(57)【要約】【課題】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の複製を抑制するための抗ウイルス薬を提供する。【解決手段】ＨＢＶゲノムＤＮＡ配列（配列番号１を参照したとき）のヌクレオチド番号１８１０〜１８９０の領域の標的配列に結合可能である、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列とを含み、かつ、該ガイドＲＮＡ及び該ＣＲＩＳＰＲ酵素を共発現する有効量のベクターを含む、被験体においてＨＢＶ複製を抑制するための抗ウイルス薬。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムＤＮＡ配列（配列番号１を参照したとき）のヌクレオチド番号１８１０〜１８９０の領域の標的配列に結合可能である、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列とを含み、かつ、該ガイドＲＮＡ及び該ＣＲＩＳＰＲ酵素を共発現するベクターを有効量で含む、被験体においてＨＢＶ複製を抑制するための抗ウイルス薬。
【請求項２】
前記ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項１に記載の抗ウイルス薬。
【請求項３】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ又はＣａｓ９ニッカーゼである、請求項１又は２に記載の抗ウイルス薬。
【請求項４】
前記ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号２、３及び４によって表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ウイルス薬。
【請求項５】
他のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列とを含み、かつ、該他のガイドＲＮＡ及び該ＣＲＩＳＰＲ酵素を共発現する他のベクターをさらに含み、但し、該他のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号５〜１４のいずれかによって表される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ウイルス薬。
【請求項６】
前記ベクターにさらに、配列番号５〜１４のいずれかによって表されるポリヌクレオチド配列を含む他のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を発現可能に含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ウイルス薬。
【請求項７】
前記被験体が、哺乳動物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ウイルス薬。
【請求項８】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項７に記載の抗ウイルス薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを利用して作製されたＢ型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス(以下、「ＨＢＶ」と称することもある)は、Ｂ型肝炎の原因ウイルスであり、ヘパドナウイルス科に分類される。このウイルスは、球状であって外被（エンベロープ）とコアの二重構造を有しており、エンベロープタンパク質がＨＢｓ抗原と呼ばれ、またコアタンパク質がＨＢｃ抗原と呼ばれる。コアの中には、不完全二本鎖のＨＢＶ・ＤＮＡやＨＢＶ関連ＤＮＡポリメラーゼが存在している。ＨＢＶ・ＤＮＡは約３，２００塩基からなり、ＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原、Ｘ蛋白質、ＤＮＡポリメラーゼなどをコードしている。ＨＢＶは遺伝子レベルでの分類が行われ、これまでにＡ型からＪ型まで１０種類の遺伝子型（ゲノタイプ）が同定されている。我国(日本)の患者ではＣ型への感染が多く、それに続いてＢ型が多い。
【０００３】
ＨＢＶに対する抗ウイルス薬の開発に関連してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを利用する試みがなされており、いくつか報告されている（特許文献１〜５）。
【０００４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムについて、２０１１年にＣａｓ９と２本のガイド鎖ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）が複合体を形成し、標的ＤＮＡを切断することが報告された（非特許文献１）。その後、このようなゲノムＤＮＡを特異的に切断する人工制限酵素を利用して、ゲノムＤＮＡを編集したり遺伝子改変したりする技術（「ゲノム編集」と称する）が行われるようになった。ゲノム編集の技術の利用は広範囲に及んでおり、例えば植物の育種、水畜産への利用、創薬、遺伝子治療、再生医療、薬物スクリーニング、疾患診断、予後診断などが挙げられる（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＵＳ２０１６／０３１７６７７Ａ１
【特許文献２】特表２０１７−５２７２５６号公報
【特許文献３】特表２０１６−５２４４７２号公報
【特許文献４】特表２０１６−５２１９９５号公報
【特許文献５】特表２０１７−５１８０７５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７１：６０２−６０７，２０１１
【非特許文献２】真下知士、山本卓編集,実験医学（増刊）,第３４巻第２０号,２０１６年,羊土社
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ゲノム編集技術を用いたＨＢＶに対する抗ウイルス薬を提供することである。このような抗ウイルス薬は、ＨＢＶ複製を高度に抑制して感染を防御し、並びにＨＢＶによる肝炎の治療に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の特徴を包含する。
[１]Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムＤＮＡ配列（配列番号１を参照したとき）のヌクレオチド番号１８１０〜１８９０の領域の標的配列に結合可能である、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列とを含み、かつ、該ガイドＲＮＡ及び該ＣＲＩＳＰＲ酵素を共発現するベクターを有効量で含む、被験体においてＨＢＶ複製を抑制するための抗ウイルス薬。
[２]上記ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、上記[１]に記載の抗ウイルス薬。
[３]上記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ又はＣａｓ９ニッカーゼである、上記[１]又は[２]に記載の抗ウイルス薬。
[４]上記ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号２、３及び４によって表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、上記[１]〜[３]のいずれかに記載の抗ウイルス薬。
[５]他のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列とを含み、かつ、該他のガイドＲＮＡ及び該ＣＲＩＳＰＲ酵素を共発現する他のベクターをさらに含み、但し、該他のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号５〜１４のいずれかによって表される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、上記[１]〜[４]のいずれかに記載の抗ウイルス薬。
[６]上記ベクターにさらに、配列番号５〜１４のいずれかによって表されるポリヌクレオチド配列を含む他のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を発現可能に含む、上記[１]〜[４]のいずれかに記載の抗ウイルス薬。
[７]上記被験体が、哺乳動物である、上記[１]〜[６]のいずれかに記載の抗ウイルス薬。
[８]上記哺乳動物が、ヒトである、上記[７]に記載の抗ウイルス薬。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の抗ウイルス薬は、ＨＢＶ感染肝細胞においてＨＢＶ複製を例えば約８０％以上抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】この図は、ＨＢＶゲノムの標的領域を示す。
【図２】この図は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を示す。ヌクレオチド位置は、配列番号１のＨＢＶ（Ｃ型）のヌクレオチド配列を参照したときの領域である。
【図３】この図は、ＷＪ１０ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド（ＷＪ１０−ｇＲＮＡ）及びＣａｓ９酵素をコードするＤＮＡ（ｈｓｐＣａｓ９）を含むベクターの例示である。
【図４】この図は、ベクター感染後７２時間、９６時間でのＨＢＶ感染ヒト肝臓癌細胞株（ＨｅｐＧ２．２．１５）の細胞及び上清におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−Ｕ６−ｇＲＮＡ−レンチウイルスベクターによるＨＢＶ複製抑制を示す。ＹＡ１１３は、ＧＦＰ陰性コントロールであり、ＹＡ１１８、１１９、１２０はそれぞれ、ＷＪ１０−ｇＲＮＡ、ＷＪ１１−ｇＲＮＡ、ＷＪ１２−ｇＲＮＡを搭載している。縦軸は、総ＤＮＡ１μｇあたりのＨＢＶ・ＤＮＡコピー数である。
【図５】この図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＡＡＶベクターの作製手順を示す。ＡＡＶはアデノ随伴ウイルスを示す。
【図６】この図は、ＡＡＶ粒子を作製するために使用したプラスミドを示す。
【図７】この図は、ＨＢＶ感染マウスにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＡＡＶベクター（ＷＪ１１）を腹腔内投与（ｉ．ｐ．）したのち６日目のＨＢＶ複製抑制を示す。縦軸は、細胞の場合、総ＤＮＡ１μｇあたりのＨＢＶ・ＤＮＡコピー数であり、上清の場合、培養上清１ｍＬあたりのＨＢＶ・ＤＮＡコピー数である。また、横軸は、ベクターのＭ．Ｏ．Ｇ．（多重感染度；すなわち細胞１個あたりのウイルスベクター遺伝子の数）である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明をさらに詳細に説明する。
【００１２】
１．Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
Ｂ型肝炎はＨＢＶが血液や体液を介して感染して起きる肝臓の疾患である。感染後、１〜６か月の潜伏期間を経て肝炎が発症する。炎症が持続すると慢性肝炎から肝硬変、さらには肝癌（肝細胞癌）へと進展する可能性がある。
【００１３】
ＨＢＶを原因とするＢ型肝炎は、血液などの体液中のＢ型肝炎表面抗原が陽性と判定されることによって診断される。
【００１４】
Ｂ型肝炎の治療には、ペグ化インターフェロン（ＰｅｇＩＮＦ）、ウイルス増殖抑制のための核酸アナログ製剤（例えば、ラミブジン（例えばゼフィックスＴＭ、アデホビル（ヘプセラＴＭ）、エンテカビル（バラクルードＴＭ）及びテノホビル（テノゼットＴＭ）））、ウルソデオキシコール酸／グリチルリチン製剤、Ｂ型肝炎ワクチン(予防)、肝庇護療法などの治療法が知られている。
【００１５】
本発明の抗ウイルス薬は、ＨＢＶのゲノムＤＮＡの機能性領域を特異的に切断して複製を顕著に抑制することができるため、急性Ｂ癌肝炎だけでなく慢性Ｂ癌肝炎の治療にも使用することができる新しい治療薬となり得る。
【００１６】
ＨＢＶは、ヘパドナウイルスに属するＤＮＡウイルスであり、直径約４２ｎｍで約３．２ｋｂの環状の二本鎖ＤＮＡとそれを包むエンベロープからなる。ＨＢＶの内部にはＤａｎｅ粒子と呼ばれるコアを有しており、そのゲノムＤＮＡには、互いに重複したＳ抗原遺伝子、Ｃ抗原遺伝子、Ｘ抗原遺伝子、Ｐ抗原遺伝子に対応する４つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する（飯島紗幸、田中靖人，ウイルス，第６３巻第１号，ｐｐ．２３−３２，２０１３）。ＨＢＶの二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、感染細胞核内で自身の産生するＤＮＡポリメラーゼの働きにより完全二本鎖ＤＮＡ（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｃｌｏｓｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ；ｃｃｃＤＮＡ（二本鎖共有結合閉環状ＤＮＡ））となるので、本発明では、ＨＢＶの標的ウイルス核酸は、好ましくは、ｃｃｃＤＮＡであるエピソームウイルス核酸である。
【００１７】
２．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列
本発明の抗ウイルス薬は、ヒトを含む哺乳動物（以下、「被験体」という）にＨＢＶが感染したとき肝細胞の核内の宿主ゲノムへのウイルスの組み込みによって生成したＨＢＶ二本鎖ＤＮＡ（例えばｃｃｃＤＮＡ）を切断することによって、ＨＢＶ複製を抑制することができる。好ましい標的ウイルス核酸は、生物のゲノムに組み込まれないＨＢＶエピソーム核酸内に含まれるＨＢＶ二本鎖共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）である。
【００１８】
上記抗ウイルス薬は、ＨＢＶゲノムＤＮＡ配列（例えば、配列番号１を参照したとき）のヌクレオチド番号１８１０〜１８９０の領域の標的配列に結合可能である、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列とを含み、かつ該ガイドＲＮＡ及び該ＣＲＩＳＰＲ酵素を共発現する有効量のベクターを含む。
【００１９】
本明細書中「ポリヌクレオチド」という用語は、特に断らない限り、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかを指す。
【００２０】
ＨＢＶゲノムＤＮＡ配列は、ＨＢＶ遺伝子型Ａ〜ＪのいずれかのゲノムＤＮＡ配列であり、地域特異性がある。例えば日本を含むアジアのＢ型肝炎患者には遺伝子型Ｂ及びＣのＨＢＶに感染する人が多いと云われている。上記例示の配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ９８１５８０）、並びに、バリアントに関するＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＬＣ３６０５０７、ＬＣ３６５２９０、ＬＣ１５５８２０、ＬＣ１５５８１９、ＬＣ１５５８１８、ＬＣ１５５８１７、ＬＣ１５５８１６、ＬＣ１５５８１５、ＬＣ１５５８１４などの配列は、例えば日本人の患者（約８５％）に多い遺伝子型ＣのＨＢＶのゲノムＤＮＡ配列を示す。ＨＢＶ遺伝子型Ａ〜ＨのゲノムＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩ（米国）のＧｅｎＢａｎｋに登録されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の例は、遺伝子型Ａでは、ＬＣ３６５２８８など、遺伝子型Ｂでは、ＡＢ９８１５８３、ＡＢ９８１５８２、ＡＢ９８１５８１など、遺伝子型Ｃでは、ＡＢ９８１５８０など、遺伝子型Ｄでは、ＬＴ７１８４４９、ＬＴ７１７７０３、ＬＴ７１７７０２など、遺伝子型Ｅでは、ＨＥ９７４３８４、ＨＥ９７４３８０など、遺伝子型Ｆでは、ＬＴ９３５６７０、ＬＴ９３５６６９、ＬＴ９３５６６８など、遺伝子型Ｇでは、ＡＢ６２５３４３、ＡＢ６２５３４２など、遺伝子型Ｈでは、ＡＢ２９８３６２、ＡＢ８４６６５０、ＡＢ５１６３９５などである。
【００２１】
本明細書中、「ガイドＲＮＡ」は、ガイド配列に連結されたｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ）と、該ｃｒＲＮＡにハイブリダイズしたｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｒＲＮＡ）とを含む複合体、或いは、ガイド配列に連結されたｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡがループ（例えばテトラループ）で連結されたｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ−ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）を指す。
【００２２】
ここで「ガイド配列」は、ＨＢＶ・ＤＮＡポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズすることができる、該標的配列に相補的な配列を含む。
【００２３】
ガイド配列は、限定されないが、例えば約１０〜約３０ヌクレオチド長、好ましくは約１５〜約２５ヌクレオチド長、さらに好ましくは約１８〜約２２ヌクレオチド長、例えば２０〜２１ヌクレオチド長を有する。
【００２４】
ガイド配列とその対応する標的配列との間の配列同一性の程度は、約７０％〜１００％、例えば、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上又は約９９％以上、１００％以下である。ガイド配列と標的配列の最適なアラインメントは、配列を整列させるための任意のアルゴリズム（例えばＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ）を用いて決定することができる。
【００２５】
標的配列は、Ｃａｓ酵素の一例であるＣａｓ９が化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９である場合に、その３’末端領域においてプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）により隣接される。
【００２６】
Ｃａｓ９は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）に属するＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼであり、２つのヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣとＨＮＨ）をもち、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡの２つのノンコーディングＲＮＡとエフェクター複合体を形成し、ｃｒＲＮＡ中のガイド配列と相補的な標的二本鎖ＤＮＡを認識し切断する。標的二本鎖ＤＮＡのうち、ｃｒＲＮＡと相補的なＤＮＡ鎖（相補的ＤＮＡ）はＨＮＨドメインにより切断され、もう一方のＤＮＡ鎖（非相補的ＤＮＡ）はＲｕｖＣドメインにより切断される。Ｃａｓ９による標的二本鎖ＤＮＡの認識には、特定の数個のヌクレオチド（例えば３〜５ヌクレオチド）からなるＰＡＭが標的配列の近傍に存在することが必要である。ＰＡＭの約３〜４塩基上流に平滑末端又は一塩基突出の末端を生じるＤＮＡ二本鎖切断が誘導される（非特許文献２のｐｐ．２４−３４（濡木理ら））。
【００２７】
ＰＡＭは、例えば５'−ＮＧＧ−３'、５'−ＮＧＣＧ−３'、５'−ＮＧＡ−３'、５’−ＮＧＡＣ−３'、５’−ＮＲＧ又は５’−ＮＮＧＲＲ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ（もしくはＵ）のいずれかであり、ＲはＧ、Ａのいずれかである。）である。また、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９酵素の場合、適切なＰＡＭは５’−ＮＲＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ（もしくはＵ）のいずれかであり、ＲはＧ、Ａのいずれかである。）である。
【００２８】
ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は１つ以上のヘアピンを有し、３０以上のヌクレオチド長、４０以上のヌクレオチド長、５０以上のヌクレオチド長、又は６０以上のヌクレオチド長である。
【００２９】
ガイド配列は、ＨＢＶのゲノムＤＮＡのＳ抗原遺伝子、Ｃ抗原遺伝子、Ｘ抗原遺伝子及び／又はＰ抗原遺伝子に対応する４つのＯＲＦのいずれかの標的配列に特異的にハイブリダイズすることができる。標的配列は、ＨＢＶゲノムＤＮＡ配列（例えば「配列番号１」を参照したとき）の例えばヌクレオチド番号（ｎｎ）１８５９〜１８７８、１８６５〜１８８４、１８１５〜１８３４、１７７５〜１７９４、１５７８〜１５９７、１５５１〜１５７０、１５２１〜１５４０、１５２０〜１５３９、１２７３〜１２５４、２３７〜２５６、１９０〜２０９、５６〜７５などの領域において約１０〜約３０ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列又はその相補的配列である。
【００３０】
具体的には、ガイド配列は、限定されないが、例えば、図２（ＷＪ１１，ＷＪ１２，Ｒ８，Ｓ１，Ｓ２，Ｘ１，Ｘ２，Ｗ１，Ｗ７，Ｗ８，ＷＪ１０，Ｒ１７，Ｒ２１）、或いは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４に示されるヌクレオチド配列である。これらのガイド配列を、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチドと組み合わせるとき、ＨＢＶの複製数をコントロール（本発明のベクターを含まない場合の複製数）の約５０％以上、好ましくは約７５％以上、例えば約８０％以上減少させることができる。
【００３１】
ガイド配列は、例えば、配列番号２、３及び４によって表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む。上記ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列はいずれも、発現可能に含まれる。
【００３２】
３．ＣＲＩＳＰＲ酵素
本明細書中「ＣＲＩＳＰＲ酵素」は、ＨＢＶのゲノムＤＮＡの標的配列（例えばウイルスの複製に関係する配列）を特異的に切断するヌクレアーゼである。この酵素には、例えばＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）酵素が含まれる。ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡであり、第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二本鎖の一方の鎖の切断を誘導し、第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導して二本鎖切断を引き起こす。
【００３３】
Ｃａｓ酵素の非限定的な例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はこれらの改変型が挙げられる。好ましいＣａｓ酵素は、Ｃａｓ９である。
【００３４】
したがって、ＣＲＩＳＰＲ酵素の好ましい例はＣａｓ酵素であり、さらに好ましい例はＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、変異型（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）Ｃａｓ９、又はＣａｓ９ニッカーゼである。ここでニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖にニックを導入する酵素であり、一本鎖ＤＮＡのみ切断するためにＣａｓ９に変異が導入されている（例えばＤ１０Ａ）。Ｃａｓ９（例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９，ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＨ０１５２３８）の変異は、例えばＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及びＤ９８６Ａからなる群から選択されるが、ＨＢＶのゲノムＤＮＡの標的配列を切断し、その複製を抑制する限り、上記の変異に限定されない。或いは、Ｃａｓ９の変異には、Ｃａｓ９のＲｕｖＣ及びＨＮＨ触媒ドメイン内の触媒ドメインの１つにおける変異が含まれ得る。
【００３５】
Ｃａｓ９は、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９（「ｓｐＣａｓ９」）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９（「ｓａＣａｓ９」）、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）由来のＣａｓ９などである。好ましいＣａｓ９酵素は、ｓｐＣａｓ９又はｓａＣａｓ９である。
【００３６】
４．ベクター
本発明のベクターは、ＨＢＶゲノムＤＮＡ配列（配列番号１を参照したとき）のヌクレオチド番号１８１０〜１８９０の領域の標的配列に結合可能である、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列とを含み、かつ該ガイドＲＮＡ及び該ＣＲＩＳＰＲ酵素を共発現する第一のベクターである。
【００３７】
ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列は、例えば、配列番号２、３及び４によって表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列である。上記ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列はいずれも、発現可能に含まれる。
【００３８】
本発明における別のベクターは、他のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列とを含み、かつ該他のガイドＲＮＡ及び該ＣＲＩＳＰＲ酵素を共発現する他のベクターであり、但し、該他のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号５〜１４のいずれかによって表される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、第二のベクターである。
【００３９】
上記の第一のベクターは、本発明の抗ウイルス薬の有効性分であり、抗ウイルス薬に、該ベクターのみを含有させてもよいし、或いは、上記の第二のベクターの少なくとも１つを第一のベクターと組み合わせて含有させてもよい。
【００４０】
或いは、上記第一のベクターには、配列番号５〜１４のいずれかによって表されるポリヌクレオチド配列を含む他のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を発現可能に含んでもよい。
【００４１】
本発明のベクターは、例えばウイルスベクター又はプラスミドベクターであり、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでもよい。
【００４２】
ウイルスベクターは、限定されないが、例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどであり、好ましくはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクターである。
【００４３】
プラスミドベクターは、限定されないが、例えばａｌｌ−ｉｎ  ｏｎｅＴＭ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｔ．  Ｓａｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＲＥＰＯＲＴＳ；４：５４００，２０１４；ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０５４００）である。ａｌｌ−ｉｎ  ｏｎｅＴＭ  ｖｅｃｔｏｒは、１つのプラスミドＤＮＡにＣａｓ９ヌクレアーゼおよびｇｕｉｄｅ  ＲＮＡクローニング用カセットが搭載されたベクターである。
【００４４】
ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの発現を駆動するためのプロモーターの非限定的な例は、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｔ７プロモーターなどであり、さらに、Ｕ６プロモーターターミネーターなどのターミネーターを含んでもよい。
【００４５】
Ｃａｓ酵素などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチドの発現を駆動するためのプロモーターの非限定的な例は、ＥＦ１αプロモーター、ＣＭＶプロモーターなどである。
【００４６】
ベクターにはさらに、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）、Ｈｉｓ−Ｔａｇ配列、レポーター遺伝子配列、選択マーカー遺伝子配列（例えば、薬剤耐性遺伝子配列）などを挿入することができる。
【００４７】
本発明のベクターは、その１つ以上を、例えばリポソーム又はリポフェクション製剤、ナノ粒子、エキソソームなどの送達システムに含有させてもよい。
【００４８】
５．抗ウイルス薬
本発明はさらに、被験体においてＨＢＶ複製を抑制するための抗ウイルス薬を提供する。
【００４９】
上記の抗ウイルス薬には、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムＤＮＡ配列（配列番号１を参照するとき）のヌクレオチド番号１８１０〜１８９０の領域の標的配列に結合可能である、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列とを含み、かつ該ガイドＲＮＡ及び該ＣＲＩＳＰＲ酵素を共発現する(第一の)ベクターを有効成分として（もしくは、有効量で）含む。
【００５０】
本発明の抗ウイルス薬にはさらに、他のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列とを含み、かつ該他のガイドＲＮＡ及び該ＣＲＩＳＰＲ酵素を共発現する他のベクターを含み、但し、該他のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号５〜１４のいずれかによって表される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、少なくとも１つの（第二の）ベクターを含有させることができる。
【００５１】
或いは、上記第一のベクターには、配列番号５〜１４のいずれかによって表されるポリヌクレオチド配列を含む他のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を発現可能に含んでもよい。
【００５２】
上記ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列は、その５'末端領域にＵ６プロモーター又はＨ１プロモーターなどのプロモーター配列を結合して含み、また、複数の異なる（プロモーター配列）−（ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列）間には、プロモーターブロック配列を挿入することができる。また、各ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列の３'末端領域には、ターミネーターを含んでもよい。
【００５３】
本明細書中「被験体」は、哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【００５４】
抗ウイルス薬には、例えば、薬学的に許容可能な担体（例えば滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノール、グリセロール、ピーナッツ油、ゴマ油など）、さらに乳化剤、ｐＨ緩衝物質、マイクロスフェア、ポリマー、防腐剤、懸濁剤、酸化防止剤などの補助剤を適宜含有させることができる。
【００５５】
投与経路は、非限定的に、例えば筋肉内、静脈内、動脈内、経皮、鼻腔内、経粘膜投与などである。投与は、１日あたり単回投与又は複数回投与のいずれでもよい。また、１週間、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月の間隔で投与することができる。
【００５６】
有効成分であるウイルスベクターを、１回投与あたり、例えば少なくとも１×１０５の粒子（粒子単位）、好ましくは少なくとも約１×１０６〜１×１０１２の粒子の用量で投与することができる。
【実施例】
【００５７】
以下の実施例を参照しながら本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって制限されるべきではない。
【００５８】
[実施例１]
＜ＨＢＶゲノム上のｇＲＮＡ標的配列の設計＞
ＨＢＶゲノム上のコア、ポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、Ｘ遺伝子ならびにオーバーラップ領域等の１５か所にｇＲＮＡの配列を設計した（図１、２）。
【００５９】
[実施例２]
＜ｇＲＮＡ発現ユニットの合成及びベクターへのクローニング＞
ｇＲＮＡはレンチウイルス作製用のａｌｌ  ｉｎ  ｏｎｅ  ベクター（図３）にクローニングした。各ｇＲＮＡはＵ６プロモーターの下流にあって発現可能である。また、ベクターにはＣａｓ９酵素がコードされており、ｇＲＮＡに作用できる。Ｃａｓ９酵素の遺伝子は野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）のものと、ｎｉｃｋａｓｅ型、変異型があるが、最終的にはｗｉｌｄ  ｔｙｐｅとｎｉｃｋａｓｅ型をクローニングに用いた。レポーター遺伝子のｎａｎｏｌｕｃ（ＮＬ）を持ったＨＢＶ  ＮＬに対してｇＲＮＡ発現ベクターを導入したところ、ｇＲＮＡ１０，１１，１２を発現するベクターが最も抑制効果が高かった。
【００６０】
[実施例３]
＜ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９レンチウイルスベクターの作製＞
そこで、ＷＪ１０，１１，１２のｇＲＮＡを持つベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションしてレンチウイルスベクターを構築した（それぞれＹＡ１１８，１１９，１２０）。この際にＭｉｓｓｉｏｎ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｍｉｘ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を同時に加えて作製した。このレンチウイルスベクターをポリブレン４μｇ／ｍＬ存在下で、ＨＢＶが持続感染するＨｅｐＧ２．２．１９細胞に約ｍｏｉ＝１で感染した（図４）。また、陰性コントロールとして、ＧＦＰ遺伝子を標的としたレンチウイルスベクターも作成した（ＹＡ１１３）。その結果、陰性コントロールに比べ、感染後７２，９６時間で、細胞内ならびに細胞上清でＨＢＶの産生量が有意に抑制された。
【００６１】
[実施例４]
＜ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＡＡＶベクター（ＷＪ１１）の作製＞
レンチウイルスベクターでｇＲＮＡの抗ＨＢＶ効果が確認できたので、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるデリバリーの実績があるＡＡＶを発現ベクターとして構築した（図５）。ＡＡＶ２型をベクターとして用いたが、クローニングできる外来遺伝子が４ｋｂまでなので、Ｃａｓ９遺伝子を上流と下流の２つに別けて構築した。ｇＲＮＡの効果を検証する場合には、ｐＡＡＶ−Ｇｕｉｄｅ  ｉｔ  Ｕｐベクター（図６Ａ）とｐＡＡＶ−Ｇｕｉｄｅ  ｉｔ  Ｄｏｗｎベクター（図６Ｂ）を共感染して行った。ｇＲＮＡ配列はｐＡＡＶ−Ｇｕｉｄｅ  ｉｔ  ｄｏｗｎベクターにＵ６プロモーターと共に組み込まれている。この他にＡＡＶを作成するためにｐＲＣ−ｍｉ３４２ベクター（図６Ｃ）とｐＨｅｌｐｅｒベクター（図６Ｄ）を使用した。
【００６２】
[実施例５]
＜ＡＡＶ−ｇＲＮＡ（ＷＪ１１）によるＨＢＶ複製抑制＞
レンチウイルスベクターで最も高いＨＢＶ複製抑制の見られたＷＪ１１のｇＲＮＡ配列を搭載したＡＡＶベクターをＨＢＶ持続感染細胞ＨｅｐＧ２．２．１９に感染させてその効果を検討した（図７）。その結果、感染６日後にはＡＡＶのｍｏｉ（２ｘ１０３〜１ｘ１０５）に用量依存的にＨＢＶの感染が細胞内ならびに上清で抑制されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の抗ウイルス薬は、ＨＢＶ感染によるＢ型肝炎の治療のために産業上利用しうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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