(57)【要約】      （修正有）【課題】ＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患の処置のための蛋白質キナーゼ阻害剤の使用の提供。【解決手段】膀胱炎を処置するための薬剤組成物を調製するための、共有結合によって連結された、少なくとも１つの第１のドメインおよび少なくとも１つの第２のドメインを含むキメラペプチドの使用であって、該第１のドメインが、輸送配列を含み、該第２のドメインが、１５０個未満のアミノ酸の長さを含むＪＮＫ阻害剤配列を含み、該キメラペプチドが、配列番号１１に記載の全Ｄアミノ酸配列を含む使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を処置するための薬剤組成物を調製するための、１５０個未満のアミノ酸の長さを含むＪＮＫ阻害剤配列の使用であって、被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する該疾患または障害が、以下の群の炎症性疾患または非炎症性疾患：
（ａ）加齢黄斑変性（ＡＭＤ：ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、特に、加齢黄斑変性の滲出型および萎縮型、ならびに白内障、
（ｂ）特に、ぶどう膜炎、強膜炎、角膜手術、結膜炎、非感染性角膜炎、虹彩炎、脈絡網膜炎症、眼の網膜を損傷する炎症性疾患（網膜症）、特に、糖尿病性網膜症、動脈性高血圧症誘発性高血圧性網膜症、放射線誘発性網膜症、太陽光誘発性日光網膜症、外傷誘発性網膜症、例えば、プルチェル網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、および過粘稠度関連網膜症から選択される、眼の炎症性疾患、
（ｃ）アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、抗リン脂質症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性多内分泌症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、バロー同心円性硬化症、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症疾患、補体成分２欠損関連疾患、クッシング症候群、デゴス病、有痛脂肪症、好酸球性肺炎、後天性表皮水疱症、新生児の溶血性疾患、寒冷グロブリン血症、エバンス症候群、進行性骨化性線維異形成症、消化器性類天疱瘡、グッドパスチャー症候群、橋本脳症、妊娠性類天疱瘡、ヒューズ−ストーヴィン症候群、低ガンマグロブリン血症、ランバート−イートン筋無力症症候群、硬化性苔癬、限局性強皮症、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋緊張病、オプソクローヌスミオクローヌス症候群、傍腫瘍性小脳変性、発作性夜間血色素尿症、パリー−ロンベルク症候群、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、壊疽性膿皮症、赤芽球ろう、レイノー現象、むずむず脚症候群、後腹膜線維症、２型自己免疫性多内分泌症候群、スティッフパーソン症候群、スザック症候群、熱性好中球性皮膚病、シドナム舞踏病、血小板減少症、および白斑、
（ｄ）関節炎、特に、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎および関節リウマチ、ならびに関節症、ならびに骨関節炎、
（ｅ）特に、乾癬、湿疹、皮膚炎、座瘡、口腔内潰瘍、紅斑、扁平苔癬、サルコイドーシス、血管炎、成年性線状ＩｇＡ疾患から選択される、皮膚疾患、
（ｆ）タウオパシー、アミロイドーシス、およびプリオン病、
（ｇ）ポリープ、
（ｈ）口腔または顎骨の炎症性疾患、特に、歯髄炎、インプラント周囲炎、歯周炎、歯肉炎、口内炎、粘膜炎、剥離性障害、顎関節障害、
（ｉ）骨壊死、
（ｊ）脳脊髄炎、特に、急性播種性脳脊髄炎、脊椎炎、特に、強直性脊椎炎、抗シンセターゼ症候群、皮膚炎、特に、アトピー性皮膚炎または接触性皮膚炎、肝炎、特に、自己免疫性肝炎、自己免疫性末梢神経障害、膵炎、特に、自己免疫性膵炎、ベーチェット病、ビッカースタッフ型脳炎、ブラウ症候群、セリアック病、シャーガス病、多発性神経障害、特に、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、骨髄炎、特に、慢性再発性多巣性骨髄炎、チャーグ−ストラウス症候群、コーガン症候群、巨細胞性動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、血管炎、特に、皮膚小血管性血管炎および蕁麻疹様血管炎、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、全身性強皮症、ドレスラー症候群、薬物誘発性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、腱付着部炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、結節性紅斑、特発性肺線維症、胃炎、グレーブス病、ギラン−バレー症候群、橋本甲状腺炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、汗腺膿瘍、特発性炎症性脱髄性疾患、筋炎、特に、封入体筋炎、膀胱炎、特に、間質性膀胱炎、川崎病、扁平苔癬、ルポイド肝炎、マジード症候群、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織疾患、脊髄炎、特に、視神経脊髄炎、甲状腺炎、特に、オルド甲状腺炎、リウマチ、特に、回帰性リウマチ、パーソネージ−ターナー症候群、尋常性天疱瘡、静脈周囲性脳脊髄炎、結節性多発動脈炎、多発筋痛症、特に、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、肝硬変、特に、原発性胆汁性肝硬変、胆管炎、特に、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、ラスムッセン脳炎、再発性多発性軟骨炎、関節炎、特に、反応性関節炎（ライター病）および関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、シュニッツラー症候群、血清病、脊椎関節症、高安動脈炎、トロサ−ハント症候群、横断性脊髄炎、およびウェゲナー肉芽腫症、
（ｋ）特に、肺線維症、心臓線維症、肝臓線維症、骨髄線維症、縦隔線維症、後腹膜線維症、皮膚線維症、腸線維症、関節線維症、および肩線維症から選択される、線維性疾患および／または線維性障害、
（ｌ）特に、糸球体腎炎一般、特に、膜性増殖性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、急性進行性糸球体腎炎、腎症一般、特に、膜性腎症または糖尿病性腎症、腎炎一般、特に、ループス腎炎、腎盂腎炎、間質性腎炎、尿細管間質性腎炎、慢性腎炎または急性腎炎、および微小変化群、ならびに巣状分節状糸球体硬化症から選択される、腎疾患および／または腎障害、
（ｍ）交感性眼炎、
（ｎ）皮膚、腎臓、心臓、肺、膵臓、肝臓、血液細胞、骨髄、角膜、偶発的に切断された四肢、特に、指、手、足、顔面、鼻梁、骨、心弁、血管、または腸の移植片拒絶反応、
（ｏ）大脳皮質基底核変性症、進行性核上麻痺、統合失調症、遺伝性クロイツフェルト−ヤコブ病、運動ニューロン病、脊髄小脳性運動失調／脊髄小脳萎縮、認知症、特に、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、遺伝性痙性対麻痺、フリードライヒ運動失調症、シャルコー−マリー−トゥース病、および
（ｐ）特に、炭水化物代謝の代謝性障害、例えば、糖原病、アミノ酸代謝障害、例えば、フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症、グルタル酸血症１型、尿素サイクル障害または尿素サイクル欠損症、例えば、カルバモイルリン酸シンセターゼＩ欠損症、有機酸代謝障害（有機酸尿症）、例えば、アルカプトン尿症、脂肪酸酸化障害およびミトコンドリア代謝障害、例えば、中鎖アシル−コエンザイムＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＭＣＡＤＤと略記されることが多い）、ポルフィリン代謝障害、例えば、急性間欠性ポルフィリン症、プリン代謝障害またはピリミジン代謝障害、例えば、レッシュ−ナイハン症候群、ステロイド代謝障害、例えば、先天性リポイド副腎過形成、または先天性副腎過形成、ミトコンドリア機能障害、例えば、カーンズ−セイヤー症候群、ペルオキシソーム機能障害、例えば、ツェルウェーガー症候群、またはリソソーム蓄積症、例えば、ゴーシェ病またはニーマン−ピック病の群から選択される遺伝性または非遺伝性の代謝性疾患、
から選択される使用。
【請求項２】
前記障害／疾患が、ＡＭＤまたは白内障である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記障害／疾患が、網膜症、特に、糖尿病性網膜症である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記疾患／障害が、乾癬である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記障害／疾患が、移植片拒絶または移植拒絶反応、特に、腎臓移植、膵臓移植、皮膚移植、または心臓移植における移植片拒絶である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記疾患／障害が、糸球体腎炎である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項７】
組織移植片または臓器移植片の移植の前に該組織移植片または臓器移植片を処置するための、１５０個未満のアミノ酸の長さを含むＪＮＫ阻害剤配列の使用。
【請求項８】
前記移植片が、腎臓、心臓、肺、膵臓、肝臓、血液細胞、骨髄、角膜、偶発的に切断された四肢、特に、指、手、足、顔面、鼻梁、骨、心弁、血管、または腸の移植片である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記ＪＮＫ阻害剤配列が、５〜１５０個の範囲のアミノ酸残基、より好ましくは、１０〜１００個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは、１０〜７５個のアミノ酸残基、および最も好ましくは、１０〜５０個の範囲のアミノ酸残基を含む、請求項１から８のいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤配列の使用。
【請求項１０】
前記ＪＮＫ阻害剤配列が、ｃ−ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）に結合する、請求項１から９のいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤配列の使用。
【請求項１１】
前記ＪＮＫ阻害剤配列がＪＮＫを発現させる細胞内に存在する場合に、該配列が、ＪＮＫに標的化される少なくとも１つの転写因子の活性化を阻害する、請求項１から１０のいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤配列の使用。
【請求項１２】
前記ＪＮＫに標的化される転写因子が、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋ１からなる群から選択される、請求項１から１１のいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤配列の使用。
【請求項１３】
前記ＪＮＫ阻害剤配列は、該ペプチドがＪＮＫを発現させる細胞内に存在する場合に、ＪＮＫ効果を変化させる、請求項１から１２のいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤配列の使用。
【請求項１４】
前記ＪＮＫ阻害剤配列が、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または、これらの組み合わせから構成されており、少なくとも１またはさらには２個、好ましくは少なくとも３、４、または５個、より好ましくは少なくとも６、７、８、または９個、およびさらにより好ましくは、少なくとも１０個またはそれ超の、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸を含むことが好ましく、該Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸が、該ＪＮＫ阻害剤配列において、ブロック状、非ブロック状、または交互になった様式に、配置されていてよい、請求項１から１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
前記ＪＮＫ阻害剤配列が、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、または配列番号１０５に記載の配列のいずれかにより規定またはコードされるとおりの、ヒトＩＢ１配列またはラットＩＢ１配列の断片、改変体、またはこのような断片の改変体を含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
前記ＪＮＫ阻害剤配列が、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の少なくとも１つのアミノ酸配列、またはそれらの断片、誘導体、もしくは改変体を含むか、または、これから構成される、請求項１から１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
共有結合によって連結された、少なくとも１つの第１のドメインおよび少なくとも１つの第２のドメインを含むキメラペプチドの使用であって、該第１のドメインが、輸送配列を含み、該第２のドメインが、被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を処置するための薬剤組成物を調製するための、請求項１から１６のいずれかに規定されるＪＮＫ阻害剤配列を含み、被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する該疾患または障害が、請求項１から８のいずれかにおいて規定される、キメラペプチドの使用。
【請求項１８】
前記キメラペプチドが、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または、これらの組み合わせから構成されており、少なくとも１またはさらには２個、好ましくは少なくとも３、４、または５個、より好ましくは少なくとも６、７、８、または９個、およびさらにより好ましくは、少なくとも１０個またはそれ超の、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸を含むことが好ましく、該Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸が、該キメラペプチドにおいて、ブロック状、非ブロック状、または交互になった様式に、配置されていてよい、請求項１４に記載のキメラペプチドの使用。
【請求項１９】
前記輸送配列が、ヒト免疫不全ウイルスＴＡＴポリペプチドのアミノ酸配列を含む、請求項１７または１８のいずれかに記載のキメラペプチドの使用。
【請求項２０】
前記輸送配列が、配列番号５、６、７、８、２１、または２２のアミノ酸配列から構成されるかこれらを含む、請求項１７から１９のいずれかに記載のキメラペプチドの使用。
【請求項２１】
前記輸送配列が、前記ペプチドの細胞内への取り込みを増進させる、請求項１７から２０のいずれかに記載のキメラペプチドの使用。
【請求項２２】
前記輸送配列が、前記ペプチドを核局在化に向ける、請求項１７から２１のいずれかに記載のキメラペプチドの使用。
【請求項２３】
前記キメラペプチドが、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかのアミノ酸配列、またはそれらの断片もしくは改変体から構成されるかこれらを含む、請求項１７から２２のいずれかに記載のキメラペプチドの使用。
【請求項２４】
前記キメラペプチドが、配列番号９または１１のアミノ酸配列から構成されるかこれらを含む、請求項１７から２３のいずれかに記載のキメラペプチドの使用。
【請求項２５】
請求項１から２０のいずれかに規定されるＪＮＫ阻害剤配列、または請求項１７から２４のいずれかに規定されるキメラペプチドをコードする単離核酸の、被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を処置するための薬剤組成物を調製するための使用であって、被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する該疾患または障害が、請求項１から８のいずれかにおいて規定される、使用。
【請求項２６】
請求項２５に規定される核酸を含むベクターの、被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を処置するための薬剤組成物を調製するための使用であって、被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する該疾患または障害が、請求項１から８のいずれかにおいて規定される、使用。
【請求項２７】
請求項２６に規定されるベクターを含む細胞の、被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を処置するための薬剤組成物を調製するための使用であって、被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する該疾患または障害が、請求項１から８のいずれかにおいて規定される、使用。
【請求項２８】
請求項１から１６のいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤配列に、または請求項１７から２４のいずれかに記載のキメラペプチドに免疫特異的に結合する抗体の、被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を処置するための薬剤組成物を調製するための使用であって、被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する該疾患または障害が、請求項１から８のいずれかにおいて規定される、使用。
【請求項２９】
前記薬剤組成物が、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、皮内経路、経皮経路を含む非経口経路、経口経路、直腸経路を含む経腸経路、経鼻経路、鼻腔内経路を含む局所経路、および表皮送達またはパッチ送達を含む他の経路からなる群から選択される投与経路により投与される、先行する請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項３０】
前記ＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドの用量（体重１ｋｇ当たり）が、１０ｍｍｏｌ／ｋｇまで、好ましくは、１ｍｍｏｌ／ｋｇまで、より好ましくは、１００μｍｏｌ／ｋｇまで、さらにより好ましくは、１０μｍｏｌ／ｋｇまで、さらにより好ましくは、１μｍｏｌ／ｋｇまで、さらにより好ましくは、１００ｎｍｏｌ／ｋｇまで、最も好ましくは、５０ｎｍｏｌ／ｋｇまでの範囲にある、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
前記ＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドの用量が、約１ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１μｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約３００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約５００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約７５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、または前記値のうちの任意の２つの値の組み合わせの範囲にある、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質キナーゼ阻害剤の使用に関し、より具体的には、蛋白質キナーゼであるｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼの阻害剤、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、またはこれらをコードする核酸のほか、これらを含有する薬剤組成物の、ＪＮＫシグナル伝達に強く関連する、多様な新規の疾患または障害を処置するための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、マイトジェン活性化蛋白質（ＭＡＰ）キナーゼのストレス活性化グループの１つのメンバーである。このキナーゼは、細胞成長および細胞分化の制御、より一般的にいうと細胞の環境刺激物に対する応答に、関連している。ＪＮＫシグナル伝達経路は、環境ストレスに反応して、且つ、幾つかのクラスの、細胞表面レセプターの関与によって、活性化される。これらのレセプターには、サイトカインレセプター、セルペンチンレセプター、およびレセプターチロシンキナーゼが含まれ得る。哺乳類細胞では、ＪＮＫは、発癌性形質転換、および環境ストレスへの適応反応を媒介するといった生物学的プロセスに関与している。ＪＮＫはまた、免疫細胞の成熟および分化を含む免疫応答の調整に関連していると共に、免疫システムによって破壊のために識別された細胞におけるプログラム細胞死を引き起こすことに関連している。この固有の特性は、ＪＮＫシグナル伝達を、薬理学的介入を開発するための有力な標的とする。幾つかの神経障害のうち、ＪＮＫシグナル伝達は、特に、虚血性脳卒中およびパーキンソン病だけでなく、以下にさらに説明する他の疾患に関連している。さらに、マイトジェン−活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ３８ａｌｐｈａは、ＪＮＫ−ｃＪｕｎ−経路を中和することによって細胞増殖に負の調節をすることが示された。従って、マイトジェン−活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ３８ａｌｐｈａは、正常および癌細胞の増殖の抑制においてアクティブであると考えられ、さらに、癌疾患におけるＪＮＫの関与を示している（例えば、Ｈｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｖｏｌ  ３９，  Ｎｏ．  ６，  （２００７年６月）を参照）。ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）が、脊髄神経ライゲーション（ＳＮＬ）によって発生する神経障害性の痛みに関係があることも示されている。ここで、ＳＮＬは、ＪＮＫ、特にＪＮＫ１のゆっくり且つ持続する活性化を誘導するが、ｐ３８マイトジェン−活性化プロテインキナーゼの活性化は、ＳＮＬの後の脊髄小膠細胞において見出され、２１日間でほとんど基礎レベルまで低下した（Ｚｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００６年３月２９日，  ２６（１３）：３５５１−３５６０））。
【０００３】
従って、ＪＮＫシグナル伝達経路を阻害または妨害すること、特に、ＪＮＫシグナル伝達経路の阻害剤を供給することは、ＪＮＫシグナル伝達に強く関連する障害を戦う有効な手段であると考えられる。しかし、現在のところ、幾つかのＪＮＫシグナル伝達経路の阻害剤だけが知られている。
【０００４】
従来技術において既に知られているＪＮＫシグナル伝達経路の阻害剤は、特に、例えば、上流側のキナーゼ阻害剤（例えば、ＣＥＰ−１３４７）は、例えばプロテインキナーゼのＡＴＰ−結合部位と競合することによって、キナーゼ活性に直接作用するＪＮＫの低分子の化学阻害剤（ＳＰ６００１２５およびＡＳ６０１２４５）、および、ＪＮＫとその基質（Ｄ−ＪＮＫＩおよびＩ−ＪＩＰ）との間の相互作用のペプチド性阻害剤を含む（例えば、Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  −  ＣＮＳ  ＆  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，  ２００５年２月，  ｖｏｌ．  ４，  ｎｏ．  １，  ｐｐ．  ６３−６７（５）を参照）。
【０００５】
上流側のキナーゼ阻害剤ＣＥＰ−１３４７（ＫＴ７５１５）とは、混合系統キナーゼファミリーの半合成の阻害剤である。ＣＥＰ−１３４７（ＫＴ７５１５）は、栄養の供与を停止した後の一次胚培養物および分化したＰＣ１２細胞において、並びに、１−メチル−４−フェニルテトラヒドロピリジンで処置したマウスにおいて、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化を阻害する量でニューロンの生存を促進する。さらに、ＣＥＰ−１３４７（ＫＴ７５１５）が、培養されたニワトリ胚後根神経節、交感神経ニューロン、毛様体ニューロン、および運動ニューロンの長期生存を促進することが可能である（例えば、Ｂｏｒａｓｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．  ９（７）  １４３５−１４３９（１９９８年５月１１日）を参照）。
【０００６】
この低分子の化学ＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５は、ｃ−Ｊｕｎリン酸化のレベルを低減し、ドーパミン作動性ニューロンをアポトーシスから保護し、Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスにおけるＭＰＴＰ−誘発ＰＤのドーパミンのレベルを部分的に回復させることが見出された（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．  ２００４年２月；  ４８（２）；  １９５−２０２）。これらの結果は、ＪＮＫ経路が、インビボのＭＰＴＰの神経毒性作用の主な媒介体であることをさらに示しており、ＪＮＫ活性を阻害することは、ＰＤを処置するための新規且つ効果的な戦略を示し得る。
【０００７】
低分子の化学ＪＮＫ阻害剤のさらなる例は、上述のＪＮＫ−阻害剤ＡＳ６０１２４５である。ＡＳ６０１２４５は、ＪＮＫシグナル伝達経路を阻害し、大脳虚血後の細胞生存を促進する。インビボでは、ＡＳ６０１２４５は、広範囲の一過性虚血のアレチネズミモデルにおいて、海馬ＣＡ１ニューロンの遅延損失に対する有意な保護を提供した。この作用は、ＪＮＫ阻害によって、従ってｃ−Ｊｕｎ発現およびリン酸化によって、媒介される（例えば、Ｃａｒｂｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．  ２００４年  ７月；  ３１０（１）２５−３２．  Ｅｐｕｂ  ２００４年２月２６日を参照）。
【０００８】
ＪＮＫシグナル伝達経路の阻害剤の第３のクラスは、上述のように、ＪＮＫとその基質との間の相互作用のペプチド性阻害剤を示している。このようなＪＮＫ阻害剤ペプチドの構築の開始点として、天然に存在するＪＮＫ蛋白質の配列アラインメントを用いてもよい。典型的には、これらの蛋白質は、ＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）を含み、ＩＢ１またはＩＢ２といった種々なインスリン結合（ＩＢ）蛋白質に存在する。このような典型的な配列アラインメントの結果は、例えば、ＩＢ１［配列番号１３］、ＩＢ２［配列番号１４］、ｃ−Ｊｕｎ［配列番号１５］、およびＡＴＦ２［配列番号１６］
のＪＮＫ結合ドメイン間の配列アラインメントである（例えば、図１Ａ〜１Ｃを参照）。このようなアラインメントによって、部分的に保存された８つのアミノ酸配列（例えば、図１Ａを参照）が明らかにされる。ＩＢ１のＪＢＤとＩＢ２のＪＢＤとの間の比較により、これら２つの配列間で高度に保存された、７つのアミノ酸および３つのアミノ酸の２つのブロックが明らかになる。
【０００９】
このようなアラインメントに基づいて構築された配列は、例えば、ＷＯ０１／２７２６８号公報またはＷＯ２００７／０３１２８０号公報に開示されている。ＷＯ２００７／０３１２８０号公報およびＷＯ０１／２７２６８号公報は、低分子の細胞透過性融合ペプチドを開示している。このペプチドは、ＨＩＶ−ＴＡＴ蛋白質の基本的な輸送配列に由来するいわゆるＴＡＴ細胞浸透配列と、ＩＢ１の最小２０個のアミノ酸の阻害配列とを含む。どちらの成分も、互いに共有結合している。ＷＯ２００７／０３１２８０号公報およびＷＯ０１／２７２６８号公報の両方に開示された、ＭＡＰＫ−ＪＮＫシグナル伝達経路の典型的な（且つ現在のところ唯一の）阻害剤は、例えば、Ｌ−ＪＮＫＩ１（Ｌアミノ酸から構成されるＪＮＫ−阻害剤ペプチド）、またはプロテアーゼ耐性Ｄ−ＪＮＫＩ１ペプチド（非ネイティブＤアミノ酸から構成されるＪＮＫ−阻害剤ペプチド）である。これらのＪＮＫ−阻害剤（ＪＮＫＩ）ペプチドは、ＪＮＫ（ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、およびＪＮＫ３）に特異的である。上述のこれらの低分子の化合物阻害剤とは対照的に、ＷＯ２００７／０３１２８０号公報またはＷＯ０１／２７２６８号公報の阻害剤配列、例えば、ＪＮＫＩ１は、むしろ、ＪＮＫとその基質との間の相互作用を阻害する。融合ペプチドは、ＴＡＴに由来するその輸送配列によって、細胞の中に効率よく輸送される。輸送成分によって得られるこの新規の特性によって、融合ペプチドは、細胞の中に能動的に輸送され、該細胞において、これら融合ペプチドは、蛋白質分解されるまで、有効に維持される。
【００１０】
しかし、ＷＯ２００７／０３１２８０号公報またはＷＯ０１／２７２６８号公報に係るペプチドは、限られた数の疾患、特に非−悪性の疾患または免疫学的に関連する細胞増殖性疾患といった疾患において有効であることが示されただけである。
【００１１】
従って、本発明の一目的は、ＪＮＫ阻害剤ペプチドで戦うことが可能なさらなる疾患を特定することにある。本発明の他の一目的は、新規のＪＮＫ阻害剤ペプチドおよびその誘導体（の使用）を、上述の疾患、およびＪＮＫシグナル伝達に強く関連することがまだ知られていない、または既に知られている疾患の処置のために、提供することにある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第０１／２７２６８号
【特許文献２】国際公開第２００７／０３１２８０号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｈｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｖｏｌ  ３９，  Ｎｏ．  ６，  （２００７年６月）
【非特許文献２】Ｚｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００６年３月２９日，  ２６（１３）：３５５１−３５６０）
【非特許文献３】Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  −  ＣＮＳ  ＆  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，  ２００５年２月，  ｖｏｌ．  ４，  ｎｏ．  １，  ｐｐ．  ６３−６７（５）
【非特許文献４】Ｂｏｒａｓｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．  ９（７）  １４３５−１４３９（１９９８年５月１１日）
【非特許文献５】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．  ２００４年２月；  ４８（２）；  １９５−２０２
【非特許文献６】Ｃａｒｂｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．  ２００４年  ７月；  ３１０（１）２５−３２．  Ｅｐｕｂ  ２００４年２月２６日
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この目的は、被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する種々の炎症性または非炎症性疾患を処置するための薬剤組成物を調製するための、１５０個未満のアミノ酸の長さを典型的に含む、好ましくは、本明細書において規定される、ＪＮＫ阻害剤配列の使用であって、疾患または障害が、以下の群：
（ａ）脳脊髄炎、特に、急性播種性脳脊髄炎、脊椎炎、特に、強直性脊椎炎、抗シンセターゼ症候群、皮膚炎、特に、アトピー性皮膚炎または接触性皮膚炎、肝炎、特に、自己免疫性肝炎、自己免疫性末梢神経障害、膵炎、特に、自己免疫性膵炎、ベーチェット病、ビッカースタッフ型脳炎、ブラウ症候群、セリアック病、シャーガス病、多発性神経障害、
特に、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、骨髄炎、特に、慢性再発性多巣性骨髄炎、チャーグ−ストラウス症候群、コーガン症候群、巨細胞性動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、血管炎、特に、皮膚小血管性血管炎および蕁麻疹様血管炎、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、全身性強皮症、ドレスラー症候群、薬物誘発性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、腱付着部炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、結節性紅斑、特発性肺線維症、胃炎、グレーブス病、ギラン−バレー症候群、橋本甲状腺炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、汗腺膿瘍、特発性炎症性脱髄性疾患、筋炎、特に、封入体筋炎、膀胱炎、特に、間質性膀胱炎、川崎病、扁平苔癬、ルポイド肝炎、マジード症候群、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織疾患、脊髄炎、特に、視神経脊髄炎、甲状腺炎、特に、オルド甲状腺炎、リウマチ、特に、回帰性リウマチ、パーソネージ−ターナー症候群、尋常性天疱瘡、静脈周囲性脳脊髄炎、結節性多発動脈炎、多発筋痛症、特に、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、肝硬変、特に、原発性胆汁性肝硬変、胆管炎、特に、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、ラスムッセン脳炎、再発性多発性軟骨炎、関節炎、特に、反応性関節炎（ライター病）および関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、シュニッツラー症候群、血清病、脊椎関節症、高安動脈炎、トロサ−ハント症候群、横断性脊髄炎、およびウェゲナー肉芽腫症、
（ｂ）特に、ぶどう膜炎、強膜炎、角膜手術、結膜炎、非感染性角膜炎、虹彩炎、脈絡網膜炎症、眼の網膜を損傷する炎症性疾患（網膜症）、特に、糖尿病性網膜症、動脈性高血圧症誘発性高血圧性網膜症、放射線誘発性網膜症、太陽光誘発性日光網膜症、外傷誘発性網膜症、例えば、プルチェル網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、および過粘稠度関連網膜症から選択される、眼の炎症性疾患、
（ｃ）アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、抗リン脂質症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性多内分泌症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、バロー同心円性硬化症、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症疾患、補体成分２欠損関連疾患、クッシング症候群、デゴス病（Ｄａｇｏｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、有痛脂肪症、好酸球性肺炎、後天性表皮水疱症、新生児の溶血性疾患、寒冷グロブリン血症、エバンス症候群、進行性骨化性線維異形成症、消化器性類天疱瘡、グッドパスチャー症候群、橋本脳症、妊娠性類天疱瘡、ヒューズ−ストーヴィン症候群、低ガンマグロブリン血症、ランバート−イートン筋無力症症候群、硬化性苔癬、限局性強皮症、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋緊張病、オプソクローヌスミオクローヌス症候群、傍腫瘍性小脳変性、発作性夜間血色素尿症、パリー−ロンベルク症候群、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、壊疽性膿皮症、赤芽球ろう、レイノー現象、むずむず脚症候群、後腹膜線維症、２型自己免疫性多内分泌症候群、スティッフパーソン症候群、スザック症候群、熱性好中球性皮膚病、シドナム舞踏病、血小板減少症、および白斑、
（ｄ）関節炎、特に、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎および関節リウマチ、ならびに関節症、ならびに骨関節炎、
（ｅ）特に、乾癬、湿疹、皮膚炎、座瘡、口腔内潰瘍、紅斑、扁平苔癬（ｌｉｃｈｅｎ  ｐｌａｎ）、サルコイドーシス（ｓａｒｃｏｉｄｏｓｅ）、血管炎（ｖａｓｃｕｌａｒｉｔｉｓ）、成年性線状ＩｇＡ疾患から選択される、皮膚疾患、
（ｆ）タウオパシー、アミロイドーシス（ａｍｙｌｏｉｄｏｓｅｓ）、およびプリオン病、
（ｇ）ポリープ、
（ｈ）口腔または顎骨の炎症性疾患、特に、歯髄炎、インプラント周囲炎、歯周炎、歯肉炎、口内炎、粘膜炎、剥離性障害、顎関節障害、
（ｉ）骨壊死、
（ｊ）加齢黄斑変性（ＡＭＤ：ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、特に、加齢黄斑変性の滲出型および萎縮型、ならびに白内障、
（ｋ）特に、肺線維症、心臓線維症、肝臓線維症、骨髄線維症、縦隔線維症、後腹膜線維症、皮膚線維症、腸線維症、関節線維症、および肩線維症から選択される、線維性疾患および／または線維性障害、
（ｌ）特に、糸球体腎炎一般、特に、膜性増殖性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、急性進行性糸球体腎炎、腎症（ｎｅｐｈｒｏｐｈａｔｈｉｅｓ）一般、特に、膜性腎症または糖尿病性腎症、腎炎一般、特に、ループス腎炎、腎盂腎炎、間質性腎炎、尿細管間質性腎炎、慢性腎炎または急性腎炎、および微小変化群、ならびに巣状分節状糸球体硬化症から選択される、腎疾患および／または腎障害、
（ｍ）交感性眼炎、
（ｎ）腎臓、心臓、肺、膵臓、肝臓、血液細胞、骨髄、角膜、偶発的に切断された四肢、特に、指、手、足、顔面、鼻梁、骨、心弁、血管、または腸の移植片拒絶反応、
（ｏ）大脳皮質基底核変性症、進行性（ｐｒｏｇｒｅｓｉｖｅ）核上麻痺、統合失調症、遺伝性クロイツフェルト−ヤコブ病、運動ニューロン病（ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、脊髄小脳性運動失調／脊髄小脳萎縮（ａｔｒｏｐｈｉｅ）、認知症、特に、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、遺伝性痙性対麻痺、フリードライヒ運動失調症（Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ’ｓ  ａｔａｘｉｅａ）、シャルコー−マリー−トゥース病（Ｃｈａｒｃｏｔ  Ｍａｒｉｅ  ｔｏｏｔ）、および
（ｐ）特に、炭水化物代謝の代謝性障害、例えば、糖原病、アミノ酸代謝障害、例えば、フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症、グルタル酸血症１型、尿素サイクル障害または尿素サイクル欠損症、例えば、カルバモイルリン酸シンセターゼＩ欠損症、有機酸代謝障害（有機酸尿症）、例えば、アルカプトン尿症、脂肪酸酸化障害およびミトコンドリア代謝障害、例えば、中鎖アシル−コエンザイムＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＭＣＡＤＤと略記されることが多い）、ポルフィリン代謝障害、例えば、急性間欠性ポルフィリン症、プリン代謝障害またはピリミジン代謝障害、例えば、レッシュ−ナイハン症候群、ステロイド代謝障害、例えば、先天性リポイド副腎過形成、または先天性副腎過形成、ミトコンドリア機能障害、例えば、カーンズ−セイヤー症候群、ペルオキシソーム機能障害、例えば、ツェルウェーガー症候群、またはリソソーム蓄積症、例えば、ゴーシェ病またはニーマン−ピック病の群から選択される、遺伝性または非遺伝性の代謝性疾患
から選択される、使用によって解決される。
【００１５】
好ましい一実施形態によれば、処置される障害／疾患は、滲出型または萎縮型のＡＭＤ、ならびに白内障である。
【００１６】
好ましい一実施形態によれば、処置される障害／疾患は、網膜症、特に、糖尿病性網膜症である。
【００１７】
好ましい一実施形態によれば、処置される障害／疾患は、乾癬である。
【００１８】
別の好ましい実施形態によれば、処置される障害／疾患は、移植片拒絶または移植拒絶反応、特に、肝臓移植、肺移植、腎臓移植、膵臓移植、皮膚移植、または心臓移植における移植片拒絶、例えば、移植片対宿主または宿主対移植片の移植片拒絶である。
【００１９】
さらに別の好ましい実施形態によれば、処置される障害／疾患は、糸球体腎炎である。
【００２０】
さらに、以下では、処置されるさらなる疾患も開示される。
【００２１】
本発明のＪＮＫ阻害剤は、例えば、例えば、急性炎症のほか、慢性炎症を含む炎症性疾患を処置するために使用することができる。本発明のＪＮＫ阻害剤を使用して、任意の種類の組織炎症、例えば、眼における炎症、口腔における炎症、特に、肺を含む呼吸器系の炎症、皮膚の炎症、心血管系内の炎症、脳の炎症、耳における炎症などを処置することができる。このような炎症性疾患状況についての幾つかの非限定的な例は、粘膜炎、口内炎、インプラント周囲炎、網膜炎、脈絡膜炎、乾燥性角結膜炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ぶどう膜炎（例えば、前部ぶどう膜炎、中間部ぶどう膜炎、後部ぶどう膜炎）、歯周炎、ＣＯＰＤ、喘息、歯髄炎、関節リウマチ、骨関節炎、クローン病、乾癬性関節炎、血管炎、間質性膀胱炎；感染部位または創傷部位の急性炎症、髄膜炎、脳炎、肺炎、咽頭炎、扁桃炎、耳炎（中耳炎を含む）、血管炎、滑膜炎、腸炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、移植片拒絶などである。
【００２２】
本明細書において開示されるＪＮＫ阻害剤は、例えば、耳疾患（特に、内耳の疾患）、聴覚喪失（特に、急性聴覚喪失）、有毛細胞不動毛の傷害、有毛細胞のアポトーシス、騒音性外傷、耳炎、中耳炎などの処置法において使用することができる。聴覚喪失および関連する有毛細胞のアポトーシスは、細胞に対するストレス状況から生じる障害であって、ＪＮＫ阻害により、ストレス応答を調整し、例えば、アポトーシスを遮断し得る障害についての非限定的な例である。
【００２３】
本発明のＪＮＫ阻害剤はまた、代謝性障害を処置するために、例えば、糖尿病（１型または２型、特に、１型）、ファブリー病、ゴーシェ病、低体温症、高体温症、低酸素症、脂質性組織球増殖症、リピドーシス、異染性白質萎縮症、ムコ多糖症、ニーマン−ピック病、肥満、およびウォルマン病を処置するためにも使用することができる。低体温症、高体温症、および低酸素症はまた、細胞に対するストレス状況であって、ＪＮＫ阻害により、ストレス応答を調整し、例えば、アポトーシスを遮断し得るストレス状況についての非限定的な例でもある。
【００２４】
同様に、本発明のＪＮＫ阻害剤は、神経疾患、神経細胞疾患、および／または神経変性疾患のそれぞれを処置するために使用することもできる。このような疾患についての例は、例えば、アレクサンダー病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、卒中、毛細血管拡張性運動失調、切断または他の形による軸索の破断、軸索切断、脳病変、ＣＭＴ（シャルコー−マリー−トゥース病）、大脳皮質基底核変性症、認知症、神経系の疾患または障害、ジストニア、てんかん、ファーバー病、フリードライヒ失調症（ＳＣＡ）、ガングリオシドーシス、ギラン−バレー症候群、遺伝性痙性対麻痺、ヒルシュプルング病、ヒト免疫不全ウイルス性認知症、ハンチントン病、脳梗塞、虚血性脳卒中、クラッベ病、レノックス−ガストー症候群、脳回欠損、多発性硬化症、骨髄異形成症候群、脊髄症、ＡＩＤＳ関連神経変性疾患、神経線維腫症２型（ＮＦ−２）、神経ラチリズム（ｎｅｕｒｏｌａｔｙｅｒｉｓｍ）、ニューロンアポトーシス、ニューロン死、神経障害性疼痛、神経障害、化学療法誘発性神経障害、糖尿病誘発性神経障害、ＮＭＤＡ誘発性神経毒性、疼痛、パーキンソン病、パーキンソニズム、ピック病、多発性神経障害、進行性核上性麻痺、サンドホフ病、脊椎披裂、脳卒中、テイ−サックス病、ＴＢＩ（びまん性軸索傷害）、例えば、炎症性疼痛により誘発されるダークニューロンの処置、ウェスト症候群、脊髄筋萎縮症などである。
【００２５】
自己免疫性障害に関し、本発明のＪＮＫ阻害剤ペプチドを、例えば、ＣＮＳの自己免疫性疾患、自己炎症性疾患、セリアック病；シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデスなどの処置法において使用することができる。
【００２６】
本発明のＪＮＫ阻害剤で処置されうる骨疾患についての例は、例えば、関節炎、椎間板ヘルニア、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）、骨関節炎、大理石骨病、骨粗鬆症、特に、糖尿病誘発性骨粗鬆症、ぺージェット病、関節リウマチなどである。
【００２７】
本発明のＪＮＫ阻害剤で処置されうる皮膚疾患についての例は、例えば、乾癬およびエリテマトーデスである。
【００２８】
本発明のＪＮＫ阻害剤で処置されうる眼疾患は、例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）；網膜色素線条；前部虚血性視神経障害；前部ぶどう膜炎；白内障、特に、加齢白内障；中心性滲出性脈絡網膜症；中心性漿液性脈絡網膜症；霰粒腫；先天性脈絡膜欠如（ｃｈｏｒｉｏｄｅｒｅｍｉａ）；脈絡膜炎（ｃｈｏｒｉｏｉｄｉｔｉｓ）；脈絡膜硬化症；結膜炎；毛様体炎；糖尿病性網膜症；ドライアイ症候群；眼内炎；上強膜炎；眼感染症；白点状眼底；脈絡膜および網膜の脳回転状萎縮症；麦粒腫；眼瞼（ｂｌｅｐｈａｒａ）の炎症性疾患；脈絡膜の炎症性疾患；毛様体の炎症性疾患；結膜の炎症性疾患；角膜の炎症性疾患；虹彩の炎症性疾患；涙腺の炎症性疾患；眼窩骨の炎症性疾患；強膜の炎症性疾患；硝子体の炎症性疾患；ぶどう膜の炎症性疾患；網膜の炎症性疾患；中間部ぶどう膜炎；虹彩炎（ｉｒｉｔｉｔｉｓ）；角膜炎；レーバー病；多巣性脈絡膜炎；眼筋の筋炎；新生血管黄斑症（例えば、強度の近視、傾斜乳頭症候群、脈絡膜骨腫などにより引き起こされる）；ＮＭＤＡ誘発性網膜毒性；非慢性または慢性の炎症性眼疾患；小口病；視神経疾患；眼窩蜂巣炎；汎眼球炎（ｐａｎｏｐｈｔａｌｍｉｔｉｓ）；全ぶどう膜炎；後嚢混濁；後発白内障（ＰＣＯ）（白内障の術後合併症）；後部ぶどう膜炎；増殖性硝子体網膜症；網膜動脈閉塞症；網膜剥離、網膜疾患；網膜傷害；網膜細動脈瘤；網膜色素上皮剥離；網膜静脈閉塞症；網膜炎；色素性網膜炎；白点状網膜炎；網膜症、特に、未熟児網膜症および糖尿病網膜症；強膜炎；スターガルト病；炎症性眼創傷および／または眼創縁の処置；眼手術後または眼外傷後における眼内炎症の処置；ぶどう膜炎；および卵黄様黄斑ジストロフィーなどを包含する。
【００２９】
本明細書において開示されるＪＮＫ阻害剤で処置されうる例示的な口腔疾患は、歯周炎、特に、慢性歯周炎；粘膜炎、口腔剥離性障害、口腔扁平苔癬（ｏｒａｌ  ｌｉｑｕｅｎ
ｐｌａｎｕｓ）、尋常性天疱瘡、歯髄炎；口内炎；顎関節障害、インプラント周囲炎などである。
【００３０】
本発明はまた、膀胱機能の喪失（例えば、尿失禁、過活動膀胱、間質性膀胱炎、または膀胱がん）をもたらす疾患の処置における使用にも適する。
【００３１】
使用の別の分野は、疼痛、特に、神経障害性疼痛、偶発性疼痛、突出痛、心因性疼痛、または幻肢痛（これらの疼痛の種類の全てが急性形態または慢性形態である）の処置である。
【００３２】
同様に、本発明のＪＮＫ阻害剤は（既にかつて、他のＪＮＫ阻害剤について提起された通り）、聴神経腫瘍、肺癌；急性リンパ球性白血病（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；腺癌；肛門癌；気管支癌；子宮頸癌；子宮頸がん；星状細胞腫；基底細胞腫；Ｂｃｒ−Ａｂｌ形質転換を伴うがん；膀胱がん；線維芽細胞腫；骨がん；脳転移；脳腫瘍；乳がん；バーキットリンパ腫；カルチノイド；子宮頸がん；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；結腸がん；結腸癌；子宮体癌；頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｎｇｅｏｍａｓ）；ＣＵＰ症候群；ウイルス誘発性腫瘍；ＥＢＶ誘発性Ｂ細胞性リンパ腫；子宮内膜癌；赤白血病（Ｍ６）；食道がん（ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  ｃａｎｃｅｒ）；胆嚢がん；消化器がん；消化管間葉系腫瘍；消化器腫瘍；尿生殖器がん；緑内障；神経膠芽腫；神経膠腫；頭頸部腫瘍；Ｂ型肝炎誘発性腫瘍；肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａまたはｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；肝細胞癌；ヘルペスウイルス誘発性腫瘍；ホジキン症候群；ＨＴＬＶ−１誘発性リンパ腫；ＨＴＬＶ−２誘発性リンパ腫；インスリノーマ；腸がん；カポジ肉腫；腎臓がん；腎臓癌；喉頭がん；白血病；眼瞼腫瘍；肝臓がん；肝転移；肺がん；リンパ球がん；リンパ腫；悪性黒色腫；乳癌；マントル細胞リンパ腫；髄芽腫；巨核芽球性白血病（Ｍ７）；黒色腫、特に、悪性黒色腫；髄膜腫；中皮腫；単球性白血病（ＭＳ）；多発性骨髄腫；菌状息肉腫；骨髄芽球性白血病（Ｍ１）；骨髄芽球性白血病（Ｍ２）；骨髄単球性白血病（Ｍ４）；神経鞘腫（ｎｅｕｒｉｎｏｍａ）；非ホジキンリンパ腫；非小細胞癌；肺非小細胞癌；食道がん（ｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）；食道癌；希突起神経膠腫；卵巣がん；卵巣癌；膵臓がん；膵臓癌；パピローマウイルス誘発性癌；陰茎がん；脳下垂体腫瘍；形質細胞腫；前骨髄球性白血病（Ｍ３）；前立腺がん；前立腺腫瘍；直腸腫瘍；直腸癌；腎細胞癌；網膜芽細胞腫；肉腫；シュネーベルガー病；小細胞肺癌；小腸がん；小腸腫瘍；軟組織腫瘍；棘細胞腫；扁平上皮癌；胃がん；精巣がん；咽頭がん；胸腺腫；甲状腺がん；甲状腺癌；舌がん；未分化ＡＭＬ（ＭＯ）；尿道がん；子宮がん；膣がん；フォンヒッペル−リンダウ病；外陰がん；ウィルムス腫瘍；色素性乾皮症など、がんおよび腫瘍性疾患などの増殖性疾患を処置するために使用することもできる。
【００３３】
ＪＮＫシグナル伝達はまた、多くの心血管疾患および障害にも関与しているので、このような疾患の処置におけるＪＮＫ阻害剤の使用は、既に過去にも示唆されている。したがって、本発明の阻害剤は、例えば、動脈性高血圧症；動脈硬化症；動脈硬化性病変；ベーチェット症候群；血管分岐；心肥大；心血管肥大；心筋症、特に、化学療法誘発性心筋症；脳虚血；冠動脈性心疾患；腹部大動脈の拡張；限局性脳虚血；全脳虚血；心臓肥大；腎臓下動脈瘤（ｉｎｆｒａｒｅｎａｌ  ａｎｅｕｒｉｓｍ）性高血圧症；虚血；心筋梗塞、特に、急性心筋梗塞；心筋炎；再灌流；再狭窄；血管炎；ウェゲナー肉芽腫症などの心血管疾患を処置するために使用することができる。
【００３４】
本発明のＪＮＫ阻害剤はまた、心血管疾患の文脈で、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ術）；経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）；および／またはステント処置に対して補完的に使用して、例えば、前記（手術）処置から生じる内膜過形成を予防または処置することもできる。
【００３５】
本発明のＪＮＫ阻害剤で効果的に処置されうる呼吸器系疾患、および、特に、肺疾患は、例えば、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；喘息；呼吸器系を侵す慢性疾病；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；嚢胞性線維症；炎症性肺疾患；肺炎；肺線維症などである。
【００３６】
先行技術における阻害剤と同様、本発明の阻害剤もまた、腸管疾患、例えば、大腸炎（例えば、非定型大腸炎、化学物質性大腸炎（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｌｉｔｉｓ）；コラーゲン性大腸炎、遠位大腸炎、空置大腸炎；劇症性大腸炎、分類不能大腸炎、感染性大腸炎、虚血性大腸炎、リンパ球性大腸炎、または顕微鏡的大腸炎）、クローン病、胃腸炎、ヒルシュプルング病、炎症性消化器疾患；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、モルブスクローン病、非慢性消化器疾患または慢性消化器疾患、非慢性または慢性炎症性消化器疾患；限局性腸炎；潰瘍性大腸炎などを処置するのに使用することができる。
【００３７】
本発明のＪＮＫ阻害剤はまた、例えば、細菌感染またはウイルス感染から生じる感染性疾患を処置するための処置剤としても用いられうる。本明細書において開示されるＪＮＫ阻害剤は、例えば、前記感染により引き起こされる炎症反応を予防または改善することができる。このような疾患状況についての、限定的であるとは考えないものとする例は、ウイルス性脳炎；ウイルス誘発性がん（例えば、上記で言及されたとおり）、ヒト免疫不全ウイルス性認知症、髄膜炎、髄膜脳炎、脳脊髄炎、扁桃炎などである。
【００３８】
本発明のＪＮＫ阻害剤を処置として使用しうる、他の多くの疾患、疾患状況、および障害であって、例えば、アールスコグ症候群、アセトアミノフェンによる肝毒性；アルダー−レイリー異常症；円形脱毛症；アルファ−１−アンチトリプシン欠損症；アナフィラキシー；アポトーシス；アポトーシス性細胞死；非定型溶血性尿毒症症候群；好塩基球減少症；好塩基球増加症；双極性障害；火傷；細胞へのせん断応力；チェディアック−東症候群（Ｃｈｅｄｉａｌ−Ｈｉｇａｓｈｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；化学療法薬に起因するＤＮＡ傷害；胆汁うっ滞；第１１染色体（１１ｑ）の部分的モノソミー；第２２染色体のモザイク型トリソミー；慢性肉芽腫症；慢性肝炎または劇症肝炎などの肝炎；臨床的うつ病；分類不能型低ガンマグロブリン血症；先天性Ｃ３欠損症；活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）からのＣＴＬの保護；難聴；抑うつおよび抑うつ障害（特に、サイトカイン誘発疾病行動のバックグラウンドにおいて発症する抑うつ障害の予防）、ディジョージ症候群；アポトーシスの欠陥により引き起こされる疾患；肝疾患；脊椎疾患；子宮疾患；ＤＮＡ傷害剤および／またはイオン化放射線への曝露に起因する疾患状況および症状、ならびに結果として生じる細胞ストレス；ダウン症候群；デュシェンヌ筋ジストロフィー；外胚葉異形成症；子宮内膜症；好酸球減少症；好酸球増加症；興奮毒性性（ｅｘｏｃｉｔｏｘｉｃ）細胞死；胎児性アルコール症候群；線維症；線維性疾患；線維性組織の形成；フリーラジカル（細胞ストレスをもたらす）；移植片拒絶；移植片対宿主病、特に、皮膚移植片対宿主病；脱毛；溶血性尿毒症症候群；肝毒性；糖尿病誘発性痛覚過敏などの痛覚過敏；高体温症；低血糖症；甲状腺機能低下症；特発性好酸球増加症候群；ＩｇＡ腎症；小児性性染色体連鎖無ガンマグロブリン血症；炎症性疼痛；腎臓下動脈瘤（ｉｎｆｒａｒｅｎａｌ  ａｎｅｙｒｉｓｍ）；膵島再生；膵島移植；ヨブ症候群（高ＩｇＥ症候群）；怠惰白血球症候群；白血球グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症；白質萎縮症；白血球減少症；リンパ球性白血球増加症；リンパ球減少症；リンパ球増加症；大うつ病；躁病；躁うつ病；マルファン症候群；肥満細胞症；メイ−ヘグリン異常症；ＩＩ型膜性増殖性子球体腎炎；単球減少症；単球増加症；良性ミエロペルオキシダーゼ欠損症；ミオパシー；好中球減少症；好中球増加症；ネゼロフ症候群；臓器移植；酸化ストレスによる傷害；ペルゲル−フェット核異常；多嚢胞性腎疾患；透析後症候群；放射線症候群；放射線治療；腎疾患；腎不全；活性化誘導細胞死からのＣＴＬのレスキュー；重度の複合型免疫不全疾患；移植拒絶；移植；トリソミー；単極性うつ病；ＵＶ誘発性傷害；ウィスコット−アルドリッチ症候群；創傷治癒などの疾患、疾患状況、および障害も存在する。
【００３９】
本発明の発明者らは、顎関節障害、粘膜炎、口内炎、口腔扁平苔癬（ｏｒａｌ  ｌｉｑｕｅｎ  ｐｌａｎｕｓ）（剥離性障害）、尋常性天疱瘡（剥離性障害）、歯周炎、慢性歯周炎、歯髄炎、インプラント周囲炎、ぶどう膜炎（前部ぶどう膜炎、中間部ぶどう膜炎、後部ぶどう膜炎）、乾燥性角結膜炎（ドライアイ症候群）、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ術）、急性心筋梗塞、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後における内膜過形成の予防、ステント留置後における内膜過形成の予防、アテローム性動脈硬化、ＣＯＰＤ、喘息、関節リウマチ、骨関節炎、クローン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、乾癬、糖尿病、脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病、全身性エリテマトーデス、および血管炎、特に、ウェゲナー肉芽腫症は特に、本発明のＪＮＫ阻害剤による処置に有用であると考える。
【００４０】
本発明の別の態様によれば、組織移植片または臓器移植片を、その移植の前に、（インビトロで）処置するための、１５０個未満のアミノ酸の長さを含む阻害剤配列。通例、脳死ドナーに由来する移植片は、ＷＩＴをかけず、８〜１２時間のＣＩＴ（調達病院から単離ラボへの輸送に必要とされる時間）にあることが典型的である。このような移植片は、宿主へと移植されるまで、それらの生存率および機能性を改善するために、本発明によるＪＮＫ阻害剤で前処置しうることが判明した。本発明のこの態様では、移植片は、腎臓、心臓、肺、膵臓、肝臓、血液細胞、骨髄、角膜、偶発的に切断された四肢、特に、指、手、足、顔面、鼻梁、骨、心弁、血管、または腸の移植片、好ましくは、腎臓、心臓、膵臓、または皮膚の移植片である。
【００４１】
当該技術分野において公知のＪＮＫ阻害剤配列は、限られた数の疾患にしか有用性が証明されていないので、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列が、上述のＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を処置するために使用可能であると共に該処置に適していることは、驚くべき所見であった。ＪＮＫ阻害剤配列は、概して、当該技術分野において公知であったが、上記のことは、従来技術によって明白でもなかったし示唆されるものでもなかった。
【００４２】
典型的に、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列は、ヒトまたはラットＩＢ１配列に由来し、好ましくは、配列番号１０２（ラットからのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列およびその予測されるアミノ酸配列を示す）、配列番号１０３（ｒＩＢ１遺伝子−スプライス供与体のエキソン−イントロン境界によってコードされたラットからのＩＢ１蛋白質配列を示す）、配列番号１０４（ホモサピエンスからのＩＢ１蛋白質配列を示す）、または、配列番号１０５（ホモサピエンスからのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列を示す）に記載の配列のうちのいずれかによって規定された、またはコードされたアミノ酸配列に由来し、より好ましくは、配列番号１０４（ホモサピエンスからのＩＢ１蛋白質配列を示す）、または、配列番号１０５（ホモサピエンスからのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列を示す）に記載の配列のうちのいずれかによって規定された、またはコードされたアミノ酸配列に由来し、または、これらの任意の断片または改変体に由来していてよい。換言すると、ＪＮＫ阻害剤配列は、ヒト若しくはラットＩＢ１配列の断片、改変体、または、このような断片の改変体を含む。ヒトまたはラットＩＢ配列は、それぞれ、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、または配列番号１０５に記載の配列によって規定またはコードされる。
【００４３】
好ましくは、本明細書において用いられるようなＪＮＫ阻害剤配列は、全部で、１５０個よりも短い長さのアミノ酸残基、好ましくは、５〜１５０個の範囲の長さのアミノ酸残基、より好ましくは１０〜１００個の範囲のアミノ酸残基、さらにより好ましくは１０〜７５個の範囲の長さのアミノ酸残基、および最も好ましくは１０〜５０個の範囲の長さのアミノ酸残基、例えば、１０〜３０個、１０〜２０個、または、１０〜１５個の長さのアミノ酸残基を含む。
【００４４】
より好ましくは、このようなＪＮＫ阻害剤配列および上述の範囲は、上述の配列のうちのいずれかから、さらにより好ましくは、配列番号１０４に従って規定された、または配列番号１０５によってコードされたアミノ酸配列から選択され、さらにより好ましくは、配列番号１０５のヌクレオチド４２０と９８０の間の領域において、または、配列番号１０４のアミノ酸１０５と２９１との間の領域において、および最も好ましくは、配列番号１０５のヌクレオチド５６１と６４７との間の領域において、または配列番号１０４のアミノ酸１５２と１８０との間の領域において、選択され得る。
【００４５】
具体的な一実施形態によれば、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、典型的には、ＪＮＫを結合し、および／または、少なくとも１つのＪＮＫ活性化転写因子、例えば、ｃ−ＪｕｎまたはＡＴＦ２（例えば、各配列番号１５および１６を参照）、またはＥｌｋ１の活性化を阻害する。
【００４６】
同様に、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、好ましくは、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００のいずれか１つに記載の少なくとも１つのアミノ酸配列、または、その断片、誘導体、若しくは改変体を含むか、または、これから構成される。より好ましくは、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のアミノ酸配列、またはそのその改変体、断片、または誘導体の、１、２、３、４、またはさらにそれより多くのコピーを含んでいてよい。１つより多いコピーが存在するならば、本明細書において使用される、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のこれらのアミノ酸配列、またはその改変体、断片、若しくは誘導体は、いかなるリンカー配列も無しに、または１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸を含むリンカー配列を介して、直接互いに連結し得る。リンカー配列を形成するアミノ酸は、好ましくは、アミノ酸残基としてのグリシンまたはプロリンから選択されている。より好ましくは、本明細書において使用される、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のこれらのアミノ酸配列、または、その断片、改変体、若しくは誘導体は、２つ、３つ、またはそれより多くのプロリン残基のヒンジによって互いに分離され得る。
【００４７】
本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または、これらの組み合わせから構成されていてよい。好ましくは、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、少なくとも１またはさらに２個、好ましくは少なくとも３、４または５個、より好ましくは少なくとも６、７、８、または９個、およびさらにより好ましくは、少なくとも１０個またはそれより多くの、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸を含み、ここで、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸は、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列において、ブロック状、非ブロック状、または交互になった様式に、配置されていてよい。
【００４８】
好ましい一実施形態によれば、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、Ｌ−アミノ酸だけから構成されていてよい。本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、さらにまた、配列番号１または３に記載の、少なくとも１つの「ネイティブＪＮＫ阻害剤配列」を含むか、またはこれから構成されていてよい。これに関して、「ネイティブ」または「ネイティブＪＮＫ阻害剤配列」という用語は、本明細書において使用されるように全体がＬ−アミノ酸から構成された、配列番号１または３のいずれかに記載の変換されていないＪＮＫ阻害剤配列を指す。
【００４９】
従って、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、少なくとも１つの（ネイティブ）アミノ酸配列ＮＨ２−Ｘｎｂ−Ｘｎａ−ＲＰＴＴＬＸＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＩＢジェネリック（ｓ））［配列番号３］、および／または、ＩＢ１のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）ＸＲＰＴＴＬＸＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤＳ／ＴＸ（Ｌ−ＩＢ（ジェネリック））［配列番号１９］を含むか、またはこれから構成されていてよい。これに関して、各Ｘは、典型的には、好ましくは任意の（ネイティブ）アミノ酸残基から選択されたアミノ酸残基を示す。Ｘｎａは、典型的には、好ましくは、セリンまたはトレオニンを除く任意のアミノ酸残基から選択された１つのアミノ酸残基を示す。ここで、ｎ（Ｘの繰り返しの数）は、０または１である。さらに、各Ｘｎｂは、任意のアミノ酸残基から選択されていてよく、ここでｎ（Ｘの繰り返しの数）は、０〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０、またはそれより多くてよいが、それは、Ｘｎａのｎ（Ｘの繰り返しの数）が０である場合に、Ｘｎｂは、好ましくは、そのＣ末端においてセリンまたはトレオニンを含まず、この位置においてセリンまたはトレオニンを回避することを条件とする。好ましくは、Ｘｎｂは、配列番号１または３に由来するペプチド残基の連続したストレッチを示す。ＸｎａおよびＸｎｂは、Ｄアミノ酸またはＬアミノ酸のいずれかを示す。さらに、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１のＪＮＫ結合ドメイン  ＤＴＹＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤＴ（Ｌ−ＩＢ１）［配列番号１７］を含む群から選択される少なくとも１つの（ネイティブ）アミノ酸配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。より好ましくは、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列はさらに、少なくとも１つの（ネイティブ）アミノ酸配列ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＩＢ１（ｓ））［配列番号１］を含むか、またはこれから構成されていてよい。さらに、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１のＪＮＫ結合ドメインであるＬ−ＩＢ１（ｓ１）（ＮＨ２−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ，配列番号３３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２）（ＮＨ２−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ，配列番号３４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３）（ＮＨ２−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ，配列番号３５）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ４）（ＮＨ２−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号３６）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ５）（ＮＨ２−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ，配列番号３７）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ６）（ＮＨ２−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ，配列番号３８）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ７）（ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ，配列番号３９）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ８）（ＮＨ２−ＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ，配列番号４０）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ９）（ＮＨ２−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ，配列番号４１）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１０）（ＮＨ２−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ，配列番号４２）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１１）（ＮＨ２−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号４３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１２）（ＮＨ２−���ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ，配列番号４４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１３）（ＮＨ２−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ，配列番号４５）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１４）（ＮＨ２−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ，配列番号４６）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１５）（ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰ−ＣＯＯＨ，配列番号４７）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１６）（ＮＨ２−ＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ，配列番号４８）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１７）（ＮＨ２−ＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ，配列番号４９）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１８）（ＮＨ２−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ，配列番号５０）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１９）（ＮＨ２−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号５１）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２０）（ＮＨ２−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ，配列番号５２）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２１）（ＮＨ２−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ，配列番号５３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２２）（ＮＨ２−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ，配列番号５４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２３）（ＮＨ２−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰ−ＣＯＯＨ，配列番号５５）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２４）（ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ−ＣＯＯＨ，配列番号５６）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２５）（ＮＨ２−ＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ，配列番号５７）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２６）（ＮＨ２−ＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ，配列番号５８）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２７）（ＮＨ２−ＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ，配列番号５９）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２８）（ＮＨ２−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号６０）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２９）（ＮＨ２−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ，配列番号６１）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３０）（ＮＨ２−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ，配列番号６２）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３１）（ＮＨ２−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ，配列番号６３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３２）（ＮＨ２−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰ−ＣＯＯＨ，配列番号６４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３３）（ＮＨ２−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ−ＣＯＯＨ，配列番号６５）；およびＬ−ＩＢ１（ｓ３４）（ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬ−ＣＯＯＨ，配列番号６６）を含む群から選択される少なくとも１つの（ネイティブ）アミノ酸配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。
【００５０】
さらに、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１の（ロング）ＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）  ＰＧＴＧＣＧＤＴＹＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤＴ（ＩＢ１−ロング）［配列番号１３］と、ＩＢ２の（ロング）ＪＮＫ結合ドメイン  ＩＰＳＰＳＶＥＥＰＨＫＨＲＰＴＴＬＲＬＴＴＬＧＡＱＤＳ（ＩＢ２−ロング）［配列番号１４］と、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫ結合ドメインＧＡＹＧＹＳＮＰＫＩＬＫＱＳＭＴＬＮＬＡＤＰＶＧＮＬＫＰＨ（ｃ−Ｊｕｎ）［配列番号１５］と、ＡＴＦ２のＪＮＫ結合ドメイン
ＴＮＥＤＨＬＡＶＨＫＨＫＨＥＭＴＬＫＦＧＰＡＲＮＤＳＶＩＶ（ＡＴＦ２）［配列番号１６］とを含む群から選択される少なくとも１つの（ネイティブ）アミノ酸配列を含むか、またはこれから構成されていてよい（例えば、図１Ａ〜１Ｃを参照）。これに関して、部分的に保存された８つのアミノ酸配列（例えば図１Ａを参照）が、アラインメントによって明らかにされ、ＩＢ１のＪＢＤとＩＢ２のＪＢＤとをさらに比較することによって、これら２つの配列間で高度に保存された、７つのアミノ酸および３つのアミノ酸の２つのブロックが明らかにされた。
【００５１】
他の好ましい一実施形態によれば、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、部分的に、上記で規定されたＤ−アミノ酸から構成される、または全くこれのみから構成されていてよい。より好ましくは、Ｄ−アミノ酸から構成されるこれらのＪＮＫ阻害剤配列は、上述の（ネイティブ）ＪＮＫ阻害剤配列の非ネイティブＤレトロ−インベルソ配列である。「レトロ−インベルソ配列」という用語は、配列の方向が逆であり各アミノ酸残基の対掌性が反転された、直線状のペプチド配列の異性体（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６８，７４４−７４６  （１９９４）；  Ｂｒａｄｙ
ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６８，  ６９２−６９３  （１９９４）を参照）を指す。Ｄ−鏡像異性体と逆合成とを組み合わせることの利点は、各アミド結合内のカルボニル基の位置とアミノ基の位置とが交換され、各アルファ炭素内の側鎖基の位置が維持される点である。他に特別な記載がない限り、本発明に従って使用される所定の任意のＬ−アミノ酸配列またはペプチドは、対応するネイティブＬ−アミノ酸配列またはペプチドに、逆の配列またはペプチドを合成することによって、Ｄレトロ−インベルソ配列またはペプチドに変換可能であると推測される。
【００５２】
本明細書において使用されると共に上記で規定されたＤレトロ−インベルソ配列は、種々な有用な特性を有している。例えば、本明細書において使用されるＤレトロ−インベルソ配列は、本明細書において使用されるＬ−アミノ酸配列と同じ程度、効率良く細胞の中に侵入する。その一方で、本明細書において使用されるＤレトロ−インベルソ配列は、対応するＬ−アミノ酸配列よりも安定している。
【００５３】
従って、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、アミノ酸配列ＮＨ２−Ｘｎｂ−ＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲ−Ｘｎａ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＩＢ１  ジェネリック（ｓ））［配列番号４］および／またはＸＳ／ＴＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲＸ（Ｄ−ＩＢ（ジェネリック））［配列番号２０］に記載の、少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。これに関して用いられるように、Ｘ、Ｘｎａ、およびＸｎｂは、上記で規定された通りであり（好ましくは、Ｄアミノ酸を示す）、Ｘｎｂは、好ましくは配列番号２または４に由来する残基の連続したストレッチを示す。さらに、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）  ＴＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＹＴＤ（Ｄ−ＩＢ１）［配列番号１８］を含むアミノ酸配列に記載の少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。より好ましくは、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、アミノ酸配列ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＩＢ１（ｓ））［配列番号２］に記載の少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。さらに、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）である  Ｄ−ＩＢ１（ｓ１）（ＮＨ２−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号６７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２）（ＮＨ２−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ，配列番号６８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３）（ＮＨ２−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ，配列番号６９）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ４）（ＮＨ２−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号７０）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ５）（ＮＨ２−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ，配列番号７１）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ６）（ＮＨ２−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ，配列番号７２）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ７）（ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ，配列番号７３）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ８）（ＮＨ２−ＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号７４）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ９）（ＮＨ２−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ，配列番号７５）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１０）（ＮＨ２−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ，配列番号７６）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１１）（ＮＨ２−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号７７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１２）（ＮＨ２−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ，配列番号７８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１３）（ＮＨ２−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ，配列番号７９）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１４）（ＮＨ２−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ，配列番号８０）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１５）（ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬ−ＣＯＯＨ，配列番号８１）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１６）（ＮＨ２−ＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号８２）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１７）（ＮＨ２−ＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ，配列番号８３）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１８）（ＮＨ２−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ，配列番号８４）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１９）（ＮＨ２−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号８５）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２０）（ＮＨ２−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ，配列番号８６）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２１）（ＮＨ２−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ，配列番号８７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２２）（ＮＨ２−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ，配列番号８８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２３）（ＮＨ２−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬ−ＣＯＯＨ，配列番号８９）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２４）（ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮ−ＣＯＯＨ，配列番号９０）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２５）（ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬ−ＣＯＯＨ，配列番号９１）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２６）（ＮＨ２−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮ−ＣＯＯＨ，配列番号９２）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２７）（ＮＨ２−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬ−ＣＯＯＨ，配列番号９３）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２８）（ＮＨ２−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ，配列番号９４）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２９）（ＮＨ２−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ，配列番号９５）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３０）（ＮＨ２−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ，配列番号９６）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３１）（ＮＨ２−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号９７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３２）（ＮＨ２−ＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ，配列番号９８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３３）（ＮＨ２−ＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ，配列番号９９）；および、Ｄ−ＩＢ１（ｓ３４）（ＮＨ２−ＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号１００）を含むアミノ酸配列に記載の少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。
【００５４】
本明細書において使用される、および上記で開示されたＪＮＫ阻害剤配列は、表１（配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００）に示されている。この表は、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列の名前およびその配列識別番号、その長さ、並びにアミノ酸配列を示している。さらに、表１は、例えば、配列番号１、２、５、６、９、および１１、並びに、配列番号３、４、７、８、１０、および１２の、配列とその一般式とをそれぞれ示す。表１はさらに、キメラ配列である配列番号９〜１２および２３〜３２（以下を参照）、Ｌ−ＩＢ１配列である配列番号３３〜６６、並びに、Ｄ−ＩＢ１配列である配列番号６７〜１００を開示している。
【表１−１】
2020055866.tif 000002
【表１−２】
2020055866.tif 000003
【表１−３】
2020055866.tif 000004
【表１−４】
2020055866.tif 000005
【表１−５】
2020055866.tif 000006
【表１−６】
2020055866.tif 000007
【００５５】
他の好ましい一実施形態によれば、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、上記で規定された、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のネイティブまたは非ネイティブアミノ酸配列の、少なくとも１つの改変体、断片、および／または、誘導体を含むか、またはこれから構成される。好ましくは、これらの改変体、断片、および／または、誘導体は、本明細書において使用される、上記で開示されたネイティブまたは非ネイティブのＪＮＫ阻害剤配列、特に、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のネイティブまたは非ネイティブアミノ酸配列の生物活性、すなわち、ＪＮＫを結合する、および／または、少なくとも１つのＪＮＫ活性化転写因子（例えばｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、またはＥｌｋ１）の活性化を阻害する生物活性を保持する。機能性は、種々な試験によって、例えば、ペプチドをその標的分子に結合させる試験、または、生物理学的方法（例えば、分光法、コンピュータモデリング法、構造解析法など）によって、試験され得る。特に、上記で規定された、ＪＮＫ阻害剤配列、またはその改変体、断片、および／または、誘導体は、親水性分析（例えば、Ｈｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ，  １９８１．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８  ３８２４−３８２８を参照）によって分析され得る。この親水性分析を利用して、ペプチドの疎水性領域および親水性領域を特定し、これによって、例えば結合実験または抗体合成といった実験的操作のための、基質の設計を支援することが可能である。第２の構造解析法を行って、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列の、または、その改変体、断片、および／または、誘導体の、特定の構造モチーフを想定する領域を特定してもよい（例えば、Ｃｈｏｕ
ａｎｄ  Ｆａｓｍａｎ，  １９７４，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３  ２２２−２２３を参照）。操作、翻訳、二次構造予測、親水性プロファイルおよび疎水性プロファイル、オープンリーディングフレーム予測およびプロッティング、並びに、配列相同性の決定は、当該技術分野において入手可能なコンピュータソフトウェアプログラムを用いて行うことが可能である。他の、例えば、Ｘ線結晶学（例えば、Ｅｎｇｓｔｒｏｍ，  １９７４．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  １１  ７−１３を参照）、質量分析法、およびガスクロマトグラフィー法（例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ，
１９９７，  Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ参照）、およびコンピュータモデリング法（例えば、Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｚｏｌｌｅｒ，  ｅｄｓ．，  １９８６．  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，  Ｉｎ  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹを参照）を含む構造解析法を用いてもよい。
【００５６】
従って、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の少なくとも１つの改変体を含むか、またはこれから構成されていてよい。本発明の文脈において、「配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の改変体」とは、好ましくは、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の配列のいずれかに由来する配列である。ここで、改変体は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のアミノ酸配列のアミノ酸変換を含む。このような変換は、典型的には、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のアミノ酸の１〜２０個、好ましくは１〜１０個、およびより好ましくは、１〜５個の置換、付加、および／または、欠失を含む。この場合、この改変体は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の配列のいずれかと、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはさらに９９％の配列同一性を示す。
【００５７】
上記に規定されていると共に本明細書において使用されるような、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の改変体が、特定のアミノ酸を置換することによって得られるならば、このような置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換を含む。保存的アミノ酸の置換には、グループ内の同義アミノ酸残基が含まれ得る。この同義アミノ酸残基は、十分に相似した物理化学的特性を有しているため、そのグループのメンバー間の置換では分子の生物活性が保存される（例えば、Ｇｒａｎｔｈａｍ，  Ｒ．  （１９７４），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８５，  ８６２−８６４参照）。上記で規定された配列において、特に、挿入および／または欠失が、わずかな数の、例えば２０個よりも少ない、および好ましくは１０個よりも少ないアミノ酸だけを含み、かつ機能的活性に重要なアミノ酸を除去または置き換えない場合、それらの機能を変更することなく、アミノ酸を挿入および／または欠失させることも可能であることは、当業者には明らかである。さらに、本明細書において使用される改変体においては、ホスホリラーゼ、好ましくはキナーゼに接近可能なアミノ酸の位置において、さらなるトレオニンを導く置換を回避して、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列の、または本明細書において使用されるキメラペプチドの、不活化をインビボまたはインビトロにおいて回避する必要がある。
【００５８】
好ましくは、同じグループに分類され、典型的には、保存的アミノ酸の置換によって交換可能である同義アミノ酸残基を、表２に規定する。
【表２】
2020055866.tif 000008
【００５９】
本明細書において使用される配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００の改変体の特別な形態は、本明細書において使用される配列番号１、１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の断片である。この断片は、典型的には、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００と比べて、少なくとも１つの欠失によって変換されている。好ましくは、１つの断片は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの少なくとも４つの連続したアミノ酸を含み、その長さは、典型的には、これらの配列のいずれかからのエピトープを特異的に認識するために十分な長さである。さらにより好ましくは、この断片は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００のうちのいずれかの、４〜１８個、４〜１５個、または最も好ましくは４〜１０個の連続したアミノ酸を含む。ここで、下限範囲は、４、または、５、６、７、８、９、または、１０個である。アミノ酸の欠失は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００の任意の位置において、好ましくはＮ−末端またはＣ−末端に、存在し得る。
【００６０】
さらに、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の断片は、上述のように、本明細書において使用される配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の配列のいずれかと、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはさらに９９％の配列同一性を共有する配列として規定され得る。
【００６１】
本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、上記で規定された、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の少なくとも１つの誘導体をさらに含む、またはこれから構成され得る。これに関して、「配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の誘導体」とは、好ましくは、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の配列のいずれかに由来するアミノ酸配列であり、ここで、誘導体は、（非天然アミノ酸（複数可）を形成する）少なくとも１つの修飾されたＬ−またはＤ−アミノ酸、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、およびさらにより好ましくは１〜５個の修飾されたＬ−またはＤ−アミノ酸を含む。改変体または断片の誘導体も、本発明の範囲である。
【００６２】
これに関して、「修飾されたアミノ酸」とは、例えば、種々な生物において異なるグリコシル化によって、リン酸化によって、または特異的アミノ酸を標識化することによって変換された、任意のアミノ酸であってよい。このようなラベルは、典型的には、次の（ｉ）〜（ｖｉ）から構成されるラベルの群から選択される：
（ｉ）放射性ラベル、すなわち、放射性リン酸化、または硫黄、水素、炭素、窒素などによる放射性ラベル、
（ｉｉ）着色された色素（例えば、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ）など）、（ｉｉｉ）蛍光基（例えば、フルオレセインなど）、
（ｉｖ）化学発光基、
（ｖ）固相における固定化のための基（例えば、Ｈｉｓタグ、ビオチン、ｓｔｒｅｐタグ、ｆｌａｇタグ、抗体、抗原など）、および、
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）のもとに記載したラベルのうちの２つ以上のラベルの組み合わせ。
【００６３】
これに関して、本発明の照会アミノ酸配列と少なくとも、例えば９５％の「配列同一性を共有する」配列を有するアミノ酸配列とは、対象となるアミノ酸配列が、照会アミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり最大５つのアミノ酸の変換を含み得ることを除いて、照会配列と同一であることを意味することを意図するものである。換言すると、照会アミノ酸配列と少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸配列を得るためには、対象となる配列のアミノ酸残基の最大５％（１００個のうちの５個）に、別のアミノ酸が挿入若しくは置換されているか、または対象となる配列のアミノ酸残基の最大５％（１００個のうちの５個）が欠失されていてもよい。
【００６４】
正確に対応してない配列では、第１の配列の「％同一性」は、第２の配列に対して決定され得る。概して、比較されるこれら２つの配列は、配列間の最大相関性を提供するように、位置合わせされている。これは、１つまたは両方の配列に、「ギャップ」を挿入して、アラインメントの程度を強化することを含み得る。その後、％同一性は、特に同一または類似の長さの配列に適した、比較される各配列の全長にわたって（いわゆるグローバルアラインメント）決定されるか、または、不等の長さにより適した、かなり短い、規定の長さにわたって（いわゆるローカルアラインメント）決定され得る。
【００６５】
特に本明細書において使用される、２つ以上の配列の同一性および相同性を比較する方法は、当該技術において周知である。すなわち、例えば、ウィスコンシン配列分析パッケージ，バージョン９．１において入手可能なプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２，  ３８７−３９５）である、例えば、プログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを用いて、２つのポリヌクレオチド間の％同一性、および、２つのポリペプチド配列間の％同一性および％相同性を決定することが可能である。ＢＥＳＴＦＩＴは、（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  （１９８１），  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １４７，  １９５−１９７）の「局所的相同性」アルゴリズムを用い、２つの配列間の単一の最も類似した領域を発見するものである。配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムも、当該技
術では公知である。例えば、ＮＣＢＩのホームページであるワールドワイド・ウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を介してアクセス可能なプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５，  ４０３−４１０）のＢＬＡＳＴファミリー、および、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  （１９９０），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８３，  ６３−９８；  Ｐｅａｒｓｏｎ
ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  （１９８８），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ  ８５，  ２４４４−２４４８）である。
【００６６】
本発明に従って用いられると共に上記で規定されたＪＮＫ−阻害剤配列は、当該技術分野において周知の方法、例えば、化学合成法によって、または以下に説明する遺伝子工学法によって、得られる、または生成され得る。例えば、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列の一部に相当する、該ＪＮＫ阻害剤配列の所望の領域を含むペプチド、または、所望の活性をインビトロまたはインビボで媒介するペプチドは、ペプチドシンセサイザを使用することによって合成可能である。
【００６７】
本明細書で用いられると共に上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列はまた、本明細書で用いられると共に上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列が、細胞の中に効率良く輸送されることを可能にする輸送配列によって修飾され得る。このような修飾されたＪＮＫ阻害剤配列は、好ましくは、キメラ配列として提供および使用される。
【００６８】
従って、第２の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの第１のドメインおよび少なくとも１つの第２のドメインを含むキメラペプチドを、被験体における、上記で規定されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を処置するための薬剤組成物を調製するために、使用することを提供する。ここで、キメラペプチドの第１のドメインは、輸送配列を含むが、キメラペプチドの第２のドメインは、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列、好ましくは配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列、またはその誘導体若しくは断片を含む。
【００６９】
典型的には、本発明に従って用いられるキメラペプチドは、少なくとも２５個の長さのアミノ酸残基、例えば、２５〜２５０個の長さのアミノ酸残基、より好ましくは、２５〜２００個の長さのアミノ酸残基、さらにより好ましくは２５〜１５０個の長さのアミノ酸残基、２５〜１００個の長さのアミノ酸残基、および最も好ましくは２５〜５０個の長さのアミノ酸残基を有している。
【００７０】
本明細書において使用されるキメラペプチドは、第１のドメインとして、好ましくは、輸送配列を含む。輸送配列は、典型的には、（該輸送配列が存在する）ペプチドを所望の細胞目的地に向けるアミノ酸の任意の配列から選択されている。従って、本明細書において使用されるような輸送配列は、典型的には、ペプチドを、形質膜を横切って、例えば、細胞の外側から形質膜を通って、細胞質へと向ける。代わりにまたは追加的に、輸送配列は、ペプチドを、細胞内の所望の位置、例えば、核、リボソーム、小胞体（ＥＲ）、リソソーム、またはペルオキシソームに向けることも可能である。これは、例えば、２つの成分（例えば、細胞透過性のための成分と、核の位置のための成分と）を混合することによって、または、例えば、細胞膜を輸送する特性、および標的とされた、例えば核内輸送を行う特性を有する、単一の成分によって行うことが可能である。輸送配列は、さらに、細胞質成分または細胞の他の任意の成分若しくは区画（例えば、小胞体、ミトコンドリア、ゴルジ装置（ｇｌｏｏｍ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）、リゾソーマル小胞）を結合することが可能な他の成分を含み得る。従って、例えば、第１のドメインの輸送配列および第２のドメインのＪＮＫ阻害剤配列は、細胞質、または、細胞の他の任意の区画に局在化され得る。これによって、取り込まれると、細胞におけるキメラペプチドの局在性を決定することが可能である。
【００７１】
好ましくは、輸送配列（本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる）は、５〜１５０個の長さのアミノ酸配列、より好ましくは、５〜１００個の長さの、および最も好ましくは５〜５０個、５〜３０個、またはさらに５〜１５個の長さのアミノ酸を有している。
【００７２】
より好ましくは、（本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる）輸送配列は、第１のドメイン内に、連続したアミノ酸配列ストレッチとして生じることも可能である。あるいは、第１のドメイン内の輸送配列は、２つ以上の断片に分割されていてもよい。この場合、これらの断片の全ては、輸送配列全体と類似しており、輸送配列自体が上記で開示されたような担体特性を保持している限り、１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸によって互いに分離されていてよい。輸送配列の断片を分離させるこれらのアミノ酸は、例えば、輸送配列とは異なるアミノ酸配列から選択されていてよい。あるいは、第１のドメインは、１つより多い成分から構成される輸送配列を含み得、各成分は、第２のドメインのカーゴＪＮＫ阻害剤配列を、例えば、特定の細胞の区画に輸送するそれ自身の機能を有し得る。
【００７３】
上記で規定された輸送配列は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または両者の組み合わせから構成されていてよい。好ましくは、（本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる）輸送配列は、少なくとも１またはさらに２個、好ましくは少なくとも３、４または５個、より好ましくは少なくとも６、７、８、または９個、およびさらにより好ましくは少なくとも１０個またはそれより多くの、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸を含んでいてよい。ここで、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸は、ＪＮＫ輸送配列内に、ブロック状、非ブロック状、または、交互になった様式に配置されていてよい。
【００７４】
代替の一実施形態によれば、本明細書において使用されるキメラペプチドの輸送配列は、Ｌ−アミノ酸のみから構成されていてよい。より好ましくは、本明細書において使用されるキメラペプチドの輸送配列は、上に規定されるとおりの、少なくとも１つの「ネイティブ」輸送配列を含むか、またはこれから構成されている。これに関して、「ネイティブ」という用語は、全体的にＬ−アミノ酸から構成された変換されていない輸送配列を指す。
【００７５】
他の代替の実施形態によれば、本明細書において使用されるキメラペプチドの輸送配列は、Ｄ−アミノ酸のみから構成されていてよい。より好ましくは、本明細書において使用されるキメラペプチドの輸送配列は、上記で示された配列のＤレトロ−インベルソペプチドを含んでいてよい。
【００７６】
本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメインの輸送配列は、天然に存在する源から得られ得るか、または、遺伝子工学技術または化学合成法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．を参照）を用いて生成可能である。
【００７７】
第１のドメインの輸送配列には、例えば、天然蛋白質、例えばＴＡＴ蛋白質（例えば米国特許第５，８０４，６０４号および同第５，６７４，９８０号に記載されているとおりであり、これらの文献の各々は、参照により本明細書に組み込まれる）、ＶＰ２２（ＷＯ第９７／０５２６５号；Ｅｌｌｉｏｔｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，  Ｃｅｌｌ  ８８    ２２３−２３３  （１９９７）  に記載されている）、非−ウイルス蛋白質（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９  １０６９１−１０６９５  （１９９２））を含むソースを用いてもよい。輸送配列は、アンテナぺディア（例えば、アンテナぺディア担体配列）に由来するか、または塩基性ペプチド（例えば、５〜１５個の長さのアミノ酸、好ましくは１０〜１２個の長さのアミノ酸を有すると共に、少なくとも８０％、より好ましくは、８５％、またはさらに９０％の、例えばアルギニン、リジン、および／または、ヒスチジンなどの塩基性アミノ酸を含むペプチド）に由来する。さらに、輸送配列として用いられる天然蛋白質のうちの１つについての改変体、断片、および誘導体をともに本明細書に開示する。改変体、断片、および誘導体に関しては、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列について上に示した規定を参照されたい。これに応じて、改変体、断片、および誘導体は、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列について上記したように規定される。特に、輸送配列との関係では、改変体または断片または誘導体は、上記で規定された輸送配列として用いられる天然蛋白質のうちの１つと、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはさらに９９％の配列同一性を共有する配列として規定され得る。
【００７８】
本明細書において使用されるキメラペプチドの好ましい一実施形態では、第１のドメインの輸送配列は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１  ＴＡＴ蛋白質に由来する配列、特に、ＴＡＴ蛋白質を構成する８６アミノ酸のうちの幾つかまたは全てを含むか、またはこれから構成されている。
【００７９】
（本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる）輸送配列では、ＴＡＴ蛋白質の機能的に有効な断片を形成する、すなわち、細胞内への侵入および取り込みを媒介する領域を含むＴＡＴペプチドを形成する、全長ＴＡＴ蛋白質の部分配列が用いられ得る。このような配列がＴＡＴ蛋白質の機能的に効果的な断片であるかどうかについては、公知の技術（例えば、Ｆｒａｎｋｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ，  ＵＳＡ  ８６    ７３９７−７４０１  （１９８９）を参照）を用いて決定可能である。従って、本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメインにおける輸送配列は、ＴＡＴ蛋白質配列の機能的に有効な断片または一部に由来していてよい。この機能的に有効な断片または一部は、８６個よりも少ないアミノ酸を含み、細胞内への取り込み、および任意により、細胞核内への取り込みを示す。より好ましくは、担体として用いられ、キメラペプチドを、細胞膜を横切って浸透させることを媒介する、ＴＡＴの部分配列（断片）は、全長ＴＡＴの塩基性の領域（アミノ酸４８〜５７個、または４９〜５７個）を含むように意図されている。
【００８０】
より好ましい一実施形態によれば、（本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる）輸送配列は、ＴＡＴ残基４８〜５７または４９〜５７、および最も好ましくはジェネリックＴＡＴ配列ＮＨ２−Ｘｎｂ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ジェネリック−ＴＡＴ（ｓ））［配列番号７］、および／または、ＸＸＸＸＲＫＫＲＲＱ  ＲＲＲＸＸＸＸ（Ｌ−ジェネリック−ＴＡＴ）［配列番号２１］を含むアミノ酸配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。ここで、ＸまたはＸｎｂは、上記で規定された通りである。さらに、配列番号８の「Ｘｎｂ」残基の数は、示されている数に制限されず、上述のように変動し得る。あるいは、本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる輸送配列は、例えば、アミノ酸配列ＮＨ２−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＴＡＴ）［配列番号５］を含むペプチドを含むか、またはこれから構成され得る。
【００８１】
他のより好ましい一実施形態によれば、（本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる）輸送配列は、上記に示された配列のＤレトロ−インベルソペプチドを含むことが可能であり、すなわち、配列ＮＨ２−Ｘｎｂ−ＲＲＲＱＲＲＫＫ
Ｒ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ジェネリック−ＴＡＴ（ｓ））［配列番号８］、および／または、ＸＸＸＸＲＲＲＱＲＲＫＫＲＸＸＸＸ（Ｄ−ジェネリック−ＴＡＴ）［配列番号２２］を有するジェネリックＴＡＴ配列のＤレトロ−インベルソ配列を含むことが可能である。ここでも、Ｘｎｂは上記で規定された通りである（好ましくはＤアミノ酸を示す）。さらに、配列番号８内の「Ｘｎｂ」残基の数は、示されている数に制限されず、上述のように変動し得る。最も好ましくは、本明細書において使用される輸送配列は、Ｄレトロ−インベルソ配列ＮＨ２−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＴＡＴ）［配列番号６］を含んでいてよい。
【００８２】
他の一実施形態によれば、本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる輸送配列は、上記で規定された輸送配列の改変体を含むか、またはこれから構成されていてよい。「輸送配列の改変体」は、好ましくは、上記で規定された輸送配列に由来する配列であり、ここで改変体は、上記で規定された輸送配列内に存在する少なくとも１つのアミノ酸の修飾を含む。修飾の例には、付加、（断片を導く）（内部）欠失、および／または、置換が含まれる。このような修飾（複数可）は、アミノ酸の、典型的には１〜２０個、好ましくは１〜１０個、およびより好ましくは１〜５個の、置換、付加、および／または、欠失を含む。さらに、改変体は、好ましくは、上記で規定された輸送配列と、より好ましくは配列番号５〜８、または２１〜２２のいずれかと、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはさらに９９％の配列相同性を示す。
【００８３】
好ましくは、本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる、このような輸送配列の修飾は、安定性が増大された、または、低減された輸送配列をもたらす。あるいは、輸送配列の改変体は、本明細書において使用されるキメラペプチドの細胞内の局在化を調節するように設計されていてよい。外因的に付加される場合、上記で規定されたこのような改変体は、典型的には、細胞に侵入するという輸送配列の能力が保持されるように（すなわち、輸送配列の改変体の細胞内への取り込みは、輸送配列として用いられるネイティブ蛋白質の取り込みと実質的に類似するように）設計されている。例えば、核局在化にとって重要であると考えられていた塩基性領域の変換（例えば、Ｄａｎｇ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４  １８０１９−１８０２３  （１９８９）；  Ｈａｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６３    １１８１−１１８７  （１９８９）  ；  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６３  １−８  （１９８９）を参照）は、結果的に、輸送配列の、従って本明細書において使用されるキメラペプチドの成分としてのＪＮＫ阻害剤配列の、細胞質位置または部分的に細胞質位置を生じさせ得る。これに加えて、例えばコレステロールまたは他の脂質成分を輸送配列に連結させて、例えば、膜可溶性が高い輸送配列を生成することによって、さらなる修飾を改変体内に導入することも可能である。本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる輸送配列の、上記に開示した改変体のいずれかは、典型的には当業者に公知の技術を用いて生成可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．を参照）。
【００８４】
第２のドメインとして、本明細書において使用されるキメラペプチドは、典型的には、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列のいずれかから選択されたＪＮＫ阻害剤配列（これらのＪＮＫ阻害剤配列の改変体、断片、および／または、誘導体を含む）を含む。
【００８５】
両方のドメイン、すなわち、本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン（複数可）および第２のドメイン（複数可）は、機能ユニットを形成するように連結され得る。第１のドメイン（複数可）と第２のドメイン（複数可）とを連結する、一般に、当該技術分野において公知の任意の方法を用いてもよい。
【００８６】
一実施形態によれば、本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン（複数可）および第２のドメイン（複数可）は、共有結合によって連結されていることが好ましい。本明細書において規定される共有結合は、例えば、上記で規定されたキメラペプチドを、融合蛋白質として発現することによって得られ得るペプチド結合であってよい。本明細書に記載される融合蛋白質は、以下に説明する標準的な組み換えＤＮＡ技術と類似の方法、または該技術から容易に適合可能な方法で、形成および使用可能である。しかしながら、両方のドメインは、側鎖を介して連結されていてもよいし、または、化学的リンカー部分によって連結されていてもよい。
【００８７】
本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメインおよび／または第２のドメインは、該キメラペプチド内の１つ以上のコピーにおいて生じ得る。両方のドメインが単一のコピーで存在するならば、第１のドメインは、第２のドメインのＮ−末端またはＣ−末端のいずれかに連結されていてよい。複数のコピーで存在するならば、第１のドメイン（複数可）および第２のドメイン（複数可）は、可能な任意の順番に配置されていてよい。例えば、第１のドメインは、本明細書において使用されるキメラペプチド内に、複数のコピーの数で、例えば、２、３、またはそれより多くのコピーで、存在していてよく、これらのコピーは、連続する順番で配置されていることが好ましい。次いで、第２のドメインは、第１のドメインを含む配列のＮ−末端またはＣ末端において生じる単一のコピーで存在し得る。あるいは、第２のドメインが、複数のコピー数で、例えば、２、３、またはそれより多くのコピーで存在し得、第１のドメインが、単一のコピーで存在し得る。これらの両方のどちらか一方によれば、第１のドメイン（複数可）および第２のドメイン（複数可）は、連続した配置における任意の位置をとることが可能である。典型的な配置を以下に示す：例えば、第１のドメイン‐第１のドメイン‐第１のドメイン‐第２のドメイン、第１のドメイン‐第１のドメイン‐第２のドメイン‐第１のドメイン、第１のドメイン‐第２のドメイン‐第１のドメイン‐第１のドメイン、または、例えば、第２のドメイン‐第１のドメイン‐第１のドメイン‐第１のドメイン。これらの例は説明のためであって、本発明の範囲がこれらの例に限定されるものではないことを、当業者は明確に理解できよう。従って、コピーおよび配置の数は、当初に規定したように変化し得る。
【００８８】
好ましくは、第１のドメイン（複数可）および第２のドメイン（複数可）は、任意のリンカー無しに互いに直接連結されていてもよい。あるいは、これらは、１〜１０、好ましくは１〜５のアミノ酸を含むリンカー配列を介して互いに連結されていてもよい。リンカー配列を形成するアミノ酸は、アミノ酸残基としてのグリシンまたはプロリンから選択されていることが好ましい。より好ましくは、第１のドメイン（複数可）および第２のドメイン（複数可）は、第１のドメイン（複数可）と第２のドメイン（複数可）との間の２つ、３つ、またはそれより多くのプロリン残基のヒンジによって互いに分離されていてよい。
【００８９】
上記で規定され本明細書において使用される、少なくとも１つの第１のドメインおよび少なくとも１つの第２のドメインを含むキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはこれら両方の組み合わせから構成されていてよい。ここでは、各ドメイン（および用いられるリンカー）は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはこれら両方の組み合わせ（例えば、Ｄ−ＴＡＴとＬ−ＩＢ１（複数可）との組み合わせ、または、Ｌ−ＴＡＴとＤ−ＩＢ１（複数可）との組み合わせなど）から構成されていてよい。好ましくは、本明細書において使用されるキメラペプチドは、少なくとも１またはさらに２個、好ましくは少なくとも３、４、または５個、より好ましくは少なくとも６、７、８、または９個、およびさらにより好ましくは少なくとも１０個またはそれより多くの、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸を含んでいてよい。ここで、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸は、本明細書において使用されるキメラペプチド内に、ブロック状、非ブロック状、または交互になった様式に、配置されていてよい。
【００９０】
具体的な一実施形態によれば、本明細書において使用されるキメラペプチドは、ジェネリックＬ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドＮＨ２−Ｘｎｂ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｘｎｂ−Ｘｎａ−ＲＰＴＴＬＸＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ（ジェネリック）（ｓ））［配列番号１０］に記載のＬ−アミノ酸キメラペプチドを含むか、またはこれから構成されており、ここで、Ｘ、Ｘｎａ、およびＸｎｂは、好ましくは、上記で規定された通りである。より好ましくは、本明細書において使用されるキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸キメラペプチドＮＨ２−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ））［配列番号９］を含むか、またはこれから構成される。代わりにまたは追加的に、本明細書において使用されるキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸キメラペプチド配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ  ＰＰＤＴＹＲＰＫＲＰ  ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ  ＲＳＱＤＴ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１）［配列番号２３］、または、ＸＸＸＸＸＸＸＲＫＫ  ＲＲＱＲＲＲＸＸＸＸ  ＸＸＸＸＲＰＴＴＬＸ  ＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤ  Ｓ／ＴＸ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢジェネリック）［配列番号２４］を含むか、またはこれから構成されており、ここでも、Ｘは、好ましくは上記で規定された通りである。あるいは、本明細書において使用されるキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸キメラペプチド配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ１））［配列番号２７］、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＸｎｃＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ２））［配列番号２８］、または、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＸｎｃＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ３））［配列番号２９］を含むか、またはこれから構成される。これに関して、各Ｘは、典型的には、上記で規定されたアミノ酸残基を示し、より好ましくは、Ｘｎｃは、ペプチド残基の連続したストレッチを示し（各Ｘは、互いに無関係に、グリシンまたはプロリンから選択されている）、例えば、単調なグリシンストレッチ、または単調なプロリンストレッチを示す。ここで、ｎ（Ｘｎｃの繰り返しの数）は、典型的には、０〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０、またはさらにはそれより多く、好ましくは０〜５または５〜１０である。Ｘｎｃは、Ｄアミノ酸またはＬアミノ酸のいずれかを示す。
【００９１】
代替の具体的な一実施形態によれば、本明細書において使用されるキメラペプチドは、上記で開示されたＬ−アミノ酸キメラペプチドのＤ−アミノ酸キメラペプチドを含むか、またはこれから構成される。本発明に記載の典型的なＤレトロ−インベルソキメラペプチドは、例えば、ジェネリックＤ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドＮＨ２−Ｘｎｂ−ＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲ−Ｘｎａ−Ｘｎｂ−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ（ジェネリック）（ｓ））［配列番号１２］である。ここで、Ｘ、Ｘｎａ、およびＸｎｂは、好ましくは、上記で規定された通りである（好ましくは、Ｄアミノ酸を示す）。より好ましくは、本明細書において使用されるキメラペプチドは、ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ））［配列番号１１］に記載のＤ−アミノ酸キメラペプチドを含むか、またはこれから構成される。代わりにまたは追加的に、本明細書において使用されるキメラペプチドは、Ｄ−アミノ酸キメラペプチド配列ＴＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＹＴＤＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１）［配列番号２５］、または、ＸＴ／ＳＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲＸＸＸＸＸＸＸＸＲＲＲＱＲＲＫＫＲＸＸＸＸＸＸＸ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢジェネリック）［配列番号２６］を含むか、またはこれから構成されるか（ここでも、Ｘは、好ましくは、上記で規定された通りである）、または、本明細書において使用されるキメラペプチドは、Ｄ−アミノ酸キメラペプチド配列ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ１））［配列番号３０］、ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＸｎｃＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ２））［配列番号３１］、または、ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＸｎｃＲＲＲＱＲＲＫＫＲ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ３））［配列番号３２］を含むか、またはこれから構成される。Ｘｎｃは、上記で規定された通りであってよい。
【００９２】
上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメイン（複数可）および第２のドメイン（複数可）は、当該技術において公知の任意の好適な方法で行われる化学的または生化学的結合によって、例えば、第１のドメイン（複数可）と第２のドメイン（複数可）との間にペプチド結合を形成することによって、例えば第１のドメイン（複数可）および第２のドメイン（複数可）を、融合蛋白質として発現することによって、または、例えば上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメイン（複数可）と第２のドメイン（複数可）とを架橋させることによって、互いに連結され得る。
【００９３】
上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメイン（複数可）と第２のドメイン（複数可）とを化学的に架橋させるために適した公知の多くの方法は、非特異的であり、すなわち、これらの方法は、結合点を、輸送ポリペプチドまたはカーゴ高分子上の任意の特定の部位に向かわせない。結果として、非特異的な架橋剤の使用は、機能的部位に作用する、または、活性部位を立体的に遮断して、複合蛋白質を生物学的に不活性にし得る。したがって、第１のドメイン（複数可）と第２のドメイン（複数可）とをさらに特異的に結合することが可能な、このような架橋法を用いることが好ましい。
【００９４】
これに関して、結合特異性を増大させる１つの方法は、架橋される第１のドメイン（複数可）および第２のドメイン（複数可）の一方または両方に、１回または数回だけ存在する官能基に、直接化学的に結合させることである。例えば、チオール基を含有する唯一の蛋白質アミノ酸であるシステインは、多くの蛋白質において数回だけ生じる。また、例えば、ポリペプチドが、リジン残基を含まない場合、第一級アミンに特異的な架橋剤は、このポリペプチドのアミノ末端にとって選択的である。結合特異性を増大させるためにこの方法の使用を成功させるには、ポリペプチドが、分子の生物活性を失うことなく変更させることが可能な分子の領域において、好適な程度の稀な且つ反応性の残基を有していることが求められる。システイン残基は、システイン残基が架橋反応に関与すると生物活性を妨げる傾向があるポリペプチド配列の一部に生じた場合には、置き換えてもよい。システイン残基を置き換える場合、典型的には、ポリペプチドの折り畳みに結果として生じる変化を最小化することが望ましい。ポリペプチドの折り畳みにおける変化は、この置き換えがシステインに化学的且つ立体的に類似している場合に、最小化される。こういった理由のため、システインの置き換えとしては、セリンが好ましい。以下の実施例において示すように、システイン残基を、架橋のために、ポリペプチドのアミノ酸配列の中に導入し得る。システイン残基を導入するときには、アミノ末端若しくはカルボキシ末端における導入、または、アミノ末端若しくはカルボキシ末端の近傍への導入が好ましい。従来の方法は、このようなアミノ酸配列修飾の場合に利用可能であり、ここで、対象となるポリペプチドは、化学合成によってまたは組換えＤＮＡの発現を介して、生成される。
【００９５】
上記で規定され本明細書において使用される、キメラペプチドの第１のドメイン（複数可）と第２のドメイン（複数可）との結合は、カップリング剤または結合剤（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）によって行うことも可能である。利用可能な分子間架橋剤が幾つか存在する（例えば、Ｍｅａｎｓ  ａｎｄ  Ｆｅｅｎｅｙ，  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，  Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ，  １９７４，  ｐｐ．  ３９−４３を参照）。これらの分子間架橋剤には、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）またはＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド（これらは両方とも、スルフヒドリル基に高度に特異的であり、不可逆リンケージを形成する）や、Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）または（スルフヒドリル基に比較的特異的である）６〜１１の炭素メチレンブリッジを有する他のそのような架橋剤、および、（アミノ基およびチロシン基と不可逆リンケージを形成する）１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンがある。この目的のために有用な他の架橋剤には、アミノ基およびフェノール基と不可逆性の架橋を形成するｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン）、（アミノ基に特異的な）アジプイミド酸ジメチル、（主にアミノ基と反応する）フェノール−１，４ジスルホニルクロリド、ヘキサメチレンジイソシアネート、若しくは（主にアミノ基と反応する）ジイソチオシアネート、またはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート、（幾つかの種々の側鎖と反応する）グルタルアルデヒド、および（チロシンおよびヒスチジンと主に反応する）ジスジアゾベンジジン（ｄｉｓｄｉａｚｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）が含まれる。
【００９６】
上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメイン（複数可）と第２のドメイン（複数可）とを架橋させるために用いられる架橋剤は、ホモ二機能性であってよく、すなわち、同じ反応をする２つの官能基を有している。好ましいホモ二機能性架橋剤は、ビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）である。ＢＭＨは、マイルドな条件（ｐＨ６．５〜７．７）下でスルフヒドリル−含有化合物と特異的に反応する２つのマレイミド官能基を含有する。これらの２つのマレイミド基は、炭化水素鎖によって接続されている。従って、ＢＭＨは、システイン残基を含むポリペプチドを不可逆架橋させるために有用である。
【００９７】
上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメイン（複数可）と第２のドメイン（複数可）とを架橋させるために用いられる架橋剤はまた、ヘテロ二機能性であってもよい。ヘテロ二機能性架橋剤は、２つの異なる官能基、例えば、アミン−反応性基およびチオール−反応性基を有している。これらの官能基は、遊離アミンおよびチオールを有する２つの蛋白質とを架橋させる。ヘテロ二機能性架橋剤の例には、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（「ＭＢＳ」）、および、ＭＢＳの伸長鎖アナログであるスクシンイミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（「ＳＭＰＢ」）がある。これらのクロスリンカーのスクシンイミジル基は、第一級アミンと反応し、チオール−反応性マレイミドは、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。
【００９８】
上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメイン（複数可）と第２のドメイン（複数可）とを架橋させるために好適な架橋剤は、水溶性が低い場合が多い。従って、その水溶性を改善するために、スルホン酸基といった親水性の部分が架橋剤に付加される。これに関して、水溶性について改変された架橋剤の例は、スルホ−ＭＢＳおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、これらを、本発明に従って用いてもよい。
【００９９】
同様に、多くの架橋剤は、基本的には、細胞条件下では開裂不可能なコンジュゲートを実現する。しかし、上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメイン（複数可）と第２のドメイン（複数可）とを架橋させることに特に適した幾つかの架橋剤は、細胞条件下で開裂させることが可能な、ジスルフィドなどの共有結合を含む。例えば、トラウト試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（「ＤＳＰ」）、および、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（「ＳＰＤＰ」）が、周知の開裂可能なクロスリンカーである。開裂可能な架橋剤の使用は、カーゴ部分を標的細胞内に送達した後に、輸送ポリペプチドから分離させることを可能にする。直接的なジスルフィドリンケージも有用であり得る。
【０１００】
上記で論じた架橋剤を含む多くの架橋剤が、市販されている。これらの使用のための詳細な指示は、商業的供給元から容易に入手可能である。蛋白質架橋およびコンジュゲート調製に関して一般的に参照されるのは、「Ｗｏｎｇ，  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳＬＩＮＫＩＮＧ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９１）」である。
【０１０１】
上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメイン（複数可）と第２のドメイン（複数可）とを化学的に架橋させることは、スペーサーアームの使用を含み得る。スペーサーアームは、分子内たわみ性を提供するか、または、コンジュゲートした部分間の分子内距離を調節し、これによって、生物活性を保持することを補助し得る。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸、例えば、プロリンを含むポリペプチド部分の形をしていて良い。あるいは、スペーサーアームが、「長鎖ＳＰＤＰ」（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．，
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ．，  ｃａｔ．  Ｎｏ．  ２１６５１  Ｈ）におけるなど、架橋剤の一部であってよい。
【０１０２】
さらに、上記で開示されたキメラペプチドのうちの１つについての改変体、断片、または誘導体をここで、用いてもよい。断片および改変体に関しては、一般に、ＪＮＫ阻害剤配列に関して上に記載した規定が参照される。
【０１０３】
特に、本発明の関連では、「キメラペプチドの改変体」とは、好ましくは、配列番号９〜１２および２３〜３２に記載の配列のいずれかに由来する配列である。ここで、キメラ改変体は、本明細書において使用される、配列番号９〜１２および２３〜３２に記載のキメラペプチドのアミノ酸変換を含む。このような変換は、典型的には、配列番号９〜１２および２３〜３２に記載のアミノ酸の、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、およびより好ましくは１〜５個の置換、付加、および／または、（断片をもたらす）欠失を含む。ここで、本明細書において使用される、変換されたキメラペプチドは、配列番号９〜１２および２３〜３２に記載の配列のいずれかと、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、または９５％、９８％、またはさらに９９％の配列同一性を示す。好ましくは、これらの改変体は、本明細書において使用されるキメラペプチドに含まれる第１のドメイン（複数可）および第２のドメイン（複数可）の生物活性を保持する。すなわち、上記で開示された第１のドメインの輸送活性と、第２のドメインの、ＪＮＫを結合するため、および／または、少なくとも１つのＪＮＫ活性化転写因子の活性化を阻害するための活性とを保持する。
【０１０４】
従って、本明細書において使用されるキメラペプチドはまた、上記で開示されたキメラペプチドの断片、特に、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかに記載のキメラペプチド配列の断片を含む。従って、本発明の関連において、「キメラペプチドの断片」とは、好ましくは、配列番号９〜１２および２３〜３２に記載の配列のいずれかに由来する配列である。ここで、断片は、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかの少なくとも４つの連続したアミノ酸を含む。この断片は、好ましくは、これらの配列のいずれかからのエピトープを特異的に認識することを十分に可能にすると共に、当該配列を細胞、核、またはさらなる所望の位置の中まで輸送するのに十分な長さを含む。さらにより好ましくは、断片は、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかの、４〜１８個、４〜１５個、または最も好ましくは４〜１０個の連続したアミノ酸を含む。本明細書において使用されるキメラペプチドの断片はさらに、配列番号９９〜１２および２３〜３２のいずれかに記載の任意の配列のいずれかと、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、または９５％、９８％、またはさらに９９％の配列同一性を共有する配列と規定され得る。
【０１０５】
最終的に、本明細書において使用されるキメラペプチドはまた、上記で開示されたキメラペプチドの誘導体、特に、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかに記載のキメラペプチド配列の誘導体を含む。
【０１０６】
本発明はさらに、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列、上記で規定されたすべての、キメラペプチドもしくはそれらの断片、改変体、または誘導体をコードする核酸配列の、被験体における、上記に規定されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を処置するための薬剤組成物を調製するための、使用に関する。本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列をコードする好ましい好適な核酸は、典型的には、ヒトＩＢ１核酸（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（ＡＦ０７４０９１）、ラットＩＢ１核酸（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１０８９５９）、若しくはヒトＩＢ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２１８７７８）から、または、上記で規定された配列のうちのいずれかをコードする任意の核酸配列、すなわち、配列番号１〜２６に記載の任意の配列から、選択される。
【０１０７】
本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列をコードする核酸、または本明細書において使用されるキメラペプチドをコードする核酸は、当該技術分野において公知の任意の方法によって（例えば、配列の３’−末端および５’−末端にハイブリダイゼーション可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、および／または、所定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチド配列を用いて、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーからクローニングすることによって）、得られ得る。
【０１０８】
さらに、本明細書には、ストリンジェントな条件において、上記で規定された（ネイティブ）ＪＮＫ阻害剤配列またはキメラペプチドをコードする適切な鎖とハイブリダイズする核酸配列も開示される。好ましくは、このような核酸配列は、特異的なハイブリダイゼーションを十分に可能にする長さを有する、少なくとも６つの（連続した）核酸を含む。より好ましくは、このような核酸配列は、６〜３８、さらにより好ましくは６〜３０、および最も好ましくは６〜２０または６〜１０の（連続した）核酸を含む。
【０１０９】
「ストリンジェントな条件」とは、配列に依存しており、異なる環境下では異なる。該して、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨにおける、特異的配列の熱融点（ＴＭ）よりも約５℃低く選択されていてよい。ＴＭは、標的配列の５０％が、完全に適合するプローブにハイブリダイズする温度（所定のイオン強度およびｐＨ下）である。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩の濃度がｐＨ７において少なくとも約０．０２モル濃度であり、温度が少なくとも約６０℃である条件である。他の因子が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー（特に、塩基組成、および相補鎖のサイズを含む）、有機溶媒の存在、および塩基のミスマッチの範囲に影響を与え得るので、任意のパラメータの絶対測定値よりも、パラメータの組み合わせがより重要である。
【０１１０】
「高ストリンジェンシー条件」とは、次のステップを含んでいてよい。例えば、ステップ１では、ＤＮＡを含むフィルターを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．０２％のＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡから構成される緩衝剤中で、６５℃で８時間から一晩にわたって前処理する。ステップ２では、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ−標識プローブを加えた、上述の事前のハイブリダイゼーション混合物において、フィルターを６５℃で４８時間ハイブリダイズする。ステップ３では、２×ＳＳＣ、０．０１％のＰＶＰ、０．０１％のフィコール、および０．０１％のＢＳＡを含む溶液において、フィルターを３７℃で１時間洗浄する。この後、０．１×ＳＳＣにおける洗浄を、５０℃で４５分間行う。ステップ４では、フィルターを、オートラジオグラフィーに曝す。高ストリンジェンシーの、使用可能な他の条件は、当該技術分野において周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，
（ｅｄｓ．），  １９９３，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ；  ａｎｄ  Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，  １９９０，  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹを参照）。
【０１１１】
「中程度のストリンジェンシー条件」とは、次のステップを含んでいてよい。ステップ１では、ＤＮＡを含むフィルターを、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％のＳＤＳ、および１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、５５℃で６時間前処理する。ステップ２では、同じ溶液に、５〜２０×１０６ｃｐｍ  ３２Ｐ−標識プローブを加えたものにおいて、フィルターを５５℃で１８〜２０時間ハイブリダイズする。ステップ３では、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む溶液において、フィルターを３７℃で１時間洗浄し、その後、１×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳを含む溶液において６０℃で３０分間洗浄することを、２回行う。ステップ４では、フィルターをドライブロッティングして、オートラジオグラフィーに曝す。中程度のストリンジェンシーの、使用可能な他の条件は、当該技術分野において周知である（例えば、「Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ．），  １９９３，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ；
および  Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，  １９９０，  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ
Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ」を参照）。
【０１１２】
最後に、「低ストリンジェンシー条件」には、次のステップを含むことが可能である。ステップ１では、ＤＮＡを含むフィルターを、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＶＰ、０．１％のフィコール、１％のＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液において、４０℃で６時間前処理する。ステップ２では、同じ溶液に、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の硫酸デキストラン、および５〜２０×１０６ｃｐｍ  ３２Ｐ−標識プローブを加えたものにおいて、フィルターを４０℃で１８〜２０時間ハイブリダイズする。ステップ３では、フィルターを、２×ＳＳＣ、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．１％のＳＤＳを含む溶液において、５５℃で１．５時間洗浄する。この洗浄溶液を、新鮮な溶液で置き換え、６０℃においてさらに１．５時間インキュベートする。ステップ４では、フィルターをドライブロッティングして、オートラジオグラフィーに曝す。必要に応じて、フィルターを６５〜６８℃で３回目の洗浄を行い、フィルムに再び曝す。低ストリンジェンシーの、使用可能な他の条件は、当該技術分野において周知である（例えば、異種間ハイブリダイゼーションに用いられるような条件）。例えば「Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ．），  １９９３，  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ；  および  Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，  １９９０，  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ」を参照されたい。
【０１１３】
上記で規定された本発明に係る核酸配列を用いて、ペプチドを発現させることが可能である。すなわち、上記で規定された本発明に係る核酸配列を用いて、分析、特徴づけ、または治療上の使用のために本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列または本明細書において使用されるキメラペプチドを、（本明細書において使用される）対応するペプチドが（組織分化若しくは発生の構成的または特別な段階において、または疾患状態において）優先的に発現される組織についてのマーカーとして発現させることが可能である。これらの核酸の他の使用には、例えば、核酸のゲル電気泳動−ベースの分析における分子量マーカーとしての使用が含まれる。
【０１１４】
本発明のさらなる一実施形態によれば、上記で規定された、１つ以上のＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドの組み換え型に発現させるという上述の目的のために、発現ベクターを用いてもよい。「発現ベクター」という用語は、本明細書では、二本鎖または一本鎖のいずれかである、環状または線形のＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを示すために用いられる。発現ベクターはさらに、宿主細胞または単細胞のまたは多細胞の宿主生物内に移入される、上記で規定された少なくとも１つの核酸を含む。本明細書において使用される発現ベクターは、好ましくは、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列またはその断片若しくは改変体、あるいは、本明細書において使用されるキメラペプチド、または、その断片若しくは改変体をコードする、上記で規定された核酸を含む。さらに、本発明に係る発現ベクターは、好ましくは、種々な調節要素を含む、発現を支援するための適切な要素を含む。これらの種々な調節要素の例には、宿主細胞内に挿入されたポリヌクレオチドの発現を駆動するウイルス源、細菌源、植物源、哺乳類の源、および他の真核細胞の源からのエンハンサー／プロモーターが挙げられる。これらの要素の例には、インスレーター、境界要素（ｂｏｕｎｄａｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）、ＬＣＲ（例えば、Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｋａｄｏｎａｇａ  （１９９８），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１，  ６１−６３によって記載されている）、または、マトリクス／スカフォード結合領域（例えば、Ｌｉ，  Ｈａｒｊｕ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  （１９９９），  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １５，  ４０３−４０８によって記載されている）などが挙げられる。幾つかの実施形態では、調節要素は、異種要素である（すなわち、ネイティブ遺伝子プロモーターではない）。あるいは、遺伝子および／またはフランキング領域のネイティブプロモーターによって、必要な転写信号および翻訳信号が、供給されてもよい。
【０１１５】
「プロモーター」という用語は、本明細書における使用では、ＤＮＡの領域であって、上記で規定された１つ以上の核酸配列の転写を制御するように機能すると共に、ＤＮＡ−依存性ＲＮＡ−ポリメラーゼの結合部位の存在、および、プロモーターの機能を調節するために相互作用する他のＤＮＡ配列の存在によって、構造的に特定される領域を指す。機能的な発現を促進するプロモーターの断片は、プロモーターとしての活性を保持する、短縮された、または、トランケート型のプロモーター配列である。プロモーター活性は、当該技術分野において公知の任意のアッセイ（例えば、Ｗｏｏｄ，  ｄｅ  Ｗｅｔ，  Ｄｅｗｊｉ，  ａｎｄ  ＤｅＬｕｃａ，  （１９８４），  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １２４，  ５９２−５９６；  Ｓｅｌｉｇｅｒ  ａｎｄ
ＭｃＥｌｒｏｙ，  （１９６０），  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ８８，  １３６−１４１を参照されたい）、またはＰｒｏｍｅｇａ（登録商標）からの市販品）によって測定可能である。
【０１１６】
本明細書に規定された発現ベクターにおいて使用される「エンハンサー領域」とは、典型的には、１つ以上の遺伝子の転写を増加させるように機能する、ＤＮＡの領域を指す。より詳細に言うと、「エンハンサー」という用語は、本明細書における使用では、遺伝子の発現を、その位置および配向に無関係に、発現される遺伝子に対して、増強、増大、改善、または、向上させるＤＮＡ調節要素であり、１つより多くのプロモーターの発現を増強、増大、改善、または、向上させることであり得る。
【０１１７】
本明細書に規定される発現ベクターにおいて使用されるプロモーター／エンハンサー配列は、植物、動物、昆虫、または、真菌の調節配列を利用していてよい。例えば、酵母および他の真菌由来のプロモーター／エンハンサー要素（例えば、ＧＡＬ４プロモーター、アルコール脱水素酵素プロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター）を用いてもよい。代わりにまたは追加的に、これらは、動物の転写制御領域を含んでいてよい。動物の転写制御領域の例には、（ｉ）膵臓ベータ細胞の内部において活性のインスリン遺伝子制御領域（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，  ｅｔ
ａｌ．，  １９８５．  Ｎａｔｕｒｅ  ３１５  １１５−１２２を参照）、（ｉｉ）リンパ球様細胞の内部において活性の免疫グロブリン遺伝子制御領域（例えば、Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｃｅｌｌ  ３８    ６４７−６５８を参照）、（ｉｉｉ）肝臓の内部において活性のアルブミン遺伝子制御領域（例えば、Ｐｉｎｃｋｅｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７．  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ  １  ２６８−２７６を参照）、（ｉｖ）脳希突起膠細胞の内部において活性のミエリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域（例えば、Ｒｅａｄｈｅａｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｃｅｌｌ  ４８  ７０３−７１２を参照）、および、（ｖ）視床下部の内部において活性の性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（例えば、Ｍａｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４  １３７２−１３７８を参照）などが挙げられる。
【０１１８】
さらに、本明細書において規定される発現ベクターは、増幅マーカーを含んでいてよい。この増幅マーカーは、例えば、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、およびＮ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸耐性（ＣＡＤ）から成る群から選択され得る。
【０１１９】
本発明に適した典型的な発現ベクターまたはその誘導体には、特に、例えば、ヒトまたは動物のウイルス（例えば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス）、昆虫ウイルス（例えばバキュロウイルス）、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例えば、ラムダファージ）、プラスミドベクター、およびコスミドベクターが含まれる。
【０１２０】
本発明はさらに、上記で規定された核酸のペプチドコード配列（複数可）を発現することが可能な、種々な宿主ベクター系を利用してよい。これらの宿主ベクター系には、（ｉ）ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどに感染した哺乳類細胞系、（ｉｉ）バキュロウイルスなどに感染した昆虫細胞系、（ｉｉｉ）酵母ベクターを含有する酵母、または（ｉｖ）バクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡで形質転換されたバクテリアが含まれるが、これらに限定されない。利用される宿主ベクター系に応じて、多数の好適な転写要素および翻訳要素のうちの任意の１つを用いてよい。
【０１２１】
このような宿主ベクター系に適した宿主細胞株であって、対象となる挿入された配列の発現を調整する宿主細胞株、または、該配列が特定の所望の方法でコードした、発現されたペプチドを変更若しくは処理する宿主細胞株が、選択されることが好ましい。さらに、特定のプロモーターからの発現は、選択された宿主株において、特定のインデューサーの存在下で強化され、従って、遺伝子工学により生産されたペプチドの発現の制御を促進することが可能である。さらに、種々な宿主細胞は、発現されたペプチドの翻訳プロセシングおよびポスト翻訳プロセシング、並びに修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化など）の特性および特別のメカニズムを有している。従って、外来ペプチドの所望の修飾およびプロセシングを確実に行うために、適切な細胞株または宿主系が選択され得る。例えば、バクテリア系内のペプチド発現を用いて、グリコシル化されていないコアペプチドを生成することが可能である。その一方で、哺乳類細胞の内部における発現は、異種のペプチドの「ネイティブ」グリコシル化を確実に行う。
【０１２２】
本発明は、さらに、上述のＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドに対する抗体を、本明細書において規定されるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を処置するための薬剤組成物を調製するために使用することを提供する。さらに、本発明に係るＪＮＫ阻害剤配列に特異的、またはこのような阻害剤配列を含むキメラペプチドに特異的な抗体を生成するために有効な手段が記載され、この目的のために用いられ得る。
【０１２３】
本発明によれば、本明細書において規定された、ＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチド、並びに、その断片、改変体、または誘導体を、これらのペプチド成分を免疫特異的に結合させる抗体を生成する免疫原として利用してもよい。このような抗体には、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリーが含まれる。具体的な一実施形態では、本発明は、上記で規定された、キメラペプチドまたはＪＮＫ阻害剤配列に対する抗体を提供する。これらの抗体の製造には、当該技術分野で公知の種々な方法を用いてよい。
【０１２４】
一例として、上記で規定された任意のキメラペプチドまたはＪＮＫ阻害剤配列を注射することによって、種々な宿主動物に、ポリクローナル抗体を生成させるための免疫を行うことが可能である。それによって免疫応答を向上させるための種々な補佐剤を用いることが可能である。補佐剤には、フロインドアジュバント（完全および不完全）、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ＣｐＧ、ポリマー、プルロニック、および、ヒト補佐剤（例えばカルメットゲラン杆菌およびコリネバクテリウムパルヴム）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２５】
上記で規定されたキメラペプチドまたはＪＮＫ阻害剤配列に対するモノクローナル抗体の調製には、連続細胞株培養によって抗体分子の生成を提供する、任意の技術を利用してよい。このような技術には、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  １９７５．  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６  ４９５−４９７を参照）、トリオーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４  ７２を参照）、および、ヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５．  Ｉｎ
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．  ７７−９６を参照）が含まれるが、これらに限定されない。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において利用可能であり、ヒトハイブリドーマの使用によって（Ｃｏｔｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０  ２０２６−２０３０を参照）、または、ヒトＢ−細胞をエプスタイン−バーウイルスによってインビトロで形質転換することによって（Ｃｏｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．，１９８５．  Ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  （Ａｌａｎ  Ｒ．
Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．  ７７−９６）を参照）生成可能である。
【０１２６】
本発明によれば、本明細書において規定されたＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドに特異的な一本鎖抗体を生成するための技術を採用してもよい（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照）。さらに、Ｆａｂ発現ライブラリーを構成するための方法（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６  １２７５−１２８１を参照）を採用して、これらのＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドにとって所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速且つ効率のよい同定を可能にすることもできる。非−ヒト抗体を当該技術分野において周知の技術によって、「ヒト化」してもよい（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照）。本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドに対してイディオタイプを含有する抗体断片を、当該技術分野において公知の技術によって生成してもよい。この抗体断片の例には、（ｉ）抗体分子をペプシン消化することによって生成されるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィドブリッジを還元することによって生成されるＦａｂ断片、（ｉｉｉ）抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって生成されるＦａｂ断片、および、（ｉｖ）Ｆｖ断片が挙げられる。
【０１２７】
本発明の一実施形態では、抗体をスクリーニングするために用いられ得る方法であって、所望の特異性を有する方法には、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、および他の、当該技術分野において公知の免疫媒介性技術が含まれるが、これらに限定されない。具体的な一実施形態では、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチド（例えば、典型的には５〜２０個、好ましくは８〜１８個、および最も好ましくは８〜１１個のアミノ酸の長さを含むその断片）の特定のエピトープに対して特異的な抗体の選択は、このようなエピトープを有する、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドの断片に結合するハイブリドーマの生成によって促進される。上記で規定されたエピトープに特異的なこれらの抗体も、本明細書において提供される。
【０１２８】
本明細書で規定される抗体を、ＪＮＫ阻害剤配列（および／または、上記で規定されたキメラペプチドに対応して）の局在化および／または数量化に関する当該技術分野で公知の方法において、用いてもよい。これは、例えば、適切な生理学的試料内のペプチドのレベルを測定することにおける使用のため、診断方法における使用のため、または、ペプチドを画像化することにおける使用のためである。
【０１２９】
本発明に従って規定される、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、および／または、抗体は、本明細書において規定される疾患のうちのいずれかの予防または処置において、特に、本明細書において規定されるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害の予防または処置において適用され得る薬剤組成物に製剤化することが可能である。典型的には、このような本発明に従って用いられる薬剤組成物は、有効成分として、例えば、（ｉ）任意の１つ以上の、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチド、および／または、その改変体、断片、若しくは誘導体、特に、配列番号１〜４および１３〜２０および３３〜１００の配列のうちのいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤配列、および／または、配列番号９〜１２および２３〜３２の配列のいずれかに記載のキメラペプチド、および／または、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２のいずれかに記載の輸送配列、または上記の規定の範囲内のその改変体若しくは断片を含むＪＮＫ阻害剤配列、および／または、（ｉｉ）上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチド、および／または、その改変体若しくは断片をコードする核酸、および／または、（ｉｉｉ）上記で規定された、ＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチド、および／または、その改変体、断片、若しくは誘導体の任意の１つ以上を含む細胞、および／または、（ｉｖ）上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチド、および／または、その改変体若しくは断片をコードする、ベクター、および／または、核酸でトランスフェクトされた細胞、を含む。
【０１３０】
好ましい一実施形態によれば、このような、本発明に従って使用される薬剤組成物は、典型的には、安全且つ有効な量の、上記で規定された成分、好ましくは、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載の少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列、および／または、配列番号９〜１２および２３〜３２の配列のいずれかに記載の少なくとも１つのキメラペプチド、および／または、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載の少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２のいずれかに記載の輸送配列、または上記の規定の範囲内のその改変体若しくは断片を含むＪＮＫ阻害剤配列、または、これをコードする少なくとも１つの核酸、または、上記で規定された、少なくとも１つのベクター、宿主細胞、若しくは抗体、を含む。
【０１３１】
本発明の発明者は、本明細書においてそれぞれ規定されるＪＮＫ−阻害剤配列およびキメラペプチドが、本発明の疾患に関連する細胞内への特に良好な取り込み率を示すことを、さらに発見した。従って、被験体に投与される薬剤組成物内の、各ＪＮＫ−阻害剤配列およびキメラペプチドの量は、非常に低い用量を有してよい（これに限定されない）。このため、その用量は、当該技術分野において公知のペプチド薬剤、例えばＤＴＳ−１０８（Ｆｌｏｒｅｎｃｅ  Ｍｅｙｅｒ−Ｌｏｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ２００８，  ２１４５−５３）よりも大幅に低くてよい。これは、例えば、潜在的な副作用の低減、および、費用の低減といった、幾つかの有利な面を有している。
【０１３２】
好ましくは、この用量（ｋｇ体重当たり）は、最大１０ｍｍｏｌ／ｋｇ、好ましくは最大１ｍｍｏｌ／ｋｇ、より好ましくは最大１００μｍｏｌ／ｋｇ、さらにより好ましくは最大１０μｍｏｌ／ｋｇ、さらにより好ましくは最大１μｍｏｌ／ｋｇ、さらにより好ましくは最大１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、最も好ましくは最大５０ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲内である。
【０１３３】
従って、この用量の範囲は、好ましくは、約１ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１μｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約３００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約５００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約７５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、またはこれらの値のうちの任意の２つの値の組み合わせであってよい。
【０１３４】
これに関して、上述の薬剤組成物を用いる場合の、処置の処方、例えば投薬量の決定などは、典型的には、一般開業医や他の医師の責任の範囲内にあり、典型的には、処置される障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与方法、および、開業医に公知の他の要因が考慮される。上述の技術およびプロトコルの例は、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，
Ａ．  （ｅｄ），  １９８０」に見出すことが可能である。従って、本発明に従って使用される、上記で規定された薬剤組成物の成分の「安全且つ有効な量」とは、これらの成分の各または全ての、本明細書において規定されるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害の良好な改変を有意に誘発するのに十分な量を意味する。しかし、同時に、「安全且つ有効な量」は、深刻な副作用を回避するために十分に少ない量であり、すなわち、利点と危険との間の実用的な関係を可能にする量である。これらの限度の決定は、典型的には、実用的な医学的判断の範囲内にある。このような成分の「安全且つ有効な量」は、処置される特定の状態、およびまた処置される患者の年齢および健康状態、状態の重篤度、処置の期間、付随する療法の性質、用いられる特定の薬学的に許容され得る担体の性質、および、担当する医師の知識および経験の範囲内である類似の要因に関連して変動する。本発明に係る薬剤組成物は、本発明に従って、ヒトへの医学目的およびまた動物への医学目的に用いることが可能である。
【０１３５】
本発明に従って用いられる薬剤組成物は、さらに、これらの物質のうちの１つに加えて、（適合性の）薬学的に許容され得る担体、賦形剤、緩衝剤、安定剤、または、当業者に周知の他の材料を含む。
【０１３６】
これに関して、「（適合性の）薬学的に許容され得る担体」という表現は、好ましくは、液体または非液体ベースの組成物を含む。「適合性の」という用語は、通常の使用条件下で組成物の薬学的有効性を実質的に低減する相互作用が生じないような様式で、本明細書において使用される薬剤組成物の構成物質が、上記で規定された薬学的に活性な成分、および１つの他の成分と混合されることが可能であることを意味している。薬学的に許容され得る担体は、処置されるヒトへの投与に適したようにするには、当然ながら、純度が十分に高く、且つ、毒性が十分に低くなければならない。
【０１３７】
本明細書において使用される薬剤組成物が、液体形態で提供されるならば、薬学的に許容され得る担体は典型的には、１つ以上の（適合性の）薬学的に許容され得る液体担体を含む。この組成物は、（適合性の）薬学的に許容され得る液体担体として、例えば、パイロジェンフリー水、等張食塩水または緩衝化（水）溶液（例えばリン酸塩、クエン酸塩など、緩衝化溶液、植物油（例えば、ラッカセイ油、綿実油、胡麻油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびシオブローマからの油など）、ポリオール（例えば、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなど）、アルギン酸などを含んでいてよい。特に、本明細書において使用される薬剤組成物を注射する場合、緩衝剤、好ましくは水性緩衝液を用いてもよい。
【０１３８】
本明細書において使用される薬剤組成物が固体形態で提供されるならば、薬学的に許容され得る担体は、典型的には、１つ以上の（適合性の）薬学的に許容され得る固形の担体を含む。この組成物は、（適合性の）薬学的に許容され得る固形の担体として、例えば、１つ以上の適合性の固体若しくは液体の充填剤または希釈剤またはヒトへの投与に適しているカプセルに包まれた化合物を用いてもよい。このような（適合性の）薬学的に許容され得る固体の担体の幾つかの例は、例えば、糖質（例えば、ラクトース、グルコース、およびサッカロース）、でんぷん（例えば、トウモロコシでんぷんまたはジャガイモでんぷんなど）、セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなど）、粉状のトラガカント、モルト、ゼラチン、獣脂、固体の滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなど）、硫酸カルシウムなどが挙げられる。
【０１３９】
（適合性の）薬学的に許容され得る担体または他の材料の正確な特性は、投与経路に依存し得る。従って、（適合性の）薬学的に許容され得る担体の選択は、原則的に、本発明に従って用いられる薬剤組成物が投与される方法によって決定され得る。本発明に従って用いられる薬剤組成物は、例えば、全身的に投与され得る。投与経路には、例えば、（例えば注射を介した）非経口経路（例えば静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、皮内経路、または、経皮経路など）、経腸経路（例えば、経口または直腸経路など）、局所経路（例えば経鼻、または鼻腔内経路など）、または他の経路（例えば表皮経路、またはパッチ送達）が含まれる。
【０１４０】
用いられる薬剤組成物の好適な量を、動物モデルを用いた常習的な実験によって決定することが可能である。このようなモデルには、うさぎ、ひつじ、マウス、ラット、イヌ、および非ヒトの霊長類モデルが含まれるが、これらに限定されることを意図するものではない。注射のための好ましい単位用量の形態は、滅菌水溶液、生理食塩水、またはこれらの混合物が含まれる。このような溶液のｐＨは、約７．４に調整されている必要がある。注射のための好適な担体には、ヒドロゲル、制御放出または遅延放出のためのデバイス、ポリ乳酸、およびコラーゲンマトリクスが含まれる。局所適用に好適な薬学的に許容され得る担体には、ローション、クリーム、ゲルなどにおける使用に適した担体が含まれる。化合物が、経口的に投与されるならば、錠剤、カプセルなどが、好ましい単位剤形である。経口投与に使用可能な、単位剤形の調製のための薬学的に許容され得る担体は、従来技術において公知である。この担体の選択は、味、費用、および貯蔵性などの二次的な検討条件に依存する。この選択は、本発明の目的には重要ではなく、当業者が容易に選択することが可能である。
【０１４１】
経口投与用の薬剤組成物は、錠剤、カプセル、粉末、または液体形態であってよい。錠剤は、上記で規定された固体の担体、例えばゼラチン、および、任意により補佐剤を含んでいてよい。経口投与用の液状薬剤組成物は、一般的には、上記で規定された液体担体、例えば水、石油、および、動物油若しくは植物油、鉱物油、または、合成油を含んでいてよい。生理食塩水溶液、デキストロース若しくは他の糖類溶液、またはグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）が含まれていてもよい。
【０１４２】
静脈内、皮膚若しくは皮下注射、または、苦痛を有する部位への注射の場合、有効成分は、非経口的に受容可能な水溶液の形態であり、この水溶液は、パイロジェンフリーであると共に、好適なｐＨ、等張性、および安定度を有している。当業者は、好適な溶液を、例えば、等張性ビヒクル（例えば塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、乳酸加リンガー注射液）を用いて、十分に調製可能である。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤、および／または、他の添加物が含まれていてもよい。個体に投与されるものが、ポリペプチド、ペプチドであろうと、核酸分子、本発明に係る薬学的に有用な他の化合物であろうと、投与は、好ましくは「予防的に有効な量」、または、「治療的に有効な量」（場合によっては）である。この量は、個体に対する利益を示すために十分な量である。投与される実際の量、および、投与の速度および時間的経過は、処置されるものの性質および重篤度に依存する。
【０１４３】
本明細書において規定される疾患の予防および／または処置には、典型的には、上記で規定された薬剤組成物の投与が含まれる。「調整する」という用語は、上述の疾患のいずれかにおいてＪＮＫが過剰に発現した時に、ＪＮＫの発現を抑制することを含む。「調整する」という用語はまた、例えば、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載の少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列、および／または、配列番号９〜１２および２３〜３２の配列のいずれかに記載の少なくとも１つのキメラペプチド、および／または、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載の少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２のいずれかに記載の輸送配列、または上記規定の範囲内のその改変体若しくは断片を含むＪＮＫ阻害剤配列を、天然のｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２、およびＮＦＡＴ４結合部位の競合阻害剤として細胞内で用いることによって、上述の疾患のいずれかにおいて、ｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２、またはＮＦＡＴ４のリン酸化を抑制することを含む。「調整する」という用語は、また、ｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２、またはＮＦＡＴ４、およびそれらの関連するパートナーから構成される（これらに限定されない）転写因子のヘテロマー複合体およびホモマー複合体、例えばｃ−ｊｕｎ、ＡＦＴ２、およびｃ−ｆｏｓから構成されるＡＰ−１複合体など、の抑制を含む。上記で規定されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害が、ＪＮＫ過剰発現と関連付けられる場合、このような抑制力のあるＪＮＫ阻害剤配列を、細胞に導入することが可能である。ある場合には、「調整する」は、例えば、ＩＢペプチド特異抗体の使用により、ＩＢ−ペプチドがＪＮＫに結合することを阻止して、これによって、ＩＢ−関連ペプチドによるＪＮＫ阻害を防止することによって、ＪＮＫ発現を増加させることを含む。
【０１４４】
被験体を、上記で開示された薬剤組成物で予防および／または処置することは、典型的には、一定の（「治療的に有効な」）量の上記薬剤組成物を被験体に投与する（インビボ）ことによって実現され得る。ここで、被験体とは、例えば任意の、哺乳類、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、または豚であってよい。「治療的に有効な」という用語は、薬剤組成物の有効成分が、上記で規定されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を十分に改善するのに十分な量のものであることを意味する。
【０１４５】
従って、上記で規定されたような任意のペプチド、例えば、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載の少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列、および／または、配列番号９〜１２および２３〜３２の配列のいずれかに記載の少なくとも１つのキメラペプチド、および／または、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載の少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２のいずれかに記載の輸送配列、または上述の規定の範囲内のその改変体若しくは断片を含むＪＮＫ阻害剤配列を、本発明の具体的な一実施形態において用いて、上記で規定されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を、例えば、活性化されたＪＮＫシグナル伝達経路を調整することにより、処置することが可能である。
【０１４６】
しかしながら、上記で規定されたペプチドは、また、核酸によってコードされていてよく、その後、例えば遺伝子療法における使用のために、本発明に係る薬剤組成物の一部を形成することが可能である。これに関して、遺伝子療法とは、上記で規定された特異的な核酸を、例えば上記で規定された薬剤組成物として、被験体に投与することによって行われる療法を指す。ここで、核酸（複数可）は、Ｌ−アミノ酸だけを含む。本発明の本実施形態では、核酸は、そのコードされたペプチド（複数可）を生成し、該コードされたペプチド（複数可）は、その後、疾患または障害を調節する機能によって、治療効果を発揮するように機能する。本発明の実施においては、当該技術内で利用可能な遺伝子療法に関する任意の方法のいずれか（例えば、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３．
Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍ  １２  ４８８−５０５を参照）を用いてよい。
【０１４７】
好ましい一実施形態では、上記で規定され遺伝子療法に用いられる核酸は、好適な宿主内の、上記で規定された任意の１つ以上のＩＢ−関連ペプチドをコードすると共に発現する発現ベクターの一部である。上記で規定された任意の１つ以上のＩＢ−関連ペプチドとは、すなわち、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤配列、および／または、配列番号９〜１２および２３〜３２の配列のいずれかに記載のキメラペプチド、および／または、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２のいずれかに記載の輸送配列、または上述の規定の範囲内のその改変体若しくは断片を含むＪＮＫ阻害剤配列である。具体的な一実施形態では、このような発現ベクターは、ＪＮＫ阻害剤配列のコーディング領域（複数可）に動作可能に連結されたプロモーターを有している。このプロモーターは、上述のように、例えば、誘導的または構成的、および、任意により組織特異的であると規定され得る。
【０１４８】
具体的な別の実施形態では、上記で規定されたような核酸分子が、遺伝子療法に用いられる。ここでは、上記で規定された核酸分子のコーディング配列（およびその、任意の他の所望の配列）が、ゲノム内の所望の部位において相同的組み換えを促進し、これらの核酸の染色体内発現を提供する領域によって挟まれている（例えば、Ｋｏｌｌｅｒ  ａｎｄ
Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，  １９８９．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６  ８９３２−８９３５を参照）。
【０１４９】
本発明によれば、上記で規定された核酸を、上記で規定されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する特に上述の疾患または障害の関連で、遺伝子療法の目的で、患者へと送達することは、直接的（すなわち、患者が核酸、または核酸−含有ベクターに直接曝される）であってもよいし、または、間接的（すなわち、最初に、核酸によって細胞をインビトロで形質転換させ、その後、患者に移植する）であってもよい。これら２つの方法は、それぞれ、インビボ遺伝子療法、または生体外遺伝子療法として公知である。本発明の具体的な一実施形態では、核酸を、直接インビボで投与する。ここで、核酸は、コードされた産生物を生成するために、発現する。これは、当該技術分野において公知の多数の方法のうちのいずれかによって実現され得る。これらの公知の方法には、例えば、核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築する方法、および、細胞内に来るように核酸を投与する方法（例えば、欠損若しくは弱毒化レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いて感染させることによって；米国特許第４，９８０，２８６号を参照）、微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を用いて裸のＤＮＡを直接注射する方法（例えば、「ＧｅｎｅＧｕｎ」、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、ＤｕＰｏｎｔ）、核酸を脂質で被覆する方法、関連する細胞表面レセプター／トランスフェクション剤を用いた方法、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル内に封入する方法、それを、核に侵入することが分かっているペプチドへ連結させて投与する方法、または、それを、レセプター媒介性のエンドサイトーシスおこし易いリガンドへ連結して投与する方法（対象となるレセプターを特異的に発現する種類の細胞を「標的」とするために用いられ得る）（例えば、Ｗｕ
ａｎｄ  Ｗｕ，  １９８７．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２  ４４２９−４４３２を参照）などが挙げられる。
【０１５０】
本発明の実施における遺伝子療法のさらなる方法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム−媒介性トランスフェクション、ウイルス感染などのような方法によって、（上記で規定されたような核酸を含む）遺伝子をインビトロ組織培養物中の細胞へと移入する方法を含む。概して、移入の方法は、同時に、選択可能なマーカーを細胞に移入することを含む。細胞はその後、選択圧（例えば、抗生物質耐性）下に置かれ、このため、移入された遺伝子を取り上げて発現する細胞の分離を促進させる。これらの細胞は、その後、患者に送達される。具体的な一実施形態では、結果として生じる組み換え細胞をインビボで投与する前に、当該技術内の公知の任意の方法（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、対象となる核酸配列を含有するウイルスまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、マイクロセル−媒介性遺伝子導入、スフェロプラスト融合、および、受容細胞の必要な発生および生理学的機能がこの移入によって妨げられないことを確実にする類似の方法を含む）により、核酸を細胞内に移入する。例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｈｒ，  １９９３．  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２１７    ５９９−６１８を参照。選択された技術は、核酸が細胞によって発現可能であるように、細胞への核酸の安定した移入を提供すべきである。好ましくは移入された核酸は、遺伝性であり、細胞後代によって発現可能である。
【０１５１】
本発明の好ましい実施形態では、結果として生じる組み換え細胞は、例えば、上皮細胞への注射（例えば皮下注射）、植皮としての組み換え皮膚細胞の患者への適用、および、組み換え血液細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）の静脈内注射を含む、当該技術内の公知の種々な方法によって、患者に送達され得る。使用が想定される細胞の総量は、所望の作用、患者の状態などに依存し、当業者によって決定され得る。遺伝子療法のために核酸が導入され得る細胞は、任意の、所望の利用可能な細胞の種類を包含し、異種、異種遺伝子的、同系、または自己的（ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）であってよい。細胞の種類には、分化した細胞、例えば、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞、および血液細胞、または、種々な幹細胞若しくは前駆細胞、特に、胎児心筋細胞、肝臓幹細胞（国際特許公開ＷＯ９４／０８５９８号）、神経幹細胞（Ｓｔｅｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  １９９２，  Ｃｅｌｌ  ７１  ９７３−９８５）、例えば、骨髄、臍帯血液、末梢血、胎児の肝臓から得られる造血幹細胞若しくは前駆細胞などが含まれるが、これらに限定されない。好ましい一実施形態では、遺伝子療法に利用されるこれらの細胞は、患者の自己細胞である。
【０１５２】
代わりにおよび／または追加的に、本明細書に記載される疾患の処置のために、ターゲティング療法を用いて上記で規定された、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、および／または、核酸を、（標的）抗体または細胞特異的リガンドのような標的システムを用いることによって、ある特定の種類の細胞により特異的に送達することができる。ターゲティングのために用いられる抗体は、典型的には、以下に規定する疾患のいずれかに関連する細胞の細胞表面蛋白質に特異的である。一例として、これらの抗体は、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲ蛋白質、ＣＤ１８（ＬＦＡ−１ベータ鎖）、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４０若しくはＢｇｐ９５、または、例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ７１、ＣＤ１３８などから選択された細胞表面蛋白質などのような、Ｂ−細胞に関連付けられた表面蛋白質などの細胞表面抗体に向けられ得る。ターゲティング構築物は、典型的には、本明細書において規定された、本発明に係るＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、および核酸を、細胞表面蛋白質に特異的な抗体に共有結合させることによって、または、細胞特異的リガンドに結合させることによって、調製され得る。蛋白質は、例えば、ペプチド結合によってまたは化学的カップリング、化学的架橋などによって、このような抗体に結合され（ｂｏｕｎｄ）得る、または、このような抗体に結合され（ａｔｔａｃｈｅｄ）得る。その後、ターゲティング療法は、ターゲティング構築物を、薬学的に有効な量で、以下に規定する投与経路のいずれか、例えば、腹腔内経路、経鼻経路、静脈内経路、経口経路、およびパッチ送達経路によって、患者に投与することによって行われ得る。好ましくは、上記で規定されたターゲティング抗体または細胞特異的リガンドに結合される、本発明に係る、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、または核酸は、例えば、共有結合の加水分解によって、ペプチダーゼによって、または、任意の他の好適な方法によって、インビトロまたはインビボにおいて放出され得る。あるいは、本発明に係る、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、または核酸が、小細胞特異的リガンドに結合されるならば、リガンドの放出は、行われない可能性がある。細胞表面に存在する場合、キメラペプチドは、その輸送配列の活性によって、細胞に侵入する。ターゲティングは、種々な理由のため、例えば、本発明に係る、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、および核酸が、許容できないような毒性である場合、または、極めて多い投薬量を必要とするような場合に望ましい場合がある。
【０１５３】
本発明に係る、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列、および／または、キメラペプチドを直接的に投与する代わりに、これらを、細胞内に導入されたコード化遺伝子から、例えば、投与されるウイルスベクターから発現させることによって、標的細胞内に生成することも可能である。ウイルスベクターは、典型的には、本発明に係る、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドをコードする。このベクターは、処置される特異的細胞に標的化され得る。さらに、このベクターは、調節要素を含むことが可能である。この調節要素は、多かれ少なかれ、選択的に、所定の調節によって、標的細胞によって切替えられる。この技術は、成熟蛋白質をその前駆体形態の代わりに利用するＶＤＥＰＴ技術の改変体（ウイルス−指向性酵素プロドラッグ療法）を示す。
【０１５４】
あるいは、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドを、抗体またはウイルスを用いることによって、前駆体形態で投与してもよい。これらのＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドは、その後、処置される細胞内に生成された活性化剤、または処置される細胞に標的化された活性化剤によって、活性形態に変換され得る。この種の方法は、ＡＤＥＰＴ（抗体−指向性酵素プロドラッグ療法）またはＶＤＥＰＴ（ウイルス−指向性酵素プロドラッグ療法）としても知られている。ＡＤＥＰＴは、細胞−特異抗体にコンジュゲートすることによって、活性化剤を細胞に標的化することを含み、ＶＤＥＰＴは、活性化剤、例えば、ＪＮＫ阻害剤配列またはキメラペプチドを、ウイルスベクター内のコード化ＤＮＡから発現させることによって、ベクターで生成することを含む（例えば、ＥＰ−Ａ−４１５７３１号公報およびＷＯ９０／０７９３６号公報を参照）。
【０１５５】
さらなる一実施形態によれば、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸配列、または、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列若しくはキメラペプチド（例えば、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤配列、および／または、配列番号９〜１２および２３〜３２の配列のいずれかに記載のキメラペプチド、および／または、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２のいずれかに記載の輸送配列、または上述の規定の範囲内のその改変体若しくは断片を含むＪＮＫ阻害剤配列）に対する抗体を、（インビトロ）アッセイ（例えば、免疫学的検定）において用いて、上記で規定されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害から選択された様々な状態および病状を検出、予測、診断、または監視するか、または、その処置を監視することが可能である。この免疫学的検定は、患者に由来する試料を、免疫特異的−結合が生じ得る条件下で、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、または核酸配列に対する抗体に接触させ、その後、該抗体によって、任意の免疫特異的−結合の量を検出または測定することを含む方法によって、行うことが可能である。具体的な一実施形態では、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、または核酸配列に特異的な抗体を用いて、患者からの組織または血清試料の、ＪＮＫまたはＪＮＫ阻害剤配列の存在を分析することが可能である。ここでは、異常なレベルのＪＮＫが、疾患状態を示している。用いられ得る免疫学的検定には、ウエスタンブロット、放射免疫学的検定（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」免疫学的検定、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、蛍光免疫測定法、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定法、および、蛋白質−Ａ免疫学的検定などといった技術を用いた、競合アッセイシステムおよび非競合アッセイシステムが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸配列、または上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列またはキメラペプチドに対する抗体を、典型的には、例えば、培養された動物細胞、ヒト細胞、または微生物から選択された標的細胞に送達して、細胞応答を、典型的には当業者に知られた生物理学的方法によって監視することによって、（インビトロ）アッセイを行ってもよい。典型的には、本明細書において用いられる標的細胞は、培養された細胞（インビトロ）、またはインビボ細胞、すなわち、生きた動物若しくはヒトの臓器または組織、または生きた動物若しくはヒト内に見出される微生物を含む細胞であってよい。
【０１５６】
本発明はさらに、診断目的または治療目的のキットの使用、特に、上記で規定されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害の処置、予防、または監視のためのキットの使用を提供する。ここで、このキットは、１つ以上の容器を備えており、該容器は、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸配列、および／または、上記で規定されたこれらのＪＮＫ阻害剤配列またはキメラペプチドに対する抗体、例えば、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤配列に対する、配列番号９〜１２および２３〜３２の配列のいずれかに記載のキメラペプチドに対する、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２のいずれかに記載の輸送配列、または上述の規定の範囲内のその改変体または断片を含むＪＮＫ阻害剤配列に対する、抗−ＪＮＫ阻害剤配列抗体、または、このような抗−ＪＮＫ阻害剤配列抗体、および任意により、該抗体への、標識化された結合パートナーを含む。それにより抗体へと組み込まれるラベルには、化学発光部分、酵素部分、蛍光部分、比色分析部分、または放射性部分が含まれ得るが、これらに限定されない。他の具体的な一実施形態では、上記で規定されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害の処置、予防、または監視における診断使用のためのキットが、提供される。このキットは、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドをコードする核酸、あるいは、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドを補完する核酸を含む１つ以上の容器を備えており、任意により、これらの核酸に対して標識化された結合パートナーも提供されている。具体的な代替の一実施形態では、このキットを、上述の目的のために、１つ以上の容器、および、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば、Ｉｎｎｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，
１９９０．  ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡを参照）、リガーゼ連鎖反応、循環プローブ反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｐｒｏｂｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、または、上記で規定された核酸との関連で用いられる当該技術内で公知の他の方法のための増幅プライマーとして機能することが可能である、一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、各々６〜３０ヌクレオチド長）を含むキットとして用いてもよい。このキットは、上述の目的のためのアッセイにおいて、診断、基準、またはコントロール（対照）としての使用のために、任意により、所定の量の、上記で規定された精製されたＪＮＫ阻害剤配列、上記で規定されたキメラペプチド、またはこれらをコードする核酸をさらに含むことが可能である。
【０１５７】
本発明の範囲は、本明細書に記載の具体的な実施形態によって限定されるものではない。むしろ、本明細書に記載されるこれらの実施形態に加えて、本発明の様々な変形が、当業者には、上述の記載および添付の図面から明らかとなろう。このような変形例は、添付の特許請求の範囲に含まれる。
【０１５８】
本明細書には、種々な文献を引用している。これらの文献の開示内容を、引用することによって、その全体を援用する。
【０１５９】
他に規定されない限り、本明細書において使用される全ての技術的且つ科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の知識を有する当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有している。本明細書に記載された方法および材料に類似または等しい方法および材料を、本発明の実施または試験において用いてもよいが、好適な方法および材料については、後に記載する。本明細書に記載される、全ての文献、特許出願、特許、および他の引用文献は、引用によって、その全体を援用する。係争時には、規定を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は、単に、例示的なものであり、限定するものであることを意図するものではない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲より明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、示される転写因子における、保存されたＪＢＤドメイン領域のアラインメントを示す図である。ここで用いられるＪＮＫ阻害剤配列は、配列アラインメントを実施することによって同定される。このアラインメントの結果が、図１のＡ〜Ｃに例示的に示されている。図１のＡは、ＩＢ１、ＩＢ２、ｃ−Ｊｕｎ、およびＡＴＦ２のＪＢＤの間で、最も相同性が高い領域を示す図である。パネルＢは、Ｌ−ＩＢ１（ｓ）のＪＢＤおよびＬ−ＩＢ１のＪＢＤのアミノ酸配列を、比較のために示す図である。完全に保存された残基は、星印で示されており、ＧＦＰ−ＪＢＤ２３Ｍｕｔベクター内のＡｌａに変換された残基は、白丸で示されている。図１のＣは、ＪＮＫ阻害剤配列および輸送配列を含むキメラ蛋白質のアミノ酸配列を示す図である。図示された実施例では、輸送配列は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＴＡＴポリペプチドに由来し、ＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１（ｓ）ポリペプチドに由来する。パネルＢおよびＣでは、ヒト、マウス、およびラットの配列は同一である。
【０１６１】
【図２】図２は、ヒト、マウス、およびラットからのジェネリックＴＡＴ−ＩＢ融合ペプチドの配列を示す図である。
【０１６２】
【図３】図３は、ワンウェルアプローチにおいて、配列番号９および１１に記載の融合ペプチドを用いた、ＨｅｐＧ２細胞における内因性のＪＮＫ−活性の阻害の結果を示す図である。図３から、特に図３のパネルｄから明らかなように、配列番号１１に記載のＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）（ここでは、Ｄ−ＪＮＫＩと省略されている）は、ＪＮＫ−活性を、配列番号９に記載のＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）（ここでは、Ｌ−ＪＮＫＩと略記）よりもさらに良好に効果的に阻害する。
【０１６３】
【図４】図４は、ＸＧ−１０２とも呼ばれる、配列番号１１に記載のキメラＪＮＫ阻害剤配列の、細胞毒性アッセイの結果を示す図である（実施例１２を参照）。図示されるように、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、ＨＦＦに対して細胞毒性ではない。ＨＦＦを、９６−ウェル組織培養プレート内に播種した。ＤＭＳＯ（５μＭの薬剤と同じレベル）、または１、２、および５μＭのＸＧ−１０２を含有する培地を添加し、２４時間保持した。ニュートラルレッドを手短に添加し、細胞を固着させ、その後、色素を抽出した。５４０ｎｍにおいて、吸光度を測定した。ＤＭＳＯと、１μＭのＸＧ−１０２との間には、差異は観察されなかった。
【０１６４】
【図５】図５は、ＸＧ−１０２とも呼ばれる、配列番号１１に記載のキメラＪＮＫ阻害剤配列の、水痘帯状疱疹ウイルスウイルス（ＶＺＶ）に対する活性を試験するために行ったプラーク減少アッセイの結果を示す図である（実施例１２を参照）。図示されるように、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、特に０．５μＭおよび１μＭの濃度において、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の強力な阻害剤である。
【０１６５】
【図６】図６は、ＸＧ−１０２とも呼ばれる、配列番号１１に記載のキメラＪＮＫ阻害剤配列を用いた、培養されたヒト線維芽細胞における水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の阻害の結果を示す図である（実施例１２を参照）。図示されるように、ＶＺＶは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）に対して有意な感受性を示している。ＶＺＶ複製は、陰性コントロール（ＸＧ−１００、Ｔａｔペプチドのみ）の存在下において、正常であった。従って、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、試験された最も低い濃度である０．２５μＭにおいても、ＶＺＶ複製を阻止した。
【０１６６】
【図７】図７は、ブレオマイシン誘発性急性肺炎症の動物モデルを用いた、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置において、肺のホモジナイゼーションにおけるＭＰＯを用いて、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の、肺における細胞動員に対する活性を示す図である。図示されているように、ＭＰＯは、ブレオマイシンの投与後には、有意には誘導されなかった。従って、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、肺のＭＰＯのレベルにわずかな影響しか有していなかった。
【０１６７】
【図８】図８は、ブレオマイシン誘発性急性肺線維症の動物モデルを用いた、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置において、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の、ＴＮＦのレベルに対する活性を示す図である。ＴＮＦのレベルを測定すると、ＢＬＭモデルでは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の投与後に、ＢＡＬＦにおいて、ＴＮＦのレベルが減少する傾向が観察された。ＢＬＭの後には、ＴＮＦのレベルは極めて低い。
【０１６８】
【図９】図９は、ブレオマイシン誘発性急性肺線維症の動物モデルを用いた、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置において、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の、気管支肺胞洗浄空間内の細胞動員に対する活性を示す図である。０．１ｍｇ／ｋｇにおいて、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、リンパ球動員を有意に低減させ、この点で、リンパ球動員によって特徴付けられる炎症段階の間に動員される全ての細胞の数を低減させる。０．１ｍｇ／ｋｇにおいて、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、リンパ球動員を増大させるか、または気管支肺胞の空間に動員される全ての細胞の数を増大させる（ｎ＝群当たり５匹のマウス；＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．００１）。
【０１６９】
【図１０】図１０は、ブレオマイシン誘発性急性肺線維症の動物モデルを用いた、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置における、組織構造の結果を示す図である。肺の３μｍの切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。ＢＬＭ投与の１０日後に、炎症細胞の集積、線維性の区域、肺構造の欠損が、観察された。図示されているように、これらのパラメータの低減は、高投与量（０．１ｍｇ／ｋｇ）ではなく、低投与量（０．００１ｍｇ／ｋｇ）のＸＧ−１０２を投与した後に、観察された。
【０１７０】
【図１１】図１１は、ＸＧ−１０２（配列番号１１）による処置が、ＥＬＩＳＡによって決定された脳のＡβ１−４０およびＡβ１−４２のレベルに与える効果を示す図である。これらのグラフは、トリトン４０およびトリトン４２による異なる脳のホモジネート画分における、ＥＬＩＳＡによって決定されたＡβ１−４０（左）およびＡβ１−４２（右）のレベルを示すものである。データは、分散した点プロットとして、個々の値（黒）および群平均値±ＳＥＭと共に、示されている。有意差に星印を付けている（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。群間の有意差は、Ａβ１−４２のトリトンＸ−１００画分においてのみ観察された。
【０１７１】
【図１２】図１２は、ＸＧ−１０２（配列番号１１）による処置が、ＥＬＩＳＡによって決定されたＣＳＦＡβ１−４０およびＡβ１−４２のレベルに与える効果を示す図である。これらのグラフは、ＣＳＦにおける、ＥＬＩＳＡによって決定されたＡβ１−４０（左）およびＡβ１−４２（右）のレベルを示している。データは、分散した点プロットとして、個々の値（黒）および群の平均値±ＳＥＭと共に、示されている。有意差に星印を付けている（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。両方の投与量のＸＧ−１０２（配列番号１１）による処置は、ＣＳＦにおけるＡβ１−４０およびＡβ１−４２の有意な減少をもたらした。
【０１７２】
【図１３】図１３は、ｈＡＰＰ  Ｔｇマウスにおける、チオフラビンＳ染色剤で視覚化されたプラークの数への、処置効果を示す図である。これらのグラフは、皮質および海馬における、チオフラビンＳで染色されたプラークのｍｍ２当りの数を示している。ＸＧ−１０２（配列番号１１）処置は、海馬において、プラークの数を、負の用量依存的に低減させた。データは、平均値＋ＳＥＭとして示されている。群当たりＮ＝８。＊…ｐ＜０．０５；＊＊…ｐ＜０．０１。
【０１７３】
【図１４】図１４は、ｈＡＰＰ  Ｔｇマウスにおける、チオフラビンＳで視覚化されたプラーク面積［％］に与える、処置効果を示す図である。これらのグラフは、皮質および海馬における、チオフラビンＳにポジティブなプラークのプラーク面積［％］を示している。ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、海馬において、プラークによって得られる面積を有意に低減させた。データは、平均値＋ＳＥＭとして示されている。群当たりＮ＝８。
【０１７４】
【図１５】図１５は、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の投与が、２型糖尿病の動物モデルにおける空腹時血糖値（絶対値および相対値）に与える結果を示す図である。群ＡおよびＣにおいて、空腹時血糖を、６８日目まで３日ごとに測定し、１１１日目の終了日まで、定期的に測定した。本発明者らは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置された糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスの空腹時血糖値が、ビヒクルコントロールと比べて、明らか且つ有意に減少すること（ｐ＜０．００１）を観察した。ＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスの空腹時血糖値は、およそ５ｍｍｏｌ／Ｌの低いプラトーに達した。この効果は、投与の１４日後に現れ、調査中はずっと、従って２１日目から１１１日目までのウォッシュアウト期間の間もずっと、持続した。これとは異なり、本発明者らは、低投与量のＸＧ−１０２（配列番号１１）（１ｍｇ／ｋｇ）では、投与を続けた２８日間において、効果がないことを観察した。
【０１７５】
【図１６】図１６は、１０ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）の投与が、２型糖尿病の動物モデルの体重に与える結果を示す図である。本発明者らは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスにおいて、体重増加が、ビヒクルコントロールと比べて、明らか且つ有意に抑制されたこと（ｐ＜０．００１）を観察した。この効果は、投与の２８日目から現れ、終了日１１１日まで持続した。これとは異なり、本発明者らは、低投与量のＸＧ−１０２（配列番号１１）（１ｍｇ／ｋｇ）では、投与を続けた２８日間において、体重について効果がなかったことを観察した。
【０１７６】
【図１７】図１７は、２型糖尿病の動物モデルにおいて、ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、調査６８日目に代謝ケージにおいて測定される、２４時間での飼料および水摂取、および、尿および糞の生成に与える影響を、図１７において（ｇ）にて示す図である。本発明者らは、飼料摂取および尿生成が減少する傾向を観察したものの、測定したこれらのパラメータのいずれにおいても、ＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、ビヒクルコントロールと比べて顕著な影響を有していなかったことを観察した。
【０１７７】
【図１８】図１８は、２型糖尿病の動物モデルにおいて、ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、調査６８日目に代謝ケージにおいて測定される、２４時間での飼料および水摂取、および、尿および糞の生成に与える影響を、図１８において（体重のｇに正規化された）示す図である。本発明者らは、食料摂取および尿生成が減少する傾向を観察したものの、測定したこれらのパラメータのいずれにおいても、ＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、ビヒクルコントロールと比べて有意な影響を有していなかったことを観察した。
【０１７８】
【図１９】図１９は、２型糖尿病の動物モデルにおいて、５７日目、７７日目、および１０８日目に測定された、ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果を示す図である。図１９は、ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、インスリン、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−６の血漿レベルに与える効果を示す。本発明者らは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、ビヒクルコントロールと比べて、測定されたパラメータのいずれにも有意な効果を有していなかったことを観察した。
【０１７９】
【図２０】図２０は、２型糖尿病の動物モデルにおいて、５７日目、７７日目、および１０８日目に測定された、ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果を示す図である。図２０は、ｔＰＡＩ−１、ＴＮＦ、およびレジスチンの血漿レベルに与える効果を示す。本発明者らは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、ビヒクルコントロールと比べて、血漿レジスチンのレベルを除く、測定されたパラメータのいずれにも有意な効果を有していなかったことを観察した。その血漿レジスチンレベルは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）で処置した動物において、７７日目および１０８日目に、有意に高かった。
【０１８０】
【図２１】図２１は、２型糖尿病の動物モデルにおいて、ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、副睾丸脂肪パッド、鼠径部皮下脂肪パッド、および、後腹膜脂肪パッドの組織重量に与える影響を示す図である。本発明者らは、ＸＧ−１０２で処置したマウスにおいて、ビヒクルコントロールと比べて、副睾丸（ｐ＜０．０５）および後腹膜（ｐ＜０．０１）の脂肪質量が有意に減少したことを観察した。
【０１８１】
【図２２】図２２は、２型糖尿病の動物モデルにおいて、ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、脳、脾臓、および心臓の組織重量に与える影響を示す図である。本発明者らは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、ビヒクルコントロールと比べて、これらのパラメータに有意に影響がないことを観察した。
【０１８２】
【図２３】図２３は、２型糖尿病の動物モデルにおいて、ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、腎臓および肝臓の組織重量に与える影響を示す図である。本発明者らは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）で処置したマウスにおいて、腎臓（ｐ＜０．０５）および肝臓（ｐ＜０．０１）の質量が、ビヒクルコントロールと比べて、有意に減少したことを観察した。
【０１８３】
【図２４】図２４は、初代培養されたマクロファージを、ＸＧ−１０２（配列番号１１）とともにインキュベートし、その後、広範囲にわたって洗浄したものを示す図である。ＸＧ−１０２（配列番号１１）の存在は、ＸＧ−１０２に対する特異抗体を用いて明らかにした。ＸＧ−１０２は、初代マクロファージにしっかりと組み込まれている。
【０１８４】
【図２５】図２５は、Ｃ１４（１ｍｇ／ｋｇ）で放射性標識されたペプチドを、３つの異なる経路（ｓ．ｃ．、ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．）を介して投与することによって、マウスを処置したものを示す図である。動物を、注射の７２時間後に屠殺し、免疫ラジオグラフィーを施した。矢状断面（ｓａｇｉｔａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ）を露出させ、主に肝臓、脾臓、および骨髄にＸＧ−１０２ペプチドが蓄積することを明らかにした（ＸＧ−１０２：配列番号１１）。
【０１８５】
【図２６】図２６は、１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２をｉ．ｖ．注射したラットの肝臓内のＸＧ−１０２（配列番号１１）に対する免疫染色を示す図である。動物を、注射の２４時間後に屠殺した。ＤＡＢ基質を用いて顕色を行った。この図も、肝臓、および特にクッパー細胞（マクロファージ）内にＸＧ−１０２が著しく蓄積していることを示している。
【０１８６】
【図２７】図２７は、２つの細胞株における、サイトカインおよびケモカインの放出の阻害を示す図である。ＸＧ−１０２（配列番号１１）が、骨髄性細胞株およびリンパ球様細胞株の両方におけるサイトカインの放出を阻害して、ＴＨＰ−１細胞（パネルＡ〜Ｃ）における、ＬＰＳ−誘導ＴＮＦａ、ＩＬ−６、およびＭＣＰ−１の放出を低減し、ジャーカット細胞（パネルＤ−Ｆ）におけるＰＭＡおよびイオノマイシン−誘導ＩＦＮｇ、ＩＬ−６、およびＩＬ−２の産生を低減する。コントロール（ＸＧ−１０１）は、安定度が悪いため、それほど効果的でない。
【０１８７】
【図２８】図２８は、は、一次細胞におけるサイトカインの放出の阻害を示す図である。ＸＧ−１０２（配列番号１１）はまた、一次リンパ球様細胞および骨髄性細胞におけるサイトカインの放出を阻害して、マウスのマクロファージ（パネルＡ〜Ｃ）におけるＬＰＳ−誘導ＴＮＦａ、ＩＬ−６、およびランテス放出を低減すると共に、マウスのＴ細胞（パネルＤ〜Ｅ）におけるＰＭＡおよびイオノマイシン−誘導ＴＮＦａ、およびＩＦＮｇの産生を低減する。細胞に傷害を与えない濃度のＸＧ−１０２において、効果が生じる（パネルＦ）。
【０１８８】
【図２９−１】図２９は、ラットからのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列、およびその予測されるアミノ酸配列（配列番号１０２）を示す図である。
【図２９−２】図２９は、ラットからのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列、およびその予測されるアミノ酸配列（配列番号１０２）を示す図である。
【０１８９】
【図３０−１】図３０は、ｒＩＢ１遺伝子−スプライス供与体のエクソン−イントロン境界によってコードされた、ラットからのＩＢ１蛋白質配列（配列番号１０３）を示す図である。
【図３０−２】図３０は、ｒＩＢ１遺伝子−スプライス供与体のエクソン−イントロン境界によってコードされた、ラットからのＩＢ１蛋白質配列（配列番号１０３）を示す図である。
【図３０−３】図３０は、ｒＩＢ１遺伝子−スプライス供与体のエクソン−イントロン境界によってコードされた、ラットからのＩＢ１蛋白質配列（配列番号１０３）を示す図である。
【０１９０】
【図３１−１】図３１は、ホモサピエンスからのＩＢ１蛋白質配列（配列番号１０４）を示す図である。
【図３１−２】図３１は、ホモサピエンスからのＩＢ１蛋白質配列（配列番号１０４）を示す図である。
【図３１−３】図３１は、ホモサピエンスからのＩＢ１蛋白質配列（配列番号１０４）を示す図である。
【０１９１】
【図３２−１】図３２は、ホモサピエンスからのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列（配列番号１０５）を示す図である。
【図３２−２】図３２は、ホモサピエンスからのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列（配列番号１０５）を示す図である。
【０１９２】
【図３３】図３３は、膵島単離のＪＮＫ／ｐ３８の活性化に対する効果を示す図である。この実験は、単離工程自体により引き起こされる、ＪＮＫまたはｐ３８などに対する任意の効果を同定するようにデザインした。コントロールとして、チューブリン検出を使用した。消化時間（分）の関数としてのウェスタンブロット染色を示す。
【０１９３】
【図３４】図３４は、単離の間における、ＸＧ−１０２の、ＪＮＫの活性化に対する効果を示す図である。
【０１９４】
【図３５】図３５は、単離の間における、ＸＧ−１０２の、ＪＮＫの活性化に対する効果を示す図である。
【０１９５】
【図３６】図３６は、単離の間における、ＸＧ−１０２の、ＯＣＲ／ＤＮＡに対する効果を示す図である。
【０１９６】
【図３７】図３７は、ＨＰＬＣ解析による、ＸＧ−１０２（ＤＪＮＫ阻害剤）の、ＡＴＰ／蛋白質Ｊに対する効果を示す図である。
【０１９７】
【図３８】図３８は、ＸＧ−１０３が、７日間の培養後に測定された膵島の生存率（ＯＣＲ／ＤＮＡ）を有意に上昇させることを示す図である。
【０１９８】
【図３９】図４１（Ａ）は、フルオレセイン注射の１０分後における、フルオレセインによる血管造影評価（平均スコア）を示す図である。平均スコアは、１４日目および２１日目の５つの群（３００マイクログラム（ｍｉｃｒｏｇｒａｍｍ）／ｍｌのＸＧ−１０２、３ｍｇ／ｍｌのＸＧ−１０２、Ｋｅｎｃｏｒｔ  ｒｅｔａｒｄ、０．９％のＮａＣｌ溶液、非処置）について提示する。  図４１（Ｂ）は、フルオレセイン注射の１０分後における、フルオレセインによる血管造影評価（平均スコア）の比率を、５つの群（３００マイクログラム／ｍｌのＸＧ−１０２、３ｍｇ／ｍｌのＸＧ−１０２、Ｋｅｎｃｏｒｔ  ｒｅｔａｒｄ、０．９％のＮａＣｌ溶液、非処置）について、１４日目および２１日目において示す図である。  図４１（Ｃ）は、フルオレセイン注射の１０分後における、ＣｈＮＶ形成の発生率を、１４日目および２１日目において、５つの群（３００マイクログラム／ｍｌのＸＧ−１０２、３ｍｇ／ｍｌのＸＧ−１０２、Ｋｅｎｃｏｒｔ  ｒｅｔａｒｄ、０．９％のＮａＣｌ溶液、非処置）について示す図である。  図４１（Ｄ）は、フルオレセイン漏出の発生率が、１４日目および２１日目において、５つの群（３００マイクログラム／ｍｌのＸＧ−１０２、３ｍｇ／ｍｌのＸＧ−１０２、Ｋｅｎｃｏｒｔ  ｒｅｔａｒｄ、０．９％のＮａＣｌ溶液、非処置）について増加すること示す図である。
【０１９９】
【図４０】図４０は、アドリアマイシン誘発性腎症の誘発による、ＸＧ−１０２の、腎組織に対する効果を評価するための実験のデザインを示す図である。ラット群およびそれらの処置レジメンが示される。
【０２００】
【図４１】図４１は、ＸＧ−１０２が、蛋白尿症に関する、いかなる有害作用も引き起こさないことを示す図である。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、アルブミン濃度を、群１、群４、および群５について、観察期間（５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、２５、３８、４１日目）の関数として決定した。
【０２０１】
【図４２】図４２は、実験開始の８日後における組織学的解析を示す図である。群１（左図）の、アドリアマイシンで処置されたラットと、群４（右図）の、アドリアマイシンおよびＸＧ−１０２で処置されたラットとの比較である。
【０２０２】
【図４３】図４３は、実験開始の１４日後における組織学的解析を示す図である。群１（左図）の、アドリアマイシンで処理されたラットと、群４（右図）の、アドリアマイシンおよびＸＧ−１０２で処置されたラットとの比較である。
【０２０３】
【図４４】図４４は、実験開始の１９日後における組織学的解析を示す図である。群１（左図）の、アドリアマイシンで処置されたラットと、群４（右図）の、アドリアマイシンおよびＸＧ−１０２で処置されたラットとの比較である。
【０２０４】
【図４５】図４５は、実験開始の４１日後における組織学的解析を示す図である。群１（左図）の、アドリアマイシンで処置されたラットと、群４（右図）の、アドリアマイシンおよびＸＧ−１０２で処置されたラットとの比較である。
【０２０５】
【図４６】図４６は、実験開始の８日後における、ｃ−ｊｕｎ発現の組織学的解析（染色）を示す図である。左図：アドリアマイシンで処置された組織学的調製物、中央図：アドリアマイシンおよびＸＧ−１０２で処置された組織学的調製物（間質内のｃ−ｊｕｎ発現の有意な低減をもたらす）、および右図：コントロールである。
【０２０６】
【図４７】図４７は、実験開始の１４日後における、ｃ−ｊｕｎ発現の組織学的解析（染色）を示す図である。左図：アドリアマイシンで処置された組織学的調製物、中央図：アドリアマイシンおよびＸＧ−１０２で処置された組織学的調製物（間質内のｃ−ｊｕｎ発現の有意な低減をもたらす）、および右図：コントロールである。
【０２０７】
【図４８】図４８は、ＡＤＲ投与後８、１４、２９、４１、および５６日目の、アドリアマイシン（ＡＤＲ：ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）誘発性腎症モデルにおけるラットの、蛋白血（ｐｒｏｔｉｄｅｍｉａ）（Ａ）および尿素レベル（Ｂ）により評価された腎機能を示す図である。群１（「ＡＤＲ」）および群２（「ＡＤＲ＋ＸＧ−１０２」）は、０日目において、ＡＤＲで処置して、腎症（ｎｅｃｒｏｐａｔｈｙ）を誘発したが、群３（「ＮａＣｌ」）および群４（「ＸＧ−１０２」）には、０．９％のＮａＣｌを施した。さらに、群２および４は、０日目において、ＸＧ−１０２で処置したが、群１および３には、ビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）を施した。
【０２０８】
【図４９】図４９は、過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ：ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ）で染色された、アドリアマイシン（ＡＤＲ）誘発性腎症モデルにおけるラットの腎切片を示す図である（元の拡大率：４０倍）。左欄に示された切片については、ＡＤＲ投与後８日目において、ラットを屠殺したが、右欄（ｌｅｆｔ  ｃｏｌｕｍｎ）に示された切片については、ラットを５６日目に屠殺した。ＡＤＲは、「ＡＤＲ」群および「ＡＤＲ＋ＸＧ１０２」群のみに投与し、「ＮａＣｌ」群には、０．９％のＮａＣｌのみを施した。「ＡＤＲ＋ＸＧ１０２」群は、０日目において、ＸＧ−１０２で処置したが、他の群（「ＡＤＲ」および「ＮａＣｌ」）には、ビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）を施した。
【０２０９】
【図５０】図５０は、０日目においてＡＤＲおよびビヒクルで処置された「ＡＤＲ」群（上パネル）、および０日目においてＡＤＲおよびＸＧ−１０２で処置された「ＡＤＲ＋ＸＧ１０２」群（下パネル）について、ＡＤＲ投与後８日目（左の４つのパネル）および５６日目（右の４つのパネル）において、マッソントリクローム（青色）で評価された、ＡＤＲ腎症における腎線維症を示す図である。元の拡大率：１０倍を、左パネルに、それぞれの日について示し、元の拡大率：４０倍を、右パネルに、それぞれの日について示す。
【０２１０】
【図５１】図５１は、ＸＧ−１０２の、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎｅ）アミノヌクレオシド（ＰＡＮ：ｐｕｒｏｍｙｃｉｎｅ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）誘発性腎症に対する効果を調査する、実験の試験デザインを示す図である。０日目および１４日目に、ＰＡＮまたはそのビヒクルを、腎症を誘発するために注射した。０日目および１４日目には、ＰＡＮをまず投与した後で、ＸＧ−１０２を投与した。０日目〜４２日目には、ＸＧ−１０２またはそのビヒクルを、上記で記載した通り、ｉ．ｖ．経路により１週間に１回投与した。５６日目には、動物を屠殺し、サンプル（血液および腎臓）を回収した。
【０２１１】
【図５２】図５２は、ＸＧ−１０２の、ピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮ）誘発性腎症における、糸球体硬化症による傷害に対する効果を示す図である。ＸＧ−１０２（凡例には「ｃｐｄ」と表示する）は、群３〜６に投与した。群２と群６とは、実施例２０の試験計画において言明されている通り、ｉｖ注射の回数に関して異なる。群２についてのスコアは、同じ実験プロトコールを使用して、Ｎａｊａｋｉｍａら（２０１０年）により報告されたスコアに極めて類似することに注意されたい。＊＊＊：対応のないスチューデントのｔ検定を使用して、群１に対してＰ＜０．００１；＃、＃＃＃：一元ＡＮＯＶＡを使用した後で、ニューマン−コイルス検定を使用して、群２に対してＰ＜０．０５、Ｐ＜０．００１；§§§：対応のないスチューデントのｔ検定を使用して、群２に対してＰ＜０．００１。
【０２１２】
【図５３】図５３は、ＸＧ−１０２の、ピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮ）誘発性腎症における、糸球体損傷に対する効果を示す図である。ＸＧ−１０２（凡例には「ｃｐｄ」と表示する）は、群３〜６に投与した。群２と群６とは、実施例２０の試験計画において言明されている通り、ｉｖ注射の回数に関して異なる。＊＊＊：対応のないスチューデントのｔ検定を使用して、群１に対してＰ＜０．００１；＃＃＃：一元ＡＮＯＶＡを使用した後で、ニューマン−コイルス検定を使用して、群２に対してＰ＜０．００１；§§§：対応のないスチューデントのｔ検定を使用して、群２に対してＰ＜０．００１。
【０２１３】
【図５４】図５４は、糖尿病性腎症のラットモデルにおいて、ＸＧ−１０２の長期投与の効果を調査する、実施例２１の試験スケジュールを示す図である。動物には、到着の直後に、高脂肪食餌を施した。群Ｅ内および群Ｆ内の動物には、ベースライン相以後の各日において、毎日投与する。
【０２１４】
【図５５】図５５は、糖尿病性腎症のラットモデルにおける、ＸＧ−１０２の長期投与の、ラットの体重に対する効果を示す図である。ＳＴＺ非処置ラットのみが、体重の増加を示した。ＸＧ−１０２で処置されたラットは、ＳＴＺモデルにおいて、ビヒクルで処置されたラットと比較して、体重の差を示さなかった。しかし、陽性基準物質（ロサルタン）で処置されたラットの体重は、有意に少なかった。
【０２１５】
【図５６】図５６は、ＸＧ−１０２が、膵島単離／膵島移植における、ＸＧ−１０２に対する用量反応関係を評価する実験（実施例２２）での、１５分間の阻血により誘導される、ＪＮＫ（Ａ）およびＰＡＦ２（Ｂ）のリン酸化を、用量依存的に減少させたことを示す図である。ラット膵島の単離は、動物屠殺直後または１５分間にわたる温阻血後のいずれかに実行した。ＪＮＫの活性化は、単離工程の終了時において、ウェスタンブロットにより評価した。陰性コントロールとして、ＪＮＫの活性化を、未処理のラット膵臓において評価した。
【０２１６】
【図５７】図５７は、ＸＧ−１０２の、１５分間の阻血ラットおよび非阻血ラットから単離された、ラット膵島の機能および生存率に対する効果を示す図である。静的インスリン分泌試験（基礎分泌またはグルコースを使用して刺激された分泌）を、膵島単離の直後および３７℃における培養の１８時間後に実施した。単離は、膵島機能に影響を及ぼし、これにより、基礎インスリン分泌は、いずれの条件でも、単離の直後に使用された膵島において、１８時間にわたりインキュベートされた膵島と比較して高度であった。しかし、培養後において、阻血および阻害剤ＸＧ−１０２は、この実験における膵島機能に対して影響を及ぼさなかった。
【０２１７】
【図５８】図５８は、阻血を３０分間まで伸ばし、ＸＧ−１０２を１００マイクロモル濃度で使用した、別の実験を示す図である。インスリン分泌試験を単離の直後に実施したところ、やはり、高度な基礎分泌が観察される。さらに、３０分間の阻血は、膵島機能に対して負の影響を及ぼした。これらの予備的結果は、３０分間の阻血が、１５分間の阻血より、ＪＮＫの活性化を誘導するのに良好なモデルであると考えられることを示唆した。阻血ラットに由来する膵島を単離し、ＸＧ−１０２と共にインキュベートしたところ、グルコース誘導性インスリン分泌は、阻血ラットと比較して高度であった。
【０２１８】
【図５９】図５９は、ＸＧ−１０２の単回結膜下注射の有効性および安全性を、術後眼内炎症において、デキサメタゾン点眼剤と比較して評価する、実施例２７の試験、すなわち、無作為化、二重盲検、並行群間、比較、多施設試験（臨床フェーズＩＩ）に組み入れられた患者の内訳を示す図である。
【０２１９】
【図６０】図６０は、実施例２７の試験について、試験処置の結膜下注射投与の２８日後までの平均前房細胞グレードを、９０μｇ  ＸＧ−１０２、９００μｇ  ＸＧ−１０２、およびデキサメタゾンの３つの処置群についての、ＰＰ解析集団について示す図である。垂直方向の線は、標準偏差（ＳＤ：ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）を表す。
【０２２０】
【図６１】図６１は、実施例２７の試験について、主要転帰の結果を、第１の副次的転帰の結果に加えて、２８日目における前房細胞グレード：信頼区間および非劣性マージンに関する、ＰＰデータセットおよびＦＡＳデータセットの両方について示す図である。
【０２２１】
【図６２】図６２は、実施例２７の試験について、試験処置の結膜下注射投与後の２８日目までに得られた前房フレアグレード（ＦＡＳについて）を、９０μｇ  ＸＧ−１０２、９００μｇ  ＸＧ−１０２、およびデキサメタゾンの３つの処置群について示す図である。垂直方向の線は、標準偏差（ＳＤ）を表す。
【０２２２】
【図６３】図６３は、実施例２７の試験について、２８日目までの試験を通して、規定された時点で得られたＬＦＭ（レーザーフレアメーター：Ｌａｓｅｒ  Ｆｌａｒｅ  Ｍｅｔｅｒ）測定値を、ＦＡＳについて示す図である。垂直方向の線は、標準偏差（ＳＤ）を表す。
【０２２３】
【図６４】図６４は、実施例２７の試験について、報告された有害事象（重篤な有害事象および重篤ではない有害事象）の、投与群ごとの大要を示す図である。
【０２２４】
【図６５】図６５は、実施例２７の試験について、３つの試験群のいずれかへと無作為化された患者の少なくとも２％について報告された、ＡＥ（ＭｅｄＤＲＡ  ＳＯＣおよびＭｅｄＤＲＡ  ＰＴの用語により分類された）の概要を示す図である。
【０２２５】
【図６６】図６６は、実施例２７の試験について、報告された重篤な有害事象（ＳＡＥ：ｓｅｒｉｏｕｓ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔ）の大要を示す図である。
【０２２６】
【図６７】図６７は、実施例２８について、ＸＧ−１０２（図では、「Ｄ−ＪＮＫＩ１」と称する）またはＰＢＳで処置されたＭａｐｋ１４ｆ／ｆマウスおよびＭａｐｋ１４Δｌｉ＊マウス（左パネル）、ならびにＸＧ−１０２（すなわち、「Ｄ−ＪＮＫＩ１」）で処置されたＭａｐｋ１４ｆ／ｆＪｕｎｆ／ｆマウスおよびＭａｐｋ１４Δｌｉ＊ＪｕｎΔｌｉ＊マウス（右パネル）における、肝細胞の増殖を示す図である。マウスに、該当する場合、ＤＥＮ処置の前に、ＸＧ−１０２（体重１ｋｇ当たり２０ｍｇ）またはＰＢＳのいずれかを注射した。肝細胞の増殖は、ＤＥＮ処置の４８時間後において、Ｋｉ６７染色により解析した。Ｋｉ６７陽性細胞定量化が示される。
【０２２７】
【図６８】図６８は、３×１０６個のＨｕｈ７ヒト肝臓がん細胞を、４週齢のヌードマウスの両側腹部領域へと皮下注射した（実施例２９）ことを示す図である。ヌードマウスに、Ｈｕｈ７の注射後、５ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２を、１週間に２回腹腔内処置した。腫瘍体積を１週間に２回測定した。マウスは、異種移植の４週間後に死なせた。ドットされた丸（ｄｏｔｔｅｄ  ｃｙｃｌｅ）は、異種移植された腫瘍を示す。
【０２２８】
【図６９】図６９は、実施例３０について、同所性に注射されたＨＥＰ  Ｇ２腫瘍を保有するマウスの、平均体重曲線および平均体重変化曲線を示す図である。マウスを、１０日目および４１日目の２回にわたり反復される、４日ごとに１回ずつ４回にわたる処置スケジュールに従い、注射１回当たり１ｍｇ／ｋｇ  ＸＧ−１０２でＩＶ処置した。これに応じて、図７０には、それぞれの統計学的データを提示する。
【０２２９】
【図７０】図７０は、実施例３０について、マウスの、ＸＧ−１０２に対する忍容性を示す図である。平均体重およびＭＢＷＣ±ＳＤが示される。ＭＢＷＣ％は、対象日と第１の処置日（１０日目）との間の平均体重の変動に対応する。統計学的解析は、ビヒクル処置群を基準とするボンフェローニ−ダン検定により実施した。
【０２３０】
【図７１】図７１は、実施例３０について、屠殺日（１８５日目）までの、群ごとの生存マウスの比率を示す、マウスの長期生存曲線を示す図である。マウスは、１０日目および４１日目の２回にわたり反復される、４日ごとに１回ずつ４回にわたる処置スケジュールに従い、表示の用量のＸＧ−１０２で処置した。
【０２３１】
【図７２】図７２は、実施例３１について、マウスの、単独または組合せによる、ＸＧ−１０２処置およびＸＧ−４１４処置に対する忍容性を示す図である。平均体重および平均体重変化±ＳＤが示される。ＭＢＷＣ％は、対象日と第１の処置日（１０日目）との間の平均体重の変動に対応する。
【０２３２】
【図７３】図７３は、実施例３１について、屠殺日（１７１日目）までの、群ごとの生存マウスの比率を示す、マウスの長期生存曲線を示す図である。６７日目に剖検のために屠殺されたマウスは、計算から除外した。マウスは、１０日目および４１日目の２回にわたり反復される、４日ごとに１回ずつ４回にわたる処置スケジュールに従い、表示の用量のＸＧ−１０２で処置した。
【０２３３】
【図７４】図７４は、実施例３１について、６７日目または６７日目と最終的な屠殺との間に屠殺されたマウスの顕微鏡的評価により観察される腫瘍の浸潤を、ヒストグラム表示として示す図である。腫瘍生着のレベルを、図の凡例で指定される、４つの異なるカテゴリーに分類した。
【０２３４】
【図７５】図７５は、実施例３２について、抗腫瘍活性実験の間の、ＰＣ−３腫瘍を保有するマウスの平均腫瘍体積を示す図である。３３日目に、動物５匹ずつの３つの群を、ビヒクルおよびＸＧ−１０２（注射１回当たり０．１ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ、４日ごとに１回ずつ４回にわたる）で処置した。
【０２３５】
【図７６】図７６は、実施例３３について、ＨＣＴ１１６腫瘍をマウス盲腸に異種移植した２６日後において、毎日１回ずつ１４回にわたる処置スケジュールに従い、投与１回当たり０．１ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇのビヒクルまたはＸＧ−１０２でＰＯ処置またはＳＣ処置された異なる群内の、肝臓またはその周縁部（門）において観察される、転移性腫瘍の浸潤のヒストグラム表示を示す図である。顕微鏡的観察の分類は、凡例に記載の通りに実施した。
【０２３６】
【図７７】図７７は、実施例３４について、アルビノラットの右眼における、網膜電図検査（ＥＲＧ：ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｐｈｙ）による測定値を示す図である。
【実施例】
【０２３７】
実施例１：ＪＮＫ阻害剤配列の同定  
ＪＮＫとの効果的な相互作用のために重要なアミノ酸配列を、公知のＪＮＫ結合ドメインＪＢＤ間の配列アラインメントによって同定した。ＩＢ１［配列番号１３］、ＩＢ２［配列番号１４］、ｃ−Ｊｕｎ［配列番号１５］、およびＡＴＦ２［配列番号１６］のＪＢＤ間の配列を比較することにより、低度に保存された８つのアミノ酸配列（図１Ａを参照）を規定した。ＪＮＫを結合させることにおいて、ＩＢ１およびＩＢ２のＪＢＤが、ｃ−ＪｕｎまたはＡＴＦ２のＪＢＤよりも約１００倍効果的であるため（Ｄｉｃｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：  ６９３  （１９９７））、最大の結合を与えるためには、当然、ＩＢ１とＩＢ２との間に保存された残基が重要であることは間違いない。ＩＢ１のＪＢＤとＩＢ２のＪＢＤとの間の比較により、これら２つの配列間で高度に保存された、７つのアミノ酸および３つのアミノ酸の２つのブロックを規定した。
【０２３８】
これら２つのブロックは、Ｌ−ＩＢ１（ｓ）［配列番号１］内の１９のアミノ酸のペプチド配列内に含まれており、比較のために、ＩＢ１［配列番号１７］に由来する２３ａａペプチド配列内に示されている。これらの配列は、図１Ｂに示されており、Ｌ−ＩＢ１配列内の破線は、保存された残基をＬ−ＩＢ１（ｓ）と揃えるために、配列内のギャップを示すものである。
【０２３９】
実施例２：ＪＮＫ阻害剤融合蛋白質の調製  
配列番号１のＣ−末端を、２つのプロリン残基から成るリンカーを介して、ＨＩＶ−ＴＡＴ４ｇ５７（Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．    ２７２：
１６０１０  （１９９７））に由来する配列番号５に記載の１０個のアミノ酸の長さの担体ペプチドのＮ−末端に共有結合させることによって、配列番号９に記載のＪＮＫ阻害剤融合蛋白質を合成した。このリンカーは、最大のたわみ性を可能にして、望ましくない二次構造変化を回避するために用いたものである。この塩基性構築物を調製して、Ｌ−ＩＢ１（ｓ）（配列番号１）およびＬ−ＴＡＴ［配列番号５］をそれぞれ指定した。
【０２４０】
配列番号１１に記載の全てのＤレトロ−インベルソペプチドを、これに応じて合成した。この塩基性構築物を調製して、Ｄ−ＩＢ１（ｓ）［配列番号２］およびＤ−ＴＡＴ［配列番号６］をそれぞれ指定した。
【０２４１】
配列番号９、１０、１１、および１２に記載の全てのＤおよびＬ融合ペプチドを、従来のＦｍｏｃ合成法によって産生し、さらに、質量分析法によって分析した。最終的に、これらの融合ペプチドを、ＨＰＬＣによって精製した。プロリンリンカーの効果を決定するために、２種類のＴＡＴペプチドを産生した。これら２種類のＴＡＴペプチドのうち、一方は２つのプロリンを有しており、他方は全く有していない。２つのプロリンを付加することは、ＴＡＴペプチドを細胞の内部に侵入させること、またはＴＡＴペプチドを細胞の内部において局在化させることを変更することはないようであった。保存されたアミノ酸残基を示すジェネリックペプチドは、図２に示されている。
【０２４２】
実施例３：ＪＢＤ１９による細胞死の阻害  
ＩＢ１（ｓ）の１９ａａの長さのＪＢＤ配列が、ＪＮＫ生物活性に与える影響を調査した。この１９ａａ配列を、Ｎ−末端で、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ  ＪＢＤ１９構築物）に結合させ、この構築物がＩＬ１によって誘導された膵臓ベータ−細胞アポトーシスに与える効果を評価した。この形態のアポトーシスは、ＪＢＤ１−２８０でトランスフェクションすることによって阻止されることが既に示されているが、当該技術分野において公知のＥＲＫ１／２またはｐ３８の特異的阻害剤は、これを、保護しなかった。
【０２４３】
１９アミノ酸の保存された配列、および、完全に保存された領域において変異した配列を有する、ＪＢＤ１９に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社からの）緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をコードするｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターのＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位の中に、方向を定めて挿入した。１０％のウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００単位／ｍＬペニシリン、および２ｍＭのグルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地において、インスリンを生成するＴＣ−３細胞を培養した。インスリンを生成するＴＣ−３細胞を、上記に示されたベクターでトランスフェクトし、この細胞培養基に、ＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加した。ＩＬ−１を添加して４８時間後に、アポトーシス細胞の数を、倒立蛍光顕微鏡を用いて計数した。アポトーシス細胞を、細胞質の「水疱形成」特性によって正常細胞から選別し、２日後に計数した。
【０２４４】
ＧＦＰは、コントロールとして用いられる緑色蛍光蛋白質発現ベクターである。ＪＢＤ１９は、ＩＢ１のＪＢＤに由来する１９ａａ配列に結合されたキメラＧＦＰを発現するベクターであり、ＪＢＤ１９Ｍｕｔは、ＧＦＰ−ＪＢＤ１９と同じベクターであるが、１つのＪＢＤは、図１Ｂとして示される４つの保存された残基において、変異しており、ＪＢＤ１−２８０は、全ＪＢＤ（ａａ１−２８０）に結合されたＧＦＰベクターである。ＧＦＰ−ＪＢＤ１９を発現する構造は、全ＪＢＤ１−２８０と同じ程度に効果的に、ＩＬ−１誘導膵臓細胞アポトーシスを妨げた。
【０２４５】
さらなるコントロールとして、完全に保存されたＩＢ１（ｓ）残基において変異した配列は、アポトーシスを妨げる能力を著しく低下させた。
【０２４６】
実施例４：ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドの細胞インポート  
ＴＡＴおよびＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（「ＴＡＴ−ＩＢペプチド」）のＬ−およびＤ−鏡像異性体形態の、細胞の中に侵入する能力を評価した。フルオレセインにコンジュゲートされたグリシン残基のＮ−末端を付加することによって、Ｌ−ＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）、およびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド［それぞれ、配列番号５、６、９、および１２］を標識化した。標識化されたペプチド（１μＭ）をＴＣ−３細胞培養物に添加し、これを、実施例３に記載したように維持した。所定の時間に何回か、細胞をＰＢＳで洗浄し、氷冷したメタノール−アセトン（１：１）において、５分間固定させた後に、蛍光顕微鏡下で検査した。フルオレセイン−標識化したＢＳＡ（１μＭ，１２モル／モル  ＢＳＡ）をコントロールとして用いた。フルオレセインで標識化した全ての上記のペプチドは、一旦、培養基に添加されると、細胞に、効果的且つ迅速（５分以内）に侵入するという結果が示された。逆に、フルオレセインで標識化したウシ血清アルブミン（１μＭ  ＢＳＡ，１２モルのフルオレセイン／モル  ＢＳＡ）は、細胞には侵入しなかった。
【０２４７】
時間経過検査では、Ｌ−鏡像異性体ペプチドについての蛍光信号の強度は、２４時間の期間の後に、７０％減少したことが示された。４８時間では、信号はほとんどもしくは全く存在しなかった。逆に、Ｄ−ＴＡＴおよびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）は、細胞の内部において極めて安定していた。
【０２４８】
これら全てのＤレトロ−インベルソペプチドからの蛍光信号は、１週間後でも、極めて強力であり、信号は、プロセシング後２週間経って漸く、わずかに減少した。
【０２４９】
実施例５：ｃ−ＪＵＮ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋ１リン酸化のインビトロ阻害  
ペプチドが、これらの標的転写因子のＪＮＫ−媒介性リン酸化に与える影響を、インビトロで調査した。活性化されていない、組み換えＪＮＫ１、ＪＮＫ２、およびＪＮＫ３を、転写および翻訳ウサギ網赤血球溶解物キット（ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ  ｒａｂｂｉｔ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ  ｋｉｔ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて産生し、基質としてｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋ１を、単独、または、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）に融合させて用いる、固相キナーゼアッセイにおいて使用した。反応緩衝液（２０ｍＭのトリス−アセテート、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニル−リン酸塩（ｐＮＰＰ）、５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭのｐ−グリセロリン酸塩、１ｍＭのジチオスレイトール）中で、組み換えＪＮＫ１、ＪＮＫ２、またはＪＮＫ３キナーゼに、Ｌ−ＴＡＴまたはＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（０−２５μＭ）を２０分間混ぜ合わせて、用量反応検査を行った。その後、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および５ｐＣｉ３３Ｐ−−ｄＡＴＰ、並びに１μｇの、ＧＳＴ−Ｊｕｎ（ａａ  １〜８９）、ＧＳＴ−ＡＦＴ２（ａａ  １〜９６）、またはＧＳＴ−ＥＬＫ１（ａａ  ３０７〜４２８）のいずれかを添加することによって、キナーゼ反応を開始させた。ＧＳＴ−融合蛋白質は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）から購入したものである。
【０２５０】
この混合物に、１０μＬのグルタチオン−アガロースビーズも添加した。その後、反応生成物を、１０％のポリアクリルアミド変性ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ゲルを乾燥させて、次にＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に曝した。２．５μＭ程の少ない投与量のＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドにおいて、ＪＮＫによるｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋ１リン酸化のほぼ完全な阻害が、観察された。しかし、顕著な例外は、Ｅｌｋ１のＪＮＫ３リン酸化のＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）が阻害されなかったことであった。全体的に、ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドは、これらの標的転写因子のＪＮＫファミリーのリン酸化を阻害することにおいて、著しい効果を示した。Ｄ−ＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）、およびＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（０−２５０μＭ用量検査）の、組み換えＪＮＫ１、ＪＮＫ２、およびＪＮＫ３によって、ＧＳＴ−Ｊｕｎ（ａａ  １〜７３）リン酸化を阻害する能力を上記のように分析した。全体的に、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドは、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫ−媒介性リン酸化を減少させるが、そのレベルは、Ｌ−ＴＡ
Ｔ−ＩＢ１（ｓ）よりも約１０−２０倍、効率が悪かった。
【０２５１】
実施例６：活性化されたＪＮＫによるｃ−ＪＵＮリン酸化の阻害  
本明細書において規定されたＬ−ＴＡＴまたはＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドが、ストレス性刺激によって活性化されたＪＮＫに与える影響を、ＵＶ−光が照射されたＨｅＬａ細胞またはＩＬ−１処理されたＰＴＣ細胞からＪＮＫをプルダウンするＧＳＴ−Ｊｕｎを用いて、評価した。ＰＴＣ細胞を上述のように培養した。１０％のウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００単位／ｍｌのペニシリン、および２ｍＭのグルタミンが補充されたＤＭＥＭ培地中で、ＨｅＬａ細胞を培養した。細胞抽出物の調製に用いる１時間前に、ＰＴＣ細胞を上述のＩＬ−１で活性化し、その一方で、ＨｅＬａ細胞をＵＶ光（２０Ｊ／ｍ２）によって活性化した。細胞培養物を、溶解緩衝液（２０ｍＭのトリス−アセテート、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％のトリトンＸ−１００、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニル−リン酸塩、５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＰ−グリセロリン酸塩、１ｍＭのジチオスレイトール）において掻爬することによって、コントロールである、ＵＶ光を照射させたＨｅＬａ細胞、およびＩＬ−１処理されたＴＣ−３細胞から、細胞抽出物を調製した。ＳＳ−３４ベックマンローターにおいて１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行うことによって、破片を除去した。１００μｇの抽出物を、１μｇのＧＳＴ−ｊｕｎ（アミノ酸１〜８９）および１０μＬのグルタチオン−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）により、室温で１時間インキュベートした。次に、掻爬緩衝液（ｓｃｒａｐｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）で４回洗浄し、Ｌ−ＴＡＴまたはＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（２５μＭ）を補充した同じ緩衝液中で、ビーズを２０分間再懸濁させた。その後、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および５ｐＣｉ３３Ｐ−ガンマ−ｄＡＴＰを添加することによってキナーゼ反応を開始させ、３０℃で３０分間インキュベートした。
【０２５２】
反応生成物を、その後、１０％ポリアクリルアミド変性ゲル上で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させた。ゲルを乾燥させて、次に、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に曝した。これらの実験では、ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドは、活性化されたＪＮＫによって、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化を効果的に妨げた。
【０２５３】
実施例７：本明細書において規定されたＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドによる、ｃ−ＪＵＮリン酸化のインビボ阻害  
本明細書において規定された細胞透過性のペプチドが、ＪＮＫシグナル伝達をインビボで阻止することができるかどうかを決定するために、本発明者らは、異種のＧＡＬ４システムを用いた。上述の通りに培養されたＨｅＬａ細胞を、５ｘＧＡＬ−ＬＵＣレポーターベクターと、ＧＡＬ４ＤＮＡ−結合ドメインに結合されたｃ−Ｊｕｎ（アミノ酸１〜８９）の活性化ドメインを含むＧＡＬ−Ｊｕｎ発現構築物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とで共トランスフェクトした。ＪＮＫの活性化を、すぐ上流のキナーゼＭＫＫ４およびＭＫＫ７を発現するベクターを共トランスフェクション（Ｗｈｉｔｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：  １５７３  （１９９９）を参照）することによって、実現した。つまり、３ｘ１０５細胞に、３．５−ｃｍの皿内のプラスミドを、ＤＯＴＡＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を製造者の取扱説明に従って用いて、トランスフェクトした。ＧＡＬ−Ｊｕｎを含む実験のために、２０ｎｇのプラスミドに、１μｇのレポータープラスミドｐＦＲ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および、０．５μｇの、ＭＫＫ４またはＭＫＫ７のいずれかを発現するプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後、細胞培地を変化させて、ＴＡＴおよびＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（１μＭ）を添加した。１６時間後に、蛋白質含有量に正規化した後のＰｒｏｍｅｇａの「Ｄｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドの添加により、ｃ−Ｊｕｎの活性化が阻止され、それに続く、ＭＫＫ４およびＭＫＫ７−媒介性のＪＮＫの活性化が阻止された。ＨｅＬａ細胞は、ＪＮＫ１およびＪＮＫ２アイソフォームを発現するが、ＪＮＫ３を発現しないため、本発明者らは、細胞をＪＮＫ３でトランスフェクトした。ここでも、ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドは、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫ２−媒介性活性化を阻害した。
【０２５４】
実施例８：全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドおよびその改変体の合成  
本発明のペプチドは、逆合成され、天然の蛋白質分解を妨げる全てのＤアミノ酸ペプチド（すなわち全てのＤレトロ−インベルソペプチド）であってよい。本発明の全てのＤレトロ−インベルソペプチドは、ネイティブペプチドに似た機能的特性を有するペプチドを提供することになる。ここで、アミノ酸成分の側鎖は、ネイティブペプチドアラインメントに対応しているが、プロテアーゼ耐性の骨格を保持している。
【０２５５】
本発明のレトロ−インベルソペプチドは、Ｄ−アミノ酸を用いて合成された類縁物質である。この合成は、アミノ酸をペプチド鎖の中に結合させて、レトロ−インベルソペプチド類縁物質におけるアミノ酸の配列が、モデルとして機能する選択されたペプチドにおける配列と正確に反対となるようにすることによって行われる。例えば、（Ｌ−アミノ酸から形成された）天然に存在するＴＡＴ蛋白質が、配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ［配列番号５］を有しているならば、この（Ｄ−アミノ酸から形成された）ペプチドのレトロ−インベルソペプチド類縁物質は、配列ＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ［配列番号６］を有していることになる。Ｄ−アミノ酸の鎖を合成して、レトロ−インベルソペプチドを形成するための手順は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６８，７４４−７４６  （１９９４）；  Ｂｒａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ，  ３６８，６９２−６９３  （１９９４）；  Ｇｕｉｃｈａｒｄ  ｅｔ
ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３９，２０３０−２０３９  （１９９６）を参照）。特に、配列番号２、４、６、８、１１〜１２、１８、２０、２２、および、２５〜２６に記載のレトロ−ペプチドを、従来のＦｍｏｃ合成法によって生成し、さらに質量分析法によって分析した。最終的に、これらをＨＰＬＣによって精製した。
【０２５６】
天然のプロテアーゼによる分解および固有の免疫原性が、ネイティブペプチド特有の問題であるため、本発明のヘテロ二価またはヘテロ多価化合物は、所望のペプチドの「レトロ−インベルソ異性体」を含むように調製される。従って、ペプチドを天然の蛋白質分解から保護することは、半減期を延長することおよび、ペプチドをアクティブに破壊することに向けた免疫応答の範囲を減少させることの両方によって、特異的ヘテロ二価またはヘテロ多価化合物の効果を増大させるはずである。
【０２５７】
実施例９：全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドおよびその改変体の長期生物活性
ペプチドへテロ結合体（上述のキメラ配列を参照）を含むＤ−ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）レトロ−インベルソの、ネイティブＬ−アミノ酸類縁物質と比較して長期の生物活性が予測されている。これは、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドが、実施例５に示されるように、ネイティブプロテアーゼによる分解から保護されているからである。
【０２５８】
Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドによる、ＩＬ−１誘導膵臓ベータ細胞死の阻害を分析した。ＴＣ−３細胞を、上述の通りに、示されたペプチド（１μＭ）を単回添加して３０分間インキュベートした後、ＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。
【０２５９】
その後、ＩＬ−１によるインキュベーションの２日後に、アポトーシス細胞を、ヨウ化プロピジウムおよびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２核染色剤を用いて計数した。各実験につき、最小１，０００細胞を計数した。平均値の標準誤差（ＳＥＭ）が示されている（ｎ＝５）。Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドは、ＩＬ−１誘導アポトーシスを、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドと同様の範囲まで減少させた。
【０２６０】
Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドによるＩＬ−１Ｐ誘導細胞死の長期阻害も分析した。ＴＣ−３細胞を、上述の通りに、示されるペプチド（１μＭ）を単回添加して３０分間インキュベートした後、ＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、その後、２日毎にサイトカインを添加した。ＩＬ−１とともにインキュベートした１５日後に、アポトーシス細胞を、ヨウ化プロピジウムおよびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２核染色剤を用いて計数した。ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドの単回添加が、長期の保護を与えるものではないことに留意されたい。各実験につき、最小１，０００細胞を計数した。結果的に、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）は、長期（１５日間）の保護を提供することが可能であったが、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）は不可能であった。
【０２６１】
実施例１０：本発明に従って用いられるＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドによるＪＮＫ転写因子の抑制  
ＡＰ−１ダブル標識プローブ（５’−ＣＧＣ  ＴＴＧ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＡ−３’（配列番号１０１）を用いて、ゲルリターデーションアッセイを行った。示されるとおり、５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファで１時間処理された、または処理されていないＨｅＬａ細胞核抽出物。本発明に従って用いられるＴＡＴおよびＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドを、ＴＮＦ−アルファの処理の３０分前に添加した。特異的ＡＰ−１  ＤＮＡ複合体を有するゲルの一部だけが示されている（標識化されていない特異的および非特異的競合物質との競合実験によって示されるように）。
【０２６２】
本発明に従って用いられるＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドは、ＴＮＦ−アルファの存在下において、ＡＰ−１  ＤＮＡ結合複合体の形成を減少させる。
【０２６３】
実施例１１：オールインワンウェルアプローチを用いたＨｅｐＧ２細胞における内因性ＪＮＫ活性の阻害（図３を参照）
【０２６４】
実験の前日に、ＨｅｐＧ２細胞を、３，０００細胞／ウェルで播種した。その後、濃度が増大されたインターロイキン−１［ＩＬ−１ベータｖ）］または腫瘍壊死因子［ＴＮＦアルファ］（ａ）を添加して、ＪＮＫを３０分間活性化させた。細胞を、２０ｍＭのヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、０．５％のトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）（ｐＨ７．４）において溶解させ、アルファスクリーン（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）ＪＮＫを処理した。（ｂ）１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１によって誘導されたＪＮＫ活性のＺ’が、３８４ウェル／プレート（ｎ＝９６）において測定された。（ｃ）化学的ＪＮＫ阻害剤［ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎおよびＳＰ６００１２５］による内因性ＩＬ−１ベータ−誘導ＪＮＫ活性の阻害。（ｄ）配列番号９に記載のペプチド性阻害剤Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）［ここでは、Ｌ−ＪＮＫｉ（ｖ）と略記されている）および配列番号１１に記載のＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）（ここではＤ−ＪＮＫｉと略記されている）およびＪＢＤ（Ｌ−ＪＮＫＩに対応しているが、ＴＡＴ配列を有さない）］の、ＩＬ−１に依存するＪＮＫ活性に与える影響。全てのパネルは、３つの独立した実験（ｎ＝３）を示すものである。
【０２６５】
方法：アルファスクリーンキナーゼアッセイ  原理：アルファスクリーンとは、マイクロプレートフォーマットの生体分子相互作用を検査するために用いられる非放射性ビーズベースの技術である。頭文字ＡＬＰＨＡは、Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ａｓｓａｙ（増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ）を表す。これは、「供与体」ビーズおよび「受容体」ビーズを近接させ、その後、化学的反応のカスケードが、増幅された信号を生成するように機能する生物学的相互作用を含む。６８０ｎｍにおけるレーザ励起によって、「供与体」ビーズ内の光応答性物質（フタロシアニン）が、周囲酸素を、励起一重項状態に変換する。その４μ秒半減期内に、一重項酸素分子が、約２００ｎｍまで溶液中に拡散することが可能であり、受容体ビーズがその近傍内にある場合、一重項酸素は、「受容体」ビ
ーズ内のチオキセン誘導体と反応して、３７０ｎｍで化学発光を生成する。この化学発光は、さらに、同一の「受容体」ビーズ内に含まれる蛍光団を活性化する。励起した蛍光団は、次に、５２０〜６２０ｎｍで発光する。受容体ビーズが存在しない場合、一重項酸素は、基底状態まで降下し、信号は生成されない。
【０２６６】
最初に、キナーゼ試薬（Ｂ−ＧＳＴ−ｃＪｕｎ、抗Ｐ−ｃＪｕｎ抗体およびアクティブＪＮＫ３）を、キナーゼ緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１００μＭのＮａ３ＶＯ４、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０）において希釈して、ウェル（１５μｌ）に添加した。その後、反応物を、１０μＭのＡＴＰの存在下で２３℃において１時間インキュベートした。検出緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭのＮａＣｌ、８０ｍＭのＥＤＴＡ、０．３％のＢＳＡ）中で希釈された１０μｌのビーズ混合物（蛋白質Ａ受容体２０μｇ／ｍｌおよびストレプトアビジン供与体２０μｇ／ｍｌ）を添加することによって、検出を行い、その後、暗所において、２３℃でさらに１時間インキュベートした。ＪＮＫ内因性活性を測定するために、キナーゼアッセイを行った。このキナーゼアッセイは、上述のとおりに行ったが、アクティブなＪＮＫ３を、細胞溶解物で置き換え、細胞溶解後に、反応キナーゼ成分を添加した点が異なった。Ｂ−ＧＳＴ−ｃｊｕｎおよびＰ−ｃＪｕｎ抗体は同じ濃度で用いたが、ＡＴＰは、１０μＭではなく、５０μＭ用いた。アルファスクリーン信号を、Ｆｕｓｉｏｎ装置またはＥｎ  Ｖｉｓｉｏｎ装置上で、直接分析した。
【０２６７】
実施例１２：水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）によるウイルス感染の処置における、全ての、Ｄレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドおよびその改変体の活性の決定  
培養された宿主細胞（ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ））において、ＪＮＫ阻害剤ペプチドＸＧ−１０２（配列番号１１）を試験化合物として用いて、本発明に従って使用されるＩＢ（ｓ）ペプチドおよび全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドの活性の決定を、試験した。ウイルスは、偏性細胞内寄生体であり、それらの生活サイクルを完結するためには機能している細胞環境を必要とする。すなわち、瀕死の細胞は、ウイルス複製を支援しない。さらに、細胞機能の阻害剤は、細胞に対して毒性を有している可能性があり、ウイルスの成長を非特異的に防止することが可能である。従って、病気または瀕死の宿主細胞は、非特異的に減少されたウイルス力価を示すことが可能である。このことが結果を変造し得るため、最初に、細胞毒性アッセイを行い、培養細胞の、試験化合物に対する耐性を決定した。次に、プラーク減少アッセイを行い、その後、ＪＮＫ阻害剤ペプチドＸＧ−１０２（配列番号１１）の、感染した細胞における、ウイルス性帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）に対する活性を試験した。
【０２６８】
Ａ）全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドの細胞毒性の判定  毒性の判定のために、培養細胞（ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ））を、９６−ウェル組織培養プレート内に播種した。ＤＭＳＯ（５μＭのＸＧ−１０２（配列番号１１）と同じレベル）、または、ＸＧ−１０２（配列番号１１）を含有する培地を、幾つかの濃度（１、２、および５μＭ）で添加し、２４時間保持した。次に、ニュートラルレッドアッセイを行った。次の（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ７８：２８５３−２８６２において行われているような）有効性アッセイのための最高投与量を設定するために、細胞毒性アッセイのためのニュートラルレッド比色アッセイ（６つの反復のセットで）を用いた。生きた細胞は、ニュートラルレッドを吸収するため、吸光度のレベルは、細胞の生存率および数の定量的尺度となる。ニュートラルレッドの取り込みは、細胞の数に正比例しており、正常なエンドサイトーシスを反映する。従って、ニュートラルレッドを短いパルスで、０時間、または２４時間において、上記培地に添加した。固定および抽出後、色素を添加し、各試料における色素の量を、５４０ｎｍにおいて、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した（図４を参照）。いずれの量のＸＧ−１０２（配列番号１１）でも、細胞毒性は観察されず、細胞の成長は、ＤＭＳＯ希釈剤だけの場合（コントロール）と比べて、制限されなかった。従って、標準的な濃度である１μＭは、ＨＦＦ細胞に明確には作用しておらず、より高い投与量でも、十分耐容性であろう。
【０２６９】
Ｂ）  ＸＧ−１０２（配列番号１１）の、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）に対する抗ウイルス作用を評価するためのプラーク減少アッセイ  
ＸＧ−１０２（配列番号１１）が、投与量に依存した抗ウイルス作用を有していたかどうかを決定するために、標準的な１μＭの投与量付近の濃度範囲を試験した。このプラーク減少アッセイでは、２４−ウェルプレート内のコンフルエントなヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）を、ＶＺＶに感染したＨＦＦと共に、１：１００（感染多重度ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝０．０１）の比率で植え付け、細胞に２時間吸収させた。過剰のウイルスを洗浄により排除し、ＸＧ−１０２（配列番号１１）を０μＭ（ＤＭＳＯだけ）、０．５μＭ、１μＭ、または２μＭ含有する培地を添加した。この時点にて、１つの試料を取り出し、感染の初期レベルを測定した。ここで、各ウェルは、約１５０ｐｆｕを含有していた。２４時間後、２つ組のウェルを、トリプシンで処理し、その後、上記細胞サスペンジョンを、３つ組のＭｅＷｏ細胞単層上で滴定して、各試料のＶＺＶに感染した細胞の数を決定した。成長が制限されていない間、ＶＺＶは、通常、１日で１０倍に増加する。これは、ＶＺＶが、細胞−細胞拡散によって増殖するからである。上記１０倍に増加する増殖は、ＤＭＳＯだけで処理された培養物にて観察されたものであり、１２００±４３０ｐｆｕを生じた（図５）。上記定量の結果は、次の表の通りである。
【表３】
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【０２７０】
従って、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、試験した全ての濃度において、強い抗ウイルス作用を有していた。ここで、ＶＺＶは、ほぼ２００〜３００ｐｆｕを生じている。これらのＥＣ５０を内挿する結果のグラフを用いることによって、およそ０．３μＭのＸＧ−１０２（配列番号１１）が、ＶＺＶの収量を５０％減少させることが計算された。
【０２７１】
細胞毒性および有効性のデータから、５．０μＭ／０．３μＭの、予備的な選択指数（ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ）（Ｔｏｘ／ＥＣ５０）を計算した。上記選択指数は、約１７の値を提供する。ここで、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の濃度は、細胞の５０％を殺傷する程度には達していないので、実際のＳＩは、より高いと考えられる。
【０２７２】
Ｃ）  ＸＧ−１０２（配列番号１１）による、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）内の水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）複製の測定  
ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）内の水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）複製をＸＧ−１０２（配列番号１１）によって防止する、ＸＧ−１０２の最小有効量を決定するために、ＨＦＦのコンフルエントな単層にＶＺＶ−ＢＡＣ−Ｌｕｃ菌株で２時間接種し、その後、０．２５μＭ、０．５μＭ、若しくは１．０μＭの濃度のＸＧ−１０２（配列番号１１）、または陰性コントロール（ＸＧ−１００，１．０μＭ）で、２４時間処理した。ウイルス収量を、ルシフェラーゼアッセイによって測定した。試料は３つ組であり、平均ルミネセンスを示す。エラーバーは、平均値からの標準偏差を示すものである。
【０２７３】
結果として、ＶＺＶ複製は、陰性コントロール（Ｔａｔペプチドのみ）の存在下では、正常であった。ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、試験した最も低い濃度である０．２５μＭにおいて、ＶＺＶ複製を防止した。本実験では、最小有効量は決定され得なかった。なぜＶＺＶが感染中のＪＮＫ−活性に依存しているかは、まだ分かっていないが、この酵素には、クリティカルな要件が存在するものと思われる。従って、培養におけるＶＺＶの拡散（ｓｐｒｅａｄ）を完全に阻止するためには、低濃度（０．２５μＭ）のＸＧ−１０２（配列番号１１）で十分である。この量のＸＧ−１０２（配列番号１１）が、感染された細胞内の全てのＪＮＫ分子に結合することが、この作用の１つの説明である。あるいは、０．２５μＭのＸＧ−１０２（配列番号１１）は、ＪＮＫ−活性を、ＶＺＶ複製に最適な閾値レベルよりも下に低下させ得る。この実験の結果は、図６にまとめられている。
【０２７４】
実施例１３：慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置における、全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドおよびその改変体の活性の決定  
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置における、典型的な全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドＸＧ−１０２（配列番号１１）の活性を決定するために、ＸＧ−１０２（配列番号１１）を、ブレオマイシン誘発性急性肺炎症および線維症の動物モデルにおいて用いる。ブレオマイシン誘発性炎症および線維症のプロトコルについては、既に、文献に記載されている。本実験の目的は、皮下（ｓ．ｃ．）経路によるＸＧ−１０２（配列番号１１）が、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）、並びにブレオマイシン誘発性炎症および線維症の肺における、好中球の動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）に与える影響を、
−ブレオマイシンの単回投与（１０ｍｇ／ｋｇ）の１日後、
−および、線維症を発症した１０日目に、
調査することであった。
【０２７５】
１）方法および実験的アプローチ  
ブレオマイシンを鼻腔内単回投与し、２つの投与量の試験化合物ＸＧ−１０２（配列番号１１）、およびビヒクルコントロールを、ｓ．ｃ．で与えたマウスを、１日後および１０日後に分析した。モデルに用いた動物は、群当たり１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）であった。実験群は、ビヒクル、０．００１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）、および０．１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）を含み、処置は、ブレオマイシンの投与の前に、ＸＧ−１０２（配列番号１１）を、３日ごとに繰り返し皮下投与することから構成された。急性肺炎症を、ＢＡＬ洗浄物、細胞学、細胞計数、および肺ミエロペルオキシダーゼ活性によって、２４時間監視した。化合物の効果を、ビヒクルコントロールと比較した。肺線維症を、ブレオマイシンの単回投与の１０日後に、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて、組織学的に評価した。
【０２７６】
１．１）  ブレオマイシンの投与  
ケタミン−キシラジンの軽い麻酔の状態で、Ｂｅｌｌｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｍｏｎｔｒｏｕｇｅ、フランス）からの生理食塩水中の硫酸ブレオマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ体重）、または生理食塩水を、容積４０μＬの鼻注入法によって、気道を介して与えた。ブレオマイシン誘発性炎症および線維症のためにブレオマイシンを投与した群には、ビヒクル、０．００１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）、および０．１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）が含まれる。ブレオマイシン誘発性炎症の経路は、皮下（ｓ．ｃ．）経路であり、投与は、単回投与として行った。ブレオマイシン誘発性線維症のための経路は、皮下（ｓ．ｃ．）経路であり、投与は、１０日間で３回行った。
【０２７７】
１．２）  気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）  
気管を切開した後に、プラスチックのカニューレを挿入し、３７°Ｃに加熱した０．３ｍｌのＰＢＳ溶液を用いて、気腔を洗浄した。採取した試料を、直ちに２つの部分に分けた。一方の第１の部分（上記２つの部分の第１の洗浄に相当する１ｍｌ）は、媒介物質の測定のために用い、他方の第２の部分は、細胞の測定に用いた（４ｍｌ）。最初の部分を、遠心分離し（６００ｇで１０分間）、上清を分別し、媒介物質の測定まで、−８０°Ｃで保存した。その後、細胞ペレットを、０．４ｍｌの滅菌ＮａＣｌ（０．９％）中に再懸濁させ、第２の部分と共にプールし、細胞計数に用いた。
【０２７８】
１．３）  肺のホモジナイゼーション  
ＢＡＬの後、肺全体を取り出し、１ｍｌのＰＢＳを有するマイクロチューブ（Ｌｙｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ  Ｄ，  Ｑ  Ｂｉｏ  Ｇｅｎｅ，  Ｉｌｌｋｒｉｃｈ、フランス）の中に置いた。Ｆａｓｔｐｒｅｐ（登録商標）システム（ＦＰ１２０，  Ｑ  Ｂｉｏ  Ｇｅｎｅ，  Ｉｌｌｋｒｉｃｈ、フランス）を用いて、全ての肺組織抽出物を調製した。その後、この抽出物を遠心分離し、上清を、媒介物質の測定、およびＳｉｒｃｏｌコラーゲンアッセイ（Ｆｒａｎｃｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、フランス）を用いたコラーゲンアッセイを行うまで、−８０°Ｃで保存した。
【０２７９】
１．４）  細胞計数および細胞判定  
細胞の総数を、ＢＡＬ液において、マラッセ（Ｍａｌａｓｓｅｚ）血球計を用いて決定した。ＭＧＧ  Ｄｉｆｆ−ｑｕｉｃｋ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  ＡＧ）で染色した後に、鑑別細胞計数をサイトスピン調製物（サイトスピン３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｈａｎｄｏｎ）上で行った。標準的な形態基準を用いて、２００の細胞について、鑑別細胞計数を行った。
【０２８０】
１．５）  ＴＮＦ測定  
ＢＡＬＦ中のＴＮＦのレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｍｏｕｓｅ  ＤｕｏＳｅｔ，  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、ミネアポリス、米国）を製造社の取扱説明に従って用いて、決定した。結果をｐｇ／ｍｌで報告する。
【０２８１】
１．６）  ＭＰＯ−測定  
ＸＧ−１０２を投与したときのＭＰＯ−レベルを測定した。本実験において、ブレオマイシンの後には、ＭＰＯは、有意に誘導されなかった。さらに、ＸＧ−１０２は、肺のＭＰＯレベルに影響しなかった。
【０２８２】
１．７）  組織構造  
ＢＡＬおよび肺灌流の後、標準的な顕微鏡分析のために、大葉を、４％の緩衝ホルムアルデヒド中で固定させた。３−ｍの切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０２８３】
２．）  結果  
Ａ）第１の調査：ブレオマイシン（ＢＬＭ）誘発性急性肺炎症  
群：ビヒクル、ＸＧ−１０２（配列番号１１）０．００１ｍｇ／ｋｇ、およびＸＧ−１０２（配列番号１１）０．１ｍｇ／ｋｇ  
経路：ｓ．ｃ．経路、単回投与  
【０２８４】
ａ）  気管支肺胞洗浄空間における細胞動員  
０．１ｍｇ／ｋｇにおいて、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、好中球動員、および炎症段階中に動員された細胞の総数を有意に低減させる。０．００１ｍｇ／ｋｇでは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、好中球の動員、または、他の種類の細胞が気管支肺胞腔の中に動員することに全く作用しない（代表的な一実験では、群当たりｎ＝５匹のマウス；＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．００１）。
【０２８５】
ｂ）  肺のホモジナイゼーションにおける、ＭＰＯを用いた肺の細胞動員  
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）は、宿主防御システムにおいて、重要な役割を果たしている。５３ｋＤａの２つの重鎖と１５ｋＤａの２つの軽鎖とから構成される、この１４０ｋＤａの蛋白質は、１９６０年代に最初に発見された。ＭＰＯが、白血球の活性化に応答して、好中球および単球の顆粒から放出されることは、過酸化水素および塩化物イオンを、強力な酸化剤である次亜鉛素酸（ＨＯＣｌ）に変換させることを可能にする。ＭＰＯは、防御システムにおける重要な目的を果たすが、ＭＰＯは、また幾つかの炎症状態に役割を果たすことを、様々な研究が示している。ここで、例えば、ＭＰＯレベルの上昇は、冠動脈疾患に関連していることが示されている。さらに、組織ＭＰＯのレベルは、好中球の活性化の状態を反映しており、好中球の組織への浸透の徴候を示す。
【０２８６】
本実験では、ブレオマイシンの投与後、ＭＰＯは、有意に誘導されなかった。従って、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、肺内のＭＰＯレベルに全く影響がなかった。（図７参照）。
【０２８７】
ｃ）  ＴＮＦ測定  
ＴＮＦのレベルを測定すると、ＸＧ−１０２（配列番号１１）を投与した後は、ＢＡＬＦ中のＴＮＦのレベルは、減少する傾向が観察され、ＢＬＭの投与後は、ＴＮＦのレベルは非常に低かった（図８参照）。  
【０２８８】
ｄ）  結論  
０．１ｍｇ／ｋｇにおいて、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、好中球および全細胞の気管支肺胞腔内への動員を減少させ、ＴＮＦのレベルの減少傾向を生じることが観察できた。さらに、組織学的スライドの本調査は、気管支の周辺空間において、炎症細胞の集積が減少していることを示した。従って、ＸＧ−１０２（配列番号１１）が、ブレオマイシン誘発性炎症を減少させるという結論付けが可能である。
【０２８９】
得られた結果に従って、本実験を、さらに、線維症モデルにおいても行った。
【０２９０】
Ｂ）  第２の調査：ブレオマイシン（ＢＬＭ）誘発性肺線維症  
群：ビヒクル、ＸＧ−１０２（配列番号１１）０．００１ｍｇ／ｋｇ、およびＸＧ−１０２（配列番号１１）０．１ｍｇ／ｋｇ  
経路：ｓ．ｃ．経路、１０日間で３回  
【０２９１】
ａ）  気管支肺胞洗浄空間への細胞動員  
０．００１ｍｇ／ｋｇにおいて、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、リンパ球動員を有意に低減させ、この時点ではリンパ球動員によって特徴付けられる炎症段階中に動員された細胞の総数を有意に低減させた。０．１ｍｇ／ｋｇでは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、全く効果がなかった（群当たりｎ＝５匹のマウス；＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．００１）（図９参照）。
【０２９２】
ａ）  組織構造  
３μｍの肺の切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。ＢＬＭ投与の１０日後に、炎症細胞の集積、線維性の区域、肺構造の欠損を観察した。ＸＧ−１０２を低投与量（０．００１ｍｇ／ｋｇ）で投与した後には、これらのパラメータの減少が、観察されたが、高投与量（０．１ｍｇ／ｋｇ）で投与した後には観察されなかった（図１０参照）。
【０２９３】
ｂ）  結論  
０．００１ｍｇ／ｋｇの低投与量で３回にわたって投与されたＸＧ−１０２（配列番号１１）が、ブレオマイシン誘発性後期炎症、特に、この時点で観察されるリンパ球動員を低減するという結論付けが可能である。さらに、当該投与量で３回にわたって投与された試験物質が、ブレオマイシン誘発性線維症を弱める。肺構造がより良好に保存された、ほとんど広がっていない線維性の区域が、観察できた。
【０２９４】
実施例１４：アルツハイマー病の処置における、全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドおよびその改変体の活性の決定  
アルツハイマー病における、典型的な全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドＸＧ−１０２（配列番号１１）の活性を決定するために、ロンドン型変異およびスウェーデン型変異のＡＰＰ７５１を過剰発現するｈＡＰＰ−遺伝子導入マウスモデルにおいて、ＸＧ−１０２（配列番号１１）を、モリス水迷路の行動試験と、プラーク負荷を測定する免疫組織学的試験と、マウスの脳内のβ−アミロイド１−４０およびβ−アミロイド１−４２レベルを測定するＥＬＩＳＡ試験とを用いて評価した。
【０２９５】
ａ）  方法  
ｉ）  イントロダクション  
本調査は、５ヶ月齢（±２週齢）の雌のｈＡＰＰＴｇマウスを用いて、試験物質（ＸＧ−１０２，配列番号１１）の、行動マーカー、生化学的マーカー、および組織学的マーカーについての有効性を評価するようにデザインされた。このために、マウスを、４ヶ月間、２週間または３週間ごとに処置し、処置期間の終わりに、行動を、モリス水迷路において評価した。屠殺したマウスの、脳、ＣＳＦ、および血液を採取した。Ｔｇマウスの異なる４つの脳のホモジネート画分およびＣＳＦにおいて、Ａβ４０およびＡβ４２のレベルを決定した。処置群当たり８匹のＴｇ動物の皮質および海馬におけるプラーク負荷を、定量した。
【０２９６】
ｉｉ）  動物  
Ｃ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡのバックグランドを有する、５ヶ月齢（±２週齢）の雌のＴｇマウスを、処置群１〜３（ｎ＝１２）にランダムに割当てた。動物に、ビヒクルまたは２つの異なる濃度のＸＧ−１０２（配列番号１１）を、生後５ヶ月から始まって４ヶ月間継続して、２週または３週ごとに皮下（ｓ．ｃ．）に適用して投与した。本調査に用いた全ての動物は、黒い目をしており、ＭＷＭプールの外の目印を知覚した可能性があった。しかし、視力が弱い動物は除外する必要があった。これは、いわゆる予備試験である可視プラットフォームのトレーニングにおいて管理した。処置開始前、予備を含む全ての動物を、調査のために隔離した（ｅｎｃｌｏｓｅｄ）。特定の動物の視覚障害が確認された場合、当該マウスは、本調査から除去される。
【０２９７】
ｉｉｉ）  動物の識別および収容  
各マウスは、耳標によって識別された。これらのマウスは、個々の換気式ケージ（ＩＶＣ）内の、Ｒｅｔｔｅｎｍａｉｅｒ（登録商標）によって提供された標準化齧歯類敷床の上に収容された。各ケージには、最大５匹のマウスが収容された。マウスは、国際基準に基づいて記載されたＪＳＷ標準操作手順（ＳＯＰ  ＧＥＮ０１１）に従って飼育した。各ケージは、調査番号、性別、マウスの個体登録番号（ＩＲＮ）、出生日、および、スクリーニング日、並びに、処置群の割当てを示す色付きのカードで識別した。調査中の温度は、約２４°Ｃに維持し、相対湿度は、約４０〜７０％に維持した。動物を、一定の光サイクル（１２時間ごとの明／暗）下で収容した。動物は、自由に、通常の水道水を利用可能であった。
【０２９８】
ｉｖ）処置  
４０匹の雌のｈＡＰＰ遺伝子導入マウスを、４ヶ月にわたり、異なる２つの投与量の試験物質ＸＧ−１０２（配列番号１１）で、２週間ごとに０．１ｍｇ／ｋｇ（ｂ．ｗ．）で、または、３週間ごとに１０ｍｇ／ｋｇ（ｂ．ｗ．）のいずれかで、処置するか（群当たりｎ＝１２）、または、３週間に１度、ビヒクル（ｎ＝１２）（ｓ．ｃ．）で処置した。
【０２９９】
ｖ）  モリス水迷路（ＭＷＭ）  
モリス水迷路（ＭＷＭ）タスクを、直径１００ｃｍの黒い円形プールにおいて行った。温度が２２±１°Ｃの水道水を充填し、プールを、視覚的に４つのセクターに分割した。水の表面の真下約０．５ｃｍに、透明のプラットフォーム（直径８ｃｍ）を置いた。予備試験を除く、全試験セッションの間、プラットフォームを、プールの南西の四分区間内に置いた。４日間続くトレーニングセッションの前日に、動物は、いわゆる「予備試験」（６０秒続く試験を２回）を行って、各マウスの視覚能力が正常であるかを確認する必要があった。このタスクを満たした動物だけを、ＭＷＭ試験に用いた。ＭＷＭタスクでは、各マウスは、４日連続して、３つの試験を行わなければならなかった。単一の試験は、最大１分間かかった。この時間の間、マウスは、隠された透明の標的を探す機会を有した。動物が、水から「道」を探すことができなければ、試験担当者が、マウスをプラットフォームに導くか、またはプラットフォーム上に載せた。各試験後、マウスは、１０〜１５秒間、プラットフォームの上で休息を許された。この時間の間に、マウスは、環境における位置確認を行うことが可能であった。追跡調査システムが悪影響することを回避するために、薄暗い照明条件下で調査を行った（Ｋａｍｉｎｓｋｉ；  ＰＣＳ，  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。プールを取り囲む壁の上には、黒、太字の幾何学記号（例えば、円および四角形）が記載されたポスターを貼った。このポスターは、マウスが、位置確認のためにこれらの記号を目印として使用することができた。試験あたりの、１つの水泳群は、５〜６匹のマウスから構成されている。そのため、試験と試験との間の時間として、約５〜１０分を確保した。逃避潜時（マウスが、隠されたプラットフォームを見つけるため、従って、水から逃避するために必要とした時間［秒］）、経路（標的に達するための軌道［メーター］の長さ）、および、ゴールの四分区間における居住の定量化のために、コンピュータによる追跡調査システムを用いた。コンピュータは、プール中央の上方に設置されたカメラに接続した。カメラは、マウスの尻尾の上に、小さなヘアピンで固定させた発光ダイオード（ＬＥＤ）の信号を検出した。４日目の最後の試験の１時間後に、マウスは、いわゆるプローブ試験を実行しなければならなかった。この時点で、プラットフォームをプールから除去して、この１分間のプローブ試験の間に、実験担当者は、元の標的位置を越えたマウスの数を計数した。さらに、この四分区間内にいるマウスと、他の３つの四分区間内にいるマウスの数を算定した。この試験の間はずっと、マウスは、プラットフォームについての、どんな性質のいかなる手がかりも、得ることはできなかった。
【０３００】
ｖｉ）  組織サンプリング  
処置期間の終わり、且つ、全ての行動試験の後に、残った全てのマウス（ｎ＝２８）を屠殺した。このために、全てのマウスを、ＳＯＰ  ＭＥＴ０３０に記載される標準の吸入麻酔（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎ，  Ｂａｘｔｅｒ）によって沈静させた。大後頭孔の鈍的切開および露出により、脳脊髄液（ＣＳＦ）を得た。露出させて、大後頭孔の中に、パスツールピペットを、約０．３〜１ｍｍの深さまで挿入した。ＣＳＦを、流れが完全に停止するまで、吸引および毛管作用によって採取した。各試料の２つのアリコートを、直ちに冷凍し、ＥＬＩＳＡ技術によるさらなる分析に用いるまで、−８０°Ｃで保持した。ＣＳＦのサンプリングの後、各マウスを仰向けに置いて、胸部を切開し、１ｃｃの注射器に取り付けられた２６−ゲージ注射針を、右心室腔の中に挿入した。この針を軽く吸引して、ＥＤＴＡの中に血を採血し、続いて、血漿を得るために用いた。血漿を得るために、各マウスからの血液サンプルを、遠心分離機（ＧＳ  −  ６Ｒ  Ｂｅｃｋｍａｎ）において、スイングバケット（ｓｗｉｎｇ  ｂｕｃｋｅｔｓ）を有するローター（ＧＨ  −  ３．８  ＢＥＣＫＭＡＮ）を用いて、１，７５０ｒｐｍ（７００ｇ）で１０分間回転させた。血漿を冷凍して、さらなる分析まで、−２０°Ｃで保存した。血液サンプリングの後、遺伝子導入マウスは、０．９％の塩化ナトリウムで心臓内灌流した。脳を、素早く取り出し、小脳を切除した。全てのマウスの右脳半球を、新たに作製した４％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）中において、室温で１時間、液浸固定させた。その後、脳を、１５％のスクロースＰＢＳ溶液に２４時間移して、凍結防止を確保した。次の日に、脳を、イソペンタン中で冷凍し、組織調査（ＳＯＰ  ＭＥＴ０４２）に用いるまで、−８０°Ｃで保存した。左脳半球の重量を計測し、液体窒素中で冷凍し、−８０°Ｃで、生化学分析用に保存した。
【０３０１】
ｖｉｉ）Ａβ１−４０およびＡβ１−４２の測定  
各Ｔｇマウスの４つの異なる脳ホモジネート画分、およびＣＳＦ試料における、Ａβ１−４０およびＡβ１−４２のレベルを、ＥＬＩＳＡ技術によって評価した。高感度のＡβ１−４０およびＡβ１−４２ＥＬＩＳＡ試験キットを、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ（商標），スイス（ＳＯＰ  ＭＥＴ０５８）から購入した。ＣＳＦを、上記のとおりに調製した。脳ホモジネートのために、冷凍した脳半球を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するＴＲＩＳ緩衝食塩水（ＴＢＳ）−緩衝液（５ｍｌ）中で、ホモジナイズした。１．２５ｍｌのこの初期の脳ＴＢＳホモジネートを、−８０°Ｃで保存した。１．２５ｍｌをさらに調査した。残りの脳ホモジネート（２．５ｍｌ）を遠心分離にかけ、結果として生じた上清（＝ＴＢＳ画分）を等分し、ＥＬＩＳＡ測定まで−２０°Ｃで保存した。ペレットを、トリトンＸ−１００（２．５ｍｌ）中に懸濁させ、遠心分離を行い、上清（＝トリトンＸ−１００画分）を等分し、−２０°Ｃで保持した。これらのステップを、ＳＤＳ（２．５ｍｌ）で繰り返した。ＳＤＳ画分からのペレットを、次の遠心分離にかける前に、７０％の蟻酸（０．５ｍｌ）中で懸濁させた。得られた上清を１ＭのＴＲＩＳ（９．５ｍｌ）で中和し、等分して−２０°Ｃで保持した（＝ＦＡ画分）。４つの脳ホモジネート画分（ＴＢＳ、トリトンＸ−１００、ＳＤＳ、およびＦＡ）の試料を、ＥＬＩＳＡ技術によるＡβ１−４０およびＡβ１−４２測定に用いた。ＥＬＩＳＡ試験キットは、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ（商標），スイス（ＳＯＰ  ＭＥＴ０６２）から購入した。ＴＢＳおよびトリトンＸ−１００が、単量体構造物からオリゴマー構造物までを溶解すると推測可能であった。前原線維および水不溶性の原線維のようなポリマーは、ＳＤＳおよびＦＡに溶解可能であった。これに関して、４つの全画分の調査は、Ａ重合化状態への洞察も提供する。
【０３０２】
ｖｉｉｉ）  脳形態の評価  
調査した全Ｔｇ動物の脳組織は、本手順のばらつきによる偏りを回避するために、正確に同じ方法で処理した。２４匹のＴｇマウス（各群８匹）の脳の半分から、各層（全部で５層）当り、２０の凍結切片を、各１０μｍの厚さ（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ  ３０５０Ｓ）で矢状に切断し、５つ（各層から１つずつ）を処理し、プラーク負荷の定量化を評価した。矢状の５つの層は、Ｐａｘｉｎｏｓ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋｌｉｎの形態アトラス「Ｔｈｅ
Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ」（第２版）に記載の、図１０４〜１０５、１０７〜１０８、１１１〜１１２、１１５〜１１６、および１１８〜１１９に対応していた。第１の層は、領域ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３、ＧＤｌｂ、およびＧＤｍｂの全海馬を含む要件によって特定されていた。海馬および皮質における免疫反応性を、モノクローナルヒトＡβ−特異抗体６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ）およびチオフラビンＳ染色剤を用いて、定量的に評価した。用いられなかった残りの脳半球または組織は、本プロジェクトが終了するまで、ＪＳＷ  ＣＮＳにおいて、保存および貯蔵した。
【０３０３】
ｂ）  評価  
ｉ）  行動  
モリス水迷路試験では、水泳路の長さ、逃避潜時、スイミング速度を、および、先のプラットフォームを越えるプローブ試験では、各Ｔｇ動物について、位置、およびプールの各四分区間で過ごす時間を、特別なコンピュータソフトウェアで測定した。
【０３０４】
ｉｉ）  生化学的評価  
全てのＴｇマウスからの、ＣＳＦ試料、および脳調製物からの試料を、市販のＡβ１−４０およびＡβ１−４２ＥＬＩＳＡで分析した。適切な標準品の測定を同時に行った。脳調製物からの試料を２つ組で分析した。試料の量が少ないため、ＣＳＦ試料は、単一の測定のみで分析した。
【０３０５】
ｉｉｉ）  組織構造
ｉ１）  アミロイド沈着およびプラーク負荷の測定
６Ｅ１０免疫組織化学のために、次の評価手順を用いた。
【０３０６】
ａａ）  スライス境界の視覚化のための画像を、画像にコントラストを適用せずに、対比する。
【０３０７】
ｂｂ）  皮質の輪郭の相互作用の描写および、その後の皮質面積（＝領域面積）を測定する。
【０３０８】
ｃｃ）  染色された対象が、ある特定の強度に基づいた閾値（各画像で同一）よりも上、且つ、８μｍ２のサイズよりも上で検出される、対象となる面積（ＡＯＩ）の相互作用を描写する。
【０３０９】
ｄｄ）  信号／ノイズ比（各画像で同一）を向上させるための滑らかなコントラスティングの後、各対象の面積、すなわち、ＡＯＩ内の染色された面積の合計、および、対象の総数を測定する。
【０３１０】
ｅｅ）  海馬についても、ａａ）−ｄｄ）を繰り返す。
【０３１１】
ｆｆ）  平均プラーク寸法（＝「プラークの総面積／プラークの総数」）、相対プラーク数および面積（＝「プラークの数／領域面積」および「プラークの総面積／領域面積＊１００」）を計算する。
【０３１２】
ｇｇ）  Ｅｘｃｅｌのスプレッドシートに、「画像の名称、領域面積、プラークの数、プラークの総面積、プラークの相対数、相対プラーク面積、および平均プラーク寸法」といったパラメータを含むデータを自動転送する。画質および除外基準をそれぞれ記録するために、備考欄のフィールドを用いた。除外基準は、スライスの欠損部分、多くの皺、顕著な傷、または、（例えば、ブロッキング試薬の完全な反応を阻害し得る膨張による）染色の不整合であった。
【０３１３】
ｈｈ）  （未加工データを未加工のまま維持するために）画像を保存せずに閉じる。
【０３１４】
ｃ）  結果  
ｉ）  一般的観察  
全部で４０匹の雌のｈＡＰＰ  Ｔｇマウスを、調査の対象とした。これらのマウスのうち、１２匹の動物が、処置期間が終了する前に、原因不明により死亡した。
【０３１５】
ｉｉ）  行動的結果  
ＭＷＭにおける空間的学習は、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の処置によっては、大きく影響されないままであった。０．１ｍｇ／ｋｇで処置したマウスは、１日目と４日目との間において、学習実績が悪いという傾向を示した。１日目および４日目の平均実績の二元配置ＡＮＯＶＡにより、全ての群（ｐ＜０．００１）にとって、有意の高い学習を示しただけでなく、因子処理の有意の影響（ｐ＝０．０４５）も示した。しかし、ボンフェローニのポストテストは、有意点まで達しなかった。
【０３１６】
ｉｉｉ）  生化学的結果  
ａａ）  脳ホモジネート画分のＡβレベル  
試験化合物ＸＧ−１０２（配列番号１１）による処置は、脳ホモジネートＡβ１−４０レベルに影響を与えなかった（図１１参照）。Ａβ１−４２レベルの群間の差異は、トリトンＸ−１００画分において現れただけであった。トリトンＸ−１００画分では、低投与量の試験化合物ＸＧ−１０２（配列番号１１）（０．１ｍｇ／ｋｇ）で処置された動物は、ビヒクル群（ｐ＜０．０５）および高投与量の群（ｐ＜０．０１）と比べて、有意な低下を示した。
【０３１７】
ｂｂ）  ＣＳＦのＡβレベル  
試験物質ＸＧ−１０２（配列番号２）による処置の後、ＣＳＦのＡβ１−４０およびＡβ１−４２レベルは、ビヒクル群と比べて、有意に低下した。どちら群も、Ａβ１−４０およびＡβ１−４２のｐ値は、高投与量（１０ｍｇ／ｋｇ）ではｐ＜０．０１であり、ＸＧ−１０２（配列番号２）の低投与量では＜０．０５であった（図１２参照）。
【０３１８】
ｉｖ）  脳組織構造および免疫組織化学の結果  
ａａ）  アミロイド沈着およびプラーク負荷  
プラーク負荷を、異なる２つの方法によって定量化した。一方では、主にヒトアミロイドペプチドのＡＡ１−１７に対する６Ｅ１０を用いたＩＨＣ染色法を行った。他方では、成熟した神経炎性プラークのベータ−シート構造およびコアを標識化するチオフラビンＳ染色法を行った。まず第一に、測定された領域面積、皮質および海馬は、全ての群を通して極めて一定であったが、これは、切開およびＩＨＣ手順における問題、および処置によってある程度誘発される萎縮症を排除することが可能であることを示していた（＞５％の変化がこの方法によって検出可能である）。６Ｅ１０およびチオフラビンＳの定量化は、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の処置の後の、プラークの中心における、ベータ−シート構造が選択的に低減され、その一方で、残留したヒトアミロイドは、この処置からは影響を受けないままであるか、または、わずかに増大したことを示していた。詳細に言うと、皮質の６Ｅ１０  ＩＲプラーク負荷は、１０ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）で処置したマウスにおいて、ビヒクルと比べて、増大した。しかし、海馬プラークの数では、有意水準に達した。図１３および１４は、６Ｅ１０  ＩＨＣと異なり、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の処置により、海馬のチオフラビンＳにポジティブなプラークの数、および、面瀬の比率（プラークの数：１０ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）の場合ｐ＜０．０５、０．１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）の場合ｐ＜０．０１）が、負の用量依存性低減をもたらしたことを示している。０．１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）の処置は，また、平均プラーク寸法を減少させた。しかし、この効果は、ＡＮＯＶＡ（対応のない両側Ｔ検定：ｐ＝０．０７４）では、有意水準に達しなかった。皮質よりも海馬において、十中八九後のプラークの病変の発症に起因する環境において、皮質のプラークでは、これらの作用は生じなかった。５ヶ月齢において処置を開始することは、海馬におけるプラーク沈着の時点に正確に適合するが、その一方で、皮質のプラークは、３ヶ月齢において、定量化のために用いられる倍率において視認可能になり始める。質的には、チオフラビンＳで染色されたプラークに対する、６Ｅ１０の比率は増大し、２重に標識化されたスライスに見られるようなベータ−シートのプラークコアの寸法は、小さくなる。まとめると、これらのデータは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の処置が、プラーク沈着の初期段階におけるベータ−シート形成、および、プラークコアにおけるベータ−シート形成に、それぞれ、作用することを、裏付けている。
【０３１９】
ｄ）  効果のまとめ、および結論  
・モリス水迷路において測定された空間的ナビゲーションは、治療から大きく影響を受けないままであった。０．１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）の治療により、学習実績は、結果的に、トレーニングの第１日目と最終日との間で、わずかにより乏しくなった。
【０３２０】
・０．１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）群のトリトンＸ−１００画分が減少したことを除いて、Ａβ１−４０およびＡβ１−４２脳レベルは、安定した状態を維持した。
【０３２１】
・ＣＳＦでは、両方の投与量および両方の画分について、Ａβレベルの減少が検出可能であった。
【０３２２】
・６Ｅ１０の定量化において、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の処置が、高投与量群のヒトアミロイドベータを、増大させる傾向があった。このことは、Ａβ  ＥＬＩＳＡにおいて得られたデータに適合している。
【０３２３】
・これとは異なり、チオフラビンＳ染色法によって検出された海馬のベータ−シート負荷は、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の処置後、投与量に依存して低減し、低投与量である０．１  ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）において、大きく低減したが、皮質のプラーク負荷は、不変のままであった。処置開始時における、年齢に依存した、海馬内のプラーク沈着の開始に従って、これは、プラーク沈着の初期の段階におけるベータ−シート形成に対する初期の作用を示唆している。
【０３２４】
実施例１５：２型糖尿病の処置における、全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドおよびその改変体の活性の決定  
実施例１５は、２型糖尿病の処置において、ＩＢ（ｓ）ペプチド、並びに、全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチド、およびその改変体の活性を決定すること、特に、２型糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスモデルにおけるＸＧ−１０２（配列番号１１）による慢性的処置の効果を、空腹時血糖値を３日ごとに（２８日間）に評価することによって、決定するようにデザインする。
【０３２５】
材料および方法  
ｉ）  動物  
全部で二十（２０）匹の雄のｄｂ／ｄｂマウス（８週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（ドイツ）から入手した。他の記載がない限り、到着後、動物は、群ごとに（群当たりｎ＝６〜７）収容し、げっ歯類用の標準食（Ａｌｔｒｏｍｉｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ＃１３２４  ｃｈｏｗ；  Ｃ．  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，  Ｒｉｎｇｓｔｅｄ，デンマーク）および水を、自由に与えた。
【０３２６】
これらのマウスを、温度および湿度が制御された部屋に、（４：００に点灯し、１６：００に消灯する）１２：１２のＬ／Ｄ周期の下で、収容した。
【０３２７】
ｉｉ）  群およびランダム化  
−４日目に、マウスを、血糖値（空腹時；Ｂｉｏｓｅｎ  Ｓ  ｌｉｎｅ分析器（ＥＫＦ
ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，ドイツ）上で測定した血糖）に従ってランダム化して、次の薬剤処置群（ｎ＝６）のうちの１つに参加させた。
１）  ビヒクルコントロール、Ｓ．Ｃ．（生理食塩水）  
２）  ＸＧ−１０２（配列番号１１）、１ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．  
３）  ＸＧ−１０２（配列番号１１）、１０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ  
列挙した全ての投与量は、遊離塩基で計算した。薬剤の純度：９５．２８％，ペプチド含有量：７８．０％。全ての化合物を、３ｍｌ／ｋｇの容積で、皮下（ｓ．ｃ．）投与した。ビヒクルコントロールおよびＸＧ−１０２（配列番号１１）の製剤説明は、次のとおりである。
【０３２８】
まず、ＸＧ−１０２（配列番号１１）をビヒクル中に溶解させた。製剤（１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの投与量にそれぞれ対応する、濃度０．３３および３．３ｍｇ／ｍｌ）を、以下に詳述する手順に従って調製した。試験品目の純度およびペプチド含有量を考慮して、濃度を計算し、表示した（乗算係数は１．３４６であった）。
・  原液の調製：冷凍−乾燥させた試験化合物ＸＧ−１０２（配列番号１１）を、最低１時間、解凍し、１ｍＭ（３．８２３ｍｇ／ｍＬに相当）の、ビヒクル中の原液として調製した。アリコートを、処置日ごとに調製し、約−８０°Ｃで保存した。この原液を、処置日ごとに、所望の濃度まで希釈した。
・  原液の保存：約−８０°Ｃ；  
・  希釈した調製物の保存：室温で最大２４時間。
【０３２９】
溶解する前に、粉末を、−２０°Ｃで保存した。原液の安定性は、約−８０°Ｃで３ヶ月である。動物に投与するための希釈した製剤の安定性は、室温で２４時間である。未使用の希釈材料は、４〜８°Ｃで保存されているならば、最大７日間保存可能であった。
【０３３０】
ｃ）  実験の手順  
８日間の環境順化の後、マウスを、アウトライン群に従って、２１日間、毎日午前８時に、午後４時の消灯の８時間前にＳＣ投与することによって、処置した。その後、調査２１日目に、最も高濃度のＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）の投与を停止し、その一方で、調査２８日目まで、毎日のビヒクルコントロールおよびＸＧ−１０２（配列番号２）（１ｍｇ／ｋｇ）の投与を継続した。２８日目から１１１日目の終了日まで、ビヒクルおよびＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置されたマウスを、ウォッシュアウト期間（投与なし）において観察し、その一方で、ＸＧ−１０２（配列番号２）（１ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスを、２８日間の処置後に、終結させた。
【０３３１】
ｉ）  血糖  
投与の６時間後に、７時間の空腹状態の動物からの血糖を、尾静脈からの１０μｌの血液試料を、ヘマトクリット管に採取することによって測定し、次に、Ｂｉｏｓｅｎ  ｓ−ｌｉｎｅ分析器（ＥＫＦ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、ドイツ）で分析した。
【０３３２】
ｉｉ）  代謝ケージ  
群１＋３：マウスを代謝ケージの中に置いて、２４時間の食料および水摂取、並びに、２４時間の尿および糞の生成を記録した。マウスを、ｎ＝６〜７の２つのサブチームに分類し、続いて、調査７１〜７２日目に、代謝の特性付けを行った。
【０３３３】
ｉｉｉ）  アディポカインパネル  
群１＋３：３つのケース（調査５７日目、６６日目、および１０８日目）において、血液を、尾静脈から、ＥＤＴＡが被覆されたヘマトクリット管（１００μｌ）を用いて採取した。その後、血液の遠心分離を行い、血漿を採取し、−２０°Ｃで、測定まで保存した。その後、次のアディポカイン／サイトカインのパネルを、Ｌｕｍｉｎｅｘに基づいた７−ｐｌｅｘ、すなわち、レプチン、レジスチン、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＴＮＦ、インスリン、およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）を用いて決定した。
【０３３４】
ｉｖ）  終了  
群１＋３（１１１日目）：次の臓器、すなわち、鼠径部皮下脂肪、副睾丸脂肪、後腹膜脂肪、脳、肝臓、腎臓、脾臓、および心臓を切除し、重量を量った。ここに記載の全ての臓器は、場合によっては行われる将来の組織病理学検査のための４％ＰＦＡ中の試料であった。また、膵臓（全体）を、場合によっては行われる立体学的且つ免疫組織化学分析のためにサンプリングし、目を、場合によっては後に行う網膜症の分析のためにサンプリングした。群２（２８日目）：組織も血漿も採集しなかった。
【０３３５】
ｃ）  結果  
ｉ）  一般的観察  
急性の投与期間の間、動物は、正常レベルの敏捷さおよび活動を示しており、薬剤で処置した動物において、鎮静作用の徴候はなかった。ビヒクルで処置した動物間では、食料および水摂取は、正常範囲内であった。しかし、およそ２週間の投与の後、皮下組織において、結節性線維症が、高投与量のＸＧ−１０２（配列番号２）化合物に対する反応として、観察された。これらの結節状線維症は、群Ｃの全てのマウスにおいて、開放創に進行した。群Ｂでは、軽い結節状線維症が観察された。結果として、注射部位の変更を行った。動物への投与が完了した後、これらの動物は治癒し、結節状線維症も、徐々に消滅した。ビヒクルで処置された動物では、何の臨床的作用も観察されなかった。
【０３３６】
ｉｉ）  血糖  
空腹時血糖値（絶対および相対）が、図１５に示されている。群ＡおよびＣにおいて、空腹時血糖を、６８日目まで３日ごとに測定し、１１１日目の終了日まで、定期的に測定した。ＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置された糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスの空腹時血糖値において、ビヒクルコントロールと比べて、明らか且つ有意の（ｐ＜０．００１）減少が観察された。ＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスの空腹時血糖値は、約５ｍｍｏｌ／Ｌの低いプラトーに達した。この効果は、投与の１４日後に明らかであり、調査の間ずっと、従って、２１日目〜１１１日目までのウォッシュアウト期間の間、持続した。これとは異なり、低投与量のＸＧ−１０２（配列番号２）（１ｍｇ／ｋｇ）では、投与した２８日間の間、何の作用も観察されなかった。
【０３３７】
ｉｉｉ）  体重  
体重の測定（絶対および相対）が、図１６に示されている。ＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスにおいて、体重増加が、ビヒクルコントロールと比べて、明らか且つ有意（ｐ＜０．００１）に防止されたことが観察された。この効果は、投与の２８日目から明らかであり、終了日である１１１日目まで持続した。これとは異なり、低投与量のＸＧ−１０２（配列番号２）（１ｍｇ／ｋｇ）では、投与した２８日間の間、体重に何の効果も観察されなかった。
【０３３８】
ｉｖ）  代謝ケージ  
ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）の、調査６８目日の代謝ケージにおいて、測定される、２４時間の食料および水摂取、並びに、尿および糞の生成に与える作用が、図１７（ｇ）および図１８（体重のｇに対して正規化された）に示されている。ＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）は、食料摂取および尿の生成を減少させる傾向があったが、ビヒクルコントロールと比べて、測定されたパラメータのいずれにも有意の作用が認められなかったことが、観察された。
【０３３９】
ｖ）  アディポカイン  
５７日目、７７日目、および１０８日目に測定されたビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、インスリン、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−６の血漿レベルに与える作用が、図１９に示されており、ｔＰＡＩ−１、ＴＮＦ、およびレジスチンの血漿レベルに与える作用が、図２０に示されている。ＸＧ−１０２（配列番号２）で処置された動物の７７日目および１０８日目において、血漿レジスチンのレベルが有意に高かったことを除いて、ＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）は、ビヒクルコントロールと比べて、測定されたパラメータのいずれにも、有意の作用を与えなかったことが観察された。
【０３４０】
ｖｉ）  終結時の組織重量  
ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）の、副睾丸脂肪パッド、鼠径部皮下脂肪パッド、および後腹膜脂肪パッドの組織重量に与える効果が、図２１に示されている。ＸＧ−１０２で処置されたマウスでは、ビヒクルコントロールと比べて、副睾丸（ｐ＜０．０５）および後腹膜（ｐ＜０．０１）の脂肪質量における有意な減少が、観察された。ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、脳、脾臓、および心臓の組織重量に与える作用が、図２２に示されている。ＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、ビヒクルコントロールと比べて、これらのパラメータに何の有意な作用も与えないことが観察された。最終的に、ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、腎臓および肝臓の組織重量に与える作用が、図２３に示されている。ＸＧ−１０２（配列番号２）で処置したマウスにおいて、ビヒクルコントロールと比べて、腎臓（ｐ＜０．０５）および肝臓（ｐ＜０．０１）の質量が有意に減少したことが観察された。
【０３４１】
これらの結果をまとめると、１０ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）の投与は、血糖値の有意な減少をもたらすようであり、従って、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、糖尿病の処置および上昇した血糖値のための、有望な新規の手段であると考えられる。
【０３４２】
（実施例１６）
無作為化、二重盲検、プラセボコントロール、用量漸増（ｅｓｃａｌａｔｉｎｇ）フェーズＩ試験において、健常男性ボランティアへと投与された、１０、４０、および８０μｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）の単回静脈内注入の、安全性、忍容性、および薬物動態
試験の主要目的は、ＸＧ−１０２の単回漸増（ｅｓｃａｌａｔｉｎｇ）用量の、健常男性ボランティアへの静脈内（ｉｖ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）注入の後における、ＸＧ−１０２の安全性および忍容性を評価することであった。試験の副次的目的は、ＸＧ−１０２の単回漸増（ｅｓｃａｌａｔｉｎｇ）用量の、健常男性ボランティアへのｉｖ注入の後における、ＸＧ−１０２の薬物動態を評価することであった。用量は、６０分間のｉｖ注入として投与した。コントロールの目的で、プラセボのｉｖ注入を、コントロールの被験体に対して行った。
【０３４３】
これは、単一施設、無作為化、二重盲検、プラセボコントロール、単回用量漸増（ａｓｃｅｎｄｉｎｇ）、逐次群試験であった。ＸＧ−１０２の３つの投与レベル（１０、４０、および８０μｇ／ｋｇ）を、用量の昇順で試験した。各群内では、６例の被験体には、ＸＧ−１０２を施し、２例の被験体には、プラセボを施すように、被験体を無作為化した。スクリーニングは、投与の前の３週間にわたり実施した。投与は、０日目において、各被験体に対して行った。治験責任医師は、ＣＲＵからの被験体の退院（投与の２４時間後における）の前に、全ての被験体の健康について点検した。被験体は、試験後評価のために、投与の８±２日後および２８±５日後に、ＣＲＵへと帰院した。
【０３４４】
８例ずつ３つの群に合計２４例の被験体（１８〜４５歳の健常男性の被験体）。２４例の被験体が、試験に参加し、これを完了した。全ての被験体についてのデータを、安全性解析に組み入れ、ＸＧ−１０２を施された全ての被験体についてのデータを、薬物動態解析に組み入れた。
要約：
薬物動態の結果：
ＸＧ−１０２の薬物動態パラメータを、以下の表に提示する。
【表４】
2020055866.tif 000010
【０３４５】
観察値のｔ１／２は、短かった。Ｃｍａｘにより測定されるピーク曝露量およびＡＵＣ０−ｌａｓｔにより測定される累積曝露量のいずれも、用量と共に増加した。用量に応じたＣｍａｘの増加は、グラフによる検査と、最大用量である８０μｇ／ｋｇの投与の後では、他の用量についての９０％の信頼区間を上回る、その用量正規化値の幾何平均（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｄｏｓｅ  ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｖａｌｕｅｓ）とに基づくと、線形比例を超えると考えられる。その幾何平均の用量正規化値についての９０％の信頼区間は、他の試験した用量の投与後における９０％の信頼区間と重なり合わないので、用量に応じたＡＵＣ０−ｌａｓｔの増加は、４０〜８０μｇ／ｋｇでは、明らかに線形比例を超えるのに対し、１０μｇ／ｋｇ投与後の値と４０μｇ／ｋｇ投与後の値とを比較すると、９０％の信頼区間は重なり合うが、１０μｇ／ｋｇ投与後における、その幾何平均の用量正規化値は、４０μｇ／ｋｇ投与後における、対応する９０％の信頼区間内の全ての値より小さい。
【０３４６】
ＸＧ−１０２は、１０、４０、または８０μｇ／ｋｇの、健常男性の被験体への単回ｉｖ用量として投与したところ、安全であり、良好に忍容された。ＸＧ−１０２を施された被験体における有害事象の発生率は、プラセボを施された被験体における発生率と同様であった。臨床検査室データ、バイタルサイン、ＥＣＧ、身体検査、または眼検査（眼底検査およびＩＯＰ検査）において、臨床的に重要な所見は見られなかった。
【０３４７】
ＸＧ−１０２の静脈内注入の終了後、その血漿濃度は、急速に低下し、最長でも１０μｇ／ｋｇのＸＧ−１０２のｉｖ注入開始の２時間後までの、４０μｇ／ｋｇのＸＧ−１０２のｉｖ注入開始の３時間後までの、および最長でも８０μｇ／ｋｇのＸＧ−１０２の静脈内注入開始の７時間後までの、定量下限を下回る値をもたらした。測定されたｔ１／２値およびＭＲＴ値は、短く、投与レベル当たりの幾何平均値は、それぞれ、０．３６〜０．６５時間および０．７６〜１．０２時間の範囲である。
【０３４８】
ＸＧ−１０２のＡＵＣ０−ｌａｓｔは、試験用量範囲内で、用量に応じた線形比例性を超えて増加し、４０μｇ／ｋｇ〜８０μｇ／ｋｇの間の用量において、その幾何平均の用量正規化値についての９０％の信頼区間は重なり合わず、１０μｇ／ｋｇ〜４０μｇ／ｋｇの間でも、その幾何平均の用量正規化値についての９０％の信頼区間の間の重なり合いは、限定的であるに過ぎなかった。
【０３４９】
ＸＧ−１０２のＣｍａｘは、４０〜８０μｇ／ｋｇにおいて、用量に応じた線形比例性を超えて増加するようである。８０μｇ／ｋｇの投与群における幾何平均の用量正規化Ｃｍａｘは、他の投与群における幾何平均の用量正規化Ｃｍａｘより大きく、これについての９０％の信頼区間の外にあるが、幾何平均の用量正規化Ｃｍａｘについての９０％の信頼区間は、全ての投与レベル間で重なり合う。
【０３５０】
ＸＧ−１０２薬物動態パラメータの被験体間における変動は、１０および４０μｇ／ｋｇの用量で処置された被験体では、中程度であった（大半のパラメータについて、幾何平均のＣＶ％は、ほぼ１５〜３０％の範囲にあったが、例外は、１０μｇ／ｋｇの投与群におけるｔ１／２および総Ｖｓｓであった）が、８０μｇ／ｋｇの投与群ではより大きく、ＭＲＴ（１４．７％）以外については約２９〜４４％の範囲であった。このより大きな変動は、サンプルサイズが小さいことの効果である可能性もあり、この用量では明らかな非線形性が観察されたことの帰結である可能性もある。
【０３５１】
（実施例１７）
ブタ膵島単離の転帰を改善する、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の使用  
目的は、（ａ）膵島単離の間に生じる、細胞ストレスおよび細胞死をもたらすＪＮＫの大規模な活性化を遮断し、（ｂ）膵島死を低減させて、単離後における膵島の生存率の改善をもたらす、ＸＧ−１０２の能力を、ブタモデルを使用して評価することであった。
【０３５２】
ブタ膵島の単離は、膵島単離手順開始の約２０分後において、組織サンプル中でまず観察される、劇的なＪＮＫの活性化をもたらす（図３３）。既存のデータの解析は、調達および単離ラボへの移送の間における、膵臓レベルでのＸｉｇｅｎ  ＸＧ−１０２  ＪＮＫ阻害剤の添加、および単離の間における、膵島単離溶液中のＸｉｇｅｎ  ＸＧ−１０２  ＪＮＫ阻害剤の添加（１０マイクロモル濃度）は、ＪＮＫの活性化を遮断し（図３４）、ｃ−ｆｏｓ遺伝子の相対発現を低減し（図３５）、ＯＣＲ／ＤＮＡ（図３６）およびＡＴＰ／蛋白質［総細胞蛋白質］（図３７）により測定される場合の、単離されたばかりの膵島の生存率に対して、統計学的に有意で重要な効果を有することを裏付ける。比較は常に、同じ膵臓ドナーに由来する、対応する非処置コントロールに対して行った。図３６および図３７において提示される、膵島の生存率についてのデータは、単離の間において典型
的に観察されるＪＮＫの活性化の低減（図３３）、および結果として生じるｃ−ｆｏｓ遺伝子の発現の低減（図３５）と符合する。生存率、ＪＮＫの活性化、およびｃ−ｆｏｓの発現の差異は、培養の７日後には小さくなった。
【０３５３】
単離６例中の６例（１００％）が、カットオフを上回るＯＣＲ／ＤＮＡ値をもたらし、ＮＨＰにおける移植に成功した（図３８）。これにより、このモデルでは、軽微な生存率の改善であってもなお、調製物の移植能力に対して深甚な効果を有しうることが確認される。入手可能なデータに基づくと、ＸＧ−１０２は、臨床ヒト膵島の単離またはブタ膵島の単離のために使用されるのに優れた薬剤であることが分かった。
【０３５４】
ブタモデルは、以下の理由のために適切である：（１）ブタ膵臓のサイズは、ラット膵臓またはイヌ膵臓よりヒト膵臓のサイズに近いこと、（２）ブタ膵島は、将来的な臨床における膵島の異種移植のための実行可能な選択肢である（したがって、火急に必要とされるブタ膵島単離の改善は、最終的にも、臨床的に適切でありうる）と考えられる。
【０３５５】
脳死ドナーに由来する、臨床における膵島の同種移植のためのヒト膵臓は、ＷＩＴをかけず、８〜１２時間のＣＩＴ（調達病院から単離ラボへの輸送に必要とされる時間）にあることが典型的である。
【０３５６】
心停止ドナーに由来するヒト膵臓は、１５分間のＷＩＴへと曝露され、現在のところ、ＷＩＴに起因する損傷についての懸念のために、日常的には活用されておらず、これらはまた、８〜１２時間のＣＩＴも経ることになろう。
【０３５７】
膵島の自己移植のために慢性膵炎患者から摘出された臓器は、ＷＩＴおよび限定的な（１〜２時間の）ＣＩＴを経る可能性がある。慢性膵炎患者に由来する膵臓は典型的に、炎症を伴い、既にストレス下にあるため、下記のブタモデルについて報告された改善は、臨床における自己移植の症例でなお大きいことが期待される。これはまた、冷阻血時間が遷延する、臨床の同種症例にも当てはまることが予測され、これは、異なるＪＮＫ阻害剤を使用する他の研究グループにより報告されている。ＪＮＫの活性化は、膵臓調達時からのＣＩＴと共に増加し、ＪＮＫ阻害剤によるＪＮＫ活性化の遮断は、膵島の収量、生存率、および移植転帰を改善し、これは、試験した冷阻血時間を最長としたときに最も顕著である。
【０３５８】
（実施例１８）
ラットアルゴンレーザー誘導性脈絡膜血管新生モデルを使用する、脈絡膜血管新生の低減における、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の有効性
【０３５９】
本実施例の目的は、２つの用量でのＸＧ−１０２の２回にわたる硝子体内投与が、レーザー誘導性脈絡膜血管新生（ＣｈＮＶ：ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）のラットモデルにおいて、脈絡膜血管新生の低下をもたらすのかどうかを決定することであった。このモデルは、加齢黄斑変性を処置するための、試験化合物の潜在的な使用について予測を行うことを可能とする。
【０３６０】
有色Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラット４０匹（＋補欠１０匹）を、各群８匹ずつの動物による５つの群へと分けた。５３２ｎｍのアルゴンレーザー光凝固装置（６つの７５μｍサイズのスポットとし、１５０ｍＷで、１００ミリ秒にわたる）を、右眼に使用して、脈絡膜血管新生を誘導した。０日目（誘導の直後）および７日目に、試験物質（ｔｅｓｔ  ｉｔｅｍ）、基準物質、およびコントロール物質を、硝子体内注射により投与した。血管造影は、誘導後１４および２１日目において、フルオレセイン（トレーサー）皮下注射の１０分後に、処置動物および非処置動物に対して実施した。
【０３６１】
２３日目における屠殺後、全ての動物に由来する、処置された右眼をサンプリングし、脈絡膜のフラットマウントを作製した。試験依頼者の要望により、ＣｈＮＶの体積の定量化は、実施しなかった。
【０３６２】
実験の用意：
ＸＧ−１０２：３，０００μｇ／ｍｌ（眼１つ当たり１５μｇに相当する）および３００μｇ／ｍｌ（眼１つ当たり１．５μｇに相当する）。コントロール基準物質としてのＫｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）Ｒｅｔａｒｄ（４％のトリアムシノロンアセトニド）。コントロールビヒクル：生理食塩液（０．９％のＮａＣｌ）。
動物
種：ラット。これは、この実験モデルにおいて最も一般に使用される種である。
系統：Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ（有色）。
週齢：約８週齢。
体重：１７５〜２００ｇ（注文時）。
性別／数：雄５０匹（試験：４０匹；補欠：１０匹）。
飼育元：「ＨＡＲＬＡＮ  ＦＲＡＮＣＥ」（ＦＲ−０３８００  ＧＡＮＮＡＴ）。
【０３６３】
試験デザイン
Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ系統に由来する有色ラット４０匹（＋補欠１０匹）を、動物８匹（＋補欠２匹）ずつによる５つの群へと分けた。５３２ｎｍのアルゴンレーザー光凝固装置（６つの７５μｍサイズのスポットとし、１５０ｍＷで、１００ミリ秒にわたる）を、右眼に使用して、脈絡膜血管新生を誘導した。
【０３６４】
０日目（同じ麻酔下で、血管新生の誘導後において）および７日目において、試験物質（２つの用量、群１〜２）、ビヒクル、および基準物質（５μｌ）を、硝子体内注射により、右眼に投与した。眼底部における新生血管は、１４および２１日目において、処置動物および非処置動物について、ハイデルベルグ網膜血管造影（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ’ｓ
Ｒｅｔｉｎａｌ  Ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ）（ＨＲＡ）を右眼に使用して評価した。
【０３６５】
下記の表は、処置群内の動物の割付けをまとめる。
【表５】
2020055866.tif 000011
【０３６６】
動物の選択
【０３６７】
本試験には、４０匹の動物＋１０匹の補欠動物を参加させた。眼欠損の目視可能な徴候を伴わない動物のみを選択した。次いで、Ｅｘｃｅｌ（登録商標）ソフトウェアのランダム関数によって、処置群内の割付けを行った。５０匹の動物を誘導し、追跡調査した。処置群内の無作為割付けにより、群ごと８匹ずつの動物および補欠動物を決定した。後者の補欠動物は、正常で参加させた１または２匹の動物が、死亡したか、投与手順において水晶体に影響を受けたか、または角膜混濁（麻酔の反復に起因する）を有した場合に限り、結果の計算に組み入れた。
【０３６８】
血管新生の誘導
０日目において、キシラジン／ケタミンミックスの筋肉内注射により、動物に麻酔をかけた。０．５％のトロピカミド１滴の滴下により右眼の瞳孔を散大させた。次いで、アルゴンレーザー光凝固装置（５３２ｎｍ；１５０ｍＷ；１００ミリ秒）を使用して、主血管枝の間の視神経乳頭の周囲において、接触レンズを伴う細隙灯を介して、６カ所の脈絡膜火傷（７５μｍのスポットサイズ）を施した。レーザー処置時における気泡の生成により、ブルッフ膜の破断が確認された。
【０３６９】
投与経路および投与法
キシラジン／ケタミンミックスの筋肉内注射により、動物に麻酔をかけた。０日目および７日目に、試験物質、基準物質、およびビヒクル（５μｌ）を、右眼に硝子体内注射した。注射は、手術用顕微鏡下で実施した。
【０３７０】
０日目にスケジュールされた硝子体内注射は、血管新生の誘導後において、同じ麻酔下で施した。
【０３７１】
硝子体内注射は、側頭上部領域内の毛様体輪に位置取りし、１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎに取り付けられた３０Ｇの注射針を使用して実施した。次いで、充填されたシリンジを、ＵｌｔｒａＭｉｃｒｏＰｕｍｐ  ＩＩＩへと取り付けて、マイクロリットル範囲の正確な注射を達成した。
【０３７２】
体重
全ての動物の体重は、試験の開始前、次いで、１週間に１回記録した。誘導および処置の前（ベースライン）、次いで、７、１４、および２１日目において記録された動物の体重は全て、ベースラインでは、正常な範囲内：１８０．６±１２．３ｇ（平均値±ＳＤ、ｎ＝４０）にあった。２１日目においても、試験物質群、ビヒクル群、および非処置群の間で、関連する差異は観察されなかった。動物は、ビヒクル群および非処置群のそれぞれについての＋５６ｇ（＋３１％）および＋５９ｇ（＋３４％）と対比して、３００μｇ／ｍｌのＸＧ−１０２群および３０００μｇ／ｍｌのＸＧ−１０２群のそれぞれについての＋５３ｇ（＋２９％）および＋６２ｇ（＋３４％）と体重が増加した。
【０３７３】
Ｋｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）ｒｅｔａｒｄで処置された動物は、ベースラインと誘導後２１日目との間で、＋２１ｇ（＋１２％）と体重が増加した。
【０３７４】
フルオレセインによる血管造影
フルオレセインによる血管造影は、ＨＲＡを使用して、１４および２１日目に実施した。キシラジン／ケタミンミックスの筋肉内注射による麻酔および散瞳の後、２６Ｇのインスリン用シリンジを使用して、体重１００ｇ当たり２５０μｌの１０％フルオレセインナトリウムを皮下注射し、色素注射の１０分後にフルオレセイン写真を記録した。
【０３７５】
本研究は、Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラット４０匹に対して実行した。アルゴンレーザーを使用して、右眼にＣｈＮＶを誘導した。ＣｈＮＶの発症は、フルオレセインによる血管造影（ＦＡ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ）により評価した。処置（試験物質、基準物質、およびコントロール物質）は、誘導後０および７日目において、硝子体内投与により施した。血管造影は、誘導後１４および２１日目において、フルオレセイン（トレーサー）注射の１０分後に実施した。グレード付けは、各病変内のフルオレセインの最大強度に基づき、漏出領域のサイズによっては決定しなかった。
【０３７６】
結果は、時点ごとの群の平均スコアとして、かつ、各処置および両方の時点の各々について得られる強度スコアに対応するスポット数の発生率により表した。マン−ホイットニー検定を使用して、処置群とコントロール群との間で、ＦＡスコアの統計学的有意差が見られるのかどうかを決定した。統計学的有意性は、マン−ホイットニーＵ検定によりｐ＜０．０５が得られた場合に考えられた。
図３９Ａは、フルオレセイン漏出の強度（平均スコア±ＳＤ）を示し、図３９Ｂは、両方の時点における、試験物質で処置された眼内の漏出スポットの比率を例示する。図３９Ｃおよび３９Ｄは、それぞれ、漏出スポット（スコア＞０）および最大漏出スポット（スコア＝３）の百分率を例示する。
【０３７７】
フルオレセインによる血管造影による評価
血管造影図上のフルオレセインの漏出は、２名の検査者により、盲検的に評価し、以下の通り：スコア０、漏出なし；スコア１、わずかな染色；スコア２、中程度の染色；スコア３、強い染色にグレード付けした。特定の病変へと割り当てられた２つのスコアが一致しない場合は、大きい方のスコアを解析に使用した。
【０３７８】
フラットマウント調製物上の標識化を介する、イソレクチンＢ４によるＣｈＮＶの評価（任意選択の定量化）
２３日目において、Ｄｏｌｅｔｈａｌ（登録商標）のｉ．ｐ．注射による安楽死の後、処置された右眼を採取し、室温で１時間にわたり、４％のパラホルムアルデヒド溶液中で固定した。洗浄後、網膜、脈絡膜、および強膜を切り出した。網膜を、注意深く剥離させた。強膜−脈絡膜をフラットマウントし、ＦＩＴＣ−イソレクチンＢ４１抗体によるブロッキングの後、インキュベートした。
【０３７９】
統計学的解析
全てのパラメータについて、群の平均値および標準偏差を計算した。多様な濃度の試験物質とビヒクルとの間の差異の統計学的有意性を評価するため、マン−ホイットニーＵ検定を使用した。
【０３８０】
結果
（１）基準化合物であるＫｅｎａｃｏｒｔ群対ビヒクル群および非処置群
以下の表は、１４および２１日目の１０分後におけるＦＡ（群ごとｎ＝８の動物、右眼）の結果をまとめる。
【表６】
2020055866.tif 000012
【０３８１】
１４日目において、非処置右眼では、スポットの９０％が漏出していたことから、ＣｈＮＶの形成が示された。平均スコアは、２．１±１．０（ｎ＝４８）であった。２１日目において、非処置動物は、９６％の漏出スポットおよび２．１±０．９（ｎ＝４８）の平均スコアを示したことから、ＣｈＮＶの遷延が示された。
【０３８２】
１４日目において、ビヒクル処置眼では、スポットの１００％が漏出しており、平均スコアは、２．９±０．５（ｎ＝４８）であったことから、ＣｈＮＶの形成および重症度が示された。２１日目まで、漏出スポットの発生率に、関連する変化はなく、漏出するスポットは９４％であり、平均スコアは、２．２±１．０（ｎ＝４８）であったことから、ＣｈＮＶの遷延が示された。
【０３８３】
ＦＡのスコア付けは、Ｋｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）ｒｅｔａｒｄが、０および７日目の２回にわたる硝子体内投与後の１４日目において、ビヒクル群についての２．９±０．５と対比した、０．１±０．３の平均スコア（ｎ＝４６）により示される通り、フルオレセイン漏出を、ビヒクルと比較して９７％（ｐ＜０．００１、マン−ホイットニーＵ検定）と有意に低減することを明らかにした。
【０３８４】
１４日目において、漏出スポットの発生率は、Ｋｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）ｒｅｔａｒｄ群において低減され、１００％の漏出スポットを示すビヒクル処置動物と比較して、１３％の漏出スポットであった。
【０３８５】
２１日目まで、Ｋｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）ｒｅｔａｒｄで２回にわたり処置された動物は、それぞれ、０．３±０．５（ｎ＝４５）対２．２±１．０の平均スコアにより示される通り、ビヒクル処置動物と比較して、血管漏出の、８６％という関連する低減を示した（ｐ＜０．００１、マン−ホイットニー検定）。
【０３８６】
２１日目における、ビヒクル群と比較した漏出スポットの比率は、ビヒクルについての９４％と対比した、Ｋｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）ｒｅｔａｒｄについての３１％の漏出スポットにより示される通り、変化しなかった。
【０３８７】
（２）ＸＧ−１０２処置群対ビヒクル群
以下の表は、１４および２１日目の１０分におけるＦＡの結果（群ごとｎ＝８の動物、右眼）をまとめる。
【表７】
2020055866.tif 000013
【０３８８】
結果の概要を、図３９に提示する。
【０３８９】
動物の全般的挙動は、いずれの用量のＸＧ−１０２の硝子体内投与の後でも変化しなかった。臨床における追跡調査期間中に、関連する合併症は、見出されなかった。
【０３９０】
動物の体重は、ビヒクル群および非処置群のそれぞれについての、＋５６ｇ（＋３１％）および＋５９ｇ（＋３４％）と対比して、３００μｇ／ｍｌのＸＧ−１０２群および３０００μｇ／ｍｌのＸＧ−１０２群のそれぞれについて、＋５３ｇ（＋２９％）および＋６２ｇ（＋３４％）と、試験期間中に増加した。Ｋｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）で処置された動物は、２１ｇ（＋１２％）の体重増加を示した。
【０３９１】
ビヒクル群では、誘導された眼は、レーザーによる傷害の１４および２１日後において、一定のフルオレセイン漏出を示した。１４日目において、平均フルオレセイン漏出は、２．９±０．５（ｎ＝４８の影響例（ｉｍｐａｃｔ））であり、漏出スポットは１００％であったことから、ＣｈＮＶの形成および重症度が示された。２１日目において、ＣｈＮＶの形成は、９４％の漏出スポットおよび２．２±１．０の平均フルオレセイン漏出（ｎ＝４８の影響例）を一貫して維持した。
【０３９２】
０および７日目における、Ｋｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）（投与１回当たり２００μｇ）の、２回にわたる硝子体内投与は、誘導後１４および２１日目におけるＣｈＮＶの形成の発生を阻害し、１４および２１日目における平均スコアは、それぞれ、ビヒクルについての２．９±０．５および２．２±１．０と対比して、Ｋｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）ｒｅｔａｒｄについての０．１±０．３（ｐ＜０．００１）および０．３±０．５（ｐ＜０．００１）であった。１４日目において、基準物質で処置された群では、漏出を示す病変が１３％であるのに対し、ビヒクル群では、１００％が漏出を示した。２１日目まで、漏出スポットの発生率は、Ｋｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）ｒｅｔａｒｄにより、ビヒクル（９４％）と比較した低減（３１％）を維持した。
【０３９３】
３００μｇ／ｍＬおよび３０００μｇ／ｍＬのＸＧ−１０２で処置された動物は、１４日目において、ビヒクルと比較して、低用量のＸＧ−１０２については、平均スコアが２．４±０．９である１７％（ｐ＜０．０５）、および高用量のＸＧ−１０２については、平均スコアが１．７±０．７である４１％（ｐ＜０．００１）と、血管漏出の有意な低減を示した。２１日目において、いずれの用量のＸＧ−１０２も、ビヒクルと比較して、関連する血管漏出の低減を示さなかった。
【０３９４】
ビヒクル群について、９０％のスポットがスコア３であるのと比較して、低濃度のＸＧ−１０２および高濃度のＸＧ−１０２のそれぞれについて、スコア３は６６％および１２％であることにより示される通り、３００μｇ／ｍｌのＸＧ−１０２群および３０００μｇ／ｍｌのＸＧ−１０２群については、１４日目において、スコア３を有するスポットの比率の低減が記録された。
【０３９５】
ＣｈＮＶを測定する解剖学的計量法および機能的計量法を使用したところ、かつ、所与の実験条件下において、３００および３０００μｇ／ｍｌで硝子体内投与されたＸＧ−１０２は、最終回の投与後７日間にわたり（試験の１４日目まで）、血管漏出を阻害した。
【０３９６】
（実施例１９）
ＸＧ−１０２のアドリアマイシン誘発性腎症に対する効果
本実施例の目的は、ＸＧ−１０２の、炎症性腎疾患である腎症に対する効果を試験することであった。アドリアマイシンによる処置は、ラットおよびマウスにおける糸球体疾患を誘発し、ヒト巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ：ｆｏｃａｌ  ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）を模倣する。このモデルでは、疾患経過中において、重度の蛋白尿症に部分的に起因する、尿細管性炎症性病変および間質性炎症性病変が生じる。治療の非存在下では、腎疾患は、８週間以内に、末期腎不全へと進行する。有足細胞の傷害は、糸球体硬化症をもたらす継起の初期段階の１つである。試験の目的は、ＸＧ−１０２が、腎病変および腎不全の発症を予防しうるのかどうかを調査することであった。
【０３９７】
ＸＧ−１０２（コントロール：０．９％のＮａＣｌ）を、ラットへとｉ．ｖ．投与した。合計５０匹のラットを処置したが、ここでは、３つの群（ラット１０匹ずつによる）に、ＸＧ−１０２（低用量（２０μｇ／ｋｇ）、中程度の用量（２００μｇ／ｋｇ）、および高用量（２０００μｇ／ｋｇ））を施した。これらの３つの群の全て（およびプラセボ群）を、０日目において、１０ｍｇ／ｋｇのアドリアマイシンで処置した。１０匹の動物による第５群には、アドリアマイシンを施さず、ＮａＣｌコントロールで処置した。組織学的調製物は、８、１４、２９、および４１日目に用意した。
【０３９８】
これらの組織学的調製物は、ＸＧ−１０２が（全観察期間にわたり）、アドリアマイシン誘発性腎症に対して、有意に明確な効果を及ぼすことを明らかに示した。腎組織は、細胞喪失から有意にレスキューされる（図４２〜４５を参照されたい）。ＸＧ−１０２による処置を伴わない場合またはＸＧ−１０２による処置を伴う場合の、ｃ−ｊｕｎの発現に対する効果を、それぞれ、図４６および４７に提示する。
【０３９９】
さらなる試験では、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）４０匹を使用した（４つの群へと１０匹ずつのラットを分けた）。腎症は、０日目において、１０ｍｇ／ｋｇのアドリアマイシンの単回静脈内注射により誘発した。０日目において、ＸＧ−１０２（配列番号１１；２ｍｇ／ｋｇ；０．９％のＮａＣｌ中）を、尾
静脈に静脈内投与した。投与容量は、０．２ｍｌであった。
下記の表は、無作為割付けをまとめる。
【表８】
2020055866.tif 000014
【０４００】
各日において、全ての動物の全般的挙動および外観を観察した。動物の健康をモニタリングした（瀕死の動物、異常で重要な体重の喪失、物質の大きな非忍容性など・・・）。除外されるラットはなかった。
【０４０１】
血液は、群ごと４匹ずつのラットの尾静脈から、７、１４、２８、４２、および５６日目において回収した。Ａｄｖｉａ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６５０（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＧ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の適切なキットを使用して、血清中クレアチニン濃度、血中尿素、および蛋白血を測定した。群ごと２匹ずつのラットを、７、１４、２８、４２、および５６日目の麻酔後において屠殺した。動物を屠殺した後、両方の腎臓を回収した。組織病理学的検査のために、固定された組織検体を、段階希釈されたアルコール溶液中で脱水し、トルエン中で清浄化し、パラフィン中に包埋した。切片（４μｍ）は、過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）で染色し、マッソントリクローム染色を実施して、コラーゲン沈着を検出した。糸球体硬化症および尿細管間質性硬化症を、顕微鏡下で定量化した。
【０４０２】
結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）ソフトウェアを使用して、個々のデータ表および要約されたデータ表の形態で表した。数値による結果は、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。試験した動物数が少ないため、統計学的解析は、実施しなかった。
【０４０３】
疾患進行の間における、ＸＧ−１０２の腎機能に対する効果：
尿素およびクレアチニンの血清レベルを測定して、腎疾患の経過中における腎機能を試験した。クレアチニンは、熱量測定における投与量（ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｏｓａｇｅ）に干渉するため、腎機能の好適な指標である尿素のみを解析した。尿素の血清レベルは、非処置ラットでは、顕著に安定だった（５ｍｍｏｌ／ｌを下回った）が、ＡＤＲは、尿素レベルの漸進性の増加を誘導し、２８日目から急激に、４１日目に２５ｍｍｏｌ／ｌまで上昇し、次いで、５６日目に４８ｍｍｏｌ／ｌまで上昇し、これは、末期腎不全を反映していた（図３８Ｂ）。他方、ＸＧ−１０２で処置されたラットは、疾患の経過を通して、１０ｍｍｏｌ／ｌを下回る尿素の血清レベルを示した（図４８Ｂ）。他方、ＸＧ−１０２で処置されたラットは、疾患の経過を通して、１０ｍｍｏｌ／ｌを下回る尿素の血清レベルを示した（図４８Ｂ）。ＸＧ−１０２単独で処置されたラットの腎機能は、０．９％のＮａＣｌで処置されたラットと同様であった。これらの結果は、ＸＧ−１０２が、腎疾患および腎不全への進行を予防することを示唆する。
【０４０４】
組織病理学的所見（ＰＡＳおよびマッソントリクローム染色）：
ＡＤＲ誘導性の構造的変化は、光学顕微鏡下で評価した。生理食塩液で処置されたコントロールラットは、形態学的に正常な糸球体および尿細管を示した。８日目において、光学顕微鏡による検査は、ＡＤＲネフローゼ群において、巣状分節状糸球体硬化症および蛋白質性円柱を伴う幾つかの領域を示した。これに対し、ＸＧ−１０２で処置されたラットでは、幾つかの尿細管は、蛋白質で満たされているが、糸球体は、メサンギウム細胞過形成が存在しないかまたは孤立する、正常なアーキテクチャーを示し、尿細管性構造および間質は、病理学的変化を示さなかった（図４９）。１４日目までに、ＡＤＲで処置されたラットは、進行性糸球体硬化症、ヒアリン沈着、尿細管拡張、および円柱形成を示した。この群では、糸球体硬化症の程度は劇的に悪化し、２９および４１日目までに、大半の糸球体において、糸球体係蹄とボーマン腔との間の明白な接着を有して、びまん性となり、それは、重度の尿細管萎縮および間質性線維症と関連していた。５６日目において、びまん性糸球体硬化症は、全ての糸球体において観察された（図５０）。しかし、ＸＧ−１０２で処置されたラットは、８日目においても比較的正常な外観を呈し、５６日目においても、ＡＤＲで処置されたラットと比較して、巣状分節状糸球体硬化症および尿細管間質性線維症をほとんど発症しなかった。まとめると、これらの結果は、ＸＧ−１０２が、糸球体線維症および尿細管間質性線維症の発症を予防することを強く示唆し、この群における腎機能の保存を説明し得る。
【０４０５】
試験結果は、ＸＧ−１０２が、ＡＤＲにより誘発された、糸球体傷害および尿細管間質性傷害の進行を予防することの証拠を提示する。さらに、この分子は、腎機能を保存する。
【０４０６】
（実施例２０）
ＸＧ−１０２の、ピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮ）誘発性腎症に対する効果
本試験の目的は、ＸＧ−１０２の、ラットにおける、慢性ピューロマイシンアミノヌクレオシド誘発性腎症に対する効果を、５６日間にわたり評価することであった。ピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮ）は、有足細胞による足突起の喪失および融合を誘発する、有足細胞毒素である。ＰＡＮ誘発性腎症は、ヒト特発性腎炎症候群および巣状分節状糸球体硬化症の、十分に記載されたモデルである（Ｐｉｐｐｉｎ  ＪＷ、２００８年）。ＰＡＮネフローゼを伴うラットにおいて見られる糸球体の形態学的変化は、ヒト微小変化群（ＭＣＤ：ｍｉｎｉｍａｌ  ｃｈａｎｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）および巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）における形態学的変化に酷似する。ラットにおけるＰＡＮの腹腔内投与は、蛋白尿症、低アルブミン血症、および高コレステロール血症（急性期）を特徴とする、腎炎症候群の急速な発生をもたらす。これは、ヒトＭＣＤの十分に確立された動物モデルである。巣状分節状糸球体硬化症の病理学的病変は、腹腔内ＰＡＮ注射の反復により誘発された慢性ＰＡＮネフローゼにおいて観察された（Ｎａｋａｊｉｍａ，  Ｔ．、
Ｋａｎｏｚａｗａ，  Ｋ．およびＭｉｔａｒａｉ，  Ｔ．（２０１０年）．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｄａｒａｖｏｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｎｅｐｈｒｏｓｉｓ．  Ｊ  Ｓａｉｔａｍａ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、３７巻（１号））。傷害の機構によれば、ＰＡＮは、慢性期における糸球体硬化症および間質性線維症（Ｈｅｗｉｔｓｏｎ  ＴＤ、２０１２年）を含む、反応性酸素分子種（ＲＯＳ）の産生を介する直接的なＤＮＡ損傷および組織損傷を引き起こす。  
【０４０７】
この実験では、雄Ｗｉｓｔａｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）９０匹を使用した（１５匹ずつのラットによる６つの群へと分けた）。腎症を誘発するために、ピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮ）を、０日目において、１３０ｍｇ／ｋｇ（５ｍｌ／ｋｇ）の用量で腹腔内投与し、１４日目において、６０ｍｇ／ｋｇ（５ｍｌ／ｋｇ）の用量で腹腔内投与した（Ｎａｋａｊｉｍａ，  Ｔ．、  Ｋａｎｏｚａｗａ，  Ｋ．およびＭｉｔａｒａｉ，  Ｔ．（２０１０年）．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｄａｒａｖｏｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ
ｎｅｐｈｒｏｓｉｓ．  Ｊ  Ｓａｉｔａｍａ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、３７巻（１号））。コントロールラット（群１）には、０日目および１４日目に、等量の生理食塩液をｉ．ｐで施した。ＸＧ−１０２またはそのビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）を、０日目における初回のＰＡＮ注射から始めて、１週間に１回（群１〜５）、０、７、１４、２１、２８、３５、および４２日目における合計７回の注射にわたり、尾静脈へと（ｉ．ｖ．）投与した。個別の実験群（群６）では、ＸＧ−１０２を、０日目におけるＰＡＮ注射の後、２１日目から始めて、１週間に１回、２１、２８、３５、および４２日目における合計４回の注射にわたり、尾静脈へと（ｉ．ｖ．）投与した。
【０４０８】
ＸＧ−１０２を投与するために、ＸＧ−１０２の粉末を、０．９％  ＮａＣｌのビヒクル中に、試験した最高濃度で溶解させた。ここで、最高濃度は、より低い濃度のための原液を表した。各原液は、濾過（０．２μｍ）滅菌した。投与されるより低い濃度の溶液は、ろ過した原液を、ｉ．ｖ．注射のための容量に応じて、生理食塩液（０．９％のＮａＣｌ）中で希釈することにより調製した。
【０４０９】
下記の表は、実験群をまとめる。
【表９】
2020055866.tif 000015
【０４１０】
試験デザインを、図５１に示す。略述すると、腎症を誘発するために、０日目および１４日目において、ＰＡＮまたはそのビヒクル（生理食塩液）を注射した。０日目および１４日目には、ＰＡＮをまず投与した後で、ＸＧ−１０２を投与した。０日目〜４２日目には、ＸＧ−１０２またはそのビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）を、上記で記載した通り、ｉ．ｖ．経路により１週間に１回投与した。
【０４１１】
動物を、１週間に１回秤量した。ＰＡＮで処置された動物は全て、体重の減少を示した。しかし、ＰＡＮで処置された動物は全て、体重について均一であった、すなわち、ＸＧ−１０２の、体重に対する、ＰＡＮ／生理食塩液群（群２）と比較した作用は、観察されなかった。
【０４１２】
５６日目には、動物を屠殺し、サンプル（血液および腎臓）を回収した。特に、血液および腎臓をサンプリングするため、ペントバルビタール（６０ｍｇ／ｋｇ；Ｃｅｖａ  Ｓａｎｔｅ  Ａｎｉｍａｌｅ；Ｌｉｂｏｕｒｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）の注射により、動物に麻酔をかけた。血液サンプルは、腹部静脈から回収し、凝固のために試験管（ＥＤＴＡ  ３Ｋ；３０分間、４℃）へと移し、次いで、血漿を回収するために遠心分離した（１０分間、３０００ｒｐｍ、４℃）。血漿は、クレアチニンアッセイおよび尿素アッセイに使用するまで、−２０℃で保存した。腎臓を摘出し、全ての結合組織および被膜を除去し、電子天秤（Ｍｅｔｔｌｅｒ、Ｔｏｌｅｄｏ）上で秤量した。腎臓サンプルは、１０％のホルマリン溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）中で、２４〜７２時間、特に、４８時間にわたり固定し、次いで、パラフィン中に包埋した。１ブロック当たり、３つの切片（３〜５μｍ）を作製した。スライドは、形態学的変化の組織学的評価、糸球体硬化症および間質性線維症の定量化のために、それぞれ、ヘマトキシリン／エオシン（ＨＥ：ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ／ｅｏｓｉｎ）、ＰＡＳ−メテナミン銀、およびＳｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄで染色した。全てのスライドは、浜松ホトニクス株式会社（日本）製のＮａｎｏｚｏｏｍｅｒ  ２．０  ＨＴを使用して、２０倍でデジタル化した。組織学的調製およびイメージングは、Ｈｉｓｔａｌｉｍ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）により実施した。血漿中クレアチニンおよび血漿中尿素は、Ｐｈｅｎｏｔｙｐａｇｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｔｏｕｌ（Ｒａｎｇｕｅｉｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）によるＡＢＸ  Ｐｅｎｔｒａ  ４００  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＨＯＲＩＢＡ）を使用して定量化した。
【０４１３】
結果は、組織病理学専門医の評価に従う半定量的スコアリングにより表す。糸球体硬化症を組織学的に検査するために、参照により本明細書に組み込まれる、Ｎａｋａｊｉｍａ，  Ｔ．、  Ｋａｎｏｚａｗａ，  Ｋ．およびＭｉｔａｒａｉ，  Ｔ．（２０１０年）．
Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｄａｒａｖｏｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ
ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｎｅｐｈｒｏｓｉｓ．  Ｊ  Ｓａｉｔａｍａ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、３７巻（１号）により記載される通りに、半定量的スコアリングシステムを使用して、糸球体の変化を評価した。略述すると、糸球体傷害の程度は、腎切片１つ当たりの糸球体２５個ずつ（動物１匹当たりの切片２つずつ）において、動物１匹当たりの糸球体の合計５０個について評価した。個々の糸球体における傷害の程度は、糸球体の罹患百分率に基づき、０〜４のスケール：
スコア０：正常、
スコア１：２５％までの糸球体における病変、
スコア２：２５〜５０％の間の糸球体における病変、
スコア３：５０〜７５％の間の糸球体における病変、および
スコア４：７５〜１００％の間の糸球体における病変
を使用してグレード付けした。
【０４１４】
全てのデータは、平均値±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．：ｓｔａｎｄａｒｄ  ｅｒｒｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅａｎ）として計算した。統計学的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、ｖｅｒｓｉｏｎ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、ＬａＪｏｌｌａ、ＵＳＡ）を使用して実施した。体重の結果についての全ての群の比較は、二元ＡＮＯＶＡの後で、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を使用して実施した。群１（生理食塩液／生理食塩液）と群２（ＰＡＮ／生理食塩液）との間の比較は、対応のないスチューデントのｔ検定を使用して実施した。ビヒクルの効果とＸＧ−１０２の効果とは、一元ＡＮＯＶＡの後で、ニューマン−コイルス検定を使用して比較した。Ｐ＜０．０５の値を、統計学的有意性として許容した。群２（ＰＡＮ／ビヒクル）と群６（ＰＡＮ／ＸＧ−１０２：４ｍｇ／ｋｇの４回にわたるｉｖ）との間の比較は、対応のないスチューデントのｔ検定を使用して実施した。
【０４１５】
糸球体硬化症による傷害の結果を、図５２に示す。本試験の主要な目的の１つは、糸球体硬化症による傷害を、ラットにおけるピューロマイシンアミノヌクレオシド注射の反復により誘発された、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の、十分に確立されたモデルにおいて評価することであった。結果は、ＸＧ−１０２の７回にわたるｉｖ注射が、ＰＡＮ誘発性糸球体硬化症を、用量依存的に、有意に軽減することを示した。しかし、１ｍｇ／ｋｇの用量では、この病理学的特徴に対して効果を有さなかった。４ｍｇ／ｋｇの用量で、２１日目から始める、ＸＧ−１０２の、４回にわたるｉｖ注射は、ＰＡＮにより誘発された糸球体硬化症の軽減における、ＸＧ−１０２の強力な効果をもたらした（図５２）。
【０４１６】
糸球体損傷の結果を、図５３に示す。本試験の主要な目的の１つは、ＸＧ−１０２の、ラットにおけるＰＡＮ注射の反復により誘発された糸球体損傷に対する効果を評価することであった。結果は、（ｉ）２および４ｍｇ／ｋｇの用量で７回にわたるｉｖ注射が、病変の重症度（糸球体傷害スコア）に関して、ＰＡＮ誘発性糸球体硬化症を有意に軽減したが、また、糸球体損傷の発生率（傷害を受けた糸球体の百分率）も有意に減少させたという点で、ＸＧ−１０２は、予防効果を有し、（ｉｉ）ＰＡＮ投与後において、４ｍｇ／ｋｇの用量で、２１日目から始める、ＸＧ−１０２の、４回にわたるｉｖ注射が、病変の重症度（糸球体傷害スコア）および糸球体損傷の発生率（傷害を受けた糸球体の百分率）のいずれに関しても、糸球体硬化症に対する強力な効果をもたらすという点で、ＸＧ−１０２は、治癒効果も有することを示した。
【０４１７】
（実施例２１）
糖尿病性腎症のラットモデルにおける、ＸＧ−１０２の長期投与の効果
本試験の目的は、ＪＮＫ阻害剤ペプチドであるＸＧ−１０２の長期投与（毎週１、２、４ｍｇ／ｋｇずつ、９週間にわたる静脈内投与）の効果を、糖尿病性腎症のラットモデルにおいて評価することであった。ロサルタンを、陽性コントロールとして使用した。
【０４１８】
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｍａｒｇａｔｅ、Ｋｅｎｔ）製の、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット７４匹（２００〜２５０ｇ；４匹の控え動物を含む）を使用した。ラットは、ポリプロピレンケージ内で、常時、高脂肪食餌（ｋｃａｌの６０％が脂肪に由来する、Ｄ１２４９２）および水道水を自由に摂取させて、２匹１組で収容した。食餌は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡから購入した。全ての動物は、２１±４℃および５５±２０％の湿度、通常の光（点灯：０７：００〜１９：００）で維持した。
【０４１９】
試験スケジュールを、図５４に示す。動物は、試験を通して、２匹１組で収容した。３週間にわたり、この期間中、動物は毎週秤量するが、食餌および水は、３週目（すなわち、月曜日および木曜日におけるＳＴＺ投与の前の週）の間に２回のみ秤量する。飼育の３週目の間に、携帯型グルコースメーター（Ｏｎｅ  Ｔｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａ  ２）を使用して、血液サンプルを、食餌自由摂取状態の外側尾静脈から採取した。血液サンプリングは、９：００頃に開始した。
【０４２０】
試験のサイズのために、動物は、７２時間ずらした、２つの別個のコホート（可能な限りにおいて、２匹１組の収容のために、各コホートのｎ＝４または６）として実施した（図５４を参照されたい）。約４０匹の動物を、コホートＡへと割り当て、残りの３０匹を、コホートＢへと割り当て、可能な限りにおいて、体重、血漿中グルコース、ならびに食餌および水の摂取について均衡させた。糖尿病を誘発するため、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ：ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）を使用した。ＳＴＺを投与された動物の糖尿病の表現型は、ＳＴＺのバッチに大きく依存するので、最適のＳＴＺ用量（３５または４５ｍｇ／ｋｇ；ｉｐ）を確認するために、パイロット試験を行った。図５４に詳しく示す通り、動物に、約３週間にわたり給餌を維持した後、ＳＴＺまたはビヒクルを施した。控えの動物にも、ＳＴＺを投与する（コホート１つ当たりの動物１組）。
【表１０】
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【０４２１】
各組の動物には、同じ処置または処置を施した（すなわち、２匹ともビヒクルで処置するか、または２匹ともＳＴＺで処置する）。ＳＴＺ投与後７日間にわたり、動物を毎日秤量し、食餌および水の摂取を毎週２回ずつ決定した。残りの試験期間にわたり、動物を秤量し、水および食餌の摂取を毎週２回ずつ評価した（常に、静脈内投与の当日において評価し、典型的には、水の補充日に評価した）。その後、下記で詳述される通り、投与レジメンの差異に照らして、ＳＴＺ後における、体重ならびに入手可能な食餌および水の摂取に基づき、動物を、群Ｂ〜Ｆに割り付けた。
【表１１】
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【０４２２】
ＳＴＺ処置（またはビヒクル処置）の１週間後において、グルコメーター（Ｏｎｅ  Ｔｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａ２）を使用して、血液サンプルを、食餌自由摂取状態の外側尾静脈から採取した（血液サンプルの採取は、９：００頃に開始した）。その後、群Ａ〜Ｅ内の動物に、静脈内経路により、ビヒクルを投与し、群Ｆ〜Ｇ内の動物に、経口経路により、１％のメチルセルロースを投与した。群Ｆ〜Ｇ内の動物には、各日９：００頃に開始して、毎日１回ずつの投与を継続した。動物を投与の前に秤量した（この体重を記録した）。食餌および水も、静脈内群（Ａ〜Ｅ）と同日に限り記録した。
【０４２３】
このベースライン期を、１週間にわたり持続させた。週末に、血中グルコース、入手可能な体重ならびに食餌および水の摂取データに基づき、動物を、薬物処置へと割り付けた。割付けは、下記の表に詳述した。
【表１２】
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【０４２４】
投与は、９週間にわたり持続させた（合計９回の投与、図５４を参照されたい）。群ＦおよびＧ内の動物を秤量し、毎日９：００頃に投与した。群Ａ〜Ｅ内の動物には、１週間に１回ずつ、静脈内経路により投与した（図５４で詳述する通り）。全ての群において、食餌および水の摂取を、毎週２回ずつ決定した（ｉｖ投与の当日および水の補充日において）。血中グルコースは、毎月決定した。サンプルは、既に詳述した通り、グルコメーター（Ｏｎｅ  Ｔｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａ２）により回収した。血液サンプルは、食餌自由摂取状態において採取した（９：００頃に開始して）。動物には、その直後に、それぞれの経路により、定時のスケジュールに従い投与した。投与の後、各動物を、２４時間にわたり、食餌および水を自由に摂取させる代謝ケージに入れた。蒸発を低減するため、ガラス製採尿器を、氷で満たしたポリスチレン容器（Ｓｃａ−ｏｎｌｉｎｅ、ＵＫ）に入れた。ＳＴＺにより、毎日の尿容量の増加が予測されたため、尿を、ある間隔を置いて（例えば、８時間ごと）回収して（そして、冷凍保存して）、各代謝ケージについて、２４時間にわたる総尿容量を記録しうることを確認した。動物１匹当たり単一の２４時間サンプルが回収されるように、各時点におけるアリコートをプールした。プールした２４時間尿から３００μｌずつ１０のアリコートを採取し、−８０℃で凍結させた。ＣＯＢＡＳ  Ｃ１１１および関連の試薬を使用して、尿サンプルについて、クレアチニン、グルコース、尿素、総蛋白質、および電解質（Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ、およびＣａ）を決定した（全ての尿被検体について、ｎ＝２）。尿回収セッションのために、ケージに入れるときおよびケージから取り出すときに、ラットを秤量した。また、摂取された食餌および飲まれた水も計算した。血中グルコースおよび尿パラメータ（クレアチニン、グルコース、尿素、総蛋白質、および電解質）はまた、既に記載した通り（図５４を参照されたい）、さらに１カ月間にわたる投与の後でも決定した。
【０４２５】
処置の８週目（図５４を参照されたい）の間に、ＦＩＴＣ−イヌリン法を使用して、動物の糸球体濾過量（ＧＦＲ：ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）を評価した。これは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｒｉｄｈ，  Ｓ．、  Ｓａｌｌｓｔｒｏｍ，  Ｊ．  ら（２００９年）：  「Ｃ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｓ  Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｒａｔｅ  ｉｎ  Ｈｙｐｅｒｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｒａｔｓ」  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｔｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ＸＸＸ．  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ．  ６４５巻：２１９〜２５頁による方法に基づき実施した。具体的には、ＦＩＴＣ−イヌリン（１．５％）を、生理食塩液中に溶解させ、０．４５μｍのシリンジフィルターを介して濾過した。残留遊離ＦＩＴＣを除去するために、１０００Ｄａのカットオフ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｏｒ  ６、Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＫ製）を使用して、溶液を、光から保護して生理食塩液２０００ｍｌ中４℃で一晩にわたり透析した。透析されたイヌリンを、使用前に、０．２２μｍのシリンジフィルターを介して濾過した。各動物に、１ｍｌ（１５ｍｇ）のＦＩＴＣ−イヌリンを、尾静脈を介して投与した（すなわち、静脈内）。投与の２、５、９、１５、２４、３５、５５、８０分後において、血液サンプル（８０μｌ）を、リチウム−ヘパリン回収試験管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ  ＣＢ３００ＬＨ）へと採取した。各血液サンプルを、冷却された遠心分離器内で遠心分離にかけ、後続の、４９６ｎｍの励起および５２０ｎｍの発光における蛍光の決定のために、血漿サンプルを、清浄なアリコートバイアルへと分注した。
【０４２６】
終了時において、動物ならびに食餌および水を秤量した。次いで、動物を死なせ、終了時における血液サンプル（ＥＤＴＡでコーティングされた試験管内に約４．５ｍＬ）を、心穿刺により採取した。血液サンプルを、冷却された遠心分離器内でスピンし、アリコート（０．５ｍＬずつのアリコート５つ）凍結保存した（−８０℃）。剖検時において、左右の腎臓を摘出し、秤量した。各腎臓を、矢状に二等分に切断し、１０％の中性緩衝ホルマリンのポットに入れ、約５日間にわたり固定した。次いで、腎臓を、蝋中包埋し、各腎臓に由来する半分を、各カセットに入れて、後続の処理のための１つの蝋ブロック（すなわち、１ブロックは、右腎の半分および左腎の半分を伴う）を作製し、残りの腎臓の半分は処分した。蝋ブロックでは、全ての組織は、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ  ＶＩＰプロセッサ（脱水のための段階希釈されたアルコールおよび清浄剤としてのキシレンを使用する）を使用して調製した。次いで、ブロックに、パラフィンｈｉｓｔｏ−ｗａｘを含浸させてから、新鮮なｈｉｓｔｏ−ｗａｘ中に包埋した。腎臓組織を、約４〜５μｍで切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ：Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  Ｅｏｓｉｎ）および過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）のための方法を使用して染色した。その後、スライドを、病理学者による評価のために送付する（例えば、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．ＵＫへと）。病理学者は、Ｈ＆ＥおよびＰＡＳで染色された全てのスライドを、糸球体硬化症、尿細管萎縮、および間質拡大について、「＋、＋＋、＋＋＋」システム（または同様のシステム）を使用して、半定量的に評価した。
【０４２７】
ＸＧ−１０２は、市販の滅菌生理食塩液中に１ｍｌ／ｋｇの容量で投与した。この目的で、初回投与の前に、滅菌生理食塩液を添加することにより、ＸＧ−１０２を調合し、これにより、最大用量（４ｍｇ／ｍｌ）を調合し、低用量は、この４ｍｇ／ｍｌの原液を希釈することにより調製した。次いで、各投与セッションのためのアリコートを調製し、使用まで凍結保存した（−８０℃、−８０℃で３カ月間にわたり安定である）。投与日の朝、各アリコートを、冷凍庫から取り出し、投与の前に室温で解凍した（例えば、３０分間にわたり）。解凍した溶液は、投与の前に、反転により混合した。全ての投与は、解凍の後、可能な限り速やかに完了させたが、試験物質は、室温の生理食塩液中、１０μｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度では、８時間にわたり安定であるので、いずれの場合も、８時間以内に完了させた。滅菌ポリプロピレンプラスチック（ピペットチップを含む）を使用した。原液は、使用の前および低用量への希釈の前に、濾過滅菌（０．２μｍ）する。ロサルタンカリウムは、化学物質供給元（例えば、Ｔｏｃｒｉｓ  ＵＫ）から購入し、毎朝の投与のために、１％のメチルセルロースのビヒクル中、５ｍｌ／ｋｇの容量で調製した。適切な場合は、投与係数（ｄｏｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）を適用した。
【０４２８】
試験の終了時において、体重ならびに食餌ボトルおよび水ボトルの重量を解析した。結果は、体重、最初の４週間については１週間当たりの体重の変化、およびそれ以後は４週間当たりの体重の変化、および薬物投与期間の全体にわたる体重の変化、試験の終了時における体重の低減％、ならびにコントロール群と比較した薬物処置、食餌および水の摂取量、累積食餌摂取量、ならびに最初の４週間については、１週間当たりの平均食餌摂取量および平均水摂取量、ならびにそれ以後は４週間当たりの平均食餌摂取量および平均水摂取量、ならびに給餌試験の持続期間にわたる平均食餌消費量および平均水消費量として表した。異なる処置の、体重および食餌、累積食餌摂取および累積水摂取に対する効果は、処置およびコホートを因子とし、ベースライン（１日目の体重、または−６〜０日目における平均食餌摂取量もしくは平均水摂取量）を共変量とする二元共分散分析の後で、各群を、適切なＳＴＺビヒクル群と比較する、適切な多重比較検定（両側）により解析した。血中グルコースは、処置およびコホートを因子とし、ベースラインの体重、採血順序、および試験前の血漿レベルを共変量とする一般線形モデルにより解析した。適切な変換および／または頑健な回帰法を使用して、異常値の影響を低減することができる。適切な多重比較検定（両側）を使用して、各群を、適切なＳＴＺビヒクル群と比較した。尿中のクレアチニン、グルコース、尿素、総蛋白質、および電解質は、処置群平均値±ＳＥＭとして表した。解析は、処置およびコホートを因子とする一般線形モデルによった。適切な変換および／または頑健な回帰法を使用して、異常値の影響を低減することができる。適切な多重比較検定（両側）を使用して、各群を、適切なＳＴＺビヒクル群と比較した。腎臓重量は、処置およびコホートを因子とし、１日目の体重を共変量とする一般線形モデルにより解析した。体重の変化により引き起こされた効果に加えた効果を決定するため、解析は、処置およびコホートを因子とし、終了時における体重を共変量とする一般線形モデルによった。適切な場合は、対数変換および／または頑健な回帰法を使用した。適切な多重比較法を使用して、各群を、適切なＳＴＺビヒクル群と比較した。病理学評価のために、各処置を、正確ウィルコクソンランクサム検定により、適切なＳＴＺビヒクル群と比較した。
【０４２９】
ＧＦＲは、ＦＩＴＣイヌリンの用量／ＡＵＣ０−∞として計算した。ＡＵＣ（ＦＩＴＣイヌリン濃度の）は、２〜５分線を０分へと外挿する対数線形台形規則（Ｓｔｒｉｄｈ）、および２４〜８０分の終末相の間の対数変換データの線形回帰により計算した。計算されたＧＦＲ値は、処置およびコホートを因子とする二元分散分析により解析した。適切な場合は、対数変換および／または頑健な回帰法を使用した。
【０４３０】
ベースライン週の間の、異なる経路による投与は、共変量として使用されるベースライン値に影響を及ぼしうるので、ＧＦＲを除く全ての解析において、ｉｖ投与された動物は、ｐｏ投与された動物と別個に解析した。非ＳＴＺ群は、上記で記載した全ての解析から除外した。解析内の全ての群を含む、非ＳＴＺ群との比較のためには、別個の解析を実施したが、投与前の週の間の共変量ではなく、ＳＴＺによる処置の前のベースライン共変量を使用した。全ての解析において、０．０５未満のｐ値を、統計学的に有意と考える。
【０４３１】
この糖尿病性腎症のラットモデルにおける、ＸＧ−１０２の、ラットの体重に対する長期投与の効果を、図５５に示す。ＳＴＺ非処置ラットのみが、体重の増加を示した。ＸＧ−１０２で処置されたラットは、ＳＴＺモデルにおいて、ビヒクルで処置されたラットと比較して、体重の差異を示さなかった。しかし、陽性基準物質であるロサルタンで処置されたラットの体重は、有意に低値であった。これらの結果は、ＸＧ−１０２が、十分に忍容されるが、陽性基準物質であるロサルタンが、体重の有意な減少をもたらしたことを示す。
【０４３２】
（実施例２２）
膵島単離／膵島移植における、ＸＧ−１０２に対する用量反応関係の評価
本試験は、膵島単離についての先行試験（実施例１７を参照されたい）およびＮｏｇｕｃｈｉらによる刊行物（Ｎｏｇｕｃｈｉ，  Ｈ．、Ｓ．  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら（２００９年）．  「Ｄｕｃｔａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＪＮＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ
ｂｅｆｏｒｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｉｓｌｅｔ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｉｓｌｅｔ  ｇｒａｆｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．」  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０巻（１号）：  ７３〜８５頁）に基づく。これらの試験は、ブタ膵島単離モデルにおいて、膵島が、膵島単離手順の開始２０分後までに始まる、劇的なＪＮＫの活性化を経ることを示した。この活性化は、既に脆弱な組織に対して、温阻血、酵素による消化、および機械的応力を組み合わせる方法の結果である。実施例１７の試験は、調達時においてブタ膵臓へと流し入れる保存溶液へのＸＧ−１０２（１０μＭ）の血管内添加が、酸素消費速度（ＯＣＲ：ｏｘｙｇｅｎ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）およびＡＴＰ濃度により評価される、膵島細胞の生存率および機能性に対して有意な影響を有し、ＪＮＫの活性化およびｃ−ｆｏｓ遺伝子の発現の低下と相関することを示した。Ｎｏｇｕｃｈｉらは、異なる阻害剤を使用し、これを、同じモル濃度で、調達の直後に、膵管へと添加した。ブタ膵臓およびヒト膵臓が使用された。Ｎｏｇｕｃｈｉらは、ＡＴＰ濃度により評価される膵島の生存率に対して同様の効果を示したが、また、糖尿病マウスの腎被膜下の移植後における糖尿病の逆転に対するインビボの影響も示した。本実験セットの目的は、ＸＧ−１０２の用量反応関係曲線および膵島単離において使用するための最適濃度を決定することであった。この問いに答えるために、齧歯動物モデルを活用した。ヒト膵臓および膵島と、齧歯動物の膵臓および膵島との差異を認めながらも、その単純さと費用効果の高さのために、このモデルを選択した。これらの実験の目的は、必要とされるＸＧ−１０２の最適用量の決定に限られるので、ラットモデルは、妥当であるようである。主要な目的は、臨床における同種膵島細胞移植の転帰を改善するための、ヒト膵臓におけるＪＮＫ阻害であるので、これらの実験では、阻害剤の膵管内注射を行った。これは、実際、化合物が臨床状況で使用される、最も可能性の高い方式である。
【０４３３】
単離後における、ラット膵島におけるＪＮＫの活性化を評価するため、コラゲナーゼを使用する古典的な酵素法により、ランゲルハンス島を、Ｌｅｗｉｓラットから単離した。単離は、動物屠殺直後または１５分間にわたる温阻血後のいずれかで実行した。ＪＮＫの活性化は、単離工程の終了時において、ウェスタンブロットにより評価した。ＪＮＫの活性化を、陰性コントロールとしての、未処理のラット膵臓において評価した。実験は、阻血の各状態のための３匹ずつのラットに加えて、陰性コントロールのための１匹のラットに対しても行い、３回にわたり反復した。これは、のべ２１匹のＬｅｗｉｓラットを表す。図５６に示される結果は、ＸＧ−１０２が、ＪＮＫ（図５６Ａ）およびＰＡＦ２（図５６Ｂ）の、１５分間の阻血により誘導されるリン酸化を、用量依存的に減少させたことを示す。
【０４３４】
ＸＧ−１０２の、膵島の生存率に対する効果を試験するため、阻血の持続時間（温阻血なし対１５分間にわたる温阻血）についての最良のモデル、すなわち、ＪＮＫ阻害後の差異を示す可能性が最も高いモデルを、かつての実験の結果に基づき選択した。単離は、コラゲナーゼ溶液中で希釈された、定められた濃度のＸＧ−１０２またはビヒクルを使用して実行し、酵素により膵臓を消化する前に、膵管へと注射した。活用される多様な洗浄溶液または精製溶液および培養培地において、単離手順全体にわたって、同じモル濃度のＸＧ−１０２またはビヒクルを使用した。単離膵島は、ＲＰＭＩベースの培養培地中で、一晩にわたり培養した。各実験セットのために、以下のＸＧ−１０２濃度：１μＭ、３μＭ、１０μＭ、５０μＭ、および１００μＭを活用した。各濃度のための各群では、３匹ずつの動物を活用し、実験は、結果に応じて、２〜３回にわたり反復した。これは、のべ６０〜９０匹のＬｅｗｉｓラットを表す。膵島収量を決定した。以下の膵島生存率の評価：ＪＮＫの活性化、ＯＣＲ、ＡＴＰ濃度、カスパーゼ放出などを実施した。
【０４３５】
ＸＧ−１０２の、インビボにおける膵島機能に対する効果を試験するため、インビボにおける膵島機能に対するＪＮＫ阻害の効果を評価するための補完的な単離を行った。上記で詳述したインビトロ実験において最も有効なＸＧ−１０２のモル濃度またはビヒクルを使用して単離された膵島のみを用いて、インビボ実験を行った。膵島の単離は、上記の通りに実施した。各単離につき、１０００〜２０００ＩＥＱずつを、ストレプトゾトシン誘発性糖尿病の免疫不全マウスの腎被膜下に移植した。糖尿病を逆転する動物の比率および糖尿病の逆転に必要な時間を、ＸＧ−１０２で処置された膵島を移植された動物、またはコントロールの膵島を移植された動物の間で比較した。移植は、３回にわたり反復した。必要とされる動物の数は、約３０匹のＬｅｗｉｓラットおよび２４匹のＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスである。
【０４３６】
図５７に示される通り、ＸＧ−１０２の、ラット膵島の機能および生存率に対する効果を試験するために、膵島を、１５分間の阻血ラットおよび非阻血ラットから単離した。静的インスリン分泌試験（基礎分泌またはグルコースを使用して刺激された分泌）を、膵島単離の直後および３７℃における培養の１８時間後に実施した。単離は、膵島機能に影響を及ぼすことを観察することができる。実際、基礎インスリン分泌は、いずれの条件でも、単離の直後に使用された膵島において、１８時間にわたりインキュベートされた膵島と比較して高度であった。これらの基礎レベルの高さは、膵島の窮迫を反映する。しかし、培養後において、阻血および阻害剤ＸＧ−１０２は、この実験における膵島機能に対して影響を及ぼさなかった。
【０４３７】
かつての実験で、１５分間の阻血ラットに由来する膵島が、グルコースに応答して、コントロールラットに由来する膵島と同量のインスリンを分泌することが示されたため、阻血を３０分間まで伸ばし、ＪＮＫ阻害剤ＸＧ−１０２を１００マイクロモル濃度で使用する、新たな実験を実施した（図５８）。この実験では、インスリン分泌試験を単離の直後に実施した場合の、高度な基礎分泌が、やはり観察される。さらに、３０分間の阻血は、膵島機能に対して負の影響を及ぼした。これらの予備的結果は、３０分間の阻血が、１５分間の阻血より、ＪＮＫの活性化を誘導するのにより良好なモデルのようであることを示唆した。阻血ラットに由来する膵島を単離し、ＸＧ−１０２と共にインキュベートしたところ、グルコース誘導性インスリン分泌は、阻血ラットと比較して高度であった（図５８）ことから、ＸＧ−１０２の、膵島機能に対する明確な効果が示唆された。
【０４３８】
（実施例２３）
結膜下注射後のラットレーザー誘導性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）モデルにおける、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の有効性
本試験の目的は、レーザー誘導性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ：ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）のモデルにおいて、ラットへの結膜下注射により投与された場合の、ＪＮＫ阻害剤であるＸＧ−１０２の有効性を決定することであった。実施例１８の文脈で概括した通り、このモデルは、化合物の、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を処置するための潜在的な使用についての予測を可能とする。結膜下投与経路はヒトにおける投与に好ましい別の経路であるため、実施例１８において記載した試験とは対照的に、本試験のためには、結膜下投与経路を選択した。
以下の実験群を割り当てた。
【表１３】
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【０４３９】
ビヒクルコントロールである０．９％のＮａＣｌは、受領された通りの状態で投与した。４％のトリアムシノロンアセトニドは、「基準物質２」として用い、これもまた、受領された通りの状態で投与した。ＸＧ−１０２を調製するために、最大投与レベルと同等の原液を、ビヒクルである、注射用０．９％塩化ナトリウム中で調製し、０．２２μｍのポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）フィルターにより滅菌濾過した。より低い投与レベルは、原液を直接希釈することにより調製した。投与製剤（ｄｏｓｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、投与量レベルの要件を満たすのに適切な濃度で、一度に調製した。全ての希釈液は、原液をビヒクルで直接希釈することにより調製した。２つの投与アリコート（１および８日目）を調製し、−２０℃を維持するように設定された冷凍庫内で保存した。各投与レベルのアリコートを、各投与日において、周囲温度で解凍し、溶液を、最長６時間にわたり、室温で維持した。
【０４４０】
雄Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ；１０週齢）４４匹を使用した。動物を実験室環境へと順応させるために、動物の受領と処置の開始との間に、１４日間にわたる最小限の馴化期間を与えた。動物を、同様の群平均体重を達成するようにデザインされた、層別化した無作為化スキームにより、群へと割り当てた。健康状態が悪いか、または体重範囲の両端の動物は、群へと割り当てなかった。投与の開始前において、試験における使用に適さないと考えられた任意の割り当てられた動物は、同じ配送物から得られ、同じ環境条件下で維持された代替動物で置きかえた。投与の開始後も、万一、偶発的傷害、試験品目以外と関連する健康問題、または類似の状況の場合は、試験動物を、置きかえ期間の間に、代替動物で置きかえた。代替動物は、３日以内に、試験における置きかえとして使用した。到着したら、無作為化するまで、動物を個別に収容した。無作為化後、動物は、自動式の給水弁を備えた、ステンレス鋼製で、床に穿孔を施したケージ内で、群として収容した（同じ投与群の動物３匹までを一緒にして）。動物は、指定の手順／活動の間に分離した。ＰＭＩ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｃｈｏｗ  Ｎｏ．５ＣＲ４（１４％の蛋白質）を、指定の手順の間を除き、試験を通して、自由に提供した。逆浸透および紫外線照射による処理後における都市水道水は、自動式給水システムを介して、各動物に自由に摂取可能とした（指定の手順の間を除く）。動物は、試験手順／活動の間を除き、心的／環境的充実のために集団で収容し、身を隠すチューブおよび噛む対象などの品目を施された。
【０４４１】
試験の１日目には、レーザー誘導性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）手順を実施した。ＣＮＶ手順の前に、散瞳点眼剤（１％のトロピカミド）を、両眼に適用した。さらなる適用は、獣医眼科専門医により適切と考えられる場合に実施した。動物には、手順の前および手順中において、イソフルラン／酸素ミックスで麻酔をかけた。麻酔下において、初期の電力設定を３００ｍＷ（気泡形成のためには、レーザー出力を増加させることができる）、初期スポットサイズを８０μｍ、および持続時間を０．１秒間とする、８１０ｎｍのダイオードレーザーを使用して、各眼の視神経乳頭周囲の主要な網膜血管の間に、４スポットのパターンを作製した。レーザーパラメータは、ブルッフ膜の破断（気泡形成と相関する）を確認するように、必要に応じて調整した。万一、特定のスポットについてブルッフ膜の破断が確認されない場合は、これを記録した。この場合または出血の場合であって、獣医眼科専門医により適切と考えられる場合は、さらなるスポットを追加することができる。網膜出血など、いかなる著明な事象も、各レーザースポットについて記録した。出血が重度に過ぎる場合は、動物を、試験から除外し、取り替えた。眼の保水は、必要に応じて、手順の間に、生理食塩液および／または１．０％のカルボキシメチルセルロースナトリウムで維持した。
【０４４２】
ビヒクルコントロール物質、試験物質、または基準物質は、上記の実験デザインで示される通り、１および８日目に、結膜下注射により、各動物の左眼および右眼へと投与する。委員会により認定された獣医眼科専門医により実施される用量投与のために、動物に麻酔をかけた（イソフルラン）。局所抗生剤（ゲンタマイシンの眼科用溶液）を、両眼へと、処置の前日において２回、注射後において２回、および注射の翌日において少なくとも１回適用した。投与の前に、散瞳点眼剤（１％のトロピカミドおよび／または２．５％のフェニレフリン）を、各眼へと適用した（さらなる適用は、獣医眼科専門医により適切と考えられる場合に実施することができる）。投与中は、動物を、イソフルラン／酸素ガスによる麻酔下で維持する。結膜は、ＵＳＰの注射用０．９％塩化ナトリウムで洗った。０．５ｃｃのＴｅｒｕｍｏインスリン用シリンジへと取り付けた、２９ゲージ、２分の１インチの注射針を、各回の結膜下注射（処置１回当たりの群ごとシリンジ１本）のために使用した。１および８日目に、ＸＧ−１０２、ビヒクルコントロール、または基準物質を、各動物の眼へと、眼１つ当たりの投与容量５０μＬで投与した。いずれの眼も、各処置の直後に検査して、投与手順により引き起こされるいかなる異常も記録した。
【０４４３】
下記に列挙される、生存中の手順、観察、および測定を実施した。適切と考えられる場合は、より高頻度の観察に着手することができる。午前に１回および午後に１回の毎日２回にわたり、試験を通して、「死亡／瀕死点検」を実施し、これにより、動物を、全般的健康／死亡および瀕死について観察した。可能な所見の同定または確認に必要でない限り、観察の間に動物をケージから取り出さなかった。−１週目に始めて、毎日１回ずつ「ケージサイド観察」を実施し、これにより、可能な所見の同定または確認に必要でない限り、観察の間に動物をケージから取り出さなかった。−１週目に始めて、毎週「詳細な臨床観察」を実施し、これにより、動物を検査のためにケージから取り出した。−２週目に始めて、毎週、健康のモニタリングのみを目的として、「体重」を記録し、これにより、動物を個別に秤量した。処置前期間の最終週の間に始めて、スケジュールされた安楽死の当日を除き、毎週、健康のモニタリングのみを目的として、「食餌消費量」を定量的に測定した。試験前に１回、スクリーニングを目的として「眼検査」を実施し、これにより、全ての動物を、眼底検査（倒像眼底検査）および生体顕微鏡（細隙灯）検査に供した。使用された散瞳剤は、１％のトロピカミドであった。試験前に１回、ならびに１、２、および３週目の終わりに「フルオレセインによる血管造影」を実施し、これにより、散瞳点眼剤（１％のトロピカミド）を、各眼へと、試験の少なくとも１０分前に適用した（さらなる適用は、必要と考えられる場合に施行することができる）。眼の保水は、生理食塩液を用いる高頻度の灌流により維持した。動物は、必要に応じて、イソフルラン／酸素ミックス下で、かつ／または鎮静剤カクテル（７５ｍｇ／ｋｇのケタミン；７．５ｇ／ｋｇのキシラジン）を用いて維持した。血管造影のための基準画像として役立つように、赤外モードおよび／またはレッドフリーモード（ｒｅｄ  ｆｒｅｅ  ｍｏｄｅ）による単一の眼底画像および／またはＡＲＴ眼底画像を得た。ＵＳＰの注射用１０％フルオレセインナトリウム  ０．２ｍｌを、急速尾静脈注射を介して（ａｂｂｏｃａｔｈにより）投与した後で、０．５ｍｌの生理食塩液による洗浄を施した。両眼に由来する静止画像も、フルオレセイン注射後の少なくとも２分およびフルオレセイン注射後の５分以内に記録した。評価のために、静止画像上の個別のレーザースポットを、漏出について、２名の独立の読み取り者が０〜４のスケールで半定量的に評価した。該読み取り者はその後にコンセンサススコアを決定する。
【０４４４】
フルオレセインによる血管造影図のスコアリング手順ではまず、「血管造影」画像（ＪＰＥＧ画像またはＢＭＰ画像）を、ＨＲＡ２からエクスポートし、ＣＤ上または他の適切なメディア上にコピーし、適切なコンピュータ上で精査した。「グレード付け」手順では、グレード付けに適切な焦点レベルで画像を選択した（全てのレーザースポットをグレードづけするために、眼１つ当たり複数の画像を必要とする場合がある）。血管造影図は、２名の科学の専門家が独立にグレード付けし、レーザースポットの各々についてのグレードを記録した。各専門家によるグレード付けの完了後、グレードを比較し、任意の不一致を両者が精査し、グレードについて合意し、記録した。グレード付けスケールは、下記に示される０〜４：
【０４４５】
０＝漏出なし（レーザーによる瘢痕またはびまん性の大きな、目視可能な小過蛍光領域に限られる）
【０４４６】
１＝最小限の漏出（レーザー誘導性欠損領域内に一般に残存する、びまん性または充実性の小過蛍光領域）
【０４４７】
２＝軽度の漏出（レーザー誘導性欠損領域の境界内に一般に残存する、半充実性の過蛍光）
【０４４８】
３＝中程度の漏出（レーザー誘導性欠損領域の境界内に一般に残存する、半充実性〜充実性の過蛍光）
【０４４９】
４＝実質的な漏出（レーザー誘導性欠損領域の境界を越えて拡大する、充実性の過蛍光領域）
である。
【０４５０】
試験中に動物が死亡するか、またはこれを安楽死させる場合、剖検は行わず、死骸は廃棄した。スケジュールされた安楽死まで生存する動物は、終了時における体重を記録した。動物は、イソフルランによる麻酔の後における、腹部大動脈からの瀉血を受ける。可能な場合、１日（または複数日）を通して、コントロールを含む各群に由来する同様の数の動物が剖検されるように、投与群全体にわたり交替で（ｒｏｔａｔｉｎｇ）動物を安楽死させた。そうでないことが示されない限り、下記の「組織の回収および保存」表で同定された組織の代表的サンプルを、全ての動物から回収し、１０％の中性緩衝ホルマリン中で保存した。
【表１４】
2020055866.tif 000020
【０４５１】
試験では、以下の重要なコンピュータ化システムを使用した。
【表１５】
2020055866.tif 000021
【０４５２】
平均値および標準偏差は、体重、食餌消費量、およびフルオレセインによる血管造影について計算した。他のデータは、個体ベースで報告した。
【０４５３】
（実施例２４）
ＪＮＫ阻害剤であるＸＧ−１０２の、ラット歯周炎モデルにおける炎症性応答に対する阻害性効果
本試験の目的は、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の、ラット歯周炎モデルにおいて誘発された炎症に対する影響を調査することである。
【０４５４】
本試験では、３０匹のラットを使用した（４つの群へと１０匹ずつのラットを分けた）。実験的歯周炎は、０日目において、第一大臼歯（動物１匹当たり１本の大臼歯）の周囲に結紮を施すことにより誘発する。２または４ｍｇ／ｋｇの単回投与を歯肉内に（ＩＧＶ：ｉｎｔｒａｇｉｎｇｉｖａｌｌｙ）施行する。
【０４５５】
下記の表は、無作為割付けをまとめる。
【表１６】
2020055866.tif 000022
【０４５６】
各日において、全ての動物の全般的挙動および外観を観察する。動物の健康が、試験の継続に適合しない場合（瀕死の動物、異常で重要な体重の喪失、物質の大きな非忍容性など・・・）は、動物を、試験責任者の責任下における倫理的判断により屠殺する。歯周炎の炎症の態様は、歯肉組織の肉眼的観察により解析する。プラーク指数および歯肉炎症指数は、歯周臨床指数として測定する。
【０４５７】
約１７日目において、動物を屠殺し、サンプルを回収する。炎症性細胞を評価するために、組織形態計測により、炎症性細胞の定量化を実施する。炎症性蛋白質レベルを評価するために、歯肉組織ホモジネートに由来する炎症性蛋白質のレベル（ｐ−ＪＮＫ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−１０、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９）を測定する。組織破壊を評価するために、放射線解析（マイクロＣＴ）により、群ごと３匹ずつの動物について、骨組織破壊を評価する。歯周複合体破壊は、組織学的解析により評価する。骨の微細構造を評価するために、骨の小柱測定値（厚さ、間隔）を、放射線解析（マイクロＣＴ）により評価する。口腔内細菌を同定するため、歯周ポケット内の細菌集団を、９つの歯周病原体についてのＤＮＡプローブ（リアルタイムＰＣＲ）により同定する。コラーゲンフレームワークについては、偏光顕微鏡法を使用して、総コラーゲン量の測定を実施する。コラーゲンＩ／コラーゲンＩＩＩ比は、組織形態計測解析により評価する。
【０４５８】
（実施例２５）
ストレプトゾトシン処置ラットによる糖尿病性網膜症の予防試験における、ＸＧ−１０２（配列番号１１）（ＩＶＴ）の効果
本試験の目的は、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で処置された（高血糖性）ラットへと、硝子体内注射により投与された場合の、糖尿病性網膜症を予防するＸＧ−１０２の能力を決定することであった。
【０４５９】
試験デザインは、以下の通りであった。
【表１７】
2020055866.tif 000023
【０４６０】
群２、３、４の全ての動物に、−７日目において、ＳＴＺ  ５５ｍｇ／ｋｇの静脈内（ＩＶ）投与を施した。
【０４６１】
０．０４１２ｇの誘発剤（ＳＴＺ）を含有する滅菌バイアルを、あらかじめ秤量し、密封し、−７日目において、群２〜４の動物および控えの動物へと投与するために、投与室へと移した。空の、適切にラベルを貼った滅菌バイアルの２連セットを用意した。投与のために、再構成されたＳＴＺ溶液を、これらのバイアルへと濾過した。基準物質である０．９％のＮａＣｌは、受領された通りの状態で投与した。ＸＧ−１０２は、１．３８３の補正係数を使用して調製した。最大投与レベルと同等の原液を、ビヒクルである、注射用０．９％塩化ナトリウム中で調製し、０．２２μｍのポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）フィルターにより滅菌濾過した。より低い投与レベルは、原液を直接希釈することにより調製した。投与製剤は、投与量レベルの要件を満たすのに適切な濃度で、一度に調製した。全ての希釈液は、原液をビヒクルで直接希釈することにより調製した。３つの投与アリコート（１、８、および１５日目）を調製し、−２０℃を維持するように設定された冷凍庫内で保存した。各投与レベルのアリコートを、各投与日において、周囲温度で解凍させ、溶液を、最長６時間にわたり、室温で維持した。
【０４６２】
雄Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラット６０匹は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｏｒｔａｇｅ、Ｉｌから受領した。動物は、約８週齢であり、１６６〜２２８ｇの間の重量があった。Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットは、ＳＴＺ誘発性糖尿病性網膜症モデルにおける使用に許容された種であるので、本試験のための動物モデルとして選択した。本試験で使用される動物の総数は、試験物質の効果を適正に特徴付けるのに必要とされる最小限の数であると考えられた。本試験は、その目的を達成するのに不必要な数の動物を必要としないようにデザインした。動物を実験室環境へと順応させるために、動物の受領と処置の開始との間に、２０日間にわたる最小限の馴化期間を与えた。動物を、同様の群平均体重を達成するようにデザインされた、層別化された無作為化スキームにより、群へと割り当てた。健康状態が悪いか、または体重範囲の両端の動物は、群へと割り当てなかった。投与の開始前において、試験における使用に適さないと考えられた任意の割り当てられた動物は、同じ配送物から得られ、同じ環境条件下で維持された代替動物で置きかえた。代替動物は、開始３日以内に、試験における置きかえとして使用した。到着したら、無作為化するまで、動物を個別に収容した。無作為化後、動物は、自動式の給水弁を備えた、ステンレス鋼製で、床に穿孔を施したケージ内で、群として収容した（同じ投与群の動物３匹までを一緒にして）。動物を保持する部屋は、試験記録に記録した。動物は、指定の手順／活動の間に分離した。３０％〜７０％の相対湿度を伴う、１９℃〜２５℃の温度を維持した。指定の手順で中断される場合を除き、１２時間にわたる明／１２時間にわたる暗周期を維持した。ＰＭＩ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｃｈｏｗ  Ｎｏ．５ＣＲ４（１４％の蛋白質）を、指定の手順の間を除き、試験を通して、自由に提供した。逆浸透および紫外線照射による処理後における都市水道水は、自動式給水システムを介して、各動物に自由に摂取可能とした（指定の手順の間を除く）。動物は、試験手順／活動により中断される場合を除き、心的／環境的充実のために集団で収容し、身を隠すデバイスおよび噛む対象などの品目を施された。
【０４６３】
誘発剤を投与する（群２〜４、−７日目）ために、動物（控えの動物を含む）１匹当たり１バイアルのＳＴＺを、注射の３分以内に、２７．５ｍｇ／ｍＬの濃度をもたらすように、１．５ｍＬのＵＳＰの注射用滅菌水で再構成した。バイアルを反転または回転させて、ＳＴＺを溶解させた。結果として得られる溶液を、０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルターを介して、適切に表示された空の滅菌バイアルへと濾過した。ＳＴＺ（５５ｍｇ／ｋｇ）は、−７日目において、処方の３分以内に、シリンジを介して、静脈内注射により投与した。投与容量は、２ｍＬ／ｋｇであり、実際の用量投与は、各動物の最近の実際の体重に基づいた。注射の間は、動物を動かないようにした。
【０４６４】
「実験デザイン」表で示される通り、１、８、および１５日目において、試験物質または基準物質を、硝子体内注射により、各動物の左眼および右眼へと投与した。委員会により認定された獣医眼科専門医により実施される用量投与のために、動物に麻酔をかけた（イソフルラン）。局所抗生剤（ゲンタマイシンの眼科用溶液）を、両眼に、処置の前日において２回、注射後において２回、および注射の翌日において少なくとも１回適用した。投与の前に、散瞳点眼剤（１％のトロピカミドおよび／または２．５％のフェニレフリン）を、各眼に適用した（獣医眼科専門医により適切と考えられる場合は、さらなる適用を実施した）。投与中は、動物を、イソフルラン／酸素ガスによる麻酔下で維持した。結膜は、ＵＳＰの注射用０．９％塩化ナトリウムで洗浄した。３２ゲージ、２分の１インチの注射針を伴う、１０μＬのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを、各回の硝子体内注射のために使用した（処置１回当たりの群ごとシリンジ１本）。投与容量は、眼１つ当たり５μＬであった。各処置の直後に、両眼を、細隙灯生体顕微鏡法および／または倒像眼底検査で検査して、投与手順により引き起こされる、いかなる異常（とりわけ、水晶体、硝子体、および網膜に対する）も記録した。角膜混濁は、麻酔を含む実験手順に続発すると考えられた。これらの混濁の一部はまた、角膜血管形成とも関連した。他の眼所見も記載されたが、一般に発生率が低いか、もしくは群全体にわたって散発性であり、かつ／または遷延しなかった。これらの所見には、多巣性／びまん性角膜混濁、硝子体内気泡、限局性／びまん性／多巣性硝子体混濁、および限局性網膜混濁が含まれたが、これらに限定されなかった。
【０４６５】
ストレプトゾトシンを、静脈内注射により投与して、ラットにおいて、糖尿病性網膜症を誘発した。硝子体内注射経路はヒトにおいて意図される投与経路であるため、試験物質のために、硝子体内注射経路を選択した。投与レベルは、かつての概念実証試験のほか、ＩＶＴ投与経路を使用するＭＴＤ毒性試験により得られた情報に基づき選択した。
【０４６６】
試験動物のための、下記に列挙される、生存中の手順、観察、および測定を実施した。試験を通して、午前に１回および午後に１回の毎日２回にわたり、動物を、全般的健康／死亡および瀕死について観察した。可能な所見の同定または確認に必要でない限り、観察の間に動物をケージから取り出さなかった。−１週目の間に始めて、毎週、動物をケージから取り出し、詳細な臨床観察を実施した。−１週目の間に始めて、毎週２回ずつ、動物を個別に秤量した。処置前期間の最終週の間に始めて、毎週、食餌消費量を定量的に測定した。全ての動物を、処置前に１回、およびまた、２２日目にも、眼底検査（倒像眼底検査）および生体顕微鏡（細隙灯）検査に供した。使用された散瞳剤は、１％のトロピカミドであった。眼内圧は、ＴｏｎｏＶｅｔ（商標）リバウンド眼圧計を使用して、試験前に１回および２２日目の、各眼科検査後において測定した。処置前における眼圧測定の読み取りは、日周変動を低減するため、最終回の測定に予期される時間と同じ時間に実施した。
【０４６７】
網膜電図評価を、処置前に１回、ならびに６、１３、および２０日目に、フルオレセインによる血管造影前に実施した。動物を、ＥＲＧ記録の前に、一晩にわたり暗順応させ、次いで、７５ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび７．５ｍｇ／ｋｇのキシラジンの筋肉内注射により麻酔をかけた。トロピカミド（１％）を、各眼へと、試験の前に適用した（さらなる適用は、必要と考えられる場合に施行した）。瞼を開瞼器により開いたままにし、接触レンズまたは金製ループ電極を、各眼の表面に配置した。ニードル電極を、各眼下の皮膚に（基準電極）および額の後方の頭部または尾の基部（接地電極）に配置した。カルボキシメチルセルロース（１％）点眼液を接触レンズ電極の内側表面に適用してから、それらを眼に配置した。各ＥＲＧ時期は、以下の一連の、暗順応単発閃光刺激：
１）−３０ｄＢの単発の閃光、ａ波の振幅および待ち時間、平均５回の単発の閃光、閃光間が１０秒間、
２）−１０ｄＢの単発の閃光、ａ波およびｂ波の振幅および待ち時間、平均５回の単発の閃光、閃光間が１５秒間、
３）０ｄＢ、平均２回の単発の閃光、ａ波およびｂ波の振幅および待ち時間、閃光間が約１２０秒間（より長い期間も許容可能である）、
から構成された。
【０４６８】
暗順応応答を評価した後、動物を、約５分間（より長い期間も許容可能であった）にわたり、約２５〜３０ｃｄ／ｍ２のバックグラウンド光へと順応させた後に、１Ｈｚ（ａ波およびｂ波の振幅および待ち時間）での平均２０スイープの明順応白色フリッカー、次いで、２９Ｈｚ（ｂ波の振幅および待ち時間）での２０スイープの明順応フリッカーを施した。ａ波およびｂ波の振幅および待ち時間について、波形を解析し、０ｄＢの暗順応刺激に由来する律動様小波（ＯＰ）１〜４を、振幅および待ち時間について、フィルタリングおよび解析した。
【０４６９】
フルオレセインによる血管造影評価を、処置前に１回、ならびに７、１４、および２１日目に、網膜電図検査後に実施した。イソフルラン／酸素ミックスを、手順の前および手順中において、麻酔として使用した。散瞳剤である１％のトロピカミドを、必要に応じて使用した。眼の保水は、必要に応じて、生理食塩液を用いる灌流により維持した。Ｕ．Ｓ．Ｐ．の注射用１０％フルオレセインナトリウム０．２ｍＬを、急速尾静脈注射を介して投与した後で、０．５ｍＬの生理食塩液による洗浄を施した。両眼に由来する眼底の静止画像も、フルオレセイン注射の１０〜１５分後の間において記録した。画像はまず、右眼から撮影した後で、左眼からも撮影した。無刺激の局所眼科軟膏を、血管造影後における眼へと投与した。画像は、血管の完全性／びまん性漏出について、定性的に評価した。
【０４７０】
「血中グルコースレベルの決定」は、ＳＴＺ処置前に１回、−６日目（ＳＴＺ投与の翌日）、およびそれ以後に１週間に３回（全ての動物）であった。必要に応じて、さらなる血中グルコース測定を実施して、動物の健康状態をモニタリングすることも可能であった。レベルは、尾静脈から採取された血液の液滴を使用してグルコメーターにより決定した。値は、ｍｍｏｌ／Ｌ単位で測定し、報告を目的として、１８を乗じることにより、ｍｇ／ｄＬへと変換した。「尿中グルコースレベルの決定」は、−１週目の間に始めて、毎週、一晩にわたる回収の後で行った。動物は、回収期間中において、食餌および水の摂取が可能であった。尿中グルコースは、Ｐ８００解析器を使用して、臨床検査部門が測定した。イソフルランによる麻酔の後における、腹部大動脈からの。可能な場合、１日を通して、同様の時点において、コントロールを含む各群に由来する同様の数の動物が剖検されるように、投与群全体にわたり交替で動物を安楽死させた。
【０４７１】
主要試験動物は、完全剖検による検査を受けさせ、これには、死骸および筋骨格系；全ての外表面および開口部；頭蓋内腔および脳の外表面；ならびにそれらの関連する臓器および組織を伴う胸腔、腹腔、および骨盤腔の評価が含まれた。剖検手順は、動物解剖学および巨視的病理学における適切な訓練および経験を有する有資格者により実施された。獣医科病理学者または他の適切な有資格者も任用可能であった。
【０４７２】
そうでないことが示されない限り、下記で同定された組織の代表的サンプルを、全ての動物から回収し、１０％の中性緩衝ホルマリン中で保存した。
【表１８】
2020055866.tif 000024
【０４７３】
本試験では、以下のパラメータおよび評価項目：死亡、臨床徴候、体重、体重変化、食餌消費量、眼科検査、眼内圧、網膜電図検査（ＥＲＧ）、フルオレセインによる血管造影、血中グルコースおよび尿中グルコースの決定、巨視的剖検による検査を評価した。
【０４７４】
高血糖症関連死、状態を悪化させる臨床徴候、および体重の減少、体重の増加、食餌消費量の増加、ならびに血中グルコースレベルおよび尿中グルコースレベルの重度の上昇が見られることは、糖尿病性網膜症ラットモデルと符合した。ＳＴＺ誘発群で注目される複数の眼の変化は、高血糖性状態、とりわけ、前皮質白内障の性質に続発した。試験中に、ＸＧ−１０２関連死は見られなかった。ＸＧ−１０２に関連する臨床徴候、または体重、体重の増加、もしくは食餌消費量に対する効果は見られなかった。フルオレセインによる血管造影画像（ｉｍａｇｅｒｙ）は、いかなる血管漏出も明らかでなく、剖検において明らかなＸＧ−１０２関連肉眼的所見も見られなかった。
【０４７５】
６、１３、および２０日目において、眼１つ当たり≦２μｇのＸＧ−１０２を施された動物についての、暗順応ＥＲＧ評価および明順応ＥＲＧ評価の一部の振幅は、ＳＴＺで処置されたコントロール動物に照らして、軽微に増加するかまたは同等であったが、これらの応答は一般に、依然としてコントロールの変動内にあった。ＸＧ−１０２群の待ち時間は、同等であり、依然として、コントロールの変動内および／または処置前の変動内にあった。眼１つ当たり≦２μｇのＸＧ−１０２を施された動物を、ＳＴＺで処置されたコントロールと比較したところ、幾つかの散発性の律動様小波振幅の差異が見られた。
【０４７６】
以下の表には、全てのＥＲＧ刺激についての振幅の概要が、時期（それぞれ、処置前、ならびに６、１３、および２０日目）ごとに含まれる。値は、群の平均値および標準偏差（下方の値）を表す。
【表１９】
2020055866.tif 000025
【表２０−１】
2020055866.tif 000026
【表２０−２】
2020055866.tif 000027
【０４７７】
これらのデータから取り出され得る通り、ＸＧ−１０２が、波の振幅の減少を逆転する傾向が見られる。
【０４７８】
（実施例２６）
ストレプトゾトシンで処置されたアルビノラットによる糖尿病性網膜症の予防試験における、ＸＧ−１０２（配列番号１１）（結膜下）の効果
本試験の目的は、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で処置された（高血糖性）ラットへと、結膜下注射により、３週間にわたり、毎週投与された場合の、糖尿病性網膜症を予防するＸＧ−１０２の能力を決定することであった。
【０４７９】
実験デザインを、以下に示す。
【表２１】
2020055866.tif 000028
【０４８０】
ナイーブＬｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラット（雄動物４２匹；投与時において１０週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｓｔ．Ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＱＣ）を使用した。Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラットは、ＳＴＺ誘発性糖尿病性網膜症モデルにおける使用に許容された種であるので、本試験のための動物モデルとして選択した。本試験で使用される動物の総数は、試験物質の効果を適正に特徴付けるのに必要とされる最小限の数であると考えられ、その目的を達成するのに不必要な数の動物を必要としないようにデザインされた。現時点では、実験室動物による試験は、ヒトへの外挿に利用可能な最良の基礎を提供する。現在のところ、生存動物を使用しない許容可能なモデルは存在しない。代替動物の始動予定は、４日目である。動物は、ステンレス鋼製ケージ内に収容する。ＰＭＩ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｃｈｏｗ  Ｎｏ．５ＣＲ４（１４％の蛋白質）は、動物のサイズおよび週齢に適切な量で毎日施した。逆浸透濾過を介して処理され、ＵＶ光処理を通した都市水道水を、各動物に自由に摂取可能とした。動物は、試験手順／活動の間を除き、心的／環境的充実のために集団（ケージ１つ当たり３匹までの動物）で収容し、身を隠すチューブおよび噛む対象などの品目を施された。試験における使用に適することが決定された動物のみを割り当てた。到着したら、無作為化するまで、動物を個別に収容した。無作為化後、動物は集団とする。
【０４８１】
０．０４１２ｇの誘発剤（ＳＴＺ）を含有する滅菌バイアルを、あらかじめ秤量し、密封し、−７日目において、群２〜５の動物および選択された控えの動物へと投与するために、投与室へと移す。空の、適切に表示した滅菌バイアルの２連セットを用意する。投与のために、再構成されたＳＴＺ溶液を、これらのバイアルへと濾過する。試験物質であるＸＧ−１０２は、提示された補正係数を使用して調製した。最大投与レベルと同等の原液を、ビヒクルである、注射用０．９％塩化ナトリウム中で調製し、０．２２μｍのポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）フィルターにより滅菌濾過した。より低い投与レベルは、この原液を生理食塩液で直接希釈することにより調製した。投与アリコートを調製し、−２０℃を維持するように設定された冷凍庫内で保存した。各投与レベルのアリコートを、各投与日において、周囲温度で解凍させ、溶液を、最長６時間にわたり、室温で維持した。ビヒクルである、注射用０．９％塩化ナトリウムは、受領された通りの状態で投与した。動物（控えの動物を含む）１匹当たり１バイアルのＳＴＺを、注射の３分以内に、２７．５ｍｇ／ｍＬの濃度をもたらすように、１．５ｍＬのＵＳＰ注射用滅菌水で再構成した。バイアルを反転または回転させて、ＳＴＺを溶解させた。再構成されたＳＴＺ溶液を、０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルターを介して投与のための空の滅菌バイアルへと濾過した。ＳＴＺは、−７日目において、処方の３分以内に、シリンジを介して、静脈内注射により投与した。投与容量は、２ｍＬ／ｋｇであり、実際の用量投与は、各動物の最近の実際の体重に基づいた。注射の間は、動物を動かないようにする。ＳＴＺで処置された動物は、血中グルコースレベルが、≧２５０ｍｇ／ｄＬであれば、糖尿病と考えられた。１、８、および１５日目において、ならびにまた、２４日目（Ｒｅｐ１）、２３日目（Ｒｅｐ２および３）、２２日目（Ｒｅｐ４）、および３４日目（Ｒｅｐ１）３３日目（Ｒｅｐ２および３）、および３２日目（Ｒｅｐ４）において、試験物質またはビヒクルを、結膜下注射により、各動物の左眼および右眼へと投与した。委員会により認定された獣医眼科専門医により実施される用量投与のために、動物に麻酔をかけた（イソフルラン）。局所抗生剤（０．３％のトブラマイシン軟膏）を、両眼へと、処置の前日において２回、注射後において２回、および注射の翌日において少なくとも１回適用した。投与の前に、散瞳点眼剤（１％のトロピカミドおよび／または２．５％のフェニレフリン）を、各眼に適用した（さらなる適用は、獣医眼科専門医により適切と考えられる場合に実施することができる）。投与中は、動物を、イソフルラン／酸素ガスによる麻酔下で維持した。結膜は、ＵＳＰの注射用０．９％塩化ナトリウムで洗浄した。０．５ｃｃのＴｅｒｕｍｏインスリン用シリンジへと取り付けた、２９ゲージ、２分の１インチの注射針を、各回の結膜下注射（処置１回当たりの群ごとシリンジ１本）のために使用した。試験物質または基準物質を、各動物の眼へと、眼１つ当たりの投与容量５０μＬで投与した。いずれの眼も、各処置の直後に検査して、投与手順により引き起こされるいかなる異常も記録した。ストレプトゾトシンをＩＶ投与して、ラットにおいて、糖尿病性網膜症を誘発する。結膜下経路はヒトにおいて意図される投与経路であるため、試験物質のために、結膜下経路を選択した。投与レベルは、かつての概念実証試験のほか、結膜下投与経路を使用するＭＴＤ毒性試験により得られた情報に基づき選択した。少なくとも毎日２回（午前および午後）にわたり、罹患率／死亡率点検を実施した。毎日１回ずつ、ケージサイド観察を実施した。毎週、詳細な臨床検査を実施した。毎週、食餌消費量の定量的測定を実施した。毎週２回ずつ、体重を記録した。試験前に１回、ならびにまた、３７日目（Ｒｅｐ１）、３６日目（Ｒｅｐ２および３）、および３５日目（Ｒｅｐ４）において、眼検査を実施した。全ての動物を、眼底検査（倒像眼底検査）および生体顕微鏡（細隙灯）検査に供した。使用される散瞳剤は、１％のトロピカミドである。眼内圧は、試験前に１回、および３７日目（Ｒｅｐ１）、３６日目（Ｒｅｐ２および３）、および３５日目（Ｒｅｐ４）に測定した。処置前における眼圧測定の読み取りは、日周変動を低減するため、最終回の測定に予期される時間と同じ時間に実施した。眼内圧は、ＴｏｎｏＶｅｔ（商標）リバウンド眼圧計を使用して、眼科検査後において測定した。
【０４８２】
処置前に１回、および７、１４、２１日目において、ならびに３６日目（Ｒｅｐ１）、３５日目（Ｒｅｐ２および３）、および３４日目（Ｒｅｐ４）において、網膜電図評価を実施した。動物を、ＥＲＧ記録の前に、一晩にわたり暗順応させ、次いで、７５ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび７．５ｍｇ／ｋｇのキシラジンの筋肉内注射により麻酔をかけた。トロピカミド（１％）を、各眼へと、試験の前に適用した（さらなる適用は、適切と考えられる場合に実施することができる）。瞼を開瞼器により開いたままにし、接触レンズまたは金製ループ電極を、各眼の表面に配置した。ニードル電極を、各眼下の皮膚に（基準電極）および額の後方の頭部または尾の基部（接地電極）に配置した。カルボキシメチルセルロース（１％）点眼液を接触レンズ電極の内側表面に適用してから、それらを眼に配置した。
１）−３０ｄＢの単発の閃光、平均５回の単発の閃光、閃光間が１０秒間
２）−１０ｄＢの単発の閃光、平均５回の単発の閃光、閃光間が１５秒間
３）０ｄＢ、平均２回の単発の閃光、閃光間が１２０秒間（より長い期間も許容可能である）、。
【０４８３】
暗順応応答を評価した後で、動物を、約５分間（より長い期間も許容可能である）にわたり、約２５〜３０ｃｄ／ｍ２のバックグラウンド光へと順応させた後で、１Ｈｚでの平均２０スイープの明順応白色フリッカー、次いで、２９Ｈｚでの２０スイープの明順応フリッカーを施した。ａ波およびｂ波の振幅および待ち時間について、波形を解析し、０ｄＢの暗順応刺激に由来する律動様小波１〜４を、振幅および待ち時間について、フィルタリングおよび解析する。
【０４８４】
インドシアニングリーンによる血管造影評価を、処置前に１回（−２または−１日目）、ならびに８、１５、２２日目、および３５日目（Ｒｅｐ１）、３４日目（Ｒｅｐ２および３）、および３３日目（Ｒｅｐ４）において実施した。イソフルラン／酸素ミックスを、手順の前および手順中において、麻酔として使用した。必要に応じて使用された散瞳剤は、１％のトロピカミドであった。眼の保水は、必要に応じて、生理食塩液を用いる灌流により維持した。０．５％のインドシアニングリーン０．２ｍＬを、急速尾静脈注射を介して投与した後で、０．５ｍＬの生理食塩液による洗浄を施した。両眼に由来する眼底の静止画像も、ＩＣＧ注射の１０〜１５分後の間において記録した。画像はまず、右眼から撮影した後で、左眼からも撮影した。無刺激の局所眼科軟膏を、血管造影後における眼へと投与した。画像は、血管の完全性／びまん性漏出について、定性的に評価した。
【０４８５】
血中グルコースレベルを、ＳＴＺ処置前に１回、−６日目（ＳＴＺ投与の翌日）、およびまた、−１日目に測定した。必要に応じて、さらなる血中グルコース測定を実施して動物の健康状態をモニタリングすることも可能である。レベルは、尾静脈から採取された血液の液滴を使用してグルコメーターにより決定した。値は、ｍｍｏｌ／Ｌ単位で測定し、報告を目的として、１８を乗じることにより、ｍｇ／ｄＬへと変換した。
【０４８６】
スケジュールされた安楽死まで生存した主要な試験動物は、イソフルランによる麻酔の後における、腹部大動脈からの瀉血により安楽死させた。可能な場合、１日を通して、同様の時点において、コントロールを含む各群に由来する同様の数の動物が剖検されるように、投与群全体にわたり交替で動物を安楽死させた。そうでないことが示されない限り、組織（眼、視神経）の代表的サンプルを、全ての動物から回収し、１０％の中性緩衝ホルマリン中で保存した。眼および視神経を、両側から回収し、Ｄａｖｉｄｓｏｎ固定液中で、２４〜４８時間にわたり固定し、次いで、７０％のエタノール中で保存した（安楽死させた動物に限られる）。
【０４８７】
（実施例２７）
ＸＧ−１０２の単回結膜下注射の有効性および安全性を、術後眼内炎症において、デキサメタゾン点眼剤と比較して評価する、無作為化、二重盲検、並行群間、比較、多施設試験（臨床フェーズＩＩ）
眼手術の技術的進歩にも関わらず、この手順による物理的外傷は、依然として処置を是認する術後眼炎症を誘発している。眼組織内で、アラキドン酸は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ：ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）により、最も重要な脂質由来の炎症メディエーターである、プロスタグラジン（ＰＧ：ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）へと代謝される１。手術による外傷は、アラキドン酸カスケードの作動を引き起こし、これは、次にはＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の活性化により、ＰＧを生成させる。細胞膜内のリン脂質は、アラキドン酸を生成させるホスホリパーゼＡの基質であり、アラキドン酸から、化学的に異なるＰＧおよびロイコトリエンのファミリーが産生される２。眼炎症を処置するための「ゴールドスタンダード」は、局所コルチコステロイドおよび／または非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である。（短期にわたる）コルチコステロイド使用について報告されている副作用には、白内障の形成、眼内圧（ＩＯＰ：ｉｎｔｒａ  ｏｃｕｌａｒ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）の上昇、ウイルス感染に対する感受性の増大、角膜上皮および間質における創傷治癒の遅延が含まれる３、４。加えて、コルチコステロイドによる処置の遷延は、グルコース障害、高血圧症、緑内障の発症、視力の減退、視野の喪失、および後嚢下白内障の形成などの全身性副作用を誘発することが公知である５。調査下にある治験薬（ＩＭＰ）（ＸＧ−１０２）は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ：ｃ−ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ）活性を、非アデノシン三リン酸（ＡＴＰ：ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）競合的な様式で、選択的に阻害するプロテアーゼ耐性ペプチドである。ＸＧ−１０２は、グリシン（非キラルである）を除く、Ｄ−立体配置にある全てのアミノ酸を伴う、３１個のＤ−アミノ酸によるＪＮＫ阻害剤ペプチドである。この選択は、通例それらを投与した直後にペプチドを分解する、プロテアーゼに対する化合物の耐性を増加させるようになされた。ＪＮＫの活性化は、アクチベーター蛋白質１（ＡＰ−１）転写因子ファミリー、および自己免疫性疾患および炎症性疾患に関与している他の細胞因子のリン酸化および活性化をもたらすので、ＪＮＫ経路を阻害する化合物は、示される治療的価値を有し得る。ラットおよびウサギにおける眼のＭＴＤ（ｍａｘｉｍｕｍ  ｔｏｌｅｒａｔｅｄ  ｄｏｓｅ）試験のほか、ウサギにおける眼の局所的忍容性は、ＸＧ−１０２が、結膜下投与、硝子体内（ＩＶＴ：ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ）投与、および静脈内（ｉｖ）投与の後において、十分に忍容されることを示した。結膜下投与後のラットおよびウサギにおける眼のＭＴＤ試験は、無毒性量（ＮＯＡＥＬ）が、ラットにおいて、約２０μｇであり、ウサギにおいて、約６００μｇであることを示した。単回結膜下投与および反復結膜下投与（７日間にわたり毎日）の後における眼内薬物動態を、ウサギにおいて試験したところ、ＸＧ−１０２は、投与の７日後においても、眼構造に応じて、１〜４時間の間のｔｍａｘで、脈絡膜内、眼球結膜内、および虹彩−毛様体内にやはり存在するが、血漿中では、いずれの時点でも検出可能でないことが示された。（術後）眼内炎症を処置するた���の、現行の「ゴールドスタンダード」の有害な副作用を踏まえると、一方では、炎症を軽減するのに有効であるが、他方では、コルチコステロイドの使用と関連する（有害な）副作用を有さない、他の代替処置法を見出すことが、臨床的に正当化される。ＸＧ−１０２は、現在実施されている前臨床試験およびフェーズＩ／Ｉｂ試験の両方において、有望な結果を示している。
【０４８８】
先行の試験は、術後眼内炎症または外傷後眼内炎症を有する患者における、「通例の」術後抗炎症治療に加えて投与される、ＸＧ−１０２の単回結膜下注射の安全性および忍容性を評価するようにデザインされた、オープンラベル、単一施設の、用量漸増／用量設定試験であった。調査されたＸＧ−１０２の用量は、４５、９０、４５０、および９００μｇであった。本試験では、合計２０例の患者（各投与群内に５例ずつの患者）を登録した。先行試験の結論は、最近の術後眼内炎症または外傷後眼内炎症を有する患者における結膜下注射として投与されるＸＧ−１０２は、安全であり、良好に忍容されることであった。完了した先行試験の成功後、眼内炎症におけるＸＧ−１０２の開発を継続し、本試験を実施することが決定された。この試験の目的は、手術直後に投与されたＸＧ−１０２の単回結膜下用量の有効性および安全性を、前房内細胞（ｃｈａｍｂｅｒ  ｃｅｌｌ）グレードにより評価される、術後眼内炎症の進展において、デキサメタゾン点眼剤と比較して評価することであった。これは、術後眼内炎症の進展における単剤治療として投与された場合のＸＧ−１０２の有効性を調査する、最初の試験である。
【０４８９】
ＳＤＤ−１００２−０３５試験の目的は、手術手順の終了後最長で３時間以内に投与された、９０または９００μｇ  ＸＧ−１０２の単回結膜下注射の有効性および安全性を、１日４回ずつ２１日間にわたり投与されたデキサメタゾン点眼剤と比較して、術後眼内炎症において評価することであった。
【０４９０】
ＳＤＤ−１００２−０３５試験の主要目的は、９００μｇ  ＸＧ−１０２の単回結膜下注射が、１日４回ずつ２１日間にわたり投与されたデキサメタゾン点眼剤による処置に対して非劣性であるかを、術後眼内炎症の進展において評価することであった。本試験の主要目的に従い、主要転帰は、試験処置の結膜下注射の投与後２８日目における平均前房細胞グレードにより、９００μｇ  ＸＧ−１０２を、デキサメタゾン点眼剤と比較して評価した。
副次的目的は、９０μｇ  ＸＧ−１０２または９００μｇ  ＸＧ−１０２いずれかの単回結膜下注射の効果を、デキサメタゾン点眼剤（１日４回ずつ２１日間にわたり投与される）と比較して、有効性の転帰パラメータ：
ａ）２８日目における前房細胞グレード（９０μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾン）
ｂ）７日目および１４日目における前房細胞グレード（９００μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾン）
ｃ）７日目および１４日目における前房細胞グレード（９０μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾン）
ｄ）７日目、１４日目、および２８日目における前房フレアグレード（９００μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾン）
ｅ）７日目、１４日目、および２８日目における前房フレアグレード（９０μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾン）
ｆ）レスキュー薬物治療の使用  
ｇ）時間経過にわたる眼内炎症の進展
【０４９１】
安全性および忍容性の転帰パラメータ：
ａ）ＥＴＤＲＳ法による視力  
ｂ）細隙灯検査の所見  
ｃ）眼底検査の結果  
ｄ）眼内圧（ＩＯＰ）測定  
ｅ）バイタルサイン（血圧（ＢＰ）、脈拍数（ＰＲ）、および律動）
ｆ）血液検査室検査および化学検査室検査の結果  
ｇ）有害事象の発生  
ｈ）患者のサブセット（約３０例）内の試験処置の投与の１時間後における、ＸＧ−１０２の血漿中の存在（または非存在）
について評価することであった。
【０４９２】
本試験は、同等なサイズの３つの並行群を伴う、無作為化（１：１：１）、比較、二重盲検、多施設の、非劣性臨床試験であった。施設によりブロック化された無作為化は、ウェブベースの、セキュリティー保護された無作為化システムを使用して実施した。適格な患者は、＞１８歳であり、以下の眼手術：（ａ）白内障および網膜剥離、白内障および黄斑上膜、ならびに／もしくは白内障および黄斑部孔のための手術が含まれうる、前区と後区とを組み合わせた手術、または（ｂ）緑内障手術、または（ｃ）複合後区手術、または（ｄ）糖尿病性網膜症と関連した白内障手術および／もしくは網膜剥離のための複合眼手術が含まれうる、複雑な眼内手術の１つを受けた、男性または女性（閉経後の女性または卵管結紮もしくは子宮摘出により不妊の女性）であった。以下の除外基準：
【０４９３】
１．試験処置の投与前１２週間以内における、任意の治験薬の投与。
【０４９４】
２．デキサメタゾン点眼剤の処方に対する禁忌の存在。
【０４９５】
３．抗感染処置に対して不応性の、遷延性の真菌性または細菌性の眼感染症の存在。
【０４９６】
４．コルチコステロイドの使用により引き起こされたことが公知である、眼内高血圧症の病歴。
【０４９７】
５．角膜潰瘍、角膜穿孔、または不完全な再上皮化と関連する病変の存在。
。
【０４９８】
６．治験責任医師が本試験に干渉し得ると判断する、任意の手術または医学的状態の存在。
【０４９９】
７．蛋白質型の薬物またはワクチンに対する、任意の重篤な有害反応または過敏性の病歴。
【０５００】
８．現在、季節性アレルギー反応（例えば、花粉症、喘息）のため処置を受けていること。
【０５０１】
９．出産の潜在的可能性がある女性。
【０５０２】
１０．試験中の２８日目（すなわち、最後の来院が行われた日付）まで、男性に、非閉経女性パートナーに対して有効な避妊法（例えば、避妊用ピルまたはバリア型避妊法を組み合わせた）を使用する意思がないこと。
【０５０３】
１１．患者に、本プロトコールの条項を遵守する意思がないこと。
のいずれかが、無作為化の時点において存在する場合、患者は、参加に適格でなかった。
【０５０４】
試験プロトコールでは、１３８例の患者を無作為化し、試験処置の結膜下注射を投与することが計画された。試験プロトコールではまた、無作為化された患者であって、試験処置の結膜下注射が投与されなかった患者は、置きかえられることも言明された。患者は、眼手術の終了後最長で３時間以内に２５０μｌの単回結膜下注射として投与される、９０μｇ  ＸＧ−１０２もしくは９００μｇ  ＸＧ−１０２のいずれか、または１日４回ずつ２１日間にわたり滴下される、デキサメタゾン点眼剤へと無作為に割り付けた。初回の試験処置の点眼剤は、試験処置の結膜下注射後、最長で１５分以内に滴下した。盲検化を維持するために、ＸＧ−１０２群へと無作為化された患者には、０．９％のＮａＣｌの溶液を含有する点眼剤を施し、デキサメタゾン群へと無作為化された患者には、０．９％のＮａＣｌを含有する結膜下注射を投与した。患者は、試験処置の結膜下注射投与後、合計２８（±５）日間にわたり追跡調査された。試験プロトコールにより、必要に応じて、来院／調査を実施するために、患者を外来診療所へと帰院させた。下記の表は、各回の来院時に実行される手順／調査に加えて、計画された来院スケジュールも示す。試験プロトコールでは、患者の安全性の監視に、データ安全性モニタリング委員会（ＤＳＭＢ：ｄａｔａ
ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｂｏａｒｄ）が責任を負うことを計画した。これは、試験中に累積患者データを精査することに加えて、重篤な有害事象（ＳＡＥ）を、それらが生じたときに精査することにより達成するものであった。データ精査のタイミングに関する詳細は、ＤＳＭＢの認可において詳述された。
【表２２】
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【０５０５】
患者は、３つの試験群：
１．９０μｇ  ＸＧ−１０２の単回結膜下注射＋１日４回ずつ２１日間にわたるプラセボの点眼剤、または
２．９００μｇ  ＸＧ−１０２の単回結膜下注射＋１日４回ずつ２１日間にわたるプラセボの点眼剤、または
３．０．９％のＮａＣｌの単回結膜下注射＋１日４回ずつ２１日間にわたるデキサメタゾン点眼剤
の１つへと無作為化した。
【０５０６】
施設によりブロック化された無作為化は、ウェブベースの（すなわち、ｅ−ＳＯＣＤＡＴＴＭ）無作為化システムを使用して、一元的に行った。
【０５０７】
試験生成物であるＸＧ−１０２は、９０および９００μｇの用量で使用した（２５０μｌの単回投与）。投与方式は、単回結膜下注射であった。処置の持続期間は、１の（ｏｎｅ）単回投与（結膜下注射）であった。（製造バッチ番号ＸＧ−１０２  ９０μｇ：ＰＦ．２４３．ＣＲおよび製造バッチ番号ＸＧ−１０２  ９００μｇ：ＰＦ．２４５．ＣＲ）。
【０５０８】
基準生成物であるデキサメタゾン（Ｄｅｘａｆｒｅｅ（登録商標））は、１ｍｇ／ｍｌの用量で使用した。投与方式は、点眼（１日４回ずつ、２１日間）であった。処置の持続期間は、２１日間（１日４回ずつ）（バッチ番号：Ｘ７５０およびＺ４７２）であった。
【０５０９】
プラセボのＮａＣｌは、０．９％の用量で使用した。投与方式は、単回結膜下注射（２５０μＬ）または点眼（１日４回ずつ、２１日間）であった。処置の持続期間は、１つの（ｏｎｅ）単回投与（結膜下注射）および点眼では２１日間（１日４回ずつ）であった。製造バッチ番号：Ｙ４７９（点眼）および１１３９５１２１１２（結膜下注射）。
【０５１０】
先行試験から得られた安全性データおよび予備的有効性データに加えて、前臨床の薬理学試験および毒性学試験に基づき、２つの用量（９０μｇ  ＸＧ−１０２および９００μｇ  ＸＧ−１０２）を、本試験のために選択した。ＳＤＤ−１００２−０２３試験では、９０μｇおよび９００μｇの用量の安全性プロファイルは、同様であった。加えて、コルチコステロイド点眼剤と組み合わせた眼内炎症低減の挙動は、いずれの投与群においても同様であった。この試験のために講じられる予防措置（ＤＳＭＢの役割、および炎症が遷延する場合に、オープンラベルの抗炎症処置を導入する可能性）を考慮すれば、この試験のために選択されたＸＧ−１０２の用量は、一方で、患者の安全性を損なわないように考えられているが、他方で、この試験の目的にかなう有意味なデータをもたらすのに十分な程度に高用量であった。結膜下投与経路は、安全性および有効性のいずれもが、この投与経路を使用する動物およびヒトにおいて示されているので、調査下にある診断がなされた患者にとって意図された投与経路の１つである。この試験のために選択された使用のための、デキサメタゾンの、頻度（すなわち、１日４回の点眼）および持続期間（すなわち、２１日間）に加えた用量（すなわち、１ｍｇ／ｍｌで０．４ｍｌの点眼）は、術後眼炎症のための臨床慣行において使用されるデキサメタゾン点眼のための、標準的な使用用量／使用持続期間である。
【０５１１】
試験プロトコールは、試験処置の結膜下注射は、眼手術の終了から最長で３時間以内に投与し、これに続き、最長で１５分以内に、初回の試験処置の点眼剤の滴下を行うべきことを規定した。眼手術の終了時における試験処置の投与は、この試験の組み込みの一部である眼手術手順に続く抗炎症処置の投与のための標準的な日常作業に後続させた。
【０５１２】
治験責任医師、患者、ＣＣ（Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ）における実施チーム、治験依頼者職員（医薬品安全性監視スタッフ以外の）のいずれにも、無作為化計画は閲覧不可能であった。ＸＧ−１０２溶液を含有する試験処置バイアルまたはプラセボ（すなわち、０．９％のＮａＣｌの溶液）を含有するバイアルは、外観および粘稠性が同一であった。デキサメタゾン溶液または０．９％のＮａＣｌのいずれかを含有する単回投与用容器内の点眼剤溶液も、外観および粘稠性が同一であった。試験処置のパッケージングおよび表示は、ＧＭＰ（医薬品の製造および品質管理に関する基準）およびＧＣＰ（医薬品の臨床試験の実施の基準）に準拠して実施した。加えて、試験処置パック上に貼付された表示の内容は、臨床試験のための地域ごとの規制にも準拠した。各患者には、番号づけが同一の２つの試験処置パックを配布した。１つの試験処置「パック」は、１バイアルのＸＧ−１０２溶液（９０または９００μｇ）または１バイアルのプラセボ（０．９％のＮａＣｌ）を含有し（患者が無作為化された処置群に応じて）、第２の「パック」は、点眼剤溶液を、１日４回ずつ２１日間にわたる処置を可能とするのに十分な供給量を伴うデキサメタゾンまたはプラセボ（０．９％のＮａＣｌ）のいずれかを含有する単回投与用容器内に含有した。患者へと割り当てられた試験処置パック番号は、別の患者へは割り当てなかった。患者の試験識別番号（すなわち、患者識別番号）は、ラベル上に、試験処置を配る職員の手で書き込まれた。試験処置の外箱のサイズおよび形状は、ＸＧ−１０２溶液とプラセボ溶液とで同一であった。患者の試験処置への割付けの知識が、該当する患者に対するさらなる医学的管理を決定するのに必要となる救急状況では、または患者の処置への割付けの知識が、規制機関への報告の目的で必要とされる場合には、盲検化された治験責任医師または治験依頼者により委任された医薬品安全性監視員のそれぞれは、ｅ−ＳＯＣＤＡＴＴＭ内の、セキュリティー保護された、ウェブベースの、試験に特化した処置割付けシステムを介して、該当する患者についての試験処置コードに対するユーザーアクセス権が与えられた。任意の１名の患者についての該処置コードがアクセスされた場合は、試験処置コードのアクセスに関する全ての情報（すなわち、処置コードにアクセスした職員の氏名、理由、日時、およびコードがアクセスされた患者）を追跡調査し、ウェブベースのシステム内で保存する。
【０５１３】
主要目的は、試験処置の結膜下投与の、投与後２８日目における平均前房細胞グレードにより評価した。主要目的の評価のための基準は、
ａ．２８日目における前房細胞グレード（９００μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾン）であった。
【０５１４】
副次的目的の評価のための基準は、
ａ．２８日目における前房細胞グレード（９０μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾン）
ｂ．７日目および１４日目における前房細胞グレード（９００μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾン）
ｃ．７日目および１４日目における前房細胞グレード（９０μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾン）
ｄ．７日目、１４日目、および２８日目における前房フレアグレード（９００μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾン）
ｅ．７日目、１４日目、および２８日目における前房フレアグレード（９０μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾン）
ｆ．レスキュー薬物治療の使用
ｇ．眼炎症の除去により評価される、時間経過にわたる眼内炎症の進展
であった。
【０５１５】
各回の来院時に実行される手順に加えて、来院のタイミングおよび頻度も示すフローチャートは、上記の表において見出すことができる。眼科検査は、ベースラインにおいて実施した（すなわち、手術の当日であるが、手術の前に実施した）。その後、結膜下注射を投与した２１（±３）時間後、次いで、７（±１）、１４（±２）、および２８（±５）日後に患者を診察した。実施者間変動を低減するために、施設には、可能な場合、同じ実施者が、試験を通して、同じ患者について、全ての眼科検査を実施すべきことを指示した。眼科検査の測定は、試験に特化した指示書に準拠して実施した。指示書は、初回来院の間および各回のモニタリング来院の間に、施設ごとのチームにより精査され、論じられた。細胞／フレアカウントおよび細胞／フレアグレードを決定するために、ＳＵＮ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐによる規定（「Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｖｅｉｔｉｓ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄａｔａ．  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｒｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｗｏｒｋｓｈｏｐ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、１４０巻、３号、５０９〜５１６頁、２００５年）を使用する施設により、ＳＵＮ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐによる総意が使用された。
【０５１６】
安全性の評価のための基準は、
ａ．ＥＴＤＲＳ法による視力
ｂ．細隙灯検査の所見
ｃ．眼底検査の結果
ｄ．眼内圧（ＩＯＰ）測定値
ｅ．バイタルサイン（血圧（ＢＰ）、脈拍数（ＰＲ）、および律動）
ｆ．血液検査室検査および化学検査室検査の結果
ｇ．有害事象の発生
ｈ．患者のサブセット（約３０例）内の試験処置の投与の１時間後における、ＸＧ−１０２の血漿中の存在（または非存在）
であった。
【０５１７】
有害事象についての規定は、
＜有害事象（ＡＥ：ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔ）とは、医薬生成物を投与された患者における、任意の有害な医学的事態であって、この処置との因果関係を必ずしも有さない医学的事態と規定される。したがって、ＡＥとは、任意の不適切で意図されない徴候、症状、または疾患であって、医薬生成物と関連すると考えられるのであれ、そうでないのであれ、医薬生成物の使用と時間的に関連した、徴候、症状、または疾患である。＞
であった。
ＡＥは、その事象が、
・死をもたらした
・生命を脅かした  
・自主入院または既存の入院の長期化を必要とした
・障害／無力の遷延または有意な障害／無力をもたらした
・処置期間中に懐胎された子供に先天性異常／出産時欠損をもたらした
・医学的に重大であった、かつ患者を危険にさらすか、または上記の転帰の１つを予防するのに介入を必要とする
のであれば、重篤であると考えられた。
【０５１８】
「重篤」の定義における「生命を脅かす」という用語は、事象の時点において、被験体に、死の危険性がある事象を指すものであり、より重度であるなら、仮説的に死を引き起こし得る事象を指すものではなかった。ＳＵＳＡＲ（Ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ  Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  Ｓｅｒｉｏｕｓ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）とは、処置と関連することが疑われる有害反応であって、予測外（すなわち、投与される試験処置の予測される転帰と符合しない）であり、かつ、重篤である有害反応と規定した。
【０５１９】
ＸＧ−１０２の血漿中の定量化（血漿）は、１つの施設に配置された３２例の患者のサブセット内で評価した。静脈血サンプル（２ｍｌ）は、試験処置の結膜下投与の６０分後において、Ｌｉ−ヘパリン試験管を使用して得た。サンプリングを実施した正確な時間を、ｅ−ＣＲＦ上に用意された記入欄に入力した。血液サンプルは、室温、２，５００ＲＰＭで１０分間にわたり遠心分離した。遠心分離後、ピペットを使用して、血漿を、１．５ｍｌのクライオチューブ２本へと移した。次いで、クライオチューブを、−８０℃の冷凍庫に入れ、次いで、その後、温度データロガーを伴うドライアイス中、解析に責任を負う中央検査室へと送付した。中央検査室で受領されたら、解析するまで、サンプルを−８０℃で保存した。
【０５２０】
統計学的方法：主要目的は、９００μｇ  ＸＧ−１０２と、デキサメタゾン点眼剤との、試験処置の結膜下注射後２８日目における前房細胞グレードについての非劣性比較であった。主要転帰は、プロトコール適合（ｐｅｒ−ｐｒｏｔｏｃｏｌ）（ＰＰ）集団について解析し、感度の理由で最大の解析対象集団（ｆｕｌｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｅｔ）（ＦＡＳ）について反復した。９００μｇ  ＸＧ−１０２の、デキサメタゾンに照らした非劣性は、推定差上下の９５％のＣＩの上限が、前房細胞グレード０．５を下回る場合に明言され得た。第１の副次的評価項目（９０μｇ  ＸＧ−１０２と、デキサメタゾンとを比較した、２８日目における前房細胞グレード）を、主要転帰についての場合と同じ様式で解析した。他の全ての副次的転帰は、０．００５の両側アルファ値を使用するＦＡＳについての優位性検定により評価した。安全性解析は、ＦＡＳ群について、施された処置ごとに実施した。
【０５２１】
本試験に組み入れられた患者の内訳を、図５９に示す。最初の患者が説明同意文書を提出したのは、２０１２年７月１８日であった。最後の患者が無作為化されたのは、２０１３年９月２日であり、最後の患者において最終回の来院が実施されたのは、２０１３年１０月３日であった。合計１５７例の患者が説明同意文書を提出し、これらのうちの１５１例を無作為化した。無作為化された患者１５１例のうち、６例には、試験処置の結膜下注射を投与しなかった。試験プロトコール中の要件に従い、これらの無作為化された患者を置きかえた。合計１４５例の患者に、試験処置（すなわち、ＸＧ−１０２またはプラセボ）の結膜下注射を投与し、１４４例の患者は、試験プロトコールにより計画される通り、試験を完了した。合計で１例の患者については、追跡調査を中止した。以下の表は、３つの試験群についての追跡調査が完全であることを示す。
【表２３】
2020055866.tif 000030
【０５２２】
ＦＡＳ（ｆｕｌｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｅｔ）は、試験処置の結膜下注射が開始／投与される、全ての無作為化された患者を含んだ。ＦＡＳセットは、ＩＴＴ（ｉｎｔｅｎｔｉｏｎ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ）の原則に従い解析した、すなわち、施された処置に関わらず、患者が無作為化された処置群内で患者を評価した。加えて、許容される時間窓の外で実施された来院についても、データを、ＦＡＳ解析セットから除外した。
【０５２３】
ＰＰ解析セットは、ＦＡＳのサブセットであった。無作為化後に大きな違反がなされた場合、および／または追跡調査期間中にオープンラベルの抗炎症処置が導入された場合は、患者を、ＰＰ解析データセットから除外した。加えて、許容される時間窓の外で実施された来院についても、データを、ＰＰ解析セットから除外した。
【０５２４】
安全性セットには、試験処置の結膜下注射が開始／投与される、全ての無作為化された患者を組み入れた。患者は、処置された通りに、すなわち、患者に施された処置に従い解析した。安全性セットは、安全性解析のための主要解析セットであった。
【０５２５】
ベースラインにおける特徴および併存疾患は、ＦＡＳおよびＰＰ集団のいずれについても、３つの処置群の間で均衡させた。下記の表は、ベースラインにおける主要な併存疾患の幾つかを、ＰＰ解析集団について、処置群ごとに示す。網膜剥離を有する患者の百分率は、９０μｇ  ＸＧ−１０２群（５２％）へと割り付けられた患者において、９００μｇ
ＸＧ−１０２群（４１％）およびデキサメタゾン群（４０％）と比較して高かったが、糖尿病を有する患者の百分率は、９００μｇ  ＸＧ−１０２群（３３％）へと無作為化された患者において、９０μｇ  ＸＧ−１０２群（２２％）およびデキサメタゾン群（２６％）と比較して高かった。
【表２４】
2020055866.tif 000031
【０５２６】
以下の表は、ＰＰ解析集団について、処置群ごとに、実施された手術の種類に加えて、ベースラインにおける、眼手術に対する適応も示す。複合後区手術を受けた患者の百分率は、９０μｇ  ＸＧ−１０２群（５０％）へと割り付けられた患者において、９００μｇ
ＸＧ−１０２群（４６％）およびデキサメタゾン群（４２％）へと割り付けられた患者と比較して高かった。ベースラインにおいて実施された手術の間に、ガス（ＳＦ６またはＣ２Ｆ６）を注入された患者の、各処置群内の百分率は、それぞれ、４３％（９０μｇ  ＸＧ−１０２）、３７％（９００μｇ  ＸＧ−１０２）、および３８％（デキサメタゾン）であった。
【表２５】
2020055866.tif 000032
【０５２７】
２８日目における前房細胞グレード（９００μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾン）：
主要評価項目は、補正反復測定モデルを使用して、９００μｇ  ＸＧ−１０２投与群を、デキサメタゾン群と比較して、２８日目における前房細胞グレードの平均差異として解析した。反復モデルでは、７、１４、および２８日目の来院について回収されたデータのみを使用した。主要解析は、ＰＰ解析データセットについて実施し、感度解析は、ＦＡＳデータセットについて実施した。第１の副次的転帰（すなわち、２８日目における前房細胞グレード（９０μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾン））についての非劣性は、前房細胞グレード０．５の、同じ非劣性マージンを使用して、主要評価項目についての場合と同じ様式で決定した。ＰＰ解析集団についての、試験処置の結膜下注射投与の２８日後までの平均前房細胞グレードを、図６０に、３つの処置群（すなわち、９０μｇ  ＸＧ−１０２群、９００μｇ  ＸＧ−１０２群およびデキサメタゾン群）について示すが、統計学的モデルの結果は、以下の表に示す。
【表２６】
2020055866.tif 000033
【０５２８】
主要転帰の結果を、第１の副次的転帰の結果に加えて、図６１に、ＰＰデータセットおよびＦＡＳデータセットの両方について示す。２８日目における前房細胞グレードにより評価される通り、９００μｇ  ＸＧ−１０２は、術後眼内炎症の進展において、デキサメタゾン点眼剤に照らして非劣性であった（前房細胞グレードで−０．０５４の差異、９５％の信頼区間（ＣＩ：ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌ）：−０．３５０〜０．２４２、ｐ＜０．００１）。同じ解析を、ＦＡＳについて反復したところ、９００μｇ  ＸＧ−１０２は、デキサメタゾン点眼剤に照らして非劣性であることが見出された（細胞グレードで−０．０３２の差異、９５％のＣＩ：−０．３０１〜０．２３８、ｐ＜０．００１）。ＦＡＳ解析セットおよびＰＰ解析セットについて、上限がゼロと交差することを踏まえると、９００μｇ  ＸＧ−１０２は、２８日目における前房細胞グレードについて、デキサメタゾン点眼剤に照らして優位性ではなかった（ＦＡＳ解析セットについてｐ＝０．８１８であり、ＰＰ解析セットについてｐ＝０．７２０であった）。
【０５２９】
２８日目における前房細胞グレード（９０μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾン）：
９０μｇ  ＸＧ−１０２をデキサメタゾン点眼剤と比較する副次的評価項目に関して、９０μｇ  ＸＧ−１０２は、術後眼内炎症の進展において、デキサメタゾンに照らして非劣性であった（前房細胞グレードで０．０８６の差異、９５％のＣＩ：−０．２１４〜０．３８５、ｐ＝０．００３）。同じ解析を、ＦＡＳについて反復したところ、９０μｇ  ＸＧ−１０２は、デキサメタゾン点眼剤に照らして非劣性であることが見出された（前房細胞グレードで０．０５３の差異、９５％のＣＩ：−０．２１５〜０．３２１、ｐ＜０．００１）。
【０５３０】
９０μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾンおよび９００μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾンについての、７日目および１４日目における前房細胞グレード：
【０５３１】
９０μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾンおよび９００μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾンについての、７日目および１４日目における前房細胞グレードについての統計学的解析を、ＦＡＳデータセットについて実施した。７日目または１４日目のいずれかにおける、９０μｇ  ＸＧ−１０２とデキサメタゾンとの間、および９００μｇ  ＸＧ−１０２とデキサメタゾンとの間で、前房細胞グレードの統計学的有意差はなかった。
【０５３２】
９０μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾンおよび９００μｇ  ＸＧ−１０２対デキサメタゾンについての、７日目、１４日目、および２８日目における前房フレアグレード：
【０５３３】
２８日目までに得られた前房フレアグレード（ＦＡＳについて）を、図６２に示し、モデルの結果を、下記の表に示す。７日目または１４日目または２８日目のいずれかにおける、９０μｇ  ＸＧ−１０２とデキサメタゾンとの間、および９００μｇ  ＸＧ−１０２とデキサメタゾンとの間で、前房フレアグレードの統計学的有意差はなかった。
【表２７】
2020055866.tif 000034
【０５３４】
眼炎症の除去：
時間経過にわたる眼炎症の評価は、眼炎症の除去により評価した。眼炎症の除去とは、眼炎症スコアの合計が、前房細胞グレード＝０および前房フレアグレード＝０として規定されるグレード０である、被験体の比率と規定した。この転帰は、７日目、１４日目、および２８日目において、９００μｇ  ＸＧ−１０２をデキサメタゾンと比較し、９０μｇ
ＸＧ−１０２をデキサメタゾンと比較して評価した。ＦＡＳ集団およびＰＰ集団についての統計学的結果の概要を、下記の表に示す。ＦＡＳについて、通例の治療群と比較して実施された解析に関して、９００μｇ  ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者についての、炎症が除去されているオッズは、術後７日目において、０．７６（９５％のＣＩ：０．２５〜２．２８）であり、術後１４日目において、１．２５（９５％のＣＩ：０．４７〜３．３２）であり、術後２８日目において、１．１３（９５％のＣＩ：０．４９〜２．６０）であった。９０μｇ  ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者群に関して、通例の治療群と比較して、炎症が除去されているオッズは、術後７日目において、０．５２（９５％のＣＩ：０．１５〜１．８３）であり、術後１４日目において、０．８５（９５％のＣＩ：０．３０〜２．４０）であり、術後２８日目において、１．２４（９５％のＣＩ：０．５４〜２．８７）であった。ＰＰ解析セットについて、通例の治療群と比較して実施された解析に関して、９００μｇ  ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者についての炎症が除去されているオッズは、術後７日目において、０．８４（９５％のＣＩ：０．２８〜２．４６）であり、術後１４日目において、１．１２（９５％のＣＩ：０．４１−  ３．０５）であり、術後２８日目において、１．２６（９５％のＣＩ：０．５２〜３．０４）であった。９０μｇ  ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者群に関して、通例の治療群と比較して、炎症が除去されているオッズは、術後７日目において、０．５６（９５％のＣＩ：０．１６〜１．９７）であり、術後１４日目において、０．９７（９５％のＣＩ：０．３４〜２．７７）であり、術後２８日目において、１．４５（９５％のＣＩ：０．５８〜３．６１）であった。
【表２８】
2020055866.tif 000035
【０５３５】
レーザーフレアメーター（ＬＦＭ）：
試験を通して、規定された時点で得られたＬＦＭ測定値を、ＦＡＳについての、時間経過にわたる、２８日目までのＬＦＭ測定値として、図６３に示す。
試験プロトコールでは、レスキュー薬物治療とは、治験責任医師により判断された眼炎症の遷延のために、追跡調査期間の間に患者のために処方される、任意のオープンラベルの抗炎症眼処置として規定された。試験プロトコールは、試験処置の点眼剤を、オープンラベルの抗炎症眼処置の導入時に中止すべきであるということを規定した。９０μｇ  ＸＧ−１０２群内で、レスキュー薬物治療を導入された患者の百分率は、デキサメタゾン群と比較した場合に、統計学的に異なった（９０μｇ  ＸＧ−１０２群およびデキサメタゾン群について、それぞれ、２１．３％対４．０％（ｐ＝０．０１３））が、９００μｇ  ＸＧ−１０２群とデキサメタゾン群との差異（２つの群について、それぞれ、１４．６％および４．０％）は、統計学的に有意でなかった（ｐ＝０．８８）。
【０５３６】
血漿中の薬物動態：
ＸＧ−１０２を定量化するための血液サンプリングは、Ｈｏｔｅｌ  Ｄｉｅｕ病院（Ｐａｒｉｓ）で募集された３２例の患者のサブセット内で、ＸＧ−１０２の結膜下投与の６０分後に行った。ＸＧ−１０２の血漿中の定量化についての解析報告は、ＸＧ−１０２が、任意の患者について、血漿中サンプルで検出されなかったことを示す（以下の表を参照されたい）。
【表２９】
2020055866.tif 000036
【０５３７】
まとめると、９００μｇ  ＸＧ−１０２は、術後眼内炎症の進展において、デキサメタゾン点眼剤に照らして非劣性であった（前房細胞グレードで−０．０５４の差異、９５％のＣＩ：−０．３５０〜０．２４２、ｐ＜０．００１）。同じ解析を、ＦＡＳについて反復したところ、９００μｇ  ＸＧ−１０２は、デキサメタゾン点眼剤に照らして非劣性であることが見出された（細胞グレードで−０．０３２の差異、９５％のＣＩ：−０．３０１〜０．２３８、ｐ＜０．００１）。ＦＡＳ解析セットおよびＰＰ解析セットについて、上限がゼロに交差することを踏まえると、９００μｇ  ＸＧ−１０２は、２８日目における前房細胞グレードについて、デキサメタゾン点眼剤に照らして優位性ではなかった（ＦＡＳ解析セットについてｐ＝０．８１８であり、ＰＰ解析セットについてｐ＝０．７２０であった）。
【０５３８】
９０μｇ  ＸＧ−１０２をデキサメタゾン点眼剤と比較する副次的評価項目に関して、９０μｇ  ＸＧ−１０２は、術後眼内炎症の進展において、デキサメタゾン点眼剤に照らして非劣性であった（前房細胞グレードで０．０８６の差異、９５％のＣＩ：−０．２１４〜０．３８５、ｐ＝０．００３）。同じ解析を、ＦＡＳについて反復したところ、９０μｇ  ＸＧ−１０２は、デキサメタゾン点眼剤に照らして非劣性であることが見出された（前房細胞グレードで０．０５３の差異、９５％のＣＩ：−０．２１５〜０．３２１、ｐ＜０．００１）。
【０５３９】
７日目または１４日目のいずれかにおける、９０μｇ  ＸＧ−１０２とデキサメタゾンとの間、および９００μｇ  ＸＧ−１０２とデキサメタゾンとの間で、前房細胞グレードの統計学的有意差はなかった。７日目または１４日目または２８日目のいずれかにおける、９０μｇ  ＸＧ−１０２とデキサメタゾンとの間、および９００μｇ  ＸＧ−１０２とデキサメタゾンとの間で、前房フレアグレードの統計学的有意差はなかった。
【０５４０】
時間経過にわたる眼炎症の評価は、眼炎症の除去により評価した。眼炎症の除去とは、眼炎症スコアの合計が、前房細胞グレード＝０および前房フレアグレード＝０として規定されるグレード０である、被験体の比率と規定した。この転帰は、７日目、１４日目、および２８日目において、９００μｇ  ＸＧ−１０２をデキサメタゾンと比較し、９０μｇ
ＸＧ−１０２をデキサメタゾンと比較して評価した。ＦＡＳについて、通例の治療群と比較して実施された解析に関して、９００μｇ  ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者についての、炎症が除去されているオッズは、術後７日目において、０．７６（９５％のＣＩ：０．２５〜２．２８）であり、術後１４日目において、１．２５（９５％のＣＩ：０．４７〜３．３２）であり、術後２８日目において、１．１３（９５％のＣＩ：０．４９〜２．６０）であった。９０μｇ  ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者群に関して、通例の治療群と比較して、炎症が除去されているオッズは、術後７日目において、０．５２（９５％のＣＩ：０．１５〜１．８３）であり、術後１４日目において、０．８５（９５％のＣＩ：０．３０〜２．４０）であり、術後２８日目において、１．２４（９５％のＣＩ：０．５４〜２．８７）であった。
【０５４１】
安全性評価
曝露の程度：
本試験は、二重盲検試験であった。無作為化され、結膜下注射が開始された、全ての患者を、投与群ごとに、安全性解析に組み入れる。処置により発生するＡＥ、すなわち、試験処置の結膜下注射の開始後に生じたＡＥのみを解析した。試験処置の点眼剤を、早期に（すなわち、２１日目以前に）中止した場合は、試験プロトコールに従い、該当する患者を、２８日目まで追跡調査し続けた。合計１４５例の患者に、試験処置の結膜下注射を投与し、このうち、４７例の患者に、９０μｇ  ＸＧ−１０２を投与し、４８例の患者に、９００μｇ  ＸＧ−１０２を投与し、デキサメタゾン群へと割り付けられた５０例の患者に、０．９％のＮａＣｌを投与した。試験処置の結膜下注射が開始された全ての患者に、試験処置の全量（すなわち、２５０μＬ）を投与した。
【０５４２】
患者群による試験処置の点眼剤の曝露を、下記の表に示す。試験処置の点眼剤に関して、試験プロトコールにより必要とされる、試験処置の点眼剤の滴下に対する全般的な遵守は、３つの試験群内で＞９０％であった。ＸＧ−１０２処置群へと割り付けられた患者の、試験処置の点眼剤の滴下に対する遵守（９０μｇ  ＸＧ−１０２群および９００μｇ  ＸＧ−１０２群について、それぞれ、９５％および９４％）は、遵守が９１％であるデキサメタゾン群へと割り付けられた患者と比較してわずかに高かった。５０例の患者に、平均２０日間（６〜２１日間、最小〜最大）にわたり、デキサメタゾン点眼剤を施し、最大累積用量は８１滴（８１×０．０５ｍｇ＝４．０５ｍｇ）であった。
【表３０】
2020055866.tif 000037
【０５４３】
有害事象
投与群ごとの有害事象の概要：
報告された有害事象（重篤な有害事象および重篤ではな有害事象）の大要を、図６４に、投与群ごとに示す。ＡＥが報告された患者の数に関して、９０μｇ  ＸＧ−１０２群とデキサメタゾン群との間、および９００μｇ  ＸＧ−１０２群とデキサメタゾン群との間で、統計学的有意差はなかった。９０μｇ  ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者については、この群へと割り付けられた患者４７例中３１例（６６％）について、のべ７８例のＡＥが報告され、９００μｇ  ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者については、患者４８例中３２例（６７％）について、のべ６９例のＡＥが報告された。デキサメタゾン群へと割り付けられた患者については、患者５０例中２９例（５８％）について、のべ５５例のＡＥが報告された。試験処置投与後２４時間以内にＡＥを経験した患者の百分率は、３つの試験処置群の間で同様（すなわち、９０μｇ  ＸＧ−１０２群、９００μｇ  ＸＧ−１０２群、およびデキサメタゾン群について、それぞれ、３４％、２７％、および３０％）であった。
【０５４４】
重症度および投与群ごとに報告されたＡＥの分布を、下記の表に示す。報告されたＡＥの大部分（約７０％）は、３つの投与群について、治験責任医師により、「軽度」であると考えられた。
【表３１】
2020055866.tif 000038
【０５４５】
試験処置の点眼剤の中断をもたらしたＡＥのまとめの大要を、投与群ごとに、以下の表に示す。
【表３２】
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【０５４６】
９０μｇ  ＸＧ−１０２投与群へと割り付けられた患者については、１１例の事象（この投与群内で報告された全てのＡＥの１４％）が、試験処置の早期の中止をもたらしたが、９００μｇ  ＸＧ−１０２投与群およびデキサメタゾン投与群では、試験処置の点眼剤は、それぞれ、８例の事象（この投与群内で報告された全てのＡＥの１２％）および３例の事象（この投与群内で報告された全てのＡＥの６％）について中断された。
【０５４７】
治験責任医師は、報告された各ＡＥの、試験処置のいずれかに対する関係性を評価した（盲検化された様式で）。治験責任医師が、この問いへの答えとして、「疑いがある」かまたは「ほぼ確実である」とチェックした場合、事象は、試験処置と関連すると考えられた。加えて、治験責任医師は、試験処置の（すなわち、ＸＧ−１０２またはデキサメタゾン）のいずれに、事象が関連すると考えられるのかも指定しなければならなかった（下記の表を参照されたい）。ＡＥは、治験責任医師（盲検化された評価）により、９０μｇ  ＸＧ−１０２群内の患者について報告された１８例の事象について、９００μｇ  ＸＧ−１０２群内の患者について報告された１３例の事象について、およびデキサメタゾン群内の患者について報告された１５例の事象について、試験薬物治療と関連する疑いがあるか、またはこれと関連することがほぼ確実であると考えられた（下記の表を参照されたい）。報告されたＳＡＥのいずれも、治験責任医師により、試験処置のいずれとも関連する疑いがあるとも、これと関連することがほぼ確実であるとも考えられなかった。
【表３３】
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【０５４８】
有害事象の提示：
治験責任医師が、ｅ−ＣＲＦにおける「試験処置との関連」という問いへの答えとして、「疑いがある」かまたは「ほぼ確実である」とチェックした場合、報告された事象は、試験処置と関連すると考えられた。３つの試験群のいずれかへと無作為化された患者の少なくとも２％について報告された、ＡＥ（ＭｅｄＤＲＡのＳＯＣおよびＰＴ用語により分類された）の概要は、図６５において見出すことができる。
【０５４９】
有害事象の解析
全般的に、ＡＥが報告された患者の数に関して、ＸＧ−１０２投与群のいずれかとデキサメタゾン投与群との間で、統計学的有意差はなかった。９０μｇ  ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者については、この群へと割り付けられた患者４７例中３１例（６６％）について、のべ７８例のＡＥが報告され、９００μｇ  ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者については、患者４８例中３２例（６７％）について、のべ６９例のＡＥが報告された。デキサメタゾン群へと割り付けられた患者については、患者５０例中２９例（５８％）について、のべ５５例のＡＥが報告された。試験処置投与後２４時間以内にＡＥを経験した患者の百分率は、３つの試験処置群の間で同様（すなわち、９０μｇ  ＸＧ−１０２群、９００μｇ  ＸＧ−１０２群、およびデキサメタゾン群について、それぞれ、３４％、２７％、および３０％）であった。
【０５５０】
最も高頻度で報告されたＡＥは、ＳＯＣ中の「眼障害」であった。このＳＯＣ中で、４９例の事象が、９０μｇ  ＸＧ−１０２へと割り付けられた患者２６例（５５％）について報告され、４３例の事象が、９００μｇ  ＸＧ−１０２へと割り付けられた患者２４例（５０％）について報告され、３０例の事象が、デキサメタゾンへと割り付けられた患者１６例（３２％）について報告された。このＳＯＣ中の事象が報告された患者の数に関して、９０μｇ  ＸＧ−１０２群とデキサメタゾン群との間で、統計学的有意差があった（ｐ＝０．０２５）。炎症を示唆する事象（「眼炎症」、「角膜浮腫」、「眼瞼浮腫」など）は、９０μｇ  ＸＧ−１０２投与群へと割り付けられた患者について、９００μｇ  ＸＧ−１０２投与群またはデキサメタゾン投与群へと割り付けられた患者と比較して高頻度で報告された。眼痛は、９００μｇ  ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者について、より高頻度で報告され、デキサメタゾン群と比較した場合、この事象が報告された患者の数の差異は、統計学的に有意であった（ｐ＝０．０２９）。ＳＯＣ中の「検査」、「眼内圧の上昇」は、９０μｇ  ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者（２３％）について、９００μｇ  ＸＧ−１０２群およびデキサメタゾン群についての、それぞれ、１０％および１４％と比較した場合に、より高頻度で報告された。この事象が報告された患者の数の差異（９０μｇ  ＸＧ−１０２群とデキサメタゾン群との差異）は、統計学的に有意ではなかった。試験処置の点眼剤は、９０μｇ  ＸＧ−１０２へと割り付けられた患者１１例について、９００μｇ  ＸＧ−１０２へと割り付けられた患者８例について、およびデキサメタゾンへと割り付けられた患者３例について、ＡＥのために中断された。図６５は、無作為化群に関わらず、少なくとも２％の患者に生じた、ＡＥ（ＭｅｄＤＲＡのＳＯＣおよび基本語（ＰＴ：ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｔｅｒｍ）の用語により分類された）の概要を示す。
【０５５１】
重篤な有害事象
該当する重篤な有害事象を、図６６に列挙する。のべ９例のＳＡＥが、９例の患者について（すなわち、９０μｇ  ＸＧ−１０２投与群へと無作為化された患者４例について、９００μｇ  ＸＧ−１０２投与群へと無作為化された患者３例について、およびデキサメタゾン投与群へと無作為化された患者２例について）報告された。のべ１例のＳＡＥ（９０μｇ  ＸＧ−１０２投与群へと無作為化された患者１例について）は、試験処置の結膜下注射投与後の最初の２４時間以内に報告された。報告されたＳＡＥのいずれも、治験責任医師により、試験処置と関連するとは考えられなかった。報告された全てのＳＡＥの「重篤性の理由」は、「入院」であった。報告されたＳＡＥの大要を、図６６に示す。
【０５５２】
臨床検査室における評価
試験のために実施された血液学アッセイおよび化学アッセイを、以下の表に示す。全ての検査室検査は、地域ごとに実施した。
【表３４】
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【０５５３】
安全性についての結論
全般的に、９０μｇ  ＸＧ−１０２および９００μｇ  ＸＧ−１０２は、複合眼手術を受けた患者において、良好に忍容された。試験処置の点眼剤は、９０μｇ  ＸＧ−１０２へと無作為化された患者１１例について、９００μｇ  ＸＧ−１０２へと無作為化された患者８例について、およびデキサメタゾンへと無作為化された患者３例について、早期に中止された。試験処置の早期の中止の理由は主に、治験責任医師の意見で抗炎症処置の強化が必要とされた眼炎症の遷延のためであった。該当する患者には、オープンラベルの抗炎症眼処置による処置が開始された。
【０５５４】
この試験では、致死性の事象は、報告されなかった。のべ９例のＳＡＥが、９例の患者について報告されたが、これらの事象のいずれも、試験処置と関連するとは考えられなかった。
【０５５５】
報告されたＡＥの全般的な数については、ＡＥが報告された患者の数に関して、ＸＧ−１０２投与群のいずれかとデキサメタゾン群との間で、統計学的有意差はない。９０μｇ
ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者については、この群へと割り付けられた患者４７例中３１例（６６％）について、のべ７８例のＡＥが報告され、９００μｇ  ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者については、患者４８例中３２例（６７％）について、のべ６９例のＡＥが報告された。デキサメタゾン群へと割り付けられた患者については、患者５０例中２９例（５８％）について、のべ５５例のＡＥが報告された。試験処置投与後２４時間以内にＡＥを経験した患者の百分率は、３つの試験処置群の間で同様（すなわち、９０μｇ  ＸＧ−１０２群、９００μｇ  ＸＧ−１０２群、およびデキサメタゾン群について、それぞれ、３４％、２７％、および３０％）であった。眼炎症を示唆するＡＥを経験した患者の数は、９０μｇ  ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者において、９００μｇ  ＸＧ−１０２群およびデキサメタゾン群と比較して高かったことから、９０μｇ
ＸＧ−１０２は、複合眼手術に続発する眼炎症の処置において、それほど有効ではない可能性があることが示唆される。眼痛を示唆するＡＥを経験した患者の数は、９００μｇ
ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者において、９０μｇ  ＸＧ−１０２群およびデキサメタゾン群と比較して高かった。９０μｇ  ＸＧ−１０２群内の２例の患者について、眼痛は、試験処置の結膜下注射後２４時間未満において報告された（これらの患者のうちの１例については、術後の鎮痛処置は、処方されなかった）。これらの患者のうちの１例について、眼痛はまた、３５日後において、ＡＥとして再度報告されたが、これは、患者のＩＯＰが上昇していると報告されたのと同じ時点であった。
【０５５６】
９００μｇ  ＸＧ−１０２群内の３例の患者（すなわち、患者ＦＲ−０２−００１３、ＦＲ−０３−００３、およびＦＲ−０５−００６０）について、眼痛は、試験処置の結膜下注射後２４時間未満において報告され、これらの患者のうちの１例（すなわち、患者ＦＲ−０２−００１３）について、眼痛はまた、５日後において、ＡＥとして再度報告された。同じ投与群内の４例の患者（すなわち、患者ＦＲ−０４−０１０８、ＦＲ−０５−０１２７、ＦＲ−０５−０１５２、およびＦＲ−０５−０１５５）について、眼痛は、試験処置の結膜下注射後＞２４時間において、相伴って報告されたこれらの患者のうちの３例（すなわち、患者ＦＲ−０２−０１１３、ＦＲ−０５−０１２７、およびＦＲ−０５−０１５５）について、眼痛は、他のＡＥと相伴なって報告された。眼痛は、デキサメタゾン群内の１例の患者（すなわち、ＦＲ−０３−００８７）については、試験処置の結膜下注射後＞２４時間において、相伴って報告された。この事象は、他のＡＥと相伴なって報告された。複合手術を実施したことを踏まえると、眼痛はまた、手術後における縫合の存在とも関連し得た。
【０５５７】
要約
遵守：試験処置の結膜下注射が開始された全ての患者に、全量（すなわち、２５０μＬ）を投与した。３つの試験処置群内で、試験処置の点眼剤に対する全般的な遵守は、＞９０％であった。
【０５５８】
安全性：有害事象が報告された患者の数に関して、ＸＧ−１０２投与群のいずれかとデキサメタゾン群との間で、統計学的有意差はなかった。９０μｇ  ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者については、この群へと割り付けられた患者４７例中３１例（６６％）について、のべ７８例の有害事象が報告され、９００μｇ  ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者については、患者４８例中３２例（６７％）について、のべ６９例の有害事象が報告された。デキサメタゾン群へと割り付けられた患者については、患者５０例中２９例（５８％）について、のべ５５例の有害事象が報告された。試験処置投与後２４時間以内に有害事象を経験した患者の百分率は、３つの試験処置群の間で同様（すなわち、９０μｇ  ＸＧ−１０２群、９００μｇ  ＸＧ−１０２群、およびデキサメタゾン群について、それぞれ、３４％、２７％、および３０％）であった。９０μｇ  ＸＧ−１０２群へと割り付けられたより多くの患者が、９００μｇ  ＸＧ−１０２群およびデキサメタゾン群と比較して、眼炎症を示唆する有害事象を経験したことから、９０μｇ  ＸＧ−１０２は、複合眼手術に続発する眼炎症の処置において、それほど有効ではない（９００μｇ投与群およびデキサメタゾン投与群と比較して）可能性があることが示唆され得る。眼痛を示唆する有害事象を経験した患者の数は、９００μｇ  ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者において、９０μｇ  ＸＧ−１０２群およびデキサメタゾン群と比較して多かった。眼痛は、手術後における縫合の存在と関連し得る。「眼内圧の上昇」は、９０μｇ  ＸＧ−１０２群へと割り付けられた患者（２３％）について、９００μｇ  ＸＧ−１０２群およびデキサメタゾン群についての、それぞれ、１０％および１４％と比較した場合に、より高頻度で報告された。この事象が報告された患者の数の差異（９０μｇ  ＸＧ−１０２群とデキサメタゾン群との差異）は、統計学的に有意ではなかった。
【０５５９】
報告された全ての有害事象（ＡＥ）の大部分（約７０％）は、治験責任医師により、軽度であると考えられた。合計ＡＥは、治験責任医師（盲検化された評価）により、９０μｇ  ＸＧ−１０２群内の患者について報告された１８例の事象について、９００μｇ  ＸＧ−１０２群内の患者について報告された１３例の事象について、およびデキサメタゾン群内の患者について報告された１５例の事象について、試験薬物治療と関連する疑いがあるか、またはこれと関連することがほぼ確実であると考えられた。この試験では、致死性の事象は、報告されなかった。のべ９例のＳＡＥが、９例の患者について報告されたが、これらの事象のいずれも、試験処置と関連するとは考えられなかった。
【０５６０】
ＸＧ−１０２の定量化は、３２例の患者のサブセット内で実施した。血液サンプルは、試験処置の結膜下注射の１時間後において得た。得られた全てのサンプルについて（かつ、割り当てられた投与群に関わらず）、ＸＧ−１０２濃度を、＜１０ｎｇ／ｍｌの定量下限（ＬＬＯＱ：ｌｏｗｅｒ  ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を下回ると解析した。
【０５６１】
本発明者らの非劣性の規定に従い、単回結膜下注射として投与された９００μｇ  ＸＧ−１０２および９０μｇ  ＸＧ−１０２のいずれも、複合眼手術を受けた患者における前房細胞グレードにより評価される通り、術後眼内炎症の処置において、１日４回ずつ２１日間にわたり滴下されたデキサメタゾン点眼剤による処置に照らして非劣性であった。
【０５６２】
全般的に、９０μｇ  ＸＧ−１０２および９００μｇ  ＸＧ−１０２は、良好に忍容された。報告された有害事象のいずれも、忍容不可能であるかまたは不可逆的なＸＧ−１０２の副作用であることが示唆されなかった。９０μｇ  ＸＧ−１０２において報告された、眼炎症を示唆する事象の数が多かったことは、この用量が、複合眼手術後の患者における術後眼内炎症の処置では、それほど有効ではないことを示唆する。これはまたおそらく、９０μｇ  ＸＧ−１０２群内の眼炎症の遷延に起因する、レスキュー薬物治療を導入された患者の百分率によっても裏付けられる。試験処置の結膜下注射の投与の１時間後において評価された、血漿中ＸＧ−１０２の定量化により、ＸＧ−１０２の全身への移行がないことが実証された。
【０５６３】
（実施例２８）
ｐ−３８（Ｍａｐｋ１４）欠損マウスにおける、ＸＧ−１０２の、インビボの肝臓癌に対する効果
ｐ−３８としてもまた公知のＭａｐｋ１４は、細胞増殖および腫瘍形成に対する、周知の負の調節物質である。この試験では、Ｍａｐｋ１４ｆ／ｆマウスおよびＭａｐｋ１４Δｌｉ＊マウスのほか、Ｍａｐｋ１４ｆ／ｆＪｕｎｆ／ｆマウスおよびＭａｐｋ１４Δｌｉ＊ＪｕｎΔｌｉ＊マウスも使用した。本明細書では、「Ｍａｐｋ１４Δｌｉ＊」および「Ｍａｐｋ１４Δｌｉ＊ＪｕｎΔｌｉ＊」は、それぞれ、ｐｏｌｙＩＣで処置されたＭｘ−ｃｒｅ／Ｍａｐｋ１４ｆ／ｆマウスおよびＭｘ−ｃｒｅ欠失Ｍａｐｋ１４ｆ／ｆＪｕｎｆ／ｆマウスを意味し、したがって、それぞれ、Ｍｘ−ｃｒｅプロセスによる、それぞれ、Ｍａｐｋ１４「欠失」およびＪｕｎ欠失をもたらす、すなわち、それぞれ、「Ｍａｐｋ１４−／−」マウスおよび「Ｍａｐｋ１４−／−Ｊｕｎ−／−」マウスをもたらす。
【０５６４】
肝細胞および肝臓の腫瘍細胞のジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）誘導性過剰増殖（Ｈｕｉ  Ｌ．ら、ｐ３８ａ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ
ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ＪＮＫ−ｃ−Ｊｕｎ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００７年；３９巻：７４１〜７４９頁を参照されたい）に対するその効果を試験するために、ＸＧ−１０２を、２０ｍｇ／ｋｇの用量で１週間に２回腹腔内投与した。ＰＢＳを、コントロールとして使用した。具体的には、Ｍａｐｋ１４ｆ／ｆマウスおよびＭａｐｋ１４Δｌｉ＊マウスに、ＤＥＮ処置の前において、ＰＢＳまたはＸＧ−１０２（体重１ｋｇ当たり２０ｍｇ）のいずれかを注射した。次いで、マウスにおける肝細胞の増殖を、ＤＥＮ処置の４８時間後において、Ｋｉ６７染色により解析し、定量化した。
【０５６５】
図６７は、左パネルにおいて、ＸＧ−１０２（図では、「Ｄ−ＪＮＫＩ１」と称する）またはＰＢＳ処置されたＭａｐｋ１４ｆ／ｆマウスおよびＭａｐｋ１４Δｌｉ＊マウスにおける肝細胞の増殖（Ｋｉ６７陽性細胞の定量化）を示す。ＰＢＳ条件（コントロール）下では、Ｍａｐｋ１４（ｐ３８）による、細胞増殖および腫瘍形成に対する負の調節が存在しないので、Ｍａｐｋ１４−／−細胞（Ｍａｐｋ１４Δｌｉ＊）は、Ｍａｐｋ１４＋／＋細胞（Ｍａｐｋ１４ｆ／ｆ）より大幅に増殖している。ＸＧ−１０２の投与は、このＭａｐｋ１４の「非活性」（Ｍａｐｋ１４−／−細胞において）を、ＸＧ−１０２（ＤＪＮＫＩ１）の活性により逆転させる。
【０５６６】
図６７の右パネルでは、ＸＧ−１０２（図では、「Ｄ−ＪＮＫＩ１」と称する）で処置されたＭａｐｋ１４ｆ／ｆＪｕｎｆ／ｆ（Ｍａｐｋ１４＋／＋Ｊｕｎ＋／＋を意味する）マウスおよびＭａｐｋ１４Δｌｉ＊ＪｕｎΔｌｉ＊（Ｍａｐｋ１４−／−Ｊｕｎ−／−を意味する）マウスにおける肝細胞の増殖（Ｋｉ６７陽性細胞の定量化）を示す。結果は、ＰＢＳ条件下のＭａｐｋ１４ｆ／ｆマウスおよびＸＧ−１０２（ＤＪＮＫＩ１）条件下のＭａｐｋ１４Δｌｉ＊マウスの結果と同等であり、これらを模倣する。したがって、ＸＧ−１０２活性は、細胞系内のＪｕｎ遺伝子の欠失と「同等」である。
【０５６７】
まとめると、これらの結果は、ＸＧ−１０２が、がん細胞系の成長に対して活性を有し（Ｍａｐｋ１４の欠失により誘導された過剰成長を逆転する）、これはおそらく、Ｊｕｎにより媒介されることを確認している。
【０５６８】
（実施例２９）
ＸＧ−１０２の、インビボのヒト肝臓がん細胞（植え込まれた）に対する効果
ＸＧ−１０２の、インビボのヒト肝臓がん細胞に対する効果を試験するため、３×１０６個のＨｕｈ７ヒト肝臓がん細胞を、４週齢のヌードマウスの両側腹部領域へと皮下注射した。ヌードマウスを、Ｈｕｈ７の注射後、５ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２で、１週間に２回腹腔内処置した。腫瘍体積を１週間に２回測定した。マウスは、異種移植の４週間後に死なせた。
【０５６９】
図６８に示される通り、ヌードマウスにおけるヒト肝細胞癌の皮下注射の後に、毎週２回ずつ腹腔内投与されたＸＧ−１０２は、５ｍｇ／ｋｇの用量で、腫瘍成長を顕著に低減した。
【０５７０】
（実施例３０）
同所性ＨＥＰ  Ｇ２ヒト肝臓癌を保有するＳｗｉｓｓヌードマウスにおける、１ｍｇ／ｋｇ  ＸＧ−１０２の抗腫瘍活性
本試験の目的は、１ｍｇ／ｋｇ  ＸＧ−１０２の抗腫瘍活性を、同所性Ｈｅｐ  Ｇ２ヒト肝臓癌を保有するＳＷＩＳＳヌードマウスモデルにおいて決定することであった。
【０５７１】
健常雌ＳＷＩＳＳヌードマウス２０匹を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から得た。動物実験は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｅｔｈｉｃａｌ
ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎおよびＥｎｇｌｉｓｈ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｗｅｌｆａｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａに準拠して実施した。動物を、温度（２３±２℃）、湿度（４５±５％）、光周期（１２時間明期／１２時間暗期）、および換気の制御条件下にある室内で維持した。動物を、ＳＰＦ条件下および室温で維持し、湿度は、持続的にモニタリングした。空調システムは、再循環を伴わない、１時間当たり１４回の換気にプログラムした。新鮮な外気は、各部屋へと均等に拡散させる前に、一連のフィルターを通す。実験室内では、高圧（２０±４Ｐａ）を維持して、マウスコロニー内の病原体による汚染または病原体の拡散を予防した。ＳＰＦ条件下で作業する全ての職員は、動物飼育領域に入るときは、衛生状態および着衣に関する特別なガイドラインに従った。動物は、食餌および水を供給するよう備えた、ポリカーボネート製のケージ（ＵＡＲ、Ｅｐｉｎａｙ  ｓｕｒ  Ｏｒｇｅ、Ｆｒａｎｃｅ）内に収容した。使用するケージの標準面積は、８００ｃｍ２とし、内部標準操作手順に従い、ケージ１つ当たり最大１０匹のマウスとした。動物の敷きわらは、滅菌おがくず（ＳＥＲＬＡＢ、Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）とし、１週間に１回取り替えた。動物の食餌は、ＳＥＲＬＡＢ（Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。滅菌制御顆粒の種類は、ＤＩＥＴＥＸとした。食餌は、ケージの上部の金属製の蓋に入れて、自由に摂取できるようにした。水もまた、ゴム製の止栓およびシッパーチューブを備えた給水ボトルから自由に給水できるようにした。給水ボトルは清浄化し、濾過により滅菌された水で満たし、１週間に２回取り替えた。
【０５７２】
ＸＧ−１０２を投与するために、原液を、滅菌水（ＷＦＩ、Ａｇｕｅｔｔａｎｔ）中に１０ｍＭ（３８．２２ｍｇ／ｍｌに対応する）で調製した。各処置日用のアリコートを調製し、約−８０℃で保存した。この原液の、ＷＦＩによる、０．２ｍｇ／ｍｌへの希釈を、各処置日用に実施し、２〜４℃で最長２４時間にわたり保存した。原液の安定性は、約−８０℃で１００日間を超え、動物への投与のための希釈処方物の安定性は、２〜４℃で２４時間である。希釈処方物は、使用まで氷上で維持し、使用されなかった希釈材料は廃棄した。ＸＧ−１０２の処置用量は、注射１回当たり１ｍｇ／ｋｇで注射した。注射は、１０日目、１４日目、１８日目、２２日目、４１日目、４５日目、４９日目、および５３日目に（［４日ごとに１回ずつ４回］×２で）実施した。ＸＧ−１０２物質は、マウスの尾静脈を介して、５ｍｌ／ｋｇで静脈内（ＩＶ）注射した。注射容量は、直近のマウスの個別体重に応じて適合させた。
【０５７３】
腫瘍細胞系および培養培地は、購入し、Ｏｎｃｏｄｅｓｉｇｎから提供された。
【表３５】
2020055866.tif 000042
【０５７４】
Ｈｅｐ  Ｇ２細胞系は、肝細胞癌を有する１５歳のアルゼンチン人の少年の腫瘍組織から、１９７５年に樹立された（ＡＤＥＮ  Ｄ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２巻：６１５〜６１６頁、１９７９年）。腫瘍細胞は、加湿雰囲気（５％のＣＯ２、９５％の空気）中、３７℃で付着性単層として成長させた。培養培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン（型番ＢＥ１２−７０２Ｆ、Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含有し、１０％のＦＢＳ（型番ＤＥ１４−８０１Ｅ、Ｌｏｎｚａ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０であった。実験における使用のために、細胞を、５分間にわたるトリプシン−バーゼン液（型番０２−００７Ｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ）による処理によって培養フラスコからはがし、カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクス培地（型番ＢＥ１０−５４３Ｆ、Ｃａｍｂｒｅｘ）中で希釈し、完全培養培地を添加することにより中和した。細胞を血球計によりカウントし、それらの生存率を、０．２５％トリパンブルー排除法により評価した。マイコプラズマの検出は、製造元の指示に従い、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）マイコプラズマ検出キット（型番ＬＴ０７−３１８、Ｌｏｎｚａ）を使用して実施した。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）アッセイは、マイコプラズマの酵素の活性を利用する、選択的な生化学試験である。生存可能なマイコプラズマを溶解させ、該マイコプラズマの酵素がＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）基質と反応し、ＡＤＰからＡＴＰへの変換を触媒する。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）基質の添加前および添加後の両方における、サンプル中のＡＴＰレベルを測定することにより、マイコプラズマの存在または非存在を示す比を得ることができる。マイコプラズマ試験は、細胞系の培養物上清から二連でアッセイし、陰性コントロールおよび陽性コントロール（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）アッセイコントロールセット、型番ＬＴ０７−５１８、Ｌｏｎｚａ）と比較した（内部標準操作手順番号：ＴＥＣ−００７／００２；データは示さないが、取得した）。
【０５７５】
実験デザイン：
腫瘍を誘発する２４時間前に、雌ＳＷＩＳＳヌードマウス２０匹に、γ線源（２．５Ｇｙ、Ｃｏ６０、ＩＮＲＡ、Ｄｉｊｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を照射した。０日目において、Ｈｅｐ  Ｇ２腫瘍を、雌ＳＷＩＳＳヌードマウス２０匹に同所性に誘発した。麻酔下では、無菌条件下の正中切開により動物の腹部を切開した。５０μｌのＲＰＭＩ  １６４０培養培地中に懸濁させたＨｅｐ  Ｇ２腫瘍細胞１０００万（１０７）個を、肝臓の被膜下領域内に注射した。その後、腹腔を、５−０縫合糸による２層で閉合した。
【０５７６】
１０日目において、処置の開始前に、それらの体重に従い、マウス１０匹ずつの２つの群を形成するように、マウスを無作為化した。各群の体重は、他の群の体重と統計学的に差がなかった（分散分析）。群１に由来するマウスには、注射１回当たり５ｍｌ／ｋｇで、ビヒクルのＩＶ注射１回を、１０日目、１４日目、１８日目、２２日目、４１日目、４５日目、４９日目、および５３日目に（［４日ごとに１回ずつ４回］×２で）施し、群２に由来するマウスには、注射１回当たり１ｍｇ／ｋｇで、ＸＧ−１０２のＩＶ注射１回を、１０日目、１４日目、１８日目、２２日目、４１日目、４５日目、４９日目、および５３日目に（［４日ごとに１回ずつ４回］×２で）施した。
【表３６】
2020055866.tif 000043
【０５７７】
１８５日目に、生存するマウスを屠殺した。
【０５７８】
マウスは、試験を通して毎日、挙動および生存についてモニタリングした。体重は、全てのマウスについて、試験を通して１週間に２回、モニタリングした。Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ（登録商標）Ｆｏｒｅｎｅ（Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ、Ｂｏｎｄｏｕｆｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、細胞の注射、ＩＶ処置、および屠殺の前において、動物に麻酔をかけた。実験の経過中において、以下：
・罹患の徴候（悪液質、体力減退、運動または摂食の困難）、
・化合物の毒性（円背位（ｈｕｎｃｈｉｎｇ）、痙攣）、
・連続３日間の間の２０％の体重減少または任意の日における２５％の体重減少
のいずれかが生じた場合は、動物を、Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ（登録商標）による麻酔下で、頸椎脱臼により死なせた。
【０５７９】
症例ごとに剖検（ａｕｔｏｐｓｙ）を実施した。マウスが瀕死に見える場合は、それらを屠殺し、剖検した（ｎｅｃｒｏｐｓｉｅｄ）。肝臓を回収し、秤量した。
【０５８０】
体重解析のために、マウスの体重曲線を作成した。平均体重変化（ＭＢＷＣ：ｍｅａｎ
ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｈａｎｇｅ）：グラム単位による処置された動物の平均体重変化（Ｘ日目における体重−１０日目における体重）を計算した。
【０５８１】
有効性パラメータは、パーセント（Ｔ／Ｃ％）として表した。Ｔは、薬物で処置された動物の中央値生存期間であり、Ｃは、ビヒクルで処置されたコントロール動物の中央値生存期間である。生存システムは、Ｔ／Ｃパーセントが１２５を超える場合に、ある程度の成功を示した。Ｔ／Ｃ％は、以下：Ｔ／Ｃ％＝［Ｔ／Ｃ］×１００の通りに表された。マウスの生存曲線を作成した。平均生存期間は、各処置群について、死までの平均日数として計算した。中央値生存期間は、各処置群について、死までの日数の中央値として計算した。ログランク（カプラン−マイヤー）検定を使用して、生存曲線を比較した。体重およびＭＢＷＣの統計学的解析を実施するのに、ＳｔａｔＶｉｅｗ（登録商標）ソフトウェア（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＵＳＡ）を使用するボンフェローニ／ダン検定（ＡＮＯＶＡによる比較）を使用した。ｐ値＜０．０５を、有意と考える。全ての群は、互いと比較した。
【０５８２】
図６９には、同所性に注射されたＨＥＰ  Ｇ２腫瘍を保有するマウスの、平均体重曲線および平均体重変化曲線を示す。マウスを、１０日目および４１日目の２回にわたり反復される、４日ごとに１回ずつ４回にわたる処置スケジュールに従い、注射１回当たり１ｍｇ／ｋｇ  ＸＧ−１０２でＩＶ処置した。図６９に示される通り、体重について明らかな差異は生じなかったことから、ＸＧ−１０２は、良好に忍容されたことが示された。これに応じて、図７０には、それぞれの統計学的データを提示する。
【０５８３】
図７１は、屠殺日（１８５日目）までの、群ごとの生存マウスの比率を示す、マウスの長期生存曲線を示す。マウスは、１０日目および４１日目の２回にわたり反復される、４日ごとに１回ずつ４回にわたる処置スケジュールに従い、表示の用量のＸＧ−１０２で処置した。これらのデータは、ＸＧ−１０２で処置されたマウスについての生存の延長を明らかに示す。これに応じて、統計学的データを下記に提示する（ＨｅｐＧ２腫瘍を異種移植され、ＸＧ−１０２で処置されたマウスの生存解析）。
【表３７】
2020055866.tif 000044
【０５８４】
マウスの生存期間は、Ｔ／Ｃ（％）値（処置群の死までの日数の中央値と、腫瘍を保有する非処置コントロール群の死までの日数の中央値との比）としての中央値生存期間として表した。統計学的解析は、ビヒクル処置群を基準とするログランク検定により実施した。  
【０５８５】
まとめると、これらのデータは、ＸＧ−１０２の投与が、ＨｅｐＧ２腫瘍を異種移植されたマウスの生存期間を延長することを示す。
【０５８６】
（実施例３１）
同所性ＨＥＰ  Ｇ２ヒト肝臓癌を保有するＳｗｉｓｓヌードマウスにおける、ＸＧ−１０２の抗腫瘍活性（用量／反応関係）
【０５８７】
この試験の目的は、ＸＧ−１０２の抗腫瘍活性（用量／反応関係）を、同所性Ｈｅｐ  Ｇ２ヒト肝臓癌腫瘍を保有するＳＷＩＳＳヌードマウスモデルにおいて決定することであった。
【０５８８】
健常雌ＳＷＩＳＳヌードマウス３２匹を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から得た。動物実験は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｅｔｈｉｃａｌ
ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎおよびＥｎｇｌｉｓｈ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｗｅｌｆａｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａに準拠して実施した。動物を、温度（２３±２℃）、湿度（４５±５％）、光周期（１２時間明期／１２時間暗期）、および換気の制御条件下にある室内で維持した。動物を、ＳＰＦ条件下および室温で維持し、湿度は、持続的にモニタリングした。空調システムは、再循環を伴わない、１時間当たり１４回の換気にプログラムした。新鮮な外気は、各部屋へと均等に拡散させる前に、一連のフィルターを通した。実験室内では、高圧（２０±４Ｐａ）を維持して、マウスコロニー内の病原体による汚染または病原体の拡散を予防した。ＳＰＦ条件下で作業する全ての職員は、動物飼育領域に入るときは、衛生状態および着衣に関する特別なガイドラインに従った。動物は、食餌および水を供給するよう備えた、ポリカーボネート製のケージ（ＵＡＲ、Ｅｐｉｎａｙ  ｓｕｒ  Ｏｒｇｅ、Ｆｒａｎｃｅ）内に収容した。使用するケージの標準面積は、８００ｃｍ２とし、内部標準操作手順に従い、ケージ１つ当たり最大１０匹のマウスとした。動物の敷きわらは、滅菌おがくず（ＳＥＲＬＡＢ、Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）とし、１週間に１回取り替えた。動物の食餌は、ＳＥＲＬＡＢ（Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。滅菌制御顆粒の種類は、ＤＩＥＴＥＸとした。食餌は、ケージの上部の金属製の蓋に入れて、自由に摂取できるようにした。水もまた、ゴム製の止栓およびシッパーチューブを備えた給水ボトルから自由に給水できるようにした。給水ボトルは清浄化し、濾過により滅菌された水で満たし、１週間に２回取り替えた。
【０５８９】
ＸＧ−１０２を投与するために、ＸＧ−１０２を、滅菌水（ＷＦＩ、Ａｇｕｅｔｔａｎｔ、Ｆｒａｎｃｅ）により、１ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した（ｐｒｅｐａｒｅｃｌ）。次いで、それを（Ｌｔ）、滅菌水により、０．２および０．０２ｍｇ／ｍｌの濃度で希釈した（ｃｌｉｌｕｔｅｄ）。これらの全てのステップは、マウスへの注射前１時間以内に実施した。ＸＧ−１０２を、注射１回当たり０．１、１、および５ｍｇ／ｋｇで注射した。４回の注射は、各回を４日間ずつ隔てて（４日ごとに１回ずつ４回にわたり）実施した。ＸＧ−１０２物質は、マウスの尾静脈を介して、５ｍｌ／ｋｇで静脈内（ＩＶ）注射した。注射容量は、直近のマウスの個別体重に応じて適合させた。
【０５９０】
腫瘍細胞系および培養培地は、購入し、Ｏｎｃｏｄｅｓｉｇｎから提供された。
【表３８】
2020055866.tif 000045
【０５９１】
Ｈｅｐ  Ｇ２細胞系は、肝細胞癌を有する１５歳のアルゼンチン人の少年の腫瘍組織から、１９７５年に樹立された（ＡＤＥＮ  Ｄ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２巻：６１５〜６１６頁、１９７９年）。腫瘍細胞は、加湿雰囲気（５％のＣＯ２、９５％の空気）中、３７℃で付着性単層として成長させた。培養培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン（型番ＢＥ１２−７０２Ｆ、Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含有し、１０％のＦＢＳ（型番ＤＥ１４−８０１Ｅ、Ｌｏｎｚａ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０であった。実験における使用のために、細胞を、５分間にわたるトリプシン−バーゼン液（型番０２−００７Ｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ）による処理によって培養フラスコからはがし、カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクス培地（型番ＢＥ１０−５４３Ｆ、Ｃａｍｂｒｅｘ）中で希釈し、完全培養培地を添加することにより中和した。細胞を血球計によりカウントし、それらの生存率を、０．２５％トリパンブルー排除法により評価した。マイコプラズマの検出は、製造元の指示に従い、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）マイコプラズマ検出キット（型番ＬＴ０７−３１８、Ｌｏｎｚａ）を使用して実施した。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）アッセイは、マイコプラズマの酵素の活性を利用する、選択的な生化学試験である。生存可能なマイコプラズマを溶解させ、該マイコプラズマの酵素がＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）基質と反応し、ＡＤＰからＡＴＰへの変換を触媒する。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）基質の添加前および添加後の両方における、サンプル中のＡＴＰレベルを測定することにより、マイコプラズマの存在または非存在を示す比を得ることができる。マイコプラズマ試験は、細胞系の培養物上清から二連でアッセイし、陰性コントロールおよび陽性コントロール（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）アッセイコントロールセット、型番ＬＴ０７−５１８、Ｌｏｎｚａ）と比較した（内部標準操作手順番号：ＴＥＣ−００７／００２）。
【０５９２】
実験デザイン：
腫瘍を誘発する２４時間前に、雌ＳＷＩＳＳヌードマウス３２匹に、γ線源（２．５Ｇｙ、Ｃｏ６０、ＩＮＲＡ、Ｄｉｊｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を照射した。０日目において、Ｈｅｐ  Ｇ２腫瘍を、雌ＳＷＩＳＳヌードマウス３２匹に同所性に誘発した。麻酔下では、無菌条件下の正中切開により動物の腹部を切開した。５０μｌのＲＰＭＩ  １６４０培養培地中に懸濁させたＨｅｐ  Ｇ２腫瘍細胞１０００万（１０７）個を、肝臓の被膜下領域内に注射した。その後、腹腔を、５−０縫合糸による２層で閉合した。
【０５９３】
１０日目において、処置の開始前に、それらの体重に従い、マウス８匹ずつの４つの群を形成するように、マウスを無作為化した。各群の体重は、他の群の体重と統計学的に差がなかった（分散分析）。群１に由来するマウスには、注射１回当たり５ｍｌ／ｋｇで、ビヒクルのＩＶ注射１回を、４日ごとに１回ずつ４回反復して（４日ごとに１回ずつ４回にわたり）施し、群２に由来するマウスには、注射１回当たり０．１ｍｇ／ｋｇで、ＸＧ−１０２のＩＶ注射１回を、４日ごとに１回ずつ４回反復して（４日ごとに１回ずつ４回にわたり）施し、群３に由来するマウスには、注射１回当たり１ｍｇ／ｋｇで、ＸＧ−１０２のＩＶ注射１回を、４日ごとに１回ずつ４回反復して（４日ごとに１回ずつ４回にわたり）施し、群４に由来するマウスには、注射１回当たり５ｍｇ／ｋｇで、ＸＧ−１０２のＩＶ注射１回を、４日ごとに１回ずつ４回反復して（４日ごとに１回ずつ４回にわたり）施した。
【表３９】
2020055866.tif 000046
【０５９４】
１７１日目に、生存するマウスを屠殺した。
【０５９５】
マウスは、試験を通して毎日、挙動および生存についてモニタリングした。体重は、全てのマウスについて、試験を通して１週間に２回、モニタリングした。Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ（登録商標）Ｆｏｒｅｎｅ（Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ、Ｂｏｎｄｏｕｆｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、細胞の注射、ＩＶ処置、および屠殺の前において、動物に麻酔をかけた。実験の経過中において、以下：
・罹患の徴候（悪液質、体力減退、運動または摂食の困難）、
・化合物の毒性（円背位、痙攣）、
・連続３日間の間の２０％の体重減少または任意の日における２５％の体重減少のいずれかが生じた場合は、動物を、Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ（登録商標）による麻酔下で、頸椎脱臼により死なせた。
【０５９６】
症例ごとに剖検を実施した。
【０５９７】
６７日目に、肉眼的発生を観察するために、無作為化の間に群ごと３匹ずつ無作為に選択したマウスを屠殺した。各群内の残りのマウスは、生存をモニタリングするために保持した。最終的な屠殺は、１７１日目に実施した。屠殺された動物から、原発腫瘍および肝臓を回収し、秤量した。各肝臓は、１０％の中性緩衝ホルマリン（ｆｏｎｎａｌｉｎ）中で固定した。回収の４８時間後、それらをパラフィン（Ｈｉｓｔｏｓｅｃ（登録商標））中に包埋し、解剖病理学的解析のために使用した。組織学的解析により、マウス肝臓内の転移性浸潤を評価するために、パラフィン包埋された切片（５μｍ）を、キシレン中で脱パラフィン処理し、１００％、９５％、および７０％のエタノール中の段階インキュベーションにより再水和させた。全ての切片は、組織学的解析のために、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）（型番：Ｓ３３０９、Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｔｒａｐｐｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）で染色した。カバースリップを、水性封入剤（Ａｑｕａｔｅｘ、型番１．０８５６２、Ｍｅｒｃｋ）でマウントし、切片を、光学顕微鏡（ＤＭＲＢ  Ｌｅｉｃａ）下で検査した。組織学切片は、病理学専門医が解析して、肝臓内の転移性浸潤を決定した。
【０５９８】
体重解析のために、マウスの体重曲線を作成した。平均体重変化（ＭＢＷＣ）：グラム単位による処置された動物の平均体重変化（Ｘ日目における体重−１０日目における体重）を計算した。
【０５９９】
有効性パラメータは、パーセント（Ｔ／Ｃ％）として表した。Ｔは、薬物で処置された動物の中央値生存期間であり、Ｃは、ビヒクルで処置されたコントロール動物の中央値生存期間である。生存システムは、Ｔ／Ｃパーセントが１２５を超える場合に、ある程度の成功を示した。Ｔ／Ｃ％は、以下：Ｔ／Ｃ％＝［Ｔ／Ｃ］×１００の通りに表された。マウスの生存曲線を作成した。平均生存期間は、各処置群について、死までの平均日数として計算した。中央値生存期間は、各処置群について、死までの日数の中央値として計算した。ログランク（カプラン−マイヤー）検定を使用して、生存曲線を比較した。体重およびＭＢＷＣの統計学的解析を実施するのに、ＳｔａｔＶｉｅｗ（登録商標）ソフトウェア（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＵＳＡ）を使用するボンフェローニ／ダン検定（ＡＮＯＶＡによる比較）を使用した。ｐ値＜０．０５を、有意と考える。全ての群は、互いと比較した。
【０６００】
図７２は、同所性に注射されたＨＥＰ  Ｇ２腫瘍を保有するマウスの平均体重曲線および平均体重変化曲線に関する統計学的データを示す。マウスは、１０日目および４１日目の２回にわたり反復される、４日ごとに１回ずつ４回にわたる処置スケジュールに従い、ＸＧ−１０２でＩＶ処置した。図７２に示される通り、体重について明らかな差異は生じなかったことから、ＸＧ−１０２は、良好に忍容されたことが示された。
【０６０１】
図７３は、屠殺日（１７１日目）までの、群ごとの生存マウスの比率を示す、マウスの長期生存曲線を示す。６７日目に剖検のために屠殺されたマウスは、計算から除外した。マウスは、１０日目および４１日目の２回にわたり反復される、４日ごとに１回ずつ４回にわたる処置スケジュールに従い、表示の用量のＸＧ−１０２で処置した。これらのデータは、ＸＧ−１０２で処置されたマウスについての生存の延長を、用量依存的な様式で明らかに示す。これに応じて、統計学的データを下記に提示する（ＨｅｐＧ２腫瘍を異種移植され、ＸＧ−１０２で処置されたマウスの生存解析）。
【表４０】
2020055866.tif 000047
【０６０２】
剖検のために６７日目に屠殺されたマウスは、計算から除外した。マウスの生存期間は、Ｔ／Ｃ（％）値（処置群の死までの日数の中央値と、腫瘍を保有する非処置コントロール群の死までの日数の中央値との比）としての中央値生存期間として表した。Ｔ／Ｃ％の値＞１２５％は、抗腫瘍有効性を示す。
【０６０３】
以下の表は、ＨｅｐＧ２がん細胞による、肝臓への腫瘍の発生を示す。肝臓における腫瘍塊の検出は、１７１日目に屠殺されたマウスにおけるＨＥ染色の後における顕微鏡的観察により実施した。
【表４１】
2020055866.tif 000048
【０６０４】
図７４には、６７日目または６７日目と最終的な屠殺との間に屠殺されたマウスの顕微鏡的評価により観察される腫瘍の浸潤を、ヒストグラム表示として示す。腫瘍生着のレベルを、図の凡例で指定される、４つの異なるカテゴリーに分類した。
【０６０５】
（実施例３２）
皮下ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍を保有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおける、ＸＧ−１０２の抗腫瘍活性
この試験の目的は、皮下ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍を保有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスモデルにおいて、ＸＧ−１０２の抗腫瘍活性（用量／反応関係）を決定することであった。
【０６０６】
健常雄Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス１５匹は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から得た。動物実験は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｅｔｈｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎおよびＥｎｇｌｉｓｈ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｗｅｌｆａｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａに準拠して実施した。動物を、温度（２３±２℃）、湿度（４５±５％）、光周期（１２時間明期／１２時間暗期）、および換気の制御条件下にある室内で維持した。動物を、ＳＰＦ条件下および室温で維持し、湿度は、持続的にモニタリングした。空調システムは、再循環を伴わない、１時間当たり１４回の換気にプログラムした。新鮮な外気は、各部屋へと均等に拡散させる前に、一連のフィルターを通す。実験室内では、高圧（２０±４Ｐａ）を維持して、マウスコロニー内の病原体による汚染または病原体の拡散を予防した。ＳＰＦ条件下で作業する全ての職員は、動物飼育領域に入るときは、衛生状態および着衣に関する特別なガイドラインに従った。動物は、食餌および水を供給するよう備えた、ポリカーボネート製のケージ（ＵＡＲ、Ｅｐｉｎａｙ  ｓｕｒ  Ｏｒｇｅ、Ｆｒａｎｃｅ）内に収容した。使用するケージの標準面積は、８００ｃｍ２とし、内部標準操作手順に従い、ケージ１つ当たり最大１０匹のマウスとした。動物の敷きわらは、滅菌おがくず（ＳＥＲＬＡＢ、Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）とし、１週間に１回取り替えた。動物の食餌は、ＳＥＲＬＡＢ（Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。滅菌制御顆粒の種類は、ＤＩＥＴＥＸとした。食餌は、ケージの上部の金属製の蓋に入れて、自由に摂取できるようにした。水もまた、ゴム製の止栓およびシッパーチューブを備えた給水ボトルから自由に給水できるようにした。給水ボトルは清浄化し、濾過により滅菌された水で満たし、１週間に２回取り替えた。
【０６０７】
ＸＧ−１０２を投与するために、ＸＧ−１０２を、滅菌水（ＷＦＩ、Ａｇｕｅｔｔａｎｔ、Ｆｒａｎｃｅ）により、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。次いで、それを、滅菌水により、０．０２ｍｇ／ｍｌの濃度へと希釈した。これらの全てのステップは、マウスへの注射前１時間以内に実施した。ＸＧ−１０２を、注射１回当たり０．１および１ｍｇ／ｋｇで注射した。４回の注射は、各回を４日間ずつ隔てて（４日ごとに１回ずつ４回にわたり）実施した。ＸＧ−１０２物質は、マウスの尾静脈を介して、５ｍｌ／ｋｇで静脈内（ＩＶ）注射した。注射期間中に尾が壊死している場合は、腹腔内（ＩＰ）経路を使用した。注射容量は、直近のマウスの個別体重に応じて適合させた。
【０６０８】
腫瘍細胞系および培養培地は、購入し、Ｏｎｃｏｄｅｓｉｇｎから提供された。
【表４２】
2020055866.tif 000049
【０６０９】
ＰＣ−３は、６２歳の白人男性による前立腺腺癌のグレードＩＶの骨転移に由来した（ＶＯＬＥＮＥＣ  Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  １９８０年；１３巻（１号）：３９〜４４頁）。腫瘍細胞は、加湿雰囲気（５％のＣＯ２、９５％の空気）中、３７℃で付着性単層として成長させた。培養培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン（型番ＢＥ１２−７０２Ｆ、Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含有し、１０％のＦＢＳ（型番ＤＥ１４−８０１Ｅ、Ｌｏｎｚａ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０であった。実験における使用のために、細胞を、５分間にわたるトリプシン−バーゼン液（型番０２−００７Ｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ）による処理によって培養フラスコからはがし、カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクス培地（型番ＢＥ１０−５４３Ｆ、Ｃａｍｂｒｅｘ）中で希釈し、完全培養培地を添加することにより中和した。細胞を血球計によりカウントし、それらの生存率を、０．２５％トリパンブルー排除法により評価した。マイコプラズマの検出は、製造元の指示に従い、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）マイコプラズマ検出キット（型番ＬＴ０７−３１８、Ｌｏｎｚａ）を使用して実施した。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）アッセイは、マイコプラズマの酵素の活性を利用する、選択的な生化学試験である。生存可能なマイコプラズマを溶解させ、該マイコプラズマの酵素がＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）基質と反応し、ＡＤＰからＡＴＰへの変換を触媒する。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）基質の添加前および添加後の両方における、サンプル中のＡＴＰレベルを測定することにより、マイコプラズマの存在または非存在を示す比を得ることができる。マイコプラズマ試験は、細胞系の培養物上清から二連でアッセイし、陰性コントロールおよび陽性コントロール（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）アッセイコントロールセット、型番ＬＴ０７−５１８、Ｌｏｎｚａ）と比較した（内部標準操作手順番号：ＴＥＣ−００７／００２）。
【０６１０】
実験デザイン：
腫瘍を誘発する４８時間前に、雄Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス１５匹に、γ線源（２．５Ｇｙ、Ｃｏ６０、ＩＮＲＡ、Ｄｉｊｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を照射した。０日目において、２００μｌのＲＰＭＩ培地中に懸濁させたＰＣ−３細胞２０００万（２×１０７）個を、雄Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス６０匹の右側腹部に皮下注射した。
【０６１１】
平均腫瘍体積が、８０±３８ｍｍ３に達したら、処置の開始前に、それらの腫瘍体積に従い、マウス５匹ずつの３つの群を形成するように、マウスを無作為化した。各群の腫瘍体積は、他の群の腫瘍体積と統計学的に差がなかった（分散分析）。
【０６１２】
試験物質の処置スケジュールは、以下の通りであった。群１に由来するマウスには、注射１回当たり５ｍｌ／ｋｇで、ビヒクルのＩＶ注射１回を、４日ごとに１回ずつ４回反復して（４日ごとに１回ずつ４回にわたり）施し、群２に由来するマウスには、注射１回当たり０．１ｍｇ／ｋｇで、ＸＧ−１０２のＩＶ注射１回を、４日ごとに１回ずつ４回反復して（４日ごとに１回ずつ４回にわたり）施し、群３に由来するマウスには、注射１回当たり１ｍｇ／ｋｇで、ＸＧ−１０２のＩＶ注射１回を、４日ごとに１回ずつ４回反復して（４日ごとに１回ずつ４回にわたり）施した。
【表４３】
2020055866.tif 000050
【０６１３】
腫瘍が、２０００ｍｍ３の最大体積に達したら、マウスを屠殺した。
【０６１４】
マウスは、試験を通して毎日、挙動および生存についてモニタリングした。体重および腫瘍体積は、全てのマウスについて、試験を通して１週間に２回、モニタリングした。Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ（登録商標）Ｆｏｒｅｎｅ（Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ、Ｂｏｎｄｏｕｆｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、細胞の注射、ＩＶ処置、および屠殺の前において、動物に麻酔をかけた。実験の経過中において、以下：
・罹患の徴候（悪液質、体力減退、運動または摂食の困難）、
・化合物の毒性（円背位、痙攣）、
・連続３日間の間の２０％の体重減少または任意の日における２５％の体重減少、
・２０００ｍｍ３を超える腫瘍体積
のいずれかが生じた場合は、動物を、Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ（登録商標）による麻酔下で、頸椎脱臼により死なせた。
【０６１５】
症例ごとに剖検を実施した。
【０６１６】
体重解析のために、マウスの体重曲線を作成した。少なくとも１つの群内で、４０％を超えるマウスの死が記録されたら、曲線を中止した。平均体重変化（ＭＢＷＣ）：グラム単位による処置された動物の平均体重変化（Ｘ日目における体重−３３日目における体重）を計算した。
【０６１７】
腫瘍体積は、以下の式：ＴＶ＝（長さ×幅２）／２［式中、長さは、最大の腫瘍直径に対応し、幅は、最小の腫瘍直径に対応する］により計算した。腫瘍成長曲線は、平均腫瘍体積（ＭＴＶ：ｍｅａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）±ＳＤを使用して作成した。４０％を超えるマウスが死んたら、曲線を中止した。個体の腫瘍体積曲線もまた作成した。下記に示す通りに異なる時点で計算された相対腫瘍体積（ＲＴＶ：ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）を使用して、相対腫瘍体積曲線も作成した。４０％を超えるマウスが死んたら、曲線を中止した。ＲＴＶは、式：
ＲＴＶ＝（Ｘ日目における腫瘍体積）／（３３日目における腫瘍体積）×１００
に従い計算した。
【０６１８】
指数関数的腫瘍成長期の間、２００％のＭＴＶに到達するのに必要とされる期間として規定される、腫瘍倍加時間（ＤＴ：ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）は、Ｖｉｖｏ  Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェアを使用して計算した。Ｖに到達するまでの時間を計算した。体積Ｖとは、実験データから推定される標的体積と規定され、腫瘍成長の指数関数期において選択される。体積Ｖは、各群の全てのマウスについて、可能な限り近接させて選択し、この体積Ｖに到達するまでの時間は、実験データから推定した。処置群の中央値腫瘍体積の、ビヒクル処置群と対比した比として規定される腫瘍成長阻害（Ｔ／Ｃ％）を計算した。ＮＣＩ基準に準拠した、Ｔ／Ｃ％比のための有効判定基準（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）は、約４２％である（ＢＩＳＳＥＲＹ  Ｍ．Ｃ．ら、Ｂｕｌｌ．
Ｃａｎｃｅｒ  １９９１年、７８巻：５８７〜６０２頁）。全ての統計学的解析は、Ｖｉｖｏ  Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェアを使用して実施した。処置の毒性および効能（ＢＷＣ、ＭＢＷＣ、ＴＶ、ＲＴＶ、ＴＴＲＶ、およびＤＴ）の統計学的解析は、ボンフェローニ／ダン検定（ＡＮＯＶＡによる比較）を使用して実施した。全ての群は、互いと比較した。
【０６１９】
図７５には、抗腫瘍活性実験の間の、ＰＣ−３腫瘍を保有するマウスの平均腫瘍体積を示す。３３日目に、動物５匹ずつの３つの群を、ビヒクルおよびＸＧ−１０２（注射１回当たり０．１および１ｍｇ／ｋｇ、４日ごとに１回ずつ４回にわたる）で処置した。これらのデータは、時間経過にわたる腫瘍体積の低減を、ＸＧ−１０２処置について、用量依存的な様式で示し、この場合、効果は、１ｍｇ／ｋｇ  ＸＧ−１０２についてより顕著であった。
【０６２０】
（実施例３３）
ＸＧ−１０２の、同所性ＨＣＴ  １１６ヒト結腸腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスにおける腫瘍成長に対する効果
この試験の目的は、ＸＧ−１０２の、ＳＣＩＤマウスに同所性に異種移植されたＨＣＴ
１１６ヒト結腸腫瘍の成長に対する効果を決定することであった。
【０６２１】
健常雌ＳＣＩＤマウス８０匹を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から得た。動物実験は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｅｔｈｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎおよびＥｎｇｌｉｓｈ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｗｅｌｆａｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａに準拠して実施した。動物を、温度（２３±２℃）、湿度（４５±５％）、光周期（１２時間明期／１２時間暗期）、および換気の制御条件下にある室内で維持した。動物を、ＳＰＦ条件下および室温で維持し、湿度は、持続的にモニタリングした。空調システムは、再循環を伴わない、１時間当たり１４回の換気にプログラムした。新鮮な外気は、各部屋へと均等に拡散させる前に、一連のフィルターを通す。実験室内では、高圧（２０±４Ｐａ）を維持して、マウスコロニー内の病原体による汚染または病原体の拡散を予防した。ＳＰＦ条件下で作業する全ての職員は、動物飼育領域に入るときは、衛生状態および着衣に関する特別なガイドラインに従った。動物は、食餌および水を供給するよう備えた、ポリカーボネート製のケージ（ＵＡＲ、Ｅｐｉｎａｙ  ｓｕｒ  Ｏｒｇｅ、Ｆｒａｎｃｅ）内に収容した。使用するケージの標準面積は、８００ｃｍ２とし、内部標準操作手順に従い、ケージ１つ当たり最大１０匹のマウスとした。動物の敷きわらは、滅菌コーンコブ敷きわら（ＬＡＢ  ＣＯＢ  １２、ＳＥＲＬＡＢ、ＣｅｒｇｙＭＰｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）とし、１週間に１回取り替えた。動物の食餌は、ＤＩＥＴＥＸから購入した。滅菌制御顆粒の種類は、ＤＩＥＴＥＸとした。食餌は、ケージの上部の金属製の蓋に入れて、自由に摂取できるようにした。水もまた、ゴム製の止栓およびシッパーチューブを備えた給水ボトルから自由に給水できるようにした。給水ボトルは清浄化し、濾過により滅菌された水で満たし、１週間に２回取り替えた。
【０６２２】
ＸＧ−１０２を投与するために、必要量のＸＧ−１０２を、ビヒクル中に溶解させた。処方物は、下記で詳述する手順に従い調製した。濃度を計算し、試験物質の純度およびペプチド含量を考慮に入れて表した（乗算係数は、７４．６％であった）。ＸＧ−１０２を解凍させた後、原液を、滅菌水（ＷＦＩ、バッチ：５００  １１１  ００Ｊ、Ａｇｕｅｔｔａｎｔ、Ｆｒａｎｃｅ）中に１０ｍＭ（３８．２２ｍｇ／ｍｌに対応する）で調製し、最短で２０分間にわたり、室温へと平衡化させた。アリコートは、各処置日用に調製し、約−８０℃で保存した。この原液の、必要な濃度への希釈を、各処置日に行い、２〜４℃で最長２４時間にわたり保存した。原液の安定期間は、約−８０℃で１００日間を超える。動物への投与のための希釈処方物の安定期間は、２〜４℃で２４時間である。希釈溶液は、使用まで氷上で維持した。使用されなかった材料は廃棄した。ＸＧ−１０２は、注射１回当たり０．１および１ｍｇ／ｋｇで、毎日１回ずつのべ１４回の連続投与にわたり（毎日１回ずつ１４回にわたり）注射した。物質投与の経路は、注射１回当たり５ｍｌ／ｋｇの皮下（ＳＣ）注射、カニューレを介する投与１回当たり５ｍｌ／ｋｇの経口強制投与によるマウスへの経口（ＰＯ：ｐｅｒ  ｏｓ）投与であった。注射および投与容量は、毎日のマウスの個別体重に応じて適合させた。
腫瘍細胞系および培養培地は、購入し、Ｏｎｃｏｄｅｓｉｇｎから提供された。
【表４４】
2020055866.tif 000051
【０６２３】
ＨＣＴ  １１６改変体細胞系は、男性患者の単一の結腸癌の初代細胞培養物から単離された（ＢＲＡＴＴＡＩＮ  Ｍ．Ｇ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８１年、４１巻：  １７５１Ｍ１７５６）。
【０６２４】
腫瘍細胞は、加湿雰囲気（５％のＣＯ２、９５％の空気）中、３７℃で付着性単層として成長させた。培養培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン（型番ＢＥ１２−７０２Ｆ、Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含有し、１０％のＦＢＳ（型番ＤＥ１４−８０１Ｅ、Ｌｏｎｚａ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０であった。実験における使用のために、細胞を、５分間にわたるトリプシン−バーゼン液（型番０２−００７Ｅ、Ｃａｍｂ
ｒｅｘ）による処理によって培養フラスコからはがし、カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクス培地（型番ＢＥ１０−５４３Ｆ、Ｃａｍｂｒｅｘ）中で希釈し、完全培養培地を添加することにより中和した。細胞を血球計によりカウントし、それらの生存率を、０．２５％トリパンブルー排除法により評価した。マイコプラズマの検出は、製造元の指示に従い、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）マイコプラズマ検出キット（型番ＬＴ０７−３１８、Ｌｏｎｚａ）を使用して実施した。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）アッセイは、マイコプラズマの酵素の活性を利用する、選択的な生化学試験である。生存可能なマイコプラズマを溶解させ、該マイコプラズマの酵素がＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）基質と反応し、ＡＤＰからＡＴＰへの変換を触媒する。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）基質の添加前および添加後の両方における、サンプル中のＡＴＰレベルを測定することにより、マイコプラズマの存在または非存在を示す比を得ることができる。マイコプラズマ試験は、細胞系の培養物上清から二連でアッセイし、陰性コントロールおよび陽性コントロール（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）アッセイコントロールセット、型番ＬＴ０７−５１８、Ｌｏｎｚａ）と比較した（内部標準操作手順番号：ＴＥＣ−００７／００２）。
【０６２５】
実験デザイン：
腫瘍を誘発する２４〜４８時間前に、ＳＣＩＤマウス５匹に、γ線源（１．８Ｇｙ、Ｃｏ６０、ＩＮＲＡ、Ｄｉｊｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を照射した。２００μｌのＲＰＭＩ培地中に懸濁させたＨＣＴ  １１６細胞１０００万（１０７）個を、雌ＳＣＪＤマウス５匹の右側腹部に皮下注射した。腫瘍が、１０００〜２０００ｍｍ３に達したら、マウスを屠殺した。腫瘍を、動物から、手術により切除して、新鮮な腫瘍断片（２０〜３０ｍｇ）を得、０日目にマウス７５匹の盲腸に同所性に植えこんだ。
【０６２６】
腫瘍を植え込む２４〜４８時間前に、ＳＣＩＤマウス７５匹に、γ線源（１．８Ｇｙ、Ｃｏ６０、ＩＮＲＡ、Ｄｉｊｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を照射した。手術は、午後に、７回目のＸＧ−１０２処置後、最低でも２時間遅らせて実施した。麻酔をかけた動物の腹部を、無菌条件下の正中切開により切開した。盲腸を露出させ、小さな損傷部を盲腸壁に形成した。腫瘍断片を、損傷部に配置し、６／０縫合糸で固定した。その後、腹腔を、４／０縫合糸による２層で閉合した。
【０６２７】
−７日目において、処置の開始前に、それらの体重に従い、マウス１５匹ずつの５つの群を形成するように、マウスを無作為化した。各群の体重は、他の群の体重と統計学的に差がなかった（分散分析）。処置は、−７日目において、以下の処置スケジュール：
・群１に由来するマウスには、注射１回当たり５ｍｌ／ｋｇで、ＸＧ−１０２ビヒクルのＰＯ投与１回を、毎日１回ずつのべ１４回の連続（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ）投与にわたり（毎日１回ずつ１４回にわたり）施し、
・群２に由来するマウスには、注射１回当たり０．１ｍｇ／ｋｇで、ＸＧ−１０２のＰＯ投与１回を、毎日１回ずつのべ１４回の連続投与にわたり（毎日１回ずつ１４回にわたり）施し、
・群３に由来するマウスには、注射１回当たり１ｍｇ／ｋｇで、ＸＧ−１０２のＰＯ投与１回を、毎日１回ずつのべ１４回の連続投与にわたり（毎日１回ずつ１４回にわたり）施し、
・群４に由来するマウスには、注射１回当たり０．１ｍｇ／ｋｇで、ＸＧ−１０２のＳＣ注射１回を、毎日１回ずつのべ１４回の逐次（ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ）投与にわたり（毎日１回ずつ１４回にわたり）施し、
・群５に由来するマウスには、注射１回当たり１ｍｇ／ｋｇで、ＸＧ−１０２のＳＣ注射１回を、毎日１回ずつのべ１４回の連続投与にわたり（毎日１回ずつ１４回にわたり）施す
に従って開始した。
【表４５】
2020055866.tif 000052
【０６２８】
マウスは、試験を通して毎日、挙動および生存についてモニタリングした。体重および腫瘍体積は、全てのマウスについて、試験を通して１週間に２回、モニタリングした。Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ（登録商標）Ｆｏｒｅｎｅ（Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ、Ｂｏｎｄｏｕｆｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、細胞の注射、手術（ｓｚｒｇｅｒｙ）（同所腫瘍植込み）、および屠殺の前において、動物に麻酔をかけた。
ＳＣ腫瘍増幅の間、腫瘍体積を、全てのマウスについて、試験を通して１週間に２回、モニタリングした。
【０６２９】
２６日目にマウスを屠殺した。全ての動物について、肝臓および腫瘍を回収し、秤量した。腫瘍小節による肝臓の浸潤は、肉眼的に評価した。肝臓および腫瘍は、１０％の中性緩衝ホルマリン中で固定した。回収の４８時間後、それらをパラフィン（Ｈｉｓｔｏｓｅｃ（登録商標））中に包埋し、組織学解析のために使用した。２枚のスライドは、各腫瘍のコア内の２つの異なる部分に由来した。各スライドは、マウス識別番号により同定した。１枚のスライドは肝臓に由来し、その中心部に限局した。スライドは、マウス識別番号により同定した。Ｋｉ６７マーカーにより増殖指標を決定するために、パラフィン包埋された切片（５μｍ）を、キシレン（型番：１１６９９０２７、Ｌａｂｏｎｏｒｄ、Ｔｅｍｐｌｅｍａｒｓ、Ｆｒａｎｃｅ）中で脱パラフィン処理し、１００％、９５％、および７０％のエタノール（型番：１３０９９５００、Ｌａｂｏｎｏｒｄ）中の段階インキュベーションにより再水和させた。内因性ペルオキシダーゼは、一次抗体を添加する前に、組織を、過酸化水素含有溶液中で、室温で１０分間にわたりインキュベートすることにより阻害した。ビオチンブロッキング系を使用して、バックグラウンドを低減した。一次抗体を添加する前に、切片を、室温で２０分間、ＰＢＳ（１倍濃度）中３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で処理し、３％のヤギ血清で完了させて、交差反応を阻害した。組織切片を、室温で１時間にわたり、マウス抗ヒトＫｉ−６７クローンＭＩＢ−１モノクローナル抗体（型番Ｍ７２４０、Ｄａｋｏ  ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ；１：１００の希釈率、８０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。非関連のビオチニル化マウスＩｇＧ１抗体（型番Ｘ０９３１、Ｄａｋｏ  ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、１：１２０の希釈率、１００μｇ／ｍｌ）を陰性コントロールスライドとして使用して、反応の特異性を確保した。切片を、ビオチンへとカップリングさせたヤギ抗マウス二次抗体（型番：８９９０４、Ｓｉｇｍａ）と共に、さらにインキュベートした。次いで、組織切片を、室温で３０分間にわたり、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（型番ＰＫ−６１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１：５０の希釈率）と共にインキュベートした。ＤＡＢペルオキシダーゼ基質（型番ＳＫ−４１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、反応を視覚化する色原体として使用した。切片は、組織学的試験のために、マイヤーヘマトキシリンで対比染色した。各インキュベーションの後、切片を、１倍濃度のＰＢＳで、２回にわたり洗浄した。カバースリップを、水性封入剤でマウントし、切片を、光学顕微鏡（ＤＭＲＢ  Ｌｅｉｃａ）下で視覚化した。
【０６３０】
組織学的解析によりマウス肝臓内の転移を検出するために、パラフィン包埋された切片（５μｍ）を、キシレン中で脱パラフィン処理し、１００％、９５％、および７０％のエタノール中の段階インキュベーションにより再水和させた。全ての切片は、組織学的解析のために、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）（型番：８３３０９、Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｔｒａｐｐｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）で染色した。カバースリップを、水性封入剤（Ａｑｕａｔｅｘ、型番１．０８５６２、Ｍｅｒｃｋ）でマウントし、切片を、光学顕微鏡（ＤＭＲＢ  Ｌｅｉｃａ）下で（ｕｎｄｅｔ）検査した。組織学切片は、経験豊富な病理学者が解析して、肝臓内の転移性浸潤を決定した。
【０６３１】
体重解析のために、マウスの体重曲線を作成した。少なくとも１つの群内で、４０％を超えるマウスの死が記録されたら、曲線を中止した。平均体重変化（ＭＢＷＣ）：グラム単位による処置された動物の平均体重変化（Ｘ日目における体重−［−７］日目における体重）を計算した。
【０６３２】
腫瘍重量を計算した。腫瘍成長阻害（Ｔ／Ｃ％）とは、処置群の中央値腫瘍重量の、ビヒクル処置群の中央値腫瘍重量に対する比と規定した。ＮＣＩ基準に準拠した、Ｔ／Ｃ％比のための有効判定基準は、≦４２％である。増殖指標（Ｋｉ−６７染色）を半定量化するため、染色された腫瘍切片の数値画像を盲検化して解析し、染色なし（染色された領域がないことに対応するレベル０）、低度の染色（１０％未満の染色された領域に対応するレベル１）、中程度の染色（１０〜３０％の染色された領域に対応するレベル２）、および強力な染色（３０％を超える染色された領域に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｕｇ）レベル３）として分類した。代表的写真を撮影した。肝臓内の転移を検出するために、平均肝臓重量を測定し、肝臓１つ当たりの転移の数を、肝臓全体において肉眼的に推定し、かつ、切片上で組織学的解析により推定した。結果を、表で報告した。代表的写真を撮影した。全ての統計学的解析は、Ｖｉｖｏ  ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェアを使用して実施し、処置の毒性および効能（ＭＢＷＣ、ＴＶ、体積Ｖ、Ｖに到達するまでの時間、ＤＴ）の統計学的解析は、ボンフェローニ／ダン検定（ＡＮＯＶＡによる比較）を使用して実施した。全ての群は、互いと比較した。
【０６３３】
１０００万（１０７）個のＨＣＴ  １１６細胞を、照射した雌ＳＣＩＤマウス５匹にＳＣ注射した。細胞にマイコプラズマは検出されず、細胞の生存率は、注射前に９９％であった。平均腫瘍体積が８６４±４２６ｍｍ３となった３９日後、マウスを屠殺した。マウスの腫瘍を単離し、約２０〜３０ｍｇの小片へと切断した。これらの小片を、０日目において、処置された動物７５匹の盲腸へと植え込んだ。０〜９日目において、腫瘍の植込み（ｉｔｎｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）に起因する手術合併症により、ビヒクル処置群内の３３％のマウスの死が誘発された。処置群では、死亡百分率は、４０％、３４％、４７％、および４０％であり、用量に関連する効果はなかった。ＸＧ−１０２による処置が、致死性を、ビヒクル処置群と比較して有意に変化させなかったという事実は、処置が動物により忍容されたことを示唆する。さらに、処置の開始日（−７日目）と手術の２日前（−２日目）の間では、６回にわたる毎日の処置は、いかなる有意な体重減少も引き起こさなかったことからもまた、ＸＧ−１０２が良好に忍容されたことが示された。−２日目に、ＭＢＷＣは、ビヒクル処置群についての＋５．２±４．６％から投与１回当たり０．１ｍｇ／ｋｇでＰＯ処置された群における＋７．１±４．６％の間に分布した。
【０６３４】
加えて、手術前のＭＢＷＣと手術後のＭＢＷＣとを比較したところ、たとえ手術により引き起こされる有意な低下は、全ての群について観察されたものの、手術の後、ビヒクルで処置された群と、異なる用量のＸＧ−１０２で処置された群との間で、ＭＢＷＣの差異は観察されなかった。
【０６３５】
２６日目に屠殺されたマウスにおける平均肝臓重量は、ビヒクル処置群における０．８
２±０．１７ｇから０．１ｍｇ／ｋｇでＰＯ処置された群における０．９１±０．１７ｇの間に（ｂｅｔｗｅｃｎ）分布した。これらは、有意には異ならなかった。ビヒクル処置群では、２０％は、肝臓内の転移を発生しなかった。図７６に示される通り、このコントロール群は、肝臓内で複数の転移を発生するマウスの数が最も多い（４０％）群であった。処置群では、このスコアは、１ｍｇ／ｋｇでＰＯ処置された群についての１２．５％から０．１ｍｇ／ｋｇでＰＯ処置された群または１ｍｇ／ｋｇでＳＣ処置された群についての２５％の間に分布した。注目すべきことに、１ｍｇ／ｋｇでＰＯ処置された群は、肝臓転移を伴わないマウスの数が最大であったことから、ＸＧ−１０２は、ＨＣＴ  １１６同所腫瘍の転移力を低下させうることが示唆された。
【０６３６】
（実施例３４）
ラット（ＡＭＤモデル）の、光による光受容体損傷の軽減における、ＸＧ−１０２の有効性の評価
この試験の目的は、ＸＧ−１０２の、光誘導性光受容体細胞死に対する投与効果を調査することであった。
【０６３７】
雄ラット５０匹（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（アルビノラット）；約８週齢；２００〜２５０ｇ（注文時））を使用した。ラットは、この実験モデルにおいて最も一般に使用されている。試験前に動物を検査し、眼に特別の注意を払った。動物は、それらの到着後２週間にわたり、観察下に保持された。動物は、疾病の徴候について毎日観察された。眼の異常のない健常動物のみが、実験における使用に許容された。動物は、標準的なケージ（４２０×２７０×１９０ｍｍ）２内で個別に収容された。全ての動物は、同一の環境条件下で収容された。温度は、２２±２℃に保持され、相対湿度は、５５±１０％に保持された。部屋は、持続的に換気された（１時間当たり１５回）。１２時間にわたる明（２００〜３００ｌｘ）および１２時間にわたる暗の周期は、自動的に制御された。これらのパラメータは、持続的に制御され、記録された。試験を通して、動物は、食餌および水を自由に摂取できた。動物は、標準的な乾燥ペレット食餌を給餌された。水道水は、プラスチック製ボトルから自由に摂取できた。
【０６３８】
試験デザイン：
４８匹のラットを、動物８匹ずつの６つの群に無作為に分けた。試験物質（ＸＧ−１０２：３０ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、および０．３ｍｇ／ｍｌ）およびビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）を、誘導の前日において、硝子体内注射により、右眼に投与した。基準物質（フェニル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（ＰＢＮ：ｐｈｅｎｙｌ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｎｉｔｒｏｎｅ）（５０ｍｇ／ｋｇ））およびビヒクルを、誘導の３０分前において、腹腔内注射し、次いで、１２時間の光曝露中に３回にわたり腹腔内注射し、次いで、誘導後において１回腹腔内注射した。動物を、２４時間にわたり、一定の光（７０００ルックス）の下に置いた。網膜電図（ＥＲＧ）を、光処理の前、ならびに誘導後９、１６、および２３日目において記録した。次いで、組織学および外核層（ＯＮＬ：ｏｕｔｅｒ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌａｙｅｒ）厚の評価のために、眼を採取した。下記の表は、処置群内の動物の割付けをまとめる。
【表４６】
2020055866.tif 000053
【０６３９】
この試験では、５０匹中４８匹の動物を使用した。眼欠損の目視可能な徴候のない動物のみを選択した。次いで、処置群内の無作為化は、Ｅｘｃｅｌ（登録商標）ソフトウェアのランダム関数によって行った。
【０６４０】
投与経路および投与法  
硝子体内注射のために、キシラジン／ケタミンの混合物の筋肉内注射により、動物に麻酔をかけた。試験物質（５μｌ）およびビヒクル（５μｌ）を右眼に注射した。注射は、手術用顕微鏡下で、５０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎに取り付けられた３３Ｇの注射針を使用して、側頭上部領域内の毛様体輪において実施した。充填されたシリンジを、ＵｌｔｒａＭｉｃｒｏＰｕｍｐ  ＩＩＩへと取り付けて、マイクロリットル範囲の正確な注射を達成した。１ｍｌのシリンジに取り付けられた３０Ｇの注射針を使用して、基準物質およびビヒクルを、２．５ｍｌ／ｋｇの投与容量で腹腔内注射した。
【０６４１】
光への曝露：一晩にわたり暗順応させたラットを、透明なプラスチック製ケージ内で、２４時間にわたり、連続白色蛍光（７０００ｌｘ）へと曝露した。各ケージは、１匹ずつのラットを含有した。曝露の後、ラットを、飼養のための周期的光条件へと戻した。
【０６４２】
全ての動物の体重は、試験の開始前、次いで、試験の終了時において記録した。各日において、全ての動物の全般的挙動および態様を観察した。
【０６４３】
ＥＲＧは、誘導前、ならびに曝露を中止した７、１４、および２１日後（９、１６、および２３日目）に、暗順応させ、麻酔をかけた動物の右眼において記録した。各回のＥＲＧでは、待ち時間（ａ波およびｂ波の）およびａ波およびｂ波の振幅を測定したが、待ち時間は、ミリ秒単位で表し、ａ波およびｂ波は、光曝露の前に得られたベースライン値に対する百分率として表した。測定の１５分前、散瞳のために、１０μｌのＭｙｄｒｉａｔｉｃｕｍ（登録商標）（０．５％のトロピカミド）を滴下した。
ＥＲＧパラメータ：
・色：最大限の白色
・最大強度：２．６ｃｄ秒／ｍ２（０ｄＢ）；持続期間：０．２４ミリ秒；閃光の回数：１
・フィルター：５０Ｈｚ
・インピーダンス閾値：９０ｋΩ。
【０６４４】
ＯＮＬ厚の測定：ＥＲＧ試験の後、過剰用量のペントバルビタールにより動物を安楽死させ、右眼を摘出し、パラフィン中に固定および包埋した。切片（５μｍの厚さ）は、垂直子午線に沿って作製し、マッソントリクロームで染色した。垂直子午線には、視神経が含まれた。「ＯＮＬ厚」は、標準的な顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を使用して、網膜下部の、視神経から５００〜３５００μｍの間で、５００μｍごとに（７点で）測定した。
【０６４５】
結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）ソフトウェアを使用して、個々のデータ表および要約されたデータ表の形態で表した。群の平均値および標準偏差を計算した。マン−ホイットニー統計学検定を使用して、対応のある群間の差異を評価した。各ビヒクル群内の時点間の比較のためには、フリードマン検定を使用した。
【０６４６】
結果
全般的挙動および外観は、全ての動物において正常であった。
【０６４７】
ベースラインにおいて、動物の体重は全て、正常な範囲内：３７９±１３ｇ（平均値±ＳＤ；ｎ＝４８）にあった。屠殺日（２３日目）において、被験品目とビヒクルとの間で、目視可能な差異は観察されなかった。各群について、試験の開始直前（ベースライン）および安楽死の当日において記録された平均体重は、正常な範囲内にあり、体重の増加は、約３１±５％（平均値±ＳＤ；ｎ＝４８）であった。
【０６４８】
網膜電図
光受容体に対する保護効果を調査するため、試験物質、ビヒクル、および基準物質を、光誘導性光変性モデルにおいて評価した。網膜の機能的状態は、網膜電図検査により評価した。網膜電図検査波の振幅は、ベースライン値に対して正規化し、ベースラインに対するパーセントとして表した。図７７は、異なる群についての回復の時間経過を示す。
アルビノラットを光誘導性光受容体死から保護することが示されている合成の抗酸化剤である、フェニル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンを、アッセイにおける基準として使用した。３つのＸＧ−１０２の用量：眼１つ当たり１．５μｇ（０．３ｍｇ／ｍｌ、低用量）、眼１つ当たり１５μｇ（３ｍｇ／ｍｌ、中程度用量）および眼１つ当たり１５０μｇ（３０ｍｇ／ｍｌ、高用量）について調べた。ａ波およびｂ波の振幅についての平均値（％による；平均値±ＳＤ）を、以下の表にまとめる。
【表４７】
2020055866.tif 000054
【０６４９】
これもまた図７７に示される通り、腹腔内注射または硝子体内注射によりビヒクルを注射された誘導群における平均ａ波振幅は、９、１６、および２３日目において、ベースラインにおけるコントロール値と比較して低減を示した。ａ波は、９日目（ｐ＜０．０１）、１６日目（ｐ＜０．０１）、および２３日目（ｐ＜０．０５）において、コントロール値の５０％未満まで低減された。ｂ波も、９日目（ｐ＜０．０１）および１６日目（ｐ＜０．０１）において、コントロール値の５０％未満まで、有意に低減された。２３日目において、低減は、統計学的に有意ではなかった。ＰＢＮで処置され、損傷光へと曝露された群では、網膜機能は大部分保存された。ａ波の回復は、９日目（ｐ＜０．０１）、１６日目（ｐ＜０．０１）、および２３日目（ｐ＜０．０１）において、ビヒクルと比較して有意に改善され、それぞれ、７０．４％、７９．６％、および７６．２％であった。同様に、ｂ波の回復も、９、１６、および２３日目において、それぞれ、ビヒクルより有意に大きく（ｐ＜０．０１）、１００％、１０３．６％および１０２．４％であった。
【０６５０】
眼１つ当たり１５μｇまでの異なる用量の硝子体内ＸＧ−１０２で処置され、損傷光へと曝露されたラットは、９、１６、および２３日目において、ビヒクルと比較して大きな程度で、網膜機能の保存を示した。ａ波の回復は、低用量および中程度用量について、それぞれ、１６日目において、４７．５％（ｐ＜０．０１）および５１．１％（ｐ＜０．０１）であり、２３日目において、４８．３％（ｐ＜０．０１）および４１．８％（ｐ＜０．０５）であった。同様に、ｂ波の回復も、ビヒクルより大きく、低用量および中程度用量について、それぞれ、９日目において、５５．３％および６０．６％であり、１６日目において、６１．７％および６２．３％であり、２３日目において、７３．５％および５６．５％であった。他方、高用量（眼１つ当たり１５０μｇの群）ＸＧ−１０２は、光損傷の予防において、効果を示さなかった。ａ波の回復は、９、１６、および２３日目において、それぞれ、ビヒクル群についての５．７％、１３．２％、および２２．５％と対比して、２３．６％、２４．１％、および２３．７％であった。同様に、ｂ波の回復も、９、１６、および２３日目において、それぞれ、ビヒクル群についての１５％、２４．８％、および３０．６％と対比して、３１．９％、３８．９％、および３７．１％であった。
【０６５１】
ＯＮＬ厚
光受容体の構造を保存する処置の能力を評価するため、ＯＮＬの厚さを、曝露中止の２１日後（２３日目）において評価した。平均値を、以下の表にまとめる。
【表４８】
2020055866.tif 000055
【０６５２】
ＯＮＬ厚の減少は、ビヒクルで処置されたラットの眼において観察された。曝露後のビヒクル処置眼では、非処置眼と比較して、６６％〜６９％の平均ＯＮＬ厚の喪失が観察された。ＰＢＮの投与は、ビヒクル群と比較して有意な保護を示した（ｉｖｔおよびｉｐ、ｐ＜０．００１）。ラットをＰＢＮで処置したところ、ＯＮＬは保存された。正常状態にある非処置眼（４０．６±４．６μｍ、内部データ）と比較して観察された減少は、ごくわずか（１６％）であった。低用量および中程度用量のＸＧ−１０２で処置されたラットでは、ＯＮＬ厚の減少が阻害された（ビヒクルと比較して、ｐ＜０．０１）。高用量のＸＧ−１０２では、保護は、観察されなかった。低用量および中程度用量のＸＧ−１０２で処置された眼では、平均ＯＮＬ厚の４０％の減少が観察された。
したがって、これらの実験条件下では、以下のことを明示できる：
・ビヒクル処置群（２つの投与経路：ｉｖｔ、ｉｐ）では、明光曝露により、網膜機能の低下および光受容体の喪失が誘導された。曝露の２３日後、ａ波の回復は、１８．６％（ｉｐ）および２２．５％（ｉｖｔ）であり、６９％（ｉｐ）および６６％（ｉｖｔ）の平均ＯＮＬ厚の喪失が観察された。
・ＰＢＮの全身投与（ｉ．ｐ．）は、網膜を、光損傷から有意に保護する。ＰＢＮ処置群は、ａ波の７６．２％を維持し、観察された平均ＯＮＬ厚の喪失はごくわずか（１６％）であった。
・眼１つ当たり１．５および１５μｇのＸＧ−１０２の硝子体内注射は、網膜を、光損傷から有意に保護する。ＸＧ−１０２処置群は、ａ波の４８．３％および４１．８％を維持し、４０％の平均ＯＮＬ厚の喪失が観察された。
【０６５３】
まとめると、統計学的解析によれば、ＸＧ−１０２の硝子体内注射（眼１つ当たり１．５および１５μｇ）は、網膜機能を保護するのに効果的であった。これらの実験条件下の結果により、眼１つ当たり１．５μｇおよび１５μｇの用量でのＩＶＴによるＸＧ−１０２は、網膜の構造および機能を、光誘導性の急性損傷から保護することが示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
2020055866.tif 000130
【図７０】
2020055866.tif 000131
【図７１】
2020055866.tif 000132
【図７２】
2020055866.tif 000133
【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
2020055866.tif 000137
【図７７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月17日(2019.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膀胱炎を処置するための薬剤組成物を調製するための、共有結合によって連結された、少なくとも１つの第１のドメインおよび少なくとも１つの第２のドメインを含むキメラペプチドの使用であって、該第１のドメインが、輸送配列を含み、該第２のドメインが、１５０個未満のアミノ酸の長さを含むＪＮＫ阻害剤配列を含み、該キメラペプチドが、配列番号１１に記載の全Ｄアミノ酸配列を含む使用。
【請求項２】
前記膀胱炎が、間質性膀胱炎である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記キメラペプチドに含まれる前記ＪＮＫ阻害剤配列が、ｃ−ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）に結合する、請求項１から２のいずれかに記載の使用。
【請求項４】
前記キメラペプチドに含まれる前記ＪＮＫ阻害剤配列がＪＮＫ発現細胞内に存在する場合に、該配列が、ＪＮＫに標的化される少なくとも１つの転写因子の活性化を阻害する、請求項１から３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記ＪＮＫに標的化される転写因子が、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋ１からなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記キメラペプチドに含まれる前記ＪＮＫ阻害剤配列は、該ペプチドがＪＮＫ発現細胞内に存在する場合に、ＪＮＫ効果を変化させる、請求項１から５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記輸送配列が、前記ペプチドの細胞内への取り込みを増進させる、請求項１から６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記輸送配列が、前記ペプチドを核局在化に向ける、請求項１から７のいずれかに記載の使用。