(57)【要約】      （修正有）【課題】イオン交換ポリマーを含む、耐塩性特性及びタンパク質に対する高い動的結合容量を有するアニオン交換媒体、たとえばアニオン交換多孔質媒体、たとえばビーズ、繊維及び膜を提供する。【解決手段】多孔質担体及び多孔質担体上に配置された架橋カチオン性ポリマーコーティングを含むアニオン交換多孔質媒体であって、架橋カチオン性ポリマーコーティングのカチオン性ポリマーが重合モノマー（Ａ）及び重合モノマー（Ｂ）を含み、モノマー（Ａ）が式：ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ１）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ’Ｒ２Ｒ３〔式中、ｎは１〜６である〕を有し、モノマー（Ｂ）が式：ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ４）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ５Ｒ６を有する構造とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質担体及び多孔質担体上に配置された架橋カチオン性ポリマーコーティングを含むアニオン交換多孔質媒体であって、
架橋カチオン性ポリマーコーティングのカチオン性ポリマーが重合モノマー（Ａ）及び重合モノマー（Ｂ）を含み、
モノマー（Ａ）が式：
ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ１）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ’Ｒ２Ｒ３
〔式中、ｎは１〜６である〕
を有し、
モノマー（Ｂ）が式：
ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ４）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ５Ｒ６
を有する
〔これらの式中、Ｒ１及びＲ４は独立にＨ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は独立にＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ１〜ＣアルコキシＣ１〜Ｃアルキル、又はトリフェニルメチルである〕、
アニオン交換多孔質媒体。
【請求項２】
Ｒ１がＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ４がＨである、請求項１に記載のアニオン交換多孔質媒体。
【請求項３】
Ｒ１がメチルである、請求項１又は２に記載のアニオン交換多孔質媒体。
【請求項４】
Ｒ２及びＲ３がＨであり、Ｒ５及びＲ６が独立にＣ１〜Ｃ６アルキルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアニオン交換多孔質媒体。
【請求項５】
Ｒ２及びＲ３がＨであり、Ｒ５及びＲ６がメチルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアニオン交換多孔質媒体。
【請求項６】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６が独立にＨ、メチル、フェニル、メトキシメチル又はトリフェニルメチルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアニオン交換多孔質媒体。
【請求項７】
Ｒ２及びＲ３がＨであり、Ｒ５及びＲ６が独立にメチル、フェニル、メトキシメチル又はトリフェニルメチルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアニオン交換多孔質媒体。
【請求項８】
架橋カチオン性ポリマーが２種の異なる重合モノマー（Ａ）及び１種の重合モノマー（Ｂ）を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアニオン交換多孔質媒体。
【請求項９】
架橋カチオン性ポリマーが２種の異なる重合モノマー（Ａ）及び２種の異なる重合モノマー（Ｂ）を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアニオン交換多孔質媒体。
【請求項１０】
架橋カチオン性ポリマーが１種の重合モノマー（Ａ）及び２種の異なる重合モノマー（Ｂ）を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアニオン交換多孔質媒体。
【請求項１１】
膜である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアニオン交換多孔質媒体。
【請求項１２】
アニオン交換多孔質媒体を生産する方法であって、
（ｉ）  少なくとも１種のモノマー（Ａ）及び少なくとも１種のモノマー（Ｂ）を含むモノマー混合物を重合させて、コポリマーを得るステップであり、
モノマー（Ａ）が式：
ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ１）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ２Ｒ３
〔式中、ｎは１〜６である〕
を有し、
モノマー（Ｂ）が式：
ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ４）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ５Ｒ６
を有する
〔これらの式中、Ｒ１及びＲ４は独立にＨ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は独立にＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ１〜ＣアルコキシＣ１〜Ｃアルキル、又はトリフェニルメチルである〕、
ステップ、
（ｉｉ）  （ｉ）で得たコポリマーの溶液及び架橋剤を多孔質担体にコーティングし、架橋させて多孔質担体に配置された架橋コーティングを得るステップ、並びに
（ｉｉｉ）  （ｉｉ）で得たコポリマーコーティングに存在するアミノ基の少なくとも一部分を、イソプロピルグリシジルエーテル、フェニルグリシジルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルグリシジルエーテル、エチルヘキシルグリシジルエーテル、グリシジルメチルエーテル又はベンジルグリシジルエーテルから選択される四級化剤と反応させることにより、四級化するステップ
を含む、方法。
【請求項１３】
架橋剤が、エチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、グリセリルトリグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、グリコールジエステル、ジアルデヒド、ジハライド、ジアシルクロリド、ジスルホニルクロリド及びその任意の組合せから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
所望のタンパク質及び１種又は複数の負荷電化学種を含む流体を処理する方法であって、流体を請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアニオン交換多孔質媒体と接触させるステップ、及び所望のタンパク質を、濃度が低下した１種又は複数の負荷電化学種で回収するステップを含む、方法。
【請求項１５】
流体が、流体が３０ｍＳ／ｃｍまでの導電率を示すような塩含有率を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
所望のタンパク質が抗体である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
所望のタンパク質が生物学的製剤である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
[0001]モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生産及びその精製には、この方法が高コストであることにより、問題が生じ続けている。高コストに寄与しているのは、単離中に生体分子が経る必要があるいくつかの精製工程である。たとえば、精製工程のうちの１つは、高い選択性で、また薬物分子の活性領域であるＦａｂ領域とは最小の相互作用で、ブドウ球菌タンパク質Ａがサブクラス１、２及び４のＩｇＧ分子と結合する、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーである。バイオテクノロジー市場が急速に成長するにしたがい、生物学的製剤を適時な空間に、コストを抑えて市場へ送り出すに当たり、これらの精製工程における改良がより望ましく、より重要になりつつある。
【０００２】
[0002]タンパク質精製中、アニオン交換媒体を使用する最終精製工程には、媒体が不純物に選択的であるだけでなく、塩導電率が高く、たとえば１５ｍＳ／ｃｍまで又はそれ以上の原料に耐えることも必要である。
【０００３】
[0003]上記には、不純物に選択的であるだけでなく、塩導電率が高い原料にも耐えるアニオン交換媒体に、満たされていないニーズの存在することが示されている。
【発明の簡単な概要】
【０００４】
[0004]本発明は、イオン交換ポリマーを含む、アニオン交換媒体、たとえばアニオン交換多孔質媒体、たとえばビーズ、繊維及び膜を提供する。このアニオン交換媒体は、耐塩性特性及びタンパク質に対する高い動的結合容量（ＤＢＣ）を有し、たとえば、流速１０ＣＶ／分でのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対するＤＢＣが最大で３００ｍｇ／ｍＬである。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】本発明の一実施形態による多孔質媒体の調製を図式的に示す図である。
【図２】本発明の別の実施形態による多孔質媒体の調製を図式的に示す図である。
【図３】ポリ（Ｎ−３−アミノプロピルメタクリルアミド−ｃｏ−ジメチルアクリルアミド）のＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４】本発明の一実施形態による、ポリ（Ｎ−３−アミノプロピルメタクリルアミド−ｃｏ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）試料の注入から得られる三重検出溶出プロファイルを示す図であり、図中、１は屈折率（ＲＩ）を示し、２は粘度を示し、３は相対角度レーザー光散乱（ＲＡＬＳ）データを示し、４はｌｏｇＭＷを示す。
【図５】本発明の一実施形態による、ポリ（Ｎ−３−アミノプロピルメタクリルアミド−ｃｏ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）試料の注入から得られる、ＭＷ分布プロットの重ね合わせを示す図であり、図中、１は正規化重量分率（ＷＦ／ｄｌｏｇＭＷ）を示し、２は累積重量分率を示し、３はマルク−ホウインク−桜田プロット（ｌｏｇ（〔η〕）対ｌｏｇ（Ｍ））を示す。
【図６】本発明の実施例１の一実施形態により、ポリ（Ｎ−３−アミノプロピルメタクリルアミド−ｃｏ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）から製造され、架橋されて第一級アミノ基を含有するようにされた多孔質媒体の、様々な塩濃度での１０％ブレークスルーでのＢＳＡに対するＤＢＣを示す図である。
【図７】本発明の実施例８及び９の別の実施形態により、ポリ（ジメチルアミノプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ジメチルアクリルアミド）から製造され、架橋されて第三級アミン基を含有するようにされ、次いでフェニルグリシジルエーテルで四級化された多孔質媒体の、様々な塩濃度での１０％ブレークスルーでのＢＳＡに対するＤＢＣを示す図である。
【図８】図６（黒塗り棒グラフ）に例示した媒体の１０％ブレークスルーでのＢＳＡに対するＤＢＣとＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ  ＰＡ膜のブレークスルー性能（灰色棒グラフ）との関係を示す図である。
【図９】実施例８及び９の本発明の一実施形態による、媒体の１０％ブレークスルーでのＢＳＡに対するＤＢＣ（黒塗り棒グラフ）と市販のＮａｔｒｉＦｌｏ  ＨＤ−Ｑ膜（灰色棒グラフ及び斜線入り棒グラフ）との関係を示す図である。
【発明の詳細な説明】
【０００６】
[0014]本発明は、多孔質担体及び多孔質担体上に配置された架橋カチオン性ポリマーコーティングを含む、アニオン交換多孔質媒体、たとえば膜、であって、
架橋カチオン性ポリマーコーティングのカチオン性ポリマーが重合モノマー（Ａ）及び重合モノマー（Ｂ）を含み、
モノマー（Ａ）が式：
ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ１）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ’Ｒ２Ｒ３
〔式中、ｎは１〜６である〕
を有し、モノマー（Ｂ）が式：ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ４）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ５Ｒ６を有する
〔これらの式中、
Ｒ１及びＲ４は独立にＨ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は独立にＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ１〜ＣアルコキシＣ１〜Ｃアルキル、又はトリフェニルメチルである〕、
アニオン交換多孔質媒体を提供する。
【０００７】
[0015]一実施形態では、多孔質媒体はビーズ又は繊維又は多孔質膜である。
【０００８】
[0016]媒体の一実施形態では、Ｒ１はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ４はＨである。
【０００９】
[0017]本願を通じてＣ１〜Ｃ６アルキル基は１個、２個、３個、４個、５個又は６個の炭素原子を有することができ、そのアルキル基は直鎖又は分枝であることができる。アルキル基の例にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、２−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、２−メチルペンチル及び３−メチルペンチルが含まれる。
【００１０】
[0018]本発明の一実施形態では、Ｒ１はメチルである。
【００１１】
[0019]上記の実施形態のうちのいずれについても、Ｒ２及びＲ３はＨであり、Ｒ５及びＲ６は独立にＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【００１２】
[0020]上記の実施形態のうちのいずれについても、Ｒ２及びＲ３はＨであり、Ｒ５及びＲ６はメチルである。
【００１３】
[0021]上記の実施形態のうちのいずれについても、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は独立にＨ、メチル、フェニル、メトキシメチル、又はトリフェニルメチルである。
【００１４】
[0022]上記の実施形態のうちのいずれについても、Ｒ２及びＲ３はＨであり、Ｒ５及びＲ６は独立にメチル、フェニル、メトキシメチル、又はトリフェニルメチルである。
【００１５】
[0023]一実施形態では、架橋カチオン性ポリマーは２種の異なる重合モノマー（Ａ）及び１種の重合モノマー（Ｂ）を含む。
【００１６】
[0024]一実施形態では、架橋カチオン性ポリマーは２種の異なる重合モノマー（Ａ）及び２種の異なる重合モノマー（Ｂ）を含む。
【００１７】
[0025]一実施形態では、架橋カチオン性ポリマーは１種の重合モノマー（Ａ）及び２種の異なる重合モノマー（Ｂ）を含む。
【００１８】
[0026]ポリマーを構成するモノマーの組合せの例には、以下：
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド及びアクリルアミド、
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド及びＮ−イソプロピルアクリルアミド、
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド及びｔｅｒｔブチルアクリルアミド、
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド及びエチルアクリルアミド、
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド及びフェニルアクリルアミド、
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド及びＮ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド及びＮ−（イソブトキシメチル）アクリルアミド、
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド及びＮ−（トリフェニルメチル）アクリルアミド、
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド及びＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、
Ｎ−（２−アミノエチル）メタクリルアミド及びＮ−イソプロピルアクリルアミド、
Ｎ−（２−アミノエチル）メタクリルアミド及びｔｅｒｔブチルアクリルアミド、
Ｎ−（２−アミノエチル）メタクリルアミド及びフェニルアクリルアミド、
Ｎ−（２−アミノエチル）メタクリルアミド及びＮ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、
Ｎ−（２−アミノエチル）メタクリルアミド及びエチルアクリルアミド、
Ｎ−（２−アミノエチル）メタクリルアミド及びＮ−（イソブトキシメチル）メタクリルアミド、
Ｎ−（２−アミノエチル）メタクリルアミド及びＮ−（トリフェニルメチル）アクリルアミド、並びに
Ｎ−（２−アミノエチル）メタクリルアミド及びＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド
が含まれる。
【００１９】
[0027]本発明は、実施形態中で、以下のポリマーのうちの１つ又は複数を提供する：
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド及びＮ−ジメチルアクリルアミドを含むコポリマーであって、このコポリマーの第一級アミン部分を使用して膜に架橋される、コポリマー。
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド及びＮ−ジメチルアクリルアミドを含むコポリマーであり、このコポリマーの第一級アミン部分を使用して、膜、たとえば、セルロースビーズ、アガロースビーズ又は繊維媒体にカップリングされるコポリマーであって、この媒体のうちのいずれも多孔質又は非多孔質であることができる、コポリマー。
アミノアルキルメタクリルアミド及びＮ−ジメチルアクリルアミドを含むコポリマーであって、このコポリマーの第一級アミン部分を使用して膜に架橋される、コポリマー。
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド、Ｎ−ジメチルアクリルアミド及びアルキルアクリルアミド、たとえば、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−フェニルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルメタクリルアミド、Ｎ−（イソブトキシメチル）メタクリルアミド及びＮ−（トリフェニルメチル）メタクリルアミドを含むターポリマーであって、コポリマーの第一級アミン部分を使用して膜に架橋される、ターポリマー。
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド、Ｎ−ジメチルアクリルアミド及びアルキルアクリルアミド、たとえば、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−フェニルアクリルアミド、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルメタクリルアミド、Ｎ−（イソブトキシメチル）メタクリルアミド及びＮ−（トリフェニルメチル）メタクリルアミドを含むターポリマーであって、このターポリマーの第三級及び第一級アミン部分を使用して膜に架橋される、ターポリマー。
【００２０】
[0028]本発明は、たとえば、抗体の最終精製、ＢＳＡクリアランス、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）クリアランス、ＤＮＡクリアランス及びウイルスベクター精製に有利に使用することができる、耐塩性アニオン交換多孔質媒体、たとえば多孔質膜を提供する。
【００２１】
[0029]本発明は、多孔質担体にコーティングしたコポリマー又はターポリマーの耐塩性特性が、ポリマーのアミノアルキルアクリルアミド部分により有利に付与される、耐塩性アニオン交換多孔質媒体、たとえば膜を提供する。
【００２２】
[0030]本発明は、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド及びＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドを含むコポリマーを提供する。
【００２３】
[0031]本発明は、第三級アミン部分を介して媒体に架橋される、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミドとＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとのコポリマーを提供する。
【００２４】
[0032]本発明は、第三級アミン部分を介して媒体に部分的に架橋されて第四級アンモニウム基を形成する、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミドとＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとのコポリマーを提供する。
【００２５】
[0033]本発明は、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミドとＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとのコポリマーでコーティングした多孔質媒体を提供する。
【００２６】
[0034]本発明は、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミドとＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとのコポリマーでコーティングし、以下のエポキシド：イソプロピルグリシジルエーテル、フェニルグリシジルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルグリシジルエーテル、エチルヘキシルグリシジルエーテル、グリシジルメチルエーテル、ベンジルグリシジルエーテル、アルカンエポキシド、又は芳香族エポキシドのうちのいずれかでさらに四級化された多孔質媒体を提供する。
【００２７】
[0035]コポリマーの分子量は任意の適切な範囲、たとえば、１０〜５００ｋＤ、１０〜３００ｋＤ、１０〜１００ｋＤ、又は２０〜１００ｋＤ、好ましくは２０ｋＤ〜５０ｋＤであることができ、分子量は三重検出ＧＰＣにより判定される。
【００２８】
[0036]コモノマーＡとコモノマーＢとは任意の適切なモル比、たとえば、それぞれ１対１０〜１０：１、１：５〜５：１、又は１：３〜３：１であることができる。たとえば、コモノマーＡ及びＢ、特にＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド及びＮ−ジメチルアクリルアミドを使用して、膜に架橋されるポリマーを形成する場合、特にクロマトグラフィー適用の際、耐塩性を向上させるためには、モノマー組合せの範囲は、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド：Ｎ−ジメチルアクリルアミドのモル比１：５〜モル比５：１である。任意のアミノアルキルメタクリルアミド及びＮ−ジメチルアクリルアミドのコモノマーを使用して、膜に架橋されるポリマーを形成する場合、クロマトグラフィー適用の際、耐塩性に影響を与えるモノマー組合せの範囲はＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド：Ｎ−ジメチルアクリルアミドのモル比１：５〜モル比５：１を含む。
【００２９】
[0037]Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド、Ｎ−ジメチルアクリルアミド及び任意のアルキルアクリルアミドたとえば、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−フェニルアクリルアミド、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ジエチルメタクリルアミド、Ｎ−（イソブトキシメチル）メタクリルアミド及びＮ−（トリフェニルメチル）メタクリルアミドを含むターモノマーを使用して、膜に架橋コーティングを形成する場合、クロマトグラフィー適用の際、耐塩性に影響を与えながら、なおもタンパク質の効率的な回収ができるモノマー組合せの範囲は、モル比１：４．７５：０．２５〜モル比２：１：１である。
【００３０】
[0038]Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドとＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとのコポリマーを使用して、タンパク質精製のための、膜に架橋されるポリマーを形成する場合、高い耐塩性を付与しながら、同時に最大でＢＳＡに対し３００ｍｇ／ｍＬの高い動的結合容量を提供するポリマー濃度の範囲は、１％〜１０％である。
【００３１】
[0039]実施形態では、最適なゲルネットワークが得られるＮ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミドのコポリマーとＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドのコポリマーとの比は、５：１〜１：５である。
【００３２】
[0040]本発明は、耐塩性正荷電媒体（たとえば、多孔質膜）を生産する方法であって、
（ｉ）  少なくとも１種のモノマー（Ａ）及び少なくとも１種のモノマー（Ｂ）を含むモノマー混合物を重合させてコポリマーを得るステップであり、
モノマー（Ａ）が式：
ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ１）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ２Ｒ３
〔式中、ｎは１〜６である〕
を有し、
モノマー（Ｂ）が式：
ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ４）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ５Ｒ６
を有する
〔これらの式中、Ｒ１及びＲ４は独立にＨ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は独立にＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ１〜ＣアルコキシＣ１〜Ｃアルキル又はトリフェニルメチルである〕、
ステップ、
（ｉｉ）  （ｉ）で得たコポリマーの溶液及び架橋剤を多孔質担体にコーティングして多孔質担体上に架橋コポリマーコーティングを得るステップ、並びに
（ｉｉｉ）  （ｉｉｉ）で得たコポリマーコーティングに存在するアミノ基の少なくとも一部分を、四級化剤と反応させることにより、四級化するステップ
を含む、方法をさらに提供する。
【００３３】
[0041]モノマーの重合は適切な開始剤−遊離基、カチオン性、又はアニオン性開始剤、特に遊離基開始剤、たとえば、アゾ化合物、過硫酸塩、過酸化物、過酸、過酢酸及び有機金属等の熱活性化遊離基開始剤を使用して実施することができる。遊離基開始剤の例には、ＡＩＢＮ、４，４−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、過酸化ベンゾイル、２，２−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）ブタン、１，１−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）シクロヘキサン、ジクミルペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシベンゾエート、ｔｅｒｔ−アミルペルオキシベンゾエート及び過硫酸カリウムが含まれる。
【００３４】
[0042]実施形態によれば、コーティング溶液は多孔質担体媒体、たとえば多孔質担体膜にスピンコーティングすることができ、多孔質膜にドリップコーティングすることができ、多孔質担体膜にスプレーコーティングすることができ、多孔質担体膜にスロットダイコーティング又はディップコーティングすることができる。
【００３５】
[0043]ポリマーの好ましい実施形態は、ポリ（ジメチルアクリルアミド−ｃｏ−ポリアクリルアミドプロピルアミン）、ポリ（アクリルアミド−ｃｏ−ポリアクリルアミドプロピルアミン）、ポリ（ジメチルアクリルアミド−ｃｏ−アミノプロピルメタクリルアミド）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド、カチオン性プロピルアクリルアミド及びポリ（アミノプロピルメタクリルアミド）を含む。
【００３６】
[0044]上記の方法の一実施形態では、架橋剤は多官能剤であり、すなわち、エポキシド、アルデヒド、ハロゲン化物及びエステルから選択される、２つ、３つ又はそれ以上の基を含み、架橋剤は、たとえば、エチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、グリセリルトリグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、グリコールジメシレートエステル又はグリコールポリメシレートエステル、たとえば、エチレングリコールジメシレートエステル、プロピレングリコールジメシレートエステル及びグリセリントリメシレートエステル、グリコールジトシレートエステル又はグリコールトリトシレートエステル、たとえば、エチレングリコールジトシレートエステル、プロピレングリコールジトシレートエステル及びグリセリントリトシレートエステル、グリコールジクロリド又はグリコールトリクロリド、たとえば、エチレングリコールジクロリド、プロピレングリコールジクロリド及びグリセリントリクロリド及びその任意の組合せから選択される。
【００３７】
[0045]本発明は、実施形態において、多孔質高密度ポリエチレン膜、ポリエーテルスルホン膜、ポリフッ化ビニリデン膜、ポリテトラフルオロエチレン膜、ポリフェニルスルホン膜、硫化ポリフェニレン膜、ポリエチレン及びポリプロピレン膜、ポリエステル膜、メルトブローンポリエステル膜、メルトブローンポリプロピレン膜、セルロース膜、ナイロン膜及びポリ塩化ビニル／アクリロニトリル上のジエポキシドでコーティングされ、架橋されたＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド−ｃｏ−アミノプロピルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド−ｃｏ−アミノプロピルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド−ｃｏ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）を提供する。
【００３８】
[0046]本発明は、所望のタンパク質及び１種又は複数の負荷電化学種を含有する流体を処理する方法であって、流体を上記のような正荷電媒体又は膜と接触させるステップ及び所望のタンパク質を濃度が低下した１種又は複数の負荷電化学種により回収するステップを含む、方法をさらに提供する。
【００３９】
[0047]アニオン交換膜を高温に長期間、たとえばコーティング後＞８０℃の温度で２０分間よりも長くさらすことは避けるべきである。
【００４０】
[0048]一実施形態では、上記で処理した流体は、流体が３０ｍＳ／ｃｍまで又はそれ以上の導電率を示すような塩含有率を有する。
【００４１】
[0049]本発明は、１５０ｍｍｏｌまでの塩化ナトリウムの塩濃度で高い動的結合容量、２００ＬＭＨまでの速い流水速度、１ＭのＮａＯＨに対する高安定性の利点を有し、１ＭのＮａＯＨによる洗浄により、５０回まで再利用することができる。
【００４２】
[0050]上記の方法の一実施形態では、所望のタンパク質はモノクローナル抗体である。本方法の別の実施形態では、所望のタンパク質は生物学的製剤である。
【００４３】
[0051]本発明の好ましい使用はｍＡｂ及びウイルスベクター精製の最終精製工程、並びにマイクロＥ溶剤からの微量金属除去についてなされる。
【００４４】
[0052]本発明の一実施形態によれば、多孔質膜は、ナノ多孔性膜、たとえば、直径１ｎｍ〜１００ｎｍの間の細孔を有する膜、又は微孔膜、たとえば、直径０．２μｍ〜１０μｍの細孔を有する膜であることができる。
【００４５】
[0053]コーティングが設けられる多孔質担体は、任意の適切な材料、たとえば、ポリマー、金属性材料、又はセラミック性材料、並びに特にポリマー、たとえばセルロースエステル等のセルロースポリマー、たとえば酢酸セルロース及びプロピオン酸セルロース、並びに酢酸／プロピオン酸セルロース等のセルロース混合エステル、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリフェニルエーテル（ＰＰＥ）、ポリフェニレンエーテルスルホン（ＰＰＥＳ）、ポリフェニレン酸化物（ＰＰＯ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ（フタラジノンエーテルスルホンケトン）（ＰＰＥＳＫ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルケトンケトン（ＰＥＫＫ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）及びそのブレンドであることができる。この多孔質担体は平板、中空繊維、フィラメント、中空若しくは非中空ビーズ、フェルトパッド、織若しくは不織マトリックス又はその任意の適切な組合せであることができる。
【００４６】
[0054]本発明の実施形態による多孔質媒体は、少なくとも１つの入口及び少なくとも１つの出口を備え、入口と出口との間に少なくとも１つの流体流路を画定するハウジングに配置することができ、少なくとも１つの本発明の膜、又は少なくとも１つの本発明の膜を含むフィルターが流体流路を横切って、濾過装置又は濾過モジュールを提供する。一実施形態では、入口及び第１の出口を備え、入口と第１の出口との間に第１の流体流路を画定するハウジング、並びに第１の流体流路を横切ってハウジングに配置される、少なくとも１つの本発明の膜、又は少なくとも１つの本発明の膜を備えるフィルターを備える濾過装置を提供する。
【００４７】
[0055]クロスフロー用途の場合、一実施形態では、少なくとも１つの入口及び少なくとも２つの出口を備え、入口と第１の出口との間に少なくとも第１の流体流路及び入口と第２の出口との間の第２の流体流路を画定するハウジング内に、第１の流体流路を横切っている少なくとも１つの本発明の多孔質膜、又は少なくとも１つの本発明の膜を備えるフィルターが配置されて、濾過装置又は濾過モジュールを提供する。例示的な一実施形態では、濾過装置はクロスフロー濾過モジュールを備え、このハウジングは、入口、濃縮液出口を備える第１の出口、及び浸透出口を備える第２の出口を備え、入口と第１の出口との間に第１の流体流路及び入口と第２の出口との間に第２の流体流路を画定しており、少なくとも１つの本発明の膜、又は少なくとも１つの本発明の膜を備えるフィルターが、第１の流体流路を横切って配置されている。
【００４８】
[0056]濾過装置又はモジュールは滅菌可能であることができる。適切な形状で、入口及び１つ又は複数の出口を備える任意のハウジングを採用することができる。
【００４９】
[0057]ハウジングは、任意の不浸透性熱可塑性材料を含み、処理する流体と適合性がある、任意の適切な硬質の不浸透性材料から作製することができる。たとえば、ハウジングはステンレス鋼等の金属、又はポリマー、たとえば、アクリル、ポリプロピレン、ポリスチレン、又はポリカーボネート樹脂等の透明な又は半透明なポリマーから作製することができる。
【００５０】
[0058]以下の例は本発明をさらに例示するが、当然ながら、多少なりとも本発明の範囲を限定するものと解釈するべきではない。
【００５１】
実施例１
[0059]本例は、本発明の一実施形態による多孔質膜の調製を例示する。
【００５２】
[0060]Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（１７．９ｇ、１００ｍＭ）をＤＩ水（２１０ｇ）中でＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（４．９６ｇ、５０ｍＭ）と混合し、５分間脱気し、次いで過硫酸アンモニウム（０．５１４ｇ、２．２５ｍｍｏｌ）を添加して溶液を得た。この溶液の温度を６０℃に上げて重合を開始し、この温度で２時間保持した。この重合混合物を室温まで冷却し、５〜８℃で保管した。
【００５３】
[0061]１０％基幹ポリマー溶液から、０．８５％の界面活性剤及び０．４５％の架橋剤を用いて、５．５％ポリマーコーティング溶液を調製した。この溶液のｐＨを１０に調整し、３ミクロンのＨＤＰＥ多孔質膜をこの溶液でディップコーティングした。このコーティングした膜を、室温で一晩架橋させた。
【００５４】
実施例２
[0062]本例は、本発明の一実施形態によるコポリマー、ポリ（Ｎ−３−アミノプロピル）メタクリルアミド−ｃｏ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、（ＰＡＰＭＡ−ＤＭＡＭ）の調製を例示する。
【００５５】
[0063]Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（１７．９ｇ、１００ｍＭ）をＤＩ水中でＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（９．９２ｇ、１００ｍＭ）と混合し、５分間脱気し、次いで過硫酸アンモニウム（０．５１４ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を６０℃で２時間撹拌し、室温まで冷却し、イソプロパノールに沈殿させることにより、この反応混合物からコポリマーを単離した。
【００５６】
実施例３
[0064]本例は、本発明の一実施形態によるターポリマー、ポリ（３−アミノプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ジメチルアクリルアミド−ｃｏ−ｔ−ブチルアクリルアミド）の調製を例示する。
【００５７】
[0065]Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（１２ｇ、６７ｍＭ）をＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（６．７ｇ、６７ｍＭ）、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（２ｇ、ＩＰＡ８ｇ中１５．７ｍＭ）及びＤＩ水１７０ｇ）と混合し、５分間脱気し、次いで過硫酸アンモニウム（０．５４６ｇ、１．６ｍＭ）を添加した。この反応混合物を６０℃で２時間撹拌し、室温まで冷却した。
【００５８】
実施例４
[0066]本例は、本発明の一実施形態によるターポリマー、ポリ（アミノプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリルアミド−ｃｏ−ｔ−ブチルアクリルアミド）の調製を例示する。
【００５９】
[0067]Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（１２ｇ、６７ｍＭ）をアクリルアミド（２．４ｇ、３３ｍＭ）、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（４．２７ｇ、ＩＰＡ１５．７３ｇ中３３．６ｍＭ）及びｄｉ水２６４ｇ）と混合し、５分間脱気し、次いで過硫酸アンモニウム（０．５４６ｇ、１．６ｍＭ）を添加した。この反応混合物を６０℃で２．５時間撹拌し、室温まで冷却した。
【００６０】
実施例５
[0068]本例は、本発明の一実施形態によるターポリマー、ポリ（アミノプロピルアクリルアミド−ｃｏ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ｔ−ブチルアクリルアミド）の調製を例示する。
【００６１】
[0069]Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（１２ｇ、６７ｍＭ）をＮ−イソプロピルアクリルアミド（３．７９ｇ、３３．６ｍＭ）、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（４．２７ｇ、ＩＰＡ１５．７３ｇ中３３．６ｍＭ）及びＤＩ水（２８４ｇ）と混合し、５分間脱気し、次いで過硫酸アンモニウム（０．４４５ｇ、１．６ｍＭ）を添加した。この反応混合物を６０℃で２．５時間撹拌し、室温まで冷却した。
【００６２】
実施例６
[0070]本例は、本発明の一実施形態によるコポリマー、ポリ（Ｎ−３−アミノプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリルアミド）（濃度１０％）の調製を例示する。
【００６３】
[0071]アクリルアミド（１０ｇ、１４０．７ｍＭ）をＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド（１２．６ｇ、７０．３ｍＭ）及びｄｉ水（２０９．７ｇ）と混合し、５分間脱気し、次いで過硫酸アンモニウム（７２２ｍｇ、３ｍＭ）を添加した。この反応混合物を６０℃で２．５時間撹拌し、室温まで冷却した。
【００６４】
実施例７
[0072]本例は、本発明の一実施形態による、アニオン交換体−第四級アンモニウムアクリルアミドコポリマー、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ジメチルアクリルアミド）、（ＰＤＭＡＰＡ−ＤＭＡ）の調製を例示する。
【００６５】
[0073]Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド（１７．１８ｇ、１００．９ｍＭ）及びＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（２０ｇ、２０１．８ｍＭ）をｄｉ水（３３４．６ｇ）と混合し、１０分間脱気し、次いで過硫酸アンモニウム（１．０４ｇ、４．５ｍＭ、１．５ｍｏｌ％）を添加した。追加の１０分間脱気を続け、この混合物を６０℃で２．５時間重合させた。
【００６６】
実施例８
[0074]本例は、５％ＤＭＡＰＡＭ−ＤＭＡＭコーティング（１００ｇ混合物）を伴う、本発明の一実施形態による、コーティングの調製を例示する。
【００６７】
[0075]１０％ＰＤＭＡＰＡ−ＤＭＡ（５０ｇ）を水（４９ｇ）、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（１５０ｍｇ）及びトリトンＸ−１００（８５０ｍｇ）と混合した。このコーティング溶液のｐＨをｐＨ１０に調整した。３μｍのＨＤＰＥ膜をディップコーティングによりこのコーティング溶液でコーティングした。このコーティングした膜を２つのピペット間にはさみ、上部から下部に向けて削って、均一の厚さのコーティングを得た。この膜を６５℃で１時間又は室温で一晩架橋させた。得られた膜を４〜２４時間冷水に浸出させ、乾燥させた。
【００６８】
[0076]四級化：５％ＤＭＡＰＡ−ＤＭＡコーティングを有する３μｍのＨＤＰＥ膜を、それぞれに１０重量％の以下の四級化試薬：イソプロピルグリシジルエーテル、フェニルグリシジルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルグリシジルエーテル、エチルヘキシルグリシジルエーテル、グリシジルメチルエーテル、又はベンジルグリシジルエーテルのうちの１つと、重量比５０：５０の水及びイソプロパノール（ＩＰＡ）の混合物とを含有する容器に添加した。この混合物のｐＨを１０〜１１の間、好ましくはｐＨ１０．５に調整した。この混合物を室温で４８時間混転した。得られた膜を水及びＩＰＡで洗浄して過剰なエポキシエーテルを除去した。この膜を室温で一晩又は６０℃で１時間乾燥させた。
【００６９】
[0077]出版物、特許出願及び特許を含む、本明細書で引用する全参考文献は、各参考文献が参照により組み込まれることが個別に及び具体的に示され、その全体が本明細書に記載されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７０】
[0078]本発明を記載する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」及び同様の指示語の使用は、本明細書中に別に示さない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するように解釈するものとする。１つ又は複数の項目のリスト（たとえば、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ）」）が続く用語「少なくとも１つ」の使用は、本明細書中に別に示さない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、リスト記載の項目から選択される１つの項目（Ａ又はＢ）又はリスト記載の項目のうちの２つ以上の任意の組合せ（Ａ及びＢ）を意味すると解釈するものとする。用語「を含む／を備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、別に示さない限りオープンエンドの用語（すなわち、「含むが、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ，）」を意味する）として解釈するものとする。本明細書中の値の範囲の記載は、本明細書中に別に示さない限り、その範囲内に含まれる各々の別々の値を個別に言及する略記方法として働くことを単に意図しており、各々の別々の値は本明細書中に個別に記載されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載されている全ての方法は、本明細書中に別に示さない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書に提供されている任意の及び全ての例、又は例示的な文言（たとえば「等の」）の使用は、本発明をより良好に明らかにすることを単に意図しており、別に特許請求しない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる文言も、特許請求されていない任意の要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈するべきではない。
【００７１】
[0079]本発明を実施するための本発明者らに知られている最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。それらの好ましい実施形態の変形形態は上記記載を読む際に当業者に明らかになるであろう。本発明者らは、当業者がそのような変形形態を適宜採用することを予想し、本発明者らは本発明が本明細書で具体的に記載している以外の形式で実施されることを意図している。したがって、本発明は、準拠法により認められる通りの、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載されている主題の全ての修正形態及び等価物を含む。さらに、本明細書中に別に示さない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、その全ての可能な変形形態における上記要素のいかなる組合せも本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【外国語明細書】
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