(57)【要約】      （修正有）【課題】早期診断およびモニタリングのための新規で低侵襲性の診断方策の開発が、臨床で緊急に求められている。【解決手段】ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＥＰＨＡ２、ＬＡＭＣ２、ＳＰＯＮ２、ＳＳＲ２、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、ＣＤ１４７、ＣＤ３２０、ＣＤＨ３、ＬＲＰ１０、ＳＰＩＮＴ２、ＳＵＳＤ２、およびＣＳＴ２からなる群から選択される少なくとも２種のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む組成物、及び乳癌または疾患再発を検出するために使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２〜２５種の抗体検出マーカからなる組成物であって、ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＥＰＨＡ２、ＬＡＭＣ２、ＳＰＯＮ２、ＳＳＲ２、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、ＣＤ１４７、ＣＤ３２０、ＣＤＨ３、ＬＲＰ１０、ＳＰＩＮＴ２、ＳＵＳＤ２、およびＣＳＴ２からなる群から選択される少なくとも２種のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む、組成物。
【請求項２】
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＥＰＨＡ２、ＧＡＬ１、ＬＡＭＣ２、ＳＰＯＮ２、ＣＳＴ２、ＳＰＩＮＴ２およびＳＳＲ２からなる群から選択される少なくとも２種のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記列挙された群のうちの少なくとも５種のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
ＭＵＣ１およびＧＲＮの一方または両方に対するヒト自己抗体を検出するための試薬をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
２〜２０種の抗体検出マーカからなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
４〜１０種の抗体検出マーカからなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
５〜１０種の抗体検出マーカからなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
以下のマーカセット：
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１、および５  ＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、およびＧＦＲＡ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＧＦＲＡ１；ならびに
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＭＵＣ１、
の１つに対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＭＵＣ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよびＬＲＲＣ１５に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ヒト自己抗体を検出するための前記試薬が、少なくとも２種のタンパク質、またはその抗原性断片を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも２種のタンパク質、またはその抗原性断片が、ネイティブの細胞外ドメインおよび／もしくはネイティブの分泌タンパク質またはそれらの抗原性断片を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記試薬が、検出可能に標識されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記試薬が、表面に固定されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
乳癌または疾患の再発を検出するための方法であって、乳癌または乳癌の再発を有するリスクがある対象からの体液試料をＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＥＰＨＡ２、ＬＡＭＣ２、ＳＰＯＮ２、ＳＳＲ２、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、ＣＤ１４７、ＣＤ３２０、ＣＤＨ３、ＬＲＰ１０、ＳＰＩＮＴ２、ＳＵＳＤ２、およびＣＳＴ２の１種または複数に対する自己抗体を検出するための１種または複数の試薬と接触させることを含み、前記１種または複数のタンパク質に対する自己抗体の存在が、前記対象が乳癌または乳癌の再発を有する可能性と相関する、方法。
【請求項１５】
前記試薬が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＥＰＨＡ２、ＧＡＬ１、ＬＡＭＣ２、ＳＰＯＮ２、ＣＳＴ２、ＳＰＩＮＴ２およびＳＳＲ２の１種または複数に対する自己抗体を検出するための試薬を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記試薬が、前記列挙されたタンパク質の２種以上に対する自己抗体を検出するための試薬を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記試薬が、前記列挙されたタンパク質の５種以上に対する自己抗体を検出するための試薬を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記試薬が、以下のマーカセット：
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１、および５  ＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、およびＧＦＲＡ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＧＦＲＡ１；ならびに
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＭＵＣ１、
の１つに対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記試薬が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＭＵＣ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよびＬＲＲＣ１５に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記１種または複数の試薬が、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物を含む、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記接触させることが、ＥＬＩＳＡの使用を含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記体液試料が、前記対象からの血清試料を含む、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
乳癌または乳癌の再発を有する可能性があるとして前記対象を同定し、前記乳癌または乳癌の再発を処置するのに十分な治療薬の量で前記対象を処置することをさらに含む、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記接触させることが、縦断的アッセイスクリーニング（Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  Ａｓｓａｙ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）の使用を含み、全ての標的バイオマーカが単一テストおよび希釈の中で検出および定量され得る、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記体液試料が、前記対象からの血液試料を含む、請求項１４〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）乳癌のリスクがある対象からの体液試料をテストすること、ならびに
（ｉ）ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＭＵＣ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよびＬＲＲＣ１５の少なくとも１つに対する自己抗体を有する；ならびに／または
（ｉｉ）ＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよび／もしくはＬＲＲＣ１５に対する自己抗体を有さない；
候補対象を同定すること；ならびに
（ｂ）前記乳癌を処置するのに十分な治療薬の量で前記候補対象を処置すること、
を含む、乳癌の対象を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる、２０１４年３月１８日出願の米国特許仮出願第６１／９５４９１４号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
背景
乳癌（ＢＣａ）の患者の場合、処置を最適化して長期生存に導くためには、早期に行う個別の診断が不可欠である。マンモグラフィーは、ＢＣａを検出するための最も広範に用いられる方法であるが、乳房の密度が高いことが大きな原因で、マンモグラムのスクリーニングのおよそ２０％が偽陰性と診断される。加えて、マンモグラムを得る女性１０名中１名が、追加の造影を必要とする。その上、１０００例のマンモグラムのスクリーニングのうち２〜４例だけが癌と診断されることから、これらの女性の圧倒的多数は、ＢＣａを有さないことになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
それゆえ、ＢＣａの早期診断およびモニタリングのための新規で低侵襲性の診断方策の開発が、臨床で緊急に求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
第一の態様において、本発明は、２〜２５種の抗体検出マーカからなる組成物であって、ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＥＰＨＡ２、ＬＡＭＣ２、ＳＰＯＮ２、ＳＳＲ２、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、ＣＤ１４７、ＣＤ３２０、ＣＤＨ３、ＬＲＰ１０、ＳＰＩＮＴ２、ＳＵＳＤ２、およびＣＳＴ２からなる群から選択される少なくとも２種のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む、組成物を提供する。一実施形態において、組成物は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＥＰＨＡ２、ＧＡＬ１、ＬＡＭＣ２、ＳＰＯＮ２、ＣＳＴ２、ＳＰＩＮＴ２およびＳＳＲ２からなる群から選択される少なくとも２種のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む。さらなる実施形態において、組成物は、列挙された群のうちの少なくとも５種のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む。別の実施形態において、組成物は、ＭＵＣ１およびＧＲＮの一方または両方に対するヒト自己抗体を検出するための試薬をさらに含む。様々な実施形態において、組成物は、２〜２０種、４〜１０種、および５〜１０種の抗体検出マーカからなる。様々なさらなる実施形態において、組成物は、以下のマーカセット：
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１、および５  ＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、およびＧＦＲＡ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＧＦＲＡ１；ならびに
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＭＵＣ１、
のうちの１つに対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む。
【０００５】
別の実施形態において、ヒト自己抗体を検出するための試薬は、少なくとも２種のタンパク質、またはその抗原性断片を含む。さらなる実施形態において、少なくとも２種のタンパク質、またはその抗原性断片は、ネイティブの細胞外ドメインおよび／もしくはネイティブの分泌タンパク質またはそれらの抗原性断片を含む。さらなる実施形態において、試薬は、検出可能に標識されている。別の実施形態において、試薬は、表面に固定されている。
【０００６】
別の態様において、本発明は、乳癌または疾患の再発を検出するための方法であって、乳癌または乳癌再発を有するリスクがある対象からの体液試料を、ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＥＰＨＡ２、ＬＡＭＣ２、ＳＰＯＮ２、ＳＳＲ２、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、ＣＤ１４７、ＣＤ３２０、ＣＤＨ３、ＬＲＰ１０、ＳＰＩＮＴ２、ＳＵＳＤ２、およびＣＳＴ２のうちの１種または複数に対する自己抗体を検出するための１種または複数の試薬と接触させることを含み、１種または複数のタンパク質に対する自己抗体の存在が、対象が乳癌または乳癌再発を有する可能性と相関する、方法を提供する。別の実施形態において、試薬は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＥＰＨＡ２、ＧＡＬ１、ＬＡＭＣ２、ＳＰＯＮ２、ＣＳＴ２、ＳＰＩＮＴ２およびＳＳＲ２のうちの１種または複数に対する自己抗体を検出するための試薬を含む。様々なさらなる実施形態において、試薬は、列挙されたタンパク質の２種以上、または５種以上に対する自己抗体を検出するための試薬を含む。別の実施形態において、試薬は、以下のマーカセット：
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１、および５  ＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、およびＧＦＲＡ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＧＦＲＡ１；ならびに
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＭＵＣ１、
のうちの１つに対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む。
【０００７】
さらなる実施形態において、試薬は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＭＵＣ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよびＬＲＲＣ１５に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む。別の実施形態において、１種または複数の試薬は、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの組成物を含む。さらなる実施形態において、接触させることは、ＥＬＩＳＡの使用を含む。別の実施形態において、体液試料は、対象からの血清試料を含む。さらなる実施形態において、方法は、対象を、乳癌または乳癌再発を有する可能性が高いと同定する。さらなる実施形態において、方法は、乳癌または乳癌再発を処置するのに十分な治療薬の量で対象を処置することをさらに含む。
【０００８】
さらなる態様において、本発明は、
（ａ）乳癌のリスクがある対象からの体液試料をテストすること、ならびに
（ｉ）ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＭＵＣ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよびＬＲＲＣ１５のうちの少なくとも１つに対する自己抗体を有する；ならびに／または
（ｉｉ）ＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよび／もしくはＬＲＲＣ１５に対する自己抗体を有さない；
候補対象を同定すること；ならびに
（ｂ）乳癌を処置するのに十分な治療薬の量で、候補対象を処置すること、
を含む、
乳癌の対象を処置する方法を提供する。
【０００９】
一実施形態において、接触させることは、縦断的アッセイスクリーニング（Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  Ａｓｓａｙ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）の利用を含み、全ての標的バイオマーカが単一テストおよび希釈の中で検出および定量され得る。さらなる実施形態において、体液試料は、対象からの血液試料を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】抗原の立体配座は、抗体認識に影響を及ぼす。Ａ．ネイティブの立体配座を有するように設計された抗原を用いるＥＬＩＳＡ分析。ウェルを抗ウサギＩｇＧで、その後２９３Ｔ細胞内で産生されたＨＥＲ−２−ＥＣＤ−ｒＦｃタンパク質でコーティングした。ネイティブＨＥＲ−２、３Ｆ３２（青色）、ハーセプチン（緑色）または変性させたＨＥＲ−２、３Ｆ２７（赤色）に対して生成させた抗ＨＥＲ−２モノクローナル抗体の希釈系列を、ＥＬＩＳＡで用いた。適切な二次抗体の添加後に、反応物を発色させた。Ｏ．Ｄ．は、反応物の吸光度値である。Ｂ．変性抗原を用いるＥＬＩＳＡ分析。ウェルを大腸菌内で産生された精製Ｈｉｓ−ＨＥＲ−２−ＥＣＤでコーティングして、３Ｆ３２（青色）、ハーセプチン（緑色）または３Ｆ２７（赤色）の希釈系列を添加した。二次抗体の添加後、反応物を発色させた。Ｃ．フローサイトメトリーを介するＳＫＢＲ３細胞上のネイティブＨＥＲ−２の検出。蛍光によって、ＳＫＢＲ３細胞表面のＨＥＲ−２の抗体認識が示される。Ｄ．立体配座保有（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａ−ｃａｒｒｙｉｎｇ）抗原ＥＬＩＳＡの特異性を実証する結合競合アッセイ。ウェルを抗ウサギＩｇＧで、その後、ＨＥＲ−２−ＥＣＤ−ｒＦｃでプレコーティングした。精製ＨＥＲ−２−Ｆｃ（黒色）またはＣＤ３０−Ｆｃ（紫色）キメラタンパク質を系列希釈し、一定量のハーセプチンに添加した後、ウェルに添加した。反応物を、二次抗体とインキュベーションした後、発色させた。
【図２】乳癌患者の分類のためのＲＯＣ曲線比較。７種の抗原（すなわち、ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮ、ＬＲＲＣ１５およびＭＵＣ１）に対する自己抗体反応を、年齢、ＢＭＩ、人種および現在の喫煙状態を含むロジスティック回帰モデルに加えた。ＲＯＣ曲線を全ての対象（上図）について、そしてＥＲ陽性、浸潤性、最大腫瘍寸法＞１ｃｍ、非浸潤性、リンパ節転移およびＨＥＲ−２増幅（下図）を含む乳癌の特異的サブタイプにより決定した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
引用された参考資料は全て、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【００１２】
本出願において、他に断りがなければ、用いられる技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １８５，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｄ．  Ｇｏｅｄｄｅｌ，  １９９１．    Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ｍ．Ｐ．  Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ，  ｅｄ．，  （１９９０）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）の中の“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”；  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ｉｎｎｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．  １９９０．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：    Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．  （Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．  １９８７．    Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ｐｐ．  １０９−１２８，  ｅｄ．  Ｅ．Ｊ．  Ｍｕｒｒａｙ，  Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  Ｃｌｉｆｔｏｎ，  Ｎ．Ｊ．）、およびｔｈｅ  Ａｍｂｉｏｎ  １９９８  Ｃａｔａｌｏｇ  （Ａｍｂｉｏｎ，  Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ）など、複数の周知の参考資料のいずれかに見出すことができる。
【００１３】
第一の態様において、本発明は、２〜２５の抗体検出マーカからなる組成物であって、ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＥＰＨＡ２、ＬＡＭＣ２、ＳＰＯＮ２、ＳＳＲ２、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、ＣＤ１４７、ＣＤ３２０、ＣＤＨ３、ＬＲＰ１０、ＳＰＩＮＴ２、ＳＵＳＤ２、およびＣＳＴ２からなる群から選択される少なくとも２種のヒトタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む、組成物を提供する。本発明者らは、列挙されたタンパク質に対する自己抗体が、対象が乳癌（ＢＣａ）に罹患しているか否かの指標を提供することを、予想外に発見した。したがって本発明の組成物は、例えば対象からの試料中の抗体の検出によりＢＣａ患者と健常患者とを識別する診断アッセイ、または処置後の乳癌患者における疾患再発を検出する診断アッセイにおいて用いられ得る。一実施形態において、組成物は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＥＰＨＡ２、ＧＡＬ１、ＬＡＭＣ２、ＳＰＯＮ２、ＣＳＴ２、ＳＰＩＮＴ２およびＳＳＲ２からなる群から選択される少なくとも２種のヒトタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む。
【００１４】
様々な実施形態において、組成物は、列挙された群における少なくとも３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、または１６種のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む。様々なさらなる実施形態において、組成物は、２〜２４、２〜２３、２〜２２、２〜２１、２〜２０、２〜１９、２〜１８、２〜１７、２〜１６、２〜１５、２〜１４、２〜１３、２〜１２、２〜１１、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜２５、３〜２４、３〜２３、３〜２２、３〜２１、３〜２０、３〜１９、３〜１８、３〜１７、３〜１６、３〜１５、３〜１４、３〜１３、３〜１２、３〜１１、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜２５、４〜２４、４〜２３、４〜２２、４〜２１、４〜２０、４〜１９、４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、４〜１４、４〜１３、４〜１４、４〜１３、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜２５、５〜２４、５〜２３、５〜２２、５〜２１、５〜２０、５〜１９、５〜１８、５〜１７、５〜１６、５〜１５、５〜１４、５〜１３、５〜１２、５〜１１、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜２５、６〜２４、６〜２３、６〜２２、６〜２１、６〜２０、６〜１９、６〜１８、６〜１７、６〜１６、６〜１５、６〜１４、６〜１３、６〜１２、６〜１１、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜２５、７〜２４、７〜２３、７〜２２、７〜２１、７〜２０、７〜１９、７〜１８、７〜１７、７〜１６、７〜１５、７〜１４、７〜１３、７〜１２、７〜１１、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜２５、８〜２４、８〜２３、８〜２２、８〜２１、８〜２０、８〜１９、８〜１８、８〜１７、８〜１６、８〜１５、８〜１４、８〜１３、８〜１２、８〜１１、８〜１０、８〜９、９〜２５、９〜２４、９〜２３、９〜２２、９〜２１、９〜２０、９〜１９、９〜１８、９〜１７、９〜１６、９〜１５、９〜１４、９〜１３、９〜１２、９〜１１、９〜１０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０〜１１、１２、１３、１４、１５、または１６種の抗体検出試薬からなる。
【００１５】
当業者により理解される通り、組成物は、追加の抗体検出マーカと、組成物の意図する用途に適した対照と、を含み得る。
【００１６】
１つの非限定的実施形態において、組成物は、ムチン−１（ＭＵＣ１）、ＨＥＲ−２（４１）、ＩＧＦＢＰ２、およびグラニュリン（ＧＲＮ）の１つまたは両方に対する抗体を検出するための試薬をさらに含み得る。
【００１７】
さらなる実施形態において、組成物は、乳癌を診断する強い予測値を提供するために、以下の実施例（表５参照）に示される以下のマーカセット：
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１、および５  ＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、およびＧＦＲＡ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＧＦＲＡ１；ならびに
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＭＵＣ１、
の１つに対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む、または試薬からなる。
【００１８】
別の実施形態において、組成物は、ヒトＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＭＵＣ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよびＬＲＲＣ１５に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む、または試薬からなる。
【００１９】
抗体検出マーカは、列挙されたタンパク質、そのタンパク質の分泌型（そのタンパク質のネイティブ分泌形態など）、またはそのタンパク質の細胞外ドメインを非限定的に含む列挙されたタンパク質に対する抗体を検出するために用いられ得る任意の適切な試薬であり得る。分泌されたタンパク質は、腫瘍細胞からリンパ節へとより容易に送達され、そこで免疫細胞の相互作用が起こり多量の高親和性抗体を生じる。膜表面タンパク質は、メタロプロテイナーゼ依存性切断を介して腫瘍細胞から可溶性形態で一般に放出される。この放出されたタンパク質は、細胞内タンパク質よりも容易にリンパ節へと移行される。したがって一実施形態において、抗体検出マーカは、列挙されたタンパク質の分泌部分または膜部分である。列挙されたヒトタンパク質の分泌部分または膜部分の例示的アミノ酸配列を、以下に示す。
【００２０】
ＡＮＧＰＴＬ４  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
ＫＳＰＲＦＡＳＷＤＥＭＮＶＬＡＨＧＬＬＱＬＧＱＧＬＲＥＨＡＥＲＴＲＳＱＬＳＡＬＥＲＲＬＳＡＣＧＳＡＣＱＧＴＥＧＳＴＤＬＰＬＡＰＥＳＲＶＤＰＥＶＬＨＳＬＱＴＱＬＫＡＱＮＳＲＩＱＱＬＦＨＫＶＡＱＱＱＲＨＬＥＫＱＨＬＲＩＱＨＬＱＳＱＦＧＬＬＤＨＫＨＬＤＨＥＶＡＫＰＡＲＲＫＲＬＰＥＭＡＱＰＶＤＰＡＨＮＶＳＲＬＨＲＬＰＲＤＣＱＥＬＦＱＶＧＥＲＱＳＧＬＦＥＩＱＰＱＧＳＰＰＦＬＶＮＣＫＭＴＳＤＧＧＷＴＶＩＱＲＲＨＤＧＳＶＤＦＮＲＰＷＥＡＹＫＡＧＦＧＤＰＨＧＥＦＷＬＧＬＥＫＶＨＳＩＴＧＤＲＮＳＲＬＡＶＱＬＲＤＷＤＧＮＡＥＬＬＱＦＳＶＨＬＧＧＥＤＴＡＹＳＬＱＬＴＡＰＶＡＧＱＬＧＡＴＴＶＰＰＳＧＬＳＶＰＦＳＴＷＤＱＤＨＤＬＲＲＤＫＮＣＡＫＳＬＳＧＧＷＷＦＧＴＣＳＨＳＮＬＮＧＱＹＦＲＳＩＰＱＱＲＱＫＬＫＫＧＩＦＷＫＴＷＲＧＲＹＹＰＬＱＡＴＴＭＬＩＱＰＭＡＡＥＡＡＳ
ＤＫＫ１  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
ＶＳＡＴＬＮＳＶＬＮＳＮＡＩＫＮＬＰＰＰＬＧＧＡＡＧＨＰＧＳＡＶＳＡＡＰＧＩＬＹＰＧＧＮＫＹＱＴＩＤＮＹＱＰＹＰＣＡＥＤＥＥＣＧＴＤＥＹＣＡＳＰＴＲＧＧＤＡＧＶＱＩＣＬＡＣＲＫＲＲＫＲＣＭＲＨＡＭＣＣＰＧＮＹＣＫＮＧＩＣＶＳＳＤＱＮＨＦＲＧＥＩＥＥＴＩＴＥＳＦＧＮＤＨＳＴＬＤＧＹＳＲＲＴＴＬＳＳＫＭＹＨＴＫＧＱＥＧＳＶＣＬＲＳＳＤＣＡＳＧＬＣＣＡＲＨＦＷＳＫＩＣＫＰＶＬＫＥＧＱＶＣＴＫＨＲＲＫＧＳＨＧＬＥＩＦＱＲＣＹＣＧＥＧＬＳＣＲＩＱＫＤＨＨＱＡＳＮＳＳＲＬＨＴＣＱＲＨ
ＥＰＨＡ２  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
ＫＥＶＶＬＬＤＦＡＡＡＧＧＥＬＧＷＬＴＨＰＹＧＫＧＷＤＬＭＱＮＩＭＮＤＭＰＩＹＭＹＳＶＣＮＶＭＳＧＤＱＤＮＷＬＲＴＮＷＶＹＲＧＥＡＥＲＩＦＩＥＬＫＦＴＶＲＤＣＮＳＦＰＧＧＡＳＳＣＫＥＴＦＮＬＹＹＡＥＳＤＬＤＹＧＴＮＦＱＫＲＬＦＴＫＩＤＴＩＡＰＤＥＩＴＶＳＳＤＦＥＡＲＨＶＫＬＮＶＥＥＲＳＶＧＰＬＴＲＫＧＦＹＬＡＦＱＤＩＧＡＣＶＡＬＬＳＶＲＶＹＹＫＫＣＰＥＬＬＱＧＬＡＨＦＰＥＴＩＡＧＳＤＡＰＳＬＡＴＶＡＧＴＣＶＤＨＡＶＶＰＰＧＧＥＥＰＲＭＨＣＡＶＤＧＥＷＬＶＰＩＧＱＣＬＣＱＡＧＹＥＫＶＥＤＡＣＱＡＣＳＰＧＦＦＫＦＥＡＳＥＳＰＣＬＥＣＰＥＨＴＬＰＳＰＥＧＡＴＳＣＥＣＥＥＧＦＦＲＡＰＱＤＰＡＳＭＰＣＴＲＰＰＳＡＰＨＹＬＴＡＶＧＭＧＡＫＶＥＬＲＷＴＰＰＱＤＳＧＧＲＥＤＩＶＹＳＶＴＣＥＱＣＷＰＥＳＧＥＣＧＰＣＥＡＳＶＲＹＳＥＰＰＨＧＬＴＲＴＳＶＴＶＳＤＬＥＰＨＭＮＹＴＦＴＶＥＡＲＮＧＶＳＧＬＶＴＳＲＳＦＲＴＡＳＶＳＩＮＱＴＥＰＰＫＶＲＬＥＧＲＳＴＴＳＬＳＶＳＷＳＩＰＰＰＱＱＳＲＶＷＫＹＥＶＴＹＲＫＫＧＤＳＮＳＹＮＶＲＲＴＥＧＦＳＶＴＬＤＤＬＡＰＤＴＴＹＬＶＱＶＱＡＬＴＱＥＧＱＧＡＧＳＫＶＨＥＦＱＴＬＳＰＥＧＳＧＮＬ
ＬＡＭＣ２  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
ＴＳＲＲＥＶＣＤＣＮＧＫＳＲＱＣＩＦＤＲＥＬＨＲＱＴＧＮＧＦＲＣＬＮＣＮＤＮＴＤＧＩＨＣＥＫＣＫＮＧＦＹＲＨＲＥＲＤＲＣＬＰＣＮＣＮＳＫＧＳＬＳＡＲＣＤＮＳＧＲＣＳＣＫＰＧＶＴＧＡＲＣＤＲＣＬＰＧＦＨＭＬＴＤＡＧＣＴＱＤＱＲＬＬＤＳＫＣＤＣＤＰＡＧＩＡＧＰＣＤＡＧＲＣＶＣＫＰＡＶＴＧＥＲＣＤＲＣＲＳＧＹＹＮＬＤＧＧＮＰＥＧＣＴＱＣＦＣＹＧＨＳＡＳＣＲＳＳＡＥＹＳＶＨＫＩＴＳＴＦＨＱＤＶＤＧＷＫＡＶＱＲＮＧＳＰＡＫＬＱＷＳＱＲＨＱＤＶＦＳＳＡＱＲＬＤＰＶＹＦＶＡＰＡＫＦＬＧＮＱＱＶＳＹＧＱＳＬＳＦＤＹＲＶＤＲＧＧＲＨＰＳＡＨＤＶＩＬＥＧＡＧＬＲＩＴＡＰＬＭＰＬＧＫＴＬＰＣＧＬＴＫＴＹＴＦＲＬＮＥＨＰＳＮＮＷＳＰＱＬＳＹＦＥＹＲＲＬＬＲＮＬＴＡＬＲＩＲＡＴＹＧＥＹＳＴＧＹＩＤＮＶＴＬＩＳＡＲＰＶＳＧＡＰＡＰＷＶＥＱＣＩＣＰＶＧＹＫＧＱＦＣＱＤＣＡＳＧＹＫＲＤＳＡＲＬＧＰＦＧＴＣＩＰＣＮＣＱＧＧＧＡＣＤＰＤＴＧＤＣＹＳＧＤＥＮＰＤＩＥＣＡＤＣＰＩＧＦＹＮＤＰＨＤＰＲＳＣＫＰＣＰＣＨＮＧＦＳＣＳＶＭＰＥＴＥＥＶＶＣＮＮＣＰＰＧＶＴＧＡＲＣＥＬＣＡＤＧＹＦＧＤＰＦＧＥＨＧＰＶＲＰＣＱＰＣＱＣＮＮＮＶＤＰＳＡＳＧＮＣＤＲＬＴＧＲＣＬＫＣＩＨＮＴＡＧＩＹＣＤＱＣＫＡＧＹＦＧＤＰＬＡＰＮＰＡＤＫＣＲＡＣＮＣＮＰＭＧＳＥＰＶＧＣＲＳＤＧＴＣＶＣＫＰＧＦＧＧＰＮＣＥＨＧＡＦＳＣＰＡＣＹＮＱＶＫＩＱＭＤＱＦＭＱＱＬＱＲＭＥＡＬＩＳＫＡＱＧＧＤＧＶＶＰＤＴＥＬＥＧＲＭＱＱＡＥＱＡＬＱＤＩＬＲＤＡＱＩＳＥＧＡＳＲＳＬＧＬＱＬＡＫＶＲＳＱＥＮＳＹＱＳＲＬＤＤＬＫＭＴＶＥＲＶＲＡＬＧＳＱＹＱＮＲＶＲＤＴＨＲＬＩＴＱＭＱＬＳＬＡＥＳＥＡＳＬＧＮＴＮＩＰＡＳＤＨＹＶＧＰＮＧＦＫＳＬＡＱＥＡＴＲＬＡＥＳＨＶＥＳＡＳＮＭＥＱＬＴＲＥＴＥＤＹＳＫＱＡＬＳＬＶＲＫＡＬＨＥＧＶＧＳＧＳＧＳＰＤＧＡＶＶＱＧＬＶＥＫＬＥＫＴＫＳＬＡＱＱＬＴＲＥＡＴＱＡＥＩＥＡＤＲＳＹＱＨＳＬＲＬＬＤＳＶＳＲＬＱＧＶＳＤＱＳＦＱＶＥＥＡＫＲＩＫＱＫＡＤＳＬＳＳＬＶＴＲＨＭＤＥＦＫＲＴＱＫＮＬＧＮＷＫＥＥＡＱＱＬＬＱＮＧＫＳＧＲＥＫＳＤＱＬＬＳＲＡＮＬＡＫＳＲＡＱＥＡＬＳＭＧＮＡＴＦＹＥＶＥＳＩＬＫＮＬＲＥＦＤＬＱＶＤＮＲＫＡＥＡＥＥＡＭＫＲＬＳＹＩＳＱＫＶＳＤＡＳＤＫＴＱＱＡＥＲＡＬＧＳＡＡＡＤＡＱＲＡＫＮＧＡＧＥＡＬＥＩＳＳＥＩＥＱＥＩＧＳＬＮＬＥＡＮＶＴＡＤＧＡＬＡＭＥＫＧＬＡＳＬＫＳＥＭＲＥＶＥＧＥＬＥＲＫＥＬＥＦＤＴＮＭＤＡＶＱＭＶＩＴＥＡＱＫＶＤＴＲＡＫＮＡＧＶＴＩＱＤＴＬＮＴＬＤＧＬＬＨＬＭＧＭ
ＳＰＯＮ２  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
ＱＰＬＧＧＥＳＩＣＳＡＲＡＰＡＫＹＳＩＴＦＴＧＫＷＳＱＴＡＦＰＫＱＹＰＬＦＲＰＰＡＱＷＳＳＬＬＧＡＡＨＳＳＤＹＳＭＷＲＫＮＱＹＶＳＮＧＬＲＤＦＡＥＲＧＥＡＷＡＬＭＫＥＩＥＡＡＧＥＡＬＱＳＶＨＥＶＦＳＡＰＡＶＰＳＧＴＧＱＴＳＡＥＬＥＶＱＲＲＨＳＬＶＳＦＶＶＲＩＶＰＳＰＤＷＦＶＧＶＤＳＬＤＬＣＤＧＤＲＷＲＥＱＡＡＬＤＬＹＰＹＤＡＧＴＤＳＧＦＴＦＳＳＰＮＦＡＴＩＰＱＤＴＶＴＥＩＴＳＳＳＰＳＨＰＡＮＳＦＹＹＰＲＬＫＡＬＰＰＩＡＲＶＴＬＬＲＬＲＱＳＰＲＡＦＩＰＰＡＰＶＬＰＳＲＤＮＥＩＶＤＳＡＳＶＰＥＴＰＬＤＣＥＶＳＬＷＳＳＷＧＬＣＧＧＨＣＧＲＬＧＴＫＳＲＴＲＹＶＲＶＱＰＡＮＮＧＳＰＣＰＥＬＥＥＥＡＥＣＶＰＤＮＣＶ
ＳＳＲ２  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
ＥＥＧＡＲＬＬＡＳＫＳＬＬＮＲＹＡＶＥＧＲＤＬＴＬＱＹＮＩＹＮＶＧＳＳＡＡＬＤＶＥＬＳＤＤＳＦＰＰＥＤＦＧＩＶＳＧＭＬＮＶＫＷＤＲＩＡＰＡＳＮＶＳＨＴＶＶＬＲＰＬＫＡＧＹＦＮＦＴＳＡＴＩＴＹＬＡＱＥＤＧＰＶＶＩＧＳＴＳＡＰＧＱＧＧＩＬＡＱＲＥＦＤＲＲＦＳＰＨ
ＧＡＬ１  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
ＬＲＶＲＧＥＶＡＰＤＡＫＳＦＶＬＮＬＧＫＤＳＮＮＬＣＬＨＦＮＰＲＦＮＡＨＧＤＡＮＴＩＶＣＮＳＫＤＧＧＡＷＧＴＥＱＲＥＡＶＦＰＦＱＰＧＳＶＡＥＶＣＩＴＦＤＱＡＮＬＴＶＫＬＰＤＧＹＥＦＫＦＰＮＲＬＮＬＥＡＩＮＹＭＡＡＤＧＤＦＫＩＫＣＶＡＦＤ
ＧＦＲＡ１  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
ＤＲＬＤＣＶＫＡＳＤＱＣＬＫＥＱＳＣＳＴＫＹＲＴＬＲＱＣＶＡＧＫＥＴＮＦＳＬＡＳＧＬＥＡＫＤＥＣＲＳＡＭＥＡＬＫＱＫＳＬＹＮＣＲＣＫＲＧＭＫＫＥＫＮＣＬＲＩＹＷＳＭＹＱＳＬＱＧＮＤＬＬＥＤＳＰＹＥＰＶＮＳＲＬＳＤＩＦＲＶＶＰＦＩＳＤＶＦＱＱＶＥＨＩＰＫＧＮＮＣＬＤＡＡＫＡＣＮＬＤＤＩＣＫＫＹＲＳＡＹＩＴＰＣＴＴＳＶＳＮＤＶＣＮＲＲＫＣＨＫＡＬＲＱＦＦＤＫＶＰＡＫＨＳＹＧＭＬＦＣＳＣＲＤＩＡＣＴＥＲＲＲＱＴＩＶＰＶＣＳＹＥＥＲＥＫＰＮＣＬＮＬＱＤＳＣＫＴＮＹＩＣＲＳＲＬＡＤＦＦＴＮＣＱＰＥＳＲＳＶＳＳＣＬＫＥＮＹＡＤＣＬＬＡＹＳＧＬＩＧＴＶＭＴＰＮＹＩＤＳＳＳＬＳＶＡＰＷＣＤＣＳＮＳＧＮＤＬＥＥＣＬＫＦＬＮＦＦＫＤＮＴＣＬＫＮＡＩＱＡＦＧＮＧＳＤＶＴＶＷＱＰＡＦＰＶＱＴＴＴＡＴＴＴＴＡＬＲＶＫＮＫＰＬＧＰＡＧＳＥＮＥＩＰＴＨＶＬＰＰＣＡＮＬＱＡＱＫＬＫＳＮＶＳＧＮＴＨＬＣＩＳＮＧＮＹＥＫＥＧＬＧＡＳＳＨＩＴＴＫＳＭＡＡＰＰＳＣＧＬＳＰＬＬＶＬＶＶＴＡＬＳＴＬＬＳＬＴＥＴＳ
ＬＲＲＣ１５  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
ＹＨＧＣＰＳＥＣＴＣＳＲＡＳＱＶＥＣＴＧＡＲＩＶＡＶＰＴＰＬＰＷＮＡＭＳＬＱＩＬＮＴＨＩＴＥＬＮＥＳＰＦＬＮＩＳＡＬＩＡＬＲＩＥＫＮＥＬＳＲＩＴＰＧＡＦＲＮＬＧＳＬＲＹＬＳＬＡＮＮＫＬＱＶＬＰＩＧＬＦＱＧＬＤＳＬＥＳＬＬＬＳＳＮＱＬＬＱＩＱＰＡＨＦＳＱＣＳＮＬＫＥＬＱＬＨＧＮＨＬＥＹＩＰＤＧＡＦＤＨＬＶＧＬＴＫＬＮＬＧＫＮＳＬＴＨＩＳＰＲＶＦＱＨＬＧＮＬＱＶＬＲＬＹＥＮＲＬＴＤＩＰＭＧＴＦＤＧＬＶＮＬＱＥＬＡＬＱＱＮＱＩＧＬＬＳＰＧＬＦＨＮＮＨＮＬＱＲＬＹＬＳＮＮＨＩＳＱＬＰＰＳＶＦＭＱＬＰＱＬＮＲＬＴＬＦＧＮＳＬＫＥＬＳＰＧＩＦＧＰＭＰＮＬＲＥＬＷＬＹＤＮＨＩＳＳＬＰＤＮＶＦＳＮＬＲＱＬＱＶＬＩＬＳＲＮＱＩＳＦＩＳＰＧＡＦＮＧＬＴＥＬＲＥＬＳＬＨＴＮＡＬＱＤＬＤＧＮＶＦＲＭＬＡＮＬＱＮＩＳＬＱＮＮＲＬＲＱＬＰＧＮＩＦＡＮＶＮＧＬＭＡＩＱＬＱＮＮＱＬＥＮＬＰＬＧＩＦＤＨＬＧＫＬＣＥＬＲＬＹＤＮＰＷＲＣＤＳＤＩＬＰＬＲＮＷＬＬＬＮＱＰＲＬＧＴＤＴＶＰＶＣＦＳＰＡＮＶＲＧＱＳＬＩＩＩＮＶＮＶＡＶＰＳＶＨＶＰＥＶＰＳＹＰＥＴＰＷＹＰＤＴＰＳＹＰＤＴＴＳＶＳＳＴＴＥＬＴＳＰＶＥＤＹＴＤＬＴＴＩＱＶＴＤＤＲＳＶＷＧＭＴＱＡＱＳＧ
ＧＲＮ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
ＴＲＣＰＤＧＱＦＣＰＶＡＣＣＬＤＰＧＧＡＳＹＳＣＣＲＰＬＬＤＫＷＰＴＴＬＳＲＨＬＧＧＰＣＱＶＤＡＨＣＳＡＧＨＳＣＩＦＴＶＳＧＴＳＳＣＣＰＦＰＥＡＶＡＣＧＤＧＨＨＣＣＰＲＧＦＨＣＳＡＤＧＲＳＣＦＱＲＳＧＮＮＳＶＧＡＩＱＣＰＤＳＱＦＥＣＰＤＦＳＴＣＣＶＭＶＤＧＳＷＧＣＣＰＭＰＱＡＳＣＣＥＤＲＶＨＣＣＰＨＧＡＦＣＤＬＶＨＴＲＣＩＴＰＴＧＴＨＰＬＡＫＫＬＰＡＱＲＴＮＲＡＶＡＬＳＳＳＶＭＣＰＤＡＲＳＲＣＰＤＧＳＴＣＣＥＬＰＳＧＫＹＧＣＣＰＭＰＮＡＴＣＣＳＤＨＬＨＣＣＰＱＤＴＶＣＤＬＩＱＳＫＣＬＳＫＥＮＡＴＴＤＬＬＴＫＬＰＡＨＴＶＧＤＶＫＣＤＭＥＶＳＣＰＤＧＹＴＣＣＲＬＱＳＧＡＷＧＣＣＰＦＴＱＡＶＣＣＥＤＨＩＨＣＣＰＡＧＦＴＣＤＴＱＫＧＴＣＥＱＧＰＨＱＶＰＷＭＥＫＡＰＡＨＬＳＬＰＤＰＱＡＬＫＲＤＶＰＣＤＮＶＳＳＣＰＳＳＤＴＣＣＱＬＴＳＧＥＷＧＣＣＰＩＰＥＡＶＣＣＳＤＨＱＨＣＣＰＱＧＹＴＣＶＡＥＧＱＣＱＲＧＳＥＩＶＡＧＬＥＫＭＰＡＲＲＡＳＬＳＨＰＲＤＩＧＣＤＱＨＴＳＣＰＶＧＱＴＣＣＰＳＬＧＧＳＷＡＣＣＱＬＰＨＡＶＣＣＥＤＲＱＨＣＣＰＡＧＹＴＣＮＶＫＡＲＳＣＥＫＥＶＶＳＡＱＰＡＴＦＬＡＲＳＰＨＶＧＶＫＤＶＥＣＧＥＧＨＦＣＨＤＮＱＴＣＣＲＤＮＲＱＧＷＡＣＣＰＹＲＱＧＶＣＣＡＤＲＲＨＣＣＰＡＧＦＲＣＡＡＲＧＴＫＣＬＲＲＥＡＰＲＷＤＡＰＬＲＤＰＡＬＲＱＬＬ
ＭＵＣ１  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
ＡＰＫＰＡＴＶＶＴＧＳＧＨＡＳＳＴＰＧＧＥＫＥＴＳＡＴＱＲＳＳＶＰＳＳＴＥＫＮＡＦＮＳＳＬＥＤＰＳＴＤＹＹＱＥＬＱＲＤＩＳＥＭＦＬＱＩＹＫＱＧＧＦＬＧＬＳＮＩＫＦＲＰＧＳＶＶＶＱＬＴＬＡＦＲＥＧＴＩＮＶＨＤＶＥＴＱＦＮＱＹＫＴＥＡＡＳＲＹＮＬＴＩＳＤＶＳＶＳＤＶＰＦＰＦＳＡＱＳＧＡＧＶＰＧ
ＣＤ１４７  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
ＡＡＧＴＶＦＴＴＶＥＤＬＧＳＫＩＬＬＴＣＳＬＮＤＳＡＴＥＶＴＧＨＲＷＬＫＧＧＶＶＬＫＥＤＡＬＰＧＱＫＴＥＦＫＶＤＳＤＤＱＷＧＥＹＳＣＶＦＬＰＥＰＭＧＴＡＮＩＱＬＨＧＰＰＲＶＫＡＶＫＳＳＥＨＩＮＥＧＥＴＡＭＬＶＣＫＳＥＳＶＰＰＶＴＤＷＡＷＹＫＩＴＤＳＥＤＫＡＬＭＮＧＳＥＳＲＦＦＶＳＳ
ＣＤ３２０  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
ＡＧＰＳＳＧＳＣＰＰＴＫＦＱＣＲＴＳＧＬＣＶＰＬＴＷＲＣＤＲＤＬＤＣＳＤＧＳＤＥＥＥＣＲＩＥＰＣＴＱＫＧＱＣＰＰＰＰＧＬＰＣＰＣＴＧＶＳＤＣＳＧＧＴＤＫＫＬＲＮＣＳＲＬＡＣＬＡＧＥＬＲＣＴＬＳＤＤＣＩＰＬＴＷＲＣＤＧＨＰＤＣＰＤＳＳＤＥＬＧＣＧＴＮＥＩＬＰＥＧＤＡＴＴＭＧＰＰＶＴＬＥＳＶＴＳＬＲＮＡＴＴＭＧＰＰＶＴＬＥＳＶＰＳＶＧＮＡＴＳＳＳＡＧＤＱＳＧＳＰＴＡＹＧ
ＣＤＨ３  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
ＥＰＣＲＡＶＦＲＥＡＥＶＴＬＥＡＧＧＡＥＱＥＰＧＱＡＬＧＫＶＦＭＧＣＰＧＱＥＰＡＬＦＳＴＤＮＤＤＦＴＶＲＮＧＥＴＶＱＥＲＲＳＬＫＥＲＮＰＬＫＩＦＰＳＫＲＩＬＲＲＨＫＲＤＷＶＶＡＰＩＳＶＰＥＮＧＫＧＰＦＰＱＲＬＮＱＬＫＳＮＫＤＲＤＴＫＩＦＹＳＩＴＧＰＧＡＤＳＰＰＥＧＶＦＡＶＥＫＥＴＧＷＬＬＬＮＫＰＬＤＲＥＥＩＡＫＹＥＬＦＧＨＡＶＳＥＮＧＡＳＶＥＤＰＭＮＩＳＩＩＶＴＤＱＮＤＨＫＰＫＦＴＱＤＴＦＲＧＳＶＬＥＧＶＬＰＧＴＳＶＭＱＭＴＡＴＤＥＤＤＡＩＹＴＹＮＧＶＶＡＹＳＩＨＳＱＥＰＫＤＰＨＤＬＭＦＴＩＨＲＳＴＧＴＩＳＶＩＳＳＧＬＤＲＥＫＶＰＥＹＴＬＴＩＱＡＴＤＭＤＧＤＧＳＴＴＴＡＶＡＶＶＥＩＬＤＡＮＤＮＡＰＭＦＤＰＱＫＹＥＡＨＶＰＥＮＡＶＧＨＥＶＱＲＬＴＶＴＤＬＤＡＰＮＳＰＡＷＲＡＴＹＬＩＭＧＧＤＤＧＤＨＦＴＩＴＴＨＰＥＳＮＱＧＩＬＴＴＲＫＧＬＤＦＥＡＫＮＱＨＴＬＹＶＥＶＴＮＥＡＰＦＶＬＫＬＰＴＳＴＡＴＩＶＶＨＶＥＤＶＮＥＡＰＶＦＶＰＰＳＫＶＶＥＶＱＥＧＩＰＴＧＥＰＶＣＶＹＴＡＥＤＰＤＫＥＮＱＫＩＳＹＲＩＬＲＤＰＡＧＷＬＡＭＤＰＤＳＧＱＶＴＡＶＧＴＬＤＲＥＤＥＱＦＶＲＮＮＩＹＥＶＭＶＬＡＭＤＮＧＳＰＰＴＴＧＴＧＴＬＬＬＴＬＩＤＶＮＤＨＧＰＶＰＥＰＲＱＩＴＩＣＮＱＳＰＶＲＱＶＬＮＩＴＤＫＤＬＳＰＨＴＳＰＦＱＡＱＬＴＤＤＳＤＩＹＷＴＡＥＶＮＥＥＧＤＴＶＶＬＳＬＫＫＦＬＫＱＤＴＹＤＶＨＬＳＬＳＤＨＧＮＫＥＱＬＴＶＩＲＡＴＶＣＤＣＨＧＨＶＥＴＣＰＧＰＷＫＧＧ
ＨＥＲ２  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）
ＴＱＶＣＴＧＴＤＭＫＬＲＬＰＡＳＰＥＴＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶＱＧＮＬＥＬＴＹＬＰＴＮＡＳＬＳＦＬＱＤＩＱＥＶＱＧＹＶＬＩＡＨＮＱＶＲＱＶＰＬＱＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬＡＶＬＤＮＧＤＰＬＮＮＴＴＰＶＴＧＡＳＰＧＧＬＲＥＬＱＬＲＳＬＴＥＩＬＫＧＧＶＬＩＱＲＮＰＱＬＣＹＱＤＴＩＬＷＫＤＩＦＨＫＮＮＱＬＡＬＴＬＩＤＴＮＲＳＲＡＣＨＰＣＳＰＭＣＫＧＳＲＣＷＧＥＳＳＥＤＣＱＳＬＴＲＴＶＣＡＧＧＣＡＲＣＫＧＰＬＰＴＤＣＣＨＥＱＣＡＡＧＣＴＧＰＫＨＳＤＣＬＡＣＬＨＦＮＨＳＧＩＣＥＬＨＣＰＡＬＶＴＹＮＴＤＴＦＥＳＭＰＮＰＥＧＲＹＴＦＧＡＳＣＶＴＡＣＰＹＮＹＬＳＴＤＶＧＳＣＴＬＶＣＰＬＨＮＱＥＶＴＡＥＤＧＴＱＲＣＥＫＣＳＫＰＣＡＲＶＣＹＧＬＧＭＥＨＬＲＥＶＲＡＶＴＳＡＮＩＱＥＦＡＧＣＫＫＩＦＧＳＬＡＦＬＰＥＳＦＤＧＤＰＡＳＮＴＡＰＬＱＰＥＱＬＱＶＦＥＴＬＥＥＩＴＧＹＬＹＩＳＡＷＰＤＳＬＰＤＬＳＶＦＱＮＬＱＶＩＲＧＲＩＬＨＮＧＡＹＳＬＴＬＱＧＬＧＩＳＷＬＧＬＲＳＬＲＥＬＧＳＧＬＡＬＩＨＨＮＴＨＬＣＦＶＨＴＶＰＷＤＱＬＦＲＮＰＨＱＡＬＬＨＴＡＮＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡＣＨＱＬＣＡＲＧＨＣＷＧＰＧＰＴＱＣＶＮＣＳＱＦＬＲＧＱＥＣＶＥＥＣＲＶＬＱＧＬＰＲＥＹＶＮＡＲＨＣＬＰＣＨＰＥＣＱＰＱＮＧＳＶＴＣＦＧＰＥＡＤＱＣＶＡＣＡＨＹＫＤＰＰＦＣＶＡＲＣＰＳＧＶＫＰＤＬＳＹＭＰＩＷＫＦＰＤＥＥＧＡＣＱＰＣＰＩＮＣＴＨＳＣＶＤＬＤＤＫＧＣＰＡＥＱＲＡＳＰＬＴ
ＩＧＦＢＰ２  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
ＥＶＬＦＲＣＰＰＣＴＰＥＲＬＡＡＣＧＰＰＰＶＡＰＰＡＡＶＡＡＶＡＧＧＡＲＭＰＣＡＥＬＶＲＥＰＧＣＧＣＣＳＶＣＡＲＬＥＧＥＡＣＧＶＹＴＰＲＣＧＱＧＬＲＣＹＰＨＰＧＳＥＬＰＬＱＡＬＶＭＧＥＧＴＣＥＫＲＲＤＡＥＹＧＡＳＰＥＱＶＡＤＮＧＤＤＨＳＥＧＧＬＶＥＮＨＶＤＳＴＭＮＭＬＧＧＧＧＳＡＧＲＫＰＬＫＳＧＭＫＥＬＡＶＦＲＥＫＶＴＥＱＨＲＱＭＧＫＧＧＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲＰＰＰＡＲＴＰＣＱＱＥＬＤＱＶＬＥＲＩＳＴＭＲＬＰＤＥＲＧＰＬＥＨＬＹＳＬＨＩＰＮＣＤＫＨＧＬＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲＧＥＣＷＣＶＮＰＮＴＧＫＬＩＱＧＡＰＴＩＲＧＤＰＥＣＨＬＦＹＮＥＱＱＥＡＲＧＶＨＴＱＲＭＱ
ＬＲＰ１０  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）
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ＳＰＩＮＴ２  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）
ＡＤＲＥＲＳＩＨＤＦＣＬＶＳＫＶＶＧＲＣＲＡＳＭＰＲＷＷＹＮＶＴＤＧＳＣＱＬＦＶＹＧＧＣＤＧＮＳＮＮＹＬＴＫＥＥＣＬＫＫＣＡＴＶＴＥＮＡＴＧＤＬＡＴＳＲＮＡＡＤＳＳＶＰＳＡＰＲＲＱＤＳＥＤＨＳＳＤＭＦＮＹＥＥＹＣＴＡＮＡＶＴＧＰＣＲＡＳＦＰＲＷＹＦＤＶＥＲＮＳＣＮＮＦＩＹＧＧＣＲＧＮＫＮＳＹＲＳＥＥＡＣＭＬＲＣＦＲＱＱＥＮＰＰＬＰＬＧＳＫＶ
ＳＵＳＤ２  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）
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ＣＳＴ２  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）
ＷＳＰＱＥＥＤＲＩＩＥＧＧＩＹＤＡＤＬＮＤＥＲＶＱＲＡＬＨＦＶＩＳＥＹＮＫＡＴＥＤＥＹＹＲＲＬＬＲＶＬＲＡＲＥＱＩＶＧＧＶＮＹＦＦＤＩＥＶＧＲＴＩＣＴＫＳＱＰＮＬＤＴＣＡＦＨＥＱＰＥＬＱＫＫＱＬＣＳＦＱＩＹＥＶＰＷＥＤＲＭＳＬＶＮＳＲＣＱＥＡ。
【００２１】
さらなる実施形態において、抗体検出マーカは、先に開示されたものなど、即ちネイティブ形態であるタンパク質である。添付の実施例に開示される通り、本発明者らは、真核生物発現系を利用して、適切に折り畳まれていて自己抗体の検出に用いるための非連続エピトープを含む、立体配座保有腫瘍抗原を作製した。タンパク質は、任意の適切な形式で用いることができ、１つの非限定的実施形態において、タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質であり得る。
【００２２】
先の実施形態の全てにおいて、抗体検出試薬は、検出可能な標識で標識され得る。一実施形態において、あるタンパク質に対する自己抗体を検出するための試薬の検出可能な標識は、他のタンパク質に対する自己抗体を検出する検出可能な標識と区別され得る。標識を検出する方法としては、分光技術、光化学技術、生化学技術、免疫化学技術、物理学的技術または化学的技術が挙げられるが、これらに限定されない。任意の適切な検出可能な標識が、用いられ得る。
【００２３】
組成物は、凍結して、凍結乾燥形態で、または溶液として保存できる。一実施形態において、組成物は、マイクロアレイまたはマイクロプレート形式などの、固体担体上に配置でき、この実施形態は、様々な検出アッセイにおいて組成物の使用を容易にする。例えば、抗ＩｇＧを用いてマイクロウェルプレートのウェルをプレコーティングでき、抗体検出試薬（本明細書で議論されるタンパク質など）を、プレコーティングされたウェルに添加できる。
【００２４】
第二の態様において、本発明は、乳癌または乳癌再発を検出するための方法であって、乳癌または乳癌再発を有するリスクのある対象からの体液試料を、ヒトＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＥＰＨＡ２、ＬＡＭＣ２、ＳＰＯＮ２、ＳＳＲ２、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、ＣＤ１４７、ＣＤ３２０、ＣＤＨ３、ＬＲＰ１０、ＳＰＩＮＴ２、ＳＵＳＤ２、およびＣＳＴ２の１種または複数に対する自己抗体を検出するための１種または複数の試薬と接触させることを含み、１種または複数のタンパク質に対する自己抗体の存在が、対象が乳癌または乳癌再発を有する可能性と相関する、方法を提供する。
【００２５】
一実施形態において、組成物は、ヒトＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＥＰＨＡ２、ＧＡＬ１、ＬＡＭＣ２、ＳＰＯＮ２、ＣＳＴ２、ＳＰＩＮＴ２およびＳＳＲ２からなる群から選択される２種のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む。
【００２６】
当業者により理解される通り、方法は、追加の抗体検出マーカと、組成物の意図する用途に適した対照と、の使用を含み得る。１つの非限定的実施形態において、組成物は、ムチン−１（ＭＵＣ１）、ＨＥＲ−２（４１）、ＩＧＦＢＰ２、およびグラニュリンの１つまたは両方に対する抗体を検出するための試薬をさらに含み得る。
【００２７】
本発明の方法の別の実施形態において、組成物は、以下のマーカセット：
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１、および５  ＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、およびＧＦＲＡ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＧＦＲＡ１；ならびに
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＭＵＣ１、
の１つに対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む、または試薬からなる。
【００２８】
別の実施形態において、組成物は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＭＵＣ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよびＬＲＲＣ１５に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む、または試薬からなる。
【００２９】
抗体検出マーカは、列挙されたタンパク質、そのタンパク質の分泌型（そのタンパク質のネイティブ分泌形態など）、またはそのタンパク質の細胞外ドメインを非限定的に含む列挙されたタンパク質に対する抗体を検出するために用いられ得る任意の適切な試薬であり得る。分泌されたタンパク質は、腫瘍細胞からリンパ節へとより容易に送達され、そこで免疫細胞の相互作用が起こり多量の高親和性抗体を生じる。膜表面タンパク質は、メタロプロテイナーゼ依存性切断を介して腫瘍細胞から可溶性形態で一般に放出される。この放出されたタンパク質は、細胞内タンパク質よりも容易にリンパ節に移行される。したがって一実施形態において、抗体検出マーカは、列挙されたタンパク質の分泌部分または膜部分である。列挙されたタンパク質の分泌部分または膜部分の例示的アミノ酸配列は、本明細書に開示される通りである。
【００３０】
別の実施形態において、抗体検出マーカは、本発明の組成物を含む、または組成物からなる。
【００３１】
接触させることは、体液試料中の自己抗体と、検出され得る結合複合体を形成する試薬との結合を促進するのに適した任意の条件下で実施され得る。適切なそのような条件は、当業者により、本明細書の教示に照らして、意図するアッセイに基づいて決定され得る。同様に、１回もしくは複数の洗浄、または未結合試薬を除去する他のステップなど、任意の適切な追加的ステップを複数の方法で用いることができる。
【００３２】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、Ｌｕｍｉｎｅｘシステムなどのビーズに基づくアッセイの原理、Ｓｅａｒｃｈｌｉｇｈｔ（登録商標）などの２Ｄアレイに基づくアッセイ原理、およびＩｎａｎｏｖａｔｅ（登録商標）「縦アッセイスクリーニング」の原理を非限定的に含む任意の適切な検出技術を用いることができ、それらの技術は、１回のテストおよび希釈で、臨床上関連する濃度の患者試料由来の列挙された乳癌バイオマーカを全て定量することができる。一実施形態において、組成物は、マイクロアレイ、ガラススライド、膜、マイクロプレート形式またはビーズなどの固体担体上に配置され得る。実施形態は、組成物の使用を容易にする。例示的なそのようなアッセイが、実施例で記載される。
【００３３】
同様に、対象由来の血清試料、血漿試料または血液試料を非限定的に含む任意の適切な体液を用いることができる。対象は、ヒト対象などの乳癌のリスクがある任意の対象であり得る。
【００３４】
さらなる実施形態において、方法は、対象を、乳癌を有する可能性があると同定し、方法は、乳癌を処置するのに十分な治療薬の量で対象を処置することをさらに含む。
【００３５】
先の実施形態のいずれかの非限定的な一実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＭＵＣ１自己抗体反応はＢＣａと相関し；ＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよびＬＲＲＣ１５に対する自己抗体反応はＢＣａと逆相関する。
【００３６】
１つの具体的実施形態において、試薬はＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＭＵＣ１、ＧＲＮおよびＬＲＲＣ１５を含み；ＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよびＬＲＲＣ１５に対する自己抗体反応はＢＣａと逆相関する。実施例に詳述される通り、７種の抗原に対する自己抗体反応を、年齢、体格指数（ＢＭＩ）、人種および現在の喫煙状態を含むベースモデルに加えた場合、アッセイは以下の診断能力を有した：ｃ統計量（９５％ＣＩ）、０．８２（０．７８〜０．８６）；感度、７３％；特異度、７６％；およびＰＬＲ（９５％ＣＩ）、３．０４（２．３４〜３．９４）。このモデルは、リスクの十分位数で較正され（ホスター・レメショウ、ｐ＝０．１３）、エストロゲン受容体陽性、ＨＥＲ−２陽性、浸潤性、非浸潤性および腫瘍サイズ＞１ｃｍを含むＢＣａの特異的サブタイプにおいてうまく機能した。他の例示的マーカセットの診断能力を、表５に示す。
【００３７】
第三の態様において、本発明は、
（ａ）乳癌のリスクのある対象由来の体液試料をテストすること、ならびに
（ｉ）ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＭＵＣ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよびＬＲＲＣ１５の少なくとも１つに対する自己抗体を有する；ならびに／または
（ｂ）ＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよび／もしくはＬＲＲＣ１５に対する自己抗体を有さない；
候補対象を同定すること；ならびに
（ｂ）乳癌を処置するのに十分な治療薬の量で、候補対象を処置すること、
を含む、
乳癌の対象を処置する方法を提供する。
【００３８】
実施例１
乳癌（ＢＣａ）患者は癌タンパク質に対する自己抗体反応を誘発し、これは腫瘍発生に関連する細胞変化を反映し増幅させる。血漿中の自己抗体の検出は、ＢＣａの早期検出のために低侵襲性メカニズムを提供し得る。液性応答を誘発する癌タンパク質を同定するために、本発明者らは、細胞内タンパク質に比較して抗体反応を誘導する可能性が高い膜および分泌タンパク質をコードするＢＣａ遺伝子に富むｃＤＮＡライブラリを作製した。患者の抗体により効率的に認識される立体配座保有抗原を作製するために、真核生物発現方策を確立した。ＢＣａ患者２００名および同年齢の健常対照２００名の血漿を、立体配座エピトープを有するように設計された２０種の異なる抗原に対する自己抗体活性について、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。条件付きロジスティック回帰モデルを利用して、２０種の異なる抗原に対する自己抗体反応の組み合わせを選択して、ＢＣａ患者を健常対照と分別した。最良の組み合わせは、ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＭＵＣ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよびＬＲＲＣ１５を包含したが、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよびＬＲＲＣ１５に対する自己抗体反応は、ＢＣａと逆相関した。７種の抗原に対する自己抗体反応を、年齢、ＢＭＩ、人種および現在の喫煙状態を含むベースモデルに加えた場合、アッセイは以下の診断能力を有した：ｃ統計量（９５％ＣＩ）、０．８２（０．７８〜０．８６）；感度、７３％；特異度、７６％；およびＰＬＲ（９５％ＣＩ）、３．０４（２．３４〜３．９４）。このモデルは、リスクの十分位数にわたって較正され（ホスマー・レメショウ、ｐ＝０．１３）、エストロゲン受容体陽性、ＨＥＲ−２陽性、浸潤性、非浸潤性および腫瘍サイズ＞１ｃｍを含むＢＣａの特異的サブタイプにおいてうまく機能した。
【００３９】
緒言
乳癌（ＢＣａ）の患者の場合、処置を最適化して長期生存に導くためには、早期に行う個別の診断が不可欠である。マンモグラフィーは、ＢＣａを検出するための最も広範に用いられる方法であるが、乳房の密度が高いことが大きな原因で、マンモグラフィーのスクリーニングのおよそ２０％が偽陰性と診断される（１）。加えて、マンモグラムを得る女性１０名中１名が、追加の造影を必要とする（２）。その上、１０００例のマンモグラムのスクリーニングのうち２〜４例だけが癌と診断されることから、これらの女性の圧倒的多数は、ＢＣａを有さないことになる（３）。それゆえ、ＢＣａを早期に診断およびモニタリングのための新規で低侵襲性の診断方策の開発が、臨床現場で緊急に求められている。
【００４０】
現在のところ、末梢循環中に分泌されて、ＢＣａの診断のために血液検査により測定され得る、確立された腫瘍マーカは存在しない。現在、臨床現場で許容される腫瘍マーカは、組織に基づく予後マーカ、例えばエストロゲン受容体（ＥＲ）、ＨＥＲ−２増幅、２１遺伝子Ｏｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸおよび７０遺伝子ＭａｍｍａＰｒｉｎｇである（６〜１２）。全てが、評価用の腫瘍組織を獲得するために侵襲性の生検または外科的な手順を必要とし、患者に重い負担をかける。血清腫瘍マーカは、サンプリングのための低侵襲性の手順を可能にして、癌の早期診断に加え処置後の予後観察を促進する貴重なツールである（４、５）。しかし腫瘍細胞により産生される腫瘍マーカは通常、特に早期段階の疾患では、末梢循環中に比較的低濃度で有する。
【００４１】
本発明者らはここに、ＢＣａ患者において抗体反応を誘発する腫瘍抗原の候補物質を同定する分子的アプローチの使用を報告する。本発明者らは過去に、分泌および膜タンパク質をコードする膜結合ポリリボソーム（ＭＡＰ）ＲＮＡからのＢＣａ  ｃＤＮＡライブラリを作製して、正常組織由来のＲＮＡを有するライブラリを差し引いた（２９）。分泌されたタンパク質は、腫瘍細胞からリンパ節へとより容易に送達されて、そこで免疫細胞の相互作用が起こり多量の高親和性抗体を生じる。膜表面タンパク質は、メタロプロテイナーゼ依存性切断を介して腫瘍細胞から可溶性形態で一般に放出される。この放出されたタンパク質は、細胞内タンパク質よりも容易にリンパ節へと移行される（３０、３１）。その結果、膜結合ポリリボソームｃＤＮＡライブラリ（ＭＡＰｃＬ）と称される、得られた差し引き後のライブラリは、ＢＣａで非常に豊富であり患者において抗体反応を優先的に誘導するはずである膜および分泌ＴＡＡをコードするクローンに富む（２９）。加えて本発明者らは、ネイティブの立体配座を有するように設計されるＦｃ融合タンパク質として組換え抗原を生成するための方法を確立したが、これは患者における抗体反応を誘導し得る膜および分泌タンパク質の発現に必須である。
【００４２】
本発明者らは、ＴＡＡのパネルに対して自己抗体を検出することによりＢＣａ患者と健常患者を識別するために立体配座保有抗原ＥＬＩＳＡに基づく方策を開発した。２０種の抗原を、ＭＡＰｃＬ中で提示される最も豊富な遺伝子から選択し、Ｆｃ融合タンパク質を作製した。血液を、新たに診断されたＢＣａ患者２００名および同年齢の対照としての健常な女性２００名から採取した。４００の血漿試料を、２０種の異なるＭＡＰｃＬ由来抗原に対する自己抗体の存在について、ＥＬＩＳＡを用いてスクリーニングした。７種の抗原を患者の人口構成と組み合わせて、最良の陽性尤度比を得て、健常者およびＢＣａ患者を識別した。
【００４３】
材料と方法
プラスミドの構築
ＭＡＰｃＬ−ウサギＦｃタグ抗体の生成のために、２種の構築物：ｐＳｅｃＴａｇ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド所在）およびｐＦＵＳＥ−ｒＩｇＧ−Ｆｃ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カリフォルニア州サンディアゴ所在）を、クローニングのための制限部位が利用可能であることから両者とも用いて、２０種のＭＡＰｃＬ−ｒＦｃ発現構築物を作製した。プライマー５’−ＣＣＧＧＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧＴＧＣＣＣＡＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）および５’−ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣ−ＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＧＣＧＧＧＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アイオワ州コーラルビル所在）を用い、テンプレートとしてｐＦＵＳＥ−ｒＩｇＧ−Ｆｃ１を用いて、ウサギＩｇＧのＦｃ部分を増幅することにより、ｐＳｅｃＴａｇ２を修飾した。ｒＦｃ  ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩで消化して、分泌のためのＩｇＫシグナル配列を含むｐＳｅｃＴａｇ２中に挿入した（ｐＳｅｃＴａｇ２−ｒＦｃと称する）。ｐＦＵＳＥ−ｒＩｇＧ−Ｆｃ１は、ＩＬ２シグナル配列を含む。２種のプラスミド間でのシグナル配列の一貫性を維持するために、ＩｇＫリーダー配列を、テンプレートとしてｐＳｅｃＴａｇ２を用いるＰＣＲを介して増幅させた。その後、ＩＬ２リーダー配列を、ＩｇＫシグナル配列と交換して、ｐＦＵＳＥ−ＩｇＫ−ｒＦｃを作製した。
【００４４】
クローニング用のテンプレートとして用いられた２０種のＭＡＰｃＬ遺伝子のアクセション番号および予測されるシグナル配列を、表１に示す。コードされるタンパク質それぞれのシグナル配列は、ＳｉｇｎａｌＰを用いて決定した（３２、３３）。タンパク質が膜貫通ドメインを含む場合、コードされた細胞外部分のみを含めた。膜貫通ドメインは、ＴＭＨＭＭデータベースを用いて予測した（３４）。クローン化された断片によりコードされるアミノ酸番号を、表１に示す。ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＨ３、ＤＫＫ１、ＳＰＯＮ２、ＳＳＲ２、ＣＳＴ２、ＧＦＲＡ１およびＧＡＬ１は、ＳｆｉＩおよびＫｐｎＩ制限部位を用いてｐＳｅｃＴａｇ２−ｒＦｃ中にカスタムクローニングした（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ニュージャージー州ピスカタウェイ所在）。ＥＰＨＡ２、ＩＧＦＢＰ２およびＬＡＭＣ２は、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を用いて、ｐＳｅｃＴａｇ２−ｒＦｃ中にカスタムクローニングした。ＧＲＮ、ＭＵＣ１およびＬＲＲＣ１５は、  ＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を用いて、ｐＳｅｃＴａｇ２−ｒＦｃ中にカスタムクローニングした。ＨＥＲ−２、ＬＲＰ１０、ＳＰＩＮＴ２およびＳＵＳＤ２は、ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いて、ｐＦＵＳＥ−ＩｇＫ−ｒＦｃ中にクローニングした。ＣＤ１４７は、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩＩを用いて、ｐＦＵＳＥ−ＩｇＫ−ｒＦｃ中にクローニングした。ＣＤ３２０は、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いて、ｐＦＵＳＥ−ＩｇＫ−ｒＦｃ中にクローニングした。
【表１】
2020187132.tif 000002
【００４５】
ＨｉｓタグＨＥＲ−２を作製するために、ＨＥＲ−２を、プライマー５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）および５’−ＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＧＴＣ−ＡＧＡＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）を用いるＰＣＲにより増幅させた。産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化して、ｐＥＴ−２８ａ発現ベクター中にディレクショナルクローニングした。
【００４６】
細胞培養
２９３ＴおよびＳＫＢＲ３細胞株を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で培養した。培養物を、加湿インキュベータ内に５％ＣＯ２と共に３７℃で保持した。細胞株は全て、信頼性が証明されており、マイコプラズマ陰性であることが検査されている。
【００４７】
タンパク質生成
ＭＡＰｃＬ−ｒＦｃ融合タンパク質を、２９３Ｔ細胞内で産生した。手短に述べると、２９３Ｔ細胞を、製造業者の仕様に従ってＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア所在）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトの間、細胞を２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で培養した。分泌された融合タンパク質を含む上清を採取し、遠心分離して細胞片を除去し、０．１％アジ化ナトリウムを補充した。Ｈｉｓ−ＨＥＲ−２を、大腸菌ＢＬ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド所在）内で産生し、ＩＭＡＣアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製した。
【００４８】
サンドイッチＥＬＳＩＡ
マイクロプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ、ニューヨーク州ロチェスター所在）を、リン酸緩衝生理食塩水で希釈された２μｇ／ｍｌヤギ抗ウサギＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルベニア州ウェストグローブ所在）で一晩コーティングした。ｒＦｃ融合タンパク質を含む上清を、標準のブロッキング緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水中の０．５％ウシ血清アルブミンおよび０．１％アジ化ナトリウム）で１：３に系列希釈した。プレートを１回洗浄し、系列希釈された上清をマイクロタイタープレートに移した。既知濃度のウサギＩｇＧを同様に希釈して、培地中に存在する融合タンパク質量を定量するためにマイクロタイタープレートの１列に添加した。２時間インキュベートした後、プレートを２回洗浄し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む標準のブロッキング緩衝液で１：３０００に希釈されたＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルベニア州ウェストグローブ所在）５０μｌを添加した。２時間のインキュベーションの後、プレートを４回洗浄して、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード所在）で発色させた。発色反応を５０μｌ／ウェルの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で５分後に停止させて、吸光度を４５０ｎｍで測定し、濃度を決定した。６９０ｎｍでの吸光度を差し引いて、バックグランドシグナルを除去した。
【００４９】
立体配座ＨＥＲ−２タンパク質と変性ＨＥＲ−２タンパク質とで対比させた抗体認識
立体配座ＨＥＲ−２アッセイのために、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌヤギ抗ウサギＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルベニア州ウェストグローブ所在）で一晩コーティングした。その後、ＨＥＲ−２−ＥＣＤ−ｒＦｃを各ウェルに添加した（１００μｌ／ウェル）。変性ＨＥＲ−２については、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌ  Ｈｉｓ−ＨＥＲ−２−ＥＣＤで一晩コーティングした。
【００５０】
３種のＨＥＲ−２抗体：抗ＨＥＲ−２  ３Ｆ２７（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、マサチューセッツ州スワンプスコット所在）、抗ＨＥＲ−２  ３Ｆ３２（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、マサチューセッツ州スワンプスコット所在）およびハーセプチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ所在）をアッセイに用いた。各抗体を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む標準のブロッキング緩衝液で１μｇ／ｍｌに希釈した。その後、抗体を系列希釈した。１回洗浄した後、５０μｌ／ウェルの系列希釈された抗体をプレートに添加して、室温で２時間インキュベートした。プレートを３回洗浄して、種の適切なＨＲＰコンジュゲート二次抗体を１：３０００希釈で添加した。プレートを４回洗浄して、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質で５分間発色させた。発色を５０μｌ／ウェルの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度を４５０ｎｍで測定し、６９０ｎｍでの吸光度を差し引いて、バックグランドシグナルを考慮した。
【００５１】
同じ抗体を用いて、ＳＫＢＲ３  ＢＣａ細胞中のＨＥＲ−２をフローサイトメトリーにより染色した。ＳＫＢＲ３細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｎｏｎ−ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  １ｘ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス所在、カタログ番号Ｃ５９１４）を用いてディッシュから剥離した。２×１０５個の細胞を０．５μｇ／ｍｌの各抗体と共に室温で１時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄して、適切な種に合わせてＰＥコンジュゲート抗体の１：２００希釈物を添加した。再度、細胞を洗浄して、ＦＡＣＳ緩衝液（５％ウシ血清アルブミンおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）に再懸濁させて、フローサイトメトリーで分析した。
【００５２】
ハーセプチン結合の競合
マイクロタイタープレートを、４μｇ／ｍｌヤギ抗ウサギＦｃでコーティングして、一晩インキュベートした。１回洗浄した後、１００μｌ／ウェルＨＥＲ−２−ＥＣＤ−ｒＦｃを各ウェルに添加して、一晩インキュベートした。ＨＥＲ−２−ＦｃおよびＣＤ３０−Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス所在）を出発濃度１０μｇ／ｍｌから系列希釈した。  ハーセプチンをキメラタンパク質系列希釈物それぞれに、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌになるように添加した。プレートを２回洗浄し、５０μｌ／ウェルのキメラタンパク質／ハーセプチン混合物をプレートに適用した。その後、プレートを３回洗浄して、ＨＲＰヤギ抗ヒトＩｇＧの１：３０００希釈物を各ウェルに５０μｌ／ウェル適用した。４回洗浄した後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を各ウェルに添加した。発色を５０μｌ／ウェルの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で５分後に停止させた。吸光度を４５０ｎｍで測定し、６９０ｎｍでの吸光度を差し引いた。
【００５３】
患者
症例の組み入れ基準は、サウスダコタ州スーフォールズ所在のＳａｎｆｏｒｄ  ＨｅａｌｔｈでＢＣａ（任意の型）と新たに診断された３０歳を超える女性であった。患者に、乳房切除術、放射線療法、化学療法または他の処置の前に、１本の予備の１０ｍｌ  ＥＤＴＡ試験管に入れた血液を提供するよう依頼した。症例対象は、過去に任意の種類の癌の病歴を有する場合のみ、除外した。健常対照群の対象は、血液採取前６ヶ月以内に陰性のマンモグラムを有した。健常対象は、過去に任意の種類の癌または自己免疫疾患の病歴がある場合には、除外した。全ての患者が、記入されたインフォームドコンセントを提出し、Ｓａｎｆｏｒｄ  Ｈｅａｌｔｈ  ＩＲＢが、試験プロトコルを認可した。ＢＣａ患者２００名の血液試料を、２００９年１０月８日〜２０１２年４月１７日に採取した。加えて、同年齢の健常対照の血液試料を、２００９年１０月１６日〜２０１１年１月１９日に採取した。登録患者の特徴については、表２を参照されたい。
【表２】
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【００５４】
血清採取
血液を１０ｍｌ  ＥＤＴＡ試験管に採取して、２０００×ｇで１０分間遠心分離した。血漿を試験管から取り出し、分注して、自己免疫の存在についてスクリーニングするまで−８０℃で貯蔵した。
【００５５】
立体配座保有抗原ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ、ニューヨーク州ロチェスター所在）を、リン酸緩衝生理食塩水中の４μｇ／ｍｌヤギ抗ウサギＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルベニア州ウェストグローブ所在）で一晩コーティングした。プレートを１回洗浄し、１００μｌ／ウェルのＭＡＰｃＬ−ｒＦｃ融合タンパク質を添加した。プレートを２時間インキュベートして、２回洗浄した。その後、プレートを５０μｌ／ウェルの最適化されたブロッキング緩衝液（０．５％ウシ血清アルブミン、０．２％粉ミルク、０．１％ポリビニルピロリドン、２０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２０ｍＭ  Ｌ−アルギニン、０．１％アジ化ナトリウム、１０％ヤギ血清、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）でコーティングした。プレートを３７℃で１時間インキュベートして、１回洗浄した。最適化されたブロッキング緩衝液で１：１００に希釈された血清試料を添加して、室温で２時間インキュベートした。その後、プレートを３回洗浄して、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む標準のブロッキング緩衝液で１：３０００に希釈されたＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルベニア州ウェストグローブ所在）を用いて自己抗体を検出した。プレートを室温で１時間インキュベートし、４回洗浄して、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード所在）で１５分間発色させた。発色を５０μｌ／ウェルの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させて、吸光度を４５０ｎｍで測定した。６９０ｎｍでの吸光度を差し引いて、バックグランドシグナルを除去した。各９６ウェルプレートは、ＢＣａ対象からの試料１４種、および正常マンモグラム対象からの試料１４種を含んだ。各試料を、同じプレート内で三重測定した。各プレートの１列に、ＥＬＩＳＡの陰性対照としてブロッキング緩衝液のみを加えた。
【００５６】
統計方法
貪欲なキャリパーマッチングアルゴリズム（３５）を用い、アッセイデータを盲検として扱って、３年の年齢枠内に入るＢＣａ患者２００名に対して、対照を１：１で個別に適合させた。各対象で、三重測定の平均からブロッキング緩衝液の平均を差し引くことにより、抗原レベルを変換した。差が０未満であれば、０と設定し、二乗根をとって、より対称な分布を得た。
【００５７】
ＢＣａ患者と対照の間の人口構成および自己抗体反応の差を、それぞれ連続データおよび分類データについて二標本ｔ検定およびカイ二乗検定を利用して検定した。各抗原への自己抗体反応を、年齢、ＢＭＩ、人種、および現在の喫煙状態を既に含むロジスティック回帰モデルに加えることにより、ｃ統計量（即ち、コンコーダンス指標、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線下面積）の漸進的改善を検定した。確率の十分位数によって予測された症例数と観察された症例数を比較することによりカイ二乗検定された統計を構築する、ホスマー・レメショウ適合度検定を利用して、モデル較正を検定した（３６）。
【００５８】
個々の抗原を評価した後、同年齢の階層での多変量条件付きロジスティック回帰解析を用いて、赤池情報量基準（３７）を最小にする抗原サブセットを決定したが、モデルは全て、ＢＭＩ、人種、および現在の喫煙状態に適合された。探索的サブグループ解析を実施して、多変量の抗原サブセットが特定のＢＣａ型で異なって作用するか否かを決定した。多変量モデルを、以下のサブグループで検定した：浸潤性、非浸潤性、ＥＲ陽性、腫瘍最大寸法＞１ｃｍ、リンパ節転移、およびＨＥＲ−２陽性。基準レベルαは、ボンフェローニ補正を利用して≦０．０５／２０抗原＝０．００２５に設定した。ＳＡＳ（登録商標）（ノースカロライナ州ケーリー所在）バージョン９．３ソフトウエアを、全ての解析に用いた。
【００５９】
結果
ネイティブ立体配座を有するように設計された腫瘍関連抗原の作製
患者において液性応答を誘発するＴＡＡを同定するために、膜および分泌タンパク質をコードする候補遺伝子を、ＭＡＰｃＬに表された最も豊富な遺伝子から選択した。タンパク質上のエピトープの１０％のみが直線の連続配列内にあるため（２４）、本発明者らは、真核生物発現系を用いて、自己抗体の検出での使用のために、適切に折り畳まれていて非連続エピトープを含む立体配座保有腫瘍抗原を作製した。候補ＭＡＰｃＬ遺伝子のシグナル配列を含まない細胞外ドメイン（ＥＣＤ）または分泌タンパク質をコードする配列が、ウサギＩｇＧ（ｒＦｃ）のＦｃ領域の５’で、制限酵素クローニング部位に応じてｐＳｅｃＴａｇ２−ｒＦｃベクターまたはｐＦＵＳＥ−ＩｇＫ−ｒＦｃ中にクローニングされた。ベクター内に含まれるＩｇＫリーダー配列は、融合タンパク質を分泌するように指揮する。融合タンパク質をコードするベクターが、２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトされ、対応する融合タンパク質が培地に分泌される。分泌された融合タンパク質の生産が、サンドイッチＥＬＩＳＡを利用して確認され、その濃度が、確定されたＣＤ１４７−ｒＦｃ標準への比較により決定された（データは示さない）。
【００６０】
生成されたＭＡＰｃＬ−ｒＦｃタンパク質がネイティブ立体配座へと折り畳まれるように設計されたことを実証するために、ＥＬＩＳＡ分析を、ネイティブ（モノクローナル抗体３Ｆ３２およびハーセプチン）または変性（モノクローナル抗体３Ｆ２７）ＨＥＲ−２タンパク質のいずれかに対して作製された市販の抗ＨＥＲ−２抗体を用いて実施した。ＨＥＲ−２のＥＣＤからなる２種の抗原（２９３Ｔ細胞内で産生された立体配座保有ＨＥＲ−２−ＥＣＤ−ｒＦｃタンパク質、および細菌内で産生されてニッケルカラムで精製されたＨｉｓ−ＨＥＲ−２−ＥＣＤタンパク質）を分析した。抗ネイティブＨＥＲ−２抗体（３Ｆ３２）は、２９３Ｔにおいて産生されたＨＥＲ−２−ＥＣＤ−ｒＦｃを認識したが（図１Ａ）、細菌内で産生された精製Ｈｉｓ−ＨＥＲ−２−ＥＣＤタンパク質を検出できなかった（図１Ｂ）。同じく、ハーセプチンは細菌から精製された変性Ｈｉｓ−ＨＥＲ−２−ＥＣＤタンパク質を検出できなかった（図１Ｂ）。しかしＨＥＲ−２−ＥＣＤ−ｒＦｃタンパク質をＥＬＩＳＡ分析で抗原として用いた場合に、強力な応答がハーセプチンで観察された（図１Ａ）。変性ＨＥＲ−２に対して生成された３Ｆ２７抗体は、ＨＥＲ−２−ＥＣＤ−ｒＦｃタンパク質を検出しなかったが（図１Ａ）、この抗体は、細菌ＨＥＲ−２−ＥＣＤに対して強力な応答を有した（図１Ｂ）。
【００６１】
購入された抗体により、ネイティブエピトープと変性エピトープを対比させて特異的認識を確認するために、フローサイトメトリーを、ＨＥＲ−２増幅を有することが知られるＢＣａ細胞株の非固定ＳＫＢＲ３細胞で実施した（３８）。表面ＨＥＲ−２は、非固定ＳＫＢＲ３細胞上でネイティブの確定（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）を保持するため、変性ＨＥＲ−２に対して特異的な抗ＨＥＲ−２  ３Ｆ２７抗体は、フローサイトメトリーによりＳＫＢＲ３細胞の細胞膜上の表面ＨＥＲ−２を検出できなかった（図１Ｃ）。抗ＨＥＲ−２  ３Ｆ３２抗体およびハーセプチン（両者とも立体配座ＨＥＲ−２を認識する）をフローサイトメトリー分析に用いた場合に、蛍光の大きなシフトが観察されたことから、これらの抗体がＳＫＢＲ３細胞の膜上に存在するＨＥＲ−２を認識することが示された（図１Ｃ）。
【００６２】
結合競合アッセイを実施して、立体配座保有抗原ＥＬＩＳＡがＭＡＰｃＬ抗原を特異的に認識していることを検証した。ウェルを抗ウサギＩｇＧで、その後、ＨＥＲ−２−ＥＣＤ−ｒＦｃでプレコーティングした。購入されたＨＥＲ−２−ＦｃおよびＣＤ３０−Ｆｃ精製キメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を系列希釈して、各ウェル内の一定量のハーセプチンに添加した。ＨＲＰコンジュゲート二次抗ヒトＩｇＧ抗体の添加に続いて、反応物を発色させた。ＨＥＲ−２−ＥＣＤ−ｒＦｃへのハーセプチン結合は、ＨＥＲ−２−Ｆｃの添加により競合されたが、ＣＤ３０−Ｆｃタンパク質とは競合しなかった（図１Ｄ）。この結果から、ハーセプチンは立体配座保有融合タンパク質のＨＥＲ−２−ＥＣＤ部分に特異的に結合していることが示される。
【００６３】
立体配座保有抗原ＥＬＩＳＡを用いる自己抗体についての患者のスクリーニング
それらのネイティブ立体配座を含むように設計された２０種のＭＡＰｃＬ−ｒＦｃ融合抗原を、ｒＦｃ配列の５’に、ＥＣＤまたは分泌タンパク質をコードする配列をクローニングすることにより作製した（２０種の抗原全ての同一性については表１を参照）。発現プラスミドを２９３Ｔ細胞に個別にトランスフェクトして、ＭＡＰｃＬ−ｒＦｃ融合タンパク質を培地に分泌させた。２０種の融合タンパク質を、サンドイッチＥＬＩＳＡ分析により定量した（データは示さない）。患者から採取された血漿中の自己抗体を検出するために、立体配座保有抗原ＥＬＩＳＡを、作製されたＭＡＰｃＬ−ｒＦｃ抗原を用いて発色させた。ＭＡＰｃＬ−ｒＦｃ融合タンパク質を固定するために、抗ウサギＩｇＧを用いて、９６ウェルプレートのウェルをプレコートした。ネイティブ立体配座を有するように設計された作製ＭＡＰｃＬ−ｒＦｃ融合タンパク質を含む、トランスフェクト２９３Ｔ細胞からの培地を、プレコートされたウェルに添加した。プレートの変動性を低下させて、アッセイの反復可能性を上昇させるために、各患者からの血漿を用いる三重の試料を、９６ウェルプレートに分配した。ＨＲＰコンジュゲート二次抗ヒトＩｇＧ抗体の添加後に、プレートを発色させて、各ウェルの吸光度を測定した。新たに診断されたＢＣａ患者から採取された２００の血漿試料、および同年齢の健常対象２００名から得られた血漿を、立体配座保有ＥＬＩＳＡを用いて２０種の抗原に対する自己抗体反応性について評価した。
【００６４】
ＢＣａ患者２００名および健常対照２００名は、５９（１１）歳の平均（ＳＤ）年齢および自己認識による白色人種９７％を有した（表２）。癌患者は、より過体重であり（２９．７対２７．１ｋｇ／ｍ２、ｐ＜０．０００１）、異なる喫煙習慣を有したため（ｐ＝０．００１４）、健常者に比較して癌対象で喫煙者がより多くを占めた（４％対１１％）。ＢＣａ患者２００名は、７４％浸潤性、２４％リンパ節転移、８６％ＥＲ陽性、１７％ＨＥＲ−２陽性および１２％三種陰性ＢＣａからなる疾患の異質性を表した（表２）。本発明者らは、個々の抗原に対する自己抗体反応の吸光度値を解析して、１２種のＴＡＡ、即ちＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＥＰＨＡ２、ＧＡＬ１、ＨＥＲ−２、ＩＧＦＢＰ２、ＬＡＭＣ２、ＭＵＣ１、ＳＰＯＮ２、ＣＳＴ２、ＳＰＩＮＴ２およびＳＳＲ２に対する自己抗体反応において、ＢＣａ患者と対照の間に有意なボンフェローニ補正有意差が存在することを決定した（表３）。より高レベルのこれらの自己抗体を、ＢＣａ患者で検出した。年齢、人種、ＢＭＩおよび現在の喫煙状態について調整されたロジスティック回帰モデルにおいて、ＭＵＣ１（１．８３）、ＤＫＫ１（１．７７）およびＧＡＬ１（１．７５）（全てｐ＜０．０００１）に対する自己抗体反応は最大オッズ比（ＯＲ）を有し、その結果、患者はこれらの３種の抗体のいずれかに対する自己抗体反応の１ＳＤ増加あたり、約１．８倍のＢＣａを有する可能性を有した（表３）。１２種の抗原のうち６種（即ち、ＧＡＬ１、ＤＫＫ１、ＭＵＣ１、ＡＮＧＰＴＬ４、ＥＰＨＡ２およびＩＧＦＢＰ２）に対する自己抗体反応はまた、それぞれを年齢、ＢＭＩ、人種および現在の喫煙状態（全てｐ＜０．０５）に関して調整されたベースのロジスティック回帰モデルに加えた場合に、ＲＯＣ曲線下面積を増加させた。６種のモデルのうち５種は、確率の十分位数で良好に較正されたが（最小ホスマー・レメショウ  ｐ＝０．１３）、ＩＧＦＢＰ２を含むモデルは、較正されなかった（ｐ＝０．０１６）。
【表３】
2020187132.tif 000004
【００６５】
立体配座保有ＥＬＩＳＡの予測能力を増大するために、個々の同年齢試験計画を組み入れてＢＭＩ、人種および現在の喫煙状態について補正している条件付きロジスティック回帰分析を用いて、抗原群に対する自己抗体反応を決定した。最良モデル適合を有する群（即ち、最小ＡＩＣ）は、以下の７種の抗原に対する自己抗体反応を含んだ：ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＭＵＣ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよびＬＲＲＣ１５（表４）。これらの７種のうち、ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＭＵＣ１およびＧＡＬ１に対する自己抗体反応のみが、ベースモデルに加えられた場合に、個別にＲＯＣ曲線下面積の有意な増加を示した（表３）。抗原群を含む完全に調整されたロジスティック回帰モデルにおいて、現在の喫煙は、一般的なＢＣａの最大ＯＲ（９５％ＣＩ）：ＯＲ＝７．８８（２．６８〜２３．２）を有し、ＢＭＩもまた、１ｋｇ／ｍ２増加につき有意な危険因子：ＯＲ＝１．０９（１．０４〜１．１３）であった（表４）。ＧＡＬ１は、ＯＲ６．７３（３．４２〜１３．３）を有し、そのため患者は、ＧＡＬ１に対する自己抗体反応１ＳＤ増加につき、ＢＣａを有する可能性がほぼ７倍であった。ＧＦＲＡ１（ＯＲ＝０．４１）、ＧＲＮ（ＯＲ＝０．５５）およびＬＲＲＣ１５（ＯＲ＝０．３２）に対する自己抗体反応は全て、他の抗原に対する反応に関して調整された場合、ＢＣａ罹患のオッズと逆の関連を有した（表４）。総括すると、７種の抗原の群に対する自己抗体反応は、ＲＯＣ曲線下面積を０．６４から０．８２に増加させ（ｐ＜０．０００１）、以下の診断値を有した：感度（７２．９％）、特異度（７６．０％）、および陽性尤度比（９５％ＣＩ）３．０４（２．３４〜３．９４）（図２）。このモデルは、リスクの十分位数でも較正された（ホスマー・レメショウ、ｐ＝０．１３）。
【表４】
2020187132.tif 000005
【００６６】
ＢＣａは異質性の疾患であるため、抗原の組み合わせに対する自己抗体反応が、全てのＢＣａサブタイプをまとめて分析するのと比べＢＣａのサブタイプを異なって分類し得る可能性がある。ＢＣａ試料を、個々のＢＣａサブタイプ：浸潤性、非浸潤性、ＥＲ陽性、腫瘍最大寸法＞１ｃｍ、リンパ節転移およびＨＥＲ−２陽性、に群分けした。各サブタイプ内で症例を対照から識別する能力を、年齢、ＢＭＩ、人種および現在の喫煙状態に加え、７種の抗原の組み合わせに対する自己抗体反応を利用して検定した（図２）。７種の抗原の組み合わせのモデルは、ＢＣａの全てのサブタイプにおいて同様に作用し、ｃ統計量は、０．８１〜０．８５であった。ＢＣａサブタイプのうち、７種の抗原の組み合わせに対する自己抗体反応について分析した場合、非浸潤性腫瘍が最大のＲＯＣ曲線下面積を有した（０．８５２０、ｐ＜０．０００１）。このモデルは、非常に低いモデル確率を有する４種の予期せぬＢＣａのため、リンパ節転移を有するそれらの癌のみを考慮すると較正されなかった（ホスマー・レメショウ、ｐ＝０．００３６）。
【００６７】
考察
ＢＣａの早期検出により、医師は転移前の早期ステージの疾患を処置でき、それにより患者のより高い寛解率または長期生存が可能になる。患者の血中の腫瘍タンパク質に対して生成された自己抗体の存在を検出することが、ＢＣａ検出の理想的方法であろう。しかし、腫瘍抗原は、患者体内の特異的自己抗体反応が確認され得る前に同定される必要がある。本発明者らは、ＢＣａにおいて高度に発現され免疫反応を誘発し得る、膜および分泌タンパク質をコードするライブラリを作成した。
【００６８】
本発明者らは、抗原の立体配座がアッセイにおける抗体結合親和性を変化させ、自己抗体の検出がエピトープの立体配座によって限定されることを示した（図１）。本発明者らは、安定な試料セット用いて、手術、化学療法または放射線処置の前に新たに診断されたＢＣａ患者から採取された２００の血漿試料からなる、立体配座保有ＥＬＩＳＡを開発した。加えて、過去６ヶ月以内の確定した正常なマンモグラムにより規定された同年齢対象２００名から、血漿を採取した（表２）。４００の血漿試料の全てを、ネイティブ立体配座を含むように設計された２０種のＴＡＡに対する自己抗体反応について、ＥＬＩＳＡを利用して個別にスクリーニングした。アッセイにおいて分析された２０種のＴＡＡのうち４種は、ＢＣａ患者において抗体反応を生成することが過去に報告されている：ＭＵＣ１（３９、４０）、ＨＥＲ−２（４１）、ＩＧＦＢＰ２（１５）およびＧＲＮ（４２）。２０種の抗原のうち１２種に対する自己抗体の検出は、正常試料と癌試料とを識別するのに統計学的に有意であった（表３、太字）。しかし本発明者らは、アッセイにおいてＧＲＮに対する有意な自己抗体反応を観察しなかった。１２種の有意な抗原のうち９種は、過去にＢＣａ自己抗体と関連づけられていなかった。我々の知る限りにおいて、これは、ＢＣａ患者でのＡＮＧＰＴＬ４、ＣＳＴ２、ＤＫＫ１、ＥＰＨＡ２、ＧＡＬ１、ＬＡＭＣ２、ＳＰＩＮＴ２、ＳＰＯＮ２およびＳＳＲ２に対する自己抗体の検出についての最初の報告である（表３）。
【００６９】
１つの抗原のみと比較して自己抗体を検出するための抗原のパネルに対し血清をスクリーニングすることは、アッセイの感度を上昇させることが、過去に示されている（１７）。この知見は、ＢＣａが異質性疾患であり（４３）、個々の患者の免疫系が異なるという事実と一致する。ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＭＵＣ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよびＬＲＲＣ１５からなる７種のＴＡＡの組み合わせは、最大の診断能力を有した（表４）。ＢＣａの自己抗体を検出するのに用いられた、過去に公表された多重抗原パネルに比較して（１７、４４〜４６）、これらの７種のＴＡＡの組み合わせは独特であり、本発明者らの試験は、ＢＣａおよび健常試料の最大患者人口を含んでいる。興味深いことに、７種の抗原の組み合わせにおいて、抗原４種は、個別に統計学的有意差を有するが（表３）、抗原３種：ＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよびＬＲＲＣ１５は、単独では統計学的に有意でなかった（表３）。しかしＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよびＬＲＲＣ１５は、ＢＣａと逆に関連したことから、患者におけるより少量のこれらの自己抗体は、より高レベルの直接関連する自己抗体との組み合わせで、ＢＣａを有する可能性を上昇させることが示される（表４）。７種の抗原を、現在の喫煙状態およびＢＭＩの情報に加えた場合、アッセイの感度および特異度は、それぞれ７２．９％および７６．０％であった。立体配座保有ＥＬＩＳＡでは、ＲＯＣ曲線下面積（９５％ＣＩ）は０．８２（０．７７〜０．８５）であり、陽性尤度比は３．０４であった。ＢＣａは異質性疾患であるため、患者を、ＥＲ陽性、ＨＥＲ−２陽性、非浸潤性、浸潤性、腫瘍サイズおよびリンパ球転移を含む腫瘍の特徴に群分けした。７種の抗原の組み合わせは、全ての群でよく機能した（図２）。これらの結果から、このアッセイが潜在的に臨床適用を有することが示唆される。病院で現在使用されているＢＣａのための血清再発マーカの１種は、ムチン関連抗原ＣＡ２７．２９である。ＣＡ２７．２９抗原は、ＭＵＣＩを認識するモノクローナル抗体を用いて患者の血中で検出される。ＣＡ２７．２９腫瘍マーカは低感度であるため、このテストは、患者をＢＣａ再発について追跡調査するために利用される（４７）。伝統的なＣＡ２７．２９腫瘍マーカに比較して、本明細書に記載された立体配座保有ＥＬＩＳＡは、大きな有望性を示す。
【００７０】
現在のところ、マンモグラフィーはＢＣａスクリーニングの標準的方法である。しかし、マンモグラムを実施するのに必要な機器は高価であり、専門の医療の操作担当者を必要とし、医療サービスが不十分な地域に運搬することは困難である。ＢＣａの早期検出のための血液検査を開発することが、スクリーニングへのアクセスを大きく進展させるであろう。採血は一般的な手順であり、血液は、分析用の臨床検査施設へ容易に郵送できる。本研究は、立体配座エピトープを含むように設計された抗原に対する自己抗体反応の組み合わせが、ＢＣａ検出の有望な方策になることを実証する。今後の研究では、さらなる抗原を同定して、アッセイの感度および特異度を病院向けへの変換のために改善することが焦点になるであろう。
【表５】
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【００７１】
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２３．  Ｔａｎ  ＥＭ，  Ｓｈｉ  ＦＤ．  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｐａｒａｄｉｇｍｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｌｕｐｕｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００３；１３４（２）：１６９−７７．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １４６１６７７３．
２４．  Ｂａｒｌｏｗ  ＤＪ，  Ｅｄｗａｒｄｓ  ＭＳ，  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＪＭ．  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  １９８６；３２２（６０８１）：７４７−８．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２４２７９５３．
２５．  Ｌａｖｅｒ  ＷＧ，  Ａｉｒ  ＧＭ，  Ｗｅｂｓｔｅｒ  ＲＧ，  Ｓｍｉｔｈ−Ｇｉｌｌ  ＳＪ．  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ：  ｍｉｓｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｒｅａｌｉｔｉｅｓ．  Ｃｅｌｌ．  １９９０；６１（４）：５５３−６．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １６９３０９５．
２６．  Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  Ｎ，  Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈ  Ｅ，  Ｂｈｕｌｌａｒ  ｂ，  Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ  Ｓ，  Ｒｏｓｅｎ  ｂ，  Ｌａｕ  ＡＹ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００４；３０５（５６８０）：８６−９０．  Ｅｐｕｂ  ２００４／０７／０３．  ｄｏｉ：  １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１０９７６３９
３０５／５６８０／８６  ［ｐｉｉ］．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １５２３２１０６．
２７．  Ｅｈｒｌｉｃｈ  ＪＲ，  Ｑｉｎ  Ｓ，  Ｌｉｕ  ＢＣ．  Ｔｈｅ  ’ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃａｐｔｕｒｅ’  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ：  ａ  ｎａｔｉｖｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂａｓｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  ２００６；１（１）：４５２−６０．  Ｅｐｕｂ  ２００７／０４／０５．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００６．６６．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １７４０６２６８．
２８．  Ｔａｎ  ＨＴ，  Ｌｏｗ  Ｊ，  Ｌｉｍ  ＳＧ，  Ｃｈｕｎｇ  ＭＣ．  Ｓｅｒｕｍ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｅａｒｌｙ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．  Ｔｈｅ  ＦＥＢＳ  ｊｏｕｒｎａｌ．  ２００９；２７６（２３）：６８８０−９０４．  Ｅｐｕｂ  ２００９／１０／２９．  ｄｏｉ：  １０．１１１１／ｊ．１７４２−４６５８．２００９．０７３９６．ｘ．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １９８６０８２６．
２９．  Ｅｇｌａｎｄ  ＫＡ，  Ｖｉｎｃｅｎｔ  ＪＪ，  Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  Ｒ，  Ｌｅｅ  ｂ，  Ｐａｓｔａｎ  Ｉ．  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅ  ＢＡＳＥ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｅｎｒｉｃｈ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２００３；１００（３）：１０９９−１０４．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １２５３８８４８．
３０．  Ｂｏｙｌｅ  ＪＳ，  Ｋｏｎｉａｒａｓ  Ｃ，  Ｌｅｗ  ＡＭ．  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｒｅ  ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ  ｗｈｅｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｓ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９７；９（１２）：１８９７−９０６．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ９４６６３１７．
３１．  Ｄｒｅｗ  ＤＲ，  Ｌｉｇｈｔｏｗｌｅｒｓ  Ｍ，  Ｓｔｒｕｇｎｅｌｌ  ＲＡ．  Ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ，  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｏｕｎｄ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔａｎｉａ  ｏｖｉｓ  ４５Ｗ  ａｎｔｉｇｅｎ．  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２０００；１８（２３）：２５２２−３２．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １０７７５７８６．
３２．  Ｂｅｎｄｔｓｅｎ  ＪＤ，  Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｈ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  Ｇ，  Ｂｒｕｎａｋ  Ｓ．  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  ＳｉｇｎａｌＰ  ３．０．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００４；３４０（４）：７８３−９５．  ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２００４．０５．０２８．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １５２２３３２０．
３３．  Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｈ，  Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ  Ｊ，  Ｂｒｕｎａｋ  Ｓ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  Ｇ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅｓ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  １９９７；１０（１）：１−６．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ９０５１７２８．
３４．  Ｋｒｏｇｈ  Ａ，  Ｌａｒｓｓｏｎ  ｂ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  Ｇ，  Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ  ＥＬ．  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００１；３０５（３）：５６７−８０．  ｄｏｉ：  １０．１００６／ｊｍｂｉ．２０００．４３１５．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １１１５２６１３．
３５．  Ｂｅｒｇｓｔｒａｌｈ  ＥＪ，  Ｋｏｓａｎｋｅ  ＪＬ．  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｓｅｓ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ．  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，  ＭＮ：  Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９５．
３６．  Ｈｏｓｍｅｒ  ＤＷ，  Ｌｅｍｅｓｈｏｗ  Ｓ．  Ｇｏｏｄｎｅｓｓ  ｏｆ  ｆｉｔ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ．    Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  −  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ；  １９８０．  ｐ．  １０４３−６９．
３７．  Ａｋａｉｋｅ  Ｈ．  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ａｎ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ．  Ｉｎ：  Ｋｏｔｚ  Ｓ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＮＬ，  ｅｄｉｔｏｒｓ．  Ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈｓ  ｉｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ：  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  １９９２．  ｐ．  ６１０−２４．
３８．  Ｎｅｖｅ  ＲＭ，  Ｃｈｉｎ  Ｋ，  Ｆｒｉｄｌｙａｎｄ  Ｊ，  Ｙｅｈ  Ｊ，  Ｂａｅｈｎｅｒ  ＦＬ，  Ｆｅｖｒ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．  ２００６；１０（６）：５１５−２７．  Ｅｐｕｂ  ２００６／１２／１３．  ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｃｃｒ．２００６．１０．００８．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １７１５７７９１；  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ２７３０５２１．
３９．  Ｋｏｔｅｒａ  Ｙ，  Ｆｏｎｔｅｎｏｔ  ＪＤ，  Ｐｅｃｈｅｒ  Ｇ，  Ｍｅｔｚｇａｒ  ＲＳ，  Ｆｉｎｎ  ＯＪ．  Ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｃｉｎ  ＭＵＣ−１  ｉｎ  ｓｅｒａ  ｆｒｏｍ  ｂｒｅａｓｔ，  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ，  ａｎｄ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９９４；５４（１１）：２８５６−６０．  Ｅｐｕｂ  １９９４／０６／０１．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ７５１４４９３．
４０．  ｖｏｎ  Ｍｅｎｓｄｏｒｆｆ−Ｐｏｕｉｌｌｙ  Ｓ，  Ｇｏｕｒｅｖｉｔｃｈ  ＭＭ，  Ｋｅｎｅｍａｎｓ  Ｐ，  Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅｎ  ＡＡ，  Ｌｉｔｖｉｎｏｖ  ＳＶ，  ｖａｎ  Ｋａｍｐ  ＧＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｍｕｃｉｎ  （ＭＵＣ−１）  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｅｎｉｇｎ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｕｒｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  １９９６；３２Ａ（８）：１３２５−３１．  Ｅｐｕｂ  １９９６／０７／０１．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ８８６９０９４．
４１．  Ｄｉｓｉｓ  ＭＬ，  Ｐｕｐａ  ＳＭ，  Ｇｒａｌｏｗ  ＪＲ，  Ｄｉｔｔａｄｉ  Ｒ，  Ｍｅｎａｒｄ  Ｓ，  Ｃｈｅｅｖｅｒ  ＭＡ．  Ｈｉｇｈ−ｔｉｔｅｒ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃａｎ  ｂｅ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅａｒｌｙ−ｓｔａｇｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  １９９７；１５（１１）：３３６３−７．  Ｅｐｕｂ  １９９７／１１／１８．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ９３６３８６７．
４２．  Ｌａｄｄ  ＪＪ，  Ｃｈａｏ  Ｔ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＭＭ，  Ｑｉｕ  Ｊ，  Ｃｈｉｎ  Ａ，  Ｉｓｒａｅｌ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｅｓｏｍｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｒｅｃｅｄｅ  ａ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｍｏｎｇ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｗｏｍｅｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１３；７３（５）：１５０２−１３．  Ｅｐｕｂ  ２０１２／１２／２８．  ｄｏｉ：  １０．１１５８／０００８−５４７２．ＣＡＮ−１２−２５６０．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２３２６９２７６．
４３．  Ｐｅｒｏｕ  ＣＭ，  Ｓｏｒｌｉｅ  Ｔ，  Ｅｉｓｅｎ  ＭＢ，  ｖａｎ  ｄｅ  Ｒｉｊｎ  Ｍ，  Ｊｅｆｆｒｅｙ  ＳＳ，  Ｒｅｅｓ  ＣＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｏｒｔｒａｉｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｕｒｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０００；４０６（６７９７）：７４７−５２．  Ｅｐｕｂ  ２０００／０８／３０．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／３５０２１０９３．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １０９６３６０２．
４４．  Ｌａｃｏｍｂｅ  Ｊ，  Ｍａｎｇｅ  Ａ，  Ｊａｒｌｉｅｒ  Ｍ，  Ｂａｓｃｏｕｌ−Ｍｏｌｌｅｖｉ  Ｃ，  Ｒｏｕａｎｅｔ  Ｐ，  Ｌａｍｙ  ＰＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ＤＣＩＳ  ａｎｄ  ｎｏｄｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｅａｒｌｙ−ｓｔａｇｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２０１３；１３２（５）：１１０５−１３．  Ｅｐｕｂ  ２０１２／０８／１４．  ｄｏｉ：  １０．１００２／ｉｊｃ．２７７６６．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２２８８６７４７．
４５．  Ｍａｎｇｅ  Ａ，  Ｌａｃｏｍｂｅ  Ｊ，  Ｂａｓｃｏｕｌ−Ｍｏｌｌｅｖｉ  Ｃ，  Ｊａｒｌｉｅｒ  Ｍ，  Ｌａｍｙ  ＰＪ，  Ｒｏｕａｎｅｔ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｒｕｍ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｕｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｏ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１２；１８（７）：１９９２−２０００．  Ｅｐｕｂ  ２０１２／０２／１１．  ｄｏｉ：  １０．１１５８／１０７８−０４３２．ＣＣＲ−１１−２５２７．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２２３２２６７０．
４６．  Ｙｅ  Ｈ，  Ｓｕｎ  Ｃ，  Ｒｅｎ  Ｐ，  Ｄａｉ  Ｌ，  Ｐｅｎｇ  ｂ，  Ｗａｎｇ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｎｉ−ａｒｒａｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  （ＴＡＡｓ）  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｌｅｔｔｅｒｓ．  ２０１３；５（２）：６６３−８．  Ｅｐｕｂ  ２０１３／０２／２０．  ｄｏｉ：  １０．３８９２／ｏｌ．２０１２．１０６２．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２３４２０７１４；  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３５７３１５３．
４７．  Ｇｉｏｎ  Ｍ，  Ｍｉｏｎｅ  Ｒ，  Ｌｅｏｎ  ＡＥ，  Ｄｉｔｔａｄｉ  Ｒ．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  ＣＡ２７．２９  ａｎｄ  ＣＡ１５．３  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．  １９９９；４５（５）：６３０−７．  Ｅｐｕｂ  １９９９／０５／０１．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １０２２２３４９．
【図１】
2020187132.tif 000007
【図２】
2020187132.tif 000008
【配列表】
2020187132000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月19日(2020.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌の再発を検出するための方法であって、乳癌の再発のリスクがあり、かつ過去に浸潤性乳癌、粘膜内の乳癌、ＥＲ陽性乳癌、および／またはＨＥＲ−２陽性乳癌を有した対象からの体液試料を、ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＥＰＨＡ２、ＬＡＭＣ２、ＳＰＯＮ２、ＳＳＲ２、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、ＣＤ１４７、ＣＤ３２０、ＣＤＨ３、ＬＲＰ１０、ＳＰＩＮＴ２、ＳＵＳＤ２、およびＣＳＴ２からなる群から選択される１種または複数のタンパク質、またはその抗原性断片と接触させることを含み、前記１種または複数のタンパク質に対する自己抗体の存在が、乳癌の再発の可能性と相関する、方法。
【請求項２】
前記１種または複数のタンパク質が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＥＰＨＡ２、ＧＡＬ１、ＬＡＭＣ２、ＳＰＯＮ２、ＣＳＴ２、ＳＰＩＮＴ２およびＳＳＲ２からなる群、またはその抗原性断片から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１種または複数のタンパク質が、前記列挙されたタンパク質の２種以上、またはその抗原性断片を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記１種または複数のタンパク質が、前記列挙されたタンパク質の５種以上、またはその抗原性断片を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記１種または複数のタンパク質が、以下のタンパク質セット：
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１、および５  ＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＧＲＡＮＵＬＩＮ、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＬＲＲＣ１５；
ＧＡＬ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＲＲＣ１５、およびＭＵＣ１；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＡＬ１、およびＧＦＲＡ１；
ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、およびＧＦＲＡ１；ならびに
ＧＡＬ１、ＧＦＲＡ１、およびＭＵＣ１、
の１つ、またはその抗原性断片を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記１種または複数のタンパク質が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＡＬ１、ＭＵＣ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮおよびＬＲＲＣ１５を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記接触させることが、ＥＬＩＳＡの使用を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記体液試料が、前記対象からの血清試料を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記接触させることが、縦断的アッセイスクリーニング（Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  Ａｓｓａｙ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）の使用を含み、全ての標的バイオマーカが単一テストおよび希釈の中で検出および定量され得る、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記体液試料が、前記対象からの血液試料を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。