(57)【要約】      （修正有）【課題】複雑なサンプル中の微生物を検出するための適切な試薬の提供。【解決手段】ａ）蛍光標識を含むオフレート（off-rate）の遅い修飾アプタマー（SOMAmer）と共にサンプルをインキュベートするステップ、ｂ）任意にサンプルを洗浄するステップ、ｃ）蛍光ベースの検出方法によってサンプルを分析するステップを含む、サンプル中の微生物、特にStaphylococcus aureusを検出する方法に関する。さらに、蛍光標識を含むSOMAmer（ここでSOMAmerはStaphylococcus aureusに特異的な塩基配列を含む）、サンプル中のStaphylococcus aureus細胞を検出するためのその使用、ならびに蛍光標識を含むかかるSOMAmerの少なくとも１つを含むマイクロアレイまたはバイオセンサーおよびキットに関する。【選択図】図１
2020072679.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の微生物を検出する方法であって
ａ）蛍光標識を含むオフレートの遅い修飾アプタマー（SOMAmer）と共にサンプルをインキュベートするステップ、
ｂ）任意にサンプルを洗浄するステップ、
ｃ）蛍光ベースの検出方法によってサンプルを分析するステップ
を含む、前記方法。
【請求項２】
微生物が、Staphylococcus aureusであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
蛍光ベースの検出方法が、フローサイトメトリー、固相サイトメトリー、蛍光ベースの分析方法および蛍光イメージングシステムからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
サンプルが、臨床サンプル、食品または飼料サンプル、飲料サンプル、医薬品サンプル、パーソナルケアまたは化粧品サンプルおよび／または水サンプルであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
SOMAmerが、Staphylococcus aureusに特異的なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
SOMAmerが、配列番号１５および配列番号１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその断片またはそれに少なくとも８０％同一である配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズする配列を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
SOMAmerが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその断片またはそれに少なくとも８０％同一である配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズする配列を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
SOMAmerが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１〜５および７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
SOMAmerが、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
蛍光標識が、フルオレセイン色素、ローダミン色素、シアニン色素、ペリジニンクロロフィル（ＰｅｒＣＰ）、Ｒ−フィコエリトリン、クマリン色素および量子ドットからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
蛍光標識を含むオフレートの遅い修飾アプタマー（SOMAmer）であって、Staphylococcus aureusに特異的なヌクレオチド配列を含む、前記SOMAmer。
【請求項１２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその断片またはそれに少なくとも８０％同一である配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズする配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のSOMAmer。
【請求項１３】
配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその断片またはそれに少なくとも８０％同一である配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズする配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のSOMAmer。
【請求項１４】
配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のSOMAmer。
【請求項１５】
サンプル中のStaphylococcus aureus細胞を検出するための、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の蛍光標識を含むSOMAmerの使用。
【請求項１６】
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の蛍光標識を含むSOMAmerの少なくとも１つを含むマイクロアレイまたはバイオセンサー。
【請求項１７】
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の蛍光標識を含むSOMAmerを少なくとも１つ含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ａ）蛍光標識を含むオフレート（off-rate）の遅い修飾アプタマー（SOMAmer）と共にサンプルをインキュベートするステップ、ｂ）任意にサンプルを洗浄するステップ、ｃ）蛍光ベースの検出方法によってサンプルを分析するステップを含む、サンプル中の微生物、特にStaphylococcus aureusを検出する方法に関する。本発明はさらに、蛍光標識を含むSOMAmer（ここでSOMAmerはStaphylococcus aureusに特異的な塩基配列を含む）、サンプル中のStaphylococcus aureus細胞を検出するためのその使用、ならびに、蛍光標識を含むかかるSOMAmersの少なくとも１つを含むマイクロアレイまたはバイオセンサーおよびキットに関する。
【０００２】
食料、水、非無菌製品または環境の微生物汚染のモニタリングは、典型的には、培養法などの従来の微生物学的方法に基づく。特定の微生物の検出のために、選択された微生物のみの増殖、または、同じ培地において増殖している別の微生物のタイプからある微生物のタイプの分離をそれぞれ可能にする、選択または分離培養培地を使用し得る。これらの方法は、それらが、増殖して目に見えるコロニーを生ずる微生物の能力に依存しているため、結果を得るために数日を必要とする。それらが時間を要するとしても、それらは依然標準的な検出方法のままである。
【０００３】
過去２０年間、核酸増幅ベースの技術（ＮＡＡＴ）およびイムノアッセイなどの多くの技術および検出システムが、迅速微生物学の分野で生じた。これらの代替技術は、従来の培養ベースの方法に比べて、検出時間を短縮する。
ＮＡＡＴは、数時間で汚染結果を与えることが知られている。しかしながら、この技術は、高い技術力を必要とするプロトコールの複雑性または偽陽性の問題などのいくつかの欠点を有し、未だサンプル調製方法によって制限されている。
イムノアッセイは、標的微生物を捕捉および／または検出するために、特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用に依存する。イムノアッセイの効率および成功は、試験で使用される抗体の品質に依存する。抗体を使用することの１つの欠点は、それらが生産される方法（動物内、または細胞培養による）に起因するバッチ間の再現性の問題である。
【０００４】
抗体の所定の欠点を克服し、アッセイの品質を改善するために、アプタマーなどの新たな親和性バインダーが開発されている。アプタマーは、種々の構造に折り畳まることができ、その標的に抗体のように特異的に結合することができる、合成の短いＤＮＡまたはＲＮＡ鎖である。
ＤＮＡアプタマーは、既に微生物（S.aureusを含む）の検出のために使用されてきた。さらに、蛍光標識ＤＮＡアプタマーはまた、蛍光ベースの方法を使用した全細菌細胞（whole bacterial cell）の検出について報告されている：
【０００５】
US 2012/0071639 A1は、様々な食品媒介性および水媒介性病原体ならびに生物毒素に結合するための特異的ＤＮＡ配列を開示している。
WO 2013/064818 A1は、サンプル中の病原性細菌の検出のための蛍光標識アプタマーを開示している。
【０００６】
Cao et al.（2009, Nucleic Acids Res 37, 4621-4628）は、全細菌SELEX法により得られたStaphylococcus aureusに特異的なｓｓＤＮＡアプタマーのパネルを開示している。これらのアプタマーの５つの組み合わせが、異なるS.aureus株の認識に良い効果をもたらした。Dwivedi et al.（2013, Appl Microbiol Biotechnol 97, 3677-3686）は、Salmonella enterica血清型Typhimuriumに特異的なＤＮＡアプタマーおよびフローサイトメトリーによるSalmonellaの検出のためのそれらの使用について記載している。
【０００７】
Gold et al.（2010, PLoS One 5, e15004）およびVaught et al.（2010, J Am Chem Soc 132, 4141-4151）は、SOMAmer（slow off-rate modified aptamer）と呼ばれる新しいアプタマーベースの試薬の開発について記載している。SOMAmerは、それらの５’位にてアミノ酸側鎖の模倣体で修飾されたピリミジン残基を含み、極めて長い（＞３０分）解離速度を有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）から作られる。これらの特徴は、標準的なＲＮＡまたはＤＮＡアプタマーに比した、SOMAmerのより優れた親和性、および、より優れた力学的特性につながる。
【０００８】
US 7947447 B2は、従来のSELEX法を用いて得られるよりも遅い解離速度定数で標的分子に結合することができるSOMAmerを製造するための改良SELEX法を開示している。
Ochsner at al.（2013, Diagn Microbiol Infect Dis. 76, 278-285）は、Clostridium difficile毒素、すなわち微生物タンパク質に特異的なSOMAmerの特性評価を記載している。
全細菌細胞を検出するためのSOMAmerの使用は、従来技術において記載されていない。
【０００９】
本発明の目的は、複雑なサンプル中の微生物を検出するための適切な試薬の提供であった。
驚くべきことに、特異性の高い蛍光標識SOMAmerが、蛍光ベースの方法を介して複雑なサンプル中の微生物を検出するための極めて有効なツールであることが見出された。
【００１０】
したがって、本発明は、
ａ）蛍光標識を含むオフレートの遅い修飾アプタマー(SOMAmer)と共にサンプルをインキュベートするステップ、
ｂ）任意にサンプルを洗浄するステップ、
ｃ）蛍光ベースの検出方法により、サンプルを分析するステップ
を含む、サンプル中の微生物を検出する方法に関する。
【００１１】
SOMAmer（オフレートの遅い修飾アプタマー）は、それらの５’位にてアミノ酸側鎖の模倣体で修飾されたピリミジン残基を含み、極めて長い（＞３０分）解離速度を有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）から作られる。これらの特徴は、標準的なＲＮＡまたはＤＮＡアプタマーに比したSOMAmerのより優れた親和性およびより優れた力学的特性につながる（Gold et al., 2010, PLoS One 5, e15004; Vaught et al., 2010, J Am Chem Soc 132, 4141-4151）。
【００１２】
本明細書で使用される「オフレートの遅い」とは、アプタマー／標的複合体が解離を開始するのにかかる時間のことを指す。これは、半減期またはアプタマー／標的複合体の５０％が解離した時点として表し得る。半減期（ｔ１／２）の値として表されるSOMAmerのオフレートまたは解離速度は、３０分超、６０分超、９０分超または１２０分超であってよい。解離時間は、当該技術分野で周知の、複合体の会合および解離をモニタリングする動的システム、例えば表面プラズモン共鳴、によって測定し得る。
【００１３】
SOMAmer試薬は、未処理または精製組み換えタンパク質を使用した複数の修飾ＤＮＡライブラリーによるSELEX法を介して、生物の細胞表面関連（cell surface-associated）タンパク質に対して生成され得る。かかるSOMAmerを生成するための適切なSELEX法は、US 7947447 B2に開示されており、これは本特許出願の開示に参照により組み込まれる。
本発明を実施するために必要な慣用の化学的、微生物学的および分子生物学的方法は、当業者に知られており、また、標準的な文献中にも見出し得る。
【００１４】
本発明によれば、用語「微生物」は、細菌、酵母または真菌に関する。好ましい態様において、微生物は細菌、好ましくは、病原性細菌である。
それは、例えば、Salmonella spp.（Salmonella typhimurium、Salmonella enteritidisなど）、Escherichia coli、Listeria spp、Listeria monocytogenes、Staphylococcus aureus、Pseudomonas、Campylobacter、Shigella、Streptococcus、 Mycobacterium、Burkholderia、Legionella、Yersinia、Clostridium、CorynebacteriumおよびVibrioからなる群から選択され得る。
本発明の好ましい態様において、微生物は、Staphylococcus aureusである。
【００１５】
それに対してSOMAmerが例えば調製され得るStaphylococcus aureusの表面関連タンパク質の例は、ＳｐＡ、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、ＳａｓＤ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣおよびＩｓｄＨを含む。これらのタンパク質の全ては、ＬＰＸＴＧのソルターゼモチーフのトレオニンおよびグリシンの間のソルターゼ媒介性の切断を介して細胞壁に付着しており、ペプチドグリカンのペンタグリシン架橋にアミド結合するようになる（Marraffini et al.,2006, Microbiol Mol Biol Rev 70: 192-221）。S.aureusプロテインＡ（ＳｐＡ）は、細菌表面上に存在するだけでなく、細胞外環境に分泌される。ＣｌｆＡおよびＣｌｆＢは構造的に関連するフィブリノゲン結合タンパク質である（McDevitt et al., 1997, Eur J Biochem 247: 416-424、Ni Eidhin et al., 1998, Mol Microbiol 30: 245-257)。
【００１６】
ＣｌｆＢは、前鼻孔の剥離した上皮細胞への付着に関与する重要な因子の１つであり、典型的には増殖の対数期初期の間に生成される（Ni Eidhin et al., 1998、上記参照)。ＦｎｂＡおよびＦｎｂＢは、細胞外マトリックスの成分であるフィブロネクチンおよびエラスチンの両方に付着し、感染の間の宿主組織への定着のために重要である（Roche et al., 2004, J Biol Chem 279: 38433-38440）。ＳａｓＤは、未知の生理的役割を有する推定接着タンパク質である（Roche et al., 2003, Microbiology 149: 643-654、Ythier et al., 2012, Mol Cell Proteomics 11: 1123-1139）。タンパク質のうち４つは、S.aureusにおいて鉄制限条件下で誘導される鉄応答性表面決定因子（Ｉｓｄ）システムに属しており、ヘモグロビンからのヘムの取り込み（ＩｓｄＢ、ＩｓｄＨ）および細胞壁を通過する輸送（ＩｓｄＡ、ＩｓｄＣ）のために重要である（Grigg et al., 2010, J Inorg Biochem 104: 341-348、Mazmanian et al., 2003, Science 299: 906-909）。
【００１７】
典型的には、分析されるサンプルは複雑なサンプルであり、臨床サンプル、食品または飼料サンプル、飲料サンプル、医薬品サンプル（注射用の水を含む）、パーソナルケアおよび／または化粧品サンプルなどである。サンプルは、原材料、完成品であってよく、または製造もしくは貯蔵の環境から採取されてよい。好ましくは、サンプルは、臨床サンプル、食品サンプル、医薬品サンプルおよび／またはパーソナルケア製品である。
【００１８】
「複雑なサンプル」は１を超える成分を含むサンプルを意味する。例えば、それが食品または飼料である場合、それは肉または肉製品（例えば未加工または調理済み肉製品）、チーズまたはヨーグルトなどの乳製品または乳製品の製造に用いられる組成物、野菜ベースの食品、即席食品または食品成分、サラダ製品、乳児用調製粉乳であってよい。一態様において、サンプルは、アイケア製品などのパーソナルケアまたは化粧品であってよく、コンタクトレンズ液などであってよい。
【００１９】
サンプルが飲料である場合、それは、例えば、ビールまたはビールの醸造中に採取されたサンプル、飲料水であってよい。医薬品サンプルは、ヒト用および動物用（すなわち、獣医用途）の医薬品に及ぶ。臨床サンプルは、例えば、体液、特に血液、血漿もしくは血清または組織サンプルであってよい。
【００２０】
例示的なサンプルは、限定されことなく、食品（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ロバ、ラクダ、ヤク、水牛およびトナカイの乳、乳製品、ウシ、ヤギ、子ヒツジ、マトン、ブタ、カエルの足、子ウシ、齧歯類、ウマ、カンガルー、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ハト（pigeon）またはハト（dove）、ダチョウ、エミューを含む家禽の肉、サケおよびティラピアなどの魚類を含む海産食品ならびに軟体動物および甲殻類ならびにカタツムリなどの貝類、肉製品、植物製品、種子、トウモロコシ、小麦、米、大麦、ソルガムおよびキビを含むイネ科植物からの穀物、ソバ、アマランスおよびキノアを含む非イネ科植物からの穀物、豆、ピーナッツ、エンドウ豆、レンズ豆を含む豆類、アーモンド、クルミおよび松の実を含むナッツ、ヒマワリ、セイヨウアブラナおよびゴマを含む油糧種子、ジャガイモ、キャッサバおよびカブを含む根菜類、アマランサス、ほうれん草、ケールなどの葉野菜、ダルス、昆布、およびバダーロックスなどの海藻、筍、ノパレス、アスパラガスなどの茎菜、グローブアーティチョーク、ブロッコリー、およびカンゾウなどの花野菜、カボチャ、オクラおよびナスなどの果菜類といったベジタブル、果物、ハーブおよびスパイス、全血、尿、痰、唾液、羊水、血漿、血清、肺洗浄液、および、限定されずに、肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、膵臓などを含む組織を含む。当業者は、上記の任意の例示的サンプルまたは前記例示的サンプルの混合物または１以上の前記例示的サンプルを含む組成物から得られた溶解物、抽出物または（均質化）物質もまた、本発明の範囲内のサンプルであることを理解する。
【００２１】
本発明の一態様において、SOMAmerは、Staphylococcus aureusに特異的なヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
本明細書において使用する用語「ヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列、およびその変異体、ホモログ、断片および誘導体（その一部など）を指す。ヌクレオチド配列は合成または組み換え由来でよく、センスまたはアンチセンス鎖を表すかにかかわらず一本鎖であってよい。本発明に関して、用語「ヌクレオチド配列」は、合成ＤＮＡよびＲＮＡを含む。好ましくは、本発明に係るSOMAmerのヌクレオチド配列は、当技術分野で周知の化学的方法を用いて、全体または一部を合成し得る。
【００２３】
本明細書で使用する用語「特異的」は、SOMAmerが他の微生物と比較してStaphylococcus aureusに選択的に反応することを意味する。
本発明に係るSOMAmerは、抗体と類似の様式で使用し得る。抗体と同様に、SOMAmerは標的結合特異性を提供する。
【００２４】
本発明の一側面において、SOMAmerは、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその断片またはそれに少なくとも８０％同一である配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズする配列を含む。
【００２５】
好ましくは、SOMAmerは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその断片またはそれに少なくとも８０％同一である配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズする配列を含む。
【００２６】
より好ましくは、SOMAmerは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００２７】
本発明の極めて好ましい態様において、SOMAmerは、配列番号１または配列番号３に係るヌクレオチド配列を含む。
【００２８】
本明細書で使用する用語「断片」は、全配列と比較して、対象とする標的に対して同等またはより良好な親和性、特異性または機能活性を有する、本明細書において教示するアプタマー配列の部分を意味する。断片は、約３５ヌクレオチド（例えば３３〜３７ヌクレオチド）から構成されてよい。断片は、好ましくは、断片で表される領域にわたって元の全長アプタマーと同様の二次構造を有している。
【００２９】
本発明はまた、本発明の核酸配列（単数または複数）と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の使用を包含する。本文脈において、類似の配列は、対象配列に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５または９８％同一であり得るヌクレオチド配列を含むと解釈される。典型的には、類似の配列は、対象SOMAmerと同一または類似の二次構造を含む。
【００３０】
一態様において、類似の配列は、対象配列と比較して、１個または数個の付加、欠失および／または置換を有するヌクレオチド配列を含むと解釈される。
配列同一性の比較は、目視によって、またはより一般的には、容易に入手可能な配列比較プログラムの助けを借りて実施し得る。これら商業的に入手可能なコンピュータープログラムは、２以上の配列間の同一性の％を計算し得る。
【００３１】
本発明は、本発明の核酸配列に相補的な配列または本発明の配列もしくはそれに相補的な配列のいずれかにハイブリダイズすることが可能である配列もまた包含する。
【００３２】
本明細書において使用する用語「ハイブリダイゼーション」は、「核酸の鎖が塩基対合を通じて相補鎖と結合するプロセス」を含むものである。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で生じる（例えば、５０℃および０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウムｐＨ７．０｝）。
【００３３】
本発明によれば、SOMAmerは蛍光標識を含む。
標識は、SOMAmerの５’または３’末端のいずれかに取り付けることができる。好ましい態様において、標識は、SOMAmerの５’末端に取り付けられる。当業者は、核酸鎖に蛍光標識を取り付けるための技術をよく知っている。これらの方法のいずれか、例えば、Schubert et al, 1990, Nucleic Acids Research 18,3427に記載されているものを、SOMAmerへ蛍光標識を取り付けるために本発明において利用し得る。原理的には、蛍光標識は、オリゴヌクレオチドの合成中または合成後に取り付けることができる。
【００３４】
蛍光標識はSOMAmerに直接的または間接的に取り付けられてもよい。間接的な取り付けのために、当業者に知られた任意の機構、例えば、ビオチンおよびストレプトアビジンまたはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）および抗ジゴキシゲニンを使用するものなどを使用し得る。
【００３５】
適切な蛍光標識は、標識の大きさおよび／または、色、蛍光励起波長、蛍光発光波長および強度などの光学特性などの様々なパラメータに基づいて当業者により選択される。多種多様の蛍光標識が商業的に入手可能である。適切な蛍光標識の例としては、フルオレセイン色素（フルオレセイン、６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ、ＴＥＴ、ＨＥＸなど）、ローダミン色素（５’−Ｔａｍｒａ、ＲＯＸ、ＴＲＩＴＣ、Ｘ−ローダミン、リサミンローダミンＢなど）、シアニン色素（Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＲＤ７００、ＩＲＤ８００、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）など）ペリジニンクロロフィル（ＰｅｒＣＰ）、Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）、クマリン色素（ヒドロキシクマリン、アミノクマリン、メトキシクマリンなど）および量子ドットである。
【００３６】
さらなる例は、Alexa Fluor（登録商標）350、Alexa Fluor（登録商標）405、Alexa Fluor（登録商標）430、Alexa Fluor（登録商標）488、Alexa Fluor（登録商標）500、Alexa Fluor（登録商標）514、Alexa Fluor（登録商標）532、Alexa Fluor（登録商標）546、Alexa Fluor（登録商標）555、Alexa Fluor（登録商標）568、Alexa Fluor（登録商標）594、Alexa Fluor（登録商標）610、Alexa Fluor（登録商標）633、Alexa Fluor（登録商標）647、Alexa Fluor（登録商標）660、Alexa Fluor（登録商標）680、Alexa Fluor（登録商標）700、Alexa Fluor（登録商標）750、Alexa Fluor（登録商標）790、DyLight 350、DyLight 408、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 594、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、DyLight 759、DyLight 800、eFluor（登録商標）660、Cascade Blue、Pacific Blue、Pacific Orange、Lucifer Yellow、NBD、Red 613、TruRed、FluorX、BODIPY-FL、Texas Redである。好ましくは、フルオロセインが使用される。
【００３７】
本発明に係る方法は、ステップａ）において、蛍光標識を含むオフレートの遅い修飾アプタマー（SOMAmer）とのサンプルのインキュベーションを含む。これは、蛍光標識を含むSOMAmerがサンプルと混合され、一定期間インキュベートされることを意味する。
【００３８】
典型的には、サンプルは、SOMAmerを用いる蛍光ベースの検出方法によるさらなる分析の前に、直接、バッファーまたは増殖培地（任意のインキュベーション）に接種される。サンプルが固体試料の場合、バッファーもしくは増殖培地の添加後または添加中にストマッキングを行う必要があり得る。さらなる代替的な態様において、固体試料は流体でリンスされ、次いで、増殖培地におけるさらなる任意のインキュベーションおよびSOMAmerによるさらなる分析のために収集される。
【００３９】
代替的に、SOMAmerは適切なバッファーまた増殖培地と混合され、次いでそれはサンプルと混合される。サンプルが固体試料の場合、SOMAmerを含むバッファー／増殖培地の添加後または添加中にストマッキングを行う必要があり得る。
【００４０】
適切なバッファーは、当業者によって選択され得る。それは、典型的には、５より高く９より低い、好ましくは６より高く８より低い、より好ましくは６．５から７．５の間のｐＨ値を有し得る。本発明の方法において使用し得るバッファーは、好ましくは、リン酸バッファー、リン酸緩衝生理食塩水バッファー（ＰＢＳ）、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（ＴＲＩＳ）バッファー、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水バッファー（ＴＢＳ）およびＴＲＩＳ／ＥＤＴＡ（ＴＥ）の群から選択される。本発明の一態様において、バッファーはさらにＭｇＣｌ２を含む。ＭｇＣｌ２は、存在する場合、典型的には０．００５から３Ｍの間、好ましくは、０．０１から１Ｍの間、より好ましくは０．０１から０．５Ｍの間、例えば、２５ｍＭの濃度で存在する。
【００４１】
典型的に、約０．０７μｍｏｌ／ＬのSOMAmerは、サンプル中の標的微生物の１０７細胞の検出のために十分であり得る。好ましい態様において、０．０１から１０μｍｏｌ／ＬバッファーのSOMAmer濃度が使用される。
【００４２】
インキュベーションは典型的には１６℃から３０℃の間、好ましくは１８℃から２８℃の間、より好ましくは室温で行われる。
典型的には、インキュベーションのための期間は、１分から６０分の間、好ましくは５分から３０分の間である。
本発明に従って使用されるSOMAmerの濃度は、当業者によって決定され得る。
【００４３】
任意に、本発明に関する方法は、サンプルを洗浄するステップを含み得る。このステップの間に、いかなる非結合SOMAmerも、結合SOMAmerの存在を検出する前に洗い流し得る。
典型的に、洗浄は、サンプルを遠心分離し、ペレットをバッファー中に再懸濁することを意味する。洗浄ステップは、１回行うか、または複数回、例えば、２回、３回または４回反復することができる。
【００４４】
本発明に係るステップｃ）において、サンプルは、蛍光ベースの検出方法によって分析される。蛍光ベースの検出方法は、好ましくは、フローサイトメトリー、固相サイトメトリー、蛍光ベースの分析方法および蛍光イメージングシステム（蛍光顕微鏡法など）からなる群から選択される。
【００４５】
フローサイトメトリーは、照射された単一細胞によって散乱する光および生じる蛍光発光の測定を可能にする分析方法である。典型的には、分析される細胞または粒子は液体中に懸濁され、個々にレーザービームを通過する。各粒子の散乱光（粒子のサイズおよび複雑性に関連する）および蛍光発光（標的粒子／細胞の蛍光標識による）が検出器によって収集され、コンピューターへ送られる。各粒子または細胞は別々に検査されるため、結果は累積的な個々のサイトメトリー特性を表す（Alvarez-Barrientos et al. 2000, Clin Microbiol Rev, 13(2): 167−195）。
【００４６】
標的分析物を含有し得るサンプルは、適切な蛍光分子で標識された、標的分析物に特異的な試薬（例えば、本発明に係るSOMAmer）と混合される。適切な結合条件および任意の洗浄ステップを適用した後、標識試料は、次いで、フローサイトメーターによって処理される：細胞はレーザービームを個々に通過し、得られた散乱光および蛍光シグナルが標的分析物（例えば細胞）に関連する情報を収集するために分析される。
【００４７】
蛍光イメージングシステムは、蛍光現象から発せられた光を用いて形成される観察対象（例えば単一の細胞、マイクロコロニー）の画像を提供する（Barrett and Myers 2003, Foundations of Image Science In Wiley Series in pure and Applied Optics ed. Saleh B.E.A. USA, New Jersey, Hoboken: John Wiley & Sons, Inc）。
蛍光顕微鏡法は、画像化された特徴が小さく、光学的拡大を介して得られる蛍光イメージングシステムの一例である。
【００４８】
標的分析物を含有し得る試料は、適切な蛍光分子で標識された、標的分析物に特異的な試薬（例えばSOMAmer）と混合される。適切な結合条件および任意の洗浄ステップを適用した後、標識されたサンプルは、顕微鏡対物レンズの下に配置される。顕微鏡のパラメータは、蛍光標識の性質と一致するように設定される。
【００４９】
固相サイトメトリーは、固体表面上で単一の粒子／細胞を検出する方法である。典型的には、固相サイトメトリーは、膜上で実現される。画像ベースの定量システムは、任意の選択されたマーカーの量、大きさおよび形状と共にそれらの膜上での局在を提供する。
標的分析物を含有し得る試料は、適切な孔サイズ（すなわち、細菌については０．４μｍ）を有するブラックメンブランフィルター（例えばポリエステルまたはポリカーボネート）上で濾過される。次いで、保持された細胞は、適切な蛍光分子で標識された、標的分析物に特異的な試薬（例えばSOMAmer）で標識される。フィルターは、その後、一連の検出ユニットにより膜上の蛍光イベント（例えば標識された微生物）を検出することを可能にするレーザーによりスキャンされる。これは膜上の標的分析物の検出および計数を可能にする（Reynolds and Fricker 1999, J Appl Microbiol 86, 785−795、Vanhee et al. 2009, Nat Protoc 4, 224-231）。
【００５０】
蛍光ベースの分析方法は、適切な蛍光タグで標識された標的分析物を検出するため、および／または、その量を測定するために使用される蛍光シグナルの全体量を測定する方法である（Skoog et al. 2007, Principles of Instrumental Analysis, Sixth edition., USA, California, Belmont: Brooks/Cole）。このタイプの方法は、広範な支持物（例えば、マイクロプレート、チューブ、マイクロチューブ、マイクロ流体装置）で実施し得る。
【００５１】
標的分析物を含むサンプルは、適切な蛍光分子で標識された、標的分析物に特異的な試薬（例えばSOMAmer）と混合される。適切な結合条件および任意の洗浄ステップを適用した後、標識されたサンプルを有する容器（例えば、マイクロプレート、チューブ）は、適切に蛍光色素を励起する特定の波長に曝露される。標的分析物と蛍光試薬との結合の結果として生じる蛍光発光は、適切な光センサによって収集される。この蛍光の量はセンサによって定量化され、分析物の測定値を提供するために、基準データとの相関関係において処理される。
【００５２】
任意の蛍光分子を任意の蛍光ベースの検出方法で使用し得る。重要な要件は、適切な励起源の所定の検出方法および選択された蛍光分子のための適切な蛍光検出器の利用可能性である。
【００５３】
蛍光検出のために使用される波長の組み合わせの例（適切な蛍光標識）：
−励起：４８８ｎｍ（青色レーザー）＋発光：５３０ｎｍ（フルオロセイン、Alexa Fluor（登録商標）488）、５８５ｎｍ（Ｒ−フィコエリトリン−Ｒ−ＰＥ）および＞６７０ｎｍ（ペリジニン  クロロフィル−ＰｅｒＣＰ）
−励起：５３２〜５６１ｎｍ（緑色および黄色／緑色レーザー）＋発光：５６０（Alexa Fluor（登録商標）532）、５８５（Ｒ−ＰＥ−Ｒ−フィコエリトリン）
−励起：６３５ｎｍ（赤色レーザー）＋発光：６６０ｎｍ（アロフィコシアニン−ＡＰＣ／シアニン５−Ｃｙ５／eFluor（登録商標）660／Alexa Fluor（登録商標)647）
【００５４】
本発明に係る方法は、抗体の使用に対して複数の利点を提供する：
−溶液中での並外れた熱安定性
−より低い分子量
−より高い多重化能
−熱、乾燥および溶媒に対する化学的安定性
−可逆的な再生
−試薬製造の容易性
−一貫したロット間の性能
−より低いコスト
【００５５】
本発明はさらに、蛍光標識を含むオフレートの遅い修飾アプタマー（SOMAmer）に関し、ここでSOMAmerは、Staphylococcus aureusに特異的なヌクレオチド配列を含む。
SOMAmer、蛍光標識およびそれらの好ましい態様は上記のとおり定義されている。
【００５６】
したがって、別の側面において、本発明は、蛍光標識を含むSOMAmerであって、SOMAmerが、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその断片またはそれと少なくとも８０％同一である配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズする配列を含むことを特徴とするものに関する。
【００５７】
別の側面において、本発明は、蛍光標識を含むSOMAmerであって、SOMAmerが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその断片またはそれと少なくとも８０％同一である配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズする配列を含むことを特徴とするものに関する。
【００５８】
さらなる側面において、本発明は蛍光標識を含むSOMAmerであって、SOMAmerが、配列番号１または配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含むものに関する。
さらなる態様において、本発明は、上で定義された蛍光標識を含むSOMAmerの、サンプル中のStaphylococcus aureus細胞を検出するための使用に関する。
【００５９】
本発明に係るSOMAmerは、基材または担体、例えば微小担体上に固定化（例えば、結合または付着）され得る。
本発明はまた、上記で定義された蛍光標識を含むSOMAmerの少なくとも１つを含むマイクロアレイまたはバイオセンサーに関する。
【００６０】
バイオセンサーは、生物学的応答を電気信号に変換する、標的分析物の検出のための分析装置である。バイオセンサーのアプリケーションは、標的分子を検出するために、酵素、抗体および核酸などの生物学的認識要素を使用する。典型的なバイオセンサーは、３つの構成要素を含む：分析物を認識または結合し得る生物学的検知素子、測定可能な信号に検出イベントを変換する変換素子および信号をデジタルフォーマットに変換するディスプレイである。検知素子は、主にバイオセンサーの選択性と感度を定義する。分析物の検出は、通常、電気的または光学的な読み出しのいずれかにより分析物を検知することに基づいている。本発明に係る蛍光標識を含むSOMAmerは、バイオセンサー用途において、生物学的要素として使用し得る。
【００６１】
本発明は、さらなる態様において、上記で定義された蛍光標識を含む少なくとも１つのSOMAmerを含むキットに関する。本発明に係るキットは、迅速検出試験キットであってよい。キットは、例えば、ｉ）本発明に係る蛍光標識を含む少なくとも１つ（２つ、３つまたは４つなど）のSOMAmerおよびｉｉ）SOMAmerの使用に関する指示を含む。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、様々な濃度の蛍光標識された４５２０−８（配列番号３）および４５３１−５６（配列番号１）のＳｐＡ  SOMAmerによる１０７細胞の染色後のフローサイトメーターによるStaphylococcus aureusの検出（１５分の結合反応）を示した図である。  （ａ）様々なSOMAmer濃度で得られた平均蛍光強度（棒）と染色された細胞の割合（線）を表す（ｎ＝３）。灰色の棒：４５２０−８（配列番号３）による平均蛍光強度、黒色の棒：４５３１−５６（配列番号１）による平均蛍光強度。黒色の線：４５２０−８（配列番号３）または４５３１−５６（配列番号１)による染色細胞の割合（同一のデータ）。  （ｂ）４５３１−５６（配列番号１）のＳｐＡ  SOMAmerで得られたフローサイトメトリー結果の例。黒色の領域：非染色細胞集団；０．０７μｍｏｌｌ−１（薄灰色）、０．７μｍｏｌｌ−１（濃灰色）および７μｍｏｌｌ−１（黒色の実線）によって染色された細胞集団。Ｍ１およびＭ２区間は、Ｍ１にコントロールの非染色細胞の蛍光シグナル（自家蛍光）を含むように設定されている。したがって、Ｍ２区間に位置する細胞集団は染色されているとみなされる。
【図２】図２は、蛍光標識された７μｍｏｌｌ−１の４５３１−５６（配列番号１）のＳｐＡ  SOMAmerによる１０７個の細胞の染色後のフローサイトメーターによるStaphylococcus aureusの検出を示した図である。様々な染色時間の比較（ｎ＝３）。平均蛍光強度は棒で、染色された細胞の割合は線グラフとして示されている。
【図３】図３は、蛍光標識された０．７μＭの４５３１−５６（配列番号１）のＳｐＡ  SOMAmerによる１０７細胞の染色後のフローサイトメーターによるStaphylococcus aureusの検出を示した図である。様々な染色時間の比較（ｎ＝３）。３０分間の染色インキュベーションにより、平均蛍光強度は、５分間の染色インキュベーション後に得られた強度と比較して、１．４倍向上する。
【実施例】
【００６３】
例１：S.aureusの標的の精製
所望の標的または標的ドメインをコードする遺伝子の関連部分を、S.aureus NRS384（USA300）のゲノムＤＮＡから、表１に示されるプライマーによりＰＣＲ増幅し、pCR-Script SK+(Stratagene)中にクローニングした。ｃｌｆＡ遺伝子は、アミノ末端にＳｔｒｅｐ−タグおよびカルボキシ末端にＨｉｓ１０−タグを保有する発現ベクターpET-51b（EMD-Novagen）にBamHI-SacIカセットとして移される。プラスミドを、遺伝子同一性、および、ＨｉｓタグおよびＳｔｒｅｐタグに関するベクターがコードする配列とのクローン化ＤＮＡ断片の適切な遺伝子融合を確認するために配列決定する。
【表１】
2020072679.tif 000003
【００６４】
組み換えタンパク質を大腸菌BL21（DE3）またはBL21（DE3）/pLysE（EMD/Novagen）中で過剰発現させる。可溶性タンパク質の最適な発現のための条件は、増殖温度（２５〜３７℃）および誘導時間（４〜１５時間）に関して最適化されている。０．１〜０．８Ｌの培養物からの細胞を１０ｍＬのBugBuster/Benzonase試薬（EMD Millipore）で溶解する。組み換えＨｉｓ１０／Ｓｔｒｅｐタグ化タンパク質を、Ni-NTAアガロースおよびStrep・Tactin（登録商標）Superflow（商標）アガロース（EMDミリポア）による一連のアフィニティークロマトグラフィーを介して、可溶性画分から精製する。未処理のブドウ球菌プロテインＡはVWRから購入し、NHS-PEG4-ビオチン（Pierce Biotechnology）によりビオチン化する。タンパク質濃度を、Quick Start Bradford Assay Kit（BioRad）により決定する。
【００６５】
例２：SOMAmerの選択
５−ベンジルアミノカルボニル−ｄＵ（ＢｎｄＵ）、５−ナフチルメチルアミノカルボニル−ｄＵ（ＮａｐｄＵ）、および５−トリプタミノカルボニル−ｄＵ（ＴｒｐｄＵ）による別々のライブラリーを、S.aureusタンパク質とのSELEXのために使用する。各選択は、ＰＣＲ増幅のために必要な固定配列に挟まれた４０個の連続するランダムに選択した位置を含む１ｎｍｏｌ（１０１４〜１０１５）の配列から開始する。SELEXは、基本的に記載されたとおりに行う(Gold et al. 2010, PLoS One 5: e15004、Ochsner et al. 2013, Diagn Microbiol Infect Dis.、Vaught et al. 2010, J Am Chem Soc 132: 4141-4151)。ｐＨ７．５の４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２および０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０からなるバッファーＳＢ１８ＴをSELEXおよびその後の結合アッセイにわたって使用する。
【００６６】
８ラウンドの選択を実行し、ラウンド２から、オフレートの遅いものを有利にするために、１０ｍＭのデキストラン硫酸によるキネティック選抜（kinetic challenge）を行う。SOMAmer-標的複合体の分離は、組み換えタンパク質のＨｉｓ１０-タグに結合する常磁性Talon Dynabeads（登録商標）Talon(登録商標)（Invitrogen）、またはビオチン化ＳｐＡのためのMyOne Streptavidin C1ビーズ（Life Technologies）を用いて達成される。選択された配列は、８０μｌの４０ｍＭ  ＮａＯＨを用いてビーズに結合した標的から溶出し、２０μｌの１６０ｍＭ  ＨＣｌで中和し、KOD EX DNAポリメラーゼ（Invitrogen-Life Technologies）を用いてＰＣＲ増幅する。次のラウンドのための修飾ＤＮＡは、記載されたとおりに(Gold et al., 2010)、ＰＣＲ産物のアンチセンス鎖からのプライマー伸長を介して、KOD EX DNAポリメラーゼにより調製し、精製する。
【００６７】
いくつかの配列または配列ファミリーの存在量の増加を示す、ラウンド３から８までの選択されたＤＮＡのＤＮＡ再会合キネティック解析（Ｃ０ｔ）を、後のラウンドの間の配列の収束の評価に使用する。溶液中での結合ラジオアッセイ（下記参照）において良好な親和性（Ｋｄ≦１０ｎＭ）を示すSOMAmerプールをクローン化し、プールあたり４８個のクローンの配列を決定する。個々のSOMAmerを、配列パターンおよび多様性に基づいて選択し、さらなる特徴付けのために酵素的に調製する。
合成SOMAmerは、標準的なホスホラミダイト化学を介して、１μｍｏｌスケールで４８〜５０マーとして調製し、ＨＰＬＣで精製する。それらは、５’ビオチン−ｄＡまたは５’フルオロセイン−ビオチン−ｄＡ、および、３’→５’エキソヌクレアーゼに対する追加の安定性ための３’末端の反転ｄＴヌクレオチド（３’ｉｄＴ）を含む。
【００６８】
例３：SOMAmerの平衡および全細胞（whole cell）放射性標識結合アッセイ
SOMAmerは、結合アッセイの前に、９５℃で５分間の加熱を介して正しく折り畳まれ、その後、１０〜１５分間かけて室温まで冷却される。
親和性（Ｋｄ’ｓ）は、段階希釈したタンパク質（０．００１〜１００ｎＭ）およびフィルタープレート上に分離するためのZorbax PSM-300A（Agilent Technologies）樹脂による、放射性標識SOMAmer（１０〜２０ｐＭ）の平衡溶液結合アッセイにより、記載されたとおりに決定する(Gold et al. 2010)。
クローニングの前に、SOMAmerのプールはまた、S.epidermidis、S.hemolyticus、S.pyogenes、E.faecalis、E.coliおよびP.aeruginosaをコントロールとして使用し、２時間の平衡結合アッセイにおいてS.aureusへの特異的結合について試験する。
【００６９】
細胞密度は１０５〜１０８ＣＦＵ／ｍＬの範囲であり、０．１ｍＭの硫酸デキストランおよび０．３５ＭのＮａＣｌを非特異的バックグラウンドを低減するために結合バッファーに添加する。加えて、個々の核酸アプタマーは、NRS382、NRS383、NRS384、NRS123、NRS385、NRS386、NRS103（NARSA）、およびATCC29213（ATCC）を含む、異なる系統に属する８つの異なるS.aureus株への結合についてスクリーニングする。
【００７０】
結果
プールの親和性アッセイにより、ＢｎｄＵ、ＮａｐｄＵまたはＴｒｐＵ修飾ｓｓＤＮＡにより得られた合計２２プールのSOMAmerの成功した選択を確認し、プールの親和性は０．１３〜８．９０ｎＭの範囲である。S.aureus細胞への特異的結合が観察されるが、S.epidermidis、S.hemolyticus、S.pyogenes、E.faecalis、E.coliまたはP.aeruginosaへの結合は観察されない。
各プールからの４８個のクローンについて決定された配列のアラインメントは、共通の配列パターンを共有するマルチコピークローンおよびファミリーを示す。代表的なクローンを親和性アッセイにおいてスクリーニングし、最良のSOMAmerのＫｄ’ｓは、０．０３〜２．１７ｎＭの範囲である（表２）。
【表２】
2020072679.tif 000004
【００７１】
精製S.aureusタンパク質に対するSOMAmerの結合親和性は、全細菌への観察された結合と良好に相関する。１つのＳｐＡ−ＮａｐｄＵクローン（４５２０−８；配列番号３）およびｔＳｐＡ−ＴｒｐｄＵクローンの１つ（４５３１−５６；配列番号１）は、試験した全てのS.aureus株の全細胞に結合することができ、検出限界は放射性標識フィルター結合アッセイにおいてウェルあたり〜１０４細胞（１０５〜１０６細胞／ｍＬ）である。S.epidermidisまたはS.hemolyticus細胞への結合は観察されず、これらSOMAmerの良好な特異性を示している。同様の結合特性は、ＣｌｆＡ  SOMAmerについても観察される。
SOMAmerの配列は表３にリストされている。
【表３】
2020072679.tif 000005
【００７２】
表３において提供される配列について「Ｔ」ヌクレオチドは、Ｃ−５修飾ピリミジンである。具体的には、ＳｐＡのタンパク質を標的とするSOMAmerについて「Ｔ」ヌクレオチドはＮａｐｄＵＴＰ（またはＮａｐｄＵ）であり、ＣｌｆＡタンパク質を標的とするSOMAmerについて「Ｔ」ヌクレオチドはＢｎｄＵＴＰ（またはＢｎｄＵ）ヌクレオチドである。
【００７３】
さらに、ＳｐＡのタンパク質に結合するアプタマー配列のためのモチーフ（４５２０）は、以下の配列で表される：ＧＧＣＷＷＣＧＧＧＷＡＣＣＷＡＷＷＡＷＮＧＧＷＷＷＡＧＣＣ（Ｎ）ｎＧＷＣ（配列番号１５）、ここで配列中の「Ｗ」は、Ｃ−５修飾ピリミジンによって占められ得る位置を表し、「Ｎ」は、任意の未修飾または修飾ヌクレオチドによって占められ得る位置を表し、ｎは０から２である（または０、１または２）。好ましくは、Ｃ−５修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵまたはＢｎｄＵである。より好ましくは、Ｃ−５修飾ピリミジンＮａｐｄＵである。
【００７４】
ＣｌｆＡタンパク質に結合するアプタマー配列のためのモチーフ（４５０３）は、以下の配列で表される：ＡＷＣＷＧＧＷＣ（Ｎ）ｎＡＷＣＷＧＧＷＷＷＷＷＡＡＧ（配列番号１６）、ここで配列中の「Ｗ」は、Ｃ−５修飾ピリミジンによって占められ得る位置を表し、「Ｎ」は、任意の未修飾または修飾ヌクレオチドによって占められ得る位置を表す。
【００７５】
さらに、ｎは１から３０（または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または）、または２から２０（または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）、または５から１８（または５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８）、または１０から１６（または１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６）の数であってよい。好ましくは、ｎは１６である。好ましくは、Ｃ−５修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵまたはＢｎｄＵである。より好ましくは、Ｃ−５修飾ピリミジンＢｎｄＵである。
【００７６】
例４：フローサイトメトリーによるStaphylococcus aureus細胞の検出
フローサイトメトリー実験における使用のために、５’ＡＢｆｌＴ（ビオチンおよびフルオレセイン）を含む４８マーとして上記のようにプロテインＡ（ＳｐＡ）に対するSOMAmerを合成する。活性は、４５２０−８（配列番号３）（Ｋｄ＝０．１７ｎＭ）および４５３１−５６（配列番号１）（Ｋｄ＝０．０９ｎＭ）について確認される。
トリプケースソイブロス（ＴＳＢ；bioMerieux, Craponne, France）にStaphylococcus aureus DSM 1104（またはATCC25923）の凍結保存培養物を接種し、振盪しながら３２．５℃で一晩インキュベートする。次いで、一晩培養物を、ワーキング培養物がＯＤ６００にて０．８（約１０８細菌ｍｌ−１）に達するまで、新鮮なＴＳＢ中３２．５℃にて振盪しながら継代培養し、チューブあたり約１０７細胞のアリコートに分割する。細菌を、２分間、１００００ｇの遠心分離によって回収する。
【００７７】
ペレットを、所定の濃度の範囲（０．０７〜７μｍｏｌｌ−１）でSOMAmerを含む１００μｌのＰＢＳ／２５ｍｍｏｌｌ−１ＭｇＣｌ2中に再懸濁する。室温での５分間、１５分間または３０分間のインキュベーション後、細菌を２分間、１００００ｇで遠心分離し、ペレットをＰＢＳ／２５ｍｍｏｌｌ−１のＭｇＣｌ２で再懸濁する。この洗浄工程を２回繰り返す。未染色細菌のコントロールは、SOMAmerを追加することなく、同じプロトコールに従うことにより含める。未染色細菌および染色細菌を、その後、フローサイトメトリーによって分析する。
【００７８】
全ての実験は、４８８ｎｍで照射する空冷１５ｍＷアルゴンイオンレーザーを搭載したFACSCalibur（商標）フローサイトメーター（Becton Dickinson Biosciences; Le Pont de Claix, France）で行われる。緑色蛍光は、対数信号としてＦＬ１チャネル（５３０±３０ｎｍ）に収集される。SOMAmerの結合の結果として生ずる平均蛍光強度および蛍光細胞の割合（規定のゲートにおいてn=10000）を、これらのアッセイにより決定する。FACSCalibur（商標）からのデータは、BD CellQuest（商標）ソフトウェア（Becton Dickinson Biosciences）を用いて分析する。
【００７９】
結果：
蛍光標識されたＳｐＡ  SOMAmer  ４５２０−８（配列番号３）および４５３１−５６（配列番号１）を、フローサイトメトリーによるS.aureusの検出についてそれらの効率を評価するために使用する。どちらのSOMAmerもS.aureus全細胞を染色することに良好に機能する。
細胞の１００％は、０．０７μｍｏｌｌ−１の低いＳｐＡ  SOMAmer濃度で早くも染色されるが、平均蛍光強度は、０．７μｍｏｌｌ−１および７μｍｏｌｌ−１の高い試薬濃度において大幅に増加する（図１ａ）。データは、蛍光標識SOMAmerによる、極めて豊富な細胞表面成分の飽和度の予期された増加と一致する。陰性集団（未染色細胞）と陽性集団（染色細胞）との間のフローサイトメトリーによる正確な区別を確保するＳｐＡ  SOMAmerの最小濃度は０．０７μｍｏｌｌ−１に設定することができる（図１ｂ）。
【００８０】
最適な結合時間を定義するために、経時的アッセイが行われる。わずか５分の結合反応後、１００％の細胞は早くもに７μｍｏｌｌ−１のＳｐＡ  SOMAmerの存在下で染色される（図２）。１５分および３０分に結合時間を増加させることにより、蛍光強度は、それぞれ約２倍および３倍に向上し、陰性集団と陽性集団との間のより良好な区別をもたらす。この蛍光強度の増加は、より低いＳｐＡ  SOMAmer濃度（０．７μｍｏｌｌ−１）で細胞を標識したときにはあまり顕著ではないが、これはSOMAmerの限界濃度によるものと考えられる（図３）。
【００８１】
開発されたＳｐＡ  SOMAmerは、S.aureusについて高い染色効率を有することが分かる。実験条件では、フローサイトメトリーによるS.aureusの最適な検出は、低い試薬濃度（０．７μｍｏｌｌ−１）と短い結合時間（１５分）を用いた、単純なワンステップの手順で達成される。ＤＮＡアプタマーは、単一または組み合わせたアプタマーを使用したS.aureusのフローサイトメトリーベースの検出（Cao et al. 2009）または全細胞SELEXによって生成されたアプタマーを使用したSalmonella typhimuriumの検出（Dwivedi et al. 2013）についてすでに報告されている。しかしながら、これらの研究で得られたアプタマー標識細胞の割合は１００％に接近せず、蛍光強度は、本発明のSOMAmerで得られた蛍光強度と比較して弱かった。
【００８２】
例５：本発明に係るSOMAmerと標準アプタマーとの比較
本発明に係るSOMAmerの、特有の遅いオフレート特性により、これらの試薬は、標準的なＲＮＡまたはＤＮＡアプタマーと比較して、より優れた親和性およびより良好な力学的特性を有するはずである。この見解を証明するために、本発明に係るＳｐＡ  SOMAmerを、S.aureusに特異的なＤＮＡアプタマー（未知標的抗原）と比較する。
【００８３】
ＤＮＡアプタマーはIntegrated DNA Technologiesによって製造されている。
本発明のアプタマーおよび標準アプタマーの両方についてのプロトコールは、例４に記載したものと同様である（標準アプタマーの例外：アッセイの前にアプタマーの加熱なし；結合バッファーとしてＰＢＳを使用）。
S.aureus DSM 1104を用いて得られたフローサイトメトリーの結果：
【表４】
2020072679.tif 000006
【００８４】
１５９μｍｏｌｌ−１の標準アプタマーを用いて得られた染色細胞の割合は、６０分の結合時間の後に１００％に達していない。一方、０．７μｍｏｌｌ−１の本発明に係るSOMAmerにより、１００％の細胞が、わずか５分で染色される。この結果は、本発明に係るSOMAmerの結合効率が、２００倍低い濃度でさえも、標準的なＤＮＡアプタマーより良好であることを示している。
【００８５】
この実験は、S.aureusのフローサイトメトリーによる検出に対する本発明に係るSOMAmerの遅いオフレート特性の利点を証明する：高い結合／検出効率は、極めて短い時間枠内で、より低い試薬濃度で達成され得る。
【図１】
2020072679.tif 000007
【図２】
2020072679.tif 000008
【図３】
2020072679.tif 000009
【配列表】
2020072679000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月22日(2020.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2020072679000001.pdf