(57)【要約】【課題】組織中の酸素レベルを正確、迅速、かつ直接的に測定するための、特に、ｉｎ−ｖｉｖｏで測定するための改良された安定的近赤外発光化合物およびセンサを提供する。【解決手段】酸素を検知する発光色素、ポリマー、およびこれらのセンサを含むセンサ、ならびにこれらのセンサおよびシステムを使用する方法が提供される。【選択図】図１
2020072650.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物を検出するためのセンサであって、
前記センサはポリマーを含み、
前記ポリマーは発光色素の１以上の残基を含み、
前記発光色素は光安定性ポルフィリン色素であり、かつ哺乳類の皮膚の近赤外光学窓領域に励起および発光スペクトルを有する発光色素である、
センサ。
【請求項２】
前記発光色素が下記式の化合物である；
【化１】
2020072650.tif 000008
（式中、
ＭはＨ、Ｐｄ、Ｚｎ、Ｐｔ、ＧｄまたはＹｂであり、
各Ｒ１は互いに同一または異なっており、かつ独立してＣ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２)ｎ−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２、Ｃ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｍＣＨ２ＣＨ２−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２またはＣＯＯＨであり、
Ｒ７はＣ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２)ｎ−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２またはＣ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｍＣＨ２ＣＨ２−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２であり、
Ｒ２およびＲ３は水素であるか、または融合していずれの場合もシクロアルケニル基、アリール基またはヘテロアリール基を形成し、
ＸはＯまたはＮＲ５であり、
ＹはＯまたはＮＨであり、
Ｒ５およびＲ４は独立してＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
各Ｒ６は互いに同一または異なっており、かつ独立してＨまたはＦであり、
ｎは１〜１０であり、
ｍは１〜３００である。）、
請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】
Ｒ２およびＲ３は水素であるか、または融合していずれの場合もシクロアルケニル基、アリール基またはヘテロアリール基を形成する、
請求項２に記載のセンサ。
【請求項４】
ＭはＰｄである、
請求項３に記載のセンサ。
【請求項５】
ＭはＰｄであり、
Ｒ２およびＲ３は融合してベンゼン環を形成し、
Ｒ１およびＲ７はともにＣ(Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２ＯＣ(Ｏ)Ｃ(ＣＨ３)ＣＨ２である、
請求項２に記載のセンサ。
【請求項６】
前記発光色素は、５００ｎｍから９００ｎｍの間の吸光極大を有し、かつ、６００ｎｍから１０００ｎｍの発光極大を有する、
請求項２に記載のセンサ。
【請求項７】
前記発光色素の前記残基は、約０.０１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で存在する、
請求項２に記載のセンサ。
【請求項８】
前記発光色素の前記残基は、約１ｍＭの濃度で存在する、
請求項５に記載のセンサ。
【請求項９】
前記ポリマーがＨＥＭＡの残基をさらに含む、
請求項２に記載のセンサ。
【請求項１０】
前記ポリマーがハイドロゲルである、
請求項２に記載のセンサ。
【請求項１１】
前記分析物が酸素である、
請求項１〜１０のいずれかに記載のセンサ。
【請求項１２】
前記センサが組織一体型である、
請求項１〜１０のいずれかに記載のセンサ。
【請求項１３】
前記センサは、対象哺乳類の皮下に置かれると検出可能な発光信号を生成する、
請求項１２に記載のセンサ。
【請求項１４】
前記センサは、対象哺乳類の皮下約５ｍｍまでの深さに置かれると検出可能な発光信号を生成する、
請求項１３に記載のセンサ。
【請求項１５】
前記センサは、対象哺乳類の皮下１ｍｍを超える深さに置かれると検出可能な発光信号を生成する、
請求項１３に記載のセンサ。
【請求項１６】
前記対象哺乳類がヒトである、
請求項１３〜１５のいずれかに記載のセンサ。
【請求項１７】
前記センサは、哺乳類の組織内で１週間より長い期間安定的である、
請求項１３〜１５のいずれかに記載のセンサ。
【請求項１８】
オキシダーゼをさらに含む、
請求項２に記載のセンサ。
【請求項１９】
前記オキシダーゼは、グルコースオキシダーゼ、エタノールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、またはヒスタミンオキシダーゼである、
請求項１８に記載のセンサ。
【請求項２０】
前記分析物は、オキシダーゼによって消費される酸素である、
請求項１８に記載のセンサ。
【請求項２１】
前記オキシダーゼは、グルコースオキシダーゼ、エタノールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、またはヒスタミンオキシダーゼである、
請求項２０に記載のセンサ。
【請求項２２】
前記センサは組織一体型である、
請求項２１に記載のセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本出願は、２０１３年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７８４，９２５号（発明の名称：「酸素センサ」）の利益を主張し、当該出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
[0002]  本開示は、発光色素、ポリマー、およびバイオセンサの分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  病状の診断、治療および管理において、罹患した臓器または組織内の酸素濃度のモニタリングが必要となる場合がある。例えば、手足、頭部または臓器に血液を運搬する動脈における血小板の蓄積によって特徴付けられる疾患である末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は、治療せず放置すると、下肢動脈の完全な閉塞を引き起こす可能性があり、観血的バイパス手術または血管内介入が必要となる。毎年、虚血組織への血流を回復するためにそのような血管再生手術が米国だけでも少なくとも１４０，０００件行われている。そのため、血管再生術中および術後に血液および酸素の流れの十分な回復とその維持を確保することが強く望まれている。現状のモニタリング法は、高価、煩雑で、時間を要するものであり、正確で継続的な組織の酸素化情報をもたらすものではない。そのため、よりよい長期的酸素組織モニタリングシステムが明白に求められている。これを最小限のユーザ管理によって非侵襲的に行うことが不可欠であり、実際のユーザ環境においてはセンサ寿命が数日から数か月であることが極めて重要である。
【０００４】
[0004]  そのようなリアルタイムの継続的な組織内酸素濃度（分圧）の測定は、組織に挿入または埋め込まれたセンサを使用し、該センサが生成する信号（シグナル）を体外に設置されたデバイスで測定することによって達成することができる。このようなセンサを設計する際、発光は有効なツールを提供する。発光酸素センサは、酸素がさまざまな化合物の分子発光に対して失活作用を有し、かつ、この作用を利用することでｉｎ  ｖｉｖｏでの酸素濃度（分圧）測定が可能となるという現象に基づいている。皮膚を通して光学的にモニタリングされるこうしたセンサは、皮膚の近赤外（ＮＩＲ）光学窓領域に励起および発光スペクトルを有する極めて安定した色素を必要とする。こうした色素特性は、組織内深くに埋め込むことができる発光酸素センサを首尾よく設計するために極めて重要な要素である。皮膚を通して非侵襲的にモニタリングする場合、光の散乱および吸収を最小限に抑え、高い信号対ノイズ比を達成するため、皮膚の光学窓領域（およそ５５０〜１０００ｎｍ）に励起および発光波長を有する色素を使用する必要がある。しかしながら、市販のＮＩＲ色素は光退色を受けやすい場合がある。パラジウムポルフィリン、例えば、テトラカルボキシフェニルポルフィリン（Ｐｄ−ＴＣＰＰ）はＮＩＲ領域に非常に大きなストークスシフトおよび発光をもつ。しかし残念ながら、これらは緑色光（５２５ｎｍ）による励起を必要とし、緑色光は皮膚およびその下の組織によって大部分が吸収されてしまう。また、埋め込み先の組織の機械的特性と大きく異なる剛性材料からなる市販のセンサは、かさ高で利便性が悪く、埋め込みによって一連の生物学的事象を誘発し、最終的には、センサを包囲してこれを体内から区別する壁となる繊維状被膜が形成されることとなる。
【０００５】
[0005]  そのため、本発明にいたるまで、本技術分野においては、組織中の酸素レベルを正確、迅速、かつ直接的に測定するための、特に、ｉｎ−ｖｉｖｏで測定するための改良された安定的近赤外発光化合物およびセンサを提供するという明白な必要性が依然として存在していた。
【発明の概要】
【０００６】
[0006]  本明細書において開示されるのは、本発明に係る発光色素、かかる色素を含むポリマー、およびかかるポリマーを含むセンサである。
【０００７】
[0007]  一実施形態において、本発明は式１の化合物に関する。
【化１】
2020072650.tif 000003
（式中、
ＭはＨ、Ｐｄ、Ｚｎ、Ｐｔ、ＧｄまたはＹｂであり、
各Ｒ１は互いに同一または異なっており、かつ独立してＣ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２)ｎ−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２、Ｃ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｍＣＨ２ＣＨ２−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２またはＣＯＯＨであり、
Ｒ７はＣ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２)ｎ−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２またはＣ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｍＣＨ２ＣＨ２−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２であり、
Ｒ２およびＲ３は水素であるか、または融合していずれの場合もシクロアルケニル基、アリール基またはヘテロアリール基を形成し、
ＸはＯまたはＮＲ５であり、
ＹはＯまたはＮＨであり、
Ｒ５およびＲ４は独立してＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
各Ｒ６は互いに同一または異なっており、かつ独立してＨまたはＦであり、
ｎは１〜１０であり、
ｍは１〜３００である。）
【０００８】
[0008]  別の側面において、本発明は、式１の化合物の残基（残部）をモノマー繰り返し単位として含むポリマーに関する。本明細書において提供されるポリマーは生体適合性発光ハイドロゲルとすることができる。
【０００９】
[0009]  別のいくつかの実施形態において、本発明は、酸素等の分析物をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出するための、本明細書において提供されるポリマーを含むさまざまな発光センサに関する。これらのセンサは、粉末状、布状（例えば、創傷包帯）、縫合糸状、針状、ロッド状、ディスク状またはその他のあらゆる好適な形状とすることができる。
【００１０】
[0010]  別の側面において、本明細書において提供される発光センサは、組織一体型であるか、または組織一体型の足場材を含み、分析物の存在下で検出可能な信号を生成し、さらに、これらのセンサは、対象の組織内に置かれると（例えば、埋め込まれると）分析物の検出をもたらす。本明細書において説明されるような組織一体型のセンサは（１以上の）分析物の長期にわたる検出を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】[0011]  図１は、化合物２（Ｐｄ−ＢＰ）の吸光および発光スペクトルを示す。ｐＨＥＭＡハイドロゲル中の共有結合したＰｄ−ＢＰについてスペクトルを測定した。６３３ｎｍの励起で８０５ｎｍの発光が発生し、ＮＩＲへのシフトが確認された。
【図２】[0012]  図２は、ｐＨＥＭＡハイドロゲルセンサに組み込まれた化合物２（Ｐｄ−ＢＰ）が組織内のより深くからより明るい信号を発生させることができることを示している。上記イメージは、ラットの胴体で測定された、ＮＩＲのＰｄ−ＢＰ（Ａ）および緑色励起のＰｄ−ＴＣＰＰ（Ｂ）の皮下ハイドロゲル埋め込み片における強度を表している。Ｐｄ−ＢＰは、ＮＩＲ励起および発光波長であるため、ＴＣＰＰと比較して極めて明るく、そのため、皮膚内に光が非常によく浸透し、より深いセンサ配置が可能である。
【図３】[0013]  図３は、マウスの脳に埋め込まれたｐＨＥＭＡ−Ｏ２センサの発光信号を示す。
【図４】[0014]  図４は、ラットの皮膚に埋め込まれた酸素センサの発光を示している（１７０日）。強度は、埋め込み深さ（ベースライン蛍光に対して正規化されたデータ）および組織の酸素濃度の関数として変化する。吸入酸素を１００％から１２％の間で調節し、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ（Ｅｘ＝６４０ｎｍ、Ｅｍ＝８００ｎｍ）にて３０秒ごとにイメージを収集した。関心領域（ＲＯＩ）をセンサの周囲に設定し、時間に対してデータをプロットした。データを図６に示す。
【図５】[0015]  図５は、組織一体型多孔性ハイドロゲル足場材のＳＥＭイメージを示す。
【図６】[0016]  図６は、Ｐｄ−ＢＰの光安定性の測定を示している。５２５ｎｍのＬＥＤを使用し、４０％のデューティサイクルで、ＰＢＳ（ｐＨ７．４、３７oＣ）中のゲルを照明した。両者の寿命（ライフタイム）信号は一定のままである。
【図７】[0017]  図７Ａおよび７Ｂは、組織に一体化された多孔性センサ（Ａ）の応答は速い（３０秒以内）のに対し、固体センサ（Ｂ）の応答はかなり遅い（５分経過しても平坦域には至らなかった）ことを示す。固体センサは同様のロッド形状および同様の材料組成である。
【図８Ａ】[0018]  図８Ａは、Ｐｄ−ＢＰハイドロゲルのＯ２に対する動的応答（Ａ）を示す。応答は線形であり、良好な感度と速い応答時間を有する。
【図８Ｂ】[0018]  図８Ｂは、Ｐｄ−ＢＰによるＯ２失活効率のシュテルン−フォルマー・プロット（Ｂ）を示す。応答は線形であり、良好な感度と速い応答時間を有する。
【図９Ａ】[0019]  図９Ａは、ＧＯｘ／Ｐｄ−ＢＰゲルのグルコースに対する動的応答（Ａ）を示す。
【図９Ｂ】[0019]  図９Ｂは、正規化されたグルコース投与量−応答曲線（Ｂ）を示す。
【図１０Ａ】[0020]  図１０Ａは、Ｏ２センサからの検出可能な調節センサ信号（Ａ）を示す。
【図１０Ｂ】[0020]  図１０Ｂは、Ｏ２センサを含むブタの生検の組織学的分析（Ｂ）を示す。
【図１１Ａ】[0021]  図１１Ａは、脱酸素化（ＦＩＯ２：０．１２）および再酸素化（ＦＩＯ２：１．００）に対する固体センサの応答（Ａ）を示す。
【図１１Ｂ】[0021]  図１１Ｂは、埋め込み後７日目および２８日目の固体センサおよび周辺組織サンプルの蛍光顕微鏡写真（Ｂ）を示す。
【図１１Ｃ】[0021]  図１１Ｃは、脱酸素化（ＦＩＯ２：０．１２）および再酸素化（ＦＩＯ２：１．００）に対する組織一体型多孔性センサの応答（Ｃ）を示す。
【図１１Ｄ】[0021]  図１１Ｄは、埋め込み後７日目および２８日目の多孔性センサおよび周辺組織サンプルの蛍光顕微鏡写真（Ｄ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
[0022]  本明細書に記載されるのは、本発明に係る、ポリマーへの組み込みに有用な重合性発光色素、およびかかる色素の残基をモノマー単位として含むポリマーである。これらの色素およびポリマーは、例えば、検知およびイメージング用途において有用であり、そのような用途として、例えば、正確、かつ場合によっては長期的なｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酸素測定がある。
【００１３】
[0023]  さらに本明細書に記載されるのは、本発明のポリマーを含むセンサである。該センサは、対象の組織内に埋め込み、さまざまな生化学的分析物に関する長期または短期の継続的および半継続的データ収集のために使用することができ、かかる使用は、場合によっては、各種の埋め込み可能なハードウェアおよび／または酵素的および電気化学的検出方法を使用しなくてもよい。一側面において、センサは組織一体型であり、例えば、センサの全領域に極めて近接して（例えば、センサの表面上およびセンサ内部に）毛細血管が成長することを可能にし、それによって、長期にわたる場合を含む、正確な分析物の測定が行われる。別の一側面では、センサは、本発明の発光色素および／またはポリマーに加えて、オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼを含むがこれに限定されない）を含み、ポリマー中にモノマー単位として組み込まれた発光色素および／またはその残基がオキシダーゼによる酸素消費量を測定するため、センサは、酸素以外の多数の分析物（例えばグルコースが挙げられるがこれに限定されない）の検出を行うことができる。
【００１４】
[0024]  本明細書において提供される色素および発光ポリマーの利点としては、（１）励起および発光波長が皮膚の光学窓領域（およそ５５０ｎｍ〜１０００ｎｍ）にあるため組織または臓器内深くにおいて分析物を検出できること；（２）信号対ノイズ比が高いこと；（３）ストークスシフトおよび発光が大きいこと；（４）光安定性である、例えば、色素および／またはポリマーが急速な光退色を受けないこと、が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１５】
[0025]  本明細書に記載されるセンサの利点としては、（１）長期間（例えば、１週間より長く、１か月より長く、６か月より長く）にわたって安定した信号を生成するデバイスを提供すること、（２）対象の組織に配置または埋め込まれ、（例えば、組織および／または毛細血管の内部成長により）該組織と一体化するデバイスを提供すること、（３）シリンジ注入またはトロカール注入により埋め込み可能なデバイスを提供すること、すなわち検知媒体を体内に配置するために外科手術を必要としないこと、（４）体内にセンサ電子機器を含まないデバイスを提供すること、（５）長期間（例えば、１週間より長く、通常、数週間、数か月または数年）にわたって分析物（例えば、酸素）の濃度を正確に評価するデバイスを提供すること、および／または（６）寸法が小さく、それによって患者の使用感が向上し体内での受容が改善するデバイスを提供すること、が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１６】
［００２６］  本明細書および添付の請求の範囲において使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」との単数形の表現は、その内容から別段の明白な規定がない限り、複数形にも言及していることに注意されたい。したがって、例えば、「１つの検知部分（ａ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）」を含むセンサへの言及は、２以上の検知部分を含むデバイスを含んでいる。同様に、「１つの分析物（ａｎ  ａｎａｌｙｔｅ）」への言及は２以上の分析物も言及するものである。
【００１７】
定義
[0027]  「組織一体型」との用語は、生体組織内に一体化された場合に該組織の血管（例えば、毛細血管）に極めて近接してとどまる材料（例えば、足場材）を意味する。
【００１８】
[0028]  「長期」とは、埋め込み片が約７日よりも長い期間、例えば、数週間、数か月または数年にわたって分析物を検知することを意味する。
【００１９】
[0029]  「生分解性」または「生体吸収性」とは、数日から数週間、数か月または数年の範囲の期間に対象の体内で分解可能な材料であることを意味する。
【００２０】
[0030]  「ハイドロゲル」とは、溶媒（例えば、水）を吸収し、識別可能な溶解を起こすことなく急速に膨潤し、可逆的な変形を可能とする３次元ネットワークを維持する材料を意味する。
【００２１】
［００３１］  「刺激応答性」との用語は、外部刺激にさらされると、あるいは、置かれた環境によって、相転移などの物理状態の変化を引き起こす物質、例えばポリマーを意味する。このようなポリマーの非制限的な例としては、「スマート・ポリマー」（Ｋｕｍａｒ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｍａｒｔ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ：  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｐｒｏｇ．  Ｐｏｆｙｍ．  Ｓｃｉ．  ３２  （２００７）  １２０５−１２３７）が挙げられる。
【００２２】
Ａ．発光ＮＩＲ色素
[0032]  一側面において、本発明は式１の化合物を提供する。
【化２】
2020072650.tif 000004
（式中、
ＭはＨ、Ｐｄ、Ｚｎ、Ｐｔ、ＧｄまたはＹｂであり、
各Ｒ１は互いに同一または異なっており、かつ独立してＣ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２)ｎ−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２、Ｃ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｍＣＨ２ＣＨ２−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２またはＣＯＯＨであり、
Ｒ７はＣ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２)ｎ−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２またはＣ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｍＣＨ２ＣＨ２−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２であり、
Ｒ２およびＲ３は水素であるか、または融合していずれの場合もシクロアルケニル基、アリール基またはヘテロアリール基を形成し、
ＸはＯまたはＮＲ５であり、
ＹはＯまたはＮＨであり、
Ｒ５およびＲ４は独立してＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
各Ｒ６は互いに同一または異なっており、かつ独立してＨまたはＦであり、
ｎは１〜１０であり、
ｍは１〜３００である。）
【００２３】
[0033]  一実施形態において、ＭはＰｄである。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ７はともにＣ(Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２ＯＣ(Ｏ)Ｃ(ＣＨ３)ＣＨ２である。別の実施形態において、Ｒ１はＣ(Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２ＯＣ(Ｏ)Ｃ(ＣＨ３)ＣＨ２であり、Ｒ７はＣＯＯＨである。さらに別の実施形態において、Ｒ１のうちの２つがＣ(Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２ＯＣ(Ｏ)Ｃ(ＣＨ３)ＣＨ２であり、Ｒ１のうちの１つがＣＯＯＨであり、Ｒ７がＣＯＯＨである。別の実施形態において、Ｒ１のうちの１つがＣ(Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２ＯＣ(Ｏ)Ｃ(ＣＨ３)ＣＨ２であり、Ｒ１のうちの２つがＣＯＯＨであり、Ｒ７がＣＯＯＨである。一実施形態において、全てのＲ１およびＲ７がＣＯＯＨである。
【００２４】
[0034]  別の実施形態において、Ｒ１およびＲ７はともにＣ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｍＣＨ２ＣＨ２−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２である。別の実施形態において、Ｒ１はＣ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｍＣＨ２ＣＨ２−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２であり、Ｒ７はＣＯＯＨである。さらに別の実施形態において、Ｒ１のうちの２つがＣ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｍＣＨ２ＣＨ２−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２であり、Ｒ１のうちの１つがＣＯＯＨであり、Ｒ７がＣＯＯＨである。別の実施形態において、Ｒ１のうちの１つがＣ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｍＣＨ２ＣＨ２−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２であり、Ｒ１のうちの２つがＣＯＯＨであり、Ｒ７がＣＯＯＨである。一実施形態において、全てのＲ１およびＲ７がＣＯＯＨである。
【００２５】
[0035]  別の実施形態において、Ｒ１およびＲ７はともにＣ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２)ｎ−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２である。別の実施形態において、Ｒ１はＣ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２)ｎ−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２であり、Ｒ７はＣＯＯＨである。さらに別の実施形態において、Ｒ１のうちの２つがＣ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２)ｎ−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２であり、Ｒ１のうちの１つがＣＯＯＨであり、Ｒ７がＣＯＯＨである。別の実施形態において、Ｒ１のうちの１つがＣ(Ｏ)Ｘ−(ＣＨ２)ｎ−ＹＣ(Ｏ)Ｃ(Ｒ４)ＣＨ２であり、Ｒ１のうちの２つがＣＯＯＨであり、Ｒ７がＣＯＯＨである。一実施形態において、全てのＲ１およびＲ７がＣＯＯＨである。
【００２６】
[0036]  一実施形態において、Ｒ２およびＲ３は融合してヘテロアリール基を形成する。一実施形態において、Ｒ２およびＲ３は融合してシクロアルケニル基を形成する。一実施形態において、Ｒ２およびＲ３は融合してテトラシクロヘキセノ基を形成する。一実施形態において、Ｒ２およびＲ３は融合してアリール基を形成する。一実施形態において、上記アリール基は過フッ素化アリール基である。一実施形態において、Ｒ２およびＲ３は融合してベンゾ基を形成する。別の実施形態において、Ｒ２およびＲ３は融合してナフト基を形成する。
【００２７】
[0037]  一実施形態において、Ｒ１は、２〜３００のエチレン単位を有するオリゴエチレングリコールリンカーを含む。別の実施形態において、Ｒ７は、２〜３００のエチレン単位を有するオリゴエチレングリコールリンカーを含む。
【００２８】
[0038]  特定の一実施形態において、ＭはＰｄであり、Ｒ１およびＲ７はともにＣ(Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２ＯＣ(Ｏ)Ｃ(ＣＨ３)ＣＨ２であり、Ｒ２およびＲ３はＨである。
【００２９】
[0039]  特定の一実施形態において、ＭはＰｄであり、Ｒ１およびＲ７はともにＣ(Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２ＯＣ(Ｏ)Ｃ(ＣＨ３)ＣＨ２であり、Ｒ２およびＲ３は融合してベンゼン環を形成する。
【００３０】
[0040]  一実施形態において、式１の化合物は、近赤外発光色素である。一実施形態において、式１の化合物は、５００ｎｍから８００ｎｍの間の吸光極大を有する。特定の一実施形態において、式１の化合物は、５００ｎｍから７００ｎｍの間の吸光極大を有する。一実施形態において、式１の化合物は、５００ｎｍから１０００ｎｍの間の発光極大を有する。一実施形態において、式１の化合物は、６５０ｎｍから９００ｎｍの間の発光極大を有する。特定の一実施形態において、式１の化合物は、８００ｎｍから９００ｎｍの間の発光極大を有する。一実施形態において、本発明の式１の化合物は、光安定性であり、皮膚のＮＩＲ光学窓領域に励起および発光スペクトルを有する。
【００３１】
[0041]  例えば、好ましい実施形態において、図１に示されるように、式２の化合物２は、ＨＥＭＡとの共重合によりハイドロゲルを形成した場合に、６３３ｎｍの吸光極大を有し、かつ８０５ｎｍの発光極大を有する。
【化３】
2020072650.tif 000005
【００３２】
[0042]  いくつかの実施形態において、本発明の色素は、酸素不透過性固体ナノ粒子内にカプセル化される。このナノ粒子は、酸素以外に感受性を有する発光用途に使用することができる。
【００３３】
Ｂ．ポリマー
[0043]  本発明の蛍光色素は、重合可能な基、例えば、アクリル酸残基またはメタクリル酸残基を含み、他のモノマーとの共重合により近赤外発光基を含むポリマーを提供することができる。上記化合物が２以上の重合可能な基を有する場合、それらと他のモノマーとの共重合によって得られるポリマーは架橋化することができる。あるいは、重合混合物に別の架橋性モノマーを加えて、得られるポリマーがより高い架橋度を達成するようにすることもできる。
【００３４】
[0044]  本明細書に記載されるポリマーは、好適なあらゆる方法で調製することができる。本明細書において提供されるポリマーを製造するために使用される好適な合成方法の非制限的な例としては、カチオン重合、アニオン重合、フリーラジカル重合が挙げられる。いくつかの特定の実施形態において、ポリマー合成は、何も添加せずに、または好適な溶媒中で行われる。好適な溶媒としては、ペンタン、ヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、水、エチレングリコール、プロピレングリコール、ＤＭＳＯ、またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの特定の実施形態において、ポリマー合成は、好適な反応温度、例えば、約−５０oＣ〜約１００oＣの反応温度、または約０oＣ〜約７０oＣの反応温度で行われる。
【００３５】
[0045]  上記ポリマーは、好ましくはフリーラジカル重合によって調製される。フリーラジカル重合プロセスを使用する場合、（ｉ）モノマー、（ｉｉ）任意で１種または複数種のコモノマー、（ｉｉｉ）任意のフリーラジカル源を用意してフリーラジカル重合プロセスを誘発する。いくつかの実施形態において、フリーラジカル源は任意であり、これは、モノマーによっては高温で加熱されることで自動的に開始するものがあるためである。場合により、重合混合物を形成した後、この混合物を重合条件下に置く。そのような条件はあらゆる好適なレベルに任意で変更され、かかる条件の非制限的な例としては、温度、圧力、光、大気、重合混合物に使用される仕込み成分比、および反応時間が挙げられる。重合は、例えば、溶液中、分散液中、懸濁液中、乳濁液中、バルク状等、あらゆる好適な方法で行われる。
【００３６】
[0046]  いくつかの実施形態では、反応混合物中に開始剤が存在する。本明細書に記載される重合プロセスに有効であればあらゆる好適な開始剤が任意で利用される。そのような開始剤の非制限的な例としては、アルキル過酸化物、置換アルキル過酸化物、アリール過酸化物、置換アリール過酸化物、アシル過酸化物、アルキルヒドロ過酸化物、置換アルキルヒドロ過酸化物、アリールヒドロ過酸化物、置換アリールヒドロ過酸化物、ヘテロアルキル過酸化物、置換ヘテロアルキル過酸化物、ヘテロアルキルヒドロ過酸化物、置換ヘテロアルキルヒドロ過酸化物、ヘテロアリール過酸化物、置換ヘテロアリール過酸化物、ヘテロアリールヒドロ過酸化物、置換ヘテロアリールヒドロ過酸化物、アルキル過酸エステル、置換アルキル過酸エステル、アリール過酸エステル、置換アリール過酸エステル、またはアゾ化合物のうちの１種または複数が挙げられる。特定の実施形態では、過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）および／またはＡＩＢＮが開始剤として使用される。
【００３７】
[0047]  いくつかの実施形態において、重合プロセスは、制御された（生体）モードで行われる。好ましい制御された（生体）重合プロセスとしては、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合プロセスおよび原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）が挙げられる。
【００３８】
[0048]  いくつかの特定の実施形態において、本発明のポリマーはハイドロゲルである。例えば、そのようなハイドロゲルは、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）を反応させてポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ｐＨＥＭＡ）を形成することで調製可能である。さらに、さまざまなコモノマーを組み合わせて使用し、ハイドロゲルの親水性、機械的特性および膨潤性を変化させることができる（ＰＥＧ、ＮＶＰ、ＭＡＡ等）。ポリマーの非制限的な例としては、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、（種々の分子量の）ポリ（エチレングリコール）モノメタクリレート、ジエチレングリコールメタクリレート、Ｎ−（２−ヒドロキプロピル）メタクリルアミド、グリセロールモノメタクリレート、２，３−ジヒドロキシプロピルメタクリレート、およびそれらの組み合わせが挙げられる。架橋剤の非制限的な例としては、テトラエチレングリコールジメタクリレート、（種々の分子量の）ポリ（エチレングリコール）（ｎ）ジアクリレート、エトキシ化トリメチロールプロパントリアクリレート、ビスアクリルアミド、およびそれらの組み合わせが挙げられる。開始剤の非制限的な例としては、Ｉｒｇａｃｕｒｅ系（ＵＶ）、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）（熱）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）（熱）が挙げられる。
【００３９】
[0049]  特定の一実施形態では、かかるポリマーは、ＨＥＭＡと式１の化合物との共重合により調製される発光ハイドロゲルである。好適な実施形態では、そのようなハイドロゲルは、種々のモル量の式２の化合物を、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）モノマー、テトラエチレングリコールジメタクリレート（ＴＥＧＤＭＡ）架橋剤、Ｉｒｇａｃｕｒｅ６５１開始剤、水、および補助溶剤と混合した後、ＵＶで開始される重合を行って共重合させることで調製される。別の実施形態では、ポリマーにおける式１の化合物の最終濃度は１ｍＭである。特定の一実施形態において、ポリマーは、５０ｗｔ％のＨＥＭＡ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、１ｗｔ％のＴＥＧＤＭＡ（トリエチレングリコールジメタクリレート）、２０ｗｔ％のエチレングリコール、２５．５ｗｔ％の水、０．５％ｖｏｌ／ｖｏｌの光開始剤Ｉｒｇａｃｕｒｅ６５１、および３％の化合物２の共重合によって調製された、酸素を検知するポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ｐＨＥＭＡ）足場材である。
【００４０】
[0050]  本発明のポリマーは、体内で分解可能（生分解性）なポリマー、あるいは分解プロセスを開始または加速させる外部開始剤（例えば、ＵＶ、超音波、高周波、温度、またはその他の分解を開始させる外因的ソース）の適用により分解可能なポリマーであってよい。例えば、ポリマーは、生分解性または生体吸収性であるか、あるいは、生分解性または生体吸収性セグメントを含んでよく、そのようなセグメントの例としては、分解可能な形態のアルギン酸塩、ポリ（乳酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ無水物、ポリ（グリコール酸）、微孔性ポリエステル、微孔性ポリエーテル、および架橋コラーゲンが挙げられるがこれらに限定されない。具体的な一例として、Ｐｈｅｌｐｓ，  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０７（８）：３３２３−３３２８に記載される、ポリ（エチレングリコール）−ジアクリレートと、アクリル化されたプロテアーゼ分解性ペプチドと、ＶＥＧＦとのＵＶ光重合がある。
【００４１】
[0051]  一実施形態において、本明細書において提供されるポリマーは生体適合性ポリマーである。本発明の別の側面において、これらポリマーは生分解性である。分解性ハイドロゲルは、ＨＥＭＡと本発明の重合性発光色素との共重合による原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）を用いて合成することができる。非分解性および分解性酸素検知ハイドロゲルに基づく多孔性センサ足場材は、球体テンプレートを使用した作製技術（ｓｐｈｅｒｅ−ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いて作成できる。分解性および非分解性ＨＥＭＡ試薬と、重合性色素とが、テンプレートとなるマイクロ粒子上で重合されることとなり、このマイクロ粒子がその後溶媒とともに溶解されることで、所望の非分解性および分解性足場材が作成される。簡単に説明すると、制御されたＡＴＲＰにより、ＰＣＬベースの分解性二官能性ＡＴＲＰ開始剤および架橋剤の存在下でＨＥＭＡの重合が行われる。この合成スキームでは、分解性開始剤の両端から同じ速度でｐＨＥＭＡ鎖が成長することにより、親ポリマーの半分のＭＷを有する分解生成物が生じることになる。親ポリマーのＭＷと、開始剤および／または架橋剤中のＰＥＧ単位およびＰＣＬ単位とを制御することで、ポリマーの分解速度を変化させることができる。親ポリマーのＭＷを１０ｋＤａに制限することで、ハイドロゲルの機械的強度を維持しながら、体内で除去することができる分解生成物をもたらし、かつ分解速度を高めることができる。
【００４２】
[0052]  いくつかの特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリマーは刺激応答性、例えば、温度感受性またはｐＨ感受性ポリマーである。そのような刺激応答性ポリマーの非制限的な一例として、ＮＩＰＡＭの共重合に由来する温度感受性ポリマーがある。こうしたポリマーは、これらのポリマーを含むセンサを組織内の所望の位置に埋め込む際に、まず、体温よりも低い注入に適した媒体にポリマーを溶解した後、得られる溶液を組織内および／または体内の所望の位置に注入する場合に有効である。ポリマーがより高い温度（例えば、体温）にさらされると、該ポリマーは、酸素モニタリングが必要となる注入位置またはその近くで析出する。
【００４３】
Ｃ．センサ
[0053]  いくつかの実施形態において、本発明のポリマーは分析物の検出に有効なセンサ内に組み込まれる。かかる分析物の検出は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出とすることもｉｎ  ｖｉｖｏ検出とすることもできる。本段落の以下の文章では、「Ｃ．センサ」のセクションにおいて使用される「ポリマー」との用語について説明する。かかるポリマーは、ポリマー骨格に共有結合された式１および／または式２の分子を含み得る。式１および／または式２の分子は、（例えば、共有結合またはその他の手段によって）結合されてもよいし、ナノ粒子キャリアまたはマイクロ粒子キャリア、あるいは、ポリマーに結合されるか、またはポリマー内に含まれるその他のキャリア内に含まれてもよい。そのようなキャリアはポリマー骨格に共有結合され得る。「ポリマー」との用語は「センサ」との用語と同義で使用することができる。
【００４４】
[0054]  非制限的な一例において、ポリマーは、創傷治癒の過程をモニタリングするため、例えば、治癒の重要な要素の一つ（すなわち、酸素化）を継続的かつ非侵襲的に評価するために使用することのできる酸素検知創傷用包帯に組み込まれる。
【００４５】
[0055]  別の実施形態では、ポリマーは、創傷治癒モニタリングセンサとして、創傷部に直接使用される粉末内に組み込まれる。本発明のセンサは、皮膚またはその下の組織の酸素化モニタリングが有益となる用途（例えば、創傷治癒モニタリング、皮膚閉鎖、ヘルニア治療、皮膚弁移植術、再建手術、およびその他の形成術用途が挙げられるがこれらに限定されない）において使用される注射剤、埋め込み片、メッシュ材、または縫合糸の形態とすることもできる。本発明のセンサは、微小循環不全および末梢動脈疾患のための測定に使用することもできる。特に、血管再生術中または薬の投与時に組織酸素を直接モニタリングすることが可能である。本発明のセンサは、腫瘍用途において組織内または臓器内の低酸素症の程度を測定するために使用することもできる。一実施形態では、動物における腫瘍の成長をモニタリングするために本センサが使用され、そのような動物としては、がん治療投薬または腫瘍代謝のモニタリング等の腫瘍薬学および診断の研究と発見において使用されるマウスまたはラットモデルが含まれるがこれらに限定されない。本発明のセンサは、例えば、ＣＯＰＤおよび喘息症状における肺機能の状態をモニタリングする際に使用することもできる。さらに別の実施形態では、運動またはトレーニングを最適化するために、例えば、兵士や運動選手のパフォーマンスまたはパーソナル訓練プログラムにおいて本センサが使用される。本センサは、酸素を検知する入れ墨の形態とすることもできる。
【００４６】
[0056]  さらに別の実施形態では、本発明のセンサは、酸素を継続的にモニタリングするために使用可能なツールが現状存在しない神経科学分野のモニタリング用途、例えば、くも膜下出血のモニタリングに使用される。
【００４７】
[0057]  一実施形態では、本発明のセンサは、スラブ状、ロッド状、シリンダ状、粒子状または粉末状とし得る固体材料である。特定の一実施形態では、本センサはロッド状である。別の実施形態では、本センサはシリンダ状である。
【００４８】
[0058]  別の実施形態において、本発明のセンサは、（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願２０１２／０２６５０３４号に記載されるように）組織一体型足場材に組み込まれて組織一体型センサを提供する。本明細書に記載されるセンサは、通常、組織一体型足場（マトリックスとも言う）材料を含む。本発明の組織一体型足場材は、該足場材が組織一体化および／または血管新生を促進するような材料および／または微細構造によって構築され得ることが好ましい。例えば、多孔性足場材は、組織と生体材料との固着をもたらし、細孔を通じた内部成長を促進する。結果として得られる組織成長の「回廊」パターンまたは「チャネル」パターンは、健康な空間充填物として長期間持続し、かつ宿主細胞の一体化を促す。本明細書に記載される生体材料の細孔は、そのほとんどまたは全ての相互に結合されている（切れ目のない）ことが好ましい。生体材料の切れ目ない細孔構造は、埋め込み片において細胞が空間を充填するように内部成長することを促し、これによって、異物反応を制限し、かつ、埋め込み片がセンサとして機能する能力を長期間（１週間より長く、数年に至るまで）持続させることとなる。組織一体型足場材をもたらす別の構造としては、繊維（例えば、直径１〜１０ミクロン以上のもの、例えば、５、６、７、８、９、１０ミクロン以上のもの）があり、こうした繊維は非ランダム構成またはランダム構成に配置し得る。多光子重合技術によって（任意の構成の）組織一体型足場材を形成することもできる。Ｋａｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０５（２６）：８８５０−８８５４；Ｎｉｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｓｍａｌｌ  １：１２０−１２５；Ｋａｓｐｒｚａｋ，  Ｄｏｃｔｏｒａｌ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，  Ｇｅｏｒｇｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｍａｙ  ２００９。
【００４９】
[0059]  組織一体型足場材の形態であることが好ましい本発明のポリマーは、式１または式２の化合物と組み合わせて任意の材料を含んでよく、例えば、合成ポリマー、天然由来物質、またはそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。例示的な合成ポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、シリコーンゴム、ポリ（[ε]−カプロラクトン）ジメチルアクリレート、ポリスルホン、（ポリ）メチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、可溶性テフロン（登録商標）−ＡＦ、（ポリ）エチレンテレフタレート（ＰＥＴ、Ｄａｃｒｏｎ）、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、およびこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な天然由来材料としては、繊維状または球状タンパク質、複合糖質、グリコサミノグリカン、細胞外マトリックス、またはこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。したがって、ポリマー足場材は、あらゆる種類のコラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸、アルギニン酸、デスミン、バーシカン、マトリクス細胞タンパク質、例えば、ＳＰＡＲＣ（オステオネクチン）、オステオポンチン、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、フィブリン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、アルブミン、キトサン等、を含み得る。天然ポリマーは足場材としてまたは添加剤として使用され得る。
【００５０】
[0060]  いくつかの特定の実施形態において、組織一体型足場材の形態であることが好ましい本発明のポリマーは、ハイドロゲルを含む。例えば、本ポリマーはハイドロゲルを、例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）を反応させることによってポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ｐＨＥＭＡを含み得る。さらに、さまざまなコモノマーを組み合わせて使用することで、ハイドロゲルの親水性、機械的特性および膨潤性を変化させることができる（ＰＥＧ、ＮＶＰ、ＭＡＡ等）。ポリマーの非制限的な例としては、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、（種々の分子量の）ポリ（エチレングリコール）モノメタクリレート、ジエチレングリコールメタクリレート、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、グリセロールモノメタクリレート、２，３−ジヒドロキシプロピルメタクリレート、およびこれらの組み合わせが挙げられる。架橋剤の非制限的な例としては、テトラエチレングリコールジメタクリレート、（種々の分子量の）ポリ（エチレングリコール）（ｎ）ジアクリレート、エトキシ化トリメチロールプロパントリアクリレート、ビスアクリルアミド、およびそれらの組み合わせが挙げられる。開始剤の非制限的な例としては、Ｉｒｇａｃｕｒｅ系（ＵＶ）、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）（熱）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）（熱）が挙げられる。
【００５１】
[0061]  組織一体型足場材の形態であることが好ましい本発明のポリマーは、例えば、Ｒａｔｎｅｒらの米国特許出願公開第２００８／００７５７５２号に記載されるような逆コロイド結晶といった、球体をテンプレートとしたハイドロゲルとしてもよく、あるいはその他の組織一体型材料としてもよい。
【００５２】
[0062]  組織一体型足場材の形態であることが好ましい本発明のポリマーは、体内で分解可能（生分解性）なポリマー、あるいは分解プロセスを開始または加速させる外的開始剤（例えば、ＵＶ、超音波、高周波、またはその他の分解を開始させる外因的ソース）の適用により分解可能なポリマーであってよい。例えば、ポリマーは、あらゆる生分解性または生体吸収性ポリマーで構成されてよく、そのようなポリマーとしては、分解可能な形態のアルギン酸塩、ポリ（乳酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ無水物、ポリ（グリコール酸）、微孔性ポリエステル、微孔性ポリエーテル、および架橋コラーゲンが挙げられるがこれらに限定されない。具体的な一例として、Ｐｈｅｌｐｓ，  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０７（８）：３３２３−３３２８に記載されるような、ポリ（エチレングリコール）−ジアクリレートと、アクリル化されたプロテアーゼ分解性ペプチドと、ＶＥＧＦとのＵＶ光重合がある。
【００５３】
［００６３］  その他の具体的な例としては、Ｋｌｏｘｉｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４：５９−６３や米国特許第６，０１３，１２２号に記載されるポリマーであって、その分解が外的エネルギー形態にさらされることによって制御されるポリマー、ならびにＡｌｅｘｅｅｖ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７５：２３１６−２３２３；Ｂａｄｙｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０：１０９−１１６；Ｂｒｉｄｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  ９４（ｌ）：２５２−２５８；Ｉｓｅｎｈａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８３Ａ：９１５−９２２；Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：１００−１０１；Ｐｈｅｌｐｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １０７（８）：３３２３−８；Ｏｓｔｅｎｄｏｒｆ  ａｎｄ  Ｃｈｉｃｈｋｏｖ  （２００６）  Ｔｗｏ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ＭｉｃｒｏＭａｃｈｉｎｉｎｇ，  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｓｐｅｃｔｒａ；Ｏｚｄｅｍｉｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｐｌａｓｔ．  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．  Ｓｕｒｇ．  １１５：１８３；米国特許出願公開第２００８００７５７５２号；Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ａ  ６７Ａ（４）：１１８１−１１８７；Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６２（２）：２２２−２２７；Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５（４）：４６２−４６７；Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６：８１３−８１８；Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ａ  ７２（３）：３３５−３４２；Ｓａｎｄｅｒｓ  （２００３）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６７（４）  ：１４１２−１４１６；Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２（１）：２３１−２３７；およびＹｏｕｎｇ  Ｍｉｎ  Ｊｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ８７Ａ：  １３６−１４６に記載されるポリマーがある。
【００５４】
[0064]  いくつかの特定の実施形態において、組織一体型足場材の形態であることが好ましい本発明のポリマーは、足場材料から組織反応修飾因子が放出されて組織一体化および血管新生が促進または強化されるように構築される。
【００５５】
[0065]  さらに、組織一体型足場材の形態であることが好ましい本発明のポリマーは、空洞であるか、または分解性物質、血管形成物質またはその他の物質（幹細胞等）で充填された導管、細孔またはポケットをもつように構築され得る。上述のように、いったん体内に入ると、導管、細孔またはポケットを埋めている材料の生分解によって、毛細血管を含む組織と材料とが一体化するための空間が形成される。最初に導管、細孔またはポケットを埋めていた分解性材料は足場材内における血管成長または組織成長を強化し得る。この構造によって、新しい血管の形成が促進され、埋め込み片の内部およびその周囲に健康で生存可能な組織が維持される。
【００５６】
[0066]  組織一体型足場材の形態であることが好ましい本発明のポリマーは、関心のある分析物に対して透過性を有するように構築され得る（例えば、酸素は、組織一体型ハイドロゲル足場材内に拡散し、ハイドロゲルマトリックス内部に埋め込まれた検知部分に到達することができる）。
【００５７】
[0067]  組織一体型足場材の形態であることが好ましい本発明のポリマーは、任意の好適な形状とすることができ、例えば、ブロック状（または任意の厚さ）、立方体状、ディスク型、円筒形、楕円形、円形、ランダムまたは非ランダム構成の繊維状等が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの特定の実施形態では、センサは、非ランダム（例えば、グリッド、層状グリッド等）またはランダムに組織され得る１以上の繊維を含む。
【００５８】
[0068]  本明細書に記載される、組織一体型足場材の形態であることが好ましい本発明のポリマーは、通常、１以上の分析物を検出する検出部分と組み合わせられる（またはそれら検知部分からなる）。一実施形態では、組織一体型足場材に組み込まれた式１および／または式２の化合物の残基がこの検知部分となる。
【００５９】
[0069]  別の実施形態では、組織一体型足場材の形態であることが好ましい本発明のポリマーは、式１および／または式２の化合物の残基に加えて、酸素を産生または消費する第２の検知部分、例えば、オキシダーゼを含み、式１および／または式２の化合物の残基は、第２の検知部分によってもたらされる酸素濃度の変化を検出するために用いられる。第２の検知部分は、例えば、基質グルコースに特異的なグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）のような酵素を含むことができる。グルコースオキシダーゼとの酵素的相互作用によるグルコースの反応により、酸素が比例的に消費され、Ｈ２Ｏ２に変換される。式１および式２の分子のようなＯ２感受性蛍光色素を使用することで、酵素付近でのＯ２の還元を測定することができる。これらの色素分子はＯ２の存在下で失活するため、ＧＯｘの作用によるＯ２の還元によって蛍光発光が増加することとなる。したがって、Ｏ２検定部分から発光される蛍光量はセンサ中のグルコース濃度に比例する。グルコース以外の他の分析物を検出するためのグルコースオキシダーゼ以外のオキシダーゼとしては、ビリルビンオキシダーゼ、エタノールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ヒスタミンオキシダーゼ、または他の関心ある分析物に特異性を有するその他のオキシダーゼを挙げることができる。
【００６０】
[0070]  組織内のＯ２濃度は生理学的にも変動する場合があり、それにより検知部分における酸化物酵素（ｏｘｉｄｅ  ｅｎｚｙｍｅ）の反応が変化または制限される。したがって、センサ内のＯ２濃度をオキシダーゼターゲット濃度とは独立して測定することが可能である。これは、数ナノメートル、マイクロメートル、ミリメートルスケールで、酵素−Ｏ２検出部分からＯ２参照部分を物理的に分離してクロストークを回避することで実現し得る。そのようなＯ２の参照測定値は、オキシダーゼ検知部分からのグルコース特異的信号に補正を加えることを可能にする。
【００６１】
[0071]  別の実施形態において、組織一体型足場材の形態であることが好ましい本発明のポリマーは、複数分析物のためのセンサであって、検出および報告される２以上の分析物のうちの１つが酸素であるセンサとし得る。この実施形態では、ポリマーは、酸素検出用の式１および／または式２の化合物の残基と、別の物質を検出するための第２の検知部分とを含んでいる。これらの検知部分によって検出し得る分析物の非制限的な例としては、酸素、活性酸素種、グルコース、乳酸塩、ピルビン酸塩、コルチゾール、クレアチニン、尿素、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、カリウム、バソプレッシン、ホルモン（黄体形成ホルモン等）、ｐＨ、サイトカイン、ケモカイン、エイコサノイド、インスリン、レプチン、小分子薬剤、エタノール、ミオグロビン、核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）、フラグメント、ポリペプチド、単一アミノ酸等が挙げられる。
【００６２】
[0072]  別の実施形態では、組織一体型足場材の形態であることが好ましい本発明のポリマーは、式１および／または式２によって検出される酸素信号が１以上の他の分析物に関する信号を補正または較正するための参照として使用されるセンサとし得る。酸素信号は報告されてもされなくてもよく、他の分析物の信号を較正または補正するための内部アルゴリズムにおいてのみ使用され得る。この実施形態では、酸素信号を参照として使用することが、センサ部位における分析物の有効性を変化させ得る生理学的ばらつき（例えば、血流の変動）の克服に寄与する。
【００６３】
[0073]  さらに別の実施形態では、検知部分は、式１および／または式２の化合物の残基に加えて、第２の発光性分析物検知部分を含み、式１および／または式２の化合物の残基は参照分子として使用される。非酸素検知部分は、分析物特異的な部分、例えば、競合的結合アッセイ（例えば、リガンド受容体部分とコンカナバリンＡやデキストランのような分析物類似体部分）、可逆的発光結合分子（例えば、グルコース検出用のボロン酸系センサ化学物質）、グルコース結合タンパク質のような結合タンパク質等を利用し得る。組織内のグルコース等の分析物を測定するため、ポリマーは、埋め込み片の長期寿命の間、所望の間隔で（例えば、９０日以上の期間にわたって５〜６０分毎）、埋め込み片上部の皮膚の上のパッチリーダから６５０ｎｍの照明を受ける。（例えば、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７等の分子からの）検出される発光信号量は、組織内の分析物（例えば、グルコース）の濃度に比例する。（例えば、式１または式２の分子からの）検出される発光信号量は、組織内のＯ２濃度に比例する。組織内のＯ２濃度は、センサ周辺における急性および／または慢性の生理学的変化を表しており、該濃度は、比例アルゴリズムによってグルコース信号またはその他の分析物信号を補正または調整するために使用し得る。
【００６４】
[0074]  別の実施形態では、組織の光学的変化に対する補正を容易にする内部参照対照材料を採用することができる。埋め込まれた組織一体型バイオセンサは、通常、スキャン表面から３〜４ｍｍ下に存在する。皮膚において、近赤外領域の励起光および蛍光発光は、光がリーダパッチと埋め込み片との間の組織を通過する際強く散乱することが広く知られている。吸収および散乱の程度は、温度等の物理的特性、あるいは、血液かん流、水和およびメラニン濃度の違いを含むがこれらに限定されない組織の組成による影響を受ける。ユーザ間に生じる皮膚の相違もあれば、一人の患者の異なる時点において生じる皮膚の相違もあり、これらの相違が、分析物特異的信号に関して正確な信号を生じる蛍光励起および発光信号に影響を及ぼす場合がある。そのため、分析物特異的蛍光発光と区別可能な発光スペクトルを有する別の蛍光分子を足場材内に固定化させることができる。そのような分子からの蛍光発光は、組織組成の変化に関する情報を伝える信号を測定するため、分析物特異的な蛍光発光とは別個に測定することができる。色素の選択は、組織変化に対して分析物特異的色素と同様の反応を示すことに基づいて行われる。式１または式２は、例えば、高架橋ＰＡＮまたはシリカシェル内に埋め込まれる等、非酸素拡散環境に組み込まれることによって、その酸素検知機能が大きく低下または消失する場合がある。このフォーマットでは、本発明の色素分子は上述の安定した内部参照対照材料として機能し得る。
【００６５】
[0075]  １以上の円筒形要素（例えば、繊維）からなる組織一体型センサは、現在使用されている埋め込み片と比較して、異物反応を除去、または大きく削減する。さらに、他の公知のセンサと異なり、毛細血管供給源から検知媒体のあらゆる部分までの平均拡散距離は天然の組織に匹敵する。
【００６６】
[0076]  検知媒体（埋め込み型センサ）の全体的寸法は、測定される対象および／または（１以上の）分析物によって異なるものであることが明らかであろう。通常、埋め込み片は、厚さ約０．００１ｍｍから２ｍｍの間（またはこの間の任意の数値）であり、直径１ｍｍから１ｃｍの間（または円形以外の形状の場合は同等の断面積、例えば、長さ／幅）であり、長さ１５ｍｍ以下であり、例えば、厚さ２ｍｍ以下、直径１０ｍｍ以下のディスク状センサがある。いくつかの特定の実施形態では、おおよそのセンササイズが、直径およそ１００〜１０００ミクロン、長さ０．２５ｍｍから１０ｍｍの間である。ディスク状の組織一体型検知媒体のサイズは、通常、厚さ２ｍｍ以下、直径１０ｍｍ以下である。
【００６７】
[0077]  本発明の別の側面は、哺乳類の体内で半継続的、継続的および／または長期的に使用するための組織一体型バイオセンサシステムである。
【００６８】
[0078]  本発明のポリマーの有利な特徴の一つとして、その安定性がある。本発明の一側面において、センサは、例えば、1週間超、1か月超、6か月超といった長期間にわたって哺乳類の組織内で安定する。例示的な一実施形態では、図２に示されるように、ラットの皮膚に１７０日間埋め込まれた場合に、センサは安定であり、かつ安定した信号を生成する。
【実施例】
【００６９】
[0079]  ＮＭＲ分光データを、３００ＭＨｚの機器を使用して室温で記録した。ＮＭＲスペクトルは重水素化ＤＭＳＯ−ｄ６またはＣＤＣｌ３の溶媒信号に合わせて較正した。信号の多重度を表すために、ｓ（一重線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、ｂｒ（ブロード）、ｍ（多重線）との略号が使用される。ＨＰＬＣ−ＭＳ分析データは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）分光計に結合されたＣ１８逆カラムを含むＨＰＬＣシステム使用して記録した。２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩およびテトラエチレングリコールジメタクリレートはＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社から調達した。その他の化学物質はすべてＳｉｇｍａ・Ａｌｄｒｉｃｈ社から調達した。
【００７０】
実施例１：重合性近赤外発光色素の合成
[0080]  スキーム１は、近赤外発光色素の例示的な一例である化合物２（「Ｐｄ−ＢＰ」とも言う）の合成を説明している。
【化４】
2020072650.tif 000006
【００７１】
［００８１］  Ｎｉｅｄｅｒｍａｉｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｉｎｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ２０１０，  ４９，  ｐ．  ９３３３に記載される方法で化合物３を調製した。簡単に説明すると、９０ｍＬの無水ＴＨＦに対し、１−ニトロシクロへキセン（２．６６ｍＬ）、エチルイソシアノアセトニトリル（２．６ｍＬ）およびＤＢＵ（３．５３ｍＬ）を加えた。７０oＣ、アルゴン下で１８時間反応を還流させた。加熱を開始するとすぐに茶色の析出物が生じた。ＴＨＦを蒸発させ、残留物を塩化メチレンに溶解し、塩化メチレン中のシリカゲルを用いたフラッシュクロマトグラフィにより生成物の精製を行った。生成物を含む分画を真空下で蒸発させ、ほとんどの溶媒を取り除き、残留溶液にヘキサンを添加して生成物の結晶化を促した。４oＣで４８時間経過後、析出物をろ過により回収することで、微細な黄色針状の生成物が２ｇ得られた。母液を部分的に蒸発させることでさらに１．４ｇの生成物が得られ、合計収率は７５％であった。
【００７２】
[0082]  化合物５：化合物３（１．４０ｇ、７．２ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの無水エチレングリコール中に懸濁させ、この溶液にＫＯＨペレット（０．７３ｇ、１３．０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物をアルゴン下で１時間還流させた。得られた透明な茶色溶液を０oＣに冷却し、該溶液に１００ｍＬのジクロロメタンを添加した。ジクロロメタン層を分離し、水（２×１００ｍＬ）および塩水（２×１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。この生成物をジクロロメタン中のシリカゲルを用いたフラッシュクロマトグラフィにより精製した。高速移動する成分を含む分画を引き抜き、ジクロロメタンで希釈して１０００ｍＬとした。得られた溶液に４−ホルミル安息香酸メチルを添加し、アルゴン下、該溶液を室温で１０分間攪拌し、ＢＦ３・ＯＥｔ２（０．１９ｍＬ、１．３ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を２時間攪拌した後、１．７３ｇ（７．６ｍｍｏｌ）のＤＤＱを添加し、この混合物を一晩攪拌した。その後、１０％Ｎａ２ＣＯ３水溶液、１ＭＨＣｌ、および塩水で該混合物を洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ジクロロメタン中のＭｅＯＨの段階的勾配（０〜２％）を使用したシリカゲルクロマトグラフィによる精製後、緑色粉末状の生成物４３０ｍｇ（２４％）が得られた。
【００７３】
[0083]  化合物６：遊離塩基として化合物５（０．４３ｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのベンゾニトリルに溶解した。この溶液に対し、ＰｄＣｌ２をアルゴン下で添加し、得られた混合物を１０分間還流させた。溶液の色は緑色から赤色へと変化した。この混合物を室温に冷却し、２００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、セライトを通してろ過した。ジクロロメタンを真空下で蒸発させ、ベンゾニトリルを留去した。ジクロロメタン中でシリカゲルを用いたフラッシュクロマトグラフィにより生成物を精製し、ヘキサン：酢酸エチル（１：１）中のシリカゲルを用いたフラッシュクロマトグラフィを行うことで最終的な精製を達成し、赤色粉末状の生成物０．１０９ｍｇ（６０％）が得られた。
【００７４】
[0084]  化合物７：化合物６（０．１０５ｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの無水ＴＨＦに溶解し、この溶液にＤＤＱ（０．３２７ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を２０分間還流させ、ＴＬＣで混合物中に出発物質が検出されなくなってから反応を終了させた。ＴＨＦを真空下で取り除き、残留物をジクロロメタンで希釈した後、１０％Ｎａ２ＳＯ４、水および塩水で洗浄した。
【００７５】
［００８５］  化合物８：Ｆｉｎｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００７，  １１１，  ｐ．  ６９７７に記載される方法でエステル７を加水分解した。簡単に説明すると、０．０７４ｇ（０．０６４ｍｍｏｌ）の化合物７を１１０ｍＬのＴＨＦに溶解した。この溶液に対し、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）を添加し、続いて２ｍＬのＭｅＯＨ中に０．５７３ｇのＫＯＨを含む溶液を添加した。溶液中には緑色析出物が生じ、溶液はほぼ無色となった。この析出物を遠心分離で回収し、１０ｍＬの水に溶解した。この溶液を０．２ｍＬの濃塩酸で酸性化し、得られた析出物を遠心分離で回収した。収率：０．０７０ｇ（８６％）。
【００７６】
[0086]  化合物２：０oＣのＤＭＦ（１０ｍＬ）およびＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中の化合物８（７０ｍｇ、６３．９μｍｏｌ）を、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（４３．１７ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（６１．２５ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（９０μＬ、０．６４ｍｍｏｌ）に添加した。２０分後、２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩（５３．２３ｍｇ、０．３１９５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１６時間、反応を攪拌させた。上記ＣＨ２Ｃｌ２を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン混合物を添加して残留するＤＭＦから粗生成物を析出させた。溶媒のデカンテーションを行い、析出した残留物をＣＨ２Ｃｌ２に溶解した後、飽和ＮａＨＣＯ３および塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、真空で濃縮した。シリカゲルを用いたフラッシュクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２中の０〜４％のメタノール勾配）で粗生成物を精製することで緑色粉末状の化合物２が得られた（１６ｍｇ、収率１６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）δ８．４０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，８Ｈ），８．３２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，８Ｈ），７．２２（ｂｒ  ｓ，８Ｈ），７．１０（ｂｒ  ｓ，８Ｈ），６．２８（ｓ，４Ｈ），５．７１（ｓ，４Ｈ），４．６１（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，８Ｈ），４．０３（ｑ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，８Ｈ），２．０６（ｓ，１２Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ８８Ｈ７３Ｎ８Ｏ１２Ｐｄについて算出：１５３９．４４０３［Ｍ＋Ｈ］＋，実測値１５３９．４４０５［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｒｔ＝１１．８分。
【００７７】
[0087]  化合物９は、スキーム２に示すように、ＨＯＢｔおよびＥＤＣの存在下、市販のテトラカルボキシフェニルポルフィリンとアミノエチルメタクリレートとを反応させることで、化合物２と同様にして合成した。
【化５】
2020072650.tif 000007
【００７８】
実施例２：組織一体型ハイドロゲル足場材に固定化された酸素感受性発光色素を有する酸素検知媒体の生成
[0088]  以下、本明細書に記載される通りの組織一体型センサを製造する一つの方法について説明する。この方法は、非架橋ＰＭＭＡテンプレートマイクロ粒子と、ｐＨＥＭＡとを足場材料として使用することを含む。ＰＭＭＡマイクロ粒子テンプレートは、単分散ＰＭＭＡ粒子（２０〜１００μｍ、好ましくは８０μｍ）を使用し、テンプレートビーズを２枚のスライドガラスの間にテフロン（登録商標）スペーサを用いて載置することで調製した。焼結プロセスは、ビーズを密にパッキングするための少なくとも１０分間の（１回以上の）超音波処理を含むものであった。超音波処理の後、ビーズを融合させるため、十分な温度まで十分な時間をかけてテンプレートを加熱する（通常、２０〜３２時間かけて１４０〜１８０oＣまで、例えば、２４時間かけておよそ１７７oＣまで加熱する）。温度および加熱時間はビーズの各ロットに対して最適化される。
【００７９】
[0089]  酸素を検知するポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ｐＨＥＭＡ）足場材の全般的調製は以下のように行った。ＨＥＭＡ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（５０ｗｔ％）、ＴＥＧＤＭＡ（トリエチレングリコール−ジメタクリレート）（１ｗｔ％）、エチレングリコール（２０ｗｔ％）、水（２５．５ｗｔ％）、光開始剤Ｉｒｇａｃｕｒｅ６５１（０．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、および３％のパラジウム−テトラメタクリレート−ベンゾポルフィリン（化合物２、重合性Ｏ２検知色素）を混合し、ポリマー前駆体溶液中の化合物２の最終濃度１ｍＭを得た。ポリマー、溶媒および検知試薬を混合し、組織を通して信号の変化を測定可能な程度に検出できるよう十分高い検知化学物質濃度を達成した。 
【００８０】
[0090]  予備混合したモノマー溶液をＰＭＭＡ鋳型内に充填した。溶液を真空下に置いて、泡を取り除き、ＰＭＭＡ鋳型を完全に浸潤させた。鋳型をＵＶ光（２８０〜３２０ｎｍ、１０〜３００ｍＷ／ｃｍ２）に５〜１０分間暴露することで重合を開始させた。続いて、ソックスレー抽出器を使用し、手動の体積変化により、２４〜４８時間の間ジクロロメタンまたはその他の溶媒系の交換を頻繁に行うことで、得られたポリマーからＰＭＭＡマイクロ粒子を溶出させた。
【００８１】
[0091]  以下では、ロッド状ハイドロゲルセンサの調製について説明する。化合物２の１０ｍＭのＤＭＳＯ溶液１００μＬをポリマー前駆体溶液［２−ヒドロキシエチルメタクリレート（０．５ｍＬ、４．１ｍｍｏｌ）、テトラエチレングリコールジメタクリレート（１０μＬ、３４μｍｏｌ）、エチレングリコール（０．２ｍＬ）、水（１８５μＬ）および２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（５ｍｇ、２μｍｏｌ）］に添加して、化合物２の最終濃度１ｍＭを得た。既にＭａｒｓｈａｌｌ，  Ａ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｉｇｈｔｌｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｓｉｚｅ  ｔｈａｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｉｎ−Ｇｒｏｗｔｈ．  ＡＣＳ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ  ４５，  １００−１０１  （２００４））によって記載される通りに、色素とポリマー前駆体との混合物を、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）ビーズを含有するガラス鋳型に注入した。この鋳型を真空下に置くことで泡を取り除き、充填が完全に行われるようにした。４００ワットの水銀球を搭載したＤｙｍａｘ２０００−ＥＣフラッド硬化システム（Ｆｌｏｏｄ  Ｃｕｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用し、およそ６”（インチ）の距離から鋳型の各面をＵＶ光（２８０〜３２０ｎｍ）で２分ずつ暴露することで重合を開始させた。ガラスプレートを取り除き、ハイドロゲルを５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２（２回交換）に浸漬し、２４時間振動させることでＰＭＭＡビーズを抽出した。ハイドロゲルを水中に移動し、５分間真空下に置くことで、多孔性足場材を完全に水和させた。埋め込みのため、ハイドロゲルをロッド状（長さ１０ｍｍ、断面積７５０μｍ×７５０μｍ）にカットし、７０％エタノールに曝して殺菌した後、使用までの間、４oＣでｐＨ７．４の無菌ＰＢＳ中に保管した。テンプレートビーズを使用しないこと以外は同様にして、非多孔性（すなわち、固体）ハイドロゲルセンサを調製した。
【００８２】
[0092]  また、足場材を調製するために使用する重合混合物にＧＯｘをさらに含ませること以外は上述の通りの方法で、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）を含むハイドロゲルを調製した（図５）。
【００８３】
実施例３：ハイドロゲルに組み込まれた化合物２の励起および発光波長の測定
[0093]  実施例２で作成した色素含有ハイドロゲルの吸光および発光スペクトルを、蛍光プレートリーダを使い、周囲大気においてｐＨ７．４のＰＢＳ中で測定した（図１）。吸光スペクトルは、４４５ｎｍにソーレー帯、６３３ｎｍにＱ帯を含んでいた。６３３ｎｍの励起によって８０５ｎｍの発光ピークが生じたことから、Ｐｄ−ＢＰ（化合物２）はＮＩＲ域に吸光と発光の双方を示すことが確認された。
【００８４】
実施例４：ハイドロゲル中の最適色素濃度の決定
[0094]  最大強度信号を達成するために必要となる最小色素濃度を決定するため、異なる濃度のＰｄ−ＢＰ（化合物２）を含有する一連のｐＨＥＭＡハイドロゲルを作成した。共有結合Ｐｄ−ＢＰ（化合物２）を０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭおよび３ｍＭの色素濃度で含有する固体および多孔性ｐＨＥＭＡハイドロゲルを調製した。全てのゲルは厚さが１ｍｍ以下であり、多孔性ゲルの平均孔径は７０μｍ以下であった。周囲空気中、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で、蛍光プレートリーダを用いて８０５ｎｍにおける各ゲルの蛍光発光（６３３ｎｍ励起）を測定した。これらのデータから、１ｍＭより高い濃度では信号飽和が見られたため、最適色素濃度は１ｍＭであることが判明した。
【００８５】
実施例５：ＮＩＲベンゾポルフィリンの光退色の特性決定
[0095]  共有結合された化合物２を含むハイドロゲルを用いて光退色調査を行い、化合物２および９の光安定性を測定した。ＬＥＤで照明しながら、生理的条件（ｐＨ７．４ＰＢＳ、３７oＣ、２１％Ｏ２）をシミュレートするように特注された流液システム（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｙｓｔｅｍ）でハイドロゲルをテストした。直径１ｍｍの光ファイバケーブルにより、ゲルサンプルの底面に励起光を直接当てた。２秒のパルス長（ＬＥＤの「ＯＮ時間」）と５秒のパルス間隔で４０％の全デューティサイクルを達成する５２５ｎｍのＬＥＤ源（出力＝１２７ｍＷ／ｃｍ２）を用いて化合物９を含むハイドロゲルを励起させる一方、同じデューティサイクルの６３０ｎｍＬＥＤ源（出力＝１４３ｍＷ／ｃｍ２）を用いて化合物２を含むハイドロゲルを励起させた。上記条件の下、連続して１５時間実験を行った。しかし、化合物２の寿命信号には５％未満の変化しか見られなかった。この実験で得られたデータを使用して、長期的なｉｎ  ｖｉｖｏでの使用中に起こり得る光退色の予測される程度およびその速度を推定する。
【００８６】
[0096]  シミュレートされた使用条件での試験において上記色素を含むゲルは極めて光安定的であった（図６）。これらのデータは、寿命信号の測定が、ｉｎ  ｖｉｖｏで長期（５か月）安定性を達成するための好ましい手法であることを示している。Ｐｄ−ＢＰ化合物の光安定性は、他のいずれかの場所で開示されている技術、例えば、金属コアの変更、あるいは主剤のフッ素化または過フッ素化等によってさらに向上させることが可能である。
【００８７】
実施例６：埋め込み
[0097]  １９〜２３ゲージの挿入針、トロカール、変形された生検デバイス、または皮下注入用に設計されたその他のデバイス内に、直径３００〜５００ｎｍ、長さ５ｍｍのロッド状に作成された組織一体型センサを配置する。より小型の挿入針が使用できるように、挿入前に、任意でセンサを脱水または圧縮してもよい。
【００８８】
[0098]  挿入後、挿入針が皮膚表面下４ｍｍまでに皮膚表面と平行になるように皮膚をつまみ上げる。流体または逆置換（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）プランジャ（またはトロカール）を使用して、シリンジが引き抜かれる際にセンサが組織内に残されるようにする。挿入部位としては、任意の皮下または真皮領域、典型的には腹部、腕部および大腿部を挙げることができる（図４）。研究モデルでは、背面皮膚、腹部、後肢および脳（図３）の全てについて調査した。以下では、ラットモデルにおけるハイドロゲルの埋め込み、ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングおよびデータ分析の一例について説明する。
【００８９】
[0099]  ハイドロゲルの埋め込みおよびｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージング
ハイドロゲルセンサ（ｎ＝３〜４の多孔性センサおよびｎ＝３〜４の固体センサ）を、１２頭の成体のオスのＣＤラット（Ｃｈａｒｌｅｓ・Ｒｉｖｅｒ・Ｌａｂｓ社、１５０〜２５０ｇ）の皮下組織に、１週間、４週間、または１７０日間注入した。センサを注入する間、ラットには２〜３％のイソフルラン（酸素中のｖ／ｖ）による麻酔を行った。多孔性および固体ハイドロゲルロッド（長さ１０ｍｍ、断面積７５０μｍ×７５０μｍ）を１８ゲージ針に装填した後、正中線に対して直交する背面皮下空間に挿入した。カニューレを通してステンレス製のプランジャを挿入することで針からセンサを放出させた。ハイドロゲルセンサはおよそ１．５ｃｍ離して埋め込まれた。ラットは正常に成長し、センサ注入後の数週間、不快な様子を示すことはなかった。
【００９０】
[00100]  ＩＶＩＳスペクトルまたは動的イメージングシステム（アメリカマサチューセッツ州ウォルサム、Ｐｅｒｋｉｎ・Ｅｌｍｅｒ社）を使用し、ｉｎ  ｖｉｖｏで３０秒ごとに１回、酸素センサの蛍光イメージングを行った。イメージング前、１．００のＦＩＯ２で、２％イソフルランによる麻酔を３０分間ラットに対して行った。ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング中にＦＩＯ２を少なくとも２回調節して５〜１０分で０．１２（ｖ／ｖ、窒素出納（Ｎ２  ｂａｌａｎｃｅ）まで下げた後、１０〜１５分で１．００に戻した。センサ周囲の関心領域（ＲＯＩ）を識別し、このＲＯＩにおける平均放射効率をＩＶＩＳシステムに含まれる生体イメージソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して測定することで、各センサの相対的反応（強度）を定量化した。
【００９１】
[00101]  埋め込み当日、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ  ＯｘｙＬｉｔｅシステムを組織酸素化の参照として使用した。Ｂｒａｕｎ，  ｅｔ．  ａｌ．（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｔｅｎｓｉｏｎ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ＯｘｙＬｉｔｅ  ｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８０，  Ｈ２５３３−２５４４  （２００１））に記載されるように、センサ注入日（０日目）に、針に収容したＯｘｙＬｉｔｅプローブをラットの背部に皮下挿入し、データ収集前に１０〜１５分かけて信号が安定状態に達するようにした。
【００９２】
[00102]  データ分析および統計的試験
ＲＯＩによって特定された各センサのデータは正規化を行って最大および最小平均放射効率とし、かつ、上記データを反転させて蛍光データと組織酸素化との間に正の相関関係を有するようにした。この正規化により、それぞれの別個の実験に関する各センサのデータを、それぞれ各センサの最大強度および最小強度である０と１の間に収めることができた。
【００９３】
[00103]  動物の健康上の懸念から暴露時間を短く（５〜１０分）する必要が生じたために低酸素試験の間に平坦域に至らないセンサが多くあった。そのため、センサの応答時間を算出するため、１０分間の低酸素（ＦＩＯ２＝０．１２）事象または１５分間の高酸素（ＦＩＯ２＝１．００）事象のいずれかの間において、９０％の蛍光強度変化量を達成するまでの時間（Ｔ９０％）を測定した。ＦＩＯ２変更事象の最後の３分間が合計変化量の１０％未満であった場合、センサは安定状態に達していたと判定した。データについては、ノンパラメトリックなウィルコクソンの順位和検定（ｐ＜０．０５）を用いた統計的有意性に関するテストを行った。
【００９４】
[00104]  組織学的分析
ラットを犠牲として、センサおよび周辺組織を取り出し、液体窒素中で急速冷凍し、−８０oＣで保管した。低温維持装置Ｌｅｉｃａ  ＣＭ１８５０上で、凍結組織サンプルを厚さ１０μｍの凍結切片とし、ポリＬ−リジンでコーティングされたスライドガラスに載せた。ラットＣＤ３１（カリフォルニア州サンホセ、ＢＤ・Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）については切片を免疫染色した。簡単に説明すると、スライドを室温で２０分間、アセトン中に固定し、１倍ＰＢＳでリンスし、染色緩衝液（１倍ＰＢＳ中に５％の正常ロバ血清を含むもの）で３０分間ブロッキングし、染色緩衝液中に１：２００の割合で含まれるマウス由来ラットＣＤ３１一次抗体で１時間培養し、抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ・Ｉｍｍｕｎｏ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）で３０分間培養し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて室温で５分間染色した。４％パラホルムアルデヒド中にサンプルを固定し、同日、イメージングを行った。１２ビットＣＣＤカメラ（ＱＩｍａｇｉｎｇ社）と、Ｌｕｄｌ  Ｍａｃ５０００駆動ユニット（Ｌｕｄｌ社）で駆動される自動スキャンステージ（Ｍａｒｚｈａｕｓｅｒ社）とを搭載したＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＳｋｏｐ  ＩＩ＋蛍光顕微鏡を用いて、サンプルの蛍光イメージングを行った。５倍の対物レンズ（ＮＡ０．２５、Ｚｅｉｓｓ社）を使用して多数の顕微鏡写真を取得した後、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを使用してそれらをつなぎ合わせて合成画像を作成した。露光は、低照明強度、１×１ビニング（ピクセルサイズ：１．３６μｍ×１．３６μｍ）、通常取得期間１００ｍｓに設定した。この実験の結果を図１１に示す。
【００９５】
実施例７：測定
[00105]  センサからのデータを、センサ位置の直上の皮膚表面に配置された蛍光リーダで収集し、このデータを処理して、スマートフォン、その他の携帯用デバイス、コンピュータ画面に、またはその他の視覚化フォーマット、例えば、市販のデータ表示デバイスを使用して表示する。未加工データを変換して、分析物濃度または分析物濃度を示す何らかの非定量的表示（例えば、高、低、範囲内）とする。任意の時点における数値、またはトレンド（経時的グラフ）、または一定期間における概略的統計値を求める。任意選択で、上記データの質を表す指標を求める。ＨＥＭＡとＮＩＲのＰｄ−ＢＰとの共重合およびＨＥＭＡと緑色励起Ｐｄ−ＴＣＰＰとの共重合により調製されたハイドロゲルをラット胴体の皮下に埋め込み、その発光を測定した（図２）。Ｐｄ−ＢＰは、ＮＩＲの励起および発光波長であるためＰｄ−ＴＣＰＰよりも極めて明るく、そのため、皮膚内に光が非常によく浸透し、より深いセンサ配置が可能であった。より良好な免疫応答のためにはより深い配置が望ましいが、もともとの緑色Ｐｄ−ＴＣＰＰ信号の大部分は、皮膚によって拡散および／または吸収される等、ブロックされてしまうため、そのような深い配置はこれまでできなかった。浅い真皮埋め込み片のみが可能であった。さらに、Ｐｄ−ＢＰハイドロゲルは、マウスの頭蓋骨下（マウスの脳内部）深くに埋め込まれた場合に明るい検出可能信号を生成した。
【００９６】
実施例８：ラット皮膚に埋め込まれたセンサの安定性
[00106]  酸素センサをラットの皮膚に埋め込み、その信号強度を１７０日間モニタリングした。図４は、マウスの皮膚に１７０日間埋め込まれたセンサの蛍光発光を示している。強度は埋め込み深さの関数として変化した（データはベースライン蛍光に対して正規化を行った）。吸入酸素を１００％から１２％の間で調節し、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ（スペクトル：Ｅｘ＝６４０ｎｍ、Ｅｍ＝８００ｎｍ、帯域幅２０ｎｍ）で３０秒ごとにイメージを収集した。関心領域（ＲＯＩ）をセンサの周囲に設定し、時間に対してデータをプロットした（図６）。このデータは、本発明の色素を用いて作成したセンサが何か月もの間ｉｎ  ｖｉｖｏで機能を維持することを示している。さらに、組織一体型センサを固体センサと比較した。組織一体型センサは固体センサに比べて酸素レベルの変化に対するより速い動的応答をもたらしており、このことは、組織一体型センサのさらに別の有利な特性を示している。
【００９７】
実施例９：低酸素濃度におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ酸素検出
[00107]  Ｐｄ−ＢＰの酸素感受性を特性付けるため、多孔性ＨＥＭＡハイドロゲル中の色素の強度および発光寿命を異なるＯ２レベル（０％、１２％および２０％のＯ２）で測定した（図８）。ハイドロゲルは、ＴａｕＴｈｅｔａ社の光ファイバ機器でモニタリングを行いながら、特注の流液システム（ｐＨ７．４ＰＢＳ、３７oＣ）で試験を行った。色素は、シュテルン−フォルマー・プロットで示される通りの良好なＯ２感受性とともに良好な可逆性を示した。
【００９８】
実施例１０：グルコースセンサの調製および特性決定
[00108]  上述の共有結合Ｐｄ−ＢＰを含むｐＨＥＭＡハイドロゲルにグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）を封入した。得られたセンサの多孔性形態をＳＥＭで確認した（図５）。流液システム（ＰＢＳ、３７oＣ）において、ＧＯｘ−Ｐｄ−ＢＰセンサを、そのグルコース応答について試験した。ゲル内部のＰｄ−ＢＰの発光強度および寿命を、生理的範囲に及ぶ一連のグルコース変移の間モニタリングした（図９）。（グルコース濃度が一定に保たれている）平坦域において強度および寿命がわずかに低下するのは、試験リザーバ内のグルコースがＧＯｘによって消費されるためである。
【００９９】
実施例１１：ブタ皮膚に対するＯ２センサの埋め込み
[00109]  化合物２を含むポリマーから調製されたＯ２センサをブタに注入する急性ブタ実験を行い、この実験から外植片試料を得た。センサ信号を取得した。蛍光寿命および強度の測定値を収集した。センサ信号測定値を取得後、ブタを犠牲として、試料を１０％のホルマリンに固定し、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。倍率４０倍のニコン顕微鏡と、Ｉｎｆｉｎｉｔｙ１顕微鏡用カメラおよびソフトウェア（バージョン６．１．０、Ｌｕｍｉｎｅｒａ社）とを用いて、イメージおよび深さ測定値を取得した。重複するイメージを連続して得ることで最終的な合成イメージを作成した。図１０は、皮膚表面下８ｍｍの深さに埋め込まれたことが判明したセンサを示している。図１０から、皮膚表面下８ｍｍのセンサ埋め込み深さであっても調節センサ信号を検出可能であったことが分かる。
【０１００】
[00110]  本明細書において、本発明の好適な実施形態を示し、それらを説明してきたが、それらの実施形態は例示の目的でのみ提供されることが当業者には明らかであろう。当業者には、本発明を逸脱することなく、多数の変形、変更および置換が想起されるだろう。本発明の実施にあたっては、本明細書に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替例を適用し得ることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の請求の範囲によって画定され、かかる請求の範囲に含まれる方法および構造ならびにそれらの均等物がその請求の範囲によってカバーされることが意図されている。
【０１０１】
[00111]  本明細書において言及される全ての特許、特許出願および刊行物は、参照によりその全体がここに組み込まれる。明確な理解のため、説明または例示として詳細な開示がなされているが、かかる開示の趣旨または範囲を逸脱することなくさまざまな変更および変形が可能であることが当業者には明らかであろう。したがって、これまでの記載および例示を制限的なものと解するべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【外国語明細書】
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