(57)【要約】      （修正有）【課題】微生物の形質転換体作成のみに依存しない、新規なプロセスによる有機化合物（α−ケト酸）の製造方法、及び、前記製造方法に利用できるコリネ型細菌の提供。【解決手段】ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む微生物を、ピルビン酸及び糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、アルデヒド及びケトンから選ばれるカルボニル化合物との存在下で培養して、α−ケト酸を生産する工程を含む、方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、
下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（２）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＯＣＯＯＨ
（上記一般式（２）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表されるα−ケト酸を生産する工程を含む、α−ケト酸の製造方法。
【請求項２】
前記培養が、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われる請求項１に記載のα−ケト酸の製造方法。
【請求項３】
前記培養が、前記微生物を培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる請求項１または２に記載のα−ケト酸の製造方法。
【請求項４】
前記一般式（１）及び（２）中、Ｒ１０１が、水素、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基またはノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である請求項１〜３の何れか１項に記載のα−ケト酸の製造方法。
【請求項５】
以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、
（ｂ）α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素をコードする第２遺伝子、および
（ｃ）アルデヒドの還元反応を触媒する酵素をコードする第３遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、
下記一般式（３）：
Ｒ１０３Ｃ（Ｏ）Ｒ１０４
（ここでＲ１０３およびＲ１０４は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である。ただし、Ｒ１０３が水素であるとき、Ｒ１０４は水素ではない。）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（４）：
Ｒ１０３Ｃ（Ｒ１０４）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ
（上記一般式（４）におけるＲ１０３およびＲ１０４は、それぞれ上記一般式（３）におけるＲ１０３およびＲ１０４と同じ基である）
により表される１，３−ジオールを生産する工程を含む、１，３−ジオールの製造方法。
【請求項６】
前記一般式（３）及び（４）中、Ｒ１０３が、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基またはノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素である請求項５に記載の１，３−ジオールの製造方法。
【請求項７】
以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、
（ｂ）α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素をコードする第２遺伝子、および
（ｃ）アルデヒドの還元反応を触媒する酵素をコードする第３遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物の存在下で培養して、１，３−ブタンジオールを生産する工程を含む、１，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項８】
以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、および
（ｄ）α−ケト酸の還元反応を触媒する酵素をコードする第４遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、
下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（５）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ
（上記一般式（５）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２，４−ジヒドロキシカルボン酸を生産する工程を含む、２，４−ジヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項９】
前記一般式（１）及び（５）中、Ｒ１０１およびＲ１０２が、水素である請求項８に記載の２，４−ジヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項１０】
下記一般式（２）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＯＣＯＯＨ
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるα−ケト酸と窒素源と還元剤とを、
グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼの存在下で反応させて、
下記一般式（６）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（上記一般式（６）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（２）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を生産する工程を含む、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項１１】
下記一般式（６）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表される２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸と酸化剤とを、
グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼの存在下で反応させて、
下記一般式（２）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＯＣＯＯＨ
（上記一般式（２）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（６）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表されるα−ケト酸を生産する工程を含む、α−ケト酸の製造方法。
【請求項１２】
以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、および
（ｅ）α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する酵素をコードする第５遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、
下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（６）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（上記一般式（６）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を生産する工程を含む、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項１３】
以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、および
（ｅ）α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する酵素をコードする第５遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物とホルムアルデヒドとの存在下で培養して、ホモセリン、スレオニンおよび２−アミノ酪酸のうち少なくとも１つを生産する工程を含む、ホモセリン、スレオニンおよび２−アミノ酪酸のうち少なくとも１つの製造方法。
【請求項１４】
以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、
（ｅ）α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する酵素をコードする第５遺伝子、および
（ｆ）２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒する酵素をコードする第６遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、メチルメルカプタンと、
下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（７）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＳＣＨ3)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（上記一般式（７）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸を生産する工程を含む、２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸の製造方法。
【請求項１５】
前記一般式（１）及び（７）中、Ｒ１０１およびＲ１０２が、水素である請求項１４に記載の２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸の製造方法。
【請求項１６】
前記微生物が、好気性細菌である請求項１〜９および１２〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記好気性細菌が、コリネ型細菌である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
以下からなる群より選択される第１遺伝子：
（１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２）配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−４）配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−５）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（１−６）配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
を含むコリネ型細菌。
【請求項１９】
以下からなる群より選択される第２遺伝子：
（２−１）配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（２−２）配列番号２４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；および
以下からなる群より選択される第３遺伝子：
（３−１）配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（３−２）配列番号２６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
を更に含む請求項１８に記載のコリネ型細菌。
【請求項２０】
以下からなる群より選択される第４遺伝子：
（４−１）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（４−２）配列番号２８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
を更に含む請求項１８に記載のコリネ型細菌。
【請求項２１】
以下からなる群より選択される第５遺伝子：
（５−１）配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−２）配列番号３０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−３）配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−４）配列番号３２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−５）配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（５−６）配列番号３４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
を更に含む請求項１８に記載のコリネ型細菌。
【請求項２２】
以下からなる群より選択される第５遺伝子：
（５−１）配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−２）配列番号３０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−３）配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−４）配列番号３２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−５）配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（５−６）配列番号３４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；および
以下からなる群より選択される第６遺伝子：
（６−１）配列番号３６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（６−２）配列番号３６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
を更に含む請求項１８に記載のコリネ型細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機化合物の製造方法およびコリネ型細菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、地球温暖化の元凶と考えられている石油資源に代わり、再生可能資源である生物資源を原料として用いて化成品を生産することが強く望まれている。そのため、糖類などの生物由来原料から化成品を生産することを目的として、微生物およびその形質転換体を用いて、工業原料、燃料、飼料、食品添加物などに用いる化成品を生産するための研究が盛んに行われている。例えば、酵母や大腸菌の形質転換体を使用して、糖類からアルコールやアミノ酸などの有機化合物を製造することが報告されている（米国特許第9926577号、米国特許第8647847号を参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、有機化合物を製造する新規方法およびこの製造方法に利用できるコリネ型細菌を提供することを目的とする。
微生物を用いた化成品の生産は、その生産対象として微生物代謝物に限定されることが一般的である。また、微生物代謝物であっても、微生物代謝系中のエネルギー不足や酸化還元バランスの不均衡によって、生産が困難な微生物代謝物も多く存在する。このような課題を解決するための一つの有効なアプローチとして、形質転換体を作成することが挙げられる。しかし、本発明者らは、この手法のみによって課題解決しようとすると、対象化合物を生産できる菌体の開発に多くの時間がかかる場合があると考えている。一方、今後、微生物代謝物以外の多様な化合物も生物由来原料から生産することが求められてくると考えている。そこで本発明者らは、有用な物質の生産については微生物の形質転換体作成のみに依存しない、新規なプロセス開発を検討した。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らが鋭意検討した結果、特定の遺伝子を有する微生物をカルボニル化合物の存在下で培養することにより、アミノ酸などの有用物質合成の鍵となる中間体が得られる生産プロセスを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
本発明の第１側面によると、
ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、
下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（２）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＯＣＯＯＨ
（上記一般式（２）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表されるα−ケト酸を生産する工程を含む、α−ケト酸の製造方法が提供される。
【０００６】
本発明の第２側面によると、
以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、
（ｂ）α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素をコードする第２遺伝子、および
（ｃ）アルデヒドの還元反応を触媒する酵素をコードする第３遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、
下記一般式（３）：
Ｒ１０３Ｃ（Ｏ）Ｒ１０４
（ここでＲ１０３およびＲ１０４は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である。ただし、Ｒ１０３が水素であるとき、Ｒ１０４は水素ではない。）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（４）：
Ｒ１０３Ｃ（Ｒ１０４）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ
（上記一般式（４）におけるＲ１０３およびＲ１０４は、それぞれ上記一般式（３）におけるＲ１０３およびＲ１０４と同じ基である）
により表される１，３−ジオールを生産する工程を含む、１，３−ジオールの製造方法が提供される。
【０００７】
本発明の第３側面によると、
以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、
（ｂ）α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素をコードする第２遺伝子、および
（ｃ）アルデヒドの還元反応を触媒する酵素をコードする第３遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物の存在下で培養して、１，３−ブタンジオールを生産する工程を含む、１，３−ブタンジオールの製造方法が提供される。
【０００８】
本発明の第４側面によると、
以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、および
（ｄ）α−ケト酸の還元反応を触媒する酵素をコードする第４遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、
下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（５）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ
（上記一般式（５）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２，４−ジヒドロキシカルボン酸を生産する工程を含む、２，４−ジヒドロキシカルボン酸の製造方法が提供される。
【０００９】
本発明の第５側面によると、
下記一般式（２）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＯＣＯＯＨ
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるα−ケト酸と窒素源と還元剤とを、
グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼの存在下で反応させて、
下記一般式（６）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（上記一般式（６）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（２）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を生産する工程を含む、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の製造方法が提供される。
【００１０】
本発明の第６側面によると、
下記一般式（６）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表される２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸と酸化剤とを、
グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼの存在下で反応させて、
下記一般式（２）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＯＣＯＯＨ
（上記一般式（２）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（６）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表されるα−ケト酸を生産する工程を含む、α−ケト酸の製造方法が提供される。
【００１１】
本発明の第７側面によると、
以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、および
（ｅ）α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する酵素をコードする第５遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、
下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（６）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（上記一般式（６）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を生産する工程を含む、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の製造方法が提供される。
【００１２】
本発明の第８側面によると、
以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、および
（ｅ）α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する酵素をコードする第５遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物とホルムアルデヒドとの存在下で培養して、ホモセリン、スレオニンおよび２−アミノ酪酸のうち少なくとも１つを生産する工程を含む、ホモセリン、スレオニンおよび２−アミノ酪酸のうち少なくとも１つの製造方法が提供される。
【００１３】
本発明の第９側面によると、
以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、
（ｅ）α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する酵素をコードする第５遺伝子、および
（ｆ）２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒する酵素をコードする第６遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、メチルメルカプタンと、
下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（７）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＳＣＨ3)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（上記一般式（７）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸を生産する工程を含む、２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸の製造方法が提供される。
【００１４】
本発明の第１０側面によると、
以下からなる群より選択される第１遺伝子：
（１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２）配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−４）配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−５）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（１−６）配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
を含むコリネ型細菌が提供される。
【００１５】
本発明によると、有機化合物を製造する方法およびこの製造方法に利用できるコリネ型細菌が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】微生物が４−ヒドロキシ−２−オキソ酪酸を生産するプロセスを示す模式図。
【図２】微生物が１，３−ブタンジオールを生産するプロセスを示す模式図。
【図３】微生物が２，４−ジヒドロキシ酪酸を生産するプロセスを示す模式図。
【図４】微生物がホモセリンを生産するプロセスを示す模式図。
【図５】微生物がメチオニンを生産するプロセスを示す模式図。
【図６】ガスクロマトグラフ質量分析の結果を示す図。
【図７】ガスクロマトグラフ質量分析の結果を示す図。
【図８】ガスクロマトグラフ質量分析の結果を示す図。
【図９】ガスクロマトグラフ質量分析の結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の説明は、本発明を詳説することを目的とし、本発明を限定することを意図しない。
（１．）α−ケト酸の製造方法
α−ケト酸の製造方法は、
ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、
下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（２）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＯＣＯＯＨ
（上記一般式（２）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表されるα−ケト酸を生産する工程を含む。
【００１８】
以下の説明において、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする遺伝子（以下、第１遺伝子と呼ぶ）を含む上記微生物を、「α−ケト酸生産微生物」とも呼ぶ。α−ケト酸生産微生物は、第１遺伝子を生来的に有する微生物であってもよいし、宿主を第１遺伝子で形質転換することによって得られる微生物であってもよい。以下、α−ケト酸生産微生物が形質転換体である場合を例として説明する。
【００１９】
（１．１）形質転換体
（１．１．１）宿主
宿主としては、任意の微生物を使用することができる。宿主としては、例えば、酵母、細菌、より具体的には、好気性細菌、より具体的には、コリネ型細菌、大腸菌、またはビブリオ  ナトリエゲンス（Vibrio natriegens）を使用することができる。好ましくは、宿主はコリネ型細菌である。
【００２０】
コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bargeys Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。
【００２１】
コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム  エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム  アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム  ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム  アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）等が挙げられる。中でも、α−ケト酸の生産性が高い点で、コリネバクテリウム  グルタミカムが好ましい。好適な菌株として、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233（FERM BP-1497）、MJ-233AB-41（FERM BP-1498）等が挙げられる。中でも、ATCC13032株、ATCC13869株が好ましい。
【００２２】
なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウム  フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム  ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、コリネバクテリウム  リリウム（Corynebacterium lilium）等のコリネ型細菌もコリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に菌名が統一されている〔Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41:255-260. (1991)、駒形和男ら, コリネフォルム細菌の分類, 発酵と工業, 45:944-963 (1987)〕。
【００２３】
旧分類のブレビバクテリウム  ラクトファーメンタムATCC13869株、ブレビバクテリウム  フラバムのMJ-233株（FERM BP-1497）、MJ-233AB-41株（FERM BP-1498）なども好適なコリネバクテリウム  グルタミカムである。
【００２４】
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム  アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）（例えばATCC6872株）等が挙げられる。
【００２５】
アースロバクター属菌としては、アースロバクター  グロビフォルミス（Arthrobacterglobiformis）（例えばATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株）等が挙げられる。
【００２６】
マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム  ボビス（Mycobacterium bovis）（例えばATCC19210株、ATCC27289株）等が挙げられる。
【００２７】
マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス  フロイデンライヒ（Micrococcusfreudenreichii）（例えばNo. 239株（FERM P-13221））、マイクロコッカス  ルテウス（Micrococcus leuteus）(例えばNo. 240株（FERM P-13222）)、マイクロコッカス  ウレアエ（Micrococcus ureae）（例えばIAM1010株）、マイクロコッカス  ロゼウス（Micrococcus roseus）（例えばIFO3764株）等が挙げられる。
【００２８】
次に、宿主に導入される第１遺伝子について説明する。
【００２９】
（１．１．２）第１遺伝子
第１遺伝子は、「ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素」をコードする。「ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素」とは、後述の測定方法に従って、酵素反応液として、精製タンパク質、ピルビン酸（初期基質濃度  1mM）およびカルボニル化合物（初期基質濃度  1mM）を含む酵素反応液を使用して測定した場合に、１０mU/ｍｇ protein以上の活性を有する酵素をいう。「ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素」におけるカルボニル化合物は、例えば、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、バレルアルデヒドまたはアセトンである。ブチルアルデヒドは、具体的には、ノルマルブチルアルデヒドまたはイソブチルアルデヒドである。バレルアルデヒドは、具体的には、ノルマルバレルアルデヒドである。「ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素」は、例えば、アルドラーゼである。
【００３０】
第１遺伝子は、以下に例示するアルドラーゼをコードする遺伝子であってもよい。
【００３１】
（ａ１）２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホグルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolase、ＥＣ番号：４．１．２．１４）、
（ａ２）２−デヒドロ−３−デオキシ−６−ホスホグルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase、ＥＣ番号４．１．２．５５）、
（ａ３）４−ヒドロキシ−２−オキソグルタレートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase、ＥＣ番号：４．１．３．１６）、
（ａ４）（４Ｓ）−４−ヒドロキシル−２−オキソグルタレートアルドラーゼ（(4S)-4-hydroxyl-2-oxoglutarate aldolase、ＥＣ番号４．１．３．４２）、
（ａ５）２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−ペントネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase、ＥＣ番号４．１．２．２８）、
（ａ６）２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-D-gluconate aldolase、ＥＣ番号４．１．２．５１）、
（ａ７）３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソネートアルドラーゼ（3-deoxy-D-manno-octulosonate aldolase、ＥＣ番号４．１．２．２３）、
（ａ８）４−ヒドロキシル−２−オキソバレレートアルドラーゼ（4-hydroxyl-2-oxovalerate aldolase、ＥＣ番号４．１．３．３９）、
（ａ９）４−（２−カルボキシフェニル）−２−オキソブ−３−エノエートアルドラーゼ（4-(2-carboxyphenyl)-2-oxobut-3-enoate aldolase、ＥＣ番号４．１．２．３４）、
（ａ１０）４−ヒドロキシ−２−オキソヘプタンジオエートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxoheptanedioate aldolase、ＥＣ番号４．１．２．５２）、
（ａ１１）２−デヒドロ−３−デオキシグルカレートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxyglucarate aldolase、ＥＣ番号４．１．２．２０）、
（ａ１２）２−ケト−３−デオキシ−Ｌ−ラムノネートアルドラーゼ（2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase、ＥＣ番号４．１．２．５３）、
（ａ１３）４−ヒドロキシル−４−メチル−２−オキソグルタレートアルドラーゼ（4-hydroxyl-4-methyl-2-oxoglutarate aldolase、ＥＣ番号４．１．３．１７）、および
（ａ１４）４−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノネートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxohexanonate aldolase、ＥＣ番号４．１．３．４３）。
【００３２】
（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）および（ａ４）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｅｄａタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｅｄａタンパク質は、大腸菌由来である。  
（ａ２）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｄｇｏＡタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｄｇｏＡタンパク質は、大腸菌由来である。  
（ａ５）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｙｊｈＨタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｙｊｈＨタンパク質は、大腸菌由来である。  
（ａ６）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｙａｇＥタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｙａｇＥタンパク質は、大腸菌由来である。  
（ａ７）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｎａｎＡタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｎａｎＡタンパク質は、大腸菌由来である。  
（ａ８）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｍｈｐＥタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｍｈｐＥタンパク質は、大腸菌由来である。なお、第１遺伝子がｍｈｐＥ遺伝子である場合、ｍｈｐＥ遺伝子は、ｍｈｐＦ遺伝子と連結した状態で宿主に導入されてもよい。  
（ａ８）および（ａ１０）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｈｐａＩタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｈｐａＩタンパク質は大腸菌由来である。  
（ａ８）および（ａ１４）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｂｐｈＩタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｂｐｈＩタンパク質は、バークホルデリア  ゼノボランス（Burkholderia xenovorans）由来である。なお、第１遺伝子がｂｐｈＩ遺伝子である場合、ｂｐｈＩ遺伝子は、ｂｐｈＪ遺伝子と連結した状態で宿主に導入されてもよい。  
（ａ９）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｐｈｄＪタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｐｈｄＪタンパク質は、ノカルディオイデス属菌（Nocardioides sp.）由来である。  
（ａ１１）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｇａｒＬタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｇａｒＬタンパク質は、大腸菌由来である。
（ａ１２）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｒｈｍＡタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｒｈｍＡタンパク質は、大腸菌由来である。
（ａ１３）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｇａｌＣタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｇａｌＣタンパク質は、シュードモナス  プチダ（Pseudomonas putida）由来である。
【００３３】
第１遺伝子は、クラスＩのアルドラーゼをコードしてもよく、クラスＩＩのアルドラーゼをコードしてもよい。
【００３４】
クラスＩのアルドラーゼとして、例えば、ｅｄａタンパク質、ｙｊｈＨタンパク質、ｙａｇＥタンパク質、ｄｇｏＡタンパク質、ｎａｎＡタンパク質、ｍｐｈＥタンパク質およびｐｈｄＪタンパク質が挙げられる。
【００３５】
クラスＩＩのアルドラーゼとして、例えば、ｈｐａＩタンパク質、ｇａｒＬタンパク質、ｒｈｍＡタンパク質、ｇａｌＣタンパク質およびｂｐｈＩタンパク質が挙げられる。
【００３６】
好ましくは、第１遺伝子は以下からなる群より選択される：
（１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、大腸菌由来のｈｐａＩタンパク質）であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２）配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、大腸菌由来のｒｈｍＡタンパク質）であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−４）配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−５）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、大腸菌由来のｎａｎＡタンパク質）であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−６）配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−７）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、大腸菌由来のｅｄａタンパク質）であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−８）配列番号８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−９）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、大腸菌由来のｙｊｈＨタンパク質）であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１０）配列番号１０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、大腸菌由来のｄｇｏＡタンパク質）であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１２）配列番号１２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１３）配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、大腸菌由来のｍｈｐＥタンパク質）であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１４）配列番号１４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１５）配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、大腸菌由来のｇａｒＬタンパク質）であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１６）配列番号１６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１７）配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、シュードモナス  プチダ由来のｇａｌＣタンパク質）であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１８）配列番号１８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１９）配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、ノカルディオイデス属菌由来のｐｈｄＪタンパク質）であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２０）配列番号２０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２１）配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、バークホルデリア  ゼノボランス由来のｂｐｈＩタンパク質）であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（１−２２）配列番号２２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００３７】
本明細書において「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加された」という表現における「１又は数個」は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、好ましくは１〜６０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個を意味する。
【００３８】
上記の１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは付加は、例えば、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、アミノ酸の欠失、置換、若しくは付加には、遺伝子が由来する細菌の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００３９】
「配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
【００４０】
「配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
【００４１】
「配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
【００４２】
「配列番号８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
【００４３】
「配列番号１０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
【００４４】
「配列番号１２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号１２に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
【００４５】
「配列番号１４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号１４に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
【００４６】
「配列番号１６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号１６に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
【００４７】
「配列番号１８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号１８に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
【００４８】
「配列番号２０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号２０に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
【００４９】
「配列番号２２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号２２に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
【００５０】
大腸菌由来のｈｐａＩタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔＫＢ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒは、例えばＱ４７０９８であり、大腸菌由来のｒｈｍＡタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔＫＢ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒは、例えばＰ７６４６９であり、大腸菌由来のｎａｎＡタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔＫＢ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒは、例えばＰ０Ａ６Ｌ４であり、大腸菌由来のｅｄａタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔＫＢ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒは、例えばP0A955であり、大腸菌由来のｙｊｈＨタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔＫＢ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒは、例えばP39359であり、大腸菌由来のｄｇｏＡタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔＫＢ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒは、例えばQ6BF16であり、大腸菌由来のｍｈｐＥタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔＫＢ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒは、例えばP51020であり、大腸菌由来のｇａｒＬタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔＫＢ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒは、例えばP23522であり、シュードモナス  プチダ由来のｇａｌＣタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔＫＢ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒは、例えばQ88JX9であり、ノカルディオイデス属菌由来のｐｈｄＪタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔＫＢ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒは、例えばQ79EM8であり、バークホルデリア  ゼノボランス由来のｂｐｈＩタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔＫＢ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒは、例えばP51015である。
【００５１】
より好ましくは、第１遺伝子は、
配列番号１に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のｈｐａＩ遺伝子、
配列番号３に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のｒｈｍＡ遺伝子、
配列番号５に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のｎａｎＡ遺伝子、
配列番号７に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のｅｄａ遺伝子、
配列番号９に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のｙｊｈＨ遺伝子、
配列番号１１に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のｄｇｏＡ遺伝子、
配列番号１３に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のｍｈｐＥ遺伝子、
配列番号１５に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のｇａｒＬ遺伝子、
配列番号１７に記載の塩基配列からなる、シュードモナス  プチダ由来由来のｇａｌＣ遺伝子、
配列番号１９に記載の塩基配列からなる、ノカルディオイデス属菌由来のｐｈｄＪ遺伝子、または
配列番号２１に記載の塩基配列からなる、バークホルデリア  ゼノボランス由来のｂｐｈＩ遺伝子である。
【００５２】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１に記載の塩基配列と配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および２２に記載のアミノ酸配列は、以下の通りである。
【００５３】
【表１】
2020182449.tif 000003
【００５４】
【表２】
2020182449.tif 000004
【００５５】
【表３】
2020182449.tif 000005
【００５６】
【表４】
2020182449.tif 000006
【００５７】
【表５】
2020182449.tif 000007
【００５８】
【表６】
2020182449.tif 000008
【００５９】
【表７】
2020182449.tif 000009
【００６０】
【表８】
2020182449.tif 000010
【００６１】
【表９】
2020182449.tif 000011
【００６２】
【表１０】
2020182449.tif 000012
【００６３】
【表１１】
2020182449.tif 000013
【００６４】
【表１２】
2020182449.tif 000014
【００６５】
【表１３】
2020182449.tif 000015
【００６６】
【表１４】
2020182449.tif 000016
【００６７】
【表１５】
2020182449.tif 000017
【００６８】
【表１６】
2020182449.tif 000018
【００６９】
【表１７】
2020182449.tif 000019
【００７０】
【表１８】
2020182449.tif 000020
【００７１】
【表１９】
2020182449.tif 000021
【００７２】
【表２０】
2020182449.tif 000022
【００７３】
【表２１】
2020182449.tif 000023
【００７４】
【表２２】
2020182449.tif 000024
【００７５】
アミノ酸配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol.,183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。gapped alignmentを得るために、Altschulら(1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)に記載されるようにGapped BLASTを利用することができる。あるいは、PSI-BlastまたはPHI-Blastを用いて、分子間の位置関係（Id.）および共通パターンを共有する分子間の関係を検出する繰返し検索を行うことができる。BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast、およびPHI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい。
【００７６】
ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性は、例えば、当該酵素反応を２ｍＭの塩化マグネシウムを含有する１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ８．０）中で２５℃にて行い、原料のピルビン酸とカルボニル化合物から生成するアルドール化合物の初期生成速度を測定することで算出できる。アルドール化合物の生成速度は、例えば、アルドール化合物自体の濃度の時間変化から算出できる。アルドール化合物の濃度の測定は、例えば、酵素反応液と１３０ｍＭのＯ−ベンジルヒドロキシアミン塩酸塩溶液（ピリジン：メタノール：水＝３３：１５：２）の溶液を１：５で混和することで反応を止め、その際アルドール化合物から生成するＯ−ベンジルオキシム誘導体を高速液体クロマトグラフィーを用いて検出し、濃度が既知の標品と比較することで可能である。ここでは、２５℃で１分間に１μｍｏｌのアルドール化合物が形成される活性を１ユニットとする。
【００７７】
「配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（以下、ｈｐａＩ遺伝子変異体という）」は、例えば、配列番号２の塩基配列に基づく情報に従い設計したプライマーまたはプローブを用いたＰＣＲまたはハイブリダイゼーションにより、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。このように選択した遺伝子は、高確率でピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードしている。
【００７８】
「配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｒｈｍＡ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
【００７９】
「配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｎａｎＡ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
【００８０】
「配列番号８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｅｄａ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
【００８１】
「配列番号１０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｙｊｈＨ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
【００８２】
「配列番号１２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｄｇｏＡ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
【００８３】
「配列番号１４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｍｈｐＥ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
【００８４】
「配列番号１６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｇａｒＬ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
【００８５】
「配列番号１８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｇａｌＣ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
【００８６】
「配列番号２０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｐｈｄＪ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
【００８７】
「配列番号２２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｂｐｈＩ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
【００８８】
（１．１．３）形質転換のための組換えベクターの構築
第１遺伝子は、形質転換のために適切なプラスミドベクターに組み込むことができる。
【００８９】
プラスミドベクターとしては、宿主に応じて、公知のプラスミドベクターを使用することができる。プラスミドベクターとしては、宿主内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであってもよいし、宿主の染色体への組み込みに必要な塩基配列を含むものであってもよい。
得られた組換えベクターを用いて形質転換体を作製することができる。
【００９０】
（１．１．４）形質転換
形質転換方法は、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法として、例えば塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、電気パルス法などが挙げられる。
【００９１】
得られた形質転換体は、形質転換後速やかに、形質転換体の培養に通常使用される培地を用いて培養してもよい。
培養温度は、形質転換体の増殖に適した温度であれば、任意の温度であってもよい。培地のｐＨは、形質転換体の増殖に適したｐＨであれば、任意のｐＨであってもよい。培地のｐＨの調整は、公知の方法によって行うことができる。培養時間は、形質転換体が増殖するのに十分な時間であれば、任意の時間であってもよい。
【００９２】
なお、上述のとおりに組換えベクターを用いて形質転換体を作製した場合、第１遺伝子のは、宿主の染色体に組み込まれてもよいし、あるいは、組換えベクターの形態で宿主の細胞質内に存在していてもよい。
【００９３】
（１．１．５）宿主染色体遺伝子の破壊または欠失
宿主は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。宿主がコリネ型細菌である場合、宿主は、野生株のコリネ型細菌が本来有する下記遺伝子の少なくとも一つを破壊または欠失させることにより得られた遺伝子破壊株または遺伝子欠失株であってもよい：ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase、例えばｌｄｈＡ）遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyrvate carboxylase、例えばｐｐｃ）遺伝子、ピルビン酸カルボキシラーゼ（pyruvate carboxylase、例えばｐｙｃ）遺伝子、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（pyruvate dehydrogenase、 例えばｐｏｘＢ）遺伝子、グルタミン酸−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（glutamate-pyruvate aminotransferase、例えばａｌａＡ）遺伝子、アセトラクテートシンターゼ（acetolactate synthase、例えばｉｌｖＢ）遺伝子、Ｎ−スクシニルジアミノピメレート（N-succinyldiaminopimelate aminotransferase、例えばｃｇ０９３１）遺伝子、S-(ヒドロキシメチル)ミコチオールデヒドロゲナーゼ（S-(hydroxymethyl)mycothiol dehydrogenase、例えばａｄｈＥ）遺伝子、およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（acetaldehyde dehydrogenase、例えばａｌｄ）遺伝子。このような遺伝子破壊株または遺伝子欠失株を宿主として用いることにより、α−ケト酸の生産性を向上させたり、副生成物の生成を抑制したりすることができる。
【００９４】
遺伝子破壊株または遺伝子欠損株の構築は、公知の方法によって行うことができる。
【００９５】
（１．１．６）α−ケト酸生産微生物の具体例
具体的には、α−ケト酸生産微生物としては、
以下からなる群より選択される第１遺伝子：
（１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２）配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−４）配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−５）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（１−６）配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
を含むコリネ型細菌を使用することができる。
【００９６】
（１．２）培養工程
α−ケト酸生産微生物（例えば、上述した形質転換体）を、ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物の存在下で培養して、α−ケト酸を生産することができる。「ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物の存在下で培養すること」は、ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を含む培養液中で培養することにより行うことができる。好ましくは、「ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物の存在下で培養すること」は、ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を添加した培養液中で培養することにより行うことができる。
【００９７】
ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物の存在下での培養に先立ち、上述した形質転換体を好気的条件下で培養して増殖させることが好ましい。この好気的条件下での培養を、以下増殖培養と呼び、ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物の存在下での培養を、以下生産培養と呼ぶ。具体的には、例えば、好気的条件下での培養とは、培養期間中に酸素が形質転換体の増殖に十分な量で培養液に供給されている条件下で培養することである。好気的条件下での培養は、公知の方法によって行うことができる。好気的条件下での培養は、例えば、通気、攪拌、振とう、またはこれらの組み合わせにより、培養液に酸素を供給することで実現できる。より具体的には、好気的条件下での培養は、振とう培養、深部通気撹拌培養によって実現できる。
【００９８】
生産培養に先立って増殖培養を行う場合、増殖培養とその後の生産培養は、例えば、以下のとおり行うことができる。増殖培養の後、先ず、増殖培養で使用した培養液（以下、増殖用培養液と呼ぶ）と増殖用培養液中に懸濁された形質転換体とを含む容器を遠心分離機にかけて、形質転換体を沈殿させることができる。その後、増殖用培養液を容器から除去し、分離された形質転換体を、生産培養で使用する培養液（以下、生産用培養液と呼ぶ）に懸濁し、生産培養を行うことができる。
【００９９】
あるいは、増殖培養とその後の生産培養は、増殖培養の後、形質転換体を含有する増殖用培養液にピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を添加し、好気的条件を嫌気的条件または微好気的条件に変更することにより、培養液の交換を行うことなく生産培養を行うことができる。このように、増殖培養と生産培養とを連続的に行うこともできる。
【０１００】
本明細書において、「培養」の用語は、形質転換体を、形質転換体の生育に適した特定の管理された条件の下で維持することを意味する。培養期間中に、形質転換体は増殖してもよいし、増殖しなくてもよい。したがって、「培養」の用語は、「インキュベーション」と言い換えることもできる。
【０１０１】
（１．２．１）増殖用培養液
増殖用培養液は、形質転換体の培養に通常使用される培地、例えば、炭素源、窒素源および無機塩類等を含有する公知の培地を用いることができる。
増殖培養における培養温度は、形質転換体の増殖に適した温度であれば、任意の温度であってもよい。増殖用培養液のｐＨは、形質転換体の増殖に適したｐＨであれば、任意のｐＨであってもよい。増殖用培養液のｐＨの調整は、公知の方法によって行うことができる。増殖培養における培養時間は、形質転換体が増殖するのに十分な時間であれば、任意の時間であってもよい。
【０１０２】
（１．２．２）生産用培養液
生産用培養液としては、ピルビン酸供給化合物、カルボニル化合物、及びその他必要な成分を含有する培養液を用いることができる。その他必要な成分として、例えば、無機塩類、糖類以外の炭素源、又は窒素源を用いることができる。本明細書に記載される、培養液中の各成分の濃度は、各成分が添加された時点における培養液中の最終濃度を指す。
【０１０３】
ピルビン酸供給化合物としては、ピルビン酸および糖類から選ばれる化合物を使用することができる。ピルビン酸供給化合物は、ピルビン酸それ自体であってもよいし、微生物の生体内でピルビン酸に変換される糖類であってもよい。ピルビン酸供給化合物としては、ピルビン酸、糖類、またはこれらの組み合わせを使用することができる。
【０１０４】
糖類としては、形質転換体が、生体内に取り込むことができ、かつピルビン酸へと変換することができる糖類であれば任意の糖類を使用することができる。具体的には、糖類としては、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖；澱粉のような多糖；糖蜜等が挙げられる。中でも、単糖が好ましく、フルクトースおよびグルコースがより好ましい。また、構成単糖としてグルコースを含む糖類、具体的には、スクロース等の二糖、構成単糖としてグルコースを含むオリゴ糖、構成単糖としてグルコースを含む多糖も好ましい。糖類は、１種を使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。また、糖類は、稲わら、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物や、スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物を糖化酵素などで糖化することにより得られた糖化液（これは、グルコースや、キシロース等の複数の糖類を含む）の形で添加することもできる。
【０１０５】
生産用培養液におけるピルビン酸供給化合物の濃度は、α−ケト酸の生産を阻害しない範囲で可能な限り高くすることができる。生産用培養液におけるピルビン酸供給化合物の濃度は、０．１〜４０（ｗ／ｖ）％の範囲内にあることが好ましく、１〜２０（ｗ／ｖ）％の範囲内にあることがより好ましい。また、α−ケト酸の生産に伴うピルビン酸供給化合物の減少に応じて、ピルビン酸供給化合物の追加添加を行うことができる。
【０１０６】
カルボニル化合物としては、下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物を使用することができる。
一例によれば、カルボニル化合物としては、上記一般式（１）において、Ｒ１０１は水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基であり、かつ、Ｒ１０２は水素であるカルボニル化合物を使用することができる。
別の例によると、カルボニル化合物は、上記一般式（１）において、Ｒ１０１はメチル基であり、かつ、Ｒ１０２は１〜５個の炭素原子を有するアルキル基であるカルボニル化合物を使用することができる。
【０１０７】
具体的には、カルボニル化合物としては、上記一般式（１）中、
Ｒ１０１が水素であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物（すなわち、ホルムアルデヒド）；
Ｒ１０１がメチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物（すなわち、アセトアルデヒド）；
Ｒ１０１がエチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物（すなわち、プロピオンアルデヒド）；
Ｒ１０１がプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物（すなわち、ブチルアルデヒド）、具体的には、Ｒ１０１がノルマルプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物（すなわち、ノルマルブチルアルデヒド）、または、Ｒ１０１がイソプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物（すなわち、イソブチルアルデヒド）；または
Ｒ１０１がペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物（すなわち、バレルアルデヒド）、具体的には、Ｒ１０１がノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物（すなわち、ノルマルバレルアルデヒド）；
を使用することができる。
また、カルボニル化合物としては、上記一般式（１）中、Ｒ１０１およびＲ１０２がいずれもメチル基であるカルボニル化合物（すなわち、アセトン）を使用することもできる。
カルボニル化合物は、１種を使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。
【０１０８】
生産用培養液におけるカルボニル化合物の濃度は、０．００１〜１０（ｗ／ｖ）％の範囲内にあることが好ましく、０．０１〜１（ｗ／ｖ）％の範囲内にあることがより好ましい。また、α−ケト酸の生産に伴うカルボニル化合物の減少に応じて、カルボニル化合物の追加添加を行うことができる。
【０１０９】
なお、１種類のカルボニル化合物を生産用培養液中に使用した場合、後述する「（１．２．４）α−ケト酸の回収」の欄に記載した分離精製を容易に行うことが可能である。
【０１１０】
さらに、必要に応じて、無機塩類を添加することもできる。無機塩類としては、リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩を用いることができる。具体的には、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等を用いることができる。無機塩は、１種を使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。生産用培養液中の無機塩類の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（ｗ／ｖ）％とすることができる。
【０１１１】
さらに、必要に応じて、糖類以外の炭素源を添加することもできる。糖類以外の炭素源としては、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；ノルマルパラフィンのような炭化水素等を用いることができる。
【０１１２】
さらに、必要に応じて、窒素源を添加することもできる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機のアンモニウム塩；尿素；アンモニア水；硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩等を使用できる。また、コーンスティープリカー；肉エキス；酵母エキス；大豆加水分解物；ペプトン、NZ−アミンまたはカゼイン分解物等の蛋白質加水分解物；アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。生産用培養液中の窒素源の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ）％とすることができる。
【０１１３】
さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
【０１１４】
具体的な生産用培養液としては、グルコース、ホルムアルデヒド、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄（ＩＩ）および硫酸マンガン（ＩＩ）を含み、６．０のｐＨを有する培地を用いることができる。
【０１１５】
具体的な生産用培養液としては、ピルビン酸、ホルムアルデヒド、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸マンガン（ＩＩ）および４−モルホリノプロパンスルホン酸を含む培地も用いることができる。
【０１１６】
また、生産用培養液としては、増殖培養で用いた増殖用培養液と同じ組成のベース培養液に、ピルビン酸供給化合物とカルボニル化合物とを添加して得られる培養液を用いることもできる。なお、上述のベース培養液中に十分な量でピルビン酸供給化合物が存在する場合、ピルビン酸供給化合物を添加しなくてもよい。
【０１１７】
（１．２．３）生産培養の条件
生産培養における培養温度は、α−ケト酸の生産に適した温度であれば、任意の温度であってもよい。生産培養における培養温度は、約２０〜５０℃が好ましく、約２５〜４７℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良くα−ケト酸を製造できる。生産用培養液のｐＨは、α−ケト酸の生産に適したｐＨであれば、任意のｐＨであってもよい。生産用培養液のｐＨは、約６〜８の範囲内に維持することが好ましい。生産用培養液のｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸；水酸化カリウム水溶液等のアルカリ溶液；尿素；炭酸カルシウム；アンモニア；４−モルホリノプロパンスルホン酸等を含むｐＨ緩衝液等を用いて行うことができる。生産培養中も必要に応じて生産用培養液のｐＨは、適宜調整することができる。生産培養における培養時間は、形質転換体がα−ケト酸を生産するのに十分な時間であれば、任意の時間であってもよい。生産培養における培養時間は、約３時間〜７日間が好ましく、約１〜３日間がより好ましい。
生産培養は、好気的条件の下で行われてもよく、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われてもよい。これは、上述した形質転換体が、好気的条件の下でも嫌気的条件または微好気的条件の下でも働く、α−ケト酸を生産する経路を有しているためである。α−ケト酸を生産する経路は、後述の「（１．３）作用および効果」の欄で述べる。
【０１１８】
＜嫌気的条件または微好気的条件＞
生産培養は、好ましくは、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われる。
【０１１９】
形質転換体を嫌気的条件下または微好気的条件下で培養すると、形質転換体は実質的に増殖せず、一層効率的にα−ケト酸を生産することができる。
【０１２０】
「嫌気的条件または微好気的条件」は、例えば、生産用培養液中の溶存酸素濃度が０〜２ｐｐｍの範囲内にある条件を指す。「嫌気的条件または微好気的条件」は、好ましくは、生産用培養液中の溶存酸素濃度が０〜１ｐｐｍの範囲内にある条件を指し、より好ましくは、生産用培養液中の溶存酸素濃度が０〜０．５ｐｐｍの範囲内にある条件を指す。培養液中の溶存酸素濃度は、例えば、溶存酸素計を用いて測定することができる。
【０１２１】
「嫌気的条件」は、厳密にいうと、溶存酸素、および、硝酸などの酸化物といった電子受容体が存在しない条件を指す技術用語である。一方、生産培養の好ましい条件としては、これら電子受容体が十分でない、もしくはその電子受容体の性質上、形質転換体が増殖せず、その分供給される炭素源がα−ケト酸の生産に利用され、その生産効率を高めることができれば、上記の厳密な条件を採用する必要はない。すなわち、生産培養の好ましい条件としては、形質転換体の増殖を抑制し、α−ケト酸の生産効率を高めることができれば、生産用培養液中に、溶存酸素、および、硝酸などの酸化物といった電子受容体が存在していてもよい。したがって、本明細書で使用される「嫌気的条件または微好気的条件」という表現は、このような状態も含む。
【０１２２】
嫌気的条件および微好気的条件は、例えば、酸素を含む気体を通気しないことによって、気液の界面から供給される酸素が形質転換体の増殖には不十分となり、実現することができる。または、生産用培養液中に不活性ガス、具体的には窒素ガスを通気することにより実現することができる。または、生産培養に用いられる容器を密閉することにより実現することができる。
【０１２３】
＜高密度条件＞
生産培養は、好ましくは、形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる。このような状態で形質転換体を培養すると、一層効率的にα−ケト酸を生産することができる。
【０１２４】
「形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態」は、例えば、形質転換体を生産用培養液中に、形質転換体の湿菌体重量％が１〜５０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態を指す。「形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態」は、好ましくは、形質転換体を生産用培養液中に、形質転換体の湿菌体重量％が３〜３０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態を指す。
【０１２５】
生産培養は、嫌気的条件または微好気的条件の下で、形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われることがより好ましい。
【０１２６】
（１．２．４）α−ケト酸の回収
上述のとおり、第１遺伝子を含む形質転換体を生産用培養液中で培養すると、生産用培養液中にα−ケト酸が生産される。
【０１２７】
具体的には、生産用培養液中に下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物を使用した場合、下記一般式（２）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＯＣＯＯＨ
（上記一般式（２）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表されるα−ケト酸を生産することができる。
【０１２８】
より具体的には、上記一般式（１）中、Ｒ１０１が水素であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（２）中、Ｒ１０１が水素であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソ酪酸）を生産することができる。
上記一般式（１）中、Ｒ１０１がメチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（２）中、Ｒ１０１がメチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸）を生産することができる。
上記一般式（１）中、Ｒ１０１がエチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（２）中、Ｒ１０１がエチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソカプロン酸）を生産することができる。
上記一般式（１）中、Ｒ１０１がプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（２）中、Ｒ１０１がプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソエナント酸）を生産することができる。具体的には、上記一般式（１）中、Ｒ１０１がノルマルプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（２）中、Ｒ１０１がノルマルプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソノルマルヘプタン酸）を生産することができる。また、具体的には、上記一般式（１）中、Ｒ１０１がイソプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（２）中、Ｒ１０１がイソプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソイソエナント酸）を生産することができる。
上記一般式（１）中、Ｒ１０１がペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（２）中、Ｒ１０１がペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソカプリル酸）を生産することができる。具体的には、上記一般式（１）中、Ｒ１０１がノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（２）中、Ｒ１０１がノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソノルマルカプリル酸）を生産することができる。
上記一般式（１）中、Ｒ１０１およびＲ１０２がいずれもメチル基であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（２）中、Ｒ１０１およびＲ１０２がいずれもメチル基であるα−ケト酸（すなわち、４−メチル−４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸）を生産することができる。
【０１２９】
生産用培養液を回収することにより上記のα−ケト酸を回収できるが、さらに、公知の方法でα−ケト酸を生産用培養液から分離精製することもできる。そのような公知の方法として、晶析法、クロマトグラフィー法、イオン交換樹脂法、活性炭吸着溶離法、溶媒抽出法等が挙げられる。
【０１３０】
また、複数種類のカルボニル化合物を使用した場合、培養液中に複数種類のα−ケト酸が生産される。複数種類のα−ケト酸は、晶析やクロマトグラフィーによって、互いに分離することができる。
【０１３１】
（１．３）作用および効果
α−ケト酸生産微生物がα−ケト酸を生産するプロセスを模式的に図１に示す。図１に示すプロセスにおいては、ピルビン酸供給化合物がグルコースであり、カルボニル化合物がホルムアルデヒドであり、α−ケト酸が４−ヒドロキシ−２−オキソ酪酸である場合を例として説明する。
【０１３２】
図１に示すように、先ず、α−ケト酸生産微生物１は、グルコース２及びホルムアルデヒド３を取り込む。次に、グルコース２は、解糖系を通じてピルビン酸４に変換される。次に、ピルビン酸４とホルムアルデヒド３とは、第１遺伝子がコードする「ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素」によって４−ヒドロキシ−２−オキソ酪酸５に変換される。以上のようにして、４−ヒドロキシ−２−オキソ酪酸が生産される。
【０１３３】
図１では、カルボニル化合物としてアルデヒドを使用した場合について説明したが、カルボニル化合物としてケトンを使用した場合であっても、「ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素」によってケトンとピルビン酸とをα−ケト酸に変換する反応は進行する。これは、アルデヒドとケトンとがいずれも同一種類の化合物（すなわち、カルボニル化合物）に属するため、酵素反応などの有機化学反応において、アルデヒドとケトンとはいずれも同一の反応の基質となりうるからである。
【０１３４】
上記で説明した製法は、上述のとおり、特定の遺伝子を有する微生物をカルボニル化合物の存在下で培養することにより、アミノ酸などの有用物質合成の鍵となる中間体が得られる生産プロセスを見出し、完成させたものである。一般的に、カルボニル化合物は微生物の生育にとって有害であるので、これが存在する下で有用な化合物が得られたことは驚きであった。また、この際に、該カルボニル化合物が微生物代謝系に取り込まれるため、通常の微生物代謝系では生産されない中間体が得られたことは、多様な化合物を生物由来原料から作るという将来的なニーズを満たす手法として期待できる。実際、本明細書に後述する通り、この中間体を経て様々な有用物質の生産へと展開できたことは、本発明技術により多様な化合物を生産できることの可能性の一部を示している。
【０１３５】
（２．）１，３−ジオールの製造方法
１，３−ジオールの製造方法は、
以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、
（ｂ）α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素をコードする第２遺伝子、および
（ｃ）アルデヒドの還元反応を触媒する酵素をコードする第３遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、
下記一般式（３）：
Ｒ１０３Ｃ（Ｏ）Ｒ１０４
（ここでＲ１０３およびＲ１０４は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である。ただし、Ｒ１０３が水素であるとき、Ｒ１０４は水素ではない。）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（４）：
Ｒ１０３Ｃ（Ｒ１０４）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ
（上記一般式（４）におけるＲ１０３およびＲ１０４は、それぞれ上記一般式（３）におけるＲ１０３およびＲ１０４と同じ基である）
により表される１，３−ジオールを生産する工程を含む。
【０１３６】
以下の説明において、第１、第２および第３遺伝子を含む上記微生物を、「１，３−ジオール生産微生物」とも呼ぶ。１，３−ジオール生産微生物は、第１、第２および第３遺伝子を生来的に有する微生物であってもよいし、宿主を第１、第２および第３遺伝子で形質転換することによって得られる微生物であってもよい。以下、１，３−ジオール生産微生物が形質転換体である場合を例として説明する。
【０１３７】
（２．１）形質転換体
（２．１．１）宿主
宿主としては、「（１．１．１）宿主」の欄に記載した宿主と同様の宿主を使用することができる。
次に、宿主に導入される第１、第２および第３遺伝子について説明する。
【０１３８】
（２．１．２）第１遺伝子
第１遺伝子としては、「（１．１．２）第１遺伝子」の欄に記載した第１遺伝子と同様の遺伝子を使用することができる。。
【０１３９】
（２．１．３）第２遺伝子
第２遺伝子は、「α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素」をコードする。「α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素」とは、後述の測定方法に従って、酵素反応液として、精製タンパク質およびα−ケト酸（初期基質濃度  1mM）を含む酵素反応液を使用して測定した場合に、１mU/ｍｇ protein以上の活性を有する酵素をいう。第２遺伝子は、例えば、第１遺伝子がコードするタンパク質が触媒するアルドール反応により得られたα−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素をコードする。「α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素」におけるα−ケト酸は、例えば、「（１．）α−ケト酸の製造方法」の欄に記載した、一般式（２）により表されるα−ケト酸である。「α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素」は、例えば、脱炭酸酵素である。
【０１４０】
第２遺伝子は、以下に例示する脱炭酸酵素をコードする遺伝子であってもよい。
【０１４１】
（ｂ１）ピルベートデカルボキシラーゼ（pyruvate decarboxylase、ＥＣ番号４．１．１．１）、
（ｂ２）ベンゾイルフォルメートデカルボキシラーゼ（benzoylformate decarboxylase、ＥＣ番号４．１．１．７）、および
（ｂ３）インドールピルベートデカルボキシラーゼ（indolepyruvate decarboxylase、ＥＣ番号４．１．１．７４）。
【０１４２】
（ｂ１）に含まれる脱炭酸酵素としては、例えば、ｐｄｃタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｐｄｃタンパク質は、ザイモモナス  モビリス（Zymomonas mobilis）由来である。  
（ｂ２）に含まれる脱炭酸酵素としては、例えば、ｍｄｌＣタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｍｄｌＣタンパク質は、シュードモナス  プチダ（Pseudomonas putida）由来である。  
（ｂ３）に含まれる脱炭酸酵素としては、例えば、ｋｉｖＤタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｋｉｖＤタンパク質は、ラクトコッカス  ラクティス（Lactococcus lactis）由来である。
【０１４３】
好ましくは、第２遺伝子は以下からなる群より選択される：
（２−１）配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、シュードモナス  プチダ由来のｍｄｌＣタンパク質）であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（２−２）配列番号２４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【０１４４】
「配列番号２４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号２４に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
【０１４５】
シュードモナス  プチダ由来のｍｄｌＣタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔＫＢ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒは、例えばＰ２０９０６である。
【０１４６】
より好ましくは、第２遺伝子は、配列番号２３に記載の塩基配列からなる、シュードモナス  プチダ由来のｍｄｌＣ遺伝子である。
【０１４７】
配列番号２３に記載の塩基配列と配列番号２４に記載のアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０１４８】
【表２３】
2020182449.tif 000025
【０１４９】
【表２４】
2020182449.tif 000026
【０１５０】
α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性は、例えば、当該酵素反応を０．５ｍＭチアミンピロリン酸、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  ＮＡＤＨ、過剰量のアルコールデヒドロゲナーゼを含有する１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）中で３０℃にて行い、原料のα−ケト酸から生成するアルデヒド化合物が逐次的に還元されて生じるアルコール化合物の初期生成速度を測定することで算出できる。アルコール化合物の生成速度は、例えば、アルコール化合物自体の濃度の時間変化から算出できる。アルコール化合物の濃度の測定は、例えば、当該アルコール化合物を高速液体クロマトグラフィーを用いて検出し、濃度が既知の標品とそれを比較することで可能である。ここでは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのα−ケト酸が脱炭酸される活性を１ユニットとする。
【０１５１】
「配列番号２４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｍｄｌＣ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
【０１５２】
（２．１．４）第３遺伝子
第３遺伝子は、「アルデヒドの還元反応を触媒する酵素」をコードする。「アルデヒドの還元反応を触媒する酵素」とは、後述の測定方法に従って、酵素反応液として、精製タンパク質およびアルデヒド（初期基質濃度  1mM）を含む酵素反応液を使用して測定した場合に、１０mU/ｍｇ protein以上の活性を有する酵素をいう。第３遺伝子は、例えば、第２遺伝子がコードするタンパク質が触媒する脱炭酸反応により得られたアルデヒドの還元反応を触媒する酵素をコードする。「アルデヒドの還元反応を触媒する酵素」におけるアルデヒドは、例えば、３−ヒドロキシブチルアルデヒド、３−ヒドロキシバレルアルデヒド、３−ヒドロキシヘキシルアルデヒド、３−ヒドロキシイソヘキシルアルデヒド、３−ヒドロキシヘプチルアルデヒドまたは３−メチル−３−ヒドロキシブチルアルデヒドである。「アルデヒドの還元反応を触媒する酵素」は、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼである。
【０１５３】
第３遺伝子は、例えば、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（1,3-propanediol dehydrogenase、ＥＣ番号１．１．１．２０２）をコードする遺伝子であってもよい。
【０１５４】
１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼとしては、例えば、ｄｈａＴタンパク質またはｌｐｏタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｄｈａＴタンパク質は、クレブシエラ  ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）由来である。また、好ましくは、ｌｐｏタンパク質は、ラクトバチルス  ロイテリ（Lactobacillus reuteri）由来である。
【０１５５】
好ましくは、第３遺伝子は以下からなる群より選択される：
（３−１）配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、クレブシエラ  ニューモニエ由来のｄｈａＴタンパク質）であって、アルデヒドの還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（３−２）配列番号２６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【０１５６】
「配列番号２６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号２６に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
【０１５７】
クレブシエラ  ニューモニエ由来のｄｈａＴタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔＫＢ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒは、例えばＱ５９４７７である。
【０１５８】
より好ましくは、第３遺伝子は、配列番号２５に記載の塩基配列からなる、クレブシエラ  ニューモニエ由来のｄｈａＴ遺伝子である。
【０１５９】
配列番号２５に記載の塩基配列と配列番号２６に記載のアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０１６０】
【表２５】
2020182449.tif 000027
【０１６１】
【表２６】
2020182449.tif 000028
【０１６２】
アルデヒドの還元反応を触媒する活性は、例えば、当該酵素反応を０．２ｍＭ  ＮＡＤＨを含有する５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．５）中で３０℃にて行い、原料のアルデヒドがアルコール化合物へ還元される際に消費されるＮＡＤＨの初期消費速度を測定することで算出できる。ＮＡＤＨの初期消費速度は、例えば、酵素反応液中のＮＡＤＨに由来する３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度を測定することで算出できる。ここでは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのアルデヒドが還元される活性を１ユニットとする。
【０１６３】
「配列番号２６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｄｈａＴ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
【０１６４】
（２．１．５）形質転換のための組換えベクターの構築
第１、第２、および第３遺伝子は、形質転換のために適切なプラスミドベクターに組み込むことができる。
【０１６５】
プラスミドベクターとしては、「（１．１．３）形質転換のための組換えベクターの構築」の欄に記載したプラスミドベクターと同様のプラスミドベクターを使用することができる。
【０１６６】
第１、第２および第３遺伝子は、各々個別のプラスミドベクターに組み込んでもよいし、あるいは同一のプラスミドベクターに組み込んでもよい。得られた組換えベクターを用いて形質転換体を作製することができる。
【０１６７】
（２．１．６）形質転換
形質転換方法は、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法としては、「（１．１．４）形質転換」の欄に記載した方法と同様の方法を使用することができる。
【０１６８】
なお、上述のとおりに組換えベクターを用いて形質転換体を作製した場合、第１、第２、および第３遺伝子の各々は、宿主の染色体に組み込まれてもよいし、あるいは、組換えベクターの形態で宿主の細胞質内に存在していてもよい。
【０１６９】
（２．１．７）宿主染色体遺伝子の破壊または欠失
宿主は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。宿主がコリネ型細菌である場合、宿主は、「（１．１．５）宿主染色体遺伝子の破壊または欠失」の欄に記載した遺伝子破壊株または遺伝子欠失株と同様の遺伝子破壊株または遺伝子欠失株を使用することができる。また、遺伝子破壊株または遺伝子欠失株を作製する方法としては、「（１．１．５）宿主染色体遺伝子の破壊または欠失」の欄に記載した方法と同様の方法を使用することができる。このような遺伝子破壊株または遺伝子欠失株を宿主として用いることにより、１，３−ジオールの生産性を向上させたり、副生成物の生成を抑制したりすることができる。
【０１７０】
（２．１．８）１，３−ジオール生産微生物の具体例
具体的には、１，３−ジオール生産微生物としては、
以下からなる群より選択される第１遺伝子：
（１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２）配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−４）配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−５）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（１−６）配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
以下からなる群より選択される第２遺伝子：
（２−１）配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（２−２）配列番号２４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；および
以下からなる群より選択される第３遺伝子：
（３−１）配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（３−２）配列番号２６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
を含むコリネ型細菌を使用することができる。
【０１７１】
（２．２）培養工程
１，３−ジオール生産微生物（例えば、上述した形質転換体）を、ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物の存在下で培養して、１，３−ジオールを生産することができる。「ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物の存在下で培養すること」は、ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を含む培養液中で培養することにより行うことができる。好ましくは、「ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物の存在下で培養すること」は、ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を添加した培養液中で培養することにより行うことができる。
【０１７２】
ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物の存在下での培養に先立ち、「（１．２）培養工程」の欄に記載した増殖培養を行うことが好ましい。
【０１７３】
生産培養に先立って増殖培養を行う場合、増殖培養とその後の生産培養は、例えば、「（１．２）培養工程」の欄に記載したとおり行うことができる。
【０１７４】
（２．２．１）増殖用培養液
増殖用培養液としては、「（１．２．１）増殖用培養液」の欄に記載した増殖用培養液と同様の培養液を使用することができる。
【０１７５】
（２．２．２）生産用培養液
生産用培養液としては、ピルビン酸供給化合物、カルボニル化合物、及びその他必要な成分を含有する培養液を用いることができる。その他必要な成分として、例えば、無機塩類、糖類以外の炭素源又は窒素源を用いることができる。
【０１７６】
ピルビン酸供給化合物としては、「（１．２．２）生産用培養液」の欄に記載したピルビン酸供給化合物を使用することができる。
【０１７７】
カルボニル化合物としては、下記一般式（３）：
Ｒ１０３Ｃ（Ｏ）Ｒ１０４
（ここでＲ１０３およびＲ１０４は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である。ただし、Ｒ１０３が水素であるとき、Ｒ１０４は水素ではない。）
により表されるカルボニル化合物を使用することができる。
一例によれば、カルボニル化合物としては、上記一般式（３）において、Ｒ１０３は水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基であり、かつ、Ｒ１０４は水素であるカルボニル化合物を使用することができる。
別の例によると、カルボニル化合物は、上記一般式（３）において、Ｒ１０３はメチル基であり、かつ、Ｒ１０４は１〜５個の炭素原子を有するアルキル基であるカルボニル化合物を使用することができる。
【０１７８】
具体的には、カルボニル化合物としては、上記一般式（１）中、
Ｒ１０３がメチル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素であるカルボニル化合物（すなわち、アセトアルデヒド）；
Ｒ１０３がエチル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素であるカルボニル化合物（すなわち、プロピオンアルデヒド）；
Ｒ１０３がプロピル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素であるカルボニル化合物（すなわち、ブチルアルデヒド）、具体的には、Ｒ１０３がノルマルプロピル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素であるカルボニル化合物（すなわち、ノルマルブチルアルデヒド）、または、Ｒ１０３がイソプロピル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素であるカルボニル化合物（すなわち、イソブチルアルデヒド）；または
Ｒ１０３がペンチル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素であるカルボニル化合物（すなわち、バレルアルデヒド）、具体的には、Ｒ１０３がノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素であるカルボニル化合物（すなわち、ノルマルバレルアルデヒド）；
を使用することができる。
また、カルボニル化合物としては、上記一般式（３）中、Ｒ１０３およびＲ１０４がいずれもメチル基であるケトン（すなわち、アセトン）を使用することができる。
カルボニル化合物は、１種を使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。
【０１７９】
生産用培養液におけるカルボニル化合物の濃度は、０．００１〜１０（ｗ／ｖ）％の範囲内にあることが好ましく、０．０１〜１（ｗ／ｖ）％の範囲内にあることがより好ましい。また、１，３−ジオールの生産に伴うカルボニル化合物の減少に応じて、カルボニル化合物の追加添加を行うことができる。
【０１８０】
なお、１種類のカルボニル化合物を生産用培養液中に使用した場合、後述する「（２．２．４）１，３−ジオールの回収」で述べる分離精製を容易に行うことが可能である。
【０１８１】
その他必要な成分としては、「（１．２．２）生産用培養液」の欄に記載したその他必要な成分と同様の成分を使用することができる。
【０１８２】
具体的な生産用培養液としては、グルコース、アセトアルデヒド、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄（ＩＩ）および硫酸マンガン（ＩＩ）を含み、６．０のｐＨを有する培地を用いることができる。  
また、生産用培養液としては、増殖培養で用いた増殖用培養液と同じ組成のベース培養液に、ピルビン酸供給化合物とカルボニル化合物とを添加して得られる培養液を用いることもできる。なお、上述のベース培養液中に十分な量でピルビン酸供給化合物が存在する場合、ピルビン酸供給化合物を添加しなくてもよい。
【０１８３】
（２．２．３）生産培養の条件
生産培養における培養温度は、１，３−ジオールの生産に適した温度であれば、任意の温度であってもよい。生産培養における培養温度は、約２０〜５０℃が好ましく、約２５〜４７℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良く１，３−ジオールを製造できる。生産用培養液のｐＨは、１，３−ジオールの生産に適したｐＨであれば、任意のｐＨであってもよい。生産用培養液のｐＨは、約６〜８の範囲内に維持することが好ましい。生産用培養液のｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸；水酸化カリウム水溶液等のアルカリ溶液；尿素；炭酸カルシウム；アンモニア；４−モルホリノプロパンスルホン酸等を含むｐＨ緩衝液等を用いて行うことができる。生産培養中も必要に応じて生産用培養液のｐＨは、適宜調整することができる。生産培養における培養時間は、形質転換体が１，３−ジオールを生産するのに十分な時間であれば、任意の時間であってもよい。生産培養における培養時間は、約３時間〜７日間が好ましく、約１〜３日間がより好ましい。
生産培養は、好気的条件の下で行われてもよく、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われてもよい。これは、上述した形質転換体が、好気的条件の下でも嫌気的条件または微好気的条件の下でも働く、１，３−ジオールを生産する経路を有しているためである。１，３−ジオールを生産する経路は、後述の「（２．３）作用および効果」の欄で述べる。
【０１８４】
＜嫌気的条件または微好気的条件＞
生産培養は、好ましくは、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われる。
【０１８５】
形質転換体を嫌気的条件下または微好気的条件下で培養すると、形質転換体は実質的に増殖せず、一層効率的に１，３−ジオールを生産することができる。
【０１８６】
「嫌気的条件または微好気的条件」は、「（１．２．３）生産培養の条件」の欄に記載した「嫌気的条件または微好気的条件」と同様の条件とすることができる。
【０１８７】
＜高密度条件＞
生産培養は、好ましくは、形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる。このような状態で形質転換体を培養すると、一層効率的に１，３−ジオールを生産することができる。
【０１８８】
「形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態」は、「（１．２．３）生産培養の条件」の欄に記載した「形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態」と同様の状態とすることができる。
【０１８９】
生産培養は、嫌気的条件または微好気的条件の下で、形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われることがより好ましい。
【０１９０】
（２．２．４）１，３−ジオールの回収
上述のとおり、第１、第２および第３遺伝子を含む形質転換体を生産用培養液中で培養すると、生産用培養液中に１，３−ジオールが生産される。
【０１９１】
具体的には、生産用培養液中に下記一般式（３）：
下記一般式（３）：
Ｒ１０３Ｃ（Ｏ）Ｒ１０４
（ここでＲ１０３およびＲ１０４は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である。ただし、Ｒ１０３およびＲ１０４は、何れも水素ではない。）
により表されるカルボニル化合物を使用した場合、下記一般式（４）：
Ｒ１０３Ｃ（Ｒ１０４）(ＯＨ) ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ
（上記一般式（４）におけるＲ１０３およびＲ１０４は、それぞれ上記一般式（３）におけるＲ１０３およびＲ１０４と同じ基である）
により表される１，３−ジオールを生産することができる。
【０１９２】
より具体的には、上記一般式（３）中、Ｒ１０３がメチル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（４）中、Ｒ１０３がメチル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素である１，３−ジオール（すなわち、１，３−ブタンジオール）を生産することができる。
上記一般式（３）中、Ｒ１０３がエチル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（４）中、Ｒ１０３がエチル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素である１，３−ジオール（すなわち、１，３−ペンタンジオール）を生産することができる。
上記一般式（３）中、Ｒ１０３がプロピル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（４）中、Ｒ１０３がプロピル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素である１，３−ジオール（すなわち、１，３−ヘキサンジオール）を生産することができる。具体的には、上記一般式（３）中、Ｒ１０３がノルマルプロピル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（４）中、Ｒ１０３がノルマルプロピル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素である１，３−ジオール（すなわち、１，３−ノルマルヘキサンジオール）を生産することができる。また、具体的には、上記一般式（３）中、Ｒ１０３がイソプロピル基であり、かつ、Ｒ１０３が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（４）中、Ｒ１０３がイソプロピル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素である１，３−ジオール（すなわち、４−メチル−１，３−ペンタンジオール）を生産することができる。
上記一般式（３）中、Ｒ１０３がペンチル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（４）中、Ｒ１０３がペンチル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素である１，３−ジオール（すなわち、１，３−ヘプタンジオール）を生産することができる。具体的には、上記一般式（３）中、Ｒ１０３がノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（４）中、Ｒ１０３がノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素である１，３−ジオール（すなわち、１，３−ノルマルヘプタンジオール）を生産することができる。
上記一般式（３）中、Ｒ１０３およびＲ１０４がいずれもメチル基であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（４）中、Ｒ１０３およびＲ１０４がいずれもメチル基である１，３−ジオール（すなわち、３−メチル−１，３−ブタンジオール）を生産することができる。
【０１９３】
生産用培養液を回収することにより上記の１，３−ジオールを回収できるが、さらに、公知の方法で１，３−ジオールを生産用培養液から分離精製することもできる。そのような公知の方法として、蒸留法、濃縮法、イオン交換樹脂法、活性炭吸着溶離法、溶媒抽出法、晶析法等が挙げられる。
なお、生産用培養液からは、第１遺伝子がコードする酵素が触媒するアルドール反応によって生じたα−ケト酸等の物質を回収することもできる。
【０１９４】
また、複数種類のカルボニル化合物を使用した場合、培養液中に複数種類の１，３−ジオールが生産される。複数種類の１，３−ジオールは、蒸留やクロマトグラフィーによって、互いに分離することができる。
【０１９５】
（２．３）作用および効果
１，３−ジオール生産微生物が１，３−ジオールを生産するプロセスを模式的に図２に示す。図２に示すプロセスにおいては、ピルビン酸供給化合物がグルコースであり、カルボニル化合物がアセトアルデヒドであり、１，３−ジオールが１，３−ブタンジオールである場合を例として説明する。
【０１９６】
図２に示すように、先ず、１，３−ジオール生産微生物６は、グルコース２及びアセトアルデヒド７を取り込む。次に、グルコース２は、解糖系を通じてピルビン酸４に変換される。次に、ピルビン酸４とアセトアルデヒド７とは、第１遺伝子がコードする「ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素」によって４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸８に変換される。次に、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸８は、第２遺伝子がコードする「α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素」によって３−ヒドロキシブチルアルデヒド９に変換される。次に、３−ヒドロキシブチルアルデヒド９は、第３遺伝子がコードする「アルデヒドの還元反応を触媒する酵素」によって１，３−ブタンジオール１０に変換される。以上のようにして、１，３−ブタンジオールが生産される。
【０１９７】
あるいは、別の実施形態として、「（２．）１，３−ジオールの製造方法」の欄で説明した１，３−ジオールの製造方法において、１，３−ブタンジオールを生産する場合に限り、生産用培養液はアセトアルデヒドを含んでいなくてもよい。
すなわち、この実施形態に係る１，３−ブタンジオールの製造方法は、１，３−ジオール生産微生物を、ピルビン酸供給化合物の存在下で培養して、１，３−ブタンジオールを生産する工程を含む。
この実施形態は、アセトアルデヒドを生産用培養液に添加しないことを除いて、上述の「１，３−ジオールの製造方法」と同様の手順に従って実施することができる。
【０１９８】
生産用培養液がアセトアルデヒドを含んでいなくても、１，３−ブタンジオールを生産できる理由を、本発明者らは以下のように考えている。先ず、１，３−ジオール生産微生物が生産用培養液中のピルビン酸供給化合物を生体内に取り込む。次に、ピルビン酸供給化合物がピルビン酸である場合、第２遺伝子にコードされる酵素によって、ピルビン酸の一部はアセトアルデヒドに変換される。ピルビン酸供給化合物が糖類である場合、糖類はピルビン酸に変換され、その後、第２遺伝子にコードされる酵素によって、ピルビン酸の一部はアセトアルデヒドに変換される。その次に、アセトアルデヒドとピルビン酸とが、第１遺伝子にコードされる酵素によって４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸に変換される。その次に、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸が、第２遺伝子にコードされる酵素によって３−ヒドロキシブチルアルデヒドに変換される。その次に、３−ヒドロキシブチルアルデヒドが１，３−ブタンジオールに変換される。このように、１，３−ジオール生産微生物は生体内でアセトアルデヒドを生産できる。したがって、生産用培養液がアセトアルデヒドを含んでいなくても、１，３−ブタンジオールは生産される。なお、１，３−ジオール生産微生物が生産したアセトアルデヒドは、１，３−ジオール生産微生物から培養液中に分泌されていてもよい。
【０１９９】
（３．）２，４−ジヒドロキシカルボン酸の製造方法
２，４−ジヒドロキシカルボン酸の製造方法は、
以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、および
（ｄ）α−ケト酸の還元反応を触媒する酵素をコードする第４遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、
下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（５）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ
（上記一般式（５）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２，４−ジヒドロキシカルボン酸を生産する工程を含む。
【０２００】
以下の説明において、第１および第４遺伝子を含む上記微生物を、「２，４−ジヒドロキシカルボン酸生産微生物」とも呼ぶ。２，４−ジヒドロキシカルボン酸生産微生物は、第１および第４遺伝子を生来的に有する微生物であってもよいし、宿主を第１および第４遺伝子で形質転換することによって得られる微生物であってもよい。以下、２，４−ジヒドロキシカルボン酸生産微生物が形質転換体である場合を例として説明する。
【０２０１】
（３．１）形質転換体
（３．１．１）宿主
宿主としては、「（１．１．１）宿主」の欄に記載した宿主と同様の宿主を使用することができる。
次に、宿主に導入される第１および第４遺伝子について説明する。
【０２０２】
（３．１．２）第１遺伝子
第１遺伝子としては、「（１．１．２）第１遺伝子」の欄に記載した第１遺伝子と同様の遺伝子を使用することができる。
【０２０３】
（３．１．３）第４遺伝子
第４遺伝子は、「α−ケト酸の還元反応を触媒する酵素」をコードする。「α−ケト酸の還元反応を触媒する酵素」とは、後述の測定方法に従って、酵素反応液として、精製タンパク質およびα−ケト酸（初期基質濃度  1mM）を含む酵素反応液を使用して測定した場合に、１０mU/ｍｇ protein以上の活性を有する酵素をいう。第４遺伝子は、例えば、第１遺伝子がコードするタンパク質が触媒するアルドール反応により得られたα−ケト酸の還元反応を触媒する酵素をコードする。「α−ケト酸の還元反応を触媒する酵素」におけるα−ケト酸は、例えば、「（１．）α−ケト酸の製造方法」の欄に記載した、一般式（２）により表されるα−ケト酸である。「α−ケト酸の還元反応を触媒する酵素」は、例えば、デヒドロゲナーゼである。
【０２０４】
第４遺伝子は、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase、ＥＣ番号１．１．１．２７）をコードする遺伝子であってもよい。
【０２０５】
乳酸デヒドロゲナーゼとしては、例えば、ｌｄｈＡタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｌｄｈＡタンパク質は、ラクトコッカス  ラクティス（Lactococcus lactis）由来のタンパク質である。なお、「ラクトコッカス  ラクティス由来のタンパク質」とは、ラクトコッカス  ラクティスから単離されたタンパク質であってもよいし、当該タンパク質の活性を維持していれば、単離されたタンパク質の変異体であってもよい。より好ましくは、ｌｄｈＡタンパク質は、ラクトコッカス  ラクティスＮＢＲＣ１００６７６株由来のタンパク質である。さらに好ましくは、ラクトコッカス  ラクティスＮＢＲＣ１００６７６株由来のｌｄｈＡタンパク質であって、Ｎ末端から８５番目のグルタミン残基がシステイン残基に置換されているタンパク質である。
【０２０６】
好ましくは、第４遺伝子は以下からなる群より選択される：
（４−１）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、ラクトコッカス  ラクティスＮＢＲＣ１００６７６株由来のｌｄｈＡタンパク質であって、Ｎ末端から８５番目のグルタミン残基がシステイン残基に置換されているタンパク質）であって、α−ケト酸の還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（４−２）配列番号２８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【０２０７】
「配列番号２８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号２８に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
【０２０８】
「配列番号２８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、Ｎ末端から８５番目の残基にシステイン残基を維持しているタンパク質をコードしていることが好ましい。
【０２０９】
より好ましくは、第４遺伝子は、配列番号２７に記載の塩基配列からなる、ラクトコッカス  ラクティスＮＢＲＣ１００６７６株由来のｌｄｈＡ遺伝子である。なお、配列番号２７に記載の塩基配列は、Ｎ末端から８５番目の残基にシステイン残基を有しているタンパク質をコードしている。
【０２１０】
配列番号２７に記載の塩基配列と配列番号２８に記載のアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０２１１】
【表２７】
2020182449.tif 000029
【０２１２】
【表２８】
2020182449.tif 000030
【０２１３】
α−ケト酸の還元反応を触媒する活性は、例えば、当該酵素反応を０．２５ｍＭ  ＮＡＤＨ、５０ｍＭ  塩化カリウム、５ｍＭ  塩化マグネシウム、 ５ｍＭ  塩化マグネシウム、５ｍＭ  D-フルクトース 1,6-ビスリン酸を含有する６０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ７．０）中で３０℃にて行い、原料のα−ケト酸が還元される際に消費されるＮＡＤＨの初期消費速度を測定することで算出できる。ＮＡＤＨの初期消費速度は、例えば、酵素反応液中のＮＡＤＨに由来する３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度を測定することで算出できる。ここでは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのα−ケト酸が還元される活性を１ユニットとする。
【０２１４】
「配列番号２８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
【０２１５】
（３．１．４）形質転換のための組換えベクターの構築
第１および第４遺伝子は、形質転換のために適切なプラスミドベクターに組み込むことができる。
【０２１６】
プラスミドベクターとしては、「（１．１．３）形質転換のための組換えベクターの構築」の欄に記載したプラスミドベクターと同様のプラスミドベクターを使用することができる。
【０２１７】
第１および第４遺伝子は、各々個別のプラスミドベクターに組み込んでもよいし、あるいは同一のプラスミドベクターに組み込んでもよい。得られた組換えベクターを用いて形質転換体を作製することができる。
【０２１８】
（３．１．５）形質転換
形質転換方法は、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法としては、「（１．１．４）形質転換」の欄に記載した方法と同様の方法を使用することができる。
【０２１９】
なお、上述のとおりに組換えベクターを用いて形質転換体を作製した場合、第１および第４遺伝子の各々は、宿主の染色体に組み込まれてもよいし、あるいは、組換えベクターの形態で宿主の細胞質内に存在していてもよい。
【０２２０】
（３．１．６）宿主染色体遺伝子の破壊または欠失
宿主は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。宿主がコリネ型細菌である場合、宿主は、「（１．１．５）宿主染色体遺伝子の破壊または欠失」の欄に記載した遺伝子破壊株または遺伝子欠失株と同様の遺伝子破壊株または遺伝子欠失株を使用することができる。また、遺伝子破壊株または遺伝子欠失株を作製する方法としては、「（１．１．５）宿主染色体遺伝子の破壊または欠失」の欄に記載した方法と同様の方法を使用することができる。このような遺伝子破壊株または遺伝子欠失株を宿主として用いることにより２，４−ジヒドロキシカルボン酸の生産性を向上させたり、副生成物の生成を抑制したりすることができる。
【０２２１】
（３．１．７）２，４−ジヒドロキシカルボン酸生産微生物の具体例
具体的には、２，４−ジヒドロキシカルボン酸生産微生物としては、
以下からなる群より選択される第１遺伝子：
（１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２）配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−４）配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−５）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（１−６）配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；および
以下からなる群より選択される第４遺伝子：
（４−１）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（４−２）配列番号２８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
を含むコリネ型細菌を使用することができる。
【０２２２】
（３．２）培養工程
２，４−ジヒドロキシカルボン酸生産微生物（例えば、上述した形質転換体）を、ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物の存在下で培養して、２，４−ジヒドロキシカルボン酸を生産することができる。「ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物の存在下で培養すること」は、ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を含む培養液中で培養することにより行うことができる。好ましくは、「ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物の存在下で培養すること」は、ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を添加した培養液中で培養することにより行うことができる。
【０２２３】
ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物の存在下での培養に先立ち、「（１．２）培養工程」の欄に記載した増殖培養を行うことが好ましい。
【０２２４】
生産培養に先立って増殖培養を行う場合、増殖培養とその後の生産培養は、例えば、「（１．２）培養工程」の欄に記載したとおり行うことができる。
【０２２５】
（３．２．１）増殖用培養液
増殖用培養液としては、「（１．２．１）増殖用培養液」の欄に記載した増殖用培養液と同様の培養液を使用することができる。
【０２２６】
（３．２．２）生産用培養液
生産用培養液としては、「（１．２．２）生産用培養液」の欄に記載した生産用培養液と同様の培養液を使用することができる。
【０２２７】
具体的な生産用培養液としては、グルコース、ホルムアルデヒド、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄（ＩＩ）および硫酸マンガン（ＩＩ）を含み、７．０のｐＨを有する培地を用いることができる。
【０２２８】
なお、１種類のカルボニル化合物を生産用培養液中に使用した場合、後述する「（３．２．４）２，４−ジヒドロキシカルボン酸の回収」の欄に記載した分離精製を容易に行うことが可能である。
【０２２９】
（３．２．３）生産培養の条件
生産培養における培養温度は、２，４−ジヒドロキシカルボン酸の生産に適した温度であれば、任意の温度であってもよい。生産培養における培養温度は、約２０〜５０℃が好ましく、約２５〜４７℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良く２，４−ジヒドロキシカルボン酸を製造できる。生産用培養液のｐＨは、２，４−ジヒドロキシカルボン酸の生産に適したｐＨであれば、任意のｐＨであってもよい。生産用培養液のｐＨは、約６〜８の範囲内に維持することが好ましい。生産用培養液のｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸；水酸化カリウム水溶液等のアルカリ溶液；尿素；炭酸カルシウム；アンモニア；４−モルホリノプロパンスルホン酸等を含むｐＨ緩衝液等を用いて行うことができる。生産培養中も必要に応じて生産用培養液のｐＨは、適宜調整することができる。生産培養における培養時間は、形質転換体が２，４−ジヒドロキシカルボン酸を生産するのに十分な時間であれば、任意の時間であってもよい。生産培養における培養時間は、約３時間〜７日間が好ましく、約１〜３日間がより好ましい。
生産培養は、好気的条件の下で行われてもよく、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われてもよい。これは、上述した形質転換体が、好気的条件の下でも嫌気的条件または微好気的条件の下でも働く、２，４−ジヒドロキシカルボン酸を生産する経路を有しているためである。２，４−ジヒドロキシカルボン酸を生産する経路は、後述の「（３．３）作用および効果」の欄で述べる。
【０２３０】
＜嫌気的条件または微好気的条件＞
生産培養は、好ましくは、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われる。
【０２３１】
形質転換体を嫌気的条件下または微好気的条件下で培養すると、形質転換体は実質的に増殖せず、一層効率的に２，４−ジヒドロキシカルボン酸を生産することができる。
【０２３２】
「嫌気的条件または微好気的条件」は、「（１．２．３）生産培養の条件」の欄に記載した「嫌気的条件または微好気的条件」と同様の条件とすることができる。
【０２３３】
＜高密度条件＞
生産培養は、好ましくは、形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる。このような状態で形質転換体を培養すると、一層効率的に２，４−ジヒドロキシカルボン酸を生産することができる。
【０２３４】
「形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態」は、「（１．２．３）生産培養の条件」の欄に記載した「形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態」と同様の状態とすることができる。
【０２３５】
生産培養は、嫌気的条件または微好気的条件の下で、形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われることがより好ましい。
【０２３６】
（３．２．４）２，４−ジヒドロキシカルボン酸の回収
上述のとおり、第１および第４遺伝子を含む形質転換体を生産用培養液中で培養すると、生産用培養液中に２，４−ジヒドロキシカルボン酸が生産される。
【０２３７】
具体的には、生産用培養液中に下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物を使用した場合、下記一般式（５）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ
（上記一般式（５）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２，４−ジヒドロキシカルボン酸を生産することができる。
【０２３８】
より具体的には、上記一般式（１）中、Ｒ１０１が水素であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（５）中、Ｒ１０１が水素であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２，４−ジヒドロキシカルボン酸（すなわち、２，４−ジヒドロキシ酪酸）を生産することができる。
上記一般式（１）中、Ｒ１０１がメチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（５）中、Ｒ１０１がメチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２，４−ジヒドロキシカルボン酸（すなわち、２，４−ジヒドロキシ吉草酸）を生産することができる。
上記一般式（１）中、Ｒ１０１がエチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（５）中、Ｒ１０１がエチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２，４−ジヒドロキシカルボン酸（すなわち、２，４−ジヒドロキシカプロン酸）を生産することができる。
上記一般式（１）中、Ｒ１０１がプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（５）中、Ｒ１０１がプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２，４−ジヒドロキシカルボン酸（すなわち、２，４−ジヒドロキシエナント酸）を生産することができる。具体的には、上記一般式（１）中、Ｒ１０１がノルマルプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（５）中、Ｒ１０１がノルマルプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２，４−ジヒドロキシカルボン酸（すなわち、２，４−ジヒドロキシノルマルヘプタン酸）を生産することができる。また、具体的には、上記一般式（１）中、Ｒ１０１がイソプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（５）中、Ｒ１０１がノイソプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２，４−ジヒドロキシカルボン酸（すなわち、２，４−ジヒドロキシイソエナント酸）を生産することができる。
上記一般式（１）中、Ｒ１０１がペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（５）中、Ｒ１０１がペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２，４−ジヒドロキシカルボン酸（すなわち、２，４−ジヒドロキシカプリル酸）を生産することができる。具体的には、上記一般式（１）中、Ｒ１０１がノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（５）中、Ｒ１０１がノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２，４−ジヒドロキシカルボン酸（すなわち、２，４−ジヒドロキシノルマルカプリル酸）を生産することができる。
より具体的には、上記一般式（１）中、Ｒ１０１およびＲ１０２がいずれもメチル基であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（５）中、Ｒ１０１およびＲ１０２がいずれもメチル基である２，４−ジヒドロキシカルボン酸（すなわち、４−メチル−２，４−ジヒドロキシ吉草酸）を生産することができる。
【０２３９】
生産用培養液を回収することにより上記の２，４−ジヒドロキシカルボン酸を回収できるが、さらに、公知の方法で２，４−ジヒドロキシカルボン酸を生産用培養液から分離精製することもできる。そのような公知の方法として、晶析法、クロマトグラフィー法、イオン交換樹脂法、活性炭吸着溶離法、溶媒抽出法等が挙げられる。
【０２４０】
なお、生産用培養液からは、第１遺伝子がコードする酵素が触媒するアルドール反応によって生じたα−ケト酸等の物質を回収することもできる。
【０２４１】
また、複数種類のカルボニル化合物を使用した場合、培養液中に複数種類の２，４−ジヒドロキシカルボン酸が生産される。複数種類の２，４−ジヒドロキシカルボン酸は、晶析やクロマトグラフィーによって、互いに分離することができる。
【０２４２】
（３．３）作用および効果
２，４−ジヒドロキシカルボン酸生産微生物が２，４−ジヒドロキシカルボン酸を生産するプロセスを模式的に図３に示す。図３に示すプロセスにおいては、ピルビン酸供給化合物がグルコースであり、カルボニル化合物がホルムアルデヒドであり、２，４−ジヒドロキシカルボン酸が２，４−ジヒドロキシ酪酸である場合を例として説明する。
【０２４３】
図３に示すように、先ず、２，４−ジヒドロキシカルボン酸生産微生物１１は、グルコース２及びホルムアルデヒド３を取り込む。次に、グルコース２は、解糖系を通じてピルビン酸４に変換される。次に、ピルビン酸４とホルムアルデヒド３とは、第１遺伝子がコードする「ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素」によって４−ヒドロキシ−２−オキソ酪酸５に変換される。次に、４−ヒドロキシ−２−オキソ酪酸５は、第４遺伝子がコードする「α−ケト酸の還元反応を触媒する酵素」によって２，４−ジヒドロキシ酪酸１２に変換される。以上のようにして、２，４−ジヒドロキシ酪酸が生産される。
【０２４４】
（４．）２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の製造方法（生物学的方法）
２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の製造方法は、
以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、および
（ｅ）α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する酵素をコードする第５遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、
下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（６）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（上記一般式（６）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を生産する工程を含む。
【０２４５】
以下の説明において、第１および第５遺伝子を含む上記微生物を、「２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸生産微生物」とも呼ぶ。２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸生産微生物は、第１および第５遺伝子を生来的に有する微生物であってもよいし、宿主を第１および第５遺伝子で形質転換することによって得られる微生物であってもよい。以下、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸生産微生物が形質転換体である場合を例として説明する。
【０２４６】
（４．１）形質転換体
（４．１．１）宿主
宿主としては、「（１．１．１）宿主」の欄に記載した宿主と同様の宿主を使用することができる。
次に、宿主に導入される第１および第５遺伝子について説明する。
【０２４７】
（４．１．２）第１遺伝子
第１遺伝子としては、「（１．１．２）第１遺伝子」の欄に記載した第１遺伝子と同様の遺伝子を使用することができる。
【０２４８】
（４．１．３）第５遺伝子
第５遺伝子は、「α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する酵素」をコードする。「α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する酵素」とは、後述の測定方法に従って、酵素反応液として、精製タンパク質およびα−ケト酸（初期基質濃度  1mM）を含む酵素反応液を使用して測定した場合に、１０mU/ｍｇ protein以上の活性を有する酵素をいう。第５遺伝子は、例えば、第１遺伝子がコードするタンパク質が触媒するアルドール反応により得られたα−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する酵素をコードする。「α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する酵素」におけるα−ケト酸は、例えば、「（１．）α−ケト酸の製造方法」の欄に記載した、一般式（２）により表されるα−ケト酸である。「α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する酵素」は、例えば、グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼ［Glutamate/phenylalanine/leucine/valine dehydrogenase, （IPR006095）］である。「グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼ」は、当該技術分野において、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼおよびバリンデヒドロゲナーゼを包含するデヒドロゲナーゼファミリーを意味する用語として使用されている。一例によると、「グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼ」は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼおよびバリンデヒドロゲナーゼからなる群より選択される少なくとも一つのデヒドロゲナーゼである。
【０２４９】
第５遺伝子は、以下に例示するグルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であってもよい。
【０２５０】
（ｄ１）ロイシンデヒドロゲナーゼ（leucine dehydrogenase、ＥＣ番号１．４．１．９）、
（ｄ２）フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（phenylalanine dehydrogenase、ＥＣ番号１．４．１．２０）、および
（ｄ３）バリンデヒドロゲナーゼ（valine dehydrogenase、ＥＣ番号１．４．１．８および１．４．１．２３）。
【０２５１】
（ｄ１）に含まれるデヒドロゲナーゼとしては、例えば、ｌｅｕＤＨタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｌｅｕＤＨタンパク質は、リシニバシラス  スフェリカス（Lysinibacillus sphaericus）、バシラス  セレウス（Bacillus cereus）またはジオバシラス  ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophillus）由来である。  
（ｄ２）に含まれるデヒドロゲナーゼとしては、例えば、ｐｈｅｄｈタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｐｈｅｄｈタンパク質は、バシラス  バディウス（Bacillus badius）由来である。  
（ｄ３）に含まれるデヒドロゲナーゼとしては、例えば、ｖａｌｄｈタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｖａｌｄｈタンパク質は、ストレプトミセス  フラジエ（streptomyces fradiae）由来である。
【０２５２】
好ましくは、第５遺伝子は以下からなる群より選択される：
（５−１）配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、リシニバシラス  スフェリカス由来のｌｅｕＤＨタンパク質）であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−２）配列番号３０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−３）配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、バシラス  バディウス由来のｐｈｅｄｈタンパク質）であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−４）配列番号３２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−５）配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、ストレプトミセス  フラジエ由来のｖａｌｄｈタンパク質）であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（５−６）配列番号３４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【０２５３】
「配列番号３０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号３０に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
【０２５４】
「配列番号３２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号３２に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
【０２５５】
「配列番号３４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号３４に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
【０２５６】
より好ましくは、第５遺伝子は、
配列番号３０に記載の塩基配列からなる、リシニバシラス  スフェリカス由来のｌｅｕＤＨ遺伝子、
配列番号３２に記載の塩基配列からなる、バシラス  バディウス由来のｐｈｅｄｈ遺伝子、または
配列番号３４に記載の塩基配列からなる、ストレプトミセス  フラジエ由来のｖａｌｄｈ遺伝子である。
【０２５７】
配列番号２９に記載の塩基配列と配列番号３０に記載のアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０２５８】
【表２９】
2020182449.tif 000031
【０２５９】
【表３０】
2020182449.tif 000032
【０２６０】
配列番号３１に記載の塩基配列と配列番号３２に記載のアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０２６１】
【表３１】
2020182449.tif 000033
【０２６２】
【表３２】
2020182449.tif 000034
【０２６３】
配列番号３３に記載の塩基配列と配列番号３４に記載のアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０２６４】
【表３３】
2020182449.tif 000035
【０２６５】
【表３４】
2020182449.tif 000036
α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性は、例えば、当該酵素反応を０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ、２００ｍＭ  塩化アンモニウムを含有する１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨバッファー（ｐＨ７．５）中で２５℃にて行い、原料のα−ケト酸がα−アミノ酸に還元される際に消費されるＮＡＤＨの初期消費速度を測定することで算出できる。ＮＡＤＨの初期消費速度は、例えば、酵素反応液中のＮＡＤＨに由来する３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度を測定することで算出できる。ここでは、２５℃で１分間に１μｍｏｌのα−ケト酸がα−アミノ酸に還元される活性を１ユニットとする。
【０２６６】
「配列番号３０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｌｅｕＤＨ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
【０２６７】
「配列番号３２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｐｈｅｄｈ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
【０２６８】
「配列番号３４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｖａｌｄｈ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
【０２６９】
（４．１．４）形質転換のための組換えベクターの構築
第１および第５遺伝子は、形質転換のために適切なプラスミドベクターに組み込むことができる。
【０２７０】
プラスミドベクターとしては、「（１．１．３）形質転換のための組換えベクターの構築」の欄に記載したプラスミドベクターと同様のプラスミドベクターを使用することができる。
【０２７１】
第１および第５遺伝子は、各々個別のプラスミドベクターに組み込んでもよいし、あるいは同一のプラスミドベクターに組み込んでもよい。得られた組換えベクターを用いて形質転換体を作製することができる。
【０２７２】
（４．１．５）形質転換
形質転換方法は、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法としては、「（１．１．４）形質転換」の欄に記載した方法と同様の方法を使用することができる。
【０２７３】
なお、上述のとおりに組換えベクターを用いて形質転換体を作製した場合、第１および第５遺伝子の各々は、宿主の染色体に組み込まれてもよいし、あるいは、組換えベクターの形態で宿主の細胞質内に存在していてもよい。
【０２７４】
（４．１．６）宿主染色体遺伝子の破壊または欠失
宿主は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。宿主がコリネ型細菌である場合、宿主は、「（１．１．５）宿主染色体遺伝子の破壊または欠失」の欄に記載した遺伝子破壊株または遺伝子欠失株と同様の遺伝子破壊株または遺伝子欠失株を使用することができる。また、遺伝子破壊株または遺伝子欠失株を作製する方法としては、「（１．１．５）宿主染色体遺伝子の破壊または欠失」の欄に記載した方法と同様の方法を使用することができる。このような遺伝子破壊株または遺伝子欠失株を宿主として用いることにより２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の生産性を向上させたり、副生成物の生成を抑制したりすることができる。
【０２７５】
（４．１．７）２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸生産微生物の具体例
具体的には、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸生産微生物としては、
以下からなる群より選択される第１遺伝子：
（１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２）配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−４）配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−５）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（１−６）配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；および
以下からなる群より選択される第５遺伝子：
（５−１）配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−２）配列番号３０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−３）配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−４）配列番号３２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−５）配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（５−６）配列番号３４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
を含むコリネ型細菌を使用することができる。
【０２７６】
（４．２）培養工程
２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸生産微生物（例えば、上述した形質転換体）を、ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物の存在下で培養して、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を生産することができる。「ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物の存在下で培養すること」は、ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を含む培養液中で培養することにより行うことができる。好ましくは、「ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物の存在下で培養すること」は、ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を添加した培養液中で培養することにより行うことができる。
【０２７７】
ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物の存在下での培養に先立ち、「（１．２）培養工程」の欄に記載した増殖培養を行うことが好ましい。
【０２７８】
生産培養に先立って増殖培養を行う場合、増殖培養とその後の生産培養は、例えば、「（１．２）培養工程」の欄に記載したとおり行うことができる。
【０２７９】
（４．２．１）増殖用培養液
増殖用培養液としては、「（１．２．１）増殖用培養液」の欄に記載した増殖用培養液と同様の培養液を使用することができる。
【０２８０】
（４．２．２）生産用培養液
生産用培養液としては、「（１．２．２）生産用培養液」の欄に記載した生産用培養液と同様の培養液を使用することができる。
【０２８１】
具体的な生産用培養液としては、グルコース、ホルムアルデヒド、硫酸アンモニウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄（ＩＩ）および硫酸マンガン（ＩＩ）を含み、７．０のｐＨを有する培地を用いることができる。
【０２８２】
なお、１種類のカルボニル化合物を生産用培養液中に使用した場合、後述する「（４．２．４）２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の回収」の欄に記載した分離精製を容易に行うことが可能である。
【０２８３】
（４．２．３）生産培養の条件
生産培養における培養温度は、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の生産に適した温度であれば、任意の温度であってもよい。生産培養における培養温度は、約２０〜５０℃が好ましく、約２５〜４７℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良く２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を製造できる。生産用培養液のｐＨは、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の生産に適したｐＨであれば、任意のｐＨであってもよい。生産用培養液のｐＨは、約６〜８の範囲内に維持することが好ましい。生産用培養液のｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸；水酸化カリウム水溶液等のアルカリ溶液；尿素；炭酸カルシウム；アンモニア；４−モルホリノプロパンスルホン酸等を含むｐＨ緩衝液等を用いて行うことができる。生産培養中も必要に応じて生産用培養液のｐＨは、適宜調整することができる。生産培養における培養時間は、形質転換体が２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を生産するのに十分な時間であれば、任意の時間であってもよい。生産培養における培養時間は、約３時間〜７日間が好ましく、約１〜３日間がより好ましい。
生産培養は、好気的条件の下で行われてもよく、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われてもよい。これは、上述した形質転換体が、好気的条件の下でも嫌気的条件または微好気的条件の下でも働く、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を生産する経路を有しているためである。２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を生産する経路は、後述の「（４．３）作用および効果」の欄で述べる。
【０２８４】
＜嫌気的条件または微好気的条件＞
生産培養は、好ましくは、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われる。
【０２８５】
形質転換体を嫌気的条件下または微好気的条件下で培養すると、形質転換体は実質的に増殖せず、一層効率的に２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を生産することができる。
【０２８６】
「嫌気的条件または微好気的条件」は、「（１．２．３）生産培養の条件」の欄に記載した「嫌気的条件または微好気的条件」と同様の条件とすることができる。
【０２８７】
＜高密度条件＞
生産培養は、好ましくは、形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる。このような状態で形質転換体を培養すると、一層効率的に２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を生産することができる。
【０２８８】
「形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態」は、「（１．２．３）生産培養の条件」の欄に記載した「形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態」と同様の状態とすることができる。
【０２８９】
生産培養は、嫌気的条件または微好気的条件の下で、形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われることがより好ましい。
【０２９０】
（４．２．４）２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の回収
上述のとおり、第１および第５遺伝子を含む形質転換体を生産用培養液中で培養すると、生産用培養液中に２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸が生産される。
【０２９１】
具体的には、生産用培養液中に下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物を使用した場合、下記一般式（６）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（上記一般式（６）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を生産することができる。
【０２９２】
より具体的には、上記一般式（１）中、Ｒ１０１が水素であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（６）中、Ｒ１０１が水素であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸）を生産することができる。
上記一般式（１）中、Ｒ１０１がメチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（６）中、Ｒ１０１がメチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−ヒドロキシ吉草酸）を生産することができる。
上記一般式（１）中、Ｒ１０１がエチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（６）中、Ｒ１０１がエチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−ヒドロキシカプロン酸）を生産することができる。
上記一般式（１）中、Ｒ１０１がプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（６）中、Ｒ１０１がプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソエナント酸）を生産することができる。具体的には、上記一般式（１）中、Ｒ１０１がノルマルプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（６）中、Ｒ１０１がノルマルプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−ヒドロキシノルマルヘプタン酸）を生産することができる。また、具体的には、上記一般式（１）中、Ｒ１０１がイソプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（６）中、Ｒ１０１がイソプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−ヒドロキシイソエナント酸）を生産することができる。
上記一般式（１）中、Ｒ１０１がペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（６）中、Ｒ１０１がペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−ヒドロキシカプリル酸）を生産することができる。具体的には、上記一般式（１）中、Ｒ１０１がノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（６）中、Ｒ１０１がノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−ヒドロキシノルマルカプリル酸）を生産することができる。
より具体的には、上記一般式（１）中、Ｒ１０１およびＲ１０２がいずれもメチル基であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（６）中、Ｒ１０１およびＲ１０２がいずれもメチル基である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、４−メチル−２−アミノ−４−ヒドロキシ吉草酸）を生産することができる。
【０２９３】
上記一般式（１）中、Ｒ１０１が水素であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合に得られる２−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸は、ホモセリンとも呼ばれる。ホモセリンは、例えば、Ｌ−ホモセリンである。上記一般式（１）中、Ｒ１０１が水素であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、生産用培養液中に、ホモセリンに加えて、ホモセリン誘導体が生産される。ホモセリン誘導体としては、スレオニンおよび２−アミノ酪酸が挙げられる。
【０２９４】
スレオニンは、例えば、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸生産微生物が保持する、ホモセリンをスレオニンに変換する酵素（例えば、ホモセリンキナーゼおよびスレオニンシンターゼ）によってホモセリンから生産される。スレオニンは、例えば、Ｌ−スレオニンである。
【０２９５】
２−アミノ酪酸は、例えば、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸生産微生物が保持する、スレオニンを２−アミノ酪酸に変換する酵素（例えば、スレオニンデアミナーゼと、アミノ酸デヒドロゲナーゼまたはアミノ基転移酵素の何れかとの組合せ）によってスレオニンから生産される。アミノ酸デヒドロゲナーゼは、例えば、グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼである。グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼは、具体的には、ロイシンデヒドロゲナーゼである。
【０２９６】
生産用培養液を回収することにより上記の２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸やホモセリン誘導体を回収できるが、さらに、公知の方法で２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を生産用培養液から分離精製することもできる。そのような公知の方法として、晶析法、クロマトグラフィー法、イオン交換樹脂法、活性炭吸着溶離法、溶媒抽出法等が挙げられる。
【０２９７】
なお、生産用培養液からは、第１遺伝子がコードする酵素が触媒するアルドール反応によって生じたα−ケト酸等の物質を回収することもできる。
【０２９８】
上述したとおり、上記一般式（１）中、Ｒ１０１が水素であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、培養液中にホモセリン、スレオニンおよび２−アミノ酪酸が生産される。ホモセリン、スレオニンおよび２−アミノ酪酸は、晶析やクロマトグラフィーによって、互いに分離することができる。
また、複数種類のカルボニル化合物を使用した場合、培養液中に複数種類の２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸が生産される。複数種類の２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸は、晶析やクロマトグラフィーによって、互いに分離することができる。
【０２９９】
（４．３）作用および効果
２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸生産微生物が２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を生産するプロセスを模式的に図４に示す。図４に示すプロセスにおいては、ピルビン酸供給化合物がグルコースであり、カルボニル化合物がホルムアルデヒドであり、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸がホモセリンである場合を例として説明する。
【０３００】
図４に示すように、先ず、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸生産微生物１３は、グルコース２及びホルムアルデヒド３を取り込む。次に、グルコース２は、解糖系を通じてピルビン酸４に変換される。次に、ピルビン酸４とホルムアルデヒド３とは、第１遺伝子がコードする「ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素」によって４−ヒドロキシ−２−オキソ酪酸５に変換される。次に、４−ヒドロキシ−２−オキソ酪酸５は、第５遺伝子がコードする「α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する酵素」によってホモセリン１４に変換される。以上のようにして、ホモセリンが生産される。
【０３０１】
（５．）２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の製造方法（化学的方法）
「（４．）２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の製造方法」の欄では、微生物を使用した生物学的方法により２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法について説明したが、この方法は微生物を使用することなく、化学的方法により実施することもできる。
すなわち、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の製造方法は、
下記一般式（２）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＯＣＯＯＨ
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるα−ケト酸と窒素源と還元剤とを、
グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼの存在下で反応させて、
下記一般式（６）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（上記一般式（６）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（２）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を生産する工程を含む。
【０３０２】
α−ケト酸と窒素源と還元剤とをグルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼの存在下で反応させることは、例えば、α−ケト酸と窒素源と還元剤とグルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼとバッファーとを含む反応液中で行うことができる。以下、α−ケト酸と窒素源と還元剤とをグルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼの存在下で反応させることは、反応液中で行われる場合を例として説明する。
【０３０３】
（５．１）反応液
反応液に含まれる各成分について以下で説明する。本明細書に記載される、反応液中の各成分の濃度は、各成分が添加された時点における反応液中の最終濃度を指す。
（５．１．１）α−ケト酸
α−ケト酸は、下記一般式（２）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＯＣＯＯＨ
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表される。
一例によれば、α−ケト酸は、上記一般式（２）において、Ｒ１０１は水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基であり、かつ、Ｒ１０２は水素であるα−ケト酸を使用することができる。
別の例によると、α−ケト酸は、上記一般式（２）において、Ｒ１０１はメチル基であり、かつ、Ｒ１０２は１〜５個の炭素原子を有するアルキル基であるα−ケト酸を使用することができる。
【０３０４】
具体的には、上記一般式（２）により表されるα−ケト酸として、上記一般式（２）中、
Ｒ１０１が水素であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソ酪酸）；
Ｒ１０１がメチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸）；
Ｒ１０１がエチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソカプロン酸）；
Ｒ１０１がプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソエナント酸）、具体的には、Ｒ１０１がノルマルプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソノルマルヘプタン酸）、または、Ｒ１０１がイソプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソイソエナント酸）；または
Ｒ１０１がペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソカプリル酸）、具体的には、Ｒ１０１がノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソノルマルカプリル酸）；
を使用することができる。
また、上記一般式（２）により表されるα−ケト酸としては、上記一般式（２）中、Ｒ１０１およびＲ１０２がいずれもメチル基であるα−ケト酸（すなわち、４−メチル−４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸）を使用することもできる。
α−ケト酸は、１種を使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。
【０３０５】
反応液におけるα−ケト酸の濃度は、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の生産を阻害しない範囲で可能な限り高くすることができる。反応液におけるα−ケト酸の濃度は、０．１ｍＭ〜１Ｍの範囲内にあることが好ましく、１ｍＭ〜３００ｍＭの範囲内にあることがより好ましい。また、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の生産に伴うα−ケト酸の減少に応じて、α−ケト酸の追加添加を行うことができる。
【０３０６】
なお、１種類のα−ケト酸を反応液中に使用した場合、後述する「（５．３）２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の回収」の欄に記載した分離精製を容易に行うことが可能である。
【０３０７】
（５．１．２）窒素源
窒素源としては、グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼが触媒する還元的アミノ化反応においてアミノ基を供給する任意の化合物を使用することができる。窒素源としては、具体的には、反応液中で解離してアンモニウムイオンを生じるアンモニウム塩、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウムを使用することができる。
【０３０８】
反応液における窒素源の濃度は、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の生産を阻害しない範囲で可能な限り高くすることができる。反応液における窒素源の濃度は、0.1mM〜1Mの範囲内にあることが好ましく、1mM〜300mMの範囲内にあることがより好ましい。また、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の生産に伴う窒素源の減少に応じて、窒素源の追加添加を行うことができる。
【０３０９】
（５．１．３）還元剤
還元剤としては、グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼが利用できる任意の電子供与体を使用することができる。例えば、NADH、NADPHを使用することができる。
【０３１０】
反応液における還元剤の濃度は、０．０１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲内にあることが好ましく、０．１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲内にあることがより好ましい。また、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の生産に伴い減少する還元剤は、適切な化合物と酵素を用いて再生することができる。適切な化合物と酵素は、例えば、エタノールとアルコールデヒドロゲナーゼである。
【０３１１】
（５．１．４）グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼ
グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼとしては、グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼに包含される任意の酵素を使用することができる。一例によると、「グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼ」は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼおよびバリンデヒドロゲナーゼからなる群より選択される少なくとも一つのデヒドロゲナーゼである。
【０３１２】
グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼとしては、以下に例示するデヒドロゲナーゼを使用することができる。
【０３１３】
（ｄ１）ロイシンデヒドロゲナーゼ（leucine dehydrogenase、ＥＣ番号１．４．１．９）、
（ｄ２）フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（phenylalanine dehydrogenase、ＥＣ番号１．４．１．２０）、および
（ｄ３）バリンデヒドロゲナーゼ（valine dehydrogenase、ＥＣ番号１．４．１．８および１．４．１．２３）。
【０３１４】
（ｄ１）に含まれるデヒドロゲナーゼとしては、例えば、ｌｅｕＤＨタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｌｅｕＤＨタンパク質は、リシニバシラス  スフェリカス（Lysinibacillus sphaericus）、バシラス  セレウス（Bacillus cereus）またはジオバシラス  ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophillus）由来である。
（ｄ２）に含まれるデヒドロゲナーゼとしては、例えば、ｐｈｅｄｈタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｐｈｅｄｈタンパク質は、バシラス  バディウス（Bacillus badius）由来である。
（ｄ３）に含まれるデヒドロゲナーゼとしては、例えば、ｖａｌｄｈタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｖａｌｄｈタンパク質は、ストレプトミセス  フラジエ（streptomyces fradiae）由来である。
【０３１５】
好ましくは、グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼは以下からなる群より選択される：
（５’−１）  配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質、
（５’−２）  配列番号３０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質、
（５’−３）  配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質、
（５’−４）  配列番号３２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質、
（５’−５）  配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質、および
（５’−６）  配列番号３４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質。
【０３１６】
「配列番号３０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質」は、「配列番号３０に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質」であってもよい。
【０３１７】
「配列番号３２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質」は、「配列番号３２に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質」であってもよい。
【０３１８】
「配列番号３４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質」は、「配列番号３４に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質」であってもよい。
【０３１９】
α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性は、「（４．１．３）第５遺伝子」の欄に記載した、活性を測定する方法と同様の方法によって測定することができる。
【０３２０】
グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼは、例えば、市販される酵素を使用してもよいし、グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を大腸菌やコリネ型細菌などの宿主で発現させることにより得られた酵素を使用してもよい。後者の場合、当該酵素を発現する微生物の細胞破砕液を酵素として使用することもできるし、当該細胞破砕液を精製して得られる酵素含有液を酵素として使用することもできる。
【０３２１】
反応液におけるグルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼの濃度は、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の生産を阻害しない範囲で可能な限り高くすることができる。反応液におけるグルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼの濃度は、0.01ug/mL〜1mg/mLの範囲内にあることが好ましく、0.1〜100ug/mLの範囲内にあることがより好ましい。
【０３２２】
（５．１．５）バッファー
バッファーは、例えば、緩衝剤およびその他必要な成分を含有する。
【０３２３】
緩衝剤としては、任意の緩衝剤を使用することができる。緩衝剤としては、例えば、ＨＥＰＥＳまたはグリシンを使用することができる。反応液における緩衝剤の濃度は、1mM〜1Mの範囲内とすることができる。
【０３２４】
さらに、必要に応じて、無機塩などを添加することもできる。
【０３２５】
（５．２）反応条件
反応温度は、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の生産に適した温度であれば、任意の温度であってもよい。反応温度は、約4〜80℃が好ましく、約20〜60℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良く２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を製造できる。反応液のｐＨは、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の生産に適したｐＨであれば、任意のｐＨであってもよい。反応液のｐＨは、約5〜11の範囲内に維持することが好ましい。反応液のｐＨの調整は、塩酸や水酸化カリウム水溶液等を用いて行うことができる。反応中も必要に応じて反応液のｐＨは、適宜調整することができる。反応時間は、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸が生産されるのに十分な時間であれば、任意の時間であってもよい。反応時間は、約1分〜10日間時間が好ましく、約1時間〜3日間がより好ましい。
【０３２６】
（５．３）２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の回収
上述したとおり、α−ケト酸と窒素源と還元剤とをグルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼの存在下で反応させると、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸が生産される。
【０３２７】
具体的には、下記一般式（２）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＯＣＯＯＨ
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるα−ケト酸を使用した場合、下記一般式（６）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（上記一般式（６）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（２）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を生産することができる。
【０３２８】
より具体的には、上記一般式（２）中、Ｒ１０１が水素であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸を使用した場合、上記一般式（６）中、Ｒ１０１が水素であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸）を生産することができる。
上記一般式（２）中、Ｒ１０１がメチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸を使用した場合、上記一般式（６）中、Ｒ１０１がメチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−ヒドロキシ吉草酸）を生産することができる。
上記一般式（２）中、Ｒ１０１がエチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸を使用した場合、上記一般式（６）中、Ｒ１０１がエチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−ヒドロキシカプロン酸）を生産することができる。
上記一般式（２）中、Ｒ１０１がプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸を使用した場合、上記一般式（６）中、Ｒ１０１がプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−ヒドロキシエナント酸）を生産することができる。具体的には、上記一般式（２）中、Ｒ１０１がノルマルプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸を使用した場合、上記一般式（６）中、Ｒ１０１がノルマルプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−ヒドロキシノルマルヘプタン酸）を生産することができる。また、具体的には、上記一般式（２）中、Ｒ１０１がイソプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸を使用した場合、上記一般式（６）中、Ｒ１０１がイソプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−ヒドロキシイソエナント酸）を生産することができる。
上記一般式（２）中、Ｒ１０１がペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸を使用した場合、上記一般式（６）中、Ｒ１０１がイソペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−ヒドロキシカプリル酸）を生産することができる。具体的には、上記一般式（２）中、Ｒ１０１がノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸を使用した場合、上記一般式（６）中、Ｒ１０１がノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−ヒドロキシノルマルカプリル酸）を生産することができる。
上記一般式（２）中、Ｒ１０１およびＲ１０２がいずれもメチル基であるα−ケト酸を使用した場合、上記一般式（６）中、Ｒ１０１およびＲ１０２がいずれもメチル基である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、４−メチル−２−アミノ−４−ヒドロキシ吉草酸）を生産することができる。
【０３２９】
反応液を回収することにより２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を回収できるが、さらに、公知の方法で２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を反応液から分離精製することもできる。そのような公知の方法として、晶析法、クロマトグラフィー法、イオン交換樹脂法、活性炭吸着溶離法、溶媒抽出法等が挙げられる。  
【０３３０】
また、複数種類のα−ケト酸を使用した場合、反応液中に複数種類の２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸が生産される。複数種類の２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸は、晶析やクロマトグラフィー方法によって、互いに分離することができる。
【０３３１】
（５．４）グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼの酸化的脱アミノ化反応を利用したα−ケト酸の製造方法
上述の２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の製造方法は、グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼの還元的アミノ化反応を利用する。
一般的に、グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼ等のアミノ酸デヒドロゲナーゼは、還元的アミノ化反応およびその逆反応、すなわち、酸化的脱アミノ化反応のいずれの反応も触媒し、また、これらデヒドロゲナーゼの活性強度には相関がある（例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ９６，  ２４８−２６２  （１９６５）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５３，  ５７１９−５７２５  （１９７８）、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １００，  ２９−３９  （１９７９））。したがって、グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼの酸化的脱アミノ化を利用して、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸からα−ケト酸を生産することができる。
よって、別の実施形態によれば、グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼの酸化的脱アミノ化反応を利用したα−ケト酸の製造方法が提供される。すなわち、この実施形態にかかるα−ケト酸の製造方法は、
下記一般式（６）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表される２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸から選ばれる２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸と酸化剤とを、
グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼの存在下で反応させて、
下記一般式（２）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＯＣＯＯＨ
（上記一般式（２）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（６）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表されるα−ケト酸を生産する工程を含む。
【０３３２】
２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸をグルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼの存在下で反応させることは、例えば、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸と酸化剤とグルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼとバッファーとを含む反応液中で行うことができる。
【０３３３】
上記一般式（６）により表される２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸としては、「（５．３）２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の回収」の欄に記載した一般式（６）により表される２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を使用することができる。
２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸は、１種を使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。
なお、１種類の２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を反応液中に使用した場合、後述する、α−ケト酸の分離精製を容易に行うことが可能である。
【０３３４】
グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼとしては、「（５．１．４）グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼ」の欄に記載したグルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼを使用することができる。
【０３３５】
酸化剤としては、グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼが利用できる任意の電子受容体を使用することができる。例えば、NAD＋、NADP＋を使用することができる。
【０３３６】
反応液における酸化剤の濃度は、０．０１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲内にあることが好ましく、０．１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲内にあることがより好ましい。また、α−ケト酸の生産に伴い減少する酸化剤は、適切な化合物と酵素を用いて再生することができる。適切な化合物と酵素は、例えば、ピルビン酸と乳酸デヒドロゲナーゼである。
【０３３７】
バッファーとしては、「（５．１．５）バッファー」の欄に記載したバッファーを使用することができる。
【０３３８】
反応温度は、α−ケト酸の生産に適した温度であれば、任意の温度であってもよい。反応温度は、約4〜80℃が好ましく、約20〜60℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良くα−ケト酸を製造できる。反応液のｐＨは、α−ケト酸の生産に適したｐＨであれば、任意のｐＨであってもよい。反応液のｐＨは、約5〜11の範囲内に維持することが好ましい。反応液のｐＨの調整は、塩酸や水酸化カリウム水溶液等を用いて行うことができる。反応中も必要に応じて反応液のｐＨは、適宜調整することができる。反応時間は、α−ケト酸が生産されるのに十分な時間であれば、任意の時間であってもよい。反応時間は、約1分〜10日間時間が好ましく、約1時間〜3日間がより好ましい。
【０３３９】
上述したとおり、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸と酸化剤とをグルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼの存在下で反応させると、α−ケト酸が生産される。
【０３４０】
具体的には、下記一般式（６）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表される２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を使用した場合、
下記一般式（２）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＯＣＯＯＨ
（上記一般式（２）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（６）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表されるα−ケト酸を生産することができる。
【０３４１】
より具体的には、上記一般式（６）中、Ｒ１０１が水素であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を使用した場合、上記一般式（２）中、Ｒ１０１が水素であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソ酪酸）を生産することができる。
上記一般式（６）中、Ｒ１０１がメチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を使用した場合、上記一般式（２）中、Ｒ１０１がメチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸）を生産することができる。
上記一般式（６）中、Ｒ１０１がエチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を使用した場合、上記一般式（２）中、Ｒ１０１がエチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソカプロン酸）を生産することができる。
上記一般式（６）中、Ｒ１０１がプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を使用した場合、上記一般式（２）中、Ｒ１０１がプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソエナント酸）を生産することができる。具体的には、上記一般式（６）中、Ｒ１０１がノルマルプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を使用した場合、上記一般式（２）中、Ｒ１０１がノルマルプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソノルマルヘプタン酸）を生産することができる。また、具体的には、上記一般式（６）中、Ｒ１０１がイソプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を使用した場合、上記一般式（２）中、Ｒ１０１がイソプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソイソエナント酸）を生産することができる。
上記一般式（６）中、Ｒ１０１がペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を使用した場合、上記一般式（２）中、Ｒ１０１がペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソカプリル酸）を生産することができる。具体的には、上記一般式（６）中、Ｒ１０１がノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を使用した場合、上記一般式（２）中、Ｒ１０１がノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるα−ケト酸（すなわち、４−ヒドロキシ−２−オキソノルマルカプリル酸）を生産することができる。
上記一般式（６）中、Ｒ１０１およびＲ１０２がいずれもメチル基である２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を使用した場合、上記一般式（２）中、Ｒ１０１およびＲ１０２がいずれもメチル基であるα−ケト酸（すなわち、４−メチル−４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸）を生産することができる。
【０３４２】
反応液を回収することにより上記のα−ケト酸を回収できるが、さらに、公知の方法でα−ケト酸を反応液から分離精製することもできる。そのような公知の方法として、晶析法、クロマトグラフィー法、イオン交換樹脂法、活性炭吸着溶離法、溶媒抽出法等が挙げられる。
【０３４３】
また、複数種類の２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を使用した場合、反応液中に複数種類のα−ケト酸が生産される。複数種類のα−ケト酸は、晶析やクロマトグラフィーによって、互いに分離することができる。
【０３４４】
（６．）２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸の製造方法
２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸の製造方法は、
以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、
（ｅ）α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する酵素をコードする第５遺伝子、および
（ｆ）２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒する酵素をコードする第６遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、メチルメルカプタンと、
下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（７）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＳＣＨ3)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（上記一般式（７）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸を生産する工程を含む。
【０３４５】
以下の説明において、第１、第５および第６遺伝子を含む上記微生物を、「２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸生産微生物」とも呼ぶ。２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸生産微生物は、第１、第５および第６遺伝子を生来的に有する微生物であってもよいし、宿主を第１、第５および第６遺伝子で形質転換することによって得られる微生物であってもよい。以下、２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸生産微生物が形質転換体である場合を例として説明する。
【０３４６】
（６．１）形質転換体
（６．１．１）宿主
宿主としては、「（１．１．１）宿主」の欄に記載した宿主と同様の宿主を使用することができる。
次に、宿主に導入される第１、第５および第６遺伝子について説明する。
【０３４７】
（６．１．２）第１遺伝子
第１遺伝子としては、「（１．１．２）第１遺伝子」の欄に記載した第１遺伝子と同様の遺伝子を使用することができる。
【０３４８】
（６．１．３）第５遺伝子
第５遺伝子としては、「（４．１．３）第５遺伝子」の欄に記載した第１遺伝子と同様の遺伝子を使用することができる。
【０３４９】
（６．１．４）第６遺伝子
第６遺伝子は、「２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒する酵素」をコードする。「２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒する酵素」とは、後述の測定方法に従って、酵素反応液として、精製タンパク質、２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸（初期基質濃度  1mM）およびメチルメルカプタン（初期基質濃度  5mM）を含む酵素反応液を使用して測定した場合に、0.1mU/ｍｇ protein以上の活性を有する酵素をいう。第６遺伝子は、例えば、第５遺伝子がコードするタンパク質が触媒する還元的アミノ化反応を経由して得られる２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒する酵素をコードする。「２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒する酵素」は、例えば、トランススルフレーション酵素である。
【０３５０】
なお、第５遺伝子がコードするタンパク質が触媒する反応と第６遺伝子がコードするタンパク質が触媒する反応との間には、更なる反応が存在する（図５参照）。具体的には、第５遺伝子がコードするタンパク質が触媒する反応により得られた２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸が、２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸生産微生物が保持する２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸をリン酸化する酵素（例えば、ホモセリンキナーゼ）によって、２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸に変換される反応が存在する。２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸は、第６遺伝子がコードするタンパク質が触媒する反応の基質として使用される。
【０３５１】
第６遺伝子は、例えば、シスタチオニンγ−シンターゼ（Cystathionine γ-synthase、ＥＣ番号２．５．１．４８）をコードする遺伝子であってもよい。
【０３５２】
シスタチオニンγ−シンターゼとしては、例えば、ＣＧＳ１タンパク質が挙げられる。好ましくは、ＣＧＳ１タンパク質は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来である。より好ましくは、ＣＧＳ１タンパク質は、シロイヌナズナ由来のＣＧＳ１成熟タンパク質である。シロイヌナズナ由来のＣＧＳ１成熟タンパク質は、シロイヌナズナ由来の野生型ＣＧＳ１タンパク質において、Ｎ末端から２〜６８番目のアミノ酸残基が欠失したタンパク質である。
【０３５３】
好ましくは、第６遺伝子は以下からなる群より選択される：
（６−１）配列番号３６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、シロイヌナズナ由来のＣＧＳ１成熟タンパク質）であって、２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（６−２）配列番号３６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【０３５４】
「配列番号３６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号３６に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
【０３５５】
シロイヌナズナ由来のＣＧＳ１タンパク質のＵｎｉｐｒｏｔＫＢ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒは、Ｐ５５２１７である。
【０３５６】
より好ましくは、第６遺伝子は、配列番号３５に記載の塩基配列からなる、シロイヌナズナ由来のＣＧＳ１遺伝子の内、成熟タンパク質となる箇所をコリネ型細菌での発現が最適になるように合成された遺伝子である。
【０３５７】
配列番号３５に記載の塩基配列と配列番号３６に記載のアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０３５８】
【表３５】
2020182449.tif 000037
【０３５９】
【表３６】
2020182449.tif 000038
【０３６０】
２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒する活性は、例えば、当該酵素反応を１ｍＭ  ジチオスレイトールを含有する１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨバッファー（ｐＨ７．５）中で２５℃にて行い、反応に伴い遊離する無機リン酸イオンの初期生成速度を測定することで算出できる。必要であれば、微量のピリドキサールリン酸を加えても良い。無機リン酸イオンの生成速度は、例えば、無機リン酸イオンの濃度の時間変化から算出できる。無機リン酸イオンの濃度の測定は、例えば、酵素反応液と２０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を１：２の比率で混合し反応を止めた後、マラカイトグリーン法により可能である。ここでは、２５℃で１分間に１μｍｏｌのスルフィド化合物が形成される活性を１ユニットとする。
【０３６１】
「配列番号３６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ＣＧＳ１遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
【０３６２】
（６．１．５）形質転換のための組換えベクターの構築
第１、第５および第６遺伝子は、形質転換のために適切なプラスミドベクターに組み込むことができる。
【０３６３】
プラスミドベクターとしては、「（１．１．３）形質転換のための組換えベクターの構築」の欄に記載したプラスミドベクターと同様のプラスミドベクターを使用することができる。
【０３６４】
第１、第５および第６遺伝子は、各々個別のプラスミドベクターに組み込んでもよいし、あるいは同一のプラスミドベクターに組み込んでもよい。得られた組換えベクターを用いて形質転換体を作製することができる。
【０３６５】
（６．１．６）形質転換
形質転換方法は、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法としては、「（１．１．４）形質転換」の欄に記載した方法と同様の方法を使用することができる。
【０３６６】
なお、上述のとおりに組換えベクターを用いて形質転換体を作製した場合、第１、第５および第６遺伝子の各々は、宿主の染色体に組み込まれてもよいし、あるいは、組換えベクターの形態で宿主の細胞質内に存在していてもよい。
【０３６７】
（６．１．７）宿主染色体遺伝子の破壊または欠失
宿主は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。宿主がコリネ型細菌である場合、宿主は、「（１．１．５）宿主染色体遺伝子の破壊または欠失」の欄に記載した遺伝子破壊株または遺伝子欠失株と同様の遺伝子破壊株または遺伝子欠失株を使用することができる。また、遺伝子破壊株または遺伝子欠失株を作製する方法としては、「（１．１．５）宿主染色体遺伝子の破壊または欠失」の欄に記載した方法と同様の方法を使用することができる。このような遺伝子破壊株または遺伝子欠失株を宿主として用いることにより２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸の生産性を向上させたり、副生成物の生成を抑制したりすることができる。
【０３６８】
（６．１．８）２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸生産微生物の具体例
具体的には、２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸生産微生物としては、
以下からなる群より選択される第１遺伝子：
（１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２）配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−４）配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−５）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（１−６）配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
以下からなる群より選択される第５遺伝子：
（５−１）配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−２）配列番号３０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−３）配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−４）配列番号３２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−５）配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（５−６）配列番号３４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；および
以下からなる群より選択される第６遺伝子：
（６−１）配列番号３６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（６−２）配列番号３６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
を含むコリネ型細菌を使用することができる。
【０３６９】
（６．２）培養工程
２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸生産微生物（例えば、上述した形質転換体）を、ピルビン酸供給化合物とカルボニル化合物とメチルメルカプタンとの存在下で培養して、２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸を生産することができる。「ピルビン酸供給化合物とカルボニル化合物とメチルメルカプタンとの存在下で培養すること」は、ピルビン酸供給化合物とカルボニル化合物とメチルメルカプタンとを含む培養液中で培養することにより行うことができる。好ましくは、「ピルビン酸供給化合物とカルボニル化合物とメチルメルカプタンとの存在下で培養すること」は、ピルビン酸供給化合物とカルボニル化合物とメチルメルカプタンとを添加した培養液中で培養することにより行うことができる。
【０３７０】
ピルビン酸供給化合物とカルボニル化合物とメチルメルカプタンとの存在下での培養に先立ち、「（１．２）培養工程」の欄に記載した増殖培養を行うことが好ましい。
【０３７１】
生産培養に先立って増殖培養を行う場合、増殖培養とその後の生産培養は、例えば、以下のとおり行うことができる。増殖培養の後、先ず、増殖培養で使用した培養液（以下、増殖用培養液と呼ぶ）と増殖用培養液中に懸濁された形質転換体とを含む容器を遠心分離機にかけて、形質転換体を沈殿させることができる。その後、増殖用培養液を容器から除去し、分離された形質転換体を、生産培養で使用する培養液（以下、生産用培養液と呼ぶ）に懸濁し、生産培養を行うことができる。
【０３７２】
あるいは、増殖培養とその後の生産培養は、増殖培養の後、形質転換体を含有する増殖用培養液にピルビン酸供給化合物、カルボニル化合物およびメチルメルカプタンを添加し、好気的条件を嫌気的条件または微好気的条件に変更することにより、培養液の交換を行うことなく生産培養を行うことができる。このように、増殖培養と生産培養とを連続的に行うこともできる。
【０３７３】
（６．２．１）増殖用培養液
増殖用培養液としては、「（１．２．１）増殖用培養液」の欄に記載した増殖用培養液と同様の培養液を使用することができる。
【０３７４】
（６．２．２）生産用培養液
生産用培養液としては、ピルビン酸供給化合物、カルボニル化合物、メチルメルカプタン及びその他必要な成分を含有する培養液を用いることができる。その他必要な成分として、例えば、無機塩類、糖類以外の炭素源又は窒素源を用いることができる。
【０３７５】
ピルビン酸供給化合物としては、「（１．２．２）生産用培養液」の欄に記載したピルビン酸供給化合物を使用することができる。
【０３７６】
カルボニル化合物としては、「（１．２．２）生産用培養液」の欄に記載したカルボニル化合物を使用することができる。
【０３７７】
なお、１種類のカルボニル化合物を生産用培養液中に使用した場合、後述する「（６．２．４）２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸の回収」で述べる分離精製を容易に行うことが可能である。
【０３７８】
生産用培養液におけるメチルメルカプタンの濃度は、１ｍＭ〜１Ｍの範囲内にあることが好ましく、１０ｍＭ〜３００ｍＭの範囲内にあることがより好ましい。また、２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸の生産に伴うメチルメルカプタンの減少に応じて、メチルメルカプタンの追加添加を行うことができる。
【０３７９】
その他必要な成分としては、「（１．２．２）生産用培養液」の欄に記載したその他必要な成分と同様の成分を使用することができる。
【０３８０】
具体的な生産用培養液としては、グルコース、ホルムアルデヒド、メチルメルカプタン、硫酸アンモニウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄（ＩＩ）および硫酸マンガン（ＩＩ）を含み、７．０のｐＨを有する培地を用いることができる。
【０３８１】
また、生産用培養液としては、増殖培養で用いた増殖用培養液と同じ組成のベース培養液に、ピルビン酸供給化合物とカルボニル化合物とメチルメルカプタンとを添加して得られる培養液を用いることもできる。なお、上述のベース培養液中に十分な量でピルビン酸供給化合物が存在する場合、ピルビン酸供給化合物を添加しなくてもよい。
【０３８２】
（６．２．３）生産培養の条件
生産培養における培養温度は、２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸の生産に適した温度であれば、任意の温度であってもよい。生産培養における培養温度は、約２０〜５０℃が好ましく、約２５〜４７℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良く２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸を製造できる。生産用培養液のｐＨは、２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸の生産に適したｐＨであれば、任意のｐＨであってもよい。生産用培養液のｐＨは、約６〜８の範囲内に維持することが好ましい。生産用培養液のｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸；水酸化カリウム水溶液等のアルカリ溶液；尿素；炭酸カルシウム；アンモニア；４−モルホリノプロパンスルホン酸等を含むｐＨ緩衝液等を用いて行うことができる。生産培養中も必要に応じて生産用培養液のｐＨは、適宜調整することができる。生産培養における培養時間は、形質転換体が２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸を生産するのに十分な時間であれば、任意の時間であってもよい。生産培養における培養時間は、約３時間〜７日間が好ましく、約１〜３日間がより好ましい。
生産培養は、好気的条件の下で行われてもよく、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われてもよい。これは、上述した形質転換体が、好気的条件の下でも嫌気的条件または微好気的条件の下でも働く、２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸を生産する経路を有しているためである。２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸を生産する経路は、後述の「（６．３）作用および効果」の欄で述べる。
【０３８３】
＜嫌気的条件または微好気的条件＞
生産培養は、好ましくは、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われる。
【０３８４】
形質転換体を嫌気的条件下または微好気的条件下で培養すると、形質転換体は実質的に増殖せず、一層効率的に２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸を生産することができる。
【０３８５】
「嫌気的条件または微好気的条件」は、の欄に記載した「（１．２．３）生産培養の条件」の欄に記載した「嫌気的条件または微好気的条件」と同様の条件とすることができる。
【０３８６】
＜高密度条件＞
生産培養は、好ましくは、形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる。このような状態で形質転換体を培養すると、一層効率的に２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸を生産することができる。
【０３８７】
「形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態」は、「（１．２．３）生産培養の条件」の欄に記載した「形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態」と同様の状態とすることができる。
【０３８８】
生産培養は、嫌気的条件または微好気的条件の下で、形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われることがより好ましい。
【０３８９】
（６．２．４）２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸の回収
上述のとおり、第１、第５および第６遺伝子を含む形質転換体を生産用培養液中で培養すると、生産用培養液中に２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸が生産される。
【０３９０】
具体的には、生産用培養液中に下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物を使用した場合、下記一般式（７）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＳＣＨ3)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（上記一般式（７）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸を生産することができる。
【０３９１】
より具体的には、上記一般式（１）中、Ｒ１０１が水素であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（７）中、Ｒ１０１が水素であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−メチルチオ酪酸）を生産することができる。
上記一般式（１）中、Ｒ１０１がメチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（７）中、Ｒ１０１がメチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−メチルチオ吉草酸）を生産することができる。
上記一般式（１）中、Ｒ１０１がエチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（７）中、Ｒ１０１がエチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−メチルチオカプロン酸）を生産することができる。
上記一般式（１）中、Ｒ１０１がプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（７）中、Ｒ１０１がプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−メチルチオエナント酸）を生産することができる。具体的には、上記一般式（１）中、Ｒ１０１がノルマルプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（７）中、Ｒ１０１がノルマルプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−メチルチオノルマルヘプタン酸）を生産することができる。また、具体的には、上記一般式（１）中、Ｒ１０１がイソプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（７）中、Ｒ１０１がイソプロピル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−メチルチオイソエナント酸）を生産することができる。
上記一般式（１）中、Ｒ１０１がペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（７）中、Ｒ１０１がペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−メチルチオカプリル酸）を生産することができる。具体的には、上記一般式（１）中、Ｒ１０１がノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（７）中、Ｒ１０１がノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸（すなわち、２−アミノ−４−メチルチオノルマルカプリル酸）を生産することができる。
上記一般式（１）中、Ｒ１０１およびＲ１０２がいずれもメチル基であるカルボニル化合物を使用した場合、上記一般式（７）中、Ｒ１０１およびＲ１０２がいずれもメチル基である２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸（すなわち、４−メチル−２−アミノ−４−メチルチオ吉草酸）を生産することができる。
なお、２−アミノ−４−メチルチオ酪酸はメチオニンとも呼ばれる。メチオニンは、例えば、Ｌ−メチオニンである。
【０３９２】
生産用培養液を回収することにより上記の２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸を回収できるが、さらに、公知の方法で２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸を生産用培養液から分離精製することもできる。そのような公知の方法として、晶析法、クロマトグラフィー法、イオン交換樹脂法、活性炭吸着溶離法、溶媒抽出法等が挙げられる。
【０３９３】
なお、生産用培養液からは、第１遺伝子がコードする酵素が触媒するアルドール反応によって生じたα−ケト酸等の物質を回収することもできる。
【０３９４】
また、複数種類のカルボニル化合物を使用した場合、培養液中に複数種類の２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸が生産される。複数種類の２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸は、晶析やクロマトグラフィーによって、互いに分離することができる。
【０３９５】
（６．３）作用および効果
２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸生産微生物が２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸を生産するプロセスを模式的に図５に示す。図５に示すプロセスにおいては、ピルビン酸供給化合物がグルコースであり、カルボニル化合物がホルムアルデヒドであり、２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸がメチオニンである場合を例として説明する。
【０３９６】
図５に示すように、先ず、２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸生産微生物１５は、グルコース２、ホルムアルデヒド３及びメチルメルカプタン１６を取り込む。次に、グルコース２は、解糖系を通じてピルビン酸４に変換される。次に、ピルビン酸４とホルムアルデヒド３とは、第１遺伝子がコードする「ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素」によって４−ヒドロキシ−２−オキソ酪酸５に変換される。次に、４−ヒドロキシ−２−オキソ酪酸５は、第５遺伝子がコードする「α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する酵素」によってホモセリン１４に変換される。次に、ホモセリン１４は、２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸生産微生物が生来的に有するホモセリンキナーゼによってО−ホスホホモセリン１７に変換される。メチルメルカプタン１６とО−ホスホホモセリン１７とは、第６遺伝子がコードする「О−ホスホホモセリンをメチオニンに変換する酵素」によってメチオニン１８に変換される。以上のようにして、メチオニンが生産される。
【０３９７】
（７．）好ましい実施形態
以下に、本発明の好ましい実施形態をまとめて示す。
［Ａ１］  ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、
下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（２）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＯＣＯＯＨ
（上記一般式（２）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表されるα−ケト酸を生産する工程を含む、α−ケト酸の製造方法。
［Ａ２］  前記一般式（１）及び（２）中、Ｒ１０２が水素である［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ３］  前記一般式（１）及び（２）中、Ｒ１０１が、水素、メチル基、エチル基、プロピル基またはペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である［Ａ１］または［Ａ２］に記載の方法。
［Ａ４］  前記一般式（１）及び（２）中、Ｒ１０１が、水素、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基またはノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である［Ａ１］〜［Ａ３］の何れか１に記載の方法。
［Ａ５］  前記培養が、前記ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［Ａ１］〜［Ａ４］の何れか１に記載の方法。
［Ａ６］  前記培養液は、前記ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を添加した培養液である［Ａ５］に記載の方法。
［Ａ７］  前記ピルビン酸供給化合物は、前記培養液中で０．１〜４０（ｗ／ｖ）％、好ましくは、１〜２０（ｗ／ｖ）％の濃度になるように添加される［Ａ６］に記載の方法。
［Ａ８］  カルボニル化合物は、前記培養液中で０．００１〜１０（ｗ／ｖ）％、好ましくは、０．０１〜１（ｗ／ｖ）％の濃度になるように添加される［Ａ６］または［Ａ７］に記載の方法。
［Ａ９］  前記ピルビン酸供給化合物は、糖類である［Ａ１］〜［Ａ８］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１０］  前記糖類は、単糖、例えばフルクトースもしくはグルコース；二糖、例えばスクロース；多糖、例えば構成単糖としてグルコースを含む多糖；または植物（例えば非可食農産廃棄物またはエネルギー作物）を糖化酵素で処理することにより得られた糖化液である［Ａ１］〜［Ａ９］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１１］  前記糖類は、グルコースである［Ａ１］〜［Ａ１０］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１２］  前記ピルビン酸供給化合物は、ピルビン酸である［Ａ１］〜［Ａ８］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１３］  前記培養が、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われる［Ａ１］〜［Ａ１２］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１４］  前記培養が、前記ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［Ａ１３］に記載の方法。
［Ａ１５］  前記嫌気的条件または前記微好気的条件は、前記培養液中の溶存酸素濃度が０〜２ｐｐｍの範囲内にあり、好ましくは０〜１ｐｐｍの範囲内にあり、より好ましくは０〜０．５ｐｐｍの範囲内にある条件である［Ａ１４］に記載の方法。
［Ａ１６］  前記培養が、前記微生物を培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる［Ａ１］〜［Ａ１５］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１７］  前記培養が、前記ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［Ａ１６］に記載の方法。
［Ａ１８］  前記微生物を前記培養液中に高密度に懸濁させた前記状態は、前記微生物を前記培養液中に、前記微生物の湿菌体重量％が１〜５０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態、好ましくは、前記微生物を前記培養液中に、前記微生物の湿菌体重量％が３〜３０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態である［Ａ１７］に記載の方法。
［Ａ１９］  前記遺伝子は、アルドラーゼをコードする［Ａ１］〜［Ａ１８］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２０］  前記遺伝子は、タイプＩのアルドラーゼをコードする［Ａ１］〜［Ａ１９］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２１］  前記遺伝子は、タイプＩＩのアルドラーゼをコードする［Ａ１］〜［Ａ１９］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２２］  前記遺伝子は、以下からなる群より選択されるアルドラーゼをコードする：
（ａ１）２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホグルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolase）、
（ａ２）２−デヒドロ−３−デオキシ−６−ホスホグルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase）、
（ａ３）４−ヒドロキシ−２−オキソグルタレートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase）、
（ａ４）（４Ｓ）−４−ヒドロキシル−２−オキソグルタレートアルドラーゼ（(4S)-4-hydroxyl-2-oxoglutarate aldolase）、
（ａ５）２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−ペントネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase）、
（ａ６）２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-D-gluconate aldolase）、
（ａ７）３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソネートアルドラーゼ（3-deoxy-D-manno-octulosonate aldolase）、
（ａ８）４−ヒドロキシル−２−オキソバレレートアルドラーゼ（4-hydroxyl-2-oxovalerate aldolase）、
（ａ９）４−（２−カルボキシフェニル）−２−オキソブ−３−エノエートアルドラーゼ（4-(2-carboxyphenyl)-2-oxobut-3-enoate aldolase）、
（ａ１０）４−ヒドロキシ−２−オキソヘプタンジオエートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxoheptanedioate aldolase）、
（ａ１１）２−デヒドロ−３−デオキシグルカレートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxyglucarate aldolase）、
（ａ１２）２−ケト−３−デオキシ−Ｌ−ラムノネートアルドラーゼ（2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase）、
（ａ１３）４−ヒドロキシル−４−メチル−２−オキソグルタレートアルドラーゼ（4-hydroxyl-4-methyl-2-oxoglutarate aldolase）、および
（ａ１４）４−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノネートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxohexanonate aldolase）；
［Ａ１］〜［Ａ２１］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２３］  前記遺伝子は、ｅｄａタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｅｄａタンパク質；ｄｇｏＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｄｇｏＡタンパク質；ｙｊｈＨタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｙｊｈＨタンパク質；ｙａｇＥタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｙａｇＥタンパク質；ｎａｎＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｎａｎＡタンパク質；ｍｈｐＥタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｍｈｐＥタンパク質；ｈｐａＩタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｈｐａＩタンパク質；ｂｐｈＩタンパク質、好ましくは、バークホルデリア  ゼノボランス由来のｂｐｈＩタンパク質；ｐｈｄＪタンパク質、好ましくは、ノカルディオイデス属菌由来のｐｈｄＪタンパク質；ｇａｒＬタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｇａｒＬタンパク質；ｒｈｍＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｒｈｍＡタンパク質；およびｇａｌＣタンパク質、好ましくは、シュードモナス  プチダ由来のｇａｌＣタンパク質；からなる群より選択されるアルドラーゼをコードする［Ａ１］〜［Ａ２２］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２４］  前記遺伝子は以下からなる群より選択される：
（１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２）配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−４）配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−５）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−６）配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−７）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−８）配列番号８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−９）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１０）配列番号１０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１２）配列番号１２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１３）配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１４）配列番号１４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１５）配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１６）配列番号１６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１７）配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１８）配列番号１８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１９）配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２０）配列番号２０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２１）配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（１−２２）配列番号２２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
［Ａ１］〜［Ａ２３］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２５］  前記遺伝子は以下からなる群より選択される：
配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号５に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号９に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１１に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１３に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１５に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１７に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１９に記載の塩基配列からなる遺伝子、および
配列番号２１に記載の塩基配列からなる遺伝子；
［Ａ１］〜［Ａ２４］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２６］  前記微生物は、好気性細菌、好ましくは、コリネ型細菌、より好ましくは、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）菌、より好ましくは、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である［Ａ１］〜［Ａ２５］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２７］  前記微生物は、前記遺伝子によって形質転換された微生物である［Ａ１］〜［Ａ２６］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２８］  前記微生物は、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase）遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyrvate carboxylase）遺伝子、ピルビン酸カルボキシラーゼ（pyruvate carboxylase）遺伝子、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（pyruvate dehydrogenase）遺伝子、グルタミン酸−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（glutamate-pyruvate aminotransferase）遺伝子、アセトラクテートシンターゼ（acetolactate synthase）遺伝子、Ｎ−スクシニルジアミノピメレート（N-succinyldiaminopimelate aminotransferase）遺伝子、S-(ヒドロキシメチル)ミコチオールデヒドロゲナーゼ（S-(hydroxymethyl)mycothiol dehydrogenase）遺伝子、およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（acetaldehyde dehydrogenase）遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の欠損株である［Ａ１］〜［Ａ２７］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２９］  前記培養の前に、前記微生物を好気的条件下で培養することを更に含む［Ａ１］〜［Ａ２８］の何れか１に記載の方法。
［Ａ３０］  生産されたα−ケト酸を回収することを更に含む［Ａ１］〜［Ａ２９］の何れか１に記載の方法。
【０３９８】
［Ｂ１］  以下の遺伝子：
以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、
（ｂ）α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素をコードする第２遺伝子、および
（ｃ）アルデヒドの還元反応を触媒する酵素をコードする第３遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、
下記一般式（３）：
Ｒ１０３Ｃ（Ｏ）Ｒ１０４
（ここでＲ１０３およびＲ１０４は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である。ただし、Ｒ１０３が水素であるとき、Ｒ１０４は水素ではない。）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（４）：
Ｒ１０３Ｃ（Ｒ１０４）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ
（上記一般式（４）におけるＲ１０３およびＲ１０４は、それぞれ上記一般式（３）におけるＲ１０３およびＲ１０４と同じ基である）
により表される１，３−ジオールを生産する工程を含む、１，３−ジオールの製造方法。
［Ｂ２］  前記一般式（３）及び（４）中、Ｒ１０４が水素である［Ｂ１］に記載の方法。
［Ｂ３］  前記一般式（３）及び（４）中、Ｒ１０３が、水素、メチル基、エチル基、プロピル基またはペンチル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素である［Ｂ１］または［Ｂ２］に記載の方法。
［Ｂ４］  前記一般式（３）及び（４）中、Ｒ１０３が、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基またはノルマルペンチル基であり、かつ、Ｒ１０４が水素である［Ｂ１］〜［Ｂ３］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ５］  前記培養が、前記ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［Ｂ１］〜［Ｂ４］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ６］  前記培養液は、前記ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を添加した培養液である［Ｂ５］に記載の方法。
［Ｂ７］  前記ピルビン酸供給化合物は、前記培養液中で０．１〜４０（ｗ／ｖ）％、好ましくは、１〜２０（ｗ／ｖ）％の濃度になるように添加される［Ｂ６］に記載の方法。
［Ｂ８］  カルボニル化合物は、前記培養液中で０．００１〜１０（ｗ／ｖ）％、好ましくは、０．０１〜１（ｗ／ｖ）％の濃度になるように添加される［Ｂ６］または［Ｂ７］に記載の方法。
［Ｂ９］  前記ピルビン酸供給化合物は、糖類である［Ｂ１］〜［Ｂ８］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１０］  前記糖類は、単糖、例えばフルクトースもしくはグルコース；二糖、例えばスクロース；多糖、例えば構成単糖としてグルコースを含む多糖；または植物（例えば非可食農産廃棄物またはエネルギー作物）を糖化酵素で処理することにより得られた糖化液である［Ｂ１］〜［Ｂ９］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１１］  前記糖類は、グルコースである［Ｂ１］〜［Ｂ１０］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１２］  前記ピルビン酸供給化合物は、ピルビン酸である［Ｂ１］〜［Ｂ８］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１３］  前記培養が、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われる［Ｂ１］〜［Ｂ１２］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１４］  前記培養が、前記ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［Ｂ１３］に記載の方法。
［Ｂ１５］  前記嫌気的条件または前記微好気的条件は、前記培養液中の溶存酸素濃度が０〜２ｐｐｍの範囲内にあり、好ましくは０〜１ｐｐｍの範囲内にあり、より好ましくは０〜０．５ｐｐｍの範囲内にある条件である［Ｂ１４］に記載の方法。
［Ｂ１６］  前記培養が、前記微生物を培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる［Ｂ１］〜［Ｂ１５］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１７］  前記培養が、前記ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［Ｂ１６］に記載の方法。
［Ｂ１８］  前記微生物を前記培養液中に高密度に懸濁させた前記状態は、前記微生物を前記培養液中に、前記微生物の湿菌体重量％が１〜５０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態、好ましくは、前記微生物を前記培養液中に、前記微生物の湿菌体重量％が３〜３０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態である［Ｂ１７］に記載の方法。
［Ｂ１９］  生産された１，３−ジオールを回収することを更に含む［Ｂ１］〜［Ｂ１８］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ２０］  以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、
（ｂ）α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素をコードする第２遺伝子、および
（ｃ）アルデヒドの還元反応を触媒する酵素をコードする第３遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物の存在下で培養して、１，３−ブタンジオールを生産する工程を含む、１，３−ブタンジオールの製造方法。
［Ｂ２１］  前記培養が、前記ピルビン酸供給化合物を含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［Ｂ２０］に記載の方法。
［Ｂ２２］  前記培養液は、前記ピルビン酸供給化合物を添加した培養液である［Ｂ２１］に記載の方法。
［Ｂ２３］  前記ピルビン酸供給化合物は、前記培養液中で０．１〜４０（ｗ／ｖ）％、好ましくは、１〜２０（ｗ／ｖ）％の濃度になるように添加される［Ｂ２２］に記載の方法。
［Ｂ２４］  前記ピルビン酸供給化合物は、糖類である［Ｂ２０］〜［Ｂ２３］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ２５］  前記糖類は、単糖、例えばフルクトースもしくはグルコース；二糖、例えばスクロース；多糖、例えば構成単糖としてグルコースを含む多糖；または植物（例えば非可食農産廃棄物またはエネルギー作物）を糖化酵素で処理することにより得られた糖化液である［Ｂ２０］〜［Ｂ２４］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ２６］  前記糖類は、グルコースである［Ｂ２０］〜［Ｂ２５］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ２７］  前記培養が、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われる［Ｂ２０］〜［Ｂ２６］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ２８］  前記培養が、前記ピルビン酸供給化合物を含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［Ｂ２７］に記載の方法。
［Ｂ２９］  前記嫌気的条件または前記微好気的条件は、前記培養液中の溶存酸素濃度が０〜２ｐｐｍの範囲内にあり、好ましくは０〜１ｐｐｍの範囲内にあり、より好ましくは０〜０．５ｐｐｍの範囲内にある条件である［Ｂ２８］に記載の方法。
［Ｂ３０］  前記培養が、前記微生物を培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる［Ｂ２０］〜［Ｂ２９］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ３１］  前記培養が、前記ピルビン酸供給化合物を含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［Ｂ３０］に記載の方法。
［Ｂ３２］  前記微生物を前記培養液中に高密度に懸濁させた前記状態は、前記微生物を前記培養液中に、前記微生物の湿菌体重量％が１〜５０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態、好ましくは、前記微生物を前記培養液中に、前記微生物の湿菌体重量％が３〜３０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態である［Ｂ３１］に記載の方法。
［Ｂ３３］  生産された１，３−ブタンジオールを回収することを更に含む［Ｂ２０］〜［Ｂ３２］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ３４］  前記第１遺伝子は、アルドラーゼをコードする［Ｂ１］〜［Ｂ３３］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ３５］  前記第１遺伝子は、タイプＩのアルドラーゼをコードする［Ｂ１］〜［Ｂ３４］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ３６］  前記第１遺伝子は、タイプＩＩのアルドラーゼをコードする［Ｂ１］〜［Ｂ３４］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ３７］  前記第１遺伝子は、以下からなる群より選択されるアルドラーゼをコードする：
（ａ１）２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホグルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolase）、
（ａ２）２−デヒドロ−３−デオキシ−６−ホスホグルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase）、
（ａ３）４−ヒドロキシ−２−オキソグルタレートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase）、
（ａ４）（４Ｓ）−４−ヒドロキシル−２−オキソグルタレートアルドラーゼ（(4S)-4-hydroxyl-2-oxoglutarate aldolase）、
（ａ５）２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−ペントネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase）、
（ａ６）２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-D-gluconate aldolase）、
（ａ７）３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソネートアルドラーゼ（3-deoxy-D-manno-octulosonate aldolase）、
（ａ８）４−ヒドロキシル−２−オキソバレレートアルドラーゼ（4-hydroxyl-2-oxovalerate aldolase）、
（ａ９）４−（２−カルボキシフェニル）−２−オキソブ−３−エノエートアルドラーゼ（4-(2-carboxyphenyl)-2-oxobut-3-enoate aldolase）、
（ａ１０）４−ヒドロキシ−２−オキソヘプタンジオエートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxoheptanedioate aldolase）、
（ａ１１）２−デヒドロ−３−デオキシグルカレートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxyglucarate aldolase）、
（ａ１２）２−ケト−３−デオキシ−Ｌ−ラムノネートアルドラーゼ（2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase）、
（ａ１３）４−ヒドロキシル−４−メチル−２−オキソグルタレートアルドラーゼ（4-hydroxyl-4-methyl-2-oxoglutarate aldolase）、および
（ａ１４）４−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノネートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxohexanonate aldolase）；
［Ｂ１］〜［Ｂ３６］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ３８］  前記第１遺伝子は、ｅｄａタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｅｄａタンパク質；ｄｇｏＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｄｇｏＡタンパク質；ｙｊｈＨタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｙｊｈＨタンパク質；ｙａｇＥタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｙａｇＥタンパク質；ｎａｎＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｎａｎＡタンパク質；ｍｈｐＥタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｍｈｐＥタンパク質；ｈｐａＩタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｈｐａＩタンパク質；ｂｐｈＩタンパク質、好ましくは、バークホルデリア  ゼノボランス由来のｂｐｈＩタンパク質；ｐｈｄＪタンパク質、好ましくは、ノカルディオイデス属菌由来のｐｈｄＪタンパク質；ｇａｒＬタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｇａｒＬタンパク質；ｒｈｍＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｒｈｍＡタンパク質；およびｇａｌＣタンパク質、好ましくは、シュードモナス  プチダ由来のｇａｌＣタンパク質；からなる群より選択されるアルドラーゼをコードする［Ｂ１］〜［Ｂ３７］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ３９］  前記第１遺伝子は以下からなる群より選択される：
（１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２）配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−４）配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−５）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−６）配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−７）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−８）配列番号８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−９）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１０）配列番号１０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１２）配列番号１２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１３）配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１４）配列番号１４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１５）配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１６）配列番号１６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１７）配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１８）配列番号１８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１９）配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２０）配列番号２０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２１）配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（１−２２）配列番号２２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
［Ｂ１］〜［Ｂ３８］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ４０］  前記第１遺伝子は以下からなる群より選択される：
配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号５に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号９に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１１に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１３に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１５に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１７に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１９に記載の塩基配列からなる遺伝子、および
配列番号２１に記載の塩基配列からなる遺伝子；
［Ｂ１］〜［Ｂ３９］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ４１］  前記第２遺伝子は、前記アルドール反応により得られたα−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する前記酵素をコードする［Ｂ１］〜［Ｂ４０］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ４２］  前記第２遺伝子は、脱炭酸酵素をコードする［Ｂ１］〜［Ｂ４１］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ４３］  前記第２遺伝子は、以下からなる群より選択される脱炭酸酵素をコードする：
（ｂ１）ピルベートデカルボキシラーゼ（pyruvate decarboxylase）、
（ｂ２）ベンゾイルフォルメートデカルボキシラーゼ（benzoylformate decarboxylase）、および
（ｂ３）インドールピルベートデカルボキシラーゼ（indolepyruvate decarboxylase）；
［Ｂ１］〜［Ｂ４２］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ４４］  前記第２遺伝子は、ｐｄｃタンパク質、好ましくは、ザイモモナス  モビリス由来のｐｄｃタンパク質；ｍｄｌＣタンパク質、好ましくは、シュードモナス  プチダ由来のｍｄｌＣタンパク質；ｋｉｖＤタンパク質、好ましくは、ラクトコッカス  ラクティス由来のｋｉｖＤタンパク質；からなる群より選択される脱炭酸酵素をコードする［Ｂ１］〜［Ｂ４３］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ４５］  前記第２遺伝子は、ｍｄｌＣタンパク質、好ましくは、シュードモナス  プチダ由来のｍｄｌＣタンパク質をコードする［Ｂ１］〜［Ｂ４４］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ４６］  前記第２遺伝子は以下からなる群より選択される：
（２−１）配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（２−２）配列番号２４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
［Ｂ１］〜［Ｂ４５］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ４７］  前記第２遺伝子は、配列番号２３に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｂ１］〜［Ｂ４６］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ４８］  前記第３遺伝子は、前記第１遺伝子がコードする前記酵素が触媒する前記アルドール反応の基質であるアルデヒドとは種類が異なるアルデヒドの還元反応を触媒する前記酵素をコードする［Ｂ１］〜［Ｂ４７］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ４９］  前記第３遺伝子は、前記脱炭酸反応により得られたアルデヒドの還元反応を触媒する前記酵素をコードする［Ｂ１］〜［Ｂ４８］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ５０］  前記第３遺伝子は、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする［Ｂ１］〜［Ｂ４９］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ５１］  前記第３遺伝子は、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（1,3-propanediol dehydrogenase）をコードする［Ｂ１］〜［Ｂ５０］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ５２］  前記第３遺伝子は、ｄｈａＴタンパク質、好ましくは、クレブシエラ  ニューモニエ由来のｄｈａＴタンパク質；およびｌｐｏタンパク質、好ましくは、ラクトバチルス  ロイテリ由来のｌｐｏタンパク質；からなる群より選択される１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼをコードする［Ｂ１］〜［Ｂ５１］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ５３］  前記第３遺伝子は以下からなる群より選択される：
（３−１）配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（３−２）配列番号２６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
［Ｂ１］〜［Ｂ５２］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ５４］  前記第３遺伝子は、配列番号２５に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｂ１］〜［Ｂ５３］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ５５］  前記微生物は、好気性細菌、好ましくは、コリネ型細菌、より好ましくは、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）菌、より好ましくは、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である［Ｂ１］〜［Ｂ５４］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ５６］  前記微生物は、前記第１、前記第２および前記第３遺伝子によって形質転換された微生物である［Ｂ１］〜［Ｂ５５］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ５７］  前記微生物は、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase）遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyrvate carboxylase）遺伝子、ピルビン酸カルボキシラーゼ（pyruvate carboxylase）遺伝子、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（pyruvate dehydrogenase）遺伝子、グルタミン酸−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（glutamate-pyruvate aminotransferase）遺伝子、アセトラクテートシンターゼ（acetolactate synthase）遺伝子、Ｎ−スクシニルジアミノピメレート（N-succinyldiaminopimelate aminotransferase）遺伝子、S-(ヒドロキシメチル)ミコチオールデヒドロゲナーゼ（S-(hydroxymethyl)mycothiol dehydrogenase）遺伝子、およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（acetaldehyde dehydrogenase）遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の欠損株である［Ｂ１］〜［Ｂ５６］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ５８］  前記培養の前に、前記微生物を好気的条件下で培養することを更に含む［Ｂ１］〜［Ｂ５７］の何れか１に記載の方法。
【０３９９】
［Ｃ１］  以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、および
（ｄ）α−ケト酸の還元反応を触媒する酵素をコードする第４遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、
下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（５）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ
（上記一般式（５）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２，４−ジヒドロキシカルボン酸を生産する工程を含む、２，４−ジヒドロキシカルボン酸の製造方法。
［Ｃ２］  前記一般式（１）及び（５）中、Ｒ１０２が水素である［Ｃ１］に記載の方法。
［Ｃ３］  前記一般式（１）及び（５）中、Ｒ１０１が、水素、メチル基、エチル基、プロピル基またはペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である［Ｃ１］または［Ｃ２］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ４］  前記一般式（１）及び（５）中、Ｒ１０１およびＲ１０２が、水素である［Ｃ１］〜［Ｃ３］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ５］  前記培養が、前記ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［Ｃ１］〜［Ｃ４］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ６］  前記培養液は、前記ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を添加した培養液である［Ｃ５］に記載の方法。
［Ｃ７］  前記ピルビン酸供給化合物は、前記培養液中で０．１〜４０（ｗ／ｖ）％、好ましくは、１〜２０（ｗ／ｖ）％の濃度になるように添加される［Ｃ６］に記載の方法。
［Ｃ８］  カルボニル化合物は、前記培養液中で０．００１〜１０（ｗ／ｖ）％、好ましくは、０．０１〜１（ｗ／ｖ）％の濃度になるように添加される［Ｃ６］または［Ｃ７］に記載の方法。
［Ｃ９］  前記ピルビン酸供給化合物は、糖類である［Ｃ１］〜［Ｃ８］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ１０］  前記糖類は、単糖、例えばフルクトースもしくはグルコース；二糖、例えばスクロース；多糖、例えば構成単糖としてグルコースを含む多糖；または植物（例えば非可食農産廃棄物またはエネルギー作物）を糖化酵素で処理することにより得られた糖化液である［Ｃ１］〜［Ｃ９］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ１１］  前記糖類は、グルコースである［Ｃ１］〜［Ｃ１０］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ１２］  前記ピルビン酸供給化合物は、ピルビン酸である［Ｃ１］〜［Ｃ１１］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ１３］  前記培養が、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われる［Ｃ１］〜［Ｃ１２］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ１４］  前記培養が、前記ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［Ｃ１３］に記載の方法。
［Ｃ１５］  前記嫌気的条件または前記微好気的条件は、前記培養液中の溶存酸素濃度が０〜２ｐｐｍの範囲内にあり、好ましくは０〜１ｐｐｍの範囲内にあり、より好ましくは０〜０．５ｐｐｍの範囲内にある条件である［Ｃ１４］に記載の方法。
［Ｃ１６］  前記培養が、前記微生物を培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる［Ｃ１］〜［Ｃ１５］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ１７］  前記培養が、前記ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［Ｃ１６］に記載の方法。
［Ｃ１８］  前記微生物を前記培養液中に高密度に懸濁させた前記状態は、前記微生物を前記培養液中に、前記微生物の湿菌体重量％が１〜５０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態、好ましくは、前記微生物を前記培養液中に、前記微生物の湿菌体重量％が３〜３０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態である［Ｃ１７］に記載の方法。
［Ｃ１９］  前記第１遺伝子は、アルドラーゼをコードする［Ｃ１］〜［Ｃ１８］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ２０］  前記第１遺伝子は、タイプＩのアルドラーゼをコードする［Ｃ１］〜［Ｃ１９］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ２１］  前記第１遺伝子は、タイプＩＩのアルドラーゼをコードする［Ｃ１］〜［Ｃ２９］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ２２］  前記第１遺伝子は、以下からなる群より選択されるアルドラーゼをコードする：
（ａ１）２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホグルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolase）、
（ａ２）２−デヒドロ−３−デオキシ−６−ホスホグルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase）、
（ａ３）４−ヒドロキシ−２−オキソグルタレートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase）、
（ａ４）（４Ｓ）−４−ヒドロキシル−２−オキソグルタレートアルドラーゼ（(4S)-4-hydroxyl-2-oxoglutarate aldolase）、
（ａ５）２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−ペントネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase）、
（ａ６）２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-D-gluconate aldolase）、
（ａ７）３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソネートアルドラーゼ（3-deoxy-D-manno-octulosonate aldolase）、
（ａ８）４−ヒドロキシル−２−オキソバレレートアルドラーゼ（4-hydroxyl-2-oxovalerate aldolase）、
（ａ９）４−（２−カルボキシフェニル）−２−オキソブ−３−エノエートアルドラーゼ（4-(2-carboxyphenyl)-2-oxobut-3-enoate aldolase）、
（ａ１０）４−ヒドロキシ−２−オキソヘプタンジオエートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxoheptanedioate aldolase）、
（ａ１１）２−デヒドロ−３−デオキシグルカレートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxyglucarate aldolase）、
（ａ１２）２−ケト−３−デオキシ−Ｌ−ラムノネートアルドラーゼ（2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase）、
（ａ１３）４−ヒドロキシル−４−メチル−２−オキソグルタレートアルドラーゼ（4-hydroxyl-4-methyl-2-oxoglutarate aldolase）、および
（ａ１４）４−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノネートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxohexanonate aldolase）；
［Ｃ１］〜［Ｃ２１］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ２３］  前記第１遺伝子は、ｅｄａタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｅｄａタンパク質；ｄｇｏＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｄｇｏＡタンパク質；ｙｊｈＨタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｙｊｈＨタンパク質；ｙａｇＥタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｙａｇＥタンパク質；ｎａｎＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｎａｎＡタンパク質；ｍｈｐＥタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｍｈｐＥタンパク質；ｈｐａＩタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｈｐａＩタンパク質；ｂｐｈＩタンパク質、好ましくは、バークホルデリア  ゼノボランス由来のｂｐｈＩタンパク質；ｐｈｄＪタンパク質、好ましくは、ノカルディオイデス属菌由来のｐｈｄＪタンパク質；ｇａｒＬタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｇａｒＬタンパク質；ｒｈｍＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｒｈｍＡタンパク質；およびｇａｌＣタンパク質、好ましくは、シュードモナス  プチダ由来のｇａｌＣタンパク質；からなる群より選択されるアルドラーゼをコードする［Ｃ１］〜［Ｃ２２］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ２４］  前記第１遺伝子は以下からなる群より選択される：
（１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２）配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−４）配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−５）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−６）配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−７）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−８）配列番号８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−９）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１０）配列番号１０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１２）配列番号１２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１３）配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１４）配列番号１４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１５）配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１６）配列番号１６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１７）配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１８）配列番号１８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１９）配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２０）配列番号２０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２１）配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（１−２２）配列番号２２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
［Ｃ１］〜［Ｃ２３］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ２５］  前記第１遺伝子は以下からなる群より選択される：
配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号５に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号９に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１１に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１３に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１５に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１７に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１９に記載の塩基配列からなる遺伝子、および
配列番号２１に記載の塩基配列からなる遺伝子；
［Ｃ１］〜［Ｃ２４］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ２６］  前記第４遺伝子は、前記アルドール反応により得られたα−ケト酸のα−ケト酸の還元反応を触媒する前記酵素をコードする［Ｃ１］〜［Ｃ２３］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ２７］  前記第４遺伝子は、デヒドロゲナーゼをコードする［Ｃ１］〜［Ｃ２６］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ２８］  前記第４遺伝子は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする［Ｃ１］〜［Ｃ２７］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ２９］  前記第４遺伝子は、ｌｄｈＡタンパク質、好ましくは、ラクトコッカス  ラクティス由来のｌｄｈＡタンパク質、より好ましくは、ラクトコッカス  ラクティスＮＢＲＣ１００６７６株由来のｌｄｈＡタンパク質、さらに好ましくは、ラクトコッカス  ラクティスＮＢＲＣ１００６７６株由来のｌｄｈＡタンパク質であって、Ｎ末端から８５番目のグルタミン残基がシステイン残基に置換されているタンパク質をコードする［Ｃ１］〜［Ｃ２８］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ３０］  前記第４遺伝子は以下からなる群より選択される：
（４−１）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（４−２）配列番号２８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
［Ｃ１］〜［Ｃ２９］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ３１］  配列番号２８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、α−ケト酸の還元反応を触媒する活性を有する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、Ｎ末端から８５番目の残基にシステイン残基を維持しているタンパク質をコードしている［Ｃ１］〜［Ｃ３０］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ３２］  前記第４遺伝子は、配列番号２７に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｃ１］〜［Ｃ３１］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ３３］  前記微生物は、好気性細菌、好ましくは、コリネ型細菌、より好ましくは、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）菌、より好ましくは、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である［Ｃ１］〜［Ｃ３２］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ３４］  前記微生物は、前記第１および前記第４遺伝子によって形質転換された微生物である［Ｃ１］〜［Ｃ３３］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ３５］  前記微生物は、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase）遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyrvate carboxylase）遺伝子、ピルビン酸カルボキシラーゼ（pyruvate carboxylase）遺伝子、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（pyruvate dehydrogenase）遺伝子、グルタミン酸−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（glutamate-pyruvate aminotransferase）遺伝子、アセトラクテートシンターゼ（acetolactate synthase）遺伝子、Ｎ−スクシニルジアミノピメレート（N-succinyldiaminopimelate aminotransferase）遺伝子、S-(ヒドロキシメチル)ミコチオールデヒドロゲナーゼ（S-(hydroxymethyl)mycothiol dehydrogenase）遺伝子、およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（acetaldehyde dehydrogenase）遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の欠損株である［Ｃ１］〜［Ｃ３４］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ３６］  前記培養の前に、前記微生物を好気的条件下で培養することを更に含む［Ｃ１］〜［Ｃ３５］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ３７］  生産された２，４−ジヒドロキシカルボン酸を回収することを更に含む［Ｃ１］〜［Ｃ３６］の何れか１に記載の方法。
【０４００】
［Ｄ１］  以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、および
（ｅ）α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する酵素をコードする第５遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、
下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（６）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（上記一般式（６）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を生産する工程を含む、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
［Ｄ２］  前記一般式（１）及び（６）中、Ｒ１０２が水素である［Ｄ１］に記載の方法。
［Ｄ３］  前記一般式（１）及び（６）中、Ｒ１０１が、水素、メチル基、エチル基、プロピル基またはペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である［Ｄ１］または［Ｄ２］に記載の方法。
［Ｄ４］  前記一般式（１）及び（６）中、Ｒ１０１およびＲ１０２が、水素である［Ｄ１］〜［Ｄ３］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ５］  生産された２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を回収することを更に含む［Ｄ１］〜［Ｄ４］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ６］  以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、および
（ｅ）α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する酵素をコードする第５遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物とホルムアルデヒド（これは、カルボニル化合物である）との存在下で培養して、ホモセリン、スレオニンおよび２−アミノ酪酸のうち少なくとも１つを生産する工程を含む、ホモセリン、スレオニンおよび２−アミノ酪酸のうち少なくとも１つの製造方法。
［Ｄ７］  生産されたホモセリン、スレオニンおよび２−アミノ酪酸のうち少なくとも１つを回収することを更に含む［Ｄ６］に記載の方法。
［Ｄ８］  前記培養が、前記ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［Ｄ１］〜［Ｄ７］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ９］  前記培養液は、前記ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を添加した培養液である［Ｄ８］に記載の方法。
［Ｄ１０］  前記ピルビン酸供給化合物は、前記培養液中で０．１〜４０（ｗ／ｖ）％、好ましくは、１〜２０（ｗ／ｖ）％の濃度になるように添加される［Ｄ９］に記載の方法。
［Ｄ１１］  カルボニル化合物は、前記培養液中で０．００１〜１０（ｗ／ｖ）％、好ましくは、０．０１〜１（ｗ／ｖ）％の濃度になるように添加される［Ｄ９］または［Ｄ１０］に記載の方法。
［Ｄ１２］  前記ピルビン酸供給化合物は、糖類である［Ｄ１］〜［Ｄ１１］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ１３］  前記糖類は、単糖、例えばフルクトースもしくはグルコース；二糖、例えばスクロース；多糖、例えば構成単糖としてグルコースを含む多糖；または植物（例えば非可食農産廃棄物またはエネルギー作物）を糖化酵素で処理することにより得られた糖化液である［Ｄ１］〜［Ｄ１２］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ１４］  前記糖類は、グルコースである［Ｄ１］〜［Ｄ１３］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ１５］  前記ピルビン酸供給化合物は、ピルビン酸である［Ｄ１］〜［Ｄ１４］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ１６］  前記培養が、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われる［Ｄ１］〜［Ｄ１５］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ１７］  前記培養が、前記ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［Ｄ１６］に記載の方法。
［Ｄ１８］  前記嫌気的条件または前記微好気的条件は、前記培養液中の溶存酸素濃度が０〜２ｐｐｍの範囲内にあり、好ましくは０〜１ｐｐｍの範囲内にあり、より好ましくは０〜０．５ｐｐｍの範囲内にある条件である［Ｄ１７］に記載の方法。
［Ｄ１９］  前記培養が、前記微生物を培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる［Ｄ１］〜［Ｄ１８］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ２０］  前記培養が、前記ピルビン酸供給化合物およびカルボニル化合物を含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［Ｄ１９］に記載の方法。
［Ｄ２１］  前記微生物を前記培養液中に高密度に懸濁させた前記状態は、前記微生物を前記培養液中に、前記微生物の湿菌体重量％が１〜５０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態、好ましくは、前記微生物を前記培養液中に、前記微生物の湿菌体重量％が３〜３０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態である［Ｄ２０］に記載の方法。
［Ｄ２２］  前記第１遺伝子は、アルドラーゼをコードする［Ｄ１］〜［Ｄ２１］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ２３］  前記第１遺伝子は、タイプＩのアルドラーゼをコードする［Ｄ１］〜［Ｄ２２］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ２４］  前記第１遺伝子は、タイプＩＩのアルドラーゼをコードする［Ｄ１］〜［Ｄ２２］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ２５］  前記第１遺伝子は、以下からなる群より選択されるアルドラーゼをコードする：
（ａ１）２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホグルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolase）、
（ａ２）２−デヒドロ−３−デオキシ−６−ホスホグルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase）、
（ａ３）４−ヒドロキシ−２−オキソグルタレートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase）、
（ａ４）（４Ｓ）−４−ヒドロキシル−２−オキソグルタレートアルドラーゼ（(4S)-4-hydroxyl-2-oxoglutarate aldolase）、
（ａ５）２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−ペントネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase）、
（ａ６）２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-D-gluconate aldolase）、
（ａ７）３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソネートアルドラーゼ（3-deoxy-D-manno-octulosonate aldolase）、
（ａ８）４−ヒドロキシル−２−オキソバレレートアルドラーゼ（4-hydroxyl-2-oxovalerate aldolase）、
（ａ９）４−（２−カルボキシフェニル）−２−オキソブ−３−エノエートアルドラーゼ（4-(2-carboxyphenyl)-2-oxobut-3-enoate aldolase）、
（ａ１０）４−ヒドロキシ−２−オキソヘプタンジオエートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxoheptanedioate aldolase）、
（ａ１１）２−デヒドロ−３−デオキシグルカレートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxyglucarate aldolase）、
（ａ１２）２−ケト−３−デオキシ−Ｌ−ラムノネートアルドラーゼ（2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase）、
（ａ１３）４−ヒドロキシル−４−メチル−２−オキソグルタレートアルドラーゼ（4-hydroxyl-4-methyl-2-oxoglutarate aldolase）、および
（ａ１４）４−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノネートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxohexanonate aldolase）；
［Ｄ１］〜［Ｄ２４］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ２６］  前記第１遺伝子は、ｅｄａタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｅｄａタンパク質；ｄｇｏＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｄｇｏＡタンパク質；ｙｊｈＨタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｙｊｈＨタンパク質；ｙａｇＥタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｙａｇＥタンパク質；ｎａｎＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｎａｎＡタンパク質；ｍｈｐＥタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｍｈｐＥタンパク質；ｈｐａＩタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｈｐａＩタンパク質；ｂｐｈＩタンパク質、好ましくは、バークホルデリア  ゼノボランス由来のｂｐｈＩタンパク質；ｐｈｄＪタンパク質、好ましくは、ノカルディオイデス属菌由来のｐｈｄＪタンパク質；ｇａｒＬタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｇａｒＬタンパク質；ｒｈｍＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｒｈｍＡタンパク質；およびｇａｌＣタンパク質、好ましくは、シュードモナス  プチダ由来のｇａｌＣタンパク質；からなる群より選択されるアルドラーゼをコードする［Ｄ１］〜［Ｄ２５］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ２７］  前記第１遺伝子は以下からなる群より選択される：
（１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２）配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−４）配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−５）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−６）配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−７）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−８）配列番号８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−９）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１０）配列番号１０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１２）配列番号１２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１３）配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１４）配列番号１４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１５）配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１６）配列番号１６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１７）配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１８）配列番号１８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１９）配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２０）配列番号２０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２１）配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（１−２２）配列番号２２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
［Ｄ１］〜［Ｄ２６］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ２８］  前記第１遺伝子は以下からなる群より選択される：
配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号５に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号９に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１１に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１３に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１５に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１７に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１９に記載の塩基配列からなる遺伝子、および
配列番号２１に記載の塩基配列からなる遺伝子；
［Ｄ１］〜［Ｄ２７］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ２９］  前記第５遺伝子は、前記アルドール反応により得られたα−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する前記酵素をコードする［Ｄ１］〜［Ｄ２８］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ３０］  前記第５遺伝子は、グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼをコードする［Ｄ１］〜［Ｄ２９］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ３１］  前記第５遺伝子は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼおよびバリンデヒドロゲナーゼからなる群より選択される少なくとも一つのデヒドロゲナーゼをコードする［Ｄ１］〜［Ｄ３０］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ３２］  前記第５遺伝子は、以下からなる群より選択されるグルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼをコードする：
（ｄ１）ロイシンデヒドロゲナーゼ（leucine dehydrogenase、ＥＣ番号１．４．１．９）、
（ｄ２）フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（phenylalanine dehydrogenase、ＥＣ番号１．４．１．２０）、および
（ｄ３）バリンデヒドロゲナーゼ（valine dehydrogenase、ＥＣ番号１．４．１．８および１．４．１．２３）；
［Ｄ１］〜［Ｄ３１］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ３３］  前記第５遺伝子は、ｌｅｕＤＨタンパク質、好ましくは、リシニバシラス  スフェリカス由来のｌｅｕＤＨタンパク質、バシラス  セレウス由来のｌｅｕＤＨタンパク質、またはジオバシラス  ステアロサーモフィラス由来のｌｅｕＤＨタンパク質；ｐｈｅｄｈタンパク質、好ましくは、バシラス  バディウス由来のｐｈｅｄｈタンパク質；およびｖａｌｄｈタンパク質、好ましくは、ストレプトミセス  フラジエ由来のｖａｌｄｈタンパク質；からなる群より選択されるアルドラーゼをコードする［Ｄ１］〜［Ｄ３２］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ３４］  前記第５遺伝子は以下からなる群より選択される：
（５−１）配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−２）配列番号３０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−３）配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−４）配列番号３２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−５）配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（５−６）配列番号３４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
［Ｄ１］〜［Ｄ３３］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ３５］  前記第５遺伝子は以下からなる群より選択される：
配列番号２９に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号３１に記載の塩基配列からなる遺伝子、および
配列番号３３に記載の塩基配列からなるｖａｌｄｈ遺伝子；
［Ｄ１］〜［Ｄ３４］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ３６］  前記微生物は、好気性細菌、好ましくは、コリネ型細菌、より好ましくは、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）菌、より好ましくは、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である［Ｄ１］〜［Ｄ３５］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ３７］  前記微生物は、前記第１および前記第５遺伝子によって形質転換された微生物である［Ｄ１］〜［Ｄ３６］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ３８］  前記微生物は、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase）遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyrvate carboxylase）遺伝子、ピルビン酸カルボキシラーゼ（pyruvate carboxylase）遺伝子、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（pyruvate dehydrogenase）遺伝子、グルタミン酸−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（glutamate-pyruvate aminotransferase）遺伝子、アセトラクテートシンターゼ（acetolactate synthase）遺伝子、Ｎ−スクシニルジアミノピメレート（N-succinyldiaminopimelate aminotransferase）遺伝子、S-(ヒドロキシメチル)ミコチオールデヒドロゲナーゼ（S-(hydroxymethyl)mycothiol dehydrogenase）遺伝子、およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（acetaldehyde dehydrogenase）遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の欠損株である［Ｄ１］〜［Ｄ３７］の何れか１に記載の方法。
［Ｄ３９］  前記培養の前に、前記微生物を好気的条件下で培養することを更に含む［Ｄ１］〜［Ｄ３８］の何れか１に記載の方法。
【０４０１】
［Ｅ１］  以下の遺伝子：
（ａ）ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、
（ｅ）α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する酵素をコードする第５遺伝子、および
（ｆ）２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒する酵素をコードする第６遺伝子
を含む微生物を、ピルビン酸および糖類から選ばれるピルビン酸供給化合物と、メチルメルカプタンと、
下記一般式（１）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｏ）Ｒ１０２
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるカルボニル化合物と
の存在下で培養して、
下記一般式（７）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＳＣＨ3)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（上記一般式（７）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（１）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸を生産する工程を含む、２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸の製造方法。
［Ｅ２］  前記一般式（１）及び（７）中、Ｒ１０２が水素である［Ｅ１］に記載の方法。
［Ｅ３］  前記一般式（１）及び（７）中、Ｒ１０１が、水素、メチル基、エチル基、プロピル基またはペンチル基であり、かつ、Ｒ１０２が水素である［Ｅ１］または［Ｅ２］に記載の方法。
［Ｅ４］  前記一般式（１）及び（７）中、Ｒ１０１およびＲ１０２が、水素である［Ｅ１］〜［Ｅ３］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ５］  前記培養が、前記ピルビン酸供給化合物と前記カルボニル化合物とメチルメルカプタンとを含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［Ｅ１］〜［Ｅ４］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ６］  前記培養液は、前記ピルビン酸供給化合物と前記カルボニル化合物とメチルメルカプタンとを添加した培養液である［Ｅ５］に記載の方法。
［Ｅ７］  前記ピルビン酸供給化合物は、前記培養液中で０．１〜４０（ｗ／ｖ）％、好ましくは、１〜２０（ｗ／ｖ）％の濃度になるように添加される［Ｅ６］に記載の方法。
［Ｅ８］  カルボニル化合物は、前記培養液中で０．００１〜１０（ｗ／ｖ）％、好ましくは、０．０１〜１（ｗ／ｖ）％の濃度になるように添加される［Ｅ６］または［Ｅ７］に記載の方法。
［Ｅ９］  メチルメルカプタンは、前記培養液中で１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは、１０ｍＭ〜３００ｍＭの濃度になるように添加される［Ｅ６］〜［Ｅ８］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１０］  前記ピルビン酸供給化合物は、糖類である［Ｅ１］〜［Ｅ９］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１１］  前記糖類は、単糖、例えばフルクトースもしくはグルコース；二糖、例えばスクロース；多糖、例えば構成単糖としてグルコースを含む多糖；または植物（例えば非可食農産廃棄物またはエネルギー作物）を糖化酵素で処理することにより得られた糖化液である［Ｅ１］〜［Ｅ１０］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１２］  前記糖類は、グルコースである［Ｅ１］〜［Ｅ１１］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１３］  前記ピルビン酸供給化合物は、ピルビン酸である［Ｅ１］〜［Ｅ９］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１４］  前記培養が、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われる［Ｅ１］〜［Ｅ１３］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１５］  前記培養が、前記ピルビン酸供給化合物と前記カルボニル化合物とメチルメルカプタンとを含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［Ｅ１７］に記載の方法。
［Ｅ１６］  前記嫌気的条件または前記微好気的条件は、前記培養液中の溶存酸素濃度が０〜２ｐｐｍの範囲内にあり、好ましくは０〜１ｐｐｍの範囲内にあり、より好ましくは０〜０．５ｐｐｍの範囲内にある条件である［Ｅ１５］に記載の方法。
［Ｅ１７］  前記培養が、前記微生物を培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる［Ｅ１］〜［Ｅ１６］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１８］  前記培養が、前記ピルビン酸供給化合物と前記カルボニル化合物とメチルメルカプタンとを含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［Ｅ１７］に記載の方法。
［Ｅ１９］  前記微生物を前記培養液中に高密度に懸濁させた前記状態は、前記微生物を前記培養液中に、前記微生物の湿菌体重量％が１〜５０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態、好ましくは、前記微生物を前記培養液中に、前記微生物の湿菌体重量％が３〜３０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態である［Ｅ１８］に記載の方法。
［Ｅ２０］  前記第１遺伝子は、アルドラーゼをコードする［Ｅ１］〜［Ｅ１９］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ２１］  前記第１遺伝子は、タイプＩのアルドラーゼをコードする［Ｅ１］〜［Ｅ２０］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ２２］  前記第１遺伝子は、タイプＩＩのアルドラーゼをコードする［Ｅ１］〜［Ｅ２０］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ２３］  前記第１遺伝子は、以下からなる群より選択されるアルドラーゼをコードする：
（ａ１）２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホグルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolase）、
（ａ２）２−デヒドロ−３−デオキシ−６−ホスホグルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase）、
（ａ３）４−ヒドロキシ−２−オキソグルタレートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase）、
（ａ４）（４Ｓ）−４−ヒドロキシル−２−オキソグルタレートアルドラーゼ（(4S)-4-hydroxyl-2-oxoglutarate aldolase）、
（ａ５）２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−ペントネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase）、
（ａ６）２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-D-gluconate aldolase）、
（ａ７）３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソネートアルドラーゼ（3-deoxy-D-manno-octulosonate aldolase）、
（ａ８）４−ヒドロキシル−２−オキソバレレートアルドラーゼ（4-hydroxyl-2-oxovalerate aldolase）、
（ａ９）４−（２−カルボキシフェニル）−２−オキソブ−３−エノエートアルドラーゼ（4-(2-carboxyphenyl)-2-oxobut-3-enoate aldolase）、
（ａ１０）４−ヒドロキシ−２−オキソヘプタンジオエートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxoheptanedioate aldolase）、
（ａ１１）２−デヒドロ−３−デオキシグルカレートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxyglucarate aldolase）、
（ａ１２）２−ケト−３−デオキシ−Ｌ−ラムノネートアルドラーゼ（2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase）、
（ａ１３）４−ヒドロキシル−４−メチル−２−オキソグルタレートアルドラーゼ（4-hydroxyl-4-methyl-2-oxoglutarate aldolase）、および
（ａ１４）４−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノネートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxohexanonate aldolase）；
［Ｅ１］〜［Ｅ２２］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ２４］  前記第１遺伝子は、ｅｄａタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｅｄａタンパク質；ｄｇｏＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｄｇｏＡタンパク質；ｙｊｈＨタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｙｊｈＨタンパク質；ｙａｇＥタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｙａｇＥタンパク質；ｎａｎＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｎａｎＡタンパク質；ｍｈｐＥタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｍｈｐＥタンパク質；ｈｐａＩタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｈｐａＩタンパク質；ｂｐｈＩタンパク質、好ましくは、バークホルデリア  ゼノボランス由来のｂｐｈＩタンパク質；ｐｈｄＪタンパク質、好ましくは、ノカルディオイデス属菌由来のｐｈｄＪタンパク質；ｇａｒＬタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｇａｒＬタンパク質；ｒｈｍＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｒｈｍＡタンパク質；およびｇａｌＣタンパク質、好ましくは、シュードモナス  プチダ由来のｇａｌＣタンパク質；からなる群より選択されるアルドラーゼをコードする［Ｅ１］〜［Ｅ２３］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ２５］  前記第１遺伝子は以下からなる群より選択される：
（１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２）配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−４）配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−５）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−６）配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−７）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−８）配列番号８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−９）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１０）配列番号１０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１２）配列番号１２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１３）配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１４）配列番号１４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１５）配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１６）配列番号１６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１７）配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１８）配列番号１８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１９）配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２０）配列番号２０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２１）配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（１−２２）配列番号２２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
［Ｅ１］〜［Ｅ２４］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ２６］  前記第１遺伝子は以下からなる群より選択される：
配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号５に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号９に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１１に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１３に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１５に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１７に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号１９に記載の塩基配列からなる遺伝子、および
配列番号２１に記載の塩基配列からなる遺伝子；
［Ｅ１］〜［Ｅ２５］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ２７］  前記第５遺伝子は、前記アルドール反応により得られたα−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する前記酵素をコードする［Ｅ１］〜［Ｅ２６］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ２８］  前記第５遺伝子は、グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼをコードする［Ｅ１］〜［Ｅ２７］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ２９］  前記第５遺伝子は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼおよびバリンデヒドロゲナーゼからなる群より選択される少なくとも一つのデヒドロゲナーゼをコードする［Ｅ１］〜［Ｅ２８］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３０］  前記第５遺伝子は、以下からなる群より選択されるグルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼをコードする：
（ｄ１）ロイシンデヒドロゲナーゼ（leucine dehydrogenase、ＥＣ番号１．４．１．９）、
（ｄ２）フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（phenylalanine dehydrogenase、ＥＣ番号１．４．１．２０）、および
（ｄ３）バリンデヒドロゲナーゼ（valine dehydrogenase、ＥＣ番号１．４．１．８および１．４．１．２３）；
［Ｅ１］〜［Ｅ２９］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３１］  前記第５遺伝子は、ｌｅｕＤＨタンパク質、好ましくは、リシニバシラス  スフェリカス由来のｌｅｕＤＨタンパク質、バシラス  セレウス由来のｌｅｕＤＨタンパク質、またはジオバシラス  ステアロサーモフィラス由来のｌｅｕＤＨタンパク質；ｐｈｅｄｈタンパク質、好ましくは、バシラス  バディウス由来のｐｈｅｄｈタンパク質；およびｖａｌｄｈタンパク質、好ましくは、ストレプトミセス  フラジエ由来のｖａｌｄｈタンパク質；からなる群より選択されるアルドラーゼをコードする［Ｅ１］〜［Ｅ３０］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３２］  前記第５遺伝子は以下からなる群より選択される：
（５−１）配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−２）配列番号３０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−３）配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−４）配列番号３２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−５）配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（５−６）配列番号３４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
［Ｅ１］〜［Ｅ３１］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３３］  前記第５遺伝子は以下からなる群より選択される：
配列番号３０に記載の塩基配列からなる遺伝子、
配列番号３２に記載の塩基配列からなる遺伝子、および
配列番号３４に記載の塩基配列からなる遺伝子；
［Ｅ１］〜［Ｅ３２］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３４］  前記第６遺伝子は、トランススルフレーション酵素をコードする［Ｂ１］〜［Ｂ３３］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３５］  前記第６遺伝子はシスタチオニンγ−シンターゼ（Cystathionine γ-synthase）をコードする［Ｅ１］〜［Ｅ３４］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３６］  前記第６遺伝子は、ＣＧＳ１タンパク質、好ましくは、シロイヌナズナ由来のＣＧＳ１タンパク質、より好ましくは、シロイヌナズナ由来のＣＧＳ１成熟タンパク質をコードする［Ｅ１］〜［Ｅ３５］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３７］  前記第６遺伝子は以下からなる群より選択される：
（６−１）配列番号３６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（６−２）配列番号３６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
［Ｅ１］〜［Ｅ３６］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３８］  第６遺伝子は、配列番号３５に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｅ１］〜［Ｅ３７］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３９］  前記微生物は、好気性細菌、好ましくは、コリネ型細菌、より好ましくは、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）菌、より好ましくは、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である［Ｅ１］〜［Ｅ３８］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４０］  前記微生物は、前記第１、前記第５および前記第６遺伝子によって形質転換された微生物である［Ｅ１］〜［Ｅ３９］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４１］  前記微生物は、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase）遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyrvate carboxylase）遺伝子、ピルビン酸カルボキシラーゼ（pyruvate carboxylase）遺伝子、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（pyruvate dehydrogenase）遺伝子、グルタミン酸−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（glutamate-pyruvate aminotransferase）遺伝子、アセトラクテートシンターゼ（acetolactate synthase）遺伝子、Ｎ−スクシニルジアミノピメレート（N-succinyldiaminopimelate aminotransferase）遺伝子、S-(ヒドロキシメチル)ミコチオールデヒドロゲナーゼ（S-(hydroxymethyl)mycothiol dehydrogenase）遺伝子、およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（acetaldehyde dehydrogenase）遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の欠損株である［Ｅ１］〜［Ｅ４３］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４２］  前記培養の前に、前記微生物を好気的条件下で培養することを更に含む［Ｅ１］〜［Ｅ４１］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４３］  生産された２−アミノ−４−メチルチオカルボン酸を回収することを更に含む［Ｅ１］〜［Ｅ４２］の何れか１に記載の方法。
【０４０２】
［Ｆ１］  下記一般式（２）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＯＣＯＯＨ
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表されるα−ケト酸と窒素源と還元剤とを、
グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼの存在下で反応させて、
下記一般式（６）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（上記一般式（６）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（２）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表される２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸を生産する工程を含む、２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
［Ｆ２］  前記一般式（２）及び（６）中、Ｒ１０２が水素である［Ｆ１］に記載の方法。
［Ｆ３］  前記一般式（２）及び（６）中、Ｒ１０１およびＲ１０２が水素である［Ｆ１］または［Ｆ２］に記載の方法。
［Ｆ４］  前記反応が、前記一般式（２）により表される前記α−ケト酸と前記窒素源と前記還元剤とグルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼとを含む反応液中で行われる［Ｆ１］〜［Ｆ３］の何れか１に記載の方法。
［Ｆ５］  前記反応液は、前記一般式（２）により表される前記α−ケト酸と前記窒素源と前記還元剤とグルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼとを添加した反応液である［Ｆ４］に記載の方法。
［Ｆ６］  前記一般式（２）により表される前記α−ケト酸は、前記反応液中で０．１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは、１ｍＭ〜３００ｍＭの濃度になるように添加される［Ｆ５］に記載の方法。
［Ｆ７］  前記窒素源は、前記反応液中で0.1mM〜1M、好ましくは、1mM〜300mMの濃度になるように添加される［Ｆ５］または［Ｆ６］に記載の方法。
［Ｆ８］  前記還元剤は、前記反応液中で０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは、０．１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度になるように添加される［Ｆ５］〜［Ｆ７］の何れか１に記載の方法。
［Ｆ９］  グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼは、前記反応液中で0.01ug/mL〜1mg/mL、好ましくは、0.1〜100ug/mLの濃度になるように添加される［Ｆ５］〜［Ｆ８］の何れか１に記載の方法。
［Ｆ１０］  前記窒素源は、アンモニウム塩である［Ｆ１］〜［Ｆ１９］の何れか１に記載の方法。
［Ｆ１１］  前記窒素源は、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウムからなる群より選択される少なくとも１つのアンモニウム塩である［Ｆ１］〜［Ｆ１０］の何れか１に記載の方法。
［Ｆ１２］  前記還元剤は、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨからなる群より選択される少なくとも１つである［Ｆ１］〜［Ｆ１１］の何れか１に記載の方法。
［Ｆ１３］  グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼおよびバリンデヒドロゲナーゼからなる群より選択される少なくとも一つのデヒドロゲナーゼである［Ｆ１］〜［Ｆ１２］の何れか１に記載の方法。
［Ｆ１４］  グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼは以下からなる群より選択される：、
（ｄ１）ロイシンデヒドロゲナーゼ（leucine dehydrogenase）、
（ｄ２）フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（phenylalanine dehydrogenase）、および
（ｄ３）バリンデヒドロゲナーゼ（valine dehydrogenase）；
［Ｆ１］〜［Ｆ１３］の何れか１に記載の方法。
［Ｆ１５］  グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼは、ｌｅｕＤＨタンパク質、好ましくは、リシニバシラス  スフェリカス由来のｌｅｕＤＨタンパク質、バシラス  セレウス由来のｌｅｕＤＨタンパク質またはジオバシラス  ステアロサーモフィラス由来のｌｅｕＤＨタンパク質；ｐｈｅｄｈタンパク質、好ましくは、バシラス  バディウス由来のｐｈｅｄｈタンパク質；およびｖａｌｄｈタンパク質、好ましくは、ストレプトミセス  フラジエ由来のｖａｌｄｈタンパク質；からなる群より選択されるデヒドロゲナーゼである［Ｆ１］〜［Ｆ１４］の何れか１に記載の方法。
［Ｆ１６］  グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼは以下からなる群より選択される：
（５’−１）  配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質、
（５’−２）  配列番号３０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質、
（５’−３）  配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質、
（５’−４）  配列番号３２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質、
（５’−５）  配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質、および
（５’−６）  配列番号３４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質；
［Ｆ１］〜［Ｆ１５］の何れか１に記載の方法。
【０４０３】
［Ｇ１］  下記一般式（６）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
（ここでＲ１０１およびＲ１０２は、互いに独立に、水素、または１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である）
により表される２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸と酸化剤とを、
グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼの存在下で反応させて、
下記一般式（２）：
Ｒ１０１Ｃ（Ｒ１０２）(ＯＨ)ＣＨ2ＣＯＣＯＯＨ
（上記一般式（２）におけるＲ１０１およびＲ１０２は、それぞれ上記一般式（６）におけるＲ１０１およびＲ１０２と同じ基である）
により表されるα−ケト酸を生産する工程を含む、α−ケト酸の製造方法。
［Ｇ２］  前記一般式（６）及び（２）中、Ｒ１０２が水素である［Ｇ１］に記載の方法。
［Ｇ３］  前記一般式（６）及び（２）中、Ｒ１０１およびＲ１０２が水素である［Ｇ１］または［Ｇ２］に記載の方法。
［Ｇ４］  前記反応が、前記一般式（６）により表される前記２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸と前記酸化剤とグルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼとを含む反応液中で行われる［Ｇ１］〜［Ｇ３］の何れか１に記載の方法。
［Ｇ５］  前記反応液は、前記一般式（６）により表される前記２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸と前記酸化剤とグルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼとを添加した反応液である［Ｇ４］に記載の方法。
［Ｇ６］  前記一般式（６）により表される前記２−アミノ−４−ヒドロキシカルボン酸は、前記反応液中で０．１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは、１ｍＭ〜３００ｍＭの濃度になるように添加される［Ｇ５］に記載の方法。
［Ｇ７］  前記酸化剤は、前記反応液中で０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは、０．１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度になるように添加される［Ｇ５］または［Ｇ６］に記載の方法。
［Ｇ８］  グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼは、前記反応液中で0.01ug/mL〜1mg/mL、好ましくは、0.1〜100ug/mLの濃度になるように添加される［Ｇ５］〜［Ｇ７］の何れか１に記載の方法。
［Ｇ９］  前記酸化剤は、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋からなる群より選択される少なくとも１つである［Ｇ１］〜［Ｇ８］の何れか１に記載の方法。
［Ｇ１０］  グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼおよびバリンデヒドロゲナーゼからなる群より選択される少なくとも一つのデヒドロゲナーゼである［Ｇ１］〜［Ｇ９］の何れか１に記載の方法。
［Ｇ１１］  グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼは以下からなる群より選択される：、
（ｄ１）ロイシンデヒドロゲナーゼ（leucine dehydrogenase）、
（ｄ２）フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（phenylalanine dehydrogenase）、および
（ｄ３）バリンデヒドロゲナーゼ（valine dehydrogenase）；
［Ｇ１］〜［Ｇ１０］の何れか１に記載の方法。
［Ｇ１２］  グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼは、ｌｅｕＤＨタンパク質、好ましくは、リシニバシラス  スフェリカス由来のｌｅｕＤＨタンパク質、バシラス  セレウス由来のｌｅｕＤＨタンパク質またはジオバシラス  ステアロサーモフィラス由来のｌｅｕＤＨタンパク質；ｐｈｅｄｈタンパク質、好ましくは、バシラス  バディウス由来のｐｈｅｄｈタンパク質；およびｖａｌｄｈタンパク質、好ましくは、ストレプトミセス  フラジエ由来のｖａｌｄｈタンパク質；からなる群より選択されるデヒドロゲナーゼである［Ｇ１］〜［Ｇ１１］の何れか１に記載の方法。
［Ｇ１３］  グルタミン酸／フェニルアラニン／ロイシン／バリンデヒドロゲナーゼは以下からなる群より選択される：
（５’−１）  配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質、
（５’−２）  配列番号３０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質、
（５’−３）  配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質、
（５’−４）  配列番号３２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質、
（５’−５）  配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質、および
（５’−６）  配列番号３４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質；
［Ｇ１］〜［Ｇ１２］の何れか１に記載の方法。
【０４０４】
［Ｈ１］  以下からなる群より選択される第１遺伝子：
（１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２）配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−４）配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−５）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（１−６）配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
を含むコリネ型細菌。
［Ｈ２］  以下からなる群より選択される第１遺伝子：
（１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２）配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−４）配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−５）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−６）配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（１−７）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−８）配列番号８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−９）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１０）配列番号１０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１２）配列番号１２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１３）配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１４）配列番号１４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１５）配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１６）配列番号１６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１７）配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１８）配列番号１８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−１９）配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２０）配列番号２０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１−２１）配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（１−２２）配列番号２２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
を含むコリネ型細菌。
［Ｈ３］  配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ１］または［Ｈ２］に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ４］  配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ１］〜［Ｈ３］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ５］  配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号５に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ１］〜［Ｈ４］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ６］  配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号７に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ１］〜［Ｈ５］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ７］  配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号９に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ１］〜［Ｈ６］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ８］  配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号１１に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ１］〜［Ｈ７］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ９］  配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号１３に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ１］〜［Ｈ８］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ１０］  配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号１５に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ１］〜［Ｈ９］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ１１］  配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号１７に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ１］〜［Ｈ１０］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ１２］  配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号１９に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ１］〜［Ｈ１１］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ１３］  配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、ピルビン酸とカルボニル化合物とのアルドール反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号２１に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ１］〜［Ｈ１２］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ１４］  前記コリネ型細菌は、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）菌、好ましくは、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、より好ましくは、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７８０、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７８１、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７８２、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７８３またはＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７８４であるコリネ型細菌である［Ｈ１］〜［Ｈ１３］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ１５］  前記コリネ型細菌は、前記第１遺伝子によって形質転換されたコリネ型細菌である［Ｈ１］〜［Ｈ１４］の何れか１に記載の方法。
［Ｈ１６］  以下からなる群より選択される第２遺伝子：
（２−１）配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（２−２）配列番号２４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；および
以下からなる群より選択される第３遺伝子：
（３−１）配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（３−２）配列番号２６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
を更に含む［Ｈ１］〜［Ｈ１５］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ１７］  配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号２３に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ１６］に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ１８］  配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号２５に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ１６］または［Ｈ１７］に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ１９］  前記コリネ型細菌は、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）菌、好ましくは、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、より好ましくは、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７８０またはＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７８１であるコリネ型細菌である［Ｈ１６］〜［Ｈ１８］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ２０］  前記コリネ型細菌は、前記第１、前記第２および前記第３遺伝子によって形質転換されたコリネ型細菌である［Ｈ１６］〜［Ｈ１９］の何れか１に記載の方法。
［Ｈ２１］  以下からなる群より選択される第４遺伝子：
（４−１）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（４−２）配列番号２８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
を更に含む［Ｈ１］〜［Ｈ２０］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ２１］  配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、α−ケト酸の還元反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号２７に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ２０］に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ２２］  前記コリネ型細菌は、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）菌、好ましくは、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、より好ましくは、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７８２であるコリネ型細菌である［Ｈ２０］または［Ｈ２１］に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ２３］  前記コリネ型細菌は、前記第１および前記第４遺伝子によって形質転換されたコリネ型細菌である［Ｈ２０］〜［Ｈ２２］の何れか１に記載の方法。
［Ｈ２４］  以下からなる群より選択される第５遺伝子：
（５−１）配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−２）配列番号３０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−３）配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−４）配列番号３２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−５）配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（５−６）配列番号３４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
を更に含む［Ｈ１］〜［Ｈ２３］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ２５］  配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号２９に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ２４］に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ２６］  配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号３１に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ２４］または［Ｈ２５］に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ２７］  配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号３３に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ２４］〜［Ｈ２６］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ２８］  前記コリネ型細菌は、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）菌、好ましくは、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、より好ましくは、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７８３であるコリネ型細菌である［Ｈ２４］〜［Ｈ２７］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ２９］  前記コリネ型細菌は、前記第１および前記第５遺伝子によって形質転換されたコリネ型細菌である［Ｈ２４］〜［Ｈ２８］の何れか１に記載の方法。
［Ｈ３０］  以下からなる群より選択される第５遺伝子：
（５−１）配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−２）配列番号３０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−３）配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−４）配列番号３２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５−５）配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（５−６）配列番号３４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；および
以下からなる群より選択される第６遺伝子：
（６−１）配列番号３６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
（６−２）配列番号３６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
を更に含む［Ｈ１］〜［Ｈ２９］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ３１］  配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号２９に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ３０］に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ３２］  配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号３１に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ３０］または［Ｈ３１］に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ３３］  配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号３３に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ３０］〜［Ｈ３２］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ３４］  配列番号３６に記載のアミノ酸配列からなる前記タンパク質であって、２−アミノ−４−ホスホノオキシカルボン酸が有するリン酸基をメチルメルカプタンが有するメチルメルカプト基で置換する反応を触媒する前記タンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号３５に記載の塩基配列からなる遺伝子である［Ｈ３０］〜［Ｈ３３］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ３５］  前記コリネ型細菌は、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）菌、好ましくは、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、より好ましくは、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７８４であるコリネ型細菌である［Ｈ３０］〜［Ｈ３４］の何れか１に記載のコリネ型細菌。
［Ｈ３６］  前記コリネ型細菌は、前記第１および前記第５遺伝子によって形質転換されたコリネ型細菌である［Ｈ３０］〜［Ｈ３５］の何れか１に記載の方法。
【実施例】
【０４０５】
１．材料および方法
（１−１）培地
試薬は特に指示がなければ富士フィルム和光純薬株式会社より購入した。
【０４０６】
（Ａ培地）
尿素２．０ｇ、硫酸アンモニウム７．０ｇ、リン酸二水素カリウム０．５０ｇ、リン酸水素二カリウム０．５０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）２．０ｇ、カサミノ酸 ビタミンアッセイ（ディフコ社製）７．０ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物６．０ｍｇ、硫酸マンガン（ＩＩ）一水和物４．２ｍｇ、Ｄ（＋）−ビオチン０．２０ｍｇ、塩酸チアミン０．２０ｍｇを０．９２Ｌの水に溶解し、ｐＨを５Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いて７．０に調整した。これを１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌し、室温まで冷却した後に、オートクレーブ滅菌済みの５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液８０ｍＬを加えることにより調製された液体培地。
【０４０７】
（Ａ寒天培地）
尿素２．０ｇ、硫酸アンモニウム７．０ｇ、リン酸二水素カリウム０．５０ｇ、リン酸水素二カリウム０．５０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）２．０ｇ、カサミノ酸 ビタミンアッセイ（ディフコ社製）７．０ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物６．０ｍｇ、硫酸マンガン（ＩＩ）一水和物４．２ｍｇ、Ｄ（＋）−ビオチン０．２０ｍｇ、塩酸チアミン０．２０ｍｇ、寒天１５ｇを０．９２Ｌの水に溶解、懸濁し、ｐＨを５Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いて７．０に調整調製した。これを１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌し、５０℃まで冷却した後に、オートクレーブ滅菌済みの５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液８０ｍＬを加え、ペトリ皿に分注後、冷却固化することで調製された固体培地。
【０４０８】
（ＢＡ培地）
尿素２．０ｇ、硫酸アンモニウム７．０ｇ、リン酸二水素カリウム０．５０ｇ、リン酸水素二カリウム０．５０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）２．０ｇ、カサミノ酸 ビタミンアッセイ（ディフコ社製）７．０ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物６．０ｍｇ、硫酸マンガン（ＩＩ）一水和物４．２ｍｇ、Ｄ（＋）−ビオチン０．２０ｍｇ、塩酸チアミン０．２０ｍｇ、４−モルホリノプロパンスルホン酸２１ｇを０．９２Ｌの水に溶解し、ｐＨを５Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いて７．０に調整した。これを１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌し、室温まで冷却した後に、オートクレーブ滅菌済みの５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液８０ｍＬを加えることにより調製された液体培地。
【０４０９】
（ＬＢ培地）
バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５．０ｇ、塩化ナトリウム１０ｇを１Ｌの水に溶解し、ｐＨを５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いて７．０に調整した後、１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌することで調製された液体培地。
【０４１０】
（ＬＢ寒天培地）
バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５．０ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、寒天１５ｇを１Ｌの水に溶解、懸濁し、ｐＨを５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いて７．０に調整した後、１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌し、５０℃まで冷却した後に、ペトリ皿に分注し、冷却固化することで調製された固体培地。
【０４１１】
（Ｓｕｃ寒天培地）
バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５．０ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、寒天１５ｇを０．５Ｌの水に溶解、懸濁し、ｐＨを５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いて７．０に調整した。これを１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌し、５０℃まで冷却した後に、オートクレーブ滅菌済みの２０％（ｗ／ｖ）のスクロース水溶液０．５Ｌを加え、ペトリ皿に分注後、冷却固化することで調製された固体培地。
【０４１２】
（ＢＨＩＳ培地）
ブレインハートインフュージョン（ディフコ社製）３６ｇ、ソルビトール９１ｇを１Ｌの水に溶解し、ｐＨを５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いて７．０に調整した後、１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌することで調製された液体培地。
【０４１３】
（ＢＨＩＳ−ＧＩＴ培地）
ブレインハートインフュージョン（ディフコ社製）３６ｇ、グリシン８．０ｇ、イソニアジド１．３ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０  ３ｍＬ、ソルビトール９１ｇを１Ｌの水に溶解し、ｐＨを５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いて７．０に調整した後、１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌することで調製された液体培地。
【０４１４】
（１−２）バッファーおよび試薬
（ＴＥバッファー）
トリスヒドロキシメチルアミノメタン１．２ｇ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸二ナトリウム塩二水和物０．３７ｇを１Ｌの水に溶解し、ｐＨを６Ｍ塩酸を用いて８．０に調整した後、１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌することで調製された緩衝液。
【０４１５】
（ＴＧバッファー）
トリスヒドロキシメチルアミノメタン０．１２ｇ、グリセロール１０ｇを１Ｌの水に溶解し、ｐＨを６Ｍ塩酸を用いて７．５に調整した後、１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌することで調製された緩衝液。
【０４１６】
（１０％グリセロール水溶液）
グリセロール１００ｇを１Ｌの水に溶解した後、１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌することで調整された水溶液。
【０４１７】
（ＢＲバッファー）
リン酸二水素カリウム０．５０ｇ、リン酸水素二カリウム０．５０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５０ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物６．０ｍｇ、硫酸マンガン（ＩＩ）一水和物４．２ｍｇを１．０Ｌの水に溶解し、ｐＨを５Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いて７．０に調整することでえられた緩衝液。
【０４１８】
（ＢＳバッファー）
リン酸二水素カリウム０．５０ｇ、リン酸水素二カリウム０．５０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５０ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物６．０ｍｇ、硫酸マンガン（ＩＩ）一水和物４．２ｍｇ、４−モルホリノプロパンスルホン酸２１ｇを１．０Ｌの水に溶解し、ｐＨを５Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いて７．０に調整することでえられた緩衝液。
【０４１９】
（ＢＴバッファー）
硫酸アンモニウム７．０ｇ、リン酸二水素カリウム０．５０ｇ、リン酸水素二カリウム０．５０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５０ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物６．０ｍｇ、硫酸マンガン（ＩＩ）一水和物４．２ｍｇを１．０Ｌの水に溶解し、ｐＨを５Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いて７．０に調整することでえられた緩衝液。
【０４２０】
（１−３）分析条件の定義および実験方法
（アガロース・ゲル電気泳動後のＤＮＡ断片の抽出、精製）
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ（マッハライ・ナーゲル社製）をその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の抽出、精製を行った。
【０４２１】
（プラスミド抽出）
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＥａｓｙＰｕｒｅ（マッハライ・ナーゲル社製）をその指示書通りに用いてプラスミドの抽出、精製を行った。
【０４２２】
（ＰＣＲ法）
以下のいずれかのＤＮＡポリメラーゼおよびそれに付属する試薬を用いて、その指示書に従いＰＣＲを行った：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、Ｔｋｓ  ＧｆｌｅｘＴＭ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）。
【０４２３】
（有機酸分析用液体クロマトグラフィー）
島津製作所製の以下の機器より構成される有機酸分析システムを用いた。システムコントローラ：ＣＢＭ−２０Ａ、送液ユニット：ＬＣ−２０ＡＢ、オンライン脱気ユニット：ＤＧＵ−２０Ａ３Ｒ、オートインジェクタ：ＳＩＬ−２０ＡＣ、カラムオーブン：ＣＴＯ−２０ＡＣ、フォトダイオードアレイ検出器：ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ。
【０４２４】
分析条件は以下の通りである。
ガードカラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＡｐａｋ−Ｐ（東ソー社製）
分析カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＡｐａｋ−Ａ（東ソー社製）
カラムオーブン温度：４０℃
移動相：０．７５ｍＭ硫酸
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ。
【０４２５】
（糖分析用液体クロマトグラフィー）
島津製作所製の以下の機器より構成される糖分析システムを用いた。システムコントローラ：ＣＢＭ−２０Ａ、送液ユニット：ＬＣ−２０ＡＢ、オンライン脱気ユニット：ＤＧＵ−２０Ａ３Ｒ、オートインジェクタ：ＳＩＬ−２０ＡＣ、カラムオーブン：ＣＴＯ−２０ＡＣ、屈折率検出器：ＲＩＤ−１０Ａ。
【０４２６】
分析条件は以下の通りである。
前処理：脱塩カートリッジ（バイオラッド社製）
分析カラム：アミネックス  ＨＰＸ−８７Ｐ（バイオラッド社製）
カラムオーブン温度：８５℃
移動相：水
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ。
【０４２７】
（アミノ酸分析用液体クロマトグラフィー）
島津製作所製の以下の機器より構成されるアミノ酸分析システムを用いた。システムコントローラ：ＣＢＭ−２０Ａ、送液ユニット：ＬＣ−２０ＡＢ１台、ＬＣ−２０ＡＤ２台、流路切り替えバルブ：ＦＣＶ−１１ＡＬ、オンライン脱気ユニット：ＤＧＵ−２０Ａ３Ｒ、オートインジェクタ：ＳＩＬ−２０ＡＣ、カラムオーブン：ＣＴＯ−２０ＡＣ、蛍光検出器：ＲＦ−２０ＡＸｓ。
【０４２８】
分析条件は島津高速液体クロマトグラフＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅアミノ酸分析システム取扱説明書に示されているＮａ型迅速条件に従い、アンモニアトラップカラムＩＳＣ−３０／Ｓ  ０５０４  ＮＡ（島津製作所製）および分析カラムＳｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＡＭＩＮＯ−ＮＡ（島津製作所製）を用いて分析を行った。
【０４２９】
（ガスクロマトグラフ質量分析（Gas Chromatography Mass Spectrometry, GCMS））
GCMSはガスクロマトグラム四重極型質量分析計（7890B GC/5977A MSD, アジレントテクノロジー社製）および多機能オートサンプラー（MPS2-xt, ゲステル社製）を用い、以下の条件で行った。
＜加熱脱着サンプリング条件＞
加熱条件：50 ℃（0.5min）→ 50 ℃ / min → 300 ℃（10 min）
トラップ温度：-100℃ → 12 ℃ / s → 300 ℃
＜ガスクロマトグラフ条件＞
分離カラム：DB-5ht［30 m × 0.25 mmID , 0.10μm, アジレントテクノロジー社製］
昇温条件度：40 ℃（5 min）→ 10 ℃ / min → 320 ℃（12 min）
＜質量分析条件＞
イオン化法：電子イオン化（EI）      測定質量範囲：m/z = 29-550
【０４３０】
（ゲノムＤＮＡ抽出）
入手元の指示書通りに液体培養した微生物を遠心分離により回収し、−８０℃で凍結した。菌体ペレットを室温で解凍し、１０ｍｇ／ｍＬリゾチーム水溶液５３７μＬを加えて３７℃で１時間振盪した。次に０．５Ｍ  ＥＤＴＡ水溶液３０μＬ、１０％ＳＤＳ水溶液３０μＬ、２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ水溶液３μＬを加えて、３７℃で１時間振盪した。その後さらに５Ｍ塩化ナトリウム水溶液１００μＬと１０％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム水溶液（０．７Ｍ塩化ナトリウム中）８０μＬを加えて、６５℃で１０分間加熱した。室温まで冷却した後、クロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）７８０μＬ加えて、穏やかに混和した。１５０００ｘｇ、４℃にて５分間遠心分離して、水層を６００μＬ回収した。これにフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１）６００μＬを加えて、穏やかに混和した。１５０００ｘｇ、４℃にて５分間遠心分離して、水層を５００μＬ回収した。これにイソプロパノール３００μＬを加えて、１５０００ｘｇ、４℃にて５分間遠心分離した後、上清を取り除いた。沈殿物として得られたゲノムＤＮＡを７０％エタノール５００μＬを加えて洗浄し、１５０００ｘｇ、４℃にて５分間遠心分離した。この洗浄を２度繰り返し、室温にて乾燥させた後、得られたゲノムＤＮＡをＴＥバッファー１００μＬに溶解した。
【０４３１】
（コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来株を形質転換するための電気穿孔法）
形質転換を行うコリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来株のグリセロールストックをＡ寒天培地に無菌条件下で接種し、３３℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体を１０ｍＬのＡ培地に接種し、３３℃にて振盪培養を行い種培養液とした。この種培養液を濁度が０．２となるように５００ｍＬフラスコ中に用意された１００ｍＬのＢＨＩＳ培地に接種した。３３℃にて振盪を行い濁度が０．５−０．７になるまで培養した。この培養液を４℃、５５００ｘｇにて２０分間遠心分離を行い、上澄み液を除去した。回収した菌体を１０ｍＬのＴＧバッファーで洗浄し、４℃、５５００ｘｇにて５分間遠心分離を行い、上澄み液を除去した。この洗浄を２度行った後、１０ｍＬの１０％グリセロール水溶液で洗浄し、４℃、５５００ｘｇにて５分間遠心分離を行い、上澄み液を除去した。得られた菌体ペレットを１ｍＬの１０％グリセロール水溶液に懸濁させ、１５０μＬずつ滅菌済みの１．５ｍＬチューブに分注後、液体窒素を用いて凍結し、コンピテントセルとして−８０℃で保存した。
【０４３２】
ゲノムＤＮＡ上の遺伝子欠失および遺伝子置換の場合：１５０μＬのコンピテントセルを氷上にて融解し、５００ｎｇのプラスミドを加えた。これを滅菌済み０．２ｃｍギャップ  エレクトロポレーションキュベット（バイオラッド社製）に移し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＸｃｅｌｌＴＭ  エレクトロポレーションシステム（バイオラッド社製）を用いて、２５μＦ、２００Ω、２５００Ｖにて電気穿孔を行った。菌体懸濁液を１ｍＬのＢＨＩＳ培地で希釈し、４６℃で６分間インキュベーションした後、３３℃にて１時間インキュベーションを行った。この菌体懸濁液を適切な抗生物質を含むＡ寒天培地に接種し、目的の形質転換体を選択した。
【０４３３】
遺伝子過剰発現用プラスミドを導入する場合：５０μＬのコンピテントセルを氷上にて融解し、２００ｎｇのプラスミドを加えた。これを滅菌済み０．２ｃｍギャップ  エレクトロポレーションキュベット（バイオラッド社製）に移し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＸｃｅｌｌＴＭ  エレクトロポレーションシステム（バイオラッド社製）を用いて、２５μＦ、２００Ω、２５００Ｖにて電気穿孔を行った。菌体懸濁液を１ｍＬのＢＨＩＳ培地で希釈し、４６℃で６分間インキュベーションした後、３３℃にて１時間インキュベーションを行った。この菌体懸濁液を適切な抗生物質を含むＡ寒天培地に接種し、目的の形質転換体を選択した。
【０４３４】
（コロニーＰＣＲ）
目的のＤＮＡ配列を増幅できるプライマーの組み合わせを用いてＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ社製）の指示書通りに鋳型ＤＮＡ以外の試薬を混合した。これに寒天培地に生じた菌株のコロニーを少量懸濁させ、これに内在するＤＮＡを鋳型とし、指示書通りにＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロース・ゲル電気泳動により分析し、目的のプラスミドを保持しいていること、または、ゲノム上の該当するＤＮＡ配列が欠失または置換していることを確認した。
【０４３５】
（濁度測定）
大腸菌およびコリネバクテリウム  グルタミカムの培養液の濁度は、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ８０００（ＧＥヘルスケア社製）を用いて６１０ｎｍの波長で測定を行った。
【０４３６】
（１−４）プライマーＤＮＡ、菌体およびプラスミドの詳細
プライマーＤＮＡ、菌体およびプラスミドの詳細は、以下の表３７〜表６７に記載した。
【０４３７】
【表３７】
2020182449.tif 000039
【０４３８】
【表３８】
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【０４３９】
【表３９】
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【０４４０】
【表４０】
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【０４４１】
【表４１】
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【０４４２】
【表４２】
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【０４４３】
【表４３】
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【０４４４】
【表４４】
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【０４４５】
【表４５】
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【０４４６】
【表４６】
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【０４４７】
【表４７】
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【０４４８】
【表４８】
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【０４４９】
【表４９】
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【０４５０】
【表５０】
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【０４５１】
【表５１】
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【０４５２】
【表５２】
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【０４５３】
【表５３】
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【０４５４】
【表５４】
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【０４５５】
【表５５】
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【０４５６】
【表５６】
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【０４５７】
【表５７】
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【０４５８】
【表５８】
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【０４５９】
【表５９】
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【０４６０】
【表６０】
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【０４６１】
【表６１】
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【０４６２】
【表６２】
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【０４６３】
【表６３】
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【０４６４】
【表６４】
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【０４６５】
【表６５】
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【０４６６】
【表６６】
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【０４６７】
【表６７】
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【０４６８】
２．プラスミド構築
（２−１）遺伝子欠失編
２−１−（１）遺伝子破壊用プラスミドの構築
ｐＮＩＣ２８−Ｂｓａ４（Ｓｏｕｒｃｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）を鋳型とし、ＧＥＰ００７（配列番号３７）とＧＥＰ００８（配列番号３８）で示される塩基配列のＤＮＡを用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片〔Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６，  １１９５（１９９２）〕をＰＣＲ法により増幅した。このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで処理し、アガロース・ゲル電気泳動後に、ＤＮＡ断片の抽出、精製を行った。また、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を有するプラスミドｐＨＳＧ２９９（タカラバイオ社製）をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで処理し、アガロース・ゲル電気泳動後に、ＤＮＡ断片の抽出、精製を行った。これら２つのＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ  ＞（タカラバイオ社製）をその指示書通りに用いて連結し、プラスミドｐＧＥ０１５を得た。
【０４６９】
ｐＧＥ０１５がｓａｃＢ上に有するＫｐｎＩ認識部位を削除することを目的として、ｐＧＥ０１５を鋳型としてＧＥＰ８０８（配列番号３９）およびＧＥＰ８０９（配列番号４０）で示される塩基配列のＤＮＡを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに用いて、変異導入およびプラスミドの増幅を行い、ｐＧＥ２０９を得た。
【０４７０】
２−１−（２）ｐｐｃ遺伝子破壊株作成用プラスミドの構築
コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターからＮＢＲＣ１２１６８株として入手し、添付の指示書通りに培養を行った後に、ゲノムＤＮＡ抽出を行った。
【０４７１】
ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ１３２（配列番号４１）とＧＥＰ１３３（配列番号４２）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ１３４（配列番号４３）とＧＥＰ１３５（配列番号４４）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ０１５をＥｃｏＲＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうして得られたプラスミドをｐＧＥ０２０とした。
【０４７２】
２−１−（３）ｐｐｃ遺伝子欠失株の作成
ｐＧＥ０２０を用い、電気穿孔法によりコリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株を形質転換し、３３℃にて２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＡ培地上でカナマイシン耐性株を選択した。次に、得られたカナマイシン耐性株をＳｕｃ寒天培地上に塗布し、３３℃で培養した。生育したコロニーをさらにＡ培地で培養し、コロニーＰＣＲによりｐｐｃ遺伝子が欠失している株を選択した。これをＧＥＳ００７と命名した。
【０４７３】
２−１−（４）ｌｄｈＡ遺伝子破壊株作成用プラスミドの構築
ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ１６９（配列番号４５）とＧＥＰ１７０（配列番号４６）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ２１５（配列番号４７）とＧＥＰ２１６（配列番号４８）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ０１５をＥｃｏＲＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ０３３とした。
【０４７４】
２−１−（５）ｌｄｈＡ遺伝子欠失株の作成
ｐＧＥ０３３を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ００７を形質転換し、ＧＥＳ００７作成時と同様な操作により選択した株をＧＥＳ０４８と命名した。
【０４７５】
２−１−（６）ｐｙｃ遺伝子破壊株作成用プラスミドの構築
ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ６１５（配列番号４９）とＧＥＰ６１６（配列番号５０）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ６１７（配列番号５１）とＧＥＰ６１８（配列番号５２）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ０１５をＥｃｏＲＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１７７とした。
【０４７６】
２−１−（７）ｐｙｃ遺伝子欠失株の作成
ｐＧＥ１７７を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ０４８を形質転換し、ＧＥＳ００７作成時と同様な操作により選択した株をＧＥＳ３８５と命名した。
【０４７７】
２−１−（８）ｐｏｘＢ遺伝子破壊株作成用プラスミドの構築
ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ４０６（配列番号５３）とＧＥＰ４０７（配列番号５４）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ６９８（配列番号５５）とＧＥＰ４０９（配列番号５６）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ０１５をＥｃｏＲＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１９１とした。
【０４７８】
２−１−（９）ｐｏｘＢ遺伝子欠失株の作成
ｐＧＥ１９１を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ３８５を形質転換し、ＧＥＳ００７作成時と同様な操作により選択した株をＧＥＳ３８８と命名した。
【０４７９】
２−１−（１０）ａｌａＡ遺伝子破壊株作成用プラスミドの構築
ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ８１０（配列番号５７）とＧＥＰ８１１（配列番号５８）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ８１２（配列番号５９）とＧＥＰ８１３（配列番号６０）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ０１５をＥｃｏＲＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ２１０とした。
【０４８０】
２−１−（１１）ａｌａＡ遺伝子欠失株の作成
ｐＧＥ２１０を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ３８８を形質転換し、ＧＥＳ００７作成時と同様な操作により選択した株をＧＥＳ３９３と命名した。
【０４８１】
２−１−（１２）ｉｌｖＢ遺伝子破壊株作成用プラスミドの構築
ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ９５６（配列番号６１）とＧＥＰ９５７（配列番号６２）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ９５８（配列番号６３）とＧＥＰ９５９（配列番号６４）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ０１５をＥｃｏＲＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ２２８とした。
【０４８２】
２−１−（１３）ｉｌｖＢ遺伝子欠失株の作成
ｐＧＥ２２８を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ３９３を形質転換し、ＧＥＳ００７作成時と同様な操作により選択した株をＧＥＳ４０５と命名した。
【０４８３】
２−１−（１４）ｃｇ０９３１遺伝子破壊株作成用プラスミドの構築
ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ１１３２（配列番号６５）とＧＥＰ１１３３（配列番号６６）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ１１３４（配列番号６７）とＧＥＰ１１３５（配列番号６８）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ０１５をＥｃｏＲＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ２５３とした。
【０４８４】
２−１−（１５）ｃｇ０９３１遺伝子欠失株の作成
ｐＧＥ２５３を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ４０５を形質転換し、ＧＥＳ００７作成時と同様な操作により選択した株をＧＥＳ４３５と命名した。
【０４８５】
２−１−（１６）ａｄｈＥ遺伝子破壊株作成用プラスミドの構築
ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２６０６（配列番号６９）とＧＥＰ２６０７（配列番号７０）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ２６０８（配列番号７１）とＧＥＰ２６０９（配列番号７２）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ２０９をＫｐｎＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１１７１とした。
【０４８６】
ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２６８８（配列番号７３）とＧＥＰ２６０７（配列番号７０）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ２６０８（配列番号７１）とＧＥＰ２６８９（配列番号７４）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ２０９をＫｐｎＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１２１８とした。
【０４８７】
２−１−（１７）ａｄｈＥ遺伝子欠失株の作成
ｐＧＥ１１７１を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ０４８を形質転換し、ＧＥＳ００７作成時と同様な操作により選択した株をＧＥＳ１０４１と命名した。
【０４８８】
ｐＧＥ１１７１を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ４３５を形質転換し、ＧＥＳ００７作成時と同様な操作により選択した株をＧＥＳ１０４２と命名した。
【０４８９】
２−１−（１８）ａｌｄ遺伝子破壊株作成用プラスミドの構築
ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２６１０（配列番号７５）とＧＥＰ２６１１（配列番号７６）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ２６１２（配列番号７７）とＧＥＰ２６１３（配列番号７８）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ２０９をＫｐｎＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１１７２とした。
【０４９０】
ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２６９２（配列番号７９）とＧＥＰ２６１１（配列番号７６）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ２６１２（配列番号７７）とＧＥＰ２６９３（配列番号８０）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ２０９をＫｐｎＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１２２１とした。
【０４９１】
２−１−（１９）ａｌｄ遺伝子欠失株の作成
ｐＧＥ１１７２を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０４１を形質転換し、ＧＥＳ００７作成時と同様な操作により選択した株をＧＥＳ１０７０と命名した。
【０４９２】
ｐＧＥ１１７２を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０４２を形質転換し、ＧＥＳ００７作成時と同様な操作により選択した株をＧＥＳ１２１１と命名した。
【０４９３】
（２−２）遺伝子置換編
２−２−（１）ｐＧＥ４０９の構築
ｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）を鋳型とし、ＧＥＰ４３３（配列番号８１）とＧＥＰ４３４（配列番号８２）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ４３７（配列番号８３）とＧＥＰ４３８（配列番号８４）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらはそれぞれカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌用複製起点ｐＵＣｏｒｉを含むＤＮＡ断片である。
【０４９４】
コリネバクテリウム  グルタミカムＮＢＲＣ１２１６９株を独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターから入手し、添付の指示書通りに培養を行い、遠心分離により菌体を回収した。菌体ペレットを１ｍＬの１０ｍＭ  Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｅｎｅｄｉｎｉｔｒｉｌｏｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）緩衝液で洗浄し、６，０００ｘｇ、４℃にて５分間遠心分離して、再度回収した。菌体ペレットを１５ｍｇ／ｍＬリゾチームを含む３００  μＬのＢｕｆｆｅｒ  Ａ１（マッハライ・ナーゲル社製のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＥａｓｙＰｕｒｅに付属）に懸濁させ、３７℃にて２時間振盪させた。その後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＥａｓｙＰｕｒｅの指示書に従って、ｐＣＧ１プラスミドの抽出および精製を行った。これを鋳型とし、ＧＥＰ４４５（配列番号８５）とＧＥＰ４４６（配列番号８６）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはコリネバクテリウム用複製起点ｐＣＧ１ｏｒｉを含むＤＮＡ断片である。
【０４９５】
以上の３つのＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうして得られたプラスミドをｐＧＥ４０３とした。
【０４９６】
ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ４７２（配列番号８７）とＧＥＰ４７８（配列番号８８）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。また、ｐＦＬＡＧ−ＣＴＣ（シグマ・アルドリッチ社製）を鋳型とし、ＧＥＰ４６７（配列番号８９）とＧＥＰ４６８（配列番号９０）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらはそれぞれＡＴＣＣ１３０３２株のｇａｐＡプロモーター（ＰｇａｐＡ）および大腸菌リボソームＲＮＡ転写ターミネーター（ＴｒｒｎＢ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ４０３をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうして得られたプラスミドをｐＧＥ４０９とした。
【０４９７】
２−２−（２）ｐＧＥ１１８５（ΔａｄｈＥ：：ｈｐａＩ置換株作成用プラスミド）の構築
ＥＣＯＳＴＭ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ニッポンジーン社製）を購入し、これをＬＢ寒天培地に無菌条件下で接種し、３７℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体を１０ｍＬのＬＢ培地に接種して生育した菌体を回収し、ゲノムＤＮＡ抽出を行った。ＢＬ２１（ＤＥ３）株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２２６８（配列番号９１）とＧＥＰ２２６９（配列番号９２）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株ｈｐａＩ遺伝子（Ｅｃ＿ｈｐａＩ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＥＴ−１５ｂ（ノバジェン社製）をＮｄｅＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうしてＥｃ＿ｈｐａＩがｐＥＴ−１５ｂへとクローニングされたプラスミドｐＧＥ１０３１を得た。
【０４９８】
ｐＧＥ１０３１を鋳型とし、ＧＥＰ２５１９（配列番号９３）とＧＥＰ２５１８（配列番号９４）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ４０９をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうしてＥｃ＿ｈｐａＩがｐＧＥ４０９へとサブクローニングされたプラスミドｐＧＥ１１４３を得た。
【０４９９】
ｐＧＥ１１４３を鋳型とし、ＧＥＰ２６３７（配列番号９５）とＧＥＰ２６３８（配列番号９６）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはＰｇａｐＡ−ｈｐａＩ−ＴｒｒｎＢを含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ１１７１をＸｈｏＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうして得られたプラスミドをｐＧＥ１１８５とした。
【０５００】
２−２−（３）ｐＧＥ１１８６（Δａｌｄ：：ｈｐａＩ置換株作成用プラスミド）の構築
ｐＧＥ１１４３を鋳型とし、ＧＥＰ２６３９（配列番号９７）とＧＥＰ２６４０（配列番号９８）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはＰｇａｐＡ−ｈｐａＩ−ＴｒｒｎＢを含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ１１７２をＸｈｏＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１８５作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１１８６とした。
【０５０１】
２−２−（４）ΔａｄｈＥ：：ｈｐａＩ  Δａｌｄ：：ｈｐａＩ置換株の作成
ｐＧＥ１１８６を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０４１を形質転換し、３３℃にて２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＡ培地上でカナマイシン耐性株を選択した。次に、得られたカナマイシン耐性株をＳｕｃ寒天培地上に塗布し、３３℃で培養した。生育したコロニーをさらにＡ培地で培養し、コロニーＰＣＲによりａｌｄ遺伝子がＰｇａｐＡ−ｈｐａＩ−ＴｒｒｎＢに置換している株を選択した。これをＧＥＳ１０５２と命名した。さらに、ｐＧＥ１１８５を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０５２を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｄｈＥ遺伝子の位置にＰｇａｐＡ−ｈｐａＩ−ＴｒｒｎＢが挿入した株を選択した。これをＧＥＳ１０６３と命名した。
【０５０２】
ｐＧＥ１１８６を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０４２を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｌｄ遺伝子がＰｇａｐＡ−ｈｐａＩ−ＴｒｒｎＢに置換している株を選択した。これをＧＥＳ１０５３と命名した。ｐＧＥ１１８５を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０５３を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｄｈＥ遺伝子の位置にＰｇａｐＡ−ｈｐａＩ−ＴｒｒｎＢが挿入した株を選択した。これをＧＥＳ１０６４と命名した。
【０５０３】
２−２−（５）ｐＧＥ１３０４（ΔａｄｈＥ：：ｒｈｍＡ置換株作成用プラスミド）の構築
Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）を購入し、これをＬＢ寒天培地に無菌条件下で接種し、３７℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体を１０ｍＬのＬＢ培地に接種して生育した菌体を回収し、ゲノムＤＮＡ抽出を行った。ＤＨ５α株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２７６５（配列番号９９）とＧＥＰ２７６６（配列番号１００）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これは大腸菌ＤＨ５α株ｒｈｍＡ遺伝子（Ｅｃ＿ｒｈｍＡ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ４０９をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ＧＥ１１４３作成時と同様な操作によりＥｃ＿ｒｈｍＡがｐＧＥ４０９へとクローニングされたプラスミドｐＧＥ１２５８を得た。
【０５０４】
ｐＧＥ１２５８を鋳型とし、ＧＥＰ２６３７（配列番号９５）とＧＥＰ２６３８（配列番号９６）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはＰｇａｐＡ−ｒｈｍＡ−ＴｒｒｎＢを含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ１２１８をＸｈｏＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１８５作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１３０４とした。
【０５０５】
２−２−（６）ｐＧＥ１３０２（Δａｌｄ：：ｒｈｍＡ置換株作成用プラスミド）の構築
ｐＧＥ１２５８を鋳型とし、ＧＥＰ２６３９（配列番号９７）とＧＥＰ２６４０（配列番号９８）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ１２２１をＸｈｏＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはＰｇａｐＡ−ｒｈｍＡ−ＴｒｒｎＢを含むＤＮＡ断片である。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１８５作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１３０２とした。
【０５０６】
２−２−（７）ΔａｄｈＥ：：ｒｈｍＡ  Δａｌｄ：：ｒｈｍＡ置換株の作成
ｐＧＥ１３０２を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０４１を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｌｄ遺伝子がＰｇａｐＡ−ｒｈｍＡ−ＴｒｒｎＢに置換している株を選択した。これをＧＥＳ１２１５と命名した。さらに、ｐＧＥ１３０４を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１２１５を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｄｈＥ遺伝子の位置にＰｇａｐＡ−ｒｈｍＡ−ＴｒｒｎＢが挿入した株を選択した。これをＧＥＳ１２４２と命名した。
【０５０７】
２−２−（８）ｐＧＥ１２７２（ΔａｄｈＥ：：ｎａｎＡ置換株作成用プラスミド）の構築
Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）を購入し、これをＬＢ寒天培地に無菌条件下で接種し、３７℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体を１０ｍＬのＬＢ培地に接種して生育した菌体を回収し、ゲノムＤＮＡ抽出を行った。ＤＨ５α株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２７２２（配列番号１０１）とＧＥＰ２７２３（配列番号１０２）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これは大腸菌ＤＨ５α株ｎａｎＡ遺伝子（Ｅｃ＿ｎａｎＡ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ４０９をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１４３作成時と同様な操作によりＥｃ＿ｎａｎＡがｐＧＥ４０９へとクローニングされたプラスミドｐＧＥ１２２６を得た。
【０５０８】
ｐＧＥ１２２６を鋳型とし、ＧＥＰ２６３７（配列番号９５）とＧＥＰ２６３８（配列番号９６）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはＰｇａｐＡ−ｎａｎＡ−ＴｒｒｎＢを含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ１２１８をＸｈｏＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１８５作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１２７２とした。
【０５０９】
２−２−（９）ｐＧＥ１２７３（Δａｌｄ：：ｎａｎＡ置換株作成用プラスミド）の構築
ｐＧＥ１２２６を鋳型とし、ＧＥＰ２６３９（配列番号９７）とＧＥＰ２６４０（配列番号９８）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ１２２１をＸｈｏＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはＰｇａｐＡ−ｎａｎＡ−ＴｒｒｎＢを含むＤＮＡ断片である。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１８５作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１２７３とした。
【０５１０】
２−２−（１０）ΔａｄｈＥ：：ｎａｎＡ  Δａｌｄ：：ｎａｎＡ置換株の作成
ｐＧＥ１２７３を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０４１を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｌｄ遺伝子がＰｇａｐＡ−ｎａｎＡ−ＴｒｒｎＢに置換している株を選択した。これをＧＥＳ１１８８と命名した。さらに、ｐＧＥ１２７２を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１１８８を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｄｈＥ遺伝子の位置にＰｇａｐＡ−ｎａｎＡ−ＴｒｒｎＢが挿入した株を選択した。これをＧＥＳ１２２３と命名した。
【０５１１】
ｐＧＥ１２７３を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０４２を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｌｄ遺伝子がＰｇａｐＡ−ｎａｎＡ−ＴｒｒｎＢに置換している株を選択した。これをＧＥＳ１１８９と命名した。さらに、ｐＧＥ１２７２を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１１８９を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｄｈＥ遺伝子の位置にＰｇａｐＡ−ｎａｎＡ−ＴｒｒｎＢが挿入した株を選択した。これをＧＥＳ１２３３と命名した。
【０５１２】
２−２−（１１）ΔａｄｈＥ  Δａｌｄ株の作成
ｐＧＥ１２７３を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０４１を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｌｄ遺伝子がＰｇａｐＡ−ｎａｎＡ−ＴｒｒｎＢに置換している株を選択した。これをＧＥＳ１１８８と命名した。さらに、ｐＧＥ１２７２を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１１８８を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｄｈＥ遺伝子の位置にＰｇａｐＡ−ｎａｎＡ−ＴｒｒｎＢが挿入した株を選択した。これをＧＥＳ１２２３と命名した。
【０５１３】
ｐＧＥ１２７３を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０４２を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｌｄ遺伝子がＰｇａｐＡ−ｎａｎＡ−ＴｒｒｎＢに置換している株を選択した。これをＧＥＳ１１８９と命名した。さらに、ｐＧＥ１２７２を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１１８９を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｄｈＥ遺伝子の位置にＰｇａｐＡ−ｎａｎＡ−ＴｒｒｎＢが挿入した株を選択した。これをＧＥＳ１２３３と命名した。
【０５１４】
（２−３）過剰発現用プラスミド編
２−３−（１）ｐＧＥ４１１の構築
ｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）を鋳型とし、ＧＥＰ４３３（配列番号８１）とＧＥＰ４３４（配列番号８２）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ４３７（配列番号８３）とＧＥＰ４３８（配列番号８４）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらはそれぞれカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌用複製起点ｐＵＣｏｒｉを含むＤＮＡ断片である。
【０５１５】
コリネバクテリウム  カゼイＪＣＭ１２０７２株を理化学研究所バイオリソース研究センターから入手し、添付の指示書通りに培養を行い、遠心分離により菌体を回収した。菌体ペレットを１ｍＬの１０ｍＭ  Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｅｎｅｄｉｎｉｔｒｉｌｏｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）緩衝液に懸濁させ、６，０００ｘｇ、４℃にて５分間遠心分離して、再度回収した。菌体ペレットを１５ｍｇ／ｍＬリゾチームを含む３００  μＬのＢｕｆｆｅｒ  Ａ１（マッハライ・ナーゲル社製のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＥａｓｙＰｕｒｅに付属する）に懸濁させ、３７℃にて２時間振盪させた。その後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＥａｓｙＰｕｒｅの指示書に従って、ｐＣＡＳＥ１プラスミドの抽出および精製を行った。これを鋳型とし、ＧＥＰ４４３（配列番号１０３）とＧＥＰ４４４（配列番号１０４）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはコリネバクテリウム用複製起点ｐＣＡＳＥ１ｏｒｉを含むＤＮＡ断片である。
【０５１６】
以上の３つのＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうして得られたプラスミドをｐＧＥ４０２とした。
【０５１７】
ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ４７４（配列番号１０５）とＧＥＰ４７７（配列番号１０６）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。また、ｐＦＬＡＧ−ＣＴＣ（シグマ・アルドリッチ社製）を鋳型とし、ＧＥＰ４６７（配列番号８９）とＧＥＰ４６８（配列番号９０）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらはそれぞれＡＴＣＣ１３０３２株のｌｄｈＡプロモーター（ＰｌｄｈＡ）および大腸菌リボソームＲＮＡ転写ターミネーター（ＴｒｒｎＢ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ４０２をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうして得られたプラスミドをｐＧＥ４１１とした。
【０５１８】
２−３−（２）ｐＧＥ９４５−２の構築
ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）を鋳型とし、ＧＥＰ４３５（配列番号１０７）とＧＥＰ４３６（配列番号１０８）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。また、ｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）を鋳型とし、ＧＥＰ４３７（配列番号８３）とＧＥＰ４３８（配列番号８４）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらはそれぞれスペクチノマイシン耐性遺伝子および大腸菌用複製起点ｐＵＣｏｒｉを含むＤＮＡ断片である。
【０５１９】
以上の２つのＤＮＡ断片、および、ｐＧＥ４０２の作成時に得たｐＣＡＳＥ１ｏｒｉを含むＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうして得られたプラスミドをｐＧＥ６１９とした。
【０５２０】
ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ４７４（配列番号１０５）とＧＥＰ４７７（配列番号１０６）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。また、ｐＦＬＡＧ−ＣＴＣ（シグマ・アルドリッチ社製）を鋳型とし、ＧＥＰ４６７（配列番号８９）とＧＥＰ２８９７（配列番号１０９）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらはそれぞれＡＴＣＣ１３０３２株のｌｄｈＡプロモーター（ＰｌｄｈＡ）および大腸菌リボソームＲＮＡ転写ターミネーター（ＴｒｒｎＢ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ６１９をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうして得られたプラスミドをｐＧＥ９４５−２とした。
【０５２１】
２−３−（３）Ｐｐ＿ｍｄｌＣ過剰発現用プラスミドの構築
シュードモナス  プチダＮＢＲＣ１４１６４株は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターから入手し、添付の指示書通りに培養を行った後に、ゲノムＤＮＡ抽出を行った。ＮＢＲＣ１４１６４株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２５５０（配列番号１１０）とＧＥＰ２５５１（配列番号１１１）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはシュードモナス  プチダＮＢＲＣ１４１６４株ｍｄｌＣ遺伝子（Ｐｐ＿ｍｄｌＣ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＥＴ−１５ｂ（ノバジェン社製）をＮｄｅＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１０３１作成時と同様な操作によりＰｐ＿ｍｄｌＣがｐＥＴ−１５ｂへとクローニングされたプラスミドｐＧＥ１１６１を得た。
【０５２２】
ｐＧＥ１１６１を鋳型とし、ＧＥＰ２６５３（配列番号１１２）とＧＥＰ２６５４（配列番号１１３）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ４０９をＮｄｅＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１８５作成時と同様な操作によりＰｐ＿ｍｄｌＣがｐＧＥ４０９へとサブクローニングされたプラスミドｐＧＥ１１９７を得た。
【０５２３】
２−３−（４）Ｋｐ＿ｄｈａＴ過剰発現用プラスミドの構築
クレブシエラ  ニューモニエ由来の遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション番号：ＬＣ４１２９０２）を含むプラスミドｐＨＡ１２−ｄｈａＢＴを広島大学田島誉久博士より供与を頂いた。これを鋳型とし、ＧＥＰ２５２９（配列番号１１４）とＧＥＰ２５３０（配列番号１１５）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはクレブシエラ  ニューモニエｄｈａＴ遺伝子（Ｋｐ＿ｄｈａＴ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＥＴ−１５ｂ（ノバジェン社製）をＮｄｅＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１６１作成時と同様な操作によりＫｐ＿ｄｈａＴがｐＥＴ−１５ｂへとクローニングされたプラスミドｐＧＥ１１５０を得た。
【０５２４】
ｐＧＥ１１５０をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、１．２ｋｂのＤＮＡ断片をアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ９４５−２をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（東洋紡社製）をその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうしてＫｐ＿ｄｈａＴがｐＧＥ９４５−２へとサブクローニングされたプラスミドｐＧＥ１１９０を得た。
【０５２５】
２−３−（５）Ｌｌ＿ｌｄｈＡ  Ｑ８５Ｃ過剰発現用プラスミドの構築
ラクトコッカス  ラクティスＮＢＲＣ１００６７６株は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターから入手し、添付の指示書通りに培養を行った後に、ゲノムＤＮＡ抽出を行った。ＮＢＲＣ１００６７６株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２７９９（配列番号１１６）とＧＥＰ２８００（配列番号１１７）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはラクトコッカス  ラクティスＮＢＲＣ１００６７６株ｌｄｈＡ遺伝子（Ｌｌ＿ｌｄｈＡ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＥＴ−１５ｂ（ノバジェン社製）をＮｄｅＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１０３１作成時と同様な操作によりＬｌ＿ｌｄｈＡがｐＥＴ−１５ｂへとクローニングされたプラスミドｐＧＥ１２７４を得た。
【０５２６】
ラクトコッカス  ラクティスＮＢＲＣ１００６７６株由来の乳酸デヒドロゲナーゼへの変異導入を目的とし、ｐＧＥ１２７４を鋳型としてＧＥＰ２８０３（配列番号１１８）およびＧＥＰ２８０４（配列番号１１９）で示される塩基配列のＤＮＡを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに用いて、変異導入およびプラスミドの増幅を行い、Ｌｌ＿ｌｄｈＡの変異遺伝子Ｌｌ＿ｌｄｈＡ  Ｑ８５Ｃの配列を有するプラスミドｐＧＥ１２７５を得た。
【０５２７】
ｐＧＥ１２７５を鋳型とし、ＧＥＰ２８０１（配列番号１２０）とＧＥＰ２８０２（配列番号１２１）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ９４５−２をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうしてＬｌ＿ｌｄｈＡ  Ｑ８５ＣがｐＧＥ９４５−２へとサブクローニングされたプラスミドｐＧＥ１２８６を得た。
【０５２８】
２−３−（６）Ｌｓ＿ｌｅｕｄｈ過剰発現用プラスミドの構築
リシニバシラス  スフェリカスＮＢＲＣ３５２５株は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターから入手し、添付の指示書通りに培養を行った後に、ゲノムＤＮＡ抽出を行った。ＮＢＲＣ３５２５株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２５２５（配列番号１２２）とＧＥＰ２５２６（配列番号１２３）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはリシニバシラス  スフェリカスＮＢＲＣ３５２５株ｌｅｕｄｈ遺伝子（Ｌｓ＿ｌｅｕｄｈ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＥＴ−１５ｂ（ノバジェン社製）をＮｄｅＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１０３１作成時と同様な操作によりＬｓ＿ｌｅｕｄｈがｐＥＴ−１５ｂへとクローニングされたプラスミドｐＧＥ１１４８を得た。
【０５２９】
ｐＧＥ１１４８を鋳型とし、ＧＥＰ２６５５（配列番号１２４）とＧＥＰ２６５０（配列番号１２５）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ９４５−２をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１２８６作成時と同様な操作によりＬｓ＿ｌｅｕｄｈがｐＧＥ９４５−２へとサブクローニングされたプラスミドｐＧＥ１２０３を得た。
【０５３０】
２−３−（７）Ｓｆ＿ｖａｌｄｈ過剰発現用プラスミドの構築
ストレプトミセス  フラジエＡＴＣＣ１９６０９株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、添付の指示書通りに培養を行った後に、ゲノムＤＮＡ抽出を行った。ＡＴＣＣ１９６０９株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２６００（配列番号１２６）とＧＥＰ２６０１（配列番号１２７）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはストレプトミセス  フラジエＡＴＣＣ１９６０９株ｖａｌｄｈ遺伝子（Ｓｆ＿ｖａｌｄｈ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＥＴ−１５ｂ（ノバジェン社製）をＮｄｅＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１０３１作成時と同様な操作によりＳｆ＿ｖａｌｄｈがｐＥＴ−１５ｂへとクローニングされたプラスミドｐＧＥ１１７５を得た。
【０５３１】
２−３−（８）Ｂｂ＿ｐｈｅｄｈ過剰発現用プラスミドの構築
バシラス  バディウスＮＢＲＣ１５７１３株は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターから入手し、添付の指示書通りに培養を行った後に、ゲノムＤＮＡ抽出を行った。ＮＢＲＣ１５７１３株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２６７８（配列番号１２８）とＧＥＰ２６７９（配列番号１２９）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはバシラス  バディウスＮＢＲＣ１５７１３株ｐｈｅｄｈ遺伝子（Ｂｂ＿ｐｈｅｄｈ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＥＴ−１５ｂ（ノバジェン社製）をＮｄｅＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１０３１作成時と同様な操作によりＢｂ＿ｐｈｅｄｈがｐＥＴ−１５ｂへとクローニングされたプラスミドｐＧＥ１２３７を得た。
【０５３２】
２−３−（９）ＡｔＣＧＳ１過剰発現用プラスミドの構築
ｐＭＫ−ＡｔＣＧＳはサーモ・フィッシャー社より購入した。ｐＭＫ−ＡｔＣＧＳはシロイヌナズナのＣＧＳ１遺伝子（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３１，６３９−６４８（１９９８）、ＤＤＢＪアクセッション番号：Ｕ４３７０９）がコードするアミノ酸配列のうち、６９番目のアミノ酸以降の配列についてコリネバクテリウム  グルタミカムでの発現が最適化された合成ＤＮＡを含むプラスミドである。これを鋳型とし、ＧＥＰ１０５３（配列番号１３０）とＧＥＰ１０５４（配列番号１３１）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはコリネバクテリウム  グルタミカムでの発現が最適化されたシロイヌナズナＣＧＳ１遺伝子（ＡｔＣＧＳ１）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ４１１をＮｄｅＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１８５作成時と同様な操作によりＡｔＣＧＳ１がｐＧＥ４１１へとサブクローニングされたプラスミドｐＧＥ４７９を得た。
【０５３３】
ｐＧＥ４７９をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、１．５ｋｂのＤＮＡ断片をアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ４０９をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（東洋紡社製）をその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうしてＡｔＣＧＳ１がｐＧＥ４０９へとサブクローニングされたプラスミドｐＧＥ５１３を得た。
【０５３４】
２−３−（１０）各種アルドラーゼ酵素過剰発現用プラスミドの構築
ＤＨ５α株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２７１２（配列番号１３２）とＧＥＰ２７１３（配列番号１３３）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、ＧＥＰ２７１４（配列番号１３４）とＧＥＰ２７１５（配列番号１３５）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、ＧＥＰ２７２０（配列番号１３６）とＧＥＰ２７２１（配列番号１３７）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、ＧＥＰ２７２６（配列番号１３８）とＧＥＰ２７２７（配列番号１３９）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、ＧＥＰ２７６７（配列番号１４０）とＧＥＰ２７６８（配列番号１４１）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはそれぞれ大腸菌ＤＨ５α株ｅｄａ遺伝子（Ｅｃ＿ｅｄａ）、ｙｊｊＪ遺伝子（Ｅｃ＿ｙｊｈＨ）、ｄｇｏＡ遺伝子（Ｅｃ＿ｄｇｏＡ）、ｍｈｐＦＥ遺伝子（Ｅｃ＿ｍｈｐＦＥ）、ｇａｒＬ遺伝子（Ｅｃ＿ｇａｒＬ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ４０９をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。各種遺伝子を有するＤＮＡ断片、およびｐＧＥ４０９由来のＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１８５作成時と同様な操作によりＥｃ＿ｅｄａ、Ｅｃ＿ｙｊｈＨ、Ｅｃ＿ｄｇｏＡ、Ｅｃ＿ｍｈｐＦＥ、Ｅｃ＿ｇａｒＬがｐＧＥ４０９へとクローニングされたプラスミドｐＧＥ１２２３、ｐＧＥ１２２４、ｐＧＥ１２２５、ｐＧＥ１２２７、ｐＧＥ１２５９を得た。
【０５３５】
シュードモナス  プチダＮＢＲＣ１４１６４株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２７６９（配列番号１４２）とＧＥＰ２７７０（配列番号１４３）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはシュードモナス  プチダＮＢＲＣ１４１６４株ｇａｌＣ遺伝子（Ｐｐ＿ｇａｌＣ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ４０９をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１８５作成時と同様な操作によりＰｐ＿ｇａｌＣがｐＧＥ４０９へとクローニングされたプラスミドｐＧＥ１２６０を得た。
【０５３６】
ノカルディオイデス属ＮＢＲＣ１０９３５１株は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターから入手し、添付の指示書通りに培養を行った後に、ゲノムＤＮＡ抽出を行った。ＮＢＲＣ１０９３５１株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２７１６（配列番号１４４）とＧＥＰ２７１７（配列番号１４５）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはノカルディオイデス属ＮＢＲＣ１０９３５１株ｐｈｄＪ遺伝子（Ｎｓ＿ｐｈｄＪ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ４０９をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１８５作成時と同様な操作によりＮｓ＿ｐｈｄＪがｐＧＥ４０９へとクローニングされたプラスミドｐＧＥ１２３９を得た。
【０５３７】
バークホルデリア  ゼノボランスＤＳＭＺ１７３６７株はＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨから入手し、添付の指示書通りに培養を行った後に、ゲノムＤＮＡ抽出を行った。ＤＳＭＺ１７３６７株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２７７１（配列番号１４６）とＧＥＰ２７７２（配列番号１４７）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはバークホルデリア  ゼノボランスＤＳＭＺ１７３６７株ｂｐｈＪＩ遺伝子（Ｂｘ＿ｂｐｈＪＩ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ４０９をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１８５作成時と同様な操作によりＢｘ＿ｂｐｈＪＩがｐＧＥ４０９へとクローニングされたプラスミドｐＧＥ１２６２を得た。
【０５３８】
３．菌体構築
（３−１）Ｐｐ＿ｍｄｌＣおよびＫｐ＿ｄｈａＴ過剰発現プラスミド導入株の作成
ｐＧＥ１１９７とｐＧＥ１１９０を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０７０を形質転換し、３３℃にて２５μｇ／ｍｌのカナマイシンと１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシを含むＡ寒天培地上でカナマイシン・スペクチノマイシ耐性株を選択した。これをＧＥＳ１２０６と命名した。
【０５３９】
ｐＧＥ１１９７とｐＧＥ１１９０を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０６３を形質転換し、３３℃にて２５μｇ／ｍｌのカナマイシンと１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシを含むＡ寒天培地上でカナマイシン・スペクチノマイシ耐性株を選択した。これをＧＥＳ１０７７と命名した。
【０５４０】
ｐＧＥ１１９７とｐＧＥ１１９０を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０６４を形質転換し、３３℃にて２５μｇ／ｍｌのカナマイシンと１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシを含むＡ寒天培地上でカナマイシン・スペクチノマイシ耐性株を選択した。これをＧＥＳ１０６８と命名した。
【０５４１】
コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）  ＧＥＳ１０６８は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８）の独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託した（寄託日：２０１８年９月１３日、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７８０）
ｐＧＥ１１９７とｐＧＥ１１９０を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１２２３を形質転換し、３３℃にて２５μｇ／ｍｌのカナマイシンと１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシを含むＡ寒天培地上でカナマイシン・スペクチノマイシ耐性株を選択した。これをＧＥＳ１２５３と命名した。
【０５４２】
ｐＧＥ１１９７とｐＧＥ１１９０を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１２３３を形質転換し、３３℃にて２５μｇ／ｍｌのカナマイシンと１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシを含むＡ寒天培地上でカナマイシン・スペクチノマイシ耐性株を選択した。これをＧＥＳ１２５４と命名した。
【０５４３】
コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）  ＧＥＳ１２５４は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８）の独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託した（寄託日：２０１８年９月１３日、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７８１）
ｐＧＥ１１９７とｐＧＥ１１９０を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１２４２を形質転換し、３３℃にて２５μｇ／ｍｌのカナマイシンと１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシを含むＡ寒天培地上でカナマイシン・スペクチノマイシ耐性株を選択した。これをＧＥＳ１２８２と命名した。
【０５４４】
（３−２）Ｌｌ＿ｌｄｈＡ  Ｑ８５Ｃ過剰発現プラスミド導入株の作成
ｐＧＥ１２８６を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０６４を形質転換し、３３℃にて１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシを含むＡ寒天培地上でスペクチノマイシ耐性株を選択した。これをＧＥＳ１２３２と命名した。
【０５４５】
コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）  ＧＥＳ１２３２は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８）の独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託した（寄託日：２０１８年９月１３日、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７８２）
ｐＧＥ１２８６を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１２１１を形質転換し、３３℃にて１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシを含むＡ寒天培地上でスペクチノマイシ耐性株を選択した。これをＧＥＳ１２９４と命名した。
【０５４６】
（３−３）Ｌｓ＿ｌｅｕｄｈ過剰発現プラスミド導入株の作成
ｐＧＥ１２０３を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０６４を形質転換し、３３℃にて１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシを含むＡ培地上でスペクチノマイシ耐性株を選択した。これをＧＥＳ１０７３と命名した。
【０５４７】
コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）  ＧＥＳ１０７３は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８）の独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託した（寄託日：２０１８年９月１３日、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７８３）
ｐＧＥ１２０３を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１２１１を形質転換し、３３℃にて１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシを含むＡ培地上でスペクチノマイシ耐性株を選択した。これをＧＥＳ１２９５と命名した。
【０５４８】
（３−４）Ｌｓ＿ｌｅｕｄｈおよびＡｔＣＧＳ１発現プラスミド導入株の作成
ｐＧＥ１２０３とｐＧＥ５１３を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０６４を形質転換し、３３℃にて２５μｇ／ｍｌのカナマイシンと１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシを含むＡ寒天培地上でカナマイシン・スペクチノマイシ耐性株を選択した。これをＧＥＳ１０９７と命名した。
【０５４９】
コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）  ＧＥＳ１０９７は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８）の独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託した（寄託日：２０１８年９月１３日、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７８４）
【０５５０】
（３−５）各種アルドラーゼ発現プラスミド導入株の作成
ｐＧＥ１１４３、ｐＧＥ１２２３、ｐＧＥ１２２４、ｐＧＥ１２２５、ｐＧＥ１２２６、ｐＧＥ１２２７、ｐＧＥ１２３９、ｐＧＥ１２５８、ｐＧＥ１２５９、ｐＧＥ１２６０、ｐＧＥ１２６２をそれぞれ用い、電気穿孔法によりＧＥＳ４３５を形質転換し、３３℃にて２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＡ寒天培地上でカナマイシン耐性株を選択した。これをそれぞれＧＥＳ１００９、ＧＥＳ１１１９、ＧＥＳ１１２０、ＧＥＳ１１２１、ＧＥＳ１１２２、ＧＥＳ１１２３、ＧＥＳ１１２７、ＧＥＳ１１５４、ＧＥＳ１１５５、ＧＥＳ１１５６、ＧＥＳ１１５７と命名した。
【０５５１】
４．物質生産実験
（４−１）４−ヒドロキシ−２−オキソ酪酸（ＨＯＢ）の生産
４−１−（１）ＧＥＳ１０７７の培養
ＧＥＳ１０７７のグリセロールストックをカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびスペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬを含むＡ寒天培地に無菌条件下で接種し、３３℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体をカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびスペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬを含む１０ｍＬのＢＡ培地に接種し、３３℃にて振盪培養を行い種培養液とした。この種培養液を濁度が０．１となるように２Ｌフラスコ中に用意されたカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびスペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬを含む５００ｍＬのＢＡ培地に接種した。３３℃にて振盪を行い終夜培養した。この本培養液を４℃、５５００ｘｇにて１５分間遠心分離を行い、上澄み液を除去した。このようにして得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
【０５５２】
４−１−（２）ＧＥＳ１０７７を用いたＨＯＢの生産
前記の通り調製された湿菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるようにＢＲバッファーに懸濁した。この菌体懸濁液に５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液および１．２Ｍのホルムアルデヒド水溶液をそれぞれ５０ｍＭ、４０ｍＭとなるように加え、１．０Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いてｐＨを６．０に維持しながら３３℃にて培養を行った。当該湿菌体濃度においては、攪拌を水酸化カリウム水溶液が効率的に混和する程度に抑えておき、かつ、通気を行わなければ、自ずと嫌気的条件下または微好気的条件が達成される。３時間後、反応液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＨＯＢが０．６５ｍＭ生成していた。
【０５５３】
４−１−（３）比較例１
前記の通り調製された湿菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるようにＢＲバッファーに懸濁した。この菌体懸濁液に５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液を５０ｍＭとなるように加え、１．０Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いてｐＨを６．０に維持しながら３３℃にて反応を行った。３時間後、反応懸濁液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＨＯＢは検出されなかった。
【０５５４】
４−１−（４）比較例２
ＧＥＳ１２０６について、前記４−１−（１）、４−１−（２）と同様の実験を行った。反応３時間後、反応懸濁液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＨＯＢは検出されなかった。
【０５５５】
４−１−（２）、４−１−（３）、４−１−（４）の結果から、ＧＥＳ１０７７のようなクラス２アルドラーゼをコードする遺伝子を持つ菌体は、糖類およびアルデヒド存在下に培養することで、糖類からピルビン酸を生成し、これとアルデヒドの間のアルドール反応を当該酵素が触媒することで、ＨＯＢに代表されるようなアルドール化合物を生成することがわかった。
【０５５６】
４−１−（５）ＧＥＳ１２８２の培養
ＧＥＳ１２８２のグリセロールストックから４−１−（１）と同様に培養し得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
【０５５７】
４−１−（６）ＧＥＳ１２８２を用いたＨＯＢの生産
前記の通り調製された湿菌体を４−１−（２）と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。３時間後、反応液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＨＯＢが０．３６ｍＭ生成していた。
【０５５８】
４−１−（７）比較例１
前記の通り調製された湿菌体を４−１−（３）と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。３時間後、反応懸濁液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＨＯＢは検出されなかった。
【０５５９】
４−１−（６）、４−１−（７）、４−１−（４）の結果から、ＧＥＳ１２８２のようなＧＥＳ１０７７とは異なるクラス２アルドラーゼをコードする遺伝子を持つ菌体も、糖類およびアルデヒド存在下に培養することで、糖類からピルビン酸を生成し、これとアルデヒドの間のアルドール反応を当該酵素が触媒することで、ＨＯＢに代表されるようなアルドール化合物を生成することがわかった。
【０５６０】
４−１−（８）ＧＥＳ１２５３の培養
ＧＥＳ１２５３のグリセロールストックから４−１−（１）と同様に培養し得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
【０５６１】
４−１−（９）ＧＥＳ１２５３を用いたＨＯＢの生産
前記の通り調製された湿菌体を４−１−（２）と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。３時間後、反応液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＨＯＢが０．３４ｍＭ生成していた。
【０５６２】
４−１−（１０）比較例１
前記の通り調製された湿菌体を４−１−（２）と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。３時間後、反応懸濁液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＨＯＢは検出されなかった。
【０５６３】
４−１−（９）、４−１−（１０）、４−１−（４）の結果から、ＧＥＳ１２５３のようなクラス１アルドラーゼをコードする遺伝子を持つ菌体は、糖類およびアルデヒド存在下に培養することで、糖類からピルビン酸を生成し、これとアルデヒドの間のアルドール反応を当該酵素が触媒することで、ＨＯＢに代表されるようなアルドール化合物を生成することがわかった。
【０５６４】
４−１−（１１）ＧＥＳ１０６８およびＧＥＳ１２５４の培養
ＧＥＳ１０６８およびＧＥＳ１２５４のグリセロールストックから４−１−（１）と同様に培養し得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
【０５６５】
４−１−（１２）ＧＥＳ１０６８およびＧＥＳ１２５４を用いたＨＯＢの生産
前記の通り調製された湿菌体を４−１−（２）と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。３時間後、反応液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＨＯＢがＧＥＳ１０６８を用いた反応では１．２ｍＭ、ＧＥＳ１２５４を用いた反応では０．４２ｍＭ生成していた。
【０５６６】
４−１−（１２）の結果から、ＧＥＳ１０６８およびＧＥＳ１２５４のようなＧＥＳ１０７７およびＧＥＳ１２５３とは異なる遺伝子型の微生物であっても、クラス２アルドラーゼをコードする遺伝子を持つ菌体であれば、糖類およびアルデヒド存在下に培養することで、糖類からピルビン酸を生成し、これとアルデヒドの間のアルドール反応を当該酵素が触媒することで、ＨＯＢに代表されるようなアルドール化合物を生成することがわかった。
【０５６７】
（４−２）１，３−プロパンジオール（ＰＤＯ）の生産
４−２−（１）ＧＥＳ１０７７、ＧＥＳ１０６８の培養
ＧＥＳ１０７７、ＧＥＳ１０６８のグリセロールストックをカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびスペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬを含むＡ寒天培地に無菌条件下で接種し、３３℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体をカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびスペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬを含む１０ｍＬのＢＡ培地に接種し、３３℃にて振盪培養を行い種培養液とした。この種培養液を濁度が０．１となるように２Ｌフラスコ中に用意されたカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびスペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬを含む５００ｍＬのＢＡ培地に接種した。３３℃にて振盪を行い終夜培養した。この本培養液を４℃、５５００ｘｇにて１５分間遠心分離を行い、上澄み液を除去した。このようにして得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
【０５６８】
４−２−（２）ＧＥＳ１０７７、ＧＥＳ１０６８を用いたＰＤＯの生産
前記の通り調製された湿菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるようにＢＲバッファーに懸濁した。この菌体懸濁液に５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液および１．２Ｍのホルムアルデヒド水溶液をそれぞれ５０ｍＭ、４０ｍＭとなるように加え、１．０Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いてｐＨを６．０に維持しながら３３℃にて培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。３時間後、反応液の上清を糖分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＰＤＯがＧＥＳ１０７７を用いた反応では７．４ｍＭ、ＧＥＳ１０６８を用いた反応では１１．４ｍＭ生成していた。
【０５６９】
以上の結果から、ＧＥＳ１０７７およびＧＥＳ１０６８のようなクラス２アルドラーゼをコードする遺伝子を持ち、糖類およびホルムアルデヒド存在下に培養するとＨＯＢを生産できる菌体が、さらにデカルボキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有する場合、ＨＯＢがさらにＰＤＯへと変換され、ＰＤＯを製造できることがわかった。
【０５７０】
４−２−（３）ＧＥＳ１２８２の培養
ＧＥＳ１２８２のグリセロールストックから４−２−（１）と同様に培養し得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
【０５７１】
４−２−（４）ＧＥＳ１２８２を用いたＰＤＯの生産
前記の通り調製された湿菌体を４−２−（２）と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。６時間後、反応液の上清を糖分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＰＤＯが１１．４ｍＭ生成していた。
【０５７２】
以上の結果から、ＧＥＳ１２８２のようなＧＥＳ１０７７やＧＥＳ１０６８とは異なるクラス２アルドラーゼをコードする遺伝子を持ち、糖類およびホルムアルデヒド存在下に培養するとＨＯＢを生産できる菌体も、さらにデカルボキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有する場合、ＨＯＢがさらにＰＤＯへと変換され、ＰＤＯを製造できることがわかった。
【０５７３】
４−２−（５）ＧＥＳ１２５３、ＧＥＳ１２５４の培養
ＧＥＳ１２５４のグリセロールストックから４−２−（１）と同様に培養し得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
【０５７４】
４−２−（６）ＧＥＳ１２５３、ＧＥＳ１２５４を用いたＰＤＯの生産
前記の通り調製された湿菌体を４−２−（２）と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。６時間後、反応液の上清を糖分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＰＤＯがＧＥＳ１２５３を用いた反応では４．１ｍＭ、ＧＥＳ１２５４を用いた反応では５．８ｍＭ生成していた。
【０５７５】
以上の結果から、ＧＥＳ１２５３およびＧＥＳ１２５４のようなクラス１アルドラーゼをコードする遺伝子を持ち、糖類およびホルムアルデヒド存在下に培養するとＨＯＢを生産できる菌体が、さらにデカルボキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有する場合、ＨＯＢがさらにＰＤＯへと変換され、ＰＤＯを製造できることがわかった。
【０５７６】
（４−３）１，３−ブタンジオール（ＢＤＯ）の生産
４−３−（１）ＧＥＳ１０６８の培養
ＧＥＳ１０６８のグリセロールストックから４−２−（１）と同様に培養し得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
【０５７７】
４−３−（２）ＧＥＳ１０６８を用いたＢＤＯの生産
前記の通り調製された湿菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるようにＢＲバッファーに懸濁した。この菌体懸濁液に５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液および１．２Ｍのアセトアルデヒド水溶液をそれぞれ５０ｍＭ、４０ｍＭとなるように加え、１．０Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いてｐＨを６．０に維持しながら３３℃にて培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。３時間後、反応液の上清を糖分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＢＤＯが８．２ｍＭ生成していた。
【０５７８】
以上の結果から、ＧＥＳ１０６８のようなアルドラーゼ、デカルボキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有する菌体を、糖類およびアセトアルデヒド存在下に培養することで、ＢＤＯを製造できることがわかった。
【０５７９】
なお、４−２−（２）において、反応時間が３時間を過ぎてホルムアルデヒド濃度が低下した後も反応を続けると、２２時間後にはＢＤＯがＧＥＳ１０７７を用いた反応では３．５ｍＭ、ＧＥＳ１０６８を用いた反応では２．７ｍＭ生成していた。これは、ホルムアルデヒドがアルドラーゼの反応に関与できない濃度まで低下した際に、ピルビン酸に対するｍｄｌＣ（脱炭酸酵素）の触媒作用によりアセトアルデヒドが発生し、これがもう一分子のピルビン酸とアルドール反応を行い、４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏｖａｌｅｒａｔｅ（ＨＯＶ）を生じ、これがさらにｍｄｌＣ，  ｄｈａＴの触媒作用で脱炭酸、還元を受けることで、  ＢＤＯを生じていると考えられる。したがって、アルドラーゼをコードする遺伝子を持ち、さらにデカルボキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有する菌体については、糖類のみを炭素源として培養し、ＢＤＯを生産することができる。実際、ＧＥＳ１０７７について４−２−（２）の記載の条件からホルムアルデヒドを添加しない条件で、培養を行ったところ、２２時間後にＢＤＯが０．６０ｍＭ生成していた。
【０５８０】
（４−４）各種１，３−ジオールの生産
４−４−（１）ＧＥＳ１０６８の培養
ＧＥＳ１０６８のグリセロールストックから４−２−（１）と同様に培養し得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
【０５８１】
４−４−（２）ＧＥＳ１０６８を用いた各種１，３−ジオールの生産
前記の通り調製された湿菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるようにＢＲバッファーに懸濁した。この菌体懸濁液に５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液およびアルデヒド（プロピオンアルデヒド、ノルマルブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、ノルマルバレルアルデヒド）をそれぞれ５０ｍＭ、４０ｍＭとなるように加え、１．０Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いてｐＨを６．０に維持しながら３３℃にて培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。３時間後、反応液の上清をＧＣＭＳにより分析したところ、各反応でプロピオンアルデヒド、ノルマルブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、ノルマルバレルアルデヒドに由来する１，３−ペンタンジオール、１，３−ヘキサンジオール、４−メチル−１，３−ペンタンジオール、１，３−ヘプタンジオールがそれぞれ確認された。図６は、プロピオンアルデヒドを使用した場合におけるガスクロマトグラフ質量分析の結果を示す。図７は、ノルマルブチルアルデヒドを使用した場合におけるガスクロマトグラフ質量分析の結果を示す。図８は、イソブチルアルデヒドを使用した場合におけるガスクロマトグラフ質量分析の結果を示す。図８は、ノルマルバレルアルデヒドを使用した場合におけるガスクロマトグラフ質量分析の結果を示す。
【０５８２】
以上の結果から、ＧＥＳ１０６８のようなアルドラーゼ、デカルボキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有する菌体を、糖類およびプロピオンアルデヒド、またはノルマルブチルアルデヒド、またはイソブチルアルデヒド、またはノルマルバレルアルデヒド存在下に培養することで、１，３−ペンタンジオール、１，３−ヘキサンジオール、４−メチル−１，３−ペンタンジオール、１，３−ヘプタンジオールを製造できることがわかった。
【０５８３】
また、一般的に、ＧＥＳ１０６８のようなアルドラーゼ、デカルボキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有する菌体を糖類およびアルデヒド類の存在下に培養することで、糖類からピルビン酸が生成し、これとアルデヒド類の反応からアルドール化合物である４−ヒドロキシ−２−オキソカルボン酸が生成し、これが３−ヒドロキシアルデヒド化合物、さらには１，３−ジオールへと変換され、最終的に１，３−ジオールが製造できることが期待される。
【０５８４】
（４−５）２，４−ジヒドロキシ酪酸（ＤＨＢ）の生産
４−５−（１）ＧＥＳ１２３２の培養
ＧＥＳ１２３２のグリセロールストックをスペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬを含むＡ寒天培地に無菌条件下で接種し、３３℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体をスペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬを含む１０ｍＬのＢＡ培地に接種し、３３℃にて振盪培養を行い種培養液とした。この種培養液を濁度が０．１となるように２Ｌフラスコ中に用意されたスペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬを含む５００ｍＬのＢＡ培地に接種した。３３℃にて振盪を行い終夜培養した。この本培養液を４℃、５５００ｘｇにて１５分間遠心分離を行い、上澄み液を除去した。このようにして得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
【０５８５】
４−５−（２）ＧＥＳ１２３２を用いたＤＨＢの生産
前記の通り調製された湿菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるようにＢＲバッファーに懸濁した。この菌体懸濁液に５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液および１．２Ｍのホルムアルデヒド水溶液をそれぞれ１００ｍＭ、４０ｍＭとなるように加え、１．０Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いてｐＨを７．０に維持しながら３３℃にて培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。３時間後、反応液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＤＨＢが１１ｍＭ生成していた。
【０５８６】
４−５−（３）比較例１
前記の通り調製された湿菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるようにＢＲバッファーに懸濁した。この菌体懸濁液に５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液を１００ｍＭとなるように加え、１．０Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いてｐＨを７．０に維持しながら３３℃にて反応を行った。３時間後、反応液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＤＨＢは検出されなかった。
【０５８７】
４−５−（４）比較例２
ＧＥＳ１２９４について、前記（１）（２）と同様の実験を行った。反応３時間後、反応懸濁液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＤＨＢは検出されなかった。
【０５８８】
以上の結果から、ＧＥＳ１２３２のようなアルドラーゼをコードする遺伝子を持ち、糖類およびホルムアルデヒド存在下に培養するとＨＯＢを生産できる菌体が、さらにＨＯＢ還元活性を有するデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有する場合、これを糖類およびホルムアルデヒド存在下に培養することで、ＨＯＢがさらにＤＨＢへと変換され、ＤＨＢを製造できることがわかった。
【０５８９】
（４−６）Ｌ−ホモセリンＮ−デヒドロゲナーゼ活性の確認
４−６−（１）ロイシンデヒドロゲナーゼの発現と酸化的脱アミノ化反応活性の測定
ｐＧＥ１１４８を用いてＥＣＯＳＴＭ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ニッポンジーン社製）をその指示書通りに形質転換し、得られた菌株をＧＥＳ１００７とした。ＧＥＳ１００７をアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に無菌条件下で接種し、３７℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体をアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含む１０ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃にて振盪培養を行い種培養液とした。この種培養液を濁度が０．１となるように５００ｍＬフラスコ中に用意されたアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含む１００ｍＬのＬＢ培地に接種した。３７℃にて振盪を行い濁度が０．７になるまで培養した。ＩＰＴＧを終濃度０．２ｍＭになるように加え、１６℃にて終夜振盪培養を行った。この本培養液を４℃、６０００ｘｇにて５分間遠心分離を行い、上澄み液を除去した。このようにして得られた湿菌体を−８０℃にて一度凍結した後、室温で融解させた。４．５ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０％グリセロールに懸濁させ、これに２．０ｇのグラスビーズＹＧＢ０１  Φ０．１ｍｍ（安井器械社製）を加え、マルチビーズショッカーＭＢ１００１Ｃ（Ｓ）（安井器械社製）を用いて２５００ｒｐｍ、４℃にて菌体の破砕を行った。１８０００ｘｇ、４℃にて３分間遠心分離を行い、上清を回収した。この破砕液のタンパク質濃度を測定したところ１２ｍｇ／ｍＬであった。
【０５９０】
この菌体破砕液を用いて、Ｌ−ホモセリンに対する酸化的脱アミノ化反応活性を測定した。反応条件は、適宜希釈した菌体破砕液を１００ｍＭグリシン−ＫＣｌ−ＫＯＨ（ｐＨ１０．０）、２．５ｍＭ  ＮＡＤ＋、５０ｍＭ  Ｌ−ホモセリンと混合し、３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨによる吸光の連続的な増加をＶａｒｉｏｓｋａｎ  ＬＵＸ（サーモ・フィッシャー社製）を用いて測定した。その結果、この菌体破砕液のＬ−ホモセリンに対する比活性は０．２１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。
【０５９１】
４−６−（２）バリンデヒドロゲナーゼの発現と酸化的脱アミノ化反応活性の測定
ｐＧＥ１１７５を用いてＥＣＯＳＴＭ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ニッポンジーン社製）をその指示書通りに形質転換し、得られた菌株をＧＥＳ１０５７とした。ＧＥＳ１０５７について、ＧＥＳ１００７と同様な操作によって得られた破砕液のタンパク質濃度を測定したところ４．２ｍｇ／ｍＬであった。
【０５９２】
この菌体破砕液を用いて、Ｌ−ホモセリンに対する酸化的脱アミノ化反応活性を４−６−（１）と同様に測定した結果、この菌体破砕液のＬ−ホモセリンに対する比活性は０．２１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。
【０５９３】
４−６−（３）フェニルアラニンデヒドロゲナーゼの発現と酸化的脱アミノ化反応活性の測定
ｐＧＥ１２３７を用いてＥＣＯＳＴＭ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ニッポンジーン社製）をその指示書通りに形質転換し、得られた菌株をＧＥＳ１１３６とした。ＧＥＳ１１３６について、ＧＥＳ１００７と同様な操作によって得られた破砕液のタンパク質濃度を測定したところ１１ｍｇ／ｍＬであった。
【０５９４】
この菌体破砕液を用いて、Ｌ−ホモセリンに対する酸化的脱アミノ化反応活性を４−６−（１）と同様に測定した結果、この菌体破砕液のＬ−ホモセリンに対する比活性は０．０４５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。
【０５９５】
以上４−６−（１）、４−６−（２）、４−６−（３）の結果から、ロイシンデヒドロゲナーゼ、バリンデヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼいずれもＬ−ホモセリンをＨＯＢへと酸化する活性を有していることが分かった。一般的に、アミノ酸デヒドロゲナーゼは、酸化的脱アミノ化反応および還元的アミノ化反応のいずれの反応も触媒し、また、これらの活性強度には相関がある。（例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ９６，  ２４８−２６２  （１９６５）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５３，  ５７１９−５７２５  （１９７８）、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １００，  ２９−３９  （１９７９））。したがって、ロイシンデヒドロゲナーゼ、バリンデヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼいずれもＨＯＢからＬ−ホモセリンへの還元的アミノ化反応を触媒することが期待される。確認のため、ロイシンデヒドロゲナーゼについて精製し、ＨＯＢの還元的アミノ化反応について酵素速度論的解析を行った。
【０５９６】
４−６−（４）ロイシンデヒドロゲナーゼの精製と還元的アミノ化反応活性の測定
４−６−（１）で得られた菌体破砕液をシリンジフィルター  ポアサイズ０．２μｍ（ザルトリウス社製）を用いて濾過処理を行った。これをＨｉｓＴｒａｐＴＭ  ＦＦ  １ｍＬカラムを接続したＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒシステム（ＧＥヘルスケア社製）を用い、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０％グリセロールを吸着バッファーとして、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０％グリセロール、５００ｍＭイミダゾールを溶出バッファーとして分画した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したロイシンデヒドロゲナーゼを含有するフラクションを回収し、限外濾過を用いて濃縮し、その後ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロールへとバッファー置換を行い、限外濾過を用いて再度濃縮することで５．９ｍｇ／ｍＬのロイシンデヒドロゲナーゼ水溶液を得た。
【０５９７】
このように得られた精製ロイシンデヒドロゲナーゼを用いて、ＨＯＢを基質としたミカエリス・メンテン式に基づいた酵素反応速度論的解析を行った。反応条件は、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ・ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ塩化アンモニウム、０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ、３．７μｇ／ｍＬロイシンデヒドロゲナーゼとし、ＨＯＢ濃度が３．１３、６．２５、１２．５、２５．０、５０．０、１００ｍＭにおける反応速度を測定した。反応速度は３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨによる吸光の連続的な減少をＶａｒｉｏｓｋａｎ  ＬＵＸ（サーモ・フィッシャー社製）を用いて測定し、算出した。各濃度における反応速度をプロットしミカエリス・メンテン式へのフィッティングを行うことで酵素反応速度論的定数を算出した結果、ＨＯＢに対するミカエリス定数ＫＭは７．７ｍＭ、触媒回転数ｋｃａｔは２．７ｓｅｃ−１であり、したがって、特異度定数ｋｃａｔ／ＫＭは０．３５ｍＭ−１  ｓｅｃ−１であった。
【０５９８】
この結果から、ロイシンデヒドロゲナーゼは期待通りＨＯＢの還元的アミノ化反応について触媒活性を示すことが分かった。また、この結果から、バリンデヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼについても還元的アミノ化反応について触媒活性を示すと考えられる。
【０５９９】
（４−７）アミノ酸の生産
４−７−（１）ＧＥＳ１０７３の培養
ＧＥＳ１０７３のグリセロールストックから４−５−（１）と同様に培養し得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
【０６００】
４−７−（２）ＧＥＳ１０７３を用いたアミノ酸の生産
前記の通り調製された湿菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるようにＢＴバッファーに懸濁した。この菌体懸濁液に５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液および２．０Ｍのホルムアルデヒド水溶液をそれぞれ２％（ｗ／ｖ）、１００ｍＭとなるように加え、５．０Ｍアンモニア水溶液を用いてｐＨを７．０に維持しながら３３℃にて培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。６時間後、反応液の上清をアミノ酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、Ｌ−ホモセリンが１５．７ｍＭ、Ｌ−スレオニンが１．３ｍＭ、２−アミノ酪酸が０．１５ｍＭ生成していた。
【０６０１】
４−７−（３）比較例１
前記の通り調製された湿菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるようにＢＴバッファーに懸濁した。この菌体懸濁液に５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液を２％（ｗ／ｖ）となるように加え、５．０Ｍアンモニア水溶液を用いてｐＨを７．０に維持しながら３３℃にて反応を行った。６時間後、反応液の上清をアミノ酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、２−アミノ酪酸のいずれも定量限界以下であった。
【０６０２】
４−７−（４）比較例２
ＧＥＳ１２９５について、前記４−７−（１）、４−７−（２）と同様の実験を行った。反応６時間後、反応懸濁液の上清をアミノ酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、２−アミノ酪酸のいずれも定量限界以下であった。
【０６０３】
以上の結果から、ＧＥＳ１０７３のようなアルドラーゼをコードする遺伝子を持ち、糖類およびホルムアルデヒド存在下に培養するとＨＯＢを生産できる菌体が、さらにＨＯＢを還元的アミノ化する活性を有するデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有する場合、これを糖類およびホルムアルデヒド存在下に培養することで、ＨＯＢがさらにＬ−ホモセリンへと変換され、Ｌ−ホモセリンを製造できることがわかった。また、Ｌ−ホモセリンが内在性の代謝系によりその一部がＯ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン（ＯＰＨ）を経てＬ−スレオニンへと変換されるため、これを製造できることもわかった。さらには、Ｌ−スレオニンが内在性の代謝系により脱水し、２−オキソ酪酸となり、内在性のアミノ酸デヒドロゲナーゼもしくはＧＥＳ１０７３が特異的に有するロイシンデヒドロゲナーゼにより２−アミノ酪酸へと変換されるため、これを製造できることがわかった。
【０６０４】
（４−８）Ｌ−メチオニンの生産
４−８−（１）ＧＥＳ１０９７の培養
ＧＥＳ１０９７のグリセロールストックから４−２−（１）と同様に培養し得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
【０６０５】
４−８−（２）ＧＥＳ１０９７を用いたアミノ酸の生産
前記の通り調製された湿菌体を２０％（ｗ／ｖ）となるようにＢＴバッファーに懸濁した。この菌体懸濁液に５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液および２．０Ｍのホルムアルデヒド水溶液および０．２Ｍのメチルメルカプタン水溶液（１５％メチルメルカプタンナトリウム水溶液（東京化成工業社製）をＢＴバッファーを用いて希釈し、濃塩酸を用いてｐＨ８．０になるように調整）を加え、さらにＢＴバッファーで希釈することで、それぞれ２％（ｗ／ｖ）、１００ｍＭ、５０ｍＭとなるように調整した。また、この時、最終的な湿菌体濃度は１０％（ｗ／ｖ）となるようにした。５．０Ｍアンモニア水溶液を用いてｐＨを７．０に維持しながら３３℃にて培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。２１時間後、反応液の上清をアミノ酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、Ｌ−メチオニンが２．１ｍＭ生成していた。また、Ｌ−ホモセリンが８．６ｍＭ、Ｌ−スレオニンが３．０ｍＭ、２−アミノ酪酸が０．８６ｍＭ生成していた。
【０６０６】
４−８−（３）比較例１
前記の通り調製された湿菌体を２０％（ｗ／ｖ）となるようにＢＴバッファーに懸濁した。この菌体懸濁液に５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液および２．０Ｍのホルムアルデヒド水溶液を加え、さらにＢＴバッファーで希釈することで、それぞれ２％（ｗ／ｖ）、１００ｍＭとなるように調整した。また、この時、最終的な湿菌体濃度は１０％（ｗ／ｖ）となるようにした。５Ｎアンモニア水溶液を用いてｐＨを７．０に維持しながら３３℃にて反応を行った。２１時間後、反応液の上清をアミノ酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、Ｌ−メチオニンは定量限界以下であった。一方、Ｌ−ホモセリンが５．４ｍＭ、Ｌ−スレオニンが５．６ｍＭ、２−アミノ酪酸が０．９８ｍＭ生成していた。
【０６０７】
４−８−（４）比較例２
ＧＥＳ１０７３について、前記４−８−（１）、４−８−（２）と同様の実験を行った。反応２１時間後、反応懸濁液の上清をアミノ酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、Ｌ−メチオニンの生成は定量限界以下であった。一方、Ｌ−ホモセリンが１２．８ｍＭ、Ｌ−スレオニンが１．６ｍＭ、２−アミノ酪酸が０．４０ｍＭ生成していた。
【０６０８】
以上の結果から、ＧＥＳ１０９７のようなアルドラーゼをコードする遺伝子およびＨＯＢを還元的アミノ化する活性を有するデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を持ち、糖類およびホルムアルデヒド存在下に培養するとＬ−ホモセリンを生産できる菌体が、さらにＯＰＨとメチルメルカプタンを結合させる活性を有するシンターゼをコードする遺伝子を有する場合、糖類、ホルムアルデヒドおよびメチルメルカプタン存在下に培養することで、Ｌ−ホモセリンがＯＰＨを経由してＬ−メチオニンへと変換され、Ｌ−メチオニンを製造できることがわかった。
【０６０９】
５．ピルビン酸からＨＯＢの生産
（５−１）ＧＥＳ１００９、ＧＥＳ１１１９、ＧＥＳ１１２０、ＧＥＳ１１２１、ＧＥＳ１１２２、ＧＥＳ１１２３、ＧＥＳ１１２７、ＧＥＳ１１５４、ＧＥＳ１１５５、ＧＥＳ１１５６、ＧＥＳ１１５７の培養
ＧＥＳ１００９、ＧＥＳ１１１９、ＧＥＳ１１２０、ＧＥＳ１１２１、ＧＥＳ１１２２、ＧＥＳ１１２３、ＧＥＳ１１２７、ＧＥＳ１１５４、ＧＥＳ１１５５、ＧＥＳ１１５６、ＧＥＳ１１５７のグリセロールストックをカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＡ寒天培地に無菌条件下で接種し、３３℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む１０ｍＬのＢＡ培地に接種し、３３℃にて振盪を行い終夜培養した。この培養液を４℃、５５００ｘｇにて１５分間遠心分離を行い、上澄み液を除去した。このようにして得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
【０６１０】
（５−２）ＧＥＳ１００９、ＧＥＳ１１１９、ＧＥＳ１１２０、ＧＥＳ１１２１、ＧＥＳ１１２２、ＧＥＳ１１２３、ＧＥＳ１１２７、ＧＥＳ１１５４、ＧＥＳ１１５５、ＧＥＳ１１５６、ＧＥＳ１１５７を用いたピルビン酸からＨＯＢの生産
前記の通り調製された湿菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるようにＢＳバッファーに懸濁した。この菌体懸濁液に１．０Ｍピルビン酸水溶液および１．２Ｍのホルムアルデヒド水溶液をともに４０ｍＭとなるように加え、３３℃にて培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。６時間後、反応液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＨＯＢがＧＥＳ１００９、ＧＥＳ１１１９、ＧＥＳ１１２０、ＧＥＳ１１２１、ＧＥＳ１１２２、ＧＥＳ１１２３、ＧＥＳ１１２７、ＧＥＳ１１５４、ＧＥＳ１１５５、ＧＥＳ１１５６、ＧＥＳ１１５７を用いた反応では、それぞれ３．６、４．１、２．１、３．４、３０．５、１．９、１８．３、１９．５、６．５、４．５、２．０ｍＭ生成していた。  
（５−３）比較例１
前記の通り調製された湿菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるようにＢＳバッファーに懸濁した。この菌体懸濁液に１．０Ｍピルビン酸水溶液を40mMとなるように加え、３３℃にて反応を行った。６時間後、反応液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、いずれの場合もＨＯＢは検出されなかった。
【０６１１】
以上の結果から、ＧＥＳ１００９、ＧＥＳ１１１９、ＧＥＳ１１２０、ＧＥＳ１１２１、ＧＥＳ１１２２、ＧＥＳ１１２３、ＧＥＳ１１２７、ＧＥＳ１１５４、ＧＥＳ１１５５、ＧＥＳ１１５６、ＧＥＳ１１５７のようなアルドラーゼをコードする遺伝子を持つ菌体は、いずれもピルビン酸とホルムアルデヒドとの間のアルドール反応を当該酵素が触媒することで、ＨＯＢに代表されるようなアルドール化合物を生成することが分かった。
【参考資料】
【０６１２】
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【０６１３】
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【０６１４】
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【０６１５】
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【０６１６】
2020182449.tif 000074
【図１】
2020182449.tif 000075
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2020182449.tif 000079
【図６】
2020182449.tif 000080
【図７】
2020182449.tif 000081
【図８】
2020182449.tif 000082
【図９】
2020182449.tif 000083
【配列表】
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