(57)【要約】      （修正有）【課題】ナチュラルキラー細胞を用いた腫瘍細胞の増殖抑制又は移植片対宿主病の治療に関し、前記ナチュラルキラー細胞培養及び増殖において、その腫瘍標的能力及び殺腫瘍能力等を低下させることなく、前記増殖抑制及び治療に適用することを可能とする新規方法の提供。【解決手段】腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、該腫瘍細胞をヒト胎盤灌流液及び臍帯血から単離されたナチュラルキラー細胞と接触させることを含む、前記方法。移植片対宿主病を治療する方法であって、ヒト胎盤灌流液及び臍帯血から単離されたナチュラルキラー細胞を、移植片対宿主病を有するか、移植片対宿主病を有することが疑われるか、又は移植片対宿主病を発症するリスクのある患者に投与することを含む、前記方法。【選択図】図１
2020196724.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、該腫瘍細胞をヒト胎盤灌流液及び臍帯血から
単離されたナチュラルキラー細胞と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２】
移植片対宿主病を治療する方法であって、ヒト胎盤灌流液及び臍帯血から単離されたナ
チュラルキラー細胞を、移植片対宿主病を有するか、移植片対宿主病を有することが疑わ
れるか、又は移植片対宿主病を発症するリスクのある患者に投与することを含む、前記方
法。
【請求項３】
前記腫瘍細胞が血液癌細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記腫瘍細胞が固形腫瘍細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記腫瘍細胞が、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、慢性骨髄性
リンパ腫(CML)細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病(CML)細胞、肺癌細胞、結
腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌細胞、結腸直腸腺癌細胞、又は網膜芽腫
細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト胎盤灌流液及び臍帯血が、複数の赤血球を除去するように処理されたものであ
る、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記接触させることがインビトロで接触させることである、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記接触させることがインビボで接触させることである、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記接触させることがヒトにおけるものである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記胎盤灌流液細胞が胎盤灌流液由来の全有核細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
前記ナチュラルキラー細胞が、少なくとも約50％のCD56+細胞を含む、請求項1記載の方
法。
【請求項１２】
前記ナチュラルキラー細胞が、少なくとも約50％のCD56+CD16-細胞を含む、請求項1記
載の方法。
【請求項１３】
前記ナチュラルキラー細胞を、免疫調節化合物と、該細胞が該免疫調節化合物と接触さ
せていない同等数の細胞よりも検出可能な程度に多くのグランザイムBを発現するのに十
分な量及び時間で接触させる、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫調節化合物がレナリドミド又はポマリドミドである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記ナチュラルキラー細胞が:
末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD
56+CD16-ナチュラルキラー細胞;
末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD3-CD
56+CD16+ナチュラルキラー細胞;
末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD
56+KIR2DL2/L3+ナチュラルキラー細胞;
末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD3-CD
56+NKp46+ナチュラルキラー細胞;
末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD
56+NKp30+ナチュラルキラー細胞;
末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD
56+2B4+ナチュラルキラー細胞;又は
末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD
56+CD94+ナチュラルキラー細胞
を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
前記ナチュラルキラー細胞が、hsa-miR-155、hsa-miR-337、hsa-miR-422a、hsa-miR-54
9、及びhsa-miR-618のうちの1つ又は複数を、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細
胞よりも検出可能な程度に多くの量で発現する、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
前記ナチュラルキラー細胞が培養されていないものである、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
前記ナチュラルキラー細胞が培養されたものである、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
前記ナチュラルキラー細胞が約21日間培養されたものである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記ナチュラルキラー細胞がフィーダー細胞の存在下で培養されたものである、請求項
18記載の方法。
【請求項２１】
さらなるフィーダー細胞が約7日目に前記培養物に添加される、請求項20記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2013年2月5日に出
願された米国仮特許出願第61/761,176号及び2013年3月13日に出願された米国仮特許出願
第61/780,115号の利益を主張するものである。
【０００２】
(1.分野)
本明細書に提示されるのは、腫瘍細胞を、胎盤灌流液、胎盤灌流液由来細胞、胎盤由来
、例えば、胎盤灌流液由来のナチュラルキラー細胞、並びに/又は胎盤由来、例えば、胎
盤灌流液及び臍帯血由来のナチュラルキラー細胞を含む組み合わされたナチュラルキラー
細胞と接触させることによって、腫瘍細胞の成長又は増殖を抑制する方法である。また本
明細書に提供されるのは、胎盤由来、例えば、胎盤灌流液、例えば、ヒト胎盤灌流液由来
の固有のナチュラルキラー細胞集団を産生する方法である。さらに本明細書に提供される
のは、胎盤灌流液、及びそれに由来するナチュラルキラー細胞を用いて、腫瘍細胞の増殖
を抑制する方法である。また本明細書に提供されるのは、腫瘍又は移植片対宿主病を有す
る個体を、胎盤灌流液、胎盤灌流液由来細胞、胎盤由来、例えば、胎盤灌流液由来のナチ
ュラルキラー細胞、並びに/又は胎盤由来、例えば、胎盤灌流液及び臍帯血由来のナチュ
ラルキラー細胞を含む組み合わされたナチュラルキラー細胞で治療する方法である。
【背景技術】
【０００３】
(2.背景)
胎盤灌流液は、灌流溶液を胎盤血管系に通すことによって得られる胎盤細胞の収集物、
及び該血管系由来、胎盤の母胎面由来、又はその両方の灌流液の収集物を含む。哺乳動物
の胎盤を灌流する方法は、例えば、米国特許第7,045,146号及び米国特許第7,255,879号に
記載されている。灌流によって得られる胎盤細胞の集団は不均質であり、造血(CD34+)細
胞、有核細胞、例えば、顆粒球、単球、及びマクロファージ、わずかな比率(1％未満)の
組織培養基材接着性胎盤幹細胞、並びにナチュラルキラー細胞を含む。これまで、腫瘍細
胞増殖の抑制における、胎盤灌流液、又は灌流液由来の胎盤細胞集団の使用を記載したも
のはいない。
【０００４】
ナチュラルキラー(NK)細胞は、自然免疫系の主要な構成要素となる細胞傷害性リンパ球
である。NK細胞は、T細胞抗原受容体(TCR)も、CD3も、表面免疫グロブリン(Ig) B細胞受
容体も発現していないが、通常ヒトでは、表面マーカーCD16(FcγRIII)及びCD56を発現す
る。NK細胞は細胞傷害性であり;その細胞質中の小顆粒は、パーフォリン、及びグランザ
イムとして知られるプロテアーゼなどの特殊なタンパク質を含有している。死滅させる予
定の細胞のすぐ近くに放出されると、パーフォリンは、標的細胞の細胞膜に孔を形成し、
そこからグランザイム及び関連分子が進入可能になり、アポトーシスが誘導される。グラ
ンザイムの1つであるグランザイムB(グランザイム2及び細胞傷害性Tリンパ球関連セリン
エステラーゼ1としても知られている)は、細胞性免疫応答における標的細胞アポトーシス
の迅速な誘導に重要なセリンプロテアーゼである。
【０００５】
NK細胞は、インターフェロン又はマクロファージ由来サイトカインに応答して活性化さ
れる。活性化されたNK細胞は、リンホカイン活性化キラー(LAK)細胞と呼ばれることもあ
る。NK細胞は、細胞の細胞傷害活性を制御する、「活性化受容体」及び「抑制性受容体」
と名付けられた、2種類の表面受容体を保有する。
【０００６】
数ある活性の中でも特に、NK細胞は、宿主による腫瘍の拒絶に役割を果たしている。癌
細胞では、クラスI MHC発現が低下しているか又はクラスI MHC発現がないので、癌細胞は
、NK細胞の標的になることができる。蓄積しつつある臨床データは、PBMC又は骨髄から単
離されたヒトNK細胞のハプロタイプ一致性移植が、検出可能な移植片対宿主病(GVHD)を保
有することなく、強力な抗白血病効果を媒介することを示唆している。Ruggeriらの文献
、Science 295:2097-2100(2002)を参照されたい。ナチュラルキラー細胞は、主要組織適
合性複合体(MHC)タンパク質を欠如しているか又はそのレベルの低下を示している細胞に
よって活性化されるようになることができる。活性化及び増殖させたNK細胞及びLAK細胞
は、進行癌を有する患者のエクスビボ療法とインビボ治療の両方で使用されており、白血
病などの骨髄関連疾患;乳癌;ある種のリンパ腫に対してある程度の成功を収めている。LA
K細胞治療では、患者にまずIL-2を投与し、次に白血球除去療法を施し、その後、回収さ
れた自己血液細胞を、IL-2の存在下で数日間、エクスビボでインキュベートし、培養する
必要がある。治療を終了するためには、LAK細胞を比較的高用量のIL-2と一緒に再注入し
なければならない。このパージ治療(purging treatment)は高価であり、重篤な副作用を
引き起こすことがある。これらの副作用には、体液貯留、肺水腫、血圧低下、及び高熱が
含まれる。
【０００７】
腫瘍細胞及びウイルス感染細胞を死滅させる上でのNK細胞の有利な特性にもかかわらず
、NK細胞は、その腫瘍標的能力及び殺腫瘍能力を培養及び増殖の間に維持するのが難しい
ことが主な理由で、取扱い及び免疫療法での適用が依然として難しい。したがって、当技
術分野では、ナチュラルキラー細胞の素早い供給が必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
(3.概要)
一態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞増殖を抑制するための、胎盤灌
流液;胎盤灌流液由来の細胞、例えば、胎盤灌流液由来の全有核細胞;胎盤灌流液細胞と臍
帯血細胞の組合せ;及び/又は胎盤由来のナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤灌流液由来
のナチュラルキラー細胞もしくは胎盤組織の消化により得られるナチュラルキラー細胞の
使用である。
【０００９】
一態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞又は腫瘍細胞の集団の増殖を抑
制する方法であって、該腫瘍細胞又は腫瘍細胞の集団をヒト胎盤灌流液と接触させること
を含む、方法である。この方法の具体的な実施態様において、該腫瘍細胞は、血液癌細胞
(a blood cancer cell)である。別の具体的な実施態様において、該腫瘍細胞は、血液癌
細胞(blood cancer cells)である。別の具体的な実施態様において、該腫瘍細胞は、固形
腫瘍細胞(a solid tumor cell)である。別の具体的な実施態様において、該腫瘍細胞は、
固形腫瘍細胞(solid tumor cells)である。別の実施態様において、該腫瘍細胞は、原発
性腺管癌細胞、白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫(CML)細胞、急性
骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病(CML)細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リ
ンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、網膜芽腫細胞、結腸直腸癌細胞、又は結腸直腸腺癌細胞
である。別の具体的な実施態様において、該接触させることは、インビトロで行われる。
別の具体的な実施態様において、該接触させることは、インビボで行われる。より具体的
な実施態様において、該インビボで接触させることは、ヒトで行われる。
【００１０】
別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、胎盤血管系に、例えば、胎盤血管系
にのみ通された灌流液である。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、胎盤血
管系に通され、胎盤の母体面から回収されたものである。別の具体的な実施態様において
、該胎盤灌流液中の細胞の全て又は実質的に全て(例えば、90％、95％、98％、もしくは9
9％超)は、胎児細胞である。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、胎児細胞
及び母親細胞を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液中の胎児細胞は、該
灌流液中の細胞の約90％、80％、70％、60％、又は50％未満を含む。別の具体的な実施態
様において、該灌流液は、0.9％NaCl溶液を胎盤血管系に通すことによって得られる。別
の具体的な実施態様において、該灌流液は培養培地を含む。別の具体的な実施態様におい
て、該灌流液は、複数の赤血球を除去するように処理されたものである。
【００１１】
本明細書で使用されるように、「胎盤由来のナチュラルキラー細胞(複数可)」という語
句は、臍帯血又は胎盤血由来のナチュラルキラー細胞を含まない。
【００１２】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖を
抑制する方法であって、該腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞を複数の胎盤灌流液細胞と接触さ
せることを含む、方法である。別の具体的な実施態様において、該複数の胎盤灌流液細胞
は、胎盤灌流液由来の全有核細胞であるか、又は該細胞を含む。別の具体的な実施態様に
おいて、該胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞、例えば、胎盤灌流液由来の全有核細胞は、少
なくとも1種類の細胞を除去するように処理されたものである。別の具体的な実施態様に
おいて、該接触させることは、インビトロで行われる。別の具体的な実施態様において、
該接触させることは、インビボで行われる。より具体的な実施態様において、該インビボ
で接触させることは、哺乳動物、例えば、ヒトで行われる。別の具体的な実施態様におい
て、該胎盤灌流液細胞は、少なくとも1種類の細胞、例えば、CD56+細胞を濃縮するように
処理されたものである。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、CD56+胎
盤細胞である。より具体的な実施態様において、該CD56+細胞は、例えば、胎盤灌流液細
胞、又は胎盤組織の機械的もしくは酵素的破壊によって得られる胎盤細胞から得られる、
CD56+CD16-ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー(PINK)細胞である
。別の具体的な実施態様において、該CD56+細胞は、CD56コンジュゲートマイクロビーズ
によって選択される。別の具体的な実施態様において、該CD56+細胞は、同等数のCD56+CD
16+ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に低いNKG2D、NKp46、又はCD94の発現を
示す細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該PINK細胞は、CD3-である。より具体
的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞中の細胞の少なくとも50％は、該CD56+細胞で
ある。該CD56+細胞が該胎盤灌流液細胞の少なくとも50％であるより具体的な実施態様に
おいて、腫瘍細胞は、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、慢性骨髄
性リンパ腫(CML)細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病(CML)細胞、肺癌細胞、
結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、網膜芽腫細胞、結腸直腸癌細
胞、又は結腸直腸腺癌細胞である。具体的な実施態様において、該接触させることは、イ
ンビトロで接触させることである。別の実施態様において、該接触させることは、インビ
ボで、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトで接触させることである。
【００１３】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖を
抑制する方法であって、該腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞を胎盤由来の複数のナチュラルキ
ラー細胞、例えば、PINK細胞と接触させることを含む、方法である。具体的な実施態様に
おいて、該胎盤由来のナチュラルキラー細胞は、胎盤灌流液から得られるナチュラルキラ
ー細胞である。別の具体的な実施態様において、該ナチュラルキラー細胞は、胎盤組織の
物理的破壊及び/又は酵素消化によって得られるナチュラルキラー細胞である。別の具体
的な実施態様において、該ナチュラルキラー細胞は、CD56+CD16-ナチュラルキラー細胞、
例えば、PINK細胞である。別の具体的な実施態様において、該ナチュラルキラー細胞は、
例えば、胎盤灌流液細胞又は胎盤組織の物理的破壊及び/もしくは酵素消化によって得ら
れる細胞から、CD56コンジュゲートマイクロビーズによって選択される。別の具体的な実
施態様において、該ナチュラルキラー細胞は、CD3-である。具体的な実施態様において、
該複数のナチュラルキラー細胞は、該ナチュラルキラー細胞を含む細胞集団内の細胞の少
なくとも80％である。別の具体的な実施態様において、該接触させることは、インビトロ
で行われる。別の具体的な実施態様において、該接触させることは、インビボで行われる
。より具体的な実施態様において、該インビボで接触させることは、哺乳動物、例えば、
ヒトで行われる。
【００１４】
本方法の別の具体的な実施態様において、該複数のナチュラルキラー細胞は、同等数の
CD56+CD16+ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に低いNKG2D、NKp46、又はCD94の
発現を示す細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該複数のナチュラルキラー細胞
、例えば、PINK細胞は、マイクロRNAのhsa-miR-100、hsa-miR-127、hsa-miR-211、hsa-mi
R-302c、hsa-miR-326、hsa-miR-337、hsa-miR-497、hsa-miR-512-3p、hsa-miR-515-5p、h
sa-miR-517b、hsa-miR-517c、hsa-miR-518a、hsa-miR-518e、hsa-miR-519d、hsa-miR-520
g、hsa-miR-520h、hsa-miR-564、hsa-miR-566、hsa-miR-618、及び/又はhsa-miR-99aのう
ちの1つ又は複数を、末梢血ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に高いレベルで
発現する。
【００１５】
別の具体的な実施態様において、該複数のナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞を
、該複数のナチュラルキラー細胞が免疫調節化合物と接触させていない同等数の該ナチュ
ラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くのグランザイムBを発現するのに十分な量及
び時間で、該免疫調節化合物と接触させる。より具体的な実施態様において、該免疫調節
化合物は、レナリドミド又はポマリドミドである。別の具体的な実施態様において、該複
数のナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞を、該ナチュラルキラー細胞が免疫調節化
合物、例えば、レナリドミド又はポマリドミドと接触させていない同等数の該ナチュラル
キラー細胞よりも検出可能な程度に大きい該腫瘍細胞に対する細胞傷害性を示すのに十分
な量及び時間で、該免疫調節化合物と接触させる。別の具体的な実施態様において、該複
数のナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞は、BAX、CCL5、CCR5、CSF2、FAS、GUSB、
IL2RA、又はTNFRSF18のうちの1つ又は複数を、該免疫調節化合物と接触させていない同等
数の該ナチュラルキラー細胞よりも高いレベルで発現する。別の具体的な実施態様におい
て、該複数のナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞は、ACTB、BAX、CCL2、CCL3、CCL
5、CCR5、CSF1、CSF2、ECE1、FAS、GNLY、GUSB、GZMB、IL1A、IL2RA、IL8、IL10、LTA、P
RF1、PTGS2、SKI、及びTBX21のうちの1つ又は複数を、該免疫調節化合物と接触させてい
ない同等数の該ナチュラルキラー細胞よりも高いレベルで発現する。
【００１６】
別の実施態様において、該胎盤由来のナチュラルキラー細胞を、別の源、例えば、胎盤
血及び/又は臍帯血由来のナチュラルキラー細胞と組み合わせて、例えば、組み合わされ
たナチュラルキラー細胞を形成させる。
【００１７】
別の実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、混合された源、例え
ば、胎盤(例えば、胎盤灌流液)及び臍帯血由来のナチュラルキラー細胞である。例えば、
組み合わされたナチュラルキラー細胞は、マッチした臍帯血及びヒト胎盤灌流液、例えば
、ドナーがマッチした源から得ることができ、ここで、該胎盤灌流液は、臍帯血と同じ胎
盤から得られる。両方から得られるナチュラルキラー細胞を、別々に又は同時に単離し、
組み合わせる。一実施態様において、ナチュラルキラー細胞は、組み合わされた臍帯血及
びヒト胎盤灌流液から単離される。組み合わされたナチュラルキラー細胞は、本明細書に
おいて「pNK」細胞と呼ばれる場合もある。より具体的な実施態様において、該胎盤由来
のナチュラルキラー細胞を、別の源由来のナチュラルキラー細胞と、約100:1、95:5、90:
10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、35:65
、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、
70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:
1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1
:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100などの比で組み合わせる。一実施態様
において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、胎盤由来(例えば、胎盤灌流液由来)
の細胞と別の源、例えば、臍帯血由来の細胞の組合せから得られる。一実施態様において
、胎盤及び別の源由来の細胞を、組み合わされたナチュラルキラー細胞の単離の前に組み
合わせる。また別の実施態様において、ナチュラルキラー細胞を胎盤から単離し、それと
は別に、ナチュラルキラー細胞を他の源から単離し、その後、これら2つの源由来のナチ
ュラルキラー細胞を組み合わせて、組み合わされたナチュラルキラー細胞を形成させる。
【００１８】
具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は培養されない。他
の実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は培養される。
【００１９】
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数
のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの量のKIR2DL2/3+、NKp30+、2B4+、
及び/又はCD94+ナチュラルキラー細胞を含む。ある実施態様において、組み合わされたナ
チュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程
度に少ない量のNKp46+ナチュラルキラー細胞を含む。
【００２０】
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は:末梢血由来の同等数
のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+CD16-ナチュラルキ
ラー細胞;末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数
のCD3-CD56+CD16+ナチュラルキラー細胞;末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よ
りも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+KIR2DL2/L3+ナチュラルキラー細胞;末梢血由
来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD3-CD56+NKp46+
ナチュラルキラー細胞;末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程
度に多くの数のCD3-CD56+NKp30+ナチュラルキラー細胞;末梢血由来の同等数のナチュラル
キラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+2B4+ナチュラルキラー細胞;又は
末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56
+CD94+ナチュラルキラー細胞を含む。他の具体的な実施態様において、組み合わされたナ
チュラルキラー細胞は培養され:末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出
可能な程度に少ない数のCD3-CD56+KIR2DL2/L3+ナチュラルキラー細胞;末梢血由来の同等
数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+NKp46+ナチュラ
ルキラー細胞;末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多く
の数のCD3-CD56+NKp44+ナチュラルキラー細胞;末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細
胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+NKp30+ナチュラルキラー細胞を含む。
【００２１】
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、miRNAのhsa-miR-155
、hsa-miR-337、hsa-miR-422a、hsa-miR-549、及びhsa-miR-618のうちの1つ又は複数を、
末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの量で発現する
。ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、miRNAのhsa-let-7b
、hsa-miR-146b、hsa-miR-19b、hsa-miR-24、hsa-miR-347、hsa-miR-381、hsa-miR-517c
、及びhsa-miR-631のうちの1つ又は複数を、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞
よりも検出可能な程度に少ない量で発現する。
【００２２】
上記の方法のいずれかの具体的な実施態様において、該腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞であ
る。別の具体的な実施態様において、該腫瘍細胞は、液性腫瘍細胞、例えば、血液腫瘍細
胞である。より具体的な実施態様において、該腫瘍細胞は、原発性腺管癌細胞、白血病細
胞、急性T細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫(CML)細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性
骨髄性白血病(CML)細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、多発性骨髄
腫細胞、網膜芽腫細胞、結腸直腸癌細胞、又は結腸直腸腺癌細胞である。
【００２３】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、単離された胎盤CD56+、CD16-ナチュラ
ルキラー細胞、例えば、PINK細胞を含む組成物である。具体的な実施態様において、該胎
盤ナチュラルキラー細胞は、胎盤灌流液から単離される。別の具体的な実施態様において
、該胎盤ナチュラルキラー細胞は、胎盤組織の物理的破壊及び/又は酵素消化によって胎
盤から単離される。別の具体的な実施態様において、該ナチュラルキラー細胞は、該組成
物中の細胞の少なくとも50％を含む。具体的な実施態様において、該ナチュラルキラー細
胞は、該組成物中の細胞の少なくとも80％を含む。別の具体的な実施態様において、該組
成物は、単離されたCD56+、CD16+ナチュラルキラー細胞を含む。より具体的な実施態様に
おいて、該CD56+、CD16+ナチュラルキラー細胞は、該CD56+、CD16-ナチュラルキラー細胞
とは異なる個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該単離されたCD
56+、CD16-ナチュラルキラー細胞は、単一の個体に由来するものである。より具体的な実
施態様において、該単離されたCD56+、CD16-ナチュラルキラー細胞は、少なくとも2人の
異なる個体由来のナチュラルキラー細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該胎盤
ナチュラルキラー細胞、例えば、該PINK細胞を増殖させる。
【００２４】
より具体的な実施態様において、該組成物は、胎盤ナチュラルキラー細胞及び別の源由
来のナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施態様において、該他の源は、臍帯血(cor
d blood)及び/又は臍帯血(umbilical cord blood)である。別の具体的な実施態様におい
て、該他の源は、末梢血である。より具体的な実施態様において、該胎盤由来のナチュラ
ルキラー細胞を、別の源由来のナチュラルキラー細胞と、約100:1、95:5、90:10、85:15
、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、2
5:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1
、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:
5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70
、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100などの比で組み合わせる。具体的な実施態様に
おいて、該組成物は、胎盤細胞(例えば、胎盤灌流液)と別の源(例えば、臍帯血)由来の細
胞の組合せから得られるナチュラルキラー細胞を含む。
【００２５】
別の具体的な実施態様において、該組成物は、単離された胎盤灌流液を含む。より具体
的な実施態様において、該胎盤灌流液は、該ナチュラルキラー細胞と同じ個体に由来する
ものである。別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、該ナチュラルキラー
細胞とは異なる個体由来の胎盤灌流液を含む。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌
流液中の細胞の全て又は実質的に全て(例えば、90％、95％、98％、もしくは99％超)は、
胎児細胞である。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、胎児細胞及び母親細
胞を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液中の胎児細胞は、該灌流液中の
細胞の約90％、80％、70％、60％、又は50％未満を含む。別の具体的な実施態様において
、該灌流液は、0.9％NaCl溶液を胎盤血管系に通すことによって得られる。別の具体的な
実施態様において、該灌流液は培養培地を含む。別の具体的な実施態様において、該灌流
液は、複数の赤血球を除去するように処理されたものである。
【００２６】
別の具体的な実施態様において、該組成物は、胎盤灌流液細胞を含む。より具体的な実
施態様において、該胎盤灌流液細胞は、該ナチュラルキラー細胞と同じ個体に由来するも
のである。別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、該ナチュラルキラ
ー細胞とは異なる個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該組成物
は、単離された胎盤灌流液及び単離された胎盤灌流液細胞を含み、ここで、該単離された
灌流液及び該単離された胎盤灌流液細胞は、異なる個体に由来するものである。胎盤灌流
液を含む上記の実施態様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液
は、少なくとも2人の個体由来の胎盤灌流液を含む。胎盤灌流液細胞を含む上記の実施態
様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、該単離された胎盤灌流液細胞は、少
なくとも2人の個体に由来するものである。該組成物は、単離されたPINK細胞をさらに含
むことができ、ここで、該PINK細胞は、該胎盤灌流液又は該灌流液細胞とは異なる個体に
由来するものである。
【００２７】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、胎盤ナチュラルキラー細胞を単離する
方法であって、複数の胎盤細胞を得ること、及びナチュラルキラー細胞を該複数の胎盤細
胞から単離することを含む、方法である。一実施態様において、本明細書に提供されるの
は、ナチュラルキラー細胞を、混合された源、例えば、胎盤(例えば、胎盤灌流液)及び臍
帯血から単離する方法であって、複数の胎盤細胞及び臍帯血細胞を得ること、並びにナチ
ュラルキラー細胞を該複数の胎盤細胞及び臍帯血細胞から単離することを含む、方法であ
る。具体的な実施態様において、該胎盤細胞は、胎盤灌流液細胞、例えば、胎盤灌流液由
来の全有核細胞であるか、又は該細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該複数の
胎盤細胞は、胎盤組織の機械的及び/もしくは酵素的消化によって得られる胎盤細胞であ
るか、又は該細胞を含む。別の実施態様において、該単離することは、1以上の抗体を用
いて実施される。より具体的な実施態様において、該1以上の抗体は、CD3、CD16、又はCD
56に対する抗体のうちの1つ又は複数を含む。より具体的な実施態様において、該単離す
ることは、CD56+細胞を該複数の胎盤細胞中のCD56-細胞から単離することを含む。より具
体的な実施態様において、該単離することは、CD56+、CD16-胎盤細胞を、CD56-又はCD16+
である胎盤細胞から単離することを含む。より具体的な実施態様において、該単離するこ
とは、CD56+、CD16-、CD3-胎盤細胞を、CD56-、CD16+、又はCD3+である胎盤細胞から単離
することを含む。別の実施態様において、該胎盤ナチュラルキラー細胞を単離する方法は
、少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又
は少なくとも99％CD56+、CD16-ナチュラルキラー細胞である胎盤細胞の集団を生じさせる
。
【００２８】
上記の方法のある実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、培養で増殖させたものであ
る。ある実施態様において、該胎盤灌流液細胞及び別の源(例えば、臍帯血)由来の細胞は
、培養で増殖させたものである。ある実施態様において、胎盤(例えば、胎盤灌流液)から
得られた又は混合された源(例えば、胎盤及び臍帯血)から得られたナチュラルキラー細胞
は、培養で増殖させたものである。様々な実施態様において、該細胞は、少なくとも、約
、又はわずか1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、2
0、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30日間増殖させたものである。具体的な
実施態様において、該細胞は、フィーダー層の存在下で及び/又は少なくとも1つのサイト
カインの存在下で増殖させたものである。より具体的な実施態様において、該フィーダー
層は、K562細胞もしくは末梢血単核細胞(PBMC)、又は両方の組合せを含む。別のより具体
的な実施態様において、該少なくとも1つのサイトカインは、インターロイキン-2である
。
【００２９】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌を有する個体を治療する方法で
あって、該個体に、本明細書に記載の胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、胎盤中間ナチュラル
キラー細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞(例えば、胎盤及び別の源、例えば、
臍帯血から得られるナチュラルキラー細胞)、又はこれらの組合せの治療有効量を投与す
ることを含む、方法である。ある実施態様において、該個体は、固形腫瘍を有する。ある
他の実施態様において、該個体は、血液癌を有する。具体的な実施態様において、該個体
は、原発性腺管癌、白血病、急性T細胞白血病、慢性骨髄性リンパ腫(CML)、急性骨髄性白
血病、慢性骨髄性白血病(CML)、肺癌、結腸腺癌、組織球性リンパ腫、多発性骨髄腫、網
膜芽腫、結腸直腸癌、又は結腸直腸腺癌を有する。
【００３０】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、移植片対宿主病を有する個体を治
療する方法である。より具体的な実施態様において、該移植片対宿主病は、同種異系骨髄
移植後に発症する。別のより具体的な実施態様において、該移植片対宿主病は、固形臓器
移植後に発症する。別のより具体的な実施態様において、該移植片対宿主病は、複合組織
同種移植後に発症する。別のより具体的な実施態様において、該移植片対宿主病は、該投
与することにより、少なくとも1段階グレードが低下する。別のより具体的な実施態様に
おいて、該移植片対宿主病は、該投与することの結果として、移植後100日以内にグレー
ドIIを超えて進行しない。別のより具体的な実施態様において、該移植片対宿主病は、該
投与することの結果として、移植後100日以内にグレードIを超えて進行しない。
【００３１】
(3.1.定義)
本明細書で使用されるように、「組み合わされたナチュラルキラー細胞」は、例えば、
マッチした臍帯血及びヒト胎盤灌流液由来のナチュラルキラー細胞であり、ここで、胎盤
灌流液は、臍帯血と同じ胎盤から得られる。両方由来のナチュラルキラー細胞は、別々に
又は同時に単離され、組み合わされる。
【００３２】
本明細書で使用されるように、「PINK」及び「PINK細胞」は、ヒト胎盤、例えば、ヒト
胎盤灌流液又は機械的に及び/もしくは酵素的に破壊された胎盤組織から得られる胎盤中
間ナチュラルキラー細胞を指す。該細胞は、例えば、フローサイトメトリー、例えば、CD
56及びCD16に対する抗体を用いる蛍光活性化細胞選別によって決定したとき、CD56+及びC
D16-である。PINK細胞は、臍帯血だけから得られるものでも、末梢血だけから得られるも
のでもない。
【００３３】
本明細書で使用されるように、「胎盤灌流液」は、胎盤、例えば、ヒト胎盤の少なくと
も一部に通した、例えば、胎盤血管系に通した灌流溶液を意味し、これには、胎盤に通す
間に、該灌流溶液によって回収される複数の細胞が含まれる。
【００３４】
本明細書で使用されるように、「胎盤灌流液細胞」は、胎盤灌流液から単離されるか又
は単離可能である有核細胞、例えば、全有核細胞を意味する。
【００３５】
本明細書で使用されるように、「腫瘍細胞抑制」、「腫瘍細胞増殖の抑制」などは、例
えば、該腫瘍細胞の集団を、PINK細胞、PINK細胞を含む細胞の集団、組み合わされたナチ
ュラルキラー細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞を含む細胞の集団、ヒト胎盤灌
流液などと接触させることによって、例えば、該腫瘍細胞の集団内の腫瘍細胞の1つ又は
複数を死滅させることにより、腫瘍細胞の集団の成長を減速させることを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
(4.図面の簡単な説明)
【図１】抗CD3抗体及び抗CD56抗体を、CD56マイクロビーズによって選択されるヒト胎盤灌流液(HPP)由来の細胞に用いたフローサイトメトリーの結果を示す。単離された細胞の大部分は、CD56+CD3-である。
【００３７】
【図２】24時間の培養後のPINK細胞及び/又は腫瘍細胞によるサイトカインの産生を示す。図2Aは、単独での又はKG-1a腫瘍細胞の存在下での胎盤灌流液由来中間ナチュラルキラー細胞(PINK)細胞によるインターフェロンガンマ(IFNγ)の分泌を示す。PINK細胞及びKG-1a細胞を単独で又は1:1の比で組み合わせて培養した。Y軸:培養物によって産生されたIFNγのピコグラム。図2Bは、単独での又はKG-1a腫瘍細胞の存在下でのPINK細胞による顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)の分泌を示す。PINK細胞及びKG-1a細胞を単独で又は1:1の比で組み合わせて培養した。Y軸:培養物によって産生されたGM-CSFのピコグラム。
【００３８】
【図３】1:1、5:1、10:1、又は20:1のPINK細胞対腫瘍細胞の比での24時間の共培養におけるKG-1a腫瘍細胞に対するPINK細胞の細胞傷害性を示す。X軸: PINK細胞対腫瘍細胞の比。Y軸: PINK細胞なしの腫瘍細胞と比較した死滅した腫瘍細胞のパーセンテージ。
【００３９】
【図４】21日間培養された胎盤ナチュラルキラー細胞及び末梢血(PB)NK細胞のK562細胞に対する細胞傷害性を示す。エラーバーは、4ユニットの培養胎盤NK細胞又は3ユニットの培養末梢血NK細胞の標準偏差を表す。
【００４０】
【図５】1:1、5:1、10:1、もしくは20:1、又は100:1のHPP細胞対腫瘍細胞の比での24時間の共培養におけるKG-1a腫瘍細胞に対する胎盤から得られた全ヒト胎盤灌流液の細胞傷害性を示す。X軸: HPP細胞対腫瘍細胞の比。Y軸: HPP細胞なしの腫瘍細胞と比較した死滅した腫瘍細胞のパーセンテージ。
【００４１】
【図６】100:1、50:1、25:1、12.5:1、6.25:1、3.12:1、1.56:1、又は0.78:1のHPP細胞又はUCB細胞対腫瘍細胞の段階希釈での48時間の共培養におけるKG-1a腫瘍細胞に対する胎盤及び臍帯血から得られた全ヒト胎盤灌流液の細胞傷害性を示す。X軸: HPP細胞又は臍帯血細胞対腫瘍細胞の比。Y軸: HPP細胞又は臍帯血細胞なしの腫瘍細胞と比較した48時間の培養時間後の死滅した腫瘍細胞のパーセンテージ。
【００４２】
【図７】100:1、50:1、25:1、12.5:1、6.25:1、3.12:1、1.56:1、又は0.78:1のHPP細胞対腫瘍細胞の段階希釈での48時間の共培養におけるKG-1a腫瘍細胞に対する胎盤から得られた全ヒト胎盤灌流液の細胞傷害性を示す。灌流液は、回収された状態で使用されたか、又は100U/mLもしくは1000U/mLのインターロイキン-2(IL-2)で24時間刺激された。X軸: HPP細胞対腫瘍細胞の比。Y軸: HPP細胞なしの腫瘍細胞と比較した48時間の培養時間後の死滅した腫瘍細胞のパーセンテージ。
【００４３】
【図８】50:1の対腫瘍細胞比でHPP又はUCB細胞と培養した後の一群の腫瘍細胞株に対するヒト胎盤灌流液の細胞傷害効果を示す。図8A: 24時間の共培養。図8B: 48時間の共培養。X軸:試験した腫瘍細胞株。Y軸:腫瘍細胞の非存在下の腫瘍細胞の数と比較した共培養後の死滅した腫瘍細胞のパーセンテージ。
【００４４】
【図９】様々なHPP細胞対腫瘍細胞比でKG-1a腫瘍細胞と共培養したHPP細胞によるIFNγ産生を示す。X軸: HPP細胞対腫瘍細胞の比を含む実験条件。Y軸: 24時間の共培養後の1ミリリットル当たりのIFNγレベル。
【００４５】
【図１０】一群の腫瘍細胞との共培養におけるHPP又はUCB細胞によるIFNγの産生。HPP又はUCB細胞を50:1の対腫瘍細胞株比で24時間(図10A)又は48時間(図10B)共培養した。IFNγレベルをLuminexアッセイ(HCYTO-60K-03, Millipore)により決定した。X軸:試験された腫瘍細胞株。Y軸:腫瘍細胞の非存在下で産生されたIFNγのピコグラムと比較した、HPP又はUCB細胞によって産生されたIFNγのピコグラム。
【００４６】
【図１１】2×107個のヒト胎盤灌流液(HPP)細胞を約332mm3の体積のKG-1細胞腫瘍を有するマウスに投与したときの腫瘍サイズの低下を示す。腫瘍内−HPP細胞を皮下腫瘍部位に直接注射した。IV−HPP細胞を静脈内投与した。対照−ビヒクル投与のみ。腫瘍体積はmm3で表されている。
【００４７】
【図１２】ドナーがマッチしたヒト胎盤由来幹細胞及び臍帯血(CB)ユニット由来のNK細胞の比較を示す。(A)ドナーがマッチしたヒト胎盤由来幹細胞及びCBユニット由来のNK細胞の免疫表現型特徴付け; 2標本t-検定を用いて、母平均がヒト胎盤由来幹細胞とCBで等しいかどうかを判定した。(B)ドナーがマッチしたヒト胎盤由来幹細胞及びCBユニット由来の増殖させたNK細胞のK562細胞に対する細胞傷害性。E＝NK細胞; T＝腫瘍細胞。
【００４８】
【図１３】末梢血(PB)NK細胞と比較した胎盤由来NK細胞(pNK)細胞の表現型特徴付けを示す。(A)ドナーがマッチしたヒト胎盤由来幹細胞及びUCB(本明細書では「コンボユニット」と呼ばれる)由来のNK細胞(pNK)並びにPB由来のNK細胞(PB NK)のフローサイトメトリーによる同定。CD56+CD3-でゲートがかけられたNK細胞は、CD16、KIR3DL1、NKG2D、KIR2DL2/L3、NKp46、CD94、CD226、NKp44、NKp30、及び2B4を含む: NK細胞活性を調節するために重要な受容体のレパートリーを発現していた。(B) NK細胞単離前のコンボユニット由来のCD56+CD3- pNK細胞のパーセンテージ。(C)コンボユニット由来の90％のCD56+CD3- NK細胞をNK細胞単離後に獲得した。
【００４９】
【図１４】増殖させたpNK細胞の細胞周期解析を示す。(A)表示された様々な時点のエクスビボ増殖させたpNKの代表的なAPC-BrdU/7-AAD細胞周期解析。(B)表示された様々な時点のエクスビボ増殖させたpNKの様々な段階での細胞周期解析(n＝5)。
【００５０】
【図１５】エクスビボ増殖させたpNK細胞の増殖倍数、表現型、及び機能的特徴付けを示す。(A)21日目の増殖させたpNK細胞の増殖倍数及び細胞生存率。(B) 21日目の増殖させたpNK細胞の表現型特徴付け。(C) 21日目の増殖させたPB NK細胞と比較した表示された様々な時点の増殖させたpNK細胞のK562に対する細胞傷害性。
【００５１】
【図１６】広範囲の腫瘍細胞株に対する21日目のエクスビボ増殖させたpNK細胞の細胞傷害性を示す。表示された10:1、5:1、2:1、及び1:1のE:T比での広範囲の腫瘍細胞株に対するエクスビボ増殖させたpNK細胞の細胞傷害性。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
(5.詳細な説明)
本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の成長又は増殖を抑制するた
めの、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び/又はそのために得られるナチュラルキラー細
胞、例えば、胎盤灌流液由来中間ナチュラルキラー(「PINK」)細胞もしくは組み合わされ
たナチュラルキラー細胞の使用である。特に、本明細書に提供されるのは、胎盤灌流液、
例えば、ヒト胎盤灌流液から単離されるか、又は別の源、例えば、臍帯血(UCB)由来の細
胞と組み合わされた胎盤灌流液から単離されるか、又は機械的に及び/もしくは酵素的に
破壊された胎盤組織から単離される、ナチュラルキラー(NK)細胞及びNK細胞の集団、該NK
細胞を得る方法、並びに該細胞を使用する方法である。本明細書に提供されるのは、ナチ
ュラルキラー細胞を含む、細胞の集団、例えば、胎盤細胞の集団でもある。胎盤灌流液を
得る方法、及び胎盤灌流液由来の細胞を得る方法は、下の第5.1節に記載されている。胎
盤組織由来の細胞を得る方法は、下の第5.2節に記載されている。胎盤灌流液由来ナチュ
ラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー(PINK)細胞、及び該細胞を得る方法
は、下の第5.3節に記載されている。胎盤灌流液細胞由来のナチュラルキラー細胞及び別
の源、例えば、臍帯血由来の細胞、並びに組み合わされたナチュラルキラー細胞を得る方
法は、下の第5.4節に記載されている。胎盤灌流液、胎盤灌流液由来細胞、胎盤灌流液由
来ナチュラルキラー細胞、例えば、中間ナチュラルキラー細胞、及び組み合わされたナチ
ュラルキラー細胞を含む組成物、並びに該細胞を保存する方法及び該細胞を用いて腫瘍細
胞の増殖を抑制する方法は、下の第5.5〜5.7節に記載されている。
【００５３】
(5.1.胎盤灌流液)
(5.1.1.細胞回収組成物)
本明細書に提供される胎盤灌流液、灌流液細胞、及び胎盤灌流液由来ナチュラルキラー
細胞は、胎盤細胞回収組成物を用いた、哺乳動物、例えば、ヒトの分娩後胎盤の灌流によ
って回収することができる。灌流液は、任意の生理的に許容し得る溶液、例えば、生理食
塩水溶液、培養培地、又はより複雑な細胞回収組成物による胎盤の灌流によって、胎盤か
ら回収することができる。胎盤の灌流に、並びに灌流液細胞、例えば、全有核胎盤灌流液
細胞又はPINK細胞の回収及び保存に好適な細胞回収組成物は、引用により完全に本明細書
中に組み込まれる関連米国特許出願公開第2007/0190042号に詳細に記載されている。
【００５４】
細胞回収組成物は、幹細胞の回収及び/又は培養に好適な任意の生理的に許容し得る溶
液、例えば、生理食塩水溶液(例えば、リン酸緩衝生理食塩水、クレブス溶液、改変クレ
ブス溶液、イーグル溶液、0.9％NaClなど)、培養培地(例えば、DMEM、H.DMEMなど)などを
含むことができる。
【００５５】
細胞回収組成物は、回収の時点から培養の時点まで、胎盤細胞を保存する、すなわち、
胎盤細胞の死を防止するか、又は胎盤細胞の死を遅延させるか、死滅する細胞の集団内の
胎盤細胞の数を低下させるなどの傾向がある1以上の成分を含むことができる。そのよう
な成分は、例えば、アポトーシス阻害剤(例えば、カスパーゼ阻害剤もしくはJNK阻害剤);
血管拡張剤(例えば、硫酸マグネシウム、抗高血圧薬、心房性ナトリウム利尿ペプチド(AN
P)、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリ
ウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシン、もしくは硫酸
マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など);壊死阻害剤(例えば、2-(1H-インドー
ル-3-イル)-3-ペンチルアミノ-マレイミド、ピロリジンジチオカルバメート、もしくはク
ロナゼパム); TNF-α阻害剤;及び/又は酸素運搬ペルフルオロカーボン(例えば、臭化ペル
フルオロオクチル、臭化ペルフルオロデシルなど)であることができる。
【００５６】
細胞回収組成物は、1以上の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロ
テアーゼ、中性プロテアーゼ、ヒアルロニダーゼ、RNアーゼ、又はDNアーゼなどを含むこ
とができる。そのような酵素としては、コラゲナーゼ(例えば、コラゲナーゼI、II、III
、又はIV、クロストリジウム・ヒストリチクム(Clostridium histolyticum)由来のコラゲ
ナーゼなど);ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、LIBERASE、ヒア
ルロニダーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
細胞回収組成物は、殺菌又は静菌有効量の抗生物質を含むことができる。ある非制限的
な実施態様において、抗生物質は、マクロライド(例えば、トブラマイシン)、セファロス
ポリン(例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファク
ロル、セフィキシム、もしくはセファドロキシル)、クラリスロマイシン、エリスロマイ
シン、ペニシリン(例えば、ペニシリンV)、又はキノロン(例えば、オフロキサシン、シプ
ロフロキサシン、もしくはノルフロキサシン)、テトラサイクリン、ストレプトマイシン
などである。特定の実施態様において、抗生物質は、グラム(+)及び/又はグラム(-)細菌
、例えば、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)
などに対して活性がある。
【００５８】
細胞回収組成物は、以下の化合物のうち1つ又は複数を含むこともできる:アデノシン(
約1mM〜約50mM); D-グルコース(約20mM〜約100mM);マグネシウムイオン(約1mM〜約50mM);
一実施態様において、内皮の完全性及び細胞の生存能力を維持するのに十分な量で存在す
る、分子量20,000ダルトン超の巨大分子(例えば、約25g/l〜約100g/l、もしくは約40g/l
〜約60g/lで存在する、合成もしくは天然のコロイド、デキストランなどの多糖類、もし
くはポリエチレングリコール);酸化防止剤(例えば、約25μM〜約100μMで存在するブチル
化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンC、も
しくはビタミンE);還元剤(例えば、約0.1mM〜約5mMで存在するN-アセチルシステイン);細
胞内へのカルシウム進入を防止する薬剤(例えば、約2μM〜約25μMで存在するベラパミル
);ニトログリセリン(例えば、約0.05g/L〜約0.2g/L);一実施態様において、残留血液の凝
固の防止を助けるのに十分な量で存在する抗凝血剤(例えば、約1000ユニット/l〜約100,0
00ユニット/lの濃度で存在するヘパリンもしくはヒルジン);又はアミロライド含有化合物
(例えば、約1.0μM〜約5μMで存在するアミロライド、エチルイソプロピルアミロライド
、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド、もしくはイソブチルアミロライ
ド)。
【００５９】
(5.1.2.胎盤の回収及び取扱い)
通常、ヒトの胎盤を、出産後のその娩出後すぐに回収する。好ましい実施態様において
、インフォームドコンセントの後、及び患者の全病歴を取得して、該胎盤と関連付けた後
、胎盤を患者から回収する。好ましくは、この病歴は分娩後も続く。そのような病歴を用
いて、胎盤又はそれから回収された細胞のその後の使用を調整することができる。例えば
、ヒト胎盤細胞を、病歴を考慮して、該胎盤と関連する乳児、又は該乳児の両親、兄弟、
もしくはその他の親族の個別化医療のために使用することができる。
【００６０】
灌流液の回収前に、臍帯血及び胎盤血を除去する。ある実施態様において、分娩後、胎
盤内の臍帯血を回収する。胎盤は、従来の臍帯血の回収プロセスに供することができる。
通常、針又はカニューレを用い、重力の助けを借りて、胎盤を放血させる(例えば、Ander
sonの米国特許第5,372,581号: Hesselらの米国特許第5,415,665号を参照されたい)。針又
はカニューレを、通常、臍帯静脈内に留置し、胎盤を穏やかにマッサージして、胎盤から
の臍帯血の排出を助けることができる。そのような臍帯血の回収は、商業的に、例えば、
LifeBank Inc.、Cedar Knolls, N.J.、ViaCord、Cord Blood Registry、及びCryoCellに
より行われてもよい。好ましくは、臍帯血を回収する間の組織破壊を最小限に抑えるため
に、胎盤を、それ以上操作することなく、重力排出させる。
【００６１】
通常、臍帯血の回収及び灌流液の回収のために、胎盤を、分娩室又は出産室から別の場
所、例えば、実験室まで輸送する。例えば、胎盤を、近位臍帯をクランプしたまま、滅菌
されたジップロック式プラスチックバッグの中に入れ、その後、このプラスチックバッグ
を断熱容器内に入れることによって、胎盤を(胎盤の温度を20〜28℃に維持する)滅菌され
た断熱輸送装置に入れて輸送することが好ましい。別の実施態様において、米国特許第7,
147,626号に実質的に記載されているように、胎盤を臍帯血回収キットに入れて輸送する
。好ましくは、胎盤を、分娩から4〜24時間後に、実験室に移送する。ある実施態様にお
いて、臍帯血の回収前に、近位臍帯を、好ましくは、胎盤への挿入部から4〜5cm(センチ
メートル)以内のところでクランプする。他の実施態様において、臍帯血の回収後、しか
し、それ以上の胎盤の処理前に、近位臍帯をクランプする。
【００６２】
胎盤を、灌流液の回収前に、滅菌条件下、かつ室温又は5〜25℃の温度(摂氏)のどちら
かで保存することができる。胎盤を灌流して残留臍帯血を除去する前に、胎盤を、48時間
よりも長い時間、好ましくは4〜24時間、保存してもよい。胎盤は、5〜25℃の温度(摂氏)
で、抗凝血剤溶液に入れて保存することが好ましい。好適な抗凝血剤溶液は当技術分野で
周知である。例えば、ヘパリン又はワルファリンナトリウム溶液を用いることができる。
好ましい実施態様において、抗凝血剤溶液は、ヘパリン溶液(例えば、1:1000溶液中に1％
w/w)を含む。放血された胎盤は、胎盤灌流液を回収する前に、36時間を超えない時間、保
存することが好ましい。
【００６３】
(5.1.3.胎盤灌流)
哺乳動物の胎盤を灌流する方法は、例えば、その開示が引用により完全に本明細書中に
組み込まれる、Haririの米国特許第7,045,148号及び第7,255,879号、並びに「臓器を回収
及び保存するための改良された組成物(Improved Composition for Collecting and Prese
rving Organs」という表題の米国出願公開第2007/0190042号に開示されている。
【００６４】
灌流液は、灌流溶液、例えば、生理食塩水溶液、培養培地、又は上記の細胞回収組成物
を、胎盤血管系に通すことによって得ることができる。一実施態様において、哺乳動物の
胎盤を、灌流溶液を臍帯動脈と臍帯静脈のどちらか又は両方に通すことによって灌流する
。胎盤を通る灌流溶液の流れを、例えば、胎盤の中への重力流を用いて達成することがで
きる。好ましくは、灌流溶液を、ポンプ、例えば、蠕動ポンプを用いて、胎盤に強制的に
通す。臍帯静脈に、例えば、滅菌チューブなどの滅菌された接続装置に接続されている、
カニューレ、例えば、TEFLON(登録商標)又はプラスチックカニューレを挿入することがで
きる。この滅菌された接続装置は、灌流マニフォールドに接続されている。
【００６５】
灌流に備えて、臍帯動脈及び臍帯静脈が胎盤の最も高い地点に位置するような形で、胎
盤を配置することが好ましい。灌流溶液を胎盤血管系に通すか、又は胎盤血管系及び周辺
組織に通すことによって、胎盤を灌流することができる。一実施態様において、臍帯動脈
及び臍帯静脈を、可撓性コネクタを介して灌流溶液のリザーバに接続されているピペット
に同時に接続する。灌流溶液を臍帯静脈及び臍帯動脈に通す。灌流溶液は、血管壁から滲
出し、及び/又は血管壁を通って胎盤の周辺組織に入り、妊娠中に母体の子宮に付着して
いた胎盤表面から好適な開放容器に回収される。灌流溶液を、臍帯開口部を介して導入し
、母体子宮壁と接触していた胎盤壁の開口部から流出又は浸出させることもできる。別の
実施態様において、灌流溶液を、臍帯静脈に通し、臍帯動脈から回収するか、又は臍帯動
脈に通し、臍帯静脈から回収する、すなわち、胎盤血管系(胎児組織)のみに通す。
【００６６】
一実施態様において、例えば、臍帯動脈及び臍帯静脈を、例えば、可撓性コネクタを介
して灌流溶液のリザーバに接続されているピペットに同時に接続する。灌流溶液を臍帯静
脈及び臍帯動脈に通す。灌流溶液は、血管壁から滲出し、及び/又は血管壁を通って胎盤
の周辺組織に入り、妊娠中に母体の子宮に付着していた胎盤表面から好適な開放容器に回
収される。灌流溶液を、臍帯開口部を介して導入し、母体子宮壁と接触していた胎盤壁の
開口部から流出又は浸出させることもできる。「受け皿(pan)」法と呼ぶことができるこ
の方法によって回収される胎盤細胞は、通常、胎児細胞と母親細胞の混合物である。
【００６７】
別の実施態様において、灌流溶液を臍帯静脈に通し、臍帯動脈から回収するか、又は臍
帯動脈に通し、臍帯静脈から回収する。「閉回路」法と呼ぶことができるこの方法によっ
て回収される胎盤細胞は、通常、ほとんど胎児のものしかない。
【００６８】
閉回路灌流法は、一実施態様において、次のように実施することができる。分娩後胎盤
を、出産後、約48時間以内に得る。臍帯をクランプし、クランプの上方で切断する。臍帯
は、廃棄することができるか、又は例えば、臍帯幹細胞を回収するために、及び/もしく
は生体材料の産生用に臍帯膜を処理するために、処理することができる。羊膜を灌流の間
保持することができるか、又は例えば、指を用いる鈍的剥離を用いて、絨毛膜から分離す
ることができる。羊膜を灌流前に絨毛膜から分離する場合、それを、例えば、廃棄するか
、又は例えば、酵素的消化によって幹細胞を得るために、もしくは例えば、羊膜生体材料
、例えば、米国特許出願公開第2004/0048796号に記載されている生体材料を産生するため
に、処理することができる。例えば、滅菌ガーゼを用いて、全ての目に見える血の塊及び
残留血液を胎盤から除去した後、例えば、臍帯膜を一部切断して、臍帯の断面を露出させ
ることにより、臍帯血管を露出させる。血管を確認し、それを、例えば、閉じたアリゲー
タークランプを各々の血管の切断端に通して前進させることによって広げる。その後、装
置、例えば、灌流装置又は蠕動ポンプに接続されたプラスチックチューブを胎盤動脈の各
々に挿入する。ポンプは、この目的に好適な任意のポンプ、例えば、蠕動ポンプであるこ
とができる。その後、滅菌された回収リザーバ、例えば、250mL回収バッグなどの血液バ
ッグに接続されたプラスチックチューブを胎盤静脈に挿入する。或いは、ポンプに接続さ
れたチューブを胎盤静脈に挿入し、回収リザーバ(複数可)に接続されたチューブを胎盤動
脈の一方又は両方に挿入する。その後、胎盤を、一定の体積の灌流溶液、例えば、約750m
lの灌流溶液で灌流する。その後、灌流液中の細胞を、例えば、遠心分離によって回収す
る。
【００６９】
一実施態様において、灌流の間、近位臍帯をクランプし、より好ましくは、胎盤への臍
帯挿入部から4〜5cm(センチメートル)以内のところで、近位臍帯をクランプする。
【００７０】
放血プロセスの間の哺乳動物の胎盤からの灌流液の最初の回収物は、通常、臍帯血及び
/又は胎盤血の残留赤血球のために色が付いている。該灌流液は、灌流が進み、残留臍帯
血細胞が胎盤から洗い流されるにつれて、より無色になっていく。通常、最初に胎盤から
血液を洗い流すためには、30〜100mLの灌流液で十分であるが、観察された結果次第で、
より多くの又はより少ない灌流液を用いることができる。
【００７１】
胎盤を灌流するために使用される灌流液の体積は、回収しようとする胎盤細胞の数、胎
盤の大きさ、単一の胎盤から行われる回収の回数などによって異なり得る。様々な実施態
様において、灌流液の体積は、50mL〜5000mL、50mL〜4000mL、50mL〜3000mL、100mL〜200
0mL、250mL〜2000mL、500mL〜2000mL、又は750mL〜2000mLであることができる。通常、放
血後、胎盤を700〜800mLの灌流液で灌流する。
【００７２】
胎盤を、数時間又は数日間かけて、複数回灌流することができる。胎盤を複数回灌流し
ようとする場合、それを、容器(container)又は他の好適な容器(vessel)中、無菌条件下
で維持又は培養し、細胞回収組成物、或いは標準的な灌流溶液(例えば、抗凝血剤(例えば
、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン)を含むかも
しくは含まない、及び/又は抗微生物剤(例えば、β-メルカプトエタノール(0.1mM):スト
レプトマイシン(例えば、40〜100μg/ml)、ペニシリン(例えば、40U/ml)、アンフォテリ
シンB(例えば、0.5μg/ml)などの抗生物質を含むかもしくは含まない通常の生理食塩水溶
液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水(「PBS」))で灌流することができる。一実施態様にお
いて、単離された胎盤を、灌流及び灌流液の回収前に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10
、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、もしくは24時間、又は2もし
くは3日間、又はそれより長い間、維持又は培養するように、該胎盤を、灌流液を回収し
ないで、しばらくの間、維持又は培養する。灌流された胎盤を、さらにもう1回以上、例
えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21
、22、23、24時間、又はそれより長い時間、維持し、例えば、700〜800mLの灌流液で再び
灌流することができる。胎盤を、1、2、3、4、5回、又はそれより多く、例えば、1、2、3
、4、5、又は6時間に1回、灌流することができる。好ましい実施態様において、回収され
た有核細胞の数が100細胞/mlを下回るまで、胎盤の灌流、及び灌流溶液、例えば、胎盤細
胞回収組成物の回収を繰り返す。異なる時点の灌流液をさらに個別に処理して、細胞、例
えば、全有核細胞の時間依存的な集団を回収することができる。異なる時点からの灌流液
をプールすることもできる。
【００７３】
(5.1.4.胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞)
胎盤灌流液は、不均質な細胞の集まりを含む。通常、使用前に、胎盤灌流液から赤血球
を除去する。そのような除去は、赤血球を有核血液細胞から分離する公知の方法によって
実施することができる。ある実施態様において、該灌流液又は灌流液細胞は、凍結保存さ
れる。ある実施態様において、胎盤灌流液由来の細胞は、凍結保存前に増殖させられるこ
とも、培養されることもない。ある実施態様において、該胎盤灌流液は、胎児細胞のみも
しくは胎児細胞と母親細胞の組合せを含み、又は該灌流液細胞は、胎児細胞のみもしくは
胎児細胞と母親細胞の組合せを含む。
【００７４】
通常、単回の胎盤灌流由来の胎盤灌流液は、約1億〜約5億個の有核細胞を含む。ある実
施態様において、該胎盤灌流液又は灌流液細胞は、幹細胞を含む。ある実施態様において
、該胎盤灌流液又は灌流液細胞は、CD34+細胞、例えば、造血幹細胞又は前駆細胞を含む
。そのような細胞は、より具体的な実施態様において、CD34+CD45-幹細胞もしくは前駆細
胞、CD34+CD45+幹細胞もしくは前駆細胞、骨髄前駆細胞、リンパ前駆細胞、及び/又は赤
血球前駆細胞を含むことができる。他の実施態様において、胎盤灌流液及び胎盤灌流液細
胞は、接着性胎盤幹細胞、例えば、CD34-幹細胞を含む。他の実施態様において、該胎盤
灌流液及び胎盤灌流液細胞は、例えば、内皮前駆細胞、骨前駆細胞、及びナチュラルキラ
ー細胞を含む。ある実施態様において、胎盤から回収され、赤血球が除去された胎盤灌流
液、又はそのような灌流液から単離された灌流液細胞は、例えば、フローサイトメトリー
、例えば、FACS解析によって測定したとき、約6〜7％のナチュラルキラー細胞(CD3-、CD5
6+);約21〜22％のT細胞(CD3+);約6〜7％のB細胞(CD19+);約1〜2％の内皮前駆細胞(CD34+
、CD31+);約2〜3％の神経前駆細胞(ネスチン+);約1〜5％(例えば、2〜5％)の造血前駆細
胞(CD34+);及び約0.5〜1.5％の接着性胎盤幹細胞(例えば、CD34-、CD117-、CD105+、及び
CD44+)を含む。
【００７５】
(5.2.PINK細胞を得るための胎盤組織の破壊及び消化)
胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞は、機械的に及び/又は酵素的に破壊さ
れた胎盤組織から得ることができる。
【００７６】
胎盤組織は、1以上の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアー
ゼ、中性プロテアーゼ、RNアーゼ、又はDNアーゼなどを用いて破壊することができる。そ
のような酵素としては、コラゲナーゼ(例えば、コラゲナーゼI、II、III、又はIV、クロ
ストリジウム・ヒストリチクム由来のコラゲナーゼなど);ディスパーゼ、サーモリシン、
エラスターゼ、トリプシン、LIBERASE、ヒアルロニダーゼなどが挙げられるが、これらに
限定されない。通常、消化後、消化された組織をストレイナー又はフィルターに通して、
部分消化された細胞塊を除去し、実質的に単一細胞の細胞懸濁液にする。
【００７７】
胎盤細胞の懸濁液を得た後、ナチュラルキラー細胞を、例えば、CD3及びCD56に対する
抗体を用いて単離することができる。具体的な実施態様において、胎盤ナチュラルキラー
細胞は、CD56+である細胞を選択して、第一の細胞集団を産生すること;該第一の細胞集団
をCD3及び/又はCD16に特異的な抗体と接触させること;並びにCD3+又はCD56+である細胞を
該第一の細胞集団から除去し、それにより、実質的にCD56+及びCD3-、CD56+及びCD16-、
又はCD56+、CD3-、及びCD16-である第二の細胞集団を産生することによって単離される。
【００７８】
一実施態様において、磁気ビーズを用いて、胎盤ナチュラルキラー細胞を胎盤細胞の懸
濁液から単離する。該細胞は、例えば、1以上の特異的抗体、例えば、抗CD56抗体を含む
磁気ビーズ(例えば、約0.5〜100μmの直径)に結合するその能力に基づいて粒子を分離す
る方法である、磁気活性化細胞選別(MACS)技術を用いて単離することができる。特定の細
胞表面分子又はハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加を含む、種々の有用な
修飾を、磁気マイクロスフェアに対して行うことができる。その後、該ビーズを該細胞と
混合して、結合させる。その後、細胞を磁場に通して、特異的な細胞表面マーカーを有す
る細胞を完全に分離する。一実施態様において、その後、これらの細胞を単離し、さらな
る細胞表面マーカーに対する抗体に結合した磁気ビーズと再び混合する。該細胞を再び磁
場に通し、両方の抗体に結合した細胞を単離する。その後、そのような細胞を希釈して、
個別のディッシュ、例えば、クローン単離用のマイクロタイターディッシュに入れること
ができる。
【００７９】
(5.3.胎盤ナチュラルキラー細胞)
一態様において、本明細書に提供されるのは、胎盤から、例えば、胎盤灌流液から及び
/又は機械的に及び/もしくは酵素的に破壊された胎盤組織から得ることができるナチュラ
ルキラー細胞、並びにそのようなナチュラルキラー細胞を含む組成物の単離、特徴付け、
及び使用である。具体的な実施態様において、該胎盤ナチュラルキラー細胞は、「胎盤中
間ナチュラルキラー細胞」又は「PINK」細胞であり、CD56+CD16-である、すなわち、例え
ば、フローサイトメトリー、例えば、上記のような、CD16及びCD56に対する抗体を用いる
蛍光活性化細胞選別によって測定したとき、CD56細胞マーカーを示し、かつCD16細胞マー
カーを欠如していると特徴付けられる。したがって、本明細書に提供されるのは、単離さ
れたPINK細胞及び単離された複数のPINK細胞である。また本明細書に提供されるのは、CD
56+CD16- PINK細胞をCD56+CD16+ナチュラルキラー細胞との組合せで含む単離された複数
の細胞である。より具体的な実施態様において、該CD56+CD16+ナチュラルキラー細胞は、
胎盤から、又は別の源、例えば、末梢血、臍帯血、骨髄などから単離することができる。
したがって、様々な他の実施態様において、PINK細胞を、CD56+CD16+ナチュラルキラー細
胞と、例えば、約1:10、2:9、3:8、4:7、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、1:10、1:9、1:8、1:
7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、又は約9:1の
比で組み合わせることができる。この文脈で使用される場合、「単離された」とは、細胞
がその通常の環境、例えば、胎盤から取り出されていることを意味する。
【００８０】
ある実施態様において、PINK細胞は、CD3-である。
【００８１】
他の実施態様において、PINK細胞は、完全に成熟したナチュラルキラー細胞によって示
される1以上の細胞マーカー(例えば、CD16)を示さないか、又はそのような1以上のマーカ
ーを完全に成熟したナチュラルキラー細胞と比較して検出可能な程度に低下したレベルで
示すか、又はナチュラルキラー細胞前駆細胞と関連するが、完全に成熟したナチュラルキ
ラー細胞と関連しない1以上の細胞マーカーを示す。具体的な実施態様において、本明細
書に提供されるPINK細胞は、NKG2D、CD94、及び/又はNKp46を、完全に成熟したNK細胞よ
りも検出可能な程度に低いレベルで発現する。別の具体的な実施態様において、本明細書
に提供される複数のPINK細胞は、全体で、NKG2D、CD94、及び/又はNKp46を、同等数の完
全に成熟したNK細胞よりも検出可能な程度に低いレベルで発現する。
【００８２】
ある実施態様において、PINK細胞は、マイクロRNAのhsa-miR-100、hsa-miR-127、hsa-m
iR-211、hsa-miR-302c、hsa-miR-326、hsa-miR-337、hsa-miR-497、hsa-miR-512-3p、hsa
-miR-515-5p、hsa-miR-517b、hsa-miR-517c、hsa-miR-518a、hsa-miR-518e、hsa-miR-519
d、hsa-miR-520g、hsa-miR-520h、hsa-miR-564、hsa-miR-566、hsa-miR-618、及び/又はh
sa-miR-99aのうちの1つ又は複数を、末梢血ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度
に高いレベルで発現する。
【００８３】
ある実施態様において、胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞は、培養で増殖
させたものである。ある他の実施態様において、胎盤灌流液細胞は、培養で増殖させたも
のである。具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、フィーダー層の存在下で及
び/又は少なくとも1つのサイトカインの存在下で増殖させたものである。より具体的な実
施態様において、該フィーダー層は、K562細胞又は末梢血単核細胞を含む。別のより具体
的な実施態様において、該少なくとも1つのサイトカインは、インターロイキン-2である
。
【００８４】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、単離された複数のPINK細胞(例え
ば、PINK細胞集団)である。別の具体的な実施態様において、該単離された細胞集団は、
胎盤灌流液由来の細胞のCD56マイクロビーズ単離によって産生される。様々な具体的な実
施態様において、該集団は、少なくとも約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、
85％、90％、95％、98％、又は少なくとも約99％のPINK細胞を含む。別の実施態様におい
て、該複数のPINK細胞は、増殖させていない;例えば、胎盤灌流液から回収された状態のP
INK細胞を含むか、又は該PINK細胞からなる。別の実施態様において、該複数のPINK細胞
は、増殖PINK細胞を含むか、又は該PINK細胞からなる。ナチュラルキラー細胞を増殖させ
る方法は、例えば、Ohnoらの文献、米国特許出願公開第2003/0157713号に記載されている
; Ysselらの文献、J. Immunol. Methods 72(1):219-227(1984)及びLitwinらの文献、J. E
xp. Med. 178(4):1321-1326(1993)、並びに下の実施例1のナチュラルキラー細胞の増殖に
関する記載も参照されたい。
【００８５】
他の実施態様において、該単離された複数のPINK細胞は、完全に成熟したナチュラルキ
ラー細胞によって示される1以上の細胞マーカー(例えば、CD16)を示さないか、又はその
ような1以上のマーカーを完全に成熟したナチュラルキラー細胞と比較して検出可能な程
度に低下したレベルで示すか、又はナチュラルキラー細胞前駆細胞と関連するが、完全に
成熟したナチュラルキラー細胞と関連しない1以上の細胞マーカーを示す。具体的な実施
態様において、本明細書に提供されるPINK細胞は、NKG2D、CD94、及び/又はNKp46を、完
全に成熟したNK細胞よりも検出可能な程度に低いレベルで発現する。別の具体的な実施態
様において、本明細書に提供される複数のPINK細胞は、全体で、NKG2D、CD94、及び/又は
NKp46を、同等数の完全に成熟したNK細胞よりも検出可能な程度に低いレベルで発現する
。
【００８６】
ある具体的な実施態様において、該PINK細胞集団は、マイクロRNAのhsa-miR-100、hsa-
miR-127、hsa-miR-211、hsa-miR-302c、hsa-miR-326、hsa-miR-337、hsa-miR-497、hsa-m
iR-512-3p、hsa-miR-515-5p、hsa-miR-517b、hsa-miR-517c、hsa-miR-518a、hsa-miR-518
e、hsa-miR-519d、hsa-miR-520g、hsa-miR-520h、hsa-miR-564、hsa-miR-566、hsa-miR-6
18、及び/又はhsa-miR-99aのうちの1つ又は複数を、末梢血ナチュラルキラー細胞よりも
検出可能な程度に高いレベルで発現する。別の具体的な実施態様において、該PINK細胞集
団は、同等数の末梢血ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの量のグランザ
イムBを発現する。
【００８７】
他の実施態様において、本明細書に提供されるPINK細胞は、培養で増殖させたものであ
る。具体的な実施態様において、該PINK細胞は、少なくとも、約、又は多くとも1、2、3
、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
25、26、27、又は28日間培養したもの、例えば、培養で増殖させたものである。具体的な
実施態様において、該PINK細胞は、約21日間培養される。
【００８８】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、PINK細胞を含む、単離された細胞
、例えば、胎盤細胞の集団である。具体的な実施態様において、該単離された細胞の集団
は、自己の単離されたPINK細胞を含む、胎盤灌流液由来の全有核細胞、例えば、胎盤灌流
液細胞である。別の具体的な実施態様において、該細胞の集団は、胎盤灌流液由来の細胞
のCD56マイクロビーズ単離によって産生される単離された細胞の集団である。様々な具体
的な実施態様において、該集団は、少なくとも約50％、55％、60％、65％、70％、75％、
80％、85％、90％、95％、98％、又は少なくとも約99％のPINK細胞を含む。
【００８９】
分娩後胎盤は、胎児由来及び母親由来の組織及び細胞を含むので、胎盤灌流液は、回収
方法に応じて、胎児細胞のみ、又は胎児細胞の実質的大部分(例えば、約90％、95％、98
％、もしくは99％超)を含むことができるか、或いは胎児細胞と母親細胞の混合物(例えば
、該胎児細胞は、該灌流液の全有核細胞の約90％、80％、70％、60％、又は50％未満を含
む)を含むことができる。一実施態様において、PINK細胞は、胎児胎盤細胞、例えば、胎
盤の閉回路灌流(上記参照)から得られる細胞のみに由来しており、ここで、該灌流は、胎
児胎盤細胞の実質的大部分、又は胎児胎盤細胞のみを含む灌流液を生じさせる。別の実施
態様において、PINK細胞は、胎児細胞及び母親細胞、例えば、受け皿法(上記参照)による
灌流によって得られる細胞に由来しており、ここで、該灌流は、胎児細胞と母親胎盤細胞
の混合物を含む灌流液を生じさせた。したがって、一実施態様において、本明細書に提供
されるのは、その実質的大部分が胎児の遺伝子型を有する胎盤由来中間ナチュラルキラー
細胞の集団である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、胎児の遺伝子型
を有するナチュラルキラー細胞及び母親の表現型を有するナチュラルキラー細胞を含む胎
盤由来中間ナチュラルキラー細胞の集団である。
【００９０】
また本明細書に提供されるのは、非胎盤源由来のナチュラルキラー細胞を含む胎盤由来
中間ナチュラルキラー細胞の集団である。例えば、一実施態様において、本明細書に提供
されるのは、臍帯血、末梢血、骨髄、又は前述のもののうちの2以上の組合せ由来のナチ
ュラルキラー細胞も含むPINK細胞の集団である。一実施態様において、本明細書に提供さ
れるのは、臍帯血由来のナチュラルキラー細胞も含むPINK細胞の集団である。PINK細胞及
び非胎盤源由来のナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞の集団は、該細胞を
、例えば、約1:10、2:9、3:8、4:7、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、10:1、1:9、1:8、1:7、1
:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、100:1、95:5
、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、3
5:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75
:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1
、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:6
0、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、又は約1:100などの比で含むことができ
る。
【００９１】
さらに本明細書に提供されるのは、臍帯血と単離されたPINK細胞の組合せである。様々
な実施態様において、臍帯血を、PINK細胞と、臍帯血1ミリリットル当たり約1×104、5×
104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、もしくは5×108個、
又はそれより多くのPINK細胞で組み合わせる。
【００９２】
また本明細書に提供されるのは、PINK細胞を単離する方法である。一実施態様において
、PINK細胞は、胎盤灌流液を得、その後、該胎盤灌流液を、CD56+細胞に特異的に結合す
る組成物、例えば、CD56に対する抗体と接触させ、その後、該結合に基づいてCD56+細胞
を単離して、CD56+細胞の集団を形成させることにより回収される。該CD56+細胞の集団は
、単離されたナチュラルキラー細胞の集団を含む。具体的な実施態様において、CD56+細
胞を、CD16+細胞に特異的に結合する組成物、例えば、CD16に対する抗体と接触させ、CD1
6+細胞をCD56+細胞の集団から排除する。別の具体的な実施態様において、CD3+細胞もCD5
6+細胞の集団から排除する。
【００９３】
一実施態様において、PINK細胞は、次のように、胎盤灌流液から得られる。分娩後ヒト
胎盤を放血させ、例えば、約200〜800mLの灌流溶液を胎盤血管系のみに通して灌流する。
具体的な実施態様において、胎盤から臍帯血を抜き、例えば、灌流溶液を胎盤血管系に流
して、該灌流の前に残留血液を除去する。灌流液を回収し、処理して、残留赤血球を除去
する。該灌流液中の全有核細胞中のナチュラルキラー細胞は、CD56及びCD16の発現に基づ
いて単離することができる。ある実施態様において、PINK細胞の単離は、CD56に対する抗
体を用いる単離を含み、ここで、単離される細胞はCD56+である。別の実施態様において
、PINK細胞の単離は、CD16に対する抗体を用いる単離を含み、ここで、単離される細胞は
CD16-である。別の実施態様において、PINK細胞の単離は、CD56に対する抗体を用いる単
離、及びCD16に対する抗体を用いる複数の非PINK細胞の排除を含み、ここで、単離される
細胞は、CD56+、CD16-細胞を含む。
【００９４】
細胞分離は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、蛍光活性化細胞選別(FACS)、又
は好ましくは、特異的抗体にコンジュゲートしたマイクロビーズを用いる磁気細胞選別に
よって達成することができる。磁気細胞選別は、例えば、AUTOMACS(商標) Separator(Mil
tenyi)を用いて実施し、自動化することができる。
【００９５】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、胎盤ナチュラルキラー細胞を単離する
方法であって、複数の胎盤細胞を得ること、及びナチュラルキラー細胞を該複数の胎盤細
胞から単離することを含む、方法である。具体的な実施態様において、該胎盤細胞は、胎
盤灌流液細胞、例えば、胎盤灌流液由来の全有核細胞であるか、又は該細胞を含む。別の
具体的な実施態様において、該複数の胎盤細胞は、胎盤組織の機械的及び/もしくは酵素
的消化によって得られた胎盤細胞であるか、又は該細胞を含む。別の実施態様において、
該単離することは、1以上の抗体を用いて行われる。より具体的な実施態様において、該1
以上の抗体は、CD3、CD16、又はCD56に対する抗体のうちの1つ又は複数を含む。より具体
的な実施態様において、該単離することは、CD56+細胞を該複数の胎盤細胞中のCD56-細胞
から単離することを含む。より具体的な実施態様において、該単離することは、CD56+、C
D16-胎盤細胞、例えば、胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞を、CD56-又はCD1
6+である胎盤細胞から単離することを含む。より具体的な実施態様において、該単離する
ことは、CD56+、CD16-、CD3-胎盤細胞を、CD56-、CD16+、又はCD3+である胎盤細胞から単
離することを含む。別の実施態様において、該胎盤ナチュラルキラー細胞を単離する方法
は、少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、
又は少なくとも99％CD56+、CD16-ナチュラルキラー細胞である胎盤細胞の集団を生じさせ
る。
【００９６】
(5.4.マッチした灌流液及び臍帯血由来の胎盤ナチュラルキラー細胞)
さらに本明細書に提供されるのは、組み合わされたナチュラルキラー細胞と本明細書で
呼ばれる、マッチしたユニットの胎盤灌流液と臍帯血の組合せから得られるか、又は該組
合せから得ることができるナチュラルキラー細胞である。ある実施態様において、本明細
書で使用される「マッチしたユニット」は、NK細胞が胎盤灌流液細胞及び臍帯血細胞から
得られることを示し、ここで、該臍帯血細胞は、該胎盤灌流液が得られる胎盤由来の臍帯
血から得られる、すなわち、該胎盤灌流液細胞及び臍帯血細胞、ひいては、各々に由来す
るナチュラルキラー細胞は同じ個体に由来するものである。ある実施態様において、その
ようなマッチしたユニットは、「ドナーがマッチした」ユニットと呼ばれる。ある実施態
様において、本明細書で使用される「マッチしたユニット」は、NK細胞が胎盤灌流液細胞
及び臍帯血細胞から得られることを示し、ここで、該臍帯血細胞は、該胎盤灌流液が得ら
れる胎盤由来の臍帯血から得られるのではなく、免疫学的にマッチした個体の臍帯血から
得られる、すなわち、該胎盤灌流液細胞及び臍帯血細胞、ひいては、各々に由来するナチ
ュラルキラー細胞は、異なるが、免疫学的にマッチした個体に由来するものである。ある
実施態様において、そのようなマッチしたユニットは、「HLAがマッチした」ユニットと
呼ばれる。
【００９７】
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、胎盤灌流液由来のナ
チュラルキラー細胞及び臍帯血由来のナチュラルキラー細胞を、例えば、約1:10、2:9、3
:8、4:7、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、10:1、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、
1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、7
5:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:8
0、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55
:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1
:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:8
0、1:85、1:90、1:95、又は約1:100などの比で含む。
【００９８】
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、CD56+及びCD16-であ
るナチュラルキラー細胞のみを含むか、又は実質的に該細胞のみを含む。ある具体的な実
施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、少なくとも40％、50％、60％
、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、又は99.5％のCD56+CD16-ナチュラ
ルキラー細胞(例えば、PINK細胞)を含む。ある他の実施態様において、組み合わされたナ
チュラルキラー細胞は、CD56+及びCD16-であるNK細胞、並びにCD56+及びCD16+であるNK細
胞を含む。特定の実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由
来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD56+CD16+ナチュ
ラルキラー細胞を含む。
【００９９】
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、CD56+及びCD3-であ
るナチュラルキラー細胞を含む。ある具体的な実施態様において、組み合わされたナチュ
ラルキラー細胞は、少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％
、98％、99％、又は99.5％のCD56+CD3-ナチュラルキラー細胞を含む。ある具体的な実施
態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラ
ルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD56+CD3-ナチュラルキラー細胞を含む
。
【０１００】
具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同
等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+CD16-ナチュラ
ルキラー細胞を含む。別の具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー
細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数の
CD3-CD56+CD16-ナチュラルキラー細胞を含む。別の具体的な実施態様において、組み合わ
されたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出
可能な程度に多くの数のCD3-CD56+KIR2DL2/L3+ナチュラルキラー細胞を含む。別の具体的
な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナ
チュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD3-CD56+NKp46+ナチュラルキラ
ー細胞を含む。別の具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は
、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD3-CD
56+NKp30+ナチュラルキラー細胞を含む。別の具体的な実施態様において、組み合わされ
たナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能
な程度に少ない数のCD3-CD56+2B4+ナチュラルキラー細胞を含む。別の具体的な実施態様
において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキ
ラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD3-CD56+CD94+ナチュラルキラー細胞を含む
。
【０１０１】
具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同
等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD3-CD56+KIR2DL2/L3+ナ
チュラルキラー細胞を含む。別の具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラル
キラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多く
の数のCD3-CD56+NKp44+ナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施態様において、組み
合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも
検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+NKp30+ナチュラルキラー細胞を含む。
【０１０２】
一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数の
ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの量のKIR2DL2/3+ナチュラルキラー細
胞を含む。ある具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、少
なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、又はそれより
多くのKIR2DL2/3+ナチュラルキラー細胞を含む。
【０１０３】
一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数の
ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの量のNKp30+ナチュラルキラー細胞を
含む。ある具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、少なく
とも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、又はそれより多く
のNKp30+ナチュラルキラー細胞を含む。
【０１０４】
一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数の
ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの量の2B4+ナチュラルキラー細胞を含
む。ある具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、少なくと
も5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、又はそれより
多くの2B4+ナチュラルキラー細胞を含む。
【０１０５】
一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数の
ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの量のCD94+ナチュラルキラー細胞を
含む。ある具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、少なく
とも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、もしくは99.5％、
又はそれより多くのCD94+ナチュラルキラー細胞を含む。
【０１０６】
一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数の
ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない量のNKp46+ナチュラルキラー細胞を
含む。ある具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、5％、1
0％、15％、20％、又は25％未満のNKp46+ナチュラルキラー細胞を含む。
【０１０７】
一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来のナチュラ
ルキラー細胞と比較して異なるマイクロRNA(miRNA)発現プロファイルを有する。具体的な
実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、miRNAのhsa-miR-337、hsa-
miR-422a、hsa-miR-549、及びhsa-miR-618のうちの1つ又は複数を検出可能な程度に発現
する。一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、hsa-miR-337、hsa
-miR-422a、hsa-miR-549、及びhsa-miR-618を検出可能な程度に発現する。一実施態様に
おいて、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、hsa-miR-337、hsa-miR-422a、hsa-miR
-549、及びhsa-miR-618のうちの1つ又は複数を、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー
細胞よりも検出可能な程度に多くの量で発現する。一実施態様において、組み合わされた
ナチュラルキラー細胞は、hsa-miR-337、hsa-miR-422a、hsa-miR-549、及びhsa-miR-618
を、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの量で発現
する。具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、同等数の末
梢血ナチュラルキラー細胞と比較してhsa-miR-155の発現が増加している。
【０１０８】
別の実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、miRNAのhsa-let-7b
、hsa-miR-146b、hsa-miR-19b、hsa-miR-24、hsa-miR-347、hsa-miR-381、hsa-miR-517c
、及びhsa-miR-631のうちの1つ又は複数を検出可能な程度には発現しない。別の実施態様
において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、miRNAのhsa-let-7b、hsa-miR-146b
、hsa-miR-19b、hsa-miR-24、hsa-miR-347、hsa-miR-381、hsa-miR-517c、及びhsa-miR-6
31を検出可能な程度には発現しない。別の実施態様において、組み合わされたナチュラル
キラー細胞は、miRNAのhsa-let-7b、hsa-miR-146b、hsa-miR-19b、hsa-miR-24、hsa-miR-
347、hsa-miR-381、hsa-miR-517c、及びhsa-miR-631のうちの1つ又は複数を、末梢血由来
の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない量で発現する。別の実施
態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、hsa-let-7b、hsa-miR-146b、hs
a-miR-19b、hsa-miR-24、hsa-miR-347、hsa-miR-381、hsa-miR-517c、及びhsa-miR-631を
、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない量で発現す
る。
【０１０９】
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、以下のmiRNA: hsa-m
iR-211、hsa-miR-520c、hsa-miR-125b、hsa-miR-100、hsa-miR-326、hsa-miR-519c、hsa-
miR-515-5p、hsa-miR-450、hsa-miR-198、hsa-miR-522、hsa-miR-518e、hsa-miR-497、hs
a-miR-566、hsa-miR-519d、hsa-miR-627、hsa-miR-524、hsa-miR-520g、hsa-miR-302c、h
sa-miR-512-3p、及びhsa-miR-520hのうちの1つ又は複数を、末梢血由来の同等数のナチュ
ラルキラー細胞よりも検出可能な程度に高いレベル(例えば、少なくとも2倍、3倍、4倍、
5倍、10倍、25倍、50倍、75倍、90倍、100倍、250倍、500倍、もしくは1000倍、又はそれ
を上回る)で発現する。
【０１１０】
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、以下のmiRNA: hsa-m
iR-331、hsa-miR-186、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-26a、hsa-miR-133b、hsa-miR-181b、hsa
-miR-222、hsa-miR-197、hsa-miR-146b、hsa-miR-342、hsa-miR-181d、hsa-miR-155、hsa
-miR-484、hsa-let-7g、hsa-miR-200c、hsa-miR-181c、hsa-miR-191、hsa-miR-596、hsa-
miR-142-5p、hsa-miR-95、hsa-let-7a、hsa-miR-21、hsa-miR-152、hsa-miR-642、hsa-mi
R-24、hsa-miR-10a、hsa-miR-429、hsa-let-7b、及びhsa-miR-199bのうちの1つ又は複数
を、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に低いレベル(例
えば、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、75倍、90倍、100倍、250倍、
500倍、もしくは1000倍、又はそれを上回る)で発現する。
【０１１１】
別の実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、同等数の末梢血ナチ
ュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多い量のグランザイムBを発現する。
【０１１２】
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、インターフェロン(I
FN)-γを、同等数の末梢血ナチュラルキラー細胞と比較して増大したレベルで誘導する。
【０１１３】
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、同等数の末梢血ナチ
ュラルキラー細胞と比較して、例えば、腫瘍細胞又は腫瘍細胞株に対するより大きい細胞
傷害性を有する。細胞傷害性は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、乳酸脱水素酵
素アッセイ又は蛍光活性化細胞選別(FACS)ベースのPKH26/TP-PRO-3アッセイ、及び例えば
、K562、U937、WERI-RB-1、RPMI8226、HCT-116、又はU266などの腫瘍細胞株を用いて測定
することができる。
【０１１４】
一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、培養したものでも、増
殖させたものでもない。別の実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は
、例えば、7日、10日、14日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日
、27日、28日間、又はそれより長い間増殖させたものである。特定の実施態様において、
組み合わされたナチュラルキラー細胞を14日よりも長い間増殖させる。ある実施態様にお
いて、組み合わされたナチュラルキラー細胞を28日よりも短い間増殖させる。特定の実施
態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞を21日間増殖させる。ある実施態様
において、増殖は、エクスビボで行われる。ある実施態様において、組み合わされたナチ
ュラルキラー細胞の増殖は、フィーダー細胞の非存在下で行われる。ある実施態様におい
て、組み合わされたナチュラルキラー細胞の増殖は、フィーダー細胞の存在下で行われる
。ある実施態様において、フィーダー細胞は、増殖の間、例えば、(フィーダー細胞あり
又はフィーダー細胞なしで)培養を開始してから5日、6日、7日、8日、9日、10日後、又は
それよりも後に、組み合わされたナチュラルキラー細胞に添加される。ナチュラルキラー
細胞の培養又は増殖において使用される当技術分野で公知の任意のフィーダー細胞、例え
ば、PBMC又はK562細胞をフィーダー細胞として使用することができる。一実施態様におい
て、PBMCとK562細胞の組合せを、フィーダー細胞として、例えば、1:10、1:9、1:8、1:7
、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、又は1:1のPBMC:K562の比で使用する。一実施態様において
、フィーダー細胞は、PBMC及びK562を1:1の比で含む。
【０１１５】
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞を、例えば、エクスビボ
で、約7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、2
6、27、28日、又はそれより長い日数の間増殖させる。一実施態様において、組み合わさ
れたナチュラルキラー細胞のエクスビボ増殖は、約21日間である。ある実施態様において
、フィーダー細胞は、増殖の間、添加される。一実施態様において、増殖の間の培養物へ
のフィーダー細胞の添加は、追加のフィーダー細胞の非存在下での増殖と比較してNK細胞
増殖の度合いを高める。一実施態様において、新鮮なフィーダー細胞は、当技術分野で公
知の技術を用いて(例えば、BrdU及び7-アミノアクチノマイシン-D(7-AAS)染色を用いて)
判定したとき、培養NK細胞の大部分がS期にある場合に添加される。一実施態様において
、追加のフィーダー細胞は、培養から1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、1
0日、11日、12日、13日、14日、又はそれより長い日数の後に添加される。一実施態様に
おいて、追加のフィーダー細胞は、培養7日目に添加される。
【０１１６】
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞の増殖は、増殖させてい
ないか又は21日よりも短い間増殖させた組み合わされたナチュラルキラー細胞と比較して
、CD56+CD3-である細胞の割合の増加をもたらす。ある実施態様において、組み合わされ
たナチュラルキラー細胞の増殖は、増殖させていないか又は21日よりも短い間増殖させた
組み合わされたナチュラルキラー細胞と比較して、NKG2D、NKp46、NKp44、及び/又はNKp3
0の発現の増加をもたらす。ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細
胞の増殖は、増殖させていないか又は21日よりも短い間増殖させた組み合わされたナチュ
ラルキラー細胞と比較して、二方向性受容体2B4の発現の減少をもたらす。
【０１１７】
ある実施態様において、増殖させた組み合わされたナチュラルキラー細胞は、増殖させ
ていないか又は21日よりも短い間増殖させた同等数の組み合わされたナチュラルキラー細
胞と比較して、特定のmiRNAの発現が増加又は減少している−例えば、下の表23参照−。
一実施態様において、miRNAのhsa-miR-155は、増殖させていない、21日よりも短い間増殖
させた、及び/又は21日よりも長い間(例えば、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28
日、もしくはそれより長い間)増殖させた組み合わされたナチュラルキラー細胞と比較し
て、21日増殖させた組み合わされたナチュラルキラー細胞で上方調節される。
【０１１８】
ある実施態様において、増殖させた(例えば、21日間増殖させた)組み合わされたナチュ
ラルキラー細胞は、増殖させていない、21日よりも短い間増殖させた、及び/又は21日よ
りも長い間(例えば、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、もしくはそれより長
い間)増殖させた同等数の組み合わされたナチュラルキラー細胞と比較して、例えば、腫
瘍細胞又は腫瘍細胞株に対するより大きい細胞傷害性を有する。
【０１１９】
ある実施態様において、増殖させた組み合わされたナチュラルキラー細胞は、インター
フェロン(IFN)-γを、増殖させていない、21日よりも短い間増殖させた、及び/又は21日
よりも長い間(例えば、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、もしくはそれより
長い間)増殖させた同等数の組み合わされたナチュラルキラー細胞と比較して増大したレ
ベルで誘導する。
【０１２０】
さらに本明細書に提供されるのは、臍帯血と組み合わされたナチュラルキラー細胞の組
合せである。様々な実施態様において、臍帯血を、組み合わされたナチュラルキラー細胞
と、臍帯血1ミリリットル当たり約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1
×107、5×107、1×108、5×108個の組み合わされたナチュラルキラー細胞の比で組み合
わせる。
【０１２１】
(5.5.灌流液/細胞組成物)
胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び胎盤ナチュ
ラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー細胞に加えて、本明細書に提供され
るのは、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖の抑制において使用するための、該灌流液又
は細胞を含む組成物である。
【０１２２】
(5.5.1.胎盤灌流液、灌流液細胞、及び胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞の組合せ)
さらに本明細書に提供されるのは、上の第5.1節、第5.3節、又は第5.4節に記載されて
いる、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、及び/又は組み合
わされたナチュラルキラー細胞の組合せを含む組成物である。一実施態様において、例え
ば、本明細書に提供されるのは、複数の胎盤灌流液細胞、及び/又は例えば、胎盤灌流液
細胞又は機械的にもしくは酵素的に破壊された胎盤組織から得られる、複数の胎盤ナチュ
ラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー細胞が補充された一定の体積の胎盤
灌流液である。具体的な実施態様において、例えば、胎盤灌流液の各ミリリットルに、約
1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個
、又はそれより多くの胎盤灌流液細胞、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、及び/又は組み
合わされたナチュラルキラー細胞を補充する。別の実施態様において、複数の胎盤灌流液
細胞に、胎盤灌流液、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、及び/又は組み合わされたナチュ
ラルキラー細胞を補充する。別の実施態様において、複数の胎盤中間ナチュラルキラー細
胞に、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び/又は組み合わされたナチュラルキラー細胞を
補充する。ある実施態様において、灌流液を補充に使用する場合、灌流液の体積は、(溶
液中の)細胞＋灌流液の全体積の約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、1
0％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％、約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％
、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％超、又は約50％、45％、40％、35％、3
0％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％未満である。ある他の
実施態様において、胎盤灌流液細胞を、複数のPINK細胞及び/又は組み合わされたナチュ
ラルキラー細胞と組み合わせる場合、該胎盤灌流液細胞は、通常、細胞の総数の約50％、
45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％
、約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、も
しくは1％超、又は約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6
％、4％、2％、もしくは1％未満を含む。ある他の実施態様において、PINK細胞を複数の
胎盤灌流液細胞及び/又は組み合わされたナチュラルキラー細胞と組み合わせる場合、該P
INK細胞は、通常、細胞の総数の約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、1
0％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％、約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％
、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％超、又は約50％、45％、40％、35％、3
0％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％未満を含む。ある他の
実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞をPINK細胞及び/又は胎盤灌流
液細胞と組み合わせる場合、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、通常、細胞の総数
の約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、も
しくは1％、約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％
、2％、もしくは1％超、又は約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％
、8％、6％、4％、2％、もしくは1％未満を含む。ある他の実施態様において、PINK細胞
、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又は胎盤灌流液細胞を用いて胎盤灌流液を補充
する場合、細胞を懸濁させる溶液(例えば、生理食塩水溶液、培養培地など)の体積は、灌
流液＋細胞の全体積の約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％
、6％、4％、2％、もしくは1％、約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、
10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％超、又は約50％、45％、40％、35％、30％、25
％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％未満を含み、その場合、該PIN
K細胞を、補充前に、1ミリリットル当たり約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、
5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個、又はそれより多くの細胞になるように懸濁
させる。
【０１２３】
他の実施態様において、上記の組合せのいずれかをさらに、臍帯血又は臍帯血由来の有
核細胞と組み合わせる。
【０１２４】
さらに本明細書に提供されるのは、2以上の源、例えば、2以上の胎盤から得られ、混合
された、例えば、プールされた、プール胎盤灌流液である。そのようなプール灌流液は、
各々の源に由来するほぼ等体積の灌流液を含むことができるか、又は各々の源に由来する
異なる体積を含むことができる。各々の源に由来する相対的な体積は、無作為に選択する
ことができるか、或いは例えば、1以上の細胞因子、例えば、サイトカイン、成長因子、
ホルモンなどの濃度もしくは量;各々の源に由来する灌流液中の胎盤細胞の数;又は各々の
源に由来する灌流液の他の特徴に基づくことができる。同じ胎盤の複数回の灌流に由来す
る灌流液を同様にプールすることができる。
【０１２５】
同様に、本明細書に提供されるのは、2以上の源、例えば、2以上の胎盤から得られ、プ
ールされた胎盤灌流液細胞及び胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞である。そのようなプ
ール細胞は、2以上の源に由来するほぼ同等数の細胞を含むことができるか、又はプール
源のうちの1つもしくは複数に由来する異なる数の細胞を含むことができる。各々の源に
由来する細胞の相対的な数は、例えば、プールされるべき細胞における1以上の特定細胞
型の数、例えば、CD34+細胞の数、CD56+細胞の数などに基づいて選択することができる。
【０１２６】
プールは、例えば、胎盤灌流液細胞が補充された胎盤灌流液;胎盤由来中間ナチュラル
キラー(PINK)細胞が補充された胎盤灌流液;胎盤灌流液細胞とPINK細胞の両方が補充され
た胎盤灌流液;胎盤灌流液が補充された胎盤灌流液細胞; PINK細胞が補充された胎盤灌流
液細胞;胎盤灌流液とPINK細胞の両方が補充された胎盤灌流液細胞;胎盤灌流液が補充され
たPINK細胞;胎盤灌流液細胞が補充されたPINK細胞;又は胎盤灌流液細胞と胎盤灌流液の両
方が補充されたPINK細胞を含むことができる。
【０１２７】
さらに本明細書に提供されるのは、例えば、所与の数の胎盤灌流液もしくはPINK細胞、
又は所与の体積の灌流液から予想される腫瘍抑制の程度又は量(すなわち、効力)を決定す
るためにアッセイされた、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び胎盤中間ナチュラルキラー
細胞、並びにそれらのプール又はそれらの組合せである。例えば、一定の分量又はサンプ
ル数の細胞を、そうでなければ腫瘍細胞が増殖するであろう条件下で既知の数の腫瘍細胞
と接触させ、胎盤灌流液、灌流液細胞、胎盤ナチュラルキラー細胞、又はそれらの組合せ
の存在下での経時的な(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10週、又はそれよ
り長い間の)腫瘍細胞の増殖速度を、灌流液、灌流液細胞、胎盤ナチュラルキラー細胞、
又はそれらの組合せの非存在下での同等数の腫瘍細胞の増殖と比較する。胎盤灌流液、胎
盤灌流液細胞、及び/もしくはPINK細胞、又はそれらの組合せもしくはプールの効力は、
例えば、腫瘍細胞成長を、例えば、約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％
、50％、又は同様の程度抑制するために必要とされる細胞の数又は溶液の体積として表す
ことができる。
【０１２８】
ある実施態様において、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及びPINK細胞は、医薬品等級の
投与可能なユニットとして提供される。そのようなユニットは、例えば、100mL、150mL、
200mL、250mL、300mL、350mL、400mL、450mL、500mLなどの不連続体積で提供することが
できる。そのようなユニットは、指定された数の、例えば、胎盤灌流液細胞、胎盤中間ナ
チュラルキラー細胞、又はその両方、例えば、1ミリリットル当たり1×104、5×104、1×
105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個、もしくはそれより
多くの細胞、又は1ユニット当たり1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1
×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、もし
くはそれより多くの細胞を含むように提供することができる。そのようなユニットは、指
定された数の、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び/又はPINK細胞のうちのいずれか2つ、
又は3つ全てを含むように提供することができる。
【０１２９】
胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び/又はPINK細胞の上記の組合せにおいて、該胎盤灌
流液、胎盤灌流液細胞、及び/又はPINK細胞のうちのいずれか1つ、いずれか2つ、又は3つ
全ては、レシピエントにとって自己のもの(すなわち、レシピエントから得られたもの)で
あることができるか、又はレシピエントにとって相同のもの(すなわち、該レシピエント
以外の少なくとも1人の他の個体から得られたもの)であることができる。
【０１３０】
PINK細胞、胎盤灌流液細胞、及び/又は胎盤灌流液の上記の組合せ又はプールはいずれ
も、例えば、胎盤灌流液、末梢血、臍帯血、骨髄などに由来するCD56+CD16+ナチュラルキ
ラー細胞を含むことができる。具体的な実施態様において、該組合せは、1ミリリットル
当たり約、少なくとも約、もしくは多くとも約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106
、5×106個、もしくはそれより多くのそのようなナチュラルキラー細胞、又は1ユニット
当たり約、少なくとも約、もしくは多くとも約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106
、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1
011個、もしくはそれより多くの細胞を含む。該CD56+CD16+ナチュラルキラー細胞は、天
然源から単離された状態で使用することができるか、又は上記の組合せもしくはプールの
うちの1つに含める前に増殖させることができる。該CD56+CD16+ NK細胞は、自己のもの(
すなわち、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び/もしくはPINK細胞と同じ個体から得られ
たもの;又はレシピエントから得られたもの)であることができるか、或いは相同のもの(
すなわち、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び/もしくはPINK細胞とは異なる個体に由来
するもの;又はレシピエントではない個体に由来するもの)であることができる。
【０１３１】
好ましくは、各々のユニットに表示を付けて、体積、細胞の数、細胞のタイプ、該ユニ
ットが特定のタイプの細胞について濃縮されているかどうか、及び／又は該ユニット中の
所与の細胞数もしくは該ユニットの所与のミリリットル数の効力が特定のタイプ(単数も
しくは複数)の腫瘍細胞の増殖の測定可能な抑制を引き起こすかどうかを明記する。
【０１３２】
また本明細書に提供されるのは、胎盤中間ナチュラルキラー細胞を単独で又は胎盤灌流
液細胞及び/もしくは胎盤灌流液との組合せで含む組成物である。したがって、別の態様
において、本明細書に提供されるのは、単離されたCD56+、CD16-ナチュラルキラー細胞を
含む組成物であり、ここで、該ナチュラルキラー細胞は、胎盤灌流液から単離されており
、かつ該ナチュラルキラー細胞は、該組成物中の細胞の少なくとも50％を含む。具体的な
実施態様において、該ナチュラルキラー細胞は、該組成物中の細胞の少なくとも80％を含
む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、単離されたCD56+、CD16+ナチュラルキ
ラー細胞を含む。より具体的な実施態様において、該CD56+、CD16+ナチュラルキラー細胞
は、該CD56+、CD16-ナチュラルキラー細胞とは異なる個体に由来するものである。別の具
体的な実施態様において、該ナチュラルキラー細胞は、単一の個体に由来するものである
。より具体的な実施態様において、該単離されたナチュラルキラー細胞は、少なくとも2
人の異なる個体由来のナチュラルキラー細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該
組成物は、単離された胎盤灌流液を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液
は、該ナチュラルキラー細胞と同じ個体に由来するものである。別のより具体的な実施態
様において、該胎盤灌流液は、該ナチュラルキラー細胞とは異なる個体由来の胎盤灌流液
を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、胎盤灌流液細胞を含む。より具体
的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、該ナチュラルキラー細胞と同じ個体に由来
するものである。別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、該ナチュラ
ルキラー細胞とは異なる個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該
組成物は、単離された胎盤灌流液及び単離された胎盤灌流液細胞をさらに含み、ここで、
該単離された灌流液及び該単離された胎盤灌流液細胞は、異なる個体に由来するものであ
る。胎盤灌流液を含む上記の実施態様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、
該胎盤灌流液は、少なくとも2人の個体由来の胎盤灌流液を含む。胎盤灌流液細胞を含む
上記の実施態様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、該単離された胎盤灌流
液細胞は、少なくとも2人の個体に由来するものである。
【０１３３】
(5.5.2.接着性胎盤幹細胞を含む組成物)
他の実施態様において、胎盤灌流液、複数の胎盤灌流液細胞、複数の組み合わされたナ
チュラルキラー細胞、及び/もしくは複数のPINK細胞、又は前述のもののいずれかの組合
せもしくはプールに、接着性胎盤幹細胞を補充する。そのような幹細胞は、例えば、Hari
riの米国特許第7,045,148号及び第7,255,879号に記載されている。接着性胎盤幹細胞は、
栄養膜細胞ではない。
【０１３４】
胎盤灌流液、複数の胎盤灌流液細胞、複数の組み合わされたナチュラルキラー細胞、及
び/もしくは複数のPINK細胞、又は前述のもののいずれかの組合せもしくはプールに、例
えば、1ミリリットル当たり1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107
、5×107、1×108、5×108個、もしくはそれより多くの細胞、又は1×104、5×104、1×1
05、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1
010、5×1010、1×1011個、もしくはそれより多くの接着性胎盤細胞を補充することがで
きる。該組合せ中の接着性胎盤幹細胞は、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12
、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、もしくは40回の集団倍加の間
、又はそれより長い間、培養された、例えば、接着性胎盤幹細胞であることができる。
【０１３５】
接着性胎盤幹細胞は、初代培養で又は細胞培養で培養したとき、組織培養基材、例えば
、組織培養容器表面(例えば、組織培養プラスチック)に接着する。培養下の接着性胎盤幹
細胞は、通常、線維芽細胞のような星状の外観をしており、いくつかの細胞質突起が中央
の細胞体から伸びている。しかしながら、接着性胎盤幹細胞は、線維芽細胞が示すよりも
多くのそのような突起を示すので、該胎盤幹細胞は、同じ条件下で培養された線維芽細胞
と形態的に区別することができる。形態的には、胎盤幹細胞は、造血幹細胞からも区別す
ることができ、造血幹細胞は、通常、培養下では、より丸みを帯びた、又は敷石状の形態
をとる。
【０１３６】
本明細書に提供される組成物及び方法において有用な接着性胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞
の集団は、該幹細胞又は該幹細胞を含む細胞の集団を同定及び/又は単離するために使用
することができる複数のマーカーを発現する。本明細書に提供される組成物及び方法にお
いて有用な接着性胎盤幹細胞及び接着性幹細胞集団には、胎盤、又は任意のその部分(例
えば、羊膜、絨毛膜、羊膜-絨毛膜板、胎盤葉、臍帯など)から直接的に得られる幹細胞及
び幹細胞含有細胞集団が含まれる。該接着性胎盤幹細胞集団は、一実施態様において、培
養下の接着性胎盤幹細胞の集団(すなわち、2個以上の接着性胎盤幹細胞)、例えば、容器
、例えば、バッグ中の集団である。
【０１３７】
接着性胎盤幹細胞は、通常、マーカーであるCD73、CD105、CD200、HLA-G、及び/又はOC
T-4を発現し、かつCD34も、CD38も、CD45も発現しない。接着性胎盤幹細胞は、HLA-ABC(M
HC-1)及びHLA-DRを発現することもできる。これらのマーカーを用いて、接着性胎盤幹細
胞を同定し、かつ胎盤幹細胞を他の幹細胞型と区別することができる。該胎盤幹細胞は、
CD73及びCD105を発現することができるので、それらは、間葉系幹細胞様の特徴を有する
ことができる。しかしながら、接着性胎盤幹細胞は、胎児特異的マーカーであるCD200及
びHLA-Gを発現することができるので、それらは、CD200もHLA-Gも発現しない間葉系幹細
胞、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞と区別することができる。同じように、CD34、CD38、
及び/又はCD45の発現の欠如により、接着性胎盤幹細胞は非造血幹細胞として同定される
。
【０１３８】
一実施態様において、接着性胎盤幹細胞は、CD200+、HLA-G+であり、ここで、該幹細胞
は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能な程度に抑制する。具体的な実施態様において、
該接着性幹細胞はまた、CD73+及びCD105+である。別の具体的な実施態様において、該接
着性幹細胞はまた、CD34-、CD38-、又はCD45-である。より具体的な実施態様において、
該接着性幹細胞はまた、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、及びCD105+である。別の実施態様
において、該接着性幹細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、1以
上の胚様体を産生する。
【０１３９】
別の実施態様において、接着性胎盤幹細胞は、CD73+、CD105+、CD200+であり、ここで
、該幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能な程度に抑制する。該集団の具体的な
実施態様において、該接着性幹細胞は、HLA-G+である。別の具体的な実施態様において、
該接着性幹細胞は、CD34-、CD38-、又はCD45-である。別の具体的な実施態様において、
該接着性幹細胞は、CD34-、CD38-、及びCD45-である。より具体的な実施態様において、
該接着性幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、及びHLA-G+である。別の具体的な実施態様に
おいて、該接着性胎盤幹細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、1
以上の胚様体を産生する。
【０１４０】
別の実施態様において、接着性胎盤幹細胞は、CD200+、OCT-4+であり、ここで、該幹細
胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能な程度に抑制する。具体的な実施態様において
、該接着性幹細胞は、CD73+及びCD105+である。別の具体的な実施態様において、該接着
性幹細胞は、HLA-G+である。別の具体的な実施態様において、該接着性幹細胞は、CD34-
、CD38-及びCD45-である。より具体的な実施態様において、該接着性幹細胞は、CD34-、C
D38-、CD45-、CD73+、CD105+、及びHLA-G+である。別の具体的な実施態様において、接着
性胎盤幹細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、1以上の胚様体を
産生する。
【０１４１】
別の実施態様において、接着性胎盤幹細胞は、CD73+、CD105+、及びHLA-G+であり、こ
こで、該接着性幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能な程度に抑制する。上記複
数の具体的な実施態様において、該接着性幹細胞はまた、CD34-、CD38-、又はCD45-であ
る。別の具体的な実施態様において、該接着性幹細胞はまた、CD34-、CD38-、及びCD45-
である。別の具体的な実施態様において、該接着性幹細胞はまた、OCT-4+である。別の具
体的な実施態様において、該接着性幹細胞はまた、CD200+である。より具体的な実施態様
において、該接着性幹細胞はまた、CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+、及びCD200+である。
【０１４２】
別の実施態様において、接着性胎盤幹細胞は、CD73+、CD105+幹細胞であり、ここで、
該幹細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で、1以上の胚様体を産生し、かつ該接着
性幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能な程度に抑制する。具体的な実施態様に
おいて、該接着性幹細胞はまた、CD34-、CD38-、又はCD45-である。別の具体的な実施態
様において、該接着性幹細胞はまた、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的な実
施態様において、該接着性幹細胞はまた、OCT-4+である。より具体的な実施態様において
、該接着性幹細胞はまた、OCT-4+、CD34-、CD38-、及びCD45-である。
【０１４３】
別の実施態様において、接着性胎盤幹細胞は、OCT-4+幹細胞であり、ここで、該接着性
胎盤幹細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、1以上の胚様体を産
生し、かつ該幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能な程度に抑制するももとして
同定されている。
【０１４４】
様々な実施態様において、該単離された胎盤細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、
少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、
少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％は、OCT4+幹細胞である。上記の
集団の具体的な実施態様において、該幹細胞は、CD73+及びCD105+である。別の具体的な
実施態様において、該幹細胞は、CD34-、CD38-、又はCD45-である。別の具体的な実施態
様において、該幹細胞は、CD200+である。より具体的な実施態様において、該幹細胞は、
CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的な実施態様におい
て、該集団は、増殖させたものであり、例えば、少なくとも1回、少なくとも3回、少なく
とも5回、少なくとも10回、少なくとも15回、又は少なくとも20回継代したものである。
【０１４５】
上記の実施態様のいずれかのより具体的な実施態様において、接着性胎盤細胞は、ABC-
p(胎盤特異的ABC輸送体タンパク質;例えば、Allikmetsらの文献、Cancer Res. 58(23):53
37-9(1998)参照)を発現する。
【０１４６】
別の実施態様において、接着性胎盤幹細胞は、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、
CD200+、CD34-、及びCD133-である。別の実施態様において、接着性胎盤幹細胞、胎盤幹
細胞は、IL-6、IL-8、及び単球走化性タンパク質(MCP-1)を構成的に分泌する。
【０１４７】
上で参照されている胎盤幹細胞の各々は、哺乳動物胎盤から直接得られ、単離された胎
盤幹細胞、又は培養され、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18
、20、25、30回、もしくはそれより多くの回数継代された胎盤幹細胞、又はそれらの組合
せを含むことができる。腫瘍細胞抑制性の複数の上記の接着性胎盤幹細胞は、約、少なく
とも、又は高々1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1
×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、又はそれより多くの接着性胎盤幹細胞を
含むことができる。
【０１４８】
(5.5.3.胎盤幹細胞馴化培地を含む組成物)
また本明細書に提供されるのは、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及
び/又は胎盤灌流液、さらには馴化培地を含む、腫瘍抑制性組成物の使用である。接着性
胎盤幹細胞、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は胎盤中
間ナチュラルキラー細胞を用いて、腫瘍細胞抑制性である馴化培地、すなわち、複数の1
以上のタイプの免疫細胞に対する検出可能な腫瘍細胞抑制効果を有する幹細胞によって分
泌又は排出される1以上の生体分子を含む培地を産生することができる。様々な実施態様
において、該馴化培地は、胎盤細胞(例えば、幹細胞、胎盤灌流液細胞、PINK細胞)又は組
み合わされたナチュラルキラー細胞が、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11
、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24日、又はそれより長い間、その
中で成長した培地を含む。他の実施態様において、該馴化培地は、該細胞が、少なくとも
30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％コンフルエンス、又は100％コンフルエンス
にまでその中で成長した培地を含む。そのような馴化培地を用いて、胎盤細胞又は別の種
類の細胞の個別の集団の培養を支援することができる。別の実施態様において、本明細書
に提供される馴化培地は、接着性胎盤幹細胞及び非胎盤幹細胞が培養された培地を含む。
【０１４９】
そのような馴化培地を、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラ
ー細胞、及び/もしくは胎盤中間ナチュラルキラー細胞のいずれか、又はこれらの任意の
組合せと組み合わせて、腫瘍細胞抑制性組成物を形成させることができる。ある実施態様
において、該組成物は、体積で半分未満の、例えば、体積で約50％、45％、40％、35％、
30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、もしくは1％、又は約50％、45％
、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、もしくは1％未満
の馴化培地を含む。
【０１５０】
したがって、一実施態様において、本明細書に提供されるのは、胎盤幹細胞の培養物由
来の培養培地を含む組成物であり、ここで、該胎盤幹細胞は、(a)基材に接着し;(b)CD200
及びHLA-Gを発現するか、又はCD73、CD105、及びCD200を発現するか、又はCD200及びOCT-
4を発現するか、又はCD73、CD105、及びHLA-Gを発現するか、又はCD73及びCD105を発現し
、かつ胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団を胚様体の形成を可能にする条件下で培養したと
きに、該集団内の1以上の胚様体の形成を促進するか、又はOCT-4を発現し、かつ胎盤幹細
胞を含む胎盤細胞の集団を胚様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、該集団内
の1以上の胚様体の形成を促進し;かつ(c)腫瘍細胞又は腫瘍細胞の集団の成長又は増殖を
検出可能な程度に抑制する。具体的な実施態様において、該組成物は、複数の該胎盤幹細
胞をさらに含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、複数の非胎盤細胞を含む
。より具体的な実施態様において、該非胎盤細胞はCD34+細胞、例えば、造血前駆細胞、
例えば、末梢血造血前駆細胞、臍帯血造血前駆細胞、又は胎盤血造血前駆細胞を含む。該
非胎盤細胞は、他の幹細胞、例えば、間葉系幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞を含
むこともできる。該非胎盤細胞は、1以上のタイプの成体細胞又は細胞株であることもで
きる。別の具体的な実施態様において、該組成物は、抗増殖剤、例えば、抗MIP-1α又は
抗MIP-1β抗体を含む。
【０１５１】
具体的な実施態様において、胎盤細胞馴化培養培地又は上清は、約1:1、約2:1、約3:1
、約4:1、又は約5:1の胎盤幹細胞対腫瘍細胞の比で複数の腫瘍細胞と共培養した複数の胎
盤幹細胞から得られる。例えば、馴化培養培地又は上清は、約1×105個の胎盤幹細胞、約
1×106個の胎盤幹細胞、約1×107個の胎盤幹細胞、もしくは約1×108個の胎盤幹細胞、又
はそれより多くの胎盤幹細胞を含む培養物から得ることができる。別の具体的な実施態様
において、馴化培養培地又は上清は、約1×105〜約5×105個の胎盤幹細胞及び約1×105個
の腫瘍細胞;約1×106〜約5×106個の胎盤幹細胞及び約1×106個の腫瘍細胞;約1×107〜約
5×107個の胎盤幹細胞及び約1×107個の腫瘍細胞;又は約1×108〜約5×108個の胎盤幹細
胞及び約1×108個の腫瘍細胞を含む共培養物から得られる。
【０１５２】
具体的な実施態様において、70kgの個体への投与に好適な馴化培地は、約200mLの培養
培地中の約7,000万個の胎盤幹細胞によって馴化された上清を含む。
【０１５３】
馴化培地を濃縮して、投与可能な医薬品等級の製品を製造することができる 。例えば
、馴化培地を、例えば、蒸発、凍結乾燥などによる水の除去により、約90％、80％、70％
、60％、50％、40％、30％、20％、10％、又はそれを超えて濃縮することができる。具体
的な実施態様において、例えば、約7,000万個の胎盤幹細胞由来の200mLの馴化培地を、約
180mL、160mL、140mL、120mL、100mL、80mL、60mL、40mL、20mL、又はそれ未満の体積に
まで濃縮することができる。該馴化培地を、例えば、蒸発、凍結乾燥などによって、例え
ば、粉末にまで、実質的に乾燥させることもできる。
【０１５４】
(5.6.灌流液及び胎盤細胞の保存)
胎盤灌流液、胎盤細胞、例えば、灌流液細胞又はPINK細胞、及び組み合わされたナチュ
ラルキラー細胞を保存する、すなわち、長期保存を可能にする条件下に、又は例えば、ア
ポトーシスもしくは壊死による細胞死を阻害する条件下に置くことができる。
【０１５５】
胎盤灌流液は、胎盤細胞組成物を、胎盤の少なくとも一部に、例えば、胎盤血管系に通
すことによって産生することができる。胎盤細胞回収組成物は、灌流液内に含まれる細胞
を保存するように作用する1以上の化合物を含む。そのような胎盤細胞回収組成物は、上
の第5.1節に記載されており、これには、例えば、2007年8月16日に公開された関連米国出
願公開US 2007-0190042号に記載されているような、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤、
及び/又は酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む組成物がある。一実施態様において、胎
盤又は胎盤組織に通した胎盤細胞回収組成物は、下の第5.4節に記載の方法において有用
な胎盤灌流液である。
【０１５６】
一実施態様において、胎盤灌流液及び/又は胎盤細胞は、該細胞を、アポトーシスの阻
害剤及び酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む胎盤細胞回収組成物と接触させることによ
り、哺乳動物、例えば、ヒトの分娩後胎盤から回収され、ここで、該アポトーシスの阻害
剤は、該アポトーシスの阻害剤と接触させていない幹細胞の集団と比較して、幹細胞の集
団におけるアポトーシスを低下させ又は防止するのに十分な量及び時間で存在する。例え
ば、該胎盤を該胎盤細胞回収組成物で灌流することができ、胎盤細胞、例えば、全有核胎
盤細胞をそれから単離する。具体的な実施態様において、該アポトーシスの阻害剤は、カ
スパーゼ阻害剤である。別の具体的な実施態様において、該アポトーシスの阻害剤は、JN
K阻害剤である。より具体的な実施態様において、該JNK阻害剤は、該幹細胞の分化も増殖
も調節しない。別の実施態様において、該胎盤細胞回収組成物は、分離相中に該アポトー
シスの阻害剤及び該酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む。別の実施態様において、該胎
盤細胞回収組成物は、エマルジョン中に該アポトーシスの阻害剤及び該酸素運搬ペルフル
オロカーボンを含む。別の実施態様において、該胎盤細胞回収組成物は、乳化剤、例えば
、レシチンをさらに含む。別の実施態様において、該アポトーシス阻害剤及び該ペルフル
オロカーボンは、該胎盤細胞を接触させるときに、約0℃〜約25℃である。別のより具体
的な実施態様において、該アポトーシス阻害剤及び該ペルフルオロカーボンは、該胎盤細
胞を接触させるときに、約2℃〜10℃、又は約2℃〜約5℃である。別のより具体的な実施
態様において、該接触させることは、該幹細胞の集団の輸送の間に行われる。別のより具
体的な実施態様において、該接触させることは、該幹細胞の集団の凍結及び解凍の間に行
われる。
【０１５７】
別の実施態様において、胎盤灌流液及び/又は胎盤細胞は、該灌流液及び/又は細胞をア
ポトーシスの阻害剤及び臓器保存化合物と接触させることによって回収及び保存すること
ができ、ここで、該アポトーシスの阻害剤は、該アポトーシスの阻害剤と接触させていな
い灌流液又は胎盤細胞と比較したとき、該細胞のアポトーシスを低下させ又は防止するの
に十分な量及び時間で存在する。
【０１５８】
具体的な実施態様において、臓器保存化合物は、UW溶液(米国特許第4,798,824号に記載
されており; VIASPAN(商標)としても知られているもの; Southardらの文献、Transplanta
tion 49(2):251-257(1990)も参照のこと)、又はSternらの米国特許第5,552,267号に記載
されている溶液である。別の実施態様において、該臓器保存化合物は、ヒドロキシエチル
スターチ、ラクトビオン酸、ラフィノース、又はこれらの組合せである。別の実施態様に
おいて、胎盤細胞回収組成物は、2相中にあるか又はエマルジョンとしてかのいずれかの
、酸素運搬ペルフルオロカーボンをさらに含む。
【０１５９】
本方法の別の実施態様において、胎盤灌流液及び/又は胎盤細胞を、灌流の間、アポト
ーシス阻害剤及び酸素運搬ペルフルオロカーボン、臓器保存化合物、又はこれらの組合せ
を含む胎盤細胞回収組成物と接触させる。別の実施態様において、胎盤細胞を、灌流によ
る回収の後に、該幹細胞回収化合物と接触させる。
【０１６０】
通常、胎盤細胞の回収、濃縮、及び単離の間、低酸素及び機械的ストレスによる細胞ス
トレスを最小限に抑えるか、又はそれらを排除することが好ましい。本方法の別の実施態
様において、それゆえ、胎盤灌流液、胎盤細胞、又は胎盤細胞の集団は、回収、濃縮、又
は単離の間、該保存の間、6時間未満、低酸素状態に曝され、ここで、低酸素状態は、正
常な血中酸素濃度を下回る酸素濃度である。より具体的な実施態様において、該胎盤細胞
の集団は、該保存の間、2時間未満、該低酸素状態に曝される。別のより具体的な実施態
様において、該胎盤細胞の集団は、回収、濃縮、又は単離の間、1時間未満、もしくは30
分未満、該低酸素状態に曝されるか、又は低酸素状態に曝されない。別の具体的な実施態
様において、該胎盤細胞の集団は、回収、濃縮、又は単離の間、剪断ストレスに曝されな
い。
【０１６１】
本明細書に提供される胎盤細胞、胎盤由来のナチュラルキラー細胞、又は組み合わされ
たナチュラルキラー細胞は、例えば、小型の容器、例えば、アンプル中の凍結保存培地に
入れて凍結保存することができる。好適な凍結保存培地としては、例えば、成長培地を含
む培養培地、又は細胞凍結培地、例えば、市販の細胞凍結培地、例えば、C2695、C2639、
もしくはC6039(Sigma)が挙げられるが、これらに限定されない。凍結保存培地は、好まし
くは、例えば、約10％(v/v)の濃度のDMSO(ジメチルスルホキシド)を含む。凍結保存培地
は、追加の薬剤、例えば、メチルセルロース及び/又はグリセロールを含んでいてもよい
。細胞は、凍結保存時に、約1℃/分で冷却されることが好ましい。好ましい凍結保存温度
は、約-80℃〜約-180℃、好ましくは約-125℃〜約-140℃である。凍結保存した細胞を液
体窒素に移した後、使用のために解凍することができる。いくつかの実施態様において、
例えば、アンプルが約-90℃に達したら、それを液体窒素保存区域に移す。凍結保存した
細胞を、好ましくは約25℃〜約40℃の温度で、好ましくは約37℃の温度で解凍する。
【０１６２】
(5.7.腫瘍細胞成長を抑制するための胎盤灌流液、PINK細胞、及び組み合わされたナチュ
ラルキラー細胞の使用)
また本明細書に提供されるのは、胎盤灌流液、胎盤灌流液から単離された細胞、単離さ
れた組み合わされたナチュラルキラー細胞、又は単離された胎盤ナチュラルキラー細胞、
例えば、胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞を用いて、腫瘍細胞の成長、例えば、増殖を
抑制する方法である。
【０１６３】
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖
を抑制する方法であって、該腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖が、胎盤灌流液、灌流液
細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又はPINK細胞と接触させていない同
じタイプの腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞と比較して検出可能な程度に低下するように、該
腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞を、該胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュ
ラルキラー細胞、及び/又はPINK細胞と接触させることを含む、方法である。
【０１６４】
本明細書で使用されるように、「接触させること」は、一実施態様において、胎盤灌流
液、胎盤灌流液細胞、胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー細
胞、及び/又は組み合わされたナチュラルキラー細胞と;腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞との
直接的で物理的な、例えば、細胞間の接触を包含する。別の実施態様において、「接触さ
せること」は、同じ物理的空間内での存在を包含し、例えば、胎盤灌流液、胎盤灌流液細
胞、胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、及び/又は組
み合わされたナチュラルキラー細胞は、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞と同じ容器、例えば
、培養ディッシュ、マルチウェルプレース中に入れられる。別の実施態様において、胎盤
灌流液、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又は胎盤中間ナチュラ
ルキラー細胞と腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞とを「接触させること」は、例えば、該胎盤
灌流液又は細胞、例えば、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又は
胎盤中間ナチュラルキラー細胞を、個体、例えば、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞を含むヒ
ト、例えば、癌患者に注射又は注入することによって達成される。
【０１６５】
ある実施態様において、胎盤灌流液は、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞を含む個体、例え
ば、癌患者に検出可能な治療的利益をもたらす任意の量で使用される。ある他の実施態様
において、胎盤灌流液細胞、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、及び/又は組み合わされた
ナチュラルキラー細胞は、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞を含む個体に検出可能な治療的利
益をもたらす任意の量で使用される。したがって、別の実施態様において、本明細書に提
供されるのは、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、該腫瘍細胞
又は複数の腫瘍細胞を、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、胎盤由来中間ナチュラルキラー細
胞もしくは複数のPINK細胞、及び/又は組み合わされたナチュラルキラー細胞と個体内で
接触させることを含み、その結果、該接触させることが、該個体にとって検出可能な程度
に又は実証可能な程度に治療的に利益があるものとなる、方法である。
【０１６６】
本明細書で使用されるように、「治療的利益」には、例えば、腫瘍のサイズの低下;腫
瘍の増殖の軽減又は停止;単位体積当たりの、組織試料、例えば、血液試料中の癌細胞の
数の低下;該個体が有する特定の癌の任意の症状の臨床的改善、該個体が有する特定の癌
の任意の症状の悪化の軽減又は停止などが含まれるが、これらに限定されない。そのよう
な治療的利益のいずれか1つ又は複数を達成する胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び/又は
PINK細胞との接触は、治療的に利益があると言われる。
【０１６７】
ある実施態様において、胎盤灌流液細胞、例えば、胎盤灌流液由来の有核細胞、組み合
わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は胎盤中間ナチュラルキラー細胞は、腫瘍細胞
又は複数の腫瘍細胞を含む個体、例えば、癌患者に検出可能な治療的利益をもたらす任意
の量又は数で使用される。胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び
/又は胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー細胞を、そのよう
な個体に、細胞の数を単位として投与することができ、例えば、該個体に、約、少なくと
も約、又は多くとも約1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×1
08、1×109、5×109、1×1010、又は5×1010個の胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュ
ラルキラー細胞、及び/又は胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞を投与することができる
。他の実施態様において、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び
/又は胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞を、そのような個体に、細胞の数を単位として
投与することができ、例えば、該個体に、該個体1キログラム当たり、約、少なくとも約
、又は多くとも約1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、
1×109、5×109、1×1010、又は5×1010個の胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラル
キラー細胞、及び/又は胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞を投与することができる。胎
盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は胎盤由来中間ナチュラ
ルキラー細胞を、そのような個体に、該個体における胎盤灌流液細胞、組み合わされたナ
チュラルキラー細胞、及び/又は胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラ
ルキラー細胞と腫瘍細胞とのおおよその比に従って投与することができる。例えば、胎盤
灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は胎盤ナチュラルキラー細
胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー細胞を、該個体に、該個体における腫瘍細胞の数
に対して約、少なくとも約、又は多くとも約1:1、1:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、
9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:
1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1、又は100:1の比で投与することができる。そのような
個体における腫瘍細胞の数は、例えば、該個体由来の組織の試料、例えば、血液試料、生
検などにおける腫瘍細胞の数を計数することによって推定することができる。具体的な実
施態様において、例えば、固形腫瘍について、該計数することは、おおよその腫瘍体積を
得るために、腫瘍(単数又は複数)のイメージングと組み合わせて行われる。
【０１６８】
さらに本明細書に提供されるのは、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチ
ュラルキラー細胞、及び/又は胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞の組合せを用いて、腫
瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法である。様々な実施態様において、本明
細書に提供されるのは、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、該
腫瘍細胞(単数又は複数)を、複数の胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細
胞、又はPINK細胞が補充された胎盤灌流液;胎盤灌流液又は複数の組み合わされたナチュ
ラルキラー細胞もしくはPINK細胞が補充された胎盤灌流液細胞;胎盤灌流液及び胎盤灌流
液細胞が補充されたPINK細胞又は組み合わされたナチュラルキラー細胞、複数のPINK細胞
及び/又は複数の組み合わされたナチュラルキラー細胞;複数の組み合わされたナチュラル
キラー細胞及び複数の胎盤灌流液細胞;組み合わされたナチュラルキラー細胞が補充され
た胎盤灌流液;或いは胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細
胞、及びPINK細胞の全ての組合せと接触させることを含む、方法である。
【０１６９】
具体的な一実施態様において、例えば、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖は、複数の
胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は複数の胎盤中間ナチ
ュラルキラー細胞が補充された胎盤灌流液によって抑制される。具体的な実施態様におい
て、例えば、胎盤灌流液の各ミリリットルに、約1×104、5×104、1×105、5×105、1×1
06、5×106個、又はそれより多くの胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細
胞、又は胎盤中間ナチュラルキラー細胞を補充する。他の具体的な実施態様において、胎
盤灌流液、例えば、1ユニット(すなわち、単一の胎盤からの回収物)、又は約100、150、2
00、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、
もしくは1000mLの灌流液に、1ミリリットル当たり約1×104、5×104、1×105、5×105、1
×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個、もしくはそれより多くのPINK細胞
、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/もしくは胎盤灌流液細胞、又は1×104、5
×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5
×109、1×1010、5×1010、1×1011個、もしくはそれより多くのPINK細胞、組み合わされ
たナチュラルキラー細胞、及び/もしくは胎盤灌流液細胞を補充する。
【０１７０】
別の具体的な実施態様において、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖は、胎盤灌流液、
組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は胎盤中間ナチュラルキラー細胞が補充
された複数の胎盤灌流液細胞によって抑制される。より具体的な実施態様において、1ミ
リリットル当たり約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107
、1×108、5×108個、もしくはそれより多くの胎盤灌流液細胞、又は1×104、5×104、1
×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1
×1010、5×1010、1×1011個、もしくはそれより多くの胎盤灌流液細胞に、1ミリリット
ル当たり約もしくは少なくとも約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1
×107、5×107、1×108、5×108個、もしくはそれより多くのPINK細胞及び/もしくは組み
合わされたナチュラルキラー細胞、又は1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×1
06、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個
、もしくはそれより多くのPINK細胞もしくは組み合わされたナチュラルキラー細胞を補充
する。他のより具体的な実施態様において、1ミリリットル当たり約1×104、5×104、1×
105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個、もしくはそれより
多くの胎盤灌流液細胞、PINK細胞、及び/もしくは組み合わされたナチュラルキラー細胞
、又は1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5
×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、もしくはそれより多くの胎盤灌
流液細胞に、約もしくは少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30
、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、3
50、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、もしくは1000mLの
灌流液、又は約1ユニットの灌流液を補充する。
【０１７１】
別の具体的な実施態様において、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖は、胎盤灌流液、
胎盤灌流液細胞、及び/又は組み合わされたナチュラルキラー細胞が補充された複数の胎
盤中間ナチュラルキラー細胞又は組み合わされたナチュラルキラー細胞によって抑制され
る。より具体的な実施態様において、約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×1
06、1×107、5×107、1×108、5×108個、もしくはそれより多くの胎盤中間ナチュラルキ
ラー細胞、又は1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1
×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、もしくはそれより多く
のPINK細胞に、1ミリリットル当たり約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×10
6、1×107、5×107、1×108、5×108個、もしくはそれより多くの胎盤灌流液細胞及び/も
しくは組み合わされたナチュラルキラー細胞、又は1×104、5×104、1×105、5×105、1
×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010
、1×1011個、もしくはそれより多くの胎盤灌流液細胞及び/もしくは組み合わされたナチ
ュラルキラー細胞を補充する。他のより具体的な実施態様において、1ミリリットル当た
り約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×1
08個、もしくはそれより多くの胎盤灌流液細胞及び/もしくは組み合わされたナチュラル
キラー細胞、又は1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、
1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、もしくはそれより多
くの胎盤中間ナチュラルキラー細胞及び/もしくは組み合わされたナチュラルキラー細胞
に、約もしくは少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40
、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400
、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、もしくは1000mLの灌流液
、又は約1ユニットの灌流液を補充する。
【０１７２】
別の実施態様において、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖は、該腫瘍細胞(単数又は
複数)を、接着性胎盤幹細胞が補充された胎盤灌流液、灌流液細胞、PINK細胞、及び/又は
組み合わされたナチュラルキラー細胞と接触させることによって抑制される。具体的な実
施態様において、該胎盤灌流液、灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又
はPINK細胞に、1ミリリットル当たり約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×10
6、1×107、5×107、1×108、5×108個、もしくはそれより多くの接着性胎盤幹細胞、又
は1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108
、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、もしくはそれより多くの接着性胎盤
幹細胞を補充する。
【０１７３】
別の実施態様において、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖は、該腫瘍細胞(単数又は
複数)を、接着性胎盤幹細胞馴化培地、例えば、1ユニットの灌流液、灌流液細胞、組み合
わされたナチュラルキラー細胞、及び/もしくはPINK細胞当たり、又は104、105、106、10
7、108、109、もしくは1010個の細胞当たり、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.1、0.8
、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mLの幹細胞馴化培養培地が補充された胎盤灌流液
、灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又はPINK細胞と接触させる
ことによって抑制される。
【０１７４】
他の実施態様において、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、胎盤ナチュラルキラー細胞、例
えば、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、並びにそれらを含む組合せ及び
プールは、最初に得られた状態で、すなわち、灌流液は、灌流の間に得られた状態で、胎
盤灌流液細胞は、そのような灌流液から単離された状態で、組み合わされたナチュラルキ
ラー細胞は、そのような灌流液及びマッチした臍帯血から単離された状態で、又はPINK細
胞は、そのような灌流液もしくはそのような胎盤灌流液細胞から単離された状態で使用さ
れる。他の実施態様において、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、PINK細胞、組み合わされた
ナチュラルキラー細胞、並びにそれらの組合せ及びプールは、使用前に処理される。例え
ば、胎盤灌流液を、胎盤から回収された状態の、その未加工、未処理の形態で使用するこ
とができる。胎盤灌流液を、例えば、1以上のタイプの細胞のネガティブ選択、脱水によ
る体積の減少;凍結乾燥及び再水和などによって、使用前に処理することもできる。同様
に、灌流液細胞の集団を、胎盤灌流液から最初に単離された状態、例えば、胎盤灌流液由
来の全有核細胞として使用することができ、又は例えば、1以上の細胞型(例えば、赤血球
)を除去するために処理することができる。PINK細胞を、例えば、CD56マイクロビーズを
用いて胎盤灌流液から最初に単離された状態で使用することができ、又は例えば、1以上
の非キラー細胞型を除去するために処理することができる。
【０１７５】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞(単数又は複数)の増殖を
抑制する方法であって、該腫瘍細胞(単数又は複数)を、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、PI
NK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又はそれらを含むプールもしくは組合せ
と接触させることを含む、方法であり、ここで、該胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、PINK細
胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又はそれらを含むプールもしくは組合せは、
該接触させることの前に一定期間、インターロイキン-2(IL-2)と接触させたものである。
ある実施態様において、該一定期間は、該接触させることの前の約、少なくとも、又は多
くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32
、34、36、38、40、42、44、46、又は48である。
【０１７６】
灌流液、灌流液細胞、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又はそれらの
プール及び/もしくは組合せは、癌を有する個体又は腫瘍細胞を有する個体に対して、抗
癌療法の期間中に1回投与することができるか、或いは治療期間中、複数回、例えば、1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、もし
くは23時間毎に1回、又は1、2、3、4、5、6、もしくは7日毎に1回、又は1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10週、もしくはそれより長い週毎に1回投与することができる。灌流液、灌
流液細胞、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、並びにそれらのプール及び
/又は組合せは、該灌流液、灌流液細胞、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細
胞、それらのプール及び/又は組合せが、癌を有する人又は腫瘍細胞を有する人に対して
過去に投与されたかどうかとは無関係に投与することができる。したがって、本明細書に
提供される方法は、癌を有する人又は腫瘍細胞を有する人への、胎盤灌流液、灌流液細胞
、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、それらを含むプール及び/又は組合
せのいずれかの組合せの投与を包含する。
【０１７７】
具体的な実施態様において、該腫瘍細胞は、血液癌細胞である。様々な具体的な実施態
様において、該腫瘍細胞は、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、慢
性骨髄性リンパ腫(CML)細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病(CML)細胞、肺癌
細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、網膜芽腫細胞、結腸直
腸癌細胞、又は結腸直腸腺癌細胞である。
【０１７８】
胎盤灌流液、灌流液細胞、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、それらを
含むプール及び/又は組合せは、1以上の他の抗癌剤を含む抗癌療法レジメンの一部である
ことができる。そのような抗癌剤は、当技術分野で周知である。灌流液、灌流液細胞、PI
NK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、それらのプール及び/又は組合せに加え
て、癌を有する個体に投与することができる具体的な抗癌剤としては、限定されないが:
アシビシン;アクラルビシン;塩酸アコダゾール;アクロニン;アドゼレシン;アルデスロイ
キン;アルトレタミン;アンボマイシン;酢酸アメタントロン;アムサクリン;アナストロゾ
ール;アントラマイシン;アスパラギナーゼ;アスペルリン;アザシチジン;アゼテパ;アゾト
マイシン;バチマスタット;ベンゾデパ;ビカルタミド;塩酸ビサントレン;ジメシル酸ビス
ナフィド;ビゼレシン;硫酸ブレオマイシン;ブレキナルナトリウム;ブロピリミン;ブスル
ファン;カクチノマイシン;カルステロン;カラセミド;カルベチマー;カルボプラチン;カル
ムスチン;塩酸カルビシン;カルゼレシン;セデフィンゴール;セレコキシブ(COX-2阻害剤);
クロラムブシル;シロレマイシン;シスプラチン;クラドリビン;メシル酸クリスナトール;
シクロホスファミド;シタラビン;ダカルバジン;ダクチノマイシン;塩酸ダウノルビシン;
デシタビン;デキソルマプラチン;デザグアニン;メシル酸デザグアニン;ジアジコン;ドセ
タキセル;ドキソルビシン;塩酸ドキソルビシン;ドロロキシフェン;クエン酸ドロロキシフ
ェン;プロピオン酸ドロモスタノロン;デュアゾマイシン;エダトレキセート;塩酸エフロミ
チン;エルサミトルシン;エンロプラチン;エンプロメート;エピプロピジン;塩酸エピルビ
シン;エルブロゾール;塩酸エソルビシン;エストラムスチン;リン酸エストラムスチンナト
リウム;エタニダゾール;エトポシド;リン酸エトポシド;エトプリン;塩酸ファドロゾール;
ファザラビン;フェンレチニド;フロクスウリジン;リン酸フルダラビン;フルオロウラシル
;フルロシタビン;ホスキドン;フォストリエシンナトリウム;ゲムシタビン;塩酸ゲムシタ
ビン;ヒドロキシ尿素;塩酸イダルビシン;イホスファミド;イルモホシン;イプロプラチン;
イリノテカン;塩酸イリノテカン;酢酸ランレオチド;レトロゾール;酢酸ロイプロリド;塩
酸リアロゾール;ロメトレキソールナトリウム;ロムスチン;塩酸ロソキサントロン;マソプ
ロコール;メイタンシン;塩酸メクロレタミン;酢酸メゲストロール;酢酸メレンゲストロー
ル;メルファラン;メノガリル;メルカプトプリン;メトトレキセート;メトトレキセートナ
トリウム;メトプリン;メツレデパ;ミチンドミド;マイトカルシン;マイトクロミン;マイト
ギリン;マイトマルシン;マイトマイシン;マイトスペル;ミトタン;塩酸ミトキサントロン;
ミコフェノール酸;ノコダゾール;ノガラマイシン;オルマプラチン;オキシスラン;パクリ
タキセル;ペガスパルガーゼ;ペリオマイシン;ペンタムスチン;硫酸ペプロマイシン;ペル
ホスファミド;ピポブロマン;ピポスルファン;塩酸ピロキサントロン;プリカマイシン;プ
ロメスタン;ポルフィマーナトリウム;ポルフィロマイシン;プレドニムスチン;塩酸プロカ
ルバジン;ピューロマイシン;塩酸ピューロマイシン;ピラゾフリン;リボプリン;サフィン
ゴール;塩酸サフィンゴール;セムスチン;シムトラゼン;スパルホセートナトリウム;スパ
ルソマイシン;塩酸スピロゲルマニウム;スピロムスチン;スピロプラチン;ストレプトニグ
リン;ストレプトゾシン;スロフェヌル;タリソマイシン;テコガランナトリウム;タキソテ
ール;テガフール;塩酸テロキサントロン;テモポルフィン;テニポシド;テロキシロン;テス
トラクトン;チアミプリン;チオグアニン;チオテパ;チアゾフリン;チラパザミン;クエン酸
トレミフェン;酢酸トレストロン;リン酸トリシリビン;トリメトレキセート;グルクロン酸
トリメトレキセート;トリプトレリン;塩酸ツブロゾール;ウラシルマスタード;ウレデパ;
バプレオチド;ベルテポルフィン;硫酸ビンブラスチン;硫酸ビンクリスチン;ビンデシン;
硫酸ビンデシン;硫酸ビネピジン;硫酸ビングリシネート;硫酸ビンロイロシン;酒石酸ビノ
レルビン;硫酸ビンロシジン;硫酸ビンゾリジン;ボロゾール;ゼニプラチン;ジノスタチン;
及び塩酸ゾルビシンが挙げられる。
【０１７９】
他の抗癌薬としては、限定されないが: 20-エピ-1,25ジヒドロキシビタミンD3; 5-エチ
ニルウラシル;アビラテロン;アクラルビシン;アシルフルベン;アデシペノール;アドゼレ
シン;アルデスロイキン; ALL-TKアンタゴニスト;アルトレタミン;アンバムスチン;アミド
ックス;アミホスチン;アミノレブリン酸;アムルビシン;アムサクリン;アナグレリド;アナ
ストロゾール;アンドログラフォリド;血管形成阻害剤;アンタゴニストD;アンタゴニストG
;アンタレリクス;抗背方化形態形成タンパク質-1;抗アンドロゲン、前立腺癌;抗エストロ
ゲン剤;アンチネオプラストン;アンチセンスオリゴヌクレオチド;アフィジコリングリシ
ネート;アポトーシス遺伝子調節物質;アポトーシス調節因子;アプリン酸; ara-CDP-DL-PT
BA;アルギニンデアミナーゼ;アスラクリン;アタメスタン;アトリムスチン;アキシナスタ
チン1;アキシナスタチン2;アキシナスタチン3;アザセトロン;アザトキシン;アザチロシン
;バッカチンIII誘導体;バラノール;バチマスタット; BCR/ABLアンタゴニスト;ベンゾクロ
リン;ベンゾイルスタウロスポリン;βラクタム誘導体;β-アレチン;βクラマイシンB;ベ
ツリン酸; bFGF阻害剤;ビカルタミド;ビサントレン;ビスアジリジニルスペルミン;ビスナ
フィド;ビストラテンA;ビゼレシン;ブレフレート;ブロピリミン;ブドチタン;ブチオニン
スルホキシミン;カルシポトリオール;カルホスチンC;カンプトテシン誘導体;カペシタビ
ン;カルボキサミド-アミノ-トリアゾール;カルボキシアミドトリアゾール; CaRest M3; C
ARN700;軟骨由来阻害剤;カルゼレシン;カゼインキナーゼ阻害剤(ICOS);カスタノスペルミ
ン;セクロピンB;セトロレリクス;クロリン;クロロキノキサリンスルホンアミド;シカプロ
スト;シス-ポルフィリン;クラドリビン;クロミフェン類似体;クロトリマゾール;コリスマ
イシンA;コリスマイシンB;コンブレタスタチンA4;コンブレタスタチン類似体;コナゲニン
;クラムベスシジン816;クリスナトール;クリプトフィシン8;クリプトフィシンA誘導体;ク
ラシンA;シクロペンタントラキノン;シクロプラタム;シペマイシン;シタラビンオクホス
フェート;細胞溶解因子;サイトスタチン;ダクリキシマブ;デシタビン;デヒドロジデンミ
ンB;デスロレリン;デキサメタゾン;デキシホスファミド;デクスラゾキサン;デクスベラパ
ミル;ジアジコン;ジデムニンB;ジドックス;ジエチルノルスペルミン;ジヒドロ-5-アザシ
チジン;ジヒドロタキソール、9-;ジオキサマイシン;ジフェニルスピロムスチン;ドセタキ
セル;ドコサノール;ドラセトロン;ドキシフルリジン;ドキソルビシン;ドロロキシフェン;
ドロナビノール;デュオカルマイシンSA;エブセレン;エコムスチン;エデルホシン;エドレ
コロマブ;エフロルニチン;エレメン;エミテフル;エピルビシン;エプリステリド;エストラ
ムスチン類似体;エストロゲンアゴニスト;エストロゲンアンタゴニスト;エタニダゾール;
リン酸エトポシド;エキセメスタン;ファドロゾール;ファザラビン;フェンレチニド;フィ
ルグラスチム;フィナステリド;フラボピリドール;フレゼラスチン;フルアステロン;フル
ダラビン;塩酸フルオロダウノルニシン;フォルフェニメックス;フォルメスタン;フォスト
リエシン;フォテムスチン;ガドリニウムテキサフィリン;硝酸ガリウム;ガロシタビン;ガ
ニレリクス;ゼラチナーゼ阻害剤;ゲムシタビン;グルタチオン阻害剤;ヘプスルファム;ヘ
レグリン;ヘキサメチレンビスアセトアミド;ヒペリシン;イバンドロン酸;イダルビシン;
イドキシフェン;イドラマントン;イルモホシン;イロマスタット;イマチニブ(例えば、GLE
EVEC(登録商標))、イミキモド;免疫刺激性ペプチド;インスリン様成長因子-1受容体阻害
剤;インターフェロンアゴニスト;インターフェロン;インターロイキン;イオベングアン;
ヨードドキソルビシン;イポメアノール、4-;イロプラクト;イルソグラジン;イソベンガゾ
ール;イソホモハリコンドリンB;イタセトロン;ジャスプラキノリド;カハラリドF;ラメラ
リン-Nトリアセテート;ランレオチド;レイナマイシン;レノグラスチム;硫酸レンチナン;
レプトルスタチン;レトロゾール;白血病阻害因子;白血球αインターフェロン;ロイプロリ
ド＋エストロゲン＋プロゲステロン;リュープロレリン;レバミソール;リアロゾール;直鎖
ポリアミン類似体;脂溶性二糖ペプチド;脂溶性白金化合物;リッソクリナミド7;ロバプラ
チン;ロンブリシン;ロメトレキソール;ロニダミン;ロソキサントロン;ロキソリビン;ルル
トテカン;ルテチウムテキサフィリン;リソフィリン;溶解性ペプチド;マイタンシン;マン
ノスタチンA;マリマスタット;マソプロコール;マスピン;マトリライシン阻害剤;マトリッ
クスメタロプロテイナーゼ阻害剤;メノガリル;メルバロン;メテレリン;メチオニナーゼ;
メトクロプラミド; MIF阻害剤;ミフェプリストン;ミルテホシン;ミリモスチム;マイトグ
アゾン;マイトラクトール;マイトマイシン類似体;ミトナフィド;マイトトキシン線維芽細
胞成長因子-サポリン;ミトキサントロン;モファロテン;モルグラモスチム; Erbitux;ヒト
絨毛性性腺刺激ホルモン;モノホスホリル脂質A＋ミオバクテリウム細胞壁sk;モピダモー
ル;マスタード抗癌剤;ミカペルオキシドB;マイコバクテリア細胞壁抽出物;ミリアポロン;
N-アセチルジナリン; N-置換ベンズアミド;ナファレリン;ナグレスチップ;ナロキソン＋
ペンタゾシン;ナパビン;ナフテルピン;ナルトグラスチム;ネダプラチン;ネモルビシン;ネ
リドロン酸;ニルタミド;ニサマイシン;一酸化窒素調節物質;窒素酸化物酸化防止剤;ニト
ルリン;オブリメルセン(GENASENSE(登録商標)); O6-ベンジルグアニン;オクトレオチド;
オキセノン;オリゴヌクレオチド;オナプリストン;オンダンセトロン;オンダンセトロン;
オラシン;経口サイトカイン誘導因子;オルマプラチン;オサテロン;オキサリプラチン;オ
キサウノマイシン;パクリタキセル;パクリタキセル類似体;パクリタキセル誘導体;パラウ
アミン;パルミトイルリゾキシン;パミドロン酸;パナキシトリオール;パノミフェン;パラ
バクチン;パゼリプチン;ペガスパルガーゼ;ペルデシン;ペントサンポリ硫酸ナトリウム;
ペントスタチン;ペントロゾール;ペルフルブロン;ペルホスファミド;ペリリルアルコール
;フェナジノマイシン;酢酸フェニル;ホスファターゼ阻害剤;ピシバニール;塩酸ピロカル
ピン;ピラルビシン;ピリトレキシム;プラセチンA;プラセチンB;プラスミノーゲン活性化
因子阻害剤;白金錯体;白金化合物;白金トリアミン錯体;ポルフィマーナトリウム;ポルフ
ィロマイシン;プレドニゾン;プロピルビス-アクリドン;プロスタグランジンJ2;プロテア
ソーム阻害剤;プロテインAに基づく免疫調節物質;タンパク質キナーゼC阻害剤;タンパク
質キナーゼC阻害剤、微細藻類性;タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤;プリンヌク
レオシドホスホリラーゼ阻害剤;プルプリン;ピラゾロアクリジン;ピリドキシル化ヘモグ
ロビンポリオキシエチレン抱合体; rafアンタゴニスト;ラルチトレキセド;ラモセトロン;
rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤; ras阻害剤; ras-GAP阻害剤;脱
メチル化レテリプチン;レニウムRe 186エチドロネート;リゾキシン;リボザイム; RIIレチ
ナミド;ロヒツキン;ロムルチド;ロキニメックス;ルビギノンB1;ルボキシル;サフィンゴー
ル;サイントピン; SarCNU;サルコフィトールA;サルグラモスチム; Sdi 1模倣剤;セムスチ
ン;老化誘導阻害剤1;センスオリゴヌクレオチド;シグナル伝達阻害剤;シゾフィラン;ソブ
ゾキサン;ナトリウムボロカプテイト;酢酸フェニルナトリウム;ソルベロール;ソマトメジ
ン結合タンパク質;ソネルミン;スパルホス酸;スピカマイシンD;スピロムスチン;スプレノ
ペンチン;スポンギスタチン1;スクアラミン;スチピアミド;ストロメライシン阻害剤;スル
フィノシン;超活性血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト;スラジスタ;スラミン;スワイ
ンソニン;タリムスチン;タモキシフェンメチオジド;タウロムスチン;タザロテン;テコガ
ランナトリウム;テガフール;テルラピリリウム;テロメラーゼ阻害剤;テモポルフィン;テ
ニポシド;テトラクロロデカオキシド;テトラゾミン;タリブラスチン;チオコラリン;トロ
ンボポイエチン;トロンボポイエチン模倣剤;チマルファシン;チモポイエチン受容体アゴ
ニスト;チモトリナン;甲状腺刺激ホルモン;スズエチルエチオプルプリン;チラパザミン;
二塩化チタノセン;トプセンチン;トレミフェン;翻訳阻害剤;トレチノイン;トリアセチル
ウリジン;トリシリビン;トリメトレキセート;トリプトレリン;トロピセトロン;ツロステ
リド;チロシンキナーゼ阻害剤;チルホスチン; UBC阻害剤;ウベニメクス;尿生殖洞由来成
長阻害因子;ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト;バプレオチド;バリオリンB;ベラレソー
ル;ベラミン;ベルジン;ベルテポルフィン;ビノレルビン;ビンキサルチン;ビタキシン;ボ
ロゾール;ザノテロン;ゼニプラチン;ジラスコルブ;及びジノスタチンスチマラマーが挙げ
られる。
【０１８０】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、移植片対宿主病(GVHD)を有するか
、又は該疾患の症状を経験しているか、又は該疾患を発症するリスクのある個体、例えば
、移植レシピエント又は移植を受けることになる個体を治療する方法であって、該個体に
、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又は
それらを含むプールもしくは組合せの治療有効量を投与することを含む、方法であり、こ
こで、該胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞
、又はそれらを含むプールもしくは組合せは、該接触させることの前に一定期間、インタ
ーロイキン-2(IL-2)と接触させたものであり、該治療有効量は、GVHDの1以上の症状の検
出可能な改善をもたらすのに十分な、又はGVHDの1以上の症状の発症を検出可能な程度に
低下させるのに十分な量である。ある実施態様において、該一定期間は、該接触させるこ
との前の約、少なくとも、又は多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、1
8、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、又は48である。
【０１８１】
(5.8.免疫調節化合物によるナチュラルキラー細胞の処理)
本明細書中の別所に記載されている、単離されたナチュラルキラー細胞、例えば、PINK
細胞又は組み合わされたナチュラルキラー細胞を、免疫調節化合物で処理して、例えば、
免疫調節化合物と接触させて、該細胞の抗腫瘍活性を増強することができる。したがって
、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞に対するナチュラルキラー細胞の細胞傷害性を増
大させる方法であって、該ナチュラルキラー細胞が、免疫調節化合物と接触させていない
ナチュラルキラー細胞と比較して、腫瘍細胞に対する増大した細胞傷害性を示すのに十分
な時間及び濃度で、該ナチュラルキラー細胞を免疫調節化合物と接触させることを含む、
方法である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、ナチュラルキラー細胞
におけるグランザイムBの発現を増加させる方法であって、該ナチュラルキラー細胞が、
免疫調節化合物と接触させていないナチュラルキラー細胞と比較して、増加したグランザ
イムBの発現を示すのに十分な時間及び濃度で、該ナチュラルキラー細胞を免疫調節化合
物と接触させることを含む、方法である。免疫調節化合物は、下記の任意の化合物、例え
ば、レナリドミド又はポマリドミドであることができる。
【０１８２】
また本明細書に提供されるのは、複数の腫瘍細胞に対する、ナチュラルキラー細胞、例
えば、PINK細胞又は組み合わされたナチュラルキラー細胞の集団の細胞傷害性を増大させ
る方法であって、該ナチュラルキラー細胞の集団が、免疫調節化合物と接触させていない
同等数のナチュラルキラー細胞と比較して、該複数の腫瘍細胞に対する検出可能な程度に
増大した細胞傷害性を示すのに十分な時間及び濃度で、該ナチュラルキラー細胞の集団を
免疫調節化合物と接触させることを含む、方法である。別の実施態様において、本明細書
に提供されるのは、ナチュラルキラー細胞の集団におけるグランザイムBの発現を増加さ
せる方法であって、該ナチュラルキラー細胞の集団が、免疫調節化合物と接触させていな
い同等数のナチュラルキラー細胞と比較して、検出可能な程度に増大した量のグランザイ
ムBを発現するのに十分な時間及び濃度で、該ナチュラルキラー細胞の集団を免疫調節化
合物と接触させることを含む、方法である。具体的な実施態様において、該ナチュラルキ
ラー細胞の集団は、胎盤灌流液細胞、例えば、胎盤灌流液由来の全有核細胞に含まれる。
【０１８３】
上記の実施態様の具体的な実施態様において、ナチュラルキラー細胞は、CD56+、CD16-
胎盤中間ナチュラルキラー細胞(PINK細胞)である。上記の実施態様の別の具体的な実施態
様において、ナチュラルキラー細胞は、組み合わされたナチュラルキラー細胞、すなわち
、マッチした胎盤灌流液及び臍帯血由来のナチュラルキラー細胞である。
【０１８４】
別の具体的な実施態様において、該免疫調節化合物と接触させた、該複数のナチュラル
キラー細胞、例えば、PINK細胞又は組み合わされたナチュラルキラー細胞は、BAX、CCL5
、CCR5、CSF2、FAS、GUSB、IL2RA、又はTNFRSF18のうちの1つ又は複数を、該免疫調節化
合物と接触させていない同等数の該ナチュラルキラー細胞よりも高いレベルで発現する。
別の具体的な実施態様において、該免疫調節化合物と接触させた、該複数のナチュラルキ
ラー細胞、例えば、PINK細胞は、ACTB、BAX、CCL2、CCL3、CCL5、CCR5、CSF1、CSF2、ECE
1、FAS、GNLY、GUSB、GZMB、IL1A、IL2RA、IL8、IL10、LTA、PRF1、PTGS2、SKI、及びTBX
21のうちの1つ又は複数を、該免疫調節化合物と接触させていない同等数の該ナチュラル
キラー細胞よりも高いレベルで発現する。
【０１８５】
また本明細書に提供されるのは、複数の腫瘍細胞に対する、ヒト胎盤灌流液細胞の集団
、例えば、胎盤灌流液由来の全有核細胞の細胞傷害性を増大させる方法であって、該胎盤
灌流液細胞が、免疫調節化合物と接触させていない同等数の胎盤灌流液細胞と比較して、
該複数の腫瘍細胞に対する検出可能な程度に増大した細胞傷害性を示すのに十分な時間及
び濃度で、胎盤灌流液細胞を免疫調節化合物と接触させることを含む、方法である。別の
実施態様において、本明細書に提供されるのは、胎盤灌流液細胞の集団におけるグランザ
イムBの発現を増加させる方法であって、該胎盤灌流液細胞の集団が、免疫調節化合物と
接触させていない同等数の胎盤灌流液細胞と比較して、検出可能な程度に増大した量のグ
ランザイムBを発現するのに十分な時間及び濃度で、該胎盤灌流液細胞の集団を免疫調節
化合物と接触させることを含む、方法である。
【０１８６】
免疫調節化合物は、市販で購入することができるか、又はその全てが引用により組み込
まれる本明細書に言及される特許もしくは特許公開に記載の方法に従って調製することが
できる。さらに、光学的に純粋な組成物は、不斉合成するか、又は既知の分割剤もしくは
キラルカラム及び他の標準的な合成有機化学技術を用いて分割することができる。免疫調
節化合物は、ラセミ化合物、ステレオマー的に濃縮されたもの、又はステレオマー的に純
粋なものであることができ、かつその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、及びプロドラ
ッグを包含することができる。
【０１８７】
本明細書で使用されるように、及び別途示されない限り、「免疫調節化合物」という用
語は、TNF-α、LPS誘導性単球IL-1β及びIL-12を顕著に阻害し、IL-6産生を部分的に阻害
する小有機分子を包含する。具体的な例において、免疫調節化合物は、レナリドミド、ポ
マリドミド、又はサリドマイドである。
【０１８８】
免疫調節化合物の具体的な例としては、限定されないが、置換スチレンのシアノ及びカ
ルボキシ誘導体、例えば、米国特許第5,929,117号に開示されているもの; 1-オキソ-2-(2
,6-ジオキソ-3-フルオロピペリジン-3イル)イソインドリン及び1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジ
オキソ-3-フルオロピペリジン-3-イル)イソインドリン、例えば、米国特許第5,874,448号
及び第5,955,476号に記載されているもの;米国特許第5,798,368号に記載されているテト
ラ置換2-(2,6-ジオキソピペルジン(dioxopiperdin)-3-イル)-1-オキソイソインドリン; 1
-オキソ及び1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)イソインドリン(例えば、
サリドマイドの4-メチル誘導体)、これには、限定されないが、米国特許第5,635,517号、
第6,476,052号、第6,555,554号、及び第6,403,613号に開示されているものが含まれる;米
国特許第6,380,239号に記載されている、インドリン環の4-位又は5-位で置換された1-オ
キソ及び1,3-ジオキソイソインドリン(例えば、4-(4-アミノ-1,3-ジオキソイソインドリ
ン-2-イル)-4-カルバモイルブタン酸);米国特許第6,458,810号に記載されている、2-位で
2,6-ジオキソ-3-ヒドロキシピペリジン-5-イルと置換されたイソインドリン-1-オン及び
イソインドリン-1,3-ジオン(例えば、2-(2,6-ジオキソ-3-ヒドロキシ-5-フルオロピペリ
ジン-5-イル)-4-アミノイソインドリン-1-オン);米国特許第5,698,579号及び第5,877,200
号に開示されているあるクラスの非ポリペプチド環状アミド;アミノサリドマイド、並び
にアミノサリドマイドの類似体、加水分解産物、代謝体、誘導体、及び前駆体、並びに置
換2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)フタルイミド及び置換2-(2,6-ジオキソピペリジン
-3-イル)-1-オキソイソインドール、例えば、米国特許第6,281,230号及び第6,316,471号
に記載されているもの;並びにイソインドール-イミド化合物、例えば、米国特許公報第20
03/0045552 A1号、米国特許第7,091,353号、及びWO 02/059106号に記載されているものが
挙げられる。本明細書で特定されている特許及び特許出願の各々の全体が引用により本明
細書中に組み込まれている。免疫調節化合物に、サリドマイドは含まれない。
【０１８９】
ある実施態様において、免疫調節化合物は、引用により完全に本明細書中に組み込まれ
る米国特許第5,635,517号に記載されているような、ベンゾ環中でアミノと置換された1-
オキソ-及び1,3 ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)イソインドリンである。
これらの化合物は、構造I:
【化１】
2020196724.tif 000003
を有し、ここで、X及びYのうちの一方はC=Oであり、X及びYのうちのもう一方は、C=O又は
CH2であり、R2は、水素又は低級アルキル、特にメチルである。具体的な免疫調節化合物
としては:
1-オキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-4-アミノイソインドリン;
1-オキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-5-アミノイソインドリン;
1-オキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-6-アミノイソインドリン;
1-オキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-7-アミノイソインドリン;
1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-4-アミノイソインドリン;及び
1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-5-アミノイソインドリン
が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
他の具体的な免疫調節化合物は、置換2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)フタルイミ
ド及び置換2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-1-オキソイソインドール、例えば、その
各々が引用により本明細書中に組み込まれる、米国特許第6,281,230号;第6,316,471号;第
6,335,349号;及び第6,476,052号、並びにWO 98/03502号に記載されているものの1つのク
ラスに属する。代表的な化合物は、次式のものであり:
【化２】
2020196724.tif 000004
式中:
X及びYのうちの一方はC=Oであり、X及びYのうちのもう一方は、C=O又はCH2であり;
(i)R1、R2、R3、及びR4の各々は、他のものとは独立に、ハロ、炭素原子1〜4個のアル
キル、もしくは炭素原子1〜4個のアルコキシであるか、又は(ii)R1、R2、R3、及びR4のう
ちの1つは-NHR5であり、R1、R2、R3、及びR4のうちの残りは水素であり;
R5は、水素、又は炭素原子1〜8個のアルキルであり;
R6は、水素、炭素原子1〜8個のアルキル、ベンジル、又はハロであり;
但し、X及びYがC=Oである場合、R6は水素以外のものであり、かつ(i)R1、R2、R3、及び
R4の各々はフルオロであるか、又は(ii)R1、R2、R3、もしくはR4のうちの1つはアミノで
ある。このクラスの代表的な化合物は、次式のものであり:
【化３】
2020196724.tif 000005
式中、R1は、水素又はメチルである。独立した実施態様において、包含されるのは、これ
らの化合物のエナンチオマー的に純粋な形態(例えば、光学的に純粋な(R)又は(S)エナン
チオマー)の使用である。
【０１９１】
さらに他の具体的な免疫調節化合物は、その各々が引用により本明細書中に組み込まれ
る、米国特許出願公開US 2003/0096841号及びUS 2003/0045552号、並びにWO 02/059106号
に開示されているイソインドール-イミドの1つのクラスに属する。代表的な化合物は、式
IIのもの、並びにその医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物、包摂化合物、エナン
チオマー、ジアステレオマー、ラセミ化合物、及び立体異性体の混合物であり:
【化４】
2020196724.tif 000006
式中:
X及びYのうちの一方はC=Oであり、もう一方は、CH2又はC=Oであり;
R1は、H、(C1-C8)アルキル、(C3-C7)シクロアルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)ア
ルキニル、ベンジル、アリール、(C0-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、(C0-C
4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、C(O)R3 、C(S)R3、C(O)OR4、(C1-C8)アルキル-N(R6
)2、(C1-C8)アルキル-OR5、(C1-C8)アルキル-C(O)OR5、C(O)NHR3、C(S)NHR3、C(O)NR3R3'
、C(S)NR3R3'、又は(C1-C8)アルキル-O(CO)R5であり;
R2は、H、F、ベンジル、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、又は(C2-C8)アルキニ
ルであり;
R3及びR3'は、独立に、(C1-C8)アルキル、(C3-C7)シクロアルキル、(C2-C8)アルケニル
、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(C0-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアル
キル、(C0-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、(C0-C8)アルキル-N(R6)2、(C1-C8)アル
キル-OR5、(C1-C8)アルキル-C(O)OR5、(C1-C8)アルキル-O(CO)R5、又はC(O)OR5であり;
R4は、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、(C1-C4)アルキル-O
R5、ベンジル、アリール、(C0-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、又は(C0-C4)
アルキル-(C2-C5)ヘテロアリールであり;
R5は、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリー
ル、又は(C2-C5)ヘテロアリールであり;
各々の出現するR6は、独立に、H、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アル
キニル、ベンジル、アリール、(C2-C5)ヘテロアリール、もしくは(C0-C8)アルキル-C(O)O
-R5であるか、又は該R6基は結合して、ヘテロシクロアルキル基を形成し;
nは、0又は1であり;かつ
*は、キラル炭素中心を表す。
式IIの具体的な化合物において、nが0であるとき、R1は、(C3-C7)シクロアルキル、(C2
-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(C0-C4)アルキル-(C1-C6)ヘ
テロシクロアルキル、(C0-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、C(O)R3、C(O)OR4、(C1-
C8)アルキル-N(R6)2、(C1-C8)アルキル-OR5、(C1-C8)アルキル-C(O)OR5、C(S)NHR3、又は
(C1-C8)アルキル-O(CO)R5であり;
R2は、H又は(C1-C8)アルキルであり;かつ
R3は、(C1-C8)アルキル、(C3-C7)シクロアルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキ
ニル、ベンジル、アリール、(C0-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、(C0-C4)ア
ルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、(C5-C8)アルキル-N(R6)2;(C0-C8)アルキル-NH-C(O)O-R5
;(C1-C8)アルキル-OR5、(C1-C8)アルキル-C(O)OR5、(C1-C8)アルキル-O(CO)R5、又はC(O)
OR5であり;かつ他の変数は、同じ定義を有する。
【０１９２】
式IIの他の具体的な化合物において、R2は、H又は(C1-C4)アルキルである。
【０１９３】
式IIの他の具体的な化合物において、R1は、(C1-C8)アルキル又はベンジルである。
【０１９４】
式IIの他の具体的な化合物において、R1は、H、(C1-C8)アルキル、ベンジル、CH2OCH3
、CH2CH2OCH3、又は
【化５】
2020196724.tif 000007
である。
【０１９５】
式IIの化合物の別の実施態様において、R1は、
【化６】
2020196724.tif 000008
であり、ここで、Qは、O又はSであり、かつ各々の出現するR7は、独立に、H、(C1-C8)ア
ルキル、(C3-C7)シクロアルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、
アリール、ハロゲン、(C0-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、(C0-C4)アルキル
-(C2-C5)ヘテロアリール、(C0-C8)アルキル-N(R6)2、(C1-C8)アルキル-OR5、(C1-C8)アル
キル-C(O)OR5、(C1-C8)アルキル-O(CO)R5、もしくはC(O)OR5であるか、又は隣接して出現
するR7は一緒になって、二環式アルキルもしくはアリール環を形成することができる。
【０１９６】
式IIの他の具体的な化合物において、R1は、C(O)R3である。
【０１９７】
式IIの他の具体的な化合物において、R3は、(C0-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール
、(C1-C8)アルキル、アリール、又は(C0-C4)アルキル-OR5である。
【０１９８】
式IIの他の具体的な化合物において、ヘテロアリールは、ピリジル、フリル、又はチエ
ニルである。
【０１９９】
式IIの他の具体的な化合物において、R1は、C(O)OR4である。
【０２００】
式IIの他の具体的な化合物において、C(O)NHC(O)のHは、(C1-C4)アルキル、アリール、
又はベンジルと置換することができる。
【０２０１】
このクラスの化合物のさらなる例としては、限定されないが:[2-(2,6-ジオキソ-ピペリ
ジン-3-イル)-1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-4-イルメチル]-アミド;(2
-(2,6-ジオキソ-ピペリジン-3-イル)-1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-4-
イルメチル)-カルバミン酸 tert-ブチルエステル; 4-(アミノメチル)-2-(2,6-ジオキソ(3
-ピペリジル))-イソインドリン-1,3-ジオン; N-(2-(2,6-ジオキソ-ピペリジン-3-イル)-1
,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-4-イルメチル)-アセトアミド; N-{(2-(2,
6-ジオキソ(3-ピペリジル)-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)メチル}シクロプロピル
-カルボキサミド; 2-クロロ-N-{(2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1,3-ジオキソイソイ
ンドリン-4-イル)メチル}アセトアミド; N-(2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1,3-ジオ
キソイソインドリン-4-イル)-3-ピリジルカルボキサミド; 3-{1-オキソ-4-(ベンジルアミ
ノ)イソインドリン-2-イル}ピペリジン-2,6-ジオン; 2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-4
-(ベンジルアミノ)イソインドリン-1,3-ジオン; N-{(2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1
,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)メチル}プロパンアミド; N-{(2-(2,6-ジオキソ(3-ピ
ペリジル))-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)メチル}-3-ピリジルカルボキサミド; N
-{(2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)メチル}ヘプ
タンアミド; N-{(2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル
)メチル}-2-フリルカルボキサミド;{N-(2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1,3-ジオキソ
イソインドリン-4-イル)カルバモイル}メチルアセタート; N-(2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリ
ジル))-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)ペンタンアミド; N-(2-(2,6-ジオキソ(3-ピ
ペリジル))-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)-2-チエニルカルボキサミド; N-{[2-(2
,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル]メチル}(ブチルアミ
ノ)カルボキサミド; N-{[2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1,3-ジオキソイソインドリン
-4-イル]メチル}(オクチルアミノ)カルボキサミド;及びN-{[2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジ
ル))-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル]メチル}(ベンジルアミノ)カルボキサミドが挙
げられる。
【０２０２】
さらに他の具体的な免疫調節化合物は、その各々が引用により本明細書中に組み込まれ
る、米国特許出願公開第2002/0045643号、国際公開WO 98/54170号、及び米国特許第6,395
,754号に開示されているイソインドール-イミドの1つのクラスに属する。代表的な化合物
は、式IIIのもの、並びにその医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物、包摂化合物
、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ化合物、及び立体異性体の混合物であり:
【化７】
2020196724.tif 000009
式中:
X及びYのうちの一方はC=Oであり、もう一方は、CH2又はC=Oであり;
Rは、H又はCH2OCOR'であり;
(i)R1、R2、R3、もしくはR4の各々は、他のものとは独立に、ハロ、炭素原子1〜4個の
アルキル、もしくは炭素原子1〜4個のアルコキシであるか、又は(ii)R1、R2、R3、もしく
はR4のうちの1つは、ニトロもしくは-NHR5であり、R1、R2、R3、もしくはR4のうちの残り
は水素であり;
R5は、水素又は炭素原子1〜8個のアルキルであり、
R6は、水素、炭素原子1〜8個のアルキル、ベンゾ、クロロ、又はフルオロであり;
R'は、R7-CHR10-N(R8R9)であり;
R7は、m-フェニレン又はp-フェニレン又は-(CnH2n)-(ここで、nは、0〜4の値を有する)
であり;
R8及びR9の各々は、もう一方とは独立に、水素又は炭素原子1〜8個のアルキルであるか
、或いは一緒になったR8及びR9は、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、
又は-CH2CH2X1CH2CH2-(ここで、X1は、-O-、-S-、もしくは-NH-である)であり;
R10は、水素、炭素原子8個のアルキル、又はフェニルであり;かつ
*は、キラル炭素中心を表す。
【０２０３】
他の代表的な化合物は、次式のものであり:
【化８】
2020196724.tif 000010
式中:
X及びYのうちの一方はC=Oであり、X及びYのうちのもう一方は、C=O又はCH2であり;
(i)R1、R2、R3、もしくはR4の各々は、他のものとは独立に、ハロ、炭素原子1〜4個の
アルキル、もしくは炭素原子1〜4個のアルコキシであるか、又は(ii)R1、R2、R3、及びR4
のうちの1つは-NHR5であり、R1、R2、R3、及びR4のうちの残りは水素であり;
R5は、水素、又は炭素原子1〜8個のアルキルであり;
R6は、水素、炭素原子1〜8個のアルキル、ベンゾ、クロロ、又はフルオロであり;
R7は、m-フェニレン又はp-フェニレン又は-(CnH2n)-(ここで、nは、0〜4の値を有する)
であり;
R8及びR9の各々は、もう一方とは独立に、水素又は炭素原子1〜8個のアルキルであるか
、或いは一緒になったR8及びR9は、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、
又は-CH2CH2X1CH2CH2-(ここで、X1は、-O-、-S-、もしくは-NH-である)であり;
R10は、水素、炭素原子8個のアルキル、又はフェニルである。
他の代表的な化合物は、次式のものであり:
【化９】
2020196724.tif 000011
式中、
X及びYのうちの一方はC=Oであり、X及びYのうちのもう一方は、C=O又はCH2であり;
R1、R2、R3、及びR4の各々は、他のものとは独立に、ハロ、炭素原子1〜4個のアルキル
、もしくは炭素原子1〜4個のアルコキシであるか、又は(ii)R1、R2、R3、及びR4のうちの
1つは、ニトロもしくは保護アミノであり、R1、R2、R3、及びR4のうちの残りは水素であ
り;かつ
R6は、水素、炭素原子1〜8個のアルキル、ベンゾ、クロロ、又はフルオロである。
【０２０４】
他の代表的な化合物は、次式のものであり:
【化１０】
2020196724.tif 000012
式中:
X及びYのうちの一方はC=Oであり、X及びYのうちのもう一方は、C=O又はCH2であり;
(i)R1、R2、R3、及びR4の各々は、他のものとは独立に、ハロ、炭素原子1〜4個のアル
キル、もしくは炭素原子1〜4個のアルコキシであるか、又は(ii)R1、R2、R3、及びR4のう
ちの1つは-NHR5であり、R1、R2、R3、及びR4のうちの残りは水素であり;
R5は、水素、炭素原子1〜8個のアルキル、又はCO-R7-CH(R10)NR8R9(ここで、R7、R8、R
9、及びR10の各々は、本明細書に定義されている通りである)であり;かつ
R6は、炭素原子1〜8個のアルキル、ベンゾ、クロロ、又はフルオロである。
該化合物の具体的な例は、次式のものであり:
【化１１】
2020196724.tif 000013
式中:
X及びYのうちの一方はC=Oであり、X及びYのうちのもう一方は、C=O又はCH2であり;
R6は、水素、炭素原子1〜8個のアルキル、ベンジル、クロロ、又はフルオロであり;
R7は、m-フェニレン、p-フェニレン、又は-(CnH2n)-(ここで、nは、0〜4の値である)で
あり;
R8及びR9の各々は、もう一方とは独立に、水素又は炭素原子1〜8個のアルキルであるか
、或いは一緒になったR8及びR9は、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、
又は-CH2CH2X1CH2CH2-(ここで、X1は、-O-、-S-、又は-NH-である)であり;かつ
R10は、水素、炭素原子1〜8個のアルキル、又はフェニルである。
【０２０５】
最も好ましい免疫調節化合物は、4-(アミノ)-2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-イソイ
ンドリン-1,3-ジオン及び3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-
ピペリジン-2,6-ジオンである。該化合物は、標準的な合成法によって得ることができる(
例えば、引用により本明細書中に組み込まれる米国特許第5,635,517号を参照されたい)。
該化合物は、Celgene Corporation, Warren, NJから入手可能である。4-(アミノ)-2-(2,6
-ジオキソ(3-ピペリジル))-イソインドリン-1,3-ジオンは、以下の化学構造を有する:
【化１２】
2020196724.tif 000014
。
化合物3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリジン-2,6-ジ
オンは、以下の化学構造を有する:
【化１３】
2020196724.tif 000015
。
【０２０６】
別の実施態様において、具体的な免疫調節化合物は、引用により本明細書中に組み込ま
れる米国公開US 2005/0096351 A1号に開示されている、3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒド
ロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオンの多形形態、例えば、形態A、B、C、
D、E、F、G、及びHを包含する。例えば、3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインド
ール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオンの形態Aは、非水性溶媒系から得ることができる非
溶媒和結晶物質である。形態Aは、約8、14.5、16、17.5、20.5、24、及び26度の2θに顕
著なピークを含むX線粉末回折パターンを有し、約270℃の示差走査熱量測定融点最大値を
有する。形態Aは、弱吸湿性又は非吸湿性であり、これまでに発見された3-(4-アミノ-1-
オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリジン-2,6-ジオンのうちの最も熱力
学的に安定な無水多形であるように思われる。
【０２０７】
3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオン
の形態Bは、限定されないが、ヘキサン、トルエン、及び水を含む、様々な溶媒系から得
ることができる半水和結晶物質である。形態Bは、約16、18、22、及び27度の2θに顕著な
ピークを含むX線粉末回折パターンを有し、DSC曲線から約146及び268℃の吸熱を有し、こ
れは、ホットステージ顕微鏡実験により、脱水及び融解と同定される。相互変換研究は、
形態Bが水性溶媒系で形態Eに変換し、アセトン及び他の無水系で他の形態に変換すること
を示している。
【０２０８】
3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオン
の形態Cは、限定されないが、アセトンなどの溶媒から得ることができる半溶媒和結晶物
質である。形態Cは、約15.5及び25度の2θに顕著なピークを含むX線粉末回折パターンを
有し、約269℃の示差走査熱量測定融点最大値を有する。形態Cは、約85％未満のRHでは吸
湿性ではないが、より高い相対湿度で形態Bに変換することができる。
【０２０９】
3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオン
の形態Dは、アセトニトリルと水の混合物から調製される結晶性溶媒和多形である。形態D
は、約27及び28度の2θに顕著なピークを含むX線粉末回折パターンを有し、約270℃の示
差走査熱量測定融点最大値を有する。形態Dは、弱吸湿性又は非吸湿性のどちらかである
が、通常、より高い相対湿度で圧力を加えたときに形態Bに変換する。
【０２１０】
3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオン
の形態Eは、3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,
6-ジオンを水中でスラリー化することによって、及びアセトン:水の比が約9:1の溶媒系に
おける3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジ
オンの低速蒸発によって得ることができる二水和結晶物質である。形態Eは、約20、24.5
、及び29度の2θに顕著なピークを含むX線粉末回折パターンを有し、約269℃の示差走査
熱量測定融点最大値を有する。形態Eは、アセトン溶媒系で形態Cに、及びTHF溶媒系で形
態Gに変換することができる。水性溶媒系において、形態Eは、最も安定な形態であるよう
に思われる。形態Eに対して行われた脱溶媒和実験は、約125℃で約5分間加熱したとき、
形態Eが形態Bに変換することができることを示している。175℃で約5分間加熱したとき、
形態Bは、形態Fに変換することができる。
【０２１１】
3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオン
の形態Fは、形態Eの脱水によって得ることができる非溶媒和結晶物質である。形態Fは、
約19、19.5、及び25度の2θに顕著なピークを含むX線粉末回折パターンを有し、約269℃
の示差走査熱量測定融点最大値を有する。
【０２１２】
3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオン
の形態Gは、形態B及びEを、限定されないが、テトラヒドロフラン(THF)などの溶媒中でス
ラリー化することによって得ることができる非溶媒和結晶物質である。形態Gは、約21、2
3、及び24.5度の2θに顕著なピークを含むX線粉末回折パターンを有し、約267℃の示差走
査熱量測定融点最大値を有する。
【０２１３】
3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオン
の形態Hは、形態Eを0％相対湿度に暴露させることによって得ることができる部分水和(約
0.25モル)結晶物質である。形態Hは、約15、26、及び31度の2θに顕著なピークを含むX線
粉末回折パターンを有し、約269℃の示差走査熱量測定融点最大値を有する。
【０２１４】
本明細書に提供される方法において使用可能な他の具体的な免疫調節化合物としては、
1-オキソ-2-(2,6-ジオキソ-3-フルオロピペリジン-3イル)イソインドリン及び1,3-ジオキ
ソ-2-(2,6-ジオキソ-3-フルオロピペリジン-3-イル)イソインドリン、例えば、その各々
が引用により本明細書中に組み込まれる、米国特許第5,874,448号及び第5,955,476号に記
載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な化合物は、次式のも
のであり:
【化１４】
2020196724.tif 000016
式中、Yは、酸素又はH2であり、かつ
R1、R2、R3、及びR4の各々は、他のものとは独立に、水素、ハロ、炭素原子1〜4個のア
ルキル、炭素原子1〜4個のアルコキシ、又はアミノである。
【０２１５】
本明細書に提供される方法において使用可能な他の具体的な免疫調節化合物としては、
引用により本明細書中に組み込まれる米国特許第5,798,368号に記載されているテトラ置
換2-(2,6-ジオキソピペルジン(dioxopiperdin)-3-イル)-1-オキソイソインドリンが挙げ
られるが、これに限定されない。代表的な化合物は、次式のものであり:
【化１５】
2020196724.tif 000017
式中、R1、R2、R3、及びR4の各々は、他のものとは独立に、ハロ、炭素原子1〜4個のアル
キル、又は炭素原子1〜4個のアルコキシである。
【０２１６】
本明細書に提供される方法において使用することができる他の具体的な免疫調節化合物
としては、引用により本明細書中に組み込まれる米国特許第6,403,613号に開示されてい
る1-オキソ及び1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)イソインドリンが挙げ
られるが、これらに限定されない。代表的な化合物は、次式のものであり:
【化１６】
2020196724.tif 000018
式中、
Yは、酸素又はH2であり、
R1及びR2の第一のものは、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキル
アミノ、シアノ、又はカルバモイルであり、R1及びR2の第二のものは、第一のものとは独
立に、水素、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シアノ
、又はカルバモイルであり、かつ
R3は、水素、アルキル、又はベンジルである。
該化合物の具体的な例は、次式のものであり:
【化１７】
2020196724.tif 000019
式中、R1及びR2の第一のものは、ハロ、炭素原子1〜4個のアルキル、炭素原子1〜4個のア
ルコキシ、ジアルキルアミノ(ここで、各々のアルキルは、炭素原子が1〜4個である)、シ
アノ、又はカルバモイルであり、
R1及びR2の第二のものは、第一のものとは独立に、水素、ハロ、炭素原子1〜4個のアル
キル、炭素原子1〜4個のアルコキシ、アルキルアミノ(ここで、アルキルは、炭素原子が1
〜4個である)、ジアルキルアミノ(ここで、各々のアルキルは、炭素原子が1〜4個である)
、シアノ、又はカルバモイルであり、かつ
R3は、水素、炭素原子1〜4個のアルキル、又はベンジルである。具体的な例としては、
1-オキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-4-メチルイソインドリンが挙げられるが
、これに限定されない。
【０２１７】
本明細書に提供される方法において使用することができる他の化合物は、次式のもので
あり:
【化１８】
2020196724.tif 000020
式中、R1及びR2の第一のものは、ハロ、炭素原子1〜4個のアルキル、炭素原子1〜4個のア
ルコキシ、ジアルキルアミノ(ここで、各々のアルキルは、炭素原子が1〜4個である)、シ
アノ、又はカルバモイルであり、
R1及びR2の第二のものは、第一のものとは独立に、水素、ハロ、炭素原子1〜4個のアル
キル、炭素原子1〜4個のアルコキシ、アルキルアミノ(ここで、アルキルは、炭素原子が1
〜4個である)、ジアルキルアミノ(ここで、各々のアルキルは、炭素原子が1〜4個である)
、シアノ、又はカルバモイルであり、かつ
R3は、水素、炭素原子1〜4個のアルキル、又はベンジルである。
【０２１８】
本明細書に提供される方法において使用することができる他の具体的な免疫調節化合物
としては、引用により本明細書中に組み込まれる、米国特許第6,380,239号及び米国出願
公開第2006/0084815号に記載されている、インドリン環の4-位又は5-位で置換された1-オ
キソ及び1,3-ジオキソイソインドリンが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な
化合物は、次式のもの;及びその塩であり:
【化１９】
2020196724.tif 000021
式中、C*と表記された炭素原子は、キラリティの中心を構成し(nが0ではなく、R1がR2と
同じではない場合); X1及びX2のうちの一方は、アミノ、ニトロ、炭素1〜6個のアルキル
、又はNH-Zであり、X1又はX2のうちのもう一方は、水素であり; R1及びR2の各々は、もう
一方とは独立に、ヒドロキシ又はNH-Zであり; R3は、水素、炭素1〜6個のアルキル、ハロ
、又はハロアルキルであり; Zは、水素、アリール、炭素1〜6個のアルキル、ホルミル、
又は炭素1〜6個のアシルであり;かつnは、0、1、又は2の値を有し;但し、X1がアミノであ
り、nが1又は2である場合、R1とR2の両方がヒドロキシであることはない。
【０２１９】
本明細書に提供される方法において使用することができるさらなる化合物は、次式のも
のであり:
【化２０】
2020196724.tif 000022
式中、C*と表記された炭素原子は、nが0ではなく、R1がR2ではない場合、キラリティの中
心を構成し; X1及びX2のうちの一方は、アミノ、ニトロ、炭素1〜6個のアルキル、又はNH
-Zであり、X1又はX2のうちのもう一方は、水素であり; R1及びR2の各々は、もう一方とは
独立に、ヒドロキシ又はNH-Zであり; R3は、炭素1〜6個のアルキル、ハロ、又は水素であ
り; Zは、水素、アリール、又は炭素1〜6個のアルキルもしくはアシルであり;かつnは、0
、1、又は2の値を有する。
【０２２０】
本明細書に提供される方法において使用することができる化合物の具体的な例としては
、それぞれ、以下の構造を有する、2-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール
-2-イル)-4-カルバモイル-酪酸及び4-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール
-2-イル)-4-カバモイル(cabamoyl)-酪酸、並びにそれらの医薬として許容し得る塩、溶媒
和物、プロドラッグ、及び立体異性体が挙げられるが、これらに限定されない:
【化２１】
2020196724.tif 000023
。
【０２２１】
他の代表的な化合物は、次式のもの;及びその塩であり:
【化２２】
2020196724.tif 000024
式中、C*と表記された炭素原子は、nが0ではなく、R1がR2ではない場合、キラリティの中
心を構成し; X1及びX2のうちの一方は、アミノ、ニトロ、炭素1〜6個のアルキル、又はNH
-Zであり、X1又はX2のうちのもう一方は、水素であり; R1及びR2の各々は、もう一方とは
独立に、ヒドロキシ又はNH-Zであり; R3は、炭素1〜6個のアルキル、ハロ、又は水素であ
り; Zは、水素、アリール、又は炭素1〜6個のアルキルもしくはアシルであり;かつnは、0
、1、又は2の値を有する。
【０２２２】
具体的な例としては、それぞれ、以下の構造を有する、4-カルバモイル-4-{4-[(フラン
-2-イル-メチル)-アミノ]-1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル}-酪酸、4
-カルバモイル-2-{4-[(フラン-2-イル-メチル)-アミノ]-1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-イ
ソインドール-2-イル}-酪酸、2-{4-[(フラン-2-イル-メチル)-アミノ]-1,3-ジオキソ-1,3
-ジヒドロ-イソインドール-2-イル}-4-フェニルカルバモイル-酪酸、及び2-{4-[(フラン-
2-イル-メチル)-アミノ]-1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル}-ペンタン
二酸、並びにそれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、プロドラッグ、及び立体異性
体が挙げられるが、これらに限定されない:
【化２３】
2020196724.tif 000025
。
【０２２３】
該化合物の他の具体的な例は、次式のものであり:
【化２４】
2020196724.tif 000026
式中、X1及びX2のうちの一方は、ニトロ又はNH-Zであり、X1又はX2のうちのもう一方は、
水素であり;
R1及びR2の各々は、もう一方とは独立に、ヒドロキシ又はNH-Zであり;
R3は、炭素1〜6個のアルキル、ハロ、又は水素であり;
Zは、水素、フェニル、炭素1〜6個のアシル、又は炭素1〜6個のアルキルであり;かつ
nは、0、1、又は2の値を有し;
但し、X1及びX2のうちの一方がニトロであり、nが、1又は2である場合、R1及びR2は、
ヒドロキシ以外のものであり;かつ
-COR2及び-(CH2)nCOR1が異なる場合、C*と表記された炭素原子は、キラリティの中心を
構成する。他の代表的な化合物は、次式のものであり:
【化２５】
2020196724.tif 000027
式中、X1及びX2のうちの一方は、炭素1〜6個のアルキルであり;
R1及びR2の各々は、もう一方とは独立に、ヒドロキシ又はNH-Zであり;
R3は、炭素1〜6個のアルキル、ハロ、又は水素であり;
Zは、水素、フェニル、炭素1〜6個のアシル、又は炭素1〜6個のアルキルであり;かつ
nは、0、1、又は2の値を有し;かつ
-COR2及び-(CH2)nCOR1が異なる場合、C*と表記された炭素原子は、キラリティの中心を
構成する。
【０２２４】
さらに他の具体的な免疫調節化合物としては、引用により本明細書中に組み込まれる米
国特許第6,458,810号に記載されている、2-位で2,6-ジオキソ-3-ヒドロキシピペリジン-5
-イルにより置換されたイソインドリン-1-オン及びイソインドリン-1,3-ジオンが挙げら
れるが、これに限定されない。代表的な化合物は、次式のものであり:
【化２６】
2020196724.tif 000028
式中:
*と表記された炭素原子は、キラリティの中心を構成し;
Xは、-C(O)-又は-CH2-であり;
R1は、炭素原子1〜8個のアルキル又は-NHR3であり;
R2は、水素、炭素原子1〜8個のアルキル、又はハロゲンであり;かつ
R3は、水素、
置換されていない、又は炭素原子1〜8個のアルコキシ、ハロ、アミノ、もしくは炭素原
子1〜4個のアルキルアミノで置換されている、炭素原子1〜8個のアルキル、
炭素原子3〜18個のシクロアルキル、
置換されていない、又は炭素原子1〜8個のアルキル、炭素原子1〜8個のアルコキシ、ハ
ロ、アミノ、もしくは炭素原子1〜4個のアルキルアミノで置換されている、フェニル、
置換されていない、又は炭素原子1〜8個のアルキル、炭素原子1〜8個のアルコキシ、ハ
ロ、アミノ、もしくは炭素原子1〜4個のアルキルアミノで置換されている、ベンジル、或
いは-COR4
であり、ここで、
R4は、水素、
置換されていない、又は炭素原子1〜8個のアルコキシ、ハロ、アミノ、もしくは炭素原
子1〜4個のアルキルアミノで置換されている、炭素原子1〜8個のアルキル、
炭素原子3〜18個のシクロアルキル、
置換されていない、又は炭素原子1〜8個のアルキル、炭素原子1〜8個のアルコキシ、ハ
ロ、アミノ、もしくは炭素原子1〜4個のアルキルアミノで置換されている、フェニル、或
いは
置換されていない、又は炭素原子1〜8個のアルキル、炭素原子1〜8個のアルコキシ、ハ
ロ、アミノ、もしくは炭素原子1〜4個のアルキルアミノで置換されている、ベンジル
である。
【０２２５】
本明細書に提供される化合物は、市販で購入することができるか、又は本明細書に開示
される特許もしくは特許公開に記載の方法に従って調製することができる。さらに、光学
的に純粋な化合物は、不斉合成するか、又は既知の分割剤もしくはキラルカラム及び他の
標準的な合成有機化学技術を用いて分割することができる。
【０２２６】
様々な免疫調節化合物は1以上のキラル中心を含有し、エナンチオマーのラセミ混合物
又はジアステレオマーの混合物として存在することができる。包含されるのは、そのよう
な化合物のステレオマー的に純粋な形態の使用及びそれらの形態の混合物の使用である。
例えば、特定の免疫調節化合物の等量又は不等量のエナンチオマーを含む混合物を、本明
細書に提供される方法及び組成物において使用することができる。これらの異性体は、不
斉合成するか、又はキラルカラムもしくはキラル分割剤などの標準的な技術を用いて分割
することができる。例えば、Jacques, J.らの文献、エナンチオマー、ラセミ化合物、及
び分割(Enantiomers, Racemates and Resolutions)(Wiley-Interscience, New York, 198
1); Wilen, S. H.らの文献、Tetrahedron 33:2725(1977); Eliel, E. L.の文献、炭素化
合物の立体化学(Stereochemistry of Carbon Compounds)(McGraw-Hill, NY, 1962);及びW
ilen, S. H.の文献、分割剤及び光学分割の表(Tables of Resolving Agents and Optical
Resolutions)、268頁(E.L. Eliel編、Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, 1972年
)を参照されたい。
【０２２７】
図示された構造とその構造に与えられている名称に矛盾がある場合、図示された構造に
より重きが置かれるということに留意すべきである。さらに、構造又は構造の一部の立体
化学が、例えば、太線又は破線で示されていない場合、該構造又は該構造の一部は、その
全ての立体異性体を包含するものと解釈すべきである。
【０２２８】
(5.9. PINK細胞、ヒト胎盤灌流液、又は組み合わされたナチュラルキラー細胞の投与)
PINK細胞、ヒト胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、そのような細
胞を含む細胞集団、又はこれらの組合せは、生細胞の投与に好適な当技術分野で公知の任
意の医学的に許容し得る経路によって、個体、例えば、腫瘍細胞を有する個体、例えば、
癌患者に投与することができる。様々な実施態様において、本明細書に提供される細胞は
、例えば、カテーテルもしくはシリンジによって、外科的に移植し、注射し、注入するか
、又は別の方法で、修復もしくは強化を必要とする部位に、直接的もしくは間接的に投与
することができる。一実施態様において、該細胞は、静脈内から個体に投与される。別の
実施態様において、該細胞は、腫瘍、例えば、固形腫瘍の部位で、個体に投与される。個
体が複数の部位に腫瘍を有する具体的な実施態様において、該細胞は、少なくとも2つ又
は全ての腫瘍部位に投与される。ある他の実施態様において、本明細書に提供される細胞
、又は該細胞を含む組成物は、経口、経鼻、動脈内、非経口、眼内(ophthalmically)、筋
肉内、皮下、腹腔内、大脳内、脳室内(intraventricularly)、脳室内(intracerebroventr
icularly)、髄腔内、嚢内、脊髄内、及び/又は脊髄近傍に投与される。ある具体的な実施
態様において、該細胞は、ポンプ装置を用いて又はポンプ装置なしで、頭蓋内又は脊椎内
(intravertebral)用の針及び/又はカテーテルによって送達される。
【０２２９】
PINK細胞、ヒト胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、もしくはこれ
らの組合せ、又はそのような細胞を含む細胞集団は、該細胞を含む組成物、例えば、マト
リックス、ヒドロゲル、スキャフォールドなどに入れて、個体に投与することができる。
【０２３０】
一実施態様において、本明細書に提供される細胞は、天然のマトリックス、例えば、胎
盤生体材料、例えば、羊膜材料の上に播種される。そのような羊膜材料は、例えば、哺乳
動物胎盤から直接切断された羊膜;固定又は熱処理された羊膜、実質的に乾燥した(すなわ
ち、H2Oが20％未満の)羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥した絨毛膜、実質的に乾燥した羊膜及
び絨毛膜などであることができる。胎盤幹細胞を播種することができる好ましい胎盤生体
材料は、その開示が引用により完全に本明細書中に組み込まれるHaririの米国出願公開第
2004/0048796号に記載されている。
【０２３１】
別の実施態様において、PINK細胞、ヒト胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキ
ラー細胞、もしくはこれらの組合せ、又はそのような細胞を含む細胞集団を、例えば、注
射に好適なヒドロゲル溶液に懸濁させる。そのような組成物のための好適なヒドロゲルと
しては、RAD16などの自己集合性ペプチドが挙げられる。一実施態様において、該細胞を
含むヒドロゲル溶液を、例えば、鋳型中で硬化させて、細胞がその中に分散している移植
用のマトリックスを形成させることができる。そのようなマトリックス中の細胞は、該細
胞が移植の前に有糸分裂で増殖するように培養することもできる。ヒドロゲルは、例えば
、共有結合、イオン結合、又は水素結合により架橋されて、水分子を捕捉してゲルを形成
させる3次元開格子構造を生成させる有機ポリマー(天然又は合成)であることができる。
ヒドロゲル形成材料としては、イオンによって架橋される、多糖、例えば、アルギネート
及びその塩、ペプチド、ポリホスファジン、並びにポリアクリレート、又はブロックポリ
マー、例えば、それぞれ、温度もしくはpHによって架橋される、ポリエチレンオキシド-
ポリプロピレングリコールブロックコポリマーが挙げられる。いくつかの実施態様におい
て、本発明のヒドロゲル又はマトリックスは生体分解性である。
【０２３２】
本発明のいくつかの実施態様において、製剤は、インサイチュ重合可能なゲルを含む(
例えば、米国特許出願公開第2002/0022676号; Ansethらの文献、J. Control Release, 78
(1-3):199-209(2002); Wangらの文献、Biomaterials, 24(22):3969-80(2003)を参照され
たい)。
【０２３３】
いくつかの実施態様において、ポリマーは、荷電側基又はその一価イオン性塩を有する
水性溶液、例えば、水、緩衝塩溶液、又は水性アルコール溶液に少なくとも部分的に可溶
性である。陽イオンと反応させることができる酸性側基を有するポリマーの例は、ポリ(
ホスファゼン)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、アクリル酸とメタクリル酸の
コポリマー、ポリ(酢酸ビニル)、及びスルホン酸化ポリマー、例えば、スルホン酸化ポリ
スチレンである。アクリル酸又はメタクリル酸とビニルエーテルモノマー又はポリマーの
反応によって形成される酸性側基を有するコポリマーを使用することもできる。酸性基の
例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化(好ましくは、フッ化)アルコール基、フ
ェノール性OH基、及び酸性OH基である。
【０２３４】
本発明の胎盤幹細胞又はその共培養物を3次元フレームワーク又はスキャフォールドの
上に播種し、インビボに移植することができる。そのようなフレームワークは、任意の1
以上の成長因子、細胞、薬物、或いは組織形成を刺激し、又は本発明の実施を別の形で強
化もしくは改善する他の成分と組み合わせて移植することができる。
【０２３５】
本発明において使用することができるスキャフォールドの例としては、不織布マット、
多孔質フォーム、又は自己集合性ペプチドが挙げられる。不織布マットは、グリコール酸
と乳酸の合成吸収性コポリマー(例えば、PGA/PLA)(VICRYL, Ethicon社, Somerville, N.J
.)から構成される繊維を用いて形成させることができる。例えば、フリーズドライ又は凍
結乾燥などの処理によって形成されるポリ(ε-カプロラクトン)/ポリ(グリコール酸)(PCL
/PGA)コポリマーから構成されるフォーム(例えば、米国特許第6,355,699号参照)をスキャ
フォールドとして使用することもできる。
【０２３６】
本発明の胎盤幹細胞は、限定されないが、モノ-、ジ-、トリ-、α-トリ-、β-トリ-、
及びテトラ-リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カ
ルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、マグネシウムリン酸カ
ルシウム、生体活性ガラス、例えば、BIOGLASS(登録商標)、並びにこれらの混合物を含む
、生理的に許容し得るセラミック材料の上に播種するか、又は該セラミック材料と接触さ
せることもできる。現在市販されている多孔性生体適合性セラミック材料としては、SURG
IBONE(登録商標)(CanMedica社, Canada)、ENDOBON(登録商標)(Merck Biomaterial France
, France)、CEROS(登録商標)(Mathys, AG, Bettlach, Switzerland)、並びに石灰化コラ
ーゲン骨移植用製品、例えば、HEALOS(商標)(DePuy社, Raynham, MA)、及びVITOSS(登録
商標)、RHAKOSS(商標)、及びCORTOSS(登録商標)(Orthovita, Malvern, Pa.)が挙げられる
。フレームワークは、天然材料及び/又は合成材料の混合物、ブレンド、又は複合物であ
ることができる。
【０２３７】
別の実施態様において、胎盤幹細胞は、例えば、PGA、PLA、PCLコポリマーもしくはブ
レンド、又はヒアルロン酸などの生体吸収性材料でできたマルチフィラメント糸から構成
されることができるフェルトの上に播種するか、又は該フェルトと接触させることができ
る。
【０２３８】
本発明の胎盤幹細胞は、別の実施態様において、複合構造であり得るフォームスキャフ
ォールドの上に播種することができる。そのようなフォームスキャフォールドは、有用な
形状、例えば、修復、置換、又は補強されるべき体内の特定の構造の部分の形状に成形す
ることができる。いくつかの実施態様において、細胞の付着を増強するために、該フレー
ムワークを、例えば、0.1M酢酸で処理し、その後、ポリリジン、PBS、及び/又はコラーゲ
ン中でインキュベートした後、本発明の細胞を接種する。マトリックスの外部表面を、例
えば、マトリクスのプラズマコーティング、又は1以上のタンパク質(例えば、コラーゲン
、弾性繊維、細網繊維)、糖タンパク質、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン硫酸、
コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸など)
、細胞マトリックス、及び/又は例えば、限定されないが、ゼラチン、アルギネート、寒
天、アガロース、及び植物ゴムなどの他の材料の付加によって修飾して、細胞の付着又は
成長及び組織の分化を改善することができる。
【０２３９】
いくつかの実施態様において、該スキャフォールドは、それを非血液凝固性にする材料
を含むか、又は該材料で処理される。これら処理及び材料は、内皮成長、移動、及び細胞
外マトリックス沈着を促進及び維持することもできる。これらの材料及び処理の例として
は、天然材料、例えば、基底膜タンパク質、例えば、ラミニン及びIV型コラーゲン、合成
材料、例えば、EPTFE及びセグメント化ポリウレタン尿素シリコーン、例えば、PURSPAN(
商標)(The Polymer Technology Group社, Berkeley, Calif.)が挙げられるが、これらに
限定されない。該スキャフォールドは、抗血栓剤、例えば、ヘパリンを含むこともでき;
該スキャフォールドを、表面の電荷を変化させる(例えば、プラズマをコーティングする)
ように処理した後、胎盤幹細胞を播種することもできる。
【０２４０】
(6.実施例)
(6.1.実施例1)
本実施例は、ヒト胎盤灌流液及び臍帯血由来のナチュラルキラー細胞の単離、培養、及
び特徴付けを示す。
【０２４１】
(ナチュラルキラー細胞の単離)
ナチュラルキラー細胞を、CD56コンジュゲートマイクロビーズを用いて、8ユニットの
ヒト胎盤灌流液(HPP)から、及び4ユニットの臍帯血(UCB、本明細書では「CB」とも呼ばれ
る)から単離した。単離は、磁気ビーズ選択(Miltenyi Biotec)によって行った。分娩後胎
盤を放血させ、約200〜約750mLの灌流溶液(0.9％NaCl注射溶液USP等級(Cat No. 68200-80
4, VWR)で灌流した。未処理の灌流液を回収し、赤血球を除去するように処理した。HPP又
はUCB由来の単核細胞を蛍光活性化細胞選別(FACS)バッファー(5％FBSを含む、フェノール
レッド非含有RPMI 1640)で1回洗浄し、その後、1500rpmで6分間遠心分離した。細胞数を
計数し、細胞ペレットを、20μLのCD3マイクロビーズ(カタログNo. 130-050-101, Milten
yi)とともに、107個の全細胞当たり80μLのバッファーに再懸濁させた。この系をよく混
合し、4〜8℃で15分間インキュベートした。107個の全細胞当たり1〜2mLのバッファーを
添加し、その後、該混合物を300gで10分間遠心分離した。上清をピペッティングして完全
に除去した。細胞ペレットを最大108個の細胞になるよう500μLのバッファーに再懸濁さ
せ、磁気分離用に調製した。LSカラム(Miltenyi Biotec)をMIDIMACS(商標)細胞分離装置(
Miltenyi Biotec)の磁場に置き、3mLのバッファーを適用して、カラムをすすぎ、細胞/マ
イクロビーズ懸濁液をカラムに適用した。カラムを通過し、かつナチュラルキラー細胞を
含む未標識のCD3-細胞を2×3mLの洗浄バッファーと一緒に回収した。CD3-細胞を計数し、
1回洗浄し、その後、CD56マイクロビーズ(Cat#: 130-050-401, Miltenyi)で染色し、上記
のCD3マイクロビーズ分離と同じプロトコルを用いて分離/単離した。CD56+CD3-集団をこ
のように回収し、さらなる解析の準備ができた。ナチュラルキラー細胞のパーセンテージ
範囲は、HPPで3.52〜11.6(中央値6.04、平均値5.22)、UCBで1.06〜8.44(中央値: 3.42、
平均値: 4.2)であった。HPP由来のナチュラルキラー細胞のCD56マイクロビーズ選択によ
って、約80％純粋な集団が生じた。図1を参照されたい。全CD56+、CD3-ナチュラルキラー
細胞集団の中で、HPP由来のCD56+、CD16-ナチュラルキラー細胞(すなわち、PINK細胞)の
パーセンテージ範囲は、56.6〜87.2(中央値74.2、平均値65.5)であり、UCB由来のCD56+、
CD16-ナチュラルキラー細胞のパーセンテージ範囲は、53.7〜96.6(中央値72.8)であった
。HPP由来のCD56+、CD16+ナチュラルキラー細胞のパーセンテージ範囲は、12.8〜43.3(中
央値25.8、平均値34.5)であり、UCB由来のCD56+、CD16+ナチュラルキラー細胞のパーセン
テージ範囲は、3.4〜46.3(中央値27.3、平均値33.4)であった。
【０２４２】
他の実験において、ナチュラルキラー細胞を、ヒト血液細胞上の細胞表面抗原(CD3、CD
4、CD14、CD19、CD20、CD36、CD66b、CD123、HLA-DR、グリコフォリンA)を標的とする磁
気ネガティブ選択キットを用いて単離した。HPP及びUCB凍結保存ユニットを解凍し、解凍
培地(RPMI培地1640(カタログ#22400, Gibco)＋20％熱非働化胎仔ウシ血清(カタログ#SH30
070.03, Hyclone))で、1:1で希釈し、1500rpmで8分間遠心分離した。上清を除去し、塩化
アンモニウム処理を適用して、赤血球をさらに除去し;各ユニットを約30mLの氷冷FACSバ
ッファー(5％FBSを含むフェノールレッド非含有RPMI 1640)に再懸濁させ、その後、60mL
の氷冷塩化アンモニウム(カタログ#07850, Stem Cell)を添加し、該溶液をボルテックス
処理し、その後、氷上で5分間インキュベートした。その後、単核細胞をFACSバッファー
で3回洗浄し、その後、1500rpmで8分間遠心分離した。細胞数を計数し、細胞ペレットを
、5×107個の生細胞/mlで、RoboSepバッファー(カタログ#20104, Stem Cell)に再懸濁さ
せ、さらに、0.1mg/mL DNAアーゼI溶液(カタログ#07900, Stem Cell)を該細胞懸濁液に添
加し、ピペットで穏やかに混合し、室温で15分間インキュベートした後、単離した。40μ
mメッシュナイロンストレイナー(カタログ#352340, BD Falcon)で濾過することによって
、塊を該細胞懸濁液から除去した後、単離を進めた。単離は、EasySepネガティブ選択ヒ
トNK細胞濃縮カクテル及びEasySep磁気微粒子を含むヒトNK細胞濃縮キット(カタログ#190
55, Stem Cell)を用いて、RoboSep(カタログ#20000, Stem Cell)装置及び「ヒトNKネガテ
ィブ選択19055及び高回収」プログラム(50μL/mLカクテル添加、100μL/mL微粒子添加、1
0分及び5分のインキュベーション、1×2.5分間の分離)により自動化される。CD56+CD3-集
団をこのように回収し、さらなる解析の準備ができた。
【０２４３】
(ナチュラルキラー細胞の増殖)
一般に、ナチュラルキラー細胞を次のように増殖させた。ナチュラルキラー細胞培養用
の出発培地を、Ysselらの文献、J. Immunol. Methods 72(1):219-227(1984)及びLitwinら
の文献、J. Exp. Med. 178(4):1321-1326(1993)に記載されているプロトコルの改変に基
づいて調製した。簡潔に述べると、出発培地は、10％FCS(Hyclone)を含むIMDM(Invitroge
n)を含み、これは、以下の最終濃度の試薬、35μg/mLのトランスフェリン(Sigma-Aldrich
)、5μg/mLのインスリン(Sigma-Aldrich)、2×10-5Mのエタノールアミン(Sigma-Aldrich)
、1μg/mLのオレイン酸(Sigma-Aldrich)、1μg/mLのリノール酸(Sigma-Aldrich)、0.2μg
/mLのパルミチン酸(Sigma-Aldrich)、2.5μg/mLのBSA(Sigma-Aldrich)、及び0.1μg/mLの
フィトヘマグルチニン(PHA-P、Sigma-Aldrich)を含む。CD56+CD3- NK細胞を、細胞培養液
で処理した24ウェルプレートもしくはT字フラスコ中、1mLの出発培地＋200U/mL IL-2(R&D
Systems)当たり2.5×105個の生細胞で再懸濁させた。マイトマイシンC処理した同種異系
PBMCとK562細胞(慢性骨髄性白血病細胞株)の両方を、フィーダー細胞として、1mL当たり1
×106個の最終濃度になるよう出発培地に添加した。NK細胞を、37℃、5％CO2で、5〜6日
間培養した。5〜6日後、及びその後は3〜4日毎に、等体積の維持培地(10％FCS、2％ヒトA
B血清、抗生物質、L-グルタミン、及び1mL当たり400ユニットのIL-2を含むIMDM)を該培養
物に添加した。NK細胞を21日目に回収した。
【０２４４】
(胎盤及び臍帯血由来のナチュラルキラー細胞の特徴付け)
ドナーがマッチしたHPP及びCBを解凍し、該細胞をFACSバッファー(5％FBSを含むRPMI-1
640)で洗浄した。その後、ナチュラルキラー細胞を、製造業者によって指示される通りに
ROBOSEP(登録商標)磁気分離システム(StemCell Technologies)を用いて、CD56マイクロビ
ーズで濃縮した。CD56濃縮ナチュラルキラー細胞集団を、免疫表現型特徴付け用の以下の
抗体(別途示されない限り、BD Bioscience): PE-Cy-7にコンジュゲートした抗CD56、抗CD
3 APC Cy7、抗CD16 FITC、抗NKG2D APC、抗NKp46 APC、抗CD94 PE(R&D)、抗NKB1 PE、及
び抗KIR-NKAT2 PEで染色した。CD94、NKG2D、及びNKp46は、NK細胞前駆細胞で存在しない
又は発現の低下を示すが、完全に分化したNK細胞上には存在するマーカーである。Freud
らの文献、「インビボにおけるヒトナチュラルキラー細胞分化の不連続状態の証拠(Evide
nce for Discrete States of Human Natural Killer Cell Differentiation In Vivo)、 
J. Exp. Med. 203(4):1033-1043(2006); Eagle及びTrowsdaleの文献、「非特異性及び単
一受容体: NKG2D (Promiscuity and the Single Receptor: NKG2D)」、Nature Reviews I
mmunology 7, 737-744(2007); Walzerらの文献、「ナチュラルキラー細胞: CD3-NKp46+か
らポストゲノミクスメタアナリシスへ(Natural Killer Cells: From CD3-NKp46+ to Post
-Genomics Meta-Analyses)」 Curr. Opinion  Immunol. 19:365-372(2007)を参照された
い。表1に示すように、KIR3DL1、KIR2DL2/L3、NKG2D、並びにCD94(及びNKp46;データは示
さない)の発現は、HPP由来の濃縮されたCD56+細胞集団と臍帯血(CB)由来のHLAがマッチし
たCD56+細胞集団の間で有意差がなかった。
表1.特定のマーカー組合せを有するNK細胞のパーセンテージ。3つの試料の平均。
【表１】
2020196724.tif 000029
【０２４５】
(6.2.実施例2)
臍帯血及び胎盤灌流液(コンボ)のドナーがマッチした単核細胞を混合し、FACSバッファ
ー(5％FBSを含むRPMI-1640)で1回洗浄し、表2に記載されている抗体を用いて、BD FACSCa
nto(BD Biosciences)で免疫表現型について特徴付けた。データをFlowJoソフトウェア(Tr
ee Star)により解析した。
表2:免疫表現型特徴付けで使用された抗体のリスト。
【表２】
2020196724.tif 000030
【０２４６】
(胎盤NK細胞及び末梢血(PB)NK細胞の免疫表現型特徴付け)
NK細胞は、2つの主要な群: CD56+CD16+ NK細胞及びCD56+CD16-細胞に分けることができ
る。CD56+CD16+ NK細胞は、豊富な細胞溶解性顆粒を有し、CD16を高発現し、したがって
、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を誘発することができる。CD56+CD16- NK細胞は、逆に、
細胞溶解性顆粒がほとんどなく、CD16発現が低下しているか又はCD16発現が見られないが
、活性化されたときにサイトカイン及びケモカインを産生することができる。個々のNK細
胞は、キラー免疫グロブリン様受容体(KIR、例えば、KIR3DL1及びKIR2DL2/3)、天然の細
胞傷害性受容体NCR(例えば、NKp30、NKp44、及びNKp46)、キラー細胞レクチン様受容体(K
LR;例えば、CD94、NKG2D)、2B4、並びにCD226を含む、活性化及び抑制性受容体の多様な
レパートリーを示す。
【０２４７】
特定のNK受容体に対する蛍光コンジュゲートmAbを用いて、胎盤(コンボ)NK及び末梢血N
K細胞に対してFACS解析を行った。特徴付けられた11のNKサブセットの中で、11のNKサブ
セットのうちの7つ(CD3-CD56+CD16-、CD3-CD56+CD16+、CD3-CD56+KIR2DL2/3+、CD3-CD56+
NKp46+、CD3-CD56+NKp30+、CD3-CD56+2B4+、及びCD3-CD56+CD94+)の細胞の数が、胎盤NK
と末梢血NK細胞の間で有意差(p＜0.05)を示した(64％の差を占める)(表3A;表3B及び3Cも
参照)。
表3A. 16ユニットのドナーがマッチした組み合わされた臍帯血及びヒト胎盤灌流液(コン
ボ)並びに13ユニットの末梢血(PB)におけるCD3-CD56+ NK細胞の表現型特徴付け。2標本t-
検定を用いて、母平均が胎盤ユニットと末梢血ユニットで等しいかどうかを判定する。
【表３】
2020196724.tif 000031
表3B及び3Cは、独立した実験における16ユニットのドナーがマッチした組み合わされた
臍帯血及びヒト胎盤灌流液(コンボ)並びに13ユニットの末梢血(PB)中のCD3-CD56+CD16-及
びCD3-CD56+CD16+ NK細胞の表現型特徴付けを示す。
表3B
【表４】
2020196724.tif 000032
表3C
【表５】
2020196724.tif 000033
【０２４８】
胎盤NK細胞の60.9％がCD56+CD16-(胎盤由来中間ナチュラルキラー(PINK)細胞)である一
方、末梢血NK細胞のわずか21.4％がCD56+CD16-である。21日間培養した後、11のNKサブセ
ットのうちの4つ(CD3-CD56+KIR2DL2/3+、CD3-CD56+NKp46+、CD3-CD56+NKp44+、及びCD3-C
D56+NKp30+)のパーセンテージは、胎盤NK細胞と末梢血NK細胞の間で有意差(p＜0.05)を示
した。
【０２４９】
さらに、独立した実験において、21日間培養した後、胎盤NK細胞及び末梢血NK細胞は、
Luminexアッセイで決定したとき、特に、IL-8について、固有のサイトカインプロファイ
ルを示すことが明らかにされた(表4)。
表4
【表６】
2020196724.tif 000034
【０２５０】
(胎盤NK細胞及び末梢血NK細胞のマイクロRNAプロファイリング)
単離し又は増殖させたNK細胞を、MIRVANA(商標) miRNA単離キット(Ambion, Cat # 1560
)を用いるマイクロRNA(miRNA)調製に供した。NK細胞(0.5〜1.5×106細胞)を変性溶解バッ
ファー中で破壊した。次に、試料を酸-フェノール＋クロロホルム抽出に供して、低分子R
NA種が高度に濃縮されたRNAを単離した。100％エタノールを添加して、該試料を25％エタ
ノールにした。この溶解物/エタノール混合物をガラス繊維フィルターに通すと、高分子R
NAは固相化され、低分子RNA種は濾液中に回収された。その後、該濾液のエタノール濃度
を55％に増大させ、該混合物を、第二のガラス繊維フィルターに通し、その中で、低分子
RNAが固相化されるようになった。このRNAを数回洗浄し、低イオン強度溶液中で溶出させ
た。回収された低分子RNAの濃度及び純度を、260nm及び280nmでのその吸光度を測定する
ことにより決定した。
【０２５１】
PINK細胞に固有であることが分かったmiRNAを表5に示す。hsa-miR-199bと表記された1
つのmiRNAは、末梢血NK細胞に固有であることが分かった
表5. qRT-PCRによるpiNK細胞及びPB NK細胞についてのmiRNAプロファイリング。
【表７】
2020196724.tif 000035
【０２５２】
(培養胎盤NK細胞及び非培養NK細胞の免疫表現型特徴付け)
培養PINK細胞の全体的特性を広範な免疫表現型研究及び細胞傷害性アッセイにより評価
した。増殖させたNK細胞の表現型を決定するために、NK受容体(NKR)、例えば、KIR、NKG2
D、NKp46、NKp44、及び2B4の発現を解析した。細胞傷害性アッセイは、腫瘍細胞(K562細
胞)をPKH26で標識し、その後、PINK細胞と4時間共培養することにより実施した。0日目か
ら21日目まで、NKG2Dの発現は、60.9％±4.8％から86％±17.4％に増大し(0.024のp値); 
NKp46は、10.5％±5.4％から82.8％±9.0％に増大し(0.00002のp値); NKp44は、9.6％±6
.5％から51.6％±27.5％に増大し(0.022のp値); 2B4は、13.0％±7.1％から0.65％±0.5
％に減少した(0.009％のp値)(表6)。これらの培養条件下で、KIR3DL1(キラー細胞免疫グ
ロブリン様受容体、3つのドメイン、長い細胞質テール1、抑制性受容体)並びにKIR2DL2/L
3(キラー細胞免疫グロブリン様受容体、2つのドメイン、長い細胞質テール2及び長い細胞
質テール3;抑制性受容体)を含む抑制性KIRは、21日間の増殖の間、影響を受けないままで
あった。NKRの発現の変化は、14日と比べた21日でのK562細胞に対する細胞溶解活性の顕
著な増加とさらに相関した(63％±15％対45％±4％、0.0004のp値)。これらの知見から、
NK細胞の細胞傷害活性とよく相関する推定上のNK細胞マーカーが同定された。
表6. 21日間の培養の前及び後のpiNK細胞の表現型特徴付け。5人のドナーの母平均につい
て、標準偏差(Stdev)を計算した。
【表８】
2020196724.tif 000036
【０２５３】
(脂質に基づくタンパク質固相化技術及び線形イオントラップLC/MSによる培養胎盤NK細胞
及び培養末梢血NK細胞の膜プロテオミクスプロファイリング)
(膜タンパク質精製:)
21日間培養された、組み合わされた胎盤灌流液及び臍帯血細胞由来の胎盤ナチュラルキ
ラー細胞、並びにPB NK細胞を、細胞溶解前に、プロテアーゼ阻害剤カクテル溶液(P8340,
Sigma Aldrich, St. Louis, MO; 4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド(AE
BSF)、ペプスタチンA、E-64、ベスタチン、ロイペプチン、及びアプロチニンを含み、金
属キレート剤を含まない)とともに15分間インキュベートした。その後、該細胞を、界面
活性剤を含まない10mM HCl溶液を添加して溶解させ、400gで10分間遠心分離して、核をペ
レット化し、除去した。核を除去した後の上清(post-nuclear supernatant)を超遠心分離
チューブに移し、T-1270ローター(Thermo Fisher Scientific, Asheville, NC)を備えたW
X80超遠心分離機で、100,000gで150分間遠心分離して、膜タンパク質ペレットを生成させ
た。
【０２５４】
(プロテオリポソームの生成、固相化、及び消化:)
膜タンパク質ペレットを、NANOXIS(登録商標)バッファー(10mM Tris、300mM NaCl、pH 
8)を用いて数回洗浄した。該膜タンパク質ペレットを1.5mLのNANOXIS(登録商標)バッファ
ーに懸濁させ、その後、VIBRA-CELL(商標) VC505超音波プロセッサー(Sonics & Material
s社, Newtown, CT)を用いて、氷上で20分間、チップ式超音波処理した(tip-sonicated)。
プロテオリポソームのサイズを、FM1-43色素(Invitrogen, Carlsbad, CA)による染色及び
蛍光顕微鏡法による可視化により決定した。該プロテオリポソーム懸濁液のタンパク質濃
度をBCAアッセイ(Thermo Scientific)により決定した。その後、該プロテオリポソームを
、標準的なピペットチップを用いてLPI(商標)フローセル(Nanoxis AB, Gothenburg, Swed
en)に注入し、1時間固相化させておいた。固相化させた後、一連の洗浄工程を実行し、5
μg/mLのトリプシン(Princeton Separations, Adelphi, NJ)をLPI(商標)フローセルに直
接注入した。チップを37℃で一晩インキュベートした。その後、トリプシン消化ペプチド
を該チップから溶出させ、その後、Sep-Pakカートリッジ(Waters Corporation, Milford,
MA)を用いて脱塩した。
【０２５５】
(強陽イオン交換(SCX)分画:)
トリプシン消化ペプチドを0.1％ギ酸/水溶液中で再構成させ、30μmのポリスルホエチ
ルアスパルトアミドSCX充填材が充填されたピペットチップである、強陽イオン交換(SCX)
TOP-TIP(商標)カラム(PolyLC, Columbia, MD)にかけた。ギ酸アンモニウムバッファー、
pH 2.8のステップ勾配(10mM〜500mM)を用いて、ペプチドをSCX TOP-TIP(商標)から溶出さ
せた。各々のSCX画分をスピード-バックシステムを用いて乾燥させ、下流のLC/MS分析に
備えて5％アセトニトリル、0.1％ギ酸で再構成させた。
【０２５６】
(LTQ線形イオントラップLC/MS/MS分析:)
各々のSCX画分を、180分勾配(バッファーA:水、0.1％ギ酸;バッファーB:アセトニトリ
ル、0.1％ギ酸)を用いて、軸方向脱溶媒和真空補助ナノキャピラリーエレクトロスプレー
イオン化(ADVANCE)源(Michrom Bioresources社)に直接接続された0.2mm×150mm 3μm 200
Å MAGIC C18カラム(Michrom Bioresources社, Auburn, CA)で分離した。ADVANCE源は、3
μL/分というかなり速い流速で動作しながらも従来のnanoESIに匹敵する感度を達成する
。溶出したペプチドは、各々のフルスキャン質量スペクトルの後に10回のデータ依存性MS
/MSスキャンを利用するLTQ線形イオントラップ質量分析計(Thermo Fisher Scientific, S
an Jose, CA)で分析した。
【０２５７】
(バイオインフォマティクス:)
各々の腫瘍細胞株(AML、CML)について回収された6つの塩画分に対応する6つのRAWファ
イルを、SORCERER(商標) SOLO(商標)ワークステーション(Sage-N Research, San Jose, C
A)でのSEQUESTアルゴリズムの実行を用いて、IPIヒトデータベースに対する1回の検索と
して検索した。1.2amuのペプチド質量許容値を指定し、メチオニンの酸化を示差修飾とし
て指定し、カルバミドメチル化を静的修飾として指定した。Trans-Proteomic Pipeline(T
PP)のScaffoldソフトウェアの実行を用いて、膜プロテオームデータを選別し、解析した
。タンパク質が95％のペプチド確率、95％のタンパク質確率、及び1つの固有のペプチド
を有すると特定された場合、それを解析にかけることを検討した。自前で開発したカスタ
ム版のPerlスクリプトを用いて、膜プロテオームデータセット間の比較を行った。
【０２５８】
この解析は、末梢血NK細胞から同定された膜タンパク質に対して固有である培養胎盤NK
細胞由来の8つの膜タンパク質の同定を明らかにした。表7を参照されたい。さらに、培養
胎盤NK細胞に対して固有である8つの膜タンパク質を末梢血NK細胞から同定した。表7を参
照されたい。同定された10の膜タンパク質のみが、培養胎盤NK細胞と末梢血NK細胞の両方
で共有されていることが分かった。
表7
【表９】
2020196724.tif 000037
【０２５９】
(6.3.実施例3)
この実施例は、胎盤中間ナチュラルキラー細胞が腫瘍細胞に対して細胞傷害性であるこ
とを示している。HPP由来のPINK細胞は、細胞傷害性アッセイで及びNK細胞サイトカイン
分泌のLuminex解析により示されるように、急性骨髄性白血病細胞に対して細胞傷害性で
ある。
【０２６０】
サイトカイン分泌アッセイにおいて、HPP由来のCD56マイクロビーズ濃縮NK細胞をKG-1a
急性骨髄性白血病細胞と1:1の比で混合した。24時間インキュベートした後、上清を回収
し、IFN-γ及びGM-CSF分泌のLuminex解析に供した。図2に示すように、CD56濃縮HPP細胞
をKG-1a細胞とともに24時間インキュベートした後、IFN-γ及びGM-CSFのレベルの増加が
観察された。
【０２６１】
(PINK細胞の細胞傷害性)
【０２６２】
PINK細胞を利用する細胞傷害性アッセイにおいて、標的腫瘍細胞をカルボキシフルオレ
セインスクシンイミジルエステル(CFSE)で標識した。CFSEは、細胞に対して毒性がなく、
かつ細胞分裂時に娘細胞間で分配される生体染料である。その後、該細胞を96ウェルのU
底組織培養プレートに入れ、10％FBSが補充されたRPMI 1640中、20:1、10:1、5:1、及び1
:1のエフェクター-標的(E:T)比で、新たに単離されたCD56+CD16- PINK細胞とともにイン
キュベートした。4時間のインキュベーション時間の後、細胞を回収し、CFSEの存在につ
いてフローサイトメトリーにより調べた。NK細胞を含まない培養物から回収された標的細
胞の数を参照として使用した。細胞傷害性は:(1-CFSE試料/CFSE対照)*100％として定義さ
れる。顕著な腫瘍細胞の細胞傷害性は、20:1の比で観察された。図3を参照されたい。
【０２６３】
(培養PINK細胞に対する腫瘍細胞の感受性)
【０２６４】
(乳酸脱水素酵素(LDH)-放出アッセイ)
LDH-放出アッセイを、CYTOTOX 96(登録商標)比色細胞傷害性アッセイキット(Promega, 
Cat# G1780)を用いて実施した。このアッセイにおいて、マッチしたHPP/UCBに由来するCD
56+CD16-細胞とCD56+CD16+細胞の組合せを含む培養NK細胞をエフェクター細胞とし、腫瘍
細胞を標的細胞とした。エフェクター細胞及び標的細胞を96ウェルのU底組織培養プレー
トに入れ、2％ヒトAB血清(Gemini, Cat# 100-512)が補充された100μlのフェノールレッ
ド非含有RPMI 1640(Invitrogen, Cat# 11835-030)中、様々なエフェクター-標的(E:T)比
でインキュベートした。培養物を、37℃、5％CO2で、4時間インキュベートした。インキ
ュベーション後、50μlの上清を酵素アッセイプレートに移し、LDH活性を、製造業者によ
って提供されているように検出し、吸収を、ELISAリーダー(Synergy HT, Biotek)中、490
nmで測定した。細胞傷害性の度合いを以下の方程式に従って計算した:％細胞傷害性＝(試
料-エフェクター自然−標的自然)/(標的最大−標的自然)*100。
【０２６５】
特定の腫瘍型は、他のものよりもNK細胞に応答性であり得る。培養PINK細胞に対するの
腫瘍細胞の感受性を解析するために、PINK細胞と共培養した12種の異なる腫瘍細胞株をLD
H放出アッセイで解析した。該12種の腫瘍細胞株には、ヒト慢性骨髄性白血病(CML)、リン
パ腫、網膜芽腫(RB)、及び多発性骨髄腫(MM)が含まれた(表8)。4時間の共培養の後、NK細
胞の細胞傷害性をLDH放出アッセイにより測定した。
表8. ATCC腫瘍細胞株
【表１０】
2020196724.tif 000038
【０２６６】
10:1のエフェクター対標的(E:T)比で、培養PINK細胞の顕著な細胞傷害性は、K562細胞(
CML)に対しては88.6％±5.6％で、U937細胞(リンパ腫)に対しては89.2％±9.8％で、WERI
-RB-1細胞(RB)に対しては73.3％±11.8％で、RPMI8226細胞(MM)に対しては61.3％±1.3％
で、及びU266細胞(MM)に対しては57.4％±4.7％で見られた(表9)。
表9.培養piNK細胞に対する腫瘍細胞の示差感受性。3人のドナーの平均細胞傷害性につい
て、平均値の標準誤差(S.E.M.)を計算した。
【表１１】
2020196724.tif 000039
【０２６７】
(レナリドミド及びポマリドミドでの処理によるPINK細胞の細胞傷害性の増強)
(RNA単離及び精製)
単離し又は増殖させたNK細胞を、RNAQUEOUS(登録商標)-4PCRキット(Ambion, Cat #AM19
14)を用いるRNA調製に供した。簡潔に述べると、NK細胞(0.5〜1.5×106細胞)をグアニジ
ウム溶解溶液中で溶解させた。その後、試料溶解物をエタノール溶液と混合し、mRNA及び
より大きいリボソームRNAに選択的かつ定量的に結合し; tRNA及び5SリボソームRNAなどの
非常に小さいRNAは定量的には結合されないシリカ系フィルターに適用した。その後、該
フィルターを洗浄して、残存するDNA、タンパク質、及び他の夾雑物質を除去し、RNAを、
重金属をキレートするための微量のEDTAを含むヌクレアーゼ非含有水中に溶出させた。該
シリカフィルターを、キットに供給されるRNアーゼ非含有微量遠心チューブに適合する小
型のカートリッジに収容した。該試料溶解物、洗浄溶液、及び溶出溶液は、遠心分離又は
真空圧により、該フィルターの中を移動させた。該フィルターからの溶出の後、RNAを、
キットに提供される超高純度DNアーゼ1で処理して、微量のDNAを除去した。最後に、該DN
アーゼ及び二価陽イオンを、同じくキットに提供される試薬により除去した。回収された
RNAの濃度及び純度を、260及び280nmでのその吸光度を測定することにより決定した。
【０２６８】
(定量的リアルタイム(qRT-PCR)解析)
その後、単離されたRNAを、TAQMAN(登録商標)逆転写試薬(Applied Biosystems, Cat #N
8080234)を用いるcDNA合成、次いで、ヒト免疫アレイ(Applied Biosystems, Cat# 437057
3)及びヒトマイクロRNAアレイ(Applied Biosystems, Cat# 4384792)を用いる7900HT高速
リアルタイムPCRシステムによるリアルタイムPCR解析に使用した。
【０２６９】
レナリドミド及びポマリドミドは、増強された抗癌活性及び抗炎症活性を有するサリド
マイドの化学類似体である。レナリドミド及びポマリドミドがPINK細胞の細胞傷害性を増
強し得るかどうかを検討するために、エクスビボ培養した(19日)PINK細胞をレナリドミド
又はポマリドミドで24時間前処理し、その後、標的結腸直腸癌細胞株のHCT-116と共培養
した。レナリドミド処理したNK細胞は、42.1％の細胞傷害性を示し、ポマリドミド処理し
たNK細胞は、47.4％の細胞傷害性を示したが、対照の未処理PINK細胞は、24.3％の細胞傷
害性しか示さなかった。
【０２７０】
定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)及びフローサイトメトリー解析は、ポマリドミドによ
って誘発されるNK細胞の細胞傷害性の増強がグランザイムB(GZMB)遺伝子発現の増加(60％
±1.7％増加)(表10)及びGZMB陽性NK細胞のパーセンテージの増加(25％増加)と相関するこ
とを示した。さらに、GM-CSFの発現は、レナリドミド(232％±1.6％増加)及びポマリドミ
ド(396％±0.3％増加)処理したPINK細胞で増加した(表10A、10B)。
【０２７１】
表10A、10B。未処理の細胞と比較したレナリドミド及びポマリドミド処理した培養PINK
細胞のqRT-PCT解析。10A:記載された遺伝子についてのレナリドミド処理試料とレナリド
ミド未処理試料の間の遺伝子発現の変化倍数。対応のあるt-検定を用いて、変化倍数がレ
ナリドミド処理試料とレナリドミド未処理試料で等しいかどうかを判定する。10B:記載さ
れている25遺伝子についてのポマリドミド処理試料とポマリドミド未処理試料の間での遺
伝子発現の変化倍数。対応のあるt-検定を用いて、変化倍数が処理試料と未処理試料で等
しいかどうかを判定する。
表10A
【表１２】
2020196724.tif 000040
BAX−BCL2関連Xタンパク質
CCL5−ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド5
CCR5−ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5
CSF2−コロニー刺激因子2(顆粒球-マクロファージ)
FAS−TNF受容体スーパーファミリー、メンバー6
GUSB−βグルクロニダーゼβ
IL2RA−αインターロイキン2受容体
TNFRSF18−腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー18
表10B
【表１３】
2020196724.tif 000041
ACTB−β-アクチン
BAX−BCL2関連Xタンパク質
CCL2−ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド2
CCL3−ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド3
CCL5−ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド5
CCR5−ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5
CSF1−コロニー刺激因子1(マクロファージ)
CSF2−コロニー刺激因子2(顆粒球-マクロファージ)
ECE1−エンドセリン変換酵素1
FAS−TNF受容体スーパーファミリー、メンバー6
GNLY−グラニュライシン
GUSB−グルクロニダーゼ-β
GZMB−グランザイムB(グランザイム2、細胞傷害性Tリンパ球関連セリンエステラーゼ1)
IL1A−αインターロイキン1
IL2RA−インターロイキン2受容体-α
IL8−インターロイキン8
IL10−インターロイキン10
LTA−リンホトキシンα(TNF スーパーファミリー、メンバー1)
PRF1−パーフォリン1(孔形成タンパク質)
PTGS2−プロスタグランジン-エンドペルオキシドシンターゼ2(プロスタグランジンG/Hシ
ンターゼ及びシクロオキシゲナーゼ)
SKI-v−ski肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ(トリ)
TBX21−Tボックス21
【０２７２】
(組み合わされたナチュラルキラー細胞の細胞傷害性)
独立した細胞傷害性アッセイにおいて、ドナーがマッチした臍帯血及び胎盤灌流液に由
来する培養NK細胞をエフェクター細胞とし、一方、腫瘍細胞を標的細胞とした。腫瘍細胞
を、その親油性脂肪族残基により細胞の形質膜に挿入するPKH26(Sigma-Aldrichカタログ#
PKH26-GL)(例えば、Lee-MacAryらの文献、J. Immunol. Meth. 252(1-2):83-92(2001)参
照)で標識し、その後、96ウェルのU底組織培養プレートに入れ、10％FBSが補充された200
μlのRPMI1640中、様々なエフェクター:標的(E:T)比で培養NK細胞とともにインキュベー
トした。培養物を、37℃、5％CO2で4時間インキュベートした。インキュベーション後、
細胞を回収し、膜不透過性DNA染料のTO-PRO-3(Invitrogenカタログ# T3605)を1μMの最終
濃度まで培養物に添加し、その後、BD FACSCantoを用いてFACS解析を行った。細胞傷害性
は、全PKH26+標的腫瘍細胞内の死細胞(PKH26+TO-PRO-3+)のパーセンテージとして表した
。
【０２７３】
この細胞傷害性アッセイでは、ヒト慢性骨髄性リンパ腫(CML)K562細胞を、細胞の形質
膜に挿入するPKH26で標識し、96ウェルのU底組織培養プレートに入れた。21日間培養され
た胎盤(コンボ)又は末梢血NK細胞を、10％v/vのFBSが補充されたRPMI1640中、10:1、5:1
、2.5:1、及び1.25:1のエフェクター対標的(E:T)比でK562細胞と混合した。4時間のイン
キュベーション時間の後、細胞を回収し、TO-PRO-3を細胞培養物に添加し、その後、PKH2
6及びTO-PRO-3の存在についてフローサイトメトリーを行った。細胞傷害性は、全PKH26+
腫瘍標的細胞内のPKH26+TO-PRO-3+死細胞のパーセンテージとして表した。胎盤NK細胞と
末梢血NK細胞はどちらも、試験された全てのE:T比でK562細胞に対する相当な毒性を示し
た(図4)。K562細胞に対する末梢血NK細胞よりも有意に高い胎盤NK細胞の毒性は、10:1と5
:1の2つのE:T比で観察された(図4)。
【０２７４】
(6.4.実施例4)
この実施例は、ヒト胎盤灌流液細胞が腫瘍細胞に対して細胞傷害性であること、及びHP
P由来の全有核細胞(TNC-HPP)のKG-1aに対する細胞傷害性が、マッチしたUCB由来のTNCの
細胞傷害性よりも高かったことを示している。HPP又は臍帯血(UCB)由来の全有核細胞を、
1:1、5:1、10:1、20:1、又は100:1の比でKG-1a細胞と混合した。24時間又は48時間のイン
キュベーションの後、細胞を回収し、CFSEの存在についてFACS解析(BD FACSCanto, BD Bi
oscience)により調べた。単独で培養された腫瘍細胞を対照として使用した。細胞傷害性
は、(1-CFSE試料/CFSE対照)*100％として定義された。顕著な細胞傷害性は、100:1の比で
示された。図5を参照されたい。
【０２７５】
独立した実験において、HPP由来の全有核細胞の細胞傷害性を臍帯血由来の全有核細胞
の細胞傷害性と比較した。マッチしたTNC-HPP又はUCBを、0.78:1、1.56:1、3.12:1、6.25
:1、12.5:1、25:1、50:1、又は100:1の比でKG-1a細胞と混合した。TNC-HPPは、UCBの細胞
傷害性と比較して、全ての比で一貫してより高い細胞傷害性を示した。図6を参照された
い。
【０２７６】
別の実験において、KG-1a細胞とインキュベーションする24時間前に、TNC-HPPを100U/m
L又は1000U/mLのIL-2で刺激し、一方、RPMI培地で培養されたHPPを対照として使用した。
KG-1a細胞当たり6.25個のNK細胞及びそれを上回る比で、IL-2は、TNC-HPPの細胞傷害性を
増大させるように見える。図7を参照されたい。
【０２７７】
5×105個のHPP細胞及び1×104個の腫瘍細胞を用いて、表11に示されるような、より広
範囲の腫瘍細胞型を用いて実験を繰り返した。
表11:胎盤灌流液の細胞傷害効果について試験された腫瘍細胞型
【表１４】
2020196724.tif 000042
【０２７８】
HPP細胞及び腫瘍細胞を、24時間又は48時間、50:1の比で共培養したとき、HPP細胞は、
腫瘍細胞に対する相当な毒性を示した。両方の時間について、共培養は、50％を超える腫
瘍細胞の死滅をもたらした。図8A及び8Bを参照されたい。
【０２７９】
(6.5.実施例5)
HPP細胞の強力な抗腫瘍効果の媒介に関与する任意の特定の作用機序に束縛されること
を望むものではないが、腫瘍細胞株と共培養されたHPP細胞のIFN-γ、TNF-α、及びGM-CS
Fサイトカイン放出プロファイルを解析し、多重化Luminexアッセイにより、様々な時点で
、腫瘍細胞株と共培養されたUCB細胞の該プロファイルと比較した。上清中のIFN-γ、TNF
-α、及びGM-CSFの源を検討するために、共培養された細胞のフローサイトメトリーに基
づく細胞内特徴付けを実施し、結果として、これらのサイトカインが腫瘍細胞では産生さ
れないことが示された。
【０２８０】
インキュベーション後に回収された上清を、IFN-γ、TNF-α、及びGM-CSFの濃度を決定
するためのLuminexアッセイ(Cat#  HCYTO-60K-03, Millipore)に供した。これら3つのサ
イトカインはNK細胞傷害性と関連している。(例えば、Imaiらの文献、Blood 2005. 106(1
):376-83を参照されたい)。また、Applied Biosystems FAST 7900HT機器及びプライマー
を用いて、定量的RT-PCRを実施して、IFN-γ、TNF-α、及びGM-CSFの発現を調べた。培養
条件は、上記の共培養細胞傷害性アッセイの場合と同じであった。サイトカインの濃度は
、Luminexアッセイを用いて決定した。
【０２８１】
腫瘍細胞と共培養されたHPP細胞からのIFN-γ、TNF-α、及びGM-CSFの分泌は、UCB細胞
からの該分泌よりも有意に多いことが分かった。ある実験において、HPP細胞を、100U/ml
のIL-2の存在下又は非存在下、0.78:1、1.56:1、3.12:1、6.25:1、12.5:1、25:1、50:1、
又は100:1の比でKG-1a細胞と混合した。TNC-HPPは、IL-2の非存在下と比較して、IL-2の
存在下で、IFN-γの産生が一貫して増加していることが示された。24時間でのIFN-γレベ
ルは、約5〜26倍(中央値:16倍)増加し; 48時間では約3〜65倍(中央値:27倍)増加すること
が分かり、これは、細胞傷害性研究の結果と一致していた。図9を参照されたい。
【０２８２】
別の実験において、KG-1a細胞とのインキュベーションの24時間前に、TNC-HPPを、100U
/mL又は1000U/mLのIL-2で刺激し、一方、RPMI培地で培養されたHPPを対照として使用した
。HPP又はマッチしたUCB細胞を、KG-1a細胞と共培養する前に、IL-2とともに又はIL-2な
しで24時間インキュベートした。IFN-γの分泌は、K562及びKG-1aと共培養されたHPP細胞
において、48時間で最も増加した。HPP細胞を100U/mLのIL-2で処理したとき、24時間及び
48時間でのKG-1aに対するHPP細胞の細胞傷害性が増大した。HPP細胞におけるIFN-γの分
泌レベルは、IL-2処理したときのマッチしたUCB細胞の分泌レベルよりも高かった。より
高いIFN-γ発現は、マッチしたHPP及びUCB由来の細胞のRT-PCR解析によって確認された。
これらの結果は、HPP細胞がUCB細胞と比較してより高い抗白血病活性を示し、このより高
い活性がIFN-γ産生の顕著な増加と関連することを示している。
【０２８３】
一群の腫瘍細胞株との共培養時のHPP細胞における及び臍帯血細胞におけるIFN-γ産生
を、上の表1に記載の腫瘍細胞株を用いて解析した。HPP細胞及び腫瘍細胞を、104個の腫
瘍細胞及び5×105個のHPP細胞を用いて、50:1の比で24時間又は48時間共培養した。CCRF-
CEM、J.RT3-T3.5、K562、KG1、KG-1a、KU812、NC1-H1417、U-937、及びWER1-RB-1細胞株
については、24時間の共培養でのHPP細胞におけるIFN-γ産生の増加は、これらの細胞株
と同じ時間共培養された臍帯血細胞におけるIFN-γ産生の増加を超えていた。図10Aを参
照されたい。48時間の共培養では、HPP細胞におけるIFN-γ産生の増加は、全ての腫瘍細
胞株について臍帯血におけるIFN-γ産生の増加を超えていた。図10Bを参照されたい。腫
瘍細胞株のうち、K562細胞は、24時間と48時間の両方でHPP細胞におけるIFN-γ産生の最
大増加を誘導した。同様の結果が、TNF-α及びGM-CSFについて観察された。
【０２８４】
細胞周期解析は、S期のKG-1aのパーセンテージが、単独で培養したKG-1a細胞と比較し
て、HPPと共培養した場合に30％減少したことを示した。HPPの異なる濃縮画分を用いて実
施されたさらなる共培養実験は、HPPの抗白血病活性が、CD56+の高発現、CD16の発現の欠
如を特徴とする高濃度の固有の未成熟ナチュラルキラー細胞に大きく起因することを示し
た。
【０２８５】
(6.6.実施例6:ヒト胎盤灌流液細胞によるインビボでの腫瘍細胞増殖の抑制)
(6.6.1.材料及び方法)
ここに提示される実施例は、ヒト胎盤灌流液細胞によるインビボでの腫瘍細胞増殖の抑
制を示している。特に、本実施例は、NOD/SCIDマウス異種移植片腫瘍モデルを用いた、腫
瘍細胞に対するインビボでのヒト胎盤灌流液の有効性を示している。
【０２８６】
(KG-1細胞の培養)
KG-1細胞を、20％胎仔ウシ血清が補充されたイスコフ改変ダルベッコ培地(成長培地)中
、37℃、95％空気/5％CO2、及び100％湿度で維持した。培養物中の培地を1日おきに交換
し、細胞を毎週継代した。KG-1細胞は懸濁物として成長する。したがって、培地交換又は
細胞継代のために、細胞懸濁液を遠心分離チューブ中に回収し、Sorvall(登録商標) Hera
eus(登録商標)ローター(品番75006434)中、2,000rpmで10分間遠心分離した。上清を捨て
、適量の細胞ペレットを培養の継続のために成長培地に再懸濁させた。
【０２８７】
(移植用のKG-1細胞の調製)
マウスへの細胞移植のために、細胞を上記の遠心分離により回収した。細胞ペレットを
回収し、リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁させた。マウスに移植されることになる細胞の数
を決定するために、該細胞懸濁液のアリコートを、血球計を用いて計数した。トリパンブ
ルー色素を用いて、該懸濁液中の非生存細胞を排除した。
【０２８８】
(移植用のHPP細胞の調製)
HPPの保存及び解凍のために、試料を、良好な条件下、断熱容器(dry shipper containe
r)中で凍結させた。解凍当日、HPPユニットを冷凍フリーザーから(1回につき1つ)取り出
し、ジップトップ式のプラスチックバッグに入れた。その後、大部分が解凍されるまで(
小さな凍結片はバッグ中に残る)、穏やかに撹拌しながらバッグを37℃の水浴に入れた。
その後、水浴からバッグを取り出し、該ユニットをジップトップ式のバッグから取り出し
、完全に解凍されるまで該ユニットを穏やかに反転させた。その後、該ユニットを層流フ
ード内に入れ、70％エタノールを噴霧することにより、血液バッグの外面を滅菌した。滅
菌鋏を用いて血液バッグを開封し、細胞を、滅菌ピペットにより、滅菌した50mlの円錐チ
ューブ(各々のHPPユニットに1本のチューブ;各々のUCBユニットに2本のチューブ)に移し
た。次に、10mLの解凍バッファー(2.5％ヒトアルブミン、5％デキストラン40)を、穏やか
に混合しながら、各々のチューブにゆっくりと(2.2〜2.9分の時間をかけて)添加した。そ
の後、各々の血液バッグを10mLの解凍バッファーですすぎ、その後、これを、50mlの円錐
チューブにゆっくりと(0.7〜1.3分の時間をかけて)添加した。
【０２８９】
解凍後、各々のユニットを、遠心分離前に水分を含んだ氷の上で保存した。全てのチュ
ーブを10分間(440×g、10℃で)遠心分離し、上清を、滅菌ピペットを用いて吸引し、チュ
ーブを振盪させることにより、ペレットを穏やかに破壊した。ビヒクル(PBS＋1％胎仔ウ
シ血清)の1mlアリコートをチューブの1つに添加し、穏やかに旋回させることにより、該
チューブを混合した。2mlピペットを用いて、内容物を第二のチューブに移し、次に、第
三のチューブ、その後、第四のチューブに移した。空のチューブを0.2mlの希釈バッファ
ーで洗浄した。
【０２９０】
細胞計数のために、25μlのアリコートを、975μlのビヒクルを含む氷上の15mlの円錐
チューブに移した。その後、4mlの冷塩化アンモニウム溶解試薬を添加し、氷上で10分間
インキュベートすることにより、赤血球を溶解させた。インキュベーション後、5mlの冷P
BSを各々のチューブに添加し、該チューブを遠心分離した(10分、400×g、10℃)。RBC溶
解後、細胞を、生存率を評価するためのトリパンブルーを用いて、血球計により計数した
。計数の結果を希釈に対して補正し、その後、溶解係数(0.46)で除して、RBC溶解前に存
在していた細胞の数を推定した。
【０２９１】
HPP用量調製のために、計数後、ビヒクルを添加することにより、HPP細胞を1×108細胞
/mlに希釈した。その後、シリンジを装填するまで、HPP細胞を氷上で保存した。第一のユ
ニットの解凍から用量調製の完了までの経過時間は3時間未満であった。
【０２９２】
シリンジを充填する前に、上記のような計数による事後用量確認のために、投与材料の
50μlアリコートを取っておいた。投与後、残りの投与材料を用量確認のために評価した
。
【０２９３】
(研究設計)
1日目に、24匹のNOD/SCID雄マウス(Jackson Laboratories)の側腹部に、500万個の生き
たKG-1細胞を皮下(S/C)移植した。木片床敷を備えた1つのマイクロアイソレーションケー
ジシステムで4〜5匹のマウスが飼育されるように、マウスを分離した。滅菌した齧歯類用
の食餌及び水を自由に与えた。マウスを、腫瘍成長について週に2回、詳しくモニタリン
グした。最初の測定可能な腫瘍は25日目に観察された。その後、体重を週に1回記録し、
腫瘍測定値を、キャリパーを用いて、週に2回記録した。移植後52日目に、動物を、3つの
独立した群に無作為に割り付けると、腫瘍体積は平均して約300〜350mm3になった。下の
表12を参照されたい。第一の群は、312mm3の平均腫瘍体積を有する4匹の対照マウスから
なっていた。これらのマウスのうちの2匹に、それぞれ、200μl及び50μlのビヒクル溶液
を、静脈内(IV)に、及び腫瘍内(IT)に2回、移植した。345mm3の平均腫瘍体積を有する第
二の群は、マウス1匹当たり200μlのHPP細胞(2×107細胞)が静脈内に移植された4匹のマ
ウスからなっていた。マウス1匹当たり50μlのHPP細胞をIT移植された最後の群もまた、3
32mm3の平均腫瘍体積を有する4匹のマウスからなっていた。
表12:インビボ腫瘍抑制実験のための実験群。
【表１５】
2020196724.tif 000043
【０２９４】
HPP細胞を移植してから14日後の66日目に、この研究は、腫瘍体積が大きくなったため
に中止された。
【０２９５】
(6.6.2.結果)
腫瘍体積(TV)は、対照群のTVが2921mm3の平均値に達した66日目(HPP細胞を移植してか
ら14日後)まで測定された。研究の終了時のIV処置群は2076mm3の平均TVを有しており、IT
群は2705mm3のTVを有していた。処置後のTVの増加％に関して、IT群がわずか20％の阻害
を示したのに対し、IV群は、対照群と比較して、35％を上回る腫瘍成長阻害を示した。IT
群の阻害は実証可能であった。図11を参照されたい。
【０２９６】
(6.7.実施例7)
この実施例は、ドナーがマッチした満期ヒト胎盤灌流液細胞及び臍帯血(UCB)細胞由来
の組み合わされたナチュラルキラー細胞の生成及び特徴付けを記載するものである。
【０２９７】
(6.7.1.材料及び方法)
(ヒト胎盤由来幹細胞及びUCBの処理)
寄附された満期胎盤に生理食塩水を灌流させて、ヒト胎盤由来幹細胞を回収した。その
後、ヒト胎盤由来幹細胞を処理して、赤血球、非生存細胞、及び組織破片を除去し、その
後、凍結保存した。処理の間、ヒト胎盤由来幹細胞を増殖させることも、培養することも
なかった。
【０２９８】
(ヒト胎盤由来幹細胞及びUCBからのナチュラルキル細胞の単離)
凍結保存されたドナーがマッチしたヒト胎盤由来幹細胞及びUCBを最初に解凍し、組み
合わせ、5％v/vの胎仔ウシ血清(FBS; Hyclone laboratories)を含むRPMI 1640(フェノー
ルレッド非含有)(Gibco)で洗浄した。いくつかのNK細胞増殖実験では、バフィーコート(B
lood Center, NJ)から得られた末梢血単核細胞(PBMC)をNK細胞の別の源として調製した。
洗浄後、細胞ペレットを、5×107細胞/mlで、RoboSepバッファー(StemCell Technologies
)に再懸濁させた。0.1mg/mlのDNアーゼI(StemCell Technologies)溶液を100μl/mlの最終
濃度まで該細胞懸濁液に添加し、ピペットにより穏やかに混合し、EasySep(登録商標) NK
細胞濃縮キット(StemCell Technologies)による単離の前に、室温で15分間インキュベー
トした。以下のヒト細胞表面抗原: CD3、CD4、CD14、CD19、CD20、CD36、CD66b、CD123、
HLA-DR、及びグリコフォリンAに対するモノクローナル抗体を含むヒトNK細胞濃縮カクテ
ルを50μl/mlの最終濃度で該細胞懸濁液に添加し、10分間インキュベートした。その後、
EasySep(登録商標)磁気微粒子を100μl/mlの最終濃度まで添加し、5分間インキュベート
した。その後、製造業者(StemCell Technologies)によって提供されるプロトコルに従っ
て全自動細胞分離装置RoboSepを用いて、NK細胞の濃縮を行った。CD56+CD3-集団をこのよ
うに回収し、さらなる解析又は培養の準備ができた。
【０２９９】
(pNK細胞のエクスビボ増殖)
濃縮された胎盤CD56+CD3- NK細胞を、以前に記載されたプロトコル(Ysselらの文献、19
84, J. Immunol. Methods. 72, 219-227)の改変に基づく出発培地中で培養した。簡潔に
述べると、出発培地は、10％胎仔ウシ血清(FBS)(Hyclone)、35mg/mlのトランスフェリン(
Sigma-Aldrich)、5μg/mlのインスリン(Sigma-Aldrich)、20μMのエタノールアミン(Sigm
a-Aldrich)、1μg/mlのオレイン酸(Sigma-Aldrich)、1μg/mlのリノール酸(Sigma-Aldric
h)、0.2μg/mlのパルミチン酸(Sigma-Aldrich)、2.5μg/mlのBSA(Sigma-Aldrich)、及び0
.1μg/mlのフィトヘマグルチニン(PHA-P、Sigma-Aldrich)が補充されたIMDM(ATCC)から構
成されていた。NK細胞を、約2.5×105/mlで、出発培地＋ペニシリン-ストレプトマイシン
(Invitrogen)及び200IU/ml IL-2(R&D Systems)に再懸濁させた。マイトマイシンC(Sigma-
Aldrich)処理したPBMC及びK562(ATCC)細胞を、PBMC細胞については1×106/ml及びK562細
胞については1×106/mlの最終濃度で、フィーダー細胞として出発培地に添加した。NK細
胞増殖を開始するために、フィーダー-NK細胞懸濁液をガス透過性培養バッグ(American F
luoroseal)に移し、インキュベーター中、37℃、5％CO2で培養した。5〜7日間培養した後
、増殖した細胞集団に維持培地を最大21日間供給した。維持培地は、10％FBS、2％ヒトAB
血清(Gemini)、ペニシリン-ストレプトマイシン、及び200IU/ml IL-2が補充されたIMDMか
ら構成されていた。全細胞数及び細胞生存率を、Easycount(Immunicon)及びEasycount Vi
asure Kit(Immunicon)を用いて調べた。次式を用いて、増殖倍数を計算した:倍数＝21日
目のCD56+ CD3- NK細胞の絶対数/0日目のNK細胞の絶対数。
【０３００】
(BrdU/7-AAD細胞周期解析)
増殖させた細胞をBrdU(BD Bioscience)で標識し、37℃、5％CO2で24時間培養した。該
細胞を回収し、固定し、製造業者によって提供されるプロトコルに従って、抗BrdU及び7-
AADで染色した。FACSCalibur(BD Biosciences)で細胞周期データを収集し、FlowJo(Tree 
Star社)で解析を遂行した。
【０３０１】
(免疫表現型特徴付け)
ドナーがマッチしたヒト胎盤由来幹細胞及びUCB由来の単核細胞(MNC)もしくは濃縮NK細
胞、又は7日、14日、21日培養物由来の増殖細胞の表現型をマルチカラーフローサイトメ
トリーにより解析した。細胞をヒト血液表面抗原に対する蛍光色素コンジュゲート型モノ
クローナル抗体: CD56-PerCP/-PE/-PE-Cy7、CD3-FITC/-APC-Cy7、CD16-FITC/-PerCP、CD1
58b-PE(キラー免疫グロブリン様受容体[KIR] 2DL2/2DL3)、CD158e1-PE(KIR3DL1)、NKG2D-
APC、NKp46-APC、NKp44-PE、NKp30-PE、CD226-PE、2B4-PE(全てBD Biosciences Pharming
enから購入したもの)、及びCD94-PE(R&D Systems)で染色した。全ての解析を、FACSCanto
I(BD Biosciences)及びFlowJo解析ソフトウェアを用いて実施した。
【０３０２】
(PKH26/TO-PRO-3細胞傷害性アッセイ)
NK細胞をエフェクター細胞として及び様々な腫瘍細胞株を標的細胞として用いて、NK細
胞のインビトロ細胞傷害性を調べた。標的細胞をPKH26(Sigma-Aldrich)で標識し(Ferlazz
oらの文献、2004; Lee-MacAryetらの文献、2001)、96ウェルのU底組織培養プレートに入
れ、10％FBSが補充された200μlのRPMI 1640中、様々なエフェクター対標的(E:T)比で、
エフェクター細胞とともにインキュベートした。37℃、5％CO2で4時間インキュベートし
た後、細胞を回収し、TO-PRO-3(Invitrogen)を1μMの最終濃度で培養物に添加し、その後
、BD FACSCanto Iを用いてFACS解析を行った。細胞傷害性は、全PKH26+標的腫瘍細胞内の
死細胞(PKH26+TO-PRO-3+)のパーセンテージとして表した。
【０３０３】
(乳酸脱水素酵素(LDH)放出アッセイ)
或いは、NK細胞のインビトロ細胞傷害性を、CYTOTOX 96(登録商標)比色細胞傷害性アッ
セイキット(Promega)を用いるLDH放出アッセイにより調べた。このアッセイでは、エフェ
クター細胞及び標的細胞を96ウェルのU底組織培養プレートに入れ、2％ヒトAB血清が補充
された100μlのフェノールレッド非含有RPMI 1640(Invitrogen)中、様々なE:T比でインキ
ュベートし、37℃、5％CO2で4時間インキュベートした。インキュベーション後、50μlの
上清を、製造業者によって指示される通りに、LDH活性の検出用の酵素アッセイプレート
に移した。細胞傷害性を、以下の方程式を用いて計算した:％細胞傷害性＝(実験的放出-
エフェクター自然放出−標的自然放出)/(標的最大放出−標的自然放出)*100。
【０３０４】
(miRNA調製及び定量的PCR(QPCR))
miRNAを、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってMIRVANA(商標) miRNA単離キ
ット(Ambion)を用いて、0.5〜1.5×106個の細胞から単離した。回収された低分子RNAの濃
度及び純度を、260及び280nmでのその吸光度を測定することにより決定した。精製RNA試
料を、TAQMAN(登録商標)逆転写試薬(Applied Biosystems)を用いるcDNA合成、次いで、79
00HT高速リアルタイムPCRシステムによるリアルタイムPCR解析に供した。ヒトマイクロRN
Aアレイ(Applied Biosystems)を遺伝子発現プロファイリング及びmiRNAプロファイリング
に使用した。各々のmiRNAについて、リアルタイムPCRからの平均ΔCtをΔCt平均＝平均(C
t試料)−平均(Ct内部)(式中、Ct試料はmiRNAのCt値であり、Ct内部は内部対照のCt値であ
る)として計算した。以下の基準を満たす場合、miRNAは、pNK又はPB NKに固有のものであ
るものとした:1)ΔCt平均＜0; 2)|ΔCt平均|≧2*Ct内部_SD(式中、|ΔCt平均|はΔCt平均
の絶対値であり、Ct内部_SDはCt内部の標準偏差である);及び3)先の2つの基準を満たすmi
RNAが該細胞型だけに限定されていた。前述の基準を使用する論拠は、miRNAが、内部対照
と比較して、少なくとも1つのドナー試料に豊富に含まれることを確認することであった
。検出可能なレベルのmiRNAを含まないドナー試料は、Ct値の平均を求めるときに、数値
的に無視された。対照遺伝子からの2標準偏差を伴った負のΔCt平均は、特定の遺伝子が
相対的に豊富にあることを保証するものである。さらに、参照遺伝子の標準偏差は全て0.
25未満であり、これにより、対照の品質が確認された。pNKとPB NKの間で有意に発現され
るmiRNA、及び0日目のpNKと21日目のpNKの間で有意に発現されるmiRNAを、ΔCt値に対す
る2標本t-検定(有意水準0.01のp値)により決定した。発現変化倍数を、R＝2(ΔCt1_平均
−ΔCt2_平均)(式中、Rは、変化倍数であり(Livak, K.J.及びSchmittgen, T.Dの文献、20
01, Methods. 4, 402-408); ΔCt1_平均は、0日目のpNKの平均ΔCtであり、ΔCt2_平均は
、PB NK又は増殖させたpNKの平均ΔCtである)に従って計算した。最も豊富にあるmiRNAの
1つであるRNU44を内部対照として使用した。試料1つ当たり8つの対照ウェルがあり、該対
照の平均Ctを用いて、ΔCtを計算した。本明細書で利用される統計的方法は、対照と比較
して豊富ではないmiRNAを排除する。
【０３０５】
(miRNA標的予測及び経路解析)
PB NK及びpNKのどちらかに固有であるmiRNA、並びに増殖させたpNKで高発現するmiRNA
の検索を、中程度から高度のストリンジェンシー検索条件を使用することにより、7つのm
iRNA標的遺伝子予測データベース(Diana-microT、miRDB、miRTar、microRNA.org、MicroC
osmTargets、picTar、及びTargetScan)並びに実験的に確認された3つの標的遺伝子データ
ベース(TarBase、miRecords、及びmiRTarBase)で実施した。5以上のデータベースによっ
て予測される遺伝子を信頼度の高い標的とみなした。その後、関連するシグナル伝達経路
及び細胞機能を決定するために、そのような標的遺伝子を経路解析(Ingenuity Systems)
で調べた。経路を、そのp-値に基づいてスコアリング及びランキングした。
【０３０６】
(6.7.2.結果及び考察)
(6.7.2.1.ヒト胎盤由来幹細胞由来NK細胞の表現型プロファイル)
ヒト胎盤由来幹細胞を3つの胎盤から回収し、細胞表面マーカーについて、ドナーがマ
ッチしたUCBと比較してフローサイトメトリーにより解析した。細胞表面マーカー発現(CD
56+CD3-)によって解析されたNK細胞組成から、ヒト胎盤由来幹細胞(0.70％±0.24％)とド
ナーがマッチしたUCB(0.63％±0.36％)の間に実質的な違いは認められなかった(n＝3)。
その後、特定のキラー細胞免疫グロブリン(Ig)様受容体(KIR)及びC-タイプレクチン受容
体(KLR)(CD94、NKG2D)に対する蛍光コンジュゲート型モノクローナル抗体を用いて、CD56
+CD3- NK細胞を調べた。2標本t-検定を用いて、母平均がヒト胎盤由来幹細胞とUCBで等し
いかどうかを判定した。図12Aに示すように、3対のドナーがマッチしたヒト胎盤由来幹細
胞及びUCBユニット由来のNK細胞は表現型の類似性を示し、CD56+CD16-、CD56+CD16+、NKG
2D、CD94、KIR3DL1、及びKIR2DL2/L3などの亜集団の発現に有意な差はなかった。21日間
別々にNKを増殖させた後、ヒト胎盤由来幹細胞由来のNK細胞及びUCB NK細胞は、様々なE:
T比でK562細胞に対する同程度の細胞傷害性を示し、増殖後のヒト胎盤由来幹細胞由来NK
細胞とUCB NK細胞の間の機能的類似性を示した(図12B)。
【０３０７】
(6.7.2.2.凍結保存されたコンボユニット由来のpNKの単離及び特徴付け)
ヒト胎盤由来幹細胞及びドナーがマッチしたUCBユニットを組み合わせて、細胞増殖の
ための出発材料として使用されるべき1つの「コンボユニット」にした。
【０３０８】
解析により、pNK細胞の約90％は、凍結保存されたコンボユニットから、70％を超えるC
D56+ CD3-細胞純度でルーチンに回収されたことが示されている。
【０３０９】
16コンボユニット由来のpNK細胞及び13ユニットのバフィーコート末梢血(PB)由来のNK
細胞を免疫表現型特徴付けに供した。KIR(KIR3DL1、KIR2DL2/3)、KLRs(CD94)、NKG2D、天
然の細胞傷害性受容体NCR(NKp46、NKp44、及びNKp30)、2B4、並びにCD226を含む細胞表面
マーカーの発現を評価した。CD56+CD16-、CD56+CD16+、KIR2DL2/3+、NKp46+、NKp30+、2B
4+、及びCD94+を含む、pNK細胞とPB NK細胞の間の有意な差が観察された(図13A及び表13)
。PB NK細胞のほとんど(79％)は成熟したCD56+CD16+表現型を示したが、pNK集団の大半(6
0％超)は未成熟なCD56+CD16-細胞であった。PB NK細胞と比較してpNK細胞で観察されたよ
り多くの割合のCD16-細胞は、pNK細胞がPB NK細胞よりも未熟なNK細胞集団を含むことを
示している。
表13. pNK細胞表現型及びPB NK細胞表現型における亜種団の比較
【表１６】
2020196724.tif 000044
【０３１０】
pNK細胞及びPB NK細胞の表現型を、TaqManアレイヒトマイクロRNAカードを用いるmiRNA
解析によりさらに調べ、pNK細胞及びPB NK細胞における365のmiRNAの発現を比較した。こ
れらの解析から、pNK細胞に固有の4つのmiRNA(hsa-miR-337、hsa-miR-422a、hsa-miR-549
、及びhsa-miR-618)、並びにPB NK細胞により固有に発現される8つのmiRNA(hsa-let-7b、
hsa-miR-146b、hsa-miR-19b、hsa-miR-24、hsa-miR-347、hsa-miR-381、hsa-miR-517c、
及びhsa-miR-631)が同定された。さらに、PB NK細胞と比較したpNK細胞において、20のmi
RNAが有意により高いレベルで発現し、及び29のmiRNAが有意により低いレベルで発現して
いた(表14及び15)。これらの結果は、pNK細胞が、PB NK細胞と比較して固有のmiRNA発現
パターンを有することを示している。
表14. pNK細胞における高発現miRNA。
【表１７】
2020196724.tif 000045
表15. PB NK細胞における高発現miRNA。
【表１８】
2020196724.tif 000046
【０３１１】
(6.7.2.3.miRNA標的遺伝子予測)
miRNA標的遺伝子予測解析を材料及び方法に記載の通りに実施した。pNKにおける14の高
発現miRNA及びPB NKにおける24の高発現miRNAを複数の標的遺伝子とともに報告した(表16
)。詳細に述べると、抗アポトーシス遺伝子のBcl-2及びBcl-2Lを標的とする、hsa-let-7a
、hsa-let-7g、hsa-mir-133b、hsa-mir-181b、及びhsa-mir-181dを含む、PB NKにおける
いくつかの高発現miRNAが同定された。さらに、miRNAのhsa-mir-146bは、PB NK細胞で高
発現しており、その標的TRAF6は、NF-kB活性を下方調節し、細胞増殖を抑制し、化学的感
受性を増強することが報告されている(Paikらの文献、2011, Clin. Cancer Res. 17, 476
1-4771)。TRAF6は、MAPK14、IL6、及びFOSなどの遺伝子とともに、自然免疫及び適応免疫
において重要な役割を果たしている(Chiffoleauらの文献、2003, J. Immunol. 171, 5751
-5759)。MAPK14、IL6、及びFOSは、それぞれ、hsa-mir-24、hsa-mir-7a、及びhsa-mir-22
2により標的とされ、全て、PB NKで高発現していることが本研究で分かった。さらに、PB
NKで3倍多いhsa-mir-181群(hsa-mir-181b、hsa-mir-181c、hsa-mir-181d)が同定された
。これらのmiRNAは、CD34+ HSCからのNK細胞の発生及び初代CD56+ NK細胞におけるIFN-γ
産生において重要な役割を果たすNotchシグナル伝達の調節因子であるnemo様キナーゼを
標的とする(Cichockiらの文献、2011, J. Immunol. 187, 6171-6175)。最近、pNKにおけ
る高発現miRNAの群において、その大部分がPB NKにおけるmiRNAの(実験的及び確認された
)標的遺伝子リストに存在しない、SOX2、BMPR1、SMO、AKT1、ATM、RAF1、及びMTORなどの
、幹細胞における多能性マーカーと細胞周期調節因子とから構成されるmiRNA:mRNA標的対
が同定された。
表16. PB NKと比較したpNKにおける示差調節されるmiR及びその確認された標的遺伝子
【表１９】
2020196724.tif 000047
2020196724.tif 000048
2020196724.tif 000049
2020196724.tif 000050
*及び**は、発現レベルが、それぞれ、PB又はpNKのみにおける内部対照よりもドナーの少
なくとも1人において有意に高い(2標準偏差高い)ことを表している。括弧内の数字は、遺
伝子が、(例えば、統計解析によって及び実験によって)以前に確認されたものに加えて、
miRによって標的とされることを示すデータベースの数を表している。
【０３１２】
(6.7.2.4. pNK細胞のエクスビボ増殖)
上記の単離手順の後、平均1000万個のpNK細胞から始めて、細胞傷害性T細胞及びヘルパ
ーT細胞を増殖させるためのプロトコル(Ysselらの文献、1984)を用いて、pNK細胞の増殖
を最適化した。まず、フィーダー細胞濃度を最適化するために、同種異系PBMC及びK562細
胞を、PBMCの濃度を1×106/mlに固定して、1:10、1:5、及び1:1の比で試験した。表17に
示すように、1:1の比(1×106/ml K562:1×106/ml PBMC)は、1:5の比の場合の31.8倍(N＝3
)及び1:10の比の場合の53.1倍(N＝9)と比較して、98.4倍という最大のNK細胞増殖(N＝14)
をもたらした。したがって、1:1の比をさらなるpNK培養に使用した。次に、新鮮なフィー
ダー細胞の補充が培養プロセスにおけるNK増殖を増強することができるかどうかを評価し
た。新鮮なフィーダー細胞の補充のための最良の時間帯を決定するために、7日目、14日
目、21日目、及び28日目におけるpNK細胞の細胞成長動態を、BrdU及び7-アミノアクチノ
マイシン-D(7-AAD)二重染色と、それに続くフローサイトメトリーで評価した。図14に見
られるように、7日目に、培養NK細胞の大部分はS期にあり、該細胞が増殖していることを
示した。活発に増殖している/分裂している細胞のパーセンテージは、その後の培養の間
に大幅に減少し、7日目が再刺激のための最適な時間帯であることが示唆された。表18に
示すように、7日目における新鮮なK562及びPBMCフィーダー細胞の添加は、NK細胞の増殖
の3倍増をもたらした。この最適化された21日間NK培養法を20回の増殖実験で繰り返して
、ドナー当たり平均1.2×109個のCD56+CD3- NK細胞が、約80％の生存率で得られた(図15A
)。
表17.フィーダー細胞としてのK562対PBMCの比の最適化
【表２０】
2020196724.tif 000051
*増殖倍数＝21日目のCD56+ CD3- NK細胞の絶対数/0日目のNK細胞の絶対数。
表18.フィーダーを様々な時点で補充する効果
【表２１】
2020196724.tif 000052
【０３１３】
(6.7.2.5.エクスビボ増殖させたpNK細胞の特徴付け)
免疫表現型及びmiRNAの変化を、増殖させていない細胞と比較して、12コンボユニット
由来の増殖させたpNK細胞で特徴付けた。21日目のpNK細胞は、例えば、増殖させていない
細胞と比較して、NKG2D、NKp46、NKp44、及びNKp30などの活性化受容体の発現の有意な増
加、並びに双方向性受容体2B4の発現の有意な減少を示した。KIR3DL1及びKIR2DL2/L3を含
む抑制性KIRの発現は、増殖させた細胞と増殖させていない細胞について同様であった(図
15B及び表19)。
表19. 21日目の増殖させたpNK対増殖させていないpNK細胞の亜集団比較
【表２２】
2020196724.tif 000053
【０３１４】
また、pNKについて確立されている最適化された単離及び増殖手順(上記)を用いた、9人
のドナーにおけるPB NKの増殖及び免疫表現型を特徴付けた。21日目の増殖させたpNKと21
日目の増殖させたPB NKの比較を表20に示す。
表20. 21日目の増殖させたpNKと21日目の増殖させたPB NKにおける亜集団比較
【表２３】
2020196724.tif 000054
【０３１５】
さらに、エクスビボ増殖後、23のmiRNAの発現は増加していたが、他の31のmiRNAは下方
調節されていた(表21)。上方調節されることが分かったmiRNAのうちの1つはhsa-miR-155
である。これは、過剰発現したとき、IFN-γの誘導の増強によって、NK細胞機能を増大さ
せることが示されている(Trottaらの文献、2012, Blood 119, 3478-3485)。
表21. pNKエクスビボ増殖の間に示差調節されるmiRNA
【表２４】
2020196724.tif 000055
2020196724.tif 000056
2020196724.tif 000057
【０３１６】
(6.7.2.6.増殖させたpNK細胞の抗腫瘍性細胞溶解活性)
増殖させたpNK細胞を、種々の腫瘍型に対する細胞溶解活性について評価した。増殖さ
せたpNKの細胞溶解活性を、K562細胞に対するFACSベースのPKH26/TO-PRO-3細胞傷害性ア
ッセイで評価した。図15Cに示すように、14日目と比べて21日目に、10:1のE:T比で、K562
に対するpNK細胞の有意な増強があった(63％±15％対45％±4％、p＜0.001)。比較により
、より小さい細胞傷害/細胞溶解活性が21日目のPB NK細胞(対pNK細胞)から観察された(42
％±7％)(図15C)。
【０３１７】
pNK細胞を21日間増殖させた後のこの細胞溶解活性の増加は、活性化受容体及びmiRNAの
発現の増加と相関している。培養を28日に延長しても、K562細胞に対する細胞溶解活性の
さらなる増加は生じなかった。
【０３１８】
11の追加の腫瘍細胞株を21日目の増殖させたpNK細胞と共培養し、10:1、5:1、2:1、及
び1:1のE:T比でのNK細胞の細胞溶解活性を4時間のLDH放出アッセイで測定した。10:1のE:
T比では、増殖させたpNK細胞は、U937細胞(89.2％±9.8％); WERI-RB-1細胞(73.3％±11.
8％); RPMI8226細胞(61.3％±1.3％); HCT-116細胞(61％±5.1％)、及びU266細胞(57.4％
±4.7％)、並びにK562細胞(88.6％±5.6％)を含む、複数の腫瘍細胞株に対する50％を超
える細胞傷害性を示した(図16)。腫瘍株に対する増殖させたpNK細胞の細胞溶解活性は、E
:T比の系統的漸増によって示したとき、用量依存的な様式であった。
【０３１９】
これらの結果は、増殖させたpNKが、血液腫瘍(例えば、白血病)と固形腫瘍の両方を含
む、種々の腫瘍細胞を死滅させる能力を有することを示している。
【０３２０】
(6.7.3.結論)
この実施例は、PB NK細胞と比較して表現型及びmiRNAプロファイルが異なるpNK細胞、
例えば、ヒト胎盤由来幹細胞及びUCB細胞由来の細胞を増殖させて、種々の腫瘍細胞型に
対して有用な、臨床的に意義のある量の細胞傷害性の高い細胞を生み出すことができるこ
とを示している。
【０３２１】
(6.8.実施例8)
この実施例は、HLA非同一(同種異系)幹細胞移植を受ける患者のGVHDを治療するためのp
NK細胞の使用を記載している。
【０３２２】
(血液悪性腫瘍を有する患者におけるHLA非同一ドナー造血幹細胞(HSC)＋pNK細胞の移植)
癌細胞の成長を停止させるために及び該個体の免疫系が健常ドナーの幹細胞を拒絶する
のを防ぐために、血液悪性腫瘍を有する個体に化学療法及び全身放射線照射を投与する。
個体に注入されるドナー由来の健常HSCは、該個体の造血再構築を助ける。その後、個体
は、再発を予防すること及び生存を向上させることに加え、GVHDを予防し又はGVHDの重症
度を軽減するために、pNK細胞移植を受ける。
【０３２３】
(均等物:)
本発明は、本明細書に記載の具体的な実施態様によって範囲が限定されるべきではない
。実際、記載された変更に加えて、本発明の様々な変更が、上の説明及び添付の図面から
当業者に明白となるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれるこ
とが意図される。
【０３２４】
本明細書で引用された全ての参考文献は、各々の個々の刊行物、特許、又は特許出願が
、あらゆる目的のために、その全体として引用により具体的かつ個別に組み込まれること
が示される場合と同じ程度に、あらゆる目的のために、引用により完全に本明細書中に組
み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示を目的としたものであり、本発
明が先行発明を理由としてそのような刊行物に先行する資格がないという承認と解釈され
るべきではない。
【図１】
2020196724.tif 000058
【図２Ａ】
2020196724.tif 000059
【図２Ｂ】
2020196724.tif 000060
【図３】
2020196724.tif 000061
【図４】
2020196724.tif 000062
【図５】
2020196724.tif 000063
【図６】
2020196724.tif 000064
【図７】
2020196724.tif 000065
【図８】
2020196724.tif 000066
【図９】
2020196724.tif 000067
【図１０】
2020196724.tif 000068
【図１１】
2020196724.tif 000069
【図１２】
2020196724.tif 000070
【図１３】
2020196724.tif 000071
【図１４】
2020196724.tif 000072
【図１５】
2020196724.tif 000073
【図１６】
2020196724.tif 000074
【配列表】
2020196724000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月27日(2020.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に実質的に記載された、新規な物、方法及び製造方法。
【外国語明細書】
2020196724000001.pdf