(57)【要約】      （修正有）【課題】中皮腫を検出する抗体および中皮腫に対する高い特異性および高い感受性を有する抗体を提供する。また、該抗体を用いた中皮腫の診断方法、並びに、該抗体を含む中皮腫診断用試薬および中皮腫診断用キットを提供する。さらに、中皮腫の診断マーカーを提供する。さらにまた、本発明の抗体若しくはその抗原結合性断片を含む中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物を提供する。【解決手段】中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に糖鎖修飾依存的に結合する、請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合性断片。
【請求項３】
中皮腫の細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体。
【請求項４】
請求項３記載の抗体であって、
（１）配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、抗体、
（２）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体、
（３）配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体、
（４）上記（１）〜（３）のいずれかの抗体と８０％以上のアミノ酸配列の配列相同性を有する抗体、
（５）上記（１）〜（４）のいずれかの抗体と結合において競合する抗体、若しくは
（６）上記（１）〜（４）のいずれかの抗体と同じエピトープに結合する抗体
またはこれらの抗原結合性断片。
【請求項５】
中皮腫細胞株で発現された配列番号５３のアミノ酸配列を有するペプチドに結合する抗体。
【請求項６】
抗原が、中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質である、請求項４に記載の抗体、またはその抗原結合性断片。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体のＶＨ領域またはＶＨ領域およびＣＨ１領域とヒトインテレクチンタンパク質との融合タンパク質と、該抗体の軽鎖とのタンパク質複合体。
【請求項８】
ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または請求項７に記載のタンパク質複合体を含む、中皮腫診断薬。
【請求項９】
ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または請求項７に記載のタンパク質複合体と、イメージングプローブとの結合体を含む、中皮腫の体内診断薬。
【請求項１０】
ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または請求項７に記載のタンパク質複合体を含む、中皮腫診断用キット。
【請求項１１】
ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または請求項７に記載のタンパク質複合体と、イメージングプローブとの結合体を含む、中皮腫の体内診断用キット。
【請求項１２】
ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または請求項７に記載のタンパク質複合体を含む、中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物。
【請求項１３】
ＨＥＧ１に対する発現抑制剤を含む、中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物。
【請求項１４】
生体から分離された試料において、ＨＥＧ１タンパク質を検出することを含む、中皮腫の検出方法。
【請求項１５】
ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または請求項７に記載のタンパク質複合体により、生体から分離された試料中のＨＥＧ１タンパク質を検出することを含む、中皮腫の検出方法。
【請求項１６】
中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質または配列番号３５のアミノ酸配列において７９９番目〜８０９番目のアミノ酸配列を含むその断片。
【請求項１７】
請求項１６に記載のＨＥＧ１タンパク質または前記その断片を含む、中皮腫の診断マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜型ムチン様タンパク質の認識とその医療応用に関する。より具体的には、本発明は、中皮腫を検出する抗体および中皮腫に対する高い特異性および高い感受性を有する抗体に関する。本発明はまた、該抗体を用いた中皮腫の診断方法、並びに、該抗体を含む中皮腫診断用試薬および中皮腫診断用キットに関する。本発明はさらに、中皮腫の診断マーカーに関する。本発明はさらにまた、本発明の抗体若しくはその抗原結合性断片を含む中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性中皮腫は、アスベストの曝露が主要原因で発生する悪性腫瘍として、大きな社会問題となっている疾患である。早期発見が困難であり、予後の悪い悪性腫瘍の一つに位置づけられている。悪性中皮腫は、転移性の腺癌や肉腫、良性の増殖である反応性中皮細胞と病理学的に類似する場合があり、病理学的鑑別にしばしば困難を伴う。また、上皮型、肉腫型など多彩な組織型をとり、診断に苦慮することも稀ではない。そのため、悪性中皮腫に特異性の高い免疫組織学的な病理診断マーカーの開発が続けられているが、頻用されている抗体でも悪性中皮腫に対する特異性が高いものばかりではなく、病理診断では陽性マーカーと陰性マーカーを組み合わせて多角的に鑑別を行うのが一般的である。
【０００３】
悪性中皮腫の病理診断のための陽性マーカーとして、カルレチニン、サイトケラチン５／６（ＣＫ５／６）、メソテリン、ポドプラニン、ウィルムス腫瘍遺伝子産物−１（ＷＴ−１）などが頻用されている。これらのマーカーは一般的に高い感度（８０−９０％程度）で上皮型悪性中皮腫を検出しうる。しかし、その特異性に関しては必ずしも優れているとは言えず、肺線がんと上皮型悪性中皮腫の鑑別や、肉腫型悪性中皮腫の検出に利用できない場合がある。また、悪性中皮腫におけるカルレチニンやＷＴ−１の核移行像は悪性中皮腫の鑑別において重要な要素となるが、これらの分子は種々の健常組織やがん細胞で細胞質に発現が認められ、発現が核内なのか細胞質なのかを判断する必要があり、病理診断マーカーとしては視認性に問題を有する。
【０００４】
非特許文献１では、悪性中皮腫においてｍＲＮＡとして発現する遺伝子の解析がなされているが、分析されたｍＲＮＡレベルの上昇は統計学的に有意な現象ではないと結論付けられ、診断に利用可能な因子の特定には至っていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Melaiu O. et al., Mutation Research, 771: 6-12, 2015
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、中皮腫を検出する抗体および中皮腫に対する高い特異性および高い感受性を有する抗体を提供する。本発明はまた、該抗体を用いた中皮腫の診断方法、並びに、該抗体を含む中皮腫診断用試薬および中皮腫診断用キットを提供する。本発明はさらに、中皮腫の診断マーカーを提供する。本発明はさらにまた、本発明の抗体若しくはその抗原結合性断片を含む中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物を提供する。
【０００７】
本発明者らは、マウスにヒト中皮腫細胞を免疫して得たＳＫＭ９−２抗体が中皮腫を高感度かつ高い特異性を持って認識できることを見出した。本発明者らはまた、ＳＫＭ９−２抗体の抗原がＨＥＧ１タンパク質であることを見出した。本発明者らは、この結果に基づいてＨＥＧ１タンパク質が中皮腫のマーカーとして用い得ることを見出した。本発明者らはさらに、ＳＫＭ９−２抗体が糖鎖修飾依存的にＨＥＧ１タンパク質に結合することを見出した。本発明者らは、中皮腫において糖鎖修飾されたＨＥＧ１タンパク質もまた中皮腫のマーカーとして用い得ることを見出した。本発明はこのような知見に基づいてなされた発明である。
【０００８】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、またはその抗原結合性断片。
［２］中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に糖鎖修飾依存的に結合する、上記［１］に記載の抗体、またはその抗原結合性断片。
［２’］中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質の糖鎖部分およびペプチド部分の両方に結合する、上記［１］または［２］に記載の抗体、またはその抗原結合性断片。
［３］中皮腫の細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体。
［４］請求項３記載の抗体であって、
（１）配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、抗体、
（２）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体、
（３）配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体、
（４）上記（１）〜（３）のいずれかの抗体と８０％以上（例えば９０％以上または９５％以上）のアミノ酸配列の配列相同性を有する抗体、
（５）上記（１）〜（４）のいずれかの抗体と結合において競合する抗体、若しくは
（６）上記（１）〜（４）のいずれかの抗体と同じエピトープに結合する抗体
またはこれらの抗原結合性断片。
［５］中皮腫細胞株で発現された配列番号５３のアミノ酸配列を有するペプチドに結合する抗体。
［６］抗原が、中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質である、上記［４］に記載の抗体、またはその抗原結合性断片。
［７］上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の抗体のＶH領域またはＶH領域およびＣＨ１領域とヒトインテレクチンタンパク質との融合タンパク質と、該抗体の軽鎖とのタンパク質複合体。
［８］ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または上記［７］に記載のタンパク質複合体を含む、中皮腫診断薬。
［９］ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または上記［７］に記載のタンパク質複合体と、イメージングプローブとの結合体を含む、中皮腫の体内診断薬。
［１０］ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または上記［７］に記載のタンパク質複合体を含む、中皮腫診断用キット。
［１１］ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または上記［７］に記載のタンパク質複合体と、イメージングプローブとの結合体を含む、中皮腫の体内診断用キット。
［１２］ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または上記［７］に記載のタンパク質複合体を含む、中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物。
［１３］ＨＥＧ１に対する発現抑制剤を含む、中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物。
［１４］生体から分離された試料において、ＨＥＧ１タンパク質を検出することを含む、中皮腫の検出方法。
［１５］ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または上記［７］に記載のタンパク質複合体により、生体から分離された試料中のＨＥＧ１タンパク質を検出することを含む、中皮腫の検出方法。
［１６］中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質または配列番号３５のアミノ酸配列において７９９番目〜８０９番目のアミノ酸配列を含むその断片。
［１６’］中皮腫から得られるＯ型糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質または配列番号３５のアミノ酸配列において７９９番目〜８０９番目のアミノ酸配列を含むその断片。
［１７］上記［１６］に記載のＨＥＧ１タンパク質または前記その断片を含む、中皮腫の診断マーカー。
［１７’］上記［１６’］に記載のＨＥＧ１タンパク質または前記その断片を含む、中皮腫の診断マーカー。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、代表的な中皮腫のサブタイプに対するＳＫＭ９−２抗体を用いた免疫組織学染色像を示す。図１Ａは上皮型中皮腫の免疫組織学染色像を示し、図１Ｂは肉腫型中皮腫の免疫組織学染色像を示す。図中の矢じりは、染色された箇所を示す。
【図２】図２は、精製ＳＫＭ９−２抗原のウェスタンブロットとＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図３】図３は、ＨＥＧ１タンパク質をノックダウンした細胞抽出物と中皮腫細胞株で発現させた組換え可溶型ＨＥＧ１タンパク質をＳＫＭ９−２抗体を用いてウェスタンブロットした結果を示す。
【図４】図４は、ＳＫＭ９−２抗体の抗原認識が、脱シアル化酵素処理により弱まることを示す図である。
【図５】図５は、ＳＫＭ９−２抗体の抗原が中皮腫の細胞表面に発現していることを示す図である。
【図６】図６は、ＳＫＭ９−２抗体を産生するハイブリドーマの抗体遺伝子の重鎖および軽鎖それぞれの塩基配列およびアミノ酸配列を示す。図中では、ＶＨ領域およびＶＬ領域が矢印により挟まれた領域として示されている。
【図７】図７は、ＳＫＭ１０−２抗体も糖鎖修飾依存的にＨＥＧ１タンパク質を検出できることを示す図である。
【図８】図８は、インテレクチン（ＩＴＬＮ）と融合したＳＫＭ９−２抗体のＶＨ領域およびＣＨ１領域と、ＶＬ領域およびＣＬ領域（すなわち、ＳＫＭ９−２抗体の軽鎖）とのタンパク質複合体が、ＳＫＭ９−２抗体と同様にＨＥＧ１タンパク質を検出できることを示す図である。
【図９】図９は、インテレクチンがジオール結合を有するビーズに強く結合することを示す図である。
【図１０】図１０は、中皮腫細胞株の細胞増殖に対するＨＥＧ１遺伝子のノックダウンの経時的影響を示す図である。
【図１１】図１１は、中皮腫細胞株の細胞増殖に対するＨＥＧ１遺伝子のノックダウンの影響を示す図である。
【図１２】図１２は、他の中皮腫細胞株の細胞増殖に対するＨＥＧ１遺伝子のノックダウンの影響を示す図である。
【図１３】図１３は、ＳＫＭ９−２抗体と、各ヒトＨＥＧ１断片との結合の陽性（＋）および陰性（−）の別を示す図である。図１３では、各ヒトＨＥＧ１断片のＨＥＧ１中での位置が示されている。図１３の最下部ではアラニンスキャニングの結果を示す。図１３中では、改変していないアミノ酸は記号「−」で示された。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＨＥＧ１全長、３ｋｂ断片、２ｋｂ断片および１ｋｂ断片それぞれとＳＫＭ９−２抗体との反応性を確認したウェスタンブロットの結果を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、各ＨＥＧ１断片とＳＫＭ９−２抗体との反応性を確認したウェスタンブロットの結果を示す。図１４Ｂでは、７．６断片および７．６２断片において陽性のシグナルが確認されている。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、各ＨＥＧ１断片とＳＫＭ９−２抗体との反応性を確認したウェスタンブロットの結果を示す。図１４Ｃでは、７．６２３断片と７．６２３１断片において陽性シグナルが確認されている。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、アラニンスキャニングの結果を示す。図中のＳ７９９Ａは、配列番号３５のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号で７９９番目のセリンがアラニンに置換された断片を示す。
【図１４Ｅ】図１４Ｅは、ノイラミニダーゼ処理された７．６２３１断片とＳＫＭ９−２抗体とが反応しないことを示す。
【発明の具体的な説明】
【００１０】
本明細書では、「対象」とは、哺乳動物であり得、好ましくは、ヒトである。対象は、中皮腫その他の腫瘍または癌に罹患している、またはそのリスクがある対象であり得る。
【００１１】
本明細書では、「抗体」は、免疫グロブリンを意味し、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。好ましい抗体は、モノクローナル抗体である。抗体の由来は、特に限定されないが例えば、非ヒト動物の抗体、非ヒト哺乳動物の抗体、およびヒト抗体が挙げられる。また、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。また、抗体は、二重特異性抗体であってもよい。
【００１２】
本明細書では、「抗原結合性断片」とは、抗原への結合性が維持された抗体の一部を意味する。抗原結合性断片は、本発明の抗体の重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域またはその両方を含みうる。抗原結合性断片は、キメラ化またはヒト化されていてもよい。抗原結合性断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、ダイアボディー、ｓｃ（Ｆｖ）２（単鎖（Ｆｖ）２）が挙げられる。このような抗体の断片は、特に限定されないが例えば、抗体を酵素で処理して得ることができる。例えば、抗体をパパインで消化すると、Ｆａｂを得ることができる。あるいは、抗体をペプシンで消化すると、Ｆ（ａｂ’）２を得ることができ、これをさらに還元するとＦａｂ’を得ることができる。本発明ではこのような抗体の抗原結合性断片を用いることができる。
【００１３】
本明細書では、「中皮腫」とは、中皮細胞由来の腫瘍を意味する。中皮腫としては、その発生部位から、胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、心膜中皮腫、および精巣鞘膜中皮腫などが知られている。本明細書では、中皮腫は、良性の中皮腫および／または悪性の中皮腫を意味する。中皮腫は、組織型から、上皮型中皮腫、肉腫型中皮腫、二相型中皮腫、その他の中皮腫（線維形成型など）に大別される。
【００１４】
ＨＥＧ１タンパク質は、その発現や機能がほとんど分かっていないタンパク質であり、遺伝子オントロジー解析から膜タンパク質であると推定されている。ヒトＨＥＧ１タンパク質としては、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）にＮＭ＿０２０７３３．１として登録された配列番号２９の配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質（配列番号３０）、配列番号３１のアミノ酸配列を有するタンパク質、ＸＭ＿００５２４７６６６として登録された配列番号３６の配列を有する遺伝子よりコードされるタンパク質（配列番号３７）、配列番号３２の配列を有する遺伝子コードされるタンパク質（配列番号３３）、および配列番号３４の配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質（配列番号３５）が挙げられる。ＨＥＧ１タンパク質の天然のバリアントとしては、特に限定されないが例えば、配列番号３０のアミノ酸配列においてＱ１４５Ｒ、Ｓ３０５Ｐ、Ｆ６０２Ｓ、Ｖ９８０Ｌ、およびＭ１０３９Ｔなどの変異に対応するアミノ酸変異を有するＨＥＧ１タンパク質のバリアントが知られている。本明細書では、ＨＥＧ１タンパク質の天然のバリアントもＨＥＧ１タンパク質に含まれる。また、ヒトＨＥＧ１タンパク質では、配列番号３０のアミノ酸配列において１３５９番目のセリンがホスホセリンであり得る。本明細書では、配列番号３０のアミノ酸配列において１３５９番目のセリンに対応するセリンがホスホセリンであるＨＥＧ１タンパク質も、ＨＥＧ１タンパク質に含まれる。遺伝子オントロジー解析の結果から、ＨＥＧ１タンパク質において、シグナルペプチド部分は、配列番号３０のアミノ酸配列の１〜２９番目に対応するドメインであり、細胞外ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列の３０〜１２４８番目に対応するドメインであり、膜貫通ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列の１２４９〜１２６９番目に対応するドメインであり、細胞内ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列の１２７０〜１３８１番目に対応するドメインであると予想される。例えば、ＨＥＧ１タンパク質には、配列番号２９、３２、３４若しくは３６により表されるＤＮＡ配列または配列番号３０、３１、３３、３５若しくは３７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するＤＮＡの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできるＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質も含まれ得る。ストリンジェントな条件とは、例えば、ハイブリダイズ後の洗浄条件において、例えば、１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウムを含む水溶液）で６５℃で洗浄する条件を挙げることができる。例えばまた、ＨＥＧ１タンパク質には、配列番号３０により表されるアミノ酸配列と９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上相同なアミノ酸配列を有するタンパク質も含まれ得る。例えば、ＨＥＧ１タンパク質には、配列番号３０により表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸置換、挿入、付加および／または欠失を含んでいてもよい。
【００１５】
本発明者らは、ＨＥＧ１タンパク質は、主に中皮腫に発現することを見出した。また、本発明者らによれば、中皮腫は、ＨＥＧ１タンパク質の発現量に基づき診断が可能である。従って、本発明によればＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体を用いて中皮腫を検出することができる。本発明によればまた、ＨＥＧ１タンパク質は、中皮腫の細胞膜表面上に発現し、細胞外ドメインを有する。従って、本発明の抗体は、中皮腫の細胞膜、中皮腫の細胞膜上の膜タンパク質、または中皮腫の細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する。また、本発明の抗体は、ＨＥＧ１タンパク質の細胞外ドメインに対する抗体またはその抗原結合性断片であり得る。本発明によれば、ＨＥＧ１タンパク質は、高分化型乳頭状中皮腫（ＷＤＰＭ）にも発現するので、これらの中皮腫の検出に用いてもよい。
【００１６】
後述の実施例によれば、ＨＥＧ１タンパク質の細胞外ドメインは中皮腫ではシアル化された糖鎖修飾を受けている。従って、ある態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、糖鎖修飾を受けたＨＥＧ１タンパク質に結合する。糖鎖修飾を受けたＨＥＧ１タンパク質は、精製してＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると見かけ上の分子量が３００ｋＤａ〜５００ｋＤａの範囲にブロードなバンドとして検出されうる。より詳細には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけ上の分子量は約４００ｋＤａであり得る。本発明のある態様では、糖鎖修飾は、中皮腫の細胞膜上に発現するＨＥＧ１タンパク質が受けている糖鎖修飾である。
【００１７】
ある態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、中皮腫細胞で見出される糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に結合するが、その結合は糖鎖修飾依存的である。すなわち、この態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、糖鎖修飾を有しないＨＥＧ１タンパク質（例えば、糖鎖を糖鎖分解処理によって分解したＨＥＧ１タンパク質）に対しては結合しないか、糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に対するよりも結合が弱い（親和性が低い）。あるいは、ある態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、中皮腫細胞で見出される糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質の糖鎖部分に結合する。このように本発明の抗体は、ある態様では、糖鎖修飾がなされたＨＥＧ１タンパク質に糖鎖修飾依存的に結合し得るが、糖鎖修飾は、中皮腫の細胞膜上に存在するＨＥＧ１タンパク質が有するものであり得る。ある態様では、本発明の抗体は、ディネーチャーした中皮腫細胞で見出される糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に結合する。ある態様では、本発明の抗体は、中皮腫細胞で見出される糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質のディネーチャーした断片であって、配列番号３５のアミノ酸配列において７９９番目〜８０９番目のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する断片に結合する。
【００１８】
ある態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト中皮腫細胞に発現するヒトＨＥＧ１タンパク質の細胞外ドメインのエピトープには結合するが、α２−３ノイラミニダーゼまたはα２−３，６，８ノイラミニダーゼ処理によりヒトＨＥＧ１タンパク質に対する結合が低減するか消失する、抗体またはその抗原結合性断片である。この態様では、ヒト中皮腫細胞に発現するヒトＨＥＧ１タンパク質の細胞外ドメインはシアル化された糖鎖修飾を受けている。本明細書では、「中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質」は、中皮腫に特徴的な糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質であり得、例えば、シアル化されたＯ型糖鎖修飾であり得る。
【００１９】
ある態様では、中皮腫の細胞膜、中皮腫の細胞膜上の膜タンパク質、または中皮腫の細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体であって、
配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および、配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つを含む抗体が提供される。ある態様では、配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３のいずれか１つ、２つ、または３つを含む重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および、配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３のいずれか１つ、２つ、または３つを含む軽鎖可変領域とを含む抗体が提供される。
【００２０】
ある態様では、中皮腫の細胞膜、中皮腫の細胞膜上の膜タンパク質、または中皮腫の細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体であって、
（１）配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、抗体、
（２）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体、
（３）配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体、
（４）上記（１）〜（３）のいずれかの抗体と８０％以上（例えば９０％以上または９５％以上）のアミノ酸配列の配列相同性を有する抗体、
（５）上記（１）〜（４）のいずれかの抗体と結合において競合する抗体、若しくは
（６）上記（１）〜（４）のいずれかの抗体と同じエピトープに結合する抗体
またはこれらの抗原結合性断片が提供される。
【００２１】
ある態様では、本発明の抗体は、配列番号５３の配列を有するペプチドに結合する抗体である。ある態様では、本発明の抗体は、中皮腫細胞株で発現した配列番号５３の配列を有するペプチドに結合する抗体である。ある態様では、本発明の抗体は、中皮腫細胞株で発現した配列番号５３の配列を有するペプチドに糖鎖修飾依存的に結合する抗体である。ある態様では、本発明の抗体は、中皮腫の細胞膜、中皮腫の細胞膜上の膜タンパク質、または中皮腫の細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体であって、配列番号５３の配列を有するペプチドに結合する抗体である。ある態様では、本発明の抗体は、中皮腫の細胞膜、中皮腫の細胞膜上の膜タンパク質、または中皮腫の細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体であって、中皮腫細胞株で発現した配列番号５３の配列を有するペプチドに結合する抗体である。ある態様では、本発明の抗体は、中皮腫の細胞膜、中皮腫の細胞膜上の膜タンパク質、または中皮腫の細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体であって、中皮腫細胞株で発現した配列番号５３の配列を有するペプチドに糖鎖修飾依存的に結合する抗体である。
【００２２】
配列相同性は、例えば、Pearson and Lipman, PNAS, 85:2444-2448, 1988のＦＡＳＴＡプログラムにより、デフォルトパラメータで決定することができる。
【００２３】
ある態様では、本発明の抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖を有する。ある態様では、本発明の抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する。ある態様では、本発明の抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖と配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有する。ある態様では、本発明の抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ領域）として、配列番号２のアミノ酸配列の２０番〜１３２番を有する。ある態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変領域（ＶＬ領域）として、配列番号４のアミノ酸配列の２０番〜１３２番を有する。ある態様では、本発明の抗体は、配列番号２のアミノ酸配列の２０番〜１３２番を有する重鎖可変領域と配列番号４のアミノ酸配列の２０番〜１３２番を有する軽鎖可変領域とを有する。ある態様では、本発明の抗体は、糖鎖修飾を受けたＨＥＧ１タンパク質との結合において上記の抗体と競合する。
【００２４】
また、本発明では、ｓｃＦｖなどの重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含むキメラ抗原受容体も提供される。キメラ抗原受容体では、例えば、ｓｃＦｖとＴ細胞受容体ζ鎖とがスペーサーを介して連結する第１世代、ＣＤ２８または４−１ＢＢを介して連結する第２世代、ＣＤ２８と４−１ＢＢまたはＯＸ４０とを介して連結する第３世代などの様々なキメラ抗原受容体を用いることができる。
【００２５】
本発明のある態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片と細胞傷害剤との結合体（コンジュゲート）が提供される。本発明によれば、本発明の抗体またはその抗原結合性断片とイメージングプローブとの結合体（コンジュゲート）を含む、中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物が提供される。本発明で用いられる細胞傷害剤としては、例えば、癌治療用の放射性同位体（例えば、Ｐ３２、Ｙ９０、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｓｍ１５３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ａｔ２１１、Ｂｉ２１２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位体）が挙げられる。本発明で用いられる細胞傷害剤としては、例えば、抗癌剤が挙げられる。
【００２６】
本発明のある態様では、ＨＥＧ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴを含む、中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物が提供される。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスオリゴは、修飾核酸であってもよい。修飾核酸としては、例えば、蛍光色素修飾された核酸、ビオチン化された核酸、コレステリル基を導入した核酸が挙げられる。ＲＮＡは安定性を高めるために、塩基に対して２’−Ｏ−メチル修飾または、２’−フルオロ修飾若しくは２’−メトキシエチル（ＭＯＥ）修飾をすることがあり、核酸バックボーンのホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合に置き換えることもある。人工核酸としては、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して架橋型ＤＮＡであるlocked nucleic acid（ＬＮＡ）、デオキシリボースまたはリボースの代わりにＮ−（２−アミノエチル）グリシンがアミド結合したポリマーが主鎖となったペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられる。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴは、ミセルやリポソームなどの小胞に内包されていてもよい。ミセルやリポソームなどの小胞は、例えば、２０〜１００ｎｍの粒径を有するものとすることができる。ミセルやリポソームなどの小胞は、ＥＰＲ効果（Enhanced permeability and retention effect）により腫瘍組織に効率よく集積し、内容物を腫瘍組織に送達できることが知られている。このような小胞は、ポリエチレングリコールのような表面改質剤により修飾されていてもよい。本発明のある態様ではまた、ＨＥＧ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴの、中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物の製造における使用が提供される。本発明のある態様ではさらに、中皮腫を処置する方法であって、その必要のある対象においてＨＥＧ１タンパク質の発現を低下させることを含む、方法が提供される。本発明のある態様では、中皮腫を処置する方法であって、その必要のある対象においてＨＥＧ１遺伝子に対する発現抑制剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴ）を投与することを含む、方法が提供される。
【００２７】
本発明のある態様では、本発明の抗体は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）または補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）などの細胞傷害活性を有し得る。この場合、本発明の抗体は、中皮腫膜表面に発現したＨＥＧ１タンパク質に結合し、中皮腫細胞に対して細胞傷害活性を示し得る。このように、ある態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を有効成分として含む中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物や中皮腫治療用薬剤が提供される。本明細書では、「処置」は治療を含む意味で用いられる。
【００２８】
本発明の抗体を有効成分として含む医薬組成物または薬剤は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、本発明の医薬組成物または薬剤は、薬学上許容可能な賦形剤を含んでいてもよい。賦形剤は、有効成分である本発明の抗体の有効量を対象に与えるために適宜投与されうる賦形剤とすることができる。ある態様では、本発明の医薬組成物または薬剤は、注射剤とすることができ、注射用の賦形剤は、無菌の水性溶液、例えば、リンガー溶液、ハンクス溶液または生理食塩水などの薬学的に許容可能な緩衝液、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液とすることができる。補助剤としては、エタノールなどのアルコール、ポリエチレングリコールなどのポリアルコール、ポリソルベート８０などの非イオン性界面活性剤などが挙げられ、製剤化の際に添加することができる。注射用の油性液としては、ゴマ油、ヤシ油および大豆油を用いることができ、補助剤として、安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールを用いることができる。本発明の医薬組成物または薬剤は、注射剤の形で非経口投与（例えば、静脈内投与または胸腔内投与）することができる。
【００２９】
抗体のＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性は、当業者に周知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣ活性は、例えば、中皮腫細胞とＦｃ受容体を発現するエフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞や単球）を本発明の抗体の存在下で生理的条件下でインキュベートし、中皮腫細胞の生細胞数および／または死細胞数をカウントすることにより決定することができる。ＣＤＣ活性は、例えば、中皮腫細胞を補体を含む溶液（例えば、ヒト血清）と抗体存在下で生理的条件下でインキュベートし、中皮腫細胞の生細胞数および／または死細胞数をカウントすることにより決定することができる。
【００３０】
細胞傷害活性は、当業者に周知の種々の方法によって増強することができる。例えば、Ｆｃ領域糖鎖のフコースが欠失した抗体、糖鎖にバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が結合した抗体、Ｆｃ領域のアミノ酸置換によりエフェクター細胞のＦｃ受容体と抗体との結合を増強し、これにより細胞傷害活性を増強する方法が知られ、このように改変した抗体も本発明の抗体として用いることができる。
【００３１】
抗体は、ヒトにおける抗体自体の抗原性を低下させること等を目的として、当業者に周知の方法により、遺伝子改変抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体とすることができる。本発明の医薬組成物または薬剤においては、本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。抗体はまた、二重特異性抗体であってもよい。
【００３２】
本発明のある態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片とイメージングプローブとの結合体（コンジュゲート）が提供される。本発明によれば、本発明の抗体またはその抗原結合性断片とイメージングプローブとの結合体（コンジュゲート）は、中皮腫の体外診断または体内診断に用いることができる。従って、本発明によれば、本発明の抗体またはその抗原結合性断片とイメージングプローブとの結合体（コンジュゲート）を含む、中皮腫の診断薬または診断キットが提供される。本発明によればまた、本発明の抗体またはその抗原結合性断片とイメージングプローブとの結合体（コンジュゲート）を含む、中皮腫の体内診断薬または体内診断キットが提供される。中皮腫の体内診断に用いることのできるイメージングプローブとしては、例えば、蛍光イメージングプローブ、核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）用造影剤などの増強剤（例えば、常磁性イオン）およびＰＥＴ分子イメージングプローブなどのイメージング用の放射性核種が挙げられる。
【００３３】
本発明の別の側面では、中皮腫から得られる糖鎖修飾（例えば、Ｏ型糖鎖修飾）を有するＨＥＧ１タンパク質またはその断片（特に配列番号３５のアミノ酸配列において７９９番目〜８０９番目のアミノ酸配列を含むその断片）が提供される。本発明によれば、中皮腫から得られる糖鎖修飾（例えば、Ｏ型糖鎖修飾）を有するＨＥＧ１タンパク質または上記その断片は、中皮腫を高感度、かつ高特異的に検出するマーカーとして用いることができる。従って、本発明のある態様では、中皮腫から得られる糖鎖修飾（例えば、Ｏ型糖鎖修飾）を有するＨＥＧ１タンパク質または上記その断片からなる中皮腫の診断マーカーが提供される。中皮腫から得られるＨＥＧ１タンパク質または上記その断片のＯ型糖鎖修飾は、シアル化されたＯ型糖鎖修飾であり得る。このようなＨＥＧ１タンパク質は、例えば、配列番号３０、３１、３３、３５および３７から選択されるいずれか１のアミノ酸配列と、８０％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有する中皮腫から得られるＨＥＧ１タンパク質、または、これらの中皮腫から得られるバリアントであり得る。中皮腫から得られる糖鎖修飾（例えば、Ｏ型糖鎖修飾）を有するＨＥＧ１タンパク質または上記その断片は、中皮腫細胞から本発明の抗体（本発明の中皮腫から得られる糖鎖修飾（例えば、Ｏ型糖鎖修飾）を有するＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体）を用いて精製することができる。あるいは、ＨＥＧ１タンパク質または上記その断片は、シアル酸とＧｌｃＮＡｃを有するので、これらに特異的に結合するレクチン（例えば、シアル酸特異的であるＷＧＡ若しくはＧｌｃＮＡｃ特異的であるＤＳＡまたはこれらの組合せ）に対するＨＥＧ１タンパク質の親和性を利用してＨＥＧ１タンパク質を精製することも考え得る。中皮腫から得られる糖鎖修飾（例えば、Ｏ型糖鎖修飾）を有するＨＥＧ１タンパク質または上記その断片（特に配列番号３５のアミノ酸配列において７９９番目〜８０９番目のアミノ酸配列を含むその断片）は、ディネーチャーされていてもよい。断片（特にディネーチャーされた断片）は、中皮腫から得られる糖鎖修飾（例えば、Ｏ型糖鎖修飾）を有するＨＥＧ１タンパク質において、配列番号３５のアミノ酸配列において７９９番目〜８０９番目のアミノ酸配列の周辺領域を含んでいてもよい。
【００３４】
インテレクチン融合タンパク質および複合体
本発明では、インテレクチンと本発明の抗体のＦａｂ断片またはｓｃＦｖ断片との融合タンパク質が提供される。この融合タンパク質では、例えば、Ｆａｂ断片の重鎖またはｓｃＦｖ断片とインテレクチンとが融合形態として存在する。例えば、インテレクチンと本発明の抗体のＶＨ領域およびリンカー（例えば、ＣＨ１領域）との融合タンパク質と本発明の抗体のＬ鎖との複合体が提供される。このような融合タンパク質またはタンパク質複合体は、中皮腫の細胞膜、細胞膜上の膜タンパク質、または細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する。本発明ではまた、本発明の抗体のｓｃＦｖ断片とインテレクチンとの融合タンパク質が提供される。このような融合タンパク質またはタンパク質複合体は、インテレクチンを含み、インテレクチンはジオール構造に特異的かつ強く結合するので、ジオール構造を表出する樹脂を用いたカラム（例えば、エポキシド架橋剤で処理された多糖（デキストランやアガロース）を含むゲルやジオール修飾により親水化されたシリカゲルなどのゲル濾過カラム）で簡単に精製することができる。例えば、表５に示すジオールセファロースビーズを用いたカラムを用いて融合タンパク質またはタンパク質複合体を精製することができる。複合体を精製した後には、抗原を連結したアフィニティーカラムで融合タンパク質をさらに生成してもよい。
【００３５】
本発明のある態様では、
（１）配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域とインテレクチンとの融合タンパク質、または
（２）上記（１）の融合タンパク質と配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、タンパク質複合体
が提供される。上記タンパク質複合体は、中皮腫の細胞膜、中皮腫の細胞膜上の膜タンパク質、または中皮腫の細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する。この態様では、例えば、重鎖可変領域は、ＣＨ１領域を介して、または介さずにインテレクチンと融合タンパク質を形成し得、好ましくは、重鎖可変領域はＣＨ１領域を介してインテレクチンと融合タンパク質を形成し得る。この融合タンパク質は、生理的条件下で互いにインテレクチン部分を介して結合して多量体（主に３量体）を形成し得る。本明細書においては、単量体および多量体が、融合タンパク質に含まれる。
【００３６】
本発明の上記インテレクチン融合タンパク質および複合体は、中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に結合することができる。従って、本発明の上記インテレクチン融合タンパク質または複合体は、中皮腫の検出に用いることができる。従って、本発明によれば、本発明の上記インテレクチン融合タンパク質または複合体を含む、中皮腫の診断薬が提供される。本発明の上記インテレクチン融合タンパク質または複合体とイメージングプローブとの結合体は、中皮腫の体内イメージングに用いることができる。従って、本発明によれば、本発明の上記インテレクチン融合タンパク質または複合体とイメージングプローブとの結合体を含む、中皮腫の体内診断薬が提供される。また、本発明の上記インテレクチン融合タンパク質および複合体と上記で定義した細胞傷害剤との結合体は、中皮腫を処置することに用いることができる。従って、本発明によれば、本発明の上記インテレクチン融合タンパク質および複合体と上記で定義した細胞傷害剤との結合体を含む、中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物が提供される。
【００３７】
抗体の作製
抗体は、当業者に周知の方法により作成することができる。すなわち、抗原とアジュバントとを動物に免疫することと、免疫した動物の血漿を得ることによりポリクローナル抗体を得ることができる。あるいは、抗原とアジュバントとを動物に免疫し、免疫した動物からＢリンパ球を得て、ミエローマと細胞融合させてハイブリドーマを形成させ、所望の抗体を産生するハイブリドーマをクローニングして得てもよい。免疫の工程は、ＨＥＧ１タンパク質を中皮腫細胞株（例えば、ＡＣＣ−ＭＥＳＯ４細胞）に強制発現させ、細胞を動物に免疫してもよい。この場合、ＨＥＧ１タンパク質は細胞表面に暴露するので免役された動物はＨＥＧ１タンパク質に対する抗体を産生しうる。または、ＨＥＧ１タンパク質を発現する細胞、好ましくは、中皮腫細胞株からＨＥＧ１タンパク質を精製して動物に免疫してもよい。あるいは、免疫の工程は、ＨＥＧ１タンパク質の可溶化型（例えば、細胞外ドメイン）を中皮腫細胞株（例えば、ＡＣＣ−ＭＥＳＯ４細胞）に強制発現させ、培養上清から得られる可溶化型ＨＥＧ１タンパク質を動物に免疫してもよい。本発明によれば、このような可溶化型ＨＥＧ１タンパク質も糖鎖修飾を受けており、この糖鎖修飾は中皮腫細胞膜上でのＨＥＧ１タンパク質の修飾と類似している。
【００３８】
キメラ抗体は、本分野において周知の方法により作製することができる。例えば、抗体の定常領域をヒトの抗体の定常領域に置換することにより作製することができる。ヒト化抗体は、例えば、ヒト以外の動物由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびヒト抗体由来の定常領域とを含む。ヒト化抗体は、例えば、上記のＣＤＲをヒト抗体に移植して得ることができる。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体を産生する遺伝子改変マウスに抗原を免疫することにより得ることができる。二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープまたは抗原に結合することができる抗体であって、当業者に周知の方法で調製することができる。二重特異性抗体は、例えば、２つの異なる抗体を産生する細胞をさらに融合して、ハイブリッドハイブリドーマを作製する方法や、ＶH領域とＶL領域を、上記２つの領域間では対を形成できない短いリンカーを介して１本のポリペプチド鎖上で発現させ、別のポリペプチド鎖であって、前記ＶＨ領域とＶＬ領域と対形成する相補的なＶH領域とＶL領域を有するポリペプチド鎖と複合体を形成させることにより作製できる。
【００３９】
ある抗体と抗原との結合において競合する抗体は、当業者に周知の競合アッセイなどにより得ることができる。競合アッセイで、例えば、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２０〜５０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、所望の抗体の結合をブロックすることができるならば、同じ抗原に対する結合において競合する抗体とすることができる。競合する抗体は、交差ブロッキングアッセイ、好ましくは、競合ＥＬＩＳＡアッセイにより確認することができる。交差ブロッキングアッセイでは、抗原を、例えばマイクロタイタープレート上にコーティングし、ここに候補となる競合抗体存在を添加してインキュベートし、抗原と候補抗体との結合を形成させる。その後、所望の抗体を標識した上でさらにウェルに添加してインキュベートし、洗浄して、所望の抗体の結合量を定量することにより、抗体が競合したか否かを判断することができる。競合する場合には、ウェル中に残存する標識量が少なくなるはずである。
【００４０】
本発明の別の側面では、ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片を用いて、中皮腫に罹患した患者または罹患しているリスクがある対象において中皮腫を診断する方法が提供される。
【００４１】
本発明ではまた、ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片を用いて、中皮腫に罹患した患者または罹患しているリスクがある対象において中皮腫を診断するための予備的な方法（例えば、工業的方法）を提供する。本発明ではさらに、ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片を用いて、中皮腫に罹患した患者または罹患しているリスクがある対象において中皮腫細胞を検出する方法を提供する。これらの態様では、中皮腫の診断は医師により行われ、本発明は医師が診断するための方法として医師に診断の基礎情報を提供するものである。
【００４２】
本発明の別の側面では、ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む、中皮腫に罹患した患者または罹患しているリスクがある対象において中皮腫を診断するための診断薬または診断キットが提供される。診断キットは、ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片を用いて中皮腫を検出するための説明書を含んでいてもよい。また、ある態様では、上記診断薬またはキットは、本発明の抗体のいずれかまたはその抗原結合性断片を含むものであってもよい。本発明の診断薬や診断キットは下記のように中皮腫を検出するために用いることができる。
【００４３】
中皮腫の検出
本発明では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片と試料とを接触させることを含む、中皮腫の診断方法、中皮腫の検出方法、中皮腫の検出のための方法、および医師による中皮腫の診断を補助するための中皮腫の検出方法が提供される。
【００４４】
本発明による中皮腫の検出は、本発明の抗体またはその抗原結合性断片と試料とを接触させて行うことができる。試料として、細胞、組織または組織切片などの生体から分離された試料を用いる場合には、当業者に周知の方法（例えば、免疫組織学染色法）により抗体の反応を検出することができる。そして、抗体の反応が観察された場合（例えば、陽性である場合）には、その試料が由来する対象が、中皮腫に罹患している可能性が高い。抗体の反応が陽性であるか否かは、Allred Score法に基づいて判定することができる（Allred DC et al., Mod Pathol, 11: 155-168, 1998参照）。AllRed score法では、例えば、
合計スコア（ＴＳ）＝染色率スコア（ＰＳ）＋染色強度スコア（ＩＳ）
により合計スコアが３以上である場合に、反応が陽性であると判定することができる。ＰＳおよびＩＳは、以下のスコア表により求めることができる。
【００４５】
Allred Score法によるスコア表
染色率スコアＰＳ
０：染色性なし
１：染色率１％未満
２：染色率１％以上１０％未満
３：染色率１０％以上１／３未満
４：染色率１／３以上２／３未満
５：染色率２／３以上
染色強度スコアＩＳ
０：陰性
１：弱染色性
２：中間染色性
３：強染色性
【００４６】
本発明のある態様では、中皮腫の検出は、
本発明の抗体またはその抗原結合性断片と、中皮腫と疑われる対象から得られた試料とを接触させることと、
試料中に存在するＨＥＧ１タンパク質（好ましくは、ＨＥＧ１タンパク質の細胞外ドメイン）の存在を、本発明の抗体を用いて検出することと
を含む。好ましい態様では、中皮腫の検出において、検出するＨＥＧ１タンパク質は、糖鎖修飾を受けたＨＥＧ１であり、より好ましくは、Ｏ型糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質であり、さらに好ましくは、中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質である。中皮腫の検出はさらに、染色率および／または染色強度を指標として中皮腫が検出されたか否かを判定することを含んでいてもよい。ある態様では、Allred Score法に基づいて中皮腫が検出されたか否かを判定することを含んでいてもよい。ある態様では、Allred Score法に基づいて合計スコア（ＴＳ）が、２以上であるとき、好ましくは３以上である時に中皮腫が検出されたと判定することを含んでいてもよい。
本発明における中皮腫の検出においては、中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に糖鎖修飾依存的に結合する抗体を用いて、中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質の存在を試料中で検出するものとすることができる。本発明における中皮腫の検出においては、中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体を用いて、中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質の存在を試料中で検出するものとしてもよい。
本発明のある態様では、試料が組織または組織切片である場合には、抗原タンパク質またはその一部は、本発明の抗体を用いた免疫組織学染色によって検出することができる。
本発明の中皮腫の診断方法、中皮腫の検出方法、中皮腫の検出のための方法、または医師による中皮腫の診断を補助するための中皮腫の検出方法では、本発明の抗体が認識する抗原が試料中に含まれる場合には、対象から中皮腫が検出されたと決定することができる。
【００４７】
本発明において、上皮型、二相型、肉腫型および線維形成型のいずれもが本発明の抗体によって検出できる。従って、本発明において検出対象となる中皮腫は、上皮型、二相型、肉腫型および線維形成型からなる群から選択される少なくとも１つの中皮腫である。特に従来の方法では、肉腫型中皮腫の検出は困難であったが、本発明の抗体を用いれば肉腫型中皮腫の検出が可能である。従って、本発明において検出対象となる中皮腫は、肉腫型中皮腫であり得る。
【００４８】
本発明によれば、中皮腫（特に上皮型中皮腫）または肺腺癌に罹患している疑いのある対象において、中皮腫（特に上皮型中皮腫）に罹患しているか、肺腺癌に罹患しているかを鑑別することができる。従って、本発明による中皮腫の検出は、中皮腫（特に上皮型中皮腫）または肺腺癌に罹患している疑いのある対象に対して行うことができる。また、本発明によれば、中皮腫とその他の癌とを鑑別することができる。従って、本発明による中皮腫の検出は、中皮腫またはその他の癌に罹患している疑いのある対象に対して行うことができる。
【００４９】
本発明では、中皮腫の検出は、本発明の抗体またはその抗原結合性断片の代わりに、イメージングプローブと本発明の抗体若しくはその抗原結合性断片との結合体、または上記で定義した本発明の抗体断片とインテレクチンとの融合タンパク質若しくは複合体を用いてもよい。上記で定義した本発明の抗体断片とインテレクチンとの融合タンパク質若しくは複合体はイメージングプローブとの結合体の形態であってもよい。
【実施例】
【００５０】
実施例１：中皮腫特異的抗体の調製
【００５１】
ヒト悪性胸膜中皮腫由来細胞株ＡＣＣ−ＭＥＳＯ１（RCB2292, RIKEN Cell Bank）、およびＡＣＣ−ＭＥＳＯ４（RCB2293, RIKEN Cell Bank）を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で１０ｃｍディッシュにコンフルエントになるまで３７℃で培養した。それぞれの細胞ディッシュ二枚分をスクレイパーで回収し、ＰＢＳで三回洗浄した。細胞を混合し、４等分して、遠心により細胞沈殿とし、−８０℃で保存した。それぞれの細胞質量は一本あたり約１０ｍｇであった。
【００５２】
冷凍保存されていた細胞沈殿を１００μＬのＰＢＳに懸濁し、１００μＬのＡｄｄａＶａｘ（ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ社）と混合した。六週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（雌）の腹腔内に全量投与し、二週間ごとに冷凍保存していた細胞沈殿を同様の方法で繰り返し投与した。計三回の免疫後、尾部静脈より血液を一滴採取し、血清を得た。ＡＭｅＸ固定（Sato Y et al. Am J Pathol 125:431-435 (1986)）されたＡＣＣ−ＭＥＳＯ１とＡＣＣ−ＭＥＳＯ４の細胞沈殿から作製した薄切切片を用いて免疫染色を行い、中皮腫細胞に対する抗体が産生されているかどうかを確認した。抗体価が高いマウスに対し、再度、前記と同様に細胞沈殿を用いて免疫を行い、一週間後に無菌的に脾臓を摘出した。
【００５３】
脾臓をステンレスメッシュ上ですりつぶし、リンパ球を１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０に分散した。ピペッティングにより大きな細胞塊をほぐした後、１５ｍＬの遠心管に移し、３分静置した。大きな凝集塊を吸わないように細胞懸濁液を新しい遠心管に移し、ＲＰＭＩ１６４０で細胞を２回洗浄し、細胞数を計測した。
【００５４】
リンパ球（６．７５×１０7細胞）とあらかじめ培養していたミエローマ細胞（ＰＡＩ）（５．２５×１０6細胞）を混合し、ＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄した後、細胞融合操作をおこなった。細胞融合はＰＥＧ１５００（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用い、製品付属のプロトコールに従い行った。融合後、細胞を１５％ＦＣＳ、１０％ＢＭ  Ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）、１×ＨＡＴ（Thermo Fisher Scientific社）を含むＲＰＭＩ１６４０（７６ｍＬ）に懸濁し、１ウェルあたり２００μＬ（約１．９×１０5細胞／ウェル）ずつ、９６穴プレート４枚にまきこんだ。３７℃で３日間培養後、約１００μＬの培養上清を除き、前述のＨＡＴ培養液１００μＬを加え培地交換を行った。融合後５日目に約１００μＬの培養上清を除き、１５％ＦＣＳ、１０％ＢＭ  Ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１、１×ＨＴ（Thermo Fisher Scientific社）を含むＲＰＭＩ１６４０を加え培地交換を行い、７日目以降、コロニーの直径が５ｍｍ以上になっているウェルについてスクリーニングを行った。
【００５５】
スクリーニングはＡＭｅＸ固定されたＡＣＣ−ＭＥＳＯ１とＡＣＣ−ＭＥＳＯ４の細胞沈殿から作製した薄切切片を用いて、免疫染色により行った。薄切切片を０．５％  カゼインで１０分間ブロッキングし、一次抗体としてハイブリドーマの培養上清１００μＬを２時間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、二次抗体としてthe EnVision+ kits（ダコ・ジャパン合同会社）を３０分間反応させ、ＤＡＢを用いて発色を行った。３８４ウェルをスクリーニングし、９３クローンが免疫染色陽性クローンとして得られた。二次スクリーニングとして、ＡＭｅＸ固定されたＡ５４９の細胞沈殿から作製した薄切切片に反応しないクローン、三次スクリーニングとしてホルマリン固定された中皮腫の組織切片に反応するクローンを選抜し、最終的にホルマリン固定された中皮腫以外のがんの組織切片にほとんど反応しないクローンが複数（ＳＫＭ９−２およびＳＫＭ１０−２）得られた。
【００５６】
実施例２：得られたモノクローナル抗体による中皮腫の検出
上述のスクリーニングで得られたＳＫＭ９−２から産生されるモノクローナル抗体を用いて、様々なタイプの中皮腫を染色した。
【００５７】
ＡＭｅＸ固定された細胞沈殿、またはホルマリン固定された組織をパラフィン包埋し、薄切切片を作製した。切片をスライドグラスに固定し、キシレンとエタノールで脱パラフィンと脱水を行い、各種条件下で抗原の賦活化を行った。切片を３％  過酸化水素で５分間処理して内在性ペルオキシダーゼを失活させた後、ＰＢＳで洗浄し、０．５％カゼインで１０分間ブロッキングを行った。一次抗体を含む溶液を１００μＬ加えて室温で２時間処理した後、ＰＢＳで洗浄し、Histofine Simple Stain MAX-PO (Multi)（ニチレイバイオサイエンス社） 、ベンタナ  ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ユニバーサルキット  （ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）またはthe EnVision+ kitsを用いて発色させた。切片をヘマトキシリン染色したあと脱水し、マリノール（武藤化学株式会社）を用いて封入して、顕微鏡にて観察を行った。抗原の賦活化条件は、カルレチニン、メソテリン、およびＳＫＭ９−２抗原が９８℃  ４０分間、サイトケラチン５／６（ＣＫ５／６）、ポドプラニン、ウィルムス腫瘍遺伝子産物１（ＷＴ−１）が９５℃  ６４分間とした。賦活化溶液はカルレチニン、ＣＫ５／６、ポドプラニンが１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．０）、ＷＴ−１、メソテリン、ＳＫＭ９−２抗原が０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）であった。一次抗体は以下の通りを用いた：カルレチニン，ウサギ抗カルレチニンポリクローナル抗体（ＰＡＤ：ＤＣ８）(Life Technologies Japan Ltd., Tokyo, Japan);ＣＫ５／６，マウス抗サイトケラチン５，６モノクローナル抗体（Ｄ５／１６Ｂ４） (ニチレイバイオサイエンス社); メソテリン, マウス抗ヒトメソテリンモノクローナル抗体（５Ｂ２）(Leica Micro- systems, Inc., Bannockburn, IL); ポドプラニン, マウス抗ポドプラニンモノクローナル抗体(D2-40) (ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社); ＷＴ−１，マウス抗ヒトＷＴ−１モノクローナル抗体（６Ｆ−Ｈ２） (ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)。
【００５８】
中皮腫の代表的な染色像は、図１ＡおよびＢに示される通りであった。ＳＫＭ９−２抗体は上皮型（図１Ａ）、肉腫型（図１Ｂ）それぞれを良好に染色できた。また、表１に示されるようにＳＫＭ９−２抗体は、他のいずれの抗体よりも感度高く中皮腫を検出することができた。以下、陽性の判定は、Ａｌｌｒｅｄ  ｓｃｏｒｅに基づく判定で１以上となった細胞が細胞に占める割合が１０％以上の場合に陽性とした。
【００５９】
【表１】
2020196730.tif 000002
【００６０】
上記の通りＳＫＭ９−２抗体が各型の中皮腫を高感度に検出できることが明らかになった。また、良性または悪性度の低い中皮腫である高分化型乳頭状中皮腫（ＷＤＰＭ）についてもＳＫＭ９−２抗体により良好に染色することができた（１例中１例）。
【００６１】
次に、中皮腫に対する検出の特異性を確認するため、他の癌の検出特性をそれぞれの抗体と比較した。ここでは、「その他の癌」としては中皮腫との鑑別診断上問題となりやすい、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、腎細胞癌、尿路上皮癌を、「軟部の肉腫」としては癌肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、滑膜肉腫、消化管間質肉腫（ＧＩＳＴ）、ユーイング肉腫、胞巣状軟部肉腫（ＡＳＰＳ）、孤在性線維性腫瘍、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）、血管肉腫、類上皮血管内皮腫、類上皮血管肉腫、２相性滑膜肉腫を、「骨の肉腫」としては軟骨肉腫、骨肉腫をそれぞれ複数種類ずつ測定した。結果は表２に示される通りであった。
【００６２】
【表２】
2020196730.tif 000003
【００６３】
表２に示されるように、ＳＫＭ９−２抗体は、中皮腫に特異性が高く、他の種類の腫瘍または癌との鑑別が高い精度で行えることが明らかとなった。また、ＳＫＭ９−２抗体は健常組織を認識することはほとんどなかった。なお、ＳＫＭ９−２抗体において陽性となったのは、尿路上皮癌（１／１０）、平滑筋肉腫（１／１０）および類上皮血管内皮種（１／６）のわずか３例であった。
【００６４】
従来の中皮腫診断抗体として知られるカルレチニン抗体、サイトケラチン５／６抗体、メソテリン抗体およびＷＴ−１抗体はそれぞれ、高い感度で上皮型中皮腫を検出することができる。しかし、これらの抗体は表２から明らかなように、必ずしも特異性は優れておらず、肺腺癌と上皮型中皮腫の鑑別が困難であったり、肉腫型中皮腫の検出が困難であることが知られていた。さらには、カルレチニンやＷＴ−１は種々の健常組織や癌組織で細胞質には発現が認められ、中皮腫で特徴的な核移行像と誤認するリスクがあり、この点で鑑別が容易な使いやすいマーカーでは無かった。対照的に、ＳＫＭ９−２抗体は、陽性か陰性かにより簡便に中皮腫を鑑別できる上に、上皮型中皮腫および肉腫型中皮腫のどちらの検出も可能であるという点で従来の抗体よりも優れていた。また、中皮腫とそれ以外の癌との鑑別も可能であった。
【００６５】
また、正常組織に対するＳＫＭ９−２抗体の反応性を免疫組織学染色により確認した。明らかな病変が見られない健常組織についてＳＫＭ９−２抗体を用いて免疫染色を行った。結果は、表３に示される通りであった。
【００６６】
【表３】
2020196730.tif 000004
【００６７】
表３に示されるように、心膜中皮細胞と血管内皮細胞において陽性像が見られたが、大部分の組織において陰性となった。精巣では精細管が陽性となる例が一例あった。心膜中皮細胞以外の正常中皮細胞は陰性で、中皮腫細胞と正常組織の判別性に優れていると考えられた。また、血管内皮細胞も陰性の細胞が多くを占め、陽性細胞は一部の細胞であった。
【００６８】
このことから、ＳＫＭ９−２抗体の認識する抗原は、中皮腫診断において極めて有用なマーカーたり得ると示唆された。
【００６９】
実施例３：得られたハイブリドーマの解析
実施例１および２において、中皮腫細胞に特異性の高いモノクローナル抗体が得られたことが明らかとなったので、ＳＫＭ９−２抗体の抗原の同定および抗体の抗原認識特性の更なる解析を行った。
【００７０】
（１）ＳＫＭ９−２抗体の抗原精製
ＡＣＣ−ＭＥＳＯ４を大量に培養し、細胞溶解液より抗原の精製を行った。１０ｃｍディッシュ２４０枚分の細胞を1% Triton X-100, 1% CHAPS, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, プロテアーゼ阻害剤（Complete ロシュ・ライフサイエンス社）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で可溶化し、次いで遠心した。得られた上清を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に４℃で１８時間透析して酸性沈殿物を得た。沈殿を０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐｈ７．２）で抽出し、遠心後の上清をアミコン  ウルトラ−１５，１００ｋＤａ（メルク・ミリポア社）を用いて濃縮、および６Ｍ塩酸グアニジンを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶液交換した。濃縮液に終濃度１０ｍＭのＴｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を加え６０℃、３０分間加熱した後、終濃度４０ｍＭのヨードアセトアミドを加え、室温で３時間反応させた。反応液を６Ｍ塩酸グアニジン、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）中でゲル濾過クロマトグラフィ（Superose 6 Increase 10/300GL (GE ヘルスケア社)）を行い、ドットブロットにて陽性となる画分を集めた。サンプルを４Ｍ  尿素、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む２５ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）に対し室温で一晩透析し、Mono Q 5/50GL（ＧＥヘルスケア社）にアプライした。４Ｍ  尿素、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む２５ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄後、０〜１ＭのＮａＣｌ塩濃度勾配により溶出を行った。ドットブロットで強陽性となる画分を集め、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む２５ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対し、室温で一晩透析し、WGA-Sepharose（Ｊオイルミルズ社）１ｍＬにアプライした。緩衝液で洗浄後、０．２Ｍ  Ｎ−アセチルグルコサミン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む２５ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出し、溶出液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（ＹＭ−３０）（ミリポア社）を用いて濃縮した。３Ｍ  ＧｄｎＨＣｌ、０．５％  ＣＨＡＰＳを含む２５ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中でゲル濾過クロマトグラフィ（Superose 6 Increase 10/300GL （ＧＥヘルスケア社））を行い、ドットブロットで強陽性となる画分を０．５％  ＣＨＡＰＳを含む２０ｍＭ  ＮＨ4ＨＣＯ3に対して室温で一晩透析し、精製抗原を得た。
【００７１】
ドットブロットは以下の通りに行った。ＰＶＤＦ膜（Immobilon-P メルク・ミリポア社）をメタノールに浸した後、純水にて洗浄、浸漬した。空気を挟まないよう水を含ませた濾紙上に親水化したＰＶＤＦ膜をおき、余分な水分を除去後、サンプルを１〜５μＬ、マイクロピペットでドット状にしみ込ませた。膜を室温で一晩乾燥させたのち、メタノールと純水で再度親水化し、５％スキムミルク、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）（ブロッキングバッファー）で、室温１時間ブロッキングを行った。ブロッキングバッファーで１，０００倍希釈したＳＫＭ９−２ハイブリドーマのマウス腹水を室温で１時間、一次抗体として反応させた後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）（ＴＢＳＴ）によって膜を洗浄した。ブロッキングバッファーにて３０，０００倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch社）を室温で１時間反応させ、ＴＢＳＴで洗浄後、ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅ（ＧＥヘルスケア社）にて発色、検出を行った。
【００７２】
精製抗原をウェスターンブロッティングにより確認した。サンプルを６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または４−１５％  ミニプロティアンＴＧＸプレキャストゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）にて分離し、０．０１％  ＳＤＳを含む１０ｍＭ  ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０．５）を用いてサブマリン型転写装置によりサンプルをＰＶＤＦ膜に転写した。転写された膜は、ドットブロットと同様にブロッキング、抗体反応を行い、ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅ（ＧＥヘルスケア社）にて発色、検出を行った。発色後、６Ｍ  塩酸グアニジン、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１％  ２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で膜を室温１５分間洗浄し、純粋でよく洗浄した後、再度ブロッキング操作を行った。コントロール抗体として５，０００倍希釈したマウス抗β−アクチンモノクローナル抗体（Sigma-Aldrich社）を用い、同様の操作により検出を行った。
【００７３】
結果は図２に示される通りであった。図２に示されるように、常法によりＣＢＢ染色すると約４００ｋＤａの位置にバンドが検出され、このバンドはウェスターンブロッティングによりＳＫＭ９−２抗体により認識された。従って、上記の操作によりＳＫＭ９−２抗体の抗原が精製できたことが明らかとなった。
【００７４】
（２）ＳＫＭ９−２抗原（ＨＥＧ１）の同定
ＣＢＢ染色で約４００ｋＤａを示した上記のバンドを切りだし、ペプチダーゼ処理後に質量分析（ｎａｎｏ−ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ）を行い、Ｍａｓｃｏｔ  ｓｅａｒｃｈにより候補蛋白質を同定した。その結果、候補タンパク質としてProtein HEG homolog 1（ＨＥＧ１）が得られた。
【００７５】
一方で、上記実施例ではＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＳＫＭ９−２抗体の抗原の分子量は約４００ｋＤａと見積もられており、推定されるＨＥＧ１タンパク質の分子量（約１５０ｋＤａ）と齟齬があった。そこで以下の実験により、ＳＫＭ９−２抗体がＨＥＧ１タンパク質を認識しうるかを確認した。
【００７６】
まず、ウェスタンブロット法によりＳＫＭ９−２抗体の認識するバンドが、ＨＥＧ１に対する発現抑制で減弱するかを確認した。加えて、ＡＣＣ−ＭＥＳＯ４で産生された組換え可溶型ＨＥＧ１がウェスタンブロット法によりＳＫＭ９−２抗体により検出できるかを確認した。
【００７７】
ヒトＨＥＧ１に対する以下３種類のｓｉＲＮＡ（Ｈ１０９７，Ｈ２６７４，Ｈ３６７１）を作製し、ＨＥＧ１の発現抑制を行った。
Ｈ１０９７センス鎖：GAUCUUUGACGGUCAGUCUGG（配列番号２３）
Ｈ１０９７アンチセンス鎖：AGACUGACCGUCAAAGAUCGC（配列番号２４）
Ｈ２６７４センス鎖：CCUAUAGCCGUACAGACUACA（配列番号２５）
Ｈ２６７４アンチセンス鎖：UAGUCUGUACGGCUAUAGGGC（配列番号２６）
Ｈ３６７１センス鎖：GCAAGUCGGGAUACUUUCAGU（配列番号２７）
Ｈ３６７１アンチセンス鎖：UGAAAGUAUCCCGACUUGCAC（配列番号２８）
陰性対照としては、Mission Negative control SIC-001, confidential sequences (Sigma社製)を用いた。
具体的には、これらのｓｉＲＮＡをそれぞれLipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific 社）を用いてＡＣＣ−ＭＥＳＯ４にトランスフェクションした。７２時間培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１％  ＳＤＳ、１２５ｍＵ／ｍＬ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅ（メルク・ミリポア社）を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）を２５μＬ／ｃｍ2加え、氷上で５分間静置し、可溶化液を回収した。遠心後の上清をサンプルとし、６％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ウェスタンブロットを行った。また、ヒトＨＥＧ１に対するｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスを用いての発現抑制も行った。レンチウイルス粒子（sc-78365-V）はサンタクルズ社より入手したものを用い、製品プロトコールに従いＡＣＣ−ＭＥＳＯ４に感染させた。４８時間後から１０μｇ／ｍＬのピューロマイシンを用いて薬剤選択を開始し、１０日後まで生存し増殖している細胞をｓｈＲＮＡ安定発現細胞として用いた。可溶化以降の操作はｓｉＲＮＡ処理の場合と同様に行った。陰性対照としては、cop GFP対照レンチウイルス粒子（sc-108084、サンタクルズ社製）を用いた。
【００７８】
結果は図３に示される通りであった。中皮腫細胞のＨＥＧ１を３種類のｓｉＲＮＡで発現抑制すると、いずれのｓｉＲＮＡでもＳＫＭ９−２抗体が認識するバンドに対するＳＫＭ９−２抗体の反応性が減少した。また、市販のレンチウイルス粒子を用いたＨＥＧ１に対するｓｈＲＮＡ発現でもＳＫＭ９−２抗体の反応性が減少した。このことから、ＳＫＭ９−２抗体は、ＨＥＧ１タンパク質を認識することが示唆された。
【００７９】
ＡＣＣ−ＭＥＳＯ４よりクローニングしたＨＥＧ１  ｃＤＮＡ（配列番号３２および３４）のうち、配列番号３２に示される塩基配列の細胞外領域に対応する塩基配列（配列番号３２の１〜４０５９番）にＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを接続した遺伝子（配列番号１７）をｐｃＤＮＡ３．１（−）(Thermo Fisher Scientific 社)のＸｈｏＩサイトとＮｏｔＩサイト間に挿入し、組換え可溶型ＨＥＧ１発現プラスミドを作製した。このプラスミドを、ＡＣＣ−ＭＥＳＯ４に、Lipofectamine LTX Reagent with PLUS Reagent (Thermo Fisher Scientific 社)を用いてトランスフェクションし、７５０μｇ／ｍＬのジェネティシン(Thermo Fisher Scientific 社)により薬剤選択を行った。二週間後に生存、増殖している細胞を集め、組換え可溶型ＨＥＧ１安定発現細胞とした。この細胞の培養上清４０ｍＬをＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌ（１ｍＬ）（ＧＥヘルスケア社）に添加し、１０ｍＭ  イミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２５ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）でカラムを洗浄後、同緩衝液中で、１０〜５００ｍＭのイミダゾール濃度勾配により溶出を行った。ドットブロットによりＳＫＭ９−２抗体の結合が陽性となる画分を集め、アミコン  ウルトラ−１５，１００ｋＤａ（メルク・ミリポア社）を用いて濃縮し、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、６Ｍ塩酸グアニジンを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶液交換後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む２５ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶液交換し、部分精製された組換え可溶型ＨＥＧ１とした。組換え可溶型ＨＥＧ１はＳＫＭ９−２抗原と同程度の分子量を示し、ＳＫＭ９−２抗体により認識された（図３）。このことから、ＨＥＧ１タンパク質は中皮腫で産生される際、翻訳後修飾等を受け、大幅に分子量が増加すること、ＳＫＭ９−２抗体は中皮腫に発現する翻訳後修飾を受けたＨＥＧ１を認識していることが示唆された。
【００８０】
（３）エピトープに含まれるＨＥＧ１の翻訳後修飾
ＨＥＧ１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけ上の分子量は約４００ｋＤａであり、予想されるタンパク質の分子量である１４８ｋＤａと比較してかなり大きなものであった。この原因を探るため、ＨＥＧ１タンパク質のアミノ酸一次配列を解析したところ、ＨＥＧ１は多数のＯ型、Ｎ型糖鎖修飾を受けることが予想された。そこで、精製抗原を糖鎖切断酵素により処理し、ＳＫＭ９−２抗体の反応性を解析した。
【００８１】
具体的には、ＡＣＣ−ＭＥＳＯ４細胞から精製したＨＥＧ１タンパク質を、未処理で、または、各種酵素で処理した後にＳＫＭ９−２抗体の反応性を確認した。反応性は上記の通りドットブロット法により確認した。
【００８２】
結果は図４に示される通りであった。図４に示されるように、抗原をノイラミニダーゼ処理すると、ＳＫＭ９−２抗体は結合しなくなった（組換え可溶型ＨＥＧ１でも同様。図省略）。α２−３ノイラミニダーゼ処理で抗原に対する抗体の反応性が消失することから、ＳＫＭ９−２抗体のエピトープにはα２−３結合されたシアル化糖鎖が含まれることが示唆された。
【００８３】
このように、ＡＣＣ−ＭＥＳＯ４細胞では、ＨＥＧ１タンパク質はシアル化糖鎖修飾された状態で発現していることが明らかとなった。また、ＳＫＭ９−２抗体は、ＨＥＧ１タンパク質の糖鎖修飾依存的に認識することが明らかとなった。なお、実施例１においてヒト悪性胸膜中皮腫由来細胞株で免疫したマウスの血清からポリクローナル抗体を得て、ノイラミニダーゼによりＨＥＧ１タンパク質を処理した後にドットプロットを行ったところ、ＨＥＧ１抗体の認識がノイラミニダーゼ処理により弱まった。このことから、得られた抗体には、ＨＥＧ１タンパク質を糖鎖修飾依存的に認識する抗体が多数含まれると考えられる。
【００８４】
さらに結果を詳細に解析すると、図４に示されるように、Ｎ−グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）処理では抗体の反応性は消失しない事から、エピトープに含まれる糖鎖はＯ型糖鎖と考えられた。さらに、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ処理によって抗体の反応性が消失する事から、エピトープにはペプチド領域も含まれることが予想された。これらの結果から、ＳＫＭ９−２抗体は、ＨＥＧ１タンパク質の糖鎖部分とペプチド部分とを認識する抗体であることが示唆された。一方で、市販の抗ＨＥＧ１抗体は、ペプチド抗原に対する抗体であり、Santa Cruz Biotechnology社のヤギポリクローナル抗体である抗ＨＥＧ１抗体（HEG1 (N-13): sc-102592）や、Bioss Inc.社のウサギポリクローナル抗体である抗ＨＥＧ１抗体は、中皮腫から精製されるＨＥＧ１タンパク質には反応しなかった。
【００８５】
（４）ＨＥＧ１タンパク質の細胞膜上の局在
ＨＥＧ１タンパク質が免疫組織学染色により細胞膜上に局在することから、ＳＫＭ９−２抗体がＨＥＧ１タンパク質の細胞外領域に結合するのか、細胞内領域に結合するのかを調べた。
【００８６】
まず、ＡＣＣ−ＭＥＳＯ４を培養し、ディッシュに接着した細胞をスクレイパーにて培養ディッシュより剥離した。剥離した細胞とＳＫＭ９−２抗体とを反応させ、次いでＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧで処理して、フローサイトメーターにて解析した。陰性対照としては細胞に結合することが無い２Ｄ２抗体を用いた。ＳＫＭ９−２抗体がＨＥＧ１タンパク質の細胞外領域に結合する場合には、細胞がＦＩＴＣ標識されることになるのでフローサイトメトリーで蛍光が観察されるはずである。この結果は、図５に示される通りであった。
【００８７】
図５に示されるように、ＳＫＭ９−２抗体は、細胞膜表面上に露出するＨＥＧ１タンパク質部分に結合することが明らかとなった。
【００８８】
実施例４：ＳＫＭ９−２抗体の配列決定
本実施例では、ＳＫＭ９−２抗体のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を決定した。
【００８９】
ＳＫＭ９−２ハイブリドーマの培養上清をIsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)を用いて解析したところ、ＳＫＭ９−２抗体のサブクラスはＩｇＧ１、Ｌ鎖はｋａｐｐａであることが示唆された。そこでハイブリドーマよりＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてＲＮＡを抽出し、マウスＩｇＧ１およびｋａｐｐａ鎖の遺伝子配列データベース情報をもとに設計したプライマーを用いて５’ＲＡＣＥ（タカラバイオ株式会社）を行った。これにより、ＳＫＭ９−２抗体のＨ鎖およびＬ鎖のオープンリーディングフレームの全塩基配列を決定した。結果は図６に示される通りであった。
【００９０】
実施例５：ＳＫＭ１０−２抗体のＨＥＧ１タンパク質への反応性
実施例１において中皮腫を特異的に認識する抗体として得られたＳＫＭ１０−２抗体について、その反応特異性を確認した。
【００９１】
組換え可溶型ＨＥＧ１（実施例３の（２）参照）およびＡＣＣ−ＭＥＳＯ４の細胞可溶化液を６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＳＫＭ１０−２の培養上清を用いてウェスタンブロットを行った。結果は、図７に示される通りであった。図７に示されるように、ＳＫＭ１０−２抗体は、ＨＥＧ１タンパク質を認識した。また、図７に示されるように、糖鎖分解処理によりその反応性が消失することから、ＳＫＭ１０−２抗体は、ＳＫＭ９−２抗体と同様にＨＥＧ１タンパク質に糖鎖依存的に結合する抗体であることが明らかになった。また、ＳＫＭ１０−２抗体は、ＳＫＭ９−２抗体とＨＥＧ１タンパク質との結合に関して競合することができる。
【００９２】
実施例６：インテレクチン融合Ｆａｂの作製
ＳＫＭ９−２抗体のＦａｂ断片とインテレクチンとの融合タンパク質を作製して、このインテレクチン融合抗体がＨＥＧ１タンパク質を認識できるかどうかを確認した。
【００９３】
ＳＫＭ９−２抗体のＨ鎖のＶH領域およびＣＨ１領域と、ヒトインテレクチン（配列番号２０）の１９〜３１３番目のアミノ酸とを融合させたタンパク質（配列番号２１）を、ＳＫＭ９−２抗体のＬ鎖と細胞に共発現させて、インテレクチン融合抗体を得た。インテレクチンは、ジオール構造と極めて高い特異性および高い親和性を有し、ジオール修飾ゲルを充填したカラムによって、高度に精製可能であることを発明者らは明らかにしている。そこで、インテレクチン融合抗体を含む培養上清をジオールセファロースを充填したカラムに添加し、１，２−プロパンジオールを用いて溶出し、精製インテレクチン融合抗体を得た。ジオールセファロースは１，４−ビス（２，３−エポキシプロピル）ブタンが導入されたセファロースビーズ（epoxy-activated Sepharose 6B（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のエポキシ基をアルカリ加水分解し作製した。このインテレクチン融合抗体がHEG1タンパク質を認識できるかをウェスタンブロット法により確認した。ウェスタンブロットは、インテレクチン融合抗体を１次抗体として用い、２次抗体としては西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトインテレクチン抗体を用いた。結果は、図８に示される通りであり、インテレクチン融合抗体は、ＳＫＭ９−２抗体と同じく糖鎖修飾ＨＥＧ１タンパク質を認識した。
【００９４】
インテレクチンは、ジオール構造と結合することを本発明者らは解明した。すなわち、ヒトインテレクチン−１を強制発現させたＲＫ−１３細胞の培養上清（リコンビナントヒトインテレクチン−１と５％ＦＣＳを含むＭＥＭ培地）５００μＬに、表４に示されるように、ジオール構造を含むビーズまたは含まないビーズを加え、２５℃で１８時間撹拌した。その後、遠心分離によりビーズを回収し、回収されたビーズを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）で一回洗浄し、１５％グリセロールを含む緩衝液で溶出した。溶出されたサンプルをSDS-PAGEにより分離してCBB染色を行った。ここで、ジオールビーズとしては、ポリスチレンビーズの表面に３−アミノ−１−プロパンジオールをアミノ基を介して結合させたビーズを用い、ジオールセファロースビーズとしては、１，４−ビス（２，３−エポキシプロピル）ブタンが導入されたセファロースビーズ（epoxy-activated Sepharose 6B（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のエポキシ基をアルカリ加水分解したものを用いた。
【００９５】
結果は図９に示される通りであった。すなわち、インテレクチンは、ジオールビーズおよびジオールセファロースビーズに強く結合し、ジオール構造を有しないビーズには結合しなかった。
【００９６】
【表４】
2020196730.tif 000005
【００９７】
また、インテレクチンとジオールセファロースビーズとの結合は、ジオール構造を有する他の化合物の存在下では阻害された。この実験は、ビアコア（GEヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、段階希釈された様々な種類の化合物の存在下で、３−アミノ−１−プロパンジオールをアミノ基を介して固定したセンサーチップに対するリコンビナントヒトインテレクチン−１の結合を測定することにより行った。インテレクチンは終濃度０．５μｇ／ｍＬで使用し、測定緩衝液として１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０３％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。化合物を添加しなかった試料を用いて測定したインテレクチンの結合量を１００％として、各試料におけるインテレクチンの結合率を測定した。
【００９８】
結果は、表５に示される通りであった。表５に示されるように、例えば、Ｌ−リボース、Ｄ−リボース、Ｌ−アスコルビン酸、モノブチリン、グリセロール、１，２−ブタンジオール、１，２−プロパンジオール、および（Ｒ）−１，２−プロパンジオールがインテレクチンとジオールセファロースビーズとの結合を阻害する際のＩＣ５０は、１ｍＭ以下であった（表５参照）。他方、エタノール、１−プロパノール、および３−アミノ−１−プロパノールなどのジオール構造を有しない化合物のＩＣ５０は、１００ｍＭを超えた。
【００９９】
【表５】
2020196730.tif 000006
【０１００】
このように、インテレクチンは化合物のジオール構造に結合するため、上記ジオールセファロースビーズなどを用いて精製することができる。さらには、抗体のＦａｂ断片とインテレクチンとの融合タンパク質は、ジオールセファロースビーズで精製することができた。例えば、表５に記載の化合物を固相化したカラムやビーズを用いれば、インテレクチン融合タンパク質を精製できることは当業者であれば当然理解できる。ジオール構造を有するカラムは安価に調達できるため、インテレクチン融合タンパク質は、製造コストの観点で中皮腫の検出において有用である。
【０１０１】
実施例７Ａ：ＨＥＧ１のノックダウンによる中皮腫の増殖抑制効果
本実施例では、ＨＥＧ１に対するｓｉＲＮＡを用いて中皮腫細胞株でＨＥＧ１をノックダウンし、中皮腫の細胞増殖に与える影響を調べた。
【０１０２】
中皮腫細胞としては、ＡＣＣ−ＭＥＳＯ−４細胞株を用いた。細胞を９６ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェルで播種し、１００μＬの培地で２４時間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄し、７．５ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ、０．１５μＬのLipofectamine 2000またはLipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific Inc.）を含む１５μＬＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Thermo Fisher Scientific Inc.）を各ウェルに添加した。２４時間、４８時間または７２時間培養し、生存細胞数をCellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Reagent (Promega K.K., Tokyo, Japan)を用いて測定した。
ｓｉＲＮＡとしては、ｓｉＲＮＡ１として上記Ｈ１０９７およびＨ２６７４の１：１混合物、ｓｉＲＮＡ２として市販のsc-78365 (Santa Cruz Biothechnology, Inc.)を用い、これらに加えて、Ｓ３８１６, SASI_Hs02_00353816; Ｓ３８１７, SASI_Hs02_00353817; Ｓ３８１８, SASI_Hs02_00353818 (Sigma-Aldrich Japan K.K.)を用いた。
また、Ｈ３０５９として、
Ｈ３０５９センス鎖：5'-GCGAAUGCGUCGCAGACAACA-3'  （配列番号３８）
Ｈ３０５９アンチセンス鎖：5'-UUGUCUGCGACGCAUUCGCCA-3'  （配列番号３９）
を用い、Ｈ９１０６として、
Ｈ９１０６センス鎖：5'-CUGGCGUUCUAGUCAGUAAAA-3'  （配列番号４０）
Ｈ９１０６アンチセンス鎖：5'-UUACUGACUAGAACGCCAGAC-3'  （配列番号４１）
を用いた。
また、対照として、MISSION siRNA Universal Negative Control (SIC-001) (Sigma-Aldrich Japan K.K., Tokyo, Japan)を用いた。
【０１０３】
経時的な細胞増殖に与えるＨＥＧ１ノックダウンの影響は、図１０に示される通りであった。図１０に示されるように、ＨＥＧ１をノックダウンした例（ＨＥＧ１  ｓｉＲＮＡ１およびｓｉＲＮＡ２）ではいずれも、対照および未処理の中皮腫細胞株よりも、細胞増殖能が低下することが明らかとなった。また、ＨＥＧ１  ｓｉＲＮＡ１では、細胞数が培養開始前よりも減少していた（図１０）。ＨＥＧ１  ｓｉＲＮＡ１で処理した中皮腫細胞の一部は、４８時間目で細胞死を誘発していた。
【０１０４】
ＨＥＧ１に対するｓｉＲＮＡを導入して７２時間後の細胞数を、上記のｓｉＲＮＡを用いて確認した。ｓｉＲＮＡの細胞への導入は上記の通り行った。結果は図１１に示される通りであった。図１１に示されるように、いずれのｓｉＲＮＡを用いてＨＥＧ１をノックダウンした場合でも、中皮腫細胞は細胞増殖能を低下させた。
【０１０５】
なお、他の中皮腫細胞株であるＮＣＩ−Ｈ２４５２細胞やＨＥＧ１を発現しないＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に対してＨ２６７４のｓｉＲＮＡを導入した結果は、図１２に示される通りであった。
図１２に示されるように、他の中皮腫細胞株においても、ＨＥＧ１  ｓｉＲＮＡによりＨＥＧ１をノックダウンすると細胞増殖が抑制された。一方で、ＨＥＧ１を発現しないＨＥＫ−２９３Ｔ細胞はｓｉＲＮＡの影響を受けなかった。
【０１０６】
このことから、中皮腫の細胞増殖には、ＨＥＧ１の発現が強く関与していることが明らかとなった。また、ＨＥＧ１の発現を抑制することで、中皮腫の細胞増殖を抑制することができることも明らかとなった。このことからＨＥＧ１の発現や、ＨＥＧ１の細胞増殖促進機能を阻害することにより、ＨＥＧ１を発現するがん（例えば、中皮腫）の処置が可能になることが示唆された。
【０１０７】
ＨＥＧ１分子を遺伝子オントロジー解析をすると、ＨＥＧ１タンパク質は、細胞外領域に３つのＥＧＦドメインを有することが分かる。例えば、ＭＵＣ４というタンパク質は、細胞外にＥＧＦドメインを有し、ＥｒｂＢ２（またはＨＥＲ２／ｎｅｕ）に結合して発がんに関与することが知られている。このことから、ＨＥＧ１タンパク質のＥＧＦドメインも、同様に発がんに関与する可能性が示唆される。本実施例では、ＨＥＧ１のノックダウンにより腫瘍細胞の細胞増殖が抑制された。すなわち、本実施例では、腫瘍細胞の増殖にはＨＥＧ１タンパク質が必要であるという結果が示された。このことから、ＨＥＧ１タンパク質の細胞増殖促進機能には、ＥＧＦドメインが関与している可能性が考えられた。
また、ＨＥＧ１の細胞内発現部位を確認すると、従来の非糖鎖修飾型ＨＥＧ１は、上皮細胞間のタイトジャンクションの部位に発現するのに対して、中皮腫に特徴的な糖鎖修飾を有するＨＥＧ１は、糖鎖修飾故に親水性であり、上皮細胞の頂上部表面（apical surface）に発現する。このことも、ＨＥＧ１が細胞増殖に関わる細胞間シグナルまたはシグナル伝達に関与している可能性を示唆するものである。
【０１０８】
実施例８Ａ：エピトープ領域の決定
本実施例では、中皮腫細胞株ＡＣＣ−ＭＥＳＯ−１の内在性ＨＥＧ１をノックダウンした上で、ヒトＨＥＧ１断片を発現させ、ＳＫＭ９−２抗体との反応性を確認した。次いで、エピトープ領域についてアラニンスキャニングにより抗体との反応性を試験し、抗体との結合に重要なアミノ酸を決定した。
【０１０９】
（１）結合ドメインの解析
中皮腫細胞株ＡＣＣ−ＭＥＳＯ−１に、ＨＥＧ１  ｓｉＲＮＡ  （Ｈ９１０６）（配列番号４０、４１）  とヒトＨＥＧ１を遺伝子導入し、ＳＫＭ９−２の反応性をウェスタンブロット法で確認した。ヒトＨＥＧ１は全長（ＨＥＧ１  ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）または断片（ＨＥＧ１  ３ｋｂ，  ＨＥＧ１  ２ｋｂ，  またはＨＥＧ１  １ｋｂ）を用いた。ここで、ヒトＨＥＧ１全長は、配列番号３５のアミノ酸配列を有するタンパク質であり、配列番号３４の塩基配列をｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１（シグマ社）に挿入して得たプラスミドを形質転換して上記中皮腫細胞株に発現させた。ＨＥＧ１  ３ｋｂ断片は、配列番号３５の２８５番目のロイシンから１３８７番目のフェニルアラニンまでの断片をインフレームとなるようｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１（シグマ社）に挿入して上記中皮腫細胞株に発現させた。ＨＥＧ１  ２ｋｂおよびＨＥＧ１  １ｋｂはそれぞれ、配列番号３５の６７７番目のロイシンから１３８７番目のフェニルアラニンまでの断片および９９２番目のバリンから１３８７番目のフェニルアラニンまでの断片を同様にして上記中皮腫細胞株に発現させた。細胞溶解物をＳＫＭ９−２抗体を用いたウェスタンブロットにより解析を行った。結果は、図１３および図１４Ａに示される通りであった。
図１３および図１４Ａに示されるように、ＨＥＧ１のエクソン７を含むＨＥＧ１  ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ、ＨＥＧ１  ３ｋｂ、ＨＥＧ１  ２ｋｂが陽性（＋）となった。一方で、ＨＥＧ１  １ｋｂは抗体との結合が陰性（−）であった（図１３および図１４Ａ）。
このことから、ＳＫＭ９−２抗体は、ＨＥＧ１のエクソン７の領域に結合することが明らかとなった。
【０１１０】
（２）結合ドメインの解析２
さらにＨＥＧ１のエクソン７の領域を詳細に解析した。ヒトＳＬＵＲＰ１にＧＰＩアンカーシグナルを接続したタンパク質（配列番号４２；以下、「ＳＬＵＲＰｇｐｉ」と呼ぶ）のＮ末端側にＨＥＧ１のエクソン７の一部のアミノ酸配列を接続した融合タンパク質を用いて、ＳＫＭ９−２の反応性をウェスタンブロット法で確認した。融合タンパク質には、シグナル配列（配列番号４３）をＮ末端に付加して発現させた。
【０１１１】
ここで、用いたＨＥＧ１のエクソン７の部分配列とＳＬＵＲＰｇｐｉとの融合タンパク質は、以下の通りとした。
アミノ酸番号７８３のアスパラギン酸から９９１番目のセリンまでの断片をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６）；
アミノ酸番号８３２のグルタミンから９９１番目のセリンまでの断片をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．７）；
アミノ酸番号８８６のグルタミンから９９１番目のセリンまでの断片をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．８）；
アミノ酸番号９４１のアラニンから９９１番目のセリンまでの断片をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．９）；
配列番号４４をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６１）；
配列番号４５をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６２）；
配列番号４６をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６３）；
配列番号４７をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６４）；
配列番号４８をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６２３）；
配列番号４９をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６２３１）；
配列番号５０をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６２３２）；
配列番号５１をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６２４１）；
配列番号５２をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６２４２）。
【０１１２】
結果は、図１３および図１４Ｂに示される通りであった。
図１３および図１４Ｂに示されるように、融合タンパク質（７．６および７．６２）が陽性となった。このことから、ＳＫＭ９−２抗体は、ＨＥＧ１のＥ７９３〜Ｔ８１２を含む領域に結合することが明らかとなった。
また、図１３および図１４Ｃに示されるように、融合タンパク質（７．６２３および７．６２３１）が陽性となった。このことから、ＳＫＭ９−２抗体は、ＨＥＧ１のＳ７９９〜Ｅ８１０を含む領域に結合することが明らかとなった。
【０１１３】
（３）アラニンスキャニングによる結合部位の解析
次に、Ｓ７９９〜Ｅ８１０断片のアミノ酸を１アミノ酸ずつアラニンに改変した断片を作成し、上記と同様にＳＬＵＲＰｇｐｉに連結させて、ＳＫＭ９−２抗体との反応性をウェスタンブロット法で確認した。
すると、図１３および図１４Ｄに示されるように、Ｓ７９９〜Ｔ８０９（ＳＫＳＰＳＬＶＳＬＰＴ；配列番号５３）がＳＫＭ９−２抗体のエピトープ（線形エピトープ）であることが分かった。
【０１１４】
さらに、７．６２３１断片を発現させた細胞の可溶化液をノイラミニダーゼ処理すると、当該断片とＳＫＭ９−２抗体との反応が消失した（図１４Ｅ参照）。このことから、ＳＫＭ９−２抗体が認識するエピトープにはシアル酸修飾が含まれていることが明らかとなった。
【０１１５】
配列表
配列番号１  ：ＳＫＭ９−２抗体重鎖核酸配列
配列番号２  ：ＳＫＭ９−２抗体重鎖アミノ酸配列
配列番号３  ：ＳＫＭ９−２抗体軽鎖核酸配列
配列番号４  ：ＳＫＭ９−２抗体軽鎖アミノ酸配列
配列番号５  ：ＳＫＭ９−２抗体の重鎖ＣＤＲ１の核酸配列
配列番号６  ：ＳＫＭ９−２抗体の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号７  ：ＳＫＭ９−２抗体の重鎖ＣＤＲ２の核酸配列
配列番号８  ：ＳＫＭ９−２抗体の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号９  ：ＳＫＭ９−２抗体の重鎖ＣＤＲ３の核酸配列
配列番号１０：ＳＫＭ９−２抗体の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１１：ＳＫＭ９−２抗体の軽鎖ＣＤＲ１の核酸配列
配列番号１２：ＳＫＭ９−２抗体の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１３：ＳＫＭ９−２抗体の軽鎖ＣＤＲ２の核酸配列
配列番号１４：ＳＫＭ９−２抗体の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１５：ＳＫＭ９−２抗体の軽鎖ＣＤＲ３の核酸配列
配列番号１６：ＳＫＭ９−２抗体の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１７：ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを有する可溶型ＨＥＧ１  ｃＤＮＡの核酸配列
配列番号１８：ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを有する可溶型ＨＥＧ１  ｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
配列番号１９：ヒトインテレクチン−１遺伝子の核酸配列
配列番号２０：ヒトインテレクチン−１タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２１：ＳＫＭ９−２抗体重鎖とインテレクチンとの融合遺伝子の核酸配列
配列番号２２：ＳＫＭ９−２抗体重鎖とインテレクチンとの融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２３：Ｈ１０９７のセンス鎖の核酸配列
配列番号２４：Ｈ１０９７のアンチセンス鎖の核酸配列
配列番号２５：Ｈ２６７４のセンス鎖の核酸配列
配列番号２６：Ｈ２６７４のアンチセンス鎖の核酸配列
配列番号２７：Ｈ３６７１のセンス鎖の核酸配列
配列番号２８：Ｈ３６７１のアンチセンス鎖の核酸配列
配列番号２９：ＮＭ＿０２０７３３．１として登録されたＨＥＧ１遺伝子の核酸配列
配列番号３０：配列番号２９によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３１：ＨＥＧ１タンパク質の天然の可溶型バリアント
配列番号３２：ＨＥＧ１タンパク質の天然のバリアントをコードする核酸の核酸配列
配列番号３３：配列番号３２によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３４：ＨＥＧ１タンパク質の天然のバリアントをコードする核酸の核酸配列
配列番号３５：配列番号３４によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３６：ＨＥＧ１タンパク質の天然のバリアントをコードする核酸の核酸配列
配列番号３７：配列番号３６によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３８：Ｈ３０５９のセンス鎖の核酸配列
配列番号３９：Ｈ３０５９のアンチセンス鎖の核酸配列
配列番号４０：Ｈ９１０６のセンス鎖の核酸配列
配列番号４１：Ｈ９１０６のアンチセンス鎖の核酸配列
配列番号４２：SLURPgpi部分のアミノ酸配列
配列番号４３：SLURPgpi融合蛋白質のシグナル配列（アミノ酸配列）
配列番号４４：SLURPgpi (7.61)断片中のＨＥＧ１部分のアミノ酸配列
配列番号４５：SLURPgpi (7.62)断片中のＨＥＧ１部分のアミノ酸配列
配列番号４６：SLURPgpi (7.63)断片中のＨＥＧ１部分のアミノ酸配列
配列番号４７：SLURPgpi (7.64)断片中のＨＥＧ１部分のアミノ酸配列
配列番号４８：SLURPgpi (7.623)断片中のＨＥＧ１部分のアミノ酸配列
配列番号４９：SLURPgpi (7.6231)断片中のＨＥＧ１部分のアミノ酸配列
配列番号５０：SLURPgpi (7.6232)断片中のＨＥＧ１部分のアミノ酸配列
配列番号５１：SLURPgpi (7.6241)断片中のＨＥＧ１部分のアミノ酸配列
配列番号５２：SLURPgpi (7.6242)断片中のＨＥＧ１部分のアミノ酸配列
配列番号５３：ＨＥＧ１タンパク質のＳ７９９からＴ８０９までのアミノ酸配列
配列番号５４：図１３のＳ７９９Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号５５：図１３のＫ８００Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号５６：図１３のＳ８０１Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号５７：図１３のＰ８０２Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号５８：図１３のＳ８０３Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号５９：図１３のＬ８０４Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号６０：図１３のＶ８０５Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号６１：図１３のＳ８０６Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号６２：図１３のＬ８０７Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号６３：図１３のＰ８０８Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号６４：図１３のＴ８０９Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号６５：図１３のＥ８１０Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
【図１】
2020196730.tif 000007
【図２】
2020196730.tif 000008
【図３】
2020196730.tif 000009
【図４】
2020196730.tif 000010
【図５】
2020196730.tif 000011
【図６】
2020196730.tif 000012
【図７】
2020196730.tif 000013
【図８】
2020196730.tif 000014
【図９】
2020196730.tif 000015
【図１０】
2020196730.tif 000016
【図１１】
2020196730.tif 000017
【図１２】
2020196730.tif 000018
【図１３】
2020196730.tif 000019
【図１４Ａ】
2020196730.tif 000020
【図１４Ｂ】
2020196730.tif 000021
【図１４Ｃ】
2020196730.tif 000022
【図１４Ｄ】
2020196730.tif 000023
【図１４Ｅ】
2020196730.tif 000024
【配列表】
2020196730000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月10日(2020.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に糖鎖修飾依存的に結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片。
【請求項３】
中皮腫の細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片。
【請求項４】
請求項３記載のモノクローナル抗体であって、
（１）配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、抗体、
（２）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体、
（３）配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体、
（４）上記（３）の抗体と前記ＨＥＧ１タンパク質に対する結合において競合する抗体、若しくは
（５）上記（３）の抗体と同じエピトープに結合する抗体
またはこれらの抗原結合性断片。
【請求項５】
中皮腫細胞株で発現された配列番号５３のアミノ酸配列からなるペプチドに結合するモノクローナル抗体。
【請求項６】
抗原が、中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質である、請求項４に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体のＶH領域またはＶH領域およびＣＨ１領域とヒトインテレクチンタンパク質との融合タンパク質と、該抗体の軽鎖とのタンパク質複合体。
【請求項８】
ＨＥＧ１タンパク質に結合するモノクローナル抗体、請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または請求項７に記載のタンパク質複合体を含む、中皮腫診断薬。
【請求項９】
ＨＥＧ１タンパク質に結合するモノクローナル抗体、請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または請求項７に記載のタンパク質複合体と、イメージングプローブとの結合体を含む、中皮腫の体内診断薬。
【請求項１０】
ＨＥＧ１タンパク質に結合するモノクローナル抗体、請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または請求項７に記載のタンパク質複合体を含む、中皮腫診断用キット。
【請求項１１】
ＨＥＧ１タンパク質に結合するモノクローナル抗体、請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または請求項７に記載のタンパク質複合体と、イメージングプローブとの結合体を含む、中皮腫の体内診断用キット。
【請求項１２】
ＨＥＧ１タンパク質に結合するモノクローナル抗体、請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または請求項７に記載のタンパク質複合体を含む、中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物。
【請求項１３】
生体から分離された試料において、細胞膜上に発現した糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質を検出することを含む、中皮腫の検出方法。
【請求項１４】
ＨＥＧ１タンパク質に結合するモノクローナル抗体、請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または請求項７に記載のタンパク質複合体により、生体から分離された試料中のＨＥＧ１タンパク質を検出することを含む、中皮腫の検出方法。
【請求項１５】
中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質の断片であって、配列番号３５のアミノ酸配列において７９９番目〜８０９番目のアミノ酸配列からなるその断片。