(57)【要約】【課題】簡便かつ低コストで実施できると共に、非標的領域の核酸増幅を妨げることなく標的領域の核酸増幅を特異的に抑制することが可能な核酸増幅の特異的抑制方法を提供すること。【解決手段】複数領域の核酸増幅が同一反応系で進行する鋳型依存的核酸増幅反応において、標的領域の核酸増幅を特異的に抑制する方法であって、標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸を反応系に添加する工程を含み、該一本鎖核酸はＲＮＡまたはＲＮＡと他の核酸とのキメラであり、かつ、１０〜２００塩基からなることを特徴とする核酸増幅抑制方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数領域の核酸増幅が同一反応系で進行する鋳型依存的核酸増幅反応において、標的領域の核酸増幅を特異的に抑制する方法であって、標的領域内の任意の位置にハイブリダイズする一本鎖核酸を反応系に添加する工程を含み、該一本鎖核酸はＲＮＡまたはＲＮＡと他の核酸とのキメラであり、かつ、１０〜２００塩基からなることを特徴とする核酸増幅抑制方法。
【請求項２】
一本鎖核酸が１０〜１００塩基からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅抑制方法。
【請求項３】
一本鎖核酸が１０〜５０塩基からなることを特徴とする請求項２に記載の核酸増幅抑制方法。
【請求項４】
一本鎖核酸が２０〜３０塩基からなることを特徴とする請求項３に記載の核酸増幅抑制方法。
【請求項５】
一本鎖核酸が一本鎖ＲＮＡである請求項１〜４のいずれかに記載の核酸増幅抑制方法。
【請求項６】
鋳型依存的核酸増幅反応が、鋳型核酸にプライマーをアニーリングさせプライマーの３’末端から核酸を伸長させることにより核酸鎖を増幅する反応であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の核酸増幅抑制方法。
【請求項７】
鋳型依存的核酸増幅反応が、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＴＲＣ法およびＴＭＡ法からなる群より選択されるいずれかであることを特徴とする請求項６に記載の核酸増幅抑制方法。
【請求項８】
鋳型依存的核酸増幅反応がＰＣＲ法またはＲＴ−ＰＣＲ法であることを特徴とする請求項７に記載の核酸増幅抑制方法。
【請求項９】
鋳型依存的核酸増幅反応に用いるＤＮＡポリメラーゼがα型ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の核酸増幅抑制方法。
【請求項１０】
標的領域の核酸増幅を特異的に抑制するキットであって、標的領域内の任意の位置にハイブリダイズする一本鎖核酸を含み、該一本鎖核酸はＲＮＡまたはＲＮＡと他の核酸とのキメラであり、かつ、１０〜２００塩基からなることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅の特異的抑制方法に関するものであり、詳細には、複数領域の核酸増幅が同一反応系で進行する鋳型依存的核酸増幅反応において、標的領域の核酸増幅を特異的に抑制する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法は、特異的な一対のプライマーとＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて特定のＤＮＡ配列を増幅する技術であり、分子生物学分野の研究に不可欠な技術である。一般的なプライマー配列を含む複数の鋳型の増幅は、遺伝子ファミリーメンバーのクローニングや臨床診断における微生物の検出に広く使われているが、このような鋳型の増幅にＰＣＲ法を利用する場合、目的領域以外の部位にプライマーがアニーリングすることに起因して、増幅させたい領域以外の領域が増幅される場合がある。このような望ましくない増幅産物が生成することにより、目的の増幅産物の検出が困難になり、また目的の増幅産物の生成が阻害される。それゆえ、望ましくない増幅産物の生成を抑制する技術の開発が求められてきた。
【０００３】
望ましくない増幅産物の生成を抑制する従来技術として、例えば以下の技術が知られている。
（１）ＰＣＲによる増幅反応を特異的に阻害するために、長鎖（７５０塩基程度）のＲＮＡを用いる方法が報告されている（非特許文献１）。この方法では、長鎖ＲＮＡをインビトロトランスクリプションで合成するため、コストと手間がかかる。また、長鎖ＲＮＡ中の配列と一部相補的な鋳型ＤＮＡの増幅も阻害される可能性があることから、阻害の特異性が低下する可能性がある。
【０００４】
（２）３’側の修飾によりプライマーとして機能しないオリゴデオキシヌクレオチド（以下「ＯＤＮ」と記す）やＬＮＡ（locked nucleic acid）をＰＣＲで増幅される領域内にアニーリングするようにデザインし、これらを反応系に加えて増幅を抑制する方法が報告されている（非特許文献２，３，４）。この方法を用いる場合は、ＯＤＮの３’側の修飾が除去されるとＯＤＮがプライマーとして働く可能性があるため、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用することができないという問題がある。また、標的の増幅を抑制するために、反応系に高濃度のＯＤＮやＬＮＡを添加する必要がある。
【０００５】
（３）Ａｌｕ配列等の繰り返し配列に一方のプライマー（第１プライマー）を設計し、特異的な配列領域に他方のプライマー（第２プライマー）を設計する必要がある場合には、第１プライマーがゲノムの他の領域にアニーリングすることによって第１プライマーのみによる非特異的な増幅産物が生成する結果、目的の増幅産物検出が困難になったり、目的の増幅産物の生成が阻害されたりする問題が生じる。このような場合に、第１プライマーと重複する配列を持つが、３’側が修飾されているためプライマーとして働かないＯＤＮを反応系に加え、繰り返し配列にプライマーがアニーリングすることを競合的に阻害する方法が開発されている（非特許文献５，６）。この方法を用いる場合は、第１プライマー同士からの増幅が効果的に阻害されるため、相対的に目的の領域の増幅が増加することになる。しかし、この方法では、（ａ）プライマーと阻害ＯＤＮの最適な量比を決めることが煩雑である、（ｂ）目的領域の増幅も阻害されるため鋳型によっては目的領域の増幅ができなくなる場合があり得る、という問題がある。また、少なくとも第２プライマーは特異的なゲノム領域に設計する必要があり、もし設計した第２プライマーがアニーリング可能な領域がゲノム中に複数ある場合には、目的領域のみを増幅することは困難である。
【０００６】
（４）目的の配列を増幅するが、目的でない配列も増幅し得る第１プライマーおよび第２プライマー以外に、目的でない配列にハイブリダイズするインターセプトプライマーを含有する反応系を用いて核酸増幅反応を行う方法が開発されている（特許文献１）。この方法では、第１プライマーとインターセプトプライマーによって、目的でない配列の一部を増幅することにより第２プライマー認識部位を欠失した配列部分を生成させ、第１プライマーと第２プライマーとの組み合わせによる目的でない配列の増幅を低減させるものである。しかしこの方法は、第１プライマーとインターセプトプライマーによる増幅は阻害されないので、第１プライマーとインターセプトプライマーによる増幅産物がノイズとなり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００７／０７４８９４号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Yuen PS, Brooks KM, Li Y. RNA: a method to specifically inhibit PCR amplification of known members of a multigene family by degenerate primers. Nucleic Acids Res. (2001) 29: E31.
【非特許文献２】Seyama T, Ito T, Hayashi T, Mizuno T, Nakamura N, et al. A novel blocker-PCR method for detection of rare mutant alleles in the presence of an excess amount of normal DNA. Nucleic Acids Res. (1992) 20: 2493-2496.
【非特許文献３】Yu D, Mukai M, Liu QL, Steinman CR. Specific inhibition of PCR by non-extendable oligonucleotides using a 5' to 3' exonuclease-deficient DNA polymerase. Biotechniques (1997) 23: 714-720.
【非特許文献４】Dominguez PL, Kolodney MS. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene (2005) 24: 6830-6834.
【非特許文献５】Puskas LG, Fartmann B, Bottka S  Restricted PCR: amplification of an individual sequence flanked by a highly repetitive element from total human DNA. Nucleic Acids Res. (1994) 22: 3251-3252.
【非特許文献６】Puskas LG, Bottka S. Reduction of mispriming in amplification reactions with restricted PCR. Genome Res. (1995) 5: 309-311.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、望ましくない増幅産物の生成を抑制する上記従来技術の問題点を改善し、簡便かつ低コストで実施できると共に、非標的領域の核酸増幅を妨げることなく標的領域の核酸増幅を特異的に抑制することが可能な核酸増幅の特異的抑制方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］複数領域の核酸増幅が同一反応系で進行する鋳型依存的核酸増幅反応において、標的領域の核酸増幅を特異的に抑制する方法であって、標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸を反応系に添加する工程を含み、該一本鎖核酸はＲＮＡまたはＲＮＡと他の核酸とのキメラであり、かつ、１０〜２００塩基からなることを特徴とする核酸増幅抑制方法。
［２］一本鎖核酸が１０〜５０塩基からなることを特徴とする前記［１］に記載の核酸増幅抑制方法。
［３］一本鎖核酸が２０〜３０塩基からなることを特徴とする前記［２］に記載の核酸増幅抑制方法。
［４］一本鎖核酸が一本鎖ＲＮＡである前記［１］〜［３］のいずれかに記載の核酸増幅抑制方法。
［５］鋳型依存的核酸増幅反応が、鋳型核酸にプライマーをアニーリングさせプライマーの３’末端から核酸を伸長させることにより核酸鎖を増幅する反応であることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載の核酸増幅抑制方法。
［６］鋳型依存的核酸増幅反応が、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＴＲＣ法およびＴＭＡ法からなる群より選択されるいずれかであることを特徴とする前記［５］に記載の核酸増幅抑制方法。
［７］鋳型依存的核酸増幅反応がＰＣＲ法またはＲＴ−ＰＣＲ法であることを特徴とする前記［６］に記載の核酸増幅抑制方法。
［８］鋳型依存的核酸増幅反応に用いるＤＮＡポリメラーゼがα型ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする前記［５］〜［７］のいずれかに記載の核酸増幅抑制方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、簡便かつ低コストで実施できると共に、非標的領域の核酸増幅を妨げることなく標的領域の核酸増幅を特異的に抑制することが可能な核酸増幅の特異的抑制方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒトゲノムＤＮＡを鋳型としてＩＲＦ−１遺伝子座の標的領域（Target）および対照領域（Reference）を増幅するためのプライマーを設計し、オリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）を用いて標的領域のＰＣＲ増幅を特異的に抑制する実験のスキームを示す図である。
【図２】図１の標的領域（Target）および対照領域（Reference）を、それぞれ図１に示したプライマーセットを用いて増幅し、得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で検出した結果を示す図である。
【図３】オリゴリボヌクレオチドＯＲＮ−３０２ＦによるＰＣＲ増幅の特異的抑制を、リアルタイムＰＣＲを用いて検討した結果を示す図である。
【図４】オリゴリボヌクレオチドＯＲＮ−２９８ＦによるＰＣＲ増幅の特異的抑制を、リアルタイムＰＣＲを用いて検討した結果を示す図である。
【図５】オリゴリボヌクレオチドＯＲＮ−３０６ＦによるＰＣＲ増幅の特異的抑制を、リアルタイムＰＣＲを用いて検討した結果を示す図である。
【図６】オリゴリボヌクレオチドＯＲＮ−３１０ＦによるＰＣＲ増幅の特異的抑制を、リアルタイムＰＣＲを用いて検討した結果を示す図である。
【図７】ＩＲＦ−１遺伝子座の標的領域におけるオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ−６６６Ｒ、ＯＲＮ−３６３Ｒ、ＯＲＮ−１８１Ｒ）がハイブリダイズする位置を示す図である。
【図８】オリゴリボヌクレオチドＯＲＮ−６６６ＲによるＰＣＲ増幅の特異的抑制を、リアルタイムＰＣＲを用いて検討した結果を示す図である。
【図９】オリゴリボヌクレオチドＯＲＮ−３６３ＲによるＰＣＲ増幅の特異的抑制を、リアルタイムＰＣＲを用いて検討した結果を示す図である。
【図１０】オリゴリボヌクレオチドＯＲＮ−１８１ＲによるＰＣＲ増幅の特異的抑制を、リアルタイムＰＣＲを用いて検討した結果を示す図である。
【図１１】ＩＲＦ−１遺伝子座の標的領域におけるオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ−３０２Ｆ、ＯＲＮ−３６３Ｒ）がハイブリダイズする位置を示す図である。
【図１２】方向が異なる２種類のＯＲＮ（ＯＲＮ−３０２ＦおよびＯＲＮ−３６３Ｒ）の同時使用によるＰＣＲ増幅の特異的抑制を、リアルタイムＰＣＲを用いて検討した結果を示す図である。
【図１３】競合的状況におけるＯＲＮによるＰＣＲ増幅の特異的抑制実験のスキームを示す図である。
【図１４】ＫＯＤポリメラーゼを用いた場合の競合的状況におけるＯＲＮによるＰＣＲ増幅の特異的抑制実験の結果を示す図である。
【図１５】Ｐｆｕポリメラーゼを用いた場合の競合的状況におけるＯＲＮによるＰＣＲ増幅の特異的抑制実験の結果を示す図である。
【図１６】参考例１の競合的状況におけるＯＤＮによるＰＣＲ増幅の特異的抑制実験のスキームを示す図である。
【図１７】参考例１の競合的状況におけるＯＤＮによるＰＣＲ増幅の特異的抑制実験の結果を示す図である。
【図１８】参考例２の競合的状況におけるＯＤＮによるＰＣＲ増幅の特異的抑制実験のスキームを示す図である。
【図１９】参考例２のＴａｑポリメラーゼを用いた場合の競合的状況におけるＯＤＮによるＰＣＲ増幅の特異的抑制実験の結果を示す図である。
【図２０】参考例２のＫＯＤポリメラーゼを用いた場合の競合的状況におけるＯＤＮによるＰＣＲ増幅の特異的抑制実験の結果を示す図である。
【図２１】本発明の核酸増幅抑制方法をマウス腸内細菌叢の解析に応用した結果を示す図であり、左が優占種特異的なＯＲＮを添加していない場合の結果、右が優占種特異的なＯＲＮを添加した場合の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、複数領域の核酸増幅が同一反応系で進行する鋳型依存的核酸増幅反応において、標的領域の核酸増幅を特異的に抑制する方法を提供する。本発明の核酸増幅抑制方法は、標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸を反応系に添加する工程を含む。
【００１４】
鋳型依存的核酸増幅反応は、鋳型核酸に基づいて核酸合成酵素により相補鎖の合成を繰り返すことにより、目的領域の核酸鎖を増幅させるものであればよく、特に限定されない。鋳型核酸は、一本鎖でもよく二本鎖でもよい。また、鋳型核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのいずれでもよい。さらに、構成ヌクレオチドが人工的な誘導体に置換されているものや、天然のＤＮＡまたはＲＮＡが修飾されているものであっても、相補鎖合成の鋳型として機能する限り鋳型核酸に含まれる。鋳型核酸として、具体的には、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、合成ＲＮＡなどが挙げられる。
【００１５】
鋳型核酸はどのような由来の核酸でもよい。生体由来の核酸が好適であるが、生体に由来しない試料から得られる核酸を用いることも可能である。生体由来の核酸は、動物および植物の生体構成成分から好適に取得することができる。生体に由来しない試料から得られる核酸としては、例えば、細胞を含む食品材料、土、水、繊維、埃等から得られる核酸が挙げられる。
【００１６】
本発明の核酸増幅抑制方法は、生きた生物内または生きた細胞内で行われる鋳型依存的核酸増幅反応（ｉｎ ｖｉｖｏ核酸増幅反応）を適用対象としない。すなわち、本発明の核酸増幅抑制方法は、生細胞内に存在する核酸を鋳型とする核酸増幅反応には適用されない。本発明の核酸増幅抑制方法を適用する鋳型依存的核酸増幅反応は、定法により細胞から抽出された核酸、または定法により作製された組織標本等の細胞中に存在する核酸を鋳型とする核酸増幅反応であることが好ましい。すなわち、本発明の核酸増幅抑制方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応またはｉｎ ｓｉｔｕ核酸増幅反応に適用することが好ましい。
【００１７】
鋳型依存的核酸増幅反応は、鋳型核酸にプライマーをアニーリングさせプライマーの３’末端から核酸を伸長させることにより核酸鎖を増幅する反応であることが好ましい。このような鋳型依存的核酸増幅反応としては、ＰＣＲ法（Polymerase Chain Reaction：White,T.J. et al., Trends Genet., 5, 185(1989)）、ＲＴ−ＰＣＲ法（Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction：James W. Larrick, Trends Biotechnol., 10, 146-152, 1992）、ＬＡＭＰ法（Loop-mediated isothermal Amplification：国際公開第ＷＯ００／２８０８２号）、ＩＣＡＮ法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids：国際公開第０２／１６６３９号）、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification：特許第２６５０１５９号公報）、ＬＣＲ法（Ligase Chain Reaction：Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.88, p.189-193, 1991）、ＳＤＡ法（Strand Displacement Amplification：特公平７−１１４７１８号公報）、ＴＲＣ法（Transcription-Reverse Transcription-Concerted method：Nakaguchi Y. et al., J. Clin. Microbiol., vol.42: p.4248-4292 (2004)）、ＴＭＡ法（Transcription-Mediated-Amplification：Sarrazin C. et al., J. Clin. Microbiol., vol.39: p.2850-2855(2001)）などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の核酸増幅抑制方法は、いずれの鋳型依存的核酸増幅方法においても好適に適用することができるが、ＰＣＲ法またはＲＴ−ＰＣＲ法に適用することが好ましい。
【００１８】
鋳型依存的核酸増幅反応において用いるプライマーは、それぞれの核酸増幅方法に応じて好適なプライマーを用いることができる。それぞれの核酸増幅方法に好適なプライマーは、公知技術に基づいて設計することができ、公知の方法で製造することができる。また、鋳型依存的核酸増幅反応の反応条件は、それぞれの核酸増幅方法の原理に則った特異的な増幅産物が生成される限り特に限定されず、公知技術に基づいて適宜設定することができる。
【００１９】
本発明の核酸増幅抑制方法は、複数領域の核酸増幅が同一反応系で進行する鋳型依存的核酸増幅反応に適用される。鋳型依存的核酸増幅反応において、複数領域の核酸増幅が同一反応系で進行する場合としては、（Ａ）目的領域を増幅するために設計したプライマーが鋳型核酸の別の部分にアニールすることにより、目的以外の領域が増幅される場合、（Ｂ）同一のプライマー（プライマーセット）により特異的に増幅される２種以上の鋳型核酸（競合的鋳型核酸）が存在する反応系で核酸増幅反応を行う場合等が挙げられる。したがって、本発明の核酸増幅抑制方法における標的領域は、上記（Ａ）の目的以外の増幅領域、または上記（Ｂ）の目的の鋳型核酸以外の競合的鋳型核酸に基づく増幅領域であることが好ましい。いずれの場合においても、標的領域は一領域に限定されず、二領域以上であってもよい。
【００２０】
標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸を設計するために、標的領域の塩基配列情報が必要である。標的領域の塩基配列情報は、鋳型核酸の塩基配列および鋳型核酸中の標的領域の位置が明らかである場合は、これらの情報に基づいて取得することができる。標的領域の塩基配列情報が不明である場合は、核酸増幅反応により増幅された目的以外の増幅産物をアガロースゲル電気泳動等の公知の方法で単離し、これを公知のシークエンス解析法に供することにより標的領域の塩基配列情報を取得することができる。取得した標的領域の塩基配列情報に基づいて、標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸を設計することができる。鋳型核酸が二本鎖（例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖からなる二本鎖ＤＮＡ）である場合、一本鎖核酸はどちらの鎖にハイブリダイズするものでもよい。
【００２１】
一本鎖核酸は、標的領域の塩基配列と完全に相補的であることが望ましいが、標的領域の核酸増幅を特異的に抑制できる限り、完全に相補的な配列でなくてもよい。標的領域とハイブリダイズできる限り、１〜数個（例えば、２、３、４個）のミスマッチがあってもよい。標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸には、標的配列の９０％以上と相補的な配列、好ましくは９５％以上と相補的な配列、より好ましくは９８％以上と相補的な配列を有し、かつ標的領域の核酸増幅を特異的に抑制できる一本鎖核酸が含まれる。
【００２２】
標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸は、ＲＮＡまたはＲＮＡと他の核酸とのキメラであればよいが、一本鎖ＲＮＡであることが好ましい。他の核酸としてはＤＮＡ、修飾されたＤＮＡ、修飾されたＲＮＡなどが挙げられる。一本鎖核酸がＲＮＡと他の核酸とのキメラである場合、他の核酸は全塩基長の５０％以下であることが好ましく、４０％以下であることがより好ましく、３０％以下であることがさらに好ましく、２０％以下であることがさらに好ましく、１０％以下であることがさらに好ましく、５％以下であることがさらに好ましい。
【００２３】
標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸の長さ（塩基長）は特に限定されないが、１０〜２００塩基が好ましく、１０〜１５０塩基がより好ましく、１０〜１２０塩基がより好ましく、１０〜１００塩基がより好ましく、１０〜９０塩基がより好ましく、１０〜８０塩基がさらに好ましく、１０〜７０塩基がさらに好ましく、１０〜６０塩基がさらに好ましく、１０〜５０塩基がさらに好ましく、１２〜４５塩基がさらに好ましく、１４〜４０塩基がさらに好ましく、１６〜３５塩基がさらに好ましく、１８〜３２塩基がさらに好ましく、２０〜３０塩基がさらに好ましく、２１〜２８塩基がさらに好ましく、２２〜２６塩基がさらに好ましい。特に好ましくは２５塩基である。
【００２４】
標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸は、その５’末端および／または３’末端が修飾されていてもよい。例えば、５’末端および／または３’末端がリン酸化、アミノ化、ビオチン化、チオール化、コレステロール化、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）化、クエンチャー修飾（ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−３など）、蛍光修飾（ＤＮＰ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡ、６−ＦＡＭなど）などで修飾された一本鎖核酸を用いることができる。
【００２５】
標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸は、標的領域とハイブリダイズできる限り、そのヌクレオチド（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド）が、糖、塩基および／またはリン酸塩が化学修飾されたヌクレオチドであってもよい。塩基が修飾されたヌクレオチドとしては、例えば、５位修飾ウリジンまたはシチジン（例えば、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、５−メチルオキシウリジン等）；８位修飾アデノシンまたはグアノシン（例えば、８−ブロモグノシン等）；デアザヌクレオチド（例えば７−デアザ−アデノシン等）；Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド（例えば、Ｎ６−メチルアデノシン等）等が挙げられる。また、糖が修飾されたヌクレオチドとしては、例えば、リボヌクレオチドの２’−ＯＨが、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロゲン原子、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、もしくはＣＮ（ここで、Ｒは炭素数１−６のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を示す）等によって置換された２’位糖修飾、５’末端がモノリン酸化された５’末端リン酸化修飾が挙げられる。リン酸塩が修飾されたヌクレオチドとしては、隣接するリボヌクレオチドを結合するホスホエステル基を、ホスホチオエート基で置換したものが挙げられる。
【００２６】
標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸は、公知の方法で人工的に化学合成することにより作製することができる。また、鋳型ＤＮＡからインビトロ転写法により作製することができる。
【００２７】
鋳型依存的核酸増幅反応に用いる核酸合成酵素は特に限定されず、上記に例示したそれぞれの核酸増幅方法に好適なＤＮＡポリメラーゼおよび／またはＲＮＡポリメラーゼを適宜選択して用いることができる。鋳型依存的核酸増幅反応にＤＮＡポリメラーゼを用いる場合、用いるＤＮＡポリメラーゼは特に限定されず、上記に例示したそれぞれの核酸増幅方法に好適なＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。例えば、ｐｏｌＩ型、α型、非ｐｏｌＩ非α型ＤＮＡポリメラーゼまたは混合型ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち複数のＤＮＡポリメラーゼの混合物）などを挙げることができる。なかでもα型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。α型ＤＮＡポリメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼである。α型ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ）などが市販されており、これらを好適に用いることができる。α型ＤＮＡポリメラーゼを用いる鋳型依存的核酸増幅反応としては、ＰＣＲが好ましい。
【００２８】
本発明の核酸増幅抑制方法は、標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸を反応系に添加する工程を含むものであればよい。通常、上記例示したそれぞれの核酸増幅方法に用いる反応液中に、標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸を添加すればよい。反応系に添加する一本鎖核酸の濃度は、標的領域の核酸増幅を抑制できる濃度であれば特に限定されない。適用する核酸増幅反応における具体的条件ごとに予備検討を行い、適宜設定することが好ましい。具体的には、例えば１μＭ以下が好ましく、５００ｎＭ以下がより好ましく、２００ｎＭ以下がさらに好ましく、１００ｎＭ以下がさらに好ましく、９０ｎＭ以下がさらに好ましく、８０ｎＭ以下がさらに好ましく、７０ｎＭ以下がさらに好ましく、６０ｎＭ以下がさらに好ましく、５０ｎＭ以下がさらに好ましい。下限は特に限定されないが、１０ｎＭ以上が好ましく、２０ｎＭ以上がより好ましく、３０ｎＭ以上がさらに好ましく、４０ｎＭ以上がさらに好ましい。
【００２９】
核酸増幅反応の反応液は、目的の反応が進行する組成の反応液であれば特に限定されないが、通常、鋳型核酸、プライマー（プライマーセット）、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはＲＮＡポリメラーゼ）、核酸合成酵素の基質となるヌクレオチドが含まれる。これら以外に、反応液には緩衝剤、塩類等が添加され、必要に応じて、酵素の保護剤、融解温度（Ｔｍ）の調整剤、界面活性剤等が添加される。緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられる。ｐＨは使用するＤＮＡ合成酵素に応じて至適ｐＨ付近に調整される。塩類は、酵素の活性維持や核酸の融解温度（Ｔｍ）調整のために適宜添加され、具体的には、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４等が用いられる。酵素の保護剤としては、ウシ血清アルブミンや糖類が使用される。さらに、融解温度（Ｔｍ）の調整剤には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド、ベタイン（N,N,N,-trimethylglycine）等が使用される。界面活性剤には、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ等が使用される。
【００３０】
標的領域の核酸増幅が特異的に抑制されていることは、例えば、核酸増幅反応後の反応液中の標的領域の増幅産物量によって確認することができる。核酸増幅反応後の反応液中の標的領域の増幅産物量は、例えば核酸増幅反応後の反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、標的領域の増幅産物のバンドの濃さによって確認することができる。標的領域の増幅産物のバンドが検出されない、または反応系に一本鎖核酸を添加しない場合と比較して標的領域の増幅産物量が減少していれば、標的領域の核酸増幅が特異的に抑制されていると判定できる。したがって、本発明の核酸増幅抑制方法を実施する際には、標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸を添加した反応系以外に、対照として当該一本鎖核酸を添加しない反応系を同時に用いることが好ましい。
【００３１】
本発明の核酸増幅抑制方法は、長鎖（７５０塩基程度）のＲＮＡを用いる従来技術（非特許文献１参照）と比較して、顕著に短い一本鎖核酸を用いる点で非標的領域の核酸増幅を妨げる可能性を極めて低くできる点で非常有用である。また、一本鎖核酸の合成に要するコストと手間においても非常に軽減することが可能となる。また、本発明の核酸増幅抑制方法は、３’側を修飾したＯＤＮを用いる方法（非特許文献２，３，４参照）と比較して、非常に少量の一本鎖核酸で標的領域の核酸増幅を特異的に抑制できると共に、非標的領域の核酸増幅を妨げない点で、非常に有用である。
【００３２】
本発明は、核酸増幅反応が使用される幅広い分野に応用することができる。特に、ＰＣＲ法が利用される分野での応用は特に有望である。応用が期待できる分野と具体的な応用例としては、例えば、（１）臨床診断における病原体や疾病マーカーの検出および定量、（２）畜産、実験動物および変異動物の遺伝子型決定、（３）遺伝子ファミリーメンバーのクローニング、（４）腸内、皮膚、口腔粘膜等の細菌叢の解析などが挙げられる。
【００３３】
本発明は、標的領域の核酸増幅を特異的に抑制するためのキットを提供する。本発明のキットは、特定のプライマー（プライマーセット）を用いて鋳型核酸を増幅する際に増幅を抑制しようとする標的領域が明らかになっている場合に、上記本発明の核酸増幅抑制方法を簡便かつ短時間で実施することが可能となる。例えば、核酸増幅反応としてＰＣＲ法を用いる場合、特定のプライマーセット、標的領域の核酸増幅を特異的に抑制するための一本鎖核酸、耐熱性ＤＮＡ合成酵素、デオキシヌクレオシド三リン酸混合液、ＰＣＲ反応用緩衝液などを含むキットとして実施することができる。特定のプライマーセットおよび一本鎖核酸を目的に応じて適宜設計することにより、目的に応じたキットとして実施することができる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
〔ＯＲＮおよびプライマー〕
実施例で用いたＯＲＮおよびプライマーは、すべてグライナー（Greiner）社に委託して化学合成したものを使用した。用いたＯＲＮを表１に、用いたプライマーを表２に示した。
【００３６】
【表１】
2020182457.tif 000002
【００３７】
【表２】
2020182457.tif 000003
【００３８】
〔実施例１：ＯＲＮによるＰＣＲ増幅の特異的抑制の検討〕
鋳型には、２９３Ｔ細胞（Mol. Cell Biol. 1987,7(1):379-87、ECACC株番号：12022001）から、定法に従い精製したゲノムＤＮＡを用いた。ヒトＩＲＦ−１（interferon regulatory factor 1、NCBI ACCESSION: NG_011450）遺伝子座内の２つの隣接する領域（いずれも０．９ｋｂｐ）が増幅されるようにプライマーを設計した。図１に示したように、プライマーセット１（hIRF1-913F/hIRF1-10R）はヒトＩＲＦ−１遺伝子のエクソン１の上流側の標的領域（図１中Target）を増幅するように設計され、プライマーセット２（hIRF1+269F/hIRF1+1167R）はヒトＩＲＦ−１遺伝子のエクソン１の下流側の対照領域（図１中Reference）を増幅するように設計されている。標的領域にハイブリダイズ可能な、長さが異なる４種類のＯＲＮ（ORN-302F（21塩基）、ORN-298F（17塩基）、ORN-306F（25塩基）、ORN-310F（29塩基））を使用した（図１参照）。
【００３９】
（１）ＰＣＲ増幅の確認
最初にＯＲＮを用いずに、プライマーセット１またはプライマーセット２を用いて、標的領域および対照領域をそれぞれＰＣＲ増幅した。すなわち、１０μＬ中に、４０ｎｇの２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡ、１×Ｂｕｆｆｅｒ、０．３２ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．２５μＭの各プライマー（プライマーセット１またはプライマーセット２）、および０．２μＬのＫＯＤ ＦＸ（東洋紡）を含むＰＣＲ反応液を調製した。反応は最初に９４℃２分間の変性を行った後、９８℃１０秒間の変性、６８℃１分間のプライマーアニーリングおよび伸長を２８サイクル行い、最後に６８℃２分間の伸長を行った。定法に従い、アガロースゲル電気泳動で増幅産物の確認を行った。
【００４０】
結果を図２に示した。図２から明らかなように、いずれのプライマーセットを用いた場合も０．９ｋｂｐのバンドが検出された。両バンドの濃さは同等であり、２つの領域の増幅効率は同等であることが示された。
【００４１】
（２）ＯＲＮによるＰＣＲ増幅の特異的抑制
最初に、２１塩基のＯＲＮ−３０２Ｆを用いて、リアルタイムＰＣＲにより特異的抑制の検討を行った。ＯＲＮ−３０２Ｆの濃度は０、１、３、１０、２０、３０、４０、６０および１００ｎＭとした。１０μＬ中に、４０ｎｇの２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡ、０．２μＭの各プライマー（プライマーセット１およびプライマーセット２）、いずれかの濃度のＯＲＮ、１×ＲＯＸリファレンス色素（ROX reference dye）、および５μＬのＫＯＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ ＭＩＸ（東洋紡）を含むリアルタイムＰＣＲ反応液を調製した。反応は最初に９８℃２分間の変性を行った後、９８℃１０秒間の変性、６０℃１０秒間のプライマーアニーリングおよび６８℃１分間の伸長を４０サイクル行った。ＰＣＲ産物の特異性は、９５℃１５秒、６０℃１５秒および９９℃１５秒の融解曲線分析（dissociation curve analysis）を行うことによって確認した。ＰＣＲ増幅産物は７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Applied Biosystems）を用いて定量した。全てのサンプルはトリプリケートでリアルタイムＰＣＲを行った。Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ（GraphPad）を用いて用量反応曲線を作成し、ＩＣ５０値を算出した。
【００４２】
結果を図３に示した。図３から明らかなように、標的領域の増幅はＯＲＮ−３０２Ｆ濃度の増加と共に抑制されたが、対照領域の増幅は抑制されなかった。この結果から、標的領域にハイブリダイズするＯＲＮを用いて、標的領域のＰＣＲ増幅を特異的に抑制できることが明らかになった。なお、ＯＲＮ−３０２ＦのＩＣ５０値は１４．８６ｎＭであった。
【００４３】
（３）長さの異なるＯＲＮによるＰＣＲ増幅の特異的抑制
２１塩基のＯＲＮ−３０２Ｆに代えて、１７塩基のＯＲＮ−２９８Ｆ、２５塩基のＯＲＮ−３０６Ｆまたは２９塩基のＯＲＮ−３１０Ｆを用い、上記と同じ方法でリアルタイムＰＣＲを行い、用量反応曲線を作成してＩＣ５０値を算出した。
【００４４】
ＯＲＮ−２９８Ｆの結果を図４に、ＯＲＮ−３０６Ｆの結果を図５に、ＯＲＮ−３１０Ｆの結果を図６にそれぞれ示した。図４、５および６から明らかなように、いずれのＯＲＮを用いても、標的領域の増幅はＯＲＮ濃度の増加と共に抑制された。ＯＲＮ−３１０Ｆの最高濃度（１００ｎＭ）を用いた場合のみ、対照領域の増幅が抑制されたが、これ以外では、対照領域の増幅は抑制されなかった。各ＯＲＮのＩＣ５０値は、ＯＲＮ−２９８Ｆが７７．６４ｎＭ、ＯＲＮ−３０６Ｆが６．４１５ｎＭ、ＯＲＮ−３１０Ｆが９．２３６ｎＭであった。この結果から、１７塩基〜２９塩基の範囲のＯＲＮを用いれば、標的領域の増幅を特異的に抑制できることが示された。
【００４５】
（４）位置の異なるＯＲＮによるＰＣＲ増幅の特異的抑制
標的領域の異なる位置にハイブリダイズする３種類のＯＲＮ（ＯＲＮ−６６６Ｒ、ＯＲＮ−３６３Ｒ、ＯＲＮ−１８１Ｒ、表２参照）をそれぞれ用いて、上記と同じ方法でリアルタイムＰＣＲを行い、用量反応曲線を作成してＩＣ５０値を算出した。標的領域（Target）における各ＯＲＮの位置を図７に示した。
【００４６】
ＯＲＮ−６６６Ｒの結果を図８に、ＯＲＮ−３６３Ｒの結果を図９に、ＯＲＮ−１８１Ｒの結果を図１０にそれぞれ示した。図８、９および１０から明らかなように、いずれのＯＲＮを用いても、標的領域（Target）の増幅はＯＲＮ濃度の増加と共に抑制され、対照領域（Reference）の増幅は抑制されなかった。各ＯＲＮのＩＣ５０値は、ＯＲＮ−６６６Ｒが１２．０１ｎＭ、ＯＲＮ−３６３Ｒが１０．６３ｎＭ、ＯＲＮ−１８１Ｒが３４．５２ｎＭであった。この結果から、標的領域におけるＯＲＮの位置は特に制限されないことが示された。したがって、ＯＲＮは標的領域内の任意の位置に設計でき、実験的に容易に最適のＯＲＮを見出すことができると考えられる。
【００４７】
（５）複数のＯＲＮの同時使用によるＰＣＲ増幅の特異的抑制
方向が異なる２種類のＯＲＮ（ＯＲＮ−３０２ＦおよびＯＲＮ−３６３Ｒ）を同時に使用して、上記と同じ方法でリアルタイムＰＣＲを行い、用量反応曲線を作成してＩＣ５０値を算出した。標的領域（Target）における各ＯＲＮの位置を図１１に示した。
【００４８】
結果を図１２に示した。図１２から明らかなように、両方を同時に使用しても標的領域（Target）の増幅はＯＲＮ濃度の増加と共に抑制され、対照領域（Reference）の増幅は抑制されなかった。両方を同時に使用したときのＩＣ５０値は８．５８０ｎＭであった。この値は、この値は、ＯＲＮ−３０２Ｆを単独で使用した場合のＩＣ５０値（１４．８６ｎＭ、図３参照）およびＯＲＮ−３６３Ｒを単独で使用した場合のＩＣ５０値（１０．６３ｎＭ、図９参照）よりわずかに低いけれども、相乗的または相加的な効果は認められなかった。この結果は、ＰＣＲ増幅の特異的抑制に用いるＯＲＮは一種類で十分であることを示唆するものである。
【００４９】
〔実施例２：競合的状況におけるＯＲＮによるＰＣＲ増幅の特異的抑制の検討〕
（１）ｈＩＲＦ−１−ｐ／ｐＢＳプラスミドの構築
ｈＩＲＦ−１−ｐ／ｐＢＳを構築するために、２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型としてｈＩＲＦ−１プロモーターの配列を、プライマーセット（hIRF1-913F_KpnI/hIRF1-10R_SacI）を用いてＰＣＲ増幅した。増幅産物を制限酵素ＫｐｎＩおよびＳａｃＩを用いて切断し、同じく制限酵素ＫｐｎＩおよびＳａｃＩを用いて切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ＋（Stratagene）にライゲートした。
【００５０】
（２）実験スキーム
実験スキームを図１３に示した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ＋（以下「ｐＢＳ」と記す）を標的鋳型とし、ｈＩＲＦ−１−ｐ／ｐＢＳを対照鋳型とした。プライマーには、Ｍ１３プライマーＭ４およびＭ１３プライマーＲＶを用いた。標的鋳型（ｐＢＳ）を用いた場合、Ｍ１３プライマーＭ４およびＭ１３プライマーＲＶにより、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む０．２５ｋｂｐの標的領域（Target）が増幅される。対照鋳型（ｈＩＲＦ−１−ｐ／ｐＢＳ）を用いた場合、Ｍ１３プライマーＭ４およびＭ１３プライマーＲＶにより、ｈＩＲＦ−１プロモーター配列を含む１．０５ｋｂｐの対照領域（Reference）が増幅される。ＯＲＮとして、ｐＢＳのＭＣＳにハイブリダイズするＯＲＮ−ＭＣＳ（２１塩基）を用いた。
【００５１】
（３）ＫＯＤポリメラーゼを用いた場合
１０μＬ中に、１０００ｐｇの標的鋳型（ｐＢＳ）および１０ｐｇの対照鋳型（ｈＩＲＦ−１−ｐ／ｐＢＳ）、１×Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．３μＭのＭ１３プライマーＭ４およびＭ１３プライマーＲＶ、いずれかの濃度のＯＲＮ−ＭＣＳ、１．５ｍＭのＭｇＳＯ４、０．２μＬのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２（東洋紡）を含むＰＣＲ反応液を用いた。反応は最初に９４℃２分間の変性を行った後、９８℃１０秒間の変性、５５℃３０秒間のプライマーアニーリングおよび６８℃１分間の伸長を３０サイクル行った。定法に従い、アガロースゲル電気泳動で増幅産物の確認を行った。
【００５２】
結果を図１４に示した。対照鋳型のみをＭ１３プライマーＭ４およびＭ１３プライマーＲＶで増幅すると、１．０５ｋｂｐの増幅産物が得られた（レーン１）。標的鋳型と対照鋳型を１００：１の比率で混合し、ＯＲＮ−ＭＣＳの非存在下でＰＣＲを行うと、標的鋳型が選択的に増幅され、対照鋳型由来の増幅産物はほとんど検出されなかった（レーン２）。ＯＲＮ−ＭＣＳの濃度が１μＭになると、標的鋳型由来の増幅産物が減少し、対照鋳型由来の増幅産物が増加した（レーン６）。この結果は、ＯＲＮによるＰＣＲ増幅の特異的抑制は、増幅が難しい少量の鋳型の選択的増幅に使用できることを示す。なお、ＯＲＮ−ＭＣＳの濃度が３μＭ以上では、標的鋳型由来の増幅産物および対照鋳型由来の増幅産物のどちらもほとんど検出されなくなったが、この原因は不明である。
【００５３】
（４）Ｐｆｕポリメラーゼを用いた場合
１０μＬ中に、１０００ｐｇのｐＢＳおよび１０ｐｇのｈＩＲＦ−１−ｐ／ｐＢＳ、１×Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、５％ＤＭＳＯ、０．４μＭのＭ１３プライマーＭ４およびＭ１３プライマーＲＶ、いずれかのＯＲＮ−ＭＣＳ、０．１μＬのＰｆｕ−Ｘ（Greiner）を含むＰＣＲ反応液を用いた。反応は最初に９５℃２分間の変性を行った後、９５℃２０秒間の変性、５５℃２０秒間のプライマーアニーリングおよび６８℃３０秒間の伸長を２５サイクル行い、最後に６８℃３０秒間の伸長を行った。定法に従い、アガロースゲル電気泳動で増幅産物の確認を行った。
【００５４】
結果を図１５に示した。ＫＯＤポリメラーゼと同様に、ＯＲＮ−ＭＣＳの濃度が１μＭになると、標的鋳型由来の増幅産物が減少し、対照鋳型由来の増幅産物が増加した（レーン６）。ＯＲＮ−ＭＣＳ濃度が３μＭおよび１０μＭでは、標的鋳型由来の増幅はほとんど検出されず、対照鋳型由来の増幅産物が増加した。
【００５５】
以上の結果から、ＫＯＤポリメラーゼおよびＰｆｕポリメラーゼはＯＲＮによるＰＣＲ増幅の特異的抑制に用いるＤＮＡポリメラーゼとして好適であることが示された。ＫＯＤポリメラーゼおよびＰｆｕポリメラーゼは、α型ＤＮＡポリメラーゼに属し、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を保持し、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性は保持しないＤＮＡポリメラーゼである。
【００５６】
〔参考例１：競合的状況におけるＯＤＮによるＰＣＲ増幅の特異的抑制の検討１〕
図１６に示したスキームで３’末端をリン酸化修飾したＯＤＮ（方向が異なる２種類のＯＤＮ、図１６中ＯＤＮ−ＦおよびＯＤＮ−Ｒ）を用いて競合的状況におけるＰＣＲ増幅の特異的抑制を検討した。
（１）ＯＤＮ−ＦおよびＯＤＮ−Ｒ
ＯＤＮ−ＦおよびＯＤＮ−Ｒの塩基配列は以下のとおりであり、３’末端にリン酸基を付加して化学合成により作製した。
ODN-F: ATGGCTACCATAGCTCTTCCCTGG（配列番号１７）
ODN-R: GGTGGACTGAATCTTGGGCCTGTA（配列番号１８）
（２）ｍＩＬ−２Ｒβ/ｐＢＳの構築
ｍＩＬ−２Ｒβ/ｐＢＳを構築するために、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1806-1810, 1990に記載のあるｍＩＬ−２Ｒβ−１０プラスミドからＢａｍＨＩを用いてマウスＩＬ−２Ｒβ ｃＤＮＡを切り出し、同じくＢａｍＨＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ＋（Stratagene）にライゲートした。
（３）ｈＳｔａｔ５／ｐＢＳの作り方
ｈＳｔａｔ５／ｐＢＳは、Immunity 2:321-329, 1995に記載されているものを利用した。
（４）ＰＣＲ
ＰＣＲには、ＱＩＡＧＥＮ Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅ ＰＣＲ Ｋｉｔを用いた。５０μＬ中に、１０ｎｇの標的鋳型（ｍＩＬ−２Ｒβ/ｐＢＳ）および１ｎｇの対照鋳型（ｈＳｔａｔ５／ｐＢＳ）、１×Ｂｕｆｆｅｒ、０．５ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．４μＭのＭ１３プライマーＭ４およびＭ１３プライマーＲＶ、いずれかのＯＤＮ、０．５μＬのＬｏｎｇ Ｒａｎｇｅ ＰＣＲ ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（QIAGEN）を含むＰＣＲ反応液を用いた。反応は最初に９３℃３分間の変性を行った後、９３℃１５秒間の変性、６２℃３０秒間のプライマーアニーリングおよび６８℃３分間の伸長を２５サイクル行い、最後に６８℃１０分間の伸長を行った。定法に従い、アガロースゲル電気泳動で増幅産物の確認を行った。
【００５７】
結果を図１７に示した。対照鋳型のみをＭ１３プライマーＭ４およびＭ１３プライマーＲＶで増幅すると、３．７ｋｂｐの増幅産物が得られた（レーン１）。標的鋳型と対照鋳型を１０：１の比率で混合し、ＯＤＮの非存在下でＰＣＲを行うと、対照鋳型由来の３．７ｋｂｐの増幅産物と標的鋳型由来の１．７ｋｂｐの増幅産物が、鋳型の比率と同様の比率で増幅された（レーン２）。ＯＤＮ−ＦおよびＯＤＮ−Ｒを８μＭ〜８０μＭの濃度で反応液に添加してＰＣＲを行うと、標的鋳型由来の増幅産物量はＯＤＮ濃度依存的に減少した（レーン３−８）。しかし、ＯＤＮ−ＦおよびＯＤＮ−Ｒでは抑制されないはずの対照鋳型の増幅が抑制され、対照鋳型由来の増幅産物が検出されなくなった（レーン３〜８）。この結果から、３’末端をリン酸化修飾したＯＤＮを用いる方法では、標的鋳型の増幅を抑制するために必要なＯＤＮの量がＯＲＮの１０００倍以上必要であることが明らかになった。また、原因は不明であるが、本実験で用いたＯＤＮは、標的鋳型の特異的増幅抑制だけでなく、対照鋳型の非特異的増幅抑制をも生じさせた。
【００５８】
〔参考例２：競合的状況におけるＯＤＮによるＰＣＲ増幅の特異的抑制の検討２〕
図１８に示したスキームで３’末端をリン酸化修飾したＯＤＮ（方向が異なる２種類のＯＤＮ、図１８中ＯＤＮ−ＦおよびＯＤＮ−Ｒ）を用いて競合的状況におけるＰＣＲ増幅の特異的抑制を検討した。
【００５９】
（１）ｈＩＬ−２Ｒα−０．３Ｋ＋０．１Ｋ／ｐＭＤ２０の構築
ｈＩＬ−２Ｒα−０．３Ｋ＋０．１Ｋ／ｐＭＤ２０を構築するために、ヒトＹＴ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型としてｈＩＬ−２Ｒαプロモーターの配列を、以下のプライマーセット（hIL2Ra-SalNot-F/hIL2Ra-SalNot-R）を用いてＰＣＲ増幅した。増幅産物をｐＭＤ２０−Ｔにライゲートし、ｈＩＬ−２Ｒα−０．３Ｋ＋０．１Ｋ／ｐＭＤ２０とした。
hIL2Ra-SalNot-F：CTGTCGACGGGGAGGACTCAGCTTATGAAGTGCTG（配列番号１９）
hIL2Ra-SalNot-R：CAGCGGCCGCCAGCCTCTTTTTGGCATCGCGCCGG（配列番号２０）
【００６０】
（２）ｈＩＬ−２Ｒα−２．４Ｋ−０．３Ｋ／ｐＭＤ２０の構築
ｈＩＬ−２Ｒα−２．４Ｋ−０．３Ｋ／ｐＭＤ２０を構築するために、ヒトＹＴ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型としてｈＩＬ−２Ｒαプロモーターの配列を、以下のプライマーセット（hIL2Ra-XhoCla-F/hIL2Ra-XhoCla-R）を用いてＰＣＲ増幅した。増幅産物をｐＭＤ２０−Ｔにライゲートし、ｈＩＬ−２Ｒα−２．４Ｋ−０．３Ｋ／ｐＭＤ２０とした。
hIL2Ra-XhoCla-F：GACTCGAGGGAACTTAGAAGACAGGTGAGTAGGTG（配列番号２１）
hIL2Ra-XhoCla-R：ATATCGATTCAGGGCTGTAACGTCCTCAGGAGTC（配列番号２２）
【００６１】
（３）Ｔａｑポリメラーゼを用いるＰＣＲ
以下に示す方向が異なる２種類のＯＤＮ（ODN-F hIL-2Rα blockSおよびODN-R hIL-2Rα blockA）を用いた。これらのＯＤＮは、３’末端にリン酸基を付加して化学合成により作製した。
ODN-F hIL-2Rα blockS: GGGGAGGACTCAGCTTATGAAGTGCTGTTA（配列番号２３）
ODN-R hIL-2Rα blockA: CAGCCTCTTTTTGGCATCGCGCCGGTAA（配列番号２４）
２５μＬ中に、１ｎｇの標的鋳型（ｈＩＬ−２Ｒα−０．３Ｋ＋０．１Ｋ／ｐＭＤ２０）および１０ｎｇの対照鋳型（ｈＩＬ−２Ｒα−２．４Ｋ−０．３Ｋ／ｐＭＤ２０）、１×Ｂｕｆｆｅｒ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．４μＭのＭ１３プライマーＭ４およびＭ１３プライマーＲＶ、いずれかのＯＤＮ、０．１２５μＬのｒＴａｑ（タカラバイオ）を含むＰＣＲ反応液を用いた。反応は最初に９４℃２分間の変性を行った後、９４℃２０秒間の変性、６０℃３０秒間のプライマーアニーリングおよび７２℃３０秒間の伸長を２５サイクル行い、最後に７２℃１０分間の伸長を行った。定法に従い、アガロースゲル電気泳動で増幅産物の確認を行った。
【００６２】
（４）ＫＯＤポリメラーゼを用いるＰＣＲ
以下に示す方向が異なる２種類のＯＤＮ（ODN-F hIL-2Rα blockS2 FおよびODN-R hIL-2Rα blockA2 R）を用いた。これらのＯＤＮは、３’末端にリン酸基を付加して化学合成により作製した。
ODN-F hIL-2Rα blockS2 F: GGATCAGCGGCCGCCAGCCTCTTTTTGGCATATA（配列番号２５）
ODN-R hIL-2Rα blockA2 R: GATTCTGTCGACGGGGAGGACTCAGCTTAACC（配列番号２６）
２５μＬ中に、１ｎｇの標的鋳型（ｈＩＬ−２Ｒα−０．３Ｋ＋０．１Ｋ／ｐＭＤ２０）および１０ｎｇの対照鋳型（ｈＩＬ−２Ｒα−２．４Ｋ−０．３Ｋ／ｐＭＤ２０）、１×Ｂｕｆｆｅｒ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．２μＭのＭ１３プライマーＭ４およびＭ１３プライマーＲＶ、いずれかのＯＤＮ、０．２５μＬのＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡）を含むＰＣＲ反応液を用いた。反応は、９４℃３０秒間の変性、６０℃２秒間のプライマーアニーリングおよび７４℃３０秒間の伸長を２５サイクル行った。定法に従い、アガロースゲル電気泳動で増幅産物の確認を行った。
【００６３】
（５）Ｔａｑポリメラーゼを用いた結果
結果を図１９に示した。標的領域の増幅はＯＤＮ濃度の増加と共に抑制され、ＩＣ５０値は約１０μＭであった。しかし、対照領域の増幅も抑制されてしまい、この条件では標的領域のＰＣＲ増幅を特異的に抑制することは難しいことが判明した。
【００６４】
（６）ＫＯＤポリメラーゼを用いた結果
結果を図２０に示した。標的領域の増幅はＯＤＮ濃度の増加と共に抑制され、ＩＣ５０値は数百ｎＭ程度であった。しかし、対照領域の増幅も抑制されてしまい、この条件では標的領域のＰＣＲ増幅を特異的に抑制することは難しいことが判明した。
【００６５】
〔実施例３：マウス腸内細菌叢解析への応用〕
１６ＳｒＤＮＡ配列の解析によりマウスの腸内細菌叢を調べる際に、優占種特異的なＯＲＮを反応系に添加してＰＣＲを行い、希少細菌の検出を試みた。
（１）鋳型の調製
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統、雌、１０．４週齢、ＳＰＦ条件下での自家繁殖）を安楽死させた後、小腸（その内容物を含む）を摘出し、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ＫおよびＰｒｏｎａｓｅ Ｅで処理した。得られたゲノムＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製し、ＰＣＲの鋳型として用いた。
【００６６】
（２）プライマーおよびＯＲＮ
プライマーには、細菌類の１６ＳｒＤＮＡ増幅用ユニバーサルプライマーである１０Ｆプライマー（5'-GTTTGATCCTGGCTCA-3' 配列番号２７）および８００Ｒプライマー（5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3' 配列番号２８）を用いた。
ＯＲＮには、菌種Ａの１６ＳｒＤＮＡにハイブリダイズするＯＲＮ（5'-GAACAAGAGGGCAGAUUAUCCACGC-3' 配列番号２９）を用いた。
【００６７】
（３）解析方法
１０μＬ中に、２０ｎｇのマウス小腸由来ゲノムＤＮＡ、１×Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、５％ＤＭＳＯ、０．４μＭの各プライマー（１０Ｆプライマーおよび８００Ｒプライマー）、および０．１μＬのＰｆｕ−Ｘ（Greiner）を含むＰＣＲ反応液を調製した。この反応液に５０μＭのＯＲＮを添加してＰＣＲを行い、ＯＲＮを添加せずにＰＣＲを行った場合と比較した。反応は最初に９５℃２分間の変性を行った後、９５℃２０秒間の変性、５５℃２０秒間のプライマーアニーリングおよび６８℃３０秒間の伸長を３０サイクル行い、最後に６８℃３０秒間の伸長を行った。定法に従い、アガロースゲル電気泳動で増幅産物の確認を行い、ゲルからＤＮＡを精製し、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Invitrogen）を用いてクローニングを行った。次いで、クローン化されたインサートの塩基配列をサンガー法により決定し、菌種を同定した。
【００６８】
結果を図２１に示した。左がＯＲＮを添加しない場合の結果、右がＯＲＮを添加した場合の結果である。図２１から明らかなように、ＯＲＮの添加により菌種Ａの割合が２１％から１１％に減少すると共に、ＯＲＮ非添加時には検出されなかった１３種類の菌が新たに検出された。この結果から、本発明の核酸増幅抑制方法は、腸内細菌叢のより詳細な解析に有用であることが示された。
【００６９】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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