(57)【要約】      （修正有）【課題】分子クローニングにおけるスクリーニングを安価に行うことができ、しかも宿主の選択の幅が広く、インサートが短い場合でもスクリーニングが可能な系およびそのためのプラスミドベクターの提供。【解決手段】インドール類縁体の３位に水酸基を導入する酸化酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドベクターであって、分子クローニングにおけるスクリーニングに用いられるベクター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インドール類縁体の３位に水酸基を導入する酸化酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドベクターであって、分子クローニングにおけるスクリーニングに用いられるベクター。
【請求項２】
該酸化酵素がジベンゾチオフェン脱硫酵素ＢｄｓＣである、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
該酸化酵素がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＷＵ−Ｓ２Ｂ由来のＢｄｓＣである、請求項１または２記載のベクター。
【請求項４】
該酸化酵素が、配列番号：１の９７位のセリンがメチオニンに置換され、９９位のプロリンがリジンに置換されたアミノ酸配列を有するものである、請求項１または２記載のベクター。
【請求項５】
該酸化酵素をコードする遺伝子が、複数の制限酵素部位を有するものである、請求項１〜４のいずれか１項記載のベクター。
【請求項６】
インドール類縁体が、非置換インドール、５−ブロモインドール、６−ブロモインドール、５−クロロインドールおよび６−クロロインドールからなる群より選択されるものである、請求項１〜５のいずれか１項記載のベクター。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載のベクターを用いて青白スクリーニングを行うことを特徴とする、分子クローニングにおけるスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプラスミドベクターに関する。詳細には、本発明は、分子クローニングにおける青白スクリーニングを安価に行えるプラスミドベクター等に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子のクローニングは遺伝子工学において不可欠な技術である。分子クローニングの成否を調べるために、青白スクリーニング（Blue-white screening）が広く用いられている（非特許文献１〜３等参照）。このスクリーニング法は、基質Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）が酵素ＬａｃＺにより分解されて青色物質であるインジゴ類縁体を生じることを利用している。しかし、この方法に用いられる基質Ｘ−ｇａｌは高価であり、コスト面で不利である。また、青白スクリーニングに用いる宿主は限定されており、ｌａｃＺ欠損かつｌａｃＺΔＭ１５を保持する大腸菌を用いる必要がある。さらに、酵素ＬａｃＺに基づく青白スクリーニングでは、インサートが短い場合は青白のコロニーの判別が難しいことがある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】"pUCプラスミドにまつわるエトセトラ"，橋本義輝：生物工学，89, 609 (2011).
【非特許文献２】"Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors.", Yanisch-Perron, C. et al.: Gene, 33, 103 (1985).
【非特許文献３】"Cloning in M13 phage or how to use biology at its best.", Messing, J.: Gene, 100, 3 (1991).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
分子クローニングにおけるスクリーニングを安価に行うことができ、しかも宿主の選択の幅が広く、インサートが短い場合でもスクリーニングが可能な系およびそのためのプラスミドベクターを提供する必要があった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは鋭意研究を重ね、インドール酸化酵素をコードする遺伝子を組み込んだプラスミドベクターを用いることにより上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち本発明は以下のものを提供する：
（１）インドール類縁体の３位に水酸基を導入する酸化酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドベクターであって、分子クローニングにおけるスクリーニングに用いられるベクター。
（２）該酸化酵素がジベンゾチオフェン脱硫酵素ＢｄｓＣである、（１）記載のベクター。
（３）該酸化酵素がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＷＵ−Ｓ２Ｂ由来のＢｄｓＣである、（１）または（２）記載のベクター。
（４）該酸化酵素が、配列番号：１の９７位のセリンがメチオニンに置換され、９９位のプロリンがリジンに置換されたアミノ酸配列を有するものである、（１）または（２）記載のベクター。
（５）該酸化酵素をコードする遺伝子が、複数の制限酵素部位を有するものである、（１）〜（４）のいずれか記載のベクター。
（６）インドール類縁体が、非置換インドール、５−ブロモインドール、６−ブロモインドール、５−クロロインドールおよび６−クロロインドールからなる群より選択されるものである、（１）〜（５）のいずれか記載のベクター。
（７）（１）〜（６）のいずれか記載のベクターを用いて青白スクリーニングを行うことを特徴とする、分子クローニングにおけるスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のプラスミドベクターを用いることにより、分子クローニングの成否を安価に調べることができる。本発明のプラスミドベクターは、宿主の選択の幅が広く、インサートが短い場合でも使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、プラスミドベクターｐＵＣ１９−ｂｄｓＣのマップを示す。
【図２】図２は、ｐＵＣ１９−ｂｄｓをもつ大腸菌を，インドール類縁体を基質とした培地上で生育させた際の呈色を示す写真である。
【図３】図３は、プラスミドベクターｐＫＢｌｕｅのマップを示す。
【図４】図４は、ｐＵＣ１９−ｂｄｓＣ、ｐＵＣ１９−ｂｄｓＣ（ＭＫ）およびｐＫＢｌｕｅをもつ大腸菌を５−ブロモインドールを含む培地上で生育させた際の青色呈色を示す写真である。
【図５】図５は、ｐＫＢｌｕｅの実用性評価の結果を示すグラフである。○は白色コロニー、●は青色コロニーを示す。○、●の右側の数字はコロニー数である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、１の態様において、インドール類縁体の３位に水酸基を導入する酸化酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドベクターであって、分子クローニングにおけるスクリーニングに用いられるベクターを提供する。
【００１０】
インドール類縁体は、インドール骨格を有するあらゆる化合物を包含する。本発明において好ましいインドール類縁体は、非置換インドール（以下において「インドール」という）ならびにインドールの４位，５位，６位または７位がハロゲン，ニトリル基，水酸基，アルデヒド基，カルボン酸，アミノ基，メトキシ基，または炭素数１〜３の低級アルキルで１カ所以上置換されたインドールである。かかる好ましいインドール類縁体の例としては、インドール、５−ブロモインドール、６−ブロモインドール、５−クロロインドール、６−クロロインドールが挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物は、Ｘ−ｇａｌと比較して安価であるため、スクリーニングのランニングコストを低廉とすることができる。
【００１１】
インドール類縁体の３位に水酸基を導入する酸化酵素（以下において「酵素」という場合がある）は特に限定されず、どのような生物種に由来するものであってもよく、どのような構造を有しているものであってもよい。本発明において好ましい酵素としては、ジベンゾチオフェン脱硫酵素やオキシゲナーゼなどが挙げられるがこれらに限定されない。本発明においてより好ましい酵素としては、ジベンゾチオフェン脱硫酵素ＢｄｓＣ、シトクロムP450モノオキシゲナーゼ，およびトリプトファンヒドロキシラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。ＢｄｓＣのなかでも、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ属，Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属，Ａｌｉｔｅｒｅｌｌａ属，Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ属，Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ属，Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ属，Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属，Ｄｏｍｉｂａｃｉｌｌｕｓ属，Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ属，Ｇｏｒｄｏｎｉａ属，Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ属，Ｍｅｔｈｙｌｏｃａｌｄｕｍ属，Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃａｌｅｓ属，Ｍｅｔｈｙｌｏｖｕｌｕｍ属，Mycobacterium属，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属，Ｎｏｃａｒｄｉａ属，Ｎｏｓｔｏｃ属，Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属，Ｐｓｅｕｄａｎａｂａｅｎａ属，Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属，Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属，およびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属に由来する酵素が好ましく、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＷＵ−Ｓ２Ｂ由来のＢｄｓＣが特に好ましい。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＷＵ−Ｓ２Ｂ由来のＢｄｓＣ（野生型）のアミノ酸配列を配列番号：１に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＷＵ−Ｓ２Ｂ由来のＢｄｓＣ（野生型）をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：２示す。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＷＵ−Ｓ２Ｂは、中等度好熱性ジベンゾチオフェン脱硫細菌として知られている。
【００１２】
酵素は野生型であってもよく、インドール類縁体の３位に水酸基を導入する活性を有するかぎり、変異体であってもよい。酵素の変異体は、野生型のアミノ酸配列において１個〜数十個、好ましくは１個〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。アミノ酸の置換、欠失、挿入、付加および修飾については公知である。酵素の変異体は、配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、例えば９５％以上、９７％以上または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するものであってもよい。酵素の変異体は、ランダム変異法、部位特異的突然変異法、化学修飾法など公知の方法にて得ることができる。酵素の変異体は、天然に存在するものであってもよい。
【００１３】
酵素の変異体の例としては、配列番号：１に示すアミノ酸配列において９７位のセリンがメチオニン、バリン、システインまたはスレオニンに置換され、９９位のプロリンがリジンまたはロイシンに置換されているアミノ酸配列を有する酵素が挙げられる。上記変異体の好ましい例として、配列番号：１に示すアミノ酸配列の９７位および９９位が実施例の表２に示すものとなっている変異体が挙げられる。このような変異体は酸化活性が強く、スクリーニングにおいて迅速かつ鮮明にコロニーを呈色させることができる。なお、酵素の変異体においてアミノ酸残基数が欠失、挿入、付加により変動する場合は、該変動に応じて上記「９７位」および「９９位」の番号も変動する。
【００１４】
酵素の変異体は、野生型の酵素の酸化活性と同等もしくはそれ以上の酸化活性を有するものが好ましい。例えば酵素の変異体の酸化活性が野生型の酵素の酸化活性の約８０％以上であってもよく、約９０％以上であってもよく、好ましくは約１００％以上、より好ましくは約１２０％以上である。酵素の酸化活性の測定方法は公知である。例えばインドール類縁体を基質として生成される３−ヒドロキシインドール類縁体量、または３−ヒドロキシインドール類縁体の酸化的二量体化により生じるインジゴ類縁体量を測定することによって酵素の酸化活性を調べてもよい。酵素の酸化活性の測定方法は上記に限定されない。
【００１５】
本発明のプラスミドベクターは、上記のような酵素の野生型またはその変異体をコードする遺伝子を含むものである。酵素をコードする遺伝子の塩基配列の例としては、配列番号：１に示すアミノ酸配列またはその変異アミノ酸配列をコードする塩基配列が挙げられるが、これらに限らない。酵素の塩基配列は、プラスミドベクターに組み込むための末端切断、酸化活性向上のための変異、コードするアミノ酸の変化を伴わない変異、あるいは制限酵素部位の導入などによって、野生型の塩基配列から変異したものであってもよい。
【００１６】
本明細書の以下の説明において、特に断らない限り、酵素という場合はその変異体も包含するものとする。
【００１７】
通常は、本発明のプラスミドベクター中の酵素をコードする遺伝子中に、複数の制限酵素部位（マルチクローニング部位）を設ける。マルチクローニングサイトが存在することにより、外部遺伝子の挿入が容易となる。
【００１８】
本発明のプラスミドベクターに用いる酵素による酸化反応を還元反応と共役させることにより、酸化活性を発揮または向上させることが好ましい。好ましい還元反応としては、フラビン還元酵素によるＦＭＮからＦＭＮＨ２への還元反応が挙げられるが、これに限定されない。したがって、本発明のプラスミドベクターを用いるスクリーニングにおいて、酵素による酸化反応と共役する還元系を持たない宿主を用いる場合は、適切な還元系を宿主に導入する必要がある。例えばフラビン還元酵素遺伝子を宿主に導入して、宿主にフラビン還元酵素を発現させてもよい。フラビン還元酵素などの還元酵素をコードする遺伝子は公知であり、該遺伝子の宿主への導入方法や手段も公知である。大腸菌のようにフラビン還元酵素を有する宿主をスクリーニングに用いる場合は、フラビン還元酵素をコードする遺伝子の導入は不要である。本発明の酵素の酸化反応と共役する還元系を有する生物の種類は極めて多く、本発明のプラスミドベクターを使用できる宿主の幅は極めて広い。
【００１９】
本発明のプラスミドベクターは、いずれのプラスミドベクターをベースにして構築されたものであってもよい。多くの種類のプラスミドベクターが公知である。プラスミドベクターの構築方法は公知である。好ましくは、本発明のプラスミドベクターはｐＵＣプラスミドをベースにして構築されたものである。ｐＵＣプラスミドの典型例はｐＵＣ１８およびｐＣＵ１９である。本発明のプラスミドベクターは、プロモーター、上記酵素をコードする遺伝子、薬剤耐性遺伝子および複製開始点などを含む。本発明のプラスミドベクターに含まれるこれらの要素は公知であり、当業者は公知の方法を用いてこれらの要素をプラスミドベクター中に組み込むことができる。
【００２０】
本発明のプラスミドベクターに用いられるプロモーターの例としては、lacプロモーター，T5プロモーター，T7プロモーター，tacプロモーター，araプロモーター，およびtrpプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のプラスミドベクターに用いられる好ましいプロモーターの例としては、lacプロモーターやtacプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のプラスミドベクターに用いられるプロモーターは１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
【００２１】
本発明のプラスミドベクターに用いられる薬剤耐性遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子，カナマイシン耐性遺伝子，ネオマイシン耐性遺伝子，テトラサイクリン耐性遺伝子，およびクロラムフェニコール耐性遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のプラスミドベクターに用いられる好ましい薬剤耐性遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。例えばアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターを導入された細胞は、アンピシリン含有培地中で増殖できるので、そのようなプラスミドを導入された細胞の選択が可能となる。本発明のプラスミドベクターに用いられる薬剤耐性遺伝子は１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
【００２２】
本発明は、もう１つの態様において、上記プラスミドベクターを用いて青白スクリーニングを行うことを特徴とする、分子クローニングにおけるスクリーニング方法を提供する。
【００２３】
青白スクリーニングは公知のスクリーニング方法であり、基質Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）が酵素ＬａｃＺにより分解されて青色物質であるインジゴ類縁体を生じることを利用して、目的遺伝子が宿主に導入されたか否かを調べる手法である。本発明の方法において、公知の青白スクリーニングとは使用する基質が異なるが、インジゴ類縁体の生成の有無を調べることから、本発明の方法を用いるスクリーニングを「青白スクリーニング」称する。
【００２４】
本発明のスクリーニング方法は、使用する基質が安価であるためランニングコストが低廉であるという特徴を有する。さらに、本発明のスクリーニング方法は、使用する本発明のベクターの宿主の選択の幅が広く、インサートが短い場合でも青白スクリーニングが可能であるので、利用範囲が広いという特徴も有する。
【００２５】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２６】
１．酸化酵素ＢｄｓＣをコードする遺伝子を含むプラスミドベクターｐＵＣ１９−ｂｄｓＣの構築
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＷＵ−Ｓ２Ｂ由来のｂｄｓＣ遺伝子（配列番号：１）を鋳型とし、ｂｄｓＣ全長をＰＣＲ増幅した。その際のプライマーには、ｂｄｓＣ５Ｈ（５’−ＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＧＡＣＡＣＣＧＣＣ−３’（配列番号：３）；下線、ＨｉｎｄＩＩＩサイト）とｂｄｓＣ３Ｘ（５’−ＧＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＴＣ−３’（配列番号：４）；下線、ＸｂａＩサイト）を使用した。ＰＣＲ産物の緩衝液をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて滅菌水に置換し、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで末端を切断した。ｐＵＣ１９（タカラバイオ）を同制限酵素で消化し、これにより得られた断片とｂｄｓＣ断片を連結した。連結物を大腸菌ＤＨ５αに導入し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地（ＬＡ培地）に５０ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌを４０μｌ塗布したプレート上で培養した（３７℃、１６時間）。薄青色を呈するコロニーからプラスミドを抽出し、ｐＵＣ１９−ｂｄｓＣを得た。ｐＵＣ１９−ｂｄｓＣのマップを図１に示す。
【００２７】
２．ｐＵＣ１９−ｂｄｓＣによる大腸菌の呈色
インドール基質（インドール（Ｉｎｄ）；５−ブロモインドール（５Ｂｒ−Ｉｎｄ）；５−クロロインドール（５Ｃｌ−Ｉｎｄ）；６−ブロモインドール（６Ｂｒ−Ｉｎｄ）；６−クロロインドール（６Ｃｌ−Ｉｎｄ））は東京化成から購入した。これらはジメチルホルムアミドに溶解させ（終濃度２５ｍｇ／ｍＬ）、−２０℃で保存した。０．５×ＬＡ培地は、０．２５％  酵母抽出液、０．５％  トリプトン、０．５％  ＮａＣｌ、２％寒天、および５０μｇ／ｍＬアンピシリンから構成された。必要に応じて、インドール基質を終濃度２５μｇ／ｍＬで添加した。ｐＵＣ１９−ｂｄｓＣを保有する大腸菌ＤＨ５αを前培養し、Ｉｎｄ、５Ｂｒ−Ｉｎｄ、５Ｃｌ−Ｉｎｄ、６Ｂｒ−Ｉｎｄ、もしくは６Ｃｌ−Ｉｎｄを含む０．５×ＬＡ培地に約１０２個の細胞を塗布した。各プレートを３７℃で培養し、２４時間および３６時間培養した時点で撮影した。陰性コントロールには、ｐＵＣ１９を保有する大腸菌ＤＨ５αを使用した。
【００２８】
結果を図２に示す。培養２４時間では、いずれのプレート上でもコロニーの呈色は見られなかった。培養３６時間では、インドール基質（５Ｂｒ−Ｉｎｄ、５Ｃｌ−Ｉｎｄ、６Ｂｒ−Ｉｎｄ、および６Ｃｌ−Ｉｎｄ）を含むプレート上でコロニー呈色が見られた。培養４８時間では、非置換インドールを含め、用いたすべてのインドール基質を含むプレート上でコロニー呈色が見られた。５Ｂｒ−Ｉｎｄを含むプレートが最も呈色しやすく、基質の値段も安かったことから、５Ｂｒ−Ｉｎｄを含む０．５×ＬＡ培地（ＢｒＩＬＡ培地）を以降の実験に使用した。
【００２９】
３．ランダム変異導入によるＢｄｓＣ活性の増強
呈色時間の短縮を目的とし、ｂｄｓＣ遺伝子への変異導入を行った。変異導入率にはエラープローンＰＣＲを用いた。その際の変異発生率はＭｎ２＋濃度で調製した。ＭｎＣｌ２溶液は、ＭｎＣｌ２（和光純薬）を１０ｍＭになるように超純水に溶解させた。１０×ｄＮＴＰｅは２ｍＭ  ｄＡＴＰ、２ｍＭ  ｄＧＴＰ、１０ｍＭ  ｄＣＴＰ、および１０ｍＭ  ｄＴＴＰから構成された。エラープローンＰＣＲの反応液（５０μｌ）は、１０×Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔａｑ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ−ｆｒｅｅ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；５  μｌ）、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；１４μｌ）、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２（１．５μｌ；終濃度０．３ｍＭ）、プライマー（Ｍ１３  ＲＶおよびＭ１３（−２０）；各１０ｐｍｏｌ）、ｐＵＣ１９−ｂｄｓＣ（０．２μｇ）、１０×ｄＮＴＰｅ（５μＬ）、およびＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、１μｌ；５  Ｕ）から構成された。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃、１分、次いで９５℃（３０秒）、５０℃（３０秒）、および７２℃（１分）を３０サイクル。ＰＣＲ産物を滅菌水（２５μｌ）に置換し、そのうち２２μｌをＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断した。ｂｄｓＣ断片（１．２ｋｂ）をゲル回収し、２０μｌの滅菌水で溶出させた。本サンプル１０μｌとｐＵＣ１９（ＸｂａＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ消化物；５μｌ；約２μｇ）を混合し、さらにＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ）溶液（１５μｌ）と混合した。１６℃で３０分反応後、反応液全量で大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（５００μｌ）を形質転換した。得られた大腸菌懸濁液（合計３ｍｌ）をＢｒＩＬＡプレート約３０枚に１００μｌずつ植菌し、３７℃で２４時間培養した。青呈色が濃いコロニーを選び、それが保有するプラスミドのｂｄｓＣ配列をシークエンス解析した。ＭｎＣｌ２の濃度を０．１５ｍＭ、０．３ｍＭ、０．６ｍＭに変更して、同様な操作を行った。結果を表１に示す。
上記実験に用いたプライマーＭ１３  ＲＶの塩基配列は５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’（配列番号：５）、Ｍ１３（−２０）の塩基配列は５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’（配列番号：６）である。
【表１】
2020182427.tif 000002
【００３０】
１回目の実験では、呈色が濃いコロニー２０株を２次スクリーニングに供し、安定して呈色が強い８株を得た。２回目の実験では、呈色が濃い１０株を２次スクリーニングに供し、安定して呈色が強い９株を得た。３回目の実験では、呈色が濃い１２株を２次スクリーニングに供し、安定して呈色が強い１１株を得た。４回目の実験では、呈色が濃い２株を２次スクリーニングに供したが、安定して呈色が強いものは得られなかった。以上の実験で得られた合計２８個の陽性クローンからプラスミドを精製し、ｂｄｓＣ遺伝子をシークエンス解析したところ、様々な変異点が見出された。９７位もしくは９９位の変異が２８クローン中２３クローンで見出されたため、これらの変異はＢｄｓＣの活性向上に有効と考察した。
【００３１】
４．飽和変異導入によるＢｄｓＣ活性向上
ＢｄｓＣの９７番目と９９番目のアミノ酸残基に飽和変異を導入するためのプライマーＳ９７Ｐ９９ｍｕｔａｔｉｏｎｓ（５’−ＣＡＧＡＴＣＡＡＴＡＡＣＧＧＣＳＮＮＧＧＴＳＮＮＧＡＧＧＴＧＧＴＡＴＣＣＧＡＡＣＡＡＧＴＧ−３’）（配列番号：７）を合成した。ｐＵＣ１９−ｂｄｓＣを鋳型に、Ｓ９７Ｐ９９ｍｕｔａｔｉｏｎｓとｂｄｓＣ５Ｈをプライマーに用いたＰＣＲにより、ランダム変異が入ったｂｄｓＣ上流部分を増幅した。このＰＣＲにはＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用した。並行して、ｂｄｓＣ下流部分をｂｄｓＣ３ＸとｂｄｓＣ３００Ｆ（５’−ＧＧＣＧＴＴＡＴＴＧＡＴＣＴＧＴＧＧＧＧ−３’）（配列番号：８）を用いて増幅した。このＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用した。得られた２断片をｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ法を用いて連結し、ｂｄｓＣ５ＨとｂｄｓＣ３Ｘを用いてｂｄｓＣ全長を再増幅した。この際のＰＣＲにもＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用した。ＰＣＲ産物（５０μｌ）の緩衝液を水に置換し、２５μｌで溶出した。そのうち２２μｌをＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｂｄｓＣ断片をゲル回収した。精製物は２０μｌの滅菌水で溶出させた。本サンプル１０μｌとｐＵＣ１９（ＸｂａＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ消化物；５μｌ；約２μｇ）を混合し、さらにＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ溶液（１５μｌ）と混合した。１６℃で３０分反応後、反応液全量でＤＨ５αコンピテントセル（５００μｌ）を形質転換した。得られた大腸菌懸濁液（合計３ｍｌ）を、ＢｒＩＬＡプレート約３０枚に１００μｌずつ植菌し、３７℃で２４時間培養した。呈色が濃い３０株を２次スクリーニングに供し、安定して呈色が強い１１株を得た。それが保有するプラスミドのｂｄｓＣ配列をシークエンス解析した。結果を表２に示す。アミノ酸表記は公知の１文字表記である。
【表２】
2020182427.tif 000003
【００３２】
９７番目はメチオニン、バリン、システイン、スレオニン、９９番目はリジン、ロイシンが２つ以上みられた。９７番目で一番多いメチオニン、９９番目に一番多いリジンの組み合わせは２クローンあった。この組み合わせのプラスミドｐＵＣ１９−ｂｄｓＣＭＫを以降の実験で用いた。ｐＵＣ１９−ｂｄｓＣＭＫを保有する大腸菌はｐＵＣ１９−ｂｄｓＣを保有する大腸菌よりもＢｒＩＬＡプレート上で早く呈色した。
【００３３】
５．クローニングベクターｐＫＢｌｕｅの構築
（１）ｐＵＣ１９−ｂｄｓＣＭＫを鋳型に、ｂｄｓＣ５とｂｄｓＣ３Ａ（５’−ＧＧＣＧＡＣＧＴＣＴＴＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＴＣ−３’；下線、ＡａｔＩＩサイト）（配列番号：９）をプライマーとしたＰＣＲによりｂｄｓＣＭＫ全長を増幅した。この際のＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用した。ＰＣＲ産物（５０μｌ）の緩衝液を置換し、２５μｌの滅菌水で溶出した。そのうち２２  μｌをＨｉｎｄＩＩＩとＡａｔＩＩで消化し、ｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ-ＡａｔＩＩ間へ挿入した。これをｐＵＣ１９−ｂｄｓＣＭＫ（ＨＡ）と命名した。
【００３４】
（２）ｐＵＣ１９−ｂｄｓＣＭＫ（ＨＡ）を鋳型に、ｂｄｓＣ（Ｇ２２５Ａ）Ｆ（５’−ＧＧＣＣＴＡＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡＧＴＧＧＴＧＣＧＴＧ−３’）（配列番号：１０）とｂｄｓＣ（Ａ１０１４Ｇ）Ｒ（５’−ＣＣＴＧＴＡＣＣＧＣＧＡＧＣＴＣＧＣＣＧＣＧＴＴＣＴＴ−３’）（配列番号：１１）をプライマーとしてｂｄｓＣＭＫの内部配列を増幅した。それを変異導入プライマーとしたＱｉｃｋＣｈａｎｇｅ法により、ｐＵＣ１９−ｂｄｓＣＭＫ（ＨＡ）のｂｄｓＣＭＫ領域内にＸｂａＩとＳａｃＩサイトを導入した。
【００３５】
（３）ｐＵＣ１９−ｂｄｓＣＭＫ（ＨＡ）を鋳型に、ｂｄｓＣ（Ｔ２５５Ｃ）Ｆ（５’−ＧＡＴＣＧＣＣＡＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＧＣＴＧＧＧＣ−３’）（配列番号：１２）とｂｄｓＣ（Ｃ９０９Ｔ）Ｒ（５’−ＣＴＧＴＡＧＴＴＣＧＡＴＡＣＣＡＡＡＴＴＣＧＣＣＧＴＡＧＣＴＧＣＧＡＡ−３’）（配列番号：１３）をプライマーとしてｂｄｓＣＭＫの内部配列を増幅した。それを変異導入プライマーとしたＱｉｃｋＣｈａｎｇｅ法により（鋳型は上記（１）のプラスミド産物）、ｐＵＣ１９−ｂｄｓＣＭＫ（ＨＡ）のｂｄｓＣＭＫ領域内にＳａｌＩサイトを導入すると同時に、２カ所あったＥｃｏＲＩサイトの１カ所を不活性化させた。
【００３６】
（４）ｐＵＣ１９−ｂｄｓＣＭＫ（ＨＡ）を鋳型に、ｂｄｓＣ（Ｃ３８７Ｇ）Ｆ（５’−ＣＣＧＧＧＡＡＣＧＣＣＴＣＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＡ−３’）（配列番号：１４）とｂｄｓＣ（Ｇ６２１Ｃ）Ｒ（５’−ＧＴＧＣＧＣＣＧＣＡＴＧＣＣＴＡＧＣＧＣＣＴＧ−３’）（配列番号：１５）をプライマーとしてｂｄｓＣＭＫの内部配列を増幅した。それを変異導入プライマーとしたＱｉｃｋＣｈａｎｇｅ法により（鋳型は上記（３）のプラスミド産物）、ｐＵＣ１９−ｂｄｓＣＭＫ（ＨＡ）のｂｄｓＣＭＫ領域内にＸｈｏＩとＳｐｈＩサイトを導入した。これにより得られたプラスミドｐＫＢｌｕｅと命名した。導入した制限酵素サイトがあることは、制限酵素マッピングにより確認した。プラスミドｐＫＢｌｕｅのマップを図３に示す。プラスミドｐＫＢｌｕｅ中の改変されたｂｄｓＣ遺伝子の塩基配列を配列番号：１６に示す。
【００３７】
６．ｐＫＢｌｕｅの実用性評価
ｐＫＢｌｕｅを保有する大腸菌をＢｒＩＬＡプレート上３７℃で２４時間培養したところ、ｐＵＣ１９−ｂｄｓＣＭＫと同程度の呈色が見られた。ｐＵＣ１９−ｂｄｓＣを保有する大腸菌は３６時間培養で呈色が見られた（図４）。
【００３８】
ｐＫＢｌｕｅを実際にクローニングに利用できるか調べるために、好熱菌（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＴＡ４２６）染色体の制限酵素消化物をｐＫＢｌｕｅのクローニングサイト（全１２ヶ所）に連結した。好熱菌染色体は常法にしたがい調製した。この溶液２−３μｌを制限酵素で消化し、同制限酵素で消化したｐＫＢｌｕｅと連結した。反応産物を大腸菌ＤＨ５αに導入し、ＢｒＩＬＡプレートに塗布した。３７℃で２４時間培養し、コロニーの呈色が青いもの８個と白いもの８個を無作為に選び、それらからプラスミドを抽出した。得られたプラスミドの制限酵素マッピングから、挿入されたＤＮＡ断片長を分析した。
【００３９】
結果を図５に示す。青色に呈したコロニー由来の全てのプラスミドについてインサートは見られなかった。呈色がなかったコロニー由来のほぼ全てのプラスミドが何らかのＤＮＡ断片を挿入していた。いくつかのクローンでは１００ｂｐ以下の短いＤＮＡ断片が挿入されていた。これらの結果から、ｐＫＢｌｕｅを用いるクローニングでは、ＤＮＡ断片の長さの範囲が広く、短いＤＮＡ断片であっても青白スクリーニングが可能であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、生物学、分子生物学、遺伝子工学など幅広い分野において利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００４１】
配列番号：１は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＷＵ−Ｓ２Ｂ由来のＢｄｓＣ（野生型）のアミノ酸配列を示す。
配列番号：２は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＷＵ−Ｓ２Ｂ由来のＢｄｓＣ（野生型）をコードする遺伝子の塩基配列を示す。
配列番号：３は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＷＵ−Ｓ２Ｂ由来のｂｄｓＣを増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：４は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＷＵ−Ｓ２Ｂ由来のｂｄｓＣを増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：５は、エラープローンＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：６は、エラープローンＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：７は、ＢｄｓＣの９７番目と９９番目のアミノ酸残基に飽和変異を導入するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：８は、ｂｄｓＣ下流部分を増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：９は、ｂｄｓＣＭＫ全長を増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１０は、ｂｄｓＣＭＫの内部配列を増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１１は、ｂｄｓＣＭＫの内部配列を増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１２は、ｂｄｓＣＭＫの内部配列を増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１３は、ｂｄｓＣＭＫの内部配列を増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１４は、ｂｄｓＣＭＫの内部配列を増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１５は、ｂｄｓＣＭＫの内部配列を増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１６は、プラスミドｐＫＢｌｕｅ中の改変されたｂｄｓＣの塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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