(57)【要約】【課題】高い純度で精製されたタンパク質を簡便に製造できる方法を提供すること。【解決手段】目的タンパク質、夾雑物及び酸性化合物とこれらが溶解している水とを含有する酸性のタンパク質水溶液のｐＨを上昇させ、それによって夾雑物を含む沈殿物を析出させる工程と、析出した沈殿物と目的タンパク質を含む上清とを分離する工程と、を備える、精製されたタンパク質を製造する方法が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質、夾雑物及び酸性化合物とこれらが溶解している水とを含有する酸性のタンパク質水溶液のｐＨを上昇させ、それによって前記夾雑物を含む沈殿物を析出させる工程と、
析出した前記沈殿物と前記目的タンパク質を含む上清とを分離する工程と、
を備える、精製されたタンパク質を製造する方法。
【請求項２】
前記タンパク質が構造タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記構造タンパク質がフィブロイン又はケラチンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記酸性のタンパク質水溶液のｐＨを２．８未満の上昇幅で上昇させ、それによって前記夾雑物を含む前記沈殿物を析出させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
塩基性化合物の添加によって前記酸性のタンパク質水溶液のｐＨを上昇させ、それによって前記夾雑物を含む前記沈殿物を析出させる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記酸性のタンパク質水溶液に含まれる前記酸性化合物の酸当量に対する、添加される前記塩基性化合物の塩基当量の比が０．５５未満である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記酸性化合物がカルボン酸を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記カルボン酸が酢酸である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酸性のタンパク質水溶液における前記カルボン酸の濃度が、前記酸性のタンパク質水溶液の体積を基準として、５．２ｍｏｌ／Ｌを超えて１５ｍｏｌ／Ｌ未満である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記目的タンパク質及び前記夾雑物を含む粗原料と前記酸性化合物を含む酸水溶液とを含有する混合物中で前記目的タンパク質及び前記夾雑物を前記酸水溶液に溶解させて、前記酸性のタンパク質水溶液を得る工程を更に備える、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記混合物を加温しながら、前記目的タンパク質及び前記夾雑物を前記酸水溶液に溶解させて、前記酸性のタンパク質水溶液を得る、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記目的タンパク質及び前記夾雑物が、前記目的タンパク質を産生した宿主細胞を含む培養物から取り出されたものである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精製されたタンパク質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、目的タンパク質を精製する各種の方法が知られている。例えば、タンパク質の一種であるクモ糸フィブロインの精製方法として、ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）を用いる方法（非特許文献１）、有機酸を含む溶媒を用いる方法（特許文献１）、及び、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いる方法（特許文献２）が検討されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００４−５０３２０４号公報
【特許文献２】特許第５４２７３２２号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ,  ３１：６７３３  （１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
有機酸を含む溶媒を用いる方法は、比較的安価な材料及び設備を用いて実施可能で、精製操作が簡便という利点を有している。しかし、この方法では十分に高い純度までタンパク質を精製することが困難であった。
【０００６】
そこで、本発明の一側面の目的は、高い純度で精製されたタンパク質を簡便に製造できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一側面は、目的タンパク質、夾雑物及び酸とこれらが溶解している水とを含有する酸性のタンパク質水溶液のｐＨを上昇させ、それによって夾雑物を含む沈殿物を析出させる工程と、析出した沈殿物と目的タンパク質を含む上清とを分離する工程と、を備える、精製されたタンパク質を製造する方法を提供する。
【０００８】
この方法によれば、高い純度で精製されたタンパク質を簡便に製造することができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の一側面によれば、高い純度で精製されたタンパク質を簡便に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】試験例１で検討した、タンパク質水溶液から得た上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。
【図２】試験例１で検討した、タンパク質水溶液から得た沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。
【図３】試験例２で検討した、タンパク質水溶液から得た上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。
【図４】試験例２で検討した、タンパク質水溶液から得た沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。
【図５】試験例３で検討した、タンパク質水溶液から得た沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。
【図６】試験例３で検討した、タンパク質水溶液から得た沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。
【図７】試験例３で検討した、タンパク質水溶液から得た沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。
【図８】試験例４で検討した、タンパク質水溶液から得た上清及び沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。
【図９】試験例５で検討した、タンパク質水溶液から得た上清及び沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明のいくつかの実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１２】
精製されたタンパク質を製造する方法の一実施形態は、目的タンパク質及び夾雑物とこれらが溶解している水とを含有する酸性のタンパク質水溶液のｐＨを上昇させ、それによって夾雑物を含む沈殿物を析出させる工程と、析出した沈殿物と目的タンパク質を含む上清とを分離する工程と、を備える。
【００１３】
この方法によれば、精製すべき目的タンパク質と、目的タンパク質以外の夾雑物とを含む粗原料から、夾雑物の大部分を除去して、精製された目的タンパク質を回収することができる。
【００１４】
＜目的タンパク質＞
目的タンパク質の種類に制限はない。目的タンパク質は、遺伝子組換え技術により微生物等で製造されたものであってもよく、化学合成によって製造されたものであってもよい。あるいは、目的タンパク質は、天然原料から取得したタンパク質であってもよい。
【００１５】
目的タンパク質は、特に、構造タンパク質であってもよい。構造タンパク質は、生体構造を構築する役割を有するタンパク質であり、酵素、ホルモン、抗体等の機能タンパク質とは異なる。構造タンパク質は、水溶液中でその立体構造を維持し易いため、水溶液のｐＨが変化したときに、凝集して沈殿物として析出し難いと考えられる。そのため、ｐＨの上昇をともなう本実施形態の方法は、構造タンパク質の精製のために特に適用し易い。
【００１６】
構造タンパク質の例としては、フィブロイン、コラ−ゲン、レシリン、エラスチン及びケラチン等の天然型構造タンパク質を挙げることができる。構造タンパク質は、フィブロイン又はケラチンであってもよい。フィブロインの例としては、昆虫又はクモが産生するフィブロインが挙げられる。
【００１７】
昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ  ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ  Ｃｙｎｔｈｉａ  ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｍｙｌｉｔｔａ）、及びムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質（絹フィブロイン）、並びに、スズメバチ（Ｖｅｓｐａ  ｓｉｍｉｌｌｉｍａ  ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
【００１８】
絹フィブロインは、天然若しくは家蚕の繭、又は中古若しくは廃棄のシルク生地を原料とし、フィブロインを覆うセリシン、及びその他の脂肪分等を除去して精製したものである。絹フィブロインは、精製したフィブロインを凍結乾燥して得られた粉末でってもよい。
【００１９】
昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、ＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
【００２０】
クモは、最大７種類の絹糸腺を有しており、それらから互いに性質の異なるフィブロイン（クモ糸フィブロイン、又はスパイダーシルクタンパク質）を産生する。その例としては、大吐糸管しおり糸タンパク質、横糸タンパク質、及び小瓶状腺タンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質は、その源泉の器官によって異なる形態を有しており、例えば、高い靭性を有する大瓶状スパイダータンパク質（ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭａＳｐ）、高度な伸長力を有する小瓶状スパイダータンパク質（ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭｉＳｐ）、並びに鞭状（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ（Ｆｌａｇ））、管状（ｔｕｂｕｌｉｆｏｒｍ）、集合（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）、ブドウ状（ａｃｉｎｉｆｏｒｍ）又はナシ状（ｐｙｒｉｆｏｒｍ）のスパイダーシルクタンパク質がある。
【００２１】
クモ糸フィブロイン（又はスパイダーシルクタンパク質）を産生するクモとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが挙げられる。
【００２２】
クモ糸フィブロイン（又はスパイダーシルクタンパク質）を産生するアシナガグモ科のクモとしては、例えば、アシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが挙げられる。
【００２３】
スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
【００２４】
クモが産生するクモ糸フィブロインのより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ−３（ａｄｆ−３）［Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ−４（ａｄｆ−４）［Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ２［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、及び、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ  ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）が挙げられる。
【００２５】
天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ  ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
【００２６】
目的タンパク質は、以上例示した天然型タンパク質に由来するポリペプチド、すなわち人造ポリペプチドであってもよい。例えば、人造ポリペプチドたる組換えフィブロインは、いくつかの異種タンパク質生産系で産生されており、その製造方法として、トランスジェニック・ヤギ、トランスジェニック・カイコ、又は組換え植物若しくは哺乳類細胞が利用されている。
【００２７】
組換えフィブロインは、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列、又は天然由来のフィブロインのアミノ酸配列に１若しくは複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／若しくは付加したものであってもよい。このように改変されたアミノ酸配列を設計し、それをコードする核酸を化学合成することにより、組換えフィブロインを得ることもできる。
【００２８】
クモ糸フィブロインの一種である大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えポリペプチドは、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質（式１中、（Ａ）ｎモチーフは４〜２０アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が７０％以上である。ＲＥＰは１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは５〜３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）であることができる。大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えポリペプチドの具体例としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。
【００２９】
横糸タンパク質に由来するタンパク質としては、例えば、式２：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（式２中、ＲＥＰ２はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘはアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選ばれる一つのアミノ酸を示す。ｏは８〜３００の整数を示す。）を挙げることができる。横糸タンパク質に由来するタンパク質の具体例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号２で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）のリピート部分及びモチーフに該当するＮ末端から１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列（ＰＲ１配列と記す。）と、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３８８４７、ＧＩ：２８３３６４９）のＣ末端から８１６残基目から９０７残基目までのＣ末端アミノ酸配列を結合し、結合した配列のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００３０】
コラーゲンの組換えポリペプチドとして、例えば、式３：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（式３中、ｐは５〜３００の整数を示す。ＲＥＰ３は、Ｇｌｙ一Ｘ一Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。コラーゲンの組換えポリペプチドの具体例としては、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号３で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００３１】
レシリンの組換えポリペプチドとして、例えば、式４：［ＲＥＰ４］ｑで表されるドメイン配列を含むタンパク質（式３中、ｑは４〜３００の整数を示す。ＲＥＰ４はＳｅｒ一Ｊ一Ｊ一Ｔｙｒ一Ｇｌｙ一Ｕ−Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であってもよい。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。レシリンの組換えポリペプチドの具体例としては、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ  ６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに置換し、かつ９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００３２】
エラスチンの組換えポリペプチドとして、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。エラスチンの組換えポリペプチドの具体例としては、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号５で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００３３】
ケラチンの組換えポリペプチドとして、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。ケラチンの組換えポリペプチドの具体例としては、配列番号６で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。
【００３４】
目的タンパク質としての組換えポリペプチドは、以上例示した組換えポリペプチドのアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドであってもよい。
【００３５】
組換えポリペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、組換えフィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
【００３６】
タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による組換えフィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列）が挙げられる。
【００３７】
グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
【００３８】
抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に組換えフィブロインを精製することができる。
【００３９】
特定のプロテアーゼで切り離すことが可能なタグ配列も使用することができる。このタグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した組換えフィブロインを回収することもできる。
【００４０】
＜タンパク質水溶液＞
一実施形態に係るタンパク質水溶液は、目的タンパク質及び夾雑物とこれらが溶解している水とを含有する酸性の水溶液である。タンパク質水溶液は、目的タンパク質を産生した培養物等に由来する不溶物を含んでいてもよいし、不溶物を含む粗原料から遠心分離等によって回収した上清から調製されたものであってもよい。
【００４１】
タンパク質水溶液は、例えば、目的タンパク質及び夾雑物を含む粗原料と酸性化合物を含む酸水溶液とを混合し、得られた混合物中で酸水溶液に目的タンパク質を溶解させて、作製される。
【００４２】
酸性化合物は、水に溶解して酸性の水溶液を形成する化合物である。この酸性化合物及びこれを含む酸水溶液は、粗原料に含まれる目的タンパク質を溶解可能なものであれば、その種類が特に限定されるものではなく、原料に含まれるタンパク質種類に応じて、適宜に決定される。例えば、タンパク質がクモ糸フィブロインである場合には、酸水溶液が含む酸性化合物は、カルボン酸等の有機酸であってもよい。カルボン酸は、例えば酢酸、ギ酸、及びプロピオン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種であってもよい。クモ糸フィブロインは、酸性化合物としてカルボン酸を含む酸水溶液に対して高い溶解度を有する傾向があるため、カルボン酸を用いることにより、高濃度のタンパク質水溶液が得られ易い。
【００４３】
酸水溶液又はタンパク質水溶液は、目的タンパク質が溶解可能な範囲で、水と相溶性のあるその他の溶媒を含んでいてもよい。その他の溶媒としては、例えば、メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）、アセトン、トリクロロ酢酸、アセトニトリル、炭酸ブチレン、炭酸プロピレン、炭酸エチレン、ブチロラクトン、テトラヒドロフラン、及びアルコール（メタノール、エタノール、プロパノールなど）が挙げられる。
【００４４】
酸水溶液の酸性化合物の濃度も何等限定されるものではなく、原料に含まれる目的たんぱく質の種類、及び酸の種類等に応じて適宜に決定される。例えば、タンパク質水溶液（特に、クモ糸フィブロイン水溶液）を作製するためにカルボン酸（特に、モノカルボン酸）が用いられる場合、カルボン酸水溶液の濃度は、カルボン酸水溶液の体積を基準として、５．０ｍｏｌ／Ｌ以上１５．０ｍｏｌ／Ｌ以下であってもよい。カルボン酸水溶液の濃度が５．０ｍｏｌ／Ｌ未満である、又は１５．０ｍｏｌ／Ｌを超えると、カルボン酸水溶液への目的タンパク質の溶解量が小さくなって、精製効率が相対的に低下する可能性がある。同様の観点から、カルボン酸水溶液の濃度は５．２ｍｏｌ／Ｌを超えて１５ｍｏｌ／Ｌ未満、５．２ｍｏｌ／Ｌを超えて１３．１ｍｏｌ／Ｌ以下、又は８．７以上１２．２ｍｏｌ／Ｌ以下であってもよい。
【００４５】
タンパク質水溶液を作製する際、酸水溶液、又は酸水溶液と粗原料との混合物に対して、無機塩を添加してもよい。この無機塩は、タンパク質水溶液におけるタンパク質の溶解度（酸水溶液に対するタンパク質の溶解量）を向上させ得る。すなわち、無機塩を、タンパク質の溶解促進剤として利用することができる。
【００４６】
溶解促進剤として用いられ得る無機塩としては、例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩、及びチオシアン酸塩が挙げられる。より具体的には、無機塩は、例えば、リン酸アルミニウム、炭酸リチウム、炭酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、フッ化アルミニウム、酢酸第二鉄、酢酸アルミニウム、水酸化亜鉛、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化マンガン、水酸化クロム、水酸化第二鉄、水酸化アルミニウム、塩化ニッケル、塩化コバルト、塩化亜鉛、塩化第一鉄、塩化マンガン、塩化クロム、塩化第二鉄、塩化アルミニウム、硝酸リチウム、硝酸ストロンチウム、硝酸ニッケル、硝酸カルシウム、硝酸コバルト、硝酸亜鉛、硝酸マグネシウム、硝酸第一鉄、硝酸マンガン、硝酸クロム、硝酸第二鉄、硝酸アルミニウム、臭化リチウム、臭化バリウム、臭化ストロンチウム、臭化ニッケル、臭化カルシウム、臭化コバルト、臭化亜鉛、臭化マグネシウム、臭化第一鉄、臭化マンガン、臭化クロム、臭化第二鉄、臭化アルミニウム、塩素酸バリウム、塩素酸ストロンチウム、塩素酸ニッケル、塩素酸カルシウム、塩素酸コバルト、塩素酸亜鉛、塩素酸マグネシウム、塩素酸第一鉄、塩素酸マンガン、塩素酸クロム、塩素酸第二鉄、塩素酸アルミニウム、ヨウ化ルビジウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化銅、ヨウ化リチウム、ヨウ化バリウム、ヨウ化ストロンチウム、ヨウ化ニッケル、ヨウ化カルシウム、ヨウ化コバルト、ヨウ化亜鉛、ヨウ化マグネシウム、ヨウ化第一鉄、ヨウ化マンガン、ヨウ化クロム、ヨウ化第二鉄、ヨウ化アルミニウム、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸鉛、過塩素酸銅、過塩素酸リチウム、過塩素酸バリウム、過塩素酸ストロンチウム、過塩素酸ニッケル、過塩素酸カルシウム、過塩素酸コバルト、過塩素酸亜鉛、過塩素酸マグネシウム、過塩素酸第一鉄、過塩素酸マンガン、過塩素酸クロム、過塩素酸第二鉄、過塩素酸アルミニウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸鉛、チオシアン酸銅、チオシアン酸リチウム、チオシアン酸バリウム、チオシアン酸ストロンチウム、チオシアン酸ニッケル、チオシアン酸カルシウム、チオシアン酸コバルト、チオシアン酸亜鉛、チオシアン酸マグネシウム、チオシアン酸第一鉄、チオシアン酸マンガン、チオシアン酸クロム、チオシアン酸第二鉄、チオシアン酸アルミニウム、シアン酸アンモニウム、シアン酸セシウム、シアン酸ルビジウム、シアン酸カリウム、シアン酸ナトリウム、シアン酸鉛、シアン酸銅、シアン酸リチウム、シアン酸バリウム、シアン酸ストロンチウム、シアン酸ニッケル、シアン酸カルシウム、シアン酸コバルト、シアン酸亜鉛、シアン酸マグネシウム、シアン酸第一鉄、シアン酸マンガン、シアン酸クロム、シアン酸第二鉄、及びシアン酸アルミニウムからなる群より選ばれる少なくとも１種であってもよい。
【００４７】
酸水溶液、又は酸水溶液と粗原料との混合物への無機塩の添加量は、特に限定されるものではなく、無機塩の種類、目的タンパク質の量等に応じて適宜に決定される。
【００４８】
粗原料及び酸水溶液を含有する混合物を加温しながら、目的タンパク質及び夾雑物を酸水溶液に溶解させて、酸性のタンパク質水溶液を作製してもよい。これによって、原料中のタンパク質の酸水溶液への溶解量が向上し、より効率的に目的タンパク質が原料中から精製され得る。酸水溶液を加温した後、加温された酸水溶液を粗原料と混合してもよいし、酸水溶液と粗原料を混合してから、混合物を加温してもよい。または、酸水溶液を、粗原料と混合する前から混合後に亘って継続的に加温してもよい。
【００４９】
加温のための温度制御の方法は、何等限定されない。例えば、所定の温度に到達した後に、その温度に一定に維持してもよいし、予め定めた温度範囲の間での変動が許容される状態で温度制御してもよい。酸水溶液又は混合物の加温は、原料中のタンパク質が酸水溶液中に均一に溶解するまで行ってもよい。酸性のタンパク質水溶液を調製した後、最終的に得られる精製されたタンパク質水溶液を、紡糸、フィルム形成その他の成形のためのドープ液として用いる場合、精製から成形まで、タンパク質水溶液を加温し続けてもよい。この場合、温度は一定の同じ温度に保たれてもよいし、タンパク質が酸水溶液に均一に溶解した後、より低い温度又は高い温度で水溶液を保温してもよい。
【００５０】
酸水溶液又はこれを含む混合物を加温する温度の範囲は、特に限定されるものではないが、加温による効果をより確実に得ると共に、最終的に得られるタンパク質の品質低下を防ぐために、室温（２５℃）より高く、且つタンパク質の変性温度又は酸水溶液の沸点より低いことが好ましい。タンパク質の変性温度が酸水溶液の沸点を超える場合には、作業性や取扱い性の面からして、酸水溶液又はこれを含む混合物を加温する温度は、酸水溶液の沸点よりも低いことが望ましい。酸水溶液又はこれを含む混合物を加温する温度は、具体的には３０〜８０℃であってもよい。酸水溶液又はこれを含む混合物を加温する温度の下限は、約３０℃、約３６℃、約３８℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、又は約６０℃であってもよい。酸水溶液又はこれを含む混合物を加温する温度の上限は、例えば、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、又は約８０℃であってもよい。これら下限及び上限は任意に組み合わされる。本明細書において、「約」を付した温度の数値は、その数値の９０％から１１０％までの範囲の数値を意味する。例えば、約４０℃とは、３６℃〜４４℃をいう。同様に、約６０℃とは、５４℃〜６６℃をいう。ここでの温度は、常圧での温度である。ここで常圧とは、純水の沸点が約９５℃〜１０５℃である気圧をいう。酸水溶液又はこれを含む混合物を加温する方法は、特に限定されず、通常の方法が何れも採用可能である。
【００５１】
＜ｐＨ上昇操作＞
目的タンパク質及び夾雑物を含む酸性のタンパク質水溶液のｐＨを上昇さることによって、タンパク質水溶液中の目的タンパク質以外の溶解成分（夾雑物）を含む沈殿物を析出させる。析出した沈殿物と目的タンパク質を含む上清とを分離することによって、精製された目的タンパク質を含むタンパク質水溶液を得ることができる。
【００５２】
タンパク質水溶液のｐＨを上昇させる方法は、特に限定されない。例えば、タンパク質水溶液に塩基性化合物、水、ｐＨ緩衝剤、又はその他のｐＨ調整剤を加える方法によって、ｐＨを上昇させることができる。必要に応じて、タンパク質水溶液のｐＨを上昇させる前に、タンパク質水溶液中の沈殿物（不溶性残渣）を除去してもよい。その際には、遠心分離等の通常の方法が適宜に採用される。
【００５３】
酸性のタンパク質水溶液のｐＨを上昇させる幅は、タンパク質水溶液から目的タンパク質以外の夾雑物が析出するように、調整される。タンパク質水溶液のｐＨの上昇幅は、２．８未満、２．６以下、又は２．３以下であってもよい。上昇後のｐＨの上限値は、例えば、タンパク質水溶液を調製するために用いられた酸水溶液の種類等によっても適宜に決定される。例えば、タンパク質水溶液のｐＨを、４．８未満、４．６以下、又は４．３以下まで上昇させてもよい。これらのｐＨの範囲は、酸水溶液がカルボン酸水溶液である場合に、特に適用され易い。
【００５４】
ｐＨを上昇させるためにタンパク質水溶液に添加され得る塩基性化合物の種類は、特に限定されない。塩基性化合物は、例えば、ＮａＯＨ、Ｋ２ＨＰＯ４、及びＮａ２ＨＰＯ４からなる群より選ばれる少なくとも１種であってもよい。これらの塩基性化合物を用いることによって、目的タンパク質が、より一層高い精製純度で得られ易い傾向がある。
【００５５】
塩基性化合物をタンパク質水溶液に添加してタンパク質水溶液のｐＨを上昇させる場合、その添加量は、目的タンパク質の析出を出来るだけ抑制しながら、その他の夾雑物が析出するような範囲に調整される。例えば、塩基性化合物のタンパク質水溶液への添加量は、タンパク質水溶液における酸の濃度に応じて決定することができる。具体的には、添加される塩基性化合物の塩基当量Ｃ１と酸の酸当量Ｃ２との比：Ｃ１／Ｃ２が、０．５５未満であってもよい。この比Ｃ１／Ｃ２が０．５５以上であると、目的タンパク質が徐々に析出し易くなる可能性がある。同様の観点から、比Ｃ１／Ｃ２は、０．５以下、又は０．４５以下であってもよい。比Ｃ１／Ｃ２が過度に小さいと、夾雑物の析出量が小さくなり、その結果、最終的な目的タンパク質の純度が低下する可能性がある。そのため、比Ｃ１／Ｃ２は、０．０４以上であってもよい。
【００５６】
＜目的タンパク質を含む上清の分離＞
沈殿物の析出の後、沈殿物と目的タンパク質を含む上清とが分離される。分離の方法は、特に限定されるものではなく、例えば、遠心分離又は濾過等の通常の方法によって、沈殿物と分離した上清を回収することができる。得られた上清から目的タンパク質を析出させ、固形の目的タンパク質を回収してもよい。回収された上清を、例えば繊維やフィルム、ゲル、スポンジ等の各種の成形体を成形するためのドープ液等として、そのまま利用することも可能である。本明細書において、「上清」の用語は、沈殿物以外の清澄部分を意味する用語として用いられ、遠心分離等によって形成される清澄液だけでなく、濾過によって回収される濾液も含む。上清が微量の沈殿物を含むこともあり得る。
【００５７】
＜目的タンパク質の製造＞
目的タンパク質及び夾雑物は、遺伝子組み換え技術によって目的タンパク質を産生した宿主細胞を含む培養物から取り出されたものであってもよい。言い換えると、一実施形態に係るタンパク質を製造する方法は、培養物中で宿主細胞に目的タンパク質を産生させる工程と、培養物から目的タンパク質及び夾雑物を含む粗原料を得る工程と、粗原料と酸水溶液とを混合して、酸性のタンパク質水溶液を得る工程とを含んでいてもよい。この場合、目的タンパク質は、例えば、当該タンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
【００５８】
タンパク質をコードする遺伝子の製造方法は特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的な合成によって、遺伝子を製造することができる。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を合成してもよい。
【００５９】
調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とするタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
【００６０】
発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、目的とするタンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有していてもよい。
【００６１】
宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも用いることができる。
【００６２】
原核生物の例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。
【００６３】
タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
【００６４】
真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。
【００６５】
酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
【００６６】
ベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。
【００６７】
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９，２１１０  （１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法を挙げることができる。
【００６８】
発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
【００６９】
タンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
【００７０】
宿主が大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、宿主の培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００７１】
炭素源としては、宿主が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。
【００７２】
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
【００７３】
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
【００７４】
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
【００７５】
培養中、必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００７６】
目的タンパク質を産生した培養物から取り出した粗原料を用いて、上述の酸性のタンパク質水溶液を作製することができる。例えば、目的タンパク質が細胞内に産生した場合、培養終了後、遠心分離等によって回収された粗原料としての宿主細胞と、酸水溶液とを混合して、タンパク質水溶液を得ることができる。タンパク質が細胞内で不溶体を形成している場合、これを蛋白質変性剤で可溶化してもよい。目的タンパク質が細胞外に分泌された場合、粗原料としての培養上清と酸水溶液とを混合して、タンパク質水溶液を得ることができる。
【実施例】
【００７７】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【００７８】
１．クモ糸フィブロインをコードする遺伝子の合成、及クモ糸フィブロインの発現
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のクモ糸フィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する改変クモ糸フィブロイン（以下、「ＰＲＴ４１０」ともいう。）を設計した。
【００７９】
配列番号１で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のクモ糸フィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列と、そのＮ末端に付加された配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）とを有する。
【００８０】
設計したＰＲＴ４１０をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
【００８１】
得られたｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターによって、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表１）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまで約１５時間、フラスコ培養を行って、シード培養液を得た。
【００８２】
【表１】
2020097524.tif 000002
【００８３】
当該シード培養液を５００ｍｌの生産培地（表２）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。
【００８４】
【表２】
2020097524.tif 000003
【００８５】
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍｌ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持しながら、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のクモ糸フィブロインを発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。回収した菌体を乾燥して、クモ糸フィブロインを発現する大腸菌の乾燥菌体を所定量得た。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法によって分析し、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするクモ糸フィブロインサイズのバンドの出現により、目的とするクモ糸フィブロインの発現を確認した。
【００８６】
２．タンパク質の精製試験
＜試験例１＞
上記のようにして得られた、クモ糸フィブロインを発現している大腸菌の乾燥菌体を５つのエッペンドルチューブに５０ｍｇずつ投入し、それら５つのエッペンドルチューブ内に８．７Ｍ（５０質量％）の酢酸水溶液を１ｍＬずつ加えた。次いで、エッペンドルチューブを、ヒートブロックシェイカーで６０℃に加温しながら３０分間撹拌した。その後、各エッペンドルチューブ内のサンプルの遠心分離を１１，０００×ｇ、２０℃、１０分間の条件で実施し、上清（酸性のタンパク質水溶液）と沈殿物とを回収した。さらに、５つエッペンドルチューブのうちの４つから、上清を１００μＬずつ、新たな４つのエッペンドルフチューブにそれぞれ分注した。この時点の上清（酸性のタンパク質水溶液）のｐＨは２．０３であった。上清（酸性のタンパク質水溶液）が入った３つのエッペンドルフチューブそれぞれに、濃度０．５Ｍ、１Ｍ又は２ＭのＮａＯＨ水溶液を１００μＬ加えて混合し、上清（酸性のタンパク質水溶液）のｐＨを上昇させた。残りの１つのエッペンドルチューブに、逆浸透膜で精製された水（ＲＯ水）を１００μＬ加えて混合し、上清（酸性のタンパク質水溶液）のｐＨを上昇させた。その後、１１，０００×ｇ、２０℃、１０分間の条件で各エッペンドルチューブ内のサンプルの遠心分離を実施し、上清及び沈殿物を回収した。表３は、ＮａＯＨ水溶液又はＲＯ水の添加によりｐＨを調整した後の各サンプルのｐＨと、調整前からのｐＨの上昇幅を示す。
【００８７】
【表３】
2020097524.tif 000004
【００８８】
各サンプルから回収した上清及び沈殿物を、それぞれ、常法に従って、２−メルカプトエタノールを含むサンプルバッファーと混合して煮沸還元した。その後、各上清のサンプルバッファーに対してそのままＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により電気泳動を行った。また、各沈殿物のサンプルに対して更に遠心分離を行って上清を分離した後、残った沈殿物についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により電気泳動を行った。電気泳動後のゲルはｏｒｉｏｌｅ染色して、蛍光により各サンプルの泳動パターンを電気泳動図として写真に記録した。ＮａＯＨ水溶液又はＲＯ水を加えていない１つのエッペンドルチューブ内からも上清及び沈殿物を回収し、それら上清と沈殿物に対して上記と同様にして電気泳動を行い、それらの泳動パターンを電気泳動図として写真を記録した。
【００８９】
図１は、上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す写真であり、図２は、沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す写真である。図１及び図２において、レーン１は０．５Ｍ  ＮａＯＨ、レーン２は１Ｍ  ＮａＯＨ、レーン３は２Ｍ  ＮａＯＨ、レーン４はＲＯ水によってタンパク質水溶液のｐＨを上昇させたサンプルであり、レーン５はＮａＯＨ水溶液又はＲＯ水をタンパク質水溶液に加えていないサンプルであり、レーン６は別途準備した精製クモ糸フィブロイン（ＳＳＰ）である。ＸＬ  Ｌａｄｄｅｒは市販の分子量マーカー（株式会社アプロサイエンス製）を示す（図２〜９も同様）。
【００９０】
図１及び図２から明らかなように、クモ糸フィブロインを発現している大腸菌の乾燥菌体に酢酸水溶液を加えて得たタンパク質水溶液のｐＨを、ＮａＯＨ水溶液又はＲＯ水のｋ添加により上昇させて得たサンプルは、タンパク質水溶液のｐＨを上昇させなかったサンプルと比較して、高い純度で精製されたクモ糸フィブロインを含んでいた。
【００９１】
＜試験例２＞
ＮａＯＨ水溶液の代わりに、濃度０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍ若しくは５ＭのＫ２ＨＰＯ４水溶液、又は、濃度０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４水溶液を用いて酸性のタンパク質水溶液（上清）のｐＨを上昇させたこと以外は試験例１と同様にして、クモ糸フィブロインの精製試験を行った。表４は、Ｋ２ＨＰＯ４水溶液又はＮａ２ＰＯ４水溶液の添加によりｐＨを上昇させた後の各タンパク質水溶液のｐＨと、調整前からのｐＨの上昇幅を示す。
【００９２】
【表４】
2020097524.tif 000005
【００９３】
試験例１と同様に、各サンプルから回収した上清及び沈殿物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した。図３は、Ｋ２ＨＰＯ４水溶液を用いたサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す写真であり、図４は、Ｎａ２ＨＰＯ４水溶液を用いたサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す写真である。図３において、レーン１は０．５ＭのＫ２ＨＰＯ４水溶液、レーン２は１Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４水溶液、レーン３は２Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４水溶液、レーン４は５ＭのＫ２ＨＰＯ４水溶液によってタンパク質水溶液のｐＨを上昇させたサンプルの上清であり、レーン５は０．５ＭのＫ２ＨＰＯ４水溶液、レーン６は１Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４水溶液、レーン７は２Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４水溶液、レーン８は５ＭのＫ２ＨＰＯ４水溶液によってタンパク質水溶液のｐＨを上昇させたサンプルの沈殿物であり、レーン９は別途準備した精製クモ糸フィブロイン（ＳＳＰ）である。図４において、レーン１は０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４水溶液によってタンパク質水溶液のｐＨを上昇させたサンプルの上清であり、レーン２は０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４水溶液によってタンパク質水溶液のｐＨを上昇させたサンプルの沈殿物であり、レーン３は別途準備した精製クモ糸フィブロイン（ＳＳＰ）である。
【００９４】
図３及び図４から明らかなように、クモ糸フィブロインを発現している大腸菌の乾燥菌体に酢酸水溶液を加えて得たタンパク質水溶液のｐＨを、Ｋ２ＨＰＯ４水溶液又はＮａ２ＨＰＯ４水溶液の添加により上昇させて得たサンプルの上清は、タンパク質水溶液のｐＨを上昇させなかったサンプルの上清（図１及び図２参照）と比較して、高い純度で精製されたクモ糸フィブロインを含んでいた。Ｋ２ＨＰＯ４水溶液の添加によりタンパク質水溶液のｐＨを５．２としたサンプル（レーン４）は、Ｋ２ＨＰＯ４水溶液の添加によりタンパク質水溶液のｐＨを３．４、３．８、又は４．４としたサンプル（レーン１〜３）と比較して、沈殿物に含まれるクモ糸フィブロインの量が多くなって精製量が少なくなる傾向が認められる。
【００９５】
＜試験例３＞
ｐＨ値とクモ糸フィブロインの精製量との関係をより詳細に確認するために、酢酸水溶液及びＮａＯＨ水溶液の濃度を変えながら、試験例１と同様にしてクモ糸ポリペプチドの精製試験を行い、得られたサンプルの沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した。表５は、酢酸濃度及びＮａＯＨ水溶液濃度の組み合わせと、ｐＨ調整後の各サンプルのタンパク質水溶液のｐＨを示す。
【００９６】
【表５】
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【００９７】
図５は５Ｍ（３０質量％）の酢酸水溶液及びＮａＯＨ水溶液を用いて得られたサンプルの沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す写真である。図６は８．７Ｍ（５０質量％）の酢酸水溶液及びＮａＯＨ水溶液を用いて得られたサンプルの沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す写真である。図７は１２．２Ｍ（７０質量％）の酢酸水溶液及びＮａＯＨ水溶液を用いて得られたサンプルの沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す写真である。
【００９８】
表３及び図５〜７の結果から、ＮａＯＨ水溶液の添加によってｐＨを上昇させた後のタンパク質水溶液のｐＨが４．８以上になると、沈殿物に含まれるクモ糸フィブロインの量が多くなって、精製量が少なくなる傾向があることが認められる。
【００９９】
＜試験例４：温度の影響＞
クモ糸フィブロインを発現している大腸菌の乾燥菌体を複数のエッペンドルチューブに５０ｍｇずつ投入し、そこに８．７Ｍ（５０質量％）の酢酸水溶液を１ｍＬ加えた。次いで、エッペンドルチューブを、ヒートブロックシェイカーで３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、又は８０℃に加温しながら３０分間撹拌した。その他は試験例１と同様に精製試験を行い、得られた各サンプルから回収した上清及び沈殿物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した。
【０１００】
図８は、タンパク質水溶液から得た上清及び沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。図８から、タンパク質水溶液を調製する際の酢酸水溶液の温度が高くなると、精製純度が高くなる傾向が認められた。
【０１０１】
＜試験例５：酢酸水溶液の濃度の影響＞
濃度が２．６ｍｏｌ／Ｌ（１５質量％）、５．２ｍｏｌ／Ｌ（３０質量％）、８．７ｍｏｌ／Ｌ（５０質量％）、１２．２ｍｏｌ／Ｌ（７０質量％）又は１５ｍｏｌ／Ｌ（８７質量％）の酢酸水溶液を用いて、試験例１と同様にしてクモ糸フィブロインの精製試験を行った。得られたサンプルから回収した上清と沈殿物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１０２】
図９は、タンパク質水溶液から得た上清及び沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。図９から、酢酸濃度が５．２ｍｏｌ／Ｌ（３０質量％）を超えて１５ｍｏｌ／Ｌ（８５質量％）未満になると、精製純度が特に高くなる傾向が認められる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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