(57)【要約】      （修正有）【課題】ＦｃＲｎ結合特性が改変され、プロテインＡ結合特性が保持されているＦｃ領域の変異を有し、かつ多重特異性ヘテロ二量体ＩｇＧ抗体の生成における２種の異なる重鎖の正しい会合を強めるための変異を有する、Ｆｃ領域変異体の提供。【解決手段】第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、前記第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは各々、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１個以上のシステイン残基を含む、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含み、一例として、前記第１のポリペプチドは、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含む、ポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドであって、
第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、該第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは各々、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１個以上のシステイン残基を含む、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含み、
ｉ）該第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、該第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）該第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、該第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｉｉｉ）該第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、該第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含む、
ポリペプチド。
【請求項２】
ヒトＦｃＲｎと特異的に結合せず、ブドウ球菌プロテインＡと特異的に結合する、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
ｉ）前記第１のポリペプチドが、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを更に含み、前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを更に含むか、又はｉｉ）前記第１のポリペプチドが、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを更に含み、前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを更に含む、請求項１〜２のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び前記免疫グロブリンＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである、請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを更に含む、請求項１〜４のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び前記免疫グロブリンＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ２サブクラスのものである、請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び前記免疫グロブリンＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ４サブクラスのものである、請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを更に含む、請求項１〜３及び７のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｐ３２９Ｇを更に含む、請求項１〜８のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１０】
二重特異性抗体である、請求項１〜９のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ポリペプチドであって、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第１のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第２のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第３のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第４のポリペプチド
を含み、
該第１の重鎖可変ドメインと該第１の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第１の結合部位を形成し、
該第２の重鎖可変ドメインと該第２の軽鎖可変ドメインは、第２の抗原と特異的に結合する第２の結合部位を形成し、
ｉ）該第１のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、該第２のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含むか、又はｉｉ）該第１のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、該第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、
該第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを更に含み、
ｉ）該第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、該第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）該第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、該第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｉｉｉ）該第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、該第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含む、
ポリペプチド。
【請求項１２】
ポリペプチドであって、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第１のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第２のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の軽鎖可変ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含む、第３のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第４のポリペプチド
を含み、
該第１の重鎖可変ドメインと該第１の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第１の結合部位を形成し、
該第２の重鎖可変ドメインと該第２の軽鎖可変ドメインは、第２の抗原と特異的に結合する第２の結合部位を形成し、
ｉ）該第１のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、該第２のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含むか、又はｉｉ）該第１のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、該第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、
該第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを更に含み、
ｉ）該第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、該第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）該第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、該第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｉｉｉ）該第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、該第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含む、
ポリペプチド。
【請求項１３】
硝子体内適用のための、請求項１〜１２のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１４】
眼血管疾患処置用の、請求項１〜１２のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項記載のポリペプチド及び場合により薬学的に許容し得る担体を含む医薬処方物。
【請求項１６】
可溶性のレセプターリガンドを、血液−眼関門を抜けて眼から血液循環に輸送するための、請求項１〜１２のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。
【請求項１７】
１種以上の可溶性のレセプターリガンドを眼から除去するための、請求項１〜１２のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。
【請求項１８】
眼疾患の処置に使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書においては、その精製特性を損なうことなく、Ｆｃ−レセプター結合に関して改変されているＩｇＧＦｃ領域が報告される。
【０００２】
発明の背景
費用効率の高い製造プロセスに対する需要が、１つ以上のアフィニティークロマトグラフィー工程を含む下流側の精製の最適化の必要性につながっていた。処理すべきものの体積がより大きいことと、定置洗浄（ＣＩＰ）プロトコールについての要件がより厳しいことが、解決を要する特性のうちのいくつかである（Hober, S., J. Chrom. B. 848 (2007) 40-47）。
【０００３】
Ｆｃ領域に親和性のある選択的なリガンドによるモノクローナル抗体の精製は、治療用モノクローナル抗体の大量生産のための最も有望な方法論である。実際、この手順は、抗体の抗原特異的な部分、即ちＦａｂドメインとの何らかの相互作用を確立する必要がなく、よって、同ドメインは不変のままであり、その特性を保持することができる（Salvalaglio, M., et al., J. Chrom. A 1216 (2009) 8678-8686を参照）。
【０００４】
アフィニティー精製工程は、その選択性故に、一連の精製操作の初期に用いられ、これにより、それに続く単位操作の数を減らすことができる（前記Hober；MacLennan, J., Biotechnol. 13 (1995) 1180; Harakas, N.K., Bioprocess Technol. 18 (1994) 259を参照）。
【０００５】
選択的にＩｇＧと結合させるのに最も採用されるリガンドは、ブドウ球菌プロテインＡ及びプロテインＧであり、これらは多くのＩｇＧのＦｃ領域と、「コンセンサス結合部位」（ＣＢＳ）（DeLano, W.L., et al., Science 287 (2000) 1279）として知られる領域（Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの間のヒンジ領域に位置する）内において、高度に選択的な相互作用を確立することができる。
【０００６】
ブドウ球菌プロテインＡ（ＳＰＡ）は、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌の表面に露出している、細胞壁関連タンパク質ドメインである。ＳＰＡは、様々な種に由来するＩｇＧ、例えばヒト、ウサギ及びモルモットＩｇＧと高い親和性を有するが、ウシ及びマウスＩｇＧとは弱い相互作用しか持たない（下記表を参照）（前記Hober; Duhamel, R.C., et al., J. Immunol. Methods 31 (1979) 211; Bjork, L. and Kronvall, G., Immunol. J. 133 (1984) 969; Richman, D.D., et al., J. Immunol. 128 (1982) 2300; Amersham Pharmacia Biotech, Handbook, Antibody Purification (2000)を参照）。
【０００７】
【表１】
2020196744.tif 000002
【０００８】
ＩｇＧのＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの間の重鎖ヒンジ領域は、プロテインＡ以外に、新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）といった数種のタンパク質と結合することができる（前記DeLano及びSalvalaglioを参照）。
【０００９】
ＳＰＡ  ＣＢＳは、抗体表面の疎水性ポケットを含む。ＩｇＧ  ＣＢＳを構成する残基は、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｍｅｔ２５２、Ｍｅｔ４２３、Ｔｙｒ３２６、Ｈｉｓ４３５、Ａｓｎ４３４、Ｈｉｓ４３３、Ａｒｇ２５５及びＧｌｕ３８０である（Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるＩｇＧ重鎖残基のナンバリング）。荷電アミノ酸（Ａｒｇ２５５、Ｇｌｕ３８０）が、Ｉｌｅ２５３及びＳｅｒ２５４で形成される疎水性ノブの周囲に位置している。このことが、極性及び親水性相互作用の確立をもたらしている（可能性がある）（前記Salvalaglioを参照）。
【００１０】
一般に、プロテインＡ−ＩｇＧ相互作用は、２つの主要な結合部位を用いて記載することができる：第１は、重鎖ＣＨ２ドメイン内に位置し、Ｐｈｅ１３２、Ｌｅｕ１３６、Ｉｌｅ１５０（プロテインＡの）と、Ｉｌｅ２５３及びＳｅｒ２５４で構成されるＩｇＧ疎水性ノブの間の疎水性相互作用と、Ｌｙｓ１５４（プロテインＡ）とＴｈｒ２５６（ＩｇＧ）の間の一つの静電的相互作用により特徴付けられる。第２の部位は、重鎖ＣＨ３ドメイン内に位置し、Ｇｌｎ１２９及びＴｙｒ１３３（プロテインＡ）と、Ｈｉｓ４３３、Ａｓｎ４３４及びＨｉｓ４３５（ＩｇＧ）の間の静電的相互作用を特徴とする（前記Salvalaglioを参照）。
【００１１】
Lindhofer, H., et al. (J. Immunol. 155 (1995) 219-225)には、ラット／マウスクアドローマ（quadromas）における、優先的な、種に制限された重鎖／軽鎖ペアリングが報告されている。
【００１２】
Jedenberg, L., et al. (J. Immunol. Meth. 201 (1997) 25-34)には、２種のＦｃ変異体（Ｆｃ１３及びＦｃ３１、各々の他のアイソタイプからのアイソタイプジペプチド置換を各々含む）のＳＰＡ−結合解析が、Ｆｃ１及びＦｃ３１はＳＰＡと相互作用するが、Ｆｃ３及びＦｃ１３では検出可能なＳＰＡ結合がないことを示したことが報告されている。もたらされたＦｃ領域変異体Ｆｃ３１のＳＰＡ結合は、導入されたジペプチド置換Ｒ４３５Ｈ及びＦ４３６Ｙによるものであると結論付けられている。
【００１３】
今日では、治療用モノクローナル抗体に関する焦点は、２種以上の標的（抗原）と特異的に結合する二重特異性又は多重特異性抗体の生成及び使用にある。
【００１４】
一つの発現細胞株において、４種の抗体鎖（２種の異なる重鎖及び２種の異なる軽鎖）から、多重特異性ヘテロ二量体ＩｇＧ抗体を生成させることにおける基本的な課題は、いわゆる鎖会合問題である（Klein, C., et al., mAbs 4 (2012) 653-663を参照）。多重特異性抗体の左腕及び右腕として異なる鎖を用いる必要があることが、１種の細胞内での発現により抗体混合物をもたらす：２種の重鎖は、（理論的には）４つの異なる組み合わせ（このうちの２つは同じもの）で会合することができ、これらが各々確率的様式で軽鎖と会合することができ、２４（＝合計１６）の理論的に可能な鎖の組み合わせをもたらす。この理論的に可能な１６の組み合わせのうち、実際に見出すことができるのは１０だが、このうち所望の機能的二重特異性抗体に該当するものは１つしかない(De Lau, W.B., et al., J. Immunol. 146 (1991) 906-914)。複合体混合物からこの所望の二重特異性抗体を単離することにおける困難さと、理論的最大値でも１２．５％という本来的に乏しい収率が、一つの発現細胞株において二重特異性抗体を製造することを極めて厳しい（challenging）ものにしている。
【００１５】
鎖会合問題を解決し、２種の異なる重鎖の正しい会合を強めるため、１９９０年代後半、GenentechのCarterらは、「ノブズ−イントゥ−ホールズ」（ＫｉＨ）と名付けられたアプローチを発明した（Carter, P., J. Immunol. Meth. 248 (2001) 7-15; Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681; Zhu, Z., et al., Prot. Sci. 6 (1997) 781-788; Ridgway, J.B., et al., Prot. Eng. 9 (1996) 617-621; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270(1997) 26-35;及び米国特許第７１８３０７６号を参照）。基本的に、この概念は、相互作用が最も生じる、抗体の２つの重鎖の２つのＣＨ３ドメイン間の界面の改変に依存している。一方の抗体重鎖のＣＨ３ドメインに嵩高い残基を導入し、これが鍵（「ノブ」）に類似した挙動を示す。他方の重鎖には「ホール」を形成し、これはこの嵩高い残基を収容することができ、錠を模倣する。得られたヘテロ二量体Ｆｃ領域は、人工ジスルフィド架橋の導入／形成により更に安定化させることができる。注目すべきは、全てのＫｉＨ突然変異はＣＨ３ドメイン内に埋没し、免疫系内において「可視」でないということである。加えて、（熱）安定性、ＦｃγＲ結合及びエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＦｃＲｎ結合）といった、ＫｉＨ突然変異を有する抗体の特性及び薬物動力学的（ＰＫ）挙動は、影響を受けない。
【００１６】
ヘテロ二量体化を伴う正しい重鎖の会合の９７％を超える収率は、６つの突然変異、「ノブ」重鎖におけるＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及び「ホール」重鎖におけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを導入することにより達成することができる（前記Carterを参照；Kabat EUインデックスナンバリングシステムによる残基のナンバリング）。ホール−ホールホモ二量体は生じうるが、ノブ−ノブホモ二量体は、典型的には観測されない。ホール−ホールホモ二量体は、選択的精製手順により、又は以下に要約する手順により欠失させることができる。
【００１７】
ランダム重鎖会合の問題には対処がなされたが、正しい軽鎖会合もまた確実にされなければならない。ＫｉＨ  ＣＨ３ドメインアプローチと同様に、最終的に完全な二重特異性ＩｇＧをもたらしうる非対称軽鎖−重鎖相互作用を調査する努力がなされている。
【００１８】
Roche社は近年、ＫｉＨ技術と組み合わせると、二重特異性ヘテロ二量体ＩｇＧ抗体における正しい軽鎖ペアリングを強める可能性として、CrossMabアプローチを開発した（前記Klein; Schaefer. W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 11187-11192; Cain, C., SciBX 4 (2011) 1-4を参照）。これは、二重特異性又は多重特異性抗体の生成を一般的な様式で可能にするものである。この形式では、意図する二重特異性抗体の一方の腕は手つかずのままである。第２の腕においては、Ｆａｂ領域全体、又はＶＨ−ＶＬドメイン又はＣＨ１−ＣＬドメインを、重鎖と軽鎖の間のドメインクロスオーバーと交換する。結果として、新たに形成された「交差」軽鎖は、（通常、即ち非交差の）二重特異性抗体の他の腕の重鎖Ｆａｂ領域とは、もはや関連がない。よって、ドメイン配置におけるこの最小限の変化により、正しい「軽鎖」会合を強めることができる（前記Schaeferを参照）。
【００１９】
Zhuらは、ダイアボディ（diabody）変異体の２箇所のＶＬ／ＶＨ界面に、ジスルフィド架橋と共に、いくつかの立体的に相補的な突然変異を導入した。抗p185HER2のＶＬ／ＶＨ界面に、突然変異VL Y87A/F98M及びVH V37F/L45Wを導入すると、総収率及び親ダイアボディと比較した親和性を維持しつつ、ヘテロ二量体ダイアボディが９０％超の収率で回収された（前記Zhuを参照）。
【００２０】
中外の研究者らは、正しい軽鎖会合を促進するためのＶＨ−ＶＬ界面への突然変異の導入（主として、ＶＨ中のＱ３９及びＶＬ中のＱ３８の荷電残基への変換）により、二重特異性ダイアボディを同様に設計した（国際公開公報第２００６／１０６９０５号；Igawa, T., et al., Prot. Eng. Des. Sel. 23 (2010) 667-677）。
【００２１】
国際公開公報第２０１１０９７６０３号には、共通軽鎖マウスが報告されている。
【００２２】
国際公開公報第２０１０１５１７９２号には、単離の容易さを提供する二重特異性抗体の様式が提供されている。この様式は、ＣＨ３ドメインにおいて別個に改変されている（即ち、ヘテロ二量体である）免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、前記別個の改変は、前記ＣＨ３改変に関し非免疫原性であるか、又は実質的に非免疫原性であり、前記改変の少なくとも１つは、前記二重特異性抗体についての、プロテインＡのような親和性試薬に関する別個の親和性をもたらすものであり、前記二重特異性抗体は、プロテインＡに関する親和性に基づき、破壊された細胞、培地又は抗体の混合物より単離可能である。
【００２３】
新生児Ｆｃ−レセプター（ＦｃＲｎ）は、インビボにおけるＩｇＧクラスの抗体の代謝運命に関して重要である。ＦｃＲｎは、ＩｇＧをリソゾーム分解経路から救出するように機能し、クリアランスの減少と半減期の延長をもたらす。これは、２種のポリペプチド：５０ｋＤａのクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α−ＦｃＲｎ）及び１５ｋＤａのβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）からなるヘテロ二量体タンパク質である。ＦｃＲｎは、クラスＩｇＧの抗体のＦｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３部と高い親和性をもって結合する。クラスＩｇＧの抗体とＦｃＲｎの間の相互作用はｐＨ依存性であり、１：２の化学量論において生じる、即ち、１個のＩｇＧ抗体分子は、その２本の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドを介して、２個のＦｃＲｎ分子と相互作用することができる（例えば、Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083を参照）。
【００２４】
よって、ＩｇＧのインビトロＦｃＲｎ結合特性（properties/characteristics）は、その血液循環中でのインビボ薬物動力学的特性を示唆するものである。
【００２５】
ＦｃＲｎとＩｇＧクラスの抗体のＦｃ領域の間の相互作用には、重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの種々のアミノ酸残基が関与している。
【００２６】
ＦｃＲｎ結合に影響を及ぼす種々の突然変異及びそれに伴う血液循環中での半減期が知られている。マウスＦｃ領域−マウスＦｃＲｎ相互作用に対して決定的なＦｃ領域残基が、部位特異的突然変異誘発により同定されている（例えば、Dall’Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180を参照）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｎ４３４及びＨ４３５（Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）が、前記相互作用に関与している（Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533-2536; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542-548）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０及びＨ４３５が、ヒトＦｃ領域のマウスＦｃＲｎとの前記相互作用に対して決定的であることが見出された（Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2885）。
【００２７】
Ｆｃ領域内の種々のアミノ酸残基：Ｔｈｒ２５０、Ｍｅｔ２５２、Ｓｅｒ２５４、Ｔｈｒ２５６、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｕ３８０、Ｍｅｔ４２８、Ｈｉｓ４３３及びＡｓｎ４３４を突然変異させることにより、Ｆｃ領域（同様にしてＩｇＧも）のＦｃＲｎとの結合を増加させる方法が行われている（Kuo, T.T., et al., J. Clin. Immunol. 30 (2010) 777-789; Ropeenian, D.C., et al., Nat. Rev. Immunol. 7 (2007) 715-725を参照）。
【００２８】
タンパク質−タンパク質相互作用研究により、突然変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅの組み合わせがＦｃＲｎ結合を向上させると、Dall'Acquaらにより記載されている（Dall'Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524）。ヒトＦｃ領域−ヒトＦｃＲｎ複合体の研究により、残基Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３５及びＹ４３６が前記相互作用に対して決定的であることが示された（Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604）。Yeung, Y.A., et al. (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671)には、残基２４８〜２５９、３０１〜３１７、３７６〜３８２及び４２４〜４３７の種々の突然変異体が報告及び調査されている。
【００２９】
国際公開公報第２０１４／００６２１７号には、三重突然変異を伴う二量体タンパク質が報告されている。ｐＨ依存性結合の機構に関連して、ＦｃＲｎ／ヘテロ二量体Ｆｃ複合体の２．８オングストロームにおける結晶構造が、Martin, W.らにより報告されている（Mol. Cell. 7 (2001) 867-877）。米国特許第６２７７３７５号には、半減期が延長された免疫グロブリン様ドメインが、国際公開公報第２０１３／００４８４２号において報告されている。Shields, R. L.らは、ＦｃガンマＲＩ、ＦｃガンマＲＩＩ、ＦｃガンマＲＩＩＩ及びＦｃＲｎについてのヒトＩｇＧ１上の結合部位の高分解能マッピング及びＦｃガンマＲとの結合が向上したＩｇＧ１変異体の設計を報告している（Biochem. Mol. Biol. 276 (2001) 6591-6604）。マウスＩｇＧ１のトランスサイトーシス及び異化に関与するアミノ酸残基の説明（delineation）が、Medesan, C.らにより報告されている（J. Immunol. 158 (1997) 2211-2217）。米国公開公報第２０１０／０２７２７２０号には、ＦｃＲｎ結合部位が改変された抗体融合タンパク質が報告されている。国際公開公報第２０１３／０６０８６７号には、ヘテロ二量体タンパク質の製造が報告されている。Qiao, S.-W.らは、抗体介在性抗原提示のＦｃＲｎ依存を報告している（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105 (2008) 9337-9342）。
【００３０】
発明の概要
本明細書においては、ブドウ球菌プロテインＡと特異的に結合し、ヒトＦｃＲｎと結合しない変異Ｆｃ領域が報告される。これらの変異Ｆｃ領域は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン中に特定のアミノ酸突然変異を含む。これらの突然変異は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域のホール鎖又はノブ鎖中で用いると、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の精製、即ちヘテロ二量体Ｆｃ領域のホモ二量体Ｆｃ領域からの分離を可能にすることが見出された。
【００３１】
本明細書において報告される一つの態様は、（二量体）ポリペプチドであって、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、１個以上のシステイン残基を含む、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド、及び、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１個以上のシステイン残基を含む、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを含み、
ｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｉｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含み（Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）、
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドは、前記免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部内の１つ以上のジスルフィド架橋により連結している、
ポリペプチドである。
【００３２】
一つの実施態様において、前記（二量体）ポリペプチドは、ヒトＦｃＲｎと特異的に結合せず、ブドウ球菌プロテインＡと特異的に結合する。
【００３３】
一つの実施態様において、前記（二量体）ポリペプチドは、ホモ二量体ポリペプチドである。
【００３４】
一つの実施態様において、前記（二量体）ポリペプチドは、ヘテロ二量体ポリペプチドである。
【００３５】
一つの実施態様において、前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（「ホール」）を更に含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（「ノブ」）を含む。
【００３６】
一つの実施態様において、前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（「ホール」）を更に含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ（「ノブ」）を含む。
【００３７】
一つの実施態様において、前記第１及び第２のポリペプチドの前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び前記免疫グロブリンＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。一つの実施態様において、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドは各々、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを更に含む。一つの実施態様において、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドは各々、突然変異Ｐ３２９Ｇを更に含む。一つの実施態様において、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドは各々、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを更に含む。
【００３８】
一つの実施態様において、前記第１及び第２のポリペプチドの前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び前記免疫グロブリンＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ２サブクラスのものである。一つの実施態様において、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドは各々、突然変異Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓを更に含む。
【００３９】
一つの実施態様において、前記第１及び第２のポリペプチドの前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び前記免疫グロブリンＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ２サブクラスのものである。一つの実施態様において、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドは各々、突然変異Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓを更に含む。
【００４０】
一つの実施態様において、前記第１及び第２のポリペプチドの前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び前記免疫グロブリンＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。一つの実施態様において、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドは各々、突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを更に含む。一つの実施態様において、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドは各々、突然変異Ｐ３２９Ｇを更に含む。一つの実施態様において、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドは各々、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを更に含む。
【００４１】
一つの実施態様において、前記第１及び第２のポリペプチドの前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び前記免疫グロブリンＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。一つの実施態様において、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドは各々、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを更に含む。一つの実施態様において、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドは各々、突然変異Ｐ３２９Ｇを更に含む。一つの実施態様において、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドは各々、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを更に含む。
【００４２】
一つの実施態様において、前記第１及び前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ４３６Ａを更に含む。
【００４３】
一つの実施態様において、前記（二量体）ポリペプチドは、Ｆｃ領域融合ポリペプチドである。
【００４４】
一つの実施態様において、前記（二量体）ポリペプチドは、（全長）抗体である。
【００４５】
一つの実施態様において、前記（全長）抗体は、単一特異性抗体である。一つの実施態様において、前記単一特異性抗体は、一価単一特異性抗体である。一つの実施態様において、前記単一特異性抗体は、二価単一特異性抗体である。
【００４６】
一つの実施態様において、前記（全長）抗体は、二重特異性抗体である。一つの実施態様において、前記二重特異性抗体は、二価二重特異性抗体である。一つの実施態様において、前記二重特異性抗体は、四価二重特異性抗体である。
【００４７】
一つの実施態様において、前記（全長）抗体は、三重特異性抗体である。一つの実施態様において、前記三重特異性抗体は、三価三重特異性抗体である。一つの実施態様において、前記三重特異性抗体は、四価三重特異性抗体である。
【００４８】
本明細書において報告される一つの態様は、抗体であって、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第１のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第２のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第３のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第４のポリペプチド
を含み、
前記第１の重鎖可変ドメインと前記第１の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第１の結合部位を形成し、
前記第２の重鎖可変ドメインと前記第２の軽鎖可変ドメインは、第２の抗原と特異的に結合する第２の結合部位を形成し、
ｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むか、又はｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｉｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含み（Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）、
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドは、前記ヒンジ領域内の１つ以上のジスルフィド架橋により連結している、
抗体である。
【００４９】
本明細書において報告される一つの態様は、抗体であって、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第１のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第２のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の軽鎖可変ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含む、第３のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第４のポリペプチド
を含み、
前記第１の重鎖可変ドメインと前記第１の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第１の結合部位を形成し、
前記第２の重鎖可変ドメインと前記第２の軽鎖可変ドメインは、第２の抗原と特異的に結合する第２の結合部位を形成し、
ｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むか、又はｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｉｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含み（Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）、
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドは、前記ヒンジ領域内の１つ以上のジスルフィド架橋により連結している、
抗体である。
【００５０】
本明細書において報告される一つの態様は、抗体であって、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第１のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第２のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第３のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第４のポリペプチド、
を含み、
前記第１の重鎖可変ドメインと前記第１の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第１の結合部位を形成し、
前記第２の重鎖可変ドメインと前記第２の軽鎖可変ドメインは、第２の抗原と特異的に結合する第２の結合部位を形成し、
ｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含むか、又はｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｉｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含み（Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）、
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドは、前記ヒンジ領域内の１つ以上のジスルフィド架橋により連結している、
抗体である。
【００５１】
本明細書において報告される一つの態様は、抗体であって、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第１のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第２のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の軽鎖可変ドメイン及びサブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含む、第３のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第４のポリペプチド
を含み、
前記第１の重鎖可変ドメインと前記第１の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第１の結合部位を形成し、
前記第２の重鎖可変ドメインと前記第２の軽鎖可変ドメインは、第２の抗原と特異的に結合する第２の結合部位を形成し、
ｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含むか、又はｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｉｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含み（Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）、
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドは、前記ヒンジ領域内の１つ以上のジスルフィド架橋により連結している、
抗体である。
【００５２】
本明細書において報告される一つの態様は、抗体であって、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメイン、ペプチド性リンカー及び第１のｓｃＦｖを含む、第１のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメイン、ペプチド性リンカー及び第２のｓｃＦｖを含む、第２のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第３のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第４のポリペプチド、
を含み、
前記第１の重鎖可変ドメインと前記第１の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第１の結合部位を形成し、前記第２の重鎖可変ドメインと前記第２の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第２の結合部位を形成し、前記第１及び前記第２のｓｃＦｖは、第２の抗原と特異的に結合し、
ｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むか、又はｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｉｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含み（Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）、
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドは、前記ヒンジ領域内の１つ以上のジスルフィド架橋により連結している、
抗体である。
【００５３】
本明細書において報告される一つの態様は、抗体であって、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメイン、ペプチド性リンカー及び第１のscFvを含む、第１のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメイン、ペプチド性リンカー及び第２のscFvを含む、第２のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の軽鎖可変ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含む、第３のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第４のポリペプチド、
を含み、
前記第１の重鎖可変ドメインと前記第１の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第１の結合部位を形成し、前記第２の重鎖可変ドメインと前記第２の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第２の結合部位を形成し、前記第１及び前記第２のｓｃＦｖは、第２の抗原と特異的に結合し、
ｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むか、又はｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｉｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含み（Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）、
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドは、前記ヒンジ領域内の１つ以上のジスルフィド架橋により連結している、
抗体である。
【００５４】
本明細書において報告される一つの態様は、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドを製造する方法であって、下記工程：
ａ）前記（二量体）ポリペプチドをコードする１種以上の核酸を含む哺乳類細胞を培養する工程、
ｂ）前記（二量体）ポリペプチドを培養培地から回収する工程、及び
ｃ）前記（二量体）ポリペプチドをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製して、前記（二量体）ポリペプチドを製造する工程
を含む方法である。
【００５５】
本明細書において報告される一つの態様は、ホモ二量体ポリペプチドからヘテロ二量体ポリペプチドを分離するための、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａの組み合わせの使用である。
【００５６】
本明細書において報告される一つの態様は、ホモ二量体ポリペプチドからヘテロ二量体ポリペプチドを分離するための、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄの組み合わせの使用である。
【００５７】
本明細書において報告される一つの態様は、ホモ二量体ポリペプチドからヘテロ二量体ポリペプチドを分離するための、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓの組み合わせの使用である。
【００５８】
本明細書において報告される一つの態様は、第１のＦｃ領域ポリペプチド内の突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａの組み合わせの、第２のＦｃ領域ポリペプチド内の突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａの組み合わせと組み合わせての、前記第１及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を、ホモ二量体Ｆｃ領域から分離するための使用である。
【００５９】
本明細書において報告される一つの態様は、第１のＦｃ領域ポリペプチド内の突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａの組み合わせの、第２のＦｃ領域ポリペプチド内の突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄの組み合わせと組み合わせての、前記第１及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を、ホモ二量体Ｆｃ領域から分離するための使用である。
【００６０】
本明細書において報告される一つの態様は、第１のＦｃ領域ポリペプチド内の突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａの組み合わせの、第２のＦｃ領域ポリペプチド内の突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓの組み合わせと組み合わせての、前記第１及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を、ホモ二量体Ｆｃ領域から分離するための使用である。
【００６１】
先の三態様の一つの実施態様において、ｉ）前記第１のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを更に含み、前記第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを更に含むか、又はｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを含む。
【００６２】
一つの実施態様において、両方のＦｃ領域ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、重鎖可変ドメイン、免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む。一つの実施態様において、前記ヒンジ領域及び前記免疫グロブリンドメインは、いずれもＩｇＧ１サブクラスのものであるか、又はいずれもＩｇＧ４サブクラスのものである。
【００６３】
本明細書において報告される一つの態様は、眼血管疾患の患者の処置方法であって、そのような処置を必要とする患者に対し、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチド又は抗体を投与することによる方法である。
【００６４】
本明細書において報告される一つの態様は、硝子体内適用のための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチド又は抗体である。
【００６５】
本明細書において報告される一つの態様は、医薬として使用するための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチド又は抗体である。
【００６６】
本明細書において報告される一つの態様は、眼血管疾患処置用の、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチド又は抗体である。
【００６７】
本明細書において報告される一つの態様は、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチド又は抗体及び場合により薬学的に許容し得る担体を含む医薬処方物である。
【００６８】
眼内のみならず、体のその他の部分にも存在する抗原を標的とする／と結合する抗体を用いるためには、全身性副作用を回避するため、眼から血中への血液−眼関門の通過後の全身半減期が短いことが有益である。
【００６９】
加えて、レセプターのリガンドと特異的に結合する抗体は、抗体−抗原複合体が眼から除去される場合、即ち、その抗体がレセプターリガンドの眼外への輸送媒体として機能し、そのことによりレセプターのシグナル伝達を阻害する場合のみ、眼疾患の処置において有効である。
【００７０】
ヒト新生児Ｆｃ−レセプターと結合しないＦｃ領域を含む抗体、即ち、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドが、血液−眼関門を超えて輸送されることが、本発明者らにより見出された。血液−眼関門を超えた輸送にはＦｃＲｎへの結合が必要と考えられているが、前記抗体はヒトＦｃＲｎと結合しないので、これは驚くべきことである。
【００７１】
本明細書において報告される一つの態様は、可溶性のレセプターリガンドを、血液−眼関門を抜けて眼から血液循環に輸送するための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチド又は抗体の使用である。
【００７２】
本明細書において報告される一つの態様は、１種以上の可溶性のレセプターリガンドを眼から除去するための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチド又は抗体の使用である。
【００７３】
本明細書において報告される一つの態様は、眼疾患、特に眼血管疾患を処置するための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチド又は抗体の使用である。
【００７４】
本明細書において報告される一つの態様は、１種以上の可溶性のレセプターリガンドを硝子体内空間から血液循環に輸送するための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチド又は抗体の使用である。
【００７５】
本明細書において報告される一つの態様は、眼疾患の処置に使用するための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチド又は抗体である。
【００７６】
本明細書において報告される一つの態様は、可溶性のレセプターリガンドの、血液−眼関門を抜けての眼から血液循環への輸送に使用するための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチド又は抗体である。
【００７７】
本明細書において報告される一つの態様は、１種以上の可溶性のレセプターリガンドの眼からの除去に使用するための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチド又は抗体である。
【００７８】
本明細書において報告される一つの態様は、眼疾患、特に眼血管疾患を処置するのに使用するための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチド又は抗体である。
【００７９】
本明細書において報告される一つの態様は、１種以上の可溶性のレセプターリガンドの、硝子体内空間から血液循環への輸送に使用するための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチド又は抗体である。
【００８０】
本明細書において報告される一つの態様は、眼血管疾患を有する個体を処置する方法であって、前記個体に、有効量の本明細書において報告される（二量体）ポリペプチド又は抗体を投与する工程を含む方法である。
【００８１】
本明細書において報告される一つの態様は、個体において、可溶性のレセプターリガンドを、血液−眼関門を抜けて眼から血液循環に輸送する方法であって、前記個体に、有効量の本明細書において報告される（二量体）ポリペプチド又は抗体を投与して、可溶性のレセプターリガンドを、血液−眼関門を抜けて眼から血液循環に輸送する工程を含む方法である。
【００８２】
本明細書において報告される一つの態様は、個体において、１種以上の可溶性のレセプターリガンドを眼から除去する方法であって、前記個体に、有効量の本明細書において報告される（二量体）ポリペプチド又は抗体を投与して、１種以上の可溶性のレセプターリガンドを眼から除去する工程を含む方法である。
【００８３】
本明細書において報告される一つの態様は、個体において、１種以上の可溶性のレセプターリガンドを硝子体内空間から血液循環に輸送する方法であって、前記個体に、有効量の本明細書において報告される（二量体）ポリペプチド又は抗体を投与して、１種以上の可溶性のレセプターリガンドを硝子体内空間から血液循環に輸送する工程を含む方法である。
【００８４】
本明細書において報告される一つの態様は、個体において、可溶性のレセプターリガンドを、血液−眼関門を抜けて硝子体内空間又は眼から血液循環に輸送する方法であって、前記個体に、有効量の本明細書において報告される（二量体）ポリペプチド又は抗体を投与して、可溶性のレセプターリガンドを、血液−眼関門を抜けて眼から血液循環に輸送する工程を含む方法である。
【００８５】
一つの実施態様において、前記（二量体）ポリペプチドは、二重特異性抗体である。一つの実施態様において、前記二重特異性抗体は、二価二重特異性抗体である。一つの実施態様において、前記二重特異性抗体は、四価二重特異性抗体である。
【００８６】
一つの実施態様において、前記（二量体）ポリペプチドは、三重特異性抗体である。一つの実施態様において、前記三重特異性抗体は、三価三重特異性抗体である。一つの実施態様において、前記三重特異性抗体は、四価三重特異性抗体である。
【００８７】
一つの実施態様において、前記（二量体）ポリペプチドは、CrossMabである。
【００８８】
一つの実施態様において、前記（二量体）ポリペプチドは、Ｆｃ領域融合ポリペプチドである。
【００８９】
一つの実施態様において、前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを更に含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを更に含む。
【００９０】
一つの実施態様において、前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを更に含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを更に含む。
【００９１】
一つの実施態様において、前記抗体又は前記Ｆｃ領域融合ポリペプチドは、サブクラスＩｇＧ１のものである。一つの実施態様において、前記抗体又は前記Ｆｃ領域融合ポリペプチドは、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを更に含む。一つの実施態様において、前記抗体又は前記Ｆｃ領域融合ポリペプチドは、突然変異Ｐ３２９Ｇを更に含む。
【００９２】
一つの実施態様において、前記抗体又は前記Ｆｃ領域融合ポリペプチドは、サブクラスＩｇＧ２のものである。一つの実施態様において、前記抗体又は前記Ｆｃ領域融合ポリペプチドは、突然変異Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓを更に含む。
【００９３】
一つの実施態様において、前記抗体又は前記Ｆｃ領域融合ポリペプチドは、サブクラスＩｇＧ４のものである。一つの実施態様において、前記抗体又は前記Ｆｃ領域融合ポリペプチドは、突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを更に含む。一つの実施態様において、前記抗体又は前記Ｆｃ領域融合ポリペプチドは、突然変異Ｐ３２９Ｇを更に含む。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異（突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａの組み合わせ（Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング））を伴うＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスの抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体の概念及び利点を示す模式図。
【図２】小スケールＤＬＳベース粘度測定：２００mM アルギニン／スクシナート緩衝液（ｐＨ５．５）中、１５０mg/mLにおける外挿粘度（抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体VEGF/ANG2-0016（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴う）の、参照抗体VEGF/ANG2-0015（そのようなＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異なし）との比較）。
【図３】２０mM ヒスチジン緩衝液、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中における、温度（ＤＬＳ凝集開始温度を含む）に依存するＤＬＳ凝集（本明細書において報告される抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体VEGF/ANG2-0016（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴う）の、参照抗体ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２−００１５（そのようなＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異なし）との比較）。
【図４】４０℃、１００mg/mLでの７日間保管（メインピークの減少及び高分子量分（ＨＭＷ）の増加）（より少ない凝集を示した、本明細書において報告される抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体VEGF/ANG2-0016（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴う）の、参照抗体VEGF/ANG2-0015（そのようなＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異なし）との比較）。
【図５Ａ】VEGF/ANG2-0015（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異なし）の定常状態ＦｃＲｎ親和性。
【図５Ｂ】VEGF/ANG2-0016（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴う）の定常状態ＦｃＲｎ親和性。
【図６】ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異なしのVEGF/ANG2-0015及びＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴うVEGF/ANG2-0016（いずれもＩｇＧ１サブクラスでＰ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ突然変異を伴う；対照として、ＩｇＧ１サブクラスの抗ジゴキシゲニン抗体（抗Ｄｉｇ抗体）及びＩｇＧ４ベースの抗体を用いた）のＦｃガンマＲＩＩＩａ相互作用測定。
【図７Ａ】血清及び全眼球溶解物中の抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体濃度測定のための薬物動力学的（ＰＫ）ＥＬＩＳＡアッセイの概略の原理。
【図７Ｂ】静脈内（ｉ．ｖ．）適用後の血清中濃度：ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異なしのVEGF/ANG2-0015と、ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴うVEGF/ANG2-0016の比較。
【図７Ｃ】硝子体内適用後の血清中濃度：ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異なしのVEGF/ANG2-0015と、ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴うVEGF/ANG2-0016の比較。
【図７Ｄ】右眼及び左眼におけるVEGF/ANG2-0016（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴う）の眼球溶解物中濃度（右眼のみに硝子体内適用後、静脈内適用と比較）：有意な濃度が硝子体内適用後の右眼のみで検出できた；静脈内適用後では、VEGF/ANG2-0016（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴う）の血清中半減期が短いために、眼球溶解物中に濃度が検出できなかった。
【図７Ｅ】右眼及び左眼におけるVEGF/ANG2-0015（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異なし）の眼球溶解物中濃度（右眼のみに硝子体内適用後、静脈内適用と比較）：硝子体内適用後の右眼において（左眼でもある程度）、VEGF/ANG2-0015の濃度が検出できた；このことは、右眼から血清、更にそこから左眼への拡散を示すものであり、これはVEGF/ANG2-0015（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異なし）の長い半減期によって説明される；静脈内適用後でも、血清に対して安定なVEGF/ANG2-0015（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異なし）の眼への拡散により、両眼の眼球溶解物において有意な濃度が検出できた。
【図８Ａ】ＦｃＲｎとの結合能に関して操作された抗体は、ＳＰＲ分析において、参照の野生型（ｗｔ）抗体に比して、延長（ＹＴＥ突然変異）又は短縮（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異）されたインビボ半減期、増強（ＹＴＥ突然変異）又は減少した結合（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異）を示し、またＦｃＲｎカラムクロマトグラフィーにおいて、延長又は減少した保持時間を示す；ａ）ｈｕＦｃＲｎトランスジェニック雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス＋／−２７６への１０mg/kgの単回ｉ．ｖ．ボーラス適用後のＰＫデータ：ｗｔ  ＩｇＧ、またＹＴＥ及びＩＨＨ−ＡＡＡ  Ｆｃ領域改変ＩｇＧについてのＡＵＣデータ；ｂ）BIAcoreセンサーグラム；ｃ）ＦｃＲｎアフィニティーカラム溶出；野生型抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（参照）、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＹＴＥ−突然変異体、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＩＨＨ−ＡＡＡ−突然変異体。
【図８Ｂ】ＦｃＲｎとの結合能に関して操作された抗体は、ＳＰＲ分析において、参照の野生型（ｗｔ）抗体に比して、延長（ＹＴＥ突然変異）又は短縮（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異）されたインビボ半減期、増強（ＹＴＥ突然変異）又は減少した結合（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異）を示し、またＦｃＲｎカラムクロマトグラフィーにおいて、延長又は減少した保持時間を示す；ａ）ｈｕＦｃＲｎトランスジェニック雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス＋／−２７６への１０mg/kgの単回ｉ．ｖ．ボーラス適用後のＰＫデータ：ｗｔ  ＩｇＧ、またＹＴＥ及びＩＨＨ−ＡＡＡ  Ｆｃ領域改変ＩｇＧについてのＡＵＣデータ；ｂ）BIAcoreセンサーグラム；ｃ）ＦｃＲｎアフィニティーカラム溶出；野生型抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（参照）、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＹＴＥ−突然変異体、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＩＨＨ−ＡＡＡ−突然変異体。
【図８Ｃ】ＦｃＲｎとの結合能に関して操作された抗体は、ＳＰＲ分析において、参照の野生型（ｗｔ）抗体に比して、延長（ＹＴＥ突然変異）又は短縮（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異）されたインビボ半減期、増強（ＹＴＥ突然変異）又は減少した結合（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異）を示し、またＦｃＲｎカラムクロマトグラフィーにおいて、延長又は減少した保持時間を示す；ａ）ｈｕＦｃＲｎトランスジェニック雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス＋／−２７６への１０mg/kgの単回ｉ．ｖ．ボーラス適用後のＰＫデータ：ｗｔ  ＩｇＧ、またＹＴＥ及びＩＨＨ−ＡＡＡ  Ｆｃ領域改変ＩｇＧについてのＡＵＣデータ；ｂ）BIAcoreセンサーグラム；ｃ）ＦｃＲｎアフィニティーカラム溶出；野生型抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（参照）、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＹＴＥ−突然変異体、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＩＨＨ−ＡＡＡ−突然変異体。
【図９】Ｆｃ領域に導入された突然変異の数に依存する、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーにおける保持時間の変化。
【図１０】Ｆｃ領域に導入された突然変異の非対称分布に依存する、ＦｃＲｎ結合の変化。
【図１１】両重鎖に突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａの組み合わせを伴う二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体（VEGF/ANG2-0121）の、２本の連続したプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムからの溶出クロマトグラム。
【図１２】両重鎖に突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを伴う抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（IGF-1R-0045）の、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムからの溶出クロマトグラム。
【図１３】ＣＭ５チップに固定されたプロテインＡへの、ＩｇＧ  Ｆｃ領域改変抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体の結合。
【図１４】種々の抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体の、ＦｃＲｎアフィニティーカラムにおける溶出クロマトグラム。
【図１５】種々の融合ポリペプチドの、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳＰＲ）との結合。
【図１６】種々の抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体及び抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体突然変異体の、固定されたプロテインＡ（ＳＰＲ）との結合。
【図１７】抗体IGF-1R 0033、0035及び0045の静脈内適用後の血清中濃度の比較。
【図１８】抗体IGF-1R 0033の硝子体内及び静脈内適用後の眼球溶解物中濃度の比較。
【図１９】抗体IGF-1R 0035の硝子体内及び静脈内適用後の眼球溶解物中濃度の比較。
【図２０】抗体IGF-1R 0045の硝子体内及び静脈内適用後の眼球溶解物中濃度の比較。
【００９５】
発明の実施態様の詳細な説明
Ｉ．定義
用語「約」は、その後に続く数値の＋／−２０％の範囲を意味する。一つの実施態様において、用語約は、その後に続く数値の＋／−１０％の範囲を意味する。一つの実施態様において、用語約は、その後に続く数値の＋／−５％の範囲を意味する。
【００９６】
本明細書における目的のため、「アクセプターヒトフレームワーク」は、下記に定義するヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク由来の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでいてもよく、アミノ酸配列変化を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と、配列が同一である。
【００９７】
「親和性成熟」抗体は、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）に１つ以上の変化を有する（そのような変化を持たない親抗体に比して）抗体であって、そのような変化が、抗原に対する抗体の親和性の向上をもたらしているものを指す。
【００９８】
用語「変化」は、改変抗体又は融合ポリペプチドを得るための、親抗体又は融合ポリペプチド、例えば、Ｆｃ領域のＦｃＲｎ結合部分を少なくとも含む融合ポリペプチド中の、１個以上のアミノ酸残基の突然変異（置換）、挿入（付加）又は欠失を意味する。用語「突然変異」は、特定されたアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で置換されることを意味する。例えば、突然変異Ｌ２３４Ａは、抗体Ｆｃ領域（ポリペプチド）中２３４位のアミノ酸残基リシンが、アミノ酸残基アラニンで置換される（リシンのアラニンによる置換)(Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング)ことを意味する。
【００９９】
「天然に存在するアミノ酸残基」は、アラニン（３文字コード：Ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）からなる群よりのアミノ酸残基を意味する。
【０１００】
用語「アミノ酸突然変異」は、少なくとも１個の既存のアミノ酸残基の、他の異なるアミノ酸残基（＝置換用（replacing）アミノ酸残基）による置換を意味する。置換用アミノ酸残基は、「天然に存在するアミノ酸残基」であってよく、アラニン（３文字コード：Ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）からなる群より選択される。置換用アミノ酸残基は、「天然に存在しないアミノ酸残基」であってもよい。例えば、米国特許第６５８６２０７号、国際公開公報第９８／４８０３２号、国際公開公報第０３／０７３２３８号、米国公開公報第２００４／０２１４９８８号、国際公開公報第２００５／３５７２７号、国際公開公報第２００５／７４５２４号、Chin, J.W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 9026-9027; Chin, J.W. and Schultz, P.G., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137; Chin, J.W., et al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024; 及びWang, L. and Schultz, P.G., Chem. (2002) 1-10（いずれも全体が参照により本明細書に組み入れられる）を参照。
【０１０１】
用語「アミノ酸欠失」は、アミノ酸配列中の所定の位置における少なくとも１個のアミノ酸残基の除去を意味する。
【０１０２】
本明細書において使用する用語「ＡＮＧ−２」は、例えばMaisonpierre, P.C., et al, Science 277 (1997) 55-60及びCheung, A.H., et al., Genomics 48 (1998) 389-91に記載されているヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）（或いは、ＡＮＧＰＴ２又はＡＮＧ２と略される）（配列番号３１）を指す。アンジオポエチン１（配列番号３２）及び２は、Ｔｉｅｓ（血管内皮細胞内で選択的に発現されるチロシンキナーゼのファミリー）のリガンドとして発見された（Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407 (2000) 242-248）。アンジオポエチンファミリーの明確なメンバーは現在４つである。アンジオポエチン３及び４（Ａｎｇ−３及びＡｎｇ−４）は、マウス及びヒトにおける同じ遺伝子座の広く分岐した対応物（widely diverged counterparts）を表しうる（Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-356; Kim, I., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 26523-26528）。ＡＮＧ−１及びＡＮＧ−２は本来、組織培養実験において各々アゴニスト及びアンタゴニストと同定された（ＡＮＧ−１については、Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-1169；ＡＮＧ−２については、Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60を参照）。公知のアンジオポエチンはいずれも、主としてＴｉｅ２（配列番号３３）と結合し、Ａｎｇ−１及び−２の両者は、３nM（Ｋｄ）の親和性で、Ｔｉｅ２と結合する（Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60）。
【０１０３】
本明細書において、用語「抗体」は最も広い意味で使用され、所望の抗原−、及び／又はプロテインＡ及び／又はＦｃＲｎ−結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体、三重特異性抗体）及び抗体フラグメントを初めとする（これらに限定されない）、さまざまな抗体構造を包含する。
【０１０４】
用語「非対称なＦｃ領域」は、Kabat EUインデックスナンバリングシステムによる対応する位置において異なるアミノ酸残基を有する、一対のＦｃ領域ポリペプチドを意味する。
【０１０５】
用語「ＦｃＲｎ結合に関する非対称なＦｃ領域」は、対応する位置（この位置はKabat EUインデックスナンバリングシステムにより決定される）において異なるアミノ酸残基を有する２本のポリペプチド鎖からなり、その異なる位置が、Ｆｃ領域のヒト新生児Ｆｃ−レセプター（ＦｃＲｎ）との結合に影響するＦｃ領域を意味する。本明細書における目的のため、「ＦｃＲｎ結合に関する非対称なＦｃ領域」におけるＦｃ領域の２本のポリペプチド鎖の間の差は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の形成を促進するために導入された差（例えば、二重特異性抗体の製造のための）を含まない。これらの差もまた非対称であり得る、即ち、２本の鎖がKabat EUインデックスナンバリングシステムによる対応しないアミノ酸残基において差がある。これらの差はヘテロ二量体化を促進し、ホモ二量体化を減少させる。そのような差の例は、いわゆる「ノブズ  イントゥ  ホールズ」置換である（例えば、米国特許第７６９５９３６号及び米国公開公報第２００３／００７８３８５号を参照）。サブクラスＩｇＧ１のＩｇＧ抗体のＦｃ領域の、個々のポリペプチド鎖における以下のノブとホールの置換は、ヘテロ二量体形成を増加させることが見出されている：１）一方の鎖においてＹ４０７Ｔ、他方の鎖においてＴ３６６Ｙ；２）一方の鎖においてＹ４０７Ａ、他方の鎖においてＴ３６６Ｗ；３）一方の鎖においてＦ４０５Ａ、他方の鎖においてＴ３９４Ｗ；４）一方の鎖においてＦ４０５Ｗ、他方の鎖においてＴ３９４Ｓ；５）一方の鎖においてＹ４０７Ｔ、他方の鎖においてＴ３６６Ｙ；６）一方の鎖においてＴ３６６Ｙ及びＦ４０５Ａ、他方の鎖においてＴ３９４Ｗ及びＹ４０７Ｔ；７）一方の鎖においてＴ３６６Ｗ及びＦ４０５Ｗ、他方の鎖においてＴ３９４Ｓ及びＹ４０７Ａ；８）一方の鎖においてＦ４０５Ｗ及びＹ４０７Ａ、他方の鎖においてＴ３６６Ｗ及びＴ３９４Ｓ；並びに９）一方の鎖においてＴ３６６Ｗ、他方の鎖においてＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ、このうち、最後に挙げたものが特に適している。加えて、２本のＦｃ領域ポリペプチド鎖の間に新たなジスルフィド架橋を作る変化は、ヘテロ二量体形成を促進する（例えば、米国公開公報第２００３／００７８３８５号を参照）。サブクラスＩｇＧ１のＩｇＧ抗体のＦｃ領域の、個々のポリペプチド鎖における新たな鎖内ジスルフィド結合形成のための、適度に間隔を開けたシステイン残基をもたらす以下の置換は、ヘテロ二量体形成を増加させることが見出されている：一方の鎖においてＹ３４９Ｃ、他方においてＳ３５４Ｃ；一方の鎖においてＹ３４９Ｃ、他方においてＥ３５６Ｃ；一方の鎖においてＹ３４９Ｃ、他方においてＥ３５７Ｃ；一方の鎖においてＬ３５１Ｃ、他方においてＳ３５４Ｃ；一方の鎖においてＴ３９４Ｃ、他方においてＥ３９７Ｃ；又は一方の鎖においてＤ３９９Ｃ、他方においてＫ３９２Ｃ。ヘテロ二量体化を促進するアミノ酸変化の更なる例は、いわゆる「電荷対置換」である（例えば、国際公開公報第２００９／０８９００４号を参照）。サブクラスＩｇＧ１のＩｇＧ抗体のＦｃ領域の、個々のポリペプチド鎖における以下の電荷対置換は、ヘテロ二量体形成を増加させることが見出されている：１）一方の鎖においてＫ４０９Ｄ又���Ｋ４０９Ｅ、他方の鎖においてＤ３９９Ｋ又はＤ３９９Ｒ；２）一方の鎖においてＫ３９２Ｄ又はＫ３９２Ｅ、他方の鎖においてＤ３９９Ｋ又はＤ３９９Ｒ；３）一方の鎖においてＫ４３９Ｄ又はＫ４３９Ｅ、他方の鎖においてＥ３５６Ｋ又はＥ３５６Ｒ；４）一方の鎖においてＫ３７０Ｄ又はＫ３７０Ｅ、他方の鎖においてＥ３５７Ｋ又はＥ３５７Ｒ；５）一方の鎖においてＫ４０９Ｄ及びＫ３６０Ｄ、かつ他方の鎖においてＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ；６）一方の鎖においてＫ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｄ、かつ他方の鎖においてＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ；７）一方の鎖においてＫ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ、かつ他方の鎖においてＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ及びＥ３５７Ｋ；８）一方の鎖においてＫ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ、他方の鎖においてＤ３９９Ｋ；９）一方の鎖においてＫ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ、他方の鎖においてＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ；１０）一方の鎖においてＫ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ、他方の鎖においてＤ３９９Ｋ及びＤ３５７Ｋ；１１）一方の鎖においてＫ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｄ、他方の鎖においてＤ３９９Ｋ及びＤ３５７Ｋ；１２）一方の鎖においてＤ３９９Ｋ、他方の鎖においてＫ４０９Ｄ及びＫ３６０Ｄ；並びに１３）一方の鎖においてＫ４０９Ｄ及びＫ４３９Ｄ、他方においてＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ。
【０１０６】
用語「結合（抗原との）」は、インビトロアッセイ、一つの実施態様においては、抗体が表面に結合し、抗原の抗体との結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定する結合アッセイにおける、抗体のその抗原との結合を意味する。結合は、１０−８M以下、いくつかの実施態様においては、１０−１３〜１０−８M、いくつかの実施態様においては、１０−１３〜１０−９Mの結合親和性（ＫＤ）を意味する。
【０１０７】
結合は、BIAcoreアッセイ（GE Healthcare Biosensor AB, Uppsala, Sweden）により調べることができる。結合の親和性は、項ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の会合についての速度定数）、ｋｄ（解離定数）及びＫＤ（ｋｄ／ｋａ）により定義される。
【０１０８】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部がある特定の供給源又は種に由来するが、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
【０１０９】
用語「ＣＨ２ドメイン」は、およそＥＵ位置２３１からＥＵ位置３４０（KabatによるEUナンバリングシステム）まで伸びる、抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。一つの態様において、ＣＨ２ドメインは、配列番号０９：ＡＰＥＬＬＧＧ  ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰ  ＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰ  ＥＶＴＣＶＷＤＶＳ  ＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ  ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡ  ＫＴＫＰＲＥＥＱ  Ｅ  ＳＴＹＲＷＳＶＬＴ  ＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ  ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡ  ＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳ  ＫＡＫのアミノ酸配列を有する。
【０１１０】
用語「ＣＨ３ドメイン」は、およそＥＵ位置３４１からＥＵ位置４４６まで伸びる、抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。一つの態様において、ＣＨ３ドメインは、配列番号１０：ＧＱＰＲＥＰＱ  ＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ  ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣ  ＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩ  ＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰ  ＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ  ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹ  ＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ  ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶ  ＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴ  ＱＫＳＬＳＬＳＰＧのアミノ酸配列を有する。
【０１１１】
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス、即ちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に更に分類され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、各々α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
【０１１２】
用語「匹敵する長さ」は、２種のポリペプチドが、同数のアミノ酸残基を含むか、又は１個以上、かつ最大で１０個のアミノ酸残基分、長さが異なるものでありうることを意味する。一つの実施態様において、（Ｆｃ領域）ポリペプチドは、同数のアミノ酸残基を含むか、又は１〜１０アミノ酸残基だけ、数が異なる。一つの実施態様において、（Ｆｃ領域）ポリペプチドは、同数のアミノ酸残基を含むか、又は１〜５アミノ酸残基だけ、数が異なる。一つの実施態様において、（Ｆｃ領域）ポリペプチドは、同数のアミノ酸残基を含むか、又は１〜３アミノ酸残基だけ、数が異なる。
【０１１３】
「エフェクター機能」は、抗体のクラスによって変わる、抗体のFc領域に起因し得る生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面レセプター（例えばＢ細胞レセプター）の下方調節；並びにＢ細胞活性化が含まれる。
【０１１４】
薬剤、例えば医薬処方物の「有効量」は、必要な投与量及び期間において、所望の治療的又は予防的結果を達成するのに有効な量を指す。
【０１１５】
用語「Ｆｃ−融合ポリペプチド」は、結合ドメイン（例えば、一本鎖抗体のような抗原結合ドメイン、又はレセプターのリガンドのようなポリペプチド）の、所望の標的、プロテインＡ−及びＦｃＲｎ−結合活性を示す抗体Ｆｃ領域との融合物を意味する。
【０１１６】
用語「ヒト起源のＦｃ領域」は、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含有する、ヒト起源の免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味する。一つの実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までにわたる。一つの実施態様において、Ｆｃ領域は、配列番号６０のアミノ酸配列を有する。ただし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在してもしなくてもよい。
【０１１７】
本明細書で使用する場合、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインについて、アミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載され、本明細書においては「Kabatによるナンバリング」と称する、Kabatナンバリングシステムによりナンバリングする。具体的には、κ及びλアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬについては、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のKabatナンバリングシステム（第６４７−６６０頁を参照）を用い、定常重鎖ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）については、Kabat EUインデックスナンバリングシステム（第６６１−７２３頁を参照）を用いる。
【０１１８】
用語「ＦｃＲｎ」は、ヒト新生児Ｆｃ−レセプターを意味する。ＦｃＲｎは、リソソーム分解経路からＩｇＧを救助する機能を果たし、クリアランスの減少と、延長された半減期をもたらす。ＦｃＲｎは、２種のポリペプチド：５０ｋＤａのクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α−ＦｃＲｎ）及び１５ｋＤａのβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）からなるヘテロ二量体タンパク質である。ＦｃＲｎは、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３部分と高い親和性で結合する。ＩｇＧとＦｃＲｎの間の相互作用は、ｐＨに厳密に依存しており、１：２の化学量論比で起こり、１個のＩｇＧが、２本の重鎖を介して２個のＦｃＲｎ分子に結合する（Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083）。酸性ｐＨ（ｐＨ＜６．５）では、ＦｃＲｎ結合がエンドソーム内で起こり、中性の細胞表面（ｐＨ約７．４）では、ＩｇＧは遊離する。相互作用のｐＨ感受性の性質が、エンドソームの酸性環境内におけるレセプターへの結合によって、細胞中へ飲作用されるＩｇＧの、細胞内分解からのＦｃＲｎを介した保護を容易にする。次いで、ＦｃＲｎは、細胞表面へのＩｇＧの再循環と、これに続くＦｃＲｎ−ＩｇＧ複合体が細胞外の中性ｐＨ環境に曝露された際の血流中への放出を促進する。
【０１１９】
用語「Ｆｃ領域のＦｃＲｎ結合部分」は、およそＥＵ位置２４３からＥＵ位置２６１、及びおよそＥＵ位置２７５からＥＵ位置２９３、及びおよそＥＵ位置３０２からＥＵ位置３１９、及びおよそＥＵ位置３３６からＥＵ位置３４８、及びおよそＥＵ位置３６７からＥＵ位置３９３、ＥＵ位置４０８、及びおよそＥＵ位置４２４からＥＵ位置４４０まで伸びる、抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。一つの実施態様において、KabatのEUナンバリングによる次のアミノ酸残基のうち１つ以上が変化している：Ｆ２４３、Ｐ２４４、Ｐ２４５Ｐ、Ｋ２４６、Ｐ２４７、Ｋ２４８、Ｄ２４９、Ｔ２５０、Ｌ２５１、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｒ２５５、Ｔ２５６、Ｐ２５７、Ｅ２５８、Ｖ２５９、Ｔ２６０、Ｃ２６１、Ｆ２７５、Ｎ２７６、Ｗ２７７、Ｙ２７８、Ｖ２７９、Ｄ２８０、Ｖ２８２、Ｅ２８３、Ｖ２８４、Ｈ２８５、Ｎ２８６、Ａ２８７、Ｋ２８８、Ｔ２８９、Ｋ２９０、Ｐ２９１、Ｒ２９２、Ｅ２９３、Ｖ３０２、Ｖ３０３、Ｓ３０４、Ｖ３０５、Ｌ３０６、Ｔ３０７、Ｖ３０８、Ｌ３０９、Ｈ３１０、Ｑ３１１、Ｄ３１２、Ｗ３１３、Ｌ３１４、Ｎ３１５、Ｇ３１６、Ｋ３１７、Ｅ３１８、Ｙ３１９、Ｉ３３６、Ｓ３３７、Ｋ３３８、Ａ３３９、Ｋ３４０、Ｇ３４１、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｐ３４６、Ｑ３４７、Ｖ３４８、Ｃ３６７、Ｖ３６９、Ｆ３７２、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ｉ３７７、Ａ３７８、Ｖ３７９、Ｅ３８０、Ｗ３８１、Ｅ３８２、Ｓ３８３、Ｎ３８４、Ｇ３８５、Ｑ３８６、Ｐ３８７、Ｅ３８８、Ｎ３８９、Ｙ３９１、Ｔ３９３、Ｓ４０８、Ｓ４２４、Ｃ４２５、Ｓ４２６、Ｖ４２７、Ｍ４２８、Ｈ４２９、Ｅ４３０、Ａ４３１、Ｌ４３２、Ｈ４３３、Ｎ４３４、Ｈ４３５、Ｙ４３６、Ｔ４３７、Ｑ４３８、Ｋ４３９及びＳ４４０（EUナンバリング）。
【０１２０】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的には、４つのＦＲドメイン、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般的には、ＶＨ（又はＶＬ）中に、次の順序で見いだされる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【０１２１】
用語「全長抗体」は、４本のポリペプチドを含むネイティブ抗体構造に実質的に同様の構造を有するか、又は本明細書において定義するＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を意味する。全長抗体は、全長抗体の鎖の１本以上とコンジュゲートしたｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂのような、更なるドメインを含んでいてよい。これらのコンジュゲートもまた、用語、全長抗体に包含される。
【０１２２】
用語「二量体ポリペプチド」は、共有結合で会合した少なくとも２本のポリペプチドを含む複合体を意味する。この複合体は、他のポリペプチドとこれも共有結合で、又は共有結合なしで会合した更なるポリペプチドを含んでいてよい。一つの実施態様において、二量体ポリペプチドは２本又は４本のポリペプチドを含む。
【０１２３】
用語「ヘテロ二量体」又は「ヘテロ二量体の」は、２本のポリペプチド（例えば、匹敵する長さの）を含む分子であって、前記２本のポリペプチドは、対応する位置における異なるアミノ酸残基を少なくとも１個有するアミノ酸配列を有し、対応する位置は、Kabat EUインデックスナンバリングシステムにより決定される分子を意味する。
【０１２４】
用語「ホモ二量体」及び「ホモ二量体の」は、匹敵する長さの２本のポリペプチドを含む分子であって、前記２本のポリペプチドは、対応する位置において同一であるアミノ酸配列を有し、対応する位置は、Kabat EUインデックスナンバリングシステムにより決定される分子を意味する。
【０１２５】
本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、ホモ二量体でもヘテロ二量体でもありえ、これは 焦点を合わせた突然変異又は特性に関して決定される。例えば、ＦｃＲｎ及び／又はプロテインＡ結合（即ち、特性に焦点を合わせている）に関し、二量体ポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ（二量体ポリペプチドのＦｃＲｎ及び／又はプロテインＡ結合特性に関し、これらの突然変異に焦点が合わせられている）についてはホモ二量体である（即ち、二量体ポリペプチドの両方のポリペプチドがこれらの突然変異を含む）が、同時に、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（これらの突然変異は、ＦｃＲｎ／プロテインＡ結合特性ではなく、二量体ポリペプチドのヘテロ二量体化に向けたものなので、これらの突然変異には焦点が合わせられていない）と、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（第１のセットは第１のポリペプチドのみに含まれるが、第２のセットは第２のポリペプチドのみに含まれる）のそれぞれについてのヘテロ二量体でもある。更に、例えば、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、Ｈ４３５Ａ及びＹ４３６Ａに関してヘテロ二量体である（即ち、これらの突然変異はいずれも、二量体ポリペプチドのＦｃＲｎ及び／又はプロテインＡ結合特性に向けたものである）、即ち、１本のポリペプチドは突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含むが、他方のポリペプチドは突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むことがあり得る。
【０１２６】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換可能に使用され、外来核酸が導入された細胞を、そのような細胞の子孫を含めて指す。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、初代形質転換細胞及びそれに由来する子孫が、継代の回数に関わらず含まれる。子孫の核酸内容は親細胞と完全に同一でなくてもよく、突然変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物活性を有する突然変異体の子孫は、本明細書に含まれる。
【０１２７】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞によって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、又は、ヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード配列を利用した非ヒト供給源に由来する抗体に対応するアミノ酸配列を持つものである。ヒト抗体のこの定義からは、非ヒト抗原結合性残基を含むヒト化抗体は、特異的に除外される。
【０１２８】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択に際して最もよく見いだされるアミノ酸残基を示すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからなされる。一般に、配列のサブグループは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols.1-3に記載のサブグループである。一つの実施態様において、ＶＬについては、サブグループは、前記Kabat et al.に記載のサブグループ・カッパＩである。一つの実施態様において、ＶＨについては、サブグループは、前記Kabat et al.に記載のサブグループＩＩＩである。
【０１２９】
用語「由来の」は、あるアミノ酸配列を、少なくとも一つの位置において変化を導入することにより、親のアミノ酸配列に由来するものとすることを意味する。よって、由来アミノ酸配列は、少なくとも一つの対応する位置（抗体Ｆｃ領域についてのKabat EUインデックスによるナンバリング）において、対応する親のアミノ酸配列とは異なる。一つの実施態様において、ある親のアミノ酸配列由来のあるアミノ酸配列は、対応する位置において、１〜１５個のアミノ酸残基が異なる。一つの実施態様において、ある親のアミノ酸配列由来のあるアミノ酸配列は、対応する位置において、１〜１０個のアミノ酸残基が異なる。一つの実施態様において、ある親のアミノ酸配列由来のあるアミノ酸配列は、対応する位置において、１〜６個のアミノ酸残基が異なる。同様に、由来アミノ酸配列は、その親のアミノ酸配列に対し、高いアミノ酸配列同一性を有する。一つの実施態様において、ある親のアミノ酸配列由来のあるアミノ酸配列は、８０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。一つの実施態様において、ある親のアミノ酸配列由来のあるアミノ酸配列は、９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。一つの実施態様において、ある親のアミノ酸配列由来のあるアミノ酸配列は、９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１３０】
用語「ヒトＦｃ領域ポリペプチド」は、「ネイティブ」又は「野生型」ヒトＦｃ領域ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を意味する。用語「変異体（ヒト）Ｆｃ領域ポリペプチド」は、少なくとも一つの「アミノ酸変化」による、「ネイティブ」又は「野生型」ヒトＦｃ領域ポリペプチド由来のアミノ酸配列を意味する。「ヒトＦｃ領域」は、２本のヒトＦｃ領域ポリペプチドからなる。「変異体（ヒト）Ｆｃ領域」は、２本のヒトＦｃ領域ポリペプチドからなるので、その両方が変異体（ヒト）Ｆｃ領域ポリペプチドであることも可能であり、又は、一方がヒトＦｃ領域ポリペプチドであり、他方が変異体（ヒト）Ｆｃ領域ポリペプチドである。
【０１３１】
一つの実施態様において、ヒトＦｃ領域ポリペプチドは、本明細書において報告される突然変異を伴う、配列番号６０のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチドの、又は、配列番号６１のヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域ポリペプチドの、又は、配列番号６３のヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチドのアミノ酸配列を有する。一つの実施態様において、変異体（ヒト）Ｆｃ領域ポリペプチドは、配列番号６０、又は６１、又は６３のＦｃ領域ポリペプチド由来のものであり、配列番号６０、又は６１、又は６３のＦｃ領域ポリペプチドに比して、少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有する。変異体（ヒト）Ｆｃ領域ポリペプチドは、一つの実施態様において、約１〜約１０のアミノ酸突然変異、一つの実施態様において、約１〜約５のアミノ酸突然変異を含む／有する。一つの実施態様において、変異体（ヒト）Ｆｃ領域ポリペプチドは、配列番号６０、又は６１、又は６３のヒトＦｃ領域ポリペプチドに対し、少なくとも約８０％の相同率を有する。一つの実施態様において、変異体（ヒト）Ｆｃ領域ポリペプチドは、配列番号６０、又は６１、又は６３のヒトＦｃ領域ポリペプチドに対し、少なくとも約９０％の相同率を有する。一つの実施態様において、変異体（ヒト）Ｆｃ領域ポリペプチドは、配列番号６０、又は６１、又は６３のヒトＦｃ領域ポリペプチドに対し、少なくとも約９５％の相同率を有する。
【０１３２】
配列番号６０、又は６１、又は６３のヒトＦｃ領域ポリペプチド由来の変異体（ヒト）Ｆｃ領域ポリペプチドは、含まれるアミノ酸変化により定義される。よって、例えば、用語Ｐ３２９Ｇは、配列番号６０、又は６１、又は６３のヒトＦｃ領域ポリペプチドに対し、アミノ酸３２９位における、プロリンからグリシンへの突然変異を伴う、ヒトＦｃ領域ポリペプチド由来変異体（ヒト）Ｆｃ領域ポリペプチドを意味する。
【０１３３】
ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６０）
【０１３４】
突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを伴うヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６４）
【０１３５】
突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを伴うヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６５）
【０１３６】
突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを伴うヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６６）
【０１３７】
突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを伴うヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６７）
【０１３８】
突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを伴うヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６８）
【０１３９】
突然変異Ｐ３２９Ｇを伴うヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６９）
【０１４０】
突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び突然変異Ｐ３２９Ｇを伴うヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７０）
【０１４１】
突然変異Ｐ２３９Ｇ及び突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを伴うヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７１）
【０１４２】
突然変異Ｐ３２９Ｇ及び突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを伴うヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７２）
【０１４３】
突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ及びＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを伴うヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７３）
【０１４４】
突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ及び突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを伴うヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７４）
【０１４５】
ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号６３）
【０１４６】
突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを伴うヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号７５）
【０１４７】
突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び突然変異Ｐ３２９Ｇを伴うヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＧＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号７６）
【０１４８】
突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを伴うヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号７７）
【０１４９】
突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを伴うヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号７８）
【０１５０】
突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを伴うヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号７９）
【０１５１】
突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを伴うヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号８０）
【０１５２】
突然変異Ｐ３２９Ｇを伴うヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＧＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号８１）
【０１５３】
突然変異Ｐ２３９Ｇ及びＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを伴うヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＧＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号８２）
【０１５４】
突然変異Ｐ３２９Ｇ及びＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを伴うヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＧＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号８３）
【０１５５】
突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ及びＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを伴うヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＧＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号８４）
【０１５６】
突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ及びＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを伴うヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＧＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号８５）
【０１５７】
種々のヒトＦｃ領域のアライメントを以下に示す（Kabat EUインデックスナンバリングシステム）：
【表２】
2020196744.tif 000003
【０１５８】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲに由来するアミノ酸残基及びヒトＦＲに由来するアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は場合により、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでよい。ある抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【０１５９】
本明細書で使用する用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変性であり（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、かつ、構造的に明確なループ（「超可変ループ」）を形成する、及び／又は抗原接触残基（「抗原接点」）を含む、抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、抗体は６個のＨＶＲを含む；３個はＶＨ中にあり（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、３個はＶＬ中にある（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。本明細書において意味するＨＶＲは、以下のものを含む：
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）及び９６〜１０１（Ｈ３）に現れる超可変ループ（Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917）；
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５Ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）に現れるＣＤＲ（Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）及び９３−１０１（Ｈ３）に現れる抗原接点（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；並びに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）及び９４−１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の組み合わせ
【０１６０】
特に断りのない限り、本明細書においては、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及びその他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Kabat EUインデックスナンバリングシステム（前記Kabat et al.）に従ってナンバリングする。
【０１６１】
本明細書で使用する用語「ＩＧＦ−１Ｒ」は、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を初めとする、何らかの脊椎動物起源からの何らかのネイティブＩＧＦ−１Ｒを指す。この用語は、「全長」、即ち未処理ＩＧＦ−１Ｒ、また細胞内での処理によって生じるあらゆる形態のＩＧＦ−１Ｒを包含する。この用語はまた、ＩＧＦ−１Ｒの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸配列を配列番号１１に示す。
【０１６２】
「個体」又は「被験者」は哺乳動物である。哺乳動物には、飼い慣らされた動物（例えば、雌ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルのような非ヒト霊長類）、ウサギ及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、それらに限定されない。特定の実施態様において、個体又は被験者はヒトである。
【０１６３】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施態様では、抗体を、９５％又は９９％を上回る純度（例えば、電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば分子排斥クロマトグラフィーイオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）などにより決定）まで精製する。抗体純度の評価方法を概観するには、例えばFlatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87を参照されたい。
【０１６４】
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、以下のような細胞に含有される核酸分子も含まれる：通常その核酸分子を含有するが、当該核酸分子が、染色体外、又はその自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在している。
【０１６５】
「抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードする単離された核酸」は、抗体重鎖及び軽鎖（又はそのフラグメント）をコードする１種以上の核酸分子（単一のベクター又は別個のベクター中のそのような核酸分子及び宿主細胞中の１つ以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む）を指す。
【０１６６】
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。即ち、この集団を構成する個々の抗体は、同一であり、及び／又は同じエピトープと結合する（可能性のある変異体抗体、例えば、天然に存在する変異を含有するもの、又はモノクローナル抗体調製物の製造中に生じるもの（一般に、そのような変異体が微量に存在する）を除く）。典型的には、異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体が含まれるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を指向する。よって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示すものであり、何らかの特定の方法による抗体の製造を要すると解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法及びヒト免疫グロブリン座位の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法（これらに限定されない）を初めとする、さまざまな技法によって製造することができ、モノクローナル抗体を製造するためのそのような方法及び他の例示的方法を、本明細書に記載する。
【０１６７】
「ネイティブ抗体」は、さまざまな構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、ネイティブＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合した２本の同一の軽鎖及び２本の同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、可変領域（ＶＨ）（可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、それに続く３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、各軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、可変領域（ＶＬ）（可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、それに続く定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプの１つに帰属することができる。
【０１６８】
用語「添付文書」は、治療用製品の市販用梱包物に通例含まれていて、適応症、用法、投与量、投与、併用療法、禁忌及び／又は当該治療用製品の使用上の注意に関する情報が掲載されている、説明書を指すために使用される。
【０１６９】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントが得られるよう、配列を整列し、必要であればギャップを導入した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の百分率（保存的置換を配列同一性の一部と見なさない）と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当技術分野の技能の範囲内にあるさまざまな方法で、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign（DNASTAR）ソフトウェアといった、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使って、達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要なあらゆるアルゴリズムを含む、配列を整列するための適当なパラメータを決定することができる。ただし、本明細書における目的のため、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使って、アミノ酸配列同一性％値を生成させる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、Genentech, Inc.によって作成されたものであり、ソースコードが米国著作権局（Washington D.C., 20559）に利用者向け文書と共に登録申請され、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech, Inc., South San Francisco, Californiaから公的に入手することができ、又は、ソースコードからコンパイルすることができる。ALIGN-2プログラムは、digital UNIX（登録商標）V4.0Dを初めとするUNIX（登録商標）オペレーティングシステム上で使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータはALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。
【０１７０】
アミノ酸配列比較にALIGN-2を使用する場合、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又は所与のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％（これは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又は所与のアミノ酸配列Ｂに対する、あるアミノ酸配列同一性％を有する、又は含む、所与のアミノ酸配列Ａ、と言い換えることもできる）は、次のように計算される。
分率Ｘ／Ｙ×１００
式中、Ｘは、配列整列プログラムALIGN-2が、そのプログラムによるＡとＢのアライメントにおいて、完全一致（identical match）と採点したアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ａの、Ｂへのアミノ酸配列同一性％が、Ｂの、Ａへのアミノ酸配列同一性％と等しくないことは、理解されるであろう。別途具体的に明言しない限り、本明細書において使用するアミノ酸配列同一性％値は全て、直前の段落に記載したように、ALIGN-2コンピュータプログラムを使って得る。
【０１７１】
用語「医薬処方物」は、調製物であって、それに含有される有効成分の生物学的活性が有効でありうるような形態にあり、その処方物を投与される被験者にとって許容できないほど毒性の追加成分を含有しない調製物を指す。
【０１７２】
「薬学的に許容し得る担体」は、被験者にとって無毒な、医薬処方物中の有効成分以外の成分を指す。薬学的に許容し得る担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤又は保存剤などが含まれるが、それらに限定されない。
【０１７３】
本明細書で使用する用語「ペプチド性リンカー」は、一つの実施態様において、合成起源であるアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。ペプチド性リンカーは、一つの実施態様において、少なくとも３０アミノ酸の長さ、一つの実施態様において、３２〜５０アミノ酸の長さのアミノ酸配列を有するペプチドである。一つの実施態様において、ペプチド性リンカーは、３２〜４０アミノ酸の長さのアミノ酸配列を有するペプチドである。一つの実施態様において、ペプチド性リンカーは、（ＧｘＳ）ｎ（Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝８，９又は１０）若しくは（ｘ＝４及びｎ＝６，７又は８））のものであり、一つの実施態様において、ｘ＝４、ｎ＝６又は７であり、一つの実施態様においてｘ＝４、ｎ＝７である。一つの実施態様において、ペプチド性リンカーは、（Ｇ４Ｓ）６Ｇ２である。
【０１７４】
本明細書で使用する用語「リコンビナント抗体」は、リコンビナント手段により調製され、発現され、生成され又は単離された全ての抗体（キメラ、ヒト化及びヒト）を意味する。これは、ＮＳ０又はＣＨＯ細胞といった宿主細胞、又はヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックな動物（例えばマウス）から単離された抗体、若しくは宿主細胞にトランスフェクトされたリコンビナント発現ベクターを用いて発現された抗体を含む。そのようなリコンビナント抗体は、可変及び定常領域を再配列された形態で有する。リコンビナント抗体を、インビボ体細胞超突然変異に付すことができる。よって、リコンビナント抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨ及びＶＬ配列由来の、またこれに関連する配列ではあるが、インビボのヒト抗体生殖細胞系レパートリーに天然には存在しない可能性がある配列である。
【０１７５】
本明細書で使用する「処置」（及び「処置する」又は「処置すること」といったその文法的異形）は、処置される個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入を指し、予防のために行うことも、臨床病理の過程において行うこともできる。処置の望ましい効果には、疾患の出現又は再発を防止すること、症状の軽減、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を防止すること、疾患進行の速度を減じること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善などが含まれるが、それらに限定されない。いくつかの実施態様では、本明細書において報告される抗体又はＦｃ領域融合ポリペプチドが、疾患の発生を遅延させ、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１７６】
本出願で使用される用語「価」は、（抗体）分子における特定数の結合部位の存在を意味する。このようなものとして、用語「二価」、「四価」及び「六価」は各々、（抗体）分子における２つの結合部位、４つの結合部位及び６つの結合部位の存在を意味する。本明細書において報告される二重特異性抗体は、「二価」という一つの好ましい実施態様にある。
【０１７７】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体のその抗原への結合に関与する、抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に類似する構造を有し、各ドメインは、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む（例えば、Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91を参照）。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分でありうる。更に、特定の抗原と結合する抗体は、その抗原と結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを使って、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングすることによって、単離することができる（例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照）。
【０１７８】
用語「眼血管疾患」は、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、未熟児網膜症、血管新生緑内障、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、黄斑変性症、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、網膜血管腫増殖症、黄斑毛細血管拡張症、虚血性網膜症、虹彩血管新生、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生及び網膜変性症（例えば、Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G.K., (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp.1625-1710を参照）といった、眼内新生血管症候群を含むが、これらに限定されない。
【０１７９】
本明細書において使用する用語「ベクター」は、それに連結された別の核酸を増殖させる能力を有する核酸分子を指す。この用語には、自己複製する核酸構造としてのベクターも、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターも含まれる。一定のベクターは、それらが作動的に連結されている核酸の発現を指示する能力を有する。そのようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と称する。
【０１８０】
本明細書で使用する用語「ＶＥＧＦ」は、ヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ−Ａ）、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子（ヒトＶＥＧＦ１６５の前駆体配列のアミノ酸２７−１９１：配列番号３０；アミノ酸１−２６は、シグナルペプチドを表す）及び関連する１２１、１８９及び２０６血管内皮細胞成長因子アイソフォーム（Leung, D.W., et al., Science 246 (1989) 1306-1309; Houck et al., Mol. Endocrin. 5 (1991) 1806-1814; Keck, P.J., et al., Science 246 (1989) 1309-1312及びConnolly, D.T., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-20024に記載）を；それらの成長因子の天然に存在する対立遺伝子型及びプロセシングされた形態と共に指す。ＶＥＧＦは、腫瘍及び眼内障害に関連する正常及び異常な血管形成及び血管新生の調節に関与する（Ferrara, N., et al., Endocrin. Rev. 18 (1997) 4-25; Berkman, R.A., et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159; Brown, L.F., et al., Human Pathol. 26 (1995)86-91; Brown, L.F., et al., Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735; Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer . 73 (1996) 931-934; 及びDvorak, H.F., et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039）。ＶＥＧＦは、いくつかの起源から単離され、いくつかのアイソフォームを含む、ホモ二量体糖タンパク質である。ＶＥＧＦは、内皮細胞について高度に特異的な分裂促進活性を示す。
【０１８１】
本明細書で使用する用語「突然変異ＩＨＨ−ＡＡＡを伴う」は、突然変異Ｉ２５３Ａ（Ｉｌｅ２５３Ａｌａ）、Ｈ３１０Ａ（Ｈｉｓ３１０Ａｌａ）及びＨ４３５Ａ（Ｈｉｓ４３５Ａｌａ）の組み合わせを指し、本明細書で使用する用語「突然変異ＨＨＹ−ＡＡＡを伴う」は、突然変異Ｈ３１０Ａ（Ｈｉｓ３１０Ａｌａ）、Ｈ４３３Ａ（Ｈｉｓ４３３Ａｌａ）及びＹ４３６Ａ（Ｔｙｒ４３６Ａｌａ）の組み合わせを指し、本明細書で使用する用語「突然変異ＹＴＥを伴う」は、突然変異Ｍ２５２Ｙ（Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ）、Ｓ２５４Ｔ（Ｓｅｒ２５４Ｔｈｒ）及びＴ２５６Ｅ（Ｔｈｒ２５６Ｇｌｕ）の組み合わせを指し（ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域内のもの）、ここで、ナンバリングはKabat EUインデックスナンバリングシステムによるものである。
【０１８２】
本明細書で使用する用語「突然変異Ｐ３２９ＧＬＡＬＡを伴う」は、ＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域における突然変異Ｌ２３４Ａ（Ｌｅｕ２３５Ａｌａ）、Ｌ２３５Ａ（Ｌｅｕ２３４Ａｌａ）及びＰ３２９Ｇ（Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ）の組み合わせを指し、ここで、ナンバリングはKabat EUインデックスナンバリングシステムによるものである。本明細書で使用する用語「突然変異ＳＰＬＥを伴う」は、ＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域における突然変異Ｓ２２８Ｐ（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）及びＬ２３５Ｅ（Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ）の組み合わせを指し、ここで、ナンバリングはKabat EUインデックスナンバリングシステムによるものである。本明細書で使用する用語「突然変異ＳＰＬＥ及びＰ３２９Ｇを伴う」は、ＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域における突然変異Ｓ２２８Ｐ（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）、Ｌ２３５Ｅ（Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ）及びＰ３２９Ｇ（Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ）の組み合わせを指し、ここで、ナンバリングはKabat EUインデックスナンバリングシステムによるものである。
【０１８３】
ＩＩ．組成物及び方法
一つの態様において、本発明は、一部において、免疫グロブリンＦｃ領域の、新生児Ｆｃ−レセプター（ＦｃＲｎ）との結合に影響を及ぼす、即ち、Ｆｃ領域のＦｃＲｎとの結合を減少させ、又は消失させもする、特定の突然変異又は突然変異の組み合わせが、同時にＦｃ領域のブドウ球菌プロテインＡとの結合をも消失させるものではないとの発見に基づくものである。このことは、採用しうる精製方法に対し重大な影響を及ぼすものであり、これは例えば、特異的で、種が制限されたアフィニティークロマトグラフィー材料（例えば、カッパ軽鎖を含む抗体のみと結合するKappaSelectのような）を必要としないことによる。よって、本明細書において報告される突然変異の組み合わせにより、ブドウ球菌プロテインＡとの結合を維持しつつ、同時にＦｃＲｎとの結合を減少させ、又は消失させることさえも可能である。
【０１８４】
一つの態様において、本発明は、一部において、各重鎖のＦｃ領域における種々の突然変異を用いることにより、例えば、二重特異性抗体のような、一方ではＦｃＲｎとの結合が減少し、又は消失してさえもおり、しかし他方では、ブドウ球菌プロテインＡとの結合能を維持するヘテロ二量体分子を提供し得るとの発見に基づくものである。このブドウ球菌プロテインＡとの結合は、ホモ二量体副生物からヘテロ二量体分子を分離するのに用いることができる。例えば、ノブズ−イントゥ−ホールアプローチを用いて、一方の重鎖Ｆｃ領域における突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを、他方の重鎖Ｆｃ領域における突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａと組み合わせることにより、一方で、ＦｃＲｎとは結合しない（両セットの突然変異は、ヒトＦｃＲｎに関して影響しない（silent））が、ブドウ球菌プロテインＡとの結合は維持している（突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを伴う重鎖Ｆｃ領域は、ＦｃＲｎと結合せず、ブドウ球菌プロテインＡとも結合しないが、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを伴う重鎖Ｆｃ領域は、ＦｃＲｎとは結合しないが、ブドウ球菌プロテインＡとは依然として結合する）ヘテロ二量体Ｆｃ領域を得ることができる。よって、ホモ二量体ホール-ホール副生物はもはやブドウ球菌プロテインＡとは結合しないので、これを標準的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて除去することができる。よって、ノブズ−イントゥ−ホールズアプローチを、ホール鎖中の突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ並びにノブ鎖中の突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａと組み合わせることにより、ホモ二量体ホール−ホール副生物からのヘテロ二量体ノブズ−イントゥ−ホールズ生成物の精製／分離を促進することができる。
【０１８５】
一つの態様において、本発明は、一部において、ＦｃＲｎ−結合を有さない硝子体内適用用抗体は有益であり、それは、これらの抗体は、血液−眼関門を越えることができ、眼内において実質的に延長又は短縮された半減期を有さず、また血液循環から迅速に除去され、そのため眼外において全く、又は極めて限られた全身性副作用しかもたらさないことによるとの発見に基づくものである。本発明の抗体は、例えば、眼血管疾患の診断又は処置に有用である。
【０１８６】
本発明は、少なくとも一部において、Ｆｃ領域の各々のＦｃ領域ポリペプチド内の種々の突然変異を用いることにより、例えば二重特異性抗体のような、テーラーメイドのＦｃＲｎ−結合を有するヘテロ二量体分子を提供でき、そしてそのことにより、テーラーメイドの全身半減期を有する抗体を提供し得るとの発見に基づくものである。
【０１８７】
突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３５Ａ、又はＬ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ、Ｌ４３２Ｄ、又はＬ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ、Ｌ４３２Ｓの組み合わせは、プロテインＡとの結合の消失をもたらすが、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３５Ａ、又はＨ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、Ｙ４３６Ａ、又はＬ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ、Ｌ４３２Ｄの組み合わせは、ヒト新生児Ｆｃレセプターとの結合の消失をもたらす。
【０１８８】
下記表は、相互作用に関与する、又は相互作用を変化させるために改変したＦｃ領域内のアミノ酸残基の例示的な概観を示す。
【０１８９】
【表３】
2020196744.tif 000004
2020196744.tif 000005
2020196744.tif 000006
【０１９０】
本明細書において報告される改変は、ヒトＦｃＲｎのような１種以上のＦｃレセプターについての結合特異性を変化させる。同時に、ヒトＦｃＲｎとの結合を変化させる突然変異のいくつかは、ブドウ球菌プロテインＡとの結合を変化させない。
【０１９１】
一つの実施態様において、本明細書において報告される突然変異の組み合わせは、二量体ポリペプチドの血清半減期を、この突然変異の組み合わせを欠く対応する二量体ポリペプチドに比して変化させるか、又は実質的に変化させる。一つの実施態様において、前記突然変異の組み合わせは、前記二量体ポリペプチドのプロテインＡとの結合を、この突然変異の組み合わせを欠く対応する二量体ポリペプチドに比して、更に変化させ、又は実質的に変化させることはない。
【０１９２】
Ａ．新生児Ｆｃ−レセプター（ＦｃＲｎ）
新生児Ｆｃ−レセプター（ＦｃＲｎ）は、インビボにおけるＩｇＧクラスの抗体の代謝運命に関して重要である。ＦｃＲｎは、野生型ＩｇＧをリソゾーム分解経路から救出するように機能し、クリアランスの減少と半減期の延長をもたらす。これは、２種のポリペプチド：５０ｋＤａのクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α−ＦｃＲｎ）及び１５ｋＤａのβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）からなるヘテロ二量体タンパク質である。ＦｃＲｎは、クラスＩｇＧの抗体のＦｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３部と高い親和性をもって結合する。クラスＩｇＧの抗体とＦｃＲｎの間の相互作用はｐＨ依存性であり、１：２の化学量論において生じる、即ち、１個のＩｇＧ抗体分子は、その２本の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドを介して、２個のＦｃＲｎ分子と相互作用することができる（例えば、Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083を参照）。
【０１９３】
よって、ＩｇＧのインビトロＦｃＲｎ結合特性は、その血液循環中でのインビボ薬物動力学的特性を示唆するものである。
【０１９４】
ＦｃＲｎとＩｇＧクラスの抗体のＦｃ領域の間の相互作用には、重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの種々のアミノ酸残基が関与している。ＦｃＲｎと相互作用するアミノ酸残基は、およそＥＵ位置２４３とＥＵ位置２６１の間、およそＥＵ位置２７５とＥＵ位置２９３の間、およそＥＵ位置３０２とＥＵ位置３１９の間、およそＥＵ位置３３６とＥＵ位置３４８の間、およそＥＵ位置３６７とＥＵ位置３９３の間、ＥＵ位置４０８及びおよそＥＵ位置４２４とＥＵ位置４４０の間に位置している。更に具体的には、Ｆｃ領域とＦｃＲｎの間の相互作用には、KabatのEUナンバリングによる次のアミノ酸残基：Ｆ２４３、Ｐ２４４、Ｐ２４５Ｐ、Ｋ２４６、Ｐ２４７、Ｋ２４８、Ｄ２４９、Ｔ２５０、Ｌ２５１、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｒ２５５、Ｔ２５６、Ｐ２５７、Ｅ２５８、Ｖ２５９、Ｔ２６０、Ｃ２６１、Ｆ２７５、Ｎ２７６、Ｗ２７７、Ｙ２７８、Ｖ２７９、Ｄ２８０、Ｖ２８２、Ｅ２８３、Ｖ２８４、Ｈ２８５、Ｎ２８６、Ａ２８７、Ｋ２８８、Ｔ２８９、Ｋ２９０、Ｐ２９１、Ｒ２９２、Ｅ２９３、Ｖ３０２、Ｖ３０３、Ｓ３０４、Ｖ３０５、Ｌ３０６、Ｔ３０７、Ｖ３０８、Ｌ３０９、Ｈ３１０、Ｑ３１１、Ｄ３１２、Ｗ３１３、Ｌ３１４、Ｎ３１５、Ｇ３１６、Ｋ３１７、Ｅ３１８、Ｙ３１９、Ｉ３３６、Ｓ３３７、Ｋ３３８、Ａ３３９、Ｋ３４０、Ｇ３４１、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｐ３４６、Ｑ３４７、Ｖ３４８、Ｃ３６７、Ｖ３６９、Ｆ３７２、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ｉ３７７、Ａ３７８、Ｖ３７９、Ｅ３８０、Ｗ３８１、Ｅ３８２、Ｓ３８３、Ｎ３８４、Ｇ３８５、Ｑ３８６、Ｐ３８７、Ｅ３８８、Ｎ３８９、Ｙ３９１、Ｔ３９３、Ｓ４０８、Ｓ４２４、Ｃ４２５、Ｓ４２６、Ｖ４２７、Ｍ４２８、Ｈ４２９、Ｅ４３０、Ａ４３１、Ｌ４３２、Ｈ４３３、Ｎ４３４、Ｈ４３５、Ｙ４３６、Ｔ４３７、Ｑ４３８、Ｋ４３９及びＳ４４０が関与している。
【０１９５】
部位特異的突然変異誘発研究により、ＩｇＧのＦｃ領域における決定的な結合部位が、ヒスチジン３１０、ヒスチジン４３５及びイソロイシン２５３、更に、それらより程度は低いがヒスチジン４３３及びチロシン４３６であることが示されている（例えば、Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2825; Raghavan, M., et al., Biochem. 34 (1995) 14649-14657; Medesan, C., et al., J Immunol. 158 (1997) 2211-2217を参照）。
【０１９６】
種々のアミノ酸残基：スレオニン２５０、メチオニン２５２、セリン２５４、スレオニン２５６、スレオニン３０７、グルタミン酸３８０、メチオニン４２８、ヒスチジン４３３及びアスパラギン４３４において、ＩｇＧを突然変異させることにより、ＩｇＧのＦｃＲｎとの結合を増加させる方法が行われている（Kuo, T.T., et al., J. Clin. Immunol. 30 (2010) 777-789を参照）。
【０１９７】
ある場合には、血液循環中での半減期が短い抗体が望まれる。例えば、硝子体内適用用医薬品は、患者における眼内での半減期は長く、血液循環内での半減期は短いものであるべきである。そのような抗体はまた、疾患部位、例えば眼内における曝露の増加という利点を有する。
【０１９８】
ＦｃＲｎ結合に影響を及ぼす種々の突然変異及びそれに伴う血液循環中での半減期が知られている。マウスＦｃ領域−マウスＦｃＲｎ相互作用に対して決定的なＦｃ領域残基が、部位特異的突然変異誘発により同定されている（例えば、Dall’Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180を参照）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｎ４３４及びＨ４３５（KabatによるEUナンバリング）が、前記相互作用に関与している（Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533-2536; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０及びＨ４３５が、ヒトＦｃのマウスＦｃＲｎとの前記相互作用に対して決定的であることが見出された（Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2885）。タンパク質−タンパク質相互作用研究により、残基Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６ＥがＦｃＲｎ結合を向上させると、Dall'Acquaらにより記載されている（Dall'Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524）。ヒトＦｃ−ヒトＦｃＲｎ複合体の研究により、残基Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３５及びＹ４３６が前記相互作用に対して決定的であることが示された（Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604）。Yeung, Y.A., et al. (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671)には、残基２４８〜２５９、３０１〜３１７、３７６〜３８２及び４２４〜４３７の種々の突然変異体が報告及び調査されている。例示的な突然変異及びＦｃＲｎ結合に対するそれらの影響を下記表に列挙する。
【０１９９】
【表４】
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2020196744.tif 000008
2020196744.tif 000009
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【０２００】
一つのＦｃ領域ポリペプチドにおける一方だけの一つの突然変異が、有意に結合を弱めるのに十分であることが見出された。Ｆｃ領域に突然変異がより多く導入されるほど、ＦｃＲｎとの結合は弱くなる。しかし、一方だけの非対称突然変異は、ＦｃＲｎ結合を完全に阻害するには十分でない。ＦｃＲｎ結合を完全に阻害するには、両方の突然変異が必要である。
【０２０１】
ＦｃＲｎ結合に影響を及ぼすＩｇＧ１  Ｆｃ領域の対称操作の結果を下記表に示す（突然変異及びＦｃＲｎ−アフィニティークロマトグラフィーカラム上での保持時間の整列）。
【０２０２】
【表５】
2020196744.tif 000012
【０２０３】
３分間未満の保持時間は、結合なしに相当するが、これは物質が素通り画分（ボイドピーク）中に存在することによる。
【０２０４】
単独の突然変異Ｈ３１０Ａは、何らかのＦｃＲｎ結合を削除するのに最も影響しない対称突然変異である。
【０２０５】
対称単独突然変異Ｉ２５３Ａ及びＨ４３５Ａは、０．３〜０．４分間の相対的な保持時間の変化をもたらす。これは一般に、検出不可能な結合と認識される。
【０２０６】
単独突然変異Ｙ４３６Ａは、ＦｃＲｎアフィニティーカラムに対し、検出可能な相互作用強度をもたらす。この理論にとらわれはしないが、この突然変異は、ＦｃＲｎ媒介インビボ半減期に、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａの組み合わせ（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異）のようなゼロ相互作用と区別し得る影響を及ぼし得る。
【０２０７】
対称改変抗ＨＥＲ２抗体について得られた結果を下記表に示す（参考としては、国際公開公報第２００６／０３１３７０号を参照）。
【０２０８】
【表６】
2020196744.tif 000013
【０２０９】
Ｆｃ領域における、ＦｃＲｎ結合に影響を及ぼす非対称突然変異導入の効果が、ノブズ−イントゥ−ホールズ技術を用いて組み立てられた二重特異性抗体について例示されている（例えば、米国特許第７６９５９３６号、米国公開公報第２００３／００７８３８５号を参照；「ホール鎖」突然変異：Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ、「ノブ鎖」突然変異：Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）。非対称に導入された突然変異のＦｃＲｎ結合に対する影響は、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー法を用いて容易に測定することができる（図９及び下記表を参照）。ＦｃＲｎアフィニティーカラムからの溶出がより後である、即ち、ＦｃＲｎアフィニティーカラム上での保持時間がより長い抗体は、インビボ半減期がより長く、その逆もあてはまる。
【０２１０】
【表７】
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【０２１１】
Ｆｃ領域における、ＦｃＲｎ結合に影響を及ぼす非対称突然変異導入の効果が、非対称突然変異導入を可能にするためのノブズ−イントゥ−ホールズ技術を用いて組み立てられた単一特異性抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体について更に例示されている（例えば、米国特許第７６９５９３６号、米国公開公報第２００３／００７８３８５号を参照；「ホール鎖」突然変異：Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ、「ノブ鎖」突然変異：Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）。非対称に導入された突然変異のＦｃＲｎ結合に対する影響は、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー法を用いて容易に測定することができる（下記表を参照）。ＦｃＲｎアフィニティーカラムからの溶出がより後である、即ち、ＦｃＲｎアフィニティーカラム上での保持時間がより長い抗体は、インビボ半減期がより長く、その逆もあてはまる。
【０２１２】
【表８】
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【０２１３】
非対称ＩＨＨ−ＡＡＡ及びＬＬＬ−ＤＤＤ突然変異（ＬＬＬ−ＤＤＤ−突然変異＝突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄの組み合わせ）は、対応する親又は野生型抗体よりも弱い結合を示す。
【０２１４】
対称ＨＨＹ−ＡＡＡ突然変異（＝突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａの組み合わせ）は、ヒトＦｃＲｎとはもはや結合しないが、プロテインＡとの結合は維持されているＦｃ領域をもたらす（図１１、１２、１３及び１４を参照）。
【０２１５】
Ｆｃ領域における、ＦｃＲｎ結合に影響を及ぼす非対称突然変異導入の効果が、非対称突然変異導入を可能にするためのノブズ−イントゥ−ホールズ技術を用いて組み立てられた単一特異性抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（ＩＧＦ−１Ｒ）、二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体（ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２）及び両重鎖のＣ−末端との融合を伴う全長抗体（fusion）について更に例示されている（例えば、米国特許第７６９５９３６号、米国公開公報第２００３／００７８３８５号を参照；「ホール鎖」突然変異：Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ、「ノブ鎖」突然変異：Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）。導入された突然変異のＦｃＲｎ結合及びプロテインＡ結合に対する影響は、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー法、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー法及びＳＰＲベースの方法を用いて容易に測定することができる（下記表を参照）。
【０２１６】
【表９】
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【０２１７】
本明細書において報告される一つの態様は、本明細書において報告される変異体ヒトＩｇＧクラスＦｃ領域を含む抗体又はＦｃ領域融合ポリペプチドである。
【０２１８】
本明細書において報告されるＦｃ領域（二量体ポリペプチド）は、Ｆｃ領域融合ポリペプチド又は全長抗体に含まれている場合、その分子に前記特徴を与える。融合パートナーは、生物活性を有し、そのインビボ半減期が短縮又は延長され得る、即ち、そのインビボ半減期が明確に定義され、意図する用途のためにテーラーメイドされる、いかなる分子でもありうる。
【０２１９】
Ｆｃ領域融合ポリペプチドは、例えば、ＴＮＦＲ−Ｆｃ領域融合ポリペプチド（ＴＮＦＲ＝ヒト腫瘍壊死因子レセプター）、又はＩＬ−１Ｒ−Ｆｃ領域融合ポリペプチド（ＩＬ−１Ｒ＝ヒトインターロイキン−１レセプター）、又はＶＥＧＦＲ−Ｆｃ領域融合ポリペプチド（ＶＥＧＦＲ＝ヒト血管内皮成長因子レセプター）、又はＡＮＧ２Ｒ−Ｆｃ領域融合ポリペプチド（ＡＮＧ２Ｒ＝ヒトアンジオポエチン２レセプター）のように、例えば、本明細書において報告される変異体（ヒト）ＩｇＧクラスＦｃ領域及びリガンドを初めとする標的と結合するレセプタータンパク質を含んでいてよい。
【０２２０】
Ｆｃ領域融合ポリペプチドは、例えば、本明細書において報告される変異体（ヒト）ＩｇＧクラスＦｃ領域及び、例えば、抗体Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖｓ（例えば、Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1126-1136を参照）又はドメイン抗体（ｄＡｂｓ）（例えば、国際公開公報第２００４／０５８８２１号、国際公開公報第２００３／００２６０９号を参照）といったものを初めとする、標的と結合する抗体フラグメントを含んでいてよい。
【０２２１】
Ｆｃ領域融合ポリペプチドは、例えば、本明細書において報告される変異体（ヒト）ＩｇＧクラスＦｃ領域及びレセプターリガンド（天然に存在するもの又は人工のもののいずれも）を含んでいてよい。
【０２２２】
抗体、例えば全長抗体又はCrossMabsは、本明細書において報告される変異体（ヒト）ヒトＩｇＧクラスＦｃ領域を含むものであり得る。
【０２２３】
Ｂ．眼血管疾患
眼血管疾患は、眼組織（網膜又は角膜など）の構造への、新たな血管の変化した又は調節されない増殖及び侵入により特徴付けられる、あらゆる病理学的状態である。
【０２２４】
一つの実施態様において、眼血管疾患は、以下からなる群より選択される：滲出型加齢黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）、乾燥型加齢黄斑変性症（乾燥型ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、非増殖性糖尿病性網膜症（ＮＰＤＲ）、増殖性糖尿病網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞様黄斑浮腫、血管炎（例えば網膜中心静脈閉塞症）、乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎、ブドウ膜炎、脈絡膜炎、多巣性脈絡膜炎、眼ヒストプラスマ、眼瞼炎、ドライアイ（シェーグレン病）及び他の眼疾患（眼疾患又は障害は、眼血管新生、血管漏出及び／又は網膜浮腫と関連するものである）。
【０２２５】
本明細書において報告される二量体ポリペプチドを含む抗体は、滲出型ＡＭＤ、乾燥型ＡＭＤ、ＣＭＥ、ＤＭＥ、ＮＰＤＲ、ＰＤＲ、眼瞼炎、ドライアイ及びブドウ膜炎、一つの好ましい実施態様においては、滲出型ＡＭＤ、乾燥型ＡＭＤ、眼瞼炎、及びドライアイ、また、一つの好ましい実施態様においては、ＣＭＥ、ＤＭＥ、ＮＰＤＲ、及びＰＤＲ、また、一つの好ましい実施態様においては、眼瞼炎、及びドライアイ、特に、滲出型ＡＭＤ及び乾燥型ＡＭＤ、また、特に、滲出型ＡＭＤの防止及び処置において有用である。
【０２２６】
いくつかの実施態様において、眼血管疾患は、滲出型加齢黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞、未熟児網膜症及び糖尿病性網膜症からなる群より選択される。
【０２２７】
角膜血管新生に関連する他の疾患には、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズの過剰装着、アトピー性角膜炎、上輪部角角膜炎、翼状片角膜炎乾性角、シェーグレン病、酒さ性ざ瘡、フィレクテヌローシス、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学熱傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状疱疹感染、原虫感染、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁角質溶解、慢性関節リウマチ、全身紅はん性、多発動脈炎、外傷、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンジョンソン病、類天疱瘡放射状角膜切開及び角膜移植拒絶が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２８】
網膜／脈絡膜新生血管形成に関連する疾患には、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、鎌状赤血球貧血、サルコイド、梅毒、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞性疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、網膜色素変性、網膜浮腫（黄斑浮腫を含む）、イールズ病、ベーチェット病、網膜炎又は脈絡膜炎を起こす感染、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、視神経ピット、シュタルガルト病、扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラズマ症、外傷、及びレーザー後合併症が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２９】
他の疾患には、ルベオーシス（角の新生血管形成）に関連付けられる疾患及び線維血管組織又は繊維組織の異常増殖（増殖性硝子体網膜症の全ての形態を含む）により起こされる疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３０】
未熟児の網膜症（ＲＯＰ）は、早期に生まれた乳児に影響する、眼の疾患である。それは、瘢痕及び網膜剥離をもたらしうる、網膜血管の無秩序な成長により起こされると考えられる。ＲＯＰは、軽度であり、自然発生的に消散しうるが、深刻な場合において失明に導きうる。そのようなものとして、全ての早産乳児には、ＲＯＰについてのリスクがあり、非常に低い出生体重は、追加のリスク因子である。酸素毒性及び相対低酸素症の両方が、ＲＯＰの発生に寄与しうる。
【０２３１】
黄斑変性症は、高齢者において主に見出される医学的状態であり、ここで、眼の内部裏打ちの中心（網膜の黄斑領域として公知である）が、菲薄化、萎縮、及び、一部の場合において、出血を被る。これは、中心視野の喪失を招きうるが、それは、細かい詳細を見る、読む、又は顔を認識することの不能を伴う。米国眼科学会によれば、それは、５０歳を上回る人々での、今日の米国での中心視野喪失（失明）の主要な原因である。若年者に影響する一部の黄斑ジストロフィーは、時々、黄斑変性症と呼ばれているが、この用語は、一般的に、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ又はＡＲＭＤ）を指す。
【０２３２】
加齢黄斑変性は、網膜色素上皮とその下の脈絡膜の間のドルーゼンと呼ばれる黄斑（詳細な中心視野を提供する網膜の中央領域で、中心窩と呼ばれる）における、特徴的な黄色沈着から始まる。これらの初期の変化（加齢性黄斑変性症とも呼ばれる）を伴う大半の人々が、良い視力を有する。ドルーゼンを伴う人々は、進み、進行性ＡＭＤを発生しうる。このリスクは、ドルーゼンが大きく、多数であり、黄斑下の色素性細胞層における乱れに関連付けられる場合、相当により高い。大きく、柔らかいドルーゼンは、上昇したコレステロール沈着に関連しており、コレステロール低下薬剤又はＲｈｅｏ手順に応答しうる。
【０２３３】
進行性ＡＭＤは、深刻な失明に関与し、乾燥型及び滲出型の２つの形態を有する。中央の地理的な萎縮は、進行性ＡＭＤの乾燥形態であり、網膜下の網膜色素上皮層への萎縮から生じ、それは、眼の中央部分において光受容体（桿体及び錐体）の喪失を通じて視力喪失を起こす。この状態についての利用可能な処置方法はないが、国立眼研究所その他により、高用量の酸化防止剤、ルテイン及びゼアキサンチンを伴うビタミンサプリメントが、乾燥黄斑変性の進行を遅らせ、一部の患者において、視力を改善することが実証されている。
【０２３４】
網膜色素変性症（ＲＰ）は、一群の眼の遺伝的状態である。ＲＰについての症状の進行において、一般的に、トンネル視を数年又は数十年先行して夜盲が起こる。ＲＰを伴う多くの人が、彼らの４０代又は５０代まで法定盲人とはならず、一部の視力を終生保持する。他は、一部の場合には小児期という早期に、ＲＰから完全な盲目に行く。ＲＰの進行は、各々の場合において異なる。ＲＰは、遺伝性網膜ジストロフィーの型であり、網膜の光受容体（桿体及び錐体）又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）の異常が進行性の視力喪失を起こす、一群の遺伝性障害である。罹患した個人は、最初に、欠陥のある暗順応又は夜盲症（夜盲）を経験し、疾患の経過における後期に、周辺視野の減少（トンネル視として公知である）及び、時々、中心視野の喪失が続く。
【０２３５】
黄斑浮腫は、液体及びタンパク質の堆積物が眼の黄斑（網膜の黄色中央領域）の上下に集まると発生し、黄斑を厚くし、膨潤させる。この膨潤が、ヒトの中心視野を歪めうる。なぜなら、黄斑は、眼球の後ろの、網膜の中心近くにあるからである。この領域は、ヒトが、直接的に視線中にある形態、色及び詳細を見ることを可能にする、シャープで明確な中心視野を提供する緊密に詰められた錐体を保持する。嚢胞様黄斑浮腫は、嚢胞形成を含む黄斑浮腫の型である。
【０２３６】
Ｃ．ブドウ球菌プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いる抗体精製
一つの態様において、二量体ポリペプチドであって、
各々、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１個以上のシステイン残基を含む、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド
を含み、
ｉ）前記第１及び前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）前記第１及び前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、
ｉｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、又は
ｉｖ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含む、
ポリペプチドが提供される。
【０２３７】
これらの二量体ポリペプチドは、突然変異のため、ヒトＦｃＲｎとは結合しないが、ブドウ球菌プロテインＡとの結合は維持されているという特性を有する。
【０２３８】
よって、これらの抗体は、MabSelectSureのような、従来のプロテインＡアフィニティー材料を用いることにより、精製する、即ち、望まない副生物から分離することができる。例えば、カッパサブクラスの軽鎖を含む抗体にしか使えないKappaSelectのような、高度に洗練されているが種が制限されたアフィニティー材料を用いる必要はない。加えて、軽鎖サブクラスの改変／交換がなされても、精製方法を導入（adopt）する必要はない（各々図１１及び１２を参照）。
【０２３９】
本明細書において報告される一つの態様は、本明細書において報告される二量体ポリペプチドを製造する方法であって、下記工程：
ａ）前記二量体ポリペプチドをコードする１種以上の核酸を含む哺乳類細胞を培養する工程、
ｂ）前記二量体ポリペプチドを培養培地から回収する工程、及び
ｃ）前記二量体ポリペプチドをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製して、前記二量体ポリペプチドを製造する工程
を含む方法である。
【０２４０】
本明細書において報告される一つの態様は、ホモ二量体ポリペプチドからヘテロ二量体ポリペプチドを分離するための、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａの組み合わせの使用である。
【０２４１】
本明細書において報告される一つの態様は、ホモ二量体ポリペプチドからヘテロ二量体ポリペプチドを分離するための、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄの組み合わせの使用である。
【０２４２】
本明細書において報告される一つの態様は、第１のポリペプチド内の突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａの、第２のポリペプチド内の突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａと組み合わせての、前記第１及び第２のポリペプチドを含むヘテロ二量体ポリペプチドを、ホモ二量体ポリペプチドから分離するための使用である。
【０２４３】
本明細書において報告される一つの態様は、第１のポリペプチド内の突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａの、第２のポリペプチド内の突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄと組み合わせての、前記第１及び第２のポリペプチドを含むヘテロ二量体ポリペプチドを、ホモ二量体ポリペプチドから分離するための使用である。
【０２４４】
先の三態様の一つの実施態様において、前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを更に含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを更に含む。
【０２４５】
先の三態様の一つの実施態様において、前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを更に含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを更に含む。
【０２４６】
本明細書において報告される一つの態様は、二量体Ｆｃ領域ポリペプチドのブドウ球菌プロテインＡとの結合を増加させるための、突然変異Ｙ４３６Ａの使用である。
【０２４７】
突然変異Ｙ４３６Ａを導入することにより、Ｆｃ領域のブドウ球菌プロテインＡ（ＳＰＡ）との結合を増加させることができることが見出された。このことは、例えば、ＳＰＡとの結合を減少させる更なる突然変異（例えば、Ｉ２５３Ａ及びＨ３１０Ａ、又はＨ３１０Ａ及びＨ４３５Ａのような）を導入する場合に有利である（図１５を参照）。
【０２４８】
本明細書において報告される一つの態様は、二量体ポリペプチドであって、
各々、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１個以上のシステイン残基を含む、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド
を含み、
前記第１の、前記第２の又は前記第１及び前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ４３６Ａ（Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）を含む、
ポリペプチドである。
【０２４９】
一つの実施態様において、前記第１及び前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｙ４３６Ａを含む。
【０２５０】
本明細書において報告される一つの態様は、単離／精製の容易さを提供する二重特異性抗体であって、別個に改変された免疫グロブリン重鎖Ｆｃ領域を含み、前記改変の少なくとも１つは、ｉ）前記二重特異性抗体の、プロテインＡに関する別個の親和性、及びｉｉ）前記二重特異性抗体の、ヒトＦｃＲｎに関する別個の親和性をもたらし、かつ前記二重特異性抗体は、プロテインＡに関する親和性に基づき、破壊された細胞、培地又は抗体の混合物より単離可能である、二重特異性抗体である。
【０２５１】
一つの実施態様において、前記二重特異性抗体は、ｐＨ４．０超のｐＨ値において溶出する。
【０２５２】
一つの実施態様において、二重特異性抗体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー及びｐＨ勾配又はｐＨ段階を用いて単離し、前記ｐＨ勾配又はｐＨ段階は、塩の添加を含む。一つの具体的な実施態様において、塩は、約０．５M〜約１Mの濃度で存在する。一つの実施態様において、塩は、リチウム、ナトリウム及びカリウムの酢酸塩；ナトリウム及びカリウムの重炭酸塩；リチウム、ナトリウム及びカリウムの炭酸塩；リチウム、ナトリウム、カリウム及びマグネシウムの塩化物；ナトリウム及びカリウムのフッ化物；ナトリウム、カリウム及びカルシウムの硝酸塩；ナトリウム及びカリウムのリン酸塩；並びにカルシウム及びマグネシウムの硫酸塩からなる群より選択される。一つの実施態様において、塩は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属のハロゲン化物塩である。一つの好ましい実施態様において、塩は塩化ナトリウムである。
【０２５３】
一つの態様において、前記二量体ポリペプチドは、ヘテロ二量体ポリペプチドを形成するように、本明細書において報告される改変された第１のポリペプチド及びプロテインＡ及びＦｃＲｎ結合に関して改変されていない第２のポリペプチドを含み、前記別個の改変は、前記別個の改変のない対応する二量体ポリペプチドに比して、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．３又は１．４ｐＨ単位だけ高いｐＨでプロテインＡアフィニティー材料から溶出する二量体ポリペプチドをもたらす。一つの実施態様において、前記別個に改変された二量体ポリペプチドは、ｐＨ４以上において溶出し、前記改変されていない二量体ポリペプチドは、ｐＨ３．５以下において溶出する。一つの実施態様において、前記別個に改変された二量体ポリペプチドは、約ｐＨ４において溶出し、前記改変されていない二量体ポリペプチドは、約ｐＨ２．８〜３．５、２．８〜３．２又は２．８〜３において溶出する。これらの実施態様において、両方のポリペプチドにおいて、「改変されていない」は、改変Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ（Kabat EUインデックスナンバリングシステム）がないことを指す。
【０２５４】
クロマトグラフィーの実行について（For chromatographic runs）、特にヒトＩｇＧ１サブクラス由来の場合、０．５M〜１Mの塩（例えば、ＮａＣｌ）の添加が、ホモ二量体ポリペプチドとヘテロ二量体ポリペプチドの分離を改善する場合がある。ｐＨ値を増加させるような溶出溶液への塩の添加は、例えば、段階的ｐＨ勾配が２つの種をうまく分離するように、溶出のためのｐＨ範囲を拡大する可能性がある。
【０２５５】
従って、一つの実施態様において、一方の鎖が、本明細書において報告される突然変異を含む、ヘテロ二量体ＩｇＧＦｃ領域を含む二重特異性抗体を分離する方法は、塩の存在下にｐＨ勾配を採用する工程を含む。一つの実施態様において、塩は、ＩｇＧＦｃ領域ホモ二量体とＩｇＧＦｃ領域ヘテロ二量体の間の、プロテインＡクロマトグラフィー材料からの溶出のｐＨ差を最大化するのに十分な濃度で存在する。一つの実施態様において、塩は、約０．５M〜約１Mの濃度で存在する。一つの実施態様において、塩は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属及びハロゲンの塩である。一つの実施態様において、塩は、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、ＣａＣｌ２又はＭｇＣｌ２のような、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩化物塩である。一つの実施態様において、ｐＨ勾配は、約ｐＨ４〜約ｐＨ５である。一つの実施態様において、勾配は直線勾配である。一つの実施態様において、pH勾配は段階的勾配である。一つの実施態様において、前記方法は、約ｐＨ４の溶液を、平衡化したプロテインＡアフィニティーカラムにかける工程を含む。一つの実施態様において、本明細書において報告される改変に関するヘテロ二量体ＩｇＧＦｃ領域を含む二重特異性抗体は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー材料から、ヘテロ二量体でない二重特異性抗体を実質的に含まない一つ以上の画分に溶出する。
【０２５６】
本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、リコンビナント手段により製造される。よって、本発明の一つの態様は、本明細書において報告される二量体ポリペプチドをコードする核酸であり、更なる態様は、本明細書において報告される二量体ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞である。リコンビナント製造の方法は、技術水準において広く知られており、原核及び真核細胞におけるタンパク（質）発現と、それに続く二量体ポリペプチドの単離及び通常は薬学的に許容し得る純度への精製を含む。宿主細胞における前記のような二量体ポリペプチドの発現のためには、第１及び第２のポリペプチドを各々コードする核酸を、標準的方法により発現ベクターに挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母又はE.coli細胞のような、適切な原核又は真核宿主細胞において行い、前記細胞（培養上清又は溶解後の細胞）から二量体ポリペプチドを回収する。
【０２５７】
抗体のリコンビナント製造の一般法は、技術水準において周知であり、例えば、総説Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880に記載されている。
【０２５８】
従って、本明細書において報告される一つの態様は、本明細書において報告される二量体ポリペプチドを製造する方法であって、
a)本明細書において報告される二量体ポリペプチドをコードする核酸分子を含む１種以上のベクターで、宿主細胞を形質転換する工程、
b)前記宿主細胞を、前記二量体ポリペプチドの製造を可能にする条件下で培養する工程、及び
c)前記二量体ポリペプチドを培養物から回収して、前記二量体ポリペプチドを製造する工程
を含む方法である。
【０２５９】
一つの実施態様において、ｃ）の前記回収工程は、免疫グロブリンＦｃ領域に特異的な捕捉試薬の使用を含む。一つの実施態様において、このＦｃ領域特異的な捕捉試薬は、結合→溶出モード（bind-and-elute-mode）で用いる。そのようなＦｃ領域特異的な捕捉試薬の例は、例えば、大スケールでの高い流速及び低い背圧を可能にする高度に硬質のアガロースベース母材を基にした、ブドウ球菌プロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーカラムである。それらは、二量体ポリペプチド、即ちそのＦｃ領域と結合するリガンドを特徴とする。リガンドは、それを標的分子との結合に容易に使用できるようにするための長い親水性スペーサーアームを介して母材に取り付けられている。
【０２６０】
本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、例えば、プロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーといった、従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地から適切に分離される。Ｂ細胞又はハイブリドーマ細胞が、二量体ポリペプチドをコードするＤＮＡ及びＲＮＡの起源として役立つものであり得る。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、従来の手順を用いて容易に単離及び配列決定される。単離すれば、ＤＮＡは、発現ベクターに挿入でき、次いでこれをＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞又はミエローマ細胞といった（このようにしなければ二量体ポリペプチドを産生しない）宿主細胞にトランスフェクションして、宿主細胞におけるリコンビナントモノクローナル二量体ポリペプチドを合成する。
【０２６１】
抗体の精製は、細胞成分又は他の混入物、例えば他の細胞性核酸又はタンパク質を排除するために、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動その他当技術分野において周知のものを含む標準的な技術により行う（Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照）。種々の方法が十分に確立され、タンパク質精製に広範に使用されている。例えば、微生物タンパク質を用いたアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）及び混合モード交換）、チオフィリック吸着（例えば、β−メルカプトエタノールその他のＳＨリガンドによるもの）、疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル−セファロース、アザ−アレノフィリック樹脂又はｍ−アミノフェニルボロン酸によるもの）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ（ＩＩ）及びＣｕ（ＩＩ）アフィニティー材料）、サイズ排除クロマトグラフィー及び電気泳動方法（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動のような）（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102）。
【０２６２】
本発明の一つの態様は、本明細書において報告される二量体ポリペプチド又は抗体を含む医薬処方物である。本発明の他の一つの態様は、医薬処方物の製造のための、本明細書において報告される二量体ポリペプチド又は抗体の使用である。本発明の更なる態様は、本明細書において報告される二量体ポリペプチド又は抗体を含む医薬処方物を製造する方法である。他の一つの態様において、本発明は、薬学的担体と共に処方された本明細書において報告される二量体ポリペプチド又は抗体を含む処方物、例えば医薬処方物を提供する。
【０２６３】
本明細書において報告される処方物は、当技術分野において公知の種々の方法により投与することができる。当業者にはわかることであろうが、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に応じて変わる。本発明の化合物をある投与経路で投与するためには、前記化合物を、その不活性化を防ぐ物質でコーティングする、又はその物質と同時に投与することが必要な可能性がある。例えば、前記化合物を、適切な担体中,例えば、リポソーム又は希釈剤中で被験者に投与してもよい。薬学的に許容し得る希釈剤には、食塩水及び水性緩衝溶液が含まれる。薬学的担体には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質用のそのような媒体及び試薬の使用は、当技術分野において公知である。
【０２６４】
送達の多くの可能な様式を使用することができ、これには眼内適用又は局所適用が含まれるが、これらに限定されない。一つの実施態様において、適用は眼内であり、これには結膜下注射、前房内注射、側頭縁（termporai limbus）を介した前房への注射、基質内注射、角膜内注射、網膜下注射、眼房水注射、テノン嚢下注射又は持続送達装置、硝子体内注射（例えば、前、中又は後硝子体内注射）が含まれるが、これらに限定されない。一実施態様において、適用は局所であり、これには角膜への点眼が含まれるが、これに限定されない。
【０２６５】
一つの実施態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチド又は本明細書において報告される医薬処方物は、硝子体内適用を介して、例えば、硝子体内注射を介して投与される。これは、当技術分野において公知の標準的な手順に従って実施することができる。例えば、Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-3276; Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206;及びWray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-185を参照。
【０２６６】
いくつかの実施態様において、本発明の治療的キットは、本明細書に記載の医薬処方物中に存在する１つ以上の投与量の本明細書において報告される二量体ポリペプチド、前記医薬処方物の硝子体内注射に適する装置、並びに適した被験者を詳述する指示書及び注射を行うためのプロトコールを含みうる。これらの実施態様において、前記処方物は、典型的には、処置を必要とする被験者に、硝子体内注射を介して投与される。これは、当技術分野において公知の標準的な手順に従って実施することができる（例えば、例えば、Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-3276; Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206;及びWray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-185を参照）。
【０２６７】
前記処方物はまた、アジュバント（例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤など）を含んでもよい。微生物の存在の防止は、滅菌手順（上記）により、並びに、種々の抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等）の包含により、確実にされうる。また、等張剤（例えば糖、塩化ナトリウム等）を前記処方物中に含むことが望ましいであろう。また、注射可能な医薬形態の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど）の包含によりもたらされうる。
【０２６８】
選択された投与経路にかかわらず、本明細書において報告される化合物（それは、適した水和形態において使用してもよい）及び／又は本明細書において報告される医薬処方物は、当業者に公知の従来の方法により、薬学的に許容し得る投与形態に処方される。
【０２６９】
本明細書において報告される 医薬処方物 における有効成分の実際の投与量レベルを変動させてもよく、患者にとって毒性となることを伴わずに、特定の患者、組成及び投与様式についての所望の治療的応答を達成するために効果的である有効成分の量を得るようにする。選択される投与量レベルは、種々の薬物動態学的因子（用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、用いられている特定の化合物の排出速度、処置の持続期間、他の薬物、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される化合物及び／又は材料、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態及び以前の病歴、並びに医学分野において周知の同様の因子を含む）に依存しうる。
【０２７０】
処方物は、滅菌であり、また処方物がシリンジにより送達可能な程度に流動性でなければならない。水に加えて、担体は、好ましい実施態様において、等張緩衝生理食塩水である。
【０２７１】
適切な流動性は、例えば、コーティング（レシチンのような）の使用により、分散液の場合は、要求される粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、多価アルコール（マンニトール又はソルビトールのような）及び塩化ナトリウムなどを組成物中に含むことが好ましい。
【０２７２】
処方物は、結膜下投与のための活性薬剤を含む眼科用デポー処方物を含むことができる。眼科用デポー処方物は、本質的に純粋な活性薬剤、例えば、本明細書において報告される二量体ポリペプチドの微粒子を含む。本明細書において報告される二量体ポリペプチドを含む微粒子は、生体適合性の薬学的に許容し得るポリマー又は脂質封入薬剤中に埋め込むことができる。デポー処方物を、長期間にわたり、実質的に全ての活性物質の全てを放出するように適応してもよい。ポリマー又は脂質マトリクスは、存在する場合、全て又は実質的に全ての活性薬剤の放出後に、十分に分解され、投与部位から輸送されるように適応してもよい。デポー処方物は、薬学的に許容し得るポリマー及び溶解又は分散した活性薬剤を含む、液体製剤でありうる。注射時、ポリマーは、例えば、ゲル化又は沈殿により、注射部位でデポーを形成する。
【０２７３】
本発明の他の一つの態様は、眼血管疾患の処置に使用するための、本明細書において報告される二量体ポリペプチド又は抗体である。
【０２７４】
本発明の一つの実施態様は、眼血管疾患の処置に使用するための、本明細書において報告される二量体ポリペプチド又は抗体である。
【０２７５】
本発明の他の一つの態様は、眼血管疾患の処置に使用するための医薬処方物である。
【０２７６】
本発明の 他の一つの態様 は、眼血管疾患処置用の医薬を製造するための、本明細書において報告される二量体ポリペプチド又は抗体の使用である。
【０２７７】
本発明の他の一つの態様は、眼血管疾患の患者の処置方法であって、そのような処置を必要とする患者に対し、本明細書において報告される二量体ポリペプチド又は抗体を投与することによる方法である。
【０２７８】
本明細書で使用する用語「を含む」は、用語「からなる」を包含することをここに明示する。よって、用語「を含む」を含有する全ての態様及び実施態様は、用語「からなる」を用いて同様に開示される。
【０２７９】
Ｄ．改変
更なる一つの態様において、前記実施態様のいずれかによる二量体ポリペプチドは、下記セクション１−６に記載されているようにして、単独又は組み合わせで、あらゆる特徴を組み入れ得る：
【０２８０】
１．抗体親和性
一つの実施態様においては、BIACORE（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、Ｋｄを測定する。例えば、BIACORE（登録商標）-2000又はBIACORE（登録商標）-3000（GE Healthcare Inc., Piscataway, NJ）を用い、約１０応答単位（ＲＵ）で結合パートナーが固定されたCM5チップにより２５℃でアッセイを行う。一つの実施態様においては、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（CM5, GE Healthcare Inc.）を、供給者の指示に従い、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。結合パートナーを１０mM酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μg/ml（約０．２μM）に希釈してから、５μl/分の流速で注入して、およそ１０応答単位（ＲＵ）の結合パートナーのカップリングを達成する。結合パートナーの注入に続いて、未反応基を保護するために１Mエタノールアミンを注入する。速度論的測定のために、二量体ポリペプチド含有融合ポリペプチド又は抗体の２倍段階希釈液（０．７８nM〜５００nM）を、０．０５％ポリソルベート２０（TWEEN-20（商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中、２５℃、およそ２５μl/分の流速で注入する。単純な１対１ラングミュア結合モデル（BIACORE（登録商標）評価ソフトウェア・バージョン３．２）を用い、会合と解離のセンサーグラムを同時にフィッティングすることによって、会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）を、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する（例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881参照）。上記の表面プラズモン共鳴アッセイで、オン速度が１０６M−１s−１を上回る場合は、抗原の濃度を増加させつつ、ストップフロー付き分光測光器（Aviv Instruments）又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-AMINCO（商標）分光測光器（ThermoSpectronic）のような分光計で測定される、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２０nMの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の、２５℃における蛍光発光強度（励起＝２９５nm；蛍光＝３４０nm、帯域幅１６nm）の増減を測定する蛍光消光技術を使って、オン速度を決定することができる。
【０２８１】
２．キメラ抗体及びヒト化抗体
ある実施態様では、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、キメラ抗体である。あるキメラ抗体が、例えば、米国特許第４８１６５６７号及びMorrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855)に記載されている。一例では、キメラ抗体が、非ヒト可変領域（例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサルのような非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例では、キメラ抗体が、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変化している「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合フラグメントが含まれる。
【０２８２】
ある実施態様では、キメラ抗体がヒト化抗体である。非ヒト抗体をヒト化するのは、典型的には、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保ったまま、ヒトに対する免疫原性を低減するためである。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合により、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基が、例えば抗体の特異性又は親和性を復活させ又は改良するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。
【０２８３】
ヒト化抗体及びそれらを作製する方法については、例えばAlmagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633に総説があり、例えば、Riechmann, I., et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; 米国特許第５８２１３３７号、米国特許第７５２７７９１号、米国特許第６９８２３２１号及び米国特許第７０８７４０９号; Kashmiri, S.V., et al., Methods 36 (2005) 25-34（特異性決定領域（ＳＤＲ）移植につき記載）; Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 （「リサーフェイシング（resurfacing）」につき記載）; Dall’Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 （「ＦＲシャフリング」につき記載）; Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68; and Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 （ＦＲシャフリングのための「誘導選択（guided selection）」アプローチにつき記載）に、更に説明されている。
【０２８４】
ヒト化に使用することができるヒトフレームワーク領域には、次に挙げるものがあるが、それらに限定されない：「ベストフィット（best-fit）」法を用いて選択されたフレームワーク領域（例えば、Sims, M.J., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308を参照）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定サブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289及びPresta, L.G., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照）；ヒト成熟（体細胞性変異型）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照）；及びスクリーニングＦＲライブラリー由来のフレームワーク領域（例えば、Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 and Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618を参照）。
【０２８５】
３．ヒト抗体
ある実施態様では、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を用いて製造できる。ヒト抗体は、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374及びLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459に全般的に記載されている。
【０２８６】
ヒト抗体は、抗原接種に反応して、インタクトなヒト抗体、又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製してもよい。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わるか、染色体外に存在するか、又は動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスにおいては、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、概して不活化されてきた。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の概説については、Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125を参照。また、例えば、米国特許第６０７５１８１号及び米国特許第６１５０５８４号（XENOMOUSE（商標）技術を記載）；米国特許第５７７０４２９号（HUMAB（登録商標）技術を記載）；米国特許第７０４１８７０号（K-M MOUSE（登録商標）技術を記載）並びに米国公開公報第２００７／００６１９００号（VELOCIMOUSE（登録商標）技術を記載）も参照。このような動物によって生成されるインタクトな抗体由来のヒト可変領域を、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせて、更に改変してもよい。
【０２８７】
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法により製造することもできる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株が記載されている（例えば、Kozbor, D., J. Immunol.133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R., et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63;及びBoerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体も、Li, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562に記載されている。更なる方法には、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の製造を記載）及びNi, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載）に記載されているものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)も、Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937及びVollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191に記載されている。
【０２８８】
ヒト抗体は、ヒト由来ファージ提示ライブラリーより選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成され得る。その後、このような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する技術を以下に記載する。
【０２８９】
４．ライブラリー由来抗体
特定の実施態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、ライブラリー由来抗体である。ライブラリー由来抗体は、コンビナトリアルライブラリーを所望の活性を有する抗体についてスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージ提示ライブラリーを生成し、このようなライブラリーを、所望の結合特徴を有する抗体についてスクリーニングするための多種多様な方法が、当技術分野において公知である。このような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37において概説されており、また、例えばMcCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472;及びLee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132に更に記載されている。
【０２９０】
あるファージ提示法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、ファージライブラリーにおいてランダムに組み換えられ、これをその後、Winter, G., et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455に記載されているようにして、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、抗体フラグメントを、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント又はＦａｂフラグメントのいずれかとして提示する。免疫された供給源由来のライブラリーは、ハイブリドーマを構築することを必要とせずに、免疫原に対して親和性の高い抗体を提供する。或いは、Griffiths, A.D., et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734に記載されるようにして、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングし、いかなる免疫付与も無しに、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対する、単一供給源の抗体を提供できる。最後に、Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388に記載されるように、幹細胞由来の再構成されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングして、高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再構成を達成するランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することによって、ナイーブライブラリーを合成的に製造することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許公報には、例えば、米国特許第５７５０３７３号、並びに米国公開公報第２００５／００７９５７４号、米国公開公報第２００５／０１１９４５５号、米国公開公報第２００５／０２６６０００号、米国公開公報第２００７／０１１７１２６号、米国公開公報第２００７／０１６０５９８号、米国公開公報第２００７／０２３７７６４号、米国公開公報第２００７／０２９２９３６号及び米国公開公報第２００９／０００２３６０号が含まれる。
【０２９１】
本明細書において、ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体フラグメントは、ヒト抗体又はヒト抗体フラグメントとみなす。
【０２９２】
５．多重特異性抗体
ある実施態様では、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様では、結合特異性の一方が第１の抗原に対するものであり、他方が別の第２の抗原に対するものである。ある実施態様では、二重特異性抗体が、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合しうる。二重特異性抗体はまた、前記抗原の少なくとも１つを発現する細胞に細胞毒性物質を局在化するためにも使用することができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体フラグメントとして調製することができる。
【０２９３】
多重特異性抗体を製造するための技術には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対のリコンビナント同時発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, 国際公開公報第９３／０８８２９号及びTraunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659を参照）、及び「ノブ−イン−ホール」操作（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）などが含まれるが、それらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製するために静電的ステアリング効果（electrostatic steering effect）を操作すること（国際公開公報第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体又はフラグメントを架橋すること（例えば、米国特許第４６７６９８０号及びBrennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83を参照）；ロイシンジッパーを使って二重特異性抗体を製造すること（例えば、Kostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照）；二重特異性抗体フラグメントを作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照）；及び単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照）；及び、例えばTutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69に記載されているようにして、三重特異性抗体を調製することによって製造することもできる。
【０２９４】
「オクトパス抗体（Octopus antibody）」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する改変抗体（engineered antibody）も、これに含まれる（例えば、米国公開公報第２００６／００２５５７６号を参照）。
【０２９５】
本明細書における抗体又はフラグメントには、「二重作用性Ｆａｂ（Dual Acting Fab）」又は「ＤＡＦ」も含まれる（例えば、米国公開公報第２００８／００６９８２０号を参照）。
【０２９６】
本明細書における抗体又はフラグメントには、国際公開公報第２００９／０８０２５１号、国際公開公報第２００９／０８０２５２号、国際公開公報第２００９／０８０２５３号、国際公開公報第２００９／０８０２５４号、国際公開公報第２０１０／１１２１９３号、国際公開公報第２０１０／１１５５８９号、国際公開公報第２０１０／１３６１７２号、国際公開公報第２０１０／１４５７９２号及び国際公開公報第２０１０／１４５７９３号に記載の多重特異性抗体も含まれる。
【０２９７】
６．抗体変異体
ある実施態様では、本明細書において報告される 二量体ポリペプチド は、抗体である。更なる実施態様では、本明細書において 提供する抗体のアミノ酸配列改変体が意図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸 配列 変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入するか、又はペプチド合成によって調製し得る。そのような改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内における残基の欠失、及び/又は挿入、及び/又は置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴（例えば、抗原結合）を有する限り、最終構築物に到達するために、欠失、挿入及び置換のいかなる組み合わせをも行うことができる。
【０２９８】
ａ）置換、挿入及び欠失変異体
ある実施態様では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体を提供する。置換突然変異誘発のための関心ある部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。下記表では、保存的置換を「好ましい置換」という見出しの下に示す。より実質的な変化は、下記表の「例示的な置換」という見出しの下に示し、これはアミノ酸側鎖クラスに関連して以下に更に記載する通りである。アミノ酸置換を関心ある抗体に導入し、生成物を所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、低減した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣについて、スクリーニングすることができる。
【０２９９】
【表１０】
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【０３００】
アミノ酸は、側鎖の共通する特性に従って分類することができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０３０１】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
【０３０２】
置換変異体の１つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、更なる研究のために選択される得られた変異体は、ある生物学的特性（例えば、増加した親和性、低減した免疫原性）において、親抗体に比して改変（例えば、改善）されているか、及び／又は、親抗体のある生物学的特性が実質的に保持されている。例示的な置換型改変体は、例えば、本明細書に記載するようなファージ提示に基づく親和性成熟技術を用いて簡便に生成され得る親和性成熟抗体である。簡単に言うと、１つ以上のＨＶＲ残基を突然変異させ、ファージ上で変異体抗体を提示させ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【０３０３】
変化（例えば置換）を、例えば抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいて起こさせてもよい。そのような変化を、ＨＶＲ「ホットスポット」、即ち、体細胞成熟過程の間に高頻度に突然変異を起こすコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196を参照）及び／又は抗原と接触する残基において起こさせてもよく、得られた変異体ＶＨ又はＶＬを結合親和性について試験する。二次ライブラリーを構築し、そこから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施態様では、多種多様な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング又はオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子に多様性を導入する。次いで、二次ライブラリーを作製する。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有するあらゆる抗体変異体を同定する。多様性を導入するための別の方法は、数個のＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６残基）をランダム化するＨＶＲ特異的なアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発又はモデル化を用いて具体的に同定され得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３は標的とされることが多い。
【０３０４】
ある実施態様では、置換、挿入又は欠失が、１つ以上のＨＶＲ内で生じてもよい（そのような変更が、抗体が抗原に結合する能力を実質的に低減させない範囲で）。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的変化（例えば、本明細書に規定する保存的置換）を、ＨＶＲ内で起こさせてもよい。そのような変化は、例えば、ＨＶＲ内の、抗原接触残基外であってもよい。先に規定した変異体ＶＨ及びＶＬ配列のある実施態様では、各ＨＶＲは変化していないか、１つ以下、２つ以下又は３つ以下のアミノ酸置換しか含まない。
【０３０５】
突然変異誘発のための標的とし得る抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085に記載されるように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基又は一群の標的残基（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕのような荷電残基）を同定し、それを中性又は負電荷を持つアミノ酸（例えばアラニン又はポリアラニン）で置換して、抗体の、抗原との相互作用が影響を受けるか否かを決定する。最初の置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置に、更なる置換を導入してもよい。或いは、又は更に、抗体と抗原の間の接触点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を用いることができる。このような接触残基及びその隣接残基を、置換の候補として標的にしても、排除してもよい。変異体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含むか否かを決定してもよい。
【０３０６】
アミノ酸配列挿入には、１残基から、１００残基又はそれ以上を含有するポリペプチドまでに及ぶ長さのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合も、単一又は複数アミノ酸残基の配列内挿入も含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体のＮ末端又はＣ末端への、酵素（例えばＡＤＥＰＴの場合）、又は抗体の血清中半減期を増加させるポリペプチドの融合が含まれる。
【０３０７】
ｂ）グリコシル化変異体
ある実施態様では、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるために、本明細書に規定する抗体を変化させる。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作出又は除去されるようにアミノ酸配列を変化させることによって、簡便に達成することができる。
【０３０８】
抗体がＦｃ領域を含む場合、そこに取り付けられる糖質を変化させてもよい。哺乳類細胞によって産生されるネイティブ抗体は、典型的には、分岐したバイアンテナ型オリゴ糖を含み、これは一般的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合によって取り付けられる。例えば、Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照。オリゴ糖は、さまざまな糖質、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸、並びにバイアンテナ型オリゴ糖構造の「ステム」中のＧｌｃＮＡｃに取り付けられたフコースを含みうる。いくつかの実施態様では、ある改良された特性を有する抗体変異体を作出するために、本発明の抗体中のオリゴ糖の改変を行ってもよい。
【０３０９】
一つの実施態様においては、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）取り付けられたフコースを欠く糖質構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％又は２０％〜４０％であってよい。フコースの量は、例えば国際公開公報第２００８／０７７５４６号に記載されているように、MALDI-TOF質量分析によって測定される、Ａｓｎ２９７に取り付けられた全ての糖構造（例えば複合型、混成型及び高マンノース型構造）の合計に比しての、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を算出することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内の約２９７位（Ｆｃ領域残基のEUナンバリング）に位置するアスパラギン残基を指すが、抗体における軽微な配列変異のため、Ａｓｎ２９７は、２９７位の上流側又は下流側約±３アミノ酸、即ち２９４位と３００位の間に位置する場合もありうる。そのようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば、米国公開公報第２００３／０１５７１０８号；米国公開公報第２００４／００９３６２１号を参照。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例には、米国公開公報第２００３／０１５７１０８号；国際公開公報第２０００／６１７３９号；国際公開公報第２００１／２９２４６号；米国公開公報第２００３／０１１５６１４号；米国公開公報第２００２／０１６４３２８号；米国公開公報第２００４／００９３６２１号；米国公開公報第２００４／０１３２１４０号；米国公開公報第２００４／０１１０７０４号；米国公開公報第２００４／０１１０２８２号；米国公開公報第２００４／０１０９８６５号；国際公開公報第２００３／０８５１１９号；国際公開公報第２００３／０８４５７０号；国際公開公報第２００５／０３５５８６号；国際公開公報第２００５／０３５７７８号；国際公開公報第２００５／０５３７４２号；国際公開公報第２００２／０３１１４０号；Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249；Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622が含まれる。脱フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例には、タンパク質フコシル化欠損性のLec13 CHO細胞（Ripka, J., et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545；米国公開公報第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開公報第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）及び、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞のようなノックアウト細胞株（例えば、Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622；Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688；及び国際公開公報第２００３／０８５１０７号を参照）が含まれる。
【０３１０】
例えば、抗体のＦｃ領域に取り付けられたバイアンテナ型オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによってバイセクト（bisect）されている、バイセクト型（bisected）オリゴ糖を有する抗体変異体が、更に提供される。そのような抗体変異体は、低減したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開公報第２００３／０１１８７８号；米国特許第６６０２６８４号；及び米国公開公報第２００５／０１２３５４６号に記載されている。Ｆｃ領域に取り付けられたオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有しうる。そのような抗体変異体は、例えば、国際公開公報第１９９７／３００８７号；国際公開公報第１９９８／５８９６４号；及び国際公開公報第１９９９／２２７６４号に記載されている。
【０３１１】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある実施態様では、本明細書において報告される二量体ポリペプチドに１つ以上の更なるアミノ酸改変を導入することにより、Fc領域変異体を生成させてもよい。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば置換／突然変異）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含みうる。
【０３１２】
ある実施態様では、本発明では、全部ではなく一部のエフェクター機能を有する二量体ポリペプチドが意図される。これは、その二量体ポリペプチドを、インビボでの二量体ポリペプチドの半減期は重要であるが、あるエフェクター機能（ＣＤＣ及びＡＤＣＣのような）は不必要又は有害であるような用途のための望ましい候補にする。ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低減／欠乏を確認するために、インビトロ及び／又はインビボ細胞毒性アッセイを行うことができる。例えば、二量体ポリペプチド抗体がＦｃγＲ結合を欠く（それゆえにおそらくＡＤＣＣ活性を欠く）が、ＦｃＲｎ結合能は保持していることを保証するために、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイを行うことができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要細胞であるＮＫ細胞が、ＦｃγＲＩＩＩだけを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492の４６４頁の表３に要約されている。関心ある分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063；及びHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502を参照）；米国特許第５８２１３３７号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361を参照）に記載されている。或いは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー用のACTI（商標）非放射性細胞毒性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA）及びCytoTox 96（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Promega, Madison, WI）を参照）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。これに代えて、又はこれに加えて、関心ある分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656に開示されているような動物モデルで、評価することもできる。二量体ポリペプチドがC1qに結合することができず、従ってCDC活性を欠くことを確認するために、C1q結合アッセイを行ってもよい。例えば、国際公開公報第２００６／０２９８７９号及び国際公開公報第２００５／１００４０２号の、Ｃ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743を参照）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期決定も、当技術分野において公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769を参照）。
【０３１３】
エフェクター機能が低減している二量体ポリペプチドには、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ領域変異体には、２６５位、２６９位、２７０位、２９７位及び３２７位のアミノ酸のうち２つ以上に置換を有するＦｃ領域（残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ領域突然変異体（米国特許第７３３２５８１号）を含む）が含まれる。
【０３１４】
ＦｃＲとの結合が改善又は減縮されているある抗体変異体は記載されている（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開公報第２００４／０５６３１２号及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照）。
【０３１５】
ある実施態様では、二量体ポリペプチド変異体が、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位及び／又は３３４位（残基のEUナンバリング）における置換を有するＦｃ領域を含む。
【０３１６】
いくつかの実施態様では、例えば、米国特許第６１９４５５１号、国際公開公報第９９／５１６４２号及びIdusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に記載されているような、Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）の変化（即ち、改善又は減縮）をもたらす変化を、Ｆｃ領域に起こさせる。
【０３１７】
半減期が増加し、胎児への母体ＩｇＧの移行の原因となる新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593及びKim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）への結合が改善されている抗体が、米国公開公報第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ以上の置換がそこに含まれているＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ領域変異体には、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の１つ以上に置換を有するもの、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７３７１８２６号）。
【０３１８】
Ｆｃ領域変異体の他の例に関しては、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開公報第９４／２９３５１号も参照。
【０３１９】
d）システイン操作抗体変異体
ある実施態様では、例えば、「チオMAb（thioMAb）」と同様に、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作（cysteine engineered）二量体ポリペプチドを作出することが望ましい可能性がある。特定の実施態様では、置換残基が二量体ポリペプチドの接近可能部位に見いだされる。それらの残基をシステインで置換することにより、二量体ポリペプチドの接近可能部位に反応性のチオール基が置かれることになり、本明細書において更に説明するように、それを使って、二量体ポリペプチドを他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分にコンジュゲートすることで、イムノコンジュゲートを作出することができる。ある実施態様では、以下の残基のいずれか１つ以上をシステインで置換してよい：軽鎖のＶ２０５（Kabatナンバリング）、重鎖のＡ１１８（EUナンバリング）及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（EUナンバリング）。システイン操作二量体ポリペプチドは、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載されているようにして生成させてよい。
【０３２０】
ｅ）誘導体
ある実施態様では、本明細書において報告される二量体ポリペプチドを、当技術分野において公知であり、容易に入手することができる追加の非タンパク質部分を含有するように、更に改変してよい。二量体ポリペプチドの誘導体化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、それらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれも）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール（propropylene glycol）ホモポリマー、ポリプロピレンオキシド（prolypropylene oxide）／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性ゆえに、製造時に有利でありうる。ポリマーは任意の分子量であってよく、分岐型であっても非分岐型であってもよい。二量体ポリペプチドに取り付けられるポリマーの数はさまざまであってよく、２つ以上のポリマーが取り付けられる場合、それらは同じ分子又は異なる分子であることができる。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、例えば、改善しようとする二量体ポリペプチドの特定の特性又は機能、二量体ポリペプチド誘導体が所定の条件下で治療に使用されるか否かを初めとする考慮事項（これらに限定されない）に基づいて決定することができる。
【０３２１】
もう一つの実施態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチドと、放射線への曝露によって選択的に加熱し得る非タンパク質部分のコンジュゲートが提供される。一つの実施態様において、前記非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は任意の波長であってよく、通常の細胞を傷つけることはないが、二量体ポリペプチド−非タンパク質部分近傍の細胞が死滅する温度まで、前記非タンパク質部分を加熱する波長が含まれるが、これに限定されない。
【０３２２】
ｆ）ヘテロ二量体化
ヘテロ二量体化を強めるためのＣＨ３改変には、いくつかのアプローチが存在し、それらは例えば、国際公開公報第９６／２７０１１号、国際公開公報第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開公報第２００７／１１０２０５号、国際公開公報第２００７／１４７９０１号、国際公開公報第２００９／０８９００４号、国際公開公報第２０１０／１２９３０４号、国際公開公報第２０１１／９０７５４号、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号、国際公開公報第２０１２０５８７６８号、国際公開公報第２０１３１５７９５４号、国際公開公報第２０１３０９６２９１号に十分に記載されている。典型的には、そのようなアプローチ全てにおいて、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインの両者を相補的な様式で操作し、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを含む重鎖）が、それ自身とのホモ二量体化はもはやできず、相補的に操作された他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化することを余儀なくされるようにする（そうすることにより、前記第１及び第２のＣＨ３ドメインはヘテロ二量体化し、２本の前記第１の、又は２本の第２のＣＨ３ドメインの間でのホモ二量体は、形成されない）。改善された重鎖ヘテロ二量体化のためのこれら種々のアプローチは、誤対合してベンスージョーンズ型副生物となる軽鎖を減少させる、本発明による多重特異性抗体における重鎖−軽鎖改変（一方の結合腕におけるＶＨ及びＶＬ交換／置換及びＣＨ１／ＣＬ界面における、電荷が逆の荷電アミノ酸による置換の導入）と組み合わされる、種々の選択肢として意図される。
【０３２３】
本発明の一つの好ましい実施態様（多重特異性抗体が、重鎖中にＣＨ３ドメインを含む場合）において、本発明による前記多重特異性抗体のＣＨ３ドメインを、例えば、国際公開公報第９６／０２７０１１号、Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621；及びMerchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681；国際公開公報第９８／０５０４３１号において、いくつかの例を用いて詳細に記載されている「ノブ−イントゥ−ホールズ」技術により変化させることができる。この方法においては、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を変化させて、これら２つのＣＨ３ドメインを含む両重鎖のヘテロ二量体化を増加させる。２つのＣＨ３ドメインそれぞれ（２本の重鎖の）は「ノブ」でありうるが、他方は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入が、ヘテロ二量体を更に安定化させ（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35）、収率を増加させる。
【０３２４】
よって、本発明の一つの実施態様において、前記多重特異性抗体は、（各重鎖中にＣＨ３ドメインを含み、かつ）更に、
前記抗体の前記第１の重鎖の前記第１のＣＨ３ドメイン（ａ）とする）（under a)）及び前記抗体の前記第２の重鎖の前記第２のＣＨ３ドメイン（ｂ）とする）（under b)）が各々、前記抗体ＣＨ３ドメインの間の元の界面を含む界面において接触し（meet）、
前記界面が、多重特異性抗体の形成を促進するように変化しており、前記変化が、
ｉ）一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変化しており、
そのことにより、前記多重特異性抗体における、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面と接触する、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面内において、
アミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、このことにより、前記一方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に、前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の空洞内に配置され得る突起が生成し、かつ
ｉｉ）他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変化しており、
そのことにより、前記多重特異性抗体における、前記第１のＣＨ３ドメインの元の界面と接触する、前記第２のＣＨ３ドメインの元の界面内において、
アミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、このことにより、前記第２のＣＨ３ドメインの界面内に空洞が生成し、その中に、前記第１のＣＨ３ドメインの界面内の突起が配置され得る
ことを特徴とする。
【０３２５】
好ましくは、前記より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される。
【０３２６】
好ましくは、前記より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群より選択される。
【０３２７】
本発明の一つの態様において、両ＣＨ３ドメインが、各ＣＨ３ドメインの対応位置のアミノ酸としてのシステイン（Ｃ）の導入により更に変化しており、そのことにより、両ＣＨ３ドメインの間にジスルフィド架橋が形成され得る。
【０３２８】
一つの好ましい実施態様において、前記多重特異性抗体は、「ノブ鎖」の前記第１のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸Ｔ３６６Ｗ突然変異及び「ホール鎖」の前記第２のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む。前記ＣＨ３ドメインの間の更なる鎖間ジスルフィド架橋も、例えば、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインへアミノ酸Ｙ３４９Ｃ突然変異、そして「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインへアミノ酸Ｅ３５６Ｃ突然変異又はアミノ酸Ｓ３５４Ｃ突然変異を導入することにより、用いることができる（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681）。
【０３２９】
一つの好ましい実施態様において、前記多重特異性抗体（各重鎖中にＣＨ３ドメインを含む）は、前記２つのＣＨ３ドメインのうちの一方におけるアミノ酸Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異及び前記２つのＣＨ３ドメインのうちの他方におけるアミノ酸Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む（一方のＣＨ３ドメインにおける追加のアミノ酸Ｓ３５４Ｃ突然変異及び他方のＣＨ３ドメインにおける追加のアミノ酸Ｙ３４９Ｃ突然変異が、鎖間ジスルフィド架橋を形成する）（Kabatによるナンバリング）。
【０３３０】
ヘテロ二量体化を強めるためのＣＨ３改変のその他の技術が、本発明の選択肢として意図されており、例えば、国際公開公報第９６／２７０１１号、国際公開公報第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開公報第２００７／１１０２０５号、国際公開公報第２００７／１４７９０１号、国際公開公報第２００９／０８９００４号、国際公開公報第２０１０／１２９３０４号、国際公開公報第２０１１／９０７５４号、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号、国際公開公報第２０１２／０５８７６８号、国際公開公報第２０１３／１５７９５４号、国際公開公報第２０１３／０９６２９１号に記載されている。
【０３３１】
一つの実施態様において、欧州公開公報第１８７０４５９Ａ１号に記載のヘテロ二量体化アプローチを代わりに用いることができる。このアプローチは、両重鎖間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面内の特定のアミノ酸位置における、電荷が逆の荷電アミノ酸での置換／突然変異の導入を基にしたものである。前記多重特異性抗体についての一つの好ましい実施態様は、（多重特異性抗体の）前記第１のＣＨ３ドメイン内のアミノ酸Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異及び多重特異性抗体の前記第２のＣＨ３ドメイン内のアミノ酸Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異（Kabatによるナンバリング）である。
【０３３２】
もう一つの実施態様において、前記多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内のアミノ酸Ｔ３６６Ｗ突然変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内のアミノ酸Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異及び「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内の追加のアミノ酸Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内のアミノ酸Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異を含む。
【０３３３】
もう一つの実施態様において、前記多重特異性抗体は、２つのうちの一方のＣＨ３ドメイン内のアミノ酸Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異及び２つのうちの他方のＣＨ３ドメイン内のアミノ酸Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含むか、又は、前記多重特異性抗体は、２つのうちの一方のＣＨ３ドメイン内のアミノ酸Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異及び２つのうちの他方のＣＨ３ドメイン内のアミノ酸Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異及び「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内の追加のアミノ酸Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内のアミノ酸Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異を含む。
【０３３４】
一つの実施態様において、国際公開公報第２０１３／１５７９５３号に記載のヘテロ二量体化アプローチを代わりに用いることができる。一つの実施態様において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ｋ突然変異を含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドは、アミノ酸Ｌ３５１Ｄ突然変異を含む。更なる一つの実施態様において、前記第１のＣＨ３ドメインは、更なるアミノ酸Ｌ３５１Ｋ突然変異を含む。更なる一つの実施態様において、前記第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅ（好ましくはＬ３６８Ｅ）より選択される更なるアミノ酸突然変異を含む。
【０３３５】
一つの実施態様において、国際公開公報第２０１２／０５８７６８号に記載のヘテロ二量体化アプローチを代わりに用いることができる。一つの実施態様において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ突然変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆ突然変異を含む。更なる一つの実施態様において、前記第２のＣＨ３ドメインは、位置Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、又はＫ３９２に、例えば、ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、又はＳ４００Ｋ  Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ  Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ  Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅより選択される更なるアミノ酸突然変異を含む。更なる一つの実施態様において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ突然変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆ突然変異を含む。更なる一つの実施態様において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｙ４０７Ａ突然変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆ突然変異を含む。更なる一つの実施態様において、前記第２のＣＨ３ドメインは、更なるアミノ酸Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒ突然変異を含む。
【０３３６】
一つの実施態様において、例えば、３６８及び４０９からなる群より選択される位置におけるアミノ酸改変による、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号に記載のヘテロ二量体化アプローチを代わりに用いることができる。
【０３３７】
一つの実施態様において、これも前記ノブズ−イントゥ−ホールズ 技術を用いる、国際公開公報第２０１１／０９０７６２号に記載のヘテロ二量体化アプローチを代わりに用いることができる。一つの実施態様において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｙ４０７Ａ突然変異を含む。一つの実施態様において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ｙ突然変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｙ４０７Ｔ突然変異を含む。
【０３３８】
一つの実施態様において、前記多重特異性抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプのものであり、国際公開公報第２０１０／１２９３０４号に記載のヘテロ二量体化アプローチを代わりに用いることができる。
【０３３９】
一つの実施態様において、国際公開公報第２００９／０８９００４号に記載のヘテロ二量体化アプローチを代わりに用いることができる。一つの実施態様において、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ３９２又はＮ３９２の、負電荷を持つアミノ酸でのアミノ酸置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）を含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｄ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６、又はＥ３５７の、正電荷を持つアミノ酸でのアミノ酸置換（例えば、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ又はＥ３５７Ｋ、より好ましくはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）を含む。更なる一つの実施態様において、前記第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ４０９又はＲ４０９の、負電荷を持つアミノ酸でのアミノ酸置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）を更に含む。更なる一つの実施態様において、前記第１のＣＨ３ドメインは、更に又は代わりに、Ｋ４３９及び／又はＫ３７０の、負電荷を持つアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ））でのアミノ酸置換を含む。
【０３４０】
一つの実施態様において、国際公開公報第２００７／１４７９０１号に記載のヘテロ二量体化アプローチを代わりに用いることができる。一つの実施態様において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ及びＫ３２２Ｄ突然変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ及びＫ２９２Ｄ突然変異を含む。
【０３４１】
一つの実施態様において、国際公開公報第２００７／１１０２０５号に記載のヘテロ二量体化アプローチを代わりに用いることができる。
【０３４２】
Ｅ．リコンビナント方法及びリコンビナント組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているようなリコンビナント方法及びリコンビナント組成物を使って製造することができる。一つの実施態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチドをコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、前記二量体ポリペプチドの前記第１のポリペプチドを含むアミノ酸配列及び／又は前記第２のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードするものでありうる。更なる一つの実施態様において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。更なる一つの実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような実施態様の一つでは、宿主細胞が、下記（１）又は（２）を含む（例えば、それにより形質転換されている）：（１）二量体ポリペプチドの前記第１のポリペプチドを含むアミノ酸配列及び二量体ポリペプチドの前記第２のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、（２）二量体ポリペプチドの前記第１のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び二量体ポリペプチドの前記第２のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクター。一つの実施態様において、宿主細胞は真核生物のもの、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ球系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一つの実施態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチドを製造するする方法であって、先に規定した二量体ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を、二量体ポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程、及び場合により、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収する工程を含む方法が提供される。
【０３４３】
本明細書において報告される二量体ポリペプチドのリコンビナント製造のために、二量体ポリペプチドをコードする核酸を、例えば前記のように単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために、１種以上のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順（例えば、変異体Ｆｃ領域ポリペプチド 並びに抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）を使って、容易に単離及び配列決定し得る。
【０３４４】
二量体ポリペプチドをコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞が含まれる。例えば、特にグリコシル化及びFcエフェクター機能が必要でない場合は、二量体ポリペプチドを細菌中で製造してもよい。細菌における抗体フラグメント及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、米国特許第５７８９１９９号及び米国特許第５８４０５２３号を参照（E. coli.における抗体フラグメントの発現を記載している、Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254も参照）。発現後に、二量体ポリペプチドを細菌細胞ペーストから可溶性画分中に単離して、更に精製してもよい。
【０３４５】
原核生物に加え、糸状菌や酵母のような真核微生物（グリコシル化経路が「ヒト化」されていて、部分的又は完全にヒトのグリコシル化パターンを有する二量体ポリペプチドの製造をもたらす真菌株及び酵母株を含む）も、二量体ポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主である。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414及びLi, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照。
【０３４６】
グリコシル化二量体ポリペプチド発現用の適切な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎生物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎生物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と一緒に使用することができ、特に、Spodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションに使用することができる、数多くのバキュロウイルス株が同定されている。
【０３４７】
植物細胞培養物もまた、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、米国特許第６０４０４９８号、米国特許第６４２０５４８号、米国特許第７１２５９７８号及び米国特許第６４１７４２９号を参照（トランスジェニック植物中で抗体を製造するためのPLANTIBODIES（商標）技術が記載されている）。
【０３４８】
脊椎動物細胞もまた、宿主として利用することができる。例えば、懸濁液中での成長に適応させた哺乳類細胞株は有用な場合がある。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7）、ヒト胎児腎臓株（例えば、Graham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74に記載のHEK293又は293細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（BHK）、マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載のTM4細胞）、サル腎臓細胞（CV1）、アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76）、ヒト子宮頸癌細胞（HELA）、イヌ腎臓細胞（MDCK）、バッファローラット肝臓細胞（BRL 3A）、ヒト肺細胞（W138）、ヒト肝臓細胞（Hep G2）、マウス乳癌（MMT 060562）、例えばMather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載のTRI細胞、MRC 5細胞及びFS4細胞である。他の有用な哺乳類宿主細胞株には、DHFR- CHO細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、並びにY0、NS0及びSp2/0などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体製造に適したある哺乳類宿主細胞株の総説は、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照。
【０３４９】
Ｆ．組み合わせ処置
ある実施態様では、本明細書において報告される二量体ポリペプチド又は本明細書において報告される医薬処方物を、本明細書に記載の１つ以上の眼血管疾患の処置のために、単独で（追加の治療的薬剤を伴わない）投与する。
【０３５０】
他の実施態様では、本明細書において報告される二量体ポリペプチド抗体又は医薬処方物を、本明細書に記載の１つ以上の眼血管疾患の処置のために、１つ以上の追加の治療剤又は処置方法との組み合わせにおいて投与する。
【０３５１】
他の実施態様では、本明細書において報告される二量体ポリペプチド又は医薬処方物を、１つ以上の追加の治療剤との組み合わせにおいて処方し、本明細書に記載の１つ以上の眼血管疾患の処置のために投与する。
【０３５２】
ある実施態様では、本明細書において提供する組み合わせ処置は、本明細書に記載の１つ以上の眼血管疾患の処置のために、本明細書において報告される二量体ポリペプチド抗体又は医薬処方物を、１つ以上の追加の治療剤と共に、順次投与することを含む。
【０３５３】
追加の治療的薬剤には、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素（ＴｒｐＲＳ）、EyeOOl（抗ＶＥＧＦ PEG化アプタマー）、スクアラミン、RETAANE（商標）（デポー懸濁液用の酢酸アネコルタブ；Alcon, Inc.）、コンブレタスタチンＡ４プロドラッグ（ＣＡ４Ｐ）、MACUGEN（商標）、MIFEPREX（商標）（ミフェプリストン−ｒｕ４８６）、サブテノントリアムシノロンアセトニド、硝子体内結晶トリアムシノロンアセトニド、プリノマスタット（ＡＧ３３４０合成マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、Pfizer）、フルオシノロンアセトニド（フルオシノン眼内インプラントを含む、Bausch & Lomb/Control Delivery Systems）、ＶＥＧＦＲ阻害剤（Sugen）、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（Regeneron/Aventis）、ＶＥＧＦレセプターチロシンキナーゼ阻害剤、例えば４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（ｌ−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）及びＳＵ１１２４８（スニチニブ）、リノマイド、並びにインテグリンｖ．ベータ．３機能及びアンジオスタチンの阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０３５４】
本明細書において報告される二量体ポリペプチド又は医薬処方物 との組み合わせにおいて使用し得る他の薬学的治療には、非熱レーザーを用いたVISUDYNE（商標）、ＰＫＣ４１２、Endovion（NeuroSearch A/S）、神経栄養因子（例として、グリア由来の神経栄養因子及び毛様体神経栄養因子を含む）、ジアタゼム、ドルゾラミド、フォトトロプ、９−シス−レチナール、目薬（エコー治療を含む）（ヨウ化ホスホリン又はエコチオフェート又は炭酸脱水酵素阻害剤を含む）、ＡＥ−９４１（AEterna Laboratories, Inc.）、Sirna-027（Sima Therapeutics, Inc.）、ペガプタニブ（NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences）、ニューロトロフィン（例として、ＮＴ−４／５、Genentechを含む）、Cand5（Acuity Pharmaceuticals）、ＩＮＳ−３７２１７（Inspire Pharmaceuticals）、インテグリンアンタゴニスト（Jerini AG及びAbbott Laboratoriesからのものを含む）、ＥＧ−３３０６（Ark Therapeutics Ltd.）、ＢＤＭ−Ｅ（BioDiem Ltd.）、サリドマイド（例えば、EntreMed, Inc.により使用される通り）、カルジオトロフィン１（Genentech）、２−メトキシエストラジオール（Allergan/Oculex）、ＤＬ−８２３４（Toray Industries）、ＮＴＣ−２００（Neurotech）、テトラチオモリブデート（ミシガン大学）、ＬＹＮ−００２（Lynkeus Biotech）、微細藻類化合物（Aquasearch/Albany, Mera Pharmaceuticals）、Ｄ−９１２０（Celltech Group plc.）、ＡＴＸ−Ｓ１０（Hamamatsu Photonics）、ＴＧＦ−β２（Genzyme/Celtrix）、チロシンキナーゼ阻害剤（Allergan, SUGEN, Pfizer）、ＮＸ−２７８−Ｌ（NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences）、ＯＰＴ−２４（OPTIS France SA）、網膜細胞神経節神経保護剤（Cogent Neurosciences）、Ｎ−ニトロピラゾール誘導体（Texas A&M University System）、ＫＰ−１０２（Krenitsky Pharmaceuticals）、シクロスポリンＡ、Ｔｉｍｉｔｅｄ網膜転座、光線力学治療（例として、レセプターを標的とするＰＤＴ、Bristol-Myers Squibb, Co.；ＰＤＴを用いた注射用のポルフィマーナトリウム；ベルテポルフィン、QLT Inc.；ＰＤＴを伴うロスタポルフィン、Miravent Medical Technologies；ＰＤＴを伴うタラポルフィンナトリウム、Nippon Petroleum；モテキサフィンルテチウム、Pharmacyclics, Inc.を含む）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例として、Novagali Pharma SAによりテストされた産物及びＩＳＩＳ−１３６５０、Isis Pharmaceuticalsを含む）、レーザー光凝固、ドルーゼンレーザー加工、黄斑円孔手術、黄斑転座手術、移植可能ミニチュアテレスコープ、ファイモーション血管造影（また、マイクロレーザー治療及びフィーダーベッセル処置として公知である）、陽子線治療、微小刺激治療、網膜剥離及び硝子体手術、強膜バックル、黄斑下手術、経瞳孔温熱治療、光化学系Ｉ治療、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用、体外レオフェレシス（また、膜差濾過及びＲｈｅｏｔｈｅｒａｐｙとして公知である）、マイクロチップ移植、幹細胞治療、遺伝子交換治療、リボザイム遺伝子治療（低酸素応答エレメント用の遺伝子治療を含む、Oxford Biomedica；Lentipak、GENETIX；ＰＤＥＦ遺伝子治療、GenVec）、光受容体／網膜細胞移植（移植可能な網膜上皮細胞、Diacrin, Inc.；網膜細胞移植、Cell Genesys, Inc.を含む）、及び鍼が含まれるが、これらに限定されない。
【０３５５】
任意の抗血管形成剤（Carmeliet and Jain, 2000, Nature 407: 249-257により列挙されるものが含まれるが、これらに限定されない）を、本明細書において報告される二量体ポリペプチド又は医薬処方物との組み合わせにおいて使用することができる。ある実施態様では、抗血管形成薬剤は、別のＶＥＧＦアンタゴニスト又はＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦ変異体、可溶性ＶＥＧＦレセプターフラグメント、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲを遮断することが可能であるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの低分子量阻害剤及びそれらの任意の組み合わせであり、これらは、抗ＶＥＧＦアプタマー（例えば、ペガプタニブ）、可溶性リコンビナントデコイレセプター（例えば、ＶＥＧＦトラップ）を含む。ある実施態様では、抗血管形成薬剤は、コルチコステロイド、血管形成抑制ステロイド、酢酸アネコルタブ、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＶＥＧＦＲ又はＶＥＧＦリガンドの発現を減少させる低分子干渉ＲＮＡ、チロシンキナーゼ阻害剤を用いたＶＥＧＦＲ後の遮断、ＭＭＰ阻害剤、ＩＧＦＢＰ３、ＳＤＦ−１遮断薬、ＰＥＤＦ、ガンマ−セクレターゼ、デルタ様リガンド４、インテグリンアンタゴニスト、ＨＩＦ−１アルファ遮断、プロテインキナーゼＣＫ２遮断、及び血管内皮カドヘリン（ＣＤ−１４４）及び間質由来因子（ＳＤＦ）−Ｉ抗体を使用した血管新生部位への幹細胞（即ち、内皮前駆細胞）ホーミングの阻害を含む。ＶＥＧＦレセプター（ＰＴＫ７８７を含む）を標的とする小分子ＲＴＫ阻害剤を使用することもできる。必ずしも抗ＶＥＧＦ化合物ではないが、血管新生に対して活性を有する薬剤も使用することができ、これには抗炎症薬物、ｍ−Ｔｏｒ阻害剤、ラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス、シクロスポリン、抗ＴＮＦ剤、抗補体剤及び非ステロイド性抗炎症剤が含まれる。神経保護的であり、潜在的に乾燥型黄斑変性症の進行を低下させうる薬剤（「神経ステロイド」と呼ばれる薬物のクラスなど）も使用することができる。これらには、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）（ブランド名：Prastera（登録商標）及びFidelin（登録商標））、硫酸デヒドロエピアンドロステロン及び硫酸プレグネノロンといった薬物が含まれる。任意のＡＭＤ（加齢性黄斑変性症）治療用薬剤を、本明細書において報告される二量体ポリペプチド又は医薬処方物との組み合わせにおいて使用することができ、これには、ＰＤＴとの組み合わせにおけるベルテポルフィン、ペガプタニブナトリウム、亜鉛又は酸化防止剤（単独又は組み合わせ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３５６】
Ｇ．医薬処方物
本明細書において報告される二量体ポリペプチドの医薬処方物は、所望の純度を有するそのような二量体ポリペプチドを、１つ以上の場合による薬学的に許容し得る担体（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.（ed.） (1980)）と混合することにより、凍結乾燥処方物又は水溶液の形態に調製される。薬学的に許容し得る担体は一般に、使用される投薬量及び濃度において、受容者にとって無毒性であり、これには、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチルパラベン又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリ（ビニルピロリドン）；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖、二糖その他の糖質、例えばグルコース、マンノース又はデキストリン；キレート化剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；及び／又は非イオン界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書における、例示的な薬学的に許容し得る担体には更に、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（sHASEGP）のような、間質薬物分散剤、例えば、rhuPH20（HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.）のような、ヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質が含まれる。rhuPH20を初めとするある例示的なsHASEGP及び使用方法は、米国特許公報第２００５／０２６０１８６号並びに同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一つの態様において、sHASEGPが、１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと併用される。
【０３５７】
例示的な凍結乾燥抗体処方物は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体処方物には、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開公報第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の処方物はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０３５８】
本明細書における処方物は、処置される特定適応症の必要に応じて、２つ以上の有効成分、好ましくは、互いに有害な影響を及ぼさない相補的活性を有するものも含有しうる。そのような有効成分は、適宜、意図した目的に有効な量で組み合わされて存在する。
【０３５９】
有効成分は、マイクロカプセル（例えば、各々コアセルベーション技術又は界面重合によって調製された、例えば、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）に、又はマクロエマルションに封入されていてよい。そのような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)に開示されている。
【０３６０】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスであって、マトリックスがフィルム又はマイクロカプセルなどの成形体の形態にあるものが含まれる。
【０３６１】
インビボ投与に使用される処方物は一般に滅菌されている。滅菌性は、例えば滅菌濾過膜による濾過によって、容易に達成することができる。
【０３６２】
Ｈ．治療方法及び治療組成物
本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、いずれも治療方法に使用することができる。
【０３６３】
一つの態様において、医薬として使用するための、本明細書において報告される二量体ポリペプチドが提供される。更なる態様では、眼疾患の処置に使用するための二量体ポリペプチドが提供される。ある実施態様では、処置方法において使用するための二量体ポリペプチドが提供される。ある実施態様では、本発明は、眼血管疾患を有する個体を処置する方法であって、前記個体に、有効量の本明細書において報告される二量体ポリペプチドを投与する工程を含む方法において使用するための二量体ポリペプチドを提供する。そのような実施態様の一つにおいて、前記方法は、前記個体に、有効量の少なくとも１種の追加の治療剤（例えば、セクションＤで前記したようなもの）を投与する工程を更に含む。更なる実施態様では、本発明は、眼における血管形成の阻害に使用するための二量体ポリペプチドを提供する。ある実施態様では、本発明は、個体における血管形成を阻害する方法であって、前記個体に、血管形成を阻害するのに有効な量の二量体ポリペプチドを投与する工程を含む方法に使用するための二量体ポリペプチドを提供する。前記実施態様のいずれかによる「個体」は、一つの好ましい実施態様において、ヒトである。
【０３６４】
更なる一つの態様において、本発明は、医薬の製造又は調製における、二量体ポリペプチドの使用を提供する。一つの実施態様において、前記医薬は、眼血管疾患処置用のものである。更なる一つの実施態様において、前記医薬は、眼血管疾患を処置する方法であって、眼血管疾患を有する個体に、有効量の前記医薬を投与する工程を含む方法に使用するためのものである。そのような実施態様の一つにおいて、前記方法は、前記個体に、有効量の少なくとも１種の追加の治療剤（例えば、前記のようなもの）を投与する工程を更に含む。更なる一つの実施態様において、前記医薬は、血管形成を阻害するためのものである。更なる一つの実施態様において、前記医薬は、個体における血管形成を阻害する方法であって、前記個体に、血管形成を阻害するのに有効な量の前記医薬を投与する工程を含む方法に使用するためのものである。前記実施態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであってよい。
【０３６５】
更なる一つの態様において、本発明は、眼血管疾患を処置する方法を提供する。一つの実施態様において、前記方法は、そのような眼血管疾患を有する個体に、有効量の本明細書において報告される二量体ポリペプチドを投与する工程を含む。そのような実施態様の一つにおいて、前記方法は、前記個体に、有効量の少なくとも１種の下記のような追加の治療剤を投与する工程を更に含む。前記実施態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであってよい。
【０３６６】
更なる一つの態様において、本発明は、個体において、眼における血管形成を阻害する方法を提供する。一つの実施態様において、前記方法は、前記個体に、血管形成を阻害するのに有効な量の本明細書において報告される二量体ポリペプチドを投与する工程を含む。一つの実施態様において、「個体」はヒトである。
【０３６７】
更なる一つの態様において、本発明は、例えば、前記いずれかの治療方法に使用するための、本明細書において報告されるいずれかの二量体ポリペプチドを含む医薬処方物を提供する。一つの実施態様において、医薬処方物は、本明細書において報告されるいずれかの二量体ポリペプチド及び薬学的に許容し得る担体を含む。もう一つの実施態様において、医薬処方物は、本明細書において報告されるいずれかの二量体ポリペプチド及び少なくとも１種の、例えば下記のような追加の治療剤を含む。
【０３６８】
本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、単独で、又は他の作用物質と組み合わせて、治療に使用することができる。例えば、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、少なくとも１種の追加の治療剤と同時投与することができる。
【０３６９】
本明細書において報告される二量体ポリペプチド（及び任意の追加治療剤）は、非経口投与、肺内投与、及び鼻腔内投与、そして局所処置にとって望ましい場合は、病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が含まれる。投薬は、投与が短期間であるか慢性的であるかにも一部依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内注射又は皮下注射のような注射によるものでありうる。単回投与、又はさまざまな時点にわたる複数投与、ボーラス投与及びパルス注入を含む（これらに限定されない）種々の投薬日程が、本明細書においては意図される。
【０３７０】
本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、適正医療基準（good medical practice）に合致する方法で、処方され、投薬され、投与される。この文脈において考慮すべき因子には、処置される特定障害、処置される特定哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与の日程計画及び医療従事者に公知の他の因子が含まれる。二量体ポリペプチドは、問題の障害を予防又は処置するために現在使用されている１つ以上の作用物質と共に処方する必要はないが、場合によりそのようにする。そのような他の作用物質の有効量は、処方物中に存在する二量体ポリペプチドの量、障害又は処置のタイプ及び先に述べた他の因子に依存する。これらは一般に、同じ投薬量及び本明細書に記載の投与経路で、又は本明細書に記載の投薬量の約１〜９９％で、又は実験的／臨床的に適当であると決定された、任意の投薬量及び任意の経路で、使用される。
【０３７１】
疾患の予防又は処置に関して、本明細書において報告される二量体ポリペプチドの適当な投薬量（単独で使用する場合、又は１つ以上の他の追加の治療剤と併用する場合）は、処置すべき疾患のタイプ、二量体ポリペプチドのタイプ、疾患の重症度及び経過、二量体ポリペプチドを予防のために投与するか治療のために投与するか、治療歴、患者の病歴及び二量体ポリペプチドに対する応答、並びに担当医の裁量に依存する。二量体ポリペプチドは、１回又は一連の処置で、患者に適切に投与される。疾患のタイプ及び重症度に依存して、例えば、１回以上の独立した投与によるか、持続注入によるかを問わず、約１μg/kg〜１５mg/kg（例えば、０．５mg/kg〜１０mg/kg）の二量体ポリペプチドを、患者への投与のための初回候補投薬量とすることができる。典型的な１日投与量は、前記の因子に依存して、約１μg/kgから１００mg/kg、又はそれ以上に及びうる。数日又はそれ以上にわたる反復投与の場合、状態に依存して、処置は一般に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで、維持される。二量体ポリペプチドの例示的投薬量の一つは、約０．０５mg/kg〜約１０mg/kgの範囲にある。よって、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg又は１０mg/kg（又はそれらの任意の組み合わせ）の用量を１回以上、患者に投与することができる。そのような用量を間欠的に、例えば毎週又は３週間ごとに（例えば、患者が二量体ポリペプチドの投与を約２回から約２０回、例えば約６回受けるように）投与してもよい。最初に高用量の初回負荷量を投与した後、低用量で１回以上投与してもよい。この治療法の進行は、従来の技法及びアッセイで容易にモニターされる。
【０３７２】
ＩＩＩ．製造品
本発明の他の一つの態様において、前記障害の処置、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器、及び容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。適切な容器には、例えば瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなど、種々の材料で形成されうる。容器は、単独で、又は別の組成物との組み合わせで、前記状態を処置、予防及び／又は診断するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、又は皮下注射針で突き刺すことができる栓を有するバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性物質は、本明細書において報告される二量体ポリペプチドである。前記ラベル又は添付文書は、その組成物が選択された状態の処置に使用されることを示す。更に、前記製造品は、（ａ）本明細書において報告される二量体ポリペプチドを含む組成物が入っている第１の容器、及び（ｂ）更なる細胞毒性物質又は他の治療剤を含む組成物が入っている第２の容器を含んでいてよい。本発明のこの実施態様の製造品は、特定の状態を処置するためにその組成物を使用できることを示す添付文書を更に含みうる。これに代えて、又はこれに加えて、製造品は、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液のような、薬学的に許容し得る緩衝液を含む第２（又は第３）の容器を更に含みうる。商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料、例えば、緩衝液、希釈剤、フィルタ、針及びシリンジを、更に含みうる。
【０３７３】
上記の製造品はいずれも、本明細書において報告される二量体ポリペプチドの代わりに、又はそれに加えて、本明細書において報告されるイムノコンジュゲートを含みうると理解される。
【０３７４】
ＩＶ．具体的な実施態様
１．二量体ポリペプチドであって、
第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、前記第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは各々、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１個以上のシステイン残基を含む、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含み、
ｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、
ｉｉｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含むか、
ｉｖ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｖ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｖｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含む、
二量体ポリペプチド。
【０３７５】
２．ヒトＦｃＲｎと特異的に結合せず、ブドウ球菌プロテインＡと特異的に結合する、項１記載の二量体ポリペプチド。
【０３７６】
３．ホモ二量体ポリペプチドである、項１〜２のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３７７】
４．ヘテロ二量体ポリペプチドである、項１〜２のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３７８】
５．ｉ）前記第１のポリペプチドが、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを更に含み、前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含むか、ｉｉ）前記第１のポリペプチドが、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを更に含み、前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを含む、項１〜４のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３７９】
６．前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び前記免疫グロブリンＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである、項１〜５のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３８０】
７．前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを更に含む、項１〜６のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３８１】
８．前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び前記免疫グロブリンＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ２サブクラスのものであり、場合により突然変異Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓを伴う、項１〜５のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３８２】
９．前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び前記免疫グロブリンＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ４サブクラスのものである、項１〜５のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３８３】
１０．前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを更に含む、項１〜５及び９のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３８４】
１１．前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｐ３２９Ｇを更に含む、項１〜１０のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３８５】
１２．Ｆｃ領域融合ポリペプチドである、項１〜１１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３８６】
１３．（全長）抗体である、項１〜１１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３８７】
１４．前記（全長）抗体が単一特異性抗体である、項１〜１１及び１３のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３８８】
１５．前記単一特異性抗体が一価単一特異性抗体である、項１〜１１及び１３〜１４のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３８９】
１６．前記単一特異性抗体が二価単一特異性抗体である、項１〜１１及び１３〜１５のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３９０】
１７．前記（全長）抗体が二重特異性抗体である、項１〜１１及び１３のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３９１】
１８．前記二重特異性抗体が二価二重特異性抗体である、項１〜１１及び１３及び１７のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３９２】
１９．前記二重特異性抗体が四価二重特異性抗体である、項１〜１１及び１３及び１７〜１８のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３９３】
２０．前記（全長）抗体が三重特異性抗体である、項１〜１１及び１３のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３９４】
２１．前記三重特異性抗体が三価三重特異性抗体である、項１〜１１及び１３及び２０のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３９５】
２２．前記三重特異性抗体が四価三重特異性抗体である、項１〜１１及び１３及び２０〜２１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３９６】
２３．二量体ポリペプチドであって、
第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、前記第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは各々、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１個以上のシステイン残基を含む、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含み、
前記第１の、前記第２の又は前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ４３６Ａ（Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）を含む、
二量体ポリペプチド。
【０３９７】
２４．前記第１及び第２のポリペプチドが、突然変異Ｙ４３６Ａを含む、項２３記載の二量体ポリペプチド。
【０３９８】
２５．ヒトＦｃＲｎと特異的に結合せず、ブドウ球菌プロテインＡと特異的に結合する、項２３〜２４のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０３９９】
２６．ホモ二量体ポリペプチドである、項２３〜２５のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４００】
２７．ヘテロ二量体ポリペプチドである、項２３〜２５のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４０１】
２８．ａ）前記第１のポリペプチドが、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを更に含み、前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含むか、
前記第１のポリペプチドが、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを更に含み、前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、かつ／又は
ｂ）ｉ）前記第１及び第２のポリペプチドが、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）前記第１及び第２のポリペプチドが、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、
ｉｉｉ）前記第１及び第２のポリペプチドが、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含むか、
ｉｖ）前記第１のポリペプチドが、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｖ）前記第１のポリペプチドが、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｖｉ）前記第１のポリペプチドが、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含む、
項２３〜２７のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４０２】
２９．前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び前記免疫グロブリンＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである項２３〜２８のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４０３】
３０．前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを更に含む、項２３〜２９のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４０４】
３１．前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び前記免疫グロブリンＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ２サブクラスのものであり、場合により突然変異Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓを伴う、項２３〜２８のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４０５】
３２．前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び前記免疫グロブリンＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ４サブクラスのものである、項２３〜２８のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４０６】
３３．前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを更に含む、項２３〜２８及び３２のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４０７】
３４．前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｐ３２９Ｇを更に含む、項２３〜３３のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４０８】
３５．Ｆｃ領域融合ポリペプチドである、項２３〜３４のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４０９】
３６．（全長）抗体である、項２３〜３４のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４１０】
３７．前記（全長）抗体が単一特異性抗体である、項２３〜３４及び３６のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４１１】
３８．前記単一特異性抗体が一価単一特異性抗体である、項２３〜３４及び３６〜３７のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４１２】
３９．前記単一特異性抗体が二価単一特異性抗体である、項２３〜３４及び３６〜３８のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４１３】
４０．前記（全長）抗体が二重特異性抗体である、項２３〜３４及び３６のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４１４】
４１．前記二重特異性抗体が二価二重特異性抗体である、項２３〜３４及び３６及び４０のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４１５】
４２．前記二重特異性抗体が四価二重特異性抗体である、項２３〜３４及び３６及び４０〜４１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４１６】
４３．前記（全長）抗体が三重特異性抗体である、項２３〜３４及び３６のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４１７】
４４．前記三重特異性抗体が三価三重特異性抗体である、項２３〜３４及び３６及び４３のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４１８】
４５．前記三重特異性抗体が四価三重特異性抗体である、項２３〜３４及び３６及び４３〜４４のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４１９】
４６．二量体ポリペプチドであって、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第１のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第２のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第３のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第４のポリペプチド
を含み、
前記第１の重鎖可変ドメインと前記第１の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第１の結合部位を形成し、
前記第２の重鎖可変ドメインと前記第２の軽鎖可変ドメインは、第２の抗原と特異的に結合する第２の結合部位を形成し、
ｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含むか、又はｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、
前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを更に含み、
ｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、
ｉｉｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含むか、
ｉｖ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｖ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｖｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含む、
二量体ポリペプチド。
【０４２０】
４７．二量体ポリペプチドであって、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第１のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第２のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の軽鎖可変ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含む、第３のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第４のポリペプチド
を含み、
前記第１の重鎖可変ドメインと前記第１の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第１の結合部位を形成し、
前記第２の重鎖可変ドメインと前記第２の軽鎖可変ドメインは、第２の抗原と特異的に結合する第２の結合部位を形成し、
ｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含むか、又はｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、
前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを更に含み、
ｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、
ｉｉｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含むか、
ｉｖ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｖ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｖｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含む、
二量体ポリペプチド。
【０４２１】
４８．二量体ポリペプチドであって、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第１のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第２のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第３のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第４のポリペプチド
を含み、
前記第１の重鎖可変ドメインと前記第１の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第１の結合部位を形成し、
前記第２の重鎖可変ドメインと前記第２の軽鎖可変ドメインは、第２の抗原と特異的に結合する第２の結合部位を形成し、
ｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含むか、又はｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、
前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを更に含み、
ｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、
ｉｉｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含むか、
ｉｖ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｖ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｖｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含む、
二量体ポリペプチド。
【０４２２】
４９．二量体ポリペプチドであって、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第１のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第２のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の軽鎖可変ドメイン及びサブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含む、第３のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第４のポリペプチド
を含み、
前記第１の重鎖可変ドメインと前記第１の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第１の結合部位を形成し、
前記第２の重鎖可変ドメインと前記第２の軽鎖可変ドメインは、第２の抗原と特異的に結合する第２の結合部位を形成し、
ｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含むか、又はｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、
前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを更に含み、
ｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、
ｉｉｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含むか、
ｉｖ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｖ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｖｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含む、
二量体ポリペプチド。
【０４２３】
５０．二量体ポリペプチドであって、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメイン、ペプチド性リンカー及び第１のｓｃＦｖを含む、第１のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメイン、ペプチド性リンカー及び第２のｓｃＦｖを含む、第２のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第３のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第４のポリペプチド、
を含み、
前記第１の重鎖可変ドメインと前記第１の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第１の結合部位を形成し、前記第２の重鎖可変ドメインと前記第２の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第２の結合部位を形成し、前記第１及び前記第２のｓｃＦｖは、第２の抗原と特異的に結合し、
ｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含むか、又はｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、
前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを更に含み、
ｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、
ｉｉｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含むか、
ｉｖ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｖ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｖｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含む、
二量体ポリペプチド。
【０４２４】
５１．二量体ポリペプチドであって、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメイン、ペプチド性リンカー及び第１のｓｃＦｖを含む、第１のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメイン、ペプチド性リンカー及び第２のｓｃＦｖを含む、第２のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の軽鎖可変ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含む、第３のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第４のポリペプチド、
を含み、
前記第１の重鎖可変ドメインと前記第１の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第１の結合部位を形成し、前記第２の重鎖可変ドメインと前記第２の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第２の結合部位を形成し、前記第１及び前記第２のｓｃＦｖは、第２の抗原と特異的に結合し、
ｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含むか、又はｉｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、
前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを更に含み、
ｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、
ｉｉｉ）前記第１及び第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含むか、
ｉｖ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｖ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｖｉ）前記第１のポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、前記第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ及びＬ４３２Ｓを含む、
二量体ポリペプチド。
【０４２５】
５２．項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチドを製造する方法であって、下記工程：
ａ）項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチドをコードする１種以上の核酸を含む哺乳類細胞を培養する工程、
ｂ）前記二量体ポリペプチドを培養培地から回収する工程、及び
ｃ）前記二量体ポリペプチドをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製する工程
を含む方法。
【０４２６】
５３．二量体ポリペプチドのプロテインＡとの結合を増加させるための、突然変異Ｙ４３６Ａの使用。
【０４２７】
５４．ホモ二量体ポリペプチドからヘテロ二量体ポリペプチドを分離するための、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａの使用。
【０４２８】
５５．ホモ二量体ポリペプチドからヘテロ二量体ポリペプチドを分離するための、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ、Ｌ４３２Ｄ又は突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ、Ｌ４３２Ｓの使用。
【０４２９】
５６．第１のポリペプチド内の突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａの、第２のポリペプチド内の突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａと組み合わせての、前記第１及び第２のポリペプチドを含むヘテロ二量体ポリペプチドを、ホモ二量体ポリペプチドから分離するための使用。
【０４３０】
５７．第１のポリペプチド内の突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａの、第２のポリペプチド内の突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ、Ｌ４３２Ｄ又は突然変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ、Ｌ４３２Ｓと組み合わせての、前記第１及び第２のポリペプチドを含むヘテロ二量体ポリペプチドを、ホモ二量体ポリペプチドから分離するための使用。
【０４３１】
５８．ｉ）前記第１のポリペプチドが、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを更に含み、前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含むか、又はｉｉ）前記第１のポリペプチドが、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のポリペプチドが、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを含む、項５３〜５７のいずれか１項記載の使用。
【０４３２】
５９．眼血管疾患の患者の処置方法であって、そのような処置を必要とする患者に対し、項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチドを投与することによる方法。
【０４３３】
６０．硝子体内適用のための、項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４３４】
６１．眼血管疾患処置用の、項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４３５】
６２．項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド及び場合により薬学的に許容し得る担体を含む医薬処方物。
【０４３６】
６３．可溶性のレセプターリガンドを、血液−眼関門を抜けて眼から血液循環に輸送するための、項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチドの使用。
【０４３７】
６４．１種以上の可溶性のレセプターリガンドを眼から除去するための、項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチドの使用。
【０４３８】
６５．眼疾患、特に眼血管疾患を処置するための、項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチドの使用。
【０４３９】
６６．１種以上の可溶性のレセプターリガンドを硝子体内空間から血液循環に輸送するための、項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチドの使用。
【０４４０】
６７．眼疾患を処置するのに使用するための、項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４４１】
６８．可溶性のレセプターリガンドの、血液−眼関門を抜けての眼から血液循環への輸送に使用するための、項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４４２】
６９．１種以上の可溶性のレセプターリガンドの眼からの除去に使用するための、項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４４３】
７０．眼疾患、特に眼血管疾患を処置するのに使用するための、項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４４４】
７１．１種以上の可溶性のレセプターリガンドの、硝子体内空間から血液循環への輸送に使用するための、項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチド。
【０４４５】
７２．眼血管疾患を有する個体を処置する方法であって、前記個体に、有効量の項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチドを投与する工程を含む方法。
【０４４６】
７３．個体において、可溶性のレセプターリガンドを、血液−眼関門を抜けて眼から血液循環に輸送する方法であって、前記個体に、有効量の項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチドを投与して、可溶性のレセプターリガンドを、血液−眼関門を抜けて眼から血液循環に輸送する工程を含む方法。
【０４４７】
７４．個体において、１種以上の可溶性のレセプターリガンドを眼から除去する方法であって、前記個体に、有効量の項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチドを投与して、１種以上の可溶性のレセプターリガンドを眼から除去する工程を含む方法。
【０４４８】
７５．個体において、１種以上の可溶性のレセプターリガンドを硝子体内空間から血液循環に輸送する方法であって、前記個体に、有効量の項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチドを投与して、１種以上の可溶性のレセプターリガンドを硝子体内空間から血液循環に輸送する工程を含む方法。
【０４４９】
７６．個体において、可溶性のレセプターリガンドを、血液−眼関門を抜けて硝子体内空間又は眼から血液循環に輸送する方法であって、前記個体に、有効量の項１〜５１のいずれか１項記載の二量体ポリペプチドを投与して、可溶性のレセプターリガンドを、血液−眼関門を抜けて眼から血液循環に輸送する工程を含む方法。
【実施例】
【０４５０】
Ｖ．実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記一般的記載に基づいて、その他様々な実施態様を実施し得ることが理解されよう。
【０４５１】
上記発明は、理解を明確にするために説明及び例によっていくらか詳細に記載してきたが、説明及び例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきものではない。本明細書において引用する全ての特許及び科学的文献の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み入れられる。
【０４５２】
方法
エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）
Ｎ−グリカナーゼplus（Roche）０．５μL及びリン酸ナトリウム緩衝液（０．１M、ｐＨ７．１）を添加し、最終試料体積１１５μLを得ることによってタンパク質アリコート（５０μg）を脱グリコシル化した。この混合物を３７℃で１８時間インキュベートした。その後、還元及び変性のために、４M 塩酸グアニジン（Pierce）に溶かした０．５M ＴＣＥＰ（Pierce）６０μL及び８M 塩酸グアニジン５０μＬを添加した。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。サイズ排除クロマトグラフィー（セファロースＧ−２５、アイソクラティック、２％ギ酸を含む４０％アセトニトリル）によって試料を脱塩した。ナノＥＳＩ供給源（TriVersa NanoMate、Advion）を装備されたＱ−ＴＯＦ機器（maXis、Bruker）を用いて、ＥＳＩ質量スペクトル（+ve）を記録した。ＭＳパラメーター設定は次のとおりであった：移動：ファンネルＲＦ、４００Ｖｐｐ；ＩＳＣＩＤエネルギー、０eV；多重極ＲＦ、４００Ｖｐｐ；四重極：イオンエネルギー、４．０eV；低質量、６００m/z；供給源：乾燥ガス、８L/分；乾燥ガスの温度、１６０℃；コリジョンセル：衝突エネルギー、１０eV；衝突ＲＦ：２０００Ｖｐｐ；イオンクーラー：イオンクーラーＲＦ、３００Ｖｐｐ；移動時間：１２０μ秒；プレパルス蓄積、１０μ秒；スキャン範囲m/z６００〜２０００。データを評価するために、施設内で開発したソフトウェア（MassAnalyzer）を使用した。
【０４５３】
ＦｃＲｎ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析
ＦｃＲｎに対する野生型抗体及び変異体の結合特性を、BIAcore T100機器（BIAcore AB, Uppsala, Sweden）を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって解析した。この方式は、分子相互作用の研究のために十分に確立されている。これにより、リガンド／分析物結合を連続的にリアルタイムでモニタリングし、従って、様々なアッセイ法設定において動態パラメーターを測定することが可能になる。ＳＰＲ技術は、金でコーティングされたバイオセンサーチップの表面近くでの屈折率の測定に基づいている。屈折率の変化から、固定化されたリガンドと溶液中に注入された分析物の相互作用によって引き起こされる表面の質量変化が示唆される。分子が、表面の固定化されたリガンドに結合する場合、質量は増加し、解離する場合は質量が減少する。本アッセイ法においては、４００応答単位（ＲＵ）のレベルまで、アミンカップリングによってＦｃＲｎレセプターをBIAcore CM5バイオセンサーチップ（GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Sweden）上に固定化した。アッセイ法は、ＰＢＳ、０．０５％Tween20 ｐＨ６．０（GE Healthcare Bioscience）をランニング（running）バッファー及び希釈用緩衝液として用いて室温で実施した。２００nMの試料を室温、流速５０μL/分で注入した。結合時間は１８０秒であった。解離相は３６０秒に及んだ。ＨＢＳ−Ｐ、ｐＨ８．０を短時間注入することにより、チップ表面の再生を達成した。注入後１８０秒及び注入後３００秒における生物学的応答シグナルの高さを比較することによって、ＳＰＲデータの評価を行った。対応するパラメーターは、ＲＵ最大レベル（注入後１８０秒）及び後期の安定性（注入終了後３００秒）である。
【０４５４】
プロテインＡ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
本アッセイは、表面プラズモン共鳴分光法に基づくものである。ＳＰＲバイオセンサーの表面に、プロテインＡを固定する。ＳＰＲ分光計のフローセルに試料を注入することにより、それが固定されたプロテインＡと複合体を形成し、このことが、センサーチップ表面上における増加する質量をもたらし、従ってより高い応答に至る（１ＲＵは１pg/mm2と定義されているので）。その後、試料-プロテインＡ複合体を解離することにより、センサーチップを再生させる。次いで、得られた応答を、応答単位（ＲＵ）の高い信号及び解離挙動に関して評価する。
【０４５５】
GE Healthcareのアミンカップリングキットを用いることにより、３５００応答単位（ＲＵ）程度（２０μg/mL）のプロテインＡを、CM5チップ（GE Healthcare）上にｐＨ４．０でカップリングさせた。
【０４５６】
試料及びシステム緩衝液は、ＨＢＳ−Ｐ＋（０．０１M ＨＥＰＥＳ、０．１５M ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０、滅菌濾過、ｐＨ７．４）であった。フローセル温度は２５℃、試料コンパートメント温度は１２℃に設定した。ランニングバッファーでシステムを準備した。次いで、５nM 試料構成体溶液を、流速３０μL/分で１２０秒間注入し、その後３００秒の解離相とした。次いで、流速３０μL/分で３０秒間のグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）注入２回により、センサーチップ表面を再生させた。各試料を３回測定した。
【０４５７】
【表１１】
2020196744.tif 000019
2020196744.tif 000020
【０４５８】
本明細書で使用する用語「突然変異ＩＨＨ−ＡＡＡを伴う」は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域における突然変異Ｉ２５３Ａ（Ｉｌｅ２５３Ａｌａ）、Ｈ３１０Ａ（Ｈｉｓ３１０Ａｌａ）及びＨ４３５Ａ（Ｈｉｓ４３５Ａｌａ）の組み合わせ（Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）を指し、本明細書で使用する用語「突然変異ＨＨＹ−ＡＡＡを伴う」は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域における突然変異Ｈ３１０Ａ（Ｈｉｓ３１０Ａｌａ）、Ｈ４３３Ａ（Ｈｉｓ４３３Ａｌａ）及びＹ４３６Ａ（Ｔｙｒ４３６Ａｌａ）の組み合わせ（Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）を指し、本明細書で使用する用語「突然変異Ｐ３２９ＧＬＡＬＡを伴う」は、ＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域における突然変異Ｌ２３４Ａ（Ｌｅｕ２３４Ａｌａ）、Ｌ２３５Ａ（Ｌｅｕ２３５Ａｌａ）及びＰ３２９Ｇ（Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ）の組み合わせ（Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）を指し、本明細書で使用する用語「突然変異ＳＰＬＥを伴う」は、ＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域における突然変異Ｓ２２８Ｐ（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）及びＬ２３５Ｅ（Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ）の組み合わせ（Kabat EUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）を指す。
【０４５９】
【表１２】
2020196744.tif 000021
【０４６０】
一般
ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報が、以下において与えられる：Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)。抗体鎖のアミノ酸残基は、EUナンバリングに従ってナンバリングし、参照する（Edelman, G. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)）。
【０４６１】
リコンビナントＤＮＡ技術
Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1989)に記載のようにして、標準的方法を用いてＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の指示に従って使用した。
【０４６２】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを、Geneart（Regensburg, Germany）での所与の仕様に従って注文した。
【０４６３】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、MediGenomix GmbH（Martinsried, Germany）又はSequiserve GmbH（Vaterstetten, Germany）で実施した二本鎖配列決定により決定した。
【０４６４】
ＤＮＡ及びタンパク質配列分析並びに配列データ管理
ＧＣＧの（Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin）ソフトウェアパッケージバージョン１０．２及びInfomaxのVector NT1 Advance suite version 8.0を、配列の作成、マッピング、分析、注釈及び図示のために使用した。
【０４６５】
発現ベクター
記載する抗体の発現のために、ＣＭＶ−イントロンＡプロモーターを伴う、若しくは伴わないｃＤＮＡ組織化、又はＣＭＶプロモーターを伴うゲノム組織化のいずれかに基づく、一過性発現（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆにおける）のための発現プラスミドを用いた。
【０４６６】
前記ベクターは、抗体発現カセットの他に、以下を含んだ：
−  E. coliにおけるこのプラスミドの複製を可能にする複製の起点、
−  E. coliにおけるアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子、及び
−  真核細胞における選択可能なマーカーとしての、ハツカネズミからのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子。
【０４６７】
抗体遺伝子の転写単位は、以下の要素で構成された：
−５’末端の固有の制限部位、
−ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−ｃＤＮＡ組織化の場合、イントロンＡ配列が続く、
−ヒト抗体遺伝子の５’非翻訳領域、
−免疫グロブリン重鎖シグナル配列をコードする核酸、
−免疫グロブリンエクソン−イントロン組織化を伴う、ｃＤＮＡとしての、又はゲノム組織化におけるヒト抗体鎖（野生型、又はドメイン交換を伴うもの）をコードする核酸、
−ポリアデニル化シグナル配列を伴う３’非翻訳領域、及び
−３’末端の固有の制限部位。
【０４６８】
抗体鎖をコードする核酸を、ＰＣＲ及び／又は遺伝子合成により生成し、公知のリコンビナント方法及び一致した核酸セグメントの接続により（例えば、それぞれのベクターにおける固有の制限部位を使用し）、組み立てた。サブクローン化した核酸配列を、ＤＮＡ配列決定により検証した。一過性トランスフェクションのために、より多量のベクターを、形質転換されたE. coli培養物（Nucleobond AX, Macherey-Nagel）からのベクター調製により調製した。
【０４６９】
細胞培養技術
標準的な細胞培養技術を、Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.に記載される通りに使用した。
【０４７０】
二重特異性抗体は、下記の懸濁液中で成長するＨＥＫ２９−Ｆ細胞中でのそれぞれの発現ベクターの一過性同時トランスフェクションにより発現させた。
【０４７１】
実施例１
発現及び精製
ＨＥＫ２９３−Ｆシステムにおける一過性トランスフェクション
単一特異性及び二重特異性抗体を、製造者の指示に従ってＨＥＫ２９３−Ｆシステム（Invitrogen）を用いて、それぞれのベクター（例えば、重鎖及び改変重鎖、並びに対応する軽鎖及び改変軽鎖をコードする）での一過性トランスフェクションにより生成した。簡単には、振盪フラスコ中又は撹拌発酵槽中のいずれかで、無血清FreeStyle（商標）２９３発現培地（Invitrogen）中、懸濁液中で成長するＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（Invitrogen）を、それぞれの発現ベクターと、２９３フェクチン（商標）又はフェクチン（Invitrogen）の混合物を用いてトランスフェクトした。２L振盪フラスコ（Corning）では、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を、６００mL中、１×１０６個細胞／mLの密度で播種し、１２０rpm、８%ＣＯ２でインキュベートした。翌日、細胞を、Ａ）重鎖又は改変重鎖のそれぞれ及び等モル比の対応する軽鎖をコードする６００μgの全ベクターＤＮＡ（１μg/mL）を含むOpti-MEM（Invitrogen） ２０mLと、Ｂ）２９３フェクチン又はフェクチン（２μl/mL） １．２mLを含むOpti-MEM ２０mLの混合物約４２mLを用いて、約１．５×１０６個細胞／mLの細胞密度でトランスフェクトした。グルコース消費に従い、発酵の過程の間にグルコース溶液を加えた。分泌された抗体を含む上清を、５−１０日後に採取し、抗体を上清から直接精製するか、又は上清を凍結及び保存した。
【０４７２】
精製
二重特異性抗体を、細胞培養上清から、MabSelectSure-セファロース（商標）（非ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異体用）（GE Healthcare, Sweden）又はkappaSelect-アガロース（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異体用）（GE Healthcare, Sweden）を用いるアフィニティークロマトグラフィー、ブチルセファロース（GE Healthcare, Sweden）を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー及びスーパーデックス200サイズ排除（GE Healthcare, Sweden）クロマトグラフィーにより精製した。
【０４７３】
簡単には、滅菌濾過した細胞培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１mM ＫＨ２ＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌ及び２．７mM ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したMabSelectSuRe樹脂（非ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異及び野生型抗体）に捕捉し、平衡緩衝液で洗浄し、ｐＨ３．０の２５mM クエン酸ナトリウムで溶出した。ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異体を、２５mM トリス、５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を用いて平衡化したkappaSelect樹脂に捕捉し、平衡緩衝液で洗浄し、ｐＨ２．９の２５mMクエン酸ナトリウムで溶出した。溶出した抗体画分をプールし、２M Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０で中和した。抗体プールは、疎水性相互作用クロマトグラフィー用に、１．６M 硫酸アンモニウム溶液を加えることにより硫酸アンモニウムの最終濃度０．８Mに調製し、酢酸を用いてｐＨをｐＨ５．０に調整した。３５mM 酢酸ナトリウム、０．８M 硫酸アンモニウム、ｐＨ５．０でブチルセファロース樹脂を平衡化した後、抗体を樹脂にかけ、平衡緩衝液を用いて洗浄し、３５mM酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０までの直線勾配を用いて溶出した。抗体（単一特異性又は二重特異性）含有画分をプールし、２０mM ヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したスーパーデックス200 26/60 GL（GE Healthcare, Sweden）カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにより、更に精製した。抗体（単一特異性又は二重特異性）含有画分をプールし、Vivaspin限外濾過装置（Sartorius Stedim Biotech S.A., France）を用いて必要な濃度まで濃縮し、−８０℃で保存した。
【０４７４】
【表１３】
2020196744.tif 000022
【０４７５】
純度及び抗体の完全性を、各精製工程後に、マイクロ流体Labchip技術（Caliper Life Science, USA）を使用し、ＣＥ−ＳＤＳにより分析した。５μlのタンパク質溶液を、製造者の指示に従い、HT Protein Express Reagent Kitを使用してＣＥ−ＳＤＳ分析用に調製し、HT Protein Express Chipを用いるLabChip GXIIシステムで分析した。データを、LabChip GX Softwareを用いて分析した。
【０４７６】
【表１４】
2020196744.tif 000023
【０４７７】
抗体試料の凝集体含量を、２×ＰＢＳ（２０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、２mM ＫＨ２ＰＯ４、２７４mM ＮａＣｌ及び５．４mM ＫＣｌ、ｐＨ７．４）ランニングバッファー中、スーパーデックス200分析用サイズ排除カラム（GE Healthcare, Sweden）を使用し、高性能ＳＥＣにより、２５℃で分析した。タンパク質２５μgを、流速０．７５ml/分でカラムに注入し、５０分間にわたりアイソクラティックで溶出した。
【０４７８】
同様にして、抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体のVEGF/ANG2-0012及びVEGF/ANG2-0201を調製及び精製し、収量は以下の通りであった：
【０４７９】
【表１５】
2020196744.tif 000024
【０４８０】
また、抗ＶＥＧＦ/ＡＮＧ２二重特異性抗体である、ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴い、かつＳＰＬＥ突然変異を伴う抗ＶＥＧＦ/ＡＮＧ２ CrossMAb IgG4（配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５）、ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴う抗ＶＥＧＦ/ＡＮＧ２ OAscFab IgG1（配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８）、ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異及びＳＰＬＥ突然変異を伴う抗ＶＥＧＦ/ＡＮＧ２ OAscFab IgG4（配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１）、ＨＨＹ−ＡＡＡ突然変異及びＰ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ突然変異を伴う抗ＶＥＧＦ/ＡＮＧ２ CrossMab IgG1（配列番号９０、配列番号９１、配列番号４０、配列番号４１）、ＨＨＹ−ＡＡＡ突然変異及びＳＰＬＥ突然変異を伴う抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２ CrossMab IgG4（配列番号９２、配列番号９３、配列番号４４、配列番号４５）、ＨＨＹ−ＡＡＡ突然変異を伴う抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２ OAscFab IgG1（配列番号９４、配列番号９５、配列番号４８）、及びＨＨＹ−ＡＡＡ突然変異及びＳＰＬＥ突然変異を伴う抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２ OAscFab IgG4（配列番号９６、配列番号９７、配列番号５１）、並びに抗ＩＧＦ-１Ｒ単一特異性抗体である、野生型抗ＩＧＦ-１Ｒ(配列番号８８、配列番号８９)、ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴う抗IGF-1R IgG1（配列番号８８、配列番号９０）、ＹＴＥ突然変異を伴う抗IGF-1R IgG1（配列番号８８、配列番号９１）、ＫｉＨ突然変異を伴う野生型抗IGF-1R IgG1（配列番号８８、配列番号９２、配列番号９３）、ＫｉＨ突然変異及びホール鎖にＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴う抗IGF-1R IgG1（配列番号８８、配列番号９４、配列番号９５）、ＫｉＨ突然変異及びホール鎖にＨＨＹ−ＡＡＡ突然変異を伴う抗IGF-1R IgG1（配列番号８８、配列番号９６、配列番号９７）、ＫｉＨ突然変異及びＹＴＥ突然変異を伴う抗IGF-1R IgG1（配列番号８８、配列番号９８、配列番号９９）、ＫｉＨ突然変異及びＤＤＤ突然変異を伴う抗IGF-1R IgG1（配列番号８８、配列番号１００、配列番号１０１）、及びＨＨＹ−ＡＡＡ突然変異を伴う抗IGF-1R IgG1（配列番号８８、配列番号１１２）を、同様に調製及び精製することができる。
【０４８１】
実施例２
分析＆発展性
小規模ＤＬＳベース粘度測定
粘度測定は本質的に、（He, F. et al., Analytical Biochemistry 399 (2009) 141-143）に記載されるようにして実施した。簡単には、試料を、２００mMコハク酸アルギニン、ｐＨ５．５中の種々のタンパク質濃度に濃縮し、その後、ポリスチレンラテックスビーズ（直径３００nm）及びポリソルベート２０（０．０２%v/v）を添加する。試料を、０．４μmフィルタープレートを通した遠心分離により、光学的３８４ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆う。ラテックスビーズの見かけ上の直径を、２５℃での動的光散乱により決定する。溶液の粘度を、η＝η０（ｒｈ／ｒｈ、０）（η：粘度；η０：水の粘度；ｒｈ：ラテックスビーズの見かけの流体力学的半径；ｒｈ、０：水中でのラテックスビーズの流体力学半径）として算出することができる。
【０４８２】
種々の試料を同じ濃度で比較できるようにするため、ムーニー等式（式１）（Mooney, M., Colloid Sci., 6 (1951) 162-170; Monkos, K., Biochem.Biophys.Acta 304 (1997) 1339）を用いて粘度−濃度データをフィッティングし、適宜データを内挿した。
【数１】
2020196744.tif 000025
（Ｓ：タンパク質の流体力学的相互作用パラメータ；Ｋ：自己込み合い因子；Φ：溶解したタンパク質の体積分率）
【０４８３】
結果を図２に示す：Ｆｃ領域にＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴うVEGF/ANG2-0016は、全ての測定された温度で、Ｆｃ部分にＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異のないVEGF/ANG2-0015に比して、低い粘度を示す。
【０４８４】
ＤＬＳ凝集開始温度
試料は、２０mM ヒスチジン／塩酸ヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中、濃度１mg/mLで調製し、０．４μmフィルタープレートを通した遠心分離により光学的３８４ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆う。試料を、０．０５℃／分の速度で、２５℃から８０℃まで加熱しつつ、流体力学半径を、動的光散乱により繰り返し測定する。凝集開始温度を、流体力学的半径が増加し始める温度と定義する。結果を図３に示す。Ｆｃ部分にＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴うVEGF/ANG2-0016に対する、ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異のないVEGF/ANG2-0015の凝集を、図３に示す。VEGF/ANG2-0016は、６１℃の凝集開始温度を示したのに対し、ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異のないVEGF/ANG2-0015は、６０℃の開始温度を示した。
【０４８５】
ＤＬＳ時間経過
試料は、２０mM ヒスチジン／塩酸ヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中、濃度１mg/mLで調製し、０．４μmフィルタープレートを通した遠心分離により光学的３８４ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆う。試料を１４５時間まで５０℃の一定温度に保持しつつ、流体力学半径を、動的光散乱により繰り返し測定する。この実験において、高温度でのネイティブな、アンフォールドタンパク質の凝集傾向は、経時的に、平均粒径の増加をもたらしうる。このＤＬＳベースの方法は、凝集物について非常に鋭敏である。なぜなら、凝集物が過剰比例的に散乱光強度に寄与するためである。５０℃（凝集開始温度に近い温度、前記を参照）では、１４５時間後でさえ、VEGF/ANG2-0015及びVEGF/ANG2-0016の両方について、見出された平均粒径の増加はわずかに０．５nm未満であった。
【０４８６】
１００mg/mLにて４０℃で７日間保存
試料を、２００mM コハク酸アルギニン、ｐＨ５．５中、１００mg/mLの最終濃度まで濃縮し、滅菌濾過し、静止状態で７日間にわたり４０℃で保存する。保存の前と後に、高分子量及び低分子量種（それぞれＨＭＷ及びＬＭＷ）の含量を、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定する。保存した試料と調製直後に測定した試料の間の、ＨＭＷ及びＬＭＷ含量における差を、それぞれ「ＨＭＷ増加」及び「ＬＭＷ増加」として報告する。結果を下記表及び図４に示すが、それらは、VEGF/ANG2-0015（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異なし）が、VEGF/ANG2-0016（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴う）に比して、主ピークのより高い低下及びより高いＨＭＷ増加を示すことを示している。驚くべきことに、VEGF/ANG2-0016（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴う）は、VEGF/ANG2-0015（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異なし）に比して低い凝集傾向を示した。
【０４８７】
【表１６】
2020196744.tif 000026
【０４８８】
抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２二重特異性抗体の機能分析は、BIAcore（登録商標）Ｔ１００又はＴ２００機器（GE Healthcare）を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により２５℃で評価した。BIAcore（登録商標）システムは、分子相互作用の試験のために十分に確立されている。ＳＰＲ技術は、金コーティングバイオセンサーチップの表面近くでの屈折率の測定に基づく。屈折率の変化は、固定化リガンドと、溶液に注入された分析物の相互作用により起こる、表面上での質量変化を示す。表面に固定化されたリガンドに分子が結合すると、質量が増加し、逆に、固定化リガンドからの分析物の解離（複合体の解離を反映する）の場合、質量は減少する。ＳＰＲは、リガンド／分析物の結合の継続的リアルタイムモニタリング及び、よって、会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び平衡定数（ＫＤ）の決定を可能にする。
【０４８９】
実施例３
ＶＥＧＦ、ＡＮＧ２、ＦｃガンマＲ及びＦｃＲｎとの結合
種交差反応性の評価を含む、ＶＥＧＦアイソフォームの動力学的親和性
約１２０００共鳴単位（ＲＵ）の捕捉システム（１０μg/mlヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）’２；オーダーコード：２８９５８３２５；GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden）を、GE Healthcareにより供給されるアミンカップリングキットを用いて、ｐＨ５．０で、CM5チップ（GE Healthcare  ＢＲ−１００５−３０）上にカップリングさせた。試料及びシステム緩衝液は、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０mM リン酸緩衝生理食塩水）ｐＨ７．４であった。フローセルを２５℃に設定し、サンプルブロックを１２℃に設定し、ランニングバッファー２回で準備した。二重特異性抗体を、５μL／分の流量で、３０秒間にわたり５０nM 溶液を注入することにより捕捉した。溶液中の種々の濃度（３００nMで開始し、１：３希釈）のヒトhVEGF121、マウスmVEGF120又はラットrVEGF164を、３０μL/分の流量で、３００秒間にわたり注入することにより、会合を測定した。解離相を１２００秒間までモニターし、試料溶液からランニングバッファーへの切り替えにより誘発した。流速３０μL／分でのグリシンｐＨ２．１溶液による６０秒間の洗浄により、表面を再生した。バルク屈折率の差を、ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２表面から得られた応答を減算することにより補正した。ブランク注入も減算する（＝二重参照）。見かけのＫＤその他の動力学的パラメータの算出のために、ラングミュア１：１モデルを使用した。結果を以下に示す。
【０４９０】
種交差反応性の評価を含むＡＮＧ２溶液親和性
溶液親和性は、平衡混合物中の遊離の相互作用パートナーの濃度を決定することにより、相互作用の親和性を測定する。溶液親和性アッセイは、抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体（一定濃度に保つ）の、種々の濃度のリガンド（＝ＡＮＧ２）との混合を含む。最大の可能な共鳴単位（例えば、１７０００共鳴単位（ＲＵ））の抗体を、GE Healthcareにより供給されるアミンカップリングキットを用い、ｐＨ５．０で、CM5チップ（GE Healthcare BR-1005-30）表面に固定化した。試料及びシステム緩衝液は、ＨＢＳ−Ｐ  ｐＨ７．４であった。フローセルを２５℃に、サンプルブロックを１２℃に設定し、ランニングバッファー２回で準備した。検量線を作成するために、ＡＮＧ２を、濃度を増加させて、固定化抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体を含むBIAcoreフローセルに注入した。結合したＡＮＧ２の量を共鳴単位（ＲＵ）で決定し、濃度に対してプロットした。各リガンド溶液（抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体について、０〜２００nMまでの１１濃度）を、１０nM ＡＮＧ２と共にインキュベートし、室温で平衡に到達させた。既知量のＡＮＧ２を含む溶液の応答を測定する前後に生成した遊離のＡＮＧ２濃度を、検量線から決定した。４パラメータ適合を、遊離ＡＮＧ２濃度をｙ軸、阻害のために使用した抗体の濃度をｘ軸として用いるモデル２０１を用い、XLfit4（IDBS Software）を用いて設定した。親和性は、この曲線の変曲点を決定することにより算出した。０．８５％Ｈ３ＰＯ４溶液による、流速３０μL/分で３０秒間の洗浄１回により、表面を再生した。バルク屈折率の差を、ブランクカップリング表面から得られた応答を、減算することにより補正した。結果を以下に示す。
【０４９１】
ＦｃＲｎの定常状態の親和性
ＦｃＲｎ測定のために、定常状態の親和性を用いて、二重特異性抗体を互いに比較した。ヒトＦｃＲｎをカップリング緩衝液（１０μg/ml、酢酸Ｎａ、ｐＨ５．０）中に希釈し、BIAcore wizardを用いる標的固定化手順により、最終応答２００ＲＵとなるよう、C1-Chip（GE Healthcare BR-1005-35）上に固定化した。フローセルを２５℃に、サンプルブロックを１２℃に設定し、ランニングバッファー２回で準備した。試料及びシステム緩衝液は、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０mM リン酸緩衝生理食塩水）ｐＨ６．０であった。各抗体について異なるＩｇＧ濃度を評価するために、濃度６２．５nM、１２５nM、２５０nM及び５００nMを調製した。流速を３０μL/分に設定し、種々の試料をチップ表面に連続的に注入し、１８０秒の会合時間を選んだ。流速３０μL/分で６０秒間にわたり注入したＰＢＳ−Ｔ  ｐＨ８により、表面を再生した。バルク屈折率の差を、ブランク表面から得られた応答を、減算することにより補正した。緩衝液注入も減算する（＝二重参照）。定常状態の親和性を算出するために、BIA-Evaluation softwareからの方法を使用した。簡単には、ＲＵ値を分析された濃度に対してプロットし、用量反応曲線を生成した。２パラメトリック適合に基づき、上部漸近線を算出し、最大半量ＲＵ値、そして親和性の決定を可能にする。結果を図５及び下記表に示す。同様に、カニクイザル、マウス及びウサギＦｃＲｎとの親和性を決定することができる。
【０４９２】
ＦｃガンマＲＩＩＩａ測定
ＦｃガンマＲＩＩＩａ測定のために、直接結合アッセイを使用した。約３０００共鳴単位（ＲＵ）の捕捉システム（１μg/ml Penta-His；Quiagen）を、GE Healthcareにより供給されるアミンカップリングキットを用いることにより、ｐＨ５．０で、CM5チップ（GE Healthcare BR-1005-30）上にカップリングさせた。試料及びシステム緩衝液は、ＨＢＳ−Ｐ＋  ｐＨ７．４であった。フローセルを２５℃に、サンプルブロックを１２℃に設定し、ランニングバッファー２回で準備した。ＦｃガンマＲＩＩＩａ−Ｈｉｓ−レセプターを、流量５μL/分で６０秒間にわたり、１００nM溶液を注入することにより捕捉した。１００nMの、二重特異性抗体又は単一特異性対照抗体（ＩｇＧ１サブクラス及びＩｇＧ４サブクラス抗体に対し、抗ジゴキシゲニン抗体）の流量３０μL/分での１８０秒にわたる注入により、結合を測定した。流速３０μL/分でのグリシンｐＨ２．５溶液による１２０秒間の洗浄により、表面を再生した。ＦｃガンマＲＩＩＩａ結合は、ラングミュア１：１モデルと異なるため、結合／無結合だけを、このアッセイを用いて決定した。同様の様式において、ＦｃガンマＲＩａ及びＦｃガンマＲＩＩａ結合を決定することができる。結果を図６に示し、そこでは、変異Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡの導入により、ＦｃガンマＲＩＩＩａへの結合がそれ以上検出できなかった、という結果になっている。
【０４９３】
抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体との独立したＶＥＧＦ及びＡＮＧ２結合の評価
約３５００共鳴単位（ＲＵ）の捕捉システム（１０μg/mLヤギ抗ヒトＩｇＧ；GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden）を、GE Healthcareにより供給されるアミンカップリングキットを用いることにより、ｐＨ５．０で、CM4チップ（GE Healthcare BR-1005-34）上にカップリングさせた。試料及びシステム緩衝液は、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０mM リン酸緩衝生理食塩水）ｐＨ７．４であった。フローセルの温度を２５℃に、サンプルブロックの温度を１２℃に設定した。捕捉前に、フローセルを、ランニングバッファー２回で準備した。
【０４９４】
二重特異性抗体を、流量５μL/分で６０秒間にわたり１０nM溶液を注入することにより捕捉した。二重特異性抗体との各リガンドの独立した結合を、順次又は同時に加えた（３０μL/分の流量）、各リガンドについての活性な結合能力を決定することにより分析した：
１．１８０秒間にわたる濃度２００nMのヒトＶＥＧＦの注入（抗原の単独結合を同定する）。
２．１８０秒間にわたる濃度１００nMのヒトＡＮＧ２の注入（抗原の単独結合を同定する）。
３．１８０秒間にわたる濃度２００nMのヒトＶＥＧＦの注入と、それに続く１８０秒間にわたる濃度１００nMのヒトＡＮＧ２の追加注入（ＶＥＧＦの存在下でのＡＮＧ２の結合を同定する）。
４．１８０秒間にわたる濃度１００nMのヒトＡＮＧ２の注入と、それに続く濃度２００nMのヒトＶＥＧＦの追加注入（ＡＮＧ２の存在におけるＶＥＧＦの結合を同定する）。
５．１８０秒間にわたる、濃度２００nMのヒトＶＥＧＦ及び濃度１００nMのヒトＡＮＧ２の同時注入（ＶＥＧＦ及びＡＮＧ２の結合を同時に同定する）。
【０４９５】
流速３０μL/分での３M ＭｇＣｌ２溶液による６０秒間の洗浄により、表面を再生した。バルク屈折率の差を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ表面から得られた応答を減算することにより補正した。
【０４９６】
アプローチ３、４及び５の結果として得られた最終シグナルが、アプローチ１及び２の個々の最終シグナルの和と等しい又はそれと同様である場合、二重特異性抗体は、両方の抗原と互いに独立に結合することができる。結果を下記表において示し、そこでは、抗体VEGF/ANG2-0016、VEGF/ANG2-0012の両者が、ＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に互いに独立に結合することができることが示されている。
【０４９７】
抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体とのＶＥＧＦ及びＡＮＧ２の同時結合の評価
第１に、約１６００共鳴単位（ＲＵ）のＶＥＧＦ（２０μg/ml）を、GE Healthcareにより供給されるアミンカップリングキットを使用することにより、ｐＨ５．０で、CM4チップ（GE Healthcare BR-1005-34）上にカップリングさせた。試料及びシステム緩衝液は、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０mM リン酸緩衝生理食塩水）ｐＨ７．４であった。フローセルを２５℃に、サンプルブロックを１２℃に設定し、ランニングバッファー２回で準備した。第２に、二重特異性抗体の５０nM溶液を、流量３０μL/分で１８０秒間にわたり注入した。第３に、ｈＡＮＧ２を、流量３０μL／分で１８０秒間にわたり注入した。ｈＡＮＧ２の結合応答は、ＶＥＧＦと結合した二重特異性抗体の量に依存し、同時結合を示す。流速３０μL/分での０．８５％Ｈ３ＰＯ４溶液による６０秒間の洗浄により、表面を再生した。先にＶＥＧＦと結合した抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体への、ｈＡＮＧ２の追加の特異的な結合のシグナルにより、同時結合が示される。二重特異性抗体VEGF/ANG2-0015及びVEGF/ANG2-0016の両者について、抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体へのＶＥＧＦ及びＡＮＧ２の同時結合を検出することができた（データは示されていない）。
【０４９８】
【表１７】
2020196744.tif 000027
【０４９９】
【表１８】
2020196744.tif 000028
【０５００】
【表１９】
2020196744.tif 000029
【０５０１】
【表２０】
2020196744.tif 000030
【０５０２】
【表２１】
2020196744.tif 000031
【０５０３】
実施例４
質量分析法
このセクションでは、正確な組み立てに重点を置き、抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体の特徴付けを記載する。予想される一次構造を、脱グリコシル化された、インタクトな又はＩｄｅＳ消化された（S. pyogenesのＩｇＧ分解酵素）抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により確認した。ＩｄｅＳ消化は、精製抗体 １００μgを用い、これをＩｄｅＳプロテアーゼ（Fabricator） ２μg（１００mmol/L ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．１中）と共に、３７℃で５時間インキュベートして行った。その後、抗体を、１mg/mLのタンパク質濃度で、Ｎ−グリコシダーゼＦ、ノイラミニダーゼ及びＯ−グリコシダーゼ（Roche）（１００mmol/L ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．１中）を用い、３７℃で１６時間まで脱グリコシル化し、その後、セファデックス G25カラム（GE Healthcare）上でのＨＰＬＣにより脱塩した。全質量を、TriVersa NanoMateソース（Advion）を備えたmaXis 4G UHR-QTOF MSシステム（Bruker Daltonik）上で、ＥＳＩ−ＭＳにより決定した。
【０５０４】
ＩｄｅＳ消化して脱グリコシル化した（下記表）、又はインタクトで脱グリコシル化した（下記表）分子について得られた質量は、２つの異なる軽鎖ＬＣＡＮＧ２及びＬＣＬｕｃｅｎｔｉｓ、並びに２つの異なる重鎖ＨＣＡＮＧ２及びＨＣＬｕｃｅｎｔｉｓからなる抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体についてのアミノ酸配列から推定される予測質量に対応する。
【０５０５】
【表２２】
2020196744.tif 000032
【０５０６】
【表２３】
2020196744.tif 000033
【０５０７】
実施例５
Ｆｃ−Ｒｎクロマトグラフィー
ストレプトアビジンセファロースとのカップリング：
ビオチン化し、透析したレセプターに、ストレプトアビジンセファロース（GE Healthcare） １ｇを添加し、振盪しつつ２時間インキュベートした。レセプター誘導化セファロースを、１mL XKカラム（GE Healthcare）に充填した。
【０５０８】
ＦｃＲｎアフィニティーカラムを用いるクロマトグラフィー：
条件：
カラム寸法：５０mm×５mm
ベッド高さ：５cm
負荷：試料５０μg
平衡緩衝液：１５０mM ＮａＣｌを含む２０mM ＭＥＳ、ｐＨ５．５に調整
溶出緩衝液：１５０mM ＮａＣｌを含む２０mM トリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．８に調整
溶出：７．５ＣＶ平衡緩衝液、１００％溶出緩衝液へ（３０ＣＶ）、１０ＣＶ溶出緩衝液
【０５０９】
ヒトＦｃＲｎアフィニティーカラムクロマトグラフィー
ヒトＦｃＲｎを含むアフィニティーカラム上での抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体の保持時間を下記表に示す。データは前記条件下で得た。
【０５１０】
【表２４】
2020196744.tif 000034
【０５１１】
実施例６
ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴う抗体の薬物動力学的（ＰＫ）特性
ヒトＦｃＲｎについてトランスジェニックなＦｃ−Ｒｎマウスを用いたＰＫデータ
生存中相：
研究対象には、マウスＦｃＲｎ欠損であるが、ヒトＦｃＲｎ（huFcRn、系統２７６−／ｔｇ）についてはヘミ接合性トランスジェニックである、雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（バックグラウンド）を含めた。
【０５１２】
パート１：
全てのマウスに対し、２μL／動物の適切な溶液（即ち、２１μg化合物／動物（VEGF/ANG2-0015（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異なし））、又は２３．６μg化合物／動物（VEGF/ANG2-0016（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴う））を用いて、右眼中に１回、硝子体内注射を行った。
【０５１３】
マウスを、各６匹ずつ２群に割り振った。血液試料を、投与後、群１からは２、２４及び９６時間目に、群２からは７、４８及び１６８時間目に採取する。
【０５１４】
マウス右眼の硝子体内への注射は、ナノリットル注射用NanoFil Microsyringeシステム（World Precision Instruments, Inc., Berlin, Germany）を用いて実施した。２．５%イソフルランでマウスを麻酔し、マウス眼球の視覚化のために、Leica MZFL3顕微鏡（倍率４０倍、Leica KL2500 LCDによる照明（lightning）のリングライト併用）を使用した。その後、２μLの化合物を、３５ゲージ針を使用して注射した。
【０５１５】
血清中の化合物レベルの測定のために、各々の動物から、反対の眼の球後静脈叢を介して血液を採取した。
【０５１６】
室温で１時間置いた後の血液から、少なくとも５０μLの血清試料を、４℃で３分間の遠心分離（９３００ｘｇ）により得た。血清試料を、遠心分離の直後に凍結し、分析まで−８０℃で凍結保存した。処理した眼球を、群１の動物では処理後９６時間目に、群２の動物では処理後１６８時間目に単離した。試料を、分析まで−８０℃で凍結保存した。
【０５１７】
パート２：
全てのマウスに対し、２００μL／動物の適切な溶液（即ち、２１μg化合物／動物（VEGF/ANG2-0015（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異なし））、又は２３．６μg化合物／動物（VEGF/ANG2-0016（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴う））を用いて、尾静脈を介して１回、静脈内注射を行った。
【０５１８】
マウスを、各５匹ずつ２群に割り振った。血液試料を、投与後、群１からは１、２４及び９６時間目に、群２からは７、４８及び１６８時間目に採取する。血清中の化合物レベルの測定のために、各々の動物から、球後静脈叢を介して血液を採取した。
【０５１９】
室温で１時間置いた後の血液から、少なくとも５０μLの血清試料を、４℃で３分間の遠心分離（９３００ｘｇ）により得た。血清試料を、遠心分離の直後に凍結し、分析まで−８０℃で凍結保存した。
【０５２０】
全眼球溶解物（マウス）の調製
実験動物からの眼球全体の物理化学的分解により、眼球溶解物を得た。機械的破壊のために、各々の眼球を、底が円錐形の１．５mLマイクロバイアルに移した。凍結及び解凍後、細胞洗浄緩衝液（Bio-Rad, Bio-Plex Cell Lysis Kit, Cat. No. 171-304011） １mLを用いて、眼球を１回洗浄した。次工程において、新たに調製した細胞溶解緩衝液 ５００μLを添加し、１．５mL組織破砕用乳棒（Kimble Chase, 1.5 mL pestle, Art. No. 749521-1500）を用いて眼球を破砕した。次いで、混合物を５回凍結及び解凍し、再度粉砕した。残存組織から溶解物を分離するため、試料を、４５００×ｇで４分間遠心分離した。遠心分離後、上清を回収し、定量ＥＬＩＳＡにおける更なる分析まで、−２０℃で保存した。
【０５２１】
分析
マウス血清及び眼球溶解物中の抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体の濃度を、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて決定した。
【０５２２】
マウス血清試料及び眼球溶解物中の抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体の定量のため、捕捉抗体及び検出抗体としてビオチン化及びジゴキシゲニン化モノクローナル抗体を用いた、標準的な固相シリアルサンドイッチイムノアッセイを実施した。分析物の二重特異性の完全性を検証するため、ビオチン化捕獲抗体が、ＶＥＧＦ結合部位を認識するのに対し、ジゴキシゲニン化検出抗体は、分析物のＡＮＧ２結合部位に結合しうる。ストレプトアビジンコーティングしたマイクロタイタープレート（ＳＡ−ＭＴＰ）の固相上の、捕捉抗体、分析物及び検出抗体の結合免疫複合体を、次に、抗ジゴキシゲニン抗体とカップリングさせた西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて検出する。ＳＡ−ＭＴＰからの非結合物質を洗浄し、ＡＢＴＳ基質を添加した後、得られたシグナルは、ＳＡ−ＭＴＰの固相上に結合した分析物の量に比例している。次に、試料の測定シグナルを、並列で分析したキャリブレータを参照して濃度に変換することにより、定量を行う。
【０５２３】
第１工程において、ＳＡ−ＭＴＰを、１００μL/ウェルの、濃度１μg/mLのビオチン化捕捉抗体溶液（mAb<Id<VEGF>>M-2.45.51-IgG-Bi(DDS)、抗イディオタイプ抗体）により、ＭＴＰシェイカー上で１時間、５００rpmでコーティングした。その間に、キャリブレータ、ＱＣ−試料及び試料を調製した。キャリブレータ及びＱＣ−試料は、２%血清マトリクスに希釈する；試料を、シグナルがキャリブレータの直線範囲内になるまで希釈した。
【０５２４】
捕捉抗体でＳＡ−ＭＴＰをコーティングした後、洗浄緩衝液で、プレートを３００μL/ウェルで３回洗浄した。その後、１００μL/ウェルのキャリブレータ、ＱＣ−試料及び試料を、ＳＡ−ＭＴＰ上でピペッティングし、５００rpmで１時間再びインキュベートした。かくして、分析物は、その抗ＶＥＧＦ結合部位により、捕捉抗体を介してＳＡ−ＭＴＰの固相に結合した。インキュベート及び洗浄による非結合分析物の除去後、１００μL/ウェルの第１検出抗体（mAb<Id-<ANG2>>M-2.6.81-IgG-Dig(XOSu)、抗イディオタイプ抗体）（濃度２５０ng/mL）をＳＡ−ＭＴＰに添加した。プレートを、シェイカー上で５００rpmで１時間再度インキュベートした。洗浄後、１００μL/ウェルの第２検出抗体（pAb<ジゴキシゲニン>S-Fab-POD（ポリ））（濃度５０mU/mL）を、ＳＡ−ＭＴＰのウェルに加え、プレートを、５００rpmで１時間再度インキュベートした。過剰の検出抗体を除去するための最終洗浄工程後、１００μL/ウェルの基質（ＡＢＴＳ）を加える。抗体−酵素コンジュゲートは、ＡＢＴＳ（登録商標）基質の呈色反応を触媒する。次いで、ＥＬＩＳＡリーダーにより、波長４０５nm（参照波長：４９０nm（［４０５／４９０］nm））でシグナルを測定した。
【０５２５】
薬物動力学的評価
薬物動力学的評価プログラムWinNonlin（商標）（Pharsight）、バージョン５．２．１を用いて、非コンパートメント分析により薬物動態学的パラメータを算出した。
【０５２６】
結果：
Ａ）血清中濃度
血清中濃度についての結果を、下記表及び図７Ｂ〜７Ｃに示す。
【０５２７】
【表２５】
2020196744.tif 000035
【０５２８】
【表２６】
2020196744.tif 000036
【０５２９】
【表２７】
2020196744.tif 000037
【０５３０】
【表２８】
2020196744.tif 000038
【０５３１】
結果：
Ｂ）左眼及び右眼の眼球溶解物中の濃度
眼球溶解物中の濃度についての結果を、下記表及び図７Ｄ〜７Ｅに示す。
【０５３２】
【表２９】
2020196744.tif 000039
【０５３３】
【表３０】
2020196744.tif 000040
【０５３４】
【表３１】
2020196744.tif 000041
【０５３５】
【表３２】
2020196744.tif 000042
【０５３６】
結果の要約：
硝子体内適用後、本明細書において報告される二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体VEGF/ANG2-0016（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴う）は、ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異のない二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体であるVEGF/ANG2-0015に比して、同様の眼球溶解物中の濃度（９６及び１６８時間後）を示す。
【０５３７】
また、加えて、硝子体内適用後、本明細書において報告される二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体VEGF/ANG2-0016（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異を伴う）は、ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異のない二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体であるVEGF/ANG2-0015に比して、血清中でのより速いクリアランス及びより短い半減期を示す。
【０５３８】
実施例７
マウス角膜マイクロポケット血管形成アッセイ
各々、配列番号２０及び２１のＶＥＧＦ結合性ＶＨ及びＶＬ、並びに配列番号２８及び２９のＡＮＧ２結合性ＶＨ及びＶＬを有する、二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体の、インビボＶＥＧＦ誘導血管形成に対する抗血管形成効果を試験するために、マウス角膜血管形成アッセイを実施した。このアッセイにおいては、ＶＥＧＦを浸したNylafloディスクを、角膜縁血管までの距離を一定にして、無血管角膜のポケット内に埋め込んだ。血管は直ちに、角膜内の方に、発生中のＶＥＧＦ勾配に向かって成長する。８〜１０週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスを、Charles River（Sulzfeld, Germany）から購入した。プロトコールは、Rogers, M.S., et al., Nat. Protoc. 2 (2007) 2545-2550により記載された方法に従って改変する。簡単には、幅約５００μmのマイクロポケットを、麻酔したマウスにおいて、外科用ブレード及び鋭利なピンセットを用い、角膜縁から約１mmの位置に、角膜の上部に向かって、顕微鏡下で調製する。直径０．６mmのディスク（Nylaflo（登録商標）, Pall Corporation, Michigan）を埋め込み、埋め込んだ領域の表面を平滑化した。ディスクを、対応する成長因子又は賦形剤中で、少なくとも３０分間インキュベートする。３、５及び７日後（又は、これに替えて、３、５又は７日後だけ）、眼の写真を撮影し、血管応答を測定する。角膜の全面積当たりの、新たな血管の面積のパーセンテージを算出することにより、アッセイを数値化する。
【０５３９】
ディスクに３００ngのＶＥＧＦ、又は対照としてのＰＢＳを含ませ、７日間埋め込む。角膜縁からディスクまでの血管の伸長を、３、５及び／又は７日目に経時的にモニターする。ディスク埋め込みの１日前、１０mg/kgの用量で抗体を静脈内投与し、ＶＥＧＦ誘導性血管形成に対する抗血管形成効果をインビボで試験する（静脈内適用であるため、血清中で安定なVEGF/ANG2-0015（ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異なし）（VEGF/ANG2-0016とは、ＩＨＨ−ＡＡＡ突然変異だけが異なり、効力を媒介する同じＶＥＧＦ及びＡＮＧ２結合性ＶＨ及びＶＬを有する）を、代用物として使用する）。対照群における動物は、賦形剤を受ける。適用容積は１０mL/kgである。
【０５４０】
実施例８
ＨＨＹ−ＡＡＡ突然変異を伴う抗体の薬物動力学的（ＰＫ）特性
ヒトＦｃＲｎについてトランスジェニックなＦｃ−Ｒｎマウスを用いたＰＫデータ
生存中相：
研究対象には、マウスＦｃＲｎ欠損であるが、ヒトＦｃＲｎ（huFcRn、系統２７６−／ｔｇ）についてはヘミ接合性トランスジェニックである、雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（バックグラウンド）を含めた。
【０５４１】
パート１：
全てのマウスに対し、IGF-1R 0033、IGF-1R 0035、IGF-1R 0045の適切な溶液（即ち、22.2μg化合物／動物のIGF-1R 0033、２４．４μg化合物／動物のIGF-1R 0035、３２．０μg化合物／動物のIGF-1R及び３２．０μg化合物／動物のIGF-1R 0045）を用いて、右眼中に１回、硝子体内注射を行った。
【０５４２】
マウス１３匹を、各々６匹と７匹の２群に割り振った。血液試料を、投与後、群１からは２、２４及び９６時間目に、群２からは７、４８及び１６８時間目に採取する。
【０５４３】
マウス右眼の硝子体内への注射は、ナノリットル注射用NanoFil Microsyringeシステム（World Precision Instruments, Inc., Berlin, Germany）を用いて実施した。２．５%イソフルランでマウスを麻酔し、マウス眼球の視覚化のために、Leica MZFL3顕微鏡（倍率４０倍、Leica KL2500 LCDによる照明（lightning）のリングライト併用）を使用した。その後、２μLの化合物を、３５ゲージ針を使用して注射した。
【０５４４】
血清中の化合物レベルの測定のために、各々の動物から、反対の眼の球後静脈叢を介して血液を採取した。
【０５４５】
室温で１時間置いた後の血液から、少なくとも５０μLの血清試料を、４℃で３分間の遠心分離（９３００ｘｇ）により得た。血清試料を、遠心分離の直後に凍結し、分析まで−８０℃で凍結保存した。処理した眼球を、群１の動物では処理後９６時間目に、群２の動物では処理後１６８時間目に単離した。試料を、分析まで−８０℃で凍結保存した。
【０５４６】
パート２：
全てのマウスに対し、IGF-1R 0033、IGF-1R 0035、IGF-1R 0045の適切な溶液（即ち、２２．２μg化合物／動物のIGF-1R 0033、２４．４μg化合物／動物のIGF-1R 0035、３２．０μg化合物／動物のIGF-1R及び３２．０μg化合物／動物のIGF-1R 0045）を用いて、尾静脈を介して１回、静脈内注射を行った。
【０５４７】
マウス１２匹を、各６匹ずつ２群に割り振った。血液試料を、投与後、群１からは１、２４及び９６時間目に、群２からは７、４８及び１６８時間目に採取する。血清中の化合物レベルの測定のために、各々の動物から、球後静脈叢を介して血液を採取した。
【０５４８】
室温で１時間置いた後の血液から、少なくとも５０μLの血清試料を、４℃で３分間の遠心分離（９３００ｘｇ）により得た。血清試料を、遠心分離の直後に凍結し、分析まで−８０℃で凍結保存した。
【０５４９】
細胞溶解緩衝液の調製
ｆａｃｔｏｒ  １ １００μL、ｆａｃｔｏｒ  ２ ５０μL及び細胞溶解緩衝液 ２４．７３mL（いずれもBio-Rad, Bio-Plex Cell Lysis Kit, Cat. No. 171-304011）を注意深く混合し、ＰＭＳＦ溶液（フェニルメチルスルホニルフルオリド １７４．４mg、２．０mL ＤＭＳＯ中に希釈） １２５μLを添加する。
【０５５０】
全眼球溶解物（マウス）の調製
実験動物からの眼球全体の物理化学的分解により、眼球溶解物を得た。機械的破壊のために、各々の眼球を、底が円錐形の１．５mLマイクロバイアルに移した。解凍後、細胞洗浄緩衝液（Bio-Rad, Bio-Plex Cell Lysis Kit, Cat. No. 171-304011） １mLを用いて、眼球を１回洗浄した。次工程において、新たに調製した細胞溶解緩衝液 ５００μLを添加し、１．５mL組織破砕用乳棒（VWR Int., Art. No. 431-0098）を用いて眼球を破砕した。次いで、混合物を５回凍結及び解凍し、再度粉砕した。残存組織から溶解物を分離するため、試料を、４５００×ｇで４分間遠心分離した。遠心分離後、上清を回収し、定量ＥＬＩＳＡにおける更なる分析まで、−２０℃で保存した。
【０５５１】
分析（血清）
マウス血清試料中の抗体の定量のため、捕捉抗体及び検出抗体としてビオチン化及びジゴキシゲニン化モノクローナル抗体を用いた、標準的な固相シリアルサンドイッチイムノアッセイを実施した。血清は、全血液試料体積の約５０％を占める。
【０５５２】
より詳細には、マウス血清試料中の抗体の濃度を、ヒト−ＩｇＧ（Ｆａｂ）特異的な固相酵素免疫検定法を用いて決定した。ストレプトアビジンコーティングしたマイクロタイタープレートを、捕捉抗体としての、アッセイ緩衝液で希釈したビオチン化抗ヒトＦａｂ（ｋａｐｐａ）モノクローナル抗体Ｍ−１．７．１０−ＩｇＧと共に、撹拌しつつ室温で１時間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水−ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄後、種々の希釈度の血清試料を添加し、次いで第２のインキュベーションを室温で１時間行った。繰り返して３回洗浄後、これに続く、ジゴキシゲニンとコンジュゲートした抗ヒトＦａｂ（ＣＨ１）モノクローナル抗体Ｍ−１．１９．３１−ＩｇＧ、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした抗ジゴキシゲニン抗体とのインキュベーションにより、結合した抗体を検出した。ＨＲＰの基質としてＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）；Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を用い、呈色反応生成物を形成した。得られた反応生成物の吸光度を、４０５nm（ＡＢＴＳ；参照波長：４９０nm）で読み取った。
【０５５３】
全ての試料、陽性及び陰性対照試料は反復して分析し、提供された抗体標準品に対して校正した。
【０５５４】
分析（眼球溶解物）
マウス眼球溶解物試料における分析物の濃度は、非ＧＬＰ条件下での、ELECSYS（登録商標）機器プラットフォーム（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）に基づく適格（qualified）電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）を用いて決定した。
【０５５５】
希釈していない上清（眼球溶解物）を、捕捉及び検出分子と共に３７℃で９分間インキュベートした。ビオチン化抗ヒト−Ｆａｂ（ｋａｐｐａ）モノクローナル抗体Ｍ−１．７．１０−ＩｇＧを捕捉分子として用い、ルテニウム（ＩＩ）トリス（ビスピリジル）３２＋ラベル化抗ヒト−Ｆａｂ（ＣＨ１）モノクローナル抗体Ｍ−１．１９．３１−ＩｇＧを検出に用いた。ストレプトアビジンコーティングした磁性微粒子を加え、３７℃で９分間更にインキュベートして、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用により、先に形成された免疫複合体を結合させた。微粒子を電極上に磁気的に捕捉し、共反応剤のトリプロピルアミン（ＴＰＡ）を用いて化学発光シグナルを発生させた。得られたシグナルを、光電子倍増管検出器により測定した。
【０５５６】
【表３３】
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【０５５７】
【表３４】
2020196744.tif 000044
【０５５８】
【表３５】
2020196744.tif 000045
【０５５９】
結果：
Ａ）血清中濃度
血清中濃度についての結果を下記表及び図１７に示す。
【０５６０】
【表３６】
2020196744.tif 000046
【０５６１】
【表３７】
2020196744.tif 000047
【０５６２】
【表３８】
2020196744.tif 000048
【０５６３】
【表３９】
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【０５６４】
結果：
Ｂ）左眼及び右眼の眼球溶解物中の濃度
眼球溶解物中の濃度についての結果を、下記表及び図１８〜２０に示す。
【０５６５】
【表４０】
2020196744.tif 000050
【０５６６】
【表４１】
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【０５６７】
【表４２】
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【０５６８】
【表４３】
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【０５６９】
【表４４】
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【０５７０】
【表４５】
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【０５７１】
【表４６】
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【０５７２】
結果の要約：
硝子体内適用後、本明細書において報告される抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体0035及び0045（一方又は両方にＨＨＹ−ＡＡＡ突然変異を伴う）は、ＨＨＹ−ＡＡＡ突然変異のない抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（IGF-1R 0033）に比して、同様の眼球溶解物中の濃度（９６及び１６８時間後）を示す。
【０５７３】
また、加えて、硝子体内適用後、本明細書において報告される抗IGF-1R抗体0035及び0045（一方又は両方にＨＨＹ−ＡＡＡ突然変異を伴う）は、ＨＨＹ−ＡＡＡ突然変異のない抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（IGF-1R 0033）に比して、血清中でのより速いクリアランス及びより短い半減期を示す。
【０５７４】
上記発明は、理解を明確にするために説明及び例によっていくらか詳細に記載してきたが、その説明及び例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきものではない。本明細書において引用する全ての特許及び科学的文献の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月24日(2020.9.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体であって、
第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含み、該第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは各々、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１個以上のシステイン残基を含む、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含み、
ｉ）該第１のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、該第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）該第１のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、該第２のポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含む、
抗体。
【請求項２】
ｉ）前記第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを更に含み、前記第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを更に含むか、又はｉｉ）前記第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを更に含み、前記第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを更に含む、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び前記免疫グロブリンＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである、請求項１又は２記載の抗体。
【請求項４】
前記第１のＦｃ領域ポリペプチド及び前記第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを更に含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体。
【請求項５】
前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び前記免疫グロブリンＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ２サブクラスのものである、請求項１又は２記載の抗体。
【請求項６】
前記免疫グロブリンヒンジ領域、前記免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及び前記免疫グロブリンＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ４サブクラスのものである、請求項１又は２記載の抗体。
【請求項７】
前記第１のＦｃ領域ポリペプチド及び前記第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを更に含む、請求項１、２及び６のいずれか１項記載の抗体。
【請求項８】
前記第１のＦｃ領域ポリペプチド及び前記第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｐ３２９Ｇを更に含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の抗体。
【請求項９】
二重特異性抗体である、請求項１〜８のいずれか１項記載の抗体。
【請求項１０】
抗体であって、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第１のＦｃ領域ポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第２のＦｃ領域ポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第３のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第４のポリペプチド
を含み、
該第１の重鎖可変ドメインと該第１の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第１の結合部位を形成し、
該第２の重鎖可変ドメインと該第２の軽鎖可変ドメインは、第２の抗原と特異的に結合する第２の結合部位を形成し、
ｉ）該第１のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、該第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含むか、又はｉｉ）該第１のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、該第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、
該第１及び第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを更に含み、
ｉ）該第１のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、該第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）該第１のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、該第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含む、
抗体。
【請求項１１】
抗体であって、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第１のＦｃ領域ポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の重鎖可変ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、第２のＦｃ領域ポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の軽鎖可変ドメイン及びサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含む、第３のポリペプチド、
Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２の軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、第４のポリペプチド
を含み、
該第１の重鎖可変ドメインと該第１の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原と特異的に結合する第１の結合部位を形成し、
該第２の重鎖可変ドメインと該第２の軽鎖可変ドメインは、第２の抗原と特異的に結合する第２の結合部位を形成し、
ｉ）該第１のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、該第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含むか、又はｉｉ）該第１のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、該第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、
該第１及び第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを更に含み、
ｉ）該第１のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、該第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、
ｉｉ）該第１のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、該第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含む、
抗体。
【請求項１２】
硝子体内適用のための、請求項１〜１１のいずれか１項記載の抗体。
【請求項１３】
眼血管疾患処置用の、請求項１〜１１のいずれか１項記載の抗体。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項記載の抗体及び場合により薬学的に許容し得る担体を含む医薬処方物。
【請求項１５】
可溶性のレセプターリガンドを、血液−眼関門を抜けて眼から血液循環に輸送するための、請求項１〜１１のいずれか１項記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
１種以上の可溶性のレセプターリガンドを眼から除去するための、請求項１〜１１のいずれか１項記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
眼疾患の処置に使用するための、請求項１〜１１のいずれか１項記載の抗体。
【外国語明細書】
2020196744000001.pdf