(57)【要約】      （修正有）【課題】糖尿病Ｉ型（Ｔ１Ｄ）、特に初発のＴ１ＤのようなＣＸＣＲ３関連障害の診断および／または処置のためのＣＸＣＲ３中和抗体の提供。【解決手段】ＣＸＣＲ３に結合することができる抗体または抗原結合フラグメントにおいて、該抗体またはフラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み：ａ）該重鎖可変領域は、特定の配列からの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み；かつ／もしくは該軽鎖可変領域は、特定の配列の３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含む、前記抗体またはフラグメント。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＸＣＲ３に結合することができる抗体または抗原結合フラグメントにおいて、該抗体またはフラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み：
ａ）該重鎖可変領域は、配列番号２、４、６、および８のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み；かつ／もしくは該軽鎖可変領域は、配列番号３、５、７、および９のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み、
ｂ）該重鎖可変領域は、配列番号１０、１２、１４、および１６のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み；かつ／もしくは該軽鎖可変領域は、配列番号１１、１３、１５、および１７のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み、
ｃ）該重鎖可変領域は、配列番号１８、２０、２２、２４、および２６〜３３のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み；かつ／もしくは該軽鎖可変領域は、配列番号１９、２１、２３、２５、および３４〜３７のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み、
ｄ）該重鎖可変領域は、配列番号３８、４０、４２、４４、４６〜４８、および６３〜６６のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み；かつ／もしくは該軽鎖可変領域は、配列番号３９、４１、４３、４５、４９〜５４、および６７〜７０のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み、
または
ｅ）該重鎖可変領域は、配列番号５５、５７、５９、および６１のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み；かつ／もしくは該軽鎖可変領域は、配列番号５６、５８、６０、および６２のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含む、前記抗体またはフラグメント。
【請求項２】
キメラであり、ＣＤＲグラフト化され、突然変異し、１つまたはそれ以上の脱アミド部位が除去されるように突然変異し、ヒトであり、ヒト化され、ヒト化され復帰突然変異し、合成であり、または組換えである、請求項１に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項３】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（Ｆｄ）、線状抗体、ナノボディ（ＶＨＨ）、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である、請求項１または２に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項４】
ａ）配列番号１の残基１〜５８を含むペプチド；
ｂ）配列番号１の残基１〜１６を含むペプチド；および／または
ｃ）配列番号１の残基１〜３７を含むペプチド
から選択されるペプチドに結合することができる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項５】
ａ）アミノ酸配列ＳＤＨＱＶＬＮＤＡＥを含むペプチド；
ｂ）アミノ酸配列ＳＤＨＱＶＬＮＤを含むペプチド；
ｃ）アミノ酸配列ＤＨＱＶＬＮＤを含むペプチド；
ｄ）アミノ酸配列ＶＬＮＤＡＥを含むペプチド；
ｅ）アミノ酸配列ＶＬＮＤを含むペプチド；
ｆ）アミノ酸配列ＸＤＸＸＶＸＮＤＸＸを含むペプチド；
ｇ）アミノ酸配列ＸＤＸＸＶＸＮＤを含むペプチド；
ｈ）アミノ酸配列ＤＸＸＶＸＮＤを含むペプチド；
ｉ）アミノ酸配列ＶＸＮＤＸＸを含むペプチド；
および／または
ｊ）アミノ酸配列ＶＸＮＤを含むペプチド
（ここでＸは、任意のアミノ酸を示す）
から選択されるペプチドに結合することができる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項６】
ａ）重鎖可変領域は、配列番号２、４、６、および８のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み；
ｂ）重鎖可変領域は、配列番号１０、１２、１４、および１６のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み；
ｃ）重鎖可変領域は、配列番号１８、２０、２２、２４、および２６〜３３のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み；
ｄ）重鎖可変領域は、配列番号３８、４０、４２、４４、４６〜４８、および６３〜６６のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み；
または
ｅ）重鎖可変領域は、配列番号５５、５７、５９、および６１のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項７】
ａ）軽鎖可変領域は、配列番号３、５、７、および９のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み、
ｂ）軽鎖可変領域は、配列番号１１、１３、１５、および１７のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み、
ｃ）軽鎖可変領域は、配列番号１９、２１、２３、２５、および３４〜３７のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み、
ｄ）軽鎖可変領域は、配列番号３９、４１、４３、４５、４９〜５４、および６７〜７０のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み、
または
ｅ）軽鎖可変領域は、配列番号５６、５８、６０、および６２のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項８】
ａ）重鎖可変領域は、配列番号２、４、６、および８のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み；かつ軽鎖可変領域は、配列番号３、５、７、および９のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み、
ｂ）重鎖可変領域は、配列番号１０、１２、１４、および１６のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み；かつ軽鎖可変領域は、配列番号１１、１３、１５、および１７のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み、
ｃ）重鎖可変領域は、配列番号１８、２０、２２、２４、および２６〜３３のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み；かつ軽鎖可変領域は、配列番号１９、２１、２３、２５、および３４〜３７のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み、
ｄ）重鎖可変領域は、配列番号３８、４０、４２、４４、４６〜４８、および６３〜６６のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み；かつ軽鎖可変領域は、配列番号３９、４１、４３、４５、４９〜５４、および６７〜７０のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配
列を含み、
または
ｅ）重鎖可変領域は、配列番号５５、５７、５９、および６１のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み；かつ軽鎖可変領域は、配列番号５６、５８、６０、および６２のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項９】
ａ）重鎖可変領域は、配列番号２、４、６、および８のいずれか１つにおける３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み；
ｂ）重鎖可変領域は、配列番号１０、１２、１４、および１６のいずれか１つにおける３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み；
ｃ）重鎖可変領域は、配列番号１８、２０、２２、２４、および２６〜３３のいずれか１つにおける３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み；
ｄ）重鎖可変領域は、配列番号３８、４０、４２、４４、４６〜４８、および６３〜６６のいずれか１つにおける３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み；
または
ｅ）重鎖可変領域は、配列番号５５、５７、５９、および６１のいずれか１つにおける３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項１０】
ａ）軽鎖可変領域は、配列番号３、５、７、および９のいずれか１つにおける３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み、
ｂ）軽鎖可変領域は、配列番号１１、１３、１５、および１７のいずれか１つにおける３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み、
ｃ）軽鎖可変領域は、配列番号１９、２１、２３、２５、および３４〜３７のいずれか１つにおける３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み、
ｄ）軽鎖可変領域は、配列番号３９、４１、４３、４５、４９〜５４、および６７〜７０のいずれか１つにおける３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み、
または
ｅ）軽鎖可変領域は、配列番号５６、５８、６０、および６２のいずれか１つにおける３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項１１】
ａ）重鎖可変領域は、配列番号２、４、６、および８のいずれか１つにおける３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み；かつ／もしくは軽鎖可変領域は、配列番号３、５、７、および９のいずれか１つにおける３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み、
ｂ）重鎖可変領域は、配列番号１０、１２、１４、および１６のいずれか１つにおける
３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み；かつ／もしくは軽鎖可変領域は、配列番号１１、１３、１５、および１７のいずれか１つにおける３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み、
ｃ）重鎖可変領域は、配列番号１８、２０、２２、２４、および２６〜３３のいずれか１つにおける３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み；かつ／もしくは軽鎖可変領域は、配列番号１９、２１、２３、２５、および３４〜３７のいずれか１つにおける３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み、
ｄ）重鎖可変領域は、配列番号３８、４０、４２、４４、４６〜４８、および６３〜６６のいずれか１つにおける３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み；かつ／もしくは軽鎖可変領域は、配列番号３９、４１、４３、４５、４９〜５４、および６７〜７０のいずれか１つにおける３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み、
または
ｅ）重鎖可変領域は、配列番号５５、５７、５９、および６１のいずれか１つにおける３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み；かつ／もしくは軽鎖可変領域は、配列番号５６、５８、６０、および６２のいずれか１つにおける３つのＣＤＲと同一な、もしくは該ＣＤＲと比べて１、２、もしくは３つのアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項１２】
ＣＸＣＲ３に結合することができる抗体または抗原結合フラグメントにおいて、該抗体またはフラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み：
ａ）該重鎖可変領域は、配列番号２、４、６、および８のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み；かつ／もしくは該軽鎖可変領域は、配列番号３、５、７、および９のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み、
ｂ）該重鎖可変領域は、配列番号１０、１２、１４、および１６のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み；かつ／もしくは該軽鎖可変領域は、配列番号１１、１３、１５、および１７のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み、
ｃ）該重鎖可変領域は、配列番号１８、２０、２２、２４、および２６〜３３のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み；かつ／もしくは該軽鎖可変領域は、配列番号１９、２１、２３、２５、および３４〜３７のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み、
ｄ）該重鎖可変領域は、配列番号３８、４０、４２、４４、４６〜４８、および６３〜６６のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み；かつ／もしくは該軽鎖可変領域は、配列番号３９、４１、４３、４５、４９〜５４、および６７〜７０のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み、
または
ｅ）該重鎖可変領域は、配列番号５５、５７、５９、および６１のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含み；かつ／もしくは該軽鎖可変領域は、配列番号５６、５８、６０、および６２のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、もしくは９９％同一な配列を含む、前記抗体またはフラグメント。
【請求項１３】
ａ）重鎖可変領域は、配列番号２、４、６、および８のいずれか１つと同一な、もしくはそれと比べて１〜１０のアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み；かつ／もしくは軽鎖可変領域は、配列番号３、５、７、および９のいずれか１つと同一な、もしくはそれと比べて１〜１０のアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み、
ｂ）重鎖可変領域は、配列番号１０、１２、１４、および１６のいずれか１つと同一な、もしくはそれと比べて１〜１０のアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み；かつ／もしくは軽鎖可変領域は、配列番号１１、１３、１５、および１７のいずれか１つと同一な、もしくはそれと比べて１〜１０のアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み、
ｃ）重鎖可変領域は、配列番号１８、２０、２２、２４、および２６〜３３のいずれか１つと同一な、もしくはそれと比べて１〜１０のアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み；かつ／もしくは軽鎖可変領域は、配列番号１９、２１、２３、２５、および３４〜３７のいずれか１つと同一な、もしくはそれと比べて１〜１０のアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み、
ｄ）重鎖可変領域は、配列番号３８、４０、４２、４４、４６〜４８、および６３〜６６のいずれか１つと同一な、もしくはそれと比べて１〜１０のアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み；かつ／もしくは軽鎖可変領域は、配列番号３９、４１、４３、４５、４９〜５４、および６７〜７０のいずれか１つと同一な、もしくはそれと比べて１〜１０のアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み、
または
ｅ）重鎖可変領域は、配列番号５５、５７、５９、および６１のいずれか１つと同一な、もしくはそれと比べて１〜１０のアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含み；かつ／もしくは軽鎖可変領域は、配列番号５６、５８、６０、および６２のいずれか１つと同一な、もしくはそれと比べて１〜１０のアミノ酸残基の突然変異を含む配列を含む、請求項１２に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項１４】
ａ）重鎖可変領域は、配列番号２、４、６、および８のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み；かつ／もしくは軽鎖可変領域は、配列番号３、５、７、および９のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み、
ｂ）重鎖可変領域は、配列番号１０、１２、１４、および１６のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み；かつ／もしくは軽鎖可変領域は、配列番号１１、１３、１５、および１７のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み、
ｃ）重鎖可変領域は、配列番号１８、２０、２２、２４、および２６〜３３のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み；かつ／もしくは軽鎖可変領域は、配列番号１９、２１、２３、２５、および３４〜３７のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み、
ｄ）重鎖可変領域は、配列番号３８、４０、４２、４４、４６〜４８、および６３〜６６のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み；かつ／もしくは軽鎖可変領域は、配列番号３９、４１、４３、４５、４９〜５４、および６７〜７０のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み、
または
ｅ）重鎖可変領域は、配列番号５５、５７、５９、および６１のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み；かつ／もしくは軽鎖可変領域は、配列番号５６、５８、６０、および６２のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含む、請求項１２または１３に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項１５】
表２中の重鎖および軽鎖可変領域の組み合わせのいずれかを含む、請求項１〜１４のい
ずれか１項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項１６】
抗体は、少なくとも約１０８Ｍ−１の親和定数でＣＸＣＲ３に結合することができる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項１７】
ＣＸＣＲ３のＡおよびＢアイソフォームの両方に結合することができる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項１８】
ＣＸＣＲ３のＡ−アイソフォームに優先的に結合することができる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項１９】
ＣＸＣＲ３活性を中和することができる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメントのアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
【請求項２１】
請求項２０に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメントを産生する方法において、該抗体またはフラグメントを産生するのに適した条件下で、培地中で請求項１９に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項２４】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体もしくはフラグメントまたは請求項２０に記載の核酸と、該抗体もしくはフラグメントを調査、診断、または治療目的で使用するための説明書とを含むキット。
【請求項２５】
初発の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を防止し、処置し、またはその進行を低減する方法において：
ａ）Ｔ１Ｄを発症するリスクがある、または初発のＴ１Ｄを有する対象を特定すること；および
ｂ）対象に、有効量の請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメントを投与し、それにより、Ｔ１Ｄ発症を予防的に防止し、または初発のＴ１Ｄを処置しまたはその進行を低減すること
からなる、前記方法。
【請求項２６】
対象は、哺乳動物である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
対象は、ヒトである、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
対象は、約０．２ｎｍｏｌ／Ｌより高いかまたはそれに等しい基底の血清Ｃ−ペプチドレベルを有し、かつ／または患者は、Ｃ−ペプチド刺激の間、約０．０３３〜１．０ｎｍｏｌ／Ｌ×分の合計の空腹時血清Ｃ−ペプチドレベルを有する、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
患者は、外因性インスリンの非存在下で約１２０ｍｇ／ｄＬより高い空腹時血液グルコースレベルを有する、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
抗体またはそのフラグメントは、ヒト化されている、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
抗体またはそのフラグメントは、約０．０３〜３．７ｍｇ／ｋｇ／用量の用量で投与される、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
抗体またはそのフラグメントは、少なくとも１日１回、週１回、２週に１回、月１回、２か月に１回、年４回、または年１回投与される、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
抗体またはそのフラグメントは、全ての投与に対する用量の合計が約０．１６〜１８ｍｇ／ｋｇで投与される、請求項２５〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
抗体またはそのフラグメントは、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、非経口、皮下、または経皮で投与される、請求項２５〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
抗体またはそのフラグメントは、膵臓に直接投与される、請求項２５〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
抗体またはそのフラグメントは、膵臓中の膵島細胞の近傍に投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
β細胞刺激因子、インスリン、またはインスリン産生細胞を投与することをさらに含む、請求項２５〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
免疫抑制剤を投与することをさらに含む、請求項２５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
初発の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を処置しまたはその進行を低減する方法において：
ａ）初発のＴ１Ｄを有し、約０．２ｎｍｏｌ／Ｌより高いかまたはそれに等しい基底の血清Ｃ−ペプチドレベルを有し、かつ／またはＣ−ペプチド刺激の間、約０．０３３〜１．０ｎｍｏｌ／Ｌ×分の合計の空腹時血清Ｃ−ペプチドレベルを有するヒト対象を特定すること；および
ｂ）約０．０３〜３．７ｍｇ／ｋｇ／用量の請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメントを投与し、
それにより初発のＴ１Ｄを処置しまたはその進行を低減すること
を含む、前記方法。
【請求項４０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメントを含む、対象における初発の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を防止し、処置し、またはその進行を低減するためのＣＸＣＲ３中和抗体またはそのフラグメント。
【請求項４１】
疾患または障害を処置するための医薬品の製造における、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメントから選択されるＣＸＣＲ３抗体またはそのフラグメントの使用。
【請求項４２】
疾患または障害は、ＣＸＣＲ３に関連する疾患または障害である、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
疾患または障害は、初発の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）である、請求項４１または４２に記載
の使用。
【請求項４４】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメントと、少なくとも１種の追加の作用剤を含むコンジュゲート。
【請求項４５】
前記追加の作用剤は、治療剤、可溶化剤、安定剤、免疫抑制剤、受容体、または抗原結合ペプチドである、請求項４４に記載のコンジュゲート。
【請求項４６】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント、または請求項２０に記載の核酸、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項４７】
少なくとも１種の追加の治療剤をさらに含む、請求項４６に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
少なくとも１種の追加の治療剤は、ＣＸＣＲ３に関連する疾患または障害を処置するための作用剤を含む、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
少なくとも１種の追加の治療剤は、β細胞刺激因子、インスリン、またはインスリン産生細胞を含む、請求項４７または４８に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
試験サンプル中のＣＸＣＲ３の存在または濃度を検出するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法において、該試験サンプルを、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメントおよび検出可能な標識と接触させることからなり、ＣＸＣＲ３の存在または濃度は、検出可能な標識によって生成したシグナルと直接的または間接的に相関する、前記方法。
【請求項５１】
ＣＸＣＲ３に関連する状態を診断するのに使用される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
状態は、Ｔ１Ｄである、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、合衆国法典第３５巻１１９条に基づき、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、２０１２年１月２０日付けで出願された米国仮出願第６１／５８８，９３６号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、抗体および抗体を使用して１型糖尿病（Ｉ型糖尿病；Ｔ１Ｄ）のようなＣＸＣＲ３シグナル伝達に関連する障害を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病は、様々な特徴的な代謝異常と共にインスリン作用の欠如の結果生じる慢性的な高血糖症を特徴とする。糖尿病は、大きくＩ型とＩＩ型に分けることができる。Ｔ１Ｄは、ランゲルハンス島の膵β細胞の損失を特徴とするが、ＩＩ型糖尿病は、インスリン分泌とインスリン感受性（インスリン耐性）の両方の減少を特徴とする。米国では、糖尿病の罹患率は人口の約２〜４パーセントであり、そのうちＩ型糖尿病（またインスリン−依存性またはＩＤＤＭとしても知られている）が全ケースの約７〜１０パーセントを占めている。
【０００４】
Ｉ型糖尿病は、グルコースホメオスタシスを維持するのに十分なインスリンを産生できないことを特徴とする。この障害は、自己免疫が介在する膵β細胞の破壊によって引き起こされると考えられている。Ｉ型糖尿病に関連する自己免疫は、自己反応性ＢおよびＴリンパ球の両方の関与を伴う。実際に、Ｉ型糖尿病患者のうち９８％までが、インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、インスリノーマ抗原−２およびインスリノーマ抗原−２ｂ（ＩＡ−２およびＩＡ−２β）、ならびに異種の膵島細胞の細胞質内抗原（ＩＣＡ）などの、それら自身のβ細胞抗原のうち１つまたはそれ以上に対する抗体を有する。必ずしも決定的とは限らないが、一般的に、１つまたはそれ以上の自己抗体のレベルは、β細胞の破壊の状態と互いに関係がある。非特許文献１；非特許文献２。したがって、自己抗体は、自己免疫性糖尿病発症の指標として役立つ可能性があり、さらに代謝の変化と共に、Ｔ１Ｄ患者の親類における糖尿病を発症するリスクを予測することができる。
【０００５】
Ｔ１Ｄ診断の時期の近くで得られた、活性化Ｔ細胞が浸潤した膵島を示す組織生検によって証明されたように、Ｉ型糖尿病の発症は、自己反応性Ｔ細胞が介在する可能性がある。非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６。
【０００６】
またケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体３（ＣＸＣＲ３）は、Ｇタンパク質共役受容体９（ＧＰＲ９）、ＣＤ１８３、ＩＰ−１０受容体、およびＭｉｇ受容体としても知られており、これらは、広範な生理学的プロセスおよびＴ１Ｄのような関連障害に関与する、自己反応性Ｔ細胞で発現されるケモカイン受容体である。ＣＸＣＲ３は、ナイーブＴ細胞には存在しないが、抗原で活性化されると上方制御されて、その主要なリガンド：ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１１に応答して組織の炎症部位に活性化細胞を動員する。β細胞は、Ｔ１Ｄのマウスモデル（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）；およびインスリン炎を有するＴ１Ｄ患者からの膵島（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献９）において、主としてＣＸＣＬ１０を発現し、ＣＸＣＬ９はそれより低いレベルであることが示されている。加えて、Ｔ１Ｄマウスモデルおよび１型糖尿病患者の膵臓サンプルにおいて、膵臓に浸潤したＴ細胞は、ＣＸＣＲ３を発現することが示されている（非特許文献７；非特許文献１２；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献９）。さらに、ＣＸＣＲ３欠損ノックアウトマウスは、発病の有意な遅延およびＴ１Ｄ
発病率の減少を実証しているが（非特許文献１３）、トランスジェニックマウスの膵島におけるＣＸＣＬ１０の過剰発現は、Ｔ細胞の浸潤を促進し、Ｔ１Ｄ発病を早める（非特許文献１４）。抗体処置によるＣＸＣＬ１０の中和は、保護的であることが示されている（非特許文献７）。
【０００７】
ＣＸＣＲ３には、ヒトで同定されたＡ、Ｂ、およびＡｌｔ．と表示される３種のアイソフォームがあり（非特許文献１５；非特許文献１６）、ＣＸＣＲ３−Ａは、ＣＸＣケモカインＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）、およびＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）に結合し；ＣＸＣＲ３−Ｂは、これらの標的にも結合するが、ＣＸＣＬ４にも結合し；ＣＸＣＲ３−Ａｌｔは、ＣＸＣＬ１１と相互作用するようである。選択的スプライシングによりＣＸＣＲ３の数種のタンパク質アイソフォームの生成が起こるが、ＣＸＣＲ３−ＢおよびＣＸＣＲ３−Ａｌｔは、タンパク質レベルにおいてかなり低いレベルで発現されるため、ｉｎ  ｖｉｖｏではＣＸＣＲ３−Ａが優勢の形態である。非特許文献１５；非特許文献１６。
【０００８】
ＣＸＣＲ３の低分子阻害剤を使用してＣＸＣＲ３経路を破壊する試みは、十分な有効性がないことが証明されている。非特許文献１７。したがって、糖尿病発病前に主としてＣＸＣＬ１０を破壊する抗体および他の方法に調査の焦点が当てられている。非特許文献８；非特許文献１８。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｉｒｖｉｎｅら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２６：１３８〜４７（１９９７）
【非特許文献２】Ｒｉｌｅｙら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２３：１１６７〜７２（１９９０）
【非特許文献３】Ｂｏｔｔａｚｚｏら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３１３：３５３〜６０（１９８５）
【非特許文献４】Ｈａｎｎｉｎｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９０：１９０１〜１０（１９９２）
【非特許文献５】Ｉｔｏｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９２：２３１３〜２２（１９９３）
【非特許文献６】Ｉｍａｇａｗａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５０：１２６９〜７３（２００１）
【非特許文献７】Ｃｈｒｉｓｔｅｎら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００３、１７１：６８３８〜６８４５
【非特許文献８】Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４；１７３；７０１７〜７０２４
【非特許文献９】Ｓａｒｋａｒら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０１２年２月；６１（２）：４３６〜４６
【非特許文献１０】Ｕｎｏら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｊ．５７：９９１〜９９６（２０１０）
【非特許文献１１】Ｒｏｅｐら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００３、１５９：３３８〜３４３
【非特許文献１２】Ｖａｎ  Ｈａｌｔｅｒｅｎら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４８：７５〜８２（２００５）
【非特許文献１３】Ｆｒｉｇｅｒｉｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８：１４１４〜１４２０（２００２）
【非特許文献１４】Ｒｈｏｄｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５（６）：３５１６〜２４（２００５）
【非特許文献１５】Ｌａｓａｇｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００３  １９７：１５３７
【非特許文献１６】Ｅｈｌｅｒｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；１７３；６２３４〜６２４０
【非特許文献１７】Ｃｈｒｉｓｔｅｎら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：３１８〜３２８（２０１１）
【非特許文献１８】Ｏｉｋａｗａら、Ｒｅｖ．Ｄｉａｂｅｔ．Ｓｔｕｄ．７：２０９〜２２４（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
Ｔ１ＤおよびＣＸＣＲ３が関連する他の障害の蔓延を考えると、ＣＸＣＲ３シグナル伝達を標的とする、例えば、患者における例えばＴ１Ｄなどの障害を処置しまたはその進行を低減する追加の方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ＣＸＣＲ３に結合することができる抗体および抗体の使用方法が、本明細書において開示される。いくつかの実施形態において、本抗体を使用して、ＣＸＣＲ３経路を標的とすることにより、対象におけるＴ１Ｄを防止し、処置しまたはその初期の進行を低減することができる。本抗体および方法は、ＣＸＣＲ３に対する中和抗体は、ＮＯＤマウスにおいて、疾患の発病前に投与されるとＴ１Ｄの発病を防止することができる、またはＮＯＤマウスにおいて、Ｔ１Ｄの初発段階で投与されると疾患の経過を元に戻すことができるという驚くべき結果に少なくとも部分的に基づいている。さらに、ＣＸＣＲ３活性の中和は、患者の免疫系の正常な動作への深刻な悪影響を伴わないため、抗体療法の望ましくない副作用が少なくなる。
【００１２】
したがって、一態様において、ＣＸＣＲ３活性を中和することができる抗体および抗原結合フラグメントが、本明細書において開示される。ある特定の実施形態において、ＣＸＣＲ３中和抗体は、配列番号１の残基１〜５８、１〜１６、または１〜３７から選択されるペプチドに結合する能力を特徴としていてもよい。いくつかの実施形態において、本抗体は、Ｃｌ１２、Ｃｌ１３５、Ｃｌ８２、Ｃｌ５３、および／またはＣｌ４と表示される抗体クローン（Ｃｌ）の全部または一部を含む。ある特定の実施形態において、開示された抗体のＣＤＲ−グラフト化変異体、ヒト化変異体、復帰突然変異した変異体、および完全ヒト変異体などの、抗体Ｃｌ１２、Ｃｌ１３５、Ｃｌ８２、Ｃｌ５３、および／またはＣｌ４の変異体が提供される。特定の実施形態において、本抗体は、本明細書で開示されたクローンＣｌ１２、Ｃｌ１３５、Ｃｌ８２、Ｃｌ５３、および／もしくはＣｌ４、またはクローン４、１２、５３、８２、および１３５の変異体のいずれかからの、１つまたはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、１つまたはそれ以上の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに／もしくは１つまたはそれ以上の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、Ｃｌ１２、Ｃｌ１３５、Ｃｌ８２、Ｃｌ５３、および／もしくはＣｌ４からの抗体、またはそれらのキメラおよびヒト化バージョンは、抗ＣＸＣＲ３クローン５Ｈ７、７Ｈ５、Ｖ４４Ｄ７、１Ｃ６、および／または４９８０１と比較してある特定の有益な特性を示す。例えば、本明細書で開示された抗体は、抗ｈＣＸＣＲ３クローン５Ｈ７、７Ｈ５、Ｖ４４Ｄ７、１Ｃ６、および４９８０１と比較して高い結合親和性を示す可能性がある。例えば、本抗体は、例えば表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）アッセイを使用）によって測定した場合、１Ｃ６のような抗ＣＸＣＲ３抗体よりも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、またはそれより高い倍率（またはその間のあらゆる値）で優れた親和性を示す可能性がある。また本明細書で開示されたヒト化抗体は、マウス抗ｈＣＸＣＲ３クローン５Ｈ７、７Ｈ５、Ｖ４４Ｄ７、１Ｃ６、および４９８０１と比較して、予測された免疫原性の低下も示す。加えて
、本明細書で開示された重鎖クローン４．７〜４．１１は、５８位および５９位（ＩＭＧＴによる番号付けを使用して）における脱アミド部位が除去されるように最適化されており、それによって、最初のマウス抗ｈＣＸＣＲ３重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲ２配列よりも安定性が強化される。
【００１３】
別の態様において、本開示は、有効量のＣＸＣＲ３中和抗体を投与することによる、対象におけるＴ１Ｄ発病前の予防方法、加えて初発のＴ１Ｄを処置しまたはその進行を低減する方法を提供する。特定の実施形態において、対象は、ヒトのような哺乳動物である。
【００１４】
ある特定の実施形態において、初発のＴ１Ｄを有する対象は、臨床診断の６ヶ月以内に、本明細書で開示された方法によって処置される。他の実施形態において、対象は、臨床診断から６ヶ月よりも後に処置され、ここで対象は、少なくとも約０．２ｎｍｏｌ／Ｌの残留した合計の空腹時血清Ｃ−ペプチドレベル（ｆａｓｔｉｎｇ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ
ｓｅｒｕｍ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅｖｅｌ）を保持する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、対象は、外因性インスリンの非存在下における、１２０ｍｇ／ｄＬを超える上昇した空腹時血液グルコースレベル、またはＣ−ペプチド刺激の間、約０．０３３〜１．０ｎｍｏｌ／Ｌ×分の異常に低い合計の空腹時血清Ｃ−ペプチドレベルを特徴としていてもよい。特定の実施形態において、ＣＸＣＲ３中和抗体は、約０．０３〜３．７ｍｇ／ｋｇ／用量の用量で投与される。いくつかの実施形態において、対象に、少なくとも１回分の用量の抗体が投与される。ある特定の実施形態において、対象に、複数回用量の抗体（例えば、少なくとも年１回、年４回、２か月に１回、月１回、２週に１回、週１回、または１日１回）が投与される。さらなる実施形態において、上述した方法は、ＣＸＣＲ３中和抗体の投与と同時に、またはそれと連続して（その前または後に）、免疫抑制剤および／またはβ細胞刺激因子（β−ｃｅｌｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ
ａｇｅｎｔ）を投与する工程をさらに含んでいてもよい。
【００１６】
様々な実施形態において、異常なＣＸＣＲ３発現を特徴とする状態を処置するために、本明細書において開示される抗ＣＸＣＲ３抗体が投与される。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ３活性の下方制御および／または中和によって利益を得る可能性があるあらゆる状態を処置するために、抗ＣＸＣＲ３抗体が投与される。いくつかの実施形態において、Ｔ１Ｄを処置するために、本明細書において開示される抗ＣＸＣＲ３抗体が投与される。
【００１７】
本発明の追加の実施形態および利点は、一部は下記の説明に記載されるが、一部はその説明から明白であると予想され、または本発明の実施により学ぶことができる。本発明の実施形態および利点は、特に添付の特許請求の範囲で指摘された要素および組み合わせによって理解され達成される。
【００１８】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明はいずれも、単に典型的かつ説明的なものであり、特許請求された発明を限定しないと理解されるものとする。
【００１９】
添付の図面は、本明細書に組み込まれてその一部を構成しており、本発明の１つの（数種の）実施形態（複数可）を例示し、説明と共に、本発明の原理を明確にするのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】６週齢の雌ＮＯＤマウス（第１の列）、１０週齢の雌ＮＯＤマウス（第２の列）、および初発の糖尿病雌ＮＯＤマウス（第３の列）からの膵臓の切片における、インスリン（左のパネル）、ＣＸＣＬ１０（中心のパネル）、およびＣＤ３（右のパネル）の発現を示す図である。
【図２】初発の糖尿病を有する雌ＮＯＤマウスの膵臓からのＴ細胞におけるＣＸＣＲ３発現のフローサイトメトリー分析のグラフである。下の２つのグラフにおいて実線で示されたように、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を同定し、ＣＸＣＲ３発現に関して染色した。同じ２つのグラフにおいて、アイソタイプ対照の染色は、影付きの曲線によって示される。
【図３】経時的な非糖尿病雌ＮＯＤマウスのパーセンテージを示す図であり、ＰＢＳ、抗ＣＸＣＲ３、および対照ＩｇＧでの動物の処置は、糖尿病発病前、１０週齢で開始した。図３Ａおよび３Ｂに２つの独立した研究からの結果を示す。
【図４】抗ＣＸＣＲ３抗体で予防的に処置した２６週齢の非糖尿病雌ＮＯＤマウスからの膵臓の切片を示す図であり、上記処置は、１０週齢で開始し、染色は、インスリン（左のパネル）またはＣＤ３／Ｆｏｘｐ３（中心および右のパネル）に関してなされた。右のパネルは、中心のパネルで示される切片の倍率を高めた画像である。
【図５】ＰＢＳ、抗ＣＸＣＲ３抗体、対照ＩｇＧ、およびマウス抗胸腺細胞グロブリン（マウスサイモグロブリン、ｍＡＴＧ）抗体で処置した雌ＮＯＤマウスの１日の早朝血液グルコース値を示す図であり、上記処置は、マウスが糖尿病とみなされてから３〜４日以内に開始された。各ラインは、個々のマウスを表す。矢印は、処置がなされた日を表示する。
【図６】Ａは、ＰＢＳ、抗ＣＸＣＲ３抗体、対照ＩｇＧ、ならびにＣＤ４＋（左のグラフ）およびＣＤ８＋（右のグラフ）であるｍＡＴＧ抗体で処置した雌ＮＯＤマウスからのＴ細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。処置の経過中に、５回目の被験物質注入後のマウスから、加えて年齢を適合させたｍＡＴＧ処置マウスから、膵臓を回収した。Ｂは、ＰＢＳ、対照抗体、または抗ＣＸＣＲ３抗体で処置したマウスの膵臓からのＣＤ４＋Ｔ細胞における、ＣＤ４４発現（縦軸）とＣＤ６２Ｌ発現（横軸）とのプロットである。Ｇ１およびＧ２は、それぞれ、ゲーティングした高ＣＤ４４／低ＣＤ６２Ｌおよび低ＣＤ４４／低ＣＤ６２ＬのＴ細胞を指す。Ｃは、アイソタイプ対照抗体で染色してリンパ球でゲーティングした細胞におけるＣＸＣＲ３発現と比較した、Ｇ１およびＧ２でのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＸＣＲ３の発現を示す。
【図７】対照ＩｇＧ（左のパネル）、抗ＣＸＣＲ３抗体（中心のパネル）、およびｍＡＴＧ（右のパネル）で処置し、インスリン（上の列）またはＣＤ３／Ｆｏｘｐ３（下の列）に関して染色した、雌ＮＯＤマウスからの膵臓の切片を示す図である。
【図８】年齢を適合させた非糖尿病雌ＮＯＤマウス（図８Ａ）、ＰＢＳで処置した糖尿病ＮＯＤマウス（図８Ｂ）、抗ＣＸＣＲ３抗体処置後に疾患が寛解しているＮＯＤマウス（図８Ｃ）、および対照ＩｇＧ抗体で処置した糖尿病ＮＯＤマウス（図８Ｄ）におけるグルコース刺激後の血液グルコースレベルのプロットである。グルコース刺激は、最初の糖尿病の診断および研究への登録の１００日後におけるマウスに行われた。各ラインは、個々の動物からのデータを表す。
【図９】ＰＢＳ、抗ＣＸＣＲ３、対照ＩｇＧ、またはｍＡＴＧ抗体で処置した雌ＮＯＤマウスから単離したプールしたドナーＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を受け入れたＮＯＤ．Ｓｃｉｄレシピエントに関する、経時的な非糖尿病マウスのパーセンテージを示す図である。ＰＢＳもしくは対照ＩｇＧでの処置から約８０〜９０日後に糖尿病雌ＮＯＤマウスから、または抗ＣＸＣＲ３もしくはｍＡＴＧ抗体での処置から約８０〜９０日間後に疾患が寛解している雌ＮＯＤマウスから、Ｔ細胞を単離した。図９Ａおよび９Ｂに２つの独立した研究からの結果を示す。
【図１０】Ａは、図９で説明されているように、ＰＢＳ、抗ＣＸＣＲ３、対照ＩｇＧ、またはｍＡＴＧ抗体で処置した雌ＮＯＤマウスから単離したＣＤ４＋およびＣＤ８＋ドナーＴ細胞のパーセンテージを示すグラフである（左のパネル）。図１０Ａの右のパネルに、各処置群に関するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞ドナープールにおけるエフェクターおよびセントラルメモリー細胞（ｃｅｎｔｒａｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ｃｅｌｌ）  のパーセンテージを示す。Ｂは、ＣＤ４およびＣＤ２５の発現またはＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘｐ３の発現によって同定された、ドナーＴ細胞プールにおける制御性Ｔ細胞のパーセンテージを示すグラフである。Ｃは、ＣＸＣＲ３も発現するドナーＴ細胞プールにおけるＣＤ８＋（左のパネル）およびＣＤ４＋（右のパネル）のパーセンテージを示すグラフである。
【図１１】未処置のままの、または抗ＣＸＣＲ３抗体もしくは対照ＩｇＧで処置したＲＩＰ−ＯＶＡレシピエントマウスへの、ドナーＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックマウスからのＴ細胞の養子免疫伝達（ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）後の、経時的な非糖尿病マウスのパーセンテージを示すグラフである。図１１Ａおよび１１Ｂに２つの研究からの結果を示す。
【図１２】Ａは、ＲＩＰ−ＯＶＡレシピエントマウスへの養子免疫伝達前の、フローサイトメトリーによって分析したドナーＴ細胞におけるＣＸＣＲ３発現（実線の曲線）を示すグラフである。アイソタイプ対照抗体での染色を影付きの曲線で示す。Ｂは、養子免疫伝達後２、４、７、９、および１５日目の、抗ＣＸＣＲ３または対照ＩｇＧ抗体で処置したレシピエントマウスの血液、脾臓、および膵リンパ節におけるドナー細胞のパーセンテージを示すグラフである。Ｃは、養子免疫伝達後、抗ＣＸＣＲ３または対照ＩｇＧ抗体で処置したレシピエントマウスの血液、脾臓、および膵リンパ節におけるドナー増殖性細胞のパーセンテージを示すグラフである。Ｄは、養子免疫伝達後、抗ＣＸＣＲ３または対照ＩｇＧ抗体で処置したレシピエントマウスの血液、脾臓、および膵リンパ節におけるＣＸＣＲ３＋ドナー細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図１３】処置せずに、インスリン（左上）もしくはＣＤ３（右上）に関して染色した、または抗ＣＸＣＲ３抗体で処置し、インスリン（左下）もしくはＣＤ３（右下）に関して染色したＲＩＰ−ＯＶＡレシピエントマウスからの膵臓の切片を示す写真である。膵臓を、ドナーＴ細胞の養子免疫伝達から６０日後に回収した。
【図１４】Ａ〜Ｃは、クローンＣｌ４、１２、５３、８２、および１３５が介在する、ＣＸＣＬ１１に対するＣＸＣＲ３介在走化性の阻害のレベルを示すグラフである。データは、走化性アッセイで移動する細胞の平均相対的な蛍光単位（ＲＦＵ）として示される。Ｄは、抗体クローンＣｌ４、１２、５３、および１３５についてカルシウム動員を５０％阻害するのに必要な抗体の濃度を示すグラフである。
【図１５】クローンＣｌ４、１２、５３、８２、および１３５が介在する、ＣＸＣＬ９（図１５Ａ）、ＣＸＣＬ１０（図１５Ｂ）、およびＣＸＣＬ１１（図１５Ｃ）に対するＣＸＣＲ３介在走化性の阻害のレベルを示すグラフである。データは、走化性アッセイで移動する細胞の平均相対的な蛍光単位（ＲＦＵ）として示される。
【図１６】様々な異なるケモカイン受容体を発現する細胞への抗体結合のヒストグラムプロットを示すグラフである。各ヒストグラムプロットについて、結合した抗体の濃度は、横軸に沿って増加する。
【図１７Ａ】クローン４．０（「親」と標識）ならびにある特定のヒト化変異体（ＶＨ１−３および７〜１１およびＶＫ１−３と標識）に関する重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＫ）可変ドメインのアラインメントを示す図である。
【図１７Ｂ】クローン１２．０（「親」と標識）ならびにある特定のヒト化変異体（ＶＨ１−３およびＶＫ１−３と標識）に関する重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＫ）可変ドメインのアラインメントを示す図である。
【図１７Ｃ】クローン５３．０（「親」と標識）ならびにある特定のヒト化変異体（ＶＨ１−６およびＶＫ１−９と標識）に関する重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＫ）可変ドメインのアラインメントを示す図である。
【図１７Ｄ】クローン８２．０（「親」と標識）ならびにある特定のヒト化変異体（ＶＨ１−３およびＶＫ１−３と標識）に関する重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＫ）可変ドメインのアラインメントを示す図である。
【図１７Ｅ】クローン１３５．０（「親」と標識）ならびにある特定のヒト化変異体（ＶＨ１−３およびＶＫ１−３と標識）に関する重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＫ）可変ドメインのアラインメントを示す図である。
【図１７Ｆ】クローン４．０（「親」と標識）ならびにある特定の４Ｄヒト化変異体（ＶＨ４−６およびＶＫ４−７と標識）に関する重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＫ）可変ドメインのアラインメントを示す図である。
【図１７Ｇ】クローン５３．０（「親」と標識）ならびにある特定の４Ｄヒト化変異体（ＶＨ７−１０およびＶＫ１０−１３と標識）に関する重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＫ）可変ドメインのアラインメントを示す図である。図１７Ａ〜Ｇにおける各アラインメントの下の配列は、最も近いヒト生殖細胞系の配列を表す。黒い囲みは、ＣＤＲドメインを表示し、影付きの残基は、それに対応する生殖細胞系の残基（図１７Ａ〜Ｅ）またはそれに対応する親の残基（図１７Ｆ〜Ｇ）と配列が異なっており、ここではＩＭＧＴによる番号付けとＣＤＲの境界が使用される。
【図１７Ｈ】クローン４．０、１２．０、８２．０、および１３５、加えて抗体クローン５Ｈ７および７Ｈ５に関する重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＫ）可変ドメインのアラインメントを示す図である。黒枠は、ＣＤＲドメインを表示し、影付きの残基は、アラインメント中の前の配列と配列が異なっており、ＩＭＧＴによる番号付けが使用されている。
【図１８】抗体クローン４、１２、５３、８２、および１３５に関する最小限のエピトープ残基の境界を示す図である。結合活性に重要な残基は、Ｘで表示される。
【図１９】キメラクローン４、１２、５３、８２、および１３５、加えてヒト化変異体Ｈｕ１、Ｈｕ２、Ｈｕ３に関する、ヒトＣＸＣＲ３でトランスフェクションした３００．１９細胞における抗体結合を示すヒストグラムプロットである。抗体を５μｇ／ｍｌ（黒のライン）、０．５μｇ／ｍｌ（暗い灰色のライン）、もしくは０．１μｇ／ｍｌ（黒の点線）で投与し、または５μｇ／ｍｌの二次抗体を単独（塗り潰された灰色のヒストグラム）で投与し、データを、蛍光の最大パーセンテージに対する細胞数（横軸）としてプロットする。
【図２０】クローン４、１２、５３、８２、および１３５、または市販のクローン１Ｃ６の１０μｇ／ｍｌのキメラ（Ｃｈｉｍ）またはヒト化（Ｈｕ１、Ｈｕ２またはＨｕ３）抗体変異体の存在下または非存在下で、ＣＸＣＬ９（図２０Ａ）、ＣＸＣＬ１０（図２０Ｂ）、およびＣＸＣＬ１１（図２０Ｃ）へのヒトＣＸＣＲ３でトランスフェクションした細胞の移動（縦軸）の阻害パーセンテージを示すグラフである。
【図２１】クローン４、１２、５３、８２、および１３５および市販のクローン１Ｃ６のキメラ（Ｃｈｉｍ）およびヒト化（Ｈｕ１、Ｈｕ２またはＨｕ３）抗体変異体の、ヒトＣＸＣＲ３−Ｇｑｉ４ｑｉ４でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞におけるカルシウム動員を阻害する能力を示すプロットである。抗体濃度（横軸）は、最大の阻害のパーセント（縦軸）に対してプロットされる。
【図２２】ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスにおける、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２２Ａ）、ＣＤ３＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２２Ｂ）、ＣＸＣＲ３＋／ＣＤ３＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２２Ｃ）、およびＣＸＣＲ３＋／ＣＤ３＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２２Ｄ）のパーセンテージに対する抗ＣＸＣＲ３抗体処置の作用を示すグラフである。ＨｕＩｇＧ１は、ヒトＩｇＧ１（ハーセプチン）を表示し、クローン４、１２、５３、８２、および１３５は、キメラ抗体クローンを指す。
【図２３Ａ】重鎖および軽鎖クローン１２．０に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２３Ｂ】重鎖および軽鎖クローン１２．１に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２３Ｃ】重鎖および軽鎖クローン１２．２に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２３Ｄ】重鎖および軽鎖クローン１２．３に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２４Ａ】重鎖および軽鎖クローン１３５．０に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２４Ｂ】重鎖および軽鎖クローン１３５．１に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２４Ｃ】重鎖および軽鎖クローン１３５．２に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２４Ｄ】重鎖および軽鎖クローン１３５．３に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２５Ａ】重鎖および軽鎖クローン４．０に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２５Ｂ】重鎖および軽鎖クローン４．１に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２５Ｃ】重鎖および軽鎖クローン４．２に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２５Ｄ】重鎖および軽鎖クローン４．３に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２５Ｅ】重鎖クローン４．４に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２５Ｆ】重鎖クローン４．５に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２５Ｇ】重鎖クローン４．６に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２５Ｈ】重鎖クローン４．７に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２５Ｉ】重鎖クローン４．８に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２５Ｊ】重鎖クローン４．９に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２５Ｋ】重鎖クローン４．１０に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２５Ｌ】重鎖クローン４．１１に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２５Ｍ】軽鎖クローン４．４に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２５Ｎ】軽鎖クローン４．５に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２５Ｏ】軽鎖クローン４．６に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２５Ｐ】軽鎖クローン４．７に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ａ】重鎖および軽鎖クローン５３．０に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｂ】重鎖および軽鎖クローン５３．１に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｃ】重鎖および軽鎖クローン５３．２に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｄ】重鎖および軽鎖クローン５３．３に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｅ】重鎖クローン５３．４に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｆ】重鎖クローン５３．５に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｇ】重鎖クローン５３．６に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｈ】軽鎖クローン５３．４に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｉ】軽鎖クローン５３．５に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｊ】軽鎖クローン５３．６に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｋ】軽鎖クローン５３．７に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｌ】軽鎖クローン５３．８に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｍ】軽鎖クローン５３．９に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｎ】重鎖クローン５３．７に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｏ】重鎖クローン５３．８に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｐ】重鎖クローン５３．９に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｑ】重鎖クローン５３．１０に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｒ】軽鎖クローン５３．１０に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｓ】軽鎖クローン５３．１１に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｔ】軽鎖クローン５３．１２に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２６Ｕ】軽鎖クローン５３．１３に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２７Ａ】重鎖および軽鎖クローン８２．０に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２７Ｂ】重鎖および軽鎖クローン８２．１に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２７Ｃ】重鎖および軽鎖クローン８２．２に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２７Ｄ】重鎖および軽鎖クローン８２．３に関するアミノ酸配列を表す図である。
【図２８Ａ】図２８Ａ〜Ｐは、重鎖クローン１２．０〜１２．３および軽鎖クローン１２．０〜１２．３、重鎖クローン１３５．０〜１３５．３および軽鎖クローン１３５．０〜１３５．３、重鎖クローン４．０〜４．１１および軽鎖クローン４．０〜４．７、重鎖クローン５３．０〜５３．６および軽鎖クローン５３．０〜５３．９、ならびに重鎖クローン８２．０〜８２．３および軽鎖クローン８２．０〜８２．３に関する核酸配列を示す。
【図２８Ｂ】図２８Ａの続き。
【図２８Ｃ】図２８Ｂの続き。
【図２８Ｄ】図２８Ｃの続き。
【図２８Ｅ】図２８Ｄの続き。
【図２８Ｆ】図２８Ｅの続き。
【図２８Ｇ】図２８Ｆの続き。
【図２８Ｈ】図２８Ｇの続き。
【図２８Ｉ】図２８Ｈの続き。
【図２８Ｊ】図２８Ｉの続き。
【図２８Ｋ】図２８Ｊの続き。
【図２８Ｌ】図２８Ｋの続き。
【図２８Ｍ】図２８Ｌの続き。
【図２８Ｎ】図２８Ｍの続き。
【図２８Ｏ】図２８Ｎの続き。
【図２８Ｐ】図２８Ｏの続き。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下で本開示に係る特定の代表的な実施形態について詳細に述べるが、そのうちいくつかの実施例が添付の図面で例示される。
【００２２】
ＣＸＣＲ３
ＣＸＣＲ３（ＭＩＭ：３００５７４、ヒト遺伝子番号：２８３３、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体３；また、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＫＲ−Ｌ２、ＣＭＫＡＲ３、ＧＰＲ９、ＩＰ１０−Ｒ、Ｍｉｇ−Ｒ、ＭｉｇＲ、Ｇタンパク質共役受容体９、ＩＰ−１０受容体、ＩＰ１０受容体、Ｍｉｇ受容体、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃ）受容体３、インターフェロン誘導性タンパク質１０受容体としても知られている）は、大部分がナイーブＴ細胞には存在しないが、抗原で活性化されると上方制御されて、その一次リガンド：ＣＸＣＬ９（ヒト遺伝子番号：４２８３）、ＣＸＣＬ１０（ヒト遺伝子番号：３６２７）、およびＣＸＣＬ１１（ヒト遺伝子番号：６３７３）に応答して組織の炎症部位にこれらの細胞を動員するケモカイン受容体である。ランゲルハンス島のβ細胞は、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０を発現し（Ｆｒｉｇｅｒｉｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８：１４１４〜１４２０（２００２）、膵臓に浸潤したＴ細胞は、ＣＸＣＲ３を発現する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００３、１７１：６８３８〜６８４５；Ｖａｎ  Ｈａｌｔｅｒｅｎら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ
４８：７５〜８２（２００５）；Ｕｎｏら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｊ．５７：９９１〜９９６（２０１０）；Ｒｏｅｐら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００３、１５９：３３８〜３４３；Ｔａｎａｋａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５８：２２８５〜２２９１（２００９）；Ｓａｒｋａｒら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０１２年２月；６１（２）：４３６〜４６）。
【００２３】
ＣＸＣＲ３は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、チンパンジー、マカク、イヌ、カエル、カモノハシ、ブタ、およびゼブラフィッシュなどの様々な生物で発現される。表１に、様々な生物からのＣＸＣＲ３に関する米国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の遺伝子番号およびタンパク質参照配列を列挙する。配列番号１は、全長ヒトＣＸＣＲ３配列（スプライス変異体Ａ）である。スプライス変異体Ｂのペプチド配列は、参照配列ＮＰ＿００１１３６２６９．１により入手できる。ヒトＣＸＣＲ３スプライス変異体Ａの予測された細胞外ドメインは、Ｃｏｌｖｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．、２６：５８３８〜４９（２００６）で説明されており、以下に示すような配列番号１の残基１〜５８、１〜１６、１１１〜１２６、１９０〜２２３、２７８〜３０１を包含する。
【００２４】
配列番号１ＮＰ＿００１４９５ヒトＣＸＣＲ３アイソフォームＡ
１  ｍｖｌｅｖｓｄｈｑｖ  ｌｎｄａｅｖａａｌｌ  ｅｎｆｓｓｓｙｄｙｇ  ｅｎｅｓｄｓｃｃｔｓ  ｐｐｃｐｑｄｆｓｌｎ  ｆｄｒａｆｌｐａｌｙ
６１  ｓｌｌｆｌｌｇｌｌｇ  ｎｇａｖａａｖｌｌｓ  ｒｒｔａｌｓｓｔｄｔ  ｆｌｌｈｌａｖａｄｔ  ｌｌｖｌｔｌｐｌｗａ  ｖｄａａｖｑｗｖｆｇ
１２１  ｓｇｌｃｋｖａｇａｌ  ｆｎｉｎｆｙａｇａｌ  ｌｌａｃｉｓｆｄｒｙ  ｌｎｉｖｈａｔｑｌｙ  ｒｒｇｐｐａｒｖｔｌ  ｔｃｌａｖｗｇｌｃｌ
１８１  ｌｆａｌｐｄｆｉｆｌ  ｓａｈｈｄｅｒｌｎａ  ｔｈｃｑｙｎｆｐｑｖ  ｇｒｔａｌｒｙｌｑｌ  ｖａｇｆｆｌｐｌｌｖ  ｍａｙｃｙａｈｉｌａ
２４１  ｖｌｌｖｓｒｇｑｒｒ  ｌｒａｍｒｌｖｖｖｖ  ｖｖａｆａｌｃｗｔｐ  ｙｈｌｖｖｉｖｄｉｌ  ｍｄｌｇａｌａｒｎｃ  ｇｒｅｓｒｖｄｖａｋ
３０１  ｓｖｔｓｇｌｇｙｍｈ  ｃｃｌｎｐｌｌｙａｆ  ｖｇｖｋｆｒｅｒｍｗ  ｍｌｌｌｒｌｇｃｐｎ  ｑｒｇｌｑｒｑｐｓｓ  ｓｒｒｄｓｓｗｓｅｔ
３６１  ｓｅａｓｙｓｇｌ
【００２５】
【表１】
2020072715.tif 000002
【００２６】
ＣＸＣＲ３およびＣＸＣＬ１０は、ヒトＴ１Ｄ患者で発現される。Ｕｎｏら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｊ．５７：９９１〜９９６（２０１０）；Ｒｏｅｐら、Ｃｌｉｎ．ａｎｄ  Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎ．１５９：３３８〜３４３（２００９）；Ｔａｎａｋａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５８：２２８５〜２２９１（２００９）。これらの患者において、ＣＸＣＬ１０は、膵島中の残存するインスリン産生ベータ細胞で発現される。ＣＸＣＲ３は、膵島周囲の浸潤性Ｔ細胞で発現される。糖尿病マウスモデルである非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスで、類似の発現パターンが再現されている。Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ
２００４；１７３；７０１７〜７０２４；Ｌｉら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１１（３０）：４７５０〜４７５２（２００５）；Ｓａｒｋａｒら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０１２年２月；６１（２）：４３６〜４６）。
【００２７】
またＣＸＣＲ３は、ある特定のタイプの炎症組織に存在するＴ細胞でも発現されるが、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１１は、炎症性病変の局所的な細胞によって産生されることが多い。したがって、いくつかの実施形態において、Ｔ１Ｄを処置するためにＣＸＣＲ３を破壊する療法が開示されている。
【００２８】
抗体
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、源、起源の種、産生方法、および／または特徴に関係なく、抗原−結合部位を含むあらゆるポリペプチドを指し、免疫グロブリンまたはそれらの抗原結合部分もしくはフラグメントを包含する。非限定的な例として、用語「抗体」は、ヒト、オランウータン、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、およびニワトリの抗体を包含する。この用語は、これらに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異的、多特異的、非特異的、ヒト化、完全ヒト、ラクダ化、一本鎖、キメラ
、合成、組換え、ハイブリッド、突然変異、復帰突然変異、およびＣＤＲ−グラフト化抗体を包含する。またこの用語は、本発明の目的のために、特に他の指定がない限り、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＶＨＨ（またナノボディとも称される）のような抗体フラグメント、および二重特異性または多重特異性抗体などの抗原結合機能を保持する他の抗体フラグメントも包含する。用語「抗体」はまた、免疫グロブリンをベースとしない抗原結合分子も指す。例えば、当技術分野で公知の非免疫グロブリン足場は、小モジュール免疫薬（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（例えば、それぞれ２００８年７月３１日および２００８年９月１８日に公開された米国特許出願公開第２００８０１８１８９２号および２００８０２２７９５８号を参照）、テトラネクチン、フィブロネクチンドメイン（例えば、アドネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ）、２００７年４月１２日に公開された米国特許出願公開第２００７／００８２３６５号を参照）、タンパク質Ａ、リポカリン（例えば、米国特許第７，１１８，９１５号を参照）、アンキリン反復、およびチオレドキシンを包含する。
【００２９】
用語「抗原−結合ドメイン」は、抗原の一部または全部に特異的に結合するか、またはそれらに相補的な領域を含む抗体分子の一部を指す。抗原が大きい場合、抗体は、抗原の特定の一部にしか結合しない可能性がある。ある特定の実施形態において、ＣＸＣＲ３抗体または抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの抗原−結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本抗体またはフラグメントが、同一または異なるエピトープで２つまたはそれ以上のＣＸＣＲ３分子と結合することができるように、または高親和性でＣＸＣＲ３および少なくとも１つの他の抗原に結合することができるように、本抗体またはフラグメントは多重特異性であり、２つまたはそれ以上の（例えば、２、３、４、５、またはそれより多くの）抗原−結合ドメインを含む。抗体の抗原結合部位は、抗原に特異的に結合する能力を保持する１つまたはそれ以上の抗体のフラグメントを含んでいてもよい。これらのフラグメントは、親抗体からの、または親抗体の変異体からの重鎖および／または軽鎖可変領域を含んでいてもよい。
【００３０】
「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体の抗原−結合ドメインとの特異的な相互作用に関与する抗原分子の部分である。抗原−結合ドメインは、１つまたはそれ以上の抗体可変ドメインによって提供される可能性がある。抗原−結合ドメインは、少なくとも１つの抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および少なくとも１つの抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む可能性がある。抗原−結合ドメインはまた、ＶＨ領域のみ、またはＶＬ領域のみを含む場合もある。例えば、ラクダおよびラマ（ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）、ラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄｓ））からの抗体は、重鎖のみで形成され軽鎖がない独特な種類の抗体を包含する。このような抗体の抗原−結合部位は、ＶＨＨと称される１つの単一ドメインである。これらは、「ラクダ化抗体」または「ナノボディ」と呼ばれる。例えば、参照により組み入れられる米国特許第５，８００，９８８号および６，００５，０７９号、ならびに国際出願公報ＷＯ９４／０４６７８号およびＷＯ９４／２５５９１号を参照されたい。
【００３１】
本明細書で開示された抗ＣＸＣＲ３抗体は、当技術分野で公知のあらゆる好適な方法によって生成することができる。例えば、本抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含んでいてもよい。ポリクローナル抗体の製造方法は、当業者に公知である（Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９８８））。ＣＸＣＲ３のポリペプチド、それらのフラグメント（例えば、１つまたはそれ以上の細胞外ドメイン、もしくはＮ末端の５８アミノ酸、もしくはＮ末端の３７アミノ酸、もしくはＮ末端の２０アミノ酸、もしくはＮ末端の１６アミノ酸など）、融合タンパク質、またはそれらの変異体を含む免疫原が、抗ＣＸＣＲ３抗体の生成に使用することができる。
【００３２】
免疫原は、ＣＸＣＲ３を産生する、または過剰産生する細胞によって産生してもよく、このような細胞は、天然に存在する細胞、天然に存在する突然変異細胞または遺伝子操作された細胞であってもよい。ポリペプチドの性質（例えば、パーセント疎水性、パーセント親水性、安定性、正味の電荷、等電点など）に応じて、免疫原を改変またはコンジュゲートして、その免疫原性を変更してもよい。例えば、ＣＸＣＲ３またはそれらの部分を担体にコンジュゲートすることができる。コンジュゲートとしては、活性な化学官能基での誘導体化による化学的なコンジュゲート、もしくは融合タンパク質に基づく方法論を介した化学的なコンジュゲート、または他の当業者に公知の方法のいずれかが挙げられる。タンパク質を変更する担体および／または他の免疫原性の例としては、これらに限定されないが、ＫＬＨ、オボアルブミン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、ダイズトリプシンインヒビター、およびプロミスカスＴヘルパーペプチド（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ）などが挙げられる。
【００３３】
免疫応答を高めるために、様々なアジュバントもＣＸＣＲ３免疫原と共に使用することができる。アジュバントの例としては、これらに限定されないが、フロインドアジュバント（完全および不完全）、ミネラルオイル、ゲル、アラム（水酸化アルミニウム）、表面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、ジニトロフェノール、およびヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））ならびにコリネバクテリウム・パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）などが挙げられる。採用される可能性があるアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。免疫化プロトコールは当技術分野で周知であり、選ばれた動物宿主において免疫反応を惹起するあらゆる方法により行うことができる。したがって、設計上の選択に従って、様々な投与経路を様々な期間で使用することができる。
【００３４】
例えば、免疫原は、本明細書で例示されたように、これらに限定されないが、ウサギ、マウス、ラクダ科の動物、ラットなどの様々な宿主動物に投与して、ＣＸＣＲ３に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導することができる。免疫原の投与は、免疫剤および場合によりアジュバントの１回またはそれ以上の注入を伴っていてもよい。いくつかの実施形態において、哺乳動物への免疫原（アジュバント有り、または無し）の注入は、複数回で皮下もしくは腹膜内に注入されるか、または筋肉内または静脈内に注入される。いくつかの実施形態において、好適なポリクローナル調製物が得られたら、個々の抗体種が得られるように、例えばアフィニティークロマトグラフィー、パニング、吸着などの公知の分離技術によって特定の抗体を単離することができる。いくつかの実施形態において、個々の抗体種は、例えば、１つまたはそれ以上のＣＤＲのアミノ酸配列を得るために、配列決定などのさらなる研究に用いられる。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ３抗体は、モノクローナルである。モノクローナル抗体は、本抗体を発現する単一種の真核生物、ファージまたは原核生物クローンから誘導されたあらゆる抗体を包含する。モノクローナル抗体は、例えば、従来のハイブリドーマ技術（参照により本明細書に組み入れられるＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９９（１９７５）ならびに米国特許第４，３７６，１１０号）、組換えＤＮＡ法（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，８１６，５６７号）、または抗体ライブラリーを使用したファージディスプレイ技術（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７（１９９１））により製造することができる。様々な他の抗体産生技術については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照されたい。モノクローナル抗体を産生するのに採用される可能性がある方法の他の例としては、これらに限定されないが、ヒトβ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；およびＣｏｌｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２０２６（１９８３））、ならびにＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、７７〜９６頁、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ（１９８５））などが挙げられる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤなどのあらゆる免疫グロブリンクラス、ならびにそれらのあらゆるサブクラスまたは変異体に属するものでもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養してもよいし、またはｉｎ  ｖｉｖｏで培養してもよい。
【００３６】
いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ３のポリペプチド、それらのフラグメント（例えば、１つまたはそれ以上の細胞外ドメイン、またはＮ末端の５８アミノ酸、またはＮ末端の３７アミノ酸、またはＮ末端の２０アミノ酸、またはＮ末端の１６アミノ酸など）、融合タンパク質、またはそれらの変異体を含む免疫原を使用して、宿主動物（例えばウサギ、マウス、ラクダ科の動物、ラットなど）を免疫化してモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成することができる。ＣＸＣＲ３に特異的に結合する抗体を産生する、または産生することができるリンパ球を免疫化された宿主から回収し、ポリエチレングリコールのような好適な融合剤（ｆｕｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を使用して骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成することができる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，５９〜１０３頁（１９８６））。
【００３７】
モノクローナル抗体を産生する複数のハイブリドーマを生成することができ、さらに、例えば、ＣＸＣＲ３リガンドのその受容体への結合を防止することにより有益な特性を示すか、または治療上の可能性を示唆するものを選択することができる。選択された抗体をさらに改変して、例えばｉｎ  ｖｉｖｏで強化された安定性を有することなどの有益な特性を獲得したりまたは強化したりすることができる。例えば、望ましい特異性、親和性、および／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、希釈法を使用してクローンをサブクローニングして、標準的な培養法で増殖させてもよい（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、５９〜１０３頁（１９８６））。好適な培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）またはＲＰＭＩ−１６４０培地などが挙げられる。加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ハイブリドーマ細胞を、動物において腫瘍として増殖させてもよい。サブクローンは、特異性、親和性、および／または活性に関してアッセイすることができ、加えてさらなる特徴付けのために最も有益な特性を示すサブクローンを選択することができる。
【００３８】
当技術分野にはモノクローナル抗体産生のための様々な代替方法があり、それらのうちのいずれかが、本明細書で開示された抗ＣＸＣＲ３抗体を産生するのに使用することができる。例えば、モノクローナル抗体は、その全体が参照により組み入れられる米国特許第４，８１６，５６７号で説明されている方法のような組換えＤＮＡ法によって製造してもよい。
【００３９】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手法を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖、またはヒト、ヒト化もしくは他の抗体からの鎖をコードする遺伝子に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）単離して配列決定することができる（Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ（１
９９０）、およびＳａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７４：５４６３（１９７７））。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの源として役立つ可能性がある。単離したら、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、これを、他の状況では免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、ＮＳＯ細胞、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクションして、組換え宿主細胞でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。また、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによってＤＮＡを改変することもできるし（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６８５１（１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドからのコード配列の全部もしくは一部を免疫グロブリンのコード配列に共有結合で合体させることによっても改変することができる。いくつかの実施形態において、非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインと置換してもよいし、または抗体の１つのＣＸＣＲ３結合部位の可変ドメインと置換して、キメラ２価抗体を作製してもよい。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本明細書において説明される抗体を改変して、ＣＤＲグラフト化された、および／または別の方法でヒト化された抗体を生成することができる。ＣＤＲグラフティングは、ヒト化の一形態であるが、他の当技術分野で公知のヒト化技術を使用することもできる。ＣＤＲグラフティングの手法は当業者に公知であり、ＩＭＧＴ（ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、および改変されたＣｈｏｔｈｉａの番号付けスキームなどのＣＤＲ番号付けによる指示に基づくものであってもよい。例えば、ｉｍｇｔ．ｏｒｇ（ＩＭＧＴの連続番号付けシステムの使用をまとめており、それによれば、このシステムは、フレームワークおよび相補性決定領域の定義、Ｘ線回折研究からの構造データ、および高度可変ループの特徴付けを考慮しこれらを組み合わせることにより、全ての種からの全てのＩＧおよびＴＲＶ−領域に対して独自の番号付けを提供している）；ＡｂｈｉｎａｎｄａｎおよびＭａｒｔｉｎ、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４５：３８３２〜９（２００８）を参照されたい；さらに、ＡｂｈｉｎａｎｄａｎおよびＭａｒｔｉｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３６９（３）：８５２〜６２（２００７）（キメラ抗体の「ヒト化の程度」を査定する方法を説明している）；Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ６７１〜４（２００５）（可変ドメイン遺伝子のＶＢＡＳＥ２データベースを説明している）；およびＪｏｈｎｓｏｎおよびＷｕ、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（１２）；１８０１〜５（１９９８）（ＣＤＲＨ３の長さの分布を説明している）も参照されたい。
【００４１】
例えば、ＩＭＧＴ番号付けシステムを使用する場合、保存されたアミノ酸は常に同じ位置を有する。さらにフレームワーク領域の疎水性アミノ酸も保存された位置で番号付けされるため、配列アラインメントを必要とせずとも、異なる配列で同じ位置に位置するフレームワークのアミノ酸（およびコドン）の比較が可能になる。別の例において、Ｋａｂａｔの番号付けシステムは、以下の通りであり、ＣＤＲ−Ｈ１は、およそアミノ酸３１（すなわち、第１のシステイン残基からおよそ９残基）から始まり、およそ５〜７アミノ酸を包含し、次のチロシン残基で終わる。ＣＤＲ−Ｈ２は、ＣＤＲ−Ｈ１が終わったあとの１５番目の残基から始まり、およそ１６〜１９アミノ酸を包含し、次のアルギニンまたはリシン残基で終わる。ＣＤＲ−Ｈ３は、ＣＤＲ−Ｈ２が終わった後のおよそ３３番目のアミノ酸残基から始まり；３〜２５アミノ酸を包含し；配列Ｗ−Ｇ−Ｘ−Ｇで終わり、ここでＸは、任意のアミノ酸である。ＣＤＲ−Ｌ１は、およそ残基２４（すなわち、システイン残基の後）から始まり；およそ１０〜１７残基包含し；次のチロシン残基で終わる。ＣＤＲ−Ｌ２は、ＣＤＲ−Ｌ１が終わったあとのおよそ１６番目の残基から始まり、およそ７残基を包含する。ＣＤＲ−Ｌ３は、ＣＤＲ−Ｌ２が終わったあとのおよそ３３番目の残基
から始まり；およそ７〜１１残基を包含し、配列Ｆ−Ｇ−Ｘ−Ｇで終わり、ここでＸは、任意のアミノ酸である。これらのＣＤＲのうち少なくとも１つを含有する抗体は、本開示の方法で使用することができる。
【００４２】
ＣＤＲ−グラフト化抗体は、ヒト抗体からの重鎖および軽鎖可変領域配列を含んでいてもよく、ここでＶＨおよび／またはＶＬの１つまたはそれ以上のＣＤＲ領域は、ドナー抗体からの、例えば、以下で説明されるＣＸＣＲ３と結合するマウス抗体からのＣＤＲ配列で置き換えられている。あらゆるヒト抗体からのフレームワーク配列が、ＣＤＲグラフティングのためのテンプレートとして役立つ可能性がある。しかしながら、このようなフレームワークへの直鎖状のＣＤＲ鎖の置き換えにより、抗原への結合親和性がいくらか失われる可能性がある。ヒト抗体の、元の抗体、例えばマウス抗体への相同が高ければ高いほど、ドナーＣＤＲとヒトフレームワークとの組み合わせにより、親和性を低下させる可能性があるＣＤＲ中の歪みが導入される可能性はより低くなる。それゆえに、いくつかの実施形態において、本開示のＣＤＲ−グラフト化ＣＸＣＲ３抗体は、ドナーのマウスＣＸＣＲ３中和抗体の可変領域フレームワークと少なくとも６５％の配列同一性を有するヒト可変フレームワークを含む。このような抗体を産生する方法は、当技術分野で公知であり（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公報ＷＯ９１／０９９６７号：および米国特許第５，２２５，５３９号；５，５３０，１０１号；および５，５８５，０８９号を参照）、例えば、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（４／５）：４８９〜４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら（１９９４）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．７（６）：８０５〜８１４；およびＲｏｇｕｓｋａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：９６９〜９７３）、チェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３５２号）、および抗イディオタイプ抗体が挙げられる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本明細書において説明される抗体は、ヒト化されてもよい。「ヒト化抗体」は、望ましい抗原と結合し、非ヒト種からの１つまたはそれ以上のＣＤＲを有し、かつヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域および／または定常ドメインを有する抗体分子である。公知のヒトＩｇ配列は、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ−／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；およびＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）に開示されている。移入したヒト配列を使用して、免疫原性を低減したり、または結合、親和性、結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）、解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）、結合活性、特異性、半減期、もしくは当技術分野で公知の他のあらゆる好適な特徴を低減、強化もしくは改変したりできる。抗体は、これらに限定されないが、参照によりその全体を本明細書に組み入れられるＪｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；Ｓｉｍｓら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１；Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３；米国特許第５，５８９，２０５号；５６５，３３２号；６，１８０，３７０号；６，６３２，９２７号；７，２４１；８７７号；７，２４４，６１５号；７，２４４，８３２号；７，２６２，０５０５号；および米国特許出願公開第２００４／０２３６０７８号（２００４年４月３０日付けで出願）で説明されている技術のような、当技術分野で公知の様々な技術を使用してヒト化されてもよい。
【００４４】
ある特定の実施形態において、ヒト化またはＣＤＲ−グラフト化抗体におけるフレームワークの残基は、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換されていてもよく、例えば、抗原との結合を変更する、例えば改善するために、抗マウスＣＸＣＲ３中和抗体からのフレームワークの残基で置換されていてもよい。Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９〜３３（１９８９年１２月）を参照されたい。これらのフレームワークの置換は、当技術分野で周知の方法によって同定され、例えば、抗原との結合に重要なフレームワークの残基を同定するためのＣＤＲとフレームワークの残基との相互作用のモデリング、および特定の位置における異常なフレームワークの残基を同定するための配列比較によって同定される。例えば、参照によりその全体を本明細書に組み入れられる米国特許第５，５８５，０８９号；およびＲｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３を参照されたい。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補の免疫グロブリン配列の可能性がある三次元立体配座構造を例示し、表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示を精査することにより、候補の免疫グロブリン配列の機能化において可能性がある残基の役割の分析、すなわち、候補の免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析が可能になる。この方式で、高いＣＸＣＲ３への親和性のような望ましい抗体の特徴が達成されるように、コンセンサスおよび移入配列からフレームワークの残基を選択して連結させることができる。
【００４５】
これらに限定されないが、Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；Ｓｉｍｓら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１；Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３；および米国特許第５，５６５，３３２号；５，７２３，３２３号；５，９７６，８６２号；５，８２４，５１４号；５，８１７，４８３号；５，８１４，４７６号；５，７６３，１９２号；５，７２３，３２３号；５，７６６，８８６号；５，７１４，３５２号；６，２０４，０２３号；６，１８０，３７０号；５，６９３，７６２号；５，５３０，１０１号；５，５８５，０８９号；５，２２５，５３９号；および４，８１６，５６７号で説明されている技術のような当技術分野で公知の様々な技術を使用して、抗体をヒト化またはＣＤＲ−グラフト化してもよいし、さらに抗原との結合を改善するのに有用なＣＤＲ−ドナーからのフレームワークの残基を同定してもよい。いくつかの実施形態において、４Ｄヒト化を使用して、本開示の抗体変異体を製造することができる（例えば、重鎖４．４〜４．６のいずれか１つおよび軽鎖４．４〜４．７のいずれか１つを含むクローン４の４Ｄヒト化変異体を製造する）。ＷＯ２００９／０３２６６１（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）の例えば４Ｄヒト化で使用される方法に関する段落［００３７］〜［００４４］を参照されたい。簡単に言えば、４Ｄヒト化は：ａ）ヒト化しようとする可変ドメインの３−Ｄモデルを構築すること；ｂ）可変ドメインの３−Ｄモデルの分子動力学シミュレーションを使用して、そのドメイン中のフレキシブルな残基を同定すること；ｃ）３−Ｄモデルの分子動力学の軌道を、４９種のヒト生殖細胞系の分子動力学軌道と比較することにより、最も近いヒト生殖細胞系を同定すること；およびｄ）ＣＤＲの一部ではないフレキシブルな残基を、（工程ｃで同定されたような）それらのヒト生殖細胞系の対応物に突然変異させること、を含んでいてもよい。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ＣＤＲグラフト化された、および／または別の方法でヒト化された抗体は、クローン４、１２、５３、８２、および１３５のＣＤＲグラフト化および／またはヒト化変異体を含んでいてもよい。例えば、クローン４、１２、５３、８２、および１３５のいずれか１つからの対応する重鎖および軽鎖領域（例えば、クローン４
の重鎖およびクローン４の軽鎖）をヒト定常ドメインに合体させて、キメラ抗体を形成することができる。キメラ抗体はさらに、１つまたはそれ以上のフレームワークまたはＣＤＲのアミノ酸をそれに対応するヒト残基に変化させることにより、ヒト化することができる。同様に、いくつかの実施形態において、クローン４、１２、５３、８２、および１３５のいずれか１つからの６つの重鎖および軽鎖ＣＤＲ領域（例えば、クローン４の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにクローン４の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、またはクローン４、１２、５３、８２、および１３５の変異体のいずれかからの６つの重鎖および軽鎖ＣＤＲ領域をヒトフレームワークおよび／または定常ドメインにサブクローニングして、ヒト化抗体を形成することができる。ヒト化は、ヒト可変ドメインを使用して、ＣＤＲのアミノ酸および／またはあらゆるバーニヤ位置（Ｖｅｒｎｉｅｒ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）の残基を排除することを包含し得る。ヒト化抗体はさらに、ＣＤＲの４つのアミノ酸内に位置する残基に、および／または例えばＩＭＧＴベースのモデリングを使用して、元の抗体配列とヒト配列との間で「まったく異なっている」と同定された位置に、さらなる復帰突然変異による変化を包含し得る。フレームワークまたはＣＤＲ領域中にさらなる突然変異を導入することにより、例えば、クローン４のＶＨのＣＤＲ２の５８位および５９位（ＩＭＧＴによる番号付け）における脱アミド部位が除去されるように突然変異を導入することにより、抗体の安定性または治療有効性を強化することができる。
【００４７】
例えば、本明細書で開示された抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体は、クローン４、１２、５３、８２、および１３５ならびにそれらのキメラまたはヒト化変異体のいずれかからの、６つのＣＤＲおよび／または重鎖および軽鎖可変ドメインを含んでいてもよい。例えば、ＣＸＣＲ３と結合することができる抗体またはフラグメントは、重鎖４．０〜４．１１、重鎖１２．０〜１２．３、重鎖５３．０〜５３．１０、重鎖８２．０〜８２．３、および重鎖１３５．０〜１３５．３のいずれか１つからの３つのＣＤＲを含んでいてもよい。同様に、本抗体またはフラグメントは、軽鎖４．０〜４．７、軽鎖１２．０〜１２．３、軽鎖５３．０〜５３．１３、軽鎖８２．０〜８２．３、および軽鎖１３５．０〜１３５．３のいずれか１つからの３つのＣＤＲを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、重鎖および軽鎖ＣＤＲは、同じクローンからのものであるが、そのクローンの異なる変異体からのもの（例えば、軽鎖４．２からの３つのＣＤＲと対になっている重鎖４．１からの３つのＣＤＲ）であってもよい。重鎖および軽鎖４．０、１２．０、８２．０、および１３５．０は、マウス抗体クローンおよびキメラ抗体中の可変ドメインを指す（この場合、この抗体は、マウス可変ドメインとヒトフレームワーク領域とを含む）。残りの重鎖および軽鎖は、表１１で示されるようなヒト化された鎖を指す。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ３と結合することができる抗体またはフラグメントは、重鎖４．０〜４．１１、重鎖１２．０〜１２．３、重鎖５３．０〜５３．１０、重鎖８２．０〜８２．３、および重鎖１３５．０〜１３５．３のいずれか１つを含んでいてもよい。同様に、本抗体またはフラグメントは、軽鎖４．０〜４．７、軽鎖１２．０〜１２．３、軽鎖５３．０〜５３．１３、軽鎖８２．０〜８２．３、および軽鎖１３５．０〜１３５．３のいずれか１つを含んでいてもよい。
【００４９】
いくつかの実施形態において、重鎖および軽鎖は、特定のクローンの重鎖からの３つのＣＤＲ（例えば、クローン４の重鎖からのＣＤＲ）が、そのクローンの軽鎖のいずれかからの３つのＣＤＲ（例えば、クローン４の軽鎖からのＣＤＲ）と対になるように選択される。いくつかの実施形態において、重鎖および軽鎖は、特定のクローンからの重鎖（例えば、クローン４の重鎖）が、そのクローンの軽鎖のいずれか（例えば、クローン４の軽鎖）と対になるように選択される。
【００５０】
いくつかの実施形態において、重鎖可変ドメイン４．０〜４．１１のいずれか１つから
の３つのＣＤＲは、軽鎖可変ドメイン４．０〜４．７のいずれか１つからの３つのＣＤＲと対になっていてもよく；重鎖可変ドメイン１２．０〜１２．３のいずれか１つからの３つのＣＤＲは、軽鎖可変ドメイン１２．０〜１２．３のいずれか１つからの３つのＣＤＲと対になっていてもよく；重鎖可変ドメイン５３．０〜５３．１０のいずれか１つからの３つのＣＤＲは、軽鎖可変ドメイン５３．０〜５３．１３のいずれか１つからの３つのＣＤＲと対になっていてもよく；重鎖可変ドメイン８２．０〜８２．３のいずれか１つからの３つのＣＤＲは、軽鎖可変ドメイン８２．０〜８２．３のいずれか１つからの３つのＣＤＲと対になっていてもよく；または重鎖可変ドメイン１３５．０〜１３５．３のいずれか１つからの３つのＣＤＲは、軽鎖可変ドメイン１３５．０〜１３５．３のいずれか１つからの３つのＣＤＲと対になっていてもよい。
【００５１】
いくつかの実施形態において、重鎖可変ドメイン４．０〜４．１１のいずれか１つは、軽鎖可変ドメイン４．０〜４．７のいずれか１つと対になっていてもよく、重鎖可変ドメイン１２．０〜１２．３のいずれか１つは、軽鎖可変ドメイン１２．０〜１２．３のいずれか１つと対になっていてもよく、重鎖可変ドメイン５３．０〜５３．１０のいずれか１つは、軽鎖可変ドメイン５３．０〜５３．１３のいずれか１つと対になっていてもよく、重鎖可変ドメイン８２．０〜８２．３のいずれか１つは、軽鎖可変ドメイン８２．０〜８２．３のいずれか１つと対になっていてもよく、または重鎖可変ドメイン１３５．０〜１３５．３のいずれか１つは、軽鎖可変ドメイン１３５．０〜１３５．３のいずれか１つと対になっていてもよい。
【００５２】
図１７にある特定の重鎖および軽鎖可変ドメインのアラインメントを示す。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されたような抗体は、表２で示されるような対になった重鎖および軽鎖可変ドメインを含んでいてもよい（Ｃｈ＝キメラ、Ｈｕ＝ヒト化、ＶＨ＝重鎖、ＶＫ＝軽鎖）。例えば、表２における第１の項目は、重鎖４．０および軽鎖４．０を含むクローン４変異体を表示する。第２の項目は、重鎖４．１および軽鎖４．１を含むクローン４変異体を表示する。各抗体は、表示された重鎖および軽鎖配列を含み、さらに表２の第２列に抗体の識別名も割り当てられた。例えば、表中の第１の項目（重鎖４．０および軽鎖４．０を含む）にはその抗体の識別名である４Ｃｈが割り当てられ、表中の第２の抗体（重鎖４．１および軽鎖４．１を含む）には識別名４Ｈｕ１が割り当てられた。
【００５３】
【表２】
2020072715.tif 000003
【００５４】
【表３】
2020072715.tif 000004
【００５５】
用語「特異的な相互作用」、または「特異的に結合する」などは、２つの分子が、生理学的な状態で比較的安定な複合体を形成することを意味する。特異的な結合は、高い親和性と、低から中程度の結合能とを特徴とする。非特異的な結合は通常、中程度から高い結合能で低い親和性を有する。典型的には、結合は、親和定数Ｋａが、１０６Ｍ−１よりも高い、または好ましくは１０８Ｍ−１よりも高い場合に特異的であるとみなされる。いくつかの実施形態において、抗体、変異体、およびそれらのフラグメントは、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９Ｍ−１、またはそれより高い結合定数でそれらの抗原（複数可）と結合する。いくつかの実施形態において、本抗体、変異体、およびそれらのフラグメントは、少なくとも表７Ａ〜Ｂ、８〜１０、および／または１２のいずれか１つで示された結合動態でＣＸＣＲ３と結合する。必要に応じて、実質的に特異的な結合に影響を及ぼさずに、結合条件を変更することにより非特異的な結合を低減してもよい。このような条件は当技術分野で公知であり、当業者であれば、慣例的な技術を使用して、適切な条件を選択することができる。条件は、通常、抗体濃度、溶液のイオン強度、温度、結合させる時間、血清アルブミンおよびミルクカゼインのようなブロック分子の濃度に関して規定される。
【００５６】
いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ３を中和することができる抗ＣＸＣＲ３抗体が、本明細書において開示される。「ＣＸＣＲ３中和抗体」は、ＣＸＣＲ３に結合して、ＣＸＣＲ３リガンドのＣＸＣＲ３への結合の結果生じる典型的な生理学的および遺伝学的な応答のような受容体の活性をブロックする。活性の中和は、完全な中和（１００％の中和）であってもよいし、または部分的な、例えば、およそ１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５％またはそれより多く（またはこれらの間のあらゆるパーセンテージ）の中和であってもよく、抗体濃度、親和性、およびエピトープ、加えて活性の中和を評価するのに使用される特定のアッセイのような当業者に公知の様々な要素に依存すると予想される。ＣＸＣＲ３中和抗体の活性の中和は、例えば、リガンド結合、ＧＴＰ結合、カルシウム動員、細胞走化性、および／または受容体の内在化の阻害を測定するアッセイにより示すことができる。中和抗体、特にＣＸＣＲ３中和抗体の活性を決定する多数のアッセイが当業者に公知であり、特定の抗体が中和していることを確認できるように容易に適合が可能である。
【００５７】
例えば、いくつかの実施形態において、本発明の方法で使用するための抗体の活性の中
和は、実質的にクローン４９８０１によって産生され、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）によって販売されている抗体（カタログ番号ＭＡＢ１６０）の添付文書に記載されているように、走化性アッセイによって査定することができる。中和量−５０（ＮＤ５０）は、特定のｒｈｌ−ＴＡＣ濃度での、反応性細胞株において細胞表面ＣＸＣＲ３が介在するｒｈｌ−ＴＡＣ応答の最大阻害の２分の１を達成するのに必要な抗体濃度と定義される。ｒｈｌ−ＴＡＣにより誘導された、ｈＣＸＣＲ３でトランスフェクションされたＢａＦ／３細胞の走化性をブロックする抗体の能力を測定するために、９６−ウェルの走化性チャンバー（ＮｅｕｒｏＰｒｏｂｅ、Ｃａｂｉｎ  Ｊｏｈｎ、ＭＤ）の下の区画にｒｈｌ−ＴＡＣを７ｎｇ／ｍＬで添加する。次いでＰＶＰ非含有ポリカーボネートフィルター（孔径５μ）を使用して走化性チャンバーを組み立てる。チャンバーの上のウェルに、抗体の連続希釈液（例えば、０．００１〜１００００μｇ／ｍＬ）を０．２５×１０６細胞／ウェルで添加する。５％ＣＯ２の加湿したインキュベーター中で３７℃で３時間インキュベートした後、チャンバーを解体し、下のチャンバーまで移動した細胞を作業用プレートに移し、例えば、リザズリン蛍光を使用して定量する。
【００５８】
Ｃｏｌｖｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．、２６：５８３８〜４９（２００６）は、ある特定の実施形態において、本発明で使用するための中和ＣＸＣＲ３抗体の中和活性を決定するために使用することができる追加のアッセイを説明している。簡単に言えば、機能的にＣＸＣＲ４を発現するマウスＢ細胞前白血病細胞株である３００−１９細胞を使用することができる。トランスフェクション後、この株は、他のケモカイン受容体、例えば、ヒトＣＸＣＲ３を機能的発現することが可能になる（例えば、参照により組み入れられる米国特許出願公開第２０１０／００６１９８３号の段落２０１〜２０９を参照）。ヒトＣＸＣＲ３を発現する３００−１９細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する完全ＲＰＭＩ培地で増殖させてもよい。候補の中和ＣＸＣＲ３抗体の存在下におけるＣＸＣＲ３リガンドのＣＸＣＲ３への結合を評価するために、９６−ウェルの組織培養プレートに、総体積１５０μＬの結合緩衝液（０．５％ＢＳＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中で、４００，０００個のＣＸＣＲ３／３００−１９細胞を入れる。この細胞に合計０．０４ｎＭの１２５Ｉ−標識ＣＸＣＬ１０（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）またはＣＸＣＬ１１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、および５×１０６ｎＭ〜５００ｎＭの非標識ＣＸＣＬ１０またはＣＸＣＬ１１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を添加して、振盪しながら室温で９０分インキュベートしてもよい。０．３％ポリエチレンイミンに予め浸して０．５ＭのＮａＣｌが補充された結合緩衝液２００μｌで３回洗浄した９６−ウェルのフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）の上に細胞を移す。プレートを乾燥させ、Ｗａｌｌａｃ  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａシンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で、シンチレーション液を添加した後に放射活性を測定する。ＣＸＣＬ９の結合は、ＣＸＣＬ１０および１１と同じように評価することができる。
【００５９】
ある特定の実施形態において、本明細書で開示された抗体は、ＣＸＣＲ３を発現する細胞へのカルシウム流出を防止または低減することができる。いくつかの実施形態において、カルシウム流出は、ＣＸＣＲ３／３００−１９細胞のような細胞で検出することができる。およそ５×１０６個の細胞を１％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ培地２ｍｌに懸濁する。Ｆｕｒａ−２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）１５マイクログラムを添加し、細胞を３７℃で２０分インキュベートする。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、カルシウム流出緩衝液（１４５ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＮａＨＰＯ４、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．８ｍＭのＭｇＣｌ２、および２２ｍＭのグルコース）２ｍｌに再懸濁する。蛍光の測定値は、３７℃でＤｅｌｔａＲＡＭ蛍光分光計（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｌａｗ
ｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ、ＮＪ）で測定される。ケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ９、１０、または  １１）の添加の前および後に、細胞内カルシウム濃度を、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍでの連続的な励起に応答して５１０ｎｍで放出された励起蛍光強度として記録し、３８０ｎｍにおける蛍光に対する３４０ｎｍにおける蛍光の相対比率として示す。
【００６０】
ある特定の実施形態において、ＣＸＣＲ３の中和は、受容体の内在化の低減を測定することによって評価することができる。いくつかの実施形態において、受容体の内在化のアッセイは、１％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ培地中で、約２．５×１０５個の、ＣＸＣＲ３／３００−１９細胞のような細胞を、様々な濃度のＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、またはＣＸＣＬ９と共に３７℃で３０分インキュベートすることによって行ってもよい。次いで細胞を氷冷した蛍光活性化セルソーター用緩衝液で洗浄し、その後、ＰＥコンジュゲートＣＸＣＲ３抗体を使用して表面におけるＣＸＣＲ３の発現について分析してもよい。
【００６１】
活性の中和を査定するための追加のアッセイは、例えば、参照により組み入れられる米国特許第７，４０５，２７５号の実施例２〜４に開示されている。
【００６２】
上記のアッセイのいずれかで査定されたように、ある特定の実施形態において、ＣＸＣＲ３抗体の中和は、およそ０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、４０、５０、または１００μｇ／ｍＬのＮＤ５０を有する可能性がある。特定の実施形態において、ＮＤ５０は、０．５〜１２μｇ／ｍＬ、より特定の実施形態において、１〜６μｇ／ｍＬであってもよい。
【００６３】
本明細書で開示された単離されたＣＸＣＲ３抗体は、ＣＸＣＲ３の特異的なエピトープと結合するものを包含し得る。例えば、本発明で使用するための抗体は、配列番号１の残基１〜５８、１〜１６、または１〜３７から選択される配列の全部または一部（例えば、少なくとも５、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、１８、または２０残基のフラグメント）を含むペプチドと結合してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された抗体は、図１８で同定されたエピトープのうち１つまたはそれ以上と結合するものを包含する。いくつかの実施形態において、抗ＣＸＣＲ３抗体は、ＳＤＨＱＶＬＮＤＡＥ（配列番号）を含むＣＸＣＲ３エピトープに結合する抗体を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、エピトープは、ＳＤＨＱＶＬＮＤ（配列番号）、ＤＨＱＶＬＮＤ（配列番号）、および／またはＶＬＮＤＡＥ（配列番号）を含む。ある特定の実施形態において、エピトープは、配列ＶＬＮＤ（配列番号）を含む。いくつかの実施形態において、エピトープは、ＸＤＸＸＶＸＮＤＸＸ（配列番号）を含み、ここでＸは、任意のアミノ酸を示す。いくつかの実施形態において、エピトープは、ＸＤＸＸＶＸＮＤ（配列番号）、ＤＸＸＶＸＮＤ（配列番号）、および／またはＶＸＮＤＸＸ（配列番号）を含み、ここでＸは、任意のアミノ酸を示す。ある特定の実施形態において、エピトープは、配列ＶＸＮＤ（配列番号）を含み、ここでＸは、任意のアミノ酸を示す。
【００６４】
抗ＣＸＣＲ３抗体は、異なる種からのＣＸＣＲ３配列に汎特異的であってもよいし、またはＣＸＣＲ３の特定の種または特定のアイソタイプからのＣＸＣＲ３配列に対して選択的であってもよい。特定の実施形態において、ＣＸＣＲ３抗体は、それが投与される対象の種に特異的である。したがって、いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ３抗体は、ヒトＣＸＣＲ３配列に特異的であってもよい（例えば、上記で列挙した配列番号１の部分配列のいずれかに相同な配列を含むペプチドと結合することができる）。相同配列は、当技術分野における通常の技術を有するものであれば、タンパク質配列アラインメントのような手段（例えば、ＢＬＡＳＴｐ、ＣｌｕｓｔａｌＷなど）により容易に同定されると予想される。特定の実施形態において、本発明で使用するための抗体は、配列の全長または少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、もしくは７０残基（またはその間のあらゆる値）の枠にわたり、配列番号１と少なくとも
９０、９５、もしくは９９％（またはその間のあらゆるパーセンテージ）類似しているかまたは同一な配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態において、本抗体は、上述したエピトープのうち１つに、少なくとも８０、８５、９０、９５、または９９％（またはその間のあらゆるパーセンテージ）類似しているかまたは同一なエピトープに結合することができる（図１８も参照）。
【００６５】
本明細書で開示された特定の抗体としては、例えば、抗体クローン（Ｃｌ）１２、Ｃｌ１３５、Ｃｌ８２、Ｃｌ５３、ならびにＣｌ４、加えてそれらのキメラおよびヒト化変異体などが挙げられる。
【００６６】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示された抗体は、抗体５Ｈ７および７Ｈ５（例えば、米国特許第７，４０５，２７５号で開示されたものであり；これらの抗体のＣＤＲは、表１および２ならびに参照配列リストに開示されており、これらは参照により組み入れられる）；Ｖ４４Ｄ７（国際公開ＷＯ２００８／０９４９４２で説明されているもの）、１Ｃ６（米国特許第７，４０７，６５５号で説明されており；エピトープマッピングは、実施例８および９で説明されており、これらは参照により組み入れられる）、およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓによりカタログ番号ＭＡＢ１６０として販売されている４９８０１などの当技術分野で公知の抗体に勝るある特定の改良された特性を示す。
【００６７】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示された抗体クローン（クローン４、１２、５３、８２、および１３５ならびにそれらのキメラおよびヒト化された対応物）は、公知の抗体５Ｈ７、７Ｈ５、Ｖ４４Ｄ７、１Ｃ６、および４９８０１に勝るある特定の驚くべき利点を示す。例えば、本明細書で開示されたクローンは、抗ｈＣＸＣＲ３クローン５Ｈ７、７Ｈ５、Ｖ４４Ｄ７、１Ｃ６、および４９８０１と比較して高い結合親和性を示す。また本明細書で開示されたヒト化クローンも、マウス抗ｈＣＸＣＲ３クローン５Ｈ７、７Ｈ５、Ｖ４４Ｄ７、１Ｃ６、および４９８０１と比較して減少した免疫原性を有する可能性がある。加えて、本明細書で開示された抗体、例えば重鎖クローン４．７〜４．１１を含む抗体は、脱アミド部位を除去して安定性を強化するための５８位および５９位（ＩＭＧＴによる番号付けを使用して）における改変によって最適化されている。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された抗体は、ＣＸＣＲ３中和活性を保持する。
【００６８】
ある特定の実施形態において、本明細書で開示された抗体またはフラグメントは、抗体Ｃｌ１２、Ｃｌ１３５、Ｃｌ８２、Ｃｌ５３、およびＣｌ４のいずれか１つにおける、またはこれらのクローンのキメラまたはヒト化変異体におけるＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ配列と約８０％〜約１００％（例えば、約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一な（例えば、Ｃｌ１２中の６つのＣＤＲ、またはＣｌ１２．１中の６つのＣＤＲなどと８０〜１００％同一な）ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、本抗体またはフラグメントは、抗体Ｃｌ１２、Ｃｌ１３５、Ｃｌ８２、Ｃｌ５３、およびＣｌ４のいずれか１つにおけるＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ配列と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸置換（付加、欠失、および保存的置換のような置換を包含する）を含有するＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を含んでいてもよい。
【００６９】
用語「パーセント（％）配列同一性」または「相同性」は、本明細書で使用される場合、配列をアラインして、必要に応じて、最大パーセントの配列同一性を達成するためにギャップを導入し、保存的な核酸置換を排除した後の、参照配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一な候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージと定義される。比較するのに最適な配列のアラインメントは、手作業の他にも、当技術分野で公知の局所的な相同性アルゴリズムによって、またはこれらのアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ  Ｐ）を使用するコンピュータープログラムによって作製することができる。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されたような単離されたＣＸＣＲ３抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖４．０〜４．１１、重鎖１２．０〜１２．３、重鎖５３．０〜５３．１０、重鎖８２．０〜８２．３、および重鎖１３５．０〜１３５．３のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（またはその間のあらゆるパーセンテージ）の同一性を含むＶＨのアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、本抗体またはフラグメントは、重鎖４．０〜４．１１、重鎖１２．０〜１２．３、重鎖５３．０〜５３．１０、重鎖８２．０〜８２．３、および重鎖１３５．０〜１３５．３のいずれか１つのアミノ酸配列に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の突然変異（付加、欠失、および保存的置換のような置換を包含する）を有するＶＨのアミノ酸配列を含む。「保存的置換」は、本明細書で使用される場合、抗体またはフラグメントの化学的、物理的および／または機能特性を実質的に変更しない、第１のアミノ酸の第２のアミノ酸での置き換えを指す（例えば、本抗体またはフラグメントは、同じ電荷、構造、極性、疎水性／親水性を保持し、および／またはＣＸＣＲ３を認識する、ＣＸＣＲ３に結合する、および／またはＣＸＣＲ３活性を中和する能力のような機能を保存する）。
【００７１】
ある特定の実施形態において、本明細書で開示されたような単離されたＣＸＣＲ３抗体または抗原結合フラグメントは、軽鎖４．０〜４．７、軽鎖１２．０〜１２．３、軽鎖５３．０〜５３．１３、軽鎖８２．０〜８２．３、および軽鎖１３５．０〜１３５．３のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間のあらゆるパーセンテージ）の同一性を含むＶＬのアミノ酸配列を含む。様々な実施形態において、本抗体またはフラグメントは、軽鎖４．０〜４．７、軽鎖１２．０〜１２．３、軽鎖５３．０〜５３．１３、軽鎖８２．０〜８２．３、および軽鎖１３５．０〜１３５．３のいずれか１つのアミノ酸配列に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の突然変異（付加、欠失、および保存的置換のような置換を包含する）を有するＶＬのアミノ酸配列を含む。
【００７２】
ある特定の実施形態において、本明細書で開示されたような単離されたＣＸＣＲ３抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖４．０〜４．１１、重鎖１２．０〜１２．３、重鎖５３．０〜５３．１０、重鎖８２．０〜８２．３、および重鎖１３５．０〜１３５．３のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を含む重鎖可変ドメインを含み、さらに軽鎖４．０〜４．７、軽鎖１２．０〜１２．３、軽鎖５３．０〜５３．１３、軽鎖８２．０〜８２．３、および軽鎖１３５．０〜１３５．３のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態において、重鎖および軽鎖は、特定のクローンからの重鎖（例えば、クローン４の重鎖）が、そのクローンの軽鎖（例えば、クローン４の軽鎖）のいずれかと対になるように選択される。いくつかの実施形態において、重鎖および軽鎖は、表２で示されるように対になっている。さらなる実施形態において、開示されたＶＨおよび／またはＶＬ配列を含む抗体またはフラグメントは、ＣＸＣＲ３活性を中和する能力を保持する。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本明細書において開示される抗体は、Ｃｌ１２、１３５、８２、５３、および／または４のヒト化変異体である。他の実施形態において、本抗体は、完全ヒトである。ある特定の実施形態において、本抗体は、クローン１２、１３５、８２、５３、および４から選択される抗体のヒト化または完全ヒト誘導体である。いくつかの実施形態において、本抗体は、少なくとも１０８Ｍ−１（例えば、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１もしくは少なくとも１０１１Ｍ−１、またはその間のあらゆる値）の親和定数を有する。いくつかの実施形態において、本抗体は、全てのＣＸＣＲ３アイソフォームに結合することができる。ある特定の実施形態において、本抗体は、ＣＸＣＲ３のＡおよびＢアイソフォームの両方に結合するこ
とができる。いくつかの実施形態において、本抗体は、ＣＸＣＲ３のＢ−アイソフォームに結合しない。
【００７４】
いくつかの実施形態において、単離されたＣＸＣＲ３抗体または抗原結合フラグメントは、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体からのＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列と約９０％〜約１００％（例えば、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一なアミノ酸配列を含む、ＶＨのＣＤＲ１、ＶＨのＣＤＲ２、ＶＨのＣＤＲ３、ＶＬのＣＤＲ１、ＶＬのＣＤＲ２、および／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、単離されたＣＸＣＲ３抗体または抗原結合フラグメントは、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体からのＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列と同一なアミノ酸配列、または該ＣＤＲ配列と比べて、１、２、３、４、または５のアミノ酸残基の突然変異（付加、欠失、および保存的置換のような置換を包含する）を含むアミノ酸配列を含む、ＶＨのＣＤＲ１、ＶＨのＣＤＲ２、ＶＨのＣＤＲ３、ＶＬのＣＤＲ１、ＶＬのＣＤＲ２、および／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態において、抗ＣＸＣＲ３抗体またはフラグメントは、３つのＣＤＲ（重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を有する重鎖と、３つのＣＤＲ（軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を有する軽鎖とを含む。いくつかの実施形態において、ＶＨのＣＤＲ１は、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体のＶＨのＣＤＲ１配列と比べて、１、２、または３のアミノ酸突然変異を有する。いくつかの実施形態において、ＶＨのＣＤＲ２は、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体のＶＨのＣＤＲ２配列と比べて、１、２、または３のアミノ酸突然変異を有する。いくつかの実施形態において、ＶＨのＣＤＲ３は、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体のＶＨのＣＤＲ３配列と比べて、１、２、または３のアミノ酸突然変異を有する。いくつかの実施形態において、ＶＬのＣＤＲ１は、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体のＶＬのＣＤＲ１配列と比べて、１、２、または３のアミノ酸突然変異を有する。いくつかの実施形態において、ＶＬのＣＤＲ２は、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体のＶＬのＣＤＲ２配列と比べて、１または２のアミノ酸突然変異を有する。いくつかの実施形態において、ＶＬのＣＤＲ３は、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体のＶＬのＣＤＲ３配列と比べて、１、２、または３のアミノ酸突然変異を有する。ある特定の実施形態において、重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤ２、およびＣＤＲ３は、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体からのＣＤＲであるか、または上記抗体クローンのいずれか１つまたはそれらのキメラ／ヒト化変異体から選択されたものに存在するＣＤＲと比べて、１〜３のアミノ酸突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異は、図１７Ａ〜Ｈのアラインメントにおいて示された強調表示された位置に存在する。いくつかの実施形態において、突然変異は、クローン４．０〜４．１１のいずれか１つからのＶＨのＣＤＲ２中の５８位および５９位のうち一方またはそれ以上に存在する。
【００７６】
いくつかの実施形態において、抗ＣＸＣＲ３抗体またはフラグメントは、重鎖および軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、重鎖は、重鎖４．０〜４．１１、重鎖１２．０〜１２．３、重鎖５３．０〜５３．１０、重鎖８２．０〜８２．３、および重鎖１３５．０〜１３５．３のいずれか１つと比べて、少なくとも約９０％同一であり（例えば、少なくとも約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一
であるか、またはその間のあらゆるパーセンテージで同一であり）、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のアミノ酸突然変異を有する。いくつかの実施形態において、軽鎖は、軽鎖４．０〜４．７、軽鎖１２．０〜１２．３、軽鎖５３．０〜５３．１３、軽鎖８２．０〜８２．３、および軽鎖１３５．０〜１３５．３のいずれか１つと比べて、少なくとも約９０％同一であり（例えば、少なくとも約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるか、またはその間のあらゆるパーセンテージで同一であり）、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のアミノ酸突然変異を有する。いくつかの実施形態において、重鎖は、重鎖４．０〜４．１１、重鎖１２．０〜１２．３、重鎖５３．０〜５３．１０、重鎖８２．０〜８２．３、および重鎖１３５．０〜１３５．３のいずれか１つと比べて、少なくとも約９０％同一であり（例えば、少なくとも約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるか、またはその間のあらゆるパーセンテージで同一であり）、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のアミノ酸突然変異を有し、ならびに／または軽鎖は、軽鎖４．０〜４．７、軽鎖１２．０〜１２．３、軽鎖５３．０〜５３．１３、軽鎖８２．０〜８２．３、および軽鎖１３５．０〜１３５．３のいずれか１つと比べて、少なくとも約９０％同一であり（例えば、少なくとも約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるか、またはその間のあらゆるパーセンテージで同一であり）、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のアミノ酸突然変異を有する。いくつかの実施形態において、突然変異は、図１７Ａ〜Ｈのアラインメントにおいて示される位置に存在する。
【００７７】
ある特定の実施形態において、上記で開示されたＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ配列を含む単離されたＣＸＣＲ３抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＸＣＲ３中和活性を保持する。
【００７８】
様々な実施形態において、ＣＸＣＲ３抗体またはフラグメントの重鎖および軽鎖可変ドメインは、少なくとも１つのフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のうち少なくとも１つ）を含んでいてもよい。重鎖のフレームワーク領域はＶＨ  ＦＲと表示され、軽鎖のフレームワーク領域はここではＶＬ  ＦＲと表示される。ある特定の実施形態において、フレームワーク領域は、置換、挿入、またはその他の変更を含有していてもよい。ある特定の実施形態において、これらの変更により、本抗体の結合親和性における改善または最適化が起こる。改変が可能なフレームワーク領域の残基の非限定的な例としては、非共有結合によって直接的にＣＸＣＲ３と結合する、ＣＤＲと相互作用するかまたはＣＤＲのコンフォメーションに作用する、および／またはＶＬ−ＶＨの境界に関与する残基が挙げられる。
【００７９】
ある特定の実施形態において、ＣＸＣＲ３抗体またはフラグメントの重鎖（ＶＨ）は、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体内の対応するＶＨフレームワーク領域に、約８０％〜約１００％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％、またはその間のあらゆるパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を有するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４を含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、ＣＸＣＲ３抗体またはフラグメントは、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体内の対応するＶＨ  ＦＲ領域と同一な、または該領域と比べて１、２、３、４、または５のアミノ酸突然変異（付加、欠失、および保存的置換のような置換を包含する）を有するアミノ酸配列を有する、少なくとも１つのＶＨ  ＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４）を含んでいてもよい。
【００８０】
ある特定の実施形態において、ＣＸＣＲ３抗体またはフラグメントの軽鎖（ＶＬ）は、
クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体内の対応するＶＬフレームワーク領域と約８０％〜約１００％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％、またはその間のあらゆるパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を有するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４を含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、ＣＸＣＲ３抗体またはフラグメントは、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体内の対応するＶＬ  ＦＲ領域と同一な、または該領域と比べて１、２、３、４、または５のアミノ酸突然変異（付加、欠失、および保存的置換のような置換を包含する）を有するアミノ酸配列を有する、少なくとも１つのＶＬ  ＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４）を含んでいてもよい。
【００８１】
ある特定の実施形態において、ＣＸＣＲ３抗体またはフラグメントは、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体内の対応するＶＨ  ＦＲ領域と同一な、または該領域と比べて１、２、３、４、または５のアミノ酸突然変異を含むアミノ酸配列を有するＶＨ  ＦＲ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４）を含み、さらに、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体内の対応するＶＬ  ＦＲ領域と同一な、または該領域と比べて１、２、３、４、または５のアミノ酸突然変異を含むアミノ酸配列を有するＶＬ  ＦＲ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４）を含む。ある特定の実施形態において、ＣＸＣＲ３抗体またはフラグメントは、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体内の対応するＶＨ  ＦＲ領域と約８０〜１００％同一なアミノ酸配列を有するＶＨ  ＦＲ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４）を含み、さらに、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体内の対応するＶＬ  ＦＲと約８０〜１００％同一なアミノ酸配列を有するＶＬ  ＦＲ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４）を含む。
【００８２】
ＣＤＲおよびＦＲ領域のそれぞれを独立して選択し、所与の抗体に関する他のあらゆるＣＤＲまたはＦＲ領域と組み合わせることができるため、本明細書で開示されたＣＤＲおよびＦＲ領域は、様々な組み合わせで連結が可能である。ある特定の実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲならびにＦＲ配列は、ＣＸＣＲ３活性を中和する能力を保持する抗体またはフラグメント中で、あらゆる組み合わせで存在していてもよい。
【００８３】
本明細書で開示されたような抗体およびフラグメントは、本明細書において説明されるアミノ酸配列を実質的に変更しない１つまたはそれ以上のアミノ酸配列を含んでいてもよい。実質的に同じアミノ酸配列としては、保存的アミノ酸置換、同様に抗体またはフラグメントのＣＸＣＲ３活性を中和する能力を損なわないアミノ酸欠失および／または挿入を含む配列が挙げられる。
【００８４】
本明細書で開示された抗体およびフラグメントはさらに、１つまたはそれ以上の追加の分子にコンジュゲートされてもよい。例えば、コンジュゲートは、治療剤、可溶化剤、安定剤、免疫抑制剤、受容体、およびそれらのフラグメント、抗原と結合するペプチド、ならびに／または他のリガンド標的部分のうち１つまたはそれ以上に、直接的に、またはリンカーを介して合体した抗体を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、治療剤は、Ｔ１Ｄおよび／またはＣＸＣＲ３に関連する他の障害を処置するのに有用な作用剤である。いくつかの実施形態において、本抗体またはフラグメントは、β細胞刺激因子またはインスリンにコンジュゲートされている。
【００８５】
ヌクレオチド配列
上述したアミノ酸配列に加えて、ある特定の実施形態において、それらのアミノ酸配列に相当するヌクレオチド配列が本明細書において開示される。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＣＸＣＲ３活性を中和することができる抗体またはフラグメントをコードする。ある特定の実施形態において、ヌクレオチド配列を使用して、細胞中での抗ＣＸＣＲ３抗体の発現（例えば、哺乳動物細胞での発現）のための発現ベクターを製造することができる。
【００８６】
また、ある特定の実施形態において、本明細書で開示されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと実質的に同一なポリヌクレオチドも本明細書において開示される。実質的に同一な配列は、多型配列、すなわち集団における代替配列または対立遺伝子であってもよい。また実質的に同一な配列は、サイレント突然変異を含む配列などの、突然変異が誘発された配列を含んでいてもよい。突然変異は、１つまたはそれ以上のヌクレオチド残基の変化、１つまたはそれ以上のヌクレオチド残基の欠失、または１つまたはそれ以上の追加のヌクレオチド残基の挿入を含んでいてもよい。また実質的に同一な配列は、核酸コードの縮重のために、本明細書で開示されたアミノ酸配列中のいずれかある特定のアミノ酸位置における同じアミノ酸をコードする様々なヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また、実質的に同一な配列には、ＣＸＣＲ３を中和する能力を保持する抗体の１つの鎖または複数の鎖をコードする配列も包含される。
【００８７】
また、ある特定の実施形態において、高度にストリンジェントな、またはそれより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、ＣＸＣＲ３中和抗体またはフラグメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドも本明細書において開示される。用語「ストリンジェンシー」は、本明細書で使用される場合、２つの核酸間の相同性の程度を評価するために行われるハイブリダイゼーション実験の実験条件（例えば、温度および塩濃度）を指し；ストリンジェンシーが高ければ、２つの核酸間のパーセント相同性はより高くなる。成句「ハイブリダイズすること」、またはそれらの文法上の変化形は、本明細書で使用される場合、低い、中程度もしくは高いストリンジェンシー条件下で、または核酸合成条件下で、第１の核酸分子が第２の核酸分子に結合することを指す。ハイブリダイゼーションには、第１の核酸分子が第２の核酸分子に結合するような例と、第１の核酸分子と第２の核酸分子とが相補的である例とがあり得る。
【００８８】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、これらに限定されないが、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中での、約４５セルシウス度でのフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーション、それに続いて０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での、約５０〜６５セルシウス度での１回またはそれ以上の洗浄を包含する。他のストリンジェントな条件は、６×ＳＳＣ中での、約４５セルシウス度での、フィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーション、それに続いて０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳでの、約６５セルシウス度での１回またはそれ以上の洗浄を包含する。公知のストリンジェンシーの他のハイブリダイゼーション条件は当業者によく知られており、本明細書に含められる。
【００８９】
ある特定の実施形態において、本明細書で開示された核酸は、ＣＸＣＲ３活性を中和することができる抗体またはフラグメント中の１つの鎖または複数の鎖のアミノ酸配列をコードしていてもよく、または核酸は、本抗体またはフラグメント中の１つの鎖または複数の鎖のアミノ酸配列をコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものでもよい。
【００９０】
ある特定の実施形態において、ＣＸＣＲ３中和抗体またはフラグメントのＶＨドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、さらに、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体の重鎖
をコードするヌクレオチド配列に少なくとも約８０〜１００％（例えば、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）（またはその間のあらゆるパーセンテージ）同一なポリヌクレオチド配列が、本明細書において開示される。ある特定の実施形態において、上記ポリヌクレオチド配列は、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体の重鎖をコードするヌクレオチド配列と比べて、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の突然変異（付加、欠失、および保存的置換のような置換を包含する）を有するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【００９１】
ある特定の実施形態において、ＣＸＣＲ３中和抗体またはフラグメントのＶＬドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、さらに、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列に少なくとも約８０〜１００％（例えば、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）（またはその間のあらゆるパーセンテージ）同一なポリヌクレオチド配列が、本明細書において開示される。ある特定の実施形態において、上記ポリヌクレオチド配列は、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列と比べて、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の突然変異（付加、欠失、および保存的置換のような置換を包含する）を有するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【００９２】
特定の実施形態において、ＶＨのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間のあらゆるパーセンテージ）同一であり、さらに、ＶＬのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間のあらゆるパーセンテージ）同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列が、本明細書において開示され、ここで上記ヌクレオチド配列は、クローン１２、１３５、８２、５３、および４のいずれか１つならびにそれらのキメラおよびヒト化変異体からの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列をコードする。
【００９３】
開示されたポリヌクレオチドは、当技術分野で公知のあらゆる方法により得てもよい。例えば、抗体のヌクレオチド配列が公知の場合、本抗体をコードするポリヌクレオチドを化学合成されたオリゴヌクレオチドから構築してもよい。これは、例えば、本抗体をコードする配列の一部を含有するオーバーラップするオリゴヌクレオチドを合成し、これらのオリゴヌクレオチドをアニールおよびライゲートし、次いでライゲートしたオリゴヌクレオチドをＰＣＲで増幅することを含むと予想される。開示されたポリヌクレオチドは、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現するあらゆる組織もしくは細胞（例えば、抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞）から単離されたｃＤＮＡライブラリーのようなその他のあらゆる好適な核酸源から生成することもできる。
【００９４】
いくつかの実施形態において、開示されたポリヌクレオチドのいずれかが、発現ベクターに取り入れられてもよい。様々なヒトおよび動物の細胞型で発現させるのに好適なベクターは、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態において、ベクターを含む宿主細胞が提供される。好適な宿主細胞としては、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＳＦ９、および／またはその他のヒトもしくは非ヒト細胞株が挙げられる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、培地中で培養されると一時的にまたは安定してベクター上の核酸を発現し、それによって本明細書で開示された抗体またはフラグメントを産生するための方法が提供される。
【００９５】
医薬組成物
医薬組成物は、本明細書で開示された抗体、またはそれらのフラグメントのいずれかを含んでいてもよい。また、例えば、遺伝子治療用途で使用するため、および／またはタンパク質またはそれらのフラグメントを産生するための宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＳＦ９、および／またはその他のヒトもしくは非ヒト細胞株）での一時的または安定な発現のための、本抗体またはそれらのフラグメントをコードする核酸を含む医薬組成物も開示される。
【００９６】
本明細書で開示された医薬組成物は、溶媒、充填剤、増量剤、崩壊剤、緩衝液、もしくは安定剤のような、薬学的に許容される担体および／または少なくとも１種の添加剤を含んでいてもよい。標準的な医薬製剤技術は当業者に周知である（例えば、２００５  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（登録商標）、Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪ、２００４；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｇｅｎｎａｄｏら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、２０００を参照）。好適な製薬用添加剤としては、例えば、マンニトール、スターチ、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。ある特定の実施形態において、医薬組成物はまた、ｐＨを緩衝化する試薬および湿潤剤または乳化剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、注射用の滅菌生理食塩水など）を含有していてもよい。さらなる実施形態において、本組成物は、保存剤またはその他の安定剤を含有していてもよい。
【００９７】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示された抗体、またはそれらのフラグメント、または本抗体もしくはフラグメントをコードする核酸のいずれかを含む医薬組成物はさらに、以下のもの：マンニトール、ポリソルベート８０、二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、および一塩基性リン酸ナトリウム一水和物のうち１種またはそれ以上を含んでいてもよい。別の実施形態において、医薬組成物は、ｐＨ６．５の１０ｍＭヒスチジン、最大２％のグリシン、最大２％のマンニトール、および最大０．０１％のポリソルベート８０を含有していてもよい。
【００９８】
医薬組成物の配合は、意図した投与経路および他のパラメーターに応じて変更することができる（例えば、Ｒｏｗｅら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第４版、ＡＰｈＡ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２００３を参照）。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、凍結乾燥したケークまたは粉末であってもよい。凍結乾燥組成物は、静脈注入による投与のために、例えばＵＳＰの滅菌注射用水で再溶解させてもよい。他の実施形態において、本組成物は、滅菌された非発熱性溶液であってもよい。
【００９９】
本明細書において説明される医薬組成物は、単独で活性な化合物として、本明細書で開示されたような抗体、またはそれらのフラグメント、または本抗体またはフラグメントをコードする核酸を含んでいてもよいし、または医薬組成物は、他の化合物、組成物、または生物学的材料との組み合わせを含んでいてもよい。例えば、医薬組成物はまた、Ｔ１ＤのようなＣＸＣＲ３に関連する疾患または障害の処置に有用な１種またはそれ以上の低分子または他の作用剤を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、β細胞刺激因子、インスリン、および／またはインスリン産生細胞を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、医薬組成物はまた、１種またはそれ以上の免疫抑制剤、ｍＴＯＲ阻害剤またはオートファジー阻害剤を含んでいてもよい。免疫抑制剤の例としては、ラパマイシンおよびベルケードが挙げられる。ラパマイシンは、ｍＴＯＲ阻害剤でもあ
る。
【０１００】
投与および投与法
いくつかの実施形態において、患者に、１種またはそれ以上の本明細書で開示された抗ＣＸＣＲ３抗体、および／またはそれらのフラグメントを投与することを含む、ＣＸＣＲ３に関連する疾患または障害に罹った患者を処置する方法が提供される。いくつかの実施形態において、本抗体またはフラグメントは、ＣＸＣＲ３を中和することができる。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、炎症性疾患である。いくつかの実施形態において、障害は、Ｔ１Ｄである。いくつかの実施形態において、本抗体またはフラグメントを含む組成物（例えば、医薬組成物）を投与することにより、ＣＸＣＲ３に関連する疾患または障害の症状が防止され、処置され、その重症度が低減され、かつ／または別の方法で改善される。いくつかの実施形態において、本抗体またはフラグメントは、ＣＸＣＲ３に関連する疾患または障害の症状を防止し、処置し、その重症度を低減し、かつ／または別の方法で改善するのに十分な用量および頻度で投与される。
【０１０１】
ある特定の実施形態において、疾患または障害を処置するための医薬品の製造で使用するための組成物が提供され、ここで医薬品は、本明細書で開示された抗体、またはそれらのフラグメントのいずれかを含む。例えば、本抗体またはフラグメントは、軽鎖可変ドメイン４．０〜４．７のいずれか１つからの３つのＣＤＲと対になっている重鎖可変ドメイン４．０〜４．１１のいずれか１つからの３つのＣＤＲ；軽鎖可変ドメイン１２．０〜１２．３のいずれか１つからの３つのＣＤＲと対になっている重鎖可変ドメイン１２．０〜１２．３のいずれか１つからの３つのＣＤＲ；軽鎖可変ドメイン５３．０〜５３．１３のいずれか１つからの３つのＣＤＲと対になっている重鎖可変ドメイン５３．０〜５３．１０のいずれか１つからの３つのＣＤＲ；軽鎖可変ドメイン８２．０〜８２．３のいずれか１つからの３つのＣＤＲと対になっている重鎖可変ドメイン８２．０〜８２．３のいずれか１つからの３つのＣＤＲ；または軽鎖可変ドメイン１３５．０〜１３５．３のいずれか１つからの３つのＣＤＲと対になっている重鎖可変ドメイン１３５．０〜１３５．３のいずれか１つからの３つのＣＤＲを含んでいてもよい。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、医薬品中の本抗体またはフラグメントは、軽鎖可変ドメイン４．０〜４．７のいずれか１つと対になっている重鎖可変ドメイン４．０〜４．１１のいずれか１つ、軽鎖可変ドメイン１２．０〜１２．３のいずれか１つと対になっている重鎖可変ドメイン１２．０〜１２．３のいずれか１つ、軽鎖可変ドメイン５３．０〜５３．１３のいずれか１つと対になっている重鎖可変ドメイン５３．０〜５３．１０のいずれか１つ、軽鎖可変ドメイン８２．０〜８２．３のいずれか１つと対になっている重鎖可変ドメイン８２．０〜８２．３のいずれか１つ、または軽鎖可変ドメイン１３５．０〜１３５．３のいずれか１つと対になっている重鎖可変ドメイン１３５．０〜１３５．３のいずれか１つを含んでいてもよい。
【０１０３】
本明細書で開示された方法で使用するためのＣＸＣＲ３抗体の用量は、患者の生理学的状態（大きさまたは表面積、体重、年齢、および代謝）ならびに病状のような当業者によく知られている多数のパラメーター、加えて送達メカニズム、配合、およびあらゆる併用療法または継続療法のような薬理学的パラメーターに基づき変更されると予想される。「有効量」のＣＸＣＲ３抗体は、例えばＨＡ１ｂｃ（ヘモグロビンＡ１ｃ）レベルの維持または低下（約７％未満、例えば、７．５、７．４、７．３、７．２、７．１、７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、または６．５％未満、またはその間のあらゆるパーセンテージ未満）、内因性インスリン産生および／または血中インスリンレベルの増加、空腹時Ｃ−ペプチドレベルの維持または増加、耐糖能の改良、外因性インスリンの非存在下における空腹時血液グルコースレベルの低減、外因性インスリンの使用の低減、β細胞の炎症の低減、ならびに／またはβ細胞群の増加および／もしくは増殖の１つまたはそれ以上
などの望ましいｉｎ  ｖｉｖｏでの作用をもたらすことができる。例えば血中でのＣＸＣＲ３＋細胞（例えば、これらに限定されないが、Ｔ細胞など）の減少、ＣＸＣＲ３リガンド結合の阻害、ＧＴＰ結合、カルシウム流入および／もしくは動員、細胞走化性、ならびに／または受容体の内在化などの、ＣＸＣＲ３阻害に関する直接的な細胞アッセイを使用することもできる。
【０１０４】
ある特定の実施形態において、有効量のＣＸＣＲ３抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、上記のパラメーターのいずれかにおいて、対照と比べて約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％（もしくはその間のあらゆるパーセンテージ）の改善、または１、２、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、もしくは１００倍（もしくはその間のあらゆる倍率）の改善、またはそれを超える改善をもたらす。ある特定の実施形態において、改善は、外因性インスリンの非存在下における空腹時血液グルコースレベルが、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２５０、３００、または３５０ｍｇ／ｄＬ（またはその間のあらゆる値）未満に低減していることを特徴としていてもよい。ある特定の実施形態において、改善は、基底の血清Ｃ−ペプチドレベルが、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．８、または１．０ｎｍｏｌ／Ｌ（またはその間のあらゆる値）よりも高いことを特徴としていてもよい。いくつかの実施形態において、改善は、（経口グルコース負荷試験後の）Ｃ−ペプチド刺激間の合計の空腹時血清Ｃ−ペプチドレベルが、約０．０３、０．０３３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．４、０．５、０．６、０．８、または１．０ｎｍｏｌ／Ｌ×分（またはその間のあらゆる値）よりも高いことを特徴としていてもよい。ある特定の実施形態において、有効量のＣＸＣＲ３抗体はさらに、膵臓中のＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞の濃度を、対照の対象と比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％（またはその間のあらゆるパーセンテージ）減少させるか、または少なくとも１、２、３、４、または５倍（またはその間のあらゆる値）減少させることを特徴としていてもよい。
【０１０５】
様々な実施形態において、有効量の抗体は、ヒト対象への投与に関して安全な用量になるようにも選択される。ある特定の実施形態において、抗ＣＸＣＲ３抗体の安全な用量は、対象における（ＣＸＣＲ３活性以外の）Ｔ細胞またはＴ細胞活性の総計の実質的な喪失（例えば、対象の血液中のＴ細胞濃度または活性によって測定した場合）が起こらない用量と特徴付けることができる。特定の実施形態において、「Ｔ細胞またはＴ細胞活性の総計の実質的な喪失」は、ＣＸＣＲ３中和抗体で処置した対象における（ＣＸＣＲ３活性以外の）ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞の濃度および／または活性が、プラセボで処置した対照の対象と比べて、および／または処置前の処置対象と比べて、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％（またはその間のあらゆるパーセンテージ）またはそれ未満で低減されることを意味する。いくつかの実施形態において、安全な用量は、調節性Ｔ細胞、Ｂ細胞、骨髄細胞、樹状細胞、および／または顆粒球から選択される１つまたはそれ以上の細胞型の濃度が、対照の対象と比べて４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％（またはその間のあらゆるパーセンテージ）またはそれ未満で減少することとさらに特徴付けることができる。
【０１０６】
ヒトのような対象に関する典型的な非限定的な用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの走化性アッセイにおいて約１〜６μｇ／ｍＬのＮＤ５０を有する抗体の場合、約０．０３、０．０６、０．１２、０．２４、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、または３．７ｍｇ／ｋｇ／用量（またはその間のあらゆる値）を包含する。ある特定の実施形態において、本抗体は、約０．０３〜３．７ｍｇ／ｋｇ／用量、０．１５〜０．７ｍｇ／ｋｇ／用量、または０．２５〜０．５ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲で投与されてもよい。
【０１０７】
抗ＣＸＣＲ３抗体は、１回の投与で投与されてもよいし、または例えば１日１回、週１回、２週に１回、月１回、２か月に１回、年４回、もしくは年１回のように様々な期間にわたり繰り返しの投与で投与されてもよい。したがって、患者は、非限定的な例において、上記で論じられた用量範囲に基づいて、処置レジメンの経過にわたり、総用量がおよそ０．１６〜１８ｍｇ／ｋｇのＣＸＣＲ３抗体を取り込んでもよい。
【０１０８】
抗ＣＸＣＲ３抗体は、例えば、静脈内、腹腔内、経鼻的、経眼、経口的、非経口的、皮下、または経皮などの当業者に公知のあらゆる好適な手段によって投与されてもよい。特定の実施形態において、本抗体は、対象の膵臓に直接、または膵臓の近傍に、または膵臓の膵島細胞のような膵臓の特定の領域に投与されてもよい。
【０１０９】
ある動物で達成された有効な投与量は、ヒトなどの別の動物で使用するために当技術分野で公知の換算係数を使用して換算することができる。例えば、Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈａｗら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２２：６５９〜６１（２００８）；Ｓｃｈｅｉｎら、Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：３〜４０（１９７０）；およびＦｒｅｉｒｅｉｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５０（４）：２１９〜２４４（１９６６）を参照されたい。例えば、ｍｇ／ｋｇで示される動物への用量に基づくヒト相当用量（ＨＥＤ）は以下の方程式：ＨＥＤ（ｍｇ／ｋｇ）＝動物用量（ｍｇ／ｋｇ）×（Ｋｍａｎｉｍａｌ／Ｋｍｈｕｍａｎで示すことができ、式中、Ｋｍ＝重量／表面積（ｋｇ／ｍ２）である。
【０１１０】
上記の方程式に基づく典型的な換算係数を以下の表に示す。上記でヒトに関して述べられた典型的な用量は、これらの係数または当業者に公知の他の手段に基づいて他の種または他のヒト患者ごとに調節することができる。
【０１１１】
【表４】
2020072715.tif 000005
【０１１２】
対象
本発明によって提供される方法で処置しようとする対象としては、ヒト、または家畜、飼育動物、および野生動物のような動物が挙げられる。いくつかの実施形態において、動物は、鳥類、ウシ属、イヌ類、クジラ目、ウマ科、ネコ科、ヒツジ、魚類／魚、ブタ、霊長類、げっ歯類、または有蹄類である。対象は、成体、幼年期、胎児、または胚などのあらゆる発生段階のものであってもよい。特定の実施形態において、患者は、哺乳動物であり、より特定の実施形態において、ヒトである。
【０１１３】
様々な実施形態において、異常なＣＸＣＲ３活性に関連する何らかの状態、もしくはＣＸＣＲ３シグナル伝達の破壊が治療上有益な可能性がある何らかの状態について予防的に、またはその発病後に対象を処置することができる。いくつかの実施形態において、Ｔ１Ｄについて予防的に、またはＴ１Ｄの発病後に対象を処置することができる。いくつかの
実施形態において、本明細書で示された方法を使用して、Ｔ１Ｄの発病前に対象を予防的に処置することができ、または本明細書で示された方法を使用して、初発のＴ１Ｄを有する対象を処置することができる。
【０１１４】
「初発のＴ１Ｄを有する対象」は、糖尿病が臨床的に診断されたときの対象の年齢に関係なく（例えば、成体、幼年期、胎児、または胚の対象を含む）、減少しているもののなお検出可能な、膵臓のβ細胞からのインスリン産生能力を有するあらゆる対象である。ある特定の実施形態において、初発のＴ１Ｄを有する対象は、好ましくはＴ１Ｄの最も初期の臨床診断から約６ヶ月以内（例えば、約１日以内、１週間以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、５週間以内、１ヶ月以内、２ヶ月以内、３ヶ月以内、４ヶ月以内、５ヶ月以内、６ヶ月以内、またはその間のあらゆる期間以内）に処置を受けると予想される。他の実施形態において、対象は、Ｔ１Ｄの最も初期の臨床診断から６ヶ月よりも後に処置を受けてもよく、その場合、対象は、約０．２ｎｍｏｌ／Ｌ（例えば、少なくとも約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．８、または１．０ｎｍｏｌ／Ｌ）以上の、ごくわずかながら測定可能な基底の血清Ｃ−ペプチドレベルを保持する。いくつかの実施形態において、処置は、１種またはそれ以上の本明細書で開示された抗体を含む１回またはそれ以上の用量の投与を含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、ＣＸＣＲ３中和抗体である。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、初発のＴ１Ｄを有する対象は、Ｃ−ペプチド刺激の間、少なくとも約０．０３、０．０３３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．４、０．５、０．６、０．８または１．０ｎｍｏｌ／Ｌ×分、例えば、約０．０３〜１．０または０．０３３〜１．０ｎｍｏｌ／Ｌ×分の合計の空腹時血清Ｃ−ペプチドレベルを保持する。特定の実施形態において、対象は、Ｃ−ペプチド刺激の間、０．０３３〜１．０ｎｍｏｌ／Ｌ×分の合計の空腹時血清Ｃ−ペプチドレベルを有する。ある特定の実施形態において、Ｃ−ペプチド刺激は、経口グルコース試験後になされ、１０．０〜１３．９ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを投与してから６０〜１５０分、合計血清Ｃ−ペプチドレベルを測定することを含んでいてもよい。Ｋｅｙｍｅｕｌｅｎら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５３：６１４〜６２３（２０１０）を参照されたい。より特定の実施形態において、対象の測定可能な経口グルコース負荷試験後の合計血清Ｃ−ペプチドレベルの増加は、０．８、０．７、０．６、０．５４、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１ｎｍｏｌ／Ｌ×分未満である。よりさらなる特定の実施形態において、対象の経口グルコース負荷試験後の合計血清Ｃ−ペプチドレベルは、０．５４ｎｍｏｌ／Ｌ×分またはそれ未満の増加を示す。Ｃ−ペプチドは、インスリン前駆体ペプチド（ヒト参照配列ＮＰ＿０００１９８）の残基５７〜８７に相当し、残基９０〜１１０および２５〜５４は、それぞれインスリンのＡおよびＢ鎖に相当する。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、初発のＴ１Ｄを有する対象は、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２５０、３００、３５０ｍｇ／ｄＬ（またはその間のあらゆる値）を超える、またはそれより高い値を超える外因性インスリンの非存在下における上昇した空腹時血液グルコースレベルを有する。ある特定の実施形態において、対象は、上述したような上昇した空腹時血液グルコースレベルと、それに加えて上述したような減少した合計の空腹時血清Ｃ−ペプチドレベルとの両方を有する場合もある。
【０１１７】
ある特定の実施形態において、対象は、初発のＴ１Ｄと診断された直後に本明細書で開示された方法によって処置される。より特定の実施形態において、対象は、初発のＴ１Ｄの臨床診断から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０日以内、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０週間以内、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月以内（もしくはその間のあらゆる期間
）に、まず本発明の方法によって処置される。より具体的な実施形態において、対象は、初発のＴ１Ｄの臨床診断の６ヶ月以内に、まず本発明の方法によって処置される。他の実施形態において、Ｔ１Ｄを有する対象は、臨床診断からの時間に関係なくあらゆる時期に本明細書で開示された方法によって処置され、ここで対象は、少なくとも約０．２ｎｍｏｌ／Ｌの残留した血清Ｃ−ペプチドレベルを保持する。
【０１１８】
追加の方法
本明細書で示された方法は、ある特定の実施形態において、本明細書で開示された抗ＣＸＣＲ３抗体の投与と同時または連続的に（その前または後に）投与され得る追加の処置を含んでいてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、対象に、抗ＣＸＣＲ３抗体に加えて免疫抑制剤を投与するさらなる工程を含む方法が開示される。免疫抑制剤としては、これらに限定されないが、アザチオプリン（イムラン）、βインターフェロン１ａ、βインターフェロン１ｂ、バシリキシマブ、コルチコステロイド、サイクロスポリン（サンディミュン）、シクロホスファミド、クロラムブシル、ダクリズマブ、デオキシスペルグアリン、エタネルセプト、グラチラマー酢酸塩、インフリキシマブ、レフルノミド、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、メトトレキセート、ミトキサントロン、ムロモナブ−ＣＤ３、ミコフェノール酸塩（ＭＦＭまたはセルセプト）、ナタリズマブ、アナキンラ、カナキヌマブ、リツキシマブ、ベリムマブ、アバタセプト、アルデスロイキン、プレドニゾン、ラパマイシン、シロリムス、タクロリムス、およびウステキヌマブなどのうち１種またはそれ以上が挙げられる。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示された方法は、抗ＣＸＣＲ３抗体を投与することに加えて、対象にβ細胞刺激因子を投与する工程を含んでいてもよい。β細胞刺激因子を投与する工程は、抗ＣＸＣＲ３抗体の投与と並行していてもよいし、またはそれと連続していてもよい（その前または後に）。典型的なβ細胞刺激因子としては、これらに限定されないが、移植したβ細胞（自己、同種異系、または同系）、移植したインスリン産生細胞（同種異系または同系）、ＤＤＰ４（ヒトタンパク質参照配列ＮＰ＿００１９２６．２）阻害剤、ＴＭ４ＳＦ２０ペプチド（ヒトタンパク質参照配列ＮＰ＿０７９０７１）、ＴＭＥＭ２７ペプチド（ヒトタンパク質参照配列ＮＰ＿０６５７１６）、エキセンジン１またはＧＬＰ−１（ヒトタンパク質参照配列ＮＰ＿００２０４５）類似体、ｇｐ１３０およびＥＧＦ受容体リガンド、ならびに米国特許出願公開第２０１００１３０４７６号の段落８〜１１で開示されたものなどのうち１種またはそれ以上が挙げられる。本発明の方法において、β細胞刺激因子は、免疫抑制剤と同時に、または（その前もしくは後に）連続的にいずれかで投与されてもよい。ある特定の実施形態において、β細胞刺激因子、インスリン産生細胞、および／または免疫抑制剤は、β細胞刺激因子、インスリン産生細胞、および／または免疫抑制剤を標的組織または臓器に送達することができる装置を移植することによって投与されてもよい。
【０１２０】
また、ＣＸＣＲ３および／またはＣＸＣＲ３を発現する細胞（例えば、ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞）を検出および／または定量する方法も、本明細書において開示される。いくつかの実施形態において、本方法は、１つまたはそれ以上の本明細書で開示された抗ＣＸＣＲ３抗体を使用して、ＣＸＣＲ３および／またはＣＸＣＲ３を発現する細胞を検出および／または定量することを含む。例えば、１つまたはそれ以上の抗体を患者のサンプル（例えば、血液サンプル）に添加して、検出可能なシグナルにコンジュゲートした二次抗体のような検出可能な標識（例えば、蛍光性の二次検出抗体）を使用して検出することができる。例えば、ＦＡＣＳソーティングを使用して、一次抗体および蛍光性の二次抗体を結合させた後、サンプル中のＣＸＣＲ３を発現する細胞のレベルを定量することができる。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ３障害またはＣＸＣＲ３関連障害（例えば、糖尿病、Ｔ１Ｄ）を診断するための診断方法を使用することができる。例えば、障害は、患
者サンプル中のＣＸＣＲ３の存在または非存在を検出することによって診断することができ、またはサンプル中のＣＸＣＲ３の濃度を、１つまたはそれ以上の参照標準におけるレベルと比較することによって診断することができ、この場合、標準におけるレベルからの偏差が、障害の存在の指標になる。
【０１２２】
様々な実施形態において、少なくとも１種の抗ＣＸＣＲ３抗体またはフラグメントを含むキットも提供される。本キットは、様々な調査、診断、および治療目的にとって有用である。例えば、対象にキット内に含有される抗ＣＸＣＲ３抗体またはフラグメントを投与することによって、ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞を検出するため、またはＩ型糖尿病を処置するために、本キットを使用することができる。単離および精製目的で、本キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）に結合させた抗体またはフラグメントを含有していてもよい。ある特定の実施形態において、本キットはまた、望ましい調査、診断、および／または治療目的のために抗ＣＸＣＲ３抗体またはフラグメントを使用するための説明書も含む。
【０１２３】
本出願において、単数形の使用は、特に他の規定がない限り、複数形を包含する。また本出願において、「または」の使用は、特に他の指定がない限り、「および／または」も意味する。さらに用語「包含」の使用、加えて「〜を包含する」および「包含される」のようなその他の形態の使用は、限定的ではない。本明細書において説明されるあらゆる範囲は、両端の値とその両端の値の間の全ての値とを包含すると理解されるものとする。
【０１２４】
本明細書において使用される章の表題は、単に構成上の目的で記載されたものであり、説明されている主題を制限すると解釈されないものとする。これらに限定されないが、特許、特許出願、論文、本、および専門書などの本出願において引用された全ての文書、または文書の一部は、あらゆる目的に関して、参照により明確にそれら全体が開示に組み入れられる。参照により組み入れられた公報および特許または特許出願が本明細書に記載された発明と矛盾しない程度に、本明細書は、矛盾しないあらゆる材料を包含する。
【０１２５】
例えば、ゲノム遺伝子座、ゲノム配列、機能的な注釈、対立遺伝子変異体、および参考ｍＲＮＡ（例えば、エキソンの境界などを含む）、およびタンパク質配列（例えば保存されたドメイン構造）を包含する遺伝子番号または受託番号のような本出願において開示された参照遺伝子配列に関連する全ての情報は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１２６】
以下の実施例は、本開示を例示するのに役立つが、本開示を限定することはまったくない。
【０１２７】
〔実施例１〕
材料および方法
免疫原の生成。ＣＨＯ細胞を全長ヒトＣＸＣＲ３をコードするＤＮＡで形質転換して、ＣＸＣＲ３を細胞表面上に発現させた（「ｒ−ＣＸＣＲ３−ＣＨＯ細胞」）。細胞を形質転換するのに使用されるＣＸＣＲ３配列を得て、ＣＸＣＲ３のオープンリーディングフレームを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１ｎｅｏ＿ＤＥＳＴに入れ、次いで３００−１９細胞（免疫原）にトランスフェクションした。アミノ酸配列、ＭＶＬＥＶＳＤＨＱＶＬＮＤＡＥＶＡＡＬＬＥＮＦＳＳＳＹＤＹＧＥＮＥＳＤＳＣ（配列番号ＸＸＸ）を有するＣＸＣＲ３細胞外ドメイン（ＥＣドメイン）のＮ末端ペプチドフラグメントをＣ末端のシステインを介してＫＬＨにコンジュゲートし、これを免疫原として使用した。ＣＸＣＲ３を発現する細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２下で、１０％の透析したウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されたＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、
Ｃａｌｉｆ．）中で維持した。上記の培地を５ｍＭのＥＤＴＡが補充されたリン酸緩衝（Ｃａ／Ｍｇ非含有）塩類溶液（ＣＭＦ−ＰＢＳ）で交換して、その緩衝液中で細胞を回収することにより注入用の細胞を調製した。回収した細胞を５００×ｇで約５分の遠心分離によってペレット化し、ペレットをＣＭＦ−ＰＢＳ中に再懸濁して前と同様にして遠心分離することにより１回洗浄し、細胞ペレットをＣＭＦ−ＰＢＳに再懸濁することにより、注入に適切な体積（例えば０．２ｍｌ中に５×１０６細胞）に計数して調節した。
【０１２８】
抗体の調製。ヒトＣＸＣＲ３のＮ末端の３７アミノ酸を使用して、抗ヒトＣＸＣＲ３に関するマウスモノクローナルハイブリドーマを生成し、さらなる特徴付けのために５種の抗体クローン（４、１２、５３、８２、および１３５）を選択した。ヒトＣＸＣＲ３の３７アミノ酸のＮ末端は、マウスＣＸＣＲ３中のアラインされた領域に６５％相同であり、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１１結合にとって重要な残基を含有する。ＢＡＬＢ／ｃマウス、約６〜８週齢（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を、ＣＸＣＲ３を発現する細胞またはＣＸＣＲ３の細胞外ペプチドで免疫化した。０日目に、あるグループのマウスの皮下（ＳＣ）にアジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、番号Ｔ２６８５−１ＭＬ）と混合されたＫＬＨコンジュゲートペプチドの１：１のエマルジョンを投与し、２〜３週のインターバルでペプチドとアジュバントとの１：１エマルジョンでＳＣに３〜５回ブーストするか、またはアジュバント非含有のＰＢＳ中の細胞で腹膜内（ＩＰ）にブーストし、屠殺する前に連続して２日間、全てアジュバント非含有のＰＢＳ中のペプチドおよび／または細胞のいずれかでＩＰにブーストした。別のグループのマウスに、ＰＢＳ中の細胞を用いて、２〜３週のインターバルで３〜５回ＩＰ投与し、続いて屠殺する前に連続して２日、ＩＰにブーストした。両方のグループのマウスにおいて、各注入には、およそ１００μｌの体積中におよそ２×１０６個の細胞が含有されていた。
【０１２９】
最後の注入の次の日に、マウスを屠殺し、脾臓を取り出し、それをペトリ皿中の無血清ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）およそ１０ｍｌ中に置いた。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜７（１９７５））の方法に基づいて、Ｓｐ２＼Ｏマウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）と免疫化マウスからの脾臓細胞とを５０％（ｗ／ｗ）ＰＥＧを使用して融合させた。この手順の最後に、細胞をＣｌｏｎａＣｅｌｌ−Ｈｙハイブリドーマ回収培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）５０ｍｌ中に再懸濁し、Ｔ７５ｃｍ２のフラスコに移し、３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。このインキュベート後に、細胞を回収し、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹメチルセルロース選択培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１００ｍｌを添加した。次いでこの混合物を１０個の１００ｍｍ２組織培養皿に分けて、１０〜１４日インキュベートした。クローンのハイブリドーマをメチルセルロースから液状培地に移し、ＣＸＣＲ３に特異的なモノクローナル抗体を同定するアッセイ用の９６マルチウェルプレート中で増殖させた。
【０１３０】
特に他の指定がない限り、これらの実施例に記載のＨｕ４．１のような抗体変異体に対する参照番号は、同じ番号の重鎖変異体および軽鎖変異体を含有する抗体を指す（例えば、Ｈｕ４．１は、重鎖４．１および軽鎖４．１を含有すると予想される）。全ての抗体に対する参照番号は、表２に示される抗体の番号付けおよびＶＨ／ＮＫ鎖の対と一致する。
【０１３１】
動物。雌ＮＯＤ／ＬｔＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入し、病原体がない状態下で維持した。ＡＣＣＵ−ＣＨＥＫ（登録商標）Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｐｌｕｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｍｅｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して、１０週齢から開始して週２回の尾静脈穿刺により、マウスを糖尿に関してスクリーニングした。血中グルコースが連続３日間２５０ｍｇ／ｄＬを超えると測定された場合、マウスは糖尿病とみなされた。処置開
始後、最低でも１００日間マウスを観察した。全ての動物実験は、社内のＩＡＣＵＣにより承認された。
【０１３２】
抗体注入。予防の研究のために、前糖尿病性ＮＯＤマウスに、１０週齢から開始して６週間、週１回で、抗体１００μｇを腹腔内（ｉ．ｐ．）注入した。回復の研究のために、マウスが糖尿病とみなされてから１週間以内に、動物をランダムに処置群に登録し、血中グルコースを、１日２回、読み取りの間を少なくとも６時間として測定し、研究の継続期間中に２５０ｍｇ／ｄＬを超える血中グルコースを有するマウスにインスリンを腹腔内注入により投与した。連続３０日間インスリン非依存性を維持した処置群のマウスが、回復したとみなされた。５回目の処置と６回目の処置との間に各グループから５匹のマウスを回収し、細胞分析のためにリンパ系の臓器、血液、骨髄、および膵臓を回収した。研究の最後に、膵臓を回収し、組織学的および免疫組織化学的な分析用に処理した。抗マウスＣＸＣＲ３抗体、クローンＣＸＣＲ３−１７３（Ｕｐｐａｌｕｒｉら、２００８）、およびハムスターＩｇＧ対照抗体を、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。
【０１３３】
ＦＡＣＳ分析。脾臓、鼠径リンパ節、膵リンパ節、および骨髄の単一細胞懸濁液を作製した。膵臓を小片に細断し、２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）中で３７℃で３０分インキュベートし、７０ミクロンの細胞濾過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を通過させて濾過し、密度勾配遠心分離を使用してリンパ球を膵臓組織から分離した。細胞を、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に関して、ＡＰＣ標識抗マウスＣＤ２５、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ４、およびＰＥ標識抗マウスＦｏｘｐ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で、活性化／メモリーＴ細胞に関して、ＰｅｒＣＰ標識抗マウスＣＤ８α、ＰＥ標識抗マウスＣＤ４４、ＡＰＣ標識抗マウスＣＤ６２Ｌ、およびＰｅＣｙ７標識抗マウスＣＸＣＲ３で、ならびにＢ細胞、骨髄細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞に関して、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ９４、ＰｅｒＣＰ標識抗マウスＣＤ４、ＡＰＣ標識抗マウスＢ２２０、ＰｅＣｙ７標識抗マウスＣＤ１１ｃ、パシフィックブルー標識抗マウスＣＤ１１ｂ、およびＰＥ標識抗マウスＮＫｐ４６で染色した。抗マウスＣＤ１６／３２で氷上で２０分ブロッキングした後に、細胞を４℃で３０分インキュベートした。調節性Ｔ細胞の染色の場合、表面染色を行い、細胞を洗浄し、固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で透過処理し、抗マウスＦｏｘｐ３抗体で氷上で３０分染色した。染色後、細胞を２回洗浄し、パラホルムアルデヒド中で固定し、ＬＳＲＩＩ血球計算器で捕捉し、データをＦｌｏｗ  Ｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して分析した。特に他の指定がない限り、全ての抗体をＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。
【０１３４】
走化性アッセイ。走化性のアッセイを、５μｍの膜を有するトランスウェル・パーミアブル・サポートを備えた２４−ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）で行った。ＣＸＣＲ３でトランスフェクションした３００．１９細胞を、ＲＰＭ１６４０（総体積０．２ｍｌ）中の２．５％熱不活化ウシ胎児血清中に１×１０６個の細胞で、トランスウェルインサート中に置いた。培地単独、または組換えケモカインの３００ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、１００ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）もしくは１００ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）が補充された培地を下の区画（０．６ｍｌ）に入れ、細胞を含有するトランスウェルインサートを下の区画に装填した。プレートを、５％ＣＯ２の加湿したインキュベーター中で、３７℃で４〜５時間インキュベートした。インキュベート期間に続いて、トランスウェルインサートを取り出し、下の区画の全ての培地をプールし、１２００ＲＰＭで５分の遠心分離によって細胞をペレット化した。培地を吸引し、細胞をカルセインＡＭ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）で３７℃で３０分染色した。細胞をペレット化し、洗浄し、培地（０．１ｍｌ）を添加し、懸濁液を９６ウェルの黒いウェルを有するク
リアボトムプレートに移した。プレートに１２００ＲＰＭでパルスを与えて細胞を定着させ、Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎで４９０／５２０ｎｍで蛍光を測定した。全ての条件を３連で試験した。得られたデータを、移動した細胞の平均相対的な蛍光単位（ＲＦＵ）で示した。図１４Ａ〜Ｃおよび図１５Ａ〜Ｃを参照されたい。
【０１３５】
ＣＸＣＲ３でブロックした場合の走化性に関して、ＣＸＣＲ３でトランスフェクションした３００．１９細胞を、走化性アッセイで使用する前に、様々な量のブロッキング抗体または対照ＩｇＧで３７℃で２０〜３０分前処置した。抗体を洗浄せず、アッセイのインキュベート中に供給した。
【０１３６】
ＦＬＩＰＲを使用したカルシウム動員アッセイ。ｈＣＸＣＲ３を発現するヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ）細胞を、ＰＢＳおよび２ｍＭのＥＤＴＡで処置することにより、８０％の密集度で回収した。細胞を１×１０６細胞／ｍＬの密度で無血清ＨＥＫ−ＳＦＭ培地に懸濁した。懸濁液１５μＬ（１５，０００個の細胞）を３８４ウェルプレートの各ウェルに分配した。再溶解したＦＬＩＰＲカルシウム４色素１５μＬを添加することによって、室温で３０分、細胞に色素を入れた。抗ヒトＣＸＣＲ３抗体クローンおよびアイソタイプ対照を、ＨＢＳＳ＋２０ｍＭのＨＥＰＥＳ＋１％ＢＳＡで連続希釈し（３倍）、１クローンあたり１０種の試験濃度を作製した。各試験濃度を同じプレート上で二連で（ｎ＝２）試験した。各ウェル中の細胞に試験濃度液１５μＬを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。細胞内カルシウム動員を惹起するためのＥＣ８０を示す固定濃度のＣＸＣＬ１１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＦＬＩＰＲの各ウェルに添加し、蛍光の変化を経時的にモニターした。各ウェルの最大応答をベースラインに対して正規化し、データを、平均した後にＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して４つのパラメーター方程式にフィッティングし、各クローンのＩＣ５０を決定した。図１４Ｄおよび図２１を参照されたい。
【０１３７】
親和性に関するＢｉａｃｏｒｅ分析。Ｂｉａｃｏｒｅ表面の調製。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００カイネティクス／アフィニティーアッセイを使用して、マウスα−ヒトＣＸＣＲ３ハイブリドーマ抗体クローン４、１２、５３、８２、および１３５のヒトＣＸＣＲ３ペプチドに対する結合親和性を計算した。標準的なアミンカップリングプログラムを使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５シリーズＳセンサーチップ（ＧＥ番号ＢＲ−１００６−６８）にウサギ−抗マウス−Ｆｃ（ＲＡＭ−Ｆｃ）捕捉抗体（ＧＥ番号ＢＲ−１００８−３８）を固定した。チップのカルボキシメチルデキストラン表面を、０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と０．４ＭのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）との１：１混合物を使用して活性化し、そのまま表面に捕捉抗体の反応性アミン基を結合させた。抗体固定に続き、ｐＨ８．５の１Ｍエタノールアミン塩酸塩／ＮａＯＨを使用して反応性センサーチップ表面の反応を止めた。固定により、１つのフローセルで８，０００ＲＵのＲＡＭ−Ｆｃ捕捉抗体が得られた。別のブランクフローセルを、データ分析中の参照差分のための表面として使用した。
【０１３８】
Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ条件。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００機器のサンプルチャンバーおよびアッセイの温度をそれぞれ４℃および２５℃に設定した。マウス抗ｈＣＸＣＲ３抗体を、ＨＢＳ−ＥＰおよびランニング緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｐ２０界面活性剤、３ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で５００ｎＭに希釈し、１０μｌ／分で３２回の注入を使用して捕捉した。これらの条件により、試験された各マウス抗ｈＣＸＣＲ３クローンの約１，２００ＲＵの安定な捕捉が達成された。ｈＣＸＣＲ３ペプチドを、ＨＢＳ−ＥＰ＋で２００、１００、５０、２５、１２．５、および０ｎＭ濃度に希釈した。各アッセイサイクルで、５０μｌ／分の流速で５分ペプチドを注入し、結合を測定し、次いでＨＢＳ−ＥＰ＋で１０分、５０μｌ／分の流速で洗浄し、解離を測定した。アッセイサイクル間で捕捉表面（ＲＡＭ−Ｆｃ）を、１０ｍＭのグリシン−
ＨＣｌ、ｐＨ１．７を５０μｌ／分で３分使用して、再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００カイネティクス・エバリュエーション・ソフトウェアｖ２．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分析を行った。センサーグラムを、１：１の結合モデルと参照フローセルおよび０ｎＭ濃度の差分（二重参照差分）とにフィッティングした。
【０１３９】
Ｂｉａｃｏｒｅの全受容体アッセイ。Ｃ末端に６×ＨｉｓとＨＰＣ４タグとを有する全長ヒトＣＸＣＲ３受容体タンパク質をバキュロウイルスベクターを有する昆虫Ｓｆ９細胞で発現させた。次いで受容体タンパク質をＮｉ−ＮＴＡおよびＨＰＣ４親和性精製により精製した。最終産物の緩衝液を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．５％ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトピラノシド、および５％グリセロールに交換した。受容体タンパク質をＮｉ−キレート化によりＮＴＡチップに捕捉し、０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および０．４ＭのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の１：１混合物の１：１０の希釈混合物を使用したアミンカップリングによってさらに安定化した。２０ｎＭのｈＣＸＣＬ１０およびｈＣＸＣＬ１１リガンドを注入することにより、安定化した受容体表面をリガンド結合活性に関して試験した。動態分析のために、ヒトＣＸＣＲ３リガンド（ｈＣＸＣＬ９、ｈＣＸＣＬ１０、およびｈＣＸＣＬ１１）を、ＨＢＳ−ＥＰ＋で２０、１０、５、２．５、１．２５、０．６１２５、０．３１２５、および０ｎＭの濃度に希釈した。抗ＣＸＣＲ３抗体を、ＨＢＳ−ＥＰ＋で８０、４０、２０、１０、５、２．５、１．２５、および０ｎＭの濃度に希釈した。分析物を５０μｌ／分の流速で５分注入し、結合を測定し、次いでＨＢＳ−ＥＰ＋で５０μｌ／分の流速で１０分洗浄し、解離を測定した。アッセイサイクル間で１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ１．７を５０μｌ／分で１分使用して、受容体表面を再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００カイネティクス・エバリュエーション・ソフトウェアｖ２．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分析を行った。センサーグラムを、１：１の結合モデルと参照フローセルおよび０ｎＭ濃度の差分（二重参照差分）とにフィッティングした。
【０１４０】
グルコース負荷試験。グルコース刺激の前の晩に、非空腹時血液グルコースをモニターし、糖尿病の動物のインスリン処置を中断した。マウスを１２時間絶食させ、その後、腹腔に２ｍｇ／ｇ体重のＤ−グルコース（２０％；Ｓｉｇｍａ）を注入した。注入前に、ならびに注入の１５、３０、６０、および１２０分後に血中グルコースを測定した。
【０１４１】
〔実施例２〕
ＮＯＤマウスの特徴付け
パラフィン包埋された６〜１０週齢の前糖尿病性雌ＮＯＤマウスおよび初発の糖尿病を有する雌ＮＯＤマウスからの代表的な膵臓の切片をインスリン、ＣＸＣＬ１０、およびＴ細胞マーカーＣＤ３に関して染色した（図１）。浸潤細胞で取り囲まれた膵島内のＮＯＤマウス膵臓においてＣＸＣＬ１０発現を検出した（図１の中央の列中の矢印）。それより高齢の前糖尿病性および初発の糖尿病マウスは、膵島のＴ細胞浸潤の著しい増加（図１、右の列）と、膵島内におけるインスリン産生の減少（図１、左の列）を示した。
【０１４２】
ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞がＮＯＤマウスの膵臓に存在するかどうかをさらに評価するために、フローサイトメトリー分析を、初発の糖尿病を有する雌ＮＯＤマウスから回収した膵臓組織で行った（図２）。ＣＤ４＋／ＴＣＲ＋およびＣＤ８＋／ＴＣＲ＋Ｔ細胞でＣＸＣＲ３発現を評価した。アイソタイプ対照抗体での染色を影付きの曲線で表す。数匹のマウスから回収されたプールした膵臓組織の単一細胞懸濁液でフローサイトメトリーを行った。データは、ＮＯＤマウスの膵臓にＣＸＣＲ３＋細胞毒性およびヘルパーＴ細胞が存在することを示す。
【０１４３】
〔実施例３〕
抗ＣＸＣＲ３抗体でのＮＯＤマウスの予防的処置
ハムスター抗マウスＣＸＣＲ３抗体（クローンＣＸＣＲ３−１７３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから購入）、または対照ハムスターＩｇＧもしくはＰＢＳ１００μｇで、６週間にわたり週１回、前糖尿病性雌ＮＯＤマウスを１０週齢から開始して処置した。血中グルコースを週２回モニターし、３回連続して２５０ｍｇ／ｄＬを超える血中グルコース測定値を示した後に、動物を糖尿病とみなして安楽死させた。図３は、各処置群における経時的な糖尿病を発症したマウスのパーセンテージを示す。各ラインは、１グループあたり１０匹のマウスからの結果を合わせたものを表す。２つの独立した研究からの結果を示す（図３Ａおよび３Ｂ）。プロットから、前糖尿病性雌ＮＯＤマウスにおいて、抗ＣＸＣＲ３抗体での予防的処置により糖尿病の発症が防止されたことが示される。
【０１４４】
予防的な抗ＣＸＣＲ３抗体投与の作用をさらに評価するために、抗ＣＸＣＲ３抗体で処置した雌ＮＯＤマウスからの代表的な膵臓の切片を、インスリン（図４、左のパネル）、ＣＤ３、およびＦｏｘｐ３（図４、中心および右のパネル）に関して染色した。図４の右側のパネルは、中心のパネルで示される切片の倍率を高めた画像である。研究期間の最後に（２６週齢）マウスから膵臓組織を回収した。図４から、抗ＣＸＣＲ３抗体で処置したＮＯＤマウスにはインスリン陽性の膵島が存在するが、Ｔ細胞の大半は、膵島の周辺に存在し、膵島に浸潤しなかったことが実証される。
【０１４５】
〔実施例４〕
ＮＯＤマウスにおける初発の糖尿病の回復
３回連続して２５０ｍｇ／ｄＬを超える血中グルコース測定値を示した雌マウスを糖尿病とみなし、処置群にランダムに登録した。登録の１週間以内に処置を開始した。マウスを、６週間にわたり週１回、ＰＢＳ、抗マウスＣＸＣＲ３抗体（クローンＣＸＣＲ３−１７３の１００μｇを腹腔内投与）または対照ＩｇＧ（１００μｇを腹腔内投与）で処置するか、または０および４日目にマウス抗胸腺細胞グロブリン（ｍＡＴＧ；５００μｇを腹腔内投与）で処置した。登録したら、午前と午後に（その間を少なくとも６時間とした）血中グルコースを測定し、血中グルコースが２５０ｍｇ／ｄＬを超えるマウスにのみインスリンを腹腔内注入により投与した。個々のマウスの１日の早朝血液グルコース値を示す（図５）。１回の研究で１グループあたり８〜１０匹のマウスを用いた４回の独立した回復研究からのデータをプールした。データから、抗ＣＸＣＲ３抗体で処置した後、ＮＯＤマウスにおいて初発の糖尿病が回復したことが実証される。
【０１４６】
抗ＣＸＣＲ３抗体で処置したマウスの膵臓におけるＴ細胞の部分集合の変化を評価するために、処置群１つあたり（ＰＢＳ、抗マウスＣＸＣＲ３、対照ＩｇＧまたはｍＡＴＧ処置マウス）４匹のマウスからの膵臓の単一細胞懸濁液をプールし、Ｔ細胞に関して染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＰＢＳ、抗マウスＣＸＣＲ３、または対照ＩｇＧの５回目の処置投与から２〜３日後に、年齢を適合させたｍＡＴＧ処置マウスから膵臓組織を回収した。図６Ａに懸濁液中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。図６Ｂは、ＰＢＳ（左）、対照ＩｇＧ（中央）、および抗マウスＣＸＣＲ３抗体（右）で処置したマウスからの膵臓中のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌの発現を示す。ゲート１（Ｇ１；ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏ）における細胞のパーセンテージは、各処置群（ＰＢＳでは６７．３％、対照ＩｇＧでは６７．１％、および抗ＣＸＣＲ３処置では３０．４％）ごとに表示される。図６Ｃは、アイソタイプ対照抗体で染色してリンパ球でゲーティングした細胞と比較した、図６Ｂで定義したようなゲート１（Ｇ１）またはゲート２（Ｇ２）におけるＣＤ４＋Ｔ細胞中のＣＸＣＲ３発現のプロットである。
【０１４７】
抗ＣＸＣＲ３処置で回復したＮＯＤマウスにインスリン陽性膵島が存在するかどうかを
評価するために、膵臓のパラフィン包埋切片を、対照ＩｇＧ（左のパネル）、抗マウスＣＸＣＲ３抗体（中央のパネル）またはマウスＡＴＧ（右のパネル）で処置した雌ＮＯＤマウスから調製し、インスリン（上の列）に関して染色するか、またはＣＤ３およびＦｏｘｐ３（下の列）に関して同時に染色した。図７を参照されたい。研究の終了時に（登録後約１００日）マウスから膵臓組織を回収した。染色した切片から、抗ＣＸＣＲ３処置で回復したＮＯＤマウスにインスリン陽性膵島が存在すること、さらに、Ｔ細胞が膵島の周辺に存在していたが、ほとんど膵島に浸潤しなかったことが実証される。
【０１４８】
グルコース刺激への応答を評価するために、グルコース負荷試験を行った（図８）。年齢を適合させた雌非糖尿病ＮＯＤマウス（図８Ａ）、ＰＢＳで処置した糖尿病ＮＯＤマウス（図８Ｂ）、抗マウスＣＸＣＲ３処置で回復した糖尿病ＮＯＤマウス（図８Ｃ）、およびＩｇＧで処置した糖尿病ＮＯＤマウス（図８Ｄ）を一晩絶食させ、グルコースを腹腔内注入することにより刺激した。刺激前（０時間）に、さらに刺激後に指示された時間で血中グルコースを測定した。処置群１つあたり４〜５匹のマウスからの代表的なデータを示す。データから、抗ＣＸＣＲ３抗体処置により、登録後１００日で空腹時の耐糖能が改良されたことが図示される。
【０１４９】
〔実施例５〕
Ｔ細胞の養子免疫伝達
抗ＣＸＣＲ３抗体（クローンＣＸＣＲ３−１７３）で処置した疾患の寛解を示すＮＯＤマウスからのＴ細胞の、レシピエント動物において糖尿病を誘導する能力を評価するために、単離したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、レシピエントＮＯＤ．ｓｃｉｄ（非肥満糖尿病−重症複合免疫不全）マウスに静脈注入により養子免疫伝達した。図９は、ＰＢＳもしくは対照ＩｇＧで処置した糖尿病マウス、またはマウスＡＴＧもしくは抗マウスＣＸＣＲ３抗体での処置後に疾患が寛解しているマウスから単離したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を養子免疫伝達した後の、経時的な非糖尿病マウスのパーセンテージを示す。異なる処置群の雌ＮＯＤマウスから登録から８０〜９０日後に回収した脾臓、膵リンパ節、および鼠径リンパ節から、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をプールし、合計で８００万個の細胞をＮＯＤ．Ｓｃｉｄレシピエントに養子免疫伝達し、糖尿病発症を週２回の血中グルコース測定によりモニターした。図９中の各ラインは、１グループあたり５匹のマウスからのデータを合わせたものを表す。２つの代表的な研究を示す（図９Ａおよび９Ｂ）。抗ＣＸＣＲ３抗体で処置したマウスから単離したＴ細胞は、疾患の伝達の遅延を示す。
【０１５０】
単離したドナーＴ細胞をさらに特徴付けた。図１０Ａは、以前の段落で説明したようなＰＢＳ、抗マウスＣＸＣＲ３抗体、対照ＩｇＧ、またはマウスＡＴＧで処置したマウスから単離したドナーＴ細胞におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（左のパネル）の総計のパーセンテージを示す。図１０Ａの右のパネルは、ＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌの発現で定義されるような、各ドナー細胞懸濁液ごとにＣＤ４＋（上のパネル）およびＣＤ８＋（下のパネル）にあたるＴ細胞の部分集合におけるエフェクターおよびセントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージを示す。単離したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のプールを、伝達前にＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌ発現に関して染色し、フローサイトメーターに捕捉し、分析した。また単離したドナーＴ細胞のプールにおける制御性Ｔ細胞のパーセンテージも評価した。図１０Ｂは、ＣＤ４およびＣＤ２５発現で、またはＣＤ４、ＣＤ２５、および細胞内Ｆｏｘｐ３発現で定義される、各処置群における制御性Ｔ細胞のパーセンテージを示す。図１０Ｃは、ＣＸＣＲ３も発現するドナー細胞におけるＣＤ８＋（左のパネル）およびＣＤ４＋（右のパネル）Ｔ細胞のパーセンテージを示す。データから、抗ＣＸＣＲ３抗体処置で回復したマウスからのドナー細胞におけるＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞のパーセンテージが減少したことが実証される。
【０１５１】
１型糖尿病のＲＩＰ−ＯＶＡモデルを使用して、ＯＴ−１  ＣＤ８＋ドナーＴ細胞を養子免疫伝達した後のＣＸＣＲ３処置の有効性を評価した。ＲＩＰ−ＯＶＡマウスは、ラットインスリンプロモーター（ＲＩＰ）によって稼働するオボアルブミンタンパク質（ＯＶＡ）をコードする導入遺伝子がマウスゲノムに導入され、その結果、膵島β細胞においてオボアルブミンの膜形態の発現が起こるトランスジェニックマウスである。マウスのバックグラウンド株は、Ｃ５７ＢＬ／６であり、ＲＩＰ−ＯＶＡマウスは自発的に糖尿病を発症しない。ＲＩＰ−ＯＶＡマウス、またいわゆるＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（Ｉｎｓ２−ＴＦＲＣ／ＯＶＡ）２９６Ｗｅｈｉ／ＷｅｈｉＪをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入したＯＴ−１  ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）トランスジェニックマウスからのオボアルブミン特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を養子免疫伝達させた後のマウスにおいて、糖尿病が発症した（Ｋｕｒｔｓら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８４：９２３〜９３０）。ＯＴ−１マウスは、マウスＴＣＲａ−Ｖ２およびＴＣＲｂ−Ｖ５遺伝子に関するトランスジェニックインサートを含有する（Ｈｏｇｑｕｉｓｔら、Ｃｅｌｌ  ７６：１７〜２７）。トランスジェニックＴＣＲは、ＭＨＣＩ  Ｈ２Ｋｂタンパク質と関連してオボアルブミン残基を認識する。ＯＴ−１マウスにおいて９５％より多くのＣＤ８＋Ｔ細胞は、トランスジェニックＴＣＲを発現し、オボアルブミンペプチドを認識し、それにより活性化される。
【０１５２】
図１１は、ＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞をＲＩＰ−ＯＶＡレシピエントマウスに養子免疫伝達し、次いで、未処置のままの、抗マウスＣＸＣＲ３抗体で処置した、または対照ＩｇＧで処置した非糖尿病マウスの、経時的なパーセンテージを示す。養子免疫伝達後、処置（腹腔内に１００μｇ）を１日（研究１および研究２）または７日（研究２）続け、さらに処置を３週間にわたり週２回行った。各ラインは、１グループあたり５匹のマウスからのデータを合わせたものを表す。図１１Ａおよび１１Ｂに２つの研究からの結果を示す。データから、ＲＩＰ−ＯＶＡモデルにおいて、抗ＣＸＣＲ３抗体処置は、マウスの糖尿病発症を防いだことが実証される。
【０１５３】
図１２は、ＲＩＰ−ＯＶＡレシピエントマウスにＯＴ−１  Ｔ細胞を養子免疫伝達した後の様々な処置の有効性を特徴付けるさらなるデータを示す。図１２Ａは、ＲＩＰ−ＯＶＡレシピエントへの養子免疫伝達前の、フローサイトメトリーによって分析したドナーＴ細胞におけるＣＸＣＲ３発現を示す。アイソタイプ対照抗体での染色を影付きの曲線で表す。図１２Ｂは、指示された時間における、ＯＴ−１  Ｔ細胞を抗マウスＣＸＣＲ３抗体または対照ＩｇＧで処置したＲＩＰ−ＯＶＡレシピエントマウスに養子免疫伝達した後の、血液、脾臓、および膵リンパ節（ｐＬＮ）中のドナー細胞のパーセンテージを示す。抗体処置（腹腔内に１００μｇ）をＴ細胞の移入後１日目に開始し、処置を２週間にわたり週２回行った。各ドットは、１匹の別個のマウスからのデータを表す。図１２Ｃは、養子免疫伝達後の指定された時間における、抗マウスＣＸＣＲ３抗体または対照ＩｇＧで処置したＲＩＰ−ＯＶＡレシピエントマウスにおける自己抗原（ＯＶＡ）刺激に応答して増殖する血液、脾臓、および膵リンパ節（ｐＬＮ）中のドナー細胞の数を表示する。ＯＴ−１
Ｔ細胞の移入後１日目に抗体処置（腹腔内に１００μｇ）を開始し、処置を２週間にわたり週２回行った。各ドットは、１匹の別個のマウスからのデータを表す。図１２Ｄは、ＯＴ−１  Ｔ細胞を抗マウスＣＸＣＲ３抗体または対照ＩｇＧで処置したＲＩＰ−ＯＶＡレシピエントマウスに養子免疫伝達した後の指定された時間における、血液、脾臓、および膵リンパ節（ｐＬＮ）中のＣＸＣＲ３を発現するドナー細胞のパーセンテージを示す。ＯＴ−１  Ｔ細胞の移入後に抗体処置（腹腔内に１００μｇ）を１日続け、処置を２週間にわたり週２回行った。各ドットは、１匹の別個のマウスからのデータを表す。抗ＣＸＣＲ３抗体での処置により、ＲＩＰ−ＯＶＡマウスにおけるＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞のパーセンテージが減少した。
【０１５４】
図１３は、処置せずに、インスリン（図１３Ａ）もしくはＣＤ３（図１３Ｂ）に関して
染色した、または抗マウスＣＸＣＲ３抗体で処置し、インスリン（図１３Ｃ）もしくはＣＤ３（図１３Ｄ）に関して染色したＲＩＰ−ＯＶＡレシピエントマウスからの代表的なパラフィン包埋膵臓切片を示す。ＯＴ−１  Ｔ細胞の移入後１日目に抗ＣＸＣＲ３処置（腹腔内に１００μｇ）を開始し、処置を３週間にわたり週２回行った。研究の終了時に（Ｔ細胞移入後約６０日）膵臓組織を回収した。切片は、抗マウスＣＸＣＲ３抗体で処置したＲＩＰ−ＯＶＡマウスにおいてＴ細胞の浸潤がないことを示す。
【０１５５】
〔実施例６〕
抗ヒトＣＸＣＲ３抗体クローンの評価
上記の材料および方法の章（実施例１）で述べた方法を使用して、抗ヒトＣＸＣＲ３抗体クローンＣｌ４、１２、５３、８２、および１３５を、ＣＸＣＲ３走化性、およびカルシウム動員に対するそれらの作用に関して評価した。走化性アッセイに関して、ヒトＣＸＣＲ３でトランスフェクションした３００．１９細胞を、走化性アッセイに添加する前に、培地単独で、または図１４Ａ〜Ｃでの表示通りの様々な濃度の抗体を含む培地で前もってインキュベートした。図１４Ａ〜Ｃは、ＣＸＣＬ１１へのＣＸＣＲ３介在走化性は、クローンＣｌ４、１２、５３、８２、および１３５によって阻害されることを示す。図１４におけるクローン２は、クローン４と同一である。
【０１５６】
カルシウム流出アッセイに関して、上記の材料および方法の章（実施例１）で述べた方法に従って、ヒトＣＸＣＲ３でトランスフェクションしたＨＥＫ細胞を、ＦＬＩＰＲに添加する前に、様々な抗体の濃度で前もってインキュベートした。図１４０に、各抗体についてカルシウム動員を５０％阻害するのに必要な抗体の濃度を示す。図１４Ｄは、ＣＸＣＬ１１へのＣＸＣＲ３介在カルシウム動員は、クローンＣｌ４、１２、５３、および１３５によって阻害されることを示す。
【０１５７】
走化性に対するクローン４、１２、５３、８２、および１３５の作用をさらに査定するために、ｈＣＸＣＲ３でトランスフェクションした３００．１９細胞を培地単独で、または５０μｇ／ｍｌ抗体を含む培地で前もってインキュベートし、その後走化性アッセイに加えて、ＣＸＣＬ９（図１５Ａ）、ＣＸＣＬ１０（図１５Ｂ）、およびＣＸＣＬ１１（図１５Ｃ）の移動を査定した。データから、クローン４、１２、５３、８２、および１３５は、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１への移動を阻害し、部分的にＣＸＣＬ９への移動を阻害することが実証される。
【０１５８】
クローン４、１２、５３、８２、および１３５の特異性を評価するために、他のケモカイン受容体への結合に関して抗体をアッセイした。３００．１９細胞をヒトＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５でトランスフェクションし、抗ヒトＣＸＣＲ３抗体クローンとインキュベートし、続いて二次抗体で染色し、フローサイトメトリーで処理することによって抗体結合を分析した。二次抗体単独の投与を陰性対照として利用した。ヒトＣＸＣＲ３でトランスフェクションした３００．１９細胞を、クローンによる染色のための陽性対照として利用した。図１６は、異なるケモカイン受容体を発現する細胞に対する抗体結合のヒストグラムプロットを示し、これから、クローン４、１２、５３、８２、および１３５は他のケモカイン受容体と結合せず、ＣＸＣＲ３に特異的であることが実証される。
【０１５９】
ケモカイン受容体結合アッセイには、標準的なフローサイトメトリーの手法を採用した。簡単に言えば、細胞株をバーセン処置により回収し、各細胞株を７つのサンプルに分けた。各サンプルを氷上で１種の一次抗体（５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、続いてＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体で染色して、結合した一次抗体を検出した。陰性対照として、細胞を（一次抗体とのインキュベートを行わずに）二次抗体単独で染色した。一次抗体は、抗ヒトＣＸＣＲ３抗体クローンまたは抗ヒトＣＸＣＲ３対照抗体クローン１Ｃ
６であった。染色後、細胞をフローサイトメーターに捕捉し、Ｆｌｏｗ  Ｊｏソフトウェアを使用してデータを分析した。図１６中の各ラインは、１種の一次抗体と二次抗体とで染色した、または二次抗体単独で染色した細胞の個々のサンプルを表す。
【０１６０】
上述した方法（実施例１）に従ってＢｉａｃｏｒｅアッセイを使用して、クローン４、１２、５３、８２、および１３５の親和性（Ｋａ）および解離速度（Ｋｄ）を分析した。以下の表４に結果を要約する。
【０１６１】
【表５】
2020072715.tif 000006
【０１６２】
〔実施例７〕
エピトープマッピング
ＣＸＣＲ３のＮ末端細胞外ドメインからの、トランケーションされた、ビオチン化したヒトＣＸＣＲ３ペプチド（１６アミノ酸のＮ末端フラグメント）を使用して、クローン４、１２、５３、８２、および１３５に関するエピトープを決定した。一連のアラニン置換フラグメントを作製し（以下の表５の、太字で示したアラニン置換を参照）、ビオチン化した。エピトープマッピングをＯｃｔｅｔ（登録商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｍｅｎｌｏ
Ｐａｒｋ、ＣＡ）およびＢｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）分析で評価した。
【０１６３】
Ｏｃｔｅｔ分析のために、ペプチドを８０％ＤＭＳＯに再懸濁し、ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈した。抗体クローン４、１２、５３、８２、１３５、および市販のクローン１Ｃ６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、ＰＢＳで１２０ｎＭに希釈した。Ｏｃｔｅｔ
ＱＫシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で３００μｌ／ウェルを備えた９６−ウェルプレートのフォーマットにおいて動態アッセイを行った。各アッセイプレートには、陽性対照としてＮ末端がビオチン化された全長ＷＴ  ｈＣＸＣＲ３  ＥＣＤペプチド（Ａｂｇｅｎｔ）、加えて参照差分のためにＰＢＳ緩衝液ブランクが含まれていた。Ｏｃｔｅｔのストレプトアビジンバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を、アッセイを行う前に少なくとも５分、ＰＢＳに前もって浸漬した。まずベースラインを得るためにバイオセンサーを振盪しないでＰＢＳに５分浸した。全ての残りの工程では、振盪速度は１０００ｒｐｍであった。ペプチド溶液にバイオセンサーを５分漬けて、ペプチドを負荷した。ＰＢＳ中で５分の別のベースライン工程を行った。次いで抗体溶液にバイオセンサーを１０分漬けて、結合を測定した。最後に、解離させるためにバイオセンサーを１５分かけてＰＢＳに移した。Ｏｃｔｅｔデータアナリシスｖ７．０を使用してセンサーグラムを分析した。結合活性を、ＷＴ全長ｈＣＸＣＲ３ペプチドと比較した、各抗体の最大応答レベルのパーセンテージとして示した。
【０１６４】
エピトープヒートマップに相対的な応答レベルを記録した。野生型ｈＣＸＣＲ３  ＥＣＤペプチドに対する最大のセンサーグラム応答は、４〜８ｎｍの範囲であった。スクリーニングされた各クローンは、独特なエピトープを有していた。試験された突然変異体のうち、クローン１Ｃ６の結合が完全に破壊されたものはなかった。１０位のバリン残基およ
び１３位のアスパラギン酸は、スクリーニングされた全ての抗体の結合において役割を果たしていた。抗体１２および１Ｃ６は、最もＮ末端側にエピトープを有しており、５位のバリン突然変異は両方の活性に影響を与えた。抗体８２は、最もＣ末端側にエピトープを有しており、結合活性の低下は９位のグルタミンから始まっていた。これらのデータに基づいて、ＣＸＣＲ３配列におけるアミノ酸のエピトープの境界は、各抗体で以下の通りである；Ｃｌ４：アミノ酸７〜１３；Ｃｌ１２：アミノ酸５〜１３；Ｃｌ５３：アミノ酸７〜１３；Ｃｌ８２：アミノ酸９〜１５；Ｃｌ１３５：アミノ酸７〜１３；およびクローン１Ｃ６：アミノ酸５〜１３。
【０１６５】
Ｂｉａｃｏｒｅ分析のために、ペプチドを、ＨＢＳ−ＥＰ＋ランニング緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％ポリソルベート２０）で１０ｎｇ／ｍｌに希釈した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（商標）を使用して、フローセルごとに２０反応単位（ＲＵ）の安定な捕捉が達成されるまで、ＣＭ５−ＳＡ（ＧＥ番号ＢＲ−１００５−３１）チップの上にペプチドを５μｌ／分の速度で注入した。各チップにおいて、フローセル１は参照差分のためにブランクのままにした。陽性対照として、各チップの１つのフローセルに野生型３７ＡＡ  ｈＣＸＣＲ３ペプチドを入れた。マウス抗ｈＣＸＣＲ３抗体４、１２、５３、８２、および１３５を、ＨＢＳ−ＥＰ＋で５０、２５、１２．５、６．２５、および３．１２５ｎＭに希釈した。各サイクルで、抗体を５０μｌ／分の流速で３分注入し、結合を測定し、続いて緩衝液を５０μｌ／分で３分注入し、解離を測定した。サイクル間で、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０を５０μｌ／分で６０秒使用してペプチド表面を再生した。センサーグラムを、１：１の結合モデルにフィッティングし、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｖ２．０．１で二重参照差分を使用して分析し、ストレプトアビジンバイオセンサーに捕捉した。典型的な応答レベルは、０〜５００ＲＵの範囲であり、「強い」、「中程度の」、および「弱い」結合応答のカットオフを決定した。相対的な応答レベルを記録して、エピトープマップを作製した。解離速度を分類して、迅速なＫｄ値（０．００１ｓ−１より高い）を示したペプチドも記録した。
【０１６６】
【表６】
2020072715.tif 000007
【０１６７】
全ての抗体が、野生型ｈＣＸＣＲ３に結合し、ｈＣＸＣＲ３配列の最初の１６ＡＡ内であった。表６にクローン４、１２、５３、８２、および１３５に関する結合データを示し、図１８に各抗体クローンに関する結合活性に必要な最小限のエピトープの境界を示す対応するマップを示し、重要な残基はＸでマークした。全ての抗体エピトープがヒトＣＸＣＲ３配列の残基６〜１５内にマッピングされ、この領域は、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１結合に関与していた。ＣＸＣＲ３ペプチドフラグメント中の所与の位置でのアラニン置換後の結合応答の低下を検出することによって、エピトープ内のアミノ酸を決定した。クローン５３および１３５が、最も類似したエピトープを有していた。クローン４および
１２が、最もＮ末端側にエピトープを有していた（結合強度への影響は、５位のバリンから始まっていた）。クローン８２は、最もＣ末端側にエピトープを有しており、結合活性の低下は、９位のグルタミンから始まっていた。８２を除く全てのクローンにとってＣＸＣＲ３中の７位のアスパラギン酸が必要である。ＣＸＣＲ３中の１０位のバリンおよび１３位のアスパラギン酸はいずれも、全てのクローンの結合において役割を果たす。５つのクローンのマウス、キメラ、およびヒト化バージョンの間でエピトープの差はなかった。
【０１６８】
【表７】
2020072715.tif 000008
【０１６９】
符号
＋＋＋  強い結合応答（３００ＲＵ超）
＋＋  中程度の結合応答（１５０〜３００ＲＵ）
＋  弱い結合応答（１０〜１５０ＲＵ）
−  結合なし（１０ＲＵ未満）
＊  比較的強い結合応答（１０ＲＵ超）にもかかわらず迅速な解離速度（Ｋｄ＞０．００１）。
【０１７０】
〔実施例８〕
抗ヒトＣＸＣＲ３クローンのヒト化
４つの変異体（キメラ、ヒト化１（Ｈｕ１）、Ｈｕ２、およびＨｕ３）を、５つの抗ＣＸＣＲ３クローン（クローン４、１２、５３、８２、および１３５）のそれぞれについて作製した。２０。ｉｎ  ｖｉｖｏでの動物モデル研究のために、全てのキメラ変異体を「プール発現」によって産生した。懸濁培養に適合させたＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、７７：４２１６〜２０（１９８０））を、キメラＣＸＣＲ３抗体クローン４、１２、５３、８２、および１３５からの重鎖および軽鎖を含有する発現ベクターでエレクトロポレーションした。またこれらの発現ベクターは、安定なＣＨＯ形質転換体を選択するためのジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子も含有する。１００ｎＭメトトレキセートで選択した後、安定してトランスフェクションされたＣＨＯプールを使用して、ＯｐｔｉＣＨＯ培地を含む振盪フラスコ中で行われた生物学的産生を完了させた。組換えキメラ抗体を、標準的なプロテインＡクロマトグラフィーを使用して調整培地から精製した。Ｈｕ１クローンをヒトフレームワー
ク領域にＣＤＲグラフト化し、完全にヒト化し、マウスＣＤＲのアミノ酸とあらゆるバーニヤ位置残基を排除した。Ｈｕ２クローンは、マウスＣＤＲの４つのアミノ酸内に位置する残基においてＨｕ１配列からの復帰突然変異による変化を含む「拡張されたＣＤＲ」クローンであった。Ｈｕ３クローンは、ＩＭＧＴベースのモデリングを使用してマウスとヒトとで「まったく異なっている」と同定された位置にＨｕ２配列からのさらなる復帰突然変異を包含していた。合計２０種の変異体をＣＨＯ−ＮＲＣ細胞で一時的に発現させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイのために精製した。
【０１７１】
クローン４および５３に追加のヒト化を行った。包含された重鎖４．７〜４．１１はさらに、ＣＤＲの外側にヒト化された復帰突然変異を包含し、加えてクローンの安定性を改善するする目的で、ＶＨのＣＤＲ２における５８位および５９位（ＩＭＧＴによる番号付け）における脱アミド部位が除去されるような改変を包含していた。特に、ＶＨ４．２における脱アミド部位を多数の代替残基で置き換えた。クローンＶＨ５３．４〜５３．６およびＶＬ５３．４〜５３．９はさらに、特に鎖をＶＨ４．１およびＶＬ４．１により類似させる目的で、ＣＤＲの外側にヒト化された復帰突然変異を包含していた。
【０１７２】
〔実施例９〕
全体の受容体結合の動態
無傷のＣＸＣＲ３ペプチドと共にＯｃｔｅｔ（登録商標）およびＢｉａｃｏｒｅ（商標）を使用して２０種の抗ＣＸＣＲ３変異体の結合動態を評価した。Ｏｃｔｅｔ分析を上述したようにして行った。Ｂｉａｃｏｒｅ分析のために、３つのカラム工程で精製したヒト野生型ＣＸＣＲ３ペプチドのＣ末端をＨｉｓおよびＨＰＣ４でタグ付けし、ニッケルキレート化およびアミンカップリングを介してＮＴＡチップ上に捕捉した。より優れたデータ品質のために、さらに２価の結合の作用を最小化するために、中程度のＲＵ（およそ１２００ＲＵ）のチップを使用した。０〜８０ｎＭの抗体サンプルを受容体の上に注入した。より優れたカーブフィッティングのための局所的なＲｍａｘフィットを利用したセンサーグラムプロットを使用して標準的なＢｉａｃｏｒｅ（商標）評価分析を行った。５種のクローン（４、１２、５３、８２、および１３５）ごとに４つの変異体（キメラ（Ｃｈ）およびヒト化（Ｈｕ）１〜３）の結合曲線を評価した。比較目的で、ヒトＣＸＣＲ３リガンドＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１１、ならびにマウスＣＸＣＬ１１（ｍＣＸＣＬ１１）の結合動態も評価した。以下の表７Ａ（ＫＤで分類）および７Ｂ（Ｋｄで分類）に結果を示す。表ではＫＤおよびＫｄで上位４つの変異体が強調表示される。ヒト化抗ｈＣＸＣＲ３ｍＡｂ変異体が解離速度（Ｋｄ）で分類した場合、変異体の多くが、最も効力のあるヒトＣＸＣＲ３リガンドのｈＣＸＣＬ１１よりも少なくとも１桁遅い解離速度を示した。
【０１７３】
【表８】
2020072715.tif 000009
【０１７４】
【表９】
2020072715.tif 000010
【０１７５】
表７Ａで示されたように、ＫＤで上位４つの変異体は、キメラクローン４（速い結合速度、遅い解離速度）、Ｈｕ３クローン４（速い結合速度、遅い解離速度）、Ｈｕ３クローン８２（速い結合速度、平均の解離速度）、およびキメラクローン５３（平均の結合速度、遅い解離速度）である。
【０１７６】
ＣＸＣＲ３を発現する細胞で抗体結合をさらに評価した。ヒトＣＸＣＲ３でトランスフェクションした３００．１９細胞を、精製したヒト化抗ｈＣＸＣＲ３抗体変異体Ｈｕ１、Ｈｕ２、Ｈｕ３、およびキメラ抗体と接触させた。図１９において、クローン４、１２、５３、８２、および１３５のそれぞれに関して、５μｇ／ｍｌ（黒のライン）、０．５μｇ／ｍｌ（暗い灰色のライン）、または０．１μｇ／ｍ１（黒の点線）または５μｇ／ｍｌの二次抗体単独（塗り潰された灰色のヒストグラム）で示した。細胞を非標識抗体クローンで氷上で３０分染色し、続いてＰＢＳ−１％ＦＢＳで２回洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ１特異的二次抗体を使用して、暗所で氷上で３０分インキュベートすることにより結合した抗体を検出した。サンプルを２回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液中で固定し、暗所で４℃で保存し、フローサイトメーターに捕捉させた。図１９に生存可能な細胞にゲーティングしたＣＸＣＲ３のヒストグラムの陽性を示す。
【０１７７】
〔実施例１０〕
抗体１Ｃ６との比較
抗ｈＣＸＣＲ３ｍＡｂクローン１Ｃ６（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号５５７１８３、同じクローンが米国特許第６，１８４，３５８号で報告されている）を、Ｂｉａｃｏｒｅの全受容体アッセイ方法を使用してマウス抗ｈＣＸＣＲ３ｍＡｂクローン４、ならびにそのヒト化変異体Ｈｕ２およびＨｕ３と比較した。クローン４は、約２
倍より優れた親和性（ＫＤ）を示した。ヒト化変異体は、さらに改善された親和性（Ｈｕ２およびＨｕ３変異体の両方でおよそ４倍より優れた親和性）を示した。表８に、クローン１Ｃ６およびクローン４、ならびにそのヒト化変異体Ｈｕ２およびＨｕ３に関する結合動態および親和性を列挙した。
【０１７８】
【表１０】
2020072715.tif 000011
【０１７９】
〔実施例１１〕
機能性アッセイ
２０種の変異体抗体の機能的な作用を評価した。これらの抗体を、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１１に応答する細胞走化性、およびカルシウム動員の阻害に対するそれらの作用に関して、ＦＬＩＰＲ（登録商標）カルシウムアッセイにより評価した。
【０１８０】
ヒトＣＸＣＲ３でトランスフェクションした３００．１９細胞の、ＣＸＣＲ３リガンドのＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１１に対する走化性を、１０μｇ／ｍｌの、クローン４、１２、５３、８２、および１３５のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体変異体の存在または非存在下で評価した。トランスフェクションされた細胞を、１０μｇ／ｍｌのヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体変異体または市販の抗体１Ｃ６で３７℃で２０分前処置した。抗体を含む細胞を５ミクロンのトランスウェルに移し、それぞれ１００または３００ｎｇ／ｍｌの組換えマウスのＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１またはＣＸＣＬ９を含有する受け取りウェルにインサートを入れた。走化性プレートを、３７℃で、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。トランスウェルインサートを除去し、受け取りウェルに移動した細胞をＵ字型底の９６ウェルプレートに移し、ペレット化し、カルセインＡＭ色素に再懸濁した。細胞を３７℃で３０分、５％ＣＯ２中でインキュベートし、１回洗浄し、黒色のクリアプレートに移し、即座にＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎで４９０／５２０ｎｍで読み取った。データは、走化性のパーセント阻害として示される。図２０は、５つのクローンそれぞれに関する異なる変異体の、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１１に対する走化性を阻害する能力を示す代表的なデータを示す。
【０１８１】
細胞内カルシウム動員の阻害を評価するために、様々な濃度の抗ＣＸＣＲ３抗体変異体または陽性対照抗体１Ｃ６の存在または非存在下で、ＣＸＣＬ１０に応答する、ヒトＣＸＣＲ３−Ｇｑｉ４ｑｉ４でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞におけるカルシウムフローを測定した。３８４−ブラックプレート中に細胞を播き（１２，０００／ウェル）、そのまま一晩付着させた。次の日、細胞に、カルシウム感受性色素のＦｌｕｏ−４ＮＷ色素を４０分で投入し、その後、抗体を添加し３７℃でインキュベートした。抗体を添加し、２０分インキュベートし、その後、ＣＸＣＲ３リガンドの組換えヒトＣＸＣＬ１０を、以前に決定されたＣＸＣＬ１０のＥＣ８０濃度で添加した。色素の添加は手作業で電動マルチチャンネルピペットを使用して行ったが、抗体およびアゴニスト添加はＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａ（登録商標）で自動的になされ、ＣＸＣＬ１０添加後すぐに、プレートを４７０〜４９５ｎｍで読取った。サンプルを二連で処理し、各抗体濃度における平均パーセント阻害（±標準偏差）をグラフ化した。クローン４Ｈｕ１は、カルシウム動員を阻害しなか
ったことから、これらの実験で陰性対照として使用した。図２１は、５つのクローンそれぞれの異なる変異体のカルシウム動員を阻害する能力を示しており、それらを市販のクローン１Ｃ６と比較している。以下の表９に、カルシウム動員アッセイにおけるＣＸＣＬ１０に対する抗体の代表的なＩＣ５０値（Ｍ）を示す。
【０１８２】
【表１１】
2020072715.tif 000012
【０１８３】
表９中の（＊）は、１Ｃ６抗体はキメラ抗体ではないが、ヒトＣＸＣＲ３に対する完全マウスＩｇＧ１抗体であることを示す。
【０１８４】
表１０で示されるように、結合反応動態のデータ（実施例９を参照）は、機能性アッセイの結果とよく関連している。結合反応動態データおよび機能性アッセイの結果に基づいて、さらなる評価および４Ｄヒト化のためにクローン４および５３を選択した。
【０１８５】
【表１２】
2020072715.tif 000013
【０１８６】
〔実施例１２〕
４Ｄヒト化
抗ｈＣＸＣＲ３抗体クローンの４Ｄヒト化は、ＷＯ２００９／０３２６６１（例えば、段落［００３７］〜［００４４］）で説明されているようになされる。簡単に言えば、４
Ｄヒト化は：ａ）ヒト化しようとする可変ドメインの３−Ｄモデルを構築すること；ｂ）可変ドメインの３−Ｄモデルの分子動力学シミュレーションを使用して、そのドメイン中のフレキシブルな残基を同定すること；ｃ）３−Ｄモデルの分子動力学の軌道を、４９種のヒト生殖細胞系の分子動力学軌道と比較することにより、最も近いヒト生殖細胞系を同定すること（従来のヒト化で行われるような抗体配列の比較ではなく）；およびｄ）ＣＤＲの一部ではないフレキシブルな残基を、（工程ｃで同定された）それらのヒト生殖細胞系の対応物に突然変異させることを含む。この方法を使用して重鎖４．４〜４．６および軽鎖４．４〜４．７を設計した。特に、最初の４Ｄヒト化コンストラクト（ＶＨ４．４およびＶＬ４．４）を設計し、次いで重鎖および軽鎖へのさらなる改変を設計して（ＶＨ４．５〜４．６およびＶＬ４．５〜４．７）、安定化および抗凝集性突然変異を導入し、他の不要なモチーフを除去した。また類似の方法を使用して、４Ｄヒト化コンストラクトＶＨ５３．７〜５３．１０およびＶＬ５３．１０〜５３．１３も設計した。
【０１８７】
表１１に、ヒト化および４Ｄヒト化鎖（ＶＨ＝重鎖；ＶＫ＝軽鎖）を包含するクローン４、１２、５３、８２、および１３５の重鎖および軽鎖変異体を調製するのに使用されるヒト化法（さらに適用される場合は、追加の改変）を表示する。
【０１８８】
クローン４（４Ｈｕ６、４Ｈｕ７、４Ｈｕ８、４Ｈｕ９、４Ｈｕ１０）の数種の４Ｄ変異体を、結合動態およびＣＸＣＲ３親和性を評価するためにＢｉａｃｏｒｅの全受容体アッセイによって評価して、クローン４キメラ抗体と比較した。表２で示したように、クローン４Ｈｕ６は、重鎖４．４および軽鎖４．４を含有していた。クローン４Ｈｕ７は、重鎖４．４および軽鎖４．７を含有していた。クローン４Ｈｕ８は、重鎖４．５および軽鎖４．５を含有していた。クローン４Ｈｕ９は、重鎖４．５および軽鎖４．６を含有していた。さらにクローン４Ｈｕ１０は、重鎖４．６および軽鎖４．４を含有していた。
【０１８９】
表１２で示されるように、クローン４の４Ｄでモデリングした変異体をキメラ変異体（４Ｃｈ）と比較したところ、５つの変異体のうち４つが改良された親和性（ＫＤ）を示した。しかしながら、４Ｄ変異体の４Ｈｕ１０は、ほぼ１桁レベルの親和性の減少を示した。
【０１９０】
【表１３】
2020072715.tif 000014
【０１９１】
【表１４】
2020072715.tif 000015
【０１９２】
【表１５】
2020072715.tif 000016
【０１９３】
〔実施例１３〕
ＮＳＧ−ＰＢＬマウスモデル
０日目に、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスに、フィコールにより単離した新鮮な２Ｅ７一次ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を注入した。動物（ｎ＝８／グループ）を、５ｍｇ／ｋｇ抗ヒトＣＸＣＲ３キメラ抗体または対照ヒトＩｇＧ１（ハーセプチン）で週２回処置し、ここで全ての研究を細胞の移動から３日目に開始した。開始から１４日目に採取した血液をフローサイトメトリー用に処理し、標準的手法を使用して、ヒトＣＤ４５（ｈＣＤ４５）、ヒトＣＤ３（ｈＣＤ３）、ヒトＣＤ４（ｈＣＤ４）、ヒトＣＤ８（ｈＣＤ８）、およびヒトＣＸＣＲ３に対する抗体で染色した。リンパ球のゲート中の細胞を、ｈＣＤ４５＋細胞でゲーティングし、続いてｈＣＤ３＋細胞でゲーティングした。ｈＣＤ４５＋ｈＣＤ３＋Ｔ細胞におけるｈＣＤ４およびｈＣＤ８発現を評価し、ヒトＣＤ４＋ＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞とヒトＣＤ８＋Ｃ４５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞とのパーセンテージを決定した。ＣＸＣＲ３を発現するヒトＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞とのパーセンテージを決定した。図２２中の各ドットは、単一のマウスを表し、３つの実験のうち代表的なデータを示す。データから、異種ＧｖＨＤ（移植片対宿主病）のＮＳＧ−ＰＢＬマウスモデルにおける抗ＣＸＣＲ３抗体処置により、ＣＸＣＲ３を発現するＴ細胞が調節されたことが示されるが、５つのクローン間の機能的な差が明らかになった。
【０１９４】
表１２は、キメラ抗ヒトＣＸＣＲ３候補抗体で処置した後の異種ＧｖＨＤを有するＮＳＧ−ＰＢＬマウスの生存期間中央値を示す。
【０１９５】
【表１６】
2020072715.tif 000017
【０１９６】
ログランク検定を使用した、ｈｕＩｇＧ１処置に対する、＊ｐ＝０．０４３；＊＊ｐ＝０．０１６；＊＊＊ｐ＝０．０１０の抗ＣＸＣＲ３抗体処置である。
【０１９７】
前記の実施例は、説明を意図しており、本開示を限定する意図はまったくない。開示された装置および方法の他の実施形態は、明細書の考察や本明細書で開示された装置および方法の実施から当業者には明らかである。
【図１】
2020072715.tif 000018
【図２】
2020072715.tif 000019
【図３】
2020072715.tif 000020
【図４】
2020072715.tif 000021
【図５】
2020072715.tif 000022
【図６】
2020072715.tif 000023
【図７】
2020072715.tif 000024
【図８】
2020072715.tif 000025
【図９】
2020072715.tif 000026
【図１０】
2020072715.tif 000027
【図１１】
2020072715.tif 000028
【図１２】
2020072715.tif 000029
【図１３】
2020072715.tif 000030
【図１４】
2020072715.tif 000031
【図１５】
2020072715.tif 000032
【図１６】
2020072715.tif 000033
【図１７Ａ】
2020072715.tif 000034
【図１７Ｂ】
2020072715.tif 000035
【図１７Ｃ】
2020072715.tif 000036
【図１７Ｄ】
2020072715.tif 000037
【図１７Ｅ】
2020072715.tif 000038
【図１７Ｆ】
2020072715.tif 000039
【図１７Ｇ】
2020072715.tif 000040
【図１７Ｈ】
2020072715.tif 000041
【図１８】
2020072715.tif 000042
【図１９】
2020072715.tif 000043
【図２０】
2020072715.tif 000044
【図２１】
2020072715.tif 000045
【図２２】
2020072715.tif 000046
【図２３Ａ】
2020072715.tif 000047
【図２３Ｂ】
2020072715.tif 000048
【図２３Ｃ】
2020072715.tif 000049
【図２３Ｄ】
2020072715.tif 000050
【図２４Ａ】
2020072715.tif 000051
【図２４Ｂ】
2020072715.tif 000052
【図２４Ｃ】
2020072715.tif 000053
【図２４Ｄ】
2020072715.tif 000054
【図２５Ａ】
2020072715.tif 000055
【図２５Ｂ】
2020072715.tif 000056
【図２５Ｃ】
2020072715.tif 000057
【図２５Ｄ】
2020072715.tif 000058
【図２５Ｅ】
2020072715.tif 000059
【図２５Ｆ】
2020072715.tif 000060
【図２５Ｇ】
2020072715.tif 000061
【図２５Ｈ】
2020072715.tif 000062
【図２５Ｉ】
2020072715.tif 000063
【図２５Ｊ】
2020072715.tif 000064
【図２５Ｋ】
2020072715.tif 000065
【図２５Ｌ】
2020072715.tif 000066
【図２５Ｍ】
2020072715.tif 000067
【図２５Ｎ】
2020072715.tif 000068
【図２５Ｏ】
2020072715.tif 000069
【図２５Ｐ】
2020072715.tif 000070
【図２６Ａ】
2020072715.tif 000071
【図２６Ｂ】
2020072715.tif 000072
【図２６Ｃ】
2020072715.tif 000073
【図２６Ｄ】
2020072715.tif 000074
【図２６Ｅ】
2020072715.tif 000075
【図２６Ｆ】
2020072715.tif 000076
【図２６Ｇ】
2020072715.tif 000077
【図２６Ｈ】
2020072715.tif 000078
【図２６Ｉ】
2020072715.tif 000079
【図２６Ｊ】
2020072715.tif 000080
【図２６Ｋ】
2020072715.tif 000081
【図２６Ｌ】
2020072715.tif 000082
【図２６Ｍ】
2020072715.tif 000083
【図２６Ｎ】
2020072715.tif 000084
【図２６Ｏ】
2020072715.tif 000085
【図２６Ｐ】
2020072715.tif 000086
【図２６Ｑ】
2020072715.tif 000087
【図２６Ｒ】
2020072715.tif 000088
【図２６Ｓ】
2020072715.tif 000089
【図２６Ｔ】
2020072715.tif 000090
【図２６Ｕ】
2020072715.tif 000091
【図２７Ａ】
2020072715.tif 000092
【図２７Ｂ】
2020072715.tif 000093
【図２７Ｃ】
2020072715.tif 000094
【図２７Ｄ】
2020072715.tif 000095
【図２８Ａ】
2020072715.tif 000096
【図２８Ｂ】
2020072715.tif 000097
【図２８Ｃ】
2020072715.tif 000098
【図２８Ｄ】
2020072715.tif 000099
【図２８Ｅ】
2020072715.tif 000100
【図２８Ｆ】
2020072715.tif 000101
【図２８Ｇ】
2020072715.tif 000102
【図２８Ｈ】
2020072715.tif 000103
【図２８Ｉ】
2020072715.tif 000104
【図２８Ｊ】
2020072715.tif 000105
【図２８Ｋ】
2020072715.tif 000106
【図２８Ｌ】
2020072715.tif 000107
【図２８Ｍ】
2020072715.tif 000108
【図２８Ｎ】
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【図２８Ｏ】
2020072715.tif 000110
【図２８Ｐ】
2020072715.tif 000111
【配列表】
2020072715000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月17日(2020.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＸＣＲ３に結合することができる抗体または抗原結合フラグメントにおいて、該抗体またはフラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み：
ａ）該重鎖可変領域は、配列番号２、４、６、および８のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み；かつ／もしくは該軽鎖可変領域は、配列番号３、５、７、および９のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み、
ｂ）該重鎖可変領域は、配列番号１０、１２、１４、および１６のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み；かつ／もしくは該軽鎖可変領域は、配列番号１１、１３、１５、および１７のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み、
ｃ）該重鎖可変領域は、配列番号１８、２０、２２、２４、および２６〜３３のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み；かつ／もしくは該軽鎖可変領域は、配列番号１９、２１、２３、２５、および３４〜３７のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み、
ｄ）該重鎖可変領域は、配列番号３８、４０、４２、４４、４６〜４８、および６３〜６６のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み；かつ／もしくは該軽鎖可変領域は、配列番号３９、４１、４３、４５、４９〜５４、および６７〜７０のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み、
または
ｅ）該重鎖可変領域は、配列番号５５、５７、５９、および６１のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含み；かつ／もしくは該軽鎖可変領域は、配列番号５６、５８、６０、および６２のいずれか１つからの３つのＣＤＲと少なくとも約９５％同一な３つのＣＤＲを含む、前記抗体またはフラグメント。