(57)【要約】      （修正有）【課題】外因的に供給されるヌクレアーゼを使用せずに細胞のゲノムを編集するための方法および組成物の提供。【解決手段】組換えウイルスベクターが、導入遺伝子をコードする第一の核酸配列、該第一の核酸配列に対して5'側または3'側に位置付けされ、かつ細胞のゲノムにおける標的組み込み部位への組み込み時に、2種類の独立した遺伝子産物の産生を促進する第二の核酸配列、該ポリヌクレオチドに対して5'側に位置付けされ、かつ細胞のゲノムにおける標的組み込み部位の5'側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む、第三の核酸配列、ならびに該ポリヌクレオチドの3'側に位置付けされ、かつ細胞のゲノムにおける標的組み込み部位の3'側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む、第四の核酸配列を含む、外因的に提供されるヌクレアーゼの非存在下での、細胞ゲノム内への導入遺伝子の標的指向化された組み込みのための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えウイルスベクターに細胞を接触させる工程
を含む、外因的に提供されるヌクレアーゼの非存在下での、細胞ゲノム内への導入遺伝子の標的指向化された組み込みのための方法であって、
該組換えウイルスベクターが、
i．第一の核酸配列および第二の核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、該第一の核酸配列が導入遺伝子をコードし；かつ該第二の核酸配列が該第一の核酸配列に対して5'側または3'側に位置付けされ、かつ細胞のゲノムにおける標的組み込み部位への組み込み時に、2種類の独立した遺伝子産物の産生を促進する、ポリヌクレオチド；
ii．該ポリヌクレオチドに対して5'側に位置付けされ、かつ細胞のゲノムにおける標的組み込み部位の5'側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む、第三の核酸配列；ならびに
iii．該ポリヌクレオチドの3'側に位置付けされ、かつ細胞のゲノムにおける標的組み込み部位の3'側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む、第四の核酸配列
を含み、
該細胞が、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸と接触しない、
前記方法。
【請求項２】
細胞が非分裂細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
接触させる工程がインビボで生じる、請求項1記載の方法。
【請求項４】
遺伝子欠損に関連した医学的状態を治療することにおいて用途が見出される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
医学的状態が、血友病、血友病A、血友病B、分岐鎖有機酸尿症、メープルシロップ尿症（MSUD）、イソ吉草酸血症（IVA）、プロピオン酸尿症（PA）、メチルマロン酸尿症（MMA）、3メチルクロトニルグリシン尿症、3-メチルグルタコン酸尿症I型、短鎖/分岐鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症、2-メチル-3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症、イソブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症、3-ヒドロキシイソ酪酸尿症、マロン酸尿症、長鎖脂肪酸酸化障害、糖原病、糖原病I型（GSD1）、カルニチン回路障害、尿素回路障害、クリグラー・ナジャール症候群、遺伝性チロシン血症、表皮水疱症、ウィルソン病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、鎌状赤血球病、X連鎖重症複合免疫不全症（SCID-X1）、サラセミア、嚢胞性線維症、α1アンチトリプシン欠損症、ダイアモンド・ブラックファン貧血、ゴーシェ病、成長ホルモン欠損症、およびパーキンソン病からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
免疫学的予防を促進することにおいて用途が見出される、請求項3記載の方法。
【請求項７】
導入遺伝子が、免疫学的予防を促進する作用物質をコードする、請求項6記載の方法。
【請求項８】
免疫学的予防を促進する作用物質が抗体またはキメラポリペプチドであり、かつヒト免疫不全ウイルス（HIV）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、マラリア原虫（Plasmodium）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、真菌、および細菌より選択される病原体に特異的である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
創傷治癒を促進することにおいて用途が見出される、請求項3記載の方法。
【請求項１０】
第一の核酸配列および第二の核酸配列を含むポリヌクレオチドカセットであって、該第一の核酸配列が導入遺伝子を含み；かつ該第二の核酸配列が該第一の核酸配列に対して5'側または3'側に位置付けされ、かつ細胞のゲノムにおける標的組み込み部位への組み込み時に、2種類の独立した遺伝子産物の産生を促進する、ポリヌクレオチドカセット；
該ポリヌクレオチドカセットに対して5'側に位置付けされ、かつ細胞のゲノムにおける標的組み込み部位の5'側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む、第三の核酸配列；ならびに
該ポリヌクレオチドカセットの3'側に位置付けされ、かつ細胞のゲノムにおける標的組み込み部位の3'側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む、第四の核酸配列
を含む、細胞のゲノムにおける標的組み込み部位に導入遺伝子を組み込むための組換えウイルスベクター。
【請求項１１】
rAAVベクターである、請求項10記載の組換えウイルスベクター。
【請求項１２】
標的組み込み部位における2種類の独立した遺伝子産物の産生を促進する核酸配列が、2Aペプチドをコードする配列；IRES；インテイン；部位特異的プロテアーゼに対する認識配列；凝固カスケードの一部として切断される切断可能なリンカーをコードする配列；第XI因子切断部位をコードする配列；およびイントロンのスプライスドナー/スプライスアクセプター配列より選択される、請求項10記載の組換えウイルスベクター。
【請求項１３】
標的組み込み部位を含む内因性遺伝子の発現および活性が、導入遺伝子の組み込みによって妨害されない、請求項12記載の組換えウイルスベクター。
【請求項１４】
内因性遺伝子の3'末端が、標的組み込み部位を含み、
第三の核酸配列の配列が、該内因性遺伝子の終止コドンの上流にあるDNA配列と実質的に相同であり；かつ
第四の核酸配列の配列が、該内因性遺伝子の終止コドンの下流にあるDNA配列と実質的に相同である、
請求項13記載の組換えウイルスベクター。
【請求項１５】
内因性遺伝子の5'末端が、標的組み込み部位を含み、
第三の核酸配列の配列が、該内因性遺伝子の開始コドンの上流にあるDNA配列と実質的に相同であり；かつ
第四の核酸配列の配列が、該内因性遺伝子の開始コドンの下流にあるDNA配列と実質的に相同である、
請求項13記載の組換えウイルスベクター。
【請求項１６】
内因性遺伝子が、アルブミン遺伝子、コラーゲン遺伝子、およびアクチン遺伝子からなる群より選択される、請求項13記載の組換えウイルスベクター。
【請求項１７】
導入遺伝子が遺伝子欠損を補完する、請求項10記載の組換えウイルスベクター。
【請求項１８】
導入遺伝子が、免疫学的予防を促進する作用物質をコードする、請求項10記載の組換えウイルスベクター。
【請求項１９】
免疫学的予防を促進する作用物質が、免疫グロブリンドメインおよびエフェクタードメインを含むポリペプチドである、請求項18記載の組換えウイルスベクター。
【請求項２０】
免疫学的予防を促進する作用物質が抗体である、請求項18記載の組換えウイルスベクター。
【請求項２１】
免疫学的予防を促進する作用物質が抗体またはキメラポリペプチドであり、かつヒト免疫不全ウイルス（HIV）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、マラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、真菌、および細菌より選択される病原体に特異的である、請求項18記載の組換えウイルスベクター。
【請求項２２】
導入遺伝子が脈管形成および/または血管新生を促進する、請求項10記載の組換えウイルスベクター。
【請求項２３】
導入遺伝子がVEGFである、請求項22記載の組換えウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、2014年9月3日に提出された米国仮特許出願第62/045,451号、2014年8月29日に提出された同第62/044,145号、2014年3月24日に提出された同第61/969,709号、および2014年3月21日に提出された同第61/969,013号の恩典を主張するものであり、その出願のそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された契約HL064274の下で政府支援によりなされた。政府は、本発明においてある程度の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、外因性ヌクレアーゼの非存在下でのゲノム編集に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ゲノムの部位特異的操作は、医学、バイオテクノロジー、および生物学的研究における多くの適用のための望ましい目標である。近年、インビトロおよびインビボでの、有糸分裂および有糸分裂後の細胞における遺伝子ターゲティングのための部位特異的ヌクレアーゼを開発するために、多くの努力がなされている。しかしながら、これらの標的指向化されたヌクレアーゼは細胞に有毒であることが多く、かつそれらのオフターゲット活性は免疫原性であり得かつ遺伝毒性を示し得る。当技術分野において必要とされるのは、外因的に提供されるヌクレアーゼを使用せずに細胞のゲノムを編集するための方法である。本発明は、これらの問題に取り組む。
【発明の概要】
【０００５】
外因的に供給されるヌクレアーゼを使用せずに細胞のゲノムを編集するための方法および組成物が提供される。該方法の局面は、標的遺伝子座内に組み込む核酸配列を含むターゲティングベクターに細胞を接触させる工程を含み、該細胞は、ヌクレアーゼとも接触するという事はない。加えて、主題の方法を実践することにおいて用途が見出される試薬、デバイス、およびそれらのキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
本発明は、付随する図面と合わせて読まれた場合に、以下の詳細な説明から最もよく理解される。一般的慣行に従って、図面の様々な特質は正確な縮尺ではないことを強調する。それどころか、様々な特質の寸法は、明確さのために任意に拡張されているまたは縮小されている。図面に含まれるのは、以下の図である。
【０００７】
【図１】ベクター設計およびターゲティングスキーム：コドン最適化ヒトF-IX cDNA（薄緑色）の前に、2Aペプチドをコードする配列（P2A、深緑色）が先行する。それは、5'（青色）からのアルブミン終止コドンおよび3'（UTR、黄色）に広がる配列と相同である配列によって隣接される。相同アームは、それぞれ1.3および1.4Kb長である。Alb遺伝子座内への組み込みは、キメラ遺伝子をもたらす。しかしながら、2Aペプチドによって誘導されるリボソームスキップにより、2種類の別個のタンパク質の産生が可能となる。アルブミンタンパク質は、21アミノ酸長の2Aタグを有して残され、一方で血液凝固因子は、後にERにおいてシグナルペプチドの一部としてプロセシングされるN末端プロリンに連結される。
【図２】2日齢のC57BL/6J（B6）マウスに、ドットブロットによって力価測定された2.5e11ベクター粒子を含有する50ulによって腹腔内（IP）注射した。生後4週目に開始して週1回、眼窩後採血後のELISAによって、血漿hF-IXを評価した。n＝6、エラーバーは標準偏差を表す。
【図３】成体C57BL/6J（B6）マウスに、ドットブロットによって力価測定された1e12ベクター粒子を含有する100ulによって静脈内（IV）注射した。生後4週目に開始して週1回、眼窩後採血後のELISAによって、血漿hF-IXを評価した。n＝3、エラーバーは標準偏差を表す。
【図４】hF-IXがオンターゲット組み込みから発現されることを示した、RTバイアスなしのPCR。プライマーRTを用いた逆転写を実施し（上）、その後にランダムプライマーを用いた第二鎖（second strand）DNA合成、MseI制限酵素による切断、リンカーライゲーション、およびプライマーペア1&2を用いたPCRが続いた。青色：Albエクソン、オレンジ色：Albイントロン、黒い実線：ベクターおよびゲノム間の相同性の終点。PCR産物（下）をシーケンシングし、オンターゲット組み込みから予想される融合アルブミン_F-IX転写産物に相当することが見出された。バイアスなしの手法は、エピソーム性発現またはオフターゲット組み込みに相当するPCR産物を生じさせなかった。
【図５】オンターゲット発現のみを表す、アルブミンのサイズについて単一の抗2Aバンドを示した、血漿についてのウェスタンブロット解析。
【図６】肝臓についてのウェスタンブロット解析。hF-IXバンドのサイズは、2Aペプチドによる効率的なリボソームスキップを表す。
【図７】F-IXノックアウトマウス（B6とCD-1との交配種）における表現型の改善。成体マウスに、1×10^12ベクターゲノム（Vg）のAAV8_hF-IXを注射した。注射の2週間後に、凝固時間をaPTTアッセイによって測定した。AAV8_hF-IXターゲティングベクターを注射されたマウスは、はるかに向上した凝固時間を示している。
【図８】ベクター設計および実験スキーム。A．rAAV8ベクターは、Alb終止コドンに対して5'側の組み込みを指揮する相同アームによって隣接された、コドン最適化hF9 cDNAおよび先行する2Aペプチドコード配列をコードする。5'および3'アームの長さは、それぞれ1.3および1.4kbである。相同組換えによる組み込みの後、AlbおよびhF9は、DNAおよびRNAレベルでは融合されているが、リボソームスキップの結果として、2種類の別個のタンパク質が産生される。B．Alb相同アームに関して、AAV逆向き対照は、2Aペプチドコード配列、隣接Albエクソン、および先行するスプライス接合部とともに逆向きになったhF9を有する。細い白色の長方形：Albイントロン；太い濃い灰色の長方形：Albエクソン；太い白色の長方形：P2A；太い白色の矢印：hF9；太い薄い灰色の長方形：遺伝子外DNA；破線：終止コドン；楕円体：逆向き末端反復；P＝プロリン。
【図９Ａ】注射されたマウスにおける、ヒト第IX因子の発現および活性。A．2.5e11 vgのhF9実験構築物（n＝6）または逆向き対照（n＝3）のいずれかによる、2日齢のB6マウスのIP注射後に、ELISAによって測定された血漿hF9。検出限界を下回る測定結果に、20ng/mLという閾値の値を割り当てた。PH＝部分肝切除。エラーバーは標準偏差を表す。破線は、通常のF9レベルの5％および20％を表示する。
【図９Ｂ】注射されたマウスにおける、ヒト第IX因子の発現および活性。B．1e12 vgのAAV hF9実験構築物（n＝7）もしくは逆向き対照（n＝3）のいずれかを用いた、9週齢のB6マウスの尾静脈注射後、または「正しい」方位にあるhF9構築物をコードする30μgのプラスミド（3.5e12個のコピー数）の流体力学的注入後に、ELISAによって測定された血漿hF9。検出の限界は20ng/mLであった。エラーバーおよび破線は、（A）にあるとおり。
【図９Ｃ】注射されたマウスにおける、ヒト第IX因子の発現および活性。C．指定されたMOIのAAV hF9実験構築物を用いた9週齢のB6マウスの尾静脈注射後に、ELISAによって測定された血漿hF9（各群に対してn＝4）。エラーバーは標準偏差を表す。
【図９Ｄ】注射されたマウスにおける、ヒト第IX因子の発現および活性。D．マウス1匹あたり1e12 AAV8-hF9 vgの尾静脈注射の2週間後の、活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）による凝固効率の測定（n＝5）。エラーバーは標準偏差を表す。
【図９Ｅ】注射されたマウスにおける、ヒト第IX因子の発現および活性。E．AAV8-hF9構築物または逆向き対照を注射されたマウスからの肝臓サンプルにおける、hF9に関するウェスタンブロット解析。hF9の予想サイズは55Kdである。
【図１０Ａ】DNAおよびRNAレベルにおけるAlbターゲティングの割合。A．オンターゲット組み込み率についての評価を、ゲノム遺伝子座にアニールするがベクターにはアニールしない、ビオチン化プライマー1（黒色）を用いた線形増幅（LAM）を用いて開始する。次いで、線形アンプリコンをストレプトアビジン化ビーズに結合させ、かつ洗浄してエピソーム性ベクターを除外する。後続の、ランダムプライマーを用いた第二鎖DNA合成の後に、CviQI制限消化が続いた。次いで、適合するリンカーをライゲーションし、その後に2ラウンドのネストPCR（青色のプライマー2-3、次いで赤色のプライマー4-5）が続く。CviQIは、標的対立遺伝子および野生型対立遺伝子の両方において、相同性境界から同じ距離で切断し、ゆえにバイアスなしの増幅が可能となる。次いで、2回目のネストPCRのアンプリコンは、プライマー6-7（緑色）または8-9（オレンジ色）のいずれかを用いたqPCRアッセイのための鋳型として働く。
【図１０Ｂ】DNAおよびRNAレベルにおけるAlbターゲティングの割合。B．mRNA定量のために、プライマー10-11または11-12を用いて、qPCRアッセイのためのcDNAを作製した。形状および塗りつぶしは、図1にある通りにコードしている。
【図１０Ｃ】DNAおよびRNAレベルにおけるAlbターゲティングの割合。C．黒色のバーは、肝細胞頻度に相当するように0.7という係数によって補正された、プライマー6-7によって増幅されたDNA鋳型の存在量とプライマー8-9によって増幅されたDNA鋳型の存在量との間の比としての、Alb対立遺伝子のターゲティング率を表す。灰色のバーは、プライマー10-11によって増幅されたcDNA鋳型の存在量とプライマー11-12によって増幅されたcDNA鋳型の存在量との間の比としての、標的Alb対立遺伝子の発現率を表す。各群に対してn＝3、エラーバーは標準偏差を表す。
【図１１Ａ】hF9発現の特異性。A．ポリdTプライマーを用いたRTから産生され、プライマー13-14または14-15を用いたqPCRアッセイのいずれかに対する鋳型として働くcDNA。
【図１１Ｂ】hF9発現の特異性。B．バーは、hF9含有mRNA全体に対するAlb_hF9 mRNAの割合を、プライマー13-14によって増幅されたcDNA鋳型の存在量とプライマー14-15によって増幅されたcDNA鋳型の存在量との間の比として表す。各群に対してn＝3、エラーバーは標準偏差を表す。
【図１１Ｃ】hF9発現の特異性。C．P2Aに対するプローブを用いた、肝臓サンプルについてのノーザンブロット解析。より低い非特異的シグナルは、18S rRNAにサイズが相当する。
【図１１Ｄ】hF9発現の特異性。D．AAV-P2A-hF9構築物または逆向き対照を注射されたマウスの肝臓サンプルからの、P2Aについてのウェスタンブロット解析。P2Aは、アルブミンに融合していると予想される（66.5Kd）。
【図１２】hF9肝臓免疫組織化学。上から下へ、パネルは、陽性対照のヒト肝臓における、DAPI核対比染色（青色）を伴うヒト第9因子染色（赤色）、陰性対照である未処置マウス肝臓、および新生仔または成体のときにAAV8-P2A-hF9で処置されたマウスからの2つの代表的な染色を示している。
【図１３−１】ターゲティング率評価のスキーム。オンターゲット組み込み率についての評価を、ゲノム遺伝子座にアニールするがベクターにはアニールしない、ビオチン化プライマー1（黒色）を用いた線形増幅（LAM）を用いて開始する（工程1）。次いで、線形アンプリコンをストレプトアビジン化ビーズに結合させ、かつ洗浄してエピソーム性ベクターを除外する（工程2）。後続の、ランダムプライマーを用いた第二鎖DNA合成（工程3）の後に、CviQI制限消化（工程4）が続いた。次いで、適合するリンカーをライゲーションし（工程5）、その後に2ラウンドのネストPCR増幅（青色のプライマー2-3 -工程6、次いで赤色のプライマー4-5 -工程7）が続く。CviQIは、標的対立遺伝子および野生型対立遺伝子の両方において、相同性境界から同じ距離で切断し、ゆえにバイアスなしの増幅が可能となる。次いで、2回目のネストPCRのアンプリコンは、プライマー6-7（緑色）または8-9（オレンジ色）のいずれかを用いたqPCRアッセイのための鋳型として働く（工程8）。
【図１３−２】図13-1の説明を参照のこと。
【図１３−３】図13-1の説明を参照のこと。
【図１３−４】図13-1の説明を参照のこと。
【図１４】qPCRによるターゲティング率評価のための標準曲線。標的対立遺伝子（プライマー8および9、図3）および非標的対立遺伝子（プライマー6および7、図3）に対するqPCR標準曲線。用いられたすべてのアンプリコンは等しい長さのものであったため、用いられる質量単位は、モル濃度と機能的に同等である。
【図１５】ALT測定による毒性評価。本発明者らの実験ベクターをコードするAAV8（1e12）、または公知の非毒性カセットをコードする陰性対照（1e12のH1プロモーター駆動性shRNA）または公知の毒性カセットをコードする陽性対照（5e11のU6プロモーター駆動性shRNA）を注射されたマウスにおいて、注射の7日後に、アラニントランスアミナーゼレベル（ALT）を評価した。データは、各群に対する4匹の独立したマウスの2回の測定結果の平均を表す。統計的有意性は、ここでは、異なる分散のサンプル間の片側t検定においてp＜0.05を有するものとして規定される。
【図１６】ベクターコピー数。プライマー8および9（図3）を用いたqPCRによって評価されたベクターコピー数。成体のときに注射されたマウスに関してn＝7、および新生仔のときに注射されかつ部分肝切除の前または後に解析されたマウスに関してn＝6。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１７】1000ゲノムプロジェクト（「http:」、その後に「//www.」、その後に「1000genomes」、その後に「.org」が続く）から抽出された、関連するAlb遺伝子座におけるヒト集団でのハプロタイプ。
【図１８】マウス1匹あたり1×1012ベクターゲノムのAAV8-F9またはAAVDJ-F9実験構築物を用いた9週齢雌B6マウスの尾静脈注射後に、ELISAによって測定された血漿F9（それぞれn＝4）。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１９】マウス1匹あたり1×1012ベクターゲノムでのAAV8-F9（上）またはマウス1匹あたり3×1011ベクターゲノムでのAAV8-F9トリプル（下）の尾静脈注射の2週間後の、活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）による凝固効率の測定（それぞれn＝5）。KO、ノックアウト。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２０】マウス1匹あたり2.5×1011ベクターゲノムのAAV8-F9実験構築物による2日齢のB6マウスの浅側頭静脈注射後に、ELISAによって測定された血漿F9（n＝4）。
【図２１】マウス1匹あたり1×1012ベクターゲノムのAAV8-VRC01実験構築物を用いた9週齢雌B6マウスの尾静脈注射後に、ELISAによって測定された血漿VRC01（HIVに対する広範囲に中和する抗体）（それぞれn＝4）。エラーバーは標準偏差を表す。サンドイッチELISAは、ヒトIgGの定常領域に対する抗体によって覆われたプレートを用いるのに対し、機能的ELISAは、VRC01抗体によって認識される抗原であるHIV糖タンパク質gp120で覆われたプレートを用いる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
外因的に供給されるヌクレアーゼを使用せずに細胞のゲノムを編集するための方法および組成物が提供される。該方法の局面は、標的遺伝子座内に組み込む核酸配列を含むターゲティングベクターに細胞を接触させる工程を含み、該細胞は、ヌクレアーゼとも接触するという事はない。加えて、主題の方法を実践することにおいて用途が見出される試薬、デバイス、およびそれらのキットが提供される。本発明のこれらのおよび他の目的、利点、および特質は、以下でより十分に説明される組成物および方法についての詳細を読めば、当業者に明白になるであろう。
【０００９】
本方法および組成物を説明する前に、本発明は、記載される特定の方法または組成物に限定されるわけではなく、それ自体は当然変化し得ることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において用いられる専門用語は、特定の態様のみを記載することを目的とするものであり、限定的であることを意図されるものではないことも理解されるべきである。
【００１０】
値の値域が提供される場合、文脈上はっきりと別様に述べられていない限り、その値域の上限および下限の間にある各介在値も、下限の単位の10分の1まで、具体的に開示されていると理解される。明記される値域内の任意の明記される値または介在値と、その明記される値域内の他の任意の明記される値または介在値との間にあるより小さな各値域は、本発明の内に包含される。これらのより小さな値域の上限および下限は、独立して、該値域内に含まれ得または除外され得、かつより小さな値域内にいずれか一方の限度が含まれる、どちらの限度も含まれない、または両方の限度が含まれる場合の各値域も、明記される値域における具体的に除外される任意の限度次第で、本発明の内に包含される。明記される値域が限度の一方または両方を含む場合、そうした含まれた限度のいずれかまたは両方を除外する値域も、本発明に含まれる。
【００１１】
別様に定義されていない限り、本明細書において用いられるすべての技術的および科学的な用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料を、本発明の実践または試験において用いることができるものの、一部の潜在的なかつ好ましい方法および材料がここに記載されている。刊行物を引用しているものに関連した方法および/または材料を開示しかつ記載する、本明細書において言及されるすべての刊行物は、参照により本明細書に組み入れられる。本開示は、矛盾が存在する程度まで、組み入れられた刊行物の任意の開示に優先すると理解される。
【００１２】
本開示を読めば当業者に明白であろうように、本明細書において記載されかつ例証される個々の態様のそれぞれは、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの態様のいずれかのものの特質と容易に分離され得るまたはそれと組み合わされ得る個別の構成要素および特質を有する。列挙される任意の方法は、列挙される事象の順序でまたは論理的に可能である他の任意の順序で行われ得る。
【００１３】
本明細書においておよび添付の特許請求の範囲において用いられるとき、「a」、「an」、および「the」という単数形は、文脈上はっきりと別様に述べられていない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。ゆえに、例えば、「細胞（a cell）」への言及には複数のそのような細胞が含まれ、かつ「ペプチド（the peptide）」への言及には、1つまたは複数のペプチドおよびその同等物、例えば当業者に公知であるポリペプチドなどへの言及が含まれる。
【００１４】
本明細書において記述される刊行物は、本出願の提出日より前のそれらの開示に関してのみ提供される。本明細書におけるいかなるものも、先行発明という理由で、本発明がそのような刊行物に先行する権利を与えられないという承認として解釈されるべきでない。さらに、提供される刊行物の日付は実際の刊行日とは異なり得、それは独立して確認される必要があり得る。
【００１５】
細胞のゲノムを編集するための方法および組成物が提供される。ゲノム編集とは、関心対象の核酸配列を挿入する、置き換える、またはゲノムから取り除く遺伝子操作を意味する。本例において、主題の方法および組成物は、本明細書において「導入遺伝子」と呼ばれる細胞内で発現される核酸配列を、標的遺伝子座における細胞のゲノム内に挿入することにおいてとくに用途が見出される。ある場合には、導入遺伝子は、ペプチドまたはポリペプチドをコードするRNAをコードする。他の場合には、導入遺伝子は、ノンコーディングRNA、すなわちペプチドまたはタンパク質をコードしないRNA、例えばリボザイム、小ヘアピンRNA（shRNA）、マイクロRNA（miRNA）、またはそれらの前駆体である長鎖ノンコーディングRNAなどをコードする核酸配列をコードする。ある場合には、1種類の導入遺伝子が標的遺伝子座内に挿入される。他の場合には、1種類を上回る種類の導入遺伝子が標的遺伝子座内に挿入される、例えば2、3、4、もしくは5種類、またはそれを上回る種類の導入遺伝子が標的遺伝子座内に挿入される。ある場合には、対象導入遺伝子は、標的組み込み部位への組み込み時に、標的遺伝子座における内因性遺伝子のプロモーターに機能的に連結されるようになる。他の場合には、対象導入遺伝子は、ウイルスベクター上でプロモーターに機能的に連結され、かつ標的組み込み部位への組み込みがあっても、依然としてそのプロモーターに機能的に連結されている。
【００１６】
主題の方法を実践することにおいて、細胞のゲノムは、外因性ヌクレアーゼを使用せずに編集される。「ヌクレアーゼ」とは、DNA、例えばゲノムDNAまたはミトコンドリアDNAのヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断して、二本鎖断裂をひき起こす事ができる酵素を意味する。人工的に操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、CRISPR/Casシステム、および操作されたメガヌクレアーゼにより再操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼ、RecBCDエンドヌクレアーゼ、T7エンドヌクレアーゼ、T4エンドヌクレアーゼIV、Bal 31エンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼI（エンドI）、エンドヌクレアーゼII（エンドVI、エキソIII）、ミクロコッカス（Micrococcal）ヌクレアーゼ、ニューロスポラ（Neurospora）エンドヌクレアーゼ、S1-ヌクレアーゼ、P1-ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼI、ウスチラゴ（Ustilago）ヌクレアーゼ、Dnase I、APエンドヌクレアーゼ、およびEndoRなどの天然に存在するヌクレアーゼを含む、ヌクレアーゼの多くの例が、当技術分野において公知である。外因性ヌクレアーゼとは、細胞の外側から来るヌクレアーゼ、例えば生きた細胞内で存在しかつ活性を有するがその細胞の外側に起源があるヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸を意味する。本明細書において機能する実施例で実証されるように、細胞における標的指向化されたゲノム編集は、細胞にヌクレアーゼを提供することなく、すなわちヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸に細胞を接触させることなく達成され得る。
【００１７】
外因性ヌクレアーゼを使用しないゲノム編集は、外因性ヌクレアーゼの使用を要する方法を上回るいくつかの有益性を提供する。例えば、ヌクレアーゼコード遺伝子を送達するベクターがそうであり得るように、ヌクレアーゼは免疫原性であり得る。加えて、ヌクレアーゼ活性は、標的特異的切断およびオフターゲット切断の両方の理由で、遺伝毒性であり得る。さらに、細胞内へのヌクレアーゼコード配列の導入は、それとともに、ゲノム内へのヌクレアーゼコード配列の考え得る組み込み、およびそれに続く該ヌクレアーゼの安定した発現というリスクも抱えており、免疫原性および遺伝毒性、ならびに該ヌクレアーゼの発現を駆動するプロモーターによる、または該ヌクレアーゼをコードするベクター上に存在している他のプロモーターによる付近遺伝子の活性化というさらにより大きなリスクにつながる。ヌクレアーゼを伴わない方法の使用は、これらのリスクを取り除く。
【００１８】
主題の方法を実践することにおいて、細胞のゲノム内に組み込む導入遺伝子は、本明細書において「ターゲティングベクター」と呼ばれるベクターに載せて、細胞に提供される。言い換えれば、標的指向化された組み込みによって細胞ゲノム内に組み込む核酸配列を含むターゲティングベクターに細胞を接触させる。後に続く詳細な説明において、ターゲティングベクターを含む組成物、それに続いてそれらの使用のための例示的な方法が記載される。
【００１９】
組成物
本発明の局面において、例えば本開示の方法によるゲノム編集において用途が見出される組成物が提供される。一部の態様において、組成物はターゲティングベクターである。上記で記述されるように、ターゲティングベクターとは、細胞のゲノム内に組み込む導入遺伝子を含むベクターを指す。本発明によって包含されるターゲティングベクターの例には、ウイルスベクター、および非ウイルスベクター、例えばプラスミド、ミニサークルなどが含まれる。
【００２０】
一部の態様において、ターゲティングベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターとは、細胞内への移入用の外来DNAフラグメントがその中に挿入され得るウイルスまたはウイルス染色体物質を指す。その生活環にDNA段階を含む任意のウイルスが、主題の方法および組成物におけるウイルスベクターとして用いられ得る。例えば、ウイルスは、一本鎖DNA（ssDNA）ウイルスまたは二本鎖DNA（dsDNA）ウイルスであり得る。それらの生活環にDNA段階を有するRNAウイルス、例えばレトロウイルス、例えばMMLV、レンチウイルスも適切であり、それらはDNAに逆転写される。ウイルスは、組み込み型ウイルスまたは非組み込み型ウイルスであり得る。
【００２１】
非限定的な一例として、関心対象の1種類のウイルスはアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルス、つまり「AAV」とは、ウイルスそれ自体またはその誘導体を意味する。該用語は、別様に必要とされる場合を除き、すべての亜型、ならびに天然に存在する形態および組換えの形態の両方、例えばAAV 1型（AAV-1）、AAV 2型（AAV-2）、AAV 3型（AAV-3）、AAV 4型（AAV-4）、AAV 5型（AAV-5）、AAV 6型（AAV-6）、AAV 7型（AAV-7）、AAV 8型（AAV-8）、AAV 9型（AAV-9）、AAV 10型（AAV-10）、AAV 11型（AAV-11）、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、霊長類AAV、非霊長類AAV、ヒツジAAV、ハイブリッドAAV（すなわち、1種類のAAV亜型のカプシドタンパク質および別の亜型の遺伝物質を含むAAV）、変異体AAVカプシドタンパク質またはキメラAAVカプシド（すなわち、AAVの2種類またはそれを上回る種類の異なる血清型、例えばAAV-DJ、AAV-LK3、AAV-LK19に由来する領域またはドメインまたは個々のアミノ酸を有するカプシドタンパク質）を含むAAVを網羅する。「霊長類AAV」とは、霊長類に感染するAAVを指し、「非霊長類AAV」とは、非霊長類哺乳動物に感染するAAVを指し、「ウシAAV」とは、ウシ哺乳動物に感染するAAVを指す、などである。
【００２２】
「組換えAAVベクター」、つまり「rAAVベクター」とは、AAV起源のものではないポリヌクレオチド配列（すなわち、AAVにとって異種のポリヌクレオチド）、典型的には、主題の方法に従って細胞内に組み込む関心対象の核酸配列、を含むAAVウイルスまたはAAVウイルス染色体物質を意味する。一般的に、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも1つ、一般的には2つのAAV逆向き末端反復配列（ITR）によって隣接される。ある場合には、組換えウイルスベクターは、組換えウイルスベクター物質のパッケージングに重要なウイルス遺伝子も含む。「パッケージング」とは、ウイルス粒子、例えばAAVウイルス粒子のアセンブリおよびカプシド形成をもたらす一連の細胞内事象を意味する。AAVパッケージングに重要な核酸配列（すなわち、「パッケージング遺伝子」）の例には、AAV「rep」および「cap」遺伝子が含まれ、それらはそれぞれ、アデノ随伴ウイルスの複製およびカプシド形成タンパク質をコードする。rAAVベクターという用語は、rAAVベクター粒子およびrAAVベクタープラスミドの両方を包含する。
【００２３】
「ウイルス粒子」とは、ウイルスに基づくポリヌクレオチド、例えばウイルスゲノム（野生型ウイルスにあるもの）、または例えば主題のターゲティングベクター（組換えウイルスにあるもの）をカプシド内封入しているカプシドを含む、ウイルスの単一ユニットを指す。「AAVウイルス粒子」とは、少なくとも1種類のAAVカプシドタンパク質（典型的には、野生型AAVのカプシドタンパク質のすべてによる）およびカプシド内包されたポリヌクレオチドAAVベクターから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子など、野生型AAVゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的に、「rAAVベクター粒子」または単に「rAAVベクター」と呼ばれる。ゆえに、そのようなベクターはrAAV粒子内に含有されるため、rAAV粒子の産生には、必然的にrAAVベクターの産生が含まれる。
【００２４】
主題のターゲティングベクターは、細胞ゲノムにおける関心対象の特異的遺伝子座、すなわち「標的遺伝子座」への導入遺伝子の組み込みを導くように編成される。言い換えれば、組み込みは標的指向化された組み込みである。ターゲティングのための、哺乳動物におけるとくに関心対象の遺伝子座の例には、アルブミン遺伝子；コラーゲン遺伝子、例えば1型コラーゲン、2型コラーゲン、3型コラーゲン、4型コラーゲン、5型コラーゲン、6型コラーゲン、7型コラーゲン、8型コラーゲン、9型コラーゲン、10型コラーゲン、11型コラーゲン、12型コラーゲン、13型コラーゲン、14型コラーゲン、15型コラーゲン、16型コラーゲン、17型コラーゲン、18型コラーゲン、19型コラーゲン、20型コラーゲン、21型コラーゲン、22型コラーゲン、23型コラーゲン、24型コラーゲン、25型コラーゲン、26型コラーゲン、27型コラーゲン、28型コラーゲン；アクチン遺伝子、例えばαアクチン、βアクチン；などが含まれる。
【００２５】
標的指向化された組み込みを促進するために、ターゲティングベクターは、組み込みの部位における相同組換えを許容する核酸配列、例えばアルブミン遺伝子、コラーゲン遺伝子、アクチン遺伝子などとの相同組換えを許容する配列を含む。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を要し、「標的」分子、すなわちその中に配列の核酸が組み込まれる核酸、例えば細胞ゲノムにおける標的遺伝子座の鋳型修復用の、「ドナー」分子、例えばターゲティングベクターを用いて、ドナーから標的への遺伝情報の移入を導く。そのため、主題の組成物のターゲティングベクターにおいて、細胞ゲノム内に組み込む導入遺伝子は、切断部位におけるゲノム配列と十分な相同性、例えば、切断部位に隣接する、例えば切断部位の約50塩基またはそれ未満の数の塩基以内、例えば約30塩基以内、約15塩基以内、約10塩基以内、約5塩基以内にある、または標的組み込み部位に直に隣接するヌクレオチド配列と70％、80％、85％、90％、95％、または100％の相同性を含有する配列によって隣接されて、それと、それが相同性を持するゲノム配列との間の相同組換えを支持し得る。ドナーとゲノム配列との間のおよそ25、50、100、250、または500ヌクレオチドまたはそれを上回る数の配列相同性は、それらの間での相同組換えを支持すると考えられる。
【００２６】
一部の態様において、相同組換えを許容する隣接配列の存在は、隣接配列を欠くベクター、または標的遺伝子座と相同でない隣接配列（例えば、異なるゲノム遺伝子座と相同である隣接配列、標的ゲノムにおけるいかなる位置とも相同性を有しない隣接配列など）を有するベクターと比較して、標的部位での組み込みの割合の増加をもたらす。一部の態様において、ターゲティングベクターを受け取る組織における細胞の中またはターゲティングベクターを受け取る細胞の中の0.01％以上（例えば、0.05％以上、0.1％以上、0.2％以上、0.3％以上、0.4％以上、0.5％以上、0.6％以上、0.7％以上、0.8％以上、0.9％以上、1％以上、1.5％以上、2％以上、5％以上、10％以上）の標的遺伝子座が、投与後に、組み込まれた導入遺伝子を含有する。標的遺伝子座内への組み込みの割合は、任意の適切なアッセイ（例えば、本明細書において記載されるもののような線形増幅アッセイ）によって測定され得る。
【００２７】
一部の態様において、導入遺伝子発現は、実質的に、標的遺伝子座における組み込みによって生じる。例えば、ある場合には、導入遺伝子発現全体の75％以上（例えば、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、99％以上、99.5％以上）が、標的遺伝子座に組み込まれている導入遺伝子由来のものである。言い換えれば、ある場合には、標的遺伝子座における組み込みからの発現と比較した、標的遺伝子座における組み込み以外の供給源（例えば、エピソーム性発現または非標的遺伝子座における組み込みなど）からの導入遺伝子発現の相対的割合は、25％またはそれ未満（例えば、20％またはそれ未満、15％またはそれ未満、10％またはそれ未満、5％またはそれ未満、1％またはそれ未満、0.5％またはそれ未満など）である。標的遺伝子座に基づく組み込みからの発現のパーセントは、任意の適切なアッセイ、例えば本明細書において開示されるアッセイによって測定され得る。
【００２８】
隣接組換え配列は、任意の長さ、例えば10ヌクレオチド以上、50ヌクレオチド以上、100ヌクレオチド以上、250ヌクレオチド以上、500ヌクレオチド以上、1000ヌクレオチド（1kb）以上、5000ヌクレオチド（5kb）以上、10000ヌクレオチド（10kb）、またはそれを上回る長さ等の配列であり得る。一般的に、ドナー配列の相同領域は、組換えが望まれるゲノム配列と少なくとも50％の配列同一性を有する。ある特定の態様において、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、または99.9％の配列同一性が存在している。ターゲティングベクターの長さに応じて、1％〜100％の任意の値の配列同一性が存在し得る。
【００２９】
ある場合には、隣接配列は、互いと長さが実質的に等しくあり得、例えば一方は、他方の隣接配列よりも30％もしくはそれを下回って短くてもよく、他方の隣接配列よりも20％もしくはそれを下回って短くてもよく、他方の隣接配列よりも10％もしくはそれを下回って短くてもよく、他方の隣接配列よりも5％もしくはそれを下回って短くてもよく、他方の隣接配列よりも2％もしくはそれを下回って短くてもよく、または他方よりもわずか数個のヌクレオチド下回ってもよい。他の場合には、隣接配列は、互いと長さが実質的に異なり得る、例えば一方は、他方の隣接配列よりも40％もしくはそれを上回って短くてもよく、50％もしくはそれを上回って短くてもよく、ときには60％もしくはそれを上回って短くてもよく、70％もしくはそれを上回って短くてもよく、80％もしくはそれを上回って短くてもよく、90％もしくはそれを上回って短くてもよく、または95％もしくはそれを上回って短くてもよい。
【００３０】
多くの場合、少なくとも1種類の隣接組換え配列は、標的遺伝子座における遺伝子に対するコード配列を含む。例えば、標的組み込み部位が内因性遺伝子の3'末端を含む場合、導入遺伝子の5'側である、ターゲティングベクター上の組換え配列は、該内因性遺伝子の終止コドンの上流にある、例えば近接したDNA配列と実質的に相同であると考えられ、一方で導入遺伝子の3'側である、ターゲティングベクター上の組換え配列は、該内因性遺伝子の終止コドンの下流にある、例えば近接したDNA配列と実質的に相同であると考えられる。別の例として、標的組み込み部位が内因性遺伝子の5'末端を含む場合、導入遺伝子の5'側である、ターゲティングベクター上の組換え配列は、該内因性遺伝子の開始コドンの上流にある、例えば近接したDNA配列と実質的に相同であると考えられ、一方で導入遺伝子の3'側である、ターゲティングベクター上の組換え配列は、該内因性遺伝子の開始コドンの下流にある、例えば近接したDNA配列と実質的に相同であると考えられる。標的遺伝子座内に、標的遺伝子座における遺伝子に対するコード配列を組み込むことは、多くの用途が見出される。例えば、挿入部位の下流、つまり3'側である標的遺伝子座における遺伝子に対するコード配列を組み込むことは、該遺伝子の発現が、関心対象の遺伝子の組み込みによって実質的に妨害されないことを保証すると考えられる。別の例として、例えば細胞の標的遺伝子座における遺伝子が変異体である場合、標的遺伝子座における遺伝子に対するコード配列を、細胞の標的遺伝子座においてそれ由来の変種である遺伝子配列を発現するように組み込むこと、例えば野生型遺伝子配列で変異体標的遺伝子座を補完して、遺伝子障害を治療することが望ましい場合がある。
【００３１】
一部の態様において、編集される遺伝子座における遺伝子の発現を実質的に妨害することなく、細胞のゲノムを編集することが望ましい。この目標に向けて、ターゲティングベクターは、標的遺伝子座における遺伝子の発現を実質的に妨害することなく導入遺伝子の発現を提供する1種類または複数種類の付加的な核酸配列も含み得る。例えば、ターゲティングベクターは、標的組み込み部位への導入遺伝子の組み込み時に、2種類の独立した遺伝子産物である、標的遺伝子座における内因性遺伝子および組み込まれた導入遺伝子の産生を促進する核酸配列を含み得る。そのような核酸配列の例には、2Aペプチドをコードする配列；IRES；インテイン；部位特異的プロテアーゼ（例えば、フーリン）に対する認識配列；凝固カスケードの一部として切断される切断可能なリンカーをコードする配列；第XI因子切断部位をコードする配列；およびイントロンのスプライスドナー/スプライスアクセプター配列が含まれる。
【００３２】
「2Aペプチド」とは、リボソームスキップにより、コード配列内の遺伝子の配置の順序にかかわらず、単一コード配列内の個別のタンパク質産物の効率的な調和した発現を可能にする小さな（18〜22個のアミノ酸の）ペプチド配列を意味する。2Aペプチドは、それらの共通モチーフ（DVEXNPGP）およびタンパク質切断を促進し得るそれらの能力によって、容易に識別可能である。任意の好都合な2Aペプチド、例えば口蹄疫ウイルス（F2A）、ウマ鼻炎Aウイルス、ブタテッショウウイルス-1（P2A）、もしくはゾセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（T2A）などのウイルス由来の2Aペプチド、またはその開示内容は参照により本明細書に組み入れられる、Szymczak-Workman, A.らの「Design and Construction of 2A Peptide-Linked Multicistronic Vectors」、出典：Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (FriedmannおよびRossi編). CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2007に記載されている2Aペプチドのうちの任意のものを、ターゲティングベクターにおいて用いてもよい。
【００３３】
典型的に、導入遺伝子および2Aペプチドコード配列は、導入遺伝子の挿入時に、標的遺伝子座における内因性遺伝子の中断されない発現、すなわち転写、翻訳、および活性を提供するように、ターゲティングベクター上で位置付けされる。例えば、標的遺伝子座における内因性遺伝子の5'末端付近の、例えば標的遺伝子座における内因性遺伝子の開始コドンのすぐ下流にある組み込み部位に、導入遺伝子を挿入することが望ましい場合がある。そのような場合、2Aペプチドコード配列は、それが導入遺伝子に対して直に3'側であるようにターゲティングベクター内で位置付けされ、かつ標的遺伝子座における内因性遺伝子の開始コドンのすぐ下流にある組み込み部位への、導入遺伝子-2Aペプチドコード配列カセットの相同組換えおよび組み込みを導くと考えられる隣接組換え配列が選択される。別の例として、標的遺伝子座における内因性遺伝子の3'末端内にある、すなわち標的遺伝子座における内因性遺伝子の終止コドンのすぐ上流にある組み込み部位に、導入遺伝子を挿入することが望ましい場合がある。そのような場合、2Aペプチドコード配列は、それが導入遺伝子に対して直に5'側であるようにターゲティングベクター内で位置付けされ、かつ標的遺伝子座における内因性遺伝子の終止コドンのすぐ上流にある組み込み部位への、2A-導入遺伝子カセットの相同組換えおよび組み込みを導くと考えられる隣接組換え配列が選択される。
【００３４】
「内部リボソーム進入部位」、つまり「IRES」とは、メッセンジャーRNA（mRNA）配列の中央部にある、タンパク質翻訳の開始を可能にするヌクレオチド配列を意味する。例えば、IRESセグメントが、2シストロン性真核生物mRNA分子における2つのオープンリーディングフレームの間に位置する場合、それは、mRNA分子の5'末端に結合している、すなわち上流タンパク質コード領域の前にある5'-キャップ構造とは無関係に、下流タンパク質コード領域の翻訳を推進し得る。そのような設定では、両方のタンパク質が細胞内で産生される。第一のシストロンに位置するタンパク質は、キャップ依存的開始手法によって合成され、一方で第二のタンパク質の翻訳開始は、2つのタンパク質コード領域間のシストロン間スペーサー領域に位置するIRESセグメントによって指揮される。IRESは、ウイルスゲノムおよび細胞ゲノムから単離されている。人工的に操作されたIRESも、当技術分野において公知である。任意の好都合なIRESが、ドナーポリヌクレオチドにおいて採用され得る。
【００３５】
典型的に、2Aペプチドと同様に、導入遺伝子およびIRESは、導入遺伝子の挿入時に、標的遺伝子座における遺伝子の中断されない発現を提供するようにターゲティングベクター上で位置付けされる。例えば、標的遺伝子座における遺伝子の5'非翻訳領域（UTR）内にある組み込み部位に、導入遺伝子を挿入することが望ましい場合がある。そのような場合、IRESは、それが導入遺伝子に対して直に3'であるようにターゲティングベクター内で位置付けされ、かつ5' UTR内の組み込み部位への、導入遺伝子-IRESカセットの相同組換えおよび組み込みを導くと考えられる隣接組換え配列が選択される。別の例として、標的遺伝子座における遺伝子の3' UTR内にある、すなわち終止コドンの下流であるがポリアデニル化配列の上流にある組み込み部位に、導入遺伝子を挿入することが望ましい場合がある。そのような場合、IRESは、それが導入遺伝子に対して直に5'側であるようにターゲティングベクター内で位置付けされ、かつ標的遺伝子座における遺伝子の3' UTR内の組み込み部位への、IRES-導入遺伝子カセットの相同組換えおよび組み込みを導くと考えられる隣接組換え配列が選択される。
【００３６】
「インテイン」とは、それ自体を切除し得、かつ翻訳されたポリペプチド配列（「エクステイン」）の残存部分をペプチド結合で再接合させ得るポリペプチドのセグメントを意味する。言い換えれば、ターゲティングベクターは、翻訳された場合に、改変された標的遺伝子座から翻訳されるポリペプチドからの、導入遺伝子によってコードされるタンパク質の切除を促進する核酸配列を含む。インテインは、天然に存在し得るもの、すなわちタンパク質スプライシング反応を自然発生的に触媒して、それら自身の配列を切除しかつ隣接エクステイン配列を接合させるインテインであり得るか、または人工的なもの、すなわち制御可能なスプライシングを受けるように操作されているインテインであり得る。インテインは、典型的に、ほとんどのN末端箇所におけるCys（C）、Ser（S）、Ala（A）、Gln（Q）、またはPro（P）および下流TXXH配列を含むN末端スプライシング領域；ならびにほとんどのC末端箇所におけるAsn（N）、Gln（Q）、またはAsp（D）および最後から2番目のC末端箇所におけるHis（H）を含むC末端スプライシング領域を含む。加えて、そこからインテインがスプライシングされるエクステインの＋1箇所（それぞれ、インテイン挿入部位に対して直にN末端およびC末端の箇所として規定される、エクステインの−1および＋1）に、Cys（C）、Ser（S）、またはThr（T）が位置する。インテインがタンパク質スプライシングを促進するメカニズム、およびインテインスプライシングの要件は、Liu, X-Q,「Protein Splicing Intein: Genetic Mobility, Origin, and Evolution」Annual Review of Genetics 2000, 34: 61-76において、および例えばワールドワイドウェブで「tools(dot)neb(dot)com/inbase/mech(dot)php」にて見出されるNew England Biolabsウェブサイト上のInBaseデータベースなどの公的に利用可能なデータベースにおいて見出され得、その開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。それが自然発生的な切除であろうとまたは制御された切除であろうと、ドナーポリヌクレオチドにインテイン関連切除を付与することが知られる任意の配列、例えばN末端スプライシング領域およびC末端スプライシング領域は、主題の組成物において用途が見出される。インテインとして編成される関心対象の遺伝子は、標的遺伝子座の任意のエクソン内の組み込み部位に、すなわち標的遺伝子座における遺伝子の開始コドンと終止コドンとの間に挿入され得る。
【００３７】
部位特異的プロテアーゼに対する認識配列とは、一般的に、タンパク質分解を実施する酵素によって認識されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を意味する。ある場合には、そのようなアミノ酸配列は、「切断可能なリンカー」と呼ばれる。例えば、ある場合には、切断可能なリンカーは、凝固カスケードの一部として切断される（例えば、ある場合には、部位特異的プロテアーゼに対する認識配列は、第XI因子切断部位である）。高度に特異的であるプロテアーゼ、およびそれらが切断する配列の非限定的な例には、トロンビン（その切断部位Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Serにおけるアルギニン残基の後で切断する）、TEVプロテアーゼ（その切断部位Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Serにおけるグルタミン残基の後で切断する）、フーリン（配列Arg-X-(Lys/Arg)-Argの最後のアルギニンの後でタンパク質を切断する）、エンテロキナーゼ（その切断部位Asp-Asp-Asp-Asp-Lysにおけるリジン残基の後で切断する）、第Xa因子（その切断部位Ile-(GluまたはAsp)-Gly-Argにおけるアルギニン残基の後で切断する）、ゲネナーゼI（部位Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyrにおいて切断する）、HRV 3Cプロテアーゼ（その切断部位Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Proにおけるグルタミン残基の後で切断する）が含まれる。一部の態様において、切断可能なリンカーは、細胞内プロテアーゼによって切断される。一部の態様において、切断可能なリンカーは、細胞外プロテアーゼによって切断される。
【００３８】
「イントロン」とは、遺伝子の最終的な成熟RNA産物を生成するためにRNAスプライシングによって取り除かれる、遺伝子内の任意のヌクレオチド配列を意味する。言い換えれば、ターゲティングベクターは、転写された場合に、改変された標的遺伝子座から転写されるプレRNAからの、関心対象の遺伝子によってコードされるプレRNAの切除を促進し、導入遺伝子が標的遺伝子座のmRNAとは別個に翻訳されるのを可能にする（または、導入遺伝子がsiRNA、miRNAなどをコードする場合にはそうではない）核酸配列を含む。イントロンは、典型的に5'スプライス部位（スプライスドナー）、3'スプライス部位（スプライスアクセプター）、および分岐部位を含む。スプライスドナーは、イントロンの5'末端にほぼ不変の配列GUを含む。スプライスアクセプターは、ほぼ不変のAG配列でイントロンを終結させる。スプライスアクセプターから上流（5'-区域）は、ピリミジン（CおよびU）またはポリピリミジントラクトが高い領域である。ポリピリミジントラクトから上流は、アデニンヌクレオチドを含む分岐点である。これらのエレメントを含むことに加えて、ターゲティングベクターは、関心対象の遺伝子から転写されるmRNAの翻訳を促進する1種類または複数種類の付加的配列、例えばコザック共通配列、リボソーム結合部位、内部リボソーム進入部位などを含み得る。イントロンとして編成される関心対象の遺伝子は、ポリアデニル化配列をコードする核酸配列の5'側のいずれかの箇所における標的遺伝子座の転写される配列内の組み込み部位、例えば標的遺伝子座における遺伝子の3'非翻訳領域、コード配列、または5'非翻訳領域に挿入され得る。
【００３９】
上記で記述されるように、ある場合には、2種類またはそれを上回る種類の関心対象の遺伝子、例えば3種もしくはそれを上回る、4種もしくはそれを上回る、または5種もしくはそれを上回る種類の関心対象の遺伝子を標的遺伝子座内に挿入することが望ましい場合がある。そのような場合、複数の2AペプチドまたはIRESを用いて、2シストロン性または多シストロン性のターゲティングベクターを創出してもよい。例えば、導入遺伝子および選択可能なマーカーは、それらの、標的遺伝子座によってコードされるポリペプチドおよび互いからの切断を促進するために用いられる2Aペプチドとともに、標的遺伝子座における遺伝子の3'領域内に組み込まれ得る。あるいは、関心対象のコード配列は、標的遺伝子座における遺伝子のものとは異なるプロモーターの制御下で、ターゲティングベクター上に提供され得る。
【００４０】
典型的に、関心対象の遺伝子、2Aペプチド、および組換え配列は、関心対象の遺伝子の挿入時に、標的遺伝子座における遺伝子の中断されない発現を提供するようにターゲティングベクター上で位置付けされる。例えば、上記で記述されるように、標的遺伝子座における遺伝子の開始コドンの3'、つまり「下流」である、例えば標的遺伝子座における遺伝子に対する開始コドン（すなわち、スタートATG）から最初の50ヌクレオチド3'側以内、例えば開始コドンから最初の25ヌクレオチド3'側以内、開始コドンから最初の10ヌクレオチド3'側以内、開始コドンから最初の5ヌクレオチド3'側以内にある組み込み部位に、またはある場合には、開始コドンの直に3'である、すなわち開始コドンに隣接した組み込み部位に、導入遺伝子を挿入することが望ましい場合がある。そのような場合、2Aペプチドは、それが関心対象の遺伝子に対して直に3'側であるようにターゲティングベクター内で位置付けされ、かつ標的遺伝子座における開始コドンの3'側である組み込み部位への、関心対象の遺伝子の相同組換えおよび組み込みを導くと考えられる隣接組換え配列が選択される。別の例として、標的遺伝子座における遺伝子の終結コドンの5'側、つまり「上流」である、例えば終結コドン（すなわち終止コドン、例えばTAA、TAG、またはTGA）から最初の50ヌクレオチド5'側以内、例えば終結コドンから最初の25ヌクレオチド5'側以内、終結コドンから最初の10ヌクレオチド5'側以内、終結コドンから最初の5ヌクレオチド以内にある組み込み部位に、または一部の態様では、終結コドンの直に5'側である、すなわち終結コドンに隣接した組み込み部位に、関心対象の遺伝子を挿入することが望ましい場合がある。そのような場合、2Aペプチドは、それが関心対象の遺伝子に対して直に5'側であるようにターゲティングベクター内で位置付けされ、かつ標的遺伝子座における終結コドンの5'側である組み込み部位への、関心対象の遺伝子の相同組換えおよび組み込みを導くと考えられる隣接組換え配列が選択される。
【００４１】
ターゲティングベクターは、組み込み部位における関心対象の遺伝子の挿入の成功について評価するために用いられ得る配列、例えば制限部位、ヌクレオチド多型、選択可能なマーカーなども含み得る。典型的に、ターゲティングベクターは、関心対象の標的領域と相同ではない配列、および関心対象の標的領域内への挿入が意図されない配列、例えばウイルス配列、例えば複製起点、cap遺伝子、rep遺伝子、ITRなどを含有するベクター骨格も含む。
【００４２】
方法
主題の方法を実践することにおいて、細胞、例えば有糸分裂細胞、有糸分裂後細胞と、ターゲティングベクターとを、インビトロまたはインビボで接触させる。言い換えれば、ターゲティングベクターが細胞によって取り込まれるように、ターゲティングベクターに細胞を接触させる。主題のターゲティングベクターは、例えば裸の核酸として、リポソームまたはポロキサマーなどの作用物質と複合した核酸として、ウイルス（例えば、アデノウイルス、AAV、レトロウイルス）中のゲノム物質としてなど、ターゲティングベクターが細胞によって取り込まれることをもたらす任意の好都合な方法によって細胞に導入され得る。エレクトロポレーション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびリポフェクションなど、プラスミドである核酸ベクターに細胞を接触させるための方法は当技術分野において周知であり、そのうちのいずれかを用いてもよい。核酸ベクターをウイルスカプシド内にパッケージするための、核酸ベクターを含むウイルス粒子を収集するための、および核酸ベクターを含むウイルス粒子と細胞を接触させるための方法およびシステムも当技術分野において周知であり、そのうちのいずれかを用いてもよい。いったん細胞の内側に入ると、ターゲティングベクターは、エピソーム的に、例えばプラスミドとして、ミニサークルDNAとして、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルスなどのウイルスとして維持され得るか、またはそれらは、相同組換えもしくはランダムな組み込み、例えばMMLV、HIV-1、ALVなどのレトロウイルス由来のベクターを介して標的細胞ゲノム内に組み込まれ得る。
【００４３】
一部の態様において、ターゲティングベクターは、ターゲティングベクターを含むウイルス粒子として細胞に提供される。そのような場合、ターゲティングベクターは、典型的に、対象の核酸配列、例えば導入遺伝子、2種類の独立した遺伝子産物の産生を促進する核酸配列、標的組み込み部位と相同な配列などを、ウイルスゲノム配列、例えば逆向き末端反復（ITR）を伴った異種配列として含む。その生活環にDNA段階を含む任意のウイルスが、主題の方法および組成物におけるウイルスベクターとして用いられ得る。例えば、ウイルスは、一本鎖DNA（ssDNA）ウイルスまたは二本鎖DNA（dsDNA）ウイルスであり得る。それらの生活環にDNA段階を有するRNAウイルス、例えばレトロウイルス、例えばMMLV、レンチウイルスも適切であり、それらはDNAに逆転写される。ウイルスは、組み込み型ウイルスまたは非組み込み型ウイルスであり得る。
【００４４】
アデノ随伴ウイルスは、例えば、主題の方法にとくに適している。アデノ随伴ウイルス、つまり「AAV」とは、ウイルスそれ自体またはその誘導体を意味する。該用語は、別様に要求される場合を除き、すべての亜型、ならびに天然に存在する形態および組換えの形態の両方、例えばAAV 1型（AAV-1）、AAV 2型（AAV-2）、AAV 3型（AAV-3）、AAV 4型（AAV-4）、AAV 5型（AAV-5）、AAV 6型（AAV-6）、AAV 7型（AAV-7）、AAV 8型（AAV-8）、AAV 9型（AAV-9）、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、霊長類AAV、非霊長類AAV、ヒツジAAV、ハイブリッドAAV（すなわち、1種類のAAV亜型のカプシドタンパク質および別の亜型の遺伝物質を含むAAV）、変異体AAVカプシドタンパク質またはキメラAAVカプシド（すなわち、AAVの2種類またはそれを上回る種類の異なる血清型、例えばAAV-DJ、AAV-LK3、AAV-LK19に由来する領域またはドメインまたは個々のアミノ酸を有するカプシドタンパク質）を含むAAVなどを網羅する。
【００４５】
関心対象の異種核酸配列、例えば導入遺伝子、2種類の独立した遺伝子産物の産生を促進する核酸配列、標的組み込み部位等と相同な配列、およびrAAVビリオンを作製するために用いられるものを含むAAV発現ベクターは、当技術分野において周知である方法を用いて構築され得る。例えば、Koerber et al. (2009) Mol. Ther. 17:2088；Koerber et al. (2008) Mol Ther.16:1703-1709；米国特許第7,439,065号、第6,951,758号、および第6,491,907号を参照されたい。例えば、異種配列は、そこから主要なAAVオープンリーディングフレーム（「ORF」）が切除されているAAVゲノム内に直接挿入され得る。ITRの十分な部分が依然として複製およびパッケージングの機能を可能にする限り、AAVゲノムの他の部分も欠失させることができる。そのような構築物は、当技術分野において周知の技法を用いて設計され得る。例えば、米国特許第5,173,414号および第5,139,941号；国際公報第WO 92/01070号（1992年1月23日公表）および第WO 93/03769号（1993年3月4日公表）；Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996；Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539；Muzyczka, N. (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97-129；Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801；Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169；ならびにZhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875を参照されたい。
【００４６】
rAAVビリオンを産生するために、トランスフェクションなどの公知の技法を用いて、AAV発現ベクターを適切な宿主細胞内に導入する。多数のトランスフェクション技法が、当技術分野において一般的に公知である。例えば、Graham et al. (1973) Virology, 52:456、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York、Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier、およびChu et al. (1981) Gene 13:197を参照されたい。とくに適切なトランスフェクション法には、リン酸カルシウム共沈殿（Graham et al. (1973) Virol. 52:456-467）、培養細胞内への直接マイクロインジェクション（Capecchi, M. R. (1980) Cell 22:479-488）、エレクトロポレーション（Shigekawa et al. (1988) BioTechnigues 6:742-751）、リポソーム介在性遺伝子移入（Mannino et al. (1988) BioTechniques 6:682-690）、脂質介在性形質導入（Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417）、および高速微粒子銃（microprojectile）を用いた核酸送達（Klein et al. (1987) Nature 327:70-73）が含まれる。
【００４７】
rAAVビリオンを産生するための適切な宿主細胞には、異種DNA分子のレシピエントとして用いられ得るまたは用いられている微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が含まれる。該用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。ゆえに、本明細書において用いられる「宿主細胞」とは、概して、外因性DNA配列をトランスフェクトされた細胞を指す。安定したヒト細胞株である293（例えば、アクセッション番号ATCC CRL1573の下で、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）を介して容易に入手可能である）由来の細胞を用いることができる。例えば、ヒト細胞株293は、アデノウイルス5型のDNAフラグメントで形質転換されており（Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36:59）、かつアデノウイルスE1aおよびE1b遺伝子を発現する（Aiello et al. (1979) Virology 94:460）ヒト胎児腎臓細胞株である。293細胞株は容易にトランスフェクトされ、かつそこでrAAVビリオンを産生する好都合なプラットフォームを提供する。昆虫細胞においてAAVビリオンを産生する方法は当技術分野において公知であり、それを用いて対象のrAAVビリオンを産生することができる。例えば、米国特許出願公開第2009/0203071号；米国特許第7,271,002号；およびChen (2008) Mol. Ther. 16:924を参照されたい。
【００４８】
産生されるAAVウイルスは、複製能を有してもまたは複製能を有しなくてもよい。「複製能を有する」ウイルス（例えば、複製能を有するAAV）とは、感染性であり、かつ（例えば、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下において）感染細胞内で複製もされ得る、表現型上は野生型のウイルスを指す。AAVの場合、複製能は、一般的に、機能的AAVパッケージング遺伝子の存在を要する。概して、本明細書において記載されるrAAVベクターは、1種類または複数種類のAAVパッケージング遺伝子の欠如により、哺乳動物細胞において（とりわけ、ヒト細胞において）複製能を有しない。典型的に、そのようなrAAVベクターは、AAVパッケージング遺伝子と新入rAAVベクターとの間の組換えによって複製能を有するAAVが生成される可能性を最小限に抑えるために、いかなるAAVパッケージング遺伝子配列をも欠く。多くの態様において、本明細書において記載されるrAAVベクター調製物は、たとえあったとしてもごくわずかな複製能を有するAAVを含有するものである（rcAAV、RCAとも呼ばれる）（例えば、102個のrAAV粒子あたり約1個未満のrcAAV、104個のrAAV粒子あたり約1個未満のrcAAV、108個のrAAV粒子あたり約1個未満のrcAAV、1012個のrAAV粒子あたり約1個未満のrcAAV、またはrcAAVなし）。
【００４９】
例えばプラスミドとして、ウイルスとしてなどの主題のターゲティングベクターと細胞をインビトロまたはインビボで接触させてもよい。インビトロで接触させる場合、細胞は、樹立細胞株由来のものであり得、またはそれらは初代細胞であり得、「初代細胞」、「初代細胞株」、および「初代培養物」とは、対象に由来しており、かつ例えば対象へ戻すために、大幅な付加的培養なしで改変された、すなわち「エクスビボ」で改変された、または培養物の限られた回数の継代、すなわち分割の間インビトロで成長させた細胞および細胞培養物を指すために、本明細書において互換可能に用いられる。例えば、初代培養物は、0回、1回、2回、4回、5回、10回、または15回、しかしながら危機的段階を通過するほど十分ではない回数継代されてきた可能性がある培養物である。典型的に、本発明の初代細胞株は、10回よりも少ない回数の継代の間インビトロで維持される。典型的に、接触させる細胞は、相同組換えを許容する。
【００５０】
細胞が初代細胞である場合、それらは、任意の好都合な方法によって個体から収集され得る。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、密度勾配分離などによって好都合に収集され得、一方で皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃などの組織由来の細胞は、生検によって最も好都合に収集される。収集された細胞の分散または懸濁のために、適当な溶液が用いられ得る。そのような溶液は、一般的に、低濃度の、一般に5〜25mMの許容されるバッファーと合わせて、子ウシ胎仔血清または他の天然に存在する因子を好都合に補充された、平衡塩類溶液、例えば通常生理食塩水、PBS、ハンクス平衡塩類溶液などである。好都合なバッファーには、HEPES、リン酸塩バッファー、乳酸塩バッファーなどが含まれる。細胞は直ちに用いられ得るか、またはそれらは長期間保管され得、凍結され得、融解されて再び用いる事ができる。そのような場合、細胞は、通例、そのような凍結温度で細胞を保存するために当技術分野において一般に用いられる10％DMSO、50％血清、40％緩衝培地、または他の何らかのそのような溶液中で凍結され、かつ凍結された培養細胞を融解するための当技術分野において一般に知られる様式で融解される。
【００５１】
インビトロでDNA組み込みを誘導するために、例えばウイルスとしてのターゲティングベクターを、約30分間〜約24時間の間、例えば1時間、1.5時間、2時間、2.5時間、3時間、3.5時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、12時間、16時間、18時間、20時間、または約30分間〜約24時間の他の任意の期間、細胞に提供し、それは、約毎日〜約4日間ごとの頻度で、例えば1.5日間ごと、2日間ごと、3日間ごと、または約毎日〜約4日間ごとの他の任意の頻度で繰り返され得る。ターゲティングベクターを、1回または複数回、例えば1回、2回、3回、または3回を上回る回数対象の細胞に提供してもよく、かつ細胞を、各接触事象の後に、ある量の時間の間、例えば16〜24時間の間、標的ベクターとともにインキュベートし、その時間の後、培地を新鮮な培地と置き換え、かつ細胞をさらに培養する。
【００５２】
ターゲティングベクターに細胞を接触させる工程は、細胞の生存を促進する任意の培養培地中でかつ任意の培養条件下で行われ得る。例えば、細胞は、子ウシ胎仔血清または熱不活性化ヤギ血清（約5〜10％）、L-グルタミン、チオール、とくに2-メルカプトエタノール、および抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンを補充されたイスコフ改変DMEMまたはRPMI 1640など、好都合である任意の適当な栄養培地中に懸濁され得る。培養物は、細胞がそれに対して反応性である成長因子を含有し得る。本明細書において規定される成長因子は、膜貫通受容体に対する特異的作用を介して、培養下でまたは無傷の組織において、細胞の生存、成長、および/または分化を促進し得る分子である。成長因子には、ポリペプチド性および非ポリペプチド性の因子が含まれる。
【００５３】
典型的に、有効量のターゲティングベクターを細胞に提供して、組換えおよび組み込みを促進する。標的ベクターの有効量とは、陰性対照、例えば空ベクターと接触させた細胞と比べて、導入遺伝子の組み込みが観察される細胞の数において、2倍またはそれを上回る増加を誘導する量である。組み込みの量は、任意の好都合な方法によって測定され得る。例えば、遺伝子座における関心対象の遺伝子の存在は、例えばフローサイトメトリーによって検出され得る。標的遺伝子座を増幅すると考えられるプライマーを用いてPCRまたはサザンハイブリダイゼーションを実施して、挿入の存在を検出してもよい。関心対象の組み込まれた遺伝子の発現または活性は、ドナーポリヌクレオチドとの接触の例えば2時間、4時間、8時間、12時間、24時間、36時間、48時間、72時間、またはそれを上回る時間の後に、ウェスタン、ELISA、タンパク質活性についての試験などによって判定され得る。別の例として、組み込みは、イメージング用マーカーまたは選択可能なマーカーを一緒に組み込み、かつ細胞において該イメージング用のまたは選択可能なマーカーの存在を検出することによって測定され得る。
【００５４】
典型的に、主題の組成物および方法を用いた細胞の遺伝子改変は、改変された遺伝子座、すなわち標的遺伝子座における遺伝子の発現の妨害を伴わない。言い換えれば、標的遺伝子座における遺伝子の通常の発現は、標的遺伝子座内への関心対象の遺伝子の標的指向化された組み込みの後、空間的に、時間的に、かつ通常レベルから実質的に変化していないレベルで、例えば通常レベルから5倍またはそれ未満の割合、例えば通常レベルから4倍もしくはそれを未満、または3倍もしくはそれを未満、より通例では2倍もしくはそれを未満の割合で異なるレベルで維持される。
【００５５】
ある場合には、細胞の集団は、遺伝子改変された細胞を残りの集団から分離することによって、導入遺伝子を含むものについて富化され得る。遺伝子改変された細胞の分離は、典型的に、標的遺伝子座内に一緒に組み込まれる選択可能なマーカーの発現に依存する。「選択可能なマーカー」とは、細胞、例えば本願の組成物によって標的とされている細胞を選択するために用いられ得る作用物質を意味する。ある場合には、選択は陽性選択であり得る；つまり、細胞を集団から単離して、例えば遺伝子改変を含む細胞の富化集団を創出する。他の場合には、選択は陰性選択であり得る；つまり、集団を細胞から単離して除いて、例えば遺伝子改変を含まない細胞の富化集団を創出する。分離は、用いられる選択可能なマーカーにとって適当な任意の好都合な分離技法によるものであり得る。例えば、蛍光マーカーが挿入されている場合、細胞は蛍光活性化細胞選別によって分離され得、一方で細胞表面マーカーが挿入されている場合、細胞は、アフィニティー分離技法、例えば磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、固体マトリックスに付着されたアフィニティー試薬による「パンニング」、または他の好都合な技法によって、異種集団から分離され得る。正確な分離を提供する技法には、多色チャンネル、低角度でかつ鈍い光散乱を検出するチャンネル、インピーダンスチャネルなど、精巧さが様々である蛍光活性化細胞選別機が含まる。細胞は、死細胞と関連した色素（例えば、ヨウ化プロピジウム）を採用することによって、死細胞に対して選択され得る。遺伝子改変された細胞の生存率にとって過度に有害でない任意の技法が採用され得る。
【００５６】
導入遺伝子を含む細胞について高度に富化される細胞組成物は、この様式で達成される。「高度に富化される」とは、遺伝子改変された細胞が、細胞組成物の70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、例えば細胞組成物の約95％以上、または98％以上であることを意味する。言い換えれば、組成物は、遺伝子改変された細胞の実質的に純粋な組成物であり得る。
【００５７】
本明細書において記載される方法によって産生される遺伝子改変された細胞は、直ちに用いられ得る。あるいは、細胞は、液体窒素温度で凍結され得かつ長期間保管され得、融解されて再び用いる事ができる。そのような場合、細胞は、通例、そのような凍結温度で細胞を保存するために当技術分野において一般に用いられる10％DMSO、50％血清、40％緩衝培地、または他の何らかのそのような溶液中で凍結され、かつ凍結された培養細胞を融解するための当技術分野において一般に知られる様式で融解される。
【００５８】
遺伝子改変された細胞は、様々な培養条件下にてインビトロで培養され得る。細胞は、培養下で増殖され得る、すなわちそれらの増殖を促進する条件下で成長し得る。培養培地は、液体、または例えば寒天、メチルセルロースなどを含有する半固体であり得る。細胞集団は、子ウシ胎仔血清（約5〜10％）、L-グルタミン、チオール、とくに2-メルカプトエタノール、および抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンを通例補充されたイスコフ改変DMEMまたはRPMI 1640など、適当な栄養培地中に懸濁され得る。培養物は、細胞がそれに対して反応性である成長因子を含有し得る。本明細書において規定される成長因子は、膜貫通受容体に対する特異的作用を介して、培養下でまたは無傷の組織において、細胞の生存、成長、および/または分化を促進し得る分子である。成長因子には、ポリペプチド性および非ポリペプチド性の因子が含まれる。
【００５９】
この方式で遺伝子改変されている細胞は、例えば疾患を治療するための遺伝子療法などの目的のために、または抗ウイルス性、抗病原性、もしくは抗癌性の治療用物質として、農業における遺伝子改変された生物の産生のために、あるいは生物学的研究のために、対象に移植され得る。対象は、新生児、幼若動物、または成体であり得る。とくに関心対象であるものは、哺乳動物対象である。本方法を用いて治療され得る哺乳動物種には、イヌおよびネコ；ウマ；ウシ；ヒツジ；など、ならびに霊長類、とくにヒトが含まれる。動物モデル、とくに小型哺乳動物、例えばマウス、ウサギなどが、実験的調査に用いられ得る。
【００６０】
細胞は、単独で、または例えばそれらが移植される組織においてそれらの成長および/もしくは組織化を支持する適切な基板もしくはマトリックスとともに対象に提供され得る。通例、少なくとも1×103個の細胞、例えば5×103個の細胞、1×104個の細胞、5×104個の細胞、1×105個の細胞、1×106個の細胞、またはそれを上回る数の細胞が投与される。細胞は、以下の経路：非経口、皮下、静脈内、頭蓋内、脊髄内、眼内、または髄液中へのうちのいずれかを介して、対象に導入され得る。細胞は、注射、カテーテルなどによって導入され得る。局所送達、つまり損傷の部位への送達のための方法の例には、例えば髄腔内送達のための、例えばOmmayaリザーバーを介したもの（参照により本明細書に組み入れられる、例えば米国特許第5,222,982号および第5385582号を参照されたい）；例えば関節内への、例えば注射器によるボーラス注射によるもの；例えば対流を有する、例えば挿管による連続注入によるもの（参照により本明細書に組み入れられる、例えば米国出願第20070254842号を参照されたい）；または細胞がその上に可逆的に取り付けられているデバイスを埋め込むことによるもの（参照により本明細書に組み入れられる、例えば米国出願第20080081064号および第20090196903号を参照されたい）が含まれる。
【００６１】
対象への治療の実施の回数は変動し得る。遺伝子改変された細胞を対象に導入する工程は、1回の事象であり得る；しかしながらある特定の状況において、そのような治療がもたらし得る改善は期間が限られており、継続的な一連の反復治療を要し得る。他の状況において、遺伝子改変された細胞の多数回投与が、効果が観察される前に要され得る。精確なプロトコールは、治療を受けている個々の対象の疾患または病状、疾患の段階、およびパラメーターによって異なる。
【００６２】
本発明の他の局面において、ターゲティングベクターを採用して、細胞DNAをインビボで改変する。これらのインビボ態様において、ターゲティングベクターは、例えばウイルスとして、個体に直接投与される。ターゲティングベクターは、対象への核酸の投与のための、当技術分野において周知の多数の方法のいずれかによって投与され得る。ターゲティングベクターは、多様な製剤に組み入れられ得る。より具体的には、本発明のターゲティングベクターは、適当な薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤との組み合わせによって、薬学的組成物中に製剤化され得る。
【００６３】
薬学的調製物は、ターゲティングベクターを、薬学的に許容されるビヒクル中に存在している例えばウイルスとして含む組成物である。「薬学的に許容されるビヒクル」は、ヒトなどの哺乳動物における使用に関して、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって認可された、または米国薬局方もしくは他の一般的に認められている薬局方に列挙されたビヒクルであり得る。「ビヒクル」という用語は、哺乳動物への投与のために、それとともに本発明の化合物が製剤化される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはキャリアを指す。そのような薬学的ビヒクルは、脂質、例えばリポソーム、例えばリポソームデンドリマー；水、およびピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など、石油、動物性、植物性、または合成の起源のものを含む油、生理食塩水などの液体；アカシアガム、ゼラチン、デンプン糊、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであり得る。加えて、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、および着色剤が用いられ得る。薬学的組成物は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐薬、注射液、吸入剤、ゲル、ミクロスフェア、およびエアロゾルなど、固体、半固体、液体、またはガスの形態で調製物中に製剤化され得る。そのため、ターゲティングベクターの投与は、経口、口腔内、直腸、非経口、腹腔内、眼内、皮内、経皮、気管内などへの投与を含む様々な方式で達成され得る。活性作用物質は、投与後に全身性であり得るか、または領域的投与である壁内投与の使用によって、もしくは埋め込みの部位で活性用量を保持するように作用するインプラントの使用によって局在性であり得る。活性作用物質は即時活性向けに製剤化され得るか、またはそれは持続的放出向けに製剤化され得る。
【００６４】
一部の病状、とくに中枢神経系の病状に関して、血液脳関門（BBB）を横断する作用物質を製剤化する必要があり得る。血液脳関門（BBB）を通じた薬物送達のための1つのストラテジーは、マンニトールもしくはロイコトリエンなどの浸透圧手段によって、またはブラジキニンなどの血管作動性物質の使用により生化学的に、BBBを妨害することを伴う。BBB開口を用いて、特異的作用物質を脳腫瘍に標的指向化する可能性も選択肢である。組成物が血管内注射によって投与される場合、BBB妨害作用物質を本発明の治療用組成物とともに共投与してもよい。BBBを通過する他のストラテジーは、カベオリン-1介在性トランスサイトーシス、グルコースおよびアミノ酸キャリアなどのキャリア介在性輸送体、インスリンまたはトランスフェリンに対する受容体介在性トランスサイトーシス、およびp-糖タンパク質などの活性流出輸送体を含む、内因性輸送システムの使用を伴い得る。活性輸送部分もまた、本発明における使用のための治療用組成物に抱合させて、血管の内皮壁を越えた輸送を促してもよい。あるいは、BBBの裏側への治療用作用物質の薬物送達は、局所送達による、例えばOmmayaリザーバーを介した、例えば髄腔内送達によるもの（参照により本明細書に組み入れられる、例えば米国特許第5,222,982号および第5385582号を参照されたい）；例えば硝子体内へのもしくは頭蓋内への、例えば注射器によるボーラス注射によるもの；例えば対流を有する、例えば挿管による連続注入によるもの（参照により本明細書に組み入れられる、例えば米国出願第20070254842号を参照されたい）；または作用物質がその上に可逆的に取り付けられているデバイスを埋め込むことによるもの（参照により本明細書に組み入れられる、例えば米国出願第20080081064号および第20090196903号を参照されたい）であり得る。
【００６５】
典型的に、有効量のターゲティングベクターが提供される。エクスビボ方法に関して上記で記述されるように、インビボにおけるターゲティングベクターの有効量または有効用量とは、陰性対照、例えば空ベクターまたは無関係のポリペプチドと接触させた細胞と比べて、ターゲティングベクターと標的遺伝子座との間の組換えが観察され得る細胞の数において、2倍またはそれを上回る増加を誘導する量である。組換えの量は、任意の好都合な方法、例えば上記で記載されるものおよび当技術分野において公知の方法によって測定され得る。投与されるターゲティングベクターの有効量または有効用量の計算は、当業者の技能の範囲内であり、かつ当業者にとって日常的であろう。言うまでもなく、投与されるべき最終量は、投与の経路に、および治療される障害または病状の性質に依存する。
【００６６】
特定の患者に与えられる有効量は、そのうちのいくつかは患者ごとに異なるであろう多様な因子に依存する。資格のある臨床医であれば、必要に応じて疾患状態の進行を停止させるまたは逆転させるために、患者に投与するターゲティングベクターの有効量を決定する事ができるであろう。LD50動物データ、および作用物質に関して入手可能な他の情報を利用すると、臨床医であれば、投与の経路に応じて、個体に対する最大安全用量を決定することができる。例えば、治療用組成物が投与されている流体がより多量であることを考慮すると、静脈内投与される用量は、髄腔内に投与される用量よりも多い可能性がある。同様に、治療濃度を維持するために、身体から急速に一掃される組成物をより高用量でまたは反復投薬で投与してもよい。通常の技能を利用すると、資格のある臨床医であれば、日常の臨床的試行の経過の中で、特定の治療法の投薬量を最適化することができるであろう。
【００６７】
医薬内への封入のために、ターゲティングベクターは、適切な商業的供給源から入手され得る。一般的命題として、投薬1回あたりの非経口的に投与されるターゲティングベクターの薬学的に有効な総量は、用量応答曲線によって測定され得る値域内にある。
【００６８】
ターゲティングベクターに基づく療法は、無菌でなければならない。無菌性は、無菌性濾過膜（例えば、0.2μmの膜）を通じた濾過によって容易に遂行される。治療用組成物は、一般的に、無菌アクセスポートを有する容器内、例えば静注用溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアル内に置かれる。ターゲティングベクターに基づく療法は、水溶液としてまたは再構成のための凍結乾燥製剤として、単位用量または多数回用量の容器内、例えば密封されたアンプルまたはバイアル内に保管され得る。凍結乾燥製剤の例として、10mLバイアルを5mlの無菌濾過された1％（w/v）の化合物の水溶液で満たし、かつ結果として生じた混合物を凍結乾燥する。輸液は、静菌性注射用水を用いて凍結乾燥化合物を再構成することによって調製される。
【００６９】
薬学的組成物は、所望される製剤に応じて、薬学的に許容される非毒性のキャリアまたは希釈剤を含み得、それは、動物またはヒト投与のための薬学的組成物を製剤化するために一般に用いられるビヒクルとして規定される。希釈剤は、配合の生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、緩衝化水、生理学的な生理食塩水、PBS、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。加えて、薬学的な組成物または製剤は、他のキャリア、アジュバント、または非毒性の、非治療用の、非免疫原性の安定剤、賦形剤などを含み得る。組成物は、pH調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤、ならびに界面活性剤など、生理学的条件に近づける付加的物質も含み得る。組成物は、例えば抗酸化物質など、多様な安定化剤のうちの任意のものも含み得る。薬学的組成物がポリペプチドを含む場合、ポリペプチドは、該ポリペプチドのインビボにおける安定性を増強する、またはそうでなければその薬理学的特性を増強する（例えば、ポリペプチドの半減期を増加させる、その毒性を低下させる、可溶性または取り込みを増強する）様々な周知の化合物と複合体化され得る。そのような改変または複合体化剤には、サルフェート、グルコネート、シトレート、およびホスフェートが含まれる。組成物の核酸またはポリペプチドは、それらのインビボ属性を増強する分子とも複合体化され得る。そのような分子には、例えば炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、および脂質が含まれる。
【００７０】
様々なタイプの投与に適している製剤に関するさらなる指針は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985) に見出され得る。薬物送達のための方法についての簡潔な概説に関しては、Langer, Science 249:1527-1533 (1990)を参照されたい。
【００７１】
薬学的組成物は、予防的および/または治療的な処置のために投与され得る。活性成分の毒性および治療効力は、例えばLD50（集団の50％に対して致死的な用量）およびED50（集団の50％において治療上有効な用量）を判定する工程を含む、細胞培養および/または実験動物における標準的な薬学的手順に従って判定され得る。毒性作用と治療的作用との間の用量比は治療指標であり、かつそれは、LD50/ED50比として表現され得る。大きな治療指標を呈する療法が好ましい。
【００７２】
一部の態様において、有効量で対象に投与される薬学的組成物は、ほとんどまたは全く肝毒性を呈しない（例えば、実質的な肝毒性の呈示なし、実質的な肝毒性を呈しない、とは、肝臓にとって実質的に非毒性である、など）。肝毒性は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ASP）の一方のレベル、両方のレベル、またはそれらの比を測定する工程など、多様な方式で測定され得る。一部の態様において、有効量の薬学的組成物を投与する工程は、肝毒性（例えば、選択された好都合なアッセイによって測定されるもの）において、そのような投与の前の肝毒性についてのそのような度合いと比較して（または、未処置の対照と比較して、もしくは該度合いに関して認められている通常の値の値域、すなわち参照値と比較して）、50％未満（例えば、40％未満、30％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、1％未満、0.5％未満、または0％）の増加を誘導する。一部の態様において、有効量の薬学的組成物を投与する工程は、肝毒性の度合いにおいて、そのような投与の前のそのような度合いと比較して（または、未処置の対照と比較して、もしくは該度合いに関して認められている通常の値の値域、すなわち参照値と比較して）、統計的に有意な増加（例えば、0.1、0.05、0.01未満またはそれを下回るp値）を誘導しない。一部の態様において、有効量の薬学的組成物を投与する工程は、そのような投与の前のそのような度合いと比較して（または、未処置の対照と比較して、もしくは該度合いに関して認められている通常の値の値域、すなわち参照値と比較して）、肝毒性の度合い（例えば、投与によって治療される病状が肝毒性を引き起こしている場合に生じ得るもの）を、5％以上（例えば、10％以上、15％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上など）低下させる。
【００７３】
細胞培養および/または動物調査から得られたデータは、ヒトに対する広範な投薬量を製剤化することにおいて用いられ得る。活性成分の投薬量は、典型的に、低い毒性を有するED50を含めた広範な循環濃度内にある。投薬量は、採用される剤形および利用される投与の経路に応じて、この値域内で変動し得る。
【００７４】
薬学的組成物を製剤化するために用いられる構成要素は、好ましくは高純度のものであり、かつ潜在的に有害な混入物を実質的に含んでいない（例えば、少なくとも食品（National Food）（NF）グレード、一般的には少なくとも分析グレード、およびより典型的には少なくとも薬学的グレード）。さらに、インビボ使用を意図される組成物は、通例無菌である。所与の化合物が使用前に合成されなければならない限りにおいて、結果として生じた産物は、典型的に、合成または精製過程の間に存在し得るいかなる潜在的に有毒な作用物質、とくにいかなる内毒素も実質的に含んでいない。非経口投与のための組成物も無菌であり、実質的に等張性であり、かつGMP条件下で作製される。特定の患者に与えられる治療用組成物の有効量は、そのうちのいくつかは患者ごとに異なるであろう多様な因子に依存する。資格のある臨床医であれば、必要に応じて疾患状態の進行を停止させるまたは逆転させるために、患者に投与する治療用作用物質の有効量を決定することができる。LD50動物データ、および作用物質に関して入手可能な他の情報を利用すると、臨床医であれば、投与の経路に応じて、個体に対する最大安全用量を決定することができる。例えば、治療用組成物が投与されている流体がより多量であることを考慮すると、静脈内投与される用量は、髄腔内に投与される用量よりも多い可能性がある。同様に、治療濃度を維持するために、身体から急速に一掃される組成物をより高用量でまたは反復投薬で投与してもよい。通常の技能を利用すると、資格のある臨床医であれば、日常の臨床的試行の経過の中で、特定の治療法の投薬量を最適化することができるであろう。
【００７５】
実用性
本明細書において開示される方法および組成物は、細胞内の特定の遺伝子座から導入遺伝子を発現させることが望ましい任意のインビトロまたはインビボ用途において、例えば標的遺伝子座における内因性遺伝子のものと同じである空間的にかつ時間的に制限されたパターンで1種類または複数種類の導入遺伝子を細胞内で発現させ、同時にその標的遺伝子座におけるその内因性遺伝子の発現を維持し、かつ同時に外因性ヌクレアーゼを用いるリスクを回避することが望ましい場合に、用途が見出される。主題の方法および組成物を用いて細胞のゲノムを編集することによって、外因性ヌクレアーゼの使用を要する方法を上回るいくつかの有益性が達成され得る。例えば、主題の方法および組成物の使用は、それがポリペプチドとしてであろうとまたはコード核酸としてであろうと、細胞に外因性ヌクレアーゼを提供することに伴う潜在的な免疫原性および遺伝毒性を回避する。増強した免疫原性および遺伝毒性、ならびにヌクレアーゼの発現を駆動するプロモーターによる付近遺伝子の活性化をもたらし得る、ゲノム内へのヌクレアーゼコード配列の考え得る組み込み、およびそれに続く該ヌクレアーゼの安定した発現のリスクも回避される。
【００７６】
標的遺伝子座における細胞DNA内に1種類または複数種類の導入遺伝子を組み込むための主題の方法および組成物は、例えば遺伝子療法、農業、バイオテクノロジー、および研究を含めた多くの分野において用途が見出される。例えば、そのような改変は、例えば対象における遺伝子変異を該遺伝子の野生型コピーで補完することによって遺伝子障害を治療するために；細胞活性を促進する/増大することによって、自然に起こるプロセスを促進するために（例えば、創傷治癒に関連した細胞活性を増大させることによって、慢性創傷の治療または急性創傷もしくは皮弁壊死（flap failure）の阻止のために創傷治癒を促進する）；細胞応答を調節するために（例えば、インスリンを提供することによって糖尿病を治療するために）；対象において（例えば特異的細胞集団においてまたは特異的条件下で、など）、抗ウイルス性、抗病原性、または抗癌性の治療用物質を発現させるために、治療上有用である。そのような遺伝子改変に関する他の使用には、例えば診断的、治療的、もしくは研究の目的のための、個体由来のiPSCを産生するための誘導性多能性幹細胞（iPSC）の誘導における使用；例えば治療的、診断的、もしくは研究の目的のための、細胞によるタンパク質の大規模産生のための製造における、遺伝子改変された生物の産生における使用；例えば改良された農作物の産生のための、農業における使用；または、例えば疾患の動物モデルの調査のための、研究における使用が含まれる。
【００７７】
例えば、主題の方法および組成物は、対象における障害、疾患、または医学的状態を治療するために用いられ得る。「治療」、「治療すること」などの用語は、概して、所望の薬理学的および/または生理学的な効果を得ることを意味するために本明細書において用いられる。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に阻止するという点において予防的であり得、かつ/または疾患および/もしくは該疾患に起因する有害な作用に対する部分的なもしくは完全な回復という点において治療的であり得る。本明細書において用いられる「治療」は、哺乳動物における疾患の任意の治療を網羅し、かつ（a）疾患にかかりやすい傾向を有し得るがそれを有するとはまだ診断されていない対象において、疾患が生じるのを阻止すること；（b）疾患を阻害すること、すなわちその発症を食い止めること；または（c）疾患を軽減すること、すなわち疾患の後退を引き起こすことを含む。治療用作用物質は、疾患または損傷の発生の前、間、または後に投与され得る。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定させるまたは低下させる場合、進行中の疾患の治療はとくに関心対象である。そのような治療は、望ましくは、罹患組織における機能の完全な喪失の前に実施される。主題の療法は、望ましくは疾患の症候性段階の間に、ある場合には、疾患の症候性段階の後に施される。「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書において互換可能に用いられ、かつそれに対する診断、治療、または療法が望まれる任意の哺乳動物対象、とくにヒトを指す。
【００７８】
この目標に向けて、主題の組成物の1種類または複数種類の導入遺伝子は、治療用作用物質をコードする遺伝子を含み得る。「治療用作用物質」とは、細胞または個体に対して治療的作用を有する、例えば医学的状態、例えば疾患または障害を治療する生物学的プロセスを促進する作用物質、例えばリボザイム、siRNA、shRNA、miRNA、ペプチド、ポリペプチドなどを意味する。
【００７９】
主題の方法および組成物を用いて細胞ゲノム内に組み込まれ得る治療用作用物質の例には、細胞活性を変更するリボザイム、siRNA、shRNA、miRNA、ペプチド（例えば、ペプチドをコードする核酸）、またはポリペプチド（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）などの作用物質が含まれる（すなわち、組み込まれた導入遺伝子がこれらをコードする）。ある場合には、導入遺伝子は、ペプチドまたはポリペプチドをコードする。（例えば、ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を介して）ペプチドまたはポリペプチドを発現する多細胞生物に対して治療的活性を有すると想定されるペプチドまたはポリペプチドの例には、第VIII因子、第IX因子、β-グロビン、低密度リポタンパク質受容体、アデノシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子、α1-アンチトリプシン、CD-18、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、分岐鎖α-ケト酸デヒドロゲナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ、グルコース6-ホスファターゼ、α-L-フコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-L-イズロニダーゼ、ガラクトース1 -リン酸ウリジルトランスフェラーゼ；神経保護因子、例えばニューロトロフィン（例えば、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、CNTF）、Kifap3、Bcl-xl、コラプシン応答メディエータータンパク質1、Chkβ、カルモジュリン2、カルシオン（calcyon）、NPT1、Eef1a1、Dhps、Cd151、Morf412、CTGF、LDH-A、Atl1、NPT2、Ehd3、Cox5b、Tuba1a、γ-アクチン、Rpsa、NPG3、NPG4、NPG5、NPG6、NPG7、NPG8、NPG9、NPG10、ドーパミン、インターロイキン、サイトカイン、小ペプチド、表1に列挙される遺伝子/タンパク質（下記を参照されたい：BCKDH複合体（E1a、E1b、およびE2サブユニット）；メチルマロニル-CoAムターゼ；プロピオニル-CoAカルボキシラーゼ（αおよびβサブユニット）；イソバレリルCoAデヒドロゲナーゼ；HADHA；HADHB；LCHAD；ACADM；ACADVL；G6PC（GSD1a）；G6PT1（GSD1b）；SLC17A3；SLC37A4（GSD1c）；酸性α-グルコシダーゼ；OCTN2；CPT1；CACT；CPT2；CPS1；ARG1；ASL；OTC；UGT1A1；FAH；COL7A1；COL17A1；MMP1；KRT5；LAMA3；LAMB3；LAMC2；ITGB4；および/またはATP7B）などが含まれるが、それらに限定されるわけではない。上記リストのタンパク質は、哺乳動物タンパク質、多くの態様においてはヒトタンパク質を指し、上記タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、当業者に一般的に公知である。
【００８０】
（表１）様々な疾患における欠陥がある遺伝子/タンパク質のリスト
2020182450.tif 000002
2020182450.tif 000003
【００８１】
他の場合には、導入遺伝子は、タンパク質をコードしないRNAをコードし、例えば核酸は、リボザイム、小ヘアピンRNA（shRNA）、マイクロRNA（miRNA）、またはそれらの前駆体をコードする。本明細書において使用するとき、「マイクロRNA」という用語は、内因性マイクロRNAおよび人工マイクロRNA（例えば、合成miRNA）を含むがそれらに限定されない、任意のタイプの干渉RNAを指す。内因性マイクロRNAは、mRNAの生産的利用を調節し得る、ゲノムにおいて天然にコードされる小型RNAである。人工マイクロRNAは、mRNAの活性を調節し得る、内因性マイクロRNA以外の任意のタイプのRNA配列であり得る。マイクロRNA配列は、これらの配列のうちのいずれか1種類または複数種類から構成されるRNA分子であり得る。マイクロRNA（つまり「miRNA」）配列は、Lim, et al., 2003, Genes & Development, 17, 991-1008、Lim et al., 2003, Science, 299, 1540、Lee and Ambrose, 2001, Science, 294, 862、Lau et al., 2001, Science 294, 858-861、Lagos-Quintana et al., 2002, Current Biology, 12, 735-739、Lagos-Quintana et al., 2001, Science, 294, 853-857、およびLagos-Quintana et al., 2003, RNA, 9, 175-179などの刊行物に記載されている。マイクロRNAの例には、より大きなRNAのフラグメントである、またはmiRNA、siRNA、stRNA、sncRNA、tncRNA、snoRNA、smRNA、shRNA、snRNA、もしくは他の小さなノンコーディングRNAである任意のRNAが含まれる。例えば、米国特許出願第20050272923号、第20050266552号、第20050142581号、および第20050075492号を参照されたい。「マイクロRNA前駆体」（つまり「プレmiRNA」）とは、その中に組み入れられたマイクロRNA配列とともに、ステムループ構造を有する核酸を指す。「成熟マイクロRNA」（つまり「成熟miRNA」）には、マイクロRNA前駆体（「プレmiRNA」）から切断され、または合成され（例えば、セルフリー合成によって実験室で合成され）、かつ約19ヌクレオチド〜約27ヌクレオチドの長さを有するマイクロRNAが含まれ、例えば成熟マイクロRNAは、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、または27ntの長さを有し得る。成熟マイクロRNAは、標的mRNAに結合することができ、該標的mRNAの翻訳を阻害することができる。
【００８２】
標的遺伝子座内に組み込まれ得る治療用作用物質の他の例には、免疫学的予防（ベクター免疫学的予防、つまりVIPとも呼ばれる）を促進する作用物質が含まれる（すなわち、組み込まれた導入遺伝子がこれをコードする）。免疫学的予防を促進する作用物質の例には、免疫グロブリンドメインおよび免疫エフェクタードメインを含む、抗体またはキメラポリペプチドが含まれるが、それらに限定されるわけではない。非限定的な例として、免疫学的予防を促進する作用物質には、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、マラリア原虫（Plasmodium）（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）など）、真菌性または細菌性の病原体などより選択される病原体に特異的な、中和抗体またはキメラポリペプチドが含まれ得る。例えば、免疫学的予防を促進する作用物質には、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、マラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫など）、真菌性または細菌性の病原体などの系統の間で保存されたエピトープを標的とする、中和抗体またはキメラポリペプチドが含まれ得る。
【００８３】
ある場合には、治療用作用物質は、該作用物質が発現される細胞の活性を変更する。言い換えれば、作用物質は、細胞内的な効果を有する。例えば、作用物質は、細胞内で発現した場合に、細胞内の変異体タンパク質の代わりになる、つまり「補完する」細胞内タンパク質、膜貫通タンパク質、または分泌タンパク質であり得る。他の場合には、治療用作用物質は、該作用物質が発現される細胞以外の細胞の活性を変更する。言い換えれば、作用物質は、細胞外的な効果を有する。例えば、関心対象の組み込まれた遺伝子は、他の細胞の活性を調節するサイトカイン、ケモカイン、成長因子、ホルモン、抗体、または細胞表面受容体をコードし得る。
【００８４】
主題の方法および組成物は、関心対象の導入遺伝子を組み込むことによって細胞活性を調節することにより恩恵を受けるであろう任意の疾患、障害、または天然の細胞プロセスに適用され得る。例えば、主題の方法および組成物は、遺伝子障害を治療することにおいて用途が見出される。規定される遺伝子欠陥により生じる任意の遺伝子障害（例えば、単一遺伝子欠陥を有する障害、2種類の欠陥遺伝子、3種類の欠陥遺伝子、4種類の欠陥遺伝子、5種類の欠陥遺伝子、2種類またはそれを上回る種類の欠陥遺伝子、3種類またはそれを上回る種類の欠陥遺伝子、4種類またはそれを上回る種類の欠陥遺伝子、5種類またはそれを上回る種類の欠陥遺伝子等を有する障害）は、主題の組成物および方法によって治療され得る。欠陥は、単一遺伝子における1つもしくは複数の変異（例えば、1、2、3、4、5個、またはそれを上回る数の変異）により生じ得るか、または2種類もしくはそれを上回る種類の遺伝子（例えば、3種類またはそれを上回る種類の遺伝子、4種類またはそれを上回る種類の遺伝子、5種類またはそれを上回る種類の遺伝子、2種類の遺伝子、3種類の遺伝子、4種類の遺伝子、5種類の遺伝子など）における1つもしくは複数の変異により生じ得る。遺伝子欠陥により生じる疾患の非限定的な例には、血友病（例えば、血友病A、血友病B）、分岐鎖有機酸尿症（例えば、メープルシロップ尿症（MSUD）、イソ吉草酸血症（IVA）、プロピオン酸尿症（PA）、およびメチルマロン酸尿症（MMA）、3-メチルクロトニルグリシン尿症、3-メチルグルタコン酸尿症I型、短鎖/分岐鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症、2-メチル-3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症、イソブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症、3-ヒドロキシイソ酪酸尿症、マロン酸尿症など）、長鎖脂肪酸酸化障害、糖原病（例えば、糖原病I型（GSD1）、糖原病II型、糖原病III型、糖原病IV型、糖原病V型、糖原病VI型、糖原病VII型、糖原病VIII型、糖原病IX型、糖原病X型、糖原病XI型、糖原病XII型、糖原病0型など）、カルニチン回路障害、尿素回路障害、クリグラー・ナジャール症候群、遺伝性チロシン血症、表皮水疱症、ウィルソン病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、鎌状赤血球病、X連鎖重症複合免疫不全症（SCID-X1）、サラセミア、嚢胞性線維症、α1アンチトリプシン欠損症、ダイアモンド・ブラックファン貧血、ゴーシェ病、成長ホルモン欠損症などが含まれる。
【００８５】
別の例として、主題の方法および組成物は、神経系病状を治療することにおける用途、ならびに神経系病状：例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、スピールマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病（バッテン病)、パーキンソン病様症状を有する前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、ピック病、プリオン病（例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病）、アミロイドーシス、緑内障、糖尿病網膜症、加齢黄斑変性症（AMD）などを含めた神経変性疾患；神経精神障害（例えば、不安障害（例えば、強迫性障害）、気分障害（例えば、うつ病）、小児期障害（例えば、注意欠陥障害、自閉症性障害）、認知障害（例えば、せん妄、認知症）、統合失調症、化学物質関連障害（例えば、依存症）、摂食障害など）；チャネル病（例えば、てんかん、偏頭痛など）；リソソーム蓄積症（例えば、テイ・サックス病、ゴーシェ病、ファブリー病、ポンペ病、ニーマン・ピック病、ムコ多糖症（MPS）および関連疾患など）；CNSの自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、脳脊髄炎、腫瘍随伴症候群（例えば、小脳変性症）、自己免疫性内耳疾患、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群など）；脳梗塞、脳卒中、外傷性脳損傷、および脊髄損傷、からCNSを保護するための用途が見出される。
【００８６】
別の例として、主題の方法および組成物は、組織修復、組織再生を促進するために治療用作用物質を異所的に発現させること、または例えば創傷治癒を促進するためにさらなる組織傷害から保護すること；例えば神経変性疾患、腎臓疾患、肝臓疾患などの例えば変性疾患において、当該細胞および/または近隣細胞の生存を促進すること；感染症を阻止するまたは治療すること等が望ましい医学的状態および疾患の治療において用いられ得る。
【００８７】
主題の方法をどのように用いて医学的状態を治療し得るかについての他の例は、本明細書における他の箇所に開示されており、または当業者に容易に明白であろう。
【００８８】
主題の方法および組成物は、関心対象の細胞、例えば関心対象の組み込まれた遺伝子を含む細胞を撮像することにおいても用途が見出される。そのため、組み込む導入遺伝子（または導入遺伝子のうちの1種類）は、イメージング用マーカーをコードし得る。「イメージング用マーカー」とは、細胞、例えば本願の組成物によって標的とされている細胞を探し出し、かつ任意で可視化するために用いられ得る非細胞傷害性作用物質を意味する。イメージング用部分、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどは、検出のための基質の添加を要し得る。あるいは、イメージング用部分は、検出のための基質の添加を要しない検出可能なシグナル、例えば発蛍光団もしくは発色団色素、例えばAlexa Fluor 488（登録商標）もしくはAlexa Fluor 647（登録商標）、または発蛍光団もしくは発色団を含むタンパク質、例えば蛍光タンパク質を提供し得る。本明細書において使用するとき、蛍光タンパク質（FP）とは、蛍光を発する（すなわち、一つの波長でエネルギーを吸収し、かつ別の波長でそれを発する）能力を所有するタンパク質を指す。例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）とは、510nmまたは約510nmで発光スペクトルにおけるピークを有するポリペプチドを指す。様々な波長で発する多様なFPが、当技術分野において公知である。関心対象のFPには、緑色蛍光タンパク質（GFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、 オレンジ色蛍光タンパク質（OFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、青色蛍光タンパク質（BFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、遠赤色蛍光タンパク質、または近赤外色蛍光タンパク質、およびそれらの変種が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００８９】
別の例として、主題の方法および組成物は、関心対象の細胞、例えば組み込まれた導入遺伝子を含む細胞を単離することにおいて用途が見出される。この目標に向けて、組み込む導入遺伝子（または導入遺伝子のうちの1種類）は、選択可能なマーカーをコードし得る。「選択可能なマーカー」とは、細胞、例えば本願の組成物によって標的とされている細胞を選択するために用いられ得る作用物質を意味する。ある場合には、選択は陽性選択であり得る；すなわち、当該細胞を集団から単離して、例えば遺伝子改変を含む細胞の富化集団を創出する。他の場合には、選択は陰性選択であり得る；すなわち、集団を当該細胞から単離して除いて、例えば遺伝子改変を含まない細胞の富化集団を創出する。任意の好都合な選択可能なマーカー、例えば薬物選択可能マーカー、例えば薬物の存在下で細胞死を阻止するマーカー、薬物の存在下で細胞死を促進するマーカー、イメージング用マーカーなど；イメージング技術、例えば蛍光活性化細胞選別を用いるために選択され得るイメージング用マーカー；アフィニティー分離技法、例えば蛍光活性化細胞選別、磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、固体マトリックスに付着されたアフィニティー試薬による「パンニング」などを用いるために選択され得るポリペプチドまたはペプチド；および同類のものが採用され得る。
【００９０】
ある場合には、導入遺伝子は、例えば補因子または薬物である例えば作用物質の非存在/存在下でコードタンパク質の安定性を調節するコードドメインに結合され得る。用いられ得る不安定化ドメインの非限定的な例には、ラパマイシン誘導体C20-MaRapの非存在下で不安定である変異体FRBドメイン（Stankunas K, et al. (2003) Conditional protein alleles using knockin mice and a chemical inducer of dimerization. Mol Cell. 12(6):1615-24)；そのリガンドShield-1の非存在下で代謝的に不安定であるFKBP12変異体ポリペプチド（Banaszynski LA, et al. (2006) A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell.126(5):995-1004)；トリメトプリム（TMP）の非存在下で代謝的に不安定である変異体大腸菌（E. coli）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）ポリペプチド（Mari Iwamoto, et al. (2010) A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chem Biol. 2010 September 24; 17(9):981-988)；および同類のものが含まれる。
【００９１】
上記で記述されるように、当業者が細胞内で発現させたい任意の核酸配列が標的遺伝子座内に組み込まれてもよく、例えばリボザイム、siRNA、shRNA、miRNA、もしくは長鎖ノンコーディングRNAなどのノンコーディングRNAをコードする任意の核酸配列；またはペプチドもしくはポリペプチドをコードするRNAをコードする任意の核酸配列が組み込まれ得る。ある場合には、発現される1種類を上回る配列が組み込まれてもよく、例えば関心対象の2種類またはそれを上回るポリヌクレオチドが組み込まれてもよく、3種類またはそれを上回るポリヌクレオチドが組み込まれてもよく、4種類またはそれを上回るポリヌクレオチドが組み込まれてもよく、例えば5種類またはそれを上回るポリヌクレオチドが組み込まれてもよい。ゆえに、例えば、治療用遺伝子およびイメージング用マーカーが組み込まれてもよく；治療用遺伝子およびノンコーディングRNAが組み込まれてもよく；治療用遺伝子および選択可能なマーカーが組み込まれてもよく；イメージング用マーカーおよび選択可能なマーカーが組み込まれてもよく；治療用遺伝子、イメージング用マーカー、および選択可能なマーカーが組み込まれてもよい、などである。
【００９２】
試薬、デバイス、およびキット
上記で記載される方法のうちの1つまたは複数を実践するための試薬、デバイス、およびそれらのキットも提供される。主題の試薬、デバイス、およびそれらのキットは、大きく変化し得る。
【００９３】
上記の構成要素に加えて、主題のキットは、主題の方法を実践するための指示書をさらに含む。これらの指示書は、多様な形態で主題のキット内に存在し得、そのうちの1つまたは複数はキット内に存在し得る。これらの指示書が存在し得る1つの形態は、キットの包装、添付文書等の状態にある、例えば情報が印刷される1枚または複数枚の紙である適切な媒体または基板上に印刷された情報としての形態である。さらに別の手段は、情報が記録されているコンピューター可読媒体、例えばディスケット、CDなどであろう。存在し得るさらに別の手段は、離れた場所で情報にアクセスするためにインターネットを介して用いられ得るウェブサイトアドレスである。任意の好都合な手段がキット内に存在し得る。
【実施例】
【００９４】
以下の実施例は、本発明をどのように行うかおよびどのように用いるかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示するものであり、本発明者らが本発明者らの発明と見なすものの範囲を限定することを意図するわけでも、下記の実験が、実施されたすべてまたは唯一の実験であることを表すことを意図するわけでもない。用いられる数（例えば、量、温度など）に関する正確性を保証するために努力がなされたが、いくらかの実験上の誤差およびズレは考慮されるべきである。別様に示されていない限り、部分は重量による部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏温度におけるものであり、かつ圧力は大気におけるまたは大気付近のものである。
【００９５】
分子および細胞生化学における一般的方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001 )；Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999)；Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996)；Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999)；Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995)；Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997)；およびCell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)のような標準的教科書において見出され得、その開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。本開示において言及される、遺伝子操作のための試薬、クローニングベクター、およびキットは、BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich、およびClonTechなどの商業的供給業者から入手可能である。
【００９６】
実施例1
ヌクレアーゼを使用しないインビボ遺伝子ターゲティングは、新生仔または成体マウスのいずれかのAAV8ベクター注射後に治療レベルのhF-IXを促す
治療レベルの部位特異的遺伝子ターゲティングを達成することは、オフターゲット効果に関連しているエンドヌクレアーゼ（例えば、CRISPR、TALEN、ZFN）の使用を要すると推測されることが多い。とくに、インビボ適用のためのエンドヌクレアーゼコードベクターの送達は、有害な免疫結果だけでなく持続的発現から生じる遺伝毒性につながり得る。ヌクレアーゼの使用を回避して、本発明者らは、血友病Bの治療のための、アルブミン遺伝子座に対するプロモーター無しhF-IX遺伝子のAAV8ベクター介在性ターゲティングをインビボで実施した。2Aペプチドをコードする配列が先行する、プロモーターの無いhF-IX遺伝子は、アルブミンORFとのDNA融合体としてのその組み込みを標的とする相同アームによって隣接される。したがって、hF-IX発現は、転写、RNAプロセシング、局在化および安定性、翻訳開始、ならびにER局在化のレベルで、強固なアルブミン発現に関連付けされる。2Aペプチドはリボソームスキップを誘導し、ゆえにアルブミンは標的とされるが妨害されない。オフターゲット組み込みは、ヌクレアーゼの使用を控えることによって最小限に抑えられ、かつベクター媒介性プロモーターの欠如は、稀なオフターゲット組み込みによる近隣癌遺伝子活性化のリスクを低減する。
【００９７】
まず、本発明者らは、2日齢のB6マウスに、hF-IXターゲティングカセットをコードするAAV8ベクターによる、マウス1匹あたり2.5e11 VgのIP注射を実施した。次いで、本発明者らは、血漿hF-IXレベルを週1回追跡した（生後4週目に開始）。血漿hF-IXのレベルは、通常の約10％で横ばいになり、これは、臨床に変換した場合大幅な疾患改善に相当する。重要なことに、hF-IX血漿レベルは、2/3部分肝切除の後まもなくそれらの元のレベルまで戻り、ゆえに安定した導入遺伝子組み込みが確立された。本発明者らは、RT、それに続くリンカーライゲーション、バイアスなしのPCR、およびシーケンシングを実施することによって、hF-IX発現が基本的にもっぱらオンターゲット組み込みから発生することを検証した。とくに、この方法は、エピソーム由来または任意のオフターゲット組み込み由来のいかなるhF-IX発現も検出しなかった。さらなる確証は、抗2Aペプチド抗体または抗アルブミン抗体のいずれかを用いた場合の、重複するウェスタンブロットシグナルによってもたらされる。抗hF-IXプローブを用いたノーザンブロットにより、アルブミン-hF-IX融合mRNAの予想サイズの単一バンドが明らかとなる。次に、本発明者らは、新生仔に関連した肝臓細胞分裂が、治療レベルの遺伝子ターゲティングに必須であるかどうかをチェックした。本発明者らは、マウス1匹あたり1e12 Vgの本発明者らのAAV8ベクターによる、成体マウスの尾静脈注射を実施した。hF-IXレベルについて週1回モニタリングすることにより、通常の15％の安定した発現が明らかとなった。本発明者らは、現在、血友病Bマウスにおいてこれらの調査を繰り返しており、かつqPCR、IHC、およびNGSを用いて、オンターゲット組み込みの割合およびオフターゲット組み込みの分布を定量しているところである。
【００９８】
結論として、AAV介在性のインビボでの非妨害的でありかつプロモーターを使用しない遺伝子ターゲティング法は、新生仔および成体の両方に適用可能である。高発現される内因性遺伝子に、導入遺伝子組み込みを2A融合体としてターゲティングすることは、ヌクレアーゼの必要を取り除き、したがって、治療レベルの導入遺伝子発現を可能としながら、オフターゲット効果が低減する。
【００９９】
実施例2
方法
ベクター構築に関して、まず、終止コドンに及ぶAlbゲノムDNAのフラグメントを、pTRUFプラスミド骨格上のAAV2 ITRの間に挿入した（Lisowski et al. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 20, 1912-1923, 2012）。次いで、P2Aコード配列およびhF9 cDNAをネスト形式で挿入した。逆向き対照に関しては、中心的セグメントを切除して取り出しかつ反対向きに組み込み直した。rAAV8をHEK293細胞において産生し、かつドットブロットによって力価測定した。2日齢B6マウスに、2.5e11 vgのrAAV8（hF9または逆向き）を腹腔内注射し、かつELISAのために、生後4週目に開始して週1回、眼窩後採血によって採血した。成体B6マウスは、1e12 vgのrAAV8（hF9または逆）の尾静脈注射または3.5e12 vgのプラスミドの流体力学的注入のいずれかを受け、かつ同様にELISAのために週1回採血された。2/3部分肝切除（PH）を、確立されたプロトコールに従って実施した。DNA、RNA、およびタンパク質解析、ならびにIHCのために、PH時およびマウスを屠殺した時点で肝組織を回収した。hF9 IHCのための凍結された肝組織を、確立されたプロトコールに従って切片にしかつ染色した。TaqMan qPCRアッセイ、ノーザンブロット、およびウェスタンブロットは、確立されたプロトコールを用いた。以前に記載されているように、aPTTアッセイを血友病Bノックアウトマウスに対して実施した（Shi et al., Gene therapy 20, 987-996, 2013）。
【０１００】
結果
組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）介在性のプロモーター無し遺伝子ターゲティングをヌクレアーゼを使用せずに実施して、血友病Bマウスにおける出血性素因を改善した。とくに、プロモーターの無いヒト凝固第IX因子（hF9）遺伝子を、肝臓に発現されるアルブミン（Alb）遺伝子座にターゲティングした。hF9を、先行する2Aペプチドコード配列とともに、Alb終止コドンのすぐ上流に組み込まれるようにターゲティングした。hF9はDNAおよびRNAレベルでAlbに融合されたものの、リボソームスキップの方式によって2種類の別個のタンパク質が合成された。したがって、hF9発現は、強固な肝臓アルブミン発現に、それを妨害することなく関連付けされた。AAV8-hF9ベクターを新生仔および成体マウスに注射して、肝細胞におけるアルブミン対立遺伝子の約0.5％へのオンターゲット組み込みを達成した。hF9はオンターゲット組み込みのみから産生され、かつリボソームスキップは非常に効率的であることが立証された。通常の7〜20％の安定したhF9血漿レベルが得られ、かつ処置された第IX因子欠損マウスは通常の凝固時間を有した。高発現される内因性遺伝子への2A融合体としての導入遺伝子組み込みは、ヌクレアーゼおよび/またはベクター媒介性プロモーターの必要を取り除いた。本実施例の方法は、組み込みからの治療レベルの発現を依然として提供しながらオフターゲット効果を大きく低減することによって、幼仔および成体の両方における安全かつ有効な遺伝子ターゲティングを可能にする。
【０１０１】
1/30,000の男性に影響を及ぼしているX連鎖劣性疾患の血友病Bにおいて欠損しているhF9遺伝子をターゲティングした。罹患個体は、肝臓から産生される血漿凝固第IX因子の欠損により、深刻な自然発生的出血に苦しんでいる。1〜2％ほどのわずかな血液凝固因子による再構成が生活の質を大幅に向上させる可能性があり、一方で5〜20％は出血性素因を著しく改善すると考えられる。組み込み時の強固な肝特異的Albプロモーターからの発現のためにhF9をターゲティングするために、肝指向性rAAV8血清型を使用した。本発明者らは、（1）たとえ組み込みがわずかな画分の肝細胞にのみ起こったとしても、Albプロモーターは、高レベルの凝固因子産生を可能にするはずであり；かつ（2）Alb遺伝子座における高い転写活性は、導入遺伝子組み込みが相同組換えによる影響をより受けやすくするであろうと仮定した。
【０１０２】
ヌクレアーゼを使用しない遺伝子ターゲティングは、肝臓においてAlb対立遺伝子のわずかな部分のみに影響を及ぼすはずである。それにもかかわらず、本発明者らは、Albリーディングフレームの末端に2A融合体としてhF9をターゲティングすることによって、Alb遺伝子の妨害および異常調節を最小限に抑えることにした（図8A）。プラス鎖RNAウイルスに由来する2Aペプチドは、リボソームスキップという手段によって、単一リーディングフレームから複数のタンパク質の産生を可能にする（Kim, J. H. et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one 6, e18556, doi:10.1371/journal.pone.0018556 (2011)）。このプロセスは、約20個のC末端アミノ酸をタグ付けされた第一の翻訳タンパク質、および1個だけの付加的N末端プロリンを有する第二のタンパク質を残す。両タンパク質の機能性は典型的に保持され、かつ2Aペプチドを用いた臨床試験は免疫原性を報告しなかった。一本鎖AAVを用いて、ブタテッショウウイルス-1 2Aペプチド（P2A）をコードする配列が先行するコドン最適化hF9 cDNAを、Alb終止コドンのすぐ5'側に組み込まれるようにターゲティングした。組み込みの後、AlbおよびhF9は強力なAlbプロモーターから共転写され、ゆえに、スプライシング、核脱出、mRNA安定性、翻訳開始、およびER局在化のレベルで共調節されるはずである。両方がシグナルペプチドを含有する2種類の別個のタンパク質が翻訳され、それのため、AlbのERに関連した翻訳のすぐ後に、分泌のための血液凝固因子の翻訳およびプロセシングが続いた。最後に、オフターゲットhF9発現の可能性をさらに低下させるために、ベクターは、hF9シグナルペプチドの前にATG開始コドンを有さず、2Aペプチドコード配列または先行するAlbエクソンに開始コドンも有しない。
【０１０３】
まず、マウス1匹あたり2.5e11ベクターゲノム（vg）の、hF9ターゲティングカセットまたは逆向き対照をコードするrAAV8を用いて、2日齢のC57BL/6（B6）マウスの腹腔内（IP）注射を実施した（図8B）。Alb相同アームに関する対照において逆向きにされたフラグメントは、hF9遺伝子だけでなく、P2Aコード配列、隣接Albエクソン、および先行するスプライス接合部も含んだ。逆向き対照は、オンターゲット組み込みがあっても有意なhF9発現を可能にしないはずであるが、実験構築物由来のものと同程度のオフターゲット発現のレベルを可能にするであろう（エピソーム性発現は他の手段によって制御される、下記）。血漿hF9タンパク質レベルを、生後4週目に開始して週1回、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって測定した（図9A）。実験群では、血漿hF9のレベルは、通常の7〜20％に相当する350〜1000ng/mLで横ばいになった。逆向き対照群では、hF9血漿レベルは検出レベル（20ng/mL）であるかまたはそれを下回り、実験群において、hF9発現は確かにオンターゲット組み込みから発生したことを暗示した。エピソーム性AAV導入遺伝子発現を＞90％低下させることが知られる外科的手順である2/3部分肝切除の後、hF9は元の血漿タンパク質レベルを保持し、安定した導入遺伝子組み込みがさらに立証された。
【０１０４】
新生仔で見られる肝成長が治療レベルの遺伝子ターゲティングに必須であるかどうかを判定するために、成体マウスにおいて、同じベクターを用いてhF9をAlb遺伝子座にターゲティングした。成体B6マウスに、rAAV8ベクターまたは逆向き対照を、マウス1匹あたり1×1012vg（およそ5e13/Kg）で、尾静脈を通して注射した。マウスの第三の群は、「正しい」向きのプロモーター無しhF9構築物をコードするプラスミドの流体力学的尾静脈注入を受けた。rAAV hF9マウス群では、血漿hF9レベルは、通常の7〜20％で安定していることが見出された（図9B）。より低いMOIでのベクター注射は、横ばいにならないより低い血漿hF9レベルにつながり、上限効果が暗示された（図9C）。成体ならびに新生仔では、逆向き対照群のhF9血漿レベルは、検出限界にあったまたはそれを下回った。hF9血漿レベルの低減は、プラスミドを流体力学的に注入されたマウスにも伴った。したがって、有意なターゲティングは、rAAVのベクター化に依存している。最後に、成体F9ノックアウト(KO）血友病Bマウスにおいて、rAAV注射を実施した。処置されたKOマウスにおける、活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）によって判定される機能的凝固は、野生型マウスのものと同程度のレベルまで回復した（図9D）。hF9生物学的活性は、野生型マウスにおけるレベルと同程度の709±91ng/mLの血漿タンパク質レベルと相関した（図9B〜D）。
【０１０５】
肝臓からのhF9発現を、免疫組織化学（IHC）によって確認した（図12）。肝臓サンプルについてのウェスタンブロット解析により、予想分子量にhF9が検出され、リボソームスキップは効率的であることが証明され、かつELISAおよびIHCシグナルの両方は、正確にプロセシングされたhF9に相当することが暗示された（図9E）。
【０１０６】
hF9は分泌タンパク質である。それゆえ、IHCシグナルはまばらであり、ターゲティング率の定量化には用いられ得なかった。その代わり、qPCRを用いて、hF9によるAlbターゲティングの割合を定量的に評価した。エピソーム性rAAV由来の偽シグナルを回避するために、まず、ゲノムAlb遺伝子座の3'セグメントを、組み込まれたhF9配列の有無によって影響を受けない様式で増幅した（図10a、図13）。バイアスなしの増幅は、標的対立遺伝子および野生型対立遺伝子における終止コドンの3'側の大体等しい距離における共通制限部位の存在によって可能となった。次いで、PCRアンプリコンを、2種類の異なるqPCRアッセイのための鋳型として用いた：一方は、標的Alb対立遺伝子の存在量を定量し、かつ他方は非標的野生型対立遺伝子の存在量を定量した。肝臓において、肝細胞のみがrAAV8によって標的とされる（Nakai, H. et al. Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice. J Virol 79, 214-224, doi:10.1128/JVI.79.1.214-224.2005 (2005)）。したがって、本発明者らは、70％の肝細胞頻度のために控えめに補正し、その結果、新生仔または成体のいずれかのときに注射されたマウスでは、hF9によってターゲティングされたAlb対立遺伝子の割合が平均0.5％であることを見出した（図10c、および図14における関連した標準曲線）。次いで、野生型Alb mRNAに対する融合Alb_hF9 mRNAの比率を、バイアスなしのcDNA鋳型に対して実施された2種類のそれぞれのqPCRアッセイを比較することによって調べた（図10B）。新生仔または成体のいずれかのときに注射されたマウスでは、比率は平均0.1％であることが見出された（図10C）。この値は、差異は統計的に有意ではなかったものの、DNAレベルにおける組み込みの割合よりも低い傾向があった。キメラhF9-Alb mRNA転写産物の産生、プロセシング、および/または安定性は、野生型Alb mRNAと比較して低下した可能性がある。一部の組み込みは、アルブミンを発現しない非実質細胞で生じた可能性もある。観察されたターゲティング率は、以前に報告されたものよりも高く（Miller, D. G. et al. Gene targeting in vivo by adeno-associated virus vectors. Nature biotechnology 24, 1022-1026, doi:10.1038/nbt1231 (2006)；Paulk, N. K., Loza, L. M., Finegold, M. J. & Grompe, M. AAV-mediated gene targeting is significantly enhanced by transient inhibition of nonhomologous end joining or the proteasome in vivo. Human gene therapy 23, 658-665, doi:10.1089/hum.2012.038 (2012)）、かつ非増殖細胞は低率の相同組換えを可能にすると予想された成体マウスにおいて、とくに注目に値する。本発明者らは、Alb遺伝子座の高い発現率および関連したクロマチン状態が、高率のターゲティングに寄与し得ると仮説する。ダメージにより誘導される増殖は、厳密には排除され得ないが、ALTレベルの上昇は注射後に見られなかった（図15）。
【０１０７】
AAVベクターは、エピソームとして、またはオンターゲットもしくはオフターゲット構成成分として細胞内に存在し得る。ベクターコピー総数をqPCRによって評価した（図16）。新生仔のときに注射されたマウスにおける部分肝切除後の、ベクターコピー数の比較的小さな変化は、エピソーム性ベクターがすでに大いに希釈されていることを暗示し得る。その場合、ベクターコピー数は、オンターゲット組み込みに対するオフターゲットの割合についての近似された下限として見なされ得る。しかしながら、ベクター媒介性プロモーターの非存在下において、hF9はオンターゲット組み込みからのみ発現されるはずである。部分肝切除後の再構成された高いhF9レベルは（図9A）、この推測を支持する。何故ならば、一過性のエピソーム性発現に関して見られるものとは異なり、安定に組み込まれた導入遺伝子のみが、そのような手順の後に元に戻り得るためである。逆向き対照ベクターによる処置後の有意なhF9血漿レベルの欠如は、オフターゲット発現の低下をさらに実証した。本発明者らは、RT-qPCRを用いて、hF9 mRNAプール全体における融合Alb_hF9 mRNAの比率を直接評価した（図11A）。この比率は新生仔のときに注射されたマウスに関して、および成体のときに注射されたマウスに関して、1:1であることが見出された（図11B）。このことは、hF9が、ほぼ独占的にオンターゲット組み込みから発現されることを暗示している。実際、P2Aプローブを用いたノーザンブロットからの唯一の特異的シグナルは、予想される融合Alb-P2A-hF9 mRNAに相当した（図11C）。最後に、抗2Aペプチド抗体を用いたウェスタンブロットにより、2Aペプチドは、発現がオンターゲット組み込みに制限されかつその後に効率的なリボソームスキップが続いた場合にのみ予想されるAlbの予想された分子量の単一の種類に関連していることが示された（図11D）。
【０１０８】
rAAVは、臨床療法用のポピュラーなベクターになっている。成体における導入遺伝子発現の期間は、少なくとも数年間存続し得るものの、多くの遺伝子障害のために要される生涯にわたる発現が、日常的なプロモーター含有ベクターを用いて獲得できるかどうかはまだ分かっていない。AAVベクターからのエピソーム性発現は、1ラウンドの細胞分裂の後でさえ急速に喪失する。このことが、細胞再生を誘導しかつ/または幼児期に治療され、一方で組織は成長し続ける疾患が、限られた発現を有する可能性を強めている。AAVベクターの二次的注入は、一次ベクター投与により生じる頑強な液性免疫が理由で、二次的形質導入をもたらす可能性は低いと考えられる。対照的に、本明細書において記載される手法は、成長中の組織にさえ、経時的な発現喪失を起こさないであろうベクター組み込みをもたらす。しかしながら、これは、既存の免疫による中和を回避するような適当なAAV血清型の選択に依存する。
【０１０９】
トランスジェニックマウスにおいて、キメラ遺伝子座へのhF9のターゲティングを実証している以前の仕事（Li, H. et al. In vivo genome editing restores haemostasis in a mouse model of haemophilia. Nature 475, 217-221, doi:10.1038/nature10177 (2011)）は、免疫学的なかつ遺伝毒性の副作用を伴い得るヌクレアーゼの発現に依存してきた。マウスおよび非ヒト霊長類においてhF8をAlb遺伝子座にターゲティングした場合でさえ、エンドヌクレアーゼに対する同じ依存が当てはまり（Anguela, X. e. a. ZFN Mediated Targeting Of Albumin「Safe Harbor」Results In Therapeutic Levels Of Human Factor VIII In a Mouse Model Of Hemophilia A. Blood 122, 720 (2013)）、これはおそらく、相同アームが提供されず代わりに組み込みが非相同末端接合に依存したためである。rAAVは、血友病Bを治療する遺伝子療法臨床試験においてすでに用いられている（Nathwani, A. C. et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England journal of medicine 365, 2357-2365, doi:10.1056/NEJMoa1108046 (2011)）。しかしながら、これらの臨床試験における導入遺伝子は、マウスにおいて報告されているように、癌遺伝子の活性化を誘導し得るベクター媒介性プロモーターから発現された（Donsante, A. et al. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science 317, 477, doi:10.1126/science.1142658 (2007)）。アラニントランスアミナーゼのレベルを測定することによって評価されるように、本明細書において記載されるhF9ターゲティングベクターの注射では、肝毒性は観察されなかった（図15）。
【０１１０】
本明細書に記載される仕事は、ヌクレアーゼを使用しないかつベクター媒介性プロモーターを使用しないインビボ遺伝子ターゲティングに関する治療的作用を実証している。ヒト患者集団における標的遺伝子座での遺伝的多型は、相同性の低下が理由で、変動しやすい治療効力に潜在的につながり得る。しかしながら、本発明者らは、ヒト集団の1000人のゲノムサンプルのうちの約95％が、関連するAlb配列においてほんの2種類以下のハプロタイプを有することを見出し、ゆえに広い適用性を有するこの手法が実証された（図17）。
【０１１１】
rAAVに関するこのプロモーターを使用しないかつヌクレアーゼを使用しない遺伝子ターゲティングストラテジーについての好ましい安全性プロファイルにより、これは、血友病および他の遺伝子欠損症の治療のための最有力候補となる（Yew, N. S. & Cheng, S. H. Gene therapy for lysosomal storage disorders. Pediatric endocrinology reviews : PER 11 Suppl 1 , 99-109 (2013)）。より一般的には、治療的作用が分泌タンパク質（例えば、広範囲に中和する抗体）によって伝えられる場合はいつでも、またはターゲティングが選択的利点を付与する場合に、このストラテジーは適用され得る（Paulk, N. K., Loza, L. M., Finegold, M. J. & Grompe, M. AAV-mediated gene targeting is significantly enhanced by transient inhibition of nonhomologous end joining or the proteasome in vivo. Human gene therapy 23, 658-665, doi:10.1089/hum.2012.038 (2012)）。
【０１１２】
実施例3
図18は、マウス1匹あたり1×1012ベクターゲノムのAAV8-F9またはAAVDJ-F9実験構築物を用いた9週齢雌B6マウスの尾静脈注射後に血漿F9を測定すること（ELISAによって測定された）によって得られたデータを提供している（それぞれn＝4）。
【０１１３】
図19は、マウス1匹あたり1×1012ベクターゲノムでのAAV8-F9の尾静脈注射（上）、またはマウス1匹あたり3×1011ベクターゲノムでのAAV8-F9トリプルの尾静脈注射（下）の2週間後に、凝固効率（活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）による）を測定することによって得られたデータを提供している（それぞれn＝5）。
【０１１４】
図20は、マウス1匹あたり2.5×1011ベクターゲノムのAAV8-F9実験構築物を用いた2日齢B6マウスの浅側頭静脈注射後に血漿F9を測定すること（ELISAによって測定された）によって得られたデータを提供している（n＝4）。
【０１１５】
図21は、マウス1匹あたり1×1012ベクターゲノムのAAV8-VRC01実験構築物を用いた9週齢雌B6マウスの尾静脈注射後に血漿VRC01（HIVに対する広範囲に中和する抗体）を測定すること（ELISAによって測定された）によって得られたデータを提供している（それぞれn＝4）。サンドイッチELISAは、ヒトIgGの定常領域に対する抗体によって覆われたプレートを用いるのに対し、機能的ELISAは、VRC01抗体によって認識される抗原であるHIV糖タンパク質gp120で覆われたプレートを用いた。
【０１１６】
上記は、本発明の原理を単に例証しているにすぎない。当業者であれば、本明細書において明示的に記載されていないまたは示されていないが本発明の原理を具体化しかつその精神および範囲の内に含まれる様々な取合わせを考案し得ることが解されるであろう。さらに、本明細書において記載されたすべての例および条件付きの言葉は、本発明の原理および当技術分野を前進させるために本発明者らによりもたらされた概念の理解において読者を助けることを主に意図したものであり、そのような具体的に挙げられた例および条件に限定されるわけではないと解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、局面、および態様、ならびにそれらの具体的な例を挙げた本明細書におけるすべての明記は、それらの構造的および機能的な同等物の両方を包含することが意図される。加えて、そのような同等物には、現在公知の同等物および将来開発される同等物の両方、すなわち構造にかかわらず同じ機能を果たす、開発された任意の要素が含まれることが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書において示されかつ記載される例示的な態様に限定されることを意図されるわけではない。むしろ、本発明の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月15日(2020.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
外因的に供給されるヌクレアーゼを使用せずに細胞のゲノムを編集するための方法および組成物が提供される。該方法の局面は、標的遺伝子座内に組み込む核酸配列を含むターゲティングベクターに細胞を接触させる工程を含み、該細胞は、ヌクレアーゼとも接触するという事はない。加えて、主題の方法を実践することにおいて用途が見出される試薬、デバイス、およびそれらのキットが提供される。
[本発明1001]
組換えウイルスベクターに細胞を接触させる工程
を含む、外因的に提供されるヌクレアーゼの非存在下での、細胞ゲノム内への導入遺伝子の標的指向化された組み込みのための方法であって、
該組換えウイルスベクターが、
i．第一の核酸配列および第二の核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、該第一の核酸配列が導入遺伝子をコードし；かつ該第二の核酸配列が該第一の核酸配列に対して5'側または3'側に位置付けされ、かつ細胞のゲノムにおける標的組み込み部位への組み込み時に、2種類の独立した遺伝子産物の産生を促進する、ポリヌクレオチド；
ii．該ポリヌクレオチドに対して5'側に位置付けされ、かつ細胞のゲノムにおける標的組み込み部位の5'側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む、第三の核酸配列；ならびに
iii．該ポリヌクレオチドの3'側に位置付けされ、かつ細胞のゲノムにおける標的組み込み部位の3'側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む、第四の核酸配列
を含み、
該細胞が、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸と接触しない、
前記方法。
[本発明1002]
細胞が非分裂細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
接触させる工程がインビボで生じる、本発明1001の方法。
[本発明1004]
遺伝子欠損に関連した医学的状態を治療することにおいて用途が見出される、本発明1003の方法。
[本発明1005]
医学的状態が、血友病、血友病A、血友病B、分岐鎖有機酸尿症、メープルシロップ尿症（MSUD）、イソ吉草酸血症（IVA）、プロピオン酸尿症（PA）、メチルマロン酸尿症（MMA）、3メチルクロトニルグリシン尿症、3-メチルグルタコン酸尿症I型、短鎖/分岐鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症、2-メチル-3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症、イソブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症、3-ヒドロキシイソ酪酸尿症、マロン酸尿症、長鎖脂肪酸酸化障害、糖原病、糖原病I型（GSD1）、カルニチン回路障害、尿素回路障害、クリグラー・ナジャール症候群、遺伝性チロシン血症、表皮水疱症、ウィルソン病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、鎌状赤血球病、X連鎖重症複合免疫不全症（SCID-X1）、サラセミア、嚢胞性線維症、α1アンチトリプシン欠損症、ダイアモンド・ブラックファン貧血、ゴーシェ病、成長ホルモン欠損症、およびパーキンソン病からなる群より選択される、本発明1004の方法。
[本発明1006]
免疫学的予防を促進することにおいて用途が見出される、本発明1003の方法。
[本発明1007]
導入遺伝子が、免疫学的予防を促進する作用物質をコードする、本発明1006の方法。
[本発明1008]
免疫学的予防を促進する作用物質が抗体またはキメラポリペプチドであり、かつヒト免疫不全ウイルス（HIV）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、マラリア原虫（Plasmodium）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、真菌、および細菌より選択される病原体に特異的である、本発明1007の方法。
[本発明1009]
創傷治癒を促進することにおいて用途が見出される、本発明1003の方法。
[本発明1010]
第一の核酸配列および第二の核酸配列を含むポリヌクレオチドカセットであって、該第一の核酸配列が導入遺伝子を含み；かつ該第二の核酸配列が該第一の核酸配列に対して5'側または3'側に位置付けされ、かつ細胞のゲノムにおける標的組み込み部位への組み込み時に、2種類の独立した遺伝子産物の産生を促進する、ポリヌクレオチドカセット；
該ポリヌクレオチドカセットに対して5'側に位置付けされ、かつ細胞のゲノムにおける標的組み込み部位の5'側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む、第三の核酸配列；ならびに
該ポリヌクレオチドカセットの3'側に位置付けされ、かつ細胞のゲノムにおける標的組み込み部位の3'側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む、第四の核酸配列
を含む、細胞のゲノムにおける標的組み込み部位に導入遺伝子を組み込むための組換えウイルスベクター。
[本発明1011]
rAAVベクターである、本発明1010の組換えウイルスベクター。
[本発明1012]
標的組み込み部位における2種類の独立した遺伝子産物の産生を促進する核酸配列が、2Aペプチドをコードする配列；IRES；インテイン；部位特異的プロテアーゼに対する認識配列；凝固カスケードの一部として切断される切断可能なリンカーをコードする配列；第XI因子切断部位をコードする配列；およびイントロンのスプライスドナー/スプライスアクセプター配列より選択される、本発明1010の組換えウイルスベクター。
[本発明1013]
標的組み込み部位を含む内因性遺伝子の発現および活性が、導入遺伝子の組み込みによって妨害されない、本発明1012の組換えウイルスベクター。
[本発明1014]
内因性遺伝子の3'末端が、標的組み込み部位を含み、
第三の核酸配列の配列が、該内因性遺伝子の終止コドンの上流にあるDNA配列と実質的に相同であり；かつ
第四の核酸配列の配列が、該内因性遺伝子の終止コドンの下流にあるDNA配列と実質的に相同である、
本発明1013の組換えウイルスベクター。
[本発明1015]
内因性遺伝子の5'末端が、標的組み込み部位を含み、
第三の核酸配列の配列が、該内因性遺伝子の開始コドンの上流にあるDNA配列と実質的に相同であり；かつ
第四の核酸配列の配列が、該内因性遺伝子の開始コドンの下流にあるDNA配列と実質的に相同である、
本発明1013の組換えウイルスベクター。
[本発明1016]
内因性遺伝子が、アルブミン遺伝子、コラーゲン遺伝子、およびアクチン遺伝子からなる群より選択される、本発明1013の組換えウイルスベクター。
[本発明1017]
導入遺伝子が遺伝子欠損を補完する、本発明1010の組換えウイルスベクター。
[本発明1018]
導入遺伝子が、免疫学的予防を促進する作用物質をコードする、本発明1010の組換えウイルスベクター。
[本発明1019]
免疫学的予防を促進する作用物質が、免疫グロブリンドメインおよびエフェクタードメインを含むポリペプチドである、本発明1018の組換えウイルスベクター。
[本発明1020]
免疫学的予防を促進する作用物質が抗体である、本発明1018の組換えウイルスベクター。
[本発明1021]
免疫学的予防を促進する作用物質が抗体またはキメラポリペプチドであり、かつヒト免疫不全ウイルス（HIV）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、マラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、真菌、および細菌より選択される病原体に特異的である、本発明1018の組換えウイルスベクター。
[本発明1022]
導入遺伝子が脈管形成および/または血管新生を促進する、本発明1010の組換えウイルスベクター。
[本発明1023]
導入遺伝子がVEGFである、本発明1022の組換えウイルスベクター。