(57)【要約】      （修正有）【課題】臨床および治療適用のためのヒト脂肪間質細胞の細胞培養培地の提供。【解決手段】哺乳細胞培養に適した基礎培地と、抗凝血剤なしで収集され、かつ血清処理前に凝固することができるヒト血清と、（ｉ）成長促進量のヒトインスリン、（ｉｉ）ヒトトランスフェリン、（ｉｉｉ）ヒト組み換え型表皮成長因子、（ｉｖ）ヒト組み換え型血漿由来成長因子−ＢＢ、（ｖ）塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）、および（ｖｉｉ）フェノールレッドのうちの少なくとも１つと、を有し、リノール酸を含まない、ヒトの臨床および治療適用のためのヒト脂肪間質細胞の臨床的成長のための細胞培養培地。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの臨床および治療適用のためのヒト脂肪間質細胞の臨床的成長のための細胞培養培地であって、前記培地は、
哺乳細胞培養に適した基礎培地と、
抗凝血剤なしで収集され、かつ血清処理前に凝固することができるヒト血清と、
（ｉ）成長促進量のヒトインスリン、（ｉｉ）ヒトトランスフェリン、（ｉｉｉ）ヒト組み換え型表皮成長因子、（ｉｖ）ヒト組み換え型血漿由来成長因子−ＢＢ、（ｖ）塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）、および（ｖｉｉ）フェノールレッドのうちの少なくとも１つと、
を有し、前記培地はリノール酸を含まない、細胞培養培地。
【請求項２】
請求項１記載の培地において、前記培地は４０以上、かつ５０倍加できる培地。
【請求項３】
請求項１記載の培地であって、１８〜２０時間につき１倍加の成長率を達成し、かつ維持する培地。
【請求項４】
請求項１記載の培地であって、少なくとも３５〜３７に持続される多能性である培地。
【請求項５】
請求項１記載の培地であって、分化が生じる前に２ヶ月以上成長を持続する培地。
【請求項６】
ヒトの臨床および治療適用のためのヒト脂肪間質細胞の臨床的成長のための細胞培養培地を作成する方法であって、前記方法は、
哺乳細胞培養に適した基礎培地、
抗凝血剤なしで収集され、かつ血清処理前に凝固することができるヒト血清、及び
（ｉ）成長促進量のヒトインスリン、（ｉｉ）ヒトトランスフェリン、（ｉｉｉ）ヒト組み換え型表皮成長因子（ｉｖ）ヒト組み換え型血漿由来成長因子−ＢＢ、（ｖ）塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）、および（ｖｉｉ）フェノールレッドのうちの少なくとも１つ、
の構成要素を組み合わせる工程からなる、方法。
【請求項７】
多能性の間充織幹細胞の成長と存在を拡大する方法であって、
ａ．請求項１記載の成長培地を用意する工程と、
ｂ．工程ａの培地中で間充織幹細胞を増殖させる工程と、
を有する方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法によって作成された間充織幹細胞であって、前記細胞は４０＋倍加まで増殖可能であり、自発的な分化が生じる前に最大２ヶ月までの間、成長が拡大され得る間充織幹細胞。
【請求項９】
請求項７記載の方法によって作成された間充織幹細胞であって、多能性は３５〜５０倍加で存在する間充織幹細胞。
【請求項１０】
請求項７記載の方法によって作成された間充織幹細胞であって、間充織幹細胞は脂肪由来の幹細胞であり、未分化細胞は以下のフェノタイプ：ＣＤ１４−、ＣＤ１９−、ＣＤ２９＋、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ４９ｄ＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１４６＋を有する間充織幹細胞。
【請求項１１】
請求項７記載の方法によって作成された間充織幹細胞であって、前記細胞はオイルレッド＋脂肪細胞、アルシアンブルー＋軟骨細胞、およびアリザリンレッド＋骨細胞に容易に分化する間充織幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年１２月３１日出願の米国仮特許出願第６２／０９８，７９９号に対して優先権を主張し、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、臨床および治療適用のためのヒト脂肪間質細胞の臨床的成長のための細胞培養培地を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
脂肪由来の幹細胞、および、実際に、すべての間充織幹細胞は血管周囲に位置すると推測され、これはヒト全身にわたる血管にごく近接して存在するということを意味する。これは、ＡＤＳＣｓおよびＭＳＣｓは『血液の』、すなわち血清豊富な環境であることが当然とされていることを示すかもしれない。ヒト血清の追加はそれらの細胞にとってより自然な培地を作り出すだろうと推測される。ＨＳＡのための全体のヒト血清を代替することもまた培地費用を大きく下げることになるだろう。
【０００４】
ヒト血清に基づくヒト脂肪間質細胞の増殖のため、商業的に実行可能な幹細胞培養培地の必要性は今日まだ存在する。
【０００５】
第一の実施形態では、本発明は臨床および治療適用のためのヒト脂肪間質細胞の臨床的成長のための細胞培養培地を対象とし、当該培地は、哺乳細胞培養に適した基礎培地と、抗凝血剤なしで収集され、かつ血清処理前に凝固することができるヒト血清と、（ｉ）成長促進量のヒトインスリン、（ｉｉ）ヒトトランスフェリン、（ｉｉｉ）ヒト組み換え型表皮成長因子、（ｉｖ）ヒト組み換え型血漿由来成長因子−ＢＢ、（ｖ）塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）、および（ｖｉｉ）フェノールレッドのうちの少なくとも１つとを含み、前記培地はリノール酸を含まない。
【０００６】
他の実施形態では、本発明は臨床および治療適用のためのヒト脂肪間質細胞の臨床的成長のための細胞培養培地を作成する方法を対象とし、この方法は、哺乳細胞培養に適した基礎培地、抗凝血剤なしに収集され、かつ血清処理前に凝固することができるヒト血清、および（ｉ）成長促進量のヒトインスリン、（ｉｉ）ヒトトランスフェリン、（ｉｉｉ）ヒト組み換え型表皮成長因子、（ｉｖ）ヒト組み換え型血漿由来成長因子−ＢＢ、（ｖ）塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）、および（ｖｉｉ）フェノールレッドのうちの少なくとも１つ、の構成要素を組み合わせる工程を含み、前記培地はリノール酸を含まない。
【０００７】
本明細書で使用されるある専門用語は便宜上のみを目的としており、本発明を限定するものではないものとする。専門用語は、特に言及された用語、それらの派生語および類似語の意味を含む。本明細書で論じられた実施形態は、正確な様式で開示されることを目的としており、包括的であったり、範囲を限定したりするように意図されない。これらの実施形態は、本発明の本質、その活用、および実用的用途を最大限に説明するため、並びに当業者が本発明を最大限に利用することができるように選択され、かつ記載されたものである。
【０００８】
脂肪由来の幹細胞、および、実際にすべての間充織幹細胞は、血管周囲に位置すると推測され、これはヒト全身にわたる血管にごく近接して存在するということを意味する。これは、ＡＤＳＣｓおよびＭＳＣｓは「血液の」、すなわち血清豊富な環境であることが当然とされていることを示す。本発明は細胞成長培地にヒト血清の追加を提供することにより、細胞成長のためにより自然な培地を作り出し、また培地にかかる費用を大幅に下げるだろう。
【０００９】
通常、血液はＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウムのような抗凝血剤の存在下で収集される。この血液から作られる「標準的な」血清は、従って、通常の凝固因子すべておよび血液凝固に伴う構造タンパク質を有すると考えられる。これは、もしかすると、標準的な血清で成長した細胞が血液凝固さらには移植に導かれる凝固因子でコーティングする結果になり得ることを意味する。「凝固しない」血清は抗凝血剤なしで収集され、血清処理前に凝固することが可能であるため、凝固因子はその中に存在しないだろう。
【００１０】
ヒト血清を使用する基礎的アイディアは次の原理に乗じており、（ｉ）（ＡＤＳＣｓを含む）ＭＳＣｓは血管周囲に位置し、ヒト全身のわたる血管にごく近接して存在することを意味する。実際に、毛細血管が位置する部分には、毛細血管が並ぶ内皮細胞があり、ＭＳＣｓは内皮細胞のすぐ外側にある。これは、生涯を通して、ＭＳＣｓは血清の存在下であり、すべては血清中にあるということを意味する。当業者であれば、「既知の培地」のアイディア、例えば、すべてが既知の割合および数量で追加されることをよく理解する。さらに当業者であれば、これらの細胞を成長させ維持するための自然環境が最適であることも認識するだろう。
【００１１】
ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、およびＦＧＦ２のようないくつかの別の成長因子の追加を有する本発明は、「過給された」、「増大された」ヒト血清を作成することであり、これは培地におけるＭＳＣｓの成長を促進することである。血清は大量のさまざまな物質を含み、その多くが全て特性を持つものではなく、成分の特有の混合が本発明の培地に至る結果となったものである。ヒト血清タンパク質は本発明において使用されるが、ＨＳＡは血清中の大きなタンパク質であり、成長因子、特定の資質、サイトカインなど多くのものが結合する。ＨＳＡは担体タンパク質であり、ＨＳＡ中に見えるロット間変動は、何がＨＳＡに結合しているかの異なりによる可能性が高い。ＨＳＡは、残念ながら高価であり、多くのロット間変動を示す。ヒト血清はより容易であり、ＨＳＡ中にない自然の有益な成分を含むだろう。
【００１２】
健康な個人からの同種血清は健康でない個人からのＭＳＣｓに健康促進効果を与えることが可能かもしれない。もしかすると、患者特定の培地は、拡張過程の間、自己として過程を維持しながら、自己血清を使うことによって作成し得る。そのように基礎培地は、活用により同種または自己血清どちらかを使用するかを使用者の選択で販売されうる。
【００１３】
本明細書で提供されるように、第一の実施形態では、本発明は臨床および治療適用のためのヒト脂肪間質細胞の臨床的成長のための細胞培養培地を対象とし、哺乳細胞培養に適した基礎培地、抗凝血剤なしで収集され、血清処理の前に凝固することができるヒト血清と、（ｉ）成長促進量のヒトインスリン、（ｉｉ）ヒトトランスフェリン、（ｉｉｉ）ヒト組み換型表皮成長因子、（ｉｖ）ヒト組み換え型血漿由来成長因子−ＢＢ、（ｖ）塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）、および（ｖｉｉ）フェノールレッドのうち少なくとも1つとを含み、前記培地はリノール酸を含まない。本発明のフェノールレッドは、培地の前の反復におけるものより低い。当業者であればフェノールレッドがエストロゲン模倣体であり、減少された量で使用されることが望ましいということを十分に評価するだろう。本明細書で提供される人口倍加は低酸素環境（通常の２０％＋に反して５％、外気）で得られた。
【００１４】
培地は４０以上、かつ５０倍加できる。
【００１５】
培地は１８〜２０時間につき１倍加の成長率を達成し、維持し得る。
【００１６】
培地は少なくとも３５〜３７に持続される多能性細胞を有する。
【００１７】
培地は自発的な分化が生じる前に２ヶ月以上成長を持続し得る。
【００１８】
本発明の培地は、その分野で存在する培地を作るより約６０％安価である。費用効率の高い培地製品を有する能力は、培地の商業的成功にとって核心部であり、それゆえにその能力は改善された培地の実施形態を得るために本培地のコンセプト上に築くものである。
【００１９】
基礎培地（ＤＭＥＭ：ＭＣＤＢ１３１：ＭＣＤＢ２０１、およびグルタミン）の主要成分は、研究室がＤＭＭと言及する１つの基礎培地中に事前準備をされても良い。成分は「原料の」形式（例えば、凍結乾燥された状態）で得られ、リストされたストック濃度で再構成する。
【００２０】
下記の表は、ストック濃度を記載し、ＯＴＣ血清を有する異物混入していない脂肪由来の幹細胞培地を調整するために最終的な成分の濃度の記載は含まれない：
【表１】
2020182470.tif 000002
【表２】
2020182470.tif 000003
【００２１】
無菌状態を確認するために、すべての成分は１０００ｍｌフィルターユニットの容器（フィルターは０．２２μｍ細孔径および低結合（ＰＥＳ））の上半分にリストされた順序で加えられる。完成した培地は３週間の賞味期限を有し、冷蔵庫（４〜８℃）に保存される。
【００２２】
成分の保存は次の方法が好まれる；基礎培地、ＧｌｕｔａＭａｘ、ＩＴＳＥ、Ｌ−アスコルビン−２−フォスフェート、２−メルカプトエタノール、デキサメタゾン−冷蔵庫（４８℃）。ＯＴＣ血清はマイナス２０℃またはそれより冷たい冷凍庫中に存在し、アリコートは超低冷凍（マイナス８０±１０℃）で保存される。調整された成長因子：ＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＰＤＧＦ−ＢＢは超低冷凍（マイナス８０±１０℃）で保存される。
【００２３】
当業者であれば、本発明の培地における増殖以前に細胞の収集、処理、および保存の重要性を認識するであろう。もっと特異的に、細胞の特性および性質を保つ方法で細胞を収集し、消化する（および、必要ならば保存する）能力は、例えば、マーカーが増殖のため、本発明の培地の成分と細胞の相互作用を確実にすることを要される。本発明の培地で増殖された細胞は、米国特許出願第１３／６４６，６４７号で発見され、その全体が明細書に組み込まれる（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｒｙｏｓｔｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅａｔｏｎｔｏｗｎ、ＮＪ）方法によって脂肪組織から作られる。６４７の出願に記載の方法によって脂肪組織から作られた結果の細胞は、明細書中で定義されたように、本発明の培地における増殖により、相乗効果および結果としてできた性質を確実にするユニークな一連の規定マーカー、性質および特性を提供する。
実施例
【００２４】
実施例は当業者によって認識される細胞培地の調整の方法によって記載されたように調整される。
実施例１
９２．５ｍｌ  ＤＭＭ・・・・・・・・・・・・・・・・・・９２．５１％
５．００ｍｌ  Ｏｆｆ−Ｔｈｅ−Ｃｌｏｔ  ヒト血清・・・・５．００％
１．００ｍｌ  ＩＴＳＥ・・・・・・・・・・・・・・・・・１．００％
１．００ｍｌ  アスコルビン−２−フォスフェート・・・・・１００μＭ
０．１８ｍｌ  ２−メルカプトエタノール・・・・・・・・・１００μＭ
０．１０ｍｌ  ＥＧＦ・・・・・・・・・・・・・・・・・・１０ｎｇ／ｍｌ
０．１０ｍｌ  ＦＧＦ２・・・・・・・・・・・・・・・・・１０ｎｇ／ｍｌ
０．１０ｍｌ  ＰＤＧＦ−ＢＢ・・・・・・・・・・・・・・５ｎｇ／ｍｌ
０．０１ｍｌ  デキサメタゾン溶液・・・・・・・・・・・・１Ｎｍ
【００２５】
当業者は、上記に記載された実施形態に本発明の広いコンセプトから離れることなく、変更を加えることができることを理解するだろう。それゆえに、本発明は記載された特定の実施形態に限定されることなく、添付の請求項によって定義された本発明の真の精神および範囲に入る変形形態を網羅することを意図する。
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月28日(2020.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの臨床および治療適用のためのヒト脂肪間質細胞の臨床的成長のための細胞培養培地であって、前記培地は、
哺乳細胞培養に適した基礎培地と、
抗凝血剤なしで収集され、かつ血清処理前に凝固することができるヒト血清と、
（ｉ）成長促進量のヒトインスリン、（ｉｉ）ヒトトランスフェリン、（ｉｉｉ）ヒト組み換え型表皮成長因子、（ｉｖ）ヒト組み換え型血漿由来成長因子−ＢＢ、（ｖ）塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）、および（ｖｉｉ）フェノールレッドのうちの少なくとも１つと、
を有し、前記培地はリノール酸を含まない、細胞培養培地。
【外国語明細書】
2020182470000001.pdf
2020182470000002.pdf
2020182470000003.pdf