(57)【要約】【課題】ヒト化ユニバーサル軽鎖マウスを提供すること。【解決手段】ヒト化重鎖免疫グロブリン遺伝子座、ユニバーサル軽鎖を発現するヒト化軽鎖遺伝子座、およびＡＤＡＭ６をコードする遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含むマウス、組織、細胞、および遺伝子材料を提供する。ヒト可変ドメインを含むヒト化重鎖を発現し、且つヒト可変ドメインを含むヒト化軽鎖を発現するマウスであって、該軽鎖が１つ以下または２つ以下の軽鎖ＶおよびＪまたは再構成されたＶ／Ｊ配列に由来する、マウスを提供する。ユニバーサル軽鎖およびヒト化重鎖を有する抗体を発現する繁殖力のある雄マウスを提供する。二重特異性結合性タンパク質を作製するための方法および組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化ユニバーサル軽鎖マウスなど。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする配列および抗体（二重特異性抗体（ユニバーサル軽鎖（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）を含む二重特異性抗体が含まれる）が含まれる）の作製のための遺伝子改変されたマウス、細胞、胚、組織、および単離核酸。組成物および方法は、内因性マウス重鎖可変遺伝子座に生殖系列置換を有する遺伝子改変マウスであって、生殖系列置換が１つまたは２つ以下の異なる軽鎖Ｖ遺伝子セグメントに由来する軽鎖を発現する改変軽鎖遺伝子座を含み、マウスはこれらの改変を有する雄マウスが繁殖性を示すようにその生殖系列においてさらに遺伝子改変されている、遺伝子改変マウスを含む。ユニバーサル軽鎖およびヒト化重鎖可変ドメインを発現する遺伝子改変マウスであって、該マウスが雄マウスにおいて機能するＡＤＡＭ６活性を含む、遺伝子改変マウスを提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ヒトへの治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）として用いるための抗体の開発には長く且つ複雑な歴史がある。１つの重要な進展は、免疫原性の可能性が軽減された有効なヒト治療薬のデザインで使用するための本質的に完全ヒト抗体配列を作製することができたことである。現在、その生殖系列において内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座での導入遺伝子としてか置換物として、再構成されていない遺伝子セグメント（重鎖および軽鎖）に由来するヒト抗体配列が生成するように改変されたマウスが存在する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスのようなマウス内の内因性遺伝子座でのマウス可変配列のヒト可変配列への置換により、マウス免疫系が本質的に正常に機能することが可能である。結果として、これらのマウスの最適な抗原への曝露により、最適な抗原に指向する完全ヒト抗体の作製において使用することができる高親和性体細胞変異ヒト可変ドメインを発現する非常に多様で豊富なクローン選択されたＢ細胞集団が生成される。
【０００３】
ヒト化マウス内で作製されたヒト可変ドメインを使用して、完全ヒト二重特異性抗体（すなわち、重鎖可変ドメインの同一性および結合特異性が異なる重鎖のヘテロ二量体である結合性タンパク質）をデザインすることができる。しかし、重鎖ヘテロ二量体と有効に会合して発現することができる軽鎖の選択に関して解決は容易ではない。ヒト治療薬で用いるヒト軽鎖可変ドメインの開発はヒト化マウスにおいて確かに可能であるが、所望の結合特性を有する重鎖と有効に会合して発現し、両方の重鎖の発現または結合の挙動に有害でない軽鎖を選択するための容易な解決法は存在しない。
【０００４】
したがって、ヒト治療薬で用いるヒト免疫グロブリン可変領域（内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座での核酸配列から生成されるヒト免疫グロブリン可変領域が含まれる）を開発するための組成物および方法が当該分野で依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
二重特異性結合性タンパク質（二重特異性抗体が含まれる）での使用に適切なヒト免疫グロブリン可変ドメインを発現するマウスであって、該マウスが内因性マウス重鎖可変遺伝子座のヒト化を含み、ヒト化を含む雄マウスが繁殖性を示し、マウスが１つ以下または２つ以下のλおよび／またはκＶ遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン軽鎖レパートリーを発現するマウスが得られる内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座のヒト化をさらに含む、マウスを記載する。
【０００６】
再構成されていないヒト重鎖Ｖ、Ｄ、およびＪセグメントのレパートリーに由来する適切な親和性成熟ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを選択する遺伝子操作マウスをであって、親和性成熟ヒト重鎖可変ドメインがヒト化ユニバーサル軽鎖と会合して発現する遺伝子操作マウスを提供する。ヒト化ユニバーサル軽鎖は、軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結される１つ以下または２つ以下のヒト軽鎖ＶセグメントおよびヒトＪセグメントまたは軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結される軽鎖可変ドメインをコードする１つ以下または２つ以下の再構成された（Ｖλ／Ｊλ、Ｖκ／Ｊκ、Ｖλ／Ｊκ、またはＶκ／Ｊλ）ヒト核酸配列のいずれかを含む遺伝子座から発現される。様々な実施形態において、ユニバーサルヒト化軽鎖ドメインは複数の親和性成熟ヒト重鎖可変ドメインと対合し、複数の重鎖可変ドメインは異なるエピトープまたは抗原と特異的に結合する。
【０００７】
一態様では、ヒト化重鎖免疫グロブリン可変遺伝子座およびヒト化軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子座を含むマウスであって、該マウスが２つ以下のユニバーサル軽鎖のうちの１つを発現し、雄であるマウスが野生型妊性を示す、マウスを作製するための核酸構築物、細胞、胚、マウス、および方法を提供する。
【０００８】
一態様では、その生殖系列内において内因性マウス重鎖遺伝子座にヒト化重鎖免疫グロブリン可変遺伝子座を含み、且つヒト化軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子座を含む改変マウスであって、該マウスがユニバーサル軽鎖を発現し、マウスがマウスＡＤＡＭ６をコードする核酸配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む、改変マウスを提供する。様々な実施形態において、ヒト化軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子座は内因性マウス軽鎖遺伝子座に存在する。
【０００９】
一実施形態では、ヒト化重鎖免疫グロブリン可変遺伝子座は、内因性マウス重鎖可変遺伝子座での、全てまたは実質的に全ての機能的マウス免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントの、１つもしくは複数のヒトＶ、ヒトＤ、およびヒトＪ遺伝子セグメントでの置換を含み、１つもしくは複数のヒトＶ、Ｄ、およびＪセグメントが作動可能に連結されて重鎖定常配列に作動可能に連結される再構成されたＶ／Ｄ／Ｊ遺伝子を形成するように再構成することができる。
【００１０】
一実施形態では、マウスは、ユニバーサル軽鎖が作製されるように操作された軽鎖遺伝子座を含み、ユニバーサル軽鎖は１つ以下の軽鎖Ｖセグメントおよび１つ以下の軽鎖Ｊセグメントを含む軽鎖遺伝子座または単一の再構成された軽鎖Ｖ／Ｊ配列を含む軽鎖遺伝子座に由来する軽鎖である。一実施形態では、マウスは、ヒト軽鎖Ｊ遺伝子セグメント（１つまたは複数のＪセグメントから選択される）を用いて再構成してヒト軽鎖可変ドメインをコードすることができる単一のヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖセグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む。別の実施形態では、マウスは、軽鎖遺伝子座に２つ以下のヒト軽鎖Ｖセグメントを含み、その各ＶセグメントはヒトＪ遺伝子セグメント（１つまたは複数の軽鎖Ｊセグメントから選択される）を用いて再構成して再構成されたヒト軽鎖可変ドメインをコードすることができる。
【００１１】
一実施形態では、単一のヒト軽鎖ＶセグメントはＪκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、およびＪκ５から選択されるヒト軽鎖Ｊセグメントに作動可能に連結されており、単一のヒト軽鎖Ｖセグメントは１つもしくは複数のヒト軽鎖Ｊセグメントのうちのいずれかを有する軽鎖可変領域遺伝子をコードする配列が形成されるように再構成することができる。
【００１２】
一実施形態では、マウスは、全てまたは実質的に全てのマウスＶおよびＪ遺伝子セグメントの、１つ以下または２つ以下の再構成された（Ｖ／Ｊ）核酸配列での置換を含む内因性軽鎖遺伝子座を含む。一実施形態では、１つ以下または２つ以下の再構成された（Ｖ／Ｊ）核酸配列は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５、Ｖκ３−２０Ｊκ１、およびその組み合わせから選択される。
【００１３】
一実施形態では、マウスは、マウス軽鎖可変ドメインを発現することができる機能的内因性軽鎖遺伝子座を欠く。一実施形態では、マウスは、κ遺伝子座でユニバーサル軽鎖の可変ドメインをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、マウスは、λ遺伝子座でユニバーサル軽鎖の可変ドメインをコードする核酸配列を含む。
【００１４】
一実施形態では、ヒトＶセグメント（または再構成されたＶ／Ｊ配列）は、ヒトまたはマウスリーダー配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、リーダー配列はマウスリーダー配列である。特定の実施形態では、マウスリーダー配列はマウスＶκ３−７リーダー配列である。
【００１５】
一実施形態では、ヒトＶセグメント（または再構成されたＶ／Ｊ配列）は免疫グロブリンプロモーター配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、プロモーター配列はヒトプロモーター配列である。特定の実施形態では、ヒト免疫グロブリンプロモーターはヒトＶκ３−１５プロモーターである。
【００１６】
一実施形態では、再構成されていないＶおよびＪセグメントまたは再構成された（Ｖ／Ｊ）配列は、軽鎖免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、定常領域遺伝子はマウスＣκ遺伝子である。
【００１７】
一実施形態では、再構成されていないＶおよびＪセグメントまたは再構成された（Ｖ／Ｊ）配列はκ軽鎖遺伝子座に存在し、κ軽鎖遺伝子座はマウスκイントロンエンハンサー、マウスκ３’エンハンサー、またはイントロンエンハンサーおよび３’エンハンサーの両方を含む。特定の実施形態では、κ遺伝子座は内因性κ遺伝子座である。
【００１８】
一実施形態では、マウスはユニバーサル軽鎖の可変ドメインをコードする配列を含むκ遺伝子座を含み、マウスは非機能的免疫グロブリンラムダ（λ）軽鎖遺伝子座を含む。特定の実施形態では、λ軽鎖遺伝子座は遺伝子座の１つもしくは複数の配列の欠失を含み、１つもしくは複数の欠失はλ軽鎖遺伝子座が再構成されて軽鎖遺伝子を形成することを不可能にする。別の実施形態では、λ軽鎖遺伝子座の全てまたは実質的に全てのＶセグメントを欠失する。１つの別の実施形態では、マウスは、全てまたは実質的に全ての内因性軽鎖可変遺伝子座の欠失を含む。
【００１９】
一実施形態では、マウスは、その生殖系列内に再構成された免疫グロブリン軽鎖配列または再構成されていない遺伝子セグメントに関して５’側のマウスκイントロンエンハンサー、マウスκ３’エンハンサー、およびその組み合わせから選択される配列をさらに含む。
【００２０】
一実施形態では、マウスのユニバーサル軽鎖可変ドメイン配列は１つもしくは複数の体細胞超変異を含み、１つの実施形態では、可変ドメイン配列は複数の体細胞超変異を含む。
【００２１】
一実施形態では、マウスは体細胞変異ヒト可変ドメインを含むユニバーサル軽鎖を作製する。一実施形態では、該軽鎖は、ヒトＶセグメント、ヒトＪセグメント、およびマウスＣκ遺伝子に由来する体細胞変異ヒト可変ドメインを含む。一実施形態では、マウスはλ軽鎖を発現しない。
【００２２】
一実施形態では、ヒト可変配列は再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列であり、マウスは（ｉ）Ｖκ１−３９Ｊκ５に由来する可変ドメインおよび（ｉｉ）マウスＣＬを含むリバースキメラ軽鎖を発現し、該軽鎖は（ｉ）マウスＣＨおよび（ｉｉ）体細胞変異ヒト重鎖可変ドメインを含むリバースキメラ重鎖と会合している。一実施形態では、マウスは体細胞変異した軽鎖を発現する。一実施形態では、ＣＬはマウスＣκである。
【００２３】
一実施形態では、ヒト可変配列は再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列であり、マウスは（ｉ）Ｖκ３−２０Ｊκ１に由来する可変ドメイン、および（ｉｉ）マウスＣＬを含むリバースキメラ軽鎖を発現し、該軽鎖は、（ｉ）マウスＣＨ、および（ｉｉ）体細胞変異ヒト重鎖可変ドメインを含むリバースキメラ重鎖と会合している。
【００２４】
一実施形態では、マウスは再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列および再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列の両方を含み、マウスは（ｉ）Ｖκ１−３９Ｊκ５配列またはＶκ３−２０Ｊκ１配列に由来する可変ドメインを含む軽鎖、および（ｉｉ）マウスＣＬを含むリバースキメラ軽鎖を発現し、該軽鎖は（ｉ）マウスＣＨ、および（ｉｉ）体細胞変異ヒト重鎖可変ドメインを含むリバースキメラ重鎖と会合している。一実施形態では、マウスは体細胞変異された軽鎖を発現する。一実施形態では、ＣＬはマウスＣκである。
【００２５】
一実施形態では、マウスはマウスＣκおよび再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列に由来する体細胞変異ヒト可変ドメインを含む軽鎖ならびにマウスＣＨおよび体細胞変異ヒト重鎖可変ドメインを含む重鎖を含むリバースキメラ抗体を発現し、マウスは完全マウス抗体を発現せず、完全ヒト抗体を発現しない。一実施形態では、マウスは、内因性マウスκ軽鎖遺伝子セグメントの、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列での置換を含み、且つ全てまたは実質的に全ての内因性マウス重鎖Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントの、ヒト重鎖Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントの完全または実質的に完全なレパートリーでの置換を含むκ軽鎖遺伝子座を含む。
【００２６】
一態様では、１つ以下または２つ以下の再構成されたκ軽鎖配列に由来する単一のκ軽鎖を発現する遺伝子改変マウスであって、該マウスが抗原で免疫されると同じ抗原で免疫された野生型マウスに匹敵する血清力価を示す、遺伝子改変マウスを提供する。特定の実施形態では、マウスは単一のκ軽鎖配列を発現し、単一のκ軽鎖配列は１つ以下の再構成されたκ軽鎖配列に由来する。一実施形態では、血清力価は総免疫グロブリンと特徴付けられる。特定の実施形態では、血清力価はＩｇＭ特異的力価と特徴付けられる。特定の実施形態では、血清力価はＩｇＧ特異的力価と特徴付けられる。さらに特定の実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５配列およびＶκ３−２０Ｊκ１配列から選択される。一実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列はＶκ１−３９Ｊκ５配列である。一実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列はＶκ３−２０Ｊκ１配列である。
【００２７】
一態様では、単一の軽鎖配列と会合した複数の免疫グロブリン重鎖を発現する遺伝子改変マウスを提供する。一実施形態では、重鎖はヒト配列を含む。種々の実施形態では、ヒト配列は、可変配列、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびその組み合わせから選択される。一実施形態では、単一の軽鎖はヒト配列を含む。種々の実施形態では、ヒト配列は、可変配列、定常配列、およびその組み合わせから選択される。一実施形態では、マウスは無能化された内因性免疫グロブリン遺伝子座を含み、導入遺伝子または染色体外エピソーム由来の重鎖および／または軽鎖を発現する。一実施形態では、マウスは、内因性マウス遺伝子座での、いくつかまたは全ての内因性マウス重鎖遺伝子セグメント（すなわち、Ｖ、Ｄ、Ｊ）、および／またはいくつかまたは全ての内因性マウス重鎖定常配列（例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、またはその組み合わせ）、および／またはいくつかまたは全ての内因性マウス軽鎖配列（例えば、Ｖ、Ｊ、定常、またはその組み合わせ）の、１つもしくは複数のヒト免疫グロブリン配列での置換を含む。
【００２８】
１つの実施形態において、前記マウスは、前記１つもしくは複数のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、または１つもしくは複数のＶおよびＪ遺伝子セグメントの再構成後、前記マウスは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする少なくとも１つの核酸配列をそのゲノム内に含む。１つの実施形態において、再構成後、前記マウスは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする少なくとも２つの核酸配列をそのゲノム内に含む。１つの実施形態において、再構成後、前記マウスは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする少なくとも１つの核酸配列をそのゲノム内に含む。１つの実施形態において、前記マウスは、前記ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をＢ細胞内に含む。
【００２９】
１つの実施形態において、前記雄マウスは、単一の未改変内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子またはそのオルソログもしくは（ｏｆ）ホモログもしくは機能的断片を内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座に含む。
【００３０】
１つの実施形態において、前記雄マウスは、内因性マウスＡＤＡＭ６対立遺伝子の場所、例えば、最後のＶ遺伝子セグメント配列の３’および最初のＤ遺伝子セグメントの５’に近いマウスゲノム内の場所にＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。
【００３１】
１つの実施形態において、前記雄マウスは、免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントをコードする核酸配列の（ＡＤＡＭ６配列の転写方向を基準にして）上流、下流、または上流および下流に隣接するＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。特定の実施形態において、前記免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、前記免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントであり、マウスにおいて機能的なマウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする配列は、ヒトＶ遺伝子セグメント間にある；１つの実施形態において、前記マウスは、２つ以上のＶ遺伝子セグメントを含み、前記配列は、前記最後のＶ遺伝子セグメントと最後から二番目のＶ遺伝子セグメントの間の位置にある。１つの実施形態において、前記配列は、前記最後のＶ遺伝子セグメントおよび前記最初のＤ遺伝子セグメントの次に来る位置にある。
【００３２】
一実施形態では、ヒト化重鎖免疫グロブリン可変遺伝子座は内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子を欠く。一実施形態では、ヒト化重鎖免疫グロブリン可変遺伝子座は、雄マウスにおいて機能するＡＤＡＭ６遺伝子を含む。特定の実施形態では、雄マウスにおいて機能するＡＤＡＭ６遺伝子はマウスＡＤＡＭ６遺伝子であり、マウスＡＤＡＭ６遺伝子はヒト化重鎖免疫グロブリン可変遺伝子座内またはそれのすぐ隣に存在する。
【００３３】
一実施形態では、ヒト化重鎖免疫グロブリン可変遺伝子座は内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、マウスは雄マウスにおいて機能する異所性ＡＤＡＭ６配列を含む。一実施形態では、雄マウスにおいて機能する異所性ＡＤＡＭ６遺伝子はマウスＡＤＡＭ６遺伝子である。一実施形態では、マウスＡＤＡＭ６遺伝子は、ヒト化重鎖免疫グロブリン可変遺伝子座と同一の染色体上に存在する。一実施形態では、マウスＡＤＡＭ６遺伝子は、ヒト化重鎖免疫グロブリン可変遺伝子座と異なる染色体上に存在する。一実施形態では、マウスＡＤＡＭ６遺伝子はエピソーム上に存在する。
【００３４】
一実施形態では、マウスは第一の内因性重鎖対立遺伝子および第二の内因性重鎖対立遺伝子を含み、第一の内因性重鎖対立遺伝子はマウスＡＤＡＭ６遺伝子座の欠失を含み、第一の内因性重鎖対立遺伝子は全てまたは実質的に全ての機能的マウスＶ、Ｄ、およびＪセグメントの、１つもしくは複数のヒトＶ、Ｄ、およびＪセグメントでの置換を含む。一実施形態では、第一および第二の内因性重鎖対立遺伝子は、各々、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の欠失を含み、第一および第二の内因性重鎖対立遺伝子は全てまたは実質的に全ての機能的マウスＶ、Ｄ、およびＪセグメントの、１つもしくは複数のヒトＶ、Ｄ、およびＪセグメントでの置換を含む。一実施形態では、第一および／または第二の対立遺伝子は、マウスＡＤＡＭ６をコードする異所性核酸配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む。１つの実施形態において、異所性の核酸配列は、前記第二の改変は、最後のマウスＶ遺伝子セグメントの（重鎖可変遺伝子座（locust）の転写方向性を基準にして）３’にあり、およびマウス（またはキメラヒト／マウス）重鎖定常遺伝子またはその断片（例えば、ヒトおよび／またはマウス：ＣＨ１および／またはヒンジおよび／またはＣＨ２および／またはＣＨ３をコードする核酸配列）の（定常配列の転写方向性を基準にして）５’にある。一実施形態では、異所性核酸配列は、Ｖセグメントの下流（Ｖセグメント遺伝子座の転写方向に関して）且つＤセグメントの上流に存在する。一実施形態では、異所性核酸配列は、最も３’側から２番目のＶセグメントと最も３’側のＶセグメントとの間に存在する。特定の実施形態では、異所性核酸配列はヒトＶセグメントＶＨ１−２とヒトＶセグメントＶＨ６−１との間に存在する。一実施形態では、２つのヒトＶ遺伝子セグメントの間のヌクレオチド配列は、ヒトＶ遺伝子セグメントに関して逆の転写方向に存在する。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＡＤＡＭ６遺伝子の転写方向に関して５’から３’にＡＤＡＭ６ａ配列をコードし、その後にＡＤＡＭ６ｂ配列をコードする。特定の実施形態では、ＡＤＡＭ６遺伝子（複数可）は、隣接するＶセグメントの上流および下流と比較して逆の転写方向に配向している。
【００３５】
１つの実施形態において、前記核酸配列は、マウスＡＤＡＭ６ａもしくはその機能的断片をコードする配列、および／またはマウスＡＤＡＭ６ｂもしくはその機能的断片をコードする配列を含み、該ＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂまたはその機能的断片（単数もしくは複数）は、プロモーターに作動可能に連結されている。１つの実施形態において、前記プロモーターは、ヒトプロモーターである。１つの実施形態において、前記プロモーターは、マウスＡＤＡＭ６プロモーターである。特定の実施形態において、前記ＡＤＡＭ６プロモーターは、最も５’側のマウスＤＨ遺伝子セグメントに最も近い第一のＡＤＡＭ６遺伝子の第一コドンと、最も５’側のＤＨ遺伝子セグメントの組換えシグナル配列との間にある配列を含み、この場合の５’は、マウス免疫グロブリン遺伝子の転写方向を基準にして示される。１つの実施形態において、前記プロモーターは、ウイルスプロモーターである。特定の実施形態において、前記ウイルスプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。１つの実施形態において、前記プロモーターは、ユビキチンプロモーターである。
【００３６】
１つの実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはＡＤＡＭ６ｂは、配列番号１のＡＤＡＭ６ａおよび／または配列番号２の配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のＡＤＡＭ６ｂから選択される。１つの実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６プロモーターは、配列番号３のプロモーターである。特定の実施形態において、前記ＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡＭ６ａの第一コドンの（ＡＤＡＭ６ａの転写方向を基準にして）直ぐ上流の配列番号３の核酸配列であって、ＡＤＡＭ６コーディング領域の上流の配列番号３の端にわたる（ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ）核酸配列を含む。もう１つの特定の実施形態において、前記ＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡＭ６ａの開始コドンの上流約５から約２０ヌクレオチド以内からＡＤＡＭ６ａの開始コドンの約０．５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂまたは３ｋｂ以上上流にわたる断片である。
【００３７】
１つの実施形態において、前記核酸配列は、ＡＤＡＭ６欠如のため不妊性であるまたは妊性が低いマウスの体内に配置されたとき、妊性を向上させるまたは妊性をほぼ野生型の妊性に回復させる、配列番号３またはその断片を含む。１つの実施形態において、配列番号３またはその断片は、雌マウス卵管を通り抜けてマウス卵子を受精させることができる精子細胞を産生する能力を雄マウスに付与する。
【００３８】
一実施形態では、マウスは、雄マウスにおいて機能するＡＤＡＭ６タンパク質をコードする核酸配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む。特定の実施形態では、核酸配列は、１つもしくは複数の免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含むヒト核酸配列内に存在するかこれに隣接する。一実施形態では、１つもしくは複数の免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは改変内因性マウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座に存在する。一実施形態では、改変は、全てまたは実質的に全ての機能的マウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントの、内因性マウス定常領域遺伝子に作動可能に連結される複数の再構成されていないヒト重鎖遺伝子セグメントでの置換を含む。特定の実施形態では、核酸配列は２つのヒトＶセグメントの間に存在する。特定の実施形態では、核酸配列はヒトＶセグメントとヒトＤセグメントとの間に存在する。特定の実施形態では、核酸配列はヒトＤセグメントとヒトＪセグメントとの間に存在する。特定の実施形態では、核酸配列は、最も５’側の（Ｖセグメントの転写方向に関して）ヒトＶセグメントの上流に存在する。特定の実施形態では、核酸配列は、ヒトＪセグメントと内因性マウス重鎖定常領域遺伝子配列との間に存在する。
【００３９】
一実施形態では、雄マウスは、野生型マウスとほぼ同一の頻度の交配によって子孫をもたらすことができる。一実施形態では、雄マウスは、マウス卵管を介してマウス子宮から移行してマウス卵を受精させることができる精液を産生し、特定の実施形態では、マウス精子は卵管を介して野生型マウス由来の精子ほどの効率で移行する。一実施形態では、マウスで産生された約５０％以上の精子が卵管に侵入および／または移行してマウス卵を受精させる能力を示す。
【００４０】
一実施形態では、マウスは機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠き、マウスは、雄マウスにおけるマウスＡＤＡＭ６機能の喪失を補完する異所性ヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、異所性ヌクレオチド配列は、雄マウスに、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を含む対応する野生型雄マウスに匹敵する子孫産生能を付与する。一実施形態では、配列は、マウスに、マウスの精子細胞表面上にＡＤＡＭ２および／またはＡＤＡＭ３および／またはＡＤＡＭ６の複合体を形成する能力を付与する。一実施形態では、配列は、マウスに、マウス卵管を介してマウス子宮からマウス卵に移動して卵を受精させる能力を付与する。
【００４１】
一実施形態では、マウスは機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠き、雄マウスにおいて機能するＡＤＡＭ６をコードする異所性ヌクレオチド配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含み、雄マウスは、同年齢および系統の野生型マウスが６ヶ月の期間にもたらす同腹仔数の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％をもたらす。
【００４２】
一実施形態では、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き且つ異所性ヌクレオチド配列を含むマウスは、６ヶ月間にわたって交配した場合、実質的に同期間にわたり、且つ実質的に同一条件下で交配した機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、且つ異所性ヌクレオチド配列を欠く同年齢で同一または類似の系統のマウスよりも少なくとも約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約４倍、約６倍、約７倍、約８倍、または約１０倍またはそれを超える子孫をもたらす。
【００４３】
一実施形態では、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、且つ異所性ヌクレオチド配列を含むマウスは、４または６ヶ月間の交配期間における同腹仔あたりの子の数を、同一期間交配した機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、且つ異所性ヌクレオチド配列を欠くマウスよりも平均して少なくとも約２倍、３倍、または４倍多くもたらす。
【００４４】
一実施形態では、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き且つ異所性ヌクレオチド配列を含むマウスは雄マウスであり、雄マウスは、交尾約５〜６時間後に卵管から回収した場合に、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き且つ異所性ヌクレオチド配列を欠くマウスの精子よりも少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、１００倍、１１０倍、または１２０倍またはそれを超える卵管移動をもたらす精子を産生する。
【００４５】
一実施形態では、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き且つ異所性ヌクレオチド配列を含むマウスは、雌マウスと交尾した場合に、野生型マウス由来の精子とほぼ同等の効率で約６時間以内に子宮を通り抜け、卵管に侵入して通り抜けることができる精子を生成する。
【００４６】
一実施形態では、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き且つ異所性ヌクレオチド配列を含むマウスは、匹敵する期間に、機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き且つ異所性ヌクレオチド配列を欠くマウスよりも約１．５倍、約２倍、約３倍、または約４倍またはそれを超える同腹仔をもたらす。
【００４７】
一態様では、ヒト化内因性マウス重鎖可変免疫グロブリン遺伝子座およびマウス軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の改変を含むマウスであって、該マウスは、ヒトまたはマウス重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖免疫グロブリン配列を含むＢ細胞を発現し、Ｂ細胞はそのゲノム内に（例えば、Ｂ細胞染色体上に）雄マウスにおいて機能するＡＤＡＭ６をコードする遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片（例えば、マウスＡＤＡＭ６遺伝子（例えば、マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂ））を含み、マウスの免疫グロブリンλまたはκ軽鎖の可変ドメインは１つ以下または２つ以下の軽鎖Ｖ遺伝子セグメントに由来するマウスを提供する。
【００４８】
１つの実施形態において、前記重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている再構成免疫グロブリン配列は、ヒト重鎖Ｖ、Ｄおよび／またはＪ配列；マウス重鎖Ｖ、Ｄおよび／またはＪ配列；ヒトまたはマウス軽鎖Ｖおよび／またはＪ配列を含む。１つの実施形態において、前記重鎖定常領域遺伝子配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびその組み合わせからなる群より選択されるヒトまたはマウス重鎖配列を含む。
【００４９】
一態様では、同一の軽鎖を有する抗体の作製に適切なマウスであって、該マウス内で作製された全てまたは実質的に全ての抗体は同一の軽鎖と共に発現され、軽鎖はヒト可変ドメインを含み、抗体はヒト可変ドメインを含む重鎖を含む、マウスを提供する。
【００５０】
一態様では、マウスがヒトＶκ１−３９Ｊκ５でもヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列でもない再構成された軽鎖配列に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現するＢ細胞を作製する能力がないことによって特徴付けられるマウスを提供する。
【００５１】
一実施形態では、マウスは、免疫グロブリン軽鎖ＶおよびＪ遺伝子セグメントの野生型相補物を含むマウスとほぼ同一であるκ：λ軽鎖比を示す。
【００５２】
一態様では、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列に由来する免疫グロブリン軽鎖を発現する本明細書に記載のマウスであって、該マウスは、全てまたは実質的に全ての内因性マウス重鎖可変領域遺伝子セグメントの、１つもしくは複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントでの置換を含み、マウスは約１〜約２０の（ａ）λ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現するＣＤ１９＋Ｂ細胞の（ｂ）κ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現するＣＤ１９＋Ｂ細胞に対する比を示す、マウスを提供する。
【００５３】
一実施形態では、マウスは単一のκ軽鎖を発現し、単一のκ軽鎖はヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列に由来し、λ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現するＣＤ１９＋Ｂ細胞の、κ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現するＣＤ１９＋Ｂ細胞に対する比は約１〜約２０であり、１つの実施形態では、比は約１〜少なくとも約６６であり、特定の実施形態では、比は約１〜６６である。
【００５４】
一実施形態では、マウスは単一のκ軽鎖を発現し、単一のκ軽鎖はヒトＶκ３−２０Ｊκ５配列に由来し、λ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現するＣＤ１９＋Ｂ細胞の、κ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現するＣＤ１９＋Ｂ細胞に対する比は約１〜約２０であり、１つの実施形態では、比は約１〜約２１である。特定の実施形態では、比は１〜２０または１〜２１である。
【００５５】
一実施形態では、マウスにおけるＩｇκ＋Ｉｇλ＋Ｂ細胞のパーセントは野生型マウスとほぼ同一である。特定の実施形態では、マウスにおけるＩｇκ＋Ｉｇλ＋Ｂ細胞のパーセントは約２〜約６パーセントである。特定の実施形態では、単一の再構成されたκ軽鎖がＶκ１−３９Ｊκ５配列に由来するマウスにおけるＩｇκ＋Ｉｇλ＋Ｂ細胞のパーセントは約２〜約３、特定の実施形態では、約２．６である。特定の実施形態では、単一の再構成されたκ軽鎖がＶκ３−２０Ｊκ１配列に由来するマウスにおけるＩｇκ＋Ｉｇλ＋Ｂ細胞のパーセントは約４〜約８、特定の実施形態では、約６である。
【００５６】
一実施形態では、マウスは、該マウスが該マウスの任意の機能的軽鎖遺伝子座を体細胞変異させる能力を低減または消失させる改変を含まない。一実施形態では、マウス内の唯一の機能的軽鎖遺伝子座は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列、ヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列、およびその組み合わせから選択される再構成された配列に由来するヒト可変ドメインを含む軽鎖を発現する。
【００５７】
一態様では、１つ以下または２つ以下の再構成されたκ軽鎖配列に由来する単一のκ軽鎖を発現する遺伝子改変マウスであって、該マウスは、完全または実質的に完全なヒトκ軽鎖遺伝子座を保有するマウスによって示される同一のκ軽鎖（すなわち、同一のＶセグメントおよび同一のＪセグメントに由来するか、同一の再構成されたＶ／Ｊセグメントに由来する）の使用量よりも約１００倍以上、少なくとも約２００倍以上、少なくとも約３００倍以上、少なくとも約４００倍以上、少なくとも約５００倍以上、少なくとも約６００倍以上、少なくとも約７００倍以上、少なくとも約８００倍以上、少なくとも約９００倍以上、少なくとも約１０００倍以上多いκ軽鎖の使用量を示す遺伝子改変マウスを提供する。特定の実施形態では、完全または実質的に完全なヒトκ軽鎖遺伝子座を保有するマウスは、機能的な再構成されていないマウスκ軽鎖配列を欠く。特定の実施形態では、マウスは、１つ以下の再構成されたκ軽鎖配列由来の単一のκ軽鎖を発現する。一実施形態では、マウスは再構成されたκ軽鎖配列の１つのコピーを含む（例えば、ヘテロ接合体）。一実施形態では、マウスは再構成されたκ軽鎖配列の２つのコピーを含む（例えば、ホモ接合体）。１つのより特定の実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列はＶκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１配列から選択される。一実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列はＶκ１−３９Ｊκ５配列である。一実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列はＶκ３−２０Ｊκ１配列である。
【００５８】
一態様では、１つ以下または２つ以下の再構成されたκ軽鎖配列に由来する単一の軽鎖を発現する遺伝子改変マウスであって、該遺伝子改変マウス内の軽鎖は、完全または実質的に完全なヒトκ軽鎖可変遺伝子座を保有するマウスによって示される同一の再構成された軽鎖の発現よりも少なくとも１０倍〜約１，０００倍、１００倍〜約１，０００倍、２００倍〜約１，０００倍、３００倍〜約１，０００倍、４００倍〜約１，０００倍、５００倍〜約１，０００倍、６００倍〜約１，０００倍、７００倍〜約１，０００倍、８００倍〜約１，０００倍、または９００倍〜約１，０００倍多い発現レベルを示す、遺伝子改変マウスを提供する。一実施形態では、軽鎖はヒト配列を含む。一実施形態では、単一の軽鎖は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５、ヒトＶκ３−２０Ｊκ１、およびその組み合わせから選択される再構成されたκ軽鎖配列に由来する。
【００５９】
一実施形態では、軽鎖の発現を、実質的に完全なヒト化軽鎖可変遺伝子座を含むマウスにおける発現と比較するための、軽鎖の発現レベルは、転写された軽鎖配列（１つまたは２つの再構成された配列由来）のｍＲＮＡを定量することおよび、それを、完全または実質的に完全な軽鎖遺伝子座を保有するマウスの転写された軽鎖配列と比較することによって特徴付けられる。
【００６０】
一態様では、抗体の作製方法であって、細胞で、（ａ）ヒトＣＨ遺伝子配列と融合される本明細書に記載の免疫マウスの第一のヒト重鎖可変ドメイン核酸配列、（ｂ）ヒトＣＬ遺伝子配列と融合される本明細書に記載の免疫マウスのヒト軽鎖可変ドメイン核酸配列を発現させること、および（ｃ）完全なヒトの抗体を発現させるのに十分な条件の下で細胞を維持し、抗体を単離することを含む方法が提供される。一実施形態では、細胞は、ヒトＣＨ遺伝子配列と融合される本明細書に記載の第二の免疫マウスの第二のヒト重鎖可変ドメイン核酸配列を含み、第一の重鎖核酸配列は第一のエピトープを認識する第一の重鎖可変ドメインをコードし、第二の重鎖核酸配列は第二のエピトープを認識する第二の重鎖可変ドメインをコードし、ここで、第一のエピトープおよび第二のエピトープは同一でない。
【００６１】
一態様では、エピトープ結合性タンパク質の作製方法であって、目的のエピトープを含む抗原に本明細書に記載のマウスを曝露させること、目的のエピトープに特異的に結合する免疫グロブリン分子をマウスが生成するのに十分な条件の下でマウスを維持すること、および目的のエピトープに特異的に結合する免疫グロブリン分子を単離することを含み、エピトープ結合性タンパク質は、マウスＣＬおよび再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１に由来するヒト可変ドメインを含む軽鎖に会合している、体細胞変異ヒト可変ドメインおよびマウスＣＨを含む重鎖を含む方法が提供される。
【００６２】
一態様では、二重特異性抗原結合性タンパク質の作製方法であって、本明細書に記載される第一のマウスを、第一のエピトープを含む目的の第一の抗原に曝露させること、本明細書に記載される第二のマウスを、第二のエピトープを含む目的の第二の抗原に曝露させること、第一および第二のマウスに目的の抗原への免疫応答を各々開始させること、目的の第一の抗原の第一のエピトープに結合する第一のヒト重鎖可変領域を第一のマウスで同定すること、目的の第二の抗原の第二のエピトープに結合する第二のヒト重鎖可変領域を第二のマウスで同定すること、目的の第一の抗原の第一のエピトープに結合する第一の重鎖をコードする第一の完全なヒトの重鎖遺伝子を作製すること、目的の第二の抗原の第二のエピトープに結合する第二の重鎖をコードする第二の完全なヒトの重鎖遺伝子を作製すること、ヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する単一の完全なヒトの軽鎖を発現する細胞で第一の重鎖および第二の重鎖を発現させて二重特異性抗原結合性タンパク質を形成すること、ならびに二重特異性抗原結合性タンパク質を単離することを含む方法が提供される。
【００６３】
一実施形態では、第一の抗原および第二の抗原は同一でない。
【００６４】
一実施形態では、第一の抗原および第二の抗原は同じであり、第一のエピトープおよび第二のエピトープは同一でない。一実施形態では、第一のエピトープへの第一の重鎖可変領域の結合は、第二のエピトープへの第二の重鎖可変領域の結合をブロックしない。
【００６５】
一実施形態では、第一の抗原は可溶性抗原および細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原）から選択され、第二の抗原は細胞表面受容体を含む。具体的な実施形態では、細胞表面受容体は免疫グロブリン受容体である。具体的な実施形態では、免疫グロブリン受容体はＦｃ受容体である。一実施形態では、第一の抗原および第二の抗原は同じ細胞表面受容体であり、第一のエピトープへの第一の重鎖の結合は第二のエピトープへの第二の重鎖の結合をブロックしない。
【００６６】
一実施形態では、軽鎖の軽鎖可変ドメインは、２から５個の体細胞変異を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、第一または第二の重鎖可変ドメインを有する第一または第二の免疫マウスのＢ細胞で発現される体細胞変異関連軽鎖である。
【００６７】
一態様では、エピトープ結合性タンパク質を発現する細胞であって、該細胞は、（ａ）再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１に由来するヒト軽鎖可変ドメインをコードするヒトヌクレオチド配列（ヒト核酸配列は（直接またはリンカーを介して）ヒト免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン核酸配列（例えば、ヒトκ定常ドメインＤＮＡ配列）に融合されている）；および（ｂ）第一のヒト重鎖可変ドメインヌクレオチド配列に由来するヒト重鎖可変ドメインをコードする第一のヒト重鎖可変ドメイン核酸配列（第一のヒト重鎖可変ドメインヌクレオチド配列は（直接またはリンカーを介して）ヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメイン核酸配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＥ配列）に融合されている）を含み、エピトープ結合性タンパク質は第一のエピトープを認識する、細胞を提供する。一実施形態では、エピトープ結合性タンパク質は、第一のエピトープと１０−６Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、または１０−１２Ｍ未満の解離定数で結合する。一実施形態では、細胞は第二のヒト重鎖可変ドメインをコードする第二のヒトヌクレオチド配列を含み、第二のヒト配列は（直接またはリンカーを介して）ヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメイン核酸配列と融合されており、第二のヒト重鎖可変ドメインは第一のエピトープを特異的に認識せず（例えば、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍ、またはそれを超える解離定数を示す）、エピトープ結合性タンパク質は第一のエピトープおよび第二のエピトープの両方と結合し、第一および第二の免疫グロブリン重鎖は、各々、（ａ）にしたがって軽鎖と会合している。一実施形態では、第二のＶＨドメインは、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、または１０−１２Ｍ未満である解離定数で第二のエピトープに結合する。
【００６８】
一実施形態では、エピトープ結合性タンパク質は、各々がユニバーサル軽鎖（例えば、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択される再構成されたヒト軽鎖可変配列に由来する軽鎖）と会合される第一の免疫グロブリン重鎖および第二の免疫グロブリン重鎖を含み、第一の免疫グロブリン重鎖はナノモル濃度範囲（例えば、１ｎＭ〜１００ｎＭ）からピコモル濃度範囲（例えば、１ｐＭ〜１００ｐＭ）の解離定数で第一のエピトープと結合し、第二の免疫グロブリン重鎖はナノモル濃度範囲からピコモル濃度範囲（例えば、１ｐＭ〜１００ｎＭ）の解離定数で第二のエピトープと結合し、第一のエピトープおよび第二のエピトープは同一ではなく、第一の免疫グロブリン重鎖は第二のエピトープと結合しないかマイクロモル濃度範囲より弱い（例えば、ミリモル濃度範囲）解離定数で第二のエピトープと結合し、第二の免疫グロブリン重鎖は第一のエピトープと結合しないかマイクロモル濃度範囲より弱い（例えば、ミリモル濃度範囲）解離定数で第一のエピトープと結合し、第二の免疫グロブリン重鎖の可変ドメインのうちの１つもしくは複数（すなわち、軽鎖可変ドメイン、第一の免疫グロブリン重鎖の重鎖可変ドメイン、および重鎖可変ドメインのうちの１つもしくは複数）が体細胞変異される。一実施形態では、エピトープ結合性タンパク質の、第一のエピトープへの結合はエピトープ結合性タンパク質の第二のエピトープへの結合を遮断しない。
【００６９】
一実施形態では、第一の免疫グロブリン重鎖は野生型プロテインＡ結合決定基を含み、第二の重鎖は野生型プロテインＡ結合決定基を欠く。一実施形態では、第一の免疫グロブリン重鎖は単離条件の下でプロテインＡに結合し、第二の免疫グロブリン重鎖はプロテインＡに結合しないか、第一の免疫グロブリン重鎖が単離条件の下でプロテインＡに結合するよりも少なくとも１０倍、１００倍または１０００倍弱くプロテインＡに結合する。具体的な実施形態では、第一および第二の重鎖はＩｇＧ１アイソタイプであり、第二の重鎖は９５Ｒ（ＥＵ  ４３５Ｒ）、９６Ｆ（ＥＵ  ４３６Ｆ）およびその組合せから選択される改変を含み、第一の重鎖はそのような改変を欠く。
【００７０】
一態様では、本明細書に記載されるとおりのマウス、胚または細胞は、内因性の調節または制御エレメント、例えばマウスκイントロンエンハンサー、マウスκ３’エンハンサーまたはイントロンエンハンサーと３’エンハンサーの両方を保持するκ軽鎖遺伝子座を含み、ここで、調節または制御エレメントは、κ軽鎖遺伝子座の発現される配列の体細胞変異および親和性成熟を促進する。
【００７１】
一態様では、本明細書に記載のマウスから単離されたマウス細胞を提供する。一実施形態では、細胞はＥＳ細胞である。一実施形態では、細胞はリンパ球である。一実施形態では、リンパ球はＢ細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞はヒトＶ遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含むキメラ重鎖；および（ａ）再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊ配列、（ｂ）再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊ配列、または（ｃ）その組み合わせに由来する軽鎖を発現し、重鎖可変ドメインはマウス定常領域と融合されており、軽鎖可変ドメインはマウスまたはヒト定常領域と融合されている。一実施形態では、マウス細胞は、少なくとも１つの、マウスＡＤＡＭ６をコードする遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む。一実施形態では、細胞はＢ細胞であり、Ｂ細胞は再構成されたヒト重鎖免疫グロブリン可変ドメインをコードする配列およびユニバーサル軽鎖可変ドメインをコードする配列を含み、Ｂ細胞は染色体上に雄マウスにおいて機能するＡＤＡＭ６タンパク質をコードする核酸配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含み、一実施形態では、マウスＢ細胞は核酸配列の２つの対立遺伝子を含む。
【００７２】
一態様では、再構成されていないヒトＶ、Ｄ、およびＪセグメントを含むヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む第一の染色体；軽鎖をコードするか軽鎖コードするように再構成することができるヒト化免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む第二の染色体（軽鎖遺伝子座は軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される１つ以下のＶセグメント（または２つ以下のＶセグメント）および１つ以下のＪセグメント（または２つ以下のＪセグメント）、または軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結される１つ以下または２つ以下の再構成された軽鎖Ｖ／Ｊ配列を含む）；および雄マウスにおいて機能するマウスＡＤＡＭ６をコードする核酸配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む第三の染色体を含むマウス細胞を提供する。一実施形態では、第一および第三の染色体は同一である。一実施形態では、第二および第三の染色体は同一である。一実施形態では、第一、第二、および第三の染色体は各々異なる。一実施形態では、マウスＡＤＡＭ６をコードする核酸配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片は２コピー中に存在する。一実施形態では、細胞は体細胞である。特定の実施形態では、体細胞はＢ細胞である。一実施形態では、細胞は生殖細胞である。
【００７３】
一態様では、ハイブリドーマであって、該ハイブリドーマを本明細書に記載のマウスのＢ細胞を使用して作製する、ハイブリドーマを提供する。特定の実施形態では、Ｂ細胞は目的のエピトープを含む抗原で免疫されている本明細書に記載のマウスに由来し、Ｂ細胞は目的のエピトープと結合する結合性タンパク質を発現し、結合性タンパク質は体細胞変異ヒト重鎖可変ドメインおよびマウス重鎖定常領域を有し、且つ再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１に由来するヒト軽鎖可変ドメインおよびマウスＣＬを有する。
【００７４】
一態様では、本明細書に記載のマウスの第一の重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む完全ヒト重鎖遺伝子および本明細書に記載のユニバーサル軽鎖配列をコードする核酸配列を含む完全ヒト軽鎖遺伝子を含む細胞を提供する。一実施形態では、細胞は本明細書に記載のマウスの第二の重鎖可変ドメインをコードする核酸配列をさらに含み、第一および第二の重鎖可変ドメインは異なる。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、およびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。
【００７５】
一態様では、マウス胚であって、該胚は本明細書に記載のマウスに由来するドナーＥＳ細胞を含む、マウス胚を提供する。
【００７６】
一態様では、本明細書に記載の遺伝子改変を含むマウス胚の使用であって、該使用は本明細書に記載の遺伝子改変マウスの作製を含む、使用を提供する。
【００７７】
一態様では、本明細書に記載のマウスで作製された抗体のヒト重鎖可変ドメインおよびヒト軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を提供する。
【００７８】
一態様では、本明細書に記載のマウスで作製された抗体のヒト重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列およびヒト軽鎖可変ドメインのヌクレオチド配列を提供する。
【００７９】
一態様では、本明細書に記載のマウスで作製された抗体またはその抗原結合性タンパク質もしくは抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ）を提供する。
【００８０】
１つの態様では、本明細書に記載のとおりのターゲティングベクター、ヌクレオチド構築物または細胞を使用して作製されるマウスを提供する。
【００８１】
１つの態様では、本明細書に記載の第一のマウスと、野生型マウスであるまたは遺伝子改変されている第二のマウスとの交配の後代を提供する。
【００８２】
一態様では、完全ヒト抗体または免疫グロブリン可変ドメインもしくはその機能的断片を含む完全ヒト抗原結合性タンパク質を作製するための本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
【００８３】
一態様では、完全ヒト二重特異性抗体を作製するための本明細書に記載のマウスまたは組織または細胞の使用を提供する。
【００８４】
一態様では、本明細書に記載のマウスによって作製された核酸配列の使用であって、該使用はヒトへの治療薬の製造における核酸配列の発現を含む、使用を提供する。
【００８５】
１つの態様では、不死化細胞系を作製するための、本明細書に記載のとおりのマウスの使用を提供する。
【００８６】
１つの態様では、ハイブリドーマまたはクアドローマを作製するための、本明細書に記載のとおりのマウスの使用を提供する。
【００８７】
１つの態様では、免疫グロブリン可変領域またはその断片をコードする核酸配列を作製するための、本明細書に記載のとおりのマウスの使用を提供する。１つの実施形態では、前記核酸配列を使用して、ヒト抗体またはその抗原結合断片を作製する。１つの実施形態では、前記マウスを使用して、抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｓｃＦｖ、二重特異性ｓｃＦｖ、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、Ｖ−ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、ＤＶＤ（すなわち、二重可変ドメイン抗原結合タンパク質）、ＳＶＤ（すなわち、単一可変ドメイン抗原結合タンパク質）または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ：ＢｉＴＥ）から選択される抗原結合タンパク質を作製する。
【００８８】
１つの態様では、ヒト疾患または障害の処置のために、薬物（例えば、抗原結合タンパク質）を製造するための、または薬物（例えば、抗原結合タンパク質）の可変配列をコードする配列を製造するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
【００８９】
本明細書に記載される実施形態および態様のいずれも、特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、互いに一緒に用いることができる。他の実施形態は、後に続く記載の概観から当業者にとって明らかになる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
マウスであって、該マウスの生殖系列において：
（ａ）重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される少なくとも１つの再構成されていないヒトＶ、少なくとも１つの再構成されていないヒトＤ、および少なくとも１つの再構成されていないヒトＪセグメントを含むヒト化免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座；
（ｂ）軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される１つ以下または２つ以下の再構成されたヒト軽鎖Ｖ／Ｊ配列を含むヒト化免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座；および
（ｃ）雄マウスにおいて機能する、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性核酸配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片
を含むマウス。
（項目２）
前記雄マウスにおいて機能する、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする核酸配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片が前記免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座以外の遺伝子座に存在する、項目１に記載のマウス。
（項目３）
前記重鎖定常領域遺伝子がマウス遺伝子である、項目１に記載のマウス。
（項目４）
前記軽鎖定常領域遺伝子がマウス遺伝子である、項目１に記載のマウス。
（項目５）
ヒト化重鎖免疫グロブリン可変遺伝子座およびヒト化軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子座を含むマウスであって、該マウスが単一の軽鎖を発現し、該マウスが雄マウスにおいて機能するＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性核酸配列を含む、マウス。
（項目６）
前記ヒト化重鎖免疫グロブリン遺伝子座が内因性マウス重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結されている、項目５に記載のマウス。
（項目７）
前記単一の軽鎖が、軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結される１つ以下の軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび軽鎖Ｊ遺伝子セグメントをコードする免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子遺伝子座からコードされる、項目５に記載のマウス。
（項目８）
前記単一の軽鎖が、前記マウスの前記生殖系列における免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子遺伝子座に由来し、該遺伝子座が軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結される、該生殖系列中の１つ以下の再構成された軽鎖Ｖ／Ｊ遺伝子セグメントをコードする、項目５に記載のマウス。
（項目９）
前記異所性核酸配列が雄マウスにおいて機能するマウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードするか、マウスＡＤＡＭ６タンパク質の断片をコードする、項目５に記載のマウス。
（項目１０）
前記異所性核酸配列が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座内ではない位置に存在する、項目５に記載のマウス。
（項目１１）
遺伝子改変マウスであって、複数の異なるＩｇＧ重鎖を発現し、該複数の異なるＩｇＧ重鎖の各々がヒト可変ドメインを含み、前記複数の異なるＩｇＧ重鎖の各々が単一のヒト免疫グロブリンＶ遺伝子セグメントに由来するヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする軽鎖配列と会合しており、該マウスが雄マウスにおいて機能するＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性核酸配列を含む、遺伝子改変マウス。
（項目１２）
前記マウスが、雄マウスにおいて機能するＡＤＡＭ６タンパク質またはその断片を発現し、該ＡＤＡＭ６タンパク質またはその断片が前記異所性核酸配列から発現される、項目１１に記載のマウス。
（項目１３）
マウス細胞であって、以下：
重鎖定常遺伝子に作動可能に連結されるヒト化重鎖免疫グロブリン可変遺伝子遺伝子座；
軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結される１つ以下または２つ以下の軽鎖Ｖ遺伝子セグメントを含むヒト化軽鎖免疫グロブリン遺伝子座；および
ＡＤＡＭ６タンパク質またはその断片をコードする異所性核酸配列であって、該ＡＤＡＭ６タンパク質またはその断片が雄マウスにおいて機能する、異所性核酸配列を含む、マウス細胞。
（項目１４）
前記異所性核酸配列がマウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする、項目１３に記載のマウス細胞。
（項目１５）
前記重鎖定常遺伝子が非ヒト重鎖定常遺伝子である、項目１３に記載のマウス。
（項目１６）
前記軽鎖定常遺伝子が非ヒト軽鎖定常遺伝子である、項目１３に記載のマウス。
（項目１７）
前記１つ以下または２つ以下（ｎｏ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｔ  ｔｗｏ）の軽鎖Ｖ遺伝子セグメントが再構成されたＶ／Ｊ遺伝子セグメントに存在する、項目１３に記載のマウス。
（項目１８）
ヒト重鎖Ｖ遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むキメラ免疫グロブリン重鎖；ならびに
（ａ）再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊ配列、
（ｂ）再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊ配列、または
（ｃ）その組み合わせ；
に由来する軽鎖を発現するマウスＢ細胞であって、
該重鎖可変ドメインが定常領域と融合されており、該軽鎖可変ドメインが定常領域と融合されており、該Ｂ細胞が異所性ＡＤＡＭ６核酸配列を含む、マウスＢ細胞。
（項目１９）
前記重鎖可変ドメインと融合される前記定常ドメインがマウス定常領域を含む、項目１８に記載のマウスＢ細胞。
（項目２０）
前記軽鎖可変ドメインと融合される前記定常領域がマウス定常領域およびヒト定常領域から選択される、項目１８に記載のマウスＢ細胞。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１Ａ】図１Ａは、約１メガ塩基（Ｍｂ）のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座（白抜きの記号）での約３メガ塩基（Ｍｂ）のマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座（黒塗りの記号）の直接ゲノム置換の一般説明図（縮尺不定）を示すものである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座の２つのほぼ同一のリピートのうちの約０．５メガ塩基（Ｍｂ）の第一のリピート、すなわち近位リピート（白抜きの記号）での約３メガ塩基（Ｍｂ）のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座（黒塗りの記号）の直接ゲノム置換の一般説明図（縮尺不定）を示すものである。
【図２Ａ】図２Ａは、すべてのマウスＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの欠失ならびに３つのヒトＶＨ、すべてのヒトＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントでの置換を生じさせる結果となるマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の直接ゲノム置換についての最初の３工程（Ａ〜Ｃ）の詳細な説明図（縮尺不定）を示すものである。ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの第一の挿入のためのターゲティングベクター（３ｈＶＨＢＡＣｖｅｃ）が示されており、このターゲティングベクターは、６７ｋｂ  ５’マウスホモロジーアーム、選択カセット（白抜きの長方形）、部位特異的組換え部位（白抜きの三角形）、１４５ｋｂヒトゲノム断片および８ｋｂ  ３’マウスホモロジーアームを有する。後続のターゲティングベクターから挿入されるヒト（白抜きの記号）およびマウス（黒塗りの記号）免疫グロブリン遺伝子セグメント、追加の選択カセット（白抜きの長方形）および部位特異的組換え部位（白抜きの三角形）が示されている。
【図２Ｂ】図２Ｂは、７７の追加のヒトＶＨ遺伝子セグメントの挿入および最後の選択カセットの除去を生じさせる結果となるマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の直接ゲノム置換についての追加の６工程（Ｄ〜Ｉ）の詳細な説明図（縮尺不定）を示すものである。最初のヒト重鎖遺伝子セグメント挿入物（３ｈＶＨ−ＣＲＥハイブリッド対立遺伝子）への追加のヒトＶＨ遺伝子セグメントの挿入のためのターゲティングベクター（１８ｈＶＨＢＡＣｖｅｃ）が示されており、このターゲティングベクターは、２０ｋｂ  ５’マウスホモロジーアーム、選択カセット（白抜きの長方形）、１９６ｋｂヒトゲノム断片および６２ｋｂヒトホモロジーアームを有し、該ヒトホモロジーアームは、示されている最初のヒト重鎖遺伝子セグメント挿入物の５’端とオーバーラップしており、該ヒト遺伝子セグメントに対して５’に部位特異的組換え部位（白抜きの三角形）がある。後続のターゲティングベクターによって挿入されるヒト（白抜きの記号）およびマウス（黒塗りの記号）免疫グロブリン遺伝子セグメントならびに追加の選択カセット（白抜きの長方形）が示されている。
【図２Ｃ】図２Ｃは、すべてのマウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの欠失（Ｉｇκ−ＣＲＥハイブリッド対立遺伝子）を生じさせる結果となるマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座の直接ゲノム置換についての最初の３工程（Ａ〜Ｃ）の詳細な説明図（縮尺不定）を示すものである。前記ターゲティングベクターから挿入される選択カセット（白抜きの長方形）および部位特異的組換え部位（白抜きの三角形）が示されている。
【図２Ｄ】図２Ｄは、前記近位リピートのすべてのヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの挿入および最後の選択カセットの欠失（４０ｈＶκｄＨｙｇハイブリッド対立遺伝子）を生じさせる結果となるマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座の直接ゲノム置換についての追加の５工程（Ｄ〜Ｈ）の詳細な説明図（縮尺不定）を示すものである。後続のターゲティングベクターによって挿入されるヒト（白抜きの記号）およびマウス（黒塗りの記号）免疫グロブリン遺伝子セグメントならびに追加の選択カセット（白抜きの長方形）が示されている。
【図３Ａ】図３Ａは、ヒト重鎖遺伝子配列の挿入およびマウス重鎖遺伝子配列の喪失についてＥＳ細胞を検出するための定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）プライマー／プローブセットの場所の一般説明図を示すものである。未改変マウス染色体（上部）および正しくターゲティングされた染色体（下部）上の欠失領域（「喪失」プローブＣおよびＤ）、挿入された領域（「ｈＩｇＨ」プローブＧおよびＨ）および隣接領域（「保持」プローブＡ、Ｂ、ＥおよびＦ）のためのｑＰＣＲプライマー／プローブセットを用いた、ＥＳ細胞およびマウスにおける第一のヒト重鎖遺伝子挿入についてのスクリーニング戦略が示されている。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの第一の挿入についての、親ＥＳ細胞および改変ＥＳ細胞における実測プローブコピー数の代表的算定を示すものである。プローブＡからＦについての実測プローブコピー数は、２／２ΔΔＣｔと算定された。ΔΔＣｔは、ａｖｅ［ΔＣｔ（試料）−ｍｅｄΔＣｔ（対照）］として算定され、この式中のΔＣｔは、被験プローブと基準プローブ（アッセイに依存して４と６の間の基準プローブ）の間のＣｔの差である。用語ｍｅｄΔＣｔ（対照）は、親ＥＳ細胞からの多数（＞６０）の非標的ＤＮＡ試料の中央値ΔＣｔである。各改変ＥＳ細胞クローンを６つひと組（ｓｅｘｔｕｐｌｉｃａｔｅ）でアッセイした。親ＥＳ細胞におけるＩｇＨプローブＧおよびＨのコピー数を算定するために、これらのプローブが改変ＥＳ細胞では１のコピー数を有すると仮定し、増幅が観察されなかったとしても３５の最大Ｃｔを用いた。
【図３Ｃ】図３Ｃは、プローブＤおよびＨのみを使用して同様にして算定した各遺伝子型の４匹のマウスについてのコピー数の代表算定を示すものである。野生型マウス：ＷＴマウス；ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの最初の挿入物に関してヘテロ接合性のマウス：ＨＥＴマウス；ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの最初の挿入物に関してホモ接合性のマウス：Ｈｏｍｏマウス。
【図４Ａ】図４Ａは、細菌相同組換え（ＢＨＲ）による３ｈＶＨＢＡＣｖｅｃの構築に用いた３工程についての説明図を示すものである。ターゲティングベクターから挿入されたヒト（白抜きの記号）およびマウス（黒塗りの記号）免疫グロブリン遺伝子セグメント、選択カセット（白抜きの長方形）および部位特異的組換え部位（白抜きの三角形）が示されている。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＮｏｔＩ消化後の３つのＢＡＣクローン（Ｂ１、Ｂ２およびＢ３）のパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を示すものである。マーカーＭ１、Ｍ２およびＭ３は、それぞれ、ローレンジ、ミドルレンジおよびラムダラダーＰＦＧマーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）である。
【図５Ａ】図５Ａは、漸増量のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントでのマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の逐次的改変の概略説明図（縮尺不定）を示すものである。重鎖ヒト化の３つの異なる段階それぞれからホモ接合型マウスを作製した。白抜きの記号はヒト配列を反映し、黒塗りの記号はマウス配列を反映する。
【図５Ｂ】図５Ｂは、漸増量のヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子セグメントでのマウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の逐次的改変の概略説明図（縮尺不定）を示すものである。κ軽鎖ヒト化の３つの異なる段階それぞれからホモ接合型マウスを作製した。白抜きの記号はヒト配列を反映し、黒塗りの記号はマウス配列を反映す。
【図６】図６は、野生型およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスにおけるＢ細胞集団のＦＡＣＳドットプロットを示すものである。野生型（ｗｔ）、またはＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）１（Ｖ１）、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）２（Ｖ２）またはＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）３（Ｖ３）マウスの脾臓（最上段、上から三段目および最下段）または鼠蹊リンパ節（上から二段目）からの細胞を、表面ＩｇＭを発現するＢ細胞（最上段、および上から二段目）、κもしくはλ軽鎖のいずれかを含有する表面免疫グロブリン（上から三段目）または特定のハプロタイプの表面ＩｇＭ（最下段）について染色し、集団をＦＡＣＳによって分離した。
【図７Ａ】図７Ａは、接合部の多様性およびヌクレオチド付加の証拠となる、ＶＨ−ＤＨ−ＪＨ（ＣＤＲ３）接合部周辺のランダムに選択したＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）抗体の代表重鎖ＣＤＲ３配列を示すものである。重鎖ＣＤＲ３配列をＤＨ遺伝子セグメント使用量（ｕｓａｇｅ）に従ってグループ分けし、その生殖細胞系を各グループの上に太字で提供する。各重鎖ＣＤＲ３配列についてのＶＨ遺伝子セグメントを各配列の５’端のカッコ内に記入する（例えば、３−７２は、ヒトＶＨ３−７２である）。各重鎖ＣＤＲ３についてのＪＨ遺伝子セグメントを各配列の３’端のカッコ内に記入する（例えば、３は、ヒトＪＨ３である）。示されている各配列についての配列番号は、上から下に進んで、次のとおりである：配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；配列番号３６；配列番号３７；配列番号３８；配列番号３９。
【図７Ｂ】図７Ｂは、接合部の多様性およびヌクレオチド付加の証拠となる、Ｖκ−Ｊκ（ＣＤＲ３）接合部周辺のランダムに選択したＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）抗体の代表軽鎖ＣＤＲ３配列を示すものである。各軽鎖ＣＤＲ３配列についてのＶκ遺伝子セグメントを各配列の５’端のカッコ内に記入する（例えば、１−６は、ヒトＶκ１−６である）。各軽鎖ＣＤＲ３についてのＪκ遺伝子セグメントを各配列の３’端のカッコ内に記入する（例えば、１は、ヒトＪκ１である）。示されている各配列についての配列番号は、上から下に進んで、次のとおりである：配列番号４０；配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３；配列番号４４；配列番号４５；配列番号４６；配列番号４７；配列番号４８；配列番号４９；配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；配列番号５３；配列番号５４；配列番号５５；配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８。
【図８】図８は、３８（非免疫ＩｇＭ）、２８（非免疫ＩｇＧ）、３２（ＩｇＧからの非免疫Ｉｇκ）、３６（免疫ＩｇＧ）または３６（ＩｇＧからの免疫Ｉｇκ）配列セットの中の各ヌクレオチド（ＮＴ；左縦列）およびアミノ酸（ＡＡ；右縦列）位置で変化した配列のパーセントとして（マッチする生殖細胞系配列へのアラインメント後に）スコアを付けたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）抗体の重鎖および軽鎖の体細胞超変異頻度を示すものである。陰影のあるバーは、ＣＤＲの場所を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、野生型マウス（白抜きのバー）またはＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（黒塗りのバー）におけるＩｇＭおよびＩｇＧアイソタイプについての血清免疫グロブリンのレベルを示すものである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、野生型マウス（白抜きのバー）またはＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（黒塗りのバー）におけるＩｇＡアイソタイプについての血清免疫グロブリンのレベルを示すものである。
【図９Ｃ】図９Ｃは、野生型マウス（白抜きのバー）またはＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（黒塗りのバー）におけるＩｇＥアイソタイプについての血清免疫グロブリンのレベルを示すものである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、インターロイキン−６受容体エクトドメインでの２ラウンドの免疫後（採血試料（ｂｌｅｅｄ）１）または３ラウンドの免疫後（採血試料２）の７匹のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（ＶＩ）および５匹の野生型（ＷＴ）マウスからの血清のインターロイキン−６受容体に対する抗原特異的ＩｇＧ力価を示すものである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、７匹のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（ＶＩ）マウスおよび５匹の野生型（ＷＴ）マウスからの抗インターロイキン−６受容体特異的ＩｇＧアイソタイプ特異的力価を示すものである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいて産生された抗インターロイキン−６受容体モノクローナル抗体の親和性分布を示すものである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（ＶＩ）マウスおよび野生型（ＷＴ）マウスにおいて産生された抗インターロイキン−６受容体モノクローナル抗体の抗原特異的遮断を示すものである。
【図１２】図１２は、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の概略説明図（縮尺不定）を示すものである。ヒト化内因性重鎖遺伝子座へのマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂの挿入のために使用したターゲティングベクター（ｍＡＤＡＭ６ターゲティングベクター）が示されており、このターゲティングベクターは、５’および３’端に操作されて作製された制限酵素認識部位を含む部位特異的組換え部位（Ｆｒｔ）が隣接する選択カセット（ＨＹＧ：ハイグロマイシン）を有する。
【図１３】図１３は、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント１−２（ＶＨ１−２）と６−１（ＶＨ６−１）の間にあるヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子（ｈＡＤＡＭ６Ψ）の概略説明図（縮尺不定）を示すものである。ヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子を欠失させ、ヒト重鎖遺伝子座にユニークな制限酵素認識部位を挿入する細菌相同組換えのためのターゲティングベクター（ｈＡＤＡＭ６Ψターゲティングベクター）が示されており、このターゲティングベクターは、５’および３’端に操作されて作製された制限酵素認識部位を含む部位特異的組換え部位（ｌｏｘＰ）が隣接する選択カセット（ＮＥＯ：ネオマイシン）を有する。部位特異的組換え部位が隣接する選択カセットを含む、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子をコードするゲノム断片を含有する、結果として得られる標的ヒト化重鎖遺伝子座の説明図（縮尺不定）が示されている。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子を含む挿入されたマウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ−Ａ６）の骨髄中のＩｇＭおよびＢ２２０の表面発現についてのシングレット（ｓｉｎｇｌｅｔ）でゲートしたリンパ球のＦＡＣＳ等高線図を示すものである。未熟（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）および成熟（Ｂ２２０ｈｉｇｈＩｇＭ＋）Ｂ細胞の百分率を各等高線図に記入する。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ−Ａ６）の大腿骨から単離した骨髄中の未熟（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）および成熟（Ｂ２２０ｈｉｇｈＩｇＭ＋）Ｂ細胞の総数を示すものである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ−Ａ６）の骨髄中のｃ−ｋｉｔおよびＣＤ４３の表面発現についてのＣＤ１９＋ゲートＢ細胞のＦＡＣＳ等高線図を示すものである。プロＢ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３＋ｃｋｉｔ＋）細胞およびプレＢ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３−ｃｋｉｔ−）細胞の百分率を各等高線図のそれぞれ右上および左下象限（ｑｕａｄｒａｎｔ）に記入する。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子を含む異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ−Ａ６）の大腿骨から単離した骨髄中のプロＢ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３＋ｃｋｉｔ＋）細胞およびプレＢ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３−ｃｋｉｔ−）細胞の総数を示すものである。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ−Ａ６）の骨髄中のＣＤ１９およびＣＤ４３の表面発現についてのシングレットでゲートしたリンパ球のＦＡＣＳ等高線図を示すものである。未熟Ｂ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３−）細胞、プレＢ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３ｉｎｔ）細胞およびプロＢ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３＋）細胞の百分率を各等高線図に記入する。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ−Ａ６）の骨髄中の未熟Ｂ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３−）細胞およびプレＢ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３ｉｎｔ）細胞のヒストグラムを示すものである。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ−Ａ６）の脾細胞におけるＣＤ１９およびＣＤ３の表面発現についてのシングレットでゲートしたリンパ球のＦＡＣＳ等高線図を示すものである。Ｂ（ＣＤ１９＋ＣＤ３−）細胞およびＴ（ＣＤ１９−ＣＤ３＋）細胞の百分率を各等高線図に記入する。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子を含む異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ−Ａ６）の脾臓におけるＩｇλおよびＩｇκ軽鎖の表面発現についてのＣＤ１９＋ゲートＢ細胞のＦＡＣｓ等高線図を示すものである。Ｉｇλ＋（左上象限）Ｂ細胞およびＩｇκ＋（右下象限）Ｂ細胞の百分率を各等高線図に記入する。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子を含む異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ−Ａ６）の脾臓におけるＣＤ１９＋Ｂ細胞の総数を示すものである。
【図１８Ａ】図１８Ａは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子を含む異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ−Ａ６）の脾臓におけるＩｇＤおよびＩｇＭの表面発現についてのＣＤ１９＋ゲートＢ細胞のＦＡＣｓ等高線図を示すものである。成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＤｈｉｇｈＩｇＭｉｎｔ）の百分率を各等高線図に記入する。右の等高線図上の矢印は、ＩｇＭおよびＩｇＤ表面発現に関連したＢ細胞の成熟過程を図示するものである。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＣＤ１９＋ＩｇＭｈｉｇｈＩｇＤｉｎｔからＣＤ１９＋ＩｇＭｉｎｔＩｇＤｈｉｇｈに成熟する間の、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ／κ−Ａ６）の脾臓におけるＢ細胞の総数を示すものである。
【図１９】図１９は、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントをヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子領域で置換するためのターゲティング戦略を説明する。
【図２０】図２０は、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントをヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子領域で置換するためのターゲティング戦略を説明する。
【図２１】図２１は、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントをヒトＶｐｒｅＢ／Ｊλ５遺伝子領域で置換するためのターゲティング戦略を説明する。
【図２２】図２２は、野生型マウス（ＷＴ）、操作されたヒトの再構成されたＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域（Ｖκ１−３９Ｊκ５ＨＯ）についてホモ接合のマウス、および操作されたヒトの再構成されたＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域（Ｖκ３−２０Ｊκ１ＨＯ）についてホモ接合のマウスの末梢血からのＣＤ１９＋Ｂ細胞（ｙ軸）の百分率を示す。
【図２３Ａ】図２３Ａは、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントによる内因性ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの置換についてホモ接合のマウス（Ｈκ）、野生型マウス（ＷＴ）、ならびに操作されたヒトの再構成されたＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域についてヘテロ接合のマウス（Ｖκ１ー３９Ｊκ５ＨＥＴ）での、操作されたヒトの再構成されたＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域の接合部に特異的なプローブ（Ｖκ１−３９Ｊκ５接合部プローブ）およびヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントに特異的なプローブ（Ｖκ１−３９プローブ）を用いる定量的ＰＣＲアッセイにおける、Ｖκ１−３９由来軽鎖の相対的ｍＲＮＡ発現（ｙ軸）を示す。シグナルは、マウスＣκの発現に標準化される。Ｎ．Ｄ．：検出されず。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントによる内因性ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの置換についてホモ接合のマウス（Ｈκ）、野生型マウス（ＷＴ）、ならびに操作されたヒトの再構成されたＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域についてホモ接合のマウス（Ｖκ１ー３９Ｊκ５ＨＯ）での、操作されたヒトの再構成されたＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域の接合部に特異的なプローブ（Ｖκ１−３９Ｊκ５接合部プローブ）およびヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントに特異的なプローブ（Ｖκ１−３９プローブ）を用いる定量的ＰＣＲアッセイにおける、Ｖκ１−３９由来軽鎖の相対的ｍＲＮＡ発現（ｙ軸）を示す。シグナルは、マウスＣκの発現に標準化される。
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントによる内因性ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの置換についてホモ接合のマウス（Ｈκ）、野生型マウス（ＷＴ）、ならびに操作されたヒトの再構成されたＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域についてヘテロ接合（ＨＥＴ）およびホモ接合（ＨＯ）のマウスでの、操作されたヒトの再構成されたＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域の接合部に特異的なプローブ（Ｖκ３−２０Ｊκ１接合部プローブ）およびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに特異的なプローブ（Ｖκ３−２０プローブ）を用いる定量的ＰＣＲアッセイにおける、Ｖκ３−２０由来軽鎖の相対的ｍＲＮＡ発現（ｙ軸）を示す。シグナルは、マウスＣκの発現に標準化される。
【図２４Ａ】図２４Ａは、βガラクトシダーゼで免疫した、野生型（ＷＴ；Ｎ＝２）および操作されたヒトの再構成されたＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域についてホモ接合のマウス（Ｖκ１−３９Ｊκ５ＨＯ；Ｎ＝２）でのＩｇＭ（左）およびＩｇＧ（右）の力価を示す。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、βガラクトシダーゼで免疫した、野生型（ＷＴ；Ｎ＝５）および操作されたヒトの再構成されたＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域についてホモ接合のマウス（Ｖκ３−２０Ｊκ１ＨＯ；Ｎ＝５）での総免疫グロブリン（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ）の力価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
（詳細な説明）
本明細書で用いる用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続する４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変（ＶＨ）領域および重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変（ＶＬ）領域および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存されている領域の間に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と略すことができ；軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と略すことができる）。用語「高親和性」抗体は、その標的エピトープに関して約１０−９Ｍ以下のＫＤ（例えば、約１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍまたは約１×１０−１２Ｍ）を有する抗体を指す。一実施形態では、ＫＤは表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥＴＭによって測定され、別の実施形態では、ＫＤはＥＬＩＳＡによって測定される。
【００９２】
語句「二重特異性抗体」は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することが可能な抗体を含む。二重特異性抗体は、２つの同一ではない重鎖を一般に含み、各重鎖は、２つの異なる分子上（例えば、２つの異なる免疫原上の異なるエピトープ）または同じ分子上（例えば、同じ免疫原上の異なるエピトープ）の異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第一のエピトープおよび第二のエピトープ）に選択的に結合することが可能な場合、第一のエピトープに対する第一の重鎖の親和性は、第二のエピトープに対する第一の重鎖の親和性より少なくとも１桁から２桁、または３桁または４桁またはそれよりも一般に低く、逆もまた同じである。二重特異性抗体が特異的に結合するエピトープは、同じか異なる標的の上（例えば、同じか異なるタンパク質の上）にあってよい。二重特異性抗体は、例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作ることができる。例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、同じか異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合させることができ、そのような配列は免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞で発現させることができる。一般的な二重特異性抗体は、各々３つの重鎖ＣＤＲと、続く（Ｎ末端からＣ末端にかけて）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する２つの重鎖、ならびに、エピトープ結合特異性を付与しないが各重鎖と会合することができるか、または各重鎖と会合することができ、かつ重鎖エピトープ結合性領域が結合するエピトープの１つもしくは複数に結合することができるか、または各重鎖と会合することができ、かつ一方もしくは両方のエピトープへの重鎖の一方もしくは両方の結合を可能にすることができる免疫グロブリン軽鎖を有する。
【００９３】
用語「細胞」には、組換え核酸配列を発現させるのに適する任意の細胞が含まれる。細胞には、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）のもの、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．など）、マイコバクテリウム細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉなど）、ヒト以外の動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合体、例えばハイブリドーマもしくはクアドローマが含まれる。一部の実施形態では、細胞はヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。一部の実施形態では、細胞は真核細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ  ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ  ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞および前記細胞に由来する細胞系。一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含む（例えばウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ細胞））。
【００９４】
語句「相補性決定領域」または用語「ＣＤＲ」には、通常（すなわち、野生型動物で）免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域の２つのフレームワーク領域の間に現れる、生物体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列が含まれる。ＣＤＲは、例えば、生殖系列配列または再構成されたかまたは再構成されていない配列がコードすることができ、例えば、ナイーヴであるか成熟したＢ細胞またはＴ細胞がコードすることができる。ＣＤＲは体細胞変異してもよく（例えば、動物の生殖系列でコードされている配列と異なる）、ヒト化、および／またはアミノ酸の置換、付加もしくは欠失で改変されてもよい。一部の状況（例えば、ＣＤＲ３に関して）では、ＣＤＲは、２つ以上の配列（例えば、生殖系列配列）であって、（例えば、再構成されていない核酸配列において）不連続であるが、例えば、配列のスプライシングまたは接続の結果として（例えば、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えによって重鎖ＣＤＲ３を形成する）Ｂ細胞核酸配列において連続している、２つ以上の配列（例えば、生殖系列配列）によってコードされてもよい。
【００９５】
保存的なアミノ酸置換を記載するために用いられる場合、用語「保存的」には、類似した化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換が含まれる。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の目的の機能特性、例えば標的エピトープに所望の親和性で特異的に結合する可変領域の能力を実質的に変えない。類似した化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンなどの脂肪族側鎖；セリンおよびトレオニンなどの脂肪族ヒドロキシル側鎖；アスパラギンおよびグルタミンなどのアミドを含む側鎖；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンなどの芳香族の側鎖；リシン、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性側鎖；アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性側鎖；ならびにシステインおよびメチオニンなどの硫黄を含む側鎖が含まれる。保存的アミノ酸置換基には、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リシン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが含まれる。一部の実施形態では、例えばアラニンスキャニング変異生成で用いられるように、保存的アミノ酸置換は、アラニンによるタンパク質の任意の天然の残基の置換であってよい。一部の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔら（１９９２年）Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ  Ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｔｉｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６巻：１４４３〜４５頁に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで正の値を有する保存的置換がもたらされる。一部の実施形態では、置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで置換が負ではない値を有するような適度に保存的な置換である。
【００９６】
一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖または重鎖での残基位置は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換によって異なる。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖またはその機能的断片（例えば、Ｂ細胞などからの発現および分泌を可能にする断片）における残基位置は、アミノ酸配列が本明細書に記載されている軽鎖と同一ではなく、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換によって異なる。
【００９７】
語句「エピトープ結合性タンパク質」には、少なくとも１つのＣＤＲを有し、エピトープを選択的に認識することが可能な、例えばエピトープに約１マイクロモル以下のＫＤ（例えば、約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍまたは約１×１０−１２ＭのＫＤ）で結合することが可能であるタンパク質が含まれる。治療的なエピトープ結合性タンパク質（例えば、治療的な抗体）は、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫＤをしばしば必要とする。
【００９８】
語句「機能的断片」には、発現、分泌させることができ、マイクロモル、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫＤでエピトープに特異的に結合するエピトープ結合性タンパク質の断片が含まれる。特異的な認識には、少なくともマイクロモルの範囲、ナノモルの範囲またはピコモルの範囲のＫＤを有することが含まれる。
【００９９】
用語「生殖系列」には、非体細胞変異細胞、例えば非体細胞変異Ｂ細胞またはプレＢ細胞または造血細胞中の免疫グロブリン核酸配列への言及が含まれる。
【０１００】
語句「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」には、任意の生物体からの免疫グロブリン重鎖定常領域配列が含まれる。特に明記しない限り、重鎖可変ドメインには３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのＦＲ領域が含まれる。重鎖の断片には、ＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにその組合せが含まれる。一般的な重鎖は、可変ドメインに続いて（Ｎ末端からＣ末端に向かって）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能的断片には、エピトープを特異的に認識する（例えば、マイクロモル、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫＤでエピトープを認識する）ことが可能で、細胞から発現および分泌させることが可能で、少なくとも１つのＣＤＲを含む断片が含まれる。
【０１０１】
配列に関連して用いられる場合、用語「同一性」には、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の同一性を測定するために用いることができる当技術分野で公知であるいくつかの異なるアルゴリズムで決定される同一性が含まれる。本明細書に記載される一部の実施形態では、同一性は、１０．０のオープンギャップペナルティ、０．１のエクステンドギャップペナルティを使用するＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖ．１．８３（スロー）アラインメントを用い、およびＧｏｎｎｅｔの類似度マトリックス（ＭａｃＶｅｃｔｏｒＴＭ１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｉｎｃ．、２００８）を用いて決定される。配列の同一性に関して比較される配列の全長は特定の配列に依存するが、軽鎖定常ドメインの場合、全長は、自己会合して正規の軽鎖定常ドメインを形成することが可能な、例えばベータストランドを含む２つのβシートを形成することが可能であり、およびヒトまたはマウスの少なくとも１つのＣＨ１ドメインと相互作用することが可能な軽鎖定常ドメインに折り畳まれるのに十分な長さの配列を含むべきである。ＣＨ１ドメインの場合、配列の全長は、ベータストランドを含む２つのβシートを形成することが可能であり、およびマウスまたはヒトの少なくとも１つの軽鎖定常ドメインと相互作用することが可能なＣＨ１ドメインに折り畳まれるのに十分な長さの配列を含むべきである。
【０１０２】
語句「免疫グロブリン分子」には、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖が含まれる。重鎖は同一であっても異なってもよく、軽鎖は同一であっても異なってもよい。
【０１０３】
語句「軽鎖」には、任意の生物体からの免疫グロブリン軽鎖配列が含まれ、特に明記しない限りヒトκおよびλ軽鎖およびＶｐｒｅＢ、ならびに代わりの軽鎖が含まれる。特に明記しない限り、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインには３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域が一般に含まれる。一般に、完全長軽鎖には、アミノ末端からカルボキシル末端にかけて、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含むＶＬドメインおよび軽鎖定常ドメインが含まれる。軽鎖には、例えば、軽鎖が現れるエピトープ結合性タンパク質が選択的に結合する第一または第二のエピトープのいずれにも選択的に結合しないものが含まれる。軽鎖には、軽鎖が現れるエピトープ結合性タンパク質が選択的に結合する１つまたは複数のエピトープに結合し認識するものか、重鎖による結合および認識を助けるものがさらに含まれる。
【０１０４】
ユニバーサル軽鎖（すなわち、共通軽鎖）は本明細書に記載のマウスで作製された軽鎖をいい、該マウスは軽鎖可変ドメインの作製に利用可能な遺伝子セグメントの選択において高度に制限されている。結果として、かかるマウスは、１つの実施形態では、１つまたは２つ以下の再構成されていない軽鎖Ｖセグメントおよび１つまたは２つ以下の再構成されていない軽鎖Ｊセグメント（例えば、１つのＶおよび１つのＪ、２つのＶおよび１つのＪ、１つのＶおよび２つのＪ、２つのＶおよび２つのＪ）に由来する軽鎖を作製する。一実施形態では、１つまたは２つ以下の再構成された軽鎖Ｖ／Ｊ配列（例えば、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列）。様々な実施形態において、ユニバーサル軽鎖には、体細胞変異（例えば、親和性成熟）バージョンが含まれる。
【０１０５】
語句「体細胞変異」には、クラススイッチングを経たＢ細胞からの核酸配列への言及が含まれ、ここで、クラススイッチングされたＢ細胞での免疫グロブリン可変領域の核酸配列（例えば、重鎖可変ドメインまたは重鎖ＣＤＲもしくはＦＲ配列を含む）は、クラススイッチングの前のＢ細胞の核酸配列に同一でなく、例えば、クラススイッチングを経ていないＢ細胞とクラススイッチングを経たＢ細胞との間のＣＤＲまたはフレームワーク核酸配列において差がある。「体細胞変異」には、親和性成熟していないＢ細胞での対応する免疫グロブリン可変領域配列（すなわち、生殖系列細胞のゲノム中の配列）に同一ではない親和性成熟Ｂ細胞からの核酸配列への言及が含まれる。語句「体細胞変異」には、目的のエピトープへのＢ細胞の曝露の後のＢ細胞からの免疫グロブリン可変領域核酸配列への言及も含まれ、ここで、核酸配列は、目的のエピトープへのＢ細胞の曝露の前の対応する核酸配列と異なる。語句「体細胞変異」は、免疫原チャレンジに応じて動物で、例えばヒト免疫グロブリン可変領域核酸配列を有するマウスで生成される、そのような動物で生得的に作動する選択プロセスから生じる抗体からの配列を指す。
【０１０６】
核酸配列に関して用語「再構成されていない」には、動物細胞の生殖系列に存在する核酸配列が含まれる。
【０１０７】
語句「可変ドメイン」には、Ｎ末端からＣ末端（特に明記しない限り）の順序での以下のアミノ酸領域を含む免疫グロブリン軽鎖または重鎖（所望により改変される）のアミノ酸配列が含まれる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【０１０８】
ヒト化された免疫グロブリン遺伝子座を有するマウス
遺伝モデルとしてのマウスは、トランスジェニックおよびノックアウト技術によって大きく向上され、これらの技術により特定の遺伝子の指向性過発現または欠失の効果の研究が可能になった。あらゆるその利点にもかかわらず、前記マウスは、マウスをヒト疾患についての不完全なモデルにならしめるおよびヒト治療薬を試験するまたはそれらを作製するための不完全なプラットホームにならしめる遺伝的障害をやはり提示する。第一に、ヒト遺伝子の約９９％はマウスホモログを有する（Ｗａｔｅｒｓｔｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら（２００２）Ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ、Ｎａｔｕｒｅ．４２０，５２０−５６２）が、可能性のある治療薬は、多くの場合、所期のヒト標的のマウスオルソログと交叉反応することができない、または不適切に交叉反応する。この問題を未然に防ぐために、選択標的遺伝子を「ヒト化」することができる、すなわち、マウス遺伝子を消去して、対応するオルソロガスヒト遺伝子配列により置換することができる（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、同第６，５９６，５４１号および同第７，１０５，３４８号明細書；これらは参照により本明細書に援用されている）。最初、「ノックアウト・プラス・トランスジェニックヒト化（ｋｎｏｃｋｏｕｔ−ｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）」戦略によりマウス遺伝子をヒト化する努力は、前記内因性遺伝子の欠失（すなわち、ノックアウト）を保有するマウスとランダムに組み込まれたヒト導入遺伝子を保有するマウスとの交配を必要とした（例えば、Ｂｒｉｌ，Ｗ．Ｓ．ら（２００６）Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｃＤＮＡ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ａｎ  Ａｒｇ（５９３）  ｔｏ  Ｃｙｓ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ９５、３４１−３４７；Ｈｏｍａｎｉｃｓ，Ｇ．Ｅ．ら（２００６）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｃｌａｓｓｉｃ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｍａｐｌｅ  ｓｙｒｕｐ  ｕｒｉｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．ＢＭＣ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ７、３３；Ｊａｍｓａｉ，Ｄ．ら（２００６）Ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ＢＡＣ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ／ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ＨｂＥ／ｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８８（３）：３０９−１５；Ｐａｎ，Ｑ．ら（２００６）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３ｄｅｌｔａ／ｅｐｓｉｌｏｎ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｉｎ  ｐｒｅＴ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｐｒｅＴＣＲ）ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｈｕｍａｎ  ＣＤ３ｄｅｌｔａ／ｅｐｓｉｌｏｎ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｔｈｅ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅＴＣＲ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＣＤ３ｇａｍｍａ−  ａｎｄ  ＣＤ３ｇａｍｍａｄｅｌｔａ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４３、１７４１−１７５０参照）。しかし、これらの努力は、サイズ制限によって妨げられた；従来のノックアウト技術は、大きなマウス遺伝子を該遺伝子の大きなヒトゲノムカウンターパートで直接置換するのに十分なものではなかった。該マウス遺伝子の同じまさにその遺伝子の場所で（すなわち内因性マウス遺伝子座で）ヒトカウンターパート遺伝子により内因性マウス遺伝子を直接置換する直接相同置換の直接的なアプローチは、技術的な難しさのため、滅多に試みられない。今まで、直接置換に対する努力は手の込んだ厄介な手順を必要とし、それ故、取り扱うことができる遺伝子材料の長さおよび操作することができる精度が限定された。
【０１０９】
外因的に導入されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、マウスの前駆体Ｂ細胞内で再構成する（Ａｌｔ，ら、Ｆ．Ｗ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｔ．Ｋ．，およびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ．（１９８５）．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １：２３１−２３６）。この発見は、ヒト抗体を発現させるためにノックアウト・プラス・トランスジェニックアプローチを用いるマウスの工学的作製に活用された（Ｇｒｅｅｎ，  Ｌ．Ｌ．ら（１９９４）．  Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  Ｉｇ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ＹＡＣｓ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ７，  １３−２１；  Ｌｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ．  （２００５）．  Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３，  １１１７−１１２５；  Ｌｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ．ら（１９９４）．  Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｅ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｆｏｕｒ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，  ８５６−８５９；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，  Ａ．ら（２００７）．  Ｆｒｏｍ  ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ，  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５，  １１３４−１１４３。内因性のマウス免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座は、これらのマウスにおいて、各内因性遺伝子座の小さいが重大な部分の標的欠失、続いて、上に記載したようなランダムに組み込まれた大きな導入遺伝子としての、またはミニ染色体としてのヒト免疫グロブリン遺伝子遺伝子座の導入により不活性化された（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ら（２０００）Ｄｏｕｂｌｅ  ｔｒａｎｓ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃ  ｍｉｃｅ：  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｉｇ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｋａｐｐａ  ｌｏｃｉ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７，  ７２２−７２７）。かかるマウスは、遺伝子工学の重要な前進を象徴した；それらから単離された完全ヒトモノクローナル抗体は、様々なヒト疾患の処置に有望な治療的可能性をもたらした（Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｂ．ら（２００６）Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ、ａ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ６、２９−３１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、２００７；Ｋｉｍ，Ｙ．Ｈ．ら（２００７）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ（ＨｕＭａｘ−ＣＤ４）：ｔｗｏ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ、Ｂｌｏｏｄ  １０９（１１）：４６５５−６２；Ｌｏｎｂｅｒｇ、２００５；Ｍａｋｅｒ，Ａ．Ｖ．ら（２００５）Ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ４  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２：ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｓｔｕｄｙ．Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  １２：１００５−１０１６；ＭｃＣｌｕｎｇ，Ｍ．Ｒ．ら（２００６）Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ  ｉｎ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｗｏｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５４、８２１−８３１）。しかし、上で論じたように、これらのマウスは、野生型マウスと比較して、損なわれたＢ細胞発生および免疫不全を示す。かかる問題は、活発な体液性応答を維持するおよびしたがって一部の抗原に対する完全ヒト抗体を産生するマウスの能力を潜在的に制限する。前記不全は、（１）ヒト免疫グロブリン導入遺伝子のランダムな導入に起因する不十分な機能性、ならびに上流および下流制御要素の欠如に起因する結果としての不正確な発現（Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｆ．Ｅ．ら（２００５）Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｎｅａｒ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ３’ｅｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩｇＨ  ｌｏｃｕｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｂ−Ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｏｃｃｕｐａｎｃｙ  ａｔ  ＣＴＣＦ  ｓｉｔｅｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２５、１５１１−１５２５；Ｍａｎｉｓ，Ｊ．Ｐ．ら（２００３）Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｂｏｕｎｄａｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３’ＩｇＨ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｇｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３９、７５３−７６０；Ｐａｗｌｉｔｚｋｙ，Ｉ．ら（２００６）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ５’ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＨ  ｌｏｃｕｓ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏ−Ｂ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ＰＵ．１，  Ｐａｘ５，ａｎｄ  Ｅ２Ａ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６、６８３９−６８５１）；（２）Ｂ細胞の正常な成熟、増殖および生存に要求されるシグナル伝達過程を害し得る、ヒト定常ドメインと細胞表面のＢ細胞受容体シグナル伝達複合体のマウス要素の間の非効率的種間相互作用（Ｈｏｍｂａｃｈ，Ｊ．ら（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ｔｈ��  ＩｇＭ  ｃｌａｓｓ．Ｎａｔｕｒｅ，３４３：７６０−７６２）；および（３）親和性選択（Ｒａｏ，Ｓ．Ｐ．ら（２００２）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＩｇＧ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ  ｏｎ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９、１８５９−１８６８）および免疫グロブリン血清濃度（Ｂｒａｍｂｅｌｌ，Ｆ．Ｗ．ら（１９６４）．Ａ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｇａｍｍａ−Ｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｎａｔｕｒｅ、２０３：１３５２−１３５４；Ｊｕｎｇｈａｎｓ，Ｒ．Ｐ．ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．（１９９６）．Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＩｇＧ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３、５５１２−５５１６；Ｒａｏら、２００２；Ｈｊｅｌｍ，Ｆ．ら（２００６）．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６４、１７７−１８４；Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．（２００７）．Ｆｃ−ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９６、１７９−２０４）を低減させ得る、可溶性ヒト免疫グロブリンとマウスＦｃ受容体の間の非効率的種間相互作用に起因し得る。これらの不全は、内因性重および軽鎖遺伝子座におけるその天然の場所の中のマウス免疫グロブリン遺伝子座の可変領域のみのｉｎ  ｓｉｔｕヒト化によって修正することができる。これは、マウス定常領域の保持に基づきマウス環境で正常な相互作用および選択が可能であろう「逆キメラ」（すなわち、ヒトＶ：マウスＣ）抗体を作製するマウスを有効に生じさせる結果となるであろう。さらに、かかる逆キメラ抗体は、治療のために完全ヒト抗体に容易に再構成される。
【０１１０】
子孫をもたらすマウスの能力を維持しながら、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン可変遺伝子でマウス生殖細胞系免疫グロブリン可変遺伝子を大規模にｉｎ  ｓｉｔｕ遺伝子置換するための方法を記載する。具体的には、前記マウス定常領域をインタクトで残しながら、６メガ塩基のマウス重鎖およびκ軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子遺伝子座両方を該遺伝子のヒトカウンターパートでの正確に置換することを記載する。結果として、マウス定常領域を維持しながら、マウスの生殖細胞系免疫グロブリン可変レパートリーすべてが等価のヒト生殖細胞系免疫グロブリン可変配列で正確に置換されたマウスを生み出した。前記ヒト可変領域をマウス定常領域に連結させて、再構成して生理的に適切なレベルで発現するキメラヒト−マウス免疫グロブリン遺伝子座を形成する。発現する抗体は、「逆キメラ」である。すなわち、それらはヒト可変領域配列およびマウス定常領域配列を含む。ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する抗体を発現するヒト化免疫グロブリン可変領域を有するこれらのマウスは、ＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスと呼ばれる。
【０１１１】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、野生型マウスのものと本質的に区別できない完全機能的体液性免疫系を示す。前記ヒト化マウスは、Ｂ細胞発生の全ての段階で正常な細胞集団を提示する。前記ヒト化マウスは、正常なリンパ器官形態を示す。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスの抗体配列は、正常な可変セグメント再構成および正常な体細胞超変異を示す。これらのマウスにおける抗体集団は、正常なクラススイッチ（例えば、正常なアイソタイプシススイッチ）の結果として生ずるアイソタイプ分布を表わす。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスを免疫することにより、治療候補として好適なヒト免疫グロブリン可変ドメインを有する抗体の大きな多様性を産生する頑強な体液性応答が得られる。このプラットホームは、薬学的に許容され得る抗体および他の抗原結合タンパク質を作製するための豊富な親和性成熟ヒト免疫グロブリン可変領域配列源を提供する。
【０１１２】
マウス免疫グロブリン可変配列の、ヒト免疫グロブリン可変配列での正確な置換により、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスを作製することができる。とはいえ、非常に大きな長さのヒト免疫グロブリン配列の逐次的リコンビニアリング（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）による、重および軽鎖遺伝子座における内因性マウス免疫グロブリン配列の、等価ヒト免疫グロブリン配列での正確の置換は、マウスとヒトの間の免疫グロブリン遺伝子座の分岐進化のため、一定の課題を提起し得る。例えば、免疫グロブリン遺伝子座内に散在する遺伝子間配列は、マウスとヒトの間で同一ではなく、一部の状況では、機能的に等価でないこともある。マウスとヒトの間の免疫グロブリン遺伝子座におけるその相違は、特に内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の一定の部分をヒト化または操作するとき、やはりヒト化マウスに異常を生じさせる結果となる場合がある。マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座における一部の改変は有害である。有害な改変としては、例えば、改変されたマウスの交配および子孫産生能力の喪失を挙げることができる。
【０１１３】
すべてのマウス定常鎖遺伝子および遺伝子座転写制御領域を含むハイブリッド遺伝子座内の隣接マウス配列をインタクトなままおよび機能的なまま、マウス重および軽鎖免疫グロブリン遺伝子座（ＶＨ−ＤＨ−ＪＨおよびＶκ−Ｊκ）の６メガ塩基可変領域の、対応する１．４メガ塩基ヒトゲノム配列での正確な大規模ｉｎ  ｓｉｔｕ置換を行った（図１）。具体的には、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号明細書およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．ら（２００３）．Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１、６５２−６５９参照）を用いて、ヒトＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、ＶκおよびＪκ遺伝子配列を、ヒト生殖細胞系可変遺伝子座のオーバーラップ断片を担持する１３のキメラＢＡＣターゲティングベクターの段階的挿入により、マウスＥＳ細胞に導入した。
【０１１４】
マウス免疫グロブリン遺伝子のヒト化は、今日までのマウスゲノムへの最大の遺伝子改変を代表する。ランダムに組み込まれたヒト免疫グロブリン導入遺伝子での以前の努力は、（上で論じた）ある程度の成果を上げたが、前記マウス免疫グロブリン遺伝子の、該遺伝子のヒトカウンターパートでの直接置換は、ほかの点では正常なマウスにおいて完全ヒト抗体を効率的に産生することができる効率を劇的に増加させる。さらに、かかるマウスは、無能化された内因性遺伝子座および完全ヒト抗体導入遺伝子を保有するマウスと比較して、実質的に任意の抗原での免疫後に得ることができる完全ヒト抗体の多様性の劇的増大を示す。様々な分化段階で有意に低減されたＢ細胞集団を示すランダムに組み込まれたヒト導入遺伝子を有するマウスとは対照的に、置換されヒト化された遺伝子座の多彩なバージョンが完全に正常な成熟および未熟Ｂ細胞レベルを示す。ヒト遺伝子導入マウスにおけるヒト遺伝子セグメント数を増加させる努力は、かかる欠陥を低減させたが、拡張されたそれらの免疫グロブリンレパートリーは、野生型マウスと比較してＢ細胞集団の低減を全部は修正しなかった。
【０１１５】
免疫グロブリン遺伝子座が置換されたマウスにおいて観察される野生型に近い体液性免疫機能にもかかわらず、ランダムに組み込まれた導入遺伝子を利用する一部のアプローチでは遭遇しない、免疫グロブリンの直接置換を利用すると遭遇する他の課題がある。マウスとヒトの間の免疫グロブリン遺伝子座の遺伝子組成の相違は、免疫グロブリン遺伝子セグメントが置換されたマウスの繁殖にとって有益な配列の発見をもたらした。具体的には、前記内因性免疫グロブリン遺伝子座内にあるマウスＡＤＡＭ遺伝子は、妊性におけるその役割のため、免疫グロブリン遺伝子座が置換されたマウスに最適に存在する。
【０１１６】
マウスＡＤＡＭ６のゲノムの場所および機能
いずれかの機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現する能力が無い雄マウスは、交配して子孫をもたらす該マウスの能力の重大な欠陥を示す。これらのマウスには、すべてのまたは実質的にすべてのマウス免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントをヒト可変領域遺伝子セグメントで置換することによって機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現する能力が無い。ＡＤＡＭ６遺伝子座が、ＤＨ遺伝子セグメントの上流にあるＶＨ遺伝子セグメント遺伝子座の３’端の近位の、前記内因性マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座の領域内にあるため、このＡＤＡＭ６機能の喪失が生ずる結果となる。すべてのまたは実質的にすべての内因性マウス重鎖可変遺伝子セグメントの、ヒト重鎖可変遺伝子セグメントでの置換に関してホモ接合性であるマウスを交配させるために、それぞれが該置換に関してホモ接合性であり、生産的交配を待つ雄と雌を供給することは、一般に厄介なアプローチである。好結果の同腹子は、比較的まれであり、同腹仔の平均サイズが非常に小さい。その代り、前記置換に関してヘテロ接合性の雄を用いて、前記置換に関してホモ接合性の雌と交配させて、前記置換に対してヘテロ接合性の後代をもたらし、その後、それらからホモ接合型マウスを繁殖させた。前記雄マウスの妊性の喪失についての可能性のある原因は、ホモ接合型雄マウスにおける機能的ＡＤＡＭ６タンパク質の不在であると本発明者らは決定した。
【０１１７】
前記ＡＤＡＭ６タンパク質は、タンパク質のＡＤＡＭファミリーのメンバーであり、ＡＤＡＭは、Ａ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ（ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）の頭文字である。タンパク質のＡＤＡＭファミリーは、大きく、多様であり、多様な機能を有する。ＡＤＡＭファミリーの一部のメンバーは、精子形成および受精に関与する。例えば、ＡＤＡＭ２は、精子−卵子相互作用に関与するタンパク質ファーティリンのサブユニットをコードする。ＡＤＡＭ３、すなわちシリテスティンは、透明帯への精子の結合に必要であるようである。ＡＤＡＭ２またはＡＤＡＭ３いずれかの不在は不妊性を生じさせる結果となる。ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ３およびＡＤＡＭ６は、マウス精子細胞の表面で複合体を形成すると仮定されている。
【０１１８】
ヒトＶＨ遺伝子セグメントＶＨ１−２とＶＨ６−１の間で通常見出されるヒトＡＤＡＭ６遺伝子は、偽遺伝子であるようである（図１２）。マウスには２つのＡＤＡＭ６遺伝子−ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ−があり、これらは、マウスＶＨ遺伝子セグメントとＤＨ遺伝子セグメントの間の遺伝子間領域において見つけられ、前記マウスにおいて、ａ遺伝子およびｂ遺伝子は、周囲の免疫グロブリン遺伝子セグメントの転写配向とは反対の転写配向に配向する（図１１）。マウスの場合、正常な受精には機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座が明らかに要求される。そこで、機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座または配列は、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座が欠けているまたは損傷を受けた内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を有する雄マウスにおいて示される受精の徹底的低減を補うまたはレスキューすることができる、ＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を指す。
【０１１９】
ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂをコードする、マウスにおける前記遺伝子間配列の位置が、内因性マウス重鎖を改変するとき該遺伝子間配列に改変を受けやすくさせる。ＶＨ遺伝子セグメントを欠失させるもしくは置換するとき、またはＤＨ遺伝子セグメントを欠失させるもしくは置換するとき、結果として得られるマウスは重度の妊性欠損を示す確率が高い。この欠損を補償するために、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の改変に起因するＡＤＡＭ６活性の喪失を補うタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むようにマウスを改変する。様々な実施形態において、補足性ヌクレオチド配列は、妊性欠損をレスキューするマウスＡＤＡＭ６ａ、マウスＡＤＡＭ６ｂ、またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードするものである。
【０１２０】
妊性をレスキューする前記ヌクレオチド配列を任意の好適な位置に配置することができる。前記配列を前記遺伝子間領域に配置することができ、またはゲノム内の任意の好適な位置に（すなわち、異所的に）配置することができる。１つの実施形態では、前記ヌクレオチド配列を、マウスゲノムにランダムに組み込む導入遺伝子に導入することができる。１つの実施形態では、前記配列をエピソームで、すなわちマウス染色体上ではなく別々の核酸上で、維持することができる。好適な位置としては、転写許容性または活性である位置、例えば、ＲＯＳＡ２６遺伝子座が挙げられる。
【０１２１】
用語「異所性」は、自然界で通常は遭遇しない位置への転位または配置（例えば、核酸配列の、該核酸配列が野生型マウスにおいて見出されるのと同じ位置でない位置への配置）を含むことを意図したものである。様々な実施形態において、この用語は、その対象がその正常なまたは正しい位置外にあるという意味で用いられる。例えば、「．．．をコードする異所性ヌクレオチド配列」という句は、マウスでは通常遭遇しない位置に出現するヌクレオチド配列を指す。例えば、マウスＡＤＡＭ６タンパク質（または雄マウスに対して同じまたは同様の妊性の恩恵をもたらすそのオルソログもしくはホモログもしくは断片）をコードする異所性ヌクレオチド配列の場合、該配列は、野生型マウスにおいて通常見出される位置とは異なるマウスのゲノム内の位置に配置されることがある。マウスＡＤＡＭ６の機能的ホモログまたはオルソログは、ＡＤＡＭ６−／−マウスにおいて観察される妊性喪失（例えば、交配により子孫をもたらす雄マウスの能力の喪失）のレスキューをもたらす配列である。機能的ホモログまたはオルソログは、ＡＤＡＭ６ａのアミノ酸配列に対しておよび／またはＡＤＡＭ６ｂのアミノ酸配列に対して少なくとも約８９％以上の同一性、例えば９９％以下の同一性を有するタンパク質、ならびにＡＤＡＭ６ａおよび／またはＡＤＡＭ６ｂの欠失またはノックアウトを含む遺伝子型を有するマウスの首尾よく交配する能力を補うまたはレスキューすることができるタンパク質を含む。
【０１２２】
前記異所位置は、（例えば、マウスＡＤＡＭ６配列を含有する導入遺伝子のランダム挿入の場合のように）どこでもよく、または例えば、野生型マウスにおける（例えば、改変内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座内だがその天然の位置の上流または下流のいずれか、例えば、改変免疫グロブリン遺伝子座内だが、異なる遺伝子セグメント間、またはマウスＶ−Ｄ遺伝子間配列内の異なる位置における）その場所に近い（しかし、正確に同じではない）位置であってもよい。異所性配置の一例は、ヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座内への配置である。例えば、１つもしくは複数の内因性ＶＨ遺伝子セグメントの、ヒトＶＨ遺伝子セグメントでの置換であって、内因性ＡＤＡＭ６配列を除去する置換を含むマウスを、マウスＡＤＡＭ６配列がヒトＶＨ遺伝子セグメントを含有する配列内に配置されるように操作して作製することができる。結果として得られる改変は、ヒト遺伝子配列内に（異所性）マウスＡＤＡＭ６配列を生じさせることとなり、このヒト遺伝子配列内へのマウスＡＤＡＭ６配列の（異所性）配置は、ヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子の位置（すなわち、２つのＶセグメント間）に近い場合もあり、またはマウスＡＤＡＭ６配列の位置（すなわち、Ｖ−Ｄ遺伝子間領域内）に近い場合もある。
【０１２３】
様々な態様において、マウスＡＤＡＭ６（例えば、雄マウスにおいて機能するそのオルソログまたはホモログまたは断片）に同様の妊性の恩恵をもたらすタンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列を含有する、内因性重鎖可変領域遺伝子座またはその部分の欠失または置換を含むマウスを作製することができる。前記異所性ヌクレオチド配列としては、異なるマウス系統または異なる種、例えば異なる齧歯動物種、のＡＤＡＭ６ホモログまたはオルソログ（またはその断片）であるタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、妊性の恩恵、例えば、指定された期間にわたっての同腹子数の増加、および／または同腹子あたりの子の数の増加、および／またはマウス卵管を通り抜けてマウス卵子を受精させる雄マウスの精子細胞の能力、を付与するヌクレオチド配列が挙げられる。
【０１２４】
１つの実施形態において、前記ＡＤＡＭ６は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質と少なくとも８９％から９９％同一である（例えば、マウスＡＤＡＭ６ａまたはマウスＡＤＡＭ６ｂと少なくとも８９％から９９％同一である）ホモログまたはオルソログである。１つの実施形態において、前記異所性ヌクレオチド配列は、マウスＡＤＡＭ６ａと少なくとも８９％同一のタンパク質、マウスＡＤＡＭ６ｂと少なくとも８９％同一のタンパク質、およびその組み合わせから独立して選択される１つもしくは複数のタンパク質をコードする。１つの実施形態において、前記ホモログまたはオルソログは、マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと同一であるまたはマウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと約８９％以上同一であるように改変されているラット、ハムスター、マウス、またはモルモットのタンパク質である。１つの実施形態において、前記ホモログまたはオルソログは、マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【０１２５】
ヒト化重鎖マウスにおける異所性ＡＤＡＭ６
ヒト抗体を作るマウスは、ここしばらくの間に利用可能になった。これらのマウスは、ヒト治療用抗体の開発の重要な前進の代表であるが、その有用性を制限する多数の重大な異常を提示する。例えば、これらのマウスは、損なわれたＢ細胞発生を提示する。この損なわれた発生は、トランスジェニックマウスと野生型マウスの間の様々な相違に起因し得る。
【０１２６】
ヒト抗体は、成熟、増殖、またはクローン選択中の生存についてのシグナルを伝達するマウス細胞の表面のマウスプレＢ細胞受容体またはＢ細部受容体と最適に相互作用しない可能性がある。完全ヒト抗体は、マウスＦｃ受容体系と最適に相互作用しない可能性があるし、マウスは、ヒトＦｃ受容体との１対１の対応を提示しないＦｃ受容体を発現する。結局、完全ヒト抗体を作る様々なマウスは、野生型Ｂ細胞発生に要求され得るすべての真正マウス配列を含まない、例えば、下流エンハンサー要素および他の遺伝子座制御要素を含まない。
【０１２７】
完全ヒト抗体を作製するマウスは、何らかの形で無能化されている内因性免疫グロブリン遺伝子座を一般に含み、可変および定常免疫グロブリン遺伝子セグメントを含むヒト導入遺伝子が、そのマウスゲノム内のランダムな場所に導入される。内因性遺伝子座が、機能的免疫グロブリン遺伝子を形成するように遺伝子セグメントを再構成できないほど無能化されている限り、たとえＢ細胞発生が損なわれていたとしても、かかるマウスにおいて完全ヒト抗体を作製するという目的を達成することができる。
【０１２８】
ヒト導入遺伝子遺伝子座から完全ヒト抗体を作製せざるを得ないのだが、マウスにおけるヒト抗体の産生は、好ましくない過程であるようである。一部のマウスでは、この過程は、トランススイッチの機序によりキメラヒト可変／マウス定常重鎖（軽鎖ではなく）が形成される結果をもたらすには好ましいものではない。この機序により、完全ヒト抗体をコードする転写産物は、ヒトアイソタイプからマウスアイソタイプへとトランスでアイソタイプスイッチされる。完全ヒト導入遺伝子は、マウス重鎖定常領域遺伝子の非損傷コピーを保持する内因性遺伝子座から離れた場所にあるため、この過程はトランスでの過程となる。かかるマウスではトランススイッチが容易に分かるが、この現象はＢ細胞発生のレスキューにやはり不十分であり、Ｂ細胞発生は明らかに害されたままである。いずれにせよ、トランススイッチ現象は軽鎖に関して起こらないので、かかるマウスにおいてトランススイッチされた抗体は、完全ヒト軽鎖を保持する；おそらく、トランススイッチは、シスでの正常なアイソタイプスイッチに（それとは異なるにせよ）用いられる内因性遺伝子座におけるスイッチ配列に依存する。したがって、完全ヒト抗体を作製するように操作されて作製されたマウスが、マウス定常領域を有する抗体を作製するためにトランススイッチ機序を選択する場合であっても、その戦略は、正常Ｂ細胞発生のレスキューにやはり不十分である。
【０１２９】
抗体ベースのヒト治療薬の作製における主な関心事は、特定のエピトープを特異的に認識し、望ましい親和性で、通常は−常にではないが−高い親和性で、そのエピトープを結合する有用な可変ドメインを同定するために十分多様なヒト免疫グロブリン可変領域配列を作製することである。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスの開発前は、マウス定常領域と共にヒト可変領域を発現するマウスが、導入遺伝子からヒト抗体を作製するマウスとの何らかの有意差を示すことになるという指摘はなかった。しかし、その仮定は間違っていた。
【０１３０】
内因性マウス遺伝子座におけるヒト免疫グロブリン可変領域でのマウス免疫グロブリン可変領域の正確な置換を含有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、Ｂ細胞発生に関して野生型マウスとの驚くべき、また注目すべき類似性を提示する。驚くべき、また実にすばらしい発生の点で、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、免疫に応答して産生される可変領域が完全ヒトのものであるという１つの重要な点のみが野生型マウスと異なる、本質的に正常な野生型応答を免疫に対して提示した。
【０１３１】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、内因性遺伝子座におけるマウス免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）および免疫グロブリン軽鎖（例えば、κ軽鎖、Ｉｇκ）の生殖細胞系可変領域の、対応するヒト免疫グロブリン可変領域での正確な大規模置換を含有する。合計で約６メガ塩基のマウス遺伝子座が約１．４メガ塩基のヒトゲノム配列で置換される。この正確な置換により、結果として、ヒト可変領域とマウス定常領域を有する重および軽鎖を作製するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスが得られる。マウスＶＨ−ＤＨ−ＪＨおよびＶκ−Ｊκセグメントの正確な置換は、隣接するマウス配列をインタクトなままおよび機能的なままハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座に残す。前記マウスの体液性免疫系は、野生型マウスのものと同様に機能する。Ｂ細胞発生はいずれの重要な点でも妨害されず、抗原チャレンジすると前記マウスにおいて多様性に富んだヒト可変領域が産生される。
【０１３２】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、重およびκ軽鎖についての免疫グロブリン遺伝子セグメントがヒトおよびマウスにおいて同様に再構成するので実現可能であるのだが、その遺伝子座は同じまたはほぼ同じであるというわけではない――明らかにそれらはそうではない。しかし、その遺伝子座は、すべてのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントを含有する約３００万塩基対の連続するマウス配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座からの等価の配列を基本的にカバーする約１００万塩基の連続するヒトゲノム配列で置換することによって重鎖可変遺伝子遺伝子座のヒト化を達成することができるほどに類似する。
【０１３３】
一部の実施形態では、一定のマウス定常領域遺伝子配列の、ヒト遺伝子配列でのさらなる置換（例えば、マウスＣＨ１配列の、ヒトＣＨ１での置換、およびマウスＣＬ配列の、ヒトＣＬ配列での置換）により、結果として、例えば完全ヒト抗体断片、例えば完全ヒトＦａｂの作製に好適な、ヒト可変領域および部分ヒト定常領域を有する抗体を作製するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスが得られる。ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスは、正常な可変遺伝子セグメント再構成、正常な体細胞超変異および正常なクラススイッチを示す。これらのマウスは、野生型マウスと区別できない体液性免疫系を示し、および、マウスにヒト可変領域遺伝子セグメントの完全レパートリーが無い場合でさえ、正常な細胞集団をすべてのＢ細胞発生段階で提示し、正常なリンパ器官構造を提示する。これらのマウスの免疫は、可変遺伝子セグメント使用量の広範な多様性を提示する頑強な体液性応答を生じさせる結果となる。
【０１３４】
マウス生殖細胞系可変領域遺伝子セグメントの正確な置換により、部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスの作製が可能になる。部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座は、再構成し、超変異し、正常にクラススイッチするため、ヒト可変領域を含むマウスでは部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座により抗体が産生される。その可変領域をコードするヌクレオチド配列を同定し、クローニングして、選ばれた任意の配列、例えば、特定の用途に好適な任意の免疫グロブリンアイソタイプと（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において）融合させ、その結果、全部がヒト配列に由来する抗体または抗原結合タンパク質を得ることができる。
【０１３５】
リコンビニアリング法による大規模ヒト化を用いてマウス胚性幹（ＥＳ）細胞を改変して、マウスＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの本質的にすべてを含む３メガ塩基以下のマウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座を、いくつかのまたは本質的にすべてのヒトＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントを含有する１メガ塩基以下のヒトゲノム配列を有する等価のヒト遺伝子セグメントで正確に置換した。本質的にすべてのヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントをコードする２つのリピートの一方を含むヒトゲノムの０．５メガ塩基以下のセグメントを使用して、マウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの本質的にすべてを含有するマウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の３メガ塩基セグメントを置換した。
【０１３６】
かかる置換免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の最も３’側のＶＨ遺伝子セグメントと最も５’側のＤＨ遺伝子セグメントの間で通常は見出される内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の破壊または欠失を含み得る。この領域の破壊は、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の機能性の低減または消去をもたらし得る。ヒト重鎖レパートリーの最も３’側のＶＨ遺伝子セグメントを置換に使用すると、ヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子であるように見える偽遺伝子を含有する遺伝子間領域がこれらのＶＨ遺伝子セグメント間、すなわち、ヒトＶＨ１−２とＶＨ１−６の間に存在する。しかし、このヒト遺伝子間配列を含む雄マウスは、妊性をほとんど示さないかまたは妊性がない。
【０１３７】
上記の置換遺伝子座を含み、マウスＡＤＡＭ６をコードする異所性核酸配列も含むマウスであって、本質的に正常な妊性を示すマウスを記載する。１つの実施形態において、前記異所性核酸配列は、改変内因性マウス重鎖遺伝子座のヒトＶＨ１−２とＶＨ６−１との間に配置された配列番号３である。配列番号３のＡＤＡＭ６遺伝子の転写方向は、周囲のヒトＶＨ遺伝子セグメントの転写の方向に対して逆である。本明細書における例は、示されるヒトＶＨ遺伝子セグメント間に異所性配列を配置することによる妊性のレスキューを示すが、マウスゲノム内の任意の好適な転写許容遺伝子座への（またはさらには染色体外への）異所性配列の配置が雄マウスの妊性を同様にレスキューすると予想されることは、当業者であれば認める。
【０１３８】
マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む異所性配列を有する機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠いているマウスを補足する現象は、非機能的なまたは最小機能的な内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を有する任意のマウスのレスキューに適用できる一般的な方法である。それ故、免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＡＤＡＭ６破壊改変を含む非常に多数のマウスを本発明の組成物および方法でレスキューすることができる。したがって、本発明は、内因性ＡＤＡＭ６機能を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多種多様な改変を有するマウスを含む。一部の（非限定的）例を本明細書に提供する。記載するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスに加えて、ＡＤＡＭ６に関する組成物および方法を非常に多くの用途に、例えば、重鎖遺伝子座を多種多様な方法で改変するときに用いることができる。
【０１３９】
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つもしくは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントでの置換と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＤＨ遺伝子セグメントおよびＪＨ遺伝子セグメントの、ヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントでの置換とを含むマウスであって、ＣＨ１領域および／またはヒンジ領域が無いマウスを提供する。１つの実施形態において、前記マウスは、（ａ）ヒトＶＨ−マウスＣＨ１−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３；（ｂ）ヒトＶＨ−マウスヒンジ−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３；および（ｃ）ヒトＶＨ−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３から選択される免疫グロブリン鎖の二量体である単一可変ドメイン結合タンパク質を作製する。
【０１４０】
１つの態様では、全てまたは実質的に全てのマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント（ｍＶＨ、ｍＤＨおよびｍＪＨ）の、１つもしくは複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント（ｈＶＨ、ｈＤＨおよびｈＪＨ）での置換を有するマウスであって、全てまたは実質的に全てのマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｍＶκ、ｍＪκ）の、１つもしくは複数のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｈＶκおよびｈＪκ）での置換をさらに含むマウスにおいて、妊性をレスキューするヌクレオチド配列をヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列内（例えば、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントとＶＨ１−６遺伝子セグメントの間）に配置する。一実施形態では、ヌクレオチド配列を、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスにおいてヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントとヒトＶＨ１−６遺伝子セグメントとの間に配置する（ＵＳ６，５９６，５４１号およびＵＳ７，１０５，３４８号（参照により本明細書に援用されている））。一実施形態では、このようにして改変されたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、全てまたは実質的に全てのヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント（全てのｈＶＨ、ｈＤＨ、およびｈＪＨ）および全てまたは実質的に全てのヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｈＶκおよびｈＪκ）での置換を含む。
【０１４１】
一態様では、機能的マウスＡＤＡＭ６遺伝子座（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）を、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの中へ配置し、内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントを置き換えることができる。一実施形態では、全てまたは実質的に全てのマウスＶＨ遺伝子セグメントを除去し、１つもしくは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントで置き換え、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座をヒトＶＨ遺伝子セグメントの３’末端のすぐ隣または２つのヒトＶＨ遺伝子セグメントの間に配置する。特定の実施形態では、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を、挿入されたヒトＶＨ遺伝子セグメントの３’末端付近の２つのＶＨ遺伝子セグメントの間に配置する。特定の実施形態では、置換はヒトＶＨ遺伝子セグメントＶＨ１−２およびＶＨ６−１を含み、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座をＶＨ１−２遺伝子セグメントの下流およびＶＨ６−１遺伝子セグメントの上流に配置する。そこで、特定の実施形態において、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの構成は、以下のものである（ヒトＶＨ遺伝子セグメントの転写方向に関して上流から下流に）：ヒトＶＨ１−２−マウスＡＤＡＭ６遺伝子座−ヒトＶＨ６−１。特定の実施形態では、ヒトＶＨ１−２とヒトＶＨ６−１間のＡＤＡＭ６偽遺伝子をマウスＡＤＡＭ６遺伝子座で置換する。１つの実施形態において、転写方向に関して、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のマウスＡＤＡＭ６ａおよびマウスＡＤＡＭ６ｂのうちの１つもしくは複数の配向は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントについての配向と比較して逆である。あるいは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、最も３’側のヒトＶＨ遺伝子セグメントと最も５’側のＤＨ遺伝子セグメントの間の遺伝子間領域に配置され得る。最も５’側のＤＨセグメントがマウスであろうと、ヒトであろうと、このとおりであるはずである。
【０１４２】
同様に、すべてのまたは実質的にすべての内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントを置換する、前記１つもしくは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメント（例えば、ＶκまたはＶλセグメント）で改変されるマウスは、上に記載したように、例えばマウスＡＤＡＭ６遺伝子座もしくはその機能的断片を含む下流ホモロジーアームを有するターゲティングベクターを利用することにより、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を維持するように改変することができ、あるいは２つのヒトＶＬ遺伝子セグメント間に、またはヒトＶＬ遺伝子セグメントとＤＨ遺伝子セグメントとの間（ヒトであろうとマウスであろうと、例えば、Ｖλ＋ｍ／ｈＤＨ）もしくはＪ遺伝子セグメントとの間（ヒトであろうとマウスであろうと、例えば、Ｖκ＋ＪＨ）に位置する異所配列で損傷マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を置換するように改変することができる。１つの実施形態において、前記置換は、２つ以上のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含み、および前記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座またはその機能的断片は、２つの最も３’側のＶＬ遺伝子セグメント間に配置される。そこで、特定の実施形態において、ヒトＶＬ遺伝子セグメントの構成は、以下のものである（ヒト遺伝子セグメントの転写方向に関して上流から下流に）：ヒトＶＬ３’−１−マウスＡＤＡＭ６遺伝子座−ヒトＶＬ３’。１つの実施形態において、転写方向に関して、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のマウスＡＤＡＭ６ａおよびマウスＡＤＡＭ６ｂのうちの１つもしくは複数の配向は、ヒトＶＬ遺伝子セグメントの配向と比較して逆である。あるいは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、最も３’側のヒトＶＬ遺伝子セグメントと最も５’側のＤＨ遺伝子セグメントの間の遺伝子間領域に配置され得る。最も５’側のＤＨセグメントがマウスであろうと、ヒトであろうとこのとおりであるはずである。
【０１４３】
１つの態様では、１つもしくは複数の内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの置換を有する、および少なくとも１つの内因性マウスＤＨ遺伝子セグメントを含むマウスを提供する。かかるマウスにおいて、前記内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの改変は、最も５’側のＤＨ遺伝子セグメントではなく、最も３’側のＶＨ遺伝子セグメントの１つもしくは複数についての改変を含み得、この場合、前記１つもしくは複数の最も３’側のＶＨ遺伝子セグメントの改変が、前記内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を破壊しないようにまたは非機能的にしないように注意する。例えば、１つの実施形態において、前記マウスは、すべてのまたは実質的にすべての内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つもしくは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントでの置換を含み、および前記マウスは、１つもしくは複数の内因性ＤＨ遺伝子セグメントおよび機能的内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を含む。
【０１４４】
もう１つの実施形態において、前記マウスは、最も３’側の内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの改変、および１つもしくは複数の内因性マウスＤＨ遺伝子セグメントの改変を含み、該改変は、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座が機能的なままである程度まで該内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の完全性が維持されるように行う。一例では、かかる改変を二工程で行う：（１）上流ホモロジーアームと、機能的マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のすべてまたは部分を含む下流ホモロジーアームとを有するターゲティングベクターを利用して、最も３’側の内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントを１つもしくは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントで置換する工程；（２）次に、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のすべてまたは機能的部分を含む上流ホモロジーアームを有するターゲティングベクターで内因性マウスＤＨ遺伝子セグメントを置換する工程。
【０１４５】
様々な態様において、改変が内因性マウスＡＤＡＭ６の機能を破壊する場合、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的ホモログをコードする異所性配列を含有するマウスの利用は有用である。内因性マウスＡＤＡＭ６機能を破壊する確率は、マウス免疫グロブリン遺伝子座への改変を行うとき、特に、マウス免疫グロブリン重鎖可変領域および周囲の配列を改変するときに高い。したがって、かかるマウスは、全部もしくは一部が欠失している、全部もしくは一部がヒト化されている、または全部もしくは一部が（例えば、ＶκもしくはＶλ配列で）置換されている免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスを作製するときに特に有益である。下に記載するマウスに対して記載の遺伝子改変を行うための方法は当業者に公知である。
【０１４６】
マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配列またはマウスＡＤＡＭ６タンパク質の妊性の恩恵をもたらす実質的に同一もしくは同様のタンパク質をコードする異所性配列を含有するマウスは、内因性マウスＡＤＡＭ６配列を破壊するかまたは欠失させるマウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座への改変に関連して特に有用である。ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する抗体を発現するマウスに関連して主として記載したが、かかるマウスは、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子を破壊する任意の遺伝子改変に関連して有用である。これが、マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座の改変を含有する多種多様な遺伝子改変マウスを包含することは、当業者であれば認める。これらには、例えば、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントのすべてまたは一部分の欠失または置換を、他の改変にかかわらず有するマウスが含まれる。非限定的な例を下に記載する。
【０１４７】
一部の態様では、マウスにおいて機能的な異所性マウス、齧歯動物または他のＡＤＡＭ６遺伝子（またはオルソログもしくはホモログもしくは断片）と１つもしくは複数のヒト免疫グロブリン可変および／または定常領域遺伝子セグメントとを含む遺伝子改変マウスを提供する。
【０１４８】
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つもしくは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントでの置換と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＤＨ遺伝子セグメントの、１つもしくは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントでの置換と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＪＨ遺伝子セグメントの、１つもしくは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントでの置換とを含むマウスを提供する。
【０１４９】
１つの実施形態において、前記マウスは、マウスＣＨ１ヌクレオチド配列の、ヒトＣＨ１ヌクレオチド配列での置換をさらに含む。１つの実施形態において、前記マウスは、マウスヒンジヌクレオチド配列の、ヒトヒンジヌクレオチド配列での置換をさらに含む。１つの実施形態において、前記マウスは、免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座（ＶＬおよびＪＬ）の、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座での置換をさらに含む。１つの実施形態において、前記マウスは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域ヌクレオチド配列の、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域ヌクレオチド配列での置換をさらに含む。特定の実施形態において、前記ＶＬ、ＪＬおよびＣＬは、免疫グロブリンκ軽鎖配列である。特定の実施形態において、前記マウスは、ヒトヒンジおよびヒトＣＨ１配列と融合したマウスＣＨ２およびマウスＣＨ３免疫グロブリン定常領域配列を含むので、該マウス免疫グロブリン遺伝子座が再構成して、（ａ）ヒト可変領域、ヒトＣＨ１領域、ヒトヒンジ領域ならびにマウスＣＨ２およびマウスＣＨ３領域を有する重鎖と、（ｂ）ヒト可変ドメインおよびヒト定常領域を含む免疫グロブリン軽鎖をコードする遺伝子とを含む結合タンパク質をコードする遺伝子を形成する。
【０１５０】
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つもしくは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントでの置換と、必要に応じて、すべてのもしくは実質的にすべてのＤＨ遺伝子セグメントおよび／もしくはＪＨ遺伝子セグメントの、１つもしくは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび／もしくはヒトＪＨ遺伝子セグメントでの置換と、または必要に応じて、すべてのもしくは実質的にすべてのＤＨ遺伝子セグメントおよびＪＨ遺伝子セグメントの、１つもしくは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントでの置換とを含むマウスを提供する。
【０１５１】
１つの実施形態において、前記マウスは、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの、１つもしくは複数のＶＬ、１つもしくは複数のＤＨ、および１つもしくは複数のＪ遺伝子セグメント（例えば、ＪκまたはＪλ）での置換を含み、これらの遺伝子セグメントは、内因性マウスヒンジ領域に作動可能に連結されており、該マウスは、転写方向に５’から３’へと、ヒトＶＬ−ヒトまたはマウスＤＨ−ヒトまたはマウスＪ−マウスヒンジ−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３を含有する再構成免疫グロブリン鎖遺伝子を形成する。１つの実施形態において、前記Ｊ領域は、ヒトＪκ領域である。１つの実施形態において、前記Ｊ領域は、ヒトＪＨ領域である。１つの実施形態において、前記Ｊ領域は、ヒトＪλ領域である。１つの実施形態において、前記ヒトＶＬ領域は、ヒトＶλ領域およびヒトＶκ領域から選択される。
【０１５２】
特定の実施形態において、前記マウスは、マウスまたはヒト定常領域と、ヒトＶκ、ヒトＤＨおよびヒトＪκ；ヒトＶκ、ヒトＤＨおよびヒトＪＨ；ヒトＶλ、ヒトＤＨおよびヒトＪλ；ヒトＶλ、ヒトＤＨおよびヒトＪＨ；ヒトＶκ、ヒトＤＨおよびヒトＪλ；ヒトＶλ、ヒトＤＨおよびヒトＪκに由来する可変領域とを有する、単一可変ドメイン抗体を発現する。特定の実施形態では、列挙したＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント間でのまたは列挙したＶおよびＪ遺伝子セグメント間での生産的再構成の発生が可能になるように、組換え認識配列を改変する。
【０１５３】
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つもしくは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントでの置換と、すべてのもしくは実質的にすべてのＤＨ遺伝子セグメントおよびＪＨ遺伝子セグメントの、ヒトＪＬ遺伝子セグメントでの置換とを含むマウスであって、ＣＨ１および／またはヒンジ領域が無いマウスを提供する。
【０１５４】
１つの実施形態において、前記マウスにはＣＨ１ドメインをコードする配列が無い。１つの実施形態において、前記マウスにはヒンジ領域をコードする配列が無い。１つの実施形態において、前記マウスにはＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードする配列が無い。
【０１５５】
特定の実施形態において、前記マウスは、マウスＣＨ３ドメインに結合しているマウスＣＨ２ドメインに融合しているヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（λまたはκ）を含む結合タンパク質を発現する。
【０１５６】
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つもしくは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントでの置換と、すべてのもしくは実質的にすべてのマウスＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの、ヒトＪＬ遺伝子セグメントでの置換とを含むマウスを提供する。
【０１５７】
１つの実施形態において、前記マウスは、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ１およびヒンジ領域、またはＣＨ１領域およびヒンジ領域およびＣＨ２領域をコードする免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列の欠失を含む。
【０１５８】
１つの実施形態において、前記マウスは、以下のものから選択されるホモ二量体を含む単一可変ドメイン結合タンパク質を作製する：（ａ）ヒトＶＬ−マウスＣＨ１−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３；（ｂ）ヒトＶＬ−マウスヒンジ−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３；（ｃ）ヒトＶＬ−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３。
【０１５９】
１つの態様では、無能化または欠失された内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を含む、無能化された内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスであって、ヒトまたはマウスまたはヒト／マウスもしくは他のキメラ抗体を発現する核酸配列を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、前記核酸配列は、組み込まれた導入遺伝子上に存在し、該導入遺伝子は、マウスゲノムにランダムに組み込まれている。１つの実施形態において、前記核酸配列は、野生型マウスでは見出さないエピソーム（例えば、染色体）上にある。
【０１６０】
共通の、またはユニバーサル、軽鎖
有用な多重特異性エピトープ結合性タンパク質、例えば二重特異性抗体を作製するこれまでの努力は、共通のパラダイムをしばしば共有する様々な問題によって妨害された：ヘテロダイマー二重特異性ヒト免疫グロブリンを対合させるのに適するフォーマットを、合理的に操作するか、試行錯誤を通して遺伝子操作するための配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択または操作。残念ながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作手法の全てではないにしてもそのほとんどは、個々の分子に適する（あるとしても）主にその場しのぎの修正を提供する。他方、ヒト治療法へと導くことが可能である適当な対合を選択するために複雑な生物体を使用するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法は、実現されていない。
【０１６１】
一般に、天然のマウス配列は、しばしば、ヒトの治療的な配列のための良い供給源ではない。少なくともその理由から、共通のヒト軽鎖と対合するマウス重鎖免疫グロブリン可変領域を生成することは、実用性において限定される。共通のヒト軽鎖と結合する能力を維持し、かつエピトープの特異性および親和性を保持することを望みながら、不確定な結果を伴ってマウス重鎖可変配列をヒト化しようと試みるための試行錯誤のプロセスにおいて、より多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作努力が費やされる。そのようなプロセスの終わりに、最終生成物は特異性および親和性の一部を維持し、かつ共通の軽鎖と会合することができる場合があるが、最終的にはヒトでの免疫原性が根深いリスクとして残るだろう。
【０１６２】
したがって、ヒト治療薬を作るのに適するマウスは、内因性のマウス重鎖可変領域遺伝子セグメントの代わりに、ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントの好適に大きなレパートリーを含むであろう。ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントは、リバースキメラ重鎖（すなわち、ヒト可変ドメインおよびマウス定常領域を含む重鎖）を形成するために、再構成して、内因性マウス重鎖定常ドメインと再結合することができるべきである。重鎖は、クラススイッチングおよび体細胞超変異が可能であるべきであり、これにより、重鎖可変ドメインの好適に大きなレパートリーを、マウスがヒト軽鎖可変領域の限られたレパートリーと会合することができるものを選択するために、利用可能である。
【０１６３】
複数の重鎖について共通の軽鎖を選択するマウスは、実際的な有用性を有する。様々な実施形態では、共通の軽鎖だけを発現することができるマウスで発現する抗体は、同一であるか実質的に同一の軽鎖と会合して発現することができる重鎖を有する。これは、二重特異性抗体の作製で特に有益である。例えば、そのようなマウスは第一の免疫原で免疫して、第一のエピトープに特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞を生成することができる。マウス（または、遺伝的に同じマウス）は、第二の免疫原で免疫して、第二のエピトープに特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞を生成することができる。重鎖可変領域はＢ細胞からクローニングすることができ、同じ重鎖定常領域および同じ軽鎖と共に発現し、かつ細胞で発現されて二重特異性抗体を作製することができ、ここで、二重特異性抗体の軽鎖成分は、軽鎖成分と会合して発現するようにマウスによって選択される。
【０１６４】
可変領域が生殖系列配列から逸脱する重鎖、例えば親和性成熟または体細胞変異可変領域を含む、重鎖のかなり多様なファミリーと好適に対合する免疫グロブリン軽鎖を生成するために、発明者らはマウスを操作した。様々な実施形態では、マウスは、ヒト軽鎖可変ドメインが、体細胞変異を含むヒト重鎖可変ドメインと対合するように工夫され、このようにして、ヒト治療薬として使用するのに適する高親和性結合性タンパク質への経路を可能にする。
【０１６５】
生物体における抗体選択の長く複雑なプロセスを介して、遺伝子操作マウスは、ヒト重鎖可変ドメインの多様なコレクションを限定された数のヒト軽鎖選択肢と対合させることにおいて、生物学的に適当な選択をする。これを達成するために、多様なヒト重鎖可変ドメイン選択肢と一緒に限定された数のヒト軽鎖可変ドメイン選択肢を提示するようにマウスは操作される。抗原チャレンジに際して、マウスは抗原に対する抗体を発生させるためにそのレパートリーにおける解法の数を最大にし、これは、そのレパートリーでの軽鎖選択肢の数によって大きく、またはそれ単独で制限される。様々な実施形態では、これは、軽鎖可変ドメインの好適で適合性の体細胞変異をマウスに達成させることを含み、該変異は、それにもかかわらず、特に体細胞変異ヒト重鎖可変ドメインを含む、比較的多様なヒト重鎖可変ドメインに適合する。
【０１６６】
限られたレパートリーの軽鎖選択肢を達成するために、天然のマウス軽鎖可変ドメインを作製または再構成する能力を、非機能的または実質的に非機能的にするようにマウスを操作する。これは、例えば、マウスの軽鎖可変領域遺伝子セグメントを欠失させることによって達成することができる。内因性マウス遺伝子座は、次に、外来性のヒト可変領域遺伝子セグメントが内因性マウス軽鎖定常領域遺伝子と結合でき、再構成されたリバースキメラ軽鎖遺伝子（ヒト可変、マウス定常）を形成することができる方法で、選択された外来性の好適なヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント（これは、内因性のマウス軽鎖定常ドメインに作動可能に連結される）によって改変され得る。様々な実施形態では、軽鎖可変領域は、体細胞変異させることが可能である。様々な実施形態では、体細胞変異を得る軽鎖可変領域の能力を最大にするために、適当なエンハンサー（複数可）がマウスで保持される。例えば、ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントで内因性マウスκ軽鎖遺伝子セグメントを置換するためにマウスκ軽鎖遺伝子座を改変することにおいて、マウスのκイントロンエンハンサーおよびマウスκ３’エンハンサーは機能的に維持されるか、破壊されない。
【０１６７】
多様なリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）重鎖と会合する限られたレパートリーのリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）軽鎖を発現する遺伝子操作マウスが提供される。様々な実施形態では、内因性マウスκ軽鎖遺伝子セグメントが欠失し、内因性マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結される単一の（または２つの）再構成されたヒト軽鎖領域遺伝子セグメントで置換される。再構成されたヒト軽鎖領域の体細胞超変異を最大にするための実施形態では、マウスκイントロンエンハンサーおよびマウスκ３’エンハンサーが維持される。様々な実施形態では、マウスは非機能的なλ軽鎖遺伝子座、またはその欠失、またはその遺伝子座がλ軽鎖を作製できないようにする欠失をさらに含む。
【０１６８】
様々な実施形態では、内因性マウス軽鎖ＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントを欠き、マウス定常領域に作動可能に連結される再構成されたヒト軽鎖可変領域（一実施形態では再構成されたヒトＶＬ／ＪＬ配列）を含む、軽鎖可変領域遺伝子座を含む遺伝子操作マウスが提供され、ここで、遺伝子座は体細胞超変異を経ることが可能であり、および遺伝子座は、マウス定常領域に連結されたヒトＶＬ／ＪＬ配列を含む軽鎖を発現する。したがって、様々な実施形態では、遺伝子座はマウスκ３’エンハンサーを含み、それは正常または野生型のレベルの体細胞超変異と相関している。
【０１６９】
目的の抗原で免疫されるとき、様々な実施形態での遺伝子操作マウスは、１つまたは２つの再構成された軽鎖を発現し、軽鎖と共に機能するヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の多様な再構成を示すＢ細胞を生成し、これには、１つまたは２つの軽鎖が、例えば１から５個の体細胞変異を含むヒト軽鎖可変領域を含む実施形態が含まれる。様々な実施形態では、そのように発現されるヒト軽鎖は、マウスで発現される任意のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域と会合して発現することが可能である。
【０１７０】
複数のエピトープに結合するエピトープ結合性タンパク質
本明細書に記載される組成物および方法は、複数のエピトープに高親和性で結合する結合性タンパク質、例えば二重特異性抗体を作製するために用いることができる。本発明の利点には、その各々が単一の軽鎖と会合する好適に高い結合性の（例えば、親和性成熟した）重鎖免疫グロブリン鎖を選択する能力が含まれる。
【０１７１】
二重特異性結合性タンパク質の合成および発現は、一部は、２つの異なる重鎖と会合して発現することができる好適な軽鎖を同定することに関連する問題のため、および一部は、単離の問題のために厄介であった。本明細書に記載される方法および組成物は、遺伝子改変マウスが、他の点では天然であるプロセスを介して、体細胞変異された（例えば、親和性成熟した）重鎖を含む複数の重鎖と会合して発現することができる好適な軽鎖を選択することを可能にする。リバースキメラ重鎖（すなわち、ヒト可変およびマウス定常）を有する親和性成熟抗体を発現する、本明細書に記載される免疫マウスの適するＢ細胞からのヒトＶＬおよびＶＨ配列を同定して、適するヒト定常領域遺伝子配列（例えば、ヒトＩｇＧ１）を有する発現ベクターにインフレームでクローニングすることができる。２つのそのような構築物を調製することができ、ここで、各構築物は異なるエピトープに結合するヒト重鎖可変ドメインをコードする。生殖系列配列における、またはＢ細胞（ここで、配列は体細胞変異されている）からのヒトＶＬの１つ（例えば、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１）は、適するヒト定常領域遺伝子（例えば、ヒトκ定常遺伝子）にインフレームで融合させることができる。これら３つの完全なヒトの重鎖および軽鎖構築物は、発現のために適する細胞に入れることができる。細胞は、２つの主要な種を発現する：同一の軽鎖を有するホモダイマー重鎖、および同一の軽鎖を有するヘテロダイマー重鎖。これらの主要な種の容易な分離を可能にするために、重鎖の１つはプロテインＡ結合決定基が削除されるように改変され、これにより、ヘテロダイマー結合性タンパク質とは異なるホモダイマー結合性タンパク質の親和性がもたらされる。この問題に対処する組成物および方法は、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１として公開された、２０１０年６月２５日に出願された「Ｒｅａｄｉｌｙ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｏｒｍａｔ」という名称のＵＳＳＮ１２／８３２，８３８に記載される。
【０１７２】
一態様では、本明細書に記載されるエピトープ結合性タンパク質が提供され、ここで、ヒトＶＬおよびＶＨ配列は、目的のエピトープを含む抗原で免疫されている本明細書に記載されるマウスに由来する。
【０１７３】
一実施形態では、第一および第二のポリペプチドを含むエピトープ結合性タンパク質が提供され、第一のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第一のエピトープに選択的に結合する第一のエピトープ結合性領域、続いてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびその組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ３領域を含む定常領域を含み；第二のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第二のエピトープに選択的に結合する第二のエピトープ結合性領域、続いてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびその組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３領域を含む定常領域を含み、第二のＣＨ３領域は、プロテインＡへの第二のＣＨ３ドメインの結合を低減または除去する改変を含む。
【０１７４】
一実施形態では、第二のＣＨ３領域はＨ９５Ｒ改変を含む（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによりＨ４３５Ｒ）。別の実施形態では、第二のＣＨ３領域はＹ９６Ｆ改変をさらに含む（ＩＭＧＴ；ＥＵによりＹ４３６Ｆ）。
【０１７５】
一実施形態では、第二のＣＨ３領域は改変ヒトＩｇＧ１に由来し、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７ＭおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによりＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７ＭおよびＶ４２２Ｉ）からなる群より選択される改変をさらに含む。
【０１７６】
一実施形態では、第二のＣＨ３領域は改変ヒトＩｇＧ２に由来し、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２ＮおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによりＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２ＮおよびＶ４２２Ｉ）からなる群より選択される改変をさらに含む。
【０１７７】
一実施形態では、第二のＣＨ３領域は改変ヒトＩｇＧ４に由来し、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９ＱおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによりＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９ＱおよびＶ４２２Ｉ）からなる群より選択される改変をさらに含む。
【０１７８】
複数のエピトープに結合するエピトープ結合性タンパク質を作製するための１つの方法は、目的の第一のエピトープを含む抗原で本発明による第一のマウスを免疫することであり、ここで、マウスは、軽鎖を再構成して形成することが可能な内因性マウスＶＬを含まない内因性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座を含み、ここで、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座はマウス内因性軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される単一の再構成されたヒトＶＬ領域であり、再構成されたヒトＶＬ領域は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択され、内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ遺伝子セグメントによって全部または一部が置換され、したがって、マウスによって作製される免疫グロブリン重鎖は、もっぱらまたは実質的に、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを含む重鎖である。免疫されるとき、そのようなマウスは、２つのヒト軽鎖可変ドメインの１つだけ（例えば、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１の１つ）を含むリバースキメラ抗体を作る。目的のエピトープに結合するＶＨをコードするＢ細胞が同定されると、ＶＨ（および、任意選択でＶＬ）のヌクレオチド配列を引き出して（例えば、ＰＣＲによって）、適するヒト免疫グロブリン定常ドメインとインフレームで発現構築物にクローニングすることができる。第二のエピトープに結合する第二のＶＨドメインを同定するためにこのプロセスを繰り返すことができ、第二のＶＨ遺伝子配列を引き出して、第二の適する免疫グロブリン定常ドメインとインフレームで発現ベクターにクローニングすることができる。第一および第二の免疫グロブリン定常ドメインは、同じか異なるアイソタイプであってよく、免疫グロブリン定常ドメインの１つ（他のものではない）を、本明細書またはＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載されるように改変することができ、エピトープ結合性タンパク質を適する細胞で発現させ、例えばＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載されるように、ホモダイマーエピトープ結合性タンパク質と比較してプロテインＡに対するその異なった親和性に基づいて単離することができる。
【０１７９】
一実施形態では、二重特異性エピトープ結合性タンパク質の作製方法であって、本明細書に記載されるマウスから第一の親和性成熟（例えば、１つまたは複数の体細胞超変異を含む）ヒトＶＨヌクレオチド配列（ＶＨ１）を同定すること、本明細書に記載されるマウスから第二の親和性成熟（例えば、１つまたは複数の体細胞超変異を含む）ヒトＶＨヌクレオチド配列（ＶＨ２）を同定すること、ＶＨ１をＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載されるプロテインＡ決定基改変を欠くヒト重鎖とインフレームでクローニングして重鎖１（ＨＣ１）を形成すること、ＶＨ２をＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載されるプロテインＡ決定基を含むヒト重鎖とインフレームでクローニングして重鎖２（ＨＣ２）を形成すること、ＨＣ１を含む発現ベクターおよびＨＣ２を含む同じか異なる発現ベクターを細胞に導入することであって、ここで、細胞はヒト軽鎖定常ドメインに融合したヒトＶκ１−３９／ヒトＪκ５またはヒトＶκ３−２０／ヒトＪκ１を含むヒト免疫グロブリン軽鎖をさらに発現する、導入すること、ＶＨ１によってコードされるＶＨドメインおよびＶＨ２によってコードされるＶＨドメインを含む二重特異性エピトープ結合性タンパク質を細胞に発現させること、ならびに単一特異的なホモダイマーエピトープ結合性タンパク質と比較して、プロテインＡに結合するその異なった能力に基づいて二重特異性エピトープ結合性タンパク質を単離すること、を含む方法が提供される。具体的な実施形態では、ＨＣ１はＩｇＧ１であり、ＨＣ２は、改変Ｈ９５Ｒ（ＩＭＧＴ；ＥＵによりＨ４３５Ｒ）を含み、改変Ｙ９６Ｆ（ＩＭＧＴ；ＥＵによりＹ４３６Ｆ）をさらに含むＩｇＧ１である。一実施形態では、ＶＨ１によってコードされるＶＨドメイン、ＶＨ２によってコードされるＶＨドメイン、またはその両方は、体細胞変異される。
【０１８０】
共通のヒトＶＬと共に発現するヒトＶＨ遺伝子
４つの異なる抗原に対して形成された親和性成熟抗体からの様々なヒト可変領域は、それらの関連軽鎖、またはヒトＶκ１−３９Ｊκ５、ヒトＶκ３−２０Ｊκ１もしくはヒトＶｐｒｅＢＪλ５から選択される少なくとも１つのヒト軽鎖と共に発現された（実施例１０を参照）。抗原の各々に対する抗体について、異なる遺伝子ファミリーからの体細胞変異高親和性重鎖は、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１領域と上手く対合し、重鎖および軽鎖を発現する細胞から分泌された。Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１について、以下のヒトＶＨ遺伝子ファミリーに由来するＶＨドメインが有利に発現した：１−２、１−８、１−２４、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、４−３１、４−３９、４−５９、５−５１および６−１。したがって、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１の片方または両方からヒトＶＬドメインの限られたレパートリーを発現するように遺伝子操作されているマウスは、ヒトＶＨ遺伝子セグメントでマウスＶＨ遺伝子セグメントを置換するように改変されたＶＨ遺伝子座から、体細胞変異ヒトＶＨドメインの多様な集団を生成する。
【０１８１】
単一の再構成された軽鎖（例えば、Ｖκ１−３９／ＪまたはＶκ３−２０／Ｊ）と会合しているリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）免疫グロブリン重鎖を発現するように遺伝子操作されたマウスは、目的の抗原で免疫される場合、多様なヒトＶＨ再構成を含み、かつ多様な特性（リガンドへの抗原の結合をブロックする能力に関して、および抗原のバリアントに結合する能力に関して）を有する多様な高親和性抗原特異的抗体を発現するＢ細胞を生成した（実施例１４から１５を参照）。
【０１８２】
したがって、本明細書に記載されるマウスおよび方法は、多様な再構成から生じ、多種多様な親和性を示し（約ナノモルまたはそれ以下のＫＤを示すことを含む）、多種多様な特異性を示し（同じ抗原の異なるエピトープへの結合を含む）、同じか実質的に同じヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域と会合して発現する、体細胞変異ヒト重鎖可変ドメインを含む、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインの作製および選択で有用である。
【０１８３】
一態様では、ヒト化重鎖可変領域遺伝子座を含む第一のマウスを、本明細書に記載の共通の（すなわち、ユニバーサル）軽鎖遺伝子座をコードする核酸配列を含む第二のマウスと交配する。一実施形態では、第一または第二のマウスは、マウスＡＤＡＭ６をコードする異所性核酸配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む。子孫を交配して、ヒト化重鎖遺伝子座についてホモ接合性およびユニバーサル軽鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウスを得る。一実施形態では、第一のマウスまたは第二のマウスは、内因性マウス軽鎖遺伝子座を非機能的にする内因性マウス軽鎖遺伝子座の改変（例えば、例えば、λおよび／またはκ内因性遺伝子座の欠失またはノックアウト）を含む。一実施形態では、第一のマウスは、全てまたは実質的に全ての機能的内因性マウスＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントの、１つもしくは複数の再構成されていないヒトＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメント（例えば、全てまたは実質的に全ての機能的ヒトＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメント）での置換を含み、マウスは、全てまたは実質的に全ての機能的軽鎖ＶおよびＪ遺伝子セグメントの、１つ以下または２つ以下の再構成された軽鎖Ｖ／Ｊ配列での置換を含む。一実施形態では、第一のマウスは、マウスＡＤＡＭ６をコードする異所性核酸配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をさらに含む。一実施形態では、異所性核酸配列はヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。
【０１８４】
一実施形態では、異所性配列を含み、且つユニバーサル軽鎖遺伝子座について、およびヒト化重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウスを目的の抗原で免疫して、ユニバーサル軽鎖と会合して発現する複数の体細胞変異したヒト可変ドメインを含む抗体を生成する。一実施形態では、マウスにおいて同定されたヒト重鎖可変ドメイン核酸配列を発現系で使用して、ヒト重鎖可変ドメインおよびマウスのユニバーサル軽鎖配列を含む軽鎖を含む完全ヒト抗体を作製する。
【０１８５】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物を作製、使用する方法を当業者に説明するために提供され、発明者が彼らの発明とみなすものの範囲を限定するものではない。用いる数（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証するように努めたが、多少の実験誤差および逸脱があることが考慮されるべきである。特に明記しない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏で示され、気圧は大気圧またはその近くである。
【実施例】
【０１８６】
実施例Ｉ
マウス免疫グロブリン遺伝子のヒト化
【０１８７】
ヒトおよびマウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）を使用して、マウス免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座のヒト化のための１３の異なるＢＡＣターゲティングベクター（ＢＡＣｖｅｃ）を操作して作製した。表１および２は、マウス免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座のヒト化にそれぞれ利用したすべてのＢＡＣｖｅｃを構築するために行った工程の詳細な説明を示すものである。
【０１８８】
ヒトおよびマウスのＢＡＣの同定。
【０１８９】
ＢＡＣライブラリーを用いてスポットしたフィルターのハイブリダイゼーションにより、またはマウスＢＡＣライブラリーＤＮＡプールのＰＣＲスクリーニングにより、免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座の５’および３’端にわたるマウスＢＡＣを同定した。対象となる領域に対応するプローブを使用して、標準条件下でフィルターをハイブリダイズした。対象となる標的領域に隣接するユニークなプライマーペアを使用してＰＣＲによりライブラリープールをスクリーニングした。同じプライマーを使用する追加のＰＣＲを行って、所与のウェルをデコンボリュートし、対象となる対応するＢＡＣを単離した。ＢＡＣフィルターとライブラリープールの両方を１２９ＳｖＪマウスＥＳ細胞（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から生成した。全免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座をカバーするヒトＢＡＣを、ＢＡＣライブラリー（Ｃａｌｔｅｃｈ  Ｂ、ＣもしくはＤライブラリーおよびＲＰＣＩ−１１ライブラリー、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてスポットしたフィルターのハイブリダイゼーションとＰＣＲベースの方法によるヒトＢＡＣライブラリープール（Ｃａｌｔｅｃｈライブラリー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のスクリーニングによるか、またはＢＡＣ末端配列データベース（Ｃａｌｔｅｃｈ  Ｄ  ｌｉｂｒａｔｙ、ＴＩＧＲ）の使用によるかの、いずれかによって同定した。
【０１９０】
ＢＡＣｖｅｃの構築（表１および２）。
【０１９１】
細菌相同組換え（ＢＨＲ）を記載されている（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ら（１９９８）Ａ  ｎｅｗ  ｌｏｇｉｃ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０、１２３−１２８）とおりに行った。殆どの場合、ＰＣＲ由来ホモロジーボックスのクローン化カセットへのライゲーション、続いてライゲーション産物のゲル単離、そして標的ＢＡＣを保有するＢＨＲコンピテント細菌へのエレクトロポレーションによって線状断片を生成した。適切な抗生物質ペトリ皿での選択の後、正しく組換えられたＢＡＣを、両方の新規接合部にわたってのＰＣＲ、続いてパルスフィールドゲルでの制限酵素分析（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｄ．Ｃ．ａｎｄ  Ｃａｎｔｏｒ，Ｃ．Ｒ．（１９８４）Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｓｉｚｅｄ  ＤＮＡｓ  ｂｙ  ｐｕｌｓｅｄ  ｆｉｅｌｄ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  ３７、６７−７５）、そしてヒト配列全域にわたって分布するプライマーを使用するＰＣＲによるスポットチェックによって同定した。
【０１９２】
３工程の逐次的ＢＨＲ工程を用いて、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の最初のヒト化工程のための３ｈＶＨ  ＢＡＣｖｅｃを構築した（図４Ａおよび表１）。第一工程（工程１）では、ヒト親ＢＡＣのヒトＶＨ１−３遺伝子セグメントから上流に、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座と相同性の領域（ＨＢ１）と細菌にカナマイシン耐性をおよび動物細胞にＧ４１８耐性を付与する遺伝子（ｋａｎＲ）と部位特異的組換え部位（例えば、ｌｏｘＰ）とを含有するカセットを導入した。第二工程（工程２）では、最後のＪＨセグメントから直ぐ下流に、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座と相同性の第二の領域（ＨＢ２）と細菌にスペクチノマイシンに対する耐性を付与する遺伝子（ｓｐｅｃＲ）とを含有する第二のカセットを導入した。この第二工程は、ＪＨ６から下流のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座配列とＢＡＣベクタークロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃｍＲ）とを欠失させることを含んだ。次に、第三工程（工程３）では、最初の２工程の間に付加されたＩ−ＣｅｕＩ部位を使用して二重改変ヒトＢＡＣ（Ｂ１）を線形化し、２つの相同性領域（ＨＢ１およびＨＢ２）によるＢＨＲによってマウスＢＡＣ（Ｂ２）に組み込んだ。第一（ｃｍ／ｋａｎ）、第二（ｓｐｅｃ／ｋａｎ）および第三（ｃｍ／ｋａｎ）工程のための薬剤選択は、所望の産物に特異的であるように設計した。制限酵素での消化後にパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）により改変ＢＡＣクローンを分析して、適切な構築物を決定した（図４Ｂ）。
【０１９３】
同様に、重鎖およびκ軽鎖遺伝子座のヒト化のために１２の追加のＢＡＣｖｅｃを操作して作製した。場合によっては、選択マーカーの注意深い配置と共に、ＢＨＲによる両方の親ＢＡＣｖｅｃへの稀な制限酵素認識部位導入による、ＢＨＲの代わりにＢＡＣライゲーションを行って、２つの大きなＢＡＣを結合した。これにより、特定の薬剤マーカーの組み合わせでの選択の際に、所望のライゲーション産物の生残が可能になった。稀な制限酵素での消化後のライゲーションによって得た組換えＢＡＣを、ＢＨＲによって得たものと同様に（上に記載したように）同定し、スクリーニングした。
【０１９４】
【表１−１】
2020072695.tif 000002
【表１−２】
2020072695.tif 000003
【表１−３】
2020072695.tif 000004
【０１９５】
【表２】
2020072695.tif 000005
【０１９６】
胚性幹（ＥＳ）細胞の改変およびマウスの産生。
【０１９７】
記載されている（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３）ようなＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学法を用いて、ＥＳ細胞（Ｆ１Ｈ４）ターゲティングを行った。胚盤胞（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３）または８細胞注入（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕら、２００７）のいずれかによる改変ＥＳ細胞からのマウスの誘導は、記載されているとおりであった。ＰＣＲベースのアッセイでプローブとプライマーのユニークなセットを用いてＥＳ細胞またはマウスからのＤＮＡをスクリーニグすることにより、標的ＥＳ細胞およびマウスを確認した（例えば、図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ）。すべてのマウス研究は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎの施設内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ：ＩＡＣＵＣ）によって監督され、承認された。
【０１９８】
核型分析および蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）。
【０１９９】
核型分析は、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ニュージャージー州カムデン）によって行われた。ＦＩＳＨは、標的ＥＳ細胞を用いて、記載されている（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３）とおりに行った。マウスＢＡＣ  ＤＮＡまたはヒトＢＡＣ  ＤＮＡのいずれかに対応するプローブを、ニック翻訳（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により蛍光標識ｄＵＴＰヌクレオチドスペクトルオレンジまたはスペクトルグリーン（Ｖｙｓｉｓ）で標識した。
【０２００】
免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座。
【０２０１】
重鎖遺伝子座の可変領域のヒト化は、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号明細書およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３参照）を用いて、９工程の逐次的工程で、すべてのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントを含有する約３百万塩基対（Ｍｂ）の連続するマウスゲノム配列を、等価ヒト遺伝子セグメントを含有する約１Ｍｂの連続するヒトゲノム配列で直接置換することによって達成した（図１Ａおよび表１）。
【０２０２】
ＪＨ遺伝子セグメントと定常領域遺伝子の間のイントロン（Ｊ−Ｃイントロン）は、転写エンハンサー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．（１９８３）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ２、１３７３−１３７８）、その後にアイソタイプスイッチ中の組換えに必要な単純リピート領域（Ｋａｔａｏｋａ，Ｔ．ら（１９８０）Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇａｍｍａ  １−ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ  ｃｌａｓｓ  ｓｗｉｔｃｈ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ７７，９１９−９２３）を含有する。マウス内でのヒト化重鎖遺伝子座の効率的発現およびクラススイッチ両方を保存するために、マウス重鎖イントロンエンハンサーおよびスイッチドメインを維持するようにヒトＶＨ−ＤＨ−ＪＨ領域とマウスＣＨ領域の間の接合部（近位接合部）を選択した。合成オリゴヌクレオチドによって駆動される細菌相同組換えを用いるＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学法（上記）の使用により、すべての置換においてこのおよび後続の接合部の正確なヌクレオチド位置が実現可能であった。このようにして、近位接合部を最後のＪＨ遺伝子セグメントから約２００ｂｐ下流に配置し、遠位接合部を、ヒト遺伝子座の最も５’側のＶＨ遺伝子セグメントの数百上流、かつＪ５５８．５５としても公知のマウスＶＨ１−８６遺伝子セグメントから約９ｋｂ下流に配置した。前記マウスＶＨ１−８６（Ｊ５５８．５５）遺伝子セグメントは最遠位重鎖可変遺伝子セグメントであり、このセグメントは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは偽遺伝子であるが、標的１２９対立遺伝子において不十分なＲＳＳ配列であるにもかかわらず潜在的に活性であると報告されている。前記マウス重鎖遺伝子座の遠位端は、報告によれば、遺伝子座発現および／または再構成を調節する制御要素を含有し得る（Ｐａｗｌｉｔｚｋｙら、２００６）。
【０２０３】
ヒト免疫グロブリンＤＮＡ配列のマウスへの第一の挿入は、約７５ｋｂのマウスホモロジーアームを使用して、３つのＶＨ、２７すべてのＤＨおよび９つのＪＨヒト遺伝子セグメントを含有するヒト重鎖遺伝子座の１４４ｋｂの近位端をマウスＩｇＨ遺伝子座の近位端に挿入し、相伴って１６．６ｋｂのマウスゲノムを欠失させることによって達成した（工程Ａ、図２Ａ；表１および３、３ｈＶＨ）。この大きな１４４ｋｂ挿入および随伴する１６．６ｋｂ欠失を単一の工程（工程Ａ）で行い、この工程は０．２％の頻度で行われた（表３）。欠失マウス配列内のおよび欠失マウス配列に隣接するプローブならびに挿入ヒト配列内のプローブを使用する天然対立遺伝子の喪失（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｎａｔｉｖｅ−ａｌｌｅｌｅ：ＬＯＮＡ）アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３）により、正しくターゲティングされたＥＳ細胞にスコアを付けし、全挿入にわたって複数のプローブを使用して大きなヒト挿入物の完全性を検証した（図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ）。多ラウンドの逐次的ＥＳ細胞ターゲティングが予想されたので、この工程およびすべての後続の工程で標的ＥＳ細胞クローンを核型分析（上記）に付し、２０のうち少なくとも１７のスプレッドにおいて正常な核型を示すクローンのみを後続の工程に用いた。
【０２０４】
工程Ａからの標的ＥＳ細胞をＢＡＣｖｅｃで再ターゲティングし、それにより、重鎖遺伝子座の遠位端に１９ｋｂ欠失を生じさせた（工程Ｂ、図２Ａ）。工程ＢのＢＡＣｖｅｃは、工程ＡのＢＡＣｖｅｃに含有されているネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）とは対照的にハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）を含有した。これら２つのＢＡＣｖｅｃからの耐性遺伝子は、同じ染色体へのターゲティング成功により、該２つの耐性遺伝子ばかりでなくＶＨ１−８６以外のすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントおよびＤＱ５２以外のすべてのＤＨ遺伝子セグメントを含有するおおよそ３Ｍｂのマウス重鎖可変遺伝子遺伝子座をｌｏｘＰ部位に隣接させるように、ならびにＤＱ５２およびすべてのマウスＪＨ鎖遺伝子セグメントが工程Ａにおいて欠失されるように設計した。同じ染色体上に二重にターゲティングされたＥＳ細胞クローンを、３ｈＶＨ近位カセットを高Ｇ４１８においてホモ接合性にさせること（Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ，Ｒ．Ｍ．ら（１９９２）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｍｕｔａｎｔ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２：２３９１−２３９５）および遠位ｈｙｇカセットの運命を追跡することによって同定した。ｌｏｘＰ部位が隣接するような手法で改変された４Ｍｂ以下のサイズのマウスセグメントは、薬剤選択不在の場合でさえ、高効率（約１１％以下）でのＣＲＥリコンビナーゼの一過的発現によりＥＳ細胞において首尾よく欠失した（Ｚｈｅｎｇ，Ｂ．ら（２０００）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ：  ｒａｎｇｅ，  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，  ａｎｄ  ｓｏｍａｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：６４８−６５５）。同様の手法で、本発明者らは、一過的ＣＲＥ発現後に８％のＥＳ細胞クローンにおいて３Ｍｂ欠失を実現した（工程Ｃ、図２Ａ、表３）。欠失マウス配列のいずれかの末端におけるプローブ、ならびにｎｅｏおよびｈｙｇの喪失、および唯一残存するｌｏｘＰ部位を含有する欠失点にわたるＰＣＲ産物の出現を用いるＬＯＮＡアッセイによって欠失にスコアを付けた。さらに、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって欠失を確認した（データを示さない）。
【０２０５】
各工程が２１０ｋｂ以下のヒト遺伝子配列の正確な挿入を含む、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学法を用いる一連の５工程（工程Ｅ〜Ｈ、図２Ｂ）で、ヒト重鎖可変領域の残部を３ｈＶＨ対立遺伝子に付加させた。各工程について、各新たなＢＡＣｖｅｃの近位端を前の工程の最遠位ヒト配列とオーバーラップするように設計し、各新たなＢＡＣｖｅｃの遠位端は、工程Ａにおいて使用したのと同じ遠位マウス相同領域を含有した。工程Ｄ、ＦおよびＨのＢＡＣｖｅｃはｎｅｏ選択カセットを含有したが、工程ＥおよびＧのものは、ｈｙｇ選択カセットを含有し、したがって、Ｇ４１８とハイグロマイシンの間で交互に選択した。工程Ｄにおけるターゲティングを、３ｈＶＨハイブリッド対立遺伝子の遠位ｌｏｘＰ部位にわたるユニークなＰＣＲ産物の喪失によってアッセイした。工程ＥからＩについてのターゲティングは、前の選択カセットの喪失によってアッセイした。最後の工程（工程Ｉ、図２Ｂ）では、Ｆｒｔ部位（ＭｃＬｅｏｄ，Ｍ．ら（１９８６）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｓｉｔｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ＦＬＰ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ２  ｍｉｃｒｏｎｓ  ｃｉｒｃｌｅ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ６、３３５７−３３６７）が隣接するｎｅｏ選択カセットを、一過的ＦＬＰｅ発現（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ｆ．ら（１９９８）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ＦＬＰ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ｅｖｏｌｖｅｄ  ｂｙ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６、６５７−６６２）によって除去した。工程Ｄ、ＥおよびＧについてのＢＡＣｖｅｃのヒト配列は、２つの親ヒトＢＡＣ各々に由来したが、工程ＦおよびＨからのヒト配列は、単一のＢＡＣからのものであった。挿入ヒト配列にわたって複数のプローブを使用して、ヒト配列の保持を工程ごとに確認した（上記したとおり、例えば図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ）。各工程で、正常な核型および生殖細胞系の潜在力を有するクローンのみを次の工程に進めた。最後の工程からのＥＳ細胞は、９種の逐次的操作（表３）の後、依然として生殖細胞系に寄与することができた。重鎖対立遺伝子の各々についてホモ接合性のマウスは、生育可能であり、健常であるように見え、および本質的に野生型の体液性免疫系を実証した（実施例３参照）。
【０２０６】
【表３】
2020072695.tif 000006
【０２０７】
免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座。
【０２０８】
重鎖のものに類似した手法で、すべてのＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含有する約３Ｍｂのマウス配列を、近位ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含有する約０．５Ｍｂのヒト配列で直接置換することにより、８工程の逐次的工程でκ軽鎖可変領域をヒト化した（図１Ｂ；表２および４）。
【０２０９】
ヒトκ軽鎖遺伝子座の可変領域は、８００ｋｂスペーサーによって隔てられた２つのほぼ同一の４００ｋｂリピートを含有する（Ｗｅｉｃｈｈｏｌｄ，Ｇ．Ｍ．ら（１９９３）Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  ｌｏｃｕｓ  ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃｏｐｉｅｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｏｒｇａｎｉｚｅｄ  ｉｎ  ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｐｏｌａｒｉｔｙ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １６：５０３−５１１）。これらのリピートは非常に類似しているので、近位リピートを使用することによりマウスにおいてほぼすべての遺伝子座多様性を再現することができる。さらに、遠位リピートを欠くκ軽鎖遺伝子座の天然ヒト対立遺伝子が報告されている（Ｓｃｈａｉｂｌｅ，Ｇ．ら（１９９３）Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  ｌｏｃｕｓ：  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  Ｃａｕｃａｓｏｉｄ  ａｎｄ  ｎｏｎ−Ｃａｕｃａｓｏｉｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ９１：２６１−２６７）。約３Ｍｂのマウスκ軽鎖可変遺伝子配列は、約０．５Ｍｂのヒトκ軽鎖可変遺伝子配列で置換されて、すべてのマウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントが、近位ヒトＶκおよびすべてのヒトＪκ遺伝子セグメントで有効に置き換えられた（図２Ｃおよび２Ｄ；表２および４）。重鎖遺伝子座について実施例１において記載する方法とは対照的に、任意のヒト配列を付加する前に３工程のプロセスですべてのＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含有する全マウスＶκ遺伝子領域を欠失させた。最初、ｎｅｏカセットを可変領域の近位端に導入した（工程Ａ、図２Ｃ）。次に、ｈｙｇカセットをκ遺伝子座の遠位端に挿入した（工程Ｂ、図２Ｃ）。残存する３ＭｂのマウスＶκ領域と共に両方の耐性遺伝子の欠失がＣＲＥ処理により誘導されるように、ｌｏｘＰ部位を各選択カセットの中に再び置いた（工程Ｃ、図２Ｃ）。
【０２１０】
重鎖について用いた方法（実施例１参照）に類似した方法を用いて、１５０ｋｂ以下のヒト免疫グロブリンκ軽鎖配列を１工程で挿入して、免全疫グロブリンκ軽鎖可変領域を含有する約４８０ｋｂサイズのヒトゲノム断片を４工程の逐次的工程（図２Ｄ；表２および４）で挿入した。最後のハイグロマイシン耐性遺伝子を一過的ＦＬＰｅ発現によって除去した。重鎖と同様に、いずれの工程後にも、標的ＥＳ細胞クローンを全ヒト挿入物の完全性、正常な核型および生殖細胞系の潜在性について評価した。κ軽鎖鎖対立遺伝子の各々についてホモ接合性のマウスが産生され、健常であることおよび正常な外観のものであることが判明した。
【０２１１】
【表４】
2020072695.tif 000007
【０２１２】
実施例ＩＩ
複数のヒト化免疫グロブリン対立遺伝子の組み合わせによる完全ヒト化マウスの産生
【０２１３】
幾つかの箇所に、実施例１に記載したようなヒト免疫グロブリン重鎖またはκ軽鎖可変レパートリーの一部分を保有するＥＳ細胞を微量注射し、得られたマウスを交配させて、ヒト生殖細胞系免疫グロブリンレパートリーの徐々に大きな断片（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスの複数のバージョンを生み出した（表５；図５Ａおよび５Ｂ）。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）１（Ｖ１）ヒト化マウスは、１８のヒトＶＨ遺伝子セグメントおよびすべてのヒトＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントを、１６のヒトＶκ遺伝子セグメントおよびすべてのヒトκ遺伝子セグメントと併せて有する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）２（Ｖ２）ヒト化マウスおよびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（Ｖ３）ヒト化マウスは、合計３９のＶＨおよび３０のＶκおよび８０のＶＨおよび４０のＶκをそれぞれ保有する増加した可変レパートリーを有する。マウスＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメント、ならびにＶκおよびＪκ遺伝子セグメントをコードするゲノム領域は完全に置換されたていたので、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスにより産生される抗体が、マウス定常領域に連結されたヒト可変領域を含有する。マウスλ軽鎖遺伝子座は、全てのバージョンのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスにおいてインタクトなままであり、様々なＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化κ軽鎖遺伝子座の発現効率についてのコンパレータとして役立つ。
【０２１４】
免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖両方のヒト化について二重にホモ接合性のマウスを、実施例１で記載した対立遺伝子のサブセットから産生させた。二重ホモ接合型マウスを産生するための交配コースの間に観察されたすべての遺伝子型は、大体メンデル比で発生した。ヒト重鎖対立遺伝子の各々についてホモ接合性の雄後代は、妊性低減を示した。妊性低減はマウスＡＤＡＭ６活性の喪失に起因した。マウス重鎖可変遺伝子遺伝子座は、２つのはめ込んだ機能的ＡＤＡＭ６遺伝子（ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ）を含有する。マウス重鎖可変遺伝子遺伝子座のヒト化の間、挿入されたヒトゲノム配列は、ＡＤＡＭ６偽遺伝子を含有した。マウスＡＤＡＭ６は、妊性に要求され得、それ故、ヒト偽遺伝子の存在にもかかわらず、ヒト化重鎖可変遺伝子遺伝子座におけるマウスＡＤＡＭ６遺伝子の欠如が、これらのマウスにおける妊性の低減をもたらした可能性がある。実施例７〜９は、欠失したマウスＡＤＡＭ６遺伝子がヒト化重鎖可変遺伝子遺伝子座へと正確な配置で戻されること、およびヒト化重鎖免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスにおける野生型レベルの妊性の回復を記載する。
【０２１５】
【表５】
2020072695.tif 000008
【０２１６】
実施例ＩＩＩ
ヒト化免疫グロブリン遺伝子を有するマウスにおけるリンパ球集団
【０２１７】
３つの異なるバージョンのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおける成熟Ｂ細胞集団をフローサイトメトリーによって評価した。
【０２１８】
簡単に言うと、標準的な方法を用いて、骨髄、脾臓および胸腺からの細胞懸濁液を作製した。ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＦＡＣＳ染色緩衝液中５×１０５細胞／ｍＬで細胞を再懸濁させ、抗マウスＣＤ１６／３２（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でブロッキングし、適切な抗体カクテルで染色し、ＢＤ  ＣＹＴＯＦＩＸ（商標）で固定し、これらの作業はすべて製造業者の指示に従って行った。最終細胞ペレットを０．５ｍＬ染色緩衝液に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ（商標）およびＢＤ  ＣＥＬＬＱＵＥＳＴ  ＰＲＯ（商標）ソフトウェアを使用して分析した。すべての抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を質量希釈／カクテルで調製し、０．５ｍｇ／１０５細胞の最終濃度まで添加した。骨髄（Ａ〜Ｄ）染色用の抗体カクテルは、次のとおりであった：Ａ：抗マウスＩｇＭｂ−ＦＩＴＣ、抗マウスＩｇＭａ−ＰＥ、抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）−ＡＰＣ；Ｂ：抗マウスＣＤ４３（Ｓ７）−ＰＥ、抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）−ＡＰＣ；Ｃ：抗マウスＣＤ２４（ＨＳＡ）−ＰＥ；抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）−ＡＰＣ；Ｄ：抗マウスＢＰ−１−ＰＥ、抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）−ＡＰＣ。脾臓および鼠蹊リンパ節（Ｅ〜Ｈ）染色用の抗体カクテルは、次のとおりであった：Ｅ：抗マウスＩｇＭｂ−ＦＩＴＣ、抗マウスＩｇＭａ−ＰＥ、抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）−ＡＰＣ；Ｆ：抗マウスＩｇ、λ１、λ２、λ３軽鎖−ＦＩＴＣ、抗マウスＩｇκ軽鎖−ＰＥ、抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）−ＡＰＣ；Ｇ：抗マウスＬｙ６Ｇ／Ｃ−ＦＩＴＣ、抗マウスＣＤ４９ｂ（ＤＸ５）−ＰＥ、抗マウスＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ；Ｈ：抗マウスＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）−ＦＩＴＣ、抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）−ＰＥ、抗マウスＣＤ８ａ−ＡＰＣ。結果を図６に示す。
【０２１９】
ホモ接合型ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスの脾臓またはリンパ節から単離したリンパ球をマーカーＢ２２０およびＩｇＭの表面発現について染色し、フローサイトメトリーを用いて分析した（図６）。試験したすべてのバージョンのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスにおけるＢ２２０＋ＩｇＭ＋成熟Ｂ細胞集団のサイズは、それらが含有するＶＨ遺伝子セグメントの数にかかわらず、実質的に野生型マウスのものと同一であった。加えて、ホモ接合性ハイブリッドヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含有するマウスも、正常マウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有するが３つしかＶＨ遺伝子セグメントを有さないマウス、またはホモ接合性ハイブリッドヒト化κ軽鎖と正常マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含有するマウスでさえも、その末梢区画に正常な数のＢ２２０＋ＩｇＭ＋細胞を有した（示さず）。これらの結果は、ヒト可変遺伝子セグメントおよびマウス定常領域を有するキメラ遺伝子座が、成熟Ｂ細胞区画に十分に集合できることを示している。さらに、重鎖またはκ軽鎖遺伝子座のいずれかにおける可変遺伝子セグメントの数、およびしたがって抗体レパートリーの理論的多様性は、成熟Ｂ細胞の野生型集団を産生する能力と相関しない。対照的に、ランダムに組み込まれた完全ヒト免疫グロブリン導入遺伝子および不活性化マウス免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスは、これらの区画に低減数のＢ細胞を有し、その欠損の重度は、導入遺伝子に含まれている可変遺伝子セグメントの数に依存する（Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．およびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．（１９９８）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｂｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８８：４８３−４９５）。これは、「ｉｎ  ｓｉｔｕ遺伝子ヒト化」戦略が、「ノックアウト・プラス・トランスジェニック」アプローチで実現されるランダムに組み込まれる導入遺伝子とは基本的に異なる機能的帰結をもたらす結果となることの証拠となる。
【０２２０】
対立遺伝子排除および遺伝子座選択
【０２２１】
対立遺伝子排除（ｍａｉｎｔａｉｎ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｅｘｌｕｓｉｏｎ）を維持する能力を、異なるバージョンのヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性のマウスで調査した。
【０２２２】
１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃおよびＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃヘテロ接合胚に由来するＦ１  ＥＳ系列（Ｆ１Ｈ４（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３））で免疫グロブリン遺伝子座のヒト化を行った。ヒト重鎖生殖細胞系可変遺伝子配列を１２９Ｓ６対立遺伝子にターゲティングする。この対立遺伝子はＩｇＭａハプロタイプを保有するが、未改変マウスＣ５７６ＢＬ／６Ｎ対立遺伝子はＩｇＭｂハプロタイプを有する。ＩｇＭのこれらの対立遺伝子形態は、ＩｇＭａまたはＩｇＭｂ対立遺伝子において見出される多型に特異的な抗体を使用してフローサイトメトリーにより区別することができる。図６（最下段）に示されているように、各バージョンのヒト化重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性のマウスにおいて同定されたＢ細胞は、単一の対立遺伝子、ＩｇＭａ（ヒト化対立遺伝子）またはＩｇＭｂ（野生型対立遺伝子）のいずれか、しか発現しない。これは、対立遺伝子排除に関与する機序が、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスにおいてインタクトであることの証拠となる。加えて、ヒト化対立遺伝子（ＩｇＭａ）について陽性のＢ細胞の相対数は、存在するＶＨ遺伝子セグメントの数に大体比例する。ヒト化免疫グロブリン遺伝子座は、１８のヒトＶＨ遺伝子セグメントを有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）１ヒト化ヘテロ接合体マウスではＢ細胞のおおよそ３０％において発現し、ならびに３９および８０のヒトＶＨ遺伝子セグメントをそれぞれ有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）２および３（示さず）ヒト化ヘテロ接合体マウスではＢ細胞の５０％において発現する。注目に値することとして、ヒト化マウス対立遺伝子を発現する細胞の、野生型マウス対立遺伝子を発現する細胞に対する比（ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）１ヒト化マウスについては０．５およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）２ヒト化マウスについては０．９）は、ヒト化遺伝子座に含有される可変遺伝子セグメント数の、野生型遺伝子座に含有される可変遺伝子セグメントの数に対する比（ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）１ヒト化マウスについては０．２およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）２ヒト化マウスについては０．４）より大きい。これは、対立遺伝子選択の確率が、１つもしくは他の染色体のランダム選択と任意の特定のＶセグメントＲＳＳのランダム選択の間の中間であることを示している。さらに、一方の対立遺伝子が組み換えに利用できるようになり、その過程を完了し、組換えを遮断し、その後、他方の対立遺伝子が利用能になるＢ細胞が、すべてではないが、一部存在し得る。加えて、ハイブリッドヒト化重鎖遺伝子座または野生型マウス重鎖遺伝子座のいずれかに由来する表面ＩｇＭ（ｓＩｇＭ）を有する細胞の一様な分布は、該ハイブリッド遺伝子座が正常レベルで動作している証拠である。対照的に、ランダムに組み込まれたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、野生型マウス免疫グロブリン遺伝子座との競合が不十分である（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら（１９８９）Ａ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．ＰＮＡＳ  ８���、６７０９−６７１３；Ｇｒｅｅｎら（１９９４）；Ｔｕａｉｌｌｏｎ，Ｎ．ら（１９９３）Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ  ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ：ｇｅｎｅ−ｓｅｇｍｅｎｔ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｍｕ  ａｎｄ  ｇａｍｍａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：３７２０−３７２４）。これは、さらに、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスによって産生される免疫グロブリンが、「ノックアウト・プラス・トランスジェニック」アプローチによって作製されるマウスにおけるランダムに組み込まれた導入遺伝子によって産生されるものとは機能的に異なることの証拠となる。
【０２２３】
１２９Ｓ６またはＣ５７ＢＬ／６Ｎでは、非ヒト化κ軽鎖遺伝子座に対するヒト化κ軽鎖遺伝子座の対立遺伝子排除の調査にＣκ領域の多型を利用できない。しかし、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスすべてが野生型マウスλ軽鎖遺伝子座を有するので、ヒト化κ軽鎖遺伝子座の再構成および発現がマウスλ軽鎖発現を防止できるかどうかを観察することが可能である。マウスλ軽鎖を発現する細胞の数に対するヒト化κ軽鎖を発現する細胞の数の比は、κ軽鎖遺伝子座に挿入されたヒトＶκ遺伝子セグメントの数にかかわらず、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスでは野生型マウスと比べて比較的不変であった（図６、上から三段目）。加えて、二重陽性（κ＋λ）細胞数の増加は無く、このことから、ハイブリッドκ軽鎖遺伝子座での生産的組換えが、マウスλ軽鎖遺伝子座の組換えの適切な抑制をもたらす結果となることが示された。対照的に、ランダムに組み込まれたκ軽鎖導入遺伝子と−野生型マウスλ軽鎖遺伝子座ではなく−不活性化されたマウスκ軽鎖遺伝子座を含有するマウスは、λ／κ比の劇的増大を示す（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８）。これは、導入されたκ軽鎖導入遺伝子が、かかるマウスでは十分に機能しないことを意味する。これは、さらに、「ノックアウト・プラス・トランスジェニック」マウスによって作製されるものと比較してＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスによって作製される免疫グロブリンにおいて観察される異なる機能的帰結の証拠となる。
【０２２４】
Ｂ細胞発生。
【０２２５】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスにおける成熟Ｂ細胞集団は、（上に記載したように）野生型マウスのものと似ているため、早期Ｂ細胞分化の欠陥を成熟Ｂ細胞集団の増殖によって補償することが可能である。フローサイトメトリーを用いてＢ細胞集団を分析することによって、様々なＢ細胞分化段階を調査した。表６は、特定の細胞表面マーカーを使用して、野生型同腹子と比較したＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスにおける、ＦＡＣＳにより定義した各Ｂ細胞系列の細胞の画分の比を示すものである。
【０２２６】
早期Ｂ細胞発生は骨髄で起こり、異なるＢ細胞分化段階は、細胞表面マーカー発現のタイプおよび量の変化によって特徴づけられる。これらの表面発現における差異は、細胞内部の免疫グロブリン遺伝子座で起こる分子の変化と相関する。プロＢ細胞からプレＢ細胞への移行には機能的重鎖タンパク質の再構成および発現の成功が必要であるが、プレＢから成熟Ｂ期への移行は、κまたはλ軽鎖の正しい再構成および発現によって支配される。したがって、Ｂ細胞分化段階間の非効率的移行は、所与の段階のＢ細胞の関連集団の変化によって検出することができる。
【０２２７】
【表６】
2020072695.tif 000009
【０２２８】
いずれのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスにおいてもＢ細胞分化に大きな欠陥は認められなかった。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスにおいて、ヒト重鎖遺伝子セグメントの導入はプロＢからプレＢへの移行に影響を及ぼすようには見えず、またヒトκ軽鎖遺伝子セグメントの導入はプレＢからＢへの移行に影響を及ぼさない。これは、ヒト可変領域およびマウス定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ）を保有する「逆キメラ」免疫グロブリン分子が、Ｂ細胞シグナル伝達および共受容体分子に関連して正常に機能して、マウス環境で適切なＢ細胞分化をもたらすことを実証している。対照的に、ランダムに組み込まれた免疫グロブリン導入遺伝子および不活性化された内因性重鎖またはκ軽鎖遺伝子座を含有するマウスでは、Ｂ細胞分化中の異なる集団間のバランスが様々な程度に摂動される（ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８））。
【０２２９】
実施例ＩＶ
ヒト化免疫グロブリンマウスにおける可変遺伝子レパートリー
【０２３０】
脾細胞およびハイブリドーマ細胞を含む複数の源からのヒト可変領域の逆転写酵素・ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスのヒト化抗体レパートリーにおけるヒト可変遺伝子セグメントの使用量を分析した。可変領域配列、遺伝子セグメント使用量、体細胞超変異、および再構成可変領域遺伝子セグメントの接合部多様性を決定した。
【０２３１】
簡単に言うと、ＴＲＩＺＯＬ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＱｉａｇｅｎ  ＲＮＥＡＳＹ（商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して１×１０７〜２×１０７脾細胞または約１０４〜１０５ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してマウス定常領域特異的プライマーでプライミングした。重鎖とκ軽鎖の両方についてのヒト可変領域の各ファミリーのためのプールされたリーダープライマーとペアで上述の３’定常特異的プライマーを個々に使用して、各試料からの２〜５μＬのＲＮＡを用いて反応を行った。試薬およびプライマーの容量、およびＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲ条件は、製造業者の指示に従って行った。プライマー配列は、複数の源の基づいた（Ｗａｎｇ，Ｘ．およびＳｔｏｌｌａｒ，Ｂ．Ｄ．（２０００）Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ＲＴ−ＰＣＲ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４４：２１７−２２５；Ｉｇ−ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔｓ、Ｎｏｖａｇｅｎ）。適宜、プールされたファミリー特異的フレームワークプライマーと第一の反応で使用したのと同じマウス３’免疫グロブリン定常特異的プライマーとを用いて第二のネステッドＰＣＲ反応を行った。各反応からのアリコート（５μＬ）をアガロース電気泳動によって分析し、ＭＯＮＴＡＧＥ（商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してアガロースから反応生成物を精製した。ＴＯＰＯ（商標）ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して精製生成物をクローニングし、エレクトロポレーションによりＤＨ１０β大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。各形質転換反応から個々のクローンを選択し、２ｍＬのＬＢブロス培養液（ＬＢ  ｂｒｏｔｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）中で抗生物質選択しながら一晩３７℃で成長させた。キットベースアプローチ（Ｑｉａｇｅｎ）により細菌培養物からプラスミドＤＮＡを精製した。
【０２３２】
免疫グロブリン可変遺伝子の使用量。
【０２３３】
ＡＢＩ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、重鎖クローンとκ軽鎖クローン両方のプラスミドＤＮＡをＴ７リバースプライマーまたはＭ１３リバースプライマーのいずれかで配列決定した。生配列データをＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）（ｖ４．５、Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ）にインポートした。各配列をコンティグに組み立て、ＩＭＧＴ  Ｖ−Ｑｕｅｓｔ（Ｂｒｏｃｈｅｔ，Ｘ．ら（２００８）ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ：ｔｈｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＩＧ  ａｎｄ  ＴＲ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  Ｖ−Ｊ  ａｎｄ  Ｖ−Ｄ−Ｊ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３６：Ｗ５０３−５０８）検索機能を用いてヒト免疫グロブリン配列にアラインして、ヒトＶＨ、ＤＨ、ＪＨおよびＶκ、Ｊκセグメント使用量を同定した。体細胞超変異および組換え接合部分析のために配列を生殖細胞系配列と比較した。
【０２３４】
ＲＡＧ相補性（Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら（１９９３）ＲＡＧ−２−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ：  ａｎ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：４５２８−４５３２）による最初の重鎖改変（３ｈＶＨ−ＣＲＥハイブリッド対立遺伝子、図２Ａの最下部）を含有するＥＳ細胞からマウスを産生させ、脾細胞ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。挿入されたヒト遺伝子セグメント内でのＶ（Ｄ）Ｊ組換えおよびその後のマウスＩｇＭ定常ドメインまたはＩｇＧ定常ドメインのいずれかへのスプライシングによって生ずることになる予測キメラ重鎖ｍＲＮＡに特異的なプライマーセット（上記）使用して、そのｃＤＮＡを増幅させた。これらのｃＤＮＡクローンに由来する配列（示さず）は、正しいＶ（Ｄ）Ｊ組換えがヒト可変遺伝子配列内で発生したこと、再構成されたヒトＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントがインフレームでマウス定常ドメインへと正しくスプライシングしたこと、およびクラススイッチ組換えが発生したことを実証した。後続のハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座のｍＲＮＡ産物のさらなる配列分析を行った。
【０２３５】
同様の実験で、免疫していない野生型およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスからのＢ細胞をフローサイトメトリーによりＢ２２０およびＩｇＭまたはＩｇＧの表面発現に基づいて分離した。Ｂ２２０＋ＩｇＭ＋または表面ＩｇＧ＋（ｓＩｇＧ＋）細胞をプールし、ＲＴ−ＰＣＲ増幅およびクローニング（上記）の後にＶＨおよびＶκ配列を得た。非免疫ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）１ヒト化マウス（表７）およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）３ヒト化マウス（表８）からの１セットのＲＴ−ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡにおける代表的な遺伝子使用量を記録した（＊不完全ＲＳＳ（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ＲＳＳ）；†欠けているか偽遺伝子）。
【０２３６】
【表７−１】
2020072695.tif 000010
【０２３７】
【表７−２】
2020072695.tif 000011
【０２３８】
【表８−１】
2020072695.tif 000012
【０２３９】
【表８−２】
2020072695.tif 000013
【０２４０】
表７および８に示したように、機能的ヒトＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントのほぼすべてが利用される。この実験のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスでは検出されなかったが記載した機能的可変遺伝子セグメントのうちの幾つかは、不完全組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を保有すると報告されており、それ故、発現することは期待されないことになる（Ｆｅｅｎｅｙ，Ａ．Ｊ．（２０００）Ｆａｃｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ２１：１９５−２０２）。ナイーブレパートリーと免疫レパートリーの両方から単離された、様々なＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスからの免疫グロブリン配列の幾つかの他のセットの分析は、これらの遺伝子セグメントの使用量を、より低い頻度においてではあるが示した（データを示さない）。集合体遺伝子使用量データは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスが含有するすべての機能的ヒトＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントが、様々なナイーブおよび免疫レパートリーにおいて観察されることを示した（データを示さない）。ヒトＶＨ７−８１遺伝子セグメントは、ヒト重鎖遺伝子座配列の分析で同定されている（Ｍａｔｓｕｄａ，Ｆ．ら（１９９８）Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｌｏｃｕｓ、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８８：２１５１−２１６２）が、全ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）３ヒト化マウスゲノムの再配列決定により確認したところ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスには存在しない。
【０２４１】
抗体の重および軽鎖の配列が、特に再構成可変ドメイン内の短鎖ポリペプチドセグメントにおいて、例外的な可変性を示すことは公知である。これらの領域は、超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）として公知であり、抗体分子の構造内に抗原の結合部位を作る。介在ポリペプチド配列は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。重鎖と軽鎖の両方に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）および４つのＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）がある。１つのＣＤＲ（ＣＤＲ３）は、このＣＤＲがＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントとＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの両方の組換えによって作られ、抗原と遭遇する前に相当量のレパートリー多様性を生じさせる点でユニークである。この接合は、エキソヌクレアーゼ活性によるヌクレオチド欠失と末端デオキシヌクレオチヂルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）による非テンプレートコード付加（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）の両方のため正確ではなく、それ故、組換え過程の結果として新規配列を可能とする。ＦＲは、全体としては可変領域の高い変異性のため実質的な体細胞変異を示すことができるが、しかし、可変性は、可変領域全域に均等に分布されない。ＣＤＲは、抗原結合を可能にする、抗体分子の表面に集中および局在する高可変領域である。接合部多様性を実証する、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスからの選択された抗体のＣＤＲ３接合部周囲の重鎖および軽鎖配列を、図７Ａおよび７Ｂにそれぞれ示す。
【０２４２】
図７Ａに示すように、非テンプレートコードヌクレオチド付加（Ｎ−付加）が、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスからの抗体におけるＶＨ−ＤＨ接合とＤＨ−ＪＨ接合の両方において認められ、これは、ヒトセグメントに関するＴｄＴの正しい機能を示している。ＶＨ、ＤＨおよびＪＨセグメントの、該セグメントの生殖細胞系カウンターパートと比較しての終点は、エンドヌクレアーゼ活性も発生したことを示している。重鎖遺伝子座とは異なり、ヒトκ軽鎖再構成は、ＶκおよびＪκセグメントの組換えによって形成されるＣＤＲ３でのＴｄＴ付加が殆どまたは全く示さない（図７Ｂ）。これは、プレＢ細胞からＢ細胞への移行のときの軽鎖再構成中にマウスにおけるＴｄＴ発現の欠如に起因すると予想される。再構成ヒトＶκ領域のＣＤＲ３で観察される多様性は、主として、組換え事象中にエキソヌクレアーゼ活性によって導入される。
【０２４３】
体細胞超変異。
【０２４４】
体細胞超変異と呼ばれるプロセスにより、胚中心反応中に再構成免疫グロブリン遺伝子の可変領域にさらなる多様性が加えられる。体細胞変異可変領域を発現するＢ細胞は、濾胞樹状細胞によって提示される抗原への接近について他のＢ細胞と競合する。抗原に対してより高い親和性を有するこれらのＢ細胞は、末梢へと出ていく前にさらに増殖し、クラススイッチされる。それ故、スイッチされたアイソタイプを発現するＢ細胞は、典型的に抗原に遭遇し、胚中心反応を経たものであり、ナイーブＢ細胞に比べて増加した変異数を有する。さらに、主としてナイーブｓＩｇＭ＋Ｂ細胞からの可変領域配列は、抗原選択を受けたｓＩｇＧ＋Ｂ細胞からの可変配列より相対的に少ない変異を有すると予想されよう。
【０２４５】
免疫していないＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスからのｓＩｇＭ＋もしくはｓＩｇＧ＋Ｂ細胞または免疫したマウスからのｓＩｇＧ＋Ｂ細胞からの、ランダムＶＨまたはＶκクローンからの配列を、その生殖細胞系可変遺伝子セグメントと比較し、生殖細胞系配列に対する変化に注釈を付けた。得られたヌクレオチド配列をコンピュータで翻訳し、アミノ酸変化をもたらす変異にも注釈を付けた。すべての可変領域からデータを照合し、所与の位置での変化率を算定した（図８）。
【０２４６】
図８に示すように、免疫していないＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスからのｓＩｇＧ＋Ｂ細胞に由来するヒト重鎖可変領域は、同じ脾細胞プールからのｓＩｇＭ＋Ｂ細胞に比べてより多くのヌクレオチドを示し、免疫したマウスに由来する重鎖可変領域は、さらに多くの変化を示す。変化の数は、フレームワーク領域に比べて相補性決定領域（ＣＤＲ）において増えており、これは抗原選択を示す。ヒト重鎖可変領域からの対応するアミノ酸配列も、ＩｇＭに比べてＩｇＧのほうが有意に多い変異の数、および免疫したＩｇＧほうがさらにいっそう多い数を示す。これらの変異もまた、フレームワーク配列と比較してＣＤＲ内においてのほうが頻度が高いようであり、これは、抗体がｉｎ  ｖｉｖｏで抗原選択されたことを示唆している。ヌクレオチド変異数とアミノ酸変異数の同様の増加が、免疫したマウスからのＩｇＧ＋Ｂ細胞に由来するＶκ配列に見出される。
【０２４７】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスにおいて観察された遺伝子使用量および体細胞超変異は、これらのマウスにおいて、存在する本質的にすべての遺伝子セグメントが、完全機能性逆キメラ抗体を形成するように再構成できることを実証している。さらに、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス由来抗体は、マウス免疫系内で、親和性選択および成熟に至るよう充分に関与して、その標的抗原を効果的に中和できる完全成熟ヒト抗体を作製する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、複数のクラスの抗原への頑強な免疫応答を開始することができ、その結果、高親和性でもあり治療使用に好適でもある広範なヒト抗体の利用がもたらされる（データを示さない）。
【０２４８】
実施例Ｖ
リンパ系構造および血清アイソタイプの分析
【０２４９】
Ｈ＆Ｅで染色した野生型またはＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスからの組織試料の脾臓、鼠蹊リンパ節、バイエル板および胸腺の全体構造を光学顕微鏡法によって調査した。野生型およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスから採集した血清中の免疫グロブリンアイソタイプのレベルを、ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）技術を用いて分析した。
【０２５０】
リンパ系器官構造。
【０２５１】
リンパ系組織の構造および機能は、造血細胞の正しい発生に一部依存する。Ｂ細胞発生または機能の欠陥は、リンパ系組織の構造の変化として示され得る。染色組織切片の分析により、野生型マウスとＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスの間に二次リンパ系器官の外観の有意差は特定されなかった（データを示さない）。
【０２５２】
血清免疫グロブリンレベル。
【０２５３】
各アイソタイプの発現レベルは、野生型マウスとＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスで類似している（図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃ）。これは、可変遺伝子セグメントのヒト化が、クラススイッチまたは免疫グロブリン発現および分泌に明白な有害作用を及ぼさず、したがって、これらの機能に必要なすべての内因性マウス配列を明白に維持することを実証している。
【０２５４】
実施例ＶＩ
ヒト化免疫グロブリンマウスにおける免疫および抗体産生
異なるバージョンのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスを抗原で免疫して、外来抗原攻撃に対する体液性応答を調査した。
【０２５５】
免疫およびハイブリドーマ開発。
【０２５６】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスおよび野生型マウスをタンパク質、ＤＮＡ、ＤＮＡとタンパク質の組み合わせ、または抗原を発現する細胞の形態の抗原で免疫することができる。典型的には、動物に３週間ごとに合計２から３回、追加免疫する。各抗原を追加免疫後、各動物から血清試料を採集し、血清力価決定により抗原特異的抗体応答について分析する。融合前に、必要に応じて５μｇのタンパク質またはＤＮＡの融合前最終追加免疫を、腹腔内注射および／または静脈内注射によってマウスに施した。脾細胞を回収し、電気融合チャンバ内で製造業者の提案プロトコル（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、メリーランド州グレンバーニー）に従ってＡｇ８．６５３骨髄腫細胞に融合させる。培養の１０日後、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を用いてハイブリドーマを抗原特異性についてスクリーニングする。あるいは、免疫したＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスから抗原特異的Ｂ細胞を直接単離し、本明細書に記載のものを含む標準的な技術を用いてスクリーニングして、対象となる抗原に特異的なヒト抗体を得る。
【０２５７】
血清力価決定。
【０２５８】
動物抗抗原血清応答をモニターするために、各追加免疫の約１０日後に血清試料を採集し、抗原特異的ＥＬＩＳＡを用いてその力価を決定する。簡単に言うと、Ｎｕｎｃ  ＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）９６ウエルプレートを２μｇ／ｍＬの抗原で一晩、４℃で被覆し、それをウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）でブロッキングする。３倍希釈系列の血清試料を１時間、室温でプレートに結合させる。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳでそのプレートを洗浄し、全ＩｇＧ力価についてはＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ウエストグローヴ）をまたはアイソタイプ特異的力価についてはビオチン標識アイソタイプ特異的ポリクローナル抗体もしくは軽鎖特異的ポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）をそれぞれ使用して結合ＩｇＧを検出する。ビオチン標識抗体については、プレート洗浄後、ＨＲＰ結合体化ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を添加する。ＢＤ  ＯＰＴＥＩＡ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）などの比色基質を使用してすべてのプレートを顕色させる。１Ｍリン酸で反応を停止させた後、４５０ｎｍでの光吸収を記録し、Ｇｒａｐｈ  ＰａｄからのＰＲＩＳＭ（商標）ソフトウェアを使用してデータを分析する。バックグラウンドシグナルの２倍のシグナルを得るために必要な希釈度を力価と定義する。
【０２５９】
１つの実験では、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスをヒトインターロイキン−６受容体（ｈＩＬ−６Ｒ）で免疫した。ｈＩＬ−６Ｒで免疫したＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）および野生型マウスについての血清力価の代表セットを図１０Ａおよび１０Ｂに示す。
【０２６０】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスおよび野生型マウスは、同様の力価範囲でＩＬ−６Ｒに対する強い応答を開始した（図１０Ａ）。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化コホートおよび野生型コホートからの数匹のマウスは、単回抗原追加免疫後に最大応答に達した。これらの結果は、この抗原に対する免疫応答強度および動態は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスおよび野生型マウスにおいて同様であったことを示す。これらの抗原特異的抗体応答をさらに分析して、血清中で見出される抗原特異的抗体の特定のアイソタイプを調査した。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化群と野生型群の両方が主としてＩｇＧ１応答を惹起した（図１０Ｂ）。これは、体液性応答中のクラススイッチが各タイプのマウスにおいて同様であることを示唆している。
【０２６１】
溶液中の抗原への抗体結合の親和性決定。
【０２６２】
抗原に対する抗体結合親和性を決定するために、ＥＬＩＳＡベースの溶液競合アッセイが典型的に設計される。
【０２６３】
簡単に言うと、順化培地中の抗体を、０から１０ｍｇ／ｍＬの範囲の抗原タンパク質の希釈系列とプレミックスする。次に、その抗体と抗原の混合物の溶液を２から４時間、室温で、結合平衡に達するまでインキュベートする。次に、その混合物中の遊離抗体の量を、定量的サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定する。ＰＢＳ溶液中の１μｇ／ｍＬの抗原タンパク質で一晩、４℃で９６ウェルＭＡＸＩＳＯＲＢ（商標）プレート（ＶＷＲ、ペンシルバニア州ウエストチェスター）を被覆し、その後、ＢＳＡでの非特異的ブロッキングを行う。次に、その抗体−抗原混合物溶液をこれらのプレートに移し、その後、１時間インキュベートする。次に、そのプレートを洗浄緩衝液で洗浄し、プレートに結合した抗体をＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体試薬（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ）で検出し、ＢＤ  ＯＰＴＥＩＡ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）などの比色基質を使用して顕色させた。１Ｍリン酸で反応を停止させた後、４５０ｎｍでの光吸収を記録し、Ｇｒａｐｈ  ＰａｄからのＰＲＩＳＭ（商標）ソフトウェアを使用してデータを分析する。溶液中の抗原の濃度に対するシグナルの依存度を４パラメータフィット分析で分析し、ＩＣ５０（溶液中に抗原が存在しない抗体試料からのシグナルの５０％低減を達成するために必要な抗原濃度）として報告する。
【０２６４】
１つの実験では、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスをｈＩＬ−６Ｒで免疫した（上記のとおり）。図１１Ａおよび１１Ｂは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスおよび野生型マウスからの抗ｈＩＬ６Ｒ抗体についての親和性測定値の代表セットを示すものである。
【０２６５】
免疫したマウスに３回目の抗原追加免疫を施した後、ＥＬＩＳＡにより血清力価を決定する。選択した野生型マウスコホートおよびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスコホートから脾細胞を単離し、Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成し、選択下で成長させた（上記のとおり）。産生された合計６７１の抗ＩＬ−６Ｒハイブリドーマのうち、２３６は、抗原特異的抗体を発現することが判明した。抗原陽性ウェルから回収した培地を使用して、溶液競合ＥＬＩＳＡを用いて抗原への結合の抗体親和性を決定した。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス由来の抗体は、溶液中の抗原への結合に関して広範な親和性を示す（図１１Ａ）。さらに、２３６の抗ＩＬ−６Ｒハイブリドーマのうちの４９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオアッセイにおいてＩＬ−６の受容体への結合を遮断することが判明した（データを示さない）。さらに、これらの４９の抗ＩＬ−６Ｒ遮断抗体は、野生型マウスの並行免疫に由来する遮断抗体のものと同様の範囲の高い溶液親和性を示した（図１１Ｂ）。
【０２６６】
実施例ＶＩＩ
マウスＡＤＡＭ６ターゲティングベクターの構築
ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術（上記）を用いて、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子のヒト化重鎖遺伝子座への挿入のためのターゲティングベクターを構築して、Ｄｒ．Ｆｒｅｄ  Ａｌｔ（Ｈａｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した細菌人工染色体（ＢＡＣ）９２９ｄ２４を改変した。マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子を含有するゲノム断片と、ヒト化重鎖遺伝子座のヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントとヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントの間にあるヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子（ｈＡＤＡＭ６Ψ）の標的欠失のためのハイグロマイシンカセットとを含有するように、９２９ｄ２４  ＢＡＣ  ＤＮＡを操作して作製した（図１２）。
【０２６７】
先ず、マウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子と約８００ｂｐの上流（５’）配列と約４８００ｂｐの下流（３’）配列とを含有するゲノム断片を９２９ｄ２４  ＢＡＣクローンからサブクローニングした。マウスＡＤＡＭ６ａ遺伝子と約３００ｂｐの上流（５’）配列と約３４００ｂｐの下流（３’）配列とを含有する第二のゲノム断片を、別途、９２９ｄ２４  ＢＡＣクローンからサブクローニングした。マウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子およびＡＤＡＭ６ａ遺伝子を含有する２つのゲノム断片を、Ｆｒｔ組換え部位が隣接するハイグロマイシンカセットにライゲートして、ターゲティングベクター（マウスＡＤＡＭ６ターゲティングベクター、図２０；配列番号３）を作製した。ヒト化重鎖遺伝子座へのライゲーションのためにマウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子に続いてそのターゲティングベクターの５’末端上およびマウスＡＤＡＭ６ａ遺伝子に続いてその３’末端上に異なる制限酵素認識部位を操作して作製した（図１２の下部）。
【０２６８】
マウス重鎖遺伝子座の、ヒト重鎖遺伝子座での置換を含有するＢＡＣクローンには、マウスＡＤＡＭ６ターゲティングベクターの後続のライゲーションのために、ヒト化遺伝子座のヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントとヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントの間にあるヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子を含む別の改変を施した（図１３）。
【０２６９】
簡単に言うと、ｌｏｘＰ組換え部位が隣接するネオマイシンカセットを、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントの３’（ｈＡＤＡＭ６Ψに対して５’）およびヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントの５’（ｈＡＤＡＭ６Ψに対して３’；図１３の中央参照）の位置に、ヒトゲノム配列を含有するホモロジーアームを含有するように、操作して作製した。このターゲティング構築物の挿入部位の場所は、ヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子の約１．３ｋｂ５’側かつ約３５０ｂｐ３’側であった。このターゲティング構築物にマウスＡＤＡＭ６ターゲティングベクターと同じ制限酵素認識部位も含めて、ヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子の欠失を含有する改変ＢＡＣクローンとマウスＡＤＡＭ６ターゲティングベクターの間での後続のＢＡＣライゲーションを可能にした。
【０２７０】
両方の構築物に由来するＢＡＣ  ＤＮＡの消化後、そのゲノム断片を互いにライゲートして、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂヌクレオチド配列を含む、異所に配置されたゲノム配列を含有するヒト化重鎖遺伝子座を含有する、操作して作製したＢＡＣクローンを構築した。ヒト化重鎖遺伝子座内のヒトＡＤＡＭ６遺伝子の欠失と、ＥＳ細胞へのマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列の挿入のための最終のターゲティング構築物は、５’から３’へ、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントの３’の約１３ｋｂのヒトゲノム配列を含有する５’ゲノム断片；マウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の下流の約８００ｂｐのマウスゲノム配列；マウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子；マウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の上流の約４８００ｂｐのゲノム配列；５’Ｆｒｔ部位；ハイグロマイシンカセット；３’Ｆｒｔ部位；マウスＡＤＡＭ６ａ遺伝子の下流の約３００ｂｐのマウスゲノム配列；マウスＡＤＡＭ６ａ遺伝子；マウスＡＤＡＭ６ａ遺伝子の上流の約３４００ｂｐのマウスゲノム配列；そしてヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントの５’の約３０ｋｂのヒトゲノム配列を含有する３’ゲノム断片を含有した（図１３の下部）。
【０２７１】
操作して作製したＢＡＣクローン（上記）を使用して、ヒト化重鎖遺伝子座を含有するマウスＥＳ細胞をエレクトロポレートして、ヒト化重鎖遺伝子座内にマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む、異所に配置されたマウスゲノム配列を含む改変ＥＳ細胞を作製した。ヒト化重鎖遺伝子座内に異所性マウスゲノム断片を含有する陽性ＥＳ細胞を、ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブを使用する定量的ＰＣＲアッセイ（Ｌｉｅ，Ｙ．Ｓ．およびＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９９８）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ５’ｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９（１）：４３−４８）によって同定した。ヒト化重鎖遺伝子座の改変部分の外側の上流および下流領域を、該改変領域内に配置したプライマーおよびプローブを使用してＰＣＲにより確認して、ヒト化重鎖遺伝子座内の異所性マウスゲノム配列の存在およびハイグロマイシンカセットの存在を確認した。上流挿入点にわたるヌクレオチド配列には、次のものが含まれ、これは、該挿入点の上流のヒト重鎖ゲノム配列と、該挿入点に存在するマウスゲノム配列に隣接して連結されている（下のカッコ内に入っている）Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ制限酵素認識部位とを示すものである：（ＣＣＡＧＣＴＴＣＡＴ  ＴＡＧＴＡＡＴＣＧＴ  ＴＣＡＴＣＴＧＴＧＧ  ＴＡＡＡＡＡＧＧＣＡ  ＧＧＡＴＴＴＧＡＡＧ  ＣＧＡＴＧＧＡＡＧＡ  ＴＧＧＧＡＧＴＡＣＧ  ＧＧＧＣＧＴＴＧＧＡ  ＡＧＡＣＡＡＡＧＴＧ  ＣＣＡＣＡＣＡＧＣＧ  ＣＡＧＣＣＴＴＣＧＴ  ＣＴＡＧＡＣＣＣＣＣ  ＧＧＧＣＴＡＡＣＴＡ  ＴＡＡＣＧＧＴＣＣＴ  ＡＡＧＧＴＡＧＣＧＡ  Ｇ）ＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧ  ＡＴＴＣＴＣＴＧＴＴ  ＣＡＧＴＧＣＡＣＴＣ  ＡＧＧＧＴＣＴＧＣＣ  ＴＣＣＡＣＧＡＧＡＡ  ＴＣＡＣＣＡＴＧＣＣ  ＣＴＴＴＣＴＣＡＡＧ  ＡＣＴＧＴＧＴＴＣＴ  ＧＴＧＣＡＧＴＧＣＣ  ＣＴＧＴＣＡＧＴＧＧ（配列番号４）。標的領域の３’端の下流挿入点にわたるヌクレオチド配列には、次のものが含まれ、これは、マウスゲノム配列と、該挿入点の下流のヒト重鎖ゲノム配列に隣接して連結されている（下のカッコ内に入っている）ＰＩ−Ｓｃｅ  Ｉ制限酵素認識部位とを示すものである：（ＡＧＧＧＧＴＣＧＡＧ  ＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴ  ＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡ  ＡＡＧＡＡＧＣＧＧＧ  ＣＡＴＣＴＧＣＴＧＡ  ＣＡＴＧＡＧＧＧＣＣ  ＧＡＡＧＴＣＡＧＧＣ  ＴＣＣＡＧＧＣＡＧＣ  ＧＧＧＡＧＣＴＣＣＡ  ＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣ  ＧＣＣＡＴＴＴＣＡＴ  ＴＡＣＣＴＣＴＴＴＣ  ＴＣＣＧＣＡＣＣＣＧ  ＡＣＡＴＡＧＡＴＡＡＡＧＣＴＴ）ＡＴＣＣＣＣＣＡＣＣ  ＡＡＧＣＡＡＡＴＣＣ  ＣＣＣＴＡＣＣＴＧＧ  ＧＧＣＣＧＡＧＣＴＴ  ＣＣＣＧＴＡＴＧＴＧ  ＧＧＡＡＡＡＴＧＡＡ  ＴＣＣＣＴＧＡＧＧＴ  ＣＧＡＴＴＧＣＴＧＣ  ＡＴＧＣＡＡＴＧＡＡ  ＡＴＴＣＡＡＣＴＡＧ（配列番号５）。
【０２７２】
上に記載した標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）マウスの工学的作製方法（例えば、米国特許第７，６５９８，４４２号、同第７，５７６，２５９号および同第７，２９４，７５４号参照）により８細胞期マウス胚に導入した。マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む異所性マウスゲノム配列を含有するヒト化重鎖遺伝子座を保有するマウスを、該ヒト化重鎖遺伝子座内のマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３）の改良法を用いる遺伝子型解析によって同定した。
【０２７３】
マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子を含有するヒト化重鎖遺伝子座を保有するマウスをＦＬＰｅデリーターマウス系統（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｃ．Ｉ．ら（２０００）Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｄｅｌｅｔｅｒ  ｍｉｃｅ  ｓｈｏｗ  ｔｈａｔ  ＦＬＰｅ  ｉｓ  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：１３９−１４０参照）と交配させて、例えばＥＳ細胞期でまたは胚で除去されないターゲティングベクターによって導入された一切のＦＲＴ化（ＦＲＴｅｄ）ハイグロマイシンカットを除去した。必要に応じて、ハイグロマイシンカセットをマウス内に保持した。
【０２７４】
子を遺伝子型解析し、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む異所性マウスゲノム断片を含有するヒト化重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性の子を、マウスＡＤＡＭ６遺伝子発現および妊性の特徴づけのために選択した。
【０２７５】
実施例ＶＩＩＩ
ＡＤＡＭ６レスキューマウスの特徴づけ
フローサイトメトリー。
【０２７６】
ヒト重およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性（Ｈ／κ）の２５週齢の３匹のマウスと、ヒト重鎖遺伝子座の両方の対立遺伝子内にマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重およびヒトκ軽鎖についてホモ接合性（Ｈ／κ−Ａ６）の１８〜２０週齢の３匹のマウスを、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でのＦＡＣｓによるリンパ球細胞集団の同定および分析のために屠殺した。リンパ球を特定の細胞系列についてゲートし、Ｂ細胞発生の様々な段階を経る発達について分析した。動物から採集した組織としては、血液、脾臓および骨髄が挙げられる。ＥＤＴＡが入っているＢＤマイクロテイナーチューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に血液を採集した。ウシ胎仔血清とピルビン酸ナトリウムとＨＥＰＥＳと２−メルカプトエタノールと非必須アミノ酸とゲンタマイシンとを補充した完全ＲＰＭＩ培地でフラッシュすることにより大腿骨から骨髄を採集した。血液、脾臓および骨髄調製物からの赤血球を塩化アンモニウム系溶解緩衝液（例えば、ＡＣＫ溶解緩衝液）で溶解し、その後、完全ＲＰＭＩ培地で洗浄した。
【０２７７】
細胞集団を染色するために、様々な組織源からの１×１０６細胞を氷上で１０分間、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（２．４Ｇ２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にインキュベートし、その後、下記の抗体カクテルの１つまたは組み合わせで３０分間、氷上で標識した。
【０２７８】
骨髄：抗マウスＦＩＴＣ−ＣＤ４３（１Ｂ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ−ｃｋｉｔ（２Ｂ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅＣｙ７−ＩｇＭ（ＩＩ／４１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−ＩｇＤ（１１−２６ｃ．２ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ７８０−Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ａ７００−ＣＤ１９（１Ｄ３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０２７９】
末梢血および脾臓：抗マウスＦＩＴＣ−κ（１８７．１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ−λ（ＲＭＬ−４２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅＣｙ７−ＩｇＭ（ＩＩ／４１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−ＩｇＤ（１１−２６ｃ．２ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ−ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１、ＢＤ）、Ａ７００−ＣＤ１９（１Ｄ３、ＢＤ）、ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ７８０−Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。標識された抗体と共にインキュベートした後、細胞を洗浄し２％ホルムアルデヒドで固定した。データ収集をＬＳＲＩＩフローサイトメーターで行い、ＦｌｏｗＪｏで分析した。代表Ｈ／κおよびＨ／κ−Ａ６マウスからの結果を図１４〜１８に示す。
【０２８０】
結果は、Ｈ／κ−Ａ６マウスのＢ細胞が、骨髄および末梢区画においてＨ／κマウスと同様の様式でＢ細胞発生段階を経て発達すること、それらが末梢に入ると正常な成熟パターンを示すことを実証している。Ｈ／κ−Ａ６マウスは、Ｈ／κマウスと比較して増大したＣＤ４３ｉｎｔＣＤ１９＋細胞集団を明示した（図１６Ｂ）。これにより、Ｈ／κ−Ａ６マウスにおける、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む異所性マウスゲノム断片を含有するヒト化重鎖遺伝子座からＩｇＭ発現の促進を示すことができる。末梢では、Ｈ／κ−Ａ６マウスのＢおよびＴ細胞集団は、正常であり、Ｈ／κマウスと同様であるようである。
【０２８１】
精巣の形態および精子の特徴づけ。
【０２８２】
ヒト化免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を有するマウスにおける不妊性が、精巣および／または精子産生の欠陥に起因するかどうかを決定するために、精巣の形態および精巣上体の精子含有量を調査した。
【０２８３】
簡単に言うと、１群につき５匹のマウスの２つの群（群１：ヒト重鎖およびκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性のマウス、ｍＡＤＡＭ６−／−；群２：ヒト重鎖可変遺伝子遺伝子座についてヘテロ接合性およびκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性のマウス、ｍＡＤＡＭ６＋／−）から精巣をインタクトな精巣上体と共に切開し、計量した。次に、その検体を固定し、パラフィンに包埋し、切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色剤で染色した。精巣切片（マウス１匹につき２つの精巣、合計２０）を形態の欠陥および精子産生の証拠について調査し、一方、精巣上体切片を精子の存在について調査した。
【０２８４】
この実験では、ｍＡＤＡＭ６−／−マウスとｍＡＤＡＭ６＋／−マウスとの間で精巣重量の差も形態の差も観察されなかった。すべての遺伝子型において、精巣および精巣上体の両方において、精子が観察された。これらの結果は、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の不在が、精巣形態の検出可能な変化をもたらさないこと、ならびにマウスにおいてこれら２つの遺伝子の存在下および不在下で精子が産生されることを確証する。したがって、雄ＡＤＡＭ６−／−マウスの妊性の欠陥が低い精子産生量に起因する可能性は低い。
【０２８５】
精子の運動能および移動。
【０２８６】
他のＡＤＡＭ遺伝子ファミリーメンバーが無いマウスは、精子の運動能または移動の欠陥に起因して不妊性である。精子の移動は、子宮から卵管に進む精子の能力と定義され、通常、マウスの受精に必要である。マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂの欠失がこのプロセスに影響を及ぼすかどうかを決定するために、ｍＡＤＡＭ６−／−マウスにおける精子の移動を評価した。精子の運動能もまた検査した。
【０２８７】
簡単に言うと、（１）ヒト重鎖可変遺伝子遺伝子座についてヘテロ接合性およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性のマウス（ＡＤＡＭ６＋／−）；（２）ヒト重鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性のマウス（ＡＤＡＭ６−／−）；（３）ヒト重鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性および野生型κ軽鎖についてホモ接合性のマウス（ＡＤＡＭ６−／−ｍκ）；および（４）野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＷＴ）の精巣から精子を得た。検査により精子数または総合的精子運動能に重大な異常は認められなかった。すべてのマウスについて、卵丘細胞分散（ｃｕｍｕｌｕｓ  ｄｉｓｐｅｒｓａｌ）が観察された。これは、各精子試料がｉｎ  ｖｉｔｒｏで卵丘細胞に侵入して透明帯を結合できることを示していた。これらの結果は、ＡＤＡＭ６−／−マウスが、卵丘に侵入して透明帯を結合し得る精子を有することを確証する。
【０２８８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマウス卵子の受精（ＩＶＦ）を、上記のマウスからの精子を使用して行った。ＩＶＦの翌日にＡＤＡＭ６−／−についてやや少ない数の卵割胚が存在し、卵子に結合した精子の低減数も観察された。これらの結果は、ＡＤＡＭ６−／−マウスからの精子が、卵子に曝露されると、卵丘に侵入して透明帯を結合し得ることを確証する。
【０２８９】
もう１つの実験では、子宮から卵管を通って移動するＡＤＡＭ６−／−マウスからの精子の能力を精子移動アッセイで決定した。
【０２９０】
簡単に言うと、５匹の過排卵雌マウスの第一の群を５匹のＡＤＡＭ６−／−雄とともに用意した。５匹の過排卵雌マウスの第二の群を５匹のＡＤＡＭ６＋／−雄とともに用意した。これらの交配ペアを交配について観察し、交配の５から６時間後、分析のためにすべての雌から子宮および付属の卵管を除去し、フラッシュした。フラッシュ溶液を卵子について点検して排卵を検証し、精子数を得た。精子移動を２つの異なる方法で評価した。第一に、両方の卵管を子宮から除去し、食塩水でフラッシュし、確認された一切の精子を計数した。卵子の存在も排卵の証拠として書き留めた。第二に、卵管を子宮に付属したまま残し、両方の組織を固定し、パラフィンに包埋し、切片にして染色した（上記のとおり）。切片を子宮内の精子の存在についても、両方の卵管における精子の存在についても調査した。
【０２９１】
５匹のＡＤＡＭ６−／−雄と交配させた雌については、卵管からのフラッシュ溶液中に精子が殆ど見つからなかった。５匹のＡＤＡＭ６＋／―雄と交配させた５匹の雌の卵管からのフラッシュ溶液は、５匹のＡＤＡＭ６−／−雄と交配させた５匹の雌の卵管からのフラッシュ溶液中に存在するものより約２５から３０倍多い精子レベル（平均、ｎ＝１０卵管）を示した。
【０２９２】
子宮および卵管の組織学的切片を調製した。その切片を子宮および卵管（ｃｏｌｌｉｃｕｌｕｓ  ｔｕｂａｒｉｕｓ）においての精子の存在について調査した。卵管および子宮の組織学的切片の検査により、ＡＤＡＭ６−／−マウスと交配させた雌マウスについては子宮では精子を認めるが卵管では認められないことが明らかにされた。さらに、ＡＤＡＭ６−／−マウスと交配させた雌からの切片により、精子が子宮卵管境界（ＵＴＪ）で認められないことが明らかになった。ＡＤＡＭ６＋／−マウスと交配させた雌からの切片では、ＵＴＪおよび卵管において精子が同定された。
【０２９３】
これらの結果は、ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子を欠いているマウスがｉｎ  ｖｉｖｏ移動欠陥を示す精子を作ることを確証する。すべての場合、精子が子宮内に観察された。これは、交配および精子放出は正常に行われたようであるが、精子数または組織学的観察のいずれかによって測定すると、交配後に卵管内で精子は殆どまたは全く観察されなかったことを示していた。これらの結果は、ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子を欠いているマウスが、子宮から卵管への移動不能を示す精子を産生することを確証する。精子が子宮卵管境界（ｕｔｅｒｉｎｅ−ｔｕｂｕｌｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を越えて、卵子が受精する卵管へと移動することができないため、この欠陥は不妊性をもたらすようである。纏めると、これらの結果のすべてが、マウスＡＤＡＭ６遺伝子は、正常移動能を有する精子を子宮から出て子宮卵管境界および卵管を通って移動するように方向づけ、そうして卵子に近づいて受精事象を実現するという仮説の支持に向けられる。ＡＤＡＭ６がこれを実現する機序は、前記ＡＤＡＭ６タンパク質の作用によって方向づけられる（ｄｉｒｅｃｔｌｙ）こともあり、または下に記載するような、精子細胞における他のタンパク質、例えば他のＡＤＡＭタンパク質、との協調発現により方向づけられることもある。
【０２９４】
ＡＤＡＭ遺伝子ファミリー発現。
【０２９５】
ＡＤＡＭタンパク質の複合体が、成熟中の精子の表面に複合体として存在することは公知である。他のＡＤＡＭ遺伝子ファミリーメンバーが無いマウスは、精子が成熟するにつれてこの複合体を喪失し、成熟精子において複数のＡＤＡＭタンパク質の低減を示す。ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の欠如が、他のＡＤＡＭタンパク質に対して同様に影響を及ぼすかどうかを決定するために、精巣（未熟精子）および精巣上体（成熟中の精子）からのタンパク質抽出物のウエスタンブロットを分析して、他のＡＤＡＭ遺伝子ファミリーメンバーの発現レベルを決定した。
【０２９６】
この実験では、４匹のＡＤＡＭ６−／−マウスおよび４匹のＡＤＡＭ６＋／−マウスからのタンパク質抽出物を分析した。その結果は、ＡＤＡＭ２およびＡＤＡＭ３の発現が影響を受けないことを精巣抽出物中で示した。しかし、ＡＤＡＭ２とＡＤＡＭ３の両方が、精巣上体抽出物中では劇的に低減していた。これは、ＡＤＡＭ６−／−マウスの精液中のＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂの不在が、精子が成熟するにつれて他のＡＤＡＭタンパク質（例えば、ＡＤＡＭ２およびＡＤＡＭ３）の発現およびおそらく機能に対して直接影響を及ぼし得ることを明示する。これは、ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂが、精子の表面にＡＤＡＭタンパク質複合体の部分として存在し、そのことが正しい精子移動にとって極めて重要であり得ることを示唆している。
【０２９７】
実施例ＩＸ
ＡＤＡＭ６レスキューマウスにおけるヒト重鎖可変遺伝子使用法
【０２９８】
ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブを使用する定量的ＰＣＲアッセイ（上記のとおり）によりマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子を欠いている（ｍＡＤＡＭ６−／−）か、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子をコードする異所性ゲノム断片を含有する（ＡＤＡＭ６＋／＋、実施例１を参照のこと）かのいずれかの、ヒト重およびκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性のマウスについて、選択ヒト重鎖可変遺伝子使用量を決定した。
【０２９９】
簡単に言うと、マウスＣＤ１９  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してｍＡＤＡＭ６−／−マウスおよびＡＤＡＭ６＋／＋マウスの脾臓からのＣＤ１９＋Ｂ細胞を精製し、ＲＮＥＡＳＹ（商標）Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを精製した。ＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅオンカラム処理剤（Ｑｉｇａｅｎ）を使用してゲノムＲＮＡを除去した。Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して約２００ｎｇのｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、その後、ＡＢＩ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＴＡＱＭＡＮ（商標）  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で増幅した。各遺伝子の相対発現をマウスκ定常（ｍＣκ）に正規化した。表９は、この実験に使用したセンス／アンチセンス／ＴＡＱＭＡＮ（商標）ＭＧＢプローブの組み合わせを示すものである。
【０３００】
【表９】
2020072695.tif 000014
【０３０１】
この実験では、分析した試料において４つすべてのヒトＶＨ遺伝子の発現が観察された。さらに、発現レベルは、ｍＡＤＡＭ６−／−マウスとＡＤＡＭ６＋／＋マウスの間で類似するものであった。これらの結果は、改変部位に対して遠位にあるヒトＶＨ遺伝子（ＶＨ３−２３およびＶＨ１−６９）および改変部位に対して近位にあるヒトＶＨ遺伝子（ＶＨ１−２およびＶＨ６−１）の両方ともすべてが、機能的に発現するヒト重鎖を形成するように組み換えることができた。これらの結果は、ヒト重鎖ゲノム配列に挿入されたマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む異所性ゲノム断片が、その遺伝子座内でのヒト重鎖遺伝子セグメントのＶ（Ｄ）Ｊ組換えに影響を及ぼさなかったこと、およびこれらのマウスが、通常の様式でヒト重鎖遺伝子セグメントを組換えて、機能的重鎖免疫グロブリンタンパク質を産生することができることを明示している。
【０３０２】
実施例Ｘ
選択されたヒト軽鎖可変領域と会合するヒト重鎖可変領域の同定
【０３０３】
単一の再構成されたヒト生殖系列軽鎖を抗原特異的ヒト抗体からのヒト重鎖と共発現させることができるか否かを判定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系を構築した。
【０３０４】
遺伝子改変マウスでヒト抗体を生成する方法は、公知である（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１を参照、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス）。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス技術は、マウスが抗原刺激に応じてヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を生成するように、内因性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に連結されたヒト重鎖および軽鎖可変領域を含むゲノムを有する遺伝子改変マウスの生成を含む。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスから生成される抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡは、完全にヒトである。最初に、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体が単離される。下記のように、抗体は、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付けされ、選択される。マウス定常領域は所望のヒト定常領域で置換され、非ＩｇＭアイソタイプ、例えば野生型または改変されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む完全にヒトの抗体が生成される。選択される定常領域は具体的な用途によって異なることができるが、高親和性抗原結合および標的特異性特性は可変領域に存在する。
【０３０５】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスを、血管形成を促進する増殖因子（抗原Ｃ）で免疫し、当技術分野で認められる標準技術を用いて抗原特異的ヒト抗体を単離し、Ｖ遺伝子の使用について配列決定をした。選択された抗体をヒト重鎖および軽鎖定常領域にクローニングし、６９個の重鎖を以下の３つのヒト軽鎖の１つとの対合のために選択した：（１）ヒトκ定常領域に連結された関連κ軽鎖、（２）ヒトκ定常領域に連結された再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５、または（３）ヒトκ定常領域に連結された再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１。重鎖および軽鎖の各対を、標準技術を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞に共トランスフェクトした。上清中の抗体の存在は、ＥＬＩＳＡアッセイで抗ヒトＩｇＧによって検出された。各重鎖／軽鎖対について抗体力価（ｎｇ／ｍｌ）を決定し、様々な再構成された生殖系列軽鎖による力価を、親の抗体分子（すなわち、関連軽鎖と対になった重鎖）で得られた力価と比較し、天然の力価の百分率を計算した（表１０）。ＶＨ：重鎖可変遺伝子。ＮＤ：現在の実験条件下で発現は検出されない。
【０３０６】
【表１０−１】
2020072695.tif 000015
【０３０７】
【表１０−２】
2020072695.tif 000016
【０３０８】
類似した実験では、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスをいくつかの異なる抗原で免疫し、抗原特異的ヒト抗体の選択された重鎖を、様々な再構成されたヒト生殖系列軽鎖と対合するそれらの能力について試験した（前記の通り）。この実験で用いた抗原には、コレステロールホメオスタシスに関与する酵素（抗原Ａ）、グルコースホメオスタシスの調節に関与する血清ホルモン（抗原Ｂ）、血管形成を促進する増殖因子（抗原Ｃ）および細胞表面レセプター（抗原Ｄ）が含まれた。抗原特異的抗体は各免疫群のマウスから単離され、重鎖および軽鎖可変領域がクローニングされ、配列決定された。重鎖および軽鎖の配列から、Ｖ遺伝子の使用が決定され、選択された重鎖はそれらの関連軽鎖または再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域と対にさせられた。各重鎖／軽鎖対を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に共トランスフェクトし、上清中の抗体の存在はＥＬＩＳＡアッセイで抗ヒトＩｇＧによって検出した。各重鎖／軽鎖対について抗体力価（μｇ／ｍｌ）を決定し、様々な再構成されたヒト生殖系列軽鎖による力価を、親の抗体分子（すなわち、関連軽鎖と対になった重鎖）で得られた力価と比較し、天然の力価の百分率を計算した（表１１）。ＶＨ：重鎖可変遺伝子。Ｖκ：κ軽鎖可変遺伝子。ＮＤ：現在の実験条件下で発現は検出されない。
【０３０９】
【表１１−１】
2020072695.tif 000017
【０３１０】
【表１１−２】
2020072695.tif 000018
【０３１１】
これらの実験から得られた結果は、様々な遺伝子ファミリーからの体細胞変異高親和性重鎖は、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１領域と対合することができ、細胞から正常な抗体分子として分泌させることができることを示す。表１０に示すように、親の抗体の関連軽鎖と比較して、抗体力価は、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖と対にした場合、約６１％（６９中４２個）の重鎖で増加し、再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖と対にした場合、約２９％（６９中２０個）の重鎖で増加した。重鎖の約２０％（６９中１４個）について、親の抗体の関連軽鎖と比較して、再構成されたヒト生殖系列軽鎖の両方が発現の増加を付与した。表１１に示すように、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域は、親の抗体の関連軽鎖と比較して、様々な異なるクラスの抗原に特異的ないくつかの重鎖の発現の増加を付与した。親の抗体の関連軽鎖と比較して、重鎖の約３５％（１５／４３）で抗体力価は２倍を超えて増加した。２つの重鎖（３１５および３１６）では、増加は親の抗体と比較して１０倍を超えていた。親の抗体の関連軽鎖と比較して発現の増加を示した全ての重鎖の中で、ファミリー３（ＶＨ３）の重鎖は、他の重鎖可変領域遺伝子ファミリーと比較してより多く提示されている。これは、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖と対合するヒトＶＨ３重鎖の好ましい関係を示す。
【０３１２】
実施例ＸＩ
再構成されたヒト生殖系列軽鎖遺伝子座の生成
【０３１３】
マウスゲノム細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローン３０２ｇ１２および２５４ｍ０４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を改変するために、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３年）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照）を用いて、様々な再構成されたヒト生殖系列軽鎖ターゲッティングベクターが作製された。これらの２つのＢＡＣクローンを用いて、ゲノム構築物を単一の再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域を含むように操作し、内因性κ可変および連結遺伝子セグメントを欠失させるために事前に改変しておいた内因性κ軽鎖遺伝子座に挿入した。
【０３１４】
再構成されたヒト生殖系列軽鎖ターゲッティングベクターの構築
【０３１５】
当技術分野で認められる標準の分子生物学技術を用いて、３つの異なる再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域を作製した。これらの３つの領域を構築するために用いたヒト可変遺伝子セグメントには、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列、再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列および再構成されたヒトＶｐｒｅＢＪｌ５配列が含まれた。
【０３１６】
マウスＶκ３−７遺伝子のエクソン１（リーダーペプチドをコードする）およびイントロン１を含むＤＮＡセグメントを、新規ＤＮＡ合成（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって作製した。天然に存在するＢｌｐＩ制限酵素部位までの５’非翻訳領域の一部が含まれた。ヒトＶκ１−３９およびＶκ３−２０遺伝子のエクソンを、ヒトゲノムＢＡＣライブラリーからＰＣＲ増幅した。フォワードプライマーは、マウスＶκ３−７遺伝子のイントロン１のスプライス受容部位を含む５’伸長部を有した。ヒトＶκ１−３９配列のＰＣＲのために用いられたリバースプライマーは、ヒトＪκ５をコードする伸長部を含んでいたが、ヒトＶκ３−２０配列のＰＣＲのために用いられたリバースプライマーはヒトＪκ１をコードする伸長部を含んでいた。ヒトＶｐｒｅＢＪλ５配列は、新規ＤＮＡ合成（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって作製した。スプライスドナー部位を含むヒトＪκ−Ｃκイントロンの一部を、プラスミドｐＢＳ−２９６−ＨＡ１８−ＰＩＳｃｅＩからＰＣＲ増幅した。フォワードＰＣＲプライマーは、ヒトＪκ５、Ｊκ１またはＪλ５配列のいずれかの一部をコードする伸長部を含んでいた。リバースプライマーは、イントロンにおいて事前に操作されたＰＩ−ＳｃｅＩ部位を含んでいた。
【０３１７】
マウスＶκ３−７エクソン１／イントロン１、ヒト可変軽鎖エクソンおよびヒトＪκ−Ｃκイントロン断片を重複伸長ＰＣＲによって一つにまとめ（ｓｅｗ）、ＢｌｐＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩで消化し、ヒトＶκ３−１５可変遺伝子セグメントからのプロモーターを含むプラスミドｐＢＳ−２９６−ＨＡ１８−ＰＩＳｃｅＩにライゲーションした。プラスミドｐＢＳ−２９６−ＨＡ１８−ＰＩＳｃｅＩ内のｌｏｘｅｄハイグロマイシンカセットを、ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩ部位が隣接するＦＲＴｅｄハイグロマイシンカセットで置換した。このプラスミドのＮｏｔＩ／ＰＩ−ＳｃｅＩ断片を、マウスＪκ−Ｃκイントロンの一部、マウスＣκエクソン、およびマウスＥＳ細胞での相同組み換えのために３’相同性アームを提供したマウスκ遺伝子座の下流のゲノム配列の約７５ｋｂを含んでいた改変マウスＢＡＣ  ２５４ｍ０４にライゲーションした。次にこのＢＡＣのＮｏｔＩ／ＡｓｃＩ断片を、ＦＲＴｅｄネオマイシンカセットおよびマウスＥＳ細胞での相同組み換えのための内因性κ遺伝子座の上流のゲノム配列の約２３ｋｂを含んでいた改変マウスＢＡＣ  ３０２ｇ１２にライゲーションした。
【０３１８】
再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１ー３９Ｊκ５ターゲッティングベクター（図１９）
【０３１９】
ターゲッティングベクターへのクローニングのために、操作軽鎖挿入物の５’末端および３’末端に制限酵素部位を導入した：５’末端にＡｓｃＩ部位、３’末端にＰＩ−ＳｃｅＩ部位。５’ＡｓｃＩ部位および３’ＰＩ−ＳｃｅＩ部位の中で、５’から３’までのターゲッティング構築物は、マウスＢＡＣクローン３０２ｇ１２から得られた内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の５’側配列を含む５’相同性アーム、ＦＲＴｅｄネオマイシン耐性遺伝子、ヒトＶκ３−１５プロモーターを含むゲノム配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのリーダー配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのイントロン配列、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域のオープンリーディングフレーム、ヒトＪκ−Ｃκイントロンの一部を含むゲノム配列、ならびにマウスＢＡＣクローン２５４ｍ０４から得られた内因性マウスＪκ５遺伝子セグメントの３’側配列を含む３’相同性アームを含んでいた（図１９、中央）。内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の上流および最も３’側のＪκ遺伝子セグメントの下流（例えば、内因性３’エンハンサー）の遺伝子および／または配列は、ターゲッティング構築物によって改変されていなかった（図１９を参照）。操作されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子座の配列を、配列番号５９に示す。
【０３２０】
再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域中の配列に位置するプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＢＡＣ  ＤＮＡへの再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域のターゲッティング挿入を確認した。簡潔には、マウスＶκ３−７リーダー配列の３’側イントロン配列は、プライマーＵＬＣ−ｍ１Ｆ（ＡＧＧＴＧＡＧＧＧＴ  ＡＣＡＧＡＴＡＡＧＴ  ＧＴＴＡＴＧＡＧ；配列番号６０）およびＵＬＣ−ｍ１Ｒ（ＴＧＡＣＡＡＡＴＧＣ  ＣＣＴＡＡＴＴＡＴＡ  ＧＴＧＡＴＣＡ；配列番号６１）で確認した。再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域のオープンリーディングフレームは、プライマー１６３３−ｈ２Ｆ（ＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡ  ＧＡＧＣＡＴＴＡＧＣ  Ａ；配列番号６２）および１６３３−ｈ２Ｒ（ＴＧＣＡＡＡＣＴＧＧ  ＡＴＧＣＡＧＣＡＴＡ  Ｇ；配列番号６３）で確認した。ネオマイシンカセットは、プライマーｎｅｏＦ（ＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧ  ＣＴＡＴＴＣＧＧＣ；配列番号６４）およびｎｅｏＲ（ＧＡＡＣＡＣＧＧＣＧ  ＧＣＡＴＣＡＧ；配列番号６５）で確認した。再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域を発現するキメラマウスを生成するための改変ＥＳ細胞を形成するために、マウスＥＳ細胞をエレクトロポレーションするために、次にターゲッティングＢＡＣ  ＤＮＡを用いた。
【０３２１】
内因性遺伝子座に挿入された操作されたＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域に特異的なプローブを用いるＴＡＱＭＡＮＴＭスクリーニングおよび核型分析によって、陽性のＥＳ細胞クローンを確認した。簡潔には、ネオマイシンマーカー遺伝子の中で結合するプローブｎｅｏＰ（ＴＧＧＧＣＡＣＡＡＣ  ＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧ  ＣＴＧ；配列番号６６）、マウスＶκ３−７リーダー配列の３’側のイントロン配列中で結合するプローブＵＬＣ−ｍ１Ｐ（ＣＣＡＴＴＡＴＧＡＴ  ＧＣＴＣＣＡＴＧＣＣ  ＴＣＴＣＴＧＴＴＣ；配列番号６７）、および再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５オープンリーディングフレーム中で結合するプローブ１６３３ｈ２Ｐ（ＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡ  ＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡ  ＧＣＣＣＣＴ；配列番号６８）。生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域を発現する同腹仔を生ませるために、雌性マウスに移植するために、次に陽性のＥＳ細胞クローンを用いた。
【０３２２】
あるいは、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域を有するＥＳ細胞は、ターゲッティング構築物によって導入されたＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、ＦＬＰを発現する構築物でトランスフェクトされる。任意選択で、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウスを繁殖させることによって除去される（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）。任意選択で、ネオマイシンカセットは、マウスで保持される。
【０３２３】
再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１ターゲッティングベクター（図２０）
【０３２４】
同じように、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１領域を発現する操作軽鎖遺伝子座を、５’から３’にかけて、マウスＢＡＣクローン３０２ｇ１２から得られた内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の５’側配列を含む５’相同性アーム、ＦＲＴｅｄネオマイシン耐性遺伝子、ヒトＶκ３−１５プロモーターを含むゲノム配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのリーダー配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのイントロン配列、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１領域のオープンリーディングフレーム、ヒトＪκ−Ｃκイントロンの一部を含むゲノム配列、ならびにマウスＢＡＣクローン２５４ｍ０４から得られた内因性マウスＪκ５遺伝子セグメントの３’側配列を含む３’相同性アームを含むターゲッティング構築物を用いて作製した（図２０、中央）。操作されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子座の配列を、配列番号６９に示す。
【０３２５】
再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域中の配列に位置するプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＢＡＣ  ＤＮＡへの再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１領域のターゲッティング挿入を確認した。簡潔には、マウスＶκ３−７リーダー配列の３’側イントロン配列は、プライマーＵＬＣ−ｍ１Ｆ（配列番号６０）およびＵＬＣ−ｍ１Ｒ（配列番号６１）で確認した。再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１領域のオープンリーディングフレームは、プライマー１６３５−ｈ２Ｆ（ＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣ  ＣＴＧＴＣＴＴＴＧ；配列番号７０）および１６３５−ｈ２Ｒ（ＡＡＧＴＡＧＣＴＧＣ  ＴＧＣＴＡＡＣＡＣＴ  ＣＴＧＡＣＴ；配列番号７１）で確認した。ネオマイシンカセットは、プライマーｎｅｏＦ（配列番号６４）およびｎｅｏＲ（配列番号６５）で確認した。再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖を発現するキメラマウスを生成するための改変ＥＳ細胞を形成するために、マウスＥＳ細胞をエレクトロポレーションするために、次にターゲッティングＢＡＣ  ＤＮＡを用いた。
【０３２６】
内因性κ軽鎖遺伝子座に挿入された操作されたＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域に特異的なプローブを用いるＴａｑｍａｎＴＭスクリーニングおよび核型分析によって、陽性のＥＳ細胞クローンを確認した。簡潔には、ネオマイシンマーカー遺伝子の中で結合するプローブｎｅｏＰ（配列番号６６）、マウスＶκ３−７リーダー配列の中で結合するプローブＵＬＣ−ｍ１Ｐ（配列番号６７）、およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１オープンリーディングフレーム中で結合するプローブ１６３５ｈ２Ｐ（ＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣ  ＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣ  ＡＧＧＧ；配列番号７２）。雌性マウスに移植するために、陽性のＥＳ細胞クローンを次に用いた。ヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域を発現する同腹仔。
【０３２７】
あるいは、ヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域を有するＥＳ細胞は、ターゲッティング構築物によって導入されたＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、ＦＬＰを発現する構築物でトランスフェクトされてもよい。任意選択で、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウスを繁殖させることによって除去されてもよい（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）。任意選択で、ネオマイシンカセットは、マウスで保持される。
【０３２８】
再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪｌ５ターゲッティングベクター（図２１）
【０３２９】
同じようにして、再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪｌ５領域を発現する操作軽鎖遺伝子座を、５’から３’にかけて、マウスＢＡＣクローン３０２ｇ１２から得られた内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の５’側配列を含む５’相同性アーム、ＦＲＴｅｄネオマイシン耐性遺伝子、ヒトＶκ３−１５プロモーターを含むゲノム配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのリーダー配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのイントロン配列、再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５領域のオープンリーディングフレーム、ヒトＪκ−Ｃκイントロンの一部を含むゲノム配列、ならびにマウスＢＡＣクローン２５４ｍ０４から得られた内因性マウスＪκ５遺伝子セグメントの３’側配列を含む３’相同性アームを含むターゲッティング構築物を用いて作製した（図２１、中央）。操作されたヒトＶｐｒｅＢＪｌ５遺伝子座の配列を、配列番号７３に示す。
【０３３０】
再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５領域軽鎖領域中の配列に位置するプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＢＡＣ  ＤＮＡへの再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５領域のターゲッティング挿入を確認した。簡潔には、マウスＶκ３−７リーダー配列の３’側イントロン配列は、プライマーＵＬＣ−ｍ１Ｆ（配列番号６０）およびＵＬＣ−ｍ１Ｒ（配列番号６１）で確認した。再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５領域のオープンリーディングフレームは、プライマー１６１６−ｈ１Ｆ（ＴＧＴＣＣＴＣＧＧＣ  ＣＣＴＴＧＧＡ；配列番号７４）および１６１６−ｈ１Ｒ（ＣＣＧＡＴＧＴＣＡＴ  ＧＧＴＣＧＴＴＣＣＴ；配列番号７５）で確認した。ネオマイシンカセットは、プライマーｎｅｏＦ（配列番号６４）およびｎｅｏＲ（配列番号６５）で確認した。再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５軽鎖を発現するキメラマウスを生成するための改変ＥＳ細胞を形成するために、マウスＥＳ細胞をエレクトロポレーションするために、次にターゲッティングＢＡＣ  ＤＮＡを用いた。
【０３３１】
内因性κ軽鎖遺伝子座に挿入された操作されたＶｐｒｅＢＪλ５軽鎖領域に特異的なプローブを用いるＴＡＱＭＡＮＴＭスクリーニングおよび核型分析によって、陽性のＥＳ細胞クローンを確認する。簡潔には、ネオマイシンマーカー遺伝子の中で結合するプローブｎｅｏＰ（配列番号６６）、マウスＩｇＶκ３−７リーダー配列の中で結合するプローブＵＬＣ−ｍ１Ｐ（配列番号６７）、およびヒトＶｐｒｅＢＪλ５オープンリーディングフレーム中で結合するプローブ１６１６ｈ１Ｐ（ＡＣＡＡＴＣＣＧＣＣ  ＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣ  ＣＣＴ；配列番号７６）。生殖系列軽鎖領域を発現する同腹仔を生ませるために、雌性マウスに移植するために、次に陽性のＥＳ細胞クローンを用いる。
【０３３２】
あるいは、再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪｌ５軽鎖領域を有するＥＳ細胞は、ターゲッティング構築物によって導入されたＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、ＦＬＰを発現する構築物でトランスフェクトされる。任意選択で、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウスを繁殖させることによって除去される（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）。任意選択で、ネオマイシンカセットは、マウスで保持される。
【０３３３】
実施例ＸＩＩ
単一の再構成されたヒト軽鎖を発現するマウスの生成
【０３３４】
上記のターゲッティングＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞期マウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７年）Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照）。特有な再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記）の改変型を用いる遺伝子タイピングによって、操作されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域、Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域またはＶｐｒｅＢＪλ５軽鎖領域を独立して有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を同定する。
【０３３５】
再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域の発現を特徴付けするために、仔を遺伝子タイピングし、特有な再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域についてヘテロ接合またはホモ接合である仔を選択する。
【０３３６】
フローサイトメトリー。
【０３３７】
共通軽鎖マウスの正常抗体レパートリーでの再構成されたヒト軽鎖領域の発現は、共通軽鎖マウスの脾細胞および末梢血での免疫グロブリンκおよびλの発現の分析によって検証した。野生型（ｎ＝５）、Ｖκ１−３９Ｊκ５共通軽鎖ヘテロ接合体（ｎ＝３）、Ｖκ１−３９Ｊκ５共通軽鎖ホモ接合体（ｎ＝３）、Ｖκ３−２０Ｊκ１共通軽鎖ヘテロ接合体（ｎ＝２）、およびＶκ３−２０Ｊκ１共通軽鎖ホモ接合体（ｎ＝２）マウスの収集された脾臓および末梢血からの細胞懸濁液を標準の方法によって作製し、蛍光標識抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を用いてＣＤ１９＋、Ｉｇｌ＋およびＩｇκ＋で染色した。
【０３３８】
簡潔には、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン２．４Ｇ２、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）と共に１×１０６個の細胞を氷上で１０分間インキュベートし、続いて氷上で３０分間に以下の抗体カクテルで標識した：ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＣＤ１９（クローン１Ｄ３、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲート抗マウスＣＤ３（クローン１７Ａ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇκ（クローン１８７．１、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、ＰＥコンジュゲート抗マウスＩｇλ（クローンＲＭＬ−４２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。染色の後、細胞を洗浄し、２％ホルムアルデヒドで固定した。ＬＳＲＩＩフローサイトメーターでデータ取得を実施し、ＦｌｏｗＪｏＴＭで分析した。ゲーティング：総Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ３−）、Ｉｇκ＋Ｂ細胞（Ｉｇκ＋Ｉｇｌ−ＣＤ１９＋ＣＤ３−）、Ｉｇｌ＋Ｂ細胞（Ｉｇκ−Ｉｇｌ＋ＣＤ１９＋ＣＤ３−）。血液および脾細胞試料から集めたデータは、類似した結果を示した。表１２は、Ｉｇｌ＋、Ｉｇκ＋またはＩｇｌ＋Ｉｇκ＋である各群からの１匹の代表的なマウスの末梢血からの陽性ＣＤ１９＋Ｂ細胞百分率を示す。野生型（ＷＴ）、およびＶκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１共通軽鎖についてホモ接合のマウスからの末梢血中のＣＤ１９＋Ｂ細胞の百分率は、図２２に示す。
【０３３９】
【表１２】
2020072695.tif 000019
【０３４０】
共通軽鎖発現。
【０３４１】
定量的ＰＣＲアッセイ（例えばＴＡＱＭＡＮＴＭ）を用いて、ヘテロ接合およびホモ接合のマウスで、各共通軽鎖（Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１）の発現を分析した。
【０３４２】
簡潔には、製造業者の仕様に従ってマウスＣＤ１９ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、野生型、対応するヒト重鎖およびκ軽鎖可変領域遺伝子座によるマウス重鎖およびκ軽鎖可変領域遺伝子座の置換についてホモ接合のマウス（Ｈκ）、ならびに各再構成されたヒト軽鎖領域についてホモ接合およびヘテロ接合のマウス（Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１）の脾臓からＣＤ１９＋Ｂ細胞を精製した。製造業者の仕様に従ってＲＮｅａｓｙＴＭ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＣＤ１９＋Ｂ細胞から全ＲＮＡを精製し、ＲＮアーゼを含まないＤＮａｓｅオンカラム処理（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＲＮＡを除去した。Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２００ｎｇのｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡにし、生じたｃＤＮＡをＴａｑｍａｎＴＭ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で増幅した。（１）両共通軽鎖についてのＶκ−Ｊκ接合部、（２）Ｖκ遺伝子単独（すなわちＶκ１−３９およびＶκ３−２０）、および（３）マウスＣκ領域にわたるプライマーおよびＴａｑｍａｎＴＭ  ＭＧＢプローブを用いるＡＢＩ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、全ての反応を実施した。表１３は、このアッセイのために使用されたプライマーおよびプローブの配列を示す。相対的発現は、マウスＣκ領域の発現に対して標準化した。結果を、図２３Ａ、２３Ｂおよび２３Ｃに示す。
【０３４３】
【表１３】
2020072695.tif 000020
【０３４４】
抗原特異的共通軽鎖抗体。
【０３４５】
内因性マウスκ軽鎖遺伝子座にＶκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１共通軽鎖のいずれかを有する共通軽鎖マウスをβガラクトシダーゼで免疫して、抗体力価を測定した。
【０３４６】
簡潔には、製造業者の指示に従って、βガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）をＴＩＴＥＲＭＡＸＴＭアジュバント（Ｓｉｇｍａ）中で乳化した。野生型（ｎ＝７）、Ｖκ１−３９Ｊκ５共通軽鎖ホモ接合体（ｎ＝２）およびＶκ３−２０Ｊκ１共通軽鎖ホモ接合体（ｎ＝５）を、１００μｇのβガラクトシダーゼ／ＴＩＴＥＲＭＡＸＴＭによる皮下注射で免疫した。５０μｇのβガラクトシダーゼ／ＴＩＴＥＲＭＡＸＴＭによる３週間隔で２回の皮下注射によってマウスを追加免疫した。第２の追加免疫の後、製造業者の指示に従って後眼窩放血を用いて麻酔下マウスから血清分離管（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に血液を収集した。抗βガラクトシダーゼのＩｇＭ抗体またはＩｇＧ抗体を測定するために、４℃で一晩、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を１μｇ／ｍＬのβガラクトシダーゼでコーティングした。過剰な抗原を洗い流した後に、室温で１時間、１％ＢＳＡを有するＰＢＳでブロックした。血清の系列希釈物をプレートに加え、室温で１時間インキュベートしてから洗浄した。次に、室温で１時間、プレートをＨＲＰコンジュゲート抗ＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）または抗ＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と一緒にインキュベートした。さらなる洗浄の後、プレートをＴＭＢ基質（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で発色させた。反応を１Ｎ硫酸で停止させ、Ｖｉｃｔｏｒ  Ｘ５プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてＯＤ４５０を読み取った。ＧＲＡＰＨＰＡＤＴＭ  Ｐｒｉｓｍでデータを分析し、バックグラウンドより２倍高い血清の希釈としてシグナルを計算した。結果を図２４Ａおよび２４Ｂに示す。
【０３４７】
この実施例に示すように、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１共通軽鎖マウスの脾臓および末梢の両方のコンパートメントでのκ／λ  Ｂ細胞の比は、野生型に近いパターンを示した（表１２および図２２）。しかし、ＶｐｒｅＢＪλ５共通軽鎖マウスはより少ない末梢Ｂ細胞を示した（その約１〜２％が操作されたヒト軽鎖領域を発現する（データは示さず））。内因性κ軽鎖遺伝子座からのＶκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１の再構成されたヒト軽鎖領域の発現レベルは、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントによるマウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの完全な置換を有する内因性κ軽鎖遺伝子座と比較して上昇した（図２３Ａ、２３Ｂおよび２３Ｃ）。ＶｐｒｅＢＪλ５の再構成されたヒト軽鎖領域の発現レベルは、ヘテロ接合マウスおよびホモ接合マウスの両方で内因性κ軽鎖遺伝子座からの類似した高い発現を示した（データは示さず）。このことは、マウスのλ、κまたは両方の内因性軽鎖遺伝子座との直接的競合で、単一の再構成されたヒトＶＬ／ＪＬ配列が、内因性κ軽鎖遺伝子座から野生型に勝るレベルの発現を生じさせ、正常な脾臓および血液のＢ細胞頻度をもたらすことができることを示す。さらに、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列のいずれかを有する操作されたκ軽鎖遺伝子座の存在は、マウスによってよく許容された。そしてこれは、免疫応答の体液性構成要素の軽鎖レパートリーのかなりの部分を占めることによって、野生型のように機能するようである（図２４Ａおよび２４Ｂ）。
【０３４８】
実施例ＸＩＩＩ
単一の再構成されたヒト生殖系列軽鎖を発現するマウスの繁殖
【０３４９】
この実施例は、複数の遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を有する複数の遺伝子改変マウス系統を作製するために、本明細書に記載される共通軽鎖マウスのいずれか１つと繁殖させることができる他のいくつかの遺伝子改変マウス系統を記載する。
【０３５０】
内因性Ｉｇλノックアウト（ＫＯ）。
【０３５１】
操作された軽鎖遺伝子座の使用を最適化するために、再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域の１つを有するマウスを、内因性λ軽鎖遺伝子座に欠失を含む別のマウスと繁殖させる。この様式において、得られる子孫は、それらの唯一の軽鎖として、実施例１１に記載される再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域を発現する。繁殖は、当技術分野で認められる標準技術によって、あるいは商業的な繁殖家（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって実施される。操作された軽鎖遺伝子座、および内因性λ軽鎖遺伝子座の欠失を有するマウス系統は、特有な軽鎖領域の存在および内因性マウスλ軽鎖の非存在についてスクリーニングされる。
【０３５２】
ヒト化内因性重鎖遺伝子座。
【０３５３】
操作されたヒト生殖系列軽鎖遺伝子座を有するマウスは、ヒト重鎖可変遺伝子の遺伝子座による内因性マウス重鎖可変遺伝子の遺伝子座の置換を含むマウスと繁殖させられる（ＵＳ６，５９６，５４１を参照；ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、マウスが抗原刺激に応じてヒト重鎖可変領域およびマウス重鎖定常領域を含む抗体を生成するように、内因性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に連結されたヒト重鎖可変領域を含むゲノムを含む。抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、ヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に連結させる。ＤＮＡは次に、抗体の完全なヒトの重鎖を発現することが可能な細胞で発現される。
【０３５４】
ヒトＶＨ遺伝子座による内因性マウスＶＨ遺伝子座の置換、および内因性κ軽鎖遺伝子座に単一の再構成されたヒト生殖系列ＶＬ領域を有するマウスが得られる。目的の抗原による免疫に際して、単一のヒト軽鎖（ヒトＶＬおよびマウスＣＬ）と体細胞変異重鎖（ヒトＶＨおよびマウスＣＨ）を含むリバースキメラ抗体が得られる。抗体を発現するＢ細胞のＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列を同定し、完全にヒトの抗体を、適する発現系でＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列をヒトＣＨおよびＣＬヌクレオチド配列と融合させることによって作製する。
【０３５５】
実施例ＸＩＶ
ヒト重鎖および再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域を発現するマウスからの抗体の生成
【０３５６】
操作されたヒト軽鎖領域を含むマウスを、他の内因性Ｉｇ遺伝子座（実施例１２に記載の）の改変および欠失を含む様々な所望の系統へ繁殖させた後、選択されたマウスを目的の抗原で免疫することができる。
【０３５７】
一般に、単一の再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域の１つを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは抗原でチャレンジされ、リンパ細胞（Ｂ細胞など）が動物の血清から収集される。不死のハイブリドーマ細胞系を調製するためにリンパ細胞を骨髄腫細胞系と融合させ、そのようなハイブリドーマ細胞系は、ヒト可変重鎖および再構成されたヒト生殖系列軽鎖を含む抗体（これは、免疫のために用いる抗原に特異的である）を生成するハイブリドーマ細胞系を同定するためにスクリーニングおよび選択される。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、重鎖および軽鎖の望ましいアイソタイプ定常領域に連結させる。内因性マウス配列の存在および内因性遺伝子座に存在するあらゆるさらなるシス活性エレメントのために、各抗体の単一の軽鎖は体細胞変異することがある。これは、単一の軽鎖および多様な重鎖配列を含む抗原特異的レパートリーにさらなる多様性を加える。生じるクローニングされた抗体配列は、ＣＨＯ細胞などの細胞でその後発現される。あるいは、抗原特異的キメラ抗体または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡは、抗原特異的リンパ球から直接的に同定される。
【０３５８】
最初に、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体が単離される。上記のように、抗体は、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付けされ、選択される。体細胞変異したヒト重鎖および本発明の再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域に由来する単一の軽鎖を含む完全なヒトの抗体を生成するために、マウス定常領域は所望のヒト定常領域で置換される。適するヒト定常領域には、例えば野生型または改変型のＩｇＧ１またはＩｇＧ４が含まれる。
【０３５９】
ヒトＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントによる内因性マウス重鎖遺伝子座の置換、ならびに操作された生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５ヒト軽鎖領域または操作された生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１ヒト軽鎖領域（上記）による内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の置換を含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスの別々のコホートを、ヒト細胞表面レセプタータンパク質（抗原Ｅ）で免疫した。抗原Ｅは、３〜４日おきの６回の連続的な注射でマウスの後ろの足蹠に直接投与する。注射の前に、２から３マイクログラムの抗原Ｅを１０μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド（カタログ♯ｔｌｒｌ−ｍｏｄｎ−ＯＤＮ１８２６オリゴヌクレオチド；ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）および２５μｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（リン酸アルミニウムゲルアジュバント、カタログ♯Ｈ−７１６３９−２５０；Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ、Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）と混合する。屠殺の３〜５日前に与えられる最終抗原リコールの前に、合計６回の注射を与える。４回目および６回目の注射の後に血液を収集し、抗体免疫応答を標準の抗原特異的イムノアッセイによってモニタリングする。
【０３６０】
所望の免疫応答が達成されるとき、脾細胞を収集し、それらの生存能力を保存し、ハイブリドーマ細胞系を形成するためにマウス骨髄腫細胞と融合させる。抗原Ｅ特異的な共通軽鎖抗体を生成する細胞系を同定するために、ハイブリドーマ細胞系をスクリーニングし、選択する。この技術を用いて、いくつかの抗抗原Ｅ特異的な共通軽鎖抗体（すなわち、ヒト重鎖可変ドメイン、同じヒト軽鎖可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有する抗体）が得られる。
【０３６１】
あるいは、参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれるＵ．Ｓ．２００７／０２８０９４５Ａ１に記載されるように、抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体は、骨髄腫細胞との融合なしに抗原陽性Ｂ細胞から直接的に単離される。この方法を用いて、いくつかの完全なヒトの抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体（すなわち、ヒト重鎖可変ドメイン、操作されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖か操作されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域のいずれか、およびヒト定常ドメインを有する抗体）が得られた。
【０３６２】
この実施例の方法に従って生成された例示的な抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体の生物学的特性は、以下に詳細に記載される。
【０３６３】
実施例ＸＶ
抗原特異的共通軽鎖抗体での重鎖遺伝子セグメントの使用
【０３６４】
生成されたヒト抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体の構造を分析するために、重鎖抗体可変領域をコードする核酸をクローニングし、配列決定をした。抗体の核酸配列および予測されたアミノ酸配列から、操作されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖か操作されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域のいずれかを含む免疫ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスから得られた、選択された共通軽鎖抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）について、遺伝子使用を特定した。結果を表１４および１５に示す。それらは、ヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０に由来する軽鎖だけから軽鎖を発現するマウスを使用するとき、様々な再構成のために、本発明によるマウスが様々なヒト重鎖遺伝子セグメントから抗原特異的共通軽鎖抗体を生成することを示す。２、３、４および５ファミリーのヒトＶＨ遺伝子セグメントは、様々なヒトＤＨセグメントおよびヒトＪＨセグメントと再構成されて、抗原特異的抗体を与えた。
【０３６５】
【表１４−１】
2020072695.tif 000021
【０３６６】
【表１４−２】
2020072695.tif 000022
【０３６７】
【表１５】
2020072695.tif 000023
【０３６８】
実施例ＸＶＩ
ＬｕｍｉｎｅｘＴＭアッセイによる抗原特異的共通軽鎖抗体のブロック能力の判定
ビーズベースのアッセイで、抗原Ｅに対する９８個のヒト共通軽鎖抗体を、抗原Ｅへの抗原Ｅの天然のリガンド（リガンドＹ）の結合をブロックするそれらの能力について試験した。
【０３６９】
抗原Ｅの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を２つのｍｙｃエピトープタグおよび６×ヒスチジンタグとコンジュゲートさせ（抗原Ｅ−ｍｍＨ）、ＭＥＳ緩衝液中の２０μｇ／ｍＬの濃度でカルボキシル化マイクロスフェアにアミンカップリングさせた。混合液を室温で２時間インキュベートし、続いて１ＭトリスｐＨ８．０でビーズ非活性化を行い、続いて０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄した。次にビーズを２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）でブロックした。９６穴フィルタープレート中で、抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体を含む上清を緩衝液で１：１５に希釈した。抗体上清と同じ媒質成分による模擬上清を含む陰性対照を調製した。抗原Ｅ標識ビーズを上清に加え、４℃で一晩インキュベートした。ビオチン化リガンドＹタンパク質を０．０６ｎＭの最終濃度まで加え、室温で２時間インキュベートした。抗原Ｅ−ｍｙｃ−ｍｙｃ−６Ｈｉｓ標識ビーズに結合したビオチン化リガンドＹの検出を、ストレプトアビジンとコンジュゲートされたＲ−フィコエリトリン（Ｍｏｓｓ  Ｉｎｃ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＭＤ）で判定し、続いてＬｕｍｉｎｅｘＴＭフローサイトメトリーベースのアナライザーで測定した。リガンドＹのない試料のバックグラウンド平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、全ての試料から引いた。ブロック百分率は、各試料のバックグラウンドを引いたＭＦＩを調整された陰性対照値で割り、１００を掛け、生じた値を１００から引くことによって計算された。
【０３７０】
同様の実験において、抗原Ｅに対する同じ９８個のヒト共通軽鎖抗体を、リガンドＹ標識ビーズへの抗原Ｅの結合をブロックするそれらの能力について試験した。
【０３７１】
簡潔には、ＭＥＳ緩衝液に希釈した２０μｇ／ｍＬの濃度で、リガンドＹをカルボキシル化マイクロスフェアにアミンカップリングさせた。混合液を室温で２時間インキュベートし、続いて１ＭトリスｐＨ８でビーズの非活性化を行い、続いて０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄した。次にビーズを２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）でブロックした。９６穴フィルタープレート中で、抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体を含む上清を緩衝液で１：１５に希釈した。抗体上清と同じ媒質成分による模擬上清を含む陰性対照を調製した。ビオチン化抗原Ｅ−ｍｍＨを０．４２ｎＭの最終濃度まで加え、４℃で一晩インキュベートした。リガンドＹ標識ビーズを次に抗体／抗原Ｅ混合物に加え、室温で２時間インキュベートした。リガンドＹビーズに結合したビオチン化抗原Ｅ−ｍｍＨの検出は、ストレプトアビジンとコンジュゲートされたＲ−フィコエリトリン（Ｍｏｓｓ  Ｉｎｃ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＭＤ）で判定し、続いてＬｕｍｉｎｅｘＴＭフローサイトメトリーベースのアナライザーで測定した。抗原Ｅのない試料のバックグラウンド平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、全ての試料から引いた。ブロック百分率は、各試料のバックグラウンドを引いたＭＦＩを調整された陰性対照値で割り、１００を掛け、生じた値を１００から引くことによって計算された。
【０３７２】
表１６および１７は、両方のＬｕｍｉｎｅｘＴＭアッセイで試験された全９８個の抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体のブロック百分率を示す。ＮＤ：現在の実験条件下で判定されない。
【０３７３】
【表１６−１】
2020072695.tif 000024
【０３７４】
【表１６−２】
2020072695.tif 000025
【０３７５】
【表１６−３】
2020072695.tif 000026
【０３７６】
【表１７−１】
2020072695.tif 000027
【０３７７】
上記の第一のＬｕｍｉｎｅｘＴＭ実験では、Ｖκ１−３９Ｊκ５操作軽鎖を含む８０個の共通軽鎖抗体を、抗原Ｅ標識ビーズへのリガンドＹ結合をブロックするそれらの能力について試験した。これらの８０個の共通軽鎖抗体のうち、６８個は＞５０％のブロックを示し、１２個は＜５０％のブロック（６個は２５〜５０％のブロック、６個は＜２５％のブロック）を示した。Ｖκ３−２０Ｊκ１操作軽鎖を含む１８個の共通軽鎖抗体については、１２個は抗原Ｅ標識ビーズへのリガンドＹ結合の＞５０％のブロックを示し、６個は＜５０％のブロック（３個は２５〜５０％のブロック、３個は＜２５％のブロック）を示した。
【０３７８】
上記の第二のＬｕｍｉｎｅｘＴＭ実験では、Ｖκ１−３９Ｊκ５操作軽鎖を含む同じ８０個の共通軽鎖抗体を、リガンドＹ標識ビーズへの抗原Ｅの結合をブロックするそれらの能力について試験した。これらの８０個の共通軽鎖抗体のうち、３６個は＞５０％のブロックを示し、４４個は＜５０％のブロック（２７個は２５〜５０％のブロック、１７個は＜２５％のブロック）を示した。Ｖκ３−２０Ｊκ１操作軽鎖を含む１８個の共通軽鎖抗体については、１個はリガンドＹ標識ビーズへの抗原Ｅの結合の＞５０％のブロックを示し、１７個は＜５０％のブロック（５個は２５〜５０％のブロック、１２個は＜２５％のブロック）を示した。
【０３７９】
表１６および１７のデータは、表１４および１５に記載される再構成が、その関連受容体抗原ＥへのリガンドＹの結合を様々な程度の効力でブロックした抗抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体を生成したことを証明し、このことは、抗原Ｅに関して重複するおよび重複しないエピトープ特異性を有する抗体を含む表１４および１５の抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体と矛盾しない。
【０３８０】
実施例ＸＶＩＩ
ＥＬＩＳＡによる抗原特異的共通軽鎖抗体のブロック能力の判定
【０３８１】
ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、抗原Ｅに対するヒト共通軽鎖抗体を、リガンドＹコーティング表面への抗原Ｅの結合をブロックするそれらの能力について試験した。
【０３８２】
リガンドＹをＰＢＳに希釈した２μｇ／ｍＬの濃度で９６穴プレートにコーティングし、一晩インキュベートし、続いて０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで４回洗浄した。次にプレートを０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）によって室温で１時間ブロックした。別々のプレート中で、抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体を含む上清を緩衝液で１：１０に希釈した。抗体の同じ成分を有する模擬上清を、陰性対照として用いた。抗原Ｅ−ｍｍＨ（上記）を０．１５０ｎＭの最終濃度まで加え、室温で１時間インキュベートした。次に、リガンドＹを含むプレートに抗体／抗原Ｅ−ｍｍＨ混合物を加え、室温で１時間インキュベートした。リガンドＹに結合した抗原Ｅ−ｍｍＨの検出は、抗ペンタ−Ｈｉｓ抗体とコンジュゲートさせた西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）で判定し、硫酸によって中和されるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いる標準の比色応答によって発色させた（ｄｅｖｅｌｏｐ）。吸光度をＯＤ４５０で０．１秒間読み取った。抗原Ｅのない試料のバックグラウンド吸光度を、全ての試料から引いた。ブロック百分率は、各試料のバックグラウンドを引いたＭＦＩを調整された陰性対照値で割り、１００を掛け、生じた値を１００から引くことによって計算された。
【０３８３】
表１８および１９は、ＥＬＩＳＡアッセイで試験された全９８個の抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体のブロック百分率を示す。ＮＤ：現在の実験条件下で判定されない。
【０３８４】
【表１８−１】
2020072695.tif 000028
【０３８５】
【表１８−２】
2020072695.tif 000029
【０３８６】
【表１９】
2020072695.tif 000030
【０３８７】
この実施例に記載されているように、リガンドＹコーティング表面への抗原Ｅの結合をブロックするそれらの能力を試験された、Ｖκ１−３９Ｊκ５操作軽鎖を含む８０個の共通軽鎖抗体のうち、２２個は＞５０％のブロックを示し、５８個は＜５０％のブロック（２０個は２５〜５０％のブロック、３８個は＜２５％のブロック）を示した。Ｖκ３−２０Ｊκ１操作軽鎖を含む１８個の共通軽鎖抗体については、１個はリガンドＹコーティング表面への抗原Ｅの結合の＞５０％のブロックを示し、１７個は＜５０％のブロック（５個は２５〜５０％のブロック、１２個は＜２５％のブロック）を示した。
【０３８８】
これらの結果はまた、抗原Ｅに関して重複するおよび重複しないエピトープ特異性を有する抗体を含む抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体プールと矛盾しない。
【０３８９】
実施例ＸＶＩＩＩ
抗原特異的共通軽鎖抗体についてのＢＩＡＣＯＲＥＴＭ親和性判定
【０３９０】
ＢＩＡＣＯＲＥＴＭＴ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）によって、選択された抗体上清の平衡解離定数（ＫＤ）を判定した。全てのデータは、ランニング緩衝液および試料緩衝液の両方としてＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）を用いて２５℃で得られた。標準のアミンカップリング化学を用いて高密度の抗ヒトＦｃ抗体で事前に誘導体化させたＣＭ５センサーチップ表面で、抗体を粗製上清試料から捕捉した。捕捉工程中、合計３分間、上清を３μＬ／分の流速で抗ヒトＦｃ表面全域に注入した。捕捉工程の後に、３５μＬ／分の流速で２分間の、ランニング緩衝液または１００ｎＭの濃度の分析物の注入が続いた。捕捉された抗体からの抗原の解離を、６分間モニタリングした。捕捉された抗体は、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５の短時間注入によって除去した。緩衝液注入からのセンサーグラムを分析物センサーグラムから引き、それによって捕捉表面からの抗体の解離に起因するアーチファクトを除くことによって、全てのセンサーグラムをダブルリファレンス（ｄｏｕｂｌｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）とした。ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ  Ｔ１００評価ソフトウェアｖ２．１を用いて、各抗体の結合データを、マストランスポートを有する１：１結合モデルにあてはめた。結果を表２０および２１に示す。
【０３９１】
【表２０−１】
2020072695.tif 000031
【０３９２】
【表２０−２】
2020072695.tif 000032
【０３９３】
【表２１】
2020072695.tif 000033
【０３９４】
表１４および１５に示す再構成を含む共通軽鎖抗体の結合親和性は様々であり、ほとんど全てはナノモル濃度範囲のＫＤを示す。親和性データは、高親和性で、クローン選択され、体細胞変異している表１４および１５に記載の再構成された可変ドメインの組合せ会合から生じる共通軽鎖抗体と矛盾しない。前に示すデータと合わせると、表１４および１５に記載される共通軽鎖抗体は、抗原Ｅの上の１つまたは複数のエピトープに特異性を示す、多様な高親和性抗体の集合を含む。
【０３９５】
実施例ＸＩＸ
ＬｕｍｉｎｅｘＴＭアッセイによる抗原特異的共通軽鎖抗体の結合特異性の判定
選択された抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体を、抗原ＥのＥＣＤおよび抗原Ｅ  ＥＣＤバリアントに結合するそれらの能力について試験した（例えば、そのアミノ酸残基の約１０％がヒトタンパク質と異なる、カニクイザルオルソログ（Ｍｆ抗原Ｅ）；ＥＣＤのＣ末端から最後の１０アミノ酸を欠く抗原Ｅの欠失変異体（抗原Ｅ−ΔＣＴ）；ならびにリガンドＹとの相互作用が疑われる位置にアラニン置換を含む２つの変異体（抗原Ｅ−Ａｌａ１および抗原Ｅ−Ａｌａ２））。抗原Ｅタンパク質はＣＨＯ細胞で生成され、各々はｍｙｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｃ末端タグを含んでいた。
【０３９６】
結合試験のために、抗ｍｙｃモノクローナル抗体（ＭＡｂ  ９Ｅ１０、ハイブリドーマ細胞系ＣＲＬ−１７２９ＴＭ；ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）で共有結合コーティングされた１×１０６個のマイクロスフェア（ＬｕｍｉｎｅｘＴＭ）ビーズと一緒での室温で２時間のインキュベーションによって、１ｍＬの培養培地からの抗原Ｅ  ＥＣＤタンパク質またはバリアントタンパク質（上記）を捕捉した。次に、ビーズを使用前にＰＢＳで洗浄した。抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体を含む上清を緩衝液で１：４に希釈し、９６穴フィルタープレートに加えた。抗体のない模擬上清を、陰性対照として用いた。捕捉された抗原Ｅタンパク質を含むビーズを次に抗体試料に加え（ウェルにつき３０００個のビーズ）、４℃で一晩インキュベートした。次の日、試料ビーズを洗浄し、結合した共通軽鎖抗体をＲ−フィコエリトリンとコンジュゲートさせた抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。ビーズの蛍光強度（約１００個のビーズを各抗原Ｅタンパク質への各抗体試料の結合について計数した）は、ＬｕｍｉｎｅｘＴＭフローサイトメトリーベースのアナライザーで測定し、ビーズ／抗体相互作用につき少なくとも１００個の計数されたビーズの中央蛍光強度（ＭＦＩ）を記録した。結果を表２２および２３に示す。
【０３９７】
【表２２−１】
2020072695.tif 000034
【０３９８】
【表２２−２】
2020072695.tif 000035
【０３９９】
【表２２−３】
2020072695.tif 000036
【０４００】
【表２３】
2020072695.tif 000037
【０４０１】
抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体上清は、抗原Ｅ−ＥＣＤに連結されたビーズへの高特異的結合を示した。これらのビーズについては、陰性対照模擬上清は、抗原Ｅ−ＥＣＤビーズ試料と組み合わせたときは無視できるシグナル（＜１０ＭＦＩ）をもたらしたが、抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体を含む上清は、強い結合シグナルを示した（９８個の抗体上清については２６２７の平均ＭＦＩ；９１／９８の抗体試料についてはＭＦＩ＞５００）。
【０４０２】
抗原ＥのＥＣＤの上の異なるエピトープを同定する選択された抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体の能力の測定手段として、バリアントに対する抗体の相対的結合を判定した。天然の抗原Ｅ−ＥＣＤ結合試験について上で記載したように、全４つの抗原Ｅバリアントを抗ｍｙｃ  ＬｕｍｉｎｅｘＴＭビーズに捕捉し、相対的な結合比（ＭＦＩバリアント／ＭＦＩ抗原Ｅ−ＥＣＤ）を判定した。表２１および２２に示す９８個の試験された共通軽鎖抗体上清について、平均比（ＭＦＩバリアント／ＭＦＩ抗原Ｅ−ＥＣＤ）は各バリアントで異なり、ビーズ上でのタンパク質の様々な捕捉量を反映しているようである（抗原Ｅ−ΔＣＴ、抗原Ｅ−Ａｌａ１、抗原Ｅ−Ａｌａ２およびＭｆ抗原Ｅについてそれぞれ０．６１、２．９、２．０および１．０の平均比）。各タンパク質バリアントについて、９８個の試験された共通軽鎖抗体のサブセットの結合は、大きく低減された結合を示し、このことは、所与のバリアントを特徴付けた変異への感度を示した。例えば、共通軽鎖抗体試料の１９個は、＜８％のＭＦＩバリアント／ＭＦＩ抗原Ｅ−ＥＣＤでＭｆ抗原Ｅに結合した。この群の多くは高いか適度に高い親和性の抗体（５個はＫＤ＜５ｎＭ、１５個はＫＤ＜５０ｎＭ）を含むので、この群の低いシグナルは、低い親和性からではなく、天然の抗原Ｅ−ＥＣＤと所与のバリアントとの間の配列（エピトープ）の差への感度から生じるようである。
【０４０３】
表１４および１５に記載される共通軽鎖抗体が、抗原Ｅの上の複数のエピトープを特異的に認識する抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体の多様な群を表すことを、これらのデータは証明する。
（項目１）  マウスであって、該マウスの生殖系列において：
（ａ）重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される少なくとも１つの再構成されていないヒトＶ、少なくとも１つの再構成されていないヒトＤ、および少なくとも１つの再構成されていないヒトＪセグメントを含むヒト化免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座；
（ｂ）軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される１つ以下または２つ以下の再構成されたヒト軽鎖Ｖ／Ｊ配列を含むヒト化免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座；および
（ｃ）マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性核酸配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片
を含むマウス。
（項目２）  前記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする核酸配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片が前記免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座以外の遺伝子座に存在する、項目１に記載のマウス。
（項目３）  前記重鎖定常領域遺伝子がマウス遺伝子である、項目１に記載のマウス。
（項目４）  前記軽鎖定常領域遺伝子がマウス遺伝子である、項目１に記載のマウス。
（項目５）  ヒト化重鎖免疫グロブリン可変遺伝子座およびヒト化軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子座を含むマウスであって、該マウスが単一の軽鎖を発現し、該マウスが雄マウスにおいて機能するＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性核酸配列を含む、マウス。
（項目６）  前記ヒト化重鎖免疫グロブリン遺伝子座が内因性マウス重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結されている、項目５に記載のマウス。
（項目７）  前記単一の軽鎖が、軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結される１つ以下の軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび軽鎖Ｊ遺伝子セグメントをコードする免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子遺伝子座からコードされる、項目５に記載のマウス。
（項目８）  前記単一の軽鎖が、前記マウスの前記生殖系列における免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子遺伝子座に由来し、該遺伝子座が軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結される、該生殖系列中の１つ以下の再構成された軽鎖Ｖ／Ｊ遺伝子セグメントをコードする、項目５に記載のマウス。
（項目９）  前記異所性核酸配列が雄マウスにおいて機能するマウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードするか、マウスＡＤＡＭ６タンパク質の断片をコードする、項目５に記載のマウス。
（項目１０）  前記異所性核酸配列が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座内ではない位置に存在する、項目５に記載のマウス。
（項目１１）  遺伝子改変マウスであって、複数の異なるＩｇＧ重鎖を発現し、該複数の異なるＩｇＧ重鎖の各々がヒト可変ドメインを含み、前記複数の異なるＩｇＧ重鎖の各々が単一のヒト免疫グロブリンＶ遺伝子セグメントに由来するヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする軽鎖配列と会合しており、該マウスが雄マウスにおいて機能するＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性核酸配列を含む、遺伝子改変マウス。
（項目１２）  前記マウスが、雄マウスにおいて機能するＡＤＡＭ６タンパク質またはその断片を発現し、該ＡＤＡＭ６タンパク質またはその断片が前記異所性核酸配列から発現される、項目１１に記載のマウス。
（項目１３）  マウス細胞であって、以下：
重鎖定常遺伝子に作動可能に連結されるヒト化重鎖免疫グロブリン可変遺伝子遺伝子座；
軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結される１つ以下または２つ以下の軽鎖Ｖ遺伝子セグメントを含むヒト化軽鎖免疫グロブリン遺伝子座；および
ＡＤＡＭ６タンパク質またはその断片をコードする異所性核酸配列であって、該ＡＤＡＭ６タンパク質またはその断片が雄マウスにおいて機能する、異所性核酸配列
を含む、マウス細胞。
（項目１４）  前記異所性核酸配列がマウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする、項目１３に記載のマウス細胞。
（項目１５）  前記重鎖定常遺伝子が非ヒト重鎖定常遺伝子である、項目１３に記載のマウス。
（項目１６）  前記軽鎖定常遺伝子が非ヒト軽鎖定常遺伝子である、項目１３に記載のマウス。
（項目１７）  前記１つ以下または２つ以下（ｎｏ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｔ  ｔｗｏ）の軽鎖Ｖ遺伝子セグメントが再構成されたＶ／Ｊ遺伝子セグメントに存在する、項目１３に記載のマウス。
（項目１８）  ヒト重鎖Ｖ遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むキメラ免疫グロブリン重鎖；ならびに
（ａ）再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊ配列、
（ｂ）再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊ配列、または
（ｃ）その組み合わせ；
に由来する軽鎖を発現するマウスＢ細胞であって、
該重鎖可変ドメインが定常領域と融合されており、該軽鎖可変ドメインが定常領域と融合されており、該Ｂ細胞が異所性ＡＤＡＭ６核酸配列を含む、マウスＢ細胞。
（項目１９）  前記重鎖可変ドメインと融合される前記定常ドメインがマウス定常領域を含む、項目１８に記載のマウスＢ細胞。
（項目２０）  前記軽鎖可変ドメインと融合される前記定常領域がマウス定常領域およびヒト定常領域から選択される、項目１８に記載のマウスＢ細胞。
【図１Ａ】
2020072695.tif 000038
【図１Ｂ】
2020072695.tif 000039
【図２Ａ】
2020072695.tif 000040
【図２Ｂ】
2020072695.tif 000041
【図２Ｃ】
2020072695.tif 000042
【図２Ｄ】
2020072695.tif 000043
【図３Ａ】
2020072695.tif 000044
【図３Ｂ】
2020072695.tif 000045
【図３Ｃ】
2020072695.tif 000046
【図４Ａ】
2020072695.tif 000047
【図４Ｂ】
2020072695.tif 000048
【図５Ａ】
2020072695.tif 000049
【図５Ｂ】
2020072695.tif 000050
【図６】
2020072695.tif 000051
【図７Ａ】
2020072695.tif 000052
【図７Ｂ】
2020072695.tif 000053
【図８】
2020072695.tif 000054
【図９Ａ】
2020072695.tif 000055
【図９Ｂ】
2020072695.tif 000056
【図９Ｃ】
2020072695.tif 000057
【図１０Ａ】
2020072695.tif 000058
【図１０Ｂ】
2020072695.tif 000059
【図１１Ａ】
2020072695.tif 000060
【図１１Ｂ】
2020072695.tif 000061
【図１２】
2020072695.tif 000062
【図１３】
2020072695.tif 000063
【図１４Ａ】
2020072695.tif 000064
【図１４Ｂ】
2020072695.tif 000065
【図１５Ａ】
2020072695.tif 000066
【図１５Ｂ】
2020072695.tif 000067
【図１６Ａ】
2020072695.tif 000068
【図１６Ｂ】
2020072695.tif 000069
【図１７Ａ】
2020072695.tif 000070
【図１７Ｂ】
2020072695.tif 000071
【図１７Ｃ】
2020072695.tif 000072
【図１８Ａ】
2020072695.tif 000073
【図１８Ｂ】
2020072695.tif 000074
【図１９】
2020072695.tif 000075
【図２０】
2020072695.tif 000076
【図２１】
2020072695.tif 000077
【図２２】
2020072695.tif 000078
【図２３Ａ】
2020072695.tif 000079
【図２３Ｂ】
2020072695.tif 000080
【図２３Ｃ】
2020072695.tif 000081
【図２４Ａ】
2020072695.tif 000082
【図２４Ｂ】
2020072695.tif 000083
【配列表】
2020072695000001.app
【外国語明細書】
2020072695000001.pdf