(57)【要約】      （修正有）【課題】血清型１０Ａ、２２Ｆ又は３３Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を適切に防御可能な新規肺炎連鎖球菌ワクチン、及び前記ワクチンの製造方法の提供。【解決手段】担体タンパク質に共有結合で連結された肺炎連鎖球菌血清型１０Ａ多糖を含む免疫原性コンジュゲートを調製するための方法。血清型１０Ａ莢膜多糖単離物を、０．１〜０．３モル当量のペルヨーデートと反応させる。０．５〜２モル当量の反応停止剤を加え、多糖の酸化度が８〜１４の間である活性化肺炎連鎖球菌血清型１０Ａ多糖を得る。前記活性化血清型１０Ａ多糖と担体タンパク質を混和し、還元剤と反応させてコンジュゲートを形成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体タンパク質に共有結合で連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ多糖を含む免疫原性コンジュゲートを調製するための方法であって、
（ａ）（ｉ）血清型１０Ａ莢膜多糖単離物を、０．１〜０．３モル当量のペルヨーデートと反応させるステップと、
（ｉｉ）０．５〜２モル当量の反応停止剤を加えることにより酸化反応を停止させ、結果として活性型肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ多糖が得られるステップであり、活性型血清型１０Ａ多糖の酸化度が８〜１４の間であるステップと
を含む調製方法によって取得した活性型血清型１０Ａ多糖と担体タンパク質を混和するステップと、
（ｂ）混和された活性化血清型１０Ａ多糖と担体タンパク質を還元剤と反応させて、血清型１０Ａ多糖：担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップと
を含む調製方法。
【請求項２】
ステップ（ｉ）における血清型１０Ａ多糖の濃度が、０．５ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ペルヨーデートがメタ過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｉ）における反応の温度が１℃〜１０℃の間に保たれる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
反応停止剤が、式（ＩＩ）の化合物
【化１】
2020055810.tif 000007
［式中、Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、またはイソプロピルからそれぞれ独立に選択される］
であるか、または、グリセロール、エチレングリコール、プロパン−１，２−ジオール、ブタン−１，２−ジオール、もしくはブタン−２，３−ジオールから選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
１〜２モル当量の反応停止剤を加えることにより酸化反応を停止させる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｉｉ）における反応の温度が１℃〜１０℃の間に保たれる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（ｃ）血清型１０Ａ多糖：担体タンパク質コンジュゲート中の未反応アルデヒドをキャッピングするステップ
をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）および（ｂ）がＤＭＳＯ中または水溶液中で実施される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）における活性化多糖の濃度が、０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬ、または０．５ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬの間である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
活性化血清型１０Ａ多糖の担体タンパク質に対する初期比が、５：１〜０．１：１、２：１〜０．１：１、２：１〜１：１、１．５：１〜１：１、０．１：１〜１：１、０．３：１〜１：１、または０．６：１〜１．２：１の間である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）において、活性化多糖を、０．５〜２．５モル当量の間のシアノ水素化ホウ素ナトリウムと反応させる、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
多糖：担体タンパク質コンジュゲートを精製するステップをさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法によって取得された、担体タンパク質に共有結合で連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ多糖を含む、免疫原性コンジュゲートであって、
免疫原性コンジュゲートが、５００ｋＤａ〜１５０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、２０００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、もしくは３０００ｋＤａ〜８０００ｋＤａの間の分子量を有するか、
免疫原性コンジュゲートが、血清型１０Ａ多糖の総量に対して、約２０％未満の遊離血清型１０Ａ多糖を含むか、
免疫原性コンジュゲートにおける血清型１０Ａ多糖の担体タンパク質に対する比が、０．５〜３の間であるか、
免疫原性コンジュゲートの少なくとも４０％が、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有するか、または
免疫原性コンジュゲートの複合化度が、２〜１５、２〜１３、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、２〜４、３〜１５、３〜１３、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、３〜４、５〜１５、５〜１０、８〜１５、８〜１２、１０〜１５、もしくは１０〜１２の間である、
免疫原性コンジュゲート。
【請求項１５】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法によって取得された、担体タンパク質に共有結合で連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ多糖を含む、免疫原性コンジュゲートであって、
免疫原性コンジュゲートが、５００ｋＤａ〜１５０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、２０００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、もしくは３０００ｋＤａ〜８０００ｋＤａの間の分子量を有し、かつ
免疫原性コンジュゲートが、血清型１０Ａ多糖の総量に対して、約２０％未満の遊離血清型１０Ａ多糖を含む、
免疫原性コンジュゲート。
【請求項１６】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法によって取得された、担体タンパク質に共有結合で連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ多糖を含む、免疫原性コンジュゲートであって、
免疫原性コンジュゲートが、５００ｋＤａ〜１５０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、２０００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、もしくは３０００ｋＤａ〜８０００ｋＤａの間の分子量を有し、かつ
免疫原性コンジュゲートにおける血清型１０Ａ多糖の担体タンパク質に対する比が、０．５〜３の間である、
免疫原性コンジュゲート。
【請求項１７】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法によって取得された、担体タンパク質に共有結合で連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ多糖を含む、免疫原性コンジュゲートであって、
免疫原性コンジュゲートが、５００ｋＤａ〜１５０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、２０００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、もしくは３０００ｋＤａ〜８０００ｋＤａの間の分子量を有し、かつ
免疫原性コンジュゲートの少なくとも４０％が、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有する、
免疫原性コンジュゲート。
【請求項１８】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法によって取得された、担体タンパク質に共有結合で連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ多糖を含む、免疫原性コンジュゲートであって、
免疫原性コンジュゲートが、５００ｋＤａ〜１５０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、２０００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、もしくは３０００ｋＤａ〜８０００ｋＤａの間の分子量を有し、かつ
免疫原性コンジュゲートの複合化度が、２〜１５、２〜１３、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、２〜４、３〜１５、３〜１３、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、３〜４、５〜１５、５〜１０、８〜１５、８〜１２、１０〜１５、もしくは１０〜１２の間である、
免疫原性コンジュゲート。
【請求項１９】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法によって取得された、担体タンパク質に共有結合で連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ多糖を含む、免疫原性コンジュゲートであって、
免疫原性コンジュゲートが、５００ｋＤａ〜１５０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、２０００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、もしくは３０００ｋＤａ〜８０００ｋＤａの間の分子量を有し、
免疫原性コンジュゲートにおける血清型１０Ａ多糖の担体タンパク質に対する比が、０．５〜３の間であり、かつ
免疫原性コンジュゲートの複合化度が、２〜１５、２〜１３、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、２〜４、３〜１５、３〜１３、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、３〜４、５〜１５、５〜１０、８〜１５、８〜１２、１０〜１５、もしくは１０〜１２の間である、
免疫原性コンジュゲート。
【請求項２０】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法によって取得された、担体タンパク質に共有結合で連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ多糖を含む、免疫原性コンジュゲートであって、
免疫原性コンジュゲートが、５００ｋＤａ〜１５０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、２０００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、もしくは３０００ｋＤａ〜８０００ｋＤａの間の分子量を有し、
免疫原性コンジュゲートにおける血清型１０Ａ多糖の担体タンパク質に対する比が、０．５〜３の間であり、
免疫原性コンジュゲートの少なくとも４０％が、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有し、かつ
免疫原性コンジュゲートの複合化度が、２〜１５、２〜１３、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、２〜４、３〜１５、３〜１３、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、３〜４、５〜１５、５〜１０、８〜１５、８〜１２、１０〜１５、もしくは１０〜１２の間である、
免疫原性コンジュゲート。
【請求項２１】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法によって取得された、担体タンパク質に共有結合で連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ多糖を含む、免疫原性コンジュゲートであって、
免疫原性コンジュゲートが、５００ｋＤａ〜１５０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、２０００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、もしくは３０００ｋＤａ〜８０００ｋＤａの間の分子量を有し、
免疫原性コンジュゲートが、血清型１０Ａ多糖の総量に対して、約２０％未満の遊離血清型１０Ａ多糖を含み、
免疫原性コンジュゲートにおける血清型１０Ａ多糖の担体タンパク質に対する比が、０．５〜３の間であり、
免疫原性コンジュゲートの少なくとも４０％が、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有し、かつ
免疫原性コンジュゲートの複合化度が、２〜１５、２〜１３、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、２〜４、３〜１５、３〜１３、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、３〜４、５〜１５、５〜１０、８〜１５、８〜１２、１０〜１５、もしくは１０〜１２の間である、
免疫原性コンジュゲート。
【請求項２２】
担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の免疫原性コンジュゲート。
【請求項２３】
担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
コンジュゲートを多価ワクチンに製剤化するステップをさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１４から２１のいずれか一項に記載の免疫原性コンジュゲートと、生理学的に許容できるビヒクルとを含む、免疫原性組成物。
【請求項２６】
アジュバントをさらに含む、請求項２５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
請求項２５または２６に記載の免疫原性組成物を含む、血清型１０Ａ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と関連する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染、疾患または状態の治療剤または防止剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性化肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖およびそれを調製するための方法に関する。本発明はまた、担体タンパク質に共有結合で連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖を含む免疫原性コンジュゲート、それを調製するための方法、ならびにそれを含む免疫原性組成物およびワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、通常は対をなして見えるが（双球菌）、短鎖状または単一細胞としても見られる、ランセット状のグラム陽性球菌である。この球菌は、血液寒天平板上で、光沢のあるコロニーを伴って容易に成長し、嫌気的に成長させない限りα溶血を示し、嫌気的に成長させる場合ではβ溶血を示す。ほとんどの肺炎球菌血清型の細胞は、各細胞を取り囲む多糖被膜である莢膜を有する。この莢膜は、抗体を細菌細胞に付着させないことにより食作用を妨げるので、ヒトにおける菌力の決定要因である。現在、確認されている既知の肺炎球菌莢膜血清型は９０を越え、最も一般的な２３の血清型が、世界中の侵襲性疾患のおよそ９０％の原因になっている。ワクチンとしては、免疫系が発達しているまたは損なわれていない個体では、肺炎球菌多糖皮膜が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する免疫を妥当な程度に付与しうるが、肺炎球菌感染のリスクが最も大きくもある乳幼児および高齢者では、適切な担体タンパク質と複合させた莢膜多糖が、免疫応答を可能にする。
【０００３】
２０００年に最初の７価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ７またはＰｒｅｖｎａｒ）が導入されて以来、こうした７つの血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆ）による侵襲性疾患は、ほとんど見られなくなった。Ｐｒｅｖｎａｒ  １３として血清型１、３、５、６Ａ、７Ｆ、および１９Ａが加わることにより侵襲性肺炎球菌疾患の件数はさらに減少した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在市場取引されている肺炎球菌ワクチンに、ヒト、特に２歳未満の子供において、血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を適切に防御するものはない。したがって、血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に対する免疫応答の誘発に使用できる免疫原性組成物が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様では、本開示は、活性化肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ莢膜多糖を調製するための方法であって、
（ａ）血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ莢膜多糖単離物を酸化剤と反応させるステップと、
（ｂ）反応停止剤（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を加えることにより酸化反応を停止させ、活性化肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖を得るステップと
を含む方法を提供する。
【０００６】
別の態様では、本発明は、本明細書で開示する活性化方法によって取得したまたは取得可能な活性化肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ莢膜多糖に関する。
【０００７】
別の態様では、本開示は、担体タンパク質に共有結合で連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖を含む免疫原性コンジュゲートを調製するための方法であって、
（ａ）本明細書で開示する方法によって取得したまたは取得可能な活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖を担体タンパク質と混和するステップと、
（ｂ）混和された活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖と担体タンパク質を還元剤と反応させて、血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖：担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップと
を含む調製方法を提供する。
【０００８】
別の態様では、本開示は、本明細書で開示する方法によって取得したまたは取得可能な血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖：担体タンパク質コンジュゲートを提供する。
【０００９】
別の態様では、本開示は、本明細書で開示する免疫原性コンジュゲートを含む免疫原性組成物およびワクチンを提供する。
【００１０】
別の態様では、本開示は、対象において、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染、血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と関連する疾患または状態を治療または防止する方法であって、本明細書で開示する免疫原性組成物またはワクチンの治療または予防有効量を投与するステップを含む方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖血清型１０Ａ反復単位の構造を示す図である。
【図２】肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖血清型２２Ｆ反復単位の構造を示す図である。
【図３】肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖血清型３３Ｆ反復単位の構造を示す図である。
【図４】酸化剤の量に応じた２３℃での活性化血清型２２Ｆ多糖の分子量を、停止ステップありとなしで示すグラフである。
【図５】酸化剤の量に応じた４℃での活性化血清型２２Ｆ多糖の分子量を、停止ステップありとなしで示すグラフである。
【図６】２〜８℃で停止ステップありもしくはなし、または２３℃で停止ステップなしでの、酸化剤の量に応じた活性化血清型３３Ｆ多糖の分子量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、本発明の好ましい実施形態および本明細書に含まれる実施例からなる以下の詳細な説明を参照することで、より難なく理解することができる。別段定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。本発明を実施し、または試す際には、本明細書に記載のものと同様または同等などのような方法および材料を使用してもよいが、本明細書には、ある特定の好ましい方法および材料を記載する。実施形態について述べ、本発明を主張する際は、ある特定の用語を、以下で述べる定義に従って使用する。
【００１３】
本明細書で使用するとき、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、別段指摘しない限り、複数の言及を包含する。したがって、たとえば、「方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」と言及される場合、１つまたは複数の方法、および／または本明細書に記載の種類および／もしくは本開示を読めば当業者には明白となる種類のステップを包含する。
【００１４】
本明細書で使用するとき、多糖または担体タンパク質−多糖コンジュゲートの「分子量」という用語は、多角度レーザー光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ）と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって算出された分子量を指す。
【００１５】
本明細書で使用するとき、用語「酸化度」（ＤＯ）とは、多糖単離物を酸化剤で活性化したときに生じる、アルデヒド基あたりの糖反復単位の数を指す。多糖の酸化度は、当業者公知の慣例的な方法を使用して求めることができる。
【００１６】
本開示では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法におけるこれら用語による意味をもちうる、たとえば、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「包含される（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「包含すること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味しうることが指摘される。このような用語は、特定の成分または成分一式を、他のいずれかの成分を除外せずに含むことを指す。「から本質的になること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」や「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの用語は、米国特許法におけるこれら用語による意味を有する、たとえば、本発明の新規または基本の特徴を損なわない追加の成分またはステップを含む余地がある、すなわち、本発明の新規または基本の特徴を損なう、列挙されない成分またはステップを除外する。用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」および「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、米国特許法におけるこれら用語による意味を有する、すなわち、これらの用語は限定的である。したがって、これらの用語は、特定の成分または成分一式を含み、他のすべての成分を除外することを指す。
【００１７】
本明細書で使用するとき、本明細書で使用する用語「コンジュゲート」または「複合多糖」とは、担体タンパク質と共有結合を介してコンジュゲートさせた多糖を指す。本発明の複合多糖およびそれを含む免疫原性組成物は、多少の量の遊離多糖を含有してもよい。
【００１８】
本明細書で使用するとき、用語「血清型１０Ａ複合多糖」または「血清型１０Ａコンジュゲート」とは、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ莢膜多糖単離物を、担体タンパク質と共有結合を介してコンジュゲートさせたものを指す。
【００１９】
本明細書で使用するとき、用語「血清型２２Ｆ複合多糖」または「血清型２２Ｆコンジュゲート」とは、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆ莢膜多糖単離物を、担体タンパク質と共有結合を介してコンジュゲートさせたものを指す。
【００２０】
本明細書で使用するとき、用語「血清型３３Ｆ複合多糖」または「血清型３３Ｆコンジュゲート」とは、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆ莢膜多糖単離物を、担体タンパク質と共有結合を介してコンジュゲートさせたものを指す。
【００２１】
本明細書で使用するとき、用語「血清型１０Ａ多糖」とは、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ莢膜多糖を指す。
【００２２】
本明細書で使用するとき、用語「血清型２２Ｆ多糖」とは、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆ莢膜多糖を指す。
【００２３】
本明細書で使用するとき、用語「血清型３３Ｆ多糖」とは、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆ莢膜多糖を指す。
【００２４】
本明細書で使用するとき、用語「遊離多糖」とは、担体タンパク質と共有結合を介してコンジュゲートしていないが、それにもかかわらず、莢膜多糖−担体タンパク質コンジュゲート組成物中に存在する莢膜多糖を意味する。遊離多糖は、多糖−担体タンパク質コンジュゲートと非共有結合で連結されていてもよい（すなわち、これに非共有結合され、吸着され、または閉じ込められていてもよい）。
【００２５】
遊離多糖のパーセンテージは、血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ莢膜多糖−担体タンパク質コンジュゲートの最終精製後に測定される。最終精製後４週間以内に測定することが好ましい。パーセンテージは、サンプル中の全多糖に対するパーセンテージとして示される。
【００２６】
本明細書で使用するとき、「コンジュゲートする」、「コンジュゲートした」、および「コンジュゲートすること」（「コンジュゲートさせる」および他の活用形）とは、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖を、共有結合を介して担体タンパク質に付着させるプロセスを指す。
【００２７】
用語「対象」とは、ヒトを含めた哺乳動物、または鳥類、魚類、爬虫類、両生類、もしくは他のいずれかの動物を指す。用語「対象」は、家庭用愛玩動物または研究動物も包含する。家庭用愛玩動物および研究動物の非限定的な例としては、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、アレチネズミ、ハムスター、モルモット、フェレット、サル、鳥、ヘビ、トカゲ、魚、カメ、およびカエルが挙げられる。用語「対象」は、家畜動物も包含する。用語「対象」は、家畜動物も包含する。家畜動物の非限定的な例としては、アルパカ、バイソン、ラクダ、ウシ、シカ、ブタ、ウマ、ラマ、ラバ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、トナカイ、ヤク、ニワトリ、ガチョウ、およびシチメンチョウが挙げられる。
【００２８】
生物である肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（肺炎球菌としても知られる）が引き起こす侵襲性疾患の防止に向けた多価コンジュゲート肺炎球菌ワクチンの調製では、選択した肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型を成長させて、ワクチンの生産に必要な多糖が供給される。細胞を発酵槽で成長させ、発酵の終わりに、デオキシコール酸ナトリウムまたは代わりの溶解剤を加えて溶解を誘発する。次いで、溶菌ブロスを収集して、下流工程において細菌細胞を取り囲む莢膜多糖を精製および回収する。活性化および担体タンパク質とのコンジュゲーション後、多糖は、最終ワクチン製品に含められ、ワクチンのターゲット集団において、選択された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型に対する免疫を付与する。
【００２９】
多糖：担体タンパク質コンジュゲートの免疫原性は、多糖のサイズを含めたいくつかの要素に左右される。多糖サイズは、各調製バッチにおいてアッセイされる品質特性であり、適正に制御されなければならない。高分子量の莢膜多糖は、抗原表面に存在するエピトープの価数がより高いために、ある特定の抗体免疫応答を誘発することができる。コンジュゲートを調製する際の多糖サイズの望ましくない縮小を防止または限定して、多糖の免疫原性を保つことが一般に好ましい。加えて、コンジュゲートの品質特性の一貫性を維持するために、活性化ステップおよび後続のコンジュゲーションの際に、多糖分子量のバッチ間のばらつきを低減することも重要である。
【００３０】
還元的アミノ化化学（ＲＡＣ）は、本発明者らによって、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ莢膜多糖−タンパク質担体コンジュゲートの調製に適する方法であることが実証された。ＲＡＣ手法は、多糖を酸化によって活性化し、引き続いて、活性化した多糖を、還元によってタンパク質担体とコンジュゲートさせるものである。血清型１０Ａ、３３Ｆ、および２２Ｆ多糖は、特に敏感な多糖であることが分かっており、コンジュゲート調製の酸化ステップの際に分解およびサイズ縮小を被りやすい。加えて、これまでに知られている活性化方法を使用すると、分子量にばらつきのある活性化血清型１０Ａ、３３Ｆ、および２２Ｆ多糖が生じた。
【００３１】
したがって、分子量が制御され、一定である、活性化肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖を調製する方法が切に求められている。
【００３２】
本発明の目的は、活性化肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖を調製するための方法である。特に、本発明の目的は、活性化肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖を調製するための方法であって、
（ａ）血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖単離物を酸化剤と反応させるステップと、
（ｂ）反応停止剤を加えることにより酸化反応を停止させ、結果として活性化肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖が得られるステップと
を含む調製方法である。
【００３３】
血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖の単離および精製
血清型１０Ａ、２２Ｆ、および３３Ｆ多糖の構造は、文献（たとえば、Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ  ＪＰＣ．Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｖｉｅｗ．Ｉｎ：Ｔｏｍａｓｚ  Ａ編、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ．ニューヨーク州ニューヨーク：Ｍａｒｙ  Ａｎｎ  Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．、２０００．８１〜１１４頁を参照されたい）で開示されている。
【００３４】
図１に示すとおり、血清型２２Ｆの多糖反復単位は、分岐状の五糖主鎖（１つのグルクロン酸（ＧｌｃｐＡ）、１つのグルコピラノース（Ｇｌｃｐ）、１つのガラクトフラノース（Ｇａｌｆ）、および２つのラムノピラノース（Ｒｈａｐ））からなり、αＧｌｃｐ分岐がβＲｈａｐ４５のＣ３ヒドロキシル基に連結している。多糖反復単位におけるβＲｈａｐ残基のＣ２ヒドロキシル基のおよそ８０％は、Ｏ−アセチル化されている。
【００３５】
図２に示すとおり、血清型１０Ａの多糖反復単位は、２つのＤ−ガラクトースフラノース、３つのＤ−ガラクトピラノース、１つのＮ−アセチルガラクトサミン、および糖鎖と１つのＤ−リビトールを介して連結しているリン酸結合からなる。
【００３６】
図３に示すとおり、血清型３３Ｆの多糖反復単位は、３つのＤ−ガラクトピラノース、２つのＤ−ガラクトフラノース、および１つのＤ−グルコピラノースからなる。特に、５−Ｄ−ガラクトフラノシル残基は、３３Ｆ多糖反復単位の約９０％においてＯ−アセチル化されている。
【００３７】
血清型１０Ａ、２２Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖は、当業者公知の単離手順を使用して、細菌から直接取得することができる（たとえば、米国特許出願公開第２００６０２２８３８０号、第２００６０２２８３８１号、第２００７０１８４０７１号、第２００７０１８４０７２号、第２００７０２３１３４０号、および第２００８０１０２４９８号、またはＷＯ２００８１１８７５２で開示されている方法を参照されたい）。加えて、これら多糖は、合成プロトコールを使用して生産することもできる。
【００３８】
本発明の免疫原性コンジュゲート中に使用されるそれぞれの多糖の作成に使用する血清型１０Ａ、２２Ｆ、および３３Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）菌株は、確立された培養物保存機関または臨床検体から入手することができる。
【００３９】
精製血清型１０Ａ、２２Ｆ、および３３Ｆ多糖は、当業者によく知られている方法によって取得する。細菌細胞は、ダイズ系培地で成長させることが好ましい。肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ莢膜多糖を産生する細菌細胞を発酵させてから、細菌細胞を溶解させて、細胞可溶化液を生産する。細菌細胞は、どのような溶菌剤を使用して溶解させてもよい。「溶菌剤」は、細胞壁の破壊、および細胞溶解を引き起こす自己溶菌酵素の放出を助ける、たとえば、洗浄剤を始めとする、いずれかの薬剤である。本明細書で使用するとき、用語「洗浄剤」とは、細菌細胞の溶解を誘発することのできるいずれかのアニオンまたはカチオン洗浄剤を指す。本発明の方法の範囲内での使用について、そのような洗浄剤の代表的な例としては、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）、Ｎ−ラウロイルサルコシン、ケノデオキシコール酸ナトリウム、およびサポニンが挙げられる。
【００４０】
本発明の一実施形態では、細菌細胞の溶解に使用される溶菌剤は、ＤＯＣである。ＤＯＣは、ウシなどの生物供給源から一般に得られる、胆汁酸であるデオキシコール酸のナトリウム塩である。ＤＯＣは、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の細胞壁成長および分裂に関与する自己溶菌酵素である、ＬｙｔＡタンパク質を活性化させる。ＬｙｔＡタンパク質は、そのＣ末端部分にコリン結合性ドメインを有しており、ｌｙｔＡ遺伝子の突然変異は、ＤＯＣによる溶解に抵抗性であるＬｙｔＡ突然変異体を生じさせることが知られている。
【００４１】
本発明の一実施形態では、細菌細胞の溶解に使用される溶菌剤は、非動物由来溶菌剤である。本発明の方法の範囲内で使用する非動物由来溶菌剤には、作用方式がＤＯＣと似通っている（すなわち、ＬｙｔＡ機能に影響を及ぼし、結果として肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細胞を溶解させる）非動物供給源からの薬剤が含まれる。このような非動物由来溶菌剤としては、限定はしないが、ＤＯＣの類似体、界面活性剤、洗浄剤、およびコリンの構造類似体が挙げられる。一実施形態では、非動物由来溶菌剤は、デカンスルホン酸、ｔｅｒｔ−オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノール（たとえば、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ−６３０、ＣＡＳ番号：９００２−９３−１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイスから入手可能）、オクチルフェノールエチレンオキシド縮合物（たとえば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイスから入手可能）、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、イミノジプロピオン酸ラウリル、ドデシル硫酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸塩、ヒオデオキシコール酸塩、グリコデオキシコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、タウロケノデオキシコール酸塩、およびコール酸塩からなる群から選択される。別の実施形態では、非動物由来溶菌剤は、Ｎ−ラウロイルサルコシンである。別の実施形態では、溶菌剤は、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムである。
【００４２】
次いで、遠心分離、深層濾過、沈殿、限外濾過、活性炭処理、透析濾過、および／またはカラムクロマトグラフィーの使用を始めとする、当業界で知られている形成技術を使用して、細胞可溶化液から莢膜多糖を精製することができる（たとえば、米国特許出願公開第２００６０２２８３８０号、第２００６０２２８３８１号、第２００７０１８４０７１号、第２００７０１８４０７２号、第２００７０２３１３４０号、および第２００８０１０２４９８号、またはＷＯ２００８１１８７５２を参照されたい）。次いで、精製血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖を、免疫原性コンジュゲートの調製に使用することができる。
【００４３】
血清型２２Ｆコンジュゲートまたは血清型３３Ｆコンジュゲートを、有利な濾過特性および／または収率で生成するために、多糖をより小さい分子量（ＭＷ）範囲にサイジングしてから、担体タンパク質とコンジュゲートさせることが好ましい。精製血清型２２Ｆ多糖または血清型３３Ｆ多糖のサイズは、たとえばＯ−アセチル基の存在などの、多糖構造の肝要な特色を保ちながら、縮小させることが有利である。精製血清型２２Ｆ多糖または血清型３３Ｆ多糖のサイズは、機械的均質化によって縮小させることが好ましい。
【００４４】
好ましい実施形態では、高圧均質化によって、精製多糖のサイズを縮小させる。高圧均質化では、工程の流れを十分に小さい寸法の流路にポンプで送り込むことにより、高いせん断速度が実現される。せん断速度は、より大きい適用均質化圧力を使用すると増加し、露出時間は、供給材料の流れをホモジナイザーに再循環させることにより、延長させることができる。
【００４５】
高圧均質化法は、精製血清型２２Ｆ多糖または血清型３３Ｆ多糖のサイズを、Ｏ−アセチル基の存在などの、多糖の構造上の特色を保ちながら縮小させるのに特に適している。
【００４６】
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）可溶化液から血清型２２Ｆ莢膜多糖を精製し、精製された多糖を場合によりサイジングすることにより取得した、血清型２２Ｆ多糖単離物は、たとえば、分子量、および血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭを始めとする、種々のパラメーターによって特徴付けることができる。
【００４７】
好ましい実施形態では、サイジングされた血清型２２Ｆ多糖は、４００ｋＤａ〜７００ｋＤａの間で構成される分子量を有する。
【００４８】
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）可溶化液から血清型３３Ｆ莢膜多糖を精製し、精製された多糖を場合によりサイジングすることにより取得した、血清型３３Ｆ多糖単離物は、たとえば、分子量、および血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭを始めとする、種々のパラメーターによって特徴付けることができる。
【００４９】
多糖のＯ−アセチル化の程度は、当業界で知られているいずれかの方法、たとえば、プロトンＮＭＲによって求めることができる（ＬｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒおよびＪｏｎｅｓ（１９９６）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９６、８３〜９６；ＪｏｎｅｓおよびＬｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒ（２００２）、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ３０、１２３３〜１２４７；ＷＯ０５／０３３１４８またはＷＯ００／５６３５７）。よく使用される別の方法は、Ｈｅｓｔｒｉｎ（１９４９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８０、２４９〜２６１に記載されている。Ｏ−アセチル基の存在を、イオンＨＰＬＣ分析によって割り出すことが好ましい。
【００５０】
好ましい実施形態では、血清型２２Ｆ多糖単離物は、
−血清型２２Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）細菌細胞の発酵培養物を調製するステップと、
−前記発酵培養物中で細菌細胞を溶解させるステップと、
−発酵培養物から血清型２２Ｆ多糖を精製するステップと
を含む方法によって取得される。
【００５１】
好ましい実施形態では、血清型２２Ｆ多糖単離物は、
−血清型２２Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）細菌細胞の発酵培養物を調製するステップと、
−前記発酵培養物中で細菌細胞を溶解させるステップと、
−発酵培養物から血清型２２Ｆ多糖を精製するステップと、
−血清型２２Ｆ多糖を、機械的サイジング、好ましくは高圧均質化によってサイジングするステップと
を含む方法によって取得される。
【００５２】
好ましい実施形態では、血清型２２Ｆ多糖単離物は、
−血清型２２Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）細菌細胞の発酵培養物を調製するステップと、
−前記発酵培養物中で細菌細胞を溶解させるステップと、
−発酵培養物から血清型２２Ｆ多糖を精製するステップと、
−血清型２２Ｆ多糖を、機械的サイジング、好ましくは高圧均質化によってサイジングするステップと
を含み、血清型２２Ｆ多糖単離物は、４００ｋＤａ〜７００ｋＤａの間で構成される分子量を有する、方法によって取得される。
【００５３】
好ましい実施形態では、血清型３３Ｆ多糖単離物は、
−血清型３３Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）細菌細胞の発酵培養物を調製するステップと、
−前記発酵培養物中で細菌細胞を溶解させるステップと、
−発酵培養物から血清型３３Ｆ多糖を精製するステップと
を含む方法によって取得される。
【００５４】
好ましい実施形態では、血清型３３Ｆ多糖単離物は、
−血清型３３Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）細菌細胞の発酵培養物を調製するステップと、
−前記発酵培養物中で細菌細胞を溶解させるステップと、
−発酵培養物から血清型３３Ｆ多糖を精製するステップと、
−血清型３３Ｆ多糖を、機械的サイジング、好ましくは高圧均質化によってサイジングするステップと
を含む方法によって取得される。
【００５５】
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）可溶化液から血清型１０Ａ莢膜多糖を精製し、精製された多糖を場合によりサイジングすることにより取得した、血清型１０Ａ多糖単離物は、たとえば分子量を始めとする、種々のパラメーターによって特徴付けることができる。血清型１０Ａ多糖単離物は、サイジングしないことが好ましい。
【００５６】
好ましい実施形態では、血清型１０Ａ多糖単離物は、
−血清型１０Ａ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）細菌細胞の発酵培養物を調製するステップと、
−前記発酵培養物中で細菌細胞を溶解させるステップと、
−発酵培養物から血清型１０Ａ多糖を精製するステップと
を含む方法によって取得される。
【００５７】
血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖の活性化
血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖単離物は、
（ａ）血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖単離物を酸化剤と反応させるステップと、
（ｂ）反応停止剤を加えることにより酸化反応を停止させ、結果として活性化肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖が得られるステップと
を含む方法によって活性化させる。
【００５８】
好ましい実施形態では、ステップ（ａ）における血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖の濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの間である。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）における血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖の濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬの間である。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）における血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ〜３ｍｇ／ｍＬの間である。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）における血清型２２Ｆまたは３３Ｆ多糖の濃度は、約２ｍｇ／ｍＬである。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）における血清型１０Ａ多糖の濃度は、約２．５ｍｇ／ｍＬである。
【００５９】
好ましい実施形態では、酸化剤は、ペルヨーデートである。ペルヨーデートは、ビシナルなヒドロキシル基を酸化して、カルボニルまたはアルデヒド基を形成し、Ｃ−Ｃ結合を切断する。
【００６０】
用語「ペルヨーデート」は、ペルヨーデートと過ヨウ素酸の両方を包含する。この用語はまた、メタペルヨーデート（ＩＯ４−）とオルトペルヨーデート（ＩＯ６５−）の両方を包含する。用語「ペルヨーデート」は、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウムを始めとする、様々な塩のペルヨーデートも包含する。好ましい実施形態では、酸化剤は、過ヨウ素酸ナトリウムである。好ましい実施形態では、血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖の酸化に使用されるペルヨーデートは、メタペルヨーデートである。好ましい実施形態では、血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖の酸化に使用されるペルヨーデートは、メタ過ヨウ素酸ナトリウムである。
【００６１】
好ましい実施形態では、多糖は、０．０１〜１０、０．０５〜５、０．１〜１、０．５〜１、０．７〜０．８、０．０１〜０．２、０．０５〜０．５、０．０５〜０．２、０．１〜０．３モル当量の酸化剤と反応させる。好ましい実施形態では、多糖は、約０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８と反応させる。好ましい実施形態では、多糖は、約０．１０モル当量の酸化剤と反応させる。好ましい実施形態では、多糖は、約０．１５モル当量の酸化剤と反応させる。好ましい実施形態では、多糖は、約０．２５モル当量の酸化剤と反応させる。好ましい実施形態では、多糖は、約０．５モル当量の酸化剤と反応させる。好ましい実施形態では、多糖は、約０．８モル当量の酸化剤と反応させる。
【００６２】
好ましい実施形態では、ステップ（ａ）における反応の持続時間は、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０時間の間の時間である。好ましい実施形態では、多糖が血清型１０Ａ多糖であるとき、ステップ（ａ）における反応の持続時間は、１時間〜１０時間の間である。好ましい実施形態では、多糖が血清型１０Ａ多糖であるとき、ステップ（ａ）における反応の持続時間は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０時間である。好ましい実施形態では、多糖が血清型１０Ａ多糖であるとき、ステップ（ａ）における反応の持続時間は、約４時間である。好ましい実施形態では、多糖が血清型２２Ｆ多糖であるとき、ステップ（ａ）における反応の持続時間は、１０時間〜２０時間の間である。好ましい実施形態では、多糖が血清型２２Ｆ多糖であるとき、ステップ（ａ）における反応の持続時間は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０時間である。好ましい実施形態では、多糖が血清型３３Ｆ多糖であるとき、ステップ（ａ）における反応の持続時間は、１５時間〜２５時間の間である。好ましい実施形態では、多糖が血清型３３Ｆ多糖であるとき、ステップ（ａ）における反応の持続時間は、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５時間である。好ましい実施形態では、多糖が血清型３３Ｆ多糖であるとき、ステップ（ａ）における反応の持続時間は、約２０時間である。
【００６３】
好ましい実施形態では、ステップ（ａ）における反応の温度は、１℃〜３０℃、１℃〜１０℃、１０℃〜２０℃、２０℃〜３０℃、２℃〜８℃の間に保たれる。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）における反応の温度は、約５℃に保たれる。
【００６４】
好ましい実施形態では、ステップ（ａ）は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、またはＢｉｓ−Ｔｒｉｓから選択される緩衝液中で実施される。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）は、リン酸カリウム緩衝液中で実施される。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）は、リン酸ナトリウム緩衝液中で実施される。
【００６５】
好ましい実施形態では、緩衝液は、１〜５００ｍＭ、１〜３００ｍＭ、５０〜２００ｍＭの間の濃度を有する。好ましい実施形態では、緩衝液は、濃度が約１００ｍＭである。
【００６６】
好ましい実施形態では、ステップ（ａ）におけるｐＨは、４〜８、５〜７、５．５〜６．５の間である。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）におけるｐＨは、約６である。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）におけるｐＨは、約５．８である。
【００６７】
一実施形態では、反応停止剤は、ビシナルジオール、１，２−アミノアルコール、アミノ酸、グルタチオン、亜硫酸塩、硫酸水素塩、亜ジオチン酸塩、メタ重亜硫酸塩、チオ硫酸塩、亜リン酸塩、次亜リン酸塩、または亜リン酸から選択される。
【００６８】
一実施形態では、反応停止剤は、式
【００６９】
【化１】
2020055810.tif 000002
の１，２−アミノアルコール
［式中、Ｒ１は、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、またはイソプロピルから選択される］
である。
【００７０】
一実施形態では、反応停止剤は、亜硫酸、硫酸水素酸、亜ジオチン酸、メタ重亜硫酸、チオ硫酸、亜リン酸、次亜リン酸のナトリウム塩およびカリウム塩、または亜リン酸から選択される。
【００７１】
一実施形態では、反応停止剤は、アミノ酸である。一実施形態では、前記アミノ酸は、セリン、トレオニン、システイン、シスチン、メチオニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、トリプトファン、チロシン、およびヒスチジンから選択される。
【００７２】
一実施形態では、反応停止剤は、亜硫酸塩、たとえば、硫酸水素塩、亜ジオチン酸塩、メタ重亜硫酸塩、チオ硫酸塩である。
【００７３】
一実施形態では、反応停止剤は、２つのビシナルヒドロキシル基、すなわち、２つの隣接した炭素原子に共有結合している２つのヒドロキシル基を含む化合物（ビシナルジオール）である。
【００７４】
反応停止剤は、式（ＩＩ）の化合物
【００７５】
【化２】
2020055810.tif 000003
［式中、Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、またはイソプロピルからそれぞれ独立に選択される］
であることが好ましい。
【００７６】
好ましい実施形態では、反応停止剤は、グリセロール、エチレングリコール、プロパン−１，２−ジオール、ブタン−１，２−ジオール、またはブタン−２，３−ジオール、アスコルビン酸である。好ましい実施形態では、反応停止剤は、ブタン−２，３−ジオールである。
【００７７】
好ましい実施形態では、０．１〜１０、０．５〜５、０．５〜３、０．５〜２モル当量の反応停止剤を加えることにより、酸化剤が中和される。好ましい実施形態では、約０．５、１、１．５、２、２．５、３モル当量の反応停止剤を加えることにより、酸化剤が中和される。好ましい実施形態では、約２モル当量の反応停止剤を加えることにより、酸化剤が中和される。
【００７８】
好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）の持続時間は、０．１〜１０、０．５〜５、または０．５〜２時間の間の時間である。好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）の持続時間は、約０．５、１、１．５、２．５、または３時間である。
【００７９】
好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）における反応の温度は、１℃〜３０℃、１℃〜２５℃、１℃〜２０℃、１℃〜１０℃、１０℃〜２０℃、２℃〜８℃の間に保たれる。好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）における反応の温度は、約１、２、３、４、５、６、７、または８℃に保たれる。
【００８０】
好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）におけるｐＨは、４〜８、５〜７、５．５〜６．５の間である。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）におけるｐＨは、約６である。
【００８１】
好ましい実施形態では、活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖は、精製されている。活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、透析、または限外濾過／透析濾過などの、当業者公知の方法に従って精製することができる。たとえば、活性化多糖は、濃縮し、限外濾過装置を使用して透析濾過することにより精製される。
【００８２】
好ましい実施形態では、血清型１０Ａ多糖単離物は、
（ａ）血清型１０Ａ多糖単離物をペルヨーデートと反応させるステップと、
（ｂ）ブタン−２，３−ジオールを加えることにより酸化反応を停止させ、結果として活性化血清型１０Ａ多糖が得られるステップと
を含む方法によって活性化される。
【００８３】
好ましい実施形態では、血清型１０Ａ多糖単離物は、
（ａ）血清型１０Ａ多糖単離物を、２℃〜８℃の間の温度でペルヨーデートと反応させるステップと、
（ｂ）２℃〜８℃の間の温度でブタン−２，３−ジオールを加えることにより酸化反応を停止させ、結果として活性化血清型１０Ａ多糖が得られるステップと
を含む方法によって活性化される。
【００８４】
好ましい実施形態では、血清型１０Ａ多糖単離物は、
（ａ）血清型１０Ａ多糖単離物を、２℃〜８℃の間の温度で、０．２〜０．３モル当量のペルヨーデートと反応させるステップと、
（ｂ）２℃〜８℃の間の温度で０．５〜２モル当量のブタン−２，３−ジオールを加えることにより酸化反応を停止させ、結果として活性化血清型１０Ａ多糖が得られるステップと
を含む方法によって活性化される。
【００８５】
好ましい実施形態では、血清型２２Ｆ多糖単離物は、
（ａ）血清型２２Ｆ多糖単離物をペルヨーデートと反応させるステップと、
（ｂ）ブタン−２，３−ジオールを加えることにより酸化反応を停止させ、結果として活性化血清型２２Ｆ多糖が得られるステップと
を含む方法によって活性化される。
【００８６】
好ましい実施形態では、血清型２２Ｆ多糖単離物は、
（ａ）血清型２２Ｆ多糖単離物を、２℃〜８℃の間の温度でペルヨーデートと反応させるステップと、
（ｂ）２℃〜８℃の間の温度でブタン−２，３−ジオールを加えることにより酸化反応を停止させ、結果として活性化血清型２２Ｆ多糖が得られるステップと
を含む方法によって活性化される。
【００８７】
好ましい実施形態では、血清型２２Ｆ多糖単離物は、
（ａ）血清型２２Ｆ多糖単離物を、２℃〜８℃の間の温度で、０．０５〜０．２モル当量のペルヨーデートと反応させるステップと、
（ｂ）２℃〜８℃の間の温度で、２〜３、好ましくは２モル当量のブタン−２，３−ジオールを加えることにより酸化反応を停止させ、結果として活性化血清型２２Ｆ多糖が得られるステップと
を含む方法によって活性化される。
【００８８】
好ましい実施形態では、血清型３３Ｆ多糖単離物は、
（ａ）血清型３３Ｆ多糖単離物をペルヨーデートと反応させるステップと、
（ｂ）ブタン−２，３−ジオールを加えることにより酸化反応を停止させ、結果として活性化血清型３３Ｆ多糖が得られるステップと
を含む方法によって活性化される。
【００８９】
好ましい実施形態では、血清型３３Ｆ多糖単離物は、
（ａ）血清型３３Ｆ多糖単離物を、２℃〜８℃の間の温度でペルヨーデートと反応させるステップと、  
（ｂ）２℃〜８℃の間の温度でブタン−２，３−ジオールを加えることにより酸化反応を停止させ、結果として活性化血清型３３Ｆ多糖が得られるステップと
を含む方法によって活性化される。
【００９０】
好ましい実施形態では、血清型３３Ｆ多糖単離物は、
（ａ）血清型３３Ｆ多糖単離物を、２℃〜８℃の間の温度で、０．０５〜０．２モル当量のペルヨーデートと反応させるステップと、
（ｂ）２℃〜８℃の間の温度で０．５〜１．５モル当量のブタン−２，３−ジオールを加えることにより酸化反応を停止させ、結果として活性化血清型３３Ｆ多糖が得られるステップと
を含む方法によって活性化される。
【００９１】
好ましい実施形態では、本発明は、上で開示した方法によって取得したまたは取得可能な活性化血清型１０Ａ莢膜多糖に関する。
【００９２】
好ましい実施形態では、本発明は、上で開示した方法によって取得したまたは取得可能な活性化血清型２２Ｆ莢膜多糖に関する。
【００９３】
好ましい実施形態では、本発明は、上で開示した方法によって取得したまたは取得可能な活性化血清型３３Ｆ莢膜多糖に関する。
【００９４】
好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）から得られた活性化血清型１０Ａ多糖は、ステップ（ａ）で使用した多糖単離物の分子量の２０％〜１００％、３０％〜９５％、４０％〜９５％、６０％〜９５％、８５％〜９５％の間、または約９０％である分子量を有する。
【００９５】
好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）から得られた活性化血清型１０Ａ多糖は、ステップ（ａ）で使用した多糖単離物の分子量の少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、または４５％である分子量を有する。好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）から得られた活性化血清型１０Ａ多糖は、ステップ（ａ）で使用した多糖単離物の分子量の少なくとも５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％である分子量を有する。
【００９６】
好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）から得られた活性化血清型２２Ｆ多糖は、ステップ（ａ）で使用した多糖単離物の分子量の５０％〜１００％、６０％〜９５％、８５％〜９５％の間、または約９０％である分子量を有する。
【００９７】
好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）から得られた活性化血清型２２Ｆ多糖は、ステップ（ａ）で使用した多糖単離物の分子量の少なくとも５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％である分子量を有する。
【００９８】
好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）から得られた活性化血清型３３Ｆ多糖は、ステップ（ａ）で使用した多糖単離物の分子量の５０％〜１００％、６０％〜９５％、８５％〜９５％の間、または約９０％である分子量を有する。
【００９９】
好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）から得られた活性化血清型３３Ｆ多糖は、ステップ（ａ）で使用した多糖単離物の分子量の少なくとも５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％である分子量を有する。
【０１００】
好ましい実施形態では、活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖の酸化度は、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１５、５〜２５、１０〜３０、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、２０〜３０、２０〜２５の間である。好ましい実施形態では、活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖の酸化度は、２〜１０、４〜８、４〜６、６〜８、６〜１２、８〜１４、９〜１１、１０〜１６、１２〜１６、１４〜１８、１６〜２０、１６〜１８、１８〜２２、１８〜２０の間である。
【０１０１】
好ましい実施形態では、活性化血清型１０Ａ多糖は、分子量が５０ｋＤａ〜４００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜３５０ｋＤａ、５０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜２５０ｋＤａ、５０ｋＤａ〜２００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜３００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜２５０ｋＤａ、または１００ｋＤａ〜２００ｋＤａの間である。好ましい実施形態では、活性化血清型１０Ａ多糖は、分子量が５０ｋＤａ〜３００ｋＤａの間である。好ましい実施形態では、活性化血清型１０Ａ多糖は、分子量が１００ｋＤａ〜２００ｋＤａの間である。好ましい実施形態では、活性化血清型１０Ａ多糖は、分子量が、１００ｋＤａ〜２００ｋＤａの間であり、酸化度が５〜２０、５〜１５、８〜１４、８〜１２、または９〜１１の間である。好ましい実施形態では、活性化血清型１０Ａ多糖は、分子量が、１００ｋＤａ〜２００ｋＤａの間であり、酸化度が９〜１１の間である。
【０１０２】
好ましい実施形態では、活性化血清型２２Ｆ多糖は、分子量が２５ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、３００ｋＤａ〜８００ｋＤａ、３００ｋＤａ〜７００ｋＤａ、３００ｋＤａ〜６００ｋＤａ、４００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、４００ｋＤａ〜８００ｋＤａ、４００ｋＤａ〜７００ｋＤａ、または４００ｋＤａ〜６００ｋＤａの間である。好ましい実施形態では、活性化血清型２２Ｆ多糖は、分子量が３００ｋＤａ〜８００ｋＤａの間である。好ましい実施形態では、活性化血清型２２Ｆ多糖は、分子量が４００ｋＤａ〜８００ｋＤａの間である。好ましい実施形態では、活性化血清型２２Ｆ多糖は、分子量が４００ｋＤａ〜６００ｋＤａの間である。好ましい実施形態では、活性化血清型２２Ｆ多糖は、分子量が、４００ｋＤａ〜８００ｋＤａの間であり、酸化度が１０〜２５、１０〜２０、１２〜２０、または１４〜１８の間である。好ましい実施形態では、活性化血清型２２Ｆ多糖は、分子量が、４００ｋＤａ〜８００ｋＤａの間であり、酸化度が１０〜２０の間である。
【０１０３】
好ましい実施形態では、活性化血清型２２Ｆ多糖は、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、もしくは０．７、または約０．８ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、活性化血清型２２Ｆ多糖は、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．５、０．６、または０．７ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、活性化血清型２２Ｆ多糖は、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、活性化血清型２２Ｆ多糖は、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含む。
【０１０４】
好ましい実施形態では、活性化血清型２２Ｆ多糖は、分子量が４００ｋＤａ〜８００ｋＤａの間であり、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。
【０１０５】
好ましい実施形態では、活性化血清型２２Ｆ多糖は、分子量が４００ｋＤａ〜８００ｋＤａの間であり、酸化度が１２〜２０の間であり、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。
【０１０６】
好ましい実施形態では、活性化血清型３３Ｆ多糖は、分子量が５０Ｄａ〜１２５０Ｄａ、２００Ｄａ〜１２００Ｄａ、５００Ｄａ〜１２００Ｄａ、５００Ｄａ〜１０００Ｄａ、７００Ｄａ〜１２００Ｄａ、８００Ｄａ〜１２００Ｄａ、８００Ｄａ〜１１００Ｄａ、９００Ｄａ〜１２００Ｄａ、８００Ｄａ〜１０００Ｄａの間である。好ましい実施形態では、活性化血清型３３Ｆ多糖は、分子量が５００ｋＤａ〜１０００ｋＤａの間である。好ましい実施形態では、活性化血清型３３Ｆ多糖は、分子量が５０ｋＤａ〜６００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、または５０ｋＤａ〜４００ｋＤａの間である。
【０１０７】
好ましい実施形態では、活性化血清型３３Ｆ多糖は、血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、もしくは０．８、または約０．９ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、活性化血清型３３Ｆ多糖は、血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６、０．７、または０．８ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、活性化血清型３３Ｆ多糖は、血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、活性化血清型３３Ｆ多糖は、血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含む。
【０１０８】
好ましい実施形態では、活性化血清型３３Ｆ多糖は、分子量が８００ｋＤａ〜１２００ｋＤａの間であり、血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、活性化血清型３３Ｆ多糖は、分子量が８００ｋＤａ〜１２００ｋＤａの間であり、血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含み、酸化度が１０〜２０の間である。
【０１０９】
好ましい実施形態では、活性化血清型３３Ｆ多糖は、分子量が５０ｋＤａ〜２００ｋＤａの間であり、血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含む。
【０１１０】
好ましい実施形態では、活性化血清型３３Ｆ多糖は、分子量が５０ｋＤａ〜２００ｋＤａの間であり、血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含み、酸化度が１０〜２０の間である。
【０１１１】
一実施形態では、活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖は、場合により凍結保護剤／凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）の存在下で凍結乾燥される。好ましい実施形態では、凍結保護剤／凍結乾燥保護剤は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレチトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトール、およびパラチニットから選択される。好ましい実施形態では、凍結保護剤／凍結乾燥保護剤は、スクロースである。凍結乾燥された活性化多糖は、次いで、担体タンパク質を含む溶液と混和することができる。
【０１１２】
別の実施形態では、活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖は、担体タンパク質と混和され、場合により凍結保護剤／凍結乾燥保護剤の存在下で凍結乾燥される。好ましい実施形態では、凍結保護剤／凍結乾燥保護剤は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレチトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトール、およびパラチニットから選択される。好ましい実施形態では、凍結保護剤／凍結乾燥保護剤は、スクロースである。共に凍結乾燥された（ｃｏ−ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）多糖と担体タンパク質は、次いで、溶液に再懸濁し、還元剤と反応させることができる。
【０１１３】
一実施形態では、本発明は、凍結乾燥された活性化血清型１０Ａ多糖に関する。一実施形態では、本発明は、凍結乾燥された活性化血清型２２Ｆ多糖に関する。一実施形態では、本発明は、凍結乾燥された活性化血清型３３Ｆ多糖に関する。
【０１１４】
一実施形態では、本発明は、共に凍結乾燥された活性化血清型１０Ａ多糖とタンパク質担体に関する。好ましい実施形態では、タンパク質担体は、ＣＲＭ１９７である。一実施形態では、本発明は、共に凍結乾燥された活性化血清型２２Ｆ多糖とタンパク質担体に関する。好ましい実施形態では、タンパク質担体は、ＣＲＭ１９７である。一実施形態では、本発明は、共に凍結乾燥された活性化血清型３３Ｆ多糖とタンパク質担体に関する。好ましい実施形態では、タンパク質担体は、ＣＲＭ１９７である。
【０１１５】
活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖の担体タンパク質とのコンジュゲーション
本明細書で開示する活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖は、
（ａ）活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖を担体タンパク質と混和するステップと、
（ｂ）混和された活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖と担体タンパク質を還元剤と反応させて、血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖：担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップと
を含む方法によって、担体タンパク質とコンジュゲートすることができる。
【０１１６】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化による、活性化血清型２２Ｆまたは３３Ｆ多糖のタンパク質担体とのコンジュゲーションは、たとえば、多糖のＯ−アセチル化のレベルが著しく低減する水相中での還元的アミノ化に比べて、多糖のＯ−アセチル含有量を維持するのに適する。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、ＤＭＳＯ中で実施される。
【０１１７】
好ましい実施形態では、ステップ（ａ）は、凍結乾燥された血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖を、担体タンパク質を含む水溶液、または担体タンパク質とＤＭＳＯとを含む溶液に溶解させることを含む。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）は、共に凍結乾燥された血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖と担体タンパク質を、水溶液またはＤＭＳＯに溶解させることを含む。
【０１１８】
ステップ（ａ）および（ｂ）を水溶液中で実施するとき、前記溶液は、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、ビシン、またはＨＥＰＢから選択されることが好ましい緩衝液から選択されることが好ましい、ｐＨが６．０〜８．５、７〜８、または７〜７．５の間である緩衝液を含む。好ましい実施形態では、緩衝液は、ＰＢＳである。好ましい実施形態では、ｐＨは、約７．３である。
【０１１９】
好ましい実施形態では、ステップ（ａ）における活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖の濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬの間である。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）における活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖の濃度は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３ｍｇ／ｍＬである。
【０１２０】
好ましい実施形態では、活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖の担体タンパク質に対する初期比（重量／重量）は、５：１〜０．１：１、２：１〜０．１：１、２：１〜１：１、１．５：１〜１：１、０．１：１〜１：１、０．３：１〜１：１、０．６：１〜１：１．２の間である。好ましい実施形態では、活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖の担体タンパク質に対する初期比は、約０．６：１および１：１．２である。好ましい実施形態では、活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖の担体タンパク質に対する初期比は、約０．４：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１である。
【０１２１】
好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）において、活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖は、０．１〜１０モル当量の間、０．５〜５モル当量の間、０．５〜２．５モル当量の間の還元剤と反応させる。好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）において、活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆは、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、または２．５モル当量の還元剤と反応させる。
【０１２２】
一実施形態では、還元剤は、ブレンステッド酸またはルイス酸存在下のシアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウムまたは亜鉛；アミンボラン、たとえば、ピリジンボラン、２−ピコリンボラン、２，６−ジボラン−メタノール、ジメチルアミン−ボラン、ｔ−ＢｕＭｅｉＰｒＮ−ＢＨ３、ベンジルアミン−ＢＨ３、または５−エチル−２−メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）である。好ましい実施形態では、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
【０１２３】
好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）の持続時間は、１〜５０、５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、２０〜３０、５〜２５、１０〜２５、１５〜２５時間の間の時間である。好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）の持続時間は、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８時間である。
【０１２４】
好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）における反応の温度は、１０℃〜４０℃、１５℃〜３０℃、２０℃〜２６℃、２１℃〜２５℃の間に保たれる。好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）における反応の温度は、約２１、２２、２３、２４、または２５℃に保たれる。
【０１２５】
好ましい実施形態では、担体タンパク質に共有結合で連結された血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖を含む免疫原性コンジュゲートを調製するための方法は、ＮａＢＨ４を加えて未反応アルデヒドをキャッピングする（停止させる）ステップ（ステップｃ）をさらに含む。
【０１２６】
好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）において、未反応アルデヒドは、０．１〜１０モル当量、０．５〜５モル当量、または１〜３モル当量のＮａＢＨ４を加えることによりキャッピングされる。好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）において、未反応アルデヒドは、約２モル当量のＮａＢＨ４を加えることによりキャッピングされる。
【０１２７】
好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）の持続時間は、０．１〜１０、０．５〜５、または２〜４時間の間の時間である。好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）の持続時間は、約３時間である。
【０１２８】
好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）における反応の温度は、１０℃〜４０℃、１５℃〜３０℃、または２０℃〜２６℃の間に保たれる。好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）における反応の温度は、約２３℃に保たれる。
【０１２９】
血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖を担体タンパク質とコンジュゲートさせた後、多糖−タンパク質コンジュゲートは、当業者公知の様々な技術によって精製する（多糖−タンパク質コンジュゲートの量について富化する）ことができる。そうした技術としては、透析、濃縮／透析濾過操作、タンジェンシャルフロー濾過沈殿／溶離、カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー）、および深層濾過が挙げられる。
【０１３０】
好ましい実施形態では、担体タンパク質は、非毒性で非反応原性であり、十分な量および純度で入手可能である。担体タンパク質は、標準のコンジュゲーション手順に適したものにすべきである。
【０１３１】
好ましい実施形態では、活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖は、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風毒素）、またはＴＴの断片Ｃ、ＣＲＭ１９７（非毒性であるが抗原として同一である、ジフテリア毒素の変異体）、他のＤＴ点突然変異体、たとえば、ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａら、Ｊ．ＢｉｏＩ．Ｃｈｅｍ．２１８、３８３８〜３８４４、１９７３）；ＣＲＭ９、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３、およびＣＲＭ１０７、ならびにＮｉｃｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔｏｘｉｎｓ、Ｆｒａｎｋｅｌ編、Ｍａｅｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ，、１９９２に記載されている他の突然変異；欠失、またはＧｌｕ−１４８のＡｓｐ、Ｇｌｎ、もしくはＳｅｒ、および／またはＡｌａ１５８のＧｌｙへの突然変異、ならびにＵＳ４７０９０１７またはＵＳ４９５０７４０で開示されている他の突然変異；少なくとも１つまたは複数の残基Ｌｙｓ５１６、Ｌｙｓ５２６、Ｐｈｅ５３０、および／またはＬｙｓ５３４の突然変異、ならびにＵＳ５９１７０１７またはＵＳ６４５５６７３で開示されている他の突然変異、またはＵＳ５８４３７１１で開示されている断片；何らかの方法で無毒化されたｐｌｙ、たとえば、ｄＰＬＹ−ＧＭＢＳ（ＷＯ０４０８１５１５、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１０２５８）やｄＰＬＹ−ホルモールを含めた肺炎球菌ニューモリシン（Ｋｕｏら（１９９５）、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６３、２７０６〜１３）、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥを含めたＰｈｔＸ（ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、またはＰｈｔＥの配列は、ＷＯ００／３７１０５またはＷＯ００／３９２９９で開示されている）およびＰｈｔタンパク質の融合物、たとえば、ＰｈｔＤＥ融合物、ＰｈｔＢＥ融合物、ＰｈｔＡ−Ｅ（ＷＯ０１／９８３３４、ＷＯ０３／５４００７、Ｗ０２００９／０００８２６）、ＯＭＰＣ（髄膜炎菌外膜タンパク質−通常は髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂから抽出される−ＥＰ０３７２５０１）、ＰｏｒＢ（髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からのもの）、ＰＤ（ヘモフィルスインフルエンザタンパク質Ｄ−たとえば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照のこと）、またはこれらの免疫学的機能同等物、合成ペプチド（ＥＰ０３７８８８１、ＥＰ０４２７３４７）、熱ショックタンパク質（ＷＯ９３／１７７１２、ＷＯ９４／０３２０８）、百日咳タンパク質（ＷＯ９８／５８６６８、ＥＰ０４７１１７７）、サイトカイン、リンホカイン、成長因子またはホルモン（ＷＯ１０９１／０１１４６）、種々の病原由来の抗原からの多数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇｉら（２００１）、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１、３８１６〜３８２４）、たとえば、Ｎ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉら（２００４）、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７２、４８８４〜７）、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ（ＷＯ０２／０９１９９８）、鉄取り込みタンパク質（ＷＯ０１／７２３３７）、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ（ＷＯ００／６１７６１）からなる群から選択される担体タンパク質とコンジュゲートされる。一実��形態では、活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖は、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）とコンジュゲートされる。別の実施形態では、活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖は、ＴＴ（破傷風トキソイド）とコンジュゲートされる。別の実施形態では、活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖は、ＴＴの断片Ｃとコンジュゲートされる。別の実施形態では、活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖は、ＰＤ（ヘモフィルスインフルエンザタンパク質Ｄ−たとえば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照のこと）とコンジュゲートされる。
【０１３２】
好ましい実施形態では、活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖は、ＣＲＭ１９７タンパク質とコンジュゲートされる。ＣＲＭ１９７タンパク質は、ジフテリア毒素の非毒性の形態であるが、ジフテリア毒素と免疫学的に区別がつかない。ＣＲＭ１９７は、毒素産生性コリネファージβのニトロソグアニジン突然変異誘発によって生み出された非毒素産生性ファージβ１９７ｔｏｘ−を感染させたジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）によって産生される（Ｕｃｈｉｄａ，Ｔ．ら、１９７１、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２３３：８〜１１）。ＣＲＭ１９７は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿法、およびイオン交換クロマトグラフィーによって精製される。ＣＲＭ１９７タンパク質は、ジフテリア毒素と分子量が同じであるが、構造遺伝子における単一の塩基変更（グアニンがアデニンになる）の点でそれと異なっている。この単一の塩基変更は、成熟タンパク質においてアミノ酸置換（グリシンの代わりにグルタミン酸）を引き起こし、ジフテリア毒素の毒性の性質がなくなる。ＣＲＭ１９７タンパク質は、糖のための安全で有効なＴ細胞依存性担体である。ＣＭＲ１９７およびその産生についてのこれ以上の細目は、たとえば、ＵＳ５，６１４，３８２において見ることができる。
【０１３３】
好ましい実施形態では、本明細書で開示する活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖は、
（ａ）活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖をＣＲＭ１９７と混和するステップと、
（ｂ）混和された活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖とＣＲＭ１９７をシアノ水素化ホウ素ナトリウムと反応させて、血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖：ＣＲＭ１９７コンジュゲートを形成するステップと
を含む方法によって、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートされる。
【０１３４】
好ましい実施形態では、本明細書で開示する活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖は、
（ａ）活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖をＣＲＭ１９７と混和するステップと、
（ｂ）混和された活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖とＣＲＭ１９７をシアノ水素化ホウ素ナトリウムと反応させて、血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖：ＣＲＭ１９７コンジュゲートを形成するステップと
を含み、
ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、ＤＭＳＯ中で実施される方法によって、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートされる。
【０１３５】
好ましい実施形態では、本明細書で開示する活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖は、
（ａ）活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖をＣＲＭ１９７と混和するステップと、
（ｂ）混和された活性化血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖とＣＲＭ１９７を、０．５〜２モル当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムと反応させて、血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ多糖：ＣＲＭ１９７コンジュゲートを形成するステップと
を含み、
ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、ＤＭＳＯ中で実施される方法によって、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートされる。
【０１３６】
一実施形態では、本発明は、本明細書で開示する方法によって取得したまたは取得可能な免疫原性コンジュゲートに関する。好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で開示する血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ活性化多糖を、還元的アミノ化によって担体タンパク質とコンジュゲートすることにより取得したまたは取得可能な免疫原性コンジュゲートに関する。好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で開示する血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆ活性化多糖を、ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化によって担体タンパク質とコンジュゲートすることにより取得したまたは取得可能な免疫原性コンジュゲートに関する。好ましい実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
【０１３７】
血清型１０Ａ免疫原性コンジュゲート
好ましい実施形態では、血清型１０Ａ免疫原性コンジュゲートは、分子量が、５００ｋＤａ〜１５０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、２０００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、または３０００ｋＤａ〜８０００ｋＤａの間である。好ましい実施形態では、血清型１０Ａ免疫原性コンジュゲートは、分子量が３０００ｋＤａ〜８０００ｋＤａの間である。免疫原性コンジュゲートの分子量は、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによって測定される。
【０１３８】
好ましい実施形態では、血清型１０Ａ免疫原性コンジュゲートは、血清型１０Ａ多糖の総量に対して、約５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、または１５％未満の遊離血清型１０Ａ多糖を含む。好ましい実施形態では、血清型１０Ａ免疫原性コンジュゲートは、血清型１０Ａ多糖の総量に対して、約２５％未満の遊離血清型１０Ａ多糖を含む。好ましい実施形態では、血清型１０Ａ免疫原性コンジュゲートは、血清型１０Ａ多糖の総量に対して、約２０％未満の遊離血清型１０Ａ多糖を含む。好ましい実施形態では、血清型１０Ａ免疫原性コンジュゲートは、血清型１０Ａ多糖の総量に対して、約１５％未満の遊離血清型１０Ａ多糖を含む。
【０１３９】
好ましい実施形態では、コンジュゲートにおける血清型１０Ａ多糖の担体タンパク質に対する比（重量／重量）は、０．５〜３の間である。好ましい実施形態では、コンジュゲートにおける血清型１０Ａ多糖の担体タンパク質に対する比は、０．５〜２、０．５〜１．５、０．５〜１、１〜１．５、１〜２の間である。好ましい実施形態では、コンジュゲートにおける血清型１０Ａ多糖の担体タンパク質に対する比は、０．８〜１．４の間である。好ましい実施形態では、コンジュゲートにおける血清型１０Ａ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比は、０．８〜１．２の間である。
【０１４０】
サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ−４Ｂ）を使用して、コンジュゲートの相対的な分子サイズ分布を決定することができる。重力供給式カラム（ｇｒａｖｉｔｙ  ｆｅｄ  ｃｏｌｕｍｎ）でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、コンジュゲートの分子サイズ分布を測定する。媒体にある孔に入らない大きい分子は、小さい分子よりすばやく溶離される。画分収集装置を使用して、カラム溶出液を収集する。画分を糖のアッセイによる比色試験にかける。Ｋｄを求めるために、カラムを較正し、分子が完全に排除される画分（Ｖ０）、すなわち（Ｋｄ＝０）、および最大の保持に相当する画分（Ｖｉ）、すなわち（Ｋｄ＝１）を定める。指定のサンプルが帰する画分（Ｖｅ）は、式Ｋｄ＝（Ｖｅ−Ｖ０）／（Ｖｉ−Ｖ０）によって、Ｋｄに関連付けられる。
【０１４１】
好ましい実施形態では、血清型１０Ａ免疫原性コンジュゲートの少なくとも３０％が、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートの少なくとも４０％が、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、血清型１０Ａ免疫原性コンジュゲートの少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％が、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、血清型１０Ａ免疫原性コンジュゲートの少なくとも６０％が、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、５０％〜８０％の間の血清型１０Ａ免疫原性コンジュゲートが、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有する。
【０１４２】
複合化度（ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、目的の多糖とコンジュゲートされている担体タンパク質中のリシン残基の数である。多糖への共有結合での連結による、担体タンパク質のリシン修飾の証拠は、当業者公知の慣例的な方法を使用するアミノ酸分析によって得られる。コンジュゲーションの結果、回収されたリシン残基の数は、コンジュゲート材料の生成に使用したＣＲＭ１９７タンパク質出発材料に比べて減少する。
【０１４３】
好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートの複合化度は、２〜１５、２〜１３、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、２〜４、３〜１５、３〜１３、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、３〜４、５〜１５、５〜１０、８〜１５、８〜１２、１０〜１５、または１０〜１２の間である。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートの複合化度は、６〜８の間である。
【０１４４】
血清型２２Ｆ免疫原性コンジュゲート
好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、もしくは０．７、または約０．８ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．５、０．６、または０．７ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含む。
【０１４５】
好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートにおける血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭの、多糖単離物における血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭに対する比は、少なくとも０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、または０．９５である。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートにおける血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭの、多糖単離物における血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭに対する比は、少なくとも０．７である。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートにおける血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭの、多糖単離物における血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭに対する比は、少なくとも０．９である。
【０１４６】
好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートにおける血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭの、活性化多糖における血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭに対する比は、少なくとも０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、または０．９５である。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートにおける血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭの、活性化多糖における血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭに対する比は、少なくとも０．７である。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートにおける血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭの、活性化多糖における血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭに対する比は、少なくとも０．９である。
【０１４７】
好ましい実施形態では、血清型２２Ｆ免疫原性コンジュゲートは、分子量が、４００ｋＤａ〜１５０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、２０００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、３０００ｋＤａ〜８０００ｋＤａ、または３０００〜５０００ｋＤａの間である。好ましい実施形態では、血清型２２Ｆ免疫原性コンジュゲートは、分子量が３０００ｋＤａ〜５０００ｋＤａの間である。免疫原性コンジュゲートの分子量は、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによって測定される。
【０１４８】
好ましい実施形態では、血清型２２Ｆ免疫原性コンジュゲートは、血清型２２Ｆ多糖の総量に対して、約５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、または１５％未満の遊離血清型２２Ｆ多糖を含む。好ましい実施形態では、血清型２２Ｆ免疫原性コンジュゲートは、血清型２２Ｆ多糖の総量に対して、約４０％未満の遊離血清型２２Ｆ多糖を含む。好ましい実施形態では、血清型２２Ｆ免疫原性コンジュゲートは、血清型２２Ｆ多糖の総量に対して、約２５％未満の遊離血清型２２Ｆ多糖を含む。好ましい実施形態では、血清型２２Ｆ免疫原性コンジュゲートは、血清型２２Ｆ多糖の総量に対して、約２０％未満の遊離血清型２２Ｆ多糖を含む。好ましい実施形態では、血清型２２Ｆ免疫原性コンジュゲートは、血清型２２Ｆ多糖の総量に対して、約１５％未満の遊離血清型２２Ｆ多糖を含む。
【０１４９】
好ましい実施形態では、コンジュゲートにおける血清型２２Ｆ多糖の担体タンパク質に対する比（重量／重量）は、０．５〜３の間である。好ましい実施形態では、コンジュゲートにおける血清型２２Ｆ多糖の担体タンパク質に対する比は、０．５〜２、０．５〜１．５、０．８〜１．２、０．５〜１、１〜１．５、または１〜２の間である。好ましい実施形態では、コンジュゲートにおける血清型２２Ｆ多糖の担体タンパク質に対する比は、０．８〜１．２の間である。好ましい実施形態では、コンジュゲートにおける血清型２２Ｆ多糖の担体タンパク質に対する比は、０．９〜１．１の間である。
【０１５０】
好ましい実施形態では、血清型２２Ｆ免疫原性コンジュゲートの少なくとも３０％が、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートの少なくとも４０％が、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、血清型２２Ｆ免疫原性コンジュゲートの少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％が、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、血清型２２Ｆ免疫原性コンジュゲートの少なくとも６０％が、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、５０％〜８０％の間の血清型２２Ｆ免疫原性コンジュゲートが、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、６５％〜８０％の間の血清型２２Ｆ免疫原性コンジュゲートが、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有する。
【０１５１】
好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートの複合化度は、２〜１５、２〜１３、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、２〜４、３〜１５、３〜１３、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、３〜４、４〜７、５〜１５、５〜１０、８〜１５、８〜１２、１０〜１５、または１０〜１２の間である。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートの複合化度は、４〜７の間である。
【０１５２】
血清型３３Ｆ免疫原性コンジュゲート
好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、もしくは０．７、または約０．８ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．５、０．６、または０．７ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含む。
【０１５３】
好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートにおける血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭの、多糖単離物における血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭに対する比は、少なくとも０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、または０．９５である。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートにおける血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭの、多糖単離物における血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭに対する比は、少なくとも０．７である。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートにおける血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭの、多糖単離物における血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭに対する比は、少なくとも０．９である。
【０１５４】
好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートにおける血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭの、活性化多糖における血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭに対する比は、少なくとも０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、または０．９５である。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートにおける血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭの、活性化多糖における血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭに対する比は、少なくとも０．７である。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートにおける血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭの、活性化多糖における血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートｍＭに対する比は、少なくとも０．９である。
【０１５５】
好ましい実施形態では、血清型３３Ｆ免疫原性コンジュゲートは、分子量が、５００ｋＤａ〜３００００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜２５０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜２００００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜１５０００ｋＤａ、５００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、１０００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、１０００ｋＤａ〜８０００ｋＤａ、１０００ｋＤａ〜５０００ｋＤａ、２０００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、２０００ｋＤａ〜８０００ｋＤａ、または２０００ｋＤａ〜５０００ｋＤａの間である。好ましい実施形態では、血清型３３Ｆ免疫原性コンジュゲートは、分子量が１０００ｋＤａ〜５０００ｋＤａの間である。免疫原性コンジュゲートの分子量は、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによって測定される。
【０１５６】
好ましい実施形態では、血清型３３Ｆ免疫原性コンジュゲートは、血清型３３Ｆ多糖の総量に対して、約５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、または１５％未満の遊離血清型３３Ｆ多糖を含む。好ましい実施形態では、血清型３３Ｆ免疫原性コンジュゲートは、血清型３３Ｆ多糖の総量に対して、約２５％未満の遊離血清型３３Ｆ多糖を含む。好ましい実施形態では、血清型３３Ｆ免疫原性コンジュゲートは、血清型３３Ｆ多糖の総量に対して、約２０％未満の遊離血清型３３Ｆ多糖を含む。好ましい実施形態では、血清型３３Ｆ免疫原性コンジュゲートは、血清型３３Ｆ多糖の総量に対して、約１５％未満の遊離血清型３３Ｆ多糖を含む。
【０１５７】
好ましい実施形態では、コンジュゲートにおける血清型３３Ｆ多糖の担体タンパク質に対する比（重量／重量）は、０．４〜３の間である。好ましい実施形態では、コンジュゲートにおける血清型３３Ｆ多糖の担体タンパク質に対する比は、０．５〜２、０．５〜１．５、０．５〜１、１〜１．５、１〜２の間である。好ましい実施形態では、コンジュゲートにおける血清型３３Ｆ多糖の担体タンパク質に対する比は、０．５〜１．５の間である。好ましい実施形態では、コンジュゲートにおける血清型３３Ｆ多糖の担体タンパク質に対する比は、０．５〜１．２の間である。
【０１５８】
好ましい実施形態では、血清型３３Ｆ免疫原性コンジュゲートの少なくとも３０％が、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートの少なくとも４０％が、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、血清型３３Ｆ免疫原性コンジュゲートの少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％が、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、血清型３３Ｆ免疫原性コンジュゲートの少なくとも６０％が、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、４０％〜８０％の間の血清型３３Ｆ免疫原性コンジュゲートが、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、４５％〜６５％の間の血清型３３Ｆ免疫原性コンジュゲートが、ＣＬ−４Ｂカラムにおいて０．３以下のＫｄを有する。
【０１５９】
好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートの複合化度は、１〜１５、２〜１３、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、２〜４、３〜１５、３〜１３、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、３〜４、５〜１５、５〜１０、８〜１５、８〜１２、１０〜１５、または１０〜１２の間である。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートの複合化度は、３〜６の間である。
【０１６０】
免疫原性組成物
用語「免疫原性組成物」は、抗原、たとえば、微生物またはその構成成分を含有する、対象における免疫応答の惹起に使用することのできるいずれかの医薬組成物に関する。
【０１６１】
本明細書で使用するとき、「免疫原性」とは、細菌莢膜多糖などの抗原（または抗原のエピトープ）、または抗原を含む複合多糖もしくは免疫原性組成物が、哺乳動物などの宿主において、液性もしくは細胞媒介性または両方の免疫応答を惹起しうる能力を意味する。
【０１６２】
好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で開示する方法によって取得した血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆコンジュゲートを含む。好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で開示する方法によって取得可能な血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆコンジュゲートを含む。
【０１６３】
一実施形態では、本明細書で開示する免疫原性組成物は、対象に投与されたとき、血清型１０Ａ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に結合しうる抗体の形成を誘発する。一実施形態では、本明細書で開示する免疫原性組成物は、対象に投与されたとき、標準のＥＬＩＳＡアッセイによって測定される、血清型１０Ａ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に結合しうる抗体の形成を誘発する。
【０１６４】
一実施形態では、本明細書で開示する免疫原性組成物は、対象に投与されたとき、本明細書で開示するとおりのオプソニン化食作用アッセイにおいて、血清型１０Ａ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）を死滅させうる抗体の形成を誘発する。
【０１６５】
一実施形態では、本明細書で開示する免疫原性組成物は、対象に投与されたとき、血清型２２Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に結合しうる抗体の形成を誘発する。一実施形態では、本明細書で開示する免疫原性組成物は、対象に投与されたとき、標準のＥＬＩＳＡアッセイによって測定される、血清型２２Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に結合しうる抗体の形成を誘発する。
【０１６６】
一実施形態では、本明細書で開示する免疫原性組成物は、対象に投与されたとき、本明細書で開示するとおりのオプソニン化食作用アッセイにおいて、血清型２２Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）を死滅させうる抗体の形成を誘発する。
【０１６７】
一実施形態では、本明細書で開示する免疫原性組成物は、対象に投与されたとき、血清型３３Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に結合しうる抗体の形成を誘発する。一実施形態では、本明細書で開示する免疫原性組成物は、対象に投与されたとき、標準のＥＬＩＳＡアッセイによって測定される、血清型３３Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に結合しうる抗体の形成を誘発する。
【０１６８】
一実施形態では、本明細書で開示する免疫原性組成物は、対象に投与されたとき、本明細書で開示するとおりのオプソニン化食作用アッセイにおいて、血清型３３Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）を死滅させうる抗体の形成を誘発する。
【０１６９】
本発明の免疫原性組成物の製剤化は、業界で認知されている方法を使用して実現することができる。たとえば、血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆコンジュゲートを生理学的に許容できるビヒクルと共に製剤化して、組成物を調製することができる。そのようなビヒクルの例としては、限定はしないが、水、緩衝食塩水、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、およびデキストロース溶液が挙げられる。
【０１７０】
好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、少なくとも１種の追加の抗原を含んでもよい。好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、少なくとも１種の追加の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖を含んでもよい。
【０１７１】
好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、担体タンパク質とコンジュゲートされた、少なくとも１種の追加の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖を含んでもよい。好ましい実施形態では、前記担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、１種または複数のアジュバントを含む。本明細書で定義するとき、「アジュバント」とは、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を増強する働きをする物質である。したがって、アジュバントは、免疫応答を追加免疫するためにしばしば与えられ、当業者によく知られている。組成物の有効性を高めるのに適するアジュバントとしては、限定はしないが、以下のものが挙げられる。
（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、たとえば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど、
（２）水中油型エマルション製剤（ムラミルペプチド（以下で定義する）や細菌細胞壁成分などの他の詳細な免疫賦活薬を含むまたは含まないもの）、たとえば、
（ａ）５％のスクアレン、０．５％の５Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％のＳｐａｎ８５を含有する（場合により、様々な量のＭＴＰ−ＰＥ（必須ではないが以下を参照されたい）を含有する）ＭＦ５９（ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１４８３７号）を、Ｍｏｄｅｌ  １１ＯＹマイクロフルダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、マサチューセッツ州ニュートン）などのマイクロフルダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化したもの、
（ｂ）１０％のスクアレン、０．４％のＴｗｅｅｎ８０、５％のｐｌｕｒｏｎｉｃブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含有するＳＡＦを、顕微溶液化してサブミクロンエマルションにしたもの、またはボルテックス撹拌してより大きい粒径のエマルションを生じさせたもの、
（ｃ）２％のスクアレン、０．２％のＴｗｅｅｎ８０、ならびに米国特許第４，９１２，０９４号に記載の３−Ｏ−脱アシル化（ｄｅａｙｌａｔｅｄ）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（商標））（Ｃｏｒｉｘａ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１種または複数の細菌細胞壁成分を含有する、Ｒｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ、モンタナ州ハミルトン）、
（３）サポニンアジュバント、たとえば、Ｑｕｉｌ  ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、マサチューセッツ州フレミーミングハム）（米国特許第５，０５７，５４０号）またはそれから生成される粒子、たとえば、ＩＳＣＯＭ（免疫賦活複合体）、
（４）細菌リポ多糖、合成リピドＡ類似体、たとえば、Ｃｏｒｉｘａから入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されている、アミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）またはその誘導体もしくは類似体（このようなＡＧＰの一つは、水性形態または安定なエマルションとして製剤化される、５２９としても知られる（正式にはＲＣ５２９として知られる）、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドである）、合成ポリヌクレオチド、たとえば、ＣｐＧモチーフを含んでいるオリゴヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）、
（５）サイトカイン、たとえば、インターロイキン（たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８など）、インターフェロン（たとえば、γインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、補助刺激分子８７−１および８７−２など、
（６）細菌ＡＤＰリボシル化毒素、たとえば、野生型または突然変異形態のコレラ毒素（ＣＴ）（たとえば、この場合、公開国際特許出願第ＷＯ００／１８４３４号（ＷＯ０２／０９８３６８およびＷＯ０２／０９８３６９も参照のこと）に従って、アミノ酸２９位のグルタミン酸が別のアミノ酸、好ましくはヒスチジンで置き換えられている）、百日咳毒素（ＰＴ）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定毒素（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（たとえば、ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと）の無毒化突然変異体、ならびに
（７）免疫賦活薬として作用して組成物の有効性を高める他の物質。
【０１７３】
ムラミルペプチドとしては、限定はしないが、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられる。
【０１７４】
本発明の一実施形態では、本明細書で開示する免疫原性組成物は、アジュバントとしてＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で使用する、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとは、免疫賦活性ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）を指し、したがって、これらの用語は、別段指摘しない限り、互換的に使用される。免疫賦活性ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、場合によりある特定の好ましい塩基状況内で、メチル化されていないシトシン−グアニンジヌクレオチドである、１つまたは複数の免疫賦活性ＣｐＧモチーフを含んでいる。ＣｐＧ免疫賦活性モチーフのメチル化状態とは、一般に、ジヌクレオチド中のシトシン残基を指す。少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含んでいる免疫賦活性オリゴヌクレオチドとは、リン酸結合によって３’グアニンに連結された５’非メチル化シトシンを含んでおり、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ−９）に結合することで免疫系を活性化する、オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９を介して免疫系を活性化するが、ＣｐＧモチーフがメチル化されていない場合ほど強く活性化しない、１つまたは複数のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含んでいてもよい。ＣｐＧ免疫抑制性オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の回文構造を含んでもよく、その回文構造が、ＣｐＧジヌクレオチドを含んでもよい。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、米国特許第６，１９４，３８８号、第６，２０７，６４６号、第６，２１４，８０６号、第６，２１８，３７１号、第６，２３９，１１６号、および第６，３３９，０６８号を含めて、いくつかの交付済み特許、公開特許出願、および他の刊行物に記載されている。
【０１７５】
本発明の一実施形態では、本明細書で開示する免疫原性組成物は、ＷＯ２０１０／１２５４８０の３頁２２行〜１２頁３６行に記載のＣｐＧオリゴヌクレオチドのいずれかを含む。
【０１７６】
異なるクラスのＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドが確認されている。それらは、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＰクラスと称され、ＷＯ２０１０／１２５４８０の３頁２２行〜１２頁３６行により詳細に記載されている。本発明の方法は、こうした異なるクラスのＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドの使用を包含する。
【０１７７】
本発明の一実施形態では、本明細書で開示する免疫原性組成物は、ＡクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。本発明の「Ａクラス」ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、次の核酸配列：５’ＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧ３’（配列番号１）を有することが好ましい。Ａクラスオリゴヌクレオチドの非限定的な一部の例として、５’Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＿Ｇ＿Ａ＿Ｃ＿Ｇ＿Ａ＿Ｃ＿Ｇ＿Ｔ＿Ｃ＿Ｇ＿Ｔ＿Ｇ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ３’（配列番号２）［配列中、＊は、ホスホロチオエート結合を指し、＿は、ホスホジエステル結合を指す］が挙げられる。
【０１７８】
本発明の一実施形態では、本明細書で開示する免疫原性組成物は、ＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、本発明で使用するＣｐＧオリゴヌクレオチドは、少なくとも、式：
５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’［配列中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、ヌクレオチドである］で表されるＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、Ｘ２は、アデニン、グアニン、またはチミンである。別の実施形態では、Ｘ３は、シトシン、アデニン、またはチミンである。
【０１７９】
本発明のＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、米国特許第６，１９４，３８８号、第６，２０７，６４６号、第６，２１４，８０６号、第６，２１８，３７１号、第６，２３９，１１６号、および第６，３３９，０６８号の上方に広く記載されている配列である。例示的な配列としては、限定はしないが、これらの後半の出願および特許に記載されている配列が挙げられる。
【０１８０】
一実施形態では、本発明の「Ｂクラス」ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、次の核酸配列を有する。
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ３’（配列番号３）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＧＴＴＴＴ３’（配列番号４）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ３’（配列番号５）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ３’（配列番号６）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＴＴＴＣＧＡ３’（配列番号７）。
【０１８１】
こうした配列のいずれかにおいて、連結のすべてが、すべてホスホロチオエート結合であってもよい。別の実施形態では、こうした配列のいずれかにおいて、好ましくはＣｐＧモチーフの「Ｃ」と「Ｇ」間で、連結の１つまたは複数がホスホジエステルであり、セミソフトＣｐＧオリゴヌクレオチドをなしていてもよい。こうした配列のいずれかにおいて、５’Ｔの代わりにエチル−ウリジンまたはハロゲンが存在してもよく、ハロゲン置換の例としては、限定はしないが、ブロモ−ウリジンまたはヨード−ウリジン置換が挙げられる。
【０１８２】
Ｂクラスオリゴヌクレオチドの非限定的な一部の例として、
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ３’（配列番号８）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ３’（配列番号９）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ３’（配列番号１０）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ３’（配列番号１１）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ３’（配列番号１２）
［配列中、＊は、ホスホロチオエート結合を指す］が挙げられる。
【０１８３】
本発明の一実施形態では、本明細書で開示する免疫原性組成物は、ＣクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、本発明の「Ｃクラス」ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、次の核酸配列を有する。
５’ＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１３）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１４）、または
５’ＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１５）、または
５’ＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１６）、または
５’ＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１７）、または
５’ＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１８）、または
５’ＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１９）、または
５’ＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号２０）、または
５’ＴＣＧＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号２１）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号２２）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧ３’（配列番号２３）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧ３’（配列番号２４）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＴ３’（配列番号２５）
【０１８４】
こうした配列のいずれかにおいて、連結のすべてが、すべてホスホロチオエート結合であってもよい。別の実施形態では、こうした配列のいずれかにおいて、好ましくはＣｐＧモチーフの「Ｃ」と「Ｇ」間で、連結の１つまたは複数がホスホジエステルであり、セミソフトＣｐＧオリゴヌクレオチドをなしていてもよい。
【０１８５】
Ｃクラスオリゴヌクレオチドの非限定的な一部の例として、
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号２６）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号２７）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号２８）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号２９）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３０）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３１）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３２）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３３）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３４）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３５）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３６）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３７）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ３’（配列番号３８）
［配列中、＊は、ホスホロチオエート結合を指し、＿は、ホスホジエステル結合を指す］が挙げられる。
【０１８６】
こうした配列のいずれかにおいて、５’Ｔの代わりにエチル−ウリジンまたはハロゲンが存在してもよく、ハロゲン置換の例としては、限定はしないが、ブロモ−ウリジンまたはヨード−ウリジン置換が挙げられる。
【０１８７】
本発明の一実施形態では、本明細書で開示する免疫原性組成物は、ＰクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、本発明で使用するＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’ＴＬＲ活性化ドメインと、少なくとも２つの回文構造領域とを含んでおり、一つの回文構造領域が、長さが少なくとも６ヌクレオチドである５’回文構造領域であり、長さが少なくとも８ヌクレオチドである３’回文構造領域に、直接またはスペーサーを介して接続している、ＰクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＹｐＲジヌクレオチドを含む。一実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ（配列番号２７）でない。一実施形態では、ＰクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ＴＬＲ活性化ドメインは、ＴＣＧ、ＴＴＣＧ、ＴＴＴＣＧ、ＴＹｐＲ、ＴＴＹｐＲ、ＴＴＴＹｐＲ、ＵＣＧ、ＵＵＣＧ、ＵＵＵＣＧ、ＴＴＴ、またはＴＴＴＴである。さらに別の実施形態では、ＴＬＲ活性化ドメインは、５’回文構造領域内にある。別の実施形態では、ＴＬＲ活性化ドメインは、５’回文構造領域のすぐ５’側にある。
【０１８８】
一実施形態では、本発明の「Ｐクラス」ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、次の核酸配列：５’ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号３９）を有する。
【０１８９】
前記配列において、連結のすべてが、すべてホスホロチオエート結合であってもよい。別の実施形態では、好ましくはＣｐＧモチーフの「Ｃ」と「Ｇ」間で、連結の１つまたは複数がホスホジエステルであり、セミソフトＣｐＧオリゴヌクレオチドをなしていてもよい。こうした配列のいずれかにおいて、５’Ｔの代わりにエチル−ウリジンまたはハロゲンが存在してもよく、ハロゲン置換の例としては、限定はしないが、ブロモ−ウリジンまたはヨード−ウリジン置換が挙げられる。
【０１９０】
Ｐクラスオリゴヌクレオチドの非限定的な一例として、
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号４０）
［配列中、＊は、ホスホロチオエート結合を指し、＿は、ホスホジエステル結合を指す］が挙げられる。
【０１９１】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホジエステル様連結を含む。別の実施形態では、ホスホジエステル様連結は、ホスホジエステル連結である。別の実施形態では、親油性基が、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている。一実施形態では、親油性基は、コレステロールである。
【０１９２】
一実施形態では、本明細書で開示するＣｐＧオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間連結が、ホスホジエステル結合である（ＰＣＴ出願ＷＯ２００７／０２６１９０に記載されている「ソフト」オリゴヌクレオチド）。別の実施形態では、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、耐分解性になっている（すなわち、安定化されている）。「安定化オリゴヌクレオチド」とは、（たとえば、エキソまたはエンドヌクレアーゼによる）ｉｎ  ｖｉｖｏ分解に相対的に耐性があるオリゴヌクレオチドを指す。核酸安定化は、主鎖修飾によって実現することができる。ホスホロチオエート連結を有するオリゴヌクレオチドは、活性が最大となり、細胞内エキソおよびエンドヌクレアーゼによる分解からオリゴヌクレオチドを保護する。
【０１９３】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル連結とホスホロチオエート連結の組合せを備えたキメラ主鎖を有していてもよい。本発明の目的では、キメラ主鎖とは、少なくとも１つのヌクレオチド間連結がホスホジエステルまたはホスホジエステル様であり、他の少なくとも１つのヌクレオチド間連結が安定化されたヌクレオチド間連結であり、少なくとも１つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様連結と、少なくとも１つの安定化された連結は、異なるものである、部分的に安定化された主鎖を指す。ホスホジエステル連結がＣｐＧモチーフ内に優先的に位置しているとき、そのような分子は、ＰＣＴ出願ＷＯ２００７／０２６１９０に記載されているように、「セミソフト」と呼ばれる。
【０１９４】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドのサイズ（すなわち、オリゴヌクレオチドの長さに沿ったヌクレオチド残基の数）も、オリゴヌクレオチドの賦活活性に寄与しうる。細胞への取り込みを促進するために、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、６ヌクレオチド残基の最小長を有することが好ましい。大きめのオリゴヌクレオチドは、細胞内部で分解されるので、６ヌクレオチドより大きい（さらにより大きいｋｂ長でも）あらゆるサイズのオリゴヌクレオチドが、十分な免疫賦活性モチーフが存在すれば、免疫応答を誘発しうる。ある特定の実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、６〜１００ヌクレオチド長、より優先的には８〜３０ヌクレオチド長である。重要な実施形態では、本発明の核酸およびオリゴヌクレオチドは、プラスミドまたは発現ベクターでない。
【０１９５】
一実施形態では、本明細書で開示するＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＷＯ２００７／０２６１９０の１３４〜１４７段落に記載されているように、塩基および／または糖などにおける置換または修飾を含む。
【０１９６】
一実施形態では、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、化学修飾されている。化学修飾の例は、当業者に知られており、たとえば、Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅ．ら（１９９０）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３；Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、米国トトワ、１９９３；Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ら（１９９６）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３６：１０７〜１２９；およびＨｕｎｚｉｋｅｒ  Ｊ．ら（１９９５）、Ｍｏｄ．Ｓｙｎｔｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７：３３１〜４１７に記載されている。本発明によるオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾がなされていてよく、そのような修飾は、自然ＤＮＡまたはＲＮＡから構成される同じ配列のオリゴヌクレオチドと比較すると、特定のホスホジエステルヌクレオシド間架橋、および／または特定のβ−Ｄ−リボース単位、および／または特定の自然ヌクレオシド塩基位に位置している。
【０１９７】
本発明の一部の実施形態では、ＣｐＧを含んでいる核酸は、当業者公知の方法（たとえば、ＷＯ０３／０２４４８０を参照のこと）に従って、免疫原性担体と単に混合してよいことになる。
【０１９８】
本発明の特定の実施形態では、本明細書で開示する免疫原性組成物はいずれも、２μｇ〜１００ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、好ましくは０．１ｍｇ〜５０ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、好ましくは０．２ｍｇ〜１０ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、好ましくは０．３ｍｇ〜５ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、なお好ましくは０．５〜２ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、なお好ましくは０．７５〜１．５ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、本明細書で開示する免疫原性組成物は、およそ１ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。
【０１９９】
好ましい実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウム系アジュバントである。一実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントを含む。
【０２００】
好ましい実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、緩衝液、凍結保護剤、塩、二価カチオン、非イオン洗浄剤、フリーラジカル酸化防止剤、希釈剤、または担体の少なくとも１つをさらに含む。
【０２０１】
免疫原性組成物は、薬学的に許容できる担体を場合により含んでもよい。薬学的に許容できる担体には、ヒトならびに非ヒト哺乳動物を含めた動物における使用について、連邦政府、州政府の規制機関、もしくは他の規制機関によって認可されている、または米国薬局方もしくは一般に認められている他の薬局方に載っている担体が含まれる。担体という用語は、医薬組成物と一緒に投与される、希釈剤、佐剤、添加剤、またはビヒクルを指すのに使用することができる。水、食塩水、ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液は、液体担体として、特に注射用溶液に用いることができる。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。製剤は、投与方式に合ったものにすべきである。
【０２０２】
免疫原性組成物は、限定はしないが、Ｔｒｉｓ（トロメタミン）、リン酸、酢酸、ホウ酸、クエン酸、グリシン、ヒスチジン、およびコハク酸から選択される、生理学的に許容できる１種または複数の緩衝液を場合により含んでもよい。ある特定の実施形態では、製剤は、約５．０〜約７．０、好ましくは約５．５〜約６．５のｐＨ範囲内に緩衝される。
【０２０３】
免疫原性組成物は、限定はしないが、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリソルベート６０（Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリソルベート４０（Ｔｗｅｅｎ４０）、およびポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、限定はしないがＢｒｉｊ５８、Ｂｒｉｊ３５を含めたポリオキシエチレンアルキルエステル、ならびに他の界面活性剤、たとえば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ＮＰ４０、Ｓｐａｎ８５、およびＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズの非イオン界面活性剤（たとえば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ１２１）を始めとする、１種または複数の非イオン界面活性剤を場合により含んでもよく、好ましい構成成分は、約０．００１％〜約２％（約０．２５％までが好ましい）の濃度のポリソルベート８０、または約０．００１％〜１％（約０．５％までが好ましい）の濃度のポリソルベート４０である。
【０２０４】
本発明はさらに、本発明の免疫原性組成物を含むワクチンに関する。
【０２０５】
免疫応答を誘発し、感染から防御する方法
本開示はまた、本明細書に記載の免疫原性組成物の使用方法を包含する。たとえば、本開示の一実施形態は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する免疫応答を誘発する方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれかを対象に免疫原性量投与することを含む方法を提供する。
【０２０６】
本開示の一実施形態は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染から対象を防御する方法、または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染を防止する方法、または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす感染と関連する少なくとも１つの症状の重症度を軽減するもしくはその発症を遅らせる方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれかを対象に免疫原性量投与することを含む方法を提供する。
【０２０７】
本開示の一実施形態は、血清型１０Ａ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染から対象を防御する方法、または血清型１０Ａ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染を防止する方法、または血清型１０Ａ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす感染と関連する少なくとも１つの症状の重症度を軽減するもしくはその発症を遅らせる方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれかを対象に免疫原性量投与することを含む方法を提供する。
【０２０８】
本開示の一実施形態は、対象において、血清型１０Ａ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と関連する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染、疾患、または状態を治療または防止する方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物の治療または予防有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。別の実施形態は、対象において、血清型１０Ａ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と関連する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染、疾患、または状態を治療または防止する方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物からポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を生成することと、前記抗体調製物を使用して対象に受動免疫を付与することとを含む方法を提供する。
【０２０９】
一実施形態では、本開示は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染から対象を防御し、かつ／または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染を防止し、かつ／または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす感染と関連する少なくとも１つの症状の重症度を軽減するもしくはその発症を遅らせ、かつ／または血清型１０Ａ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染から対象を防御し、かつ／または血清型１０Ａ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染を防止し、かつ／または血清型１０Ａ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす感染と関連する少なくとも１つの症状の重症度を軽減するもしくはその発症を遅らせる医薬を製造するための、本明細書で開示する免疫原性コンジュゲートまたは免疫原性組成物の使用に関する。
【０２１０】
本開示の一実施形態は、血清型２２Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染から対象を防御する方法、または血清型２２Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染を防止する方法、または血清型２２Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす感染と関連する少なくとも１つの症状の重症度を軽減するもしくはその発症を遅らせる方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれかを対象に免疫原性量投与することを含む方法を提供する。
【０２１１】
本開示の一実施形態は、対象において、血清型２２Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と関連する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染、疾患、または状態を治療または防止する方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物の治療または予防有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。別の実施形態は、対象において、血清型２２Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と関連する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染、疾患、または状態を治療または防止する方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物からポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を生成することと、前記抗体調製物を使用して対象に受動免疫を付与することとを含む方法を提供する。
【０２１２】
一実施形態では、本開示は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染から対象を防御し、かつ／または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染を防止し、かつ／または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす感染と関連する少なくとも１つの症状の重症度を軽減するもしくはその発症を遅らせ、かつ／または血清型２２Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染から対象を防御し、かつ／または血清型２２Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染を防止し、かつ／または血清型２２Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす感染と関連する少なくとも１つの症状の重症度を軽減するもしくはその発症を遅らせる医薬を製造するための、本明細書で開示する免疫原性コンジュゲートまたは免疫原性組成物の使用に関する。
【０２１３】
本開示の一実施形態は、血清型３３Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染から対象を防御する方法、または血清型３３Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染を防止する方法、または血清型３３Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす感染と関連する少なくとも１つの症状の重症度を軽減するもしくはその発症を遅らせる方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれかを対象に免疫原性量投与することを含む方法を提供する。
【０２１４】
本開示の一実施形態は、対象において、血清型３３Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と関連する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染、疾患、または状態を治療または防止する方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物の治療または予防有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。別の実施形態は、対象において、血清型３３Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と関連する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染、疾患、または状態を治療または防止する方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物からポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を生成することと、前記抗体調製物を使用して対象に受動免疫を付与することとを含む方法を提供する。
【０２１５】
一実施形態では、本開示は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染から対象を防御し、かつ／または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染を防止し、かつ／または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす感染と関連する少なくとも１つの症状の重症度を軽減するもしくはその発症を遅らせ、かつ／または血清型３３Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染から対象を防御し、かつ／または血清型３３Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）への感染を防止し、かつ／または血清型３３Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす感染と関連する少なくとも１つの症状の重症度を軽減するもしくはその発症を遅らせる医薬を製造するための、本明細書で開示する免疫原性コンジュゲートまたは免疫原性組成物の使用に関する。
【０２１６】
免疫原性組成物に対する「免疫応答」とは、目的の免疫原性組成物またはワクチン組成物中に存在する分子に対する液性および／または細胞媒介性免疫応答が対象において展開されることである。本開示の目的では、「液性免疫応答」は、抗体が媒介となる免疫応答であり、本開示の免疫原性組成物またはワクチン中の抗原を認識し、いくらかの親和性で結合する抗体の誘導および生成を伴うのに対し、「細胞媒介性免疫応答」は、Ｔ細胞および／または他の白血球が媒介となるものである。「細胞媒介性免疫応答」は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のクラスＩまたはクラスＩＩ分子、ＣＤ１、または他の非古典的ＭＨＣ様分子と共同した抗原性エピトープの提示によって惹起される。これによって、抗原特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）が活性化される。ＣＴＬは、古典的または非古典的ＭＨＣによってコードされ細胞表面に発現されるタンパク質と共同して提示される、ペプチド抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内の微生物の細胞内での破壊、またはそのような微生物に感染した細胞の溶解の誘導および促進を助ける。細胞性免疫の別の側面には、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答が関与する。ヘルパーＴ細胞は、その表面上で古典的または非古典的ＭＨＣ分子と共同してペプチドまたは他の抗原を示す細胞に対して、非特異的なエフェクター細胞の機能を刺激し、その活性を集中させるのを助ける働きをする。「細胞媒介性免疫応答」は、サイトカイン、ケモカイン、ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞から派生するものを含めて、活性化Ｔ細胞および／または他の白血球によって産生される他のそうした分子の産生も指す。特定の抗原または組成物が細胞媒介性免疫応答を刺激しうる能力は、いくつかのアッセイ、たとえば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイ、感作された対象における抗原に特異的なＴリンパ球のアッセイ、または抗原による再刺激に応じたＴ細胞によるサイトカイン産生の測定によって決定することができる。このようなアッセイは、当業界でよく知られている。たとえば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（１９９３）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：４１８９〜４１９９、およびＤｏｅら（１９９４）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２３６９〜２３７６を参照されたい。
【０２１７】
本明細書で使用するとき、「治療」（その変形語、たとえば、「治療する」または「治療される」を含める）とは、（ｉ）伝統的なワクチンでのような感染または再感染の防止、（ｉｉ）症状の重症度の軽減またはその解消、および（ｉｉｉ）問題の病原または障害の実質的または完全な除去のいずれか１つまたは複数を意味する。すなわち、治療は、（感染する前に）予防的に、または（感染してから）治療的に行うことができる。本開示では、予防的治療が好ましい形式である。本開示の特定の実施形態によれば、宿主動物を血清型１０Ａ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染に対して予防的および／または治療的に免疫化することを含めて治療する組成物および方法が提供される。本開示の特定の実施形態によれば、宿主動物を血清型２２Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染に対して予防的および／または治療的に免疫化することを含めて治療する組成物および方法が提供される。本開示の特定の実施形態によれば、宿主動物を血清型３３Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染に対して予防的および／または治療的に免疫化することを含めて治療する組成物および方法が提供される。本開示の方法は、対象に予防的および／または治療的な免疫を付与するのに有用である。本開示の方法は、生物医学的研究用途のための対象において実施することもできる。
【０２１８】
本明細書で互換的に使用される「免疫原性量」および「免疫学的有効量」とは、当業者公知の標準のアッセイによって測定される、細胞性（Ｔ細胞）もしくは液性（Ｂ細胞もしくは抗体）応答のいずれかまたは両方の免疫応答を惹起するのに十分な抗原または免疫原性組成物の量を指す。
【０２１９】
好ましい実施形態では、前記対象はヒトである。最も好ましい実施形態では、前記対象は、新生児（すなわち、月齢３か月未満）、乳児（月齢３か月〜１歳）、または幼児（すなわち、１歳から４歳）である。
【０２２０】
一実施形態では、本明細書で開示する免疫原性組成物は、ワクチンとして使用するためのものである。
【０２２１】
このような実施形態では、ワクチン接種される対象は、１歳未満でもよい。たとえば、ワクチン接種される対象は、月齢約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２か月でよい。一実施形態では、ワクチン接種される対象は、月齢約２、４、または６か月である。別の実施形態では、ワクチン接種される対象は、２歳未満である。たとえば、ワクチン接種される対象は、月齢約１２〜１５か月でよい。ある場合では、１用量程度の少量の本発明による免疫原性組成物が必要とされるが、状況によっては、２回目、３回目、または４回目の用量が与えられる場合もある（投薬計画の部を参照されたい）。
【０２２２】
本発明の一実施形態では、ワクチン接種される対象は、５０歳以上の成人、より好ましくは５５歳以上の成人である。一実施形態では、ワクチン接種される対象は、６５歳以上、７０歳以上、７５歳以上、または８０歳以上の成人である。
【０２２３】
一実施形態では、ワクチン接種される対象は、免疫無防備状態の個体、特にヒトである。免疫無防備状態の個体とは、一般に、感染性因子による攻撃に対して正常な液性または細胞性防御を展開しうる能力の弱体化または低下を示す者と定義される。
【０２２４】
本発明の一実施形態では、ワクチン接種される免疫無防備状態の対象は、免疫系を損ない、結果として抗体応答を肺炎球菌疾患からの防御またはその治療に不十分にする、疾患または状態に罹患している。
【０２２５】
一実施形態では、前記疾患は、原発性免疫不全障害である。前記原発性免疫不全障害は、複合型Ｔ細胞Ｂ細胞免疫不全症（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｔ−ａｎｄ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、抗体不全症、明確に定義された症候群、免疫調節不全疾患、食細胞障害、先天免疫不全症、自己炎症性障害、および補体不全症からなる群から選択されることが好ましい。一実施形態では、前記原発性免疫不全障害は、ＰＣＴ出願ＷＯ２０１０／１２５４８０の２４頁１１行〜２５頁１９行で開示されているものから選択される。
【０２２６】
本発明の特定の実施形態では、ワクチン接種される免疫無防備状態の対象は、ＨＩＶ感染、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、がん、慢性の心臓または肺障害、うっ血性心不全、真性糖尿病、慢性肝疾患、アルコール中毒、肝硬変、髄液漏、心筋症、慢性気管支炎、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、脾臓不全症（鎌状赤血球症など）、脾臓機能の欠如（無脾症）、血液悪性病変、白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病、リンパ腫、腎不全、ネフローゼ症候群、および喘息からなる群から選択される疾患に罹患している。
【０２２７】
本発明の一実施形態では、ワクチン接種される免疫無防備状態の対象は、栄養失調症に罹患している。
【０２２８】
本発明の特定の実施形態では、ワクチン接種される免疫無防備状態の対象は、感染に対する身体の抵抗力を低下させる薬物または治療を受けている。一実施形態では、前記薬物は、ＰＣＴ出願ＷＯ２０１０／１２５４８０の２６頁３３行〜２６頁４０行で開示されているものから選択される。
【０２２９】
本発明の特定の実施形態では、ワクチン接種される免疫無防備状態の対象は、喫煙者である。
【０２３０】
本発明の特定の実施形態では、ワクチン接種される免疫無防備状態の対象は、白血球数（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ、ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｃｏｕｎｔ）が、１リットルあたり５×１０９細胞未満、または１リットルあたり４×１０９細胞未満、または１リットルあたり３×１０９細胞未満、または１リットルあたり２×１０９細胞未満、または１リットルあたり１×１０９細胞未満、または１リットルあたり０．５×１０９細胞未満、または１リットルあたり０．３×１０９細胞未満、または１リットルあたり０．１×１０９細胞未満である。
【０２３１】
白血球数（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ、ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｃｏｕｎｔ）：血液中の白血球（ＷＢＣ）の数。ＷＢＣは、普通はＣＢＣ（全血球計算）の一環として測定される。白血球は、血液中の、感染と闘う細胞であり、赤血球として知られる赤い（酸素を運搬する）血液細胞と区別される。好中球（多形核白血球、ＰＭＮ）、杆状球（わずかに未熟な好中球）、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、単球、好酸球、および好塩基球を含めた、異なるタイプの白血球が存在する。すべてのタイプの白血球が白血球数に反映される。白血球数の正常範囲は、普通、血液１立方ミリメートルあたり４，３００細胞〜１０，８００細胞の間である。白血球数は、ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｃｏｕｎｔとも呼ばれることがあり、国際単位では１リットルあたり４．３〜１０．８×１０９細胞と示すことができる。
【０２３２】
本発明の特定の実施形態では、ワクチン接種される免疫無防備状態の対象は、好中球減少症に罹患している。本発明の特定の実施形態では、ワクチン接種される免疫無防備状態の対象は、好中球数が、１リットルあたり２×１０９細胞未満、または１リットルあたり１×１０９細胞未満、または１リットルあたり０．５×１０９細胞未満、または１リットルあたり０．１×１０９細胞未満、または１リットルあたり０．０５×１０９細胞未満である。
【０２３３】
少ない白血球数または「好中球減少症」は、循環血液中の好中球のレベルが異常に低いことを特徴とする状態である。好中球は、感染の防止を助け、感染と闘う、特殊な種類の白血球である。がん患者が好中球減少症になる最も一般的な理由は、化学療法の副作用としてであるとされる。化学療法によって誘発された好中球減少症のせいで、患者の感染のリスクは高まり、がん治療は中断される。
【０２３４】
本発明の特定の実施形態では、ワクチン接種される免疫無防備状態の対象は、ＣＤ４＋細胞数が５００／ｍｍ３未満、またはＣＤ４＋細胞数が３００／ｍｍ３未満、またはＣＤ４＋細胞数が２００／ｍｍ３未満、ＣＤ４＋細胞数が１００／ｍｍ３未満、ＣＤ４＋細胞数が７５／ｍｍ３未満、またはＣＤ４＋細胞数が５０／ｍｍ３未満である。
【０２３５】
ＣＤ４細胞試験は、通常、ｍｍ３中の細胞の数として報告する。正常なＣＤ４数は、５００〜１６００の間であり、ＣＤ８数は、３７５〜１１００の間である。ＣＤ４数は、ＨＩＶのヒトでは劇的に減少する。
【０２３６】
本発明の一実施形態では、本明細書で開示する免疫無防備状態の対象のいずれもが、男性のヒトまたは女性のヒトである。
【０２３７】
組成物中のコンジュゲートの量は、一般に、そのコンジュゲートについてコンジュゲートされ、またコンジュゲートされていない、全多糖を基準として算出される。たとえば、遊離多糖が２０％であるコンジュゲートは、１００ｍｃｇの多糖用量中に約８０ｍｃｇのコンジュゲートされた多糖と約２０ｍｃｇのコンジュゲートされていない多糖を有する。コンジュゲートへのタンパク質の寄与は、普通、コンジュゲートの用量を算出する際に考慮に入れない。一般に、各用量は、０．１〜１００ｍｃｇ、特に０．１〜１０ｍｃｇ、より特段には１〜１０ｍｃｇ、より特段には１〜５μｇの多糖を含む。各用量は、約１．１、２、２．２、３、３．３、４、４．４μｇの多糖を含むことが好ましい。
【０２３８】
特定の免疫原性組成物またはワクチンに最適な構成成分量は、対象における適切な免疫応答の観察を含む標準の研究によって突き止めることができる。対象は、初回ワクチン接種に続いて、十分に間隔を置いた１回または数回の追加免疫化を受けることができる。
【０２３９】
免疫原としての抗原の有効性は、増殖アッセイ、細胞溶解アッセイ、たとえば、Ｔ細胞がその特異的ターゲット細胞を溶解しうる能力を測定するクロム放出アッセイ、または血清中の抗原に特異的な循環抗体のレベルを測定することによるＢ細胞活性レベルの測定のいずれかによって測定することができる。抗原投与後に誘導される抗原特異的抗体の血清レベルを測定する、より詳細には、そのようにして誘導された抗体が、本明細書に記載するとおりの特定の白血球のオプソニン化食作用能を増強しうる能力を測定することにより、免疫応答を検出してもよい。免疫応答の防御レベルは、免疫化された宿主に、投与されたことのある抗原を負荷することにより測定できる。たとえば、免疫応答が望まれる抗原が細菌である場合、免疫原性量の抗原によって誘発される防御のレベルは、動物に細菌細胞を負荷した後の生存パーセントまたは死亡パーセントを検出することにより測定される。一実施形態では、防御の量は、細菌感染と関連する少なくとも１つの症状、たとえば、感染と関連する発熱を計測することにより測定できる。多抗原または多成分ワクチンまたは免疫原性組成物中の抗原それぞれの量は、他の構成成分それぞれに対して異なるものになり、当業者公知の方法によって求めることができる。そのような方法は、免疫原性および／またはｉｎ  ｖｉｖｏ効力を測定する手順を含むであろう。
【０２４０】
本開示はさらに、本開示の莢膜多糖または複合多糖に特異的および選択的に結合する抗体および抗体組成物を提供する。一部の実施形態では、抗体は、本開示の莢膜多糖または複合多糖が対象に投与されて生成される。一部の実施形態では、本開示は、本開示の莢膜多糖または複合多糖の１つまたは複数に照準を合わせた、精製または単離抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示の抗体は、動物効力モデルまたはオプソニン化食作用死滅アッセイのいずれかで細菌の死滅を測定したとき、機能しうるものである。一部の実施形態では、本開示の抗体は、対象に受動免疫を付与する。本開示はさらに、本開示の抗体もしくは抗体断片をコードするポリヌクレオチド分子、ならびに、当業者によく知られている技術を使用して本開示の抗体または抗体組成物を産生する細胞、細胞系（たとえば、抗体の組換え産生用のハイブリドーマ細胞または他の操作された細胞系）、またはトランスジェニック動物を提供する。
【実施例】
【０２４１】
（実施例１）
血清型２２Ｆ多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの調製
１．１．肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆ多糖単離物の調製
血清型２２Ｆ莢膜多糖は、当業者公知の単離手順を使用して、細菌から直接取得することができる（たとえば、米国特許出願公開第２００６０２２８３８０号、第２００６０２２８３８１号、第２００７０１８４０７１号、第２００７０１８４０７２号、第２００７０２３１３４０号、および第２００８０１０２４９８号、またはＷＯ２００８１１８７５２で開示されている方法を参照されたい）。血清型２２Ｆ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）をシードボトルで成長させ、次いでシード発酵槽に移した。目標光学濃度に達したら、細胞を産生発酵槽に移した。Ｎ−ラウロイルサルコシンを加えて発酵ブロスを不活化し、限外濾過および透析濾過によって精製した。
【０２４２】
精製された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆ多糖は、ＰＡＮＤＡ２Ｋ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（登録商標）（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ）を使用しての高圧均質化によってサイジングして、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆ多糖単離物を生産した。
【０２４３】
１．２．肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆ莢膜多糖単離物の酸化
多糖の酸化は、算出された量の５００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．８）およびＷＦＩを順次加えて最終多糖濃度を２．０ｇ／Ｌとすることにより取得した１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．８±０．２）中で実施した。所望であれば、反応ｐＨをおよそ５．８に調整した。ｐＨ調整後、反応温度を５±３℃に下げた。０．１０±０．０２モル当量（ＭＥｑ）の過ヨウ素酸ナトリウムを加えて酸化を開始した。目標酸化反応時間は、５±３℃で１６±１時間である。
【０２４４】
５±３℃で１〜２時間継続的に撹拌しながら、２ＭＥｑの２，３−ブタンジオールで酸化反応を停止させた。
【０２４５】
活性化多糖の濃縮および透析濾過を、１００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過カセットを使用して実施した。透析濾過は、３５倍透析濾過体積のＷＦＩに対して行った。精製された活性化多糖を５±３℃で保管した。精製された活性化糖は、特に、（ｉ）ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる分子量、（ｉｉ）Ｏ−アセチルの存在、および（ｉｉｉ）酸化度によって特徴付けられる。
【０２４６】
多糖および多糖−タンパク質コンジュゲートの分子量を求めるのには、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳを使用する。ＳＥＣを使用して、流体力学的体積により多糖を分離する。屈折率（ＲＩ）および多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器を使用して分子量を求める。光は、物体と相互作用すると散乱し、散乱光の量は、濃度、ｄｎ／ｄｃ（比屈折率増分）の２乗、および物体のモル質量に関連付けられる。分子量測定値は、ＭＡＬＬＳ検出器からの散乱光シグナルおよびＲＩ検出器からの濃度シグナルの読み取りに基づき算出される。
【０２４７】
活性化多糖の酸化度（ＤＯ＝糖反復単位のモル／アルデヒドのモル）は、次のとおりに求めた。
糖反復単位のモルは、たとえば、アンスロン法を使用するなどの種々の比色法によって求められる。最初に、硫酸および熱の作用によって多糖を単糖に分解する。アンスロン試薬は、ヘキソースと反応すると黄色から緑色の錯体を形成し、その吸光度を６２５ｎｍで分光光度的に読み取る。アッセイの範囲内で、吸光度は、存在するヘキソースの量に正比例する。
【０２４８】
アルデヒドのモルも、ＭＢＴＨ比色法を使用して同時に求められる。ＭＢＴＨアッセイは、（所与のサンプルからの）アルデヒド基を３−メチル−２−ベンゾチアゾロンヒドラゾン（ＭＢＴＨアッセイ試薬）と反応させることによりアジン化合物を形成するものである。余分な３−メチル−２−ベンゾチアゾロンヒドラゾンは、酸化して反応性カチオンを形成する。反応性カチオンとアジンは、反応して青色の発色団を形成する。次いで、形成した発色団を６５０ｎｍで分光光度的に読み取る。
【０２４９】
１．３．活性化肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆ多糖のＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
コンジュゲーション方法は、次のステップからなる。
ａ．スクロース添加剤との混和および凍結乾燥
ｂ．凍結乾燥された多糖およびＣＲＭ１９７の再溶解
ｃ．活性化多糖のＣＲＭ１９７とのコンジュゲーションおよびキャッピング
ｄ．コンジュゲートの精製
【０２５０】
ａ．スクロースとの混和および凍結乾燥
活性化多糖をスクロース（ＷＦＩ中５０％ｗ／ｖ）と混和して、活性化多糖１グラムあたり２５グラムの比とした。次いで、混和した混合物のボトルを凍結乾燥した。凍結乾燥後、凍結乾燥された活性化多糖を含有するボトルを−２０±５℃で保管した。算出された量のＣＲＭ１９７タンパク質（目標Ｓ／Ｐ投入量比＝１）を、別途シェルフリージングし、凍結乾燥した。凍結乾燥されたＣＲＭ１９７を−２０±５℃で保管した。
【０２５１】
ｂ．凍結乾燥された活性化多糖およびＣＲＭ１９７タンパク質の再溶解
凍結乾燥された活性化多糖を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で再溶解した。多糖が完全に溶解したら、凍結乾燥されたＣＲＭ１９７に等量の無水ＤＭＳＯを加えて再溶解した。
【０２５２】
ｃ．活性化多糖のＣＲＭ１９７とのコンジュゲーションおよびキャッピング
再溶解された（ＤＭＳＯ中の）ＣＲＭ１９７を、コンジュゲーション反応容器において再溶解された活性化多糖と混和した。反応溶液中の最終多糖濃度は、１ｇ／Ｌとする。反応混合物に１．５±０．１ＭＥｑのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えてコンジュゲーションを開始し、反応液を２３±２℃で２０±２時間インキュベートした。２ＭＥｑの水素化ホウ素ナトリウムを加えてコンジュゲーション反応を終結させた。キャッピング反応液を２３±２℃で３±１時間インキュベートした。
【０２５３】
ｄ．コンジュゲートの精製
１００Ｋ  ＭＷＣＯ膜を使用するタンジェンシャルフロー濾過による精製の準備において、コンジュゲート溶液を、冷却した５ｍＭコハク酸−０．９％食塩水（ｐＨ６．０）で１：５に希釈し、５ｍＭコハク酸−０．９％食塩水（ｐＨ６．０）を媒質として使用して２０倍透析濾過を行った。透析濾過が完了した後、コンジュゲート保持液をさらに希釈し、０．２２μｍフィルターで濾過し、２〜８℃で保管した。
【０２５４】
表１は、本発明の方法によって取得した血清型２２Ｆ多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの特徴付けデータを含む。特に、表のコンジュゲート５および６は、実施例１で開示したとおりに取得したものである。
【０２５５】
ＲＡＣ−ＤＭＳＯ法によって生成した血清型２２Ｆ多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートは、表１に示すとおり、ＲＡＣ−水溶液法によって生成したコンジュゲートに比べて、良好な収率を達成し、良好なバッチ間のＭＷ統一性を示し、それと共に顕著に低い遊離糖レベル％とより高い担体タンパク質（リシン）修飾を示した。
【０２５６】
【表１】
2020055810.tif 000004
【０２５７】
（実施例２）
血清型１０Ａ多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの調製
２．１．肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ多糖単離物の調製
血清型１０Ａ多糖単離物は、精製多糖をサイジングしなかったことを除き、実施例１．１で開示したとおりに取得した。
【０２５８】
２．２．肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ莢膜多糖単離物の酸化
多糖溶液に、算出された体積の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）および注射用水（ＷＦＩ）を加えて、最終多糖濃度を２．５ｇ／Ｌとし、リン酸カリウム緩衝液の最終濃度を２５ｍＭとした。必要なら、ｐＨをおよそ６．０に調整した。次いで、希釈された多糖を５±３℃に冷却した。０．２５±０．０２モル当量（ＭＥｑ）の過ヨウ素酸ナトリウム溶液を加えて酸化を開始した。酸化反応時間は、５±３℃でおよそ４時間とした。５±３℃で１〜２時間継続的に撹拌しながら、１ＭＥｑの２，３−ブタンジオールで酸化反応を停止させた。
【０２５９】
目標反応時間に達した後、３０Ｋ  ＭＷＣＯ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ限外濾過カセットを使用して活性化多糖を濃縮した。次いで、２０倍透析濾過体積のＷＦＩに対して透析濾過を行った。精製された活性化多糖を５±３℃で保管した。精製された活性化糖は、特に、（ｉ）ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる分子量および（ｉｉ）酸化度によって特徴付けられる。
【０２６０】
２．３  活性化肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ多糖のＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
コンジュゲーション方法は、次のステップからなる。
ａ．スクロース添加剤との混和および凍結乾燥
ｂ．凍結乾燥された多糖およびＣＲＭ１９７の再溶解
ｃ．活性化多糖のＣＲＭ１９７とのコンジュゲーションおよびキャッピング
ｄ．コンジュゲートの精製
【０２６１】
ａ．スクロースとの混和
活性化多糖をスクロースと混和して、活性化多糖１グラムあたり２５±２．５グラムのスクロースの比とした。次いで、混和した混合物のボトルを凍結乾燥した。凍結乾燥後、凍結乾燥された活性化多糖を含有するボトルを−２０±５℃で保管した。
【０２６２】
ｂ．凍結乾燥された活性化多糖およびＣＲＭ１９７タンパク質の再溶解
凍結乾燥された活性化多糖を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で再溶解した。多糖が完全に溶解したら、算出されたＣＲＭ１９７に同量の無水ＤＭＳＯを加えて再溶解した。
【０２６３】
ｃ．活性化多糖のＣＲＭ１９７とのコンジュゲーションおよびキャッピング
コンジュゲーション反応器において、再溶解された活性化多糖に、再溶解された（ＤＭＳＯ中の）ＣＲＭ１９７を加えた。最終多糖濃度は、１ｇ／Ｌとする。反応混合物に１．２±０．１ＭＥｑのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えてコンジュゲーションを実施した。反応液を２３±２℃で２４±２時間インキュベートした。２ＭＥｑの水素化ホウ素ナトリウムを加えてコンジュゲーション反応を終結させた。キャッピング反応液を２３±２℃で３±１時間インキュベートした。
【０２６４】
２ＭＥｑの水素化ホウ素ナトリウムを加えてコンジュゲーション反応を終結させた。このキャッピング反応は、２３±２℃で３±１時間進められた。
【０２６５】
ｄ．コンジュゲートの精製
次いで、コンジュゲート溶液を５倍（体積）の冷却した５ｍＭコハク酸−０．９％食塩水（ｐＨ６．０）に希釈し、５ｍＭコハク酸−０．９％食塩水（ｐＨ６．０）を使用して２０倍透析濾過を行った。最初の透析濾過が完了した後、コンジュゲート保持液を０．２２μｍフィルターを介して移した。コンジュゲートを５ｍＭコハク酸／０．９％食塩水（ｐＨ６）でさらに希釈し、最終の０．２２μｍ濾過ステップの後、２〜８℃で保管した。
【０２６６】
表２は、本発明の方法によって取得した血清型１０Ａ多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの特徴付けデータを含む。特に、表２のコンジュゲート４〜６は、実施例２で開示したとおりに取得したものである。
【０２６７】
ＲＡＣ−ＤＭＳＯ法によって生成した血清型１０Ａ多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートは、表２に示すとおり、ＲＡＣ−水溶液法によって生成したコンジュゲートに比べて、良好な収率を達成し、良好なバッチ間のＭＷ統一性を示し、それと共に顕著に低い遊離糖レベル％とより高い担体タンパク質（リシン）修飾を示した。
【０２６８】
【表２】
2020055810.tif 000005
【０２６９】
（実施例３）
血清型３３Ｆ多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの調製
３．１．肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆ多糖単離物の調製
血清型３３Ｆ多糖単離物は、実施例１．１で開示したとおりに取得した。
【０２７０】
３．２．肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆ莢膜多糖単離物の酸化
多糖溶液に、算出された体積の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）および注射用水（ＷＦＩ）を加えて、最終多糖濃度を２ｇ／Ｌとした。必要なら、ｐＨをおよそ６．０に調整した。次いで、希釈された多糖を５±３℃に冷却した。０．１モル当量（ＭＥｑ）の過ヨウ素酸ナトリウム溶液を加えて酸化を開始した。酸化反応時間は、５±３℃でおよそ２０時間とした。５±３℃で約１時間継続的に撹拌しながら、１ＭＥｑの２，３−ブタンジオールで酸化反応を停止させた。目標反応時間に達した後、１００Ｋ  ＭＷＣＯ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ限外濾過カセットを使用して活性化多糖を濃縮した。次いで、４０倍透析濾過体積のＷＦＩに対して透析濾過を行った。精製された活性化多糖を５±３℃で保管した。精製された活性化糖は、特に、（ｉ）ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる分子量および（ｉｉ）酸化度によって特徴付けられる。
【０２７１】
３．３  活性化肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆ多糖のＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
血清型３３Ｆ多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートは、実施例３．２で取得した活性化３３Ｆ多糖を使用して、実施例１．３と同様の方法によって取得した。
【０２７２】
ＲＡＣ−ＤＭＳＯ法によって生成した血清型３３Ｆ多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートは、表３に示すとおり、ＲＡＣ−水溶液法によって生成したコンジュゲートに比べて、良好な収率を達成し、Ｏ−アセチルレベルの保存に関して良好なバッチ間の統一性が良好を示し、それと共に全般に低い遊離糖レベル％とより高い担体タンパク質（リシン）修飾を示した
【０２７３】
【表３】
2020055810.tif 000006
【０２７４】
（実施例４）
停止処理が活性化血清型２２Ｆおよび３３Ｆ多糖の分子量に与える効果
２２Ｆおよび３３Ｆ多糖の活性化を４℃または２２℃で実施した。どちらの温度でも、同様のＤＯ値が得られた。しかし、温度が高められた結果、活性化多糖の分解がより速くなり、それによって、（たとえば、図４（２２℃）と図５（４℃）を比較して分かるとおり）活性化多糖ＭＷが小さくなったことから、活性化反応には４℃が一般に好ましかった。加えて、活性化データによって、酸化後の未反応ＮａＩＯ４の停止処理が、活性化、特に多めの量のＮａＩＯ４を使用する活性化にとって、不可欠なステップであることが示された。図６に示すグラフから、（停止処理を用いて）漸増する濃度のペルヨーデートを活性化に使用したとき、活性化３３Ｆ多糖のＭＷは比較的安定するものの、そうしたＭＷは、停止処理ステップを使用しないと非常に変化しやすいことが示される。目標酸化度を実現するために定めた特殊な条件において、活性化多糖の分子量は、停止処理ステップを使用すると、より変化しにくい。酸化の後に反応停止試薬を加えることは、たとえば限外濾過や透析濾過による精製が完了するまで、活性化多糖の構造の完全性を保つ助けとなる。
【０２７５】
（実施例５）
オプソニン化食作用活性アッセイ（ＯＰＡ）
本明細書で開示する方法によって取得したコンジュゲートの免疫原性は、以下に記載するオプソニン化食作用アッセイ（ＯＰＡ）を使用して評価することができる。
【０２７６】
３０匹の雌の６〜７週齢Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスからなる群を、０週目に、皮下経路によって、０．００１μｇ、０．０１μｇ、または０．１μｇの試験コンジュゲートで免疫化した。３週目にマウスを同じ用量のコンジュゲートで追加免疫し、次いで４週の時点で採血した。４週目の血清サンプルで血清型専用のＯＰＡを実施した。
【０２７７】
検証されたオプソニン化食作用活性（ＯＰＡ）アッセイを使用して、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型１０Ａ、２２Ｆ、または３３Ｆに特異的な、マウス血清中の機能抗体を測定する。莢膜多糖に特異的な免疫グロブリンが細菌をオプソニン化し、補体付着を誘発し、それによって食作用、および食作用による細菌の死滅を促進しうる能力を測定するアッセイの反応に、試験血清をセットする。ＯＰＡ力価は、試験血清なしの対照ウェルと比較して細菌数を５０％減少させる希釈度の逆数であると定義される。ＯＰＡ力価は、この５０％死滅カットオフ値をもたらす２つの希釈度から内挿される。
【０２７８】
ＯＰＡ手順は、Ｈｕら、Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５；１２（２月号（２））：２８７〜９５に記載の方法に準拠し、次の変更を加えた。試験血清を２．５倍に連続希釈し、マイクロタイターアッセイプレートに加えた。生きた血清型１０Ａ、２２Ｆ、および３３Ｆターゲット細菌株をウェルに加え、プレートを２５℃（血清型２２Ｆ）または３７℃（血清型１０Ａおよび３３Ｆ）で３０分間振盪した。分化させたＨＬ−６０細胞（食細胞）および仔ウサギ血清（３〜４週齢、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ（登録商標）、最終濃度１２．５％）をウェルに加え、プレートを３７℃で４５分間（血清型２２Ｆおよび３３Ｆ）または６０分間（血清型１０Ａ）振盪した。反応を終結させるために、８０μＬの０．９％ＮａＣｌをすべてのウェルに加え、混合し、１０μＬの分割量を、２００μＬの水を含有するＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＨＴＳ  ＨＶフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））のウェルに移した。プレートを介して液体を真空濾過し、１５０μＬのＨｙＳｏｙ培地を各ウェルに加え、濾過した。次いで、フィルタープレートを３７℃、５％ＣＯ２で終夜インキュベートし、次いでＤｅｓｔａｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で固定した。次いで、プレートをクーマシーブルーで染色し、一度脱染した。コロニーを画像処理し、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＣＴＬ）ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）で数え上げた。生コロニー数を使用して死滅曲線にプロットし、ＯＰＡ力価を算出した。
【０２７９】
実施例１〜３で開示したとおりに取得した血清型１０Ａ多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、血清型２２Ｆ多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、および血清型３３Ｆ多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートを上で開示したＯＰＡアッセイで試験し、免疫原性であることがわかった。
【図１】
2020055810.tif 000008
【図２】
2020055810.tif 000009
【図３】
2020055810.tif 000010
【図４】
2020055810.tif 000011
【図５】
2020055810.tif 000012
【図６】
2020055810.tif 000013
【配列表】
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