に対するＧＭ１局在パターンの比と比較するステップをさらに含んでもよい。一実施形態では、公知の受精能状態は、受精能を有する男性に対応する。別の実施形態では、公知の受精能状態は、不妊男性に対応する。このような一実施形態では、比較するステップは、所定数の、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと、標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップとを含む。
【００７７】
本明細書に開示されている一実施形態は、男性の受精能状態を決定するための方法である。一実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露され、少なくとも１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間または２４時間、固定剤で固定され、かつＧＭ１局在パターンのための標識分子で染色された、男性に由来する精子試料の第１の部分を得るステップであって、標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記ＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得した状態に割り当て、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得していない状態に割り当てるステップと；男性の受精能状態を特徴付けるステップとを含む。一実施形態では、特徴付けるステップは、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率に関連する受精能の閾値を決定するステップであって、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率が、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；基準平均百分率の２標準偏差下である百分率未満であると不妊であることを示す、ステップと；標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率を、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較するステップと；受精能の閾値を、この比較に基づいて特定するステップとを含む。
【００７８】
別の実施形態では、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率と関連する受精能の閾値が決定され、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率は、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと通常の男性の受精能を示し；基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であると異常な男性の不妊を示す。標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率は、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較される。受精能の閾値は、この比較に基づいて特定される。
【００７９】
一部の実施形態では、特定するステップは、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が実質的に一定となるまで繰り返される。このような一実施形態では、特定するステップの後、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子に対するＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が標識された細胞の総数の５％未満、３％未満となるか、または標識された細胞の総数の１％〜５％、２〜５％の範囲となるまで、その数を決定するステップが実施される。このような別の実施形態では、特定するステップの後、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子に対するＬｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンの数が標識された細胞の総数の２５％、２０％、１５％もしくは１０％未満となるか、または標識された細胞の総数の２％〜２５％、２％〜２０％、２〜１５％、２〜１０％、２〜５％の範囲となるまで、その数を決定するステップが実施される。
【００８０】
このような方法の一実施形態では、本方法は、ＧＭ１局在パターンの比を、公知の受精能状態を有する男性に対するＧＭ１局在パターンの比と比較するステップをさらに含んでもよい。一実施形態では、公知の受精能状態は、受精能を有する男性に対応する。別の実施形態では、公知の受精能状態は、不妊男性に対応する。このような一実施形態では、比較するステップは、所定数の、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと、標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップとを含む。
【００８１】
一実施形態では、男性の受精能状態を決定するための方法が、本明細書で開示される。一実施形態では、方法は、精子試料を得るステップであって、精子試料の少なくとも一部が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子を得るためにｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露され、少なくとも１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間または２４時間、固定剤に曝露され、かつＧＭ１に対して染色されている、ステップと；精子試料の１つまたは複数の精液パラメータに対する値を得るステップと；１つまたは複数の標識されたＧＭ１局在パターンに基づいて、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを決定するステップであって、前記標識されたＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体後方細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；決定されたＣＡＰ−Ｓｃｏｒｅおよび１つまたは複数の得られた精液パラメータに基づいて、男性の受精能指数（ＭＦＩ）値を計算するステップとを含む。一実施形態では、精子試料の１つまたは複数の精液パラメータは、元の精子試料の体積、精子濃度、精子の運動性、および精子の形態からなる群より選択される。
【００８２】
本明細書で開示されている実施形態は、男性の受精能状態を決定するための方法である。一実施形態では、本方法は、以下のステップを含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子細胞の試料を、蛍光標識で処理する。１つまたは複数の受精能を獲得した蛍光画像を得、画像は、蛍光標識されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子細胞と関連する１つまたは複数のＧＭ１局在パターンを示す。先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、それぞれ、ｃａｐ−蛍光画像においてそれぞれ示された、受精能を獲得した状態に割り当て、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得していない状態に割り当てる。ＧＭ１局在パターンに対する数を測定し、そのパターンは、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率を決定するために、受精能を獲得した蛍光画像において示された、蛍光標識されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子細胞に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターン、ＡＰＭのＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを含む。［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率に関連する受精能の閾値を決定し、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率は、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；基準平均百分率の２標準偏差下である百分率未満であると不妊であることを示す。［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率を、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較される。受精能の閾値を、この比較に基づいて特定する。
【００８３】
別の実施形態では、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率と関連する受精能の閾値が決定され、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率は、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと通常の男性の受精能を示し；基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であると異常な不妊を示す。標識され、固定されたｉｎ
ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率は、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率と比較される。受精能の閾値は、この比較に基づいて特定される。
【００８４】
このような一実施形態では、特定するステップは、以下：患者の人口統計、女性パートナーの生殖状態、精子濃度、総運動性、直進運動性、精液の体積、精液のｐＨ、精液の粘度および／または精子の形態、ならびにそれらの組み合わせのうちの１つまたは複数にも基づく。
【００８５】
本明細書に記載されている方法の種々の実施形態では、精子細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、少なくとも１時間、少なくとも３時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間の受精能獲得期間；０．５時間から３時間、３時間から１２時間、６時間から１２時間、３時間から２４時間、１２時間から２４時間、または１８時間から２４時間の間の範囲の受精能獲得期間、受精能獲得条件で処理される。
【００８６】
本明細書に記載されている方法の種々の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子細胞は、少なくとも０．５時間、少なくとも３時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、または少なくとも４８時間の固定期間、０．５時間から３時間、３時間から１２時間、６時間から１２時間、３時間から１８時間、６〜１８時間、６〜２４時間、１２時間から２４時間、１８時間から２４時間、１８〜３０時間、１８〜３６時間、２４〜３０時間、２４〜２６時間、１８〜４８時間、２４〜４８時間、または３６〜４８時間の間の範囲の固定期間、固定剤で処理される。
【００８７】
本明細書に記載されている方法の種々の実施形態では、２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンは、ＡＡのＧＭ１局在パターン、ＡＰＭのＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、中間（ＩＮＴＥＲ）のＧＭ１局在パターン、先体後方細胞膜（ＰＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、先体頂部／先体後方（ＡＡ／ＰＡ）のＧＭ１局在パターン、赤道セグメント（ＥＳ）のＧＭ１局在パターン、および散在性（ＤＩＦＦ）のＧＭ１局在パターンを含む。
【００８８】
一実施形態では、精子試料の第１の部分を非受精能獲得条件に曝露するステップと精子試料の第２の部分を受精能獲得条件に曝露するステップとは同時に起こる。
【００８９】
雄性の個体は、ヒトまたは非ヒト動物であってもよい。非ヒト動物の場合には、受精能状態と相関するパターンの特定を、本明細書で提供される教示に基づいて行うことができる。非ヒト動物として、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、シカ、ウサギ、ニワトリ、シチメンチョウ、様々な種の魚、および様々な動物学上の種が挙げられる。
【００９０】
一実施形態では、この開示の方法は、不妊の可能性があると男性を指定するための方法であって、受精能獲得条件および非受精能獲得条件下でインキュベートされ、任意選択で固定された個体および正常な対照に由来する精子のＧＭ１局在パターン（例えば、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、ＡＡのＧＭ１局在パターン、ＡＰＭのＧＭ１局在パターン、および全ての他のＧＭ１局在パターンのうちの１つまたは複数）を得るステップと、ＧＭ１局在パターンを比較するステップとを含む、方法を提供する。正常な対照では、ある特定の局在パターンを示す精子の百分率において、統計的に有意な変化が観察されることとなる。同一の変化が試験個体に由来する精子において観察されない場合、この個体は、異常な受精能状態を有すると指定される。一実施形態では、正常および異常な受精能状態の情報を与えるパターンは、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ、ＩＮＴＥＲ、ＡＡおよび／またはＡＰＭの局在パターンである。したがって、正常な受精能状態を有することが公知である個体（対照として使用されてもよい）に由来する試料において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非受精能獲得条件に曝露された精子と比較した場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件への曝露の際に、ＡＡおよび／またはＡＰＭの局在パターンを示す精子の百分率が高く、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌおよび／またはＩＮＴＥＲの局在パターンを示す精子の百分率が低い。精子がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非受精能獲得条件に曝露された場合と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件への曝露の際にこれらの局在パターンのうちの１つまたは複数の百分率において、差または有意な差が観察されない場合、個体は、受精能の問題を有すると指定される。上記実施形態の変形例では、対照は、不妊であるかまたは受精能が低いことが公知の個体に由来してもよい。この実施形態では、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ、ＩＮＴＥＲ、ＡＡおよび／またはＡＰＭ局在パターンにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得の際の試験個体に由来するＧＭ１パターンの変化が、対照と同一である場合、個体は、受精能が低いかまたは不妊であると考えることができる。
【００９１】
上記実施形態のさらに別の変形例では、試験個体に由来する試料は、対照と比較することなく評価することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件への曝露の際に、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ、ＩＮＴＥＲ、ＡＡおよび／またはＡＰＭのパターンの数に変化、または有意な変化が観察されない場合、個体は、異常であると考えることができ、さらなる試験について指定される場合があるが、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌおよび／またはＩＮＴＥＲが減少し、ＡＡが増加し、かつ／またはＡＰＭが増加するような変化が観察される場合、個体は、正常な受精能を有すると指定される場合がある。
【００９２】
一実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露された精子のＡＡおよびＡＰＭのパターンの数を特定するためのＧＭ１局在パターンの分析を含む。この数は、全体に対するＧＭ１分布パターンのうちの１つまたは複数の百分率として表現することができる。一実施形態では、受精能は、所定の受精能の閾値、例えば、不妊および受精能が低いと分類された個体間の閾値（すなわち、カットオフ）レベル、または、受精能が低いと分類された個体と受精能を有すると分類された個体の間の閾値レベルに対する、ＡＡおよび／またはＡＰＭの局在パターンの数の比較に基づいて予測される。
【００９３】
他の実施形態では、受精能の閾値は、公知の受精能を有する男性の集団に由来する精子において見出されるパターンの統計分析によって決定されてもよい。この出願の目的として、男性が、自然受胎または３もしくはそれより少ないサイクルの子宮内受精法のいずれかを使用して妊娠したパートナーを有するか、または３年以内に子どもの父親となっている場合に、男性は、受精能を有するとみなされるか、または通常の男性の受精能を有する。この出願の目的として、男性が、避妊法を使用せずに、６〜１２カ月で妊娠を達成できず、妊娠を達成するために３サイクルを超える子宮内受精法を必要とした場合には、男性は受精能が低いとみなされる。この出願の目的として、男性が、避妊法を使用せずに、１年以内に妊娠を達成できず、子宮内受精法のサイクルを繰り返し使用しても妊娠を達成することができなかった場合には、男性は不妊とみなされる。この出願の目的として、異常な男性の受精能には、受精能が低い男性および不妊の男性が含まれる。
【００９４】
図４に示されるように、７３個の精液試料を、受精能を有することが知られている２４名の男性から得た。これらの精子を受精能獲得のための刺激、この場合は、４ｍＭの２−ヒドロキシ−プロピル−βシクロデキストリンと共にインキュベートし、０．０１％のパラホルムアルデヒド（最終濃度）で固定した。受精能を獲得したことを示すパターン（例えば、ＡＡ＋ＡＰＭ）を有する細胞の百分率を評価した。ＡＡおよびＡＰＭのパターンを有する精子の平均百分率は４１％であり、平均からの２標準偏差を２７％および５５％として計算した。
【００９５】
その受精能状態の医学的評価を求めている１４名の男性に由来する１４個の試料におけるＧＭ１局在パターンを分析した。ＡＡ＋ＡＰＭの局在パターンを有する精子の相対的百分率は、公知の受精能を有する男性の集団から特定された統計的閾値に対して比較される（図５）。ベースライン（刺激なし、非受精能獲得条件）下でインキュベートされた試料では、差は観察されなかった。しかし、１４名の男性のうちの５名は、４ｍＭの２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンと共にインキュベートした場合に、低百分率のＡＡ＋ＡＰＭのパターンを有する精子を示す試料を生じた。これら５つの試料は全て、平均から２標準偏差下回った。妊娠が困難なカップルのおよそ３０〜５０％が、男性因子の構成要素を有すると考えられる。これらのデータは、予期された範囲内にあった。
【００９６】
一態様では、本開示は、男性の受精能状態の決定のためのキットを提供する。キットは、以下：精子膜のせん断を妨げるのに十分な直径サイズのオリフィスを有するピペット、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得のための刺激として作用することができる薬剤、受精能獲得培地、非受精能獲得培地、固定剤、ＧＭ１局在パターンを決定するための標識試薬、受精能を獲得した精子の１つまたは複数のＧＭ１局在パターンと受精能を獲得していない精子の１つまたは複数のＧＭ１局在パターンとを示す図のうちの１つまたは複数を含む。このような受精能を獲得した精子のＧＭ１局在パターンと受精能を獲得していない精子のＧＭ１局在パターンは、公知の受精能状態を反映する。このようなキットの実施形態では、固定剤組成物は、精子膜に損傷を与えるべきではない。このような実施形態では、精子膜に損傷を与える可能性のある試薬が、精液の粘度を低下させるために使用される種々の試薬から選択される。一部の実施形態では、膜に損傷を与える試薬として、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、粘液溶解剤、リパーゼ、エステラーゼおよびグリコシドヒドロラーゼのうちの１つまたは複数が挙げられる。別のキットの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで精子細胞に適用される場合に、受精能獲得培地および非受精能獲得培地は、図に反映されているように、受精能を獲得した精子を示すＧＭ１局在パターンおよび受精能を獲得していない精子を示すパターンを生じる。
【００９７】
一実施形態では、キットは、受精能獲得を刺激する４％のシクロデキストリンを有する薬剤を含む。
【００９８】
一実施形態では、受精能獲得培地は、３ｍＭの最終濃度を得るために添加された２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンを有する修正ヒト卵管液を含み、非受精能獲得培地は、修正ヒト卵管液を含み、固定剤は、１％のパラホルムアルデヒドであり、ＧＭ１パターンを決定するための試薬は、コレラ毒素のｂサブユニット（１５μｇ／ｍｌの最終濃度）である。他の実施形態では、パラホルムアルデヒドの最終濃度は、０．０１％である。
【００９９】
例示的なキットは、ＨＥＰＥＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、参照  ９０１２６）で緩衝されたゲンタマイシンを有する修正ＨＴＦ培地を含む。重炭酸緩衝培地またはＨＥＰＥＳ緩衝培地のどちらが使用されたかにかかわらず、ＧＭ１局在パターン、生存率または精子回収、および受精能獲得における差は観察されなかった。したがって、重炭酸緩衝培地を使用することもできる。ＨＥＰＥＳ緩衝液の使用によって、ＣＯ２インキュベーターにのみ適合するのとは対照的に、エアーインキュベーターまたはウォーターバスを使用するクリニックで行われるアッセイが可能となる。同様に、市販のアルブミン（ＨＴＦ−ＳＳＳＴＭ、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃまたはプラスマネート）または粉末アルブミンのどちらかにかかわらず、補助タンパク質を添加しても、回収または生存率は変化せず、受精能獲得状態が都合よく増強されることはなかった。
【０１００】
例示的なキットは、細胞単離培地（例えば、Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｓ−Ｐｌｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ、９０％  Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ製、参照：１５２３２  ＥＳＰ−１００−９０％）をさらに含むことができる。例示的な試薬、消耗品および手順を実証して、ヒト精子に関するＧＭ１の有利な標識を得た。
【０１０１】
例示的なキットは、ワイドオリフィスピペット（２００μｌの大型オリフィスチップ、ＵＳＡ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１０１１〜８４００）をさらに含むことができる。例示的なキットは、ワイドオリフィストランスファーピペット（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｉｐｅｔｔｅｓ、Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｕｌｂ参照：２０２−２０Ｓ、ＶＷＲカタログ番号１４６７０−１４７）をさらに含むことができる。一実施形態では、ピペットは、非金属である。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージまたは１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍまたは１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。
【０１０２】
例示的なキットは、１．５ｍｌのチューブ（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｃａｐ、ｎｏｎｃａｐ、ＣＤ）（ＵＳＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  １４１５９７００）−１つは、受精能獲得を刺激する粉末形態のシクロデキストリンを含有し、１つは、培地のみの非受精能獲得条件のために空である−をさらに含むことができる。一部の実施形態では、シクロデキストリンは、保存溶液を作製するために培地が添加される別のチューブに見られ、シクロデキストリン自体は受精能獲得チューブに添加されることが可能である。
【０１０３】
精漿から精子を単離する際に、ヒトの男性学研究室では、密度勾配を使用して精子を採取するのが通常である。例示的なキットは、密度勾配材料および／または密度勾配から精漿を除去し、次いで、新たなトランスファーピペットを使用してペレット化した精子を採取する指示をさらに含むことができる。
【０１０４】
例示的なキットは、固定剤（０．１％のＰＦＡなど）をさらに含むことができ、任意選択で、輸送、保存または規制上の目的に有用な情報フォーム（患者の要請フォームなど）、標識および容器／バッグ／パウチなどを含む。例えば、キットは、ホイルパウチ、患者の試料を郵送するための吸着剤を有するバイオハザードバッグ、吸着剤を有する再封可能なバッグ、およびフォームチューブプレースホルダーを含有することができる。
【０１０５】
例示的なキットは、本明細書で開示されている方法のいずれかを記載する指示をさらに含むことができる。
【０１０６】
別の態様では、男性個体の生殖能を測定するための方法が提供される。ＧＭ１局在アッセイにより、精子が受精能を獲得し、それによって、卵子と受精する能力を有することができるかどうかを示すことができる。上記のように、このアッセイは、精子の頭部におけるＧＭ１局在の特異的パターンを有する形態学的に正常な精子の百分率としてスコア化されてもよい。ＡＰＭおよびＡＡのパターンは、精子が、受精能獲得のための刺激に応答するときに増加する。カットオフを使用して、射精液の相対的受精能を区別し、男性の受精能に基づいて精液試料を群に分離することができる（例えば、受精能を有する男性を受精能の低い男性、不妊の男性と区別する）。しかし、精子数、運動性、および形態も男性の受精能に影響を及ぼし得るため、本開示は、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅおよび１つまたは複数の関連する精液パラメータ（例えば、数、運動性、および形態など）を包含する男性の受精能（「男性の受精能指数」または「ＭＦＩ」）の指数を創出するための方法を提供する。Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（ＧＭ１スコアとも称される）は、１つまたは複数のＧＭ１パターンの数である。例えば、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅは、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ、ＩＮＴＥＲ、ＡＡ、およびＡＰＭのうちの１つまたは複数の数であり得る。特異的な精液パラメータを強調する様々な指数が生じ得る。例えば、本開示による指数として以下が挙げられる：
・Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ×直進運動性を有する％×絶対数、
・Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ×形態学的に正常な精子の％×絶対数、
・Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ×総運動性の％×絶対数×形態学的に正常な精子の％、および
・Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅとこれらのパラメータの他のバリエーションもしくは組み合わせ、またはＣＡＳＡ（コンピューター支援精子分析）を使用して得られたものを含む他の特異的パラメータ、例えば、ＶＳＬ（直線速度（ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｓｔｒａｉｇｈｔ  ｌｉｎｅ））；ＳＴＲ（直線性）；ＬＩＮ（線形性）；ＶＣＬ（曲線速度（ｃｕｒｖｉｌｉｎｅａｒ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ））；ＶＡＰ（平均速度経路（ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ａｖｅｒａｇｅ  ｐａｔｈ））；運動性の％；運動性の継続期間；ＬＨＡ（側方頭部振幅（ｌａｔｅｒａｌ  ｈｅａｄ  ａｍｐｌｉｔｕｄｅ））；ＷＯＢ（揺れ（ｗｏｂｂｌｅ））；ＰＲＯＧ（直進）；およびＢＣＦ（頭部振動数（Ｂｅａｔ  ｃｒｏｓｓ  ｎｕｍｂｅｒ））など。例えば、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、「ＷＨＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｐｅｒｍ」、（第５版、２０１０年）を参照のこと。
【０１０７】
男性の受精能指数は、男性個体の受精能状態を測定するための方法として具体化されてもよい。上述のように、測定される個体に由来し、その少なくとも一部が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露され、固定剤に曝露され、かつＧＭ１に対して染色された精子試料が得られる。例えば、個体に由来する元の試料の体積、ならびに／または試料の精子の濃度、運動性、および／もしくは形態などの１つまたは複数の精液パラメータの値は、精子試料について得られる。ＭＦＩは、１つまたは複数のＧＭ１パターンの数（例えば、「ＣＡＰ」スコア）および１つまたは複数の得られた精液パラメータ値から決定される。本明細書で使用される例では、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅは、受精能獲得条件下で、３時間における１つまたは複数のＧＭ１パターンの百分率であるが、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅの他の変種は、この開示に照らして明らかとなる（例えば、他の時間間隔における数、受精能を獲得していない場合から受精能を獲得した場合におけるＧＭ１パターンの数の変化など）。
【０１０８】
一実施形態では、男性の受精能指数スコアは、以下の等式に従って男性の試料に対して計算されてもよい：男性の受精能指数／受精能を有する群＝ａ＋ｂ１＊ｘ１＋ｂ２＊ｘ２＋．．．＋ｂｍ＊ｘｍ、式中、ａは定数であり、ｂ１からｂｍは回帰係数であり、ｘ１からｘｍは、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ、運動性、形態、体積、および濃度などの男性の受精能の変数である。判別関数分析を使用して、どの受精能変数が２つまたはそれより多い天然に存在する群の間で判別するのかを決定してもよい。例えば、個体が、受精能を有する、受精能が低いまたは不妊の群に入るかどうかを決定するために、精子の機能および精液の質を説明する多数の受精能変数についてのデータを採取する。次いで、判別分析を使用して、どの変数（複数可）が受精能を有する群の最も優れた予測因子であり、各受精能変数に、相対的にどの程度加重するべきかを決定してもよい。
【０１０９】
男性の受精能指数は、ＧＭ１局在アッセイを読み取る研究室で作成されてもよい。研究室では、１つまたは複数の施設（例えば、不妊クリニック、精子バンクなど）に由来する精子試料、およびその精子試料に対応する精液分析を得てもよい。精液分析情報は、研究室に電子的に送信された、および／またはその他の手段で提供されたＧＭ１局在アッセイキットに含まれるカードに含まれ得る。別の例示的実施形態では、研究室では、精子試料のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅが得られ、またその精子試料に対する精液分析情報が得られる。一実施形態では、研究室では、得られたＣａｐ−Ｓｃｏｒｅおよび得られた精液分析データに基づく男性の受精能指数が計算される。
【０１１０】
男性の受精能状態を特定するための例示的方法は、個体に由来する精子試料をｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非受精能獲得条件およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露することを含む。精子は固定され、固定された精子の選択されたＧＭ１パターンの百分率が決定される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非受精能獲得条件およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露された精子の異なるＧＭ１パターンに対する百分率が比較される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非受精能獲得条件に曝露された精子に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露された精子の１つまたは複数の選択されたＧＭ１パターンの百分率の変化は、個体の受精能状態を示す。選択されたＧＭ１パターンは、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ、ＩＮＴＥＲ、ＡＡおよび／またはＡＰＭであり得る。一実施形態では、個体の受精能状態は、受精能を獲得した精子に対する標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算することによって決定される。
【０１１１】
男性の受精能状態を特定するための例示的方法は、個体に由来する精子試料をｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露するステップを含む。精子は固定され、固定された精子の選択されたＧＭ１パターンの百分率が決定される。異なるＧＭ１パターンに対する百分率は、対照に由来する百分率と比較され、ここで、対照の精子試料は、同一のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件および同一の固定剤に曝露されたものである。対照における変化と比べた、１つまたは複数の選択されたＧＭ１パターンの百分率の変化が、対照の受精能状態とは異なる個体の受精能状態を示す。ＧＭ１パターンは、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ、ＩＮＴＥＲ、ＡＡおよび／またはＡＰＭであり得る。一実施形態では、個体の受精能状態は、受精能を獲得した精子に対する標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算することによって決定される。一実施形態では、曝露するステップの前に、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用し、精液の粘度を低下させるために使用される種々の試薬から選択された、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精液試料を処理して、精液の粘度を低下させる。一部の実施形態では、膜に損傷を与える試薬は、（ｉ）プロテアーゼ、（ｉｉ）ヌクレアーゼ、（ｉｉｉ）粘液溶解剤、（ｉｖ）リパーゼ、（ｖ）エステラーゼ、および（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼからなる群より選択される。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージまたは１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍまたは１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。
【０１１２】
例示的方法では、対照は、正常な受精能状態を有することが公知である個体または異常な受精能状態を有することが公知である個体に由来する精子試料であり得る。対照は、複数の個体を含むデータセット、例えば、少なくとも５０個の個体を含むデータセットから得られる値であり得る。
【０１１３】
男性の受精能状態を、不妊、受精能が低い、または受精能を有すると特定するための例示的方法は、個体に由来する精子試料をｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露するステップを含む。試料におけるＧＭ１パターンが決定される。１つまたは複数のＧＭ１パターンの百分率が受精能の閾値と比較され、ここで、受精能の閾値未満の百分率は、受精能の問題を示す。例えば、受精能の閾値未満の百分率は、不妊または受精能が低いという受精能の状態を示し得る。ＧＭ１パターンは、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ、ＩＮＴＥＲ、ＡＡおよび／またはＡＰＭであり得る。一実施形態では、個体の受精能状態は、受精能を獲得した精子に対する標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算することによって決定される。一実施形態では、曝露するステップの前に、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用し、精液の粘度を低下させるために使用される種々の試薬から選択された、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精液試料を処理して、精液の粘度を低下させる。一部の実施形態では、膜に損傷を与える試薬は、（ｉ）プロテアーゼ、（ｉｉ）ヌクレアーゼ、（ｉｉｉ）粘液溶解剤、（ｉｖ）リパーゼ、（ｖ）エステラーゼ、および（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼからなる群より選択される。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージまたは１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍまたは１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。
【０１１４】
例示的方法におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件は、ｉ）重炭酸およびカルシウムイオン、ならびにｉｉ）２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎仔臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質、またはリポソームなどのステロール流出メディエーターへの曝露を含み得る。例示的方法では、対照の受精能獲得条件または非受精能獲得条件への曝露は、試験試料と並行して行うことができる。
【０１１５】
男性の受精能状態を、不妊、受精能が低い、または受精能を有すると特定するための例示的方法は、個体に由来する精子試料を受精能獲得条件に曝露するステップを含む。試料におけるそれぞれのＧＭ１パターンの百分率が決定される。１つまたは複数のＧＭ１パターンの百分率が不妊の閾値と比較され、ここで、不妊の閾値未満の百分率は、受精能の問題を示す。例示的方法における受精能獲得条件は、ｉ）重炭酸およびカルシウムイオン、ならびにｉｉ）２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎仔臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質、またはリポソームなどのステロール流出メディエーターへの曝露を含み得る。１つまたは複数のＧＭ１局在パターンは、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ、ＩＮＴＥＲ、ＡＡおよび／またはＡＰＭであり得る。一実施形態では、個体の受精能状態は、受精能を獲得した精子に対する標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算することによって決定される。一実施形態では、曝露するステップの前に、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用し、精液の粘度を低下させるために使用される種々の試薬から選択された、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精液試料を処理して、精液の粘度を低下させる。一部の実施形態では、膜に損傷を与える試薬は、（ｉ）プロテアーゼ、（ｉｉ）ヌクレアーゼ、（ｉｉｉ）粘液溶解剤、（ｉｖ）リパーゼ、（ｖ）エステラーゼ、および（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼからなる群より選択される。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１８ゲージ、１６ゲージまたは１４ゲージのゲージサイズを有する。一部の実施形態では、ワイドオリフィスピペットは、少なくとも１ｍｍ、１．２ｍｍまたは１．４ｍｍのオリフィスサイズを有する。
【０１１６】
例示的方法における受精能の閾値は、集団の受精能の実質的な増大が終わるＡＡ＋ＡＰＭのパターンの百分率であり得る。例えば、受精能の閾値は、集団の５０％超が受精能を有するＡＡ＋ＡＰＭのレベル、集団の６０〜８５％超が受精能を有するＡＡ＋ＡＰＭのレベル、または３５〜４０の範囲（全ＧＭ１パターンの相対的百分率）（範囲の両端の値を含む）のＡＡ＋ＡＰＭのレベルであり得る。受精能の閾値は、３８、３８．５、３９、または３９．５％のＡＡ＋ＡＰＭ（全ＧＭ１パターンに対する）であり得る。
【０１１７】
例示的方法は、不妊の閾値に対する１つまたは複数のＧＭ１パターンの百分率を比較するステップをさらに含んでもよく、ここで、不妊の閾値未満の百分率は、不妊を示す。例えば、不妊の閾値は、集団の受精能が実質的に増大し始めるＡＡ＋ＡＰＭのパターンの百分率、集団の５０％未満が受精能を有するＡＡ＋ＡＰＭのレベル、集団の６０〜８５％より多くが受精能を有するＡＡ＋ＡＰＭのレベル、または１４〜１８（全ＧＭ１パターンの相対的百分率）（範囲の両端の値を含む）の範囲内のＡＡ＋ＡＰＭのレベルであり得る。不妊の閾値は、１４、１４．５、１５、または１５．５％のＡＡ＋ＡＰＭ（全ＧＭ１パターンに対する）であり得る。
【０１１８】
男性の受精能状態を特定するための例示的方法は、精子試料を得るステップであって、精子試料は個体に由来し、精子試料は、非受精能獲得条件または受精能獲得条件に曝露され、固定され、ＧＭ１に対して染色されたものである、ステップを含む。精子の選択されたＧＭ１パターンの数が決定される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非受精能獲得条件およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露された精子の異なるＧＭ１パターンに対する百分率が比較される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非受精能獲得条件に曝露された精子に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露された精子の１つまたは複数の選択されたＧＭ１パターンの百分率の変化は、個体の受精能状態を示す。ＧＭ１パターンは、ＡＡ、ＡＰＭ、ＩＮＴＥＲ、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌおよびそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。一実施形態では、個体の受精能状態は、受精能を獲得した精子に対する標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算することによって決定される。
【０１１９】
男性個体の受精能状態を特定するための例示的方法は、精子試料を得るステップであって、精子試料は個体に由来し、精子試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露され、固定され、ＧＭ１の存在に対して染色されたものである、ステップを含む。精子の選択されたＧＭ１パターンの数が決定される。１つまたは複数の異なるＧＭ１パターンに対する百分率が、対照に由来するパターンの百分率または所定の基準と比較される。対照の精子試料は、同一のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件および同一の固定剤に曝露されたものである。対照の変化に対する１つまたは複数の選択されたＧＭ１パターンの百分率の変化は、対照の受精能状態とは異なる個体の受精能状態を示す。
【０１２０】
男性個体の受精能状態を特定するための例示的方法は、精子試料を得るステップであって、精子試料は個体に由来し、精子試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露され、固定され、ＧＭ１パターンに対して染色されたものである、ステップを含む。試料におけるＧＭ１局在パターンが決定される。１つまたは複数のＧＭ１パターンの百分率が、不妊の閾値と比較され、不妊の閾値未満の百分率は、受精能の問題を示す。
【０１２１】
男性個体の受精能状態を測定するための例示的方法は、精子試料を得るステップであって、精子試料は個体に由来し、精子試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露され、固定剤に曝露され、ＧＭ１に対して染色されたものである、ステップを含む。元の試料の体積、ならびに元の試料における精子の濃度、運動性、および形態のうちの１つまたは複数に対する値が得られる。精子試料のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅは、試料における１つまたは複数のＧＭ１局在パターンの百分率として決定される。個体の男性の受精能指数（ＭＦＩ）値は、決定されたＣａｐ−Ｓｃｏｒｅならびに１つまたは複数の得られた体積、濃度、運動性、および形態に基づいて計算される。例えば、ＭＦＩ値は、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ、体積、濃度、運動性の値、および形態の値を掛けることによって計算することができる。運動性は、運動性である精子の百分率であり得る。形態は、形態学的に正常である精子の百分率であり得る。
【０１２２】
男性個体の受精能状態を測定するための例示的方法は、試料における１つまたは複数のＧＭ１局在パターンの百分率として、個体の精子試料のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを得るステップを含む。元の試料の体積、ならびに元の試料における精子の濃度、運動性、および形態のうちの１つまたは複数に対する値が得られる。個体の男性の受精能指数（ＭＦＩ）値は、決定されたＣａｐ−Ｓｃｏｒｅならびに１つまたは複数の得られた体積、濃度、運動性、および形態に基づいて計算される。
【０１２３】
本発明は、以下の例示的実施例を通してさらに説明されるが、例示的実施例は、限定として解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１２４】
（実施例１）
本実施例は、ヒトの精子に関して得られたＧＭ１局在パターンの実証を提供する。射精された精子を男性ドナーから採取し、３７℃で２０分間液化させ、次いで、体積、初期数、運動性および形態評価を実施した。１ｍｌの精液試料を、１５ｍＬのコニカルチューブ内の１ｍｌの密度勾配（９０％のＥｎｈａｎｃｅ−Ｓ；Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）の上に積層した。このチューブを１０分間３００×ｇで遠心分離した。底部の１ｍｌの画分を新しい１５ｍｌのチューブに移し、次いで、４ｍｌのｍＨＴＦ中で再懸濁した。これを１０分間６００×ｇで遠心分離した。上清を除去し、精子ペレットを０．５ｍｌのｍＨＴＦ中で再懸濁した。次いで、洗浄した精子を濃度と運動性について評価した。次いで、同じ体積の精子を、各チューブの最終体積が３００μｌとなり、精子の最終濃度が１，０００，０００／ｍｌとなるように２つのチューブに添加した。第１のチューブは、ｍＨＴＦを含有し（非受精能獲得条件）、第２のチューブは、ｍＨＴＦに加えて２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンを３ｍＭの最終濃度で含有した（受精能獲得条件）。時間の長さを変えて精子をインキュベートしたが、一般的には３時間を使用した。これらのインキュベーションは３７℃で実施した。
【０１２５】
インキュベーション期間の終わりに、それぞれのチューブの内容物を穏やかに混合し、それぞれのチューブから１８μｌを取り出し、別々の微小遠心チューブに移した。２μｌの１％（重量／体積）パラホルムアルデヒドを、０．１％の最終濃度を達成するために添加した。別の実施形態では、０．１％（重量／体積）パラホルムアルデヒドを、０．０１％の最終濃度を達成するために添加した。これらのチューブを穏やかに混合し、室温で１５分間インキュベートし、その時点で０．３μｌの１ｍｇ／ｍｌのコレラ毒素ｂサブユニットを添加した。２つのチューブの内容物を再び穏やかに混合し、さらに５分間室温でインキュベートした。それぞれのチューブから５μｌを取り出し、蛍光顕微鏡法による評価のためにスライドガラス上に置いた。対比染色を提供し、焦点面の決定を速やかにし、蛍光シグナルの寿命を長くするために、３μｌのＤＡＰＩ／Ａｎｔｉｆａｄｅを時々添加した。
【０１２６】
図２に示すように、正常なヒト精子中のＧＭ１の局在パターンは、受精能獲得条件に対する応答を反映する。完全な応答は、正常な受精能を有する男性でのみ観察され、子宮腔内受精（ＩＵＩ）または体外受精（ＩＶＦ）を以前に試みて失敗した未解明の不妊を有する男性では、この応答性パターンは、大きく低減するか、または存在しなかった。図１は、ヒト精子中のＧＭ１パターンを示す。しかしながら、診断アッセイの目的のために、ＰＡＰＭ、ＡＡ／ＰＡ、ＥＳ、およびＤＩＦＦなどの異常性を反映するパターンを、分析を容易にするために群に分けることも可能である。図２Ａ〜２Ｃは、非受精能獲得条件（ＮＣ、図２Ａ）、または受精能獲得条件（ＣＡＰ、図２Ｂ）下でインキュベートされた正常な精液中の異なるパターンの相対分布を示す。ＩＮＴＥＲのパターンの低減は、ＣＡＰへの曝露の際の正常な精液中で観察され（図２Ｃ）、一方、ＡＡのパターンとＡＰＭのパターンの有意な増加も観察される。これらの正常なデータとの比較では、未解明の不妊を有することが知られている男性の群の精子も、ＧＭ１アッセイに供した。これらの精子では、受精能獲得条件下でのＡＡのパターンまたはＡＰＭのパターンの増加は、ほとんどなかった。
【０１２７】
（実施例２）
本実施例では、３４名の患者の病歴を、これまでに妊娠の臨床的証拠を達成した履歴に対して、彼らのＧＭ１アッセイスコアの綿密な分析を実施するために研究した。患者カップルが、３またはそれより少ないサイクル以内に受精／臨床的妊娠の何らかの証拠（たとえ生化学的証拠または超音波による心拍なしの嚢に限定されても）を達成した場合、男性患者を「受精能を有する」と定義した。
【０１２８】
これら３４名の患者についてのデータの分析は、３時間の時点で、受精能獲得試料のスコアに対して４０％（ＡＰＭ＋ＡＡ）のカットオフを適用した場合、「合格」（３９．５％またはそれより高いスコアを有する）である８名のうち７名が「受精能を有する」と指定された（８７．５％）ことが見出されたことを明らかにした。「不合格」（３９．４またはそれより低いスコアを有する）２６名のうち、３／２６のみが、臨床的妊娠の証拠を有した（１１．５％）（以下の表１を参照のこと）。
【０１２９】
カットオフを低減する場合、臨床的に受精能の低いより多くの人が合格スコアを得て、アッセイを合格し、３サイクル以内に受精能を有する百分率が低下すると予想される。興味深いことに、結果は受精能（≦３サイクルの基準によって定義される）に関して、滑らかな勾配または連続曲線ではなかった。すなわち、４０または３５と規定されたアッセイに不合格であるかどうかは、受精確率の有意な変化と相関せず、常に低かった（１１．５〜１４．３％の間）。逆に、３５対４０でのアッセイの合格は、受精確率における非常に大きな差と一致した（それぞれ、５３．８〜８７．５％の範囲）。この点を強調し反復すると、ＡＰＭ＋ＡＡの組み合わせの百分率の５％の変化は、受精歴の３０％を超える変化に相当した。
【０１３０】
これらの結果は、男性の受精能が「階段関数」により近いことを示唆し、階段関数では、スコアの小さな変化が対応して小さくなるものの連続的な男性の受精能（臨床的妊娠を達成する確率）の変化と一致するというよりむしろ、男性の受精能アッセイのスコアの範囲が「受精能を有する」「受精能が低い」または「不妊」の分類と対応する。これらのデータは、およそ３８．５〜４０のスコアが、「受精能が低い」または「受精能を有する」の指定の間のカットオフであることを強く示す。データのさらなる検討は、１４．５％未満のカットオフが、「不妊」の可能性があるとの指定として使用できることを示唆する。
【表１−１】
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【０１３１】
平均精液パラメータの観点では全て類似しているこれらの男性のデータを要約すると、以下の範囲（絶対スコアに基づく）が示唆される：不妊：＜１４．５、受精能が低い：１４．５〜３８．４、受精能を有する：≧３８．５。
【０１３２】
あるいは、受精能獲得条件下のインキュベーション時間にわたるＡＰＭおよび／もしくはＡＡのパターンの相対数の変化を比較することによって、または非受精能獲得条件下で観察される相対数に対して比較することによって、試料の受精能を評価することができる。例えば、受精能獲得条件下での３時間のインキュベーション後のＡＰＭ＋ＡＡの相対数を、インキュベーション開始時のそれらのパターンの相対数と比較することができる。さらに別の実施形態では、ＡＰＭおよび／またはＡＡの頻度の変化を、逐次的な時点（例えば、１、２および３時間）から得られた結果と比較することも可能である。実際に、Ｙ軸に相対頻度を、Ｘ軸に時点をプロットし、非受精能獲得条件および受精能獲得条件下のＩＮＴＥＲ、ＡＰＭおよび／またはＡＡの試料のうちの１つまたは複数の増加する数の変化の勾配または割合を評価することができる。分析へのこのアプローチを、６３名の患者の群で実施したとき、正常な基準群に適合するスコアを有する３１名の男性が特定され、非受精能獲得培地において１７％−２２％−２８％の、および受精能獲得培地において２６％−３１％−３８％（それぞれ、１、２および３時間のインキュベーションに対して）のベースラインＧＭ１パターンを有していた（図３を参照のこと）。非受精能獲得培地において１５％−２０％−２４％、受精能獲得培地において２０％−２５％−２９％の、基準値を下回る３２名の男性が特定された。数、運動性および正常な形態のパーセントの精液分析パラメータ（厳格なＷＨＯ基準を使用）は、２つの群間で同等であった。正常な範囲のＧＭ１パターンを有する集団は、４５．２％（１４／３１）の子宮腔内受精（ＩＵＩ）妊娠率を有し、そのうち８名（２５．８％）が、少なくとも１度の胎児心拍を生じた。この群の３組のさらなるカップルは、独力で妊娠に至った。基準未満のＧＭ１パターンを有する男性では、ＩＵＩ臨床的妊娠率は、わずか６．３％（２／３２、Ｐ＝０．０３）であった。このコホートでは、１３名がＩＣＳＩを受け、６名が妊娠に至った（４６．２％）。
【０１３３】
（実施例３）
精子細胞を、固定剤中で２４時間インキュベートした以外、実施例１に記載したように処理した。次いで、標識した精子細胞を蛍光顕微鏡法で評価した。新たなＧＭ１局所パターン、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌを図６Ａ、６Ｂ、６Ｃおよび６Ｄで示したように特定した。Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌでは、図６Ａに示したように、赤道セグメントの底部／先体後方領域の頂部、および先体を覆う細胞膜にＧＭ１シグナルが存在する。シグナルは、先体後方／赤道領域、および先体を覆う細胞膜に均一に分布する。シグナルが欠如する赤道セグメントのバンドも存在する。図６Ｂに示すように、先体を覆う細胞膜のシグナルは、先体後方／赤道バンドのシグナルより明るい。図６Ｃおよび６Ｄに示すように、先体後方／赤道バンドに見られるシグナルは、先体を覆う細胞膜のシグナルより明るい。
【０１３４】
単一のドナーに由来する精子細胞を洗浄し、受精能獲得条件（Ｓｔｉｍ）および非受精能獲得条件（Ｎｏｎ−Ｓｔｉｍ）下の両方でインキュベートし、次いで、０日目（およそ５時間の固定を維持した）と１日目（およそ２７．５時間の固定を維持した）の両方でスコア化した。Ｓｔｉｍ処理に対して、０日目から１日目のＬｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌの百分率にはほとんど変化がなかった。対照的に、Ｎｏｎ−Ｓｔｉｍ処理では、０日目から１日目のｌｉｎｅｄ  ｃｅｌｌの百分率が３から２２％に増加した。この変化と併せて、ＩＮＴＥＲが７６から５１％に、これに続いて低下した。これらのデータは、０日目のｉｎｔｅｒのパターンを有する細胞から１日目に発生するｌｉｎｅｄ  ｃｅｌｌのパターンに一致する。
【表１−２】
2020072758.tif 000003
【０１３５】
（実施例４）
単一のドナーに由来する細胞を洗浄し、受精能獲得条件（Ｓｔｉｍ）および非受精能獲得条件（Ｎｏｎ−Ｓｔｉｍ）下の両方でインキュベートし、次いで、０日目（およそ４時間の固定を維持した）と１日目（およそ２５時間の固定を維持した）の両方でスコア化した。０日目にはｌｉｎｅｄ  ｃｅｌｌはほとんど観察されなかったため、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅを決定するために、Ｌｉｎｅｄ−ｃｅｌｌ数を含めてまたはそれを含まずに、同様のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅが０日目に得られた。しかし、１日目にＬｉｎｅｄ−ｃｅｌｌが出現すると、Ｌｉｎｅｄ−ｃｅｌｌをどのように解釈するかによって異なるＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）値を得ることができた。例えば、Ｌｉｎｅｄ−ｃｅｌｌが受精能を獲得していないものとして処理された場合、Ｓｔｉｍとｎｏｎ−Ｓｔｉｍ処理の両方で同様のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）が得られた。しかし、Ｌｉｎｅｄ−ｃｅｌｌが受精能を獲得したものとして処理されたか、分離されたか、またはＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）の計算から除去された場合、Ｓｔｉｍ処理に対するよりも大きなＣａｐ−ＳｃｏｒｅがＮｏｎ−Ｓｔｉｍ処理に対して得られた。Ｎｏｎ−Ｓｔｉｍ処理に対してより大きなＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）値を有することには意味がない。なぜなら、これらの精子細胞が基底条件下でインキュベートされ、したがって、受精能獲得に関連するＧＭ１パターンを示さなかったためである。これらの観察により、Ｌｉｎｅｄ−ｃｅｌｌが受精能を獲得していない状態を表し、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）を計算する場合にそのようなものとして処理されるべきであるという補完的な証拠がさらに提供される。
【表２】
2020072758.tif 000004
【０１３６】
（実施例５）
１８名の固有のドナーに由来する４０個の異なる精液試料を洗浄し、受精能獲得条件（Ｓｔｉｍ）および非受精能獲得条件（Ｎｏｎ−Ｓｔｉｍ）下の両方でインキュベートし、次いで、０日目と１日目の両方でスコア化した。Ｌｉｎｅｄ−ｃｅｌｌが受精能を獲得していないものとして処理される場合、０日目と１日目に得られたＳｔｉｍ  Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）値の間で有意な相関が観察される（ｒ＝０．３２、ｎ＝４０、ｐ＜０．０５）。対照的に、Ｌｉｎｅｄ−ｃｅｌｌが受精能を獲得したものとして処理されるか、ＧＭ１局在パターンに基づき、受精能を獲得したビン（ｂｉｎ）もしくは受精能を獲得していないビンに分離されるか、または単にＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）から除去される場合、０日目と１日目の間に相関は観察されない。これらの観察によって、Ｌｉｎｅｄ−ｃｅｌｌの局在パターンは、精子が終夜維持される場合に生じ、０日目にはこれらの精子はｉｎｔｅｒ／受精能を獲得していないパターンを示すという見解が支持される。受精能を獲得していないものとしてのＬｉｎｅｄ−ｃｅｌｌの処理は、時間をわたってＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（商標）を安定させ、不妊である細胞を反映するこのパターンと一致する。さらに、これらのデータによって、Ｌｉｎｅｄ−ｃｅｌｌが受精能を獲得していないとの解釈は、集団に適用可能であることが実証される。それにもかかわらず、１日目のＬｉｎｅｄ−ｃｅｌｌの出現はドナーに依存する。このことにより、これらのＬｉｎｅｄ−ｃｅｌｌを観察すると、これらのドナーおよびその精子の受精する能力についてのさらなる情報が提供される可能性が生じる。
【０１３７】
本開示を１つまたは複数の特定の実施形態に関して説明したが、本開示の他の実施形態が、本開示の精神および範囲を逸脱することなくなされ得、このような他の実施形態が本開示の範囲内であると意図されていることが理解されるであろう。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
男性に由来する精子試料の第１の部分を非受精能獲得条件に曝露して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料を得るステップと；
前記精子試料の第２の部分を受精能獲得条件に曝露して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を得るステップと；
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、少なくとも１時間の期間、固定剤でそれぞれ固定するステップと；
前記固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および前記固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、ＧＭ１局在パターンのための標識分子でそれぞれ処理するステップであって、前記標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記標識されたＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料に対する前記標識されたＧＭ１局在パターンを、前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する前記標識されたＧＭ１局在パターンと比較するステップと；
前記比較に基づいて、前記先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび前記先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得した状態に割り当て、前記Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび前記全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得していない状態に割り当てるステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対して、前記特定され、標識されたＧＭ１局在パターンに基づいて、前記男性の受精能状態を特徴付けるステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記特徴付けるステップが、
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率に関連する受精能の閾値を決定するステップであって、
公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率が、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；前記基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、かつ前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率未満であると不妊であることを示す、ステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記百分率を、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記基準百分率と比較するステップと；
前記受精能の閾値を、前記比較に基づいて特定するステップと
を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記特徴付けるステップが、
所定数の、前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと；
所定数の、前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料に対する標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップと
をさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンが、ＡＡのＧＭ１局在パターン、ＡＰＭのＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、中間（ＩＮＴＥＲ）のＧＭ１局在パターン、先体後方細胞膜（ＰＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、先体頂部／先体後方（ＡＡ／ＰＡ）のＧＭ１局在パターン、赤道セグメント（ＥＳ）のＧＭ１局在パターン、および散在性（ＤＩＦＦ）のＧＭ１局在パターンを含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記受精能獲得条件が、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出メディエーターのうちの１つまたは複数への曝露を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎仔臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質、またはリポソームである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンである、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記非受精能獲得条件が、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出メディエーターのうちの１つまたは複数への曝露の欠如を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記固定剤が、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはそれらの組み合わせを含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンのための前記標識分子が、蛍光標識されたコレラ毒素ｂサブユニットである、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記特定するステップが、前記曝露するステップの２〜２４時間後に実施される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記精子試料の前記第１の部分を非受精能獲得条件に曝露することと前記精子試料の前記第２の部分を受精能獲得条件に曝露することとが同時に起こる、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子の比を、公知の受精能状態を有する、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子の比と比較するステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子の比を、公知の受精能状態を有する、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子の比と比較するステップと
をさらに含む、項目３に記載の方法。
（項目１４）
前記曝露するステップの前に、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用し、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精液試料を処理して、精液の粘度を低下させるステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
男性の受精能状態を特定するためのキットであって、
受精能を獲得した精子の１つまたは複数のＧＭ１局在パターンと受精能を獲得していない精子の１つまたは複数のＧＭ１局在パターンとを示す図であって、前記受精能を獲得した精子のＧＭ１局在パターンと前記受精能を獲得していない精子のＧＭ１局在パターンが公知の受精能状態を反映する、図と；
精子膜のせん断を妨げるのに十分な直径サイズのオリフィスを有するワイドオリフィスピペットと；
以下：受精能獲得培地、非受精能獲得培地、固定剤組成物、ＧＭ１局在パターンを決定するための標識試薬のうちの１つまたは複数とを含み、
但し、前記組成物は精子膜に損傷を与えず、前記受精能獲得培地および前記非受精能獲得培地は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで精子細胞に適用される場合、前記図に反映されるように、受精能を獲得した精子を示すＧＭ１局在パターンおよび受精能を獲得していない精子を示すパターンを生じる、キット。
（項目１６）
前記ワイドオリフィスピペットが、少なくとも１８ゲージのオリフィスサイズを有する、項目１５に記載のキット。
（項目１７）
前記ワイドオリフィスピペットが、非金属材料から作製されている、項目１５および１６のいずれかに記載のキット。
（項目１８）
精子膜に損傷を与える可能性のある試薬が、（ｉ）プロテアーゼ、（ｉｉ）ヌクレアーゼ、（ｉｉｉ）粘液溶解剤、（ｉｖ）リパーゼ、（ｖ）エステラーゼ、および（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼからなる群より選択される、項目１５から１７のいずれかに記載のキット。
（項目１９）
前記精子膜に損傷を与えるのを避けるために精子の取り扱いのための指示をさらに含む、項目１５から１８のいずれかに記載のキット。
（項目２０）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非受精能獲得条件に曝露され、少なくとも１時間、固定剤で固定され、かつＧＭ１局在パターンのための標識分子で処理された、男性に由来する精子試料の第１の部分を得るステップであって、前記標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと；
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露され、固定剤で固定され、かつＧＭ１局在パターンのための前記標識分子で処理された、前記精子試料の第２の部分を得るステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記標識されたＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料に対する前記標識されたＧＭ１局在パターンを、前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する前記標識されたＧＭ１局在パターンと比較するステップと；
前記比較に基づいて、前記先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび前記先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得した状態に割り当て、前記Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび前記全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得していない状態に割り当てるステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対して、前記特定され、標識されたＧＭ１局在パターンに基づいて、前記男性の受精能状態を特徴付けるステップと
を含む、方法。
（項目２１）
前記特徴付けるステップが、
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率に関連する受精能の閾値を決定するステップであって、
公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率が、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；前記基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、かつ前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率未満であると不妊であることを示す、ステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記百分率を、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記基準百分率と比較するステップと
前記受精能の閾値を、前記比較に基づいて特定するステップと
を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記特徴付けるステップが、
所定数の、前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料のそれぞれに対するＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップと
を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記特徴付けるステップが、
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料の比を、公知の受精能状態を有する男性に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子のＧＭ１局在パターンの比と比較するステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料の比を、公知の受精能状態を有する男性に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子のＧＭ１局在パターンの比と比較するステップと
をさらに含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記公知の受精能状態が、受精能を有する、受精能を有さない、およびそれらの組み合わせを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンが、ＡＡのＧＭ１局在パターン、ＡＰＭのＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、中間（ＩＮＴＥＲ）のＧＭ１局在パターン、先体後方細胞膜（ＰＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、先体頂部／先体後方（ＡＡ／ＰＡ）のＧＭ１局在パターン、赤道セグメント（ＥＳ）のＧＭ１局在パターン、および散在性（ＤＩＦＦ）のＧＭ１局在パターンである、項目２０に記載の方法。
（項目２６）
前記受精能獲得条件が、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出メディエーターのうちの１つまたは複数への曝露を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２７）
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎仔臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質、またはリポソームである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンである、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記非受精能獲得条件が、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出メディエーターのうちの１つまたは複数への曝露の欠如を含む、項目２０に記載の方法。
（項目３０）
前記固定剤が、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはそれらの組み合わせを含む、項目２０に記載の方法。
（項目３１）
前記ＧＭ１局在パターンのための前記標識分子が、蛍光標識されたコレラ毒素ｂサブユニットである、項目２０に記載の方法。
（項目３２）
前記特定するステップが、前記曝露するステップの２〜２４時間後に実施される、項目２０に記載の方法。
（項目３３）
前記精子試料の前記第１の部分を非受精能獲得条件に曝露することと前記精子試料の前記第２の部分を受精能獲得条件に曝露することとが同時に起こる、項目２０に記載の方法。
（項目３４）
前記得るステップの前に、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用し、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精液試料を処理して、精液の粘度を低下させるステップをさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目３５）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、男性に由来する精子試料を受精能獲得条件に曝露するステップと；
前記受精能を獲得した精子試料を、少なくとも１時間、固定剤で固定するステップと；
前記固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、ＧＭ１局在パターンのための標識分子で処理するステップであって、前記標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと；
前記標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記標識されたＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；
前記先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび前記先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得した状態に割り当て、前記Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび前記全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得していない状態に割り当てるステップと；
前記男性の受精能状態を特徴付けるステップと
を含む、方法。
（項目３６）
前記特徴付けるステップが、
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率に関連する受精能の閾値を決定するステップであって、
公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率が、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；前記基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、かつ前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率未満であると不妊であることを示す、ステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記百分率を、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記基準百分率と比較するステップと
前記受精能の閾値を、前記比較に基づいて特定するステップと
を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
ＧＭ１局在パターンの比を、公知の受精能状態を有する男性に対するＧＭ１局在パターンの比と比較するステップ
をさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記比較するステップが、
所定数の、前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと、
標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップと
を含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記２つ以上のＧＭ１局在パターンが、ＡＡのＧＭ１局在パターン、ＡＰＭのＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、中間（ＩＮＴＥＲ）のＧＭ１局在パターン、先体後方細胞膜（ＰＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、先体頂部／先体後方（ＡＡ／ＰＡ）のＧＭ１局在パターン、赤道セグメント（ＥＳ）のＧＭ１局在パターン、および散在性（ＤＩＦＦ）のＧＭ１局在パターンである、項目３５から３８のいずれかに記載の方法。
（項目４０）
前記受精能獲得条件が、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出メディエーターのうちの１つまたは複数への曝露を含む、項目３５に記載の方法。
（項目４１）
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎仔臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質、またはリポソームである、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記公知の受精能状態が、受精能を有する男性に対応する、項目３７に記載の方法。
（項目４４）
前記公知の受精能状態が、不妊男性に対応する、項目３７に記載の方法。
（項目４５）
前記固定剤が、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはそれらの組み合わせを含む、項目３５に記載の方法。
（項目４６）
ＧＭ１局在パターンのための前記標識分子が、蛍光標識されたコレラ毒素ｂサブユニットである、項目３５に記載の方法。
（項目４７）
前記特定するステップが、前記曝露するステップの２〜２４時間後に実施される、項目３５に記載の方法。
（項目４８）
前記曝露するステップの前に、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用し、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精液試料を処理して、精液の粘度を低下させるステップをさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目４９）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露され、少なくとも１時間、固定剤で固定され、かつＧＭ１局在パターンのための標識分子で染色された、男性に由来する精子試料の第１の部分を得るステップであって、前記標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記ＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；
前記先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび前記先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得した状態に割り当て、前記Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび前記全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得していない状態に割り当てるステップと；
前記男性の受精能状態を特徴付けるステップと
を含む、方法。
（項目５０）
前記特徴付けるステップが、
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率に関連する受精能の閾値を決定するステップであって、
公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率が、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；前記基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、かつ前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率未満であると不妊であることを示す、ステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記百分率を、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記基準百分率と比較するステップと
前記受精能の閾値を、前記比較に基づいて特定するステップと
を含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
ＧＭ１局在パターンの比を、公知の受精能状態を有する男性に対するＧＭ１局在パターンの比と比較するステップ
をさらに含む、項目４９に記載の方法。
（項目５２）
前記比較するステップが、
所定数の、前記標識され、固定された受精能を獲得した精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと、
標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップと
を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記２つ以上のＧＭ１局在パターンが、ＡＡのＧＭ１局在パターン、ＡＰＭのＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、中間（ＩＮＴＥＲ）のＧＭ１局在パターン、先体後方細胞膜（ＰＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、先体頂部／先体後方（ＡＡ／ＰＡ）のＧＭ１局在パターン、赤道セグメント（ＥＳ）のＧＭ１局在パターン、および散在性（ＤＩＦＦ）のＧＭ１局在パターンである、項目４９から５２のいずれかに記載の方法。
（項目５４）
前記受精能獲得条件が、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出メディエーターのうちの１つまたは複数への曝露を含む、項目４９に記載の方法。
（項目５５）
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎仔臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質、またはリポソームである、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンである、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記公知の受精能状態が、受精能を有する男性に対応する、項目５１に記載の方法。
（項目５８）
前記公知の受精能状態が、不妊男性に対応する、項目５１に記載の方法。
（項目５９）
前記固定剤が、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはそれらの組み合わせを含む、項目４９に記載の方法。
（項目６０）
ＧＭ１局在パターンのための前記標識分子が、蛍光標識されたコレラ毒素ｂサブユニットである、項目４９に記載の方法。
（項目６１）
前記特定するステップが、前記曝露するステップの２〜２４時間後に実施される、項目４９に記載の方法。
（項目６２）
前記得るステップの前に、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用し、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精液試料を処理して、精液の粘度を低下させるステップをさらに含む、項目４９に記載の方法。
（項目６３）
精子試料を得るステップであって、前記精子試料の少なくとも一部が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子を得るためにｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露され、少なくとも１時間、固定剤に曝露され、かつＧＭ１に対して染色されている、ステップと；
前記精子試料の１つまたは複数の精液パラメータに対する値を得るステップと；
１つまたは複数の標識されたＧＭ１局在パターンに基づいて、前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを決定するステップであって、前記標識されたＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体後方細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；
前記決定されたＣＡＰ−Ｓｃｏｒｅおよび前記１つまたは複数の得られた精液パラメータに基づいて、前記男性の受精能指数（ＭＦＩ）値を計算するステップと
を含む、方法。
（項目６４）
前記精子試料の前記１つまたは複数の精液パラメータが、元の精子試料の体積、精子濃度、精子の運動性、および精子の形態からなる群より選択される、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅが、ＡＡのＧＭ１局在パターン、ＡＰＭのＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび中間（ＩＮＴＥＲ）のＧＭ１局在パターン、先体後方細胞膜（ＰＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、先体頂部／先体後方（ＡＡ／ＰＡ）のＧＭ１局在パターン、赤道セグメント（ＥＳ）のＧＭ１局在パターン、ならびに散在性（ＤＩＦＦ）のＧＭ１局在パターンに基づく、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
前記得るステップの前に、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用し、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精液試料を処理して、精液の粘度を低下させるステップをさらに含む、項目６３に記載の方法。
（項目６７）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子細胞の試料を蛍光標識で処理するステップと；
蛍光標識されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子細胞と関連する１つまたは複数のＧＭ１局在パターンを示す、１つまたは複数の受精能を獲得した蛍光画像を得るステップと；
先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、前記受精能獲得蛍光画像において示された受精能を獲得した状態に割り当て、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを、前記受精能獲得蛍光画像において示された受精能を獲得していない状態に割り当てるステップと；
［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率を決定するために、前記受精能獲得蛍光画像で示された、前記蛍光標識されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子細胞に対するＡＡのＧＭ１局在パターン、ＡＰＭのＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを含むＧＭ１局在パターンの数を測定するステップと；
［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率と関連する受精能の閾値を決定するステップであって；
公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率が、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；前記基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、かつ前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率未満であると不妊であることを示す、ステップと；
［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記百分率を、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記基準百分率と比較するステップと；
前記受精能の閾値を、前記比較に基づいて特定するステップと
を含む、方法。
（項目６８）
前記特定するステップが、以下：患者の人口統計、女性パートナーの生殖状態、精子濃度、総運動性、直進運動性、精液の体積、精液のｐＨ、精液の粘度および／または精子の形態、ならびにそれらの組み合わせのうちの１つまたは複数にも基づく、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
２つ以上のＧＭ１局在パターンが、ＡＡのＧＭ１局在パターン、ＡＰＭのＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、ＩＮＴＥＲのＧＭ１局在パターン、ＰＡＰＭのＧＭ１局在パターン、ＡＡ／ＰＡのＧＭ１局在パターン、ＥＳのＧＭ１局在パターン、およびＤＩＦＦのＧＭ１局在パターンを含む、項目６７に記載の方法。
（項目７０）
前記精子細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、少なくとも１時間、少なくとも３時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間の受精能獲得期間；０．５時間から３時間、３時間から１２時間、６時間から１２時間、３時間から２４時間、１２時間から２４時間、または１８時間から２４時間の間の範囲の受精能獲得期間、受精能獲得条件で処理される、項目６７に記載の方法。
（項目７１）
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子細胞が、少なくとも０．５時間、少なくとも３時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、または少なくとも４８時間の固定期間、０．５時間から３時間、３時間から１２時間、６時間から１２時間、３時間から１８時間、６〜１８時間、６〜２４時間、１２時間から２４時間、１８時間から２４時間、１８〜３０時間、１８〜３６時間、２４〜３０時間、２４〜２６時間、１８〜４８時間、２４〜４８時間、または３６〜４８時間の間の範囲の固定期間、固定剤で処理される、項目６７に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【外国語明細書】
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