(57)【要約】  【課題】  高いがん治療効果を有する医薬の探索。  【解決手段】  ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物を含むがん治療用医薬組成物であって、前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３１４０、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−６３１、およびｍｉＲ−６５７からなる群から選択される１または複数のｍｉＲＮＡである、医薬組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物を含むがん治療用医薬組成物であって、
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３１４０、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−６３１、およびｍｉＲ−６５７からなる群から選択される１または複数のｍｉＲＮＡであることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬組成物であって、
前記がんが、固形がんであることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の医薬組成物であって、
前記固形がんが、大腸がん、膵臓がん、舌がん、中皮腫、子宮肉腫、骨肉腫、乳がん、肺がん、または頭頸部がんであることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の医薬組成物であって、
前記ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、２本鎖ｍａｔｕｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの５’末端側から発現する１本鎖ｍａｔｕｒｅ−ｍｉＲＮＡ、または、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの３’末端側から発現する１本鎖ｍａｔｕｒｅ−ｍｉＲＮＡであることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の医薬組成物であって、
前記ｍｉＲＮＡが、
（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号８、または、配列番号１１で表される配列からなるｍａｔｕｒｅ−ｍｉＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号８、または、配列番号１１で表される配列からなるｍａｔｕｒｅ−ｍｉＲＮＡに対して、１〜５塩基の置換、付加、および／または欠失を有し、がん治療効果を有する、ｍｉＲＮＡ；または、
（ｉｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号８、または、配列番号１１で表される配列からなるｍａｔｕｒｅ−ｍｉＲＮＡに対して、８０％以上の配列相同性を有し、がん治療効果を有する、ｍｉＲＮＡ；
であることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記ｍｉＲＮＡが、化学的に修飾されていることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の医薬組成物であって、
前記化学的修飾が、ＬＮＡ化、ＢＮＡ化、ＥＮＡ化、２’−ＯＭｅ修飾、ホスホロチオエート化、Ｓ−ＴｕＤ化、モルフォリノ修飾、ペプチド付加、糖鎖付加、アプタマー付加、疎水性分子付加、高分子付加、および、非修飾ＤＮＡ付加からなる群から選択される、１または複数の化学的修飾であることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記医薬組成物が、核酸トランスフェクション剤をさらに含むことを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の医薬組成物であって、
前記トランスフェクション剤が、脂質系トランスフェクション剤、ポリマー系トランスフェクション剤、磁気粒子系トランスフェクション剤、核酸デリバリー用エクソソーム、または、核酸デリバリー用ウイルスタンパク質であることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項１０】
請求項８に記載の医薬組成物であって、
前記トランスフェクション剤は、ＧＧＧＧＤＤ（Ｇ４Ｄ２）、ＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ６Ｄ２）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ８Ｄ２）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ１０Ｄ２）、ＡＡＡＡＡＡＤ（Ａ６Ｄ）、ＡＡＡＡＡＡＤＤ（Ａ６Ｄ２）、ＡＡＡＡＡＡＫ（Ａ６Ｋ）、ＡＡＡＡＡＡＫＫ（Ａ６Ｋ２）、ＶＶＶＶＶＶＤ（Ｖ６Ｄ）、ＶＶＶＶＶＶＤＤ（Ｖ６Ｄ２）、ＶＶＶＶＶＶＫ（Ｖ６Ｋ）、ＶＶＶＶＶＶＫＫ（Ｖ６Ｋ２）、ＬＬＬＬＬＬＤ（Ｌ６Ｄ）、ＬＬＬＬＬＬＤＤ（Ｌ６Ｄ２）、ＬＬＬＬＬＬＫ（Ｌ６Ｋ）、または、ＬＬＬＬＬＬＫＫ（Ｌ６Ｋ２）のアミノ酸配列で表されるペプチドを含むトランスフェクション剤であることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、局所投与用であることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、
他の抗がん剤と併用されることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の医薬組成物であって、
前記他の抗がん剤が、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、抗がん性抗生物質、分子標的薬、ホルモン製剤、免疫調節薬、インターフェロン、インターロイキン、植物由来抗がん剤、ＢＲＭ製剤からなる群から選択される、１または複数の抗がん剤であることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項１４】
ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物の、がん治療用医薬組成物の製造のための使用であって、
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３１４０、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−６３１、およびｍｉＲ−６５７からなる群から選択される１または複数のｍｉＲＮＡであることを特徴とする、
使用。
【請求項１５】
がんの治療方法であって、
前記方法は、がん患者に対して、治療上有効量の、ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物を含む抗がん用医薬組成物を適用するステップ、
を含み、
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３１４０、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−６３１、およびｍｉＲ−６５７からなる群から選択される１または複数のｍｉＲＮＡであることを特徴とする、
治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物を含む、がん治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（以下、ｍｉＲＮＡ）は、ゲノム上にコードされ、多段階的な生成過程を経て、最終的に２０〜２５塩基長程度の微小ＲＮＡとなる、機能性核酸である。ｍｉＲＮＡは機能性のｎｃＲＮＡ（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）に分類され、様々な生命現象（例えば、遺伝子の発現制御、等）において重要な役割を果たすことが解明されつつある。現在までに公知となっている種々のｍｉＲＮＡは、ヒトのｍｉＲＮＡも含め、ｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／参照）に登録されている。
【０００３】
ｍｉＲＮＡは、がん、心血管疾患、神経変性疾患、精神疾患、慢性炎症性疾患、等などの発症と進行に関わっていることが指摘されている。特に近年、ｍｉＲＮＡが、細胞のがん化や細胞の老化に深く関与していることが指摘されている。
【０００４】
例えば、特許文献１には、ｍｉＲ−２２が、細胞の老化を促進させ、がんの浸潤および／転移を抑制することが記載さている。また、特許文献２には、ｍｉＲ−３４を含む組成物が、がんの治療に用い得ることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／０７８０３７
【特許文献２】ＷＯ２００８／１３７８６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、極めて多くのｍｉＲＮＡの中から、がんに対して治療効果を有するｍｉＲＮＡを鋭意探索した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
その結果、本発明者らは、先行技術に記載のｍｉＲＮＡよりも顕著に高いがん治療効果を有する特定のｍｉＲＮＡを見出し、本発明を完成させるに到った。
【０００８】
すなわち本発明は、ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物を含むがん治療用医薬組成物であって、
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３１４０、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−６３１、およびｍｉＲ−６５７からなる群から選択される１または複数のｍｉＲＮＡであることを特徴とする、
医薬組成物に関する。
【０００９】
本発明の一実施形態においては、前記がんが、固形がんであることを特徴とする。
【００１０】
本発明の一実施形態においては、前記固形がんが、大腸がん、膵臓がん、舌がん、中皮腫、子宮肉腫、骨肉腫、乳がん、肺がん、または頭頸部がんであることを特徴とする。
【００１１】
本発明の一実施形態においては、前記ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、２本鎖ｍａｔｕｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの５’末端側から発現する１本鎖ｍａｔｕｒｅ−ｍｉＲＮＡ、または、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの３’末端側から発現する１本鎖ｍａｔｕｒｅ−ｍｉＲＮＡであることを特徴とする。
【００１２】
本発明の一実施形態においては、前記ｍｉＲＮＡが、
（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号８、または、配列番号１１で表される配列からなるｍａｔｕｒｅ−ｍｉＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号８、または、配列番号１１で表される配列からなるｍａｔｕｒｅ−ｍｉＲＮＡに対して、１〜５塩基の置換、付加、および／または欠失を有し、がん治療効果を有する、ｍｉＲＮＡ；または、
（ｉｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号８、または、配列番号１１で表される配列からなるｍａｔｕｒｅ−ｍｉＲＮＡに対して、８０％以上の配列相同性を有し、がん治療効果を有する、ｍｉＲＮＡ；
であることを特徴とする。
【００１３】
本発明の一実施形態においては、前記ｍｉＲＮＡが、化学的に修飾されていることを特徴とする。
【００１４】
本発明の一実施形態においては、前記化学的修飾が、ＬＮＡ化、ＢＮＡ化、ＥＮＡ化、２’−ＯＭｅ修飾、ホスホロチオエート化、Ｓ−ＴｕＤ化、モルフォリノ修飾、ペプチド付加、糖鎖付加、アプタマー付加、疎水性分子付加、高分子付加、および、非修飾ＤＮＡ付加からなる群から選択される、１または複数の化学的修飾であることを特徴とする。
【００１５】
本発明の一実施形態においては、前記医薬組成物が、核酸トランスフェクション剤をさらに含むことを特徴とする。
【００１６】
本発明の一実施形態においては、前記トランスフェクション剤が、脂質系トランスフェクション剤、ポリマー系トランスフェクション剤、磁気粒子系トランスフェクション剤、核酸デリバリー用エクソソーム、または、核酸デリバリー用ウイルスタンパク質であることを特徴とする。
【００１７】
本発明の一実施形態においては、前記トランスフェクション剤は、ＧＧＧＧＤＤ（Ｇ４Ｄ２）、ＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ６Ｄ２）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ８Ｄ２）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ１０Ｄ２）、ＡＡＡＡＡＡＤ（Ａ６Ｄ）、ＡＡＡＡＡＡＤＤ（Ａ６Ｄ２）、ＡＡＡＡＡＡＫ（Ａ６Ｋ）、ＡＡＡＡＡＡＫＫ（Ａ６Ｋ２）、ＶＶＶＶＶＶＤ（Ｖ６Ｄ）、ＶＶＶＶＶＶＤＤ（Ｖ６Ｄ２）、ＶＶＶＶＶＶＫ（Ｖ６Ｋ）、ＶＶＶＶＶＶＫＫ（Ｖ６Ｋ２）、ＬＬＬＬＬＬＤ（Ｌ６Ｄ）、ＬＬＬＬＬＬＤＤ（Ｌ６Ｄ２）、ＬＬＬＬＬＬＫ（Ｌ６Ｋ）、または、ＬＬＬＬＬＬＫＫ（Ｌ６Ｋ２）のアミノ酸配列で表されるペプチドを含むトランスフェクション剤であることを特徴とする。
【００１８】
本発明の一実施形態においては、本発明の医薬組成物は、局所投与用であることを特徴とする。
【００１９】
本発明の一実施形態においては、本発明の医薬組成物は、他の抗がん剤と併用されることを特徴とする。
【００２０】
本発明の一実施形態においては、前記他の抗がん剤が、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、抗がん性抗生物質、分子標的薬、ホルモン製剤、免疫調節薬、インターフェロン、インターロイキン、植物由来抗がん剤、ＢＲＭ製剤からなる群から選択される、１または複数の抗がん剤であることを特徴とする。
【００２１】
本発明の他の実施形態は、ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物の、がん治療用医薬組成物の製造のための使用であって、
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３１４０、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−６３１、およびｍｉＲ−６５７からなる群から選択される１または複数のｍｉＲＮＡであることを特徴とする、
使用に関する。
【００２２】
本発明の他の実施形態は、がんの治療方法であって、
前記方法は、がん患者に対して、治療上有効量の、ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物を含む抗がん用医薬組成物を適用するステップ、
を含み、
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３１４０、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−６３１、およびｍｉＲ−６５７からなる群から選択される１または複数のｍｉＲＮＡであることを特徴とする、
治療方法に関する。
【００２３】
上記に挙げた本発明の一または複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本実施例における、ｍｉＲＮＡのスクリーニングの流れを説明する。
【図２】図２は、本実施例における、ｍｉＲＮＡのスクリーニングの流れを説明する。
【図３】図３は、ｍｉＲＮＡのスクリーニングにおいて選別された、多くの種類のがん細胞に対して増殖抑制効果を示す、４つのｍｉＲＮＡを示す。
【図４】図４は、本発明のｍｉＲＮＡの、舌がん細胞株（ＨＳＣ−４細胞、ＯＳＣ１９細胞）に対する効果を示す。
【図５】図５は、本発明のｍｉＲＮＡの、舌がん細胞株（ＳＡＳ細胞）に対する効果を示す。
【図６】図６は、本発明のｍｉＲＮＡの、中皮腫細胞株（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞）に対する効果を示す。
【図７】図７は、本発明のｍｉＲＮＡの、中皮腫細胞株（ＥＨＭＥＳ−１０細胞）に対する効果を示す。
【図８】図８は、本発明のｍｉＲＮＡの、子宮肉腫細胞株（ＭＥＳ−ＳＡ細胞）に対する効果を示す。
【図９】図９は、本発明のｍｉＲＮＡの、骨肉腫細胞株（Ｕ２−ＯＳ細胞）に対する効果を示す。
【図１０】図１０は、本発明のｍｉＲＮＡの、がん幹細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞）に対する効果を示す。
【図１１】図１１は、本発明のｍｉＲＮＡの、肺がん細胞株（Ａ５４９細胞）に対する効果を示す。
【図１２】図１２は、本発明のｍｉＲＮＡの、大腸がん細胞株（ＳＷ６２０細胞、ＳＷ４８０細胞、ＨＴ２９細胞）に対する効果を示す。
【図１３】図１３は、本発明のｍｉＲＮＡの、インビボにおけるがん治療効果を示す。
【図１４】図１４は、腫瘍細胞移植後１２、１９、２６、３３日後における腫瘍組織のイメージング解析結果を示す。
【図１５】図１５は、図１４におけるイメージング解析結果を定量したグラフを示す。
【図１６】図１６は、エンドポイントにおける腫瘍の重量を比較した結果を示す。
【図１７】図１７は、腫瘍細胞移植後における腫瘍組織のイメージング解析結果を示す。
【図１８】図１８は、エンドポイントにおける腫瘍の重量を比較した結果を示す。
【図１９】図１９は、実験７のスケジュールを示す。
【図２０】図２０は、ｍｉＲ−３１４０−３ｐを１回投与したときのイメージング結果を示す。
【図２１】図２１は、ｍｉＲ−３１４０−３ｐを１回投与したときのイメージング結果を示す。
【図２２】図２２は、ｍｉＲ−３１４０−３ｐを１回投与したときのマウスの生存率を示す。
【図２３】図２３は、ｍｉＲ−３１４０−３ｐを２回投与したときのイメージング結果を示す。
【図２４】図２４は、ｍｉＲ−３１４０−３ｐを２回投与したときのイメージング結果を示す。
【図２５】図２５は、ｍｉＲ−３１４０−３ｐを２回投与したときのマウスの生存率を示す。
【図２６】図２６は、ｍｉＲ−３１４０−３ｐを３回投与したときのイメージング結果を示す。
【図２７】図２７は、ｍｉＲ−３１４０−３ｐを３回投与したときのイメージング結果を示す。
【図２８】図２８は、ｍｉＲ−３１４０−３ｐを３回投与したときのマウスの生存率を示す。
【図２９】図２９は、実験８の結果を示す。
【図３０】図３０は、ｍｉＲ−３１４０−３ｐとシスプラチンの腫瘍抑制効果の比較を示す。
【図３１】図３１は、ｍｉＲ−３１４０−３ｐとシスプラチンの腫瘍抑制効果の比較を示す。
【図３２】図３２は、ｍｉＲ−３１４０−３ｐとシスプラチンの腫瘍抑制効果の比較を示す。
【図３３】図３３は、ｍｉＲ−３１４０−３ｐ投与群とシスプラチン投与群の生存率の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ）をコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物を含むがん治療用医薬組成物に関する。一般的なｍｉＲＮＡは、連続したプロセスを経て生合成される。ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の一次転写産物はＰｒｉｍａｒｙ  ｍｉＲＮＡ転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれ、一般的に、ステムループのヘアピン構造を有する。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、マイクロプロセッサ複合体により切断され、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ系酵素であるＤｒｏｓｈａによりヘアピン形態をとり、７０塩基程度の中間前駆体であるｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｍｉＲＮＡ  （ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が産生される。その後、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは核より細胞質へと移送される。細胞質では、別のＲＮａｓｅＩＩＩ酵素であるＤｉｃｅｒによりさらに切断され、２本鎖ｍａｔｕｒｅ  ｍｉＲＮＡが産生される。一般的に、２本鎖のうち、前駆体の５’末端側から発現するものに“−５ｐ”、３’末端側から発現するものに“−３ｐ”を付加し、“ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ”、“ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ”のように表記される。なお、公知のｍｉＲＮＡについては、原則としてｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）に登録される。
【００２６】
なお、ｍａｔｕｒｅ  ｍｉＲＮＡの一方の鎖のみが所望の効果を奏する場合もあり、それぞれの鎖が所望の効果を奏する場合もあり、２本鎖の状態で所望の効果を奏する場合もある。また、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの状態やｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの状態で所望の効果を奏することもあり得る。
【００２７】
本発明の組成物に含まれる核酸は、ｍｉＲ−３１４０、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−６３１、および、ｍｉＲ−６５７からなる群から選択される１または複数のｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物であってよく、また、当該核酸の機能を保持する変異体または改変体であってもよい。
【００２８】
本発明の一実施形態において使用される、ｍｉＲ−３１４０をコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物の配列は以下のとおりである。
【表１】
2020055886.tif 000002
なお、ｍｉＲ−３１４０のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡをコードするＩｎｔｒｏｎ領域の配列を、配列番号４に示す。
【００２９】
本発明の一実施形態において使用される、ｍｉＲ−１３７をコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物の配列は以下のとおりである。
【表２】
2020055886.tif 000003
なお、ｍｉＲ−１３７のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡをコードするＩｎｔｒｏｎ領域の配列を、配列番号７に示す。
【００３０】
本発明の一実施形態において使用される、ｍｉＲ−６３１をコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物の配列は以下のとおりである。
【表３】
2020055886.tif 000004
なお、ｍｉＲ−６３１のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡをコードするＩｎｔｒｏｎ領域の配列を、配列番号１０に示す。
【００３１】
本発明の一実施形態において使用される、ｍｉＲ−６５７をコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物の配列は以下のとおりである。
【表４】
2020055886.tif 000005
なお、ｍｉＲ−６５７のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡをコードするＩｎｔｒｏｎ領域の配列を、配列番号１３に示す。
【００３２】
本発明の組成物に含まれる核酸は、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号８、または、配列番号１１で表される配列からなるｍａｔｕｒｅ−ｍｉＲＮＡに対して、１、２、３、４または５塩基の置換、付加、および／または欠失を有し、がん細胞の成長を阻害する効果を有する核酸であってよい。ｍａｔｕｒｅ−ｍｉＲＮＡに対する塩基の置換は、例えば本分野において知られているＲＮＡの保存的置換であってよい。
【００３３】
また、本発明の組成物に含まれる核酸は、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号８、または、配列番号１１で表される配列からなるｍａｔｕｒｅ−ｍｉＲＮＡに対して、８０％以上（好ましくは、８５％以上、９０％以上、９５％以上）の配列相同性（または、配列同一性）を有し、がん細胞の成長を阻害する効果を有する核酸であってよい。
【００３４】
配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号８、または、配列番号１１で表される配列からなるｍａｔｕｒｅ−ｍｉＲＮＡは、本分野において一般的に使用されるＲＮＡ合成機器によって容易に製造することができ、特定の塩基を置換、付加、および／または、欠失させた核酸も同様に容易に製造することができる。また、多くの企業が核酸の受託合成を行っており、そのような企業から所望の配列のＲＮＡを入手することも容易である。したがって、本分野における当業者であれば、常法により、過度の負担なく、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号８、または、配列番号１１で表される配列からなるｍａｔｕｒｅ−ｍｉＲＮＡの変異体や改変体の性質や機能を調査することができる。
【００３５】
また、本発明の組成物に含まれる核酸は、ＲＮＡの安定性や特異性等を向上させる目的で、本分野において公知の化学的修飾が施されていてよい。本発明に用い得る化学的修飾は、例えば、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）化、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）化、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）化、２’−ＯＭｅ修飾、ホスホロチオエート化（Ｓ化）、Ｓ−ＴｕＤ（合成Ｔｏｕｇｈ  Ｄｅｃｏｙ）化、モルフォリノ修飾、ペプチド付加、糖鎖付加、アプタマー付加、コレステロール等の疎水性分子付加、ＰＥＧ等の高分子付加、または、非修飾ＤＮＡ付加であってよい。これらの化学的修飾は、本分野において知られている公知の手段によって行うことができる。
【００３６】
本発明は、様々ながんの治療に用いることができるが、例えば固形がんに好適に用いることができる。より好ましくは、本発明の対象は、大腸がん、膵臓がん、舌がん、中皮腫、子宮肉腫、骨肉腫、乳がん、肺がん、または頭頸部がんであってよい。
【００３７】
本発明をがん細胞へ適切に導入するため、本発明の組成物は、核酸トランスフェクション剤をさらに含んでよい。本発明に用いてよい核酸トランスフェクション剤の例としては、脂質系トランスフェクション剤、ポリマー系トランスフェクション剤、磁気粒子系トランスフェクション剤、核酸デリバリー用エクソソーム、または、核酸デリバリー用ウイルスタンパク質が挙げられる。
【００３８】
脂質系トランスフェクション剤の例としては、カチオン性脂質が挙げられる。カチオン性脂質は、核酸―カチオン性脂質複合体がエンドサイトーシスを介して細胞に取り込まれ、細胞質に放出されることにより、核酸が細胞へ導入される（リポフェクション）。具体的には、例えば、市販されている様々なリポフェクション用試薬を用いてよい。
【００３９】
ポリマー系トランスフェクション剤の例としては、例えば、カチオン性ポリマーが挙げられる。カチオン性ポリマーは、核酸と接触すると核酸−ポリマー複合体を形成し、複合体は、静電相互作用を介して細胞膜に付着し、エンドサイトーシスを介して細胞に取り込まれる。具体的には、カチオン性ペプチドおよびその誘導体（例えば、ポリリジン、ポリオルニチン）、直鎖または分岐鎖の合成ポリマー（例えば、ポリブレン、ポリエチレンイミン）、多糖ベースの導入分子（例えば、シクロデキストリン、キトサン）、天然ポリマー（例えば、ヒストン、コラーゲン）、および、活性型および非活性型デンドリマー等を用いてよい。また、ミセル化ナノ粒子を形成するブロックコポリマーを用いたトランスフェクション剤、カーボンナノホーンを用いるトランスフェクション剤等、いわゆるナノＤＤＳにおいて用いられるトランスフェクション剤も、本発明に使用することができる。
【００４０】
磁気粒子系トランスフェクション剤の例としては、陽イオン分子でコートされた磁気粒子を用いたトランスフェクション剤が挙げられる。磁気粒子系トランスフェクション剤は、磁気粒子の表面に核酸を接着させた後、当該磁気粒子を磁気によって細胞内へ導入することにより、トランスフェクションを実行する。具体的には、例えば、市販されている様々なトランスフェクション用磁気粒子を用いてよい。
【００４１】
また、一般的に利用可能なエクソソームを用いた核酸のトランスフェクション剤や、アデノウイルス等のウイルスタンパク質を利用したトランスフェクション剤も、本発明に使用することができる。
【００４２】
さらに、本発明においては、ＧＧＧＧＤＤ（Ｇ４Ｄ２）（配列番号１４）、ＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ６Ｄ２）（配列番号１５）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ８Ｄ２）（配列番号１６）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ１０Ｄ２）（配列番号１７）、ＡＡＡＡＡＡＤ（Ａ６Ｄ）（配列番号１８）、ＡＡＡＡＡＡＤＤ（Ａ６Ｄ２）（配列番号１９）、ＡＡＡＡＡＡＫ（Ａ６Ｋ）（配列番号２０）、ＡＡＡＡＡＡＫＫ（Ａ６Ｋ２）（配列番号２１）、ＶＶＶＶＶＶＤ（Ｖ６Ｄ）（配列番号２２）、ＶＶＶＶＶＶＤＤ（Ｖ６Ｄ２）（配列番号２３）、ＶＶＶＶＶＶＫ（Ｖ６Ｋ）（配列番号２４）、ＶＶＶＶＶＶＫＫ（Ｖ６Ｋ２）（配列番号２５）、ＬＬＬＬＬＬＤ（Ｌ６Ｄ）（配列番号２６）、ＬＬＬＬＬＬＤＤ（Ｌ６Ｄ２）（配列番号２７）、ＬＬＬＬＬＬＫ（Ｌ６Ｋ）（配列番号２８）、または、ＬＬＬＬＬＬＫＫ（Ｌ６Ｋ２）（配列番号２９）のアミノ酸配列で表されるペプチドを含むトランスフェクション剤を用いてよく、特にＡＡＡＡＡＡＤ（Ａ６Ｄ）またはＡＡＡＡＡＡＫ（Ａ６Ｋ）を好適に用いることができる。これらのペプチドのトランスフェクション剤としての効果は、例えばＷＯ２０１０／０２４２６２に開示されている。
【００４３】
本発明のがん治療用医薬組成物は、本分野において公知の他の抗がん剤と併用することができる。併用される他の抗がん剤は限定されないが、例えば、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、抗がん性抗生物質、分子標的薬、ホルモン製剤、免疫調節薬、インターフェロン、インターロイキン、植物由来抗がん剤、ＢＲＭ製剤からなる群から選択される、１または複数の抗がん剤を用いることができる。
【００４４】
本発明のがん治療用医薬組成物と本分野において公知の他の抗がん剤との併用の態様は限定されず、対象とするがんの種類や治療ステージ等に応じて、当業者（例えば、医師）が様々な態様で実施することができる。本発明のがん治療用医薬組成物と他の抗がん剤とは、同時又は異時に対象に投与されてよい。また、本発明のがん治療用医薬組成物と他の抗がん剤とは、それぞれを含む配合剤として準備され、対象へ投与されてもよい。また、本発明のがん治療用医薬組成物と他の抗がん剤とは、それぞれを別々に備えるキットとして準備されてもよい。
【００４５】
本発明のがん治療用医薬組成物と他の抗がん剤とを同時に投与する態様としては、例えば、本発明のがん治療用医薬組成物と他の抗がん剤とを含む配合剤を対象へ投与する態様であってよい。
【００４６】
本発明において、本発明のがん治療用医薬組成物と他の抗がん剤とを異時に投与する態様としては、例えば、本発明のがん治療用医薬組成物と他の抗がん剤とを、時間をずらしてそれぞれ投与する態様であってよく、また、例えば、本発明のがん治療用医薬組成物と他の抗がん剤とを異なる投与経路から投与する態様であってよい。
【００４７】
本発明のがん治療用医薬組成物の投与経路は限定されず、全身投与であっても、局所投与であってもよい。投与経路としては、例えば、舌下投与を含む経口投与、吸入投与、カテーテルや注射による標的組織に対する直接投与、点滴を含む静脈内投与、貼付剤等による経皮投与、座薬、または、経鼻胃管、経鼻腸管、胃ろうチューブ、もしくは腸ろうチューブ等を用いる強制的経腸栄養法による投与等の非経口投与を挙げることができる。
【００４８】
本発明のがん治療用医薬組成物の剤型は、前記投与経路に応じて適宜決定してよく、限定はされないが、注射剤、点滴剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ等に溶解した水剤、貼付剤、座薬剤等を挙げることができる。
【００４９】
本発明の医薬組成物を投与する対象は限定されず、例えば、哺乳動物（ヒト、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、イヌ、ネコ、ラット、マウス等）に対して本発明を用いることができる。しかし、好ましくない場合には、ヒトを対象から除くこともできる。
【００５０】
本発明の医薬組成物の対象への投与方法（投与経路、投与量、１日の投与回数、投与のタイミング、等）は限定されず、対象の健康状態、疾患の程度、併用する薬剤の種類等に応じて、当業者（例えば、医師）が適宜決定することができる。
【００５１】
本明細書において用いられる用語は、特に定義されたものを除き、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
【００５２】
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
【００５３】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【００５４】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【００５５】
実験１：細胞の老化誘導能の高いｍｉＲＮＡのスクリーニング
【００５６】
（１）全ｍｉＲＮＡのＴＩＧ−３細胞へのトランスフェクション（図１）
【００５７】
全２０２８種類のｍｉＲＮＡ（ｍｉｒＶａｎａ；Ａｍｂｉｏｎ）を、自動分注機Ｂｒａｖｏ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、ＴＩＧ−３細胞（ヒト線維芽細胞）へトランスフェクションした。トランスフェクションは以下の手順によって実施した。
【００５８】
１：７０μＬの無血清培地（Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭ））に対して０．３５μＬのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。
２：１の溶液を、Ｂｒａｖｏを用いて９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（μ−ｐｌａｔｅ；ｉｂｉｄｉ）に加えた。
３：２にｍｉＲＮＡ（Ｓｔｏｃｋ  Ｃｏｎｃ．  ２μＭ）を、Ｂｒａｖｏを用いて０．７μＬ加え、ピペッティングにより混和した。
４：室温で２０分間インキュベートした。
５：３．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した細胞懸濁液を、Ｂｒａｖｏを用いて７０μＬずつ分注した。
６：３７℃，５％ＣＯ２条件下でインキュベートした。
【００５９】
（２−１）トランスフェクション細胞の染色
【００６０】
トランスフェクションを行った日を０日として、５日後に細胞数と細胞の大きさを評価するため、染色を行った。以下にその手順を示した。
【００６１】
１：ＰＢＳ（−）を用いて２回洗浄を行った。
２：３．７％ホルマリン溶液を加え、室温で１０分間インキュベートし細胞を固定した。
３：ＰＢＳ（−）を用いて２回洗浄を行った。
４：Ｓｔａｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、室温で３０分間インキュベートし、染色した。
５：ＰＢＳ（−）を用いて３回洗浄を行った。
６：染色し終わったプレートは、自動写真撮影装置Ｏｐｅｒｅｔｔａ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて全視野撮影を行った。
７：撮影した写真は、画像解析ソフトＣｏｌｕｍｂｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて定量解析を行った。
【００６２】
【表５】
2020055886.tif 000006
【００６３】
（２−２）トランスフェクション細胞のＳＡ−β−ガラクトシダーゼアッセイ
【００６４】
トランスフェクションを行った日を０日として、７日目にＳＡ−β−ガラクトシダーゼアッセイを行った。操作手順を以下に示した。
【００６５】
１：ＰＢＳ（−）を用いて２回洗浄した。
２：２％ホルマリン溶液を加え、室温で５分間インキュベートし細胞を固定した。
３：ＰＢＳ（−）を用いて２回洗浄した。
４：β−Ｇａｌ  ｓｔａｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを用事調製し、ウェルに加えた。
５：３７℃で１２−１６時間インキュベートした。
６：染色し終わったプレートは、自動写真撮影装置Ｏｐｅｒａ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて撮影した。
【００６６】
【表６】
2020055886.tif 000007
【００６７】
（３）スクリーニングの結果解析（図２）
得られた細胞数、細胞の大きさの数値をそれぞれ、ネガティブコントロールであるランダム配列ｍｉＲＮＡの数値およびポジティブコントロールであるｍｉＲ−３４ａ−５ｐの数値を用いてスコア化した。スコア化の方法を以下に示した。
【００６８】
各プレート内において
１：ネガティブコントロールの値からポジティブコントロールの値を引いた。
２：ネガティブコントロールの値からそれぞれのｍｉＲＮＡの値を引いた。
３：２の値を１の値で割り、スコア値とした。
４：横軸に細胞数のスコア値を縦軸に細胞の大きさのスコア値を取り散布図を描いた。
５：ｍｉＲ−２２−３ｐおよびｍｉＲ−２２−５ｐのスコア値よりも少なくとも一方が高いスコア値を示したｍｉＲＮＡを老化誘導ｍｉＲＮＡ候補として５７９種類同定した。
６：５７９種類の候補中、細胞老化マーカーであるβ−ガラクトシダーゼの活性化を誘導したｍｉＲＮＡを老化誘導ｍｉＲＮＡとして３４９種類同定した。
【００６９】
実験２：がん細胞株を用いたさらなるスクリーニング
【００７０】
スクリーニングで得られた３４９種類の老化誘導ｍｉＲＮＡ（ｍｉｒＶａｎａ；Ａｍｂｉｏｎ）を、自動分注機Ｂｒａｖｏ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、各種がん細胞株（大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６（ｐ５３野生型およびｐ５３欠損）、膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ−３およびＣＦＰＡＣ−１、舌がん細胞株ＨＳＣ−４）へトランスフェクションした。
トランスフェクションは以下の手順で実施した。
【００７１】
１：７０μＬの無血清培地（Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭ））に対して０．３５μＬのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。
２：１の溶液を、Ｂｒａｖｏを用いて９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（μ−ｐｌａｔｅ；ｉｂｉｄｉ）に加えた。
３：２にｍｉＲＮＡ（Ｓｔｏｃｋ  Ｃｏｎｃ．  ２００ｎＭ）をＢｒａｖｏを用いて０．７μＬ加え、ピペッティングにより混和した。
４：室温で２０分間インキュベートした。
５：３．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ希釈した細胞懸濁液をＢｒａｖｏを用いて７０μＬずつ分注した。
６：３７℃，５％ＣＯ２条件下でインキュベートした。
【００７２】
トランスフェクションを行った日を０日として、５日目に細胞生存率をＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて評価した。以下に操作手順を示した。
【００７３】
１．２０倍希釈したＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅを含む培地に交換し、３７℃で１時間インキュベートした。
２．Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて蛍光値（Ｅｘ／Ｅｍ＝５６０ｎｍ／５９０ｎｍ）を測定した。
３．試薬のみのウェルから得られる蛍光値をバックグラウンドとして、細胞生存率を求めた。
【００７４】
上記の手順をそれぞれのがん細胞株（大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６（ｐ５３野生型およびｐ５３欠損）、膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ−３およびＣＦＰＡＣ−１、舌がん細胞株ＨＳＣ−４）について実施し、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐよりも有意に細胞増殖を抑制するｍｉＲＮＡを選別した。
【００７５】
すべての細胞株で共通してｍｉＲ−３４−５ｐよりも有意に細胞増殖を抑制したｍｉＲＮＡを選別した結果、４つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１３７−３ｐ，ｍｉＲ−６３１−５ｐ，ｍｉＲ−６５７−３ｐ，ｍｉＲ−３１４０−３ｐ）が見出された（図３）。
【００７６】
実験３．各種がん細胞株を用いた細胞増殖抑制効果の確認
【００７７】
（１）舌がん細胞株（ＨＳＣ−４，ＯＳＣ−１９）（図４）
【００７８】
舌がん細胞株（ＨＳＣ−４，ＯＳＣ−１９）へ４つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１３７−３ｐ，ｍｉＲ−６３１−５ｐ，ｍｉＲ−６５７−３ｐ，ｍｉＲ−３１４０−３ｐ）をトランスフェクションし、細胞の増殖を観察した。トランスフェクションは以下の手順で実施した。
【００７９】
１：３５ｍｍ  ｄｉｓｈに５００μＬの無血清培地（Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭ））および５μＬのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。
２：１の溶液に核酸（Ｃｏｎｔｒｏｌ，ｍｉＲ−１３７−３ｐ，ｍｉＲ−６３１−５ｐ，ｍｉＲ−６５７−３ｐ，ｍｉＲ−３１４０−３ｐ，４つのｍｉＲＮＡの等量混合物）をそれぞれ１μＬずつ加えた。（終濃度１０ｎＭ）
３：室温で２０分間インキュベートした。
４：６．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した細胞懸濁液を１．５ｍＬずつ３５ｍｍ  ｄｉｓｈに加えた。
５：３７℃，５％ＣＯ２条件下でインキュベートした。
６：トランスフェクション後５日後に細胞計数を行った。
【００８０】
図４に示すとおり、いずれの舌がん細胞株においても、４つのｍｉＲＮＡは細胞増殖抑制効果を示した。
【００８１】
（２）舌がん細胞株（ＳＡＳ）（図５）
【００８２】
舌がん細胞株（ＳＡＳ）へ４つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１３７−３ｐ，ｍｉＲ−６３１−５ｐ，ｍｉＲ−６５７−３ｐ，ｍｉＲ−３１４０−３ｐ）をトランスフェクションし、細胞の増殖を観察した。トランスフェクションは以下の手順で実施した。
【００８３】
１：３５ｍｍ  ｄｉｓｈに５００μＬの無血清培地（Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭ））および５μＬのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。
２：１の溶液にｍｉＲＮＡ溶液をそれぞれ４μＬずつ加えた（表３参照）。（終濃度１０ｎＭ）
３：室温で２０分間インキュベートした。
４：６．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した細胞懸濁液を１．５ｍＬずつ３５ｍｍｄｉｓｈに加えた。
５：３７℃，５％ＣＯ２条件下でインキュベートした。
６：トランスフェクション後２日後に再び１−３の操作を行った。
７：６により調製した溶液を５で培養中のｄｉｓｈにそれぞれ添加した。
８：最初のトランスフェクション後７日後に細胞計数を行った。
【００８４】
図５に示すとおり、４つのｍｉＲＮＡは、いずれも舌がん細胞株ＳＡＳに対して細胞増殖抑制効果を示した。
【００８５】
【表７】
2020055886.tif 000008
【００８６】
（３）悪性胸膜中皮腫細胞株、子宮肉腫細胞株、骨肉腫細胞株（図６〜９）
【００８７】
上記の４つのｍｉＲＮＡのうち、特に細胞増殖抑制効果が高かったｍｉＲ−３１４０−３ｐを悪性胸膜中皮腫細胞株（ＭＳＴＯ−２１１ＨおよびＥＨＭＥＳ−１０）、子宮肉腫細胞株（ＭＥＳ−ＳＡ）、骨肉腫細胞株（Ｕ２−ＯＳ）へそれぞれトランスフェクションし、細胞の増殖を観察した。比較対象として、先行研究において細胞増殖抑制効果が示されているｍｉＲ−２２−３ｐおよびｍｉＲ−３４ａ−５ｐを用いた。トランスフェクションは以下の手順で実施した。
【００８８】
１：３５ｍｍ  ｄｉｓｈに５００μＬの無血清培地（Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭ））および５μＬのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。
２：１の溶液にｍｉＲ−ＣｏｎｔｒｏｌまたはｍｉＲ−３１４０−３ｐ，ｍｉＲ−２２−３ｐ，ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ（ｓｔｏｃｋ  ｃｏｎｃ．  ２０μＭ）をそれぞれ１μＬ加えた。（終濃度１０ｎＭ）
３：室温で２０分間インキュベートした。
４：６．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した細胞懸濁液を１．５ｍＬずつ３５ｍｍｄｉｓｈに加えた。
５：３７℃，５％ＣＯ２条件下でインキュベートした。
６：トランスフェクション後４日後に細胞計数を行った。
【００８９】
図６〜９に示すとおり、いずれの細胞株においても、ｍｉＲ−３１４０−３ｐは、先行技術であるｍｉＲ−２２−３ｐおよびｍｉＲ−３４ａ−５ｐと比較して、極めて高い細胞増殖抑制効果を示した。
【００９０】
（４）乳がん幹細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞）（図１０）
【００９１】
ｍｉＲ−３１４０−３ｐを、乳がんの高転移がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞）へトランスフェクションし、細胞の増殖を観察した。比較対象として、先行研究において細胞増殖抑制効果が示されているｍｉＲ−２２−３ｐおよびｍｉＲ−３４ａ−５ｐを用いた。トランスフェクションは以下の手順で実施した。
【００９２】
１：３５ｍｍ  ｄｉｓｈに５００μＬの無血清培地（Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭ））および５μＬのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。
２：１の溶液にｍｉＲ−ＣｏｎｔｒｏｌまたはｍｉＲ−３１４０−３ｐ，ｍｉＲ−２２−３ｐ，ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ（ｓｔｏｃｋ  ｃｏｎｃ．  ２μＭ）をそれぞれ12.5μＬ加えた。（終濃度１２．５ｎＭ）
３：室温で２０分間インキュベートした。
４：６．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した細胞懸濁液を１．５ｍＬずつ３５ｍｍｄｉｓｈに加えた。
５：３７℃，５％ＣＯ２条件下でインキュベートした。
６：トランスフェクション後４日後に細胞計数を行った。
【００９３】
また、下記の手順により、ｍｉＲ−３１４０−３ｐをトランスフェクションした乳がん細胞におけるアポトーシスマーカーＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖの発現を解析した。
１：上記と同様の手順で、ｍｉＲ−３１４０−３ｐのトランスフェクションを行なった。
２：トランスフェクション６日後に細胞を上清ごと回収した。
３：Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔのプロトコルに従い、ＦＡＣＳ用サンプルを調製した。
４：Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣにより染色した細胞を、がん幹細胞マーカーであるＣＤ４４に対する抗体（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を用いて染色した。
５：調製したサンプルを、セルソーター（ＳＯＮＹ）を用いて解析した。
【００９４】
図１０の上段に示すとおり、ｍｉＲ−３１４０−３ｐは、乳がん幹細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞）に対して、極めて高い細胞増殖抑制効果を示した。
【００９５】
また、図１０の下段に示すとおり、ｍｉＲ−３１４０−３ｐをトランスフェクションして６日後の乳がん幹細胞においては、アポトーシスマーカーであるＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖが高度に陽性であった（９６．９７％）。すなわち、ｍｉＲ−３１４０−３ｐはがん幹細胞に対して顕著にアポトーシスを誘導することが示された。
【００９６】
（５）肺がん細胞株（Ａ５４９）（図１１）
【００９７】
ｍｉＲ−３１４０−３ｐを、肺がん細胞株（Ａ５４９）へトランスフェクションし、細胞の増殖を観察した。比較対象として、先行研究において細胞増殖抑制効果が示されているｍｉＲ−２２−３ｐおよびｍｉＲ−３４ａ−５ｐを用いた。トランスフェクションは以下の手順で実施した。
【００９８】
１：３５ｍｍ  ｄｉｓｈに５００μＬの無血清培地（Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭ））および５μＬのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。
２：１の溶液にｍｉＲ−ＣｏｎｔｒｏｌまたはｍｉＲ−３１４０−３ｐ，ｍｉＲ−２２−３ｐ，ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ（ｓｔｏｃｋ  ｃｏｎｃ．  ２０μＭ）をそれぞれ１μＬ加えた。（終濃度１０．０ｎＭ）
３：室温で２０分間インキュベートした。
４：６．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した細胞懸濁液を１．５ｍＬずつ３５ｍｍｄｉｓｈに加えた。
５：３７℃，５％ＣＯ２条件下でインキュベートした。
６：トランスフェクション後６日後に細胞計数を行った。
【００９９】
図１１に示すとおり、ｍｉＲ−３１４０−３ｐは肺がん細胞株（Ａ５４９）に対して極めて高い細胞増殖抑制効果を示した。
【０１００】
（６）大腸がん細胞株（ＳＷ６２０、ＳＷ４８０，ＨＴ２９）（図１２）
【０１０１】
ｍｉＲ−３１４０−３ｐを、大腸がん細胞株（ＳＷ６２０、ＳＷ４８０、ＨＴ２９）へトランスフェクションし、細胞の増殖を観察した。トランスフェクションは以下の手順で実施した。
【０１０２】
１：３５ｍｍ  ｄｉｓｈに５００μＬの無血清培地（Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭ））および５μＬのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。
２：１の溶液にｍｉＲ−ＣｏｎｔｒｏｌまたはｍｉＲ−３１４０−３ｐ，ｍｉＲ−２２−３ｐ，ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ（ｓｔｏｃｋ  ｃｏｎｃ．  ２μＭ）をそれぞれ１２．５μＬ加えた。（終濃度１０．０ｎＭ）
３：室温で２０分間インキュベートした。
４：６．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した細胞懸濁液を１．５ｍＬずつ３５ｍｍｄｉｓｈに加えた。
５：３７℃，５％ＣＯ２条件下でインキュベートした。
６：トランスフェクション後７日後に細胞計数を行った。
【０１０３】
結果を図１２に示した。コントロール導入細胞の細胞数１００％とし、ｍｉＲ−３１４０−３ｐを導入した細胞の生存率を％で表した。図１２に示すとおり、ｍｉＲ−３１４０−３ｐはいずれの大腸がん細胞株に対しても、極めて高い細胞増殖抑制効果を示した。
【０１０４】
実験４．本発明のｍｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果（悪性胸膜中皮腫細胞）（図１３）
【０１０５】
本発明のｍｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を確認するため、悪性胸膜中皮腫細胞を移植した実験動物を用いて実験を行った。
【０１０６】
（１）細胞調製
悪性胸膜中皮腫細胞ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞を使用した。
１：ディッシュ上の細胞をＰＢＳ（−）で２回ウォッシュした。
２：トリプシンを用いて細胞を剥がした。
３：培地で懸濁し、細胞計数を行った。
４：１０００ｒｐｍ  ３ｍｉｎの条件で遠心し、ペレットダウンした。
５：細胞を２．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようＰＢＳ（−）で再懸濁した。
【０１０７】
（２）マウスへの細胞移植
マウスは６週齢のＣ−Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ  Ｊｃｌ（ＳＣＩＤ  マウス）を使用した。ＳＣＩＤマウスの皮下に調製した細胞懸濁液１００μＬを投与し、細胞を定着させた。
【０１０８】
（３）ｍｉＲＮＡ投与
コントロール配列であるネガティブコントロールと、本発明のｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−３１４０−３ｐを用いた。核酸デリバリー試薬として、Ａ６Ｋ（３Ｄマトリックス社）を用いた。マウスへのｍｉＲＮＡの投与は以下の手順で実施した。
【０１０９】
１：１００μＭの核酸（ｍｉＲＮＡ）を７１．４μＭとなるように、１０％生理食塩水と滅菌水を用いて希釈した。
２：１％Ａ６Ｋ溶液を使用前に５分間超音波処理を行った。
３：希釈した核酸と１％Ａ６Ｋ溶液を１：１の割合で混合し、投与核酸とした。
４：ＳＣＩＤマウス皮下（腫瘍部）に投与核酸を５０μＬずつ投与した。
【０１１０】
（５）評価
以下の手順で実験結果の評価を行った。
１：移植後４日後から、１日または２日おきに核酸を投与した。
２：計１３回投与し、移植後３４日後をエンドポイントとした。
３：マウスを解剖し、皮下にある腫瘍を摘出し、その重量を測定した。
【０１１１】
実験結果を図１３に示す（ｎ＝３）。図１３に示すとおり、腫瘍部にｍｉＲ−３１４０−３ｐを導入したマウスにおいては、コントロール群と比較して腫瘍の重量が有意に低かった。
【０１１２】
実験５．本発明のｍｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果（悪性胸膜中皮腫細胞）（図１４〜１６）
【０１１３】
（１）細胞調製
悪性胸膜中皮腫細胞ＥＨＭＥＳ−１０細胞を使用した。
１：ディッシュ上の細胞をＰＢＳ（−）で２回ウォッシュした。
２：トリプシンを用いて細胞を剥がした。
３：培地で懸濁し、細胞計数を行った。
４：１０００ｒｐｍ  ３ｍｉｎの条件で遠心し、ペレットダウンした。
５：細胞を２．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようＰＢＳ（−）で再懸濁した。
【０１１４】
（２）マウスへの細胞移植
マウスは６週齢のＣ−Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ  Ｊｃｌ（ＳＣＩＤ  マウス）を使用した。ＳＣＩＤマウスの皮下に調製した細胞懸濁液１００μＬを投与し、細胞を定着させた。
【０１１５】
（３）ｍｉＲＮＡ投与
コントロール配列であるネガティブコントロールと、本発明のｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−３１４０−３ｐを用いた。核酸デリバリー試薬として、Ａ６Ｋ（３Ｄマトリックス社）を用いた。マウスへのｍｉＲＮＡの投与は以下の手順で実施した。
【０１１６】
１：１００μＭの核酸（ｍｉＲＮＡ）を７１．４μＭとなるように、１０％生理食塩水と滅菌水を用いて希釈した。
２：１％Ａ６Ｋ溶液を使用前に５分間超音波処理を行った。
３：希釈した核酸と１％Ａ６Ｋ溶液を１：１の割合で混合し、投与核酸とした。
４：ＳＣＩＤマウス皮下（腫瘍部）に投与核酸を５０μＬずつ投与した。
【０１１７】
（５）評価
以下の手順で実験結果の評価を行った。
１：移植後２日後から、１日または２日おきに核酸を投与した。
２：計１３回投与し、移植後３３日後をエンドポイントとした。
３：移植後１２、１９、２６、３３日後にルシフェリンを腹腔内に投与し、イメージングを行うことで腫瘍の大きさをトレースした。
４：エンドポイントでマウスを解剖し、皮下にある腫瘍を摘出し、その重量を測定した。
【０１１８】
腫瘍細胞移植後１２、１９、２６、３３日後における腫瘍組織のイメージング解析結果を図１４および図１５に示す。図１４および図１５に示すとおり、腫瘍部にｍｉＲ−３１４０−３ｐを導入したマウスにおいては、コントロール群と比較して腫瘍の増大が抑制されていた。また、エンドポイントにおける腫瘍の重量を比較した図１６においても、同様の結果が示された。
【０１１９】
実験６．本発明のｍｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果（舌がん細胞）（図１７、１８）
【０１２０】
（１）細胞調製
舌がん細胞株ＨＳＣ−４細胞を使用した。
１：ディッシュ上の細胞をＰＢＳ（−）で２回ウォッシュした。
２：トリプシンを用いて細胞を剥がした。
３：培地で懸濁し、細胞計数を行った。
４：１０００ｒｐｍ  ３ｍｉｎの条件で遠心し、ペレットダウンした。
５：細胞を２．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようＰＢＳ（−）で再懸濁した。
【０１２１】
（２）マウスへの細胞移植
マウスは６週齢のＣ−Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ  Ｊｃｌ（ＳＣＩＤ  マウス）を使用した。ＳＣＩＤマウスの皮下に調製した細胞懸濁液１００μＬを投与し、細胞を定着させた。
【０１２２】
（３）ｍｉＲＮＡ投与
コントロール配列であるネガティブコントロールと、本発明のｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−３１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−６３１およびｍｉＲ−６５７を用いた。核酸デリバリー試薬として、Ａ６Ｋ（３Ｄマトリックス社）を用いた。マウスへのｍｉＲＮＡの投与は以下の手順で実施した。
【０１２３】
１：１００μＭの核酸（ｍｉＲＮＡ）を７１．４μＭとなるように、１０％生理食塩水と滅菌水を用いて希釈した。
２：１％Ａ６Ｋ溶液を使用前に５分間超音波処理を行った。
３：希釈した核酸と１％Ａ６Ｋ溶液を１：１の割合で混合し、投与核酸とした。
４：ＳＣＩＤマウス皮下（腫瘍部）に投与核酸を５０μＬずつ投与した。
【０１２４】
（５）評価
以下の手順で実験結果の評価を行った。
１：移植後３日後から、１日または２日おきに核酸を投与した。
２：計１１回投与し、移植後２８日後をエンドポイントとした。
３：移植後７、１４、２１、２８日後にルシフェリンを腹腔内に投与し、イメージングを行うことで腫瘍の大きさをトレースした。
４：エンドポイントでマウスを解剖し、皮下にある腫瘍を摘出し、その重量を測定した。
【０１２５】
腫瘍細胞移植後における腫瘍組織のイメージング解析結果を図１７に示す。図１７に示すとおり、腫瘍部に本発明のｍｉＲＮＡを導入したマウスにおいては、コントロール群と比較して腫瘍の増大が抑制されていた。また、エンドポイントにおける腫瘍の重量を比較した図１８においても、同様の結果が示された。
【０１２６】
以上の結果から、本発明のｍｉＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても極めて高い抗腫瘍効果を奏することが示された。
【０１２７】
実験７．本発明のｍｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果（悪性胸膜中皮腫細胞）（図１９〜２８）
【０１２８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｍｉＲ−３１４０−３ｐの腫瘍抑制効果を、胸腔内同所移植モデルマウスを用いて検討した。
【０１２９】
マウスは、６週齢のオスのマウス（Ｃ−Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄＪｃｌ）を使用した。腫瘍細胞は、ルシフェラーゼ遺伝子を発現する悪性胸膜中皮腫細胞株ＥＨＭＥＳ−１０を使用した。
【０１３０】
以下に実験の手順を示す。
１：マウス腹腔内に体重１０ｇあたり０．１ｍＬの塩酸メデトミジン、ミダゾラム、酒石酸ブトルファノールの混合麻酔薬を投与した。
２：麻酔後マウス胸部の毛を剃り、ハサミで表皮を切開した。
３：マウス胸腔内に２７Ｇのインスリン用シリンジを用いて、腫瘍細胞（３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を１００μＬ移植した。
４：移植後３日後、ＩＶＩＳ  ＳｐｅｃｔｒｕｍＣＴ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、腫瘍細胞のイメージングを行なった。
５：イメージング後、移植に成功したマウスを用いて、群分けを行なった。
６：マウス腹腔内に体重１０ｇあたり０．１ｍＬの塩酸メデトミジン、ミダゾラム、酒石酸ブトルファノールの混合麻酔薬を投与し、マウスを麻酔した。
７：麻酔後、マウス胸腔内にｍｉＲＮＡ／Ａ６Ｋ混合物を１００μＬ投与した。
８：最初のイメージングから１週間おきにイメージングを行い、腫瘍増大を観察した。
９：マウスの死亡日時を記録し、マウス生存率を算出した。
【０１３１】
投与およびイメージングのスケジュールを図１９に示した。塩酸メデトミジン、ミダゾラム、酒石酸ブトルファノールの混合麻酔薬は下記表４のように調製した。ｍｉＲＮＡ／Ａ６Ｋ混合物は表５のように調製した。また、コントロール群においては、本発明のｍｉＲＮＡのかわりに、表６に示すＲＮＡを投与した。
【０１３２】
なお、発現効率を向上させるため、ｍｉＲＮＡは、一部ミスマッチを含む相補鎖と組み合わせた二本鎖として投与した。
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【０１３３】
実験結果を図２０〜図２８に示す。
【０１３４】
ｍｉＲ−３１４０−３ｐを１回投与した群では２回目のイメージング（移植後１０日目）には腫瘍の縮小が見られ、４回目のイメージング（移植後２４日目）までその効果が持続していた（図２０）。
【０１３５】
イメージング結果を数値化し、グラフにしたところ、ｍｉＲ−３１４０−３ｐは有意に腫瘍増大を抑制することが示された（図２１）。
【０１３６】
マウスの生存率を比較したところ、ｍｉＲ−３１４０−３ｐ投与群でマウスの生存率が向上していることが観察された（図２２）。
【０１３７】
ｍｉＲ−３１４０−３ｐを２回および３回投与した群においても、１回投与した群と同様に、ｍｉＲ−３１４０−３ｐが有意に悪性胸膜中皮腫を抑制することが示された（図２３〜２８）。
【０１３８】
マウスの生存率は、３回ｍｉＲ−３１４０−３ｐを投与した群で、より向上した（図２８）。
【０１３９】
実験８．ＩＣ５０値の算出（図２９）
【０１４０】
悪性胸膜中皮腫細胞ＥＨＭＥＳ−１０を用いてｍｉＲ−３１４０−３ｐのＩＣ５０値の算出を行なった。
【０１４１】
以下にその手順を示す。
１：２５μＬの無血清培地（Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭ））に対し０．２５μＬのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。
２：ｍｉＲ−ＣｏｎｔｒｏｌおよびｍｉＲ−３１４０−３ｐを終濃度が４０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、１ｐＭとなるように段階希釈し、ＳＦＭ／ＲＮＡｉＭＡＸ複合体と混合した。
３：室温で２０分間インキュベートした。
４：６．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞を７５μＬずつ各ｗｅｌｌに加えた。
５：３７℃、５％ＣＯ２条件下でインキュベートした。
６：トランスフェクション後５日後にＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  ８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて細胞の生存率を検討した。以下にその手順を示す
（ｉ）Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  を培地で１０倍希釈した。
（ｉｉ）各ｗｅｌｌに２００μＬずつ希釈したＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔを添加した。
（ｉｉｉ）３７℃、５％ＣＯ２条件下で１時間インキュベートした。
（ｉｖ）プレートリーダーを用いて４５０ｎｍ／６００ｎｍの値を測定した。
【０１４２】
なお、コントロールとしては、実験７で使用したものと同じコントロールＲＮＡを用いた。
【０１４３】
結果を図２９に示す。図２９に示すとおり、ｍｉＲ−３１４０−３ｐは悪性胸膜中皮腫細胞株ＥＨＭＥＳ−１０に対して、非常に低い濃度でも増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。ＩＣ５０値を算出したところ、終濃度０．５７ｎＭであった。
【０１４４】
実験９．化学療法剤との抗腫瘍効果の比較（図３０〜３３）
【０１４５】
ｍｉＲ−３１４０−３ｐの抗腫瘍効果の相対的な優位性を検討するため、悪性胸膜中皮腫の第一選択薬であるシスプラチンの腫瘍抑制効果とｍｉＲ−３１４０−３ｐの腫瘍抑制効果をｉｎ  ｖｉｖｏにて比較した。
【０１４６】
マウスは、６週齢のオスのマウス（Ｃ−Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄＪｃｌ）を使用した。腫瘍細胞は、ルシフェラーゼ遺伝子を発現する悪性胸膜中皮腫細胞株  ＥＨＭＥＳ−１０を使用した。
【０１４７】
以下に手順を示す。
１：マウス腹腔内に体重１０ｇあたり０．１ｍＬの塩酸メデトミジン、ミダゾラム、酒石酸ブトルファノールの混合麻酔薬を投与した。
２：麻酔後マウス胸部の毛を剃り、ハサミで表皮を切開した。
３：マウス胸腔内に２７Ｇのインスリン用シリンジを用いて、腫瘍細胞（３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を１００μＬ移植した。
４：移植後４日後にＩＶＩＳ  ＳｐｅｃｔｒｕｍＣＴ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて腫瘍細胞のイメージングを行なった。
５：イメージング後、移植に成功したマウスを用いて、群分けを行なった。
６：マウス腹腔内に体重１０ｇあたり０．１ｍＬの塩酸メデトミジン、ミダゾラム、酒石酸ブトルファノールの混合麻酔薬を投与し、マウスを麻酔した。
７：麻酔後、ｍｉＲＮＡ投与群にはｍｉＲＮＡ／Ａ６Ｋ混合物を胸腔内に１００μＬ、シスプラチン投与群にはシスプラチン（６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与した。
８：最初のイメージングから１週間おきにイメージングを行い、腫瘍増大を観察した。
【０１４８】
混合麻酔薬は前掲の表４のように調製した。ｍｉＲＮＡ／Ａ６Ｋ混合物は前掲の表５、表６のように調製した。シスプラチンは以下の表７のように調製した。
【表１１】
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【０１４９】
なお、コントロールとしては、実験７で使用したものと同じコントロールＲＮＡを用いた。
【０１５０】
実験結果を図３０〜３３に示す。各図に示すとおり、ｍｉＲ−３１４０−３ｐは、悪性胸膜中皮腫の第一選択薬でもあるシスプラチンと比較して、同等あるいはそれ以上の抗腫瘍効果を奏し得ることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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