(57)【要約】      （修正有）【課題】一塩基多型（ＳＮＰ）およびインデルのようなＤＮＡ中のバリアントを検出する、より効率的で誤りが少ない方法の提供。【解決手段】ｒｈＰＣＲのためのブロックされた切断可能なプライマーであって、５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−３’［式中、Ａは、存在しても存在していなくてもよく、標的と相補的ではないテール伸長部であり；Ｂは、標的と相補的である配列ドメインであり；Ｃは、識別ドメインであり；Ｄは、標的とハイブリダイズしたときにＲＮアーゼＨ２によって切断可能である、切断可能なドメインであり；Ｅは、プライマーの伸長を阻止するブロッキングドメインである］を含む前記プライマー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｒｈＰＣＲのためのブロックされた切断可能なプライマーであって、
５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−３’
［式中、
Ａは、存在しても存在していなくてもよく、標的と相補的ではないテール伸長部であり；
Ｂは、標的と相補的である配列ドメインであり；
Ｃは、識別ドメインであり；
Ｄは、標的とハイブリダイズしたときにＲＮアーゼＨ２によって切断可能である、切断可能なドメインであり；
Ｅは、プライマーの伸長を阻止するブロッキングドメインである］
を含む前記プライマー。
【請求項２】
Ｄは１〜３個のＲＮＡ塩基で構成されている、請求項１に記載のプライマー。
【請求項３】
Ｄは１個のＲＮＡ塩基で構成されている、請求項１に記載のプライマー。
【請求項４】
切断ドメインは、以下の部分：ＤＮＡ残基、無塩基残基、改変されたヌクレオシド、または改変されたヌクレオチド間リン酸結合のうちの１つまたはそれ以上を含む、請求項１に記載のプライマー。
【請求項５】
配列に隣接する切断部位は、ヌクレアーゼ切断に耐性の１つまたはそれ以上のヌクレオシド間結合を含む、請求項４に記載のプライマー。
【請求項６】
ヌクレアーゼ耐性結合はホスホロチオエートである、請求項５に記載のプライマー。
【請求項７】
ＲＮＡ残基のうちの少なくとも１個の３’酸素原子は、アミノ基、チオール基、またはメチレン基で置換されている、請求項２に記載のプライマー。
【請求項８】
ブロッキング基は、プライマーの３’末端ヌクレオチドに結合される、請求項１に記載のプライマー。
【請求項９】
Ａは、ユニバーサルフォワードプライマーおよび場合によりプローブ結合ドメインと同一である領域で構成されている、請求項１に記載のプライマー。
【請求項１０】
標的ＤＮＡ配列におけるバリエーションを検出する方法であって、
（ａ）反応混合物を提供するステップであって、該反応混合物は、（ｉ）ブロッキング基の５’およびバリエーションの部位の３’に位置する切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマーであって、該ブロッキング基は、オリゴヌクレオチドプライマーの３’端の末端またはその近くに結合されており、プライマー伸長を阻止するおよび／またはプライマーがＤＮＡ合成のためのテンプレートとして働くのを阻害する、オリゴヌクレオチドプライマーと、（ｉｉ）標的配列を有していてもよいしまたは有していなくてもよい核酸サンプルであって、該標的配列は、バリエーションを有していてもよいしまたは有していなくてもよい、核酸サンプルと、（ｉｉｉ）切断酵素と、（ｉｖ）ポリメラーゼとを含む、ステップ；
（ｂ）プライマーを標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズさせて二本鎖基質を形成させるステップ；
（ｃ）プライマーがバリエーションにおいて相補的である場合に、ハイブリダイズしたプライマーを、切断ドメイン内のまたはそれに隣接した位置で切断酵素で切断して、ブロッ
キング基をプライマーから除去するステップ；および
（ｄ）プライマーをポリメラーゼで伸長させるステップ
を含む前記方法。
【請求項１１】
切断酵素は、耐熱性であり、より低い温度で低下した活性を有するホットスタート切断酵素である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
切断酵素は、耐熱性であり、より低い温度で低下した活性を有する化学的に改変されたホットスタート切断酵素である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ホットスタート切断酵素は、化学的に改変されたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉのＲＮアーゼＨ２である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
切断酵素は、耐熱性であり、より低い温度で低下した活性を有する、より低い温度で抗体との相互作用を通して可逆的に不活化されるホットスタート切断酵素である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
切断ドメインは、少なくとも１個のＲＮＡ塩基で構成されており、切断酵素は、バリエーションに相補的な部位と該ＲＮＡ塩基との間を切断する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
切断ドメインは、１個またはそれ以上の２’改変ヌクレオシドで構成されており、切断酵素は、バリエーションに相補的な部位と１個またはそれ以上の該改変ヌクレオシドとの間を切断する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
１個またはそれ以上の改変ヌクレオシドは、２’−フルオロヌクレオシドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ポリメラーゼは、高識別ポリメラーゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
ポリメラーゼは、変異型Ｈ７８４Ｑ  Ｔａｑポリメラーゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
変異型Ｈ７８４Ｑ  Ｔａｑポリメラーゼは、化学改変、アプタマー改変または抗体改変を介して可逆的に不活化される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
プライマーは、ユニバーサルプライマー配列および場合によりユニバーサルプローブ配列を含む５’テール配列を含み、該テールは、標的ＤＮＡ配列と非相補的である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
標的サンプルをジェノタイピングするためのオリゴヌクレオチド組成物であって、５’から３’に：
（ａ）標的サンプルと非相補的であるが、ユニバーサルフォワードプライマーと同一な第１の配列とアレルに対応するレポータープローブ配列と同一な第２の配列とを（５’から３’に）含む、テール部分と；
（ｂ）標的と相補的な領域と；
（ｃ）アレル特異的ドメインと；
（ｄ）ブロッキングドメインを含む３’末端領域と
を含む前記組成物。
【請求項２３】
アレル特異的ドメインは、標的サンプルとハイブリダイズしたときにＲＮアーゼＨ酵素
によって切断することができる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
アレル特異的ドメインは、５’−Ｄ−Ｒ−３’であり、式中、Ｄは、目的のＳＮＰ部位に位置合わせされるＤＮＡ塩基であり、Ｒは、ＲＮＡ塩基である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドは、約１５〜３０塩基長である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
ブロッキングドメインは、０〜５個のＤＮＡ塩基で構成されている、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２７】
ブロッキングドメインは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、１，３−プロパンジオール、ミスマッチしたＤＮＡまたはＲＮＡ、および標識部分のうちの少なくとも２つで構成されている、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２８】
アレル特異的ドメインは、２’−フルオロアナログで構成されている、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２９】
ジェノタイピングアッセイのためのキットであって、
（ａ）請求項２２に記載の通りに構成される第１のアレルオリゴヌクレオチドと；
（ｂ）請求項２２に記載の通りに構成される第２のアレルオリゴヌクレオチドと；
（ｃ）座位特異的リバースプライマーと；
（ｄ）ユニバーサルフォワードプライマーと；
（ｅ）ポリメラーゼと；
（ｆ）第１のアレルに対応する第１のプローブと；
（ｇ）第２のアレルに対応する第２のプローブと；
（ｈ）ＲＮアーゼＨ酵素と
を含む前記キット。
【請求項３０】
アレルの増幅プロットから複数の異なる蛍光シグナルを可視化する方法であって、
（ａ）単一の反応ウェル内の複数の蛍光色素シグナルから３つの蛍光シグナルを使用し、Ｄｙｅ１およびＤｙｅ２からの蛍光シグナルから、最も低い蛍光Ｄｙｅ３を減算するステップ；
（ｂ）方程式
【数１】
2020182493.tif 000022
を用いて、起点からのデータの距離と、軸のうちの１つからの角度とを算出するステップ、および
（ｃ）得られた距離を、各色素またはアレルにつき１つの計３つの軸を有する円プロット上にプロットするステップ
を含む前記方法。
【請求項３１】
標的濃縮の方法であって、
（ａ）反応混合物を提供するステップであって、該反応混合物は、（ｉ）標的配列と相補的でないテールドメインと、ブロッキング基の５’およびバリエーションの部位の３’に位置する切断ドメインとを有する第１のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該テー
ルドメインは、第１のユニバーサルプライマー配列を含み、該ブロッキング基は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’端の末端またはその近くに結合されており、プライマー伸長を阻止するおよび／または第１のプライマーがＤＮＡ合成のためのテンプレートとして働くのを阻害する、第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、（ｉｉ）標的配列を有するまたは有さない核酸サンプルと、（ｉｉｉ）切断酵素と、（ｉｖ）ポリメラーゼとを含む反応混合物を提供するステップ；
（ｂ）第１のプライマーを標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズさせて二本鎖基質を形成させるステップ；
（ｃ）第１のプライマーが標的と相補的である場合に、ハイブリダイズした第１のプライマーを、切断ドメイン内のまたはそれに隣接した位置で切断酵素で切断して、ブロッキング基を第１のプライマーから除去するステップ；および
（ｄ）第１のプライマーをポリメラーゼで伸長させるステップ
を含む前記方法。
【請求項３２】
方法は、第１のプライマー伸長産物のプライミングおよび伸長を支持するためのリバース方向の第２のプライマーをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第２のプライマーは、第２のユニバーサルプライマー配列を含むテールドメインをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
工程ｂ〜ｄは、１〜１０回実行される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
未伸長プライマーを反応物から除去することと、ユニバーサルプライマーを伸長産物にハイブリダイズさせて第２の伸長産物を形成することとをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ユニバーサルプライマーは、アダプター配列を第２の伸長産物に付加するためのテール付きの配列をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
シークエンシングは、標的の配列を決定するために第２の伸長産物上で行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
標的ＤＮＡ配列は、遺伝子編集酵素で処理されたサンプルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項３９】
標的ＤＮＡ配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素で処理されたサンプルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項４０】
標的ＤＮＡ配列は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１酵素で処理されたサンプルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項４１】
標的ＤＮＡ配列は、遺伝子編集酵素で処理されたサンプルである、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
標的ＤＮＡ配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素で処理されたサンプルである、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
標的ＤＮＡ配列は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１酵素で処理されたサンプルである、請求項３１に記載の方法。
【請求項４４】
切断酵素は、耐熱性であり、より低い温度で低下した活性を有するホットスタート切断酵素である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
切断酵素は、耐熱性であり、より低い温度で低下した活性を有する化学的に改変されたホットスタート切断酵素である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４６】
ホットスタート切断酵素は、化学的に改変されたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉのＲＮアーゼＨ２である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
切断酵素は、耐熱性であり、より低い温度で低下した活性を有する、より低い温度で抗体との相互作用を通して可逆的に不活化されるホットスタート切断酵素である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４８】
切断ドメインは、少なくとも１個のＲＮＡ塩基で構成されており、切断酵素は、バリエーションに相補的な部位と該ＲＮＡ塩基との間を切断する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４９】
切断ドメインは、１個またはそれ以上の２’改変ヌクレオシドで構成されており、切断酵素は、バリエーションに相補的な部位と１個またはそれ以上の該改変ヌクレオシドとの間を切断する、請求項３１に記載の方法。
【請求項５０】
１個またはそれ以上の改変ヌクレオシドは、２’−フルオロヌクレオシドである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ポリメラーゼは、高識別ポリメラーゼである、請求項３１に記載の方法。
【請求項５２】
ポリメラーゼは、変異型Ｈ７８４Ｑ  Ｔａｑポリメラーゼである、請求項３１に記載の方法。
【請求項５３】
変異型Ｈ７８４Ｑ  Ｔａｑポリメラーゼは、化学改変、アプタマー改変または抗体改変を介して可逆的に不活化される、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明を使用して、一塩基多型（ＳＮＰ）、多塩基多型（ＭＮＰ）、およびインデルのような、ＤＮＡにおけるバリアントを検出する、より効率的で誤りが少ない方法を提供することができる。本発明は、安価な多色アッセイを行うための方法も提供し、二次元プロットをもたらす複数のアレルを可視化するための方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮアーゼＨ２依存的ＰＣＲ（ｒｈＰＣＲ）（参照によって本明細書にその全体が組み入れられる特許文献１を参照されたい）および標準的なアレル特異的ＰＣＲ（ＡＳＰＣＲ）の両方は、変異検出に利用することができる。ＡＳＰＣＲでは、ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーの３’末端またはその近くにあるミスマッチの検出によってミスマッチ識別を行う。ＡＳＰＣＲは、ミスマッチ検出に成功する時もあるが、その識別は、野生型ＤＮＡポリメラーゼのミスマッチ検出能力が低いために限定される。
【０００３】
ＡＳＰＣＲとは対照的に、ｒｈＰＣＲにおけるＲＮアーゼＨ２酵素のミスマッチ感受性は、ＤＮＡ変異の高感度の検出、および反応物からのプライマーダイマー人為産物の除去の両方を可能にする。しかし、ｒｈＰＣＲでＤＮＡ変異の検出を試みるときには、プライマー内でのミスマッチの配置が重要である。ミスマッチの位置が、切断可能なＲＮＡに近ければ近いほど、ＲＮアーゼＨ２酵素からより多くの識別が認められ、得られたｒｈＰＣＲアッセイの識別がより大きくなる。Ｔａｑのような最も一般的な野生型ＤＮＡポリメラーゼは低レベルのミスマッチ検出を示すことが多いという事実を考慮に入れると、ＲＮアーゼＨ２切断後にポリメラーゼがこの識別を行うのを単独であてにすることはできない。標準ｒｈＰＣＲのすべてのサイクルから望まれる繰り返される識別とカップリングして、ＲＮＡのすぐに反対側以外のどこかにミスマッチを配置することは、これらのポリメラーゼを利用するときには望ましくない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第ＵＳ２００９／０３２５１６９Ａ１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示は、高識別ポリメラーゼ変異型、またはＲＮＡの５’に位置するミスマッチを利用することができる新しいアッセイ設計を作成するための他のミスマッチ高識別ポリメラーゼを使用したアッセイを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明を使用して、ＳＮＰおよびインデルのような、ＤＮＡにおける変異を検出する、より効率的で誤りが少ない方法を提供することができる。本発明は、安価な多色アッセイを行うための方法も提供する。
【０００７】
本発明のこれらおよび他の利点、ならびに追加の本発明の機能は、本明細書中に記載の本発明の説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明において利用される２つのプライマー設計を示しているダイアグラムである。部分ａ）は、テンプレートにハイブリダイズされたときに目的のＳＮＰがＲＮＡ塩基の５’であるように設計された、ブロックされた切断可能なプライマーである。ＲＮアーゼＨ２は、高識別性ＤＮＡポリメラーゼによってマッチまたはミスマッチのいずれかであることが決定される、３’識別塩基を残して、切断する。熱サイクリングは、この方法の継続を可能にする。部分ｂ）は、ＲＮアーゼＨ２切断を例示し、ＳＮＰ検出はａ）と同一であるが、プライマーは、プローブおよびユニバーサルフォワードプライマーのための結合部位を含む５’「テール」ドメインも含む。ＲＮアーゼＨ２およびポリメラーゼでの１〜１０サイクルの識別の後に、高度に濃縮されたユニバーサルフォワードプライマーは、増幅の優位を占めるようになり、増幅するときにプローブを分解する。このサイクルは、２５〜５０回繰り返され、アウトプットシグナルが生成される。このプライマー設計は、マルチプレックス化することができ、１チューブの多色アッセイ設計を可能にする。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、実施例１に記載のアッセイからのエンドポイント蛍光プロットである。ＦＡＭおよびＨＥＸ蛍光値が、ＸおよびＹ軸上にプロットされている。図２Ａは、野生型Ｔａｑポリメラーゼで行ったｒｓ３５１８５５についての「ユニバーサル」ＳＮＰアッセイである。図２Ｂは、変異型Ｈ７８４Ｑ  Ｔａｑポリメラーゼで行ったｒｓ３５１８５５についての「ユニバーサル」ＳＮＰアッセイであり、変異型Ｔａｑの場合にクラスターのより大きい分離によって認められるようなアレルバリアントのそれぞれの間の識別が大きく促進されることを実証している。いずれの場合においても、テンプレートなしの対照（ＮＴＣ）（四角）は、所望により、（０，０）座標に近い。アレル１サンプルは円として、アレル２サンプルはひし形として、ヘテロ接合体は三角として示されている。各反応を三連で行った。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、ｒｓ４６５５７５１についてのジェノタイピングコールでのアレル識別プロットである。反応プレートを、反応セットアップの後に直ちにサイクルにかけた（Ａ）またはサイクリングの前に４８時間、実験台上で室温で保持した（Ｂ）。ひし形：テンプレートなしの対照（ＮＴＣ）；四角：アレル１サンプル；円：アレル２サンプル；三角：ヘテロ接合体。遺伝子型は、密にクラスター化されて良好な角度の分離を有し、優れたアレル特異性を示す。各サンプルは、正しいジェノタイピングコールに帰属され、性能における変化は、４８時間の保持期間にわたって観察されなかった。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ＴａｑＭａｎに基づくアッセイ対ｒｈＰＣＲからの遺伝子ＣＣＲ２、ｒｓ１７９９８６５のアレル識別プロットの並べての比較を例示している図である。ひし形：テンプレートなしの対照（ＮＴＣ）；四角：アレル１サンプル；円：アレル２サンプル；三角：ヘテロ接合体。ｒｈＰＣＲジェノタイピングアッセイ（図４Ｂ）は、従来の５’−ヌクレアーゼジェノタイピングアッセイ（図４Ａ）と比較して、同向性の結果を示しながらより高い蛍光シグナルを達成した。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）７  Ｆｌｅｘプラットフォーム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）上でｒｈＰＣＲジェノタイピング単一チューブマルチプレックスアッセイを使用した、トリアレルのＳＮＰ、ＣＹＰ２Ｃ８（ｒｓ７２５５８１９５）のアレル識別プロットである。図５Ａにおいて、ひし形：テンプレートなしの対照（ＮＴＣ）；四角：アレルＧ（アレル１）サンプル；円：アレルＡ（アレル２）サンプル；三角形：ヘテロ接合体。図５Ｂにおいて、ひし形：テンプレートなしの対照（ＮＴＣ）；四角：アレルＧ（アレル１）サンプル；円：アレルＣ（アレル３）サンプル；三角形：ヘテロ接合体。
【図６】単一の反応物中にマルチプレックス化された３種のアレル特異的プライマーを用いたｒｈＰＣＲジェノタイピングアッセイを使用した、ＣＹＰ２Ｃ８  ｒｓ７２５５８１９５のトリアレルのアレル識別３６０プロットを示している図である。
【図７】定量ジェノタイピングを行うためのｒｈＰＣＲアッセイの能力を例示しているアレル識別プロットである。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、ジェノタイピング結果および本発明で可能なアレルコピー数バリエーションの検出を例示している図である。多様なコピー数および多様な参照遺伝子型を使用してｇＤＮＡサンプルを試験した。図８Ａにおいて、ひし形：テンプレートなしの対照（ＮＴＣ）；四角：アレルＧサンプル；円：アレルＣサンプル；および三角形：ヘテロ接合体。得られたデータは、試験のインプットと相関する。
【図９】マルチプレックスｒｈＰＣＲの概略図である。
【図１０】プライマーダイマーを減少させることおよび所望のアンプリコンの収量を増加させることにおけるマルチプレックスｒｈＰＣＲ法の有効性を示している、得られたテープステーション画像である。
【図１１】マッピングされたリード数およびオンターゲットのリード数のパーセントで示したｒｈプライマーの有効性を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、ブロックされた切断可能なｒｈＰＣＲプライマー（参照によって本明細書にその全体が組み入れられる米国特許出願公開第ＵＳ２００９／０３２５１６９号Ａ１を参照されたい）および高レベルのミスマッチ識別を有するＤＮＡポリメラーゼを利用する一塩基多型（ＳＮＰ）識別の方法に関する。一実施形態では、ミスマッチは、ＲＮＡ塩基の反対側以外の位置に配置される。これらの状況において、識別の大部分は、ＲＮアーゼＨ２ではなく、高識別ポリメラーゼに由来する。ブロックされた切断可能なプライマーをＲＮアーゼＨ２と共に使用することにより、プライマーダイマーを減少させまたは排除して、いくらか増加した量のＳＮＰまたはインデル（挿入／欠失）識別を提供するように機能する（図１ａ）。
【００１０】
本発明の目的では、高度な識別とは、野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ポリメラーゼの平均的な識別を超えるあらゆる量の識別として定義される。例としては、ＫｌｅｎＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｗａｙｎｅ  Ｂａｒｎｅｓ）、ならびにＨ７８４Ｍ、Ｈ７８４Ｓ、Ｈ７８４ＡおよびＨ７８４Ｑ変異型のような（参照によって本明細書にその全体が組み入れられる）米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０１９１７０７号に記載の変異型ポリメラーゼが含まれる。
【００１１】
さらなる実施形態では、ユニバーサル検出配列は、ブロックされた切断可能なプライマーの５’末端に付加される。検出配列には、プローブのための結合部位、およびユニバーサル増幅プライマーのための結合部位が含まれる。プライマー結合部位は、最終オリゴヌクレオチドの５’末端またはその近くに配置され、プローブ結合部位は、ユニバーサルプライマー部位とＳＮＰ検出プライマードメインとの間の内部に配置される。異なるプローブ結合部位が用いられる場合、検出反応物中での２種以上のこうしたキメラプローブの使用は、プライマーがマルチプレックス化されるのを可能にし、ＳＮＰまたは他のゲノムの特徴の多色検出をさらに可能にする。ブロックされた切断可能なｒｈＰＣＲプライマーは、プライマーダイマーを減少させるまたは排除する。プライマーダイマーは、ＳＮＰ検出アッセイにおける「ユニバーサル」プライマー設計の使用に関する主要な問題であり、それは、それらの有用性を制限する（図１ｂ）。ブロックされた切断可能なプライマー様式においてユニバーサル増幅／検出ドメインをＳＮＰプライマードメインと組み合わせることにより、この問題点が克服される。
【００１２】
これまで、ｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別に最良の好ましい実施形態では、単一のＲＮＡ塩基（切断部位）の反対側に位置するミスマッチ（ＳＮＰ部位）を有するブロックされた切断可能なプライマーが採用された。これが多くのＳＮＰ標的について機能するのに対して、強力な塩基コーリングについて十分な識別が得られない塩基マッチ／ミスマッチ対形成がある。さらに、ｒｈＰＣＲで認められた高レベルの示差的なＳＮＰ識別により、特に、ヘテロ接合性標的ＤＮＡでの、エンドポイント検出は困難になる可能性がある。提唱された方法において、ＲＮＡ塩基は、両方の識別プライマーにおいて同一であり、この問題が排除されている。
【００１３】
本発明の一実施形態では、該方法は、ミスマッチがＲＮＡの１〜２塩基５’に配置され
た、ブロックされた切断可能なプライマーの使用を含む。さらなる実施形態では、該方法は、ＲＮＡ残基の３’に３個以上のＤＮＡ塩基を有するブロックされた切断可能なプライマーの使用を含み、プライマーは、ミスマッチがＲＮＡのすぐ５’に配置されるように設計される。
【００１４】
ＲＮアーゼＨ２による切断後、残りのプライマーは、３’末端のちょうどＳＮＰ部位に配置されたＤＮＡ残基を有し、ＡＳＰＣＲプライマーを効果的に作製する。この立体構造において、特異性の高いＤＮＡポリメラーゼは、テンプレート鎖を用いてマッチおよびミスマッチの間で識別することができる（図１ａおよびｂ）。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのような、天然のＤＮＡポリメラーゼは、このプライマー立体構造においていくらかのレベルの識別を示すことになり、達成される識別のレベルが高スループットアッセイ様式での強力なＳＮＰコーリングに十分でない場合には、向上したテンプレート識別を有するポリメラーゼの使用を使用することができる。一実施形態では、（参照によって本明細書にその全体が組み入れられる）米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０１９１７０７号に開示されているもののような、変異型ＤＮＡポリメラーゼ、またはテンプレート識別を向上させるために設計もしくは最適化された他の任意のポリメラーゼを使用することができる。増強されたミスマッチ識別を有するポリメラーゼを使用するときには、達成されるマッチ／ミスマッチ識別の最終レベルは、ＡＳＰＣＲプライマーポリメラーゼ相互作用およびｒｈＰＣＲプライマー／ＲＮアーゼＨ２相互作用の両方からの寄与と相加的になることになる。さらに、ブロックされた切断可能なプライマーの使用は、プライマーダイマー形成のリスクを低減させ、これは、全体的な反応をより強力にし、より高い感度およびより高い特異性を有する、偽陽性シグナルを生成する。アッセイの各成分の相対的な寄与は、異なるポリメラーゼ、プライマーの３’末端上の異なるブロッキング基および異なるＲＮアーゼＨ２酵素の使用と共に変化しうる。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、ユニバーサルフォワードプライマー結合部位配列および場合によりユニバーサルプローブ配列を含む、プライマーの５’末端に付加された「テール」ドメインを利用することができる。このテールは、目的のテンプレートと相補的ではなく、プローブが使用されるときに、このテールは、安価な蛍光シグナル検出を可能にすると予想され、そのためｑＰＣＲにおける多色シグナル検出を可能にするためにマルチプレックス化することができる（図１ｂ）。一実施形態では、１〜１０サイクルの最初のサイクリングおよび識別は、ＲＮアーゼＨ２およびＤＮＡポリメラーゼの両方から生じる。この最初のプレサイクリングの後に、高濃度の非識別性のユニバーサルフォワードプライマーは、増幅の優位を占めるようになり、ＤＮＡが増幅するときにプローブを分解して蛍光シグナルを生じる。このサイクルは、２５〜５０回繰り返され、強力な検出を可能にする。このアッセイ設計は、プライマーダイマーに関する問題を起こしやすく、ブロックされた切断可能なドメインがプライマー中に存在することにより、これらの問題が抑制または排除されることになる。
【００１６】
別の実施形態では、フォワードプライマーは、場合により、リバースプライマーと共に使用され、テールドメインは、フォワードおよびリバースのプライマーセットのうちの１つまたは両方の５’末端に付加される。テールドメインは、ユニバーサルフォワードプライマー結合部位を含む。これらのプライマーは、目的のゲノムサンプルのような標的をハイブリダイズおよび増幅させるために使用することができる。プライマーは、ユニバーサルプライミング部位を標的に付加するはずであり、さらなるサイクルの増幅は、Ｐ５／Ｐ７フローセル結合部位および結合指標の付加または次世代シークエンシングのためのアダプターにおいて有用な配列をバーコード化することのように、サンプルをさらに加工することを可能にするアダプター配列を含むユニバーサルプライマーを使用して行うことができる（図９を参照されたい）。さらなる実施形態では、忠実度の高いポリメラーゼが使用され、これは、伸長産物中への塩基誤取り込みの割合をさらに低下させて本発明の方法の
精度を高めることになる。
【００１７】
さらなる実施形態では、上記に詳述したテール付きのプライマーを使用して、ゲノム編集技術のための編集事象を検出することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ゲノムＤＮＡ内の標的化された二本鎖切断（ＤＳＢ）の生成を可能にするゲノム編集において革命的な戦略である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−これは、ガイドＲＮＡによって二本鎖ＤＮＡに標的化されるエンドヌクレアーゼで構成される細菌の免疫防御システムである−によってＤＳＢを達成する方法は、遺伝子破壊、遺伝子ノックアウト、遺伝子挿入などにおいて広く使用されている。哺乳動物細胞では、エンドヌクレアーゼ活性の後に、野生型ＤＮＡにおいて標的座位でのいくらかの頻度の挿入／欠失／置換を導く内因性の修復方法が続き、これにより、結果としてゲノム編集がもたらされる。
【００１８】
ＲＮアーゼＨ切断可能なプライマーは、１）ユニバーサルテールを有する座位特異的なアンプリコンを生成するため、および２）その後、次世代シークエンシングのためのインデックス付けされたＰ５／Ｐ７ユニバーサルプライマーで増幅するために、編集座位に隣接するように設計されている。パイロット実験において、この戦略は、ハイスループットで再現性のある様式でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集事象を捕える、信頼性の高い、座位特異的な増幅をもたらした。鍵となる発見は、このＮＧＳに基づく方法による全体的な標的化編集が９５％であると決定されたことである；一方、同じサンプルからの全体的な編集を示唆した以前の酵素的戦略は、目的の標的部位で約５５％であった。さらに、プライマーは、内部バイオインフォマティクスツールによるコンピュータ上での予測に基づくゲノム編集のオフターゲット位置を増幅するように設計された。
【００１９】
これらのアッセイは、オンターゲット、ならびにガイドＲＮＡに対する配列相同性によって媒介されるオフターゲットゲノム編集のための＞１００個の潜在的な部位を捕えるための単一ゲノムＤＮＡサンプルの増幅のためにプールされるはずである。この実験からの結果は、１）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９オフターゲット部位の同定、およびそれらの影響を減少させるための戦略を比較するためのアッセイを提供すること、２）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９オフターゲット予測アルゴリズムの改良された設計、ならびに３）プライマーセットの改良された設計を可能にするはずである。
【００２０】
（参照によって本明細書にその全体が組み入れられる）米国特許出願公開第ＵＳ２００９／０３２５１６９号に注記されているように、ＲＮアーゼＨ２は、１個またはそれ以上のＲＮＡ塩基を含む位置で、２’−フルオロヌクレオシドのような２’改変ヌクレオシドにおいて切断することができる。プライマーは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはメチルホスホネートのようなヌクレアーゼ耐性結合も含むことができる。
【００２１】
他に定義されていない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む、本文書が優先される。本明細書中に記載されているものと同様または等価な方法および材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料は、以下に記載されている。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「相補」または「相補的」とは、核酸を意味し、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの間のワトソン−クリック（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン型塩基対を意味する場合がある。
【００２３】
「フルオロフォア」または「蛍光標識」とは、約３５０および９００ｎｍの間で最大の蛍光放出を有する化合物を指す。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」とは、相補的塩基対形成による、２本の一本鎖核酸による二重螺旋構造の形成を指す。ハイブリダイゼーションは、完全に相補的な核酸鎖間または小さい領域のミスマッチを含む「実質的に相補的な」核酸鎖間で生じうる。「同一の」配列とは、正確に同じ配列の配列、またはシグナルを生成させるもしくは相補的な核酸配列にハイブリダイズさせる目的で同じ様式で作用するのに十分に類似した配列を指す。「プライマーダイマー」とは、２個のオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーションを指す。本明細書中で使用される場合、「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」とは、完全に相補的な核酸鎖のハイブリダイゼーションが強く好まれる条件を意味する。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、第１の核酸配列（例えば、プライマー）は、核酸の複合混合物中などで、第２の核酸配列（例えば、標的配列）にハイブリダイズされることになる。ストリンジェント条件は、配列依存的であり、異なる状況で異なることになる。ストリンジェント条件は、定められたイオン強度ｐＨでの特異的な配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択することができる。Ｔｍは、（定められたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度の下で）標的に相補的な５０％のオリゴヌクレオチドが平衡で標的配列にハイブリダイズする温度でありうる（Ｔｍで、標的配列が過剰に存在するので、平衡で５０％のプローブで占められる）。ストリンジェント条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０から８．３で約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）のような、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオンであり、温度が、短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃であり、（例えば、約５０ヌクレオチドを超える）長いプローブでは少なくとも約６０℃であるものにすることができる。ストリンジェント条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加でも達成することができる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションでは、陽性シグナルは、バックグラウンドのハイブリダイゼーションの少なくとも２から１０倍でありうる。例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件には、以下が含まれる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベートすること、または、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベートすること、加えて０．２×ＳＳＣ中での洗浄、および６５℃での０．１％ＳＤＳ。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、または「ポリヌクレオチド」という用語は、共有結合的に一緒に結合された少なくとも２個のヌクレオチドを指す。一本鎖の記述により、相補鎖の配列も定義される。したがって、核酸には、記述された一本鎖の相補鎖も包含される。核酸の多くのバリアントを、所与の核酸と同じ目的のために使用することができる。したがって、核酸には、実質的に同一の核酸およびその相補鎖も包含される。一本鎖は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズすることができるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００２６】
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、または二本鎖および一本鎖の配列の両方の部分を含んでいてもよい。核酸は、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方の、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってもよく、ここで、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含んでいてもよい。核酸は、化学合成法によってまたは組換え法によって得ることができる。特定の核酸配列には、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、コドン置換）、アレル、オーソログ、一塩基多型（ＳＮＰ）、および相補的な配列ならびに明確に指示された配列が包含されてもよい。
【００２７】
「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで基質ＤＮＡからＤＮＡ断片が合成および増幅される酵素反応を指す。反応には、典型的には、数百から数千塩基対の短い距離によって分離された基質ＤＮＡ中のヌクレオチド配列と相補的である２種の
合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの使用が含まれる。連鎖反応は、一続きの１０から４０サイクルからなる。各サイクルにおいて、基質ＤＮＡは、最初に高温で変性される。冷却後に、大過剰で存在する合成プライマーを、基質ＤＮＡとハイブリダイズさせ、相補的ヌクレオチド配列に沿って二本鎖構造を形成させる。プライマー−基質ＤＮＡ複合体は、次いで、ＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるＤＮＡ合成反応のための開始部位としての役割を果たすことになり、結果として、基質ＤＮＡ鎖に相補的な新しいＤＮＡ鎖の合成をもたらす。合成方法は、基質ＤＮＡの増幅産物を生成する、それぞれの追加のサイクルと共に繰り返される。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「プライマー」とは、好適な条件下で、ＤＮＡ合成のための開始点として作用する能力のあるオリゴヌクレオチドを指す。好適な条件には、テンプレート核酸へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが生じ、異なる４種のヌクレオシド三リン酸および伸長のための作用剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の存在下において適切な緩衝液中で好適な温度で、標的配列の合成または増幅が生じるものが含まれる。
【００２９】
「プローブ」および「蛍光生成プローブ」は、同義であり、ａ）付加されたフルオロフォアおよび／またはクエンチャーを有する配列特異的オリゴヌクレオチド、ならびに場合により副溝結合剤、またはｂ）これに限定されないが、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ色素のような、ＤＮＡ結合試薬のいずれかを指す。
【００３０】
「クエンチャー」とは、ドナーに結合されたまたはドナーに近接したときに、蛍光ドナーからの放出を低減する能力のある、分子、または化合物の部分を指す。クエンチングは、蛍光共鳴エネルギー移動、光誘導性の電子伝達、項間交差の常磁性増強、デクスター交換カップリング、および暗色複合体の形成のような励起子カップリングを含むいくつかの機序のうちのいずれかによって生じうる。
【００３１】
「ＲＮアーゼＨ  ＰＣＲ（ｒｈＰＣＲ）」という用語は、「ブロックされた」オリゴヌクレオチドプライマーおよびＲＮアーゼＨ酵素を利用するＰＣＲ反応を指す。「ブロックされた」プライマーは、テンプレート核酸へのブロックされたプライマーのハイブリダイゼーションが、ＤＮＡポリメラーゼによる核酸の増幅なしで、生じるように、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドに結合された少なくとも１つの化学基（例えば、これに限定されないが、リボ核酸残基）を含む。ブロックされたプライマーがテンプレートまたは標的核酸に一度ハイブリダイズすると、化学基は、高温（例えば、５０℃またはそれ以上）で活性化される、ＲＮアーゼＨ酵素による切断によって除去される。ＲＮアーゼＨ切断後、標的ＤＮＡの増幅が生じうる。
【００３２】
一実施形態では、ブロックされたプライマーの３’末端は、基ｒＤＤＤＤＭｘを含んでいてもよく、ここで、標的核酸配列に対して、「ｒ」はＲＮＡ残基であり、「Ｄ」は相補的ＤＮＡ残基であり、「Ｍ」はミスマッチしたＤＮＡ残基であり、「ｘ」はＣ３スペーサーである。Ｃ３スペーサーは、オリゴヌクレオチドの末端３’ヒドロキシル基に付加された短い３−炭素鎖であり、これはさらに、ＲＮＡ残基の切断前にＤＮＡポリメラーゼが結合されるのを阻害する。
【００３３】
本明細書に記載の方法は、任意の生物に由来するまたはそれから得られる任意の好適なＲＮアーゼＨ酵素を使用して行うことができる。典型的には、ＲＮアーゼＨ依存的ＰＣＲ反応は、ＲＮアーゼＨ２のように、超好熱性古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ（Ｐ．ａ．）から得られるまたはそれに由来するＲＮアーゼＨ酵素を使用して行われる。したがって、一実施形態では、本明細書に記載の方法において用いられるＲＮアーゼＨ酵素は、望ましくは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉから得られるまたはそれに由来
し、好ましくは、ＲＮアーゼＨ２は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉから得られるまたはそれに由来する。他の実施形態では、本明細書に記載の方法において用いられるＲＮアーゼＨ酵素は、他の種、例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｉｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ、またはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓから得ることができるまたはそれらに由来する。
【００３４】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するものであるが、いかなる形であれその範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００３５】
この実施例は、識別性の高いＤＮＡポリメラーゼおよび識別のためのＲＮアーゼＨ２を利用する増強されたｒｈＰＣＲアッセイを示すものである。
【００３６】
これらの新しいアッセイ設計の有用性を実証するために、ｒｈプライマーおよび標準アレル特異的プライマーを、ヒトＢＲＡＦ遺伝子におけるＶ６００Ｅ変異、ｒｓ１１３４８８０２２に対して設計した。これらのプライマーを、野生型またはＨ７８４Ｑ変異型のＴａｑポリメラーゼを用いてＰＣＲおよびｒｈＰＣＲにおいて試験した。これらのアッセイにおいて利用したプライマーは、表１（配列番号１〜７）に示している通りであった。
【００３７】
【表１】
2020182493.tif 000002
【００３８】
１０μＬの反応量をこれらのアッセイにおいて使用した。反応を行わせるために、２×Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）ｒｈＰＣＲジェノタイピングマスターミックス５μＬ（ｄＮＴＰ、Ｈ７８４Ｑ変異型または野生型のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、安定剤、およびＭｇＣｌ２を含む）を、２００ｎＭ（２ｐｍｏｌ）のいずれかのアレルプライマーと組み合わせた。２００ｎＭ（２ｐｍｏｌ）のプローブ、ならびに２００ｎＭ（５ｐｍｏｌ）のリバースプライマーも添加した。さらに、２．５ｍＵ（５．２５ｆｍｏｌ／０．５３ｎＭ）のＰ．ａ．  ＲＮアーゼＨ２および１０００コピーの合成ｇＢｌｏｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）テンプレート（アレル１  １０００コピー、アレル１  ５００コピー＋アレル２  ５００コピー（ヘテロ接合体）、またはアレル２  １０００コピー）（ｇＢｌｏｃｋ（商標）配列については、表２、配列番号８〜９を参照されたい）を反応混合物に添加した。この反応物を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（商標）ＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステム上で熱サイクルにかけた。
サイクリング条件は、以下の通りであった：９５３：００−（９５０：１０−６５０：３０）×６５サイクル。各反応を三連で行った。
【００３９】
【表２】
2020182493.tif 000003
【００４０】
この実験のＣｑ結果を表３に示している。このデータは、アッセイシステムのミスマッチ識別が、野生型Ｔａｑポリメラーゼを用いてｒｈＰＣＲでＡＳＰＣＲを超えて増加すること、およびＨ７８４Ｑ  Ｔａｑポリメラーゼの使用によって識別が促進されることを示す。
【００４１】
【表３】
2020182493.tif 000004
【実施例２】
【００４２】
以下の実施例は、識別性の高いＤＮＡポリメラーゼおよび識別のためのＲＮアーゼＨ２を利用する増強されたｒｈＰＣＲアッセイを示すものである。
【００４３】
この新しいアッセイ設計が機能できることを実証するために、ｒｈプライマーおよび標準アレル特異的プライマーを、ヒトＢＲＡＦ遺伝子におけるＶ６００Ｅ変異、ｒｓ１１３４８８０２２に対して設計した。これらのプライマーを、Ｈ７８４Ｑ変異型Ｔａｑポリメラーゼを用いてＰＣＲおよびｒｈＰＣＲにおいて試験した。これらのアッセイにおいて利用したプライマーは、表４（配列番号１、４および１０〜１２）に示している通りであった。
【００４４】
【表４】
2020182493.tif 000005
【００４５】
１０μＬの反応量をこれらのアッセイにおいて使用した。反応を行わせるために、２×Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）ｒｈＰＣＲジェノタイピングマスターミックス５μＬ（ｄＮＴＰ、Ｈ７８４Ｑ変異型ＤＮＡポリメラーゼ、安定剤、およびＭｇＣｌ２を含む）を、２００ｎＭ（２ｐｍｏｌ）のいずれかのアレルプライマーと組み合わせた。２００ｎＭ（２ｐｍｏｌ）のプローブ、ならびに２００ｎＭ（５ｐｍｏｌ）のリバースプライマーも添加した。さらに、７．５ｍＵ（１５．７５ｆｍｏｌ／１．５８ｎＭ）、５０ｍＵ（１０５ｆｍｏｌ／１０．５ｎＭ）または２００ｍＵ（４２０ｆｍｏｌ／４２ｎＭ）のＰ．ａ．  ＲＮアーゼＨ２および５ｅ４コピーの合成ｇＢｌｏｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）テンプレート（アレル１  １ｅ５コピー、アレル１  ５ｅ４コピー＋アレル２  ５ｅ４コピー（ヘテロ接合体）、またはアレル２  １ｅ５コピー）（ｇＢｌｏｃｋ（商標）配列については、表２、配列番号８〜９を参照されたい）を反応混合物に添加した。この反応物を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（商標）ＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステム上で熱サイクルにかけた。サイクリング条件は、以下の通りであった：９５３：００−（９５０：１０−６５０：３０）×６５サイクル。各反応を三連で行った。
【００４６】
この実験のＣｑ結果を表５に示している。このデータは、アッセイシステムのミスマッチ識別が、野生型Ｔａｑポリメラーゼを用いてｒｈＰＣＲでＡＳＰＣＲを超えて増加すること、およびＨ７８４Ｑ  Ｔａｑポリメラーゼの使用によって識別が促進されることを示す。
【００４７】
【表５】
2020182493.tif 000006
【００４８】
デルタＣｑ値は、これらのプライマーのＧｅｎ１バージョンで得られるものよりも有意に高く、これにより、ｒｈＰＣＲにおいて以前に認められているように、このプライマー設計に対する利点があることが示された。
【実施例３】
【００４９】
以下の実施例は、高度なミスマッチ識別を有するＤＮＡポリメラーゼを使用するユニバーサルアッセイの高められた信頼性を例示するものである。
【００５０】
開示のアッセイがユニバーサル様式で機能できること、およびそれらが高度なミスマッチ識別を有するポリメラーゼで有意に改良されることを実証するために、「ユニバーサル」アッセイプライマーを、ヒトＦＧＦＲ４遺伝子におけるＧ３３８Ｒ変異、ｒｓ３５１８５５に対して設計した。この「ユニバーサル」アッセイ設計は、アレル特異的ｒｈプライマーをマルチプレックス化して多色のリードアウトを得る能力を含む、多数の利点を有する。このアッセイにおいて利用したプライマーは、表６（配列番号１３〜１８）に示している通りであった。
【００５１】
【表６】
2020182493.tif 000007
【００５２】
１０μＬの反応量をこれらのアッセイにおいて使用した。反応を行わせるために、２×Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）ｒｈＰＣＲジェノタイピングマスターミックス５μＬ（ｄＮＴＰ、変異型または野生型のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、安定剤、およびＭｇＣｌ２を含む）を、各５０ｎＭ（５００ｆｍｏｌ）の２種のアレルプライマーと組み合わせた。各２５０ｎＭ（２．５ｐｍｏｌ）の２種のプローブ、ならびに５００ｎＭ（５ｐｍｏｌ）のユニバーサルフォワードプライマーおよび５００ｎＭ（５ｐｍｏｌ）のリバースプライマーも添加した。さらに、２．５ｍＵ（５．２５ｆｍｏｌ／０．５３ｎＭ）のＰ．ａ．ＲＮアーゼＨ２および１０００コピーの合成ｇＢｌｏｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）テンプレート（アレル１の１０００コピー、アレル１の５００コピー＋アレル２の５００コピー（ヘテロ接合体）、またはアレル２の１０００コピー）（ｇＢｌｏｃｋ（商標）配列については、表７、配列番号１９〜２０を参照されたい）を反応混合物に添加した。この反応物を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（商
標）ＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステム上で熱サイクルにかけた。サイクリング条件は、以下の通りであった：９５３：００−（９５０：１０−６００：３０）×３サイクル−（９５０：１０−６５０：３０）×６５サイクル。各反応を三連で行った。合計５０サイクルが完了した後に、蛍光読み取りを行った。蛍光値をＦＡＭおよびＨＥＸ軸上にプロットし、結果を図２ａおよび２ｂに示している。
【００５３】
【表７】
2020182493.tif 000008
【００５４】
野生型Ｔａｑを使用して得られたデータは、アレルのコールを作成することがより困難であることを示すが、これらの結果より、ホモ接合体間のミスマッチ識別は、両方のポリメラーゼに関して十分であることが例示される。しかし、重要なことに、野生型Ｔａｑポリメラーゼは、ヘテロ接合体をホモ接合体と効率良く識別することができず、それらをアレル１および２のシグナルの近くに配置しすぎる（図２ａ）。対照的に、変異型Ｔａｑポ
リメラーゼを利用したアッセイにおけるヘテロ接合体からのシグナルは、簡単にホモ接合体と識別可能である（図２ｂ）。
【００５５】
変異型Ｔａｑの重要性は、この実施例からＣｑ値を調査するときに、さらに理解することができる（表８）。このデータにより、Ｈ７８４Ｑ  Ｔａｑ変異型は、ミスマッチ識別を劇的に増加させるだけでなく、ＮＴＣのＣｑも、５０台始め〜半ばから、アッセイにおいて試験したよりも大きい数値まで（＞６５）減少させることが示される。この試験から、アレル同一性は、Ｃｑ値ならびにエンドポイント蛍光から決定できることが示される。
【００５６】
【表８】
2020182493.tif 000009
【実施例４】
【００５７】
以下の実施例は、本発明のアッセイ設計を用いたまれなアレルバリアントの検出を例示するものである。まれなアレルバリアントを検出するためのこれらの新しいアッセイ設計の有用性を実証するために、以前に記載されている第二世代のｒｈプライマー（ｒｄｘｘｄｍ）を、ヒトＢＲＡＦ遺伝子におけるＶ６００Ｅ変異、ｒｓ１１３４８８０２２に対して利用した（表４、配列番号１、４および１０〜１２を参照されたい）。
【００５８】
１０μＬの反応量をこれらのアッセイにおいて使用した。反応を行わせるために、２×Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）ｒｈＰＣＲジェノタイピングマスターミックス５μＬ（ｄＮＴＰ、Ｈ７８４Ｑ変異型または野生型のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、安定剤、およびＭｇＣｌ２を含む）を、２００ｎＭ（２ｐｍｏｌ）のいずれかのアレルプライマー、または非識別性フォワードプライマーと組み合わせた。２００ｎＭ（２ｐｍｏｌ）のプローブ、ならびに２０
０ｎＭ（５ｐｍｏｌ）のリバースプライマーも添加した。さらに、５０ｍＵ（１０５ｆｍｏｌ／１０．５ｎＭ）のＰ．ａ．  ＲＮアーゼＨ２および５０，０００コピーの合成ｇＢｌｏｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）マッチテンプレートを、０、５０、または５００コピーのいずれかの逆アレルと組み合わせて（ｇＢｌｏｃｋ（商標）配列については、表６、配列番号１６〜１７を参照されたい）反応混合物に添加した。この反応物を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（商標）ＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステム上で熱サイクルにかけた。サイクリング条件は、以下の通りであった：９５３：００−（９５０：１０−６００：３０）×６５サイクル。各反応を三連で行った。
【００５９】
野生型ポリメラーゼについてのデータは表９に、Ｈ７８４Ｑ変異型Ｔａｑポリメラーゼについては表１０に示している。「従来の」ｒｈＰＣＲを超えるまれなアレルの検出のためのこのシステムの利点のうちの１つは、両方のアレルについて単一量のＲＮアーゼＨ２を利用する能力である。この利点は、切断に必要とされる酵素量を決定するための潜在的な必要条件を半減させる。
【００６０】
【表９】
2020182493.tif 000010
【００６１】
【表１０】
2020182493.tif 000011
【００６２】
このデータは、Ｈ７８４Ｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、ｒｓ１１３４８８０２２の変異型Ａアレルについて、１１サイクルを超えるデルタＣｑで、５０コピーの標的を５０，０００コピーのバックグラウンドＤＮＡ中から検出すること（１：１０００の識別レベル）を可能にすることを明白に示している。わずかに３サイクルを超えるだけであるのがこのアッセイにおいてＴアレルについて認められたが、これは、Ｔアレルについていかなる識別も示さず、Ａアレルについての３サイクルのデルタだけである野生型Ｔａｑポリメラーゼを超える有意な向上であった。
【実施例５】
【００６３】
この実施例は、ユニバーサルｒｈＰＣＲジェノタイピングアッセイおよびＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）ｒｈＰＣＲジェノタイピングマスターミックスの使用での好結果のアレル識別、および反応成分の強力な安定性を示すものである。アッセイ設計および混合物成分の強力な性質を実証するために、ユニバーサルプライマーを、ヒト１番染色体上に位置するＳＮＰ、ｒｓ４６５７７５１に対して設計した（表１１、配列番号１４、２１〜２５を参照されたい）。
【００６４】
同一のユニバーサルｒｈＰＣＲジェノタイピング反応を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４  Ｔｏｕｃｈ（商標）リアルタイム  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ上で２枚の白色Ｈａｒｄ−Ｓｈｅｌｌ（登録商標）３８４ウェルのスカート付きＰＣＲプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）内で１０μＬの最終容量で設定した。各ウェルには、ｒｈＰＣＲアッセイプライマー（ｒｓ４６５７７５１アレル特異的プライマー１（配列番号２３）１５０ｎＭ、ｒｓ４６５７７５１アレル特異的プライマー２（配列番号２４）１５０ｎＭ、およびｒｓ４６５７７５１座位特異的プライマー（配列番号２５）５００ｎＭ）が含まれていた。反応物には、以下の濃度でユニバーサルレポーターオリゴが含まれていた：ユニバーサルＦＡＭプローブ（配列番号１４）２５０ｎＭ、ユニバーサルＹａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）（配列番号２２）プローブ４５０ｎＭ、およびユニバーサルフォワードプライマー（配列番号２１）１０００ｎＭ、および２×Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）ｒｈＰＣＲジェノタイピングマスターミックス５μＬ（ｄＮＴＰ、変異型Ｈ７８４Ｑ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｅｈｌｋｅら、Ｕ．Ｓ．２０１５／０１９１７０７を参照されたい）、化学的に改変されたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉのＲＮアーゼＨ２（Ｗａｌｄｅｒら、ＵＡ２０１３０２８８２４５Ａ１を参照されたい）、安定剤、およびＭｇＣｌ２を含む）。
【００６５】
ｒｓ４６５７７５１  ＳＮＰのいずれかのアレルを含むｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）をテンプレートＤＮＡの供給源として利用した（表１２、配列番号２６および２７を参照されたい）。各ウェルは、以下の３つの可能な遺伝子型のうちの１つであるテンプレートを含んでいた：アレル１ホモ接合体（ｒｓ４６５７７５１アレル１  ｇＢｌｏｃｋ（登録商標）テンプレート（配列番号２６）１０００コピー）、アレル２ホモ接合体（ｒｓ４６５７７５１アレル２  ｇＢｌｏｃｋ（登録商標）テンプレート（配列番号２７）１０００コピー）、またはヘテロ接合体（ｒｓ４６５７７５１アレル１  ｇＢｌｏｃｋ（登録商標）テンプレート（配列番号２６）５００コピーおよびｒｓ４６５７７５１アレル２  ｇＢｌｏｃｋ（登録商標）テンプレート（配列番号２７）５００コピーの混合物）。テンプレート、またはテンプレートなしの対照（ＮＴＣ）反応のための水を、２枚の別個のプレートの三連の重複したウェル内に添加した。反応物に以下のサイクリングプロトコールを行った：９５℃１０分間、その後、４５サイクルの９５℃１０秒間および６０℃４５秒間。
【００６６】
【表１１】
2020182493.tif 000012
【００６７】
【表１２】
2020182493.tif 000013
【００６８】
経時的な反応安定性を実証するために、１枚の反応プレートを直ちにサイクルにかけ（実験台上で０時間保持）、１枚の反応プレートを室温で２日間保持した（実験台上で４８時間保持）。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  ３．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用してアレルの識別解析を行った。ＦＡＭおよびＹａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗフルオロフォアを各ウェル内で検出した。両方のフルオロフォアについて、ベースラインサイクルをサイクル１０で開始してサイクル２５で終了するように設定した。４５サイクルの終了時の各ウェル内の蛍光シグナル（ＲＦＵ）を使用してアレル識別プロットを作成し、遺伝子型を解析ソフトウェアのオートコール機能で決定した。即時に実行したプレート（図３Ａ）および４８時間保持したプレート（図３Ｂ）で同一の性能が得られ、反応成分の強力な安定性が実証された。各サンプルは、正しいジェ
ノタイピングコールに帰属され、同じ遺伝子型のサンプルは、一緒に密にクラスター化された。ヘテロ接合体クラスターは、約４５度の角度で両方のホモ接合型クラスターから分離され、ユニバーサルｒｈＰＣＲジェノタイピングアッセイおよびマスターミックスの優れたアレル特異性を示す。
【実施例６】
【００６９】
以下の実施例は、従来の５’ヌクレアーゼジェノタイピングアッセイ法（Ｔａｑｍａｎ（商標））に対する本発明のジェノタイピング法の性能を比較するものである。
【００７０】
ＣＣＲ２遺伝子内のｒｓ１７９９８６５  ＳＮＰを選択し、ｒｈＰＣＲジェノタイピングプライマーならびにｒｓ１７９９８６５  ５’ヌクレアーゼアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ））を設計および入手した。ｒｓ１７９９８６５  ｒｈＰＣＲゲノムＳＮＰアッセイのための配列を表１４（配列番号１４、２１、２２、および２８〜３０）に示している。Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  ５’ヌクレアーゼプライマー／プローブ（Ｔａｑｍａｎ（商標））配列は公表されておらず、したがって、この文書に含まれていない。
【００７１】
ＣｏｒｉｅｌｌゲノムＤＮＡ（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）１０ｎｇ、ユニバーサルＦＡＭプローブ（配列番号１４）２５０ｎＭ、ユニバーサルＹａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）（配列番号２２）プローブ４５０ｎＭ、ユニバーサルフォワードプライマー（配列番号２１）１０００ｎＭ、２種のアレル特異的フォワードプライマー（配列番号２８および２９）１５０ｎＭ、リバースプライマー（配列番号３０）５００ｎＭ、および２×Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）ｒｈＰＣＲジェノタイピングマスターミックス５μＬ（ｄＮＴＰ、変異型Ｈ７８４Ｑ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｅｈｌｋｅら、Ｕ．Ｓ．２０１５／０１９１７０７を参照されたい）、化学的に改変されたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉのＲＮアーゼＨ２（Ｗａｌｄｅｒら、ＵＡ２０１３０２８８２４５Ａ１を参照されたい）、安定剤、およびＭｇＣｌ２を含む）を含む、１０μＬの容積で反応を行わせた。
【００７２】
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）７  ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲ機器上で以下のサイクリング条件を使用してＰＣＲを行った：９５℃で１０分、その後、５０サイクルの９５℃１０秒間および６０℃４５秒間。４５サイクル後、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）リアルタイムＰＣＲソフトウェアｖ１．３（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で各プレートのエンドポイント解析を行った。
【００７３】
【表１３】
2020182493.tif 000014
【００７４】
図４Ａおよび４Ｂは、得られたアレル識別プロットの並べての比較を示している。ｒｈＰＣＲジェノタイピングアッセイ（図４Ｂ）は、従来の５’−ヌクレアーゼジェノタイピングアッセイ（図４Ａ）と比較して、同向性の結果を示しながらより高い蛍光シグナルを達成した。ｒｈＰＣＲアッセイにおけるより高いシグナルおよびＮＴＣからの最小の非特異的増幅は、より良好なクラスター分離および正確な遺伝子型コールを可能にする。
【実施例７】
【００７５】
以下の実施例は、トリアレルＳＮＰの検出および解析を可能にする本方法を例示するものである。ｒｓ７２５５８１９５  ＳＮＰは、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子内に存在し、３つの潜在的に可能な遺伝子型を有する。このＳＮＰをｒｈＰＣＲジェノタイピングシステムでの
解析用に選択した。
【００７６】
図５Ａおよび５Ｂに例示しているように、トリアレルのＳＮＰを調べる従来のワークフローには、同じサンプルを使用した１対のアッセイを実行すること、マニュアルコーリング、およびサンプルの本当の遺伝子型を得るために対のアッセイ結果を比較することが含まれる。
【００７７】
こうしたシステムがユニバーサルｒｈＰＣＲジェノタイピングシステムで機能できることを実証するために、反応を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）７  ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲ上で白色Ｈａｒｄ−Ｓｈｅｌｌ（登録商標）３８４ウェルのスカート付きＰＣＲプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）内で１０μＬの最終容量で設定した。各ウェルには、ｒｈＰＣＲアッセイプライマーが含まれていた（表１６、配列番号１４、２１、２２、３１〜３３を参照されたい）。特に、ｒｓ７２５５８１９５  Ｇ：Ａアレル特異的プライマー１（配列番号３１）１５０ｎＭおよびｒｓ７２５５８１９５  Ｇ：Ａアレル特異的プライマー２（配列番号３２）１５０ｎＭ、またはｒｓ７２５５８１９５  Ｇ：Ａアレル特異的プライマー１（配列番号３１）１５０ｎＭおよびｒｓ７２５５８１９５  Ｇ：Ｃアレル特異的プライマー３（配列番号３３）１５０ｎＭならびにｒｓ７２５５８１９５座位特異的プライマー（配列番号３４）５００ｎＭが反応物に含まれていた。
【００７８】
反応物には、以下の濃度でユニバーサルレポーターオリゴが含まれていた：ユニバーサルＦＡＭプローブ（配列番号１４）２５０ｎＭ、ユニバーサルＹａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）（配列番号２２）プローブ４５０ｎＭ、およびユニバーサルフォワードプライマー（配列番号２１）１０００ｎＭ、ＲＯＸ内部標準５０ｎＭ、および２×Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）ｒｈＰＣＲジェノタイピングマスターミックス５μＬ（ｄＮＴＰ、変異型Ｈ７８４Ｑ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｅｈｌｋｅら、Ｕ．Ｓ．２０１５／０１９１７０７を参照されたい）、化学的に改変されたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉのＲＮアーゼＨ２（Ｗａｌｄｅｒら、ＵＡ２０１３０２８８２４５Ａ１を参照されたい）、安定剤、およびＭｇＣｌ２を含む）。
【００７９】
【表１４】
2020182493.tif 000015
【００８０】
ｒｓ７２５５８１９５  ＳＮＰのアレルを含むｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）をテンプレートＤＮＡの供給源として利用した（表１７、配列番号３５、３６および３７を参照されたい）。各ウェルは、以下の６つの可能
な遺伝子型のうちの１つであるテンプレートを含んでいた：アレル１ホモ接合体（ｒｓ７２５５８１９５アレル１  ｇＢｌｏｃｋ（登録商標）テンプレート（配列番号３５）１０００コピー）、アレル２ホモ接合体（ｒｓ７２５５８１９５アレル２  ｇＢｌｏｃｋ（登録商標）テンプレート（配列番号３６）１０００コピー）、アレル３ホモ接合体（ｒｓ７２５５８１９５アレル２  ｇＢｌｏｃｋ（登録商標）テンプレート（配列番号３７）１０００コピー）、ヘテロ接合体（ｒｓ７２５５８１９５アレル１  ｇＢｌｏｃｋ（登録商標）テンプレート（配列番号３５）５００コピーおよびｒｓ７２５５８１９５アレル２  ｇＢｌｏｃｋ（登録商標）テンプレート（配列番号３６）５００コピーの混合物）、ヘテロ接合体（ｒｓ７２５５８１９５アレル１  ｇＢｌｏｃｋ（登録商標）テンプレート（配列番号３５）５００コピーおよびｒｓ７２５５８１９５アレル３  ｇＢｌｏｃｋ（登録商標）テンプレート（配列番号３７）５００コピーの混合物）。テンプレート、またはテンプレートなしの対照（ＮＴＣ）反応のための水を、２枚の別個のプレートの三連の重複したウェル内に添加した。反応物に以下のサイクリングプロトコールを行った：９５℃１０分間、その後、４５サイクルの９５℃１０秒間および６０℃４５秒間。
【００８１】
【表１５】
2020182493.tif 000016
【００８２】
これらの結果を図５Ａおよび５Ｂに示している。これより、ユニバーサルｒｈＰＣＲジェノタイピングシステムを使用して、複数のアレルの遺伝子型を特徴付けできることは明らかである。
【００８３】
トリアレルのＡＤ  ３６０プロットを、アレル識別を例示するために設計した。各色素の最終ＰＣＲサイクルからの蛍光シグナル（ΔＲｎ）を、同じウェルからの３つの色素にわたって標準化した。以下の式を使用して角度および起点からのデータポイントの距離を算出する：
【００８４】
【数１】
2020182493.tif 000017
【００８５】
図５Ｂは、単一の反応物中にマルチプレックス化された３種のアレル特異的プライマーを用いたｒｈＰＣＲジェノタイピングアッセイを使用した、ｒｓ７２５５８１９５のトリアレルのアレル識別３６０プロットを示している。すべてのアッセイからの蛍光シグナルを収集することによって、６つの遺伝子型を単一の反応物中で検出することができた。起点からのデータポイントの距離は色素のシグナル強度を示し、データクラスター間の大きい角度の分離はマルチプレックスアッセイの特異性を示した。プロットの中心にあるＮＴＣは、プライマーダイマーまたは非特異的な増幅がないことを示した。マルチプレックスアッセイの特異性は、前述の実施例において使用されたようなＲＮアーゼＨ２および変異型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの選択性によって達成される。このＡＤ  ３６０プロットは、ジェノタイピングソフトウェアによるオートコール能力も可能にすることになる。
【００８６】
３６０プロットは、テトラアレル、ペンタアレルまたはヘキサアレルの可視化について行うことができた。したがって、可視化は、複数の塩基ならびに潜在的な欠失を有することができた位置について可能である。起点からの距離はそれぞれの計算について不変のままであり、角度の式は以下の通りになる：
【００８７】
【数２】
2020182493.tif 000018
【実施例８】
【００８８】
以下の実施例は、異なるアレルのコピー数の決定を可能にする、定量ＳＮＰジェノタイピングを提供する本発明の方法の能力を例示するものである。これを実証するために、アッセイを、ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子におけるＳＮＰ、ｒｓ１１３５８４０に対して設計した。この遺伝子は複数コピーで存在することができ、ｒｓ１１３５８４０  ＳＮＰについてのコピー数は薬物代謝（薬物デブリソキンの急速な代謝）に影響するようである。
【００８９】
このアッセイシステムによってアレル比における小さな差異を検出できることを実証するために、解析のための標準曲線を作成した。２種のｇＢｌｏｃｋ（商標）（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）遺伝子断片を合成し（ｒｓ１１３５８４０  ＳＮＰの２種のアレルバリアント（Ｇ＞Ｃ）を表す、アレル１およびアレル２）、次いで、異なる比率で混合した。示されている比率（１０：０、９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８、１：９、および０：１０）のテンプレート合計１５００コピー、
ユニバーサルＦＡＭプローブ（配列番号１４）２５０ｎＭ、ユニバーサルＹａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）（配列番号２２）プローブ４５０ｎＭ、ユニバーサルフォワードプライマー（配列番号２１）１０００ｎＭ、２種のアレル特異的フォワードプライマー１５０ｎＭ、リバースプライマー５００ｎＭ、および２×Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）ｒｈＰＣＲジェノタイピングマスターミックス５μＬ（ｄＮＴＰ、変異型Ｈ７８４Ｑ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｅｈｌｋｅら、Ｕ．Ｓ．２０１５／０１９１７０７を参照されたい）、化学的に改変されたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉのＲＮアーゼＨ２（Ｗａｌｄｅｒら、ＵＡ２０１３０２８８２４５Ａ１を参照されたい）、安定剤、およびＭｇＣｌ２を含む）を含む、１０μＬの容積で反応を行わせた。
【００９０】
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）７  ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲ機器上で以下のサイクリング条件を使用してＰＣＲを行った：９５℃で１０分、その後、４５サイクルの９５℃１０秒間および６０℃４５秒間。４５サイクル後、それぞれの会社によって提供されたソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  ３．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）およびＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）リアルタイムＰＣＲソフトウェアｖ１．３（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））で各プレートのエンドポイント解析を行った。
【００９１】
【表１６】
2020182493.tif 000019
【００９２】
得られたデータを図７に例示している。サンプル混合物のそれぞれの拡散は、各テンプレートのコピー数の決定に十分である。
【００９３】
アレル数量の分離の必要量の実証後、実験的なサンプルにおける各アレルのコピー存在数を決定することが可能である。これを試験するために、ｒｓ１１３５８４０に対して設計した前述のアッセイを利用して、多様なＣＹＰ２Ｄ６コピー数を有し多様なｒｓ１１３５８４０遺伝子型を有する１３種のＣｏｒｉｅｌｌゲノムＤＮＡ（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）サンプルを試験した。これらのサンプルは、ユニバーサルｒｈＰＣＲジェノタイピング混合物での試験後に検証することができた既知の確定されたコピー数およびｒｓ１１３５８４０遺伝子型を有する。このことから、これらのサンプルは、いずれかのアレルについてホモ接合体である、またはヘテロ接合体であるとして分類することもできる。
【００９４】
データからコピー数を算出するために、各サンプルについて２通りずつの重複した反応を行わせた。以下のゲノムＤＮＡのうちの１種：ＮＡ１７１２３、ＮＡ１７１３１、ＮＡ１７１３２、ＮＡ１７１４９、ＮＡ１７１０４、ＮＡ１７１１３、ＮＡ１７１４４、ＮＡ１７２１３、ＮＡ１７２２１、ＮＡ１７１１４、ＮＡ１７２３５、またはＮＡ１７２４１
３ｎｇを含む、１０μＬの容積で反応を行わせた。各個のアッセイには、ＲＯＸ標準化オリゴ５０ｎＭ、ユニバーサルＦＡＭプローブ（配列番号１４）２５０ｎＭ、ユニバーサルＹａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）（配列番号２２）プローブ４５０ｎＭ、ユニバーサルフォワードプライマー（配列番号２１）１０００ｎＭ、２種のアレル特異的フォワードプライマー（配列番号３８および３９）１５０ｎＭ、リバースプライマー（配列番号４０）５００ｎＭ、および２×Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）ｒｈＰＣＲジェノタイピングマスターミックス５μＬ（ｄＮＴＰ、変異型Ｈ７８４Ｑ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｅｈｌｋｅら、Ｕ．Ｓ．２０１５／０１９１７０７を参照されたい）、化学的に改変されたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉのＲＮアーゼＨ２（Ｗａｌｄｅｒら、ＵＡ２０１３０２８８２４５Ａ１を参照されたい）、安定剤、およびＭｇＣｌ２を含む）も含まれていた。アッセイには、テンプレート濃度の標準化のために別のＲＮアーゼＰアッセイ（表１７、配列番号４１〜４３を参照されたい）も含まれていた。
【００９５】
【表１７】
2020182493.tif 000020
【００９６】
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）７  ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲ機器上で以下のサイクリング条件を使用して定量ＰＣＲを行った：９５℃で１０分、その後、４５サイクルの９５℃１０秒間および６０℃４５秒間。４５サイクル後、該会社によって提供されたＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）リアルタイムＰＣＲソフトウェアｖ１．３（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で各プレートのエンドポイント解析を行った。
【００９７】
以下の方法によってコピー数を決定した。ホモ接合体であることが示されたそれぞれのサンプルでは、ΔＣｑ（ＲＮアーゼＰ  Ｃｑ−ｒｓ１１３５８４０アッセイＣｑ）をそれぞれのサンプルについて算出した。ヘテロ接合体であることが示されたサンプルでは、ΔＣｑを両方のアレルについて算出した（ＲＮアーゼＰ  Ｃｑ−ｒｓ１１３５８４０アッセ
イ１  ＣｑおよびＲＮアーゼＰ  Ｃｑ−ｒｓ１１３５８４０アッセイ２  Ｃｑ）。次に、ΔΔＣｑ（ΔＣｑ−既知の２コピー対照ＤＮＡサンプルについての平均ΔＣｑ）をそれぞれのアレルについて算出した。この補正は、ＳＮＰアッセイとＲＮアーゼＰアッセイとの間の増幅差異に対する標準化を可能にした。最後に、以下の式を使用してそれぞれのアレルについてのコピー数を算出した：
アレルのコピー数＝２＊（２＾（ΔΔＣｑ））
【００９８】
得られたエンドポイントデータを図８Ａに示しており、算出されたコピー数を図８Ｂに示している。図８Ａにおいて決定された遺伝子型（ホモ接合体アレル１、ホモ接合体アレル２、またはヘテロ接合体）はすべて既知の遺伝子型にマッチし、コピー数の正確な計算を可能にした。個々のサンプルの確立された参照コピー数をそれぞれの結果の下に示している。それぞれの場合において、アッセイによって決定されたコピー数は、インプットＤＮＡの遺伝子型およびコピー数を正確に決定した。
【実施例９】
【００９９】
以下の実施例は、ｒｈＰＣＲプローブのバリエーションを、マルチプレックス化したｒｈＰＣＲに使用できることを示すものである。
【０１００】
アッセイ概略図を図９に示している。１回目のＰＣＲでは、５’テール付きの標的特異的ｒｈプライマーを使用する。５’テールは、アンプリコン内への組み込みにより、適用特異的な配列を付加するための異なるプライマー（ブロックされた、またはブロックされていない）を用いた２回目のＰＣＲのための結合部位を含む。例えば、図９に示しているように、このシステムを次世代シークエンシングのための増幅濃縮に使用することができる。この場合には、５’テール付きのｒｈＰＣＲプライマーは、リード１／リード２プライマー配列を含む。２回目のＰＣＲは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）に基づくシークエンシングプラットフォームのためのＰ５／Ｐ７シリーズのようなアダプター配列または、バーコード／固有の分子識別子を含むものを含む、他のアダプターを付加する。このアプローチは、任意のＮＧＳプラットフォーム型内へのインプットに必要なアンプリコン上に任意の追加の配列を付加することを可能にする。
【０１０１】
図１０に例示しているように、５’テール付きのｒｈプライマーの９６プレックスセットを含む１組、および９６種のＤＮＡ「標準」５’テール付きＰＣＲプライマーを含む１組を含む、２組のプライマーセットをＩＤＴアルゴリズムを使用して設計した。２組のプライマーセットは、ｒｈプライマーが３’末端上に内部切断可能なＲＮＡ塩基およびブロッキング基を含むことにおいてのみ異なっていた。一度ブロッキング基がＲＮアーゼＨ２切断によって除去されると、プライマー配列は同一になる。
【０１０２】
１回目のＰＣＲ反応は、ブロックされた各標的特異的プライマー１０ｎＭ、ＮＡ１２８７８ヒトゲノムＤＮＡ  １０ｎｇ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）、化学的に改変されたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉのＲＮアーゼＨ２  ２００ｍＵ（Ｗａｌｄｅｒら、ＵＡ２０１３０２８８２４５Ａ１を参照されたい）（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）および１×ＫＡＰＡ  ２Ｇ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ（商標）（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）の９６プレックスを含んでいた。熱サイクリングプロファイルは、９５℃で１０分、その後、８サイクルの９５℃１５秒間および６０℃４分間、ならびに最後の９９℃の仕上げ工程１５分間であった。反応物を２×ＡＭＰｕｒｅ（商標）ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）で洗浄した。簡単に説明すると、ＡＭＰｕｒｅ（商標）ＳＰＲＩビーズ１００μＬを各ＰＣＲウェルに添加して、室温で５分間インキュベートし、プレートマグネット（ＤｙｎａＭａｇ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｔｈｅｒｈａｍ、ＭＡ）９
６ウェルプレートサイドマグネット）上で室温で５分間収集した。ビーズを８０％エタノールで２回洗浄し、室温で３分間乾燥させた。サンプルをｐＨ８．０のＴＥ  ２２μＬ中に溶出した。
【０１０３】
洗浄した１回目のＰＣＲ産物２０μＬ、ユニバーサルＰＣＲ−５０ＦおよびＰＣＲ−４７Ｒプライマー（表１８、配列番号４４および４５を参照されたい）２ｕＭ、ならびに１×ＫＡＰＡ  ２Ｇ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ（商標）（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、２回目のＰＣＲを設定した。反応物を９８℃で４５秒間、その後、２０サイクルの９８℃１５秒間、６０℃３０秒間、および７２℃３０秒間のサイクルにかけた。最後の１分７２℃のポリッシング工程で反応を完了させた。サンプルを０．８×ＡＭＰｕｒｅ（商標）ビーズで再び洗浄した。簡単に説明すると、ＡＭＰｕｒｅ（商標）ＳＰＲＩビーズ４０μＬを第２のＰＣＲウェルに添加して、室温で５分間インキュベートし、プレートマグネット（ＤｙｎａＭａｇ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｔｈｅｒｈａｍ、ＭＡ）９６ウェルプレートサイドマグネット）上で室温で５分間収集した。ビーズを８０％エタノールで２回洗浄し、室温で３分間乾燥させた。サンプルをｐＨ８．０のＴＥ  ２２μＬ中に溶出し、２０μＬを新しいチューブに移した。
【０１０４】
Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）２２００  Ｔａｐｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）上でＡｇｉｌｅｎｔ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｄ１０００（商標）Ｓｃｒｅｅｎ  Ｔａｐｅ（商標）を使用して、２μＬのサンプルを解析した。製造業者のプロトコールに従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＰｌａｔｆｏｒｍのためのＫＡＰＡ
Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を使用して定量を行った。重複したサンプルを１０ｐＭの最終濃度にプールして、１％のＰｈｉＸバクテリオファージシークエンシング対照を添加した。製造業者からの標準プロトコールを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）ＭｉＳｅｑ（商標）プラットフォーム上でＶ２  ３００  ｃｙｃｌｅ  ＭｉＳｅｑ（商標）キットを用いてサンプルを操作した。
【０１０５】
【表１８】
2020182493.tif 000021
【０１０６】
図１０は、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）Ｔａｐｅ  Ｓｔａｔｉｏｎからの結果を示している。プライマーダイマー産物は、ＤＮＡテンプレートの存在下において標準ＤＮＡプライマーを使用して生成された最も顕著な産物であって、期待された完全長の産物は少量のみであった。テンプレートの非存在下では、プライマーダイマー産物が反応物の主要な成分であった。ブロックされたｒｈＰＣＲプライマーの場合には、物質の大部分が望ましいＰＣＲ産物であって、プライマーダイマーはほとんど認められなかった。テンプレートの非存在下では、プライマーダイマーは存在せず、ブロックされていないＤＮＡプライマー
のテンプレートなしのレーンにおいて認められる圧倒的な存在量のプライマーダイマーとは対照的である。産物対プライマーダイマーバンドの定量化により、ブロックされていないＤＮＡプライマーについての産物対プライマーダイマーの質量比は０．６であったことが示される。ｒｈＰＣＲプライマーについての質量比は、６．３であった。
【０１０７】
図１１は、２つの鍵となるシークエンシング測定基準をまとめたものである。１つ目は、シークエンシングデータからのマッピングされたリード数のパーセントである。ｒｈＰＣＲ反応により、ヒトゲノムにマッピングされたリード数の百分率は８５％であったのに対して、ブロックされていないＤＮＡプライマーでは２０未満のマッピングされたリード数の百分率がもたらされた。２つ目の測定基準であるオンターゲットリード数の百分率は、ｒｈＰＣＲプライマーを使用するときにはもう少しで９５％であるが、ブロックされていないプライマーをマルチプレックスで使用するときには８５％未満である。これらの結果は、ｒｈＰＣＲをマルチプレックスで使用することの有用性を明白に実証しており、ここで、望ましい物質の大きな増加が認められ、望ましくない副産物の大きな減少が観察される。この差異は、望ましくないシークエンシングリード数がより少ないことを意味し、望ましい配列の網羅範囲はより大きい。
【０１０８】
本明細書中に引用している、刊行物、特許出願、および特許を含む、すべての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組み入れるものとして個別具体的に示されて本明細書中にその全体が記載されているのと同程度に、参照によって本明細書によって組み入れる。
【０１０９】
本発明を説明する文脈における（特に添付の特許請求の範囲の文脈における）「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という用語ならびに同様の指示対象の使用は、本明細書中に他に明記されていない限りまたは文脈によって明白に否定されていない限り、単数および複数の両方をカバーするものとして解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、他に注記されていない限り、拡張可能な用語（すなわち、「含むが、それに限定されない」ことを意味するもの）として解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲についての詳述は、本明細書中に他に明記されていない限り、範囲内に入る別個の値を個別に指す短縮方法としての役目を果たすことが意図されるものにすぎず、別個の値は、本明細書中に個別に詳述されているものとして本明細書中に組み入れる。本明細書中に記載のすべての方法は、本明細書中に他に明記されていない限りまたは文脈によって明白に否定されていない限り、任意の好適な順序で行うことができる。本明細書中に記載のあらゆるすべての例、または例示的な言葉（例えば、「ような」）の使用は、他に主張されていない限り、本発明をよりわかりやすくすることが意図されるものにすぎず、本発明の範囲について制限するものではない。本明細書中のいかなる言葉も、主張されていない何らかの要素を本発明の実施に不可欠なものとして示すものとして解釈されるべきはない。
【０１１０】
本発明の好ましい実施形態は、本明細書中に記載されており、本発明者らが知っている、本発明を実施するための最良の様式を含む。それらの好ましい実施形態の変形形態は、上記の記載を読むことによって当業者に明らかになるであろう。本発明者らは、当業者が必要に応じてこうした変形形態を用いることを予想しており、本明細書中に詳細に記載している以外の方法で本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用される法律によって許可されているように、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載の対象事項のすべての改変形態および等価形態を含む。さらに、可能なすべてのそれらの変形形態における上記の要素のいかなる組み合わせも、本明細書中に他に明記されていない限りまたは文脈によって明白に否定されていない限り、本発明によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月27日(2020.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的濃縮の方法であって、該方法は：
（ａ）反応混合物を提供するステップであって、該反応混合物は：
（ｉ）標的配列と相補的でないテールドメインと、ブロッキング基の５'およびバリエーションの部位の３'に位置する切断ドメインとを有する第１のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該テールドメインは、第１のユニバーサルプライマー配列を含み、該ブロッキング基は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３'端の末端またはその近くに結合されており、プライマー伸長を阻止するおよび／または第１のプライマーがＤＮＡ合成のためのテンプレートとして働くのを阻害する、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、
（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素で処理された核酸サンプルであって、該核酸サンプルは、標的配列を有するまたは有さない、前記核酸サンプルと、
（ｉｉｉ）切断酵素と、
（ｉｖ）ポリメラーゼと、
を含む、前記反応混合物を提供するステップ；
（ｂ）第１のプライマーを標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズさせて二本鎖基質を形成させるステップ；
（ｃ）第１のプライマーが標的と相補的である場合に、ハイブリダイズした第１のプライマーを、切断ドメイン内のまたはそれに隣接した位置で切断酵素で切断して、ブロッキング基を第１のプライマーから除去するステップ；および
（ｄ）第１のプライマーをポリメラーゼで伸長させるステップ；
を含む、前記方法。
【請求項２】
標的ＤＮＡ配列は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１酵素で処理されたサンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
方法は、第１のプライマー伸長産物のプライミングおよび伸長を支持するためのリバース方向の第２のプライマーをさらに含み；
場合により、該第２のプライマーは、第２のユニバーサルプライマー配列を含むテール
ドメインをさらに含む；
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）〜（ｄ）は、１〜１０回実行される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
未伸長プライマーを反応物から除去することと、ユニバーサルプライマーを伸長産物にハイブリダイズさせて第２の伸長産物を形成することとをさらに含み；
場合により、該ユニバーサルプライマーは、アダプター配列を第２の伸長産物に付加するためのテール付きの配列をさらに含み；
さらに場合により、シークエンシングは、標的の配列を決定するために第２の伸長産物上で行われる；
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
切断酵素は、耐熱性であり、より低い温度で低下した活性を有するホットスタート切断酵素であり；
場合により、該切断酵素は、ＲＮアーゼＨ２酵素であり；
さらに場合により、該切断酵素は、ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓａｂｙｓｓｉのＲＮアーゼＨ２酵素である；
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
切断酵素は、耐熱性であり、より低い温度で低下した活性を有する化学的に改変されたホットスタート切断酵素であり；
場合により、該ホットスタート切断酵素は、化学的に改変されたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓａｂｙｓｓｉのＲＮアーゼＨ２酵素である；
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
切断酵素は、耐熱性であり、より低い温度で低下した活性を有する、より低い温度で抗体との相互作用を通して可逆的に不活化されるホットスタート切断酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
切断ドメインは、少なくとも１個のＲＮＡ塩基を含み、切断酵素は、バリエーションに相補的な部位と該ＲＮＡ塩基との間を切断し；
場合により、該切断ドメインは、バリエーションの部位の３’に位置する少なくとも１個のＲＮＡ塩基を含み、該バリエーションの部位と該ＲＮＡ塩基との間に１個のＤＮＡ塩基を含む；
請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
切断ドメインは、１個またはそれ以上の２’改変ヌクレオシドを含み、切断酵素は、バリエーションに相補的な部位と１個またはそれ以上の該改変ヌクレオシドとの間を切断し；
場合により、１個またはそれ以上の該改変ヌクレオシドは、２’−フルオロヌクレオシドである；
請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ポリメラーゼは、高識別ポリメラーゼであり；
場合により、該ポリメラーゼは、変異型Ｈ７８４ＱＴａｑポリメラーゼであり；
さらに場合により、該変異型Ｈ７８４ＱＴａｑポリメラーゼは、化学改変、アプタマー改変または抗体改変を介して可逆的に不活化される；
請求項１に記載の方法。
【外国語明細書】
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