(57)【要約】【課題】25-OHC誘導性細胞死の抑制剤を提供する。【解決手段】ACAT阻害剤を含む、25-OHC誘導性細胞死の抑制剤である。ACAT阻害剤は例えば、K-604、F12511又はCS-505である。更にα-トコフェロールを包含することも可能である。25-OHC誘導性細胞死の抑制剤を包含する薬剤は神経原性疾患の予防及び／又は治療に使用される。神経原性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、運動ニューロン障害（ＭＮＤ）、末梢神経障害、重症筋無力症、先天性筋無力症等である。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ACAT阻害剤を含む、25-OHC誘導性細胞死の抑制剤。
【請求項２】
前記ACAT阻害剤は、下記化学式(1)で示される化合物又はその誘導体を含むことを特徴とする請求項１に記載の25-OHC誘導性細胞死の抑制剤。
【化１】
2020196694.tif 000006
【請求項３】
前記ACAT阻害剤は、下記化学式(2)で示される化合物又はその誘導体を含むことを特徴とする請求項１に記載の25-OHC誘導性細胞死の抑制剤。
【化２】
2020196694.tif 000007
【請求項４】
前記ACAT阻害剤は、下記化学式(3)で示される化合物又はその誘導体を含むことを特徴とする請求項１に記載の25-OHC誘導性細胞死の抑制剤。
【化３】
2020196694.tif 000008
【請求項５】
更に、α-トコフェロール、β-トコフェロール、γ-トコフェロール、及び、δ-トコフェロールの少なくとも何れか一つを包含することを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の25-OHC誘導性細胞死の抑制剤。
【請求項６】
更に、α-トコフェロールを包含することを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の25-OHC誘導性細胞死の抑制剤。
【請求項７】
前記25-OHC誘導性細胞死は神経細胞の細胞死であることを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項に記載の25-OHC誘導性細胞死の抑制剤。
【請求項８】
前記神経細胞は、運動神経細胞であることを特徴とする請求項７に記載の25-OHC誘導性細胞死の抑制剤。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか１項に記載の抑制剤を包含することを特徴とする神経原性疾患の予防及び／又は治療のための薬剤。
【請求項１０】
前記神経原性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、運動ニューロン障害（ＭＮＤ）、末梢神経障害、重症筋無力症、先天性筋無力症、及び、神経筋接合部疾患からなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の薬剤。
【請求項１１】
α-トコフェロール、β-トコフェロール、γ-トコフェロール、及び、δ-トコフェロールの少なくとも何れか一つを包含することを特徴とする25-OHC誘導性細胞死の抑制剤。
【請求項１２】
α-トコフェロールを包含することを特徴とする25-OHC誘導性細胞死の抑制剤。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の抑制剤を包含することを特徴とする神経原性疾患の予防及び／又は治療のための薬剤。
【請求項１４】
前記神経原性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、運動ニューロン障害（ＭＮＤ）、末梢神経障害、重症筋無力症、先天性筋無力症、及び、神経筋接合部疾患からなる群から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、25-OHC誘導性細胞死の抑制剤に関する。また、本発明は、神経原性疾患の予防及び／又は治療のための薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体膜は、脂質膜と膜タンパク質とからなり、コレステロールはその脂質膜の主要成分であるリン脂質の分子間に入り込み、膜タンパク質にとって最適な膜の構造や物性になるように調節する重要な役割を担っている。体内ではコレステロールはフリーラジカルとの反応又は代謝の過程により様々な酸化体である酸化ステロールとなる。炭化水素鎖のC25位が酸化した25-hydroxycholesterol(25-OHC)は酵素(Cholesterol 25-hydroxylase)の作用によって産生し、さまざまな生理活性を持つ一方で、細胞毒性を持つことが知られている。
【０００３】
筋萎縮性側索硬化症(ALS)患者の脳内や血清中で増加することが知られている25-OHCは運動神経細胞に細胞死を誘導することが示されており、ALSの発症への関与が示唆されている(非特許文献１)。しかしながら、24S-OHC誘導性細胞死はACATが関与している(特許文献1)等報告されているが、25-OHC誘導性細胞死のメカニズムはほとんど分かっていない。
【０００４】
脳の中で余分に合成されたコレステロールはそのままでは代謝できないのでコレステロール24-ヒドロキシラーゼ(CYP46A1)という酵素の働きによって24S-hydroxycholesterol(24S-OHC)に形を変えて脳外へ排出されるが、アルツハイマー病初期患者の脳内では24S-OHCの量が増えており24S-OHCの脳神経への影響が示唆されている。
【０００５】
コレステロールは細胞膜を構成する重要な脂質であるが過剰に増えると細胞にダメージを与えるため、小胞体に存在するAcyl-CoA:cholesterol acyltransferase/Sterol O-acyltransferase (ACAT/SOAT)の働きによってコレステロールがエステル化され、細胞の中に脂肪滴として蓄えることでその毒性が抑制される。24S-OHC誘導性細胞死においてはACATによる24S-OHCのエステル化とそれに伴う脂肪滴様構造の形成が重要であり、ACAT阻害剤によれば脂肪滴様構造が消えるとともに24S-OHCに関わる細胞死を抑制することが確認されている(特許文献1)。しかしながらACAT阻害剤が25-OHC誘導性の細胞死を抑制できるか否かについては解明されていない。また24S-OHC誘導性細胞死は、ビタミンEの一種であるα-Tocopherol(以下α-Tocと記載することがある。)やγ-Tocopherol(以下、γ-Tocと記載することがある。)で抑制されることが確認されている(非特許文献２，３)。しかしながらα-Tocやγ-Tocが25-OHC誘導性の細胞死を抑制できるか否かについても解明されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許６１４３４３５号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】25-Hydroxycholesterol is involved in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis, Sung-Min Kim et al, Oncotarget, 8 (2017) 11855-11867
【非特許文献２】Tocopherol suppresses 24(S)-hydroxycholesterol-induced cell deathvia inhibition of CaMKII phosphorylation, Yasuomi Urano et al, Biochimie, 153 (2018) 203-209
【非特許文献３】Effect of vitamin E on 24(S)-hydroxycholesterol-induced necroptosis-like cell death and apoptosis, Yasuomi Urano et al, Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 169 (2017) 69-76
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、25-OHC誘導性細胞死の抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明にかかる25-OHC誘導性細胞死の抑制剤は、ACAT阻害剤を含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明にかかる25-OHC誘導性細胞死の抑制剤は、α-Toc、β-Toc、γ-Toc、及び、δ-Tocの少なくとも何れか一つを包含することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、25-OHC誘導性細胞死を適切に抑制できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】K-604及びCS-505の25-OHC誘導性細胞死の抑制効果を示す図である。
【図２】F12511の25-OHC誘導性細胞死の抑制効果を示す図である。
【図３】K-604、CS-505及びF12511について25-OHC誘導性細胞死の抑制効果を比較検討する図である。
【図４】K-604及びα-Tocの25-OHC誘導性細胞死の抑制効果を示す図である。
【図５】K-604、α-Toc及びα-Tocotrienol (以下α-Toc3と記載することがある。)の25-OHC誘導性細胞死の抑制効果を示す図である。
【図６】Bodipy陽性構造を観察する写真図である。
【図７】25-OHC誘導性細胞死がCaspase依存的細胞死であるか確認するWestern Blottingの写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１４】
本実施形態にかかる25-OHC誘導性細胞死の抑制剤は、ACAT阻害剤を含む。
【００１５】
コレステロールの25位の炭素がCholesterol 25-hydroxylase によって水酸化された25-OHCは、免疫系においてIgAの産生を抑制する等の役割を持つ一方、ALS患者の脳脊髄液や血清中において増加しており、運動ニューロンに細胞死を誘導する。
【００１６】
25-OHC誘導性細胞死は25-OHCの存在によって誘導される細胞死を意味し、その細胞死形態や機序は特に限定されない。25-OHC誘導性細胞死にはアポトーシス及びネクロトーシスの両方が含まれる。
【００１７】
ACATは、ステロール及び酸化ステロールのエステル化を触媒する酵素である。ACAT阻害剤は、その触媒活性を阻害する活性を有する物質であり、特に限定されるものではないが、例えば、K-604、F12511、CS-505、FR145237、F-1394、Dup128、E5324、 CI277082、NTE-122、CI-976、CI-1011、AS-183、KW-3033、FY 087、FCE 27677、TEI 6522、RP 73163、FR179254、S 58-035、エルダシミベ、オクチミバート等を例示することができる。ACAT阻害剤の含有量は、例えば、10 nM、50 nM、100 nM、500 nM、750 nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μMであるが、これらに限定されない。好ましくは、50 nM〜10μMである。
【００１８】
ACAT阻害剤は、好ましくは下記に示されるK-604又はその誘導体である。
【００１９】
【化１】
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【００２０】
また、ACAT阻害剤は、好ましくは下記に示されるF12511又はその誘導体である。
【００２１】
【化２】
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【００２２】
また、ACAT阻害剤は、好ましくは下記に示されるCS-505又はその誘導体である。
【００２３】
【化３】
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【００２４】
ACAT阻害剤は、ACATをコードする遺伝子の発現を抑制することによりACATの働きを阻害することが可能な核酸分子であってもよい。そのような核酸分子としては、ACATをコードするポリヌクレオチドを標的としたアンチセンス鎖、siRNA、miRNA、shRNA、リボザイム、又はこれらを含むベクターを挙げることできる。
【００２５】
ACATにはACAT1及びACAT2という２種類のアイソザイムの存在が知られている。ACAT1は多くの組織の細胞に存在するのに対し、ACAT2は小腸及び肝臓に特異的に発現していると考えられる。ACAT阻害剤は、ACAT1とACAT2のいずれかを特異的に阻害してもよく、両方を阻害するものであっても良い。
【００２６】
ビタミンEは脂溶性のビタミンで、クロマン環のメチル基の数と位置によってα・β・γ・δの四種類に分けられ、そしてさらに尾部の二重結合の有無によってそれぞれTocとToc3の計8種類に分類される。一般的に知られている作用として抗酸化作用があり、この抗酸化作用は主にクロマン環のヒドロキシ基から水素を供与することによって起きる。ビタミンEの同族体間の活性の差はTocでα・β＝γ・δの順になっている。ヒトはビタミンEを生合成できないため、必要なビタミンEはすべて食事由来となっており、食事由来のビタミンEは胆汁酸等と一緒にミセルを形成し、小腸から吸収される。そしてキロミクロンによって同族体の違いに関係なく結合し、体内を循環するが、肝臓へ運ばれたビタミンEはここでα-Tocの選択性が非常に高いα-Toc輸送タンパク質によって選択的にVLDLへ組み込まれ、再び体内を循環する。そして体内のVLDL受容体やLDL受容体によってα-Tocが細胞へと分配されるため、ヒトの体内に存在するビタミンEはα-Tocがほとんどである。細胞へ分配されたα-Tocは脂溶性のため、細胞質にはほぼ存在せず、細胞膜や小胞体といった細胞内オルガネラの膜中に存在している。
【００２７】
本実施形態にかかる25-OHC誘導性細胞死の抑制剤は、α-Toc、β-Toc、γ-Toc、及び、δ-Tocの少なくとも何れか一つを包含する。好ましくは本実施形態にかかる25-OHC誘導性細胞死の抑制剤は、α-Tocを包含する。α-Toc、β-Toc、γ-Toc、及び、δ-Tocの少なくとも何れか一つを包含する場合、その含有量は、例えば、10 nM、50 nM、100 nM、500 nM、750 nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μMであるが、これらに限定されない。好ましくは、100 nM〜80μMである。
【００２８】
本実施形態にかかる25-OHC誘導性細胞死の抑制剤は、ACAT阻害剤に加えて、α-Toc、β-Toc、γ-Toc、及び、δ-Tocの少なくとも何れか一つを包含することも可能である。好ましくは、本実施形態にかかる25-OHC誘導性細胞死の抑制剤は、ACAT阻害剤と、α-Tocとを包含する。
【００２９】
本実施形態にかかる発明において、25-OHC誘導性細胞死が抑制される細胞は、例えば神経細胞である。神経細胞は、例えば脳内に存在する神経細胞とすることもでき、好ましくは運動神経細胞である。本実施形態にかかる発明において、25-OHC誘導性細胞死が抑制される細胞は、星状細胞、小膠細胞、希突起膠細胞等のグリア細胞を対象とすることも可能である。
【００３０】
本実施形態にかかる25-OHC誘導性細胞死の抑制剤においては、ACAT阻害剤のみからなっていても良く、トコフェロール(α-Toc、β-Toc、γ-Toc及びδ-Tocの少なくとも何れか一つを包含する)のみからなっていても良く、ACAT阻害剤及びトコフェロール(α-Toc、β-Toc、γ-Toc及びδ-Tocの少なくとも何れか一つを包含する)のみからなっても良く、更には任意の他の成分を含んでいても良い。
【００３１】
本実施形態にかかる薬剤は、前述の25-OHC誘導性細胞死の抑制剤を包含する神経原性疾患の予防及び／又は治療のための薬剤である。
【００３２】
神経原性疾患は、例えば、ＡＬＳ、運動ニューロン障害（ＭＮＤ）、末梢神経障害、重症筋無力症、先天性筋無力症、及び、神経筋接合部疾患からなる群から選択される。なお、本実施形態にかかる薬剤は、前述の25-OHC誘導性細胞死の抑制剤を包含する神経変性疾患の予防及び／又は治療のための薬剤とすることも可能であり、神経変性疾患には例えばパーキンソン病、多発性硬化症、アルツハイマー病等が包含される。
【００３３】
本明細書において「予防」には疾患の発症を抑えること及び遅延させることが含まれ、疾患になる前の予防だけでなく、治療後の疾患の再発に対する予防も含まれる。一方、「治療」には、症状を治癒すること、症状を改善すること及び症状の進行を抑えることが含まれる。
【００３４】
本実施形態にかかる薬剤は、薬学的許容される担体と組み合わせて種々の剤形とすることができる。
【００３５】
薬学的に許容される担体としては、製剤の技術分野において賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として使用される各種の有機又は無機担体物質を挙げることができる。
【００３６】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、Ｄ-マンニトール、塩化ナトリウム、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウム、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、ホウ酸末、コロイドシリカ等が挙げられる。結合剤としては、例えば、デキストリン、デンプン液、ゼラチン溶液、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００３７】
崩壊剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ナミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム等が挙げられる。溶剤としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ-マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００３８】
懸濁化剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、及び、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ-マンニトール等が挙げられる。緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール等が挙げられる。
【００３９】
薬剤には、担体の他に、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等添加物を用いることもできる。防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸等が挙げられる。
【００４０】
本実施形態にかかる薬剤は、その剤形に応じて経口的又は非経口的に哺乳動物（例、マウス、ラット、イヌ、サル、ヒト等）に安全に投与することができる。例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、又は懸濁剤等の剤形で調製する場合は、経口投与が適しており、注射剤、坐剤又は舌下錠等の剤形で調製する場合は、静脈内、皮下又は筋肉内等への非経口投与が適している。投与量は、症状の程度、投与対象の年齢、性別、体重、投与の時期、間隔、医薬製剤の性質、種類、ACAT阻害剤やトコフェロールの種類等によって異なり、特に限定されないが、通常、成人に対して１日に当たり、ACAT阻害剤の量で又はトコフェロールの量で、約１０ μｇ〜１００ ｍｇ／ｋｇ体重とすることができる。
【実施例】
【００４１】
(1)実施例１
WST8 assayにより、K-604又はCS-505が、25-OHC誘導性細胞死を抑制できるか検討した。WST-8 assayは細胞の還元能力を利用して、細胞生存率を測定する方法である。WST-8は乳酸脱水素酵素の補酵素であるnicotinamide adenine dinucleotide (NADH) から電子伝達物質を介して、電子を受けとって還元され、オレンジ色のWST-8ホルマザンが産生される。このホルマザンの量を比色定量することで細胞数が測定される。
【００４２】
ヒト神経芽細胞腫（SH-SY5Y細胞）は、European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC)から購入したものを培養して使用した。培地500 mlに対し、56℃で30分間処理し非働化したFBS 50 mlと、Penicillin-Streptomycin 溶液5 mlを含む DMEM-F12 培地を用いた。0.25％ trypsin EDTAはPBSで5倍希釈し、0.05％ Trypsin EDTAとして使用した。
【００４３】
SH-SY5Y細胞の継代の手順としては、サブコンフルエントになった100 mm dish (FPI)から培地を除去して5 mlのPBSで洗浄した。PBS除去後、trypsin EDTA溶液を1 ml添加し30秒ほど静置した。その後1 mlの培地を添加して細胞を回収した。室温で1,000 rpm、5分間遠心を行い、上清を除去した。培地を1 ml添加して細胞をしっかり懸濁し、さらに培地を2 ml加えて懸濁した。トリパンブルーによって染色を行い、ノイバウエル血球計算版（ヱルマ販売株式会社）を用いて、細胞数をカウントした。1.9×106 cells/ml、10 ml/dishで播種し、37℃の5％CO2インキュベーター内で培養を行った。
【００４４】
96 well plateに1.2×104 cells/mlの濃度の細胞懸濁液を100 μlそれぞれのwellに播種した。96 well plateに細胞を播種した24時間後、10 mM K-604のストック溶液を培地で希釈し、5 μMになるよう培地交換によって前処理した。その30分後、25-OHCの10 mMのストック溶液を、終濃度30 μMになるよう培地で希釈し、培地交換によって刺激した。24時間後に、WST-8 assayにより細胞生存率の測定を行った。また、96 well plateに細胞を播種した24時間後、CS-505を10 mMのストック溶液を培地で希釈し、5 μMになるよう培地交換によって前処理した。その30分後、10 mM 25-OHCのストック溶液を、終濃度30 μMになるよう培地で希釈し、培地交換によって刺激した。24時間後に、WST-8 assayにより細胞生存率の測定を行った。
【００４５】
統計処理はエクセル統計に従い、分散分析の結果、水準間に差があると認められたとき、Tukey-Kramer法によって多重比較検定を行った。危険率5％で有意差があるものと判断した。
【００４６】
その結果、K-604でもCS-505でも25-OHC誘導性細胞死は抑制された（図１）。このことから、25-OHC誘導性細胞死はエステル化が関与していることが示唆された。
【００４７】
(2)実施例2
WST8 assayにより、F12511が、25-OHC誘導性細胞死を抑制できるか検討した。96 well plateに1.2×104cells/mlの濃度のSH-SY5Y細胞の細胞懸濁液を100μlそれぞれのwellに播種した。96 well plateに細胞を播種した24時間後、10 mM F12511のストック溶液を培地で希釈し、5 μMになるよう培地交換によって前処理した。その30分後、10 mM 25-OHCのストック溶液を、終濃度30 μMになるよう培地で希釈し、培地交換によって刺激した。24時間後に、WST-8 assayにより細胞生存率の測定を行った。その結果、F12511でも25-OHC誘導性細胞死は抑制された(図２)。
【００４８】
(3)実施例3
WST8 assayにより、K-604、CS-505及びF12511について、25-OHC誘導性細胞死の抑制の程度を比較した。96 well plateに1.2×104 cells/mlの濃度のSH-SY5Y細胞の細胞懸濁液を100 μlそれぞれのwellに播種した。96 well plateに細胞を播種した24時間後、K-604、CS-505及びF12511について、それぞれを10 mMのストック溶液を培地で希釈し、0.1 μMになるよう培地交換によって前処理した。その30分後、10 mM 25-OHCのストック溶液を、終濃度30 μMになるよう培地で希釈し、培地交換によって刺激した。24時間後に、WST-8 assayにより細胞生存率の測定を行った。その結果、K-604は25-OHC誘導性細胞死の抑制能が一番高いものであり、次にF12511が25-OHC誘導性細胞死の抑制能が高く、CS-505の25-OHC誘導性細胞死の抑制能は一番低いものであった(図３)。
【００４９】
(4)実施例4
WST8 assayにより、SH-SY5Y細胞において、K-604及び／又はα-Tocによる25-OHC誘導性細胞死の阻害活性を試験した。96 well plateに1.2×104 cells/mlの濃度のSH-SY5Y細胞の細胞懸濁液を100 μlそれぞれのwellに播種した。96 well plateに細胞を播種した24時間後、10 mM K-604のストック溶液を培地で希釈し、5 μMになるよう培地交換によって前処理した。その30分後、10 mM 25-OHCのストック溶液を、終濃度30 μMになるよう培地で希釈し、培地交換によって刺激した。24時間後に、WST-8 assayにより細胞生存率の測定を行った。96 well plateに細胞を播種した24時間後、10 mM α-Tocのストック溶液を培地で希釈し、50 μMになるよう培地交換によって前処理した。その30分後、10 mM 25-OHCのストック溶液を、終濃度30 μMになるよう培地で希釈し、培地交換によって刺激した。24時間後に、WST-8 assayにより細胞生存率の測定を行った。96 well plateに細胞を播種した24時間後、10 mM K-604のストック溶液を培地で希釈し5 μMになるとともに、10 mM α-Tocのストック溶液を培地で希釈し50 μMになるよう培地交換によって前処理した。その30分後、10 mM 25-OHCのストック溶液を、終濃度30 μMになるよう培地で希釈し、培地交換によって刺激した。24時間後に、WST-8 assayにより細胞生存率の測定を行った。その結果、K-604もα-Tocも25-OHC誘導性細胞死の抑制能は高いものであり、K-604及びα-Tocを同時に添加した場合は更に25-OHC誘導性細胞死の抑制能が高くなることが判明した(図４)。
【００５０】
(5)実施例5
WST-8 assayにより、SH-SY5Y細胞において、α-Tocとα-Toc3とについての25-OHC誘導性細胞死の阻害活性を試験した。96 well plateに1.2×104 cells/mlの濃度のSH-SY5Y細胞の細胞懸濁液を100 μlそれぞれのwellに播種した。96 well plateに細胞を播種した24時間後、10 mM α-Tocのストック溶液を培地で希釈し、50 μMになるよう培地交換によって前処理した。その30分後、10 mM 25-OHCのストック溶液を、終濃度30 μMになるよう培地で希釈し、培地交換によって刺激した。24時間後に、WST-8 assayにより細胞生存率の測定を行った。96 well plateに細胞を播種した24時間後、10 mM α-Toc3のストック溶液を培地で希釈し、50 μMになるよう培地交換によって前処理した。その30分後、10 mM 25-OHCのストック溶液を、終濃度30 μMになるよう培地で希釈し、培地交換によって刺激した。24時間後に、WST-8 assayにより細胞生存率の測定を行った。96 well plateに細胞を播種した24時間後、10 mM K-604のストック溶液を培地で希釈し、5 μMになるよう培地交換によって前処理した。その30分後、10 mM 25-OHCのストック溶液を、終濃度30 μMになるよう培地で希釈し、培地交換によって刺激した。24時間後に、WST-8 assayにより細胞生存率の測定を行った。その結果、α-TocはK-604と同じくらいに25-OHC誘導性細胞死の抑制能は高いものであるが、α-Toc3では25-OHC誘導性細胞死は抑制されないことが判明した(図５)。
【００５１】
(6)実施例6
蛍光色素であるHoechst 33342は、DNAの二重らせん中のAT配列に結合する蛍光色素である。Hoechst 33342は生細胞に取り込まれ核染色剤として用いた。Bodipy 493/503 (Bodipy)はより高感度かつS / N比が高い中性脂質を染める染色剤で、脂肪滴様構造の染色剤として用いた。
【００５２】
手順としては、6 well plateに4.0×105cells/mlの濃度のSH-SY5Y細胞の細胞懸濁液を2 mlそれぞれのwellに播種した。細胞を播種した24時間後、10 mM 25-OHCのストック溶液を培地で希釈し、終濃度30 μMになるよう処理をした。このとき、10 mMのK-604、α-Tocのストック溶液を培地で希釈しK-604は5 μM、α-Tocは50 μMで25-OHCと同時に刺激した。刺激を行った6時間後に染色した。染色は培地除去後、PBS (+)  1 ml/wellでwashを2回行い、4% Paraformaldehyde溶液を1 ml/wellを加えて、遮光30分処理で細胞を固定した。固定後、PBS (−)で3回washし、DMSOに溶解しているBodipy (1 mg/ml)を終濃度0.5 μg/mlになるようにPBS (−) で希釈後、1 ml/well加え、遮光して15分静置処理を行った。次に、3回PBS wash後、Hoechst 33342 (1 mg/ml) を終濃度1 μg/mlになるようにPBS (−)で希釈後、1 ml/well加え、遮光して5分静置処理を行った。その後PBSで3回washし、3回目のPBS (−)を入れた状態のまま、蛍光顕微鏡を用いて解析した。
【００５３】
その結果、25-OHC添加によりBodipy陽性構造が観察された(図６)。またこのBodipy陽性構造はK-604で形成が抑制された(図６)。またα-TocではBodipy陽性構造の形成は抑制されなかった(図６)。以上のことから、25-OHC誘導性細胞死はエステル化依存的細胞死である可能性が考えられた。またトコフェロールはBodipy陽性構造形成の抑制を伴わず細胞死抑制効果を示したことから、ACAT阻害とは異なるメカニズムにより細胞死を抑制している可能性が考えられた。
【００５４】
(7)実施例7
25-OHC誘導性細胞死がCaspase依存的細胞死であるか確認するため、Caspase依存性アポトーシス誘導剤であるStaurosporine (STS)をポジティブコントロールとして、Western Blotting法を用いてCaspase 3の活性化を確認した。まず、SH-SY5Y細胞に終濃度が30 μMとなるよう培地で希釈した25-OHCと、終濃度が1 μMとなるよう培地で希釈したSTSを細胞に添加し、6時間後（25-OHC）又は3時間後（STS）に回収、その後、Western Blotting法を用いた。その結果、25-OHC処理細胞では、STS処理細胞で観察された活性型Caspase 3が観察されなかった(図７)。これらの結果から、25-OHC誘導性細胞死はCaspase依存的細胞死ではないことが分かった。SH-SY5Y細胞において、24S-OHC誘導性細胞死の細胞死形態の決定にはCaspaseが重要であるが、25-OHC誘導性神経細胞死はCaspase依存的細胞死ではない。そのためACAT阻害剤の24S-OHC誘導性細胞死への適用結果が、ACAT阻害剤の25-OHC誘導性細胞死への適用結果を必ずしも示唆されるものでないと思われる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
神経原性疾患の治療に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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