(57)【要約】【課題】体内での脂肪の蓄積の抑制を可能にする脂肪細胞分化抑制剤を提供する。【解決手段】３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩を有効成分とし、脂肪前駆細胞、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化過程にある細胞、又は前記脂肪細胞に作用して、脂肪細胞への分化を抑制する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩を有効成分とし、脂肪前駆細胞、前記脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化過程にある細胞、又は前記脂肪細胞に作用して、前記脂肪細胞への分化を抑制する脂肪細胞分化抑制剤。
【請求項２】
前記脂肪前駆細胞又は前記脂肪細胞がヒト由来である請求項１に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
【請求項３】
前記３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩が、前記脂肪細胞において脂肪酸合成を抑制する働きを持つ請求項１又は２に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の脂肪細胞分化抑制剤を含有する化粧料。
【請求項５】
前記３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩を０．１ｍＭ以上９５ｍＭ未満含有している請求項４に記載の化粧料。
【請求項６】
脂肪前駆細胞、前記脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化過程にある細胞、又は前記脂肪細胞に、３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩を作用させ、前記脂肪細胞への分化を抑制する分化抑制工程を含む脂肪細胞分化抑制方法。
【請求項７】
前記分化抑制工程は、前記脂肪前駆細胞、前記脂肪前駆細胞から前記脂肪細胞への分化過程にある細胞、又は前記脂肪細胞を、前記３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩を含む培地で培養する工程である請求項６に記載の脂肪細胞分化抑制方法。
【請求項８】
前記培地は、前記３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩のモル濃度が０．１ｍＭ以上９５ｍＭ未満である請求項７に記載の脂肪細胞分化抑制方法。
【請求項９】
前記脂肪前駆細胞又は前記脂肪細胞がヒト由来である請求項６〜８のいずれか一項に記載の脂肪細胞分化抑制方法。
【請求項１０】
前記３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩が、前記脂肪細胞において脂肪酸合成を抑制する働きを持つ請求項６〜９のいずれか一項に記載の脂肪細胞分化抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪細胞分化抑制剤及びこれを含有する化粧料、並びに脂肪細胞分化抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、３−ヒドロキシ酪酸（以下、「３ＨＢ」ともいう）は、美白効果や、細胞賦活効果、保湿効果などがあることから、化粧水、乳液、クリーム、パック、分散液、洗浄料等の化粧品や、軟膏剤、クリーム剤、外用液剤等の外用医薬品（以下、「化粧料」と総称する）として利用されるようになっている（例えば、特許文献１記載の美白化粧料、細胞賦活化粧料及び保湿化粧料）。
【０００３】
また、３ＨＢに関する研究が進むにつれて、当該３ＨＢには、様々な遺伝子の発現やタンパク質の活性に影響するシグナル伝達物質としての作用があることが判明し、特許文献２には、３ＨＢが脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌を抑制するという新たな特徴に着目し、体重調節による抗肥満作用のためにアディポネクチンの分泌を調節（抑制）する、３ＨＢを有効成分としたアディポネクチン分泌調節剤が提案されている（特許文献２）。
【０００４】
特許文献２においては、アディポネクチンの産生を抑制することによって痩身効果が発揮されるとの知見を基に、アディポネクチンの分泌を抑制して血中のアディポネクチン濃度を適正な濃度に調節するために、体重調節による抗肥満作用を有する用途剤としてアディポネクチン分泌調節剤を用いている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１７−２００８８３号公報
【特許文献２】特許第５４９９４１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
アディポネクチンの産生と肥満との関係については、特許文献２に記載されているように、アディポネクチンの産生を抑制することで痩身効果を示す（別の言い方をすれば、肥満の抑制に繋がる）という説も唱えられているが、アディポネクチンの産生と肥満との関係についてはこの他にも多数の説が唱えられている。
【０００７】
例えば、アディポネクチンは、脂肪前駆細胞が分化した脂肪細胞から産生されるだけでなく、この脂肪細胞が成熟した脂肪細胞（成熟脂肪細胞）からも産生され、興味深いことに、両者から産生されるアディポネクチンの量は、脂肪細胞より成熟脂肪細胞の方が少ないという説も唱えられている。この説からすれば、より脂肪の蓄積が進んだ成熟脂肪細胞が増えることでアディポネクチンの産生量が減少するのであるから、アディポネクチンの産生が減っている場合の方が肥満が進行していることになる。
【０００８】
このように、アディポネクチンの産生を抑制することが肥満の抑制に繋がるとは必ずしも言えないという実情がある以上、アディポネクチンの産生と肥満の抑制とを関連付けてアディポネクチンの産生に着目することにさほど意義はない。
【０００９】
特許文献２は、アディポネクチンの産生と肥満の抑制とを関連付けてアディポネクチンの産生に着目しているが、特許文献２においては、脂肪前駆細胞を脂肪細胞に分化させた後、この分化後の脂肪細胞を３ＨＢを含む無血清培地で培養することで、アディポネクチンの産生量を指標として、３ＨＢに関する、脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌抑制能を評価している。しかしながら、アディポネクチンの産生量の変化は、脂肪細胞が成熟脂肪細胞に成熟したことに起因するものであるのか、或いは、３ＨＢの作用に起因するものであるのかを明確に区別することができない以上、３−ヒドロキシ酪酸に関するアディポネクチンの分泌抑制能が実験的に示されていると言えず、アディポネクチンの分泌の抑制と肥満の抑制との関係についても具体的な実験データが示されているわけでない。したがって、特許文献２の内容を鑑みても、アディポネクチンと肥満の抑制とを関連付けてアディポネクチンの産生に着目することにさほど意義があるとは考え難い。
【００１０】
これらの事情に鑑みれば、抗肥満作用を有する化粧料を開発する上では、アディポネクチンの産生とは無関係に、実際の体内での脂肪の蓄積を抑制して肥満を抑えられる物質や、当該物質の使用方法を見出したり、そのような物質がどのようにして脂肪の蓄積を抑制するのかを解明したりすることが極めて重要である。
【００１１】
本発明は以上の実情に鑑みなされたものであり、体内での脂肪の蓄積の抑制を可能にする脂肪細胞分化抑制剤及びこれを用いた化粧料、並びに脂肪細胞分化抑制方法の提供を、その目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、体内での脂肪の蓄積を抑制する手段について鋭意研究を重ねた結果、脂肪前駆細胞を脂肪細胞へ分化誘導させる際の培地に３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩が含まれていることで、この３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩が分化過程において脂肪前駆細胞に作用して脂肪細胞への分化が抑制され、更に、脂肪細胞中の脂肪酸合成が抑制されることで、結果的に体内での脂肪の蓄積が抑えられること、即ち、３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩が脂肪蓄積抑制効果を有することを見出した。更に、本発明者らは、脂肪細胞を培養する際に培地に３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩が含まれていることで、これらが脂肪蓄積抑制効果を発揮し、脂肪細胞内での脂肪滴の蓄積が抑えられることも見出した。尚、分化とは細胞が特定の役割を持つことであるため、本願において、「脂肪細胞への分化」とは、脂肪前駆細胞から脂肪細胞へ分化すること、及び細胞が脂肪酸を合成して細胞内に脂肪滴を蓄積することを含む概念である。
【００１３】
即ち、上記目的を達成するための本発明に係る脂肪細胞分化抑制剤の特徴構成は、３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩を有効成分とし、脂肪前駆細胞、前記脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化過程にある細胞、又は前記脂肪細胞に作用して、前記脂肪細胞への分化を抑制する点にある。
【００１４】
上記特徴構成によれば、脂肪前駆細胞が脂肪細胞へと分化する過程や脂肪細胞の培養過程において、３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩が脂肪前駆細胞や脂肪細胞に作用することで脂肪細胞への分化（脂肪細胞内での脂肪滴の蓄積を含む）が抑制される。このように、上記特徴構成では、アディポネクチンの産生とは無関係に、脂肪細胞への分化を抑制することで、体内での脂肪の蓄積を抑えることができる。
【００１５】
また、本発明に係る脂肪細胞分化抑制剤の更なる特徴構成は、前記脂肪前駆細胞又は前記脂肪細胞がヒト由来である点にある。
【００１６】
上記特徴構成によれば、ヒト由来の脂肪前駆細胞が脂肪細胞へ分化するのを抑制することができ、また、ヒト由来の脂肪細胞での脂肪滴の蓄積を抑制することができるため、人に対して好適に用いることができる。
【００１７】
尚、上記のように、３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩を有効成分として含有していることで、脂肪細胞中の脂肪酸合成が抑制され、体内での脂肪の蓄積が抑えられることから、３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩は、脂肪細胞において脂肪酸合成を抑制する働きを持っている。
【００１８】
即ち、本発明に係る脂肪細胞分化抑制剤の更なる特徴構成は、前記３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩が、前記脂肪細胞において脂肪酸合成を抑制する働きを持つ点にある。
【００１９】
上記脂肪細胞分化抑制剤は、一般的に用いられ得る添加剤（界面活性剤や希釈剤、安定剤など）とともに、化粧料の原料として好適に使用することができる。
【００２０】
即ち、本発明に係る化粧料の特徴構成は、上記脂肪細胞分化抑制剤を含有する点にある。
【００２１】
また、本発明に係る化粧料の更なる特徴構成は、前記３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩を０．１ｍＭ以上９５ｍＭ未満含有している点にある。
【００２２】
化粧料に３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩が０．１ｍＭ以上９５ｍＭ未満含有していることで、当該化粧料を人に対して使用した場合に、脂肪前駆細胞や脂肪細胞に作用して脂肪細胞への分化（脂肪細胞内での脂肪滴の蓄積を含む）を抑制でき、優れた脂肪蓄積抑制効果を発揮する。尚、０．１ｍＭ未満であると、３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩による脂肪蓄積抑制効果が発揮され難くなる。
【００２３】
また、上記目的を達成するための脂肪細胞分化抑制方法の特徴構成は、脂肪前駆細胞、前記脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化過程にある細胞、又は前記脂肪細胞に、３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩を作用させ、前記脂肪細胞への分化を抑制する分化抑制工程を含む点にある。
【００２４】
上述したように、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、脂肪前駆細胞を脂肪細胞へ分化誘導させる際の培地に３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩が含まれていることで、この３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩が分化過程において脂肪前駆細胞に作用して脂肪細胞への分化が抑制されること（即ち、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化が抑制されたり、脂肪細胞中の脂肪酸合成が抑制されたりすること）を発見し、更に、脂肪細胞を培養する際の培地に３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩が含まれていることで、これらが脂肪蓄積抑制効果を発揮し、脂肪細胞内での脂肪滴の蓄積が抑えられることも発見した。上記特徴構成によれば、脂肪前駆細胞、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化過程にある細胞、又は脂肪細胞に対して３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩が作用して脂肪細胞への分化（脂肪細胞内での脂肪滴の蓄積を含む）を抑制することができる。
【００２５】
また、本発明に係る脂肪細胞分化抑制方法の更なる特徴構成は、前記分化抑制工程は、前記脂肪前駆細胞、前記脂肪前駆細胞から前記脂肪細胞への分化過程にある細胞、又は前記脂肪細胞を、前記３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩を含む培地で培養する工程である点にある。
【００２６】
上記特徴構成によれば、３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩を含む培地で、脂肪前駆細胞、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化過程にある細胞、又は脂肪細胞を培養するため、３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩が脂肪前駆細胞、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化過程にある細胞、又は脂肪細胞に作用し易く、脂肪細胞への分化を効果的に抑制できる。
【００２７】
更に、本発明に係る脂肪細胞分化抑制方法の更なる特徴構成は、前記培地は、前記３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩のモル濃度が０．１ｍＭ以上９５ｍＭ未満である点にある。
【００２８】
上記特徴構成によれば、細胞に対する毒性を抑えた上で、脂肪細胞への分化を効果的に抑制することができる。尚、０．１ｍＭ未満であると、脂肪細胞への分化が抑制され難くなる。
【００２９】
また、本発明に係る脂肪細胞分化抑制方法の更なる特徴構成は、前記脂肪前駆細胞又は前記脂肪細胞がヒト由来である点にある。
【００３０】
上記特徴構成によれば、ヒト由来の脂肪前駆細胞が脂肪細胞へ分化するのを抑制することができ、また、ヒト由来の脂肪細胞での脂肪滴の蓄積を抑制することができる。
【００３１】
尚、上記のように、３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩を作用させることで、脂肪細胞中の脂肪酸合成が抑制されることから、３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩は、脂肪細胞において脂肪酸合成を抑制する働きを持っている。
【００３２】
即ち、本発明に係る脂肪細胞分化抑制方法の更なる特徴構成は、前記３−ヒドロキシ酪酸又は３−ヒドロキシ酪酸塩が、前記脂肪細胞において脂肪酸合成を抑制する働きを持つ点にある。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】確認試験１におけるオイルレッドＯ染色試験の流れを模式的に表した図である。
【図２】確認試験１におけるオイルレッドＯ染色試験の結果を示すグラフである。
【図３】確認試験１におけるオイルレッドＯ染色試験の結果（分化誘導処理なしのコントロール１）を示す顕微鏡写真である。
【図４】確認試験１におけるオイルレッドＯ染色試験の結果（分化誘導処理ありのコントロール２）を示す顕微鏡写真である。
【図５】確認試験１におけるオイルレッドＯ染色試験の結果（モル濃度０．７６ｍＭ）を示す顕微鏡写真である。
【図６】確認試験１におけるオイルレッドＯ染色試験の結果（モル濃度３．８ｍＭ）を示す顕微鏡写真である。
【図７】確認試験１におけるオイルレッドＯ染色試験の結果（モル濃度１９ｍＭ）を示す顕微鏡写真である。
【図８】確認試験１における生細胞数測定試験の結果を示すグラフである。
【図９】確認試験２におけるオイルレッドＯ染色試験の流れを模式的に示した図である。
【図１０】確認試験２におけるオイルレッドＯ染色試験の結果を示すグラフである。
【図１１】確認試験２における生細胞数測定試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明の実施形態に係る脂肪細胞分化抑制剤、化粧料、及び脂肪細胞分化抑制方法について説明する。
【００３５】
〔３ＨＢ〕
３ＨＢ（（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸）は、３ＨＢ生産性のハロモナス菌を添加した発酵プロセスを行い、得られた発酵液からハロモナス菌を分離除去し、精製することにより得られる。発酵プロセスは、果汁等の糖質栄養源を含有する原料液に、３ＨＢ生産性のハロモナス菌をそのまま添加し、好気発酵、嫌気発酵を順に行うプロセス（特開２０１３−０８１４０３号公報等参照）として実施することができる。これにより、糖質が３ＨＢに変換され、発酵液中に生産されることになる。生産された３ＨＢは、常法にて、膜分離、分離精製を経た後、純粋な３ＨＢとして用いられる。
【００３６】
〔脂肪細胞分化抑制剤〕
脂肪細胞分化抑制剤は、上記３ＨＢを有効成分として含有するものであり、当該３ＨＢは、それ自体の他、遊離酸や種々の塩（３−ヒドロキシ酪酸塩）として用いることができ、塩には金属塩（無機塩）及び有機塩のいずれも含む。また、脂肪細胞分化抑制剤は、３ＨＢを主たる機能性成分の一つとして含んでいれば、必要に応じて種々の添加剤を含んでいても良く、３ＨＢのもつ特性が現れる態様であれば、配合割合に特に制限はない。更に、３ＨＢは、必ずしも脂肪細胞分化抑制剤中で最も多い成分である必要はない。尚、脂肪細胞分化抑制剤には、精製された３ＨＢに代えて、発酵プロセスにより得られた発酵液をそのまま用いても良いし、その発酵液をベースに種々の添加剤を添加したものを用いても良い。
【００３７】
この脂肪細胞分化抑制剤によれば、有効成分である３ＨＢが脂肪前駆細胞や脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化過程にある細胞、脂肪細胞に対して作用することで、脂肪細胞への分化（脂肪細胞内での脂肪滴の蓄積を含む）が抑制され、脂肪細胞中の脂肪酸合成が抑制される。特に、脂肪前駆細胞、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化過程にある細胞、又は脂肪細胞がヒト由来である場合、３ＨＢの高い分化抑制効果が発揮されることを実験的に確認している。
【００３８】
〔化粧料〕
本発明の脂肪細胞分化抑制剤は、化粧料の原料として用いることができる。この化粧料には、必要に応じて水や一般的な化粧料に配合される種々の公知の添加成分を本発明の効果を損なわない程度に任意の処方で含有することができるが、３ＨＢによって、脂肪前駆細胞や脂肪細胞に作用して脂肪細胞への分化（脂肪細胞内での脂肪滴の蓄積を含む）が抑制され、優れた脂肪蓄積抑制効果が有効に発揮されるようにするという観点からすると、３ＨＢを０．１ｍＭ以上９５ｍＭ未満含有していることが好ましく、０．１ｍＭ以上１９ｍＭ以下含有していることがより好ましい。尚、公知の添加成分としては、例えば、水性基剤や油性基剤、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、ゲル化剤、酸化防止剤、防腐剤、殺菌剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、紫外線吸収剤、還元剤、酸化剤、高分子粉体、無機粉体、ビタミン類及びその誘導体類、糖類及びその誘導体類、有機酸類、酵素類、アルコール類、香料、色素などを例示することができる。
【００３９】
具体的には下記表１に示す処方にて、化粧水を構成することができる。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
具体的には下記表２に示す処方にて、乳液を構成することができる。
【００４２】
【表２】
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【００４３】
具体的には下記表３に示す処方にて、クリームを構成することができる。
【００４４】
【表３】
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【００４５】
このような化粧水や乳液、クリームなどの化粧料によれば、この化粧料を人の肌に塗布することで、有効成分として含まれている３ＨＢが人の脂肪前駆細胞や脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化過程にある細胞、脂肪細胞に対して作用して、脂肪細胞への分化が抑制されるため、結果的に、体内での脂肪の蓄積を抑えることができる。
【００４６】
〔脂肪細胞分化抑制方法〕
本発明の脂肪細胞分化抑制方法は、脂肪前駆細胞、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化過程にある細胞、又は脂肪細胞に、３ＨＢを作用させ、脂肪細胞への分化を抑制する分化抑制工程を含み、具体的に、分化抑制工程において、脂肪前駆細胞、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化過程にある細胞、又は脂肪細胞を、３ＨＢを含む培地で培養する。この脂肪細胞分化抑制方法によれば、脂肪前駆細胞、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化過程にある細胞、又は脂肪細胞に対して３ＨＢを作用させ、脂肪細胞への分化（脂肪細胞内での脂肪滴の蓄積を含む）を抑制し、脂肪細胞中の脂肪酸合成を抑制することができる。
【００４７】
尚、３ＨＢを含む培地は、その３ＨＢのモル濃度が０．１ｍＭ以上９５ｍＭ未満（より望ましくは０．１ｍＭ以上１９ｍＭ以下）である場合、細胞に対する毒性を抑えた上で、脂肪細胞への分化を効果的に抑制することができることを実験的に確認している。また、特に、脂肪前駆細胞、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化過程にある細胞、又は脂肪細胞がヒト由来である場合、３ＨＢの高い分化抑制効果が発揮されることを実験的に確認している。
【００４８】
〔３ＨＢの分化抑制能の確認試験１〕
以下、ヒト白色脂肪前駆細胞を分化誘導下・被験物質（３ＨＢＮａ）添加下で培養し、被験物質による分化抑制能を検証した方法及び結果について説明する。尚、図１には、本確認試験１において行ったヒト白色脂肪前駆細胞に関する培養過程及びオイルレッドＯ染色による測定過程を模式的に図示した。
【００４９】
尚、検証のための各種試験に使用した被験物質、細胞、試薬、試験用キットは以下の通りである。
（被験物質）
・（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸ナトリウム（発酵プロセス由来）
（細胞）
・ヒト白色脂肪前駆細胞（皮下脂肪）（タカラバイオ株式会社製）
（試薬及び試験用キット）
・脂肪前駆細胞増殖培地キット（タカラバイオ株式会社製）
・脂肪分化誘導培地（株式会社バイオ未来工房製）
・脂肪維持培地（株式会社バイオ未来工房製）
・ホルムアルデヒド溶液（富士フイルム和光純薬株式会社製）
・２−プロパノール（富士フイルム和光純薬株式会社製）
・オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製）
・生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）
・ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）
・ダルベッコＰＢＳ（日水製薬株式会社製）
【００５０】
各種試験は、以下のように行った。
１．被験物質の調製
１５ｇの３ＨＢＮａを精製水に溶解させ、４９４ｇ／Ｌ（ｐＨ６．７）の被験物質溶液を調製した。この被験物質溶液は、所定モル濃度の３ＨＢを含む培地となるように適宜希釈した上で、１０％（ｖ／ｖ）となるように各培地に溶解後、ろ過滅菌（０．２２μｍ）し、ストックとして使用した。
【００５１】
２．オイルレッドＯ染色試験
２−１．細胞培養
脂肪前駆細胞を、増殖培地を用いて６×１０４ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ／ウェルで、２４ウェルプレートに播種し、ＣＯ２インキュベータ内（５％ＣＯ２、３７℃）で１日間培養した（７０％コンフルエント）。その後、０．７６ｍＭ、３．８ｍＭ、１９ｍＭの３ＨＢを含む分化誘導培地に置換して３日間培養した（分化誘導処理）。しかる後、０．７６ｍＭ、３．８ｍＭ、１９ｍＭの３ＨＢを含む分化維持培地に交換して更に３日間培養した。
２−２．オイルレッドＯ染色
分化維持培地で３日間培養した細胞について、十分な脂肪滴の蓄積を確認した後、オイルレッドＯ染色を実施した。具体的には、以下の手順で行った。
（１）プレート各ウェルの細胞をＰＢＳで２回洗浄する。
（２）４％ＰＦＡで１０分間、室温にて固定する。
（３）ＰＢＳで２回洗浄する。
（４）固定された細胞を６０％イソプロパノールに１分間置換する。
（５）オイルレッドＯ染色液に置換し、２０分間、室温にて染色を行う。
（６）染色液を除去後、６０％イソプロパノールで１回洗浄する。
（７）ＰＢＳで２回洗浄する。
（８）ＰＢＳ中にて顕微鏡で染色細胞を観察、撮影する。
（９）ＰＢＳを除去後、５００μＬのイソプロパノールを添加し、染色しているオイルレッドを抽出する。
（１０）抽出液を１．５ｍＬチューブに移し、遠心分離により細胞片を除去した後、上清について４９２ｎｍの光学濃度にて吸光度測定を行う。尚、測定した値からブランク（プレートウェルのみでオイルレッドＯ染色を実施した区画）値を引いた値を測定値とした。
【００５２】
３．生細胞数測定試験
３−１．細胞培養
上記２−１と同手法にて細胞培養を実施した。
３−２．生細胞数の計測
培養終了後に各ウェルから培養上清を除去し、終濃度１０％の生細胞数測定試薬（ＷＳＴ−８）を含む維持培地を１ｍＬ／ウェルで添加し、３７℃にて反応させる。添加後３０分及び９０分後の吸光度（測定波長４５０ｎｍ、参照波長６２０ｎｍ）をプレートリーダーにて測定し、両値から６０分間の吸光度の変化量を算出し、生細胞数として計測した。
【００５３】
４．遺伝子発現試験
４−１．細胞培養
脂肪前駆細胞を、増殖培地を用いて３×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／ウェルで、６ウェルプレートに播種し、ＣＯ２インキュベータ内（５％ＣＯ２、３７℃）で１日間培養した（７０％コンフルエント）。その後、０．７６ｍＭ、３．８ｍＭ、１９ｍＭの３ＨＢを含む分化誘導培地に置換して３日間培養した。しかる後、０．７６ｍＭ、３．８ｍＭ、１９ｍＭの３ＨＢを含む分化維持培地に交換して更に３日間培養した。
４−２．トータルＲＮＡの回収
培養終了後に、１９ｍＭの３ＨＢを含む処理区のみについて、トータルＲＮＡを回収した。具体的には、各ウェルの培養上清を除去した後、１×ＰＢＳを０．３ｍＭ／ウェルで添加して細胞を洗浄し、ＰＢＳを除去した後に５０μＬのトリプシンＥＤＴＡ溶液を添加して３７℃で反応させた。その後、各ウェルに４５０μＬの１０％ＦＢＳを含むＰＢＳを添加し、トリプシン反応を停止させた。しかる後、細胞剥離液を回収し、遠心力５００×ｇで１０分間、室温にて遠心分離を行い、上清を除去して沈殿した細胞を回収した。回収した細胞からのＲＮＡ抽出は以下の手順で行った。
（１）回収した細胞に３５０μＬのＲＬＴ  ｂｕｆｆｅｒを添加し、細胞塊を緩やかに懸濁する。
（２）細胞懸濁液を１分間、ボルテックス（攪拌）処理する。
（３）細胞懸濁液に３５０μＬの７０％エタノールを添加し、ピペットにて緩やかに懸濁する。
（４）反応液をＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎに移し、遠心力８０００×ｇで１５秒間遠心分離を行い、ろ液を破棄する。
（５）カラムに３５０μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＲＷ１を添加し、遠心力８０００×ｇで１５秒間遠心分離を行い、ろ液を破棄する。
（６）１０μＬのＤＮａｓｅ  Ｉ  ｓｔｏｃｋ溶液を７０μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＲＤＤに添加し混和する。
（７）カラムに上記（６）のＤＮａｓｅ溶液８０μＬを添加して室温で１５分間静置して反応させる。
（８）カラムに３５０μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＲＷ１を添加し、遠心力８０００×ｇで１５秒間遠心分離を行い、ろ液を破棄する。
（９）カラムを新たな２ｍＬ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅに移し、５００μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＲＰＥを添加し、遠心力８０００×ｇで１５秒間遠心分離を行い、ろ液を破棄する。
（１０）カラムに５００μＬの８０％エタノールを添加し、遠心力８０００×ｇで１５秒間遠心分離を行い、ろ液を破棄する。
（１１）カラムを新たな２ｍＬ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅに移し、遠心力１２０００×ｇで５分間遠心分離を行い、ろ液を破棄する。
（１２）カラムを新たなチューブに移し、１４μＬのＲＮａｓｅフリー水を添加し、１２０００×ｇで５分間遠心分離を行い、ろ液をＲＮＡサンプルとした。
５−３．ＤＮＡマイクロアレイ解析
単離した各トータルＲＮＡをクラボウ株式会社において、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社製のＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙにて遺伝子発現解析を実施し、遺伝子発現に差異があった遺伝子についてＧＯ機能解析とｐａｔｙｗａｙ解析を実施した。
【００５４】
以下、各種試験結果について説明する。
【００５５】
１．オイルレッドＯ染色試験の結果
表４は、分化誘導処理を行わずに培養した細胞、即ち脂肪前駆細胞（コントロール１）、３ＨＢを含まない培地を用いて分化誘導処理を行って培養した細胞、即ち脂肪細胞（コントロール２）、０．７６ｍＭ、３．８ｍＭ、１９ｍＭの３ＨＢを含む培地を用いて分化誘導処理を行って培養した細胞に関するオイルレッドＯ染色試験の結果をまとめた表であり、また、図２は、コントロール１の吸光度に対する割合を縦軸としたグラフである。また、図３〜図７は、オイルレッドＯ染色試験の結果を示す顕微鏡写真であり、図３はコントロール１、図４はコントロール２、図５は３ＨＢのモル濃度が０．７６ｍＭ、図６は３ＨＢのモル濃度が３．８ｍＭ、図７は３ＨＢのモル濃度が１９ｍＭの場合に関するものであり、図中の赤色部分が染色された脂肪滴である。
表４から明らかなように、分化誘導処理の有無によって、吸光度に大きな差が出ており、分化誘導処理を行って培養することで培養後の細胞に脂肪が蓄積されることを確認することができ、図２と図３〜図７とを比較しても、分化誘導処理を行って培養することで、赤色部分が増加、即ち、細胞内に脂肪が蓄積されていることが確認できる。また、分化誘導処理を行って培養した場合、培地中に含まれる３ＨＢのモル濃度が高くなるほど吸光度が減少、即ち、脂肪の蓄積量が少なくなっていることが確認でき、特に、３ＨＢのモル濃度が３．８ｍＭ及び１９ｍＭである場合において、濃度依存的な有意な脂肪の蓄積の抑制を確認することができた。また、図３〜図７を比較しても、３ＨＢのモル濃度が高くなるほど赤色部分が減少、即ち、細胞内に蓄積された細胞が少なくなっていることが確認できる。このことから、３ＨＢが、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化を抑制する分化抑制能を有することが分かり、特に、分化過程において３ＨＢがモル濃度３．８ｍＭ及び１９ｍＭで存在していることで、３ＨＢの分化抑制能が十分に発揮されることが明らかになった。
【００５６】
【表４】
2020055795.tif 000006
【００５７】
２．生細胞数測定試験の結果
表５は、分化誘導処理を行わずに培養した細胞（コントロール１）、３ＨＢを含まない培地を用いて分化誘導処理を行って培養した細胞（コントロール２）、０．７６ｍＭ、３．８ｍＭ、１９ｍＭの３ＨＢを含む培地を用いて分化誘導処理を行って培養した細胞に関する生細胞数測定試験の結果をまとめた表であり、図８は、細胞生存度を縦軸としたグラフである。
表５及び図８から明らかなように、分化誘導処理の有無、培地中の３ＨＢの有無、培地中の３ＨＢのモル濃度にかかわらず、生細胞数に大きな変化は見られない。このことから、オイルレッドＯ染色試験によって確認された脂肪の蓄積量の減少が、細胞数が減少したことによるものでないことが明らかになった。
【００５８】
【表５】
2020055795.tif 000007
【００５９】
３．遺伝子発現試験の結果
表６は、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化に関する遺伝子についての遺伝子発現解析の結果をまとめた表であり、表７は、脂肪酸の合成に関する遺伝子についての遺伝子発現解析の結果をまとめた表である。
表６に示すように、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体δ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｌｔａ）、リポタンパク質リパーゼ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｐａｓｅ）、ペリリピン１（ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  １）、脂肪酸結合タンパク質３（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３，  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  ｈｅａｒｔ（ｍａｍｍａｒｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ））、マトリックスメタロペプチダーゼ１（間質コラゲナーゼ）（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  １（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓe））、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ（Δ９デサチュラーゼ）（ｓｔｅａｒｏｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ  （ｄｅｌｔａ−９−ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ））の遺伝子発現が抑制されているため、脂肪前駆細胞のまま未分化の細胞があり、分化後の脂肪を蓄える脂肪細胞の数が相対的に少なくなる結果として、上記オイルレッドＯ染色試験において、培地中に３ＨＢが存在する場合に脂肪の蓄積が減少したと考えられる。このことから、３ＨＢに、脂肪前駆細胞や脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化過程にある細胞に作用して分化を抑制する作用があることが遺伝子レベルで明らかになった。
また、表７に示すように、ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ／３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ／エノイルＣｏＡヒドラターゼ（三機能タンパク質）αサブユニット（ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／３−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｌａｓｅ／ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ  ｈｙｄｒａｔａｓｅ  （ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ），  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ）、ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ２（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ２）、ＥＬＯＶＬ脂肪酸エロンガーゼ５（ＥＬＯＶＬ
ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｅｌｏｎｇａｓｅ  ５）、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ（Δ９デサチュラーゼ）（ｓｔｅａｒｏｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ（ｄｅｌｔａ−９−ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ））、脂肪酸シンターゼ（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）の遺伝子発現が抑制されているため、脂肪細胞中の脂肪の蓄積量が少ないと考えられる。このことから、３ＨＢには、脂肪酸の合成自体を抑制する作用があることも明らかになった。
【００６０】
【表６】
2020055795.tif 000008
【００６１】
【表７】
2020055795.tif 000009
【００６２】
〔３ＨＢの分化抑制能の確認試験２〕
以下、ヒト白色脂肪前駆細胞を分化誘導段階から被験物質（３ＨＢＮａ）を添加した場合（条件Ａ）、及び分化維持段階の途中から被験物質（３ＨＢＮａ）を添加した場合（条件Ｂ）における被験物質による分化抑制能を検証した方法及び結果について説明する。尚、図９には、確認試験２におけるオイルレッドＯ染色試験の流れを模式的に示した。尚、図９中において、オイルレッドＯ染色による測定過程は確認試験１と同様であるため、図示を省略し、条件Ａ及び条件Ｂの場合についての細胞培養過程のみを図示した。
【００６３】
尚、検証のための各種試験では、確認試験１と同様の被験物質、細胞、試薬、試験用キットを使用した。
【００６４】
各種試験は、以下のように行った。
１．被験物質の調製
４５．９８％の３ＨＢＮａ溶液を、所定モル濃度（０．７６ｍＭ、３．８ｍＭ、１９ｍＭ）の３ＨＢを含む培地となるように適宜希釈した上で試験培地に添加し、ろ過滅菌（０．２２μｍ）後に使用した。
【００６５】
２．オイルレッドＯ染色試験
２−１．細胞培養
確認試験１と同様に、増殖培地上での培養、分化誘導培地上での培養及び分化維持培地上での培養を行った。
具体的に、条件Ａでは、増殖培地上での培養を１日間、０．７６ｍＭ、３．８ｍＭ、１９ｍＭの３ＨＢを含む分化誘導培地上での培養を３日間、０．７６ｍＭ、３．８ｍＭ、１９ｍＭの３ＨＢを含む分化維持培地上での培養を１８日間行い、分化維持培地上での培養時は、２〜３日おきに培地を交換した。
また、条件Ｂでは、増殖培地上での培養を１日間、３ＨＢを含まない分化誘導培地上での培養を３日間、３ＨＢを含まない分化維持培地上での培養を１１日間、０．７６ｍＭ、３．８ｍＭ、１９ｍＭの３ＨＢを含む分化維持培地上での培養を７日間行い、分化維持培地上での培養時は、２〜３日おきに培地を交換した。
２−２．オイルレッドＯ染色試験
条件Ａ及び条件Ｂで培養した細胞について、確認試験１と同様の手順でオイルレッドＯ染色を実施した。
【００６６】
３．生細胞数測定試験
３−１．細胞培養
上記２−１と同手法により条件Ａ及び条件Ｂにて細胞培養を実施した。
３−２．生細胞数の計測
確認試験１と同様の手順で行った。
【００６７】
以下、各種試験結果について説明する。
【００６８】
１．オイルレッドＯ染色試験の結果
表８は、条件Ａにて３ＨＢのモル濃度を０．７６ｍＭ、３．８ｍＭ、１９ｍＭとした培地で培養した細胞、条件Ｂにて３ＨＢのモル濃度を０．７６ｍＭ、３．８ｍＭ、１９ｍＭとした培地で培養した細胞、３ＨＢを添加していない培地で培養した細胞（コントロールＡ，Ｂ）に関するオイルレッドＯ染色試験の結果をまとめた表である。図１０は、オイルレッドＯ染色試験の結果を示すグラフであり、同図において、縦軸はコントロールＡ又はコントロールＢの吸光度に対する割合である。
表８及び図１０から分かるように、分化誘導段階から培地中に３ＨＢが存在している場合（条件Ａ）と、分化維持段階の途中から培地中に３ＨＢが存在している場合（条件Ｂ）とを比較すると、条件Ａの方が若干吸光度の減少割合が大きくなっているが、両者の間に顕著な差は見られず、いずれの条件でも、培地中に含まれる３ＨＢのモル濃度が高くなるほど吸光度が減少、即ち、脂肪の蓄積量が少なくなっている。特に、条件Ａについては３ＨＢのモル濃度が３．８ｍＭ、１９ｍＭの場合に有意な脂肪蓄積の抑制を確認でき、条件Ｂについては３ＨＢのモル濃度が１９ｍＭの場合に有意な脂肪蓄積の抑制を確認できた。尚、条件Ｂについては、３ＨＢを含まない培地で細胞を培養している間に脂肪の蓄積量が経時的に増加していくことを確認している。以上のことから、３ＨＢは、脂肪前駆細胞から脂肪細胞へと既に変化している細胞に対しても作用することが分かり、脂肪細胞での脂肪滴の蓄積を抑制するという分化抑制能を３ＨＢが有することが明らかとなった。
【００６９】
【表８】
2020055795.tif 000010
【００７０】
２．生細胞数測定試験の結果
表９は、条件Ａにて３ＨＢのモル濃度を０．７６ｍＭ、３．８ｍＭ、１９ｍＭとした培地で培養した細胞、条件Ｂにて３ＨＢのモル濃度を０．７６ｍＭ、３．８ｍＭ、１９ｍＭとした培地で培養した細胞、上記コントロールＡ，Ｂに関する生細胞数測定試験の結果をまとめた表である。また、図１１は、生細胞数測定試験の結果を示すグラフであり、同図において、縦軸は細胞生存度である。
表９及び図１１から明らかなように、条件Ａ及び条件Ｂのいずれの条件であっても、培地中の３ＨＢのモル濃度にかかわらず、生細胞数に大きな変化は見られない。したがって、上記条件Ａ及び条件Ｂのいずれの条件においても確認できた脂肪の蓄積量の減少は、細胞数が減少したことによるものでないことが明らかとなった。
【００７１】
【表９】
2020055795.tif 000011
【産業上の利用可能性】
【００７２】
体内での脂肪の蓄積の抑制を可能にする脂肪細胞分化抑制剤及びこれを用いた化粧料、並びに脂肪細胞分化抑制方法に利用することができる。
【図１】
2020055795.tif 000012
【図２】
2020055795.tif 000013
【図３】
2020055795.tif 000014
【図４】
2020055795.tif 000015
【図５】
2020055795.tif 000016
【図６】
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【図７】
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【図８】
2020055795.tif 000019
【図９】
2020055795.tif 000020
【図１０】
2020055795.tif 000021
【図１１】
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