(57)【要約】      （修正有）【課題】重要な副作用をもたらす、特に子供の成長と副腎抑制をもたらす強力な抗炎症剤、コルチコステロイドを含む既知の治療法の欠点を克服することができる嚢胞性線維症（ＣＦ）の新しい治療法の提供。【解決手段】嚢胞性線維症の治療における使用のためのチモシンα１。【選択図】図１
2020196749.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
嚢胞性線維症の治療における使用のためのチモシンα１。
【請求項２】
抗生物質、抗真菌剤、ＣＦＴＲ中和剤、ＣＦＴＲ増強剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤とチモシンα１の組み合わせであって、嚢方性線維症の治療において別々のまたは逐次使用のために、前記ＣＦＴＲ中和剤または増強剤は、チモシンα１以外である、上記組み合わせ。
【請求項３】
前記少なくとも１つの抗生物質が、トブラマイシン、シプロフロキサシン、コリスチンからなる群から選択される、請求項２に係る使用のための、請求項２に記載の組み合わせ。
【請求項４】
前記少なくとも１つの抗真菌剤が、イトラコナゾール、アンフォテリシンＢからなる群から選択される、請求項２に係る使用のための、請求項２に記載の組み合わせ。
【請求項５】
チモシンα１以外の前記少なくとも１つのＣＦＴＲ中和剤または増強剤は、アイバカフトール（Ｉｖａｆａｃｔｏｒ）、ルマカフトール（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）からなる群から選択される、請求項２に係る使用のための、請求項２に記載の組み合わせ。
【請求項６】
嚢胞性線維症の治療において使用のための１つ以上の添加剤および／または補助剤と一緒に、有効成分としてチモシンα１を含むか、またはからなる医薬組成物。
【請求項７】
抗生物質、抗真菌剤、ＣＦＴＲ中和剤またはＣＦＴＲ増強剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤をさらに含み、前記ＣＦＴＲ中和剤または増強剤は、チモシンα１以外である、請求項６に係る使用のための、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１つの抗生物質が、トブラマイシン、シプロフロキサシン、コリスチンからなる群から選択される、請求項６に係る使用のための、請求項６〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１つの抗真菌剤が、イトラコナゾール、アンフォテリシンＢからなる群から選択される、請求項６に係る使用のための、請求項６〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
チモシンα１以外の前記少なくとも１つのＣＦＴＲ中和剤または増強剤は、アイバカフトール（Ｉｖａｆａｃｔｏｒ）、ルマカフトール（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）からなる群から選択される、請求項６に係る使用のための、請求項６〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
嚢胞性線維症に罹患した患者の慢性炎症の治療および／または予防における使用のためのチモシンα１。
【請求項１２】
チモシンα１と、抗生物質、抗真菌剤、ＣＦＴＲ中和剤、ＣＦＴＲ増強剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤との組み合わせであって、嚢胞性線維症に罹患した患者の慢性炎症における別々のまたは逐次使用のために、前記ＣＦＴＲ中和剤または増強剤は、チモシンα１以外である、上記組み合わせ。
【請求項１３】
抗生物質が、トブラマイシン、シプロフロキサシン、コリスチンからなる群から選択される、請求項１２に係る使用のための、請求項１２に記載の組み合わせ。
【請求項１４】
抗真菌剤が、イトラコナゾール、アンフォテリシンＢからなる群から選択される、請求項１２に係る使用のための、請求項１２に記載の組み合わせ。
【請求項１５】
チモシンα１以外のＣＦＴＲ中和剤または増強剤は、アイバカフトール（Ｉｖａｆａｃｔｏｒ）、ルマカフトール（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）からなる群から選択される、請求項１２に係る使用のための、請求項１２に記載の組み合わせ。
【請求項１６】
嚢胞性線維症に罹患した患者において炎症の治療および／または予防において使用のための１つ以上の添加剤および／または補助剤と一緒に、有効成分としてチモシンα１を含むか、またはからなる医薬組成物。
【請求項１７】
抗生物質、抗真菌剤、ＣＦＴＲ中和剤、ＣＦＴＲ増強剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤をさらに含み、前記ＣＦＴＲ中和剤または増強剤は、チモシンα１以外である、請求項１６に係る使用のための、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
抗生物質が、トブラマイシン、シプロフロキサシン、コリスチンからなる群から選択される、請求項１６に係る使用のための、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
抗真菌剤が、イトラコナゾール、アンフォテリシンＢからなる群から選択される、請求項１６に係る使用のための、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
チモシンα１以外のＣＦＴＲ中和剤または増強剤は、アイバカフトール（Ｉｖａｆａｃｔｏｒ）、ルマカフトール（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）からなる群から選択される、請求項１６に係る使用のための、請求項１７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嚢胞性線維症の治療における使用のためのチモシンα１（Ｔα１）に関する。より詳細には、本発明は、ＣＦＴＲ中和剤、ＣＦＴＲ増強剤および抗炎症剤として嚢胞性線維症の治療における使用のためのチモシンα１に関する。
【背景技術】
【０００２】
嚢胞性線維症（ＣＦ、ＯＭＩＭ ２１９７００）は、生命を脅かす遺伝的障害であり、主に肺および消化器系に影響を与える。それは、生命を制限する常染色体劣性疾患であり、世界中の７万人に影響を及ぼす。この疾患を有する患者の見通しは、主に早期診断、より積極的な治療、および専門センターでのケアの提供の結果として、長年にわたり改善されている（１）。研究者は現在、ＣＦの基礎となる分子生物学的欠陥をより完全に理解しており、治療への新しいアプローチにつながっている。
【０００３】
ＣＦは、呼吸器よび胃腸管における上皮表面液体分泌を調節するＣＦ膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子の突然変異によって引き起こされる。ＣＦＴＲ細胞プロセシングは、翻訳、小胞体でのフォールディング、ゴルジ輸送、翻訳後修飾、先端原形質膜ターゲティング、およびエンドソームリサイクリングおよび回収を含む。血漿膜ＣＦＴＲは、エンドサイトーシスによって内在化され、次に原形質膜にリサイクルされるか、またはリソソーム分解の標的とされる（２、３）。
【０００４】
ほぼ２，０００の変異体は、嚢胞性線維症突然変異データベースに報告されている（４）。これらの突然変異は、６つのクラスに分類されている：クラスＩ突然変異体は、早期に切断されたＣＦＴＲタンパク質産生を生じる欠失、フレームシフトおよび非センス突然変異を含み、クラスＩＩ突然変異体は、細胞内輸送に欠陥があり、クラスＩＩＩ突然変異体は、イオンチャネル活性をほとんどまたは全く有しない全長タンパク質であり、クラスＩＶ突然変異体は、わずかに低下したチャネル活性のみを有するＣＦＴＲを生じ、クラスＶ突然変異体タンパク質は、機能的であるが、低下したレベルで発現され、一方、クラスＶＩ突然変異体は、野生型レベルで発現されるが、原形質膜で低下した安定性を示す（５）。この多数のＣＦＴＲ疾患対立遺伝子にもかかわらず、北欧起源のＣＦ患者の大多数（＞９０％）は、５０８位にフェニルアラニンを欠くＣＦＴＲ分子をコードする単一突然変異対立遺伝子ΔＦ５０８の少なくとも１つのコピーを有する。ＣＦＴＲにおける５０８位のフェニルアラニンの欠失（ΔＦ５０８）は、温度感受性フォールでディング欠陥、小胞体におけるタンパク質の保持、およびその後の早期分解のためのプロテアーゼへの標的化をもたらす（６）。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲフォールディングは、ゴルジ装置に到達する前に、プロテアソーム分解の標的とされるΔＦ５０８−ＣＦＴＲの９９％超えで、非効率的である。
【０００５】
タンパク質フォールディング、プロセシング、およびタンパク質分解経路の介入による誤ってフォールディングされたＣＦＴＲの細胞内運命の変化は、「下流病変」を解釈するために中断するために示された約束を有する。欠陥のあるΔＦ５０８−ＣＦＴＲフォールディングまたは細胞プロセシング（中和剤）およびチャネルゲーティング（増強剤）を修正するための特定のターゲットの同定は、根本的な欠陥を修正するＣＦの治療のための治療戦略を提供する。中和剤は、Ｆ５０８ｄｅｌ−ＣＦＴＲ自体と相互作用し、そのフォールディングおよび細胞プロセシングを促進することにより「薬理学的シャペロン」として、またはΔＦ５０８−ＣＦＴＲ認識およびプロセシングを変更する細胞質制御機構を調節することによって「プロテオスタシス調節遺伝子」として作用することができる（７）。ＣＦ疾患兆候を治療する抗生物質、抗炎症剤、粘液溶解薬、霧状高張食塩水、および膵臓酵素置換などの現在の治療とは対照的に、中和剤および増強剤は、基礎となるＣＦＴＲアニオンチャネル欠陥を修正する。
【０００６】
これまで、多くのＣＦＴＲ増強剤が同定され、インビトロおよびインビボ研究の両方で効果的であることが確認されているが（８、９）、ほとんどの中和剤の有効性は、幾分失望させている。２０１２年、米国ＦＤＡは、ゲーティング欠陥のみを引き起こすＧ５５１Ｄ−ＣＦＴＲ突然変異を有するＣＦ患者の治療のために、ＣＦＴＲ媒介塩化物輸送を増強することができる増強剤であるアイバカフトール（Ｉｖａｃａｆｔｏｒ）（ＶＸ−７７０, Ｋａｌｙｄｅｃｏ, Ｖｅｒｔｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を承認した（１０）。Ｋａｌｙｄｅｃｏはまた、Ｆ５０８ｄｅｌ−ＣＦＴＲの少量のみが細胞原形質膜に標的化されるので、臨床的利点がないＦ５０８ｄｅｌ−ＣＦＴＲについてホモ接合性である患者で試験されている。その後、増強剤（シクロプロパンカルボキサミドＶＸ−８０９（Ｖｅｒｔｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによるルマカフトール（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ））／アイバカフトール（Ｉｖａｃａｆｔｏｒ）の併用療法（ＯＲＫＡＭＢＩ）を、ホモ接合性Ｆ５０８ｄｅｌ−ＣＦＴＲ ＣＦ患者において試験した。この薬剤の組み合わせは、肺機能を３〜４％改善し、悪化を３５％減少させた（１１）。研究は、急性アイバカフトール（Ｉｖａｃａｆｔｏｒ）／ルマカフトール（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）併用療法は、ルマカフトール（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）の救済されたΔＦ５０８−ＣＦＴＲ活性を増強することができたことを確認し、結果の低下も報告されている。特に、（アイバカフトール（Ｉｖａｃａｆｔｏｒ）を含む）いくつかのゲーティング増強剤は、ルマカフトール（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ））による修正されたΔＦ５０８−ＣＦＴＲの不安定化のために、ルマカフトール（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）の修正効果を低下させることができる（１２）。
【０００７】
ルマカフトール（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）の修正効果に対するアイバカフトール（Ｉｖａｃａｆｔｏｒ）の無効化効果は、ＣＦにおける中和剤−増強剤併用療法の臨床的利益を最大にするために、増強剤のさらなる最適化の必要性を示唆する。
【０００８】
また、ΔＦ５０８は、単純なクラスＩＩ突然変異体としてではなく、クラスＩＩ、ＩＩＩ、およびＶの特性を有する混合突然変異体とみなされるべきであることを考えると、これは、より複雑な治療戦略が、単一のΔＦ５０８突然変異によって引きこされる複数のタンパク質プロセシング欠陥を修正するために考慮されるか、または設計されなければならないことを示唆する（６）。
【０００９】
さらに、慢性期からの肺疾患の逆転のための治療戦略の同定における顕著な進展はなかった。したがって、クロライドチャネル機能の救済が、慢性ＣＦ肺疾患の炎症病変を逆転させるのに十分ならば、それは未解決の問題のままである（１３）。
【００１０】
実際には、ＣＦＴＲタンパク質の機能不全をもたらすＣＦ遺伝子欠損（または突然変異）は、肺の上皮細胞および炎症細胞の両方に影響を与え、塩化物流出の減少および炎症反応の増加をもたらす（１４）。
【００１１】
ＣＦ気道における過剰な炎症に関して、過炎症反応は、慢性感染の結果であるのか、またはＣＦＴＲ機能障害の主要な結果であるかは依然として議論の余地がある（１５）。
【００１２】
ＣＦＴＲ突然変異による不完全なイオンおよび液体輸送は、ＣＦ気道内に捕捉される粘膜および物質のクリアランスが不十分になる。保持された材料は、気道閉塞、炎症、および感染のサイクルをもたらす。したがって、ＣＦにおける肺免疫応答は、いくつかのレベルで調節不全である自然免疫応答の早期および非分解活性化によって特徴付けられ（１６）、増加した細菌または真菌のクリアランスを生じず（１７）、ＣＦにおける肺疾患の病因における極めて重要な役割を果たす（１８）。生涯の早期に細菌の損なわれた撲滅は、肺を傷つけ、気道リモデリングおよび気道閉塞を促進する主に好中球性の炎症応答を誘導する。強力な抗生物質療法にもかかわらず（１９）、慢性ＣＦ肺感染の顕著な持続は、ＣＦ肺疾患における初期の気道炎症反応の解明が、翻訳研究の優先分野となったいくつかの革新的なアプローチを促した（２０）。証拠は、特定の炎症／抗炎症経路を標的とすることが、実験的ＣＦにおける有効な治療戦略を表し得ることを示す（２１、２２）。
【００１３】
したがって、１つの抗炎症薬（非ステロイド剤イブプロフェン）のみは、これまで２年間にわたりＦＥＶ１の低下率の改善および好ましいリスクプロファイルで有効性を示しており；したがって、それは、７〜１８歳の患者にとって有益な治療法として推奨されている（２３）。
【００１４】
ＣＦの抗炎症療法の開発は、それらの作用機序が、肺機能または肺悪化の頻度など、より一般的に使用される臨床結果の尺度に急激な変化をもたらすのではなく、長期的な臨床衰退を予防することであるため、困難であった。これらの課題にもかかわらず、いくつかの治療法は、現在、フェーズ２の段階に移行している。３つの例は、Ｎ−アセチルシステイン、ドコサヘキサエン酸、およびシルデナフィルを含む。Ｎ−アセチルシステインは、好中球の酸化還元不均衡に対処することによって生じると考えられるＣＦおよびベースラインの炎症、効果を有する患者の炎症尺度に影響を及ぼす１フェーズ２試験で示されている経口抗酸化剤である（２４）。Ｎ−アセチルシステインの最近のフェーズ２ｂ臨床試験は、肺機能に対する効果を示すが、炎症に対する効果は、報告されたかった（２４）。同様に、ドコサヘキサエン酸は、２００３年の短期臨床試験において、抗炎症活性を示し、乳児の第２相試験が完了したオメガ３脂肪酸であり；結果は、今後発表される予定である。シルデナフィルの第２相試験は、現在、気道炎症のマーカーについてこの経口ホスホジエステラーゼ阻害剤の効果を評価している（２５）。
【００１５】
したがって、上記観点において、重要な副作用が与えられている、特に子供の成長と副腎抑制である強力な抗炎症剤、コルチコステロイドを含む既知の治療法の欠点を克服することができる嚢胞性線維症（ＣＦ）の新しい治療法を提供する必要があることは明らかである（２６）。
【００１６】
ＣＦ治療における一般的な合意は、将来の治療が、患者が症候性になる前に、病原性炎症を含む既存の臓器損傷を改善するよりも予防することを目的とするだろう。
【００１７】
理想的なＣＦ薬物治療は、膜ＣＦＴＲタンパク質を救助するだけではなく、高炎症応答を緩和し、慢性ＣＦ肺疾患の進行を潜在的に弱めることができるはずであることは明らかである。二重の中和剤および増強剤活性を有する単一化合物、並びに抗炎症活性の同定は、当該技術分野において非常に望ましいだろう。
【００１８】
チモシンα１（Ｔα１）は、最初に記載され、１９７２年にＧｏｌｄｓｔｅｉｎらによって特徴付けられた２８アミノ酸の天然に存在するポリペプチドである（２７）。Ｔα１は、いくつかのインビトロおよびインビボアッセイでその免疫調節特性について医療分野で周知である（２７）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
Ｔα１の以前の使用は、既に知られている。ペプチドは、ウイルス感染、免疫不全、および悪性腫瘍を含む異種のヒト疾患を治療するためのアジュバントまたは免疫療法剤として世界中で使用されている（２８、２９）。ペプチドは、Ｔ細胞、樹状細胞および抗体応答を増強し、サイトカインおよびケモカイン産生を調節し、胸腺細胞のステロイド誘発アポトーシスを阻止することができる。樹状細胞機能を調節し、異なる機能に異なって寄与する複数のシグナル経路を活性化するその中心的な役割は、その多面発現作用のための説得可能な説明を提供し得る。さらに、移植中に免疫寛容を授与し、慢性炎症を永続させる悪循環を抑制するインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ酵素を活性化する能力は、免疫の潜在的な特異的機能を示唆する転換点であった（３０）。したがって、Ｔα１は、免疫再構築を促進し、第Ｉ／ＩＩ相臨床試験でＨＬＡ適合兄弟Ｔ細胞枯渇幹細胞移植のレシピエントの生存を改善することが最近示されている（３１）。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明によると、Ｔα１は、ＣＦ患者における抗炎症効果を有することが見出されている。実際には、Ｔα１は、輸送／安定性欠損を伴うΔＦ５０８−ＣＦＴＲ突然変異体を是正することができた；炎症（ＩＬ１βおよびＩＬ１α）サイトカイン産生を阻害すること、炎症性ブロッキングサイトカインＩＬ−１ＲＡの産生を増加させること、保護Ｔｈ１／Ｔｒｅｇ寛容原性軸を促進することによって、クロライドチャネルの活性を戻すこと、およびネズミＣＦの炎症／抗炎症バランスに取り組むこと、一方、ＣＦ肺炎症に含まれる炎症性Ｔｈ１７／Ｔｈ２軸に再び取り組む。一緒に、結果は、Ｔα１修正が、気道上皮機能に影響を及ぼすレベルに到達する可能性があることを示唆し、したがって臨床的に有意義である可能性がある。これは、その固有の抗炎症活性に加えて、ＣＦ療法において、Ｔα１を理想的な候補にする。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
したがって、嚢胞性線維症の治療において使用のための本発明のチモシンα１の具体的な目的である。チモシンα１は、実際には、嚢胞性線維症に罹患している患者のＣＦＴＲ中和剤、ＣＦＴＲ増強剤および抗炎症剤として有利に使用されることができる。本発明はまた、抗生物質、抗真菌剤、ＣＦＴＲ中和剤、ＣＦＴＲ増強剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤とチモシンα１との組み合わせに関し、嚢胞性線維症の治療における別々のまたは逐次使用のために、前記ＣＦＴＲ中和剤または増強剤は、チモシンα１以外である。
【００２２】
本発明の組み合わせによると、抗生物質剤は、例えば、トブラマイシン、シプロフロキサシン、コリスチンからなる群から選択されることができ；抗真菌剤は、例えば、イトラコナゾール、アンフォテンシンＢからなる群から選択されることができ；最終的には、チモシンα１以外のＣＦＴＲ中和剤または増強剤は、例えば、アイバカフトール（Ｉｖａｆａｃｔｏｒ）、ルマカフトール（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）からなる群から選択されることができる。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、嚢胞性線維症の治療における使用のための１つ以上の添加剤および／またはコアジュバントと一緒に、有効成分として、チモシンα１を含むか、またはからなる医薬組成物である。
【００２４】
本発明に係る医薬組成物は、抗生物質、抗真菌剤、ＣＦＴＲ中和剤、ＣＦＴＲ増強剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤をさらに含むことができ、前記ＣＦＴＲ中和剤または増強剤は、チモシンα１以外である。
【００２５】
上記のように、抗生物質剤は、例えば、トブラマイシン、シプロフロキサシン、コリスチンからなる群から選択されることができ；抗真菌剤は、例えば、イトラコナゾール、アンフォテリシンＢからなる群から選択されることができ；最終的には、チモシンα１以外のＣＦＴＲ中和剤または増強剤は、例えば、アイバカフトール（Ｉｖａｆａｃｔｏｒ）、ルマカフトール（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）からなる群から選択されることができる。
【００２６】
上記のように、チモシンα１は、嚢胞性線維症に罹患した患者において、抗炎症効果を示す。
したがって、本発明のさらなる目的は、嚢胞性線維症に罹患した患者における炎症の治療および／または予防において使用のためのチミシンα１である。
【００２７】
本発明はまた、抗生物質、抗真菌剤、ＣＦＴＲ中和剤、ＣＦＴＲ増強剤からなる群から選択される少なくとも１つ薬剤とチモシンα１の組み合わせに関し、嚢胞性線維症に罹患した患者における炎症の治療および／または予防で別々のまたは逐次使用のために、前記ＣＦＴＲ中和剤またはＣＦＴＲ増強剤は、チモシンα１以外である。
【００２８】
本発明の組み合わせによれば、抗生物質剤は、例えば、トブラマイシン、シプロフロキサシン、コリスチンからなる群から選択されることができ；抗真菌剤は、例えば、イトラコナゾール、アンフォテリシンＢからなる群から選択されることができ；最終的には、チモシンα１以外のＣＦＴＲ中和剤または増強剤は、例えば、アイバカフトール（Ｉｖａｆａｃｔｏｒ）、ルマカフトール（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）からなる群から選択されることができる。
【００２９】
本発明のさらなる目的は、嚢胞性線維症に罹患している患者における炎症の治療および／または予防における使用のための１つ以上の添加剤および／またはコアジュバントと一緒に、有効成分として、チモシンα１を含むか、またはからなる医薬組成物である。
【００３０】
本発明に係る医薬組成物は、抗生物質、抗真菌剤、ＣＦＴＲ中和剤、ＣＦＴＲ増強剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤をさらに含むことができ、前記ＣＦＴＲ中和剤または増強剤は、チモシンα１以外である。
【００３１】
上記のように、抗生物質剤は、例えば、トブラマイシン、シプロフロキサシン、コリスチンからなる群から選択されることができ；抗真菌剤は、例えば、イトラコナゾール、アンフォテリシンＢからなる群から選択されることができ；最終的には、チモシンα１以外のＣＦＴＲ中和剤または増強剤は、例えば、アイバカフトール（Ｉｖａｆａｃｔｏｒ）、ルマカフトール（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）からなる群から選択されることができる。
【００３２】
本発明に係る使用において、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、炎症媒介疾患の重篤度の進行、活性化または低下を予防、抑制、緩和、阻害、改善、停止、抑止、減速または逆転することを含む通常の意味を有する。
【００３３】
本発明によれば、「別々の使用」は、同時に、異なる医薬形態での本発明に係る組み合わせの２つ以上の化合物の投与を意味すると理解される。「逐次使用」は、本発明に係る組成物の２つ以上の化合物の連続投与を意味し、各々は、別個の医薬品形態であると理解される。
【００３４】
炎症反応を治療するために投与されるＴα１の有効量は、進行を予防、禁止、緩和、改善、停止、抑制、制限、遅らせる若しくは逆行させ、または前記炎症反応の重篤度を低減させるのに必要な量であり、投与されるべき１日量は、プライマリケア医の判断にしたがって、患者の体重、年齢および患者の全身状態に依存するだろう。
【００３５】
Ｔα１は、薬学的に許容可能な担体または添加剤と組み合わせて医薬組成物の形態で投与されることができ、その割合および性質は、選択された担体および／または添加剤中の化合物の溶解性および化学的性質、投与の選択された経路、および標準的な製薬実務によって決定される。
【００３６】
担体または添加剤は、固体、半固体または液体物質であってもよく、これは、活性成分のための添加剤または媒体として働くことができる。適切な担体または添加剤は、当該技術分野で周知である。医薬組成物は、経口、吸入、非経口または局所使用に適合され得、錠剤、カプセル、エアロゾル、吸入、坐剤、溶液、懸濁液、リポソームなどの形態で患者に投与され得る。
【００３７】
本発明は、添付図面を特に参照して、限定的な方法ではなく、その好ましい態様に従って、実例によって記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、ＣＦ肺疾患の病態生理学のモデルを示す。このモデルによると、ＣＦＴＲ突然変異による不完全なイオンおよび液体輸送は、ＣＦ気道において捕捉される粘膜および材料の不適切なクリアランスをもたらす。保持された材料は、気道閉塞、炎症、および感染のサイクルをもたらす。ＣＦＴＲ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子。
【図２】図２は、対照（ＨＢＥ  ＷＴ）およびＴα１で処理されたΔＦ５０８（ＨＢＥ  ΔＦ５０８）細胞からの全細胞タンパク質の代表的なイムノブロットを示す（Ａ）；Ｔα１はＰＭでΔＦ５０８ＣＦＴＲの発現を増加させた（Ｂ）；ＰＭでＣＦＴＲの濃度測定（Ｃバンド）は、ＣＦＴＲ  ＰＭ／ＣＦＴＲ合計比として発現された（Ｃ）；Ｔα１は、５人の患者のうち３人の患者（患者ｎ１、２および５）でＣＦＴＲの発現（バンドＣ）を増加させた（Ｄ）。
【図３】図３は、Ｔα１は、ＣＦＢＥ  ４１ｏ細胞（Ａ）およびＣＦ患者からのＨＢＥ（Ｂ）において、（１００％参照値としてＷＴ対照を考慮して）対照に対して約７０％にΔＦ５０８ＣＦＴＲ細胞の塩化物透過性を増加させたことを示す。
【図４】図４は、Ｔα１は、曝露の４時間後に対照およびＣＦ細胞でＴＭＥＭ１６Ａ発現を著しく増加ささたことを示す。しかしながら、ＴＭＥＭ１６Ａ発現は、２４時間で対照細胞のベースラインレベルに戻ったが、ＣＦ細胞では上昇したままでる（Ａ）。
【図５】図５は、Ｔα１は、ΔＦ５０８トランスフェクトされた細胞においてＣＦＴＲの未熟形態（Ｂで示す）と比較して成熟形態（Ｃで示す）の発現を増加させたことを示す（Ａ、総細胞タンパク質の代表的なイムノプロット。ＣＦＴＲバンドをデンシトメトリーによって定量化し、Ｃ／Ｂ比として表した）。矢印は、相対移動性に基づくＣＦＴＲのＢおよびＣ形態の位置を示す。Ｔα１単独またはアイバカフトール（Ｉｖａｆａｃｔｏｒ）との組み合わせのいずれかは、（１００％参考値としてＷＴ対照を考慮して）対照に対して６０〜７０％の間のΔＦ５０８ＣＦＴＲ細胞の塩化物透過性を増加させた（Ｂ、フォスフォコリンＦｓｋとの刺激の際の蛍光アッセイによって評価した）。ルマカフトール（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）と比較して、Ｔα１の活性は、ΔＦ５０８ＣＦＴＲを発現するＣＦＢＥ４１ｏ細胞ではより低かったが（Ｂ）、ＣＦ患者由来のＨＢＥ細胞では同様であった（Ｃ）。ルマカフトール（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）と組み合わせて、Ｔα１は、ルマカフトール（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）の活性を増加させなかった（ＢおよびＣ）。
【図６】図６は、ＣＦマウスが感染において炎症性病変に感受性であることを示す。ＢＡＬ（Ａ）および肺（ＢおよびＣ）における好中球（ＰＭＮ）および好酸球（ＥＯＳ）補充によって特徴付けられる長時間続き持続性の炎症応答が、感染前に炎症の程度がすでに見られたＣｆｔｒ−／−マウスにおいて観察された（Ｃ、異なるｄｐｉで肺組織学（過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ、および挿入図において、ゴモリ（Ｇｏｍｏｒｉ）染色））。単核細胞（ＭＮＣ）、ＰＭＮ細胞およびＥＯＳの分化細胞数を、感染後（ｄｐｉ）の異なる日に、Ｍａｙ Ｇｒｕｎｗａｌｄ Ｇｉｅｍｓａ染色の際に決定した。値は、グループ当たり３匹のマウスの平均±ＳＥＭを表し、３回の実験の代表である。写真は、×２０対物レンズを使用して高分解能Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ７１を用いて撮影した。スケールバー２００μｍ。（Ｃ）Ｇｒ１＋陽性細胞の数を、異なるｄｐｉで全肺細胞のフローサイトメトリーによって評価した。＊Ｐ＜０．０５
【図７】図７は、Ｔα１は、炎症性病変からＣＦマウスを保護することを示す。スクランブルペプチドでなくＴα１は、肺の中への（Ａ）並びにＢＡＬにおける（Ｂ）炎症細胞（主にＰＭＮ、挿入図参照）補充の減少によって示されるように、Ｃ５７／ＢＬ６マウスおよびさらによりＣｆｔｒ−／−マウスの両方で局所炎症細胞補充および肺病変を有意に減少させた。（Ａ）肺組織学（過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆおよび、挿入図において、細胞補充）。写真を、×２０対物レンズを使用して高分解能Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ７１を用いて撮影した。スケールバー２００μｍ。（Ｂ）感染後７日目（ｄｐｉ）のＢＡＬ形態測定。単核細胞（ＭＮＣ）、多形核白血球（ＰＭＮ）細胞および好酸球（ＥＯＳ）の分化細胞数を、Ｍａｙ Ｇｒｕｎｗａｌｄ Ｇｉｅｍｓａ染色の際に決定した。値は、グループ当たり３匹のマウスの平均±ＳＥＭを表し、３回の実験の代表である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図８】図８は、Ｔα１は、アスペルギルス症を有するＣＦマウスにおいて、炎症性サイトカインを下方制御することを示す。ＢＡＬ中のＩＬ−１β、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１ＲＡのレベルを、感染後７日目にＥＬＩＳＡ（ｐｇ／ｍｌ）によって測定した。示された結果は、２つの実験からのプールされたデータを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図９】図９は、Ｔα１は、アスペルギルス症を有するＣＦマウスにおいて、Ｔｈ細胞バランスを調節することを示す。Ｔα１は、Ｔｈ１７（ＩＬ−１７ＡおよびＴｈ１７転写因子Ｒｏｒｃの低下したレベル）、Ｔｈ２（低ＩＬ−４およびＧａｔｅ３）細胞活性化を低下させたが、Ｔｈ１（増加したＩＦＮ−γおよびＴｂｅｔ）およびＴｒｅｇ（増加したＩＬ−１０およびＦｏｘｐ３）細胞活性を促進する。示された結果は、２つの実験からプールされたデータを表す。ｎ．ｄ．は実施なし（ｎｏｔ ｄｏｎｅ）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【実施例】
【００３９】
実施例１： 嚢胞性線維症においてＣＦＴＲ中和剤および増強剤および抗炎症剤としてチモジンα１の効果に関する研究
【００４０】
材料および方法
細胞
細胞株および細胞培養−δＦ５０８突然変異およびそのアイソジェニック野生型についてホモ接合性であるヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥ）細胞を、肺移植（ＣＦ患者）または肺切除（非ＣＦ患者）（イタリアの嚢胞性線維症財団のＬＪ Ｇａｌｉｅｔｔａによって親切に提供された）から得た。細胞を、５％ＣＯ２を含む大気中の加湿インキュベータ内で３７℃で維持し、実験をプレーティングの５日後に行った（２１、２２）。ＷＴ−ＣＦＴＲまたはΔＦ５０８−ＣＦＴＲのいずれかを用いて、Ｄ. Ｇｒｕｅｎｅｒｔ博士と共働者（３２）によって本来は不死化され、特徴付けられた親ＣＦＢＥ４１ｏ細胞（ΔＦ５０８／ΔＦ５０８）の安定したレンチウイルスベースの形質導入を、Ｔｒａｎｚｙｍｅ, Ｉｎｃ. （Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ, ＡＬ）によって行った。形質導入されたＣＦＢＥ４１ｏ細胞を、３７℃で５％ＣＯ２、９５％空気のインキュベータ中で、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％のウシ胎児血清、および１μｇ／ｍｌのブラスティサイジン（ＷＴ−ＣＦＴＲ）または２μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ）の補充された最小イーグル培地中で維持した。親ＣＦＢＥ４１ｏ細胞を、同じ培養条件下で、ブラストサイジンまたはピューロマイシンなしで維持した。分極した単層を確立するために、ＣＦＢＥ４１ｏ細胞を、２×１０６で２４ｍｍ直径のトランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）透過性担体（０．４ｍｍ孔径；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｒｐ., Ｃｏｒｎｉｎｇ, ＮＹ）上に播種し、３７℃で６〜９日間、次に２７℃で３６時間、気−液界面培養で増殖させた。ＣＦＴＲタンパク質発現および機能の評価の前に、細胞を、Ｔα１  １００ｎｇ／ｌ（ＣＲＩＢＩ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, Ｐａｄｏｖａ、以下を参照）、３μＭ  ＶＸ−８０９（ルマカフトール（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）、Ａｕｒｏｇｅｎｅ Ｒｏｍｅ, イタリア）、１μＭ  ＶＸ−７７０（アイバカフトール（Ｉｖａｆａｃｔｏｒ）、Ａｕｒｏｇｅｎｅ）単独または組み合わせを用いて２４時間培養した。ＤＭＳＯ賦形剤単独（０．１％ｖ／ｖ）を２４時間、対照として使用した。
【００４１】
マウス
８〜１２週齢の野生型（ＷＴ）同系交配のＣ５７ＢＬ６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｃａｌｃｏ, イタリア）から購入した。遺伝子操作されたホモ接合体Ｃｆｔｒ−／−マウス（３３）を、Ｓａｎ Ｒａｆｆａｅｌｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ, Ｍｉｌａｎ, イタリアの嚢胞性線維症のコア動物施設で飼育した。実験は、欧州経済共同体理事会指令並びに組織の動物保護および使用ガイドラインに従って機関動物委員会が承認したプロトコルに従って、実施された。
【００４２】
感染および治療
マウスを、２×１０７のＡ. ｆｕｍｉｇａｔｕｓ （Ａｆ２９３）休息分生子／２０μｌ生理食塩水の鼻腔内点滴前に２．５％アベルチン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ, Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ, ＭＯ）のｉ.ｐ.注射によって麻酔した。組織学について、パラフィン包理組織を、過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）で染色し、ＢＡＬ液体回収を記載の通りに行った（２１、２２）。処理は次の通りであった：Ｔα１およびスクランブルされたポリペプチドを、精製された（エンドトキシンレベルは、標準リムルス溶解物アッセイによって＜０．０３ｐｇ／ｍｌであった）無菌凍結乾燥アセチル化ポリペプチドとして供給した。配列は次の通りであった：Ａｃ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｏ （Ｔα１） （配列番号１）およびＡｃ−Ａｌａ−Lyｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−ＯＨ（スクランブルされたペプチド）（配列番号２）。凍結乾燥粉末を滅菌水中で再構築し、２００μｇ／ｋｇ／ｉ．ｐ．を、感染の日から６日間連続して毎日与えた。
【００４３】
細胞抗原発現のための染色を、記載されている通りに行った（２１、２２）。細胞を、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔＴＭソフトウェアを備えたＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ, Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ, ＣＡ）を用いて分析する。標識前に、ＦｃＲブロッキングを行った。無関係な抗体を有する細胞の対照染色を使用して、バックグラウンド蛍光値を得る。データは、分析された全細胞に渡って陽性細胞のパーセンテージとして表される。
【００４４】
ＣＦＴＲイムノブロット分析
抗ＣＦＴＲ抗体（クローンＣＦ３、Ａｂｃａｍ）を使用するイムノブロット技術を、ＣＦＴＲまたはＦ５０８ｄｅｌ−ＣＦＴＲを発現するＦＲＴ、ＨＥＫ−２９３、またはＨＢＥ細胞中でＣＦＴＲ成熟を測定するために使用した（３４）。インキュベーション後、細胞を、氷冷Ｄ−ＰＢＳ溶液（カルシウムおよびマグネシウムなし）中で採取し、４℃で１,０００×ｇでペレット化した。細胞ペレットを、氷上で３０分間、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．８、および１ｍＭのＥＤＴＡ＋プロテアーゼ阻害剤混合物（１：２５０； Ｒｏｃｈｅ）中で溶解した。溶解物を、１０分間、１０，０００×ｇで、４℃で回転させて、核および不溶性材料をペレット化した。約１２μｇの全タンパク質を、３７℃で５分間、５％β−メルカプトエタノールでＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で加熱し、３％〜８％トリス−アセテートゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に充填した。ゲルをニトロセルロースに移し、β−アクチンに対するモノクロナールＣＦＴＲ抗体またはポリクロナール（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、ウエスタンブロッティング処理した。ブロットは、増強された化学発光によって開発された。ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ ＸＲＳ＋ Ｉｍａｇｉｇシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するＬｉｔｅＡｂｌｏｔＰｌｕｓ化学発光基質（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ Ｓ.ｐ.Ａ.）およびブロット定量を、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ ３．１．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用するデンシトメトリー画像分析によって得た。
【００４５】
ＣＦＴＲの活性化
ＣＦＴＲチャネルは、ヨウ化物に対して透過性であるため、ＳＰＱ（６−メトキシ−Ｎ−（３−スルホプロピル）キノリウム）蛍光プローブを使用する比色分析によって予め充填された細胞からこのイオンの流出を決定することができる（３５）。
【００４６】
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
記載されているように、ｃＤＮＡの総ＲＮＡ抽出および合成およびＰＣＲを、全肺細胞で行った（２１、２２）。増幅効率は、Ｇａｐｄｈに対して有効にされ、標準化された。ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲの熱プロファイルは、９５℃で３分間、次に９５℃で３０秒間の変性および６０℃で３０秒間のアニーリング／伸長のステップの４０サイクルであった。各データポイントは、増幅プロットの分析によって完全性について試験された。ｍＲＮＡ正規化データは、非刺激細胞のｍＲＮＡと比較して、処理細胞における相対ｍＲＮＡとして発現された。
【００４７】
ＥＬＩＳＡによるサイトカイン決定
記載されるように、処理および未処理マウスからの肺ホモジネート中のサイトカインレベルは、サイトカイン特異的ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ, Ｉｎｃ. Ｓｐａｃｅ Ｉｍｐｏｒｔ−Ｅｘｐｏｒｔ ｓｒｌ, Ｍｉｌａｎ, イタリア）で決定した（２１、２２）。
【００４８】
統計分析
Ｓｔｕｄｅｎｔの対応ｔ検定を使用して、実験サンプル中の値の有意性を決定した（有意性を、Ｐ＜０．０５として定義した）。生存データをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用して分析した。インビボ群は、６匹の動物からなっていた。他に示されない限り、データは平均±ＳＥである。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４．０３プログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）によって分析した。
【００４９】
結果
Ｔα１は、ＣＦ細胞においてΔＦ５８−ＣＦＴＲの細胞表面発現を増加させることによって中和剤として働く。
ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ突然変異についてホモ接合であるＳＶ４０形質転換ＣＦ気道上皮細胞株（ＣＦＢＥ４１ｏ−）を使用した（３２）。ΔＦ５０８ＣＦＴＲまたはＷＴ  ＣＦＴＲを安定に発現するＣＦＢＥ４１ｏ細胞を、３０分から２４時間、１００ｎｇ／ｍｌのＴα１で処理した。図２は、Ｔα１で処理された対照（ＨＢＥ  ＷＴ）およびΔＦ５０８（ＨＢＥ  ΔＦ５０８）細胞からの全細胞タンパク質の代表的なイムノブロットを示す（パネルＡ、図２）。イムノブロット技術を使用して、小胞体からのΔＦ５０８−ＣＦＴＲ出口およびゴルジ体通過を測定し、これは、グリコシル化の結果として、ＣＦＴＲの分子量の増加（１３５〜１４０ｋＤａバンドから１７０〜１８０ｋＤａバンド）によって特徴付けられる。ＣＦＴＲがゴルジによって処理された後、成熟した複合体−グリコシル化ＣＦＴＲ形態は、細胞表面に送達される。
【００５０】
Ｔα１は、ＷＴ  ＣＦＴＲとは対照的に、曝露後３０分後から２４時間後まで、ΔＦ５０８成熟ＣＦＴＲの細胞発現（Ｃで示す）を持続的に増加させた。ＣＦＴＲバンドをデンシトメトリーによって定量化し、Ｃ／Ｂ比として表した。図２において、矢印は、相対的移動性に基づくＣＦＴＲのＣ（成熟）およびＢ（未成熟）形態の位置を示す。ΔＦ５０８ＣＦＴＲの増加した発現は、原形質膜（ＰＭ）でのその増加した輸送および安定性と相関することを証明するために、ＰＭタンパク質を、上記のように、Ｔα１で処理された細胞由来の細胞質成分から精製した。画分を抗ＣＦＴＲ抗体でイムノブロットし、ＦＬＯＴ１（クローンＣ−２  Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して細胞表面タンパク質特異的局在を確認した。結果は、Ｔα１がＰＭでΔＦ５０８ＦＴＲの発現を増加させたことを示す（パネルＢ、図２）。ＰＭにおけるＣＦＴＲ（Ｃバンド）のデンシトメトリー測定を、ＣＦＴＲ  ＰＭ／ＣＦＴＲ全比率として表した（パネルＣ、図２）。
【００５１】
Ｔα１はまた、ＣＦ患者におけるＣＦＴＲの発現を増加させたかどうかを評価するために、５人のＣＦ患者からの気管支肺細胞（ＨＢＥ、ヒトＢＥ）を、２４時間、１００ｎｇ／ｍｌのＴα１で処理し、ＣＦＴＲタンパク質発現について評価した。結果は、５人の患者のうち３人（患者ｎ．１、２および５）でＣＦＴＲの発現を増加させたことを示す（パネルＤ、図２）。これらの結果は、Ｔα１は、ΔＦ５０８  ＣＦＴＲ成熟を増加させ、細胞表面密度および安定性を増加させ、Ｔα１を中和剤とみなすことを示す。
【００５２】
Ｔα１は、ＣＦ細胞におけるΔ５０８−ＣＦＴＲの機能的活性を増加させることによって増強剤として作用する。
増強剤は、細胞表面で突然変異体ＣＦＴＲのｃＡＭＰ依存性クロライドチャネル活性を回復させることを意図される。インビボでＣＦＴＲ機能の３０％未満（５〜３０％）を回復することは、肺機能を改善することによってＣＦ患者に少なくとも部分的な臨床的有益性を与えると考えられている（３６）。ＣＦ患者からのＴα１、ＣＦＢＥ４１ｏ−細胞およびＨＢＥ細胞のＣｌ−チャネル活性を評価するために、２４時間、１００ｎｇ／ｍｌのＴα１で処理し、ｃＡＭＰ／ＰＫＡ経路を介してＣＦＴＲを活性化させるために、フォリスコリンでの刺激の際に、ハロゲン感受性蛍光プローブ（６−メトキシ−Ｎ−（−スルホプロピル）キノリウム（ＳＰＱ）の使用によって、塩化物輸送を評価した（３５）。結果は、Ｔα１は、ＣＦＢＥ  ４１ｏ−細胞（図３、パネルＡ）およびＣＦ患者からのＨＢＥ細胞（図３、パネルＢ）において、（１００％参照値としてＷＴ対照を考慮して）対照に対して約７０％にΔＦ５０８ＣＦＴＲの塩化物透過性を増加させたことを示す。したがって、Ｔα１は、膜関連ＣＦＴＲの増加したレベルに関連して、ＣＦＴＲ媒介塩化物透過性を増加させた。
【００５３】
Ｔα１は、代替イオンチャネルＴＭＥＭ１６Ａの発現を誘導する。
突然変異体ＣＦＴＲの標的化によるイオン輸送欠陥の薬理学的修正、またはＣＦＴＲ機能不全を補償し得る代替イオンチャネルは、ＣＦの原因療法への魅力的なアプローチとして長く考えられてきた（３７）。ＴＭＥＭ１６Ａは、Ｃａ２＋活性化Ｃｌ−チャネルであり、カルシウム依存性塩化物電流と関連しており（３８）、ＣＦＴＲとは異なるが、ＣＦＴＲと機能的および分子的相互作用を示す（３９）。薬理作用のある物質とのＴＭＥＭ１６Ａの活性化は、ＣＦＴＲ遺伝子型にかかわらず、ＣＦの主要な欠陥を回避することができる（４０）。ＤＮＡマイクロアレイ分析は、ＴＭＥＭ１６Ａの発現が、Ｔα１での治療の際に、肺アスペルギウス症のマウスで大幅に増加した（未発表の結果）。これらの知見に基づいて、ＴＭＥＭ１６Ａ発現が、対照またはＣＦ患者由来のＨＢＥ細胞上でＴα１によって誘導されたかどうかが評価された。この目的のために、細胞は、２４時間まで１００ｎｇ／ｍｌのＴα１に曝露し、細胞からの総ＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲによってＴＭＥＭ１６Ａ  ｍＲＮＡ発現を評価した。結果は、Ｔα１は、対照および曝露の４時後のＣＦ細胞でＴＭＥＭ１６Ａ発現を著しく増加させたことを示す。しかしながら、ＴＭＥＭ１６Ａ発現は、２４時間で対照細胞のベースラインレベルに戻ったが、ＣＦ細胞で上昇したままであった（図４Ａ）。これらの結果は、代替のＣｌ−チャネルＴＥＭ１６Ａの発現を誘導することにより、Ｔα１が、ＣＦにおけるイオンチャネル活性をさらに改善することができることを示唆する。
【００５４】
Ｔα１は、単独でまたは増強剤アイバカフトール（ｉｖａｆａｃｔｏｒ）と組み合わせて、増強剤ルマカフトール（lｕｍａｃａｆｔｏｒ）と同様の程度までΔＦ５０８ＣＦＴＲ活性を救済する。
Ｔα１の活性は、単独またはアイバカフトール（ｉｖａｆａｃｔｏｒ）と組み合わせて、ΔＦ５０８ＣＦＴＲを発現するＣＦＢＲ４１ｏ−細胞上でおよびＣＦ患者由来のＨＢＥ細胞上で、ルマカフトール（lｕｍａｃａｆｔｏｒ）の活性と比較的に評価されている。この目的のために、細胞を、Ｔα１（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＶＸ−７７０（１μＭ）またはＶＸ−８０９（３μＭ）単独または組み合わせて、２４時間処理し、ＣＦＴＲタンパク質発現および機能について評価した。結果は、ルマカフトール（lｕｍａｃａｆｔｏｒ）と同様に、Ｔα１は、ΔＦ５０８トランスフェクトされた細胞でＣＦＴＲの未成熟形態（Ｂで示す）と比較して、成熟形態（Ｃで示す）の発現を増加させることを示す（Ａ、全細胞タンパク質の代表的なイムノブロット（図５）。ＣＦＴＲバンドを、デンシトメトリーによって定量し、Ｃ／Ｂ比として表した）。図５において、矢印は、相対移動性に基づくＣＦＴＲのＢおよびＣ型の位置を示す。）ルマカフトール（lｕｍａｃａｆｔｏｒ）は、ＣＦＴＲ発現を増加させなかったが、Ｔα１／アイバカフトール（ｉｖａｆａｃｔｏｒ）の組み合わせは、それを行った。イオンチャネル活性の観点から、Ｔα１は、単独またはアイバカフトール（ｉｖａｆａｃｔｏｒ）と組み合わせて、（１００％参照値としてＷＴ対照を考慮して）対照と比較して、６０〜７０％の間のΔＦ５０８ＣＦＴＲ細胞の塩化物透過性を増加させた（Ｂ、フォリスコリンＦｓｋ刺激の際の蛍光アッセイによって評価した）。ルマカフトール（lｕｍａｃａｆｔｏｒ）と比較して、Ｔα１の活性は、ΔＦ５０８ＣＦＴＲを発現するＣＦＢＥ４１ｏ細胞で低かったが（Ｂ）、ＣＦ患者由来のＨＥ細胞では同様であった（Ｃ）。ルマカフトール（lｕｍａｃａｆｔｏｒ）と組み合わせて、Ｔα１は、ルマカフトール（lｕｍａｃａｆｔｏｒ）の活性を増加させなかった（ＢおよびＣ）。これらの結果は、ＣＦＴＲ発現を増加させるＴα１の能力は、ルマカフトール（lｕｍａｃａｆｔｏｒ）の能力に匹敵し、アイバカフトール（ｉｖａｆａｃｔｏｒ）との併用療法に利用できることを示す。
【００５５】
ＣＦマウスは、感染において炎症性病変に感受性である。
ＣＦにおけるＴα１の治療活性を評価するために、ＣＦ患者の気道の既知の微生物コロニー剤であるアスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）による感染に関連する炎症性病状に関連するＣ５７ＢＬ／６およびＣｆｔｒ―／−マウスの感受性（４１）が、評価されている。Ｃ５７ＢＬ／６およびＣｆｔｒ―／−マウスは、生存Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓで鼻腔内に感染させ、炎症のパラメータについて評価した。ＢＡＬ（図６、パネルＡ）および肺（図６、パネルＢおよびＣ）における好中球（ＰＭＮ）および好酸球（ＥＯＳ）補充によって特徴付けられる長時間続き持続性な炎症反応が、炎症の程度が感染前にすでに目に見えるＣｆｔｒ―／−マウスで観察された（Ｃ、異なるｄｐｉで肺組織学（過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆｍ、挿入図で、ゴモリ染色）。単核細胞（ＭＮＣ）、ＰＭＮ細胞およびＥＯＳの異なる細胞数を、感染後の異なる日（ｄｐｉ）で、Ｍａｙ Ｇｒｕｎｗａｌｄ Ｇｉｅｍｓａ染色の際に決定した。値は、グループ当たり３匹のマウスの平均±ＳＥＭを表し、３回の実験の代表である。写真は、２０倍の対物レンズを使用して高解像度Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ７１で撮影した。スケールバー２００μｍ。（Ｃ）Ｇｒ１＋陽性細胞の数を、異なるｄｐｉで全肺細胞のフローサイトメトリーによって評価した。＊Ｐ＜０．０５
【００５６】
Ｔα１は、炎症性病変からＣＦマウスを保護する。
ＣＦマウスは、アスペルギルス感染およびアレルギーに関連する炎症応答に感受性があり、したがってＴα１の効果を評価するのに適したモデルを表す。
【００５７】
アスペルギルス感染マウスを、感染の日から６日間連続して毎日２００μｇ／ｋｇ／腹腔内投与で処理した。感染後７日目に、肺の炎症性病変および細胞補充についてモニターした。Ｔα１は、スクランブルペプチドではなく、肺への炎症細胞の減少（主にＰＭＮ、挿入図参照）のように（パネルＡ、図７）並びにＢＡＬおいて（パネルＢ、図７）、Ｃ５７／ＢＬ６マウスおよび、さらにＣｆｔｒ―／−マウスの両方で、局所炎症細胞補充および肺病変を有意に減少させた。これらのデータは、Ｔα１は、感染中のＣＦマウスの肺における炎症細胞補充を制限するのに有効である。（Ａ）肺組織学（過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ、および挿入図において、細胞補充）。写真は、２０倍の対物レンズを使用して、高解像度Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ７１で撮影した。スケールバー２００μｍ。（Ｂ）感染後７日（ｄｐｉ）のＢＡＬ形態計測。単核細胞（ＭＮＣ）、多形核（ＰＭＮ）細胞および好酸球（ＥＯＳ）の異なる細胞数をＭａｙ Ｇｒｕｎｗａｌｄ Ｇｉｅｍｓａ染色の際に決定した。値は、グループ当たり３匹のマウスの平均±ＳＥＭを表し、３回の実験の代表である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００５８】
Ｔα１は、アスペルギウス症のＣＦマウスにおいて炎症性サイトカインを下方制御する。
Ｃ５７ＢＬ／６およびＣｆｔｒ―／−マウスを、生存Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子で鼻腔内に感染させ、感染の日から６日間連続して毎日Ｔα１を２００μｇ／ｋｇ／腹腔内投与で処理した。結果を図８に示す。それらは、感染中のＢＡＬ中のＩＬ−１βおよびＩＬ−１αのＣ５７／ＢＬ６と比較して、Ｃｆｔｒ―／−マウスにおける高められたおよび未解決の炎症応答がより高いレベルに関連していることを示す。Ｔα１処理の際に、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１αの両方のレベルが、いずれのマウスのタイプにおいても急激に減少し、大きな関心のあった炎症性ブロッキングサイトカイン（ＩＬ−１ＲＡ）のレベルが上昇した。ＩＬ−１βおよびＩＬ−１αの高いレベルが、ＣＦ患者で観察されることから（４２）、これらのデータは、Ｔα１は、ＣＦ患者の局所炎症／抗炎症サイトカインバランスに寄与し得ることを示す。ＢＡＬ中のＩＬ−１β、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１ＲＡのレベルを、ＥＬＩＳＡ（ｐｇ／ｍｌ）によって感染後７日目に測定した。示された結果は、２つの実験からプールされたデータを示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００５９】
Ｔα１は、アスペルギルス症のＣＦマウスのＴｈ細胞バランスを調節する。
炎症Ｔｈ１７経路は、ＣＦ肺炎に含まれ（２１、２２、４３）、Ｔｈ２経路は、ＣＦ真菌アレルギーに関連する（４４）。Ｔｈ細胞活性化に対するＴα１の効果の影響を評価のために、肺におけるＴｈサイトカインおよび排出リンパ節における対応する転写因子のレベルは、上記のようなＴα１で感染され処理されたＣ５８ＢＬ／６およびＣｆｔｒ―／−マウスで測定された。Ｔα１は、Ｔｈ１７（ＩＬ−１７ＡおよびＴｈ１７転写因子Ｒｏｒｃの低下したレベル）、Ｔｈ２（低ＩＬ−４およびＧａｔａ３）細胞活性を低下させたが、Ｔｈ１（増加したＩＦＮ−γおよびＴｂｅｔ）およびＴｒｅｇ（増加したＩＬ−１０およびＦｏｘｐ３）細胞活性の両方を促進する。これらの結果は、炎症性Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞の活性化を抑制しながら、Ｔα１が、ＣＦにおける抗炎症性Ｔｈ１／Ｔｒｅｇ軸の強力な活性化剤であることを示す（図９）。サイトカインレベルを、肺ホモジネート（ＥＬＩＳＡまたはＲＴ−ＰＣＴによる）および排出胸部リンパ節における対応するＴｈ転写因子の発現（ＲＴ−ＰＣＲによる）で評価した。示された結果は、２つの実験からのプールされたデータを表す。ｎ．ｄ．実施なし。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００６０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月28日(2020.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
嚢胞性線維症に罹患している患者の炎症の治療における使用のための、チモシンα１を含むか又はチモシンα１からなる医薬組成物。
【請求項２】
チモシンα１と、
抗生物質、抗真菌剤、ＣＦ膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）中和剤、ＣＦＴＲ増強剤及び抗炎症剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤
との組み合わせを含む請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
抗生物質が、トブラマイシン、シプロフロキサシン及びコリスチンからなる群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
抗真菌剤が、イトラコナゾール及びアンフォテリシンＢからなる群から選択される、請求項２又は３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＣＦＴＲ中和剤又はＣＦＴＲ増強剤が、アイバカフトール（Ｉｖａｆａｃｔｏｒ）及びルマカフトール（Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）からなる群から選択される、請求項２〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
抗炎症剤がイブプロフェンである請求項２〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
チモシンα１と少なくとも１つの薬剤の患者への投与が、一緒に、別々に、又は逐次的に、なされる、請求項２〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
１種又は２種以上の賦形剤及び／又はコアジュバントを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
炎症が慢性の炎症である、請求項１〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
患者がΔＦ５０８−ＣＦＴＲ突然変異を有している、請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
嚢胞性線維症に罹患している患者の、炎症サイトカインの下方制御又はＴｈ細胞バランスの調節における使用のための、チモシンα１を含むか又はチモシンα１からなる医薬組成物。
【請求項１２】
チモシンα１と、
抗生物質、抗真菌剤、ＣＦＴＲ中和剤、ＣＦＴＲ増強剤及び抗炎症剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤
との組み合わせを含む請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
抗生物質が、トブラマイシン、シプロフロキサシン及びコリスチンからなる群から選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
抗真菌剤が、イトラコナゾール及びアンフォテリシンＢからなる群から選択される、請求項１２又は１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＣＦＴＲ中和剤又はＣＦＴＲ増強剤が、アイバカフトール及びルマカフトールからなる群から選択される、請求項１２〜１４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１６】
抗炎症剤がイブプロフェンである請求項１２〜１５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１７】
チモシンα１と少なくとも１つの薬剤の患者への投与が、一緒に、別々に、又は逐次的に、なされる、  請求項１２〜１６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１８】
１種又は２種以上の賦形剤及び／又はコアジュバントを含む、請求項１１〜１７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１９】
患者がΔＦ５０８−ＣＦＴＲ突然変異を有している、請求項１１〜１８のいずれかに記載の医薬組成物。