(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳類動物対象における疾患を予防又は治療する方法の提供。【解決手段】ヒトクラスＩＩ主要組織適合性抗原のサブユニットの両方をコードする配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むアルファウイルスレプリコンと、レトロウイルスｇａｇタンパク質と、膜融合性エンベロープタンパク質とを含むウイルス性粒子（ＶＬＰ）を含み、ＶＬＰがアルファウイルス構造タンパク質遺伝子を含有しない、有効投与量の医薬組成物を、上記予防又は治療を必要とする対象に投与することを含む方法。【選択図】図４
2020072720.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、
ａ．ヒトクラスＩＩ主要組織適合性抗原のサブユニットの両方をコードする配列及び疾患細胞に特異的な抗原をコードする配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むアルファウイルスレプリコンと、
ｂ．レトロウイルスｇａｇタンパク質と、
ｃ．膜融合性エンベロープタンパク質と、
を含み、アルファウイルス構造タンパク質遺伝子を含有しない、ウイルス様粒子。
【請求項２】
前記アルファウイルスレプリコンがシンドビスウイルス又はベネズエラ馬脳炎ウイルスの核酸配列を含む、請求項１に記載のウイルス様粒子。
【請求項３】
レトロウイルスｐｏｌ遺伝子を含まず、又は発現しない、請求項１又は２に記載のウイルス様粒子。
【請求項４】
アルファウイルスレプリコンをコードする第１のポリヌクレオチド及びレトロウイルスｇａｇタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドを含み、前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが共有結合せず、操作可能に連結しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
【請求項５】
前記膜融合性エンベロープタンパク質が糖タンパク質又はその断片若しくはその誘導体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
【請求項６】
疾患細胞に特異的な前記抗原が腫瘍特異的抗原である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
【請求項７】
前記腫瘍特異的抗原が、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、カルシトニン、カルレチニン、癌胎児性抗原、ＣＤ３４、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、クロモグラニン、シトケラチン、デスミン、上皮膜タンパク質（ＥＭＡ）、ＶＩＩＩ因子、ＣＤ３１、ＦＬ１、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グロス嚢胞性疾患液タンパク質（ＧＣＤＦＰ−１５）、ＨＭＢ−４５、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インヒビン、ケラチン、リンパ球マーカー、ＭＡＲＴ−１（Ｍｅｌａｎ−Ａ）、Ｍｙｏ  Ｄ１、筋特異的アクチン（ＭＳＡ）、神経フィラメント、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、胎盤性アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、前立腺特異的抗原、ＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）、Ｓ１００タンパク質、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、シナプトフィシン、チログロブリン、甲状腺転写因子−１、腫瘍Ｍ２−ＰＫ、ビメンチン、ＣＤ８０、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤ２０、ＣＤ２５及びＣＤ１０からなる群から選択される、請求項６に記載のウイルス様粒子。
【請求項８】
前記腫瘍特異的抗原及び前記ヒトクラスＩＩ主要組織適合性抗原がともに前記アルファウイルスレプリコンによりコードされている、請求項１〜７のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
【請求項９】
前記ウイルス様粒子が真核細胞に結合することができる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
【請求項１０】
前記真核細胞がヒト細胞である、請求項９に記載のウイルス様粒子。
【請求項１１】
前記結合が標的細胞に特異的である、請求項１０に記載のウイルス様粒子。
【請求項１２】
前記膜融合性エンベロープタンパク質が特異的に腫瘍細胞に結合する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
【請求項１３】
疾患細胞に特異的な前記抗原が、感染因子の遺伝子により発現される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
【請求項１４】
前記感染因子が感染性ウイルスである、請求項１３に記載のウイルス様粒子。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の前記ウイルス様粒子と細胞とを接触させることを含む、真核細胞において少なくとも１種の組換えポリヌクレオチドを発現させる方法。
【請求項１６】
対象に、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の前記ウイルス様粒子を投与することを含む、該対象に前記組換えポリヌクレオチドを送達する方法。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の前記ウイルス様粒子を含む医薬組成物。
【請求項１８】
前記組成物が非経口投与に適している、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
哺乳類動物対象の疾患を予防又は治療する方法であって、有効投与量の請求項１７に記載の医薬組成物を、該予防又は治療を必要とする哺乳類動物対象に投与することを含む方法。
【請求項２０】
前記哺乳類動物対象が腫瘍を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルス様粒子によりコードされるクラスＩＩ主要組織適合性抗原（クラスＩＩ  ＭＨＣ抗原）は、前記哺乳類動物対象の該クラスＩＩ  ＭＨＣ抗原と異なる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記医薬組成物は腫瘍特異的免疫性を誘導する、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳類動物対象が、乳房、子宮頸部、前立腺、卵巣、腎腫、肺、胃、膵臓、神経膠芽腫及び大腸に由来する固形腫瘍を有する癌患者群から選択される癌患者である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記腫瘍特異的抗原が、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、カルシトニン、カルレチニン、癌胎児性抗原、クロモグラニン、シトケラチン、デスミン、上皮膜タンパク質（ＥＭＡ）、ＶＩＩＩ因子、ＦＬ１、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グロス嚢胞性疾患液タンパク質（ＧＣＤＦＰ−１５）、ＨＭＢ−４５、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インヒビン、ケラチン、リンパ球マーカー、ＭＡＲＴ−１（Ｍｅｌａｎ−Ａ）、Ｍｙｏ  Ｄ１、筋特異的アクチン（ＭＳＡ）、神経フィラメント、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、胎盤性アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、前立腺特異的抗原、Ｓ１００タンパク質、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、シナプトフィシン、チログロブリン、甲状腺転写因子−１、腫瘍Ｍ２−ＰＫ、ビメンチン、表面抗原分類１０（ＣＤ１０）、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５（ＰＴＰＲＣ）、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、及びそれらのフラグメントからなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記腫瘍特異的抗原及び前記クラスＩＩ主要組織適合性抗原を同じ宿主細胞により共発現させる、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記疾患が感染症である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記組換えポリペプチドが感染因子の配列を更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記医薬組成物が前記感染症から免疫性を誘導する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記感染因子が感染性ウイルスである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ウイルス様粒子は、前記哺乳類動物対象の免疫系の細胞に対して抗原提示を生じる、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記医薬組成物が化学療法剤との併用療法において投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記併用療法が、タキサン（パクリタキセル又はドセタキセル）、アントラサイクリン（ドキソルビシン又はエピルビシン）、シクロホスファミド、カペシタビン、タモキシフェン、レトロゾール、カルボプラチン、ゲムシタビン、シスプラチン、エルロチニブ、イリノテカン、フルオロウラシル及びオキサリプラチンからなる薬剤群から選択される化学療法薬の投与を更に含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記医薬組成物が放射線療法と組み合わせて投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
治療有効量の請求項１７に記載の前記医薬組成物を含む、哺乳類動物対象の疾患の予防又は治療のためのウイルス様粒子の使用。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づき、２０１３年１２月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／９１６，３９４号の利益を主張し、この米国仮特許出願の開示内容はその全体が、引用することにより本明細書の一部をなす。
【０００２】
本明細書に記載の発明は、複製欠陥ウイルス様粒子を用いた、クラスＩＩ主要組織適合性抗原を発現する核酸の哺乳類動物への送達及び転写に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌療法、特に化学療法の主な課題は、小分子を全身に投与すると標的癌細胞に対して特異性を失い、分裂指数の高い全ての細胞に影響を及ぼし、有害な副作用を生じることである。抗体に基づく療法は、標的細胞に対する特異性は改善するが、有効性が低くなることが示されている。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、最も大きなクラスの試薬又は薬剤の１つを構成する。ｍＡｂの現在の世界市場は、３６０億ドルを超える（非特許文献１）。抗体に基づく癌療法の現在の戦略は、癌細胞の外膜に接触可能であり、膜上で発現する一握りの細胞外タンパク質又は受容体のみに限られている（非特許文献２；非特許文献３）。これらのタンパク質又は受容体が接触可能であることから、癌細胞に対する抗体を産生することが可能となった。その例として、リンパ腫を治療する抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるリツキシマブ（リツキサン（米国登録商標）又はマブセラ（米国登録商標））、一部の乳癌を治療する抗Ｈｅｒ２  ｍＡｂであるトラスツズマブ（ハーセプチン（米国登録商標））、及び頭頚部の癌及び結腸直腸癌を治療する抗ＦＧＦ受容体ｍＡｂであるセツキシマブ（エルビツクス（米国登録商標））（非特許文献４）がある。これらは癌細胞を認識し、破壊するのに有効な作用物質であることが証明されている。しかし、癌細胞表面に新たに接触可能な癌マーカーはなく、これにより今後の産生され得るＡｂレパートリーが制限される。
【０００４】
癌療法における細胞内癌抗原として未知に広がる供給源を活用したいという要求は満たされずにいる。このような細胞内癌治療標的の例としては、Ｒａｓ突然変異体、ホスファターゼ、キナーゼ転写因子、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、カルシトニン、カルレチニン、癌胎児性抗原、クロモグラニン、シトケラチン、デスミン、上皮膜タンパク質（ＥＭＡ）、ＶＩＩＩ因子、ＣＤ３１、ＦＬ１、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グロス嚢胞性疾患液タンパク質（ＧＣＤＦＰ−１５）、ＨＭＢ−４５、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インヒビン、ケラチン、リンパ球マーカー、ＭＡＲＴ−１（Ｍｅｌａｎ−Ａ）、Ｍｙｏ  Ｄ１、筋特異的アクチン（ＭＳＡ）、神経フィラメント、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、胎盤性アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、前立腺特異的抗原、ＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）、Ｓ１００タンパク質、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、シナプトフィシン、チログロブリン、甲状腺転写因子−１、腫瘍Ｍ２−ＰＫ、ビメンチン、表面抗原分類１０（ＣＤ１０）、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ９９及びＣＤ１１７が挙げられる。抗体はサイズが大きいことにより細胞内の局所に到達することができないことから、細胞内癌抗原は抗体に接触することなく、そのためこれらの抗原に対する抗体を用いて癌患者を治療することはより困難となる。
【０００５】
１つのアプローチとして、これらの癌抗原を呼び出し、腫瘍細胞表面に提示させ、これらの腫瘍細胞を誘導性抗原提示細胞（ｉＡＰＣ）に変換させ、腫瘍細胞に対する癌ワクチンを産生し、それによりこれらのワクチンに対する抗体を作製させる細胞機構を活性化させる腫瘍細胞を示す。腫瘍細胞は、強力な免疫源となる複数のタンパク質を合成し、これらのタンパク質からプロセッシングしたペプチドが患者の抗腫瘍応答を活性化させることが知られている。トランスフェクションされた腫瘍細胞はＴ（ＣＤ４＋）ヘルパーに対してこれらの抗原を提示し、細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋細胞）を活性化させ、エフェクターＴ細胞及びワクチンを産生する免疫記憶Ｔ細胞を産生し、これが転移、つまり癌による死の主な原因からの保護に極めて重要となる可能性がある。癌療法のこのアプローチの魅力は、癌抗原（複数の場合もあり）の事前の情報を必要としないことである。したがって、このアプローチはいかなる種類の癌に起因するタンパク質又は抗原にも作用し得る。健常な細胞に対する傷害性が最小であるのに加え、腫瘍特異的応答を誘導する可能性があることから、癌ワクチンは癌治療及び予防のための有望なツールである。
【０００６】
マウス（自家）系統のマウスであるＨＬＡ／ＣＤ８０は、生存率が長期であることが認められている（非特許文献５；非特許文献６）。この系統は腫瘍細胞を単離し、腫瘍細胞を増殖させ、これらの遺伝子を含有する組換えレトロウイルスを用いて細胞を改変させ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）、免疫療法を試験するためにこれらの細胞をマウスに再移植させることを必要とする。この手法は厄介で長期にわたり、ｅｘ  ｖｉｖｏの工程時に異物混入しやすい。さらに、報告された結果は、遺伝的及び同系の、免疫学的に同一の系統に基づいたものである。レトロウイルスの使用により、宿主ゲノム内のレトロウイルスの組込みの可能性が潜在的に危険となり得る位置で生じる。
【０００７】
ｅｘ  ｖｉｖｏ手法の欠点を含まず、かつ宿主を傷つけるおそれのあるレトロウイルスの使用を必要としない遺伝子療法を作製する手段の開発が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ledford, 2020, Nature 468:18-19
【非特許文献２】Baker, 2005, Nature Biotech, 23:1065-72
【非特許文献３】Cohen他、 2009, MAbs, 1:56-66
【非特許文献４】Adams, 2005, Nature Biotech, 23:1147-57
【非特許文献５】Armstrong他、 1997, Proc Natl Acad Sci, 94:6886-91
【非特許文献６】Humphreys他、 2004, Cell Mol lmmunol, 1:180-85
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
癌の誘導性免疫療法の新規な方法が記載されている。この免疫療法は、患者の腫瘍細胞内にクラスＩＩ主要組織適合性（ＭＨＣ）抗原を共発現させ、腫瘍抗原に対する免疫応答を刺激することに関する。トランスフェクションされた細胞は、抗原提示細胞として作用する。発見されたのは、トランスフェクションされた腫瘍細胞に発現したＭＨＣ抗原が抗原提示分子として作用することにより腫瘍抗原に関する免疫反応を誘導することである。次いで、腫瘍細胞に関する免疫応答が、宿主の抗原提示細胞により提示される腫瘍抗原の存在により高められる。更に記載のものは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原をコードするＲＮＡと動物に投与することができる腫瘍抗原とを含有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、これは、動物の宿主細胞にこれらの抗原を発現するよう誘導させる。ＶＬＰ介在性ＲＮＡ送達系は、その全体を引用することにより本明細書の一部をなす国際公開第２０１３／１４８３０２号に先述されており、この中で哺乳類動物細胞においてタンパク質を発現させるのに効率的であることが示されている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
哺乳類動物対象における疾患を予防又は治療する方法であって、
ａ．クラスＩＩ主要組織適合性抗原のサブユニットの両方をコードする配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むアルファウイルスレプリコンと、
ｂ．レトロウイルスｇａｇタンパク質と、
ｃ．膜融合性エンベロープタンパク質と、
を含むＶＬＰを含み、
ＶＬＰがアルファウイルス構造タンパク質遺伝子を含有しない、有効量の医薬組成物を、前記予防又は治療を必要とする対象に投与することを含む方法が記載されている。組換えポリペプチドは、共刺激シグナルタンパク質をコードする配列を更に含み得る。共刺激シグナルタンパク質は、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＣＴＬＡ−４からなる群から選択されることが好ましい。共刺激シグナルタンパク質はＣＤ８０を含むことがより好ましい。
【００１１】
本明細書に記載の方法は、腫瘍を有する患者の疾患を予防又は治療することに関し得る。患者は癌患者とすることができ、癌患者は、好ましくは乳房、子宮頸部、前立腺、卵巣、腎腫、肺、胃、膵臓、神経膠芽腫及び大腸に由来する固形腫瘍を有する癌患者からなる群から選択され、最も好ましくは乳癌患者である。したがって組換えポリヌクレオチドは、腫瘍特異的抗原、好ましくはＡＦＰ、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、カルシトニン、カルレチニン、癌胎児性抗原、クロモグラニン、シトケラチン、デスミン、ＥＭＡ、ＶＩＩＩ因子、ＦＬ１、ＧＦＡＰ、ＧＣＤＦＰ−１５、ＨＭＢ−４５、ｈＣＧ、インヒビン、ケラチン、リンパ球マーカー、ＭＡＲＴ−１（Ｍｅｌａｎ−Ａ）、Ｍｙｏ  Ｄ１、ＭＳＡ、神経フィラメント、ＮＳＥ、ＰＬＡＰ、前立腺特異的抗原、Ｓ１００タンパク質、ＳＭＡ、シナプトフィシン、チログロブリン、甲状腺転写因子−１、腫瘍Ｍ２−ＰＫ、ビメンチン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５（ＰＴＰＲＣ）、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、及びそれらのフラグメントからなる群から選択されるポリペプチドをコードする配列を更に含み得る。
【００１２】
本明細書に記載の方法は、感染症を予防又は治療することに関し得る。それに応じて組換えポリペプチドは感染因子の配列を更に含み得る。感染因子は感染性ウイルスであってよい。
【００１３】
本明細書に記載の方法のＶＬＰは、シンドビスウイルス又はベネズエラ馬脳炎ウイルス由来のアルファウイルスレプリコンを含み得る。ＶＬＰの膜融合性エンベロープタンパク質は、糖タンパク質又はその断片若しくはその誘導体を含み得る。膜融合性エンベロープタンパク質は腫瘍細胞に特異的に結合し得る。それに応じて、ＶＬＰは真核細胞に結合することが可能となり得る。真核細胞はヒト細胞であってよい。結合は標的細胞に特異的であってよい。
【００１４】
本明細書に記載の方法は、非経口にて医薬組成物を投与することができる。医薬組成物を静脈内注射により投与することができる。医薬組成物を腫瘍内に注入することにより投与することができる。
【００１５】
本明細書に記載の方法において、医薬組成物を化学療法剤と組み合わせて投与することができる。化学療法剤は、タキサン（パクリタキセル又はドセタキセル）、アントラサイクリン（ドキソルビシン又はエピルビシン）、シクロホスファミド、カペシタビン、タモキシフェン、レトロゾール、カルボプラチン、ゲムシタビン、シスプラチン、エルロチニブ、イリノテカン、フルオロウラシル及びオキサリプラチンからなる薬剤群から選択することができる。医薬組成物は放射線療法と組み合わせて投与してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ベクターの一例を示す概略図である。ベクターのＤＮＡ配列を本明細書に添付の配列表（配列番号１）に挙げる。
【図２】本明細書に記載のＶＬＰを産生し、使用する基本的概念を示す図である。レプリコンプラスミドは、目的のレプリコン及び遺伝子の発現を誘導するＣＭＶプロモーターを含有する。レプリコンはエレメントのＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３及びＮＳＰ４を含有する。目的遺伝子は、２つのクラスＩＩ  ＭＨＣ抗原サブユニット及び疾患特異的抗原をコードする核酸を含有する。構造ベクターは、ＣＭＶプロモーターの制御下においてＲＳＶ由来のＧａｇを含有する。エンベロープベクターは、ＣＭＶプロモーターの制御下においてＶＳＶ−Ｇタンパク質を含有する。これらをプロデューサー宿主細胞にトランスフェクションさせ、これによりＶＬＰを含有するＲＮＡを作製する。ＶＬＰを使用し、標的細胞を感染させることができ、これにより目的遺伝子によりコードされるタンパク質が産生される。
【図３】実施例の特異的構築物を示す図である。これはＨＬＡ−ＤＲ１及びＣＤ８０タンパク質をコードする核酸を含有する、レプリコンプラスミドであるＶＬＰ−ＶＥＥを示す。
【図４】４Ｔ１−Ｌｕｃ２（乳癌）細胞移植後の動物の生存率を示す図である。
【図５】４Ｔ１−Ｌｕｃ２細胞への抗原投与後の免疫付与した動物の生存率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
「１つ（one）」、「１つ（a）」、又は「１つ（an）」という用語を本開示内で使用するとき、これらの用語は他に明記されない限り、「少なくとも１つ」又は「１つ又は複数」を意味する。
【００１８】
本明細書において使用される場合、「膜融合性タンパク質」という用語は、ＶＬＰの細胞膜由来のエンベロープのレシピエント細胞膜への融合を誘導することができるタンパク質を指すことを意味する。
【００１９】
「発現する」及び「産生する」という用語は本明細書において同義的に使用され、遺伝子産物の生合成を指す。これらの用語は遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。これらの用語はまた、１つ又は複数のポリペプチドへのＲＮＡの翻訳を包含し、天然の転写後及び翻訳後改変全てを更に包含する。抗体又はその抗原結合断片の発現又は産生は、細胞の細胞質内又は細胞外の環境、例えば細胞培養の成長培地であってよい。
【００２０】
「ポリヌクレオチド」は同義的に「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」と呼ばれ、未改変のＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は改変されたＲＮＡ若しくはＤＮＡであってよいいずれかのポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」は一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ、一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖のＲＮＡ、並びに一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖若しくはより典型的には二本鎖、又は一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であってよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子を含むが、これらに限定されない。さらに、「ポリヌクレオチド」はＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語はまた、１つ又は複数の改変塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ及び安定性又は他の理由により改変された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡを含む。「改変」塩基は、例えばトリチル化塩基及びイノシン等の固有の塩基を含む。種々の改変を、ＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができ、したがって「ポリヌクレオチド」は通例天然に見られるポリヌクレオチドの化学的に、酵素により、又は代謝により改変された形態、並びにウイルス及び細胞の特徴のあるＤＮＡ及びＲＮＡの化学形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖を包含し、多くの場合オリゴヌクレオチドと呼ばれる。
【００２１】
本明細書において使用される場合、「レプリコン」は、配列の複製を促進するのに必要な遺伝エレメントを有し、同時に翻訳も行うことができるポリヌクレオチドを指す。
【００２２】
本明細書において使用される場合、「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）は、ウイルス粒子に類似する構造体を指す。好ましい実施形態において、ＶＬＰは粒子の表面に提示される少なくとも１種の膜融合性タンパク質を含有する。本発明によるウイルス様粒子は、ウイルスゲノムの複製構成要素の全て又は一部を欠いている。通例、本発明によるウイルス様粒子は、ウイルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝情報を担持しない。
【００２３】
ベクター
アルファウイルスは第４群トガウイルス科のウイルスに属する。アルファウイルスは、一本のポジティブのセンス鎖ＲＮＡのゲノムを有する小さい球状のエンベロープウイルスである。総ゲノム長は１１０００ヌクレオチド〜１２０００ヌクレオチドの範囲となり、５’キャップ及び３’ポリ−Ａ尾部を有する。４つの非構造タンパク質遺伝子（ＮＳＰ遺伝子）がゲノムの５’末端の３分の２にコードされるが、３つの構造タンパク質は、ゲノムの３’末端の３分の１と共直線のサブゲノムｍＲＮＡから翻訳される。
【００２４】
アルファウイルスゲノムには非構造的及び構造的な２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がある。１つ目はＮＳＰ遺伝子を含み、ウイルスＲＮＡの転写及び複製に必要なタンパク質（ｎｓＰ１〜ｎｓＰ４）をコードする。２つ目は３つの構造タンパク質である、ヌクレオカプシドコアタンパク質Ｃ並びにヘテロダイマーとして結び付くエンベロープタンパク質Ｐ６２及びＥ１をコードする。ウイルス膜アンカー表面糖タンパク質は、受容体認識及び膜融合を介した標的細胞への侵入に関与する。
【００２５】
シンドビスウイルス（ＳＩＮ）及びベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）は、ゲノムに１１７０３ヌクレオチドのポジティブｍＲＮＡ鎖を含むアルファウイルスである。ＳＩＮは種々の脊椎動物宿主に感染する。シンドビスウイルスのゲノムは、宿主細胞の細胞質において直接翻訳される非構造タンパク質（ＮＳ、レプリコン）及び構造タンパク質（カプシド及びｐＨ依存性膜融合性エンベロープ）をコードする。アルファウイルスはまた、アウラウイルス、ババンキウイルス、バーマ森林ウイルス、ベバルウイルス、カバソウウイルス、チクングニアウイルス、東部馬脳炎ウイルス、エヴァグレーズウイルス、フォートモーガンウイルス、ゲタウイルス、ハイランドＪウイルス、キジラガチウイルス、マヤロウイルス、Ｍｅ  Ｔｒｉウイルス、ミデルブルフウイルス、モッソダスペドラス（Mosso das Pedras）ウイルス、ムカンボウイルス、ヌドゥムウイルス、オニョンニョンウイルス、ピクスナウイルス、リオネグロウイルス、ロスリバーウイルス、サケ膵臓病ウイルス、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）、ミナミゾウアザラシウイルス、トナテ（Tonate）ウイルス、トロカラウイルス、ウナウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、及びワタロアウイルスを含む。
【００２６】
アルファウイルスの宿主細胞への感染は、最終的にアポトーシスとなる細胞傷害性を生じる。これはほとんどが、大量のアルファウイルスゲノムＲＮＡの発現により宿主細胞における抗ウイルス状態が誘発されることと、アルファウイルス非構造タンパク質（ＳＩＮのＮＳＰ２又はＶＥＥＶのＮＣ）が、宿主細胞上の細胞ｍＲＮＡ合成又は細胞変性効果（ＣＰＥ）を生じる翻訳シャットオフに直接相互作用することとの両方によるものである。非構造タンパク質の１つであるＮＳＰ２における点突然変異（７２６位）を含有する天然のＳＩＮ変異体は、感染細胞から回収したウイルス価が実質的に減少したが、感染細胞内での持続性及び非細胞変性の成長を示していた（Frolov他、1999, J Virol, 73:3845-65）。
【００２７】
アルファウイルスは、遺伝子療法の研究者にとって興味深いものである。ロスリバーウイルス、ＳＩＮ、ＳＦＶ、及びＶＥＥＶは全て遺伝子送達用のベクターの開発に用いられてきた。アルファウイルスエンベロープ糖タンパク質とレトロウイルスカプシドとを組み合わせることにより偽型ウイルスを形成することができる。アルファウイルスエンベロープ糖タンパク質偽型レトロウイルス又はレンチウイルスは、宿主となり得る細胞に担持させる遺伝子を組み込むことができる。偽型アルファウイルスを認識し、アルファウイルスエンベロープタンパク質のＥ２及びＥ１によって感染させる。安定したウイルス遺伝子の組込みに、これらのベクターのレトロウイルス内部が介在する。
【００２８】
標的化の特異性がないことから遺伝子療法の領域においてアルファウイルスの使用は限られている。しかし、Ｅ２の構造体の非保存ループ内の抗体の可変ドメインを導入することにより、特定の細胞集団が標的化されている。さらに、遺伝子療法にアルファウイルス全体を使用することは、いくつかの内部アルファウイルスタンパク質が感染時のアポトーシス誘導に関与するため、また、アルファウイルスのカプシドがｍＲＮＡの宿主細胞への一過性の導入しか介在しないための両方において、有効性が限られたものとなっている。これらの制限はいずれもレトロウイルス又はレンチウイルスのアルファウイルスエンベロープ偽型に及ぶことはない。標的細胞のトランス遺伝子発現のための種々のアルファウイルスに基づく発現ベクターについての記載がある（Xiong他、1989, Science, 243:1188-91及びBredenbeek他、1993, J Virol, 67:6439-46）。安全性の懸念として、これらの発現系は通常２つのプラスミドを含む。第１のプラスミドはウイルスレプリコン（すなわち、非構造タンパク質）をコードする配列と内部プロモーターとトランス遺伝子をコードする領域とを含有し、一方、第２のプラスミドはウイルス構造遺伝子をコードする。これらのプラスミドを使用し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにてｍＲＮＡを作製し、次いでこれを宿主細胞にエレクトロポーレーションし、１回感染のウイルス粒子を作製する。次いでこれらのウイルス粒子を使用して、トランス遺伝子発現用の標的細胞に感染させる。しかし、これらの粒子は、非構造ウイルスエレメントをコードする配列エレメントと構造ウイルスエレメントをコードする配列エレメントとの間の組換えがｉｎ  ｖｉｖｏにて有意な細胞変性作用を介在する能力を有する複製可能なアルファウイルス粒子を生じるおそれがあるため、安全性の懸念がある。
【００２９】
この問題の考えられ得る解決策として、関連のないＶＬＰを使用してアルファウイルスレプリコンを哺乳類動物細胞の細胞質に送達するものがあり、この場合これらのレプリコンはいずれの核も関与することなく自己複製し、目的遺伝子を発現させることができる。これらのＶＬＰを３つのベクターを使用して産生することができる。第１のベクターは、哺乳類動物プロモーター（例えば、ＣＭＶ）、レトロウイルス特異的ＲＮＡパッケージングシグナル、及び目的の遺伝子又はポリヌクレオチドの制御下においてアルファウイルスレプリコンをコードする配列を含む。この遺伝子は治療用途又は研究用途のタンパク質若しくはｓｈＲＮＡ、又は他の制御核酸を発現させることができる。第２のベクターはレトロウイルスＧａｇを含む。第３のベクターは標的細胞の感染に適したエンベロープ糖タンパク質をもたらす。
【００３０】
適切なパッケージング細胞株への共トランスフェクション時に、第１のベクターに存在する細胞プロモーターから転写されたＲＮＡ分子を第２のベクターから産生されたＶＬＰにパッケージングする。これらのＶＬＰはＶＬＰに存在するエンベロープ糖タンパク質に基づき標的細胞にアルファウイルスに基づくレプリコンを送達することができる。一旦細胞内に入ると、宿主の翻訳機構が、導入されたアルファウイルスＲＮＡを翻訳し、アルファウイルス複製タンパク質を産生し、すなわちＲＮＡを増幅させ、目的の遺伝子又はポリヌクレオチドを発現させる。突然変異体レプリコン、例えば上記に記載のものは、宿主細胞への衝撃は最小で、発現期間をかなり延長させることができる。さらに、アルファウイルス構造エレメントの遺伝子をコードするＤＮＡが標的細胞に存在しないため、提唱する系の安全性はかなり強化されている。
【００３１】
本明細書において、ＶＬＰに関連する組成物及び上記のＶＬＰを製造し、使用する方法について説明する。上記の組成物はＶＬＰと、上記のＶＬＰを産生するために使用されるベクター及び細胞とを含む。本明細書に記載の関連の方法は、ＶＬＰを産生する方法、ＶＬＰを使用して細胞を形質導入させる方法、及び本明細書に記載のＶＬＰを用いて標的細胞にて目的のタンパク質又はポリヌクレオチドを産生させる方法に関する。また、ウイルス感染の危険がなく、標的細胞において目的のタンパク質又はポリヌクレオチドを発現させるアルファウイルスに基づくレプリコンについて説明する。
【００３２】
本明細書において、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないアルファウイルスに基づくレプリコンを担持するＶＬＰの産生時に使用するベクターについて説明する。この種のＶＬＰを産生するため、いくつかの構成要素を、これらの構成要素をコードする１つ又は複数のベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製するための細胞株にトランスフェクション又はヌクレオフェクションすることにより作製することができる。いくつかの実施形態において、これらの構成要素を個別のベクターによってコードさせ、得られたＶＬＰが複製可能となる可能性を低減させる。例えば、多重プラスミド系を使用することができるが、この場合１つのプラスミドが遺伝子材料、例えばシンドビスウイルス又はＶＥＥＶ非構造タンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドをコードし、ＶＬＰがパッケージングし、別のプラスミドがＶＬＰの構造タンパク質、例えばｇａｇをコードし、また別のプラスミドが融合タンパク質、例えばＶＳＶ−Ｇをコードし、標的細胞の膜へのＶＬＰの融合を促進させる。
【００３３】
宿主細胞がパッケージングする遺伝子材料をコードするベクターは、選択性又は誘導性プラスミド等の種々の形態を取ることができるが、一般に何らかの共通の特性を有する。例えば、本明細書に記載のＲＮＡアルファウイルスに基づくレプリコンをコードするベクターは、プロモーター配列、レトロウイルスパッケージングシグナル配列、翻訳開始配列、非構造アルファウイルスタンパク質、目的の遺伝子又はポリヌクレオチドを挿入するためのクローニング部位、挿入された目的の遺伝子又はポリヌクレオチド、３’末端の非翻訳領域、及びポリアデノシン尾部セグメントを含むことができる。
【００３４】
いくつかの実施形態において、上記のベクターは、ベクターのセグメントを宿主細胞によって転写させることが可能なプロモーターエレメントを含む。いくつかの実施形態において、ベクター配列をＲＮＡに転写し、ＶＬＰにパッケージングすることができる。上記のベクターのほとんどの実施形態において、プロモーター配列は、ベクター内に含まれる翻訳可能なエレメント全ての上流に配置される（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター「ｐＣＭＶ」の配置を示す図１を参照のこと）。本明細書に記載のいくつかの実施形態において、プロモーター配列は、ウイルス、例えばＣＭＶ、又はシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来である。多くの他のプロモーター配列は、当業者であれば既知であり、本明細書に記載のベクターとの使用は記載の説明に基づき明らかである。
【００３５】
いくつかの実施形態において、宿主細胞がパッケージングする遺伝子材料をコードする上記のベクターはレトロウイルスパッケージングシグナル配列（プサイ（Ψ）エレメントとしても知られる）をコードするポリヌクレオチド配列を含み、ベクターから転写した１つ又は２つのＲＮＡ配列のコピーを宿主細胞内に形成されたＶＬＰ粒子にパッケージングさせることができる。全てではないがほとんどのレトロウイルスはこの種のパッケージング配列を有し、したがってこれらの配列及び上記のベクターへの組込みは、当業者であれば容易に明らかであるだろう。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のベクターは、ラウス肉腫ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ＨＩＶ、ヒトＴリンパ好性ウイルス等由来のレトロウイルスパッケージング配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、レトロウイルスパッケージング配列はラウス肉腫ウイルス由来である。代替法として、レトロウイルスパッケージング配列はマウス白血病ウイルス由来である。
【００３６】
本明細書に記載の宿主細胞がパッケージングする遺伝子材料をコードするベクターの別の態様は翻訳開始配列であり、これはベクターによってコードされたＲＮＡ配列を宿主細胞において翻訳させることができる。いくつかの実施形態において、上記の翻訳開始配列は、アルファウイルスに基づく非構造タンパク質の発現を可能にすることができ、これにより、上記のＶＬＰが一旦宿主細胞に送達されると、このＶＬＰにより担持されたＲＮＡ配列を複製することができる。いくつかの実施形態において、上記の翻訳開始配列は、目的遺伝子の発現を可能にすることができる。いくつかの実施形態において、翻訳開始配列は、目的遺伝子が宿主細胞の翻訳複合体によって翻訳されることを可能にすることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の翻訳開始配列は、アルファウイルス、例えばシンドビスウイルス又はＶＥＥＶ由来であってよい。他の実施形態において、翻訳開始配列は、哺乳類動物の翻訳複合体によってＲＮＡ配列の翻訳を開始することができる翻訳開始配列を有することが知られているウイルス遺伝子等の他の遺伝子由来であってよい。代替法として、翻訳開始配列は他の遺伝子、例えば上記のアルファウイルスレプリコンに挿入された目的遺伝子の天然の翻訳開始配列由来であってよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の翻訳開始配列は、パッケージングされたＲＮＡ分子の２つ以上の位置に配置されることができるため、上記のベクターにより１回又は複数回コードされる場合がある。例えば、上記のシンドビス又はＶＥＥＶ非構造タンパク質をパッケージＲＮＡ分子によってコードされる目的遺伝子から個別に翻訳することが望ましい場合がある。このような例において、非構造タンパク質をコードするポリヌクレオチド（複数の場合もあり）及び目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの両方は、ベクター内及びパッケージングされたＲＮＡ内のそれぞれの位置の５’末端に配置された個別の翻訳開始配列を有する。この記載に基づき、当業者であれば、哺乳類動物細胞のＲＮＡの翻訳を促進することができる種々の翻訳開始配列を本明細書に記載の上記のＶＬＰパッケージングされたＲＮＡに組み込むことができることが理解されるだろう。
【００３７】
宿主細胞がパッケージングする遺伝子材料をコードするベクターはまた、非構造アルファウイルスタンパク質、例えばＳＩＮ又はＶＥＥＶ由来の非構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、上記のベクターは、１つ又は複数のシンドビスウイルス非構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、上記のベクターは、１つ又は複数のＶＥＥＶ非構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、上記のベクターは、ＳＩＮ又はＶＥＥＶ非構造タンパク質であるＮＳＰ１をコードするポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、上記のベクターは、シンドビスウイルス又はＶＥＥＶ非構造タンパク質であるＮＳＰ２をコードするポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、上記のベクターは、ＳＩＮ又はＶＥＥＶ非構造タンパク質であるＮＳＰ３をコードするポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、上記のベクターは、シンドビスウイルス又はＶＥＥＶ非構造タンパク質であるＮＳＰ４をコードするポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、上記のベクターは、ＳＩＮ又はＶＥＥＶ非構造タンパク質であるＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、及びＮＳＰ４をコードするポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする上記のベクターのポリヌクレオチドは、アルファウイルスゲノム、例えばシンドビスウイルス又はＶＥＥＶの対応するゲノム配列由来である。いくつかの実施形態において、構造タンパク質が、存在する非構造タンパク質配列と同じアルファウイルス由来であるか又は異なるアルファウイルス由来であるかに関わらず、アルファウイルス非構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、アルファウイルス構造タンパク質をコードする任意のポリヌクレオチドを含むことはない。
【００３８】
宿主細胞がパッケージングする遺伝子材料を組み込むための本明細書に記載のベクターはまた、ベクターによってコードされる遺伝子材料を担持するＶＬＰにより形質導入される宿主細胞に発現し得る目的ポリヌクレオチドを含有することができる。いくつかの実施形態において、上記のベクターは、ＶＬＰにパッケージングされるＲＮＡポリヌクレオチド配列をコードすることができ、次いでこれを細胞のＶＬＰ介在性形質導入により宿主細胞に送達することができる。一旦ＲＮＡポリヌクレオチド配列が標的細胞に送達されると、ＲＮＡによってコードされる目的ポリヌクレオチドは、目的タンパク質の発現をもたらし得る。それに応じて、本明細書に記載のベクターは、一旦標的細胞内に入ると目的遺伝子を発現させることができるＶＬＰにパッケージングされるＲＮＡをコードするよう設計される。それゆえ、いくつかの実施形態において、上記のベクターは、目的ポリヌクレオチド配列を含む。上記のベクターのいくつかの実施形態において、目的ポリヌクレオチド配列は目的タンパク質をコードすることができる。例えば、いくつかの実施形態において、目的ポリヌクレオチド配列は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードすることができ、標的細胞のウイルス形質導入を検出可能なマーカーとなる。別の実施形態において、目的ポリヌクレオチド配列は、標的細胞に対して内因性のタンパク質の機能的な部分（version）をコードすることができる。別の実施形態において、目的ポリヌクレオチド配列は、標的対象に対して内因性のタンパク質の機能的な部分をコードすることができる。別の実施形態において、目的ポリヌクレオチド配列は、標的細胞に対して異物であるタンパク質をコードすることができる。別の実施形態において、目的ポリヌクレオチド配列は、標的対象に対して異物であるタンパク質をコードすることができる。いくつかの実施形態において、目的ポリヌクレオチド配列は、標的細胞に対して治療効果を有し得るタンパク質をコードすることができる。いくつかの実施形態において、目的ポリヌクレオチド配列は、標的対象に対して治療効果を有し得るタンパク質をコードすることができる。代替の実施形態において、目的ポリヌクレオチド配列は、干渉ＲＮＡ分子として作用し、宿主細胞の内因性遺伝子発現を調節するよう機能することができる。例えば、いくつかの実施形態において、目的ポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ干渉を開始するＲＮＡヘアピンループを形成する配列を含むことができる。さらに、目的ポリヌクレオチドは、パッケージングされたＲＮＡ分子によってコードされたアルファウイルス非構造タンパク質が形成するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ複合体により転写され得るＲＮＡのポジティブ又はネガティブのセンス鎖であってよい。このＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはポジティブセンス及びネガティブセンス方向にＲＮＡを転写することができることから、干渉ＲＮＡ配列、例えばｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを、パッケージングされたＲＮＡレプリコンに挿入することができ、いずれかの方向の干渉ポリヌクレオチドをコードするよう設計することができる。当業者であれば、対象内の選択されたタンパク質の発現を可能にすることができるとして、この上記��形質導入系の態様の治療的特徴について理解されるだろう。この上記のベクターの態様によれば、１つ又は複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を有するクローニング部位もベクターに含まれ、目的ポリヌクレオチド配列の挿入を促進することができる。
【００３９】
本明細書に記載のＶＬＰの産生に有用な別のベクターは、ウイルス構造タンパク質をコードするベクターである。このようなクラスのタンパク質の１つは、レトロウイルス群特異的抗原（ｇａｇ）タンパク質である。ｇａｇタンパク質はレトロウイルスのコア構造タンパク質であり、いくつかの例において、真核細胞において発現することでエンベロープウイルスコアを形成することができる。この特性により、特にＶＬＰの産生に有用なｇａｇタンパク質が作製されるが、これは粒子の基本構造の態様を形成することができ、レトロウイルスパッケージングシグナル配列と関連するＲＮＡのパッケージングを可能にするためである。それに応じて、本明細書においてレトロウイルスｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターについて説明する。いくつかの実施形態において、上記のベクターはレトロウイルスｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びｇａｇ遺伝子配列が宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼによってｍＲＮＡに転写されることを可能にするプロモーターポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、プロモーターポリヌクレオチド配列はウイルス、例えばＳＶ４０又はＣＭＶ由来である。いくつかの実施形態において、ベクターは目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを更に含む。当業者であれば、任意のレトロウイルス由来のｇａｇタンパク質のポリヌクレオチド配列を使用して、本明細書に記載のベクター及びＶＬＰを産生することができることが理解されるだろう。いくつかの実施形態において、ｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ラウス肉腫ウイルス由来であってよい。いくつかの実施形態において、ｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、マウス白血病ウイルス由来であってよい。いくつかの実施形態において、ｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＩＶ由来であってよい。いくつかの実施形態において、ｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ヒトＴリンパ好性ウイルス由来であってよい。
【００４０】
本明細書に記載のＶＬＰの産生に有用な別のベクターは、タンパク質をコードし、ＶＬＰエンベロープと宿主細胞との融合を介在するベクターである。この目的に適した或るクラスのタンパク質は、エンベロープウイルスの膜と宿主細胞の膜とを融合させることにより細胞のウイルス感染を促進するウイルス融合タンパク質である。ウイルス融合タンパク質の多くはまた、選択された細胞型を標的とすることができる既知の細胞受容体タンパク質、又は細胞受容体タンパク質の候補を有し、又はインフルエンザウイルスについてのシアル酸等の更に固有の受容体の場合では、標的をより一般化したものが望まれ得る。いくつかの例において、ウイルス融合タンパク質は、ウイルス接着タンパク質、細胞受容体のリガンド、細胞リガンドの受容体、又はアクセサリータンパク質と組み合わせて作用し、したがってこの種のタンパク質はまた、ウイルス融合タンパク質をコードするベクターに加えて上記のベクターによって、又はウイルス融合タンパク質をコードするベクターによってもコードされ得る。代替法において、いくつかの実施形態において１種のウイルス由来のウイルス融合タンパク質は、ＶＬＰの所望の細胞型への標的化を促進し、又は方向づける、別のウイルスのウイルス接着タンパク質、細胞受容体のリガンド、細胞リガンドの受容体、又はアクセサリータンパク質とともに上記のベクターによってコードすることができる。いくつかの実施形態において、ウイルス融合タンパク質、ウイルス接着タンパク質、細胞受容体のリガンド、細胞リガンドの受容体、又はアクセサリータンパク質はＩ型膜タンパク質であり、これは、細胞表面に存在するとき、タンパク質の細胞外ドメインを細胞外に配向することが可能である。これにより、パッケージング細胞からＶＬＰが出芽後に融合タンパク質を正確に配向することを可能にする。細胞内のこのようなタンパク質の発現は通例、細胞表面がタンパク質で被覆され、そうして細胞膜の任意の部分からのＶＬＰの出芽により細胞膜の表面にいくらかのタンパク質（複数の場合もあり）を含むＶＬＰが得られる。いくつかの実施形態において、上記のベクターは、ウイルス融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び融合タンパク質遺伝子配列を宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼによってｍＲＮＡに翻訳することを可能にするプロモーターポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、プロモーターポリヌクレオチド配列は、ウイルス、例えばＳＶ４０又はＣＭＶ由来である。いくつかの実施形態において、上記のベクターは、ウイルス接着タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び接着タンパク質遺伝子配列を宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼによってｍＲＮＡに翻訳することができるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、プロモーターポリヌクレオチド配列は、ウイルス、例えばＳＶ４０又はＣＭＶ由来である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のベクターは、水疱性口炎ウイルスＧタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のベクターは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のベクターは、インフルエンザノイラミニダーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のベクターは、呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のベクターは、ロタウイルスＶＰ７タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。他のこのような融合タンパク質は、当業者であれば関連のウイルスの所望の向性又は細胞標的に基づき明らかであるだろう。
【００４１】
上記のベクターを発現する細胞
本明細書において、ＶＬＰを産生する上記のベクターを含む細胞を提供する。これらの細胞を使用し、ベクターのポリヌクレオチドを転写又は発現させることにより本明細書に記載のＶＬＰを産生することができる。例えば、目的の遺伝子又はポリヌクレオチド及びパッケージングシグナルを有するアルファウイルスＲＮＡ構築物をコードするポリヌクレオチド配列を有するベクター、レトロウイルスｇａｇタンパク質をコードするベクター、及びウイルス融合タンパク質をコードするベクターを用いてトランスフェクションされた哺乳類動物細胞は、発現したウイルス融合タンパク質を有するＶＬＰを表面上に産生することができ、そのＶＬＰの内部には１つ又は２つのコードされたアルファウイルスＲＮＡ構築物のコピーが収められている。さらに、これらのベクターはどれもアルファウイルス構造タンパク質をコードしないため、感染ウイルスを作製する可能性はアルファウイルス構造タンパク質を含む系に比べ実質的に少ない。
【００４２】
上記の細胞は転写が可能な任意の真核細胞であってよく、（ｇａｇタンパク質及び融合タンパク質の場合等の）必要な場合、上記のベクターのポリヌクレオチドを翻訳することができる。多くの実施形態において、細胞は哺乳類動物細胞である可能性がある。例えば、齧歯類細胞、例えばマウス、ハムスター（ＣＨＯ又はＢＨＫ−２１）、又はラット細胞を使用し、上記のベクターを発現させることができ、イヌ細胞、例えばＭａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞を使用し、上記のベクターを発現させることができ、霊長類細胞、例えばベロ細胞を使用し、上記のベクターを発現させることができ、ヒト細胞、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒト腎臓）、Ｈｅｐ−２細胞（ヒト気道）、Ｃａｃｏ−２（腸）、ＨｅＬａ（上皮）、及び当該技術分野において既知の他のこのような細胞株を使用し、上記のベクターを発現させることができる。いくつかの実施形態において、当該技術分野において既知の標準的なトランスフェクション及び選択法を用いて、上記の細胞をトランスフェクション及び選択し、安定して上記のベクターの１つ又は複数を含むことができる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞株は、アルファウイルスレプリコンをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを含有し、この場合アルファウイルスレプリコンは、目的タンパク質、ｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター、及び異種膜融合性エンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターをコードし、ベクター及び細胞はいずれもアルファウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子を含有しない。いくつかの実施形態において、アルファウイルスレプリコンはシンドビスウイルス又はＶＥＥＶ由来であってよい。いくつかの実施形態において、アルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス又はＶＥＥＶ非構造タンパク質であるＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４、及びレトロウイルスパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチド配列を有し得る。いくつかの実施形態において、レトロウイルスパッケージングシグナルは、ラウス肉腫ウイルス又はマウス白血病ウイルスのいずれかの由来であってよい。いくつかの実施形態において、ｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列はラウス肉腫ウイルス由来である。いくつかの実施形態において、異種膜融合性エンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列はＶＳＶ−Ｇをコードする。
【００４４】
ウイルス様粒子
ベクター及び細胞を用いて産生されるＶＬＰも本明細書において説明する。本明細書に記載のＶＬＰは４つの一般的な特性を有する：アルファウイルスレプリコン及び場合により目的タンパク質をコードする１つ又は２つのＲＮＡ分子を含む；レトロウイルスｇａｇタンパク質、又はいくつかの実施形態においてｇａｇ融合タンパク質を含むウイルスコアを有する；細胞との融合を促進する表面タンパク質を有する；及びアルファウイルス構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有しない。
【００４５】
本明細書に記載のＶＬＰは、本明細書における目的タンパク質を発現するために細胞を形質導入するのに有用である。それに応じて、上記のＶＬＰは、目的タンパク質をコードすることができる１つ又は２つのアルファウイルスに基づくＲＮＡポリヌクレオチドを組み込むことができる。ＲＮＡ配列の翻訳を促進するため、上記のパッケージングされたＲＮＡのいくつかの実施形態は、本明細書に記載の翻訳開始配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＶＬＰに組み込まれたＲＮＡ配列は、ＲＮＡの形成ＶＬＰへの組入れを促進するレトロウイルスパッケージング配列を含む。いくつかの実施形態において、レトロウイルスパッケージング配列は、ラウス肉腫ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、ＳＩＶ、ＨＩＶ、ヒトＴリンパ好性ウイルス等の由来である。特定の実施形態において、レトロウイルスパッケージング配列は、ラウス肉腫ウイルス由来である。代替法として、レトロウイルスパッケージング配列は、マウス白血病ウイルス由来であってよい。さらに、ＶＬＰに含まれるＲＮＡ配列は、非構造アルファウイルスタンパク質をコードすることが可能であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、パッケージングされたＲＮＡは１種又は複数種のシンドビスウイルス又はＶＥＥＶ非構造タンパク質をコードすることができる。いくつかの実施形態において、パッケージングされたＲＮＡは、シンドビスウイルス又はＶＥＥＶ非構造タンパク質であるＮＳＰ１をコードすることができる。いくつかの実施形態において、パッケージングされたＲＮＡはシンドビスウイルス又はＶＥＥＶ非構造タンパク質であるＮＳＰ２をコードすることができる。いくつかの実施形態において、パッケージングされたＲＮＡはシンドビスウイルス又はＶＥＥＶ非構造タンパク質であるＮＳＰ３をコードすることができる。いくつかの実施形態において、パッケージングされたＲＮＡは、シンドビスウイルス又はＶＥＥＶ非構造タンパク質であるＮＳＰ４をコードすることができる。いくつかの実施形態において、パッケージングされたＲＮＡは、シンドビスウイルス又はＶＥＥＶ非構造タンパク質であるＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、及びＮＳＰ４をコードすることができる。パッケージングされたＲＮＡはまた、目的タンパク質のポリヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、目的ポリヌクレオチド配列は、ＧＦＰをコードし、標的細胞のウイルス形質導入を検出可能なマーカーとなることができる。別の実施形態において、目的ポリヌクレオチド配列は、標的細胞に対して内因性のタンパク質の機能的部分をコードすることができる。別の実施形態において、目的ポリヌクレオチド配列は、標的対象に対して内因性のタンパク質の機能的部分をコードすることができる。別の実施形態において、目的ポリヌクレオチド配列は、標的細胞に対して異物であるタンパク質をコードすることができる。別の実施形態において、目的ポリヌクレオチド配列は、標的対象に対して異物であるタンパク質をコードすることができる。いくつかの実施形態において、目的ポリヌクレオチド配列は、標的細胞に対して治療効果を有し得るタンパク質をコードすることができる。いくつかの実施形態において、目的ポリヌクレオチド配列は、標的対象に対して治療効果を有し得るタンパク質をコードすることができる。当業者であれば、細胞又は対象内の選択されたタンパク質の発現を可能にすることができるとして、この上記のＶＬＰの態様の治療的特徴について理解されるだろう。
【００４６】
本明細書に記載のＶＬＰはまた、粒子にウイルスコア構造を与えるウイルスｇａｇタンパク質を含むことができる。ｇａｇタンパク質はレトロウイルスのコア構造タンパク質であり、いくつかの例において、真核細胞において発現することでエンベロープウイルスコアを形成することができる。この特性により、特にＶＬＰの産生に有用なｇａｇタンパク質が作製されるが、これは粒子の基本構造の態様を形成することができ、レトロウイルスパッケージングシグナル配列と関連するＲＮＡのパッケージングを可能にするためである。当業者であれば、任意のレトロウイルス由来のｇａｇタンパク質を使用し、本明細書に記載のベクター及びＶＬＰを産生することができることが理解されるだろう。いくつかの実施形態において、ｇａｇタンパク質はラウス肉腫ウイルス由来であってよい。いくつかの実施形態において、ｇａｇタンパク質はマウス白血病ウイルス由来であってよい。代替の実施形態において、ｇａｇタンパク質はＳＩＶ、ＨＩＶ、ヒトＴリンパ好性ウイルス、又は類似のレトロウイルス由来であってよい。
【００４７】
本明細書に記載のＶＬＰの別の構成要素は、ＶＬＰエンベロープと宿主細胞との融合を介在するタンパク質である。この目的に適した或るクラスのタンパク質は、エンベロープウイルスの膜と宿主細胞の膜とを融合させることにより細胞のウイルス感染を促進するウイルス融合タンパク質である。ウイルス融合タンパク質の多くはまた、選択された細胞型を標的とすることができる既知の細胞受容体タンパク質、又は細胞受容体タンパク質の候補を有し、又はインフルエンザウイルスについてのシアル酸等の更に固有の受容体の場合では、標的をより一般化したものが実現され得る。いくつかの例において、ウイルス融合タンパク質は、ウイルス接着タンパク質、細胞受容体のリガンド、細胞リガンドの受容体、又はアクセサリータンパク質と組み合わせて作用し、したがってこの種のタンパク質はまた、ウイルス融合タンパク質に加えてＶＬＰ表面に存在することができる。代替法において、いくつかの実施形態において上記のＶＬＰは、ＶＬＰの所望の細胞型への標的化を促進し、又は方向づける、或るウイルス由来のウイルス融合タンパク質及び別のウイルスのウイルス接着タンパク質、細胞受容体のリガンド、細胞リガンドの受容体、又はアクセサリータンパク質を有し得る。同様に、選択された種々の細胞型への融合を促進することができるとしてＶＬＰエンベロープに２種以上の融合タンパク質を有するように上記のＶＬＰを産生することができる。いくつかの実施形態において、ＶＬＰ表面タンパク質（複数の場合もあり）はＩ型膜タンパク質であり、これは細胞表面に存在するとき、タンパク質の細胞外ドメインを細胞外に配向することが可能である。これはまた、パッケージング細胞からのＶＬＰの出芽後に融合タンパク質を正確に配向することを可能にする。細胞内のこのようなタンパク質の発現は通例、細胞表面がタンパク質で被覆され、そうして細胞膜の任意の部分からのＶＬＰの出芽により細胞膜の表面にいくらかの融合タンパク質を含むＶＬＰが得られる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＶＬＰは、細胞融合を介在するＶＳＶ−Ｇタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＶＬＰは、細胞融合を介在するインフルエンザヘマグルチニンタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＶＬＰは、細胞融合を促進するインフルエンザノイラミニダーゼタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＶＬＰは呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＶＬＰはロタウイルスＶＰ７タンパク質を含む。他のこのような融合タンパク質は、当業者であれば関連のウイルスの所望の向性又は細胞標的に基づき明らかであるだろう。
【００４８】
本明細書に記載のＶＬＰは、アルファウイルスレプリコンを含むことができ、この場合アルファウイルスレプリコンは、目的ポリヌクレオチドを含み、又は目的タンパク質、レトロウイルスｇａｇタンパク質、及び異種膜融合性エンベロープタンパク質をコードし、ＶＬＰはアルファウイルス構造タンパク質遺伝子を含有しない。いくつかの実施形態において、ＶＬＰのアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス又はＶＥＥＶ由来である。例えば、本明細書に記載のＶＬＰは、シンドビスウイルス又はＶＥＥＶ非構造タンパク質であるＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、及びＮＳＰ４をコードするアルファウイルスレプリコンを有し得る。いくつかの実施形態において、上記のＶＬＰのパッケージングされたＲＮＡに関連したレトロウイルスパッケージングシグナルは、ラウス肉腫ウイルス又はマウス白血病ウイルスのいずれかの由来である。この記載に基づき、当業者であれば上記のＶＬＰをＶＬＰ安定性、ＲＮＡパッケージング、又は細胞導入を促進することができるウイルスの態様に組み込むよう改変することができることが容易に理解されるだろう。このような改変は、本明細書に提供される開示の範囲内であると理解されるものとする。
一実施形態は、クラスＩＩ主要組織適合性抗原のサブユニットの両方をコードする配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むアルファウイルスレプリコンと、レトロウイルスｇａｇタンパク質と、膜融合性エンベロープタンパク質とを含むＶＬＰからなり、ＶＬＰはアルファウイルス構造タンパク質遺伝子を含有しない。
ＶＬＰの組換えポリペプチドは、共刺激シグナルタンパク質をコードする配列を更に含み得る。共刺激シグナルタンパク質は、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＣＴＬＡ−４からなる群から選択されることが好ましい。共刺激シグナルタンパク質はＣＤ８０を含むことが最も好ましい。
【００４９】
上記のＶＬＰを産生する方法
本明細書に記載のＶＬＰを、提示された開示に基づき当業者に明らかな種々の方法において産生することができる。これらの種々の方法に対する共通点は、必要なタンパク質（ｇａｇ及び融合タンパク質）を発現させ、アルファウイルスに基づくＲＮＡレプリコンを産生することができる細胞内に上記ベクターを発現させることである。それに応じて、本明細書に記載のＶＬＰを産生する方法は、アルファウイルスレプリコンをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを用いて真核細胞を共形質転換、トランスフェクション、又はヌクレオフェクションすることを含むことができ、この場合アルファウイルスレプリコンは目的ポリヌクレオチドを含み、又は目的タンパク質、レトロウイルスｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター、及び異種膜融合性エンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターをコードし、各ベクターがコードした産物を産生するのに適した条件下において共形質転換した細胞を培養し、それによりウイルス様粒子を産生する。いくつかの実施形態において、アルファウイルスレプリコンをコードするポリヌクレオチド配列は、シンドビスウイルス又はＶＥＥＶ由来であってよい。いくつかの実施形態において、アルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス又はＶＥＥＶ非構造タンパク質であるＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４、及びレトロウイルスパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチド配列を有し得る。いくつかの実施形態において、レトロウイルスパッケージングシグナルは、ラウス肉腫ウイルス又はマウス白血病ウイルスのいずれかの由来であってよい。いくつかの実施形態において、ｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列はラウス肉腫ウイルス由来である。いくつかの実施形態において、異種膜融合性エンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列はＶＳＶ−Ｇをコードする。
【００５０】
組成物及び投与の方法
本明細書において、少なくとも１つの上記のＶＬＰ及び薬学的に許容される担体を含む組成物について説明する。このような組成物は、例えば外因性タンパク質の発現又は対象と同じ種のものに通常認められるタンパク質の発現の増加を必要とする対象に投与するのに有用である。組成物を、本明細書に記載及び例示のものを含む当該技術分野において既知及び好適な種々の調製物のいずれかとして配合することができる。いくつかの実施形態において、組成物は水性配合物である。水溶液を、水又は好適な生理学的緩衝液にＶＬＰを混合させ、所望の場合、場合により好適な着色剤、風味剤、防腐剤、安定化剤、及び増粘剤等を添加することにより調製することができる。水性懸濁液もＶＬＰを水又は生理学的緩衝液に粘性材料、例えば天然又は合成ガム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び他のよく知られている懸濁剤とともに分散させることにより作製することができる。
【００５１】
組成物を対象への注射用として配合することができる。注射用において、上記の組成物を、水溶液、例えば水又は生理学的に適合した緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理食塩緩衝液において配合することができる。溶液は、１つ又は複数の配合剤、例えば懸濁剤、安定化剤、又は分散剤を含有することができる。注射用配合物はまた、使用前に好適なベヒクル、例えば滅菌水、生理食塩溶液、又はアルコール等を含むことにより使用直前に注射に適した液状形態調製物に変換されるようにした固体形態の調製物として調製することができる。本明細書に記載の方法は非経口にて医薬組成物を投与することができる。医薬組成物を静脈内注射により投与することができる。医薬組成物を注射により組織、好ましくは腫瘍又は癌内に投与することができる。
【００５２】
組成物を対象にエアロゾル状態で送達するために配合することができる。エアロゾル送達において、上記の組成物を水溶液、例えば水又は生理学的に適合した緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理学的食塩緩衝液において配合することができる。溶液は、１つ又は複数の配合剤、例えば懸濁剤、安定化剤、又は分散剤を含有することができる。
【００５３】
組成物を徐放型ベヒクル又はデポー調製物において配合することができる。このような長期作用型配合物を移植（例えば、皮下又は筋肉内）により、又は筋肉注射により投与することができる。したがって、例えば組成物を、好適なポリマー材料若しくは疎水性材料（例えば、許容される油に含まれる乳濁液）若しくはイオン交換樹脂とともに、又は難溶性誘導体、例えば難溶性の塩として配合することができる。リポソーム及び乳濁液は、疎水性薬剤用の担体としての使用に適した送達ベヒクルのよく知られた例である。
【００５４】
治療様式
本明細書に記載の方法は、腫瘍患者の疾患の予防又は治療に関し得る。患者は癌患者とすることができ、癌患者は、好ましくは乳房、子宮頸部、前立腺、卵巣、腎腫、肺、胃、膵臓、神経膠芽腫及び大腸に由来する固形腫瘍を有する癌患者の群から選択され、最も好ましくは乳癌患者である。したがって組換えポリヌクレオチドは、腫瘍特異的抗原、好ましくはアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、カルシトニン、カルレチニン、癌胎児性抗原、クロモグラニン、シトケラチン、デスミン、上皮膜タンパク質（ＥＭＡ）、ＶＩＩＩ因子、ＦＬ１、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グロス嚢胞性疾患液タンパク質（ＧＣＤＦＰ−１５）、ＨＭＢ−４５、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インヒビン、ケラチン、リンパ球マーカー、ＭＡＲＴ−１（Ｍｅｌａｎ−Ａ）、Ｍｙｏ  Ｄ１、筋特異的アクチン（ＭＳＡ）、神経フィラメント、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、胎盤性アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、前立腺特異的抗原、Ｓ１００タンパク質、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、シナプトフィシン、チログロブリン、甲状腺転写因子−１、腫瘍Ｍ２−ＰＫ、ビメンチン、表面抗原分類１０（ＣＤ１０）、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５（ＰＴＰＲＣ）、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、及びそれらのフラグメントからなる群から選択されるポリペプチドをコードする配列を更に含み得る。
【００５５】
本明細書に記載の方法は、非経口にて医薬組成物を投与することができる。医薬組成物を静脈内注射により投与することができる。医薬組成物を注射により腫瘍内に投与することができる。
【００５６】
本明細書に記載の方法において、医薬組成物を化学療法剤と組み合わせて投与することができる。化学療法剤は、タキサン（パクリタキセル又はドセタキセル）、アントラサイクリン（ドキソルビシン又はエピルビシン）、シクロホスファミド、カペシタビン、タモキシフェン、レトロゾール、カルボプラチン、ゲムシタビン、シスプラチン、エルロチニブ、イリノテカン、フルオロウラシル及びオキサリプラチンからなる薬剤群から選択され得る。医薬組成物を放射線療法と併せて投与することができる。
【００５７】
本明細書に記載の方法において、医薬組成物は、腫瘍特異的ＣＤ８＋細胞溶解性Ｔ細胞を誘導する。本方法は更に、腫瘍特異的免疫性を誘導するクラスＩＩ  ＭＨＣ抗原を含むＶＬＰを含む医薬組成物に関する。
【００５８】
本明細書に記載の方法は、感染症の予防又は治療に関し得る。それに応じて、組換えポリペプチドは、感染因子の配列を更に含むことができる。感染因子は感染性ウイルスであってよい。
【実施例】
【００５９】
以下の実施例は図示目的であり、先述の開示を限定するものではなく深めることを意味する。
【００６０】
実施例１−アルファウイルスに基づく遺伝子発現系の産生
アルファウイルス遺伝子発現系は、細胞変性のウイルス感染を生じる危険の少ない、外因性の目的遺伝子（ＧＯＩ）又は目的タンパク質（ＰＯＩ）の標的細胞へのＶＬＰ介在性送達を可能にするよう設計された。発現系は、パッケージング細胞株において発現し、形質導入ＶＬＰを産生することができる３つのベクターを用いて設計された。そのベクターの１つはアルファウイルスに基づく発現構築物をコードし、もう１つのベクターはＶＬＰ形成を促進するレトロウイルスｇａｇタンパク質をコードし、３つ目のベクターは宿主細胞へのＶＬＰ融合を介在する融合タンパク質をコードする。さらに、この系は、存在しているアルファウイルス構造タンパク質を必要とすることなく作用するよう構築された。
【００６１】
これを実現するため、目的遺伝子（ＧＯＩ）の発現を誘導するよう、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）と、次に各レトロウイルスパッケージングタンパク質ＧＡＧのレトロウイルスパッケージングシグナルと、次に非構造タンパク質であるＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、及びＮＳＰ４をコードするシンドビス又はＶＥＥウイルス遺伝子と、最後に組換えポリヌクレオチドからなり、多重クローニング部位に挿入された、１つ又は複数のサブゲノムプロモーター（ＳＧＰ；ウイルスをコードするＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター、ｍＲＮＡの形成を生じる）と、３’末端の非翻訳領域（ＵＲＴ）と、ポリＡ尾部とを有するアルファウイルスに基づくＤＮＡプラスミドを産生した（図１）。
【００６２】
別のプラスミドをレトロウイルスｇａｇタンパク質及び第２の任意の目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードするよう構築した。第３のプラスミドをＶＳＶ−Ｇウイルス融合タンパク質の発現をもたらすよう構築した。
【００６３】
一旦構築されると、プラスミドの、目的遺伝子を有するシンドビスウイルスレプリコンを担持するＶＬＰを産生する能力について試験した。これらの実験において、遺伝子の送達及び細胞内発現の検出を促進するため、ＧＦＰを目的遺伝子として使用した。ＶＬＰを産生するため、上記に記載の３つのプラスミドのそれぞれを製造業者（Lonza）の説明書に従いＡｍａｘａシステムを用いて標準的なヌクレオフェクション手法を使用して、新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ−２１）細胞にトランスフェクションした。
【００６４】
つまり、３×１０６個のＢＨＫ−２１細胞を１００μｌのヌクレオフェクション溶液Ｌ（Ａｍａｘａ）に再懸濁させ、４．５μｇのＧＡＧをコードするプラスミド、３μｇのＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質をコードするプラスミド、及び１００ナノグラムのシンドビスアルファウイルスレプリコンをコードするプラスミド又は２．５マイクログラムのＶＥＥレプリコン（総容量１０μｌ）の入ったチューブに移した。細胞及びプラスミドの混合物をヌクレオフェクションキュベットに移し、ＢＨＫ−２１用の設定を用いてＡｍａｘａ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ型装置を使用してヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクションした細胞を５００μｌの完全培養培地に再懸濁させ、培養培地溶液の入った組織培養プレートに移し、３７℃にて７２時間〜９６時間又は３２℃にて７２時間インキュベーションした。その後、ＶＬＰ及び封入アルファウイルスレプリコンからなる上清を、４℃、３０００ＰＲＭ／１０分間の遠心分離により清澄化し、０．４５ｕｍフィルターにより濾過し、１０単位のＤＮＡｓｅＩ（ｔｕｒｂｏ（商標）−ＤＮＡｓｅ：Ambion）下に室温にて３０分間置いた。プロセッシングしたＶＬＰを４℃にて保存し、又はドライアイス上で凍結させ、−８０℃に移した。ネガティブコントロール（融合欠損ＶＬＰ）として、ＢＨＫ−２１細胞をｐＣＭＶ−Ｓｉｎ  Ｒｅｐ−ＰＯＩ−２プラスミド又はＶＥＥＶ−Ｒｅｐ−ＰＯＩプラスミド及びｐＧＡＧ−ＰＯＩ−１プラスミドのみを用いたが、ＶＳＶ−Ｇをコードするｐエンベローププラスミドは用いずにヌクレオフェクションした。トランスフェクション後、細胞を正常な成長条件下において組織培養培地に４８時間〜７２時間インキュベーションし、プラスミド誘導によってＶＬＰを産生させた。一旦トランスフェクションされると、細胞のインキュベーションを終了し、いくらか産生したＶＬＰを含有するはずの組織培養上清を回収した。次いで、回収した細胞上清を培養したＢＨＫ−２１細胞に添加し、細胞へのＧＦＰの形質導入が成功したかどうかを決定した。３つ全てのプラスミドを用いてトランスフェクションされたＢＨＫ−２１細胞から回収された細胞上清は、トランスフェクションされていないＢＨＫ−２１細胞下に置いたとき、堅固なＧＦＰ発現を生じていた。反対に、ｐＣＭＶ−Ｓｉｎ  Ｒｅｐ−ＰＯＩ−２プラスミド及びｐＧＡＧ−ＰＯＩ−１プラスミドのみを用いてトランスフェクションしたＢＨＫ−２１細胞から回収された細胞上清とインキュベーションしたトランスフェクションしていないＢＨＫ−２１においては、ＧＦＰ発現は観察されなかった。同様の実験もヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞を用いて行われ、構築したＶＬＰがヒト細胞に形質導入され得ることを示した。さらに、構築されたＶＬＰも、細胞を形質導入する能力を失うことなく、４℃にて少なくとも３０日間保存することができた。
【００６５】
ＶＥＥＶに基づくアルファウイルスレプリコンの、細胞内にタンパク質を発現する能力を評価する実験も行われた。これらの試験において、ＢＨＫ−２１細胞をＶＥＥＶレプリコンに挿入されたガウシアルシフェラーゼ遺伝子を有するＶＬＰを用いて形質導入させた。形質導入後、細胞上清のルシフェラーゼタンパク質の発現をモニタリングした。外因性遺伝子を含まず、又はＧＦＰをコードする遺伝子を含む対照ＶＥＥＶレプリコンに対して、ガウシアルシフェラーゼ遺伝子を有するＶＥＥＶレプリコンを用いて形質導入させた細胞の上清に多量のルシフェラーゼを検出した。さらにルシフェラーゼタンパク質の発現は、形質導入後急速に増大した。ｃｒｅリコンビナーゼ（赤血球）の非存在下においてＧＦＰを発現するよう操作された細胞に、機能的ｃｒｅリコンビナーゼを送達する点においても同様の結果が得られた。
【００６６】
細胞に、ＧＦＰをコードするシンドビスに基づくＶＬＰ又はＧＦＰをコードするＶＥＥＶに基づくＶＬＰのいずれかを用いて並行して形質導入した。アルファウイルスに基づくＶＬＰはともに堅固なＧＦＰ発現を生じたが、ＶＥＥＶに基づくＶＬＰで形質導入した細胞は発現レベルがより高いことが観察された。
【００６７】
実施例２−ＶＥＥ  ＶＬＰを用いて形質導入された標的細胞内における多数のタンパク質の発現
ＶＬＰを用いたＲＮＡ送達の基本概念を図２に示す。本実験において、乳癌モデルを使用した。ＨＬＡ−ＤＲ１及びＣＤ８０を発現する、レプリコンの二重のプロモーターベクターを開発した（図３）。これらの２つの抗原をコードするＶＬＰを使用し、４Ｔ１−Ｌｕｃ２乳癌細胞を感染させた。抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体及びＣＤ８０抗体に基づく結果として、この細胞において両方のタンパク質が実際に発現することが示された。ＨＬＡ−ＤＲ１及びＣＤ８０は、図２のＶＬＰ−ＶＥＥレプリコンを含むＶＬＰを用いてトランスフェクションされた４Ｔ１−Ｌｕｃ２細胞において発現した。ＨＬＡ−ＤＲ１発現細胞をＦＩＴＣ標識した、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体により同定した。ＣＤ８０発現細胞をＰＥ標識した、抗ＣＤ８０抗体により同定した。
【００６８】
アルファウイルスレプリコンが同じ細胞内にて２つの個別のタンパク質を発現することができるかを評価するため、実験は、或るサブゲノムプロモーターの制御下においてＨＬＡ−ＤＲ１及び別のサブゲノムプロモーター下においてＣＤ８０を有するＶＥＥレプリコンを用いて行われた。上記のＶＥＥレプリコンを有するＶＬＰの産生後、細胞を形質導入し、両方のタンパク質の発現を試験した。図４に示されるように、形質導入された細胞は、両方のタンパク質（免疫標識されたＨＬＡ−ＤＲ１を緑色で示し（ＦＩＴＣ）、ＣＤ８０を赤で示す（フィコエリトリン））を発現することができた。
【００６９】
実施例３−ＶＥＥ  ＶＬＰを用いて形質導入された標的細胞内における多数のタンパク質の発現
マウス動物系におけるＶＬＰを試験するため、攻撃性が高い、転移性の乳癌細胞である４Ｔ１−Ｌｕｃ２細胞を１０匹のマウスの乳房脂肪体に移植した。数日以内に腫瘍が目視可能となり、１週間以内に明らかに及び触診可能（５ｍｍ〜７ｍｍ）になった。３匹のマウスに不活性タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＶＬＰを腫瘍内に注射し、２匹のマウスにヒトＨＬＡ−ＤＲ１／ＣＤ８０（異種）を発現するＶＬＰを注射し、５匹のマウスは対照として注射しないままとした。
【００７０】
１週間後、腫瘍を全てのマウスから外科手術により取り出し、腫瘍の再増殖及び転移を数週間にわたり追跡した。結果（図５）は、５匹の非注射マウス（非処置対照）のうち４匹は、肺、乳房、及び肝臓における癌の再増殖及び転移により４週間〜６週間以内に死亡した。ＶＬＰ／ＧＦＰ（非特異的タンパク質対照）を注射したマウス３匹全ても、肺、乳房、及び肝臓における癌の再増殖及び転移により４週間〜６週間以内に死亡した。しかし、ＶＬＰ／ＨＬＡ−ＤＲ１／ＣＤ８０を処置したマウスはともに腫瘍の発達の兆候がなく２５週間を超えて生存していた。
【００７１】
腫瘍細胞に対してマウスの免疫力が実際に発達したことを示すため、先の実験で生存していたマウスに４Ｔ１−Ｌｕｃ２細胞を再度抗原投与した。４匹の新たな対照マウスも含まれた。抗原投与実験において、全てのマウスに１００００個の４Ｔ１−Ｌｕｃ２細胞を静脈内注射し、腫瘍の成長及び進行をモニタリングした。マウスの免疫が発生していた場合、生存したマウスの腫瘍は発達せず、転移は認められないと思われる。免疫力がない場合、マウスは転移性癌に屈して死亡すると思われる。４匹の対照動物は、４Ｔ１−Ｌｕｃ２細胞を静脈内注射して２週間以内に転移性癌に屈して死亡したが、ＶＬＰ治療剤で処置した動物は、抗原投与後４週間を超えて生存した（図５）。これは、ＨＬＡ／ＣＤ８０で処置した動物は腫瘍細胞に対して免疫力を獲得したことを示す。
【００７２】
上記の種々の特性及びプロセスをそれぞれ個々に使用することができ、又は種々の方法において組み合わせることができる。全ての考えられ得る組合せ及び部分的な組合せは、本開示の範囲内であることが意図される。さらに、いくつかの方法又はプロセスの区分を一部の実施態様では省略することができる。本明細書に記載の方法及びプロセスは、任意の特定の順を制限するものではなく、それに関連する区分又は状態は、適切である他の順において行うことができる。例えば、記載の区分若しくは状態を特に開示される以外の順で行うことができ、又は、複数の区分若しくは状態を単一の区分若しくは状態において組み合わせることができる。実施例の区分又は状態を連続して、並行して、又は何らかの他の方法において行うことができる。区分又は状態を開示の例示的な実施形態に追加し、又はこれらの実施形態から除去することができる。本明細書に記載の実施例の系及び構成要素を、記載と異なって構成することができる。例えばエレメントを開示の例示的な実施形態に追加し、これらの実施形態から除去し、又はこれらの実施形態と比べて再配列することができる。
【００７３】
特に、「できる」、「できた」、「してもよい」、「し得る」、「例えば」等のような、本明細書において用いられる条件語句は、特に別様に記載のない限り、又は用いられる文脈内で別様に理解されない限り、一般に、いくつかの実施形態が、他の実施形態は含まないが、いくつかの特徴、要素、及び／又は工程を含むことを伝えることを意図される。したがって、そのような条件語句は一般に、特徴、要素、及び／又は工程が、１つ若しくは複数の実施形態で任意の方法で必要とされること、又は、１つ若しくは複数の実施形態が、作者の入力若しくはプロンプトあり若しくはなしで、これらの特徴、要素、及び／又は工程が含まれるか否か、若しくは任意の特定の実施形態で実行すべきか否かを決定する論理を必然的に含むことを暗に示すことを意図されない。「含む（comprising）」、「含む（including）」、「有する（having）」等の用語は同義であり、オープンエンドの様式において包括的に使用され、追加の要素、特性、作用、操作等が除外される。また、「又は」という用語をその包括的な文において使用し（その排他的な意味において使用せず）、そうして例えば一覧の要素をつなげて使用するとき、「又は」という用語は、一覧の要素の１つ、いくつか、又は全てを意味する。
【００７４】
いくつかの例示的な実施形態を記載したが、これらの実施形態は例として提示されているに過ぎず、本明細書に開示の発明の範囲を制限することを意図しない。したがって、上記の説明における全てが任意の特定の特性、特徴、工程、モジュール、又は区分が必要又は不可欠であることを意味することを意図するものではない。実際に、本明細書に記載の新規の方法及び系を種々の他の形態において具現化することができ、さらに、本明細書に記載の方法及び系の形態の種々の省略、置換、及び変更は本明細書に開示の発明の趣旨から逸脱することなく行われ得る。添付の特許請求の範囲及びその等価物は、本明細書に開示の発明のうちのいくつかの範囲及び趣旨内にある形態又は変更を包含することを意図する。
【００７５】
【表１】
2020072720.tif 000003
【００７６】
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【００７７】
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【００７８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2020072720000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月7日(2020.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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2020072720000003.pdf
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