(57)【要約】      （修正有）【課題】被験体における新生児ＨＩＥ（低酸素性虚血性脳症）を早期に、化学的に検出する方法の提供。【解決手段】Ｌｏｘ−１（レクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体１）をコードする特定の塩基配列、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列、相補的な塩基配列に対して高ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物である核酸又はその翻訳産物であるタンパク質の新生児低酸素性虚血性脳症マーカーとしての使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）〜（d）で示すいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物である核酸又はその翻訳産物であるタンパク質の新生児低酸素性虚血性脳症マーカーとしての使用。
（a）配列番号１０に示す塩基配列
（b）配列番号１０に示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列
（c）配列番号１０に示す塩基配列に対して90％以上の同一性を有する塩基配列、及び
（d）配列番号１０に示す塩基配列と相補的な塩基配列に対して高ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
【請求項２】
被験体における新生児低酸素性虚血性脳症の罹患の鑑別を補助するための方法であって、
被験体及び健常体から入手した試料の単位量あたりに含まれる請求項１に記載の新生児低酸素性虚血性脳症マーカーの量を測定してその測定値を得る測定工程、
前記測定工程で得られた被験体及び健常体におけるそれぞれの測定値を比較して、その値が被験体で有意に高い場合、その被験体は新生児低酸素性虚血性脳症に罹患していることを示す比較鑑別工程
を含む前記方法。
【請求項３】
請求項１に記載の新生児低酸素性虚血性脳症マーカーを測定するためのプローブ、プライマーセット、アプタマー、及び／又は抗体を含む、新生児低酸素性虚血性脳症鑑別キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳循環障害を検出できるバイオマーカー及びそれを用いた被験体における脳循環障害を検出する方法、並びに脳循環障害抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
新生児低酸素性虚血性脳症（neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy；nHIE）（以下、しばしば「新生児HIE」又は「新生仔HIE]と表す）は、重症新生児仮死、急性呼吸循環不全、又は胎児低酸素症等により予期せず発症する脳循環障害である。新生児HIEは、予後不良の疾患で、発生頻度は0.1〜0.6%、致死率は10〜60％、脳性麻痺やてんかん等の神経学的後遺症の発生率は25％と非常に高い（非特許文献１〜３）。その病態には、低酸素及び虚血によって神経細胞間隙に放出される興奮性神経伝達物質グルタミン酸の神経毒性やサイトカイン等の炎症性物質による神経細胞傷害及び脳浮腫が深く関わっている（非特許文献４及び５）。したがって、新生児HIEの治療には、不可逆的な細胞傷害を生じる前の潜伏期（latent phase）、すなわち、通常、出生後6時間以内での処置が重要となる。
【０００３】
現在までのところ新生児HIEに対して神経保護作用が証明されているのは、低体温療法のみである（非特許文献６〜１１）。しかし、低体温療法を行うには冷却装置、人工呼吸器、脳波モニター等の特別な機器を必要とし、手技、管理が非常に煩雑であるため、特定の高度医療機関でしか行うことができない。ところが、新生児仮死及び新生児HIEは、あらゆる出産施設において予期せずに起こり得るものであり、低体温療法を行うためには高度医療機関への新生児搬送が必要となる。一方、新生児HIEは、出生前又は出生時から進行しており、低体温療法であっても前述のように出生後6時間以内に施術を開始しなければ効果がない。さらに、低体温療法を施術できた場合であっても、施術後の復温時に脳圧のリバウンド上昇を生じる場合がある（非特許文献１２）。それ故に、新生児のような発達段階の脳においては、低体温療法後の脳浮腫に対する対策が非常に重要となっている（非特許文献１３）。このように新生児HIEに対して現在最も有効とされる低体温療法も様々な問題を抱えている。
【０００４】
そこで、低体温療法に代わり、新生児HIEの発症後、その病態を迅速かつ正確に検出することができ、またあらゆる出産施設で迅速かつ簡便に実施可能であり、さらに脳圧のリバウンド上昇による脳浮腫の発生リスクが低い新たな治療方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Shankaran S, 2009, J Neurotrauma. 26(3):437-443. doi: 10.1089/ neu.2008.0678.
【非特許文献２】Gunn AJ., 2000, Curr Opin Pediatr. 12(2):111-115.
【非特許文献３】Vannucci RC &Perlman JM, 1997, Pediatrics. 100(6):1004-1014.
【非特許文献４】Drury PP, et al., 2010, Semin Fetal Neonatal Med. 15(5):287-292. doi: 10.1016/j.siny.2010.05.005.
【非特許文献５】Johnston MV, et al., 2011, Lancet Neurol. 10(4):372-82. doi: 10.1016/S1474-4422(11)70016-3.
【非特許文献６】Gluckman PD, et al., 2005, Lancet. 365(9460):663-670.
【非特許文献７】Shankaran S, et al., 2005, N Engl J Med. 353(15):1574-1584.
【非特許文献８】Azzopardi DV, et al., 2009, N Engl J Med. 361(14):1349-1358. doi: 10.1056/NEJMoa0900854.
【非特許文献９】Simbruner G, et al., 2010, Pediatrics. 126(4):e771-778. doi: 10.1542/peds.2009-2441.
【非特許文献１０】Zhou WH, et al., 2010, J Pediatr. 157(3):367-372, 372.e1-3. doi: 10.1016/j.jpeds.2010.03.030.
【非特許文献１１】Jacobs SE, et al., 2011, Arch Pediatr Adolesc Med. 165(8):692-700. doi: 10.1001/archpediatrics.2011.43.
【非特許文献１２】Wu TC &Grotta JC, 2013, Lancet Neurol. 12(3):275-284. doi: 10.1016/S1474-4422(13)70013-9.
【非特許文献１３】Baburamani AA, et al., 2012, Front Physiol. 3:424. doi: 10.3389/fphys.2012.00424.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、被験体における脳循環障害を早期に、化学的に検出する方法、また、新生児HIE等の脳循環障害に対して、検出後、迅速に実施可能で、かつ低体温療法を必要としない簡便な脳循環障害抑制剤を開発し、提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らは、新生児HIEのモデルラットを作製して、新生児HIE発症時に発現が有意に増減し、逆に低体温療法処置によってその増減が解消された12種類の遺伝子を同定した。また、新生児HIE発症時に発現が有意に増加した遺伝子翻訳産物の機能をその遺伝子産物に対する中和抗体で抑制したところ、脳循環障害による脳神経細胞のアポトーシスや脳浮腫の発生を有意に抑制することができた。本発明は、これらの実験結果に基づくもので、下記を提供する。
（１）配列番号１〜１２に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子の遺伝子産物、又はその一部からなる脳循環障害検出マーカー。
（２）前記脳循環障害が新生児低酸素性虚血性脳症である、（１）に記載の検出マーカー。
（３）被験体の脳循環障害を検出する方法であって、被験体及び健常体から入手した試料の単位量あたりに含まれる（１）に記載の脳循環障害検出マーカーの量を測定してその測定値を得る測定工程、前記測定工程で得られた被験体及び健常体における脳循環障害検出マーカーの測定値を比較して、脳循環障害検出マーカーが配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子の産物又はその一部であって、その測定値が被験体で有意に低い場合、又は脳循環障害検出マーカーが配列番号２〜１２に示す塩基配列からなる遺伝子の産物又はその一部であって、その測定値が被験体で有意に高い場合、その被験体が脳循環障害を有していると鑑別する比較鑑別工程を含む前記方法。
（４）前記測定工程で、試料中の二以上の脳循環障害検出マーカーの量を測定する、（３）に記載の検出方法。
（５）前記脳循環障害が新生児低酸素性虚血性脳症である、（３）又は（４）に記載の検出方法。
（６）（１）又は（２）に記載の一以上の脳循環障害検出マーカーを測定するためのプローブ、プライマーセット、アプタマー、及び／又は抗体を含む、脳循環障害検出キット。
（７）前記配列番号２〜１２に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子のいずれか一の遺伝子の発現又は前記配列番号２〜６及び８〜１１に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子のいずれか一の遺伝子翻訳産物の機能を抑制するアポトーシス抑制剤。
（８）前記遺伝子翻訳産物に対する抗体、アプタマー又は低分子化合物で構成され、遺伝子翻訳産物の機能を抑制する、（７）に記載のアポトーシス抑制剤。
（９）配列番号１０に示す塩基配列からなる遺伝子翻訳産物に対して、その機能を抑制する低分子化合物からなる、（８）に記載のアポトーシス抑制剤であって、
前記低分子化合物がPLAzPC、ginkgolide B、Spiro、kappa-carragreenan、resveratol、pterostibene、polyinosonic acid及び Angiotensin(1-7)からなる群から選択される前記アポトーシス抑制剤。
（１０）前記遺伝子発現の抑制が遺伝子転写産物に対するRNA干渉剤、アンチセンス核酸、核酸酵素又はU1アダプターで構成され、該遺伝子の発現を抑制する、（７）に記載のアポトーシス抑制剤。
（１１）神経細胞のアポトーシスを抑制する、（７）〜（１０）のいずれかに記載のアポトーシス抑制剤。
（１２）（１１）に記載のアポトーシス抑制剤を有効成分として包含する脳循環障害抑制剤。
（１３）前記アポトーシス抑制剤を二以上包含する、（１２）に記載の脳循環障害抑制剤。
（１４）前記脳循環障害が新生児低酸素性虚血性脳症である、（１２）又は（１３）に記載の脳循環障害抑制剤。
【０００８】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2014-031109号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、被験体における脳循環障害を早期に、化学的に検出することができる。また、新生児HIE等の脳循環障害に対して、検出後、迅速かつ簡便に実施可能で、脳浮腫の発生リスクが低い抑制剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】低酸素性虚血性脳症群（HIE群）モデルラット、低体温療法群（HT群）モデルラット及びコントロール群（CTL群）ラット、さらに本発明の脳循環障害抑制剤によるHIE治療群（HIE＋抗LOX-1抗体群）ラットとその対照用であるPBS群（HIE＋PBS群）ラットの作製概念図を示す。
【図２】LOX-1の発現部位を示すin situ hybridizationの結果である。Ａは脳の冠状断面図、ＢはＡ図黒枠内の20倍拡大図である。Ｂ図中、矢印で示す部位がLOX-1の発現を示す部位である。
【図３】図１に示した各群のNissl染色した脳の冠状断面図を示す。梗塞側左半球（L)の破線枠で囲んだ領域は、傷害組織の面積を示す。
【図４】図１に示した各群の脳梗塞側左半球におけるアポトーシス細胞を示すTUNEL染色図である。
【図５】アポトーシス誘導タンパク質であるactive caspase 3の発現量を評価した結果を示す。図中の※印は、p＜0.05を示す。
【図６】右脳水分率に対する脳梗塞側左脳水分率の脳水分率比を示す。図中の※印は、p＜0.05を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．脳循環障害検出マーカー
１−１．概要
本発明の第１の態様は、脳循環障害検出マーカーである。本発明の脳循環障害検出マーカーは、特定の遺伝子又はその変異遺伝子の遺伝子産物、又はその一部で構成され、被験体由来の試料中に存在する量を測定することで、その被験体における脳循環障害を検出することができる。
【００１２】
１−２．構成
本明細書において「脳循環障害」とは、脳血流の低下等の脳内血液循環の変動によって引き起こされる脳神経細胞傷害、及びそれによって発症する脳機能障害や脳細胞傷害をいう。例えば、新生児低酸素性虚血性脳症（新生児HIE）、脳梗塞、脳塞栓、脳血管性認知症等が挙げられる。本明細書において脳循環障害は、特に限定はしないが、本発明の各態様において好ましい脳循環障害は、新生児HIEである。
【００１３】
本明細書において「脳循環障害検出マーカー」とは、12種類の遺伝子又はその変異遺伝子の遺伝子産物、又はその一部からなり、被験体における脳循環障害を検出可能なバイオマーカーをいう。以下、脳循環障害検出マーカーの構成について具体的に説明をする。
【００１４】
前記「12種類の遺伝子」とは、脳循環障害の発症に伴い有意に発現が増減する表１に示す配列番号１〜１２に示す塩基配列からなるヒト由来の遺伝子である。特に、配列番号１０に示す塩基配列からなるLox-1遺伝子は、本発明の脳循環障害検出マーカーとして好ましい。なお、表１において、配列番号１に示す遺伝子は、脳循環障害の発症に伴い発現が有意に減少する遺伝子であり、また、配列番号２〜１２に示す遺伝子は、脳循環障害の発症に伴い発現が有意に増加する遺伝子である。
【００１５】
【表１】
2020072701.tif 000002
【００１６】
前記「その変異遺伝子」とは、前記配列番号１〜１２に示す塩基配列からなるヒト由来の遺伝子において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる遺伝子、配列番号１〜１２に示す塩基配列に対して80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％、95％以上、97％以上、98％以上、又は99％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号１〜１２に示す塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子をいう。前記「数個」とは、2〜10個、例えば、2〜7個、2〜5個、2〜4個、2〜3個をいう。また、前記「同一性」とは、2つの塩基配列を適当なギャップを導入して又は導入しないでアラインメントしたときに、配列番号１〜１２に示す塩基配列の全塩基数に対する同一塩基数の割合（％）をいう。前記「ストリンジェントな条件」とは、配列番号１〜１２に示す塩基配列と特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが実質的に形成されない条件をいう。通常は低ストリンジェント〜高ストリンジェントな条件が挙げられるが、高ストリンジェントな条件が好ましい。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば5×SSC、0.1% SDSを含むバッファを用いて42℃〜50℃で洗浄する条件である。また高ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば65℃、0.1×SSC及び0.1% SDSで洗浄する条件である。一般に、低塩濃度で、かつ高温であるほど高ストリンジェントな条件となる。ここでいう低塩濃度は、具体的には、例えば、15〜750mM、好ましくは15〜500mM、15〜300mM又は15〜200mMをいう。また、ここでいう高温は、具体的には、例えば、50〜68℃、又は55〜70℃である。
【００１７】
本発明における変異遺伝子の具体例としては、配列番号１〜１２に示す塩基配列からなるヒト由来の遺伝子のSNP（一塩基多型）等の多型に基づく変異遺伝子、スプライスバリアント、アミノ酸縮重に基づく変異遺伝子の他、配列番号１〜１２に示す塩基配列からなるヒト由来の遺伝子の他生物種におけるオルソログ遺伝子等が挙げられる。
【００１８】
前記「遺伝子産物」とは、前記配列番号１〜１２に示す塩基配列からなるヒト由来の遺伝子又はその変異遺伝子の発現によって生じる産物であって、具体的には、RNAからなる遺伝子転写産物（ただし、逆転写によって得られるcDNAを含む）、及びペプチドからなる遺伝子翻訳産物が該当する。遺伝子転写産物には、例えば、配列番号１〜６及び８〜１１に示す塩基配列からなる遺伝子の転写産物であるmRNA（mRNA前駆体を含む）、及び配列番号７及び１２に示す塩基配列からなる遺伝子の転写産物である核内低分子RNAが挙げられる。遺伝子翻訳産物には、例えば、配列番号１〜６及び８〜１１に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物であるタンパク質が該当する。具体的には、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号３に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号４に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号１５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号５に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号６に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号８に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号１８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号９に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号１９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号１０に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号２０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。また、配列番号１１に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号２１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００１９】
前記「その一部」とは、前記遺伝子産物の一部をいう。ここでいう「一部」とは、断片を意味する。すなわち、前記配列番号１〜１２に示す塩基配列からなるヒト由来の遺伝子又はその変異遺伝子の発現によって生じる遺伝子産物の断片が該当する。具体的には、例えば、配列番号１〜６及び８〜１１に示す塩基配列からなる遺伝子転写産物であるmRNAの断片、又は配列番号７及び１２に示す塩基配列からなる遺伝子転写産物である核内低分子RNAの断片が挙げられる。また、例えば、配列番号１３〜２１に示すアミノ酸配列からなる遺伝子翻訳産物であるタンパク質の断片が挙げられる。前記遺伝子産物は、生体内に存在するヌクレアーゼ、プロテアーゼ、又はペプチダーゼ等によって分解され、断片化された状態で存在し得る。それ故、前記遺伝子産物の一部も脳循環障害検出マーカーとなり得る。
【００２０】
１−３．効果
本発明の脳循環障害検出マーカーは、脳循環障害の発症後、その病態を正確に検出するバイオマーカーとなり得る。
【００２１】
２．脳循環障害検出方法
２−１．概要
本発明の第２の態様は、脳循環障害検出方法である。本発明の脳循環検出方法は、被験体由来の試料中に存在する第１態様の脳循環障害検出マーカーの量を測定し、健常者由来の試料中に存在するその脳循環障害検出マーカーの量と比較することによって、被験体における脳循環障害を検出することができる。
【００２２】
２−２．方法
本発明の脳循環障害検出方法は、（１）測定工程、及び（２）比較鑑別工程を必須の工程として含む。以下、各工程について具体的に説明をする。
（１）測定工程
「測定工程」とは、被験体及び健常体から入手した試料の単位量あたりに含まれる第1態様に記載の脳循環障害検出マーカーの量を測定してその測定値を得る工程である。
【００２３】
本態様において「被験体」とは、脳循環障害の検出を目的として本態様の方法に供される動物個体をいう。ここでいう動物とは、哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００２４】
本態様において「健常体」とは、脳循環障害を有さない動物個体、好ましくはいずれの疾患や異常も有さない健康な動物個体をいう。本態様で用いる健常体は、前記被験体と同種である。さらに、同性で、年齢（週齢、月齢）、身長（体長）、及び体重等の各種身体的条件が被験体と同一又は近似であることが好ましい。
【００２５】
「入手した試料」とは、前記被験体及び健常体のそれぞれから採取された試料をいう。本態様において「試料」とは、体液、組織及び／又は細胞をいう。本明細書において「体液」は、脳循環障害検出マーカーを含み得る生物学的流動体をいう。例えば、髄液、血液、リンパ液、腹水等が含まれる。ここでいう「血液」とは、全血、血漿及び血清を含む。全血は、静脈血、又は動脈血を問わない。本明細書において「組織」とは、脳循環障害検出マーカーを含み得る生体を構成する組織をいう。組織の種類は、特に限定はしないが、例えば、粘膜、粘膜下組織、結合組織等が挙げられる。本態様において試料は、被験体と健常体とで同種又は近似のものが好ましい。
【００２６】
「単位量」は、容量又は重量の所定の単位であって、例えば、マイクロリットル、ミリリットル、マイクログラム、ミリグラム、グラム等が挙げられる。
【００２７】
本明細書において「測定値」とは、本工程で測定される脳循環障害検出マーカーの量を示す値である。測定値は、容量又は重量のような絶対値であってもよく、また濃度、イオン強度、吸光度又は蛍光強度のような相対値であってもよい。
【００２８】
本工程では、被験体由来の試料（「被験体試料」という）と健常体試料由来の試料（「健常体試料」という）のそれぞれに含まれる脳循環障害検出マーカーの量を測定する。測定する脳循環障害検出マーカーは、第１態様に記載の脳循環障害検出マーカーのいずれか1つでよいが、2つ以上を組み合わせて測定することもできる。複数の脳循環障害検出マーカーを組み合わせて測定することによって、脳循環障害の偽陽性率又は偽陰性率を下げ、検出精度を高めることができる。
【００２９】
脳循環障害検出マーカーの測定方法は、公知の核酸又はペプチドの定量方法であればよく、特に限定はしない。例えば、核酸であれば定量的核酸増幅法が、またペプチドであれば免疫学的検出法又は質量分析法が挙げられる。
【００３０】
定量的核酸増幅法には、例えば、定量PCR法（ゲル電気泳動法、SYBRグリーン法、リアルタイムPCR法を含む）が挙げられる。
【００３１】
免疫学的検出法には、例えば、酵素免疫測定法（ELISA法、EIA法を含む）、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法（RIA）、発光免疫測定法、表面プラズモン共鳴法（SPR法）、水晶振動子マイクロバランス（QCM）法、免疫比濁法、ラテックス凝集免疫測定法、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応法、金コロイド法、キャピラリー電気泳動法、ウェスタンブロット法又は免疫組織化学法（免疫染色法）が挙げられる。
【００３２】
質量分析法には、高速液体クロマトグラフ質量分析法（LC-MS）、高速液体クロマトグラフタンデム質量分析法（LC-MS/MS）、ガスクロマトグラフ質量分析法（GC-MS）、ガスクロマトグラフタンデム質量分析法（GC-MS/MS）、キャピラリー電気泳動質量分析法（CE-MS）及びICP質量分析法（ICP-MS）が挙げられる。
【００３３】
上記分析法は、いずれも当該分野に公知の技術であって、それらの方法に準じて行えばよい。例えば、Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York；Christopher J., et al., 2005, Chemical Review,105:1103-1169；Iijima Y. et al., 2008,.The Plant Journal, 54,949-962；Hirai M. et al.,2004, Proc Natl Acad Sci USA, 101(27) 10205-10210；Sato S, et al., 2004,,The Plant Journal, 40(1)151-163； Shimizu M. et al., 2005, Proteomics, 5,3919-3931に記載の方法に準じて行うことができる。また、各メーカーから各種核酸又はペプチド定量キットが市販されており、それらを利用することもできる。
【００３４】
なお、前記測定工程における健常体の測定値は、予め様々な身体的条件の健常体から得られた試料中の各脳循環障害検出マーカー量を測定しておき、それをデータベース化したものを使用してもよい。
【００３５】
（２）比較鑑別工程
「比較鑑別工程」とは、被験体及び健常体における脳循環障害検出マーカーの測定値を比較して、その結果から被験体が脳循環障害の有無を鑑別する工程である。
【００３６】
本工程では、前記測定工程で得られた被験体と健常体における同種の脳循環障害検出マーカーの測定値を比較する。このとき、被験体及び健常体の定量結果を補正するために、単位量あたりの試料において量的差異のないことが期待される公知の核酸又はタンパク質を内在性コントロールとして用いてもよい。このような内在性コントロール用核酸として、例えば、β-アクチン、GAPDH、及びβ-glucronidase(GUS)等が、また内在性コントロール用タンパク質として、例えば、アルブミンが挙げられる。
【００３７】
比較の結果は、脳循環障害検出マーカーの種類に応じて以下のように鑑別する。
【００３８】
脳循環障害検出マーカーが配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子の産物又はその一部の場合には、被験体の測定値が健常体よりも有意に低い場合に、その被験体が脳循環障害を有していると鑑別する。逆に有意に高い場合は、その被験体が脳循環障害を有している可能性は低いと鑑別する。
【００３９】
一方、脳循環障害検出マーカーが配列番号２〜１２に示す塩基配列からなる遺伝子の産物又はその一部の場合には、被験体の測定値が健常体よりも有意に高い場合に、その被験体が脳循環障害を有していると鑑別する。逆に有意に低い場合は、その被験体が脳循環障害を有している可能性は低いと鑑別する。
【００４０】
本明細書において「有意」とは、統計学的に有意の意味であり、被験体と健常体の測定値の差異を統計学的に処理したときに、両者間に有意差があることをいう。具体的には、例えば、危険率（有意水準）が5％、1％又は0.1％より小さい場合が挙げられる。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントt検定法、多重比較検定法を用いることができる。
【００４１】
２−３．効果
本発明の脳循環障害検出方法によれば、本発明の脳循環障害検出マーカーを用いることで、あらゆる医療施設において簡便かつ正確に、また迅速に脳循環障害を検出することができる。
【００４２】
３．脳循環障害検出キット
３−１．概要
本発明の第３の態様は、脳循環障害検出キットである。本発明の脳循環障害キットは、試料中の脳循環障害検出マーカーを検出及び／又は測定するために必要な試料、試薬、説明書等を適当な組み合わせで、又は包括的に含むキットであり、前記第２態様の脳循環障害検出方法における測定工程等で用いることができる。
【００４３】
３−２．構成
本キットは、プローブ、プライマーセット、アプタマー、及び抗体のいずれか一以上を必須の構成要素として包含する。これらは、いずれも第１態様に記載の特定の脳循環障害検出マーカーを特異的に検出することができる。
【００４４】
プローブ及びプライマーセットは、検出すべき脳循環障害検出マーカーが遺伝子転写産物の場合に、その脳循環障害検出マーカーを構成する塩基配列の特異的な領域に対して相補的な塩基配列を含む核酸である。例えば、配列番号１０に示す塩基配列からなるLox-1の遺伝子転写産物であるmRNA又はcDNAにおいて、Lox-1遺伝子に特異的な塩基配列に相補的な塩基配列を含むDNAや、Lox-1遺伝子のcDNAを鋳型としてLox-1遺伝子を特異的に増幅可能な塩基配列を含むプライマーセットが挙げられる。
【００４５】
前記プローブ又はプライマーを構成する核酸は、自然界に存在する天然型核酸（DNA及びRNA）、化学修飾核酸（例えば、メチルホスホネート型DNA/RNA、ホスホロチオエート型DNA/RNA、ホスホルアミデート型DNA/RNA、2'-O-メチル型DNA/RNA等）、天然型核酸に類似の性質及び／又は構造を有する人工的に構築された又は人工的に化学修飾された人工核酸、核酸類似体（ペプチド核酸（PNA：Peptide Nucleic Acid）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（PHONA）、架橋化核酸（BNA/LNA：Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid）、モルフォリノ核酸（ホルフォリノオリゴを含む）等）及びそれらの組合せを含んでいてもよい。プローブ又はプライマーを構成する核酸は、必要に応じて、リン酸基、糖及び／又は塩基が標識されていてもよい。標識は、当該分野で公知の標識物質を利用することができる。例えば、放射性同位元素（例えば、32P、3H、14C）、DIG、ビオチン、蛍光色素（例えば、FITC、Texas、cy3、cy5、cy7、FAM、HEX、VIC、JOE、Rox、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA）、又は発光物質（例えば、アクリジニウムエスター）が挙げられる。
【００４６】
アプタマー及び抗体は、検出すべき脳循環障害検出マーカーが遺伝子翻訳産物、すなわちペプチドの場合に用いることができる。これらの基本構成については、次章の「４．アポトーシス抑制剤」で詳述する。なお、本態様のキットに包含され得るアプタマー及び抗体は、必要に応じて標識されていてもよい。例えば、核酸アプタマーであれば、標識は、上述した当該分野で公知の標識物質を利用することができる。また抗体であれば、蛍光色素（Alexa、フルオレセイン、FITC、ローダミン、テキサスレッド、Cy3、Cy5）、蛍光タンパク質（例えば、PE、APC、GFP）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、放射性同位元素（例えば、3H、14C、35S）又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジン等の公知の標識物質を利用することができる。
【００４７】
上記の他にも、本発明のキットには、必要に応じて標識二次抗体、標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、又は試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を含むことができる。さらに、そのキットの使用説明書を包含することもできる。
【００４８】
４．アポトーシス抑制剤
４−１．概要
本発明の第４の態様は、アポトーシス抑制剤である。本発明のアポトーシス抑制剤は、脳循環障害検出マーカーの機能を抑制し、それによって細胞の、特にグルタミン酸の神経毒性やサイトカイン等の炎症性物質によって傷害を受けた神経細胞のアポトーシスを抑制することができる。
【００４９】
４−２．構成
配列番号２〜１２に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子は、脳循環障害発症時にその発現量が増加し、その結果、神経細胞のアポトーシスが誘導される。したがって、それらの遺伝子又はその変異遺伝子の発現、及び／又は配列番号２〜６及び８〜１１に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子のいずれか一の遺伝子翻訳産物の機能を抑制すれば、アポトーシスを抑制することができる。本発明のアポトーシス抑制剤は、この原理を利用したもので、前記表１に記載の配列番号２〜１２に示す塩基配列からなるいずれか一の遺伝子又はその変異遺伝子（以下「標的遺伝子」とする）の発現、又は前記配列番号２〜６及び８〜１１に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子のいずれか一の遺伝子翻訳産物（以下「標的タンパク質」とする）の機能を抑制する、つまり、第１態様に記載の脳循環障害検出マーカーを抑制する特徴を有する。
【００５０】
「アポトーシス」とは、多細胞生物におけるカスパーゼ依存型のプログラムされた細胞死である。本明細書においてアポトーシスを受ける細胞は、特に制限はしない。好ましくは神経細胞、特に脳細胞である。
【００５１】
以下、標的遺伝子の発現を抑制するアポトーシス抑制剤と、その遺伝子翻訳産物の機能を抑制するアポトーシス抑制剤のそれぞれについて説明をする。
【００５２】
４−２−１．標的遺伝子の発現を抑制するアポトーシス抑制剤
「標的遺伝子の発現を抑制するアポトーシス抑制剤」は、標的遺伝子の転写後、その遺伝子転写産物であるmRNA（以下、「標的mRNA」とする）が翻訳されるまでの間に、標的遺伝子の発現を抑制することのできる物質である。例えば、核内において標的遺伝子の転写後、標的mRNAのmRNAスプライシングを阻害又は抑制する物質、標的mRNAの核外輸送を阻害又は抑制する物質、遺伝子サイレンシングのように核外において標的mRNAを分解する物質又は標的mRNAの翻訳を阻害する物質が挙げられる。このうち、標的mRNAを分解する物質や標的mRNAの翻訳を阻害する物質としては、例えば、標的遺伝子のRNA干渉剤、アンチセンス核酸、核酸酵素、又はU1アダプターが該当する。以下、各アポトーシス抑制剤について具体的に説明をする。
【００５３】
（１）RNA干渉剤
「RNA干渉剤」とは、生体内においてRNA干渉（RNA inteference：RNAi）を誘導する物質をいう。RNA干渉とは、標的とする遺伝子転写産物の分解を介してその遺伝子の発現を抑制する配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングである。本明細書における「標的遺伝子のRNA干渉剤」は、配列番号２〜１２に示す塩基配列からなる遺伝子転写産物に対して特異的なサイレンシングを誘導することのできる物質をいう。例えば、siRNA、又はshRNAが挙げられる。RNA干渉については、例えば、Bass B.L., 2000, Cell, 101, 235-238；Sharp P.A., 2001, Genes Dev., 15 ,485-490；Zamore P.D., 2002, Science, 296, 1265-1269；Dernburg ,A.F. &Karpen, G.H., 2002, Cell, 111,159-162に詳述されている。以下、各RNA干渉剤について詳細に説明をする。
【００５４】
（ｉ）siRNA
「siRNA」（短分子干渉RNA:small interference RNA）とは、標的遺伝子の塩基配列の一部に相当する塩基配列で構成されるセンス鎖（パッセンジャー鎖）、及びそのアンチセンス鎖（ガイド鎖）からなる小分子二本鎖RNAである。siRNAは、被験体の細胞（真核細胞）へ導入することによってRNA干渉を誘導することができる（Fire A. et al．，1998，Nature，391, 806-811）。
【００５５】
siRNAは、標的遺伝子の塩基配列に基づいて公知の方法により設計すればよい。例えば、Ui-Teiらの方法（Nucleic Acids Res., 2004, 32:936-948）、Reynoldsらの方法（Nat. Biotechnol., 2004, 22:326-330）、Amarzguiouiらの方法（Biochem. Biophys. Res. Commun.,2004, 316: 1050-1058）の方法に基づいて、設計することができる。
【００５６】
siRNA設計の具体例を挙げると、配列番号２〜１２に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子のいずれか一の塩基配列（例えば、配列番号１０で示すLox-1遺伝子の塩基配列）からRNAセンス鎖の塩基配列として、15塩基以上35塩基以下、好ましくは15塩基以上30塩基以下、又は18塩基以上25塩基以下の連続した塩基配列を選択領域として選択する。このとき選択する領域の塩基配列は、標的とする標的遺伝子の塩基配列と完全に一致させるように留意する。それ故、選択領域内には標的遺伝子の既知の変異箇所（例えば、SNPを含む）を包含しないように設計することが好ましい。ただし、意図的にそのような変異塩基を有する標的遺伝子を特異的に抑制することを目的とする場合は、この限りではない。RNAアンチセンス鎖の塩基配列は、選択した前記RNAセンス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列とする。なお、siRNAの調製に際しては、センス鎖及びアンチセンス鎖共に選択領域内のT（チミン）塩基をU（ウラシル）塩基に変換しておく。
【００５７】
前記RNAセンス鎖の選択領域は、標的遺伝子に特異的な配列であれば特に限定はしない。好ましくは開始コドンから少なくとも50塩基、より好ましくは70塩基〜100塩基よりも下流の領域である。さらに、RNAセンス鎖の候補領域内においてAA（アデニン‐アデニン）を5'側に有する塩基配列領域を選択することが好ましい。選択した領域内のGC（グアニン‐シトシン）含有量は、好ましくは20〜80％、より好ましくは30〜70％又は40〜60％である。siRNAの設計は、ウェブサイト上でも多数公開されており、標的遺伝子の塩基配列を入力すれば、有効かつ適切なsiRNAをウェブ上で設計することができる。代表的なsiRNA設計ウェブサイトとしては、siDirect（http://design.RNAi.jp/）、siDESIGN Center（http://www.dharmacon.com/designcenter/designcenterpage.aspx）、siRNA Selection Server （http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/）等が挙げられる。
【００５８】
siRNAの一方の末端又は両末端には、標的遺伝子の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列とは関連しない一以上のDNA、RNA、及び／又は核酸類似体からなる塩基配列が存在していてもよい。このようなsiRNAの末端に存在する塩基数は、特に限定はしないが、1〜20個の範囲内であることが好ましい。具体的には、例えば、siRNAのセンス鎖側及びsiRNAアンチセンス鎖側の3'末端側にTT（チミン‐チミン）又はUU（ウラシル‐ウラシル）等を付加する場合が挙げられる（Tuschl T et al., 1999, Genes Dev, 13(24):3191-7）。
【００５９】
（ｉｉ）shRNA
「shRNA」（short hairpin RNA）とは、前記siRNAが適当な短いスペーサ配列で連結された一本鎖RNAをいう。したがって、shRNAは、一分子内でセンス領域とアンチセンス領域が互いに塩基対合してステム構造を形成し、さらにスペーサ配列がループ構造をとることによって、分子全体としてヘアピン型のステム−ループ構造を有する。shRNAが細胞内に導入されると、ループ構造部分が切断されて二本鎖RNA分子、すなわちsiRNAが生成される。生じたsiRNAは、前項で述べたsiRNAと同様のRNA干渉機構によって標的遺伝子の発現を抑制することができる。
【００６０】
shRNAの設計は、例えば、前記siRNAにおけるセンス領域の3'末端と前記アンチセンス鎖の5'末端とをスペーサ配列で連結する。スペーサ配列は、通常3〜24塩基、好ましくは、4〜15塩基あればよい。スペーサ配列については、siRNAが塩基対合することができる配列であれば、特に制限はない。
【００６１】
（２）アンチセンス核酸
「アンチセンス核酸」とは、標的遺伝子の転写産物であるmRNAを標的とし、その塩基配列の全部又は一部に対して相補的な塩基配列を有し、標的mRNAにハイブリダイズしてその翻訳を阻害する核酸分子である。核酸は、主としてDNAで構成されるが、例えば、PNAやLNAのような核酸類似体やRNAも含むことができる。
アンチセンス核酸は、当該分野における公知の核酸合成技術を用いて作製することができる。例えば、前述のGreen, M.R. and Sambrook, J.（2012）を参照されたい。
【００６２】
（３）核酸酵素
「核酸酵素」とは、触媒活性を有する核酸分子で、標的mRNAを基質として特異的に結合し、標的mRNAにおける特定の部位を切断する触媒機能を有する。核酸酵素には、DNAで構成されるデオキシリボザイム、及びリボ酵素とも呼ばれRNAで構成されるリボザイムが知られているが、本明細書における核酸酵素は、いずれであってもよい。デオキシリボザイム及びリボザイムは、いずれも構成塩基に化学修飾核酸、人工核酸及び／又は核酸類似体を一部に含むことができる。
【００６３】
（４）U1アダプター
「U1アダプター」とは、標的遺伝子のmRNA前駆体における3'末エクソンに相補的な5'側の「標的ドメイン」と、U1 snRNAの5'領域に相補的な配列を有する3'側の「U1ドメイン」を含む二機能性の約25塩基からなる一本鎖核酸である（Goraczniak R. et al., 2009, Nat Biotechnol., Vol 27, p257-263,）。生体内にU1アダプターを導入すると、U1 snRNAを含むU1核内低分子リボ核蛋白質(U1 snRNP)が標的遺伝子のmRNA前駆体におけるポリAシグナル周辺に結合し、該mRNAのポリアデニル化を特異的に阻害する。その結果、標的遺伝子のmRNA前駆体が不安定化し、その後、核内で分解されることによって、遺伝子のサイレンシングが生じる。
【００６４】
４−２−２．標的遺伝子の遺伝子翻訳産物の機能を抑制するアポトーシス抑制剤
「標的遺伝子の遺伝子翻訳産物の機能を抑制するアポトーシス抑制剤」は、配列番号２〜６及び８〜１１に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子のいずれか一の遺伝子翻訳産物である標的タンパク質に作用して、その機能を特異的に抑制することのできる物質である。例えば、アンタゴニストや競合物質のように標的タンパク質の活性部位に結合して標的タンパク質を失活させることのできる阻害物質が該当する。具体例としては、標的タンパク質に対する抗体、アプタマー、又は低分子化合物が挙げられる。以下、各アポトーシス抑制剤について具体的に説明をする。
【００６５】
（１）抗体（抗標的タンパク質抗体）
本態様の抗体は、免疫グロブリンに由来するフレームワーク領域（FR：frame work region）及び相補性決定領域(CDR:complementarity determining region)を含み、抗原である標的タンパク質に特異的に結合し、その機能を阻害又は抑制する中和抗体としての機能を有するポリペプチドをいう。具体的には、配列番号２〜６及び８〜１１に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子の遺伝子翻訳産物、例えば、配列番号１３〜２１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質のいずれか一を標的タンパク質とし、その標的タンパク質に特異的に結合してその機能を阻害又は抑制する中和抗体である。例えば、配列番号１０に示す塩基配列からなるLox-1遺伝子の翻訳産物である配列番号２０に示すアミノ酸配列からなるLOX-1タンパク質を標的タンパク質とし、このタンパク質に特異的に結合して、LOX-1タンパク質の機能を阻害又は抑制する抗LOX-1抗体が挙げられる。
【００６６】
本態様の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、合成抗体、及び抗体フラグメントを含む。前記「特異的に結合」とは、標的抗原（例えば、抗ヒトLOX-1抗体であればヒトLOX-1又はその断片）のみと結合することを意味する。
【００６７】
抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の場合、免疫グロブリン分子は、任意のクラス（例えば、IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及びIgY）、又は任意のサブクラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2）でよい。一般にモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いる場合、投与する抗体は、哺乳動物及び鳥を含めた動物由来である。例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ロバ、ヒツジ、ラクダ、ウマ、ニワトリ又はヒト等が挙げられる。しかし、投与による拒絶反応を回避するために本発明のアポトーシス抑制剤を投与する生物種と同種由来の抗体であることが好ましい。例えば、アポトーシス抑制剤をヒトに投与する場合、アポトーシス抑制剤としてのモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、ヒト由来の抗体であることが好ましい。
【００６８】
「組換え抗体」とは、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は多重特異性抗体をいう。「キメラ抗体」とは、異なる動物由来の抗体のアミノ酸配列を組み合わせて作製される抗体で、ある抗体の可変領域（V領域）を他の抗体のV領域で置換した抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体のV領域をヒト抗体のV領域と置き換え、可変領域（V領域）がマウス由来、C領域がヒト由来となった抗体が該当する。「ヒト化抗体」とは、ヒト以外の哺乳動物、例えば、適当なマウス抗体の可変領域（V領域）における相補性決定領域（CDR；CDR1、CDR2及びCDR3）をヒトモノクローナル抗体のCDRとを置換したグラフト抗体である。キメラ抗体とヒト化抗体は、重鎖及び軽鎖のV領域、又は重鎖及び軽鎖のV領域における相補性決定領域がマウス等の非ヒト動物抗体由来ではあるが、C領域、又はV領域におけるフレームワーク領域（FR；FR1、FR2、FR3及びFR4）と重鎖及び軽鎖のC領域がヒト抗体由来であることから、ヒト体内における当該抗体に対する免疫反応を軽減し得る。
【００６９】
「多重特異性抗体」とは、多価抗体、すなわち抗原結合部位を一分子内に複数有する抗体において、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する抗体をいう。例えば、IgGのように2つの抗原結合部位を有する抗体で、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する二重特異性抗体（Bispecific抗体）が挙げられる。
【００７０】
「合成抗体」とは、化学的に又は組換えDNA法を用いることによって合成した抗体をいう。例えば、組換えDNA法を用いて新たに合成された抗体が挙げられる。具体的には、例えば、単鎖抗体（scFv：single chain Fragment of variable region）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）又はテトラボディ（tetrabody）等が挙げられる。
【００７１】
「抗体フラグメント」とは、例えば、Fab、F(ab'2）、Fv等が該当する。
抗体は、修飾されていてもよい。抗体の修飾には、機能上の修飾又は標識上の修飾を含む。機能上の修飾には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、又はPEG化が挙げられる。標識上の修飾には、蛍光色素（フルオレセイン、FITC、ローダミン、テキサスレッド、Cy3、Cy5）、蛍光タンパク質（例えば、PE、APC、GFP）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、放射性同位元素（例えば、3H、14C、35S）又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジンによる標識が挙げられる。
【００７２】
本発明で用いることができる抗標的タンパク質抗体を用いて、頭部エコーやCT、MRI等による脳浮腫、脳梗塞、又は脳組織障害の広がりを調べたり、脳脊髄液検査で神経細胞の障害を調べることによって、脳循環障害の重症度を評価することができる。
【００７３】
抗標的タンパク質抗体は、当該分野で公知の方法によって作製すればよい。例えば、Green, M.R. and Sambrook, J.,（2012；前述）に記載の方法を参考にすればよい。また、標的タンパク質に対する抗体がメーカーから市販されている場合には、それを利用することもできる。
【００７４】
（２）アプタマー
「アプタマー」とは、立体構造によって標的物質と強固、かつ特異的に結合し、標的物質の機能を特異的に抑制する能力を持つリガンド分子である。アプタマーは、その分子の種類により、核酸アプタマーとペプチドアプタマーに大別することができる。本発明のアポトーシス抑制剤としてのアプタマーは、配列番号２〜６及び８〜１１に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子のいずれか一の遺伝子翻訳産物を標的タンパク質とし、その機能を特異的に抑制することができれば、いずれであってもよい。好ましくは核酸アプタマーである。アプタマーに関しては、例えば、Janasena, Clin. Chem. 45:1628-1650 (1999)を参照されたい。
【００７５】
核酸アプタマーとは、核酸で構成されるアプタマーをいう。核酸アプタマーを構成する核酸は、DNA、RNA又はそれらの組合せのいずれであってもよい。必要に応じて、PNA、LNA／BNA、メチルホスホネート型DNA、ホスホロチオエート型DNA、2'-O-メチル型RNA等の化学修飾核酸を含むこともできる。
【００７６】
アプタマーは、必要に応じて標識されていてもよい。標識は当該分野で公知のあらゆる核酸用標識物質を利用することができる。例えば、放射性同位元素（例えば、32P、3H、14C）、DIG、ビオチン、蛍光色素（例えば、FITC、Texas、cy3、cy5、cy7、FAM、HEX、VIC、JOE、Rox、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA）、又は発光物質（例えば、アクリジニウムエスター）が挙げられる。このような標識物質で標識されたアプタマーは、標的タンパク質と結合したアプタマーを検出する際に有用なツールとなり得る。このような標識されたアプタマーは、前記第３態様の脳循環障害検出キットにおいて脳循環障害検出マーカーを検出するアプタマーとしても利用できる。
【００７７】
アプタマーは、いずれか一の標的タンパク質を標的分子として、当該分野で公知の方法により作製することができる。例えば、SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)法を用いて試験管内選別により作製してもよい。SELEX法とは、ランダム配列領域とその両端にプライマー結合領域を有する多数のRNA分子によって構成されるRNAプールから標的分子に結合したRNA分子を選択し、回収後にRT-PCR反応によって増幅した後、得られたcDNA分子を鋳型として転写を行い、それを次のラウンドのRNAプールにするという一連のサイクルを数〜数十ラウンド繰り返して、標的分子に対して、より結合力の強いRNAを選択する方法である。ランダム配列領域とプライマー結合領域の塩基配列長は特に限定はしない。一般的にランダム配列領域は、20〜80塩基、プライマー結合領域は、それぞれ15〜40塩基の範囲である。標的分子への特異性を高めるためには、標的分子に類似する分子とRNAプールとを混合し、その分子と結合しなかったRNA分子からなるプールを用いればよい。以上の方法によって最終的に得られたRNA分子をVHSV結合性RNAアプタマーとして利用する。なお、SELEX法は、公知の方法であり、具体的な方法は、例えば、Panら（Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, U.S.A.92: 11509-11513）に準じて行えばよい。
【００７８】
ペプチドアプタマーとは、アミノ酸で構成されるアプタマーで、抗体と同様に、特定の標的分子の表面構造を認識して、特異的に結合する1〜6kDのペプチド分子である。ファージディスプレイ法や細胞表層ディスプレイ法を用いて製造することができる。ペプチドアプタマーの製造法は、当該分野で公知の方法に基づいて作製すればよい。例えば、Whaley,S.R., et al., 2000, Nature, 405, 665-668を参照することができる。
【００７９】
（３）低分子化合物
本明細書において「低分子化合物」は、分子量1万以下の化合物であって、標的物質に結合し、その機能を特異的に抑制する作用を持つリガンド分子をいう。通常は化学物質のみが該当するが、本明細書では、抗体又はアプタマー以外のペプチド分子、及び核酸アプタマー以外の核酸分子も包含する概念とする。
【００８０】
低分子化合物の種類は、特に限定しない。標的物質に対して抑制作用を有する限り、いかなる種類であってもよい。例えば、配列番号１０で示すLox-1の場合、化学物質であるPLAzPC、ginkgolide B、Spiro、kappa-carragreenan、resveratol、pterostibene、polyinosonic acid等や、ペプチドであるAngiotensin (1-7)等が、受容体であるLox-1のアンタゴニストになることから、標的物質がLox-1の場合には、これらのいずれも本明細書における低分子化合物となり得る。
【００８１】
４−３．効果
本発明のアポトーシス抑制剤は、脳循環障害検出マーカーの機能を抑制することによって、細胞、特にグルタミン酸の神経毒性やサイトカイン等の炎症性物質によって傷害を受けた神経細胞のアポトーシスを抑制することができる。
【００８２】
本発明のアポトーシス抑制剤によれば、脳神経細胞のアポトーシスに起因する疾患、例えば、HIE（新生児HIEを含む）、パーキンソン病やアルツハイマー病の進行抑制剤になり得る。
【００８３】
５．脳循環障害抑制剤
５−１．概要
本発明の第５の態様は、脳循環障害抑制剤である。本発明の脳循環障害抑制剤は、前記第４態様に記載のアポトーシス抑制剤を有効成分として包含し、新生児HIEのような脳循環障害の発症又はその進行を抑制することができる医薬組成物である。
【００８４】
５−２．構成
５−２−１．有効成分
本発明の脳循環障害抑制剤は、前記第４態様に記載のアポトーシス抑制剤を有効成分として包含する。ここで、本発明の脳循環障害抑制剤は、第４態様に記載の異なる二以上のアポトーシス抑制剤を含むことができる。
【００８５】
脳循環障害抑制剤に配合される第４態様に記載のアポトーシス抑制剤の含有量は、アポトーシス抑制剤の種類及び／又はその有効量、脳循環障害の種類、薬物組成物の剤形、並びに後述する担体の種類によって異なるため、それぞれの条件を勘案して適宜定めればよい。
【００８６】
本明細書において「有効量」とは、脳循環障害抑制剤においてアポトーシス抑制剤が有効成分としての機能を発揮する上で必要な量であって、かつそれを適用する生体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量をいう。この有効量は、被験体の情報、投与経路、及び投与回数等の様々な条件によって変化し得る。
【００８７】
本明細書において「被験体の情報」とは、脳循環障害抑制剤を適用する生体の様々な個体情報であって、例えば、全身の健康状態、疾患・病害に罹患している場合にはその進行度や重症度、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性、併用薬物の有無及び治療に対する耐性等を含む。例として、脳循環障害が新生児HIEであれば、生後経過時間、HIEの進行度や重症度等に基づいて決定される。最終的な有効量、及びそれに基づいて算出される１回又は１日あたりの適用量は、前記被験体の情報等に基づいて、医師、又は獣医師等の判断によって決定される。
【００８８】
５−２−２．担体
本発明の脳循環障害抑制剤は、必要に応じて薬学的に許容可能な単体を包含し得る。担体は、主として脳循環障害抑制剤の製剤化や投与を容易にし、また剤形及び薬剤効果を維持するために用いられるものである。
【００８９】
「薬学的に許容可能な担体」とは、ヒトをはじめとする動物に対して、副作用等の有害な影響がないか又は非常に小さいことから製剤技術分野において通常使用し得る溶媒及び／又は添加剤をいう。
【００９０】
製剤技術分野において通常使用し得る溶媒には、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。これらは、殺菌されていることが望ましく、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。
【００９１】
また、製剤技術分野において通常使用し得る添加剤には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤等が挙げられる。
【００９２】
賦形剤としては、例えば、糖（例えば、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム)、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、カオリン、ケイ酸、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００９３】
結合剤としては、例えば、デンプン糊、シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック及び／又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００９４】
崩壊剤としては、例えば、デンプン、乳糖、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド又はそれらの塩が挙げられる。
【００９５】
充填剤としては、例えば、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が挙げられる。
【００９６】
乳化剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが挙げられる。
【００９７】
流動添加調節剤及び滑沢剤としては、例えば、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが挙げられる。
【００９８】
本発明の薬学的に許容可能な担体は、上記の他、必要に応じて、等張化剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤（例えば、第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウム）、増量剤、pH調整剤、保湿剤（例えば、グリセリン、デンプン）、吸着剤（例えば、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸）、崩壊抑制剤（例えば、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油）、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤、無痛化剤等を含むこともできる。
【００９９】
５−３．脳循環障害抑制剤の剤型
脳循環障害抑制剤の剤型は、その投与方法によって異なり、また処方条件に応じて適宜選択される。投与方法については後述するが、通常は経口投与及び非経口投与に大別することができる。
【０１００】
経口投与に適した剤型としては、例えば、錠剤、糖衣剤、丸剤、カプセル剤、ドロップ剤、舌下剤、末剤、散剤、顆粒剤、液剤、トローチ剤等を挙げることができる。さらに錠剤は、必要に応じ、当該分野で公知の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠又は多層錠とすることができる。
【０１０１】
非経口剤に適した剤型としては、例えば、注射剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、点鼻剤、クリーム剤、粉剤、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、硬膏剤又は座剤等が挙げられる。これらは、組織内投与、局所投与又は経直腸的投与のように、その投与方法に適した剤型にすることができる。
【０１０２】
組織内投与に適した剤型としては、例えば、注射剤を挙げることができる。
【０１０３】
局所投与に適した剤型としては、例えば、液剤、クリーム剤、粉剤、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、硬膏剤、点眼剤又は点鼻剤等を挙げることができる。
【０１０４】
経直腸的投与に適した剤型としては、例えば、坐剤を挙げることができる。
【０１０５】
前記各剤型の形状、大きさについては、いずれも当該分野で公知の剤型の範囲内にあればよく、特に限定はしない。新生児に投与する場合、好ましい方法は注射である。
【０１０６】
注射剤として調製する場合には、第４態様に記載のアポトーシス抑制剤を溶媒で溶解し、好ましくは血液と等張にした希釈剤を用いて当該分野で慣用されている方法により製造することができる。
【０１０７】
５−４．脳循環障害抑制剤の投与方法
本発明の脳循環障害抑制剤は、経口投与、組織内投与（例えば、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与）、局所投与（例えば、経皮投与）又は経直腸的投与で投与することができる。上記の脳循環障害抑制剤は、これらの投与方法に適した剤型で投与されることが好ましい。例えば、経口投与用製剤であれば、固形、粉末又は液剤の用量単位で投与することができる。
【０１０８】
組織内投与の場合、皮下投与、筋肉内投与又は静脈内投与等のいずれの方法も使用できる。血流を介した投与が好ましい。それ故、好ましい投与方法は注射である。特に新生児HIEに投与する場合に注射による投与方法は好ましい。注射の場合、注入部位は特に限定しない。例えば、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、関節内、骨髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、腸内又は舌下等が挙げられる。好ましくは、静脈内注射又は動脈内注射等の血管内への注射である。血流を介して本発明の脳循環障害抑制剤を直ちに脳を含む全身に行き渡らせることが可能であり、また比較的侵襲性が低く、被験体に与える負担が小さいからである。
【０１０９】
５−５．効果
本発明の脳循環障害抑制剤によれば、低体温療法等で用いる特殊な装置や設備を必要とせず、患者に対して早期に施行が可能であり、脳循環障害の発症及び進行を簡便かつ効率的に抑制することができる。
【０１１０】
[実施例]
１．新生仔HIE、低体温療法、及び新生仔HIE治療の各モデル動物の作製
Riceらの方法（Rice JE 3rd, et al., 1981, Ann Neurol. 9(2):131-41）に従って、生後7日齢のSprague-Dawley（SD）ラット（CLEA Japan Inc.）を使用し、低酸素性虚血性脳症群（HIE群）、低体温療法群（HT群）のモデルラット、及び本発明の脳循環障害抑制剤によるHIE治療群（HIE＋抗LOX-1抗体群）ラットを作製した。対照用としてコントロール群（CTL群）ラット及びPBS群（HIE＋PBS群）ラットを作製した。各群の作製概念図を図１に示す。
【０１１１】
新生仔HIEモデル（HIE群）作成のための低酸素・虚血負荷（hypoxic-ischemic insult: HI負荷）は、前記新生仔220匹に麻酔後、片側性頸動脈結紮を行うため頸部正中に切開を入れ、左総頸動脈を同定、二重結紮し、結紮間にて動脈を切断した。2時間の母仔飼育後、新生仔HIEモデルのための低酸素・虚血負荷（hypoxic-ischemic insult: HI負荷）として8％の低酸素状態に2時間保持した。HI負荷の間、全てのラットの体温を36℃に保持した。体温は、一実験の中で無作為に選ばれた一匹のラットで、直腸温にてモニターし、ヒートマットを利用した体温コントローラー（ACT-101B, Unique Medical）によって管理した。CTL群のラットは生後7日齢に体温を36℃に3時間保ち、その他の手術や治療は行わなかった。HIE群のラットは、生後7日齢にHI負荷を施したのち、体温を36℃で3時間保持し、母親のもとに返した。HT群のラットは生後7日齢にHI負荷を施し、速やかに外気温とice packによって体温を28℃に冷却し、体温を28℃で3時間保持した後に母親のもとに返した。新たな治療薬として、抗LOX-1中和抗体（R&D Systems）を用いた。各種治療群では、生後7日齢にHI負荷を施し、HI負荷直後から治療を開始し、同時に体温を36℃で3時間保持してから母親のもとに返した。抗LOX-1中和抗体は、PBSに溶き、6μg/kgあるいは60μg/kgの用量で腹腔内投与した。
【０１１２】
LOX-1(Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1)は、oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL)の受容体として同定されたが（Sawamura T, et al., 1997, Nature. 386(6620):73-77.）、そのリガンドにはox-LDL、アポトーシス細胞、C-reactive protein (CRP)など様々なものがあり、angiotensin II、CRP、interleukin-1β、oxidant speciesなど様々なストレスにて発現が誘導される。粥状硬化症において、LOX-1の活性化は血管内皮細胞のアポトーシス・機能不全、血管内皮細胞への単球の接着、血管平滑筋細胞の増殖・アポトーシス、マクロファージの泡沫細胞形成、血小板の凝集を引き起こすことが知られている（Mehta JL, et al., 2006, Cardiovasc Res. 69(1):36-45；Chen XP, et al., 2007, Cardiovasc Drug Rev. 25(2):146-161；Dunn S, et al., 2008, Biochem J. 409(2):349-355；Navarra T, et al., 2010, J Atheroscler Thromb. 17(4):317-331；Yan M, et al., 2011, Cardiovasc Drugs Ther. 25(5):451-459. doi: 10.1007/s10557-011-6342-4；Xu S, et al., 2013, Cell Mol Life Sci. 70(16):2859-2872. doi: 10.1007/s00018-012-1194-z.）。Lox-1は、表１に示した本発明の脳循環障害検出マーカー及びアポトーシス抑制剤の一つであり、本実施例において、その効果を示す例として使用した。対照としてPBS治療群を作り、PBSを0.1mL/回にて腹腔内投与した。それぞれ、ラットが屠殺されるまで最大72時間、1日2回投与された。ラットは屠殺するまで12時間毎の明暗サイクルの部屋で管理した。
【０１１３】
２．脳組織の準備
ラットはHI、負荷後3、6、24、48、及び72時間に麻酔下で経心室的にリン酸緩衝食塩水（phosphate buffer saline : PBS, pH 7.4）又は4％パラフォルムアルデヒドで十分に灌流後、速やかに脳を摘出した。
【０１１４】
病理組織学的解析のために、4％パラフォルムアルデヒドで灌流後、4℃で24時間4％パラフォルムアルデヒドにて後固定した。その後、エタノールで脱水し、パラフィン包埋した。脳のパラフィンブロックは、ミクロトーム (NS-400, SAKURA, Alphen aan den Rijn) にて冠状方向で厚さ4μmの切片にした後、Nissl染色、TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL)解析、及びin situ hybridizationに使用した。
【０１１５】
発現解析のために、マイクロアレイ解析と定量polymerase chain reaction（PCR）用の脳をPBSにて灌流後、脳下垂体茎の1mm前方で冠状方向に切断した。切断面の後部の左大脳皮質の病巣部を切除し、液体窒素にて凍結後、−80℃にて保存した。全ての手技は、RNase free処置した状態で行った。
【０１１６】
ウェスタンブロットとenzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）用の脳は、PBSにて灌流後、大脳を左右半球に分けて液体窒素にて凍結後、−80℃にて保存した。
【０１１７】
３．梗塞面積の評価
梗塞面積の評価は、Nissl染色で、梗塞側（左）半球の正常な組織面積の合計と健側（右）半球全体の面積を測定し、その比（梗塞側の正常組織面積／健側の面積）を計算して梗塞面積の評価に使用した。面積の測定はImage Jソフトにて行った。
【０１１８】
４．アポトーシスの評価
アポトーシスの評価は、海馬・視床レベルの切片においてTUNEL解析にて行った。TUNEL解析は、ApopTag Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit (Millipore)を使用し、プロトコールに従って染色を行った。また、神経細胞でのアポトーシスを確認するため、抗NeuNマウス抗体 (Millipore)にて二重染色した。二重染色においては、蛍光標識抗digoxigenin抗体反応後、PBSにて洗浄し、2% bovine serum albumin（BSA）in PBSにてブロッキングした。1000倍希釈の抗NeuNマウス抗体と4℃で一晩反応させ、二次抗体として蛍光標識抗マウスIgG抗体と室温で60分間反応させた後にDAPI染色を行った。染色した切片の写真は、蛍光顕微鏡（BX51 ; Olympus）にて200倍率の拡大にて撮影した。1x1mm2に観察されるTUNEL陽性細胞とDAPI陽性細胞を数え、その比（TUNEL陽性細胞数／DAPI陽性細胞数）を計算した。これを梗塞側大脳新皮質4か所で行い、その平均値を計算し、アポトーシスの評価を行った。
【０１１９】
５．マイクロアレイと定量PCRによる遺伝子発現解析
RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を使用し、−80℃に保存されていた梗塞側大脳皮質のサンプルから総RNAを抽出した。DNase I（QIAGEN）にてDNAを分解処理した。NanoDrop (Thermo Fisher Scientific Inc.)にて、抽出した総RNAのRNA濃度を測定した。
【０１２０】
マイクロアレイ解析は、HI負荷後3時間のラットを用いて行った。2匹のラットから別々に抽出した総RNAを等量ずつ混合し、1つのサンプルとし、各群2サンプルずつ準備した。Ambion WT Expression Kit及びGeneChip WT Terminal Labeling Kit and Controls Kit（Affymetrix, Santa Clara）を使用し、添付のプロトコール通りに解析を行った。各群で2サンプルの平均値を計算し、群間の発現量の比較を行った。HI負荷による遺伝子発現の変化は3倍以上の上昇、又は1/2以下の低下を有意な変化とした。その結果、HI負荷前後で発現が有意に変化する12種類の遺伝子を単離した。これらの遺伝子を表２に示す。
【０１２１】
【表２】
2020072701.tif 000003
【０１２２】
６．In situ hybridization
遺伝子発現解析によって治療ターゲットの候補となったLox-1(又はOlr1）の発現部位を同定するために、in situ hybridizationを行った。PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche)を使用して、Lox-1のプライマーセット（forward(F)プライマー: 配列番号２２；reverse(R)プライマー:配列番号２３）を用い、PCRにてテンプレートDNAを増幅し、digoxigenin（DIG）に標識したプローブを作成した。海馬・視床レベルの冠状断のパラフィン切片を脱パラフィン後、4％パラフォルムアルデヒドにて20分間再固定を行った。Tris-buffered saline（TBS, pH 7.5）にて洗浄後、200mM HClにて10分間タンパク変性を行った。TBSで洗浄後、非特異的バックグラウンドを減らすため、0.5%無水酢酸を含む100mM Tris（pH 8.0）にて10分間処理した。TBSにて洗浄後、プロテナーゼK溶液（2mM CaCl2、20μg/mLプロテナーゼK inTBS）にて37℃、20分間処理し、洗浄、反応停止後にエタノールにて脱水した。その後、切片とプローブを55℃、16時間ハイブリダイズさせた。洗浄後、10% BSA in TBSにてブロッキングを行い、アルカリフォスファターゼ標識の抗DIG抗体と60分間反応させ、4-nitro blue tetrazolium chloride(NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate（BCIP）にて発色させた。全ての手技は、ヌクレアーゼフリーの状態で行った。
【０１２３】
７．ウェスタンブロットとELISA
低体温療法及び新たな治療法の分子動態を調べるため、梗塞側半球でのアポトーシス、酸化ストレス、tight junction proteins (TJPs)の量的評価をウェスタンブロットとELISAによって行った。梗塞側の半球全体を組織溶解液（50mM Tris-HCl, pH7.4, 0.15M NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 1% deoxycholic acid）の中で、Astrason Ultrasonic Processor XL (Misonix)を使用して溶解し、タンパク質を抽出した。BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc.)を用いて、抽出液のタンパク質濃度を測定した。
【０１２４】
ウェスタンブロットでは、sodium dodecyl sulfate (SDS)ポリアクリルアミドゲル（12％）に各レーン20μgずつのタンパク質をのせ、125Vで電気泳動後にポリビニリデンジフルオリド膜に2mA/cm2、1時間にて転写した。5%スキムミルクin PBS-Tweenにて37℃、20分間のブロッキング後、ポリビニリデンジフルオリド膜を4℃で一晩、一次抗体と反応させた。二次抗体（5000倍希釈の抗ウサギIgG抗体）と室温で60分間反応後、膜上の目的タンパク質はECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare)にて検出した。一次抗体として、抗active-caspase 3ウサギ抗体（1000倍希釈）（Sigma-Aldrich Corporate）、抗occludinウサギ抗体（250倍希釈）（Zymed Laboratories Inc.）、抗ZO-1ウサギ抗体（500倍希釈）（Zymed Laboratories Inc.）、抗Gapdhウサギ抗体（1000倍希釈）（Abcam）を用いた。特異的バンドを検出後、Image Quant TL (GE Healthcare)にて相対的発現量を評価した。Gapdhをレファランスタンパクとして補正を行った。結果を図５に示す。
【０１２５】
Malondialdehyde（MDA）の量的評価を行うために、Rat MDA ELISA Kit (CUSABIO)を使用し、プロトコール通りにELISAを行った。MDAレベルはサンプルのタンパク質濃度にて補正した。全ての検体は二重に検出を行い、その平均値を用いた。
【０１２６】
８．脳浮腫の評価
脳浮腫の評価として、脳水分率の評価を行った。HI負荷後24、48、72時間にラットをジエチルエーテル吸入にて麻酔し、速やかに脳を取り出した。直後に左右大脳半球を切断し、それぞれ重量を測定した（乾燥前重量）。その後、オーブンにて85℃で72時間、脳を乾燥させ、左右半球それぞれの重量を測定した（乾燥後重量）。各半球で脳水分率を｛（乾燥前重量−乾燥後重量）／（乾燥前重量）｝として計算し、健側半球を対照として、梗塞側半球／健側半球の比を算出した。この比を脳浮腫の評価に使用した。
【０１２７】
９．統計解析
全てのデータは平均値±標準偏差で表した。Statcel 2（OMS Publication）を用いて、多群間の比較にはanalysis of variance（ANOVA）解析を、2群間の比較にはt検定又はMann-Whitney's U検定を行った。p＜0.05を有意差とした。
【０１２８】
１０.結果
上記実施例の結果を以下に示す。
【０１２９】
図２に、in situ hybridizationによるLOX-1の発現部位を示す。Ｂ図から、LOX-1は大脳皮質の神経細胞で発現していることが示された。
【０１３０】
図３に各群のNissl染色した冠状断面図を示す。破線枠で囲んだ梗塞側左半球（L)の傷害組織の面積は、HIE群では左半球の大部分を占めるが、このHIE群に本発明の脳循環障害抑制剤の一つである抗LOX-1抗体を投与したHIE＋抗LOX-1抗体群では、傷害組織の面積が減少した。
【０１３１】
図４に各群のTUNEL染色した脳梗塞側左半球の細胞を示す。アポトーシスを生じたTUNEL陽性細胞は、図２のNissl染色の結果と同様にHIE群に本発明の脳循環障害抑制剤の一つである抗LOX-1抗体を投与したHIE＋抗LOX-1抗体群で減少した。
【０１３２】
図５は、アポトーシス誘導タンパク質であるactive caspase 3の発現量を評価した結果である。HIE群で観察されたHI負荷48時間、及び72時間後のアポトーシス誘導タンパク質の増加は、抗LOX-1抗体の投与によって有意に抑制された。
【０１３３】
図３〜５の結果は、本発明の脳循環障害抑制剤が新生仔HIEのような脳循環障害の抑制剤として有効であることを示している。
【０１３４】
図６は、右脳水分率に対する脳梗塞側左脳水分率の脳水分率比を示す。HIE群ではHI負荷48時間後に左脳水分率が増加しているが、この増加は、抗LOX-1抗体の投与によって有意に抑制された。この結果は、本発明の脳循環障害抑制剤が脳循環障害による脳浮腫の発生を抑制できることを示している。
【図１】
2020072701.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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