(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞表面に抗原分子または抗原分子の一部を発現させる方法を提供する。【解決手段】細胞の表面に抗原分子または抗原分子の一部を発現させる方法であって、細胞を抗原分子、光感作性薬剤、およびサイトカインと接触させること、並びに、光感作性薬剤を活性化するのに有効な波長の光を細胞に照射すること、を含み、前記抗原分子は、前記細胞のサイトゾルに放出され、その後、前記抗原分子または前記抗原分子の一部が、細胞の表面に提示される、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の表面に抗原分子または抗原分子の一部を発現させる方法であって、
細胞を抗原分子、光感作性薬剤、およびサイトカインと接触させること、並びに、光感作性薬剤を活性化するのに有効な波長の光を細胞に照射すること、を含み、
前記抗原分子は、前記細胞のサイトゾルに放出され、その後、前記抗原分子または前記抗原分子の一部が、細胞の表面に提示される、方法。
【請求項２】
前記サイトカインは、Ｉ型サイトカイン受容体またはＩＩ型サイトカイン受容体のリガンドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サイトカインは、ＩＬ−２受容体ファミリーメンバーのリガンド、またはＧＭ−ＣＳＦ受容体ファミリーメンバーのリガンドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記サイトカインは、インターフェロンであり、好ましくはＩ型ＩＦＮである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記サイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２１、あるいはこれらの相同体または誘導体から選択され、前記サイトカインは、好ましくはＧＭ−ＣＳＦである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原分子は、免疫応答を刺激することができる分子であり、好ましくはワクチン抗原またはワクチン成分である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗原提示によって免疫応答が刺激される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法は、インビトロまたはエキソビボで行われる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記光感作性薬剤は、ＴＰＣＳ2a、ＡｌＰｃＳ2a、ＴＰＰＳ4、およびＴＰＢＳ2aから
選択され、好ましくはＴＰＣＳ2aであるか、または光増感剤と式（Ｉ）で定義されるキトサンとの抱合体である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【化１】
2020182486.tif 000025
ここで、ｎは３以上の整数であり、
Ｒは前記化合物においてｎ回現れ、
前記総Ｒｎ基の０．１％〜９９．９％（好ましくは０．５％〜９９．５％）において、各Ｒは、
【化２】
2020182486.tif 000026
［式中、各Ｒ1は、同一であっても異なっていてもよいが、Ｈ、ＣＨ3、および−（ＣＨ2
）b−ＣＨ3から選択され、ａは１、２、３、４、または５であり、ｂは０、１、２、３、４、または５であって（対イオンは、例えば、Ｃｌ-であってもよい）、好ましくは、Ｒ1はＣＨ3でありｂは１である。］
と
【化３】
2020182486.tif 000027
［式中、ＹはＯ、Ｓ、ＳＯ2、−ＮＣＨ3、または−Ｎ（ＣＨ2）dＣＨ3であり、ｃは１、
２、３、４、または５であり、ｄは１、２、３、４、または５であって、好ましくは、ＹはＮＣＨ3でありｃは１である］
と、から選択されるＡ基であり、
各Ｒ基は同一であっても異なっていてもよく、
前記総Ｒｎ基の０．１％〜９９．９％（好ましくは０．５％〜９９．５％）において、各Ｒは、
【化４】
2020182486.tif 000028
と
【化５】
2020182486.tif 000029
［式中、ｅは０、１、２、３、４、または５であり、ｆは１、２、３、４、または５であって、好ましくはｅおよびｆは１であり、
Ｒ2は
【化６】
2020182486.tif 000030
と
【化７】
2020182486.tif 000031
と
【化８】
2020182486.tif 000032
（式中、ＷはＯ、Ｓ、ＮＨ、またはＮ（ＣＨ3）から選択される基であり、好ましく
はＮＨである。）
と、から選択される基であり、
Ｒ3は
【化９】
2020182486.tif 000033
と
【化１０】
2020182486.tif 000034
と
【化１１】
2020182486.tif 000035
（式中、ＶはＣＯ、ＳＯ2、ＰＯ、ＰＯ2Ｈ、またはＣＨ2から選択される基であり、
好ましくはＣＯである。）
と、から選択される基であり、
Ｒ4は、同一であっても異なっていてもよいが、Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ3、−ＣＨ3、
−ＣＯＣＨ3、Ｃ（ＣＨ3）4、−ＮＨ2、−ＮＨＣＨ3、−Ｎ（ＣＨ3）2、および−ＮＣＯ
ＣＨ3から選択される基（ｏ位、ｍ位、またはｐ位が置換されている）であり、好ましく
はＨである。］
と、から選択されるＢ基であり、
各Ｒ基は同一であっても異なっていてもよい。
【請求項１０】
前記抗原分子は、ペプチドである、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞は、抗原提示細胞であり、好ましくは樹状細胞である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞を、前記抗原分子、前記光感作性薬剤、および前記サイトカインと、同時に、別々に、または順次に接触させる、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
被験体の免疫応答を引き起こす方法であって、
前記被験体に、請求項１、６または１０に記載の抗原分子、請求項１または９に記載の光感作性薬剤、および請求項１から５のいずれか１項に記載のサイトカインを投与すること、並びに、前記被験体に、前記光感作性薬剤を活性化するのに有効な波長の光を照射すること、を含み、免疫応答が引き起こされる、方法。
【請求項１４】
前記方法は、予防接種の方法である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
疾患、障害、または感染を治療または予防するための、好ましくは癌を治療または予防するための、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記被験体は、非哺乳動物であり、好ましくは魚類であるか、または哺乳類であり、好ましくはネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットであり、最も好ましくは被験体はヒトである、請求項１３から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原分子、前記光感作性薬剤、および前記サイトカインを、前記被験体へ、同時に、別々に、または順次に投与する、請求項１３から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１、６または１０のいずれか１項に記載の抗原分子、請求項１または９に記載の光感作性薬剤、および請求項１から５のいずれか１項に記載のサイトカイン、並びに１つ
以上の薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
細胞表面に抗原分子または抗原分子の一部を発現する細胞またはその集団であって、細胞は、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法によって得ることができ、前記細胞は、好ましくは樹状細胞である、細胞。
【請求項２０】
請求項１９に記載の細胞または細胞の集団、および１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
予防または治療に用いられる、請求項１９に記載の細胞または細胞集団、あるいは請求項１８または２０に記載の組成物。
【請求項２２】
被験体の免疫応答を刺激するのに用いられる、好ましくは被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防するための、好ましくは予防接種および／または癌の治療または予防のための、請求項１９に記載の細胞または細胞集団、あるいは請求項１８または２０に記載の組成物。
【請求項２３】
被験体の免疫応答を刺激する薬物の調製のための、好ましくは被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防するための、好ましくは予防接種および／または癌の治療または予防のための、請求項１９に記載の細胞集団の使用、あるいは請求項１８または２０に記載の組成物の使用。
【請求項２４】
前記刺激、前記治療、または前記予防は、前記被験体に前記薬物を投与することを含む、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
予防または治療に用いる、請求項１、６または１０のいずれか１項に記載の抗原分子、請求項１または９に記載の光感作性薬剤、および請求項１から５のいずれか１項に記載のサイトカイン。
【請求項２６】
被験体の免疫応答を刺激するのに用いられる、好ましくは被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防するための、好ましくは予防接種および／または癌の治療または予防のための、請求項２５に記載の使用のための抗原分子、光感作性薬剤、およびサイトカインであって、好ましくは、前記使用は、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法を含む、抗原分子、光感作性薬剤、およびサイトカイン。
【請求項２７】
請求項２５または２６に記載の使用のための、請求項１から５のいずれか１項に記載の抗原分子、光感作性薬剤、およびサイトカインであって、前記使用は、細胞集団を調製するために請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法を含み、好ましくは前記細胞は樹状細胞である、抗原分子、光感作性薬剤、およびサイトカイン。
【請求項２８】
前記細胞集団は、前記被験体に投与されるものである、請求項２７に記載の使用のための抗原分子、光感作性薬剤、および薬剤。
【請求項２９】
被験体の免疫応答を刺激するための、好ましくは被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防するための、好ましくは予防接種および／または癌の治療または予防のための薬物の製造における、請求項１、６、または１０のいずれか１項に記載の抗原分子、および／または請求項１または９に記載の光感作性薬剤、および／または請求項１から５のいずれか１項に記載のサイトカインの使用であって、好ましくは前記免疫応答は請求項１３から１７に記載の方法で刺激される、使用。
【請求項３０】
前記薬物は、抗原分子または抗原分子の一部を細胞表面に発現する細胞集団であって、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる細胞集団を含む、前記被験体に投与するための、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法において、前記抗原分子、および／または前記光感作性薬剤、および／または前記サイトカインを用いて、前記薬物の製造のための前記細胞集団を得る、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
被験体の免疫応答を刺激するのに同時に、別々に、または順次に用いられる、好ましくは被験体の疾患、障害、または感染を治療するまたは予防するための、好ましくは予防接種および／または癌の治療または予防のための、あるいは請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法において、細胞表面に抗原分子または抗原分子の一部を発現させるための、組み合わせ製剤として、請求項１、６、または１０のいずれか１項に記載の抗原分子、請求項１または９に記載の光感作性薬剤、および請求項１から５のいずれか１項に記載のサイトカインを含む、製品。
【請求項３３】
被験体の免疫応答を刺激するのに用いられる、好ましくは被験体の疾患、障害、または感染を治療するまたは予防するための、好ましくは予防接種および／または癌の治療または予防のための、あるいは請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法において、細胞表面に抗原分子または抗原分子の一部を発現させる、キットであって、
請求項１または９に記載の光感作性薬剤を含む第１の容器と、
請求項１、６または１０のいずれか１項に記載の抗原分子を含む第２の容器と、
請求項１から５のいずれか１項に記載のサイトカインを含む第３の容器と、を含む、キット。
【請求項３４】
被験体の免疫応答を引き起こす、好ましくは被験体の疾患、障害、または感染を治療するまたは予防する、好ましくは予防接種および／または癌の治療または予防のための方法であって、
請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法にしたがって細胞集団を調製すること、および、その後に細胞を被験体に投与すること、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光感作性薬剤と、ワクチン成分などの抗原分子と、本明細書で定義されるサイトカインであって、光化学的内在化（ＰＣＩ）媒介性予防接種の効果を増強する薬剤とを用い、光感作性薬剤を活性化するのに有効な波長の光を照射する、予防接種方法または免疫化方法に関する。本発明は、また、このような方法に有用なワクチン組成物などの抗原組成物に関する。本発明は、また、例えば予防接種のために、免疫応答を起こすのに用いられ得る抗原提示細胞を産生する方法であって、上述したものと同じ成分を用いてワクチン成分などの抗原分子を細胞に導入し抗原提示を達成する方法、およびこのような方法に有用な抗原組成物を提供する。本発明は、また、このような方法によってインビトロで産生された細胞の使用であって、例えば予防接種を達成するなど、免疫応答を誘起させるためにインビボで患者に投与するための細胞の使用を提供する。抗原分子を細胞内に内在化する方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
予防接種は、免疫系を刺激して病原体に対する適応免疫の獲得を促進するために、抗原分子を投与することを含む。ワクチンは、感染による罹患状態を予防または改善することができる。予防接種は、感染症を予防する最も有効な方法であり、予防接種による免疫の普及が、天然痘の世界的な根絶並びにポリオ、はしか、および破傷風などの疾患を世界の多くの地域で制限することに大いに貢献している。
【０００３】
ワクチンの作用剤は、原因となる病原体の完全だが不活化された（感染しない）または弱められた（感染性が減じられた）形態であってもよく、免疫性であることが見出されている病原体の精製成分（例えば、ウイルスの外被タンパク質など）であってもよい。毒素による疾患に対する免疫化のために、例えば毒性作用は除くが免疫原性作用は保持するようにした破傷風のテタノスパスミン毒素の改変体などの、トキソイドが生産される。
【０００４】
たいていのワクチンは、エンドサイトーシスにより抗原提示細胞に取り込まれ、ＭＨＣクラスＩＩ経路を介した抗原の切断および提示のために、エンドソームを介してリソソームに輸送されるので、予防接種によって、主にＣＤ４ Ｔヘルパー細胞およびＢ細胞が活
性化される。癌などの障害または疾患、さらには細胞内感染と闘うためには、細胞障害性ＣＤ８ Ｔ細胞応答を刺激することが重要である。しかしながら、サイトゾルおよび抗原
提示のＭＨＣクラスＩ経路に抗原を送達することが困難であるために、通常、細胞障害性ＣＤ８ Ｔ細胞は誘導されない。光化学的内在化（ＰＣＩ）によってサイトゾルへの分子
の送達が改善されるため、ＰＣＩを採用する予防接種方法が知られている。ＰＣＩは、光感作性薬剤を、該薬剤を活性化する照射工程と組み合わせて用いる技術であり、細胞に同時投与された分子を該細胞のサイトゾルへ放出させることが知られている。この技術により、細胞によってエンドソームなどの細胞小器官に取り込まれた分子が、照射後に、これら細胞小器官からサイトゾルへ放出される。ＰＣＩは、広範な細胞の破壊または細胞死を招かない様式で、本来膜不透過性（または、難透過性）の分子を細胞のサイトゾルに導入する機構を提供する。
【０００５】
光化学的内在化（ＰＣＩ）の基本的方法は、国際公開第９６／０７４３２号および国際公開第００／５４８０２号に記述されており、これらは参照により本明細書に援用される。このような方法においては、内在化される分子（本発明においては、抗原分子）および光感作性薬剤を、細胞と接触させる。光感作性薬剤および内在化される分子は、細胞内の細胞膜結合性サブコンパートメントに取り込まれる、すなわち、細胞内小胞（例えば、リソソームまたはエンドソーム）にエンドサイトーシスされる。細胞を適切な波長の光に曝
露すると、細胞内小胞の膜を破壊する反応性種を直接的または間接的に生成する光感作性薬剤が活性化される。これによって、内在化された分子がサイトゾルに放出される。
【０００６】
このような方法においては、たいていの細胞は、機能性または生存率に有害な影響を受けないということが見出された。したがって、「光化学的内在化」と名付けられたこのような方法の有用性が、治療薬を含む様々な異なる分子の、サイトゾル、すなわち細胞の内部への輸送に対して提案された。
【０００７】
国際公開第００／５４８０２号では、このような一般的な方法を利用して、細胞表面に輸送分子を提示または発現している。したがって、細胞のサイトゾルへ分子が輸送され放出された後、その分子（または分子の一部）は、細胞の表面へ輸送され、そこで細胞の外側、すなわち細胞表面に提示されてもよい。このような方法は、予防接種の分野において特に有用であり、免疫応答を誘導、促進、または増強させるために、ワクチン成分、すなわち抗原または免疫原が細胞に導入され、細胞の表面で提示されてもよい。
【発明の概要】
【０００８】
予防接種は、いくつかの注目すべき成功をおさめてきているが、改善された別の予防接種方法がいまだ必要とされている。本発明は、この必要性に応えるものである。
【０００９】
驚くべきことに、本発明者らは、光感作性薬剤と、ワクチン成分などの抗原分子と、本明細書で定義されるサイトカインである薬剤とを用い、光感作性薬剤を活性化するのに有効な波長の光を照射する方法によって、有利に予防接種が改善される、または免疫応答が改善されることを見出した。
【００１０】
下記実施例においてより詳細に述べるように、本発明の方法によって、抗原特異的Ｔ細胞の産生量が増加するなど、改善された予防接種、または改善された免疫応答が提供される。相乗効果が得られることも期待される。
【００１１】
理論に拘束されることを望むものではないが、本発明の方法によって、ＭＨＣクラスＩ分子に対する抗原提示が増大して、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が増大し、これによって予防接
種方法が改善されると考えられる。実施例で述べる通り、ＭＨＣクラスＩ提示を評価するために、ＯＴ−１細胞を利用するモデル系を用いることができる（例えば、Ｄｅｌａｍａｒｒｅら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９８：１１１〜１２２、２００３を参照）。この
モデル系においては、抗原エピトープＳＩＩＮＦＥＫＬのＭＨＣクラスＩ提示によってＯＴ−１ Ｔ細胞が活性化され、抗原特異的Ｔ細胞の増殖、あるいはＩＦＮγまたはＩＬ−
２の産生量の増大における増加量として、この活性化を測定することができる。
【００１２】
したがって、本発明は、第一の態様において、細胞の表面に抗原分子または抗原分子の一部を発現させる方法を提供する。該方法は、細胞を抗原分子、光感作性薬剤、およびサイトカインである薬剤と接触させること、並びに、光感作性薬剤を活性化するのに有効な波長の光を細胞に照射すること、を含み、前記抗原分子は、細胞のサイトゾルに放出され、その後、前記抗原分子または抗原分子の一部が、細胞の表面に提示される。
【００１３】
好ましくは、本方法（および続いて述べる方法）は、該方法において、上述した３つの有効成分（薬剤）のみを用い、該薬剤は、本方法の効能に影響を及ぼす（すなわち、ＰＣＩ予防接種／抗原提示／免疫応答刺激を増強するのに能動的な役割を果たす）ように、本方法において適切なレベル（例えば、以下で述べる最小レベル）で存在する。したがって、薬剤は、好ましくは、他の有効成分を含まないバッファー中に存在する。
【００１４】
このような方法においては、上記抗原分子および上記光感作性薬剤、および必要に応じ
て本明細書で定義されるサイトカインである上記薬剤は、それぞれ細胞内小胞に取り込まれ、細胞に照射を行うと、細胞内小胞の膜が破壊されて、抗原分子が細胞のサイトゾルに放出される。
【００１５】
種々の薬剤は、同一の細胞内小胞に取り込まれてもよいし、互いに異なる細胞内小胞に取り込まれてもよい。光増感剤によって産生される活性種が、それらが包含されている小胞を越えて広がり得ること、および／または破壊された小胞と一体化することで小胞が内容物を放出することができるように、小胞が一体化し得ることが見出されている。本明細書で言及される「取り込まれる」とは、取り込まれた分子が小胞内に完全に包含されていることを意味する。細胞内小胞は、膜によって区切られており、例えばエンドソームまたはリソソームなどの、エンドサイトーシス後に生じる小胞であればどのようなものでもよい。
【００１６】
本明細書で用いられる「破壊された」区画とは、その区画の膜の完全性が、永久にまたは一時的に、その区画に包含されている抗原分子を放出できるほど十分に壊されていることを意味する。
【００１７】
本明細書で言及される「光感作性薬剤」は、該薬剤が適切な波長および強度の照射で活性化して活性種を生成する際に、吸収した光エネルギーを化学反応へ転換することができる化合物である。このプロセスにおける高反応性最終生成物は、細胞毒性および血管毒性を生じ得る。このような光感作性薬剤は、好都合には、細胞内区画、特にエンドソームまたはリソソームに局在するものであってもよい。
【００１８】
光増感剤は、様々な機構により、直接的または間接的に、その効果を発揮してもよい。したがって、例えば、ある光増感剤は、光によって活性化された際に直接的な毒性を有し、別の光増感剤は、細胞材料並びに脂質、タンパク質、および核酸などの生体分子にとって極めて有害な、一重項酸素または他の活性酸素種のような酸化剤などの毒性種を生成する。
【００１９】
このような光感作性薬剤として様々なものが当該技術分野において知られており、参照により本明細書に援用される国際公開第９６／０７４３２号などの文献中で述べられている。本発明の方法において、このような薬剤を用いてもよい。ポルフィリン、フタロシアニン、プルプリン、クロリン、ベンゾポルフィリン、リソソーム作用性弱塩基、ナフタロシアニン、カチオン系染料、およびテトラサイクリン、またはこれらの誘導体を含む、多くの光感作性薬剤が知られている（Ｂｅｒｇら、（１９９７）、 Ｊ． Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ、６５、４０３〜４０９）。他の光感作性薬剤として、テキサフィリン、フェオホルビド、ポルフィセン、バクテリオクロリン、ケトクロリン、ヘマトポルフィリン誘導体、および５−アミノレブリン酸およびその誘導体によって誘導される内因性光増感剤、フォトフリン、光増感剤の二量体またはその他の抱合体などが挙げられる。
【００２０】
ポルフィリンは、最も広く研究されている光感作性薬剤である。その分子構造は、メチン架橋を介して連結されたピロール環を４つ含む。ポルフィリンは、金属錯体を形成可能であることが多い、天然化合物である。例えば、酸素輸送タンパク質であるヘモグロビンの場合、ヘムＢのポルフィリン中心に鉄原子が導入される。
【００２１】
クロリンは、中心が４つのメチン結合によって連結した３つのピロールと１つのピロリンからなる、大きな芳香族複素環である。したがって、クロリンは、ポルフィリンとは異なり、おおむね芳香族性であるが、環の外周全体でみると芳香族性をもたない。
【００２２】
当業者は、どの光増感剤が本発明での使用に適しているかを理解するであろう。特に、細胞のエンドソームまたはリソソームに位置する光感作性薬剤が好ましい。したがって、光感作性薬剤は、好ましくはリソソームまたはエンドソームの内部区画に取り込まれる薬剤である。光感作性薬剤は、好ましくは、エンドサイトーシスによって細胞内区画に取り込まれる。好ましい光増感剤は、ジスルホン化アルミニウムフタロシアニンおよびテトラスルホン化アルミニウムフタロシアニン（例えば、ＡｌＰｃＳ2a）、スルホン化テトラフェニルポルフィン（ＴＰＰＳn）、スルホン化テトラフェニルバクテリオクロリン（例え
ば、ＴＰＢＳ2a）、ナイルブルー、クロリンｅ6誘導体、ウロポルフィリンＩ、フィロエ
リスリン、ヘマトポルフィリン、およびメチレンブルーである。本発明での使用に適したさらなる光増感剤は、参照として本明細書に援用される国際公開第０３／０２０３０９号において述べられており、すなわち、スルホン化メソ−テトラフェニルクロリンであり、好ましくはＴＰＣＳ2aである。好ましい光感作性薬剤は、両親媒性のフタロシアニン、ポルフィリン、クロリン、および／またはバクテリオクロリンなどの両親媒性光増感剤（例えば、ジスルホン化光増感剤）であり、特に、ＴＰＰＳ2a（ジスルホン酸テトラフェニルポルフィン）、ＡｌＰｃＳ2a（ジスルホン酸アルミニウムフタロシアニン）、ＴＰＣＳ2a（ジスルホン酸テトラフェニルクロリン）、およびＴＰＢＳ2a（ジスルホン酸テトラフェニルバクテリオクロリン）、またはこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。また、例えば、ＴＰＰＳ4（テトラスルホン酸メソ−テトラフェニルポルフィン）などの親水性
光感作性薬剤も好ましい。特に好ましい光感作性薬剤は、スルホン化アルミニウムフタロシアニン、スルホン化テトラフェニルポルフィン、スルホン化テトラフェニルクロリン、およびスルホン化テトラフェニルバクテリオクロリンであり、好ましくはＴＰＣＳ2a、ＡｌＰｃＳ2a、ＴＰＰＳ4、およびＴＰＢＳ2aである。本発明の特に好ましい実施形態にお
いて、光感作性薬剤は、クロリンＴＰＣＳ2a（例えば、アンフィネックス（Amphinex）（登録商標）などのジスルホン化テトラフェニルクロリン）である。
【００２３】
光増感剤を担体と結合させて、光感作性薬剤を提供してもよい。したがって、本発明の本実施形態の好ましい態様において、光感作性薬剤は、光増感剤と式（Ｉ）で定義されるキトサンとの抱合体である。：
【化１】
2020182486.tif 000002
ここで、ｎは３以上の整数であり、
Ｒは該化合物においてｎ回現れ、
前記総Ｒｎ基の０．１％〜９９．９％（好ましくは０．５％〜９９．５％）において、各Ｒは、
【化２】
2020182486.tif 000003
［式中、各Ｒ1は、同一であっても異なっていてもよいが、Ｈ、ＣＨ3、および−（ＣＨ2
）b−ＣＨ3から選択され、ａは１、２、３、４、または５であり、ｂは０、１、２、３、４、または５であって（対イオンは、例えば、Ｃｌ-であってもよい）、好ましくは、Ｒ1はＣＨ3でありｂは１である。］
と
【化３】
2020182486.tif 000004
［式中、ＹはＯ、Ｓ、ＳＯ2、−ＮＣＨ3、または−Ｎ（ＣＨ2）dＣＨ3であり、ｃは１、
２、３、４、または５であり、ｄは１、２、３、４、または５であって、好ましくは、ＹはＮＣＨ3でありｃは１である。］
と、から選択されるＡ基であり、
各Ｒ基は同一であっても異なっていてもよく、
前記総Ｒｎ基の０．１％〜９９．９％（好ましくは０．５％〜９９．５％）において、各Ｒは
【化４】
2020182486.tif 000005
と
【化５】
2020182486.tif 000006
［式中、ｅは０、１、２、３、４、または５であり、ｆは１、２、３、４、または５であって、好ましくはｅおよびｆは１であり、
Ｒ2は
【化６】
2020182486.tif 000007
と
【化７】
2020182486.tif 000008
と
【化８】
2020182486.tif 000009
（式中、ＷはＯ、Ｓ、ＮＨ、またはＮ（ＣＨ3）から選択される基であり、好ましく
はＮＨである。）
と、から選択される基であり、
Ｒ3は
【化９】
2020182486.tif 000010
と
【化１０】
2020182486.tif 000011
と
【化１１】
2020182486.tif 000012
（式中、ＶはＣＯ、ＳＯ2、ＰＯ、ＰＯ2Ｈ、またはＣＨ2から選択される基であり、
好ましくはＣＯである。）
と、から選択される基であり、
Ｒ4は、同一であっても異なっていてもよいが、Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ3、−ＣＨ3、
−ＣＯＣＨ3、Ｃ（ＣＨ3）4、−ＮＨ2、−ＮＨＣＨ3、−Ｎ（ＣＨ3）2、および−ＮＣＯ
ＣＨ3から選択される基（ｏ位、ｍ位、またはｐ位が置換されている）であり、好ましく
はＨである。］
と、から選択されるＢ基であり、
各Ｒ基は同一であっても異なっていてもよい。
【００２４】
キトサンポリマーは、構成単位を少なくとも３つ有する（ｎ＝３）。しかしながら、ｎは、好ましくは、少なくとも１０、２０、５０、１００、５００、１０００であり、例えば１０〜１００または１０〜５０である。
【００２５】
好ましい実施形態において、Ｒ2は、
【化１２】
2020182486.tif 000013
と
【化１３】
2020182486.tif 000014
と
【化１４】
2020182486.tif 000015
とから選択される。
【００２６】
さらに好ましい実施形態において、Ｒ3は、
【化１５】
2020182486.tif 000016
と
【化１６】
2020182486.tif 000017
と
【化１７】
2020182486.tif 000018
とから選択される。
【００２７】
Ｒ2またはＲ3は、好ましくは、ＴＰＰa、ＴＰＣa1、またはＴＰＣc1である。
【００２８】
Ａ基は、総Ｒｎ基の７０〜９５％であってもよく、Ｂ基は、総Ｒｎ基の５〜３０％であってもよい。
【００２９】
最も好ましい実施形態において、光増感剤およびキトサンの抱合体は、
１７：  Ｂ:２５％、Ａ:７５％
【化１８】
2020182486.tif 000019
と
１９：  Ｂ:２５％、Ａ:７５％
【化１９】
2020182486.tif 000020
と
３３：  Ｂ:１０％、Ａ:９０％
【化２０】
2020182486.tif 000021
と
３７：  Ｂ:１０％、Ａ:９０％
【化２１】
2020182486.tif 000022
とから選択される（図４のスキーム１〜５Ｂにおける番号を参照）。
【００３０】
上記の構造において、与えられているＡ／Ｂ％の値は、Ａ基またはＢ基であるＲｎ基の割合を示す。アステリスクは、キトサンポリマーの残部を表す。
【００３１】
これらの化合物は、当該技術分野において標準的な手順を利用する、当業者によく知られているであろう合成法によって合成されてもよい。例として、後述する好ましい抱合体である１７番、１９番、３３番、および３７番の合成を図１の反応スキーム１〜５Ｂに示す（図１の説明文も参照）。
【００３２】
本明細書で言及される「抗原」分子は、適切に免疫系または免疫細胞に提示された際に、それ自身、またはその一部が免疫応答を刺激することができる分子である。したがって、抗原分子は、有利には、ポリペプチド包含体などのワクチン抗原またはワクチン成分とされる。
【００３３】
当該技術分野において、このような抗原または抗原ワクチン成分が多く知られており、あらゆる種類の細菌性抗原またはウイルス抗原、あるいは、実際には、原生動物または高等生物を含むあらゆる病原種の抗原または抗原成分が含まれる。従来は、ワクチンの抗原成分は、生物全体（生物は生きているか、死んでいるか、あるいは弱毒化されている）を含む、すなわち全細胞ワクチンであったが、それに加えて、サブユニットワクチン、すなわちタンパク質またはペプチド、さらには炭水化物などの生物の特定の抗原成分に基づくワクチンが広く研究され、文献にて報告されてきている。本発明の抗原分子としては、どのような「サブユニット」系ワクチン成分を用いてもよい。
【００３４】
しかしながら、本発明は、ペプチドワクチンの分野において特に有用である。したがって、本発明に係る好ましい抗原分子は、ペプチドである（本明細書において、ペプチドとは、短鎖ペプチドおよび長鎖ペプチドの両方、すなわちペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチド、およびタンパク質分子またはその断片も含むものであると定義され、例えば、１５〜７５または８〜２５アミノ酸のような１０〜２５０アミノ酸からなるペプチドなどの５〜５００アミノ酸からなるペプチドである）。本発明の好ましい態様を形成する抗原分子として、例えばオボアルブミンを用いて本発明を説明しているが、実施例で用いているような、オボアルブミンではない抗原分子が特に好ましい。
【００３５】
例えば、ＡＩＤＳ／ＨＩＶ感染、またはインフルエンザ、イヌパルボウイルス、ウシ白血病ウイルス、肝炎などのウイルス性疾患およびウイルス感染の治療において、膨大な数のペプチドワクチンの候補が文献にて提案されている（例えば、Ｐｈａｎｕｐｈａｋら、Ａｓｉａｎ Ｐａｃ． Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、１５（１）、４１〜８；Ｎａｒｕｓｅ、北海道医学雑誌、１９９４、６９（４）、８１１〜２０；Ｃａｓａｌら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、１９９５、６９（１１）、７２７４〜７；Ｂｅｌｙａ
ｋｏｖら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１９９８、９５（４）、１７０９〜１４；Ｎａｒｕｓｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１９９
４、９１（２０）、９５８８〜９２；Ｋａｂｅｙａら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９６、１４（１２）、１１１８〜２２；Ｉｔｏｈら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１９８６、８３（２３）、９１７４〜８を参照）。同様に、細菌ペプチドを用いてもよく、また実際は、他の生物または種由来のペプチド抗原を用いてもよい。
【００３６】
病原生物由来の抗原に加えて、癌または多発性硬化症などの疾患に対するワクチンとして、ペプチドを用いることが提案されている。例えば、変異型癌遺伝子ペプチドは、細胞障害性Ｔリンパ球を刺激する際に抗原として作用する癌ワクチンとして大いに有望である（Ｓｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、１９９５、１２１、４４３〜４５１；Ｃｕｒｔｉｓ、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ、１９９７、１７、３１６〜３２７）。したがって、黒
色腫抗原を、本発明の抗原分子として用いてもよい。別の実施形態において、黒色腫抗原ではない抗原分子を用いてもよい。本明細書で言及される「黒色腫抗原」は、適切に免疫系または免疫細胞に提示された際に、それ自身、またはその一部が免疫応答を刺激することができる、黒色腫細胞由来の分子である。黒色腫「由来の」分子は、黒色腫細胞に出現し得る分子、または、黒色腫中の天然型分子が、例えば、改変分子を与える切断、発現後修飾、および／または配列の改変などによって改変された分子であって、天然型分子を認識する免疫応答を改変型分子によって引き起こすことを可能にする天然型分子のエピトープを１つ以上維持する分子である。黒色腫抗原は、被験者の黒色腫などの適切な供給源から単離することで得てもよいし、例えば、化学合成またはペプチド／タンパク質発現によって合成してもよい。
【００３７】
また、合成ペプチドワクチンも、転移性黒色腫の治療において検討されている（Ｒｏｓ
ｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、１９９８、４（３）、３２１〜７）。多発性硬化
症治療用のＴ細胞受容体ペプチドワクチンについては、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ． Ｎｅｕｒ
ｏｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、７６（１〜２）、１５〜２８で述べられている。本発明の抗原分子としては、どのようなペプチドワクチン成分を用いてもよく、また実際は、文献にてペプチドワクチンとして述べられている、または提案されているいずれのペプチドを用いてもよい。したがって、ペプチドは、合成したものであっても、生物から単離または抽出したものであってもよい。好ましいペプチドとしては、実施例で用いられるもの、例えば、配列がＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲであるＨＰＶ長鎖ペプチドなどのＨＰＶペプチドが挙げられる。
【００３８】
一実施形態において、本発明の方法では、アジュバントも用いられる。例えば、アジュバントは、トール様受容体（ＴＬＲ）３リガンドなどのＴＬＲリガンドから選択されてもよく、例えば、ポリ（ＩＣ）（例えば、高分子量ポリ（ＩＣ）（例えば、平均サイズが１．５〜８ｋｂ）や低分子量ポリ（ＩＣ）（例えば、平均サイズが０．２〜１ｋｂ）など）である。ポリ（ＩＣ）の投与量は、５μｇ〜２００μｇ、例えば１０μｇ〜１００μｇであってもよく、好ましくはマウスに対して１０μｇまたは５０μｇであり、他の動物の治療では、必要であれば適切に調整してもよい。本発明の製品、方法、または使用は、好ましくは、ポリ（ＩＣ）を含むか、またはポリ（ＩＣ）を用いる。
【００３９】
抗原分子は、光化学的内在化プロセスによって一旦細胞のサイトゾルに放出されると、細胞の抗原処理機構によって処理されてもよい。したがって、細胞の表面に発現または提示された抗原分子は、内在化された（エンドサイトーシスされた）抗原分子の一部または断片であってもよい。提示または発現された抗原分子の「一部」は、好ましくは、細胞内部の抗原処理機構によって生成された一部を含む。しかしながら、一部は、適切な抗原設計（例えば、ｐＨ感受性結合）によって達成されてもよい他の手段、または他の細胞処理手段によって生成されてもよい。このような一部は、好都合には、例えば、ペプチドの大きさが、１０アミノ酸または２０アミノ酸よりも大きいなど、５アミノ酸よりも大きい場合に、免疫応答を起こすのに十分な大きさを有する。
【００４０】
本明細書で論ずるように、ＰＣＩ媒介性予防接種を増強する薬剤は、サイトカインである。「サイトカイン」なる用語は、様々な胎生由来の細胞により全身に亘って産生される広く多様な調整物質のファミリーを包含する。サイトカインは、小さな細胞シグナル伝達分子であり、タンパク質、ペプチド、または糖タンパク質であり得る。サイトカインとしては、インターロイキン（ＩＬ）やインターフェロン（ＩＦＮ）などの免疫調整剤が挙げられ、また、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、および他の調節分子も挙げられる。サイトカインは、機能、分泌細胞、または作用の対象に基づいて、リンフォカイン、インターロイキン、およびケモカインに分類されている。サイトカインには、それぞれ、適合した細胞表面受容体があり、細胞機能を変化させる細胞内シグナル伝達カスケードを開始する。サイトカインは、当該技術分野において周知のものであり、本発明に係る使用のために、このようなサイトカインがすべて包含される。好ましいファミリーは、本明細書で述べるとおりである。
【００４１】
サイトカインは、構造および／または機能に基づいて様々に分類されており、様々なファミリーが同定されている。サイトカインは、それらが結合する受容体に基づいて分類され得る。受容体（またそのリガンド）は、１型サイトカイン（ヘモポイエチン）受容体、ＩＩ型サイトカイン受容体、ＴＮＦ受容体、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体、および７回膜貫通型α−ヘリックス受容体に分類され得る。
【００４２】
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、Ｃ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、およびＩＬ−５と共に、上述した造血サイトカイン受容体に対するリガン
ドであるサイトカインのファミリーに属する。ＧＭ−ＣＳＦ受容体ファミリーは、共通β鎖を有するこの受容体ファミリーに属する。ＧＭ−ＣＳＦは、様々な細胞種によって、保存されたジスルフィド結合を有する１２８アミノ酸からなる１本鎖糖タンパク質として分泌される。ＧＭ−ＣＳＦの機能は、ＧＭ−ＣＳＦ受容体によって媒介され、この受容体は、ＧＭ−ＣＳＦ特異的α鎖と、ヒトの細胞においては、ＩＬ−３受容体およびＩＬ−５受容体が共有しているβ鎖とを含む。α鎖は、単量体として細胞表面に発現され、高い親和性でＧＭ−ＣＳＦと結合する。このような結合に続き、β鎖が複合体にリクルートされて、シグナル伝達および機能的応答を活性化する。さらに、α鎖は、可溶性外部分子（選択的スプライシングによって生じる）として存在することができる。この受容体は、サイトカインが結合する膜結合性の同等物と競合するが、拮抗的なシグナル伝達には関与しない。ＧＭ−ＣＳＦは、白血球成長因子として機能する。ＧＭ−ＣＳＦは、幹細胞を刺激して、顆粒球（好中球、好酸球、および好塩基球）および単球を産生する。したがって、ＧＭ−ＣＳＦは、感染と戦う際に重要である。
【００４３】
ＩＬ−２受容体ファミリーもまた、Ｉ型サイトカイン受容体ファミリーに属する。このファミリーのメンバーは、共通γ鎖を有する。このファミリーの受容体としては、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−９受容体、ＩＬ−１５受容体、およびＩＬ−２１受容体が挙げられる。インターロイキンの大多数は、ヘルパーＣＤ４ Ｔリ
ンパ球によるだけでなく、単球、マクロファージ、および内皮細胞を通じても合成される。これらは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および造血細胞の成長および分化を促進する。
【００４４】
ＩＬ−７は、インターロイキン−７受容体αおよび共通γ鎖受容体からなるヘテロダイマーであるＩＬ−７受容体と結合する。ＩＬ−７は、Ｂ細胞およびＴ細胞のどちらの成長にも重要である。このサイトカインおよび肝細胞成長因子（ＨＧＦ）は、プレプロＢ細胞成長刺激因子として機能するヘテロダイマーを形成する。ＩＬ−７はまた、Ｔ細胞成長の初期におけるＴ細胞受容体ベータ（ＴＣＲβ）のＶ（Ｄ）Ｊ再構成の補足因子でもある。ＩＬ−７は、腸上皮細胞および上皮杯細胞によって局所的に産生され得るが、リンパ球自身によっては産生されず、血清ＩＬ−７濃度は、リンパ球数と反比例する。サイトカインがその受容体と結合することによって、胸腺およびその残存物並びにその周囲のどちらにおいても、Ｔ細胞の成長に重要なシグナル伝達が引き起こされる。ＩＬ−７は、多分化能（多能性）造血幹細胞のリンパ球前駆細胞への分化を刺激する（ＩＬ−３によって分化が刺激される骨髄系前駆細胞とは対照的である）。ＩＬ−７はまた、リンパ系（Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞）のすべての細胞の増殖を刺激する。ＩＬ−７は、Ｂ細胞の成熟や、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の生存、成長、ホメオスタシスのある段階における増殖に重要である。
【００４５】
上述した通り、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２１は、いわゆるサイトカインのガンマ（ｃ）ファミリーに属している、すなわち、共通γ鎖を有する受容体と結合するという点で、ＩＬ−７と関連している。これらのサイトカインは、すべて、共通のサイトカインγ鎖を用いてシグナル伝達を行い、Ｔ細胞およびＮＫ細胞に対して強い影響を及ぼす。
【００４６】
ＩＬ−２は、主にＴヘルパー細胞によって産生され、先天性免疫系および適応免疫系の様々な免疫細胞に作用する。ＩＬ−２は、応答性Ｔ細胞の増殖を誘導するリンフォカインである。さらに、成長因子および抗体産生刺激剤として、受容体特異的な結合を介してＢ細胞に作用する。ＩＬ−２は、単一の糖修飾ポリペプチドとして分泌され、活性化にはシグナル配列の切断を必要とする。溶液ＮＭＲによって、ＩＬ−２の構造は、４本のヘリックス（Ａ〜Ｄと呼ぶ）を含み、両側に２本の短いヘリックスおよび境界が明確でない数本のループが隣接していることが示唆されている。ヘリックスＡの残基およびヘリックスＡとヘリックスＢとの間のループ領域の残基は、受容体の結合に重要である。二次構造解析
によって、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦとの類似性が示唆されている。
【００４７】
ＩＬ−１５は、様々な細胞種および組織によって恒常的に発現されるが、主に膜と結合している。ＩＬ−１５およびＩＬ−２は、同様の免疫効果を奏し、ＩＬ−２受容体サブユニットであるＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγ（ｃ）を共有しているが、これらのサイトカインは、それぞれ別のα受容体を有する。ＩＬ−１５は、細胞性免疫応答の刺激および維持を含む、様々な生物学的機能を有する。ＩＬ−１５は、Ｔリンパ球の増殖を刺激する。
【００４８】
ＩＬ−２１は、ＩＬ−１５と相同であるが、その受容体は、ＩＬ−２１Ｒαと呼ばれる固有のサブユニットとＩＬ−２Ｒγ（ｃ）とからなる。ＩＬ−２１は、活性化ＣＤ４+Ｔ
ヘルパー細胞およびＮＫ Ｔ細胞によって産生される。リンパ球および樹状細胞は、すべ
て、ＩＬ−２１受容体を有する。サイトカインが結合することによって受容体が刺激されると、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の同時刺激、活性化、および増殖、ＮＫ細胞毒性の増強、ＣＤ４
０によるＢ細胞の増殖、分化、およびアイソタイプスイッチング、並びにＴｈ１７細胞の分化促進が引き起こされる。
【００４９】
インターフェロン（ＩＦＮ）は、ＩＩ型サイトカイン受容体と結合するサイトカインの例である。インターフェロンは、ウイルス、細菌、寄生虫、または腫瘍細胞などの病原体の存在に応答して、宿主細胞が産生し、放出するタンパク質である。これらは、細胞間の情報伝達を可能にして、病原体や腫瘍を除去する免疫系の防御防衛を誘発する。インターフェロンは、ナチュラルキラー細胞やマクロファージなどの免疫細胞を活性化することができ、非感染宿主の能力を増大してウイルスの新たな感染を阻止する。
【００５０】
哺乳類では、およそ１０種の異なるＩＦＮが同定されている（ヒトでは７種）。ＩＦＮには、分類が３つあり、これらはシグナル伝達を行う受容体の種類に基づいて表されている。Ｉ型ＩＦＮは、すべて、ＩＦＮＡＲ１鎖およびＩＦＮＡＲ２鎖からなるＩＦＮ−α受容体（ＩＦＮＡＲ）として知られている特定の細胞表面受容体複合体と結合する。ヒトのＩ型インターフェロンは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−ωである。ＩＩ型ＩＦＮは、ＩＦＮＧＲ１鎖およびＩＦＮＧＲ２鎖からなるＩＦＮＧＲと結合する。ヒトにおいては、ＩＦＮ−γである。ＩＩＩ型インターフェロンは、ＩＬ１０Ｒ２およびＩＦＮＬＲ１からなる受容体複合体を通じてシグナル伝達を行う。
【００５１】
ＩＦＮ−αタンパク質は、白血球によって産生され、主に、ウイルス感染に対する先天性免疫応答に関与する。ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、およびＩＦＮＡ２１の、１３種のサブタイプが存在する。これらのＩＦＮ−α分子の遺伝子は、９番染色体上の遺伝子群において共に見出される。
【００５２】
本発明にしたがえば、薬剤はどのサイトカインであってもよい。機能的に同等な変異体、誘導体、および断片を含む、上述したサイトカインの公知の形態は、すべて、本発明において用いることができる。したがって、本明細書で用いる「サイトカイン」なる用語は、公知のサイトカインポリペプチドのアミノ酸配列変異体およびサイトカインポリペプチドの断片、またはそれらの誘導体が、活性であるかまたは「機能的」である、すなわち、該当するサイトカインの機能または活性（例えば、生物学的活性）のうち少なくとも１つを維持している限りにおいて、このような断片、変異体、または誘導体を含む。サイトカインは、組換え型ポリペプチドであっても、合成ポリペプチドであってもよく、天然源から単離したものであってもよい。サイトカインは、市販品で当業者に知られているものが適切であり、例えば、ヒトサイトカインは、ジェンスクリプト社（GenScript）（ピスカ
タウェイ、ＮＪ、ＵＳＡ）から入手可能である。
【００５３】
サイトカインは、どのような種から（より好ましくは、どのような脊椎動物種から）得たものであってもよいが、好ましくは哺乳類のサイトカイン、より好ましくはヒトのサイトカインである。
【００５４】
サイトカインの変異体としては、天然に見られる異なる対立遺伝子変異体、例えば、他の種に出現しているものや地理的な相違などに起因するものなどが挙げられ得る。また、機能的に同等な変異体としては、公知の配列に対して１つ以上のアミノ酸の置換あるいは内部配列もしくは末端の欠失または付加が行われたポリペプチドが挙げられ得る。
【００５５】
機能的に同等な変異体は、アミノ酸配列の化学修飾を含み得、例えば、化学的に置換されたまたは修飾されたアミノ酸残基を含むもの、あるいはＰＥＧ化されたサイトカインが挙げられる。
【００５６】
誘導体は、サイトカインポリペプチドのペプチド模倣体である分子であってもよい。言い換えると、誘導体は、ポリペプチドと機能的に同等であるかまたは類似したものであり、ポリペプチド同等物と類似の立体構造を採用することができるが、ペプチド結合によって連結したアミノ酸のみからなるものではない分子であってもよい。したがって、ペプチド模倣体は、構造的、機能的にアミノ酸に類似しているがアミノ酸ではないサブユニットからなるものであってもよい。サブユニットの骨格部は、標準的なアミノ酸とは異なっていてもよく、例えば、１つ以上の炭素原子に代えて１つ以上の窒素原子を含んでいてもよい。好ましいペプチド模倣体の種類は、ペプトイド、すなわち、Ｎ−置換グリシンである。ペプトイドは、そのペプチド同等物の近縁であるが、分子の骨格に沿って、アミノ酸中のα炭素ではなく窒素原子に側鎖が付加されている点で、化学的に異なっている。
【００５７】
該当するサイトカインの活性を維持し、本発明に係る光化学的内在化を増強する場合、例えば、実施例で述べる方法論によって評価されるＰＣＩ媒介性予防接種を増強する場合は、このような変異体および誘導体が、すべて含まれる。
【００５８】
当該技術分野において、活性を維持しながら、タンパク質またはペプチドの配列を改変することが知られており、この改変は、ランダム突然変異または部位特異的突然変異、核酸の開裂および連結、ペプチドの化学合成などの当該技術分野において標準的な技術を用いて達成し得る。
【００５９】
アミノ酸の変化は、好ましくは軽度であり、すなわち、タンパク質の折り畳みおよび／または活性に大きく影響しない保存的アミノ酸置換；典型的には１〜３０アミノ酸の、小さな欠失；アミノ末端またはカルボキシル末端の小さな伸長；約２０〜２５残基以下の小さなリンカーペプチドの付加；あるいは、ポリヒスチジン配列、抗原エピトープ、または結合ドメインなどの、実効電荷を変化させるかまたは別の機能によって精製を容易にする小さな伸長、である。したがって、タンパク質またはペプチドのＮ末端および／またはＣ末端の伸長は、本定義に含まれる。伸長された誘導体の長さは、それぞれ異なっていてもよく、例えば、誘導体は、５０、３０、２０、１０、または５以下のアミノ酸の分だけ、伸長されていてもよい。
【００６０】
保存的置換としては、例えば、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リシン、およびヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えば、グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えば、ロイシン、イソロイシン、およびバリン）、芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン）、および小さいアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、スレオニン、およびメチオニン）の各グループ内における置換が挙げられる。サイトカインは、本明細書で述べるサイトカインの公知のアミノ酸配列に対して
、好ましくは、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または配列類似性を有する。例えば、好ましい公知のサイトカインのアミノ酸配列を、以下の表に示す。
【００６１】
【表１】
2020182486.tif 000023
【００６２】
２つの核酸配列間、および２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、ＧＣＧプログラムパッケージ（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４８：４４３〜４５３）に含まれるＧＡＰなどの、当該技術分野において公知のコンピュータプログラムによって決定し得る。２つのアミノ酸配列間の同一性の程度を決定する目的で、ＧＡＰ作成ペナルティが３．０、ＧＡＰ伸長ペナルティが０．１の設定でＧＡＰを用いることができる。アミノ酸類似性は、ウィスコンシン大学のＧＣＧバージョン１０ソフトウェアパッケージのベストフィット（Best Fit）プログラムを用いて測定し得る。このプログラムは、初期値として、ギャップ作成ペナルティを８、ギャップ伸長ペナルティを２、平均一致を２．９１２、平均不一致を２．０３としたＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズムを用いている。
【００６３】
本発明に係る使用のためのサイトカインは、好ましくは、Ｉ型サイトカイン受容体またはＩＩ型サイトカイン受容体のリガンドであるサイトカインである。サイトカインは、特に好ましくは、ＩＬ−２受容体ファミリーメンバーのリガンド、またはＧＭ−ＣＳＦ受容体ファミリーメンバーのリガンドであるか、あるいはサイトカインは、インターフェロンであり、好ましくはＩ型ＩＦＮである。本発明の特に好ましい実施形態において、サイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、またはＩＬ−２１、あるいはこれらの相同体または誘導体から選択され、さらに好ましくは、サイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、またはＩＦＮ−αから選択される。サイトカインは、最も好ましくは、ＧＭ−ＣＳＦであるが、本発明は、ＧＭ−ＣＳＦでないサイトカインの使用にも及ぶものである。サイトカインは、好ましくは、ヒト由来である。
【００６４】
本明細書で定義される「リガンド」とは、受容体と結合し、その受容体を通じてシグナル伝達を開始することができるか、あるいはその受容体を通じた固有のリガンドによるシグナル伝達と拮抗する分子またはそのシグナル伝達を作動させる分子である。
【００６５】
本明細書で用いられる「発現する」または「提示する」は、抗原分子の少なくとも一部が細胞の周囲の環境に露出し、接触可能なように、好ましくは、提示された細胞またはその一部に対して免疫応答を起こしてもよいように、抗原分子またはその一部が細胞表面に存在することをいう。発現される分子が細胞膜および／またはその膜に存在してもよい、
または存在するようにされてもよい膜成分と接触する「表面」で、発現が成されてもよい。
【００６６】
本明細書で用いられる「細胞」なる語は、全ての真核細胞（昆虫細胞および真菌細胞を含む）を含んでいる。したがって、代表的な「細胞」は、全ての種類の哺乳動物細胞および非哺乳動物細胞（例えば、魚類の細胞）、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、および原生動物を含む。しかしながら、細胞は、好ましくは哺乳動物細胞であり、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット由来の細胞であるが、最も好ましいのはヒト由来の細胞である。本発明の方法、使用などに供される細胞は、そのサイトゾルに投与または輸送される分子を、表面に発現または提示することができるものであれば、どのような細胞でもよい。
【００６７】
細胞は、好都合には、免疫細胞、すなわち免疫応答に関わる細胞である。しかしながら、他の細胞も、免疫系に対して抗原を提示する場合があり、このような細胞も、本発明の範囲に含まれる。したがって、本発明に係る細胞は、有利には、以下に述べる抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、本明細書で定義される免疫応答のどのような態様または「武器」に関わっていてもよい。
【００６８】
細胞障害性細胞の刺激には、抗原提示細胞によって、例えばＭＨＣクラスＩ提示などの特定の様式で、刺激される細胞に対して抗原が提示されることが必要である（例えば、ＣＤ８+細胞障害性Ｔ細胞の活性化にはＭＨＣ−Ｉ抗原提示が必要である）。抗体産生細胞
は、抗原提示細胞による抗原提示によって刺激されてもよい。
【００６９】
抗原は、エンドサイトーシスによって抗原提示細胞に取り込まれ、エンドサイトーシス小胞内でペプチドまで分解されてもよい。これらのペプチドは、エンドソームにおいてＭＨＣクラスＩＩ分子と結合して細胞表面に輸送され、そこで、ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ複合体が、ＣＤ４＋ Ｔヘルパー細胞によって認識され、免疫応答を誘導してもよい。
あるいは、サイトゾルのタンパク質が、例えばプロテアソームによって分解されてＴＡＰ（抗原提示に関するトランスポーター）によって小胞体へ輸送され、そこで、ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子と結合して細胞表面に輸送されてもよい（ＹｅｗｄｅｌｌおよびＢｅｎｎｉｎｋ、１９９２、Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５２：１〜１２３）。ペプチドが外部抗原由来である場合、ペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体は、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識される。ＣＴＬは、ペプチド−ＭＨＣ（ＨＬＡ）クラスＩ複合体と結合し、それによって活性化され、増殖を開始し、ＣＴＬのクローンを形成する。標的細胞、および細胞表面に同じペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体を有する他の標的細胞は、ＣＴＬクローンによって殺され得る。十分量の抗原をサイトゾルに導入することができた場合に、外部抗原に対する免疫が確立され得る（上記ＹｅｗｄｅｌｌおよびＢｅｎｎｉｎｋ、１９９２；Ｒｏｃｋ、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １７：１３１〜１３７）。これが、とりわけ癌ワクチン開発の基礎となっている。実用上最大の問題の１つは、サイトゾルに十分量の抗原（または抗原の一部）を導入することである。この問題は、本発明によって解決され得る。
【００７０】
上記したように、抗原分子は、光科学的内在化プロセスによって一旦細胞のサイトゾルに放出されると、細胞の抗原処理機構によって処理され、適切な様式で、例えばクラスＩ
ＭＨＣによって、細胞表面に提示され得る。この処理は、抗原の分解、例えば、タンパ
ク質抗原またはポリペプチド抗原のペプチドへの分解を含んでもよく、ペプチドはその後、提示のためのＭＨＣ分子と複合体を形成する。したがって、本発明に係る細胞の表面に発現または提示される抗原分子は、内在化（エンドサイトーシス）された抗原分子の一部または断片であってもよい。
【００７１】
例えばリンパ球（Ｔ細胞およびＢ細胞の両方）、樹状細胞、マクロファージなどを含む、種類の異なる様々な細胞が、その表面に抗原を提示することができる。他には、例えば黒色腫細胞などの癌細胞がある。これらの細胞を、本明細書において、「抗原提示細胞」という。当該技術分野において、主として免疫系のエフェクター細胞への抗原提示に関わる免疫系の細胞である「プロフェッショナル抗原提示細胞」が知られていて、文献にも記載されており、この細胞は、Ｂリンパ球、樹状細胞、およびマクロファージを含む。細胞は、好ましくは、プロフェッショナル抗原提示細胞である。
【００７２】
抗原提示細胞による、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に対する抗原提示には、抗原分子が抗原提示細胞のサイトゾルに入ることが必要である（Ｇｅｒｍａｉｎ、Ｃｅｌｌ、１９９４、７６、２８７〜２９９）。
【００７３】
例えば、インビトロまたはエキソビボの方法に関わる、あるいはインビボの方法に関わる本発明の実施形態において、細胞は樹状細胞である。樹状細胞は、哺乳類の免疫系の一部を形成する免疫細胞である。その主な機能は、抗原性物質を処理し、表面において、それを免疫系の他の細胞に対して提示することである。樹状細胞は、一旦活性化されると、リンパ節に移動し、そこで、Ｔ細胞およびＢ細胞と相互作用して適応免疫応答を引き起こす。
【００７４】
樹状細胞は、造血性骨髄前駆細胞由来である。これら前駆細胞は、初めは、高い細胞障害活性および低いＴ細胞活性化能が特徴の未成熟樹状細胞に変化する。一旦、提示可能な抗原と接触すると、成熟樹状細胞へと活性化し、リンパ節への移動を開始する。未成熟樹状細胞は、病原体を貪食してそのタンパク質を小片へと分解し、成熟化すると、ＭＨＣ分子を用いてその断片を細胞表面に提示する。
【００７５】
樹状細胞は、樹状細胞の適切な供給源であればどのような由来であってもよく、例えば、皮膚、鼻の内層、肺、胃、および腸または血液由来であってもよい。本発明の特に好ましい実施形態において、樹状細胞は骨髄由来である。
【００７６】
樹状細胞は、天然源から単離されて本発明のインビトロの方法で用いられてもよいし、インビトロで産生されてもよい。樹状細胞は、単球、すなわち、体内を循環し、適切なシグナルに応じて、樹状細胞またはマクロファージに分化することができる白血球から生じる。単球は、ひいては、骨髄の幹細胞から形成される。単球由来の樹状細胞は、インビトロにおいて、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から産生させることができる。組織培養フラスコにＰＢＭＣを平板培養することで、単球が付着する。これら単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）で処理することにより、約１週間で未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）へ分化する。続いて、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）で処理することにより、ｉＤＣは成熟樹状細胞へとさらに分化する。
【００７７】
本明細書で用いられる「接触する」は、例えば２５〜３９℃の適切な栄養培地中において、または体温、すなわち３６〜３８℃のインビボにおいて、例えば好ましくは３７℃で、細胞への内在化に適切な条件下、細胞並びに光感作性薬剤、および／または抗原分子、および／または本明細書で定義されるサイトカインを互いに物理的に接触させることをいう。
【００７８】
細胞は、光感作性薬剤、および抗原分子、および本明細書で定義されるサイトカインと、順次接触させてもよいし、同時に接触させてもよい。これらの成分は、好ましくは、また好都合には、細胞に同時に接触させる。光感作性薬剤および抗原分子（並びに、必要に応じてサイトカイン）は、細胞によって、同じ細胞内区画に取り込まれてもよいし、異なる細胞内区画に取り込まれてもよい（例えば、共転移してもよい）。
【００７９】
次に、細胞を適切な波長の光に露光させて光感作性化合物を活性化し、その結果、細胞内区画の膜を破壊する。
【００８０】
国際公開第０２／４４３９６号（参照により本明細書に援用される）には、例えば、内在化される分子（この場合は抗原分子）を細胞と接触させる前に、光感作性薬剤を細胞と接触させ、照射によって活性化させるように、工程を順序立てた方法が記載されている。この方法は、内在化される分子が、照射時に、光感作性薬剤と同じ細胞サブコンパートメントに存在する必要はないということを利用している。
【００８１】
したがって、一実施形態において、上記光感作性薬剤および／または上記抗原分子および／または本明細書で定義されるサイトカインは、一緒に、または相互に独立して、細胞に与えられる。次いで、少なくとも抗原分子および光感作性薬剤が同じ細胞内区画に現れた時に、照射を行う。これを、「後照射」法という。
【００８２】
別の実施形態において、上記方法は、上記細胞をまず光感作性薬剤に接触させ、次いで抗原分子および／または本明細書で定義されるサイトカインと接触させることで行うことができ、照射は、光感作性薬剤が細胞内区画に取り込まれた後、抗原分子（および、必要に応じてサイトカイン）が細胞によって該光感作性薬剤を含む細胞内区画に取り込まれる前（例えば、露光時に異なる細胞内区画に存在していてもよい）、好ましくは細胞によっていずれかの細胞内区画に取り込まれる前、例えばいずれかの細胞による取り込みの前に行われる。したがって、例えば、光感作性薬剤を投与した後に照射を行い、その後残りの薬剤を投与してもよい。これが、いわゆる「前照射」法である。
【００８３】
本明細書で用いられる「内在化」は、細胞内、例えばサイトゾルへの分子の送達をいう。この場合、「内在化」は、細胞内区画／膜結合区画から、細胞のサイトゾルへ分子を放出する工程を含んでいてもよい。
【００８４】
本明細書で用いられる「細胞による取り込み」または「転移」は、細胞膜外にある分子が、例えば小胞体、ゴルジ体、リソソーム、エンドソームなどの細胞内の膜制限区画への、またはこれら細胞内の膜制限区画に結合する、エンドサイトーシスまたは他の適切な取り込み機構によって、周辺の細胞膜よりも内側に見出されるように細胞に取り込まれる内在化の工程の１つをいう。
【００８５】
細胞を各種薬剤に接触させる工程は、都合のよい方法で行われても、所望の方法で行われてもよい。したがって、接触工程がインビトロで行われる場合、細胞は、好都合には、例えば適切な細胞培養培地などの水性媒体中に維持されてもよく、適切な時点において、適切な条件下、例えば適切な濃度で適切な期間、各種薬剤を媒体に容易に加えることができる。例えば、細胞は、血清を含まない培地の存在下で薬剤と接触させてもよいし、血清を含む培地とともに薬剤と接触させてもよい。
【００８６】
以下のコメントでは、各種薬剤を細胞に別々に与えることを論じている。しかしながら、上述したように、これらの薬剤は、細胞に一緒に与えられてもよいし、別々に与えられてもよいし、同時に与えられてもよいし、順次与えられてもよい。本明細書で言及されるように、本発明の方法で用いられる各種薬剤は、インビトロで細胞に与えられてもよいし、インビボで与えられてもよい。後者の場合、以下でより詳細に述べるように、直接投与（すなわち、局所的投与）によって与えられてもよいし、間接投与（すなわち、全身投与または非局所的投与）によって与えられてもよい。
【００８７】
用いられる特定の光感作性薬剤並びに標的細胞の種類および位置などの要因に依存し、
常用の技術を用いて当業者が容易に決定することができる適切な濃度および適切な期間、光感作性薬剤を細胞に接触させる。光感作性薬剤の濃度は、好都合には、光感作性薬剤が、例えば１つ以上の細胞内区画に取り込まれるか、またはこれら細胞内区画に結合するなどにより、細胞に一旦取り込まれ、照射によって活性化した際に、例えば１つ以上の細胞内区画が溶解されるかまたは破壊されるなどにより、１つ以上の細胞構造が破壊されるような濃度である。例えば、本明細書で述べる光感作性薬剤は、例えば１０〜５０μｇ／ｍｌの濃度で用いられてもよい。インビトロでの使用では、その範囲はより広く、例えば０．０００５〜５００μｇ／ｍｌである。インビボでのヒトの治療では、光感作性薬剤は、全身投与の場合、０．０５〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で用いられてもよい。あるいは、全身投与では、０．００５〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で用いられてもよい。例えば、皮内投与、皮下投与、または腫瘍内投与など、局所的に投与される場合には、用量は、１〜５０００μｇの範囲、例えば、１０〜２５００μｇ、２５〜１０００μｇ、５０〜５００μｇ、１０〜３００μｇ、または１００〜３００μｇであってもよい。用量は、好ましくは、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、および２５０μｇから選択される。用量は、好ましくは、７５〜１２５μｇであり、例えば１００μｇである。与えられた用量は、ヒトの平均体重（すなわち７０ｋｇ）あたりのものである。皮内注射では、１回の用量の光増感剤は、１００μｌ〜１ｍｌに溶解されてもよく、すなわち、その濃度は、１〜５００００μｇ／ｍｌの範囲であってもよい。より小型の動物では、局所的に投与する場合に、異なる動物に対して投与を変化させる必要はほとんどないが、濃度範囲は異なっていてもよく、それなりに調節することができる。
【００８８】
用いられる抗原の濃度は、用いられる抗原に依存する。好都合には、インビトロでは、濃度が０．００１〜５００μｇ／ｍｌ（例えば、２０〜５００μｇ／ｍｌ、２０〜３００μｇ／ｍｌ、２０〜１００μｇ／ｍｌ、２０〜５０μｇ／ｍｌ、１０〜５０μｇ／ｍｌ、５〜５０μｇ／ｍｌ、１〜５０μｇ／ｍｌ、０．０１〜５０μｇ／ｍｌ、または０．００１〜５０ μｇ／ｍｌ）の抗原を用いてもよい。ペプチド抗原では、例えば、０．００１
〜５００μｇ／ｍｌなどのより低い濃度、例えば０．００１〜１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、または１００μｇ／ｍｌの濃度を用いてもよい。タンパク質抗原では、０．５〜５００μｇ／ｍｌなどのより高い濃度を用いてもよい。インビボでの使用では、タンパク質抗原の用量は、０．５〜５００μｇ、例えば１０〜１００μｇまたは１０〜２００μｇの範囲であってもよい。ペプチド抗原では、インビボでの用量は、０．１〜４０００μｇが用いられてもよく、例えば０．１〜２０００μｇ、０．１〜１０００μｇ、または０．１〜５００μｇ、例えば０．１〜１００μｇが用いられてもよい。このような用量は、局所的投与に適している。件の薬剤の件の細胞への取り込み効率、および細胞内で達成されることが望まれる終濃度に応じて、適切な濃度を決定することができる。
【００８９】
本明細書で定義されるサイトカインの濃度も、用いられる特定の分子に依存する。インビトロにおいては、好都合には、下記の表に示される濃度が用いられてもよい。局所的投与などのインビボでの用量として、ＧＭ−ＣＳＦについては、５〜５００μｇ、例えば５０〜２５０μｇが用いられてもよく、ＩＦＮ−αについては、５００，０００〜５０，０００，０００ＩＵが用いられてもよい。インビボでの濃度として、ＩＬ−２については５００，０００〜１０，０００，０００ＩＵ／ｋｇ（またはＩＵ／ｍ2）が用いられてもよ
く、ＩＬ−７については１〜５００μｇ／ｋｇ、例えば２０〜５０μｇ／ｋｇが用いられてもよく、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１については１〜１００μｇ／ｋｇ、例えば１０〜５０μｇ／ｋｇが用いられてもよい。
【００９０】
【表２】
2020182486.tif 000024
【００９１】
たいていの場合、光感作性薬剤、抗原分子、および本明細書で定義されるサイトカインは、一緒に投与されるが、そうでなくてもよい。したがって、投与（または細胞との接触）の時間、または形態、または部位が異なっていることが、異なる成分それぞれに対して意図され、このような方法は、本発明の範囲に包含される。
【００９２】
一実施形態において、本明細書で定義されるサイトカインは、例えば別処方において、抗原とは別に投与されるか、または経口投与などによって、抗原とは別に全身投与される。したがって、一実施形態において、サイトカインは、抗原および／または光増感剤の投与よりも先に、例えば２４時間前に、投与されてもよい。
【００９３】
サイトカインは、例えば照射の約２時間前に、他の薬剤とは別に投与されてもよい。別の実施形態において、薬剤は、抗原と一緒に、または抗原と同じ時間に、すなわち同時に、投与されてもよい。
【００９４】
細胞と光感作性薬剤、および／または抗原分子、および／または本明細書で定義されるサイトカインとの接触は、好都合には、１５分〜２４時間行われ、例えば３０分〜４時間、好ましくは１．５〜２．５時間行われる。あるいは、時間範囲は、約１時間〜約４８時間であってもよく、例えば１２時間〜３０時間、１６時間〜２０時間などの約２時間〜約４０時間または約６時間〜約３６時間であってもよく、例えば１８時間または約１８時間であってもよい。
【００９５】
好ましい実施形態において、細胞は、初めに、光感作性薬剤とともにインキュベートされる。一実施形態において、光感作性薬剤の投与と抗原分子および／またはサイトカインの投与との間の時間は、数時間である。例えば、光感作性薬剤は、照射の１６〜２０時間前、例えば１８時間前に与えられてもよく、抗原分子および／またはサイトカインは、照射の１〜３時間前、例えば２時間前に与えられてもよい。したがって、光感作性薬剤の投与と抗原分子および／またはサイトカインの投与との間の時間は、１５〜２３時間の範囲であってもよい。
【００９６】
したがって、細胞は、光増感剤とインキュベートされた後、続いて抗原および／または本明細書で定義されるサイトカインとともにインキュベートされる。好都合には、光増感剤／抗原との接触後、照射までの間、光増感剤および抗原分子およびサイトカインとのインキュベートのタイミングに応じて、例えば１．５時間〜２．５時間などの３０分〜４時間、細胞を光増感剤／抗原非含有媒体に入れてもよい。
【００９７】
インビボにおいて、各種薬剤を標的細胞と接触させる適切な方法およびインキュベート時間は、用いられる薬剤の投与形態および種類などの要因に依存する。例えば、治療／照
射される腫瘍、組織、または器官に、薬剤を注射する場合、注射地点付近の細胞は、注射地点から遠く離れた細胞よりも速く、薬剤と接触してこれを取り込む傾向があり、これら注射地点から離れた細胞は、より遅い時点で低濃度の薬剤と接触することになる。時間としては、好都合には、６〜２４時間が用いられる。
【００９８】
さらに、静脈注射によって投与された薬剤、または経口投与された薬剤は、標的細胞に到達するまでに時間がかかる場合があり、したがって、十分な量、または最適な量の薬剤が標的細胞または標的組織に蓄積するためには、投与後長く、例えば数日、かかる場合がある。したがって、インビボにおいて個々の細胞に必要な投与時間は、これらのパラメータおよび他のパラメータに応じて変化しやすい。
【００９９】
しかしながら、インビボでの状況は、インビトロよりも複雑ではあるが、本発明の基本的概念は、なお同じである。すなわち、分子が標的細胞と接触する時間は、照射が行われる前に、適切な量の光感作性薬剤が標的細胞によって取り込まれ、かつ（ｉ）照射前または照射中に、細胞内、例えば光感作性薬剤と同じ細胞内区画または異なる細胞内区画に、抗原分子（および、必要に応じてサイトカイン）がすでに取り込まれているか、または標的細胞と十分に接触してから取り込まれる、あるいは（ｉｉ）照射後に、抗原分子（および、必要に応じてサイトカイン）が細胞に取り込まれるのに十分な期間、細胞と接触する、ような時間でなければならない。
【０１００】
本明細書で述べる薬剤のインビボでの投与では、当該技術分野において一般的な投与形態または標準的な投与形態であれば、例えば、体内面および体外面両方への、注射、点滴、局所的投与、経皮投与など、どのような形態を用いてもよい。インビボでの使用では、本発明は、光感作性薬剤を含む化合物または内在化される分子が局在化する細胞を含む組織であれば、体液部および固形組織など、どのような組織に対しても用いることができる。標的細胞によって光増感剤が取り込まれ、かつ光を適切に届けることができる限り、全ての組織を治療することができる。好ましい投与形態は、皮内投与または皮内注射、皮下投与または皮下注射、局所的投与または局所的注射、あるいは腫瘍内投与または腫瘍内注射である。投与は、好ましくは、皮内注射によって行われる。
【０１０１】
抗原提示、免疫応答の発生、または予防接種など、所望の結果を達成するために、本方法またはその一部が繰り返されてもよく、例えば、「再接種」が行われてもよい。したがって、適切な間隔を空けた後、本方法の全体をそのまま複数回（例えば、２回、３回、またはそれ以上）行ってもよいし、例えば本明細書で定義されるサイトカインをさらに投与する、または照射工程を追加するなど、本方法の一部を繰り返してもよい。例えば、本方法または本方法の一部を、最初に行ってから、数日後、例えば７〜２０日後などの５〜６０日後（７日後、１４日後、１５日後、２１日後、２２日後、４２日後、または５１日後など）、好ましくは１４日後に再び行ってもよいし、数週間後、例えば１〜５週間後（１週間後、２週間後、３週間後、または４週間後など）に、再び行ってもよい。適切な間隔を空けて、例えば２週間毎、つまり１４日毎に、本方法の全てまたは一部を複数回繰り返してもよい。好ましい実施形態において、本方法は、少なくとも１回繰り返される。別の実施形態において、本方法は２回繰り返される。
【０１０２】
一実施形態において、２回目またはその次に本方法を実施する際に、抗原分子が、光増感剤とともに投与されて照射を受ける。すなわち、２回目またはその次に本方法を実施する際には、サイトカインは投与されない。
【０１０３】
アジュバント（例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ））が用いられる本方法の実施形態において、２回目またはその次に本方法を実施する際に、抗原分子が、光増感剤とともに投与されて照射を受けてもよい。すなわち、２回目またはその次に本方法を実施する際には、アジュバ
ントは投与されない。この場合、サイトカインは、２回目またはその次に本方法を実施する際に、存在していてもよいし、存在していなくてもよい。
【０１０４】
別の実施形態において、本発明の方法が実施される前に、本発明の方法の一部を実施してもよい。例えば、本発明の方法を実施する前に、サイトカイン非存在下で、本方法を１回以上、例えば２回、実施してもよい。あるいは、本発明の方法を実施する前に、光増感剤非存在下で照射を行わずに、本方法を１回以上、例えば２回、実施してもよい。本発明の方法を実施する数日前、例えば７日前または１４日前に、本方法の一部を実施してもよいし、数週間前、例えば１週間、３週間、または４週間前に、実施してもよい。本発明の方法が実施される前に、このような間隔を空けて、１回以上本方法の一部を繰り返してもよい。したがって、好ましい態様において、抗原分子は、（例えば、上述した間隔を空けて）２回以上（例えば、被験体に）投与され、少なくとも該抗原分子の投与は、本発明の方法にしたがって行われる。
【０１０５】
光感作性薬剤を活性化する「照射」とは、以下に述べるように直接的または間接的に光をあてることをいう。したがって、被験体または細胞は、例えば、直接的に（例えばインビトロで細胞それぞれに）光源から照射を受けてもよいし、細胞が皮膚の表面下にある場合、または全ての細胞が直接的に照射されるわけではない、すなわち全ての細胞が他の細胞に遮蔽されているわけではない細胞層の形態である場合に、例えばインビボにおいて、間接的に光源から照射を受けてもよい。細胞または被験体の照射は、光感作性薬剤、抗原分子、および本明細書で定義されるサイトカインが投与されてから、約１８〜２４時間後に行われてもよい。
【０１０６】
光感作性薬剤を活性化する光照射工程は、当該技術分野において周知である技術および手順にしたがって行われてもよい。用いられる光の波長は、用いられる光感作性薬剤に応じて選択される。当該技術分野において、適切な人工光源がよく知られており、例えば青色波長光（４００〜４７５ｎｍ）または赤色波長光（６２０〜７５０ｎｍ）を用いる。例えば、ＴＰＣＳ2aでは、４００〜５００ｎｍの波長、より好ましくは４３０〜４４０ｎｍなどの４００〜４５０ｎｍの波長、さらに好ましくは約４３５ｎｍの波長または４３５ｎｍの波長が用いられてもよい。適切である場合は、ポルフィリンまたはクロリンなどの光増感剤は、緑色光によって活性化されてもよく、例えば、キラーレッド（KillerRed）（
エブロゲン社（Evrogen）、モスクワ、ロシア）光増感剤は、緑色光で活性化されてもよ
い。
【０１０７】
当該技術分野において適切な光源がよく知られており、例えば、ＰＣＩバイオテクＡＳ社（PCI Biotech AS）のルミソース（LumiSource）（登録商標）ランプが挙げられる。あるいは、６０ｍＷ以下の調節可能な出力電源を有し、発光スペクトルが４３０〜４３５ｎｍであるＬＥＤ系照明装置を用いてもよい。赤色光では、適切な光源は、ＰＣＩバイオテクＡＳ社（PCI Biotech AS）の６５２ｎｍレーザーシステム ＳＮ５７６００３ダイオー
ドレーザーであるが、適切な赤色光源であればどのようなものを用いてもよい。
【０１０８】
本発明の方法において、細胞に光をあてる時間は、様々であってよい。そこを超えると細胞障害、ひいては細胞死が増加する最大限までは、光をあてる時間を増加させるにつれて、分子のサイトゾルへの内在化の効率は上昇する。
【０１０９】
照射工程の好ましい時間は、標的、光増感剤、標的細胞または標的組織に蓄積される光増感剤の量、および光増感剤の吸収スペクトルと光源の発光スペクトルとの重なりなどの要因に依存する。一般的には、照射工程の時間は、秒から分のオーダー、または数時間以下（さらには１２時間以下）であり、例えば、好ましくは６０分以下であり、例えば０．２５分〜３０分または１分〜３０分であり、例えば０．５〜３分または１〜５分または１
〜１０分であり、例えば３〜７分であり、好ましくは約３分であり、例えば２．５〜３．５分である。より短い照射時間が用いられてもよく、例えば１〜６０秒であり、１０〜５０秒、２０〜４０秒、または２５〜３５秒などである。
【０１１０】
当業者であれば、適切な光照射量を選択することができ、あらためて、光照射量は、用いられる光増感剤、および標的細胞または標的組織に蓄積される光増感剤の量に依存している。可視スペクトルの吸光係数（用いられる光増感剤に応じて、例えば、赤色領域における吸光係数、または青色光を用いる場合は青色領域における吸光係数）の高い光増感剤を用いる場合は、光照射量は通常低い。例えば、６０ｍＷ以下の調節可能な出力電源を有し、発光スペクトルが４３０〜４３５ｎｍであるＬＥＤ系照明装置を用いる場合、フルエンスが０．０５〜２０ｍＷ／ｃｍ2の範囲、例えば２．０ｍＷ／ｃｍ2で、０．２４〜７．２Ｊ／ｃｍ2の範囲の光照射量が用いられてもよい。あるいは、例えばルミソース（LumiSource）（登録商標）ランプを用いる場合、フルエンスが０．１〜２０ｍＷ／ｃｍ2（例えば、ルミソース（LumiSource）（登録商標）では１３ｍＷ／ｃｍ2）の範囲で、０．１〜
６Ｊ／ｃｍ2の範囲の光照射量が適切である。赤色光では、フルエンスが０．５〜５ｍＷ
／ｃｍ2の範囲、例えば０．８１ｍＷ／ｃｍ2で、０．０３〜１Ｊ／ｃｍ2の範囲、例えば
０．３Ｊ／ｃｍ2の光照射量が用いられてもよい。
【０１１１】
さらに、細胞の生存率を維持しようとする場合は、過剰なレベルの毒性種の生成は避けられるべきであり、関連するパラメータがそれに応じて調整されてもよい。
【０１１２】
本発明の方法は、光化学的処理によって、すなわち、光感作性薬剤が活性化する際に毒性種が生成することによる光力学的な治療効果によって、不可避的にいくらかの細胞障害を引き起こす場合がある。提案された使用によっては、この細胞死は重大ではないかもしれず、ある用途（例えば、癌の治療）においては、実際のところ有利であるかもしれない。しかしながら、たいていの実施形態において、提示細胞に免疫応答を起こさせるために、細胞死は回避される。本発明の方法は、光感作性薬剤の濃度に対応して光照射量を選択することによって、生存細胞の割合または比率が調節されるように変更されてもよい。あらためて、当該技術分野において、このような技術は知られている。
【０１１３】
好ましくは、実質的に全ての細胞、またはかなり大多数の細胞（例えば、少なくとも７５％の細胞、より好ましくは、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の細胞）が殺されない。インビトロでは、ＭＴＳ試験などの、当該技術分野において公知の標準的な技術によって、ＰＣＩ処理後の細胞の生存率を測定することができる。インビボでは、１種類以上の細胞の細胞死を、投与地点の半径１ｃｍ以内で（または組織のある深さにおいて）、例えば検鏡によって評価してもよい。細胞死は、直ちには起こらない場合があるので、％細胞死は、照射後数時間以内（例えば照射後４時間以内）に生存している細胞の割合をいうが、好ましくは照射から４時間以上経過後の％生存細胞をいう。
【０１１４】
本方法は、インビボ、インビトロ、またはエキソビボで行われてもよい。本方法は、好ましくは、インビボでの投与のための細胞を産生するためにインビトロまたはエキソビボで用いられるか、または本方法はインビボで用いられる。したがって、好ましい特徴において、本方法を用いて、被験体の免疫応答を起こしてもよい。
【０１１５】
したがって、さらなる態様において、本発明は、被験体の免疫応答を起こす方法を提供する。該方法は、抗原分子、光感作性薬剤、および上記定義されるサイトカインを被験体に投与すること、並びに、光感作性薬剤を活性化させるのに有効な波長の光を被験体に照射すること、を含み、免疫応答が引き起こされる方法である。
【０１１６】
引き起こされ得る「免疫応答」は、体液性免疫および細胞媒介性免疫であってもよく、
例えば、抗体産生の刺激や、あるいは表面に「外部」抗原を発現する細胞を認識し破壊（そうでなければ排除）し得る細胞障害性細胞またはキラー細胞の刺激であってもよい。したがって、「免疫応答を刺激する」なる用語は、全ての種類の免疫応答、および免疫応答を刺激する全ての種類の機構を含み、本発明の好ましい態様を形成するＣＴＬを刺激することを包含する。刺激される免疫応答は、好ましくは、細胞障害性ＣＤ８ Ｔ細胞である
。免疫応答の程度は、免疫応答のマーカー、例えば、ＩＬ−２またはＩＦＮγなどの分泌された分子によって、または抗原特異的Ｔ細胞の産生によって、評価されてもよい（例えば、実施例で述べるように評価されてもよい）。
【０１１７】
細胞障害性細胞または抗体産生細胞の刺激には、抗原提示細胞によって、例えばＭＨＣクラスＩ提示などの特定の様式で、刺激される細胞に対して抗原が提示されることが必要である（例えば、ＣＤ８+細胞障害性Ｔ細胞の活性化にはＭＨＣ−Ｉ抗原提示が必要であ
る）。免疫応答は、好ましくは、ＭＨＣ−Ｉ提示を介して刺激される。
【０１１８】
免疫応答を用いて、好ましくは、癌などの疾患、障害、または感染を治療または予防する。本明細書で述べる方法および使用において、癌は、黒色腫であってもよい。別の実施形態において、癌は、黒色腫ではない癌であってもよい。
【０１１９】
本方法は、好ましくは、予防接種に用いられる。本明細書で言及される「予防接種」は、疾患、障害、または感染の発症（またはさらなる進展）に対して予防効果または治療効果を有する免疫応答を誘起するための抗原（または抗原を含有する分子）の使用であり、その疾患、障害、または感染は、その抗原の異常な発現または異常な存在と関連している。好ましくは、疾患は癌である（予防接種は治療用）か、または、免疫応答が感染によって引き起こされる（予防接種は予防用）。
【０１２０】
本発明の好ましい実施形態において、本方法、例えば予防接種の被験体は非哺乳動物（例えば、魚類）または哺乳類であり、好ましくは、ネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットであるが、最も好ましくは、被験体はヒトである。
【０１２１】
本明細書で述べる方法は、好ましくは、相乗効果を達成する。すなわち、（ｉ）サイトカイン非存在下で抗原分子を用いて本方法を行うことによって観察される増強と、（ｉｉ）光感作性薬剤非存在下で照射工程を行わずに抗原分子を用いて本方法を行うことによって観察される増強と、を合わせた分よりも、細胞表面における提示または引き起こされた免疫応答の程度が増強される、つまり、本方法の間で相乗効果が観察される。細胞表面における提示または引き起こされた免疫応答のレベルは、適切な手段、例えば、抗原特異的ＣＤ８＋細胞の数、またはＩＦＮγまたはＩＬ−２などの免疫応答活性化マーカーのレベルによって、評価されてもよい。
【０１２２】
本明細書で用いられる「相乗効果」とは、単なる相加効果を越える量的な改善をいう。
【０１２３】
本発明の方法で用いられる各種薬剤は、被験体に対して、別々に投与されてもよいし、順次投与されてもよいし、同時に投与されてもよい。
【０１２４】
抗原分子または抗原分子の一部を細胞表面に発現する本発明の方法に関する上述した態様および特徴は、適切である場合は、上記の免疫応答を起こす方法にも適用することができる。
【０１２５】
本発明は、細胞のサイトゾルに抗原分子を導入する方法を提供する。該方法は、導入される抗原分子、光感作性薬剤、および本明細書で定義されるサイトカインと細胞を接触さ
せること、並びに、光感作性薬剤を活性化するのに有効な波長の光を細胞に照射すること、を含む。一旦活性化されると、前記化合物を含む細胞内の細胞内区画は、これら区画に含まれる分子をサイトゾルへ放出する。
【０１２６】
例えば、インサイチュ（in situ）での治療またはエキソビボでの治療のいずれかを行
うために、上記本発明の方法をインビトロまたはインビボで用いた後に、処理後の細胞を体内に投与してもよい。
【０１２７】
本発明は、さらに、表面に抗原分子または抗原分子の一部を発現する細胞、またはその細胞群を提供する。ここで、細胞は、本明細書で定義される方法のいずれかによって得ることができるもの（または得られたもの）である。また、以下で述べる予防または治療に用いる細胞または細胞集団も提供される。
【０１２８】
細胞集団は、１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を他に含む医薬組成物に提供されてもよい。
【０１２９】
本発明は、抗原分子、光感作性薬剤、および本明細書で定義されるサイトカイン、並びに１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む医薬組成物も提供する。
【０１３０】
これらの組成物（および本発明の製品）は、薬学分野において公知の技術および手順にしたがう簡便な様式であればどのような様式で処方されてもよく、例えば、１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤が用いられる。本明細書で言及される「薬学的に許容される」とは、組成物（または製品）の他の成分と共存し、さらに受容者に生理学的に許容される成分をいう。組成物および担体または賦形剤材料の性質、用量などは、投与の選択肢およびその所望の経路、治療目的などにしたがって、常用の様式で選択されてもよい。用量は、同様に、常用の様式で決定されてもよいし、分子（あるいは、組成物または製品の成分）の性質、治療目的、患者の年齢、投与形態などに応じて決定されてもよい。光感作性薬剤に関しては、照射時に膜を破壊する効力／能力も考慮されるべきである。
【０１３１】
例えば抗原提示細胞などの細胞は、インビトロで調製されてもよい。治療法において、これらの細胞は、該細胞が、例えば予防目的または治療目的で、免疫応答を刺激し得るように、インビボで体内に投与されてもよいし、エキソビボで体組織に投与されてもよい。
【０１３２】
したがって、本発明は、予防または治療に用いるための、または例えば予防接種の目的で、免疫応答を刺激するのに用いるための、例えば、被験体のＣＴＬを刺激する、好ましくは被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防する、特に癌を治療または予防する、本明細書で定義される細胞集団（またはこれを含む組成物）、または抗原分子、光感作性薬剤、および本明細書で定義されるサイトカインをさらに提供する。別の定義では、本発明は、被験体の免疫応答を刺激する（例えばＣＴＬを刺激する）のに用いられる薬物を調製するための、好ましくは被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防するための、また好ましくは予防接種のため、かつ／または癌を治療または予防するための、（ｉ）細胞集団、（ｉｉ）本明細書で定義される組成物、または（ｉｉｉ）抗原分子および／または光感作性薬剤および／またはサイトカイン、の使用を提供し、前記免疫応答は、好ましくは、本明細書で定義される方法によって刺激される。
【０１３３】
前記刺激、前記治療、または前記予防は、好ましくは、前記薬物を前記被験体に投与することを含む。
【０１３４】
抗原分子、光感作性薬剤、およびサイトカインは、一体にして組成物に提供されてもよい。別の表現では、本発明は、免疫応答を刺激する（例えば、被験体のＣＴＬを刺激する）、好ましくは被験体の疾患、障害、感染を治療または予防する、特に予防接種を目的とする、薬物の製造における、抗原分子および／または光感作性薬剤および／または本明細書で定義されるサイトカインの使用を提供する。前記薬物は、被験体への投与のために、細胞表面に抗原分子または抗原分子の一部を発現する、本明細書で定義される方法によって得ることができる細胞の集団を含む。細胞集団は、好ましくは、このような方法で得られる。細胞集団は、被験体へ投与するためのものである。
【０１３５】
別の実施形態において、本発明は、被験体の免疫応答を刺激する（例えば、ＣＴＬを刺激する）ために、好ましくは被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防するために、抗原分子または抗原分子の一部を細胞表面に発現するのに用いる、抗原分子、光感作性薬剤、および本明細書で定義されるサイトカインを提供する。前記使用は、好ましくは樹状細胞などの細胞の集団を調製するための、本明細書で定義される方法を含む。これらの細胞は、その後、被験体に投与されてもよい。
【０１３６】
本発明は、さらに、抗原分子、光感作性薬剤、および本明細書で定義されるサイトカインを含む製品を、本明細書で定義される方法において、被験体の免疫応答を刺激する（つまり、抗原分子または抗原分子の一部を細胞表面に発現させる、または抗原分子を細胞のサイトゾルへ内在化させる）のに、同時に、別々に、または順次用いるための、好ましくは被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防するための、複合製剤として提供する。
【０１３７】
本発明は、また、被験体の免疫応答を刺激するのに用いるための、好ましくは被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防するためのキットであって、例えば、本明細書で定義される方法において、予防接種または免疫化に用いるための、あるいは抗原分子または抗原分子の一部を細胞表面に発現させるか、または抗原分子を細胞のサイトゾルへ内在化させるためのキットも提供する。該キットは、本明細書で定義される光感作性薬剤を含む第１の容器と、本明細書で定義される上記抗原分子を含む第２の容器と、本明細書で定義されるサイトカインを含む第３の容器と、を含む。
【０１３８】
本発明の製品およびキットを用いて、本明細書で定義される細胞表面提示（または治療法）が達成されてもよい。
【０１３９】
またさらなる実施形態において、本発明は、被験体の免疫応答を起こす（例えばＣＴＬを刺激する）ための、好ましくは被験体の疾患、障害、または感染を治療または予防するための方法を提供する。該方法は、本明細書で定義される方法にしたがって細胞集団を調製すること、および、それに続いて細胞を被験体に投与すること、を含む。
【０１４０】
本発明によって達成される抗原提示は、有利には、処理された細胞がインビボで投与される場合に、免疫応答の刺激をもたらしてもよい。好ましくは、抗原分子または抗原分子の一部の含有体または包含体による次の攻撃に対する防御を付与する免疫応答が引き起こされ、その結果、本発明は、予防接種の方法としての特別な有用性が見出される。
【０１４１】
疾患、障害、または感染は、免疫応答が引き起こされること、例えば、正常細胞からの区別（および除去）を可能にする抗原（またはその発現レベル）に基づいて認識され得る異常細胞または外部細胞を除去することによって、治療または予防され得る疾患、障害、または感染である。用いられる抗原分子の選択によって、治療される疾患、障害、または感染が決定される。上述した抗原分子に基づいて、本明細書で述べる方法、使用、組成物、製品、キットなどを用いて、例えば、感染（上述したウイルス感染または細菌感染など
）、癌、または多発性硬化症などを治療または予防してもよい。このような疾患、障害、または感染の予防が、予防接種を構成してもよい。
【０１４２】
本明細書で定義される「治療」とは、治療中の疾患、障害、または感染の１つ以上の症状を、治療前の症状に比べて、低減、緩和、または除去することをいう。「予防」（または、予防法）とは、疾患、障害、感染の発症を遅らせる、または防止することをいう。予防は、絶対的（疾患が全く発症しない）であってもよいし、一部の個人に対してのみ、または限られた期間においてのみ、有効なものであってもよい。
【０１４３】
インビボでの細胞の投与では、当該技術分野において一般的であるかまたは標準的である細胞集団の投与形態であれば、どのような形態を用いてもよく、例えば、注射または点滴が適切な経路で用いられる。細胞は、好都合には、リンパ内注射によって投与される。好ましくは、被検体１ｋｇあたり、１×１０4〜１×１０8個の細胞が投与される（例えば、ヒトでは１ｋｇあたり１．４×１０4〜２．８×１０6個）。したがって、例えば、ヒトでは、１回の服用で、すなわち、例えば予防接種１回の服用量として１回あたり、０．１×１０7〜２０×１０7個の用量の細胞を投与してもよい。必要であれば、この用量を後で繰り返すこともできる。
【０１４４】
次に、本発明を、以下の限定されない実施例において、以下の図面を参照してより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１−１】図１は、スキーム１：化合物５を合成するための合成経路を示す。試薬および条件：（ａ）プロピオン酸、還流、１時間（２０％）；（ｂ）ＮａＮＯ2（１．８ｅｑ）、ＴＦＡ、室温（rt）、３分（６７％）；（ｃ）ＳｎＣｌ2．２Ｈ2Ｏ、濃縮ＨＣｌ、６０℃、１時間（８８％）；（ｄ）ブロモアセチルブロミド、Ｅｔ3Ｎ、ＣＨ2Ｃｌ2、室温、１時間（６４％）；（ｅ）ピペラジン、ＣＨ2Ｃｌ2、室温、１時間（９４％）。
【図１−２】スキーム２は、Ｎ改変キトサン誘導体（ＴＰＰ−ＣＳ−ＴＭＡおよびＴＰＰ−ＣＳ−ＭＰ）の合成を示す。ここで、Ａは第１バッチの化合物を表し、Ｂは第２バッチの化合物を表す。試薬および条件：（ａ）ＭｅＳＯ3Ｈ／Ｈ2Ｏ、１０℃〜室温、１時間、（９０%）；（ｂ）ＴＢＤＭＳＣｌ、イミダゾール、ＤＭＳＯ、室温、２４時間（９６％）；（ｃ）ブロモアセチルブロミド、Ｅｔ3Ｎ、ＣＨ2Ｃｌ2、−２０℃、１時間（９２％）；（ｄ）化合物５すなわちＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐ（０．１ｅｑまたは０．２５ｅｑ）、Ｅｔ3Ｎ、ＣＨＣｌ3、室温、２時間（９２〜９０％）；（ｅ）ＮＭｅ3または１−メチルピペラジン、ＣＨＣｌ3、室温、２４時間；（ｆ）ＴＢＡＦ、ＮＭＰ、５５℃、２４時間または濃縮ＨＣｌ／ＭｅＯＨ、室温、２４時間。
【図１−３】スキーム３は、化合物１、３、２０および２１の合成スキームを示す。反応および条件：（ａ）プロピオン酸、還流、１時間、（２０％）；（ｂ）ＮａＮＯ2（１．８ｅｑ）、ＴＦＡ、室温、３分；（ｃ）ＳｎＣｌ2．２Ｈ2Ｏ、ｃｏｎｃ．ＨＣｌ、６０℃、１時間、（５４％）；（ｄ1）ｐ−トルエンスルホニルヒドラジド、Ｋ2ＣＯ3、ピリジン、還流、２４時間；（ｄ2）ｏ−クロラニル、ＣＨ2Ｃｌ2、室温、（８０％）；（ｅ）クロロアセチルクロリド、Ｅｔ3Ｎ、ＣＨ2Ｃｌ2、室温、２時間、in situ；（ｆ）ピペラジン、ＣＨ2Ｃｌ2、室温、１２時間、（６１％）。化合物２０および２１の誘導体は全て、ＴＰＣａ1およびＴＰＣａ2の異性体を含む。しかしながら、スキームおよび構造図には、ＴＰＣａ1の構造のみを示している。
【図１−４】スキーム４は、化合物２２〜２８の合成スキームを示す。反応および条件：（ａ）塩化アセチル、ＭｅＯＨ、還流、２４時間、（８７％）；（ｂ）ＢＦ3．Ｅｔ2Ｏ、ＣＨＣｌ3、室温、ｐ−クロラニル、４８時間（１４％）；（ｃ）２Ｎ ＫＯＨ（ＭｅＯＨ中）、ＴＨＦ：ピリジン（１０：１）、還流、２４時間（７１％）；（ｄ1）ｐ−トルエンスルホニルヒドラジド、Ｋ2ＣＯ3、ピリジン、還流、２４時間（ｄ2）ｏ−クロラニル、ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ（７５：２５）、室温（７０％）；（ｅ）ＥＤＣＩ．ＨＣｌ、ＨＯＢＴ、Ｅｔ3Ｎ、Ｎ−Ｂｏｃ−ピペラジン５、ＤＭＦ、室温、２４時間（５４％）；（ｆ）ＴＦＡ、ＣＨ2Ｃｌ2、室温、１時間（８９％）。化合物２６〜２８の誘導体は全て、ＴＰＣｃ1およびＴＰＣｃ2の異性体を含む。しかしながら、スキームおよび構造図には、ＴＰＣｃ1の構造のみを示している。
【図１−５】スキーム５Ａおよび５Ｂ。試薬および条件（６Ａ）：（ａ）化合物２１すなわちＴＰＣ−ＮＨ−Ｐｉｐ（０．１ｅｑ）、Ｅｔ3Ｎ、ＣＨＣｌ3、室温、２時間（７８％）；（ｂ）ＮＭｅ3または１−メチルピペラジン、ＣＨＣｌ3、室温、２４時間。試薬および条件（６ｂ）：（ａ）化合物２８すなわちＴＰＣ−ＣＯ−Ｐｉｐ（０．１ｅｑ）、Ｅｔ3Ｎ、ＮＭＰ、７５℃、１２時間（８９％）；（ｂ）ＮＭｅ3または１−メチルピペラジン、ＣＨＣｌ3、室温、２４時間。
【図２】図２は、アジュバント（adjuvant）としてのＧＭ−ＣＳＦの効果を示す。マウスを、１０μｇのＯＶＡ；１０μｇのＯＶＡおよび１０μｇのＧＭ−ＣＳＦ；１０μｇのＯＶＡおよび１５０μｇのＴＰＣＳ2a；または１０μｇのＯＶＡ、１０μｇのＧＭ−ＣＳＦ、および１５０μｇのＴＰＣＳ2a、を用いて免疫化するか、または未処理のままとした。ＴＰＣＳ2aを与えたマウスには、照射を行った。７日目にマウスから採血し、フローサイトメトリーによって、ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の度数を解析した。（Ａ）は、フローサイトメトリー解析の代表的なドットプロットを示す。まず、細胞を、ＣＤ８の発現についてゲーティングし、ＳＩＩＮＦＥＫＬペンタマー結合（ｙ軸）およびＣＤ４４の発現（ｘ軸）について、ＣＤ８+集団を解析した。したがって、楕円内の集団は、ＣＤ８+、ペンタマー+、ＣＤ４４+である細胞を表し、これは、抗原特異的（ペンタマー結合性）かつ活性化された（ＣＤ４４の発現）ＣＤ８+細胞である。（Ｂ）は実験群の平均値（全ＣＤ８＋細胞に対する抗原特異的ＣＤ４４+細胞の％）を示す（各群５匹、エラーバーは平均値の標準誤差）。
【図３】図３は、ＨＰＶ １６ Ｅ７ペプチド抗原を用いたマウスの予防接種に対するＧＭ−ＣＳＦの効果を示す。マウスは、ＰＣＩの有無は問わず、ＨＰＶのみまたはＨＰＶとＧＭ−ＣＳＦを用いて免疫化した。図は、全ＣＤ８細胞のうちＨＰＶペンタマーを発現したものの％を示す。
【図４】図４は、必要に応じてポリ（ＩＣ）を用いた場合の、ＨＰＶ １６ Ｅ７ペプチド抗原を用いたマウスの予防接種に対するＧＭ−ＣＳＦの効果を示す。マウスは、図に示すように、ＰＣＩの有無は問わず、ＨＰＶ、ポリ（ＩＣ）、および／またはＧＭ−ＣＳＦを用いて免疫化した。図中最後の棒グラフ２つで示す結果では、免疫化を２回行った。図は、全ＣＤ８細胞のうちＨＰＶペンタマーを発現したものの％を示す。
【実施例】
【０１４６】
実施例
実施例１：インビボでのＯＶＡの接種に対するサイトカインの効果
材料および方法
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ハーラン社（Harlan）（ホルスト、オランダ）から購入する。オボアルブミン（ＯＶＡ）のＭＨＣクラスＩ制限エピトープＯＶＡ257-264を認識する
Ｔ細胞受容体についてトランスジェニックであるＯＴ−Ｉマウスを、チューリッヒ大学の施設内で飼育する（もともとは、タコニック・ヨーロッパ（Taconic Europe）（リュー、デンマーク）から購入）。全てのマウスは、特定病原体を除去した（ＳＰＦ）条件下で飼育し、行った手順は、スイス家畜当局によって承認されている。ＯＴ−１マウスにおいて、Ｔ細胞受容体の遺伝子は、これらのマウスのＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＯＴ−１細胞と呼ぶ）
のほぼ全てが、オボアルブミン（ＯＶＡ）抗原の特定のペプチドエピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を特異的に認識するように設計される。
【０１４７】
免疫化のプロトコール
０日目に、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に、Ｒａｇ２／ＯＴ−１マウスの脾細胞１．５×１０6個を静脈注射する。このように、接種されたマウスは、ＯＶＡのＳＩＩＮ
ＦＥＫＬエピトープが、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩで適切に提示された場合に限り、ＯＶＡのＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープに応答することができるＣＤ８ Ｔ細胞の「バック
グラウンド」を有する。したがって、ＯＴ−１細胞を移植することによって、接種されたマウスにおける検出システムが「増強」され、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞並びにＩＦＮ
−γおよびＩＬ−２の産生を測定することによって、インビボでの接種の効果を容易に分析することが可能になる。
４時間後に、動物の腹腔に皮内接種を行う（以下に明示される成分を含む溶液を２×５０ μｌ）。４匹ずつの１４群に対し、以下の全用量を与える。
１群：２５０μｇ ＴＰＣＳ2a（アンフィネックス（Amphinex））＋１０μｇ オボアルブミン（ＯＶＡ、グレードＶ、シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich））
２群：２５０μｇ ＴＰＣＳ2a＋１０μｇ オボアルブミン＋１０μｇ ＧＭ−ＣＳＦ
３群：２５０μｇ ＴＰＣＳ2a＋１０μｇ オボアルブミン＋５０００００ＩＵ ＩＬ
−２
４群：２５０μｇ ＴＰＣＳ2a＋１０μｇ オボアルブミン＋１０μｇ ＩＬ−７
５群：２５０μｇ ＴＰＣＳ2a＋１０μｇ オボアルブミン＋１０μｇ ＩＬ−１５
６群：２５０μｇ ＴＰＣＳ2a＋１０μｇ オボアルブミン＋１０μｇ ＩＬ−２１
７群：２５０μｇ ＴＰＣＳ2a＋１０μｇ オボアルブミン＋３，０００，０００ＩＵ
ＩＦＮα
８群：１０μｇ オボアルブミン
９群：１０μｇ オボアルブミン＋２５μｇ ＧＭ−ＣＳＦ
１０群：１０μｇ オボアルブミン＋５００，０００ＩＵ ＩＬ−２
１１群：１０μｇ オボアルブミン＋１０μｇ ＩＬ−７
１２群：１０μｇ オボアルブミン＋１０μｇ ＩＬ−１５
１３群：１０μｇ オボアルブミン＋１０μｇ ＩＬ−２１
１４群：１０μｇ オボアルブミン＋３，０００，０００ＩＵ ＩＦＮα
１日目に、１〜７群の動物に麻酔をかけ、ルミソース（LumiSource）ランプ（ＰＣＩバイオテクＡＳ社（PCI Biotech AS））を用いて、青色光を６分間照射する。抗原溶液を注射してから約１８時間後に動物に照射を行う。照射のフルエンス率は、約１３ｍＷ／ｃｍ2である。７日目に、マウスの尾静脈から採血し、フローサイトメトリー解析（下記プロ
トコール参照）のために、血液細胞をＳＩＩＮＦＥＫＬペンタマー（プロイミューン社（ProImmune））、ＣＤ８抗体、およびＣＤ４４抗体で染色する。１４日目に、マウスを安
楽死させ、脾臓を採取する。脾細胞の一定分量をＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（ＥＭＣマイクロコレクション社（EMC microcollections）、テュービンゲン、ドイツ）で再刺激し、細胞内ＩＦＮ−γの発現を見るために染色し、フローサイトメトリー解析によって解析する（以下参照）。脾細胞の別の一定分量を細胞培養液に再懸濁し、再刺激を行わずにこの培地中で一晩（単に、実施上の理由のため）おき、上述のようにＳＩＩＮＦＥＫＬペンタマーで染色して、フローサイトメトリーによって解析する（下記プロトコール参照）。
【０１４８】
脾臓細胞のＳＩＩＮＦＥＫＬペンタマー染色
細胞培地に再懸濁し、再刺激を行わずにこの培地中で一晩（単に、実施上の理由のため）おいた細胞に対して、脾臓細胞に対するＳＩＩＮＦＥＫＬペンタマー染色およびフローサイトメトリーを行う。
【０１４９】
ＳＩＩＮＦＥＫＬペンタマー染色およびフローサイトメトリー
尾から、全血を５〜１０滴採取し、赤血球溶解溶液（シグマ社（Sigma））を０．５ｍ
ｌ加える。５〜６分後、細胞を遠沈させ、０．５ｍｌのＰＢＳで２回洗浄する。細胞ペレットをＦＡＣＳバッファー（０．０１％ アジ化ナトリウムを含む２％ ＦＣＳ／ＰＢＳ）に再懸濁し、Ｕ型の９６穴プレートに移し、氷上で１０分間、ＦｃＲ阻止抗体（１．０μ
ｌ 抗ＣＤ１６／ＣＤ３２、ファーミンジェン社（Pharmingen））とインキュベートする
（１μｌ＋４９μｌ ＦＡＣＳバッファー）。洗浄せずに、ＳＩＩＮＦＥＫＬペンタマー
−ＰＥ（プロイミューン社（ProImmune）；１試料あたり５μｌ）を加え、混合し、３７
℃で１５分間インキュベートする。洗浄せずに、蛍光ラベルしたＣＤ８またはＣＤ４４を終濃度が１：１００となるように加え、氷上で２５〜４５分間インキュベートする。細胞を１００μｌのＦＡＣＳバッファーで洗浄し、１００μｌのＦＡＣＳバッファーに懸濁する。細胞を、ＦＡＣＳカント（FACSCanto）を用いて解析する。
【０１５０】
エキソビボでの脾細胞の再刺激
溶解バッファー（シグマ社（Sigma））中で１〜２分攪拌後、２％ ＦＣＳ／ＰＢＳで洗浄することによって、脾臓を破砕し、２％ ＦＣＳ／ＰＢＳ中で細胞を分離することで、
細胞内染色のために脾細胞を単離、調製する。完全培地の細胞懸濁液を２４穴プレート１ウェルあたり１ｍｌ（５００，０００細胞／ｍｌ）加え、各ウェルに５μｇ／ｍｌのＳＩＩＮＦＥＫＬ を加え、３７℃で一晩インキュベートする。ブレフェルディンＡ（Brefeldin A）（１〜２μｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、３７℃で４時間インキュベートする。細胞をＵ型の９６穴プレートに移し、２％ ＦＣＳ／ＰＢＳで洗浄し、ＦｃＲ阻止抗体（１
．０μｌ 抗ＣＤ１６／ＣＤ３２、ファーミンジェン社（Pharmingen））を加えたＦＡＣ
Ｓバッファー５０μｌに再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートする。洗浄せずに、細胞を、表面抗体ＣＤ８またはＣＤ４４と氷上（暗所）で２０〜４５分間インキュベートし、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、氷上で１０〜２０分間、１００μｌのパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（ＰＢＳ中１％）に再懸濁することで固定する。細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、１００μｌのＮＰ４０（ＰＢＳ中０．１％）に再懸濁し、氷上で３分間インキュベートする。ＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、蛍光ラベルしたインターフェロンγ抗体を加え、氷上、暗所で３５分間インキュベートする。ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、再懸濁した後、ＦｌｏｗＪｏ８．５．２ソフトウェア（ツリー・スター社（Tree Star, Inc.）、アシュランド、ＯＲ）を用いたＦＡＣＳカント（FACSCanto）によって、細胞を解析する。
【０１５１】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳカント（FACSCanto）、ＢＤバイオサイエンス社（BD Biosciences）、サンノゼ、ＵＳＡ）によって、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞の度数を求める。フ
ローサイトメトリーを行う前に、各抗体で別々に染色したビーズを用いて補正を行う。抗体染色の前に、赤血球溶解溶液（シグマ社（Sigma））を用いて、赤血球を溶解する。各
試料につき１００００のＣＤ８+のイベントを記録し、ＳＩＩＮＦＥＫＬペンタマー陽性
細胞の割合を、ツリー・スター社（Tree Star, Inc.）（アシュランド、ＯＲ；http://www.flowjo.com/）のＦｌｏｗＪｏ８．５．２ソフトウェアを用いて算出する。
【０１５２】
ＥＬＩＳＡ
当該分子用のレディ・セット・ゴー！（Ready-set Go!）キット（ｅバイオサイエンス
社（eBioscience））を用い、製造元の説明書にしたがってＥＬＩＳＡを行う。
上述した免疫化のプロトコールによって、マウスにインビボで接種を行う。７日後に血液を、１４日後に脾臓を単離する。血液に関しては、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞につい
ての解析を行い、脾臓細胞に関しては、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞についての直接的な
解析か、インビトロで再刺激した後のＩＦＮ−γまたはＩＬ−２の産生についての解析のいずれかを行う。
【０１５３】
血液または脾臓における抗原特異的Ｔ細胞レベル
抗原特異的Ｔ細胞レベルを、抗原特異的Ｔ細胞に特異的に結合する蛍光ラベルした抗原特異的「ペンタマー」を用いて、フローサイトメトリーによって測定する。動物における全ＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞数の％を求める（免疫化のプロト
コールで述べた染色およびフローサイトメトリー解析、並びにＳＩＩＮＦＥＫＬ染色の詳細を参照）。
Ｔ細胞に対する一般的な刺激効果は、抗原特異的な細胞の％を増加させない内因性Ｔ細胞にも影響を及ぼすので、内因性Ｔ細胞は、この効果の抗原特異性に対する内部標準として役立つ。典型的には、ＯＴ−１細胞の％を、接種前、および接種後の（複数の）時点において測定する。抗原のみの効果（「従来の接種」）を、抗原＋ＰＣＩの効果と比較する。
【０１５４】
エキソビボでの抗原による刺激後の脾臓細胞におけるＩＦＮ−γ産生レベル（フローサイトメトリー）
接種から１４日後に採取した脾臓を、脾細胞単離に供し、ＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原ペプチドによる再刺激、および上記プロトコールで述べたフローサイトメトリーによるＣＤ８＋
Ｔ細胞の解析のためのＩＦＮ−γ産生の細胞内染色を行う。
【０１５５】
エキソビボでの抗原による刺激後の脾臓細胞におけるＩＦＮ−γおよびＩＬ−２産生レベル（ＥＬＩＳＡ）
接種から１４日後に採取した脾臓を、脾細胞単離に供し、ＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原ペプチドによる再刺激、および上記プロトコールで述べたＥＬＩＳＡによるＩＦＮ−γおよびＩＬ−２産生の解析を行う。
【０１５６】
実施例２：インビボでのＯＶＡの接種に対するＧＭ−ＣＳＦの効果
材料および方法
動物
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ハーラン社（Harlan）（ホルスト、オランダ）から購入した。ＣＤ８ Ｔ細胞受容体トランスジェニックＯＴ−Ｉマウス（Ｂ６．１２９Ｓ６−Ｒａｇ
２ｔｍ１Ｆｗａ Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ）を、タコニック・ヨーロッ
パ（Taconic Europe）（リュー、デンマーク）またはジャクソン・ラボラトリー（Jackson Laboratories）（バー・ハーバー、メイン州）から購入した。ＯＴ−Ｉ ＣＤ８ Ｔ細胞は、オボアルブミンのＨ−２Ｋb制限エピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ、ａａ２５７
〜２６４）を認識する。マウスは全てＳＰＦ条件下で飼育され、行った手順は、スイスおよびノルウェーの家畜当局によって承認された。
【０１５７】
材料および細胞
ニワトリＯＶＡをシグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）（ブフス、スイス）から
、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドをＥＭＣマイクロコレクション社（EMC microcollections）（テュービンゲン、ドイツ）から、ＧＭ−ＣＳＦをプレプロテック社（Preprotech）（ウィーン）から購入した。光増感剤であるジスルホン酸テトラフェニルクロリン（ＴＰＣＳ2a）を、ＰＣＩバイオテク社（PCI Biotech）（ライサカー、ノルウェー）から入手した
。ＯＶＡ、ＴＰＣＳ2a、および、目的に適合する場合は、ＧＭ−ＣＳＦをＰＢＳ中で混合し、遮光した状態を維持し、調製してから６０分以内にマウスに投与した。ルミソース（LumiSource）（商標）（ＰＣＩバイオテク社（PCI Biotech））を用いた照射によって、
ＴＰＣＳ2aを活性化した。
【０１５８】
マウスの皮内光増感および免疫化
免疫化の１日前に、雌のＯＴ−１マウスから脾臓およびリンパ節を単離し、溶血（赤血球溶解バッファー ハイブリ・マックス（Hybri-Max）、シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich））によって、均質化した細胞懸濁液から赤血球を除去した。残った細胞をＰＢ
Ｓで洗浄し、７０ミクロンのナイロン濾過器を通して濾過し、２×１０6個のＯＴ−１細
胞を、静脈注射によって、受容者である雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに投与した。ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の養子免疫伝達によって、フローサイトメトリーによる免
疫応答の測定が容易となる。１日後または８時間後、マウスの尾から採血を行い、ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の基準度数解析のために、ヘパリンが入った試験管に血液を集めた
。
次に、マウスの腹部領域の毛を剃り、ＯＶＡからなる、あるいはＯＶＡ、ＴＰＣＳ2a、およびＧＭ−ＣＳＦ（１０μｇ）の異なる混合物からなるワクチンを、２９Ｇ注射針を付けたシリンジを用いて皮内注射した。ワクチンは、遮光した状態を維持し、調製してから６０分以内に用いられた。ワクチンは、腹部の正中線の左側および右側に、５０μｌずつ２回注射して与えられた。ＯＶＡは、１０μｇまたは１００μｇの用量で用いられ、ＴＰＣＳ2aの用量は１５０μｇであった。ワクチンを注射してから１８時間後、ケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ体重）およびキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ）の混合物を腹腔内注射することによって、マウスに麻酔をかけ、ルミソース（LumiSource）光源上に置いた（照射および光増感剤ＴＰＣＳ2aの活性化のため）。照射時間は、６分であった。
その後７日目に、マウスの尾から採血を行い、赤血球を溶血によって除去してから、フローサイトメトリーによって、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を解析した。実験の最後に、マ
ウスを安楽死させた。
【０１５９】
免疫応答の解析
抗ＣＤ８抗体およびＨ−２Ｋb／ＳＩＩＮＦＥＫＬプロ５ペンタマー（プロイミューン
社（Proimmune）、オックスフォード、ＵＫ）を用いてフローサイトメトリー解析用に細
胞を染色することで、血液中のＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の度数を測定した。フローサ
イトメトリーによってＣＤ４４の発現を調べることで、細胞の活性化の状況をさらに解析した。細胞の解析は、ＦＡＣＳカント（FACSCanto）（ＢＤバイオサイエンス社（BD Biosciences）、サンノゼ、ＵＳＡ）を用いて行い、またＦｌｏｗＪｏ８．５．２ソフトウェ
ア（ツリー・スター社（Tree Star, Inc.）、アシュランド、ＯＲ）を用いた。
【０１６０】
ＧＭ−ＣＳＦ実験
材料および方法で述べたように実験を行い、接種から７日後のマウス血液試料を、上述したように、フローサイトメトリーによって解析した。マウスは全て、上述したようにＯＴ−１細胞を投与された。
以下の実験群が含まれる。
１．未処理：マウスは、ＯＴ−１細胞を投与されているが、接種または照射は行わなかった。
２．ＯＶＡ：１０μｇのＯＶＡをマウスに接種した。照射は行わなかった。
３．ＯＶＡ＋ＧＭ−ＣＳＦ：１０μｇ ＯＶＡ＋１０μｇ ＧＭ−ＣＳＦの混合物をマウスに接種した。照射は行わなかった。
４．ＯＶＡ ＰＣＩ：１０μｇ ＯＶＡ＋１５０μｇ ＴＰＣＳ2aの混合物をマウスに
接種した。上述のように照射を行った。
５．ＯＶＡ＋ｇｍ−ＣＳＦ ＰＣＩ：１０μｇ ＯＶＡ＋１０μｇ ｇｍ−ＣＳＦ＋１
５０μｇ ＴＰＣＳ2aの混合物をマウスに接種した。上述のように照射を行った。
図２Ａは、フローサイトメトリー解析の代表的なドットプロットを示す。したがって、楕円内の集団は、ＣＤ８+、ペンタマー+、ＣＤ４４+である細胞を表し、これは、抗原特
異的（ペンタマー結合性）かつ活性化された（ＣＤ４４の発現）ＣＤ８+細胞である。Ｏ
ＶＡ＋ＧＭ−ＣＳＦ群およびＯＶＡ ＰＣＩ群において、この集団中の細胞数が増加して
おり（ＯＶＡ群との比較）、ＯＶＡ＋ＧＭ−ＣＳＦ ＰＣＩ群において、この効果がさら
に顕著に増強されていることがわかる。
図２Ｂは、実験群の平均値（全ＣＤ８+細胞に対する抗原特異的ＣＤ４４+細胞の％）を示し、その他すべての群よりもＯＶＡ＋ＧＭ−ＣＳＦ ＰＣＩ群において実質的に増加し
ていることが、あらためて示されている。
【０１６１】
実施例３：インビボでのＨＰＶの接種に対するＧＭ−ＣＳＦの効果
材料および方法
動物
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ハーラン社（Harlan）（ホルスト、オランダ）から購入した。マウスは全てＳＰＦ条件下で飼育され、行った手順は、ノルウェーの家畜当局によって承認された。
【０１６２】
材料および細胞
ＨＰＶ １６ Ｅ７ペプチド抗原（配列はＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ、ＣＤ８エピトープを下線で示す）を、ユナイテッド・ペプチド社（United Peptides）（ハーンドン、ＶＡ）から入手した。高分子量ポリ（ＩＣ）
をインビボジェン社（InvivoGen）（サンディエゴ、ＵＳＡ）から入手した。ＧＭ−ＣＳ
Ｆ（ネズミ組み換え体）をペプロテック社（PeproTech Inc.）（ロッキーヒル、ＵＳＡ）から購入した（カタログ番号：３１５−０３）。光増感剤であるジスルホン酸テトラフェニルクロリン（ＴＰＣＳ2a）をＰＣＩバイオテク社（PCI Biotech）（ライサカー、ノル
ウェー）から、ＨＰＶペンタマーをプロイミューン社（Proimmune）（オックスフォード
、ＵＫ）から入手した（プロイミューンのペプチドコード：５０２Ｈ）。
【０１６３】
マウスの皮内光増感および免疫化
マウスの腹部領域の毛を剃り、５０μｇ ＨＰＶ長鎖ペプチド抗原、１００μｇ ＴＰＣＳ2a、および１０μｇ ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはポリ（ＩＣ）からなるワクチン（
以下に明示する通り）を、２９Ｇ注射針を付けたシリンジを用いて皮内注射した。ワクチンは、遮光した状態を維持し、調製してから６０分以内に用いられた。ワクチンは、腹部の正中線の左側および右側に、５０μｌずつ２回注射して与えられた。免疫化してから１８時間後、ケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ体重）およびキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ）の混合物を腹腔内注射することによって、マウスに麻酔をかけ、以下に述べるように照射を行った。
免疫化後７日目に、マウスの尾から採血を行い、赤血球を溶血によって除去してから、フローサイトメトリーによって、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を解析した。
【０１６４】
免疫化したマウスに対する照射
ルミソース（LumiSource）（商標）（ＰＣＩバイオテク社（PCI Biotech））を用いた
照射によってＴＰＣＳ2aを活性化した。ルミソースによる照射は、免疫化してから１８時間後に６分間行った。
【０１６５】
ペンタマー染色による免疫応答の解析
抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４４抗体、および用いられたＨＰＶ抗原に応じたペンタマーを用いて細胞を染色した後、血液中の抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の度数を、フローサイトメト
リーによって測定した。フローサイトメトリーによってＣＤ４４の発現を調べることで、細胞の活性化の状況を解析した。細胞の解析は、ＦＡＣＳカント（FACSCanto）（ＢＤバ
イオサイエンス社（BD Biosciences）、サンノゼ、ＵＳＡ）を用いて行い、またＦｌｏｗＪｏ８．５．２ソフトウェア（ツリー・スター社（Tree Star, Inc.）、アシュランド、
ＯＲ）を用いた。
【０１６６】
実施例３ａ：ＨＰＶ長鎖ペプチド抗原およびＧＭ−ＣＳＦを用いたＰＣＩの効果
材料および方法で述べたように実験を行った。０日目および１４日目に、以下に明示されるワクチン混合物を用いて動物を免疫化した。免疫化してから１８時間後に、ルミソース（LumiSource）照明装置を用いて６分間の照射を行った。各免疫化後６日目の血液試料を、ＨＰＶペンタマー、ＣＤ８抗体、およびＣＤ４４抗体で染色し、上述したように、フローサイトメトリーによって解析した。以下の実験群が含まれる。
２×ＨＰＶ：５０μｇ ＨＰＶ長鎖ペプチドを用いて、マウスを２回免疫化した。マ
ウスに対して照射は行わなかった。
２×ＨＰＶ＋ＧＭ−ＣＳＦ：５０μｇ ＨＰＶ長鎖ペプチドおよび１０μｇ ＧＭ−ＣＳＦを用いて、マウスを２回免疫化した。マウスに対して照射は行わなかった。
２×ＨＰＶ＋ＧＭ−ＣＳＦ＋ＰＣＩ：５０μｇ ＨＰＶ長鎖ペプチド、１００μｇ ＴＰＣＳ2a、および１０μｇ ＧＭ−ＣＳＦを用いて、マウスを２回免疫化した。いずれの
免疫化後も、マウスに対して照射を行った。
【０１６７】
結果
図３からわかるように、抗原＋ＧＭ−ＣＳＦを用いて免疫化を２回行っても、免疫学的なＣＤ８細胞応答は、抗原のみの場合に観察される応答より上昇することはなかった。しかしながら、ＧＭ−ＣＳＦをＰＣＩと組み合わせると、ＣＤ８細胞応答は実質的に上昇した。
【０１６８】
実施例３ｂ：ＨＰＶ長鎖ペプチド抗原、ＧＭ−ＣＳＦ、およびポリ（ＩＣ）を用いたＰＣＩの効果
材料および方法で述べたように実験を行った。０日目および１４日目に、以下に明示されるワクチン混合物を用いて動物を免疫化した。免疫化してから１８時間後に、ルミソース（LumiSource）照明装置を用いて６分間の照射を行った。各免疫化後６日目の血液試料を、ＨＰＶペンタマー、ＣＤ８抗体、およびＣＤ４４抗体で染色し、上述したように、フローサイトメトリーによって解析した。以下の実験群が含まれる。
２×ＨＰＶ：５０μｇ ＨＰＶ長鎖ペプチドを用いて、マウスを２回免疫化した。マ
ウスに対して照射は行わなかった。
２×ＨＰＶ＋ポリ（ＩＣ）：５０μｇ ＨＰＶ長鎖ペプチドおよび１０μｇ ポリ（ＩＣ）を用いて、マウスを２回免疫化した。マウスに対して照射は行わなかった。
１回目：ＨＰＶ＋ｐ（ＩＣ）＋ＰＣＩ；２回目：ＨＰＶ＋ＰＣＩ：５０μｇ ＨＰＶ
長鎖ペプチド、１０μｇ ポリ（ＩＣ）、および１００μｇ ＴＰＣＳ2aの混合物（１回目の免疫化）、並びに５０μｇ ＨＰＶ長鎖ペプチドおよび１００μｇ ＴＰＣＳ2a（２回目の免疫化）を用いて、マウスを免疫化した。いずれの免疫化後も、マウスに対して照射を行った。
１回目：ＨＰＶ＋ｐ（ＩＣ）＋ＧＭ−ＣＳＦ＋ＰＣＩ；２回目：ＨＰＶ＋ＧＭ−ＣＳＦ＋ＰＣＩ：５０μｇ ＨＰＶ長鎖ペプチド、１０μｇ ポリ（ＩＣ）、１０μｇ ＧＭ−
ＣＳＦ、および１００μｇ ＴＰＣＳ2aの混合物（１回目の免疫化）、並びに５０μｇ ＨＰＶ長鎖ペプチド、１０μｇ ＧＭ−ＣＳＦ、および１００μｇ ＴＰＣＳ2a（２回目の免疫化）を用いて、マウスを免疫化した。いずれの免疫化後も、マウスに対して照射を行った。
【０１６９】
結果
本実験では、１回目の免疫化を、ＨＰＶ抗原のみ、抗原＋ポリ（ＩＣ）の組み合わせ、あるいは抗原＋ポリ（ＩＣ）＋ＰＣＩ、または抗原＋ポリ（ＩＣ）＋ＧＭ−ＣＳＦ＋ＰＣＩの組み合わせ、を用いて行った。２回目の免疫化は、同じ組み合わせを用いて行ったが、ＰＣＩ処理を行う試料についてはポリ（ＩＣ）を用いなかった。図４から、ＰＣＩ＋ポリ（ＩＣ）を用いた処理方法のみが免疫応答に好影響を与えたが、同じ処理方法にＧＭ−ＣＳＦを加えることで、その応答が実質的に高まったことがわかる。抗原＋ＧＭ−ＣＳＦ＋ＰＣＩを用いて免疫化を行うと、免疫学的なＣＤ８細胞応答は、抗原のみの場合（図３）に観察される応答よりも顕著に上昇したが、その応答の規模は、ＧＭ−ＣＳＦ、ポリ（ＩＣ）、およびＰＣＩの組み合わせ（図４）の場合に観察される応答よりも実質的に小さかった。ポリ（ＩＣ）を用いても、ＰＣＩを行わなければ、抗原のみを用いた場合に達成される免疫応答よりも免疫応答が上昇することはないという観察結果と合わせると、本実験は、ＧＭ−ＣＳＦおよびポリ（ＩＣ）を用いてＰＣＩを行う場合、ＰＣＩが相乗効果的に作用してペプチド抗原に対するＣＤ８の応答を増強するということを示している。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２】
2020182486.tif 000041
【図３】
2020182486.tif 000042
【図４】
2020182486.tif 000043
【配列表】
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