(57)【要約】      （修正有）【課題】より育毛・発毛促進効果の高い毛乳頭細胞賦活促進剤又はＶＥＧＦ産生促進剤の提供。【解決手段】イソサポナリンを有効成分として含有する化粧品、医薬部外品、医薬品又は食品。化粧品及び医薬部外品におけるイソサポナリンの含有量は０．００１μｍｏｌ／Ｌ〜５０００μｍｏｌ／Ｌであり、医薬品及び食品におけるイソサポナリンの含有量は０．１ｍｇ〜５．０ｇである。イソサポナリンは、わさび及び西洋わさびのうち少なくとも一方から抽出された成分である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛乳頭細胞賦活促進剤であって、
前記毛乳頭細胞賦活促進剤は、イソサポナリンを有効成分として含有し、
前記毛乳頭細胞賦活促進剤は、化粧品、医薬部外品、医薬品又は食品として使用され、
前記化粧品及び前記医薬部外品における前記イソサポナリンの含有量は０．００１μｍｏｌ／Ｌ〜５０００μｍｏｌ／Ｌであり、
前記医薬品及び前記食品における前記イソサポナリンの含有量は０．１ｍｇ〜５．０ｇである、
毛乳頭細胞賦活促進剤。
【請求項２】
請求項１に記載の毛乳頭細胞賦活促進剤であって、
前記イソサポナリンは、わさび及び西洋わさびのうち少なくとも一方から抽出された成分である、毛乳頭細胞賦活促進剤。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の毛乳頭細胞賦活促進剤であって、
前記毛乳頭細胞賦活促進剤は、前記化粧品として使用され、
前記化粧品における前記イソサポナリンの含有量は０．１μｍｏｌ／Ｌ〜１０００μｍｏｌ／Ｌである、毛乳頭細胞賦活促進剤。
【請求項４】
毛乳頭細胞のＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）産生促進剤であって、
前記ＶＥＧＦ産生促進剤は、イソサポナリンを有効成分として含有し、
前記ＶＥＧＦ産生促進剤は、化粧品、医薬部外品、医薬品又は食品として使用され、
前記化粧品及び前記医薬部外品における前記イソサポナリンの含有量は０．００１μｍｏｌ／Ｌ〜５０００μｍｏｌ／Ｌであり、
前記医薬品及び前記食品における前記イソサポナリンの含有量は０．１ｍｇ〜５．０ｇである、
ＶＥＧＦ産生促進剤。
【請求項５】
請求項４に記載のＶＥＧＦ産生促進剤であって、
前記イソサポナリンは、わさび及び西洋わさびのうち少なくとも一方から抽出された成分である、ＶＥＧＦ産生促進剤。
【請求項６】
請求項４又は請求項５に記載のＶＥＧＦ産生促進剤であって、
前記ＶＥＧＦ産生促進剤は、前記化粧品として使用され、
前記化粧品における前記イソサポナリンの含有量は０．１μｍｏｌ／Ｌ〜１０００μｍｏｌ／Ｌである、ＶＥＧＦ産生促進剤。
【請求項７】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の毛乳頭細胞賦活促進剤を有する育毛・発毛促進剤。
【請求項８】
請求項４〜請求項６のいずれか１項に記載のＶＥＧＦ産生促進剤を有する育毛・発毛促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本国際出願は、２０１５年１２月２日に日本国特許庁に出願された日本国特許出願第２０１５−２３５９６５号に基づく優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２０１５−２３５９６５号の全内容を本国際出願に参照により援用する。
【０００２】
本開示は、育毛・発毛促進剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
毛髪の成長は、成長期、退行期及び休止期からなる周期的なヘアサイクル（毛周期）に従って、成長及び脱落を繰り返している。ヘアサイクルでは様々な細胞が作用しているが、当該ヘアサイクルを制御する上で最も重要な役割を果たしているのが毛乳頭細胞である。毛乳頭細胞は、毛根の根幹部分に位置する細胞である。毛乳頭細胞は、毛乳頭細胞の周囲に存在する毛母細胞に働きかけて、毛母細胞の増殖を促す等、毛髪の分化に重要な役割を担っている。
【０００４】
また、脱毛は、加齢、生活環境要因によるストレス、ホルモンバランスの崩壊、薬剤の副作用等が原因となり生じる。このような様々な原因により毛乳頭細胞の代謝が低下すると、毛母細胞の活性化及び分化が抑制される。そして、ヘアサイクルの期間が短縮されることにより、脱毛が生じる。
【０００５】
近年、ストレスの増加や食生活の変化等様々な要因によって、薄毛や抜け毛で悩む男女は増加傾向にあり、育毛・発毛促進剤への期待が高まっている。そのような社会的要求に応じて様々な育毛・発毛促進剤が開発されている。育毛・発毛促進剤の有効成分としては、例えば、ミノキシジル（化学名：６−（１−ピペリジニル）−２，４−ピリミジンジアミン−３−オキサイド）やアデノシン関連化合物等が知られている。
【０００６】
ミノキシジルは、末梢血管を拡張することにより、血行を促進させ、毛乳頭細胞を刺激することにより育毛を促進することが知られている。また、アデノシン及びその誘導体は、毛乳頭細胞のアデノシン受容体に作用し、繊維芽細胞増殖因子の産生を促進し、毛母細胞を活性化させる効果があることが報告されている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−２９７０１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上述のような公知の育毛・発毛促進剤では、未だ需要者の要求を十分に満足させるには至っていない。このような事情から、市場では、より育毛・発毛促進効果の高い育毛・発毛促進剤が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述のような課題を解決するため、本発明者らは、鋭意研究した結果、従来、育毛作用との関係が全く知られていなかったフラボノイド類及びフェニルプロパノイド類に、育毛作用があることを見出した。
【００１０】
すなわち、本開示の一局面は、下記に記載された式（Ｉ）で表される一種又は複数種のフラボノイド類を有効成分として含有する育毛・発毛促進剤を提供するものである。
【００１１】
【化１】
2020055848.tif 000002
【００１２】
ただし、上記式（Ｉ）中、Ｒ１はグリコシル、グリコシル−グリコシル−Ｏ−シナポイル又はＨ、Ｒ２はＯ−シナポイル又はＯＨ、Ｒ３はＨ又はＯＨ、Ｒ４はＯ−グリコシル、ＯＨ又はＯ−グリコシル−シナポイルである。
【００１３】
また、本開示の一局面は、下記に記載された式（ＩＩ）で表される一種又は複数種のフェニルプロパノイド類を有効成分として含有する育毛・発毛促進剤を提供するものである。
【００１４】
【化２】
2020055848.tif 000003
【００１５】
ただし、上記式（ＩＩ）中、Ｒ５はＨ又はＯＨ、Ｒ６はＯＨ又はＯＣＨ３である。
本発明者らの研究結果によれば、上記式（Ｉ）で表される一種又は複数種のフラボノイド類及び上記式（ＩＩ）で表される一種又は複数種のフェニルプロパノイド類には、毛乳頭細胞を活性化する作用がある。このような作用があることは、後述する実施形態から明らかである。したがって、上記フラボノイド類及び上記フェニルプロパノイド類を有効成分として含有する育毛・発毛促進剤を利用すれば、極めて優れた育毛・発毛効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒト頭髪毛乳頭細胞を用いたイソサポナリンの細胞毒性試験を行った結果を示すグラフである。
【図２】ヒト頭髪毛乳頭細胞を用いたイソサポナリン処理１日後の細胞賦活作用を検討した結果を示すグラフである。
【図３】ヒト頭髪毛乳頭細胞を用いたイソサポナリン処理３日後の細胞賦活作用を検討した結果を示すグラフである。
【図４】ヒト頭髪毛乳頭細胞を用いたイソサポナリン処理３日後のＶＥＧＦ産生促進作用を検討した結果を示すグラフである。
【図５】ヒト頭髪毛乳頭細胞を用いたアピゲニンの細胞毒性試験を行った結果を示すグラフである。
【図６】ヒト頭髪毛乳頭細胞を用いたクマル酸の細胞毒性試験を行った結果を示すグラフである。
【図７】ヒト頭髪毛乳頭細胞を用いたカフェ酸メチルエステルの細胞毒性試験を行った結果を示すグラフである。
【図８】ヒト頭髪毛乳頭細胞を用いたイソサポナリン以外の被験物質による細胞賦活作用を検討した結果を示すグラフである。
【図９】ヒト頭髪毛乳頭細胞を用いたイソサポナリン以外の被験物質によるＶＥＧＦ産生量を示すグラフである。
【図１０】ヒト頭髪毛乳頭細胞を用いたイソサポナリン以外の被験物質によるＦＧＦ−７遺伝子発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示の育毛・発毛促進剤は、上記式（Ｉ）で表される一種又は複数種のフラボノイド類を有効成分として含有するものである。また、本開示の育毛・発毛促進剤は、上記式（ＩＩ）で表される一種又は複数種のフェニルプロパノイド類を有効成分として含有するものである。ここで「含有する」とは、本開示の育毛・発毛促進剤が一種又は複数種のフラボノイド類からなるものであってもよく、また育毛・発毛促進剤に一種又は複数種のフラボノイド類以外の他の成分が含有されていてもよいことを意味する。また、本開示の「育毛・発毛促進剤」とは、後述するメカニズムにより育毛効果、発毛効果、育毛効果兼発毛効果を発揮する物質である。育毛効果とは、毛を発育させ、脱毛を予防すること、及び脱毛を低減させる効果を意味する。発毛効果とは毛を発生させる効果を意味する。よって、本開示の育毛・発毛促進剤は、育毛剤、発毛剤、及び育毛剤兼発毛剤、いずれとしても使用され得る。
【００１８】
上記式（Ｉ）で表されるフラボノイド類としては、例えば、上記式（Ｉ）中、Ｒ１がグリコシル、Ｒ２がＯＨ、Ｒ３がＨ、及びＲ４がＯ−グリコシルで表されるイソサポナリン［別名：イソビテキシン４´−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノサイド（ｉｓｏｖｉｔｅｘｉｎ４´−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）］、上記式（Ｉ）中、Ｒ１がグリコシル、Ｒ２がＯ−シナポイル、Ｒ３がＨ、及びＲ４がＯ−グリコシルで表される７−Ｏ−トランス−シナポイルイソビテキシン４´−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノサイド（７−Ｏ−ｔｒａｎｓ−ｓｉｎａｐｏｙｌｉｓｏｖｉｔｅｘｉｎ４´−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、上記式（Ｉ）中、Ｒ１がグリコシル、Ｒ２がＯ−シナポイル、Ｒ３がＨ、及びＲ４がＯＨで表される７−Ｏ−トランス−シナポイルイソビテキシン（７−Ｏ−ｔｒａｎｓ−ｓｉｎａｐｏｙｌｉｓｏｖｉｔｅｘｉｎ）、上記式（Ｉ）中、Ｒ１がグリコシル、Ｒ２がＯ−シナポイル、Ｒ３がＨ、及びＲ４がＯ−グリコシル−シナポイルで表される７−Ｏ−トランス−シナポイルイソビテキシン４´−Ｏ−（６−Ｏ−トランス−シナポイル−β−Ｄ−グルコピラノサイド）（７−Ｏ−ｔｒａｎｓ−ｓｉｎａｐｏｙｌｉｓｏｖｉｔｅｘｉｎ４´−Ｏ−（６−Ｏ−ｔｒａｎｓ−ｓｉｎａｐｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ））、上記式（Ｉ）中、Ｒ１がグリコシル−グリコシル−Ｏ−シナポイル、Ｒ２がＯ−シナポイル、Ｒ３がＨ、及びＲ４がＯＨで表される６´´−Ｏ−（２−Ｏ−トランス−シナポイル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−７−Ｏ−トランス−シナポイルイソビテキシン（６´´−Ｏ−（２−Ｏ−ｔｒａｎｓ−ｓｉｎａｐｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−７−Ｏ−ｔｒａｎｓ−ｓｉｎａｐｏｙｌｉｓｏｖｉｔｅｘｉｎ）、上記式（Ｉ）中、Ｒ１がグリコシル−グリコシル−Ｏ−シナポイル、Ｒ２がＯ−シナポイル、Ｒ３がＨ、及びＲ４がＯ−グリコシルで表される６´´−Ｏ−（２−Ｏ−トランス−シナポイル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−７−Ｏ−トランス−シナポイルイソビテキシン４´−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノサイド（６´´−Ｏ−（２−Ｏ−ｔｒａｎｓ−ｓｉｎａｐｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−７−Ｏ−ｔｒａｎｓ−ｓｉｎａｐｏｙｌｉｓｏｖｉｔｅｘｉｎ４´−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、上記式（Ｉ）中、Ｒ１がグリコシル、Ｒ２がＯＨ、Ｒ３がＨ、及びＲ４がＯＨで表されるイソビテキシン（ｉｓｏｖｉｔｅｘｉｎ）、上記式（Ｉ）中、Ｒ１がグリコシル、Ｒ２がＯＨ、Ｒ３がＯＨ、及びＲ４がＯＨで表されるイソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）、上記式（Ｉ）中、Ｒ１がグリコシル、Ｒ２がＯＨ、Ｒ３がＯＨ、及びＲ４がＯ−グリコシルで表されるイソオリエンチン４´−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノサイド（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ４´−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、上記式（Ｉ）中、Ｒ１がＨ、Ｒ２がＯＨ、Ｒ３がＨ、及びＲ４がＯＨで表されるアピゲニン［別名：２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−ヒドロキシ−７−ヒドロキシ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン（２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｈｙｄｒｏｘｙ−��Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ）］、上記式（Ｉ）中、Ｒ１がＨ、Ｒ２がＯＨ、Ｒ３がＯＨ、及びＲ４がＯＨで表されるルテオリン［別名：２−（３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシフェニル）−５−ヒドロキシ−７−ヒドロキシ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン（２−（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｈｙｄｒｏｘｙ−４Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ）］等を挙げることができる。さらに、上記式（Ｉ）で表されるフラボノイド類は、イソサポナリンが好ましい。なお、イソサポナリンのＩＵＰＡＣに基づいた名称は、４´−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）−５，７−ジヒドロキシ−６−β−Ｄ−グルコピラノシルフラボンである。これらのフラボノイド類は、単独で用いることができるが、複数種を混合して用いることもできる。
【００１９】
上記式（ＩＩ）で表されるフェニルプロパノイド類としては、例えば、上記式（ＩＩ）中、Ｒ５がＨ、Ｒ６がＯＨで表されるクマル酸、Ｒ５がＯＨ、Ｒ６がＯＣＨ３で表されるカフェ酸メチルエステル等を挙げることができる。これらのフェニルプロパノイド類は、単独で用いることができるが、複数種を混合して用いることもできる。また、フラボノイド類及びフェニルプロパノイド類を混合して用いてもよい。
【００２０】
上記式（Ｉ）で表されるフラボノイド類及び上記式（ＩＩ）で表されるフェニルプロパノイド類は、化学的な合成法により得ることができるが、植物から抽出・精製したものでもよい。前記植物としては、例えば、アブラナ科植物、ナデシコ科植物（王不留行  学名  Ｖａｃｃａｒｉａ  ｓｅｇｅｔａｌｉｓ）、セリ科植物、イネ科植物、フウチョウソウ科植物、パパイア科植物、モクセイソウ科植物、ノウゼンハレン科植物等を挙げることができる。よって、上記式（Ｉ）で表されるフラボノイド類及び上記式（ＩＩ）で表されるフェニルプロパノイド類は、当該植物のうち少なくとも１つから抽出された成分であってもよい。例えば、上記式（Ｉ）で表されるフラボノイド類及び上記式（ＩＩ）で表されるフェニルプロパノイド類は、アブラナ科植物であるわさび（Ｗａｓａｂｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）［別名：本わさび］及び西洋わさび（Ａｒｍｏｒａｃｉａ  ｒｕｓｔｉｃａｎａ）［別名：山わさび］のうち少なくとも一方から抽出された成分であってもよい。
【００２１】
前記植物からの抽出・精製方法としては、例えば、わさびや西洋わさびから上記式（Ｉ）で表されるフラボノイド類及び上記式（ＩＩ）で表されるフェニルプロパノイド類を抽出する方法等を挙げることができる。特に、本わさびからイソサポナリンを抽出する方法は、国際公開第２０１１／０５８６６１号によって公開されている。イソサポナリンは、イソサポナリン以外の上記式（Ｉ）で表されるフラボノイド類よりも、本わさびから抽出された抽出物に多く含まれている。したがって、イソサポナリンは本わさびから抽出された成分であってもよい。
【００２２】
上記式（Ｉ）で表されるフラボノイド類は、下記の実施例１に示すように、毛乳頭細胞を賦活することが認められている。
また、上記式（Ｉ）で表されるフラボノイド類は、下記の実施例２に示すように、毛乳頭細胞における血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）の量を増加することが認められている。
【００２３】
上記式（ＩＩ）で表されるフェニルプロパノイド類は、下記の実施例７に示すように、毛乳頭細胞の賦活、ＶＥＧＦ産生量の増加、及びＦＧＦ−７遺伝子発現量の増加が認められている。
【００２４】
ここで、ＶＥＧＦは、血管内皮細胞に働き、細胞の増殖、遊走を促進させたり、血管新生を促進させたり、又血管透過性を亢進させたりすることが知られている。ＶＥＧＦは、あらゆる細胞において産生されるが、毛乳頭細胞からも産生されている。毛乳頭細胞から産生されたＶＥＧＦは血管新生を促進し、それにより毛乳頭細胞の周囲に存在する毛母細胞が活性化することで発毛が促進されると考えられている。したがって、ＶＥＧＦ産生促進作用を有すると、毛母細胞活性化作用、発毛促進作用等に寄与すると考えられる。
【００２５】
ＦＧＦ−７は、毛乳頭細胞から分泌される繊維芽細胞増殖因子である。ＦＧＦ−７は、毛母細胞に作用してその増殖を促進することにより毛髪の成長を促進し、ヘアサイクルでの成長期に有効であると考えられている。
【００２６】
上記式（Ｉ）で表されるフラボノイド類は、上述したように、毛乳頭細胞に対して細胞賦活作用及びＶＥＧＦ産生促進作用を有していることから、非常に良好な育毛・発毛作用があると考えられる。よって、本開示の育毛・発毛促進剤は、上記式（Ｉ）で表されるフラボノイド類を含有するため、優れた育毛効果、発毛効果、及び育毛効果兼発毛効果を発揮する。また、上記式（ＩＩ）で表されるフェニルプロパノイド類は、上述したように、毛乳頭細胞賦活作用、ＶＥＧＦ産生促進作用、及びＦＧＦ−７遺伝子促進作用を有していることから、非常に良好な育毛・発毛作用があると考えられる。よって、本開示の育毛・発毛促進剤は、上記式（ＩＩ）で表されるフェニルプロパノイド類を含有するため、優れた育毛効果、発毛効果、及び育毛効果兼発毛効果を発揮する。また、本開示の育毛・発毛促進剤は、毛乳頭細胞賦活促進剤、及び毛乳頭細胞のＶＥＧＦ産生促進剤としても使用することができる。
【００２７】
上記式（Ｉ）で表されるフラボノイド類は、化粧品、医薬部外品及び医薬品、又は、食品に配合することが可能である。また、上記式（ＩＩ）で表されるフェニルプロパノイド類は、化粧品、医薬部外品及び医薬品、又は、食品に配合することが可能である。そのため、本開示の育毛・発毛促進剤は、化粧品、医薬部外品及び医薬品、又は食品として使用可能である。
【００２８】
本開示の育毛・発毛促進剤を化粧品、医薬部外品、医薬品の形態で実施する場合、皮膚外用剤として使用してもよい。ただし、育毛・発毛促進剤は、経口摂取も可能であるため、皮膚外用剤に限定されるものではない。
【００２９】
本開示の育毛・発毛促進剤を化粧品の形態として実施する場合、化粧品中のフラボノイド類の含有量は、０．００１μｍｏｌ／Ｌ〜５，０００μｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜１，０００μｍｏｌ／Ｌがさらに好ましい。本開示の育毛・発毛促進剤を医薬部外品の形態として実施する場合、医薬部外品中のフラボノイド類の含有量は、０．００１μｍｏｌ／Ｌ〜５，０００μｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜１，０００μｍｏｌ／Ｌがさらに好ましい。本開示の育毛・発毛促進剤を医薬品の形態として実施する場合、医薬品中のフラボノイド類の含有量は、０．１ｍｇ〜５．０ｇが好ましく、０．２ｍｇ〜１．０ｇがさらに好ましい。また、当該医薬品の成人１人あたりの１日の投与量は、１ｍｇ〜１０ｇが好ましく、２０ｍｇ〜１．０ｇがさらに好ましい。
【００３０】
本開示の育毛・発毛促進剤を食品の形態で実施する場合、機能性食品、例えば、特定保健用食品や機能性表示食品等として使用してもよい。本開示の育毛・発毛促進剤を食品の形態として実施する場合、食品中のフラボノイド類の含有量は、０．１ｍｇ〜５．０ｇが好ましく、０．２ｍｇ〜１．０ｇがさらに好ましい。
【００３１】
本開示の育毛・発毛促進剤は、有効成分である上記式（Ｉ）で表されるフラボノイド類に加え、本開示の効果を損なわない範囲において、一般に、化粧品、医薬部外品及び医薬品、又は、食品に用いられる各種任意成分を必要に応じて適宜配合してもよい。また、本開示の育毛・発毛促進剤は、有効成分である上記式（ＩＩ）で表されるフェニルプロパノイド類に加え、本開示の効果を損なわない範囲において、一般に、化粧品、医薬部外品及び医薬品、又は、食品に用いられる各種任意成分を必要に応じて適宜配合してもよい。例えば、下記に例示する成分や添加剤を任意に選択・併用してもよい。さらに、育毛・発毛効果を増強する目的で、抗酸化剤等の任意の薬効成分、生理活性物質、及び一般に育毛・発毛効果に有効であると知られている成分等を必要に応じて配合することで、本開示の構成成分との相乗効果が発揮され、通常期待される以上の優れた使用効果をもたらすことがある。
【００３２】
例えば、油脂類としては、大豆油、月見草油、米胚芽油、米糠油、小麦胚芽油、アボカド油、グレープシード油、ツバキ油、ホホバ油、エゴマ油、オリーブ油、ゴマ油、カカオ油、カミツレ油、キャロット油、キューカンパー油、牛脂脂肪酸、ココナッツ油、サフラワー油、トウモロコシ油、ナタネ油、ヒマシ油、綿実油、落花生油、ミンク油、卵黄油、パーム油、パーム核油、ヤシ油、牛脂、豚脂、シアバター、スクワレン、スクワラン、プリスタン又はこれら油脂類の水素添加物（硬化油等）等が挙げられる。
【００３３】
例えば、ロウ類としては、蜜ロウ、サラシ蜜ロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン類、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウ、ライスワックス等が挙げられる。
例えば、鉱物油としては、流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタンワックス等が挙げられる。
【００３４】
例えば、脂肪酸としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、ラノリン脂肪酸等の天然脂肪酸、イソペンタン酸等の脂肪酸等が挙げられる。
【００３５】
例えば、アルコール類としては、エタノール、イソピロパノール、エチレングリコール、ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、フェノキシエタノール、２−ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、２−オクチルドデカノール等、多価アルコール類として、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノルブチルエーテル、ポリエチレングリコール、酸化プロピレン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、１、３−ブチレングリコール、ペンチルグリコール、グリセリン、ペンタエリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、ガラクチトール、ソルビトール、マンニトール、ラクチトール、マルチトール等が挙げられる。
【００３６】
例えば、エステル類としては、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸へキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸オレイル、オリン酸デシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、酢酸ラノリン、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、モノステアリン酸グリセリン、ジオレイン酸プロピレングリコール等が挙げられる。
【００３７】
例えば、金属セッケン類としては、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、パルミチン酸亜鉛、ミリスチン酸マグネシウム、ラウリン酸亜鉛等が挙げられる。
【００３８】
例えば、ガム質、糖類又は水溶性高分子化合物としては、アラビアゴム、キサンタンガム、グアゴム、カラヤゴム、寒天、カゼイン、乳糖、果糖、ショ糖又はそのエステル、トレハロース又はその誘導体、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、カラギーナン、キチン又はキトサン類、アルギン酸やヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸又はその塩、ヘパリン、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、結晶セルロース、β−グルカン、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリアクリル酸塩、ポリアルキレンオキサイド又はその架橋重合物、カルボキシビニルポリマー等が挙げられる。
【００３９】
例えば、界面活性剤としては、アルキルカルボン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩等のアニオン界面活性剤、アルキルアミン塩、アルキル四級アンモニア塩等のカチオン界面活性剤、カルボン酸型両性界面活性剤、硫酸エステル型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル型両性界面活性剤、非イオン界面活性剤等の両性界面活性剤、天然界面活性剤、タンパク質加水分解物の誘導体、高分子界面活性剤、チタン・ケイ素を含む界面活性剤、フッ化炭素系界面活性剤等のその他の界面活性剤等が挙げられる。
【００４０】
例えば、ビタミン類としては、レチノール、レチナール、デヒドロレチナール、カロチン、リコピン等のビタミンＡ群、チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩、リボフラビン、ピリドキシン、シアノコパラミン、葉酸類等のビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビオチン、パントテン酸、リン酸アスコルビルマグネシウム塩、リン酸アスコルビルナトリウム塩、テトラへキシルデカン酸アスコルビル等のビタミンＣ誘導体、ビタミンＤ群、ビタミンＥ群及びその誘導体、ビタミンＫ群、その他、必須脂肪酸、カルニチン、フェルラ酸、γ−オリザノール、ビタミンＰ類、ビタミンＵ類等が挙げられる。
【００４１】
例えば、アミノ酸としては、バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、オルニチン、ヒスチジン等や、それらの硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、クエン酸、あるいはピロリドンカルボン酸等のアミノ酸誘導体等が挙げられる。
【００４２】
例えば、紫外線吸収／遮断剤としては、β−イソプロピルフラノン誘導体、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、パラジメチル安息香酸オクチル、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸等のベンゾフェノン誘導体、パラアミノ安息香酸、パラアミノ安息香酸エチル等のパラアミノ安息香酸誘導体、パラメトキシ桂皮酸エチル、パラメトキシ桂皮酸イソプロピル等のメトキシ桂皮酸誘導体、サリチル酸誘導体、アントラニル酸誘導体、ウロカニン酸誘導体、クマリン誘導体、アミノ酸系化合物、ベンゾトリアゾール誘導体、テトラゾール誘導体、イミダゾリン誘導体、ピリミジン誘導体、ジオキサン誘導体、カンファー誘導体、フラン誘導体、ピロン誘導体、核酸誘導体、アラントイン誘導体、ニコチン酸誘導体、ビタミンＢ６誘導体、ウンベリフェロン、エスクリン、桂皮酸ベンジル、シノキサート、オキシベンゾン、ジオキシベンゾン、オクタベンゾン、スリソベンゾン、ベンゾレソルシノール、アルブチン、グアイアズレン、シコニン、バイカリン、バイカレイン、ベルベリン、ネオヘリオパン、エスカルロール、酸化亜鉛、酸化チタン、タルク、カオリン等が挙げられる。
【００４３】
例えば、代謝促進作用／細胞賦活物質としては、ハイドロキノン、乳酸菌エキス、胎盤エキス、霊芝エキス、ビタミンＡ、ビタミンＥ、アラントイン、脾臓エキス、胸腺エキス、酵母エキス、発酵乳エキス、植物エキス、（アロエ、オウゴン、スギナ、ゲンチアナ、ゴボウ、シコン、ニンジン、ハマメリス、ホップ、ヨクイニン、オドリコソウ、センブリ、トウキ、トウキンセンカ、アマチャ、オトギリソウ、キュウリ、タチジャコウソウ、マンネンロウ、パセリ）等が挙げられる。
【００４４】
例えば、活性酸素消去剤として、コハク酸、タンニン酸、アラントイン、塩化亜鉛、硫酸亜鉛等の収斂剤も用いられ、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ等が挙げられる。
【００４５】
例えば、抗酸化剤として、ビタミンＣ又はその塩、ステアリン酸エステル、ビタミンＥ又はその誘導体、ノルジヒドログアセレテン酸、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ヒドロキシチロソール、パラヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、セサモール、セサモリン、ゴシポール、プロポリス等が挙げられる。
【００４６】
例えば、過酸化脂質生成抑制剤として、β−カロチン、植物エキス、（ゴマ、アマチャ、オトギリソウ、ハマメリス、チョウジ、メリッサ、エンメイソウ、シラカバ、サルビア、マンネンロウ、南天実、エイジツ、イチョウ、緑茶）等が挙げられる。
【００４７】
例えば、抗炎症剤として、イクタモール、インドメタシン、カオリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸メチル、アセチルサリチル酸、塩酸ジフェンヒドラミン、ｄ−カンフル、ｄｌ−カンフル、ヒドロコルチゾン、グアイアズレン、カマズレン、マレイン酸クロルフェニラミン、グリチルリチン酸又はその塩、グリチルレチン酸又はその塩、甘草エキス、シコンエキス、エイジツエキス、ユキノシタエキス、シソエキス、ヨクイニンエキス、プロポリス等が挙げられる。
【００４８】
例えば、抗菌・殺菌・消毒薬として、ヒノキチオール、アクリノール、イオウ、グルコン酸カルシウム、グルコン酸クロルヘキシジン、スルファミン、マーキュロクロム、ラクトフェリン又は加水分解物、塩化アルキルジアミノエチルグリシン液、トリクロサン、次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴ、サラシ粉、ヨウ素化合物、ヨードホルム、ソルビン酸又は塩、プロピオン酸又は塩、サルチル酸、デヒドロ酢酸、安息香酸、安息香酸ナトリウム、パラヒドロキシ安息香酸エステル類、ウンデシレン酸、チアミンラウリル硫酸塩、チアミンラウリル硝酸塩、フェノール、クレゾール、ｐ−クロロフェノール、ｐ−クロロ−ｍ−キシレノール、ｐ−クロロ−ｍ−クレゾール、チモール、フェネチルアルコール、Ｏ−フェニルフェノール、イルガサンＣＨ３５６５、ハロカルバン、ヘキサクロロフェン、クロロヘキシジン、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、ベンジルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、フェノキシエタノール、１，２−ペンタンジオール、ジンクピリジオン、クロロブタノール、イソプロピルメチルフェノール、ポリオキシエチレンラウリルエーテル等の非イオン界面活性剤、両性界面活性剤、ラウリル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤、塩化ベンザルコニウム等のカチオン界面活性剤、ホルムアルデヒド、ヘキサミン、感光素１０１号、感光素２０１号、感光素４０１号、Ｎ−長鎖アシル塩基性アミノ酸誘導体及びその酸附加塩、酸化亜鉛、ヒノキチオール、クジン、プロポリス、油溶性甘草エキス等が挙げられる。
【００４９】
例えば、保湿剤として、グリセリン、プロピレングリコール、１、３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、トリカプリルカプリン酸グリセリン、グリコール酸（−ヒドロキシ酸）、ヒアルロン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸又はその塩、水溶性キチン又はその誘導体あるいはキトサン誘導体、ピロリドンカルボン酸又はその塩、乳酸ナトリウム、尿素、ソルビトール、アミノ酸又はその誘導体、オリーブ油、カミツレ油、ヒマシ油等の油脂類（硬化油含む）、ミツロウ、ラノリン、セラックロウ等のロウ類、流動パラフィン、ワセリン、パラフィン等の鉱物油、納豆菌代謝物、納豆抽出エキス、絹繊維抽出物、カミツレ、アロエ等の植物エキス等が挙げられる。
【００５０】
例えば、角質溶解剤として、フロオロリン酸ジイソプロピル、植物エキス（オウゴン、オトギリソウ、クララ、桑の葉、ケイヒ、ゲンノショウコ、コンフリー、サルビア、セイヨウニワトコ、ボダイジュ、ボタンピ）海藻エキス等のエラスターゼ活性阻害剤、ビタミンＥ又はその誘導体、センブリエキス、ニンニクエキス、人参エキス、アロエエキス、ゲンチアナエキス、トウキエキス、セファランチン、塩化カルプロニウム、ミノキシジル等の末梢血管血流促進剤、さらにはトウガラシチンキ、ノニル酸バニルアミド、カンタリスチンキ、ショウキョウチンキ、ハッカ油、１−メントール、カンフル、ニコチン酸ベンジル等の刺激剤、ピリドキシン又はその誘導体、イオウ、ビタミンＢ６等の抗脂漏剤、レゾルシン、サリチル酸、乳酸、尿素等が挙げられる。
【００５１】
例えば、香料として、ジャコウ等の天然動物性香料、メントール、スペアミント、ペパーミント、アニス精油、オレンジ精油、カルダモン精油、グアヤクウッド精油、クミン精油、ケイ皮精油、シンナモン精油、ゲラニウム精油、コリアンデル精油、シソ精油、シダーウッド精油、シトロネラ精油、ジャスミン精油、ジンジャーグラス精油、杉精油、スペアミント精油、西洋ハッカ精油、橙花精油、冬緑精油、バラ精油、檜精油、ヒバ精油、白檀精油、ベイ精油、ベルガモット精油、ユーカリ精油、ライム精油、ラベンダー精油、レモン精油、ローズマリー精油、和種ハッカ精油等の植物性香料、その他合成香料等が挙げられる。
【００５２】
例えば、ホルモン類として、エストラジオール及びそのエステル、エストロン、エチニルエストラジオール、コルチゾン及びそのエステル、ヒドロコルチゾン及びそのエステル、ブレドニゾン、プレドニゾロン等が挙げられる。
【００５３】
例えば、一般に育毛・発毛効果に有効であると知られている成分としては、ペンタデカン酸グリセリド、コレウスエキス、ゲンチアナエキス、マツカサエキス、ローヤルセリーエキス、クマザサエキス、ｔ−フラバノン、６−ベンジルアミノプリン、センブリエキス、塩化カルプロニウム、ミノキシジル、フィナステリド、アデノシン、ニコチン酸アミド、桑の根エキス、ジオウエキス、５−アミノレブリン酸等が挙げられる。
【００５４】
その他として、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、防腐・防バイ剤、清涼剤、安定化剤、乳化剤、動・植物蛋白質及びその分解物、動・植物性多糖類及びその分解物、動・植物性糖蛋白質及びその分解物、血流促進剤、抗炎症剤、消炎剤、防腐剤、抗アレルギー剤、創傷治療剤、増泡剤、増粘剤、酵素、色素、精製水、口腔用剤、消炎・脱臭剤、苦味料等が挙げられる。
【００５５】
また、本開示の育毛・発毛促進剤の利用形態は任意であり、限定されるものではない。具体的には、化粧品、医薬部外品、医薬品としては、例えば、内用・外用剤、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パック、皮膚洗浄剤、シャンプー、リンス、ヘアトリートメント、ヘアクリーム、ポマード、ヘアスプレー、整髪料、パーマ剤、ヘアトニック、染毛剤等が挙げられる。食品としては、例えば、健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品等の保健機能食品及び特定用途食品、清涼飲料水、茶飲料、ドリンク剤、アルコール飲料等の液体食品、菓子、米飯類、パン類、麺類、惣菜類、調味料等が挙げられる。
【００５６】
本開示の育毛・発毛促進剤を化粧品、医薬部外品、医薬品の形態で実施する場合、剤形は限定されず、アンプル、カプセル、粉末、顆粒、丸剤、錠剤、固形剤、液剤、ゲル、気泡、乳液、クリーム、軟膏、シート、ムース等多様なものとすることができる。
【００５７】
以下に本開示をより詳細に説明するために実施例を挙げるが、本開示はこれらによってなんら限定されるものではない。
［実施例１：毛乳頭細胞賦活作用の評価］
（１−１）ヒト頭髪毛乳頭細胞の培養方法
試験対象細胞は、育毛剤の薬効評価に広く用いられている細胞であるヒト頭髪毛乳頭細胞（カタログ番号：ＣＡ６０２０５ａ、ロット番号：２５４８、白色人種、４７歳女性由来、販売元：東洋紡株式会社）を用いた。ヒト頭髪毛乳頭細胞は、毛乳頭細胞増殖培地（カタログ番号：ＴＭＴＰＧＭ−２５０、販売元：東洋紡株式会社）を用い、二酸化炭素インキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）内で培養した。培養に使用したフラスコは、Ｉ型コラーゲンでコートして使用した。細胞の継代には、毛乳頭細胞専用サブカルチャーセット（カタログ番号：ＣＡ０９０Ｋ、販売元：東洋紡株式会社）を用いて、細胞をフラスコより剥離して使用した。
【００５８】
（１−２）ヒト毛乳頭細胞毒性試験
本実施例ではイソサポナリンを被験物質とし、ヒト頭髪毛乳頭細胞に対する毒性の有無を評価した。
【００５９】
ヒト頭髪毛乳頭細胞を５×１０３個／ウェル（本試験では０．１ｍＬ／ウェル）となるように、Ｉ型コラーゲンコートの９６ウェルプレートに播種した。二酸化炭素インキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）内で、１日間培養後（５０％コンフルエント）、イソサポナリンを含む試験培地に置換し、その後、３日間培養した。細胞の増殖性を生細胞数測定試薬ＳＦ（カタログ番号：０７５５３、販売元：ナカライテスク株式会社）で比較検討した。生細胞数測定時の吸光度測定の際に細胞に付着した析出物が吸光度に影響を及ぼす可能性を考慮し、３日間の培養終了後、培養の上澄み液を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（略称：ＰＢＳ）で細胞を洗浄した。ＰＢＳで洗浄した後、生細胞測定試薬ＳＦを１０％含む培地を１ウェルあたり１００μＬ添加した。添加後、３０分後及び９０分後に培養上澄み液の吸光度（測定波長４５０ｎｍ、参照波長５９５ｎｍ）を測定した。９０分及び３０分の値から１時間あたりの吸光度ＡＢＳの変化量（単位：ＡＢＳ／ｈｒ）を算出した。試験数３にて実施した。
【００６０】
図１に示すように、イソサポナリンは１０００μｍｏｌ／Ｌ以下であればヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、毒性を示さなかった。したがって、後述するイソサポナリンの評価実験においては、０．１μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、１０００μｍｏｌ／Ｌのイソサポナリン試験濃度を用いた。この試験濃度は、イソサポナリン（分子量５９４．５２）を１００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように毛乳頭細胞増殖培地に溶解したストック溶液から調製された。
【００６１】
（１−３）ヒト頭髪毛乳頭細胞賦活作用の評価
ヒト頭髪毛乳頭細胞を１．２×１０４個／ウェル（本試験では０．３ｍＬ／ウェル）となるように、４８ウェルプレートに播種した。二酸化炭素インキュベータ内で、１日間培養後、終濃度０．１μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、１０００μｍｏｌ／Ｌのイソサポナリンになるように溶解した毛乳頭細胞増殖培地に置換した。その後、１日間及び３日間培養し、それぞれの細胞の増殖性を生細胞数測定試薬ＳＦで比較検討した。１日間及び３日間の培養がそれぞれ終了した後、培養の上澄み液を除去し、ＰＢＳで細胞を洗浄した。ＰＢＳで洗浄した後、生細胞測定試薬ＳＦを１０％含む培地を１ウェルあたり３００μＬ添加した。添加後、３０分後及び９０分後に１ウェルあたりの培養上澄み液１００μＬを別の９６ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダにて吸光度（測定波長４５０ｎｍ、参照波長５９５ｎｍ）を測定した。９０分及び３０分の値から１時間あたりの吸光度ＡＢＳの変化量（単位：ＡＢＳ／ｈｒ）を算出し、細胞賦活作用を評価した。試験数５にて実施した。なお、イソサポナリンの比較対照区として無添加対照区を用いた。
【００６２】
陽性対照として、終濃度１００μｍｏｌ／Ｌのアデノシン（カタログ番号：０１６−１０４９３、販売元：和光純薬工業株式会社）及び終濃度３０μｍｏｌ／Ｌのミノキシジル（カタログ番号：Ｍ４１４５−２５ＭＧ、販売元：シグマアルドリッチジャパン株式会社）を添加した場合についても、同様の試験を行った。なお、アデノシンはジメチルスルホキシド（略称：ＤＭＳＯ）に溶解後、ＤＭＳＯの終濃度が０．１％となるように試験培地に添加した。溶媒対照として、０．１％ＤＭＳＯ試験区を設けた。ミノキシジルはエタノールに溶解後、エタノールの終濃度が０．１％となるように試験培地に添加した。一般に、毛乳頭細胞では、０．１％以下のエタノール濃度では細胞機能に影響を与えないことから、ミノキシジルの比較対照区として無添加対照区を用いた。
【００６３】
被験物質であるイソサポナリンを添加後、１日間培養した測定結果を図２に示し、イソサポナリンを添加後、３日間培養した測定結果を図３に示した。比較試験区間では有意差検定を行った。検定はＳｔｕｄｅｎｔ  Ｔ−ｔｅｓｔとして行い、Ｐ＜０．０５（帰無仮説が５％未満）のものを有意性ありと判断し、図中に記載した。
【００６４】
図２から明らかなように、処理期間１日間において、イソサポナリン処理をした群では、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜１０００μｍｏｌ／Ｌの範囲でヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、無添加対照区よりわずかではあるが有意な細胞賦活作用が認められた。また、図３から明らかなように、処理期間３日間において、イソサポナリン処理をした群では、０．１μｍｏｌ／Ｌ〜１０００μｍｏｌ／Ｌの範囲でヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、無添加対照区よりも顕著な細胞賦活作用が認められた。その細胞賦活作用は、ミノキシジルを処理した場合の約３倍の作用が認められた。
【００６５】
一方、陽性対照物であるアデノシンは、処理期間３日間において、ヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、０．１％ＤＭＳＯ試験区よりも有意な細胞賦活作用が認められた。また、陽性対照物であるミノキシジルは、処理期間１日間において、ヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、無添加対照区よりもわずかではあるが有意な細胞賦活作用が認められた。処理期間３日間においては、ミノキシジルは、ヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、無添加対照区よりも有意な細胞賦活作用が認められた。
【００６６】
この結果から、イソサポナリンを頭皮等に適用することにより、極めて優れた毛乳頭細胞賦活作用を発揮し、育毛効果及び発毛効果が期待できることが示唆された。
［実施例２：イソサポナリンのＶＥＧＦ産生促進作用の評価］
イソサポナリン処理を施したヒト頭髪毛乳頭細胞が産生するＶＥＧＦ量を測定することのより、ヒト頭髪毛乳頭細胞に対するイソサポナリンのＶＥＧＦ産生促進作用について評価した。
【００６７】
ヒト頭髪毛乳頭細胞に対してイソサポナリンを３日間処理した培養上澄み液におけるＶＥＧＦ量をＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（製品名：Ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ、カタログ番号：ＤＶＥ００、販売元：Ｒ＆Ｄシステム社）にて測定した。イソサポナリンを３日間処理した培養上澄み液は、上記（１−３）項において３日間培養した際の上澄み液を用いた。具体的には、上記（１−３）項では、吸光度を測定するために、イソサポナリンの添加３日後、培養の上澄み液を除去したが、ＶＥＧＦ産生促進作用の評価試験においては、イソサポナリンの添加３日後の培養上澄み液を回収し、当該上澄み液を検体として用いた。試験数５にて実施した。
【００６８】
以下にＶＥＧＦの測定方法を詳述する。なお、ＶＥＧＦの測定には、上澄み液を希釈せずに、原液を用いた。
手順１−１．ＶＥＧＦ標準原液（２０００ｐｇ／ｍＬ）をもとに、反応緩衝液を用いて、１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２、１５．６ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦ標準溶液を調製した。
手順１−２．ＶＥＧＦ標準溶液及び検体（培養上澄み液）２００μＬを５０μＬの希釈用液を各ウェルに添加したＶＥＧＦ固相化マイクロプレートに添加し、室温にて２時間反応した（一次反応）。
手順１−３．ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で３回洗浄した。
手順１−４．西洋わさびペルオキシダーゼ結合ＶＥＧＦ抗体溶液を各ウェルに２００μＬずつ添加し、室温で２時間反応させた（二次反応）。
手順１−５．ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で３回洗浄した。
手順１−６．基質溶液２００μＬを各ウェルに添加し、室温で２０分反応させた。
手順１−７．反応停止溶液を各ウェルに５０μＬずつ添加し、プレートミキサーで１分間混和後、プレートリーダで各ウェルの吸光度を測定した（測定波長４５０ｎｍ）。
手順１−８．標準曲線から、検体中のＶＥＧＦ濃度を算出した。
【００６９】
また、イソサポナリンの比較対照区として無添加対照区を用いた。
陽性対照として、終濃度３０μｍｏｌ／Ｌのミノキシジルを添加した場合についても、同様の試験を行った。ミノキシジルの比較対照区として無添加対照区を用いた。
【００７０】
被験物質を３日間処理した培養上澄み液中のＶＥＧＦ量を測定した結果を図４に示した。上記（１−３）項と同様に、有意差検定を行い、図中に記載した。
図４から明らかなように、ヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、イソサポナリン１０００μｍｏｌ／Ｌ濃度区で、無添加対照区と比較して、有意にＶＥＧＦ量が増加していた。一方、陽性対照物であるミノキシジルは、ヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、無添加対照区と比較して、有意にＶＥＧＦ量が増加していた。
【００７１】
この結果から、イソサポナリンを頭皮等に適用することにより、ＶＥＧＦ産生量が高められ、優れた育毛効果及び発毛効果が期待できることが示唆された。
［実施例３：化粧品の製造］
本わさび１００ｋｇを水で洗浄した後、１ｃｍ幅にカットし、カッターミキサーにて粉砕した。粉砕した本わさびに５０％ブチレングリコールを２００ｋｇ加え、１時間撹拌した。その後、圧搾して１８０ｋｇの圧搾液を得た。さらに、当該圧搾液を９０℃で３０分加熱殺菌して抽出物を得た。こうして得られた本わさびの抽出物を用いて、下記に示す配合の頭髪用化粧品を製造した。下記の配合は全量を１００ｇとして表示した。当該頭髪用化粧品１００ｇ中にイソサポナリンは１．５ｍｇ含有する。
水                          ８６．４８ｇ
ブチレングリコール          ５．０ｇ
グリセリン                  ２．０ｇ
本わさびの抽出物            ５．０ｇ
トレハロース                １．０ｇ
フェノキシエタノール        ０．５ｇ
クエン酸ナトリウム          ０．０１ｇ
クエン酸                    ０．０１ｇ
［実施例３の変形例］
上記実施例３では、化粧品として、頭髪用化粧品１００ｇ中にイソサポナリン１．５ｍｇ含有する例を示したが、これに限定されるものではない。例えば、化粧品１００ｍＬ中にイソサポナリン５μｇ（０．１μｍｏｌ／Ｌ）〜５９．０ｍｇ（１，０００μｍｏｌ／Ｌ）含有していてもよい。
【００７２】
また、上記実施例３では、頭髪用化粧品中にイソサポナリンが含有されている例を示したが、フェニルプロパノイド類が含有されていてもよい。具体的には、頭髪用化粧品１００ｍＬには、フェニルプロパノイド類が１．０ｍｇ含まれていてもよい。また、フェニルプロパノイド類の含有量は、これに限定されるものではない。例えば、化粧品１００ｍＬ中にフェニルプロパノイド類０．００１〜１００ｍｇを含有してもよい。
【００７３】
［実施例４：食品の製造（その１）］
本わさび１００ｋｇを水で洗浄した後、１ｃｍ幅にカットし、カッターミキサーにて粉砕した。粉砕した本わさびに５０％エタノールを２００ｋｇ加え、１時間撹拌した。その後、圧搾して１８０ｋｇの液を得た。さらに、当該液を濃縮してアルコール分を除去した後、９０℃で３０分加熱処理により殺菌した。セルロース１０ｋｇを加えて混練した後、乾燥・粉砕して本わさびのエキス粉末を得た。こうして得られたエキス粉末２００ｍｇをハードカプセル（３号）に充填して、剤形がカプセルである食品（例えばサプリメント等）を製造した。当該カプセル中のイソサポナリンは、１ｍｇ／粒含有する。
【００７４】
［実施例５：食品の製造（その２）］
実施例４で作製したエキス粉末１５０ｍｇを使用して、下記に示す配合比で原料組成物を調製して、打錠し、剤形が錠剤である食品（例えばサプリメント等）を製造した。当該錠剤中のイソサポナリンの含有量は、０．７５ｍｇ／粒である。
錠剤  １．５ｇ／粒（５粒／日）
グラニュー糖          １．２０ｇ
濃縮果汁              ０．０４５ｇ
クエン酸              ０．０７５ｇ
香料                  ０．０３ｇ
本わさびのエキス粉末  ０．１５ｇ
［実施例６：食品の製造（その３）］
本わさび１００ｋｇを洗浄してカットし、５０％エタノールを２００ｋｇ加え１８０ｋｇの抽出液を得た。得られた抽出液を濃縮してアルコール分を除去し、セルロースを３０ｋｇ添加して乾燥、粉末化した。得られた粉末を打錠し、１錠２００ｍｇの錠剤を作成した。１錠中には、１．０ｍｇのフェニルプロパノイド類が含まれる。
【００７５】
［実施例４、５、６の変形例］
上記実施例５では、剤形が錠剤である食品として、１．５ｇ／粒の錠剤にイソサポナリン０．７５ｍｇ／粒含有する例を示したが、これに限定されるものではない。例えば、２５０ｍｇ／粒の錠剤にイソサポナリン０．５ｍｇ〜１００ｍｇ／粒含有していてもよい。
【００７６】
また、上記実施例５では、錠剤の製造方法の例を示したが、これに限定されるものではない。例えば、イソサポナリンとデキストリンを混合して、打錠し、錠剤を製造してもよい。また、例えば、実施例４で作製したエキス粉末とデキストリンを混合して、打錠し、錠剤を製造してもよい。
【００７７】
また、上記実施例６では、１錠中に１．０ｍｇのフェニルプロパノイド類が含有する例を示したが、これに限定されるものではない。例えば、濃縮率を変えることで、１錠中に１．０ｍｇ〜１００ｍｇのフェニルプロパノイド類を含有してもよい。
【００７８】
［実施例７：イソサポナリン以外の被験物質による評価］
実施例７では、表１に示される被験物質それぞれが添加された培養液でヒト頭髪毛乳頭細胞を培養した後、生細胞数測定、ＶＥＧＦ産生量、及びＦＧＦ−７遺伝子発現量を検証した。
【００７９】
【表１】
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【００８０】
被験物質のアピゲニンとしては、和光純薬工業株式会社、カタログ番号０１２−１８９１３を用いた。被験物質のクマル酸としては、シグマアルドリッチ社、カタログ番号：Ｃ９００８を用いた。被験物質のカフェ酸メチルエステルとしては、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ社、カタログ番号：Ｊ６３８７６を用いた。
【００８１】
また、各被験物質のストック溶液を作製するために使用した溶媒及びストック溶液の濃度を表１に示す。各ストック溶液はろ過滅菌し試験に使用した。
陽性対照であるアデノシンはＤＭＳＯを溶媒として１００ｍｍｏｌ／Ｌストック溶液を作製、それを終濃度１００μｍｏｌ／Ｌとなるように試験培地に添加した（溶媒対照として０．１％ＤＭＳＯ試験区を使用した）。ミノキシジルは５０％エタノールを用いて濃度１５ｍｍｏｌ／Ｌのストック溶液を作製し、それを終濃度３０μｍｏｌ／Ｌとなるように試験培地に添加した。このときの溶媒（エタノール）濃度は０．２％であることから０．２％エタノール試験区を対照区とした。
【００８２】
（７−１）ヒト頭髪毛乳頭細胞の培養方法
試験対象細胞は、ヒト頭髪毛乳頭細胞（カタログ番号：ＣＡ６０２ｔ０５ａ、ロット番号：２８６８、白色人種、５１歳男性由来、頭頂部、販売元：東洋紡株式会社）を用いた。実施例１の（１−１）項に記載された方法と同様に、ヒト頭髪毛乳頭細胞を培養した。
【００８３】
（７−２）ヒト毛乳頭細胞毒性試験
実施例１の（１−２）項に記載された方法と同様に、被験物質のヒト頭髪毛乳頭細胞に対する毒性の有無を評価した。その結果を図５〜図７に示す。
【００８４】
図５に示すように、アピゲニンは、０．０８ｍｍｏｌ／Ｌ以上でヒト頭髪毛乳頭細胞に対して毒性を示した。図６に示すように、クマル酸は、２ｍｍｏｌ／Ｌ以上でヒト頭髪毛乳頭細胞に対して毒性を示した。図７に示すように、カフェ酸メチルエステルは、０．０１６ｍｍｏｌ／Ｌ以上でヒト頭髪毛乳頭細胞に対して毒性を示した。細胞毒性試験の結果をもとに本試験での試験濃度を表２の通りにした。
【００８５】
【表２】
2020055848.tif 000005
【００８６】
各被験物質の試験最高濃度での溶媒濃度は０．１％以下であることから本試験での溶媒の影響がないと判断し、有意差比較では無添加対照区を比較基準とした。なお、検定はＳｔｕｄｅｎｔ  Ｔ−ｔｅｓｔとして行い、Ｐ＜０．１、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、及びＰ＜０．００１のものを有意性ありと判断し、図中に記載した。
【００８７】
（７−３）ヒト頭髪毛乳頭細胞賦活作用及びＶＥＧＦ産生促進作用の評価
ヒト頭髪毛乳頭細胞を１．２×１０４個／ウェル（本試験では０．３ｍＬ／ウェル）となるように、４８ウェルプレートに播種した。二酸化炭素インキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）内で、１日間培養後、被験物質を含む培地に置換する。その後、３日間培養し、それぞれの細胞の増殖性を生細胞数測定試薬ＳＦで比較検討した。試験数５にて実施した。３日間の培養が終了した後、培養の上澄み液を回収し、当該上澄み液中のＶＥＧＦ産生量を実施例２と同様にＥＬＩＳＡ  ｋｉｔにて測定した。
【００８８】
さらに、当該上澄み液を除去し、ＰＢＳで細胞を洗浄後、生細胞測定試薬ＳＦを１０％含む培地を添加（３００μＬ／ウェル）した。添加後、３０分後及び９０分後に１ウェルあたりの培養上澄み液１００μＬを別の９６ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダにて吸光度（測定波長４５０ｎｍ、参照波長５９５ｎｍ）を測定した。９０分及び３０分の値から１時間あたりの吸光度ＡＢＳの変化量（単位：ＡＢＳ／ｈｒ）を算出し、細胞賦活作用を評価した。
【００８９】
有意差検定により有意性ありと判断した被験物質について、生細胞数の測定結果を図８に示し、ＶＥＧＦ蛋白産生量の結果を図９に示す。
図８に示すように、アピゲニンを処理した群では、０．００１μｍｏｌ／Ｌ〜１μｍｏｌ／Ｌの範囲でヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、無添加対照区よりも有意な細胞賦活作用が認められた。また、アピゲニンを処理した群では、１０μｍｏｌ／Ｌで有意性を示さなかった。よって、アピゲニンを処理した群に関しては、０．００１μｍｏｌ／Ｌ〜９μｍｏｌ／Ｌの範囲でヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、無添加対照区よりも有意な細胞賦活作用が認められると考えられる。
【００９０】
クマル酸を処理した群では、０．１μｍｏｌ／Ｌでヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、無添加対照区よりも有意な細胞賦活作用が認められた。また、クマル酸を処理した群では、０．０１μｍｏｌ／Ｌ及び１０μｍｏｌ／Ｌで有意性を示さなかった。よって、クマル酸を処理した群に関しては、０．０１１μｍｏｌ／Ｌ〜９μｍｏｌ／Ｌで、好ましく０．０１１μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌで、ヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、無添加対照区よりも有意な細胞賦活作用が認められると考えられる。
【００９１】
一方、陽性対照物であるアデノシンは、ヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、０．１％ＤＭＳＯ試験区よりも有意な細胞賦活作用が認められた。また、陽性対照物であるミノキシジルは、ヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、０．２％エタノール試験区よりも有意な細胞賦活作用が認められた。
【００９２】
この結果から、アピゲニン及びクマル酸を頭皮等に適用することにより、優れた毛乳頭細胞賦活作用を発揮し、育毛効果及び発毛効果が期待できることが示唆された。
また、図９に示すように、アピゲニンを処理した群では、０．００１μｍｏｌ／Ｌ〜０．０１μｍｏｌ／Ｌの範囲でヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、無添加対照区よりも有意にＶＥＧＦ量が増加していた。また、アピゲニンを処理した群では、０．１μｍｏｌ／Ｌで有意性を示さなかった。よって、アピゲニンを処理した群に関しては、０．００１μｍｏｌ／Ｌ〜０．０９μｍｏｌ／Ｌの範囲でヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、無添加対照区よりも有意にＶＥＧＦ量が増加すると考えられる。
【００９３】
カフェ酸メチルエステルを処理した群では、１μｍｏｌ／Ｌでヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、無添加対照区よりも有意にＶＥＧＦ量が増加していた。また、カフェ酸メチルエステルを処理した群では、０．１μｍｏｌ／Ｌ及び１０μｍｏｌ／Ｌで有意性を示さなかった。よってカフェ酸メチルエステルを処理した群に関しては、０．１１μｍｏｌ／Ｌ〜９μｍｏｌ／Ｌで、好ましく０．０１１μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌで、ヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、無添加対照区よりも有意にＶＥＧＦ量が増加すると考えられる。
【００９４】
一方、陽性対照物であるアデノシンは、ヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、０．１％ＤＭＳＯ試験区よりもわずかではあるが有意にＶＥＧＦ量が増加していた。また、陽性対照物であるミノキシジルは、ヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、０．２％エタノール試験区よりも有意にＶＥＧＦ量が増加していた。
【００９５】
（７−４）ＦＧＦ−７遺伝子発現の評価
ヒト頭髪毛乳頭細胞を１×１０５個／ウェル（本試験では０．３ｍＬ／ウェル）となるように、コラーゲンコート４８ウェルプレートに播種した。二酸化炭素インキュベータ内（５％ＣＯ２、３７℃）で、１日間培養後（１００％コンフルエントを確認する）、被験物質（３段階濃度：無毒性濃度域）を含む培地に置換した。その後、２時間培養し、トータルＲＮＡを回収、ｃＤＮＡに逆転写した後、リアルタイムＰＣＲ法にてＦＧＦ−７遺伝子発現を測定した。内部標準としてＧＡＰＤＨ遺伝子を用いて陰性対照群との相対値として算出し、試験数３にて実施した。各手法の詳細を以下に示す。
【００９６】
まず、細胞からトータルＲＮＡの回収及びｃＤＮＡ化は、ＦａｓｔＬａｎｅ  Ｃｅｌｌ  ＲＴ−ＰＣＲキットの手順に従って行った。
手順７−１．ＰＢＳで洗浄した細胞にウェルあたり５００μＬのバッファーＦＣＷを添加、すぐにバッファーＦＣＷを除去吸引した。
【００９７】
手順７−２．ウェルあたり２００μＬのバッファーＦＣＰを添加、室温（２５℃）で５分間インキュベート後、ＦａｓｔＬａｎｅサイセートを９６ウェルＰＣＲチューブに移した。チューブを−８０℃にて次のｃＤＮＡ化作業まで保存した。
【００９８】
手順７−３．室温で手順７−２のライセートを溶解した。新たなＰＣＲチューブに２μＬのｇＤＮＡ  Ｗｉｐｅｏｕｔ  Ｂｕｆｆｅｒ、１μＬのＦａｓｔＬａｎｅライセート、１１μＬのＲＮａｓｅフリー水を添加し４２℃にて５分間反応した。その後、すぐに氷上へ移した。（実際はライセートの入ったチューブにｇＤＮＡ  Ｗｉｐｅｏｕｔ  Ｂｕｆｆｅｒ、ＲＮａｓｅフリー水のマスターミックスを適量添加した。）
手順７−４．手順７−３で得られた反応液１４μＬに逆転写反応マスターミックス（１μＬのＱｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、４μＬのＱｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｂｕｆｆｅｒ、１μＬのＲＴ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ／チューブ）を６μＬ添加し、４２℃、３０分間インキュベートした。
【００９９】
手順７−５．反応液を９５℃、３分間処理することで逆転写酵素を失活させた。この反応液を合成ｃＤＮＡとしてリアルタイムＰＣＲに用いた。解析に用いるまで−８０℃で保存した。
【０１００】
次に、リアルタイムＰＣＲ専用チューブに以下のように反応液を調整し、ＰＣＲを行った。ＰＣＴ反応として、９５℃１０秒間及び６０℃３０秒間を６０サイクル行った。
ｄｓＨ２Ｏ                                      ２．４μＬ
ＳＹＢＥＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ          ４．０μＬ
フォワードプライマー（２０μｍｏｌ／Ｌ）        ０．３μＬ
リバースプライマー（２０μｍｏｌ／Ｌ）          ０．３μＬ
合成ｃＤＮＡ                                    １．０μＬ
合計    ８．０μＬ
試験に使用したＦＧＦ−７の特異的プライマー、及び内部標準としたＧＡＤＰＨの特異的プライマーを以下に示す。
ＦＧＦ−７のプライマー
フォワードプライマー：tctgtcgaacacagtggtacctgag（配列番号１）
リバースプライマー：gccactgtcctgatttccatga（配列番号２）
ＧＡＤＰＨのプライマー
フォワードプライマー：catccctgcctctactggcgctgcc（配列番号３）
リバースプライマー：ccaggatgcccttgagggggccctc（配列番号４）
各遺伝子の相対発現量を次のように算出した。各遺伝子の増幅曲線と閾値線との交点より、Ｃｔ値（ＰＣＲサイクル数）を算出した。目的遺伝子のＣｔ値より内部標準ＧＡＰＤＨ遺伝子のＣｔ値を引いたＣｔ（目的遺伝子）−Ｃｔ（ＧＡＰＤＨ２）＝ΔＣｔ値である。さらに、ΔＣｔ値よりブランクの平均ΔＣｔ値を引いたΔＣｔ（サンプル処理区）−ΔＣｔ（ブランク区）＝ΔΔＣｔ値とする。ΔΔＣｔ値を乗数項に代入した２−ΔΔＣｔ値が相対発現量となる。
【０１０１】
有意差検定により有意性ありと判断した被験物質について、ＦＧＦ−７遺伝子発現量の結果を図１０に示す。
図１０に示すように、クマル酸を処理した群では、０．００１μｍｏｌ／Ｌでヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、無添加対照区よりも有意にＦＧＦ−７遺伝子発現の上昇を示した。また、クマル酸を処理した群では、０．０１μｍｏｌ／Ｌで有意性を示さなかった。よって、クマル酸を処理した群に関しては、０．００１μｍｏｌ／Ｌ〜０．００９μｍｏｌ／Ｌで、好ましく０．００１μｍｏｌ／Ｌ〜０．００５μｍｏｌ／Ｌで、ヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、無添加対照区よりも有意にＦＧＦ−７遺伝子発現の上昇を示すと考えられる。
【０１０２】
一方、陽性対照物であるアデノシンは、ヒト頭髪毛乳頭細胞に対して、０．１％ＤＭＳＯ試験区よりも有意にＦＧＦ−７遺伝子発現の上昇を示した。
以上、育毛・発毛促進剤の実施例について説明したが、上述の実施例において例示した構成については種々変形することができる。例えば、上記実施例では、上記式（Ｉ）で表されるフラボノイド類の例として、イソサポナリン及びアピゲニンを用いる例を示したが、これに限定されるものではない。イソサポナリン及びアピゲニン以外には、既に本明細書中において例示したフラボノイド類を用いることができ、これらのフラボノイド類を用いた場合でも、イソサポナリンを用いた場合と同様の育毛・発毛促進効果を期待することができる。
【０１０３】
また、上記実施例では化粧品及び食品の原料として、本わさびを利用した例を示したが、これに限定されるものではない。化粧品及び食品の原料は、例えば、西洋わさびであってもよく、本わさびと西洋わさびを併用してもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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