(57)【要約】  【課題】産業利用が可能な新規微細藻類と、その使用方法とを提供する。【解決手段】イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類であって、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有する、藻類。イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類又はその抽出物を含む、栄養成分組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類であって、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有する、藻類。
【請求項２】
前記１倍体の細胞形態が、ｐＨ７の条件下で、その細胞が破裂する、請求項１に記載の藻類。
【請求項３】
リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子の塩基配列が、配列番号１又は２に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する、請求項１又は２に記載の藻類。
【請求項４】
シアニジウム・エスピー（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）ＹＦＵ３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３３４）、シアニジウム・エスピー（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）ＨＫＮ１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３３３）、及びこれらの変異株からなる群より選択される、請求項３に記載の藻類。
【請求項５】
形質転換体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の藻類。
【請求項６】
前記形質転換体が、セルフクローニングにより作製されたものである、請求項５に記載の藻類。
【請求項７】
前記１倍体の細胞形態である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の藻類。
【請求項８】
（ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の藻類であって、２倍体の細胞形態の細胞を培養する工程と、
（ｂ）前記培養中に生じた１倍体の細胞形態の細胞を単離する工程と、
を含む、１倍体の藻類の製造方法。
【請求項９】
前記工程（ａ）の培養を、温度３０〜５０℃、ｐＨ１．０〜５．０、及びＣＯ２濃度１〜３％の条件下で行う、請求項８に記載の１倍体の藻類の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の藻類を含む藻類培養物であって、
前記藻類培養物に含まれる全藻類の細胞数における、前記１倍体の細胞形態の藻類の細胞数の割合が、７０〜１００％である、藻類培養物。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の藻類を、乾燥膨潤処理した、低温処理物。
【請求項１２】
イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類又はその抽出物を含む、栄養成分組成物。
【請求項１３】
前記藻類が、１倍体の藻類である、請求項１２に記載の栄養成分組成物。
【請求項１４】
前記藻類が、ｐＨ７の条件下で、その細胞が破裂する藻類である、請求項１２又は１３に記載の栄養成分組成物。
【請求項１５】
前記藻類が、シアニディオシゾン属（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）に属する藻類である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の栄養成分組成物。
【請求項１６】
前記藻類が、請求項１〜７のいずれか一項に記載の藻類である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の栄養成分組成物。
【請求項１７】
前記藻類が、少なくとも１種の栄養成分の細胞内含有量が高められた形質転換体である、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の栄養成分組成物。
【請求項１８】
前記形質転換体が、セルフクローニングにより製造されたものである、請求項１７に記載の栄養成分組成物。
【請求項１９】
アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される少なくとも１種の栄養成分を含む、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の栄養成分組成物。
【請求項２０】
請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の栄養成分組成物を含む、食品。
【請求項２１】
機能性食品、又は栄養補助食品である、請求項２０に記載の食品。
【請求項２２】
請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の栄養成分組成物を含む、飼料又はペットフード。
【請求項２３】
請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の栄養成分組成物を含む、化粧品。
【請求項２４】
（ａ）イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類の細胞を破壊して細胞破壊物を得る工程と、
（ｂ）前記細胞破壊物から少なくとも１種の栄養成分を分離する工程と、
を含む栄養成分の製造方法。
【請求項２５】
前記栄養成分が、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２４に記載の栄養成分の製造方法。
【請求項２６】
前記アミノ酸類が、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、及びγ−アミノ酪酸からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２５に記載の栄養成分の製造方法。
【請求項２７】
前記ビタミン類が、ビタミンＡ、β−カロテン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、ナイアシン、イノシトール、葉酸、及びビオチンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２５に記載の栄養成分の製造方法。
【請求項２８】
前記藻類が、１倍体の藻類である、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の栄養成分の製造方法。
【請求項２９】
前記藻類が、ｐＨ７の条件下で、その細胞が破裂する藻類である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の栄養成分の製造方法。
【請求項３０】
前記藻類が、シアニディオシゾン属（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）に属する藻類である、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の栄養成分の製造方法。
【請求項３１】
前記藻類が、請求項１〜７のいずれか一項に記載の藻類である、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の栄養成分の製造方法。
【請求項３２】
前記藻類が、少なくとも１種の栄養成分の細胞内含有量が高められた形質転換体である、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の栄養成分の製造方法。
【請求項３３】
前記形質転換体が、セルフクローニングにより製造されたものである、請求項３２に記載の栄養成分の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規微細藻類、及びその使用に関する。より具体的には、新規微細藻類、及び１倍体である前記微細藻類の製造方法等に関する。また、本発明は、栄養成分組成物、及び栄養成分の製造方法に関する。
本願は、２０１７年１１月２８日に、日本に出願された特願２０１７−２２８３９４号及び特願２０１７−２２８３９６号、２０１８年５月２８日に、日本に出願された特願２０１８−１０１７５３号、並びに２０１８年９月２１日に、日本に出願された特願２０１８−１７７４１６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
微細藻類は、陸上植物と比較して、高い二酸化炭素固定能力を有すること、及び農産物と生育場所が競合しないことから、いくつかの種は、大量培養されて、飼料、機能性食品、化粧品材料等として産業的に利用されている。
微細藻類を産業利用する場合には、コスト面等から、屋外で大量培養可能な微細藻類であることが望ましい。しかしながら、屋外で大量培養可能な微細藻類であるためには、環境変動（光、温度等）に耐性を有すること、他の生物が生存できないような条件で培養できること、高密度まで増殖可能であること、等の条件が求められる。そのため、現在までに、産業的に実用化されているのは、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）等の数種に限られている。
上記の藻類種は、高塩濃度、高ｐＨ、低ｐＨ等の他の生物が生育困難な環境で培養可能である点に特徴がある。これらの藻類種は、アミノ酸類、ビタミン類を豊富に含み、機能性食品やサプリメントの原料として利用されている。
【０００３】
一方、単細胞原始紅藻であるイデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類は、硫酸酸性温泉において優先増殖する。イデユコゴメ綱には、シアニディオシゾン（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）属、シアニジウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）属、及びガルデリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）属があるが（非特許文献１）、１倍体のものとしてはシアニディオシゾン・メロラエ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅ）のみが知られている（非特許文献２）。シアニディオシゾン・メロラエは、強固な細胞壁をもたない（非特許文献１、２）。
シアニディオシゾン・メロラエは、極めて単純な細胞小器官セットにより構成されており、ゲノム配列の解読が完了している。そのため、光合成生物の基礎研究のためのモデル生物として利用されており、遺伝子改変技術の開発も進められている（非特許文献３、４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Pinto, G. (2007) Cyanidiophyceae: looking back - looking forward, In: J. Seckbach (ed.) Algae and Cyanobacteria in Extreme Environments. Springer, Dordrecht, The Netherlands, pp. 389-397.
【非特許文献２】Misumi O et al. (2005) Cyanidioschyzon merolae Genome. A Tool for Facilitating Comparable Studies on Organelle Biogenesis in Photosynthetic Eukaryotes. Plant Physiol. 137(2): 567-585.
【非特許文献３】Fujiwara T et al.(2013) Gene targeting in the red alga Cyanidioschyzon merolae: single- and multi-copy insertion using authentic and chimeric selection markers. PLOS ONE. Sep 5;8(9):e73608.
【非特許文献４】Fujiwara T et al.(2015) A nitrogen source-dependent inducible and repressible gene expression system in the red alga Cyanidioschyzon merolae. Front Plant Sci. Aug 26;6:657.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、現在までに、産業的に実用化されている微細藻類は、数種の藻類種に限定されている。
【０００６】
そこで、本発明は、産業利用が可能な新規微細藻類と、その使用方法とを提供することを課題とする。また、本発明は、栄養成分を豊富に含む微細藻類を用いた栄養成分組成物剤、及び当該微細藻類を用いた栄養成分の製造方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、２倍体の藻類の細胞から１倍体の細胞を作製する方法、当該方法により作製された１倍体の細胞、及び当該１倍体の細胞を培養して得られる１倍体の藻類の細胞群を提供することを課題とする。
また、１倍体の藻類の細胞からから２倍体の細胞を作製する方法、当該方法により作製された２倍体の細胞、及び当該２倍体の細胞を培養して得られる２倍体の藻類の細胞群を提供することを課題とする。
また、本発明は、１倍体の藻類の細胞を用いて、セルフクローニング又は多重セルフクローニングにより形質転換された藻類細胞を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、イデユコゴメ綱に属する藻類の中には、１倍体の細胞形態を有する世代と、２倍体の細胞形態を有する世代のあるものが存在すること、さらに、イデユコゴメ綱に属する藻類において、強固な細胞壁を有するものは２倍体の細胞であること、さらに、強固な細胞壁を有する２倍体の細胞から強固な細胞壁を有しない細胞を誘導する方法を見出した。さらに、前記方法で得られた強固な細胞壁を有しない細胞が１倍体の細胞形態であることを見出した。さらに、イデユコゴメ綱に属する藻類が、アミノ酸類及びビタミン類等の栄養成分を豊富に含んでいることを見出した。これらの知見に基づき、本発明者らは、以下の発明を完成した。
【０００８】
本発明は、以下の態様を含む。
（１）イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類であって、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有する、藻類。
（１−２）イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類であって、２倍体の細胞形態の細胞群からなる、（１）に記載の藻類の細胞群。
（１−３）イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類であって、１倍体の細胞形態の細胞群からなる、（１）に記載の藻類の細胞群。
（１−４）イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類であって、２倍体の細胞形態の細胞群と、１倍体の細胞形態の細胞群とが、混在している、（１）に記載の藻類の細胞群。
（２）前記１倍体の細胞形態が、ｐＨ７の条件下で、その細胞が破裂する、（１）に記載の藻類。
（３）リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子の塩基配列が、配列番号１又は２に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する、（１）又は（２）に記載の藻類。
（４）シアニジウム・エスピー（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）ＹＦＵ３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３３４）、シアニジウム・エスピー（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）ＨＫＮ１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３３３）、及びこれらの変異株からなる群より選択される、（３）に記載の藻類。
（５）形質転換体である、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の藻類。
（６）前記形質転換体が、セルフクローニングにより作製されたものである、（５）に記載の藻類。
（７）前記１倍体の細胞形態である、（１）〜（６）のいずれか一項に記載の藻類。
（８）（ａ）（１）〜（６）のいずれか一項に記載の藻類であって、２倍体の細胞形態の細胞（藻類）を培養する工程と、（ｂ）前記培養中に生じた１倍体の細胞形態の細胞（藻類）を単離する工程と、を含む、１倍体の藻類の製造方法。
（９）前記工程（ａ）の培養を、温度３０〜５０℃、ｐＨ１．０〜５．０、及びＣＯ２濃度１〜３％の条件下で行う、請求項８に記載の１倍体の藻類の製造方法。
（１０）（１）〜（７）のいずれか一項に記載の藻類を含む藻類培養物であって、前記藻類培養物に含まれる全藻類の細胞数における、前記１倍体の細胞形態の藻類の細胞数の割合が、７０〜１００％である、藻類培養物。
（１１）（１）〜（７）のいずれか一項に記載の藻類を、乾燥膨潤処理した、乾燥膨潤処理物。
【０００９】
また、本発明は、以下の態様も含む。
（１２）（ａ）（１）〜（７）のいずれか一項に記載の藻類の細胞を破壊して細胞破壊物を得る工程と、（ｂ）前記細胞破壊物から栄養成分を分離する工程と、を含む栄養成分の製造方法。
（１３）前記栄養成分が、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される少なくとも１種である、（１２）に記載の栄養成分の製造方法。
（１４）前記アミノ酸類が、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、及びγ−アミノ酪酸からなる群より選択される少なくとも１種である、（１３）に記載の栄養成分の製造方法。
（１５）前記ビタミン類が、ビタミンＡ、β−カロテン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、及びビタミンＫ２からなる群より選択される少なくとも１種である、（１３）に記載の栄養成分の製造方法。
（１６）前記工程（ａ）における前記細胞の破壊を、中和処理、低張処理、及び凍結融解処理からなる群より選択される少なくとも１種の処理により行う、（１２）〜（１５）のいずれか一項に記載の栄養成分の製造方法。
（１７）前記工程（ａ）の前に、（１）〜（７）のいずれか一項に記載の藻類を、０〜５℃の温度で低温処理する工程、を含む、（１２）〜（１６）のいずれか一項に記載の栄養成分の製造方法。
（１８）（１）〜（７）のいずれか一項に記載の藻類又はその抽出物を含む、栄養成分組成物。
（１９）（１８）に記載の栄養成分組成物を含む、食品。
（２０）機能性食品、又は栄養補助食品である、（１９）に記載の食品。
（２１）（１８）に記載の栄養成分組成物を含む、飼料又はペットフード。
（２２）（１８）に記載の栄養成分組成物を含む、化粧品。
（２３）（１）〜（７）のいずれか一項に記載の藻類又はその抽出物を含む、栄養剤。
（２４）（２３）に記載の栄養剤を含む、食品。
（２５）機能性食品、又は栄養剤である、（２４）に記載の食品。
（２６）（２３）に記載の栄養剤を含む、飼料又はペットフード。
（２７）（２３）に記載の栄養剤を含む、化粧品。
（２８）（２３）に記載の栄養剤を含む、栄養成分補給用組成物。
（２９）食品である、（２８）に記載の栄養成分補給用組成物。
（３０）機能性食品、又は栄養補助食品である、（２９）に記載の栄養成分補給用組成物。
（３１）飼料又はペットフードである、（２８）に記載の栄養成分補給用組成物。
（３２）化粧品である、（２８）に記載の栄養成分補給用組成物。
（３３）（１０）に記載の藻類培養物又はその抽出物を含む、栄養成分組成物。
（３４）（３３）に記載の栄養成分組成物を含む、食品。
（３５）機能性食品、又は栄養補助食品である、（３４）に記載の食品。
（３６）（３３）に記載の栄養成分組成物を含む、飼料又はペットフード。
（３７）（３３）に記載の栄養成分組成物を含む、化粧品。
（３８）（１０）に記載の藻類培養物又はその抽出物を含む、栄養剤。
（３９）（３８）に記載の栄養剤を含む、食品。
（４０）機能性食品、又は栄養剤である、（３９）に記載の食品。
（４１）（３８）に記載の栄養剤を含む、飼料又はペットフード。
（４２）（３８）に記載の栄養剤を含む、化粧品。
（４３）（３８）に記載の栄養剤を含む、栄養成分補給用組成物。
（４４）食品である、（４３）に記載の栄養成分補給用組成物。
（４５）機能性食品、又は栄養補助食品である、（４４）に記載の栄養成分補給用組成物。
（４６）飼料又はペットフードである、（４３）に記載の栄養成分補給用組成物。
（４７）化粧品である、（４３）に記載の栄養成分補給用組成物。
（４８）（ａ）（１０）に記載の藻類培養物から、藻類を回収する工程と、（ｂ）前記藻類の細胞を破壊して細胞破壊物を得る工程と、（ｃ）前記細胞破壊物から、少なくとも１種の栄養成分を分離する工程と、を含む栄養成分の製造方法。
（４９）前記栄養成分が、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される少なくとも１種である、（４８）に記載の栄養成分の製造方法。
（５０）前記アミノ酸類が、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、及びγ−アミノ酪酸からなる群より選択される少なくとも１種である、（４９）に記載の栄養成分の製造方法。
（５１）前記ビタミン類が、ビタミンＡ、β−カロテン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、及びビタミンＫ２からなる群より選択される少なくとも１種である、（４９）に記載の栄養成分の製造方法。
（５２）前記工程（ａ）における前記細胞の破壊を、中和処理、低張処理、凍結融解処理、及び乾燥膨潤処理からなる群より選択される少なくとも１種の処理により行う、（４８）〜（５１）のいずれか一項に記載の栄養成分の製造方法。
【００１０】
また、本発明は、以下の態様も含む。
（５３）イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類又はその抽出物を含む、栄養成分組成物。
（５４）前記藻類が、１倍体の藻類である、（５３）に記載の栄養成分組成物。
（５５）前記藻類が、ｐＨ７の条件下で、その細胞が破裂する藻類である、（５３）又は（５４）に記載の栄養成分組成物。
（５６）前記藻類が、シアニディオシゾン属（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）に属する藻類である、（５３）〜（５５）のいずれか一項に記載の栄養成分組成物。
（５７）前記藻類が、少なくとも１種の栄養成分の細胞内含有量が高められた形質転換体である、（５３）〜（５６）のいずれか一項に記載の栄養成分組成物。
（５８）前記形質転換体が、セルフクローニングにより製造されたものである、（５７）に記載の栄養成分組成物。
（５９）アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される少なくとも１種の栄養成分を含む、（５３）〜（５８）のいずれか一項に記載の栄養成分組成物。
（６０）（５３）〜（５９）のいずれか一項に記載の栄養成分組成物を含む、食品。
（６１）機能性食品、又は栄養補助食品である、（６０）に記載の食品。
（６２）（５３）〜（５９）のいずれか一項に記載の栄養成分組成物を含む、飼料又はペットフード。
（６３）（５３）〜（５９）のいずれか一項に記載の栄養成分組成物を含む、化粧品。
（６４）（ａ）イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類の細胞を破壊して細胞破壊物を得る工程と、（ｂ）前記細胞破壊物から、少なくとも１種の栄養成分を分離する工程と、を含む栄養成分の製造方法。
（６５）前記栄養成分が、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される少なくとも１種である、（６４）に記載の栄養成分の製造方法。
（６６）前記アミノ酸類が、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、及びγ−アミノ酪酸からなる群より選択される少なくとも１種である、（６５）に記載の栄養成分の製造方法。
（６７）前記ビタミン類が、ビタミンＡ、β−カロテン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、ナイアシン、イノシトール、葉酸、及びビオチンからなる群より選択される少なくとも１種である、（６５）に記載の栄養成分の製造方法。
（６８）前記藻類が、１倍体の藻類である、（６４）〜（６７）のいずれか一項に記載の栄養成分の製造方法。
（６９）前記藻類が、ｐＨ７の条件下で、その細胞が破裂する藻類である、（６４）〜（６８）のいずれか一項に記載の栄養成分の製造方法。
（７０）前記藻類が、シアニディオシゾン属（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）に属する藻類である、（６４）〜（６９）のいずれか一項に記載の栄養成分の製造方法。
（８０）前記藻類が、少なくとも１種の栄養成分の細胞内含有量が高められた形質転換体である、（６４）〜（７０）のいずれか一項に記載の栄養成分の製造方法。
（８１）前記形質転換体が、セルフクローニングにより製造されたものである、（８０）に記載の栄養成分の製造方法。
（８２）前記工程（ａ）における前記細胞の破壊を、中和処理、低張処理、凍結融解処理、及び乾燥膨潤処理からなる群より選択される少なくとも１種の処理により行う、（６４）〜（８１）のいずれか一項に記載の栄養成分の製造方法。
【００１１】
また、本発明は、以下の態様も含む。
（８３）イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類又はその抽出物を含む、栄養剤。
（８４）前記藻類が、１倍体の藻類である、（８３）に記載の栄養剤。
（８５）前記藻類が、ｐＨ７の条件下で、その細胞が破裂する藻類である、（８３）又は（８４）に記載の栄養剤。
（８６）前記藻類が、シアニディオシゾン属（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）に属する藻類である、（８３）〜（８５）のいずれか一項に記載の栄養剤。
（８７）前記藻類が、少なくとも１種の栄養成分の細胞内含有量が高められた形質転換体である、（８３）〜（８６）のいずれか一項に記載の栄養剤。
（８８）前記形質転換体が、セルフクローニングにより製造されたものである、（８７）に記載の栄養剤。
（８９）アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される少なくとも１種の栄養成分を補給するためのものである、（８３）〜（８８）のいずれか一項に記載の栄養剤。
（９０）（８３）〜（８９）のいずれか一項に記載の栄養剤を含む、食品。
（９１）機能性食品、又は栄養補助食品である、（９０）に記載の食品。
（９２）（８３）〜（８９）のいずれか一項に記載の栄養剤を含む、飼料又はペットフード。
（９３）（８３）〜（８９）のいずれか一項に記載の栄養剤を含む、化粧品。
（９４）（８３）〜（８９）のいずれか一項に記載の栄養剤を含む、栄養成分補給用組成物。
（９５）食品である、（９４）に記載の栄養成分補給用組成物。
（９６）機能性食品、又は栄養補助食品である、（９５）に記載の栄養成分補給用組成物。
（９７）飼料又はペットフードである、（９４）に記載の栄養成分補給用組成物。
（９８）化粧品である、（９４）に記載の栄養成分補給用組成物。
（９９）アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される少なくとも１種の栄養成分を補給するためのものである、（９４）〜（９８）のいずれか一項に記載の栄養成分補給用組成物。
【００１２】
また、本発明は、以下の態様も含む。
（１００）（ａ）（１）〜（６）のいずれか一項に記載の藻類の、１倍体の細胞形態である細胞を２種類以上混合し、培養する工程と、（ｂ）前記培養中に生じた２倍体の細胞形態の細胞を単離する工程と、を含む、２倍体の藻類の製造方法。
（１０１）前記藻類が、シアニジウム・エスピー  ＹＦＵ３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３３４）、シアニジウム・エスピー  ＨＫＮ１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３３３）、及びシアニディオシゾン・メロラエ、並びにこれらの変異株からなる群より選択される藻類である、（１００）に記載の２倍体の藻類の製造方法。
（１０２）シアニジウム・エスピー  ＹＦＵ３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３３４）又はその変異株の２倍体の細胞形態の細胞。
（１０３）シアニジウム・エスピー  ＨＫＮ１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３３３）又はその変異株の２倍体の細胞形態の細胞。
（１０４）シアニディオシゾン・メロラエの２倍体の細胞形態の細胞。
（１０５）前記藻類が、ガルデリア属に属する藻類及びシアニジウム属に属する藻類からなる群より選択される藻類である、（８）に記載の１倍体の藻類の製造方法。
（１０６）ガルデリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）属に属する藻類の１倍体の細胞形態の細胞。
（１０７）前記ガルデリア属に属する藻類が、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ又はＧａｌｄｉｅｒｉａ  ｐａｒｔｉｔａである、（１０６）に記載の１倍体の細胞形態の細胞。
（１０８）シアニジウム属に属する藻類の１倍体の細胞形態の細胞。
（１０９）前記シアニジウム属に属する藻類が、シアニジウム・エスピー  ＹＦＵ３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３３４）又はシアニジウム・エスピー  ＨＫＮ１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３３３）である、（１０８）に記載の１倍体の細胞形態の細胞。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、産業利用が可能な新規微細藻類と、その使用方法とが提供される。また、本発明によれば、栄養成分を豊富に含む微細藻類を用いた栄養成分組成物、及び当該微細藻類を用いた栄養成分の製造方法が提供される。
また、本発明によれば、２倍体の藻類の細胞から１倍体の細胞を作製する方法、当該方法により作製された１倍体の細胞、及び当該１倍体の細胞を培養して得られる１倍体の藻類の細胞群が提供される。
また、本発明によれば、１倍体の藻類の細胞からから２倍体の細胞を作製する方法、当該方法により作製された２倍体の細胞、及び当該２倍体の細胞を培養して得られる２倍体の藻類の細胞群が提供される。
また、本発明は、１倍体の藻類の細胞を用いて、セルフクローニング又は多重セルフクローニングにより形質転換された藻類細胞が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】実施例２で用いた、形質転換用断片のコンストラクト（ＥＧＦＰ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片）を示す。
【図１Ｂ】実施例２で用いた、形質転換用断片のコンストラクト（ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片）を示す。
【図１Ｃ】実施例２で用いた、形質転換用断片のコンストラクト（ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｇｓ断片）を示す。
【図２】実施例２で作製した形質転換株のイムノブロッティングの結果を示す。右図は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルを染色したものである。左図は、抗ＨＡ抗体を用いたイムノブロッティングの結果である。
【図３】実施例２で作製した、ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株と、野生株（ＷＴ）とを比較した、イムノブロッティングの結果を示す。
【図４】実施例２で作製した、ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｇｓ断片形質転換株において、グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のコピー数を確認した結果を示す。
【図５】シアニディオシゾン・メロラエ  １０Ｄ及びシアニディウム・カルダリウムＲＫ−１の乾燥膨潤処理を行い、膨潤処理後の細胞懸濁液を遠心分離して得た遠心上清及び遠心沈殿についてＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った結果を示す。
【図６Ａ】日本国神奈川県足柄下郡箱根町の温泉から単離された微細藻類（シアニジウム・エスピーＨＫＮ１株）の写真を示す。シアニジウム・エスピーＨＫＮ１株を、ＭＡ培地で培養し、静止期となった時期の培養液の写真である。矢印は、静止期に出現したシアニディオシゾン・メロラエ様細胞を示す。
【図６Ｂ】日本国神奈川県足柄下郡箱根町の温泉から単離された微細藻類（シアニジウム・エスピーＨＫＮ１株）の写真を示す。図６Ａの静止期の培養液から単離されたシアニディオシゾン・メロラエ様細胞を示す。
【図７】シアニジウム・エスピーＨＫＮ１株、及びシアニジウム・エスピーＨＫＮ１株の静止期の培養液から単離されたシアニディオシゾン・メロラエ様細胞の、ゲノムの一領域の配列解析結果を示す。シアニディオシゾン・メロラエ様細胞は、シアニジウム・エスピーＨＫＮ１株（２倍体）が減数分裂して生じた１倍体（ＨＫＮ１株（１倍体））であることが確認された。
【図８】イデユコゴメ綱に属する藻類の顕微鏡写真である。ガルデリア・スルフラリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）  ０７４の顕微鏡写真、（Ｂ）はシアニジウム・カルダリウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ）  ＲＫ−１、（Ｃ）はシアニディオシゾン・メロラエ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅ）  １０Ｄ、（Ｄ）はＹＦＵ３株（１倍体）、（Ｅ）はＨＫＮ１株（１倍体）の顕微鏡写真である。スケールバーは５μｍを表す。
【図９】ＹＦＵ３株（１倍体）、ＨＫＮ１株（１倍体）及びシアニディオシゾン・メロラエにおいて、リボソームＤＮＡ  ＩＴＳ１のサイズを比較したアガロース電気泳動の結果を示す。
【図１０】葉緑体リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子に基づくイデユコゴメ綱に属する藻類の分子系統樹を示す。各枝の近傍に最尤法によるローカルブートストラップ値（５０以上のみ記載、左）及びベイズ法による事後確率（０．９５以上のみ記載、右）を示す。既知のシアニディオシゾン・メロラエを点線で囲み、ＹＦＵ３株及びＨＫＮ１株を実線で囲んだ。
【図１１】実施例６において作製した、ＹＦＵ３株（１倍体）及びシアニディオシゾン・メロラエ  １０Ｄのクロラムフェニコール耐性形質転換株の、クロラムフェニコール耐性を示す。
【図１２】実施例６において作製した、ＹＦＵ３株（１倍体）及びシアニディオシゾン・メロラエ  １０Ｄのクロラムフェニコール耐性形質転換株において、ゲノムへのＣＡＴ遺伝子の挿入をＰＣＲで確認した結果を示す。
【図１３】実施例７で用いた、形質転換用ＣＡＴベクターのコンストラクト（上図：ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ）と、ＨＫＮ１株（１倍体）のゲノムへの挿入位置（下図：Ｇｅｎｏｍｅ）を示す。下図（Ｇｅｎｏｍｅ）中、矢印は、クロラムフェニコール耐性形質転換株のゲノムにおける、ｍＶｅｎｕｓ−ＣＡＴ遺伝子の挿入の確認に用いたプライマーの位置を示す。
【図１４】実施例７で作製したクロラムフェニコール形質転換株のゲノムにおける、ｍＶｅｎｕｓ−ＣＡＴ遺伝子の挿入を、ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動で確認した結果を示す。
【図１５】実施例７で作製したクロラムフェニコール形質転換株の蛍光顕微鏡写真を示す。左図（ｍＶｅｎｕｓ）はｍＶｅｎｕｓの蛍光を検出した蛍光顕微鏡写真であり、中図（Ｃｈｌ）は葉緑体の自家蛍光を検出した蛍光顕微鏡写真であり、右図（ｍｅｒｇｅｄ）は前記２つの蛍光顕微鏡写真をマージしたものである。
【図１６】強固な細胞壁を有さない藻類と、細胞壁を有する藻類において、乾燥膨潤処理を行い、膨潤処理後の細胞懸濁液を遠心分離して得た遠心上清及び遠心沈殿についてＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った結果を示す。
【図１７Ａ】ＨＫＮ１株（１倍体）どうしの掛け合わせにより取得した、強固な細胞壁を有する２倍体様の細胞の顕微鏡写真である。
【図１７Ｂ】強固な細胞壁を有する２倍体様の細胞、及びＨＫＮ１株（１倍体）のＤＡＰＩ染色の結果を示す。
【図１８Ａ】Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ  ＳＡＧ１０８．７９の通常の細胞形態（２倍体）（左図）、及び強固な細胞壁を有さない細胞形態（右図）の顕微鏡写真である。
【図１８Ｂ】Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｐａｒｔｉｔａ  ＮＢＲＣ１０２７５９の通常の細胞形態（２倍体）（左図）、及び強固な細胞壁を有さない細胞形態（右図）の顕微鏡写真である。
【図１９】Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ  ＳＡＧ１０８．７９の強固な細胞壁を有さない細胞形態の、ゲノムの一領域の配列解析結果を示す。２Ｎ＿ａｌｌｅｌｅ１（配列番号６１）及び２Ｎ＿ａｌｌｅｌｅ２（配列番号６２）は、それぞれ、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ  ＳＡＧ１０８．７９の通常の細胞形態（２倍体）の各アレルの配列を示す。Ｎ＿ｃｌｏｎｅ１、Ｎ＿ｃｌｏｎｅ２、及びＮ＿ｃｌｏｎｅ３は、それぞれ、強固な細胞壁を有さない細胞形態の３つの株で確認されたアレルの配列を示す。
【図２０】Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ  ＳＡＧ１０８．７９及びＧａｌｄｉｅｒｉａ  ｐａｒｔｉｔａ  ＮＢＲＣ１０２７５９の２倍体の細胞形態、並びに１倍体の細胞形態おいて、乾燥膨潤処理を行い、膨潤処理後の細胞懸濁液を遠心分離して得た遠心上清及び遠心沈殿についてＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った結果を示す。
【図２１】実施例１２で用いた、形質転換用断片のコンストラクト（ＶＥ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片）を示す。
【図２２】実施例１２で作製した形質転換株のイムノブロッティングの結果を示す。左図（ＴＣ−ＨＡ）は、抗ＨＡ抗体を用いてイムノブロッティングを行った結果を示し、右図（ＨＰＴ−ＦＬＡＧ）は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてイムノブロッティングを行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類］
後述する実施例で示されるように、イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類は、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維等の栄養成分を豊富に含むことが見出された。そのため、本発明は、イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類を用いた、栄養成分組成物、栄養剤、食品、飼料又はペットフード、化粧品等を提供する。また、イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類を用いた、栄養成分の製造方法を提供する。
【００１６】
イデユコゴメ綱は、分類学上、紅色植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に分類される。イデユコゴメ綱には、現在、シアニディオシゾン（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）属、シアニジウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）属、及びガルデリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）属の３属が分類されている。本発明の実施形態にかかる栄養成分組成物等では、これら  のいずれの属に属する藻類を用いてもよい。
ある藻類が、イデユコゴメ綱に属するか否かの判定は、例えば、１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子又は葉緑体ｒｂｃＬ遺伝子の塩基配列を用いた系統解析により行うことができる。系統解析は、公知の方法で行えばよい。
本明細書において「１倍体の細胞形態」とは、観察対象の細胞の遺伝情報が１セットであること、「２倍体の細胞形態」とは、観察対象の細胞の遺伝情報が２セットであることをいう。細胞形態が１倍体であるか２倍体であるかという判定は、細胞のＤＮＡ含有量の測定により行うこともできるが、後述する次世代シーケンサーなどにより行うことも出来る。
本明細書において「２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有する」とは、イデユコゴメ綱に属する藻類において、天然から採取される細胞が１倍体の細胞形態である場合と、２倍体の細胞形態である場合があること、および、本発明の方法により作出されたこれまでに知られていなかったイデユコゴメ綱に属する藻類において、１倍体の細胞形態である場合と、２倍体の細胞形態ある場合があることをいう。
本明細書において「２倍体の細胞形態の細胞群」及び「１倍体の細胞形態の細胞群」は、クローンの細胞群であってもよく、クローンでない細胞群であってもよい。
【００１７】
イデユコゴメ綱に属する藻類の中でも、シアニディオシゾン・メロラエは、強固な細胞壁を有さないことが知られていた。シアニディオシゾン・メロラエ以外のイデユコゴメ綱に属する藻類の多くは、強固な細胞壁を有する細胞形態の藻類細胞として見出されていた。後述する実施例で示すように、これらの強固な細胞壁を有する細胞は、２倍体であることが確認された。しかしながら、後述する本発明の一実施形態にかかる方法に従えば１倍体の細胞形態の藻類細胞を作出することができ、当該作出された１倍体の藻類細胞は強固な細胞壁を有さないことが多い。そのような強固な細胞壁を有さない１倍体の細胞形態の藻類細胞は、中和処理、低張処理、凍結融解処理などの比較的温和な処理により、細胞を破壊することができる。なお、本明細書において、「強固な細胞壁を有さない」とは、下記（Ａ）〜（Ｃ）の細胞破裂処理のいずれかで細胞破裂を生じることを意味する。
【００１８】
（Ａ）藻類細胞をｐＨ７の等張液に懸濁し、１週間以上放置する。
（Ｂ）藻類細胞を蒸留水に懸濁し、１分以上放置する。
（Ｃ）藻類細胞の乾燥処理を行い、ｐＨ７の等張液に懸濁する。
上記（Ａ）〜（Ｃ）において、藻類細胞が培養細胞である場合、各処理を行う前に、遠心分離等により培地を除去し、等張液等で藻類細胞を洗浄してもよい。
上記（Ａ）及び（Ｃ）において、等張液としては、１０％スクロース及び２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むｐＨ７の緩衝液が挙げられる。
上記（Ｃ）において、乾燥処理としては、冷蔵庫内（４℃）での乾燥、凍結乾燥等が挙げられる。乾燥処理には、遠心分離により回収した藻類細胞の沈殿を用いる。冷蔵庫内で乾燥する場合、乾燥処理時間は、藻類細胞の量によるが、３日以上が例示される。
【００１９】
また、細胞破裂が生じたか否かは、上記（Ａ）〜（Ｃ）の細胞破裂処理後の藻類細胞懸濁液を遠心分離（１，５００×ｇ、３分）し、藻類細胞懸濁液中の全タンパク質量に対する、遠心上清中のタンパク質量の割合を求めることにより、判定することができる。具体的には、下記式により求められる破裂率が、２０％以上である場合に、細胞破裂が生じたと判定することができる。
【００２０】
【数１】
2020072698.tif 000002
【００２１】
あるいは、藻類細胞懸濁液中の藻類細胞を光学顕微鏡（例えば、倍率６００倍）で観察し、細胞破裂が生じている細胞の割合が、藻類細胞全体の１０％程度以上、好ましくは２０％程度以上である場合に、細胞破裂が生じたと判断してもよい。
【００２２】
上記（Ａ）〜（Ｃ）の細胞破裂処理では、ｐＨ７の等張液を用いることができるため、上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの細胞破裂処理で細胞破裂が生じる細胞は、ｐＨ７の条件下で細胞破裂が生じる細胞であるということができる。
シアニディオシゾン属に属する藻類に限らず、ｐＨ７の条件下で、その細胞が破裂する藻類であれば、栄養成分の抽出が容易であるため好ましい。また、後述する栄養剤等に藻類細胞のまま配合した場合であっても、栄養剤摂取後に藻類細胞内の栄養成分が吸収されやすいという利点もある。したがって、本実施形態の栄養成分組成物では、イデユコゴメ綱に属し、ｐＨ７の条件下で、その細胞が破裂する藻類を、好適に用いることができる。
ｐＨ７の条件下で、その細胞が破裂する藻類であるか否かは、ｐＨ７の緩衝液等に藻類細胞を浸漬し、１０〜３０分程度観察して、藻類細胞が破裂するか否かを確認することにより、判定することができる。
藻類細胞が強固な細胞壁を有さない場合、光学顕微鏡による観察（例えば、倍率６００倍）では、通常、細胞壁が観察されない。
シアニディオシゾン・メロラエは、通常、ｐＨ６以下の条件で温和な低張処理を行っても細胞破裂を生じない。そのため、ｐＨ６以下の条件での温和な低張処理により細胞破裂が生じるか否かは、強固な細胞壁を有さない藻類であるか否かの判定には影響しない。
【００２３】
イデユコゴメ綱に属する藻類の中でも、シアニディオシゾン属、とりわけシアニディオシゾン・メロラエに属する藻類は、１倍体であるという特徴を有する。そして、強固な細胞壁を有さない。そのため、シアニディオシゾン属、とりわけシアニディオシゾン・メロラエに属する藻類は、遺伝子組換技術を用いて、比較的容易に、形質転換を行うことができる。例えば、後述する実施例で示すように、遺伝子組換技術を用いて、栄養成分の細胞内含有量が高められた形質転換体を作製することもできる。
シアニディオシゾン属、とりわけシアニディオシゾン・メロラエに属する藻類に限らず、１倍体の藻類であれば、比較的容易に、形質転換を行うことができるため好ましい。例えば、後述する２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを有する、イデユコゴメ綱に属する藻類であって、１倍体の細胞形態をとっている藻類細胞もまた、比較的容易に、形質転換を行うことができるため好ましい。したがって、本発明の実施形態にかかる栄養成分組成物等では、イデユコゴメ綱に属する、１倍体の藻類を、好適に用いることができる。
藻類が１倍体であることの判定は、同一遺伝子座のコピー数を確認することにより行うことができる。すなわち、同一遺伝子座のコピー数が１であれば、１倍体であると判定される。
また、例えば、次世代シーケンサー等を用いて、藻類が１倍体であることの判定を行うこともできる。例えば、次世代シーケンサー等で全ゲノムのシーケンスリードを取得し、それらのシーケンスリードをアセンブルした後、アセンブルして得られた配列に対して、シーケンスリードをマッピングする。２倍体ではアレルごとの塩基の違いがゲノム上の様々な領域で見つかるが、１倍体では１アレルしか存在しないため、その様な領域は見つからない。
また、藻類がホモ２倍体である場合には、細胞のＤＮＡ含量を測定することにより、１倍体であるか、２倍体であるかを判定することができる。１倍体の細胞のＤＮＡ含有量は、２倍体の細胞のＤＮＡ含有量の１／２倍である。
【００２４】
イデユコゴメ綱に属する１倍体の藻類であって、且つｐＨ７の条件下で細胞破裂を生じる藻類としては、シアニディオシゾン属に属する藻類が挙げられる。シアニディオシゾン属には、現在、シアニディオシゾン・メロラエ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅ）の１種のみが分類されている。したがって、シアニディオシゾン・メロラエは、本発明の実施形態にかかる栄養成分組成物等で用いる藻類の好適な例である。
さらに、本発明により得られた従来知られていなかったシアニディオシゾン・メロラエ以外の１倍体のシアニディオシゾン属に属する藻類だけでなく、１倍体のガルデリア属、１倍体のシアニジウム属に属する藻類も好適な例である。
【００２５】
イデユコゴメ綱に属する藻類は、高温（３０〜５５℃）・酸性（ｐＨ０．１〜３．０）条件下において、高密度（３０ｇ／Ｌ程度）まで増殖することができる。そのような高温・酸性環境下では、他の生物は生育困難であるため、イデユコゴメ綱に属する藻類は、屋外大量培養に適している。
また、イデユコゴメ綱に属する藻類は、高温・酸性条件下のみならず、中温環境（１５〜３０℃）、中性環境（ｐＨ６程度）などの比較的広い範囲の環境条件下で増殖可能である。そのため、地域や季節に応じて培養条件を変更することも可能であり、この点でも、屋外大量培養に適している。
さらに、高塩耐性もあり、高塩（３００  ｍＭ  ＮａＣｌ）条件下でも増殖可能である。また、増殖可能な光強度の範囲も広く、５〜１５００μｍｏｌ／ｍ２ｓの範囲で高密度に増殖することができ、強光下でも増殖可能である。
【００２６】
後述する実施例で示すように、イデユコゴメ綱に属する藻類は、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、食物繊維等の栄養成分を豊富に含有する。特に、アミノ酸類及びビタミン類は、従来利用されている藻類（クロレラ、ユーグレナ、スピルリナ）と比較しても、高濃度に含有することが確認されている。また、その成分組成も特異的である。したがって、イデユコゴメ綱に属する藻類を用いることにより、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される栄養成分、特に、アミノ酸類やビタミン類等の栄養成分を豊富に含む栄養成分組成物、及び栄養剤等を製造することができる。
【００２７】
本明細書において、「アミノ酸類」とは、アミノ基及びカルボキシ基を有する有機化合物を意味する。
イデユコゴメ綱に属する藻類が含有するアミノ酸類としては、例えば、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、γ−アミノ酪酸等が挙げられる。イデユコゴメ綱に属する藻類は、従来利用されている藻類と比較して、総アミノ酸含有量が高い点に特徴があり、個々のアミノ酸の含有量についても概ね高い傾向にある。
イデユコゴメ綱に属する藻類の総アミノ酸類の含有量としては、例えば、６０〜８０ｇ／１００ｇ乾燥重量が例示される。また、イデユコゴメ綱に属する藻類は、γ−アミノ酪酸を含有する点にも特徴がある。イデユコゴメ綱に属する藻類のγ−アミノ酪酸の含有量としては、例えば、０．１〜０．３ｇ／１００ｇ乾燥重量が例示される。なお、本明細書において、「総アミノ酸含有量」とは、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、及びセリンの含有量を合計した値を意味する。
【００２８】
本明細書において、「ビタミン類」とは、生物の生存に必要な栄養素のうち、炭水化物、タンパク質、及び脂質以外の有機化合物を意味する。
イデユコゴメ綱に属する藻類が含有するビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、β−カロテン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、ナイアシン、イノシトール、葉酸、ビオチン等が挙げられる。これらの中でも、イデユコゴメ綱に属する藻類は、従来利用されている藻類と比較して、β−カロテン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、及び葉酸の含有量が特に高い点に特徴がある。
イデユコゴメ綱に属する藻類の各ビタミン類の含有量としては、例えば、β−カロテンの含有量としては２００〜２５０ｍｇ／１００ｇ乾燥重量、ビタミンＣの含有量としては４０〜７０ｍｇ／１００ｇ乾燥重量、ビタミンＥの含有量としては１５０〜１８０ｍｇ／１００ｇ乾燥重量、ビタミンＫ１の含有量としては３０００〜５０００μｇ／１００ｇ乾燥重量、ビタミンＫ２の含有量としては４０００〜７０００μｇ／１００ｇ乾燥重量、葉酸の含有量としては３５００〜６５００μｇ／１００ｇ乾燥重量が、それぞれ例示される。
【００２９】
イデユコゴメ綱に属する藻類の中でも、強固な細胞壁を有さないものは、ヒト又はヒト以外の動物に摂取された場合に、上記のような栄養成分が効率よく体内に吸収され得る。また、イデユコゴメ綱に属する藻類から、栄養成分を含む抽出物を調製する場合も、強固な細胞壁を有さないものは、上記（Ａ）〜（Ｃ）の細胞破裂処理等の簡易な操作で、当該抽出物を調製することができる。
【００３０】
イデユコゴメ綱に属する藻類は、硫酸酸性温泉などの硫酸酸性環境において優先増殖するため、硫酸酸性温泉などから単離して入手することができる。また、イデユコゴメ綱に属する藻類は、カルチャー・コレクション等から入手してもよい。例えば、シアニディオシゾン・メロラエは、国立研究開発法人国立環境研究所微生物系統保存施設（日本国茨城県つくば市小野川１６−２）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 USA）等から入手することができる。
【００３１】
イデユコゴメ綱に属する藻類は、微細藻類培養用の培地を用いて培養することができる。培地としては、特に限定されないが、窒素源、リン源、微量元素（亜鉛、ホウ素、コバルト、銅、マンガン、モリブデン、鉄など）等を含む無機塩培地が例示される。例えば、窒素源としては、アンモニウム塩、硝酸塩、亜硝酸塩等が挙げられ、リン源としては、リン酸塩等が挙げられる。そのような培地としては、例えば、２×Ａｌｌｅｎ培地（Allen MB. Arch. Microbiol. 1959 32: 270-277.）、Ｍ−Ａｌｌｅｎ培地（Minoda A et al. Plant Cell Physiol. 2004 45: 667-71.）、ＭＡ２培地（Ohnuma M et al. Plant Cell Physiol. 2008 Jan;49(1):117-20.）、改変Ｍ−Ａｌｌｅｎ培地等が挙げられる。
【００３２】
イデユコゴメ綱に属する藻類は、上記のとおり、比較的幅広い培養条件で高密度に増殖させることができる。ｐＨ条件としては、ｐＨ１．０〜６．０を例示することができ、ｐＨ１．０〜５．０が好ましい。屋外で培養する場合には、他の生物の増殖を防ぐために、酸性度が高い条件で培養することが好ましく、そのような条件としてはｐＨ１．０〜３．０が挙げられる。
温度条件としては、１５〜５０℃を例示することができ、３０〜５０℃が好ましい。屋外で培養する場合には、他の生物の増殖を防ぐために、高温で培養することが好ましく、そのような条件としては３５〜５０℃が挙げられる。
光強度としては、５〜２０００μｍｏｌ／ｍ２ｓを例示することができ、５〜１５００μｍｏｌ／ｍ２ｓが好ましい。屋外で培養する場合には、太陽光下で培養すればよい。室内で培養する場合には、連続光で培養してもよく、明暗周期（１０Ｌ：１４Ｄなど）を設けてもよい。
【００３３】
培養により増殖させたイデユコゴメ綱に属する藻類は、遠心分離やろ過等の公知の方法により回収し、適宜、洗浄、乾燥等を行って、本実施形態の栄養剤に用いることができる。
【００３４】
なお、イデユコゴメ綱に属する藻類は、自然界から単離されたものに限定されず、天然のイデユコゴメ綱に属する藻類に変異が生じたものであってもよい。変異は、自然発生的に生じたものであってもよく、人為的に生じたものであってもよい。例えば、自然界から単離されたシアニディオシゾン・メロラエは、１倍体の細胞形態を有するが、ゲノムサイズが小さく（約１６Ｍｂｐ）、ゲノム配列の解読が完了しているため（Matsuzaki M et al., Nature. 2004 Apr 8;428(6983):653-7.）、遺伝子改変を行いやすい。したがって、シアニディオシゾン・メロラエを遺伝子改変して生じた形質転換体は、イデユコゴメ綱に属する藻類の好適な例である。また、シアニディオシゾン・メロラエに限らず、遺伝子改変可能であれば、イデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体を、イデユコゴメ綱に属する藻類として、本発明の実施形態にかかる栄養成分組成物等に用いてもよい。例えば、後述するように、天然から単離されるガルデリア属に属する藻類及びシアニジウム属に属する藻類は強固な細胞壁を有する２倍体の細胞形態を有するが、本発明の方法により１倍体の細胞形態とすることが出来るので、１倍体の細胞形態と、２倍体の細胞形態とを有する。いずれの細胞形態も細胞群として用いても良い。これらの藻類の１倍体の細胞形態の細胞のうち、アニディオシゾン・メロラエと同様に強固な細胞壁を持たない細胞は、遺伝子改変を行いやすい。したがって、ガルデリア属又はシアニジウム属に属する藻類の１倍体の細胞形態の細胞または強固な細胞壁を持たない細胞を遺伝子改変して生じた形質転換体もまた、イデユコゴメ綱に属する藻類の好適な例である。より具体的には、シアニディオシゾン・メロラエのほかにはガルデリア属の１倍体、シアニジウム属の１倍体、シアニディオシゾン・メロラエ以外のシアニディオシゾン属の１倍体、シアニジウム属の１倍体を用いることが好ましい。また、これらのうちで強固な細胞壁を持たない細胞を用いることがより好ましい。また、強固な細胞壁を持たないイデユコゴメ綱に属する２倍体も好ましい。
【００３５】
イデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体としては、特に限定されないが、例えば、少なくとも１種の栄養成分の細胞内含有量が高められた形質転換体が挙げられる。細胞内含有量が高められる栄養成分の好適な例としては、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される少なくとも１種の栄養成分が挙げられる。すなわち、野生株と比較して、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される少なくとも１種の栄養成分の細胞内含有量が高い、イデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体が好ましく例示される。本明細書において、「野生株」とは、形質転換の対象となった元の細胞であって、形質転換が行われていない細胞を意味する。
これらの中でも、アミノ酸類及びビタミン類からなる群より選択される少なくとも１種の栄養成分が好ましい。そのような形質転換体は、野生株と比較して、特定の栄養成分の細胞内含有量が高いため、当該栄養成分を豊富に含有する栄養成分組成物及び栄養剤等を調製することができる。上記栄養成分の細胞内含有量を高める方法は、特に限定されない。
例えば、目的とする栄養成分の合成経路のいずれかの反応を触媒する酵素の発現量が多くなるように遺伝子改変を行ってもよい。酵素の発現量を多くする遺伝子改変の方法としは、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。そのような方法としては、例えば、当該酵素をコードする遺伝子（以下、「酵素遺伝子」という。）を導入する方法、当該酵素遺伝子の発現を促進する因子をコードする遺伝子を導入する方法、当該酵素遺伝子の発現を阻害する因子をコードする遺伝子を破壊する方法、等が挙げられる。なお、酵素遺伝子を藻類細胞に導入する場合には、当該酵素遺伝子のプロモーター配列に替えて、導入する藻類細胞において発現量の多い遺伝子のプロモーターを用いてもよい。酵素は、目的とする栄養成分の合成経路のいずれかの反応を触媒する酵素であれば、特に限定されないが、目的とする栄養成分の合成酵素、目的とする栄養成分の前駆体の合成酵素、等が挙げられる。なお、「栄養成分の前駆体」は、目的とする栄養成分の合成経路において、当該栄養成分が合成される前の段階までに生成されるいずれの化合物であってもよい。
【００３６】
栄養成分の細胞内含有量を高める方法は、例えば、目的とする栄養成分の合成経路のいずれかの反応を阻害する因子（以下、「阻害因子」という。）の発現量を少なくするような遺伝子改変であってもよい。阻害因子の発現量を少なくする方法としては、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。そのような方法としては、例えば、阻害因子をコードする遺伝子を破壊する方法、阻害因子をコードする遺伝子の発現を抑制する因子をコードする遺伝子を導入する方法、阻害因子をコードする遺伝子の発現を促進する因子をコードする遺伝子を破壊する方法、等が挙げられる。
【００３７】
例えば、グルタミン酸デカルボキシラーゼは、γ−アミノ酪酸の合成酵素である。そのため、グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の発現量が多くなるように、イデユコゴメ綱に属する藻類の遺伝子改変を行うことにより、γ−アミノ酪酸の細胞内含有量が高められた形質転換体を得ることができる。また、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼ及びトコフェロールシクラーゼは、ビタミンＥの生合成経路上の反応を触媒する酵素である。すなわち、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼは、２−メチル−６−フィチルベンゾキノンを合成する酵素であり、トコフェロールシクラーゼは、γ−トコトリエノールを合成する酵素である。そのため、これらの酵素遺伝子のいずれか又は両方の発現量が多くなるように、イデユコゴメ綱に属する藻類の遺伝子改変を行うことにより、ビタミンＥの細胞内含有量が高められた形質転換体を得ることができる。なお、ビタミンＥの細胞内含有量を高めるために、ビタミンＥの生合成経路上の他の反応を触媒する酵素の発現量が多くなるようにしてもよい。他の栄養成分についても同様に、目的とする栄養成分の生合成経路上のいずれかの反応（好ましくは生合成経路上の律速となっている反応）を触媒する酵素の発現量を多くすることにより、当該栄養成分の細胞内含有量を高めることができる。
これらの合成酵素遺伝子の配列情報はＧｅｎＢａｎｋ等の公知の配列データベースより取得可能である。なお、シアニディオシゾン・メロラエのグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＣＭＦ０７２Ｃ）の配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に示す。
また、シアニディオシゾン・メロラエのホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＭＮ２０２Ｃ）の配列を配列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６に示す。また、シアニディオシゾン・メロラエのトコフェロールシクラーゼ遺伝子（ＣＭＬ３２６Ｃ）の配列を配列番号７に、アミノ酸配列を配列番号８に示す。
【００３８】
例えば、前記のような栄養成分の合成酵素遺伝子（例、グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子）を、イデユコゴメ綱に属する藻類に導入することにより、当該栄養成分の細胞内含有量が高められた形質転換体を得ることができる。導入遺伝子に用いるプロモーターは、当該合成酵素遺伝子のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。他の遺伝子のプロモーターを用いる場合、導入対象である藻類細胞において発現量が高い遺伝子のプロモーターが好ましい。シアニディオシゾン・メロラエの場合、そのようなプロモーターとしては、例えば、ＡＰＣＣ（ＣＭＯ２５０Ｃ）のプロモーター（例、−６００〜−１；「−１」は開始コドンの直前のヌクレオチドを示す。）、ＣＰＣＣ（ＣＭＰ１６６Ｃ）のプロモーター、Ｃａｔａｌａｓｅ（ＣＭＩ０５０Ｃ）のプロモーター等が挙げられる。
これらのプロモーターの配列情報はＧｅｎＢａｎｋ等の公知の配列データベースより取得可能である。なお、シアニディオシゾン・メロラエのＡＰＣＣのプロモーター配列を配列番号９に、シアニディオシゾン・メロラエのＣＰＣＣ（ＣＭＰ１６６Ｃ）のプロモーター配列を配列番号１０に、シアニディオシゾン・メロラエのＣａｔａｌａｓｅ（ＣＭＩ０５０Ｃ）のプロモーター配列を配列番号１１に示す。
【００３９】
イデユコゴメ綱に属する藻類の中でも、シアニディオシゾン・メロラエは、セルフクローニングが可能な藻類である（Fujiwara et al., PLoS One. 2013 Sep 5;8(9):e73608）。なお、「セルフクローニング」とは、細胞に導入する核酸として、（１）当該細胞が由来する生物と同一の分類学上の種に属する生物の核酸、及び（２）自然条件において当該細胞が由来する生物の属する分類学上の種との間で核酸を交換する種に属する生物の核酸、のみを用いる、遺伝子組換技術をいう。セルフクローニングにより作製された形質転換体は、カタルヘナ議定書における遺伝子組換え生物の対象から除外されているため、野外でも培養可能である。したがって、セルフクローニングによるイデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体は、本実施形態の栄養剤に用いる藻類として好適である。中でも、セルフクローニングによるシアニディオシゾン・メロラエの形質転換体が好ましい。
【００４０】
シアニディオシゾン・メロラエにおいてセルフクローニングを行う方法は、特に限定されないが、選択マーカーとして、ＵＲＡ５．３遺伝子（ＣＭＫ０４６Ｃ）を用いる方法が挙げられる。シアニディオシゾン・メロラエには、ウラシル栄養要求性の変異株であるシアニディオシゾン・メロラエ  Ｍ４株（Minoda et al., Plant Cell Physiol. 2004 Jun;45(6):667-71.）が存在する。シアニディオシゾン・メロラエ  Ｍ４株は、ＵＲＡ５．３遺伝子に変異を有しており、ウラシルを合成することができない。そのため、シアニディオシゾン・メロラエ  Ｍ４株は、ウラシルを含まない培地では生育できない。そこで、シアニディオシゾン・メロラエ  Ｍ４株を親株とし、選択マーカーに野生株のＵＲＡ５．３遺伝子を用いることにより、セルフクローニングを行うことができる。より具体的には、シアニディオシゾン・メロラエ野生株（例えば、１０Ｄ株）のＵＲＡ５．３遺伝子セットに、シアニディオシゾン・メロラエの任意の遺伝子セットを連結し、シアニディオシゾン・メロラエ  Ｍ４株に導入する。その後、ウラシルを含まない培地で培養することにより、任意の遺伝子セットが導入された細胞を得ることができる。なお、上記において、「遺伝子セット」とは、任意のプロモーターと、目的遺伝子のＯＲＦと、任意の３’ＵＴＲと、が連結されたものを意味する。なお、３’ＵＴＲは、特に限定されず、目的遺伝子の３’ＵＴＲであってもよく、他の遺伝子の３’ＵＴＲを用いてもよい。よく用いられる３’ＵＴＲとしては、β−チューブリンの３’ＵＴＲが例示される。選択マーカーは、ＵＲＡ５．３遺伝子に限定されず、他の栄養要求性に関連する遺伝子であってもよい。
【００４１】
上記のように栄養要求性関連遺伝子を選択マーカーとして用いて遺伝子改変を行った場合、藻類細胞に導入された栄養要求性関連遺伝子をノックアウトすることにより、再度、同じ栄養要求性関連遺伝子を選択マーカーとして、遺伝子改変を行うことができる。すなわち、多重セルフクローニングが可能である。選択マーカーとして導入した栄養要求性関連遺伝子のノックアウト方法は、特に限定されず、公知のノックアウト技術を用いればよい。ノックアウト技術としては、例えば、相同組換え、遺伝子編集技術等が挙げられる。
例えば、上記のように、シアニディオシゾン・メロラエにおいては、ＵＲＡ５．３遺伝子（ＣＭＫ０４６Ｃ）を選択マーカーとし、シアニディオシゾン・メロラエ  Ｍ４株を親株として、セルフクローニングを行うことが得きる。形質転換されていない細胞は、ウラシルを含まない培地では生育できないため、形質転換後の細胞をウラシルを含まない培地で培養することにより、形質転換体を選抜することができる。さらに、セルフクローニングを行う場合には、相同組換え等の公知のノックアウト技術により、ＵＲＡ５．３遺伝子をノックアウトする。例えば、導入したＵＲＡ５．３遺伝子全体を欠失させてもよく、ＵＲＡ５．３遺伝子を部分的に欠失させてもよく、ＵＲＡ５．３遺伝子に点変異を導入してもよい。ＵＲＡ５．３遺伝子のノックアウト株は、ウラシル及び５−フルオロチン酸（５−ＦＯＡ）を含む培地で培養することにより、選抜することができる。ＵＲＡ５．３遺伝子を正常に発現する株では、ＵＲＡ５．３遺伝子の遺伝子産物により、ウラシル及び５−ＦＯＡが、毒性のある５-フルオロウラシルに変換されるためである。このようにして得たＵＲＡ５．３ノックアウト株を親株とすれば、再度、ＵＲＡ５．３遺伝子を選択マーカーとして用いて、セルフクローニングを行うことができる。同様の操作を繰り返し行うことにより、所望の回数のセルフクローニングを行うことが可能である。
【００４２】
イデユコゴメ綱に属する藻類に任意の核酸を導入する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、ポリエチレングリコール法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、遺伝子銃法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法などが挙げられる。
【００４３】
イデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換を行う場合、導入核酸は、核ゲノム、葉緑体ゲノム、及びミトコンドリアゲノムのいずれかに挿入してもよい。導入核酸をゲノムに挿入する場合、ゲノムの特定の位置に挿入してもよく、ランダムにゲノムに挿入してもよい。
ゲノムの特定の位置に導入核酸を挿入する方法としては、相同組換えを用いることができる。例えば、シアニディオシゾン・メロラエでは、全ゲノム配列の解読が終了しているため（Matsuzaki M et al., Nature. 2004 Apr 8;428(6983):653-7.）、ゲノム上の所望の位置に導入核酸を挿入することが可能である。シアニディオシゾン・メロラエにおける導入遺伝子の挿入位置は、特に限定されないが、例えば、ＣＭＤ１８４ＣとＣＭＤ１８５Ｃとの間の領域が例示される。
【００４４】
イデユコゴメ綱に属する藻類の変異株の好ましい具体例としては、以下の（１）〜（１８）が例示されるが、これらに限定されない。
（１）野生株と比較して、γ−アミノ酪酸及びビタミンＥからなる群より選択される少なくとも１種の栄養成分の細胞内含有量が高い、イデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体。
（２）野生株と比較して、グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の発現量が高い、（１）に記載のイデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体。
（３）グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含む核酸が発現可能な状態で導入された、（２）に記載のイデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体。
（４）前記核酸が、イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞内で機能するプロモーターと、前記プロモーターに機能的に連結されたグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含む、（３）に記載のイデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体。
（５）野生株と比較して、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼ遺伝子及びトコフェロールシクラーゼ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の発現量が高い、（１）に記載のイデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体。
（６）ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼ遺伝子及びトコフェロールシクラーゼ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種を含む核酸が発現可能な状態で導入された、（５）に記載のイデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体。
（７）前記核酸が、イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞内で機能するプロモーターと、前記プロモーターに機能的に連結されたホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む、（６）に記載のイデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体。
（８）前記核酸が、イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞内で機能するプロモーターと、前記プロモーターに機能的に連結されたトコフェロールシクラーゼ遺伝子、を含む、（６）又は（７）に記載のイデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体。
（９）前記プロモーターが、ＡＰＣＣプロモーター、ＣＰＣＣプロモーター、及びＣａｔａｌａｓｅプロモーターからなる群より選択される、（４）、（７）及び（８）のいずれかに記載のイデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体。
（１０）前記核酸が、分類学上の別種に属する細胞に由来する塩基配列を含まない、（３）、（４）、及び（６）〜（９）のいずれかに記載のイデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体。
（１１）前記核酸が、栄養要求性関連遺伝子を選択マーカーとして、細胞に導入されたものである、（１０）に記載のイデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体。
（１２）前記核酸が、栄養要求性関連遺伝子を選択マーカーとして、前記栄養要求性関連遺伝子のノックアウト細胞に導入されたものである、（１０）に記載のイデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体。
（１３）前記イデユコゴメ綱に属する藻類が、シアニディオシゾン属に属する藻類である、（１）〜（１２）のいずれかに記載のイデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体。
（１４）前記イデユコゴメ綱に属する藻類が、シアニディオシゾン・メロラエである、（１３）に記載のイデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体。
（１５）前記栄養要求性遺伝子がＵＲＡ５．３遺伝子である、（１４）に記載のイデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体。
（１６）前記イデユコゴメ綱に属する藻類が、ガルデリア属に属する藻類の１倍体の細胞形態の細胞である、（１）〜（１２）のいずれかに記載のイデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体。
（１７）前記ガルデリア属に属する藻類が、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ、又はＧａｌｄｉｅｒｉａ  ｐａｒｔｉｔａである、（１６）に記載のイデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体。
（１８）前記イデユコゴメ綱に属する藻類が、シアニジウム属に属する藻類の１倍体の細胞形態の細胞である、（１）〜（１２）のいずれかに記載のイデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体。
【００４５】
本明細書において、「機能的に連結」とは、第一の塩基配列が第二の塩基配列に十分に近くに配置され、第一の塩基配列が第二の塩基配列又は第二の塩基配列の制御下の領域に影響を及ぼしうることを意味する。例えば、遺伝子がプロモーターに機能的に連結するとは、当該遺伝子が、当該プロモーターの制御下で発現するように連結されていることを意味する。「発現可能な状態」とは、遺伝子が導入された細胞内で、該遺伝子が転写・翻訳され得る状態にあることを指す。
【００４６】
［イデユコゴメ綱に属する藻類の抽出物］
本発明の実施形態にかかる藻類の抽出物は、１種類のイデユコゴメ綱に属する藻類から抽出されているものを指すが、２種類以上のイデユコゴメ綱に属する藻類から抽出されているものや、未破壊のイデユコゴメ綱の細胞が混在していてもよく、また、イデユコゴメ綱に属さない藻類の抽出物や細胞が混在していても良い。
本発明の実施形態にかかる栄養成分組成物等では、イデユコゴメ綱に属する藻類に替えて、又はイデユコゴメ綱に属する藻類と共に、イデユコゴメ綱に属する藻類の抽出物を用いてもよい。イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類の抽出物も、イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類と同様に、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維等の栄養成分を豊富に含み得る。そのため、本発明は、イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類の抽出物を用いた、栄養成分組成物、栄養剤、食品、飼料又はペットフード、化粧品等もまた提供する。
【００４７】
本明細書において、「イデユコゴメ綱に属する藻類の抽出物」とは、イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞に対して、物理的処理又は化学的処理を行って、細胞内の成分を抽出したものをいう。例えば、イデユコゴメ綱に属する藻類の抽出物は、物理的処理又は化学的処理によって、イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞を破壊した細胞破壊物であってもよい。また、イデユコゴメ綱に属する藻類の抽出物は、前記細胞破壊物を濃縮したものであってもよく、前記細胞破壊物から固形分を除去したものであってもよく、前記細胞破壊物から一部の成分を分離したものであってもよい。
【００４８】
細胞に対する物理的処理又は化学的処理の方法は、特に限定されず、細胞の破壊に一般的に用いられる方法を用いることができる。物理的処理としては、例えば、ガラスビーズ、乳鉢、超音波処理、フレンチプレス、ホモジナイザー等による細胞破壊が挙げられる。
化学的処理としては、例えば、中和処理、低張処理、凍結融解処理、乾燥膨張処理等が挙げられる。より具体的には、上記（Ａ）〜（Ｃ）の細胞破裂処理が例示される。
細胞破壊物を濃縮する場合、濃縮方法は特に限定されず、一般的に用いられる濃縮方法を用いればよい。細胞破壊物の濃縮方法としては、例えば、乾燥、凍結乾燥、減圧乾燥等が挙げられる。
細胞破壊物から固形分を除去する場合、固形分の除去方法は特に限定されず、固形分の除去等に一般的に用いられる方法を用いることができる。固形分の除去方法としては、例えば、ろ過、遠心分離等が挙げられる。
細胞破壊物から一部の成分を分離する場合、分離方法は特に限定されず、生化学物質の分離・精製等に一般的に用いられる方法を用いることができる。分離方法としては、例えば、塩析、透析、溶媒抽出、吸着、カラムクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ等が挙げられる。これらの方法は、単独で用いてもよく、２種以上の処理を組み合わせて用いてもよい。ただし、単一の成分に精製されたものは、「イデユコゴメ綱に属する藻類の抽出物」からは除かれる。イデユコゴメ綱に属する藻類の抽出物は、好ましくは、イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞成分を１０種以上、より好ましくは１５種以上、さらに好ましくは２０種以上含む。好ましくは、イデユコゴメ綱に属する藻類の抽出物は、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される栄養成分を含み、より好ましくは、アミノ酸類、及びビタミン類からなる群より選択される栄養成分を含む。アミノ酸類の具体例としては、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、γ−アミノ酪酸等が挙げられる。ビタミン類の具体例としては、ビタミンＡ、β−カロテン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、ナイアシン、イノシトール、葉酸、ビオチン等が挙げられる。
【００４９】
［２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを有する藻類］
１実施形態において、本発明は、イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類であって、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有する、藻類、を提供する。
【００５０】
本実施形態の藻類は、イデユコゴメ綱に属する藻類であることに加えて、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有するという特徴を備える。従来、イデユコゴメ綱に属する藻類では、シアニディオシゾン属に属する藻類において１倍体のものが知られていた。しかし、イデユコゴメ綱に属する藻類では、２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態の両方を有するものは、これまでに知られていなかった。すなわち、イデユコゴメ綱に属するシアニディオシゾン属に属すシアニディオシゾン・メロラエにおいては、１倍体のもののみが天然から採取され、また、他のイデユコゴメ綱に属する藻類であるガルデリア属、シアニジウム属については２倍体のもののみが天然から採取されていた。本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類の２倍体の細胞形態の細胞から作出された１倍体の細胞形態を有する藻類、２個以上の１倍体細胞から生じる２倍体の細胞形態を有する藻類を提供する。本明細書においてはかかる事情につき、「２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態の両方を有する」と表現する。
【００５１】
一方、本実施形態の藻類は、２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態との両方を有する。
本実施形態の藻類において、１倍体の細胞形態は、２倍体の細胞形態が減数分裂することにより生じる。そして、１倍体の細胞は、２個の細胞の接合により、２倍体の細胞を生じると考えられる。そのため、本実施形態の藻類においては、所望の形質を有する１倍体の細胞同士を接合させることにより、それらの形質を併せ持つ２倍体の細胞を作製することができる。
例えば、１倍体の細胞では、２倍体の細胞に比べて、遺伝子組換技術を用いた形質転換体の作製が容易である。そのため、１倍体の細胞を用いて任意の形質を有する形質転換体を複数作製し、任意の形質を有する形質転換体同士を掛け合わせることにより、それらの形質を併せ持つ２倍体を作製することが考えられる。
本実施形態の藻類は、１倍体の細胞のみからなる細胞群で生育することができる。
本実施形態の藻類は、２倍体の細胞のみからなる細胞群で生育することができる。
また、後述の実施例からも明らかなように、２倍体の細胞から１倍体の細胞を作出することも、２種以上の１倍体の細胞から２倍体の細胞を作出することもできる。また、２倍体の細胞から１倍体の細胞を作出する場合に、または１倍体の細胞から２倍体の細胞を作出する場合に、１倍体の細胞と２倍体の細胞とが混在する場合がある。
【００５２】
藻類が２倍体であるか、１倍体であるかの判定は、上記「［イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類］」で例示した方法で行うことができる。
また、藻類が２倍体及び１倍体の両方の細胞形態を有することの判定は、例えば、以下のような方法により行うことができる。まず、２倍体の細胞形態のものを静止期になるまで培養し、静止期のまま培養を継続したときに、２倍体のものとは異なる形態の細胞が出現するかを確認する。２倍体のものとは異なる形態の細胞が出現した場合には、その細胞を採取し、その細胞が１倍体の細胞であるかを確認する。その結果、１倍体の細胞であれば、当該藻類が、２倍体及び１倍体の両方の細胞形態を有すると、判定することができる。
【００５３】
本実施形態の藻類においては、少なくとも一方の細胞形態が、強固な細胞壁を有さないことが好ましい。強固な細胞壁を有さないことにより、中和処理、低張処理、凍結融解処理などの比較的温和な処理により、細胞を破壊することができる。強固な細胞壁を有さない藻類であるか否かの判定は、上記「［イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類］」で記載した方法により行うことができる。
【００５４】
本実施形態の藻類では、２倍体及び１倍体の細胞形態の少なくとも一方が、強固な細胞壁を有さないものであることが好ましいが、１倍体の細胞形態が、強固な細胞壁を有さないことがより好ましい。すなわち、１倍体の細胞形態が、上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの細胞破裂処理で、その細胞が破裂することが好ましい。
細胞が強固な細胞壁を有さない場合、光学顕微鏡による観察（例えば、倍率６００倍）では、通常、細胞壁が観察されない。本実施形態の藻類は、通常、２倍体の細胞形態の細胞は強固な細胞壁を有するが、１倍体の細胞形態は強固な細胞壁を有さない。
【００５５】
後述する実施例で示すように、本実施形態の藻類は、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、食物繊維等の栄養成分を豊富に含有する。特に、アミノ酸類及びビタミン類は、従来利用されている藻類（クロレラ、ユーグレナ、スピルリナ）と比較しても、高濃度に含有することが確認されている。したがって、後述する栄養剤や栄養成分の製造方法に利用することができる。
【００５６】
本実施形態の藻類が含有するアミノ酸類としては、例えば、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、γ−アミノ酪酸等が挙げられる。本実施形態の藻類は、従来利用されている藻類と比較して、総アミノ酸含有量が高い点に特徴があり、個々のアミノ酸の含有量についても概ね高い傾向にある。
【００５７】
例えば、本実施形態の藻類における総アミノ酸含有量は、５０ｇ／１００ｇ乾燥重量以上であることが好ましい。総アミノ酸含有量の範囲としては、例えば、５０〜７０ｇ／１００ｇ乾燥重量が例示される。なお、本明細書において、「総アミノ酸含有量」とは、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、及びセリンの含有量を合計した値を意味する。
本実施形態の藻類におけるイソロイシンの含有量としては、１．５ｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。イソロイシン含有量の範囲としては、例えば、１．５〜５ｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるロイシンの含有量としては、４．５ｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。イソロイシン含有量の範囲としては、例えば、４．５〜８ｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるリジンの含有量としては、２．５ｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。リジン含有量の範囲としては、例えば、２．５〜６ｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるメチオニンの含有量としては、０．５ｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。メチオニン含有量の範囲としては、例えば、０．５〜４ｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるシスチンの含有量としては、０．５ｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。シスチン含有量の範囲としては、例えば、０．５〜３ｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるフェニルアラニンの含有量としては、１．５ｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。フェニルアラニン含有量の範囲としては、例えば、１．５〜５ｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるチロシンの含有量としては、２．０ｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。チロシン含有量の範囲としては、例えば、２．０〜５ｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるスレオニンの含有量としては、２．０ｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。スレオニン含有量の範囲としては、例えば、２．０〜５ｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるトリプトファンの含有量としては、０．５ｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。トリプトファン含有量の範囲としては、例えば、０．５〜３ｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるバリンの含有量としては、２．５ｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。バリン含有量の範囲としては、例えば、２．５〜６ｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるアルギニンの含有量としては、４．５ｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。フェニルアラニン含有量の範囲としては、例えば、４．５〜８ｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるヒスチジンの含有量としては、０．５ｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。ヒスチジン含有量の範囲としては、例えば、０．５〜３ｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるアラニンの含有量としては、３．５ｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。アラニン含有量の範囲としては、例えば、３．５〜７ｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるアスパラギン酸の含有量としては、４．５ｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。アスパラギン酸含有量の範囲としては、例えば、４．５〜８ｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるグルタミン酸の含有量としては、５．５ｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。グルタミン酸含有量の範囲としては、例えば、５．５〜９ｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるグリシンの含有量としては、２．０ｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。グリシン含有量の範囲としては、例えば、２．０〜５．５ｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるプロリンの含有量としては、１．５ｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。プロリン含有量の範囲としては、例えば、１．５〜５ｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるセリンの含有量としては、２．０ｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。セリン含有量の範囲としては、例えば、２．０〜５ｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるγ−アミノ酪酸の含有量としては、０．０５ｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。γ−アミノ酪酸の含有量の範囲としては、例えば、０．０５〜０．３ｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
【００５８】
本実施形態の藻類が含有するビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、β−カロテン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、葉酸等が挙げられる。
これらの中でも、本実施形態の藻類は、従来利用されている藻類と比較して、β−カロテン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、及び葉酸の含有量が特に高い点に特徴がある。
【００５９】
本実施形態の藻類におけるビタミンＡの含有量としては、８ｍｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。ビタミンＡの含有量の範囲としては、例えば、８〜２０ｍｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるβ−カロテンの含有量としては、１００ｍｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。β−カロテンの含有量の範囲としては、例えば、１００〜２００ｍｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるビタミンＣの含有量としては、２０ｍｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。ビタミンＣの含有量の範囲としては、例えば、２０〜５０ｍｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるビタミンＥの含有量としては、８０ｍｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。ビタミンＥの含有量の範囲としては、例えば、８０〜１５０ｍｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるビタミンＫ１の含有量としては、４０００μｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。ビタミンＫ１の含有量の範囲としては、例えば、４０００〜８０００μｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類におけるビタミンＫ２の含有量としては、１０００μｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。ビタミンＫ２の含有量の範囲としては、例えば、１０００〜３０００μｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
本実施形態の藻類における葉酸の含有量としては、１５００μｇ／１００ｇ乾燥重量以上が好ましい。葉酸の含有量の範囲としては、例えば、１５００〜４０００μｇ／１００ｇ乾燥重量が挙げられる。
【００６０】
本実施形態の藻類は、微細藻類培養用の培地を用いて培養することができる。培養は、上記「［イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類］」で記載した方法と同様に行うことができる。
【００６１】
本実施形態の藻類は、酸性温泉排水を用いた培地で培養することもできる。「酸性温泉排水」とは、温泉施設から排出される酸性の排水を意味する。酸性温泉排水としては、特に限定されないが、ｐＨ１．０〜４．０であることが好ましく、ｐＨ１．０〜３．０であることがより好ましい。また、「酸性温泉排水を用いた培地」とは、酸性温泉排水に窒素源、リン源、微量元素等を添加して調製した培地を意味する。酸性温泉排水を用いた培地としては、酸性温泉排水に窒素源を添加したものが好ましく、窒素源及びリン源を添加したものがより好ましい（例えば、Hirooka S and Miyagishima S.Y. (2016) Cultivation of Acidophilic Algae Galdieria sulphuraria and Pseudochlorella sp. YKT1 in Media Derived from Acidic Hot Springs. Front Microbiol. Dec 20;7:2022.参照）。  窒素源としては、アンモニウム塩（硫酸アンモニウム等）、尿素、硝酸塩（硝酸ナトリウム等）等が挙げられるが、アンモニウム塩、尿素が好ましく、アンモニウム塩がより好ましい。窒素源の添加量としては、例えば、窒素添加量として１〜５０ｍＭを挙げることができる。窒素源の添加量は、窒素添加量として５〜４０ｍＭが好ましく、１０〜３０ｍＭがより好ましい。リン源としては、リン酸塩（リン酸二水素カリウム等）が挙げられる。リン源の添加量としては、リン添加量として０．１〜１０ｍＭを挙げることができる、リン源の添加量は、リン添加量として０．５〜５ｍＭが好ましく、１〜３ｍＭがより好ましい。本実施形態の藻類は、酸性温泉排水を用いた培地で培養することもできるため、酸性温泉排水の有効利用が可能であり、且つ低コストで培養することができる。
本実施形態の藻類が、ガルデリア属に属する藻類である場合、上記の窒素源としては、アンモニア塩、尿素が好ましく、アンモニア塩がより好ましい。本実施形態の藻類が、シアニジウム属に属する藻類である場合、上記の窒素源としては、アンモニア塩、硝酸塩が好ましく、アンモニア塩がより好ましい。
【００６２】
（ＹＦＵ３株、ＨＫＮ１株）
本実施形態の藻類の具体例としては、例えば、シアニジウム・エスピー（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）ＹＦＵ３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３３４）（以下、「ＹＦＵ３株」という。）、及びシアニジウム・エスピー（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）ＨＫＮ１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３３３）（以下、「ＨＫＮ１株」という。）、並びにこれらの近縁種、変異株、及び子孫が挙げられる。
【００６３】
ＹＦＵ３株及びＨＫＮ１株は、いずれも、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態とを有する。以下、ＹＦＵ３株について、２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを区別して記載する場合には、２倍体の細胞形態を「ＹＦＵ３株（２倍体）」、１倍体の細胞形態を「ＹＦＵ３株（１倍体）」と記載する。同様に、ＨＫＮ１株について、２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを区別して記載する場合には、２倍体の細胞形態を「ＨＫＮ１株（２倍体）」、１倍体の細胞形態を「ＨＫＮ１株（１倍体）」と記載する。単に、「ＹＦＵ３株」又は「ＨＫＮ１株」と記載する場合には、２倍体の細胞形態及び１倍体の細胞形態の両方を包含するものとする。
【００６４】
ＹＦＵ３株（１倍体）は、日本国大分県由布市の温泉の高温酸性水より単離された単細胞紅藻である。ＹＦＵ３株は、２０１７年６月２８日付で、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３３４として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３３４として、２０１８年５月２３日付で国際寄託に移管されている。
ＨＫＮ１株は、日本国神奈川県足柄下郡箱根町の温泉の高温酸性水より単離された単細胞紅藻である。ＨＫＮ１株（１倍体）は、２０１７年６月２８日付で、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３３３として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３３３として、２０１８年５月２３日付で国際寄託に移管されている。
【００６５】
ＹＦＵ３株及びＨＫＮ１株は、いずれも、クロロフィルａに加えて、青色色素であるフィコシアニンを有するため、青緑色を呈している。ＹＦＵ３株及びＨＫＮ１株は、いずれも、高温酸性環境で好適に増殖し、至適温度は約４２℃、至適ｐＨはｐＨ２付近である。
【００６６】
ＹＦＵ３株（２倍体）及びＨＫＮ１株（２倍体）の細胞の大きさは、いずれも、約４μｍである。また、ＹＦＵ３株（１倍体）及びＨＫＮ１株（１倍体）の細胞の大きさは、いずれも、約２μｍである。また、ＹＦＵ３株（２倍体）及びＨＫＮ１株（２倍体）は、いずれも、強固な細胞壁を有する。すなわち、ｐＨ７の条件下で細胞破裂を生じない。一方、ＹＦＵ３株（１倍体）及びＨＫＮ１株（１倍体）は、いずれも、強固な細胞壁を有さない。すなわち、ｐＨ７の条件下で細胞破裂を生じる。
【００６７】
なお、ＹＦＵ３株（１倍体）及びＨＫＮ１株（１倍体）の細胞は、シアニディオシゾン・メロラエ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅ）の細胞に類似している（図８参照）。シアニディオシゾン・メロラエは、従来、イデユコゴメ綱に属する藻類の中で、強固な細胞壁を有さない、１倍体の藻類として、唯一知られている種である。本明細書においては、シアニディオシゾン・メロラエの細胞に類似した細胞を、「シアニディオシゾン・メロラエ様細胞」と記載することがある。
【００６８】
ＹＦＵ３株（２倍体）を静止期に入るまで培養し、静止期のまま培養を継続すると、幾つかのＹＦＵ３株（２倍体）が減数分裂し、１細胞のＹＦＵ３株（２倍体）から、４細胞のＹＦＵ３株（１倍体）生じる。同様に、ＨＫＮ１株（２倍体）を静止期に入るまで培養し、静止期のまま培養を継続すると、幾つかのＨＫＮ１株（２倍体）が減数分裂し、１細胞のＨＫＮ１株（２倍体）から、４細胞のＨＫＮ１株（１倍体）生じる。ＹＦＵ３株（１倍体）及びＨＫＮ１株（１倍体）は、いずれも、二分裂により、１倍体の細胞形態を維持したまま増殖することができる。
【００６９】
本実施形態の藻類の好適な例としては、上記ＹＦＵ３株及びＨＫＮ１株のほか、ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の近縁種であって、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有する、藻類が挙げられる。ＹＦＵ３株及びＨＫＮ１株の近縁種である藻類としては、例えば、ｒｂｃＬ遺伝子の塩基配列が、ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株のｒｂｃＬ遺伝子の塩基配列と、９０％以上の同一性を有する藻類が挙げられる。ＹＦＵ３株のｒｂｃＬ遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。また、ＨＫＮ１株のｒｂｃＬ遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す。したがって、ｒｂｃＬ遺伝子の塩基配列が、配列番号１又は２に記載の塩基配列と、９０％以上の同一性を有する藻類もまた、本実施形態の藻類の好適な例として挙げられる。当該藻類が有するｒｂｃＬ遺伝子の塩基配列と、配列番号１又は２に記載の塩基配列との同一性は、９５％以上であることが好ましく、９７％以上であることがより好ましく、９８％以上であることがさらに好ましく、９９％以上であることが特に好ましい。
藻類が有するｒｂｃＬ遺伝子の塩基配列は、公知の方法により得ることができる。例えば、対象とする藻類の細胞から公知の方法によりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法等によりｒｂｃＬ遺伝子のＤＮＡ断片を増幅し、増幅したＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシーケンサーで解析することにより、対象とする藻類のｒｂｃＬ遺伝子の塩基配列を得ることができる。ｒｂｃＬ遺伝子を増幅するためのプライマーとしては、例えば、本明細書の実施例で用いたプライマー等が挙げられる。
【００７０】
本実施形態の藻類の好適な例としては、ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の変異株であって、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有する、藻類、もまた挙げられる。本明細書において、「変異株」とは、自然発生的又は人為的に、元の藻類株のゲノム（核ゲノム、葉緑体ゲノム、ミトコンドリアゲノムを含む。以下、同じ。）に変異が生じた藻類株を意味する。ゲノムに変異を生じさせる人為的手法は、特に限定されず、紫外線照射、放射線照射、亜硝酸などによる化学的処理；遺伝子導入、ゲノム編集などの遺伝子工学的手法等を例示することができる。なお、本明細書において、「ＹＦＵ３株の変異株」とは、ＹＦＵ３株のゲノムに変異が生じた藻類株であって、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有する藻類株を指す。また、ＨＫＮ１株の変異株」とは、ＨＫＮ１株のゲノムに変異が生じた藻類株であって、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有する藻類株を指す。
ＹＦＵ３株の変異株としては、ＹＦＵ３株の全ゲノムに対する変異の割合が、全ゲノム中の１０％以下であることが好ましく、５％以下であることがより好ましく、３％以下であることがさらに好ましく、２％以下又は１％以下であることが特に好ましい。
ＨＫＮ１株の変異株としては、ＨＫＮ１株の全ゲノムに対する変異の割合が、全ゲノム中の１０％以下であることが好ましく、５％以下であることがより好ましく、３％以下であることがさらに好ましく、２％以下又は１％以下であることが特に好ましい。
上記において、全ゲノムに対する変異の割合は、２倍体の細胞形態同士の全ゲノム、又は１倍体の細胞形態同士の全ゲノムを比較して算出するものとする。
【００７１】
上記の中でも、ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の近縁種又は変異株としては、ＹＦＵ３株又はＨＮＫ１株が有する栄養成分組成と類似の栄養成分組成を有するものが好ましい。
例えば、ＹＦＵ３株及びＨＫＮ１株は、アミノ酸類及びビタミン類を豊富に含有する点に特徴がある。そのため、アミノ酸類又はビタミン類の含有量が、ＹＦＵ３株及びＨＫＮ１株と類似するものが好ましい。アミノ酸類及びビタミン類の含有量としては、上記に例示した含有量が挙げられる。
【００７２】
ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の変異株の具体例としては、遺伝子工学的手法を用いて遺伝子改変した形質転換体が挙げられる。遺伝子改変は、２倍体の細胞形態及び１倍体の細胞形態のいずれで行ってもよいが、１倍体の細胞形態で行う方が容易である。遺伝子改変の種類は、特に限定されず、任意の改変であってよい。
【００７３】
例えば、ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体の例としては、少なくとも１種の栄養成分の細胞内含有量が高められた形質転換体が挙げられる。細胞内含有量が高められる栄養成分の好適な例としては、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される少なくとも１種の栄養成分が挙げられる。すなわち、野生株と比較して、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される少なくとも１種の栄養成分の細胞内含有量が高い、ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体が好ましく例示される。
これらの中でも、アミノ酸類及びビタミン類からなる群より選択される少なくとも１種の栄養成分が好ましい。そのような形質転換体は、野生株と比較して、特定の栄養成分の細胞内含有量が高いため、当該栄養成分を豊富に含有する栄養剤を調製することができる。
栄養成分の細胞内含有量を高める方法は、特に限定されず、任意の方法を用いることができる。例えば、上記「［イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類］」で例示した方法と同様の方法が挙げられる。例えば、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼ、及びトコフェロールシクラーゼ等の栄養成分合成に関与する任意の酵素遺伝子の発現量が多くなるように、ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株を改変することにより、任意の栄養成分の細胞内含有量を高めることができる。
【００７４】
これらの合成酵素遺伝子の配列情報は、公知の方法により、対象遺伝子をクローニングし、クローニングした対象遺伝子の配列解析を行うことにより、取得することができる。
例えば、イデユコゴメ綱に属する藻類が有する公知の同種遺伝子の配列情報に基づいて、プライマーを設計し、ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株のゲノムを鋳型として、ＰＣＲ等により対象遺伝子の増幅断片を得てもよい。あるいは、公知のイデユコゴメ綱に属する藻類が有する同種遺伝子の配列情報に基づいて、プローブを設計し、ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてもよい。
また、導入遺伝子として、導入細胞で機能する限り、他種の生物の遺伝子を用いてもよい。例えば、イデユコゴメ綱に属する藻類の公知の遺伝子を用いてもよい。公知遺伝子の配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知の配列データベースより取得可能である。例えば、シアニディオシゾン・メロラエのグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＣＭＦ０７２Ｃ）、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＭＮ２０２Ｃ）、及びトコフェロールシクラーゼ遺伝子（ＣＭＬ３２６Ｃ）等を利用可能である。
【００７５】
例えば、前記のような栄養成分の合成酵素遺伝子（例、グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子）を、ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株に導入することにより、当該栄養成分の細胞内含有量が高められた形質転換体を得ることができる。導入遺伝子に用いるプロモーターは、当該合成酵素遺伝子のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。他の遺伝子のプロモーターを用いる場合、導入対象である藻類細胞において発現量が高い遺伝子のプロモーターが好ましい。そのようなプロモーターとしては、例えば、ＡＰＣＣ（ＣＭＯ２５０Ｃ）のプロモーター、ＣＰＣＣ（ＣＭＰ１６６Ｃ）のプロモーター、Ｃａｔａｌａｓｅ（ＣＭＩ０５０Ｃ）のプロモーター等が挙げられる。プロモーターは、導入細胞で機能する限り、導入細胞と同種の生物に由来するものであってもよく、他種の生物に由来するものであってもよい。
公知の遺伝子のプロモーターを用いる場合、その配列情報はＧｅｎＢａｎｋ等の公知の配列データベースより取得可能である。
【００７６】
ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体は、任意の核酸を導入したものであり得るが、セルフクローニングにより作製されたものであることがより好ましい。例えば、イデユコゴメ綱に属する藻類の中でも、シアニディオシゾン・メロラエでは、セルフクローニングの手法が確立されている（Fujiwara et al., PLoS One. 2013 Sep 5;8(9):e73608）。そのため、ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株においても、シアニディオシゾン・メロラエにおける方法と同様の方法により、セルフクローニングを行うことができる。
【００７７】
セルフクローニングを行う方法は、特に限定されないが、栄養要求性の変異株を用いる方法が挙げられる。例えば、シアニディオシゾン・メロラエでは、選択マーカーとして、ＵＲＡ５．３遺伝子（ＣＭＫ０４６Ｃ）を用いる方法が提案されている。上記「［イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類］」参照）。
【００７８】
ＹＦＵ３株及びＨＫＮ１株においても、公知の遺伝子ノックアウト技術等により、栄養要求性関連遺伝子をノックアウトして、栄養要求性変異株を作製することにより、当該ノックアウト対象の遺伝子を選択マーカーとして、セルフクローニングを行うことができる。ノックアウト技術としては、特に限定されず、公知の方法を用いればよい。ノックアウト技術としては、例えば、相同組換え、遺伝子編集技術等が挙げられる。ノックアウト対象とする遺伝子は、当該遺伝子のノックアウトにより栄養要求性が変化するものであれば、特に限定されない。ノックアウト対象の遺伝子としては、例えば、オロチジン−５’−デカルボキシラーゼ等が挙げられる。
【００７９】
また、上記のように栄養要求性関連遺伝子を選択マーカーとして用いて遺伝子改変を行った場合、藻類細胞に導入された栄養要求性関連遺伝子をノックアウトすることにより、再度、同じ栄養要求性関連遺伝子を選択マーカーとして、遺伝子改変を行うことができる。すなわち、多重セルフクローニングが可能である。選択マーカーとして導入した栄養要求性関連遺伝子のノックアウト方法は、特に限定されず、公知のノックアウト技術を用いればよい。ノックアウト技術としては、例えば、相同組換え、遺伝子編集技術等が挙げられる。
例えば、上記のように、シアニディオシゾン・メロラエにおいては、ＵＲＡ５．３遺伝子（ＣＭＫ０４６Ｃ）を選択マーカーとし、シアニディオシゾン・メロラエ  Ｍ４株を親株として、セルフクローニングを行うことが得きる。ＹＦＵ３株及びＨＫＮ１株においても、ＵＲＡ５．３遺伝子ノックアウト株を作製すれば、当該ノックアウト株は、ウラシルを含まない培地では生育できない。これを親株として、ＵＲＡ５．３遺伝子を導入して形質転換し、当該形質転換細胞をウラシルを含まない培地で培養することにより、形質転換体を選抜することができる。さらに、セルフクローニングを行う場合には、相同組換え等の公知のノックアウト技術により、ＵＲＡ５．３遺伝子を再度ノックアウトする。ＵＲＡ５．３遺伝子の再ノックアウト株は、ウラシル及び５−フルオロチン酸（５−ＦＯＡ）を含む培地で培養することにより、選抜することができる。ＵＲＡ５．３遺伝子を正常に発現する株では、ＵＲＡ５．３遺伝子の遺伝子産物により、ウラシル及び５−ＦＯＡが、毒性のある５-フルオロウラシルに変換されるためである。このようにして得たＵＲＡ５．３再ノックアウト株を親株とすれば、再度、ＵＲＡ５．３遺伝子を選択マーカーとして用いて、セルフクローニングを行うことができる。同様の操作を繰り返し行うことにより、所望の回数のセルフクローニングを行うことが可能である。ＵＲＡ５．３遺伝子のノックアウトは、ＵＲＡ５．３遺伝子全体を欠失させてもよく、ＵＲＡ５．３遺伝子を部分的に欠失させてもよく、ＵＲＡ５．３遺伝子に点変異を導入してもよい。
【００８０】
ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株に任意の核酸を導入する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、ポリエチレングリコール法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、遺伝子銃法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法などが挙げられる。
【００８１】
ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換を行う場合、導入核酸は、核ゲノム、葉緑体ゲノム、及びミトコンドリアゲノムのいずれかに挿入してもよい。導入核酸をゲノムに挿入する場合、ゲノムの特定の位置に挿入してもよく、ランダムにゲノムに挿入してもよい。ゲノムの特定の位置に導入核酸を挿入する方法としては、相同組換えを用いることができる。
【００８２】
以下に、ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株における形質転換方法の一例を例示するが、これに限定されない。
まず、ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株を、ＭＡ２Ｕ培地（実施例７参照）等の適切な培地に適当な濃度となるように希釈し、適切な培養条件下（例、明暗周期  １２Ｌ：１２Ｄ、光  ５０μｍｏｌ／ｍ２ｓ、温度  ４２℃）でエアレーションしながら、４０〜８０時間程度培養する。次に、前記培養液に最終濃度０．００２％となるようにＴｗｅｅｎ−２０を添加した後、遠心分離により細胞を回収し、ＭＡ２Ｕ培地等の適切な培地に懸濁する。ＰＥＧ４０００を含有する、４５０μＬのＭＡ２Ｕ培地に溶解し（９５℃、１０分）、６０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ４０００溶液を調製した。その後、ＰＥＧ４０００溶液を、使用するまで、ヒートブロック上で４２℃に維持した。
適切な選択マーカーを含む形質転換用ベクター及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００等）を含む形質転換用混合液に、ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の細胞懸濁液を添加して撹拌し、ＭＡ２Ｕ培地等の適切な培地に移して、適切な培養条件下（例、連続光  ２０μｍｏｌ／ｍ２ｓ）、温度  ４２℃）で、４０〜６０時間程度静置培養を行う。その後、遠心分離により細胞を回収し、塚原鉱泉培地（Hirooka et al. 2016 Front in Microbiology）または改変ＭＡ培地（実施例７参照）等の適切な培地に懸濁する。前記細胞懸濁液を、使用した選択マーカーに応じた選択培地（例、塚原鉱泉培地または改変ＭＡ培地等に特定物質を添加したもの又は前記培地等から特定物質を除去したもの）に加え、適切な培養条件下（例、連続光  ２０μｍｏｌ／ｍ２ｓ、温度  ４２℃、３％ＣＯ２）で、５〜１０日間程度静置培養する。緑色の濃くなった部分の培養液を採取した新たな選択培地に加え、さらに５〜１０日間程度静置培養し、形質転換体を選抜する。形質転換体は、例えば、倒立顕微鏡下で、先端を細くしたパスツールピペットを用いて、一細胞ずつ単離し、塚原鉱泉培地または改変ＭＡ培地等の適切な培地で静置培養することにより、形質転換株を得ることができる。
上記では、ポリエチレングリコール法による形質転換の例を述べたが、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、遺伝子銃法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等の他の形質転換法を用いてもよい。
【００８３】
ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の変異株の好ましい具体例としては、以下の（１）〜（１８）が例示されるが、これらに限定されない。
（１）野生株と比較して、γ−アミノ酪酸及びビタミンＥからなる群より選択される少なくとも１種の栄養成分の細胞内含有量が高い、ＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体。
（２）野生株と比較して、グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の発現量が高い、（１）に記載のＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体。
（３）グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含む核酸が発現可能な状態で導入された、（２）に記載のＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体。
（４）前記核酸が、イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞内で機能するプロモーターと、前記プロモーターに機能的に連結されたグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含む、（３）に記載のＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体。
（５）野生株と比較して、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼ遺伝子及びトコフェロールシクラーゼ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の発現量が高い、（１）に記載のＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体。
（６）ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼ遺伝子及びトコフェロールシクラーゼ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種を含む核酸が発現可能な状態で導入された、（５）に記載のＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体。
（７）前記核酸が、イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞内で機能するプロモーターと、前記プロモーターに機能的に連結されたホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む、（６）に記載のＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体。
（８）前記核酸が、イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞内で機能するプロモーターと、前記プロモーターに機能的に連結されたトコフェロールシクラーゼ遺伝子、を含む、（６）又は（７）に記載のＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体。
（９）前記プロモーターが、ＡＰＣＣプロモーター、ＣＰＣＣプロモーター、及びＣａｔａｌａｓｅプロモーターからなる群より選択される、（４）、（７）及び（８）のいずれかに記載のＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体。
（１０）前記核酸が、分類学上の別種に属する細胞に由来する塩基配列を含まない、（３）、（４）、及び（６）〜（９）のいずれかに記載のＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体。
（１１）前記核酸が、栄養要求性関連遺伝子を選択マーカーとして、細胞に導入されたものである、（１０）に記載のイデユコゴメ綱に属する藻類の形質転換体。
（１２）前記核酸が、栄養要求性関連遺伝子を選択マーカーとして、前記栄養要求性関連遺伝子のノックアウト細胞に導入されたものである、（１０）に記載のＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体。
（１３）前記グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子が、シアニディオシゾン・メロラエのグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子である、（３）、（４）及び（９）のいずれかに記載のＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体。
（１４）前記ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼ遺伝子が、シアニディオシゾン・メロラエのホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼ遺伝子である、（６）、（７）及び（９）のいずれかに記載のＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体。
（１５）前記トコフェロールシクラーゼ遺伝子が、シアニディオシゾン・メロラエのトコフェロールシクラーゼ遺伝子である、（６）、（８）及び（９）のいずれかに記載のＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体。
（１６）前記プロモーターが、シアニディオシゾン・メロラエに由来するプロモーターである、（４）及び（７）〜（９）のいずれかに記載のＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体。
（１７）１倍体の細胞形態の細胞である、（１）〜（１６）のいずれかに記載のＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体。
（１８）２倍体の細胞形態の細胞である、（１）〜（１６）のいずれかに記載のＹＦＵ３株又はＨＫＮ１株の形質転換体。
【００８４】
また、後述する実施例で示すように、ガルデリア属に属する藻類もまた、１倍体の細胞形態と、２倍体の細胞形態とを有することが確認された。したがって、本実施形態の藻類は、ガルデリア属に属する藻類であってもよい。ガルデリア属に属する藻類としては、例えば、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（例えば、ＳＡＧ１０８．７９株）、及びＧａｌｄｉｅｒｉａ  ｐａｒｔｉｔａ（例えば、ＮＢＲＣ  １０２７５９株）等が挙げられる。さらに、本実施形態の藻類は、上記ＹＦＵ３株及びＨＫＮ１株以外のシアニジウム属に属する藻類であってもよい。
【００８５】
［１倍体の藻類の製造方法］
本発明は、（ａ）イデユコゴメ綱に属する藻類であって、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態とを有する藻類の、前記２倍体の細胞形態の細胞を培養する工程と、（ｂ）前記培養中に生じる前記１倍体の細胞形態の細胞を単離する工程と、を含む、１倍体の細胞形態の藻類の製造方法を提供する。
【００８６】
イデユコゴメ綱に属する藻類であって、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態とを有する藻類（以下、「本藻類」という場合がある。）は、上記「［２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを有する藻類］」において説明した藻類と同様である。本藻類の好ましい例としては、ＹＦＵ３株及びＨＫＮ１株、並びにこれらの変異株もしくは類縁株等が挙げられる。
また、後述する実施例で示されるように、ガルデリア属に属する藻類（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ  ＳＡＧ１０８．７９、及びＧａｌｄｉｅｒｉａ  ｐａｒｔｉｔａ  ＮＢＲＣ  １０２７５９）も、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態とを有することが確認された。この結果は、イデユコゴメ綱（例えば、ガルデリア属及びシアニジウム属）には、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有する藻類が広く存在している可能性を示唆する。したがって、本実施形態の製造方法を適用可能な藻類は、ガルデリア属又はシアニジウム属に属する藻類であってもよく、上記例示したものに限定されない。ガルデリア属に属する藻類の具体例としては、例えば、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ、及びＧａｌｄｉｅｒｉａ  ｐａｒｔｉｔａが挙げられる。
本実施形態の製造方法によれば、２倍体の細胞形態から、１倍体の細胞形態の藻類を製造することができる。１倍体の藻類では、２倍体の藻類に比べて、形質転換を容易に行うことができる。
【００８７】
（工程（ａ））
工程（ａ）は、イデユコゴメ綱に属する藻類であって、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態とを有する藻類（本藻類）の、２倍体の細胞形態の細胞を培養する工程である。
【００８８】
本藻類は、特に限定されず、イデユコゴメ綱に属する藻類で、２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを有することが確認された藻類の、２倍体の細胞形態の細胞を培養すればよい。具体例としては、ＹＦＵ３株（２倍体）及びＨＫＮ１株（２倍体）、並びにこれらの近縁種、変異株等が挙げられる。また、ガルデリア属に属する藻類（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｐａｒｔｉｔａ等）の２倍体の細胞形態、シアニジウム属に属する藻類の２倍体の細胞形態等が挙げられる。
【００８９】
培養条件としては、上記「［イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類］」又は「［２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを有する藻類］」に挙げた培養条件が挙げられる。具体的には、ｐＨ条件としては、ｐＨ１．０〜６．０を例示することができ、ｐＨ１．０〜５．０が好ましい。また、温度条件としては１５〜５０℃を例示することができ、３０〜５０℃が好ましい。培地は、上記「［イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類］」又は「［２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを有する藻類］」で挙げた培地が例示され、中でも、酸性温泉排水を用いた培地が好ましい。酸性温泉排水を用いた培地の具体例としては、塚原鉱泉培地（Hirooka et al. 2016 Front in Microbiology）が挙げられる。
【００９０】
培養は、上記実施形態の藻類が、静止期になるまで行うことが好ましく、静止期のまま培養を任意の期間継続することがより好ましい。培養期間としては、例えば、２〜６０日、３〜４０日、又は５〜３５日等が挙げられる。培養開始から静止期になるまでの期間は、藻類の種類により異なるため、藻類の種類に応じて培養期間を設定することができる。また、静止期の培養液から細胞を回収して植え継ぎを行い、さらに１〜５日程度培養を行ってもよい。
【００９１】
（工程（ｂ））
工程（ｂ）は、前記培養中に生じる１倍体の細胞形態の細胞を単離する工程である。
【００９２】
工程（ａ）における培養により、２倍体の細胞形態の本藻類が減数分裂し、１倍体の細胞形態の本藻類が生じる。光学顕微鏡観察を行った場合、１倍体の細胞形態の細胞は、２倍体の細胞形態の細胞とは細胞の形状が異なっている（例えば、２倍体の細胞形態の細胞よりも細胞サイズが小さい、強固な細胞壁が観察されない等）。そのため、細胞形状の差異に基づき、１倍体の細胞形態の細胞を見分けることができる。当該１倍体の細胞形態の細胞をパスツールピペット等により採取して単離することにより、１倍体の細胞形態の藻類を製造することができる。
単離した１倍体の細胞形態の藻類は、上記「［イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類］」又は「［２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを有する藻類］」で挙げた培地等を用いて培養すればよい。前記の２倍体の細胞形態の細胞の培養液中に出現した１倍体の細胞形態の細胞を、１細胞ずつ単離して、それぞれ増殖させることにより、単一クローンの１倍体の細胞形態の藻類を得ることができる。
【００９３】
他の態様において、本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類であって、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有する藻類（本藻類）の、１倍体の細胞形態である、藻類（細胞）を提供する。当該藻類は、前記の１倍体の藻類の製造方法により得ることができる。また、本発明は、ＹＦＵ３株の１倍体の細胞形態である藻類（細胞）、ＨＫＮ１株の１倍体の細胞形態である藻類（細胞）、シアニジウム属に属する藻類の１倍体の細胞形態である藻類（細胞）、及びガルデリア属に属する藻類の１倍体の細胞形態である藻類（細胞）もまた提供する。ガルデリア属に属する藻類の具体例としては、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ及びＧａｌｄｉｅｒｉａ  ｐａｒｔｉｔａが挙げられる。
【００９４】
［２倍体の藻類の製造方法］
本発明は、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有する藻類であって、（ａ）２種類以上の１倍体の細胞形態の細胞を混合し、培養する工程と、（ｂ）前記培養中に生じた２倍体の細胞形態の細胞を単離する工程と、を含む、１倍体の藻類の製造方法を提供する。
【００９５】
後述する実施例で示されるように、１倍体の細胞形態の細胞どうしを混合して培養することにより、２倍体の細胞形態の細胞を得ることができる。
【００９６】
（工程（ａ））
工程（ａ）は、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有する藻類であって、２種類以上の１倍体の細胞形態の細胞を混合し、培養する工程である。
【００９７】
本工程で混合する２種類以上の１倍体の細胞形態の細胞は、同種の藻類の細胞であることが好ましい。より好ましくは、同じ株の２倍体の細胞形態の細胞に由来する１倍体の細胞形態の細胞を用いる。
【００９８】
培養条件としては、上記「［イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類］」又は「［２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを有する藻類］」に挙げた培養条件が挙げられる。具体的には、ｐＨ条件としては、ｐＨ１．０〜６．０を例示することができ、ｐＨ１．０〜５．０が好ましい。また、温度条件としては１５〜５０℃を例示することができ、３０〜５０℃が好ましい。培地は、上記「［イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類］」又は「［２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを有する藻類］」で挙げた培地が例示される。
【００９９】
培養は、例えば、１〜４週間程度行うことが好ましく、さらに植え継ぎを行って３〜１０日間程度培養を行ってもよい。
【０１００】
（工程（ｂ））
工程（ｂ）は、前記培養中に生じた２倍体の細胞形態の細胞を単離する工程である。
【０１０１】
工程（ａ）における培養により、１倍体の細胞形態の細胞どうしが接合し、２倍体の細胞形態の細胞が生じる。当該２倍体の細胞形態の細胞をパスツールピペット等により採取して単離することにより、２倍体の藻類を製造することができる。
単離した２倍体の藻類は、上記「［イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類］」又は「［２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを有する藻類］」で挙げた培地(好ましくはＭ−Ａｌｌｅｎ培地等の人工合成培地)等を用いて培養すればよい。
【０１０２】
他の態様において、本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類であって、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有する藻類（本藻類）の、２倍体の細胞形態である、藻類（細胞）を提供する。当該藻類は、前記の２倍体の藻類の製造方法により得ることができる。また、本発明は、ＹＦＵ３株の２倍体の細胞形態である藻類（細胞）、ＨＫＮ１株の２倍体の細胞形態である藻類（細胞）、シアニディオシゾン属に属する藻類の１倍体の細胞形態である藻類（細胞）もまた提供する。シアニディオシゾン属に属する藻類の具体例としては、シアニディオシゾン・メロラエが挙げられる。
【０１０３】
［本藻類の培養物］
本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類であって、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有する藻類（本藻類）を含む藻類培養物を提供する。本実施形態の藻類培養物では、全藻類の細胞数における、１倍体の細胞形態の藻類の細胞数の割合が、７０〜１００％である。
【０１０４】
本藻類は、自然界では、２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とが混在していると推測されるが、公知のガルデリア属に属する藻類、及びシアニジウム属に属する藻類は、いずれも強固な細胞壁を有する細胞として見出されていることから、自然界では、２倍体の細胞形態として存在するものがほとんどであると考えられる。
一方、上記実施形態にかかる１倍体の藻類の製造方法によれば、２倍体の細胞形態の本藻類を静止期になるまで培養し、そのまま培養を継続すると、２倍体の細胞形態の本藻類が減数分裂し、１倍体の細胞形態の本藻類が出現してくる。前記の１倍体の細胞形態の本藻類は、二分裂で増殖し、そのまま培養を継続すると、１倍体の細胞形態の本藻類の割合が大きくなっていく。そして、さらに培養を継続するか、１倍体の細胞形態のものを単離して培養することにより、１倍体の細胞形態の本藻類が７０〜１００％の藻類培養物を得ることができる。
【０１０５】
本藻類は、特に限定されず、イデユコゴメ綱に属する藻類で、２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを有することが確認された藻類の、２倍体の細胞形態を培養すればよい。具体例としては、ＹＦＵ３株（２倍体）及びＨＫＮ１株（２倍体）、並びにこれらの近縁種、変異株等が挙げられる。また、ガルデリア属に属する藻類（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｐａｒｔｉｔａ等）の２倍体の細胞形態、シアニジウム属に属する藻類の２倍体の細胞形態等が挙げられる。
２倍体の細胞形態の本藻類の培養条件としては、上記「［イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類］」又は「［２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを有する藻類］」で挙げた培養条件と同様の条件が挙げられる。
【０１０６】
本実施形態の藻類培養物は、１倍体の細胞形態が、７０〜１００％であるため、自然界における１倍体の細胞形態の割合とは大きく異なる。
【０１０７】
他の態様において、本発明は、イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類であって、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有する、藻類の、２倍体の細胞形態の細胞からなる細胞群を提供する。前記のイデユコゴメ綱に属する藻類の好ましい例としては、ＹＦＵ３株、ＨＫＮ１株、及びこれらの変異株、並びにシアニディオシゾン属に属する藻類が挙げられる。前記シアニディオシゾン属に属する藻類としては、シアニディオシゾン・メロラエが挙げられる。
他の態様において、本発明は、イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類であって、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有する、藻類の、１倍体の細胞形態の細胞からなる細胞群を提供する。前記のイデユコゴメ綱に属する藻類の好ましい例としては、ＹＦＵ３株、ＨＫＮ１株、及びこれらの変異株、並びに前記以外のシアニジウム属に属する藻類、ガルデリア属に属する藻類属に属する藻類が挙げられる。ガルデリア属に属する藻類としては、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ及びＧａｌｄｉｅｒｉａ  ｐａｒｔｉｔａが挙げられる。
他の態様において、本発明は、イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類であって、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有する、藻類の、２倍体の細胞形態の細胞と、１倍体の細胞形態の細胞とが、混在している、細胞群を提供する。
【０１０８】
［本藻類の乾燥膨潤処理物］
本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類であって、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有する藻類（本藻類）を、乾燥膨潤処理した、乾燥膨潤処理物を提供する。
【０１０９】
本藻類を、乾燥膨潤処理することにより、藻類細胞を死滅させることができる。そのため、セルフクローニングによらない形質転換体であっても、開放系で取り扱うことができる。なお、「乾燥膨潤処理」とは、藻類細胞を乾燥させた後、当該乾燥物に水性媒体等を加えて、再度湿潤させることをいう。乾燥膨潤処理の具体例としては、例えば、上記（３）の細胞破砕処理が挙げられる。
乾燥膨潤処理に供する本藻類は、２倍体の細胞形態であってもよく、１倍体の細胞形態であってもよく、２倍体の細胞形態及び１倍体の細胞形態の混合物であってもよい。例えば、上記実施形態の藻類培養物から回収した細胞であってもよい。乾燥膨潤処理に供する倍数性変化型藻類は、好ましくは、１倍体の細胞形態である。
【０１１０】
［本藻類の抽出物］
本藻類は、上記のように、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、食物繊維等の栄養成分を豊富に含有するため、下記に説明する栄養成分組成物、又は栄養剤として用いることができる。また、食品、飼料、ペットフード、化粧品等に配合することにより、栄養成分の強化された製品を提供することができる。また、前記のような製品には、本藻類に替えて、又は本藻類共に、本藻類の抽出物を用いてもよい。そのため、本発明は、本藻類の抽出物もまた提供する。
【０１１１】
本明細書において、「本藻類の抽出物」とは、本藻類の細胞に対して、物理的処理又は化学的処理を行って、細胞内の成分を抽出したものをいう。例えば、本藻類の抽出物は、物理的処理又は化学的処理によって、本藻類の細胞を破壊した細胞破壊物であってもよい。また、本藻類の抽出物は、前記細胞破壊物を濃縮したものであってもよく、前記細胞破壊物から固形分を除去したものであってもよく、前記細胞破壊物から一部の成分を分離したものであってもよい。
【０１１２】
細胞に対する物理的処理又は化学的処理の方法は、特に限定されず、細胞の破壊に一般的に用いられる方法を用いることができる。物理的処理としては、例えば、ガラスビーズ、乳鉢、超音波処理、フレンチプレス、ホモジナイザー等による細胞破壊が挙げられる。
化学的処理としては、例えば、中和処理、低張処理、凍結融解処理、乾燥膨潤処理等が挙げられる。より具体的には、上記（Ａ）〜（Ｃ）の細胞破裂処理が例示される。
細胞破壊物を濃縮する場合、濃縮方法は特に限定されず、一般的に用いられる濃縮方法を用いればよい。細胞破壊物の濃縮方法としては、例えば、乾燥、凍結乾燥、減圧乾燥等が挙げられる。
また、細胞破壊物から固形分を除去する場合、固形分の除去方法は特に限定されず、固形分の除去等に一般的に用いられる方法を用いることができる。固形分の除去方法としては、例えば、ろ過、遠心分離等が挙げられる。
細胞破壊物から一部の成分を分離する場合、分離方法は特に限定されず、生化学物質の分離・精製等に一般的に用いられる方法を用いることができる。分離方法としては、例えば、塩析、透析、溶媒抽出、吸着、カラムクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ等が挙げられる。これらの方法は、単独で用いてもよく、２種以上の処理を組み合わせて用いてもよい。ただし、単一の成分に精製されたものは、「本藻類の抽出物」からは除かれる。本藻類の抽出物は、好ましくは、本藻類の細胞成分を１０種以上、より好ましくは１５種以上、さらに好ましくは２０種以上含む。
好ましくは、本藻類の抽出物は、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される栄養成分を含み、より好ましくは、アミノ酸類、及びビタミン類からなる群より選択される栄養成分を含む。アミノ酸類の具体例としては、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、γ−アミノ酪酸等が挙げられる。ビタミン類の具体例としては、ビタミンＡ、β−カロテン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、葉酸等が挙げられる。
【０１１３】
［栄養成分組成物］
１実施形態において、本発明は、イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類又はその抽出物を含む、栄養成分組成物を提供する。
【０１１４】
本実施形態の栄養成分組成物は、イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類又はその抽出物を含むため、当該藻類が豊富に含有する栄養成分を豊富に含む。例えば、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される栄養成分を豊富に含み、特にアミノ酸類及びビタミン類からなる群より選択される栄養成分を豊富に含み得る。そのため、後述する栄養剤、食品、飼料、ペットフード、化粧品等に配合して用いることができる。
【０１１５】
イデユコゴメ綱に属する藻類は、特に限定されないが、上記本藻類又はシアニディオシゾン属に属する藻類が好ましく例示される。
【０１１６】
本藻類は、２倍体の細胞形態であってもよく、１倍体の細胞形態であってもよく、２倍体の細胞形態及び１倍体の細胞形態の混合物であってもよい。例えば、上記実施形態の藻類培養物から回収した細胞であってもよい。本実施形態の栄養成分組成物に含まれる本藻類の例としては、上記「［２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを有する藻類］」で挙げたものが挙げられる。具体例としては、ＹＦＵ３株及びＨＫＮ１株、並びにこれらの近縁種、変異株等が挙げられる。また、前記以外のシアニジウム属に属する藻類、及びガルデリア属に属する藻類も挙げられる。中でも、ＹＦＵ３株、ＨＫＮ１株、及びこれらの変異株、並びにガルデリア属に属する藻類が好ましく、ＹＦＵ３株、ＨＫＮ１株、及びこれらの変異株がより好ましい。
２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態のいずれかが強固な細胞壁を有さない場合、強固な細胞壁を有さない細胞形態のものを用いることが好ましい。それにより、栄養成分の抽出が容易であるという利点を有する。また、藻類細胞のまま栄養成分組成物に配合した場合であっても、栄養成分組成物摂取後に藻類細胞内の栄養成分が吸収されやすいという利点もある。例えば、ＹＦＵ３株、ＨＫＮ１株、又はこれらの変異株を用いる場合には、ＹＦＵ３株（１倍体）、ＨＫＮ１株（１倍体）、又はこれらの変異株を用いることが好ましい。また、ガルデリア属に属する藻類（例えば、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｐａｒｔｉｔａ等）の１倍体の細胞形態、シアニジウム属に属する藻類の１倍体の細胞形態も好ましく例示される。中でも、ＹＦＵ３株（１倍体）、ＨＫＮ１株（１倍体）、若しくはこれらの変異株、及びガルデリア属に属する藻類の１倍体の細胞形態が好ましい。
【０１１７】
イデユコゴメ綱に属する藻類は、本藻類以外のイデユコゴメ綱に属する藻類であってもよい。中でも、シアニディオシゾン属に属する藻類は、強固な細胞壁を有さない。そのため、中和処理、低張処理、凍結融解処理などの比較的温和な処理により、細胞を破壊することができる。したがって、シアニディオシゾン属に属する藻類（例、シアニディオシゾン・メロラエ）は、イデユコゴメ綱に属する藻類の好ましい例である。
【０１１８】
イデユコゴメ綱に属する藻類は、適切な培地を用いて培養して増殖させ、遠心分離やろ過等の公知の方法により回収し、適宜、洗浄、乾燥等を行って、本実施形態の栄養剤に用いることができる。あるいは、上記実施形態の藻類培養物から藻類細胞を回収し、適宜、洗浄、乾燥等を行って本実施形態の栄養成分組成物に用いてもよい。
【０１１９】
また、本実施形態の栄養成分組成物は、イデユコゴメ綱に属する藻類に替えて、又はイデユコゴメ綱に属する藻類と共に、イデユコゴメ綱に属する藻類の抽出物を含んでいてもよい。
【０１２０】
本実施形態の栄養成分組成物は、イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物に加えて、適宜、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、特に限定されないが、薬学的に許容される担体等が挙げられる。なお、「薬学的に許容される担体」とは、イデユコゴメ綱に属する藻類が含む栄養成分の機能を阻害せず、且つ、その投与対象に対して実質的な毒性を示さない担体を意味する。また、「実質的な毒性を示さない」とは、その成分が通常使用される投与量において、投与対象に対して毒性を示さないことを意味する。薬学的に許容される担体としては、特に限定されないが、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、乳化剤、安定剤、希釈剤、油性基剤、増粘剤、酸化防止剤、還元剤、酸化剤、キレート剤、溶媒等が挙げられる。薬学的に許容される担体は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【０１２１】
本実施形態の栄養成分組成物におけるイデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物の含有量は、特に限定されず、例えば、１〜１００質量％の範囲で適宜選択可能である。本実施形態の栄養剤におけるイデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物の含有量としては、５０〜１００質量％が好ましく、６０〜１００質量％がより好ましく、７０〜１００質量％がさらに好ましい。
イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物は、適宜他の成分と混合し、定法に従って、乾燥粉末、顆粒剤、錠剤、ゼリー剤、液剤、カプセル剤等の形態とすることができる。
【０１２２】
［栄養剤］
１実施形態において、本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物を含む、栄養剤を提供する。
【０１２３】
栄養剤とは、ヒト又はヒト以外の動物が栄養成分を補給するために使用されるものであり、剤形、精製度等は特に限定されない。上記のとおり、イデユコゴメ綱に属する藻類は、アミノ酸類、ビタミン類等の栄養成分を多く含むため、イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物を用いることにより、アミノ酸類、ビタミン類等の栄養成分を多く含む栄養剤を得ることができる。
本実施形態の栄養剤は、アミノ酸類やビタミン類等の栄養成分を多く含むため、これらの栄養成分の補給用栄養剤としてヒトやヒト以外の動物に使用することができる。本実施形態の栄養剤により供給される栄養成分としては、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、食物繊維等が例示される。中でも、本実施形態の栄養剤は、アミノ酸類（イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、γ−アミノ酪酸など）、及びビタミン類（ビタミンＡ、β−カロテン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、ナイアシン、イノシトール、葉酸、ビオチンなど）を補給するために、好適に用いることができる。イデユコゴメ綱に属する藻類が本藻類である場合、本実施形態の栄養剤は、特に、アミノ酸類（イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、γ−アミノ酪酸など）、及びビタミン類（ビタミンＡ、β−カロテン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、ナイアシン、イノシトール、葉酸、ビオチンなど）を補給するために、好適に用いることができる。
本実施形態の栄養剤は、特に、γ―アミノ酪酸、β−カロテン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、葉酸を補給するために、好適に用いることができる。
【０１２４】
本実施形態の栄養剤は、イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物に加えて、適宜、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、特に限定されないが、薬学的に許容される担体等が挙げられる。薬物的に許容される担体としては、上記「［栄養成分組成物］」で例示したものと同様のものが挙げられる。薬学的に許容される担体は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【０１２５】
本実施形態の栄養剤におけるイデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物の含有量は、特に限定されず、例えば、１〜１００質量％の範囲で適宜選択可能である。本実施形態の栄養剤におけるイデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物の含有量としては、５０〜１００質量％が好ましく、６０〜９９質量％がより好ましく、７０〜９９質量％がさらに好ましい。
イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物は、適宜他の成分と混合し、定法に従って、乾燥粉末、顆粒剤、錠剤、ゼリー剤、液剤、カプセル剤等の形態とすることができる。
【０１２６】
また、本実施形態の栄養剤は、そのままヒト又はヒト以外の生物に用いてもよく、後述する食品、飼料、ペットフード、化粧品等の栄養成分補給用組成物に配合して用いてもよい。本実施形態の栄養剤を配合することにより、アミノ酸類、ビタミン類等の栄養成分の補給に適した組成物を調製することができる。
【０１２７】
また、他の態様において、本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類を培養する工程と、培養した前記イデユコゴメ綱に属する藻類を回収する工程と、回収した前記イデユコゴメ綱に属する藻類を製剤化する工程と、を含む栄養剤の製造方法を提供する。
また、他の態様において、本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類を培養する工程と、培養した前記イデユコゴメ綱に属する藻類を回収する工程と、回収した前記イデユコゴメ綱に属する藻類の抽出物を得る工程と、前記イデユコゴメ綱に属する藻類の抽出物を製剤化する工程と、を含む栄養剤の製造方法を提供する。
【０１２８】
［栄養成分補給用組成物］
１実施形態において、本発明は、上述の栄養剤を含む、栄養成分補給用組成物を提供する。
【０１２９】
本明細書において、「栄養成分補給用組成物」とは、ヒト又はヒト以外の動物が栄養成分を体内に取り入れるために用いられる組成物をいう。栄養成分の体内への取り込みは、経口的なものであってもよく、非経口的なものであってもよい。
【０１３０】
本実施形態の栄養成分補給用組成物は、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維等を多く含む。これらの成分は、上述の栄養剤が多く含む栄養成分である。
これらの中でも、本実施形態の栄養成分補給用組成物は、アミノ酸類、及びビタミン類を多く含む点に特徴がある。
特に、アミノ酸類の中では、γ−アミノ酪酸を多く含む点に特徴があり、ビタミン類の中では、β−カロテン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、及び葉酸を多く含む点に特徴がある。例えば、γ−アミノ酪酸は、脳機能改善効果や血圧低下効果を有することが知られている。また、βカロテン、ビタミンＣ、ビタミンＥは、抗酸化作用を有することが知られている。また、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２は、骨粗鬆症改善効果を有することが知られている。また、葉酸は、妊娠期の胎児の発育に必要であることが知られており、循環器疾患改善効果も報告されている。
したがって、本実施形態の栄養成分補給用組成物を摂取することにより、上記のような栄養成分が有する体調改善効果等を得ることができる。そのため、本実施形態の栄養成分補給用組成物は、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維から選択される少なくとも１種の栄養成分を補給するために好適に用いられる。また、本実施形態の栄養成分補給用組成物は、アミノ酸類、及びビタミン類からなる群より選択される少なくとも１種の栄養成分を補給するためにより好適に用いられる。
【０１３１】
本実施形態の栄養成分補給用組成物は、ヒト又はヒト以外の動物が栄養成分を体内に取り入れるために用いられるものであれば、特に限定されない。本実施形態の栄養成分補給用組成物としては、例えば、食品、飼料、ペットフード、化粧品等が挙げられる。
【０１３２】
（食品）
本実施形態の栄養成分補給用組成物は、食品であってもよい。したがって、本発明は、上記実施形態の栄養成分組成物又は栄養剤を含む、食品、もまた提供する。また、本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物を含む、食品、もまた提供する。
本実施形態の栄養成分補給用組成物が食品である場合、上述の栄養成分組成物又は栄養剤は、食品添加剤として、食品に添加されてもよい。上述の栄養成分組成物又は栄養剤を食品に添加することにより、上述の栄養成分組成物又は栄養剤が含む栄養成分が強化された食品を調製することができる。そのため、他の態様において、本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物を含む食品添加剤を提供する。
本実施形態の食品は、上述の栄養成分組成物又は栄養剤を食品原料に添加し、適宜他の食品添加物を添加して、食品の種類に応じた既知の方法に従って、製造することができる。
【０１３３】
本実施形態の食品において、食品の種類は特に限定されない。食品としては、例えば、そば、うどん、はるさめ、中華麺、即席麺、カップ麺などの各種の麺類；パン、小麦粉、米粉、ホットケーキ、マッシュポテトなどの炭水化物類；青汁、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、野菜飲料、乳酸飲料、乳飲料、スポーツ飲料、茶、コーヒーなどの飲料；豆腐、おから、納豆などの豆製品；カレールー、シチュールー、インスタントスープなどの各種スープ類；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷などの冷菓類；飴、クッキー、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、その他の焼き菓子などの菓子類；かまぼこ、はんぺん、ハム、ソーセージなどの水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳、バター、チーズ、ヨーグルトなどの乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシングなどの油脂及び油脂加工食品；ソース、ドレッシング、味噌、醤油、たれなどの調味料；各種レトルト食品、ふりかけ、漬物などのその他加工食品、等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１３４】
上記のような食品において、上述の栄養成分組成物又は栄養剤の含有量は特に限定されず、食品の種類に応じて適宜含有量を設定すればよい。例えば、食品の風味等を考慮し、食品における上述の栄養成分組成物又は栄養剤の含有量は、イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物の含有量として、０．０１〜３０質量％を例示することができる。食品の風味等の観点からは、０．０５〜２０質量％が好ましく、０．１〜１５質量％がより好ましく、０．１〜１０質量％がさらに好ましく、０．１〜５質量％が特に好ましい。
【０１３５】
また、食品は、機能性食品又は栄養補助食品であってもよい。機能性食品又は栄養補助食品は、上述のような一般的な食品の形態であってもよく、乾燥粉末、顆粒剤、錠剤、ゼリー剤、ドリンク剤等の形態であってもよい。この場合、上述の栄養成分組成物又は栄養剤と、適宜他の成分とを混合して、定法に従って、乾燥粉末、顆粒剤、錠剤、ゼリー剤、ドリンク剤等の形態とすることができる。他の成分としては、特に限定されず、例えば、薬学的に許容される担体等が例示される。薬学的に許容される担体としては、上記「［栄養成分組成物］」で挙げたものと同様のものが挙げられる。また、風味等を改善するために、甘味剤、矯味剤、各種調味料、香料、油脂類、その他の食品添加物等を他の成分として用いてもよい。他の成分は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【０１３６】
上記のような機能性食品又は栄養補助食品において、上述の栄養成分組成物又は栄養剤の含有量は特に限定されず、機能性食品又は栄養補助食品の種類に応じて適宜含有量を設定すればよい。例えば、機能性食品又は栄養補助食品が乾燥粉末、顆粒剤、錠剤等の形態である場合、当該機能性食品又は栄養補助食品における上述の栄養成分組成物又は栄養剤の含有量は、イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物の含有量として、０．１〜９９質量％が例示される。
風味及び栄養成分の効率的補給の観点からは、１〜９０質量％が好ましく、１０〜８５質量％がより好ましく、２０〜８５質量％がさらに好ましく、２５〜８５質量％が特に好ましい。また、機能性食品又は栄養補助食品がゼリー剤、ドリンク剤等の形態である場合、当該機能性食品又は栄養補助食品における上述の栄養剤の含有量は、イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物の含有量として、０．０５〜８０質量％が例示される。風味及び栄養成分の効率的補給の観点からは、１〜７５質量％が好ましく、１０〜７０質量％がより好ましく、１５〜７０質量％がさらに好ましく、２０〜７０質量％が特に好ましい。
【０１３７】
本実施形態の食品は、イデユコゴメ綱に属する藻類が含有する上述のような栄養成分を効率的に補給するために、摂取することができる。本実施形態の食品は、特に、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される栄養成分を効率的に補給するために、摂取することができる。これらの栄養成分の中でも、本実施形態の食品は、アミノ酸類、及びビタミン類からなる群より選択される栄養成分の摂取に有効である。
【０１３８】
（飼料、ペットフード）
本実施形態の栄養成分補給用組成物は、飼料又はペットフードであってもよい。したがって、本発明は、上記実施形態の栄養成分組成物又は栄養剤を含む、飼料又はペットフードもまた提供する。また、本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物を含む、飼料又はペットフード、もまた提供する。
本実施形態の栄養成分補給用組成物が飼料又はペットフードである場合、上述の栄養成分組成物又は栄養剤は、飼料添加剤又はペットフード添加剤として、飼料又はペットフードに添加されてもよい。上述の栄養成分組成物又は栄養剤を飼料又はペットフードに添加することにより、上述の栄養成分組成物又は栄養剤が含む栄養成分が強化された飼料又はペットフードを調製することができる。そのため、他の態様において、本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物を含む飼料添加剤又はペットフード添加剤を提供する。
【０１３９】
本実施形態の飼料又はペットフードは、上述の栄養成分組成物又は栄養剤を飼料原料又はペットフード原料に添加し、適宜他の飼料添加物又はペットフード添加物を添加して、飼料原料又はペットフードの種類に応じた既知の方法に従って、製造することができる。
【０１４０】
本実施形態の飼料又はペットフードが与えられる動物の種類は特に限定されない。例えば、家畜類（牛、豚、鶏、馬、ヒツジ、ヤギなど）、魚類、貝類、ペット（イヌ、ネコ、ハムスター、ウサギ、インコ、熱帯魚、爬虫類、両生類、昆虫など）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４１】
本実施形態の飼料又はペットフードにおいて、上述の栄養成分組成物又は栄養剤の含有量は特に限定されず、飼料又はペットフードの種類に応じて適宜含有量を設定すればよい。例えば、飼料又はペットフードにおける上述の栄養成分組成物又は栄養剤の含有量は、イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物の含有量として、０．０１〜９０質量％が例示され、０．１〜８０質量％が好ましく、１〜７０質量％がさらに好ましく、１〜６０質量％が特に好ましい。
【０１４２】
本実施形態の飼料又はペットフードは、イデユコゴメ綱に属する藻類が含有する上述のような栄養成分を、当該動物に効率的に補給させるために用いることができる。本実施形態の飼料又はペットフードは、特に、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される栄養成分を、当該動物に効率的に補給させるために用いることができる。これらの栄養成分の中でも、本実施形態の飼料又はペットフードは、アミノ酸類、及びビタミン類からなる群より選択される栄養成分の摂取に有効である。
【０１４３】
（化粧品）
本実施形態の栄養成分補給用組成物は、化粧品であってもよい。したがって、本発明は、上記実施形態の栄養成分組成物又は栄養剤を含む、化粧品もまた提供する。また、本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物を含む、化粧品、もまた提供する。
本実施形態の栄養成分補給用組成物が化粧品である場合、上述の栄養成分組成物又は栄養剤は、化粧品添加剤として、化粧品に添加されてもよい。上述の栄養成分組成物又は栄養剤を化粧品に添加することにより、上述の栄養成分組成物又は栄養剤が含む栄養成分を含む化粧品を調製することができる。そのため、他の態様において、本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物を含む化粧品添加剤を提供する。
【０１４４】
本実施形態の化粧品は、上述の栄養成分組成物又は栄養剤と、適宜他の成分とを混合して、化粧品の種類に応じた既知の方法に従って、製造することができる。他の成分としては、特に限定されず、例えば、薬学的に許容される担体等が例示される。薬学的に許容される担体としては、上記「［栄養成分組成物］」で挙げたものと同様のものが挙げられる。また、化粧品添加物として公知の材料を他の成分として用いてもよい。他の成分は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【０１４５】
本実施形態の化粧品において、化粧品の種類は特に限定されない。化粧品としては、例えば、化粧水、乳液、ローション、クリーム、ジェル、サンスクリーン剤、パック、マスク、美容液などの基礎化粧品；ファンデーション類、化粧下地、口紅類、リップグロス、頬紅類などのメーキャップ化粧品；洗顔剤、ボディーシャンプー、クレンジング剤などの洗浄料；シャンプー、リンス、ヘアコンディショナー、トリートメント、整髪剤などの毛髪用化粧品；ボディーパウダー、ボディーローションなどのボディ用化粧品等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
本実施形態の化粧品において、上述の栄養成分組成物又は栄養剤の含有量は特に限定されず、化粧品の種類に応じて適宜含有量を設定すればよい。例えば、化粧品の使用感等を考慮し、化粧品における上述の栄養成分組成物又は栄養剤の含有量は、イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物の含有量として、０．０１〜３０質量％を例示することができる。化粧品の使用感等の観点からは、０．１〜２０質量％が好ましく、０．１〜１５質量％がより好ましく、０．１〜１０質量％がさらに好ましく、０．１〜５質量％が特に好ましい。
【０１４７】
本実施形態の化粧品は、イデユコゴメ綱に属する藻類が含有する上述のような栄養成分を皮膚や毛髪に補給するために、皮膚や毛髪に塗布して用いることができる。本実施形態の化粧品は、特に、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される栄養成分を皮膚や毛髪に補給するために、皮膚や毛髪に塗布して用いることができる。これらの栄養成分の中でも、本実施形態の化粧品は、アミノ酸類、及びビタミン類からなる群より選択される栄養成分の補給に有効である。
【０１４８】
また、他の態様において、本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物を食品に配合する工程を含む、食品の製造方法を提供する。
また、他の態様において、本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物を薬学的に許容される担体と混合する工程を含む、機能性食品又は栄養補助食品の製造方法を提供する。
また、他の態様において、本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物を飼料又はペットフードに配合する工程を含む、飼料又はペットフードの製造方法を提供する。
また、他の態様において、本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類又はその抽出物を化粧品に配合する工程を含む、化粧品の製造方法を提供する。
また、他の態様において、本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類を培養する工程と、培養した前記イデユコゴメ綱に属する藻類を回収する工程と、回収した前記イデユコゴメ綱に属する藻類を製剤化する工程と、を含む食品添加剤、飼料添加剤、ペットフード添加剤、又は化粧品添加剤の製造方法を提供する。
また、他の態様において、本発明は、イデユコゴメ綱に属する藻類を培養する工程と、培養した前記イデユコゴメ綱に属する藻類を回収する工程と、回収した前記イデユコゴメ綱に属する藻類の抽出物を得る工程と、前記イデユコゴメ綱に属する藻類の抽出物を製剤化する工程と、を含む食品添加剤、飼料添加剤、ペットフード添加剤、又は化粧品添加剤の製造方法を提供する。
【０１４９】
［栄養成分の製造方法］
１実施形態において、本発明は、栄養成分の製造方法を提供する。本実施形態の栄養成分の製造方法は、（ａ）イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞を破壊して細胞破壊物を得る工程と、（ｂ）前記細胞破壊物から、少なくとも１種の栄養成分を分離する工程と、を含む。
以下、本実施形態の製造方法の各工程について説明する。
【０１５０】
（工程（ａ））
工程（ａ）は、イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞を破壊して細胞破壊物を得る工程である。
【０１５１】
本工程で用いるイデユコゴメ綱に属する藻類の好適な例としては、上記本藻類及びシアニディオシゾン属に属する藻類（例、シアニディオシゾン・メロラエ）が挙げられる。本藻類の好適な例としては、上述の「［２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを有する藻類］」で記載したものと同様のものが挙げられる。具体例としては、ＹＦＵ３株及びＨＫＮ１株、並びにこれらの近縁種、変異株等が挙げられる。また、前記以外のシアニジウム属に属する藻類、及びガルデリア属に属する藻類も挙げられる。中でも、ＹＦＵ３株、ＨＫＮ１株、及びこれらの変異株、並びにガルデリア属に属する藻類が好ましく、ＹＦＵ３株、ＨＫＮ１株、及びこれらの変異株がより好ましい。
本藻類は、２倍体の細胞形態であってもよく、１倍体の細胞形態であってもよく、２倍体の細胞形態及び１倍体の細胞形態の混合物であってもよい。
例えば、上記実施形態の藻類培養物から回収した細胞であってもよい。したがって、本実施形態の製造方法は、（ａ）上記実施形態の藻類培養物から、藻類を回収する工程と、（ｂ）前記藻類の細胞を破壊して細胞破壊物を得る工程と、（ｃ）前記細胞破壊物から、少なくとも１種の栄養成分を分離する工程と、を含む栄養成分の製造方法もまた提供する。
２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態のいずれかが強固な細胞壁を有さない場合、強固な細胞壁を有さない細胞形態のものを用いることが好ましい。それにより、比較的温和な処理により細胞を破壊することができる。例えば、ＹＦＵ３株、ＨＫＮ１株、又はこれらの変異株を用いる場合には、ＹＦＵ３株（１倍体）、ＨＫＮ１株（１倍体）、又はこれらの変異株を用いることが好ましい。また、ガルデリア属に属する藻類（例えば、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｐａｒｔｉｔａ等）の１倍体の細胞形態、シアニジウム属に属する藻類の１倍体の細胞形態も好ましく例示される。中でも、ＹＦＵ３株（１倍体）、ＨＫＮ１株（１倍体）、若しくはこれらの変異株、及びガルデリア属に属する藻類の１倍体の細胞形態が好ましい。
【０１５２】
イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞の破壊方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。細胞の破壊方法としては、例えば、ガラスビーズ、乳鉢、超音波処理、フレンチプレス、ホモジナイザーなどの物理的処理；中和処理、低張処理、凍結融解処理、乾燥膨潤処理などの化学的処理等が挙げられる。これらの処理は、単独で行ってもよく、２種以上の処理を組み合わせて行ってもよい。
【０１５３】
イデユコゴメ綱に属する藻類が、強固な細胞壁を有さないものである場合、中和処理、低張処理、凍結融解処理、乾燥膨潤処理などの比較的温和な処理により、細胞を破壊することができる。これらの処理は、物理的処理と比較してエネルギーコストが低く、簡易に実施可能である。そのため、イデユコゴメ綱に属する藻類として強固な細胞壁を有さないものを用いる場合、細胞破壊の方法としては、中和処理、低張処理、凍結融解処理、及び乾燥膨潤処理が好ましい。また、上記（１）〜（３）のいずれかの細胞破裂処理も、細胞破壊の方法として好適な例である。
【０１５４】
中和処理の方法としては、ｐＨ７〜１０程度の中和液に、強固な細胞壁を有さないイデユコゴメ綱に属する藻類の細胞を浸漬する方法が挙げられる。イデユコゴメ綱に属する藻類は、酸性域のｐＨに適応しているため、強固な細胞壁を有さないものであれば、中性〜塩基性の中和液に浸漬することにより、細胞が破壊される。中和液の組成は、特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液などの緩衝液等を用いることができる。中和液への細胞の浸漬時間は、細胞が破壊される程度の時間とすればよく、例えば、１週間程度が例示される。好適には、上記（１）の細胞破裂処理が例示される。
低張処理の方法としては、水などの低張液に、イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞を浸漬する方法が挙げられる。イデユコゴメ綱に属する藻類のうち、強固な細胞壁を有さないものは、水などの低張液に浸漬することにより、細胞が破裂する。低張液の組成は、特に限定されず、イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞が破裂する程度の低張な液体であればよい。低張液としては、例えば、水、低塩濃度の緩衝液等を挙げることができる。低張液への細胞の浸漬時間は、細胞が破裂する程度の時間とすればよく、例えば、１〜３０分程度が例示される。また、低張液への浸漬後、遠心分離等で藻類細胞を回収し、低張液に再懸濁することを、繰り返してもよい。再懸濁回数は、特に限定されないが、１〜５回が例示される。好適には、上記（２）の細胞破裂処理が例示される。
凍結融解処理の方法としては、イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞に対して、凍結と融解のサイクルを１回以上行う方法が挙げられる。凍結と融解のサイクル回数は、特に限定されず、強固な細胞壁を有さないイデユコゴメ綱に属する藻類の細胞が破壊される程度の回数であればよい。凍結と融解のサイクル回数は、例えば、１〜５回程度が例示される。凍結及び融解の各時間は、特に限定されず、例えば、各々１０〜３０分程度が例示される。
乾燥膨潤処理の方法としては、藻類細胞に対して、乾燥と緩衝液への再懸濁のサイクルを１回以上行う方法が挙げられる。乾燥と再懸濁のサイクル回数は、特に限定されず、強固な細胞壁を有さないイデユコゴメ綱に属する藻類の細胞が破壊される程度の回数であればよい。乾燥と再懸濁のサイクル回数は、例えば、１〜５回程度が例示される。好適には、上記（３）の細胞破裂処理が例示される。
【０１５５】
上記のような方法で、イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞を破壊することにより、イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞破壊物を得ることができる。
【０１５６】
（工程（ｂ））
工程（ｂ）は、イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞破壊物から、少なくとも１種の栄養成分を分離する工程である。
【０１５７】
本工程において、分離対象となる栄養成分は、イデユコゴメ綱に属する藻類が有する栄養成分であれば特に限定されない。上述の「［２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを有する藻類］」において記載したように、イデユコゴメ綱に属する藻類は、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、食物繊維等の栄養成分を多く含む。そのため、本工程において分離対象となる栄養成分としては、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、及び食物繊維からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。
【０１５８】
前記栄養成分の中でも、本工程では、アミノ酸類、及びビタミン類からなる群より選択される少なくとも１種の栄養成分を分離することが好ましい。アミノ酸類の具体例としては、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、及びγ−アミノ酪酸からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。好ましくは、アミノ酸類としては、γ−アミノ酪酸が挙げられる。
また、ビタミン類の具体例としては、ビタミンＡ、β−カロテン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、ナイアシン、イノシトール、葉酸、及びビオチンからなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。特に、イデユコゴメ綱に属する藻類が本藻類である場合、ビタミン類の具体例としては、ビタミンＡ、β−カロテン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、及び葉酸からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。好ましくは、ビタミン類としては、β−カロテン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、葉酸からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。
【０１５９】
本工程において分離される栄養成分は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。また、アミノ酸類、脂溶性ビタミン類（ビタミンＡ、β−カロテン、ビタミンＥ，ビタミンＫ１、ビタミンＫ２など）、水溶性ビタミン類（ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ナイアシン、イノシトール、葉酸、ビオチンなど）等の種類ごとに分離してもよい。
【０１６０】
細胞破壊物からの栄養成分の分離方法は、特に限定されず、栄養成分の種類に応じて適切な方法を選択すればよい。栄養成分の分離方法には、生化学物質の分離・精製等に一般的に用いられる方法を適宜組み合わせて用いることができる。分離方法としては、例えば、遠心分離、洗浄、塩析、透析、再結晶、再沈殿、溶媒抽出、吸着、濃縮、ろ過、ゲルろ過、限外ろ過、各種クロマトグラフィ（薄層クロマトグラフィ、カラムクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ、吸着クロマトグラフィなど）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
（任意工程）
本実施形態の製造方法は、工程（ａ）及び（ｂ）に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、例えば、イデユコゴメ綱に属する藻類を培養する工程（培養工程）、イデユコゴメ綱に属する藻類を培養液から回収する工程（回収工程）、イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞を洗浄する工程（洗浄工程）、イデユコゴメ綱に属する藻類を低温処理する工程（低温処理工程）、イデユコゴメ綱に属する藻類を乾燥する工程（乾燥工程）、イデユコゴメ綱に属する藻類を冷凍する工程（冷凍工程）等が挙げられる。これらの工程は、上述の工程（ａ）の前に行うことができる。
【０１６２】
培養工程は、上述の「［イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する藻類］」又は「［２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを有する藻類］」に記載の方法で行うことができる。また、回収工程は、ろ過や遠心分離等の公知の方法により行うことができる。また、洗浄工程は、ｐＨ１.０〜６．０の洗浄液（緩衝液等）に細胞を懸濁し、次いでろ過や遠心分離等の方法で洗浄液から細胞を回収することにより行うことができる。
【０１６３】
低温処理工程は、イデユコゴメ綱に属する藻類を、０〜５℃の温度で処理することにより行うことができる。
例えば、上記培養工程及び回収工程を経て、回収されたイデユコゴメ綱に属する藻類の細胞を、０〜５℃の温度環境下に置くと、藻類細胞を死滅させることができる。そのため、セルフクローニングによらない形質転換体であっても、開放系で取り扱うことができる。低温処理の時間は、特に限定されないが、例えば、８日以上、好ましくは１０日以上が挙げられる。
【０１６４】
乾燥工程は、イデユコゴメ綱に属する藻類を、常温乾燥機、低温乾燥機、凍結乾燥機等の乾燥機で乾燥することにより行うことができる。例えば、上記培養工程及び回収工程を経て、回収されたイデユコゴメ綱に属する藻類の細胞を、乾燥機で乾燥すると、藻類細胞を死滅させることができる。そのため、セルフクローニングによらない形質転換体であっても、開放系で取り扱うことができる。
【０１６５】
冷凍工程は、イデユコゴメ綱に属する藻類を、液体窒素、冷凍庫等で冷凍することにより行うことができる。
例えば、上記培養工程及び回収工程を経て、回収されたイデユコゴメ綱に属する藻類の細胞を−４℃以下、好ましくは−２０℃以下の環境下に置くと、藻類細胞を死滅させることができる。そのため、セルフクローニングによらない形質転換体であっても、開放系で取り扱うことができる。
冷凍処理の時間は、特に限定されないが、例えば、１０分以上、好ましくは３０分以上が挙げられる。
【０１６６】
本実施形態の製造方法により製造された栄養成分は、栄養剤、食品、飼料、ペットフード、化粧品、医薬品、試薬類等の各種用途に用いることができる。
【０１６７】
［他の態様］
イデユコゴメ綱に属する藻類は、酸耐性であるため、胃酸に対する抵抗性があると考えられる。一方、イデユコゴメ綱に属する藻類の中でも、強固な細胞壁を有さないもの（例えば、ＹＦＵ３株（１倍体）、ＨＫＮ１株（１倍体）、シアニディオシゾンに属する藻類（例、シアニディオシゾン・メロラエ）、ガルデリア属に属する藻類の１倍体、シアニジウム属に属する藻類の１倍体等）は、中性環境下（ｐＨ７〜１０程度）で細胞破裂を生じるため、腸管内で細胞破裂が生じると考えられる。さらに、形質転換系が確立されており、任意の遺伝子を導入可能である。そのため、任意の薬剤を生成する遺伝子を導入した形質転換体を作製することにより、当該形質転換体を胃酸耐性の薬剤カプセルとして用いることができる。したがって、本発明は、薬剤生成遺伝子が導入された、イデユコゴメ綱に属する藻類を含む、医薬組成物もまた提供する。
なお、「薬剤生成遺伝子」とは、イデユコゴメ綱に属する藻類の細胞内で発現する遺伝子であって、当該遺伝子の翻訳産物が、ヒト又はヒト以外の動物（哺乳類等）の疾患を治療又は予防する薬剤を生成する遺伝子を意味する。薬剤生成遺伝子の翻訳産物自体が、薬剤であってもよく、薬剤生成遺伝子の翻訳産物が、薬剤合成反応を触媒する酵素であってもよい。
【０１６８】
薬剤は、特に限定されないが、例えば、病原性微生物又は病原性ウイルスの抗原タンパク質等が例示される。例えば、病原性ウイルスとしては、特に限定されないが、狂犬病ウイルス、ブタサーコウイルス、ウシロタウイルス、インフルエンザウイルス、エイズウイルス等が挙げられる。これらの病原性微生物又は病原性ウイルスの抗原タンパク質を導入したイデユコゴメ綱に属する藻類は、これらによって引き起こされる感染症に対するワクチンとして用いることができる。
【実施例】
【０１６９】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１７０】
［実施例１］イデユコゴメ綱に属する藻類の成分分析
（イデユコゴメ綱に属する藻類の培養）
シアニディオシゾン・メロラエ  １０Ｄを、５Ｌの２×Ａｌｌｅｎ培地を用いて、通気培養した。培養温度は約３５℃とし、連続白色光（５００μｍｏｌ／ｍ２ｓ）下で、２週間培養を行った。
２×Ａｌｌｅｎ培地の組成を表１に示す。
【０１７１】
【表１】
2020072698.tif 000003
【０１７２】
（イデユコゴメ綱に属する藻類の成分分析）
〔アミノ酸類、ビタミン類等〕
上記のように培養したシアニディオシゾン・メロラエ  １０Ｄの細胞を遠心分離にて回収し、一般財団法人  日本食品分析センターに委託して、成分分析を行った。前記成分分析によって得た湿重量当たりの分析値を、０．２４８で割ることにより、乾燥重量当たりの値に変換した。
【０１７３】
各成分の分析方法を表２及び３に示す。
【０１７４】
【表２】
2020072698.tif 000004
【０１７５】
【表３】
2020072698.tif 000005
【０１７６】
成分分析の結果を表４〜６に示す。表４はアミノ酸類の分析結果、表５はビタミン類の分析結果、表６はその他の栄養成分の分析結果をそれぞれ示す。表４及び表５には、参考として、クロレラ、ユーグレナ、及びスピルリナにおいて公開されている分析値を併記した。表４〜６中、シアニディオシゾン・メロラエ  １０Ｄは、「シゾン」と表記した。
【０１７７】
【表４】
2020072698.tif 000006
【０１７８】
【表５】
2020072698.tif 000007
【０１７９】
【表６】
2020072698.tif 000008
【０１８０】
表４に示されるように、シアニディオシゾン・メロラエ  １０Ｄは、従来食品等に利用されている他の藻類と比較して、総アミノ酸含有量が多いことが明らかになった。また、個々のアミノ酸についても、他の藻類と比較して、シゾンでの含有量が多い傾向にあった。
また、シアニディオシゾン・メロラエは、γ−アミノ酪酸を含んでいることも確認された。γ−アミノ酪酸は、抑制性の神経伝達物質として機能する物質であり、脳機能改善効果、血圧降下作用、鎮静作用等が認められている。γ−アミノ酪酸を多く含む食品としてはトマトが知られているが、トマトのγ−アミノ酪酸含有量は０．０６２ｇ／１００ｇ湿重量との報告がある（広がりつつあるサプリメントを理解する―腎不全患者に活用するために[各論]8 GABA(ギャバ)、臨床透析Vol.24.No.13、2008年12月）。シゾンのγ−アミノ酪酸含有量は、トマトと比較しても、遜色のないものであるといえる。
【０１８１】
表５に示されるように、シアニディオシゾン・メロラエは、他の藻類と比較して、ビタミン類を多く含有している傾向にあった。特に、他の藻類と比較して、β−カロテン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、及び葉酸の含有量が高かった。
ビタミンＥを多く含む食品としてはアーモンドが知られているが、アーモンドのビタミンＥ含有量は３０．３ｍｇ／１００ｇ湿重量との報告がある（日本食品標準成分表2015年版）。また、ビタミンＫを多く含む食品としては納豆が知られているが、納豆のビタミンＫ含有量は６００μｇ／１００ｇ湿重量との報告がある（日本食品標準成分表2015年版）。シゾンのビタミンＥ及びビタミンＫの含有量は、これらの食品と比較しても、高いといえる。
【０１８２】
以上の結果より、シアニディオシゾン・メロラエは、従来食品等に利用されている他の藻類と比較しても、アミノ酸類やビタミン類等の栄養成分の含有量が高いことが確認された。
【０１８３】
［実施例２］γ−アミノ酪酸産生能増強株の作製
（形質転換用断片の作製）
形質転換用断片の作製は、Fujiwara et al.(PLoS One. 2013 Sep 5;8(9):e73608)に記載の方法で行った。形質転換用断片の作製に用いたプライマーを表７に示す。以下、使用したプライマーを、表７に記載のプライマーＮｏ．で記載する。
【０１８４】
【表７】
2020072698.tif 000009
【０１８５】
＜ＥＧＦＰ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片の作製＞
ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ選択マーカーを作製するために、ＵＲＡ５．３遺伝子（８９７ｂｐ上流配列及び４７１下流配列を含む。）を含むＤＮＡ断片をシアニディオシゾン・メロラエ  １０ＤのゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセットＮｏ．１／２を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＣＭＤ１８４Ｃ断片（ＣＤＣ１８４Ｃ  ＯＲＦの最後の１，９６１ｂｐ及び１．９ｋｂ下流配列を含む。）及びｐＱＥ８０ベクター（ＱＩＡＧＥＮ）を、それぞれ、プライマーセットＮｏ．３／４、及びプライマーセットＮｏ．５／６を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＣＭＤ１８４Ｃ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ｐＱＥ８０ベクターにサブクローニングした。その結果できたｐＤ１８４ベクターを、プライマーセットＮｏ．７／８を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＣＭＯ２５０Ｃの上流配列（−６００〜−１：配列番号９）、ＥＧＦＰ  
ＯＲＦ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．，）、及びβ−チューブリンの下流配列（＋１〜＋２００）を、それぞれ、プライマーセットＮｏ．９／１０、プライマーセットＮｏ．１１／１２、及びプライマーセットＮｏ．１３／１４を用いて、ＰＣＲにより増幅し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、ｐＱＥにサブクローニングした。その結果できたｐＱ２５０−ＥＧＦＰベクターを鋳型ＤＮＡとして、アセンブリ断片（ＣＭＯ２５０Ｃの上流領域［−６００〜−１］，ＥＧＦＰ  ＯＲＦ，β−チューブリンの下流領域［＋１〜＋２００］）を、プライマーセットＮｏ．１５／１６を用いて、ＰＣＲにより増幅し、増幅したｐＤ１８４ベクターにサブクローニングした。その結果できたｐＤ１８４−Ｏ２５０−ＥＧＦＰベクターを、プライマーセットＮｏ．１７／１８を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ選択マーカーを、増幅したｐＤ１８４−Ｏ２５０−ＥＧＦＰベクターにサブクローニングした。その結果としてできたｐＤ１８４−Ｏ２５０−ＥＧＦＰ−ＵＲＡＣｍ−Ｃｍベクターを、プライマーセットＮｏ．１９／２０を用いて、ＥＧＦＰ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片を増幅するための鋳型として使用した。増幅されたＤＮＡ断片（ＥＧＦＰ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片）を形質転換用に用いた。なお、ＥＧＦＰ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片は、ネガティブコントロールとして用いた。ＥＧＦＰ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片のコンストラクトを図１（Ａ）に示す。
【０１８６】
＜ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片の作製＞
ＥＧＦＰ  ＯＲＦの替わりに、シアニディオシゾン・メロラエのＣＭＦ０７２Ｃ（グルタミン酸デカルボキシラーゼ：ＧＡＤ：配列番号３）の３’末端に３×ＨＡタグを付加したＤＮＡ断片を用いたこと以外は、上記「＜ＥＧＦＰ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片の作製＞」と同様の方法で、ｐＤ１８４−Ｏ２５０−ＧＡＤ−ＵＲＡＣｍ−Ｃｍベクターを作製した。ｐＤ１８４−Ｏ２５０−ＧＡＤ−ＵＲＡＣｍ−Ｃｍベクターを鋳型として、プライマーセットＮｏ．１９／２０を用いて、ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片をＰＣＲにより増幅した。増幅されたＤＮＡ断片（ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片）を形質転換に用いた。ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片のコンストラクトを図１（Ｂ）に示す。
【０１８７】
＜ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｇｓ断片の作製＞
ｐＤ１８４−Ｏ２５０−ＧＡＤ−ＵＲＡＣｍ−Ｃｍベクターから、ＵＲＡＣｍ−ＣｍのＯＭＰ−デカルボキシラーゼドメインを含む配列を除去するために、プライマーセットＮｏ．２１／２２を用いて、ＰＣＲによりベクターを増幅した。ガルデリア・スルフラリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）のＵＲＡ５．３のＯＭＰ−デカルボキシラーゼドメインを含む配列を、プライマーセットＮｏ．２３／２４、及びＵＲＡＣｍ−Ｇｓ選択マーカーを鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲにより増幅し、配列をｐＤ１８４−Ｏ２５０−ＧＡＤ−ＵＲＡＣｍ−Ｃｍベクターにサブクローニングした。結果としてできたｐＤ１８４−Ｏ２５０−ＥＧＡＤ−ＵＲＡＣｍ−Ｇｓベクターを、プライマーセットＮｏ．１９／２０及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＭＡＸ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｇｓ断片を増幅するための鋳型として使用した。増幅されたＤＮＡ断片（ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｇｓ断片）を形質転換に用いた。ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｇｓ断片のコンストラクトを図１（Ｃ）に示す。
【０１８８】
（形質転換）
形質転換の親株として、ウラシル栄養要求性の変異株である、シアニディオシゾン・メロラエ  Ｍ４（Minoda et al., Plant Cell Physiol. 2004 Jun;45(6):667-71.）を用いた。細胞を、ウラシル（０．５ｍｇ／ｍＬ）及び５−フルオロオロチン酸（０．８ｍｇ／ｍL）を含むＭＡ２培地（Ohnuma M et al. Plant Cell Physiol. 2008 Jan;49(1):117-20.）中で増殖させた。培養は、連続白色光（８０μｍｏｌ／ｍ２ｓ）、４０℃の条件下で、１３０ｒｐｍでの振とう培養とした。ＭＡ２培地を０．５％（ｗ／ｖ）のゲランガム（Ｗａｋｏ）で凝固した。ｐＨを２．３に調製するために、硫酸を最終濃度０．０５％（ｖ／ｖ）となるように添加した。形質転換は、Ohnuma M et al（Plant Cell Physiol. 2008 Jan;49(1):117-20.）及びImamura S et al(Plant Cell Physiol. 2010 May;51(5):707-17)に記載の方法で行った。形質転換には、上記で作製した各形質転換用断片を４μｇ使用した。細胞を、コロニーが形成されるまで、連続白色光下、４０℃で培養した。その後、コロニーを、ウラシル（０．５ｍｇ／ｍＬ）を含むＭＡ２固体培地上のスターチに移した。
【０１８９】
（イムノブロッティング）
各形質転換用断片による各形質転換株の細胞溶解物（タンパク質量で４μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１ｍｍ厚ゲル、１０％アクリルアミド、２５ｍＡで５０分）により分離した。その後、ゲル内のタンパク質を、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした（３００Ｖ、４００ｍＡ、７５分）。５％スキムミルクでブロッキングを行い、一次抗体として抗ＨＡ抗体（１６Ｂ１２，１：２，０００）を１時間反応させた。次に、二次抗体として抗マウスＨＲＰ標識抗体（１：２５，０００）を１時間反応させた。Ｉｍｍｏｂｌｉｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）とＬＡＳ−３０００（ＦＵＪＩ  ＦＩＬＭ）を用いて、化学発光シグナルを検出した。
【０１９０】
結果を図２に示す。図２中、右図は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルを染色したものである。左図は、イムノブロッティングの結果を示す。ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株、及びＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｇｓ断片形質転換株では、化学発光シグナルが検出された。一方、ＥＧＦＰ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片で形質転換したものでは、シグナルは検出されなかった。この結果は、ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株、及びＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｇｓ断片形質転換株において、ＨＡタグ付加ＧＡＤが発現していることを示す。なお、ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株よりも、ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｇｓ断片形質転換株の方が、ＨＡタグ付加ＧＡＤの発現量が多かった。
また、ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株と野生株（ＷＴ）とを比較した結果を図３に示す。ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株では、図２同様、ＨＡタグ付加ＧＡＤの発現が確認されたが、野生株ではシグナルは検出されなかった。
【０１９１】
（形質転換株におけるＧＡＤ導入コピー数の確認）
表８に示すプライマーを用いて、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行った。シアニディオシゾン・メロラエの野生株では、ＧＡＤ（ＣＭＦ０７２Ｃ）を１コピー有することが確認されている。そこで、ネガティブコントロールとして用いたＥＧＦＰ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株において、表８のＡのプライマーセットを用いて増幅された値（Ａ値）／表８のＢのプライマーセットを用いて増幅された値（Ｂ値）＝１とし、他の形質転換株におけるＧＡＤ（ＣＭＦ０７２Ｃ）のコピー数を確認した。
【０１９２】
その結果、ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株では、形質転換により、ＧＡＤが１コピー導入されており、内在ＧＡＤと合わせて２コピー有することが確認された。一方、ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｇｓ断片形質転換株では、形質転換により、ＧＡＤが９コピー導入されており、内在ＧＡＤと合わせて１０コピー有することが確認された。ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｇｓ断片形質転換株におけるコピー数の確認結果を図４に示す。
【０１９３】
【表８】
2020072698.tif 000010
【０１９４】
（形質転換株における細胞内γ−アミノ酪酸量の測定）
ＥＧＦＰ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株、ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株、及びＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｇｓ断片形質転換株を、ＭＡ２培地中で増殖させた。培養は、連続白色光、４０℃の条件下で行った。
培養後、細胞を遠心分離により回収し、前記回収した細胞から７５%エタノールにより可溶物を抽出した。抽出した可溶物中のγ−アミノ酪酸を、ＨＰＬＣを用いて、ＯＰＡ−ポストカラム誘導体化法により定量した。
【０１９５】
結果を表９に示す。表９では、ＥＧＦＰ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株におけるγ−アミノ酪酸濃度（細胞乾重量当たり）を１．０としたときの相対値で示した。
【０１９６】
【表９】
2020072698.tif 000011
【０１９７】
表９に示すように、ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株及びＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｇｓ断片形質転換株では、ネガティブコントロールであるＥＧＦＰ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株と比較して、γ−アミノ酪酸濃度が高かった。また、ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株と比較して、ＧＡＤ／ＵＲＡＣｍ−Ｇｓ断片形質転換株の方が、γ−アミノ酪酸濃度が高かった。この結果は、導入されたＧＡＤコピー数に応じて、細胞内γ−アミノ酪酸濃度が高くなることを示している。
これらの結果から、シアニディオシゾン・メロラエでは、形質転換により、特定の栄養成分の細胞内濃度を高めることが可能であることが確認された。
【０１９８】
［実施例３］シアニディオシゾン属に属する藻類の細胞破裂処理（藻類細胞の乾燥膨潤処理）
シアニディオシゾン・メロラエ  １０Ｄを実施例１と同様に培養し、培養液１ｍＬを遠心分離（１，５００×ｇ、２分間）した。遠心分離後の上清を捨て、藻類細胞の沈殿を等張液（１０％スクロース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）に懸濁し、遠心分離（１，５００×ｇ、３分間）を行って、藻類細胞の洗浄を行った。遠心後の上清を捨て、藻類細胞の沈殿を冷蔵庫内（４℃）で３日間放置し、藻類細胞を乾燥した。
３日後、藻類細胞を４５μＬの等張液（１０％スクロース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）に懸濁し、遠心分離（１，５００×ｇ、３分間）を行って、遠心上清及び沈殿を回収した。
また、強固な細胞壁を有するイデユコゴメ綱に属する藻類として、シアニディウム・カルダリウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ）ＲＫ−１を培養し、上記と同様の乾燥膨潤処理を行い、遠心上清及び沈殿を得た。
【０１９９】
（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ））
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルを調製するために、上記遠心上清に、１５μＬの４×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加した。また、遠心沈殿に、６０μＬの１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加した。前記のように調製した上清サンプル及び沈殿サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをクマシーブリリアントブルーで染色し、遠心上清及び沈殿中のタンパク質を確認した。
【０２００】
結果を図５に示す。シアニディオシゾン・メロラエ  １０Ｄでは、乾燥膨潤処理後の上清及び沈殿のいずれでも複数種類のタンパク質が検出された。この結果により、シアニディオシゾン・メロラエ  １０Ｄの細胞は、乾燥膨潤処理により細胞破裂を生じることが確認された。一方、シアニディウム・カルダリウムＲＫ−１では、乾燥膨潤処理後の上清において、タンパク質が全く検出されなかった。この結果は、シアニディウム・カルダリウムＲＫ−１の細胞は、乾燥膨潤処理により細胞破裂が生じないことを示す。
【０２０１】
［実施例４］新規微細藻類の単離
（新規微細藻類の単離）
日本国大分県由布市の温泉において、高温酸性水を採取した。同様に、日本国神奈川県足柄下郡箱根町の温泉において、高温酸性水を採取した。採取した高温酸性水を、Ｍ−Ａｌｌｅｎ培地で培養（４０℃、ｐＨ２．０、１００μｍｏｌ／ｍ２ｓ）し、微細藻類の単離を行った。由布市で採取した高温酸性水からＹＦＵ３株が単離され、箱根町で採取した高温酸性水からＨＫＮ１株が単離された。
Ｍ−Ａｌｌｅｎ培地（以下、「ＭＡ培地」ともいう。）の組成を表１０に示す。
【０２０２】
【表１０】
2020072698.tif 000012
【０２０３】
（１倍体藻類の単離）
箱根町で採取した高温酸性水から単離されたＨＫＮ１株を、Ｍ−Ａｌｌｅｎ培地で約１カ月静置培養した（４０℃、２％ＣＯ２）。約１カ月の培養により、増殖期は終了し、静止期となっていた。静止期となった時期に、ＨＫＮ１株の培養液を観察すると、いずれの培養液においても、シアニディオシゾン・メロラエ様の小さな細胞が確認された。図６（Ａ）に、ＨＫＮ１株の静止期の培養液の写真（倍率：６００倍）を示す。図６（Ａ）中、矢印は、シアニディオシゾン・メロラエ様細胞を示す。
倒立顕微鏡（CKX41；Olympus）下で、先端を細くしたパスツールピペットを用いて、このシアニディオシゾン・メロラエ様細胞を、一細胞単離し、１ｍＬの温泉培地または改変ＭＡ培地（実施例７参照）で静置培養した。なお、温泉培地には、塚原温泉（ｐＨ１．１５）又は玉川温泉（ｐＨ１．１４）から採取した温泉水に、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４を添加したものを使用した（Hirooka S and Miyagishima SY., Front Microbiol. 2016 Dec 20;7:2022.）。温泉培地で増殖させた後、静止期に入った細胞を、Ｍ−Ａｌｌｅｎ培地又はＭＡ２培地（Ohnuma M et al. Plant Cell Physiol. 2008 Jan;49(1):117-20.）で維持した。図６（Ｂ）に、ＨＫＮ１株の静止期の培養液から単離されたシアニディオシゾン・メロラエ様細胞の写真（倍率：６００倍）を示す。シアニディオシゾン・メロラエ様細胞は、その後培養を継続しても、そのシアニディオシゾン・メロラエ様の細胞形態が維持された。
【０２０４】
上記で単離したシアニディオシゾン・メロラエ様細胞と、ＨＫＮ１株との関係を確認するために、これらの細胞について、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）により、ゲノムの一領域の配列解析を行った。その結果、ＨＫＮ１株の静止期の培養液からそれぞれ単離されたシアニディオシゾン・メロラエ様細胞（ＨＫＮ１株由来シゾン様細胞）は、いずれも、前記解析領域について１つのアレル配列しか有さず、１倍体の細胞であることが確認された。一方、ＨＫＮ１株は、前記解析領域について２つのアレル配列を有し、２倍体の細胞であることが確認された。同様に、ＨＫＮ１株由来シゾン様細胞のアレル配列は、ＨＫＮ１の２つのアレル配列が交差した配列であった。図７に、ＨＫＮ１株の２つのアレル配列（ＨＫＮ１＿ａｌｌｅｌｅ  １：配列番号１２、ＨＫＮ１＿ａｌｌｅｌｅ  ２：配列番号１３）と、ＨＫＮ１株由来シゾン様細胞のアレル配列（ＨＫＮ１シゾン様＿ａｌｌｅｌｅ  １：配列番号１４）を示す。なお、図７中、矢尻は、アレル間で多型の見られる塩基を示す。
これらの結果から、ＨＫＮ１株由来シゾン様細胞は、２倍体のＨＫＮ１株が減数分裂して生じた１倍体細胞であることが確認された。
【０２０５】
なお、由布市で採取した高温酸性水から単離されたＹＦＵ３株は、シアニディオシゾン様細胞であり、１倍体細胞であった。
【０２０６】
以下、ＹＦＵ３株の２倍体細胞を「ＹＦＵ株（２倍体）」、１倍体のＹＦＵ３株由来シゾン様細胞を「ＹＦＵ３株（１倍体）と記載し、両者をまとめて指す場合は「ＹＦＵ３株」と記載する。また、ＨＫＮ１株の２倍体細胞をＨＫＮ１株（２倍体）、１倍体のＨＫＮ１株由来シゾン様細胞をＨＫＮ１株（１倍体）と記載し、両者をまとめて指す場合は「ＨＫＮ１株」と記載する。
【０２０７】
ＹＦＵ３株（１倍体）及びＨＫＮ１株（１倍体）、並びに他のシアニジウムを顕微鏡（BX51; Olympus）で観察した写真（倍率：６００倍）を図８に示す。図８中、（Ａ）はガルデリア・スルフラリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）  ０７４、（Ｂ）はシアニジウム・カルダリウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ）  ＲＫ−１、（Ｃ）はシアニディオシゾン・メロラエ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅ）  １０Ｄ、（Ｄ）はＹＦＵ３株（１倍体）、（Ｅ）はＨＫＮ１株（１倍体）の顕微鏡写真である。図３中のスケールバーは５μｍを表す。ガルデリア・スルフラリア
０７４（図８Ａ）及びシアニジウム・カルダリウム  ＲＫ−１（図８Ｂ）は、強固な細胞壁を有し、内生胞子を母細胞壁内に形成することで増殖する。一方、ＹＦＵ３株（１倍体）（図８Ｄ）及びＨＫＮ１株（１倍体）（図８Ｅ）は、シアニディオシゾン・メロラエ  １０Ｄ（図８Ｃ）と同様に、強固な細胞壁を有さず、二分裂により増殖することが確認された。また、ＹＦＵ３株（１倍体）及びＨＫＮ１株（１倍体）の細胞の大きさは、いずれも、約２μｍであった。
【０２０８】
（リボソームＤＮＡ  ＩＴＳ１のサイズ比較）
ＹＦＵ３株（１倍体）と、ＨＫＮ１株（１倍体）と、シアニディオシゾン・メロラエ  １０Ｄとについて、リボソームＤＮＡ  ＩＴＳ１のサイズの比較を行った。
ＹＦＵ３株、ＨＫＮ１株、及びシアニディオシゾン・メロラエ  １０Ｄの細胞からＤＮＡを抽出し、リボソームＤＮＡ  ＩＴＳ１をＰＣＲにより増幅した。増幅されたＩＴＳ１断片を、アガロースゲル電気泳動し、各微細藻類のＩＴＳ１のサイズを比較した。ＩＴＳ１の増幅に使用したプライマーは、以下の通りである。
フォワードプライマー：TAGAGGAAGGAGAAGTCGTAA（配列番号１５）
リバースプライマー：TTGCGTTCAAAGACTCGATGATTC（配列番号１６）
【０２０９】
アガロースゲル電気泳動の結果を図９に示す。図９に示すように、ＹＦＵ３株（１倍体）及びＨＫＮ１株（１倍体）のＩＴＳ１のサイズは、いずれも約１．５ｋｂであった。また、ＹＦＵ３株（１倍体）及びＨＫＮ１株（１倍体）のＩＴＳ１は、いずれも、シアニディオシゾン・メロラエ  １０ＤのＩＴＳ１よりも大きいサイズを有していた。
【０２１０】
（ｒｂｃＬ遺伝子配列に基づく系統解析）
ＹＦＵ３株（１倍体）及びＨＫＮ１株（１倍体）の細胞からそれぞれ抽出したＤＮＡを鋳型として、ｒｂｃＬ遺伝子をＰＣＲで増幅し、配列解析を行った。ＹＦＵ３株（１倍体）及びＨＫＮ１株（１倍体）のｒｂｃＬ遺伝子の塩基配列を配列番号１及び２にそれぞれ示す。
なお、ｒｂｃＬの増幅に使用したプライマーの配列は以下のとおりである。
フォワードプライマー：aaaactttccaaggrccwgc（配列番号１７）
リバースプライマー：gcwgttggtgtytchacwaaatc（配列番号１８）
【０２１１】
ＹＦＵ３株（１倍体）及びＨＫＮ１株（１倍体）のｒｂｃＬ遺伝子の塩基配列に基づき、最尤法による分子系解析を行った。ｒｂｃＬ遺伝子の塩基配列に基づく分子系統樹を図１０に示す。
【０２１２】
上記分子系統解析の結果より、ＹＦＵ３株及びＨＫＮ１株は、シアニジウム属に属すると判定された。
【０２１３】
（ＹＦＵ３株（１倍体）及びＨＫＮ１株（１倍体）の酸性温泉排水培地による培養）
ＹＦＵ３株（１倍体）及びＨＫＮ１株（１倍体）が、酸性温泉排水培地により培養可能であるか確認した。酸性温泉排水には、塚原温泉、または玉川温泉を用いた。塚原温泉又は玉川温泉の酸性温泉排水に、窒素源として、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４を添加して酸性温泉排水培地を調製した。あるいは、窒素源として１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、及びリン源として２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４を添加して酸性温泉排水培地を調製した。ＹＦＵ３株（１倍体）又はＨＫＮ１株（１倍体）を、５０ｍＬの酸性温泉排水培地を用いて、通気培養した。培養温度は４０℃とし、連続白色光（１００μｍｏｌ／ｍ２ｓ）下で、２週間培養を行った。
その結果、ＹＦＵ３株（１倍体）及びＨＫＮ１株（１倍体）は、いずれの酸性温泉排水培地でも培養することができた。
【０２１４】
［実施例５］新規微細藻類の栄養成分分析
ＹＦＵ３株（１倍体）を、５ＬのＭ−Ａｌｌｅｎ培地を用いて、通気培養した。培養温度は３５℃とし、連続白色光（５００μｍｏｌ／ｍ２ｓ）下で、２週間培養を行った。
【０２１５】
上記のように培養したＹＦＵ３株（１倍体）の細胞を遠心分離にて回収し、一般財団法人  日本食品分析センターに委託して、成分分析を行った。前記成分分析によって得た湿重量当たりの分析値を、０．２４８で割ることにより、乾燥重量当たりの値に変換した。
各成分の分析方法は、上記表２及び表３に示したとおりである。
【０２１６】
成分分析の結果を表１１及び表１２に示す。表１１はアミノ酸類の分析結果、表１２はビタミン類の分析結果をそれぞれ示す。表１１及び表１２には、参考として、クロレラ、ユーグレナ、及びスピルリナにおいて公開されている分析値を併記した。
【０２１７】
【表１１】
2020072698.tif 000013
【０２１８】
【表１２】
2020072698.tif 000014
【０２１９】
表１１に示されるように、ＹＦＵ３株（１倍体）は、従来食品等に利用されている他の藻類と比較して、総アミノ酸含有量が多いことが明らかになった。また、個々のアミノ酸についても、他の藻類と比較して、ＹＦＵ３株（１倍体）での含有量が多い傾向にあった。
また、ＹＦＵ３株（１倍体）は、γ−アミノ酪酸を含んでいることも確認された。γ−アミノ酪酸は、抑制性の神経伝達物質として機能する物質であり、脳機能改善効果、血圧降下作用、鎮静作用等が認められている。γ−アミノ酪酸を多く含む食品としてはトマトが知られているが、トマトのγ−アミノ酪酸含有量は０．０６２ｇ／１００ｇ湿重量との報告がある（広がりつつあるサプリメントを理解する―腎不全患者に活用するために[各論]8 GABA(ギャバ)、臨床透析Vol.24.No.13、2008年12月）。ＹＦＵ株（１倍体）のγ−アミノ酪酸含有量は、トマトと比較しても、遜色のないものであるといえる。
【０２２０】
表１２に示されるように、ＹＦＵ３株（１倍体）は、他の藻類と比較して、ビタミン類を多く含有している傾向にあった。特に、他の藻類と比較して、β−カロテン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、及び葉酸の含有量が高かった。
ビタミンＥを多く含む食品としてはアーモンドが知られているが、アーモンドのビタミンＥ含有量は３０．３ｍｇ／１００ｇ湿重量との報告がある（日本食品標準成分表2015年版）。また、ビタミンＫを多く含む食品としては納豆が知られているが、納豆のビタミンＫ含有量は６００μｇ／１００ｇ湿重量との報告がある（日本食品標準成分表2015年版）。ＹＦＵ株のビタミンＥ及びビタミンＫの含有量は、これらの食品と比較しても、高いといえる。
【０２２１】
以上の結果より、ＹＦＵ３株（１倍体）は、従来食品等に利用されている他の藻類と比較しても、アミノ酸類やビタミン類等の栄養成分の含有量が高いことが確認された。
【０２２２】
［実施例６］新規微細藻類（ＹＦＵ３株）の形質転換
（形質転換用断片の作製）
形質転換用断片の作製は、Fujiwara et al.(Front Plant Sci. 2017 Mar 14;8:343)に記載の方法で行った。形質転換用断片の作製に用いたプライマーを表１３に示す。以下、使用したプライマーを、表１３に記載のプライマーＮｏ．で記載する。
【０２２３】
【表１３】
2020072698.tif 000015
【０２２４】
＜シアニディオシゾン・メロラエ形質転換用ＣＡＴベクターの作製＞
シアニディオシゾン・メロラエのＡＰＣＣ  ＯＲＦ（ＣＭＯ２５０Ｃ）において葉緑体移行配列（６０アミノ酸）をコードする１〜１８０ヌクレオチドを、シアニディオシゾン・メロラエ  １０ＤのゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセットＮｏ．１／Ｎｏ．２を用いて、ＰＣＲにより増幅した。また、シアニディオシゾン・メロラエのβ−チューブリン  ＯＲＦの下流ヌクレオチド（２００ｂｐ，βｔ３’）を、シアニディオシゾン・メロラエ  １０ＤのゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセットＮｏ．３／Ｎｏ．４を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＣＡＴ  ＯＲＦを、ｐＣ１９４（ｐＣ１９４，Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４５９４９０４；スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を鋳型として、プライマーセットＮｏ．５／Ｎｏ．６を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＡＰＣＣの葉緑体移行配列をコードする配列、ＣＡＴ  ＯＲＦ、及びβ−チューブリンの下流配列を、プライマーセットＮｏ．７／Ｎｏ．８を用いて増幅したｐＤ１８４−Ｏ２５０−ＥＧＦＰ−ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ（Fujiwara et al., PLoS One. 2013 Sep 5;8(9):e73608）に、ＩｎＦｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてクローニングし、プラスミドｐＤ１８４−ＣＡＴを構築した。プラスミドｐＤ１８を鋳型として、プライマーセットＮｏ．９／Ｎｏ．１０を用いて、ＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅し、シアニディオシゾン・メロラエ形質転換用ＣＡＴベクターを作製した。
【０２２５】
＜新規微細藻類形質転換用ＣＡＴベクターの作製＞
上記で作製したプラスミドｐＤ１８を鋳型として、プライマーセットＮｏ．１１／Ｎｏ．１２を用いて、ＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅し、新規微細藻類形質転換用ＣＡＴベクターを作製した。
【０２２６】
（形質転換）
形質転換は、Ohnuma M et al（Plant Cell Physiol. 2008 Jan;49(1):117-20.）に記載の方法を改変して行った。シアニディオシゾン・メロラエ  １０Ｄと、ＹＦＵ３株（１倍体）と、を形質転換の親株として用いた。各親株の細胞を、５０ｍＬのＭＡ２Ｕ培地（０．５ｍｇ／ｍＬのウラシルを含むＭＡ２培地）中に希釈して、ＯＤ７５０＝０．３の濃度となるようにし、連続光（１００μｍｏｌ／ｍ２ｓ）下でエアレーション（６００ｍＬ  ａｍｂｉｅｎｔ  ａｉｒ／ｍｉｎ）しながら、１９時間培養した。次いで、培養液に最終濃度０．００２％となるようにＴｗｅｅｎ−２０を添加した後、遠心分離（２，０００ｇ、５分）により細胞を回収した。回収した細胞を、２７０μＬのＭＡ２Ｕ培地に懸濁した。形質転換は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いるプロトコールにより行った。
０．６ｇのＰＥＧ４０００（Ａｌｄｒｉｃｈ，＃８１２４０）を、４５０μＬのＭＡ２Ｕ培地に溶解し（９５℃、１０分）、６０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ４０００溶液を調製した。その後、ＰＥＧ４０００溶液を、使用するまで、ヒートブロック上で４２℃に維持した。
上記で調整した各形質転換用ＣＡＴベクター４μｇを、９０μＬの水で調整した。９０μＬのベクター溶液、１０μＬの１０ｘＴＦ溶液（４００ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、４０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．３％  Ｈ２ＳＯ４）、及び１００μＬのＰＥＧ４０００溶液を、１．５ｍＬチューブ中で、ピペッティングにより混合した。次いで、２５μＬの細胞懸濁液を、２００μＬのＴＦ−ＣＡＴベクター−ＰＥＧ４０００混合液に添加し、３〜４回上下反転させて攪拌し、すぐに４０ｍＬのＭＡ２Ｕ培地に移して、連続光（１００μｍｏｌ／ｍ２ｓ）下でエアレーション（３００ｍＬ  ａｍｂｉｅｎｔ  ａｉｒ／ｍｉｎ）しながら、１日培養した。その後、遠心分離（１，５００ｇ、５分間）により細胞を回収し、２ｍＬのＭＡ２Ｕ培地に懸濁した。細胞を２４ウェルプレート（ＴＰＰ  Ｔｅｃｈｎｏ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＡＧ）中で、連続光、４２℃、５％ＣＯ２の条件下で、２〜３日間培養した。次いで、クロラムフェニコール（ＣＰ）を培養液に添加して、１０日間培養し、ＣＰ耐性形質転換体を選抜した。ＣＰ耐性形質転換体は、ＣＰフリーのＭＡ２Ｕ培地で洗浄して段階希釈し、ＭＡ２Ｕゲランガムプレート上のスターチベッドにスポットした。スターチベッド及びＭＡ２Ｕゲランガムプレートは、Imamura S et al(Plant Cell Physiol. 2010 May;51(5):707-17)に記載の方法に、マイナーな改変（Fujiwara et al., PLoS One. 2013 Sep 5;8(9):e73608）を加えた方法により調製した。プレートは、５％ＣＯ２インキュベーター内で、コロニーが出現するまで２週間培養した。コロニーは、Fujiwara et al.(PLoS One. 2013 Sep 5;8(9):e73608）に記載の方法に従い、新たなＭＡ２Ｕ培地プレート上のスターチベッドに移した。
【０２２７】
（クロラムフェニコール（ＣＰ）耐性の評価）
上記の形質転換後、ＣＰを添加したＭＡ２液体培地で培養することにより、シアニディウムシゾン・メロラエ  １０Ｄ及びＹＦＵ３株（１倍体）のＣＰ耐性形質転換体を選抜した。各ＣＰ形質転換株のＣＰ耐性濃度を評価するために、野生株（ＷＴ）と形質転換体（ＴＦ）とを、各濃度（０，５０，１００，１５０，２００，２５０μｇ／ｍＬ）のＣＰを含むＭＡ２液体培地で１０日間培養した。
【０２２８】
結果を図１１に示す。図１１中、１０Ｄ＿ＴＦ及び１０Ｄ＿ＷＴは、それぞれ、シアニディウムシゾン・メロラエ  １０ＤのＣＰ耐性形質転換体及び野生株を示す。また、ＹＦＵ３＿ＴＦ及びＹＦＵ３＿ＷＴは、それぞれ、ＹＦＵ３株（１倍体）のＣＰ耐性形質転換体及び野生株を示す。図１１に示されるように、シアニディウムシゾン・メロラエ  １０Ｄ及びＹＦＵ３株（１倍体）のいずれにおいても、野生株よりも、ＣＰ耐性形質転換体の方が、高いＣＰ濃度に耐性を示した。
【０２２９】
また、図１１において培養した細胞についてＣＡＴ遺伝子の導入を確認するために、ＡＰＣＣの葉緑体移行配列の５’末端配列及びＣＡＴ  ＯＲＦの３’末端配列に対するプライマーを設計した。プライマーの配列は、以下のとおりである。
APCC(1)フォワードプライマー：ATGTTCGTTCAGACCAGTTTCTTT（配列番号３１）
CAT(650)リバースプライマー：TAAAAGCCAGTCATTAGGCCTA（配列番号３２）
【０２３０】
図１１において、０μｇ／ｍＬ、又は１５０μｇ／ｍＬのＣＰで培養したシアニディウムシゾン・メロラエ  １０ＤのＣＰ耐性形質転換体（ＴＦ＿０、ＴＦ＿１５０）、並びに、０μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬのＣＰで培養したＹＦＵ３株（１倍体）のＣＰ耐性形質転換体（ＴＦ＿０、ＴＦ＿１００）の細胞を回収し、上記プライマーセットを用いて、ＰＣＲを行った。その後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＰＣＲによる増幅断片の有無を確認した。
【０２３１】
結果を図１２に示す。図１２中、「ｗ／ｏ  ＴＦ」は、形質転換操作を行っていない細胞（野生株）を示す。図１２に示すように、ＹＦＵ３株（１倍体）のＣＰ耐性形質転換体では、ＣＰ濃度０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬのいずれで培養した場合でも、ＣＡＴ遺伝子の増幅断片が確認された。一方、シアニディオシゾン・メロラエでは、ＣＰ濃度１５０μｇ／ｍＬで培養したものではＣＡＴ遺伝子の増幅断片が確認されたが、ＣＰ濃度０μｇ／ｍＬで培養したものではＣＡＴ遺伝子の増幅断片が確認できなかった。シアニディオシゾン・メロラエでは、ＣＰ非存在下での培養により、導入されたＣＡＴ遺伝子が脱落したものと思われる。
以上の結果より、ＹＦＵ３株（１倍体）は、シアニディオシゾン・メロラエと同様に、形質転換が可能であることが示された。
【０２３２】
［実施例７］新規微細藻類（ＨＫＮ１株）の形質転換
（形質転換用断片の作製）
形質転換用断片の作製に用いたプライマーを表１４に示す。以下、使用したプライマーを、表１４に記載のプライマーＮｏ．で記載する。
【０２３３】
【表１４】
2020072698.tif 000016
【０２３４】
＜新規微細藻類形質転換用ＣＡＴベクターの作製＞
ＵＲＡ５．３遺伝子の上流に遺伝子導入を行うためのコンストラクトを、以下のように作製した。ＵＲＡ５．３遺伝子の上流配列（−２５００〜−５０１）のＤＮＡ断片を、ＨＫＮ１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセットＮｏ．１／２を用いて、ＰＣＲにより増幅した。次いで、前記ＰＣＲ増幅断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、ｐＵＣ１９にサブクローニングした。その結果できたベクターをｐＵＲＡ５．３ｕｐベクターとする。
続いて、ＡＰＣＣの上流配列（−５００〜−１）のＤＮＡ断片を、ＨＫＮ１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセットＮｏ．３／４を用いて、ＰＣＲにより増幅した。また、ｍＶｅｎｕｓ  ＯＲＦ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ株式会社で合成）を、プライマーセットＮｏ．５／６を用いて、ＰＣＲにより増幅した。また、β−チューブリンの下流配列（＋１〜＋２５０）のＤＮＡ断片を、ＨＫＮ１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセットＮｏ．７／８を用いて、ＰＣＲにより増幅した。前記３つのＰＣＲ増幅断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、ｐＵＣ１９にサブクローニングした。その結果できたベクターをｐｍＶｅｎｕｓベクターとする。
続いて、ＣＰＣＣの上流配列（−５００〜−１）のＤＮＡ断片を、ＨＫＮ１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセットＮｏ．９／１０を用いてＰＣＲにより増幅した。また、ＰＯＰのオルガネラ移行配列のＤＮＡ断片を、シアニディオシゾン・メロラエ  １０ＤのゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセットＮｏ．１１／１２を用いて、ＰＣＲにより増幅した。また、ＣＡＴ  ＯＲＦ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ株式会社で合成）を、プライマーセットＮｏ．１３／１４を用いて、ＰＣＲにより増幅した。また、ユビキチンの下流配列（＋１〜＋２５０）のＤＮＡ断片を、ＨＫＮ１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセットＮｏ．１５／１６を用いて、ＰＣＲにより増幅した。前記４つのＰＣＲ増幅断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、ｐＵＣ１９にサブクローニングした。その結果できたベクターをｐＣＡＴベクターとする。
続いて、前記ｐｍＶｅｎｕｓベクターを鋳型として、プライマーセットＮｏ．１７／１８を用いて、ＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅した。また、前記ｐＣＡＴベクターを鋳型として、プライマーセットＮｏ．１９／２０を用いて、ＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅した。さらに、プライマーセットＮｏ．２１／２２を用いて、ｐＵＲＡ５．３ｕｐベクターをＰＣＲにより増幅した。次いで、前記のｐｍＶｅｎｕｓベクターの増幅断片及び前記のｐＣＡＴベクターの増幅断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、前記のように増幅したｐＵＲＡ５．３ｕｐベクターにクローニングした。その結果としてできたｐＵＲＡ５．３ｕｐ−ｍＶｅｎｕｓ−ＣＡＴベクターを鋳型として、プライマーセットＮｏ．２３／２４を用いて、ＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅した。この増幅されたＤＮＡ断片を形質転換用ＣＡＴベクターとして用いた。形質転換用ＣＡＴベクターの構造を、図１３にＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔとして示した。
【０２３５】
（形質転換）
形質転換は、Ohnuma M et al（Plant Cell Physiol. 2008 Jan;49(1):117-20.）に記載の方法を改変して行った。ＨＫＮ１株（１倍体）を形質転換の親株として用いた。親株の細胞を、５０ｍＬのＭＡ２Ｕ培地（０．５ｍｇ／ｍＬのウラシルを含むＭＡ２培地）中に希釈して、ＯＤ７５０＝０．３の濃度となるようにし、明暗周期（１２Ｌ：１２Ｄ）、光（５０μｍｏｌ／ｍ２  ｓ）、温度（４２℃）下でエアレーション（６００ｍＬ  ａｍｂｉｅｎｔ  ａｉｒ／ｍｉｎ）しながら、６０時間培養した。次いで、培養液に最終濃度０．００２％となるようにＴｗｅｅｎ−２０を添加した後、遠心分離（２，０００ｇ、５分）により細胞を回収した。回収した細胞を、２７０μＬのＭＡ２Ｕ培地に懸濁した。形質転換は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いるプロトコールにより行った。０．６ｇのＰＥＧ４０００（Ａｌｄｒｉｃｈ，＃８１２４０）を、４５０μＬのＭＡ２Ｕ培地に溶解し（９５℃、１０分）、６０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ４０００溶液を調製した。その後、ＰＥＧ４０００溶液を、使用するまで、ヒートブロック上で４２℃に維持した。
形質転換用ＣＡＴベクター４μｇを、９０μＬの水で調製した。９０μＬのベクター溶液、１０μＬの１０ｘＴＦ溶液（４００ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、４０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．３％  Ｈ２ＳＯ４）、及び１００μＬのＰＥＧ４０００溶液を、１．５ｍＬチューブ中で、ピペッティングにより混合し、ＴＦ−ＣＡＴベクター−ＰＥＧ４０００混合液を調製した。次いで、２５μＬの細胞懸濁液を、２００μＬのＴＦ−ＣＡＴベクター−ＰＥＧ４０００混合液に添加し、３〜４回上下反転させて攪拌し、すぐに１０ｍＬのＭＡ２Ｕ培地に移して、連続光（２０μｍｏｌ／ｍ２ｓ）、温度（４２℃）下で、２日間静置培養した。その後、遠心分離（１，５００ｇ、５分間）により細胞を回収し、塚原鉱泉培地または改変ＭＡ培地１ｍＬに懸濁した。１００μＬの細胞懸濁液を、１００μｇ／ｍＬのＣＰを含む１ｍＬの塚原鉱泉培地または改変ＭＡ培地に加え、２４ウェルプレート（ＴＰＰ  Ｔｅｃｈｎｏ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＡＧ）中で、連続光（２０μｍｏｌ／ｍ２ｓ）、４２℃、３％ＣＯ２の条件下で、７日間静置培養した。緑色の濃くなった部分を新たな１００μｇ／ｍＬのＣＰを含む１ｍＬの塚原鉱泉培地または改変ＭＡ培地に加え、さらに７日間静置培養し、ＣＰ耐性形質転換体を選抜した。ＣＰ耐性形質転換体は、倒立顕微鏡（ＣＫＸ４１；Ｏｌｙｍｐｕｓ）下で、先端を細くしたパスツールピペットを用いて、一細胞単離し、１ｍＬの塚原鉱泉培地または改変ＭＡ培地で静置培養した。
改変ＭＡ培地の組成を表１５に示す。
【０２３６】
【表１５】
2020072698.tif 000017
【０２３７】
（形質転換体の確認）
単離培養したＣＰ耐性形質転換株の細胞についてｍＶｅｎｕｓ−ＣＡＴ遺伝子が目的の場所に導入されていることを確認するためのプライマーを設計した（図１３参照、プライマーのおおよその位置を図１３下図（Ｇｅｎｏｍｅ）中に矢印で示した。）。プライマーの配列は、以下のとおりである。
フォワードプライマー：CATTGCACAGCAATGAAAAGCG（配列番号８７）
リバースプライマー：ATCGAAACTGCGTAGATAGTGTCGG（配列番号８８）
【０２３８】
ＣＰ形質転換体の細胞を回収し、上記プライマーセットを用いて、ＰＣＲを行い、アガロースゲル電気泳動を行った。
その結果を図１４に示す。野生株（ＷＴ）では約２．５ｋｂに増幅断片が見えるが、ＣＰ耐性形質転換株（ＴＦ）では約５．５ｋｂに増幅断片が検出された。この結果から、形質転換株（ＴＦ）では、目的の場所（図１３参照）に、ｍＶｅｎｕｓ−ＣＡＴ遺伝子が挿入されていることが確認された。以上の結果より、ＨＫＮ１（１倍体）は遺伝子ターゲッティングが可能であることが示された。
【０２３９】
さらに、蛍光顕微鏡を用いて、ＣＰ耐性形質転換株を観察し、ｍＶｅｎｕｓの緑色蛍光が観察されるかを確認した。その結果を図１５に示す。図１５中、左図（ｍＶｅｎｕｓ）はｍＶｅｎｕｓの蛍光を検出した蛍光顕微鏡写真であり、中図（Ｃｈｌ）は葉緑体の自家蛍光を検出した蛍光顕微鏡写真であり、右図（ｍｅｒｇｅｄ）は前記２つの蛍光顕微鏡写真をマージしたものである。図１５に示すように、ＣＰ耐性形質転換株では、ｍＶｅｎｕｓが細胞質中に発現しており、緑色の蛍光が検出された。以上の結果より、ＨＫＮ１（１倍体）は外来遺伝子の発現が可能であることが示された。
【０２４０】
［実施例８］ＹＦＵ３株、ＨＫＮ１株の細胞破裂処理
（藻類細胞の乾燥膨潤処理）
ＹＦＵ３株（１倍体）、ＨＫＮ１株（１倍体）、及びＨＫＮ１株（２倍体）を実施例５と同様に培養し、培養液１ｍＬを遠心分離（１，５００×ｇ、２分間）した。遠心分離後の上清を捨て、藻類細胞の沈殿を等張液（１０％スクロース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）に懸濁し、遠心分離（１，５００×ｇ、３分間）を行って、藻類細胞の洗浄を行った。遠心後の上清を捨て、藻類細胞の沈殿を冷蔵庫内（４℃）で３日間放置し、藻類細胞を乾燥した。
３日後、藻類細胞を４５μＬの等張液（１０％スクロース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）に懸濁し、遠心分離（１，５００×ｇ、３分間）を行って、遠心上清及び沈殿を回収した。
また、強固な細胞壁を有する藻類のコントロールとして、シアニディウム・カルダリウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ）ＲＫ−１、強固な細胞壁を有さない藻類のコントロールとして、シアニディウムシゾン・メロラエ  １０Ｄを培養し、上記と同様の乾燥膨潤処理を行い、遠心上清及び沈殿を得た。
【０２４１】
（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ））
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルを調製するために、上記遠心上清に、１５μＬの４×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加した。また、遠心沈殿に、６０μＬの１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加した。前記のように調製した上清サンプル及び沈殿サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをクマシーブリリアントブルーで染色し、遠心上清及び沈殿中のタンパク質を確認した。
【０２４２】
結果を図１６に示す。ＹＦＵ３株（１倍体）、ＨＫＮ１株（１倍体）、及びシアニディオシゾン・メロラエ  １０Ｄでは、乾燥膨潤処理後の上清及び沈殿のいずれでも複数種類のタンパク質が検出された。この結果により、ＹＦＵ３株（１倍体）、ＨＫＮ１株（１倍体）、及びシアニディオシゾン・メロラエ  １０Ｄは、乾燥膨潤処理により細胞破裂を生じることが確認された。一方、ＨＫＮ１株（２倍体）、及びシアニディウム・カルダリウムＲＫ−１では、乾燥膨潤処理後の上清において、タンパク質が全く検出されなかった。この結果は、ＨＫＮ１株（２倍体）、及びシアニディウム・カルダリウムＲＫ−１の細胞は、乾燥膨潤処理により細胞破裂が生じないことを示す。
【０２４３】
［実施例９］１倍体の掛け合わせによる２倍体の作製
（ＨＫＮ１株（１倍体）どうしの掛け合わせ）
ＨＫＮ１株（１倍体）のＮｏ．１株とＮｏ．５株とを混合し、ＭＡ培地を用いて、４０℃、光５０μｍｏｌ／ｍ２ｓ、明暗周期（１２Ｌ：１２Ｄ）、２％ＣＯ２の培養条件下で、３週間培養した。３週間培養後、さらに新しい培地に植え継ぎ（２０倍希釈）、１週間培養した。その後、藻類細胞を顕微鏡で観察した。その結果、強固な細胞壁を有する２倍体様の細胞が確認された（図１７Ａ）。
前記の２倍体様の細胞を採取し、ＤＡＰＩ染色を行って蛍光強度の定量を行った。比較のために、ＨＫＮ１株（１倍体）のＤＡＰＩ染色も行った。その結果を図１７Ｂに示す。
図１７Ｂに示されるように、２倍体様の細胞は、１倍体の株と比較し、２倍の蛍光強度を示した。この結果から、２倍体様の細胞は、２倍体であることが確認された。以上の結果から、１倍体の細胞形態を混合して培養することにより、２倍体の細胞形態を作製できることが明らかとなった。
【０２４４】
（ＹＦＵ３株（１倍体）どうしの掛け合わせ）
ＹＦＵ３株（１倍体）について上記と同様の操作を行ったところ、２倍体の細胞形態が出現したことを光学顕微鏡により確認した。
【０２４５】
［実施例１０］ガルデリア属に属する藻類の１倍体の細胞形態の作製
（強固な細胞壁を有さない細胞形態の作出：Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）
（方法（ａ））
塚原鉱泉培地（Hirooka et al. 2016 Front in Microbiology）または改変ＭＡ培地１ｍＬを２４穴プレートに入れて、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ  ＳＡＧ１０８．７９を各ウェルに約１０個程度投入し、温度４２℃、光５０μｍｏｌ／ｍ２ｓ，ＣＯ２  ２％で１週間培養した。この培地中には、オタマジャクシ様の細胞と丸い細胞が混在していた。顕微鏡下、先端を細くしたパスツールピペットを用いて、オタマジャクシ様の細胞を単離し、さらに、ＭＡ培地で４２℃、光５０μＥ／ｍ２Ｓ，ＣＯ２  ２％で培養した。
【０２４６】
（方法（ｂ））（三段培養）
Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ  ＳＡＧ１０８．７９を、ＭＡ培地でプラトーに達するまで培養し、この培養液から細胞群を取り出して、１００倍に希釈してさらにＭＡ培地に植え継ぎをした。３日間の培養後、オタマジャクシ様の細胞が出現したため、この培養液から顕微鏡観察下、先端を細くしたパスツールピペットを用いて、オタマジャクシ様の形をした細胞を単離し、さらに、ＭＡ培地で４２℃、光５０μＥ／ｍ２Ｓ，ＣＯ２  ２％で培養した。
図１８Ａは、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ  ＳＡＧ１０８．７９の通常の細胞形態（左図）と、前記細胞の培養後に確認された強固な細胞壁を有さない細胞形態（右図）を示す。
【０２４７】
（強固な細胞壁を有さない細胞形態の作出：Ｇ．ｐａｒｔｉｔａ）
上記（方法（ａ））と同様の方法で、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ  ＳＡＧ１０８．７９の代わりに、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｐａｒｔｉｔａ  ＮＢＲＣ  １０２７５９（ＮＩＴＥ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒから入手）を用いて一倍体を作出した。図１８Ｂは、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｐａｒｔｉｔａ  ＮＢＲＣ  １０２７５９の通常の細胞形態（左図）と、前記細胞の培養後に確認された強固な細胞壁を有さない細胞形態（右図）を示す。
【０２４８】
（光学顕微鏡観察）
上記、いずれの培養においても、強固な細胞壁を有さない細胞形態は、凍結融解等で容易に細胞を破砕することができ、細胞内容物を抽出することができた。ガルデリア属に属する藻類の培養中に出現した強固な細胞壁を有さない細胞形態は、オタマジャクシ様の細胞と丸い細胞とが混在していた。図１８Ａ及び図１８Ｂの左図中、矢印で示すものは、減数分裂後に脱ぎ捨てた母細胞壁と考えられる。
【０２４９】
（アレル解析）
Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ  ＳＡＧ１０８．７９の培養により出現した強固な細胞壁を有さない細胞形態の細胞を採取し、ゲノムＤＮＡの一領域をＰＣＲで増幅し、サンガー法により配列解析を行った。比較のために、強固な細胞壁を有する細胞形態の細胞についても、同一領域の配列解析を行った。その結果を図１９に示す。
強固な細胞壁を有する細胞形態では、２種類のアレル配列（２Ｎ＿ａｌｌｅｌｅ１（配列番号６１）、２Ｎ＿ａｌｌｅｌｅ２（配列番号６２））を有していた。一方、強固な細胞壁を有さない細胞形態では、２Ｎ＿ａｌｌｅｌｅ１及び２Ｎ＿ａｌｌｅｌｅ２のいずれか一方しか有さなかった。この結果から、強固な細胞壁を有さない細胞形態が、１倍体であることが確認された。したがって、ガルデリア属に属する藻類も、２倍体の細胞形態と、１倍体の細胞形態と、を有することが示された。
【０２５０】
以下、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ  ＳＡＧ１０８．７９の２倍体及び１倍体を、それぞれ、ＳＡＧ１０８．７９（２倍体）及びＳＡＧ１０８．７９（１倍体）と記載する。Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｐａｒｔｉｔａ  ＮＢＲＣ  １０２７５９の２倍体及び１倍体を、それぞれ、ＮＢＲＣ  １０２７５９株（２倍体）及びＮＢＲＣ  １０２７５９（１倍体）と記載する。
【０２５１】
［実施例１１］ガルデリア属に属する藻類の細胞破裂処理
ＹＦＵ３株（１倍体）等に替えて、ＳＡＧ１０８．７９（２倍体）、ＳＡＧ１０８．７９（１倍体）、ＮＢＲＣ  １０２７５９株（２倍体）及びＮＢＲＣ  １０２７５９（１倍体）を用いたこと以外は、実施例８と同様に、細胞破裂処理を行った。次いで、実施例８と同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをクマシーブリリアントブルーで染色し、遠心上清及び沈殿中のタンパク質を確認した。
【０２５２】
結果を図２０に示す。ＳＡＧ１０８．７９（１倍体）及びＮＢＲＣ  １０２７５９株（１倍体）では、乾燥膨潤処理後の上清及び沈殿のいずれでも複数種類のタンパク質が検出された。この結果により、ＳＡＧ１０８．７９（１倍体）及びＮＢＲＣ  １０２７５９株（１倍体）は、乾燥膨潤処理により細胞破裂を生じることが確認された。一方、ＳＡＧ１０８．７９（２倍体）及びＮＢＲＣ  １０２７５９株（２倍体）では、乾燥膨潤理後の上清において、タンパク質が全く検出されなかった。この結果は、ＳＡＧ１０８．７９（２倍体）及びＮＢＲＣ  １０２７５９株（２倍体）の細胞は、乾燥膨潤処理により細胞破裂が生じないことを示す。
【０２５３】
［実施例１２］ビタミン産生能増強株の作製
（形質転換株の作製）
ＥＧＦＰ  ＯＲＦの替わりに、シアニディオシゾン・メロラエのＣＭＬ３２６Ｃ（トコフェロールシクラーゼ：ＴＣ）の３’末端に３×ＨＡタグを付加したＤＮＡ断片を用いたこと以外は、上記実施例２の「＜ＥＧＦＰ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片の作製＞」と同様の方法で、ｐＤ１８４−Ｏ２５０−ＴＣ−ＵＲＡＣｍ−Ｃｍベクターを作製した。さらに、ＣＭＰ１６６Ｃの上流配列（−５００〜−１）、ＣＭＮ２０２Ｃ（ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼ：ＨＰＴ）の３’末端に３×ＦＬＡＧタグを付加したもの、及びＣＭＫ２９６Ｃの下流配列（＋１〜＋２７８）をＰＣＲにより増幅し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、ｐＤ１８４−Ｏ２５０−ＴＣ−ＵＲＡＣｍ−ＣｍのＵＲＡＣｍ−Ｃｍ選択マーカーの下流に導入し、ｐＤ１８４−Ｏ２５０−ＶＥ−ＵＲＡＣｍ−Ｃｍベクターを作製した。ｐＤ１８４−Ｏ２５０−ＶＥ−ＵＲＡＣｍ−Ｃｍベクターを鋳型として、表７のプライマーセットＮｏ．１９／２０を用いて、ＶＥ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片をＰＣＲにより増幅した。増幅されたＤＮＡ断片（ＶＥ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片）を形質転換に用いた。図２１に、形質転換用のＤＮＡ断片（ＶＥ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片）の構成を示す。当該ＤＮＡ断片（ＶＥ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片）を用いて、ウラシル栄養要求性の変異株である、シアニディオシゾン・メロラエ  Ｍ４の形質転換を行った。形質転換及び形質転換後の培養は、実施例２と同様の方法で行った。次いで、実施例２と同様の方法で、抗ＨＡ抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、イムノブロッティングを行った。
【０２５４】
結果を図２２に示す。左図は、抗ＨＡ抗体を用いてイムノブロッティングを行った結果を示し、右図は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてイムノブロッティングを行った結果を示す。図２２中、「ＧＦＰ」は、ＥＧＦＰ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片（図１Ａ）で形質転換された細胞（ＥＧＦＰ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株）を示す。「ＶＥ」は、ＶＥ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片で形質転換された細胞（ＶＥ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株）を示す。
図２２の結果から、ＶＥ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株は、トコフェロールシクラーゼ及びホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼを発現していることが確認された。
【０２５５】
（形質転換株における細胞内ビタミンＥ量の測定）
ＥＧＦＰ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株、及びＶＥ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株を、ＭＡ２培地中で増殖させた。培養は、連続白色光、４０℃の条件下で行った。培養後、細胞を遠心分離により回収し、前記回収した細胞から７５％エタノールにより可溶物を抽出した。抽出した可溶物中のビタミンＥを定量した。ビタミンＥの定量は、一般財団法人  日本食品分析センターに委託して、高速液体クロマトグラフ法により行った。
【０２５６】
結果を表１６に示す。表１６では、ＥＧＦＰ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株におけるビタミンＥ濃度（細胞乾重量当たり）を１．０としたときの相対値で示した。
【０２５７】
【表１６】
2020072698.tif 000018
【０２５８】
表１６に示すように、ＶＥ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株では、ネガティブコントロールであるＥＧＦＰ／ＵＲＡＣｍ−Ｃｍ断片形質転換株と比較して、ビタミンＥ濃度が高かった。この結果から、シアニディオシゾン・メロラエでは、形質転換により、ビタミンＥの細胞内濃度を高めることが可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０２５９】
本発明によれば、産業利用が可能な新規微細藻類及びその使用が提供される。本発明により提供される新規微細藻類は、栄養成分組成物、栄養剤、栄養成分補給用組成物、及び栄養成分の製造方法等に利用可能である。または、本発明により提供される新規微細藻類は、各種加工食品、機能性食品、栄養補助食品どの食品、飼料、ペットフード、化粧品等に利用可能である。
また、本発明によれば、アミノ酸類やビタミン類等の栄養成分を豊富に含む、栄養成分組成物又は栄養剤が提供される。当該栄養成分組成物又は栄養剤は、各種加工食品、機能性食品、栄養補助食品などの食品や、飼料、ペットフード、化粧品等に利用可能である。
また、本発明によれば、アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂質、食物繊維等の栄養成分の製造方法が提供される。
【図１Ａ】
2020072698.tif 000019
【図１Ｂ】
2020072698.tif 000020
【図１Ｃ】
2020072698.tif 000021
【図２】
2020072698.tif 000022
【図３】
2020072698.tif 000023
【図４】
2020072698.tif 000024
【図５】
2020072698.tif 000025
【図６Ａ】
2020072698.tif 000026
【図６Ｂ】
2020072698.tif 000027
【図７】
2020072698.tif 000028
【図８】
2020072698.tif 000029
【図９】
2020072698.tif 000030
【図１０】
2020072698.tif 000031
【図１１】
2020072698.tif 000032
【図１２】
2020072698.tif 000033
【図１３】
2020072698.tif 000034
【図１４】
2020072698.tif 000035
【図１５】
2020072698.tif 000036
【図１６】
2020072698.tif 000037
【図１７Ａ】
2020072698.tif 000038
【図１７Ｂ】
2020072698.tif 000039
【図１８Ａ】
2020072698.tif 000040
【図１８Ｂ】
2020072698.tif 000041
【図１９】
2020072698.tif 000042
【図２０】
2020072698.tif 000043
【図２１】
2020072698.tif 000044
【図２２】
2020072698.tif 000045
【配列表】
2020072698000001.app