(57)【要約】【課題】インフルエンザ感染症またはコロナウイルス感染症を予防および／または治療するための新規な医薬を提供する。【解決手段】本発明によれば、化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物を有効成分として含有する、抗インフルエンザウイルス剤および抗コロナウイルス剤、並びに、インフルエンザウイルス感染症またはコロナウイルス感染症の予防および／または治療剤が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物を有効成分として含有する、抗インフルエンザウイルス剤。
【化１】
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【請求項２】
下記の化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物を有効成分として含有する、インフルエンザウイルス感染症の予防および／または治療剤。
【化２】
2020196704.tif 000016
【請求項３】
下記の化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物、および薬学的に許容される担体を含有する、インフルエンザウイルス感染症の予防および／または治療用医薬組成物。
【化３】
2020196704.tif 000017
【請求項４】
下記の化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物を、必要とする患者に投与することを含む、インフルエンザウイルス感染症の予防および／または治療方法。
【化４】
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【請求項５】
インフルエンザウイルス感染症の予防および／または治療剤の製造のための、下記の化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物の使用。
【化５】
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【請求項６】
下記の化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物を有効成分として含有する、コロナウイルス感染症の予防および／または治療剤。
【化６】
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【請求項７】
前記コロナウイルス感染症が２０１９新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）感染症である、請求項６に記載の予防および／または治療剤。
【請求項８】
下記の化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物を、必要とする患者に投与することを含む、コロナウイルス感染症の予防および／または治療方法。
【化７】
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【請求項９】
前記コロナウイルス感染症が２０１９新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）感染症である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
下記の化学式（１）で表される化合物またはその塩もしくは水和物：
【化８】
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化学式（１）中、
Ｘは、水素原子または炭素原子数１〜４のアシル基を表し、
Ｙ１は、水素原子もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＨ（ここで、ｎは１〜４の整数である）で表される基を表し、
Ｙ２およびＹ３は、水素原子もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＨ（ここで、ｎは１〜４の整数である）で表される基を表すか、あるいは一緒になって下記化学式（２）で表される基を形成し、
【化９】
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化学式（２）中、＊は結合部位を表す、
ただし、化学式（１）は、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＨ（ここで、ｎは１〜４の整数である）で表される基または化学式（２）で表される基のいずれか一方を１つ含む。
【請求項１１】
請求項１０に記載の化合物またはその塩もしくは水和物を含有する医薬。
【請求項１２】
抗インフルエンザウイルス剤である、請求項１０に記載の医薬。
【請求項１３】
抗コロナウイルス剤である、請求項１０に記載の医薬。
【請求項１４】
請求項１０に記載の化合物またはその塩もしくは水和物を有効成分として含有する、コロナウイルス感染症の予防および／または治療剤。
【請求項１５】
前記コロナウイルス感染症が２０１９新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）感染症である、請求項１４に記載の予防および／または治療剤。
【請求項１６】
請求項１０に記載の化合物またはその塩もしくは水和物を、必要とする患者に投与することを含む、コロナウイルス感染症の予防および／または治療方法。
【請求項１７】
前記コロナウイルス感染症が２０１９新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）感染症である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルス感染症またはコロナウイルス感染症の新規な予防および／または治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスを病原体とするインフルエンザ感染症は、現代においてもその強烈な伝播力によって大きな流行を繰り返す伝染病であり、社会に莫大な被害を及ぼしている。様々な伝染病が克服される中、インフルエンザウイルスに有効で安全性の高い薬剤は少ないうえに、それらに対する耐性ウイルスの出現なども問題視されており、新しい抗インフルエンザ薬の開発が期待されている。
【０００３】
インフルエンザウイルスは急性の呼吸器感染症を引き起こし、その臨床症状は、急激な発熱、頭痛、関節痛、全身倦怠などの全身症状とともに、鼻汁、咳などの風邪にみられる種々の呼吸器症状および３８℃以上の高熱を伴うのが特徴である。健常人では通常１〜２週間程度で治癒するが、乳幼児、高齢者や呼吸器・循環器・腎臓に慢性疾患を持つ患者、糖尿病などの代謝疾患や免疫機能が低下している患者などでは、細菌などによる二次感染や肺炎を併発して死に至る場合も少なくない。また、呼吸器の局所感染にとどまらず、インフルエンザ脳炎・脳症などに代表される重症神経系合併症といった極めて重篤な症例も報告されている。このほか、腹痛、悪心・嘔吐、下痢などの消化器症状がみられることもあり、特に小児では注意を要する。診断する上で注意すべき大きな特徴は、呼吸器症状に比べて、熱その他の全身症状が顕著である点である。
【０００４】
現在、インフルエンザに対する対策としては、予防的観点から、ワクチン接種が基本と考えられている。ワクチン以外の抗インフルエンザ薬としては、Ｍ２タンパク質イオンチャネル機能阻害活性を有するアマンタジン（医薬品名：シンメトレル）のほか、ノイラミニダーゼ阻害剤であるオセルタミビル（医薬品名：タミフル）やザナミビル（医薬品名：リレンザ）などが認可されているのみである。例えばオセルタミビルは、ＥＣ５０＝０．０３、ＣＣ５０＞１００と、医薬品として優れた性能を有している。
【０００５】
ウイルスの細胞への感染は、次のような過程で始まる。まず、ウイルスの有するヘマグルチニンタンパク質（以下、「ヘマグルチニン」とも称する）が細胞側のシアル酸受容体に結合し、エンドサイトーシスによってウイルスが細胞内に取り込まれる。続いて、エンドソーム内の酸性化によって起こるウイルス膜とエンドソーム膜との融合により、ウイルス遺伝子が細胞質内に進入する。この融合には、宿主細胞由来のエンドプロテアーゼによるヘマグルチニンの特異的配列部位でのペプチド結合の開裂が必須であり、この開裂によりヘマグルチニンの膜融合ドメインが露出し、エンドソーム膜との融合が起こることが報告されている（最新医学、2004、Vol. 59, 215-222）。この感染成立後、ウイルスは細胞内で増殖し、新たな細胞・組織へ感染を拡大するために感染細胞から出芽する。この出芽には、ウイルス由来ノイラミニダーゼによるヘマグルチニンとシアル酸受容体との切断が必須である。既存の抗インフルエンザ薬であるオセルタミビルやザナミビルは、この感染後のウイルス出芽時に作用するため、初期感染の成立を阻止することはできない。さらに、近年では、上述したようなノイラミニダーゼ阻害剤やＭ２タンパク質イオンチャネル阻害剤に対して耐性を有するインフルエンザウイルスの出現も報告されている（Matsuzaki Y, et al., Virol J. 2010; 7:53、Dong G, et al., PloS One. 2015; 10(3):e0119115）。
【０００６】
ところで、本発明者らは以前に、１６員環マクロライド系抗生物質であるスピラマイシンまたはジョサマイシン（ロイコマイシンＡ３）がインフルエンザウイルスの感染による劇症型肺炎の治療に有効であることを報告している（特開２０１２−０２０９５３号公報）。また、１４員環マクロライド系抗生物質であるクラリスロマイシンがインフルエンザウイルスの増殖を抑制するとの報告もある（Yamaya M, et al., J Pharmacol Exp Ther. 2010 Apr; 333(1):81-90）。しかしながら、アジスロマイシン等の１５員環マクロライド系抗生物質が抗インフルエンザウイルス作用を有しているとの報告はこれまで存在しない。むしろ、オセルタミビルを経口投与したマウスに対し、アジスロマイシンをさらに腹腔内投与しても、オセルタミビルの単独投与と比較して生存率やウイルス力価、サイトカインレベルなどの観点での治療効果の改善は見られなかったとの報告がある（Fage C, et al., J med Virol. 2017; 89(12):2239-43）。
【０００７】
さらに、インフルエンザウイルスとは異なり、一部のコロナウイルスがヒトに対して種々の疾患症状を引き起こすことが知られている。そのような病原性のコロナウイルスとしては、風邪症候群を引き起こすヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１のほか、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を引き起こすＳＡＲＳ−ＣｏＶ、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）を引き起こすＭＥＲＳ−ＣｏＶ、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ−１９）を引き起こす２０１９新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）などが知られている。しかしながら、これらのコロナウイルスに対しても、１５員環マクロライド系抗生物質が有効に作用することは知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ウイルスは一般に、容易に構成タンパク質のアミノ酸変異を起こし、場合によっては薬の効かない薬剤耐性ウイルスへと変異することが知られている。そして、かような薬剤耐性ウイルスの出現は、臨床上深刻な問題となりうる。実際、上述したMatsuzaki Y, et al., Virol J. 2010; 7:53、Dong G, et al., PloS One. 2015; 10(3):e0119115でも報告されているように、薬剤耐性ウイルスの出現は現実的な脅威として存在している。
【０００９】
そこで本発明は、インフルエンザ感染症またはコロナウイルス感染症を予防および／または治療するのに有効に用いられうる新規な医薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上述した従来技術に鑑み、鋭意研究を行った。その過程で、驚くべきことに、いくつかの化合物が、抗インフルエンザウイルス作用を示すことを見出した。そして、この知見に基づいて、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明の第１の形態によれば、下記の化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物を有効成分として含有する、抗インフルエンザウイルス剤が提供される。
【００１２】
【化１】
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【００１３】
また、本発明の第２の形態によれば、上記の化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物を有効成分として含有する、インフルエンザウイルス感染症の予防および／または治療剤が提供される。
【００１４】
さらに、本発明の第３の形態によれば、上記の化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物、および薬学的に許容される担体を含有する、インフルエンザウイルス感染症の予防および／または治療用医薬組成物が提供される。
【００１５】
また、本発明の第４の形態によれば、上記の化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物の有効量を、必要とする患者に投与することを含む、インフルエンザウイルス感染症の予防および／または治療方法が提供される。
【００１６】
さらに、本発明の第５の形態によれば、インフルエンザウイルス感染症の予防および／または治療剤の製造のための、上記の化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物の使用が提供される。
【００１７】
また、本発明の第６の形態によれば、上記の化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物を有効成分として含有する、２０１９新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）感染症等のコロナウイルス感染症の予防および／または治療剤が提供される。
【００１８】
さらに、本発明の第７の形態によれば、上記の化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物の有効量を、必要とする患者に投与することを含む、２０１９新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）感染症等のコロナウイルス感染症の予防および／または治療方法が提供される。
【００１９】
そして、化合物１〜化合物４のうち、化合物２〜化合物４は、新規化合物であることも判明した。したがって、本発明の他の形態によれば、後述する化学式（１）で表される化合物またはその塩もしくは水和物もまた提供され、これらの化合物等を有効成分として含有する、抗インフルエンザウイルス剤または抗コロナウイルス剤等の医薬もまた、提供される。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、インフルエンザ感染症またはコロナウイルス感染症の予防および／または治療に有効に用いられうる新規な医薬が提供されうる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、Ａ５４９細胞にヒトインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスを感染させたところへ、４つの異なる条件下でアジスロマイシン（ＡＺＭ）を投与した後の培養液中のウイルス力価（図１ａ）およびウイルスのマトリックスタンパク質１（Ｍ１）遺伝子の細胞中での発現レベル（図１ｂ）を、それぞれウイルスプラークアッセイおよび定量的ＰＣＲ法により測定した結果を示すグラフである。
【図２】図２ａは、感染と同時の処理により、Ａ５４９細胞に感染した子ウイルスの増殖に対するＡＺＭのＩＣ５０値を算出した結果を示すグラフである。図２ｂは、ＡＺＭが宿主であるＡ５４９細胞に対して毒性を示す濃度を決定するため、広範な濃度範囲のＡＺＭを用い、非感染条件下または感染条件下においてＭＴＴアッセイを行った結果を示すグラフである。
【図３】図３は、Ａ５４９細胞中のウイルスＭ１遺伝子の発現状態に基づきＩＣ５０値を算出した結果を示すグラフである。
【図４】図４は、ヘマグルチニン阻害アッセイにより、ウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）と赤血球（ＲＢＣ）上のシアル酸（ＳＡ）との結合をＡＺＭが阻害するかどうかを調べた結果を示す写真およびグラフである。
【図５】図５は、ウイルスの感染における接着段階（図５ａ）または内部移行段階（図５ｂ）に対するアジスロマイシン（ＡＺＭ）の効果を測定することを目的として、Ａ５４９細胞に感染したウイルスの接着段階または内部移行段階にＡＺＭをインキュベートした後、Ａ５４９細胞から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し、ウイルスのＭ１および核タンパク質（ＮＰ）の発現レベルを定量的ＰＣＲ法により測定した結果を示すグラフである。
【図６】図６は、ＡＺＭがウイルスの感染および子ウイルスの増殖の繰り返しサイクルを阻害しうるとの仮説を実証することを目的として行った実験の結果を示すグラフである。図６ａおよび図６ｂは、Ａ５４９細胞にインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスを感染させ、細胞をＡＺＭの存在下または不存在下で１０時間培養し、培養液中の子ウイルスの力価および宿主細胞におけるウイルスのＭ１の発現レベルがＡＺＭの存在下と不存在下で同等レベルであることをそれぞれ確認したグラフである。また、図６ｃは、発芽子ウイルスを含有する培養上清を回収し、これを新たに調製したＡ５４９細胞にＡＺＭの存在下または不存在下で感染させ、ウイルスに感染したＡ５４９細胞をＡＺＭ無添加の培地中で７時間培養した後に、子ウイルスを含有する培地中で培養されたＡ５４９細胞におけるＭ１発現レベルをＡＺＭの存在下と不存在下で比較した結果を示すグラフである。
【図７】図７ａは、マウスにインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスを経鼻的に感染させた手法を示すプロトコールである。図７ｂは、アジスロマイシン（ＡＺＭ）のマウスへの経鼻投与後の肺組織から抽出した全ＲＮＡからウイルスのＭ１およびＮＰ遺伝子の発現レベルを定量的ＰＣＲ法により測定した結果を示すグラフである。また、図７ｃは、この実験におけるマウスの直腸体温および体重を比較したグラフである。
【図８】図８は、アジスロマイシン（ＡＺＭ）および化合物２〜化合物４、並びに陰性対照として化合物５〜化合物７（化合物５および化合物６は弱い抑制活性を有するが）を用いて、図１ａの「感染と同時の処理」に示したのと同様の実験を行った結果を示すグラフである。
【図９】図９ａ〜図９ｃは、Ａ５４９細胞にヒトインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスを感染させたところへ、４つの異なる条件下で化合物２〜化合物４をそれぞれ投与した後の培養液中のウイルス力価をウイルスプラークアッセイにより測定した結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、図８において抗インフルエンザウイルス活性を示した化合物２〜化合物４を用いて、図２ａに示したのと同様の実験を行い、ＩＣ５０値を測定した結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、図８において抗インフルエンザウイルス活性を示した化合物２〜化合物４を用いて、図２ｃに示したのと同様の実験（ＭＴＴアッセイ）を行った結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ヘマグルチニン阻害アッセイにより、ウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）と赤血球（ＲＢＣ）上のシアル酸（ＳＡ）との結合を化合物２〜化合物４が阻害するかどうかを調べた結果を、図４に示すＡＺＭの結果と併せて示した写真およびグラフである。
【図１３】図１３は、ウイルスの感染における接着段階（図１３ａ）または内部移行段階（図１３ｂ）に対する化合物２〜化合物４の効果を測定することを目的として、Ａ５４９細胞に感染したウイルスの接着段階または内部移行段階に各化合物をインキュベートした後、Ａ５４９細胞から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し、ウイルスのＭ１の発現レベルを定量的ＰＣＲ法により測定した結果を、図５に示すＡＺＭの結果と併せて示したグラフである。
【図１４】図１４は、アジスロマイシン（ＡＺＭ）について、投与薬剤の濃度を２００μＭからＡＺＭのＩＣ５０である６８μＭに変更したこと以外は、図１に示した実験と同様の手法により、クラリスロマイシン（ＣＡＭ）との対比実験を行った結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の第１の形態は、上記の化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物を有効成分として含有する、抗インフルエンザウイルス剤である。また、本発明の第２の形態は、上記の化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物を有効成分として含有する、インフルエンザウイルス感染症の予防および／または治療剤である。上述したように、上記の有効成分がインフルエンザウイルス感染症の予防および／または治療に有効であるという知見はこれまで存在せず、本願の発明者らによって初めて見出された新規な知見である。
【００２３】
本発明の第１および第２の形態に係る剤の有効成分は、上記の化合物１〜化合物４からなる群から選択される１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物であり、これらのうち１種または２種以上が用いられる。これらのうち、化合物１は「アジスロマイシン」として知られる１５員環マクロライド化合物である。日本では、アジスロマイシン水和物が「ジスロマック（登録商標）」の商品名で上市されており、その適応症は深在性皮膚感染症、リンパ管・リンパ節炎、咽頭・喉頭炎、扁桃炎、急性気管支炎、肺炎などである。ただし、アジスロマイシンが抗インフルエンザウイルス作用を有することは知られていない。なお、上記の化合物１〜化合物４の塩の例としては、アミノ基等の任意のカチオン性基が任意のアニオンと塩形成したものが挙げられる。また、上記の化合物１〜化合物４の水和物における水和水の数は特に制限されず、安定に存在しうる形態の水和物であればよい。
【００２４】
化合物１〜化合物４のうち、抗インフルエンザウイルス活性の観点からは、化合物１（ＡＺＭ）、化合物３または化合物４が好ましく用いられ、化合物１（ＡＺＭ）または化合物３がより好ましく用いられ、化合物１（ＡＺＭ）が特に好ましく用いられる。
【００２５】
本発明に係る抗インフルエンザウイルス剤が対象とするインフルエンザウイルスの種類について特に制限はなく、従来公知のインフルエンザウイルスや、将来的に発生する可能性のある新型のインフルエンザウイルスを対象としてもよい。なかでも、Ａ型インフルエンザウイルスを対象とすることが好ましく、Ｈ１Ｎ１型ウイルスを対象とすることが好ましく、２００９年にパンデミックをもたらした新型インフルエンザウイルスであるヒトインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスを対象とすることが最も好ましい。さらに言えば、今後流行する可能性のある新型インフルエンザウイルスをも対象とすることが好ましい。
【００２６】
また、上述した新規な知見に基づき、本発明によれば、上述した抗インフルエンザウイルス剤と同様に、抗コロナウイルス剤も提供される。具体的には、まず、上記の化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物を有効成分として含有する、２０１９新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）感染症等のコロナウイルス感染症の予防および／または治療剤（第６の形態）が提供される。同様に、本発明によれば、上記の化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物の有効量を、必要とする患者に投与することを含む、２０１９新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）感染症等のコロナウイルス感染症の予防および／または治療方法（第７の形態）もまた、提供される。
【００２７】
本発明に係る抗コロナウイルス剤が対象とするコロナウイルスの種類について特に制限はなく、従来公知のコロナウイルスや、将来的に発生する可能性のある新型のコロナウイルスを対象としてもよい。そのような病原性のコロナウイルスとしては、風邪症候群を引き起こすヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１のほか、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を引き起こすＳＡＲＳ−ＣｏＶ、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）を引き起こすＭＥＲＳ−ＣｏＶ、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ−１９）を引き起こす２０１９新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）などが挙げられる。なかでも、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、ＭＥＲＳ−ＣｏＶまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を対象とすることが好ましく、２０１９〜２０２０年にパンデミックをもたらした新型コロナウイルスであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を対象とすることが最も好ましい。さらに言えば、今後流行する可能性のある新型コロナウイルスをも対象とすることが好ましい。
【００２８】
本発明の第１の形態に係る抗インフルエンザウイルス剤や、第２の形態に係るインフルエンザウイルス感染症の予防および／または治療剤、本発明の第６の形態に係るコロナウイルス感染症の予防および／または治療剤は、インフルエンザウイルスまたはコロナウイルスに感染した患者、または感染する（した）虞のある者に投与するためのものである。一般に、感染患者は、くしゃみ、鼻水、鼻づまり、咳、痰、悪寒、発熱、頭痛、咽頭痛等の症状を示すことから、本発明の剤に加えて、対症療法薬を併せて投与（併用）してもよい。また、併用するだけでなく、本発明の剤に配合して合剤（組成物）とすることも可能である。
【００２９】
本発明の剤とともに投与可能な対症療法薬の一例としては、アスピリン、アスピリンアルミニウム、サザピリン、エテンザミド、サリチルアミド、イブプロフェン、アセトアミノフェン、イソプロピルアンチピリン等の解熱鎮痛薬；カフェイン、無水カフェイン、安息香酸ナトリウムカフェイン等の中枢神経興奮薬；ブロムワレリル尿素、アリルイソプロピルアセチル尿素等の鎮静剤；マレイン酸クロルフェニラミン、ジフェンヒドラミン、サリチル酸ジフェンヒドラミン、フマル酸クレマスチン、マレイン酸カルビノキサミン、メキタジン、酒石酸アリメマジン、塩酸ジフェニルピラリン、塩酸トリプロリジン等の抗ヒスタミン薬；塩化リゾチーム、ブロメライン、セラペプターゼ、セミアルカリプロティナーゼ、グリチルリチン酸、グリチルリチン酸ジカリウム、グリチルリチン酸アンモニウム、グリチルレチン酸、アズレンスルホン酸ナトリウム等の抗炎症薬；リン酸ジヒドロコデイン、リン酸コデイン、塩酸ノスカピン、ノスカピン、臭化水素酸デキストロメトルファン、デキストロメトルファンフェノールフタリン塩、リン酸ジメモルファン、ヒベンズ酸チペピジン、クエン酸チペピジン、塩酸エプラジノン、メチルエフェドリン、塩酸メチルエフェドリン、塩酸メトキシフェナミン、塩酸トリメトキノール、塩酸フェニルプロパノールアミン等の鎮咳薬；塩酸Ｌ−エチルシステイン、グアヤコールスルホン酸カリウム、クレゾール酸カリウム、グアイフェネシン、塩酸ブロムヘキシン、カルボシステイン等の去痰薬；テオフィリン、アミノフィリン、ジプロフィリン等の気管支拡張薬；ベラドンナ（総）アルカロイド、ベラドンナエキス、ヨウ化イソプロパミド、臭化水素酸スコポラミン、ロートエキス、臭化ブチルスコポラミン、臭化メチルベナクチジウム、臭化チメピジウム、ピレンゼピン等の抗アセチルコリン剤；セチルピリジニウム、塩化セチルピリジニウム、ポピドンヨード、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化デカリニウム、チモール、ヨウ素・ヨウ化カリウム、フェノール、塩酸クロルヘキシジン、クレオソート、塩化ベンゼトニウム等の殺菌消毒剤；塩酸ジブカイン、アミノ安息香酸エチル、リドカイン、塩酸リドカイン、オキセサゼイン等の局所麻酔剤；ビタミンＡ、肝油、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、アスコルビン酸カルシウム、ビタミンＤ、ビタミンＥ、コハク酸トコフェロールカルシウム等のビタミン剤；パントテン酸、パンテノール、パントテン酸ナトリウム、パントテン酸カルシウム、パンテチン、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、グルクロン酸、グルクロノラクトン、アミノエチルスルホン酸、ビオチン、γ−オリザノール等の代謝性成分；地黄、ケイヒ、ゴオウ、ショウキョウ、キキョウ、マオウ、カンゾウ、キョウニン、ハンゲ、シャゼンソウ、セネガ、サイコ、ブクリョウ、シンイ等の生薬およびこれら生薬の抽出物（エキス、チンキ等）等が挙げられるが、これらに限定されない。対症療法薬は、単一成分を配合してもよく、２種以上のものを組み合わせて併用、配合してもよい。
【００３０】
本発明に係る剤の投与経路としては、全身投与または局所投与のいずれも選択されうる。この際、疾患・症状などに応じた適当な投与経路が選択される。本発明に係る剤は、経粘膜投与としての鼻腔経路、経口経路、非経口経路のいずれによっても投与されうる。非鼻腔経路および非経口経路としては、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内などへの投与が挙げられる。さらに、経皮投与を実施することも可能である。好ましくは鼻腔内投与が採用されうる。
【００３１】
本発明に係る剤の剤形は、特に限定されず、種々の剤形、例えば、経鼻投与のためのエアゾール剤、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、またはエリキシル剤とすることができる。非経口剤としては、例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、または腹腔内注射剤などの注射剤；経皮投与または貼付剤、軟膏またはローション；口腔内投与のための舌下剤、口腔貼付剤；並びに坐剤とすることができるが、これらに限定されない。これらの製剤は、製剤工程において通常用いられる公知の方法により製造することができる。また本発明に係る薬剤は、持続性または徐放性剤形であってもよい。
【００３２】
経鼻投与のためのエアゾール剤を調製する場合は、滑沢剤、結合剤、保存剤、防腐剤、矯臭剤、賦形剤等を加えることができる。例えば、滑沢剤としてタルク、ステアリン酸およびナトリウム塩、カルシウム塩などの塩、カープレックス等、結合剤としてデンプン、デキストリン等、ｐＨ調節剤としてクエン酸、グリシン等、保存剤としてアスコルビン酸等、防腐剤としてパラオキシ安息香酸エステル類、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クロロブタノール等、矯臭剤としてメントール、カンキツ香料等、賦形剤として酢酸セルロース等が挙げられる。
【００３３】
経口用固形製剤を調製する場合は、有効成分に対して、賦形剤および必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、および矯臭剤などを加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、およびカプセル剤などを製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、および珪酸などを、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、およびポリビニルピロリドンなどを、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、および乳糖などを、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、およびポリエチレングリコールなどを、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、および酒石酸などを例示することができる。
【００３４】
経口用液体製剤を調製する場合は、有効成分に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、および矯臭剤などを加えて常法により内服液剤、シロップ剤、およびエリキシル剤などを製造することができる。この場合矯味剤としては上述したものが用いられうる。また、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウムなどが、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、およびゼラチンなどが挙げられる。
【００３５】
注射剤を調製する場合は、有効成分にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、および局所麻酔剤などを添加し、常法により皮下、筋肉内および静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のｐＨ調節剤および緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、およびリン酸ナトリウムなどが挙げられる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、およびチオ乳酸などが挙げられる。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、および塩酸リドカインなどが挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウムおよびブドウ糖などが例示されうる。
【００３６】
坐剤を調製する場合は、有効成分に対して、当業界において公知の製剤用担体、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、および脂肪酸トリグリセライドなどを、さらに必要に応じてＴｗｅｅｎ（登録商標）のような界面活性剤などを加えた後、常法により製造することができる。
【００３７】
軟膏剤を調製する場合は、有効成分に通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、および保存剤などが必要に応じて配合され、常法により混合などにより、製剤化される。基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、およびパラフィンなどが挙げられる。保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、およびパラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。
【００３８】
貼付剤を調製する場合は、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、およびペーストなどを常法により塗布すればよい。支持体としては、綿、スフ、および化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、およびポリウレタンなどのフィルムまたは発泡体シートが適当である。
【００３９】
本発明に係る剤に含有される有効成分の量は、当該有効成分の用量範囲や投薬の回数などにより適宜決定されうる。
【００４０】
用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断などに応じて適宜設定されうる。一般的に適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１回〜数回に分けて投与することができる。
【００４１】
他の観点から、本発明に係る剤の有効成分として上述した化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物は、インフルエンザウイルス感染症またはコロナウイルス感染症を予防および／または治療する方法において用いられうる。このような方法は、例えば、上述した有効成分を薬学的に許容される担体とともに含む医薬組成物を適当な投与経路で対象（患者）に投与することにより実施されうる。この際の投与経路や投与量（有効量）は、上述した薬剤に関する説明および本願の出願時における技術常識を参酌することにより、当業者が適宜設定することが可能である。さらに他の観点から、上述した化合物１〜化合物４からなる群から選択される１種または２種以上の１５員環マクロライド化合物またはその塩もしくは水和物は、インフルエンザウイルス感染症またはコロナウイルス感染症の予防および／または治療剤の製造にも用いられうる。
【００４２】
上述した化合物１〜化合物４で表される１５員環マクロライド化合物またはその塩若しくは水和物の入手経路について特に制限はなく、市販品が入手可能である場合には当該市販品を購入してもよいし、従来公知の知見を参照しつつ自ら合成してもよい。ここで、上述したように、化合物１〜化合物４のうち、化合物２〜化合物４は、本願において初めて提供される新規な化合物である。本発明によれば、これらの化合物２〜化合物４を含む新規化合物として、下記の化学式（１）で表される化合物またはその塩もしくは水和物が提供される。
【００４３】
【化２】
2020196704.tif 000004
【００４４】
上記化学式（１）において、Ｘは、水素原子または炭素原子数１〜４のアシル基を表す。ここで、炭素原子数１〜４のアシル基としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基が挙げられる。なかでも、Ｘとしては水素原子、アセチル基またはプロピオニル基が好ましく、水素原子またはアセチル基が特に好ましい。
【００４５】
上記化学式（１）において、Ｙ１は、水素原子もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＨ（ここで、ｎは１〜４の整数である）で表される基を表す。ここで、Ｙ１が−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＨで表される基である場合、ｎは１〜３の整数であることが好ましく、ｎは１または２であることがより好ましく、ｎは１であることが特に好ましい。また、抗インフルエンザウイルス活性の観点から、Ｙ１は水素原子であることが最も好ましい。
【００４６】
上記化学式（１）において、Ｙ２およびＹ３は、水素原子もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＨ（ここで、ｎは１〜４の整数である）で表される基を表すか、あるいは一緒になって下記化学式（２）で表される基を形成する。化学式（１）は、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＨ（ここで、ｎは１〜４の整数である）で表される基または化学式（２）で表される基のいずれか一方を１つ含む。ここで、Ｙ２またはＹ３が−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＨで表される基である場合、ｎは１〜３の整数であることが好ましく、ｎは２または３であることがより好ましく、ｎは３であることが特に好ましい。
【００４７】
【化３】
2020196704.tif 000005
【００４８】
ここで、上記化学式（２）において、＊は結合部位を表す。なかでも、抗インフルエンザウイルス活性の観点から、Ｙ２およびＹ３は、一緒になって上記化学式（２）で表される基を形成していることが好ましく、一方が−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＨで表される基で他方が水素原子であることがより好ましく、Ｙ２が−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＨで表される基でＹ３が水素原子であることがより好ましい。
【００４９】
以下では、化学式（１）で表される化合物を製造するための手法の一例について、簡単に説明する（後述する製造例を参照）。
【００５０】
化学式（１）で表される化合物のうち、例えば化合物４のようにＹ２が−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＨで表される基でＹ３が水素原子である化合物は、化合物１（ＡＺＭ）や化合物１においてＹ１がアシル化された化合物に加熱還流条件下でＯ＝Ｃ＝Ｎ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＨで表されるイソシアネート化合物を反応させることによって合成することができる。なお、Ｏ＝Ｃ＝Ｎ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＨで表されるイソシアネート化合物は、対応するカルボン酸であるＨＯ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＨを塩基性条件下で加熱還流しながらジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）と反応させることで、酸アジドを経由して得ることができる。
【００５１】
また、化合物３のようにＹ２およびＹ３が一緒になって化学式（２）で表される基を形成している化合物は、化合物１（ＡＺＭ）や化合物１においてＸがアシル化された化合物に加熱還流下でトリメチルボロジンを反応させることにより合成することができる。そして、このようにして得られたＹ２およびＹ３が一緒になって化学式（２）で表される基を形成している化合物をさらに原料として用い、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）およびプロパルギルアミン等のアルキニルアミンと順に反応させることによって、Ｙ１に−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＨで表される基を導入することができる。その後、シリカの存在下で加熱することにより、Ｙ２およびＹ３をヒドロキシ基へと変換することもできる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例等により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらに限定されない。
【００５３】
≪製造例≫
［製造例１：５−（１−ペンタニル）イソシアネート（１）の合成］
【００５４】
【化４】
2020196704.tif 000006
【００５５】
５−ヘキサン酸（６００ｍｇ、５．３５ミリモル）のベンゼン（２６．８ｍＬ）溶液に、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）（１．１９ｍＬ、５．５１ミリモル）およびＴＥＡ（０．７７ｍＬ、５．５１ミリモル）を添加した。８５℃にて２時間撹拌後、反応混合物を室温まで冷却して、ベンゼン中の粗生成物（１）（約０．１８Ｍ）を得た。この溶液を精製することなく次の工程に使用した。
【００５６】
［製造例２：化合物４の合成］
【００５７】
【化５】
2020196704.tif 000007
【００５８】
粗５−（１−ペンタニル）イソシアネート（１）（〜４．４０ミリモル）のベンゼン溶液（約０．１８Ｍ）に、アジスロマイシン（ＡＺＭ）（３．０ｇ、４．０１ミリモル）を室温で加え、反応混合物を８０℃まで加温した。１０５分間撹拌後、反応混合物を室温まで冷却し、次いで飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（５０ｍＬ）を添加してクエンチし、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２８ｍＬ）を用いてｐＨ７．０まで中和した。この混合物を酢酸エチル（８０ｍＬ×２）を用いて抽出し、有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４を用いて乾燥し、ろ過し、濃縮した。
【００５９】
粗生成物をシリカゲルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ３＝２０／１／０．１）により精製して、無色固体である化合物４（１．４２ｇ，４１％）を得た。
【００６０】
【化６】
2020196704.tif 000008
【００６１】
［製造例３：化合物３の合成］
【００６２】
【化７】
2020196704.tif 000009
【００６３】
２’−Ｏ−Ａｃ−ＡＺＭについては、既報（Eur. J. Med. Chem. 2009, 44, 4010-4020）に従って合成した。
【００６４】
２’−Ｏ−Ａｃ−ＡＺＭ（２．２０ｇ、２．７８ミリモル）の溶液に、トリメチルボロジン（０．０５５ｍＬ、０．３９１ミリモル）を室温で添加し、反応混合物を１２０℃まで加温した。２時間撹拌後、混合物を室温まで冷却し、次いで減圧下で濃縮してほぼ純粋な生成物（化合物３）（２．２７ｇ、当量）を無色粉末として得た。
【００６５】
【化８】
2020196704.tif 000010
【００６６】
［製造例４：化合物２の合成］
【００６７】
【化９】
2020196704.tif 000011
【００６８】
化合物３（２．２７ｇ、２．７８ミリモル）のＴＨＦ（２８．０ｍＬ）溶液に、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（３．０ｇ、８．３４ミリモル）を室温で添加し、反応混合物を６０℃まで加温した。２時間４５分間撹拌後、反応混合物にプロパルギルアミン（１．８ｍＬ、２７．８ミリモル）を添加し、得られた混合物をさらに６０℃にて２４時間撹拌した。次いで、この混合物を室温まで冷却し、減圧下で濃縮して粗生成物を得て、これを精製することなく次の工程に用いた。
【００６９】
粗生成物のＭｅＯＨ（２８．０ｍＬ）溶液に、ＳｉＯ２（２．８ｇ）を添加した。この混合物を５０℃まで加温し、２１時間撹拌し、次いで室温まで冷却した。このＭｅＯＨ溶液を濃縮し、残渣をシリカゲルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ３＝６０／１／０．１から１０／１／０．１）により精製して、無色固体である化合物２（１．２ｇ、３工程で５２％）を得た。
【００７０】
【化１０】
2020196704.tif 000012
【００７１】
［統計解析］
すべての実験データについては、ＧｒａｐｈＰｒｉｓｍ７．０２を用いて、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定（ＭＷＵ）、一元配置（ｏｎｅ−ｗａｙ）または二元配置（ｔｗｏ−ｗａｙ）の分散分析（ＡＮＯＶＡ）により解析した。
【００７２】
≪アジスロマイシン（ＡＺＭ）を用いた実験手法≫
［マクロライド化合物の入手経路］
すべての実験について、アジスロマイシン無水物（ＡＺＭ）は、東京化成工業株式会社より購入したものを用いた。
【００７３】
［細胞培養］
ヒト肺癌（Ａ５４９）細胞およびＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞を３７℃にて、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、２０μＭ／ｍＬ  Ｌ−グルタミンおよび１００μｇ／ｍＬのペニシリンおよびストレプトマイシンが添加されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）または最小必須培地（ＭＥＭ）（シグマライフサイエンス社）中で１００％コンフルエントまで培養した。
【００７４】
［インフルエンザウイルス］
ヒトインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（Ａ／カリフォルニア／７／２００９（Ｈ１Ｎ１））ウイルスとしては、国立大学法人千葉大学および株式会社Ａ−ＣＬＩＰ研究所が管理しているウイルスを使用した。このウイルスをＭＤＣＫ細胞に感染させ、２４時間培養した。次いで、後述するウイルスプラークアッセイにより培養液中のウイルス力価を測定し、使用するまで小分け分取して−８０℃または−１５０℃にて保存しておいた。
【００７５】
（Ａ）宿主細胞に感染させる場合のインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスの調製
−８０℃または−１５０℃にて保存しておいたインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスを融解して、必要な力価量のウイルスをヒト肺癌（Ａ５４９）細胞に感染させた。
【００７６】
（Ｂ）マウスに適合するインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスの調製
インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスを、イソフルランで麻酔した８週齢の雌マウスに１×１０４プラーク形成単位（ｐｆｕ）のヒトインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスを経鼻的に感染させた。４日後、肺組織を１．５ｍＬリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中でホモジナイズした。８０００ｒｐｍで５分間スピンダウンした後、上清を回収し、次回継代用の初回継代ウイルスとして、２％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で３回希釈した。３０μＬのアリコートを２回目の接種に用い、上記のマウスに継代する工程を１０回繰り返した。最後に継代したウイルスをマウス適合ウイルスとして以下の動物実験に用いた。
【００７７】
［宿主細胞におけるウイルス感染に対する異なるアジスロマイシン処理］
ＡＺＭをエタノール中に溶解させ、ＤＭＥＭ中のエタノールの最終濃度を０．２％に調整した。６ウェルプレート中のコンフルエントの単層Ａ５４９細胞に、ヒトインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスを、感染多重度（ＭＯＩ）１で以下の４つの異なる処理条件下で感染させた。ＡＺＭの濃度は２００μＭとした。
（ｉ）感染後の処理：Ａ５４９細胞にウイルスを３５℃にて１時間感染させた。感染後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＡＺＭ添加またはＡＺＭ無添加の補充ＤＭＥＭ培地２ｍＬ中、３７℃にて４８時間培養した。
（ｉｉ）細胞の前処理：３００μＬのＡＺＭ添加またはＡＺＭ無添加の非補充ＤＭＥＭ培地を用いて宿主細胞を３７℃にて１時間前処理した。培地を除去した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、これにウイルスを３５℃にて１時間感染させた。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＡＺＭ無添加の補充ＤＭＥＭ培地２ｍＬ中、３７℃にて４８時間培養した。
（ｉｉｉ）ウイルスの前処理：３００μＬのＡＺＭ添加またはＡＺＭ無添加の非補充ＤＭＥＭ培地を用いてウイルスを３７℃にて１時間前処理した。この前処理の後、Ａ５４９細胞にウイルスを３５℃にて１時間感染させた。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＡＺＭ無添加の補充ＤＭＥＭ培地２ｍＬ中、３７℃にて４８時間培養した。
（ｉｖ）感染と同時の処理：３００μＬのＡＺＭ添加またはＡＺＭ無添加の非補充ＤＭＥＭ培地とウイルスとを混合し、これを用いて速やかにＡ５４９細胞にウイルスを３５℃にて１時間感染させた。感染後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＡＺＭ添加またはＡＺＭ無添加の補充ＤＭＥＭ培地２ｍＬ中、３７℃にて４８時間培養した。
【００７８】
培養液中のウイルス力価およびウイルスのマトリックスタンパク質１（Ｍ１）遺伝子の細胞中での発現レベルを、それぞれウイルスプラークアッセイおよび定量的ＰＣＲ法により測定した。
【００７９】
［ウイルス力価評価法としてのプラークアッセイ］
コンフルエントの単層ＭＤＣＫ細胞に、各実験から回収した培養液を系列希釈したものを３５℃にて１時間感染させた。この培養液を除去した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．８％アガロース、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１５％炭酸水素ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２μｇ／ｍＬトリプシンおよび５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有するイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）でオーバーレイした。３７℃にて４８時間インキュベートした後、１０％ホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、次いで０．１％クリスタルバイオレット溶液を用いて染色してウイルスプラークを計数した。
【００８０】
［５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の算出］
上述した宿主細胞中のウイルス感染に対する異なるアジスロマイシン処理の欄に記載した手法（ｉｖ；感染と同時の処理）により、ウイルス増殖に対するＡＺＭの５０％阻害濃度を評価した。６００μＭまでの種々の濃度のＡＺＭを含有する非補充ＤＭＥＭ培地３００μＬにウイルスを予め混合しておき、これを速やかに宿主細胞であるＡ５４９細胞に３５℃にて１時間感染させた。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＡＺＭ無添加の補充ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて４８時間培養した。培養液中の子ウイルスの力価をウイルスプラークアッセイにより測定して、ＩＣ５０値を算出した。
【００８１】
［細胞毒性の評価］
Ａ５４９細胞に対するＡＺＭの細胞毒性を、細胞増殖キットＩ（ロシュ社）を用い、製造者の指示書に従ってＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド］アッセイにより評価した。６００μＭまでの種々の濃度のＡＺＭを含有し、ウイルス（１ＭＯＩ）が存在または不存在の非補充ＤＭＥＭ培地３００μＬ中で３５℃にて１時間細胞をインキュベートした。処理後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＡＺＭ無添加の補充ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて４８時間培養した。培地を除去し、ＭＴＴラベル化試薬（０．５ｍｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭを１ｍＬ添加して、３時間インキュベートした。次いで、可溶化溶液１ｍＬを添加して、３７℃にて１４時間インキュベートした。ｉＭａｒｋマイクロプレートリーダー（バイオラッド社）を用いた分光光度法により可溶化ホルマザン生成物を測定した。
【００８２】
［発芽子ウイルスに対するＡＺＭの阻害効果の評価］
インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルス（１ＭＯＩ）を、Ａ５４９細胞に３５℃にて１時間感染させ、ＡＺＭ（２００μＭ）の存在下または不存在下で培養した。１０時間培養後、細胞中でのウイルスの遺伝子発現および培養液中での発芽子ウイルスの力価を、それぞれ定量的ＰＣＲ法およびプラークアッセイにより測定した。子ウイルスを含有する培養液を回収したものを、新たに調製したＡ５４９細胞に、ＡＺＭの存在下または不存在下で３５℃にて１時間感染させた。感染後、ＡＺＭ無添加の補充培地中で細胞を３７℃にて７時間培養し、これをＭ１発現解析に供した。
【００８３】
［ヘマグルチニン阻害アッセイ］
新鮮な赤血球（ＲＢＣ）のＰＢＳ溶液（１％）をトリ全血（バイオテスト社）から調製した。インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスを系列希釈した溶液（６４０赤血球凝集単位（ＨＡＵ）／ｍＬ）２５μＬを、等体積のＰＢＳまたはＡＺＭ／エタノールのＰＢＳ溶液中で室温（２０〜２２℃）にて３０分間インキュベートした。１％ＲＢＣ溶液５μＬを添加し、次いで室温にて２０分間インキュベートした。赤血球凝集を観察することで、ウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）と赤血球（ＲＢＣ）上のシアル酸（ＳＡ）との結合をＡＺＭが阻害するかどうかを調べた。
【００８４】
［ウイルスの感染における接着段階または内部移行段階に対するＡＺＭの効果を測定するための阻害アッセイ］
接着段階のアッセイ：コンフルエントの単層Ａ５４９細胞を２００μＭのＡＺＭおよびウイルス（１ＭＯＩ）の混合物とともに４℃にて１時間インキュベートした。混合物を除去した後、宿主細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、全ＲＮＡを抽出した。
【００８５】
内部移行段階のアッセイ：Ａ５４９細胞をウイルス（１ＭＯＩ）とともに４℃にて１時間インキュベートした。細胞を温ＰＢＳで洗浄し、２００μＭのＡＺＭを含有する培地中で３７℃にて１時間培養した。インキュベートした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、プロテイナーゼＫ（富士フイルム和光純薬社）のＰＢＳ溶液（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）で３７℃にて５分間処理して細胞表面に残留しているウイルスを除去した。抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ウイルスのＭ１および核タンパク質（ＮＰ）の発現レベルを定量的ＰＣＲ法により測定した。
【００８６】
［定量的リアルタイムＰＣＲ］
ゲノムＤＮＡ除去剤を含有するＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡社）を用い、２０μＬの反応混合物中で全ＲＮＡ１μｇをｃＤＮＡへ逆転写した。得られたｃＤＮＡについては、ＰｏｗｅｒＵｐ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（サーモフィッシャサイエンティフィック社）を用いた定量的ＰＣＲ法によるウイルスの遺伝子発現解析に用いた。この際、ＰＣＲには下記の表１に示すプライマーセットを用い、以下の条件に従って実施した：５０℃で２分間、９５℃で２分間、「９５℃で１５秒間および６０℃で１分間」を４０サイクル。
【００８７】
【表１】
2020196704.tif 000013
【００８８】
［マウス］
インフルエンザウイルス感染の動物プロトコールについては、帝京大学のガイドラインに従い、帝京大学動物実験に関する倫理委員会の承認を受けた（ＡＵＰ番号：１６−０２１）。野生型の８週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスをＳＬＣ社より購入し、病原体フリーの環境で飼育した。
【００８９】
［動物の感染実験およびＡＺＭの投与］
ＡＺＭをエタノールに溶解させ、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）と混合して、総体積５０μＬに２００μｇのＡＺＭを含有する混合溶液を調製した。当該混合物中のエタノールの最終濃度は３％以内に調整した。麻酔したマウスに、３００ｐｆｕのマウス適合インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスを経鼻的に感染させた。感染の６時間後に、１つの群のマウスからすべての肺組織を切除してコントロール（未処理）とした。他の群のマウスには、感染の３日後に、イソフルラン麻酔下で１日１２時間間隔で２回、ＡＺＭ添加（１０ｍｇ／ｋｇ）または無添加の上記混合溶液を経鼻的に投与した。マウスの直腸体温および体重をモニターした。異なる時点において、処理したマウスからすべての肺組織を切除し、ビーズ細胞破砕機（ＭｉｃｒｏＳｍａｓｈＴＭ  ＭＳ−１００、トミー社）を用いてＲＮＡｉｓｏプラス溶液中でホモジナイズした。抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡプールを合成し、ウイルスのＭ１およびＮＰ遺伝子の発現レベルを定量的ＰＣＲ法により測定した。
【００９０】
≪実験結果≫
（ＡＺＭはウイルスとの直接的な相互作用によりインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスの活性を阻害する）
最も効果的な抗ウイルス活性を示すＡＺＭの処理条件を調べるため、４つの異なる処理条件で実験を行った。その結果、図１に示すように、感染後にＡＺＭを投与した場合には、コントロールと比較して同等レベルの培養液中の子ウイルス力価（図１ａ）および同等レベルの宿主細胞中のＭ１遺伝子発現レベル（図１ｂ）を示した。感染の１時間前にウイルスをＡＺＭで前処理した場合には、子ウイルスの力価およびＭ１発現が顕著に低下した。感染と同時にＡＺＭを投与した場合にも、子ウイルス力価はウイルスの前処理で観察されたのと同等のレベルまで顕著に低下した。これに対し、宿主であるＡ５４９細胞をＡＺＭで１時間前処理した場合には、コントロールと比較して子ウイルスの力価およびＭ１発現レベルの双方において顕著な相違が観察された。これらの結果から、ＡＺＭは感染の初期段階においてインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスと相互作用してウイルス活性を阻害することが示唆された。１時間の前処理および感染と同時のＡＺＭ処理はともに、子ウイルスの増殖に対して同等の阻害効果を示した。
【００９１】
（ＡＺＭはＩＣ５０範囲において宿主細胞に対して細胞毒性を示さない）
次いで、子ウイルスの増殖に対するＡＺＭのＩＣ５０値を算出した（図２）。ＡＺＭの投与により、培養液中へ放出される子ウイルスは用量依存的に減少し、平均ＩＣ５０は約６８μＭであった（図２ａ）。Ａ５４９細胞中のウイルスＭ１遺伝子の発現状態は、ウイルス力価の傾向と相関していた（図３）。
【００９２】
ＡＺＭが宿主であるＡ５４９細胞に対して毒性を示す濃度を決定するため、広範な濃度範囲のＡＺＭを用いてＭＴＴアッセイを行った（図２ｂ）。非感染条件下では、２００μＭ未満の濃度のＡＺＭと共培養を行っても有意な細胞毒性は観察されなかった（図２ｂ、左パネル）。同様に、感染条件下では、６００μＭのＡＺＭ濃度までＡ５４９細胞に対する毒性作用は観察されなかった（図２ｂ、右パネル）。これらの結果から、非感染状態および感染状態の双方において、ＩＣ５０の範囲内ではＡＺＭは宿主細胞の生存率に対して悪影響を及ぼすことはないことが示唆された。
【００９３】
（ＡＺＭは接着状態には影響しないが、ウイルスの内部移行に影響を及ぼす）
ＡＺＭの抗ウイルス活性のメカニズムを探るため、ウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）と赤血球表面のシアル酸とが結合する相互作用をＡＺＭが阻害するかどうかを調べた。図４上段に示す結果からわかるように、１／１６希釈されたウイルスでも赤血球凝集が観察されたが、この希釈範囲における赤血球凝集はＡＺＭが存在しても有意に阻害されることはなかった。このことから、ＡＺＭはウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）と細胞上のシアル酸（ＳＡ）受容体との結合活性に影響を及ぼすことはないことが示唆された。なお、図４下段のグラフは、図４上段の写真から赤血球凝集単位の数値としてグラフ化したものである。
【００９４】
また、ウイルスの接着および内部移行のプロセスに対するＡＺＭの阻害メカニズムを、宿主細胞におけるウイルス遺伝子の発現プロファイルに基づいて検討した（図５）。その結果、図５ａに示すように、感染と同時にウイルスをＡＺＭで処理した群において、細胞表面に接着したウイルスではＭ１およびＮＰの発現には変化が見られなかった。これに対し、ウイルスの接着後にＡＺＭを投与し、プロテイナーゼＫを用いてオーファンウイルスを除去した群では、宿主細胞におけるＭ１およびＮＰの発現が有意に減少した（図５ｂ）。これらの結果から、ＡＺＭはウイルスの結合活性には影響しないものの、ウイルスの侵入の初期段階における内部移行プロセスを阻害することが示唆された。また、ＡＺＭがこのようなメカニズムを介してインフルエンザウイルスに対して増殖抑制作用を示していることに鑑みると、同様のメカニズムによってコロナウイルスの増殖も同様な機構により抑制されることが示唆される。
【００９５】
（ＡＺＭは新たに産生された子ウイルスをも攻撃する）
感染時における親ウイルスの内部移行におけるＡＺＭの阻害作用から、ＡＺＭはウイルスの感染および子ウイルスの増殖の繰り返しサイクルを阻害しうるとの仮説を設定した。そして、この仮説を検証すべく、親ウイルスの一次感染および子ウイルスの二次感染の各時点でのウイルス量をＡＺＭの存在下で比較した（図６）。まず、宿主であるＡ５４９細胞にインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスを感染させ、細胞をＡＺＭの存在下または不存在下で１０時間培養した。この時点で、培養液中の子ウイルスの力価または宿主細胞におけるウイルスのＭ１の発現レベルはＡＺＭの存在下と不存在下で同等レベルであった（図６ａおよび図６ｂ）。この結果は、図１に示す結果と整合するものである。次いで、発芽子ウイルスを含有する培養上清を回収し、これを新たに調製したＡ５４９細胞にＡＺＭの存在下または不存在下で感染させた。次いで、ウイルスに感染したＡ５４９細胞をＡＺＭ無添加の培地中で７時間培養した。この時点で、子ウイルスおよびＡＺＭを含有する培地中で培養されたＡ５４９細胞におけるＭ１発現レベルは顕著に低下していた（図６ｃ）。これらの結果から、ＡＺＭは細胞外のウイルスが宿主細胞に侵入する際の内部移行を阻害しうるという上記仮説は実証された。
【００９６】
（感染したマウスにおけるウイルス量はＡＺＭの単回投与により減少した）
上述したインビトロでのＡ５４９細胞での結果を踏まえ、ＡＺＭをウイルスで感染させたマウスに（インビボで、経鼻的に）投与する実験を行った（図７ａ）。図７ｂに示すように、ＡＺＭ投与により、感染３日後の肺組織におけるウイルスのＭ１遺伝子およびＮＰ遺伝子の発現は減少する傾向が観察された。ウイルス発現の最大阻害は、ウイルスが劇的に増殖する感染２日後に観察された（図７ｂ）。ウイルスの投与によって引き起こされる体温の低下は３日後に顕著にあらわれ、ＡＺＭによって抑制された（図７ｃ）。一方、感染３日後の時点で感染したマウスの体重には影響が見られなかった（図７ｄ）。以上のことから、ＡＺＭを経鼻的に投与することで肺におけるウイルス量が減少し、これによってインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルス感染時の低体温が緩和されることが示された。
【００９７】
≪アジスロマイシン誘導体を用いた実験手法≫
上記で合成した化合物２〜化合物４を用いて、以下の実験を行った。なお、陰性対照として、以下の化合物５〜化合物７を用いた。
【００９８】
【化１１】
2020196704.tif 000014
【００９９】
具体的には、まず、図１ａの「感染と同時の処理」に示したのと同様の実験を行った。その結果、図８に示すように、化合物２〜化合物４で処理した場合にはＡＺＭと同様にして、子ウイルスの力価の顕著な低下が確認された。一方、化合物５〜化合物７で処理した場合には、化合物５および化合物６については弱い抑制活性を示したものの、化合物２〜化合物４ほど子ウイルスの力価は低下しなかった。また、図１ａに記載のその他の処理形態（感染後の処理、細胞の前処理およびウイルスの前処理）についても、化合物２〜化合物４を用いて同様の実験を行った。その結果、図９のａ〜ｃにそれぞれ示すように、化合物２〜化合物４のいずれを用いた場合であっても、ＡＺＭと同様にして、感染の１時間前にウイルスを化合物で前処理した場合（ウイルスの前処理）や、感染と同時に化合物を投与した場合（感染と同時の処理）に、子ウイルスの力価が顕著に低下した。これらの結果から、化合物２〜化合物４もまた、ＡＺＭと同様に感染の初期段階においてインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスと相互作用してウイルス活性を阻害することが示唆された。
【０１００】
また、化合物２〜化合物４を用いて、図２ａに示したのと同様の実験を行った。その結果、図１０の上段パネルに示すように、化合物２〜化合物４のウイルス力価に対するＩＣ５０値はそれぞれ、１３０μＭ、８４μＭおよび８４μＭと算出された。さらに、宿主細胞におけるＭ１遺伝子の発現レベルを指標として同様の実験を行った。その結果、図１０の下段パネルに示すように、化合物２〜化合物４のＭ１遺伝子発現レベルに対するＩＣ５０値はそれぞれ、１４０μＭ、１４０μＭおよび１１６μＭと算出された。
【０１０１】
また、上記で抗インフルエンザウイルス活性を示した化合物２〜化合物４を用いて、図２ｃに示したのと同様の実験（ＭＴＴアッセイ）を行った。その結果、図１１に示すように、感染条件下（上段パネル）および非感染条件下（下段パネル）の双方において、６００μＭのＡＺＭ濃度までＡ５４９細胞に対する毒性作用は観察されなかった。
【０１０２】
さらに、化合物２〜化合物４を用いて、図４に示したのと同様の実験（ヘマグルチニン阻害アッセイ）を行った。その結果を図４のＡＺＭの結果と併せて図１２に示す。図１２に示すように、化合物２〜化合物４についても、ＡＺＭと同様にして、１／１６希釈されたウイルスでも赤血球凝集が観察されたが、この希釈範囲における赤血球凝集はＡＺＭが存在しても有意に阻害されることはなかった。このことから、化合物２〜化合物４もまた、ウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）と細胞上のシアル酸（ＳＡ）受容体との結合活性に影響を及ぼすことはないことが示唆された。なお、図１２下段のグラフは、図１２上段の写真から赤血球凝集単位の数値としてグラフ化したものである。
【０１０３】
また、化合物２〜化合物４を用いて、図５に示したのと同様の実験（接着アッセイおよび内部移行アッセイ）を行った。ここで、図５に示したように、ＡＺＭはウイルスによる接着段階には影響を及ぼさずに内部移行（エンドサイトーシス）の段階を抑制していた。これに対し、図１３に示すように、化合物２〜化合物４はいずれも、ウイルスの内部移行（エンドサイトーシス）の段階を抑制することに加えて、接着段階に対しても阻害作用を示していることがわかる。このことから、化合物２〜化合物４に代表されるＡＺＭ誘導体は、ヘマグルチニンおよびシアル酸を介さないウイルス−宿主細胞の結合を阻害するメカニズムを有している可能性があることが示唆される。
【０１０４】
≪アジスロマイシン（ＡＺＭ）とクラリスロマイシン（ＣＡＭ）との対比実験≫
アジスロマイシン無水物（ＡＺＭ）について、投与薬剤の濃度を２００μＭからＡＺＭのＩＣ５０である６８μＭに変更したこと以外は、図１に示した実験と同様の手法により、クラリスロマイシン（ＣＡＭ）との対比実験を行った。その結果、図１４ａに示すように、感染の１時間前にウイルスをＡＺＭで前処理した場合および感染と同時にＡＺＭを投与した場合には、子ウイルスの力価が顕著に低下した。一方、クラリスロマイシン（ＣＡＭ）を投与した場合には、このような子ウイルスの力価の低下は観察されなかった（図１４ｂ）。なお、クラリスロマイシン（ＣＡＭ）をザナミビルと併用してもヒトインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスのインビトロでの複製を阻害しなかったとの報告もある（Ｌｅｅ  ＡＣＹ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．  ２０１８；  １６３：  ２３４９-２３５８）。これらのことから、クラリスロマイシン（ＣＡＭ）はヒトインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスの活性に影響を及ぼさず、当該ウイルスの内部移行に対する阻害作用も示さないことがわかる。
【０１０５】
本出願は、２０１９年５月２９日に出願された日本特許出願番号２０１９−１００６９１号に基づいており、その開示内容は、参照により全体として組み入れられている。
【配列表フリーテキスト】
【０１０６】
〔配列番号：１〕
インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスのマトリックスタンパク質１（Ｍ１）をコードする遺伝子を増幅するためのフォワードプライマーのＤＮＡ配列である。
【０１０７】
〔配列番号：２〕
インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスのマトリックスタンパク質１（Ｍ１）をコードする遺伝子を増幅するためのリバースプライマーのＤＮＡ配列である。
【０１０８】
〔配列番号：３〕
インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスの核タンパク質（ＮＰ）をコードする遺伝子を増幅するためのフォワードプライマーのＤＮＡ配列である。
【０１０９】
〔配列番号：４〕
インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスの核タンパク質（ＮＰ）をコードする遺伝子を増幅するためのリバースプライマーのＤＮＡ配列である。
【０１１０】
〔配列番号：５〕
マウスにおけるハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子を増幅するためのフォワードプライマーのＤＮＡ配列である。
【０１１１】
〔配列番号：６〕
マウスにおけるハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子を増幅するためのリバースプライマーのＤＮＡ配列である。
【０１１２】
〔配列番号：７〕
ヒトにおけるハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子を増幅するためのフォワードプライマーのＤＮＡ配列である。
【０１１３】
〔配列番号：８〕
ヒトにおけるハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子を増幅するためのリバースプライマーのＤＮＡ配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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