(57)【要約】【課題】分子の末端構造の変化をかいして修飾ｍＲＮＡ分子の製造および最適化する方法および組成物を提供する。【解決手段】本願発明に係る合成単離末端最適化ｍＲＮＡは、（ａ）目的とするポリペプチドをコードする、結合ヌクレオシドの第１の領域と、（ｂ）少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素（ＴＥＥ）を含む前記第１の領域に対して５’側に位置する、第１の末端領域と、（ｃ）前記第１の領域に対して３’側に位置する第２の末端領域と、（ｄ）結合ヌクレオシドの３’尾部と、を含む。【選択図】図２
2020072766.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成単離末端最適化ｍＲＮＡであって、
（ａ）目的とするポリペプチドをコードする、結合ヌクレオシドの第１の領域と、
（ｂ）少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素（ＴＥＥ）を含む前記第１の領域に対して５’側に位置する、第１の末端領域と、
（ｃ）前記第１の領域に対して３’側に位置する第２の末端領域と、
（ｄ）結合ヌクレオシドの３’尾部と、
を含む、合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項２】
前記領域（ａ）〜（ｄ）のいずれかが少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む、請求項１記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項３】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオシドがシュードウリジン類似体からなる群から選択される、請求項２記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項４】
前記シュードウリジン類似体が１−メチルシュードウリジンである、請求項３記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項５】
修飾ヌクレオシド５−メチルシチジンをさらに含む、請求項４記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項６】
前記合成単離末端最適化ｍＲＮＡの少なくとも１つの領域がコドン最適化されている、請求項１記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項７】
連結ヌクレオシドの前記第１の領域がコドン最適化されている、請求項６記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項８】
前記第１の末端領域が５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、請求項１記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項９】
前記５’ＵＴＲが、前記目的とするコードされたポリペプチドの天然５’ＵＴＲである、請求項８記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項１０】
前記５’ＵＴＲが、コザック配列および配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）からなる群から選択される翻訳開始配列を含む、請求項９記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項１１】
前記５’ＵＴＲが構造化ＵＴＲである、請求項９記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項１２】
前記第１の末端領域が少なくとも１つの５’キャップ構造を含む、請求項１記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの５’キャップ構造が、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジド−グアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、およびＣＡＰ−００３〜ＣＡＰ−２２５からなる群から選択される、請求項１２記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項１４】
前記ＴＥＥがＴＥＥ−００１〜ＴＥＥ−７０５からなる群から選択される、請求項１記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項１５】
前記第２の末端領域が、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位または前記マイクロＲＮＡ結合部位のシードを含む、請求項１記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位または前記マイクロＲＮＡ結合部位のシードが、免疫細胞特異的マイクロＲＮＡのためである、請求項１５記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項１７】
前記免疫細胞特異的マイクロＲＮＡが、ｍｉｒ−１２２、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ、およびｍｉＲ−１４６ｂからなる群から選択される、請求項１６記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項１８】
連結ヌクレオシドの前記３’尾部領域が鎖終結ヌクレオシドをさらに含む、請求項１記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項１９】
前記鎖終結ヌクレオシドが、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−デオキシウリジン、３’−デオキシシトシン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミン、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシウリジン、２’，３’−ジデオキシシトシン、２’，３’−ジデオキシグアノシン、２’，３’−ジデオキシチミン、２’−デオキシヌクレオシド、および−Ｏ−メチルヌクレオシドからなる群から選択される、請求項１８記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項２０】
前記３’尾部領域がステムループ配列を含む、請求項１記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項２１】
合成単離末端最適化ｍＲＮＡであって、
（ａ）目的とするポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの第１の領域と、
（ｂ）前記第１の領域に対して５’側に位置する第１末端領域と、
（ｃ）前記第１の領域に対して３’側に位置する第２末端領域と、
（ｄ）連結ヌクレオシドの３’尾部領域と、
（ｅ）前記合成単離末端最適化ｍＲＮＡに対して３’側に位置する少なくとも１つの鎖終結ヌクレオシドと、
を含む、合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項２２】
前記領域（ａ）〜（ｅ）のいずれかが少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む、請求項２１記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオシドがシュードウリジン類似体からなる群から選択される、請求項２２記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項２４】
前記シュードウリジン類似体が１−メチルシュードウリジンである、請求項２３記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項２５】
修飾ヌクレオシド５−メチルシチジンをさらに含む、請求項２４記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項２６】
前記合成単離末端最適化ｍＲＮＡの少なくとも１つの領域がコドン最適化されている、請求項２１記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項２７】
連結ヌクレオシドの前記第１の領域がコドン最適化されている、請求項２６記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項２８】
前記第１の末端領域が５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、請求項２１記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項２９】
前記５’ＵＴＲが、前記目的とするコードされたポリペプチドの前記天然５’ＵＴＲである、請求項２８記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項３０】
前記５’ＵＴＲが構造化ＵＴＲである、請求項２８記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項３１】
前記第１の末端領域が少なくとも１つの５’キャップ構造を含む、請求項２１記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの５’キャップ構造が、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジド−グアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、およびＣＡＰ−００３〜ＣＡＰ−２２５からなる群から選択される、請求項３１記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項３３】
前記５’ＵＴＲが、コザック配列および配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）からなる群から選択される翻訳開始配列を含む、請求項２１記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの鎖終結ヌクレオシドが、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−デオキシウリジン、３’−デオキシシトシン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミン、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシウリジン、２’，３’−ジデオキシシトシン、２’，３’−ジデオキシグアノシン、２’，３’−ジデオキシチミン、２’−デオキシヌクレオシド、および−Ｏ−メチルヌクレオシドからなる群から選択される、請求項２１記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項３５】
前記３’尾部領域がステムループ配列を含む、請求項２１記載の合成単離末端最適化ｍＲＮＡ。
【請求項３６】
生物体中において抗原介在性免疫応答を減少させる方法であって、前記生物体と合成単離末端最適化ｍＲＮＡとを接触させることを含み、前記合成単離末端最適化ｍＲＮＡは、
（ａ）前記抗原をコードする連結ヌクレオシドの第１の領域と、
（ｂ）前記第１の領域に対して５’側に位置する第１の末端領域と、
（ｃ）少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位または前記マイクロＲＮＡ結合部位のシードを含む、前記第１の領域に対して３’側に位置する第２の末端領域と、
（ｄ）連結ヌクレオシドの３’尾部領域と、
を含む、生物体中において抗原介在性免疫応答を減少させる方法。
【請求項３７】
前記領域（ａ）〜（ｄ）のいずれかが少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオシドがシュードウリジン類似体からなる群から選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記シュードウリジン類似体が１−メチルシュードウリジンである、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記合成単離末端最適化ｍＲＮＡが前記修飾ヌクレオシド５−メチルシチジンをさらに含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記領域（ａ）〜（ｄ）のいずれかがコドン最適化されている、請求項３６記載の方法。
【請求項４２】
連結ヌクレオシドの前記第１の領域がコドン最適化されている、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記第１の末端領域が５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、請求項３６記載の方法。
【請求項４４】
前記５’ＵＴＲが、前記コードされた抗原の天然５’ＵＴＲである、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
前記５’ＵＴＲが構造化ＵＴＲである、請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
前記５’ＵＴＲが、コザック配列、配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、またはその断片からなる群から選択される少なくとも１つの翻訳開始配列を含む、請求項４３記載の方法。
【請求項４７】
前記５’ＵＴＲが少なくとも１つのＩＲＥＳの断片を含む、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記５’ＵＴＲが５つのＩＲＥＳの断片を含む、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記第１の末端領域が少なくとも１つの５’キャップ構造を含む、請求項３６記載の方法。
【請求項５０】
前記少なくとも１つの５’キャップ構造が、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジド−グアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、およびＣＡＰ−００３〜ＣＡＰ−２２５からなる群から選択される、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位または前記マイクロＲＮＡ結合部位のシードが、免疫細胞特異的マイクロＲＮＡである、請求項３６記載の方法。
【請求項５２】
前記免疫細胞特異的マイクロＲＮＡが、ｍｉｒ−１２２、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ、およびｍｉＲ−１４６ｂからなる群から選択される、請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
第１の末端領域が少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素（ＴＥＥ）配列を含む、請求項３６記載の方法。
【請求項５４】
前記３’尾部領域が鎖終結ヌクレオシドを含む、請求項３６記載の方法。
【請求項５５】
前期鎖終結ヌクレオシドが、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−デオキシウリジン、３’−デオキシシトシン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミン、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシウリジン、２’，３’−ジデオキシシトシン、２’，３’−ジデオキシグアノシン、２’，３’−ジデオキシチミン、２’−デオキシヌクレオシド、および−Ｏ−メチルヌクレオシドからなる群から選択される、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記３’尾部領域がステムループ配列を含む、請求項３６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１１月２６日出願の米国仮特許出願第６１／７２９，９３３号、表題「Ｔｅｒｍｉｎｉａｌｌｙ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＮＡｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，２２４号、表題「Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＮＡｓ」、２０１３年１月３１日出願の米国仮特許出願第６１／７５８，９２１号、表題「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」、２０１３年３月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７８１，１３９号、表題「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」、２０１３年５月３１日出願の米国仮特許出願第６１／８２９，３５９号、表題「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」、２０１３年６月２７日出願の米国仮特許出願第６１／８３９，９０３号、表題「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」、２０１３年７月３日出願の米国仮特許出願第６１／８４２，７０９号、表題「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」、２０１３年７月２３日出願の米国仮特許出願第６１／８５７，４３６号、表題「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」、２０１３年３月９日出願の米国仮特許出願第６１／７７５，５０９号、表題「Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍＲＮＡ」、および２０１３年３月３１日出願の米国仮特許出願第６１／８２９，３７２号、表題「Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍＲＮＡ」に対する優先権を主張するものである。これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、配列表と共に電子書式で出願されている。配列表は、２０１３年１０月１日に作成され、３，２６２，９３４バイトの大きさであるＭ３９ＰＣＴ２．ｔｘｔと題されたファイルとして提供される。この配列表の電子書式での情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、修飾ｍＲＮＡおよび／または最適化ｍＲＮＡの製造および使用のための組成物および方法、ならびにＲＮＡ結合タンパク質をコードする１つ以上の修飾ｍＲＮＡまたは野生型ｍＲＮＡと組み合わせたそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然に存在するＲＮＡは４つの塩基性リボヌクレオチド、すなわちＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、およびＧＴＰから合成されるが、転写後修飾ヌクレオチドを含有し得る。さらに、およそ１００個の異なるヌクレオシド修飾がＲＮＡにて同定されている（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄ  ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ．（１９９９）．Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ：１９９９更新．核酸参照番号２７：１９６〜１９７、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０００３】
タンパク質発現を生じさせる従前の方法には多くの問題がある。例えば、細胞に導入された異種デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、娘細胞（異種ＤＮＡが染色体に組み込まれたか否かにかかわらず）に、または子孫に継承され得る。導入されたＤＮＡは、ある頻度で宿主細胞ゲノムＤＮＡに組み込まれて、宿主細胞ゲノムＤＮＡの変性および／または損傷をもたらし得る。加えて、タンパク質が作製される前に生じなければならないステップが多く存在する。いったん細胞内に入ると、ＤＮＡは、それがＲＮＡ転写される核内に輸送されなければならない。その後、ＤＮＡから転写されたＲＮＡは、それがタンパク質に翻訳される細胞質に入らなければならない。この複数の処理ステップを必要とするこにより目的とするタンパク質の生成前に遅れ時間差をもたらす。さらに、ＤＮＡが頻繁に細胞に入るが、発現されないか、または妥当な速度もしくは濃度で発現されないため、細胞におけるＤＮＡ発現を達成することは困難である。これは、ＤＮＡが一次細胞または修飾細胞株に導入されるときに特に問題になり得る。免疫刺激能、安定性、およびＲＮＡの翻訳効率におけるヌクレオシド修飾の役割、ならびにタンパク質発現の増強および治療の作成のためのこの結果としての利点は、以前に研究されている。そのような研究は、公開された同時係属出願である、２０１年８月５日出願の国際公開第ＷＯ２０１２０１９１６８号、２０１１年１０月３日出願の国際公開第ＷＯ２０１２０４５０８２号、２０１１年１０月３日出願の国際公開第ＷＯ２０１２ ０４５０７５号、２０１２年１０月３日出願の国際公開第ＷＯ２０１３０５２５２３号、および２０１２年１２月１４日出願の国際公開第ＷＯ２０１３０９０６４８号に詳述されており、これらの内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００４】
抗体、ウイルス、獣医学における適用の分野、および様々なインビボ環境における修飾ポリヌクレオチドの使用が研究されており、これらの研究は、例えば、同時係属および共同所有の、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８６２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８６６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８６８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ
Ｖａｃｃｉｎｅｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８７０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４９号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３９号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８７３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６５０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１４７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８７８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６５４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１５２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８８５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６５８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１５５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８９６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年７月５日出願の米国仮特許出願第６１／６６８，１５７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６６１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１６０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９１１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６６７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年１２月１４出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１６８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９２２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６７５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１７４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９３５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６８７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１８４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９４５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６９６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１９１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ
Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９５３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，７０４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，２０３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ
ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，７２０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，２１３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，７４２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ
ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１３年３月９日出願の米国特許出願第１３／７９１，９２２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６
３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日出願の米国特許出願第１３／７９１，９２１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００５９号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１３年３月９日出願の米国特許出願第１３／７９１，９１０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」；および２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００７０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２０１３年３月１５日出願の国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３１８２１号、表題「Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」に開示されている。これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００５】
修飾ポリヌクレオチドの製剤化および送達は、例えば、同時係属および共同所有の、２０１２年１２月１４日出願の国際公開第ＷＯ２０１３０９０６４８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  核酸Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」、ならびに２０１２年１２月１４日出願の米国特許公開ＵＳ２０１３０１５６８４９号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」に記載されている。これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、当該技術分野において、核酸の細胞内翻訳の調節に対処する生物学的様式に対する必要が存在する。本発明は、分子の末端構造の変化をかいして修飾ｍＲＮＡ分子の製造および最適化する方法および組成物を提供することで、この必要に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
修飾ｍＲＮＡから増加したタンパク質発現を安定化させる方法または誘導する方法が本明細書に提供される。別の方法において、目的とするポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡと１つ以上のＲＮＡ結合タンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡとを組み合わせて、細胞と接触させる。
【０００８】
一実施形態において、第１の領域に対して５’側に位置する目的とするポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの第１の領域、第１の末端領域に対して３’側に位置する第２の末端領域、および３’尾部領域を含む、末端最適化ｍＲＮＡが本明細書に提供される。第１の末端領域は、例えば、限定されないが、ＴＥＥ−００１〜ＴＥＥ−７０５といった表２８に記載のＴＥＥ等の少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素（ＴＥＥ）を含んでいてもよいが、これらに限定されない。
【０００９】
第１の末端領域は、コードされた目的とするポリペプチドの天然５’ＵＴＲであり得るか、またはコードされた目的とするポリペプチドと非相同であり得る、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含んでいてもよい。一態様において、５’ＵＴＲは、コザック配列、配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、および／またはその断片等の少なくとも１つの翻訳開始配列を含んでいてもよい。非限定的な例として、５’ＵＴＲは少なくとも１つのＩＲＥＳの断片を含み得る。別の非限定的な例として、５’ＵＴＲは少なくとも５つのＩＲＥＳの断片を含み得る。別の態様において、５’ＵＴＲは構造化ＵＴＲを含んでいてもよい。
【００１０】
第２の末端領域は、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位、シード配列、またはシード配列を有しないマイクロＲＮＡ結合部位を含み得る。一態様において、マイクロＲＮＡは、ｍｉｒ−１２２、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ、およびｍｉＲ−１４６ｂ等の免疫細胞特異的マイクロＲＮＡであるが、これらに限定されない。
【００１１】
一実施形態において、３’尾部領域は、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−デオキシウリジン、３’−デオキシシトシン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミン、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシウリジン、２’，３’−ジデオキシシトシン、２’，３’−ジデオキシグアノシン、２’，３’−ジデオキシチミン、２’−デオキシヌクレオシド、および−Ｏ−メチルヌクレオシド等の鎖終結ヌクレオシドを含み得るが、これらに限定されない。一態様において、３’尾部領域はステムループ配列またはポリＡ尾部である。
【００１２】
一実施形態において、第１の領域に対して５’側に位置する目的とするポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの第１の領域、第１の末端領域に対して３’側に位置する第２の末端領域、および連結ヌクレオシドの３’尾部領域、ならびに末端最適化ｍＲＮＡに対して３’側に位置する少なくとも１つの鎖終結ヌクレオシドを含む、末端最適化ｍＲＮＡが本明細書に提供される。一態様において、第２の末端領域は、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位、シード配列、またはシード配列を有しないマイクロＲＮＡ結合部位を含み得る。一態様において、マイクロＲＮＡは、ｍｉｒ−１２２、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ、およびｍｉＲ−１４６ｂ等の免疫細胞特異的マイクロＲＮＡであるが、これらに限定されない。
【００１３】
本明細書に記載の末端最適化ｍＲＮＡは少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含み得る。一実施形態において、末端最適化ｍＲＮＡは、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、１−タウリノメチル−シュードウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、１−メチル−４−チオ−シュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）、および２’−Ｏ−メチル−シュードウリジン（ψｍ）等のシュードウリジン類似体を含んでいてもよいが、これらに限定されない。別の実施形態において、末端最適化ｍＲＮＡはシュードウリジン類似体１−メチルシュードウリジンを含む。さらに別の実施形態において、末端最適化ｍＲＮＡはシュードウリジン類似体１−メチルシュードウリジンを含み、修飾ヌクレオシド５−メチルシチジンを含む。
【００１４】
本明細書に記載の末端最適化ｍＲＮＡは、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジド−グアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、およびＣＡＰ−００３〜ＣＡＰ−２２５等の少なくとも１つの５’キャップ構造を含んでいてもよいが、これらに限定されない。
【００１５】
一態様において、少なくとも１つの末端最適化ｍＲＮＡの領域はコドン最適化されていてもよい。非限定的な例として、連結ヌクレオシドの第１の領域はコドン最適化されていてもよい。
【００１６】
末端最適化ｍＲＮＡを使用する方法もまた、本明細書に記載される。
一実施形態において、生物体における抗原介在性免疫応答を、生物体と末端最適化ｍＲＮＡを接触させることで減少させる方法が提供される。末端最適化ｍＲＮＡは、第１の領域に対して５’側に位置する目的とするポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの第１の領域、第１の末端領域に対して３’側に位置する第２の末端領域、および３’尾部領域を含み得る。第２の末端領域は、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位、シード配列、またはシード配列を有しないマイクロＲＮＡ結合部位を含み得る。一態様において、マイクロＲＮＡは、ｍｉｒ−１２２、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ、およびｍｉＲ−１４６ｂ等の免疫細胞特異的マイクロＲＮＡであるが、これらに限定されない。
【００１７】
別の実施形態において、抗原介在性免疫応答を減少させる末端最適化ｍＲＮＡは、ＴＥＥ−００１〜ＴＥＥ７０５、鎖終結ヌクレオシド、および／またはステムループ配列等の少なくとも１つの翻訳エンハンサー要素（ＴＥＥ）配列を含んでいてもよいが、これらに限定されない。
【００１８】
さらに別の実施形態において、抗原介在性免疫応答を減少させる末端最適化ｍＲＮＡは、コドン最適化された少なくとも１つの領域を含んでいてもよい。非限定的な例として、連結ヌクレオシドの第１の領域はコドン最適化されていてもよい。
【００１９】
本発明の様々な実施形態の詳細が、以下の発明を実施するための形態において説明される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、発明を実施するための形態および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の一次構築物の概略図である。
【図２】ポリヌクレオチドのセンサー要素を説明する、本発明の一次構築物の第２の隣接する領域の拡大図である。
【図３】本発明において有用なクローンマップである。
【図４】２つの濃度で次第に長くなるポリＡ尾部を有する、本発明の修飾ｍＲＮＡからの改善したタンパク質産生を示すヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
分子の末端構造の変化を介した、修飾ｍＲＮＡ分子の製造および最適化のための組成物および方法が本明細書に記載される。具体的には、ｍＲＮＡの末端領域を変化させることでタンパク質産生を増加させる方法が、開示される。そのような末端領域は、少なくとも５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’ＵＴＲを含む。コード領域の５’側または３’側を修飾することができ、これらに見出され得る他の特徴は、修飾ｍＲＮＡ（修飾ＲＮＡ）の５’キャップおよびポリＡ尾部を含む。
【００２２】
一般的に、細胞内に導入された外因性核酸、特にウイルス性核酸は自然免疫応答を誘導し、インターフェロン（ＩＦＮ）産生および細胞死をもたらす。しかしながら、治療薬、診断、試薬の分野、および生物学的アッセイについて、例えば、核酸の細胞内翻訳およびコードされた目的とするタンパク質の産生を引き起こすために、インビトロまたはエクスビボにかかわらず、細胞内に核酸、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）を送達することは、重要なことである。標的細胞への組み込みによって特徴付けられる核酸は、一般的にそれらの発現レベルにおいて不正確であり、子孫および隣接する細胞に対して有害な伝達性を有し、著しく高い変異のリスクがあるので、非組み込み核酸の送達および機能が特に重要である。
【００２３】
本明細書に記載の末端修飾は、例えば、限定されないが、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８６２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙヌクレオチドｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８６６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８６８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ
ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８７０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４９号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３９号、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８７３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６５０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１４７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８７８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６５４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１５２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８８５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６５８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１５５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８９６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年７月５日出願の米国仮特許出願第６１／６６８，１５７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６６１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１６０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９１１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６６７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１６８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９２２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６７５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１７４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９３５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６８７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１８４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９４５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６９６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１９１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年４月２日出願の米国特許出願第６１／６１８，９５３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年８月１０日出願の米国特許出願第６１／６８１，７０４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年１２月１４日出願の米国特許出願第６１／７３７，２０３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｏｅｔｉｄｅｓ」；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００５９号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；
２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００７０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」；および２０１３年３月１５日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３１８２１号、表題「Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１３年１月１７日出願の米国仮特許出願第ＵＳ  ６１／７５３，６６１号、表題「Ｓｉｇｎａｌ−Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、２０１３年１月１８日出願の米国仮特許出願第ＵＳ  ６１／７５４，１５９号、表題「Ｓｉｇｎａｌ−Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、２０１３年３月１４日出願の米国仮特許出願第ＵＳ６１／７８１，０９７号、表題「Ｓｉｇｎａｌ−Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、２０１３年５月３１日出願の米国仮特許出願第ＵＳ  ６１／８２９，３３４号、表題「Ｓｉｇｎａｌ−Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ
Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、２０１２年１１月２６日出願の米国仮特許出願第６１／７２９，９３３号、表題「Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，２２４号、表題「Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ」、２０１３年１月３１日出願の米国仮特許出願第ＵＳ  ６１／７５８，９２１号、表題「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」、２０１３年３月１４日出願の米国仮特許出願第ＵＳ  ６１／７８１，１３９号、表題「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」、２０１３年５月３１日に出願の米国仮出願第６１／８２９，３５９号、表題「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」に記載の目的とするポリペプチドといった、目的とするポリペプチドをコードする修飾核酸に用いることができ、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２４】
細胞の状態、機能、および／または活性を調節することができるポリペプチドをコードする核酸分子、ならびにこれらの核酸およびポリペプチドの作成および使用方法が、一部本明細書に提供される。本明細書、ならびに同時係属および共同所有の、２０１１年８月５日に出願の国際公開第ＷＯ２０１２０１９１６８号、２０１１年１０月３日出願の国際公開第ＷＯ２０１２０４５０８２号、２０１１年１０月３日出願の国際公開第ＷＯ２０１２０４５０７５号、２０１２年１０月３日出願の国際公開第ＷＯ２０１３０５２５２３号、および２０１２年１２月１４日出願の国際公開第ＷＯ２０１３０９０６４８号（これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、これらの修飾核酸分子は、それらが導入された細胞集団の自然免疫活性を現象させることができ、したがって、その細胞集団におけるタンパク質産生の効率を増加させることができる。
【００２５】
本発明の修飾ＲＮＡにおける、２０１２年１０月３日出願の米国特許公開第ＵＳ２０１３０１１５２７２号（これら内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるもの等の非天然ヌクレオシドおよびヌクレオチドの利用にくわえて、変化した末端構造の併用もまた細胞集団からのタンパク質産生を増加させ得ることが、現在判明している。Ｉ．本発明の組成物
本発明は、合成であってもよく、１つ以上の修飾ヌクレオシド（「修飾核酸」または「修飾核酸分子」と称される）およびポリヌクレオチド、一次構築物、および修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を含有し、ｍＲＮＡが導入される細胞の自然免疫応答の著しい誘導の欠如を含む、有用な特徴を有する、ｍＲＮＡ等のＲＮＡを含む拡散分子を提供する。これらの修飾核酸は、タンパク質産生の効率、核酸の細胞内貯蔵、および接触した細胞の生存率を増強し、減少した免疫原性を有するので、これらの特徴を有するこれらの核酸は、本明細書において「エンハンスド」核酸または修飾ＲＮＡと称される。
【００２６】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、翻訳された際に生物体に治療効果をもたらす細胞にシグナルを伝達する１つ以上の目的とするポリペプチドをコードする、核酸転写物である。シグナルポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの微小環境を認識し、（ａ）翻訳されるペプチドまたはタンパク質と関連する機能または表現型の結果、（ｂ）シグナルポリヌクレオチドの発現レベル、および／または両方を変化させる、配列（翻訳可能または翻訳不可能）をさらに任意に含んでいてもよい。
【００２７】
「核酸」という用語は、その最も広い意味において、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。これらのポリマーは、多くの場合、ポリヌクレオチドと称される。
【００２８】
例示の核酸には、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはこれらのハイブリッドが含まれる。これらはまた、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒活性ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクター等を含み得る。好ましい実施形態において、修飾核酸分子は１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。
【００２９】
好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。本明細書で使用するとき、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、目的とするポリペプチドをコードし、かつ翻訳されてインビトロ、インビボ、インサイツ、またはエクスビボで、コードされた目的とするポリペプチドを産生することができる任意のポリヌクレオチドを指す。本発明のポリヌクレオチドはｍＲＮＡまたは任意の核酸分子であってもよく、化学的に修飾されていてもされていなくてもよい。
【００３０】
従来、ｍＲＮＡ分子の主要成分には、少なくともコーディング領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ、およびポリＡ尾部が含まれる。この野生型モジュール構造を基に、本発明は、モジュール組織を維持するが、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドが導入される部分への細胞の自然免疫応答の実質的な誘導の欠如を含む、有用な特性をポリヌクレオチドに付与する１つ以上の構造および／もしくは化学修飾または改変を含むポリヌクレオチドまたは一次ＲＮＡ構築物を提供することによって従来のｍＲＮＡ分子の機能の範囲を拡大する。したがって、本発明の修飾ｍＲＮＡ分子は、合成されたものであってもよく、「ｍｍＲＮＡ」と称される。本明細書で使用するとき、「構造的」特徴または修飾は、２個以上の結合ヌクレオチドが、ヌクレオチド自体への著しい化学修飾なく、ポリヌクレオチドポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡにおいて挿入、欠失、複製、反転、またはランダム化される特徴または修飾である。化学結合が必然的に破壊および再形成されて構造修飾をもたらすため、構造修飾は、化学的性質のものであり、したがって、化学修飾である。しかしながら、構造修飾は、異なるヌクレオチド配列をもたらす。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は、「ＡＴ−５ｍｅＣ−Ｇ」に化学修飾され得る。同一のポリヌクレオチドは、「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」に構造修飾され得る。ここで、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入されており、ポリヌクレオチドへの構造修飾をもたらす
翻訳可能領域、および１つ、２つ、または３つ以上の異なるヌクレオシド修飾を含有する修飾核酸が提供される。いくつかの実施形態において、修飾核酸は、対応する無修飾核酸に対して、核酸が導入される細胞における分解の減少を示す。
【００３１】
いくつかの実施形態において、化学修はヌクレオチドの糖部分に位置していてもよい。
いくつかの実施形態において、化学修飾はヌクレオチドのリン酸骨格に位置していてもよい。
【００３２】
ある特定の実施形態において、例えば、タンパク質産生の正確なタイミングが望まれる場合、細胞に導入された修飾核酸が細胞内で分解されることが望ましい。したがって、本発明は、細胞内にてその目的のための様式で作用されることができる分解ドメインを含有する修飾核酸を提供する。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ構造
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書で証明されるように核酸系治療薬を用いた効果的なポリペプチド産生の既存の問題の打開に役立つそれらの機能的および／または構造的設計特徴において野生型ｍＲＮＡと区別される。
【００３３】
図１は、本発明の代表的な一次構築物１００を示す。本明細書で使用するとき、「一次構築物」または「一次ｍＲＮＡ構築物」という用語は、１個以上の目的とするポリペプチドをコードし、その中でコードされる目的とするポリペプチドが翻訳されることを可能とするのに十分な構造的および／または化学的特徴を保持する、ポリヌクレオチド転写物を指す。一次構築物は、本発明のポリヌクレオチドであり得る。構造または化学修飾された場合、一次構築物は、ｍｍＲＮＡと称され得る。
【００３４】
図１を参照して、ここで、一次構築物１００は、第１の隣接領域１０４および第２の隣接領域１０６に隣接する結合ヌクレオチド１０２の第１の領域を含有する。本明細書で使用するとき、「第１の領域」は、「コーディング領域」もしくは「コード領域」、または単に「第１の領域」と称され得る。この第１の領域は、コードされた目的とするポリペプチドを含み得るが、これに限定されない。目的とするポリペプチドは、その５’末端に、シグナルペプチド配列領域１０３によってコードされた１つ以上のシグナルペプチド配列を含み得る。隣接領域１０４は、１つ以上の完全または不完全な５’ＵＴＲ配列を含む結合ヌクレオチドの領域を含み得る。隣接領域１０４は、５’末端キャップ１０８も含み得る。第２の隣接領域１０６は、１つ以上の完全または不完全な３’ＵＴＲを含む結合ヌクレオチドの領域を含み得る。隣接領域１０６は、３’尾部配列１１０および３’ＵＴＲ１２０も含み得る。
【００３５】
第１の領域１０２と第１の隣接領域１０４の５’末端の架橋は、第１の操作領域１０５である。従来、この操作領域は、開始コドンを含む。あるいは、この操作領域は、開始コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含み得る。
【００３６】
第１の領域１０２と第２の隣接領域１０６の３’末端の架橋は、第２の操作領域１０７である。従来、この操作領域は、終止コドンを含む。あるいは、この操作領域は、終止コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含み得る。本発明に従って、複数の連続終止コドンも使用され得る。一実施形態において、本発明の動作領域は２つの終止コドンを含み得る。第１の終止コドンは「ＴＧＡ」であり得、第２の終止コドンは「ＴＡＡ」、「ＴＧＡ」、および「ＴＡＧ」からなる群から選択することができる。動作領域は、３つの終止コドンをさらに含んでいてもよい。第３の終止コドンは、「ＴＡＡ」、「ＴＧＡ」、および「ＴＡＧ」からなる群から選択することができる。
【００３７】
図２を参照すると、第２の隣接領域１０６の３’ＵＴＲ１２０は１つ以上のセンサー配列１３０を含み得る。本明細書に記載のこれらのセンサー配列は、一次構築物またはポリヌクレオチドの局所微小環境のリガンドに対する偽性受容体（または結合部位）として作動する。例えば、マイクロＲＮＡ結合部位またはｍｉＲＮＡシードがポリヌクレオチドの環境下に存在する任意のマイクロＲＮＡに対する偽性受容体として機能するように、それらをセンサーとして使用してもよい。
【００３８】
概して、本発明の一次構築物の第１の領域の最短の長さは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、またはデカペプチドをコードするのに十分な核酸配列の長さであり得る。別の実施形態において、この長さは、２〜３０個のアミノ酸、例えば、５〜３０、１０〜３０、２〜２５、５〜２５、１０〜２５、または１０〜２０個のアミノ酸のペプチドをコードするのに十分であり得る。この長さは、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１７、２０、２５、もしくは３０個のアミノ酸のペプチド、または４０個のアミノ酸より長くないペプチド、例えば、３５、３０、２５、２０、１７、１５、１４、１３、１２、１１、もしくは１０個のアミノ酸より長くないペプチドをコードするのに十分であり得る。ポリヌクレオチド配列がコードし得るジペプチドの例には、カルノシンおよびアンセリンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３９】
概して、本発明の目的とするポリペプチドをコードする第１の領域の長さは、約３０ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも、約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、および３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、もしくは１００，０００ヌクレオチド長（１００，０００を含む）まで、またはそれらを超える）。本明細書で使用するとき、「第１の領域」は、「コーディング領域」もしくは「コード領域」、または単に「第１の領域」と称され得る。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、約３０〜約１００，０００個のヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜３，０００、３０〜５，０００、３０〜７，０００、３０〜１０，０００、３０〜２５，０００、３０〜５０，０００、３０〜７０，０００、１００〜２５０、１００〜５００、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜３，０００、１００〜５，０００、１００〜７，０００、１００〜１０，０００、１００〜２５，０００、１００〜５０，０００、１００〜７０，０００、１００〜１００，０００、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜３，０００、５００〜５，０００、５００〜７，０００、５００〜１０，０００、５００〜２５，０００、５００〜５０，０００、５００〜７０，０００、５００〜１００，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜３，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜７，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜２５，０００、１，０００〜５０，０００、１，０００〜７０，０００、１，０００〜１００，０００、１，５００〜３，０００、１，５００〜５，０００、１，５００〜７，０００、１，５００〜１０，０００、１，５００〜２５，０００、１，５００〜５０，０００、１，５００〜７０，０００、１，５００〜１００，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜７，０００、２，０００〜１０，０００、２，０００〜２５，０００、２，０００〜５０，０００、２，０００〜７０，０００、および２，０００〜１００，０００個）を含む。
【００４１】
本発明に従って、第１および第２の隣接領域は、独立して、１５〜１，０００ヌクレオチド長の範囲（例えば、３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、および９００を超えるヌクレオチド長、または少なくとも３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、および１，０００ヌクレオチド長）であり得る。
【００４２】
本発明に従って、尾部配列は、０〜５００ヌクレオチド長の範囲（例えば、少なくとも６０、７０、８０、９０、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド長）であり得る。尾部領域がポリＡ尾部である場合、長さは、ポリＡ結合タンパク質結合の単位で、またはその関数として決定され得る。この実施形態において、ポリＡ尾部は、ポリＡ結合タンパク質の少なくとも４個の単量体に結合するのに十分な長さである。ポリＡ結合タンパク質の単量体は、一続きの約３８個のヌクレオチドに結合する。したがって、約８０個のヌクレオチドおよび１６０個のヌクレオチドのポリＡ尾部が機能的であることが観察されている。
【００４３】
本発明に従って、キャッピング領域は、単一のキャップまたはキャップを形成する一連のヌクレオチドを含み得る。この実施形態において、キャッピング領域は、１〜１０、例えば、２〜９、３〜８、４〜７、１〜５、５〜１０、または少なくとも２、もしくは１０以下のヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、キャップは不在である。
【００４４】
本発明に従って、第１および第２の操作領域は、３〜４０、例えば、５〜３０、１０〜２０の範囲、１５、または少なくとも４、もしくは３０以下のヌクレオチド長であり得、開始コドンおよび／または終止コドンに加えて、１つ以上のシグナルおよび／または制限配列を含み得る。
環状ポリヌクレオチド
本発明に従って、核酸、修飾ＲＮＡ、または一次構築物は、環化またはコンカテマー化されて翻訳コンピテント分子を生成し、ポリＡ結合タンパク質と５’末端結合タンパク質との間の相互作用を補助し得る。環化またはコンカテマー化の機構は、少なくとも３つの異なる経路、すなわち１）化学的経路、２）酵素的経路、および３）リボザイム触媒経路を通って生じ得る。新たに形成された５’／３’連結は、分子内または分子間であり得る。
【００４５】
第１の経路において、核酸の５’末端および３’末端は、接近しているときに分子の５’末端と３’末端との間に新たな共有結合を形成する化学反応基を含有する。有機溶媒中で、合成ｍＲＮＡ分子の３’末端上の３’−アミノ末端ヌクレオチドが５’−ＮＨＳ−エステル部分上で求核攻撃を経て新たな５’／３’アミド結合を形成するように、５’末端は、ＮＨＳ−エステル反応基を含有し得、３’末端は、３’−アミノ末端ヌクレオチドを含有し得る。
【００４６】
第２の経路において、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いて、５’−リン酸化核酸分子を核酸の３’−ヒドロキシル基に酵素結合させて、新たなホスホロジエステル結合を形成することができる。反応の例において、１μｇの核酸分子が、製造業者のプロトコルに従って、１〜１０単位のＴ４  ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）と３７℃で１時間インキュベートされる。連結反応が、５’領域および３’領域の両方と並んで塩基対合して、酵素的連結反応を補助することができる分裂したオリゴヌクレオチドの存在下で生じ得る。
【００４７】
第３の経路において、ｃＤＮＡ鋳型の５’末端または３’末端のいずれかは、インビトロ転写中に、結果として生じる核酸分子が核酸分子の５’末端を核酸分子の３’末端に連結することができる活性リボザイム配列を含有し得るように、リガーゼリボザイム配列をコードする。リガーゼリボザイムは、Ｉ群イントロン、Ｉ群イントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピンリボザイムに由来し得るか、またはＳＥＬＥＸ（試験管内進化法、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）によって選択され得る。リボザイムリガーゼ反応は、０〜３７℃の温度で１〜２４時間かかり得る。
ポリヌクレオチド多量体
本発明に従って、複数のはっきりと異なる核酸、修飾ＲＮＡ、または一次構築物は、３’末端で修飾されたヌクレオチドを用いて３’末端を介して結合され得る。化学的複合体形成を用いて、細胞への送達の化学量論を制御することができる。例えば、グリオキシル酸回路酵素、イソクエン酸リアーゼ、およびリンゴ酸シンターゼは、ＨｅｐＧ２細胞に１：１の比率で供給されて細胞脂肪酸の代謝を変化させ得る。この比率は、一方の核酸または修飾ＲＮＡ種に３’−アジド末端ヌクレオチドを用い、かつ反対側の核酸または修飾ＲＮＡ種にＣ５−エチニルまたはアルキニル含有ヌクレオチドを用いて化学結合核酸または修飾ＲＮＡを化学結合させることによって制御され得る。この修飾されたヌクレオチドは、製造業者のプロトコルに従って末端トランスフェラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を用いて転写後に添加される。３’末端修飾ヌクレオチドの添加後、これら２個の核酸または修飾ＲＮＡ種は、銅の存在下または不在下において水溶液中で合わせられて、文献内に記載のクリック化学機構を介して新たな共有結合を形成し得る。
【００４８】
別の例において、３個以上のポリヌクレオチドが官能化リンカー分子を用いて結合され得る。例えば、官能化サッカリド分子は、複数の化学反応基（ＳＨ−、ＮＨ２−、Ｎ３等）を含有して３’−官能化ｍＲＮＡ分子上の同族部分（すなわち、３’−マレイミドエステル、３’−ＮＨＳ−エステル、アルキニル）と反応するように化学修飾され得る。この修飾されたサッカリド上の反応基の数は、化学量論的様式で制御されて、複合体化された核酸またはｍＲＮＡの化学量論比を直接制御し得る。
修飾ＲＮＡ複合体および組み合わせ
タンパク質産生をさらに亢進するために、本発明の核酸、修飾ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、または一次構築物は、他のポリヌクレオチド、染料、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンドに特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、または骨細胞等の特定の細胞型に結合する抗体、ホルモンおよびホルモン受容体、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、共同因子、または薬物と複合体化されるように設計され得る。
【００４９】
複合体化は、安定性および／または半減期の増加をもたらし得、核酸、修飾ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、または一次構築物を、細胞、組織、または生物体の特定の部位に標的化するときに特に有用であり得る。
【００５０】
本発明に従って、核酸、修飾ＲＮＡ、または一次構築物は、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、もしくはベクター等のうちの１つ以上とともに投与され得るか、またはこれらをさらにコードし得る。
二機能性ポリヌクレオチド
本発明の一実施形態は、二機能性ポリヌクレオチド（例えば、二機能性核酸、二機能性修飾ＲＮＡ、または一次構築物）である。その名称が示すように、二機能性ポリヌクレオチドは、少なくとも２つの機能を有するか、または少なくとも２つの機能の能力があるポリヌクレオチドである。これらの分子は、慣例により、多機能性とも称され得る。
【００５１】
二機能性ポリヌクレオチドの複数の機能は、ＲＮＡによってコードされ得る（この機能は、コードされた産物が翻訳されるまで現れ得ない）か、またはポリヌクレオチド自体の特性であり得る。これは、構造的または化学的であり得る。二機能性修飾ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと共有結合的または静電的に関連した機能を含み得る。さらに、これら２つの機能は、修飾ＲＮＡおよび別の分子の複合体との関連において提供され得る。
【００５２】
二機能性ポリヌクレオチドは、抗増殖性ペプチドをコードし得る。これらのペプチドは、線状、環状、拘束、またはランダムコイルであり得る。これらは、アプタマー、シグナル伝達分子、リガンド、またはこれらの模倣物もしくはミメティックとして機能し得る。抗増殖性ペプチドは、翻訳されると、３〜５０アミノ酸長であり得る。それらは、５〜４０、１０〜３０、または約１５アミノ酸長であり得る。それらは、一本鎖、多本鎖、または分岐鎖であり得、翻訳されると、複合体、凝集体、または任意の多ユニット構造を形成し得る。
非コードポリヌクレオチド
本明細書に記載されるように、部分的または実質的に翻訳可能ではない配列、例えば、非コード領域を有する核酸、修飾ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、および一次構築物が提供される。そのような分子は、通常翻訳されないが、リボソームタンパク質または転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）等の１つ以上の翻訳機構成分への結合および隔離のうちの１つ以上によってタンパク質産生に影響を及ぼし、それによって、細胞におけるタンパク質発現を効果的に低下させるか、細胞における１つ以上の経路またはカスケードを調節し得、それが次いでタンパク質レベルを変化させる。核酸、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍＲＮＡは、１個以上の長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡもしくはｌｉｎｃＲＮＡ）もしくはその部分、低分子核ＲＮＡ（ｓｎｏ−ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはＰｉｗｉ干渉ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）を含有し得るか、あるいはこれらをコードし得る。
目的とするポリペプチド
本発明に従って、一次構築物は、１個以上の目的とするポリペプチドまたはその断片をコードするように設計される。目的とするポリペプチドは、全ポリペプチド、複数のポリペプチド、またはポリペプチドの断片を含み得るが、これらに限定されず、これらは、独立して、１個以上の核酸、複数の核酸、核酸の断片、または前述のうちのいずれかの変異形によってコードされ得る。本明細書で使用するとき、「目的とするポリペプチド」という用語は、選択されて本発明の一次構築物においてコードされる任意のポリペプチドを指す。本明細書で使用するとき、「ポリペプチド」とは、ほとんどの場合ペプチド結合によって結合されるアミノ酸残基（天然または非天然）のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用するとき、任意の大きさ、構造、または機能を有するタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。いくつかの例において、コードされたポリペプチドが約５０個のアミノ酸よりも小さい場合、このポリペプチドは、ペプチドと称される。ポリペプチドがペプチドである場合、これは、少なくとも約２、３、４、または少なくとも５アミノ酸残基長である。したがって、ポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルソログ、パラログ、前述の断片および他の等価物、変異形、ならびに類似体を含む。ポリペプチドは、単一の分子であり得るか、または二量体、三量体、もしくは四量体等の多分子複合体であり得る。それらは、抗体またはインスリン等の一本鎖または多本鎖ポリペプチドも含み得、会合または結合され得る。ほとんどの場合、ジスルフィド結合が多本鎖ポリペプチドに見られる。「ポリペプチド」という用語は、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。
【００５３】
「ポリペプチド変異形」という用語は、それらのアミノ酸配列が天然配列または参照配列とは異なる分子を指す。アミノ酸配列変異形は、天然配列または参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置に置換、欠失、および／または挿入を有し得る。通常、変異形は、天然配列または参照配列と少なくとも約５０％の同一性（相同性）を有し、好ましくは、それらは、天然配列または参照配列と少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約９０％同一（相同）である。
【００５４】
いくつかの実施形態において、「変異形模倣物」が提供される。本明細書で使用するとき、「変異形模倣物」という用語は、活性化配列を模倣する１個以上のアミノ酸を含有するものである。例えば、グルタミン酸塩は、ホスホロ−トレオニンおよび／またはホスホロ−セリンの模倣物の役割を果たし得る。あるいは、変異形模倣物は、その模倣物を含有する産物の失活または不活性化をもたらし得、例えば、フェニルアラニンは、チロシンの不活性化置換としての機能を果たし得るか、またはアラニンは、セリンの不活性化置換としての機能を果たし得る。
【００５５】
「相同性」は、アミノ酸配列に適用されるとき、最大の相同パーセントを得るために、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の第２の配列のアミノ酸配列内の残基と同一の候補アミノ酸配列内の残基の割合（％）と定義される。整列させるための方法およびコンピュータプログラムは、当技術分野で周知である。相同性が同一性パーセントの計算に依存するが、計算に導入されるギャップおよびペナルティのため値が異なり得ることが理解される。
【００５６】
「相同体」とは、ポリペプチド配列に適用されるとき、第２の種の第２の配列に対してかなりの割合の同一性を有する他の種の対応する配列を意味する。
「類似体」は、親または出発ポリペプチドの特性のうちの１つ以上を依然として維持する、１つ以上のアミノ酸改変、例えば、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失によって異なるポリペプチド変異形を含むよう意図される。
【００５７】
本発明は、変異形および誘導体を含むポリペプチド系のいくつかの種類の組成物を企図する。これらは、置換、挿入、欠失、および共有結合変異形および誘導体を含む。「誘導体」という用語は、「変異形」という用語と同義に使用されるが、概して、任意の方法で参照分子または出発分子に対して修飾され、かつ／または変化した分子を指す。
【００５８】
したがって、参照配列に対して置換、挿入および／または付加、欠失、ならびに共有結合修飾を含有する目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、本発明の範囲内に包含される。例えば、配列タグまたはアミノ酸、例えば、１個以上のリジンが、本発明のペプチド配列に付加され得る（例えば、Ｎ末端またはＣ末端で）。配列タグは、ペプチド精製または局在化に使用され得る。リジンを用いて、ペプチド溶解度を増加させるか、またはビオチン化を可能にする。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシおよびアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基が任意に欠失されて、切断配列を提供し得る。あるいは、ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）は、配列の使用に応じて、例えば、可溶性のより大きい配列の一部として配列の発現時に欠失され得るか、または固体支持体に結合され得る。
【００５９】
「置換変異形」とは、ポリペプチドについて言及するとき、天然配列または出発配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、その場所の同一の位置に異なるアミノ酸が挿入されたものである。これらの置換は、単一置換であり、分子中の１個のアミノ酸のみが置換されたものであり得、またはこれらの置換は、多置換であり、同一の分子中の２個以上のアミノ酸が置換されたものであり得る。
【００６０】
本明細書で使用するとき、「保存アミノ酸置換」という用語は、配列に通常存在するアミノ酸を、同様の大きさ、電荷、または極性を有する異なるアミノ酸で置換することを指す。保存置換の例には、イソロイシン、バリン、およびロイシン等の非極性（疎水性）残基の別の非極性残基との置換が挙げられる。同様に、保存置換の例には、アルギニンとリジン、グルタミンとアスパラギン、およびグリシンのセリン等の極性（親水性）残基の別の残基との置換が挙げられる。さらに、リジン、アルギニン、もしくはヒスチジン等の塩基性残基の別の塩基性残基との置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸等のある酸性残基の別の酸性残基との置換が、保存置換のさらなる例である。非保存置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニン等の非極性（疎水性）アミノ酸残基の、システイン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはリジン等の極性（親水性）残基との置換、および／または極性残基の非極性残基との置換が挙げられる。
【００６１】
「挿入変異形」とは、ポリペプチドについて言及するとき、１個以上のアミノ酸が天然配列または出発配列内の特定の位置のアミノ酸にすぐ隣接して挿入されたものである。アミノ酸に「すぐ隣接した」とは、アミノ酸のα−カルボキシ官能基またはα−アミノ官能基のいずれかに連結されていることを意味する。
【００６２】
「欠失変異形」とは、ポリペプチドについて言及するとき、天然アミノ酸配列または出発アミノ酸配列内の１個以上のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失変異形は、１個以上のアミノ酸を分子の特定の領域で欠失させる。
【００６３】
「共有結合誘導体」は、ポリペプチドについて言及するとき、有機タンパク質性もしくは非タンパク質性誘導体化剤での天然タンパク質もしくは出発タンパク質の修飾、および／または翻訳後修飾を含む。共有結合修飾は、従来、タンパク質の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、または選択された組換え宿主細胞において機能する翻訳後修飾の機構を利用することによって導入される。結果として生じる共有結合誘導体は、組換え糖タンパク質の免疫親和性精製のための抗タンパク質抗体の生物学的活性、免疫学的アッセイ、または調製に重要な残基の特定を目的としたプログラムにおいて有用である。そのような修飾は、当技術分野の技術の範囲内であり、過度の実験なく行われる。
【００６４】
ある特定の翻訳後修飾は、発現ポリペプチドにおける組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、高い頻度で、翻訳後に対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれかの形態も、本発明に従って産生されたポリペプチドに存在し得る。
【００６５】
他の翻訳後修飾は、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化を含む（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））。
【００６６】
「特徴」は、ポリペプチドについて言及するとき、分子のはっきりと異なるアミノ酸配列に基づく成分と定義される。本発明のｍｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの特徴には、表面出現、局所立体配座形状、折り畳み、ループ、半ループ、ドメイン、半ドメイン、部位、末端、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００６７】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「表面出現」という用語は、タンパク質のポリペプチド系成分が最も外側の表面に現れることを指す。
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「局所立体配座形状」という用語は、タンパク質の定義可能な空間内に位置するタンパク質のポリペプチド系構造の出現を意味する。
【００６８】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「折り畳み」という用語は、エネルギー最小化時のアミノ酸配列の結果として生じる立体構造を指す。折り畳みは、折り畳みプロセスの二次または三次レベルで生じ得る。二次レベルの折り畳みの例には、βシートおよびαヘリックスが挙げられる。三次レベルの折り畳みの例には、エネルギー力の凝集または分離が原因で形成されるドメインおよび領域を含む。このようにして形成された領域は、疎水性および親水性ポケット等を含む。
【００６９】
本明細書で使用する「回転」という用語は、タンパク質構造に関するとき、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を変化させる屈曲を意味し、１、２、または３個以上のアミノ酸残基が関与し得る。
【００７０】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「ループ」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を逆転させる役目を果たし得るポリペプチドの構造的特徴を指す。ループがポリペプチドで見つけられ、かつ骨格の方向のみを変化させる場合、これは、４個以上のアミノ酸残基を含み得る。Ｏｌｉｖａらは、少なくとも５つのクラスのタンパク質ループを特定している（Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６６（４）：８１４−８３０；１９９７）。ループは、開ループまたは閉ループであり得る。閉ループまたは「環状」ループは、架橋部分の間に２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上のアミノ酸を含み得る。そのような架橋部分は、ジスルフィド架橋を有するポリペプチドにおいて典型的なシステイン−システイン架橋（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）を含み得るか、またはあるいは架橋部分は、本明細書で用いられるジブロモジルイル剤（ｄｉｂｒｏｍｏｚｙｌｙｌ  ａｇｅｎｔ）等の非タンパク質系のものであり得る。
【００７１】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「半ループ」という用語は、それが由来するループとして特定されたアミノ酸残基の少なくとも半数を有するループの部分を指す。ループが必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有するわけではないことが理解される。したがって、ループが奇数のアミノ酸を含有するか、または奇数のアミノ酸を含むと特定された場合において、奇数のループの半ループは、ループの整数部分または次の整数部分（ループのアミノ酸の数／２＋／−０．５個のアミノ酸）を含む。例えば、７アミノ酸ループと特定されたループは、３個のアミノ酸または４個のアミノ酸（７／２＝３．５＋／−０．５で３または４になる）の半ループをもたらし得る。
【００７２】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「ドメイン」という用語は、１つ以上の特定可能な構造または機能特徴または特性（例えば、結合能力、タンパク質間の相互作用の部位としての役割を果たす）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
【００７３】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「半ドメイン」という用語は、それが由来するドメインとして特定されたアミノ酸残基の少なくとも半数を有するドメインの部分を意味する。ドメインが必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有するわけではないことが理解される。したがって、ドメインが奇数のアミノ酸を含有するか、または奇数のアミノ酸を含むと特定された場合において、奇数のドメインの半ドメインは、ドメインの整数部分または次の整数部分（ドメインのアミノ酸の数／２＋／−０．５個のアミノ酸）を含む。例えば、７アミノ酸ドメインと特定されたドメインは、３個のアミノ酸または４個のアミノ酸（７／２＝３．５＋／−０．５で３または４になる）の半ドメインをもたらし得る。サブドメインがドメインまたは半ドメイン内で特定され得、これらのサブドメインが、それらが由来するドメインまたは半ドメインで特定された構造特性または機能特性のすべてに満たない構造特性または機能特性を有することも理解される。本明細書のドメイン型のうちのいずれを含むアミノ酸もポリペプチドの骨格に沿って隣接している必要はない（すなわち、非隣接アミノ酸が構造的に折り畳まれて、ドメイン、半ドメイン、またはサブドメインをもたらし得る）ことも理解される。
【００７４】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「部位」という用語は、アミノ酸系の実施形態に関するとき、「アミノ酸残基」および「アミノ酸側鎖」と同義に使用される。部位は、本発明のポリペプチド系分子内で修飾、操作、改変、誘導体化、または変更され得るペプチドまたはポリペプチド内の位置を表す。
【００７５】
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「末端（ｔｅｒｍｉｎｉ）」または「末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドの端を指す。そのような端は、ペプチドまたはポリペプチドの第１または最終部位に限定されるだけでなく、末端領域にさらなるアミノ酸も含み得る。本発明のポリペプチド系分子は、Ｎ末端（アミノ酸によって遊離アミノ基（ＮＨ２）で終端する）もＣ末端（アミノ酸によって遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）で終端する）もいずれも有することを特徴とし得る。本発明のタンパク質は、ある場合には、ジスルフィド結合または非共有結合力（多量体、オリゴマー）によって結び付けられた複数のポリペプチド鎖から成り得る。これらの種類のタンパク質は、複数のＮ末端およびＣ末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末端は、それらが場合によって有機複合体等の非ポリペプチド系部分で始まるか、または終了するように修飾され得る。
【００７６】
これらの特徴のうちのいずれかが本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの所望の成分であると特定または定義されると、これらの特徴のいくつかの操作および／または修飾のうちのいずれも、移動、交換、反転、欠失、ランダム化、または複製によって行われ得る。さらに、特徴の操作が本発明の分子に対する修飾と同一の結果をもたらすことが理解される。例えば、ドメインの欠失を伴う操作は、全長分子未満をコードする核酸の修飾のような分子の長さの改変をもたらす。
【００７７】
修飾および操作は、部位特異的変異誘発等であるが、これに限定されない当技術分野で既知の方法によって達成され得る。その後、結果として生じる修飾された分子は、本明細書に記載のアッセイ等のインビトロまたはインビボアッセイ、または当技術分野で既知の任意の他の好適なスクリーニングアッセイを用いて活性について試験され得る。
【００７８】
本発明に従って、ポリペプチドは、一連の実験によって発見されるコンセンサス配列を含み得る。本明細書で使用するとき、「コンセンサス」配列とは、１つ以上の部位で可変性を可能にする配列の集合集団を表す単一配列である。
【００７９】
当業者によって認識されるように、タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、および相同タンパク質も、本発明の目的とするポリペプチドの範囲内であると見なされる。例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００を超えるアミノ酸長の参照タンパク質の任意のタンパク質断片（少なくとも１個のアミノ酸残基が参照ポリペプチド配列よりも短いが、他の点では同一であるポリペプチド配列を意味する）が本明細書に提供される。別の例において、本明細書に記載の配列のうちのいずれかと約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％同一の一続きの約２０、約３０、約４０、約５０、または約１００個のアミノ酸を含む任意のタンパク質が本発明に従って利用され得る。ある特定の実施形態において、本発明に従って利用されるポリペプチドは、本明細書に提供または参照される配列のうちのいずれかに示される２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の変異を含む。目的とするコードされたポリペプチド
本発明の一次構築物、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡは、ペプチドおよびタンパク質などの目的とするポリペプチドをコードするように設計され得る。
【００８０】
一実施形態において、本発明の一次構築物、核酸、またはｍｍＲＮＡは、参照ポリペプチド配列とある特定の同一性を有する変異形ポリペプチドをコードし得る。本明細書で使用するとき、「参照ポリペプチド配列」は、出発ポリペプチド配列を指す。参照配列は、別の配列の設計において参照される野生型配列または任意の配列であり得る。「参照ポリペプチド配列」は、例えば、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８６２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８６６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８６８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８７０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４９号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ
ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３９号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８７３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６５０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１４７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８７８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ
Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６５４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１５２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８８５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６５８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１５５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８９６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年７月５日出願の米国仮特許出願第６１／６６８，１５７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６６１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１６０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９１１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６６７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１６８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９２２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６７５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１７４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９３５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６８７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１８４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ
Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９４５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６９６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１９１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ
ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年４月２日出願の米国特許出願第６１／６１８，９５３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年８月１０日出願の米国特許出願第６１／６８１，７０４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１２年１２月１４日出願の米国特許出願第６１／７３７，２０３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ
ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｏｅｔｉｄｅｓ」；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００５９号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００７０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」；および２０１３年３月１５日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３１８２１号、表題「Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」に列記されるタンパク質配列のうちのいずれかであり得、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８１】
当技術分野で既知の「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される２個以上のペプチドの配列間の関係を指す。当技術分野において、同一性は、２個以上のアミノ酸残基のストリング間のマッチ数によって決定されるペプチド間の配列関連性の程度も意味する。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって処理されるギャップアライメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列のうちのより小さい配列間の同一のマッチの割合（％）を測定する。関連ペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算され得る。そのような方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ
Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１、およびＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載の方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
いくつかの実施形態において、ポリペプチド変異形は、参照ポリペプチドと同一または同様の活性を有し得る。あるいは、変異形は、参照ポリペプチドと比較して変化（例えば、増加または減少）した活性を有し得る。概して、本発明の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異形は、本明細書に記載され、かつ当業者に既知の配列アライメントプログラムおよびパラメータによって決定されるように、特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異形と少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。そのようなアライメントのツールは、ＢＬＡＳＴプログラム一式を含む（Ｓｔｅｐｈｅｎ
Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ
Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），“Ｇａｐｐｅｄ
ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ
ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂｅｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”，核酸  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。他のツールは、本明細書、具体的には、「同一性」の定義に記載される。
【００８３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムの初期設定パラメータは、例えば、予測閾値１０、ワードサイズ２８、マッチ／ミスマッチスコア１、−２、線形ギャップコストを含む。任意のフィルター、ならびに種特異的繰り返し配列、例えば、ヒト特異的繰り返し配列の選択が適用され得る。
【００８４】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および／またはｍｍＲＮＡを使用して、対象における疾患、障害、および／または状態を治療することができる。
【００８５】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡを使用して、対象における腫瘍成長を減少、排除、または阻害することができる。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡを使用して、対象における少なくとも１つの癌の症状を減少および／または寛解させることができる。癌の症状として、限定されないが、衰弱、痛みおよび疼痛、発熱、疲労、体重減少、血液凝固、血中カルシウム濃度の増加、低白血球数、息切れ、眩暈、頭痛、色素沈着過剰、黄疸、紅斑（ｅｒｔｈｅｍａ）、そう痒症、多毛症、排便習慣の変化、膀胱機能の変化、持続性の痛み、口内の白斑、舌の白点、異常出血または分泌、身体の一部の肥厚または塊、消化不良、嚥下困難、疣贅または黒子の変化、新しい皮膚の変化、および持続性の咳または嗄声を挙げることができる。さらに、ポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡは、ケモブレイン、末梢神経障害、疲労、うつ状態、吐き気、嘔吐、疼痛、貧血、リンパ浮腫、感染症、性機能への副作用、低受精率または不妊、オストミック（ｏｓｔｏｍｉｃｓ）、不眠、および脱毛等の、限定されないが、癌に関連する副作用を減少させることができる。
末端構造修飾：非翻訳領域（ＵＴＲ）
遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが、翻訳されない。５’ＵＴＲが転写開始部位で始まり開始コドンに続くが、開始コドンを含まない一方で、３’ＵＴＲは、終止コドンの直後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子および翻訳の安定性においてＵＴＲが果たす制御的役割についての報告が相次いでいる。ＵＴＲの制御特徴は、本発明核酸または修飾ＲＮＡに組み込まれて、分子の安定性を高め得る。特定の特徴も組み込まれて、万が一それらが望ましくない器官部位に誤指向される場合には転写物の制御された発現低下を確保することができる。ｍＲＮＡを産生することができるか、ならびに／または細胞、組織および／もしくは生物体に送達されて目的とするポリペプチドを産生することができるベクターシステムへ、非翻訳領域を組み込んでもよい。
５’ＵＴＲおよび翻訳開始
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始に関与する特徴を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することで一般に知られているコザック配列のような特徴を有する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、式中、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、この後に別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも知られている。
【００８６】
伸長因子結合に関する５’ＵＴＲ二次構造は、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲにおける他のＲＮＡ結合分子と相互に作用して遺伝子発現を制御することができる。例えば、５’ＵＴＲの二次構造化要素に結合する伸長因子ＥＩＦ４Ａ２はマイクロＲＮＡ媒介抑制に必要である（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｅｉｊｅｒ  ＨＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４０，８２−８５）。５’ＵＴＲにおける異なる二次構造を、特異的な組織または細胞において安定化または選択的に脱安定化されたｍＲＮＡのいずれかに隣接する領域へ組み込むことができる。
【００８７】
特定の標的器官の多量に発現した遺伝子において典型的に見られる特徴を操作することによって、本発明の核酸またはｍＲＮＡの安定性およびタンパク質産生を高めることができる。例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、αフェトタンパク質、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子等の肝臓で発現したｍＲＮＡの５’ＵＴＲ導入を用いて、肝細胞株または肝臓でのｍｍＲＮＡ等の核酸分子の発現を高めることができる。同様に、他の組織特異的ｍＲＮＡからの５’ＵＴＲを用いてその組織での発現を高めることは、筋肉（ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルクリン（Ｈｅｒｃｕｌｉｎ））、内皮細胞（Ｔｉｅ−１、ＣＤ３６）、骨髄細胞（Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ−１、ｉ−ＮＯＳ）、白血球（ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）、および肺上皮細胞（ＳＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）において可能である。
【００８８】
他の非ＵＴＲ配列が、５’ＵＴＲ（または３’ＵＴＲ）に組み込まれ得る。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部は、本発明の核酸またはｍＲＮＡの隣接領域に組み込まれ得る。イントロン配列の組み込みは、タンパク質産生、ならびにｍＲＮＡレベルを増加させ得る。
【００８９】
一実施形態において、ＧＴＸ遺伝子からの少なくとも１つのＩＲＥＳ配列の断片が５’ＵＴＲに含まれていてもよい。非限定的な例として、断片はＧＴＸ遺伝子のＩＲＥＳから１８ヌクレオチド長の配列であってもよい。別の非限定的な例として、ＧＴＸ遺伝子のＩＲＥＳ配列から１８ヌクレオチド長の配列断片は本明細書に記載のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲで縦列反復され得る。１８ヌクレオチド長の配列は５’ＵＴＲにおいて、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または１０回以上反復され得る。
【００９０】
一実施形態において、５’ＵＴＲは、５’ＵＴＲに含まれ得るＧＴＸ遺伝子からのＩＲＥＳ配列の少なくとも５つの１８ヌクレオチド長断片を含んでいてもよい（例えば、表６２に記載の１８ヌクレオチド長の断片を参照のこと）。
【００９１】
ヌクレオチドは、５’（または３’）ＵＴＲから変異、置換、および／または除去することができる。例えば、開始コドンから上流の１つ以上のヌクレオチドは別のヌクレオチドと置換することができる。置換されるヌクレオチド（複数可）は、開始コドンの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、または６０超のヌクレオチド長の上流であり得る。別の例として、開始コドンから上流の１つ以上のヌクレオチドはＵＴＲから除いてもよい。
【００９２】
一実施形態において、開始コドンから上流の少なくとも１つのプリンはピリミジンと置換することができる。置換されるプリンは、開始コドンから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、または６０超のヌクレオチド長の上流であってもよい。非限定的な例として、開始コドンから３ヌクレオチド上流のアデニンをチミンと置換してもよい。別の非限定的な例として、開始コドンから９ヌクレオチド上流のアデニンをチミンと置換してもよい。
【００９３】
一実施形態において、開始コドンから上流の少なくとも１つのヌクレオチドをＵＴＲから除いてもよい。一態様において、開始コドンから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、または６０ヌクレオチド超の上流を本明細書に記載のポリヌクレオチドのＵＴＲから除いてもよい。非限定的な例として、開始コドンから９ヌクレオチド長上流をＵＴＲから除いてもよい（例えば、表６０に記載のＧ−ＣＳＦ  ９ｄｅｌ５’構造を参照のこと）。
５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および翻訳エンハンサー要素（ＴＥＥ）
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲは、少なくとも１つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、翻訳エンハンサー要素（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、翻訳エンハンサー要素（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）（一括して「ＴＥＥ」と称される）を含み得る。非限定的な例として、ＴＥＥは転写プロモーターと開始コドンとの間に位置し得る。５’ＵＴＲに少なくとも１つのＴＥＥを有するポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡは、５’ＵＴＲにキャップを含み得る。さらに、少なくとも１つのＴＥＥは、キャップ依存的またはキャップ非依存的翻訳を起こすポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲに位置していてもよい。
【００９４】
「翻訳エンハンサー要素（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」または「翻訳エンハンサー要素（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ
ｅｌｅｍｅｎｔ）」という用語（本明細書では一括して「ＴＥＥ」と称する）は、ｍＲＮＡから産生されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる配列を指す。
【００９５】
一態様において、ＴＥＥは、例えば、限定されないが、キャップ依存的またはキャップ非依存的翻訳等の核酸の翻訳活性を促進できるＵＴＲの保存要素である。これらの配列の保存は、Ｐａｎｅｋら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３，１−１０；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によりヒトを含む１４の種に渡って以前に示されている。
【００９６】
一実施形態において、ＴＥＥは、実施例４５の表３２に列挙するＴＥＥのいずれかであり得、その部分および／または断片を含む。ＴＥＥ配列は、表３２に開示されるＴＥＥ配列の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは９９％以上を含んでいてもよく、および／またはＴＥＥ配列は、表３２に開示されるＴＥＥ配列の５〜３０ヌクレオチド断片、５〜２５ヌクレオチド断片、５〜２０ヌクレオチド断片、５〜１５ヌクレオチド断片、５〜１０ヌクレオチド断片を含んでいてもよい。
【００９７】
１つの非限定的な例において、既知のＴＥＥはＧｔｘホメオドメインタンパク質の５’リーダー中にあってもよい（Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：９５９０−９５９４，２００４、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００９８】
別の非限定的な例において、ＴＥＥは、米国特許公開第ＵＳ２００９０２２６４７０号の配列番号１〜３５、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１７７５８１号の配列番号１〜３５、国際特許公開第ＷＯ２００９０７５８８６号の配列番号１〜３５、国際特許公開第ＷＯ２０１２００９６４４号の配列番号１〜５および７〜６４５、国際特許公開第ＷＯ１９９９０２４５９５号の配列番号１、米国特許第ＵＳ６３１０１９７号の配列番号１、ならびに米国特許第ＵＳ６８４９４０５号の配列番号１として開示されており、これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９９】
さらに別の非限定的な例において、ＴＥＥは、米国特許第ＵＳ７４６８２７５号、米国特許公開第ＵＳ２００７００４８７７６号、および同第ＵＳ２０１１０１２４１００号、ならびに国際特許公開第ＷＯ２００７０２５００８号および同第ＷＯ２００１０５５３６９号（これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているもの等の配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ＨＣＶ−ＩＲＥＳ、またはＩＲＥＳ要素であってもよいが、これらに限定されない。ＩＲＥＳ要素は、Ｃｈａｐｐｅｌｌら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：９５９０−９５９４，２００４）、およびＺｈｏｕら（ＰＮＡＳ  １０２：６２７３−６２７８，２００５）、ならびに米国特許公開第ＵＳ２００７００４８７７６号、および同第ＵＳ２０１１０１２４１００号、ならびに国際特許公開第ＷＯ２００７０２５００８号（これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のＧｔｘ配列（例えば、Ｇｔｘ９−ｎｔ、Ｇｔｘ８−ｎｔ、Ｇｔｘ７−ｎｔ）を含み得るが、これらに限定されない。
【０１００】
「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド」または「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列」は、本明細書に例示した、および／または当該技術分野において開示された１つ以上の特異的なＴＥＥ（例えば、ＵＳ６３１０１９７、ＵＳ６８４９４０５、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、ＵＳ２００９０２２６４７０、ＵＳ２００７００４８７７６、ＵＳ２０１１０１２４１００、ＵＳ２００９００９３０４９、ＵＳ２０１３０１７７５８１、ＷＯ２００９０７５８８６、ＷＯ２００７０２５００８、ＷＯ２０１２００９６４４、ＷＯ２００１０５５３７１、ＷＯ１９９９０２４５９５、ならびにＥＰ２６１０３４１Ａ１、およびＥＰ２６１０３４０Ａ１を参照のこと。これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を含むポリヌクレオチド、またはそれらの変異形、相同体、もしくは機能性誘導体である。特異的ＴＥＥの１つまたは複数の複製が、ポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡに存在し得る。翻訳エンハンサーポリヌクレオチドにおけるＴＥＥは１つ以上の配列セグメントに組織化することができる。配列セグメントは、本明細書に例証される特定のＴＥＥのうちの１つ以上を内部に有することができ、各ＴＥＥは１つ以上の複製で存在する。複数の配列セグメントが翻訳エンハンサーポリヌクレオチドに存在する場合、これらは相同または非相同であり得る。したがって、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中の複数の配列セグメントは、各配列セグメント内に、本明細書に例証される特異的ＴＥＥの同一の型もしくは異なる型、同じ数もしくは異なる数の特異的ＴＥＥの各々の複製、および／またはＴＥＥの同一のもしくは異なる構成を有することができる。
【０１０１】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡは、国際特許公開第ＷＯ１９９９０２４５９５号、同第ＷＯ２０１２００９６４４号、同第ＷＯ２００９０７５８８６号、同第ＷＯ２００７０２５００８号、同第ＷＯ１９９９０２４５９５号、欧州特許公開第ＥＰ２６１０３４１Ａ１号、および同第ＥＰ２６１０３４０Ａ１号、米国特許第ＵＳ６３１０１９７号、同第ＵＳ６８４９４０５号、同第ＵＳ７４５６２７３号、同第ＵＳ７１８３３９５号、米国特許公開第ＵＳ２００９０２２６４７０号、同第ＵＳ２０１１０１２４１００号、同第ＵＳ２００７００４８７７６号、同第ＵＳ２００９００９３０４９号、および同第ＵＳ２０１３０１７７５８１号（これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の少なくとも１つのＴＥＥを含んでいてもよい。ＴＥＥはポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲに位置し得る。
【０１０２】
別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡは、各々が、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第ＵＳ２００９０２２６４７０号、同第ＵＳ２００７００４８７７６号、同第ＵＳ２０１３０１７７５８１号、および同第ＵＳ２０１１０１２４１００号、国際特許公開第ＷＯ１９９９０２４５９５号、同第ＷＯ２０１２００９６４４号、同第ＷＯ２００９０７５８８６同第、および同第ＷＯ２００７０２５００８号、欧州特許公開第ＥＰ２６１０３４１Ａ１号、および同第ＥＰ２６１０３４０Ａ１号、米国特許第ＵＳ６３１０１９７号、同第ＵＳ６８４９４０５号、同第ＵＳ７４５６２７３号、同第ＵＳ７１８３３９５号に記載のＴＥＥと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つのＴＥＥを含み得る。
【０１０３】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５個、または６０個超のＴＥＥ配列を含み得る。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＴＥＥ配列は、同一または異なるＴＥＥ配列であってもよい。ＴＥＥ配列は、ＡＢＡＢＡＢ、もしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ、もしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、または１回、２回、もしくは３回超反復したそれらの変異形等のパターンであってもよい。これらのパターンにおいて、各文字、Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチド量で異なるＴＥＥ配列を示す。
【０１０４】
一実施形態において、５’ＵＴＲは、２つのＴＥＥ配列を分離するスペーサーを含んでいてもよい。非限定的な例として、スペーサーは、１５ヌクレオチドスペーサー、および／または当該技術分野で既知の他のスペーサーであり得る。別の非限定的な例として、５’ＵＴＲは、５’ＵＴＲにおいて少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、および少なくとも９回、または９回以上反復したＴＥＥ配列スペーサーモジュールを含み得る。
【０１０５】
別の実施形態において、２つのＴＥＥ配列を分けるスペーサーは、本明細書に記載のｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ結合部位およびｍｉＲシード）等の、これらに限定されない本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡの翻訳を調節することができる、当該技術分野で既知の他の配列を含んでいてもよい。非限定的な例として、２つのＴＥＥ配列を分けるために用いられる各スペーサーは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の構成要素（例えば、ｍｉＲシード配列）を含み得る。
【０１０６】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＴＥＥは、米国特許公開第ＵＳ２００９０２２６４７０号、同第ＵＳ２００７００４８７７６号、同第ＵＳ２０１３０１７７５８１号、および同第ＵＳ２０１１０１２４１００号、国際特許公開第ＷＯ１９９９０２４５９５号、同第ＷＯ２０１２００９６４４号、同第ＷＯ２００９０７５８８６号、および同第ＷＯ２００７０２５００８号、欧州特許公開第ＥＰ２６１０３４１Ａ１号、および同第ＥＰ２６１０３４０Ａ１号、米国特許第ＵＳ６３１０１９７号、同第ＵＳ６８４９４０５号、同第ＵＳ７４５６２７３号、同第ＵＳ７１８３３９５号に記載のＴＥＥ配列の、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または９９％以上を含み得る。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＴＥＥは、米国特許公開第ＵＳ２００９０２２６４７０号、同第ＵＳ２００７００４８７７６号、同第ＵＳ２０１３０１７７５８１号、および同第ＵＳ２０１１０１２４１００号、国際特許公開第ＷＯ１９９９０２４５９５号、同第ＷＯ２０１２００９６４４号、同第ＷＯ２００９０７５８８６号、および同第ＷＯ２００７０２５００８号、欧州特許公開第ＥＰ２６１０３４１Ａ１号、および同第ＥＰ２６１０３４０Ａ１号、米国特許第ＵＳ６３１０１９７号、同第ＵＳ６８４９４０５号、同第ＵＳ７４５６２７３号、同第ＵＳ７１８３３９５号（これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のＴＥＥ配列の５〜３０ヌクレオチド断片、５〜２５ヌクレオチド断片、５〜２０ヌクレオチド断片、５〜１５ヌクレオチド断片、５〜１０ヌクレオチド断片を含み得る。
【０１０７】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＴＥＥは、Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：９５９０−９５９４，２００４）およびＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ  １０２：６２７３−６２７８，２００５）によって開示されたＴＥＥ配列、Ｗｅｌｌｅｎｓｉｅｋら（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１３；ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２）によって開示された捕捉表１および捕捉表２に開示されたＴＥＥ配列の、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または９９％以上を含み得る。これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＴＥＥはＣｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：９５９０−９５９４，２００４）、およびＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ  １０２：６２７３−６２７８，２００５）において開示されたＴＥＥ配列、Ｗｅｌｌｅｎｓｉｅｋら（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１３；ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２）によって開示された捕捉表１および捕捉表２に開示されたＴＥＥ配列の、５〜３０ヌクレオチド断片、５〜２５ヌクレオチド断片、５〜２０ヌクレオチド断片、５〜１５ヌクレオチド断片、５〜１０ヌクレオチド断片を含み得る。これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおいて使用されるＴＥＥは、米国特許第ＵＳ７４６８２７５号、および国際特許公開第ＷＯ２００１０５５３６９号（これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるもの等のＩＲＥＳ配列であるが、これらに限定されない。
【０１０９】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおいて使用されるＴＥＥは、米国特許公開第ＵＳ２００７００４８７７６号、および同第ＵＳ２０１１０１２４１００号、ならびに国際特許公開第ＷＯ２００７０２５００８号、および同第ＷＯ２０１２００９６４４号（これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法で特定することができる。
【０１１０】
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおいて使用されるＴＥＥは、米国特許第ＵＳ７４５６２７３号、および同第ＵＳ７１８３３９５号、米国特許公開第ＵＳ２００９００９３０４９号、ならびに国際公開第ＷＯ２００１０５５３７１号（これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の転写制御因子であってもよい。転写制御因子は、限定されないが、米国特許第ＵＳ７４５６２７３号、および同第ＵＳ７１８３３９５号、米国特許公開第ＵＳ２００９００９３０４９号、ならびに国際公開第ＷＯ２００１０５５３７１号（これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法等の、当該技術分野において既知の方法によって特定することができる。
【０１１１】
さらに別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおいて使用されるＴＥＥは、米国特許第ＵＳ７４５６２７３号、および同第ＵＳ７１８３３９５号、米国特許公開第ＵＳ２００９００９３０４９号、ならびに国際公開第ＷＯ２００１０５５３７１号（これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるようなオリゴヌクレオチドまたはその部分である。
【０１１２】
本発明に記載の少なくとも１つのＴＥＥを含む５’ＵＴＲは、限定されないが、ベクター系または核酸ベクター等のモノシストロニク配列中に組み込まれていてもよい。非限定的な例として、ベクター系および核酸ベクターは、米国特許第７４５６２７３号、および同第ＵＳ７１８３３９５号、米国特許公開第ＵＳ２００７００４８７７６号、同第ＵＳ２００９００９３０４９号、および同第ＵＳ２０１１０１２４１００号、ならびに国際特許公開第ＷＯ２００７０２５００８号、および同第ＷＯ２００１０５５３７１号（これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるものを含んでいてもよい。
【０１１３】
一実施形態において、本明細書に記載のＴＥＥは、ポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲに位置し得る。３’ＵＴＲに位置するＴＥＥは、５’ＵＴＲに位置するＴＥＥと、および／または５’ＵＴＲへの組み込みについて記載されたＴＥＥと、同一であるかおよび／または異なっていてもよい。
【０１１４】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５個、または６０個超のＴＥＥ配列を含み得る。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおけるＴＥＥ配列は、同一または異なるＴＥＥ配列であってもよい。ＴＥＥ配列は、ＡＢＡＢＡＢ、もしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ、もしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、または１回、２回、もしくは３回以上反復したそれらの変異形等のパターンであってもよい。これらのパターンにおいて、各文字、Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドのレベルでで異なるＴＥＥ配列を示す。
【０１１５】
一実施形態において、３’ＵＴＲは２つのＴＥＥ配列を分離するスペーサーを含んでいてもよい。非限定的な例として、スペーサーは、１５ヌクレオチドスペーサー、および／または当該技術分野で既知の他のスペーサーであり得る。別の非限定的な例として、３’ＵＴＲは、３’ＵＴＲにおいて少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、および少なくとも９回、または９回以上反復したＴＥＥ配列スペーサーモジュールを含み得る。
【０１１６】
別の実施形態において、２つのＴＥＥ配列を分けるスペーサーは、本明細書に記載のｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ結合部位およびｍｉＲシード）等の、これらに限定されない本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および／またはｍｍＲＮＡの翻訳を調節することができる、当該技術分野で既知の他の配列を含んでいてもよい。非限定的な例として、２つのＴＥＥ配列を分けるために用いられる各スペーサーは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の構成要素（例えば、ｍｉＲシード配列）を含み得る。
【０１１７】
一実施形態において、ｍｉＲ配列および／またはＴＥＥ配列の取り込みは、ステムループ領域の形を変化させ、それは翻訳を増加および／または減少させ得る。（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｅｄｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｐｕｍｉｌｉｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  ｐ２７−３’ＵＴＲ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｍｉＲ−２２１  ａｎｄ  ｍｉＲ−２２  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０を参照のこと）。
非相同５’ＵＴＲ
５’ＵＴＲは、本発明の修飾核酸（ｍＲＮＡ）、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸に隣接する領域として提供され得る。５’ＵＴＲは、本発明の修飾核酸（ｍＲＮＡ）、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸中に見出されるコード領域と、相同または非相同であり得る。複数の５’ＵＴＲが隣接する領域に含まれていてもよく、同じ配列または異なる配列であってもよい。何も含まない場合も含め、隣接する領域の任意の部分はコドン最適化されていてもよく、いずれも１つ以上の異なる構造的または化学的修飾を、コドン最適化の前および／または後に、独立して含有することができる。
【０１１８】
２０１３年３月９日出願の米国仮出願第６１／７７５，５０９号、表題「Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍＲＮＡ」の長い表２１、ならびに２０１３年５月３１日出願の米国仮出願第６１／８２９，３７２号、表題「Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍＲＮＡ」（これら各々の内容が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の長い表２１および表２２には、、本発明の修飾核酸（ｍＲＮＡ）、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の開始部位および終始部位の一覧が示される。表２１において、各５’ＵＴＲ（５’ＵＴＲ−００５から５’ＵＴＲ６８５１１）は、それらの天然または野生型（相同）転写物に対するそれらの開始部位および終始部位によって特定される（ＥＮＳＴ；ＥＮＳＥＭＢＬデータベースにて用いられる識別名）。
【０１１９】
本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸と共に用いられ得るさらなる５’ＵＴＲは、本開示の表６、表３８、および表４１において示される。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの１つ以上の性質を変化させるために、本発明の修飾核酸（ｍＲＮＡ）、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸のコード領域に非相同である５’ＵＴＲを、本発明の化合物中に操作する。その後、修飾核酸（ｍＲＮＡ）、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を、細胞、組織、または生物体に投与し、タンパク質レベル、局在性、および／または半減期等の結果を測定して、非相同５’ＵＴＲが本発明の修飾核酸（ｍＲＮＡ）、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸に有し得る有益な効果を評価する。Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧを含む１つ以上のヌクレオチドが終端に添加されるかまたは除去される、５’ＵＴＲの変異形が有用であり得る。５’ＵＴＲはまた、コドン最適化されていても、または本明細書に記載されるいずれかの方法で修飾されていてもよい。
マイクロＲＮＡ結合部位の組み込み
一実施形態において、本発明の修飾核酸（ｍＲＮＡ）、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸はポリペプチドをコードするだけでなく、センサー配列もまたコードする。センサー配列として、例えば、マイクロＲＮＡ結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列、および／またはモチーフ、内因性核酸結合分子に対する偽性受容体として働くように操作された人工的な結合部位が挙げられる。少なくとも１つのセンサー配列を含むポリヌクレオチドの非限定的な例は、同時係属および共同所有の、２０１３年１月１７日出願の米国仮特許出願第ＵＳ  ６１／７５３，６６１号、表題「Ｓｉｇｎａｌ−Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、２０１３年１月１８日出願の米国仮特許出願第ＵＳ  ６１／７５４，１５９号、表題「Ｓｉｇｎａｌ−Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ、２０１３年３月１４日出願の米国仮特許出願第ＵＳ６１／７８１，０９７号、表題「Ｓｉｇｎａｌ−Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、２０１３年５月３１日出願の米国仮特許出願第ＵＳ  ６１／８２９，３３４、表題「Ｓｉｇｎａｌ−Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、２０１３年６月２７日出願の米国仮特許出願第ＵＳ  ６１／８３９，８９３号、表題「Ｓｉｇｎａｌ−Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、２０１３年７月３日出願の米国仮特許出願第ＵＳ  ６１／８４２，７３３号、表題「Ｓｉｇｎａｌ−Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ」、および２０１３年７月２３日出願の米国仮特許出願第ＵＳ  ６１／８５７，３０４号、表題「Ｓｉｇｎｌａ−Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ」に記載されており、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
一実施形態において、標的細胞または組織のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）プロファイリングを実施し、細胞または組織中におけるｍｉＲＮＡの存在または非存在を決定する。
マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、かつ核酸分子安定性を低下させるか、または翻訳を阻害するかのいずれかによって遺伝子発現を下方制御する１９〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。本発明の修飾核酸（ｍＲＮＡ）、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、またはマイクロＲＮＡ種を含み得る。そのような配列は、米国特許公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号および米国特許公開第ＵＳ２００５／００５９００５号(これらの内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる)に教示されるもの等の任意の既知のマイクロＲＮＡに対応し得る。非限定的な実施形態として、ヒトゲノムにおける既知のマイクロＲＮＡ、それらの配列、およびシード配列を、以下の表１１に列挙する。
【０１２１】
マイクロＲＮＡ配列は、「種」領域、すなわち、成熟マイクロＲＮＡの２〜８位の領域における配列を含み、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対して完全なワトソン・クリック相補性を有する。マイクロＲＮＡ種は、成熟マイクロＲＮＡの２〜８位または２〜７位を含み得る。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ種は、７個のヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜８位）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるこの種相補的部位は、マイクロＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）に隣接する。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ種は、６個のヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜７位）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的における種相補的部位は、マイクロＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）に隣接する。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ  Ａ，Ｆａｒｈ  ＫＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ  Ｐ，Ｌｉｍ  ＬＰ，Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ；Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００７  Ｊｕｌ  ６；２７（１）：９１−１０５を参照されたい。マイクロＲＮＡ種の塩基は、標的配列と完全な相補性を有する。マイクロＲＮＡ標的配列を操作して、本発明の核酸またはｍＲＮＡの３’ＵＴＲに入れることによって、分解または翻訳減少のためにこの分子を標的化することができるが、但し、対象となるマイクロＲＮＡが利用可能であることを条件とする。このプロセスは、核酸分子送達時のオフターゲット効果の危険を低下させる。マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ標的領域、およびそれらの発現パターンの特定、ならびに生物学におけるそれらの役割が報告されている（それぞれ、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｏｎａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２０１０  １１：９４３−９４９、Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ
Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ａｎｄ  Ｒａｏ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０１２  ２６：４０４−４１３（２０１１  Ｄｅｃ  ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）、Ｂａｒｔｅｌ  Ｃｅｌｌ  ２００９  １３６：２１５−２３３、Ｌａｎｄｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００７  １２９：１４０１−１４１４、Ｇｅｎｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ
Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２  ８０：３９３−４０３、ならびにこれらに記載の全ての参考文献）。
【０１２２】
例えば、ｍＲＮＡが肝臓に送達されることが意図されないが、そこで落ち着く場合、肝臓中に豊富なマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１２２が、ｍｉＲ−１２２の１つまたは複数の標的部位が操作されて、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の３’ＵＴＲに入れられると、目的とする遺伝子の発現を阻害することができる。異なるマイクロＲＮＡの１つまたは複数の結合部位の導入を操作して、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の長寿命、安定性、およびタンパク質翻訳をさらに減少させることができる。本明細書で使用するとき、「マイクロＲＮＡ部位」という用語は、マイクロＲＮＡ標的部位もしくはマイクロＲＮＡ認識部位、またはマイクロＲＮＡが結合もしくは会合する任意のヌクレオチド配列を指す。「結合」は、従来のワトソン・クリックハイブリダイゼーション規則に従い得るか、あるいはマイクロＲＮＡ部位に、またはマイクロＲＮＡ部位に隣接して標的配列を有するマイクロＲＮＡの任意の安定した会合を示し得ることを理解されたい。
【０１２３】
逆に、本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の目的のために、特定の組織でのタンパク質発現を増加させるために自然に生じるマイクロＲＮＡ結合部位を操作して配列から出す（すなわち、配列から除去する）ことができる。例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位が除去されて、肝臓でのタンパク質発現を改善することができる。
【０１２４】
一実施形態において、本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、正常細胞および／または癌細胞（例えば、ＨＥＰ３ＢもしくはＳＮＵ４４９）といった、限定されないが、特定の細胞に対する細胞傷害性または細胞保護的なｍＲＮＡ治療薬を目的とするために、３’ＵＴＲにおける少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含んでいてもよい。
【０１２５】
別の実施形態において、本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、正常細胞および／または癌細胞（例えば、ＨＥＰ３ＢもしくはＳＮＵ４４９）といった、限定されないが、特異的な細胞に対する細胞傷害性または細胞保護的なｍＲＮＡ治療薬を目的とするために、３’ＵＴＲにおける３つのｍｉＲＮＡ結合部位を含んでいてもよい。
【０１２６】
複数の組織での発現の制御は、１つまたはいくつかのマイクロＲＮＡ結合部位の導入または除去によって達成され得る。以下の表１２に、異なる組織および細胞にて差次的に発現し、多くの場合、異なる型の疾患（例えば、癌細胞）と関連するマイクロＲＮＡを示す。マイクロＲＮＡ結合部位、または任意の組み合わせの除去または挿入の決定は、疾患におけるマイクロＲＮＡ発現パターンおよびそれらのプロファイリングに応じる。
【０１２７】
マイクロＲＮＡがｍＲＮＡを制御し、その結果タンパク質発現を制御することで知られている組織の例には、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）、および肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
特に、マイクロＲＮＡは、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）、マクロファージ、単核球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞等の免疫細胞（造血細胞とも称される）中において差次敵に発現することが知られている。免疫細胞特異的マイクロＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染症に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子治療、および組織／臓器移植後の望まれない免疫応答に関係する。免疫細胞特異的マイクロＲＮＡはまた、造血細胞（免疫細胞）の発生、増殖、分化、およびアポトーシスの多くの側面を調節する。例えば、ｍｉＲ−１４２およびｍｉＲ−１４６は免疫細胞中で、特に骨髄樹状細胞中で大量に排他的に発現する。ｍｉＲ−１４２結合部位を送達された遺伝子構築物の３’ＵＴＲへ加え、組織および細胞におけるより安定した遺伝子導入を可能にすることで、外因性核酸分子に対する免疫応答が遮断されたことが当該技術分野において示された。ｍｉＲ−１４２は効率的に抗原提示細胞中の外因性ｍＲＮＡを分解し、形質導入された細胞の細胞傷害性除去を抑制する（これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｎｎｏｎｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，５１５２−５１６１；Ｂｒｏｗｎ  ＢＤ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  ｍｅｄ．２００６，１２（５），５８５−５９１；Ｂｒｏｗｎ  ＢＤ，ｅｔ  ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００７，１１０（１３）：４１４４−４１５２）。
【０１２９】
抗原介在性免疫応答は、生物体の進入時に、抗原提示細胞によって処理され、抗原提示細胞の表面に示される外来抗原によって引き起こされる免疫応答を指すことができる。Ｔ細胞は示された抗原を認識することができ、抗原を発現する細胞の細胞傷害性除去を誘導することができる。
【０１３０】
ｍｉＲ−１４２結合部位を本発明のポリペプチドの３’ＵＴＲへ導入することで、ｍｉＲ−１４２媒介ｍＲＮＡ分解を介した抗原提示細胞における遺伝子発現を選択的に抑制することができ、ＡＰＣ（例えば、樹状細胞）における抗原提示を制限し、それによりポリヌクレオチドの送達後の抗原介在性免疫応答を防ぐことができる。したがって、ポリヌクレオチドは、細胞傷害性除去を引き起こすことなく標的組織または細胞において安定に発現する。
【０１３１】
一実施形態において、免疫細胞で、特に抗原提示細胞で発現することが知られているマイクロＲＮＡ結合部位をポリヌクレオチド中に操作して、マイクロＲＮＡ媒介ＲＮＡ分解、抗原介在性免疫応答の抑制を介したＡＰＣにおけるセンサーシグナルポリヌクレオチドの発現を抑制することができる一方で、ポリヌクレオチドの発現は免疫細胞特異的マイクロＲＮＡが発現しない非免疫細胞中に維持される。例えば、肝特異タンパク質発現によって引き起こされる免疫応答を防止するために、ｍｉＲ−１２２結合部位を取り除くことができ、ｍｉＲ−１４２（および／またはｍｉｒＲ−１４６）結合部位はポリヌクレオチドの３−ＵＴＲ中に操作して含めることができる。
【０１３２】
ＡＰＣおよびマクロファージ中のｍＲＮＡの選択的分解および抑制をさらに推進するために、ポリヌクレオチドは、３−ＵＴＲにおいて別の陰性調節因子を、単独でまたはｍｉｒ−１４２および／もしくはｍｉｒ−１４６結合部位と組み合わせてのいずれかで含むことができる。非限定的な例として、ある１つの調節因子は恒常的崩壊因子（ＣＤＥ）である。
【０１３３】
免疫細胞特異的マイクロＲＮＡとして、限定されないが、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｈｓａ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１１８４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−１−−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２−−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２７９、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４７ａ、ｍｉＲ−１４７ｂ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ｂ、ｍｉＲ−１５５−３ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１６−１−３ｐ、ｍｉＲ−１６−２−３ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１９７−３ｐ、ｍｉＲ−１９７−５ｐ、  ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−２２３−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ，ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−１−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ，ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−２９０９、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ，、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３３１−５ｐ、ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｍｉＲ−３３９−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−３ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７７−３ｐ、ｍｉＲ−３７７−５ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、ｍｉＲ−５４２、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｊ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｍｉＲ−５９８、ｍｉＲ−７１８、ｍｉＲ−９３５、ｍｉＲ−９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、およびｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが挙げられる���免疫細胞の特異型に濃縮されたマイクロＲＮＡを、表１３に列挙する。さらに、新規のマイクロＲＮＡ（ｍｉｒｏＲＮＡ）マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびミクロトーム分析によって当該技術分野において免疫細胞中で発見されている（各々の内容が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｉｍａ  ＤＤ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：ｅ１１８−ｅ１２７；Ｖａｚ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，１１，２８８）。
【０１３４】
肝臓で発現すること知られているマイクロＲＮＡとして、限定されないが、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｍｉＲ−１２２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２２８−５ｐ、ｍｉＲ−１２４９、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１３０３、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−５５７、ｍｉＲ−５８１、ｍｉＲ−９３９−３ｐ、ｍｉＲ−９３９−５ｐが挙げられる。任意の肝臓特異的マイクロＲＮＡからのマイクロＲＮＡ結合部位をポリヌクレオチドに導入するか、またはポリヌクレオチドから取り除き、肝臓のポリヌクレオチドの発現を調節することができる。肝臓のタンパク質発現に対する免疫応答を防ぐために、肝臓特異的マイクロＲＮＡ結合部位を単独で、または免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）マイクロＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
【０１３５】
肺で発現すること知られているマイクロＲＮＡとして、限定されないが、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３２−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−５ｐ、ｍｉＲ−３８１−３ｐ、ｍｉＲ−３８１−５ｐが挙げられる。任意の肺特異的マイクロＲＮＡからのマイクロＲＮＡ結合部位をポリヌクレオチドに導入するか、またはポリヌクレオチドから取り除き、肺のポリヌクレオチドの発現を調節することができる。肺のタンパク質発現に対する免疫応答を防ぐために、肺特異的マイクロＲＮＡ結合部位を単独で、または免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）マイクロＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
【０１３６】
心臓で発現すること知られているマイクロＲＮＡとして、限定されないが、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１８６−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７４４−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、およびｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが挙げられる。任意の心臓特異的マイクロＲＮＡからのマイクロＲＮＡ結合部位をポリヌクレオチドに導入するか、またはポリヌクレオチドから取り除き、心臓のポリヌクレオチドの発現を調節することができる。心臓のタンパク質発現に対する免疫応答を防ぐために、心臓特異的マイクロＲＮＡ結合部位を単独で、または免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）マイクロＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
【０１３７】
神経系で発現すること知られているマイクロＲＮＡとして、限定されないが、ｍｉＲ−１２４−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ，ｍｉＲ−１２７１−３ｐ、ｍｉＲ−１２７１−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１８１ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ａ、ｍｉＲ−１９０ｂ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ，ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ−３６６６、ｍｉＲ−３８０−３ｐ、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４２５−３ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｍｉＲ−４５４−５ｐ、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−５１０、ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５７１、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−８０２、ｍｉＲ−９２２、ｍｉＲ−９−３ｐ、およびｍｉＲ−９−５ｐが挙げられる。神経系に豊富なマイクロＲＮＡとして、限定されないが、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−３２０ｅ、ｍｉＲ−３２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−９２２を含む神経細胞で特異的に発現するもの、および限定されないが、ｍｉＲ−１２５０、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０６５−３ｐ、ｍｉＲ−３０６５−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｍｉＲ−６５７を含むグリア細胞で特異的に発現するものがさらに挙げられる。任意のＣＮＳ特異的マイクロＲＮＡからのマイクロＲＮＡ結合部位をポリヌクレオチドに導入するか、またはポリヌクレオチドから取り除き、神経系のポリヌクレオチドの発現を調節することができる。神経系のタンパク質発現に対する免疫応答を防ぐために、神経系特異的マイクロＲＮＡ結合部位を単独で、または免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）マイクロＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
【０１３８】
膵臓で発現すること知られているマイクロＲＮＡとして、限定されないが、ｍｉＲ−１０５−３ｐ、ｍｉＲ−１０５−５ｐ、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１９５−３ｐ、ｍｉＲ−１９５−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、およびｍｉＲ−９４４が挙げられる。任意の膵臓特異的マイクロＲＮＡからのマイクロＲＮＡ結合部位をポリヌクレオチドに導入するか、またはポリヌクレオチドから取り除き、膵臓のポリヌクレオチドの発現を調節することができる。膵臓のタンパク質発現に対する免疫応答を防ぐために、膵臓特異的マイクロＲＮＡ結合部位を単独で、または免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）マイクロＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
【０１３９】
腎臓で発現すること知られているマイクロＲＮＡとして、限定されないが、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、およびｍｉＲ−５６２が挙げられる。任意の腎臓特異的マイクロＲＮＡからのマイクロＲＮＡ結合部位をポリヌクレオチドに導入するか、またはポリヌクレオチドから取り除き、腎臓のポリヌクレオチドの発現を調節することができる。腎臓のタンパク質発現に対する免疫応答を防ぐために、腎臓特異的マイクロＲＮＡ結合部位を単独で、または免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）マイクロＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
【０１４０】
肺で発現すること知られているマイクロＲＮＡとして、限定されないが、ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２８６、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２５−３ｐ、およびｍｉＲ−２５−５ｐが挙げられる。任意の筋肉特異的マイクロＲＮＡからのマイクロＲＮＡ結合部位をポリヌクレオチドに導入するか、またはポリヌクレオチドから取り除き、筋肉のポリヌクレオチドの発現を調節することができる。筋肉のタンパク質発現に対する免疫応答を防ぐために、筋肉特異的マイクロＲＮＡ結合部位を単独で、または免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）マイクロＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
【０１４１】
マイクロＲＮＡは、内皮細胞、上皮細胞、および脂肪細胞等の細胞の異なる型で差次的に発現される。例えば、内皮細胞で発現されるマイクロＲＮＡとして、限定されないが、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１００−３ｐ、ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｍｉＲ−１０１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２３６−３ｐ、ｍｉＲ−１２３６−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−２２２−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３６１−３ｐ、ｍｉＲ−３６１−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２４−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−１−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−２−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、およびｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが挙げられる。多くの新規マイクロＲＮＡが、大規模シークエンシング分析からの内皮細胞にて発見されている（各々の内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｖｏｅｌｌｅｎｋｌｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，２０１２，１８，４７２−４８４）。任意の内皮細胞特異的マイクロＲＮＡからのマイクロＲＮＡ結合部位を、ポリヌクレオチドに導入するか、またはポリヌクレオチドから取り除き、様々な状態における内皮細胞にてポリヌクレオチドの発現を調節することができる。
【０１４２】
さらなる例として、上皮細胞で発現するマイクロＲＮＡとして、限定されないが、呼吸器線毛上皮細胞に特異的な、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−８０２、およびｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−４４９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４４９ｂ−５ｐ；肺上皮細胞に特異的な、ｌｅｔ−７ファミリー、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１２６；腎臓上皮細胞に特異的な、ｍｉＲ−３８２−３ｐ、ｍｉＲ−３８２−５ｐ、ならびに角膜上皮細胞に特異的なｍｉＲ−７６２が挙げられる。任意の上皮細胞特異的マイクロＲＮＡからのマイクロＲＮＡ結合部位を、ポリヌクレオチドに導入するか、またはポリヌクレオチドから取り除き、様々な状態における上皮細胞にてポリヌクレオチドの発現を調節することができる。
【０１４３】
そのうえ、マイクロＲＮＡの大集団は胚性幹細胞に濃縮され、幹細胞の自己複製、ならびに神経系細胞、心臓細胞、造血細胞、皮膚細胞、骨形成原細胞、および筋細胞等の、様々な細胞系譜の発生および／または分化を制御する（Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ  ＫＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２０１３，１３（５），７５７−７６４；Ｖｉｄｉｇａｌ  ＪＡ  ａｎｄ  Ｖｅｎｔｕｒａ  Ａ，Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．２０１２，２２（５−６），４２８−４３６；Ｇｏｆｆ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２；Ｍｏｒｉｎ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０−６２１；Ｙｏｏ  ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２０１２，２１（１１），２０４９−２０５７、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。胚性幹細胞に豊富なマイクロＲＮＡとして、限定されないが、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ７ｄ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−１３８−１−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−２−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−１５４−３ｐ、ｍｉＲ−１５４−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２９０、ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｅ、ｍｉＲ−３６７−３ｐ、ｍｉＲ−３６７−５ｐ、ｍｉＲ−３６９−３ｐ、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｅ、ｍｉＲ−５４８ｆ、ｍｉＲ−５４８ｇ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｋ、ｍｉＲ−５４８ｌ、ｍｉＲ−５４８ｍ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５４８ｏ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｏ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７６６−３ｐ、ｍｉＲ−７６６−５ｐ、ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｍｉＲ−９３−３ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−９６−３ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、およびｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが挙げられる。多くの予想された新規マイクロＲＮＡは、ヒト胚性幹細胞において大規模によって発見されている（Ｍｏｒｉｎ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０−６２１；Ｇｏｆｆ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２；Ｂａｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，２００８，２６，２４９６−２５０５、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１４４】
一実施形態において、胚性幹細胞特異的マイクロＲＮＡの結合部位をポリヌクレオチドの３−ＵＴＲに含むかまたはそこから取り除いて、胚性幹細胞の発生および／または分化の調節、変性状態における幹細胞の老化（例えば、変性疾患）の阻害、または疾患状態における幹細胞の老化およびアポトーシスの刺激（例えば、癌幹細胞）を行うことができる。
【０１４５】
様々な癌細胞／組織および他の疾患におけるマイクロＲＮＡの差次的な発現をプロファイルするために、多くのマイクロＲＮＡ発現研究が行われている。いくつかのマイクロＲＮＡはある特定の癌細胞にて異常に過剰発現し、その他は低発現する。例えば、マイクロＲＮＡは、癌細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＵＳ２０１３／００５９０１５、ＵＳ２０１３／００４２３３３、ＷＯ２０１１／１５７２９４）；癌幹細胞（ＵＳ２０１２／００５３２２４）；膵癌および疾患（ＵＳ２００９／０１３１３４８、ＵＳ２０１１／０１７１６４６、ＵＳ２０１０／０２８６２３２、ＵＳ８３８９２１０）；喘息および炎症（ＵＳ８４１５０９６）；前立腺癌（ＵＳ２０１３／００５３２６４）；肝細胞癌（ＷＯ２０１２／１５１２１２、ＵＳ２０１２／０３２９６７２、ＷＯ２００８／０５４８２８、ＵＳ８２５２５３８）；肺癌細胞（ＷＯ２０１１／０７６１４３、ＷＯ２０１３／０３３６４０、ＷＯ２００９／０７０６５３、ＵＳ２０１０／０３２３３５７）；皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＷＯ２０１３／０１１３７８）；結腸直腸癌細胞（ＷＯ２０１１／０２８１７５６、ＷＯ２０１１／０７６１４２）；癌陽性リンパ節（ｃａｎｃｅｒ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｌｙｍｐｈｏ  ｎｏｄｅｓ）（ＷＯ２００９／１００４３０、ＵＳ２００９／０２６３８０３）；上咽頭癌（ＥＰ２１１２２３５）；慢性閉塞性肺疾患（ＵＳ２０１２／０２６４６２６、ＵＳ２０１３／００５３２６３）；甲状腺癌（ＷＯ２０１３／０６６６７８）；卵巣癌細胞（ＵＳ２０１２／０３０９６４５、ＷＯ２０１１／０９５６２３）；乳癌細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＷＯ２００７／０８１７４０、ＵＳ２０１２／０２１４６９９）、白血病およびリンパ腫（ＷＯ２００８／０７３９１５、ＵＳ２００９／００９２９７４、ＵＳ２０１２／０３１６０８１、ＵＳ２０１２／０２８３３１０、ＷＯ２０１０／０１８５６３にて差次的に発現し、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１４６】
非限定的な例として、ある特定の癌および／または腫瘍細胞において過剰発現するマイクロＲＮＡ部位は、目的とするポリペプチドをコードし、癌細胞における過剰発現マイクロＲＮＡによって抑制された発現を修復するポリヌクレオチドの３−ＵＴＲから除去することができ、したがって対応する生物学的機能、例えば、転写刺激および／または抑制、細胞周期停止、アポトーシス、および細胞死を寛解させることができる。マイクロＲＮＡ発現が情報制御されていない正常細胞および組織は影響されないままとなる。
【０１４７】
マイクロＲＮＡはまた、血管新生等の複合体の生物学的作用（ｍｉＲ−１３２）を制御することができる（Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６）。本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸において、そのような作用に関係するマイクロＲＮＡに対する結合部位を、生物額的に関連する細胞型または生物学的に関連する作用の構成に、修飾核酸の発現、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸発現を合わせるために、除去または導入することができる。この文脈において、ｍＲＮＡは栄養要求性ｍＲＮＡと定義される。
【０１４８】
マイクロＲＮＡ遺伝子制御は、周辺配列の種、配列の型（例えば、非相同、相同、および人工）、周辺配列における調節因子、および／または周辺配列における構造要素といった、これらに限定されない、マイクロＲＮＡの周囲の配列に影響され得る。マイクロＲＮＡは５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲに影響され得る。非限定的な例として、非ヒト３’ＵＴＲは目的とするポリペプチドの発現におけるマイクロＲＮＡ配列の調節作用を、同じ配列型のヒト３’ＵＴＲと比較して増加させることができる。
【０１４９】
一実施形態において、５’−ＵＴＲの他の調節因子および／または構造要素はマイクロＲＮＡ媒介遺伝子制御に影響することができる。調節因子および／または構造要素の一例は５’ＵＴＲにおける構造化ＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）であり、ペプチド鎖成長因子の結合がタンパク質翻訳を開始するのに必要である。この５’ＵＴＲにおける二次構造化要素に結合するＥＩＦ４Ａ２は、マイクロＲＮＡ媒介遺伝子発現に必要である（Ｍｅｉｊｅｒ  ＨＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４０，８２−８５、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。マイクロＲＮＡ媒介遺伝子制御をエンハンスするために、この構造化５’−ＵＴＲを含むように本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸をさらに修飾することができる。
【０１５０】
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ部位は本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の３’ＵＴＲ中に操作することができる。この文脈において、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個以上のマイクロＲＮＡ部位を、本発明のリボ核酸の３’ＵＴＲ中に操作してもよい。一実施形態において、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸中に組み込まれたマイクロＲＮＡ部位は、同一であっても、または異なるマイクロＲＮＡ部位であってもよい。別の実施形態において、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸に組み込まれたマイクロＲＮＡ部位は体内の同じまたは異なる組織を標的としてもよい。非限定的な例として、修飾核酸ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおける組織特異的、細胞型特異的、または疾患特異的マイクロＲＮＡ結合部位の導入を介して、特定の細胞型（例えば、肝細胞、骨髄系細胞、内皮細胞、癌細胞等）の発現度を減少させることができる。
【０１５１】
一実施形態において、マイクロＲＮＡ部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端とのおよそ中間、および／または３’ＵＴＲの３’末端付近を操作することができる。非限定的な例として、マイクロＲＮＡ部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近、および３’ＵＴＲの５’末端と３’末端とのおよそ中間を操作してもよい。別の非限定的な例として、マイクロＲＮＡ部位は、３’ＵＴＲの３’末端付近、および３’ＵＴＲの５’末端と３’末端とのおよそ中間を操作してもよい。さらに別の非限定的な例として、マイクロＲＮＡ部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近、および３’ＵＴＲの３’末端付近を操作してもよい。
【０１５２】
別の実施形態において、３’ＵＴＲは４つのマイクロＲＮＡ部位を含むことができる。マイクロＲＮＡ部位は、完全マイクロＲＮＡ結合部位、マイクロＲＮＡシード配列、および／またはシード配列を有しないマイクロＲＮＡ結合部位配列であってもよい。
【０１５３】
一実施形態において、抗原提示細胞によって抗原提示を減衰させるために、少なくとも１つのマイクロＲＮＡを含むように本発明の核酸を操作してもよい。マイクロＲＮＡは、完全マイクロＲＮＡ配列、マイクロＲＮＡシード配列、シードを有しないマイクロＲＮＡ配列、またはこれらの組み合わせであり得る。非限定的な例として、核酸に組み込まれたマイクロＲＮＡは造血系に特異的であり得る。別の非限定的な例として、抗原提示を減衰させるために本発明の核酸に組み込まれたマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐである。
【０１５４】
一実施形態において、対象の異なる組織において発現するマイクロＲＮＡ部位を含むように、核酸を操作してもよい。非限定的な例として、対象の肝臓および腎臓において修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の発現を制御するｍｉＲ−１９２およびｍｉＲ−１２２を含むように、本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を操作してもよい。別の実施形態において、同一の組織について２つ以上のマイクロＲＮＡ部位を含むように、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を操作してもよい。例えば、対象の内皮細胞において修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡまたはリボ核酸の発現を制御するｍｉＲ−１７−９２およびｍｉＲ−１２６を含むように、本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を操作してもよい。
【０１５５】
一実施形態において、本発明のシグナルをコードする修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸（本明細書においてポリヌクレオチドとも称される）によってコードされた標的ポリペプチドと関連する治療濃度域および／または発現差異は、変化し得る。例えば、ポリヌクレオチドが設計されてもよく、それにより死のシグナルが、それらの細胞のｍｉＲＮＡ特徴によって癌細胞（または正常細胞における生存シグナル）でより高く発現される。癌細胞が低レベルの特定のｍｉＲＮＡを発現する場合、そのｍｉＲＮＡ（または複数のｍｉＲＮＡｓ）について結合部位をコードするポリヌクレオチドはより高く発現される。したがって、ポリヌクレオチドによってコードされた標的ポリペプチドが、細胞死を引き起こすか、または誘導するタンパク質として選択される。３’ＵＴＲでコードされた結合部位または「センサー」と結合するｍｉＲＮＡの影響のためにポリヌクレオチドが低レベルで発現する際、非癌細胞と隣接して同じｍｉＲＮＡの高い発現を有することはコードされた死のシグナルによって影響されることがより少ない。反対に、細胞生存または細胞保護的シグナルが、ｍｉＲＮＡが癌細胞にてより高い発現を有する癌細胞および非癌細胞を含有する組織に伝達され得る。すなわち、この結果は癌細胞のより低い生存シグナルおよび正常細胞のより大きな生存特徴である。以前のパラダイムに従って異なるシグナルを有する複数のポリヌクレオチドをデザインして投与することができる。
【０１５６】
一実施形態において、核酸の発現を、核酸における少なくとも１つのセンサー配列の取り込み、および核酸の処方によって調節してもよい。非限定的な例として、核酸は、ｍｉＲ−１２２結合部位を組み込まれた核酸を有することで生所性の腫瘍へ標的化され、陽イオン性脂質ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡを含む脂質ナノ粒子で処方され得る（例えば、実施例４９Ａおよび４９Ｂに記載の実験を参照のこと）。
【０１５７】
本発明に従って、当該技術分野の他のポリペプチドコード分子の欠損を避けるように、ポリヌクレオチドを修飾することができる。したがって、この実施形態において、ポリヌクレオチドは修飾ポリヌクレオチドと称される。
【０１５８】
異なる細胞型におけるマイクロＲＮＡの発現パターンの理解を通じて、ポリヌクレオチド等の、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、特定の細胞型におけるより標的化された発現または特定の生物学的条件下のみでのより標的化された発現のために操作され得る。組織特異的マイクロＲＮＡ結合部位の導入によって、組織でのタンパク質発現または生物学的条件に関連したタンパク質発現に最適な修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を設計することができ得る。
【０１５９】
操作された修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を用いたトランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、タンパク質産生をトランスフェクション後の様々な時点でアッセイすることができる。例えば、細胞を、異なるマイクロＲＮＡ結合部位操作修飾核酸またはｍＲＮＡでトランスフェクトすることができ、関連タンパク質に対してＥＬＩＳＡキットを用いてトランスフェクション後６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および７日時点で産生されたタンパク質をアッセイすることができる。マイクロＲＮＡ結合部位操作分子を用いたインビボ実験を行って、製剤化された修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の組織特異的発現の変化を試験することもできる。
【０１６０】
これらの研究において有用であり得る細胞株の非限定的な例として、ＭＲＣ−５、Ａ５４９、Ｔ８４、ＮＣＩ−Ｈ２１２６［Ｈ２１２６］、ＮＣＩ−Ｈ１６８８［Ｈ１６８８］、ＷＩ−３８、ＷＩ−３８  ＶＡ−１３サブライン２ＲＡ、ＷＩ−２６  ＶＡ４、Ｃ３Ａ［ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ、Ｈｅｐ  Ｇ２の誘導体（ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６５）］、ＴＨＬＥ−３、Ｈ６９ＡＲ、ＮＣＩ−Ｈ２９２［Ｈ２９２］、ＣＦＰＡＣ−１、ＮＴＥＲＡ−２
ｃｌ．Ｄ１［ＮＴ２／Ｄ１］、ＤＭＳ  ７９、ＤＭＳ  ５３、ＤＭＳ  １５３、ＤＭＳ
１１４、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、ＳＷ  １５７３［ＳＷ−１５７３、ＳＷ１５７３］、ＳＷ  １２７１［ＳＷ−１２７１、ＳＷ１２７１］、ＳＨＰ−７７、ＳＮＵ−３９８、ＳＮＵ−４４９、ＳＮＵ−１８２、ＳＮＵ−４７５、ＳＮＵ−３８７、ＳＮＵ−４２３、ＮＬ２０、ＮＬ２０−ＴＡ［ＮＬ２０Ｔ−Ａ］、ＴＨＬＥ−２、ＨＢＥ１３５−Ｅ６Ｅ７、ＨＣＣ８２７、ＨＣＣ４００６、ＮＣＩ−Ｈ２３［Ｈ２３］、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＮＣＩ−Ｈ１８７［Ｈ１８７］、ＮＣＩ−Ｈ３５８［Ｈ−３５８、Ｈ３５８］、ＮＣＩ−Ｈ３７８［Ｈ３７８］、ＮＣＩ−Ｈ５２２［Ｈ５２２］、ＮＣＩ−Ｈ５２６［Ｈ５２６］、ＮＣＩ−Ｈ７２７［Ｈ７２７］、ＮＣＩ−Ｈ８１０［Ｈ８１０］、ＮＣＩ−Ｈ８８９［Ｈ８８９］、ＮＣＩ−Ｈ１１５５［Ｈ１１５５］、ＮＣＩ−Ｈ１４０４［Ｈ１４０４］、ＮＣＩ−Ｎ８７［Ｎ８７］、ＮＣＩ−Ｈ１９６［Ｈ１９６］、ＮＣＩ−Ｈ２１１［Ｈ２１１］、ＮＣＩ−Ｈ２２０［Ｈ２２０］、ＮＣＩ−Ｈ２５０［Ｈ２５０］、ＮＣＩ−Ｈ５２４［Ｈ５２４］、ＮＣＩ−Ｈ６４７［Ｈ６４７］、ＮＣＩ−Ｈ６５０［Ｈ６５０］、ＮＣＩ−Ｈ７１１［Ｈ７１１］、ＮＣＩ−Ｈ７１９［Ｈ７１９］、ＮＣＩ−Ｈ７４０［Ｈ７４０］、ＮＣＩ−Ｈ７４８［Ｈ７４８］、ＮＣＩ−Ｈ７７４［Ｈ７７４］、ＮＣＩ−Ｈ８３８［Ｈ８３８］、ＮＣＩ−Ｈ８４１［Ｈ８４１］、ＮＣＩ−Ｈ８４７［Ｈ８４７］、ＮＣＩ−Ｈ８６５［Ｈ８６５］、ＮＣＩ−Ｈ９２０［Ｈ９２０］、ＮＣＩ−Ｈ１０４８［Ｈ１０４８］、ＮＣＩ−Ｈ１０９２［Ｈ１０９２］、ＮＣＩ−Ｈ１１０５［Ｈ１１０５］、ＮＣＩ−Ｈ１１８４［Ｈ１１８４］、ＮＣＩ−Ｈ１２３８［Ｈ１２３８］、ＮＣＩ−Ｈ１３４１［Ｈ１３４１］、ＮＣＩ−Ｈ１３８５［Ｈ１３８５］、ＮＣＩ−Ｈ１４１７［Ｈ１４１７］、ＮＣＩ−Ｈ１４３５［Ｈ１４３５］、ＮＣＩ−Ｈ１４３６［Ｈ１４３６］、ＮＣＩ−Ｈ１４３７［Ｈ１４３７］、ＮＣＩ−Ｈ１５２２［Ｈ１５２２］、ＮＣＩ−Ｈ１５６３［Ｈ１５６３］、ＮＣＩ−Ｈ１５６８［Ｈ１５６８］、ＮＣＩ−Ｈ１５７３［Ｈ１５７３］、ＮＣＩ−Ｈ１５８１［Ｈ１５８１］、ＮＣＩ−Ｈ１６１８［Ｈ１６１８］、ＮＣＩ−Ｈ１６２３［Ｈ１６２３］、ＮＣＩ−Ｈ１６５０［Ｈ−１６５０、Ｈ１６５０］、ＮＣＩ−Ｈ１６５１［Ｈ１６５１］、ＮＣＩ−Ｈ１６６６［Ｈ−１６６６、Ｈ１６６６］、ＮＣＩ−Ｈ１６７２［Ｈ１６７２］、ＮＣＩ−Ｈ１６９３［Ｈ１６９３］、ＮＣＩ−Ｈ１６９４［Ｈ１６９４］、ＮＣＩ−Ｈ１７０３［Ｈ１７０３］、ＮＣＩ−Ｈ１７３４［Ｈ−１７３４、Ｈ１７３４］、ＮＣＩ−Ｈ１７５５［Ｈ１７５５］、ＮＣＩ−Ｈ１７５５［Ｈ１７５５］、ＮＣＩ−Ｈ１７７０［Ｈ１７７０］、ＮＣＩ−Ｈ１７９３［Ｈ１７９３］、ＮＣＩ−Ｈ１８３６［Ｈ１８３６］、ＮＣＩ−Ｈ１８３８［Ｈ１８３８］、ＮＣＩ−Ｈ１８６９［Ｈ１８６９］、ＮＣＩ−Ｈ１８７６［Ｈ１８７６］、ＮＣＩ−Ｈ１８８２［Ｈ１８８２］、ＮＣＩ−Ｈ１９１５［Ｈ１９１５］、ＮＣＩ−Ｈ１９３０［Ｈ１９３０］、ＮＣＩ−Ｈ１９４４［Ｈ１９４４］、ＮＣＩ−Ｈ１９７５［Ｈ−１９７５、Ｈ１９７５］、ＮＣＩ−Ｈ１９９３［Ｈ１９９３］、ＮＣＩ−Ｈ２０２３［Ｈ２０２３］、ＮＣＩ−Ｈ２０２９［Ｈ２０２９］��ＮＣＩ−Ｈ２０３０［Ｈ２０３０］、ＮＣＩ−Ｈ２０６６［Ｈ２０６６］、ＮＣＩ−Ｈ２０７３［Ｈ２０７３］、ＮＣＩ−Ｈ２０８１［Ｈ２０８１］、ＮＣＩ−Ｈ２０８５［Ｈ２０８５］、ＮＣＩ−Ｈ２０８７［Ｈ２０８７］、ＮＣＩ−Ｈ２１０６［Ｈ２１０６］、ＮＣＩ−Ｈ２１１０［Ｈ２１１０］、ＮＣＩ−Ｈ２１３５［Ｈ２１３５］、ＮＣＩ−Ｈ２１４１［Ｈ２１４１］、ＮＣＩ−Ｈ２１７１［Ｈ２１７１］、ＮＣＩ−Ｈ２１７２［Ｈ２１７２］、ＮＣＩ−Ｈ２１９５［Ｈ２１９５］、ＮＣＩ−Ｈ２１９６［Ｈ２１９６］、ＮＣＩ−Ｈ２１９８［Ｈ２１９８］、ＮＣＩ−Ｈ２２２７［Ｈ２２２７］、ＮＣＩ−Ｈ２２２８［Ｈ２２２８］、ＮＣＩ−Ｈ２２８６［Ｈ２２８６］、ＮＣＩ−Ｈ２２９１［Ｈ２２９１］、ＮＣＩ−Ｈ２３３０［Ｈ２３３０］、ＮＣＩ−Ｈ２３４２［Ｈ２３４２］、ＮＣＩ−Ｈ２３４７［Ｈ２３４７］、ＮＣＩ−Ｈ２４０５［Ｈ２４０５］、ＮＣＩ−Ｈ２４４４［Ｈ２４４４］、ＵＭＣ−１１、ＮＣＩ−Ｈ６４［Ｈ６４］、ＮＣＩ−Ｈ７３５［Ｈ７３５］、ＮＣＩ−Ｈ７３５［Ｈ７３５］、ＮＣＩ−Ｈ１９６３［Ｈ１９６３］、ＮＣＩ−Ｈ２１０７［Ｈ２１０７］、ＮＣＩ−Ｈ２１０８［Ｈ２１０８］、ＮＣＩ−Ｈ２１２２［Ｈ２１２２］、Ｈｓ  ５７３．Ｔ、  Ｈｓ  ５７３．Ｌｕ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＢＥＡＳ−２Ｂ、Ｈｅｐ  Ｇ２、Ｔｅｒａ−１、Ｔｅｒａ−２、ＮＣＩ−Ｈ６９［Ｈ６９］、ＮＣＩ−Ｈ１２８［Ｈ１２８］、ＣｈａＧｏ−Ｋ−１、ＮＣＩ−Ｈ４４６［Ｈ４４６］、ＮＣＩ−Ｈ２０９［Ｈ２０９］、ＮＣＩ−Ｈ１４６［Ｈ１４６］、ＮＣＩ−Ｈ４４１［Ｈ４４１］、ＮＣＩ−Ｈ８２［Ｈ８２］、ＮＣＩ−Ｈ４６０［Ｈ４６０］、ＮＣＩ−Ｈ５９６［Ｈ５９６］、ＮＣＩ−Ｈ６７６Ｂ［Ｈ６７６Ｂ］、ＮＣＩ−Ｈ３４５［Ｈ３４５］、ＮＣＩ−Ｈ８２０［Ｈ８２０］、ＮＣＩ−Ｈ５２０［Ｈ５２０］、ＮＣＩ−Ｈ６６１［Ｈ６６１］、ＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ［Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ−Ｈ５１０］、ＳＫ−ＨＥＰ−１、Ａ−４２７、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、Ｃａｌｕ−６、ＳＫ−ＬＵ−１、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＳＷ  ９００［ＳＷ−９００、ＳＷ９００］、Ｍａｌｍｅ−３Ｍ、およびＣａｐａｎ−１を含む、ＡＴＣＣ（ヴァージニア州マナッサス）からの細胞株が挙げられる。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、既知のシード配列と１００％の同一性を有するか、またはシード配列と１００％未満の同一性を有するかのいずれかであるマイクロＲＮＡ結合領域部位を組み込むように、修飾メッセンジャーＲＮＡをデザインすることができる。シード配列は部分的に変異してマイクロＲＮＡ結合親和性を減少させることができ、そのような変異はそのｍＲＮＡ転写の減少した発現低下をもたらす。要するに、標的ｍＲＮＡとマイクロＲＮＡシードとの一致または不一致の程度は、タンパク質発現を調節するマイクロＲＮＡの能力をより細かく調整するための加減抵抗器として働くことができる。くわえて、マイクロＲＮＡ結合部位の非シード領域における変異はまた、タンパク質発現を調節するマイクロＲＮＡの能力に影響し得る。
【０１６２】
一実施形態において、ｍｉＲ配列はステムループの輪に組み込まれていてもよい。
別の実施形態において、ｍｉＲシード配列はステムループの輪に組み込まれていてもよく、ｍｉＲ結合部位はステムループの５’または３’側基部に組み込まれていてもよい。
【０１６３】
一実施形態において、ＴＥＥはステムループの基部の５’末端に組み込まれていてもよく、ｍｉＲシードはステムループの基部に組み込まれていてもよい。別の実施形態において、ＴＥＥはステムループの基部の５’末端に組み込まれていてもよく、ｍｉＲシードはステムループの基部に組み込まれていてもよく、ｍｉＲ結合部位は基部の３’末端またはステムループ後の配列に組み込まれていてもよい。ｍｉＲシードおよびｍｉＲ結合部位は同一および／または異なるｍｉＲ配列に対してであってもよい。
【０１６４】
一実施形態において、ｍｉＲ配列および／またはＴＥＥ配列の組み込みは、翻訳を増加および／または減少させ得るステムループ領域の形を変化させる。（例えば、Ｋｅｄｄｅ
ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｐｕｍｉｌｉｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  ｐ２７−３’ＵＴＲ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｍｉＲ−２２１  ａｎｄ  ｍｉＲ−２２  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１６５】
一実施形態において、ｍｉＲ配列および／またはＴＥＥ配列の組み込みは、翻訳を増加および／または減少させ得るステムループ領域の形を変化させる。（例えば、Ｋｅｄｄｅ
ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｐｕｍｉｌｉｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  ｐ２７−３’ＵＴＲ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｍｉＲ−２２１  ａｎｄ  ｍｉＲ−２２  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１６６】
一実施形態において、５’ＵＴＲは少なくとも１つのマイクロＲＮＡ配列を含み得る。マイクロＲＮＡ配列は、限定されないが、１９または２２ヌクレオチド長配列および／またはシードを有しないマイクロＲＮＡ配列であり得る。
【０１６７】
一実施形態において、５’ＵＴＲにおけるマイクロＲＮＡ配列を用いて、本明細書に記載の核酸および／またはｍＲＮＡを安定化させることができる。
別の実施形態において、５’ＵＴＲにおけるマイクロＲＮＡ配列を用いて、限定されないが、開始コドン等の翻訳開始の部位の接触性を減少させることができる。Ｍａｔｓｕｄａら（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１０  １１（５）：ｅ１５０５７；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、第１の開始コドン（ＡＵＧ）への接触性を減少させるために、開始コドン（ＡＵＧコドンのＡが＋１である、−４〜＋３７）周辺のアンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド、およびエクソン−ジャンクション複合体（ｅｘｏｎ−ｊｕｎｃｔｉｎｏ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）（ＥＪＣ）を使用した。Ｍａｔｓｕｄａは、ＬＮＡまたはＥＪＣで開始コドン周辺の配列を変えることで、核酸またはｍＲＮＡの効率、長さ、および構造安定性が影響されることを示した。本発明の核酸またはｍＲＮＡは、Ｍａｔｓｕｄａらによって記載されたＬＮＡまたはＥＪＣ配列の代わりに、翻訳開始部位の接触性を減少させるため、翻訳開始部位の付近にマイクロＲＮＡ配列を含むことができる。翻訳開始部位は、マイクロＲＮＡ配列の前、後、またはその内側であり得る。非限定的な例として、翻訳開始部位はシード配列または結合部位等のマイクロＲＮＡ配列中に位置し得る。別の非限定的な例として、翻訳開始部位はシード配列またはｍｉｒ−１２２結合部位等のｍｉＲ−１２２配列の内側に位置し得る。
【０１６８】
一実施形態において、本発明の核酸またはｍＲＮＡは、抗原提示細胞による抗原提示の減衰のために少なくとも１つのマイクロＲＮＡを含んでいてもよい。マイクロＲＮＡは、完全マイクロＲＮＡ配列、マイクロＲＮＡシード配列、シードを有しないマイクロＲＮＡ配列、またはこれらの組み合わせであり得る。非限定的な例として、本発明の核酸またはｍＲＮＡに組み込まれたマイクロＲＮＡは造血系に特異的であり得る。別の非限定的な例として、抗原提示を減衰させるために本発明の核酸またはｍＲＮＡに組み込まれたマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐである。
【０１６９】
一実施形態において、本発明の核酸またはｍＲＮＡは、目的とする細胞におけるコードされたポリペプチドの発現を減衰させるために、少なくとも１つのマイクロＲＮＡを含んでいてもよい。非限定的な例として、本発明の核酸またはｍＲＮＡは、肝臓におけるコードされた目的とするポリペプチドの発現を減衰させるために、少なくとも１つのｍｉＲ−１２２結合部位を含んでいてもよい。別の非限定的な例として、本発明の核酸またはｍＲＮＡは、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−３ｐシード配列、シードを有しないｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐシード配列、シードを有しないｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４６結合部位、ｍｉＲ−１４６シード配列、および／またはシード配列を有しないｍｉＲ−１４６結合部位を含んでいてもよい（例えば、実施例２４、２５、２６、２６、３６、および４８に概説された実験を参照のこと）。
【０１７０】
一実施形態において、本発明の核酸またはｍＲＮＡは、治療の送達によって引き起こされる望まれない免疫原性応答を抑制する免疫細胞においてｍＲＮＡ治療薬を選択的に分解するために、３’ＵＴＲに少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含んでいてもよい。非限定的な例として、マイクロＲＮＡ結合部位は抗原提示細胞においてより安定する修飾核酸であってもよい。これらのマイクロＲＮＡの非限定的な例として、ｍｉｒ−１４２−５ｐ、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉｒ−１４６ａ−５ｐ、およびｍｉｒ−１４６−３ｐが挙げられる。
【０１７１】
一実施形態において、本発明の核酸またはｍＲＮＡは、ＲＮＡ結合タンパク質と相互に作用し得る核酸またはｍＲＮＡの領域に、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ配列を含む。ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）に対するＲＮＡモチーフ
ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）は、限定されないが、ＲＮＡスプライシング、局在化、翻訳、代謝回転、ポリアデニル化、キャッピング、修飾、排出、および局在化等の、同時および転写後遺伝子発現の多数の側面を調節することができる。ＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、例えば、限定されないが、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲ）、およびｈｎＲＮＰ  Ｋ相同性（ＫＨ）ドメインは、典型的にＲＢＰとそれらのＲＮＡ標的との配列会合を調節する（Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３．４９９：１７２−１７７；配列会合）。一実施形態において、基準のＲＢＤは短いＲＮＡ配列を結合することができる。別の実施形態において、基準のＲＢＤは構造ＲＮＡを認識することができる。
【０１７２】
ＲＮＡ結合タンパク質、ならびに関連する核酸、およびタンパク質配列の非限定的な例を実施例２３の表２６に示す。
一実施形態において、目的とするｍＲＮＡの安定性を増加させるために、ＨｕＲをコードするｍＲＮＡを目的とするｍＲＮＡと共に細胞または組織内に同時導入または同時注入することができる。これらのタンパク質はまた、目的のｍＲＮＡにインビトロで繋留し、その後細胞へ一緒に投与することができる。ポリＡ尾部結合タンパク質（ＰＡＢＰ）は真核細胞翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇと相互作用して、翻訳開始を刺激する。これらのＲＢＰをコードするｍＲＮＡとｍＲＮＡ薬剤との同時投与、ならびに／またはこれらのタンパク質とｍＲＮＡ薬剤のインビトロでの繋留、およびタンパク質結合ｍＲＮＡの細胞への投与は、ｍＲＮＡの翻訳効率を増加させることができる。この同様の概念は、ｍＲＮＡと、様々な翻訳因子をコードするｍＲＮＡ、および促進剤、ならびにＲＮＡ安定性および／または翻訳効率に影響するタンパク質それら自身との同時投与にまで拡張することができる。
【０１７３】
一実施形態において、核酸および／またはｍＲＮＡは、限定されないが、ＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）等の少なくとも１つのＲＮＡ結合モチーフを含むことができる。
一実施形態において、ＲＢＤは、Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３．４９９：１７２−１７７；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって記載されたＲＢＤ、それらの断片、または変異形のいずれかであり得る。
【０１７４】
一実施形態において、本発明の核酸またはｍＲＮＡは少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）に対する配列を含み得る。本発明の核酸またはｍＲＮＡが２つ以上のＲＢＤを含む場合、ＲＢＤは同じ種由来である必要はなく、または同じ構造的分類由来である必要すらない。
【０１７５】
一実施形態において、少なくとも１つの隣接する領域（例えば、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ）は少なくとも１つのＲＢＤを含んでいてもよい。別の実施形態において、第１の隣接する領域および第２の隣接する領域は、共に少なくとも１つのＲＢＤを含んでいてもよい。ＲＢＤは同一であってもよいか、またはＲＢＤの各々が他のＲＢＤと少なくとも６０％の配列同一性を有していてもよい。非限定的な例として、少なくとも１つのＲＢＤは、本発明の核酸またはｍＲＮＡの３’ＵＴＲの、前、後、および／またはその内側に位置していてもよい。別の非限定的な例として、少なくとも１つのＲＢＤは３’ＵＴＲの最初の３００ヌクレオシドの前またはその内側に位置していてもよい。
【０１７６】
別の実施形態において、本発明の核酸および／またはｍＲＮＡは連結ヌクレオシドの第１の領域に少なくとも１つのＲＢＤを含んでいてもよい。ＲＢＤはコード領域（例えば、ＯＲＦ）の前、後、またはその内側に位置していてもよい。
【０１７７】
さらに別の実施形態において、連結ヌクレオシドの第１の領域および／または少なくとも１つの隣接する領域は、少なくとも１つのＲＢＤを含んでいてもよい。非限定的な例として、連結ヌクレオシドの第１の領域はスプライシング因子に関するＲＢＤを含んでいてもよく、少なくとも１つの隣接する領域は安定性および／または翻訳因子に関するＲＢＤを含んでいてもよい。
【０１７８】
一実施形態において、本発明の核酸および／またはｍＲＮＡは、核酸および／またはｍＲＮＡのコード領域および／または非コード領域に位置する、少なくとも１つのＲＢＤを含んでいてもよい。
【０１７９】
一実施形態において、少なくとも１つのＲＢＤを少なくとも１つの隣接する領域に組み込んで、本発明の核酸および／またはｍＲＮＡの安定性を増加させることができる。
一実施形態において、ＲＮＡ結合タンパク質モチーフにおけるマイクロＲＮＡ配列を使用して、限定されないが、開始コドン等の翻訳開始部位の接触性を減少させることができる。本発明の核酸またはｍＲＮＡは、Ｍａｔｓｕｄａらによって記載されたＬＮＡまたはＥＪＣ配列の代わりに、翻訳開始部位の接触性を減少させるため、翻訳開始部位の付近にマイクロＲＮＡ配列を含むことができる。翻訳開始部位は、マイクロＲＮＡ配列の前、後、またはその内側であり得る。非限定的な例として、翻訳開始部位はシード配列または結合部位等のマイクロＲＮＡ配列中に位置し得る。別の非限定的な例として、翻訳開始部位はシード配列またはｍｉｒ−１２２結合部位等のｍｉＲ−１２２配列の内側に位置し得る。
【０１８０】
別の実施形態において、アンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチドおよびエクソン−ジャンクション複合体（ｅｘｏｎ−ｊｕｎｃｔｉｎｏ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）（ＥＪＣ）を、ＲＮＡ結合タンパク質モチーフにおいて使用してもよい。第１の開始コドン（ＡＵＧ）への接触性を減少させるために、ＬＮＡおよびＥＪＣは開始コドン（ＡＵＧコドンのＡが＋１である、−４〜＋３７）周辺に使用することができる。
３’ＵＴＲにおけるその他の調節因子
マイクロＲＮＡ結合部位にくわえて、異なる組織と細胞でｍＲＮＡ安定性および翻訳を調節する天然ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲにおけるその他の調節配列を除去するか、または修飾メッセンジャーＲＮＡに組み込むことができる。そのようなｃｉｓ−調節因子は、限定されないが、Ｃｉｓ−ＲＮＰ（リボヌクレオタンパク質）／ＲＢＰ（ＲＮＡ結合タンパク質）調節因子、ＡＵ−リッチ領域（ＡＵＥ）、構造化ステムループ、恒常的崩壊因子（ＣＤＥ）、ＧＣ濃度、および他の構造化ｍＲＮＡモチーフ（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｐａｒｋｅｒ  ＢＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，２１，１９２９−１９４３）を含み得る。例えば、ＣＤＥはそれらのロキン（Ｒｏｑｕｉｎ）タンパク質との相互作用によってｍＲＮＡ分解を媒介する、調節モチーフの分類である。特に、ＣＤＥは、発生および炎症の調節因子をコードしてマクロファージ中のサイトカイン産生を制限する多くのｍＲＮＡにおいて見出されている（Ｌｅｐｐｅｋ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｃｅｌｌ，１５３，８６９−８８１、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１８１】
一実施形態において、細胞または組織におけるポリペプチドの分解が望まれる場合、特定のＣＤＥを核酸またはｍＲＮＡに導入することができる。特定のＣＤＥをまた、タンパク質発現の持続のために核酸またはｍＲＮＡから取り除いて細胞または組織中のより安定したｍＲＮＡを維持することもできる。
栄養要求性ｍＲＮＡ
一実施形態において、本発明の核酸またはｍＲＮＡは栄養要求性であり得る。本明細書で使用するとき、「栄養要求性」という用語は、タンパク質発現が実質的に妨げられるかまたは減少するように、空間的または時間的キューに応じてｍＲＮＡの引き金となる、ｍＲＮＡを促進する、またはｍＲＮＡを誘導する少なくとも１つの特徴を含むｍＲＮＡを指す。そのような空間的または時間的キューは、特定の組織、もしくは臓器、または細胞環境等の翻訳されるｍＲＮＡの位置を含む。温度、ｐＨ、イオン強度、含水量といったものを含むキューもまた予想される。
【０１８２】
一実施形態において、特徴は本発明の核酸またはｍＲＮＡの末端領域に位置する。非限定的な例として、栄養要求性ｍＲＮＡは、選択された組織において栄養要求性ｍＲＮＡが実質的に妨げられるかまたは減少するように、選択された組織に発現したｍｉＲと結合する末端領域にｍｉＲ結合部位を含有していてもよい。この目的のために、例えば、ｍｉＲ−１２２が肝臓で発現し、ｍｉＲの結合が栄養要求性ｍＲＮＡの破壊をもたらすので、肝臓に局在化した場合ｍｉＲ−１２２結合部位を含有する栄養要求性ｍＲＮＡはタンパク質を産生しない。非限定的な例として、ＨＥＫ２９３細胞はｍｉＲ−１２２を発現しないため、ＨＥＫ２９３にｍｉＲ−１２２配列を有する本発明の核酸またはｍＲＮＡの発現低下はほとんどないかまたは全く存在しないが、ｍｉＲ−１２２を発現する肝細胞については、肝細胞におけるｍｉＲ−１２２配列を有する本発明の核酸またはｍＲＮＡの下方調節があるであろう（例えば、実施例１４に概説の試験を参照のこと）。別の非限定的な例として、少なくとも１つのｍｉＲ−１２２結合部位、シード配列を有しないｍｉＲ−１２２結合部位、またはｍｉＲ−１２２結合部位をコードする本発明の核酸またはｍＲＮＡを投与する前に、ｍｉＲ−１２２濃度を、ＨｅＬａ細胞、一次ヒト肝細胞、および一次ラット肝細胞にて測定することができる。投与の後、マイクロＲＮＡ配列を有する修飾核酸の発現を測定して、修飾核酸におけるｍｉＲ−１２２の減衰効果を決定することができる（例えば、実施例２８、２９、３０、３５、４５、４６、および４７に概説の試験を参照のこと）。さらに別の非限定的な例として、限定されないが、最大の減衰効果等の所望の結果のための適切なＵＴＲを決定するために、異なる３’ＵＴＲにおける、ｍｉＲ−１２２結合部位、ｍｉＲ−１２２シード、またはシードを有しないｍｉＲ−１２２結合部位の有効性を評価してもよい（例えば、実施例３５および４６に概説の試験を参照のこと）。
【０１８３】
一実施形態において、栄養要求性ｍＲＮＡの分解または不活性化はｐＨの変化に応答する特徴を含み得る。非限定的な例として、栄養要求性ｍＲＮＡは、ｐＨ５．０〜６．０またはｐＨ６．０〜６．５等のｐＨ４．５〜８．０のｐＨを有する環境で引起され得る。ｐＨの変化は、０．１単位、０．２単位、０．３単位、０．４単位、０．５単位、０．６単位、０．７単位、０．８単位、０．９単位、１．０単位、１．１単位、１．２単位、１．３単位、１．４単位、１．５単位、１．６単位、１．７単位、１．８単位、１．９単位、２．０単位、２．１単位、２．２単位、２．３単位、２．４単位、２．５単位、２．６単位、２．７単位、２．８単位、２．９単位、３．０単位、３．１単位、３．２単位、３．３単位、３．４単位、３．５単位、３．６単位、３．７単位、３．８単位、３．９単位、４．０単位、またはそれ以上の変化であり得る。
【０１８４】
別の実施形態において、栄養要求性ｍＲＮＡの分解または不活性化は温度の変化で引き起こされ得るか、または誘導され得る。非限定的な例として、室温から体温への温度の変化が挙げられる。温度変化は、１℃未満、５℃未満、１０℃未満、１５℃未満、２０℃未満、２５℃未満、または２５℃超であり得る。
【０１８５】
さらに別の実施形態において栄養要求性ｍＲＮＡの分解または不活性化は対象におけるイオン濃度の変化によって引き起こされ得るか、または誘導され得る。イオンは、限定されないが、ナトリウムイオン、カリウムイオン、塩素イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、および／またはリン酸イオン等の陽イオンまたは陰イオンであり得る。
３’ＵＴＲおよびＡＵ豊富な要素
３’ＵＴＲは、それらに包理される一続きのアデノシン（アデノシン）およびウリジン（ウリジン）を有することで知られている。これらのＡＵ豊富な特徴は、特に高代謝回転率を有する遺伝子においてよく見られる。それらの配列特徴および機能特性に基づいて、ＡＵ豊富な要素（ＡＲＥ）は、３つのクラスに分類され得る（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）：クラスＩのＡＲＥは、Ｕ豊富な領域内にＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散したコピーを含有する。Ｃ−ＭｙｃおよびＭｙｏＤは、クラスＩのＡＲＥを含有する。クラスＩＩのＡＲＥは、２個以上の重複したＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）九量体を有する。この種のＡＲＥを含有する分子は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−ａを含む。クラスＩＩＩのＡＲＥは、あまり明確にされていない。これらのＵ豊富な領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。Ｃ−Ｊｕｎおよびミオゲニンが、十分に研究されたこのクラスの例の２つである。ＡＲＥに結合する大半のタンパク質がメッセンジャーを不安定にすることで知られているが、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、中でも注目すべきＨｕＲがｍＲＮＡの安定性を向上させることが実証されている。ＨｕＲは、これら３つのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を操作して核酸分子の３’ＵＴＲに入れることで、ＨｕＲ結合、ひいてはインビボでのメッセージの安定化につながる。
【０１８６】
３’ＵＴＲのＡＵ豊富な要素（ＡＲＥ）の導入、除去、または修飾を用いて、本発明の核酸またはｍＲＮＡの安定性を調節することができる。特定の核酸またはｍＲＮＡを操作するとき、ＡＲＥの１つ以上のコピーが導入されて、本発明の核酸またはｍＲＮＡの安定性を低下させ、それによって、結果として生じるタンパク質の翻訳を抑制し、その産生を低減させ得る。同様に、ＡＲＥは、特定および除去されるか、または変異されて、細胞内安定性を向上させ、ひいては結果として生じるタンパク質の翻訳および産生を増加させることができる。本発明の核酸またはｍＲＮＡを用いたトランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、タンパク質産生をトランスフェクション後の様々な時点でアッセイすることができる。例えば、細胞を、異なるＡＲＥ操作分子でトランスフェクトすることができ、関連タンパク質に対してＥＬＩＳＡキットを用いてトランスフェクション後６時間、１２時間、２４時間、４８時間、および７日時点で産生されたタンパク質をアッセイすることができる。
３’ＵＴＲおよび三重らせん
一実施形態において、本発明の核酸は、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の３’末端に三重らせんを含み得る。本発明の核酸の３’末端は、三重らせん単独か、またはポリＡ尾部と組み合わせて含んでいてもよい。
【０１８７】
一実施形態において、本発明の核酸は、少なくとも第１および第２のＵリッチ領域、第１の領域と第２の領域との間の保存ステムループ領域、ならびにＡリッチ領域に含まれ得る。第１および第２のＵリッチ領域、ならびにＡリッチ領域は会合して核酸の３’末端上に三重らせんを形成することができる。この三重らせんは核酸を安定化し、核酸の翻訳効率を高め、および／または分解から３’末端を保護することができる。例示的な三重らせんは、限定されないが、転移関連肺腺癌転写物１（ＭＡＬＡＴ１）、ＭＥＮ−β、およびポリアデニル化核内（ＰＡＮ）ＲＮＡの三重らせん配列が挙げられる（Ｗｉｌｕｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０１２  ２６：２３９２−２４０７を参照のこと；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。一実施形態において、本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の３’末端は、ＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴ（配列番号１）を含む第１のＵリッチ領域、ＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号２）またはＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴ（配列番号３）を含む第２のＵリッチ領域、ＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡ（配列番号４）を含むＡリッチ領域を含む。別の実施形態において、本発明の核酸の３’末端は、第１のＵリッチ領域、保存領域、第２のＵリッチ領域、およびＡリッチ領域を含む、三重らせん形成構造を含む。
【０１８８】
一実施形態において、三重らせんは、クローバー葉構造の前にＭＡＬＡＴ１配列の切断から形成してもよい。理論によって束縛されることを望まないが、ＭＡＬＡＴ１は長い非コードＲＮＡであり、切断されるとき、三重らせんおよびｔＲＮＡ様クローバー葉構造を形成する。その後、ＭＡＬＡＴ１転写物は核スペックルに局在化し、ｔＲＮＡ様クローバー葉は細胞質に局在化する（Ｗｉｌｕｓｚ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｅｌｌ  ２００８  １３５（５）：９１９−９３２；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１８９】
非限定的な例として、次いで、ＭＡＬＡＴ１配列を含む本発明の核酸の末端は、クローバー葉構造からＲＮａｓｅＰを切断した後に、核酸を安定化させる三重らせん構造を形成することができる（Ｐｅａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎ−ｍＲＮＡ  ３’ｅｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｈｏｗ  ｔｈｅ  ｏｔｈｅｒ  ｈａｌｆ  ｌｉｖｅｓ；ＷＩＲＥｓ  ＲＮＡ
２０１３；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１９０】
一実施形態において、本明細書に記載の核酸またはｍＲＮＡはＭＡＬＡＴ１配列を含む。別の実施形態において、核酸またはｍＲＮＡはポリアデニル化され得る。さらに別の実施形態において、核酸またはｍＲＮＡは、ポリアデニル化されないが、無修飾核酸またはｍＲＮＡと比べて分解への増加した耐性を有する。
【０１９１】
一実施形態において、本発明の核酸は第２の隣接する領域（例えば、３’ＵＴＲ）にＭＡＬＡＴ１配列を含み得る。非限定的な例として、ＭＡＬＡＴ１配列はヒトまたはマウスであってもよい（例えば、実施例３８の表３７に記載のポリヌクレオチドを参照のこと）。
【０１９２】
別の実施形態において、ＭＡＬＡＴ１配列のクローバー葉構造はまた、ｍａｓｃＲＮＡ（ＭＡＬＡＴ１関連低分子量細胞質ＲＮＡ）と称されるｔＲＮＡ様構造を形成する酵素を添加するＲＮａｓｅＺおよびＣＣＡによってプロセシングされ得る。非限定的な例として、ｍａｓｃＲＮＡはタンパク質またはその断片をコードし得るか、および／またはマイクロＲＮＡ配列を含み得る。ｍａｓｃＲＮＡは本明細書に記載の少なくとも１つの化学修飾を含んでいてもよい。
ステムループ
一実施形態において、本発明の核酸は、限定されないが、ヒストンステムループ等のステムループを含み得る。ステムループは、限定されないが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１３１０３６５９号に記載の配列番号７〜１７等の約２５または約２６ヌクレオチド長であるヌクレオチド配列であってもよい。ヒストンステムループはコード領域に対して３’側（例えば、コード領域の３’末端）に位置し得る。非限定的な例として、ステムループは本明細書に記載の核酸の３’末端に位置していてもよい。
【０１９３】
一実施形態において、ステムループは第２の末端領域に位置し得る。非限定的な例として、ステムループは第２の末端領域の非翻訳領域（例えば、３’ＵＴＲ）内に位置していてもよい。
【０１９４】
一実施形態において、ヒストンステムループを含む、限定されないが、ｍＲＮＡ等の核酸は少なくとも１つの鎖終結ヌクレオシドの添加によって安定化され得る。理論によって束縛されることを望むものではないが、少なくとも１つの鎖終結ヌクレオシドの添加は、核酸の分解を遅くし得、したがって核酸の半減期を増加させることができる。
【０１９５】
一実施形態において、鎖終結ヌクレオシドは、限定されないが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１３１０３６５９号に記載されるものであってもよい。別の実施形態において、本発明で使用され得る鎖終結ヌクレオシドとして、限定されないが、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−デオキシウリジン、３’−デオキシシトシン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミン、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、例えば、２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシウリジン、２’，３’−ジデオキシシトシン、２’，３’−ジデオキシグアノシン、２’，３’−ジデオキシチミン、２’−デオキシヌクレオシド、または−Ｏ−メチルヌクレオシドが挙げられる。
【０１９６】
別の実施形態において、ヒストンステムループを含む、限定されないが、ｍＲＮＡ等の核酸は、オリジオ（ｏｌｉｇｉｏ）（Ｕ）（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１３１０３６５９号を参照のこと）の添加を防止および／または阻害することができる核酸の３’領域に対する修飾によって、安定化することができる。
【０１９７】
さらに別の実施形態において、ヒストンステムループを含む、限定されないが、ｍＲＮＡ等の核酸は、３’−デオキシヌクレオシド、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、３’−０−メチルヌクレオシド、３’−０−エチルヌクレオシド、３’−アラビノシド、ならびに当該技術分野で既知の、および／または本明細書に記載の他の修飾ヌクレオシドで終わるオリゴヌクレオチドの添加によって、安定化することができる。
【０１９８】
一実施形態において、本発明の核酸は、ヒストンステムループ、ポリＡ尾部配列、および／または５’キャップ構造を含み得る。ヒストンステムループはポリＡ尾部配列の前および／または後に存在し得る。ヒストンステムループおよびポリＡ尾部配列を含む核酸は、本明細書に記載の鎖終結ヌクレオシドを含んでいてもよい。
【０１９９】
別の実施形態において、本発明の核酸はヒストンステムループおよび５’キャップ構造を含み得る。５’キャップ構造は、限定されないが、本明細書に記載のもの、および／または当該技術分野で既知のものを含み得る。
【０２００】
一実施形態において、保存ステムループ領域は本明細書に記載のｍｉＲ配列を含み得る。非限定的な例として、ステムループ領域は本明細書に記載のｍｉＲ配列のシード配列を含み得る。別の非限定的な例において、ステムループ領域はｍｉＲ−１２２シード配列を含み得る。
【０２０１】
別の実施形態において、保存ステムループ領域は本明細書に記載のｍｉＲ配列を含んでいてもよく、またＴＥＥ配列を含んでいてもよい。
一実施形態において、ｍｉＲ配列および／またはＴＥＥ配列の組み込みは、翻訳を増加および／または減少させ得るステムループ領域の形を変化させる。（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｅｄｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｐｕｍｉｌｉｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  ｐ２７−３’ＵＴＲ
ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｍｉＲ−２２１  ａｎｄ  ｍｉＲ−２２  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０を参照のこと）。
【０２０２】
一実施形態において、本明細書に記載の修飾核酸は、少なくとも１つのヒストンステムループ、およびポリＡ配列、またはポリアデニル化シグナルを含み得る。少なくとも１つのヒストンステムループ、およびポリＡ配列、またはポリアデニル化シグナルをコードする核酸配列の非限定的な例は、国際特許公開第ＷＯ２０１３１２０４９７号、同第ＷＯ２０１３１２０６２９号、同第ＷＯ２０１３１２０５００号、同第ＷＯ２０１３１２０６２７号、同第ＷＯ２０１３１２０４９８号、同第ＷＯ２０１３１２０６２６号、同第ＷＯ２０１３１２０４９９号、および同第ＷＯ２０１３１２０６２８号に記載されており、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ヒストンステムループ、およびポリＡ配列、またはポリアデニル化シグナルをコードする核酸は、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１３１２０４９９号および同第ＷＯ２０１３１２０６２８号に記載の核酸配列等の、病原体抗原またはその断片をコードすることができる。別の実施形態において、ヒストンステムループ、およびポリＡ配列、またはポリアデニル化シグナルをコードする核酸は、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１３１２０４９７号および同第ＷＯ２０１３１２０６２９号に記載の核酸配列等の、治療用タンパク質をコードすることができる。一実施形態において、ヒストンステムループ、およびポリＡ配列、またはポリアデニル化シグナルをコードする核酸は、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１３１２０５００号および同第ＷＯ２０１３１２０６２７号に記載の核酸配列等の、腫瘍抗原またはその断片をコードすることができる。別の実施形態において、ヒストンステムループ、およびポリＡ配列、またはポリアデニル化シグナルをコードする核酸は、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１３１２０４９８号および同第ＷＯ２０１３１２０６２６号に記載の核酸配列等の、アレルゲン性抗原または自己免疫性自己抗原をコードすることができる。５’キャッピング
ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外輸送に関与し、ｍＲＮＡの安定性を向上させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、これは、ＣＢＰのポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を介して細胞におけるｍＲＮＡ安定性および翻訳適格性に関与し、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成する。このキャップはさらに、ｍＲＮＡスプライシング中に５’近位のイントロンの除去を支援する。
【０２０３】
内因性ｍＲＮＡ分子は、５’末端キャップされて、末端グアノシンキャップ残基とｍＲＮＡの５’末端転写センスヌクレオチドとの間に５’−ｐｐｐ−５’−トリホスフェート結合をもたらし得る。その後、この５’−グアニル酸キャップがメチル化されて、Ｎ７−メチル−グアニル酸残基を生成し得る。ｍＲＮＡの５’末端の末端および／または前末端転写ヌクレオチドのリボース糖も、任意に２’−Ｏ−メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解および切断を介する５’デキャッピングは、分解するためにｍＲＮＡ分子等の核酸分子を標的とし得る。
【０２０４】
本発明の核酸の修飾は、デキャッピングを阻止する非加水分解性のキャップ構造を生成し、その結果ｍＲＮＡの半減期を増加させ得る。キャップ構造の加水分解が５’−ｐｐｐ−５’ホスホロジエステル結合の切断を必要とするため、修飾ヌクレオチドが、キャッピング反応中に用いられ得る。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（マサチューセッツ州イプスウィッチ）のワクシニアキャッピング酵素を製造業者の指示に従ってα−チオ−グアノシンヌクレオチドとともに用いて、５’−ｐｐｐ−５’キャップにおけるホスホロチオエート結合を引き起こすことができる。α−メチル−ホスホネートおよびセレノ−ホスフェートヌクレオチド等のさらなる修飾グアノシンヌクレオチドを用いることができる。
【０２０５】
さらなる修飾には、糖環の２’−ヒドロキシル基におけるｍＲＮＡの５’末端および／または５’前末端ヌクレオチドのリボース糖の２’−Ｏ−メチル化（上述のもの）が含まれるが、これに限定されない。複数のはっきりと異なる５’−キャップ構造を用いて、ｍＲＮＡ分子等の核酸分子の５’キャップを生成することができる。
【０２０６】
本明細書において合成キャップ類似体、化学キャップ、化学キャップ類似体、または構造もしくは機能キャップ類似体とも称されるキャップ類似体は、それらの化学構造の点で天然の（すなわち、内因性、野生型、または生理学的）５’キャップとは異なるが、キャップ機能は保持する。キャップ類似体は、化学的（すなわち、非酵素的）もしくは酵素的に合成され、かつ／核酸分子に結合され得る。
【０２０７】
例えば、反逆方向キャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップは、５’−５’−トリホスフェート基によって結合される２個のグアニンを含有し、一方のグアニンは、Ｎ７メチル基、ならびに３’−Ｏ−メチル基（すなわち、Ｎ７，３’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−トリホスフェート−５’−グアノシン（ｍ７Ｇ−３’ｍｐｐｐ−Ｇ、これは同等に３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと指定され得る）を含有する。他方の未修飾グアニンの３’−Ｏ原子は、キャップされた核酸分子（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）の５’末端ヌクレオチドに結合される。Ｎ７−および３’−Ｏ−メチル化グアニンは、キャップされた核酸分子（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）の末端部分を提供する。
【０２０８】
別の例示のキャップには、ｍＣＡＰがあり、これは、ＡＲＣＡと同様であるが、グアノシン上に２’−Ｏ−メチル基（すなわち、Ｎ７，２’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−トリホスフェート−５’−グアノシン、ｍ７Ｇｍ−ｐｐｐ−Ｇ）を有する。
【０２０９】
一実施形態において、キャップはジヌクレオチドキャップ類似体である。非限定的な例として、ジヌクレオチドキャップ類似体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第ＵＳ  ８，５１９，１１０号に記載のジヌクレオチドキャップ類似体等のボラノリン酸基またはホスホロセレノエート（ｐｈｏｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）基で、異なるリン酸位置にて修飾され得る。
【０２１０】
別の実施形態において、キャップは、キャップ類似体は、当該技術分野において既知の、および／または本明細書に記載のキャップ類似体のＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態である。キャップ類似体のＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態の非限定的な例として、Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）−Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、およびＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）−ｍ３’−ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体が挙げられる（例えば、Ｋｏｒｅ
ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１３  ２１：４５７０−４５７４に記載の、様々なキャップ類似体およびキャップ類似体を合成する方法を参照のこと；これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。別の実施形態において、本発明のキャップ類似体は４−クロロ／ブロモフェノキシエチル類似体である。
【０２１１】
キャップ類似体がインビトロ転写反応において同時に起こる核酸分子のキャッピングを可能にする一方で、転写物の最大２０％がキャップされないままである。これ、ならびに内因性細胞転写機構によって産生される核酸の内因性５’−キャップ構造とのキャップ類似体の構造差は、翻訳適格性の低下および細胞安定性の低下をもたらし得る。
【０２１２】
本発明の修飾核酸は、より真正の５’−キャップ構造を生成するために、酵素を用いて転写後にもキャップされ得る。本明細書で使用するとき、「より真正の」という表現は、構造的または機能的のいずれかで内因性または野生型特徴を酷似させるか、または模倣する特徴を指す。すなわち、「より真正の」特徴は、先行技術の合成特徴もしくは類似体等と比較して、より良好に内因性、野生型、天然、もしくは生理学的細胞機能および／もしくは構造を表しているか、またはこれは、対応する内因性、野生型、天然または生理学的特徴を１つ以上の点においてしのぐ。本発明のより真正の５’キャップ構造の非限定的な例には、当技術分野で既知の合成５’キャップ構造（または野生型、天然、または生理学的５’キャップ構造）と比較して、とりわけ、強化されたキャップ結合タンパク質の結合、増加した半減期、低下した５’エンドヌクレアーゼに対する感受性、および／または低下した５’デキャッピングを有するものがある。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素および組換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素は、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間に基準の５’−５’−トリホスフェート結合を生成し得、キャップグアニンは、Ｎ７メチル化を含有、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルを含有する。そのような構造は、キャップ１構造と称される。このキャップは、例えば、当技術分野で既知の他の５’キャップ類似体構造と比較して、より高い翻訳適格性および細胞安定性、ならびに細胞炎症誘発性サイトカインの活性化の低下をもたらす。キャップ構造には、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、７ｍＧ（５’）−ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）、およびｍ（７）Ｇｐｐｐｍ（３）（６，６，２’）Ａｐｍ（２’）Ａｐｍ（２’）Ｃｐｍ（２）（３，２’）Ｕｐ（キャップ４）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１３】
修飾核酸が転写後にキャップされ得、かつこのプロセスがより効率的であるので、ほぼ１００％の修飾核酸がキャップされ得る。これは、キャップ類似体がインビトロ転写反応の過程でｍＲＮＡに結合されるときの約８０％とは大いに異なる。
【０２１４】
本発明に従って、５’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。本発明に従って、５’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体には、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、および２−アジド−グアノシンが含まれる。
【０２１５】
一実施形態において、本明細書に記載の核酸は修飾５’キャップを含有し得る。５’キャップへの修飾はｍＲＮＡの安定性を増加させ、ｍＲＮＡの半減期を増加させることができ、ｍＲＮＡ翻訳効率を増加させることができる。修飾５’キャップは、限定されないが、以下の修飾のうち１つ以上を含み得る：キャッピングされたグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）の２’位および／もしくは３’位での修飾、（環状炭素を産生した）糖環酸素とメチレン部分（ＣＨ２）との置換、キャップ構造の三リン酸架橋部分での修飾、または核酸塩基（Ｇ）部分での修飾。
【０２１６】
修飾され得る５’キャップ構造として、限定されないが、
【０２１７】
【化１】
2020072766.tif 000003
【０２１８】
のキャップ依存翻訳に対して基質構造を有するＣａｐ０、または
【０２１９】
【化２】
2020072766.tif 000004
【０２２０】
のキャップ依存翻訳に対して基質構造を有するＣａｐ１等の本明細書に記載のキャップが挙げられる。
非限定的な例として、修飾５’キャップは、以下のキャップ依存翻訳に対して基質構造を有していてもよく、
【０２２１】
【化３】
2020072766.tif 000005
【０２２２】
【化４】
2020072766.tif 000006
【０２２３】
【化５】
2020072766.tif 000007
【０２２４】
【化６】
2020072766.tif 000008
【０２２５】
【化７】
2020072766.tif 000009
【０２２６】
【化８】
2020072766.tif 000010
【０２２７】
【化９】
2020072766.tif 000011
【０２２８】
【化１０】
2020072766.tif 000012
【０２２９】
【化１１】
2020072766.tif 000013
【０２３０】
【化１２】
2020072766.tif 000014
【０２３１】
【化１３】
2020072766.tif 000015
【０２３２】
【化１４】
2020072766.tif 000016
【０２３３】
【化１５】
2020072766.tif 000017
【０２３４】
【化１６】
2020072766.tif 000018
【０２３５】
【化１７】
2020072766.tif 000019
【０２３６】
【化１８】
2020072766.tif 000020
【０２３７】
【化１９】
2020072766.tif 000021
【０２３８】
【化２０】
2020072766.tif 000022
【０２３９】
【化２１】
2020072766.tif 000023
【０２４０】
【化２２】
2020072766.tif 000024
【０２４１】
式中のＲ１およびＲ２は、以下の表１にて定義され、
表１
【０２４２】
【表０００１−１】
2020072766.tif 000025
【０２４３】
【表０００１−２】
2020072766.tif 000026
【０２４４】
【表０００１−３】
2020072766.tif 000027
【０２４５】
または
【０２４６】
【化２３】
2020072766.tif 000028
【０２４７】
式中のＲ１およびＲ２は、以下の表２にて定義される。
表２
【０２４８】
【表０００２】
2020072766.tif 000029
【０２４９】
表１において、「ＭＯＭ」はメトキシメチルを表し、「ＭＥＭ」はメトキシエトキシメチルを表し、「ＭＴＭ」はメチルチオメチルを表し、「ＢＯＭ」はベンジルオキシメチルを表し、「ＭＰ」はモノホスホネートを表す。表１および表２において、「Ｆ」はフッ素を表し、「Ｃｌ」は塩素を表し、「Ｂｒ」は臭素を表し、「Ｉ」はヨウ素を表す。
【０２５０】
非限定的な例において、修飾５’キャップは、以下のワクシニアｍＲＮＡキャッピング酵素に対する基質構造を有していてもよく、
【０２５１】
【化２４】
2020072766.tif 000030
【０２５２】
【化２５】
2020072766.tif 000031
【０２５３】
【化２６】
2020072766.tif 000032
【０２５４】
【化２７】
2020072766.tif 000033
【０２５５】
【化２８】
2020072766.tif 000034
【０２５６】
【化２９】
2020072766.tif 000035
【０２５７】
【化３０】
2020072766.tif 000036
【０２５８】
【化３１】
2020072766.tif 000037
【０２５９】
【化３２】
2020072766.tif 000038
【０２６０】
【化３３】
2020072766.tif 000039
【０２６１】
【化３４】
2020072766.tif 000040
【０２６２】
【化３５】
2020072766.tif 000041
【０２６３】
【化３６】
2020072766.tif 000042
【０２６４】
【化３７】
2020072766.tif 000043
【０２６５】
【化３８】
2020072766.tif 000044
【０２６６】
【化３９】
2020072766.tif 000045
【０２６７】
【化４０】
2020072766.tif 000046
【０２６８】
【化４１】
2020072766.tif 000047
【０２６９】
【化４２】
2020072766.tif 000048
【０２７０】
【化４３】
2020072766.tif 000049
【０２７１】
【化４４】
2020072766.tif 000050
【０２７２】
【化４５】
2020072766.tif 000051
【０２７３】
【化４６】
2020072766.tif 000052
【０２７４】
【化４７】
2020072766.tif 000053
【０２７５】
【化４８】
2020072766.tif 000054
【０２７６】
式中のＲ１およびＲ２は、以下の表３にて定義され、
表３
【０２７７】
【表０００３−１】
2020072766.tif 000055
【０２７８】
【表０００３−２】
2020072766.tif 000056
【０２７９】
【表０００３−３】
2020072766.tif 000057
【０２８０】
または
【０２８１】
【化４９】
2020072766.tif 000058
【０２８２】
式中のＲ１およびＲ２は、以下の表４にて定義される。
表４  
【０２８３】
【表０００４】
2020072766.tif 000059
【０２８４】
表３において、「ＭＯＭ」はメトキシメチルを表し、「ＭＥＭ」はメトキシエトキシメチルを表し、「ＭＴＭ」はメチルチオメチルを表し、「ＢＯＭ」はベンジルオキシメチルを表し、「ＭＰ」はモノホスホネートを表す。表３および表４において、「Ｆ」はフッ素を表し、「Ｃｌ」は塩素を表し、「Ｂｒ」は臭素を表し、「Ｉ」はヨウ素を表す。
【０２８５】
別の非限定的な例において、修飾キャッピング構造基質ＣＡＰ−１１２〜ＣＡＰ−２２５を、ワクシニアキャッピング酵素の存在下において、限定されないが、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）等の酵素活性を生み出す成分と共に添加して、ｍＲＮＡに対する修飾キャップを形成することができた。
【０２８６】
一実施形態において、Ｃ−Ｎ結合が酸または酵素加水分解に抵抗性であるので、（環状炭素を産生した）糖環酸素とメチレン部分（ＣＨ２）との置換は、ホスホリラーゼに対してＣ−Ｎ結合のより大きな安定性を作り出し得る。メチレン部分はまた三リン酸架橋部分の安定性を増加させることもでき、したがってｍＲＮＡの安定性を増加させることができる。非限定的な例として、キャップ依存翻訳に対するキャップ基質構造は、限定されないが、ＣＡＰ−０１４およびＣＡＰ−０１５等の構造、ならびに／または、限定されないが、ＣＡＰ−１２３およびＣＡＰ−１２４等のワクシニアｍＲＮＡキャッピング酵素に対するキャップ基質構造を有していてもよい。別の例において、ＣＡＰ−１１２〜ＣＡＰ−１２２および／またはＣＡＰ−１２５〜ＣＡＰ−２２５は、（環状炭素を産生した）糖環酸素とメチレン部分（ＣＨ２）との置換によって修飾することができる。
【０２８７】
別の実施形態において、三リン酸架橋は、少なくとも１つの酸素と、硫黄（チオ）、ボラン（ＢＨ３）部分、メチル基、エチル基、メトキシ基、および／またはこれらの組み合わせとの置換によって修飾され得る。この修飾は脱キャッピング酵素に対してｍＲＮＡの安定性を増加させ得る。非限定的な例として、キャップ依存翻訳に対するキャップ基質構造は、限定されないが、ＣＡＰ−０１６〜ＣＡＰ−０２１等の構造、および／または、限定されないが、ＣＡＰ−１２５〜ＣＡＰ−１３０等のワクシニアｍＲＮＡキャッピング酵素に対するキャップ基質構造を有していてもよい。別の例において、ＣＡＰ−００３〜ＣＡＰ−０１５、ＣＡＰ−０２２〜ＣＡＰ−１２４、および／またはＣＡＰ−１３１〜ＣＡＰ−２２５は、三リン酸架橋酸素の少なくとも１つと、硫黄（チオ）、ボラン（ＢＨ３）部分、メチル基、エチル基、メトキシ基、および／またはこれらの組み合わせとの置換によって三リン酸架橋上で修飾することができる。
【０２８８】
一実施形態において、ＣＡＰ−００１〜１３４および／またはＣＡＰ−１３６〜ＣＡＰ−２２５を修飾して、ＣＡＰ−１３５と類似したチオグアノシン類似体にしてもよい。チオグアノシン類似体は、限定されないが、三リン酸部分（例えば、ＢＨ３、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＯＣＨ３、Ｓ、およびＯＣＨ３とのＳ）での修飾、本明細書に記載の６−チオグアノシンの２’位および／もしくは３’位での修飾、ならびに／または本明細書に記載の（環状炭素を産生した）糖環酸素の置換等の、さらなる修飾を含み得る。
【０２８９】
一実施形態において、ＣＡＰ−００１〜１２１および／またはＣＡＰ−１２３〜ＣＡＰ−２２５を修飾して、ＣＡＰ−１２２と類似した修飾５’キャップにしてもよい。修飾５’キャップは、限定されないが、三リン酸部分（例えば、ＢＨ３、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＯＣＨ３、Ｓ、およびＯＣＨ３とのＳ）での修飾、本明細書に記載の６−チオグアノシンの２’位および／もしくは３’位での修飾、ならびに／または本明細書に記載の（環状炭素を産生した）糖環酸素の置換等の、さらなる修飾を含み得る。
【０２９０】
一実施形態において、５’キャップ修飾は、ビオチンの付着、またはＧＴＰの２’位もしくは３’位での結合（ｃｏｎｊｕｆａｔｉｏｎ）であり得る。
別の実施形態において、５’キャップ修飾はＣＦ２修飾三リン酸部分を含み得る。
３’ＵＴＲおよびウイルス配列
大麦縞萎縮ウイルス（ＢＹＤＶ−ＰＡＶ）の翻訳エンハンサー配列等であるが、これに限定されないさらなるウイルス配列は、本発明の核酸またはｍＲＮＡの３’ＵＴＲに操作および挿入され得、インビトロおよびインビボで構築物の翻訳を刺激し得る。トランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、ＥＬＩＳＡによってタンパク質産生をトランスフェクション後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および７日時点でアッセイすることができる。
ＩＲＥＳ配列
さらに、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有する核酸が提供される。最初に特徴的なピコルナウイルスＲＮＡと特定されたＩＲＥＳは、５’キャップ構造の不在下でタンパク質合成を開始するときに重要な役割を果たす。ＩＲＥＳは、ｍＲＮＡの唯一のリボソーム結合部位として働き得るか、または複数のリボソーム結合部位のうちの１つの役割を果たし得る。２個以上の機能的リボソーム結合部位を含有する核酸またはｍＲＮＡは、リボソーム（「多シストロン性核酸分子」）によって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る。核酸またはｍＲＮＡにＩＲＥＳが提供されるとき、第２の翻訳可能な領域がさらに任意に提供される。本発明に従って用いられ得るＩＲＥＳ配列の例には、制限なく、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものが挙げられる。
末端構造修飾：ポリＡ尾部
ＲＮＡ処理中、長いアデニンヌクレオチド鎖（ポリＡ尾部）は通常、分子の安定性を向上させるためにメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に付加される。転写直後、転写物の３’末端が切断されて３’ヒドロキシルを遊離させる。その後、ポリＡポリメラーゼは、アデニンヌクレオチド鎖をＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは、１００〜２５０残基長であるポリＡ尾部を付加する。
【０２９１】
特有のポリＡ尾部の長さが、本発明の修飾ＲＮＡにある特定の利点を提供することが見出されている。
概して、本発明のポリＡ尾部の長さは、３０ヌクレオチド長を超える。別の実施形態において、ポリＡ尾部は、３５ヌクレオチド長を超える。別の実施形態において、長さは少なくとも４０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも４５ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも５５ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも６０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも６０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも８０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも９０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１２０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１４０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１６０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１８０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも２００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも２５０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも３００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも３５０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも４００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも４５０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも５００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも６００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも７００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも８００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも９００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１０００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１１００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１２００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１３００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１４００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１５００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１６００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１７００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１８００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１９００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも２０００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも２５００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも３０００ヌクレオチド長である。
【０２９２】
いくつかの実施形態において、核酸またはｍＲＮＡは、約３０〜約３，０００個のヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜７５０、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜２，０００、３０〜２，５００、５０〜１００、５０〜２５０、５０〜５００、５０〜７５０、５０〜１，０００、５０〜１，５００、５０〜２，０００、５０〜２，５００、５０〜３，０００、１００〜５００、１００〜７５０、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜２，０００、１００〜２，５００、１００〜３，０００、５００〜７５０、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜２，５００、５００〜３，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜２，５００、１，０００〜３，０００、１，５００〜２，０００、１，５００〜２，５００、１，５００〜３，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜２，５００、および２，５００〜３，０００個）を含む。
【０２９３】
一実施形態において、ポリＡ尾部は、限定されないが、実施例１３に記載の修飾ＲＮＡのポリＡ尾部長等の、８０ヌクレオチド長、１２０ヌクレオチド長、１６０ヌクレオチド長であってもよい。
【０２９４】
別の実施形態において、ポリＡ尾部は、限定されないが、実施例４４に記載の修飾ＲＮＡのポリＡ尾部長等の、２０、４０、８０、１００、１２０、１４０、または１６０ヌクレオチド長であってもよい。
【０２９５】
一実施形態において、ポリＡ尾部は、全体の修飾ＲＮＡ分子の長さに対して設計される。この設計は、修飾ＲＮＡのコーディング領域の長さ、特定の特徴もしくは修飾ＲＮＡ領域の長さ（ｍＲＮＡ等）に基づき得るか、または修飾ＲＮＡから発現した最終産物の長さに基づき得る。修飾ＲＮＡ（例えば、ポリＡ尾部を含むｍＲＮＡ部分以外）の任意のさらなる特徴に関するとき、ポリＡ尾部は、さらなる特徴よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％長い長さであり得る。ポリＡ尾部は、それが属する修飾ＲＮＡの画分としても設計され得る。この文脈において、ポリＡ尾部は、構築物の全長または構築物の全長からポリＡ尾部を差し引いた長さの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以上であり得る。
【０２９６】
一実施形態において、結合部位の操作、および／または核酸もしくはｍＲＮＡのポリＡ結合タンパク質への複合体化は、発現の促進に使用することができる。操作された結合部位は、核酸および／またはｍＲＮＡの局所微小環境のリガンドに対する結合部位として作動することができる、センサー配列であってもよい。非限定的な例として、核酸および／またはｍＲＮＡは、ポリＡ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）およびその類似体の結合親和性を変化させるように少なくとも１つの操作された結合部位を含んでいてもよい。少なくとも１つの操作された結合部位の組み込みはＰＡＢＰおよびその類似体の結合親和性を増加させ得る。
【０２９７】
さらに、複数のはっきりと異なる核酸またはｍＲＮＡは、ポリＡ尾部の３’末端で修飾されたヌクレオチドを用いて３’末端を介してＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）に結合され得る。トランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、ＥＬＩＳＡによってタンパク質産生をトランスフェクション後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および７日時点でアッセイすることができる。非限定的な例として、トランスフェクション実験を用いて、少なくとも１つの操作された結合部位を添加した結果としての、ＰＡＢＰまたはその類似体の結合親和性への影響を評価してもよい。
【０２９８】
一実施形態において、ポリＡ尾部を用いて、翻訳開始を調節してもよい。理論によって束縛されることを望むものではないが、ポリＡ尾部は翻訳開始複合体と次いで相互作用できるＰＡＢＰを補充するため、タンパク質合成に必要不可欠であり得る。
【０２９９】
別の実施形態において、ポリＡ尾部はまた、本発明において３’−５’エキソヌクレアーゼ消化に対する保護に用いることができる。
一実施形態において、本発明の核酸またはｍＲＮＡは、ポリＡ〜Ｇ四重項を含むように設計される。Ｇ四重項は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方においてＧ豊富な配列によって形成され得る４個のグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。この実施形態において、Ｇ四重項は、ポリＡ尾部の終端に組み込まれる。結果として生じる核酸またはｍＲＮＡは、安定性、タンパク質産生、および様々な時点での半減期他のパラメータについてアッセイされ得る。ポリＡ〜Ｇ四重項が、１２０個のヌクレオチドのポリＡ尾部を単独で用いてもたらされるタンパク質産生の少なくとも７５％に相当するタンパク質産生をもたらすことが見出されている。
【０３００】
一実施形態において、本発明の核酸またはｍＲＮＡはポリＡ尾部を含んでいてもよく、鎖終結ヌクレオシドの添加によって安定化されてもよい。ポリＡ尾部を有する核酸および／またはｍＲＮＡは、５’キャップ構造をさらに含んでいてもよい。
【０３０１】
別の実施形態において、本発明の核酸またはｍＲＮＡは、ポリＡ−Ｇ４分子（ｐｏｌｙ
Ａ−Ｇ  Ｑｕａｒｔｅｔ）を含み得る。ポリＡ−Ｇ４分子を有する核酸および／またはｍＲＮＡは５’キャップ構造をさらに含み得る。
【０３０２】
一実施形態において、ポリＡ尾部またはポリＡ−Ｇ４分子を含む核酸またはｍＲＮＡの安定化に用いることができる鎖終結ヌクレオシドは、限定されないが、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１３１０３６５９号に記載されるものであってもよい。別の実施形態において、本発明で使用され得る鎖終結ヌクレオシドとして、限定されないが、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−デオキシウリジン、３’−デオキシシトシン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミン、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、例えば、２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシウリジン、２’，３’−ジデオキシシトシン、２’，３’−ジデオキシグアノシン、２’，３’−ジデオキシチミン、２’−デオキシヌクレオシド、または−Ｏ−メチルヌクレオシドが挙げられる。
【０３０３】
別の実施形態において、ポリＡ尾部またはポリＡ−Ｇ４分子を含む、限定されないが、ｍＲＮＡ等の核酸は、オリジオ（Ｕ）（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１３１０３６５９号を参照のこと）の添加を防止および／または阻害することができる核酸の３’領域に対する修飾によって、安定化することができる。
【０３０４】
さらに別の実施形態において、ポリＡ尾部またはポリＡ−Ｇ４分子を含む、限定されないが、ｍＲＮＡ等の核酸は、３’−デオキシヌクレオシド、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、３’−０−メチルヌクレオシド、３’−０−エチルヌクレオシド、３’−アラビノシド、ならびに当該技術分野で既知の、および／または本明細書に記載の他の修飾ヌクレオシドで終わるオリゴヌクレオチドの添加によって、安定化することができる。
定量化
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡは、１つ以上の体液由来のエクソソームにおいて定量化され得る。本明細書で使用するとき、「体液」には、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、クーパー腺液または射精前液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜および腹水、心嚢液、リンパ液、粥状液、乳糜、胆汁、間質液、帯下、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞腔液、および臍帯血が含まれる。あるいは、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、睾丸、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、および胎盤からなる群から選択される器官から回収され得る。
【０３０５】
定量化方法において、２ｍＬ未満の試料が対象から得られ、エクソソームが、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸収捕獲、親和性精製、微小流体分離、またはこれらの組み合わせによって単離される。分析において、ポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡのレベルまたは濃度は、投与された構築物の発現レベル、存在、不在、切断、または改変であり得る。このレベルを１つ以上の臨床表現型またはヒト疾患バイオマーカーについてのアッセイと相関させることは、有利である。このアッセイが、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ−ＰＣＲ、実時間ＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはこれらの組み合わせを用いて行われ得る一方で、エクソソームは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）等の免疫組織化学法を用いて単離され得る。エクソソームは、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸収捕獲、親和性精製、微小流体分離、またはこれらの組み合わせによっても単離され得る。
【０３０６】
これらの方法は、残存しているか、または送達されたポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡのレベルをリアルタイムで監視する能力を研究者に提供する。これは、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡが、構造および／または化学修飾に起因して内因性形態とは異なるといった理由から、可能である。
ＩＩ．ポリヌクレオチドの設計および合成
本発明に従って用いるポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡは、化学合成、一般にインビトロ転写（ＩＶＴ）と称される酵素合成、またはより長い前駆体の酵素的もしくは化学的切断等を含むが、これらに限定されない任意の利用可能な技法に従って調製され得る。ＲＮＡを合成する方法は、当技術分野において既知である（例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれる、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ［Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ］，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８４、およびＨｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖ．２８８（Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００５を参照のこと）。
【０３０７】
本発明の一次構築物の設計および合成のプロセスは、概して、遺伝子構築ステップ、ｍＲＮＡ産生ステップ（修飾を伴うか、または伴わない）、および精製ステップを含む。酵素合成方法において、目的とするポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチド配列が、増幅されてｃＤＮＡ鋳型を産生するベクターへの組み込みのために最初に選択される。任意に、標的ポリヌクレオチド配列および／または任意の隣接配列は、コドン最適化され得る。その後、ｃＤＮＡ鋳型を用いて、インビトロ転写（ＩＶＴ）によってｍＲＮＡを産生する。産生後、ｍＲＮＡは、精製および浄化プロセスを経り得る。これらのステップは、以下でより詳細に提供される。
遺伝子構築
遺伝子構築ステップは、遺伝子合成、ベクター増幅、プラスミド精製、プラスミド線形化および浄化、ならびにｃＤＮＡ鋳型合成および浄化を含み得るが、これらに限定されない。
遺伝子合成
目的とするポリペプチドまたは標的が産生のために選択された時点で、一次構築物が設計される。一次構築物内で、目的とするポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの第１の領域は、選択された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）転写物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を用いて構築され得る。ＯＲＦは、野生型ＯＲＦ、アイソフォーム、変異形、またはその断片を含み得る。本明細書で使用するとき、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、目的とするポリペプチドをコードすることができる核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指すよう意図される。ＯＲＦは、多くの場合、開始コドンＡＴＧで始まり、ナンセンスまたは終止コドンもしくはシグナルで終わる。
【０３０８】
さらに、第１の領域のヌクレオチド配列は、コドン最適化され得る。コドン最適化方法は、当技術分野において既知であり、いくつかの目標のうちの１つ以上を達成する取り組みにおいて有用であり得る。これらの目標には、標的および宿主生物体におけるコドン頻度を一致させて適切な折り畳みを確実にすること、ＧＣ含量を付勢させてｍＲＮＡの安定性を高めるか、または二次構造を減少させること、遺伝子構築または発現を障害し得る縦列反復コドンまたは塩基泳動を最小限に抑えること、転写および翻訳制御領域をカスタマイズすること、タンパク質輸送配列を挿入または除去すること、コードされたタンパク質における翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加すること、タンパク質ドメインを付加、除去、または組み替えること、制限部位を挿入するか、または欠失させること、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡ分解部位を修飾すること、翻訳速度を調節してタンパク質の様々なドメインの適切な折り畳みを可能にすること、あるいはｍＲＮＡ内の問題の二次構造を減少させるか、または排除することが含まれる。コドン最適化ツール、アルゴリズム、およびサービスは、当技術分野において既知であり、非限定的な例には、ＧｅｎｅＡｒｔのサービス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および／またはＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）が挙げられる。一実施形態において、ＯＲＦ配列は、最適化アルゴリズムを用いて最適化される。各アミノ酸のコドン選択肢が表５に提供される。
表５．コドン選択肢  
【０３０９】
【表０００５】
2020072766.tif 000060
【０３１０】
一実施形態において、ヌクレオチド配列がコドン最適化された後に、制限部位を含有する領域についてさらなる評価を行ってもよい。制限部位領域内の少なくとも１つのヌクレオチドを、配列から制限部位を除去するために別のヌクレオチドと置換してもよいが、ヌクレオチドの置換はコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列を変化させない。
【０３１１】
本発明のいくつかの実施形態において有益であると見なされ得る特徴は、一次構築物によってコードされ得、第１または第２の隣接領域としてＯＲＦに隣接し得る。この隣接領域は、ＯＲＦの最適化前および／または後に一次構築物に組み込まれ得る。一次構築物が５’隣接領域と３’隣接領域の両方を含有する必要はない。そのような特徴の例には、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、オリゴ（ｄＴ）配列、および検出可能なタグが挙げられるが、これらに限定されず、ＸｂａＩ認識を有し得る複数のクローニング部位も挙げられ得る。
【０３１２】
いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲが、隣接領域として提供され得る。複数の５’または３’ＵＴＲが、隣接領域に含まれ得、同一または異なる配列であり得る。隣接領域の任意の部分（そのような部分がない場合を含み）が、コドン最適化され得、それらのいずれも、独立して、コドン最適化の前および／または後に１つ以上の異なる構造または化学修飾を含有し得る。特徴の組み合わせは、第１および第２の隣接領域に含まれ得、他の特徴内に含有され得る。例えば、ＯＲＦは、ポリＡ尾部の鋳型付加のために、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有し得る５’ＵＴＲおよび／またはオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る３’ＵＴＲに隣接し得る。
【０３１３】
表２および３は、隣接領域として本発明の一次構築物において利用され得る例示のＵＴＲの一覧を提供する。代表的な本発明の５’非翻訳領域の一覧が表６に示される。Ａ、Ｔ、Ｃ、もしくはＧを含む１個以上のヌクレオチドが末端に付加されるか、または末端から除去される５’ＵＴＲの変異形が利用され得る。
表６．５’非翻訳領域
【０３１４】
【表０００６】
2020072766.tif 000061
【０３１５】
別の実施形態において、５’ＵＴＲは、第１および第２の断片が同じまたは異なる遺伝子に由来し得る、第１のポリヌクレオチド断片および第２のポリヌクレオチド断片を含んでいてもよい（例えば、ＵＳ２０１００２９３６２５およびＵＳ２０１１０２４７０９０を参照されたく、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。非限定的な例として、第１のポリヌクレオチドはイヌ、ヒト、またはマウスＳＥＲＣＡ２遺伝子であってもよく、および／または第２のポリヌクレオチド断片はウシ、マウス、ラット、またはヒツジβカゼイン遺伝子である。
【０３１６】
一実施形態において、第１のポリヌクレオチド断片は第２のポリヌクレオチド断片の５’末端に位置し得る。（例えば、ＵＳ２０１００２９３６２５およびＵＳ２０１１０２４７０９０を参照されたく、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０３１７】
別の実施形態において、第１のポリヌクレオチド断片は筋小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ遺伝子の第２のイントロンを含んでいてもよく、および／または第２のポリヌクレオチド断片は真核生物カゼイン遺伝子の５’ＵＴＲの少なくとも一部分を含む。（例えば、ＵＳ２０１００２９３６２５およびＵＳ２０１１０２４７０９０を参照されたく、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。第１のポリヌクレオチド断片はまた、筋小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ遺伝子のエクソン２および／またはエクソン３の少なくとも一部分を含んでいてもよい。（例えば、ＵＳ２０１００２９３６２５およびＵＳ２０１１０２４７０９０を参照されたく、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０３１８】
本発明の３’非翻訳領域の代表的な一覧が表７に示される。Ａ、Ｔ、Ｃ、もしくはＧを含む１個以上のヌクレオチドが末端に付加されるか、または末端から除去される３’ＵＴＲの変異形が利用され得る。
表７．３’非翻訳領域
【０３１９】
【表０００７−１】
2020072766.tif 000062
【０３２０】
【表０００７−２】
2020072766.tif 000063
【０３２１】
【表０００７−３】
2020072766.tif 000064
【０３２２】
【表０００７−４】
2020072766.tif 000065
【０３２３】
【表０００７−５】
2020072766.tif 000066
【０３２４】
【表０００７−６】
2020072766.tif 000067
【０３２５】
【表０００７−７】
2020072766.tif 000068
【０３２６】
【表０００７−８】
2020072766.tif 000069
【０３２７】
【表０００７−９】
2020072766.tif 000070
【０３２８】
先の表に列記されるものは例であり、任意の遺伝子由来の任意のＵＴＲが一次構築物のそれぞれの第１または第２の隣接領域に組み込まれ得ることを理解されたい。さらに、任意の既知の遺伝子の複数の野生型ＵＴＲが利用され得る。野生型遺伝子の変異形ではない人工ＵＴＲを提供することも本発明の範囲内である。これらのＵＴＲもしくはその部分は、それらが選択され得る転写物のＵＴＲもしくはその部分と同一の配向で配置され得るか、または配向もしくは位置を変更し得る。したがって、５’または３’ＵＴＲは、反転し、短縮され、延長され、１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲでキメラにされ得る。本明細書で使用する「変更される」という用語は、ＵＴＲ配列に関するとき、ＵＴＲが参照配列との関連である点において変化したことを意味する。例えば、３’または５’ＵＴＲは、上で教示される配向もしくは位置の変化によって野生型または天然ＵＴＲに対して変更され得るか、またはさらなるヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換もしくは転置によって変更され得る。「変更された」ＵＴＲ（３’または５’にかかわらず）をもたらすこれらの変化のうちのいずれかは、変異形ＵＴＲを含む。
【０３２９】
一実施形態において、５’または３’ＵＴＲ等の二重、三重、または四重ＵＴＲが用いられ得る。本明細書で使用するとき、「二重」ＵＴＲは、同一のＵＴＲの２つのコピーが連続して、または実質的に連続してのいずれかでコードされるものである。例えば、内容が参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１００１２９８７７号に記載の二重β−グロビン３’ＵＴＲが用いられ得る。
【０３３０】
パターン化されたＵＴＲを有することも本発明の範囲内である。本明細書で使用するとき、「パターン化されたＵＴＲ」は、１回、２回、または３回以上繰り返された繰り返しまたは交互のパターン、例えば、ＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたはその変異形を示すＵＴＲである。これらのパターンにおいて、各文字、Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルでの異なるＵＴＲを表す。
【０３３１】
一実施形態において、隣接領域は、そのタンパク質が共通の機能、構造、特性特徴を共有する転写物のファミリーから選択される。例えば、目的とするポリペプチドは、特定の細胞、組織で発現するか、または発生中のある時点で発現するタンパク質のファミリーに属し得る。これらの遺伝子のうちのいずれのＵＴＲも、同一または異なるタンパク質ファミリーの任意の他のＵＴＲと交換されて、新たなキメラ一次転写物を作成し得る。本明細書で使用するとき、「タンパク質のファミリー」は、最も広い意味において、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する２個以上の目的とするポリペプチドの群を指すために用いられる。
【０３３２】
最適化後（所望の場合）、一次構築物成分は、プラスミド、ウイルス、コスミド、および人工染色体等であるが、これらに限定されないベクターに再構築および変換され得る。例えば、最適化された構築物は、化学的にコンピテントな大腸菌、酵母、アカパンカビ、トウモロコシ、ショウジョウバエ等に再構築および変換され得、高コピー数のプラスミド様または染色体構造は、本明細書に記載の方法によって生じる。
終止コドン
一実施形態において、本発明の一次構築物は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも２つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、ＴＧＡ、ＴＡＡ、およびＴＡＧから選択され得る。一実施形態において、本発明の一次構築物は、終止コドンＴＧＡおよびもう１つの終止コドンを含む。さらなる実施形態において、もう１つの終止コドンは、ＴＡＡであり得る。
ベクター増幅
一次構築物を含有するベクターは、その後、増幅され、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＨｉＰｕｒｅ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキット（カリフォルニア州カールスバッド）を用いたマキシプレップ等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いてプラスミドが単離および精製される。
プラスミド線形化
プラスミドは、その後、制限酵素および緩衝液の使用等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて線形化され得る。線形化反応物は、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲマイクロキット（カリフォルニア州カールスバッド）、ならびに強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）等であるが、これらに限定されないＨＰＬＣに基づく精製方法、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの標準ＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲキット（カリフォルニア州カールスバッド）を含む方法を用いて精製され得る。精製方法は、もたらされた線形化反応物の大きさに応じて修正され得る。その後、線形化されたプラスミドを用いて、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応のためのｃＤＮＡを生成する。ｃＤＮＡ鋳型合成
ｃＤＮＡ鋳型は、線形化されたプラスミドにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を経させることによって合成され得る。表８は、本発明のＰＣＲ反応において有用であり得るプライマーおよびプローブの一覧である。この一覧が網羅的ではなく、任意の増幅のためのプライマー−プローブ設計が当技術分野の技術の範囲内であることを理解されたい。プローブは、標的分子に対する塩基対合忠実性および塩基対合強度を高めるように化学的に修飾された塩基も含有し得る。そのような修飾には、５−メチル−シチジン、２、６−ジ−アミノ−プリン、２’−フルオロ、ホスホロ−チオエート、またはロックド核酸が含まれ得る。
表８．プライマーおよびプローブ  
【０３３３】
【表０００８】
2020072766.tif 000071
【０３３４】
＊ＵＦＰはユニバーサル順方向プライマーであり、ＵＲＰはユニバーサル逆方向プライマーである。
一実施形態において、ｃＤＮＡは、転写を経る前に配列決定分析のために提出され得る。
ポリヌクレオチド産生
ポリヌクレオチド産生のプロセスは、インビトロ転写、ｃＤＮＡ鋳型除去およびＲＮＡ浄化、ならびにキャッピングおよび／またはテーリング反応を含み得るが、これらに限定されない。
インビトロ転写
先のステップで産生されたｃＤＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）系を用いて転写され得る。この系は、典型的には、転写緩衝液、ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、およびポリメラーゼを含む。ＮＴＰは、自家で製造され得るか、供給業者から選択され得るか、または本明細書に記載されるように合成され得る。ＮＴＰは、天然および非天然（修飾された）ＮＴＰを含む本明細書に記載のＮＴＰから選択され得るが、これらに限定されない。ポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、および修飾された核酸に組み込むことができるポリメラーゼ等であるが、これらに限定されない変異体ポリメラーゼから選択され得るが、これらに限定されない。ＲＮＡポリメラーゼ
任意の数のＲＮＡポリメラーゼまたは変異形が本発明の一次構築物の設計において用いられ得る。
【０３３５】
ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ配列のアミノ酸を挿入するか、または欠失させることによって修飾され得る。非限定的な例として、ＲＮＡポリメラーゼは、未修飾ＲＮＡポリメラーゼと比較して、２’−修飾ヌクレオチドトリホスフェートを組み込む能力の向上を示すように修飾され得る（参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００８０７８１８０号および米国特許第８，１０１，３８５号を参照のこと）。
【０３３６】
変異形は、ＲＮＡポリメラーゼを進化させ、ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸および／または核酸配列を最適化し、かつ／または当技術分野で既知の他の方法を用いることによって得られ得る。非限定的な例として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ変異形は、Ｅｓｖｅｌｔら（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７２（７３４４）：４９９−５０３）によって立案された連続指向進化システムを用いて進化させられ得、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのクローンは、９３位のリジンがトレオニンで置換された変異（Ｋ９３Ｔ）、Ｉ４Ｍ、Ａ７Ｔ、Ｅ６３Ｖ、Ｖ６４Ｄ、Ａ６５Ｅ、Ｄ６６Ｙ、Ｔ７６Ｎ、Ｃ１２５Ｒ、Ｓ１２８Ｒ、Ａ１３６Ｔ、Ｎ１６５Ｓ、Ｇ１７５Ｒ、Ｈ１７６Ｌ、Ｙ１７８Ｈ、Ｆ１８２Ｌ、Ｌ１９６Ｆ、Ｇ１９８Ｖ、Ｄ２０８Ｙ、Ｅ２２２Ｋ、Ｓ２２８Ａ、Ｑ２３９Ｒ、Ｔ２４３Ｎ、Ｇ２５９Ｄ、Ｍ２６７Ｉ、Ｇ２８０Ｃ、Ｈ３００Ｒ、Ｄ３５１Ａ、Ａ３５４Ｓ、Ｅ３５６Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ａ３８３Ｖ、Ｙ３８５Ｃ、Ｄ３８８Ｙ、Ｓ３９７Ｒ、Ｍ４０１Ｔ、Ｎ４１０Ｓ、Ｋ４５０Ｒ、Ｐ４５１Ｔ、Ｇ４５２Ｖ、Ｅ４８４Ａ、Ｈ５２３Ｌ、Ｈ５２４Ｎ、Ｇ５４２Ｖ、Ｅ５６５Ｋ、Ｋ５７７Ｅ、Ｋ５７７Ｍ、Ｎ６０１Ｓ、Ｓ６８４Ｙ、Ｌ６９９Ｉ、Ｋ７１３Ｅ、Ｎ７４８Ｄ、Ｑ７５４Ｒ、Ｅ７７５Ｋ、Ａ８２７Ｖ、Ｄ８５１Ｎ、またはＬ８６４Ｆ等であるが、これらに限定されない少なくとも１つの変異をコードし得る。別の非限定的な例として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ変異形は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１００１２００２４号および同第２００７０１１７１１２号に記載の少なくとも１つの変異をコードし得る。ＲＮＡポリメラーゼの変異形には、置換変異形、保存アミノ酸置換、挿入変異形、欠失変異形、および／または共有結合誘導体も含まれ得るが、これらに限定されない。
【０３３７】
一実施形態において、一次構築物は、野生型または変異形ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるように設計され得る。そうすることで、一次構築物は、野生型または親一次構築物由来の配列変化部位または領域を含有するように修飾され得る。
【０３３８】
一実施形態において、一次構築物は、５’ＵＴＲ内、５’ＵＴＲの前、および／または５’ＵＴＲの後に、少なくとも１つの置換および／または挿入を、一次構築物のＲＮＡポリメラーゼ結合または認識部位の上流、ＲＮＡポリメラーゼ結合または認識部位の下流、ＴＡＴＡボックス配列の上流、ＴＡＴＡボックス配列の下流であるが、一次構築物のコーディング領域の上流に含むように設計され得る。
【０３３９】
一実施形態において、一次構築物の５’ＵＴＲは、同一の塩基のヌクレオチドの少なくとも１つの領域および／またはストリングの挿入によって置換され得る。ヌクレオチドの領域および／またはストリングは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８個のヌクレオチドを含み得るが、これらに限定されず、このヌクレオチドは、天然および／または非天然であり得る。非限定的な例として、このヌクレオチド基は、５〜８個のアデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示の他のヌクレオチドのうちのいずれかのストリング、および／またはこれらの組み合わせを含み得る。
【０３４０】
一実施形態において、一次構築物の５’ＵＴＲは、アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示の他のヌクレオチドのうちのいずれか、および／またはこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない２つの異なる塩基のヌクレオチドの少なくとも２つの領域および／またはストリングの挿入によって置換され得る。例えば、５’ＵＴＲは、５〜８個のアデニン塩基を挿入し、その後、５〜８個のシトシン塩基を挿入することによって置換され得る。別の例において、５’ＵＴＲは、５〜８個のシトシン塩基を挿入し、その後、５〜８個のアデニン塩基を挿入することによって置換され得る。
【０３４１】
一実施形態において、一次構築物は、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得る転写開始部位の下流に少なくとも１つの置換および／または挿入を含み得る。非限定的な例として、少なくとも１つの置換および／または挿入は、転写開始部位のすぐ下流（＋１〜＋６等であるが、これらに限定されない）の領域内の少なくとも１個の核酸を置換することによって転写開始部位の下流で生じ得る。転写開始部位のすぐ下流のヌクレオチド領域を変化させることにより、開始速度に影響を及ぼし、見かけ上のヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）反応一定値を増加させ、かつ初期転写物を硬化させることによる転写複合体からの短い転写物の解離を高め得る（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｒｉｅｂａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１：５１４４−５１４９）。少なくとも１個の核酸の修飾、置換、および／または挿入は、核酸配列のサイレント変異を引き起こし得るか、またはアミノ酸配列における変異を引き起こし得る。
【０３４２】
一実施形態において、一次構築物は、転写開始部位の下流で、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３個のグアニン塩基の置換を含み得る。
【０３４３】
一実施形態において、一次構築物は、転写開始部位のすぐ下流の領域において、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６個のグアニン塩基の置換を含み得る。非限定的な例として、その領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡであるとき、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４個のアデニンヌクレオチドによって置換され得る。別の非限定的な例において、その領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡであるとき、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４個のシトシン塩基によって置換され得る。別の非限定的な例において、その領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡであるとき、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、もしくは少なくとも４個のチミン、および／または本明細書に記載のヌクレオチドのうちのいずれかによって置換され得る。
【０３４４】
一実施形態において、一次構築物は、開始コドンの上流に少なくとも１つの置換および／または挿入を含み得る。明確化のために、当業者は、開始コドンがタンパク質コーディング領域の第１のコドンである一方で、転写開始部位が、転写が始まる部位であることを理解する。一次構築物は、ヌクレオチド塩基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、もしくは少なくとも８つの置換および／または挿入を含み得るが、これらに限定されない。ヌクレオチド塩基は、開始コドンの上流の１つ、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４、もしくは少なくとも５つの位置に挿入または置換され得る。挿入および／または置換されたヌクレオチドは、同一の塩基（例えば、すべてＡもしくはすべてＣもしくはすべてＴもしくはすべてＧ）、２個の異なる塩基（例えば、ＡおよびＣ、ＡおよびＴ、もしくはＣおよびＴ）、３個の異なる塩基（例えば、Ａ、Ｃ、およびＴ、もしくはＡ、Ｃ、およびＴ）、または少なくとも４個の異なる塩基であり得る。非限定的な例として、一次構築物内のコーディング領域の上流のグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミン、または本明細書に記載のヌクレオチドのうちのいずれかで置換され得る。別の非限定的な例において、一次構築物におけるグアニン塩基の置換は、転写開始部位の下流であり、かつ開始コドンの前の領域に１個のグアニン塩基を残すように設計され得る（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７２（７３４４）：４９９−５０３を参照のこと）。非限定的な例として、少なくとも５個のヌクレオチドは、転写開始部位の下流および開始コドンの上流の１つの位置に挿入され得、少なくとも５個のヌクレオチドは、同一の塩基型であり得る。
ｃＤＮＡ鋳型除去および浄化
ｃＤＮＡ鋳型は、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ  Ｉ）での処理等であるが、これに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて除去され得る。ＲＮＡ浄化は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（マサチューセッツ州ダンバース）のＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ＣＬＥＡＮＳＥＱ（登録商標）システム；強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）等であるが、これらに限定されないＨＰＬＣに基づく精製方法等であるが、これらに限定されない精製方法も含み得る。
キャッピングおよび／またはテーリング反応
一次構築物またはｍｍＲＮＡは、キャッピングおよび／またはテーリング反応も経り得る。キャッピング反応は、５’キャップを一次構築物の５’末端に付加する当技術分野で既知の方法を用いて行われ得る。キャッピングのための方法には、ワクシニアキャッピング酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）の使用が含まれるが、これに限定されない。
【０３４５】
ポリＡテーリング反応は、２’Ｏ−メチルトランスフェラーゼおよび本明細書に記載の方法等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて行われ得る。ｃＤＮＡから生成された一次構築物がポリＴを含まない場合、一次構築物が浄化される前にポリＡテーリング反応を行うことは有益であり得る。
精製
一次構築物またはｍｍＲＮＡ精製は、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ浄化、品質保証、および品質管理を含み得るが、これらに限定されない。ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ浄化は、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、マサチューセッツ州ダンバース）；ポリＴビーズ；ＬＮＡ（商標）オリゴＴ捕捉プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ、Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）；または強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）等であるが、これらに限定されないＨＰＬＣに基づく精製方法等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて行われ得る。「精製されたｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ」等の「精製された」という用語は、ポリヌクレオチドとの関連で用いられるとき、少なくとも１つの混入物質から分離されるものを指す。本明細書で使用するとき、「混入物質」とは、別の物質を不適切、不純、または劣性にする任意の物質である。したがって、精製されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、天然に見られる形態もしくは環境とは異なる形態もしくは環境、またはそれを処理もしくは精製方法に供する前に存在した形態もしくは環境とは異なる形態もしくは環境において存在する。
【０３４６】
品質保証および／または品質管理検査は、ゲル電気泳動、紫外線吸収、または分析的ＨＰＬＣ等であるが、これらに限定されない方法を用いて行われ得る。
別の実施形態において、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡは、逆転写ＰＣＲを含むが、これに限定されない方法を用いて配列決定され得る。
【０３４７】
一実施形態において、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡは、紫外可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）等であるが、これに限定されない方法を用いて定量化され得る。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的な例には、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）がある。定量化されたｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡが適切な大きさであり得るかを決定し、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡの分解が生じていないことを確認するために分析され得る。ｍＲＮＡおよび／またはｍｍＲＮＡの分解は、アガロースゲル電気泳動；強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）等であるが、これらに限定されないＨＰＬＣに基づく精製方法；液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）；キャピラリー電気泳動（ＣＥ）；ならびにキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）等であるが、これらに限定されない方法を用いて確認され得る。シグナルペプチドまたはタンパク質
一次構築物またはｍｍＲＮＡは、ポリペプチドの治療関連部位への輸送を促進するさらなる特徴もコードし得る。タンパク質輸送を支援するそのような特徴の１つに、シグナルペプチド配列がある。本明細書で使用するとき、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」とは、それぞれ、コーディング領域またはコードされたポリペプチドの５’（またはＮ末端）に組み込まれる、それぞれ、約９〜２００ヌクレオチド長（３〜６０アミノ酸長）のポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。これらの配列の付加は、１つ以上の分泌経路を通るコードされたポリペプチドの小胞体への輸送をもたらす。いくつかのシグナルペプチドは、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
【０３４８】
表９は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡをコードするために組み込まれ得るシグナルタンパク質またはペプチドの代表的な一覧である。
表９．シグナルペプチド  
【０３４９】
【表０００９−１】
2020072766.tif 000072
【０３５０】
【表０００９−２】
2020072766.tif 000073
【０３５１】
【表０００９−３】
2020072766.tif 000074
【０３５２】
【表０００９−４】
2020072766.tif 000075
【０３５３】
【表０００９−５】
2020072766.tif 000076
【０３５４】
【表０００９−６】
2020072766.tif 000077
【０３５５】
表９において、ＳＳは分泌シグナルであり、ＭＬＳはミトコンドリアリーダーシグナルである。本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、配列番号９８〜１５９のシグナルペプチド配列のうちのいずれか、またはその断片もしくは変異形をコードするように設計され得る。これらの配列は、ポリペプチドコーディング領域の最初、中間、もしくは最後に含まれ得るか、またはあるいは隣接領域に含まれ得る。さらに、本発明のポリヌクレオチド一次構築物のうちのいずれかは、配列番号３６〜９７によって定義される配列のうちの１つ以上も含み得る。これらは、第１の領域またはいずれかの隣接領域に存在し得る。
【０３５６】
本発明において利用され得るさらなるシグナルペプチド配列は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／またはｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／で見出されるデータベース等のデータベースに教示されるシグナル配列を含む。米国特許第８，１２４，３７９号、同第７，４１３，８７５号、および同第７，３８５，０３４号に記載のものも本発明の範囲内であり、これら各々の内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０３５７】
一実施形態において、修飾核酸分子は核局在化シグナル（ＮＬＳ）および／または核外輸送シグナル（ＮＥＳ）をコードする核酸配列を含み得る。一態様において、修飾核酸分子は核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする核酸配列を含み得る。ＮＬＳをコードする修飾核酸分子は核内にポリペプチドを輸送し、生存または死のシグナルを核の微小環境に送達することができる。別の態様において、修飾核酸分子はＮＥＳ１および／またはＮＥＳ２等の核外輸送シグナルをコードする拡散配列を含み得る。非限定的な例として、修飾核酸分子は、ＨＩＦ１−αと相互作用して癌細胞のトランスクリプトーム（ｔｒａｎｓｃｒｉｔｏｍｅ）を変化させるために、翻訳可能ではないＮＥＳ１、ＮＥＳ２、およびＮＬＳシグナル、ならびにオンコロジー関連ポリペプチド、または組換え（ｓｃａｍｂｌｅｄ）配列をコードすることができる。
標的選択
本発明にしたがって、一次構築物は、少なくとも１つの目的とするポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの少なくとも第１の領域を含む。本発明の目的とするポリペプチドまたは「標的」またはタンパク質およびペプチドは、２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８６２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８６６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８６８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８７０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６４９号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１３９号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８７３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６５０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１４７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８７８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６５４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１５２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８８５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６５８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１５５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ
Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，８９６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年７月５日出願の米国仮特許出願第６１／６６８，１５７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６６１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１６０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９１１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６６７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１６８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９２２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６７５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１７４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９３５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６８７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１８４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９４５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，６９６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，１９１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１２年４月２日出願の米国仮特許出願第６１／６１８，９５３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１２年８月１０日出願の米国仮特許出願第６１／６８１，７０４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１２年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７３７，２０３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、米国仮特許出願第６１／７５３，６６１号、表題「Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ
Ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６２号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６３号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｏｅｔｉｄｅｓ」；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６４号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００５９号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６６号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日
出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６１号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６８号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」；２０１３年３月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００７０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ
Ｏｎｃｏｌｏｇｙ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」；および２０１３年３月１５日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３１８２１号、表題「Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」に列挙され、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
タンパク質切断シグナルおよび部位
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも１個のタンパク質切断部位を含有する少なくとも１個のタンパク質切断シグナルを含み得る。タンパク質切断部位は、Ｎ末端とＣ末端の真ん中、Ｎ末端と中間点との間、中間点とＣ末端との間、およびこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されないＮ末端とＣ末端との間の任意の空間で、Ｎ末端、Ｃ末端に位置し得る。
【０３５８】
本発明のポリペプチドは、プロタンパク質コンバターゼ（またはプロホルモンコンバターゼ）、トロンビン、または第Ｘａ因子タンパク質切断シグナルを含み得るが、これらに限定されない。プロタンパク質コンバターゼは、プロホルモンコンバターゼ１／３（ＰＣ１／３）、ＰＣ２、フーリン、ＰＣ４、ＰＣ５／６、対合塩基性アミノ酸切断酵素４（ＰＡＣＥ４）、およびＰＣ７として既知の酵母ケキシンに関連した７個の塩基性アミノ酸特異的サブチリシン様セリンプロテイナーゼと、サブチリシンケキシンアイソザイム１（ＳＫＩ−１）およびプロタンパク質コンバターゼサブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）と呼ばれる非塩基性残基で切断する他の２個のサブチラーゼを含む９個のプロテイナーゼのファミリーである。タンパク質切断シグナルアミノ酸配列の非限定的な例が表１０に列記される。表１０において、「Ｘ」は、任意のアミノ酸を指し、「ｎ」は、０、２、４、または６個のアミノ酸であり得、「＊」は、タンパク質切断部位を指す。表１０において、配列番号１６２は、ｎが４であるときを指し、配列番号１６３は、ｎが６であるときを指す。
表１０．タンパク質切断部位配列  
【０３５９】
【表００１０】
2020072766.tif 000078
【０３６０】
一実施形態において、本発明の一次構築物、修飾核酸、およびｍｍＲＮＡは、一次構築物、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡが少なくとも１個のコードされたタンパク質切断シグナルを含有するように操作され得る。コードされたタンパク質切断シグナルは、開始コドンの前、開始コドンの後、コーディング領域の前、コーディング領域内に位置し得、例えば、コーディング領域の中間、開始コドンと中間点との間、中間点と終止コドンとの間、コーディング領域の後、終止コドンの後、２つの終止コドンの間、終止コドンの後、およびこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない。
【０３６１】
一実施形態において、本発明の一次構築物またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１個のタンパク質切断部位を含有する少なくとも１個のコードされたタンパク質切断シグナルを含み得る。コードされたタンパク質切断シグナルは、プロタンパク質コンバターゼ（もしくはプロホルモンコンバターゼ）、トロンビン、および／または第Ｘａ因子タンパク質切断シグナルを含み得るが、これらに限定されない。当業者であれば、上の表５または他の既知の方法を用いて、本発明の一次構築物、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡに含める適切なコードされたタンパク質切断シグナルを決定することができる。例えば、表１０のシグナルから始め、表５のコドンを考慮して、結果として生じるポリペプチドにおいてタンパク質シグナルを生成し得る一次構築物のシグナルを設計することができる。
【０３６２】
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも１個のタンパク質切断シグナルおよび／または部位を含む。
非限定的な例として、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，３７４，９３０号および米国特許公開第２００９０２２７６６０号は、フーリン切断部位を用いて、発現産物におけるＧＬＰ−１のＮ末端メチオニンをその細胞のゴルジ装置から切断する。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも１個のタンパク質切断シグナルおよび／または部位を含むが、但し、ポリペプチドがＧＬＰ−１ではないことを条件とする。
【０３６３】
一実施形態において、本発明の一次構築物、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１個のコードされたタンパク質切断シグナルおよび／または部位を含む。
一実施形態において、本発明の一次構築物、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１個のコードされたタンパク質切断シグナルおよび／または部位を含むが、但し、一次構築物、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡがＧＬＰ−１をコードしないことを条件とする。
【０３６４】
一実施形態において、本発明の一次構築物、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡは、２つ以上のコーディング領域を含み得る。複数のコーディング領域が本発明の一次構築物、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡに存在する場合、複数のコーディング領域は、コードされたタンパク質切断部位によって分離され得る。非限定的な例として、一次構築物、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡは、順序付けられたパターンで書き込まれ得る。そのようなパターンは、ＡＸＢＹ形態に従い、式中、ＡおよびＢは、同一もしくは異なるコーディング領域であり得、かつ／または同一もしくは異なるポリペプチドをコードし得るコーディング領域であり、ＸおよびＹは、同一もしくは異なるタンパク質切断シグナルをコードし得るコードされたタンパク質切断シグナルである。第２のそのようなパターンは、ＡＸＹＢＺ形態に従い、式中、ＡおよびＢは、同一もしくは異なるコーディング領域であり得、かつ／または同一もしくは異なるポリペプチドをコードし得るコーディング領域であり、Ｘ、Ｙ、およびＺは、同一もしくは異なるタンパク質切断シグナルをコードし得るコードされたタンパク質切断シグナルである。第３のパターンは、ＡＢＸＣＹ形態に従い、Ａ、Ｂ、およびＣは、同一もしくは異なるコーディング領域であり得、かつ／または同一もしくは異なるポリペプチドをコードし得るコーディング領域であり、ＸおよびＹは、同一もしくは異なるタンパク質切断シグナルをコードし得るコードされたタンパク質切断シグナルである。
【０３６５】
一実施形態において、ポリペプチド、一次構築物および、ｍｍＲＮＡは、ポリペプチド、一次構築物、およびｍｍＲＮＡがタンパク質切断部位に特異的なプロテアーゼでの処理によって担体領域または融合パートナーから放出され得るように、前述のタンパク質切断部位をコードする配列も含有し得る。
【０３６６】
表１１は、ｍｉＲおよびｍｉＲ結合部位（ｍｉＲ  ＢＳ）、ならびに本発明で用いられ得るそれらの配列の非包括的なリストである。
表１１．Ｍｉｒおよびｍｉｒ結合部位  
【０３６７】
【表００１１−１】
2020072766.tif 000079
【０３６８】
【表００１１−２】
2020072766.tif 000080
【０３６９】
【表００１１−３】
2020072766.tif 000081
【０３７０】
【表００１１−４】
2020072766.tif 000082
【０３７１】
【表００１１−５】
2020072766.tif 000083
【０３７２】
【表００１１−６】
2020072766.tif 000084
【０３７３】
【表００１１−７】
2020072766.tif 000085
【０３７４】
【表００１１−８】
2020072766.tif 000086
【０３７５】
【表００１１−９】
2020072766.tif 000087
【０３７６】
【表００１１−１０】
2020072766.tif 000088
【０３７７】
【表００１１−１１】
2020072766.tif 000089
【０３７８】
【表００１１−１２】
2020072766.tif 000090
【０３７９】
【表００１１−１３】
2020072766.tif 000091
【０３８０】
【表００１１−１４】
2020072766.tif 000092
【０３８１】
【表００１１−１５】
2020072766.tif 000093
【０３８２】
【表００１１−１６】
2020072766.tif 000094
【０３８３】
【表００１１−１７】
2020072766.tif 000095
【０３８４】
【表００１１−１８】
2020072766.tif 000096
【０３８５】
【表００１１−１９】
2020072766.tif 000097
【０３８６】
【表００１１−２０】
2020072766.tif 000098
【０３８７】
【表００１１−２１】
2020072766.tif 000099
【０３８８】
【表００１１−２２】
2020072766.tif 000100
【０３８９】
【表００１１−２３】
2020072766.tif 000101
【０３９０】
【表００１１−２４】
2020072766.tif 000102
【０３９１】
【表００１１−２５】
2020072766.tif 000103
【０３９２】
【表００１１−２６】
2020072766.tif 000104
【０３９３】
【表００１１−２７】
2020072766.tif 000105
【０３９４】
【表００１１−２８】
2020072766.tif 000106
【０３９５】
【表００１１−２９】
2020072766.tif 000107
【０３９６】
【表００１１−３０】
2020072766.tif 000108
【０３９７】
【表００１１−３１】
2020072766.tif 000109
【０３９８】
【表００１１−３２】
2020072766.tif 000110
【０３９９】
【表００１１−３３】
2020072766.tif 000111
【０４００】
【表００１１−３４】
2020072766.tif 000112
【０４０１】
【表００１１−３５】
2020072766.tif 000113
【０４０２】
【表００１１−３６】
2020072766.tif 000114
【０４０３】
【表００１１−３７】
2020072766.tif 000115
【０４０４】
【表００１１−３８】
2020072766.tif 000116
【０４０５】
【表００１１−３９】
2020072766.tif 000117
【０４０６】
【表００１１−４０】
2020072766.tif 000118
【０４０７】
【表００１１−４１】
2020072766.tif 000119
【０４０８】
【表００１１−４２】
2020072766.tif 000120
【０４０９】
【表００１１−４３】
2020072766.tif 000121
【０４１０】
【表００１１−４４】
2020072766.tif 000122
【０４１１】
【表００１１−４５】
2020072766.tif 000123
【０４１２】
【表００１１−４６】
2020072766.tif 000124
【０４１３】
【表００１１−４７】
2020072766.tif 000125
【０４１４】
【表００１１−４８】
2020072766.tif 000126
【０４１５】
【表００１１−４９】
2020072766.tif 000127
【０４１６】
【表００１１−５０】
2020072766.tif 000128
【０４１７】
【表００１１−５１】
2020072766.tif 000129
【０４１８】
【表００１１−５２】
2020072766.tif 000130
【０４１９】
表１２に示すように、マイクロＲＮＡは異なる組織および細胞で差次的に発現し、多くの場合、疾患の異なる型（例えば、癌細胞）と関連する。マイクロＲＮＡ結合部位、または任意の組み合わせの除去または挿入の決定は、癌細胞におけるマイクロＲＮＡ発現パターンおよびそれらのプロファイリングに応じる。表１２において、「ＨＣＣ」は肝細胞癌を表し、「ＡＬＬ」は急性リンパ性白血病を表し、「ＲＣＣ」は腎臓細胞癌を表し、「ＣＬＬ」は慢性リンパ性白血病を表し、「ＭＡＬＴ」は粘膜内リンパ組織を表す。
表１２．ｍｉｓ、組織/細胞発現、および疾患  
【０４２０】
【表００１２−１】
2020072766.tif 000131
【０４２１】
【表００１２−２】
2020072766.tif 000132
【０４２２】
【表００１２−３】
2020072766.tif 000133
【０４２３】
【表００１２−４】
2020072766.tif 000134
【０４２４】
【表００１２−５】
2020072766.tif 000135
【０４２５】
【表００１２−６】
2020072766.tif 000136
【０４２６】
【表００１２−７】
2020072766.tif 000137
【０４２７】
【表００１２−８】
2020072766.tif 000138
【０４２８】
【表００１２−９】
2020072766.tif 000139
【０４２９】
【表００１２−１０】
2020072766.tif 000140
【０４３０】
【表００１２−１１】
2020072766.tif 000141
【０４３１】
【表００１２−１２】
2020072766.tif 000142
【０４３２】
【表００１２−１３】
2020072766.tif 000143
【０４３３】
【表００１２−１４】
2020072766.tif 000144
【０４３４】
【表００１２−１５】
2020072766.tif 000145
【０４３５】
【表００１２−１６】
2020072766.tif 000146
【０４３６】
【表００１２−１７】
2020072766.tif 000147
【０４３７】
【表００１２−１８】
2020072766.tif 000148
【０４３８】
【表００１２−１９】
2020072766.tif 000149
【０４３９】
【表００１２−２０】
2020072766.tif 000150
【０４４０】
【表００１２−２１】
2020072766.tif 000151
【０４４１】
【表００１２−２２】
2020072766.tif 000152
【０４４２】
【表００１２−２３】
2020072766.tif 000153
【０４４３】
【表００１２−２４】
2020072766.tif 000154
【０４４４】
【表００１２−２５】
2020072766.tif 000155
【０４４５】
【表００１２−２６】
2020072766.tif 000156
【０４４６】
【表００１２−２７】
2020072766.tif 000157
【０４４７】
【表００１２−２８】
2020072766.tif 000158
【０４４８】
【表００１２−２９】
2020072766.tif 000159
【０４４９】
【表００１２−３０】
2020072766.tif 000160
【０４５０】
【表００１２−３１】
2020072766.tif 000161
【０４５１】
【表００１２−３２】
2020072766.tif 000162
【０４５２】
【表００１２−３３】
2020072766.tif 000163
【０４５３】
【表００１２−３４】
2020072766.tif 000164
【０４５４】
【表００１２−３５】
2020072766.tif 000165
【０４５５】
【表００１２−３６】
2020072766.tif 000166
【０４５６】
【表００１２−３７】
2020072766.tif 000167
【０４５７】
【表００１２−３８】
2020072766.tif 000168
【０４５８】
【表００１２−３９】
2020072766.tif 000169
【０４５９】
【表００１２−４０】
2020072766.tif 000170
【０４６０】
【表００１２−４１】
2020072766.tif 000171
【０４６１】
【表００１２−４２】
2020072766.tif 000172
【０４６２】
【表００１２−４３】
2020072766.tif 000173
【０４６３】
【表００１２−４４】
2020072766.tif 000174
【０４６４】
【表００１２−４５】
2020072766.tif 000175
【０４６５】
【表００１２−４６】
2020072766.tif 000176
【０４６６】
【表００１２−４７】
2020072766.tif 000177
【０４６７】
【表００１２−４８】
2020072766.tif 000178
【０４６８】
【表００１２−４９】
2020072766.tif 000179
【０４６９】
【表００１２−５０】
2020072766.tif 000180
【０４７０】
【表００１２−５１】
2020072766.tif 000181
【０４７１】
【表００１２−５２】
2020072766.tif 000182
【０４７２】
【表００１２−５３】
2020072766.tif 000183
【０４７３】
【表００１２−５４】
2020072766.tif 000184
【０４７４】
【表００１２−５５】
2020072766.tif 000185
【０４７５】
【表００１２−５６】
2020072766.tif 000186
【０４７６】
【表００１２−５７】
2020072766.tif 000187
【０４７７】
【表００１２−５８】
2020072766.tif 000188
【０４７８】
【表００１２−５９】
2020072766.tif 000189
【０４７９】
【表００１２−６０】
2020072766.tif 000190
【０４８０】
【表００１２−６１】
2020072766.tif 000191
【０４８１】
【表００１２−６２】
2020072766.tif 000192
【０４８２】
【表００１２−６３】
2020072766.tif 000193
【０４８３】
【表００１２−６４】
2020072766.tif 000194
【０４８４】
【表００１２−６５】
2020072766.tif 000195
【０４８５】
【表００１２−６６】
2020072766.tif 000196
【０４８６】
【表００１２−６７】
2020072766.tif 000197
【０４８７】
【表００１２−６８】
2020072766.tif 000198
【０４８８】
【表００１２−６９】
2020072766.tif 000199
【０４８９】
【表００１２−７０】
2020072766.tif 000200
【０４９０】
【表００１２−７１】
2020072766.tif 000201
【０４９１】
【表００１２−７２】
2020072766.tif 000202
【０４９２】
【表００１２−７３】
2020072766.tif 000203
【０４９３】
【表００１２−７４】
2020072766.tif 000204
【０４９４】
【表００１２−７５】
2020072766.tif 000205
【０４９５】
【表００１２−７６】
2020072766.tif 000206
【０４９６】
【表００１２−７７】
2020072766.tif 000207
【０４９７】
【表００１２−７８】
2020072766.tif 000208
【０４９８】
【表００１２−７９】
2020072766.tif 000209
【０４９９】
【表００１２−８０】
2020072766.tif 000210
【０５００】
【表００１２−８１】
2020072766.tif 000211
【０５０１】
【表００１２−８２】
2020072766.tif 000212
【０５０２】
【表００１２−８３】
2020072766.tif 000213
【０５０３】
【表００１２−８４】
2020072766.tif 000214
【０５０４】
【表００１２−８５】
2020072766.tif 000215
【０５０５】
【表００１２−８６】
2020072766.tif 000216
【０５０６】
【表００１２−８７】
2020072766.tif 000217
【０５０７】
【表００１２−８８】
2020072766.tif 000218
【０５０８】
【表００１２−８９】
2020072766.tif 000219
【０５０９】
【表００１２−９０】
2020072766.tif 000220
【０５１０】
【表００１２−９１】
2020072766.tif 000221
【０５１１】
【表００１２−９２】
2020072766.tif 000222
【０５１２】
【表００１２−９３】
2020072766.tif 000223
【０５１３】
【表００１２−９４】
2020072766.tif 000224
【０５１４】
【表００１２−９５】
2020072766.tif 000225
【０５１５】
【表００１２−９６】
2020072766.tif 000226
【０５１６】
【表００１２−９７】
2020072766.tif 000227
【０５１７】
【表００１２−９８】
2020072766.tif 000228
【０５１８】
【表００１２−９９】
2020072766.tif 000229
【０５１９】
【表００１２−１００】
2020072766.tif 000230
【０５２０】
【表００１２−１０１】
2020072766.tif 000231
【０５２１】
【表００１２−１０２】
2020072766.tif 000232
【０５２２】
【表００１２−１０３】
2020072766.tif 000233
【０５２３】
【表００１２−１０４】
2020072766.tif 000234
【０５２４】
【表００１２−１０５】
2020072766.tif 000235
【０５２５】
【表００１２−１０６】
2020072766.tif 000236
【０５２６】
【表００１２−１０７】
2020072766.tif 000237
【０５２７】
【表００１２−１０８】
2020072766.tif 000238
【０５２８】
【表００１２−１０９】
2020072766.tif 000239
【０５２９】
【表００１２−１１０】
2020072766.tif 000240
【０５３０】
【表００１２−１１１】
2020072766.tif 000241
【０５３１】
【表００１２−１１２】
2020072766.tif 000242
【０５３２】
【表００１２−１１３】
2020072766.tif 000243
【０５３３】
【表００１２−１１４】
2020072766.tif 000244
【０５３４】
【表００１２−１１５】
2020072766.tif 000245
【０５３５】
【表００１２−１１６】
2020072766.tif 000246
【０５３６】
【表００１２−１１７】
2020072766.tif 000247
【０５３７】
【表００１２−１１８】
2020072766.tif 000248
【０５３８】
【表００１２−１１９】
2020072766.tif 000249
【０５３９】
【表００１２−１２０】
2020072766.tif 000250
【０５４０】
【表００１２−１２１】
2020072766.tif 000251
【０５４１】
【表００１２−１２２】
2020072766.tif 000252
【０５４２】
【表００１２−１２３】
2020072766.tif 000253
【０５４３】
【表００１２−１２４】
2020072766.tif 000254
【０５４４】
【表００１２−１２５】
2020072766.tif 000255
【０５４５】
【表００１２−１２６】
2020072766.tif 000256
【０５４６】
【表００１２−１２７】
2020072766.tif 000257
【０５４７】
【表００１２−１２８】
2020072766.tif 000258
【０５４８】
【表００１２−１２９】
2020072766.tif 000259
【０５４９】
【表００１２−１３０】
2020072766.tif 000260
【０５５０】
【表００１２−１３１】
2020072766.tif 000261
【０５５１】
【表００１２−１３２】
2020072766.tif 000262
【０５５２】
【表００１２−１３３】
2020072766.tif 000263
【０５５３】
【表００１２−１３４】
2020072766.tif 000264
【０５５４】
【表００１２−１３５】
2020072766.tif 000265
【０５５５】
【表００１２−１３６】
2020072766.tif 000266
【０５５６】
【表００１２−１３７】
2020072766.tif 000267
【０５５７】
【表００１２−１３８】
2020072766.tif 000268
【０５５８】
【表００１２−１３９】
2020072766.tif 000269
【０５５９】
【表００１２−１４０】
2020072766.tif 000270
【０５６０】
【表００１２−１４１】
2020072766.tif 000271
【０５６１】
【表００１２−１４２】
2020072766.tif 000272
【０５６２】
【表００１２−１４３】
2020072766.tif 000273
【０５６３】
【表００１２−１４４】
2020072766.tif 000274
【０５６４】
【表００１２−１４５】
2020072766.tif 000275
【０５６５】
【表００１２−１４６】
2020072766.tif 000276
【０５６６】
【表００１２−１４７】
2020072766.tif 000277
【０５６７】
【表００１２−１４８】
2020072766.tif 000278
【０５６８】
【表００１２−１４９】
2020072766.tif 000279
【０５６９】
【表００１２−１５０】
2020072766.tif 000280
【０５７０】
【表００１２−１５１】
2020072766.tif 000281
【０５７１】
【表００１２−１５２】
2020072766.tif 000282
【０５７２】
【表００１２−１５３】
2020072766.tif 000283
【０５７３】
【表００１２−１５４】
2020072766.tif 000284
【０５７４】
【表００１２−１５５】
2020072766.tif 000285
【０５７５】
【表００１２−１５６】
2020072766.tif 000286
【０５７６】
【表００１２−１５７】
2020072766.tif 000287
【０５７７】
【表００１２−１５８】
2020072766.tif 000288
【０５７８】
【表００１２−１５９】
2020072766.tif 000289
【０５７９】
【表００１２−１６０】
2020072766.tif 000290
【０５８０】
【表００１２−１６１】
2020072766.tif 000291
【０５８１】
【表００１２−１６２】
2020072766.tif 000292
【０５８２】
【表００１２−１６３】
2020072766.tif 000293
【０５８３】
【表００１２−１６４】
2020072766.tif 000294
【０５８４】
【表００１２−１６５】
2020072766.tif 000295
【０５８５】
【表００１２−１６６】
2020072766.tif 000296
【０５８６】
【表００１２−１６７】
2020072766.tif 000297
【０５８７】
【表００１２−１６８】
2020072766.tif 000298
【０５８８】
【表００１２−１６９】
2020072766.tif 000299
【０５８９】
【表００１２−１７０】
2020072766.tif 000300
【０５９０】
【表００１２−１７１】
2020072766.tif 000301
【０５９１】
【表００１２−１７２】
2020072766.tif 000302
【０５９２】
特定の免疫細胞の型において豊富なマイクロＲＮＡを表１３に列挙する。さらに、新規のマイクロＲＮＡ（ｍｉｒｏＲＮＡ）は、マイクロアレイハイブリダイゼーション法およびミクロトーム分析によって当該技術分野における免疫細胞で発見されている（Ｊｉｍａ
ＤＤ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：ｅ１１８−ｅ１２７；Ｖａｚ  Ｃ
ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，１１，２８８、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。表１３において、「ＨＣＣ」は肝細胞癌を表し、「ＡＬＬ」は急性リンパ性白血病を表し、「ＣＬＬ」は慢性リンパ性白血病を表す。
表１３．免疫細胞におけるマイクロＲＮＡ  
【０５９３】
【表００１３−１】
2020072766.tif 000303
【０５９４】
【表００１３−２】
2020072766.tif 000304
【０５９５】
【表００１３−３】
2020072766.tif 000305
【０５９６】
【表００１３−４】
2020072766.tif 000306
【０５９７】
【表００１３−５】
2020072766.tif 000307
【０５９８】
【表００１３−６】
2020072766.tif 000308
【０５９９】
【表００１３−７】
2020072766.tif 000309
【０６００】
【表００１３−８】
2020072766.tif 000310
【０６０１】
ＩＩＩ．修飾
本明細書における、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド（例えば、修飾ＲＮＡ、修飾核酸分子、修飾ＲＮＡ（複数）、核酸、および修飾核酸といった、本発明の核酸等）において、「修飾」または必要に応じて「修飾された」という用語は、Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣリボヌクレオチドに対する修飾を指す。概して、本明細書において、これらの用語は、天然に存在する５’末端ｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すようには意図されていない。ポリペプチドにおいて、「修飾」という用語は、基準の組の２０個のアミノ酸と比較した修飾を指す。
【０６０２】
この修飾は、様々なはっきりと異なる修飾であり得る。いくつかの実施形態において、核酸または修飾ＲＮＡにおいては、コーディング領域、隣接領域、および／または末端領域は、１つ、２つ、または２つ以上の（任意に異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含有し得る。いくつかの実施形態において、細胞に導入された修飾核酸または修飾ＲＮＡは、未修飾核酸または修飾ＲＮＡと比較して、細胞における分解の減少を呈し得る。
【０６０３】
ポリヌクレオチド、一次構築物、核酸、または修飾ＲＮＡは、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合（例えば、結合リン酸／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格への）等に対する任意の有用な修飾を含み得る。ピリミジン核酸塩基の１個以上の原子は、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたチオール、任意に置換されたアルキル（例えば、メチルもしくはエチル）、またはハロ（例えば、クロロもしくはフルオロ）と置き換えれ得るか、またはこれらで置換され得る。ある特定の実施形態において、修飾（例えば、１つ以上の修飾）は、糖およびヌクレオシド間結合の各々において存在する。本発明に従う修飾は、例えば、リボフラニシル環の２’ＯＨの２’Ｈへの置換といった、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはこれらのハイブリッド）に対するリボ核酸（ＲＮＡ）の修飾であり得る。さらなる修飾が本明細書に記載される。
【０６０４】
本明細書に記載されるように、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、核酸、または修飾ＲＮＡは、ポリヌクレオチド、一次構築物、核酸、または修飾ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）が導入される細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。誘導された自然免疫応答の特徴には、１）炎症誘発性サイトカインの発現の増加、２）細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５等の活性化、および／または３）タンパク質翻訳の終結もしくは減少が含まれる。
【０６０５】
ある特定の実施形態において、細胞に導入された修飾核酸分子を細胞内で分解することが望ましくあり得る。例えば、修飾核酸分子の分解は、タンパク質産生の正確なタイミングが所望される場合に好ましくあり得る。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、指向された様式で細胞内にて作用され得る、分解ドメインを含有する修飾核酸分子を提供する。別の態様において、本開示は、ポリヌクレオチド、一次構築物、核酸、または修飾ＲＮＡとの主溝相互作用（例えば、結合）パートナーの結合を攪乱し得るヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、一字構築物、核酸、または修飾ＲＮＡを提供する（例えば、修飾ヌクレオチドは、未修飾ヌクレオチドと比較して、主溝相互作用パートナーに対して低下した結合親和性を有する場合）。
【０６０６】
ポリヌクレオチド、一次構築物、核酸、または修飾ＲＮＡは、他の作用物質（例えば、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクター等）を任意に含み得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、核酸、または修飾ＲＮＡは、１個以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド（すなわち、修飾ｍＲＮＡ分子）を有する１個以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み得る。これらの核酸または修飾ＲＮＡについての詳細は、以下に続く。
修飾ｍＲＮＡ分子
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、核酸、または修飾ＲＮＡは、目的とするポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの第１の領域、第１の領域の５’末端に位置する第１の隣接領域、および第１の領域の３’末端に位置する第２の隣接領域を含む。結合ヌクレオチドの第１の領域は、翻訳可能な領域であり得る。
【０６０７】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡ（例えば、第１の領域、第１の隣接する領域、または第２の隣接する領域）は、この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１２年１０月３日に出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／５８５１９号（代理人整理番号：Ｍ００９．２０）に記載の、式Ｉ〜ＩＸまたはそれらの任意の下部構造のものを含むが、これらに限定されない、任意の塩基、糖、骨格、構成要素、または他の構造もしくは式を有する、ｎ個の連結ヌクレオシドを含む。そのような構造は、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合、またはそれらの組み合わせへの修飾を含む。
【０６０８】
化学修飾の組み合わせは、２０１２年１０月３日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／５８５１９号（代理人整理番号：Ｍ００９．２０）に記載されるが、これらに限定されないものを含む、この中で論じられる組み合わせを含み、この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０６０９】
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの合成は、２０１２年１０月３日に出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／５８５１９号（代理人整理番号：Ｍ００９．２０）に記載の方法に従ってもよく、この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０６１０】
いくつかの実施形態において、シトシン、グアニン、アデニン、およびウラシルからなる群から選択される核酸塩基である。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する例示の核酸塩基およびヌクレオシドには、シュードウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチルウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチルウリジン（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有するもの）、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−シュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２��−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−メチル−シュードウリジン（ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、および５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−アラ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、および５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）ウリジンが挙げられる。
【０６１１】
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する例示の核酸塩基およびヌクレオシドには、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃ４Ｃ）、５−ホルミルシチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチルシチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチルシチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、α−チオ−シチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’−Ｆ−アラ−シチジン、２’−Ｆ−シチジン、および２’−ＯＨ−アラ−シチジンが挙げられる。
【０６１２】
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示の核酸塩基およびヌクレオシドには、２−アミノプリン、２、６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、α−チオ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’−Ｆ−アラ−アデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラ−アデノシン、およびＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル）−アデノシンが挙げられる。
【０６１３】
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示の核酸塩基およびヌクレオシドには、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ）、未修飾ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、クエオシン（Ｑ）、エポキシクエオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−クエオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−クエオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアノシン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ１Ｉｍ）、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオ−グアノシン、Ｏ６−メチル−グアノシン、２’−Ｆ−アラ−グアノシン、および２’−Ｆ−グアノシンが挙げられる。
【０６１４】
ホスホロチオエートＤＮＡおよびＲＮＡは増加したヌクレアーゼ耐性を有し、続いて細胞環境におけるより長い半減期を有する。ホスホロチオエート結合核酸はまた、細胞自然免疫分子のより弱い結合／活性を通して、自然免疫応答を減少させることも予期される。
【０６１５】
ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリン、またはピリミジン類似体から独立して選択され得る。例えば、核酸塩基はそれぞれ、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、またはヒポキサンチンから独立して選択され得る。別の実施形態において、核酸塩基には、例えば、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ（例えば、８−ブロモ）、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、デアザグアニン、７−デアザグアニン、３−デアザグアニン、デアザアデニン、７−デアザアデニン、３−デアザアデニン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、イミダゾ［１，５−ａ］１，３，５トリアジノン、９−デアザプリン、イミダゾ［４，５−ｄ］ピラジン、チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン、ピラジン−２−オン、１，２，４−トリアジン、ピリダジン、および１，３，５トリアジンを含む塩基の天然に存在する合成誘導体も含み得る。ヌクレオチドがＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵの略語を用いて示されるとき、各文字は、代表的な塩基および／またはその誘導体を指し、例えば、Ａは、アデニン、または、例えば、７−デアザアデニンのようなアデニン類似体を含む。
ヌクレオシド間結合における修飾
核酸または修飾ＲＮＡ分子に組み込まれ得る修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、リン酸骨格）において修飾され得る。本明細書において、ポリヌクレオチド、一次構築物、核酸、または修飾ＲＮＡ骨格との関連で、「リン酸塩」および「ホスホジエステル」という表現は、同義に使用される。骨格リン酸基は、酸素原子のうちの１個以上を異なる置換基で置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、未修飾リン酸塩部分の別の本明細書に記載のヌクレオシド間結合との大規模な置換を含み得る。修飾リン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレナート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロラミデート、ホスホロジアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロジチオエートは、硫黄で置換された両方の非結合酸素を有する。リン酸リンカーは、結合酸素の窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）での置換によっても修飾され得る。
【０６１６】
α−チオ置換リン酸部分は、非天然ホスホロチオエート骨格結合を介してＲＮＡおよびＤＮＡポリマーに安定性を付与するように提供される。ホスホロチオエートＤＮＡおよびＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性の増加、続いて細胞環境においてより長い半減期を有する。理論によって束縛されることを望むものではないが、ホスホロチオエート結合ポリヌクレオチド、一次構築物、核酸、または修飾ＲＮＡ分子は、細胞の自然免疫分子のより弱い結合／活性化によって自然免疫応答も低下させることが見込まれている。
【０６１７】
特定の実施形態において、修飾ヌクレオシドは、α−チオ−ヌクレオシド（例えば、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−アデノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−シチジン（α−チオ−シチジン）、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−グアノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−ウリジン、または５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−シュードウリジン）を含む。
【０６１８】
リン原子を含有しないヌクレオシド間結合を含む本発明に従って用いられ得る他のヌクレオシド間結合は、以下の本明細書に記載される。
修飾糖、核酸塩基、およびヌクレオシド間結合の組み合わせ
本発明の核酸または修飾ＲＮＡは、糖、核酸塩基、および／またはヌクレオシド間結合への修飾の組み合わせを含み得る。これらの組み合わせは、本明細書に記載のいずれか１つ以上の修飾を含み得る。例えば、式（Ｉａ）、（Ｉａ−１）〜（Ｉａ−３）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ）における本明細書に記載のヌクレオチドのうちのいずれかは、本明細書に記載の核酸塩基のうちのいずれ（例えば、式（ｂ１）〜（ｂ４３）または本明細書に記載の任意の他のもの）とも組み合わせられ得る。
核酸または修飾ＲＮＡ分子（修飾ＲＮＡ）の合成
本発明に従った使用のための核酸は、化学合成、一般にインビトロ転写と称される酵素合成、より長い前駆体の酵素開裂または化学開裂等を含むが、これらに限定されない、本明細書に記載の任意の有用な技術、または任意の有用な技術に従って調製することができる。ＲＮＡを合成する方法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ［Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ］，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８４；ａｎｄ  Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖ．２８８（Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００５を参照のこと；どちらの内容も参照により本明細書に組み込まれる）。
【０６１９】
本明細書にて開示の修飾ＲＮＡの合成に使用した修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の一般方法および手順を用いて容易に入手可能な出発物質から調製することができる。典型的なまたは好適な作業条件（すなわち、反応温度、時間、反応物のモル比、溶媒、圧力等）が与えられる場合、他の作業条件もまた、別段に示されない限り使用することができることを理解されたい。最適な反応条件は特定の反応物または使用する溶媒に応じて変化し得るが、そのような条件は、当業者が通常の最適化手順によって決定することができる。
【０６２０】
本明細書に記載のプロセスは当該技術分野において既知の任意の好適な方法に従ってモニターすることができる。例えば、生産物形成は、核磁気共鳴分光法（例えば、１Ｈまたは１３Ｃ）、赤外分光法、分光光度法（例えば、紫外可視）、もしくは質量分析法等の分光学的な方法によって、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、もしくは薄層クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーによってモニターすることができる。
【０６２１】
本発明の修飾ＲＮＡの製造または合成で使用する修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドの調製は、様々な化学基の保護および脱保護が関与し得る。保護および脱保護、ならびに適切な保護基の選択の必要性は、当業者が容易に決定することができる。
【０６２２】
保護基の化学反応は例えば、Ｇｒｅｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９１にて見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０６２３】
本明細書に記載のプロセスの反応は、有機合成分野の技術者によって容易に選択され得る好適な溶媒において行われ得る。好適な溶媒は、反応が行われる温度、すなわち、溶媒の凍結温度から溶媒の沸点の範囲であり得る温度で、出発物質（反応物）、中間体、または産物とは実質的に非反応性であり得る。所与の反応は、１つの溶媒または２つ以上の溶媒の混合物において行われ得る。特定の反応ステップに応じて、特定の反応ステップに好適な溶媒が選択され得る。
【０６２４】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドのラセミ混合物の分解は、当技術分野で既知の多数の方法のうちのいずれかによって行われ得る。方法の例には、光学活性の塩形成有機酸である「キラル分解酸」を用いた分別再結晶が挙げられる。分別再結晶法に好適な分解酸には、例えば、酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、リンゴ酸、乳酸、または様々な光学活性カンファースルホン酸のＤおよびＬ形態等の光学活性酸がある。ラセミ混合物の分解は、光学活性分解剤（例えば、ジニトロベンゾイルフェニルグリシン）を充填したカラム上での溶出によっても行われ得る。好適な溶出溶媒組成物は、当業者によって決定され得る。
【０６２５】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば、構成要素分子）は、Ｏｇａｔａ  ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７４：２５８５−２５８８（２００９）；Ｐｕｒｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（１）：７２−７８，（１９９４）；Ｆｕｋｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１（４）：５６３−５６８（１９６２）；およびＸｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８（９）：１７２９−１７４０（１９９２）に記載の合成方法に従って調製することができ、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０６２６】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば、構成要素分子）は、Ｏｇａｔａ  ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７４：２５８５−２５８８（２００９）；Ｐｕｒｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（１）：７２−７８，（１９９４）；Ｆｕｋｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１（４）：５６３−５６８（１９６２）；およびＸｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８（９）：１７２９−１７４０（１９９２）に記載の合成方法に従って調製することができ、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０６２７】
本発明の修飾核酸は、分子の全長に沿って均一に修飾されてもされなくてもよい。異なるヌクレオチド修飾および／または骨格構造は核酸における様々な位置に存在していてもよい。ヌクレオチド類似体または他の修飾（複数可）は、核酸の機能が実質的に減少しないように、核酸の任意の位置（複数可）に位置していてもよいことを、当業者は理解されたい。修飾はまた、５’または３’末端修飾であってもよい。核酸は、最小１％および最大１００％修飾ヌクレオチド、または少なくとも５０％修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％修飾ヌクレオチド等の任意の介在する割合で含有していてもよい。例えば、１種類以上またはすべての種類のヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずか１つ以上もしくはすべて）は、本発明の核酸または修飾ＲＮＡまたはその所与の既定の配列領域において均一に修飾されてもされなくてもよい。いくつかの実施形態において、本発明の核酸または修飾ＲＮＡ（またはその所与の配列領域）におけるすべてのヌクレオチドＸが修飾され、ここでＸは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずれか１つ、または組み合わせＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、もしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのうちのいずれか１つであり得る。
【０６２８】
異なる糖修飾、ヌクレオチド修飾、および／またはヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）は、核酸または修飾ＲＮＡの様々な位置で存在し得る。当業者であれば、ヌクレオチド類似体または他の修飾（複数可）が、核酸または修飾ＲＮＡの機能が実質的に低下するように、核酸または修飾ＲＮＡの任意の位置（複数可）に位置し得ることを認識する。修飾は、５’または３’末端修飾でもあり得る。核酸または修飾ＲＮＡは、約１％〜約１００％の修飾ヌクレオチド（全ヌクレオチド含量または１種類以上のヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのうちのいずれか１つ以上のいずれかと関連したもの）または任意の中間の割合（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、および９５％〜１００％）を含有し得る。
【０６２９】
いくつかの実施形態において、核酸または修飾ＲＮＡは、修飾ピリミジン（例えば、修飾ウラシル／ウリジン／Ｕまたは修飾シトシン／シチジン／Ｃ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸または修飾ＲＮＡ分子中のウラシルまたはウリジン（概して、Ｕ）は、約１％〜約１００％の修飾ウラシルまたは修飾ウリジン（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、および９５％〜１００％の修飾ウラシルまたは修飾ウリジン）と置換され得る。修飾ウラシルまたはウリジンは、単一の固有の構造を有する化合物または異なる構造（例えば、本明細書に記載の２、３、４つ以上の固有の構造）を有する複数の化合物に置換され得る。いくつかの実施形態において、核酸または修飾ＲＮＡ分子中のシトシンまたはシチジン（概して、Ｃ）は、約１％〜約１００％の修飾シトシンまたは修飾シチジン（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、および９５％〜１００％の修飾シトシンまたは修飾シチジン）と置換され得る。修飾シトシンまたはシチジンは、単一の固有の構造を有する化合物または異なる構造（例えば、本明細書に記載の２、３、４つ以上の固有の構造）を有する複数の化合物に置換され得る。
【０６３０】
核酸の他の成分は任意であり、いくつかの実施形態において有益である。例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および／または３’ＵＴＲが提供され、これらのいずれか、または両方ともに、独立して、１つ以上の異なるヌクレオチド修飾を含有し得る。そのような実施形態において、ヌクレオチド修飾は、翻訳可能な領域においても存在し得る。ＩＲＥＳ配列を含み得るかまたはＩＲＥＳ配列を含み得ないコザック配列を含有する核酸も提供される（例えば、実施例３１中の表３０に記載されるポリヌクレオチドを参照のこと）。
【０６３１】
そのうえ、核酸から切り取ることができる１つ以上のイントロンヌクレオチド配列を含有する核酸が提供される。
ヌクレオチドの組み合わせ
修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの組み合わせのさらなる例が以下の表１４に提供される。修飾ヌクレオチドのこれらの組み合わせを用いて、本発明の核酸または修飾ＲＮＡを形成することができる。別途述べられない限り、修飾ヌクレオチドは、本発明の核酸または修飾ＲＮＡの天然ヌクレオチドと完全に置換され得る。非限定的な例として、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドで置換され得る。別の非限定的な例において、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に開示の修飾ヌクレオシドのうちの少なくとも１つで部分的に置換され得る（例えば、約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９．９％）。表１４．化学修飾  
【０６３２】
【表００１４−１】
2020072766.tif 000311
【０６３３】
【表００１４−２】
2020072766.tif 000312
【０６３４】
ある特定の修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチドの組み合わせが本発明者によって研究されている。これらの知見は、２０１０年１０月１日出願の米国仮出願第６１／４０４，４１３号、表題「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」、現在は放棄されている２０１１年１０月３日出願の米国特許出願第１３／２５１，８４０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」、２０１２年５月２５日出願の米国特許出願第１３／４８１，１２７号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，ａｎｄ
Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」、２０１１年１０月３日出願の国際特許公開第ＷＯ２０１２０４５０７５号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」、２０１１年１０月３日に出願の米国特許公開第ＵＳ２０１２０２３７９７５号、表題「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」、および国際特許公開第ＷＯ２０１２０４５０８２号に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０６３５】
修飾ヌクレオチドの組み合わせのさらなる例が以下の表１５に提供される。修飾ヌクレオチドのこれらの組み合わせを用いて、本発明の核酸を形成することができる。
表１５．化学修飾  
【０６３６】
【表００１５】
2020072766.tif 000313
【０６３７】
いくつかの実施形態において、シトシンの少なくとも２５％は、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）、または（ｂ３２）〜（ｂ３５）の化合物に置換される（例えば、式（ｂ１０）または（ｂ３２）の化合物の、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
【０６３８】
いくつかの実施形態において、ウラシルの少なくとも２５％は、式（ｂ１）〜（ｂ９）、（ｂ２１）〜（ｂ２３）、または（ｂ２８）〜（ｂ３１）の化合物に置換される（例えば、式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）、または（ｂ３０）の化合物の、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
【０６３９】
いくつかの実施形態において、シトシンの少なくとも２５％は、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）、または（ｂ３２）〜（ｂ３５）（例えば、式（ｂ１０）もしくは（ｂ３２））に化合物に置換され、ウラシルの少なくとも２５％は、式（ｂ１）〜（ｂ９）、（ｂ２１）〜（ｂ２３）、または（ｂ２８）〜（ｂ３１）（例えば、式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）、または（ｂ３０））の化合物に置換される（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
リンカーおよびペイロードを含む修飾
ペイロード
本明細書に記載の方法および組成物は生物学的標的にペイロードを送達するのに有用である。ペイロードは、例えば、標識化（例えば、フルオロフォア等の検出可能な薬剤）に対して、または治療目的（例えば、細胞毒または他の治療薬）に対して使用することができる。
ペイロード：治療薬
いくつかの実施形態において、ペイロードは、細胞毒、放射性イオン、化学療法剤、または他の治療剤等の治療剤である。細胞毒または細胞傷害性薬剤には、細胞に有害であるいずれの薬剤も含まれる。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎｅ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、マイタンシノイド、例えば、マイタンシノール（米国特許第５，２０８，０２０号）、ＣＣ−１０６５（米国特許第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、同第５，８４６，５４５号を参照のこと）、ならびにこれらの類似体または相同体が挙げられる。放射性イオンには、ヨウ素（例えば、ヨウ素１２５またはヨウ素１３１）、ストロンチウム８９、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、リン酸塩、コバルト、イットリウム９０、サマリウム１５３、およびプラセオジミウムが含まれるが、これらに限定されない。他の治療剤には、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、ＣＣ−１０６５、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（かつてはダウノマイシン）およびｄオキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（かつてはアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、およびマイタンシノイド）が含まれるが、これらに限定されない。
ペイロード：検出可能な薬剤
検出可能な物質の例として、種々の有機小分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素もしくは酵素基質、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、化学発光物質、放射性物質、および造影剤が挙げられる。そのような光検出可能な標識には、例えば、制限なく、４−アセトアミド−４’−イソチオシアン酸スチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体：アクリジンおよびアクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホン酸塩；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体；クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）；シアニン色素；シアノシン；４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５”−ジブロモピロガロール−スルホナフタレン（ｎａｐｈｔｈａｌｅｉｎ）（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアン酸フェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸塩；４，４’−ジイソチオシアン酸ジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアン酸スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］−ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体；エオシンおよびエオシンイソチオシアネート；エリスロシンおよび誘導体；エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオロセインおよび誘導体；５−カルボキシフルオロセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオロセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオロセイン、フルオロセイン、フルオロセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、酪酸ピレン、スクシンイミジル１−ピレン；酪酸塩量子ドット；リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（ｒｈｏｄａｒｎｉｎｅ）（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；シアニン−３（Ｃｙ３）；シアニン−５（Ｃｙ５）；シアニン−５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン−７（Ｃｙ７）；ＩＲＤ  ７００；ＩＲＤ  ８００；Ａｌｅｘａ  ６４７；Ｌａ  Ｊｏｌｔａ  Ｂｌｕｅ；フタロシアニン；ならびにナフタロシアニンが含まれる。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、Ｃｙ５およびＣｙ３等の蛍光色素である。
【０６４０】
発光物質の例として、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる。
好適な放射性物質の例として、直接的もしくは間接的のいずれかで、１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈ、９９ｍＴｃ（例えば、過テクネチウム酸（テクネチウム酸塩（ＶＩＩ）、ＴｃＯ４−として）、または電波放射の直接計数によって、もしくはシンチレーション測定によって検出可能な他の放射性同位体が挙げられる。
【０６４１】
加えて、造影剤、例えば、ＭＲＩまたはＮＭＲ用、Ｘ線ＣＴ、ラマンイメージング、光干渉断層撮影、吸収イメージング、超音波画像診断、または熱写真法様の造影剤を使用することができる。例えば、金（例えば、金ナノ粒子）、ガドリニウム（例えば、キレート化Ｇｄ）、酸化鉄（例えば、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、単結晶酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）、および極小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ）、マンガンキレート（例えば、Ｍｎ−ＤＰＤＰ）、硫酸バリウム、ヨード系造影剤媒体（イオヘキソール（Ｉｏｈｅｘｏｌ））、微小気泡、またはペルフルオロ炭素を含む例示的な造影剤もまた使用することができる。
【０６４２】
いくつかの実施形態において、検出可能な薬剤は、活性化されると検出可能となる、検出不可能な前駆体である。例として、蛍光発生テトラジン−フルオロフォア構築物（例えば、テトラジン−ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、テトラジン−オレゴングリーン４８８、またはテトラジン−ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ）、または酵素により活性化可能な蛍光発生剤（例えば、ＰＲＯＳＥＮＳＥ（登録商標）（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ））が挙げられる。
【０６４３】
化合物が、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素標識される場合、酵素標識は生産物に対する適切な基質の転換の決定によって検出される。
【０６４４】
これらの組成物が使用され得るインビトロアッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光法、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、およびウエスタンブロット分析が含まれる。
【０６４５】
本明細書に記載されるもの以外の標識が本開示によって企図され、他の光学的に検出可能な標識を含む。標識を切断可能なリンカーの切断の際に組み込まれた塩基から除去することができるように、標識は標準的な化学変化を用いて任意の位置で本開示の修飾ヌクレオチドに結合することができる。
ペイロード：細胞透過性ペイロード
いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドおよび修飾核酸はまた、組成物の細胞内送達を促進する細胞透過性部分または薬剤を含み得るペイロードも含む。例えば、組成物は、細胞内空間への送達を容易にする細胞透過性ペプチド配列、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはｈＣＴ由来細胞透過性ペプチドを含み得る（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３（３）：３１０−８（２００１）、Ｌａｎｇｅｌ，Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬ，２００２）、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１１（２８）：３５９７−６１１（２００３）、およびＤｅｓｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６２（１６）：１８３９−４９（２００５）を参照のこと）。組成物は、組成物の細胞内空間への送達を向上させる細胞透過性薬剤、例えば、リポソームを含むように製剤化することもできる。
ペイロード：生物学的標的
本明細書に記載の修飾ヌクレオチドおよび修飾核酸を用いて、ペイロードを特定のリガンドが存在するか、または生成され得る任意の生物学的標的へ送達することができる。リガンドは生物学的標的へ共有結合的または非共有結合的のいずれかで結合することができる。
【０６４６】
例示的な生物学的標的として、生体高分子例えば、抗体、ＲＮＡおよびＤＮＡ等の核酸、タンパク質、酵素が挙げられる。例示的なタンパク質として、酵素、受容体、およびイオンチャネルが挙げられる。いくつかの実施形態において、標的は、組織特異的マーカーまたは細胞型特異的マーカーであり、例えば、選択された組織または細胞型において特異的に発現するタンパク質である。いくつかの実施形態において、標的は、原形質膜受容体および核受容体等の受容体であるが、これらに限定されない。より具体的な例として、Ｇタンパク質共役型受容体、細胞ポアタンパク質、輸送タンパク質、表面発現抗体、ＨＬＡタンパク質、ＭＨＣタンパク質、および増殖因子受容体が挙げられる。
修飾ヌクレオチドの合成
本明細書に記載の修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の一般的な方法および手順を用いて容易に入手可能な出発物質から調製することができる。典型的なまたは好適な作業条件（すなわち、反応温度、時間、反応物のモル比、溶媒、圧力等）が与えられる場合、他の作業条件もまた、別段に示されない限り使用することができることを理解されたい。最適な反応条件は特定の反応物または使用する溶媒に応じて変化し得るが、そのような条件は、当業者が通常の最適化手順によって決定することができる。
【０６４７】
本明細書に記載のプロセスは当該技術分野において既知の任意の好適な方法に従ってモニターすることができる。例えば、生産物形成は、核磁気共鳴分光法（例えば、１Ｈまたは１３Ｃ）、赤外分光法、分光光度法（例えば、紫外可視）、もしくは質量分析法等の分光学的な方法によって、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、もしくは薄層クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーによってモニターすることができる。
【０６４８】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドの調製は、様々な化学基の保護および脱保護を伴い得る。保護および脱保護の必要性、ならびに適切な保護基の選択は、当業者によって容易に決定され得る。保護基の化学は、例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｒｅｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９１において見出され得る。
【０６４９】
本明細書に記載のプロセスの反応は、有機合成分野の技術者によって容易に選択され得る好適な溶媒において行われ得る。好適な溶媒は、反応が行われる温度、すなわち、溶媒の凍結温度から溶媒の沸点の範囲であり得る温度で、出発物質（反応物）、中間体、または産物とは実質的に非反応性であり得る。所与の反応は、１つの溶媒または２つ以上の溶媒の混合物において行われ得る。特定の反応ステップに応じて、特定の反応ステップに好適な溶媒が選択され得る。
【０６５０】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドのラセミ混合物の分解は、当技術分野で既知の多数の方法のうちのいずれかによって行われ得る。方法の例には、光学活性の塩形成有機酸である「キラル分解酸」を用いた分別再結晶が挙げられる。分別再結晶法に好適な分解酸には、例えば、酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、リンゴ酸、乳酸、または様々な光学活性カンファースルホン酸のＤおよびＬ形態等の光学活性酸がある。ラセミ混合物の分解は、光学活性分解剤（例えば、ジニトロベンゾイルフェニルグリシン）を充填したカラム上での溶出によっても行われ得る。好適な溶出溶媒組成物は、当業者によって決定され得る。
長さ
一般的に、本発明の修飾ｍＲＮＡの長さは３０ヌクレオチド長より長い。別の実施形態において、ＲＮＡ分子は３５ヌクレオチド長より長い。別の実施形態において、長さは少なくとも４０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも４５ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも５５ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも６０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも６０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも８０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも９０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１２０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１４０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１６０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１８０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも２００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも２５０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも３００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも３５０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも４００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも４５０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも５００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも６００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも７００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも８００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも９００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１０００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１１００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１２００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１３００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１４００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１５００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１６００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも１８００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも２０００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも２５００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも３０００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも４０００ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも５０００ヌクレオチド長超である。別の実施形態において、長さは少なくとも５０００ヌクレオチド長、または６０００ヌクレオチド長超である。別の実施形態において、長さは少なくとも７０００ヌクレオチド長、または７０００ヌクレオチド長超である。別の実施形態において、長さは少なくとも８０００ヌクレオチド長、または８０００ヌクレオチド長超である。別の実施形態において、長さは少なくとも９０００ヌクレオチド長、または９０００ヌクレオチド長超である。別の実施形態において、長さは少なくとも１０，０００ヌクレオチド長、または１０，０００ヌクレオチド長超である。
修飾ＲＮＡの使用
自然細胞免疫応答活性の予防または減少
「自然免疫応答」という用語は、一般的にはウイルス起源または細菌起源の外因性一本鎖核酸に対する細胞応答を含み、これは、サイトカイン、特にインターフェロンの発現および放出、ならびに細胞死の誘導を含む。タンパク質合成はまた、自然細胞免疫応答の際にも減少する。細胞における自然免疫応答を排除することは有利である一方で、本発明は、そのような応答を完全に除去せず、インターフェロンシグナル伝達を含む、実質的に免疫応答を減少させる修飾ｍＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態において、免疫応答は、対応する非修飾核酸に誘導される免疫応答と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または９９．９％超低い。そのような低減は、１型インターフェロンの発現もしくは活性のレベル、またはトール様受容体（例えば、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８）等のインターフェロン制御遺伝子の発現により測定され得る。自然免疫応答の低減は、細胞集団への修飾ＲＮＡの１つ以上の投与に従って減少された細胞死を測定することによっても測定され得る。例えば、細胞死は、対応する非修飾核酸で観察された細胞死頻度よりも１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９５％超少ない。さらに、細胞死は、修飾核酸と接触した細胞の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％、または０．０１％未満に影響し得る。
【０６５１】
本発明は、例えば、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで修飾核酸の標的細胞集団への反復導入（例えば、トランスフェクション）を提供する。細胞集団の接触ステップが、１回以上（２、３、４、５、または５回を超える等）反復され得る。いくつかの実施形態において、細胞集団を修飾核酸と接触するステップは、細胞集団におけるタンパク質翻訳の既定の効率を達成するのに十分であるように数回反復される。標的細胞集団の低減された細胞傷害性を核酸修飾によって提供したと仮定すると、そのような反復トランスフェクションが多様な一連の細胞型において達成可能である。
主溝相互作用パートナー
本明細書に記載されるように、「主溝相互作用パートナー」という表現は、ヌクレオチドまたは核酸の主溝の面との相互作用、例えば結合を通して、ＲＮＡリガンドを検出し、それに応答するＲＮＡ認識受容体を指す。したがって、本明細書に記載の修飾ＲＮＡ等の修飾ヌクレオチドまたは核酸を含むＲＮＡリガンドは、主溝結合パートナーとの相互作用を減少させ、ゆえに、自然免疫応答を減少させる。
【０６５２】
例示の主溝相互作用、例えば結合パートナーには、以下のヌクレアーゼおよびヘリカーゼを含むが、これらに限定されない。膜内において、ＴＬＲ（トール様受容体（（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体））３、７、および８は、一本鎖および二重鎖ＲＮＡに応答することができる。細胞質内において、ＤＥＸ（Ｄ／Ｈ）ヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼのスーパーファミリー２クラスのメンバーは、ＲＮＡを感知して抗ウイルス応答を開始することができる。これらのヘリカーゼには、ＲＩＧ−Ｉ（レチノイン酸誘導性遺伝子（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ）Ｉ）およびＭＤＡ５（メラノーマ分化関連遺伝子（ｍｅｌａｎｏｍａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ）５）を含む。他の例には、遺伝学と生理学の研究所（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）２（ＬＧＰ２）、ＨＩＮ−２００ドメイン含有するタンパク質、またはヘリカーゼドメイン含有タンパク質が挙げられる。
ＲＮＡ結合タンパク質
本発明のいくつかの実施形態において、ＲＮＡ結合タンパク質が提供される。ＲＮＡ結合タンパク質はタンパク質および／またはそのようなタンパク質をコードする核酸として提供され得る。ＲＮＡ結合タンパク質はＲＮＡ安定性およびタンパク質翻訳の調節において多数の役割を果たす。ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおけるＡ／Ｕリッチ要素は、増加したまたは減少したｍＲＮＡ安定性をもたらすＡ／Ｕリッチ結合タンパク質（ＡＲＥＢＰ）によって結合する二次構造の形成を引き起こす（Ｆａｎ，Ｘ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨｕＲ，ａ  ｎｕｃｌｅａｒ−ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＡＲＥ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍＲＮＡｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １９９８  Ｊｕｎ  １５；１７（１２）：３４４８−６０）。ＨｕＲは安定化ＡＲＥＢＰである。目的とするｍＲＮＡの安定性を増加させるために、ＨｕＲをコードするｍＲＮＡは目的とするｍＲＮＡと共に細胞内または組織内へ同時導入され得るか、または同時注入され得る。これらのタンパク質はまた、目的とするｍＲＮＡにインビトロで繋留することができ、その後細胞へ共に投与することができる。ポリＡ尾部結合タンパク質（ＰＡＢＰ）は真核細胞翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇと相互作用して、翻訳開始を刺激する。これらのＲＢＰをコードするｍＲＮＡとｍＲＮＡ薬剤との同時投与、および／またはこれらのタンパク質とｍＲＮＡ薬剤のインビトロでの繋留、ならびにタンパク質結合ｍＲＮＡの細胞内への投与は、ｍＲＮＡの翻訳効率を増加させる。同一のコンセプトは、ＲＮＡ安定性および／または翻訳効率に影響する、様々な翻訳因子および促進因子をコードするｍＲＮＡとｍＲＮＡのと同時投与、ならびにタンパク質それら自身とｍＲＮＡとの同時投与にまで渡り得る。ポリペプチド変異形
参照ポリペプチド配列とある特定の同一性を有する様々なポリペプチドをコードする拡散が提供される。「同一性」という用語は、当該技術分野で既知であるように、２つ以上のペプチドの配列間の、配列を比較することで決定される関係を指す。当該技術分野において、「同一性」はまた、２つ以上のアミノ酸残基の紐間の一致数によって決定されるペプチド間の配列の関連性の程度を意味する。
【０６５３】
「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって処理される、より小さい２つ以上の配列とギャップアライメント（もしあれば）との完全な一致の割合（％）を測定する。関連するペプチドの同一性は既知の方法によって容易に算出することができる。そのような方法として、限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載の方法が挙げられる。
【０６５４】
いくつかの実施形態において、ポリペプチド変異形は参照ポリペプチドと同一または同様の活性を有する。あるいは、変異形は参照ポリペプチドに対して活性変化（例えば、増加または減少）を有する。一般的に、本発明の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異形は、特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して、本明細書に記載の、および当業者に既知の配列アライメントプログラムおよびパラメータによって決定される、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する。
【０６５５】
当業者によって認識されるように、タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、および相同性タンパク質もまた、本発明の範囲内であるとみなされる。例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００アミノ酸長以上の、参照タンパク質のあらゆるタンパク質断片（少なくとも１つのアミノ酸残基が参照ポリペプチド配列よりも短いが、そうでなければ同一であるポリペプチド配列を意味する）が、本発明にて提供される。別の例において、本明細書に記載の任意の配列と約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％同一である、一連の約２０、約３０、約４０、約５０、または約１００アミノ酸を含むあらゆるタンパク質が、本発明に従って使用することができる。ある特定の実施形態において、本発明に従って使用されるタンパク質配列は、本明細書に提供される、または参照される配列のいずれかに示されるような、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の変異を含む。
ポリペプチドライブラリ
ヌクレオシド修飾を含有するポリヌクレオチドライブラリもまた提供され、ポリヌクレオチドは個々に、当該技術分野において既知である、抗体、タンパク質結合パートナー、裏打ちタンパク質、および他のポリペプチド等のポリペプチドをコードする第１の核酸配列を含有する。好ましくは、ポリヌクレオチドは、標的細胞宿主への直接導入に適した形態であるｍＲＮＡであり、その宿主細胞は、次いでコードされたポリペプチドを合成する。
【０６５６】
ある特定の実施形態において、それぞれ異なるアミノ酸修飾（複数可）を有するタンパク質の複数の変異形は、薬物動態、安定性、生体適合性、および／もしくは生物学的活性、または発現レベル等の生物物理学的特性の点で最善の変異形を決定するために、産生および試験され得る。そのようなライブラリは、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または１０９を超える可能な変異形（１個以上の残基の置換、欠失、および１個以上の残基の挿入を含むが、これらに限定されない）を含有し得る。
ポリペプチド核酸複合体
好適なタンパク質翻訳は、ｍＲＮＡと関連するいくつかのポリペプチドおよび核酸の物理的集合が関与する。ｍＲＮＡと結合した１つ以上のヌクレオシド修飾（例えば、少なくとも２つの異なるヌクレオシド修飾）、および１つ以上のポリペプチドを含有する、タンパク質および核酸の抱合体を含有する複合体が本発明に提供される。一般的に、タンパク質は、複合体が導入される細胞の自然免疫応答を妨げるまたは減少させるのに効果的な量で提供される。
標的部分
本発明の実施形態において、インビボもしくはインビトロのいずれかで、細胞を特定の組織空間に標的化するか、または特定の部分と相互作用する働きをする細胞の表面上のタンパク質結合パートナーまたは受容体を発現するように、修飾核酸が提供される。好適なタンパク質結合パートナーには、抗体およびその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチドが含まれる。さらに、修飾核酸を用いて、脂質、炭水化物、または他の生物学的部分の合成および細胞外局在化を指向することができる。
【０６５７】
本明細書に記載されるとき、本発明の修飾核酸の有用な特徴は、外因性核酸に対する細胞の自然免疫応答を減少させる能力である。細胞内、または細胞の集団における免疫応答の滴定、低減、または排除を実施するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、細胞を、翻訳可能領域および少なくとも１つのヌクレオシド修飾を含む第１の用量の第１の外因性核酸を含有する第１の組成物と接触させ、第１の外因性核酸に対する細胞の自然免疫応答のレベルを決定する。続いて、細胞を、第１の用量と比べてより少ない量の第１の外因性核酸を含有する第２の用量の第１の外因性核酸を含む第二の組成物と接触させる。
【０６５８】
あるいは、細胞を第１の用量の第２の外因性核酸と接触させる。第２の外因性核酸は１つ以上の修飾ヌクレオシドを含有していてもよく、第１の外因性核酸と同一であるか、または異なっていてもよく、あるいは、第２の外因性核酸は修飾ヌクレオシドを含有し得ない。細胞を第１の組成物および／または第２の組成物と接触させるステップは１回以上繰り返してもよい。
【０６５９】
くわえて、細胞でのタンパク質産生（例えば、タンパク質翻訳）の効率は任意に決定され、細胞は標的タンパク質産生効率が達成されるまで繰り返し、第１および／または第２の組成物を再トランスフェクトされ得る。
【０６６０】
一実施形態において、本明細書に記載の修飾核酸の３’末端は、限定されないが、細胞内の微小胞等の細胞における所望の位置へ修飾核酸を標的化する配列を含み得る。標的化のための配列は、分子を細胞内の様々な場所へ輸送することができる細胞機構によって認識され得るように、その官能基において「ジップコード様（ｚｉｐ  ｃｏｄｅ−ｌｉｋｅ）」であり得る。核酸を標的化する配列の非限定的な例は、国際特許公開第ＷＯ２０１３１０９７１３号に記載され、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ジップコードおよびマイクロＲＮＡがどちらもｍＲＮＡの転写後調節における役割を有するため、ジップコード様配列およびｍｉＲ−１２８９は、微小胞中のｍＲＮＡを濃縮するようにＢｏｌｕｋｂａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．によって示される（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  ２０１２  １，ｅ１０；この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０６６１】
一実施形態において、修飾核酸を標的化する配列は、国際特許公開第ＷＯ２０１３１０９７１３号に記載の、配列番号２２、配列番号３８、または少なくとも１つの配列番号２２および少なくとも１つの配列番号３８のコンカテマーであり、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ワクチン
本明細書に記載されるように、実質的に翻訳可能ではない配列、有するｍＲＮＡが提供される。そのようなｍＲＮＡは、哺乳類対象に投与されたとき、ワクチンとして効果的である。
【０６６２】
１つ以上の非コード領域を含有する修飾核酸もまた提供される。そのような修飾核酸は、通常翻訳されないが、リボソームタンパク質または転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）等の１つ以上の翻訳機構成分へ結合および隔離することができ、それによって、細胞におけるタンパク質発現を効果的に低下させる。修飾核酸は、低分子核ＲＮＡ（ｓｎｏ−ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはＰｉｗｉ干渉ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）を含有し得る。
【０６６３】
さらに、ある特定の修飾ヌクレオシド、またはその組み合わせは、修飾核酸に導入されると、自然免疫応答を活性化する。例えば修飾ＲＮＡといったそのような活性化修飾核酸は、ポリペプチドまたは他のワクチンと組み合わせられる場合、アジュバントとして有用である。ある特定の実施形態において、活性化修飾ｍＲＮＡは、ワクチンとして有用であるポリペプチド配列をコードする翻訳可能領域を含有し、このようにして、自己アジュバントとなる能力を提供する。
治療薬
本明細書に記載される、修飾核酸（修飾ＲＮＡ）および修飾核酸から翻訳されるタンパク質は、治療剤または予防剤として使用することができる。例えば、本明細書に記載の修飾核酸は、対象に投与することができ、この修飾核酸は、インビボで翻訳されて、対象において治療的ペプチドを産生する。ヒトおよび他の哺乳動物における疾患または状態の治療または予防のための、組成物、方法、キット、および試薬が提供される。本発明の活性治療薬は、修飾核酸、修飾核酸またはこの修飾核酸から翻訳されるポリペプチドを含有する細胞、修飾核酸から翻訳されるポリペプチド、および修飾核酸またはこの修飾核酸から翻訳されるポリペプチドを含有する細胞と接触する細胞を含む。
【０６６４】
ある特定の実施形態において、抗体依存性細胞傷害性を誘導するタンパク質とともに、哺乳類対象の免疫性を後押しするタンパク質（単数または複数）をコードする翻訳可能領域を含有する、１つ以上の修飾核酸を含有する、組み合わせ治療薬が提供される。例えば、トラスツズマブおよび顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）をコードする１つ以上の核酸を含有する治療薬が提供される。具体的には、そのような組み合わせ治療薬は、トラスツズマブへの誘導耐性を発達するＨｅｒ２＋乳癌患者において有用である。（例えば、Ａｌｂｒｅｃｈｔ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．２（６）：７９５−８（２０１０）を参照のこと）。
【０６６５】
本明細書に記載の修飾核酸を用いて、細胞集団内で組換えポリペプチドの翻訳を誘導する方法が、本明細書に提供される。そのような翻訳は、インビボ、エクスビボ、培養下、またはインビトロであり得る。細胞集団は、少なくとも１つのヌクレオシド修飾および組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有する核酸を含有する有効量の組成物と接触させられる。集団は、核酸が細胞集団の１つ以上の細胞内に局在化され、組換えポリペプチドが細胞内で核酸から翻訳されるような条件下で接触させられる。
【０６６６】
有効量の組成物が、少なくとも部分的に、標的組織、標的細胞型、投与手段、核酸の物理的特徴（例えば、サイズ、および修飾ヌクレオシドの程度）、および他の決定因子に基づいて提供される。一般に、有効量の組成物は、細胞内での効率的な、好ましくは対応する未修飾核酸を含有する組成物よりも効率的な、タンパク質産生を提供する。増加した効率は、増加した細胞トランスフェクション（すなわち、核酸でトランスフェクトされた細胞の割合（％））、核酸からの増加したタンパク質翻訳、減少した核酸分解（例えば、修飾核酸からのタンパク質翻訳の増加した持続期間によって実証される）、または宿主細胞の低減された自然免疫応答によって実証され得る。
【０６６７】
本発明の態様は、必要性のある哺乳類対象において組換えポリペプチドのインビボ翻訳を誘導する方法を対象とする。その中で、少なくとも１つのヌクレオシド修飾および組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有する核酸を含有する、有効量の組成物が、本明細書に記載の送達方法を用いて対象に投与される。核酸は、核酸が対象の細胞内に局在化され、組換えポリペプチドが細胞内で核酸から翻訳されるような量および他の条件下で提供される。核酸が局在化される細胞、または細胞が存在する組織は、１周期以上の核酸投与により標的とされ得る。
【０６６８】
本発明の他の態様は、哺乳類対象への、修飾核酸を含有する細胞の移植に関する。哺乳類対象への細胞の投与は、当業者に知られており、薬剤的に許容される担体中の細胞の製剤のような、局所移植（例えば、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）または皮下投与）、器官送達または全身埋込（例えば、静脈内注入または吸入）等である。修飾核酸を含有するそのような組成物は、筋肉内に、経動脈的に、眼内に、経膣的に、経直腸的に、腹腔内に、静脈内に、鼻腔内に、皮下に、内視鏡的に、経皮的に、または髄腔内に投与するために製剤化することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、持続放出のために製剤化されてもよい。
【０６６９】
治療剤が投与され得る対象は、疾患、障害、または有害な状態を患うか、またはそれを発症する危険性があり得る。これらに基づいて、対象を特定する、診断する、および分類する方法が提供され、それは臨床診断、バイオマーカーレベル、全ゲノム相関解析（ＧＷＡＳ）、および当技術分野で既知の他の方法を含んでもよい。
【０６７０】
ある特定の実施形態において、投与される修飾核酸は、組換えポリペプチドが翻訳される細胞内で実質的に不在である機能的活性を提供する、１つ以上の組換えポリペプチドの産生を指示する。例えば、欠損した機能的活性は、酵素的活性、構造的活性、または遺伝子調節活性の性質を有し得る。関連する実施形態において、投与される修飾核酸は、組換えポリペプチドが翻訳される細胞内に存在しているが、実質的に不全である機能的活性を（例えば、相乗的に）増加させる、１つ以上の組換えポリペプチドの産生を指示する。
【０６７１】
他の実施形態において、投与される修飾核酸は、組換えポリペプチドが翻訳される細胞内で実質的に不在である１つのポリペプチド（または複数のポリペプチド）を置き換える、１つ以上の組換えポリペプチドの産生を指示する。そのような不在性は、コード遺伝子の遺伝子突然変異またはその調節経路に起因し得る。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、細胞内の内因性タンパク質のレベルを所望のレベルまで増加させ、そのような増加は、内因性タンパク質のレベルを正常未満のレベルから正常なレベルへと、または正常なレベルから過正常なレベルへと至らせ得る。
【０６７２】
あるいは、組換えポリペプチドは、細胞内に存在する、最上の表面上にある、または細胞から分泌される内因性タンパク質の活性に拮抗するように機能する。通常、内因性タンパク質の活性は対象に有害であり、例えば、内因性タンパク質の突然変異が変化した活性または局在化をもたらすように成す。さらに、組換えポリペプチドは、細胞内に存在する、最上の表面上にある、拮抗対象の生体部分の例としては、脂質（例えば、コレステロール）、リポタンパク質（例えば、低比重リポタンパク質）、核酸、炭水化物、志賀毒素および破傷風毒素等のタンパク質毒素、またはボツリヌス毒素、コレラ毒素、およびジフテリア毒素等の小分子毒素が挙げられる。さらに、拮抗対象の生物学的分子は、細胞傷害性活性または細胞増殖抑制性活性等の望ましくない活性を示す内因性タンパク質である場合がある。本明細書に記載の組換えタンパク質は、細胞内、可能性としては核等の特定の区画内での局在化のために操作されてもよく、または細胞からの分泌もしくは細胞の原形質膜への移行のために操作される。
治療学
欠損したタンパク質活性の置換または異常なタンパク質活性の克服によって、タンパク質活性の欠損または異常を特徴とする疾患の症状を、治療または予防する方法が提供される。ウイルスＤＮＡベクターと比較して、修飾ｍＲＮＡの導入に続いてタンパク質産生が速やかに開始するため、本発明の化合物は、敗血症、脳卒中、および心筋梗塞等の急性疾患の治療に特に有利である。さらに、本発明の修飾ｍＲＮＡの転写制御の欠失はタンパク質産生が達成できる正確な用量設定のために有利である。
【０６７３】
いくつかの実施形態において、本発明に従う修飾ｍＲＮＡおよびそれらのコードされたポリペプチドは、治療目的に使用されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明に従う修飾ｍＲＮＡおよびそれらのコードされたポリペプチドは、次のうちの１つ以上を含むが、それれらに限定されない多様な疾患、障害、および／または状態のいずれの治療に使用されてもよい：自己免疫障害（例えば、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ）；炎症性障害（例えば、関節炎、骨盤内炎症性疾患）；感染性疾患（例えば、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＲＳＶ）、細菌感染、真菌感染、敗血症）；神経障害（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病；自閉症；デュシェンヌ型筋ジストロフィー）；心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、血栓、凝固障害、黄斑変性等の血管新生障害）；増殖性障害（例えば、癌、良性新生物）；呼吸器障害（例えば、慢性閉塞性肺疾患）；消化器障害（例えば、炎症性腸疾患、胃潰瘍）；筋骨格障害（例えば、線維筋痛症、関節炎）；内分泌、代謝、および栄養障害（例えば、糖尿病、骨粗鬆症）；泌尿器障害（例えば、腎疾患）；精神的障害（例えば、うつ病、統合失調症）；皮膚障害（例えば、創傷、湿疹）；血液およびリンパ系障害（例えば、貧血症、血友病）等。
【０６７４】
機能不全のまたは異常なタンパク質活性によって特徴付けられる疾患には、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血症、表皮水疱症、筋萎縮性側索硬化症、およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素欠損症が含まれる。本発明は、本明細書に提供される修飾核酸を含有する核酸または細胞ベースの治療薬を導入することによって、対象においてそのような状態または疾患を治療するための方法を提供し、この修飾核酸は、対象の細胞内に存在する異常なタンパク質活性に拮抗するか、またはそれに打ち勝つタンパク質をコードする。機能不全のタンパク質の具体的な例としては、嚢胞性線維症を引き起こすＣＦＴＲタンパク質の機能不全のタンパク質変異形を産生する、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子のミスセンス突然変異変異形が挙げられる。
【０６７５】
欠損した（または生理学的タンパク質機能が生じないほどに実質的に低下した）タンパク質活性によって特徴付けられる疾患には、嚢胞性線維症、ニーマン・ピック病Ｃ型、重症型βサラセミア、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハーラー症候群、ハンター症候群、および血友病Ａが含まれる。そのようなタンパク質は、存在しない場合があるか、または本質的に非機能的である。本発明は、本明細書に提供される修飾核酸を含有する核酸または細胞ベースの治療薬を導入することによって、対象においてそのような状態または疾患を治療するための方法を提供し、この修飾核酸は、対象の標的細胞から欠損したタンパク質活性を置き換える。機能不全のタンパク質の具体的な例としては、嚢胞性線維症を引き起こすＣＦＴＲタンパク質の非機能的なタンパク質変異形を産生する、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子のナンセンス突然変異変異形が挙げられる。
【０６７６】
したがって、対象の細胞を、有効量のＣＴＦＲポリペプチドが細胞内に存在するような条件下で、機能的ＣＦＴＲポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有する修飾核酸と接触させることによって、哺乳類対象において嚢胞性線維症を治療する方法が提供される。好ましい標的細胞は、肺等の上皮、内皮、および中皮細胞であり、投与方法は、標的組織を考慮して決定される、すなわち、肺送達に関して、ＲＮＡ分子は、吸入による投与のために製剤化される。
【０６７７】
別の実施形態において、本発明は、対象の細胞集団に、ゲノム研究によって最近特徴付けられたタンパク質であるＳｏｒｔｉｌｉｎをコードする修飾ｍＲＮＡ分子を用いて導入し、それによって対象において高脂血症を寛解させることによって、対象において高脂血症を治療するための方法を提供する。ＳＯＲＴ１遺伝子は、Ｓｏｒｔｉｌｉｎと呼ばれるトランスゴルジ網（ＴＧＮ）膜貫通タンパク質をコードする。遺伝子研究は、５人に１人の個人が、ＳＯＲＴ１遺伝子の１ｐ１３遺伝子座において、低レベルの低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）および超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の素因を付与する一塩基多型ｒｓ１２７４０３７４を有することを示している。人々の約３０％において存在するこの劣性対立遺伝子の各コピーは、ＬＤＬコレステロールを８ｍｇ／ｄＬだけ変化させる一方で、集団の約５％において存在するこの劣性対立遺伝子の２つのコピーは、ＬＤＬコレステロールを１６ｍｇ／ｄＬ低下させる。この劣性対立遺伝子の保因者は、心筋梗塞の４０％減少した危険性を有することも示されている。マウスにおける機能的インビボ研究は、マウス肝臓組織内のＳＯＲＴ１の過剰発現が、最大８０％より低い、有意により低いＬＤＬ−コレステロールレベルをもたらし、ＳＯＲＴ１のサイレンシングがＬＤＬコレステロールをおよそ２００％増加させることを記載する（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｕｓｕｎｕｒｕ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｏｍ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｖａｒｉａｎｔ  ｔｏ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｖｉａ  ＳＯＲＴ１  ａｔ  ｔｈｅ  １ｐ１３  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｌｏｃｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ２０１０；４６６：７１４−７２１）。
細胞運命の調節
標的哺乳類細胞における細胞運命の変化を誘導する方法が提供される。標的哺乳類細胞は前駆体細胞であってもよく、変化は分化を系譜内に推進すること、またはそのような分化を遮断することを含み得る。あるいは、標的哺乳類細胞は分化細胞であってもよく、細胞運命変化は、脱分化を多能性前駆体細胞内に推進すること、または癌幹細胞への癌細胞の脱分化等のそのような脱分化を遮断することを含む。細胞運命の変化が望まれる状況において、細胞運命誘導性ポリペプチドをコードする有効量のｍＲＮＡが、細胞運命の変化が誘導されるような条件下で標的細胞に導入される。いくつかの実施形態において、修飾ｍＲＮＡは、第１の表現型から第２の表現型へ細胞の亜集団を再プログラムするのに有用である。そのような再プログラミングは、一時的または永久的であってもよい。
【０６７８】
任意に、再プログラミングは、中間表現型を装うように標的細胞を誘導する。
さらに、本発明の方法は、高い効率のトランスフェクション、細胞を再トランスフェクトする能力、および標的細胞内で産生される組換えポリペプチドの量の妥当性によって、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を生成するのに特に有用である。さらに、本明細書に記載の方法を用いて生成されたｉＰＳ細胞の使用は、テラトーマ形成の低減された発生率を有することが予期される。
【０６７９】
標的細胞集団における細胞分化を低減する方法もまた提供される。例えば、ポリペプチドが翻訳され、かつ前駆体細胞の分化を低減するような条件下で、１つ以上の前駆体細胞型を含有する標的細胞集団を、ポリペプチドをコードする有効量の修飾ｍＲＮＡを有する組成物と接触する。非限定的な実施形態において、標的細胞集団は、哺乳類対象における損傷組織または外科的処置を受けた組織を含む。前駆体細胞は、例えば、間質前駆体細胞、神経前駆体細胞、または間葉系前駆体細胞である。
【０６８０】
具体的な実施形態において、１つ以上の分化因子Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ４をコードする修飾核酸が提供される。これらのｍＲＮＡ生成因子が、線維芽細胞内に導入され、再プログラミングを心筋細胞に推進する。そのような再プログラミングは、ｍＲＮＡ含有パッチまたは他の材料を損傷された心臓組織と接触することによってインビボで行われ、心臓の再分化を容易にすることができる。そのようなプロセスは、線維症とは対照的に心筋細胞発生を促進する。
病原性生物の標的化；生物材料の精製
細胞増殖抑制性または細胞傷害性ポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡを用いて、細菌、酵母、原虫、蠕虫等の病原性微生物を標的とするための方法が本明細書に提供される。好ましくは、導入されるｍＲＮＡは、治療の見込まれるオフターゲット効果を低減させるために、標的病原性生物において排他的または優先的に翻訳された修飾ヌクレオシドまたは他の核酸配列修飾を含む。そのような方法は、血液、精液、卵子、ならびに胚、組織、および器官を含む移植材料を含む生体材料から病原性生物を除去するのに有用である。疾患細胞の標的化
細胞増殖抑制性または細胞傷害性ポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡを用いて、病原性細胞または疾患細胞、具体的には癌細胞を標的とするための方法が本明細書に提供される。好ましくは、導入されるｍＲＮＡは、治療の見込まれるオフターゲット効果を低減させるために、標的病原性生物において排他的または優先的に翻訳された修飾ヌクレオシドまたは他の核酸配列修飾を含む。あるいは、本発明は修飾ｍＲＮＡを標的化して、標的病原性細胞に優先的に結合し、かつ進入することができる標的部分を提供する。
タンパク質産生
本明細書に提供される方法は、細胞培養プロセスにおけるタンパク質産物収率を向上させるのに有用であり得る。複数の宿主細胞を含有する細胞培養において、本明細書に記載の修飾ｍＲＮＡの導入は、対応する未修飾核酸と比べて増加したタンパク質産生効率をもたらす。そのような増加したタンパク質産生効率は、例えば、増加した細胞トランスフェクション、核酸からの増加したタンパク質翻訳、減少した核酸分解、および／または低減された宿主細胞の自然免疫応答を示すことによって実証することができる。タンパク質産生はＥＬＩＳＡによって測定することができ、タンパク質活性は当技術分野で既知の様々な機能的アッセイによって測定することができる。タンパク質産生は、連続的または流加（ｂａｔｃｈ−ｆｅｄ）哺乳類プロセスにおいて生成され得る。
【０６８１】
さらに、潜在的対象の細胞株または細胞株の収集物において、特定のポリペプチド、特に既知の活性を有する参照タンパク質のタンパク質変異形等の改変タンパク質の発現を最適化することが有用である。一実施形態において、複数の標的細胞型を提供することによって、および独立して、その複数の標的細胞型のそれぞれと改変ポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡとを接触させることによって、標的細胞において改変タンパク質の発現を最適化する方法が提供される。さらに、培養条件を変化させ、タンパク質産生効率を増加させることができる。続いて、複数の標的細胞型における目的とするポリペプチドの存在および／またはレベルを検出および／または定量し、改変ポリペプチドの発現に関する効率的な標的細胞および細胞培養条件の選択により、その最適化を可能にする。そのような方法は、しばしば効率的なタンパク質産生を複雑化する状況である、ポリペプチドが１つ以上の翻訳後修飾を含有するか、または実質的な三次構造を有する場合に、特に有用である。
遺伝子サイレンシング
本明細書に記載の修飾ｍＲＮＡは、細胞集団における１つ以上の標的遺伝子の発現を発現停止させる（すなわち、予防するか、または大幅に低減させる）ために有用である。配列特異的ヒストンＨ３メチル化を指示することができる目的とするポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡが、ポリペプチドが翻訳され、ヒストンＨ３メチル化および続いてヘテロクロマチン形成を介して標的遺伝子の遺伝子転写が低減されるような条件下の集団における細胞内に導入される。いくつかの実施形態において、サイレンシング機構は、哺乳類対象中に存在する細胞集団上で行われる。非限定的な例として、有用な標的遺伝子は、その中で哺乳類対象が、異常なキナーゼ活性の結果である骨髄増殖性疾患から被る変異体標的遺伝子を発現する、変異ヤヌスキナーゼ−２ファミリーメンバーである。
【０６８２】
修飾ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの同時投与もまた本明細書に提供される。酵母で示されるように、配列特異的トランスサイレンシングは細胞機能を変化させるのに効果的な機構である。分裂酵母は、ｓｉＲＮＡ媒介ヘテロクロマチン構築に２つのＲＮＡｉ複合体、ＲＮＡ誘導転写サイレンシング（ＲＩＴＳ）複合体およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ複合体（ＲＤＲＣ）を必要とする（Ｍｏｔａｍｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２００４，１１９，７８９−８０２）。分裂酵母において、ＲＩＴＳ複合体は、ｓｉＲＮＡ結合アルゴノートファミリータンパク質Ａｇｏ１、クロモドメインタンパク質Ｃｈｐ１、およびＴａｓ３を含有する。分裂酵母ＲＤＲＣ複合体は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＲｄｐ１、推定ＲＮＡヘリカーゼＨｒｒ１、およびポリＡポリメラーゼファミリータンパク質Ｃｉｄ１２からなる。これら２つの複合体は、活性にダイサーリボヌクレアーゼおよびＣｌｒ４ヒストンＨ３メチルトランスフェラーゼを必要とする。Ａｇｏ１は、Ｒｄｐ１同時転写的に作成された作成ｄｓＲＮＡ転写物のダイサー媒介切断によって作成されたｓｉＲＮＡ分子を一緒に結合し、Ｃｈｐ１、Ｔａｓ３、Ｈｒｒ１、およびＣｌｒ４を、メチル化およびヒストン修飾、次いで転写的に発現停止された異質染色質へのコンパクションの運命にあるＤＮＡの領域と配列特異的直接会合させる。この機構はＤＮＡのセントロメア領域とシスにおいて機能するが、配列特異的トランスサイレンシングが、ＤＮＡの特異的領域およびｓｉＲＮＡリボヌクレアーゼＥｒｉ１の随伴性ＲＮＡｉ定方向サイレンシングに対する二本鎖ｓｉＲＮＡに同時導入を介して可能である（Ｂｕｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２００６，１２５，８７３−８８６、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
生体経路の調節
細胞内に導入される修飾ｍＲＮＡの急速翻訳は、標的生体経路を調節する所望の機構を提供する。そのような調節には、所与の経路のアンタゴニズムまたはアゴニズムが含まれる。一実施形態において、核酸が細胞内に局在化され、組換えポリペプチドが、核酸から細胞内で翻訳されることができ、その組換えポリペプチドが、生体経路におけるポリペプチド機能の活性を阻害するような条件下で、細胞を、組換えポリペプチドをコードする核酸を含む有効量の組成物と接触させることによって、細胞内の生体経路を拮抗するための方法が、提供される。例示の生体経路は、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、狼瘡エリテマトーデス、強直性脊椎炎、大腸炎、またはクローン病等の自己免疫または炎症性障害において欠損しているものである。特に、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３シグナル伝達経路のアンタゴニズムは、特に有用性がある（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｉｋｌｙ  Ｋ，Ｌｉｕ  Ｌ，Ｎａ  Ｓ，Ｓｅｄｇｗｉｃｋ  ＪＤ（２００６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（６）：６７０−５）を参照のこと）。
【０６８３】
さらに、ケモカイン受容体のアンタゴニストをコードする修飾核酸が提供される。ケモカイン受容体ＣＸＣＲ−４およびＣＣＲ−５は、例えば、ＨＩＶが宿主細胞内に進入するために必要とされる（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｒｅｎｚａｎａ−Ｓｅｉｓｄｅｄｏｓ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ．Ｏｃｔ  ３；３８３（６５９９）：４００）。
【０６８４】
あるいは、核酸が細胞内に局在化され、組換えポリペプチドが核酸から細胞内で翻訳されることができ、その組換えポリペプチドが、生体経路におけるポリペプチド機能の活性を誘導するような条件下で、細胞を組換えポリペプチドをコードする有効量の修飾核酸と接触させることによって、細胞内の生体経路を刺激する方法が提供される。例示の刺激された生体経路には、細胞運命決定を調節する経路を含む。そのような刺激化（ａｇｏｎｉｚａｔｉｏｎ）は、可逆性であるか、または不可逆性である。
細胞核酸送達
本発明の方法は、インビボ、エキソビボ、または培養内での細胞集団への核酸送達を促進する。例えば、複数の宿主細胞（例えば、酵母または哺乳類細胞等の真核細胞）を含有する細胞培養を、少なくとも１つのヌクレオシド修飾、および任意に翻訳可能領域を有するエンハンスド核酸を含有する組成物と接触させる。組成物はまた、一般的に、トランスフェクション試薬または宿主細胞へのエンハンスド核酸取り込みの効率を増加させる他の化合物を含有する。エンハンスド核酸は、対応する無修飾核酸と比べて細胞集団における強化された保持率を示す。エンハンスド核酸の保持率は無修飾核酸の保持率よりも大きい。いくつかの実施形態において、無修飾核酸の保持率よりも、少なくとも約５０％、７５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、または２００％以上大きい。そのような保持率の優位性は１回のエンハンスド核酸のトランスフェクションによって達成することができるか、または続くトランスフェクションの数回の繰り返しによって得ることができる。
【０６８５】
いくつかの実施形態において、エンハンスド核酸は標的細胞集団へ１つ以上のさらなる核酸とともに送達される。そのような送達は同時であってもよく、またはエンハンスド核酸が１つ以上のさらなる核酸の送達に先んじて送達される。さらなる１つ以上の核酸は修飾核酸または無修飾核酸であり得る。エンハンスド核酸の初回の存在は細胞集団の自然免疫応答を実質的に誘導しないこと、さらに、自然免疫応答は無修飾核酸の後の存在によって達成され得ないことを理解されたい。この点において、標的細胞集団に存在することが望まれるタンパク質が無修飾核酸から翻訳される場合、エンハンスド核酸それ自体は翻訳可能領域を含有し得ない。
ＩＶ．医薬組成物
製剤化、投与、送達、および投薬
本発明は、１つ以上の薬剤的に許容される賦形剤と組み合わせた修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、およびリボ核酸ＲＮＡの組成物および複合体を提供する。医薬組成物は、任意に、１つ以上のさらなる活性物質、例えば、治療上および／または予防上活性物質を含んでもよい。医薬品の製剤および／または製造における一般の考慮事項は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５において見出され得る。
【０６８６】
一実施形態において、リボ核酸が進入する細胞の自然免疫応答を避けるように操作された有効量のリボ核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡを含有する核酸）を含有する製剤が提供される。リボ核酸は一般的に目的とするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０６８７】
いくつかの実施形態において、組成物は、ヒト、すなわちヒト患者または対象に投与される。本開示の目的のために、「活性成分」という表現は、一般に、本明細書に記載の送達対象の修飾核酸、エンハンスド核酸、またはリボ核酸を指す。
【０６８８】
本明細書に提供される医薬組成物の説明は、原則的に、ヒトへの投与に好適である医薬組成物を対象とするが、そのような組成物は一般に、任意の他の動物への、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に好適であることが当業者によって理解されるであろう。組成物を種々の動物への投与に好適であるようにするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の修飾は、よく理解されており、獣医薬理学の専門家は、たとえ用いるとしても単なる通常の実験法を用いて、そのような修飾を設計および／または実施することができる。医薬組成物の投与が企図される対象には、ヒトおよび／もしくは他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／もしくはラット等の商業的に関連性のある哺乳動物を含む哺乳動物；ならびに／または家禽類、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／もしくはシチメンチョウ等の商業的に適切な鳥類を含む鳥類が含まれるが、これらに限定されない。
【０６８９】
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野で既知であるか今後開発される、任意の方法によって調製されて得る。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の副成分と混合し、次いで、必要かつ／または望ましい場合、生成物を所望の単回または複数回用量単位へと分割、成形、および／またはパッケージ化するステップを含む。
【０６９０】
本発明に従う医薬組成物は、バルクで、１つの単回単位用量として、および／または複数の単回単位用量として、調製され、パッケージ化され、かつ／または販売され得る。本明細書で使用されるとき、「単位用量」は、既定量の活性成分を含む、医薬組成物の個別的な量である。活性成分の量は一般に、対象に投与されるであろう活性成分の投薬量、および／または例えば、そのような投薬量の２分の１もしくは３分の１等の、そのような投薬量の好都合な分率に等しい。
【０６９１】
本発明に従う医薬組成物中の活性成分、薬剤的に許容される賦形剤、および／または任意のさらなる成分の相対的な量は、治療される対象の素性、大きさ、および／または状態に応じて変化し、組成物が投与されるべき経路に応じてさらに変化するあろう。例として、組成物は、０．１％〜１００ｗ／ｗ％、例えば、０．５〜５０ｗ／ｗ％、１〜３０ｗ／ｗ％、５〜８０ｗ／ｗ％、少なくとも８０ｗ／ｗ％の活性成分を含み得る。
製剤化
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、およびリボ核酸は、：（１）安定性を増加させ、（２）細胞トランスフェクションを増加させ、（３）（例えば、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸のデポー製剤からの）持続放出もしくは遅延放出を可能にし、（４）生体分布を変化させ（例えば、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の標的を特定の組織または細胞型に定める）、（５）コードされたタンパク質の翻訳をインビボで増加させ、かつ／または（６）コードされたタンパク質の放出プロファイルをインビボで変化させるために、１つ以上の賦形剤を用いて製剤化することができる。ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤等の伝統的な賦形剤に加えて、本発明の賦形剤は、制限なく、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸（例えば、対象への移植のために）でトランスフェクトされた細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、およびこれらの組み合わせを含むことができる。
【０６９２】
したがって、本発明の製剤は、１つ以上の賦形剤を含むことができ、各々は一緒にポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、もしくはリボ核酸の安定性を増加させる、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸による細胞トランスフェクションを増加させる、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸によりコードされるタンパク質の発現を増加させる、および／またはポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸によりコードされるタンパク質の放出プロファイルを変化させる量である。さらに、本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、自己集合性核酸ナノ粒子を用いて製剤化されてもよい。
【０６９３】
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野で既知であるか今後開発される、任意の方法によって調製され得る。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の副成分と混合するステップを含む。
【０６９４】
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、およびリボ核酸は、対象の組織および／または臓器に送達されるように処方することができる。臓器は、限定されないが、心臓、肺、脳、肝臓、基底核、脳幹髄質、中脳、脳橋、小脳、大脳皮質、視床下部、目、下垂体、甲状腺、副甲状腺、食道、胸腺、副腎、虫垂、膀胱、胆嚢、腸（例えば、大腸および象徴）、腎臓、膵臓、脾臓、胃、皮膚、前立腺、精巣、卵巣、子宮、副腎、肛門、気管支、耳、食道、生殖器、喉頭（発生器）、リンパ節、髄膜、口、鼻、上皮小体、脳下垂体、直腸、唾液腺、脊髄、胸腺、舌、気管、尿管、尿道、結腸を含み得る。組織は、限定されないが、心臓弁、骨、静脈、中耳、筋肉（心筋、平滑筋、または骨格筋）軟骨、腱、または靱帯を含み得る。非限定的な例として、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、およびリボ核酸は、脂質ナノ粒子中に処方してもよく、限定されないが、肝臓、脾臓、腎臓、または肺等の臓器にに送達され得る。別の非限定的な例において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、およびリボ核酸は、陽イオン性脂質ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡを含む脂質ナノ粒子中に処方してもよく、限定されないが、肝臓、脾臓、腎臓、または肺等の臓器に送達され得る。
【０６９５】
本開示による医薬組成物は、バルクで、１つの単回単位用量として、および／または複数の単回単位用量として、調製され、パッケージ化され、かつ／または販売されてもよい。本明細書で使用されるとき、「単位用量」は、既定量の活性成分を含む、医薬組成物の個別的な量を指す。活性成分の量は一般に、対象に投与されるであろう活性成分の投薬量、および／または例えば、そのような投薬量の２分の１もしくは３分の１を含むが、これらに限定されない、そのような投薬量の好都合な分率に等しい。
【０６９６】
本開示による医薬組成物中の活性成分、薬剤的に許容される賦形剤、および／または任意のさらなる成分の相対的な量は、治療されている対象の素性、サイズ、および／または状態に応じて変化し、組成物が投与されるべき経路に応じてさらに変化するであろう。例えば、組成物は、０．１〜９９ｗ／ｗ％の活性成分を含み得る。
【０６９７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の修飾ｍＲＮＡ製剤は、少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡを含有し得る。製剤は、１、２、３、４、または５つの修飾ｍＲＮＡを含有してもよい。一実施形態において、製剤は、ヒトタンパク質、獣医学的タンパク質（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、細菌タンパク質、生体タンパク質、抗体、免疫原性タンパク質、治療的ペプチドおよびタンパク質、分泌タンパク質、原形質膜タンパク質、細胞質および細胞骨格タンパク質、細胞内（ｉｎｔｒａｎｃｅｌｌｕｌａｒ）膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連したタンパク質および／または非ヒト疾患に関連したタンパク質等であるが、これらに限定されないカテゴリーから選択されるタンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡを含有し得る。一実施形態において、製剤は、少なくとも３つの修飾ｍＲＮＡがコードするタンパク質を含有する。一実施形態において、製剤は、少なくとも５つの修飾ｍＲＮＡがコードするタンパク質を含有する
薬学的製剤は、所望される特定の剤形に適している、本明細書で使用されるときにありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤等を含むが、これらに限定されない、薬剤的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。医薬組成物を製剤化するための種々の賦形剤および組成物を調製するための技法は、当技術分野で知られている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照のこと）。任意の従来の賦形剤媒体が任意の望ましくない生体影響を引き起こすか、またはさもなければ医薬組成物の任意の他の構成成分（複数可）と有害な様態で相互作用するといった、物質またはその誘導体と不適合性である場合を除いて、その使用が本開示の範囲内で企図され得る。
【０６９８】
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子の粒径は、増加および／または減少し得る。粒径の変化は、炎症等であるが、これらに限定されない生体反応に対抗する一助となることが可能であり得るか、または哺乳動物に送達される修飾ｍＲＮＡの生体効果を増加させ得る。
【０６９９】
医薬組成物の製造に使用される薬剤的に許容される賦形剤には、不活性希釈剤、界面活性剤および／もしくは乳化剤、防腐剤、緩衝剤、滑沢剤、ならびに／または油が含まれるが、これらに限定されない。そのような賦形剤が任意に本発明の薬学的製剤に含まれてもよい。
リピドイド
リピドイドの合成が詳細に記載されており、これらの化合物を含有する製剤は、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、およびリボ核酸の送達に特に適している（これらすべてが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｍａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２０１０  ２１：１４４８−１４５４、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．２０１０  ２６７：９−２１、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８  ２６：５６１−５６９、Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０  １０７：１８６４−１８６９、Ｓｉｅｇｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１１１０８：１２９９６−３００１を参照のこと）。
【０７００】
これらのリピドイドを用いて、齧歯類および非ヒト霊長類において２本鎖低分子干渉ＲＮＡが有効に送達されているが（これらすべて、それらの全体が本明細書に組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８  ２６：５６１−５６９、Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００８  １０５：１１９１５−１１９２０、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９  １７：８７２−８７９、Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０  １０７：１８６４−１８６９、Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  ２９：１００５−１０１０を参照のこと）、本開示は、１本鎖ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、およびリボ核酸を送達することにおけるそれらの製剤化および使用を記載する。これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソーム、または粒子が調製され得、したがって、局所および／または全身投与経路を介したリピドイド製剤の注入後に、コードされたタンパク質の産生によって判定するとき、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、およびリボ核酸の有効な送達をもたらすことができる。ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、およびリボ核酸のリピドイド複合体は、静脈内、筋肉内、または皮下経路を含むが、これらに限定されない、種々の手段によって投与することができる。
【０７０１】
核酸のインビボ送達は、製剤組成、粒子ＰＥＧ化の性質、負荷の程度、オリゴヌクレオチド対脂質比を含むが、これらに限定されない多くのパラメータ、および粒径等であり、生物物理学的パラメータによって影響を受け得る（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９  １７：８７２−８７９）。例として、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質のアンカー鎖長のわずかな変化が、インビボ有効性に対する大きな効果をもたらし得る。ペンタ［３−（１−ラウリルアミノプロピオニル）］−トリエチレンテトラミン塩酸塩（ＴＥＴＡ−５ＬＡＰ（９８Ｎ１２−５としても知られる）、Ｍｕｒｕｇａｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０１：６１（２０１０）を参照のこと）、Ｃ１２−２００（誘導体および変異形を含む）、およびＭＤ１を含み、異なるリピドイドを有する製剤がインビボ活性について試験され得る。
【０７０２】
本明細書において「９８Ｎ１２−５」と称されるリピドイドは、参照によりその全体が組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９  １７：８７２−８７９によって開示されている。
【０７０３】
本明細書において「Ｃ１２−２００」と称されるリピドイドは、両方ともに参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０  １０７：１８６４−１８６９およびＬｉｕ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１０  ６６９−６７０によって開示されている。リピドイド製剤は、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、およびリボ核酸に加えて、３つもしくは４つのいずれかまたはそれよりも多い構成成分を含む粒子を含むことができる。例として、ある特定のリピドイドを有する製剤は、９８Ｎ１２−５を含むが、これらに限定されず、４２％リピドイド、４８％コレステロール、および１０％ＰＥＧ（Ｃ１４アルキル鎖長）を含有してもよい。別の例として、ある特定のリピドイドを有する製剤は、Ｃ１２−２００を含むが、これらに限定されず、５０％リピドイド、１０％ジステアロイルホスファチジル（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン、３８．５％コレステロール、および１．５％ＰＥＧ−ＤＭＧを含有してもよい。
【０７０４】
一実施形態において、全身静脈内投与のためにリピドイドとともに製剤化される修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、肝臓を標的とすることができる。例えば、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を使用し、４２％の９８Ｎ１２−５、４８％のコレステロール、および１０％のＰＥＧ−脂質の脂質モル組成を含み、約７．５〜１の総脂質対ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の最終重量比、およびＰＥＧ脂質上のＣ１４アルキル鎖長を有し、概ね５０〜６０ｎｍの平均粒径を有する、最終的な最適化された静脈内製剤は、肝臓への９０％超の製剤の分布をもたらし得る（全体が本明細書に組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９  １７：８７２−８７９を参照のこと）。別の例において、Ｃ１２−２００（各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国仮出願第６１／１７５，７７０号および公開された国際出願第ＷＯ２０１０１２９７０９号を参照のこと）リピドイドを使用し、５０／１０／３８．５／１．５のＣ１２−２００／ジステアロイルホスファチジル（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比を有し得、７対１の総脂質対ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の重量比、および８０ｎｍの平均粒径を有する静脈内製剤が、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を肝細胞に送達するのに有効であり得る（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０  １０７：１８６４−１８６９を参照のこと）。別の実施形態において、ＭＤ１リピドイド含有製剤を用いて、インビボでポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を肝細胞に有効に送達し得る。筋肉内または皮下経路のために最適化されたリピドイド製剤の特性は、標的細胞型、および製剤が細胞外マトリックスを介して血流中に拡散する能力に応じて大きく異なり得る。内皮窓（ｆｅｎｅｓｔｒａｅ）のサイズに起因して、１５０ｎｍ未満の粒径が有効な肝細胞送達のために所望され得るが（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９  １７：８７２−８７９を参照のこと）、製剤を、内皮細胞、骨髄細胞、および筋肉細胞を含むが、これらに限定されない他の細胞型に送達するためのリピドイド製剤化ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの使用は、同様にサイズ制限されない場合がある。ｓｉＲＮＡをインビボで骨髄細胞および内皮等の他の非肝細胞に送達するためのリピドイド製剤の使用が報告されている（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８  ２６：５６１−５６９、Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  ２９：１００５−１０１０、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２００９  １９：３１１２−３１１８、８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｕｄａｈ  Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ８−９，２０１０を参照のこと）。単球等の骨髄細胞への有効な送達、リピドイド製剤は、同様の構成成分モル比を有し得る。リピドイドと、ジステアロイルホスファチジル（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン、コレステロール、およびＰＥＧ−ＤＭＧを含むが、これらに限定されない他の構成成分との異なる比率を用いて、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の製剤を、肝細胞、骨髄細胞、筋肉細胞等を含むが、これらに限定されない異なる細胞型への送達のために最適化し得る。例えば、構成成分モル比は、５０％のＣ１２−２００、１０％のジステアロイルホスファチジル（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン、３８．５％のコレステロール、および１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧを含み得るが、これらに限定されない（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１１  ２９：１００５−１０１０を参照のこと）。皮下送達または筋肉内送達のいずれかを介した、核酸の細胞（脂肪細胞および筋肉細胞等であるが、これらに限定されない）への局所送達のためのリピドイド製剤の使用は、全身送達に所望される製剤構成成分のすべてを必要とするわけではない場合があり、したがって、リピドイドおよびポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸のみを含んでもよい。
【０７０５】
リピドイドは、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸による細胞トランスフェクションを増加させ、かつ／またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させることが可能であり得るため、異なるリピドイドの組み合わせを用いて、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の指示によるタンパク質産生の有効性を改善し得る（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１，１９：１６８８−１６９４を参照のこと）。
リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を用いて製剤化することができる。一実施形態において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の医薬組成物は、リポソームを含む。リポソームは、主に脂質二重層から構成され得、栄養素および薬学的製剤の投与のための送達ビヒクルとして使用され得る、人工的に調製された小胞である。リポソームは、直径数百ナノメートルであり得、かつ狭い水性の区画によって分離される一連の同心状二重層を含有し得る多層小胞（ＭＬＶ）、直径５０ｎｍよりも小さい場合がある小さい単細胞小胞（ＳＵＶ）、および直径５０〜５００ｎｍであり得る大きい単層小胞（ＬＵＶ）等であるが、これらに限定されない、異なるサイズのものであり得る。リポソーム設計は、不健康な組織へのリポソームの結合を改善するため、またはエンドサイトーシス等であるが、これらに限定されない事象を活性化するための、オプソニンまたはリガンドを含むが、これらに限定されない。リポソームは、薬学的製剤の送達を改善するために低ｐＨまたは高ｐＨを含有してもよい。
【０７０６】
リポソームの形成は、封入される薬学的製剤およびリポソーム成分、脂質小胞が分散される媒体の性質、封入される物質の有効濃度およびその潜在的な毒性、小胞の適用および／または送達中に伴われる任意のさらなるプロセス、意図される適用のための小胞の最適化サイズ、多分散性、および貯蔵寿命、ならびに安全かつ効率的なリポソーム生成物のバッチ間の再現性および大規模産生の可能性等であるが、これらに限定されない、物理化学特性に依存し得る。
【０７０７】
一実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、制限なく、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソーム、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ワシントン州ボセル）によるＤｉＬａ２リポソーム、１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、およびＭＣ３（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１００３２４１２０号）から形成されるもの等のリポソーム、ならびにＪａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（ペンシルヴァニア州ホーシャム）によるＤＯＸＩＬ（登録商標）等であるが、これらに限定されない小分子薬物を送達し得るリポソームを含んでもよい。一実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、制限なく、以前に記載されており、インビトロおよびインビボでのオリゴヌクレオチド送達に好適であることが示された、安定化プラスミド−脂質粒子（ＳＰＬＰ）または安定化核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）の合成から形成されるもの等のリポソームを含んでもよい（これらすべてが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｗｈｅｅｌｅｒ
ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９９  ６：２７１−２８１、Ｚｈａｎｇ
ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９９  ６：１４３８−１４４７、Ｊｅｆｆｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２００５  ２２：３６２−３７２、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５  ２：１００２−１００７、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００６  ４４１：１１１−１１４、Ｈｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．２００５  １０７：２７６−２８７、Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０  ２８：１７２−１７６、Ｊｕｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００９  １１９：６６１−６７３、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓＨｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８  １９：１２５−１３２を参照のこと）。Ｗｈｅｅｌｅｒらによる元の製造方法は、洗浄剤透析法（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ）であり、それは後にＪｅｆｆｓらによって改善され、自発的小胞形成法（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ
ｖｅｓｉｃｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）と称される。リポソーム製剤は、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸に加えて、３〜４つの脂質構成成分から構成される。例としてリポソームは、Ｊｅｆｆｓらによって記載されるように、５５％のコレステロール、２０％のジステアロイルホスファチジル（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン（ＤＳＰＣ）、１０％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＳＧ、および１５％の１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）を含有することができるが、これらに限定されない。別の例として、ある特定のリポソーム製剤は、Ｈｅｙｅｓらによって記載されるように、４８％のコレステロール、２０％のＤＳＰＣ、２％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、および３０％のカチオン性脂質を含有してもよいが、これらに限定されず、このカチオン性脂質は、１，２−ジステアリルオキシ（ｄｉｓｔｅａｒｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、または１，２−ジリノレニルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）であり得る。
【０７０８】
一実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１つの免疫原をコードし得るポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、およびリボ核酸を送達するために形成され得る、リポソームを含んでもよい。ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、およびリボ核酸は、リポソームによってカプセル封入されてもよく、かつ／またはそれは、水性コアに含有されてもよく、それが次いでリポソームによってカプセル封入されてもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０３１０４６号、同第ＷＯ２０１２０３１０４３号、同第ＷＯ２０１２０３０９０１号、および同第ＷＯ２０１２００６３７８号を参照のこと）。別のポリヌクレオチド、実施形態において、免疫原をコードし得る修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、およびリボ核酸は、カチオン性水中油型エマルション中で製剤化されてもよく、そのエマルション粒子は、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、およびリボ核酸と相互作用して分子をエマルション粒子に固着させることができる油中子およびカチオン性脂質を含む（国際公開第ＷＯ２０１２００６３８０号を参照のこと）。さらに別の実施形態において、脂質製剤は、トランスフェクションを向上させ得る脂質である少なくともカチオン性脂質、および脂質部分に連結された親水性頭頂基を含有する少なくとも１つの脂質を含んでもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１０７６８０７号および米国公開第２０１１０２００５８２号を参照のこと）。別の実施形態において、免疫原をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、官能化脂質二重層の間に架橋を有し得る脂質小胞中に製剤化されてもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１２０１７７７２４号を参照のこと）。
【０７０９】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、官能化脂質二重層の間に架橋を有し得る脂質小胞中に製剤化されてもよい。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化されてもよい。脂質−ポリカチオン複合体の形成は、当技術分野で既知の方法によって、および／または参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２０１２０１７８７０２号に記載されるように遂行されてもよい。非限定的な例として、ポリカチオンには、ポリリジン、ポリオルニチン、および／またはポリアルギニン等であるが、これらに限定されないカチオン性ペプチドまたはポリペプチドが含まれてもよい。別の実施形態において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）等であるが、これらに限定されない中性脂質をさらに含み得る、脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化されてもよい。
【０７１０】
リポソーム製剤は、カチオン性脂質構成成分の選択、カチオン性脂質飽和の程度、ＰＥＧ化の性質、すべての構成成分の比率、およびサイズ等の生物物理学的パラメータによって影響を受け得るが、これらに限定されない。Ｓｅｍｐｌｅら（Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０  ２８：１７２−１７６）による一例において、リポソーム製剤は、５７．１％のカチオン性脂質、７．１％のジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％のコレステロール、および１．４％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡから構成された。別の例として、カチオン性脂質の組成を変化させることにより、ｓｉＲＮＡを種々の抗原提示細胞により有効に送達することができた（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｂａｓｈａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１１  １９：２１８６−２２００）。
【０７１１】
いくつかの実施形態において、ＬＮＰ製剤中のＰＥＧの比率は、増加もしくは減少し得、かつ／またはＰＥＧ脂質の炭素鎖長がＣ１４からＣ１８に修飾されて、ＬＮＰ製剤の薬物動態および／もしくは生体分布を変化させ得る。非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、およびコレステロールと比較して、１〜５％の脂質モル比のＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有してもよい。別の実施形態において、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧは、ＰＥＧ−ＤＳＧ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）またはＰＥＧ−ＤＰＧ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）等であるが、これらに限定されないＰＥＧ脂質と置き換えられてもよい。カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００、およびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ等であるが、これらに限定されない、当技術分野で既知の任意の脂質から選択されてもよい。
【０７１２】
一実施形態において、カチオン性脂質は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０４０１８４号、同第ＷＯ２０１１１５３１２０号、同第ＷＯ２０１１１４９７３３号、同第ＷＯ２０１１０９０９６５号、同第ＷＯ２０１１０４３９１３号、同第ＷＯ２０１１０２２４６０号、同第ＷＯ２０１２０６１２５９号、同第ＷＯ２０１２０５４３６５号、同第ＷＯ２０１２０４４６３８号、同第ＷＯ２０１００８０７２４号、同第ＷＯ２０１０２１８６５号、および同第ＷＯ２００８１０３２７６号、米国特許第７，８９３，３０２号、および同第７，４０４，９６９号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１０００３６１１５号に記載のカチオン性脂質から選択されてもよいが、これらに限定されない。別の実施形態において、カチオン性脂質は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０４０１８４号、同第ＷＯ２０１１１５３１２０号、同第ＷＯ２０１１１４９７３３号、同第ＷＯ２０１１０９０９６５号、同第ＷＯ２０１１０４３９１３号、同第ＷＯ２０１１０２２４６０号、同第ＷＯ２０１２０６１２５９号、同第ＷＯ２０１２０５４３６５号、および同第ＷＯ２０１２０４４６３８号に記載の式Ａから選択されてもよいが、これらに限定されない。さらに別の実施形態において、カチオン性脂質は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００８１０３２７６号の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，８９３，３０２号の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，４０４，９６９号の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＸＸＩＩ、および米国特許公開第ＵＳ２０１０００３６１１５号の式Ｉ−ＶＩから選択されてもよいが、これらに限定されない。非限定的な例として、カチオン性脂質は、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ（ｄｉｍｅｍｙｌｈｅｘａｃｏｓａ）−１７，２０−ジエン−９−アミン、（１Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ５Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−８−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルドコサ−１３Ｊ１６−ジエン−５−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘニコサ−１２，１５−ジエン−４−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−６−アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−７−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−１０−アミン、（１５Ζ，１８Ζ）−Ν，Ν−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−５−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−４−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ（ｄｉｍｅｉｈｙｌｏｃｔａｃｏｓａ）−１９，２２−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ，２１  Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−８−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−７−アミン、（１６Ｚ；１９Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−６−アミン、（２２Ｚ，��５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２，２５−ジエン−１０−アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）−Ｎ；Ｎ−ジメチルトリアコンタ−２１，２４−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ（ｄｉｍｅｔｙｌｈｅｐｔａｃｏｓ）−１８−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７−エン−９−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−ＮＪＮ−ジメチルオクタコサ−１９，２２−ジエン−７−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサン−１０−アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ−エチル−Ｎ−メチルノナコサ−２０Ｊ２３−ジエン−１０−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−１−ノニルイコサ−１１，１４−ジエン−１−イル］ピロリジン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−２０−エン−１０−アミン、（１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエプタコサ（ｅｐｔａｃｏｓ）−１５−エン−１０−アミン、（１４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１４−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１７−エン−１０−アミン、（２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリトリアコンタ−２４−エン−１０−アミン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０−エン−１０−アミン、（２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２−エン−１０−アミン、（１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６−エン−８−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘニコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（ｌＳ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］エプタデカン（ｅｐｔａｄｅｃａｎ）−８−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヘキシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナデカン−１０−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘニコサン−１０−アミン，Ν，Ν−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン，Ν，Ν−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン−８−アミン、Ν，Ν−ジメチル−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン−５−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−｛７−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン−１−アミン、１−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヘプチルシクロプロピル］−Ν，Ν−ジメチルオクタデカン−９−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−デシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタデカン−６−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（ｌＳ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ペンタデカン−８−アミン、Ｒ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、Ｓ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−［（５Ｚ）−オクタ−５−エン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘプチルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−（ノニルオキシ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物９）；（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−６，９，１２−トリエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（ペンチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−３−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ν，Ν−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−ｌ３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ）−ドコサ−１３−エン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ）−ドコサ−１３−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（９Ｚ）−ヘキサデカ−９−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｈ（１−メトイルオクチル）オキシ］−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−１−［（３，７−ジメチルオクチル）オキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（オクチルオキシ）−３−（｛８−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−｛［８−（２−オクチルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、および（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ；Ｎ−ジメチルノナコサ−１１，２０，２−トリエン−１０−アミン、またはそれらの薬剤的に許容される塩もしくは立体異性体から選択されてもよい。
【０７１３】
一実施形態において、カチオン性脂質は、当技術分野で既知の方法によって、かつ／または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０４０１８４号、同第ＷＯ２０１１１５３１２０号、同第ＷＯ２０１１１４９７３３号、同第ＷＯ２０１１０９０９６５号、同第ＷＯ２０１１０４３９１３号、同第ＷＯ２０１１０２２４６０号、同第ＷＯ２０１２０６１２５９号、同第ＷＯ２０１２０５４３６５号、同第ＷＯ２０１２０４４６３８号、同第ＷＯ２０１００８０７２４号、および同第ＷＯ２０１０２１８６５号に記載されるように合成されてもよい。
【０７１４】
一実施形態において、ＬＮＰ製剤は、３％脂質モル比ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有してもよい。別の実施形態において、ＬＮＰ製剤は、１．５％脂質モル比ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有してもよい。
【０７１５】
一実施形態において、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ  ２０００（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００）を含有してもよい。一実施形態において、ＬＮＰ製剤は、当技術分野で既知のカチオン性脂質であるＰＥＧ−ＤＭＧ  ２０００および少なくとも１つの他の構成成分を含有してもよい。別の実施形態において、ＬＮＰ製剤は、当技術分野で既知のカチオン性脂質であるＰＥＧ−ＤＭＧ  ２０００、ＤＳＰＣ、およびコレステロールを含有してもよい。非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ  ２０００、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、およびコレステロールを含有してもよい。別の非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、２：４０：１０：４８のモル比で、ＰＥＧ−ＤＭＧ  ２０００、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、およびコレステロールを含有してもよい（Ｇｅａｌｌ  ｅｔ
ａｌ．，Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ＲＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＰＮＡＳ  ２０１２；ＰＭＩＤ：２２９０８２９４を参照のこと）。
【０７１６】
一実施形態において、ＬＮＰ製剤は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１１２７２５５号または同第ＷＯ２００８１０３２７６号に記載の方法によって製剤化されてもよい。非限定的な例として、本明細書に記載の修飾ＲＮＡは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１１１２７２５５号および／または同第ＷＯ２００８１０３２７６号に記載されるように、ＬＮＰ製剤中にカプセル封入されてもよい。
【０７１７】
一実施形態において、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、ポリカチオン性組成物を含んでもよい。非限定的な例として、ポリカチオン性組成物は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第ＵＳ２００５０２２２０６４号の式１〜６０から選択されてもよい。別の実施形態において、ポリカチオン性組成物を含むＬＮＰ製剤は、本明細書に記載の修飾ＲＮＡのインビボおよび／またはインビトロでの送達に使用されてもよい。
【０７１８】
一実施形態において、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、透過性促進剤分子をさらに含んでもよい。非限定的な透過性促進剤分子は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第ＵＳ２００５０２２２０６４号に記載されている。
【０７１９】
一実施形態において、医薬組成物は、ＤｉＬａ２リポソーム（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ワシントン州ボセル）、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ワシントン州ボセル）、中性ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）系リポソーム（例えば、卵巣癌に対するｓｉＲＮＡ送達（Ｌａｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００６  ５（１２）１７０８−１７１３））、およびヒアルロナンコーティングリポソーム（Ｑｕｉｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｓｒａｅｌ）等であるが、これらに限定されないリポソーム中に製剤化されてもよい。
【０７２０】
脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質を、急速排出（ｒａｐｉｄｌｙ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ）脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）として知られている生分解性カチオン性脂質と置き換えることによって改善されてもよい。ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、およびＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ等であるが、これらに限定されない、イオン化できるカチオン性脂質は、時間とともに血漿および組織中に蓄積することが示されてきており、潜在的な毒性の源であり得る。急速排出脂質の急速な代謝は、ラットにおいて１ｍｇ／ｋｇ用量〜１０ｍｇ／ｋｇ用量の１桁分、脂質ナノ粒子の耐性および治療指数を改善することができる。酵素的に分解されるエステル結合の組み込みは、ｒｅＬＮＰ製剤の活性を依然として維持しながら、カチオン性構成成分の分解および代謝プロファイルを改善することができる。エステル結合は、脂質鎖の内部に位置することができるか、またはそれは、脂質鎖の末端において末端に位置してもよい。内部エステル結合は、脂質鎖内の任意の炭素を置き換えてもよい。
【０７２１】
一実施形態において、内部エステル結合は、飽和炭素のいずれの側に位置してもよい。ｒｅＬＮＰの非限定的な例としては、
【０７２２】
【化５０】
2020072766.tif 000314
【０７２３】
【化５１】
2020072766.tif 000315
【０７２４】
【化５２】
2020072766.tif 000316
【０７２５】
および
【０７２６】
【化５３】
2020072766.tif 000317
【０７２７】
が挙げられる。
一実施形態において、免疫応答が、ナノ化学種、ポリマー、および免疫原を含み得る脂質ナノ粒子を送達することによって、誘発され得る。（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１２０１８９７００号および国際公開第ＷＯ２０１２０９９８０５号）。ポリマーは、ナノ化学種をカプセル封入しても、ナノ化学種を部分的にカプセル封入してもよい。免疫原は、本明細書に記載の組換えタンパク質、修飾ＲＮＡであってもよい。一実施形態において、脂質ナノ粒子は、病原体に対するもの等であるが、これらに限定されないワクチンにおいて使用するために製剤化されてもよい。
【０７２８】
脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子が粘膜関門を透過するように、粒子の表面特性を変化させるように操作されてもよい。粘液は、口腔（例えば、周口膜および食道膜ならびに扁桃組織）、眼、胃腸（例えば、胃、小腸、大腸、結腸、直腸）、鼻、呼吸器（例えば、経鼻、咽頭、気管、および気管支膜）、生殖器（例えば、膣内、子宮頚部、および尿道膜）上に位置する粘膜組織等であるが、これらに限定されない。より高い薬物カプセル封入効率および幅広い薬物の持続送達を提供する能力のために好ましい１０〜２００ｎｍよりも大きいナノ粒子、は、粘膜関門を通って急速に拡散するには大きすぎると考えられている。粘液は、継続的に分泌され、脱落し、破棄されるかまたは消化され、再生されるため、捕捉された粒子のほとんどは、数秒または数時間以内に粘膜（ｍｕｃｏｓｌａ）組織から除去され得る。低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で密にコーティングされた大きいポリマーナノ粒子（直径２００ｎｍ〜５００ｎｍ）は、水中で拡散している同じ粒子よりもわずか４〜６倍低く、粘液を通って拡散した（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ２００７  １０４（５）：１４８２−４８７、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２００９  ６１（２）：１５８−１７１）。ナノ粒子の輸送は、蛍光退色後回復測定（ＦＲＡＰ）および高解像度多数粒子追跡（ＭＰＴ）を含むが、これらに限定されない、透過速度および／または蛍光顕微鏡技法を用いて決定され得る。
【０７２９】
粘液を透過するように操作された脂質ナノ粒子は、ポリマー材料（すなわちポリマーコア）および／またはポリマー−ビタミン複合体および／またはトリブロックコポリマーを含んでもよい。ポリマー材料には、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、およびポリアリレートが含まれてもよいが、これらに限定されない。ポリマー材料は、生分解性および／または生体適合性であってもよい。具体的なポリマーの非限定的な例としては、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＥＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＰＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリアルキルシアノアクリレート（ａｃｒａｌａｔｅ）、ポリウレタン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリエチレンおよびポリプロピレン等のポリアルキレン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）等のポリアルキレングリコール、ポリ（エチレンテレフタレート）等のポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリ（酢酸ビニル）等のポリビニルエステル、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）等のハロゲン化ポリビニル、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース等の誘導体化セルロース、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）等のアクリル酸のポリマー、ならびにそのコポリマーおよび混合物、ポリジオキサノンおよびそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマル酸塩、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、およびトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドンが挙げられる。脂質ナノ粒子は、ブロックコポリマー、および（ポリ（エチレングリコール）−（ポリ（プロピレンオキシド）−（ポリ（エチレングリコール）トリブロックコポリマー（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１２０１２１７１８号および米国公開２０１００００３３３７号を参照のこと）等であるが、これらに限定されない、コポリマーでコーティングされるか、またはそれと会合されてもよい。コポリマーは、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）ポリマーであってもよく、脂質ナノ粒子の形成は、新たな化学実体が何ら作り出されないような方式であってもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、新たな化学実体を形成することなく、依然としてヒト粘液に急速に透過可能である、ポロキサマーコーティングＰＬＧＡナノ粒子を含んでもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１１
５０：２５９７−２６００）。
【０７３０】
ポリマー−ビタミン複合体のビタミンは、ビタミンＥであってもよい。この複合体のビタミン部分は、ビタミンＡ、ビタミンＥ、他のビタミン、コレステロール、他の界面活性剤の疎水性部分または疎水性構成成分（例えば、ステロール鎖、脂肪酸、炭化水素鎖、およびアルキレンオキシド鎖）等であるが、これらに限定されない他の好適な構成成分で置換されてもよい。
【０７３１】
粘液に透過するように操作された脂質ナノ粒子には、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、リボ核酸、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、ジメチルジオクタデシル−アンモニウムブドミド等の、例えば、カチオン性界面活性剤）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、およびポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、Ｎ−アセチルシステイン、餅草、ブロメライ、パパイン、クレロデンドロン、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、サイモシンβ４ドルナーゼα、ネルテネキシン、エルドステイン）、およびｒｈＤＮａｓｅを含む種々のＤＮａｓｅ等であるが、これらに限定されない表面変質剤が含まれてもよい。表面変質薬剤は、粒子の表面に包埋されるもしくは絡ませられるか、または脂質ナノ粒子の表面上に（例えば、コーティング、吸着、共有結合、または他のプロセスによって）配置されてもよい。（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開２０１００２１５５８０号および米国公開２００８０１６６４１４号を参照のこと）。
【０７３２】
粘液透過性脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、リボ核酸、またはアニオン性タンパク質を含んでもよい。修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、脂質ナノ粒子中にカプセル封入され、かつ／または粒子の表面上に配置されてもよい。ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、脂質ナノ粒子に共有結合されてもよい。粘液透過性脂質ナノ粒子の製剤は、複数のナノ粒子を含んでもよい。さらに、製剤は、粘液と相互作用し、周囲の粘液の構造特性および／または付着特性を、粘膜付着を減少させるように変質させ得、それにより粘液透過性脂質ナノ粒子の粘膜組織への送達を増加させ得る、粒子を含有してもよい。
【０７３３】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、制限なく、Ｓｉｌｅｎｃｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（英国、ロンドン）によるＡＴＵＰＬＥＸ（商標）系、ＤＡＣＣ系、ＤＢＴＣ系、および他のｓｉＲＮＡ−リポプレックス技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）（マサチューセッツ州ケンブリッジ）によるＳＴＥＭＦＥＣＴ（商標）、ならびにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはプロタミンベースの標的を定めたおよび標的を定めない核酸送達等の、リポプレックスとして製剤化される（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｌｅｋｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８  ６８：９７８８−９７９８、Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ
ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１２  ５０：７６−７８、Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６  １３：１２２２−１２３４、Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６  １３：１３６０−１３７０、Ｇｕｔｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０  ２３：３３４−３４４、Ｋａｕｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ２０１０  ８０：２８６−２９３Ｗｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９  ３２：４９８−５０７、Ｗｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８  ３１：１８０−１８８、Ｐａｓｃｏｌｏ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１２８５−１２９４、Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：１−１５、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，２３：７０９−７１７、Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７  ６；１０４：４０９５−４１００、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓＨｕｍ  Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．２００８  １９：１２５−１３２）。
【０７３４】
一実施形態において、そのような製剤は、それらが受動的または能動的に、肝細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞、および白血球を含むが、これらに限定されない異なる細胞型をインビボで指向するようにも構築され得るか、または組成を変化し得る（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０  １８：１３５７−１３６４、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５  ２３：７０９−７１７、Ｊｕｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００９  １１９：６６１−６７３、Ｋａｕｆｍａｎｎ
ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ２０１０  ８０：２８６−２９３、Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６  １３：１２２２−１２３４、Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６  １３：１３６０−１３７０、Ｇｕｔｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０  ２３：３３４−３４４、Ｂａｓｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１  １９：２１８６−２２００、Ｆｅｎｓｋｅ  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｉｓ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２００８  ５：２５−４４、Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８  ３１９：６２７−６３０、Ｐｅｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１１  １８：１１２７−１１３３）。肝臓細胞に対する製剤の受動的な標的化の一例としては、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、およびＭＣ３ベースの脂質ナノ粒子製剤が挙げられ、それらはアポリポタンパク質Ｅに結合し、インビボでこれらの製剤の結合および肝細胞中への取り込みを促進することが示されている（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒ．２０１０  １８：１３５７−１３６４）。製剤は、葉酸塩、トランスフェリン、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、および抗体で標的を定めるアプローチにより例として示されるが、これらによって限定されない、それらの表面上の異なるリガンドの発現を介して選択的に標的を定めることもできる（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｏｌｈａｔｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  ８：１９７−２０６、Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ  ａｎｄ  Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．２０１１  １６：１３８８−１４１２、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．２０１０  ２７：２８６−２９８、Ｐａｔｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．２００８  ２５：１−６１、Ｂｅｎｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１  １２：２７０８−２７１４、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２００８  ５：３０９−３１９、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０  １８：１３５７−１３６４、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２  ８２０：１０５−１１６、Ｂｅｎ−Ａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２  ７５７：４９７−５０７、Ｐｅｅｒ  ２０１０  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２０：６３−６８、Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７  １０４：４０９５−４１００、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１１  ７２１：３３９−３５３、Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０  １８：２０２８−２０３７、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５  ２３：７０９−７１７、Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８  ３１９：６２７−６３０、Ｐｅｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１１  １８：１１２７−１１３３）。
【０７３５】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、固体脂質ナノ粒子として製剤化される。固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は、平均直径が１０〜１０００ｎｍの球状であり得る。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができ、界面活性剤および／または乳化剤により安定化され得る、固体脂質コアマトリックスを有する。さらなる実施形態において、脂質ナノ粒子は、自己集合性脂質−ポリマーナノ粒子であってもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ
ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，２００８，２（８），ｐｐ  １６９６−１７０２を参照のこと）。
【０７３６】
リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、これらの製剤が、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、もしくはリボ核酸による細胞トランスフェクションを増加させ、かつ／またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させることが可能であり得るため、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の指示によるタンパク質産生の有効性を改善するために使用されてもよい。１つのそのような例は、ポリプレックスプラスミドＤＮＡの有効な全身送達を可能にするための脂質カプセル封入の使用を伴う（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００７  １５：７１３−７２０）。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の安定性を増加させるためにも使用され得る。
【０７３７】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、制御放出および／または標的を定めた送達のために製剤化することができる。本明細書で使用されるとき、「制御放出」は、特定の放出パターンに適合して治療成果をもたらす、医薬組成物または化合物放出プロファイルを指す。一実施形態において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、制御放出および／または標的を定めた送達のために、本明細書に記載され、かつ／または当技術分野で既知の送達剤中にカプセル封入されてもよい。本明細書で使用されるとき、「カプセル封入」という用語は、封入する、包囲する、または包み込むことを意味する。それが本発明の化合物の製剤に関するとき、カプセル封入は、実質的、完全、または部分的であってもよい。「実質的にカプセル封入される」という用語は、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、９９．９％超、９９．９％超、または９９．９９９％超が、送達剤内に封入される、包囲される、または包み込まれることを意味する。「部分的カプセル封入」は、本発明の医薬組成物または化合物の１０未満、１０、２０、３０、４０、５０以下が、送達剤内に封入される、包囲される、または包み込まれることを意味する。有利なことに、カプセル封入は、蛍光および／または電子顕微鏡写真を用いて、本発明の医薬組成物または化合物の脱出または活性を測定することによって決定されてもよい。例えば、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９、または９９．９９％超が、送達剤中にカプセル封入される。
【０７３８】
別の実施形態において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、脂質ナノ粒子または急速排出脂質ナノ粒子中にカプセル封入されてもよく、脂質ナノ粒子または急速排出脂質ナノ粒子は次いで、本明細書に記載され、かつ／または当技術分野で既知のポリマー、ヒドロゲル、および／または手術用シーリング材中にカプセル封入されてもよい。非限定的な例として、ポリマー、ヒドロゲル、または手術用シーリング材は、ＰＬＧＡ、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、フロリダ州アラチューア）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，カリフォルニア州サンディエゴ）、フィブリノーゲンポリマー（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州コーネリア）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ、イリノイ州ディアフィールド）、ＰＥＧベースのシーリング材、およびＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ、イリノイ州ディアフィールド）等の手術用シーリング材であってもよい。
【０７３９】
一実施形態において、脂質ナノ粒子は、対象に注入されるとゲルを形成し得る、当技術分野で既知の任意のポリマーまたはヒドロゲル中にカプセル封入されてもよい。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、生分解性であり得るポリマーマトリックス中にカプセル封入されてもよい。
【０７４０】
一実施形態において、制御放出および／または標的を定めた送達のためのポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸製剤は、少なくとも１つの制御放出コーティング剤も含んでもよい。制御放出コーティング剤には、ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ＥＵＤＲＡＧＩＴ  ＲＬ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ  ＲＳ（登録商標）、およびエチルセルロース水性分散液（ＡＱＵＡＣＯＡＴ（登録商標）およびＳＵＲＥＬＥＡＳＥ（登録商標））等のセルロース誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【０７４１】
一実施形態において、制御放出および／または標的を定めた送達製剤は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１つの分解性ポリエステルを含んでもよい。分解性（Ｄｅｇｒａｄｅａｂｌｅ）ポリエステルには、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するためのＰＥＧ複合体化を含んでもよい。
【０７４２】
一実施形態において、本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、治療的ナノ粒子中にカプセル封入されてもよい。治療的ナノ粒子は、本明細書に記載の方法、ならびに各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、同第ＷＯ２０１００３０７６３号、同第ＷＯ２０１０００５７２１号、同第ＷＯ２０１０００５７２３号、同第ＷＯ２０１２０５４９２３号、米国公開第第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、同第ＵＳ２０１００１０４６４５号、同第ＵＳ２０１０００８７３３７号、同第ＵＳ２０１０００６８２８５号、同第ＵＳ２０１１０２７４７５９号、同第ＵＳ２０１０００６８２８６、ならびに米国特許第８，２０６，７４７号等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法によって製剤化されてもよい。別の実施形態において、治療的ポリマーナノ粒子は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第ＵＳ２０１２０１４０７９０号に記載の方法によって特定されてもよい。
【０７４３】
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、持続放出のために製剤化されてもよい。本明細書で使用されるとき、「持続放出」は、特定の一定期間にわたる放出速度に適合する医薬組成物または化合物を指す。一定期間は、数時間、数日間、数週間、数ヶ月間、および数年間を含んでもよいが、これらに限定されない。非限定的な例として、持続放出ナノ粒子は、ポリマー、ならびに本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸等であるが、それらに限定されない治療剤を含んでもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１００７５０７２号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１００２１６８０４号、および同第ＵＳ２０１１０２１７３７７号を参照のこと）。
【０７４４】
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、標的特異的となるように製剤化されてもよい。非限定的な例として、治療的（ｔｈｅｒｅａｐｅｕｔｉｃ）ナノ粒子は、コルチコステロイドを含んでもよい（国際公開第ＷＯ２０１１０８４５１８号を参照のこと）。一実施形態において、治療的ナノ粒子は、癌特異的となるように製剤化されてもよい。非限定的な例として、治療的ナノ粒子は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００８１２１９４９号、同第ＷＯ２０１０００５７２６号、同第ＷＯ２０１０００５７２５号、同第ＷＯ２０１１０８４５２１号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１０００６９４２６号、同第ＵＳ２０１２０００４２９３号、および同第ＵＳ２０１００１０４６５５号に記載のナノ粒子に製剤化されてもよい。
【０７４５】
一実施形態において、本発明のナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含んでもよい。非限定的な例として、ナノ粒子は、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート（ｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）またはこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない２つ以上のポリマーを含んでもよい。
【０７４６】
一実施形態において、ジブロックコポリマーには、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート（ｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）またはこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されないポリマーと組み合わせたＰＥＧが含まれてもよい。
【０７４７】
非限定的な例として、治療的ナノ粒子は、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーを含む（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第ＵＳ２０１２０００４２９３号および米国特許第８，２３６，３３０号を参照のこと）。別の非限定的な例において、治療的ナノ粒子は、ＰＥＧとＰＬＡまたはＰＥＧとＰＬＧＡのジブロックコポリマーを含む、ステルスナノ粒子である（各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２４６，９６８号を参照のこと）。
【０７４８】
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、少なくとも１つのアクリルポリマーを含んでもよい。アクリルポリマーには、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレート、ならびにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０７４９】
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、本明細書に記載され、かつ／または当技術分野で既知の少なくとも１つのカチオン性ポリマーを含んでもよい。
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、およびこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない少なくとも１つのアミン含有ポリマーを含んでもよい。
【０７５０】
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１つの分解性ポリエステルを含んでもよい。分解性（Ｄｅｇｒａｄｅａｂｌｅ）ポリエステルには、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するためのＰＥＧ複合体化を含んでもよい。
【０７５１】
別の実施形態において、治療的ナノ粒子は、少なくとも１つの標的化リガンドの複合体化を含んでもよい。
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、水溶液中で製剤化されてもよく、それを用いて癌を標的としてもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１０８４５１３号および米国公開第ＵＳ２０１１０２９４７１７号を参照のこと）。
【０７５２】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、合成ナノ担体中にカプセル封入され、それと連結され、かつ／またはそれと会合されてもよい。合成ナノ担体は、当技術分野で既知のおよび／または本明細書に記載の方法を用いて製剤化され得る。非限定的な例として、合成ナノ担体は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、同第ＷＯ２０１００３０７６３号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、同第ＵＳ２０１００１０４６４５号、および同第ＵＳ２０１２０１０００８７３３７号に記載の方法によって製剤化され得る。別の実施形態において、合成ナノ担体製剤は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１０７２２１８号および米国特許第８，２１１，４７３号に記載の方法によって凍結乾燥させ得る。
【０７５３】
一実施形態において、合成ナノ担体は、本明細書に記載の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を放出するための反応性基を含有してもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０９５２５５２号および米国公開第ＵＳ２０１２０１７１２２９号を参照のこと）。
【０７５４】
一実施形態において、合成ナノ担体は、合成ナノ担体の送達による免疫応答を向上させるための免疫刺激性薬剤を含有してもよい。非限定的な例として、合成ナノ担体は、免疫系のＴｈ１ベースの応答を向上させ得るＴｈ１免疫刺激性薬剤を含んでもよい（各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１０１２３５６９号および米国公開第ＵＳ２０１１０２２３２０１号を参照のこと）。
【０７５５】
一実施形態において、合成ナノ担体は、標的を定めた放出のために製剤化されてもよい。一実施形態において、合成ナノ担体は、指定されるｐＨで、かつ／または所望の時間間隔の後にポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を放出するように製剤化される。非限定的な例として、合成ナノ粒子は、２４時間後にかつ／または４．５のｐＨでポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を放出するように製剤化されてもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１０１３８１９３号、および同第ＷＯ２０１０１３８１９４号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１１００２０３８８号、および同第ＵＳ２０１１００２７２１７号を参照のこと）。
【０７５６】
一実施形態において、合成ナノ担体は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の制御放出および／または持続放出のために製剤化されてもよい。非限定的な例として、持続放出のための合成ナノ担体は、当技術分野で既知であり、本明細書に記載され、かつ／または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１０１３８１９２および米国公開第２０１００３０３８５０号に記載の方法によって製剤化されてもよい。
【０７５７】
一実施形態において、合成ナノ担体は、ワクチンとして使用するために製剤化されてもよい。一実施形態において、合成ナノ担体は、少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つの修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸をカプセル封入してもよい。非限定的な例として、合成ナノ担体は、少なくとも１つの抗原およびワクチン剤形のため賦形剤を含んでもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１１５０２６４号および米国公開第ＵＳ２０１１０２９３７２３号を参照のこと）。別の非限定的な例として、ワクチン剤形が、同じまたは異なる抗原を有する少なくとも２つの合成ナノ担体、および賦形剤を含んでもよい（各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１１５０２４９号および米国公開第ＵＳ２０１１０２９３７０１号を参照のこと）。ワクチン剤形は、本明細書に記載され、当技術分野で既知であり、かつ／または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１１５０２５８号および米国公開第ＵＳ２０１２００２７８０６号に記載の方法によって、選択されてもよい。
【０７５８】
一実施形態において、合成ナノ担体は、少なくとも１つのアジュバントをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を含んでもよい。別の実施形態において、合成ナノ担体は、少なくとも１つの修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸、およびアジュバントを含んでもよい。非限定的な例として、アジュバントを含む合成ナノ担体は、各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１１５０２４０号および米国公開第ＵＳ２０１１０２９３７００号に記載の方法によって製剤化されてもよい。
【０７５９】
一実施形態において、合成ナノ担体は、ウイルス由来のペプチド、断片、または領域をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸をカプセル封入してもよい。非限定的な例として、合成ナノ担体には、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０２４６２１号、同第ＷＯ２０１２０２６２９号、同第ＷＯ２０１２０２４６３２号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１２００６４１１０号、同第ＵＳ２０１２００５８１５３号、および同第ＵＳ２０１２００５８１５４号に記載のナノ担体が含まれるが、これらに限定されない。
ポリマー、生分解性ナノ粒子、およびコア−シェルナノ粒子
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、天然および／または合成ポリマーを用いて製剤化することができる。送達に使用され得るポリマーの非限定的な例としては、ＭＩＲＵＳ（登録商標）Ｂｉｏ（ウィスコンシン州マディソン）およびＲｏｃｈｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ（ウィスコンシン州マディソン）によるＤｙｎａｍｉｃ  ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥＴＭ製剤、制限なく、ＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（商標）（ワシントン州シアトル）等のＰＨＡＳＥＲＸ（商標）ポリマー製剤、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、Ｖｉｃａｌ（カリフォルニア州サンディエゴ）によるＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（登録商標）アジュバント、キトサン、Ｃａｌａｎｄｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（カリフォルニア州パサデナ）によるシクロデキストリン、デンドリマーおよびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ＲＯＮＤＥＬ（商標）（ＲＮＡｉ／オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州パサデナ）、ならびにＰＨＡＳＥＲＸ（商標）（ワシントン州シアトル）等であるが、これらに限定されないｐＨ応答性ブロックコポリマー（ｃｏ−ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）が挙げられる。
【０７６０】
ＰＬＧＡ製剤の非限定的な例としては、ＰＬＧＡ注入用デポーが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、ＰＬＧＡを、６６％のＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中に溶解させることによって形成され、残りの部分が水性溶媒およびロイプロリドである、ＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）。一旦注入されると、ＰＬＧＡおよびロイプロリドペプチドは、皮下腔に沈殿する）。
【０７６１】
これらのポリマーアプローチのうちの多くは、インビボでオリゴヌクレオチドを細胞の細胞質中に送達することにおいて有効性を実証している（参照により全体が本明細書に組み込まれる、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８  １９：１２５−１３２において概説される）。核酸（この実例では小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いて）の強固なインビボ送達をもたらした２つのポリマーアプローチは、動的ポリ複合体（ｐｏｌｙｃｏｎｊｕｇａｔｅ）およびシクロデキストリンベースのナノ粒子である。これらの送達アプローチのうちの第１のアプローチは、動的ポリ複合体を使用し、マウスにおいてインビボでｓｉＲＮＡを有効に送達し、肝細胞内で内因性標的ｍＲＮＡをサイレンシングすることが示されている（Ｒｏｚｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７  １０４：１２９８２−１２８８７）。この特定のアプローチは、多成分ポリマー系であり、その主要な特長として、核酸（この実例ではｓｉＲＮＡ）がジスルフィド結合を介して共有結合され、ＰＥＧ（電荷遮蔽のため）基およびＮ−アセチルガラクトサミン（肝細胞標的化のため）基の両方がｐＨ感受性結合を介して連結される、膜活性ポリマーが含まれる（Ｒｏｚｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７  １０４：１２９８２−１２８８７）。肝細胞に結合し、エンドソームに進入すると、ポリマー複合体は、低ｐＨ環境において解体し、このポリマーがその陽電荷を露出して、エンドソームからの脱出、およびポリマーから細胞質へのｓｉＲＮＡの放出をもたらす。Ｎ−アセチルガラクトサミン基の、マンノース基との置き換えを介して、アシアロ糖タンパク質受容体を発現する肝細胞から、類洞内皮細胞およびクッパー細胞へと標的合わせを変化させ得ることが示された。別のポリマーアプローチは、トランスフェリンを標的とするシクロデキストリン含有ポリカチオンナノ粒子を使用することを伴う。これらのナノ粒子は、トランスフェリン受容体を発現するユーイング肉腫腫瘍細胞において、ＥＷＳ−ＦＬＩ１遺伝子産物の標的を定めたサイレンシングを実証してきており（Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５  ６５：８９８４−８９８２）、これらのナノ粒子中に製剤化されたｓｉＲＮＡは、非ヒト霊長類において耐性が良好であった（Ｈｅｉｄｅｌｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００７  １０４：５７１５−２１）。これらの送達戦略の両方は、標的を定めた送達機構およびエンドソームからの脱出機構の両方を用いた合理的なアプローチを組み込む。
【０７６２】
ポリマー製剤は、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の持続放出または遅延放出を可能にし得る（例えば、筋肉内または皮下注入後に）。ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸についての変化した放出プロファイルは、例えば、長期間にわたってコードされたタンパク質の翻訳をもたらすことができる。ポリマー製剤をまた使用して、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の安定性を増加させ得る。生分解性ポリマーが、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸以外の核酸を分解から保護するために以前に使用されており、インビボでペイロードの持続放出をもたらすことが示されている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｏｚｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７  １０４：１２９８２−１２８８７、Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１０  ７：１４３３−１４４６、Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１０  Ｏｃｔ  １、Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｊａｎ  １３、Ｍａｎｇａｎｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１２  ３３：２３０１−２３０９、Ｂｅｎｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１  １２：２７０８−２７１４、Ｓｉｎｇｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．２０１１  ２：１３３−１４７、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８  １９：１２５−１３２、Ｓｃｈａｆｆｅｒｔ  ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８  １６：１１３１−１１３８、Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１１  ８：１４５５−１４６８、Ｄａｖｉｓ、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．２００９  ６：６５９−６６８、Ｄａｖｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０  ４６４：１０６７−１０７０）。
【０７６３】
一実施形態において、医薬組成物は、持続放出製剤であってもよい。さらなる実施形態において、持続放出製剤は、皮下送達のためであってもよい。持続放出製剤には、ＰＬＧＡミクロスフェア、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．フロリダ州アラチューア）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）、フィブリノーゲンポリマー（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．、ジョージア州コーネリア）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ、イリノイ州ディアフィールド）、ＰＥＧベースのシーリング材、およびＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ、イリノイ州ディアフィールド）等の手術用シーリング材が含まれ得る。
【０７６４】
非限定的な例として、修飾ｍＲＮＡは、調整可能な放出速度を有する（例えば、数日間および数週間）ＰＬＧＡミクロスフェアを調製し、修飾ｍＲＮＡを、カプセル封入プロセス中に修飾ｍＲＮＡの完全性を維持しながら、ＰＬＧＡミクロスフェア中にカプセル封入することによって、ＰＬＧＡミクロスフェア中に製剤化されてもよい。ＥＶＡｃは、前臨床の持続放出埋込物適用において広範に使用される、非生分解性（ｎｏｎ−ｂｉｏｄｅｇｒａｄｅａｂｌｅ）の、生体適合性ポリマーである（例えば、緑内障に対するピロカルピン眼内挿入物である持続放出製品Ｏｃｕｓｅｒｔまたは持続放出プロゲステロン子宮内器具であるＰｒｏｇｅｓｔａｓｅｒｔ；経皮送達系Ｔｅｓｔｏｄｅｒｍ、Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ、およびＳｅｌｅｇｉｌｉｎｅ；カテーテル）。ポロキサマー  Ｆ−４０７  ＮＦは、５℃未満の温度で低粘度を有する、親水性の非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンのトリブロックコポリマーであり、１５℃を超える温度で固体ゲルを形成する。ＰＥＧベースの手術用シーリング材は、１分間で調製することができ、３分間でシーリングし、３０日以内に再吸収される、送達デバイスにおいて混合された２つの合成ＰＥＧ構成成分を含む。ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）および天然ポリマーは、投与部位におけるインサイツのゲル化が可能である。それらは、イオン性相互作用（ｉｎｅｒａｃｔｉｏｎ）を介してタンパク質およびペプチド治療候補と相互作用して、安定化効果を提供することが示されている。
【０７６５】
ポリマー製剤は、葉酸塩、トランスフェリン、およびＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）により例として示されるが、これらによって限定されない異なるリガンドの発現を介して選択的に標的を定めることもできる（各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｅｎｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１  １２：２７０８−２７１４、Ｒｏｚｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７  １０４：１２９８２−１２８８７、Ｄａｖｉｓ，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．２００９  ６：６５９−６６８、Ｄａｖｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０  ４６４：１０６７−１０７０）。
【０７６６】
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、ポリマー化合物とともにまたはポリマー化合物中に製剤化されてもよい。ポリマーには、ポリエテン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｎｅｓ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ｌ−リジン）（ＰＬＬ）、ＰＬＬにグラフトされたＰＥＧ、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、架橋分岐状ポリ（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、修飾ポロキサマー、生分解性ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルブロックランダムコポリマー、線状生分解性コポリマー、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸）（ＰＡＧＡ）、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート（ｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、アクリルポリマー、アミン含有ポリマー、またはこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない少なくとも１つのポリマーが含まれてもよい。
【０７６７】
非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，１７７，２７４号に記載のＰＬＬでグラフトされたＰＥＧのポリマー化合物とともに製剤化されてもよい。製剤は、インビトロで細胞をトランスフェクトするため、または修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸のインビボ送達のために使用されてもよい。別の例において、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、カチオン性ポリマーを含む溶液もしくは媒体中に、乾燥した医薬組成物中に、または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２００９００４２８２９号および同第２００９００４２８２５号に記載の乾燥させることができる溶液中に懸濁させてもよい。
【０７６８】
別の非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマー（各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第ＵＳ２０１２０００４２９３号および米国特許第８，２３６，３３０号を参照のこと）とともに製剤化されてもよい。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、ＰＥＧとＰＬＡまたはＰＥＧとＰＬＧＡのジブロックコポリマーとともに製剤化されてもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２４６，９６８号を参照のこと）。
【０７６９】
ポリアミン誘導体を用いて、核酸を送達するか、または疾患を治療および／もしくは予防するか、または埋込型もしくは注入型デバイスに含めてもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１００２６０８１７号）。非限定的な例として、医薬組成物は、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸、ならびに内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２０１００２６０８１７号に記載のポリアミン誘導体を含んでもよい。
【０７７０】
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、少なくとも１つのアクリルポリマーとともに製剤化されてもよい。アクリルポリマーには、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレート、ならびにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０７７１】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１１１５８６２号、同第ＷＯ２０１２０８２５７４号、および同第ＷＯ２０１２０６８１８７号に記載の少なくとも１つのポリマーとともに製剤化されてもよい。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１１１５８６２号に記載の式Ｚのポリマーとともに製剤化されてもよい。さらに別の実施形態において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０８２５７４号または同第ＷＯ２０１２０６８１８７号に記載の式Ｚ、Ｚ’、またはＺ’’のポリマーとともに製剤化されてもよい。本発明の修飾ＲＮＡとともに製剤化されるポリマーは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２０８２５７４号または同第ＷＯ２０１２０６８１８７号に記載の方法によって合成されてもよい。
【０７７２】
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の製剤は、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、またはこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない少なくとも１つのアミン含有ポリマーを含んでもよい。
【０７７３】
例えば、本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、リボ核酸は、ポリ（アルキレンイミン）、生分解性カチオン性リポポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ポリマー、もしくは生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、生分解性ポリエステルランダムコポリマー、線状生分解性コポリマー、ＰＡＧＡ、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、またはこれらの組み合わせを含む薬学的化合物中に製剤化されてもよい。生分解性カチオン性リポポリマーは、当技術分野で既知の方法、ならびに／または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６９６，０３８号、米国出願第２００３００７３６１９号、および同第２００４０１４２４７４号に記載の方法によって作製されてもよい。ポリ（アルキレンイミン）は、当技術分野で既知の方法、および／または参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２０１００００４３１５号に記載の方法を用いて作製されてもよい。生分解性（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂａｌｅ）ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、または生分解性ポリエステルランダムコポリマーは、当技術分野で既知の方法、ならびに／または内容がそれぞれ参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５１７，８６９号および同第６，２６７，９８７号に記載の方法を用いて作製されてもよい。線状生分解性コポリマーは、当技術分野で既知であり、かつ／または米国特許第６，６５２，８８６号に記載の方法を用いて作製されてもよい。ＰＡＧＡポリマーは、当技術分野で既知の方法、ならびに／または参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２１７，９１２号に記載の方法を用いて作製されてもよい。ＰＡＧＡポリマーは、共重合して、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギン（ｐｏｌｙａｒｇｉｎｅ）、ポリオルニチン、ヒストン、アビジン、プロタミン、ポリラクチド、およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）等であるが、これらに限定されないポリマーとともにコポリマーまたはブロックコポリマーを形成してもよい。生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマーは、当技術分野で既知の方法、ならびに／または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，０５７，８２１もしくは米国公開第２０１２００９１４５号に記載の方法によって作製されてもよい。例えば、マルチブロックコポリマーは、分岐状ポリエチレンイミンと比較して明確に異なるパターンを有する線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）ブロックを用いて合成されてもよい。さらに、組成物または医薬組成物は、当技術分野で既知の方法、本明細書に記載の方法、または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１００００４３１５号もしくは米国特許第６，２６７，９８７号および同第６，２１７，９１２号に記載の方法によって作製されてもよい。
【０７７４】
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１つの分解性ポリエステルとともに製剤化されてもよい。分解性（Ｄｅｇｒａｄｅａｂｌｅ）ポリエステルには、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するためのＰＥＧ複合体化を含んでもよい。
【０７７５】
一実施形態において、本明細書に記載のポリマーは、脂質末端を有する（ｌｉｐｉｄ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ）ＰＥＧに複合体化されてもよい。非限定的な例として、ＰＬＧＡは、脂質末端を有するＰＥＧに複合体化されて、ＰＬＧＡ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧを形成してもよい。別の非限定的な例として、本発明とともに使用するためのＰＥＧ複合体は、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２００８１０３２７６号に記載されている。
【０７７６】
一実施形態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド、修飾ＲＮＡは、別の化合物と複合体化されてもよい。複合体の非限定的な例は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９６４，５７８号および同第７，８３３，９９２号に記載されている。別の実施形態において、本発明の修飾ＲＮＡは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９６４，５７８号および同第７，８３３，９９２号に記載の式１〜１２２の複合体と複合体化されてもよい。
【０７７７】
参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２０１００００４３１３号に記載されるように、遺伝子送達組成物は、ヌクレオチド配列およびポロキサマーを含んでもよい。例えば、本発明（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎｖｅｉｔｉｏｎ）の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、米国公開第２０１００００４３１３号に記載のポロキサマーを含む遺伝子送達組成物において使用されてもよい。
【０７７８】
一実施形態において、本発明のポリマー製剤は、カチオン性担体を含み得るポリマー製剤を、コレステロール基およびポリエチレングリコール基に共有結合され得るカチオン性リポポリマーと接触させることによって、安定化されてもよい。ポリマー製剤は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２００９００４２８２９号に記載の方法を用いてカチオン性リポポリマーと接触させてもよい。カチオン性担体には、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド−ポリアミン、ジデオキシ−ジアミノ−ｂ−シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸塩（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ−コレステロールＨＣｌ）ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチル塩化アンモニウムＤＯＤＡＣ）、およびこれらの組み合わせが含まれてもよいが、これらに限定されない。
【０７７９】
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡは、ポリマー、脂質、および／またはリン酸カルシウム等であるが、これらに限定されない他の生分解性薬剤の組み合わせを用いてナノ粒子として製剤化することもできる。構成成分は、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の送達が向上し得るようにナノ粒子の微調整を可能にするために、コア−シェル、ハイブリッド、および／または交互積層アーキテクチャとして組み合わされてもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ．２００６  ５：７９１−７９６、Ｆｕｌｌｅｒ  ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００８  ２９：１５２６−１５３２、ＤｅＫｏｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１１  ６３：７４８−７６１、Ｅｎｄｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１  ３２：７７２１−７７３１、Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．２０１１  Ｊｕｎ  ６；８（３）：７７４−８７）。
【０７８０】
脂質および／またはポリマーと組み合わせた生分解性リン酸カルシウムナノ粒子は、インビボでポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を送達することが示されている。一実施形態において、アニスアミド等の標的化リガンドもまた含有し得る、脂質でコーティングされたリン酸カルシウムナノ粒子を用いて、本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を送達してもよい。例えば、マウス転移性肺モデルにおいてｓｉＲＮＡを有効に送達するために、脂質でコーティングされたリン酸カルシウムナノ粒子が使用された（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．２０１０  １４２：４１６−４２１、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．２０１２  １５８：１０８−１１４、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒ．２０１２  ２０：６０９−６１５）。この送達系は、ｓｉＲＮＡの送達を改善するために、標的を定めたナノ粒子と、エンドソームからの脱出を向上させるための構成成分リン酸カルシウムとの両方を組み合わせる。
【０７８１】
一実施形態において、ＰＥＧ−ポリアニオンブロックコポリマーとともにリン酸カルシウムを用いて、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を送達してもよい（Ｋａｚｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．２００４  ９７：３４５−３５６、Ｋａｚｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．２００６  １１１：３６８−３７０）。
【０７８２】
一実施形態において、ＰＥＧ電荷変換型ポリマー（Ｐｉｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１  ３２：３１０６−３１１４）を用いて、本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を送達するためのナノ粒子を形成してもよい。ＰＥＧ電荷変換型ポリマーは、酸性ｐＨでポリカチオンへと切断され、それ故に、エンドソームからの脱出を向上させることによって、ＰＥＧ−ポリアニオンブロックコポリマーを改善し得る。
【０７８３】
コア−シェルナノ粒子の使用は、カチオン性架橋ナノゲルコアおよび種々のシェルを合成するための高処理アプローチにさらに焦点を当てている（Ｓｉｅｇｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１１  １０８：１２９９６−１３００１）。ポリマーナノ粒子の複合体形成、送達、および内在化は、ナノ粒子のコア構成成分およびシェル構成成分の両方の化学組成を変化させることによって精密に制御することができる。例えば、コア−シェルナノ粒子は、コレステロールをナノ粒子に共有結合させた後に、ｓｉＲＮＡをマウス肝細胞に効率的に送達し得る。
【０７８４】
一実施形態において、中間のＰＬＧＡ層およびＰＥＧを含有する外側の中性脂質層を含む、中空の脂質コアを用いて、本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、リボ核酸を送達してもよい。非限定的な例として、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒｅａｓｅ）発現腫瘍を担持するマウスにおいて、脂質−ポリマー−脂質ハイブリッドナノ粒子が、従来のリポプレックスと比較して、ルシフェラーゼ発現を有意に抑制することが確認された（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ．２０１１
５０：７０２７−７０３１）。
ペプチドおよびタンパク質
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸による細胞のトランスフェクションを増加させるために、ペプチドおよび／またはタンパク質とともに製剤化することができる。一実施形態において、細胞透過性ペプチドならびに細胞内送達を可能にするタンパク質およびペプチド等であるが、これらに限定されないペプチドを用いて、薬学的製剤を送達してもよい。本発明の薬学的製剤とともに使用され得る細胞透過性ペプチドの非限定的な例としては、細胞内空間への送達を容易にする、ポリカチオンに結合した細胞透過性ペプチド配列、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはｈＣＴ由来細胞透過性ペプチドである（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３（３）：３１０−８（２００１）、Ｌａｎｇｅｌ，Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬ，２００２）、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１１（２８）：３５９７−６１１（２００３）、およびＤｅｓｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６２（１６）：１８３９−４９（２００５）を参照のこと）。組成物は、組成物の細胞内空間への送達を向上させる細胞透過性薬剤、例えば、リポソームを含むように製剤化することもできる。本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、細胞内送達を可能にするために、Ａｉｌｅｒｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）およびＰｅｒｍｅｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）によるペプチドおよび／またはタンパク質等であるが、これらに限定されない、ペプチドおよび／またはタンパク質に複合体形成されてもよい（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｒｏｎｉｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１０  ５：７４７−７５２、ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００９  １０６：６１１１−６１１６、Ｓａｗｙｅｒ，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．２００９  ７３：３−６、Ｖｅｒｄｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｉｌｉｎｓｋｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１２；５０３：３−３３）。
【０７８５】
一実施形態において、細胞透過性ポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含み得る。第１のドメインは、超荷電ポリペプチドを含み得る。第２のドメインは、タンパク質結合パートナーを含み得る。本明細書で使用されるとき、「タンパク質結合パートナー」には、抗体およびその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチドが含まれるが、これらに限定されない。細胞透過性ポリペプチドは、タンパク質結合パートナーのための細胞内結合パートナーをさらに含み得る。細胞透過性ポリペプチドは、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、リボ核酸が導入され得る細胞から分泌されることが可能であり得る。
【０７８６】
ペプチドまたはタンパク質を含む製剤を用いて、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸による細胞トランスフェクションを増加させ、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の生体分布を変化させ（例えば、具体的な組織または細胞型を標的とすることによって）、かつ／またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させることができる。
細胞
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、エクスビボで細胞中にトランスフェクトすることができ、それがその後、対象に移植される。非限定的な例として、医薬組成物は、修飾ＲＮＡを肝臓および骨髄細胞に送達するための赤血球、修飾ＲＮＡをウイルス様粒子（ＶＬＰ）中で送達するためのビロソーム、ならびにＭＡＸＣＹＴＥ（登録商標）（メリーランド州ゲイザースバーグ）による細胞、およびＥＲＹＴＥＣＨ（登録商標）（フランス、リヨン）による細胞等であるが、これらに限定されない、修飾ＲＮＡを送達するためのエレクトロポレーション処理された細胞を含んでもよい。ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸以外のペイロードを送達するための赤血球、ウイルス粒子、およびエレクトロポレーション処理された細胞の使用例が、文書化されている（すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｏｄｆｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１２  １２：１２７−１３３、Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１２  １２：３８５−３８９、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１１  １０８：１０９８０−１０９８５、Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２０１０  ２７：４００−４２０、Ｈｕｃｋｒｉｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００７；１７：３９−４７、Ｃｕｓｉ，Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ．２００６  ２：１−７、ｄｅ  Ｊｏｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００６  １３：４００−４１１）。修飾ＲＮＡは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１１０８５２３１号および米国公開第２０１１０１７１２４８号に記載の方法によって合成される合成ＶＬＰ中で送達されてもよい。
【０７８７】
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の細胞ベースの製剤を用いて、細胞トランスフェクションを確実にし（例えば、細胞担体中の）、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の生体分布を変化させ（例えば、細胞担体の標的を具体的な組織または細胞型に定めることによって）、かつ／またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させてもよい。
細胞内への導入
ウイルスおよび非ウイルス媒介性技法を含む、核酸の細胞内への導入に好適である多様な方法が当技術分野で知られている。典型的な非ウイルス媒介性技法の例としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介性移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介性移入、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル媒介性移入（ナノ粒子）、カチオン性ポリマー媒介性移入（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等）、または細胞融合が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７８８】
ソノポレーション、または細胞超音波処理の技法は、細胞原形質膜の透過性修飾するために音（例えば、超音波周波数）を使用するものである。ソノポレーション法は、当業者に知られており、例えば、それが細菌に関する場合には、米国特許公開第２０１００１９６９８３号において、それが他の細胞型に関する場合には、例えば、米国特許公開２０１００００９４２４号において教示され、これらの各々は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０７８９】
エレクトロポレーション技法もまた、当技術分野で周知である。一実施形態において、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、実施例１１に記載されるようにエレクトロポレーションによって送達され得る。
ヒアルロニダーゼ
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ，またはリボ核酸の筋肉内または皮下局所注入は、ヒアルロナンの加水分解を触媒する、ヒアルロニダーゼを含むことができる。介在性の関門の構成物質であるヒアルロナンの加水分解を触媒することによって、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を低下させて、それによって組織透過性を増加させる（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｆｒｏｓｔ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．（２００７）４：４２７−４４０）。それらの分散およびトランスフェクトされた細胞によって産生されるコードされたタンパク質の全身への分布を加速することが有用である。あるいは、ヒアルロニダーゼを用いて、筋肉内にまたは皮下に投与された本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸に曝露される細胞の数を増加させることができる。
ナノ粒子模倣体
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、ナノ粒子模倣体内にカプセル封入されかつ／またはそれに吸収され得る。ナノ粒子模倣体は、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、および細胞等であるが、これらに限定されない、生物または粒子の送達機能を模倣することができる。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、ウイルスの送達機能を模倣することができる非バイロン（ｖｉｒｏｎ）粒子中にカプセル封入されてもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２００６３７６号を参照のこと）。
ナノチューブ
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、ロゼットナノチューブ、リンカーを用いたツイン塩基（ｔｗｉｎ  ｂａｓｅｓ）を有するロゼットナノチューブ、カーボンナノチューブおよび／または単層カーボンナノチューブ等であるが、これらに限定されない、少なくとも１つのナノチューブに付着または結合され得る。ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、立体（ｓｔｅｒｉｃ）力、イオン力、共有結合力、および／または他の力等であるが、これらに限定されない力を介してナノチューブに結合され得る。
【０７９０】
一実施形態において、ナノチューブは、１つ以上のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を細胞内に放出することができる。少なくとも１つのナノチューブのサイズおよび／または表面構造を、体内でナノチューブの相互作用を制御し、かつ／または本明細書に開示のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸に付着または結合するように変化させることができる。一実施形態において、少なくとも１つのナノチューブのビルディングブロックおよび／またはそのビルディングブロックに結合される官能基を、ナノチューブの寸法および／または特性を調整するように変化させることができる。非限定的な例として、ナノチューブの長さは、ナノチューブが正常な血管の壁の穴を通過するのを妨害するが、依然として腫瘍組織の血管におけるより大きい穴を通過するのに十分に小さくあるように変化させてもよい。
【０７９１】
一実施形態において、少なくとも１つのナノチューブは、ポリエチレングリコール等であるが、これらに限定されないポリマーを含む送達向上化合物でコーティングされてもよい。別の実施形態において、少なくとも１つのナノチューブおよび／または修飾ｍＲＮＡは、薬剤的に許容される賦形剤および／または送達ビヒクルと混合されてもよい。
【０７９２】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、または修飾ｍＲＮＡは、少なくとも１つのロゼットナノチューブに付着および／または結合される。ロゼットナノチューブは、当技術分野で既知のプロセスによって、かつ／または参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０９４３０４号に記載のプロセスによって形成され得る。少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡは、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０９４３０４号に記載のプロセスによって、少なくとも１つのロゼットナノチューブに付着および／または結合されてもよく、ここでロゼットナノチューブまたはロゼットナノチューブを形成するモジュールは、水性媒体中で、少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡがロゼットナノチューブに付着または結合するようになり得る条件下で、少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡと混合される。
複合体
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、担体もしくは標的化基に共有結合された、または一緒に融合タンパク質を産生する２つのコード領域を含む（例えば、標的化基および治療的タンパク質またはペプチドを担持する）、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸等の複合体を含む。
【０７９３】
本発明の複合体は、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、またはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）、または脂質等の、天然に生じる物質を含む。リガンドは、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）等の組換えまたは合成分子であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリアミノ酸は、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル（ａｃｒｙｌｌｉｃ）酸）、Ｎ−イソプロピルａｃｒｙｌアミドポリマー、またはポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｉｎｅ）が挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、αヘリックスペプチドが挙げられる。
【０７９４】
ポリヌクレオチド複合体の調製、特にＲＮＡへのの調製を教示する、代表的な米国特許には、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７号、５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号、同第６，２９４，６６４号、同第６，３２０，０１７号、同第６，５７６，７５２号、同第６，７８３，９３１号、同第６，９００，２９７号、同第７，０３７，６４６号が含まれるが、これらに限定されない。
【０７９５】
一実施形態において、本発明の複合体は、本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸のための担体として機能し得る。複合体は、ポリ（エチレングリコール）でグラフトされ得る、ポリアミン、ポリリジン、ポリアルキレンイミン、およびポリエチレンイミン等であるが、これらに限定されないカチオン性ポリマーを含んでもよい。非限定的な例として、複合体は、ポリマー複合体と同様であってもよく、ポリマー複合体を合成する方法は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，５８６，５２４号に記載されている。
【０７９６】
複合体は、標的化基、例えば、細胞または組織標的化薬剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば、腎臓細胞等の指定される細胞型に結合する抗体も含み得る。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体、またはアプタマーであり得る。
【０７９７】
標的化基は、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンド（ｃｏ−ｌｉｇａｎｄ）に対する特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、もしくは骨細胞等の指定される細胞型に結合する抗体であり得る。標的化基には、ホルモンおよびホルモン受容体も含まれ得る。それらには、等の脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、またはアプタマー等の非ペプチド種も含まれ得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、またはｐ３８
ＭＡＰキナーゼの活性化因子であり得る。
【０７９８】
標的化基は、具体的な受容体を標的とすることが可能な任意のリガンドであり得る。例としては、制限なく、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、アプタマー（ａｐａｔａｍｅｒｓ）、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ、およびＨＤＬリガンドが挙げられる。特定の実施形態において、標的化基は、アプタマーである。アプタマーは、修飾されていないことも、本明細書に開示の修飾の任意の組み合わせを有することもあり得る。
【０７９９】
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、ロックト核酸と同様の修飾等であるが、これらに限定されない化学修飾を含んでもよい。
Ｓａｎｔａｒｉｓによるもの等のロックト核酸（ＬＮＡ）の調製を教示する、代表的な米国特許には、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２６８，４９０号、同第６，６７０，４６１号、同第６，７９４，４９９号、同第６，９９８，４８４号、同第７，０５３，２０７号、同第７，０８４，１２５号、および同第７，３９９，８４５号が含まれるが、これらに限定されない。
【０８００】
ＰＮＡ化合物の調製を教示する、代表的な米国特許には、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、および同第５，７１９，２６２号が含まれるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００において見出すことができる。
【０８０１】
本発明の特色をなすいくつかの実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有する修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸、ならびに他の修飾骨格、特に、上に参照される米国特許第５，４８９，６７７号の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られている］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、および−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［式中、天然ホスホジエステル骨格は、−−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−−Ｏ−−ＣＨ２−−として表される］、および上に参照される米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を有する、オリゴヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書の特色をなすポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｔｏｔｉｄｅｓ）は、上に参照される米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
【０８０２】
２’位における修飾もまた、送達を補助し得る。好ましくは、２’位における修飾は、ポリペプチドコード配列には位置しない、すなわち、翻訳可能領域にない。２’位における修飾は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および／または尾部領域に位置してもよい。２’位における修飾は、２’位において次のうちの１つを含むことができる：Ｈ（すなわち、２’−デオキシ）；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（式中、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。例示の好適な修飾には、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が含まれ、式中、ｎおよびｍは、１〜約１０である。他の実施形態において、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、２’位において次のうちの１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、薬物動態特性を改善するための基、または薬力学特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。いくつかの実施形態において、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥ）としても知られている）（Ｍａｒｔｉｎｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６−５０４）すなわち、アルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示の修飾は、本明細書の以下の実施例に記載の２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている）、および同様に本明細書の以下の実施例に記載の２’−ジメチルアミノエトキシ（当技術分野で２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ２）２である。他の修飾は、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の修飾は、他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位で、または２’−５’結合ｄｓＲＮＡにおいて、および５’末端ヌクレオチドの５’位で行われてもよい。本発明のポリヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖模倣体を有してもよい。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，���１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、および同第５，７００，９２０号が含まれるが、これらに限定されない。
【０８０３】
依然として他の実施形態において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、細胞透過性ポリペプチドに共有結合的に複合体化される。細胞透過性ペプチドは、シグナル配列も含み得る。本発明の複合体は、増加した安定性、増加した細胞トランスフェクション、および／または変化した生体分布（例えば、具体的な組織または細胞型に標的を定められる）を有するように設計することができる。
自己集合性核酸ナノ粒子
自己集合性ナノ粒子は、核酸鎖が容易にリプログラミング可能であり得るように精密に制御され得る、明確に定義されたサイズを有する。例えば、２０ｎｍ超の直径が、向上した透過性および保持効果により腎クリアランスを回避し、ある特定の腫瘍への送達を向上させるため、癌標的化ナノ送達担体のために最適な粒径は、２０〜１００ｎｍである。自己集合性核酸ナノ粒子を用いて、向上した送達のために癌標的化リガンドの精密に制御された空間定位および密度を有する、サイズおよび形が均一な単一の集団。非限定的な例として、オリゴヌクレオチドナノ粒子が、短いＤＮＡ断片および治療的ｓｉＲＮＡのプログラミング可能な自己集合を用いて調製された。これらのナノ粒子は、制御可能な粒径ならびに標的リガンド箇所および密度を有して、分子的に同一である。ＤＮＡ断片およびｓｉＲＮＡは、１ステップ反応へと自己集合して、標的を定めたインビボ送達のためにＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ四面体ナノ粒子を生成した。（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１２  ７：３８９−３９３）。
賦形剤
薬学的製剤は、本明細書で使用されるとき、所望される特定の剤形に適している、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑沢剤等を含む、薬剤的に許容される賦形剤をさらに含んでもよいが、これらに限定されない。医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤、およびその組成物を調製する技術は、当該技術分野において既知である（参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照のこと）。従来の賦形剤媒体の使用は、任意の従来の賦形剤媒体が任意の望ましくない生体影響を引き起こし得るか、またはさもなければ医薬組成物の任意の他の構成成分（複数可）と有害な様態で相互作用するといった、物質またはその誘導体と不適合性である場合を除いて、本開示の範囲内で企図される。
【０８０４】
いくつかの実施形態において、薬剤的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋であり得る。いくつかの実施形態において、賦形剤は、ヒトにおける使用および獣医学的使用に対して認可され得る。いくつかの実施形態において、賦形剤は、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって認可され得る。いくつかの実施形態において、賦形剤は、医薬品等級である。いくつかの実施形態において、賦形剤は、米国薬局方（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（ＵＳＰ））、欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（ＥＰ））、英国薬局方（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）、および／または国際薬局方（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）の基準を満たし得る。
【０８０５】
医薬組成物の製造に使用される薬剤的に許容される賦形剤には、不活性希釈剤、分散化剤および／もしくは造粒剤、界面活性剤および／もしくは乳化剤、崩壊剤、結合剤、防腐剤、緩衝剤、滑沢剤、ならびに／または油が含まれるが、これらに限定されない。そのような賦形剤が任意に薬学的製剤中に含まれてもよい。組成物はまた、ココアバターおよび坐剤ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、ならびに／または芳香剤等の賦形剤であってもよい。
【０８０６】
例示の希釈剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、ショ糖、セルロース、微小結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、粉糖等、および／またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０８０７】
例示の造粒剤および／または分散化剤には、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘パルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木質製品、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル−ピロリドン）（クロスポビドン）、ナトリウムカルボキシメチルデンプン（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、α化デンプン（デンプン１５００）、微小結晶デンプン、水不溶性デンプン、カルシウムカルボキシメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（Ｖｅｅｇｕｍ）、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物等、ならびに／またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０８０８】
例示の界面活性剤および／または乳化剤には、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガント、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、コロイド状粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］およびＶＥＥＧＵＭ（登録商標）［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、モノステアリン酸トリアセチン（ｔｒｉａｃｅｔｉｎ
ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ）、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、およびモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末化セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノラウリル酸ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０］、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、モノパルミチン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、モノステアリン酸ソルビタン［Ｓｐａｎ（登録商標）６０］、トリステアリン酸ソルビタン［Ｓｐａｎ（登録商標）６５］、モノオレイン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、モノステアリン酸ポリオキシエチレン［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシル化（ｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ）ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシメチレン、およびＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標））、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル、（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニル−ピロリドン）、モノラウリル酸ジエチレングリコール、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ＰＬＵＯＲＩＮＣ（登録商標）Ｆ  ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドキュセートナトリウム等、ならびに／またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０８０９】
例示の結合剤には、デンプン（例えば、トウモロコシデンプンおよびデンプンペースト）；ゼラチン；糖類（例えば、ショ糖、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール、）；天然および合成ガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュ・モスの抽出物、パンワールガム（ｐａｎｗａｒ  ｇｕｍ）、ガッチガム（ｇｈａｔｔｉ  ｇｕｍ）、イサポール皮（ｉｓａｐｏｌ  ｈｕｓｋ）の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微小結晶セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、およびカラマツアラビノガラクタン（ｌａｒｃｈ  ａｒａｂｏｇａｌａｃｔａｎ））；アルギン酸塩；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート；ワックス；水；アルコール等；ならびにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０８１０】
例示の防腐剤には、酸化防止剤、キレート剤、抗菌性防腐剤、抗真菌性防腐剤、アルコール防腐剤、酸性防腐剤、および／または他の防腐剤が含まれ得るが、これらに限定されない。例示の酸化防止剤には、αトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル（ａｓｃｏｒｂｉｃ）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および／または硫酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。例示のキレート剤には、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、および／またはエデト酸三ナトリウムが含まれる。例示の抗菌性防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール（ｃｈｌｏｒｏｘｙｌｅｎｏｌ）、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジ、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および／またはチメロサールが含まれるが、これらに限定されない。例示の抗真菌性防腐剤には、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、および／またはソルビン酸が含まれるが、これらに限定されない。例示のアルコール防腐剤には、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール系化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸塩、および／またはフェニルエチルアルコールが含まれるが、これらに限定されない。例示の酸性防腐剤には、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、β−カロテン、クエン酸、酢酸、ジヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および／またはフィチン酸が含まれるが、これらに限定されない。他の防腐剤には、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム（ｄｅｔｅｒｏｘｉｍｅ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅｄ）（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ＧＬＹＤＡＮＴ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）、メチルパラベン、ＧＥＲＭＡＬＬ（登録商標）１１５、ＧＥＲＭＡＢＥＮ（登録商標）ＩＩ、ＮＥＯＬＯＮＥ（商標）、ＫＡＴＨＯＮ（商標）、および／またはＥＵＸＹＬ（登録商標）が含まれるが、これらに限定されない。
【０８１１】
例示の緩衝剤には、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプチン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、Ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、第二リン酸カリウム、第一リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、二炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱性物質除去水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール等、および／またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０８１２】
例示の滑沢剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸（ｂｅｈａｎａｔｅ）グリセリル、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム等、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０８１３】
例示の油には、アーモンド油、杏仁油、アボカド油、ババス油、ベルガモット油、ブラックカラント種子油、カデ油、カモミール油、キャノーラ油、キャラウェイ油、カルナウバ油、ヒマシ油、桂皮油、ココアバター油、ココナッツ油、タラの肝油、コーヒー油、トウモロコシ油、綿実油、エミュー油、ユーカリ油、月見草油、魚油、亜麻仁油、ゲラニオール油、ヒョウタン油、ブドウ種子油、ヘーゼルナッツ油、ヒソップ油、ミリスチン酸イソプロピル油、マンゴー種子油、メドウフォーム種子油、ミンク油、ナツメグ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラフィー油、パーム油、パーム核油、桃仁油、ピーナッツ油、ケシ油、カボチャ種子油、菜種油、コメヌカ油、ローズマリー油、ベニバナ油、ビャクダン油、サスクアナ（ｓａｓｑｕａｎａ）油、セボリー、シーバックソーン油、ゴマ油、シアバター油、シリコーン油、大豆油、ヒマワリ油、ティーツリー油、アザミ油、ツバキ油、ベチバー油、胡桃油、および小麦胚芽油が含まれるが、これらに限定されない。例示の油には、ブチルステアリン酸、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、および／またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０８１４】
調合者の判断に従って、ココアバターおよび坐剤ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、ならびに／または芳香剤等の賦形剤が、組成物中に存在し得る。
送達
本開示は、薬物送達の科学進展の見込みを考慮した任意の適切な経路による、治療目的、薬学目的、診断目的、または撮像目的のうちのいずれのためのポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の送達をも包含する。送達は、ネイキッドであっても製剤化されてもよい。
ネイキッド送達
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、ネイキッドで細胞に送達されてもよい。本明細書で使用されるとき、「ネイキッド」とは、トランスフェクションをエンハンスドする薬剤を用いずにポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を送達することを指す。例えば、細胞に送達されるポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、修飾を全く含有しない場合がある。ネイキッドポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、細胞に、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載の投与経路を用いて送達されてもよい。
製剤化された送達
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、本明細書に記載の方法を用いて製剤化されてもよい。製剤は、修飾されているかつ／または修飾されていない場合があるポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を含有してもよい。製剤は、細胞透過剤、薬剤的に許容される担体、送達剤、生崩壊性または生体適合性ポリマー、溶媒、および持続放出送達デポーをさらに含むことができるが、これらに限定されない。製剤化されたポリヌクレオチド、修飾核酸、またはエンハンスド修飾ＲＮＡは、細胞に、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載の投与経路を用いて送達されてもよい。
【０８１５】
組成物は、直接浸水または浸漬、カテーテルを介して、ゲル、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、および／または液滴によって、組成物でコーティングまたは含浸された織物または生分解性材料等の基質を使用することによって等を含むが、これらに限定されない当技術分野におけるいくつかの方法のうちのいずれかにおける器官または組織への直接送達のためにも製剤化され得る。
【０８１６】
ある特定の実施形態において、製剤は１つ以上の細胞透過薬剤、例えば、トランスフェクション剤を含む。特定の一実施形態において、リボ核酸はトランスフェクション剤（またはその混合物）と混ぜられる（ｍｉｘｅｄ）かまたは混合（ａｄｍｉｘｅｄ）され、得られた混合物を使用して細胞をトランスフェクトする。好ましいトランスフェクション剤は陽イオン性脂質組成物であり、具体的には一価および多価の陽イオン性脂質組成物であり、より具体的には「ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ」、「ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ」、「ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ」、「ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ」、ＤＭＲＩＥ−Ｃ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＳＰＡ、およびＤＯＳＰＥＲであり、ならびにデンドリマー組成物であり、高密度スターデンドリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、グラフト化デンドリマー、およびデンドリグラフトおよび「ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ」として知られるデンドリマーを含む、具体的にはＧ５−Ｇ１０デンドリマーである。第２の特定のトランスフェクション方法において、リボ核酸は核酸結合基、例えば、ポリアミンと複合体化し、およびより具体的にはスペルミンと複合体化し、次いで細胞に導入されるか、またはトランスフェクション剤（またはその混合物）と混合され、得られた混合物を使用して細胞をトランスフェクトする。第３の特定の実施形態において、融合性（ｆｕｓａｇｅｎｉｃ）ペプチドまたはタンパク質を含む、１つ以上のトランスフェクション促進ペプチド、タンパク質、もしくはタンパク質断片の混合物、運搬もしくは輸送ペプチドもしくはタンパク質、受容体リガンドペプチドもしくはタンパク質、もしくは核局在化ペプチドもしくはタンパク質、および／またはそれらの修飾された類似体（例えば、スペルミン修飾ペプチドもしくはタンパク質）、またはそれらの組み合わせを、リボ核酸と混合させ、複合体化させて、随意にトランスフェクション剤と混合されている細胞中に導入し、得られた混合物を使用して、細胞をトランスフェクトする。さらに、トランスフェクション剤（例えば、脂質、陽イオン性脂質、またはデンドリマー）の構成成分を、選択したペプチド、タンパク質、またはタンパク質断片と、直接、または結合もしくはスペーサー基を介して共有結合で複合体化させる。融合性、膜透過性、運送性または輸送性であるペプチドまたはタンパク質が、この実施形態における特定の目的であるか、または細胞標的化のために機能する。ペプチドまたはタンパク質トランスフェクション剤複合体はリボ核酸と結合させられ、トランスフェクションのために用いられる。
【０８１７】
ある特定の実施形態において、製剤は、有効量のポリヌクレオチド、修飾核酸、またはリボ核酸をもたらす薬剤的に許容可能な担体を含み、実質的に細胞を含有する標的組織中に保持される。
投与
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、治療上有効成果をもたらす任意の経路によって投与されてもよい。これらには、経腸、経胃腸、硬膜外、経口、経皮、硬膜外（硬膜上）、脳内（大脳の中へ）、脳室内（脳室の中へ）、皮膚上（皮膚上への適用）、皮内、（皮膚自体の中へ）、皮下（皮膚の下）、経鼻投与（鼻を介して）、静脈内（静脈の中へ）、動脈内（動脈の中へ）、筋肉内（筋肉の中へ）、心臓内（心臓の中へ）、骨内輸注（骨髄の中へ）、髄腔内（脊柱管の中へ）、腹腔内（腹腔の中への輸注または注入）、膀胱内輸注、硝子体内（眼を介して）、空洞内注入（陰茎基部の中へ）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身への分布のための無傷の皮膚（ｉｎｔａｃｔ  ｓｋｉｎ）を介した拡散）、経粘膜（粘膜を介した拡散）、ガス注入（鼻からの吸引）、舌下、口唇下、浣腸、点眼（結膜上に）、または点耳におけるもの含まれるが、これらに限定されない。
【０８１８】
一実施形態において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、または操作されたリボヌクレオチドを含有するインビボデポー剤を作成するための組成物が提供される。例えば、組成物は、生体内分解性生体適合性ポリマー、ポリマーを可塑化してそれと共にゲルを形成するのに有効な量で存在する溶媒、およびポリヌクレオチド、修飾核酸、または操作されたリボ核酸を含有する。ある特定の実施形態において、組成物はまた本明細書に記載の細胞透過薬剤も含む。他の実施形態において、組成物はまた、チキソトロピーな組成物を形成するのに効果的であるように、ポリマーと混合できるチキソトロピーな量のチキソトロープ剤を含有する。さらに、組成物は、安定化剤、充填剤、キレート剤、または緩衝剤を含む。
【０８１９】
他の実施形態において、患者の環境（臓器または組織部位を意味する）において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、または操作されたリボ核酸の投与のため等の徐放性送達デポー剤が提供される。そのようなデポー剤は概して、操作されたリボ核酸および可動性鎖状ポリマーの両方が架橋マトリクスタンパク質の多孔質マトリクス中に捕捉されている、操作されたリボ核酸および可動性鎖状ポリマーを含有する。通常、孔径は１ｍｍ未満であり、例えば、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、または１００ｎｍ未満等である。通常、可動性鎖状ポリマーは親水性である。通常、可動性鎖状ポリマーは少なくとも５０ｋＤａの分子量、例えば、７５ｋＤａ、１００ｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、２５０ｋＤａ、３００ｋＤａ、４００ｋＤａ、５００ｋＤａ、または５００ｋＤａより大きい分子量を有する。通常、可動性鎖状ポリマーはマトリクスタンパク質の１０％未満の持続長、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、１、または１％未満の持続長を有する。通常、可動性鎖状ポリマーはマトリクスタンパク質の電荷と類似した電荷を有する。いくつかの実施形態において、可動性鎖状ポリマーは、マトリクスからポリヌクレオチド、修飾核酸、操作されたリボ核酸が進入できる細胞を含む周辺組織へと操作されたリボ核酸の拡散を持続させることができる大きさまで、架橋マトリクスタンパク質のマトリクスの効果的な孔径を変化させる。
【０８２０】
特定の実施形態において、組成物は、それらが血液−脳関門、血管関門、または他の上皮関門を横断することを可能にするような方式で投与されてもよい。本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸のための非限定的な投与経路が以下に記載される。
【０８２１】
本発明は、本発明に従ったポリヌクレオチド、修飾ｍＲＮＡ、およびそれらのコードされたタンパク質または複合体を、それらを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。核酸、タンパク質もしくは複合体、または医薬組成物、造影用組成物、診断用組成物、またはその予防的な組成物は、疾患、障害、および／または状態（例えば、作業記憶欠損に関連する疾患、障害、および／または状態）の予防、治療、診断、または造影に効果的な任意の投与量および任意の投与経路を用いて対象に投与することができる。必要とされる正確な量は患者間で変化し、対象の種、年齢、および全身健康、疾患の重症度、特定の組成物、その投与方法、その活性方法といったものに依存する。本発明に従った組成物は典型的に、投与のし易さおよび投与量の均一性のための剤形で処方される。しかしながら、本発明の組成物の１日の総使用量は医学的良識の範囲内で主治医が決定することができることを理解されたい。あらゆる特定の患者にして特定の治療効果のある、予防効果のある、または適切な造影用量レベルは、治療される障害および障害の重症度；使用される特定の化合物の活性；使用される特定の組成物；患者の年齢、体重、全身健康、性別、および食事制限；使用される特定の化合物の投与期間、投与経路、および排泄率；治療の期間；使用される特定の化合物と、組み合わせてまたは同時に使用される薬剤；ならびに医療の分野において周知である同様の要因を含む、様々な要因に依存する。
非経口および注入による投与
経口投与および非経口投与のための液体剤形には、薬剤的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および／またはエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸塩、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（具体的には、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル等の可溶化剤および乳化剤、ならびにこれらの混合物等の、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、および／または芳香剤等のアジュバントを含むことができる。非経口投与のためのある特定の実施形態において、組成物は、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはこれらの組み合わせ等の可溶化剤と混合される。
【０８２２】
注入用調製物、例えば、滅菌注入用水性または油性懸濁液は、既知の技術に従って、好適な分散化剤、湿潤剤、および／または懸濁化剤を用いて製剤化されてもよい。滅菌注入用調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤および／または溶媒中の、滅菌注入用溶液、懸濁液、および／またはエマルション、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液としてのものであってもよい。用いられ得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張塩化ナトリウム溶液がある。無刺激の固定油が溶媒または懸濁化媒体として慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無菌性の固定油が用いられ得る。オレイン酸等の脂肪酸が注入物の調製において使用され得る。
【０８２３】
注入用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、かつ／または使用前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体中に溶解もしくは分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌することができる。
【０８２４】
活性成分の効果を延長するために、皮下または筋肉内注入からの活性成分の吸収を緩徐化することがしばしば望ましい。これは、水への溶解度が低い結晶質または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって遂行されてもよい。薬物の吸収速度は次いで、その溶解速度に依存し、溶解速度が今度は、結晶サイズおよび結晶形に依存し得る。あるいは、非経口的に投与される薬物形態の遅延吸収は、薬物を油性ビヒクル中に溶解させるまたは懸濁させることによって遂行される。注入用デポー形態は、薬物のマイクロカプセルマトリックス（ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌｅ  ｍａｔｒｉｃｅｓ）を、ポリラクチド−ポリグリコライド等の生分解性ポリマー中に形成することによって作製される。薬物対ポリマーの比および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注入用製剤は、薬物を、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション中に封入することによって調製される。
直腸および膣内投与
直腸または膣内投与のための組成物は、典型的に坐剤であり、それは組成物を、周囲温度では固体であるが、体温では液体であり、したがって直腸または膣腔で溶解して活性成分を放出する、ココアバター、ポリエチレングリコール、または坐剤ワックス等の好適な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができる。
経口投与
経口投与のための固体剤形には、カプセル、錠剤、丸薬、粉剤、および顆粒が含まれる。そのような固体剤形において、活性成分は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム等の少なくとも１つの不活性な薬剤的に許容される賦形剤、および／または充填剤もしくは増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトール、およびケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、ショ糖、およびアカシア）、保水剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、第四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイト粘土）、ならびに滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、ならびにこれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤、および丸薬の場合、剤形は、緩衝剤も含んでもよい。
局所または経皮投与
本明細書に記載されるように、本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を含有する組成物は、局所的な投与のために製剤化されてもよい。皮膚は、それが容易に接触可能であるため、送達に理想的な標的であり得る。遺伝子発現は、皮膚に対してのみ制限され、非特異的な毒性を回避する可能性があるだけでなく、皮内の特定の層および細胞型にも制限され得る。
【０８２５】
送達された組成物の皮膚発現の部位は、核酸送達の経路に依存する。次の３つの経路がポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を皮膚へと送達するために考慮される：（ｉ）局所適用（例えば、局所／局部治療のため）、（ｉｉ）経皮注入（例えば、局所／局部治療のため）、ならびに（ｉｉｉ）全身送達（例えば、皮膚領域および皮膚外領域の両方を侵す皮膚疾患の治療のため）。ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、当技術分野で既知のいくつかの異なるアプローチによって皮膚に送達することができる。非カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体、カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体の局所適用、粒子媒介性（遺伝子銃）、穿刺媒介性遺伝子トランスフェクション、およびウイルス送達アプローチ等であるが、これらに限定されない、ほとんどの局所送達アプローチが、ＤＮＡの送達に有効であることが示されている。核酸の送達後に、遺伝子産物が、基底角化細胞、皮脂腺細胞、真皮線維芽細胞、および真皮マクロファージを含むが、これらに限定されない、いくつかの異なる皮膚細胞型において検出されている。
【０８２６】
一実施形態において、本発明は、本発明の方法を好都合にかつ／または有効に行うための多様なドレッシング（例えば、創傷ドレッシング）または包帯（例えば、粘着包帯）を提供する。典型的に、ドレッシングまたは包帯は、使用者が対象（複数可）の複数の治療を行うことを可能にするために、本明細書に記載の十分な量の医薬組成物および／またはポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を含むことができる。
【０８２７】
一実施形態において、本発明は、１回を超える注入で送達されるポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸組成物を提供する。
一実施形態において、局所および／または経皮投与の前に、皮膚等の少なくとも１つの組織の領域が、透過性を増加させ得るデバイスおよび／または溶液に供されてもよい。一実施形態において、組織は、皮膚の透過性を増加させるために、研磨デバイスに供されてもよい（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００８０２７５４６８号を参照のこと）。別の実施形態において、組織は、超音波強化デバイスに供されてもよい。超音波強化デバイスには、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２００４０２３６２６８号ならびに米国特許第６，４９１，６５７号および同第６，２３４，９９０号に記載のデバイスが含まれてもよいが、これらに限定されない。組織の透過性を向上させる方法は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２００４０１７１９８０号および同第２００４０２３６２６８号ならびに米国特許第６，１９０，３１５号に記載されている。
【０８２８】
一実施形態において、デバイスを用いて、本明細書に記載の修飾ｍＲＮＡ製剤を送達する前に組織の透過性を増加させてもよい。皮膚の透過性は、当技術分野で既知の方法、および／または参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９０，３１５号に記載の方法によって測定することができる。非限定的な例として、修飾ｍＲＮＡ製剤は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９０，３１５号に記載の薬物送達方法によって送達されてもよい。
【０８２９】
別の非限定的な例において、組織は、透過性を増加させ得るデバイスに組織が供され得る前、その間および／またはその後に、局所麻酔薬の共融混合物（ＥＭＬＡ）クリームで処理されてもよい。Ｋａｔｚら（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ（２００４）；９８：３７１−７６）は、ＥＭＬＡクリームを低エネルギーと組み合わせて使用して、表在性皮膚鎮痛の発生が低エネルギー超音波での前処理の早くも５分後に見られたことを示した。
【０８３０】
一実施形態において、透過性を増加させるために組織が処理される前、その間、および／またはその後に、促進剤が組織に適用されてもよい。促進剤には、輸送促進剤、物理的促進剤、および空洞形成（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）促進剤が含まれるが、これらに限定されない。促進剤の非限定的な例は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９０，３１５号に記載されている。
【０８３１】
一実施形態において、デバイスを用いて、免疫応答を呼び起こす物質をさらに含有し得る、本明細書に記載の修飾ｍＲＮＡの製剤を送達する前に、組織の透過性を増加させてもよい。別の非限定的な例において、免疫応答を呼び起こす物質を含有する製剤は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２００４０１７１９８０号および同第２００４０２３６２６８号に記載の方法によって送達されてもよい。
【０８３２】
組成物の局所および／または経皮投与のための剤形には、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤、および／またはパッチが含まれてもよい。一般に、活性成分は、滅菌条件下で、必要とされ得る通りに薬剤的に許容される賦形剤ならびに／または任意の必要とされる防腐剤および／もしくは緩衝液と混和される。さらに、本発明は、経皮パッチの使用を企図し、それはしばしば、身体への化合物の制御送達を提供するという追加の利点を有し得る。そのような剤形は、例えば、化合物を適正な媒体中に溶解させるおよび／または分与することによって、調製することができる。あるいは、またはさらに、速度は、速度制御膜を提供することかつ／または化合物をポリマーマトリックスおよび／もしくはゲル中に分散させることによってのいずれかで制御することができる。
【０８３３】
局所投与に好適な製剤には、リニメント剤、ローション等の液体および／もしくは半液体調製物、クリーム、軟膏、および／もしくはペースト等の水中油型および／もしくは油中水型エマルション、ならびに／または溶液および／もしくは懸濁液が含まれるが、これらに限定されない。
【０８３４】
局所的に投与可能な製剤は、例えば、約０．１ｗ／ｗ％〜約１０ｗ／ｗ％の活性成分を含み得るが、活性成分の濃度は、最大で溶媒中の活性成分の可溶性の限度まで高くてもよい。局所投与のための製剤は、本明細書に記載のさらなる成分のうちの１つ以上をさらに含んでもよい。
デポー投与
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、組成物は、持続放出のためのデポー中に製剤化される。一般に、具体的な器官または組織（「標的組織」）が、投与のための標的とされる。
【０８３５】
本発明のいくつかの態様において、核酸（特にポリペプチドをコードするリボ核酸）は、標的組織内またはその近位で空間的に保持される。標的組織（１つ以上の標的細胞を含有する）を組成物と、組成物、特に組成物の核酸構成成分（複数可）が標的組織内に実質的に保持される、つまり、組成物の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９、または９９．９９％超が標的組織内に保持されるような条件下で接触させることによって、組成物を哺乳類対象の標的組織に提供する方法が提供される。有利なことに、保持は、１つ以上の標的細胞に進入する、組成物中に存在する核酸の量を測定することによって決定される。例えば、投与の一定期間後に、対象に投与される核酸の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９、または９９．９９％超が、細胞内に存在する。例えば、哺乳類対象への筋肉内注入が、リボ核酸およびトランスフェクション試薬を含有する水性組成物を用いて行われ、組成物の保持は、筋肉細胞内に存在するリボ核酸の量を測定することによって決定される。
【０８３６】
本発明の態様は、標的組織（１つ以上の標的細胞を含有する）を組成物と、組成物が標的組織内に実質的に保持されるような条件下で接触させることによって、組成物を哺乳類対象の標的組織に提供する方法を対象とする。別の実施形態において、目的とするポリペプチドが少なくとも１つの標的細胞内で産生されるような条件下の、ポリヌクレオチド、進入する細胞の自然免疫応答を回避するように操作されたリボ核酸。組成物は一般に、細胞透過剤、および薬剤的に許容される担体を含有するが、「ネイキッド」核酸（細胞透過剤または他の薬剤を含まない核酸等）もまた企図される。
【０８３７】
いくつかの状況において、組織内の細胞によって産生されるタンパク質の量は、望ましくは増加される。好ましくは、タンパク質産生のこの増加は、標的組織内の細胞に空間的に制限される。したがって、哺乳類対象の組織内における目的とするタンパク質の産生を増加させる方法が提供される。リボ核酸が侵入する細胞の自然免疫応答を回避するように操作され、目的とするポリペプチドをコードするリボ核酸を含有する組成物が提供され、この組成物は、標的組織の既定体積内に含有される細胞の実質的な割合（％）において目的とするポリペプチドを産生するように組成物の単位量が決定されていることで特徴付けられる。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを含有する組成物が提供される。
【０８３８】
いくつかの実施形態において、組成物は、複数の異なるリボ核酸を含み、このリボ核酸のうちの１つ以上がそのリボ核酸が進入する細胞の自然免疫応答を回避するように操作され、リボ核酸のうちの１つ以上が目的とするポリペプチドをコードする。任意に、組成物は、リボ核酸の細胞内送達を補助するための細胞透過剤も含有する。標的組織の既定体積内に含有される細胞のかなりの割合（％）において目的とするポリペプチドを産生する（一般に、既定体積に隣接した、または標的組織に遠位の組織において、目的とするポリペプチドの大幅な産生を誘導することなく）のに必要とされる組成物の用量の決定が行われる。この決定に次いで、決定された用量が哺乳類対象の組織に直接導入される。
【０８３９】
一実施形態において、本発明は、１回を超える注入でまたは分割用量注入によって送達される対象となるポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を提供する。
【０８４０】
一実施形態において、本発明は、小型の使い捨て薬物リザーバまたはパッチポンプを用いて、標的組織の付近で保持されてもよい。パッチポンプの非限定的な例としては、ＢＤ（登録商標）（ニュージャージー州フランクリンレイクス）、Ｉｎｓｕｌｅｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マサチューセッツ州ベドフォード）、ＳｔｅａｄｙＭｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（カリフォルニア州サンフランシスコ）、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ（ミネソタ州ミネアポリス）（例えば、ＭｉｎｉＭｅｄ）、ＵｎｉＬｉｆｅ（ペンシルヴァニア州ヨーク）、Ｖａｌｅｒｉｔａｓ（ニュージャージー州ブリッジウォーター）、およびＳｐｒｉｎｇＬｅａｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（マサチューセッツ州ボストン）によって製造および／または販売されるものが挙げられる。
肺投与
医薬組成物は、口腔を介した肺投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ／または販売されてもよい。そのような製剤は、活性成分を含み、かつ約０．５ｎｍ〜約７ｎｍまたは約１ｎｍ〜約６ｎｍの範囲の直径を有する、乾燥粒子を含んでもよい。そのような組成物は、好適には、噴射剤の流れが粉末を分散するようにそこに向けられ得る乾燥粉末リザーバを含むデバイスを用い、かつ／または密封容器中の低沸点噴射剤中に溶解および／もしくは懸濁させた活性成分を含むデバイス等の自己噴射溶媒／粉末分与容器を用いた投与のために、乾燥粉末の形態にある。そのような粉末は、粒子の少なくとも９８重量％が０．５ｎｍ超の直径を有し、粒子の少なくとも９５％（数量）が７ｎｍ未満の直径を有する、粒子を含む。あるいは、粒子の少なくとも９５重量％は、１ｎｍ超の直径を有し、粒子の少なくとも９０％（数量）は、６ｎｍ未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖等の固体微粉末希釈剤を含んでもよく、それは単位用量形態で好都合に提供される。
【０８４１】
低沸点噴射剤には一般に、大気圧で６５°Ｆ（約１８．３℃）を下回る融点を有する液体噴射剤が含まれる。一般に、噴射剤は、組成物の５０ｗ／ｗｖ％〜９９．９ｗ／ｗｖ％を構成し得、活性成分は、組成物の０．１ｗ／ｗ％〜２０ｗ／ｗ％を構成し得る。噴射剤は、液体非イオン性および／もしくは固体アニオン性界面活性剤ならびに／または固体希釈剤（活性成分を含む粒子と同じ規模の粒径を有し得る）等のさらなる成分をさらに含んでもよい。
【０８４２】
肺送達のために製剤化される医薬組成物は、溶液および／または懸濁液の液滴の形態で活性成分を提供してもよい。そのような製剤は、任意に滅菌された、活性成分を含む、水性および／または希釈アルコール溶液および／または懸濁液として調製され、パッケージ化され、かつ／または販売されてもよく、好都合に、任意の噴霧および／または微粒化デバイスを用いて投与され得る。そのような製剤は、サッカリンナトリウム等の香味剤、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、および／または安息香酸メチルヒドロキシ等の防腐剤を含むが、これらに限定されない１つ以上のさらなる成分をさらに含んでもよい。この投与経路によって提供される液滴は、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。
鼻腔内、経鼻、および頬側投与
肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、医薬組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、約０．２μｍ〜５００μｍの平均粒子を有する、粗粉である。そのような製剤は、鼻からの吸入が行われる様態で、すなわち、鼻に近接して保持された粉末の容器からの鼻孔を通じた急速な吸入によって、投与される。
【０８４３】
経鼻投与に好適な製剤は、例えば、最少約０．１ｗ／ｗ％〜最大１００ｗ／ｗｖ％の活性成分を含んでもよく、本明細書に記載のさらなる成分のうちの１つ以上を含んでもよい。医薬組成物は、頬側投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ／または販売されてもよい。そのような製剤は、例えば、従来の方法を用いて作製される錠剤および／またはロゼンジの形態にあってもよく、また、例えば、０．１ｗ／ｗ％〜２０ｗ／ｗ％の活性成分であってもよく、残りが経口的に溶解性および／または分解性の組成物、ならびに任意に、本明細書に記載のさらなる成分のうちの１つ以上を含む。代わりに、頬側投与に好適な製剤は、活性成分を含む、粉末ならびに／またはエアロゾル化および／もしくは微粒化溶液および／もしくは懸濁液を含んでもよい。そのような粉末化、エアロゾル化、および／またはエアロゾル化製剤は、分散されるとき、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均粒径および／または液滴径を有し得、本明細書に記載の任意のさらなる成分のうちの１つ以上をさらに含んでもよい。
眼内投与
医薬組成物は、眼内投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ／または販売されてもよい。そのような製剤は、例えば、水性または油性液体賦形剤中に、例えば、０．１／１．０ｗ／ｗ％の活性成分の溶液および／または懸濁液を含む、点眼の形態にあってもよい。そのような液滴は、緩衝剤、塩、および／または本明細書に記載の任意のさらなる成分のうちのもう１つ以上をさらに含んでもよい。有用である他の眼内投与可能な製剤には、微小結晶形態でおよび／またはリポソーム調製物中に活性成分を含むものが含まれる。点耳および／または点眼は、本発明の範囲内にあるものとして企図される。
ペイロード投与：検出可能な薬剤および治療剤
本明細書に記載のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、物質（「ペイロード」）の生体標的への送達、例えば、標的の検出のための検出可能な物質の送達、または治療剤の送達が所望される、いくつかの異なるシナリオにおいて使用することができる。検出方法には、インビトロ画像法およびインビボ画像法の両方、例えば、免疫組織化学、生物発光画像法（ＢＬＩ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、電子顕微鏡法、Ｘ線コンピュータ断層撮影法、ラマン画像法、光干渉断層撮影法、吸収画像法、熱画像法、蛍光反射画像法、蛍光顕微鏡法、蛍光分子トモグラフィー画像法、核磁気共鳴画像法、Ｘ線画像法、超音波画像法、光音響画像法、研究室アッセイ、またはタギング／染色／画像法が必要とされる任意の状況における方法が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０８４４】
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡは、任意の有用な定位でリンカーおよびペイロードの両方を含むように設計することができる。例えば、２つの末端を有するリンカーを用いて、デアザ−アデノシンもしくはデアザ−グアノシンのＣ−７もしくはＣ−８位において、またはシトシンもしくはウラシルのＮ−３もしくはＣ−５位に等、一方の末端がペイロードに、および他方の末端が核酸塩基に結合される。本発明のポリヌクレオチドは、１つを超えるペイロード（例えば、標識および転写阻害剤）、ならびに切断可能リンカーを含むことができる。
【０８４５】
一実施形態において、修飾ヌクレオチドは、切断可能リンカーの一方の末端が７−デアザ−アデニンのＣ７位に結合され、リンカーの他方の末端が阻害剤（例えば、シチジン上の核酸塩基のＣ５位）に結合され、標識（例えば、Ｃｙ５）がリンカーの中心に結合される、修飾７−デアザ−アデノシン三リン酸塩である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，９９４，３０４号の図５におけるＡ＊ｐＣｐ  Ｃ５  Ｐａｒｇ  Ｃａｐｌｅｓｓの化合物１ならびに第９および１０欄を参照のこと）。修飾７−デアザ−アデノシン三リン酸塩がコード領域へと組み込まれると、結果として生じる切断可能リンカーを有するポリヌクレオチドは、標識および阻害剤（例えば、ポリメラーゼ阻害剤）に結合される。リンカーが切断されると（例えば、切断可能ジスルフィド部分を有するリンカーを還元するための還元条件により）、標識および阻害剤が放出される。さらなるリンカーおよびペイロード（例えば、治療剤、検出可能な標識、および細胞透過性ペイロード）が本明細書に記載される。
【０８４６】
例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を再プログラミングするのに使用することができ、それによりクラスター中の総細胞と比較して、トランスフェクトされる細胞を直接追跡することができる。別の例において、リンカーを介して修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸に結合され得、また蛍光標識され得る薬物を用いて、薬物をインビボで、例えば、細胞内で追跡することができる。他の例としては、細胞内への可逆的な薬物送達におけるポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８４７】
本明細書に記載のポリヌクレオチド、修飾修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ，またはリボ核酸は、ペイロード、例えば、検出可能な薬剤または治療剤の、特定の細胞小器官への細胞内標的化において使用することができる。例示の細胞内標的には、高度なｍＲＮＡプロセシングのための核局在化、または阻害剤を含有するｍＲＮＡに連結された核局在化配列（ＮＬＳ）が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０８４８】
さらに、本明細書に記載のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を用いて、例えば、生存動物において、治療剤を細胞または組織に送達することができる。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を用いて、癌細胞を死滅させるために高極性化学療法剤を送達することができる。リンカーを介して治療剤に結合されるポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、部材の透過を容易にすることにより、治療剤が細胞内に移動して細胞内標的に到達することを可能にし得る。
【０８４９】
別の例において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、切断可能リンカーを介してポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸ウイルス阻害性ペプチド（ＶＩＰ）に結合され得る。切断可能リンカーは、ＶＩＰおよび色素を細胞内に放出することができる。別の例において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、リンカーを介して、コレラ毒素、ジフテリア毒素、および百日咳毒素等のいくつかの細菌毒素の作用に関与する、ＡＤＰ−リボシレートに結合され得る。これらの毒素タンパク質は、ヒト細胞において標的タンパク質を修飾するＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼである。例えば、コレラ毒素ＡＤＰ−リボシレートＧタンパク質は、致命的な下痢をもたらす、小腸の内壁からの大量の体液分泌を引き起こすことによって、ヒト細胞を変性させる。
【０８５０】
いくつかの実施形態において、ペイロードは、細胞毒、放射性イオン、化学療法剤、または他の治療剤等の治療剤であってもよい。細胞毒または細胞傷害性薬剤には、細胞に有害であり得るいずれの薬剤も含まれる。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎｅ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、マイタンシノイド、例えば、マイタンシノール（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２０８，０２０号）、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５、すべてが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、および同第５，８４６，５４５号を参照のこと）、ならびにこれらの類似体または相同体が挙げられるが、これらに限定されない。放射性イオンには、ヨウ素（例えば、ヨウ素１２５またはヨウ素１３１）、ストロンチウム８９、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、リン酸塩、コバルト、イットリウム９０、サマリウム１５３、およびプラセオジミウムが含まれるが、これらに限定されない。他の治療剤には、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（かつてはダウノマイシン）およびｄオキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（かつてはアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、およびマイタンシノイド）が含まれるが、これらに限定されない。
【０８５１】
いくつかの実施形態において、ペイロードは、種々の有機小分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素もしくは酵素基質、蛍光物質、発光物質（例えば、ルミノール）、生物発光物質（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびイクオリン）、化学発光物質、放射性物質（例えば、１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、またはｒ９９ｍＴｃ（例えば、過テクネチウム酸塩（テクネチウム酸塩（ＶＩＩ）、ＴｃＯ４−として）、および造影剤（例えば、金（例えば、金ナノ粒子）、ガドリニウム（例えば、キレート化Ｇｄ）、酸化鉄（例えば、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、単結晶酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）、および極小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ）、マンガンキレート（例えば、Ｍｎ−ＤＰＤＰ）、硫酸バリウム、ヨード系造影剤媒体（イオヘキソール（Ｉｏｈｅｘｏｌ））、微小気泡、またはペルフルオロ炭素）等の検出可能な薬剤であり得る。そのような光検出可能な標識には、例えば、制限なく、４−アセトアミド−４’−イソチオシアン酸スチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体（例えば、アクリジンおよびアクリジンイソチオシアネート）；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホン酸塩；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体（例えば、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、および７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）；シアニン色素；シアノシン；４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５”−ジブロモピロガロール−スルホナフタレン（ｎａｐｈｔｈａｌｅｉｎ）（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアン酸フェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸塩；４，４’−ジイソチオシアン酸ジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアン酸スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］−ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体（例えば、エオシンおよびエオシンイソチオシアネート）；エリスロシンおよび誘導体（例えば、エリスロシンＢおよびエリスロシンイソチオシアネート）；エチジウム；フルオロセインおよび誘導体（例えば、５−カルボキシフルオロセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオロセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオロセイン、フルオロセイン、フルオロセインイソチオシアネート、Ｘ−ローダミン−５−（および−６）−イソチオシアネート（ＱＦＩＴＣまたはＸＲＩＴＣ）、およびフルオレスカミン）；２−［２−［３−［［１，３−ジヒドロ−１，１−ジメチル−３−（３−スルホプロピル）−２Ｈ−ベンズ［ｅ］インドール−２−イリデン］エチリデン］−２−［４−（エトキシカルボニル）−１−ピペラジニル］−１−シクロペンテン−１−イル］エテニル］−１，１−ジメチル−３−（３−スルホプロピル（ｓｕｌｆｏｒｐｒｏｐｙｌ））−１Ｈ−ベンズ［ｅ］インドリウム水酸化物、分子内塩、ｎ，ｎ−ジエチルエタンアミン（１：１）（ＩＲ１４４）との化合物；５−クロロ−２−［２−［３−［（５−クロロ−３−エチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾール−イリデン）エチリデン］−２−（ジフェニルアミノ）−１−シクロペンテン−１−イル］エテニル］−３−エチルベンゾチアゾリウム過塩素酸塩（ＩＲ１４０）；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体（例えば、ピレン、酪酸ピレン、およびスクシンイミジル１−ピレン）；酪酸塩量子ドット；リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；ローダミンおよび誘導体（例えば、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（ｒｈｏｄａｒｎｉｎｅ）（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）テトラメチルローダミン、およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；シアニン−３（Ｃｙ３）；シアニン−５（Ｃｙ５）；シアニン−５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン−７（Ｃｙ７）；ＩＲＤ  ７００；ＩＲＤ  ８００；Ａｌｅｘａ  ６４７；Ｌａ  Ｊｏｌｔａ  Ｂｌｕｅ；フタロシアニン；ならびにナフタロシアニンが含まれる。
【０８５２】
いくつかの実施形態において、検出可能な薬剤は、活性化されると検出可能となる、検出不可能な前駆体（例えば、蛍光発生テトラジン−フルオロフォア構築物（例えば、テトラジン−ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、テトラジン−オレゴングリーン４８８、またはテトラジン−ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ）、または酵素により活性化可能な蛍光発生剤（例えば、ＰＲＯＳＥＮＳＥ（登録商標）（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ））であってもよい。酵素標識組成物が使用され得るインビトロアッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光法、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、およびウエスタンブロット分析が含まれるが、これらに限定されない。
【０８５３】
組み合わせ
修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、１つ以上の他の治療剤、予防剤、診断剤、または撮像剤と組み合わせて使用されてもよい。「と組み合わせて」とは、薬剤が同時に投与されるかつ／または一緒に送達するために製剤化される必要があることを暗示するようには意図さないが、これらの送達方法は、本開示の範囲内にある。組成物は、１つ以上の他の所望の治療薬または医療処置と並行して、その前に、またはその後に投与することができる。一般に、各薬剤は、その薬剤のために決定された用量でおよび／または時間スケジュールに基づいて投与されるであろう。いくつかの実施形態において、本開示は、薬学的、予防的、診断的、または撮像組成物を、それらの生体利用能を改善し、それらの代謝を低減および／もしくは修飾し、それらの排泄を阻害し、かつ／またはそれらの体内分布を修飾し得る薬剤と組み合わせて、送達することを包含する。非限定的な例として、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、癌の治療のためまたは過剰増殖性細胞を制御するための医薬品と組み合わせて使用されてもよい。参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，９６４，５７１号において、リポポリマーとともにインターロイキン−１２をコードするＤＮＡプラスミドを含む医薬組成物を使用し、また少なくとも１つの抗癌剤または化学療法剤を投与する、原発性または転移性固形腫瘍の治療のための併用療法が記載される。さらに、抗増殖性分子をコードする本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、リポポリマーとともに医薬組成物中にあってもよい（例えば、抗増殖性分子をコードするＤＮＡプラスミドおよびリポポリマーを含む医薬組成物を特許請求する、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１１０２１８２３１号を参照のこと）、それは少なくとも１つの化学療法剤または抗癌剤とともに投与され得る。
ペイロード投与：細胞透過性ペイロード
いくつかの実施形態において、例えば、ＲＮＡまたはｍＲＮＡといった核酸中に組み込まれる、ポリヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸分子はまた、組成物の細胞内送達を促進する細胞透過性部分または薬剤であり得るペイロードも含む。例えば、組成物は、限定されないが、細胞内空間への送達を容易にする細胞透過性ペプチド配列、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、透過因子（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｓ）、輸送因子（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎｓ）、またはｈＣＴ由来細胞透過ペプチドを含むことができる。例えば、Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．３（３）：３１０−８；Ｌａｎｇｅｌ，Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬ  ２００２）；Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．１１（２８）：３５９７−６１１；およびＤｅｓｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ６２（１６）：１８３９−４９を参照のこと；これら各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。組成物はまた、細胞内空間への組成物の送達を促進する、例えばリポソーム等の細胞透過剤を含むように処方することができる。
ペイロード投与：生物学的標的
例えば、ＲＮＡまたはｍＲＮＡといった核酸に組み込まれる、本明細書に記載の修飾ヌクレオチドおよび修飾核酸分子を使用して、任意の生物学的標的へペイロードを送達することができ、これに対して特定のリガンドが存在するか、またはそれを作成することができる。リガンドは生物学的標的に共有結合または非共有結合のいずれかで結合することができる。
【０８５４】
生物学的標的の例として、限定されないが、生体高分子、例えば、抗体、ＲＮＡおよびＤＮＡなどの核酸、タンパク質、酵素が挙げられる。タンパク質の例として、限定されないが、酵素、受容体、およびイオンチャネルが挙げられる。いくつかの実施形態において、標的は、組織特異的または細胞型特異的マーカーであってもよく、例えば、選択された組織または細胞型に特異的に発現するタンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、標的は、限定されないが、原形質膜受容体および各受容体等の受容体であり得る。より特定の例として、限定されないが、Ｇタンパク質共役型受容体、細胞ポアタンパク質、輸送タンパク質、表面発現抗体、ＨＬＡタンパク質、ＭＨＣタンパク質、および増殖因子受容体が挙げられる。
投薬
本発明は、本発明に従う修飾ｍＲＮＡおよびそれらのコードされたタンパク質または複合体をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。核酸、タンパク質、もしくは複合体、またはその薬学的、画像化、診断的、もしくは予防的組成物は、疾患、障害、および／または状態（例えば、記憶障害の取り組みに関連した疾患、障害、および／または状態）の予防、治療、診断、または画像化に有効な任意の量および任意の投与経路を用いて対象に投与することができる。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与方法、その活性方法等に応じて、対象によって異なる。本発明に従う組成物は、投与を容易にし、かつ投薬量を均一にするために、典型的には、単位剤形で製剤化される。しかしながら、本発明の組成物の総１日使用量は、適切な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されてもよいことが理解される。任意の特定の患者の特定の治療上有効、予防上有効、または適切な画像化用量レベルは、治療される障害および障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および食生活；投与時間、投与経路、および用いられる特定の化合物の排泄速度；治療の持続期間；用いられる特定の化合物と組み合わせて、またはそれと同時に使用される薬物；医学分野で周知の要素等を含む様々な要素に依存する。
【０８５５】
ある特定の実施形態において、本発明に従う組成物は、所望の治療的、診断的、予防的、または画像効果を得るために、１日当たり約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）を１日１回以上送達するのに十分な投薬量レベルで投与され得る。所望の投薬量は、１日３回、１日２回、１日１回、１日おきに、２日おきに、週１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回送達されてもよい。ある特定の実施形態において、所望の投薬量は、複数回の投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回以上の投与）によって送達されてもよい。
【０８５６】
本発明に従って、分割用量レジメンでの修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の投与が哺乳類対象においてより高いレベルのタンパク質を産生することが見出されている。本明細書で使用されるとき、「分割用量」とは、単回単位用量または総１日用量の２つ以上の用量、例えば、単回単位用量の２回以上の投与への分割である。本明細書で使用されるとき、「単回単位用量」とは、１回用量で／一度に／単一経路で／単一接触点で、すなわち、単回投与事象で投与される任意の治療薬の用量である。本明細書で使用されるとき、「総１日用量」は、２４時間内に所与または処方される量である。これは、単回単位用量として投与されてもよい。一実施形態において、本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、分割用量で対象に投与される。修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、緩衝液のみまたは本明細書に記載の製剤中で製剤化されてもよい。
剤形
本明細書に記載の医薬組成物は、局所、鼻腔内、気管内、または注入用（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、心臓内、腹腔内、皮下）等の本明細書に記載の剤形に製剤化され得る。
液体剤形
非経口投与用の液体剤形には、薬剤的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および／またはエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（具体的には、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含むが、これらに限定されない当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。非経口投与についてのある特定の実施形態において、組成物は、可溶化剤、例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、修飾油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはこれらの組み合わせと混合されてもよい。
注入物
注入用調製物、例えば、滅菌注入用水性または油性懸濁液は、既知の技術に従って製剤化されてもよく、好適な分散化剤、湿潤剤、および／または懸濁化剤を含んでもよい。滅菌注入用調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤および／または溶媒、例えば、１，３−ブタンジオール溶液中の滅菌注入用溶液、懸濁液、および／またはエマルションであり得る。用いられ得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張性塩化ナトリウム溶液が含まれるが、これらに限定されない。無刺激固定油が溶媒または懸濁化媒体として慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激固定油が用いられ得る。オレイン酸等の脂肪酸が注入物の調製において使用され得る。
【０８５７】
注入用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、かつ／または使用前に滅菌剤を滅菌水または他の滅菌注入用媒体中に溶解もしくは分散され得る滅菌固体組成物の形態で組み込むことによって滅菌され得る。
【０８５８】
長活性成分の効果を長引かせるために、皮下または筋肉内注入からの活性成分の吸収を遅延させることが所望され得る。これは、水への溶解度が低い結晶質または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって遂行されてもよい。その後、修飾ｍＲＮＡの吸収速度は、その溶解速度に依存し、次いで、結晶の大きさおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口的に投与された修飾ｍＲＮＡの遅延吸収は、修飾ｍＲＮＡを油ビヒクル中に溶解または懸濁させることによって遂行され得る。注入用デポー形態は、修飾ｍＲＮＡのマイクロカプセルマトリックスを、ポリラクチド−ポリグリコリド等の生分解性ポリマー中に形成することによって作製される。修飾ｍＲＮＡとポリマーとの比率、および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、修飾ｍＲＮＡの放出速度を調節することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられるが、これらに限定されない。デポー注入用製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡを、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション中に封入することによって調製されてもよい。
肺
肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、医薬組成物の鼻腔内送達にも使用され得る。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、約０．２μｍ〜５００μｍの平均粒子を有する粗粉であってもよい。そのような製剤は、鼻からの吸入が行われる様態で、すなわち鼻に近接して保持された粉末の容器からの鼻孔を通じた急速な吸入によって投与されてもよい。
【０８５９】
経鼻投与に好適な製剤は、例えば、最少約０．１ｗ／ｗ％〜最大１００ｗ／ｗ％の活性成分を含んでもよく、本明細書に記載のさらなる成分のうちの１つ以上を含んでもよい。医薬組成物は、頬側投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ／または販売されてもよい。そのような製剤は、例えば、従来の方法を用いて作製される錠剤および／またはロゼンジの形態であってもよく、例えば、約０．１ｗ／ｗ％〜２０ｗ／ｗ％の活性成分を含有してもよく、この平衡物は、経口溶解性および／または分解性組成物と、任意に、本明細書に記載のさらなる成分のうちの１つ以上とを含んでもよい。代わりに、頬側投与に好適な製剤は、活性成分を含む、粉末ならびに／またはエアロゾル化および／もしくは微粒化溶液および／もしくは懸濁液を含んでもよい。そのような粉末化、エアロゾル化、および／またはエアロゾル化製剤は、分散されるとき、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均粒径および／または液滴径を有し得、本明細書に記載の任意のさらなる成分のうちの１つ以上をさらに含んでもよい。
【０８６０】
医薬品の製剤および／または製造における一般の考慮事項は、例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ２１ｓｔｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５において見出され得る。
コーティング剤またはシェル
錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤、および顆粒の固体剤形を、コーティング剤およびシェル、例えば、腸溶性コーティング剤および医薬品製剤化分野で周知の他のコーティング剤で調製することができる。それらは、任意に、乳白剤を含んでもよく、それらが、腸管のある特定の部分において、任意に、遅延様式で、活性成分（複数可）のみを放出するか、またはそれを優先的に放出する組成物であり得る。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。同様の種類の固体組成物は、そのような賦形剤をラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコール等として使用した軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いてもよい。
キット
本発明は、好都合におよび／または効果的に本発明の方法を行うための多様なキットを提供する。典型的には、キットは、使用者が対象の（複数可）複数の治療を実施する、および／または複数の実験を実施することを可能にするのに十分な量および／または数の構成成分を含む。
【０８６１】
一態様において、本発明は、翻訳可能領域を含む第１の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を含む、タンパク質産生のためキットを提供する。キットは、製剤組成物を形成するための包装および説明書ならびに／または送達剤をさらに含んでもよい。送達剤は、本明細書で開示される食塩水、緩衝液、リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）、または任意の送達剤を含んでもよい。
【０８６２】
一実施形態において、緩衝液には、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸塩、および／またはＥＤＴＡが含まれてもよい。別の実施形態において、緩衝液は、食塩水、２ｍＭカルシウムを含有する食塩水、５％ショ糖、２ｍＭカルシウムを含有する５％ショ糖、５％マンニトール、２ｍＭカルシウムを含有する５％マンニトール、Ｒｉｎｇｅｒの乳酸塩、塩化ナトリウム、２ｍＭカルシウムを含有する塩化ナトリウムを含み得るが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、緩衝液は沈殿されてもよく、または凍結乾燥されてもよい。各構成成分の量は、一貫した、再現性のある高濃度食塩水または単純緩衝製剤を可能にするように変更され得る。構成成分は、一定期間にわたって、および／または多様な条件下での緩衝液中における修飾ＲＮＡの安定性を増加させるようにも変更され得る。
【０８６３】
一態様において、本発明は、標的細胞内に導入されるとき、所望の量の翻訳可能領域によってコードされるタンパク質を産生するのに有効な量で提供される、翻訳可能領域を含む修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸と、細胞の自然免疫応答を実質的に阻害するのに有効な量で提供される、阻害性核酸を含む第２の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸と、包装および説明書と、を含む、タンパク質産生のためのキットを提供する。
【０８６４】
一態様において、本発明は、核酸が細胞ヌクレアーゼによる低減された分解を示す、翻訳可能領域を含む修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸と、包装および説明書と、を含む、タンパク質産生のためのキットを提供する。
【０８６５】
一態様において、本発明は、その核酸が細胞ヌクレアーゼによる低減された分解を示す、翻訳可能領域を含む修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸と、第１の核酸の翻訳可能領域の翻訳に適した哺乳類細胞と、を含む、タンパク質産生のためのキットを提供する。
デバイス
本発明は、目的とするポリペプチドをコードする修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を組み込み得るデバイスを提供する。これらのデバイスは、安定した製剤中に、ヒト患者等のそれを必要とする対象に即時に送達されることができる製剤中に核酸を合成するための試薬を含有する。そのような目的とするポリペプチドの非限定的な例としては、創傷治癒のための成長因子および／または血管形成刺激因子、感染制御を容易にするためのペプチド抗細菌剤、ならびに新たに確認されたウイルスに対する免疫応答を急速に刺激するための抗原が挙げられる。
【０８６６】
いくつかの実施形態において、デバイスは、自己完結型であり、任意に、生成された修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の合成および／または分析のための指示を得るための無線遠隔通信が可能である。デバイスは、少なくとも１つの修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸、および好ましくは無制限の異なる修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸のモバイル合成が可能である。ある特定の実施形態において、デバイスは、１または少数の個体によって輸送されることができる。他の実施形態において、デバイスは、卓上または机に合うように調整される。他の実施形態において、デバイスは、スーツケース、バックパック、または同様の大きさの対象に収まるように調整される。別の実施形態において、デバイスは、ポイントオブケアまたは手持ち式デバイスであってもよい。さらなる実施形態において、デバイスは、乗用車、運搬車、もしくは救急車等の自動車、または戦車もしくは兵員輸送車等の軍用車両に収まるように調整される。目的とするポリペプチドをコードするリボ核酸生成するために必要な情報は、デバイスに存在するコンピュータ可読媒体内に存在する。
【０８６７】
一実施形態において、デバイスは、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の形態で投与されたタンパク質のレベルを評価するために使用され得る。デバイスは、血液、尿、または他の生物流体（ｂｉｏｆｌｕｉｄｉｃ）検査を含んでもよい。
【０８６８】
いくつかの実施形態において、デバイスは、核酸およびポリペプチド配列のデータベースを用いて通信（例えば、無線通信）が可能である。デバイスは、１つ以上の試料容器を挿入するための少なくとも１つの試料ブロックを含む。そのような試料容器は、テンプレートＤＮＡ、ヌクレオチド、酵素、緩衝剤、および他の試薬等の任意の数の材料の液体または他の形態を受け入れることが可能である。試料容器は、試料ブロックとの接触によって加熱または冷却されることも可能である。試料ブロックは、一般的に、少なくとも１つの試料ブロックのための１つ以上の電子制御装置を有するデバイス基部と通信している。試料ブロックは、好ましくは、試料容器およびその構成要素を約−２０℃〜＋１００℃を超える温度に加熱および／または冷却することができるような加熱モジュールである、加熱モジュールを含む。デバイス基部は、電池または外部電圧源等の電圧源と通信している。デバイスは、ＲＮＡ合成のための材料を貯蔵および分配するための手段も含む。
【０８６９】
任意に、試料ブロックは、合成された核酸を分離するためのモジュールを含む。あるいは、デバイスは、試料ブロックに作動可能に連結される分離モジュールを含む。好ましくは、デバイスは、合成された核酸を分析するための手段を含む。そのような分析には、配列同一性（ハイブリダイゼーション等によって実証される）、望ましくない配列の不在、合成されたｍＲＮＡの完全性の測定（分光光度法と組み合わせた微小流体粘度測定によるもの等）、ならびに修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸の濃度および／または効力（分光光度法によるもの等）が挙げられる。
【０８７０】
ある特定の実施形態において、デバイスは、対象から得られた生物材料中に存在する病原体の検出のための手段、例えば、微生物同定用のＩＢＩＳ  ＰＬＥＸ−ＩＤシステム（Ａｂｂｏｔｔ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）と組み合わせられる。
【０８７１】
本明細書に記載の医薬組成物を皮内送達する際に用いるのに適したデバイスには、米国特許第４，８８６，４９９号、同第５，１９０，５２１号、同第５，３２８，４８３号、同第５，５２７，２８８号、同第４，２７０，５３７号、同第５，０１５，２３５号、同第５，１４１，４９６号、および同第５，４１７，６６２号に記載のデバイス等の短針デバイスが挙げられる。皮内組成物は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／３４８５０号に記載のデバイスおよびその機能的等価物等の皮膚の中への針の有効な貫通長さを制限するデバイスによって投与され得る。液体ジェット式注入器を介して、および／または角質層に穴を開ける針を介して、液体組成物を真皮に送達し、真皮に到達するジェットを生じるジェット式注入デバイスが好適である。ジェット式注入デバイスは、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号、同第５，５９９，３０２号、同第５，３３４，１４４号、同第５，９９３，４１２号、同第５，６４９，９１２号、同第５，５６９，１８９号、同第５，７０４，９１１号、同第５，３８３，８５１号、同第５，８９３，３９７号、同第５，４６６，２２０号、同第５，３３９，１６３号、同第５，３１２，３３５号、同第５，５０３，６２７号、同第５，０６４，４１３号、同第５，５２０，６３９号、同第４，５９６，５５６号、同第４，７９０，８２４号、同第４，９４１，８８０号、同第４，９４０，４６０号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９７／３７７０５号および同第ＷＯ９７／１３５３７号に記載されている。圧縮ガスを用いて、粉末形態にあるワクチンを加速させ、皮膚の外層を通して真皮に到達させる弾道粉末／粒子送達デバイスが、好適である。
【０８７２】
あるいは、またはさらに、従来のシリンジを皮内投与の古典的なマントゥー法で用いることができる。
いくつかの実施形態において、デバイスは、ポンプであってもよく、または血液脳関門を横断する本発明の化合物または組成物の投与用のカテーテルを含む。そのようなデバイスには、加圧嗅覚送達デバイス、イオン泳動デバイス、多層微小流体デバイス等が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなデバイスは、携帯型または固定型であってもよい。それらは、身体に埋め込み可能であるか、または身体に外的に係留されるか、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【０８７３】
投与用デバイスを用いて、本発明で教示される単回、複数回、または分割投薬レジメンに従って、本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を送達してもよい。そのようなデバイスは、以下に記載される。
【０８７４】
細胞、器官、および組織への複数回投与のための当技術分野で既知の方法およびデバイスは、本発明の実施形態として本明細書で開示される方法および組成物とともに使用されることが企図される。これらには、例えば、複数の針、例えば、ルーメンまたはカテーテルを用いるハイブリッドデバイスならびに熱、電流、または放射線駆動機構を利用するデバイスを有する方法およびデバイスが挙げられる。
【０８７５】
本発明に従って、これらの複数回投与デバイスを利用して、本明細書で企図される単回用量、複数回用量、または分割された用量が送達されてもよい。
治療剤を固体組織に送達するための方法は、Ｂａｈｒａｍｉらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２０１１０２３０８３９号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｂａｈｒａｍｉによると、一連の針はデバイス内に組み込まれ、各針の長さに沿ってその固体組織内の任意の箇所で実質的に同量の流体を送達する。
【０８７６】
生物組織を横断して生物材料を送達するためのデバイスは、Ｋｏｄｇｕｌｅらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２０１１０１７２６１０号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｋｏｄｇｕｌｅによると、１つ以上の金属から作製され、かつ約２００ミクロン〜約３５０ミクロンの外径および少なくとも１００ミクロンの長さを有する複数の中空型マイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸分子、脂質、および他の薬剤的に有効な成分またはそれらの組み合わせを送達する。
【０８７７】
治療剤の組織への送達のための送達プローブは、Ｇｕｎｄａｙらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２０１１０２７０１８４号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｇｕｎｄａｙによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、デバイスは、付加されたカプセルを作動位置と非作動位置との間で移動させ、その針を通してカプセルの外に薬剤を出させる。
【０８７８】
複数回注入医療器具が、Ａｓｓａｆによって説明されており、例えば、米国特許公開第２０１１０２１８４９７号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ａｓｓａｆによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、デバイスは、その針のうちの１つ以上に接続するチャンバと、各注入の後、連続的にそのチャンバに医療用流体を補充する手段と、を有する。
【０８７９】
一実施形態において、修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸は、少なくとも３つの針を介して皮下にまたは筋肉内に、同時または６０分以内に３つの異なる、任意に隣接した部位へ投与される（例えば、同時または６０以内に４、５、６、７、８、９、または１０個の部位への投与）。分割された用量は、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１１０２３０８３９号および同第２０１１０２１８４９７号に記載のデバイスを用いて、同時に隣接した組織に投与され得る。
【０８８０】
物質を患者の身体に注入するための少なくとも部分的に埋め込み可能なシステム、具体的には陰茎勃起刺激システムが、Ｆｏｒｓｅｌｌによって説明されており、例えば、米国特許公開第２０１１０１９６１９８号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｆｏｒｓｅｌｌによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、デバイスは、患者の左および右の陰核海綿体に隣接する１つ以上の筐体とともに埋め込まれる。また、針を通して薬物を供給するためにリザーバおよびポンプも埋め込まれる。
【０８８１】
治療的有効量の鉄分の経皮送達のための方法が、Ｂｅｒｅｎｓｏｎによって説明されており、例えば、米国特許公開第２０１００１３０９１０号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｂｅｒｅｎｓｏｎによると、複数の針を用いて、イオン泳動パッチ上のイオン性鉄分の経皮送達を強化するために角質層内に複数のマイクロチャネルを作製することができる。
【０８８２】
生物組織を横断する生物材料の送達のための方法が、Ｋｏｄｇｕｌｅらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２０１１０１９６３０８号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｋｏｄｇｕｌｅによると、治療的活性成分を含む複数の生分解性マイクロニードルがデバイスに組み込まれ、タンパク質、炭水化物、核酸分子、脂質、および他の薬学的活性成分、またはそれらの組み合わせを送達する。
【０８８３】
ボツリヌス毒素組成物を含む経皮パッチが、Ｄｏｎｏｖａｎによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００８０２２００２０号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｄｏｎｏｖａｎによると、複数の針がパッチ内に組み込まれ、血液を破裂させることなく、皮膚の角質層を通して突出するその針を通してボツリヌス毒素を角質層下に送達する。
【０８８４】
およそ０．２〜１５ｍＬの液体製剤を保持することができる小さい使い捨ての薬物リザーバ、またはパッチポンプを皮膚上に配置し、製剤を細い針（例えば、２６〜３４ゲージ）を用いて連続的に皮下に送達することができる。非限定的な例として、パッチポンプは、３０〜３４ゲージ針を有するばね式の５０ｍｍ×７６ｍｍ×２０ｍｍ（ＢＤ（商標），Ｍｉｃｒｏｉｎｆｕｓｅｒ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）、インスリン等の薬物送達に使用される２ｍＬリザーバを有する４１ｍｍ×６２ｍｍ×１７ｍｍ（ＯＭＮＩＰＯＤ（登録商標），Ｉｎｓｕｌｅｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ベドフォード）、または０．５〜１０ｍＬリザーバを有する４３〜６０ｍｍ直径、１０ｍｍ厚（ＰＡＴＣＨＰＵＭＰ（登録商標），ＳｔｅａｄｙＭｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、カリフォルニア州サンフランシスコ）であってもよい。さらに、パッチポンプは、電池式および／または充電式であり得る。
【０８８５】
低温治療の箇所への活性剤の投与用の凍結探針が、Ｔｏｕｂｉａによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００８０１４００６１号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｔｏｕｂｉａによると、複数の針がプローブ内に組み込まれ、プローブは、チャンバ内への活性剤を受容し、薬剤を組織に投与する。
【０８８６】
炎症を治療するか、もしくは予防し、または健常な関節を促進するための方法が、Ｓｔｏｃｋらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００９０１５５１８６号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｓｔｏｃｋによると、複数の針がデバイスに組み込まれ、シグナル伝達調節因子化合物を含有する組成物を投与する。
【０８８７】
多部位注入システムが、Ｋｉｍｍｅｌｌらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２０１００２５６５９４号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｋｉｍｍｅｌｌによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、その針を通して薬物を角質層内に送達する。
【０８８８】
インターフェロンを皮内区画に送達するための方法が、Ｄｅｋｋｅｒらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００５０１８１０３３号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｄｅｋｋｅｒによると、０〜１ｍｍの露出された高さを持つ放出口を有する複数の針がデバイス内に組み込まれ、それが０．３ｍｍ〜２ｍｍの深さで物質を送達することによって、薬物動態およびバイオアベイラビリティを改善する。
【０８８９】
遺伝子、酵素、および生物薬剤を組織細胞に送達するための方法が、Ｄｅｓａｉによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００３００７３９０８号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｄｅｓａｉによると、複数の針が体内に挿入されるデバイス内に組み込まれ、その針を通して薬物流体を送達する。
【０８９０】
線維芽細胞を用いて不整脈を治療するための方法が、Ｌｅｅらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００４０００５２９５号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｌｅｅによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、線維芽細胞を組織の局所的領域に送達する。
【０８９１】
磁力制御されたポンプ使用して脳腫瘍を治療するための方法が、Ｓｈａｃｈａｒらによって説明されており、例えば、米国特許第７，７９９，０１２号（方法）および同第７，７９９，０１６号（デバイス）に教示され、それらの内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｓｈａｃｈａｒによると、複数の針がポンプに組み込まれ、ポンプは、制御された速度でその針を通して薬物治療剤を押す。
【０８９２】
雌哺乳類における膀胱の機能的障害を治療する方法が、Ｖｅｒｓｉらによって説明されており、例えば、米国特許第８，０２９，４９６号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｖｅｒｓｉによると、一連のマイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、その針を通して直接膀胱の膀胱三角部内に治療剤を送達する。
【０８９３】
マイクロニードル経皮輸送デバイスが、Ａｎｇｅｌらによって説明されており、例えば、米国特許第７，３６４，５６８号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ａｎｇｅｌによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、デバイスは、異なる方向から表面内に挿入されるその針を通して物質を体表内に輸送する。マイクロそのニードル経皮輸送デバイスは、中実型マイクロニードルシステムまたは中空型マイクロニードルシステムであってもよい。非限定的な例として、中実型マイクロニードルシステムは、薬物で被覆された約１５０〜７００μｍの高さの、ｃｍ２当たり３００〜１５００の中実マイクロニードルを伴う最大０．５ｍｇの容量を有し得る。マイクロニードルは、角質層に透過し、短い持続期間（例えば、２０秒間〜１５分間）、皮膚に残存する。別の例において、中空型マイクロニードルシステムは、最大３ｍＬの容量を有し、およそ９５０μｍの高さであるｃｍ２当たり１５〜２０マイクロニードルを用いて液体製剤を送達する。マイクロニードルは皮膚に透過し、液体製剤がデバイスから皮膚内に流れることを可能にする。中空型マイクロニードルシステムは、製剤体積および粘度に応じて、１〜３０分間で消耗し得る。
【０８９４】
皮下輸注用デバイスが、Ｄａｌｔｏｎらによって説明されており、例えば、米国特許第７，１５０，７２６号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｄａｌｔｏｎによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、その針を通して流体を皮下組織に送達する。
【０８９５】
マイクロカニューレを通したワクチンおよび遺伝子治療剤の皮内送達用デバイスおよび方法が、Ｍｉｋｓｚｔａらによって説明されており、例えば、米国特許第７，４７３，２４７号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｍｉｔｓｚｔａによると、少なくとも１つの中空型マイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、０．０２５ｍｍ〜２ｍｍの深さでワクチンを対象の皮膚に送達する。
【０８９６】
インスリンを送達する方法が、Ｐｅｔｔｉｓらによって説明されており、例えば、米国特許第７，７２２，５９５号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｐｅｔｔｉｓによると、２つの針はデバイス内に組み込まれ、第１の針はインスリンを皮内区画に送達するように２．５ｍｍ未満の深さで、第２の針はインスリンを皮内区画に送達するように２．５ｍｍ超えかつ５．０ｍｍ未満の深さで、両方の針は基本的に同時に皮膚内に挿入される。
【０８９７】
吸引下での皮膚注入送達が、Ｋｏｃｈａｍｂａらによって説明されており、例えば、米国特許第６，８９６，６６６号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｋｏｃｈａｍｂａによると、互いに比較的に隣接した複数の針がデバイス内に組み込まれ、皮膚層の下に流体を注入する。
【０８９８】
皮膚を通して物質を取り除くか、または送達するためのデバイスが、Ｄｏｗｎらによって説明されており、例えば、米国特許第６，６０７，５１３号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｄｏｗｎによると、複数の皮膚透過メンバーがデバイス内に組み込まれ、約１００ミクロンから約２０００ミクロンの長さを有し、約３０〜５０ゲージである。
【０８９９】
物質を皮膚に送達するためのデバイスが、Ｐａｌｍｅｒらによって説明されており、例えば、米国特許第６，５３７，２４２号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｐａｌｍｅｒによると、一連のマイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、その針と皮膚との接触を強化するために引っ張りアセンブリを使用し、物質のより均一な送達をもたらす。
【０９００】
局所薬物送達のための灌流デバイスが、Ｚａｍｏｙｓｋｉによって説明されており、例えば、米国特許第６，４６８，２４７号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｚａｍｏｙｓｋｉによると、複数の皮下針が、皮下注射器が後退するときに皮下注射器の内容物を組織内に注入するデバイス内に組み込まれる。
【０９０１】
マイクロニードルおよびヒト皮膚との間の相互作用を改善することによる組織を横断する薬物および生体分子の増強された輸送のための方法が、Ｐｒａｕｓｎｉｔｚらによって説明されており、例えば、米国特許第６，７４３，２１１号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｐｒａｕｓｎｉｔｚによると、複数のマイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、デバイスは、そこにマイクロニードルが適用される、より強固で、より変形しにくい表面を示すことができる。
【０９０２】
医薬剤の器官内投与のためのデバイスが、Ｔｉｎｇらによって説明されており、例えば、米国特許第６，０７７，２５１号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｔｉｎｇによると、増強投与のための側面開口部を有する複数の針がデバイス内に組み込まれ、デバイスは、その針を針チャンバからおよび針チャンバ中へ伸長および後退することによって医薬剤をリザーバからその針の中へ押し進め、その医薬剤を標的器官に注入する。
【０９０３】
複数の持針器および皮下多重チャネル輸注ポートが、Ｂｒｏｗｎによって説明されており、例えば、米国特許第４，６９５，２７３号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｂｒｏｗｎによると、持針器上の複数の針が輸注ポートの中隔を通して挿入され、その輸注ポート内の単離されたチャンバと連通する。
【０９０４】
二重皮下シリンジが、Ｈｏｒｎによって説明されており、例えば、米国特許第３，５５２，３９４号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｈｏｒｎによると、デバイス内に組み込まれる２つの針が、６８ｍｍ未満の間隔で離間され、異なるスタイルおよび長さであってもよく、このため注入が異なる深さで行われることを可能にする。
【０９０５】
複数の針および複数の流体区画を有するシリンジが、Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇによって説明されており、例えば、米国特許第３，５７２，３３６号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇによると、複数の針が複数の流体区画を有するシリンジ内に組み込まれ、１つの注入に混合することができない相性の悪い薬物を同時に投与することができる。
【０９０６】
流体の皮内の注入のための外科用器具が、Ｅｌｉｓｃｕらによって説明されており、例えば、米国特許第２，５８８，６２３号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｅｌｉｓｃｕによると、複数の針がその器具内に組み込まれ、流体を皮内により幅広い分散で注入する。
【０９０７】
複数の乳房内の乳管への物質の同時送達のための装置が、Ｈｕｎｇによって説明されており、例えば、欧州特許第１８１８０１７号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｈｕｎｇによると、複数のルーメンがデバイス内に組み込まれ、乳管網のオリフィスを通して挿入し、流体を乳管網に送達する。
【０９０８】
心臓または他の器官の組織への薬物の導入のためのカテーテルが、Ｔｋｅｂｕｃｈａｖａによって説明されており、例えば、国際公開第ＷＯ２００６１３８１０９号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｔｋｅｂｕｃｈａｖａによると、平坦な軌道で器官壁に進入する２つの湾曲針が組み込まれる。
【０９０９】
医薬剤を送達するためのデバイスが、Ｍｃｋａｙらによって説明されており、例えば、国際公開第ＷＯ２００６１１８８０４号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｍｃｋａｙによると、各針上に複数のオリフィスを有する複数の針がデバイス内に組み込まれ、脊髄円板の内部円板空間等の組織への局部送達を容易にする。
【０９１０】
哺乳類皮膚内の皮内空間内に免疫調節物質を直接送達するための方法が、Ｐｅｔｔｉｓによって説明されており、例えば、国際公開第ＷＯ２００４０２００１４号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｐｅｔｔｉｓによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、針を通して物質を０．３ｍｍ〜２ｍｍの深さに送達する。
【０９１１】
全身性吸収および改善された薬物動態のための皮膚の少なくとも２つの区画内へ物質を投与するための方法およびデバイスが、Ｐｅｔｔｉｓらによって説明されており、例えば、国際公開第ＷＯ２００３０９４９９５号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｐｅｔｔｉｓによると、約３００μｍ〜約５ｍｍの長さを有する複数の針がデバイス内に組み込まれ、皮内および皮下組織区画へ同時に送達する。
【０９１２】
針およびローラーを有する薬物送達デバイスが、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎらによって説明されており、例えば、国際公開第ＷＯ２０１２００６２５９号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｚｉｍｍｅｒｍａｎによると、ローラー内に位置する複数の中空針がデバイス内に組み込まれ、ローラーが回転すると、針を通してリザーバ内の内容物を送達する。
カテーテルおよび／またはルーメンを利用する方法およびデバイス
カテーテルおよびルーメンを使用する方法およびデバイスを用いて、単回、複数回、または分割された投薬スケジュールにおいて本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を投与することができる。そのような方法およびデバイスを、以下に記載する。
【０９１３】
骨格筋芽細胞から損傷された心臓の心筋へのカテーテルベースの送達が、Ｊａｃｏｂｙらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００６０２６３３３８号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｊａｃｏｂｙによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、その少なくとも一部が血管内に挿入され、針を通して細胞組成物を対象の心臓の局所領域に送達する。
【０９１４】
神経毒素を用いて喘息を治療するための装置が、Ｄｅｅｍらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００６０２２５７４２号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｄｅｅｍによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、その針を通して神経毒素を気管支組織内に送達する。
【０９１５】
複数成分療法を施すための方法が、Ｎａｙａｋによって説明されており、例えば、米国特許第７，６９９，８０３号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｎａｙａｋによると、複数の注入カニューレがデバイス内に組み込まれてもよく、深さを制御するための深度スロットが含まれてもよく、治療用物質はそこで組織内に送達される。
【０９１６】
チャネルを切断し、少なくとも１つの治療剤を組織の所望の領域内に送達するための外科用デバイスが、ＭｃＩｎｔｙｒｅらによって説明されており、例えば、米国特許第８，０１２，０９６号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＭｃＩｎｔｙｒｅによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、これはチャネルを取り囲む組織の領域内に治療剤を分注し、特に経心筋血行再建手術によく適している。
【０９１７】
雌哺乳類における膀胱の機能的障害を治療する方法が、Ｖｅｒｓｉらによって説明されており、例えば、米国特許第８，０２９，４９６号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｖｅｒｓｉによると、一連のマイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、その針を通して直接膀胱の膀胱三角部内に治療剤を送達する。
【０９１８】
流体を柔軟な生体バリアーに送達するためのデバイスおよび方法が、Ｙｅｓｈｕｒｕｎらによって説明されており、例えば、米国特許第７，９９８，１１９号（デバイス）および同第８，００７，４６６（方法）号に教示され、それらの内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｙｅｓｈｕｒｕｎによると、デバイス上のマイクロニードルが柔軟な生体バリアーに透過および伸長し、流体は中空型マイクロニードルの孔を通して注入される。
【０９１９】
心外膜表面を有し、心外膜を有する心臓の組織の領域に物質を介して注入するための、胴体内に配置される方法が、Ｂｏｎｎｅｒらによって説明されており、例えば、米国特許第７，６２８，７８０号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｂｏｎｎｅｒによると、デバイスは、針を組織内に操縦し、その針を通して医薬剤を組織内に注入するための細長いシャフトおよび遠位注入ヘッドを有する。
【０９２０】
穿刺創を密封するためのデバイスが、Ｎｉｅｌｓｅｎらによって説明されており、例えば、米国特許第７，９７２，３５８号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｎｉｅｌｓｅｎによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、穿刺路を取り囲む組織内に閉鎖剤を送達する。
【０９２１】
筋形成および血管形成のための方法が、Ｃｈｉｕらによって説明されており、例えば、米国特許第６，５５１，３３８号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｃｈｉｕによると、少なくとも１．２５ｍｍの最大直径と、６〜２０ｍｍの穿刺深度を提供するのに有効な長さと、を有する５〜１５の針がデバイス内に組み込まれ、心筋近くに挿入し、外因性血管新生または筋原性因子をその針の少なくとも一部の中にある導管を通してその心筋に供給する。
【０９２２】
前立腺組織の治療ための方法が、Ｂｏｌｍｓｊらによって説明されており、例えば、米国特許第６，５２４，２７０号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｂｏｌｍｓｊによると、尿道を通して挿入されるカテーテルを含むデバイスが、周囲の前立腺組織内に伸長可能な少なくとも１つの中空端を有する。収斂薬および鎮痛薬は、その端部を通してその前立腺組織内に投与される。
【０９２３】
流体を骨内部位に輸注する方法が、Ｆｉｎｄｌａｙらによって説明されており、例えば、米国特許第６，７６１，７２６号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｆｉｎｄｌａｙによると、軟質材料の層で覆われた材料の硬質殻を貫通することが可能な複数の針がデバイス内に組み込まれ、その材料の硬質殻から下へ規定の距離で流体を送達する。
【０９２４】
薬物を血管壁内に注入するためのデバイスが、Ｖｉｇｉｌらによって説明されており、例えば、米国特許第５，７１３，８６３号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｖｉｇｉｌによると、複数の注入器がデバイス内の可撓管のそれぞれの上に設置され、血管壁内への輸注のためにマルチルーメンカテーテルを通してその可撓管の中へ、およびその注入器の外へ薬物流体を導入する。
【０９２５】
治療用および／または診断用薬剤を身体通路を取り囲む組織に送達するためのカテーテルが、Ｆａｘｏｎらによって説明されており、例えば、米国特許第５，４６４，３９５号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｆａｘｏｎによると、少なくとも１つの針カニューレがカテーテル内に組み込まれ、カテーテルの外部へ突出するその針を通して所望の薬剤を組織に送達する。
【０９２６】
治療剤を送達するためのバルーンカテーテルが、Ｏｒｒによって説明されており、例えば、国際公開第ＷＯ２０１００２４８７１号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｏｒｒによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、治療剤を組織内の異なる深さに送達する。
電流を利用する方法およびデバイス
本明細書に教示される単回、複数回、または分割された投薬レジメンに従って、電流を利用する方法およびデバイスを用いて、本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾ＲＮＡ、またはリボ核酸を送達することができる。そのような方法およびデバイスが、以下に記載される。
【０９２７】
電気コラーゲン誘導治療デバイスが、Ｍａｒｑｕｅｚによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００９０１３７９４５号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｍａｒｑｕｅｚによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、皮膚を繰り返し穿刺し、最初に皮膚に適用される物質の一部を皮膚部分に引き込む。
【０９２８】
動電システムが、Ｅｔｈｅｒｅｄｇｅらによって説明されており、例えば、米国特許公開第２００７０１８５４３２号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｅｔｈｅｒｅｄｇｅによると、マイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、電流によって、針を通して薬物を標的とされる治療部位に推進する。
【０９２９】
イオン泳動デバイスが、Ｍａｔｓｕｍｕｒａらによって説明されており、例えば、米国特許第７，４３７，１８９号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｍａｔｓｕｍｕｒａによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、イオン化可能薬物をより速い速度で、またはより高効率で生体内に送達することができる。
【０９３０】
無針注入およびエレクトロポレーションによる生物活性剤の皮内送達が、Ｈｏｆｆｍａｎｎらによって説明されており、例えば、米国特許第７，１７１，２６４号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｈｏｆｆｍａｎｎによると、１つ以上の無針注入器がエレクトロポレーションデバイスに組み込まれ、無針注入とエレクトロポレーションとの組み合わせは、薬剤を皮膚、筋肉、または粘膜の細胞内に導入するのに十分である。
【０９３１】
電気透過化処理（ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を介した細胞内送達のための方法が、Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔらによって説明されており、例えば、米国特許第６，６２５，４８６号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔによると、一対の針電極がカテーテル内に組み込まれる。そのカテーテルは体内ルーメン内に位置し、そのルーメンを取り囲む組織内に透過させるためのその針電極が続く。次いでデバイスは、その針電極のうちの少なくとも１つを通して薬剤を導入し、その針電極で電界をかけ、その薬剤が細胞膜を通して治療部位の細胞内へ通過することを可能にする。
【０９３２】
経皮免疫化のための送達システムが、Ｌｅｖｉｎらによって説明されており、例えば、国際公開第ＷＯ２００６００３６５９号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｌｅｖｉｎによると、複数の電極がデバイス内に組み込まれ、電気エネルギーを電極間に印加し、経皮送達を容易にするためのマイクロチャネルを皮膚内に生成する。
【０９３３】
ＲＦエネルギーを皮膚の中へ送達するための方法が、Ｓｃｈｏｍａｃｋｅｒによって説明されており、例えば、国際公開第ＷＯ２０１１１６３２６４号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｓｃｈｏｍａｃｋｅｒによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、針がＲＦエネルギーをプレート上の孔を通して皮膚に挿入し、送達するように、皮膚をプレートとの接触に誘引するために減圧する。
定義
本明細書中の種々の箇所で、本開示の化合物の置換基が、群においてまたは範囲において開示される。本開示は、そのような群および範囲のメンバーのありとあらゆる個々の部分的組み合わせを含むことが具体的に意図される。例えば、「Ｃ１−６アルキル」という用語は、メチル、エチル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、およびＣ６アルキルを個々に開示することが具体的に意図される。
【０９３４】
約：本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、列挙される値の＋／−１０％を意味する。
動物：本明細書で使用されるとき、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、任意の発達段階にあるヒトを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、任意の発達段階にある非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。いくつかの実施形態において、動物には、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、サカナ、および蠕虫が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作動物、またはクローンである。
【０９３５】
およそ：本明細書で使用されるとき、目的とする１つ以上の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、定められる参照値と同様である値を指す。ある特定の実施形態において、「およそ」または「約」という用語は、別途定められるか、または文脈から別途明白でない限り、定められる参照値のいずれかの方向（それよりも大きいまたはそれよりも小さい）における、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の内に該当する値の範囲を指す（そのような数字が可能な値の１００％を超えるような場合を除く）。
【０９３６】
と会合される：本明細書で使用されるとき、２つ以上の部分に関して使用される際、「と会合される」、「複合体化される」、「連結される」、「結合される」、および「係留される」という用語は、直接、または連結剤としての役目を果たす１つ以上のさらなる部分を介してのいずれかで、その部分が互いに物理的に会合されるか、または結合されて、その部分が、構造が使用される条件下、例えば、生理的条件下で、物理的に会合されたままであるように十分に安定した構造を形成することを意味する。「会合」は、厳密に直接的な共有化学結合を経る必要はない。それは、「会合した」実体が物理的に会合したままであるように十分に安定したイオン結合もしくは水素結合またはハイブリダイゼーションベースの結合性も示唆し得る。
【０９３７】
栄養要求性：本明細書で使用するとき、「栄養要求性」という用語は、選択された組織または臓器において、タンパク質発現を実質的に妨げるかまたは減少させるように、ｍＲＮＡの分解または不活性化を引き起こすかまたは誘導する、少なくとも１つの特徴を含むｍＲＮＡを指す。
【０９３８】
二機能性：本明細書で使用されるとき、「二機能性」という用語は、少なくとも２つの機能を維持することが可能である任意の物質、分子、または部分を指す。この機能は、同じ結果または異なる結果を達成してもよい。この機能をもたらす構造は、同じであることも、異なることもある。例えば、本発明の二機能性修飾ＲＮＡが、細胞傷害性ペプチド（第１の機能）をコードし得る一方で、コードＲＮＡを含むヌクレオシドは、それ自体として、細胞傷害性（第２の機能）である。この例において、癌細胞への二機能性修飾ＲＮＡの送達は、癌を寛解させ得るまたは治療し得るペプチドまたはタンパク質分子をもたらすだけでなく、万一、修飾ＲＮＡの翻訳の代わりに分解が生じることがあった場合、ヌクレオシドの細胞傷害性ペイロードを細胞に送達するであろう。
【０９３９】
生体適合性：本明細書で使用されるとき、「生体適合性」という用語は、損傷、毒性、または免疫系による拒絶の危険性をほとんどもしくは全くもたらさず、生細胞、組織、器官、または系と適合性であることを意味する。
【０９４０】
生分解性：本明細書で使用されるとき、「生分解性」という用語は、生き物の作用によって無害の生成物へと分解されることが可能であることを意味する。
生物学的に活性：本明細書で使用されるとき、「生物学的に活性」という表現は、生体系および／または生物において活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物に投与されるときに、その生物に対して生物学的効果を有する物質は、生物学的に活性であると見なされる。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、その核酸分子のほんの一部分でも、生物学的に活性であるか、生物学的に関連性があると見なされる活性を模倣する場合、生物学的に活性であると見なされ得る。
【０９４１】
化学用語：以下は、「アシル」から「チオール」までの種々の化学用語の定義を提供する。
本明細書で使用されるとき、「アシル」という用語は、本明細書に定義されるカルボニル基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義される水素またはアルキル基（例えば、ハロアルキル基）を表し、ホルミル（すなわち、カルボキシアルデヒド基）、アセチル、プロピオニル、ブタノイル等により例として示される。例示の非置換アシル基は、１〜７、１〜１１、または１〜２１個の炭素を含む。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換される。
【０９４２】
本明細書で使用されるとき、「アシルアミノ」という用語は、本明細書に定義されるアミノ基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるアシル基を表す（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｒであり、式中、Ｒは、Ｈであるか、または任意に置換されるＣ１−６、Ｃ１−１０、もしくはＣ１−２０アルキル基であり、ＲＮ１は、本明細書に定義される通りである）。例示の非置換アシルアミノ基は、１〜４１個の炭素（例えば、１〜７、１〜１３、１〜２１、２〜７、２〜１３、２〜２１、または２〜４１個の炭素）を含む。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、もしくは４個の置換基でさらに置換され、かつ／またはアミノ基は、−ＮＨ２もしくは−ＮＨＲＮ１であり、式中、ＲＮ１は、独立して、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、またはアリールであり、各ＲＮ２は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり得る。
【０９４３】
本明細書で使用されるとき、「アシルオキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるアシル基を表す（すなわち、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒであり、式中、Ｒは、Ｈであるか、または任意に置換されるＣ１−６、Ｃ１−１０、もしくはＣ１−２０アルキル基である）。例示の非置換アシルオキシ基は、１〜２１個の炭素（例えば、１〜７または１〜１１個の炭素）を含む。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、もしくは４個の置換基でさらに置換され、かつ／またはアミノ基は、−ＮＨ２もしくは−ＮＨＲＮ１であり、式中、ＲＮ１は、独立して、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、またはアリールであり、各ＲＮ２は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり得る。
【０９４４】
本明細書で使用されるとき、「アルカリール（ａｌｋａｒｙｌ）」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるアリール基を表す。例示の非置換アルカリール基は、７〜３０個の炭素（例えば、Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、Ｃ１−１０アルク−Ｃ６−１０アリール、またはＣ１−２０アルク−Ｃ６−１０アリール等の、７〜１６または７〜２０個の炭素）である。いくつかの実施形態において、アルキレンおよびアリールは各々、それぞれの基について本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。接頭辞「アルク−」に続く他の基は、同じように定義され、ここで「アルク」は、別途注記のない限り、Ｃ１−６アルキレンを指し、結合される化学構造は、本明細書に定義される通りである。
【０９４５】
「アルクシクロアルキル（ａｌｋｃｙｃｌｏａｌｋｙｌ）」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基（例えば、１〜４、１〜６、１〜１０、または１〜２０個の炭素のアルキレン基）を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるシクロアルキル基を表す。いくつかの実施形態において、アルキレンおよびシクロアルキルは各々、それぞれの基について本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０９４６】
本明細書で使用されるとき、「アルケニル」という用語は、別途明記されない限り、１つ以上の炭素−炭素二重結合を含有する、２〜２０個の炭素（例えば、２〜６または２〜１０個の炭素）の、一価の直鎖または分岐鎖基を表し、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル等により例として示される。アルケニルは、シスおよびトランス異性体の両方を含む。アルケニル基は、本明細書に定義されるアミノ、アリール、シクロアルキル、もしくはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）から独立して選択される１、２、３、もしくは４個の置換基、または本明細書に記載の例示のアルキル置換基のうちのいずれかで、任意に置換されてもよい。
【０９４７】
「アルケニルオキシ」という用語は、式−ＯＲの化学置換基を表し、式中、Ｒは、別途明記されない限り、Ｃ２−２０アルケニル基（例えば、Ｃ２−６またはＣ２−１０アルケニル）である。例示のアルケニルオキシ基には、エテニルオキシ、プロペニルオキシ等が含まれる。いくつかの実施形態において、アルケニル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換され得る。
【０９４８】
「アルクヘテロアリール」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるヘテロアリール基を指す。例示の非置換アルクヘテロアリール基は、２〜３２個の炭素（例えば、Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロアリール、Ｃ１−１０アルク−Ｃ１−１２ヘテロアリール、またはＣ１−２０アルク−Ｃ１−１２ヘテロアリール等の、２〜２２、２〜１８、２〜１７、２〜１６、３〜１５、２〜１４、２〜１３、または２〜１２個の炭素）である。いくつかの実施形態において、アルキレンおよびヘテロアリールは各々、それぞれの基について本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。アルクヘテロアリール基は、アルクヘテロシクリル基の部分集合である。
【０９４９】
「アルクヘテロシクリル」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。例示の非置換アルクヘテロシクリル基は、２〜３２個の炭素（例えば、Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロシクリル、Ｃ１−１０アルク−Ｃ１−１２ヘテロシクリル、またはＣ１−２０アルク−Ｃ１−１２ヘテロシクリル等の、２〜２２、２〜１８、２〜１７、２〜１６、３〜１５、２〜１４、２〜１３、または２〜１２個の炭素）である。いくつかの実施形態において、アルキレンおよびヘテロシクリルは各々、それぞれの基について本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０９５０】
「アルコキシ」という用語は、式−ＯＲの化学置換基を表し、式中、Ｒは、別途明記されない限り、Ｃ１−２０アルキル基（例えば、Ｃ１−６またはＣ１−１０アルキル）である。例示のアルコキシ基には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ（例えば、ｎ−プロポキシおよびイソプロポキシ）、ｔ−ブトキシ等が含まれる。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基（例えば、ヒドロキシまたはアルコキシ）でさらに置換され得る。
【０９５１】
「アルコキシアルコキシ」という用語は、アルコキシ基で置換されるアルコキシ基を表す。例示の非置換アルコキシアルコキシ基は、２〜４０個の炭素（例えば、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−１０アルコキシ−Ｃ１−１０アルコキシ、またはＣ１−２０アルコキシ−Ｃ１−２０アルコキシ等の、２〜１２または２〜２０個の炭素）を含む。いくつかの実施形態において、各アルコキシ基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０９５２】
「アルコキシアルキル」という用語は、アルコキシ基で置換されるアルキル基を表す。例示の非置換アルコキシアルキル基は、２〜４０個の炭素（例えば、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−１０アルコキシ−Ｃ１−１０アルキル、またはＣ１−２０アルコキシ−Ｃ１−２０アルキル等の、２〜１２または２〜２０個の炭素）を含む。いくつかの実施形態において、アルキルおよびアルコキシは各々、それぞれの基について本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０９５３】
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニル」という用語は、カルボニル原子を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるアルコキシを表す（例えば、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲであり、式中、Ｒは、Ｈであるか、または任意に置換されるＣ１−６、Ｃ１−１０、もしくはＣ１−２０アルキル基である）。例示の非置換アルコキシカルボニルは、１〜２１個の炭素（例えば、１〜１１または１〜７個の炭素）を含む。いくつかの実施形態において、アルコキシ基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換される。
【０９５４】
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニルアルコキシ」という用語は、本明細書に定義されるアルコキシカルボニル基で置換される、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す（例えば、−Ｏ−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲであって、式中、Ｒは、任意に置換されるＣ１−６、Ｃ１−１０、またはＣ１−２０アルキル基である）。例示の非置換アルコキシカルボニルアルコキシは、３〜４１個の炭素（例えば、Ｃ１−６アルコキシカルボニル−Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−１０アルコキシカルボニル−Ｃ１−１０アルコキシ、またはＣ１−２０アルコキシカルボニル−Ｃ１−２０アルコキシ等の、３〜１０、３〜１３、３〜１７、３〜２１、または３〜３１個の炭素）を含む。いくつかの実施形態において、各アルコキシ基は、独立して、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換される。
【０９５５】
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニルアルキル」という用語は、本明細書に定義されるアルコキシカルボニル基で置換される、本明細書に定義されるアルキル基を表す（例えば、−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲであって、式中、Ｒは、任意に置換されるＣ１−２０、Ｃ１−１０、またはＣ１−６アルキル基である）。例示の非置換アルコキシカルボニルアルキルは、３〜４１個の炭素（例えば、Ｃ１−６アルコキシカルボニル−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−１０アルコキシカルボニル−Ｃ１−１０アルキル、またはＣ１−２０アルコキシカルボニル−Ｃ１−２０アルキル等の、３〜１０、３〜１３、３〜１７、３〜２１、または３〜３１個の炭素）を含む。いくつかの実施形態において、各アルキルおよびアルコキシ基は、独立して、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換される。
【０９５６】
本明細書で使用されるとき、「アルキル」という用語は、別途明記されない限り、１〜２０個（例えば、１〜１０または１〜６個）の炭素の直鎖および分岐鎖両方の飽和基を含む。アルキル基は、メチル、エチル、ｎ−およびイソ−プロピル、ｎ−、ｓｅｃ−、イソ−、およびｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル等により例として示され、次のものからなる群から独立して選択される１、２、３個の置換基で、または２個以上の炭素のアルキル基の場合には４個の置換基で、任意に置換されてもよい：（１）Ｃ１−６アルコキシ；（２）Ｃ１−６アルキルスルフィニル；（３）本明細書に定義されるアミノ（例えば、非置換アミノ（すなわち、−ＮＨ２）または置換アミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２、式中、ＲＮ１は、アミノについて定義される通りである）；（４）Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ；（５）アジド；（６）ハロ；（７）（Ｃ２−９ヘテロシクリル）オキシ；（８）ヒドロキシ；（９）ニトロ；（１０）オキソ（例えば、カルボキシアルデヒドまたはアシル）；（１１）Ｃ１−７スピロシクリル；（１２）チオアルコキシ；（１３）チオール；（１４）−ＣＯ２ＲＡ’（式中、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ）Ｃ２−２０アルケニル（例えば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１−２０アルキルである）、および（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるＣ１−６アルキルである）からなる群から選択される）；（１５）−Ｃ（Ｏ）ＮＲＢ’ＲＣ’（式中、ＲＢ’およびＲＣ’の各々は、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（１６）−ＳＯ２ＲＤ’（式中、ＲＤ’は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）ヒドロキシからなる群から選択される）；（１７）−ＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’（式中、ＲＥ’およびＲＦ’の各々は、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（１８）−Ｃ（Ｏ）ＲＧ’（式中、ＲＧ’は、（ａ）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ）Ｃ２−２０アルケニル（例えば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１−２０アルキルである）、および（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるＣ１−６アルキルである）からなる群から選択される）；（１９）−ＮＲＨ’Ｃ（Ｏ）ＲＩ’（式中、ＲＨ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、ＲＩ’は、（ａ２）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２−２０アルケニル（例えば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６−１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１−２０アルキルである）、および（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるＣ１−６アルキルである）からなる群から選択される）；（２０）−ＮＲＪ’Ｃ（Ｏ）ＯＲＫ’（式中、ＲＪ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、ＲＫ’は、（ａ２）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２−２０アルケニル（例えば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６−１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１−２０アルキルである）、および（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるＣ１−６アルキルである）からなる群から選択される）；ならびに（２１）アミジン。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、Ｃ１−アルカリールのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイル（ａｒｙｌｏｙｌ）置換基をもたらすことができる。
【０９５７】
本明細書で使用されるとき、「アルキレン」および接頭辞「アルク−」という用語は、２つの水素原子の除去によって直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素に由来する、飽和二価炭化水素基を表し、メチレン、エチレン、イソプロピレン等により例として示される。「Ｃｘ−ｙアルキレン」および接頭辞「Ｃｘ−ｙアルク−」という用語は、ｘ〜ｙ個の炭素を有するアルキレン基を表す。ｘに関する例示の値は、１、２、３、４、５、および６であり、ｙに関する例示の値は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、または２０である（例えば、Ｃ１−６、Ｃ１−１０、Ｃ２−２０、Ｃ２−６、Ｃ２−１０、またはＣ２−２０アルキレン）。いくつかの実施形態において、アルキレンは、アルキル基について本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０９５８】
本明細書で使用されるとき、「アルキルスルフィニル」という用語は、−Ｓ（Ｏ）−基を介して親分子基に結合されるアルキル基を表す。例示の非置換アルキルスルフィニル基は、１〜６、１〜１０、または１〜２０個の炭素である。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０９５９】
本明細書で使用されるとき、「アルキルスルフィニルアルキル」という用語は、アルキルスルフィニル基によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。例示の非置換アルキルスルフィニルアルキル基は、２〜１２、２〜２０、または２〜４０個の炭素である。いくつかの実施形態において、各アルキル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０９６０】
本明細書で使用されるとき、「アルキニル」という用語は、炭素−炭素三重結合を含有する、２〜２０個の炭素原子（例えば、２〜４、２〜６、または２〜１０個の炭素）の、一価の直鎖または分岐鎖基を表し、エチニル、１−プロピニル等により例として示される。アルキニル基は、本明細書に定義されるアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）から独立して選択される１、２、３、もしくは４個の置換基、または本明細書に記載の例示のアルキル置換基のうちのいずれかで、任意に置換されてもよい。
【０９６１】
「アルキニルオキシ」という用語は、式−ＯＲの化学置換基を表し、式中、Ｒは、別途明記されない限り、Ｃ２−２０アルキニル基（例えば、Ｃ２−６またはＣ２−１０アルキニル）である。例示のアルキニルオキシ基には、エチニルオキシ、プロピニルオキシ等が含まれる。いくつかの実施形態において、アルキニル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換され得る。
【０９６２】
本明細書で使用されるとき、「アミジン」という用語は、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２基を表す。
本明細書で使用されるとき、「アミノ」という用語は、−Ｎ（ＲＮ１）２を表し、式中、各ＲＮ１は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ（ＲＮ２）２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、Ｎ−保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、アルカリール、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、カルボキシアルキル、スルホアルキル、ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、またはアルクヘテロシクリル（例えば、アルクヘテロアリール）であり、これらの列挙されるＲＮ１基の各々は、各基について本明細書に定義されるように任意に置換され得るか、または２つのＲＮ１が組み合わさって、ヘテロシクリルもしくはＮ保護基を形成し、各ＲＮ２は、独立して、Ｈ、アルキル、またはアリールである。本発明のアミノ基は、非置換アミノ（すなわち、−ＮＨ２）または置換アミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２）であり得る。好ましい実施形態において、アミノは、−ＮＨ２または−ＮＨＲＮ１であり、式中、ＲＮ１は、独立して、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、カルボキシアルキル、スルホアルキル、またはアリールであり、各ＲＮ２は、Ｈ、Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）、またはＣ６−１０アリールであり得る。
【０９６３】
本明細書に記載の「アミノ酸」という用語は、側鎖、アミノ基、および酸性基（例えば、−ＣＯ２Ｈのカルボキシ基または−ＳＯ３Ｈのスルホ基）を有する分子を指し、このアミノ酸は、側鎖、アミノ基、または酸性基（例えば、側鎖）によって親分子基に結合される。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、カルボニル基によって親分子基に結合され、この側鎖またはアミノ基は、カルボニル基に結合される。例示の側鎖には、任意に置換されるアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルカリール、アルクヘテロシクリル、アミノアルキル、カルバモイルアルキル、およびカルボキシアルキルが含まれる。例示のアミノ酸には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシノルバリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、ピロリジン、セレノシステイン、セリン、タウリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが含まれる。アミノ酸基は、次のものからなる群から独立して選択される１、２、３個の置換基で、または２個以上の炭素のアミノ酸基の場合には４個の置換基で、任意に置換されてもよい：（１）Ｃ１−６アルコキシ；（２）Ｃ１−６アルキルスルフィニル；（３）本明細書に定義されるアミノ（例えば、非置換アミノ（すなわち、−ＮＨ２）または置換アミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２（式中、ＲＮ１は、アミノについて定義される通りである））；（４）Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ；（５）アジド；（６）ハロ；（７）（Ｃ２−９ヘテロシクリル）オキシ；（８）ヒドロキシ；（９）ニトロ；（１０）オキソ（例えば、カルボキシアルデヒドまたはアシル）；（１１）Ｃ１−７スピロシクリル；（１２）チオアルコキシ；（１３）チオール；（１４）−ＣＯ２ＲＡ’（式中、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ）Ｃ２−２０アルケニル（例えば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１−２０アルキルである）、および（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるＣ１−６アルキルである）からなる群から選択される）；（１５）−Ｃ（Ｏ）ＮＲＢ’ＲＣ’（式中、ＲＢ’およびＲＣ’の各々は、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（１６）−ＳＯ２ＲＤ’（式中、ＲＤ’は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）ヒドロキシからなる群から選択される）；（１７）−ＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’（式中、ＲＥ’およびＲＦ’の各々は、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（１８）−Ｃ（Ｏ）ＲＧ’（式中、ＲＧ’は、（ａ）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ）Ｃ２−２０アルケニル（例えば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１−２０アルキルである）、および（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるＣ１−６アルキルである）からなる群から選択される）；（１９）−ＮＲＨ’Ｃ（Ｏ）ＲＩ’（式中、ＲＨ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、ＲＩ’は、（ａ２）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２−２０アルケニル（例えば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６−１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１−２０アルキルである）、および（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるＣ１−６アルキルである）からなる群から選択される）；（２０）−ＮＲＪ’Ｃ（Ｏ）ＯＲＫ’（式中、ＲＪ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、ＲＫ’は、（ａ２）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２−２０アルケニル（例えば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６−１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１−２０アルキルである）、および（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール（式中、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３の各々は、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるＣ１−６アルキルである）からなる群から選択される）；ならびに（２１）アミジン。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。
【０９６４】
本明細書で使用されるとき、「アミノアルコキシ」という用語は、本明細書に定義されるアミノ基によって置換された、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。アルキルおよびアミノは各々、それぞれの基について本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基（例えば、ＣＯ２ＲＡ’（式中、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、例えば、カルボキシからなる群から選択される））でさらに置換され得る。
【０９６５】
本明細書で使用されるとき、「アミノアルキル」という用語は、本明細書に定義されるアミノ基によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。アルキルおよびアミノは各々、それぞれの基について本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基（例えば、ＣＯ２ＲＡ’（式中、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、例えば、カルボキシからなる群から選択される））でさらに置換され得る。
【０９６６】
本明細書で使用されるとき、「アリール」という用語は、１つまたは２つの芳香族環を有する単環式、二環式、または多環式の炭素環式環系を表し、フェニル、ナフチル、１，２−ジヒドロナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、フルオレニル、インダニル、インデニル等により例として示され、次のものからなる群から独立して選択される１、２、３、４、または５個の置換基で任意に置換されてもよい：（１）Ｃ１−７アシル（例えば、カルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルスルフィニル−Ｃ１−６アルキル、アミノ−Ｃ１−６アルキル、アジド−Ｃ１−６アルキル、（カルボキシアルデヒド）−Ｃ１−６アルキル、ハロ−Ｃ１−６アルキル（例えば、ペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、ニトロ−Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６チオアルコキシ−Ｃ１−６アルキル）；（３）Ｃ１−２０アルコキシ（例えば、ペルフルオロアルコキシ等のＣ１−６アルコキシ）；（４）Ｃ１−６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６−１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール；（８）アジド；（９）Ｃ３−８シクロアルキル；（１０）Ｃ１−６アルク−Ｃ３−８シクロアルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１−１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１−１２ヘテロアリール）；（１３）（Ｃ１−１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１６）Ｃ１−２０チオアルコキシ（例えば、Ｃ１−６チオアルコキシ）；（１７）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（１８）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＢ’およびＲＣ’は、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から独立して選択される）；（１９）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＤ’は、（ａ）アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、および（ｃ）アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（２０）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＥ’およびＲＦ’の各々は、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（２１）チオール；（２２）Ｃ６−１０アリールオキシ；（２３）Ｃ３−８シクロアルコキシ；（２４）Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ；（２５）Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロアリール）；（２６）Ｃ２−２０アルケニル；ならびに（２７）Ｃ２−２０アルキニル。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、Ｃ１−アルカリールまたはＣ１−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイルおよび（ヘテロシクリル）オイル置換基をもたらすことができる。
【０９６７】
本明細書で使用されるとき、「アリールアルコキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるアルカリール基を表す。例示の非置換アルコキシアルキル基は、７〜３０個の炭素（例えば、Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−１０アルコキシ、またはＣ６−１０アリール−Ｃ１−２０アルコキシ等の、７〜１６または７〜２０個の炭素）を含む。いくつかの実施形態において、アリールアルコキシ基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基で置換され得る。
【０９６８】
「アリールオキシ」という用語は、式−ＯＲ’の化学置換基を表し、式中、Ｒ’は、別途明記されない限り、６〜１８個の炭素のアリール基である。いくつかの実施形態において、アリール基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基で置換され得る。
【０９６９】
本明細書で使用されるとき、「アリーロイル」という用語は、カルボニル基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるアリール基を表す。例示の非置換アリーロイル基は、７〜１１個の炭素のものである。いくつかの実施形態において、アリール基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基で置換され得る。
【０９７０】
「アジド」という用語は、−Ｎ３基を表し、それは、−Ｎ＝Ｎ＝Ｎとしても表され得る。
本明細書で使用されるとき、「二環式」という用語は、芳香族でも非芳香族でもあり得る２つの環を有する構造を指す。二環式構造には、本明細書に定義されるスピロシクリル基、および１つ以上の架橋を共有する２つの環が含まれ、そのような架橋は、１個の原子、または２個、３個、もしくはそれよりも多い原子を含む鎖を含むことができる。例示の二環式基には、二環式カルボシクリル基（その第１および第２の環は、本明細書に定義されるカルボシクリル基である）；二環式アリール基（その第１および第２の環は、本明細書に定義されるアリール基である）；二環式ヘテロシクリル基（その第１の環は、ヘテロシクリル基であり、第２の環は、カルボシクリル（例えば、アリール）またはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）基である）；および二環式ヘテロアリール基（その第１の環は、ヘテロアリール基であり、第２の環は、カルボシクリル（例えば、アリール）またはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）基である）が含まれる。いくつかの実施形態において、二環式基は、シクロアルキル、ヘテロシクリル、およびアリール基について本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基で置換され得る。
【０９７１】
本明細書で使用されるとき、「炭素環式」および「カルボシクリル」という用語は、芳香族でも非芳香族でもあり得る環が炭素原子によって形成される、任意に置換されるＣ３−１２単環式、二環式、または三環式構造を指す。炭素環式構造には、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびアリール基が含まれる。
【０９７２】
本明細書で使用されるとき、「カルバモイル」という用語は、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＲＮ１）２を表し、式中、各ＲＮ１の意味は、本明細書に提供される「アミノ」の定義において見出される。
【０９７３】
本明細書で使用されるとき、「カルバモイルアルキル」という用語は、本明細書に定義されるカルバモイル基によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。アルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０９７４】
本明細書で使用されるとき、「カルバミル」という用語は、構造−ＮＲＮ１Ｃ（＝Ｏ）ＯＲまたは−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＮ１）２を有するカルバメート基を指し、式中、各ＲＮ１の意味は、本明細書に提供される「アミノ」の定義において見出され、Ｒは、本明細書に定義されるアルキル、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、アリール、アルカリール、ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、またはアルクヘテロシクリル（例えば、アルクヘテロアリール）である。
【０９７５】
本明細書で使用されるとき、「カルボニル」という用語は、Ｃ（Ｏ）基を表し、それは、Ｃ＝Ｏとしても表され得る。
「カルボキシアルデヒド」という用語は、構造−ＣＨＯを有するアシル基を表す。
【０９７６】
本明細書で使用されるとき、「カルボキシ」という用語は、−ＣＯ２Ｈを意味する。
本明細書で使用されるとき、「カルボキシアルコキシ」という用語は、本明細書に定義されるカルボキシ基によって置換された、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。アルコキシ基は、アルキル基について本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０９７７】
本明細書で使用されるとき、「カルボキシアルキル」という用語は、本明細書に定義されるカルボキシ基によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。アルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０９７８】
本明細書で使用されるとき、「シアノ」という用語は、−ＣＮ基を表す。
「シクロアルコキシ」という用語は、式−ＯＲの化学置換基を表し、式中、Ｒは、別途明記されない限り、本明細書に定義されるＣ３−８シクロアルキル基である。シクロアルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。例示の非置換シクロアルコキシ基は、３〜８個の炭素である。いくつかの実施形態において、シクロアルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０９７９】
本明細書で使用されるとき、「シクロアルキル」という用語は、別途明記されない限り、３〜８個の炭素の一価の飽和または不飽和非芳香族環状炭化水素基を表し、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、ビシクロ［２．２．１．］ヘプチル等により例として示される。シクロアルキル基が１つの炭素−炭素二重結合を含むとき、シクロアルキル基は、「シクロアルケニル」基と称され得る。例示のシクロアルケニル基には、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等が含まれる。本発明のシクロアルキル基は、次のもので任意に置換され得る：（１）Ｃ１−７アシル（例えば、カルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルスルフィニル−Ｃ１−６アルキル、アミノ−Ｃ１−６アルキル、アジド−Ｃ１−６アルキル、（カルボキシアルデヒド）−Ｃ１−６アルキル、ハロ−Ｃ１−６アルキル（例えば、ペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、ニトロ−Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６チオアルコキシ−Ｃ１−６アルキル）；（３）Ｃ１−２０アルコキシ（例えば、ペルフルオロアルコキシ等のＣ１−６アルコキシ）；（４）Ｃ１−６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６−１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール；（８）アジド；（９）Ｃ３−８シクロアルキル；（１０）Ｃ１−６アルク−Ｃ３−８シクロアルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１−１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１−１２ヘテロアリール）；（１３）（Ｃ１−１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１６）Ｃ１−２０チオアルコキシ（例えば、Ｃ１−６チオアルコキシ）；（１７）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（１８）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＢ’およびＲＣ’は、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ６−１０アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から独立して選択される）；（１９）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＤ’は、（ａ）Ｃ６−１０アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、および（ｃ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（２０）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＥ’およびＲＦ’の各々は、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ６−１０アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（２１）チオール；（２２）Ｃ６−１０アリールオキシ；（２３）Ｃ３−８シクロアルコキシ；（２４）Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ；（２５）Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロアリール）；（２６）オキソ；（２７）Ｃ２−２０アルケニル；ならびに（２８）Ｃ２−２０アルキニル。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、Ｃ１−アルカリールまたはＣ１−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイルおよび（ヘテロシクリル）オイル置換基をもたらすことができる。
【０９８０】
本明細書で使用されるとき、「ジアステレオマー」という用語は、互いの鏡像でなく、互いの上に重ね合わせ不可能である、立体異性体を意味する。
本明細書で使用されるとき、本明細書で使用される薬剤の「有効量」は、有益なまたは所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用されている前後関係に依存する。例えば、癌を治療する薬剤を投与することの前後関係において、有効量の薬剤は、例えば、薬剤の投与を伴わずに得られる反応と比較して、本明細書に定義される癌の治療を達成するのに十分な量である。
【０９８１】
本明細書で使用されるとき、「鏡像異性体」という用語は、少なくとも８０％（すなわち、一方の鏡像異性体が少なくとも９０％および他方の鏡像異性体が多くても１０％）、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９８％の光学純度または鏡像異性体過剰率（当技術分野で標準の方法によって決定するとき）を有する、本発明の化合物の各個々の光学活性型を意味する。
【０９８２】
本明細書で使用されるとき、「ハロ」という用語は、臭素、塩素、ヨウ素、またはフッ素から選択されるハロゲンを表す。
本明細書で使用されるとき、「ハロアルコキシ」という用語は、ハロゲン基（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ）によって置換された、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。ハロアルコキシは、１、２、３個のハロゲンで、または２個以上の炭素のアルキル基の場合には４個のハロゲンで置換されてもよい。ハロアルコキシ基には、ペルフルオロアルコキシ（例えば、−ＯＣＦ３）、−ＯＣＨＦ２、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＣｌ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ）ＣＨ３、および−ＯＣＨＩＣＨ３が含まれる。いくつかの実施形態において、ハロアルコキシ基は、アルキル基について本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０９８３】
本明細書で使用されるとき、「ハロアルキル」という用語は、ハロゲン基（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ）によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。ハロアルキルは、１、２、３個のハロゲンで、または２個以上の炭素のアルキル基の場合には４個のハロゲンで置換されてもよい。ハロアルキル基には、ペルフルオロアルキル（例えば、−ＣＦ３）、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＣｌ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ）ＣＨ３、および−ＣＨＩＣＨ３が含まれる。いくつかの実施形態において、ハロアルキル基は、アルキル基について本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０９８４】
本明細書で使用されるとき、「ヘテロアルキレン」という用語は、構成炭素原子のうちの１個または２個が各々、窒素、酸素、または硫黄によって置き換えらた、本明細書に定義されるアルキレン基を指す。いくつかの実施形態において、ヘテロアルキレン基は、アルキレン基について本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【０９８５】
本明細書で使用されるとき、「ヘテロアリール」という用語は、芳香族である、本明細書に定義されるヘテロシクリルの部分集合を表し、すなわち、それらは単環式または多環式環系内に４ｎ＋２個のπ電子を含有する。例示の非置換ヘテロアリール基は、１〜１２個（例えば、１〜１１、１〜１０、１〜９、２〜１２、２〜１１、２〜１０、または２〜９個）の炭素ものもである。いくつかの実施形態において、ヘテロアリールは、ヘテロシクリル基について定義される１、２、３、または４個の置換基で置換される。
【０９８６】
本明細書で使用されるとき、「ヘテロシクリル」という用語は、別途明記されない限り、窒素、酸素、および硫黄からなる群から独立して選択される１、２、３、または４個のヘテロ原子を含有する、５、６、または７員環を表す。５員環は、０〜２つの二重結合を有し、６および７員環は、０〜３つの二重結合を有する。例示の非置換ヘテロシクリル基は、１〜１２個（例えば、１〜１１、１〜１０、１〜９、２〜１２、２〜１１、２〜１０、または２〜９個）の炭素のものである。「ヘテロシクリル」という用語は、１個以上の炭素および／またはヘテロ原子が単環式環の２つの隣接していない員を架橋する、架橋多環式構造を有する複素環式化合物、例えば、キヌクリジニル基も表す。「ヘテロシクリル」という用語は、上記の複素環式環のうちのいずれかが１、２、もしくは３つの炭素環式環、例えば、アリール環、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環、シクロペンタン環、シクロペンテン環、またはインドリル、キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル等の別の単環式の複素環式環に縮合される、二環式、三環式、および四環式基を含む。縮合ヘテロシクリルの例としては、トロパンおよび１，２，３，５，８，８ａ−ヘキサヒドロインドリジンが挙げられる。複素環には、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピリジル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ピラジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリジニル、インドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、キノキサリニル、ジヒドロキノキサリニル、キナゾリニル、シノリニル、フタラジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアジアゾリル、フリル、チエニル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル（例えば、１，２，３−オキサジアゾリル）、プリニル、チアジアゾリル（例えば、１，２，３−チアジアゾリル）、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロインドリル、ジヒドロキノリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ジヒドロイソキノリル、ピラニル、ジヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチエニル等が含まれ、１つ以上の二重結合が還元され、水素と置き換えられる、それらのジヒドロおよびテトラヒドロ形態を含む。さらに他の例示のヘテロシクリルには、２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−オキサゾリル；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−イミダゾリル；２，３，４，５−テトラヒドロ−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾリル（例えば、２，３，４，５−テトラヒドロ−２−フェニル−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾリル）；２，３，４，５−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−１Ｈ−イミダゾリル（例えば、２，３，４，５−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−５−メチル−５−フェニル−１Ｈ−イミダゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−１，３，４−オキサジアゾリル（例えば、２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−５−フェニル−１，３，４−オキサジアゾリル）；４，５−ジヒドロ−５−オキソ−１Ｈ−トリアゾリル（例えば、４，５−ジヒドロ−３−メチル−４−アミノ５−オキソ−１Ｈ−トリアゾリル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソピリジニル（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３，３−ジエチルピリジニル）；２，６−ジオキソ−ピペリジニル（例えば、２，６−ジオキソ−３−エチル−３−フェニルピペリジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソピリジミニル；１，６−ジヒドロ−４−オキソピリミジニル（例えば、２−（メチルチオ）−１，６−ジヒドロ−４−オキソ−５−メチルピリミジン−１−イル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソピリミジニル（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３−エチルピリミジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソ−ピリダジニル（例えば、１，６−ジヒドロ−６−オキソ−３−エチルピリダジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソ−１，２，４−トリアジニル（例えば、１，６−ジヒドロ−５−イソプロピル−６−オキソ−１，２，４−トリアジニル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−インドリル（例えば、３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−インドリルおよび２，３−ジヒドロ−２−オキソ−３，３’−スピロプロパン−１Ｈ−インドール−１−イル）；１，３−ジヒドロ−１−オキソ−２Ｈ−イソ−インドリル；１，３−ジヒドロ−１，３−ジオキソ−２Ｈ−イソ−インドリル；１Ｈ−ベンゾピラゾリル（例えば、１−（エトキシカルボニル）−１Ｈ−ベンゾピラゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンズイミダゾリル（例えば、３−エチル−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンズイミダゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾオキサゾリル（例えば、５−クロロ−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾオキサゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾオキサゾリル；２−オキソ−２Ｈ−ベンゾピラニル；１，４−ベンゾジオキサニル；１，３−ベンゾジオキサニル；２，３−ジヒドロ−３−オキソ，４Ｈ−１，３−ベンゾチアジニル；３，４−ジヒドロ−４−オキソ−３Ｈ−キナゾリニル（例えば、２−メチル−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−３Ｈ−キナゾリニル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３Ｈ−キナゾリル（例えば、１−エチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３Ｈ−キナゾリル）；１，２，３，６−テトラヒドロ−２，６−ジオキソ−７Ｈ−プリニル（例えば、１，２，３，６−テトラヒドロ−１，３−ジメチル−２，６−ジオキソ−７Ｈ−プリニル）；１，２，３，６−テトラヒドロ−２，６−ジオキソ−１Ｈ−プリニル（例えば、１，２，３，６−テトラヒドロ−３，７−ジメチル−２，６−ジオキソ−１Ｈ−プリニル）；２−オキソベンズ［ｃ，ｄ］インドリル；１，１−ジオキソ−２Ｈ−ナフト［１，８−ｃ，ｄ］イソチアゾリル；および１，８−ナフチレンジカルボキサミドが含まれる。さらなる複素環には、３，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロ−ピロｌｏ［３，４−ｂ］ピロｌ−（２Ｈ）−イル、および２，５−ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−イル、ホモピペラジニル（またはジアゼパニル）、テトラヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、オキセパニル、チエパニル、アゾカニル、オキセカニル、およびチオカニルが含まれる。複素環基は、式：
【０９８７】
【化５４】
2020072766.tif 000318
【０９８８】
の基も含み、式中、
Ｅ’は、−Ｎ−および−ＣＨ−からなる群から選択され、Ｆ’は、−Ｎ＝ＣＨ−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−Ｏ−、および−Ｓ−からなる群から選択され、Ｇ’は、−ＣＨ−および−Ｎ−からなる群から選択される。本明細書で言及されるヘテロシクリル基のうちのいずれかは、次のものからなる群から独立して選択される１、２、３、４、または５個の置換基で任意に置換されてもよい：（１）Ｃ１−７アシル（例えば、カルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルスルフィニル−Ｃ１−６アルキル、アミノ−Ｃ１−６アルキル、アジド−Ｃ１−６アルキル、（カルボキシアルデヒド）−Ｃ１−６アルキル、ハロ−Ｃ１−６アルキル（例えば、ペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、ニトロ−Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６チオアルコキシ−Ｃ１−６アルキル）；（３）Ｃ１−２０アルコキシ（例えば、ペルフルオロアルコキシ等のＣ１−６アルコキシ）；（４）Ｃ１−６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６−１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール；（８）アジド；（９）Ｃ３−８シクロアルキル；（１０）Ｃ１−６アルク−Ｃ３−８シクロアルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１−１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ２−１２ヘテロアリール）；（１３）（Ｃ１−１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１６）Ｃ１−２０チオアルコキシ（例えば、Ｃ１−６チオアルコキシ）；（１７）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（１８）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＢ’およびＲＣ’は、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から独立して選択される）；（１９）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＤ’は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、および（ｃ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（２０）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’（式中、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＥ’およびＲＦ’の各々は、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される）；（２１）チオール；（２２）Ｃ６−１０アリールオキシ；（２３）Ｃ３−８シクロアルコキシ；（２４）アリールアルコキシ；（２５）Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロアリール）；（２６）オキソ；（２７）（Ｃ１−１２ヘテロシクリル）イミノ；（２８）Ｃ２−２０アルケニル；ならびに（２９）Ｃ２−２０アルキニル。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、Ｃ１−アルカリールまたはＣ１−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイルおよび（ヘテロシクリル）オイル置換基をもたらすことができる。
【０９８９】
本明細書で使用されるとき、「（ヘテロシクリル）イミノ」という用語は、イミノ基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基で置換され得る。
【０９９０】
本明細書で使用されるとき、「（ヘテロシクリル）オキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基で置換され得る。
【０９９１】
本明細書で使用されるとき、「（ヘテロシクリル）オイル」という用語は、カルボニル基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基で置換され得る。
【０９９２】
本明細書で使用されるとき、「炭化水素」という用語は、炭素および水素原子のみからなる基を表す。
本明細書で使用されるとき、「ヒドロキシ」という用語は、−ＯＨ基を表す。
【０９９３】
本明細書で使用されるとき、「ヒドロキシアルケニル」という用語は、１〜３個のヒドロキシ基によって置換された、本明細書に定義されるアルケニル基を表すが、但し、１個を超えるヒドロキシ基がアルキル基の単一の炭素原子に結合することはないことを条件とし、それはジヒドロキシプロペニル、ヒドロキシイソペンテニル等により例として示される。
【０９９４】
本明細書で使用されるとき、「ヒドロキシアルキル」という用語は、１〜３個のヒドロキシ基によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表すが、但し、１個を超えるヒドロキシ基が、アルキル基の単一の炭素原子に結合することはないことを条件とし、それはヒドロキシメチル、ジヒドロキシプロピル等により例として示される。
【０９９５】
本明細書で使用されるとき、「異性体」という用語は、本発明の化合物のいずれかの任意の互変異性体、立体異性体、鏡像異性体、またはジアステレオマーを意味する。本発明の化合物は、１つ以上のキラル中心および／または二重結合を有することができ、したがって、二重結合異性体（すなわち、幾何Ｅ／Ｚ異性体）またはジアステレオマー（例えば、鏡像異性体（すなわち、（＋）または（−））またはシス／トランス異性体）等の立体異性体として存在し得ることが認識される。本発明に従って、本明細書に描写される化学構造、したがって本発明の化合物は、対応する立体異性体のすべて、つまり、立体異性的に純粋な形態（例えば、幾何的に純粋、鏡像異性的に純粋、またはジアステレオマー的に純粋）と、鏡像異性体混合物および立体異性体混合物、例えば、ラセミ体との両方を包含する。本発明の化合物の鏡像異性体混合物および立体異性体混合物は、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高性能液体クロマトグラフィー、キラル塩錯体としての化合物の結晶化、またはキラル溶媒中の化合物の結晶化等の周知の方法によって、典型的にそれらの構成要素の鏡像異性体または立体異性体へと分解することができる。鏡像異性体および立体異性体は、周知の不斉合成法によって、立体異性的または鏡像異性的に純粋な中間体、試薬、および触媒からも得ることができる。
【０９９６】
本明細書で使用されるとき、「Ｎ保護アミノ」という用語は、本明細書に定義される１つまたは２つのＮ保護基に結合している、本明細書に定義されるアミノ基を指す。
本明細書で使用されるとき、「Ｎ保護基」という用語は、合成手順中に、望ましくない反応に対してアミノ基を保護するよう意図される基を表す。一般的に使用されるＮ保護基は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｒｅｅｎｅ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）に開示されている。Ｎ保護基には、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、４−ニトロベンゾイル等の、アシル、アリーロイル、またはカルバミル基、および保護されたまたは保護されいないＤ、Ｌ、またはＤ等のキラル助剤、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン等のＬ−アミノ酸；ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル等のスルホニル含有基；ベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、２，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニルｙｌ）−１−メチルエトキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２，−トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、４−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−９−メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニル等のカルバメート形成基、ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチル等のアルカリール基、ならびにトリメチルシリル等のシリル基が含まれる。好ましいＮ保護基は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、アラニル、フェニルスルホニル、ベンジル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）である。
【０９９７】
本明細書で使用されるとき、「ニトロ」という用語は、−ＮＯ２基を表す。
本明細書で使用されるとき、「オキソ」という用語、＝Ｏを表す。
本明細書で使用されるとき、「ペルフルオロアルキル」という用語は、アルキル基に結合した各水素ラジカルがフッ化物ラジカルによって置き換えられた、本明細書に定義されるアルキル基を表す。ペルフルオロアルキル基は、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル等により例として示される。
【０９９８】
本明細書で使用されるとき、「ペルフルオロアルコキシ」という用語は、アルコキシ基に結合した各水素ラジカルがフッ化物ラジカルによって置き換えられた、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。ペルフルオロアルコキシ基は、トリフルオロメトキシ、ペンタフルオロエトキシ等により例として示される。
【０９９９】
本明細書で使用されるとき、「スピロシクリル」という用語は、その両端が親基の同じ炭素原子に結合してスピロ環式基を形成するＣ２−７アルキレンジラジカル、およびまた、その両端が同じ炭素原子に結合するＣ１−６ヘテロアルキレンジラジカルを表す。スピロシクリル基を形成するヘテロアルキレンラジカルは、窒素、酸素、および硫黄からなる群から独立して選択される１、２、３、または４個のヘテロ原子を含有することができる。いくつかの実施形態において、スピロシクリル基は、そのジラジカルが結合する炭素原子を除いて、１〜７個の炭素を含む。本発明のスピロシクリル基は、シクロアルキル基および／またはヘテロシクリル基に対する任意の置換基として本明細書に提供される１、２、３、または４個の置換基で任意に置換されてもよい。
【１０００】
本明細書で使用されるとき、「立体異性体」という用語は、化合物（例えば、本明細書に記載の任意の式の化合物）が有し得るすべての可能性のある様々な異性型ならびに立体配座型、特にすべての可能性のある立体化学的および立体配座的異性型、基本的な分子構造のすべてのジアステレオマー、鏡像異性体、および／または配座異性体を指す。本発明のいくつかの化合物は、異なる互変異性型として存在してもよく、後者のすべてが本発明の範囲内に含まれる。
【１００１】
本明細書で使用されるとき、「スルホアルキル」という用語は、−ＳＯ３Ｈのスルホ基によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【１００２】
本明細書で使用されるとき、「スルホニル」という用語は、−Ｓ（Ｏ）２−基を表す。
本明細書で使用されるとき、「チオアルカリール」という用語は、式−ＳＲの化学置換基を表し、式中、Ｒは、アルカリール基である。いくつかの実施形態において、アルカリール基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【１００３】
本明細書で使用されるとき、「チオアルクヘテロシクリル」という用語は、式−ＳＲの化学置換基を表し、式中、Ｒは、アルクヘテロシクリル基である。いくつかの実施形態において、アルクヘテロシクリル基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【１００４】
本明細書で使用されるとき、「チオアルコキシ」という用語は、式−ＳＲの化学置換基を表し、式中、Ｒは、本明細書に定義されるアルキル基である。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、または４個の置換基でさらに置換され得る。
【１００５】
「チオール」という用語は、−ＳＨ基を表す。
化合物：本明細書で使用されるとき、「化合物」という用語は、描写される構造のすべての立体異性体、幾何異性体、互変異性体、および同位体を含むことが意図される。
【１００６】
本明細書に記載の化合物は、不斉であり得る（例えば、１つ以上の立体中心を有する）。別途指定されない限り、鏡像異性体およびジアステレオマー等の、すべての立体異性体が意図される。不斉置換炭素原子を含有する本開示の化合物は、光学活性型またはラセミ型で単離することができる。光学活性型を光学活性の出発物質からどのように調製するかに関する方法は、ラセミ混合物の分解によって、または立体選択的合成によって等、当技術分野で知られている。オレフィンの多くの幾何異性体、Ｃ＝Ｎ二重結合等もまた、本発明に記載の化合物中に存在することができ、すべてのそのような安定な異性体が本開示において企図される。本開示の化合物のシスおよびトランス幾何異性体が記載され、それは異性体の混合物としてまたは分離した異性型として単離され得る。
【１００７】
本開示の化合物は、互変異性型も含む。互変異性型は、単結合と、プロトンの付随する移動と一緒に結合する隣位二重結合との交換からもたらされる。互変異性型は、同じ実験式および総電荷を有する異性体プロトン化状態である、プロトン互変異性体（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｉｃ  ｔａｕｔｏｍｅｒｓ）を含む。例示のプロトン互変異性体には、ケトン−エノール対、アミド−イミド酸対、ラクタム−ラクチム対、アミド−イミド酸対、エナミン−イミン対、およびプロトンが複素環式系の２つ以上の位置を占有し得る環状型、例えば、１Ｈ−および３Ｈ−イミダゾール、１Ｈ−、２Ｈ−、および４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、１Ｈ−および２Ｈ−イソインドール、ならびに１Ｈ−および２Ｈ−ピラゾールが含まれる。互変異性型は、平衡し得るか、または適切な置換によって１つの形態へと立体的に固定され得る。
【１００８】
本開示の化合物は、中間体または最終化合物中で生じる原子の同位体もすべて含む。「同位体」は、同じ原子番号を有するが、核内の中性子の数が異なることに起因して異なる質量数を有する、原子を指す。例えば、水素の同位体には、トリチウムおよびジュウテリウムが含まれる。
【１００９】
本開示の化合物および塩は、通例の方法によって、溶媒または水分子と組み合わせて溶媒和物および水和物を形成することにより調製することができる。
保存される：本明細書で使用されるとき、「保存される」という用語は、比較されている２つ以上の配列の同じ位置において変化することなく生じる残基である、それぞれ、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基を指す。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列内の他の箇所に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも関連した配列の間で保存されているものである。
【１０１０】
いくつかの実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％同一である場合、「完全に保存される」と言われる。いくつかの実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「高度に保存される」と言われる。いくつかの実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％、または約９９％同一である場合、「高度に保存される」と言われる。いくつかの実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「保存される」と言われる。いくつかの実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合、「保存される」と言われる。配列の保存は、オリゴヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に適用してもよく、またはその一部分、領域、または特長に適用してもよい。配列の保存は、オリゴヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に適用され得、またはその一部分、領域、または特長に適用され得る。
【１０１１】
送達：本明細書で使用されるとき、「送達」は、化合物、物質、実体、部分、積荷、またはペイロードを送達する作用または様態を指す。
送達剤：本明細書で使用されるとき、「送達剤」は、標的とされる細胞への修飾核酸のインビボ送達を少なくとも部分的に容易にする、任意の物質を指す。
【１０１２】
検出可能な標識：本明細書で使用されるとき、「検出可能な標識」は、放射線写真撮影、蛍光、化学発光、酵素的活性、吸光等を含む当技術分野で既知の方法によって容易に検出される別の実体と結合されるか、それとともに組み込まれるか、またはそれと会合される１つ以上のマーカー、シグナル、または部分を指す。検出可能な標識には、放射性同位体、フルオロフォア、発色団、酵素、色素、金属イオン、リガンド、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテン、量子ドット等が含まれる。検出可能な標識は、本明細書に開示のペプチドまたはタンパク質における任意の位置に位置してもよい。それらは、アミノ酸、ペプチド、もしくはタンパク質の内にあっても、またはＮ末端もしくはＣ末端に位置してもよい。
【１０１３】
装置：本明細書で使用するとき、「装置」という用語は、特別な目的に供するために設計されたある特定の設備を指す。装置は、限定されないが、構成要素、電気関係（例えば、配線および回路）、記憶モジュール、および分析モジュール等の多くの特徴を含み得る。
【１０１４】
疾患：本明細書で使用するとき、「疾患」という用語は、多くの場合、特定の身体症状を示す、生物体の身体に影響する異常な状態を指す。
障害：本明細書で使用するとき、「障害」という用語は、身体の正常機能または確立されたシステムの混乱、またはそれらへの干渉を指す。
【１０１５】
消化：本明細書で使用されるとき、「消化」という用語は、より小さい片または構成成分へと分解することを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質に言及するとき、消化は、ペプチドの産生をもたらす。
【１０１６】
コードされたタンパク質の切断シグナル：本明細書で使用されるとき、「コードされたタンパク質の切断シグナル」は、タンパク質切断シグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。
【１０１７】
操作：本明細書で使用されるとき、本発明の実施形態は、それらが、構造的であろうと化学的であろうと、出発点分子、野生型分子、または天然分子から異なる特長または特性を有するように設計されるとき、「操作」される。
【１０１８】
エクソソーム：本明細書で使用されるとき、「エクソソーム」は、哺乳類細胞によって分泌される小胞、またはＲＮＡ分解に関与する複合体である。
発現：本明細書で使用されるとき、核酸配列の「発現」は、次の事象のうちの１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの生成（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセシングによる）、（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳、および（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
【１０１９】
特長：本明細書で使用されるとき、「特長」は、特徴、特性、または特有の要素を指す。
製剤：本明細書で使用されるとき、「製剤」は、少なくとも修飾核酸と、送達剤とを含む。
【１０２０】
断片：本明細書で使用されるとき、「断片」は、一部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された完全長タンパク質を消化することによって得られる、ポリペプチドを含み得る。
【１０２１】
機能的：本明細書で使用されるとき、「機能的」生体分子は、それが特徴付けられる特性および／または活性を示す形態にある、生体分子である。
非相同：本明細書で使用するとき、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ等の非翻訳領域に関する「非相同」という用語は、同一のまたは本明細書のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのコード領域で自然にはみられない、核酸の領域、特に非翻訳核酸を意味する。例えば、相同ＵＴＲは、野生型ＵＴＲ等のｍＲＮＡのコード領域と関連して自然に見られるＵＴＲを表す。
【１０２２】
相同性：本明細書で使用されるとき、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間、および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態において、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である場合、互いに「相同」であると見なされる。いくつかの実施形態において、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同様である場合、互いに「相同」であると見なされる。「相同」という用語は必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を指す。
【１０２３】
本発明に従って、２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも一続きにわたって少なくとも約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一である場合、相同であると見なされる。
【１０２４】
いくつかの実施形態において、相同ポリヌクレオチド配列は、少なくとも４〜５つの固有に指定されるアミノ酸の一続きをコードする能力によって特徴付けられる。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列について、相同性は、少なくとも４〜５つの固有に指定されるアミノ酸の一続きをコードする能力によって特徴付けられる。本発明に従って、２つのタンパク質配列は、タンパク質が、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも一続きにわたって少なくとも約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、または約９０％同一である場合、相同であると見なされる。
【１０２５】
同一性：本明細書で使用されるとき、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、オリゴヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間、および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの算出は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列を整列させることによって行うことができる（例えば、最適なアライメントのために第１および第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的のために非同一配列を無視することができる）。ある特定の実施形態において、比較目的のために整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。対応するヌクレオチド位置におけるヌクレオチドが次いで比較される。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じヌクレオチドによって占有されるとき、その分子は、その位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れながら、配列によって共有される同一位置の数の関数である。２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて遂行することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ
Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１に記載の方法の等を用いて決定することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１−１７）のアルゴリズムを用いて決定することができ、それはＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを用いてＡＬＩＧＮプログラム（第２．０版）に組み込まれている。２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、あるいは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを用いて決定することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般的に用いられる方法には、参照により本明細書に組み込まれるＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に開示の方法が含まれるが、これらに限定されない。同一性を決定するための技法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて成文化されている。２つの配列間の相同性を決定するための例示のコンピュータソフトウェアには、ＧＣＧプログラムパッケージ、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１），３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ、Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３（１９９０））が含まれるが、これらに限定されない。
【１０２６】
遺伝子の発現を阻害する：本明細書で使用されるとき、「遺伝子の発現を阻害する」という表現は、遺伝子の発現産物の量の低減を引き起こすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、または遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドであり得る。典型的に、ｍＲＮＡのレベルの低減は、そこから翻訳されたポリペプチドのレベルの低減をもたらす。発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定するための標準的な技法を用いて決定されてもよい。
【１０２７】
インビトロ：本明細書で使用されるとき、「インビトロ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、または微生物）内ではなく、例えば、試験管または反応槽中、細胞培養物中、ペトリ皿中等の、人工的な環境で生じる事象を指す。
【１０２８】
インビボ：本明細書で使用されるとき、「インビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、もしくは微生物、またはその細胞もしくは組織）内で生じる事象を指す。
単離された：本明細書で使用されるとき、「単離された」という用語は、それが会合された（自然にであるか、実験的設定であるかにかかわらず）構成成分のうちの少なくとも一部から分離された物質または実体を指す。単離された物質は、それが会合した物質に関して様々なレベルの純度を有し得る。単離された物質および／または実体は、それらが最初に会合されたその他の構成成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれよりも多くから分離され得る。いくつかの実施形態において、単離された薬剤は、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超、または約９９％超純粋である。本明細書で使用されるとき、物質は、他の構成成分が実質的にない場合、「純粋」である。実質的に単離される：「実質的に単離される」とは、化合物が、それが形成されたまたは検出された環境から実質的に分離されることを意味する。部分的分離には、例えば、本開示の化合物を豊富に含んだ組成物が含まれ得る。実質的な分離には、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、または少なくとも約９９重量％の本開示の化合物、またはその塩を含有する組成物が含まれ得る。化合物およびそれらの塩を単離するための方法は、当技術分野で通例である。
【１０２９】
リンカー：本明細書で使用されるとき、リンカーは、例えば、１０〜１，０００原子の原子団を指し、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、およびイミン等であるが、これらに限定されない、原子または群からなり得る。リンカーは、第１の末端で核酸塩基または糖部分上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドに、および第２の末端でペイロード、例えば、検出可能な薬剤または治療剤に、結合され得る。リンカーは、核酸配列への組み込みを干渉しないような十分な長さものもであり得る。リンカーは、任意の有用な目的のため、例えば、修飾ｍＲＮＡ多量体（例えば、２つ以上の修飾核酸の連鎖を介して）または修飾ｍＲＮＡ複合体を形成するため、かつ本明細書に記載のペイロードを投与するために使用することができる。リンカーに組み込むことができる化学基の例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルが挙げられるが、これらに限定されず、これらの各々は、本明細書に記載されるように任意に置換され得る。リンカーの例としては、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、エチレンまたはプロピレングリコールモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール）、ならびにデキストランポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、還元剤または光分解を用いて切断され得る、例えば、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）またはアゾ結合（−Ｎ＝Ｎ−）等の、リンカー内の切断可能部分が挙げられるが、これらに限定されない。選択的に切断可能な結合の非限定的な例としては、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、または他の還元剤および／もしくは光分解の使用によって切断され得る、アミド結合、ならびに例えば、酸性または塩基性加水分解によって切断され得る、エステル結合が挙げられる。
【１０３０】
修飾された：本明細書で使用されるとき、「修飾された」とは、本発明の分子の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、および機能的修飾を含む、多くの方式で修飾されてもよい。一実施形態において、本発明のｍＲＮＡ分子は、非天然ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの導入によって修飾される。
【１０３１】
天然に生じる：本明細書で使用されるとき、「天然に生じる」は、人工的補助を伴わずに自然界に存在することを意味する。
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用されるとき、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、所与のリーディングフレーム内に終止コドンを含有しない配列を指す。
【１０３２】
作動可能に連結される：本明細書で使用されるとき、「作動可能に連結される」という表現は、２つ以上の分子、構築物、転写物、実体、部分等の間の機能的結合を指す。
患者：本明細書で使用されるとき、「患者」は、治療を求め得るもしくは治療を必要とし得る、治療を要する、治療を受けている、治療を受けることになる、または特定の疾患もしくは状態のために訓練を受けた専門家の看護下にある、対象を指す。
【１０３３】
任意に置換される：本明細書において、「任意に置換されるＸ」（例えば、任意に置換されるアルキル）という形態の語句は、「Ｘであって、式中、Ｘは、任意に置換される」（例えば、「アルキル、式中、該アルキルは、任意に置換される」）と同等であることが意図される。特長「Ｘ」（例えば、アルキル）自体が任意であることを意味することは意図されない。ペプチド：本明細書で使用されるとき、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長である。
【１０３４】
ペプチド：本明細書で使用されるとき、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長である。
【１０３５】
医薬組成物：「医薬組成物」という表現は、疾患、障害、および／または状態の病因を変化させる組成物を指す。
薬剤的に許容される：「薬剤的に許容される」という表現は、本明細書で、健全な医療判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに好適であり、妥当な便益／危険性比率に見合った、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すように用いられる。
【１０３６】
薬剤的に許容される賦形剤：本明細書で使用されるとき、「薬剤的に許容される賦形剤」という表現は、本明細書に記載の化合物以外のものであり（例えば、活性化合物を懸濁させるまたは溶解させることが可能なビヒクル）、かつ患者において実質的に非毒性および非炎症性である特性を有する、任意の成分を指す。賦形剤には、例えば、粘着防止剤（ａｎｔｉａｄｈｅｒｅｎｔｓ）、酸化防止剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｉｄｓ）、崩壊剤、色素（色）、軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、薄膜形成剤またはコーティング剤、香味剤、着香剤、流動促進剤（流動性促進剤）、滑沢剤、防腐剤、印刷インキ、吸着剤、懸濁化剤または分散化剤、甘味剤、および水和水が含まれてもよい。例示の賦形剤には、次のものが含まれるが、これらに限定されない：ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（第二）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋結合ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微小結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、α化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、ショ糖、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトール。
【１０３７】
薬剤的に許容される塩：本開示は、本明細書に記載の化合物の薬剤的に許容される塩も含む。本明細書で使用されるとき、「薬剤的に許容される塩」は、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換する（例えば、遊離塩基を好適な有機酸と反応させることによって）ことによって親化合物が修飾される、開示される化合物の誘導体を指す。薬剤的に許容される塩の例としては、アミン等の塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸等の酸性残基のアルカリ塩または有機塩等が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリル酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチニン酸塩（ペクチンａｔｅ）、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアネート、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が含まれる。代表的なアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等、ならびにアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等を含むが、これらに限定されない、非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオンが含まれる。本開示の薬剤的に許容される塩には、例えば、非毒性無機酸または有機酸から形成される、親化合物の従来の非毒性塩が含まれる。本開示の薬剤的に許容される塩は、従来の化学方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸型または遊離塩基型を、化学量論的量の適切な塩基または酸と、水中もしくは有機溶媒中で、またはその２つの混合物中で反応させることによって調製することができ、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはブタノール）、またはアセトニトリル等の非水性媒体が好ましい。好適な塩の一覧は、各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８、およびＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，２（１９７７）において見出される。
【１０３８】
薬物動態：本明細書で使用されるとき、「薬物動態」は、生存生物に投与される物質の運命の決定に関わるような、分子または化合物の任意の１つ以上の特性を指す。薬物動態は、吸収、分布、代謝、および排泄の程度および速度を含む、いくつかの領域に分割される。これは、一般的に、ＡＤＭＥと称され、ここで（Ａ）吸収は、物質が血液循環に進入するプロセスであり、（Ｄ）分布は、身体の流体および組織全体にわたる物質の分散または散布であり、（Ｍ）代謝（または生体内変換）は、親化合物の娘代謝産物への不可逆的な変換であり、（Ｅ）排泄（または排除）は、身体からの物質の排除を指す。まれな場合において、いくつかの薬物は、身体組織内に不可逆的に蓄積する。
【１０３９】
薬剤的に許容される溶媒和物：本明細書で使用されるとき、「薬剤的に許容される溶媒和物」という用語は、好適な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれる、本発明の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される投薬量で生理学的に耐性がある。例えば、溶媒和物は、結晶化、再結晶化、または沈殿によって、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液から調製されてもよい。好適な溶媒の例としては、エタノール、水（例えば、一、二、および三水和物）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、ベンジル安息香酸塩等が挙げられる。水が溶媒であるとき、その溶媒和物は、「水和物」と称される。
【１０４０】
物理化学：本明細書で使用されるとき、「物理化学」は、物理特性および／または化学特性のものまたはそれに関わることを意味する。
予防する：本明細書で使用されるとき、「予防する」という用語は、感染、疾患、障害、および／もしくは状態の発症を部分的もしくは完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、および／もしくは状態の１つ以上の症状、特長、もしくは臨床徴候の発症を部分的もしくは完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、および／もしくは状態の１つ以上の症状、特長、もしくは徴候の発症を部分的もしくは完全に遅延させること；感染からの、特定の疾患、障害、および／もしくは状態の進行を部分的もしくは完全に遅延させること；ならびに／または感染、疾患、障害、および／もしくは状態に関連した病理を発症する危険性を減少さることを指す。
【１０４１】
プロドラッグ：本開示は、本明細書に記載の化合物のプロドラッグも含む。本明細書で使用されるとき、「プロドラッグ」は、化学的または物理的変化を経ると治療薬として作用する物質、分子、または実体に属する形態にある、任意の物質、分子、または実体を指す。プロドラッグは、何らかの方式で共有結合されるかまたは隔離され得、哺乳類対象に投与される前、投与されると、または投与された後に、活性薬物を放出するか、または活性薬物部分に変換される。プロドラッグは、化合物中に存在する官能基を、修飾部分が通例の操作でまたはインビボでのいずれかで親化合物へと切断されるような方式で修飾することによって、調製することができる。プロドラッグは、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基が任意の基に結合される化合物であり、それは哺乳類対象に投与されると、切断されてそれぞれ遊離ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基を形成する。プロドラッグの調製および使用は、両方とも参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ，“Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｖｏｌ．１４  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓに、およびＢｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，ｅｄ．Ｅｄｗａｒｄ  Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７で論じられている。
【１０４２】
タンパク質切断部位：本明細書で使用されるとき、「タンパク質切断部位」は、化学的、酵素的、または光化学的手段によってアミノ酸鎖の制御された切断が遂行される部位を指す。
【１０４３】
タンパク質切断シグナル：本明細書で使用されるとき、「タンパク質切断シグナル」は、切断のためにポリペプチドにフラグまたはマークを付ける少なくとも１つのアミノ酸を指す。
【１０４４】
目的とするタンパク質：本明細書で使用されるとき、「目的とするタンパク質」または「所望のタンパク質」という用語は、本明細書に提供されるもの、ならびにそれらの断片、変異体、変異形、および改変体を含む。
【１０４５】
近位：本明細書で使用されるとき、「近位」という用語は、中心の、または目的とする点もしくは領域のより近くに位置することを意味する。
シュードウリジン：本明細書で使用されるとき、シュードウリジンは、ヌクレオシドウリジンのＣ−グリコシド異性体を指す。「シュードウリジン類似体」は、シュードウリジンの任意の修飾、変異形、アイソフォーム、または誘導体である。例えば、シュードウリジン類似体には、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、１−タウリノメチル−シュードウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、１−メチル−４−チオ−シュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）、および２’−Ｏ−メチル−シュードウリジン（ψｍ）が含まれるが、これらに限定されない。
【１０４６】
精製される：本明細書で使用されるとき、「精製する」、「精製される」、「精製」は、実質的に純粋にするか、または望ましくない構成成分、汚染材料、混和物、もしくは不完全性を取り除くことを意味する。
【１０４７】
効果を減少させる：本明細書で使用するとき、症状に関係する場合の「効果を減少させる」という表現は、対象における症状を減少させること、除去すること、または緩和させることを意味する。実際には、症状が完全に除去される、減少される、または緩和されることを意味する必要はない。
【１０４８】
試料：本明細書で使用されるとき、「試料」または「生体試料」という用語は、その組織、細胞、または構成部分の部分集合（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血、尿、膣液、および精液を含むが、これらに限定されない体液）を指す。試料には、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸器管、腸管、および尿生殖器管、涙液、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、器官を含むが、これらに限定されない、全生物、またはその組織、細胞、もしくは構成部分の部分集合、またはその画分もしくは一部分から調製される、ホモジネート、可溶化液、または抽出物がさらに含まれ得る。試料はさらに、タンパク質または核酸分子等の細胞構成成分を含有し得る、栄養ブロスまたはゲル等の培地を指す。
【１０４９】
試料：本明細書で使用されるとき、「試料」または「生体試料」という用語は、その組織、細胞、または構成部分の部分集合（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血、尿、膣液、および精液を含むが、これらに限定されない体液）を指す。試料には、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸器管、腸管、および尿生殖器管、涙液、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、器官を含むが、これらに限定されない、全生物、またはその組織、細胞、もしくは構成部分の部分集合、またはその画分もしくは一部分から調製される、ホモジネート、可溶化液、または抽出物がさらに含まれ得る。試料はさらに、タンパク質または核酸分子等の細胞構成成分を含有し得る、栄養ブロスまたはゲル等の培地を指す。
【１０５０】
シード：マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に関して本明細書にて使用するとき、ｍｉＲＮＡ「シード」は、ｍｉＲＮＡの２〜８位とヌクレオチド同一性を有する配列である。一実施形態において、ｍｉＲＮＡシードは成熟ｍｉＲＮＡの２〜７位を含む。
【１０５１】
副作用：本明細書で使用するとき、「副作用」という表現は、治療の二次的な影響を指す。
シグナルペプチド配列：本明細書で使用されるとき、「シグナルペプチド配列」という表現は、タンパク質の輸送または局在化を指示することができる配列を指す。
【１０５２】
類似性：本明細書で使用されるとき、「類似性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間、および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。ポリマー分子の互いとの類似性パーセントの算出は、同一性パーセントの算出と同様に行うことができるが、当技術分野で理解されるように、類似性パーセントの算出が保存的置換を考慮に入れることを除く。
【１０５３】
分割用量：本明細書で使用されるとき、「分割用量」は、単回単位用量または総１日用量の、２つ以上の用量への分割である。
安定した：本明細書で使用されるとき、「安定した」は、反応混合物から有用な純度で単離後に残存するのに十分に強固であり、好ましくは効果的な治療剤へと製剤可能である、化合物を指す。
【１０５４】
安定化される：本明細書で使用されるとき、「安定化」、「安定化される」、「安定化領域」という用語は、安定させるまたは安定となることを意味する。
対象：本明細書で使用されるとき、「対象」または「患者」という用語は、本発明に従う組成物が、例えば、実験、診断、予防、および／または治療目的のために投与され得る、任意の生物を指す。典型的な対象には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒト等の哺乳動物）および／または植物が含まれる。
【１０５５】
実質的に：本明細書で使用されるとき、「実質的に」という用語は、目的とする特徴または特性の全範囲もしくは程度またはほぼ全範囲もしくは程度を示す、定性的状態を指す。生物学技術分野の専門家であれば、生物学的および化学的現象が、完了するかつ／もしくは完了まで進行する、または絶対的な結果を達成するもしくはそれを回避することは、あってもまれであることを理解するであろう。「実質的に」という用語は、したがって、多くの生物学的および化学的現象に本来的に存在するの完全性の潜在的な欠如を捕捉するように本明細書で使用される。
【１０５６】
実質的に等しい：それが用量間の時差に関するように本明細書で使用されるとき、この用語は、プラス／マイナス２％を意味する。
実質的に同時に：本明細書で使用され、かつそれが複数の用量に関するとき、この用語は、１５秒以内を意味する。
【１０５７】
を患う：疾患、障害、および／または状態「を患う」個体は、疾患、障害、および／もしくは状態であると診断されているか、または疾患、障害、および／もしくは状態の１つ以上の症状を呈する。
【１０５８】
に罹患しやすい：疾患、障害、および／または状態「に罹患しやすい」個体は、疾患、障害、および／もしくは状態であると診断されておらず、かつ／または疾患、障害、および／もしくは状態の症状を呈しないことがあるが、疾患もしくはその症状を発症する傾向を内部に持つ。いくつかの実施形態において、疾患、障害、および／または状態（例えば、癌）に罹患しやすい個体は、次のうちのうちの１つ以上によって特徴付けられ得る：（１）疾患、障害、および／または状態の発症に関連した遺伝子突然変異、（２）疾患、障害、および／または状態の発症に関連した遺伝子多型、（３）疾患、障害、および／または状態に関連したタンパク質および／または核酸の増加したおよび／または減少した発現および／または活性、（４）疾患、障害、および／または状態の発症に関連した習慣および／または生活様式、（５）疾患、障害、および／または状態の家族歴、ならびに（６）疾患、障害、および／または状態の発症に関連した微生物への曝露および／またはその微生物への感染。いくつかの実施形態において、疾患、障害、および／または状態に罹患しやすい個体は、その疾患、障害、および／または状態を発症することになる。いくつかの実施形態において、疾患、障害、および／または状態に罹患しやすい個体は、その疾患、障害、および／または状態を発症することにはならない。
【１０５９】
症状：本明細書で使用するとき、「症状」という用語は、疾患、障害、および／または状態のシグナルである。例えば、症状は、それを有する対象に感じられ得るかまたは気付かれ得るが、対象の外観または挙動を注目しても容易に発見され得ない。症状の例として、限定されないが、衰弱、痛みおよび疼痛、発熱、疲労、体重減少、血液凝固、血中カルシウム濃度の増加、低白血球数、息切れ、眩暈、頭痛、色素沈着過剰、黄疸、紅斑（ｅｒｔｈｅｍａ）、そう痒症、多毛症、排便習慣の変化、膀胱機能の変化、持続性の痛み、口内の白斑、舌の白点、異常出血または分泌、身体の一部の肥厚または塊、消化不良、嚥下困難、疣贅または黒子の変化、新しい皮膚の変化、および持続性の咳または嗄声を挙げることができる。
【１０６０】
合成：「合成」という用語は、人間の手によって生成される、調製される、および／または製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは他の分子の合成は、化学的であっても酵素的であってもよい。
【１０６１】
標的とされる細胞：本明細書で使用されるとき、「標的とされる細胞」は、目的とする任意の１つ以上の細胞を指す。この細胞は、インビトロで、インビボで、インサイツで、または生物の組織もしくは器官内で見つけられ得る。生物は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、最も好ましくは患者であり得る。
【１０６２】
末端領域：本明細書で使用するとき、「末端領域」という用語は、目的とするポリペプチドまたはコード領域をコードする連結ヌクレオシドの領域の５’または３’末端における領域を指す。
【１０６３】
末端最適化：核酸に関する場合の「末端最適化」という用語は、核酸の末端領域が天然末端領域よりも改善することを意味する。
治療剤：「治療剤」という用語は、対象に投与されたときに、治療、診断、および／もしくは予防効果を有し、かつ／または所望の生物学的および／もしくは薬理学的効果を誘発する、任意の薬剤を指す。
【１０６４】
治療上有効量：本明細書で使用されるとき、「治療上有効量」という用語は、疾患、障害、および／または状態を患うか、またはそれらに罹患しやすい対象に投与されたときに、疾患、障害、および／または状態を治療する、その症状を改善する、診断する、予防する、かつ／またはその発症を遅延させるのに十分である、送達対象の薬剤（例えば、核酸、薬物、治療剤、診断剤、予防剤等）の量を意味する。
【１０６５】
治療上有効成果：本明細書で使用されるとき、「治療上有効量」という用語は、疾患、障害、および／または状態を患うか、またはそれらに罹患しやすい対象に投与されたときに、疾患、障害、および／または状態を治療する、その症状を改善する、診断する、予防する、かつ／またはその発症を遅延させるのに十分である、送達対象の薬剤（例えば、核酸、薬物、治療剤、診断剤、予防剤等）の量を意味する。
【１０６６】
総１日用量：本明細書で使用されるとき、「総１日用量」は、２４時間の期間に与えられるまたは処方される量である。それは、単回単位用量として投与されてもよい。
転写因子：本明細書で使用されるとき、「転写因子」という用語は、例えば、転写の活性化または抑制によって、ＤＮＡのＲＮＡへの転写を調節する、ＤＮＡ結合タンパク質を指す。いくつかの転写因子は、転写の調節を単独でもたらす一方で、他の転写因子は、他のタンパク質と協働して作用する。いくつかの転写因子は、ある特定の条件下で、転写の活性化および抑制の両方を行うことができる。一般に、転写因子は、標的遺伝子の調節領域内の特定のコンセンサス配列に非常に類似した、特定の標的配列（単数または複数）に結合する。転写因子は、標的遺伝子の転写を単独でまたは他の分子と複合して調節し得る。
【１０６７】
治療する：本明細書で使用されるとき、「治療する」という用語は、特定の感染、疾患、障害、および／もしくは状態の１つ以上の症状または特徴を、部分的にまたは完全に緩和すること、寛解させること、改善すること、軽減すること、その発症を遅延させること、その進行を阻害すること、その重症度を低減すること、および／またはその発生率を低減することを指す。例えば、癌を「治療する」とは、腫瘍の生存、成長、および／または転移を阻害することを指し得る。治療は、疾患、障害、および／または状態に関連した病理を発症する危険性を減少させる目的のために、疾患、障害、および／もしくは状態の徴候を呈しない対象に、ならびに／または疾患、障害、および／もしくは状態の早期徴候のみを呈する対象に投与されてもよい。
【１０６８】
未修飾：本明細書で使用されるとき、「未修飾」は、任意の方式で変化させられる前の任意の物質、化合物、または分子を指す。未修飾は、生体分子の野生型または天然型を指し得るが、必ずしもそうとは限らない。分子は、一連の修飾を経てもよく、それによって各修飾分子は、その後の修飾のための「未修飾」出発分子としての役目を果たし得る。
均等物および範囲
当業者であれば、ほんの日常的な実験を用いて、本明細書に記載の本発明に従う具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、解明することができる。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるようには意図されず、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されるように限定されることが意図される。
【１０６９】
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」等の冠詞は、それとは反対の指定があるか、または文脈から別途明白でない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。群の１つ以上の構成員の間に「または」を含む特許請求項または記述は、それとは反対の指定があるか、または文脈から別途明白でない限り、その群の構成員のうちの１つ、２つ以上、またはすべてが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、それにおいて用いられるか、あるいはそれと関連性がある場合、満たされると見なされる。本発明は、群の厳密に１つの構成員が所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、それにおいて用いられるか、あるいはそれと関連性のある実施形態を含む。本発明は、群の構成員のうちの１つを超えるものまたはすべてが所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、それにおいて用いられるか、あるいはそれと関連性のある実施形態を含む。
【１０７０】
また、「含む」という用語は、制限がないことが意図され、さらなる要素またはステップの組み込みを許容することに留意する。
範囲が与えられる場合、端点が含まれる。さらに、別途指定されるか、または文脈および当業者の理解から別途明白でない限り、範囲として表される値は、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、本発明の異なる実施形態において定められる範囲内で、その範囲の下限の単位の１０分の１までの任意の具体的な値または部分範囲をとることができることを理解されたい。
【１０７１】
さらに、先行技術の範囲内に該当する本発明の任意の特定の実施形態が、請求項のうちの任意の１つ以上から明示的に除外されてもよいことを理解されたい。そのような実施形態は当業者に既知であるとされるため、その除外が本明細書に明示的に記載されないとしても、それらは除外されてもよい。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の核酸またはそれによってコードされるタンパク質、任意の産生方法、任意の使用方法等）が、先行技術の存在に関連するか否かに関わらず、任意の理由で、任意の１つ以上の請求項から除外され得る。
【実施例】
【１０７２】
実施例１．修飾ｍＲＮＡの産生
本発明に従う修飾ｍＲＮＡは、標準的な実験室方法および材料を用いて作製する。
様々な上流または下流領域（β−グロビン、タグ等）を有するオープンリーディングフレームは、ＤＮＡ２．０（カリフォルニア州メンローパーク）から購入することができ、ＸｂａＩ認識を有する複数のクローニング部位も概して含有する。構築物を受容すると、それが再構築され、化学的にコンピテントな大腸菌に変換され得る。本発明には、ＮＥＢ
ＤＨ５−αコンピテント大腸菌を使用する。典型的なクローンマップは図３に示す。変換は、ＮＥＢの指示に従って、１００ｎｇのプラスミドを用いて行う。プロトコルは次の通りである。
１．  氷上のＮＥＢ  ５−αコンピテント大腸菌細胞の管を１０分間解凍する。
２．  １ｐｇ〜１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを含有する１〜５μＬを細胞混合物に添加する。管を慎重に４〜５回振り、細胞とＤＮＡを混合する。ボルテックスしないこと。
３．  混合物を３０分間氷上に置く。混ぜないこと。
４．  ４２℃で正確に３０秒間熱ショックを与える。混ぜないこと。
５．  ５分間氷上に置く。混ぜないこと。
６．  室温のＳＯＣを９５０μＬピペットで混合物に入れる。
７．  ３７℃で６０分間置く。激しく振盪させる（２５０ｒｐｍ）か、または回転させる。
８．  選択プレートを３７℃に温める。
９．  管を振り、逆さにすることによって完全に細胞を混合する。
１０．  ５０〜１００μＬの各希釈物を選択プレートに広げ、３７℃で一晩インキュベートする。あるいは、３０℃で２４〜３６時間または２５℃で４８時間インキュベートする。
【１０７３】
次いで、単一コロニーを使用し、適切な抗生物質を用いて５ｍＬのＬＢ成長培地を接種し、５時間成長させる（２５０ＲＰＭ、３７℃）。次いで、これを使用して、２００ｍＬの培養培地を接種し、同じ条件下で一晩成長させる。
【１０７４】
プラスミドを単離するために（最大８５０μｇ）、製造業者の指示に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＨｉＰｕｒｅ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州カールスバッド）を用いてマキシプレップを行う。
【１０７５】
インビトロ転写（ＩＶＴ）のためのｃＤＮＡを生成するために、プラスミドを、ＸｂａＩ等の制限酵素を用いてまず線形化する。ＸｂａＩでの典型的な制限消化には、以下が含まれる：プラスミド１．０μｇ；１０倍緩衝液１．０μＬ；ＸｂａＩ１．５μＬ；ｄＨ２０最大１０μＬ；３７℃で１時間のインキュベーション。実験室規模（５μｇ未満）で行う場合、製造業者の指示に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＰＣＲ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、反応物を浄化する。より大規模な精製は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの標準的ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州カールスバッド）等、より大きな充填容量を有する製品を用いて行う必要があり得る。浄化した後、線形化されたベクターを、ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて定量化し、アガロースゲル電気泳動を用いて分析して線形化を確認する。
【１０７６】
非限定的な例として、Ｇ−ＣＳＦは、目的とするポリペプチドを表し得る。実施例１〜５に概説されるステップに使用される配列を、表１１に示す。開始コドン（ＡＴＧ）は、表１１の各配列中に下線で示されていることに留意されたい。
表１６．Ｇ−ＣＳＦ配列  
【１０７７】
【表００１６−１】
2020072766.tif 000319
【１０７８】
【表００１６−２】
2020072766.tif 000320
【１０７９】
実施例２：ｃＤＮＡ産生のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡの調製のためのＰＣＲ手順を、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）による２×ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘを用いて行う。このシステムには、２×ＫＡＰＡ  ＲｅａｄｙＭｉｘ１２．５μＬ、順方向プライマー（１０ｕＭ）０．７５μＬ、逆方向プライマー（１０ｕＭ）０．７５μＬ、鋳型ｃＤＮＡ１００ｎｇ、および２５．０μＬに希釈したｄＨ２０が含まれる。反応条件は、９５℃で５分間、９８℃で２０秒間を２５サイクル、その後５８℃で１５秒間、続いて７２℃で４５秒間、次いで７２℃で５分間、次いで４℃で終了までである。
【１０８０】
本発明の逆方向プライマーは、ｍＲＮＡにおけるポリＡ１２０のためのポリＴ１２０を組み込む。より長いかまたは短いポリ（Ｔ）路を有する他の逆方向プライマーを使用して、ｍＲＮＡにおけるポリ（Ａ）尾部の長さを調節することができる。
【１０８１】
反応物を、製造業者の指示に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＰＣＲ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州カールスバッド）を用いて浄化する（５μｇまで）。より大規模な反応は、より大容量の製品を用いて浄化する必要がある。浄化した後、ｃＤＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）を用いて定量化し、アガロースゲル電気泳動によって分析して、ｃＤＮＡが予測した大きさであることを確認する。次いで、ｃＤＮＡを、シークエンシング分析に出した後に、インビトロ転写反応を進める。
実施例３．インビトロ転写（ＩＶＴ）
インビトロ転写反応により、修飾ヌクレオチドまたは修飾ＲＮＡを含有するｍＲＮＡを生成する。投入するヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）混合物は、天然および非天然のＮＴＰを用いてで自家作製したものである。
【１０８２】
典型的なインビトロ転写反応物には、次のものが含まれる。
１．  鋳型ｃＤＮＡ  １．０μｇ
２．  １０倍転写緩衝液（４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１９０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭスペルミジン）２．０μＬ
３．  カスタムＮＴＰ（２５ｍＭずつ）７．２μＬ
４．  ＲＮａｓｅ阻害剤  ２０Ｕ
５．  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  ３０００Ｕ
６．  ｄＨ２０  最大２０．０μＬ
７．  ３７℃で３時間〜５時間のインキュベーション。
【１０８３】
粗製ＩＶＴ混合物を、翌日の浄化のために４℃で一晩保管され得る。次いで、１ＵのＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅを使用して、元の鋳型を消化させる。３７℃で１５分間のインキュベーションの後、ｍＲＮＡを、製造業者の指示に従ってＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）Ｋｉｔ（テキサス州オースティン）を用いて精製する。このキットは、最大５００μｇのＲＮＡを精製することができる。浄化させた後、ＲＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて定量化し、アガロースゲル電気泳動によって分析して、ＲＮＡが適正な大きさであること、およびＲＮＡの分解が生じていないことを確認する。
実施例４．ｍＲＮＡの酵素キャッピング
ｍＲＮＡのキャッピングを、次のように行い、混合物には、ＩＶＴ  ＲＮＡが６０μｇ〜１８０μｇおよびｄＨ２０が最大７２μＬ含まれる。混合物を、６５℃で５分間インキュベートしてＲＮＡを変性させ、その後すぐに氷上に移す。
【１０８４】
このプロトコルは、次いで、１０倍キャッピング緩衝液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（１０．０μＬ）、２０ｍＭ  ＧＴＰ（５．０μＬ）、２０ｍＭ  Ｓ−アデノシルメチオニン（２．５μＬ）、ＲＮａｓｅ阻害剤（１００Ｕ）、２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）、ワクシニアキャッピング酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）、ｄＨ２０（２８μＬまで）、および６０μｇのＲＮＡについては３７℃で３０分間のインキュベーションまたは１８０μｇのＲＮＡでは最大２時間のインキュベーションを伴う。
【１０８５】
次いで、ｍＲＮＡを、製造業者の指示に従ってＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）Ｋｉｔ（テキサス州オースティン）を用いて精製する。浄化させた後、ＲＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて定量化し、アガロースゲル電気泳動によって分析して、ＲＮＡが適正な大きさであること、およびＲＮＡの分解が生じていないことを確認する。また、配列決定のためのｃＤＮＡを生成するために、ＲＮＡ産物に、逆転写ＰＣＲを実行して配列決定を行ってもよい。
実施例５．ポリＡテーリング反応
ｃＤＮＡにポリＴがない場合、最終産物を浄化する前に、ポリＡテーリング反応を行う必要がある。これは、キャップされたＩＶＴ  ＲＮＡ（１００μＬ）、ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ）、１０倍テーリング緩衝液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（１２．０μＬ）、２０ｍＭ  ＡＴＰ（６．０μＬ）、ポリＡポリメラーゼ（２０Ｕ）、ｄＨ２０最大１２３．５μＬを混合し、３７℃で３０分間インキュベートすることによって行う。ポリＡ尾部が既に転写物中に存在する場合、テーリング反応を省略し、直接ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）ｋｉｔ（最大５００μｇ）での浄化に進んでもよい。ポリＡポリメラーゼは、好ましくは、酵母に発現される組み換え酵素である。
【１０８６】
本明細書において実行および記載される研究においては、ポリＡ尾部は、１６０ヌクレオチド長を含むように、ＩＶＴ鋳型にコードされる。しかしながら、ポリＡテーリング反応の進行性または完全性は、常に正確に１６０個のヌクレオチドをもたらすわけではないことを理解されたい。したがって、約１６０ヌクレオチド、例えば、約１５０〜１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、または１６５のポリＡ尾部は、本発明の範囲内である。
実施例６．天然の５’キャップおよび５’キャップ類似体
修飾ＲＮＡの５’キャッピングは、製造業者のプロトコルに従って、次の化学的ＲＮＡキャップ類似体を用いたインビトロ転写反応の際に付随して完了し得、５’グアノシンキャップ構造が生成される：３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）。修飾ＲＮＡの５’キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を用いて転写後に完了し、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を生成し得る。キャップ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素および２’−Ｏメチルト−ランスフェラーゼの両方を用いて生成され得、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ−２’−Ｏ−メチルが得られる。キャップ２構造は、２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを用いて、５’末端から３番目のヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化の後に、キャップ１構造から生成され得る。キャップ３構造は、２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを用いて、５’末端から４番目のヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化の後に、キャップ２構造から生成され得る。酵素は、好ましくは組み換え源に由来する。
【１０８７】
哺乳動物細胞にトランスフェクトする場合、修飾ｍＲＮＡは、１２〜１８時間、または１８時間を超える、例えば、２４、３６、４８、６０、７２、もしくは７２時間を超える安定性を有し得る。
実施例７．化学的キャップ対酵素的に抽出されたキャップタンパク質発現アッセイ
ＡＲＣＡを含有するヒトＧ−ＣＳＦをコードする合成ｍＲＮＡを、等濃度でヒト初代ケラチノサイトにトランスフェクトすることができる。トランスフェクションの６、１２、２４、および３６時間後に、培養培地に分泌されたＧ−ＣＳＦの量を、ＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。培地中により高レベルのＧ−ＣＳＦを分泌する合成ｍＲＮＡは、より高度は翻訳的にコンピテントなキャップ構造を有する合成ｍＲＮＡに対応する。
実施例８．化学的キャップ対酵素的に抽出されたキャップ純度分析
ＡＲＣＡキャップ類似体またはキャップ１構造の粗製合成産物を含有する、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする合成ｍＲＮＡを、変性アガロース−尿素ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析を用いて、純度について比較することができる。電気泳動により単一の集約された帯域を有する合成ｍＲＮＡは、複数の帯域または筋状の帯域を有する合成ｍＲＮＡと比較して、より高い純度の産物に対応する。単一のＨＰＬＣピークを有する合成ｍＲＮＡもより高い純度の産物に対応する。より高効率のキャッピング反応により、より純粋なｍＲＮＡ集団が得られる。
実施例９．化学的キャップ対酵素的に抽出されたキャップサイトカイン分析
ＡＲＣＡキャップ類似体またはキャップ１構造を含有する、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする合成ｍＲＮＡを、複数の濃度でヒト初代ケラチノサイトにトランスフェクトすることができる。トランスフェクションの６、１２、２４、および３６時間後に、培養培地に分泌されたＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−β等の炎症促進性サイトカインの量を、ＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。培地中により高レベルの炎症促進性サイトカインを分泌する合成ｍＲＮＡは、免疫活性化キャップ構造を有する合成ｍＲＮＡに対応する。
実施例１０．化学的キャップ対酵素的に抽出されたキャップキャッピング反応効率
ＡＲＣＡキャップ類似体またはキャップ１構造を含有する、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする合成ｍＲＮＡを、キャップされたｍＲＮＡのヌクレアーゼ処理の後に、ＬＣ−ＭＳによってキャッピング反応効率について分析することができる。キャップされたｍＲＮＡのヌクレアーゼ処理により、ＬＣ−ＭＳによって検出可能な遊離ヌクレオチドとキャップされた５’−５−トリホスフェートキャップ構造の混合物が得られる。ＬＣ−ＭＳスペクトル上のキャップされた生成物の量は、反応からの全ｍＲＮＡの割合（％）として表すことができ、キャッピング反応効率に対応するであろう。より高いキャッピング反応効率を有するキャップ構造は、ＬＣ−ＭＳにより、より高い量のキャップされた生成物を有するであろう。
実施例１１．修飾ＲＮＡまたはＲＴ  ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動
個々の修飾ＲＮＡ（２０μＬ体積中２００〜４００ｎｇ）または逆転写されたＰＣＲ産物（２００〜４００ｎｇ）を、非変性１．２％アガロースＥ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）のウェルに充填し、製造業者のプロトコルに従って１２〜１５分間泳動させる。
実施例１２．Ｎａｎｏｄｒｏｐ修飾ＲＮＡの定量化およびＵＶスペクトルデータ
ＴＥ緩衝液（１μＬ）中の修飾ＲＮＡを、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＵＶ吸光読み取りに使用して、インビトロ転写反応からの各ＲＮＡの収率を定量化する。
実施例１３．変動するポリＡ尾部長さを含有する修飾ＲＮＡのインビトロ転写
修飾ｍＲＮＡは、ヌクレオチド混合物が修飾ヌクレオチドを含有することを除いては、インビトロ転写のための標準の実験室方法および物質を用いて作成した。本実施例の修飾ｍＲＮＡは５−メチシトシンおよびシュードウリジンを含んだ。目的とする遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、アデノシン類似体を組み込まない修飾ＲＮＡに対するポリＡ尾部の鋳型付加のために、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有する５’非翻訳領域（ＵＴＲ）およびオリゴ（ｄＴ）配列で終結するα−グロビン３’ＵＴＲに隣接する。アデノシン含有修飾ＲＮＡを、転写後ポリ（Ａ）ポリメラーゼポリ（Ａ）尾部を可能にするようにオリゴ（ｄＴ）配列なしで合成される。０ｎｔｓ、８０ｎｔｓ、１２０ｎｔｓ、１６０ｎｔｓのポリＡ尾部長さをヒトＧ−ＣＳＦに対して作成した。Ｇ−ＣＳＦ配列は、ｃＤＮＡ配列（配列番号４２５７）、ｍＲＮＡ配列（配列番号４２５８）、およびタンパク質配列（配列番号４２５９）を含む。Ｇ−ＣＳＦの検出は、順方向プライマーＴＴＧ  ＧＡＣ  ＣＣＴ  ＣＧＴ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＡＡＴ  ＡＣＧ（配列番号４２６０）、鋳型ポリ（Ａ）尾部Ｔ（１２０）ＣＴ  ＴＣＣ  ＴＡＣ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＣＣＡ（配列番号４２６１）のための逆方向プライマー、および転写後ポリ（Ａ）ポリメラーゼ尾部ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＧＣＴ
ＴＴＡ  ＴＴＣ  ＡＡＡ  ＧＡＣ  ＣＡ（配列番号４２６２）のための逆方向プライマーを含む、ｃＤＮＡのためのプライマープローブセットによって実施してもよい。検出はまた、Ｇ−ＣＳＦ修飾核酸分子逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）順方向プライマーＴＧＧ  ＣＣＧ  ＧＴＣ  ＣＣＧ  ＣＧＡ  ＣＣＣ  ＡＡ（配列番号４２６３）および逆方向プライマーＧＣＴ  ＴＣＡ  ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＡＴ（配列番号４２６４）によって実施してもよい。
【１０８８】
合成された逆方向プライマーを設計し、ＩＤＴから計取り寄せた。逆方向プライマーは、ポリＴ４０、ポリＴ８０、ポリＴ１２０、ポリＴ１６０を、それぞれポリＡ４０、ポリＡ８０ポリＡ１２０、およびポリＡ１６０に対して組み込む。ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３を、イーグル基礎培地（ＥＭＥＭ）および１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中にて８０〜９０％のコンフルエンスに達するまで育成した。およそ８０，０００個の細胞を、２４ウェルプレート中において、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）のＲＮＡｉＭａｘと複合体化した１００ｎｇおよび５００ｎｇの修飾ＲＮＡでトランスフェクトした。ＲＮＡ：ＲＮＡｉＭａｘ複合体を、５倍体積測定希釈中にて室温で１０分間、ＥＭＥＭによってＲＮＡｉＭａｘを最初にインキュベートすることよって形成した。
【１０８９】
次いで、ＲＮＡのバイアルをＲＮＡｉＭＡＸ（商標）のバイアルと混合し、室温で２０〜３０インキュベートした後、滴下方式で細胞に添加した。遺伝子組換えヒトＧ−ＣＳＦを２ｎｇ／ｍＬで対照細胞培養ウェルに添加した。分泌されたヒトＧ−ＣＳＦの濃度をトランスフェクションの１２時間後に測定した。図４は、以下の可動ポリＡ尾部長さ：０ｎｔｓ、８０ｎｔｓ、１２０ｎｔｓ、１６０ｎｔｓを有していたヒトＧ−ＣＳＦ修飾ＲＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からのヒトＧ−ＣＳＦに対する、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）についてのヒストグラムを示す。１６０ｎｔｓのポリＡ尾部にてタンパク質発現の増加が確認された。
【１０９０】
データより、より長いポリＡ尾部がより多くのタンパク質を産生し、この活性は用量依存性であることを判定することができる。
実施例１４．マイクロＲＮＡ結合部位を有する修飾核酸の発現
ヒト胎児由来腎臓上皮細胞（ＨＥＫ２９３Ａ）および一次ヒト肝細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）を、１ウェルあたり２００，０００個の細胞密度にて５００μｌの細胞培地（Ｃｅｌｓｉｓ（イリノイ州シカゴ）のＩｎＶｉｔｒｏ  ＧＲＯ培地）中に播種した。α−グロビン３’ＵＴＲを有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  α）（ｃＤＮＡ配列は配列番号４２６５に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号４２６６に示される；配列に示されていないおよそ１６０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよびシュードウリジンで完全修飾されている）、α−グロビン３’ＵＴＲおよびｍｉＲ−１２２結合部位を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１２２）（ｃＤＮＡ配列は配列番号４２６７に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号４２６８に示される；配列に示されていないおよそ１６０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよびシュードウリジンで完全修飾されている）、またはシード欠失した４つのｍｉＲ−１２２結合部位を伴うα−グロビン３’ＵＴＲを有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（シードなしＧ−ＣＳＦ）（ｃＤＮＡ配列は配列番号４２６９に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号４２７０に示される；配列に示されないおよそ１６０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよびシュードウリジンで完全修飾されている）を、２４ウェルプレートにて１ウェルにつき２５０ｎｇの濃度で試験した。Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡによって測定し、結果を表１７に示す。
表１７．ｍｉＲ−１２２結合部位  
【１０９１】
【表００１７】
2020072766.tif 000321
【１０９２】
ＨＥＫ２９３細胞はｍｉＲ−１２２を発現しないので、ｍｉＲ−１２２を含有する配列由来のＧ−ＣＳＦタンパク質の発現低下は存在しなかった。ところが、ヒト肝細胞は高レベルのｍｉＲ−１２２を発現し、Ｇ−ＣＳＦ配列がｍｉＲ−１２２標的配列を含有したとき、Ｇ−ＣＳＦタンパク質の劇的な発現低下が観察された。結果として、ｍＲＮＡは栄養要求性ｍＲＮＡとして機能した。
実施例１５．シュードウリジンおよびＮ１−メチル−シュードウリジンの対象のＳＡＲ
ピリミジンヌクレオシドシュードウリジンへの最近の注目に伴い、一連の構造活性研究は、シュードウリジンまたはＮ１−メチル−シュードウリジン（ｐｓｅｕｄｏｕｒｄｉｎｅ）への修飾を含むｍＲＮＡを研究するように設計された。
【１０９３】
本研究は、Ｎ１位、Ｃ６位、２−位、４−位において、およびリン酸骨格上で修飾が行われる場合の、鎖長の効果、増加した親油性、環構造の存在、および疎水性または親水性相互作用の変化を調査するために設計された。安定性も研究する。
【１０９４】
この目的のため、アルキル化、シクロアルキル化、アルキル−シクロアルキル化、アリール化、アルキル−アリール化、アミノ基を有するアルキル化部分、カルボン酸基を有するアルキル化部分、ならびにアミノ酸荷電部分を含むアルキル化部分、を含む修飾を研究する。アルキル化の程度は、概して、Ｃ１〜Ｃ６である。化学修飾の例には、表１８および表１９に示されるものが挙げられる。
表１８．シュードウリジンおよびＮ１-メチルシュードウリジンＳＡＲ  
【１０９５】
【表００１８】
2020072766.tif 000322
【１０９６】
表１９．シュードウリジンおよびＮ１-メチルシュードウリジンＳＡＲ  
【１０９７】
【表００１９−１】
2020072766.tif 000323
【１０９８】
【表００１９−２】
2020072766.tif 000324
【１０９９】
【表００１９−３】
2020072766.tif 000325
【１１００】
実施例１６．天然および非天然ヌクレオシドの組み込み
天然および非天然ヌクレオシドを、目的とするポリペプチドをコードするｍＲＮＡ内に組み込む。これらの例を表２０および２１に示す。ある特定の市販のヌクレオシドトリホスフェート（ＮＴＰ）を本発明のポリヌクレオチド中で研究する。これらの選択肢を表２０に示す。次いで、結果として得られるｍＲＮＡを、タンパク質を産生する、サイトカインを誘導する、および／または治療的成果を生じるその能力について検査する。
表２０．天然および非天然ヌクレオシド  
【１１０１】
【表００２０】
2020072766.tif 000326
【１１０２】
表２１．非天然ヌクレオシドトリホスファターゼ  
【１１０３】
【表００２１】
2020072766.tif 000327
【１１０４】
実施例１７．核酸塩基および炭水化物（糖）に対する修飾の組み込み
天然および非天然ヌクレオシドを、目的とするポリペプチドをコードするｍＲＮＡ内に組み込む。核酸塩基および炭水化物（糖）の両方に対する修飾を有する市販のヌクレオシドおよびＮＴＰを、ｍＲＮＡ内に組み込まれ、タンパク質を産生し、サイトカインを誘導し、かつ／または治療的成果を生み出すその能力について検査する。これらのヌクレオシドの例を表２２および２３に示す。
表２２．組み合わせ修飾  
【１１０５】
【表００２２】
2020072766.tif 000328
【１１０６】
表２３．天然の組み合わせ  
【１１０７】
【表００２３】
2020072766.tif 000329
【１１０８】
本表内において、「ＵＴＰ」はウリジントリホスフェートの略であり、「ＧＴＰ」はグアノシントリホスフェートの略であり、「ＡＴＰ」はアデノシントリホスフェートの略であり、「ＣＴＰ」はシトシントリホスフェートの略であり、「ＴＰ」はトリホスフェートの略であり、「Ｂｚ」はベンジルの略である。
実施例１８．シグナル配列交換研究
ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）をコードするｍｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ配列は配列番号４２５８に示される；約１６０ヌクレオチドのポリＡ尾部は配列内に示されない；５’キャップ、キャップ１）の複数の変異体を、修飾ヌクレオチドシュードウリジンおよび５−メチルシトシン（シュード−Ｕ／５ｍＣ）を用いて合成した。これらの変異体には、野生型Ｎ末端分泌シグナルペプチド配列（ＭＡＧＰＡＴＱＳＰＭＫＬＭＡＬＱＬＬＬＷＨＳＡＬＷＴＶＱＥＡ；配列番号４２７１）、非分泌シグナルペプチド配列、または他のｍＲＮＡから得た分泌シグナルペプチド配列のいずれかをコードするＧ−ＣＳＦ構築物が含まれた。これらは、野生型Ｇ−ＣＳＦシグナルペプチド配列がヒトα−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）（ＭＭＰＳＳＶＳＷＧＩＬＬＬＡＧＬＣＣＬＶＰＶＳＬＡ；配列番号４２７２）、ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）（ＭＱＲＶＮＭＩＭＡＥＳＰＳＬＩＴＩＣＬＬＧＹＬＬＳＡＥＣＴＶＦＬＤＨＥＮＡＮＫＩＬＮＲＰＫＲ；配列番号４２７３）、ヒトプロラクチン（Ｐｒｏｌａｃ）（ＭＫＧＳＬＬＬＬＬＶＳＮＬＬＬＣＱＳＶＡＰ；配列番号４２７４）、またはヒトアルブミン（Ａｌｂ）（ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ；配列番号４２７５）のいずれかのシグナルペプチド配列で置換された配列を含んでいた。
【１１０９】
各Ｇ−ＣＳＦ変異体をコードする２５０ｎｇの修飾ｍＲＮＡを、１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、各ウェルが３００，０００の細胞を含有する２４ウェルプレートにおいてＨＥＫ２９３Ａ（表中２９３Ａ）、マウス筋芽細胞（表中ＭＭ）（Ｃ２Ｃ１２、ＣＲＬ−１７７２、ＡＴＣＣ）、およびラット筋芽細胞（表中ＲＭ）（Ｌ６株、ＣＲＬ−１４５８、ＡＴＣＣ）の細胞株にトランスフェクトした。上清を２４時間後に収集し、分泌されたＧ−ＣＳＦタンパク質を、ヒトＧ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＥＬＩＳＡによって分析した。表２４に示されるデータは、アルブミンシグナルペプチドをコードするＧ−ＣＳＦ  ｍｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞が、その野生型対応物よりも少なくとも１２倍多くのＧ−ＣＳＦタンパク質を分泌することを示す。
表２４．シグナルペプチド交換  
【１１１０】
【表００２４】
2020072766.tif 000330
【１１１１】
実施例１９．３’非翻訳領域
３’ＵＴＲを隣接する領域に提供し得る。複数の３’ＵＴＲが隣接する領域に含まれていてもよく、同じ配列または異なる配列であってもよい。何も含まない場合も含め、隣接する領域の任意の部分はコドン最適化されていてもよく、いずれも１つ以上の異なる構造的または化学的修飾を、コドン最適化の前および／または後に、独立して含有することができる。
【１１１２】
本発明の３’非翻訳領域のリストが表７に示される。Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧを含む１つ以上のヌクレオチドが終端に添加されるかまたは除去される、３’ＵＴＲの変異形が有用であり得る。
実施例２０．ポリヌクレオチド輸送の変化：ＮＬＳおよびＮＥＳ
本発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得る２つの核外輸送シグナル（ＮＥＳ）として、Ｍｕｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ（Ｔｒａｆｆｉｃ，２００９，１０：５１４−５２７）に報告されるものが挙げられ、これらは遺伝子ＣＯＭＭＤ１を介するシグナル伝達と関連する。これらは、ＮＥＳ１、ＰＶＡＩＩＥＬＥＬ（配列番号４２７６）およびＮＥＳ２、ＶＮＱＩＬＫＴＬＳＥ（配列番号４２７７）である。
【１１１３】
核局在化シグナルもまた使用され得る。ある１つのそのような配列は、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４２７８）である。
細胞株またはマウスに、コードされたＮＬＳまたはＮＥＳを有する１つ以上のポリヌクレオチドを投与する。投与の際、ポリヌクレオチドは代替的な位置、例えば、ＮＬＳを用いる核内へ輸送される。ＮＬＳを有するポリペプチドは、生存シグナルまたは死のシグナルのいずれかを核の微小環境に送達するであろう核に送達されるであろう。核に局在化され得るポリペプチドは、細胞、組織、または生物体に対する治療上有益な方法で細胞の発現プロファイルを変化させるように機能し得るＤＮＡのための、変化した結合特性を有するものを含む。
【１１１４】
一実験において、ポリヌクレオチドは、Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（Ｔｒａｆｆｉｃ
２００９；１０：５１４−５２７）およびｖａｎ  ｄｅ  Ｓｌｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ，（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１０；１２０（６）：２１１９−２１３０）に従ってＣＯＭＭＤ１  ｍｕｔ１／ｍｕｔ２＋ＮＬＳ（例えば、両方の分裂したＮＥＳシグナル＋加えられたＮＬＳ）をコードする。シグナル配列はポリペプチドまたは翻訳不可能な組換え配列をコードし得る。コードされたシグナル配列はＨＩＦ１−αと相互作用して、癌細胞のトランスクリトーム（ｔｒａｎｓｃｒｉｔｏｍｅ）を変化させるであろう。
【１１１５】
実験は正常条件下および低酸素条件下において繰り返される。
一度特定されると、ＨＩＦ１−α依存性ポリヌクレオチドを癌細胞株中で試験し、クローン生存またはアポトーシスのマーカーを測定し、対照または偽治療細胞と比較する。
実施例２１．ポリヌクレオチドにおけるセンサー配列として有用なｍｉＲＮＡ結合部位（ＢＳ）
ｍｉＲＮＡ結合部位を、特異的細胞（正常細胞および／または癌細胞）に対する細胞傷害性または細胞保護的ｍＲＮＡ治療薬を目的とする、ｍＲＮＡ治療薬の３’ＵＴＲにおいて使用する。
【１１１６】
強力なアポトーシスシグナル（すなわち、ＡＩＦｓｈアポトーシス誘発因子短アイソフォーム）をポリペプチドまたは「シグナル」としてコードし、ｍｉｒ−１２２ａのため等の一連の３’ＵＴＲ  ｍｉＲ結合部位結合部位と共にコードする。これは、ポリヌクレオチドを、正常細胞細胞よりも癌細胞において相対的にさらに安定させるであろう。
【１１１７】
癌細胞株が特定のｍｉＲ特徴を有する、癌肝細胞株対正常肝細胞株を比較する実験をインビトロで実施する。ＳＮＵ４４９またはＨＥＰ３Ｂ（ヒト由来ＨＣＣ細胞株）の両方が「検出不可能なｍｉＲ−１２２ａ」を有すると示されているが、正常肝細胞は非常に高いｍｉＲ−１２２ａレベルを有するはずであるため、これらを使用する。まず、ＡＩＦｓｈポリヌクレオチドに感受性がある（すなわち、アポトーシスをもたらす）癌細胞を選択する。
【１１１８】
３つのｍｉＲ−１２２ａ結合部位をＡＩＦｓｈについてｍＲＮＡ配列の３’ＵＴＲにてコードし、試験群は、２つの細胞株（正常肝細胞、ＳＮＵ４４９またはＨＥＰ３Ｂ）×５処置群（媒体単独、ポリヌクレオチド翻訳不可能群、ポリヌクレオチドＡＩＦｓｈ群（３’ＵＴＲ中にｍｉＲ  ＢＳなし）、３’ＵＴＲ［ｍｉＲ１２２ａ  ＢＳ×３］−ポリヌクレオチド翻訳不可能群、３’ＵＴＲ［ｍｉＲ１２２ａ  ＢＳ×３］−ポリヌクレオチドＡＩＦｓｈ）を含む。
【１１１９】
期待される結果は、任意の３’ＵＴＲ−ｍｉＲ１２２ａ  ＢＳの非存在下における、正常細胞株および癌細胞株（ＨＥＰ３ＢまたはＳＮＵ４４９）の両方でのポリヌクレオチドＡＩＦｓｈの表面における有意なアポトーシスであろう。しかしながら、３’ＵＴＲ［ｍｉＲ１２２ａ  ＢＳ×３］−ポリヌクレオチドＡＩＦｓｈの表面における、正常細胞株対癌細胞株の相対的なアポトーシスに有意な差。
【１１２０】
効果の可逆性が、癌細胞株に対するｍｉＲ１２２ａの同時投与で示されている（例えば、癌細胞株へと戻るｍｉＲ１２２ａ活性のいくつかの伝達を介する）。
次いで、インビボでの動物試験を本明細書に開示されたモデルのいずれか、または市販の正所性ＨＣＣモデルを用いて実施する。
実施例２２．ポリヌクレオチドの研究のための細胞株
本発明のまたは国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／６９６１０号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のポリヌクレオチドを含む本発明のポリヌクレオチドおよび製剤が、多くの癌細胞株または正常細胞株において調査され得る。本発明において有用な細胞株はＡＴＣＣ（ヴァージニア州マナッサス）の細胞株を含み、表２５に列挙される。
表２５．細胞株  
【１１２１】
【表００２５−１】
2020072766.tif 000331
【１１２２】
【表００２５−２】
2020072766.tif 000332
【１１２３】
【表００２５−３】
2020072766.tif 000333
【１１２４】
【表００２５−４】
2020072766.tif 000334
【１１２５】
【表００２５−５】
2020072766.tif 000335
【１１２６】
【表００２５−６】
2020072766.tif 000336
【１１２７】
【表００２５−７】
2020072766.tif 000337
【１１２８】
【表００２５−８】
2020072766.tif 000338
【１１２９】
【表００２５−９】
2020072766.tif 000339
【１１３０】
【表００２５−１０】
2020072766.tif 000340
【１１３１】
【表００２５−１１】
2020072766.tif 000341
【１１３２】
【表００２５−１２】
2020072766.tif 000342
【１１３３】
【表００２５−１３】
2020072766.tif 000343
【１１３４】
実施例２３．ＲＮＡ結合タンパク質
ＲＮＡ結合タンパク質はタンパク質として、および／またはそのようなタンパク質をコードする核酸として提供され得る。ＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡ安定性およびタンパク質翻訳の調節において多数の役割を果たす。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ結合タンパク質は、本発明の要素を有するタンパク質および／または核酸形態で提供される。そのようなＲＮＡ結合タンパク質として、限定されないが、表２６に列挙されるもの（ＥＮＳＧ数に加えて、対応遺伝子および１つ以上のＥＮＳＴ数の同定、各々の転写性の変異形の特定）が挙げられる。
表２６．ＲＮＡ結合タンパク質  
【１１３５】
【表００２６−１】
2020072766.tif 000344
【１１３６】
【表００２６−２】
2020072766.tif 000345
【１１３７】
【表００２６−３】
2020072766.tif 000346
【１１３８】
【表００２６−４】
2020072766.tif 000347
【１１３９】
【表００２６−５】
2020072766.tif 000348
【１１４０】
【表００２６−６】
2020072766.tif 000349
【１１４１】
【表００２６−７】
2020072766.tif 000350
【１１４２】
【表００２６−８】
2020072766.tif 000351
【１１４３】
【表００２６−９】
2020072766.tif 000352
【１１４４】
【表００２６−１０】
2020072766.tif 000353
【１１４５】
【表００２６−１１】
2020072766.tif 000354
【１１４６】
【表００２６−１２】
2020072766.tif 000355
【１１４７】
【表００２６−１３】
2020072766.tif 000356
【１１４８】
【表００２６−１４】
2020072766.tif 000357
【１１４９】
【表００２６−１５】
2020072766.tif 000358
【１１５０】
【表００２６−１６】
2020072766.tif 000359
【１１５１】
【表００２６−１７】
2020072766.tif 000360
【１１５２】
【表００２６−１８】
2020072766.tif 000361
【１１５３】
【表００２６−１９】
2020072766.tif 000362
【１１５４】
【表００２６−２０】
2020072766.tif 000363
【１１５５】
【表００２６−２１】
2020072766.tif 000364
【１１５６】
【表００２６−２２】
2020072766.tif 000365
【１１５７】
【表００２６−２３】
2020072766.tif 000366
【１１５８】
【表００２６−２４】
2020072766.tif 000367
【１１５９】
【表００２６−２５】
2020072766.tif 000368
【１１６０】
【表００２６−２６】
2020072766.tif 000369
【１１６１】
【表００２６−２７】
2020072766.tif 000370
【１１６２】
【表００２６−２８】
2020072766.tif 000371
【１１６３】
【表００２６−２９】
2020072766.tif 000372
【１１６４】
【表００２６−３０】
2020072766.tif 000373
【１１６５】
【表００２６−３１】
2020072766.tif 000374
【１１６６】
ＨｕＲは安定化ＡＲＥＢＰである。目的とするｍＲＮＡの安定性を増加させるために、ＨｕＲをコードするｍＲＮＡは目的とするｍＲＮＡと共に細胞内または組織内へ同時導入され得るか、または同時注入され得る。これらのタンパク質はまた、目的とするｍＲＮＡにインビトロで繋留することができ、その後細胞へ共に投与することができる。ポリＡ尾部結合タンパク質（ＰＡＢＰ）は真核細胞翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇと相互作用して、翻訳開始を刺激する。これらのＲＢＰをコードするｍＲＮＡとｍＲＮＡ薬剤との同時投与、および／またはこれらのタンパク質とｍＲＮＡ薬剤のインビトロでの繋留、ならびにタンパク質結合ｍＲＮＡの細胞内への投与は、ｍＲＮＡの翻訳効率を増加させる。同一のコンセプトは、ＲＮＡ安定性および／または翻訳効率に影響する、様々な翻訳因子および促進因子をコードするｍＲＮＡとｍＲＮＡのと同時投与、ならびにタンパク質それら自身とｍＲＮＡとの同時投与にまで渡り得る。
実施例２４．マイクロＲＮＡ結合部位を有する修飾核酸の発現
ヒト胎児由来腎臓上皮細胞（ＨＥＫ２９３Ａ）、抗原提示細胞、または単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）、もしくはＰＢＭＣ等の高発現したｍｉｒ−１４２／１４６を有する細胞株を、１ウェルあたり２００，０００の密度にて５００μｌの細胞培地（Ｃｅｌｓｉｓ（イリノイ州シカゴ）のＩｎＶｉｔｒｏ  ＧＲＯ培地）中に播種した。Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ配列は配列番号４２５８に示される；配列に示されていない少なくとも１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−５ｐ）（ｃＤＮＡ配列は配列番号４９８５に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号４９８６に示され、配列にしめされていない少なくとも１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位由来のシード配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−５ｐ−シード）（ｃＤＮＡ配列は配列番号４９８７に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号４９８８に示される；配列に示されていない少なくとも１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、シード配列を有しないでｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−５ｐ−シードレス）（ｃＤＮＡ配列は配列番号４９８９に示され、ｍＲＮＡ配列は配列番号４９９０に示される；配列に示されていない少なくとも１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−３ｐ）（ｃＤＮＡ配列は配列番号４９９１に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号４９９２に示される；配列に示されていない少なくとも１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位由来のシード配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−３ｐ−シード）（ｃＤＮＡ配列は配列番号４９９３に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号４９９４に示される；配列に示されていない少なくとも１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、シード配列を有しないが、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−３ｐ−シードレス）（ＤＮＡ配列は配列番号４９９５に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号４９９６に示される；配列に示されていない少なくとも１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、ｍｉＲ−１４６ａ結合部位を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４６ａ）（ｃＤＮＡ配列は配列番号４９９７に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号４９９８に示される；配列に示されていない少なくとも１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、ｍｉＲ−１４６ａ結合部位由来のシード配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４６ａ−シード）（ｃＤＮＡ配列は配列番号４９９９に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号５０００に示される；配列に示されていない少なくとも１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、また���シード配列を有しないが、ｍｉＲ−１４６ａ結合部位を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４６ａ−シードレス）（ｃＤＮＡ配列は配列番号５００１に示される；ｍＲＮＡ配列は配列番号５００２に示される；配列に示されていない少なくともヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）が、１ウェルあたり２５０ｎｇの濃度にて２４ウェルプレート中に播種される。ｍＲＮＡ配列を、５−メチルシチジンおよびシュードウリジンで完全修飾されているもの、５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されているもの、シュードウリジンで完全修飾されているもの、１−メチルシュードウリジンで完全修飾されているものを含む、本明細書に記載の、および／または当該技術分野において既知の様々な化学修飾で評価し、ここでウリジン残基の２５％が２−チオウリジンで修飾され、シトシン残基の２５％が５−メチルシチジンで修飾される。各試料におけるＧ−ＣＳＦの発現はＥＬＩＳＡによって測定される。
【１１６７】
上に記載のｍｉＲ結合部位を有するＤＮＡおよびｍＲＮＡ  Ｇ−ＣＳＦ配列が表２７に示される。表において、各配列の開始コドンには下線を引いている。
表２７．結合部位を有するＧ−ＣＳＦ  
【１１６８】
【表００２７−１】
2020072766.tif 000375
【１１６９】
【表００２７−２】
2020072766.tif 000376
【１１７０】
【表００２７−３】
2020072766.tif 000377
【１１７１】
【表００２７−４】
2020072766.tif 000378
【１１７２】
【表００２７−５】
2020072766.tif 000379
【１１７３】
【表００２７−６】
2020072766.tif 000380
【１１７４】
【表００２７−７】
2020072766.tif 000381
【１１７５】
【表００２７−８】
2020072766.tif 000382
【１１７６】
【表００２７−９】
2020072766.tif 000383
【１１７７】
【表００２７−１０】
2020072766.tif 000384
【１１７８】
【表００２７−１１】
2020072766.tif 000385
【１１７９】
結合部位「シード」配列はｍｉｒｃｏＲＮＡ結合を誘導するのに充分なようであり、Ｇ−ＣＳＦの発現は、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ−シード、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ−シード、ｍｉＲ−１４６ａ、またはｍｉＲ−１４６ａ−シードをトランスフェクトされた細胞内で発現低下するはずである。一方で、ｍｉＲ−１４２−３ｐ−シードレス、ｍｉＲ−１４２−５ｐ−シードレス、ｍｉＲ−１４６ａ−シードレスは、マイクロＲＮＡ結合部位を有しないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡをトランスフェクトされた細胞と比較して、Ｇ−ＣＳＦの発現を変化させ得ない。
実施例２５．修飾核酸媒介免疫刺激を抑制するＡＰＣ特異的マイクロＲＮＡ結合部位
マイクロＲＮＡに対する結合部位を、免疫細胞においてｍＲＮＡ治療薬を選択的に分解するｍＲＮＡ治療薬の３’ＵＴＲにおいて使用して、ｍＲＮＡ治療薬送達によって引き起こされる望まれない免疫原性応答を抑制する。
【１１８０】
ｍｉｒ−１４２−５ｐ、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉｒ−１４６ａ−５ｐ、およびｍｉｒ−１４６ａ−３ｐ等の、限定されないが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）において本発明の核酸またはｍＲＮＡをより不安定にさせる一連の３’ＵＴＲ  ｍｉＲ結合部位を含むポリヌクレオチドは、本発明のオンコロジー関連ポリペプチドをコードする。シグナルセンサーポリヌクレオチドを不安定にさせる３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ結合部位の添加は、修飾ｍＲＮＡ媒介免疫刺激を抑制するであろう。
【１１８１】
ＡＰＣ特異的マイクロＲＮＡ特徴を有するポリペプチドによって誘導されたサイトカイン発現（例えば、ＴＮＦ−α）と、そのような特徴を有しないものとを比較する実験は、本明細書に記載の方法、および／または当該技術分野において既知の方法によってインビトロで実施される。
実施例２６．ｍｉＲ結合部位を有するｍＲＮＡのインビトロ発現
ヒト胎児腎臓上皮細胞（ＨＥＫ２９３Ａ）、抗原提示細胞、または単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）、もしくはＰＢＭＣ等の高発現したｍｉｒ−１４２／１４６を有する細胞株を、１ウェルあたり２００，０００個の密度にて５００μｌの細胞培地（Ｃｅｌｓｉｓ（イリノイ州シカゴ）のＩｎＶｉｔｒｏ  ＧＲＯ培地）中に播種する。培養された細胞を、実施例２４に記載のようなマイクロＲＮＡ特徴を有するまたは有しないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡでトランスフェクトする。細胞は、５日間連続でトランスフェクトする。トランスフェクション複合体を、各回のトランスフェクションの４時間に取り出す。
【１１８２】
培養上清を、製造業者のプロトコルに従って毎日ＥＬＩＳＡによりトランスフェクション後に、分泌されたＧ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログＤＣＳ５０）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、およびインターフェロンα（ＩＦＮ−αについてアッセイする。細胞を、初回トランスフェクションの６時間および１８時間後に、ならびにその後は１日おきに、ＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ  ＧＬＯ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７０）用いて生存率について分析する。収集した細胞と同時に、全ＲＮＡを単離し、製造業者のプロトコルに従ってＲＮＡＥＡＳＹマイクロキット（カタログ番号７４００４）を用いてＤＮＡＳＥ（登録商標）で処理する。１００ｎｇの全ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３６８８１４）を用いてｃＤＮＡ合成に使用する。次いで、ｃＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＢｉｏｒａｄ  ＣＦＸ  ３８４機器においてＳｙｂｒＧｒｅｅｎを用いて定量的リアルタイムＰＣＲによって自然免疫応答遺伝子の発現について分析する。
実施例２７．自然免疫応答研究のインビボ検出
核酸またはｍＲＮＡタンパク質発現、およびインビボでの免疫応答を試験するため、メスのＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝５）に、実施例２４に記載のようなマイクロＲＮＡ特徴を有するまたは有しないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡを筋肉内に注射する。血液を投与の８時間後に収集する。Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−αのタンパク質レベルをＥＬＩＳＡによって決定する。
【１１８３】
サイトカイン酸性の差異は血清中のマウスＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−αレベルによる測定の際に見られる。ｍｉＲ−１４２、およびｍｉＲ−１４６ａ結合部位または結合部位シードを有するＧ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡの注射はインビボでのより低いサイトカイン反応を示す。
実施例２８．一次幹細胞におけるｍｉＲ−１２２の発現
ラットおよびヒト一次幹細胞における幹細胞特異的ｍｉＲ−１２２レベルを測定した。Ｈｅｌａ細胞、ならびに一次ラットおよびヒト幹細胞を培養し、ＲＮＡを細胞可溶化物から抽出した。ラットおよびヒト一次幹細胞におけるｍｉＲ−１２２レベルを、Ｈｅｌａ細胞におけるレベルと比較した。ｍｉＲ−１２２レベルは、Ｈｅｌａ細胞におけるレベルと比較してそれぞれ、一次ヒト幹細胞において約６倍、一次ラット幹細胞において約１２倍増加している。
実施例２９．ｍｉＲ−１２２結合部位を有する修飾核酸の、肝細胞における発現
一次ラットおよびヒト肝細胞、ならびにＨｅｌａ細胞を、１ウェルあたり２００，０００個の細胞密度にて５００μｌの細胞培地（Ｃｅｌｓｉｓ（イリノイ州シカゴ）のＩｎＶｉｔｒｏ  ＧＲＯ培地）中に播種した。ｍｉＲ−１２２３’ＵＴＲにおいて結合部位を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１２２−１Ｘ）（ｍＲＮＡ配列は配列番号４２６８に示される；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、５−メチルシチジンおよびシュードウリジン（５ｍＣ／ｐＵ）で完全修飾されたもの、またはシュードウリジン（ｐＵ）もしくはシードを欠失した４つのｍｉＲ−１２２結合部位を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡで完全修飾されたもの（シードなしＧ−ＣＳＦ）（ｍＲＮＡ配列は配列番号４２７０に示される；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、５−メチルシチジンおよびシュードウリジン（５ｍＣ／ｐＵ）で完全修飾されたもの、またはシュードウリジン（ｐＵ）で完全修飾されたものを、２４ウェルプレートにて１ウェルにつき２５０ｎｇの濃度で試験した。トランスフェクションの２４時間後に、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡによって測定し、結果を表２８に示す。
表２８．Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉｒ１２２発現  
【１１８４】
【表００２８】
2020072766.tif 000386
【１１８５】
実施例３０．肝細胞におけるｍｉｒ−１２２結合部位を有する修飾核酸の発現
翻訳抑制および／または標的メッセンジャーＲＮＡの分解によるマイクロＲＮＡ対照遺伝子発現。Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡを含有するＭｉｒ−１２２結合部位を、肝臓細胞において翻訳的に調節した。
【１１８６】
一次ラットおよびヒト肝細胞、ならびにＨｅｌａ細胞を、１ウェルあたり２００，０００個の細胞密度にて５００μｌの細胞培地（Ｃｅｌｓｉｓ（イリノイ州シカゴ）のＩｎＶｉｔｒｏ  ＧＲＯ培地）中に播種した。５−メチルシチジンおよびシュードウリジン（５ｍＣ／ｐＵ）で完全修飾された、Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦα）（ｍＲＮＡ配列は配列番号４２６６に示される；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、５−メチルシチジンおよびシュードウリジン（５ｍｃ／ｐＵ）で完全修飾された、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２結合部位を有するＧ−ＣＳＦ
ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１２２−１Ｘ）（ｍＲＮＡ配列は配列番号４２６８に示されない；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、または５−メチルシチジンおよびシュードウリジン（５ｍＣ／ｐＵ）で完全修飾された、欠失したシードを伴う４つのｍｉＲ−１２２結合部位を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（シードなしＧ−ＣＳＦ）（ｍＲＮＡ配列は配列番号４２７０に示される；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）を、２４ウェルプレートにて１ウェルにつき２５０ｎｇの濃度で試験した。トランスフェクションの２４時間後に、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡによって測定した。Ｇ−ＣＳＦ剤（ｍＲＮＡ）レベルおよびタンパク質レベルを表２９に示す。
表２９．Ｇ−ＣＳＦ薬剤およびタンパク質濃度  
【１１８７】
【表００２９】
2020072766.tif 000387
【１１８８】
実施例３１．コザックおよび／またはＩＲＥＳ配列を有す修飾ｍＲＮＡ配列または有しない修飾ｍＲＮＡ配列
コザックおよび／またはＩＲＥＳ配列を有するまたは有しないＧ−ＣＳＦをコードする修飾ｍＲＮＡ、ならびにそれらの対応するｃＤＮＡ配列を、以下の表３０に示す。表３０において、各配列の開始コドンには下線を引いている。
表３０．Ｇ−ＣＳＦ配列  
【１１８９】
【表００３０−１】
2020072766.tif 000388
【１１９０】
【表００３０−２】
2020072766.tif 000389
【１１９１】
【表００３０−３】
2020072766.tif 000390
【１１９２】
【表００３０−４】
2020072766.tif 000391
【１１９３】
【表００３０−５】
2020072766.tif 000392
【１１９４】
【表００３０−６】
2020072766.tif 000393
【１１９５】
【表００３０−７】
2020072766.tif 000394
【１１９６】
【表００３０−８】
2020072766.tif 000395
【１１９７】
【表００３０−９】
2020072766.tif 000396
【１１９８】
【表００３０−１０】
2020072766.tif 000397
【１１９９】
これらの修飾ｍＲＮＡ配列は少なくとも１つの本明細書に記載の化学修飾を含み得る。Ｇ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡ配列は、本明細書に記載の方法および／または当該技術分野において既知の方法を用いて、トランスフェクションおよび／または投与に先んじて処方することができる。
【１２００】
Ｇ−ＣＳＦをコードする修飾ｍＲＮＡ配列は、本明細書に開示の方法および／または当該技術分野において既知の方法を用いて、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＰＢＭＣ、およびＢＪ繊維芽細胞、ならびに表２５に記載の細胞型等の、様々な細胞型へインビトロでトランスフェクトすることができる。その後、細胞を、本明細書に記載の方法および／または当該技術分野にて既知の方法を用いて分析して、Ｇ−ＣＳＦの濃度および／または細胞生存率を決定する。
【１２０１】
Ｇ−ＣＳＦをコードする修飾ｍＲＮＡ配列はまた、マット（ｍａｔ）、ラット、非ヒト霊長類、およびヒトを含む哺乳類に投与することができる。血清および周辺組織を一定間隔で収集し、本明細書に記載の方法および／または当該技術分野において既知の方法を用いて分析して、Ｇ−ＣＳＦの濃度および本明細書にて言及される他の薬物動態特性を決定することができる。
実施例３２．α−グロビンＵＴＲにおける修飾ｍＲＮＡ配列およびｍｉＲ−１２２配列
Ｇ−ＣＳＦ、またはヒトもしくはマウスα−グロビン３’ＵＴＲにｍｉｒ−１２２配列を有する第ＩＸ因子をコードする修飾ｍＲＮＡ、ならびにそれらの対応するｃＤＮＡ配列を、以下表３１に示す。表３１において、各配列の開始コドンには下線を引いている。
表３１．Ｇ−ＣＳＦおよびＦＩＸ配列  
【１２０２】
【表００３１−１】
2020072766.tif 000398
【１２０３】
【表００３１−２】
2020072766.tif 000399
【１２０４】
【表００３１−３】
2020072766.tif 000400
【１２０５】
【表００３１−４】
2020072766.tif 000401
【１２０６】
【表００３１−５】
2020072766.tif 000402
【１２０７】
【表００３１−６】
2020072766.tif 000403
【１２０８】
【表００３１−７】
2020072766.tif 000404
【１２０９】
【表００３１−８】
2020072766.tif 000405
【１２１０】
【表００３１−９】
2020072766.tif 000406
【１２１１】
【表００３１−１０】
2020072766.tif 000407
【１２１２】
【表００３１−１１】
2020072766.tif 000408
【１２１３】
【表００３１−１２】
2020072766.tif 000409
【１２１４】
【表００３１−１３】
2020072766.tif 000410
【１２１５】
【表００３１−１４】
2020072766.tif 000411
【１２１６】
【表００３１−１５】
2020072766.tif 000412
【１２１７】
【表００３１−１６】
2020072766.tif 000413
【１２１８】
【表００３１−１７】
2020072766.tif 000414
【１２１９】
これらの修飾ｍＲＮＡ配列は、少なくとも１つの本明細書に記載の化学修飾を含み得る。Ｇ−ＣＳＦおよび／または第ＩＸ因子修飾ｍＲＮＡ配列は、本明細書に記載の方法および／または当該技術分野において既知の方法を用いて、トランスフェクションおよび／または投与に先んじて処方することができる。
【１２２０】
Ｇ−ＣＳＦまたは第ＩＸ因子をコードする修飾ｍＲＮＡ配列は、本明細書に開示の方法および／または当該技術分野において既知の方法を用いて、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＰＢＭＣ、およびＢＪ繊維芽細胞、ならびに表２５に記載の細胞型等の、様々な細胞型へインビトロでトランスフェクトすることができる。その後、細胞を、本明細書に記載の方法および／または当該技術分野において既知の方法を用いて分析して、Ｇ−ＣＳＦもしくは第ＩＸ因子の濃度、および／または細胞生存率を決定する。
【１２２１】
Ｇ−ＣＳＦまたは第ＩＸ因子をコードする修飾ｍＲＮＡ配列はまた、マット、ラット、非ヒト霊長類、およびヒトを含む哺乳類に投与することができる。血清、周辺組織、および臓器を一定間隔で収集し、本明細書に記載の方法および／または当該技術分野において既知の方法を用いて分析して、Ｇ−ＣＳＦまたは第ＩＸ因子の濃度および本明細書にて言及される他の薬物動態特性を決定することができる。
実施例３３．微生理学的システム
本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡは、緩衝剤、脂質ナノ粒子、およびＰＬＧＡ等の本明細書に記載の方法のうち１つを用いて処方される。その後、これらの製剤を、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１３０８６５０２号、同第ＷＯ２０１３０８６４８６号、および同第ＷＯ２０１３０８６５０５号に記載される臓器チップから作成された微生理学的システムに投与するかまたはそれと接触させる。
実施例３４．非翻訳領域における翻訳エンハンス要素（ＴＥＥ）
本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、および／またはｍｍＲＮＡにおける５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、少なくとも１つの翻訳エンハンス要素（ＴＥＥ）を含み得る。５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ中に含まれ得るそのようなＴＥＥは、限定されないが、それらの部分および／または断片を有する表３２に列挙されるＴＥＥを含む。ＴＥＥ配列は、表２８に開示されるＴＥＥ配列の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または９９％以上を含んでいてもよく、および／またはＴＥＥ配列は、表３２に開示されるＴＥＥ配列の５〜３０ヌクレオチド長断片、５〜２５ヌクレオチド長断片、５〜２０ヌクレオチド長断片、５〜１５ヌクレオチド長断片、５〜１０ヌクレオチド長断片を含んでいてもよい。
表３２．ＴＥＥ配列  
【１２２２】
【表００３２−１】
2020072766.tif 000415
【１２２３】
【表００３２−２】
2020072766.tif 000416
【１２２４】
【表００３２−３】
2020072766.tif 000417
【１２２５】
【表００３２−４】
2020072766.tif 000418
【１２２６】
【表００３２−５】
2020072766.tif 000419
【１２２７】
【表００３２−６】
2020072766.tif 000420
【１２２８】
【表００３２−７】
2020072766.tif 000421
【１２２９】
【表００３２−８】
2020072766.tif 000422
【１２３０】
【表００３２−９】
2020072766.tif 000423
【１２３１】
【表００３２−１０】
2020072766.tif 000424
【１２３２】
【表００３２−１１】
2020072766.tif 000425
【１２３３】
【表００３２−１２】
2020072766.tif 000426
【１２３４】
【表００３２−１３】
2020072766.tif 000427
【１２３５】
【表００３２−１４】
2020072766.tif 000428
【１２３６】
【表００３２−１５】
2020072766.tif 000429
【１２３７】
【表００３２−１６】
2020072766.tif 000430
【１２３８】
【表００３２−１７】
2020072766.tif 000431
【１２３９】
【表００３２−１８】
2020072766.tif 000432
【１２４０】
【表００３２−１９】
2020072766.tif 000433
【１２４１】
【表００３２−２０】
2020072766.tif 000434
【１２４２】
【表００３２−２１】
2020072766.tif 000435
【１２４３】
【表００３２−２２】
2020072766.tif 000436
【１２４４】
【表００３２−２３】
2020072766.tif 000437
【１２４５】
【表００３２−２４】
2020072766.tif 000438
【１２４６】
【表００３２−２５】
2020072766.tif 000439
【１２４７】
【表００３２−２６】
2020072766.tif 000440
【１２４８】
【表００３２−２７】
2020072766.tif 000441
【１２４９】
【表００３２−２８】
2020072766.tif 000442
【１２５０】
【表００３２−２９】
2020072766.tif 000443
【１２５１】
【表００３２−３０】
2020072766.tif 000444
【１２５２】
【表００３２−３１】
2020072766.tif 000445
【１２５３】
【表００３２−３２】
2020072766.tif 000446
【１２５４】
【表００３２−３３】
2020072766.tif 000447
【１２５５】
【表００３２−３４】
2020072766.tif 000448
【１２５６】
【表００３２−３５】
2020072766.tif 000449
【１２５７】
【表００３２−３６】
2020072766.tif 000450
【１２５８】
【表００３２−３７】
2020072766.tif 000451
【１２５９】
【表００３２−３８】
2020072766.tif 000452
【１２６０】
【表００３２−３９】
2020072766.tif 000453
【１２６１】
【表００３２−４０】
2020072766.tif 000454
【１２６２】
【表００３２−４１】
2020072766.tif 000455
【１２６３】
実施例３５．ｍｉＲ−１２２を有する修飾核酸のインビトロ発現
マイクロＲＮＡは、翻訳抑制および／または標的メッセンジャーＲＮＡの分解を介して、遺伝子発現を制御する。ヒトまたはマウスα−グロビン３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡおよび第ＩＸ因子ｍＲＮＡの発現を、３’ＵＴＲにてｍｉＲ−１２２配列を用いてヒト一次肝細胞内で下方制御した。
【１２６４】
一次ヒト肝細胞を、１ウェルあたり３５００００個の細胞密度にて５００μｌの細胞培地（Ｃｅｌｓｉｓ（イリノイ州シカゴ）のＩｎＶｉｔｒｏ  ＧＲＯ培地）中に播種した。
ヒトα−グロビン３’ＵＴＲを有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  Ｈｓ３’ＵＴＲ；配列番号５７１６に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、またはマウスα−グロビン３’ＵＴＲ（Ｇ−ＣＳＦ  Ｍｍ３’ＵＴＲ；配列番号５７１７に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）を、５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有するヒト３’ＵＴＲを含有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  Ｈｓ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２；配列番号５０１８に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−１２２シード配列（Ｇ−ＣＳＦ  Ｈｓ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２シード；配列番号５０２０に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲにシード配列を有しない（Ｇ−ＣＳＦ  Ｈｓ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２シードレス；配列番号５０２２に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）を、５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有するマウス３’ＵＴＲを含有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  Ｍｍ３’ＵＴＲ
ｍｉＲ−１２２；配列番号５０２４に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−１２２シード配列（Ｇ−ＣＳＦ  Ｍｍ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２シード；配列番号５０２６に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲにシード配列を有しないｍｉＲ−１２２配列（Ｇ−ＣＳＦ  Ｍｍ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２シードレス；配列番号５０２８に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）を、５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した。
【１２６５】
ヒトα−グロビン３’ＵＴＲを有する第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（第ＩＸ因子Ｈｓ３’ＵＴＲ；配列番号５７１８に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、またはマウスα−グロビン３’ＵＴＲ（第ＩＸ因子Ｍｍ３’ＵＴＲ；配列番号５７１９に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）を、５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有するヒト３’ＵＴＲを含有する第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（第ＩＸ因子Ｈｓ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２；配列番号５０３０に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−１２２シード配列（第ＩＸ因子Ｈｓ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２シード；配列番号５０３２に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲにシード配列を有しないｍｉＲ−１２２配列（第ＩＸ因子Ｈｓ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２シードレス；配列番号５０３４に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）を、５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有するマウス３’ＵＴＲを含有する第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（第ＩＸ因子Ｍｍ３’ＵＴＲ
ｍｉＲ−１２２；配列番号５０３６に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−１２２シード配列（第ＩＸ因子Ｍｍ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２シード；配列番号５０３８に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲにシード配列を有しないｍｉＲ−１２２配列（第ＩＸ因子Ｍｍ３’ＵＴＲ  ｍｉＲ−１２２シードレス；配列番号５０４０に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）を、５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した。
【１２６６】
各Ｇ−ＣＳＦまたは第ＩＸ因子ｍＲＮＡ配列を２４ウェルプレートにて５００ｎｇの濃度で試験した。トランスフェクションの２４、４８、および７２時間後、タンパク質の発現をＥＬＩＳＡによって測定した。Ｇ−ＣＳＦに対するタンパク質レベルを表３３に示し、第ＩＸ因子に対するタンパク質レベルを表３４に示す。
表３３．Ｇ−ＣＳＦタンパク質発現  
【１２６７】
【表００３３】
2020072766.tif 000456
【１２６８】
表３４．第ＩＸ因子タンパク質発現  
【１２６９】
【表００３４】
2020072766.tif 000457
【１２７０】
実施例３６．ｍｉｒ−１４２またはｍｉＲ−１４６結合部位を有する修飾核酸のインビトロ発現
ＨｅＬａおよびＲＡＷ２６４細胞を、それぞれ１ウェルあたり１７０００の密度、および１ウェルあたり８００００の密度で１００μｌの細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に播種した。
【１２７１】
Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ；配列番号４２５８に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）を、５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した。
【１２７２】
３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２−３ｐ配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−３ｐ；配列番号４９９２に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−１４２−３ｐシード配列（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−３ｐシード；配列番号４９９４に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲにシード配列を有しないｍｉＲ−１４２−３ｐ配列（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−３ｐシードレス；配列番号４９９６に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）を、５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した。
【１２７３】
３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２−５ｐ配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−５ｐ；配列番号４９８６に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−１４２−５ｐシード配列（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−５ｐシード；配列番号４９８８に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲにシード配列を有しないｍｉＲ−１４２−５ｐ配列（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４２−５ｐシードレス；配列番号４９９０に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）を、５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した。
【１２７４】
３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４６ａ配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４６ａ；配列番号４９９８に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−１４６ａシード配列（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４６ａシード；配列番号５０００に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、または３’ＵＴＲにシード配列を有しないｍｉＲ−１４６ａ配列（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ−１４６ａシードレス；配列番号５００２に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）を、５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した。
【１２７５】
各Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ配列を、１ウェル辺り５００ｎｇの密度で２４ウェルプレートにて各細胞型に対して試験した。トランスフェクションの２４時間後、タンパク質の発現をＥＬＩＳＡによって測定し、タンパク質レベルを表３５に示す。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２−３ｐ配列を有するはＲＡＷ２６４細胞におけるＧ−ＣＳＦ発現を下方制御したが、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２−５ｐまたはｍｉＲ−１４６ａ配列を有するＧ−ＣＳＦ配列はＧ−ＣＳＦ発現を下方制御しなかった。
表３５．Ｇ−ＣＳＦ発現  
【１２７６】
【表００３５】
2020072766.tif 000458
【１２７７】
実施例３７．修飾核酸の発現におけるコザック配列の影響
ＨｅＬａ細胞を１ウェルあたり１７０００個の細胞密度にて１００μｌの細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に播種した。ＩＲＥＳ配列およびコザック配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ＩＲＥＳコザック；配列番号５００４に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、ＩＲＥＳ配列を有するがコザック配列を有しないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ＩＲＥＳ；配列番号５００６に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、ＩＲＥＳまたはコザック配列を有しないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（コザックなしＧＣＳＦ；配列番号５００８に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）、またはコザック配列を有するＧ−ＣＳＦ配列（Ｇ−ＣＳＦコザック；配列番号５７２０に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１）を、５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたもので完全に修飾され、１ウェルあたり７５ｎｇの濃度で２４ウェルプレートにて試験した。トランスフェクションの２４時間後、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡによって測定し、結果を表３６に示す。
表３６．Ｇ−ＣＳＦ発現  
【１２７８】
【表００３６】
2020072766.tif 000459
【１２７９】
実施例３８．ＭＡＬＡＴ１構築物
ヒトまたはマウスＭＡＬＡＴ１配列、およびそれらの対応するｃＤＮＡ配列を有するＧ−ＣＳＦまたはｍＣｈｅｒｒｙをコードする修飾ｍＲＮＡを、以下の表３７に示す。表３７において、各配列の開始コドンには下線を引き、ＭＡＬＡＴ１配列は太字にしてある。表３７．ＭＡＬＡＴ１構築物  
【１２８０】
【表００３７−１】
2020072766.tif 000460
【１２８１】
【表００３７−２】
2020072766.tif 000461
【１２８２】
【表００３７−３】
2020072766.tif 000462
【１２８３】
【表００３７−４】
2020072766.tif 000463
【１２８４】
【表００３７−５】
2020072766.tif 000464
【１２８５】
【表００３７−６】
2020072766.tif 000465
【１２８６】
これらの修飾ｍＲＮＡ配列は、本明細書に記載の少なくとも１つの化学修飾を含み得る。Ｇ−ＣＳＦまたはｍＣｈｅｒｒｙ修飾ｍＲＮＡ配列は、本明細書に記載の方法および／または当該技術分野において既知の方法を用いて、トランスフェクションおよび／または投与に先んじて処方することができる。
【１２８７】
Ｇ−ＣＳＦまたはｍＣｈｅｒｒｙをコードする修飾ｍＲＮＡ配列は、本明細書に開示の方法および／または当該技術分野において既知の方法を用いて、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＰＢＭＣ、およびＢＪ繊維芽細胞、ならびに表２５に記載の細胞型等の、様々な細胞型へインビトロでトランスフェクトすることができる。その後、細胞を、本明細書に記載の方法および／または当該技術分野にて既知の方法を用いて分析して、Ｇ−ＣＳＦもしくはｍＣｈｅｒｒｙの濃度および／または細胞生存率を決定する。
実施例３９．非相同５’ＵＴＲの利用
５’ＵＴＲが、本発明の核酸、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡに隣接する領域として提供され得る。５’ＵＴＲは、本発明の核酸、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡ中に見出されるコード領域と、相同または非相同であり得る。複数の５’ＵＴＲが隣接する領域に含まれていてもよく、同じ配列または異なる配列であってもよい。何も含まない場合も含め、隣接する領域の任意の部分はコドン最適化されていてもよく、いずれも１つ以上の異なる構造的または化学的修飾を、コドン最適化の前および／または後に、独立して含有することができる。
【１２８８】
２０１３年３月９日出願の米国仮出願第６１／７７５，５０９号、表題「Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍＲＮＡ」の長い表２１、および２０１３年５月３１日出願の米国仮出願第６１／８２９，３７２号、表題「Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍＲＮＡ」の長い表２１には、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡの開始部位および終始部位の一覧が示される。各５’ＵＴＲ（５’ＵＴＲ−００５から５’ＵＴＲ  ６８５１１）は、それらの天然または野生型（相同）転写物に対するそれらの開始部位および終始部位によって特定される（ＥＮＳＴ；ＥＮＳＥＭＢＬデータベースにて用いられる識別名）。
【１２８９】
本発明の核酸、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡの１つ以上の性質を変化させるために、本発明の核酸、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡのコード領域に非相同である５’ＵＴＲを本発明の化合物内に操作する。その後、核酸、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡを、細胞、組織、または生物体に投与し、タンパク質レベル、局在性、および／または半減期等の結果を測定して、非相同５’ＵＴＲが本発明の核酸、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡに有し得る有益な効果を評価する。Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧを含む１つ以上のヌクレオチドが終端に添加されるかまたは除去される、５’ＵＴＲの変異形が有用であり得る。５’ＵＴＲはまた、コドン最適化されていても、または本明細書に記載されるいずれかの方法で修飾されていてもよい。
実施例４０．５’非翻訳領域のさらなる利用
５’ＵＴＲは、本発明の核酸、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡと隣接する領域として提供され得る。５’ＵＴＲは、本発明の核酸、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡ中に見出されるコード領域と、相同または非相同であり得る。複数の５’ＵＴＲが隣接する領域に含まれていてもよく、同じ配列または異なる配列であってもよい。何も含まない場合も含め、隣接する領域の任意の部分はコドン最適化されていてもよく、いずれも１つ以上の異なる構造的または化学的修飾を、コドン最適化の前および／または後に、独立して含有することができる。
【１２９０】
本発明の核酸、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡと共に用いられ得る５’非翻訳領域の一覧が表３８に示される。
本発明の核酸、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡの１つ以上の性質を変化させるために、本発明の核酸、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡのコード領域に非相同である５’ＵＴＲを本発明の化合物内に操作する。その後、核酸、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡを、細胞、組織、または生物体に投与し、タンパク質レベル、局在性、および／または半減期等の結果を測定して、非相同５’ＵＴＲが本発明の核酸、修飾核酸、またはｍｍＲＮＡに有し得る有益な効果を評価する。Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧを含む１つ以上のヌクレオチドが終端に添加されるかまたは除去される、５’ＵＴＲの変異形が使用され得る。５’ＵＴＲはまた、コドン最適化されていても、または本明細書に記載されるいずれかの方法で修飾されていてもよい。
表３８．５′−非翻訳領域  
【１２９１】
【表００３８】
2020072766.tif 000466
【１２９２】
実施例４１．非相同５’ＵＴＲを用いるタンパク質産生
トランスフェクションの前日、２０，０００個のＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２；ヴァージニア州マナッサス）を、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）で処理することによって収集し、９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ヴァージニア州マナッサス）にて総体積１ウェルあたり１００μｌのＥＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳおよび１×Ｇｌｕｔａｍａｘで補充）で播種した。細胞を３７℃で５％のＣＯ２雰囲気下において一晩育成した。翌日、３７．５ｎｇ、７５ｎｇ、または１５０ｎｇの５ＵＴＲ−００１に対する核酸配列を含むＧ−ＣＳＦ  修飾ＲＮＡ（配列番号５に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、５ＵＴＲ−６８５１５に対する核酸配列を含むＧ−ＣＳＦ修飾ＲＮＡ（配列番号５７３２に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、５ＵＴＲ−６８５１６に対する核酸配列を含むＧ−ＣＳＦ修飾ＲＮＡ（配列番号５７３３に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、５ＵＴＲ−６８５２１に対する核酸配列を含むＧ−ＣＳＦ修飾ＲＮＡ（配列番号５７３８に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、または５ＵＴＲ−６８５２２に対する核酸配列を含むＧ−ＣＳＦ修飾ＲＮＡ（配列番号５７３９に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）を、１０μｌの最終体積のＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）中に希釈した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）をトランスフェクション試薬として使用し、０．２μｌを１０μｌの最終用量のＯＰＴＩ−ＭＥＭ中に希釈した。室温でインキュベートした５分後、両方の溶液を合わせ、さらに１５分間室温でインキュベートした。その後、２０μｌの合わせた溶液を、ＨｅＬａ細胞を含有する１００μｌの細胞培地に添加し、室温でインキュベートした。
【１２９３】
２４時間のインキュベーションの後に、Ｇ−ＣＳＦを発現する細胞を、説明書に従って１００μｌのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）で溶解した。Ｇ−ＣＳＦタンパク質産生をＥＬＩＳＡによって決定した。
【１２９４】
表３９に示されるこれらの結果は、５ＵＴＲ−６８５１５または５ＵＴＲ−６８５２１を含むＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡが一番多くのタンパク質を産生したが、一方で５ＵＴＲ−６８５２２を含むＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡは一番少ない量のタンパク質を産生したことを示す。
表３９．非相同５’ＵＴＲからのＧ−ＣＳＦタンパク質産生  
【１２９５】
【表００３９】
2020072766.tif 000467
【１２９６】
実施例４２．修飾核酸におけるコザック配列の影響
ＨｅＬａ細胞を１ウェルあたり１５，０００個の細胞密度にて１００μｌの細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に播種した。コザック配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦコザック；配列番号５００４に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、またはコザック配列を有しないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（コザックなしＧ−ＣＳＦ；配列番号５００８に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、１ウェルあたり７５ｎｇの濃度にて９６ウェルプレートで三重でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間、４８時間、および７２時間後に、上澄みを回収し、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡによって測定し、結果を表４０に示す。表４０．Ｇ−ＣＳＦ発現  
【１２９７】
【表００４０】
2020072766.tif 000468
【１２９８】
実施例４３．修飾核酸における５’ＵＴＲの変化の影響
目的とするポリペプチドをコードし、ポリＡ配列およびキャップを有するｍＲＮＡは、本明細書に記載の化学変化、および／または同時係属出願であり、この内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３０５２５２３号に記載の化学変化のうち少なくとも１つで完全修飾され、ｍＲＮＡは表４１の５’ＵＴＲを含む。ＨｅＬａ細胞を細胞培地に播種し、ｍＲＮＡによって所定の濃度（１ウェルあたりのｎｇ）でウェルプレートにおいてトランスフェクトする。トランスフェクション後、所定の間隔（例えば、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、および／または７２時間）で、上澄みを回収し、タンパク質の発現をＥＬＩＳＡによって測定する。表４１．５’ＵＴＲ  
【１２９９】
【表００４１】
2020072766.tif 000469
【１３００】
実施例４４．修飾核酸におけるポリＡ尾部長さの影響
Ａ．バイオアナライザー
２０、４０、８０、１００、１２０、１４０、もしくは１６０ヌクレオチド長のポリＡ尾部を有する、もしくはポリＡ尾部を有しない、修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（配列番号５７４５に示されるｍＲＮＡ配列；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジン（５ｍｃ／１ｍｐＵ）で完全修飾した、または１−メチルシュードウリジン（１ｍｐＵ）で完全修飾した５’キャップ、キャップ１）、修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ｍＲＮＡ（配列番号５７４６に示されるｍＲＮＡ配列；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジン（５ｍｃ／１ｍｐＵ）で完全修飾した、または１−メチルシュードウリジン（１ｍｐＵ）で完全修飾した５’キャップ、キャップ１）、修飾エリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡ（配列番号５７４７に示されるｍＲＮＡ配列；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジン（５ｍｃ／１ｍｐＵ）で完全修飾した、または１−メチルシュードウリジン（１ｍｐＵ）で完全修飾した５’キャップ、キャップ１）、または修飾ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ（配列番号５７４８に示されるｍＲＮＡ配列；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジン（５ｍｃ／１ｍｐＵ）で完全修飾した、または１−メチルシュードウリジン（１ｍｐＵ）で完全修飾した５’キャップ、キャップ１）を、バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザー）によって分析した。全ての試料は、バイオマーカーによって決定して、ｍＲＮＡの完全性を維持した。
【１３０１】
Ｂ．ＢＪ線維芽細胞
ヒト一次包皮線維芽細胞（ＢＪ線維芽細胞）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（カタログ番号ＣＲＬ−２５２２）から入手し、５％のＣＯ２下において３７℃で、１０％のウシ胎仔血清を補充したイーグルＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地（ＡＴＣＣ、カタログ番号１１０９５−１１４）中で育成した。ＢＪ線維芽細胞を２４ウェルプレートにおいて１ウェルあたり１００，０００個の細胞密度で、０．５ｍｌの培地中に播種した。２０、４０、８０、１００、１２０、１４０、もしくは１６０ヌクレオチド長のポリＡ尾部を有する、もしくはポリＡ尾部を有しない、２５０ｎｇの修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（配列番号５７４５に示されるｍＲＮＡ配列；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジン（５ｍｃ／１ｍｐＵ）で完全修飾した、または１−メチルシュードウリジン（１ｍｐＵ）で完全修飾した５’キャップ、キャップ１）、修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ｍＲＮＡ（配列番号５７４６に示されるｍＲＮＡ配列；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジン（５ｍｃ／１ｍｐＵ）で完全修飾した、または１−メチルシュードウリジン（１ｍｐＵ）で完全修飾した５’キャップ、キャップ１）、修飾エリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡ（配列番号５７４７に示されるｍＲＮＡ配列；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジン（５ｍｃ／１ｍｐＵ）で完全修飾した、または１−メチルシュードウリジン（１ｍｐＵ）で完全修飾した５’キャップ、キャップ１）、または修飾ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ（配列番号５７４８に示されるｍＲＮＡ配列；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジン（５ｍｃ／１ｍｐＵ）で完全修飾した、または１−メチルシュードウリジン（１ｍｐＵ）で完全修飾した５’キャップ、キャップ１）を、説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いてトランスフェクトした。ＦＩＸ、Ｇ−ＣＳＦ、およびＥＰＯは、３重でトランスフェクトした。
【１３０２】
上澄みを、ＦＩＸ、Ｇ−ＣＳＦ、およびＥＰＯについては、２４時間、４８時間、および７２時間の時点で、ｍＣｈｅｒｒｙについては２４時間の時点で回収した。タンパク質発現を、ＦＩＸ、Ｇ−ＣＳＦ、およびＥＰＯについてはＥＬＩＳＡによって分析し、ｍＣｈｅｒｒｙについては蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって分析した。Ｇ−ＣＳＦに関する結果を表４２に示し、ＥＰＯに関する結果を表４３に示し、ＦＩＸに関する結果を表４４に示し、ｍＣｈｅｒｒｙに関する結果を表４５に示す。
表４２．Ｇ−ＣＳＦタンパク質発現  
【１３０３】
【表００４２】
2020072766.tif 000470
【１３０４】
表４３．ＥＰＯタンパク質発現  
【１３０５】
【表００４３】
2020072766.tif 000471
【１３０６】
表４４．ＦＩＸタンパク質発現  
【１３０７】
【表００４４】
2020072766.tif 000472
【１３０８】
表４５．ｍＣｈｅｒｒｙ発現
【１３０９】
【表００４５】
2020072766.tif 000473
【１３１０】
実施例４５．ｍｉｒ−１２２配列を有する修飾核酸
Ａ．ＨｅＬａ細胞
ＨｅＬａ細胞を１ウェルあたり１５，０００個の細胞密度にて１００μｌの細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に播種した。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ１２２；配列番号５０２４に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、３’ＵＴＲにまたはシード配列を有しないが、ｍｉＲ−１２２配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦシードレス；配列番号５０２８に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）を、１ウェルあたり０．３μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００によって１ウェルあたり７５ｎｇの濃度のｍＲＮＡで９６ウェルプレートにおいてトランスフェクトした。上澄みをトランスフェクションの１６〜１８時間後に回収し、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡによって測定し、結果を表４６に示す。
表４６．ＨｅＬａにおけるＧ−ＣＳＦ発現  
【１３１１】
【表００４６】
2020072766.tif 000474
【１３１２】
Ｂ．一次ヒトおよびラット幹細胞
一次ヒトまたはラット肝細胞を、１ウェルあたり３５０，０００個の細胞密度にて５００μｌの細胞培地（ＩｎｖｉｔｒｏＧＲＯ  ＣＰおよびＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ  ＨＩ  Ｍｅｄｉｕｍ＋２．２％Ｔｏｒｐｅｄｏ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｍｉｘ）に播種した。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ１２２；配列番号５０２４に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）、または３’ＵＴＲにシード配列を有しないが、ｍｉＲ−１２２配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦシードレス；配列番号５０２８に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）を、一次ヒト肝細胞および一次ラット肝細胞について２４ウェルプレートにて１ウェルあたり５００ｎｇのｍＲＮＡ密度で、１ウェルあたり１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いてトランスフェクトした。上澄みをトランスフェクションの１６〜１８時間後に回収し、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡによって測定し、結果を表４７に示す。ｍＲＮＡにおけるｍｉｒ−１２２結合部位配列は、一次幹細胞でのＧ−ＣＳＦ  タンパク質発現を減衰させた。
表４７．肝細胞におけるＧ−ＣＳＦ発現  
【１３１３】
【表００４７】
2020072766.tif 000475
【１３１４】
実施例４６．ｍｉｒ−１２２配列を有する修飾核酸の時間経過
Ａ．ＨｅＬａ細胞
ＨｅＬａ細胞を１ウェルあたり１７，０００個の細胞密度にて１００μｌの細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に播種した。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有しないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ；配列番号５７１７に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した；配列番号５７１６に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有する（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ１２２；配列番号５０２４に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した；配列番号５０１８に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２シード配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦシード；配列番号５０２６に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した；配列番号５０２０に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、３’ＵＴＲにシード配列を有しないが、ｍｉＲ−１２２配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦシードレス；配列番号５０２８に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した；配列番号５０２２に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有しない第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（ＦＩＸ；配列番号５７１９に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した；配列番号５７１８に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有する第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（ＦＩＸ  ｍｉＲ１２２；配列番号５０３６に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲ��Ａ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した；配列番号５０３０に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２シード配列を有する第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（ＦＩＸシード；配列番号５０３８に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した；配列番号５０３２に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、または３’ＵＴＲにシード配列を有しないが、ｍｉＲ−１２２配列を有する第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（ＦＩＸシードレス；配列番号５０４０に示されるマウス３’ＵＴＲ
ｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した；配列番号５０３４に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）を、１ウェルあたり０．３μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００によって１ウェルあたり７５ｎｇの濃度のｍＲＮＡで９６ウェルプレートにおいてトランスフェクトした。上澄みをトランスフェクションの１６〜１８時間後に回収し、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡによって測定し、結果を表４８に示す。
表４８．ＨｅＬａにおける発現  
【１３１５】
【表００４８】
2020072766.tif 000476
【１３１６】
Ｂ．一次ヒトおよびラット肝細胞
一次ヒトまたはラット肝細胞を、１ウェルあたり３５０，０００個の細胞密度にて５００μｌの細胞培地（ＩｎｖｉｔｒｏＧＲＯ  ＣＰおよびＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ  ＨＩ  Ｍｅｄｉｕｍ＋２．２％Ｔｏｒｐｅｄｏ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｍｉｘ）に播種した。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有しないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ；配列番号５７１７に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている；配列番号５７１６に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ１２２；配列番号５０２４に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている；配列番号５０１８に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２シード配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦシード；配列番号５０２６に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている；配列番号５０２０に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）、３’ＵＴＲにシード配列を有しないが、ｍｉＲ−１２２配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦシードレス；配列番号５０２８に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている；配列番号５０２２に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有しない第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（ＦＩＸ；配列番号５７１９に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている；配列番号５７１８に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有する第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（ＦＩＸ  ｍｉＲ１２２；配列番号５０３６に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている；配列番号５０３０に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２シード配列を有する第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（ＦＩＸシード；配列番号５０３８に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている；配列番号５０３２に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）、または３’ＵＴＲにシード配列を有しないが、ｍｉＲ−１２２配列を有する第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（ＦＩＸシードレス；配列番号５０４０に示されるマウス３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている；配列番号５０３４に示されるヒト３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）を、一次ヒト肝細胞および一次ラット肝細胞について２４ウェルプレートにて１ウェルあたり５００ｎｇの濃度で、１ウェルあたり１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いてトランスフェクトした。上澄みを、トランスフェクションの２４時間、４８時間、７２時間後に回収し、Ｇ−ＣＳＦの発現および第ＩＸ因子をＥＬＩＳＡによって測定し、結果を表４９に示す。ｍＲＮＡにおけるｍｉｒ−１２２結合部位配列は、一次肝細胞におけるＧ−ＣＳＦおよび第ＩＸ因子タンパク質発現を減衰させた。
表４９．肝細胞におけるＧ−ＣＳＦ発現  
【１３１７】
【表００４９−１】
2020072766.tif 000477
【１３１８】
【表００４９−２】
2020072766.tif 000478
【１３１９】
実施例４７．癌細胞におけるｍｉｒ−１２２配列を有する修飾核酸の時間経過
Ａ．ｍｉＲ−１２２の基準レベル
ヒト肝細胞、ラット肝細胞、ヒト肝細胞癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）、およびＨｅＬａ細胞におけるｍｉｒ−１２２の基準レベルを、ＴＡＱＭＡＮ（商標）分析によって説明書を用いて決定した。レベルをＵ６に正規化し、結果を表５０に示す。
表５０．様々な細胞型におけるｍｉＲ−１２２濃度  
【１３２０】
【表００５０】
2020072766.tif 000479
【１３２１】
Ｂ．一次ヒト肝細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞
一次ヒト肝細胞を１ウェルあたり５０，０００個の細胞密度にて１００μｌの細胞培地（ＩｎｖｉｔｒｏＧＲＯ  ＣＰおよびＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ  ＨＩ  Ｍｅｄｉｕｍ＋２．２％Ｔｏｒｐｅｄｏ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｍｉｘ）に播種し、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を１ウェルあたり２０，０００個の細胞密度にて１００μｌの細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に播種した。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有しないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ；配列番号５７４５に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ１２２；配列番号５０１８に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２シード配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦシード；配列番号５０２０に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）、または３’ＵＴＲにシード配列を有しないが、ｍｉＲ−１２２配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦシードレス；配列番号５０２２に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）を、１ウェルあたり０．３μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００によって１ウェルあたり７５ｎｇの濃度のｍＲＮＡで９６ウェルプレートにおいて、一次ヒト肝細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞についてトランスフェクトした。上澄みを、トランスフェクションの２４時間、４８時間、７２時間後に回収し、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡによって測定し、結果を表５１に示す。ｍＲＮＡにおけるｍｉｒ−１２２結合部位配列は、一次ヒト肝細胞におけるＧ−ＣＳＦタンパク質発現を減衰させたが、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるＧ−ＣＳＦタンパク質発現は減衰させなかった。
表５１．Ｇ−ＣＳＦ発現  
【１３２２】
【表００５１】
2020072766.tif 000480
【１３２３】
実施例４８．ｍｉｒ−１４２  ３ｐ配列を有する修飾核酸の時間経過
Ａ．ｍｉＲ−１４３  ３ｐの基準レベル
ＲＡＷ２６４．７細胞およびＨｅＬａ細胞におけるのｍｉＲ−１４２  ３ｐ基準レベルを、ＴＡＱＭＡＮ（商標）分析によって説明書を用いて決定した。レベルをＵ６に正規化し、結果を表５２に示す。
表５２．様々な細胞型におけるｍｉＲ−１４２  ３ｐ濃度  
【１３２４】
【表００５２】
2020072766.tif 000481
【１３２５】
Ｂ．ＨｅＬａ細胞およびＲＡＷ２６４．７細胞
ＨｅＬａ細胞を１ウェルあたり１７，０００個の細胞密度にて１００μｌの細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に播種し、ＲＡＷ２６４．７１をウェルあたり２０，０００個の細胞密度にて１００μｌの細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に播種した。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２  ３ｐ配列を有しないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ；配列番号５７４９に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２  ３ｐ配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ１４２  ３ｐ；配列番号５７５０に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２  ３ｐシード配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦシード；配列番号５７５１に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）、または３’ＵＴＲにシード配列を有しないが、ｍｉＲ−１４２  ３ｐ配列を有する（Ｇ−ＣＳＦシードレス；配列番号５７５２に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）を、１ウェルあたり０．３μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００によって１ウェルあたり７５ｎｇの濃度のｍＲＮＡで９６ウェルプレートにおいて、ＲＡＷ２６４．７細胞についてトランスフェクトした。上澄みをトランスフェクションの１６〜１８時間後に回収し、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡによって測定し、結果を表５３に示す。Ｇ−ＣＳＦにおけるｍｉＲ−１４２  ３ｐ部位はＲＡＷ２６４．７細胞においてＧ−ＣＳＦ発現を下方制御すると示された。
表５３．発現  
【１３２６】
【表００５３】
2020072766.tif 000482
【１３２７】
Ｃ．ＲＡＷ２６４．７細胞における時間経過
ＲＡＷ２６４．７細胞を１ウェルあたり６，０００個の細胞密度にて１００μｌの細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に播種した。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２  ３ｐ配列を有しないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ；配列番号５７４９に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２  ３ｐ配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ１４２  ３ｐ；配列番号５７５０に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２  ３ｐシード配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦシード；配列番号５７５１に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）、または３’ＵＴＲにシード配列を有しないが、ｍｉＲ−１４２  ３ｐ配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦシードレス；配列番号５７５２に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）を、１ウェルあたり０．３μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００によって１ウェルあたり７５ｎｇの濃度のｍＲＮＡで９６ウェルプレートにおいてトランスフェクトした。上澄みを、トランスフェクションの２４時間、４８時間、７２時間後に回収し、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡによって測定し、結果を表５４に示す。ｍＲＮＡにおけるｍｉｒ−１４２  ３ｐ結合部位配列は、時間経過と共にＲＡＷ２６４．７細胞におけるＧ−ＣＳＦ発現の強い抑制を示した。
表５４．Ｇ−ＣＳＦ発現  
【１３２８】
【表００５４】
2020072766.tif 000483
【１３２９】
Ｄ．ＰＢＭＣにおけるｍｉＲ−１４２  ３ｐ
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を１ウェルあたり１５，０００個の細胞密度にて１００μｌの細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、トランスフェクション後に１０％ＦＢＳを添加）に播種した。３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２  ３ｐ配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｍｉＲ１４２  ３ｐ；配列番号５７５０に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部肝細胞；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２  ３ｐシード配列を有する（Ｇ−ＣＳＦシード；配列番号５７５１に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部肝細胞；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、または３’ＵＴＲにシード配列を有しないが、ｍｉＲ−１４２  ３ｐ配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦシードレス；配列番号５７５２に示される配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部肝細胞；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）を、１ウェルあたり０．４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００によって１ウェルあたり５００ｎｇの濃度のｍＲＮＡで９６ウェルプレートにおいて、２人または３人のドナーについて３重にトランスフェクトした。上澄みをトランスフェクションの２４時間後に回収し、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡによって測定した。２人のドナーについての結果を表５５に示し、３人のドナーについての結果を表５６に示す。ｍＲＮＡにおけるｍｉｒ−１４２  ３ｐ結合部位配列は、ヒトＰＢＭＣにおけるＧ−ＣＳＦ発現の下方制御を示した。
表５５．発現ＰＢＭＣ（２人のドナー）  
【１３３０】
【表００５５】
2020072766.tif 000484
【１３３１】
表５６．発現ＰＢＭＣ（３人のドナー）  
【１３３２】
【表００５６】
2020072766.tif 000485
【１３３３】
実施例４９．修飾ｍＲＮＡのインビボ発現
Ａ．ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウス
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、ｍｉＲ−１２２結合部位（「非標的化ｍＲＮＡ」；配列番号５７５３に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部肝細胞；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）を有しない、表５７に記載の脂質ナノ粒子中に処方された０．１ｍｇ／ｋｇのルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ、または表５８に記載の脂質ナノ粒子中に処方された３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２結合部位を有するルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ（「ｍｉＲ−１２２標的化ｍＲＮＡ」；配列番号５７５４に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部肝細胞；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）を静脈内に注射した。表５７．非標的化ｍＲＮＡに対する脂質ナノ粒子  
【１３３４】
【表００５７】
2020072766.tif 000486
【１３３５】
表５８．標的化ｍＲＮＡに対する脂質ナノ粒子  
【１３３６】
【表００５８】
2020072766.tif 000487
【１３３７】
処置の２４時間後、動物に麻酔をかけ、ルシフェラーゼ基質Ｄ−ルシフェリンを注射し、生きている動物からの生物発光画像（ＢＬＩ）をＩＶＩＳイメージャーにて１５分後に評価した。シグナルを非標的化ｍＲＮＡおよびｍｉＲ−１２２標的化ｍＲＮＡを注射された動物から得て、表５９に示した。ｍｉＲ  １２２標的化ｍＲＮＡで治療された動物の肝臓から作成された総光シグナルは、非標的化ｍＲＮＡより、２９倍倍低く、３’ＵＴＲの操作された要素が正常組織のタンパク質発現を阻害し得ることを示す。
表５９．操作されたｍｉＲ１２２結合部位によって修飾された修飾ｍＲＮＡのインビボ発現  
【１３３８】
【表００５９】
2020072766.tif 000488
【１３３９】
Ｂ．肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウス
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに２ｘ１０６個の肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞を肝臓内に埋め込み、得られた正所性腫瘍を２４日間成長させた。その後、腫瘍担持マウスに、表５７または表５８（上記）に記載の、ｍｉＲ−１２２結合部位（「非標的化ｍＲＮＡ」；配列番号５７５３に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部肝細胞；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）を有しない、表５７に記載の脂質ナノ粒子中に処方された０．１ｍｇ／ｋｇのルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ、または表５８に記載の脂質ナノ粒子中に処方された３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２２結合部位を有するルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ（「ｍｉＲ−１２２標的化ｍＲＮＡ」；配列番号５７５４に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部肝細胞；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾されている）を静脈内に注射した。処置の２４時間後、動物に麻酔をかけ、ルシフェラーゼ基質Ｄ−ルシフェリンを注射し、生きている動物からの生物発光画像（ＢＬＩ）をＩＶＩＳイメージャーにて２０分後に評価した。隣接する正常肝臓と比較して所性腫瘍からのシグナルを定量し、脂質ナノ粒子によって全身へと送達されたｍｉＲ−１２２標的化ｍＲＮＡは、正常な肝臓と比べて腫瘍内で２倍を超える濃縮を達成した。
実施例５０．修飾核酸におけるコザック配列の影響
ＨｅＬａ細胞を１ウェルあたり１５，０００個の細胞密度にて１００μｌの細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に播種した。コザック配列を有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦコザック；配列番号５７１６に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、コザック配列を有しないＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（コザックなしＧ−ＣＳＦ；配列番号５００８に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、開始コドン上流にある−３位のＡがＴに変換されたＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ３ｔ５’；配列番号５７５５（表６０）に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、開始コドンの上流にある−９位のＡがＴに変換されたＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ９ｔ５’；配列番号５７５６（表６０）に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、または開始コドン（ＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）の９ヌクレオチド長上流が欠失したＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ９ｄｅｌ５’；配列番号５７５７（表６０）に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、および１ウェルあたり３７．５ｎｇの濃度で９６ウェルプレートにおいて３重でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間、４８時間、および７２時間後に、上澄みを回収し、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡによって測定し、結果を表６１に示す。表６０において、各配列の開始コドンには下線を引いている。表６０において、Ｇ−ＣＳＦ  ３ｔ５’について、開始コドン上流にある−３位のＡは太字にし下線を引いてあり、Ｇ−ＣＳＦ  ９ｔ５’について、開始コドンの上流にある−９位のＡは太字にし下線を引いてある。
表６０．Ｇ−ＣＳＦ配列  
【１３４０】
【表００６０−１】
2020072766.tif 000489
【１３４１】
【表００６０−２】
2020072766.tif 000490
【１３４２】
表６１．Ｇ−ＣＳＦ発現  
【１３４３】
【表００６１】
2020072766.tif 000491
【１３４４】
実施例５１．修飾核酸における５’ＵＴＲの修飾の影響
ＢＪ線維芽細胞Ｔ細胞を、１ウェルあたり１００，０００個の細胞密度にて５００μｌの細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に播種した。合成５’ＵＴＲを有するＧ−ＣＳＦ
ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ；配列番号５７１６に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、またはＧＴＸ遺伝子のＩＲＥＳから１８ヌクレオチド長配列の５回の縦列反復を伴う５’ＵＴＲを含有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（ＧＴＸ  Ｇ−ＣＳＦ；配列番号５７５８（表６２）に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、および１ウェルあたり２５０ｎｇの濃度で２４ウェルプレートにおいて３重でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間、４８時間、および７２時間後に、上澄みを回収し、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡによって測定し、結果を表６３に示す。表６２において、各配列の開始コドンには下線を引いてあり、ＧＴＸ遺伝子のＩＲＥＳからの１８ヌクレオチド長配列の５回の縦列反復は太字にしてあり、１８ヌクレオチド長配列の１回目、３回目、および５回目の縦列反復にもまた下線を引いてある。
表６２．ＧＴＸ  Ｇ−ＣＳＦ配列  
【１３４５】
【表００６２】
2020072766.tif 000492
【１３４６】
表６３．５’ＵＴＲ  
【１３４７】
【表００６３】
2020072766.tif 000493
【１３４８】
実施例５３．修飾核酸における５’ＵＴＲの修飾の影響
ＢＪ線維芽細胞Ｔ細胞を１ウェルあたり１００，０００個の細胞密度にて５００μｌの細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に播種した。合成５’ＵＴＲを有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ；配列番号５７１６に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、またはＧＴＸ遺伝子のＩＲＥＳから１８ヌクレオチド長配列の５回の縦列反復を伴う５’ＵＴＲを含有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇｔｘ  Ｇ−ＣＳＦ；配列番号５７５８（表６２）に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、および１ウェルあたり２５０ｎｇの濃度で２４ウェルプレートにおいて３重でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間、４８時間、および７２時間後に、上澄みを回収し、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡによって測定し、結果を表６４に示す。
表６４．５’ＵＴＲ  
【１３４９】
【表００６４】
2020072766.tif 000494
【１３５０】
実施例５４．５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで修飾された核酸における５’ＵＴＲの修飾のインビボでの影響
修飾核酸における５’ＵＴＲの修飾の影響を試験するために、メスのＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３；１２週齢；Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州サウスイーストン））をリポプレックス化ｍＲＮＡで処置した。
【１３５１】
３匹のマウスを処置するために、８μｇの合成５’ＵＴＲを有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ；配列番号５７１６に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、または開始コドンの９ヌクレオチド長上流が欠失したＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ９ｄｅｌ５’；配列番号５７５７（表６０）に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）を、無菌および無血清ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で希釈して２００μｌの総体積を得た。３匹のマウスを処理するために、全部で８μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１６６８０１９）を無菌および無血清ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド；１１９６５−１１８）で希釈して、２００μｌの総体積を得た。インキュベーションの５分後、２つの溶液を合わせ、ピペットで慎重に混合した。２０分後、ｍＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００リポプレックスの形成が完了した。リポプレックス溶液を、２７ゲージ注射針（ＢＤ永久装着針（ｐｅｒｍａｎｅｎｔｌｙ  ａｔｔａｃｈｅｄ  ｎｅｅｄｌｅ）（カタログ番号３０５９３５）中に２９Ｇ×１／２を備える０．３ｍＬ  ＢＤ  ＳａｆｅｔｙＧｌｉｄｅインスリンシリンジ）を備える無菌の１ｍｌシリンジ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に移した。２μｇのリポプレックス化ｍＲＮＡを含有する１００μｌの尾静脈内注射の前に、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを太陽灯の下に５分間置いた。注射の６時間後、マウスを麻酔にかけ、血清採集のために心穿刺によって出血させた。その後、血清試料にＧ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号ＳＣＳ５０）を実施し、結果を表６５に示す。開始コドンの９ヌクレオチド長上流が欠失したＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡは、合成ＵＴＲを有するＧ−ＣＳＦと比べてより高いＧ−ＣＳＦ発現レベルを６時間の時点で有した。
表６５．インビボでのＧ−ＣＳＦコザック発現  
【１３５２】
【表００６５】
2020072766.tif 000495
【１３５３】
実施例５５．５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで修飾されたＧ−ＣＳＦ核酸における５’ＵＴＲのＧＴＸ修飾のインビボでの影響
修飾核酸における５’ＵＴＲの修飾の影響を試験するために、メスのＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３；１２週齢；Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州サウスイーストン））をリポプレックス化ｍＲＮＡで処置した。
【１３５４】
３匹のマウスを処理するために、８μｇの合成５’ＵＴＲを有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ；配列番号５７１６に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、またはＧＴＸ遺伝子のＩＲＥＳから１８ヌクレオチド長配列の５回の縦列反復を伴う５’ＵＴＲを含有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（ＧＴＸ  Ｇ−ＣＳＦ；配列番号５７５８（表６２）に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）を、無菌および無血清ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で希釈して２００μｌの総体積を得た。３匹のマウスを処理するために、全部で８μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１６６８０１９）を無菌および無血清ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド；１１９６５−１１８）で希釈して、２００μｌの総体積を得た。インキュベーションの５分後、２つの溶液を合わせ、ピペットで慎重に混合した。２０分後、ｍＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００リポプレックスの形成が完了した。リポプレックス溶液を、２７ゲージ注射針（ＢＤ永久装着針（カタログ番号３０５９３５）中に２９Ｇ×１／２を備える０．３ｍＬ  ＢＤ  ＳａｆｅｔｙＧｌｉｄｅインスリンシリンジ）を備える無菌の１ｍｌシリンジ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に移した。２μｇのリポプレックス化ｍＲＮＡを含有する１００μｌの尾静脈内注射の前に、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを太陽灯の下に５分間置いた。注射の６時間後、マウスを麻酔にかけ、血清採集のために心穿刺によって出血させた。その後、血清試料にＧ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号ＳＣＳ５０）を実施し、結果を表６６に示す。ＧＴＸ遺伝子のＩＲＥＳから１８ヌクレオチド長配列の５回の縦列反復を伴う５’ＵＴＲを含有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡは、合成ＵＴＲを有するＧ−ＣＳＦと比べてより高いＧ−ＣＳＦ発現レベルを６時間の時点で有した。
表６６．インビボでのＧＴＸ  Ｇ−ＣＳＦ発現  
【１３５５】
【表００６６】
2020072766.tif 000496
【１３５６】
実施例５６．１−メチルシュードウリジンで修飾されたＧ−ＣＳＦ核酸における５’ＵＴＲのＧＴＸ修飾のインビボでの影響
修飾核酸における５’ＵＴＲの修飾の影響を試験するために、メスのＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３；１２週齢；Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州サウスイーストン））をリポプレックス化ｍＲＮＡで処置した。
【１３５７】
３匹のマウスを処理するために、８μｇの合成５’ＵＴＲを有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ；配列番号５７１６に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；５−メチルシチジンおよび１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）、またはＧＴＸ遺伝子のＩＲＥＳから１８ヌクレオチド長配列の５回の縦列反復を伴う５’ＵＴＲを含有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（ＧＴＸ  Ｇ−ＣＳＦ；配列番号５７５８（表６２）に示されるｍＲＮＡ配列；配列に示されていないおよそ１４０ヌクレオチド長のポリＡ尾部；５’キャップ、キャップ１；１−メチルシュードウリジンで完全修飾した）を、無菌および無血清ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で希釈して２００μｌの総体積を得た。３匹のマウスを処理するために、全部で８μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１６６８０１９）を無菌および無血清ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド；１１９６５−１１８）で希釈して、２００μｌの総体積を得た。インキュベーションの５分後、２つの溶液を合わせ、ピペットで慎重に混合した。２０分後、ｍＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００リポプレックスの形成が完了した。リポプレックス溶液を、２７ゲージ注射針（ＢＤ永久装着針（カタログ番号３０５９３５）中に２９Ｇ×１／２を備える０．３ｍＬ  ＢＤ
ＳａｆｅｔｙＧｌｉｄｅインスリンシリンジ）を備える無菌の１ｍｌシリンジ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に移した。２μｇのリポプレックス化ｍＲＮＡを含有する１００μｌの尾静脈内注射の前に、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを太陽灯の下に５分間置いた。注射の６時間後、マウスを麻酔にかけ、血清採集のために心穿刺によって出血させた。その後、血清試料にＧ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号ＳＣＳ５０）を実施し、結果を表６７に示す。ＧＴＸ遺伝子のＩＲＥＳから１８ヌクレオチド長配列の５回の縦列反復を伴う５’ＵＴＲを含有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡは、合成ＵＴＲを有するＧ−ＣＳＦと比べてより高いＧ−ＣＳＦ発現レベルを６時間の時点で有した。
表６７．インビボでのＧＴＸ  Ｇ−ＣＳＦ発現  
【１３５８】
【表００６７】
2020072766.tif 000497
【１３５９】
他の実施形態
使用した単語は、限定ではなく説明のための単語であり、その広範な態様において本発明の真の範囲と精神から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更が行われ得ることが理解される。
【１３６０】
本発明は、いくつかの記載の実施形態に関してある程度詳しく具体的に記載されたが、これが任意のそのような詳細もしくは実施形態、または任意の特定の実施形態に限定されるべきであるようには意図されず、先行技術を考慮してそのような特許請求の範囲の可能な限り広範な解釈を提供し、それにより本発明の意図される範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。
【１３６１】
本明細書に言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、データベースエントリ、他の参考文献、および技術は、引用中に明確に示されていなくとも、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾が生じる場合、定義を含む本明細書が優先されるものとする。加えて、節の見出し、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定するようには意図されない。
【図１】
2020072766.tif 000498
【図２】
2020072766.tif 000499
【図３】
2020072766.tif 000500
【図４】
2020072766.tif 000501
【配列表】
2020072766000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月19日(2020.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における治療用ポリペプチドの標的化された発現のためのｍＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であって、
前記ｍＲＮＡ分子が、
（ａ）前記治療用ポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの領域と、
（ｂ）５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、
（ｃ）対象の細胞または組織内で差次的に発現される少なくとも１つのマイクロＲＮＡ分子に結合する少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）と、
（ｄ）連結ヌクレオシドの３’尾部と、
を含み、
前記治療用ポリペプチドの標的化された発現が起こるように、前記治療用ポリペプチドの発現が前記マイクロＲＮＡ分子を発現する前記対象の細胞または組織内で低減される、ＬＮＰ。
【請求項２】
前記ｍＲＮＡが、完全に修飾されたウリジンヌクレオシドを含む、請求項１記載のＬＮＰ。
【請求項３】
前記治療用ポリペプチドが、オンコロジー関連ポリペプチドである、請求項１または２に記載のＬＮＰ。
【請求項４】
前記完全に修飾されたウリジンヌクレオシドがシュードウリジン類似体である、請求項２または３記載のＬＮＰ。
【請求項５】
前記シュードウリジン類似体が１−メチルシュードウリジンである、請求項４記載のＬＮＰ。
【請求項６】
前記ｍＲＮＡの少なくとも１つの領域がコドン最適化されている、請求項１〜５のいずれか一項記載のＬＮＰ。
【請求項７】
前記５’ＵＴＲが、前記治療用ポリペプチドと非相同である、請求項１〜６のいずれか一項記載のＬＮＰ。
【請求項８】
前記５’ＵＴＲが、前記治療用ポリペプチドの天然５’ＵＴＲである、請求項１〜６のいずれか一項記載のＬＮＰ。
【請求項９】
少なくとも１つの５’キャップ構造を含む、請求項１〜８のいずれか一項記載のＬＮＰ。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの５’キャップ構造が、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジド−グアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、およびＣＡＰ−００３〜ＣＡＰ−２２５からなる群から選択される、請求項９記載のＬＮＰ。
【請求項１１】
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、およびｍｉＲ−２０４からなる群から選択されたマイクロＲＮＡに結合する、請求項１〜１０のいずれか一項記載のＬＮＰ。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位が、免疫細胞内に存在するマイクロＲＮＡによって結合される、請求項１〜１０のいずれか一項記載のＬＮＰ。
【請求項１３】
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ、およびｍｉＲ−１４６ｂからなる群から選択されるマイクロＲＮＡに結合する、請求項１２記載のＬＮＰ。
【請求項１４】
前記連結ヌクレオシドの３’尾部領域が、少なくとも１００、少なくとも１２０、または少なくとも１４０ヌクレオシドのポリＡ尾部を含む、請求項１〜１３のいずれか一項記載のＬＮＰ。
【請求項１５】
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号１４０４で示される配列を含むｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位である、請求項１〜１４のいずれか一項記載のＬＮＰ。
【請求項１６】
ＰＥＧ脂質、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、およびコレステロールを含む、請求項１〜１５のいずれか一項記載のＬＮＰ。
【請求項１７】
対象において治療用ポリペプチドを差次的に発現させる方法のための、請求項１〜１６のいずれか一項記載のＬＮＰを含む組成物。