(57)【要約】【課題】ヒトの臨床病態を反映した非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の非ヒトモデル動物（ＮＡＦＬＤモデル動物）を提供する。【解決手段】非ヒト動物にタンパク質を実質的に含有しないことを特徴とするコリン不含・Ｌ−アミノ酸規定（ＣＤＡＡ）飼料を与えて飼育することにより、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の非ヒトモデル動物を作製する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト動物にコリン不含・Ｌ−アミノ酸規定（ＣＤＡＡ）飼料を与えて飼育する工程を含む、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の非ヒトモデル動物を作製する方法であって、
前記ＣＤＡＡ飼料が、タンパク質を実質的に含有しないことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記非ヒト動物が、霊長類、げっ歯類、食肉類および偶蹄類からなる群より選択される哺乳類目の動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非ヒト動物がブタである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法により作製される、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の非ヒトモデル動物。
【請求項５】
以下の所見（１）〜（６）の少なくとも１つを示す、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の非ヒト動物モデル：
（１）血中総コレステロール濃度の低下
（２）血中アルブミン濃度の低下
（３）ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）の値の低下
（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度の上昇
（５）血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度の上昇
（６）血中ヒアルロン酸濃度の上昇。
【請求項６】
非ヒト動物において非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を惹起するために用いられる、タンパク質を実質的に含有しない、コリン不含・Ｌ−アミノ酸規定（ＣＤＡＡ）飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の非ヒトモデル動物およびその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪性肝疾患（Non-Alcoholic Fatty Liver Disease：ＮＡＦＬＤ）は脂肪肝を基本病変とし、飲酒歴が乏しいにもかかわらず、アルコール性肝障害に類似する肝実質の炎症・壊死、線維化などの組織変化を呈する病態である。ＮＡＦＬＤは基本的に無症候性であり、病態の進行に伴い、脂肪肝から脂肪性肝炎、さらに肝硬変を経て肝癌に移行する。ＮＡＦＬＤにおける脂肪性肝炎を非アルコール性脂肪性肝炎（Non-Alcoholic SteatoHepatitis：ＮＡＳＨ）と称する。特に近年、肥満または糖尿病などを背景とするメタボリック症候群が社会問題となっており、ＮＡＳＨもメタボリック症候群の一つであると考えられている。ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨには、合併症として、肥満、糖尿病、高脂血症および高血圧などの生活習慣病が認められ、その臨床病態の主な特徴としては、血中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）やヒアルロン酸濃度の上昇、それに対して、血中の総コレステロールやアルブミン濃度の低下などが挙げられる。しかしながら、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの発症機序は未だ不明な点も多く、その効果的な治療法および治療薬は確立されていないのが現状である。その原因の一端は、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨはヒトの生活習慣病を発症の基盤とする為に、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの研究のための適当な非ヒトモデル動物が未だ確立されていないことにある。
【０００３】
肝硬変、肝癌など致死性の疾患に進展する可能性のあるＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの病態の解明は、効果的な治療法および治療薬の開発に必須であり、そのためには適当なＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの非ヒトモデル動物が必要である。これまでに、ＮＡＳＨのモデル動物については報告されているが（例えば、特許文献１および２）、ＮＡＦＬＤの非ヒトモデル動物、特に大型動物についてはＮＡＳＨも含め、ほとんど報告されていない。このような状況下、疾患の進展の観点上、より基盤となるＮＡＦＬＤの非ヒトモデル動物が求められている。とりわけ、ヒトにおけるＮＡＦＬＤの治療法および治療薬の確立を目的として、生理学的、解剖学的および遺伝学的にヒトにより近い非ヒト動物のＮＡＦＬＤモデルが求められていると言える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０１３２４７号
【特許文献２】国際公開第２００８／００１６１４号
【発明の概要】
【０００５】
そこで、本発明は、ＮＡＦＬＤの非ヒトモデル動物およびその作製方法、ならびに、その作製に用いられる飼料を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。本発明者は、マイクロミニブタを用いて、特定の組成のコリン不含・Ｌ−アミノ酸規定（ＣＤＡＡ）飼料を与えることにより、生理学的、解剖学的および遺伝学的にヒトにより近いマイクロミニブタで、ＮＡＦＬＤモデル動物（モデルブタ）の作製に成功し、本発明を完成させた。当該モデルブタにおいては、血中の総コレステロールやアルブミンの濃度の低下、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）やアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の濃度の上昇、および、ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）の値の低下など、ＮＡＦＬＤにおいて特徴的な血中パラメータの変化が認められた。
【０００７】
すなわち、本発明としては、具体的には以下のものが例示される。
［１］非ヒト動物にコリン不含・Ｌ−アミノ酸規定（ＣＤＡＡ）飼料を与えて飼育する工程を含む、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の非ヒトモデル動物を作製する方法であって、
前記ＣＤＡＡ飼料が、タンパク質を実質的に含有しないことを特徴とする、方法。
［２］前記非ヒト動物が、霊長類、げっ歯類、食肉類および偶蹄類からなる群より選択される哺乳類目の動物である、［１］に記載の方法。
［３］前記非ヒト動物がブタである、［１］または［２］に記載の方法。
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載の方法により作製される、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の非ヒトモデル動物。
［５］以下の所見（１）〜（６）の少なくとも１つを示す、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の非ヒト動物モデル：
（１）血中総コレステロール濃度の低下
（２）血中アルブミン濃度の低下
（３）ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）の値の低下
（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度の上昇
（５）血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度の上昇
（６）血中ヒアルロン酸濃度の上昇。
［６］非ヒト動物において非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を惹起するために用いられる、タンパク質を実質的に含有しない、コリン不含・Ｌ−アミノ酸規定（ＣＤＡＡ）飼料。
【０００８】
本発明により、生理学的、解剖学的および遺伝学的にヒトにより近い非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の非ヒトモデル動物およびその作製方法が提供される。また、本発明により、非ヒト動物において非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を惹起するために用いられる飼料が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の方法により得られた非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）のモデル動物（マイクロミニブタ）の肝臓組織の生検写真。
【発明の具体的説明】
【００１０】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を発症する非ヒトモデル動物（以下、「本発明のモデル動物」ともいう）を提供する。
【００１１】
本発明のモデル動物は、例えば、後述する特定の組成のコリン不含・Ｌ−アミノ酸規定（ＣＤＡＡ）飼料を非ヒト動物に与えて飼育することにより作製することができる。
【００１２】
本発明のモデル動物を作製するために使用される非ヒト動物（以下、「本発明で用いられる非ヒト動物」ともいう）は、実験動物として一般に使用される非ヒト動物であれば特に制限されないが、好ましくは非ヒト脊椎動物であり、より好ましくは非ヒト哺乳動物であり、さらに好ましくは偶蹄類動物である。本発明で用いられる非ヒト動物としては、具体的には、ブタ、ミニブタ、マイクロミニブタ等を例示することができる。本発明で用いられる非ヒト動物は、好ましくは、ミニブタまたはマイクロミニブタであり、特に好ましくはマイクロミニブタである。市販されているマイクロミニブタとしては、例えば、富士マイクラ株式会社製のマイクロミニブタ（系統：Fuji Micromini Pig）が挙げられる。
【００１３】
本発明で用いられる非ヒト動物とは、ヒトと同様に肥満、糖尿病、高脂血症または高血圧などの生活習慣病を有していてもよい。本発明で用いられる非ヒト動物が生活習慣病を有する場合には、該非ヒト動物が有する生活習慣病の種類は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。これらの生活習慣病は、遺伝的に先天的に有するものであってもよく、後天的に獲得されたものであってもよい。
【００１４】
本発明において用いられるコリン不含・Ｌ−アミノ酸規定（ＣＤＡＡ）飼料（以下、「本発明で用いられる飼料」ともいう）は、タンパク質を実質的に含有しないことを特徴とする。「タンパク質を実質的に含有しない」とは、具体的には、飼料全体に対するタンパク質の含有量が、好ましくは１×１０−７重量％未満であり、より好ましくは１×１０−８重量％未満であり、特に好ましくは０重量％であることを意味する。
【００１５】
本発明で用いられる飼料の組成は、上述したタンパク質の含有量の範囲を満たし、本発明で用いられる非ヒト動物においてＮＡＦＬＤの症状を誘発できる限り特に制限されず、例えば、本発明で用いられる非ヒト動物の種類に合わせて適宜設定することができる。例えば、従来のコリン不含・Ｌ−アミノ酸規定（ＣＤＡＡ）飼料の組成を基本にして、本発明で用いられる飼料の組成を設定すればよい。本発明の飼料の組成を設定し、該飼料を作製することは、当業者であれば本明細書の記載および公知の情報や技術、例えば、米国RESEARCH DIETS社製のA15022101およびA02082002Bなどを参照して容易に実施することができる。本発明で用いられる飼料は、公知の情報や技術に基づいて作製してもよく、上記市販を応用・改良したものであってもよい。
【００１６】
本発明の方法において、本発明で用いられる非ヒト動物に本発明で用いられるＣＤＡＡ飼料を与え始める時期は、ＮＡＦＬＤを誘発できる限り特に制限されず、例えば非ヒト動物の種類や合併症の有無に応じて適宜設定することができる。例えば、本発明で用いられる非ヒト動物が糖尿病等の生活習慣病を有する場合には、生活習慣病を発症した後、摂餌を開始するのが好ましい。また、該飼料の摂取量は、ＮＡＦＬＤを誘発できる限り特に制限されず、例えば本発明で用いられる非ヒト動物の種類、大きさまたは体重等に応じて適宜設定することができる。例えばマイクロミニブタを用いる場合には、１日当たりの該飼料の摂取量は３００ｇ程度である。また、該飼料を餌として用いて飼育する期間は、ＮＡＦＬＤを誘発できる限り特に制限されず、例えば本発明で用いられる非ヒト動物の種類に応じて適宜設定することができる。例えばマイクロミニブタを用いる場合には、通常６週間以上、好ましくは８週間以上、より好ましくは１２週間以上、該飼料を餌として用いて飼育することが好ましい。このようにして、本発明で用いられる飼料を用いて飼育することにより、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を誘発することができる。また、例えばマイクロミニブタを用いる場合には、該飼料で飼育を続けると、およそ１４週以降で腹水がたまり、死に至ることがある。
【００１７】
なお、本発明の方法において、「飼料を与えて飼育する」とは、本発明で用いられるＣＤＡＡ飼料自体を与える場合に限らず、該ＣＤＡＡ飼料の各成分を別個に与える場合も含む。また、ＮＡＦＬＤを誘発できる限りにおいて他の飼料を併用してもよい。
【００１８】
本発明の方法により作製され得るＮＡＦＬＤモデル動物は、ＮＡＦＬＤ、特に、ヒトのＮＡＦＬＤの特徴的な臨床病態をよく反映し、また、該モデル動物においてはヒトのＮＡＦＬＤと同様の緩やかな病態の進行が認められる。よって、本発明の方法により作製され得るＮＡＦＬＤモデル動物は、ヒトへの外挿性が高く有用である。また、飼料を摂餌させるだけで、ＮＡＦＬＤ症状を生じさせることができるため作製が簡便である。
【００１９】
本発明のモデル動物は、以下の（１）〜（６）から選択される少なくとも１つの所見を示す。
（１）血中総コレステロール濃度の低下
（２）血中アルブミン濃度の低下
（３）ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）の値の低下
（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度の上昇
（５）血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度の上昇
（６）血中ヒアルロン酸濃度の上昇。
なお、本明細書においては、上記所見（１）〜（６）を総称して、「ＮＡＦＬＤの所見」と称する場合がある。
【００２０】
上記所見（１）〜（６）において、「低下」または「上昇」とは、各所見に該当するパラメータが、ＮＡＦＬＤを惹起しない飼料を用いて飼育された正常個体における「標準値」と比較して「低下」または「上昇」していることを意味する。詳細には、各所見について「標準値」と比較した際の統計学的有意差に基づき判断できる。なお、各所見において、統計解析手法としては公知の統計解析手法を適宜選択して使用することができ、統計解析手法としては、例えば、多群間の検定の場合にはＡＮＯＶＡが挙げられるが、本発明の場合、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較が好ましく用いられる。上記検定法においてＰ値が０．０５未満であった場合に「低下」または「上昇」が認められたと判断する。一方、Ｐ値が０．０５以上であった場合に「低下」または「上昇」が認められなかったと判断することができる。また、ＮＡＦＬＤを惹起しない飼料、すなわち通常飼料としては、例えば固形飼料ＭＰ−Ａ（オリエンタル酵母工業株式会社製）などが挙げられる。なお、通常飼料を用いて飼育した場合には、ＮＡＦＬＤの所見や病態が認められないことが、実験動物販売者および研究者等の当業者間では共有された認識であることから、本発明のモデル動物を作製する上で、上記各所見に該当するパラメータの経時的な変化量の有意性を検討することが非常に好ましいと言える。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これら実施例により制限されるものではなく、本発明の範囲内で種々の変更が可能である。
【００２２】
＜実施例１：ＮＡＦＬＤの非ヒトモデル動物の作製＞
マイクロミニブタを用いて、以下の手順でＮＡＦＬＤの非ヒトモデル動物を作製した。
【００２３】
約７ヶ月齢（体重約１０ｋｇ）の雄マイクロミニブタ（系統：Fuji Micromini Pig）を富士マイクラ株式会社から購入し、６個体について、自然換気、温度：２０±５℃、相対湿度：５５±２５％、照明サイクル：７：００〜１９：００が明、１９：００〜７：００が暗の飼育環境の下、通常飼料である固形飼料ＭＰ−Ａ（オリエンタル酵母株式会社製、含有コリン：０．２９％、含有粗タンパク質：１５．３％）を飼料として、１日３００ｇ給餌して馴化を行った。なお、給餌は各日の８：００頃に行った。
【００２４】
使用した通常飼料ＭＰ−Ａの主な成分の組成を表１に示す。
【００２５】
【表１】
2020072658.tif 000002
【００２６】
一週間程度の馴化期間の終了後、タンパク質を実質的に含有しないＣＤＡＡ飼料（RESERCH DIETS社製、A15022101）を飼料として、１日３００ｇ給餌して、同一の飼育環境の下、１６週間にわたり自由摂餌により飼育した。なお、給餌は各日の８：００頃に行った。
【００２７】
使用したＣＤＡＡ飼料の主な成分の組成を表２に示す。
【００２８】
【表２】
2020072658.tif 000003
【００２９】
詳細な結果については後述するが、タンパク質を実質的に含有しないＣＤＡＡ飼料を与えて飼育することにより、ＮＡＦＬＤに外挿可能なＮＡＦＬＤマイクロミニブタを作製することができた。
【００３０】
＜実施例２：ＮＡＦＬＤの非ヒトモデル動物の臨床病態の検討＞
上記のように飼育された各マイクロミニブタ群について、ＮＡＦＬＤの臨床病態の検討を行った。ＮＡＦＬＤの臨床病態としては、ヒトのＮＡＦＬＤを診断する指標を参考にして、以下の項目（１）〜（６）を設定した（ＮＡＦＬＤの所見）。
（１）血中総コレステロール濃度の低下
（２）血中アルブミン濃度の低下
（３）ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）の値の低下
（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度の上昇
（５）血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度の上昇
（６）血中ヒアルロン酸濃度の上昇。
【００３１】
（ａ）測定方法
実施例１において記載された、通常飼料ＭＰ−Ａによる一週間程度の馴化期間は、ＮＡＦＬＤの病態は認められなかった。従って、馴化期間終了後のマイクロミニブタ６個体について、採血を行い血清を得、得られた血清試料を用いて、以下の（１）〜（６）の各項目について測定を行い、その測定値を「標準値」とした。
（１）血中総コレステロール濃度
（２）血中アルブミン濃度
（３）ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）の値
（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度
（５）血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度
（６）血中ヒアルロン酸濃度
【００３２】
上記（１）〜（６）の各項目の測定は、以下の手法およびキット等を用いて行った。
（１）血中総コレステロール濃度については、コレステロール脱水素酵素（ＵＶ）法を用いて測定した。
（２）血中アルブミン濃度については、ネフェロメトリー（ＢＣＰ改良法）を用いて測定した。
（３）ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）値については、凝固時間測定を用いて測定した。
（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度については、Type IV collagen ELISA kit, ACB（フナコシ株式会社製）を用いて測定した。
（５）血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度については、ＪＳＣＣ標準化対応法を用いて測定した。
（６）血中ヒアルロン酸濃度については、ラテックス凝集免疫比濁法を用いて測定した。
【００３３】
続いて、馴化期間終了後のマイクロミニブタ６個体を、タンパク質を実質的に含有しないＣＤＡＡ飼料（RESEARCH DIETS社製、A15022101）を飼料としてさらに飼育し、タンパク質を実質的に含有しないＣＤＡＡ飼料を給餌開始後１６週間にわたり、２週間ごとに採血を行い血清を得た。得られた血清試料を用いて、上記（１）〜（６）の各項目について測定を行った。
【００３４】
（ｂ）測定結果
各個体の標準値と、タンパク質を実質的に含有しないＣＤＡＡ飼料で飼育開始後１６週までの、上記（１）〜（６）の項目の経時的な変化を表３に示す。
【００３５】
【表３】
2020072658.tif 000004
【００３６】
（ｃ）測定結果の比較
上記（１）〜（６）各項目について、通常飼料でＭＰ−Ａで一週間程度飼育（馴化）した時点での測定値（標準値）と、タンパク質を実質的に含有しないＣＤＡＡ飼料を給餌後１６週間までの、２週間ごとの測定値とを比較した結果を表４に示す。
【００３７】
【表４】
2020072658.tif 000005
【００３８】
表４中、上向き矢印または下向き矢印で示したものは、６個体の標準値の平均値に対して測定値の平均値が上昇または低下したことを意味する。一本の矢印は、標準値の平均値に対して測定値の平均値が１０％以上上昇または低下したことを意味し、二本矢印は、３０％以上上昇または低下したことを意味し、三本矢印は、５０％以上上昇または低下したことを意味する。また、ハイフンは１０％未満の上昇または低下を意味する。
【００３９】
表３および４に示した結果から、タンパク質を実質的に含有しないＣＤＡＡ飼料を用いて飼育した６個体のマイクロミニブタのすべてについて、血中のアルブミン濃度、総コレステロール濃度およびヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）値の著しい低下が認められた。一方、血中のＩＶ型コラーゲン濃度、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度およびヒアルロン酸濃度の著しい上昇が認められた。
【００４０】
（ｄ）肝臓組織の生検
６個体のマイクロミニブタのうちの１個体（個体番号：３）について、肝臓組織を取り出して生検写真を得た。生検写真を図１に示す。
【００４１】
図１の生検写真において、灰色で示す部分は肝細胞を示し、白色の小さな粒状部分は脂肪（脂肪滴）を示す。本発明の方法により得られたマイクロミニブタの肝臓組織においては、正常の肝臓組織では認められないような、多量の脂肪（脂肪滴）の肝細胞への沈着が生じており、生検写真からもＮＡＦＬＤの所見が認められた。
【００４２】
以上より、タンパク質を実質的に含有しないＣＤＡＡ飼料を用いて飼育したマイクロミニブタは、当該飼料の摂餌開始後６〜１２週目において、ＮＡＦＬＤの臨床病態を示すことが明らかとなった。特に、摂餌開始後１０〜１２週目においては、ヒトのＮＡＦＬＤに特徴的な病態の多くを反映しており、タンパク質を実質的に含有しないＣＤＡＡ飼料を与えて飼育することにより、ヒトのＮＡＦＬＤに外挿可能なＮＡＦＬＤモデル動物を作製できることが確認された。このようなタンパク質を実質的に含有しないＣＤＡＡ飼料を用いて飼育したマウスにおいては、ヒトのＮＡＦＬＤと同様の緩やかな病態の進行が認められたことから、本発明のＮＡＦＬＤモデル動物はＮＡＦＬＤの病態の解析に好適であると考えられる。また、タンパク質を実質的に含有しないＣＤＡＡ飼料は、非ヒト動物において非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を惹起するために用いられ得ると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明により、ヒトと同様の臨床病態を示す非アルコール性脂肪性心疾患（ＮＡＦＬＤ）の非ヒトモデル動物を作製することができる。該非ヒトモデル動物を利用することで、ヒトのＮＡＦＬＤの治療方法および治療薬の開発が可能となる。
【図１】
2020072658.tif 000006