(57)【要約】【課題】本発明は、ワクチン調製に使用することができるアジュバント特性を有する特定のポリフェノール(類)に関する。【解決手段】本発明は、前記ポリフェノール(類)と、免疫刺激再構成インフルエンザビロソーム(IRIV)のような送達システムとを含むアジュバントシステムを提供する。本発明は、前記ポリフェノール(類)、又はそのようなポリフェノール(類)とIRIVとを含むアジュバントシステムが、慣用的なワクチンシステムよりも、目的の抗原に対する免疫応答をより良いレベルで提供することができることを示す。本発明の好ましいポリフェノールは、ベータ−シトステロールであり得る。場合により、ベータ−シトステロールを既知のアジュバントと組み合わせて、免疫応答を増強することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）抗原と；
（ｂ）アジュバントとしてのベータ−シトステロールと
を含む免疫原性組成物。
【請求項２】
送達システム又は第二のアジュバントをさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
ビロソームである、請求項２に規定の送達システム。
【請求項４】
免疫刺激再構成インフルエンザビロソーム(IRIV)又は呼吸器合胞体ウイルスビロソームである、請求項３に規定のビロソーム。
【請求項５】
第二のアジュバントが、アルムベースのアジュバント、金属塩アジュバント、完全フロイントアジュバント(CFA)、不完全フロイントアジュバント(IFA)、モンタニド、MF59及びアジュバント65、細菌由来のアジュバント、親油性アジュバント、疎水性アジュバント及びそれらの組み合わせから選択される、請求項２に規定のアジュバント。
【請求項６】
金属塩アジュバントが、カルシウム、鉄及びジルコニウム又はそれらの適切な組み合わせの塩から選択される、請求項５に記載のアジュバント。
【請求項７】
親油性アジュバントが、テロルメディックス、モノリン脂質A、グルコピラノシル脂質アジュバント及びそれらの適切な組み合わせから選択される、請求項５に記載のアジュバント。
【請求項８】
（ａ）ベータ−シトステロールと；
（ｂ）免疫刺激再構成インフルエンザビロソーム又は第二のアジュバント(IRIV)と
を含む、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
（ａ）抗原の調製工程と；
（ｂ）抗原と改変ビロソームを配合する工程、又は第二のアジュバントと抗原とを含む混合物を調製する工程と；
（ｃ）抗原を有する改変ビロソームへの、又は第二のアジュバントと抗原とを含む混合物へのベータ−シトステロールの添加工程と
を含む、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物の調製方法。
【請求項１０】
ビロソームが、免疫刺激再構成インフルエンザビロソーム(IRIV)である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第二のアジュバントを、アルムベースのアジュバント、金属塩アジュバント、完全フロイントアジュバント(CFA)、不完全フロイントアジュバント(IFA)、モンタニド、MF59及びアジュバント65、細菌由来のアジュバント、親油性アジュバント、疎水性アジュバント又はそれらの適切な組み合わせから選択することができる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
場合により、抗原に対する免疫応答を誘導するための１種以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を有する、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物を含む医薬組成物。
【請求項１３】
抗原に対する免疫応答を誘導するための、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物を含むワクチン。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の適切な用量を投与する工程を含む、それを必要とする患者の免疫応答を刺激する方法。
【請求項１５】
抗原が、細菌、ウイルス、寄生物及び真菌から選択される感染物である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
抗原が、組み換え抗原又は抗原性ペプチド又はウイルス様粒子である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
抗原が、リーシュマニア、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、E型肝炎ウイルス(HEV)、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、結核、単純ヘルペスウイルス(HSV)、マラリアの原因となる寄生虫、ヒトパピローマウイルス(HPV)、PCSK9ペプチド、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、エボラウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、西ナイルウイルス(WNV)又はそれらの組み合わせから選択される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
以下の工程を含む、請求項１から１７の一項に記載のベータ−シトステロールの抽出方法：
（ａ）植物システムの異なる有機物の単離；
（ｂ）単離した有機物からの植物油の抽出；
（ｃ）抽出した植物油からの、所望の成分、好ましくはフラボノイド類もしくはポリフェノール類の抽出；
（ｄ）ポリフェノール類の混合物からのベータ−シトステロールの分離。
【請求項１９】
以下の工程を含む、請求項１８に記載のベータ−シトステロールの抽出方法：
（ａ）柑橘類果実のフラベドの単離；
（ｂ）フラベドからの植物油の抽出；
（ｃ）抽出した植物油からの、所望の成分、好ましくはフラボノイド類もしくはポリフェノール類の抽出；
（ｄ）ポリフェノール類の混合物からのベータ−シトステロールの分離。
【請求項２０】
溶媒抽出法もしくはマイクロ波抽出もしくはCO2法との超臨界流体抽出、又はこれらの組み合わせを用いることにより実行される、請求項１８に記載の所望の成分の抽出方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載のCO2法との超臨界流体抽出が500バールの圧力で実行される、抽出方法。
【請求項２２】
ヒト用量１回あたり抗原1μｇから1000μｇ、好ましくはヒト用量１回あたり抗原1μｇから500μｇ、より好ましくはヒト用量１回あたり抗原5μｇから250μｇの濃度範囲で存在する、請求項１から２１のいずれか一項に規定の抗原。
【請求項２３】
ヒト用量１回あたりベータ−シトステロール1μｇから200μｇ、好ましくはヒト用量１回あたりベータ−シトステロール5μｇから100μｇ、より好ましくはヒト用量１回あたりベータ−シトステロール20μｇから50μｇの量で存在する、請求項１から２２のいずれか一項に規定のベータ−シトステロール。
【請求項２４】
ヒト用量１回あたり第二のアジュバント溶液又は送達システム0.01mlから5ml、好ましくはヒト用量１回あたり第二のアジュバント溶液又は送達システム0.02mlから2ml、より好ましくはヒト用量１回あたり第二のアジュバント溶液又は送達システム0.05mlから1mlの量で存在する、請求項１から２３のいずれか一項に規定の第二のアジュバント溶液又は送達システム。
【請求項２５】
ヒト用量１回あたり抗原1μｇから500μｇ、好ましくはヒト用量１回あたり抗原5μｇから80μｇ、より好ましくはヒト用量１回あたり抗原5μｇから25μｇの濃度範囲で存在する、請求項１６に規定の組み換え抗原又はウイルス様粒子、あるいは
ヒト用量１回あたり抗原1μｇから500μｇ、好ましくはヒト用量１回あたり抗原50μｇから500μｇ、より好ましくはヒト用量１回あたり抗原50μｇから250μｇの濃度範囲で存在する、請求項１６に規定の抗原ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン調製に使用することができるアジュバント特性を有する特定のポリフェノール(類)に関する。また、本発明は、前記ポリフェノール(類)と、免疫刺激再構成インフルエンザビロソーム(immunostimulating reconstituted influenza virosome) (IRIV)のような送達システムとを含むアジュバントシステムを提供する。本発明は、前記ポリフェノール(類)、又はそのようなポリフェノール(類)とIRIVとを含むアジュバントシステムが、慣用的なワクチンシステムよりも、目的の抗原に対する免疫応答をより良いレベルで提供することができることを示す。本発明による好ましいポリフェノールは、ベータ−シトステロールであり得る。ベータ−シトステロールを、場合により既知のアジュバントと組み合わせて、免疫応答を増強することができる。
【背景技術】
【０００２】
現在研究されているワクチン抗原の大部分は、高度に精製された病原体の組み換え分子もしくはサブユニットからなり、従ってそれらは、固有の免疫刺激を含む病原体の複数の特徴を欠いており、従って強い免疫応答を引き起こさないことがしばしばある。多数のアジュバントが調査されているにも関わらず、アルミニウムベースの金属塩（アルム）が、いまだにヒトワクチンに承認されたアジュバントとして最も多く使用されて続けている。アルムは良好な安全実績を有しており、抗体反応により防ぐことができる感染に対するワクチン化に対するアジュバントの選択肢とみなされており、従って多くの認可されたワクチンで広くかつ成功して使用されている。しかし、アルムの複数の制限もまたよく知られている。アルムは、低サイズのペプチド、ならびに腸チフスやインフルエンザワクチンのような特定のワクチンに対する抗体反応を十分に増大させることができない。特に、アルムは、複数の致命的な感染に対抗するために必要な細胞傷害性Ｔ細胞免疫及び1型ヘルパーＴ(Th1)応答の誘導に対して不十分なアジュバントとして知られている(Vaccine 28 (2010) 2363-2366)。従って、現在まで伝統的なワクチン戦略に耐性である病原体に対するワクチンの開発をサポートし、かつ利用可能な認可アジュバントの限界を克服する新規なアジュバントの開発が緊急に必要とされている。
【０００３】
鉱物塩、無毒化された毒、リポペプチド、エマルジョン、サイトカイン、多糖、核酸等を含む、新規のアジュバントの開発に焦点を当てた多大な努力がなされたにもかかわらず、ヒトの使用に現在承認されたものはほとんどない。新規のアジュバントの開発における主な難点は、局所的もしくは全身的でありうる望ましくない副作用、製造の困難性、低い安定性及び高い製造コストに関する。
【０００４】
その優勢な作用メカニズムに基づいて、アジュバントを、2つのクラス：免疫強化物質及び送達システムに分類できる。免疫強化物質は、固有の免疫を、直接（例えばサイトカイン）、又は（細菌成分などの）パターン認識レセプター(PRR)を介して活性化する一方、送達システム（例えばマクロ粒子及びナノ粒子）は、抗原を濃縮し、反復パターンで抗原を提示し、抗原提示細胞(APC)にワクチン抗原を標的化し、抗原と免疫強化物質の共局在を援助する。従って、免疫強化物質及び送達システムの両方がインビボで抗原特異的免疫応答の増大に役立ちうる。
【０００５】
最初のアジュバントは、1926年、アルムに吸着したジフテリアトキソイドで実験的に発見された。それ以来、数十年の研究にもかかわらず、数個のアジュバントのみが、主な市場においてヒトに使用するために認可されている。アルムよりもより強力であると評価されるにかかわらず、現在までに発見されているアジュバントのほとんどは、その局所的又は全身的な毒性のためにヒトの使用に適さないと考えられている。従って、アジュバント研究における主な挑戦の一つは、有効性を得る一方で毒性を最小化することである。この目的を達成する困難性は、80年以上前に最初に発見されたにもかかわらず、アルムが今日でも使用される主要なヒトアジュバントであり続けているという事実に反映されている。
【０００６】
ここで本発明は、ワクチン調製に使用できるアジュバント特性を有する選択されたポリフェノール(類)を提供する。これらのポリフェノール(類)は、好ましくは植物ステロール類である。本発明は、標的抗原(類)に対するワクチンを調製するためのアジュバントとしての選択されたポリフェノール、好ましくはベータ−シトステロールを提供する。
【０００７】
「蓄積されている証拠によると、選択されたビタミンと、集団で栄養アジュバントと呼ばれる、フラボノイドであるポリフェノール類のサブクラスが、免疫調節特性を有することが示唆される。ほとんどのビタミン及びフラボノイドが、免疫増強用の食品サプリメントとして使用されてきている。植物油中に配合された選択されたビタミンとフラボノイドの組み合わせが、抗原と共投与され、粘膜（経鼻及び舌下）ならびに全身性（筋肉内）経路を経由して与えられた場合に、免疫応答を相乗効果的に増強した。しかし、免疫制御特性を有することが知られている、フラボノイド類を含む全ての植物ステロールがアジュバントして機能するわけではない。複数のフラボノイドは、免疫増強特性を有する；その同じフラボノイドに対するインビトロ及びインビボの他の研究により、免疫抑制効果が示唆される。選択されたビタミンとフラボノイドのそれぞれの食品サプリメントが、組み合わせて免疫増強もしくは免疫抑制効果を誘導しうる」(Expert Opin. Biol. Ther. (2011) 11(11):1501-1513)。この文献は、その免疫抑制又は免疫増強特性に関するフラボノイドの不確かさを示す。さらに、栄養サプリメントとしてビタミンと組みわせたフラボノイド類の使用が示唆される。
【０００８】
特に、本発明は、標的抗原と、単独のアジュバントとして植物ステロール類を含有する新規のワクチン組成物を提供する。そのような本発明の新規のワクチン組成物は、アルムもしくは他の慣用的なアジュバント(類)とともに標的抗原を含む組成物と比較して、標的抗原に対して驚くほど高い免疫応答を提供する。さらに、本発明は、前記ポリフェノール(類)と、免疫刺激再構成インフルエンザビロソーム(IRIV)のような適切な送達システムを含む新規アジュバントシステムを提供する。
【０００９】
リンゴポリフェノール抽出物(APE)の研究の一つは、最適な用量のAPEの共投与により、天然のコレラ毒素(CT)の粘膜アジュバント活性を改変することなく、CT毒素を劇的に緩和し、マウスモデルの粘膜及び全身区分においてAg特異的体液免疫を誘導するという証拠を提供している。このような発見は、CTのアジュバント性及び毒性に対するAPEの生物学的効果は用量依存的であることを示した(Vaccine 27 (2009) 4808-4817)。再び、それはコレラ毒アジュバントと組み合わせてリンゴ果実から抽出したポリフェノールを使用することにより、コレラ毒素を緩和することを示唆する。APEは、ここでアジュバントとしては評価されていなかった。
【００１０】
WO 2005/117958は、封入型ウイルス、特にインフルエンザウイルス由来の抗原と、サポニンアジュバントを含有する前記ウイルスからのビロソーム調製物を提供する。特に本発明は、場合によりステロールとともにインフルエンザ抗原QS21を含有するインフルエンザウイルスからのビロソーム調製物を提供する。適切なステロールは、ベータ−シトステロール、スティグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール及びコレステロールを含み、コレステロールが好ましい。これらのステロールは当業者によく知られており、例えばコレステロールは、メルクインデックス第11版、341頁に、動物の脂肪にみられる天然に発生するステロールとして開示されている。前記組成物は、サポニンに関連したビロソームのアジュバント効果を維持する一方、サポニンアジュバントを含有する非ビロソームインフルエンザ製剤と比較して反応原性(reactogenicity)が減少するという利点を有する。この特許出願は、サポニンのアジュバント効果を維持し、アジュバント効果を有するサポニンと組み合わせたその使用を示唆するためのステロールの使用を開示する。
【００１１】
「選択ビタミン類、並びに薬学的に許容できる有機及び無機担体を含む種々の送達システムにおいて植物ベースのポリフェノールの組み合わせからなる栄養免疫増強送達システム(Nutritive Immune-enhancing Delivery System)(NIDS)は、NIDSでの粘膜及び全身ワクチン化に続く、マウスモデルにおける局所及び全身免疫応答の両方を増強することが知られている」(J Vaccines Vaccin 2012, 3:4-74)。再び、それはビタミン類と組み合わせてポリフェノールを使用して、免疫応答を増強することを示唆している。ここで、ポリフェノールは、種々の一般的な用語で開示される。多数のポリフェノール類が、免疫を増強する食品サプリメントとして一般的に使用されるものとして存在している。それらのいずれも、標的抗原に対するワクチン調製のためのアジュバントとして評価されていない。
【００１２】
本明細書で参照され、議論される先行技術は、ワクチン組成物において使用される既知のアジュバントのアジュバント特性を維持するために、ポリフェノール又はステロールを使用することを示唆している。それは、免疫応答の増強のための単独のアジュバントとしてポリフェノール又はステロールを使用することを提供しない。ここで、本発明において、本発明者は、標的抗原に対する免疫応答を増強するためのアジュバントとして、選択される植物ステロール、好ましくはベータ−シトステロールを発見した。さらに、本発明で開示されるアジュバントは、より高い免疫応答の提供において、数個の抗原に限定されない。それは、ペプチド抗原、組み換え抗原、ウイルス様粒子ベースの抗原、ビロソーム形態の抗原等の種々の抗原に対してより高い免疫応答を提供することができる。
【００１３】
「多数の挑戦が、アジュバント開発に関連し続けている。実際には、単一の免疫刺激物もしくは送達システムのいずれも、全ての新規ワクチンに必要とされる広範で長期間継続する免疫を誘導するために十分であろうとは考えにくい。効果的なアジュバントシステムは、1つ又は複数の免疫刺激物と、担体もしくは送達システムとの間の相乗効果を必要としているようである。さらに、アジュバント配合及び特性評価は標準化されていないために、異なる研究室で、もしくは同じ研究室においてさえ、解析されたアジュバントを比較することが不可能であることがしばしばある。さらに、各抗原は異なる固有の免疫原性を有し、免疫刺激物及び担体と異なる仕様で相互作用し、抗原の物理化学的もしくは免疫学的特性に基づき最適なアジュバントを選択することを可能とする信用できるアルゴリズムは存在しない」(Trends in Immunology, Vol.30, No.1, p23-32)。このような状況で、本発明は、副作用なしに、種々の抗原に対する驚くほど高い免疫応答を提供することができる単一のアジュバントを提供する。さらに、そのようなアジュバントは、IRIVのような送達システム、及びアルムのような免疫増強剤などの他の既知のアジュバントと相乗効果を有する。従って、本発明は、本発明の新規のアジュバントと他のアジュバントの間で相乗効果がある、新規のアジュバントシステムを提供する。アジュバントシステムに対するチャレンジは、各成分が相互に相乗効果を発揮して、より頑強な免疫応答を導き出すことができる、効果的で安全な製剤のための最良の組み合わせを規定することであることがよく知られている。従って、全ての既知のアジュバントが、既知の他のアジュバントと効果的にはたらくことができるわけではない一方、本発明は、標的抗原に対する驚くべき高い免疫応答を提供することができる、新規アジュバントベータ−シトステロールと他の既知のアジュバントを含むアジュバントシステムを提供する。
【００１４】
ビロソーム：
インフルエンザビロソームは、ヒトにおいて優れた安全性及び寛容性プロファイルを有するワクチン担体／アジュバントシステムであることが臨床的に証明されている。ワクチンとしてのインフルエンザビロソームは、欧州、アジア及びアメリカで7千万人に広まっているように分散されている。ビロソーム送達システムの、外因性及び内因性経路の両方を介する抗原プロセシングを仲介する能力は、担体を、良好な試験候補とする。IRIVのアジュバント特性は、例えばWO 92/19267から当業者に既知であり、カップリングされた抗原に対するIRIVのアジュバント効果が開示されている。
【００１５】
しかし、アジュバントとしてのビロソームの使用は、例えば低い毒性及び高い免疫原性のような多数の利点があるにもかかわらず、現在のワクチン学における問題の一つは、低い免疫原性抗原の必要とされる免疫原性が欠けていることである。従って、リポソーム又はビロソームのような送達システムと一緒の、免疫応答を上昇することができるアジュバントの組み合わせが好ましい。サブユニットワクチンについて、送達システム、アジュバントのような免疫増強剤、及び単離した抗原の組み合わせが、最適な免疫応答を導き出すために非常に望ましい。多くの場合、さらなるアジュバント、例えばアルムアジュバントの高い極性がビロソームを変形し、MF-59のようなスクアレンベースのアジュバントはビロソーム膜を安定化するため、ビロソーム製剤に対するさらなるアジュバントの付加は、ビロソーム配合物の免疫学的特性を破壊する。それは、送達システム及び／又は免疫増強剤を含むアジュバントシステムの開発が困難であることを示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】WO 2005/117958
【特許文献２】WO 92/19267
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Vaccine 28 (2010) 2363-2366
【非特許文献２】Expert Opin. Biol. Ther. (2011) 11(11):1501-1513
【非特許文献３】Vaccine 27 (2009) 4808-4817
【非特許文献４】J Vaccines Vaccin 2012, 3:4-74
【非特許文献５】Trends in Immunology, Vol.30, No.1, p23-32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って、免疫原性組成物の調製に使用することができる効果的な免疫増強アジュバントシステムを開発し、所望の抗原に対する優れた体液性及び細胞性免疫応答を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
ここで、本願において、本発明者は、各システムの免疫刺激効果を破壊することなく、植物ステロール類、好ましくはベータ−シトステロールと、免疫刺激再構成インフルエンザビロソーム(TRIV)の新規な組み合わせを開発した。驚くべきことに、そのようなアジュバントシステムは、ビロソーム単独よりも、より高い刺激効果を示した。
【００２０】
最初の態様において、本発明は、標的抗原に対するワクチン調製のためのアジュバントとして、特定のポリフェノール(類)を提供する。
【００２１】
好ましい態様において、ポリフェノール(類)は、好ましくはフラボノイド類のような植物ステロール類であり、より好ましくはベータ−シトステロールである。
【００２２】
第二の態様において、本発明は、特定のポリフェノール類と適切な送達システムを含む新規のアジュバントシステムを提供する。好ましくは、ポリフェノール類はベータ−シトステロールであり、送達システムは本発明によるIRIVである。
【００２３】
第三の態様において、本発明は、本発明のポリフェノール(類)とともに所望の抗原を含む免疫原性組成物を提供する。
【００２４】
さらなる態様において、本発明は、所望の抗原と、本明細書に記載のIRIVのような適切な送達システムとの本願発明のポリフェノール(類)の組み合わせとを含む免疫原性組成物を提供する。
【００２５】
第四の態様において、本発明は、所望の抗原と、第二のアジュバントとして他の既知のアジュバント（複数可）との本願発明のポリフェノール類の組み合わせとを含む免疫原性組成物を提供する。
【００２６】
態様の一つにおいて、所望の抗原は、細菌、ウイルス、寄生物及び真菌から選択される感染物を含む。好ましい態様において、所望の抗原は、ウイルスの単離断片、又はウイルス全体、又は寄生物の単離断片、又は真菌の単離断片である。本発明の単離断片は、所望の抗原の構造タンパク質でありうる。
【００２７】
第五の態様において、本発明は、野菜又は果物のような植物起源の、ポリフェノール(類)、好ましくはフラボノイドの抽出方法を提供する。
【００２８】
第六の態様において、本発明は、所望の抗原と、ポリフェノール、好ましくはベータ−シトステロールとを含む免疫原性組成物の調製方法を提供する。
【００２９】
さらなる態様において、本発明は、ポリフェノール類と適切な送達システムとを含むアジュバントシステムの調製方法を提供する。好ましくは、送達システムは、本発明のIRIVである。
【００３０】
第七の態様において、本発明は、感染因子又は発がん性もしくは病原性薬剤又は標的タンパク質に対するワクチンを開発するためのアジュバントとしてのフィトフェノール(類)の使用を提供する。
【００３１】
第八の態様において、本発明は、感染因子又は発がん性もしくは病原性薬剤又は標的タンパク質に対するワクチンを開発するためのビロソーム(IRIV)及びフィトフェノール(類)を含むアジュバントシステムの使用を提供する。
【００３２】
さらなる態様において、本発明は、感染因子又は発がん性もしくは病原性薬剤又は標的タンパク質に対するワクチンを開発するための、第二のアジュバントとしての既知のアジュバント（複数可）とフィトフェノール(類)を含むアジュバントシステムの使用を提供する。
【００３３】
好ましい態様において、本発明は、保護レベルの免疫応答を誘導する、抗原とのアジュバントシステムの組み合わせを提供する。
【００３４】
第九の態様において、本発明は、薬学的に許容可能な適切な担体又は賦形剤とともに、本発明のアジュバント又はアジュバントシステムと、所望の抗原を含む免疫原性組成物を含む、免疫原性分子（所望の抗原）に対する免疫応答を誘導するための医薬組成物を提供する。
【００３５】
第十の態様において、本発明は、種々の抗原に対する、本発明の免疫原性組成物を含むワクチンを提供する。これらのワクチンを、慣用的な経路及び用量で投与することができる。
【００３６】
態様の一つにおいて、本発明の抗原の効果的な用量又は有効量は、ヒト用量１回あたり抗原1μｇから1000μｇ、好ましくはヒト用量１回あたり抗原1μｇから500μｇ、より好ましくはヒト用量１回あたり抗原5μｇから250μｇである。
【００３７】
好ましい態様において、本発明の組み換え抗原又はVLPベースの抗原の効果的な用量又は有効量は、ヒト用量１回あたり抗原1μｇから500μｇ、好ましくはヒト用量１回あたり抗原5μｇから80μｇ、より好ましくはヒト用量１回あたり抗原5μｇから25μｇである。
【００３８】
別の態様において、本発明の抗原性ペプチドの効果的な用量又は有効量は、ヒト用量１回あたり抗原1μｇから500μｇ、好ましくはヒト用量１回あたり抗原50μｇから500μｇ、より好ましくはヒト用量１回あたり抗原50μｇから250μｇである。
【００３９】
さらなる態様において、本発明のベータ−シトステロールの効果的な量は、ヒト用量１回あたりベータ−シトステロール1μｇから200μｇ、好ましくはヒト用量１回あたりベータ−シトステロール5μｇから100μｇ、より好ましくはヒト用量１回あたりベータ−シトステロール20μｇから50μｇである。
【００４０】
別の態様において、本発明の第二のアジュバントの効果的な量は、ヒト用量１回あたりアジュバント1μｇから1000μｇ、好ましくはヒト用量１回あたりアジュバント1μｇから900μｇ、より好ましくはヒト用量１回あたりアジュバント2μｇから500μｇである。
【００４１】
別の態様において、本発明の第二のアジュバント又は送達システムの溶液の効果的な量は、ヒト用量１回あたりアジュバント溶液又は送達システム0.01mlから5ml、好ましくはヒト用量１回あたりアジュバント溶液又は送達システム0.02mlから2ml、より好ましくはヒト用量１回あたりアジュバント溶液又は送達システム0.05mlから1mlである。
【００４２】
一つの態様において、本発明は、本明細書に開示の免疫原性組成物を適切な用量で投与する工程を含む、それを必要とする患者の免疫応答を刺激する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】インフルエンザA/シンガポール/6/86(H1N1)に対する全長IgG抗体の血清力価を示す。
【図２】インフルエンザA/シンガポール/6/86(H1N1)に対する全長IgG2a抗体の血清力価を示す。
【図３】インフルエンザA/シンガポール/6/86(H1N1)に対する全長IgG1抗体の血清力価を示す。
【図４】ガルダシル(Gardasil)（グループＡ）、水酸化アルミニウムを配合したHPVワクチン（グループＢ）、ベータ−シトステロールを配合したHPVワクチン（グループＣ）及び陰性対照としてPBS（リン酸緩衝食塩水）で免疫化したマウスにおいて導き出された抗HPV16L1及び抗HPV18L1中和抗体力価を示す。グループ間の力価における差異の統計的有意性を、一元ノンパラメトリック分散分析により決定した。P<0.05を統計的に有意であるとみなした。有意性を、ガルダシルグループに対して計算した（*は有意性のレベルを示し、ＮＳは有意でないことを示す）。抗体力価を、log10IC50±S.Dとして表示する。
【図５】ヒト適合性アジュバントAlヒドロゲル、ベータ−シトステロール及びモンタニド(Montanide)ISA720と配合したPfMSPFu24+PfF2又はPfMSPFu24で免疫化したマウス由来の血清の成長阻害活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明は、標的タンパク質に対するワクチン調製物のためのアジュバントとしての特定のポリフェノール(類)の使用に関する。
【００４５】
本発明によるポリフェノール(類)を、植物（柑橘類果実若しくは野菜）のような天然資源から採取することができる。それをまた本発明により化学的に合成することもできる。「ポリフェノール」もしくは「植物ステロール」もしくは「フラボノイド」の語を、本発明では相互に置換して使用することができる。ポリフェノール類は、抗酸化特性を有する天然植物食物資源に豊富にみられる化合物を意味する、植物化学物質である。茶、ワイン、チョコレート、果物、野菜及び一番搾りのオリーブオイルのような食物にみられる8000種を超えるポリフェノールが同定されている。
【００４６】
態様の一つにおいて、ポリフェノール(類)は、好ましくは、ステロールのような植物ステロール及び他のフラボノイドである。植物ステロール(類)を、シトステロール、スティグマステロール、カンペステロール、コレステロール等から選択することができる。フラボノイドを、フラボン類、イソフラボン類、フラボノール類、カテキン類、フラボノン類、アントシアニン類、プロアントシアニジン類等から選択することができる。植物ステロール及び他のフラボノイド類が免疫制御特性を有すると知られていることは公知である。それらの栄養サプリメントとしての適用も、当業者に公知である。しかし、免疫制御特性を有するすべてのステロール類がワクチン調製物においてアジュバントとして作用するわけではない。
【００４７】
本発明は、標的タンパク質に対するワクチンを調整するためのアジュバントとしての植物ステロールとして好ましく選択される特定のポリフェノール類を提供する。好ましい態様において、本発明のポリフェノール類は、ベータ−シトステロール、カンペステロールナリゲニン、ネオヘスペリジンから選択される。より好ましい態様において、本発明のアジュバントとして使用されるポリフェノール類は、ベータ−シトステロールである。
【００４８】
特定の態様において、本発明は、標的抗原と、ポリフェノール類、好ましくは植物ステロール類とを含有するワクチン組成物を提供する。アジュバントとして選択された植物ステロール、好ましくはベータ−シトステロールを含むそのようなワクチン組成物は、他の既知の植物ステロール類もしくはIRIV（ヒトワクチンに承認されたアジュバント）もしくはアルム（ヒトワクチンに承認されたアジュバント）もしくはいずれかの慣用的なアジュバントと比較して、驚くほど高い免疫応答を提供する。
【００４９】
本発明のポリフェノール(類)もしくは植物ステロールは、有効なワクチン調製物に適しており、とりわけ、安全なワクチンを提供する。知られているように、アジュバント研究の分野で主要な挑戦の一つは、高い効力を有する一方最小の毒性を有するアジュバントを選択することである。
【００５０】
好ましい態様において、本発明は、標的抗原自体と比較して、標的抗原に対して毒性を低下させて高い免疫応答を提供することができる、所望の抗原ともに植物ステロールを含むワクチン組成物を提供する。
【００５１】
より好ましい態様において、本発明は、標的抗原に対してより高い免疫応答を提供することができる、ベータ−シトステロールと所望の抗原とを含むワクチン組成物を提供する。
【００５２】
別の態様において、本発明は、前記植物ステロール(類)と適切な送達システム及び／又は適切なアジュバント（複数可）を含む新規アジュバントシステムを提供する。本発明により開発した前記アジュバントシステムは、システムのたの構成物のアジュバント特性に影響を与えることなく、慣用的なアジュバントと比較して、驚くほど高い免疫応答を提供する。
【００５３】
本発明による適切な送達システムは、ビロソーム調製の標準方法を使用していずれかの抗原から調製されるビロソームであり得る。ビロソームは、膜脂質とウイルス糖タンパク質を有するがウイルス遺伝情報を欠く再構成ウイルスエンベロープである。そのようなビロソームは、免疫刺激再構成インフルエンザビロソーム(IRIV)又は呼吸器合胞体ウイルスから調製したビロソーム(RSVビロソーム)等である。ビロソームを、RSV膜を溶解し、遺伝物質を除去し、天然RSVタンパク質を含む脂質膜を再構成することにより、RSVウイルスから製造することができる。
【００５４】
適切なアジュバントは、アルムベースのアジュバント、金属塩アジュバント、完全フロイントアジュバント(CFA)、不完全フロイントアジュバント(IFA)、モンタニド、MF59及びアジュバント65、細菌由来のアジュバント、親油性アジュバント、疎水性アジュバント及びそれらの組み合わせを含む。金属塩アジュバントは、カルシウム、鉄及びジルコニウム又はそれらの適切な組み合わせの塩から選択される。親油性アジュバントは、テロルメディックス(Telormedix)、モノリン脂質A(MPL)、グルコピラノシル脂質アジュバント(GLA)又はそれらの組み合わせから選択される。
【００５５】
別の態様において、本発明は、本発明のポリフェノール(類)又は前記植物ステロール(類)と適切な送達システム又は適切なアジュバントを含むアジュバントシステムとともに所望の抗原を含む免疫原性組成物を提供する。そのような免疫原性組成物は、抗原に対する保護レベルの免疫応答を誘導する。
【００５６】
好ましい態様において、本発明は、所望の抗原と、ベータ−シトステロール、あるいはベータ−シトステロールと送達システムを含むアジュバントシステム、又は適切な第二のアジュバントとを含む免疫原性組成物を提供する。
【００５７】
より好ましい態様において、本発明は、所望の抗原と、ベータ−シトステロール、あるいはベータ−シトステロールとIRIVを含むアジュバントシステム又はベータ−シトステロールとアルムもしくはGLAもしくはMPLもしくは他のものとを含むアジュバントシステムとを含む免疫原性組成物を提供する。
【００５８】
ビロソームは、所望の抗原に吸着するか、それ自体の中に所望の抗原を取り込み、所望の抗原それぞれに対して体液性もしくは細胞性応答を誘導する。
【００５９】
本発明によるビロソーム調製：
所望の抗原に対する体液性免疫応答を得るために、最初にビロソームを配合する。親油性抗原の場合、抗原を配合したビロソームと混合する；一方親水性抗原の場合、抗原を、架橋剤を介してビロソームの表面に共有結合で連結させるか、あるいはビロソーム構造中にトラップさせることができる。
【００６０】
ここで、インフルエンザウイルス由来のIRIV調製物が与えられる。IRIVは、以下の三つの成分から構成される：（ａ）リン脂質の混合物；（ｂ）本質的に再構成された機能性ウイルスエンベロープ；（ｃ）生物学的に活性で、細胞膜と前記IRIVの融合を誘導し、抗原提示細胞、好ましくはマクロファージもしくはＢ細胞によるエンドサイトーシス後に前記IRIVの溶解を誘導することができるインフルエンザヘマグルチニンタンパク質(HA)、あるいはその誘導体。
【００６１】
より好ましい態様において、本発明は、（ａ）リン脂質の混合物；（ｂ）本質的に再構成された機能性ウイルスエンベロープ；（ｃ）生物学的に活性で、細胞膜と前記IRIVの融合を誘導し、抗原提示細胞、好ましくはマクロファージもしくはＢ細胞によるエンドサイトーシス後に前記IRIVの溶解を誘導することができるインフルエンザヘマグルチニンタンパク質(HA)、あるいはその誘導体；ならびに（ｄ）アジュバント、好ましくは親油性アジュバントとしてポリフェノール、好ましくは植物ステロール、及び（ｅ）所望の抗原を含む免疫原性組成物を提供する。
【００６２】
本明細書において「リン脂質の混合物」は、天然もしくは合成リン脂質、又はその混合物を含有する。少なくともそれは、ホスファチジルコリンもしくはホスファチジルエタノールアミンのようなグリセロリン脂質の群から選択される2種類の異なる化合物、及びコレステロールを含有する。
【００６３】
「本質的に再構成された機能性ウイルスエンベロープ」は、インフルエンザウイルスエンベロープの膜部分（より低い）の内部に天然に存在する成分に本質的に欠く再構成インフルエンザウイルスエンベロープを指す。好ましい態様において、本質的に再構成された機能性ウイルスエンベロープは、単層(unilamellar)の二重層の形態を示す。そのような欠いた成分の例は、天然インフルエンザウイルスエンベロープのマトリックスタンパク質である。
【００６４】
本発明のIRIVの成分としての「生物学的に活性なHAあるいはその誘導体」は、天然HAの実質的に完全な生物学的活性を示し、従って本発明のIRIVが、シアル酸含有レセプターを介したその標的細胞への吸着に介在することができる、HAあるいはその誘導体を指す。さらに、そのようなHA成分を、抗インフルエンザ抗体を循環させることにより認識することができる。この生物学的活性は、本発明のIRIVの本質的な特徴である。
【００６５】
「親油性アジュバント」の語は、TLR7（Toll様レセプター）コンジュゲートリン脂質、すなわちテロルメディックス（本明細書でTMXと称する）、モノリン脂質A（本明細書でMPLと称する）、GLA又はそれらの組み合わせを指す。
【００６６】
ある態様において、所望の抗原は、微生物、ウイルス、寄生物及び真菌から選択される感染物を含む。好ましい態様において、所望の抗原は、ウイルスの単離断片、又はウイルス全体、又は寄生物の単離断片、又は真菌の単離断片である。本発明の単離断片は、所望の抗原の構造タンパク質でありうる。
【００６７】
別の態様において、所望の抗原は、標的タンパク質に由来する「抗原性ペプチド」であり、同一の標的タンパク質に対する抗体に関して免疫応答を誘導する能力を有しうる。例えば、PCSK9タンパク質に対する抗原性ペプチドは、本発明の所望の抗原である。患者において自己抗PCSK9抗体を誘導する能力を有するそのような抗原性PCSK9ペプチドは、本発明の所望の抗原でありうる。WO 2011/027257は、そのような抗原性PCSK9ペプチドあるいはその機能的に活性なバリアントを開示する。本明細書における「抗原性ペプチド」を、免疫原性担体に連結することができる。
【００６８】
本明細書における「免疫原性担体」の語は、宿主動物において独立に免疫応答を導き出す特性を有し、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質中の遊離カルボキシル、アミノもしくはヒドロキシル基と、免疫原性担体物質上の対応する基との間でペプチドもしくはエステル結合を直接形成することにより、又は慣用的な二機能性連結物質を介する結合により、あるいは融合タンパク質として、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に共有結合で結合することができる物質を含む。そのような免疫原性担体の例は、WO 2011/027257に言及されている。
【００６９】
態様の一つにおいて、所望の抗原は、ウイルス様粒子(VLP)である。本明細書において、「ウイルス様粒子」の語は、ウイルス粒子に類似しているが、非病原性であることが示されている構造を指す。一般的に、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムの少なくとも一部を欠く。また、ウイルス様粒子は、しばしば異種発現により大量に製造することができ、容易に精製できることができる。本発明によるウイルス様粒子は、そのゲノムと異なる核酸を含んでよい。本発明によりウイルス様粒子の典型的で好ましい態様は、対応するウイルス、バクテリオファージ又はRNAファージのウイルスカプシドのようなウイルスカプシドである。より好ましい態様において、本発明によるVLPは、HPVウイルスのVLP又はHEVのVLP等である。
【００７０】
別の態様において、所望の抗原は組み換え抗原である。それを、組み換え技術を使用して調製することができる。
【００７１】
態様の一つにおいて、本発明による所望の抗原は、リーシュマニア(Leishmania)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、E型肝炎ウイルス(HEV)、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、結核、単純ヘルペスウイルス(HSV)、マラリアの原因となる寄生虫、ヒトパピローマウイルス(HPV)、PCSK9ペプチド、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプス・ウイルス、エボラウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、西ナイルウイルス(WNV)等を含む。ここで、所望の抗原は、上述のウイルス抗原からの単離タンパク質であり得る。好ましくは、上述の単離タンパク質は、標的ウイルスの構造タンパク質であり得る。
【００７２】
所望の抗原を、順次所望の遺伝子をクローニングし、所望の遺伝子を発現し、所望の遺伝子から得られたタンパク質を精製及び特徴付けすることを含む、慣用的な方法もしくは技術により調製することができる。上述の工程は、公知のツール及び技術を含む。当業者は、所望の抗原の望ましい発現及び精製を達成するための必要に応じて、そのような公知技術を選択することができる。
【００７３】
所望の遺伝子を、DNA単離、PCR技術等のような当業者が利用可能な技術を使用して寄生物のゲノムDNAから単離することができ、あるいは化学的に合成することができる。所望の遺伝子のクローニングは、異なるクローニング部位における制限酵素を使用することによる所望の遺伝子の挿入を含む。組み換え技術に使用されるベクターは、当業者に知られている。
【００７４】
クローニングの後、宿主細胞システムを使用することによる所望の挿入遺伝子からのタンパク質のさらなる生成のために形質転換もしくは形質感染を行う。所望の遺伝子を有するベクターを、所望の挿入遺伝子からタンパク質が生成される宿主細胞に形質転換もしくは形質感染する。
【００７５】
引き続いて、高細胞濃度発酵を、公知の方法を使用して必要なスケールで行うことができる。そのような方法は、バッチ、フェドバッチ及び灌流法を含む。ここで、本発明において、フェドバッチ法が所望の抗原の大スケール生成に好ましい方法である。所望の遺伝子から得られたタンパク質の精製を、カラムクロマトグラフィー技術又はろ過技術又はこれらの適切な組み合わせを使用することにより実行する。カラムクロマトグラフィー技術は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、親和性カラムクロマトグラフィー、サイズ除去カラムクロマトグラフィー、ミックスモードカラムクロマトグラフィー、及びこれらの組み合わせを含む。ろ過技術は主に、リン酸バッファー、トリスバッファー、クエン酸バッファー等のような種々のバッファーを使用する、限外ろ過及び透析濾過を含む。当業者であれば、当業者が利用可能である適切な精製技術を選択して、所望のレベルの純度を達成することができる。ここで、本発明によると、イオン交換カラムクロマトグラフィー技術を使用して、所望のタンパク質、好ましくは標的抗原のタンパク質を精製する。
【００７６】
さらなる態様において、本発明は、ポリフェノール類と、適切な送達システムもしくは適切なアジュバントとを含むアジュバントシステムを調製する方法を提供する。好ましくは、ポリフェノール、送達システム及び適切なアジュバントは、それぞれ本発明のベータ−シトステロール、IRIV及びアルムもしくはGLSである。
【００７７】
態様の一つにおいて、本発明は、野菜又は果物のような植物起源の、ポリフェノール(類)、好ましくはフラボノイドの抽出方法を提供する。抽出方法は、主に以下の工程を含む：（ａ）植物システムの異なる有機物の単離、（ｂ）抽出有機物からの植物油の抽出、（ｃ）抽出植物油からの、所望の成分、好ましくはフラボノイド類もしくはポリフェノール類の抽出、（ｄ）所望のフラボノイドもしくはポリフェノールの分離。
【００７８】
本発明による好ましい植物システムは、柑橘類植物であり、より好ましくは柑橘類果実でありうる。種子、果汁、果皮、中果皮又はフラベドを、本発明による抽出のために単離することができる。植物器官は、新鮮な材料、又は異なる貯蔵条件下の貯蔵物質でありうる。本発明による好ましいポリフェノールは、ベータ−シトステロールであり得る。溶媒抽出、超臨界流体抽出(SFE)、マイクロ波抽出又は当業者に知られた他のいずれかの方法のような種々の抽出方法を、植物油の抽出に使用することができる。これらの抽出法は当業者によく知られている。ここで、本発明において、パラメータについてSFEを最適化して、抽出物の収量を改善する。
【００７９】
態様の一つにおいて、本発明は、（ａ）抗原の調製；（ｂ）ベータ−シトステロール又はアジュバントシステムの調製を含む免疫原性組成物の調製方法を提供する。
【００８０】
より好ましい態様において、本発明は、以下を含む免疫原性組成物の調製方法を提供する：（ａ）抗原の調製；（ｂ）抗原と改変ビロソームの配合、又は第二のアジュバントと抗原を含む混合物の調製；（ｃ）抗原を有する改変ビロソームへの、又は第二のアジュバントと抗原とを含む混合物中へのベータ−シトステロールの添加。
【００８１】
好ましい態様において、本発明は、以下を含むアジュバントシステムの調製方法を提供する：（ａ）抗原、好ましくは親油性抗原及び疎水性抗原から選択される抗原との改変ビロソームの配合、又は第二のアジュバントと抗原とを含む混合物の調製；（ｂ）抗原を有する改変ビロソーム中への、又は第二のアジュバントと抗原とを含む混合物中への、植物ステロールのようなポリフェノールの添加。
【００８２】
ここで、本願発明により、ポリフェノール(類)は、好ましくはステロール類のような植物ステロール類及び他のフラボノイド類である。植物ステロール(類)を、本発明によるシトステロール、スティグマステロール、カンペステロール、コレステロール等から選択することができる。フラボノイド類を、本発明によるフラボン類、イソフラボン類フラボノール類、カテキン類、フラバノン類、アントシアニン類、プロアントシアニジン類等から選択することができる。より好ましい態様において、本発明による植物ステロールは、ベータ−シトステロールである。
【００８３】
別の態様において、本発明は、感染因子又は発がん性もしくは病原性薬剤に対するワクチンを開発するためのアジュバントとしての本発明のフィトフェノール(類)の使用を提供する。
【００８４】
好ましい態様において、本発明は、感染因子又は発がん性もしくは病原性薬剤に対するワクチンを開発するためのアジュバントとしてのベータ−シトステロールの使用を提供する。
【００８５】
さらなる態様において、本発明は、ビロソームと、感染因子又は発がん性もしくは病原性薬剤に対するワクチンを開発するためのアジュバントとして使用されるポリフェノール、好ましくは植物ステロール(類)を含むアジュバントシステムの使用を提供する。
【００８６】
本発明によると、ベータ−シトステロールが、アジュバントとして使用するために好ましい植物ステロールである。
【００８７】
好ましい態様において、本発明は、保護レベルの免疫応答を誘導する抗原とのアジュバントシステムの組み合わせを提供する。
【００８８】
さらなる態様において、本発明は、慣用的なアジュバントと、ポリフェノール、より好ましくは感染因子又は発がん性もしくは病原性薬剤に対するワクチンの開発に使用するポリフェノールとしてベータ−シトステロールとを含むアジュバントシステムの使用を提供する。
【００８９】
態様の一つにおいて、本発明は、免疫原性分子（所望の抗原）に対する免疫応答を誘導するための、薬学的に許容しうる担体もしくは賦形剤とともに本発明による免疫原性組成物を含む医薬組成物を提供する。非経口投与に適する医薬組成物の配合物は、典型的には一般に、滅菌水もしくは滅菌等張生理食塩水のような薬学的に許容しうる担体と組み合わせた活性成分を含む。そのような配合物を、ボーラス投与に、もしくは連続投与に適した形態で、調製し、封入し、もしくは販売してよい。注射可能な配合物を、アンプル中のような単位剤型で、又は保存薬を含有する他剤型コンテナで、調製し、封入し、もしくは販売してよい。非経口投与用の配合物は、懸濁物、溶液、油もしくは水性ビヒクル中のエマルジョン、ペースト等を含むが、それに限定されない。そのような配合物はさらに、懸濁剤、安定化剤、もしくは分散剤を含むがそれに限定されない、一種以上の付加成分を含んでよい。非経口投与用の配合物の一態様において、活性成分は、再構成組成物の非経口投与の前に、適切なビヒクル（例えば、滅菌ピロゲンフリー水）と再構成するための乾燥（すなわち粉末もしくは顆粒）形態で提供される。非経口配合物はまた、塩、炭水化物及びバッファー剤のような（好ましくは3から9のpHの）賦形剤を含んでよい水性溶液を含むが、複数の適用について、それらを、滅菌ピロゲンフリー水のような適切なビヒクルと組み合わせて使用する、滅菌非水性溶液として、もしくは乾燥形態としてより適切に配合してよい。例示的な非経口投与形態は、滅菌水性溶液中の溶液もしくは懸濁物、例えば水性プロピレングリコールもしくはデキストロース溶液を含む。そのような剤型を、望ましければ、適切にバッファー化することができる。他の有用な非経口投与配合物は、微結晶形態、微粒子、もしくはリポソーム調製物中の活性成分を含むものを含む。非経口投与用配合物を、即時及び／又は改変放出であるよう配合してよい。改変放出配合物は、遅延、維持、パルス、制御、標的化及びプログラム化放出を含む。
【００９０】
好ましい態様において、本発明は、種々の抗原用の、本発明の免疫原性組成物を含むワクチンを提供する。ワクチンは、有効量の抗原と、標的抗原に対する免疫応答を導き出すことができる本発明に開示の免疫原性組成物とを含む。これらのワクチンを、慣用的な経路、及び「薬学的有効用量」もしくは「治療上有効用量」のような用量で投与することができる。
【００９１】
本発明の抗原もしくは組成物の「有効量」は、哺乳動物被験者において標的抗原に対する免疫応答を含むために有効である、単一剤型もしくは一連の一部のいずれかで、前記被験者に送達される量である。この量は、治療される個人の健康及び身体状態、治療される個人の分類群、個人の免疫系の抗体を合成する能力、ワクチンの配合物、及び他の関連因子に依存して変動する。量は、ルーチンな試験を介して決定できる相対的に広い範囲内にあると予想される。
【００９２】
「薬学的有効用量」もしくは「治療上有効用量」は、対象における一種以上の抗原関連疾患もしくは兆候を治療もしくは予防、又は回避するために必要な用量である。薬学的有効用量は、投与される特定の化合物、兆候の重症度、副作用に対する対象の感受性、疾患の種類、使用される組成物、投与経路、治療される哺乳動物の種類、健康及び身体状態のような考慮下にある特定の哺乳動物の身体特性、併用投薬、抗体を合成する個人の免疫系の能力、望まれる保護の程度、及び医療上当業者が認識するであろう他の因子にとりわけ依存する。予防目的のために、各剤型中のペプチドの量は、典型的なワクチンにおいて有意な副作用効果を示さず免疫保護応答を誘導する量として選択される。最初のワクチン化に続き、対象は、十分な間隔で、1回又は複数回のブースター免疫化を受けてよい。
【００９３】
態様の一つにおいて、本発明による抗原の効果的な用量又は有効量は、ヒト用量１回あたり抗原1μｇから1000μｇ、好ましくはヒト用量１回あたり抗原1μｇから500μｇ、より好ましくはヒト用量１回あたり抗原5μｇから250μｇである。
【００９４】
好ましい態様において、本発明の組み換え抗原又はVLPベースの抗原の効果的な用量又は有効量は、ヒト用量１回あたり抗原1μｇから500μｇ、好ましくはヒト用量１回あたり抗原5μｇから80μｇ、より好ましくはヒト用量１回あたり抗原5μｇから25μｇである。
【００９５】
別の好ましい態様において、本発明の抗原性ペプチドの効果的な用量又は有効量は、ヒト用量１回あたり抗原1μｇから500μｇ、好ましくはヒト用量１回あたり抗原50μｇから500μｇ、より好ましくはヒト用量１回あたり抗原50μｇから250μｇである。
【００９６】
態様の一つにおいて、本発明のベータ−シトステロールの効果的な量は、ヒト用量１回あたりベータ−シトステロール1μｇから200μｇ、好ましくはヒト用量１回あたりベータ−シトステロール5μｇから100μｇ、より好ましくはヒト用量１回あたりベータ−シトステロール20μｇから50μｇである。
【００９７】
別の態様において、本発明の第二のアジュバントの効果的な量は、ヒト用量１回あたりアジュバント1μｇから1000μｇ、好ましくはヒト用量１回あたりアジュバント1μｇから900μｇ、より好ましくはヒト用量１回あたりアジュバント2μｇから500μｇである。態様の一つにおいて、好ましいアジュバントは、アルムもしくはGLAもしくはMPL等である。
【００９８】
別の態様において、本発明の第二のアジュバント又は送達システムの溶液の効果的な量は、ヒト用量１回あたりアジュバント溶液又は送達システム0.01mlから5ml、好ましくはヒト用量１回あたりアジュバント溶液又は送達システム0.02mlから2ml、より好ましくはヒト用量１回あたりアジュバント溶液又は送達システム0.05mlから1mlである。態様の一つにおいて、好ましいアジュバントの溶液は、モンタニドもしくはビロソームもしくはMF59等である。
【００９９】
態様の一つにおいて、本発明は、本明細書に開示の免疫原性組成物を適切な用量で投与する工程を含む、それを必要とする患者の免疫応答を刺激する方法を提供する。
【０１００】
本発明で使用される分析技術
ELISA：これは、動物におけるセロコンバージョンを、これらの抗体が対応する抗原と有する相互作用により測定する、酵素連結吸着アッセイである。得られる結果を、反応に使用された基質との反応後に反応混合物が呈する色の強度により測定する。結果を、ELISA単位で測定する。
【０１０１】
HPV偽ウイルスベース中和アッセイ：Vaccine 34 (2016) 4724-4731under section 2.5.2に記載されたように実行する。マラリア抗原に対する生育阻害試験：PLoS ONE, October 2008, Volume 3, Issue 10, e3557, p1-10 under title CWRU (Growth inhibition Assays)に記載されたように実行する。
【０１０２】
柑橘類からベータ−シトステロールのようなポリフェノールを抽出するために使用される抽出方法
柑橘類からの成分の抽出に関して、種子、果汁、果皮、中果皮又はフラベドのような植物分類の異なる部分を、抽出の出発物質として使用することができる。それとともに、新鮮な物質、又は異なる貯蔵条件下で貯蔵物質からの抽出物もまた、評価することができる。それに使用することができる異なる貯蔵条件は、室温での貯蔵、真空蒸留、加水分解水と真空蒸留、水冷と真空蒸留等である。
【０１０３】
本発明において、選択される溶液の一つは、フラベドから得られる油成分の抽出である。植物分類の異なる一部の貯蔵条件に関して、最善の方法は、水冷と真空蒸留の組み合わせである。水冷を、氷水中に浸すことにより、収穫後の果実及び野菜の熟成を停止するプロセスもしくは技術として規定することができる。真空蒸留を、通常よりも低い温度で沸騰することを可能とする、減圧下での液体の蒸留と定義することができる。
【０１０４】
以下に言及する異なる抽出方法を、フラボノイド類を抽出するために、フラベド又は果実分類の他のいずれかの部分から得られる油に適用することができる。
【０１０５】
溶媒が、エタノール、メタノール、もしくはジメチルホルムアミド又は他の同等溶媒である溶媒抽出法を、抽出に使用することができる。マイクロ波抽出法は、溶媒抽出法と比較して、抽出成分の収量の改善を提供する。本発明において、CO2との超臨界液体抽出(SFE)が、フラボノイド類、フェノール酸類、及びテルペン類を含む柑橘類油中に同定される成分の抽出のために使用されている。この方法の利点は、生物学的適合性、溶媒の痕跡すらないこと、所望の化合物の抽出のための時間の短縮である。本発明による抽出のための最適パラメータは以下である：容器100ml；容器の温度：50°C；マイクロメーターバルブの温度150°C；静的相：40分、動的相：20分；流速：6L/分；圧力：500バール；1:1-1:2の比で試料と混合する珪藻土。抽出時間：300分。前記最適化パラメータを有する抽出方法により得られる収量は、4.1%w/wである。それは、すでに出版されたCO2法(J. of Supercritical Fluids 55 (2010) 132-141)での超臨界液体抽出(SFE)を使用する収量よりも優れている。
【実施例】
【０１０６】
以下の非限定的な実施例に、本発明により調製することができる、所望の抗原の一つを有するアジュバントシステムとその配合物を記載する。異なる抗原を有する他の免疫原性組成物を調製できること、ならびにそのような免疫原性組成物が、当業者の実施できる範囲内にあり、本発明の範囲内に含まれることが理解されるであろう。
【０１０７】
実施例１：IRIVの調製
精製インフルエンザウイルスのペレットを、バッファー及び洗剤システムを使用して可溶化した。混合物を遠心分離し、インフルエンザスパイクタンパク質(HA)及びウイルスリン脂質を含有する上清を、リン脂質混合物に添加した。懸濁物全体を、特定の時間撹拌した。続けて、洗剤を除去し、インフルエンザビロソーム粒子を得るために、懸濁物をバッチクロマトグラフィーにかけた。
【０１０８】
この免疫原性組成物を分析して、慣用技術により体液性免疫応答を測定した。残基分析を、本明細書で「グループH」分析と称する。
【０１０９】
実施例２：アジュバントとしてのベータ−シトステロールの調製
ベータ−シトステロール粉末を、CMC 0.1-1%；Tween80(商標) 1%及びPBSを含有する溶液中で調製した。代替物として、他の洗剤も使用することができる。溶液は、1-10%の濃度でスクアレンオイルも含んでよい。溶液を室温で撹拌し、その後超音波振動にかけ、使用時まで4°Cに維持する。代替方法において、ベータ−シトステロールを、慣用的な抽出方法、ならびにCO2法での最適化した超臨界液体抽出(SFE)を使用して柑橘類果実から抽出した。ベータ−シトステロールのようなポリフェノール類の抽出のための、本発明で使用することができる慣用的な抽出方法又は他の最適化方法は、本明細書で別に言及される。
【０１１０】
実施例３：IRIV及びベータ−シトステロール配合物の調製
使用の直前に、実施例２に記載されるように調製される溶液を、マイクロエマルジョンニードルにかけ、その後IRIVと混合する。
【０１１１】
実施例４：インフルエンザビロソーム−ベータ−シトステロールの免疫原性試験
5週齢のBalb/cマウスのグループは、以下の表１によるフラボノイド類とともに、又はフラボノイド類を含まずに、1μｇのインフルエンザAビロソームを含有する以下の配合物で皮下に免疫化してあった。
【０１１２】
同様に配合した3種類のフラボノイド類を分析した：ヘスペリジン、リノール酸エチルエステル及びベータ−シトステロール。50mlの配合物を、0日目と21日目に2回の投与レジメンで投与した。
【０１１３】
【表１】
2020055874.tif 000002
【０１１４】
ELISAによる体液性応答の分析のために、血液サンプルを35日後に回収した。ELISAにより分析した体液性応答を、図１、図２及び図３のグラフ形状に示す。図に示されるデータは、分析した他のフラボノイド類と比較して、及びアジュバントなしのビロソームと比較して、ベータ−シトステロールがより高い免疫応答を提供することを明確に示す。この実施例はまた、インフルエンザウイルスに対するアジュバントシステムとして、ベータ−シトステロールとビロソーム調製物の組み合わせの相乗効果も示す。
【０１１５】
実施例５：ベータ−シトステロールと調製したHPVワクチンの免疫原性試験
HPV16L1及びHPV18L1抗原を含有するヒトパピローマワクチンを、WO 2016/038625の国際公報の実施例１に記載されたとおり調製した。本明細書において、HPV16L1及びHPV18L1抗原を、WO 2016/038625に記載された通りコドン最適化配列（配列番号２及び配列番号３）から調製した。HPV16L1及びHPV18L1抗原を、HPV16L1及びHPV18L1抗原のアミノ酸配列をコードする既知のヌクレオチド配列のいずれかから調製することができる。柑橘類果実−オレンジから、CO2法で超臨界液体抽出(SFE)を使用して、本明細書の実施例２で言及されたように、ベータ−シトステロールを単離した。免疫化試験のために、4つのグループのマウスを設計した：グループAのマウスはガラダシル(Gardasil)（承認されたHPVワクチン）で免疫化し、グループBのマウスは上記のように調製したHPVワクチンと、水酸化アルミニウムを有する配合物で免疫化し、グループCのマウスは上記のように調製したHPVワクチンと、ベータ−シトステロールを有する配合物で免疫化し、陰性対照としてPBSをグループDのマウスに投与した。5週齢のBalb/cマウスのグループは、以下の表に言及されるように、以下の配合物で皮下に免疫化してあった。マウスにおける免疫原性試験の実験デザインを、以下の表２に記載する。ELISAによる体液性応答をの分析のために、28日目に血液サンプルを回収した。免疫化後に導き出される中和抗体力価を、「分析技術」として本明細書に記載された「HPV偽ウイルスベース中和アッセイ」により分析した。図４は、ベータ−シトステロールと配合したHPVワクチンが、ガラダシルにより得られた応答、及び水酸化アルミニウムとのHPVワクチン配合物により得られた応答と比較して、HPV抗原（HPV16L1及びHPV18L1）に対して驚くほど高い免疫応答を提供することを明確に示している。図４に示す結果はまた、ベータ−シトステロールが、VLPベースのワクチンにおいて、より優れたアジュバントとして働きうることも示す。さらに、ベータ−シトステロールと配合したHPVワクチンの投与用量は、承認されたHPVワクチン−ガラダシルの投与用量の半分である。それは、ベータ−シトステロールが、ワクチンの安全性及び毒性パラメータの点で実質的である用量を減少させる点で役立ちうることを示す。
【０１１６】
【表２】
2020055874.tif 000003
【０１１７】
実施例６：ベータ−シトステロールと調製したマラリアワクチンの免疫原性試験
言及される免疫原性試験のために組み換え技術を使用して調製した2つの異なるマラリア抗原構築物が存在する。その一つは、インド国出願IN 1737/DEL/2008に記載されるように調製したPfMSP-Fu24構築物であった。PfMSP-Fu24マラリア抗原のアミノ酸配列は、IN 1737/DEL/2008に記載の配列番号１である。別の構築物PfF2は、WIPO公報WO 2002/12292又はWO 2013/108272の実施例に記載されるように調製した。PfMSP-Fu24マラリア抗原のアミノ酸配列は、WO 2013/108272に記載の配列番号１７である。ここで、本試験において、2つの別々のマラリア抗原調製物を、これらの２つのマラリア構築物から作成した。一つはマラリア抗原としてPfMSP-Fu24を有し、もう一つはマラリア抗原としてPfMSP-Fu24とPfF2 (PfMSP-Fu24 + PfF2)の組み合わせを有した。後者の調製物は、WIPO公報WO 2013/108272に記載されるように調製した。両方のマラリア抗原調製物を、3つの異なるアジュバントと配合し、異なる配合物のアジュバント効果を分析した。マウスにおける免疫原性試験のための実験デザインを、以下の表３に記載する。ここで、ベータ−シトステロールを、CO2法との超臨界液体抽出(SFE)を使用して本明細書の実施例２に記載されるように単離した。ELISAによる体液性応答の分析のために、28日目に血液サンプルを収集した。上記配合物での免疫化により得られた3D7 P. falciparum株に対するマウス結成の生育阻害活性を、PLoS ONE, October 2008, Volume 3, Issue 10, e3557, p1-10に記載された生育阻害試験により分析した。1:5希釈の熱不活性化血清を、生育阻害アッセイに使用した。表４は、記載された免疫原性試験により得られた結果を示す。図５は、この実施例で記載の免疫化マウスの異なる３つのグループにおける生育阻害のパーセンテージ(%)を示す。図５は、ベータ−シトステロールと配合したマラリアワクチンが、水酸化アルミニウム及びモンタニドISA 720と配合したマラリアワクチンによる生育阻害の%と比較して、驚くほど高い生育阻害の%を提供することを明確に示す。図５に示す結果はまた、ベータ−シトステロールが、組み換えワクチンにおいてより優れたアジュバントとして働きうることも示す。
【０１１８】
【表３】
2020055874.tif 000004
【０１１９】
【表４】
2020055874.tif 000005
【０１２０】
実施例７：ベータ−シトステロールと調製したPCSK9ワクチンの免疫原性試験
PCSK9ワクチンを、WIPO公報WO 2011/027257に記載されたように調製した。ここで、WO 2011/027257に記載された「VR_9.5」を、本試験のPCSK9ペプチドとして使用している。他の開示されたPCSK9ペプチドもまた、PCSK9構築物として使用することができる。調製したPCSK9構築物を、免疫原性担体としてジフテリアトキソイドとコンジュゲートした。前記調製物を、さらなる試験の抗原調製物として使用した。コンジュゲートしたPCSK9抗原を、アルムとベータ−シトステロールとともに配合した。ここで、CO2法との超臨界液体抽出(SFE)を使用して本明細書の実施例２で言及したようにベータ−シトステロールを単離した。ELISAによる体液性応答の分析のために、血液サンプルを63日目に回収した。ELISAにより分析した体液性応答を、以下の表に示す。マウスにおける免疫原性試験のための実験デザインを、以下の表５に記載する。表６は、ELISAにより得られた以下の結果を提供した。
【０１２１】
【表５】
2020055874.tif 000006
【０１２２】
【表６】
2020055874.tif 000007
【０１２３】
表６に示される結果は、GLAと比較して、ベータ−シトステロールがPCSK9抗原ペプチドに対してより高い免疫応答を提供することを明確に示す。ここで、アルムをベータ−シトステロールとともに使用する。それは、ベータ−シトステロールが、アルム及びそのような他のアジュバントと組み合わせて作用し、免疫応答の増強の点で相乗効果を提供しうることを示す。
【図１】
2020055874.tif 000008
【図２】
2020055874.tif 000009
【図３】
2020055874.tif 000010
【図４】
2020055874.tif 000011
【図５】
2020055874.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月15日(2020.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベータ−シトステロールを含む、抗原に対する免疫応答を刺激又は増強するためのアジュバント組成物であって、ワクチン組成物中で投与するための免疫原性組成物において抗原と組み合わせる、アジュバント組成物。
【請求項２】
ワクチン組成物が第二のアジュバントをさらに含む、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項３】
ワクチン組成物がビロソームを含む、請求項１又は２に記載のアジュバント組成物。
【請求項４】
ビロソームが免疫刺激再構成インフルエンザビロソーム(IRIV)又は呼吸器合胞体ウイルスビロソームである、請求項３に記載のアジュバント組成物。
【請求項５】
第二のアジュバントが、アルムベースのアジュバント、金属塩アジュバント、完全フロイントアジュバント(CFA)、不完全フロイントアジュバント(IFA)、モンタニド、MF59及びアジュバント65、細菌由来のアジュバント、親油性アジュバント、疎水性アジュバント及びそれらの適切な組み合わせから選択される、請求項２に記載のアジュバント組成物。
【請求項６】
金属塩アジュバントが、カルシウム、鉄及びジルコニウム又はそれらの適切な組み合わせの塩から選択される、請求項５に記載のアジュバント組成物。
【請求項７】
親油性アジュバントが、テロルメディックス、モノリン脂質A、グルコピラノシル脂質アジュバント及びそれらの適切な組み合わせから選択される、請求項５に記載のアジュバント組成物。
【請求項８】
ワクチン組成物が１種以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のアジュバント組成物。
【請求項９】
抗原が、細菌、ウイルス、寄生物及び真菌から選択される感染物である、請求項１から８のいずれか一項に記載のアジュバント組成物。
【請求項１０】
抗原が、組み換え抗原又は抗原性ペプチド又はウイルス様粒子である、請求項１から９のいずれか一項に記載のアジュバント組成物。
【請求項１１】
抗原が、リーシュマニア、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、E型肝炎ウイルス(HEV)、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、結核、単純ヘルペスウイルス(HSV)、マラリアの原因となる寄生虫、ヒトパピローマウイルス(HPV)、PCSK9ペプチド、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、エボラウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、西ナイルウイルス(WNV)又はそれらの組み合わせに由来する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のアジュバント組成物。
【請求項１２】
免疫原性組成物中に、ヒト用量１回あたり1μｇから1000μｇ、好ましくはヒト用量１回あたり1μｇから500μｇ、より好ましくはヒト用量１回あたり5μｇから250μｇの濃度範囲で抗原が存在する、請求項１から１１のいずれか一項に記載のアジュバント組成物。
【請求項１３】
ヒト用量１回あたり1μｇから200μｇ、好ましくはヒト用量１回あたり5μｇから100μｇ、より好ましくはヒト用量１回あたり20μｇから50μｇの量でベータ−シトステロールが存在する、請求項１から１２のいずれか一項に記載のアジュバント組成物。
【請求項１４】
ワクチン組成物中に、ヒト用量１回あたり0.01mlから5ml、好ましくはヒト用量１回あたり0.02mlから2ml、より好ましくはヒト用量１回あたり0.05mlから1mlの量で第二のアジュバントが存在する、請求項２から１３のいずれか一項に記載のアジュバント組成物。
【外国語明細書】
2020055874000001.pdf