(57)【要約】【課題】ＣＢ１受容体抗原結合タンパク質、例えば、抗体及びかかるＣＢ１受容体抗体の使用方法を提供すること。【解決手段】ＣＢ１受容体抗体は、ＣＢ１受容体に対する拮抗的抗体を含んでよく、さまざまな健康状態の治療に使用してよい。健康状態には、肥満または糖尿病またはＣＢ１受容体の拮抗により利益を受けるあらゆる疾患を含むことができる。実施形態１は、配列番号１に特異的に結合する、本質的に配列番号４及び配列番号５からなる抗原結合タンパク質である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトカンナビノイド受容体１（ＣＢ１受容体）に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその結合断片であって、該抗体またはその結合断片が、ｈＣＢ１受容体のＥＣ２ドメイン内のエピトープに結合し、受容体活性を拮抗する、モノクローナル抗体またはその結合断片。
【請求項２】
前記ｈＣＢ１受容体の前記ＥＣ２ドメインが、アミノ酸配列ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥを含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその結合断片。
【請求項３】
前記抗体またはその結合断片が、前記ＥＣ２ドメインのグルタミン酸（Ｅ）およびヒスチジン（Ｈ）残基を含むエピトープに結合する、請求項２に記載のモノクローナル抗体またはその結合断片。
【請求項４】
前記抗体またはその結合断片が、マウスＣＢ１受容体に結合しない、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその結合断片。
【請求項５】
前記抗体またはその結合断片が、ｈＣＢ１受容体介在性のリガンド結合を阻害する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその結合断片。
【請求項６】
前記抗体またはその結合断片が、前記ｈＣＢ１受容体のＧタンパク質シグナル伝達を拮抗する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその結合断片。
【請求項７】
前記抗体またはその結合断片が、ｈＣＢ１受容体に対して２００ｎＭ未満の結合親和性を有する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその結合断片。
【請求項８】
前記抗体またはその結合断片が、ｃＡＭＰアッセイにおいて１００ｎＭ以下のＥＣ５０を有する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその結合断片。
【請求項９】
前記抗体またはその結合断片が、ｃＡＭＰアッセイにおいて５０ｎＭ以下のＥＣ５０を有する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその結合断片。
【請求項１０】
前記抗体またはその結合断片が、キメラ抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその結合断片。
【請求項１１】
前記抗体またはその結合断片が、ヒト化抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその結合断片。
【請求項１２】
前記抗体またはその結合断片が、ヒト抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその結合断片。
【請求項１３】
前記抗体またはその結合断片が、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３で指定される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域と、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３で指定されるＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含み、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３が、それぞれ配列番号１７、１８、および１９の配列を有し、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３が、それぞれ配列番号２０、２１、および２２の配列を有する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその結合断片。
【請求項１４】
前記抗体またはその結合断片が、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号３７、または配列番号３８から選択される配列に少なくとも９５％同一である重鎖と、配列番号５、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、または配列番号３６から選択される配列と少なくとも９５％同一である軽鎖とを含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその結合断片。
【請求項１５】
請求項１に記載の抗体またはその結合断片を含む、ｈＣＢ１受容体の活性の阻害を必要とする被検者におけるｈＣＢ１受容体の活性を阻害するための組成物。
【請求項１６】
前記被検者が代謝性障害を有する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記代謝性障害が、糖尿病または肥満である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の抗体またはその結合断片を含む、代謝パラメータの改善を必要とする被検者における代謝パラメータを改善するための組成物であって、該組成物が、該被験者に投与され、１以上の代謝パラメータが、投与後に該被験体において改善される、組成物。
【請求項１９】
前記改善された代謝パラメータが、血漿グルコース濃度の低下、インスリン濃度の低下、トリグリセリド濃度の低下、ＨｂＡ１ｃの低下、腹腔内肝脂肪の低下、血圧低下、アディポネクチン上昇、ＨＤＬ上昇、コレステロール上昇、またはエネルギー消費量の増加から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年６月２６日に提出したＵ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．６１／８３９,４５８号の利益を主張するものであり、該出願は、参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、電子フォーマットの配列表とともに提出されている。かかる配列表は、Ａ-１８３５-ＷＯ-ＰＣＴ＿ＳＥＱ．ｔｘｔというファイル名で２０１４年６月２５日に作成され、サイズは９９，６８０バイトである。電子フォーマットの配列表情報は、それを参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、ＣＢ１受容体抗原結合タンパク質、例えば、抗体、及びＣＢ１受容体抗体の使用方法に関する。ＣＢ１受容体抗体は、カンナビノイド受容体ＣＢ１のシグナル伝達を拮抗する抗体を含んでよい。
【背景技術】
【０００４】
ＣＢ１受容体（カンナビノイド受容体１、遺伝子名Ｃｎｒ１）は、Ｇｉ共役型Ｇタンパク質受容体であり、ＣＮＳ及び末梢神経系において広く発現する。ＣＢ１受容体をアゴニスト刺激するとアデニリシクラーゼ（ａｄｅｎｙｌｙ  ｃｙｃｌａｓｅ）活性が抑制され、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼが活性化される。ＣＢ１受容体は、ヒト、マウス及びラットにおいて高度に保存されている。
【０００５】
ＣＢ１受容体は、哺乳類の脳内に最も多量に広く分布しているＧタンパク質共役型受容体の一種である。これらの受容体は、脂肪、肝臓、筋肉及び消化管などの末梢組織にも見られる。
【０００６】
ＣＢ１受容体の内因性アゴニストにはアナンダミド及び２-アラキドノイルグリセロールを含むことができる。外因性のアゴニストにはΔ９-テトラヒドロカンナビノールを含むことができる。リモナバン（ｒｉｍｏｎａｂａｎｔ）またはタラナバン（ｔａｒａｎａｂａｎｔ）などの低分子のアンタゴニストまたはインバースアゴニスト（同義で使用する）は、体重を減少させ、代謝パラメータの改善、例えば、血漿グルコース濃度及びインスリン濃度の低値の改善をもたらすことが示されている。
【０００７】
残念なことに、これらの低分子アンタゴニストは、ＣＮＳへの有害作用があることも示されている。例えば、ＣＢ１受容体に結合する、低分子ＣＢ１受容体アンタゴニスト／インバースアゴニストであるリモナバン（ｒｉｍｏｎａｂａｎｔ）により、複数の臨床試験において不安、うつ病、及び自殺念慮の発生率が増加したことが報告されている（ＮＤＡ（新薬承認申請）２１-８８８、ＦＤＡ報告資料（Ｂｒｉｅｆｉｎｇ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ
）、２００７年６月１３日）
脳への浸透性が低い低分子アンタゴニスト（例えば、ＡＭ６５４５及びＪＤ５０３７）は、マウスにおいて、食事摂取と体重増加を抑え、複数の代謝パラメータを改善させることが報告されている（Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０：２９５３〜６６，２０１０；Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  １６：１〜１３，２０１２）。末梢拘束性の別の低分子が記載されている（ＵＳ２０１１／０１４４１５７）。
ＣＢ１アンタゴニストのプラスの代謝作用を、末梢受容体により媒介させることが可能である。したがって、末梢に作用する高分子なら不成功であった低分子治療よりも有効かつ安全であり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１／０１４４１５７号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０：２９５３〜６６，２０１０
【非特許文献２】Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  １６：１〜１３，２０１２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書に開示する、ＣＢ１アンタゴニスト抗体は、これまでに同定された唯一の高分子アンタゴニストであると考えられる。さまざまなグループによる低分子アンタゴニストについての記載があるが、ＣＢ１アンタゴニスト抗体の場合は、例えば、ＣＮＳへ浸透しない、及び、クリアランス減少による投与回数の減少といった薬物動態特性が異なっている、などの点で低分子アンタゴニストとは異なっている。
【００１１】
本発明は、ＣＢ１受容体抗原結合タンパク質及びその断片に関する。ＣＢ１受容体に結合するＣＢ１受容体抗原結合タンパク質及びその断片は、拮抗的に作用する？ＣＢ１受容体抗原結合タンパク質であり得る。さまざまな実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体である。本明細書に記載する抗原結合タンパク質の使用も提供する。
【００１２】
本開示では、本発明のさまざまな実施形態を提供する。
【００１３】
実施形態１は、配列番号１に特異的に結合する、本質的に配列番号４及び配列番号５からなる抗原結合タンパク質である。別の関連実施形態は、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列で構成されても、またはかかる配列を含んでもよい。
【００１４】
実施形態２は、配列番号１への結合が、ＧＴＰ-Ｅｕアッセイ、エクオリンアッセイま
たはｃＡＭＰアッセイで測定した場合のＧタンパク質シグナル伝達を拮抗する、実施形態１に記載の抗原結合タンパク質である。
【００１５】
実施形態３は、前記抗原結合タンパク質がモノクローナル抗体またはその断片である、実施形態１に記載の抗原結合タンパク質である。
【００１６】
実施形態４は、前記抗原結合タンパク質がマウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体または多重特異性抗体である、実施形態１に記載の抗原結合タンパク質である。
【００１７】
実施形態５は、抗原結合タンパク質が、図１に示すようにヒトＣＢ１受容体のＥＣ２ドメイン領域に結合する、実施形態１に記載の抗原結合タンパク質である。正確なＥＣ２ドメインを、アミノ酸の数を多く、または少なくしたさまざまな実施形態で表されてよい。
【００１８】
実施形態６は、抗原結合タンパク質が配列番号１のアミノ酸ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥに特異的に結合する、実施形態５に記載の抗原結合タンパク質である。
【００１９】
実施形態７は、抗原結合タンパク質が、アミノ酸配列ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥの少なくとも１５アミノ酸に結合する、実施形態６に記載の抗原結合タンパク質である。
【００２０】
実施形態８は、抗原結合タンパク質が、アミノ酸配列ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥの少なくとも１０アミノ酸に結合する、実施形態７に記載の抗原結合タンパク質である。
【００２１】
実施形態９は、抗原結合タンパク質が、ｃＡＭＰアッセイでのＥＣ５０が２５０ｎＭ未満である、実施形態１に記載の抗原結合タンパク質である。
【００２２】
実施形態１０は、抗原結合タンパク質が、ｃＡＭＰアッセイでのＥＣ５０が１００ｎＭ未満である、実施形態９に記載の抗原結合タンパク質である。さまざまな実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＥＣ５０がピコモルの範囲にあってよい。
【００２３】
実施形態１１は、配列番号４及び配列番号５との同一性が少なくとも９９％である抗原結合タンパク質である。
【００２４】
実施形態１２は、配列番号１７〜２２、配列番号３６〜３７または配列番号３６と３８を含む、配列番号１に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。別の関連実施形態は、抗原結合配列のアミノ酸配列で構成されても、または本質的にかかる配列で構成されてもいずれでもよい。
【００２５】
実施形態１３は、配列番号１への結合が、ＧＴＰ-Ｅｕアッセイ、エクオリンアッセイ
またはｃＡＭＰアッセイで測定した場合のＧタンパク質シグナル伝達を拮抗する、実施形態１２に記載の抗原結合タンパク質である。
【００２６】
実施形態１４は、前記抗原結合タンパク質がモノクローナル抗体またはその断片である、実施形態１２に記載の抗原結合タンパク質である。
【００２７】
実施形態１５は、前記抗原結合タンパク質がマウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体である、実施形態１４に記載の抗原結合タンパク質である。
【００２８】
実施形態１６は、抗原結合タンパク質が、図１に示すようにヒトＣＢ１受容体のＥＣ２ドメイン領域に結合する、実施形態１２に記載の抗原結合タンパク質である。正確なＥＣ２ドメインを、アミノ酸の数を増減させて表してよい
【００２９】
実施形態１７は、抗原結合タンパク質が配列番号１のアミノ酸ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥに特異的に結合する、実施形態１６に記載の抗原結合タンパク質である。
【００３０】
実施形態１８は、抗原結合タンパク質が、アミノ酸配列ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥの少なくとも１５アミノ酸に結合する、実施形態１７に記載の抗原結合タンパク質である。
【００３１】
実施形態１９は、抗原結合タンパク質が、アミノ酸配列ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥの少なくとも１０アミノ酸に結合する、実施形態１８に記載の抗原結合タンパク質である。
【００３２】
実施形態２０は、抗原結合タンパク質が、ｃＡＭＰアッセイでのＥＣ５０が３００ｎＭ未満である、実施形態１２に記載の抗原結合タンパク質である。
【００３３】
実施形態２１は、抗原結合タンパク質が、ｃＡＭＰアッセイでのＥＣ５０が１００ｎＭ未満である、実施形態２０に記載の抗原結合タンパク質である。さまざまな実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＥＣ５０がピコモルの範囲にあってよい。
【００３４】
実施形態２２は、配列番号１７〜２２との同一性が少なくとも９９％である抗原結合タンパク質である。
【００３５】
実施形態２２は、配列番号７と８、配列番号７と１０、配列番号７と１２、配列番号６と１６、配列番号４と１４、配列番号３６と３７、または配列番号３６と３８を含む、配列番号１に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。別の関連実施形態は、抗原結合配列のアミノ酸配列で構成されても、または本質的にかかる配列で構成されてもいずれでもよい。
【００３６】
実施形態２３は、配列番号１への結合が、ＧＴＰ-Ｅｕアッセイ、エクオリンアッセイ
またはｃＡＭＰアッセイで測定した場合のＧタンパク質シグナル伝達を拮抗する、実施形態２２に記載の抗原結合タンパク質である。
【００３７】
実施形態２４は、前記抗原結合タンパク質がモノクローナル抗体またはその断片である、実施形態２２に記載の抗原結合タンパク質である。
【００３８】
実施形態２５は、前記抗原結合タンパク質がマウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体である、請求項２４に記載の抗原結合タンパク質である。
【００３９】
実施形態２６は、抗原結合タンパク質が、図４Ａに示すようにヒトＣＢ１受容体のＥＣ２ドメイン領域に結合する、実施形態２２に記載の抗原結合タンパク質である。正確なＥＣ２ドメインを、アミノ酸の数を増減させて表してよい。
【００４０】
実施形態２７は、抗原結合タンパク質が配列番号１のアミノ酸ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥに結合する、実施形態２６に記載の抗原結合タンパク質である。
【００４１】
実施形態２８は、抗原結合タンパク質が、アミノ酸配列ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥの少なくとも１５アミノ酸に結合する、実施形態２７に記載の抗原結合タンパク質である。
【００４２】
実施形態２９は、抗原結合タンパク質が、アミノ酸配列ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥの少なくとも１０アミノ酸に結合する、実施形態２８に記載の抗原結合タンパク質である。
【００４３】
実施形態３０は、ｃＡＭＰアッセイでのＥＣ５０が３００ｎＭ未満である、実施形態２２に記載の抗原結合タンパク質である。
【００４４】
実施形態３１は、ｃＡＭＰアッセイでのＥＣ５０が１００ｎＭ未満である、実施形態３０に記載の抗原結合タンパク質である。さまざまな実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＥＣ５０がピコモルの範囲にあってよい。
【００４５】
実施形態３２は、実施形態２２に記載の抗原結合タンパク質の１つと少なくとも９９％同一な抗原結合タンパク質である。
【００４６】
実施形態３３は、実施形態１、１２または２２のいずれか１形態に記載の抗原結合タンパク質をコードする核酸である。
【００４７】
実施形態３４は、実施形態３３の核酸を含む発現ベクターである。
【００４８】
実施形態３５は、実施形態３４のベクターを含む宿主細胞である。
【００４９】
実施形態３６は、細胞が真核細胞または原核細胞である、実施形態３５の宿主細胞である。
【００５０】
実施形態３７は、真核細胞は哺乳類の細胞である、実施形態３６の宿主細胞である。
【００５１】
実施形態３８は、抗原結合タンパク質の製造方法であり、実施形態３７の宿主細胞を、核酸が発現して抗原結合タンパク質が産生されるような好適な条件下で培養することを含む。
【００５２】
実施形態３９は、宿主細胞の培養物から抗体を回収することをさらに含む、実施形態３８の方法である。
【００５３】
実施形態４０は、実施形態１、１２、２２または４４のいずれか１形態に記載の抗原結合タンパク質、及び薬理学的に許容される担体、希釈剤または添加物を含む組成物である。
【００５４】
実施形態４１は、実施形態４０に記載の組成物を投与すること含む、ＣＢ１受容体への拮抗を必要としている患者の治療方法である。
【００５５】
実施形態４２は、患者を治療することにより体重減少または代謝パラメータの改善がもたらされる、実施形態３２に記載の方法である。
【００５６】
実施形態４３は、改善される代謝パラメータが、血漿グルコース濃度の低下、インスリン濃度の低下、トリグリセリド濃度の低下、ＨｂＡ１ｃの低下、腹腔内脂肪と肝脂肪の低下、血圧の低下、アディポネクチンの上昇、ＨＤＬ、コレステロールの上昇またはエネルギー消費量の増加である、実施形態４２の方法である。
【００５７】
実施形態４４は、配列番号１に特異的に結合し、ＧＴＰ-Ｅｕアッセイ、エクオリンア
ッセイまたはｃＡＭＰアッセイで測定した場合にＧタンパク質のシグナル伝達を拮抗する抗原結合タンパク質である。
【００５８】
実施形態４５は、前記抗原結合タンパク質がモノクローナル抗体またはその断片である、実施形態４４に記載の抗原結合タンパク質である。
【００５９】
実施形態４６は、前記抗原結合タンパク質がマウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体または多重特異性抗体である、実施形態４５に記載の抗原結合タンパク質である。
【００６０】
実施形態４７は、抗原結合タンパク質がヒトＣＢ１受容体のＥＣ２ドメイン領域に結合する、実施形態４４に記載の抗原結合タンパク質である。正確なＥＣ２ドメインを、アミノ酸の数を増減させて表してよい
【００６１】
実施形態４８は、抗原結合タンパク質が配列番号１のアミノ酸ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥに特異的に結合する、実施形態４７に記載の抗原結合タンパク質である。
【００６２】
実施形態４９は、前記抗原結合タンパク質がアミノ酸配列ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥの少なくとも１５アミノ酸に結合する、請求項４８に記載の抗原結合タンパク質である。
【００６３】
実施形態５０は、前記抗原結合タンパク質がアミノ酸配列ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥの少なくとも１０アミノ酸に結合する、請求項４８に記載の抗原結合タンパク質である。
【００６４】
実施形態５１は、ｃＡＭＰアッセイでのＥＣ５０が２５０ｎＭ未満である、実施形態４４に記載の抗原結合タンパク質である。
【００６５】
実施形態５２は、ｃＡＭＰアッセイでのＥＣ５０が少なくとも１００ｎＭ未満である、実施形態５１に記載の抗原結合タンパク質である。さまざまな実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＥＣ５０がピコモルの範囲にあってよい。
【００６６】
当業者には理解されるであろう他の実施形態を本明細書に記載する。さまざまな実施形態を上述したが、本明細書に詳述する実施例及び試験はあくまで例示にすぎないことは当業者には十分理解されよう。本発明の趣旨から逸脱することなくさまざまな修正が可能であることを理解されるべきである。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
本質的に配列番号４及び配列番号５からなる、配列番号１に特異的に結合する、抗原結合タンパク質。
（項目２）
配列番号１への前記結合が、ＧＴＰ-Ｅｕアッセイ、エクオリンアッセイまたはｃＡＭ
Ｐアッセイで測定したＧタンパク質シグナル伝達を拮抗する、項目１に記載の抗原結合タンパク質。
（項目３）
前記抗原結合タンパク質がモノクローナル抗体またはその断片である、項目１に記載の抗原結合タンパク質。
（項目４）
前記抗原結合タンパク質が、マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体または多重特異性抗体である、項目１に記載の抗原結合タンパク質。
（項目５）
前記抗原結合タンパク質がヒトＣＢ１受容体のＥＣ２ドメイン領域に結合する、項目１に記載の抗原結合タンパク質。
（項目６）
前記抗原結合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥに特異的に結合する、項目５に記載の抗原結合タンパク質。
（項目７）
前記抗原結合タンパク質が、アミノ酸配列ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥの少なくとも１５アミノ酸に結合する、項目６に記載の抗原結合タンパク質。
（項目８）
前記抗原結合タンパク質が、アミノ酸配列ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥの少なくとも１０アミノ酸に結合する、項目７に記載の抗原結合タンパク質。
（項目９）
前記抗原結合タンパク質が、ｃＡＭＰアッセイで少なくとも３００ｎＭのＥＣ５０を有する、項目１に記載の抗原結合タンパク質。
（項目１０）
前記抗原結合タンパク質が、ｃＡＭＰアッセイで少なくとも１００ｎＭのＥＣ５０を有する、項目９に記載の抗原結合タンパク質。
（項目１１）
配列番号４及び配列番号５に対し少なくとも９９％の同一性を有する抗原結合タンパク質。
（項目１２）
配列番号１７〜２２、配列番号３６〜３７または３６と３８を含む、配列番号１に特異的に結合する抗原結合タンパク質。
（項目１３）
配列番号１への前記結合が、ＧＴＰ-Ｅｕアッセイ、エクオリンアッセイまたはｃＡＭＰアッセイで測定したＧタンパク質シグナル伝達を拮抗する、項目１２に記載の抗原結合タンパク質。
（項目１４）
前記抗原結合タンパク質が、モノクローナル抗体またはその断片である、項目１２に記載の抗原結合タンパク質。
（項目１５）
前記抗原結合タンパク質が、マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体である、項目１４に記載の抗原結合タンパク質。
（項目１６）
前記抗原結合タンパク質が、ヒトＣＢ１受容体のＥＣ２ドメイン領域に結合する、項目１２に記載の抗原結合タンパク質。
（項目１７）
前記抗原結合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥに特異的に結合する、項目１６に記載の抗原結合タンパク質。
（項目１８）
前記抗原結合タンパク質が、アミノ酸配列ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥの少なくとも１５アミノ酸に結合する、項目１７に記載の抗原結合タンパク質。
（項目１９）
前記抗原結合タンパク質が、アミノ酸配列ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥの少なくとも１０アミノ酸に結合する、項目１８に記載の抗原結合タンパク質。
（項目２０）
前記抗原結合タンパク質が、ｃＡＭＰアッセイで２５０ｎＭ未満のＥＣ５０を有する、項目１２に記載の抗原結合タンパク質。
（項目２１）
前記抗原結合タンパク質が、ｃＡＭＰアッセイで少なくとも２００ｎＭのＥＣ５０を有する、項目２０に記載の抗原結合タンパク質。
（項目２２）
配列番号１７〜２２に対し少なくとも９９％の同一性を有する、配列番号１に特異的に結合する抗原結合タンパク質。
（項目２３）
配列番号７と８、配列番号７と１０、配列番号７と１２、配列番号６と１６、配列番号４と１４、配列番号３６と３７または配列番号３６と３８を含む、抗原結合タンパク質。
（項目２４）
配列番号１への前記結合が、ＧＴＰ-Ｅｕアッセイ、エクオリンアッセイまたはｃＡＭＰアッセイで測定したＧタンパク質シグナル伝達を拮抗する、項目１２に記載の抗原結合タンパク質。
（項目２５）
前記抗原結合タンパク質が、モノクローナル抗体またはその断片である、項目２３に記載の抗原結合タンパク質。
（項目２６）
前記抗原結合タンパク質が、マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体である、項目２５に記載の抗原結合タンパク質。
（項目２７）
前記抗原結合タンパク質が、ヒトＣＢ１受容体のＥＣ２ドメイン領域に結合する、項目２３に記載の抗原結合タンパク質。
（項目２８）
前記抗原結合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥに結合する、項目２７に記載の抗原結合タンパク質。
（項目２９）
前記抗原結合タンパク質が、アミノ酸配列ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥの少なくとも１５アミノ酸に結合する、項目２８に記載の抗原結合タンパク質。
（項目３０）
前記抗原結合タンパク質が、アミノ酸配列ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥの少なくとも１０アミノ酸に結合する、項目２９に記載の抗原結合タンパク質。
（項目３１）
前記抗原結合タンパク質が、ｃＡＭＰアッセイで２５０ｎＭ未満のＥＣ５０を有する、項目２３に記載の抗原結合タンパク質。
（項目３２）
前記抗原結合タンパク質が、ｃＡＭＰアッセイで１００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する、項目３１に記載の抗原結合タンパク質。
（項目３３）
項目２３に記載の抗原結合タンパク質の１つに対する同一性が少なくとも９９％である、抗原結合タンパク質。
（項目３４）
項目１、１２または２２のいずれか一項に記載の前記抗原結合タンパク質をコードする、核酸。
（項目３５）
項目３４に記載の核酸を含む、発現ベクター。
（項目３６）
項目３５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目３７）
前記細胞が、真核細胞または原核細胞である、項目３６に記載の宿主細胞。
（項目３８）
前記真核細胞が、哺乳類の細胞である、項目３７に記載の宿主細胞。
（項目３９）
項目３７に記載の宿主細胞を、核酸が発現して抗原結合タンパク質が産生されるような好適な条件下で培養することを含む、抗原結合タンパク質の製造方法。
（項目４０）
前記抗原結合タンパク質を宿主細胞培養物から回収することをさらに含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
項目１、１２、２２または４５のいずれか一項に記載の前記抗原結合タンパク質及び薬理学的に許容される担体、希釈剤または添加物を含む、組成物。
（項目４２）
項目４１に記載の任意の前記組成物を投与することを含む、ＣＢ１受容体の拮抗を要する患者の治療方法。
（項目４３）
患者の前記治療により体重減少または代謝パラメータの改善がもたらされる、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記改善された代謝パラメータが、血漿グルコース濃度の低下、インスリン濃度の低下、トリグリセリド濃度の低下、ＨｂＡ１ｃの低下、腹腔内肝脂肪の低下、血圧低下、アディポネクチン上昇、ＨＤＬ上昇、コレステロール上昇、またはエネルギー消費量の増加である、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
配列番号１に特異的に結合し、ＧＴＰ-Ｅｕアッセイ、エクオリンアッセイまたはｃＡＭＰアッセイで測定されるＧタンパク質のシグナル伝達を拮抗する、抗原結合タンパク質。
（項目４６）
前記抗原結合タンパク質が、モノクローナル抗体またはその断片である、項目４５に記載の抗原結合タンパク質。
（項目４７）
前記抗原結合タンパク質が、マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体または多重特異性抗体である、項目４５に記載の抗原結合タンパク質。
（項目４８）
前記抗原結合タンパク質が、ヒトＣＢ１受容体のＥＣ２ドメイン領域に結合する、項目４５に記載の抗原結合タンパク質。
（項目４９）
前記抗原結合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥに特異的に結合する、項目４８に記載の抗原結合タンパク質。
（項目５０）
前記抗原結合タンパク質が、アミノ酸配列ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥの少なくとも１５アミノ酸に結合する、項目４９に記載の抗原結合タンパク質。
（項目５１）
前記抗原結合タンパク質が、アミノ酸配列ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥの少なくとも１０アミノ酸に結合する、項目５０に記載の抗原結合タンパク質。
（項目５２）
前記抗原結合タンパク質は、ｃＡＭＰアッセイでのＥＣ５０が２５０ｎＭ未満である、項目４５に記載の抗原結合タンパク質。
（項目５３）
前記抗原結合タンパク質が、ｃＡＭＰアッセイで少なくとも１００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する、項目５２に記載の抗原結合タンパク質。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、ヒト（配列番号１）、マウス（配列番号２）、及びラット（配列番号３）のＣＢ１タンパク質配列のアライメントを示しており、細胞外ループ１及び２（ＥＣ１及びＥＣ２；ＥＣドメイン領域とも言う）の約の位置が、配列上の実線により示されている。図４に示すエピトープマッピング試験に使用する残基は、図１中で黒の陰影で示されており、−ＥＣ１は（Ｒ１８６Ｐ-ヒト配列とマウス／ラット配列との間）並びにＥＣ２では（Ｅ２５８Ｋ-ヒト配列とマウス／ラット配列との間）及び（Ｈ２７０Ｌ−ヒト配列とマウス／ラット配列との間）の位置である。配列上部にある位置番号は便宜上付されているものであり、必ずしもその通りに正確にアライメントする必要はないことに留意すべきである。ヒトとげっ歯類の配列間でさらに相違のある箇所は矢印で示されている。
【００６８】
【図２Ａ】図２Ａ及び２Ｂは、さまざまな抗ＣＢ１抗体の重鎖及び軽鎖のタンパク質配列を比較したものである。重鎖および軽鎖のタンパク質配列のフレームワーク及びＣＤＲ領域におけるいくつかのクローン間でのアミノ酸の相違である。
【図２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂは、さまざまな抗ＣＢ１抗体の重鎖及び軽鎖のタンパク質配列を比較したものである。重鎖および軽鎖のタンパク質配列のフレームワーク及びＣＤＲ領域におけるいくつかのクローン間でのアミノ酸の相違である。
【００６９】
【図３】図３は、ＣＢ１アンタゴニスト抗体１０Ｄ１０の野生型及び変異型のさらなる特性を示す。
【００７０】
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃは、抗体結合部位を提供する上で有用な、ＣＢ１受容体に対してなされた変異を示す。図４Ａは変異体を表す絵図であり、図４ＢはＦＡＣＳ結合データを示し、また、図４Ｃはエクオリンシグナル伝達データを示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｃは、抗体結合部位を提供する上で有用な、ＣＢ１受容体に対してなされた変異を示す。図４Ａは変異体を表す絵図であり、図４ＢはＦＡＣＳ結合データを示し、また、図４Ｃはエクオリンシグナル伝達データを示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、抗体結合部位を提供する上で有用な、ＣＢ１受容体に対してなされた変異を示す。図４Ａは変異体を表す絵図であり、図４ＢはＦＡＣＳ結合データを示し、また、図４Ｃはエクオリンシグナル伝達データを示す。
【００７１】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃは、ｃＡＭＰ（図５Ａ）シグナル伝達アッセイ、エクオリン（図５Ｂ）シグナル伝達アッセイ及びＫｉｎＥｘＡ（図５Ｃ）結合アッセイにおけるＣＢ１アンタゴニスト抗体の活性を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｃは、ｃＡＭＰ（図５Ａ）シグナル伝達アッセイ、エクオリン（図５Ｂ）シグナル伝達アッセイ及びＫｉｎＥｘＡ（図５Ｃ）結合アッセイにおけるＣＢ１アンタゴニスト抗体の活性を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｃは、ｃＡＭＰ（図５Ａ）シグナル伝達アッセイ、エクオリン（図５Ｂ）シグナル伝達アッセイ及びＫｉｎＥｘＡ（図５Ｃ）結合アッセイにおけるＣＢ１アンタゴニスト抗体の活性を示す。
【００７２】
【図６Ａ】図６Ａは、ＧＴＰ-ＥｕアッセイでＣＢ１アンタゴニスト抗体の活性をアナンダミドと比較したものを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、１０Ｄ１０の濃度を変えた場合のＧＴＰ-Ｅｕに及ぼす影響を示す。
【００７３】
【図７】図７は、ＣＢ１アンタゴニスト抗体のさまざまなミュータンズ（ｍｕｔａｎｓ）とＣＢ１活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
ＣＢ１受容体に結合するＣＢ１受容体抗原結合タンパク質（抗体及びその機能的結合断片など）を本明細書に開示する。かかる抗原結合タンパク質は、ＣＢ１受容体に結合し、ＣＢ１受容体がさまざまに機能すること、例えば、受容体活性を拮抗することがないよう防ぐ。ＣＢ１受容体結合タンパク質は、ＣＢ１受容体に結合して、例えば、ｃＡＭＰアッセイ、エクオリンアッセイまたはＧＴＰ-Ｅｕアッセイで測定した場合にシグナル伝達が
起こらないよう防ぐ。
【００７５】
上述の概要は、本発明の態様または実施形態すべてを定義することを意図するものではなく、さらなる態様が他の項にて記載され得る。本文献全体が統一開示として関連していることが意図され、したがって、特徴のその組み合わせが本文献中の同一の文章、段落、または項内に同時に記載されていない場合であっても、本明細書に記載の特徴のあらゆる組み合わせが意図されることを理解されるべきである。
【００７６】
上述に加え、追加態様として、いかなる意味においても、本明細書の特定段落により定義される変形形態より範囲の狭い実施形態はすべて本開示に含めることができる。例えば、ある態様で１つの属としての記載がある場合は、その１つの属のメンバーすべてが個々別々に一実施形態であり得ることを理解されるべきである。また、１つの属または１つの属のメンバーから選択すると記載されている態様は、その属の２以上のメンバーの組み合わせを包含することを理解されるべきである。本明細書中さまざまな実施形態が用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用してさまざまな状況で提示される場合があるが、関連実施形態を用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を使用して記載してもよいことも理解されるべきである。
【００７７】
本明細書の記載は、あくまでも例示及び説明にすぎず、本発明の主張を制限するものではないことが理解されるであろう。本明細書において、単数形を使用することにより、特に具体的に断らない限り、複数形も含まれる。本明細書において、「または（ｏｒ）」の使用により、特に断らない限り、「及び／または」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、並びに他の形の「含む（を含む）」及び「含まれている（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの用語を使用する場合、非限定的であることをいう。また、「要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）」または「構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」などの用語は、特に具体的に断らない限り、ユニットを１つ含んでいる要素及び構成要素、並びにサブユニットを１つ以上含んでいる要素及び構成要素のいずれをも包含する。また、「部（ｐｏｒｔｉｏｎ）」という用語の使用により、部分（ｍｏｉｅｔｙ）の一部または部分（ｍｏｉｅｔｙ）全体を含むことができる。
【００７８】
数値の範囲を記載する場合、記載されている特徴はその範囲内の一数値であると考えられることも理解されるべきである。例えば、「約ｐＨ４〜約ｐＨ６のｐＨ」では、非限定的に、ｐＨ４、４．２、４．６，５．１、５．５など、その数値範囲にあるあらゆる数値が考えられる。さらに、「約ｐＨ４〜約ｐＨ６のｐＨ」は、問題のｐＨがｐＨ４からｐＨ６まで２ｐＨ単位で変動するという意味で解釈されるべきではなく、むしろ溶液のｐＨ値は、２つのｐＨ値の範囲内から選んでよい。
【００７９】
いくつかの実施形態では、用語「約」を使用する場合、記述されている数値の５％、１０％、１５％またはそれ以上が、記述されている数値に対して加算または減算されることを意味する。意図される実変数は文脈から決定可能である。
【００８０】
本明細書で使用する項の題名は、あくまで編成上のものにすぎず、記載されている主題を限定するものとして解釈されないこととする。本明細書で引用する特許、特許出願、論文、書籍、及び条約などを非限定的に含む全資料、または資料の一部は、何らかの目的でそれらを参照することによりその全体が明白に本明細書に取り込まれる。本開示に従い使用する場合、以下の用語は、特に明記しない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００８１】
本明細書で使用する用語「ＣＢ１」とは、ＣＮＳ及び末梢神経系に広く発現するＧｉ共役型Ｇタンパク質受容体であるカンナビノイド受容体１をいう。ＣＢ１受容体の刺激は、アデニリシクラーゼ（ａｄｅｎｙｌｙ  ｃｙｃｌａｓｅ）を抑制し、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼを活性化させることが知られている。ＣＢ１タンパク質配列はヒト、マウス及びラットの間で高度に保存されている。ＣＢ１受容体は、哺乳類の脳内に最も多量に広く分布しているＧタンパク質共役型受容体の一種である。これらの受容体は、脂肪、肝臓、筋肉及び消化管などの他組織にも見られる。
【００８２】
本明細書で使用する場合、抗体または抗原結合性断片は、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
【００８３】
「アゴニスト」とは、ポリペプチド（受容体など）、またはポリヌクレオチドに結合し、特に、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性または発現を刺激する、上昇させる、活性化する、促進する、活性化を増強する、感受性を増強するまたは上方制御する物質をいう。
【００８４】
「アンタゴニスト」とは、ポリペプチド（受容体など）またはポリヌクレオチドに結合し、特に、部分的または完全に刺激を遮断する、結合したポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を低下させる、予防する、活性化を遅らせる、不活性化する、脱感受性にする、または下方制御する物質をいう。アンタゴニストは、特に、受容体の構成的シグナル伝達を低下させ得るようなインバースアゴニストであってもよい。
【００８５】
「抗原結合タンパク質」（“ＡＢＰ”）とは、特定の標的抗原を結合するあらゆるタンパク質をいう。本明細書では、特定の標的抗原はＣＢ１受容体またはその断片もしくは領域であり得る。「抗原結合タンパク質」には、免疫学的に機能的な断片のような抗体及びその結合部分が含まれるが、これらに限定されない。ペプチボディも抗原結合タンパク質の一例である。
【００８６】
「ＣＢ１受容体抗原結合タンパク質」とは、ＣＢ１受容体を結合することができるタンパク質をいう。「ＣＢ１受容体抗原結合タンパク質」は、受容体を結合する「ＣＢ１受容体のアンタゴニスト抗体」であり得る。ＣＢ１受容体抗体はＣＢ１受容体のシグナル伝達を遮断することができる。シグナル伝達を遮断すると、体重減少及び代謝パラメータの改善、例えば、血漿グルコース濃度及びインスリン濃度の低下というような細胞性反応及び生理学的反応の両方が起こり得る。
【００８７】
ＣＢ１タンパク質の「細胞外（ＥＣ）結合領域」は図１に示されているが、これは「細胞外ループ」または「細胞外ドメイン領域」とも呼ばれる。例えば、ＥＣ２ドメイン領域は配列番号１の配列ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥを有すると考えられている。さまざまな実施形態では、ＥＣ２ドメイン領域は、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれにでもさらなる１、２、３、４または５アミノ酸をさらに含んでよい。その他の実施形態では、ＥＣ２ドメイン領域は、配列のアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれにおいてでも１、２、３、４または５アミノ酸少なく有してよい。本明細書に開示する抗体は、上記のあらゆるＥＣ２ドメインに、または配列番号１の配列ＮＣＥＫＬＱＳＶＣＳＤＩＦＰＨＩＤＥまたはこの配列の少なくとも１０もしくは少なくとも１５のアミノ酸に結合してよい。図１に示すように、さまざまな抗体が代替的にＥＣ１ドメイン領域に結合してよい。
【００８８】
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」には、一本鎖ヌクレオチド重合体及び二本鎖ヌクレオチド重合体の双方が含まれる。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはこれらのヌクレオチドの修飾型であり得る。前記の修飾としては、ブロモウリジン誘導体及びイノシン誘導体などの塩基修飾、２’,３’-ジデオキシリボースなどのリボース修飾、並びにホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロジセレノアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアニラダート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）及びホスホロアミダートなどのヌクレオチド間結合が含まれる。
【００８９】
用語「オリゴヌクレオチド」は、２００以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは長さ約１０〜約６０塩基である。その他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さ約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、もしくは約２０ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、例えば、変異遺伝子の構築に使用する場合は、一本鎖または二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、検出法用に放射性標識、蛍光標識、ハプテンまたは抗原性標識などの標識を含むことができる。オリゴヌクレオチドを、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
【００９０】
「単離された核酸分子」は、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくは合成由来、またはそれらをいくつか組み合わせた、ＤＮＡもしくはＲＮＡを意味し、自然界において見られる単離されたポリヌクレオチドをその中にもつポリヌクレオチドの全部または一部と会合していないもの、または自然界においては連結することがないポリヌクレオチドに連結しているものを意味する。本開示のために、特定のヌクレオチド配列「を含む核酸分子」は、完全な染色体を包含していないことを理解されるべきである。特定の核酸配列「を含む」単離された核酸分子は、特定の配列に加え、最高１０、さらには最高２０の他のタンパク質またはそれらの複数部分をコードするコード配列を含むことができる、または記述された核酸配列のコード領域の発現を制御する、機能的に連結された制御配列を含むことができる、及び／またはベクター配列を含むことができる。さまざまな実施形態では、記載の核酸は、「単離された核の（ｎｕｃｌｅｉｃ）分子」であり得る。
【００９１】
他に明記しない限り、本明細書で論じるあらゆる一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向を５’方向と呼ぶ。新生ＲＮＡ転写産物の付加が行われる５’から３’へ向かう方向を転写方向と呼び；ＲＮＡ転写産物の５’末端に５’が対応する、ＲＮＡ転写産物と同一の配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域を「上流配列と呼び」；ＲＮＡ転写産物の３’末端に３’が対応する、ＲＮＡ転写産物と同一の配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域を「下流配列」と呼ぶ。
【００９２】
核酸は、本明細書のさまざまな実施形態に開示する抗原結合タンパク質、例えば、ＣＢ１受容体抗原結合タンパク質または抗ＣＢ１受容体抗体をコードすることができる。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合、「機能的に連結され」ている、と言われる。例えば、プレ配列または分泌リーダーに対するＤＮＡとポリペプチドに対するＤＮＡとが連結しており、そのポリペプチドの分泌に関与する前駆タンパク質として該ポリペプチドが発現すれば、これらは機能的に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーがコード配列に連結しており、配列の転写に影響を与えれば、これらは機能的に連結されており；または、リボソーム結合部位がコード配列に連結しており、翻訳を促進するような位置にあれば、これらは機能的に連結されている。一般に、「機能的に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が互いに近接し、また、分泌リーダーの場合は、配列が隣接しリーディングフェーズ（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位がない場合、合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーを従来の実施方法に従い使用する。
【００９３】
用語「アミノ酸」とは、天然及び／または非天然型アミノ酸を指し、当該技術分野の通常の意味を含む。アミノ酸は、標準または非標準アミノ酸とも言われる。
【００９４】
用語「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、野生型タンパク質、すなわち、天然型の、組換え型ではない細胞により産生されたタンパク質のアミノ酸配列を有する高分子を意味するか；または、遺伝子操作もしくは組換えを行った細胞により産生され得るタンパク質であり、かつ、野生型タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、もしくは野生型配列のアミノ酸の１以上について欠失、付加、及び／もしくは置換を有する分子を含むタンパク質を意味する。かかる用語には、１以上のアミノ酸が、対応する天然型アミノ酸及び重合体の化学的類似体であるアミノ酸重合体も含まれる。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、特に、ＣＢ１受容体抗原結合タンパク質、抗体、または抗原結合タンパク質のアミノ酸の１つ以上について欠失、付加、及び／もしくは置換を有する配列を包含する。用語「ポリペプチド断片」とは、アミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失、及び／または完全長野生型タンパク質と比較した場合に配列内の欠損を有するポリペプチドをいう。このような断片に、野生型タンパク質と比較した場合に修飾のあるアミノ酸を含有させることもできる。さまざまな実施形態では、断片長は約５〜約５００アミノ酸であり得る。例えば、断片長は、少なくとも約５、約６、約８、約１０、約１４、約２０、約５０、約７０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約約４００、または約４５０アミノ酸であり得る。有用なポリペプチド断片としては、結合ドメインを含め、抗体の免疫学的に機能的な断片がある。ＣＢ１受容体-結合抗体の場合、有用
な断片には、ＣＤＲ領域、重鎖及び／もしくは軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の一部、またはそのうち、１、２、３、４、５もしくは６のＣＤＲを含んでいる可変領域のみ等が含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
用語「単離されたタンパク質」は、対象タンパク質が、（１）通常であればともに見られる少なくとも他のいくつかのタンパク質を含んでいない、（２）同一の供給源、例えば、同一種からの他のタンパク質を本質的に含んでいない、（３）異なる種の細胞により発現する、（４）自然界ではともに会合しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質から少なくとも約５０パーセント分離されている、（５）自然界ではともに会合しないポリペプチドと（共有結合または非共有結合的な相互作用により）機能的に会合しているは、または（６）自然界には存在しない、ことを意味する。単離されたタンパク質は、ＣＢ１抗原結合タンパク質または抗体であり得る。典型的に、「単離されたタンパク質」は、試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％またはそれ以上を占め得る。合成由来のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせは、かかる単離されたタンパク質をコードすることができる。さまざまな実施形態では、単離されたタンパク質は、それを治療、診断、予防、調査または他の用途に使用した場合に障害となることが考えられるような、その天然の環境では存在するタンパク質またはポリペプチドまたは他の混入物質を実質的に含まない。単離された「抗原結合タンパク質」または「単離された抗体」は、「単離されたタンパク質」とみなすことができる。さまざまな実施形態では、抗原結合タンパク質は、単離された抗原結合タンパク質または単離された抗体であり得る。
【００９６】
ポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質、または抗体）の「多様体」または「変異体」は、別のポリペプチド配列に比べてアミノ酸配列の１以上のアミノ酸残基に、挿入、欠失及び／または置換がなされているアミノ酸配列を含む。多様体には融合タンパク質が含まれる。
【００９７】
本明細書で使用する場合、一般的な２０種類（標準または天然型）のアミノ酸及びそれらの略語は従来用法に従っている。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ-Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ＆Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照のこと。なお、これは、何らかの目的で参照することにより本明細書に組み込まれる。従来の２０種類のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ-アミノ酸）、α-、α-二置換アミノ酸、Ｎ-アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非従来型アミノ酸のような異形アミノ酸も、本明細書に記載するさまざまな実施形態のポリペプチドの好適な構成要素となり得る。非従来型アミノ酸の例としては、４-ヒドロキシプロリン、γカルボキシグルタミン酸、ε-Ｎ、Ｎ、Ｎ-トリメチルリジン、ε-Ｎ-アセチルリジン、Ｏ-ホスホセリン、Ｎ-アセチルセリン、Ｎ-ホルミルメチオニン、３-メチルヒスチジン、５-ヒドロキシリジン、σ-Ｎ-メチルアルギニン、並びに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４-ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用するポリペプチドの注釈では、標準的な用法及び慣用に従い、左方向はアミノ末端の方向、また右方向はカルボキシ末端の方向である。
【００９８】
保存的アミノ酸置換は、生物系での合成ではなく化学的ペプチド合成により典型的に組み込まれる非天然型アミノ酸残基を包含することができる。これらには、ペプチドミメティクス及び他のアミノ酸部分逆転型または反転型が含まれる。
【００９９】
天然型残基は、側鎖の共通する特性に基づきそれぞれのクラスに分類することができる：
・  疎水性：Ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
・  中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
・  酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
・  塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
・ 鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；並びに
・  芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１００】
例えば、非保存的置換では、これらのクラスのあるメンバーと別のクラスのメンバーとの交換を行うことが可能である。こうして置換した残基を、例えば、ヒト抗体の非ヒト抗体と相同な領域に、または分子の非相同領域に導入することができる。
【０１０１】
抗原結合タンパク質（抗体などの）に変更を行う際、特定の実施形態によれば、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮に入れることができる。各アミノ酸は、その疎水性と電荷特性に基づいて疎水性親水性指標が付されている。これらのアミノ酸とは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（-０．４）、スレオニン（-０．７）、セリン（-０．８）、トリプトファン（-０．９）、チロシン（-１．３）、プロリン（-１．６）、ヒスチジン（-３．２）、グルタマート（-３．５）、グルタミン（-３．５）、アスパラギン酸（-３．５）、アスパラギン（-３．５）、リシン（-３．９）；並びにアルギニン（-４．５）である。
【０１０２】
タンパク質上での生物学的な相互作用機能を検討する際にアミノ酸の疎水性親水性指数が重要であることは当該技術分野で理解されている。Ｋｙｔｅ，ら．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５〜１３１、（１９８２）。特定のアミノ酸は、同様の疎水性親水性指標またはスコアを有する別のアミノ酸と置換してもなお、同様の生物学的活性を保持できることが知られている。疎水性親水性指標に基づき変更を行う際、ある実施形態では、疎水性親水性指標が±２以内のアミノ酸の置換を含む。ある実施形態では、±１以内のアミノ酸を含み、また、ある実施形態では、±０．５以内のものを含む。
【０１０３】
類似のアミノ酸置換は、特に、それにより作製された生物学的に機能的なタンパク質またはペプチドが免疫学的実施形態で使用することが意図される場合、親水性に基づいて有効に行うことができることも当該技術分野で理解されている。ある実施形態では、タンパク質の局所的最大平均親水値は、そのタンパク質が隣接するアミノ酸の親水性に左右され、その免疫原性及び抗原性と相関する、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相関する。
【０１０４】
これらのアミノ酸残基の親水性値は以下の通りである：アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタマート（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（-０．４）、プロリン（-０．５±１）、アラニン（-０．５）、ヒスチジン（-０．５）、システイン（-１．０）、メチオニン（-１．３）、バリン（-１．５）、ロイシン（-１．８）、イソロイシン（-１．８）、チロシン（-２．３）、フェニルアラニン（-２．５）、及びトリプトファン（-３．４）。親水性値に基づき変更を行う際、ある実施形態では、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換を含み、ある実施形態では、±１以内のアミノ酸を含み、また、ある実施形態では、±０．５以内のものを含む。一次アミノ酸配列から親水性を基にエピトープを同定することも可能である。これらの領域は、「エピトープのコア領域」とも呼ぶ。
【０１０５】
例示的なアミノ酸置換を、表１に記載する。
表１：アミノ酸置換
【表１−１】
2020196763.tif 000002
【表１−２】
2020196763.tif 000003
【０１０６】
用語「誘導体」とは、アミノ酸（または核酸）の挿入、欠失、もしくは置換以外の化学修飾を含む分子を指す。ある実施形態では、誘導体は共有結合的な修飾を含み、これには例えば、重合体、脂質、または他の有機もしくは無機部分との化学結合があるが、これらに限定されない。ある実施形態では、化学修飾された抗原結合タンパク質は、化学修飾されていない抗原結合タンパク質よりも循環血中半減期が長くなり得る。ある実施形態では、化学修飾された抗原結合タンパク質は、所望の細胞、組織、及び／または臓器に対するさらに改善された標的能力を有し得る。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質の誘導体は共有結合修飾され水溶性重合体の結合を１つ以上含み、これらとしては、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，６４０，８３５；４，４９６，６８９；４，３０１，１４４；４，６７０，４１７；４，７９１，１９２及び４，１７９，３３７を参照のこと。ある実施形態では、抗原結合タンパク質の誘導体は重合体を１つ以上含み、これらとしては、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロースなど炭水化物系重合体、ポリ（Ｎ-ビニルピロリドン）-ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、オキシエチル化されたポリオールの重合体（例えば、グリセロール）及びポリビニルアルコール、並びにこのような重合体の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
ある実施形態では、誘導体を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のサブユニットで共有結合修飾する。ある実施形態では、１つ以上の水溶性重合体を、誘導体の１か所以上の特定位置、例えばアミノ末端で、結合する。ある実施形態では、１つ以上の水溶性重合体は、誘導体の１つ以上の側鎖に無作為に結合している。ある実施形態では、抗原結合タンパク質の治療的能力改善のためにＰＥＧを使用する。ある実施形態では、ヒト化抗体の治療的能力改善のためにＰＥＧを使用する。このような方法の特定のものは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，１３３，４２６で考察されており、これは、何らかの目的で参照することにより本明細書に取り込まれる。
【０１０８】
ペプチド類似体は、一般に、鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）ペプチドと似た特性を有する非ペプチド薬物として医薬業界においてに使用されている。こうした種類の非ペプチド化合物を、「ペプチド模倣物質」または「ペプチドミメティクス」という。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．，Ａｄｖ．ＤｒｕｇＲｅｓ．，１５：２９、（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ＆Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，ＴＩＮＳ，ｐ．３９２、（１９８５）；並びにＥｖａｎｓら．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３０：１２２９、（１９８７）、これらは、何らかの目的で参照することにより本明細書に組み込まれる。このような化合物は、コンピュータを使用した分子モデリングで作製されることが多い。治療的に有用なペプチドと構造的に類似したペプチド模倣物質を使用し、治療的または予防的効果を同様に得ることができる。一般に、ペプチドミメティクスは、ヒト抗体のような規範となるポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似しているが、当技術分野において周知の方法により、--ＣＨ２ＮＨ--、--ＣＨ２Ｓ--、--ＣＨ２-ＣＨ２--、--ＣＨ＝ＣＨ-（シス＆トランス）、--ＣＯＣＨ２--、--ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２--、及び--ＣＨ２ＳＯ--から選択される少なくとも１つの結合で必要に応じて置換されるペプチド結合を１つ以上有している。ある実施形態では、より安定なペプチドを作製するために、コンセンサス配列のアミノ酸１以上を同一種のＤ-アミノ酸（例えば、Ｌ-リシンの代わりにＤ-リシン）と系統的に置換する方法を使用できる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一なコンセンサス配列の変形配列を含む規制（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチドは、当技術分野で公知の方法（Ｒｉｚｏ＆Ｇｉｅｒａｓｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１：３８７、（１９９２）。なお、これを何らかの目的で参照することにより本明細書に組み込まれる）、例えば、分子内でジスルフィド架橋を形成してペプチドを環化させることができる内部システイン残基を加える方法により作製可能である。
【０１０９】
本明細書全体を通してポリペプチド、核酸、宿主細胞などの生物学的材料と関連させて使用される用語「天然型」とは、自然界に見られる物質または自然界に見られる物質の形態をいう。
【０１１０】
用語「同一な」またはパーセントの「同一性」とは、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈においては、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを下記で記載のデフォルトパラメータで使用して、または手動アライメントで目視確認で測定した場合に、２以上の配列または部分配列が、同一であるか、または同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを特定の割合で有することをいう（例えば、さまざまな実施形態では、最大対応箇所について比較枠（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）または指定領域上で比較及びアライメントを行った場合に、抗原結合タンパク質は、本明細書で提示する配列に対し、ある特定領域にわたって約６０％の同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上の同一性を有してよい）（例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／などを参照のこと）。また、このような配列は、「実質的に同一である」と言われる。この定義は、試験配列のコンプリメント（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）配列をも指す、すなわち、適応してもよい。かかる定義には、欠失及び／または付加を有する配列、並びに置換を有する配列も含まれる。本明細書に記載のように、各アルゴリズムはギャップなどを考慮することができる。さまざまな実施形態では、同一性は、長さが少なくとも約２５アミノ酸、約５０アミノ酸もしくはヌクレオチドである領域にわたり存在するか、または長さが５０〜１００アミノ酸またはヌクレオチドである領域にわたり存在する。
【０１１１】
配列比較の場合、典型的に１つの配列をリファレンス配列とし、それに対して試験配列の比較を行う。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及びリファレンス配列をコンピュータに入力して必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用するか、または代替パラメータを指定することができる。その後、配列比較アルゴリズムにより、リファレンス配列に対する試験配列の配列同一性パーセントがプログラムパラメータに基づいて計算される。
【０１１２】
「比較枠（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）」には、所望の連続位置番号のいずれか１つの位置のセグメントに対するリファレンスが含まれる。いくつかの実施形態では、「比較枠（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）」は、約５０〜約２００、または約１００〜約１５０、または１５０それ以上からなる群から選択することができるが、そのように所望される場合は、比較対象配列及びそれと同じ連続位置番号のリファレンス配列を最適にアライメントしてから２配列の比較を行ってよい。比較対象配列のアライメント方法は、当技術分野で周知である。比較対象配列の最適アライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２：４８２、（１９８１）により；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，．４８：４４３、（１９７０）により；Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎの類似性検索法、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４、（１９８８）により；これらのアルゴリズム実装コンピュータ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ内ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，及びＴＦＡＳＴＡ）により；または、手動アライメントで目視確認（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら．，ｅｄｓ．１９９５  補遺）を参照のこと）により、実施可能である。
【０１１３】
配列同一性及び配列類似性の割合測定に好適なアルゴリズムの例にＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムがあり、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２、（１９７７）、及びＡｌｔｓｃｈｕｌら．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０、（１９９０）に記載されている。本明細書に記載のパラメータでＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０を使用し、さまざまな実施形態の核酸及びタンパク質について配列同一性の割合を測定する。ＢＬＡＳＴ解析実行用ソフトウェアは、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に公開されており入手可能である。このアルゴリズムではまず問い合わせ配列内で長さが短いワードＷを同定することによりスコアの高い配列ペア（ＨＳＰ：ｈｉｇｈ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐａｉｒｓ）を同定するが、このワードＷは、データベース配列内の同じ長さのワードとアライメントを行った場合に閾値スコアＴの正の値と一致するかまたはそれを満たすワードである。Ｔは隣接ワード（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ）スコア閾値といわれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。こうして最初に見つかった隣接ワード（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ）をもとに、これらが含まれている、長さのより長いＨＳＰの検索を開始する。見つかったワードを各配列の両端方向へ伸ばしていき、累積アライメントスコアが高くなる限り伸展させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列には、パラメータＭ（一致する残基１組の報酬スコア；常に＞０）及びＮ（一致しない残基；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列の場合は、スコア行列を使用して累積スコアを計算する。累積アライメントスコアが到達最大値から量Ｘ下がった場合；残基アライメントスコアで負の値が１以上蓄積したために累積スコアがゼロ以下になる場合；または配列の終端に到達した場合は、見つかったワードの各方向への伸展を中止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータのＷ、Ｔ、及びＸに応じて、アライメントの感度及び速度が決まる。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）では、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝-４及び両鎖比較がデフォルトで使用される。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長３、及び期待値（Ｅ）１０をデフォルトで使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１０９１５、（１９８９）を参照のこと）はアライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝-４、及び両鎖比較をデフォルトで使用する。
【０１１４】
用語「対照配列」とは、その連結先であるコード配列の発現及びプロセッシングに影響を与えるポリヌクレオチド配列をいう。このような対照配列の性質は宿主生物に応じて異なりうる。特定の実施形態では、原核生物の対照配列に、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含めることができる。例えば、真核生物の対照配列には、転写因子、転写エンハンサー配列、及び転写終結配列に対する単数または複数の認識部位を含むプロモーターを含めることができる。「対照配列」は、リーダー配列及び／または融合相手の配列を含むことができる。
【０１１５】
用語「ベクター」は、タンパク質コード情報を宿主細胞内に導入するために使用するあらゆる分子または実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を意味する。
【０１１６】
用語「発現ベクター」または「発現構成体」とは、宿主細胞の形質転換に好適であり、かつ、それに機能的に連結された１か所以上の異種コード領域の発現を指令及び／または制御する（宿主細胞と共に）核酸配列を含有するベクターをいう。発現構成体には、転写、翻訳に影響を与えるかまたは制御する配列、及び、イントロンがある場合は、機能的に連結したコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を与える配列を非限定的に含むことができる。本明細書に記載のさまざまな実施形態に有用な発現ベクターは、発現させようとするＤＮＡ配列または断片に機能的に連結した発現制御配列を少なくとも１つ含有することができる。制御配列を、クローニングしたＤＮＡ配列の発現を制御し調節するためにベクターに挿入する。有用な発現制御配列の例は、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ラムダファージの主なオペレーター及びプロモーター領域、ｆｄ外被タンパク質の制御領域、酵母解糖系プロモーター、例えば、３-ホスホグリセロール酸キナーゼのプロモーター、酵母の酸性ホスファターゼプロモーター、例えば、酵母α接合因子プロモーターであるＰｈｏ５、並びにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、及びシミアンウイルスに由来するプロモーター、例えば、早期及び晩期のプロモーターまたはＳＶ４０、並びに原核細胞または真核細胞の遺伝子発現及びこれらの細胞のウイルスもしくはその組み合わせを制御することが知られている他の配列である。
【０１１７】
用語「宿主細胞」は、核酸配列を用いてこれまでに形質転換されている、または形質転換を行うことが可能で、これにより対象遺伝子を発現する細胞を意味する。かかる用語には親細胞の後代が含まれ、対象遺伝子が存在するかぎり、その後代が形態面または遺伝子構造面で元の親細胞と同一であるかないかは問わない。
【０１１８】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来または外因性ＤＮＡの取り込みを意味し、外因性のＤＮＡが細胞膜内側に導入されたとき、その細胞は「トランスフェクトされた」という。多数のトランスフェクション技術が当技術分野において周知であり、本明細書に開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，前出；Ｄａｖｉｓら、１９８６、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕら、１９８１，Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照のこと。このような技術を使用して１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞内に導入することができる。トランスフェクションは一過性であってよい。
【０１１９】
用語「形質転換」とは、細胞の遺伝的特徴の変化をいい、細胞が修飾されて新しいＤＮＡまたはＲＮＡを含有する場合、その細胞は形質転換されたという。例えば、トランスフェクション、形質導入、または他の技術を介して新しく遺伝物質を導入したことにより、細胞がその野生型状態に遺伝的修飾を受けている場合、細胞は形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入の後、形質転換しているＤＮＡは、細胞の染色体内に物理的に組み込んで細胞のＤＮＡと組み換えることができるか、または、複製はせずにエピソーム因子として一過的に維持することができるか、または別個にプラスミドとして複製することができる。形質転換しているＤＮＡが細胞分裂で複製される場合、その細胞は「安定に形質転換された」とみなされる。
【０１２０】
抗体または免疫グロブリン鎖（重鎖または軽鎖）の抗原結合タンパク質の「免疫学的に機能的な断片」（または、単に「断片」）という用語は、本明細書で使用する場合、完全長鎖に存在するアミノ酸が少なくともいくつか欠失してはいるが抗原特異的な結合能を失っていない抗体の一部分（その部分を入手または合成した方法は問わない）を含む抗原結合タンパク質種である。
【０１２１】
「特異的結合」、「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｓ）」または「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」とは、抗原結合タンパク質がＣＢ１に選択的に結合する意味であることを理解されるべきである。しかしながら、これは必ずしも、抗原結合タンパク質がＣＢ１以外のタンパク質に結合することを除外するわけではない。さまざまな実施形態では、他のタンパク質への結合は、結合した全タンパク質の約５％未満、約１０％未満、約１５％未満、約２０％未満または約２５％未満を占める。「特異的に結合する」ＣＢ１抗原結合タンパク質は、ＣＢ１またはＣＢ１の特定配列、例えば、ＣＢ１細胞外ドメインに主に結合する。「特異的に結合する（Ｂｉｎｄｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」または「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」は、記載した標的（複数可）または特異配列以外への結合を除外すると解釈されるべきではないが、主な結合活性は特定の標的（複数可）またはアミノ酸配列に対するものであるべきである。
【０１２２】
抗原結合タンパク質の断片は生物学的に活性であり、ここで、それらの断片は標的抗原に結合し、完全抗体など他の抗原結合タンパク質と競合して所与のエピトープまたは抗原に結合することができる。いくつかの実施形態では、断片は、中和断片である。いくつかの実施形態では、断片は、ＣＢ１とそのリガンド（複数可）とが相互作用する可能性を遮断または抑制することができる。ある態様では、このような断片は、完全長の軽鎖または重鎖に存在するＣＤＲの少なくとも１つが保持され、また、いくつかの実施形態では、１本の重鎖及び／または軽鎖またはその一部が含まれる。これらの生物学的に活性な断片は、組換えＤＮＡ技術により産生され得るか、または完全抗体などの抗原結合タンパク質を酵素的にもしくは化学的に切断することにより産生され得る。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片としては、非限定的に、Ｆａｂ、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）（軽鎖可変ドメインがある同一ポリペプチド上で重鎖可変ドメインが、同一鎖上で２つのドメインをペアにするには短すぎる、短いペプチドリンカーを介して接続されている）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体及び一本鎖抗体が含まれ、かかる断片は、ヒト、マウス、ラット、ラクダ科動物またはウサギを含むが、これらに限定されない、あらゆる哺乳類供給源に由来してよい。本明細書に開示する抗原結合タンパク質の機能的部分、例えば、１つ以上のＣＤＲは、体内の特定の標的へ向かい、二面的な治療的特性を有する、または血清半減期が長い治療剤を創製するために、第２のタンパク質または低分子に共有結合が可能であることがさらに意図される。当業者には理解されるであろうが、抗原結合タンパク質は、非タンパク質成分を含むことができる。
【０１２３】
本明細書に記載する特定の抗原結合タンパク質は、抗体であるか、または抗体由来である。ある実施形態では、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、小型抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「疑似抗体」といわれることもある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体（本明細書では「抗体複合体」といわれることもある）、及びそれぞれの断片を含むが、これらに限定されない抗体に基づいている。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質はアビマー（ａｖｉｍｅｒ）（結合の強いペプチド）を含む、またはアビマー（ａｖｉｍｅｒ）からなる。
【０１２４】
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１及びＣＨ２ドメインを含む重鎖断片を２つ含む。この２つの重鎖断片は、２以上のジスルフィド結合、及びＣＨ３ドメインの疎水性相互作用により結合している。
【０１２５】
「Ｆａｂ断片」は、１本の軽鎖並びに１本の重鎖のＣＨ１及び可変領域を含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【０１２６】
「Ｆａｂ’断片」は、軽鎖１本並びにＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインのほかにＣＨ１とＣＨ２ドメインの間の領域も含有する１本の重鎖の一部を含み、２つのＦａｂ’断片の２本の重鎖間にジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）２分子が形成され得るようにする。
【０１２７】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、軽鎖２本及びＣＨ１とＣＨ２ドメインの間の定常領域の一部を含有する２本の重鎖を含有し、その２本の重鎖間にジスルフィド結合が形成されるようにする。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２本の重鎖間がジスルフィド結合で結合した２つのＦａｂ’断片で構成される。
【０１２８】
「Ｆｖ領域」は、重鎖及び軽鎖それぞれの可変領域を含むが、定常領域はない。
【０１２９】
「一本鎖抗体」は、Ｆｖ分子であり、これにおいて、重鎖及び軽鎖のそれぞれの可変領域は可動性リンカーにより接続されて１本のポリペプチド鎖が形成され、これが抗原結合領域を形成する。一本鎖抗体は、国際特許出願公開ＷＯ８８／０１６４９及びＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ第４，９４６，７７８号及び第５，２６０，２０３号で詳細に論じられており、それらの開示内容は参照により取り込まれる。
【０１３０】
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。ある場合には、２つ以上のＶＨ領域はペプチドリンカーで共有結合で繋がれ二価のドメイン抗体を創る。二価のドメイン抗体の２つのＶＨ領域は同一または異なる抗原を標的にすることができる。
【０１３１】
「二価の抗原結合タンパク質」または「二価抗体」は、２か所の抗原結合性部位を含む。ある場合には、かかる２か所の結合部位は同一の抗原特異性を有している。二価の抗原結合タンパク質及び二価抗体は、本明細書で定義されるように二重特異性であり得る。ある実施形態では、「多重特異性」または「多機能性」抗体以外の二価抗体は、典型的に、各々の結合部位が同一であると理解される。
【０１３２】
「多重特異性抗原結合タンパク質」または「多重特異性抗体」は、１つ以上抗原またはエピトープを標的にするものである。
【０１３３】
「二重特異性」、「ＣＢ１特異的」、もしくは「二機能性」である抗原結合タンパク質または抗体は、それぞれ、異なる抗原結合性部位を２か所有するハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。二重特異性抗原結合タンパク質及び抗体は、多重特異性抗原結合タンパク質抗体であり、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含むが、これらに限定されないさまざまな方法で作製され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ、１９９０、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９：３１５〜３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１５４７〜１５５３を参照のこと。二重特異性の抗原結合タンパク質または抗体の２か所の結合部位は、２つの異なるエピトープに結合するが、これらのエピトープは同一標的タンパク質上にあっても、または異なる標的タンパク質上にあってもよい。
【０１３４】
個々のＣＢ１免疫グロブリン鎖の各々は、典型的に、いくつかの「免疫グロブリンドメインで構成される」。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成する塩基性ユニットである。ヒトでは、ＩｇＡ及びＩｇＤのアイソタイプは重鎖４本及び軽鎖４本を含有し、；ＩｇＧ及びＩｇＥのアイソタイプは、重鎖２本及び軽鎖２本を含有し；また、ＩｇＭのアイソタイプは重鎖５本及び軽鎖５本を含有する。重鎖Ｃ領域は典型的に、エフェクター機能に関与し得るドメインを１つ以上含む。重鎖の定常領域ドメインの数はアイソタイプにより決まる。ＩｇＧ重鎖は、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３として知られる３つのＣ領域ドメインを含有する。提供する抗体は、これらのアイソタイプおよびサブタイプのいずれを有してもよい。
【０１３５】
「抗原結合領域」は、特定の抗原を特異的に結合するタンパク質、またはタンパク質の一部（例えば、パラトープ）であることを意味する。例えば、抗原と相互作用し、かつ、かかる抗原に対する自身の特異性と親和性を抗原結合タンパク質に与えるアミノ酸残基が含有された抗原結合タンパク質の部分を「抗原結合領域」と呼ぶ。抗原結合領域は、典型的に、１つ以上の相補性結合領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ）（ＣＤＲ）を含む。特定の抗原結合領域は、１つ以上の「フレームワーク」領域も含む。「ＣＤＲ」は、抗原結合の特異性及び親和性に寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は、ＣＤＲの適切なコンホメーションが維持されるように働いて抗原結合領域と抗原との間の結合を促進することができる。構造的には、フレームワーク領域を、抗体内のＣＤＲに挟まれる部分に位置させることができる。
【０１３６】
特定の態様では、ＣＢ１受容体を結合する組換え型抗原結合タンパク質を提供する。この文脈において、「組換え型抗原結合タンパク質」は、組換え技術を使用して、すなわち、本明細書に記載する組換え型核酸を発現させることにより作製されたタンパク質である。組換えタンパク質の方法及び技術は、当技術分野において周知である。
【０１３７】
用語「抗体」とは、標的抗原に対する特異結合で完全抗体と競合することができる、任意のアイソタイプの完全状態の免疫グロブリン、またはその断片をいい、これには、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、及び二重特異性抗体が含まれる。「抗体」は、抗原結合タンパク質種である。完全抗体は、一般に、完全長重鎖２本と完全長軽鎖２本を少なくとも含むが、ある場合には、重鎖しか含むことができないラクダ科動物の天然型抗体のように少ない数の鎖を含むことができる。抗体は、単一供給源のみに由来し得るか、または、下記で詳述するように、抗体の異なる部分が異なる２抗体に由来してよい、いわゆる、「キメラ」であり得る。抗原結合タンパク質、抗体、または結合断片は、組換えＤＮＡ技術、または完全抗体を酵素的もしくは化学的に切断することにより、ハイブリドーマに作製可能である。特に明記しない限り、用語「抗体」には、完全長重鎖２本及び完全長軽鎖２本を含む抗体に加え、誘導体、多様体、断片、及びそれらの変異タンパク質が含まれ、これらの例を以下に記載している。さらに、明白に除外しない限り、抗体には、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、小型抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「疑似抗体」といわれることもある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体（本明細書では「抗体複合体」といわれることもある）、及びそれぞれの断片が含まれる。いくつかの実施形態では、かかる用語はペプチボディも包含する。
【０１３８】
天然型抗体の構造ユニットは、典型的に、四量体を含む。このような四量体はそれぞれ典型的に同一な２対のポリペプチド鎖で構成され、各対は、完全長「軽」鎖１本及び完全長「重」鎖１本を有している。各鎖のアミノ末端部分は、典型的に、抗原認識に典型的に関与する可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、典型的に、エフェクター機能に関与し得る定常領域を決定する。軽鎖／重鎖の各対の可変領域は典型的に抗原結合性部位を形成する。
【０１３９】
可変領域は、典型的に、相補性決定領域すなわちＣＤＲとも呼ばれる超可変領域３つと、比較的保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）とが繋がっている、同じ一般構造をしている。各対の２本の鎖のＣＤＲは、典型的に、フレームワーク領域ごとに配されており、特定のエピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端へ向かって、軽鎖及び重鎖の両可変領域は、典型的に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４の各ドメインを含む。各ドメインのアミノ酸配置は典型的に、Ｋａｂａｔの定義Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、（１９８７及び１９９１）、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７、（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら．，Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７８〜８８３、（１９８９））に従う。
【０１４０】
ある実施形態では、抗体の重鎖は、抗体の軽鎖の非存在下で抗原に結合する。ある実施形態では、抗体の軽鎖は、抗体の重鎖の非存在下で抗原に結合する。ある実施形態では、抗体結合領域は、抗体の軽鎖の非存在下で抗原に結合する。ある実施形態では、抗体結合領域は、抗体の重鎖の非存在下で抗原に結合する。ある実施形態では、ｉｎｄｉｖｉＣＢ１の可変領域は、他の可変領域の非存在下で抗原に特異的に結合する。
【０１４１】
ある実施形態では、ＣＤＲ像、並びに抗体の結合部位を含む残基の同定は、抗体の構造を解くことによって、及び／または抗体-リガンド複合体の構造を解くことによって最終的に明らかになる。ある実施形態では、Ｘ線結晶解析のような、当業者に公知のさまざまな技術のいずれによっても達成できる。ある実施形態では、ＣＤＲ領域を同定する、または近似領域を求めるためにさまざまな解析方法を使用することができる。このような方法の例としては、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、“ＡｂＭ”定義及び接触の定義が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４２】
Ｋａｂａｔの定義は、抗体の各残基に番号付けをするための標準であり、ＣＤＲ領域を同定するために典型的に使用される。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｗｕ，核ｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２８：２１４-８、（２０００）を参照のこと。Ｃｈｏｔｈｉａの定義はＫａｂａｔの定義と似ているが、Ｃｈｏｔｈｉａの定義では特定の構造ループ領域の位置を考慮に入れる。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜１７，（１９８６）；Ｃｈｏｔｈｉａら．，Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７〜８３、（１９８９）を参照のこと。“ＡｂＭ”の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐにより作成された、抗体構造のモデリングを行うコンピュータプログラム統合パッケージを使用する。例えば、Ｍａｒｔｉｎら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６：９２６８〜９２７２、（１９８９）；”ＡｂＭ（商標）、Ａ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｌｔｄを参照のこと。ＡｂＭの定義は、Ｓａｍｕｄｒａｌａら、“Ａｂ
Ｉｎｉｔｉｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”、ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，補遺、３：１９４〜１９８、（１９９９）に記載のような、知識データベースと各種ａｂ  ｉｎｉｔｉｏ方法との組み合わせを使用して一次配列から抗体の三次構造のモデリングを行う。接触の定義は、利用可能な複合体の結晶構造解析に基づいている。例えば、ＭａｃＣａｌｌｕｍら．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５：７３２〜４５、（１９９６）を参照のこと。
【０１４３】
慣例により、重鎖ＣＤＲ領域は、典型的に、Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３と呼ばれ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向へ順次番号付けされる。軽鎖ＣＤＲ領域は、典型的に、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３と呼ばれ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向へ順次番号付けされる。
【０１４４】
用語「軽鎖」には、完全長軽鎖、及び結合特異性を与えるために十分な可変領域配列を有する、完全長軽鎖の断片が含まれる。完全長軽鎖には、可変領域ドメインのＶＬ及び定常領域ドメインのＣＬが含まれる。軽鎖の可変領域ドメインはポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖は、カッパ鎖とラムダ鎖を含む。
【０１４５】
さまざまな実施形態の抗体またはその断片のＣＢ１受容体に対する特異性は、親和性及び／または結合力（ａｖｉｄｉｔｙ）に基づいて測定することができる。親和性は、抗体が結合した抗原の平衡解離定数（Ｋｄ）で表され、抗原決定基と抗体結合部位間の結合強度を測定する。結合力（ａｖｉｄｉｔｙ）は、抗体とその抗原間の結合強度を測定したものである。結合力（ａｖｉｄｉｔｙ）は、エピトープとそのエピトープに対する抗体上の抗原結合性部位との親和性、及び抗体の結合価の両方に関連しており、特定のエピトープに特異的な抗原結合性部位の数を指す。Ｋｄ値が小さいほど、抗原決定基と抗体結合部位間の結合強度は強い。
【０１４６】
用語「重鎖」には、完全長重鎖、及び結合特異性を与えるために十分な可変領域配列を有する、完全長重鎖の断片が含まれる。完全長重鎖には、可変領域ドメインのＶＨ、及び３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３が含まれる。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端に、また、ＣＨドメインはカルボキシル末端にあり、ＣＨ３がポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の各サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２の各サブタイプを含む）、ＩｇＭ及びＩｇＥなどいずれのアイソタイプでもよい。
【０１４７】
二重特異性抗体または二機能性抗体は、典型的に、重鎖／軽鎖の２対が異なり、かつ、２か所の結合部位が異なっている、人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ'断片の連結を含むが、これらに限定されないさまざまな方法で作製され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉら．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９：３１５〜３２１、（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１５４７〜１５５３、（１９９２）を参照のこと。
【０１４８】
哺乳類の一部の種は、重鎖１本しか有さない抗体も産生することができる。
【０１４９】
個々のＣＢ１免疫グロブリン鎖の各々は、典型的に、いくつかの「免疫グロブリンドメイン」で構成される。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成する塩基性ユニットである。重鎖Ｃ領域は、典型的に、エフェクター機能に関与し得るドメインを１つ以上含む。重鎖の定常領域ドメインの数はアイソタイプにより決まる。提供する抗体は、アイソタイプおよびサブタイプのいずれを有してもよい。
【０１５０】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の軽鎖及び／または重鎖の一部をいう。ある実施形態では、異なる抗体間では、それらの可変領域は、たとえ同一種の抗体同士であってもアミノ酸配列が大きく異なる。抗体の可変領域は、典型的に、特定の抗体の特定の標的に対する特異性を決定する
【０１５１】
用語「中和抗原結合タンパク質」または「中和抗体」とは、それぞれ、リガンドに結合して、そのリガンドの結合相手にかかるリガンドが結合することを予防または抑制する、抗原結合タンパク質または抗体をいう。これは、例えば、リガンド上の結合部位を直接遮断することによって、またはリガンドに結合してリガンドの結合能力を間接的手段（リガンドの構造またはエネルギーの改変など）で改変することによって可能である。いくつかの実施形態では、かかる用語は、それが結合しているタンパク質が生物学的機能を果たせないように防ぐ抗原結合タンパク質も意味することができる。抗原結合タンパク質、例えば、抗体またはその免疫学的に機能的な断片の結合性及び／または特異性の評価において、過剰の抗体により、リガンドに結合した結合相手の量が少なくとも約１〜２０、約２０〜３０％、約３０〜４０％、約４０〜５０％、約５０〜６０％、約６０〜７０％、約７０〜８０％、約８０〜８５％、約８５〜９０％、約９０〜９５％、約９５〜９７％、約９７〜９８％、約９８〜９９％またはそれ以上減少する（インビトロ競合結合アッセイで測定した場合）場合、抗体または断片は、リガンドがその結合相手に結合するのを実質的に阻害することができる。いくつかの実施形態では、ＣＢ１受容体抗原結合タンパク質の場合は、こうした中和分子は受容体の結合能力を減退させることができる。いくつかの実施形態では、中和能力は明らかにされ、かつ／または競合アッセイを介して記載される。いくつかの実施形態では、中和能力はＩＣ５０値またはＥＣ５０値について記載される。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、非中和抗原結合タンパク質であってよい。
【０１５２】
用語「標的」とは、抗原結合タンパク質による結合を受けることが可能な分子または分子の一部をいう。ある実施形態では、標的には１つ以上のエピトープがあり得る。ある実施形態では、標的は抗原である。「抗原結合タンパク質」という語句において「抗原」を使用する場合、単に、かかる抗原を含むタンパク質配列が抗体により結合され得ること意味する。この文脈において、タンパク質が外来であること、または、免疫応答を誘導する能力があることは必要ではない。
【０１５３】
同一エピトープについて競合する抗原結合タンパク質（例えば、中和抗原結合タンパク質または中和抗体）という文脈で使用する「競合する（ｃｏｍｐｅｔｅ）」という用語は、抗原結合タンパク質同士が競合することを意味し、アッセイで測定した場合、被検抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的に機能的な断片）は、参照抗原結合タンパク質（例えば、リガンドまたは参照抗体）が共通抗原（例えば、ＣＢ１またはその断片）に特異的に結合することを防ぐ、または阻害する（例えば、抑制する）。ある抗原結合タンパク質と別の抗原結合タンパク質とが競合するかどうかを測定するために多くの種類の競合結合アッセイを使用することができ、例えば：固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）直接法または間接法、固相酵素免疫測定法（ＥＩＡ）直接法または間接法、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉら、１９８３、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、９：２４２〜２５３を参照のこと）；ビオチン-アビジンＥＩＡ固相直接法（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄら、１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、．１３７：３６１４〜３６１９を参照のこと）固相直接標識法、固相直接標識サンドイッチ法（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８、抗体，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）；Ｉ-１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌら、１９８８、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２５：７〜１５を参照のこと）；固相直接ビオチン-アビジンＥＩＡ法（例えば、Ｃｈｅｕｎｇら、１９９０、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７６：５４６〜５５２を参照のこと）；並びに直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら、１９９０、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：７７〜８２）がある。典型的に、このようなアッセイでは、非標識の被験抗原結合タンパク質及び標識した参照抗原結合タンパク質を担持する、固相の表面もしくは細胞に結合した精製抗原を使用する。競合的阻害は、被験抗原結合タンパク質の存在下で固相の表面または細胞に結合した標識の量を測定することにより求められる。通常は、被験抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイで同定された抗原結合タンパク質（競合する抗原結合タンパク質）は、参照抗原結合タンパク質と同一のエピトープに結合する抗原結合タンパク質、及び、立体障害のために、参照抗原結合タンパク質の結合を受けているエピトープに十分に近位で隣接するエピトープに結合する抗原結合タンパク質を含む。競合的結合の測定方法に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例に提供されている。通常、競合する抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、参照抗原結合タンパク質の共通抗原に対する特異的結合が少なくとも約４０〜４５％、約４５〜５０％、約約５０〜５５％、約５５〜６０％、約６０〜６５％、約６５〜７０％、約７０〜７５％または約７５％またはそれ以上阻害（例えば、抑制）される。ある場合には、結合は、少なくとも約８０〜８５％、約８５〜９０％、約９０〜９５％、約９５〜９７％、または約９７％またはそれ以上阻害される。
【０１５４】
用語「抗原」とは、抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的機能的断片を含む）などの選択的結合性物質による結合を受けることが可能な分子または分子の一部をいう。いくつかの実施形態では、こうした抗原は動物に使用されて、その抗原に結合できる抗体を産生させることができる。抗原は、１つ以上のエピトープを持つことができ、それぞれ異なる抗原結合タンパク質、例えば、抗体と相互作用することができる。
【０１５５】
用語「エピトープ」は、抗体などの抗原結合タンパク質による結合を受けることができる、またはＴ細胞受容体に結合することができる、あらゆる決定基を含む。エピトープとは、抗原の一領域であり、その抗原を標的とする抗原結合タンパク質がそこに結合し、抗原がタンパク質の場合、抗原結合タンパク質と直接接触する特定アミノ酸を含む。ほとんどの場合、エピトープはタンパク質上にあるが、核酸などの他の分子種上にある場合もある。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基などの化学的に活性な表面分子団を含み、三次元構造の特異的特徴、及び／または特異的電荷特性を有することができる。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質の複合混合体及び／または高分子の標的抗原上のエピトープを選択的に認識する。
【０１５６】
本明細書で使用する場合、「実質的に純粋な」とは、記載される分子種が主な存在分子種である、すなわち、モルで、その同じ混合物内の他のどのｉｎｄｉｖｉＣＢ１種よりも豊富にあることを意味する。ある実施形態では、実質的に純粋な分子は、目的種が、そこに存在する全高分子種の少なくとも約５０％（モルで）を構成する組成物である。その他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、その組成物に存在する全高分子種の少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％を構成する。その他の実施形態では、目的種は精製されて本質的に均質であり、ここでは、従来の検出方法で組成物内の汚染種が検出されず、したがって、その組成物は検出可能な高分子１種で構成される。さまざまな実施形態では、抗原結合タンパク質は、精製抗原結合タンパク質または精製抗体であり得る。
【０１５７】
用語「生物学的試料」には、本明細書で使用する場合、非限定的に、生物または生きていた生物に由来のあらゆる量の物質を含む。このような生物としては、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギなどの動物が含まれるが、これらに限定されない。そのような物質としては、血液、血清、尿、細胞、臓器、組織、骨、骨髄、リンパ節、及び皮膚が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５８】
本明細書で使用する用語「医薬品組成物」（または薬剤または薬物）とは、患者に適切に投与した際に所望の治療効果を誘導することができる化学的化合物、組成物、薬剤または薬物をいう。これには必ずしも１種以上の成分を必要とするわけではない。
【０１５９】
用語「治療的有効量」及び「治療的有効用量」とは、哺乳類において治療応答を与えることが測定されたＣＢ１受容体抗原結合タンパク質量をいう。このような治療的有効量は、当業者により確認され得る。正確な用量及び製剤は、治療目的に応じて決定され、公知の技術を使用して当業者により確認可能である（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（第１〜３巻，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄｉｔｏｒ（２００３），ａｎｄ  Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９））を参照のこと。
【０１６０】
用語「薬理学的に許容される塩」または「薬理学的に許容される担体」は、本明細書に記載する化合物の特定の置換基に応じて、比較的非毒性の酸または塩基で調製される活性化合物の塩を含むことが意図される。
【０１６１】
用語「モジュレータ」は、本明細書で使用する場合、分子の活性または機能を変化させるかまたは改変する化合物である。例えば、モジュレータは、分子の特定の活性または機能の程度を、モジュレータの非存在下で観察される活性または機能の程度よりも高めるかまたは低下させることができる。ある実施形態では、モジュレータは阻害剤であり、分子の少なくとも１つの活性または機能の程度を低下させる。分子の特定の例示的な活性及び機能には、結合親和性、酵素活性、及びシグナル伝達が含まれるが、これらに限定されない。特定の例示的な阻害物質には、タンパク質、ペプチド、抗原結合性断片、抗体、ペプチボディ、炭水化物または有機低分子が含まれるが、これらに限定されない。抗体は、ＣＢ１  ＣＢ１受容体に対するよう作製され得る。ペプチボディは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，６６０，８４３（ＰＣＴ出願第ＷＯ０１／８３５２５に相当）に記載されている。
【０１６２】
用語「患者」及び「被検者」は同義に使用され、ヒト及び非ヒト動物被検体で、以前に障害の診断を受けている、以前に障害が認められたが現在はない、診察を受けている、障害を発症するリスクがあるなどの被験体を含む。
【０１６３】
用語「治療する」及び「治療」には、治療的処置、予防的、及び、被検者が障害または他の危険因子を発症するリスクを低下させる適用が含まれる。治療は、障害の完全な治癒を必要としてはおらず、症状または根底にある危険因子低減させる実施形態を包含する。
【０１６４】
用語「予防する」は、事象の可能性を１００％排除することを必要としていない。むしろ、事象が発現する可能性が化合物または方法の存在下で低下したことを意味する。
【０１６５】
標準的な技術を使用して、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、並びに組織培養及び形質転換（例えば、電気穿孔法、リポフェクション法）を行うことができる。酵素反応及び精製技術は、製造者の規格にしたがって、または当該技術分野で一般的な方法で、または本明細書の記載にしたがって実施することができる。上述の技術及び手順は、一般に、当技術分野において周知の従来方法、並びに、本明細書全体を通じて引用及び論じられている、さまざまな一般文献及びより具体的な文献の記載に従い実施することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと。なお、これは、何らかの目的で参照することにより本明細書に組み込まれる。特別に定義されない限り、本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、及び創薬化学・医化学に関連して使用される、専門語並びに実験室手順及び技術は、当該技術分野で周知かつ一般に使用されるものである。標準的な技術を使用して、化学合成、化学解析、医薬調製、製剤化、及び送達、及び患者の治療が可能である。
【０１６６】
本明細書は、ＣＢ１受容体を結合する抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、提供される抗原結合タンパク質は、本明細書に記載のように、相補性決定領域（ＣＤＲ）を１つ以上含むポリペプチドである。いくつかの抗原結合タンパク質では、ＣＤＲは「フレームワーク」領域に埋め込まれており、この領域は、ＣＤＲ（複数可）の適切な抗原結合特性が達成されるようにＣＤＲ（複数可）の方向付けを行う。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する抗原結合タンパク質は、ＣＢ１受容体を妨害、遮断、抑制または調節することができる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する抗原結合タンパク質は、ＣＢ１介在性の活性、例えば、リガンド結合を抑制することができる。その他の実施形態では、ＣＢ１受容体エピトープに結合する抗原結合タンパク質は、ＣＢ１受容体により媒介される生理的作用を抑制することができる。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒト／マウスキメラのようなキメラである。
【０１６８】
抗原結合タンパク質は、さまざまな治療用途に使用できる。例えば、体重を減少させるため、または、例えば、血漿グルコース、インスリン、ＨＤＬコレステロール、トリグリセリド、アディポネクチン、及びＨｂＡ１ｃ値といった代謝パラメータ、腹腔脂肪や肝脂肪、エネルギー消費、及び血圧を改善するために使用できる。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、提供される抗原結合タンパク質は、１つ以上のＣＤＲ（例えば、１、２、３、４、５または６つのＣＤＲ）を含む。その他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、（ａ）ポリペプチド構造及び（ｂ）そのポリペプチド構造に挿入されている、及び／または結合している１つ以上のＣＤＲを含む。ポリペプチド構造は、多種多様な形態をとり得る。例えば、天然型抗体のフレームワーク、またはその断片もしくは多様体であり得る、もしくは含む、または完全に合成のものであり得る。
【０１７０】
ある実施形態では、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、抗体であるか、または抗体由来であり、これらとしては、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、小型抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「疑似抗体」といわれることもある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合体（「抗体複合体」といわれることもある）、及び、それぞれの部分または断片を含むが、これらに限定されない〜。ある場合には、抗原結合タンパク質は、抗体の免疫学的断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ'断片、Ｆ（ａｂ'）２断片、Ｆｖ断片、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、またはｓｃＦｖ
などの一本鎖抗体分子）である。
【０１７１】
抗原結合タンパク質を治療用途使用する実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＣＢ１の１つ以上の生物学的活性を抑制、妨害、または調節することができる。ある実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＣＢ１受容体に特異的に結合し、かつ／または実質的にヒトＣＢ１受容体の結合もしくはシグナル伝達を少なくとも約２０％-４０％、約４０〜６０％、約６０〜８０％、約８０〜８５％、またはそれ以上（例えば、インビトロアッセイで測定した場合）阻害する。
【０１７２】
本明細書で提供するいくつかの抗原結合タンパク質は抗体である。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、Ｋｄが約１０-７、約１０-８、約１０-９、約１０-１０、約１０-１１、約１０-１２、約１０-１３Ｍより小さい（結合がより強い）。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＣＢ１受容体の結合またはシグナル伝達遮断のＩＣ５０が約１μＭ未満、約１０００ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１０ｎＭ、約約１０ｎＭ〜約１ｎＭ、約１０００ｐＭ〜約５００ｐＭ、約５００ｐＭ〜約２００ｐＭ、約２００ｐＭ未満、約２００ｐＭ〜約１５０ｐＭ、約２００ｐＭ〜約１００ｐＭ、約１００ｐＭ〜約１０ｐＭ、約１０ｐＭ〜約１ｐＭである。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＣＢ１受容体の特定のコンホメーション状態に結合して受容体活性を妨げる。
【０１７４】
本明細書に記載する、ＣＢ１受容体に対する抗原結合タンパク質は、ヒト化抗体及び／またはその一部分を含むことができる。このような方法が実際に適用されるのは、マウス液性免疫系の「ヒト化」である。
【０１７５】
ある実施形態では、ヒト化抗体は、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である。ある実施形態では、ヒト化抗体の標的に対する親和性は、ヒト化抗体が由来する別の種の抗体の親和性と実質的に同一である。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，５３０，１０１；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，６９３，７６１；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，６９３，７６２；並びにＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，５８５，０８９を参照のこと。
【０１７６】
ある実施形態では、抗原結合性ドメインの免疫原性を低下させながらもその野生の親和性は低下させずに修飾可能な抗体可変ドメインのアミノ酸は同定される。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．５，７６６，８８６及び５，８６９，６１９を参照のこと。
【０１７７】
ある実施形態では、当技術分野で公知の方法による抗体修飾は、典型的に、標的に対する高い結合親和性を達成し、かつ／またはレシピエントの抗体の免疫原性を低下させるよう設計される。ある実施形態では、ヒト化抗体は、抗体の同族抗原に対するその抗体の親和性を高めるために、修飾を施してグリコシル化部位を排除することができる。例えば、Ｃｏら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３０：１３６１〜１３６７、（１９９３）を参照のこと。ある実施形態では、ヒト化抗体を作製するために「再構成（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）」、「超キメラ化（ｈｙｐｅｒｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）」、または「ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）／表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」などの技術を使用する。例えば、Ｖａｓｗａｍｉら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ，＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８１：１０５、（１９９８）；Ｒｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．，９：８９５〜９０４、（１９９６）；並びにＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，０７２，０３５を参照のこと。特定のこのような実施形態では、このような技術は、典型的に、外来残基数を減らすことで抗体の免疫原性を抑制するが、抗体を繰り返し投与した後の抗イディオタイプ及び抗アロタイプの応答は妨げられることはない。免疫原性を抑制する他の特定の方法は、例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６２（６）：３６６３〜７１、（１９９９）に記載がある。
【０１７８】
場合によっては、抗体のヒト化により抗原結合能を失い得る。ヒト化抗体は、その後、「復帰変異させる」ことができる。このような実施形態では、ヒト化抗体は、ドナー抗体に見られたアミノ酸残基の１以上を誘導するために変異させることができる。例えば、Ｓａｌｄａｎｈａら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３６：７０９〜１９、（１９９９）を参照のこと。
【０１７９】
ある実施形態では、ＣＢ１受容体に対する抗体の軽鎖及び重鎖の各可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、同一種または別の種に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）に移植され得る。ある実施形態では、ＣＢ１受容体に対する抗体の軽鎖及び重鎖の各可変領域のＣＤＲは、コンセンサスヒトＦＲに移植され得る。コンセンサスヒトＦＲを創作するため、ある実施形態では、ヒトの重鎖または軽鎖のいくつかのアミノ酸配列に由来する各ＦＲのアライメントを行い、コンセンサスアミノ酸配列を同定する。ある実施形態では、ＣＢ１受容体に対する抗体の重鎖または軽鎖の各ＦＲを別の重鎖または軽鎖に由来するＦＲと置換する。ある実施形態では、ＣＢ１受容体に対する抗体の重鎖及び軽鎖の各ＦＲ内にあるまれなアミノ酸は置換せず、それ以外のＦＲアミノ酸を置換する。まれなアミノ酸とは、通常ＦＲ内では見られない位置にある特定のアミノ酸である。ある実施形態では、ＣＢ１受容体に対する抗体由来の移植可変領域は、ＣＢ１受容体に対する抗体の定常領域とは異なる定常領域と共に使用できる。ある実施形態では、移植可変領域は、一本鎖Ｆｖ抗体の一部分である。ＣＤＲの移植については、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．：６，１８０，３７０；６，０５４，２９７；５，６９３，７６２；５，８５９，２０５；５，６９３，７６１；５，５６５，３３２；５，５８５，０８９；並びに５，５３０，１０１、並びに、Ｊｏｎｅｓ，ら．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２〜５２５、（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３〜３２７、（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，ら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４〜１５３６、（１９８８）、Ｗｉｎｔｅｒ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．，４３０：９２〜９４、（１９９８）に記載があり、これらは、何らかの目的で参照することにより本明細書に取り込まれる。
【０１８０】
ある実施形態では、抗原結合タンパク質（抗体など）は、抗原（例えば、ＣＢ１受容体またはその断片）を用いた免疫化により産生される。抗体は、完全長受容体、可溶形態の受容体、触媒ドメイン単独、成熟形態のＣＢ１受容体、受容体のスプライス多様体、またはその断片を用いた免疫化により産生され得る。ある実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体であり得、かつ／または組換え抗体であり得る。
【０１８１】
ある実施形態では、抗体の、自身の標的に対する親和性といった抗体本来の特性を操作するために各種方法を用いることができる。このような方法には、抗体をコードするポリヌクレオチド分子の部位特異的またはランダムな変異誘発を行い、抗体多様体を作製する方法の使用が含まれるが、これに限定されない。ある実施形態では、こうして作製した後、所望の変化、例えば、親和性の向上または低下を示す抗体多様体についてスクリーニングを行う。
【０１８２】
ある実施形態では、変異誘発方法の目的アミノ酸残基はＣＤＲ内のアミノ酸残基である。その他の実施形態では、可変ドメインのフレームワーク領域内のアミノ酸を目的とし得る。このようなフレームワーク領域は、特定の抗体の標的結合特性に寄与することが示されている。例えば、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、９：３９５〜４０２、（１９９９）及びその参考文献を参照のこと。
【０１８３】
ある実施形態では、より規模が小さく、より有効にスクリーニングされた抗体多様体ライブラリーは、ランダムまたは部位指向性の変異誘発をＣＤＲ内の高頻度変異部位、すなわち、体細胞親和性成熟法中に変異を受けやすい領域に対応する部位に限定することにより作製可能であり。例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ＆Ｐａｓｔａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：５６８〜５７２、（１９９９）及びその参考文献を参照のこと。ある実施形態では、特定種類のＤＮＡ要素を使用して高頻度変異部位の同定が可能であり、これらには、特定の直接反復及び逆方向反復、特定のコンセンサス配列、特定の二次構造、及び特定の回文などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、高頻度変異部位の同定に使用可能なかかるＤＮＡ要素には、プリン（ＡまたはＧ）の後にグアニン（Ｇ）、その後にピリミジン（ＣまたはＴ）、その後にアデノシンまたはチミジンのいずれか（ＡまたはＴ）（すなわち、Ａ／Ｇ-Ｇ-Ｃ／Ｔ-Ａ／Ｔ）を含む４塩基配列が含まれるが、これに限定されない。高頻度変異部位の同定に使用できるＤＮＡ要素の別の例は、セリンのコドンのＡ-Ｇ-Ｃ／Ｔである。
【０１８４】
さまざまな実施形態の好適な抗体、例えば、組換え抗体、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の調製には、当技術分野で公知の多くの技術を使用できる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５〜４９７、（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２、（１９８３）；Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐ．７７〜９６（１９８５）；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）；並びにＧｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ  ｅｄ．１９８６）を参照のこと）。対象抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子は、細胞からクローニング可能で、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、組換えモノクローナル抗体の作製に使用することができる。モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーをハイブリドーマまたは形質細胞から作製することもできる。重鎖及び軽鎖の遺伝子産物をランダムに組み合わせることで、抗原特異性の異なる抗体プールが大量に得られる（例えば、Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（３ｒｄ  ｅｄ．１９９７）を参照のこと）。一本鎖抗体または組換え抗体の作製技術（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，９４６，７７８；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，８１６，５６７）を適応させて、さまざまな実施形態のポリペプチド用抗体を作製することができる。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳類のような他の生物を使用してヒト化またはヒト抗体を発現させてもよい（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，６６１，０１６；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９〜７８３、（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８５６〜８５９、（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８１２〜１３、（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８４５〜５１、（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８２６、（１９９６）；並びにＬｏｎｂｅｒｇ＆Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３、（１９９５）を参照のこと）。別の方法では、ファージディスプレイ技術を使用して、選択抗原に特異的に結合する抗体及びヘテロマーＦａｂ断片を同定することができる、ｔｈａｔ（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２〜５５４、（１９９０）；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９〜７８３、（１９９２）を参照のこと）。抗体は、二重特異性、すなわち、異なる２つの抗原を認識できるよう作製可能である（例えば、ＷＯ９３／０８８２９、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５〜３６５９、（１９９１）；並びにＳｕｒｅｓｈら、方法ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０、（１９８６）参照のこと）。抗体は、ヘテロ複合体、例えば、共有結合で結合している２つの抗体、または免疫毒素（ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ）でもあり得る（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，６７６，９８０、ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；並びにＥＰ０３０８９を参照のこと）。
【０１８５】
非ヒト抗体をヒト化または霊長類化するする方法は、当技術分野において周知である。一般に、ヒト化抗体には、非ヒト供給源由来のアミノ酸残基を１以上導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば移入残基と呼ばれ、典型的に、移入可変ドメインから取り入れられる。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒ及び協力者らの方法に従い（例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２〜５２５、（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３〜３２７、（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，ら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４〜１５３６、（１９８８）及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６、（１９９２）を参照のこと）、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置き換えることにより実施できる。したがって、このようなヒト化抗体はキメラ抗体であり（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，８１６，５６７）、これにおいて、完全ヒト可変ドメインより実質的に少ないヒト可変ドメインが対応する非ヒト種配列で置き換えられている。実際には、ヒト化抗体は、典型的に、いくつかのＣＤＲ残基及びおそらくはいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体の類似部位由来の残基で置き換えられるヒト抗体である。
【０１８６】
別の代替法では、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．などのように、「ミニ座位（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」法が用いられている。ミニ座位（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）法では、外因性Ｉｇ座位は、Ｉｇ座位由来のピース（ｉｎｄｉｖｉＣＢ１遺伝子）を含めることにより模倣される。したがって、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、ミュー定常領域、及び通常は第２の定常領域（例えば、ガンマ定常領域）を構成体内に形成して動物に挿入される。この手法はＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，５４５，８０７（Ｓｕｒａｎｉ，ら）及びＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．：５，５４５，８０６；５，６２５，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，６６１，０１６；５，７７０，４２９；５，７８９，６５０；５，８１４，３１８；５，８７７，３９７；５，８７４，２９９；並びに６，２５５，４５８（それぞれＬｏｎｂｅｒｇ＆Ｋａｙ）、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，５９１，６６９及び６，０２３，０１０（Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ＆Ｂｅｒｎｓ）、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．５，６１２，２０５，５，７２１，３６７、及び５，７８９，２１５（Ｂｅｒｎｓら）、及びＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，６４３，７６３（Ｃｈｏｉ＆Ｄｕｎｎ）、及びＧｅｎＰｈａｒｍ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．：０７／５７４，７４８；０７／５７５，９６２；０７／８１０，２７９；０７／８５３，４０８；０７／９０４，０６８；０７／９９０，８６０；０８／０５３，１３１；０８／０９６，７６２；０８／１５５，３０１；０８／１６１，７３９；０８／１６５，６９９；０８／２０９，７４１に記載されており、それらの開示内容は参照により本明細書に取り込まれる。また、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．０５４６０７３Ｂ１、国際特許出願番号：ＷＯ９２／０３９１８；ＷＯ９２／２２６４５；ＷＯ９２／２２６４７；ＷＯ９２／２２６７０；ＷＯ９３／１２２２７；ＷＯ９４／００５６９；ＷＯ９４／２５５８５；ＷＯ９６／１４４３６；ＷＯ９７／１３８５２；並びにＷＯ９８／２４８８４、及びＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，９８１，１７５を参照のこと。なお、これらの開示内容は参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。さらに、Ｔａｙｌｏｒら、１９９２、Ｃｈｅｎら、１９９３；Ｔｕａｉｌｌｏｎら、１９９３；Ｃｈｏｉら、１９９３、Ｌｏｎｂｅｒｇら、（１９９４）；Ｔａｙｌｏｒら、（１９９４）、及びＴｕａｉｌｌｏｎら、（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、（１９９６）も参照のこと。なお、これらの開示内容は参照により本明細書に取り込まれる。
【０１８７】
ある実施形態では、抗体は「エフェクター」部分に結合している。エフェクター部分は、放射性標識または蛍光標識などの標識部分を含む任意の数の分子であり得るか、または治療的部分であり得る。
【０１８８】
抗体は、さらなるアミノ酸残基に融合され得る。このようなアミノ酸残基は、おそらくは単離を促すためにペプチドタグであり得る。抗体が特定の臓器または組織にホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）するための他のアミノ酸残基も意図される。
【０１８９】
ある実施形態では、本明細書に記載する抗体または本明細書に記載のあらゆるモノクローナル抗体の抗原結合領域を癌または網膜症の治療のために使用できる。
【０１９０】
十分に理解されるように、抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株に発現させることができる。特定の抗体をコードする配列を使用して好適な哺乳類宿主細胞を形質転換させることができる。形質転換は、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する任意の公知方法により可能であり、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス内（またはウイルスベクター内）にパッケージングし、宿主細胞にかかるウイルス（またはベクター）を用いて形質導入する方法、またはＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．：４，３９９，２１６；４，９１２，０４０；４，７４０，４６１；並びに４，９５９，４５５に例示されている、当技術分野で公知のトランスフェクション手順による方法などがある（これにより、これらの特許は参照により本明細書に組み込まれる）。使用する形質転換手順は、形質転換を受ける宿主に依存する。異種ポリヌクレオチドを哺乳類細胞に導入する方法は、当技術分野において周知であり、これらには、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降法、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔法、ポリヌクレオチド（複数可）のリポソーム内封入、及び核内への直接的ＤＮＡマイクロインジェクションが含まれる。
【０１９１】
発現用に宿主として利用可能な哺乳類細胞株は、当技術分野において周知であり、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を含み、これらには、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅｌａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨＥＰＧ２）、ヒト上皮腎２９３細胞など他の多数の細胞株が含まれるが、これらに限定されない。特定の望ましい細胞株の選択は、対象抗体を高発現している細胞株についての測定を介して行う。
【０１９２】
ある実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＭアイソタイプの少なくとも１つの免疫グロブリン分子を含むことができる。ある実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒトのカッパ型軽鎖及び／またはヒト重鎖を含む。ある実施形態では、重鎖はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＭアイソタイプの重鎖である。ある実施形態では、抗原結合タンパク質は、哺乳類細胞で発現させるためにクローニングされている。ある実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＭアイソタイプの定常領域のいずれでもない定常領域を含む。
【０１９３】
ある実施形態では、ＣＢ１受容体に対する抗体の機能的及び／または化学的特性を実質的に変更するには、（ａ）置換領域の分子骨格構造、例えば、シートまたは螺旋コンホメーション、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさ、を維持する作用において有意に異なる、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列の置換を選択することにより達成され得る。
【０１９４】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置でアミノ酸残基の極性または電荷にほとんど、またはまったく影響を与えないよう、野生型アミノ酸残基を非野生型残基で置換する方法を使用し得る。さらに、「アラニンスキャン変異誘発」について先に記載があるように、ポリペプチドのどの野生型残基でもアラニンで置換が可能である。
【０１９５】
所望のアミノ酸置換（保存的またか非保存的かは問わない）は、このような置換が所望される時点で当業者が判断することができる。ある実施形態では、アミノ酸置換を使用して、ＣＢ１受容体に対する抗体の重要残基を同定する、または本明細書に記載するＣＢ１受容体に対する抗体の親和性を向上もしくは低下させることができる。
【０１９６】
ある実施形態では、抗体または抗原結合タンパク質は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株に発現させることができる。特定の抗体をコードする配列を、好適な哺乳類宿主細胞の形質転換に使用できる。特定の実施形態によれば、形質転換は、例えばポリヌクレオチドをウイルス内（またはウイルスベクター内）にパッケージングし、宿主細胞にかかるウイルス（またはベクター）を用いて形質導入するか、またはＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．：４，３９９，２１６；４，９１２，０４０；４，７４０，４６１；並びに４，９５９，４５５に例示されている、当技術分野で公知のトランスフェクション手順など、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するためのいずれの公知方法でも可能である（これにより、これらの特許は、何らかの目的で参照することにより本明細書に組み込まれる）。ある実施形態では、使用する形質転換手順は形質転換を受ける宿主に依存し得る。異種ポリヌクレオチドを哺乳類細胞に導入する方法は、当技術分野において周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降法、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔法、ポリヌクレオチド（複数可）のリポソーム内封入、及び核内への直接的ＤＮＡマイクロインジェクションが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９７】
発現用に宿主として利用可能な哺乳類細胞株は当技術分野において周知であり、それらとして、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅｌａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨＥＰＧ２）など他の多数の細胞株を含むがこれらに限定されない、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が非限定的に含まれる。ある実施形態では、細胞株の選択は、発現レベルの高い細胞株、及び構成的ＨＧＦ結合特性を有する抗体を産生する細胞株についての測定を介して行う。哺乳類の宿主細胞に適切な発現ベクターは周知である。
【０１９８】
ある実施形態では、抗原結合タンパク質は、１つ以上のポリペプチドを含む。さまざまな発現ベクター／宿主系のいずれを使用しても、抗原結合タンパク質構成要素１つ以上または抗原結合タンパク質そのものを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を発現させることができる。このような系には、組換え型のバクテリオファージ、プラスミド、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を用いたトランスフェクションもしくは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）を用いた形質転換を行った植物細胞系；または動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９９】
ある実施形態では、抗原結合タンパク質構成要素１つ以上または抗原結合タンパク質そのものを含むポリペプチドは、組換えにより発現させた酵母である。特定のこのような実施形態では、市販の発現系、例えば、ピチア発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を製造者の指示書に従い使用する。ある実施形態では、このような系はプレ-プロ-α配列に依存して直接分泌する。ある実施形態では、インサートの転写は、メタノールで誘導された際にアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターにより引き起こされる。
【０２００】
ある実施形態では、抗原結合タンパク質構成要素を１つ以上または抗原結合タンパク質そのものを含む分泌されたポリペプチドを酵母生育培地から精製する。ある実施形態では、酵母生育培地を精製するために使用する方法は、細菌及び哺乳類の細胞の上清からポリペプチドを精製する際に使用する方法と同じである。
【０２０１】
ある実施形態では、抗原結合タンパク質構成要素１つ以上または抗原結合タンパク質そのものを含むポリペプチドをコードする核酸をｐＶＬ１３９３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のようなバキュロウイルス発現ベクター内にクローニングする。ある実施形態では、このようなベクターを製造者（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）の使用指示書にしたがって使用し、ｓＦ９無タンパク質培地内でＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染させ、組換え型ポリペプチドを得る。ある実施形態では、ポリペプチドを精製し、かかる培地からヘパリンセファロース（ｈｅｐａｒｉｎ-Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して濃縮させる。
【０２０２】
ある実施形態では、抗原結合タンパク質構成要素１つ以上または抗原結合タンパク質そのものを含むポリペプチドを昆虫系で発現させる。ポリペプチド発現用の特定の昆虫系は、当業者に周知である。このような系の１つでは、ｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使用して外来遺伝子をＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫に発現させる。ある実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸分子をウイルスの非必須遺伝子内、例えば、ポリヘドリン遺伝子内に挿入し、その遺伝子のプロモーター制御下に置く。ある実施形態では、核酸分子の挿入が成功すると非必須遺伝子が不活性となる。ある実施形態では、そうした不活性化で検出可能な特徴がもたらされる。例えば、ポリヘドリン遺伝子を不活性化すると外被タンパク質を欠くウイルスが得られる。
【０２０３】
ある実施形態では、組換え型ウイルスを使用して、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫を感染させることができる。例えば、Ｓｍｉｔｈ，ら．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４６：５８４、（１９８３）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、９１：３２２４〜７、（１９９４）を参照のこと。
【０２０４】
ある実施形態では、細菌細胞内に作製する抗原結合タンパク質構成要素１つ以上または抗原結合タンパク質そのものを含むポリペプチドを、不溶性封入体として細菌内に作製する。このような封入体を含む宿主細胞は、遠心分離し、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡで洗浄した後、０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）処理を室温にて１５分間行うことにより採取される。ある実施形態では、溶解液を超音波処理により澄明にし、１２，０００Ｘｇでて１０分間遠心分離を行い細胞残渣をペレットにする。ある実施形態では、ポリペプチド含有ペレットを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁させ、５０％グリセロール上に層状塗布した後、６０００Ｘｇで３０分間遠心分離を行う。ある実施形態では、得られたペレットをＭｇ＋＋及びＣａ＋＋を含有しない標準リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に再懸濁することができる。ある実施形態では、再懸濁したペレットを変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに分画することによりポリペプチドをさらに精製する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）。ある実施形態では、このようなゲルを０．４Ｍ  ＫＣｌに浸漬してそのタンパク質を可視化でき、これを切り取りＳＤＳを欠くゲルランニング（ｇｅｌ-ｒｕｎｎｉｎｇ）緩衝液内で電気溶出できる。特定の実施形態によれば、グルタチオンＳ-転移酵素（ＧＳＴ）融合タンパク質を可溶性タンパク質として細菌内に作製する。ある実施形態では、このようなＧＳＴ融合タンパク質は、ＧＳＴ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して精製する。
【０２０５】
ある実施形態では、特定のポリペプチド、例えば、抗原結合タンパク質構成要素１つ以上または抗原結合タンパク質そのものを含むポリペプチドを「リフォールディングする」ことが望ましい。ある実施形態では、このようなポリペプチドは、本明細書で論じる特定の組換え系を使用して作製する。ある実施形態では、ポリペプチドを「リフォールディング」し、かつ／または酸化して所望の三次構造を形成し、かつ／またはジスルフィド結合を生成させる。ある実施形態では、このような構造及び／または結合は、ポリペプチドの特定の生物学活性に関連している。ある実施形態では、リフォールディングを、当技術分野で公知の多数の手順の任意の手順を使用して達成する。例示的方法には、可溶化されたポリペプチド物質をカオトロピック物質の存在下で典型的に７を超えるｐＨに暴露する方法が含まれるが、これに限定されない。例示的なカオトロピック物質はグアニジンである。ある実施形態では、リフォールディング／酸化用溶液は、還元剤及びその還元剤の酸化型も含有する。ある実施形態では、還元剤及びその酸化型は、ジスルフィド結合シャッフリングの発生を可能にする特定の酸化還元電位を発生させる比で存在する。ある実施形態では、このようなシャッフリングによりシステイン架橋の形成が可能になる。例示的な酸化還元対には、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオトレイトールＤＴＴ／ジチアンＤＴＴ、及び２-メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ-ｂＭＥが含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、共溶媒を使用してリフォールディングの有効性を高める。例示的な共溶媒は、グリセロール、さまざまな分子量のポリエチレングリコール、及びアルギニンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２０６】
ある実施形態では、抗原結合タンパク質構成要素１つ以上または抗原結合タンパク質そのものを含むポリペプチドは実質的に精製される。特定のタンパク質精製技術は当業者に公知である。ある実施形態では、タンパク質の精製には非ポリペプチド画分から分画したポリペプチド粗分画を使用する。ある実施形態では、ポリペプチドを、クロマトグラフィー法及び／または電気泳動法を使用して精製する。例示的な精製方法には、硫酸アンモニウム塩析；ＰＥＧ沈殿；免疫沈降法；加熱変性とその後の遠心分離；アフィニティクロマトグラフィ（例えば、タプロテインＡセファロース）、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、及び逆相クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されないクロマトグラフィー；ゲルろ過；ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー；等電点電気泳動法；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；並びに各種の組み合わせ技術が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、ポリペプチドを、高速タンパク質液体クロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製する。ある実施形態では、精製工程の交換または特定工程の省略が可能であり、なおも実質的に精製されたポリペプチドの調製方法として好適である。
【０２０７】
ある実施形態では、ポリペプチド調製物の精製度を定量化する。精製度を定量化する特定の方法は、当業者に公知である。特定方法の例には、調製物の特異的結合活性の測定及びＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析による調製物内ポリペプチド量の評価が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチド調製物の精製量を評価する特定方法例には、調製物の結合活性の計算及び初期抽出物の結合活性との比較を含む。ある実施形態では、このような計算結果は「倍精製？」として表される。結合活性量を表すために用いる単位は実施する個々のアッセイにより決定される。
【０２０８】
ある実施形態では、抗原結合タンパク質構成要素１つ以上または抗原結合タンパク質そのものを含むポリペプチドを部分的に精製する。部分的精製は、精製工程を少なくする、または同じ一般精製スキームの異なる形態を使用することにより達成され得る。例えば、ある実施形態では、ＨＰＬＣ装置を用いて行う陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般に、低圧クロマトグラフィー系を用いた同一手法よりも「倍精製」が大きくなる。ある実施形態では、精製度が低い方法は回収ポリペプチド総量、またはポリペプチドの結合活性維持の点で有利である。
【０２０９】
場合によっては、ポリペプチドの電気泳動移動はＳＤＳ／ＰＡＧＥの条件により、場合によっては極めて異なる。例えば、Ｃａｐａｌｄｉ，ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、７６：４２５、（１９７７）を参照のこと。異なる電気泳動条件下では、精製された、または部分的に精製されたポリペプチドの見かけの分子量は異なり得ることは認識されよう。
【０２１０】
本明細書に記載するさまざまな実施形態では、抗体は、研究方法または診断方法用にインビボ及びインビトロで使用可能であり、それらの方法は当技術分野において周知である。かかる診断方法は、さまざまな実施形態の抗体を含有するキットを含む。その他の実施形態では、本明細書に記載する抗体を治療用として使用できる。
【０２１１】
ＣＢ１-受容体抗体を予防または治療を目的として哺乳類に使用する場合、かかる抗体は、薬理学的に許容される担体をさらに含むことができる組成物の形態で投与可能であることが理解される。好適な薬理学的に許容される担体としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１つ以上、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０２１２】
薬理学的に許容される担体は、抗原結合タンパク質の有効期間または有効性を高める、湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤または緩衝剤などの少量の助剤をさらに含むことができる。注射組成物は、当技術分野で周知であるように、哺乳類への投与後、活性成分を速効的、持続的または遅効的に放出されるように製剤化することができる。
【０２１３】
医薬製剤、特に、本明細書に記載の使用に供する抗体の製剤は、所望の純度を有する抗体と、任意の薬理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤とを混合することにより調製可能である。このような製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液であり得る。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに非毒性である。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩などの有機酸；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）保存剤  低分子量ポリペプチド；血清アルブミンもしくはゼラチンなどのタンパク質、またはポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｌｌｏｌｉｄｏｎｅ）などの親水性ポリマー；並びにアミノ酸、単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、またはデキストリンなどの他の炭水化物；キレート剤；並びにイオン性及び非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート）；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）；並びに／または非イオン性界面活性剤であり得る。抗体は、濃度０．５〜２００ｍｇ／ｍｌで製剤化し得る。
【０２１４】
治療用途では、組成物を、疾患（例えば、筋肉消耗性疾患）に罹患している患者に「治療的有効用量」を投与する。この用途の有効量は疾患重症度及び患者の全身健康状態に依存する。組成物の投与は、患者に必要、かつ忍容される用量及び頻度に応じ、単回または頻回投与で行ってよい。本明細書における「患者」または「被検者」には、ヒト及び他の動物、特に哺乳類のいずれも含むことができる。したがって、かかる方法はヒトの治療及び獣医学用途の双方に適用可能である。さまざまな実施形態では、患者は哺乳類である。哺乳類は、霊長類、さらにはヒトであり得る。
【０２１５】
医薬組成物の投与経路は、公知の方法と一致し、例えば、経口投与、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、病変内の各経路、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮、皮下、または腹腔内への注射投与；並びに、持続放出系または植込みデバイスの経鼻、腸内、局所、舌下、尿道、膣、もしくは直腸の各手段による投与である。所望される場合、組成物は、ボーラス注射または持続的輸注、または植込みデバイスにより投与してよい。別法または追加として、組成物を、所望分子を吸収させた、または封入した膜、スポンジ、または別の適切な材料を介して局所的に投与してよい。植込みデバイスを使用する場合、かかるデバイスは、任意の好適な組織または器官内に植込んでよく、所望分子の送達は、拡散、徐放性  ボーラス、または連続投与を介して行ってよい。
【０２１６】
ある実施形態では、製剤成分は、投与部位に対し許容される濃度で存在している。ある実施形態では、組成物を生理的ｐＨまたはそれよりわずかに低いｐＨ、典型的には範囲約５〜約８ｐＨ以内に維持するために緩衝剤を使用する。
【０２１７】
ある実施形態では、非経口投与を考える場合、治療組成物は、ＣＢ１に対する所望のＣＢ１受容体抗原結合タンパク質を、さらなる治療剤の有無を問わず、薬理学的に許容されるビヒクルに含む、パイロジェンフリーの非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。ある実施形態では、注射用ビヒクルは無菌蒸留水であり、その中で、１剤以上のさらなる治療剤の有無を問わず、ＣＢ１受容体に対するＣＢ１受容体抗原結合タンパク質を、適切に保存された無菌等張液として製剤化する。ある実施形態では、調製に際し、注入可能な微粒子、生物侵食性粒子、高分子化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸などの）、ビーズ、またはリポソームなどの物質を用いて所望分子を製剤化することができ、これにより、製剤の制御放出または持続放出が可能となり、デポー注射を介して送達することができる。ある実施形態では、ヒアルロン酸を使用することも可能であり、循環中で徐放的な持続を促進する効果を有し得る。ある実施形態では、植込み型の薬物送達デバイスを使用して所望分子を導入することができる。
【０２１８】
ＣＢ１受容体抗原結合組成物の使用
本発明は、ＣＢ１受容体の量または活性を抑制、低下または中和する方法及び医薬組成物を提供する。
【０２１９】
ある態様では、本発明は、有効用量のＣＢ１受容体抗原結合タンパク質組成物を被検者に投与することにより、このような治療を必要としている被検者のＣＢ１関連障害を治療する方法及び試薬を提供する。本明細書で使用する用語「被検者」とは、ヒトを含む哺乳類などあらゆる動物をいう。
【０２２０】
ＣＢ１受容体抗原結合タンパク質組成物により治療可能な障害として、糖尿病及び関連障害などさまざまな代謝性障害が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２１】
本明細書に記載する抗原結合タンパク質を投与すると、血漿グルコース値または脂質濃度が改善される可能性がある。したがって、本明細書に開示する組成物の投与により、適切な被検者の糖尿病、肥満または高血糖状態が改善される可能性がある。さらに、抗原結合タンパク質を含有する組成物は、個人の摂食量を低減させる可能性がある。
【０２２２】
本発明の他の態様は当業者に理解されるものであり、それらは本明細書に記載されている。以下の実施例を含め、本発明のさまざまな実施形態が本明細書に記載されているが、本明細書に詳述される具体的実施例及び試験はあくまで例示にすぎないことは、当業者には十分に理解されるであろう。本発明の趣旨から逸脱することなくさまざまな修正が可能であることを理解されるべきである。
【実施例】
【０２２３】
以下の配列は、本出願に関連するものである：
表２
【表２−１】
2020196763.tif 000004
【表２−２】
2020196763.tif 000005
【０２２４】
実施例１
抗体生成
複数抗体のキャンペーンを実施した。第１のキャンペーンでは、ヒトＣＢ１のアンタゴニスト１０Ｄ１０を含め、４１のＣＢ１結合体を同定した。第２のキャンペーンでは、５０７のＣＢ１結合体を得たが、いずれもＣＢ１アンタゴニストではなかった。第３のキャンペーンでは、５８のＣＢ１結合体を同定し、すべてヒトＣＢ１のアンタゴニストであった。ＣＢ１結合抗体はいずれもマウスＣＢ１に対しアンタゴニストではなかった。
【０２２５】
ＣＢ１抗体１０Ｄ１０を、ＰＡＤＲＥ-ｈＣＢ１及びＥ３Ｋ-ｈＣＢ１を発現している一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を用いてゼノマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）株ＸＭＧ２／Ｋ及びＸＭＧ４／ＫＬを免疫化することにより、生成した。陽性の抗体価を示すマウス由来の免疫細胞組織を回収、プールし、ハイブリドーマ作製用に供した。ｈＣＢ１結合抗体含有ハイブリドーマ・スーパータント（ｓｕｐｅｒｔａｎｔｓ）をｈＣＢ１発現ＣＨＯ細胞を使用してＦＡＣＳ解析により同定し、アンタゴニスト活性を、ｈＣＢ１  ｃＡＭＰアッセイを使用して評価した。
【０２２６】
抗体１０Ｄ１０を得て配列決定を行った。重鎖、軽鎖、ＣＤＲ領域及びフレームワーク領域の配列を以下に提供する。
１０Ｄ１０  ＨＣ（配列番号４）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＲＲＧＧＤＹＷＳＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＡＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＤＩＬＴＧＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
１０Ｄ１０  ＬＣ（配列番号５）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＲＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２２７】
１０Ｄ１０のＣＤＲ領域及びフレームワーク領域の配列は以下のとおりである：
ＣＤＲ配列
ＨＣ-ＣＤＲ１  ＲＧＧＤＹＷＳ（配列番号１７）
ＨＣ-ＣＤＲ２  ＹＩＹＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１８）
ＨＣ-ＣＤＲ３  ＤＹＤＩＬＴＧＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号１９）
ＬＣ-ＣＤＲ１  ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤ（配列番号２０）
ＬＣ-ＣＤＲ２  ＬＧＳＮＲＡＳ（配列番号２１）
ＬＣ-ＣＤＲ３  ＭＱＡＬＱＴＰＲＴ（配列番号２２）
フレームワーク配列
ＨＣ-ＦＲ１  ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＲ（配列番号２３）
ＨＣ-ＦＲ２  ＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（配列番号２４）
ＨＣ-ＦＲ３  ＲＡＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号２７）
ＬＣ-ＦＲ１  ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣ（配列番号２８）
ＬＣ-ＦＲ２  ＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹ（配列番号２９）
ＬＣ-ＦＲ３  ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＲＲＶＥＡＥＤＶＧＹＹＣ（配列番号３０）
【０２２８】
いくつかのさらなる抗体のＨＣ及びＬＣのフレームワーク領域及びＣＤＲ領域を、図２Ａ〜２Ｂに提供する。これらは、ＨＣ  ＦＲ１（配列番号２３）、ＨＣ  ＦＲ２（配列番号２４）及びＨＣ  ＦＲ３（配列番号２７）である。関連する、ＨＣ  ＣＤＲ１（配列番号１７）、ＨＣ  ＣＤＲ２（配列番号２６−ｙｉｙｙｓｇｓｔＹｙｎｐｓｌｋｓ）及びＨＣ  ＣＤＲ３（配列番号１９）配列も、同図に提供する。また、関連する、ＬＣ  ＣＤＲ１（配列番号２０）、ＬＣ  ＣＤＲ２（配列番号２１）及びＬＣ  ＣＤＲ３（配列番号２２）も示す。図を解釈する当業者であれば、１Ａ１１の配列から開始し、あとは指定されているアミノ酸の変更を行えば、さらに記載されている抗体の配列が得られることがわかるであろう。
【０２２９】
抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域の変異誘発を行い、さらなる抗原結合タンパク質を得た。単一アミノ酸残基のランダム変異誘発（ＮＮＫコドン）（Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣ；Ｋ＝ＴまたはＧ）を、上記のＨＣ-ＣＤＲ全３領域及びＬＣ-ＣＤＲ全３領域のすべての残基について実施した（配列番号１７〜２２）。
【０２３０】
変異誘発プライマーを、２４の野生型ヌクレオチドの５-プライムと２４の野生型ヌクレオチドの３-プライムとを有するＮＮＫを目的位置に隣接させることにより設計した。ＨＣ-ＣＤＲで４０か所及びＬＣ-ＣＤＲで３２か所の位置をそれぞれ変異させた。合計１３６８変異体を作製した。
【０２３１】
ｐＴＴ５ベクターの、１０Ｄ１０重鎖含有プラスミドＤＮＡ及び１０Ｄ１０軽鎖含有プラスミドＤＮＡを、変異誘発反応の鋳型として使用した。ＣＢ１変異体を、配列決定及び単離により同定した。単一残基変異体を、全軽鎖変異体と野生型重鎖とのペアリング、及び全重鎖変異体と野生型軽鎖とのペアリングを行い創作した。条件培地（ＣＭ）をトランスフェクション後第７日目に回収し、細胞ベースＥＬＩＳＡに使用して結合性を評価した。
【０２３２】
ＣＤＲの有益な変異２〜４を特定の変異誘発プライマーを使用して組み合わせ、部位指向性複合変異体（ＣＳＤＭ）を作製した。親和性がさらに改善されたＣＳＤＭを、抗体濃度０．１ｕｇ／ｍＬでＦＡＣＳにより同定した。ＣＳＤＭ変異体ＬＣとＣＳＤＭ変異体ＨＣとのペアリングにより親和性がさらに改善された。ＣＳＤＭ変異体の生化学的特性を改善するため、特定の変異誘発プライマーを使用してＮ３５Ｙ変異をＣＳＤＭ変異体ＬＣに加えた。
【０２３３】
１０Ｄ１０を基にした以下のＬＣ及びＨＣ変異体が得られ、その配列を以下に示す。
【０２３４】
１０Ｄ１０-Ｄ８３Ｋ  ＨＣ（配列番号６）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＲＲＧＧＤＹＷＳＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＡＴＩＳＶＫＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＤＩＬＴＧＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２３５】
１０Ｄ１０-３１Ｙ  ＨＣ、１０Ｄ１０-４１Ｙ  ＨＣ、１０Ｄ１０-４３Ｙ  ＨＣ（Ｈ２-１）（配列番号７）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＲＲＧＧＤＹＷＳＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＬＹＮＰＲＬＫＳＲＡＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＤＩＬＴＧＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２３６】
１０Ｄ１０-３１Ｙ  ＬＣ（Ｌ１-８Ｙ）（配列番号８）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＹＨＳＹＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＲＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２３７】
１０Ｄ１０-３１Ｙ  Ｒ９４Ｓ  ＬＣ（Ｌ１-８Ｙ  Ｒ９４Ｓ）（配列番号９）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＹＨＳＹＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２３８】
１０Ｄ１０-４１Ｙ  ＬＣ（Ｌ２-１Ｙ）（配列番号１０）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＹＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＹＫＫＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＲＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２３９】
１０Ｄ１０-４１Ｙ  Ｒ９４Ｓ  ＬＣ（Ｌ２-１Ｙ  Ｒ９４Ｓ）（配列番号１１）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＹＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＹＫＫＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２４０】
１０Ｄ１０-４３Ｙ  ＬＣ（Ｌ３-２Ｙ）（配列番号１２）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＹＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＲＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＲＧＴＶＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２４１】
１０Ｄ１０-４３Ｙ  Ｒ９４Ｓ  ＬＣ（Ｌ３-２Ｙ  Ｒ９４Ｓ）（配列番号１３）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＹＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＲＧＴＶＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２４２】
１０Ｄ１０-ＬＹＹＹ-５  ＬＣ（Ｌ１ＹＹＹ-５）（配列番号１４）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＹＹＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＲＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２４３】
１０Ｄ１０-ＬＹＹＹ-５  Ｒ９４Ｓ  ＬＣ（Ｌ１ＹＹＹ-５  Ｒ９４Ｓ）（配列番号１５）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＹＹＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２４４】
１０Ｄ１０-Ｎ３５Ｙ  ＬＣ（Ｎ３５Ｙ）（配列番号１６）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＹＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＲＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２４５】
変異ＨＣと変異ＬＣのさまざまな組み合わせが作られた。かかる組み合わせを、表３に記載する。
表３
【表３】
2020196763.tif 000006
【０２４６】
親和性の高い成熟抗体の特性を、図３に示す。
【０２４７】
図２は、第１のキャンペーンの結合体に関する資料を提供する。図には、ＨＣ及びＬＣのフレームワーク配列及びＣＤＲ配列が示されている。各種抗体間の配列に大きな相違はないことに留意されるであろう。図２Ａ及び２Ｂを見てみると、当業者であれば、図に開示したさらなる抗体を得るために、１Ａ１１の提示配列で１〜８のアミノ酸の置換が可能であることが認識されるであろう。これらの抗体はいずれも、本開示のさまざまな実施形態に包含され得る。
【０２４８】
共分散分析により抗体に対するさらなる変更が示唆される。これらの示唆される変更を、下記表４及び５に示す。
表４．共分散分析で示唆される３１Ｙ、４１Ｙ、４３Ｙ及びＬＹＹＹ-５の各多様体への変更
【表４】
2020196763.tif 000007
表５．さらなる共分散分析で示唆されるＮ３５Ｙ／Ｄ８３Ｋ及びＤ８３Ｒの各多様体への変更
【表５】
2020196763.tif 000008
【０２４９】
実施例２
抗体特性
いくつかの異なる抗体の特性を各種アッセイを使用して明らかにしＣＢ１受容体抗体の特性について研究した。例示的抗体１０Ｄ１０は、ゼノマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）抗体（すなわち、ヒト抗体）であり、ｃＡＭＰ、エクオリン及びＧＴＰ-Ｅｕ各アッセイでは機能的である。これらのアッセイの結果から、抗体は、合成アゴニスト（ＣＰ５５，９４０）及び内因性（アナンダミド）アゴニストに拮抗すること、及び図１のＥＣ２ドメイン領域により提示されるエピトープに結合することが示される。
【０２５０】
１０Ｄ１０、及び、アンタゴニストではない別の抗体３Ａ４の、野生型ＣＢ１受容体及び変異型ＣＢ１受容体の両配列に対する結合の結果を図４Ａにまとめている。分析に使用した異なる変異体ＣＢ１受容体を絵図を用いて表している。それらには、野生型ヒトＣＢ１（ｈＣＢ１）、野生型マウスＣＢ１（ｍＣＢ１）、細胞外Ｎ末端（ΔＮＴ）を含有しないヒトＣＢ１、ＥＣ１（Ｒ１８６Ｐ）及びＥＣ２（Ｅ２５８Ｋ及びＨ２７０Ｌ）に単一アミノ酸置換を含有するヒトＣＢ１受容体、及びヒトＣＢ１（ｈＣＢ２／ｈＣＢ１）の細胞外ループ３本を含有するヒトＣＢ２が含まれている。
【０２５１】
ＥＣ２ドメイン領域（Ｅ２５８Ｋ及びＨ２７０Ｌ）に変異がある場合、またはＣＢ１にマウス配列がある場合は、１０Ｄ１０は結合または拮抗しないが、ＥＣ１ドメイン領域（Ｒ１８６Ｐ）で変異をさせた場合はなおも拮抗することがわかる。１０Ｄ１０は、細胞外Ｎ末端を含有しない変異ＣＢ１受容体も結合及び拮抗するであろう。これとは対照的に、３Ａ４抗体は、ＣＢ１のＥＣ１またはＥＣ２各ドメインいずれも変異があったにも関わらず、なおも結合し、拮抗はしないが、細胞外Ｎ末端を含有しない変異ＣＢ１受容体には結合しない。
【０２５２】
図４Ｂは、ＦＡＣＳアッセイでさまざまな受容体構成体を用いてトランスフェクトした細胞に対するＣＢ１抗体の結合を示す。各受容体のＮ末端にあるエピトープタグ（例えば、Ｖ５またはＥ３Ｋ）に対して生成された抗体により受容体発現を記録に取る。試験に使用する受容体は、野生型マウスＣＢ１（Ｖ５-ｍＣＢ１）、野生型ヒトＣＢ１（Ｖ５-ｈＣＢ１）、細胞外Ｎ末端を含有しないヒトＣＢ１（Ｅ３Ｋ-ｈＣＢ１Ｄｅｌ．ＮＴ）、ヒトＣＢ１の細胞外ループ３本を含有するヒトＣＢ２（Ｖ５-ｈＣＢ２／ｈＣＢ１  ＥＣＬ１-３）、単一アミノ酸置換をＥＣ１（Ｖ５-ｈＣＢ１  Ｒ１８６Ｐ）及びＥＣ２（Ｖ５-ｈＣＢ１  Ｅ２５８Ｋ及びＶ５-ｈＣＢ１  Ｈ２７０Ｌ）に含有する３つのヒトＣＢ１受容体である。細胞を、無抗体（Ｕｎ）、対照抗体（ＩｇＧ-ＰＥ）、抗Ｖ５抗体（Ｖ５）、抗Ｅ３Ｋ抗体（Ｅ３Ｋ）、及びさまざまな抗ＣＢ１抗体（３Ａ４、３Ｈ７、１０Ｂ４、１０Ｄ２、１０Ｄ１０、１Ａ１１、１Ｅ９、及び５Ｇ４）いずれかを用いてプローブした。強調表示されている欄は、アッセイの陽性シグナルを指す。１０Ｂ４及び１０Ｄ２では結合を示すようには見られないことに留意すべきである。これは、Ａｂ低濃度またはクローンが成長した際に結合活性を消失したためである可能性がある。
【０２５３】
図４Ｃは、アンタゴニスト活性には１０Ｄ１０がＣＢ１に結合することが必要であることを示す。図示したデータはエクオリンアッセイのものである。陽性対照である低分子アンタゴニストＳＲ１４１７１６Ａは、野生型のＣＢ１、ｈＣＢ１  Ｒ１８６Ｐ、ｈＣＢ１  Ｈ２７０Ｌ、及びｈＣＢ１  Ｅ２５８Ｋで活性である。１０Ｄ１０は、結合相手である野生型のＣＢ１及びｈＣＢ１  Ｒ１８６Ｐでのみアンタゴニスト活性を示し、結合相手ではないｈＣＢ１  Ｈ２７０Ｌ及びｈＣＢ１  Ｅ２５８Ｋではアンタゴニスト活性は示さない。
【０２５４】
抗体特性を明らかにするために使用したアッセイを以下に記載する。
【０２５５】
ＧＴＰ-Ｅｕアッセイ
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製試薬ＤＥＬＦＩＡ  ＧＴＰ-Ｅｕ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ、ＤＥＬＦＩＡ  ＧＴＰ-ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒｓ、及びｈＣＢ１膜を使用してＧＴＰ-Ｅｕアッセイを実施した。アンタゴニストを、膜４．５ｕｇ／ウェル、５０ｕｇ／ウェルのサポニン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｎＭ  ＧＴＰ-Ｅｕ、５ｕＭ  ＧＤＰ、０．１％ＢＳＡ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳとともに９６ウェルろ過プレートＰａｌｌ  ＡｒｃｏＷｅｌｌで１５分間プレインキュベートし、次いで、６００ｎＭ（図６Ａ）または、ＣＢ１アゴニストのアナンダミドの用量反応（図６Ｂ）量を４５分間付加してアンタゴニスト活性を測定した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅマニフォールドを使用してプレートをＧＴＰ洗浄緩衝液で２回洗浄し、Ｖｉｃｔｏｒリーダーで読み取った。
ｃＡＭＰアッセイ
ｈＣＢ１を安定発現しているＣＨＯ細胞（Ｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ）を、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｌ-グルタミン、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び４００ｕｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含有するＤＭＥＭ内で増殖させた。アンタゴニスト活性を測定するため、０．５％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｌ-グルタミン、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び４００ｕｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含有するＤＭＥＭ８０ｕｌ内にウェルあたり１０，０００細胞の濃度で９６ウェルプレートに細胞を播種した。一晩インキュベーションした後、培地を５μｌの新鮮培地と交換し、次いで、５μｌフォルスコリン及びＣＰ５５-９４０を培地に添加し、その後、抗体４０μｌを加えた。フォルスコリン及びＣＰ５５，９４０の最終濃度はそれぞれ１５μＭ及び２５０ｐＭであった。抗体をｐＨ５．０酢酸ナトリウム（ＮａＡｃｅｔａｔｅ）１０ｍＭ，ＮａＣｌ１５０ｍＭで希釈した。フォルスコリン／ＣＰ５５，９４０／抗体の混合物を細胞上に３７℃にて３０分間放置してから取り出し、ｃＡＭＰレベルを、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  ＸＳ＋ｃＡＭＰアッセイキットを製造者の操作手順にしたがって使用し測定した。プレートの読取りをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社のＶｉｅｗＬｕｘ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｉｍａｇｅｒで３０秒間行った。
エクオリンアッセイ
１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２で増殖させたＣＨＯＫ１細胞を１０ｃｍ皿に皿あたり５ｘ１０６細胞の濃度で採取し、その後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用しＣＢ１をコードするプラスミドとＧａ１６とエクオリンとを２：１：１０の比で用いてＯｐｔｉ-Ｍｅｍ内に一過的にトランスフェクションした。一晩インキュベーションした後、細胞をトリプシン処理して、ＨＢＳＳ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０１％無脂肪酸ＢＳＡ及び１０ｕｌセレンテラジン（１ｕｇ／ｕｌ）を含有するエクオリン緩衝液１０ｍｌ内に再懸濁させ、フォイルで覆ったビーカーに移して室温にて２時間穏やかに撹拌した。細胞を、Ｍｉｃｒｏｌｕｍａｔを用いて、最終濃度の２倍の抗体及び６０ｎＭ  ＣＰ５５，９４０を含有する予め温めた（３７oＣ）アッセイプレートに分注した。典型的に、１００ｕｌの細胞を１００ｕｌの被験物に加えた。動態測定を２０ｓ実施し、２〜２０ｓの曲線下面積を使用して用量反応曲線を作成した。
ＫｉｎＥｘＡ法アッセイ
１％ＦＢＳ及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２でｈｕＣＢ１を発現しているＣＨＯ３５細胞１ｘ１０６，３ｘ１０６、及び９ｘ１０６細胞／ｍｌと共に１００ｐＭ抗体をインキュベートし、試料を４時間室温にて振動させた。結合しなかった遊離の抗体を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ遠心分離器を約２２０ｘｇで５分間使用して全細胞及び抗体-細胞複合体から分離した。上清を０．２２μＭフィルターでろ過した後、ヤギ抗ｈｕＦｃコーティングＵｌｔｒａＬｉｎｋ  Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔレジンに通した。ビーズに結合したＡｂ量を蛍光標識した抗ｈｕＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体で定量化した。結合シグナルは、各細胞濃度で、溶液中の遊離Ａｂ濃度に比例する。相対結合シグナル１００％は、１００ｐＭ抗体単体を表す。シグナル低下は、抗体が細胞と結合していることを指す。
【０２５６】
１０Ｄ１０抗体は、マウスＣＢ１（配列番号２）を認識せず、ｈＣＢ１に対し２００ｎＭ未満の親和性を有する。その後、インビトロでの熟成を試みた結果、やはりヒトＣＢ１受容体のシグナル伝達を拮抗する、より強力な（約４〜６倍）さらなる抗体を得た。これらの抗体例はＮ３５Ｙ／Ｄ８３Ｋ、４１Ｙ、４３Ｙ、ＬＹＹＹ-５である。
【０２５７】
Ｎ３５Ｗは、１０Ｄ１０を基にした、親和性が成熟した拮抗的ＣＢ１抗体であり、１０Ｄ１０より約４倍強力である。これを図５Ａ-５Ｃに示す。図５Ａにおいて、ｃＡＭＰアッセイによるＮ３５ＷのＥＣ５０は６．９７３×１０-８であるのに対し、１０Ｄ１０は２．８２６×１０-７である。また、１０Ｄ１０及びＮ３５Ｗの双方において、濃度上昇に伴いｃＡＭＰレベルが上昇することがわかる。エクオリンアッセイ（図５Ｂ）では、Ｎ３５ＷのＥＣ５０は３．８７８×１０-７であるのに対し、１０Ｄ１０は１．５２０×１０-６であり、抗体量が増加すると曲線下面積は減少する。両図において、抗体量の増加
に伴うＣＢ１阻害が示されている。
【０２５８】
ＫｉｎＥｘＡ結合分析（図５ｃ）から、１０Ｄ１０より多くのＮ３５Ｗが、ＣＨＯ細胞を発現しているＣＢ１に結合していることがわかり（インキュベーション後の遊離抗体数が少ない）、Ｎ３５Ｗは、１０Ｄ１０よりも結合親和性が高いことを意味している。
【０２５９】
図６Ａは、ＧＴＰ-Ｅｕアッセイにおいて、ＣＢ１抗体である１０Ｄ１０、１Ｅ９及び３Ｈ７が内因性ＣＢ１アゴニストのアナンダミドを拮抗することを示している。本アッセイでは、低分子アンタゴニストＳＲ１４１７１６Ａを比較対照として用い、４アンタゴニストすべてのＩＣ５０値が表６に示されている。図６Ｂは、ＧＴＰ-Ｅｕアッセイにおいて、１０Ｄ１０の濃度を高くするとアナンダミドの用量反応曲線が右へ移動することを示しており、１０Ｄ１０のアンタゴニスト活性をさらに示している。
表６
【表６】
2020196763.tif 000009
【０２６０】
実施例３
いくつかの１０Ｄ１０変異体を調製した。被験抗体実施例はＹ５４１４３であり、１０Ｄ１０-ＬＹＹＹ５．００２  ＨＣ（配列番号３７）とペアリングさせた１０Ｄ１０-Ｙ５４１４３  ＬＣ（配列番号３６）を有し、Ｔ１４４Ｌ変異をＨＣ内に含有する。また、Ｙ５４１４３-Ｂも１０Ｄ１０-Ｙ５４１４３  ＬＣ（配列番号３６）を有し、１０Ｄ１０-３１Ｙ．００２  ＨＣ（配列番号３８）とペアリングされている。配列を下記に示す：
【０２６１】
１０Ｄ１０-３１４１  ＬＣ（配列番号３１）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＹＨＳＹＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＹＫＫＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２６２】
１０Ｄ１０-３１４３  ＬＣ（配列番号３２）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＹＨＳＹＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＲＧＴＶＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２６３】
１０Ｄ１０-３１４１４３  ＬＣ（配列番号３３）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＹＨＳＹＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＹＫＫＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＲＧＴＶＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２６４】
１０Ｄ１０-Ｙ５４１  ＬＣ（配列番号３４）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＹＹＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＹＫＫＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２６５】
１０Ｄ１０-Ｙ５４３  ＬＣ（配列番号３５）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＹＹＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＲＧＴＶＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２６６】
１０Ｄ１０-Ｙ５４１４３  ＬＣ（配列番号３６）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＹＹＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＹＫＫＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＲＧＴＶＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２６７】
１０Ｄ１０-ＬＹＹＹ５．００２  ＨＣ（配列番号３７）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＲＲＧＧＤＹＷＳＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＡＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＤＩＬＴＧＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２６８】
１０Ｄ１０-３１Ｙ．００２  ＨＣ（配列番号３８）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＲＲＧＧＤＹＷＳＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＬＹＮＰＲＬＫＳＲＡＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＤＩＬＴＧＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２６９】
プロリン置換を有する、１０Ｄ１０変異体のＬＣ及びＨＣ
１０Ｄ１０-Ｙ５４１４３-ＬＰ１  ＬＣ（配列番号３９）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＹＹＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＹＫＫＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＲＧＴＶＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２７０】
１０Ｄ１０-Ｙ５４１４３-ＬＰ２  ＬＣ（配列番号４０）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＹＹＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＹＫＫＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＰＲＧＴＶＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２７１】
１０Ｄ１０-Ｙ５４１４３-ＬＰ３  ＬＣ（配列番号４１）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＹＹＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＹＫＫＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＰＲＧＴＶＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２７２】
１０Ｄ１０-Ｙ５４１４３-ＨＰ１  ＨＣ（配列番号４２）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＲＲＧＧＤＹＷＳＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＬＹＮＰＲＬＫＳＲＡＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＤＰＬＴＧＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２７３】
１０Ｄ１０-Ｙ５４１４３-ＨＰ２  ＨＣ（配列番号４３）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＲＲＧＧＤＹＷＳＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＬＹＮＰＲＬＫＳＲＡＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＤＩＰＴＧＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２７４】
１０Ｄ１０-Ｙ５４１４３-ＨＰ３  ＨＣ（配列番号４４）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＲＲＧＧＤＹＷＳＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＬＹＮＰＲＬＫＳＲＡＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＤＩＬＴＧＹＳＹＹＹＹＧＭＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２７５】
１０Ｄ１０-Ｙ５４１４３-ＨＰ４  ＨＣ（配列番号４５）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＲＲＧＧＤＹＷＳＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＬＹＮＰＲＬＫＳＲＡＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＤＰＰＴＧＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２７６】
１０Ｄ１０-Ｙ５４１４３-ＨＰ５  ＨＣ（配列番号４６）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＲＲＧＧＤＹＷＳＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＬＹＮＰＲＬＫＳＲＡＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＤＰＬＴＧＹＳＹＹＹＹＧＭＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２７７】
１０Ｄ１０-Ｙ５４１４３-ＨＰ６  ＨＣ（配列番号４７）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＲＲＧＧＤＹＷＳＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＬＹＮＰＲＬＫＳＲＡＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＤＩＰＴＧＹＳＹＹＹＹＧＭＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２７８】
１０Ｄ１０-Ｙ５４１４３-ＨＰ７  ＨＣ（配列番号４８）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＲＲＧＧＤＹＷＳＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＬＹＮＰＲＬＫＳＲＡＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＤＰＰＴＧＹＳＹＹＹＹＧＭＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２７９】
図７は、これらの変異体のいくつかについての結果を示す。いくつかの変異体では１０Ｄ１０より効力が高いことが、曲線が左へシフトしていることからわかる。プロリン置換を有するいくつかの被験１０Ｄ１０抗原結合タンパク質は、Ｙ５４１４３よりも、より高い効力を示さなかったことにも留意されるべきである。
【０２８０】
本明細書全体を通してさまざまな刊行物、特許及び特許出願が参照されている。これらの文献の開示内容はその全体が、参照により本明細書に取り込まれる。しかしながら、このような文献の参照をもって、かかる文献が本明細書に先行する技術であることを認めると解釈されるべきではない。さらに、参照により文献が取り込まれるという理由のみで、必ずしも出願人らが文献内容に完全に同意していることを指すわけではない。
【図１】
2020196763.tif 000010
【図２Ａ】
2020196763.tif 000011
【図２Ｂ】
2020196763.tif 000012
【図３】
2020196763.tif 000013
【図４Ａ】
2020196763.tif 000014
【図４Ｂ】
2020196763.tif 000015
【図４Ｃ】
2020196763.tif 000016
【図５Ａ】
2020196763.tif 000017
【図５Ｂ】
2020196763.tif 000018
【図５Ｃ】
2020196763.tif 000019
【図６Ａ】
2020196763.tif 000020
【図６Ｂ】
2020196763.tif 000021
【図７】
2020196763.tif 000022
【配列表】
2020196763000001.app
【外国語明細書】
2020196763000001.pdf