(57)【要約】      （修正有）【課題】シアリダーゼ活性を有する酵素剤の提供。【解決手段】（ａ）特定のアミノ酸配列を有するタンパク質、（ｂ）該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質、又は（ｃ）該アミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失若しくは付加されたアミノ酸を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質を含む、シアリダーゼ活性を有する酵素剤、並びに該酵素剤酵素剤を用いる、糖鎖の処理方法、糖鎖特性の決定方法、及び糖鎖分解産物の生産方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含むシアリダーゼ活性を有する酵素剤。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及及び／又は付加されたアミノ酸を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ及びＫＤＮからなる群から選択される１種又は２種以上の基質に作用する、請求項１に記載の酵素剤。
【請求項３】
α（２→３）結合、α（２→６）結合、α（２→８）結合及びα（２→９）結合のα−グリコシド結合したシアル酸の遊離活性を有する、請求項１又は２に記載の酵素剤。
【請求項４】
さらに、至適ｐＨが６．５以上７．５以下である、請求項１〜３のいずれかに記載の酵素剤。
【請求項５】
糖鎖含有化合物を請求項１〜４のいずれかに記載の酵素剤で処理する処理工程、を備える、糖鎖の処理方法。
【請求項６】
前記糖鎖含有化合物は、糖タンパク質及び糖脂質から選択される、請求項５に記載の処理方法。
【請求項７】
前記処理工程は、細胞表面に提示される前記糖鎖含有化合物を前記酵素剤で処理する工程である、請求項５又は６に記載の処理方法。
【請求項８】
糖鎖含有化合物を請求項１〜４のいずれかに記載の酵素剤で処理する処理工程と、
前記酵素剤で処理によって脱離したシアル酸残基を検出する検出工程と、
を備える、糖鎖特性の決定方法。
【請求項９】
糖鎖分解産物の生産方法であって、
糖鎖含有化合物を請求項１〜４のいずれかに記載の酵素剤で処理する処理工程と、
前記処理工程によって生じるシアル酸残基及び／又は前記シアル酸残基脱離物を回収する工程と、
を備える、生産方法。
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含むシアリダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを備える、シアリダーゼ発現ベクター。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及及び／又は付加されたアミノ酸を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項１１】
シアリダーゼ発現キットであって、
請求項１０に記載のシアリダーゼ発現ベクターを備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、シアリダーゼ活性を有する酵素剤及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
シアリダーゼは、シアル酸のO−グリコシド結合を加水分解してシアル酸を遊離させる酵素である。シアル酸は、ノイラミン酸を基本骨格としてそのアミノ基やヒドロキシ基の水素原子が置換された物質を総称するものであり、分子内にアミノ基とカルボキシ基とを備える９炭糖である。シアル酸は、生体内においては、概して、糖タンパク質や糖脂質にある糖鎖の非還元末端に存在している。シアル酸としては、例えば、ノイラミン酸の５位のアミノ基の水素原子がグリコール酸で置換されたＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、同様に水素原子がアセチル基で置換されたＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、５位の窒素が水酸基に置換されたデアミノノイラミン酸（２−ケトー３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト ノノン酸、ＫＤＮ）などが天然に存在している。
【０００３】
シアリダーゼは、バクテリアからヒトまで広く存在しており、バクテリアによる資化、宿主感染への関与、動物生体内代謝、ガラクトース残基の露出による細胞制御に関わっていると考えられている。また、シアリダーゼは、in vitro及びin vivoにおける研究や医療目的でのシアル酸除去にも用いられている。各種のシアリダーゼが提供されている（特許文献１、非特許文献１〜６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平８−９９７２号公報
【０００５】
【非特許文献１】Uchida Y, et al., Enzymatic properties of neuraminidases from Arthrobacter ureafaciens. J Biochem. Nov;86(5):1573-85(1979).
【非特許文献２】Bouwstra JB, et al., Purification and kinetic properties of sialidase from Clostridium perfringens. Biol Chem Hoppe Seyler. Mar;368(3):269-75(1987).
【非特許文献３】Ada, G. L. et al., Purification and properties of neuraminidase from Vibrio cholerae. J. Gen. Microbiol. 24, 409-421 (1961).
【非特許文献４】Scanlon KL, et al.,. Purification and properties of Streptococcus pneumoniae neuraminidase. Enzyme. 41(3):143-50(1989).
【非特許文献５】Rogerieux F, et al., Determination of the sialic acid linkage specificity of sialidases using lectins in a solid phase assay.Anal Biochem. Jun;211(2):200-4(1993).
【非特許文献６】Corfield AP et al., The release of N-acetyl- and N-glycolloyl-neuraminic acid from soluble complex carbohydrates and erythrocytes by bacterial, viral and mammalian sialidases. Biochem J. Aug 1;197(2):293-9（1981）.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、多くのシアリダーゼは、ｐＨが６．２以下の酸性側に至適ｐＨを有しているほか、いくつかのシアリダーゼは、Ｎｅｕ５Ａｃを基質とすることは判明しているものの他のシアル酸については不明である。また、加水分解対象となるグリコシド結合の結合態様も、α（２→３）結合、α（２→６）結合、α（２→８）結合が挙げられているものの、その程度は必ずしも明らかではない。
【０００７】
このように、現状においては、複数のシアル酸を好適な基質として脱離するシアリダーゼが提供されていない。糖鎖からシアル酸を脱離させる場合、複数のシアル酸基質を対象として脱離させることが研究等において有利な場合がある。
【０００８】
本明細書は、複数のシアル酸を好適な基質とするシアリダーゼ活性を有する酵素剤及びその利用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、Sphingobacterium属に属する菌が有するタンパク質の一つをシアリダーゼと推測して、当該タンパク質を取得してその活性を確認したところ、新規な基質特異性を有するシアリダーゼであるという知見を得た。かかる知見に基づき、本明細書の開示は、以下の手段を提供する。
【００１０】
［１］以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含むシアリダーゼ活性を有する酵素剤。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及及び／又は付加されたアミノ酸を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
［２］Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ及びＫＤＮからなる群から選択される１種又は２種以上の基質に作用する、［１］に記載の酵素剤。
［３］α（２→３）結合、α（２→６）結合、α（２→８）結合及びα（２→９）結合のα−グリコシド結合したシアル酸残基の遊離活性を有する、［１］又は［２］に記載の酵素剤。
［４］さらに、至適ｐＨが６．５以上７．５以下である、［１］〜［３］のいずれかに記載の酵素剤。
［５］糖鎖含有化合物を［１］〜［４］のいずれかに記載の酵素剤で処理する処理工程、を備える、糖鎖の処理方法。
［６］前記糖鎖含有化合物は、糖タンパク質及び糖脂質から選択される、［５］に記載の処理方法。
［７］前記処理工程は、細胞表面に提示される前記糖鎖含有化合物を前記酵素剤で処理する工程である、［５］又は［６］に記載の処理方法。
［８］糖鎖含有化合物を［１］〜［４］のいずれかに記載の酵素剤で処理する処理工程と、
前記酵素剤で処理によって脱離したシアル酸残基を検出する検出工程と、
を備える、糖鎖特性の決定方法。
［９］糖鎖分解産物の生産方法であって、
糖鎖含有化合物を［１］〜［４］のいずれかに記載の酵素剤で処理する処理工程と、
前記処理工程によって生じるシアル酸残基及び／又は前記シアル酸残基脱離物を回収する工程と、
を備える、生産方法。
［１０］以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含むシアリダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを備える、シアリダーゼ発現ベクター。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及及び／又は付加されたアミノ酸を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
［１１］シアリダーゼ発現キットであって、
［１０］に記載のシアリダーゼ発現ベクターを備える、キット。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本剤のシアリダーゼ活性の概要を示す図である。
【図２】組換え体シアリダーゼ（タグ付き）の精製結果示す図である。
【図３】組換え体シアリダーゼ（タグなし）の精製結果を示す図である。
【図４】組換え体シアリダーゼのシアリダーゼ活性のｐＨ依存性を示す図である。
【図５】組換え体シアリダーゼのシアリダーゼ活性の温度依存性を示す図である。
【図６】組換え体シアリダーゼのシアリダーゼ活性の基質特異性（シアル酸分子種）を示す図である。
【図７】組換え体シアリダーゼのシアリダーゼ活性の基質特異性（結合様式特異性）を示す図である。
【図８】ＣＨＯ細胞に対する組換え体シアリダーゼによる処理による細胞表面のポリシアル酸の変化を、抗ポリシアル酸抗体を用いたフローサイトメトリーにより評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書は、シアリダーゼ活性を有する新規酵素剤及び当該酵素剤を用いた糖鎖含有化合物の処理方法、糖鎖特性の決定方法及び、糖鎖含有化合物の分解産物の生産方法等に関する。
【００１３】
本明細書に開示されるシアリダーゼ活性を有するタンパク質（以下、本タンパク質ともいう。）は、本発明者らが、Sphingobacterium属に属する菌（本発明者らが当該菌を取り扱っていた時点においてはSphingobacterium multivorumと推定された。）のゲノム情報から取得した配列番号１で表されるアミノ酸配列に関連している。このアミノ酸配列は、シアリダーゼのファミリーにおいて保存されている配列を含むが、その活性は知られていなかった。
【００１４】
本タンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有することができる。配列番号１で表されるアミノ酸配列で特定されるタンパク質は、ＣＡＺｙ（Carbohydrate active enzymes）という糖質関連酵素のデータベース上でアミノ酸配列の類似性によりＧＨ３３に分類されている。ＧＨ３３の特徴としては、6-fold-β-propellerドメインを備えていることが挙げられる。このアミノ酸配列は、バクテリアのシアリダーゼが有するアスパラギン酸ボックス（S-X-D-X-G-X-T-W, Xは任意のアミノ酸）というモチーフを４個備えるとともに、そのアミノ酸配列のN末端付近にはシアリダーゼが有することが多いとされているＲＩＰ配列というモチーフも備えている。
【００１５】
したがって、このアミノ酸配列から、このタンパク質のシアリダーゼ活性を類推できないとはいえない。しかしながら、カビなどのシアリダーゼではアスパラギン酸ボックスを１個備えるだけでもシアリダーゼ活性を持つことが報告されているし、当該タンパク質と同様、Sphingobacterium属細菌ゲノム上において見出されたシアリダーゼ様の他のタンパク質は、いずれも、CAZｙにおいてＧＨ３３に分類され、アスパラギン酸ボックスを１〜２個備えているにもかかわらず、シアリダーゼ活性が見出されていない。以上のことからすると、アミノ酸配列のみから、そのタンパク質がシアリダーゼ活性を有することを類推することは容易であるとはいえない。
【００１６】
また、たとえ、アミノ酸配列からそのタンパク質のシアリダーゼ活性を類推できたとしても、シアリダーゼの基質特異性を、アミノ酸配列や立体構造から推測することは現状においては極めて困難である。加えて、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、未だ報告例のないNeu5Ac、Neu5Gc、KDNの全てのシアル酸を基質とする新規な基質特異性を有しており、かかる基質特異性を類推することは当業者といえども不可能であった。
【００１７】
本発明者らによれば、本明細書に開示されるシアリダーゼ活性を有する酵素剤（以下、単に、本剤ともいう。）は、従来のシアリダーゼとは異なる基質特異性を有する新規シアリダーゼを提供することができる。本剤は、例えば、従来のシアリダーゼよりも広い基質活性を有することができる。さらに例えば、本剤は、至適ｐＨもより中性側にあり、細胞表層の糖タンパク質、糖脂質であるガングリオシドに対するシアリダーゼ処理に有利である。さらに例えば、本剤は、鎖含有化合物の処理、糖鎖特性の決定及び糖鎖含有化合物の分解産物の生産方法等についても、広い基質特性等に基づいてより確実に実施することができる。
【００１８】
以下、本開示の代表的かつ非限定的な具体例について、適宜図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本開示の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに発明は、さらに改善された「シアリダーゼ活性を有する酵素剤及びその利用」を提供するために、他の特徴や発明とは別に、又は共に用いることができる。
【００１９】
また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本開示を実施する際に必須のものではなく、特に本開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。
【００２０】
本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。
【００２１】
なお、本明細書において、「以上」の語は、下限として以上のほか超としての意義を有する。また、「以下」の語は、上限値として以下のほか未満の意義を有する。したがって、「以上」及び「以下」として記載される範囲は、以上及び以上のほか、超及び以下、超及び未満、以上及び未満の意義を有する。
【００２２】
以下、本剤及びその利用に関し、各種実施形態を詳細に説明する。
（シアリダーゼ及び酵素剤）
本明細書において、シアリダーゼとは、O−グリコシド結合により結合したシアル酸残基を、O−グリコシド結合の加水分解により遊離させる酵素をいう。また、シアリダーゼ活性とは、O−グリコシド結合の加水分解によりシアル酸残基を遊離する活性をいう。
【００２３】
本剤が含むシアリダーゼ（以下、単に、本シアリダーゼともいう。）は、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるいずれかのタンパク質である。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及及び／又は付加されたアミノ酸を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
【００２４】
本シアリダーゼが有する配列番号１で表されるアミノ酸配列は、既述するように、Sphingobacterium属に属する菌（本発明者らが当該菌を取り扱っていた時点においてはSphingobacterium multivorumと推定された。）のゲノム情報から取得されたものである。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１〜１９位を除いた配列である。この配列は、分泌シグナル配列であると考えられるが、分泌タンパク質として本シアリダーゼを製造する場合以外には、必ずしも必要ではない。
【００２５】
また、本シアリダーゼは、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と一定以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００２６】
本明細書において、同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997)）やUniＰrotＫＢのアライメント機能を利用し決定することができる。BLASTやUniProt KBのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いることができる。
【００２７】
本シアリダーゼは、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有することができるが、例えば、同８５％以上、また例えば、同８６％以上、また例えば、同８７％以上、また例えば、同８８％以上、また例えば、同８９％以上、また例えば、同９０％以上、また例えば、同９１％以上、同９２％以上、また例えば、同９５％以上、また例えば同９６％以上、また例えば、同９７％以上、また例えば、同９８％以上、また例えば、同９９％以上、また例えば、９９．５％以上である。
【００２８】
本シアリダーゼは、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有することができるが、例えば、同８５％以上、また例えば、同８６％以上、また例えば、同８７％以上、また例えば、同８８％以上、また例えば、同８９％以上、また例えば、同９０％以上、また例えば、同９１％以上、同９２％以上、また例えば、同９５％以上、また例えば同９６％以上、また例えば、同９７％以上、また例えば、同９８％以上、また例えば、同９９％以上、また例えば、９９．５％以上である。
【００２９】
本シアリダーゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、例えば、７２位〜７９位、１４０位〜１４７位、２７２位〜２７９位及び３２７位〜３３４位に対応する位置の１又は２以上、また例えば３以上、また例えば全てにおいて、アスパラギン酸ボックス（S-X-D-X-G-X-T-W, Xは任意のアミノ酸）を備えることができる。
【００３０】
本シアリダーゼは、また、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の変異を有するものであってもよい。アミノ酸の変異は、置換、挿入、欠失及及び付加から選択される１種又は２種以上である。また、変異数は、１個以上であるが、例えば、５０個以下であり、また例えば、４０個以下であり、また例えば、３０個以下であり、また例えば、２５個以下であり、また例えば、２０個以下であり、また例えば、１５個以下であり、また例えば、１０個以下であり、また例えば、８個以下であり、また例えば、６個以下であり、また例えば、４個以下である。
【００３１】
なお、変異個所は、特に限定するものではないが、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、例えば、７２位〜７９位、１４０位〜１４７位、２７２位〜２７９位及び３２７位〜３３４位に対応する位置の１又は２以上、また例えば３以上、また例えばこれらの全ての位置においてアスパラギン酸ボックス（S-X-D-X-G-X-T-W）を有する場合には、当該アスパラギン酸ボックス以外の位置においてアミノ酸置換変位などを有することができる。また、例えば、７２位〜７９位、１４０位〜１４７位、２７２位〜２７９位及び３２７位〜３３４位に対応する位置の１又は２以上、また例えば３以上、また例えばこれらの全ての位置においてアスパラギン酸ボックスを有する場合において、当該アスパラギン酸ボックス（S-X-D-X-G-X-T-W）のＸ（任意のアミノ酸残基）に対応する位置においてアミノ酸置換変異などを有することができる。
【００３２】
例えば、こうした変異としてのアミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
【００３３】
（シアリダーゼ活性）
本シアリダーゼは、例えば、以下（１）〜（３）のいずれか１つ以上のシアリダーゼ活性を有する。
（１）Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ及びＫＤＮからなる群から選択される１種又は２種以上のシアル酸分子種を基質とする
（２）α（２→３）結合、α（２→６）結合、α（２→８）結合及びα（２→９）結合のα−グリコシド結合したＮｅｕ５Ａｃの遊離活性を有する
（３）至適ｐＨが６．５以上７．５以下である
（４）至適温度が２５℃以上４０℃以下である
【００３４】
本シアリダーゼは、シアル酸の分子種として、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ及びＫＤＮから選択される１種又は２種以上を基質とすることができる。対象分子種は、それぞれのみを基質とすることができるほか、例えば、Ｎｅｕ５Ａｃ及びＮｅｕ５Ｇｃであり、また例えば、Ｎｅｕ５Ａｃ及びＫＤＮであり、また例えば、Ｎｅｕ５Ｇｃ及びＫＤＮであり、また例えば、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ及びＫＤＮの全てを基質とすることができる。
【００３５】
本シアリダーゼが対象とするシアル酸分子種は、例えば、合成基質として４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ｃなど、分子種に対応する合成基質を準備して反応させ、得られた分解生成物である４ＭＵに基づく蛍光シグナルを検出することなどによって行うことができる。
【００３６】
なお、シアリダーゼについて、Ｎｅｕ５Ｇｃについて分解対象分子種として明示しているもの報告は少なく、既存シアリダーゼでＫＤＮ特異的に分解するものが報告（特許文献１）されているが、他の分子種を分解対象とするシアリダーゼは知られていない。
【００３７】
例えば、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ及びＫＤＮの全てを対象とする分子種特性を有する場合、Ｎｅｕ５Ａｃに対して他２種よりも高い活性を有していることがある。例えば、Ｎｅｕ５Ａｃに対する活性を１００として場合において、基質のみを変更して同条件で反応させたとき、Ｎｅｕ５Ｇｓに対する遊離活性は、例えば１５〜２０であり、ＫＤＮに対する活性は、０超２０である。
【００３８】
本シアリダーゼは、各種の結合様式のｏ−グリコシドを加水分解してシアル酸分子種を遊離することができる。例えば、α（２→３）結合、α（２→６）結合、α（２→８）結合及びα（２→９）結合のα−グリコシド結合した既述のシアル酸分子種の遊離活性を有することができる。既存のシアリダーゼに関して、α（２→３）、α（２→６）及びα（２→８）を対象結合様式とすることは記載されているが、α（２→９）を対象結合様式とするシアリダーゼは報告されていない。
【００３９】
例えば、Ｎｅｕ５Ａｃについて、上記全ての結合様式のｏ−グリコシド結合を加水分解して当該分子種を遊離することができる。
【００４０】
本シアリダーゼが対象とする結合様式は、例えば、種々の結合様式の二糖類（一つはシアル酸である。）を準備して反応させ、その分解生成物を薄層クロマトグラフィーなどで分離検出することにより行うことができる。
【００４１】
本シアリダーゼは、例えば、至適ｐＨが６．５以上７．０以下である。至適ｐＨは、後述する実施例において記載される条件によって規定することができる。例えば、本シアリダーゼが対象とする分子種を用いて合成基質を準備して、当該合成基質に関して至適ｐＨを取得できる。典型的には、４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃ及び／又は４ＭＵ−ＫＤＮについての至適ｐＨを参照することができる。また例えば、４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃについての至適ｐＨのみを参照することもできる。
【００４２】
既存のシアリダーゼは、より酸性側（最も中性側でも６．２）に至適ｐＨをしている。本シアリダーゼは、より中性に近い条件でシアリダーゼ処理が可能であり、細胞障害性が低減された条件下でシアリダーゼ処理が可能となっている。
【００４３】
本シアリダーゼは、例えば、至適温度が３０℃以上３７℃以下である。至適温度は、後述する実施例において記載される条件によって規定することができる。例えば、本シアリダーゼが対象とする分子種を用いて合成基質を準備して、当該合成基質に関して至適温度を取得できる。典型的には、合成基質である４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃ及び／又は４ＭＵ−ＫＤＮについての至適温度を参照することができる。また例えば、４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃについての至適温度のみを参照することもできる。
【００４４】
本剤は、少なくとも本シアリダーゼを含んでいる。本剤は、本シアリダーゼのほか、同時に用いることができる他のシアル酸分子種特異性などを有するシアリダーゼを含んでいてもよい。さらに、本剤は、また、シアリダーゼ以外の他の酵素を含んでいてもよい。
【００４５】
（シアリダーゼの製造）
本シアリダーゼの製造方法は、特に限定するものではなく、公知のタンパク質の製造方法によって取得することができる。例えば、Sphingobacterium属細菌などを培養して、本シアリダーゼを分離精製することができるほか、化学合成により取得することもできる。
【００４６】
また例えば、遺伝子工学的手法により、本シアリダーゼを組換えタンパク質として取得することができる。すなわち、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列に対して一定の同一性を有するアミノ酸配列、また例えば、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列においてアミノ酸変異を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成又はSphingobacterium属細菌などのＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ法などの公知の方法により取得し、当該ＤＮＡを、適当な宿主細胞においてタンパク質をコードする遺伝子として発現可能に構成したＤＮＡコンストラクトとして宿主細胞を形質転換し、当該宿主細胞を培養することで、培養産物として本シアリダーゼを取得することができる。
【００４７】
なお、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と一定の同一性や１以上のアミノ酸変異を有するタンパク質は、例えば、前記アミノ酸配列とコードするＤＮＡ又はその相補鎖の少なくとも一部をプローブとして用いたハイブリダイゼーション、エラープローンＰＣＲや公知の変異導入方法に従い取得することができる。こうしたタンパク質については、そのアミノ酸配列及びシアリダーゼ活性を評価することで、本シアリダーゼであることを確認することができ、本シアリダーゼとして上記と同様に製造できる。
【００４８】
宿主細胞としては、特に限定するものではなく、公知の宿主細胞を用いることができる。例えば、大腸菌、枯草菌等の細菌、カンディダ・ウチリス（Candida utilis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母以外に、リゾープス・ニベウス（Rhizopus niveus）、リゾープス・デルマー（Rhizopus delemar）や高等真核生物（例えばＣＨＯ細胞など）を用いることができる。例えば、本シアリダーゼは、Rosetta gami２など大腸菌（Ｋ−１２株）由来の宿主細胞を用いることで、シアリダーゼ活性を有し、かつ高い収量で取得することができる。
【００４９】
また、ＤＮＡコンストラクトとしてのベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案して適宜選択することができる。例えば、ＤＮＡコンストラクトは、プラスミド、コスミド、ウイルス性の発現ベクターであってもよい。ＤＮＡコンストラクトは、また、宿主細胞内で複製可能であってもよいし、宿主染色体に組み込まれて複製可能に構成されていてもよい。ＤＮＡコンストラクトは、適宜、商業的に入手可能な種々のプラスミドなどを用いて構築することができる。
【００５０】
なお、ＤＮＡコンストラクトは、遺伝子発現に必要な種々のＤＮＡ配列、例えば、プロモーター、ターミネーター、リボゾーム結合部位、転写終結シグナルなどの転写調節信号、翻訳調節信号などを有することができる。また、適宜、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子などの適宜選択マーカーを有することができる。以上のような、遺伝子工学的な手法については、当業者であれば、例えば、適宜、Molecular Cloning: A Laboratory  Manualに記載の方法に準じて行なうことができる。
【００５１】
形質転換した宿主細胞の培養は、使用する宿主細胞に応じて一般的な方法を用いることができる。通常、１〜４日程度の培養により細胞内または細胞外の培養物中に酵素が生成され蓄積される。培養条件（培地、ｐＨ、温度等）に関しては、例えば、細菌では２５〜３７℃、酵母では２５〜３０℃、真核細胞では３７℃程度が一般的である。培養条件については、例えば、遺伝子発現実験マニュアル（講談社）等を参照することができる。
【００５２】
形質転換体が産生した組み換え酵素の単離・精製は、常法に従い、公知の分離方法や精製方法を適当に組み合わせて行なうことができる。これらの分離・精製方法は、特に限定するものではないが、例えば、塩沈殿、溶媒沈殿のような溶解性の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過およびＳＤＳ−ポリアクリル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、さらに等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法、このほかにアフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。実施例に記載した生成方法のほかに、一般的な分離・精製法に関しては、例えば蛋白質・酵素の基礎実験法（南江堂）等を参照することができる。
【００５３】
（シアリダーゼ発現ベクター及びキット）
本明細書によれば、シアリダーゼ発現ベクターのほか、シアリダーゼ発現ベクターを備える、シアリダーゼ発現キットも提供される。さらに、かかるキットは、シアリダーゼの発現などに適した大腸菌などの宿主細胞も備えることができる。さらにまた、この種の発現ベクターに用いる公知の他の試薬も適宜備えることができる。
【００５４】
（酵素剤の利用）
本剤は、そのシアリダーゼ活性を利用して、糖鎖含有化合物の処理、糖鎖特性の決定及び糖鎖分解産物の生産方法等に利用することができる。本剤によれば、そのシアル酸分子種特異性、結合様式特異性及び至適ｐＨにより、より種々の糖鎖に作用して、シアル酸分子種を遊離させ、シアル酸残基が脱離させた糖鎖を調製したり、脱離したシアル酸残基の解析により糖鎖特性を決定したり、脱離したシアル酸分子種を取得したりできる。また、シアル酸の遊離前（シアル酸修飾状態）と、シアル酸遊離後の糖鎖含有化合物又はその当該化合物を提示する細胞の生理的機能の相違から、シアル酸修飾の意義について新たな知見を得ることができる。
【００５５】
（糖鎖の処理方法）
本明細書に開示される糖鎖の処理方法は、糖鎖含有化合物を本剤で処理する処理工程を備えることができる。本処理方法によれば、糖鎖含有化合物の有する糖鎖から効率的にシアル酸残基を遊離させて、シアル酸残基が除去された糖鎖含有化合物とすることができる。
【００５６】
本明細書において、「糖鎖」とは、糖がグリコシド結合によって連結した化合物をいう。糖鎖含有化合物とは、かかる糖鎖からなる化合物のほか、かかる糖鎖が他の化合物と結合した化合物をいい、例えば、タンパク質と糖鎖とが結合した糖タンパク質、脂質と糖鎖が結合した糖脂質及びプロテオグリカンなどの複合糖質が挙げられる。なお、糖鎖含有化合物における糖鎖は、１以上の単糖が結合したものであればよい。
【００５７】
ここで、糖タンパク質は、タンパク質を構成するアミノ酸の一部に１又は２以上の糖鎖が結合したものである。糖鎖は、概して、数本〜数十本であり、主として細胞膜タンパク質や分泌タンパク質である。糖鎖が結合するアミノ酸は、典型的には、アスパラギン（Ｎ型糖鎖）、セリン及びスレオニン（Ｏ型糖鎖）が挙げられる。また、糖タンパク質を構成する糖鎖の構成単糖としては、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎｅｕ５Ａｃ及びキシロースなどが挙げられる。
【００５８】
プロテオグリカンとしては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸などの１００〜２００程度の単糖からなる糖鎖を有し、グリコサミノグリカンがタンパク質に結合した複合体をいう。糖鎖は、二糖の繰り返し構造を概して備える。プロテオグリカンは、典型的には、線維タンパク質間を充填するように存在している。
【００５９】
糖脂質としては、糖鎖が結合した脂質をいい、糖とグリセリンとのエーテル結合を含むグリセロ糖脂質と糖とスフィンゴシンとのグリコシド結合を含むスフィンゴ糖脂質とに大別される。スフィンゴ糖脂質は、糖としてヘキソース１分子をもつ単純なセレブロシドのほか、ガラクトース、グルコース、N‐アセチルガラクトサミン、N‐アセチルグルコサミン、フコースなどのヘキソース糖やシアル酸を含むガングリオシド、硫酸化糖を含むスルファチドなどがある。
【００６０】
処理工程に供される糖鎖含有化合物としては、糖タンパク質や糖脂質が、シアル酸残基を含む場合が多いため、かかる複合糖質の処理に本剤は有用である。また、本処理方法の処理工程は、遊離した状態の糖鎖含有化合物を本剤で処理するほか、細胞表層に存在する糖鎖含有化合物を本剤で処理することを含む。本剤は、細胞障害性の低い条件で高いシアリダーゼ活性を発揮できるため、細胞の処理に有用である。
【００６１】
処理工程では、糖鎖含有化合物と本剤とを、本シアリダーゼのシアリダーゼ活性を発揮可能な条件下、液性媒体中で接触させることにより、そのシアリダーゼ活性によりシアル酸残基が遊離させることができる。処理工程における反応濃度は、本シアリダーゼが安定的に作用する温度域であれば特に限定するものではないが、例えば、３０℃以上３７℃以下又はこれらの近傍とすることができる。また、処理工程におけるｐＨは、本シアリダーゼが安定的に作用するｐＨ域であれば特に限定するものではないが、例えば、ｐＨ６．５以上７．０又はこれらの近傍とすることができる。
【００６２】
また、処理工程における反応温度は、反応時間の全体を通して一定である必要はなく、反応時間の初期に併用するその他の酵素の活性を高めることが望ましい場合には、その酵素の活性が高くなる温度域に、反応初期の温度を設定し、反応時間の中期や後期には、本発明の酵素の活性が高くなる温度域に温度を設定するなど、適宜調整することができる。
【００６３】
処理工程における反応時間は、反応温度や基質の濃度、その他の酵素を併用する場合には使用する酵素の活性等を考慮して適宜決定できる。本シアリダーゼ単剤を利用する場合には、特に限定するものではないが、例えば、１０分〜１６時間の範囲で適宜設定することができる。
【００６４】
本処理方法によれば、本シアリダーゼによるシアリダーゼ活性が、従来になく広いシアル酸分子種及び結合様式でシアル酸残基を遊離させることができる。このため、これまでよりもシアル酸残基が脱離された糖鎖含有化合物を取得できる。したがって、例えば、シアル酸修飾による影響を評価しやすくなる。
【００６５】
本処理方法においては、適宜、本シアリダーゼ以外のシアリダーゼや他のグリコシダーゼ、例えば、ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、フコシダーゼ、マンノシダーゼなどのエキソグリコシダーゼから選択される１種又は２種以上を同時にあるいは順次処理することもできる。
【００６６】
（糖鎖特性の決定方法）
本明細書に開示される糖鎖特性の決定方法（以下、単に、本決定方法ともいう。）は、糖鎖含有化合物を本剤で処理する処理工程と、本剤の処理によって脱離したシアル酸残基を検出する検出工程と、を備えることができる。ここで、糖鎖特性とは、糖鎖含有化合物の有する糖鎖の構成糖の組成や順序をいう。本決定方法における処理工程は、既述の本処理方法における処理工程と同様の態様で実施することができる。また、本決定方法における検出工程は、特に限定するものではないが、例えば、処理工程後の反応液中のシアル酸残基などを、各種マススペクトロメトリー、各種のクロマトグラフィー、各種ＮＭＲ、各種電気泳動により分離同定する工程とすることができる。なお、分離同定に先立って、あるいは同時に、分離後に、遊離したシアル酸残基を、蛍光標識などのシグナル要素が付加された又は付加可能に形成されたレクチンや特異的抗体と結合させてもよい。こうした、糖鎖のフィンガープリントについては、適宜公知の手法を適用することができる。
【００６７】
また、さらに、本決定方法は、シアリダーゼ処理後の糖鎖化合物と糖転移酵素を作用させてその反応性や特異的抗体により、シアリダーゼ処理により露出された糖鎖末端を検出する工程を備えていてもよい。糖転移酵素としては、適宜、公知の糖転移酵素を用いることができる。
【００６８】
なお、本決定方法においても、本処理方法と同様、本シアリダーゼ以外のシアリダーゼ及び各種グリコシダーゼを、同時にあるいは順次処理することもできる。そして、これらのグリコシダーゼによって遊離される残基や残存末端を、それぞれ検出して、糖鎖特性を決定することもできる。
【００６９】
（糖鎖分解産物の生産方法）
本明細書に開示される糖鎖分解産物の生産方法（以下、本生産方法ともいう。）は、糖鎖含有化合物を本シアリダーゼで処理する処理工程と、前記処理工程によって生じるシアル酸残基及び／又は前記シアル酸残基脱離物を回収する回収工程と、を備えることができる。本生産方法における処理工程は、既述の本処理方法における処理工程と同様の態様を採ることができる。
【００７０】
本生産方法における回収工程は、処理工程における分解産物、すなわち、遊離したシアル酸残基及びシアル酸残基脱離物の少なくとも一部を分離回収する工程である。本生産方法は、予定される遊離シアル酸残基及びシアル酸残基脱離物の少なくとも一部を回収する工程であればよく、これらの分離回収方法は、例えば、本決定方法において決定に際して用いる分離同定工程を、回収工程として実施することができる。
【００７１】
なお、本生産方法においても、本処理方法と同様、本シアリダーゼ以外のシアリダーゼ及び各種グリコシダーゼを、同時にあるいは順次処理することもできる。そして、これらのグリコシダーゼによって遊離される残基や残存末端を、それぞれ回収することもできる。
【００７２】
なお、本明細書によれば、本剤を用いて、糖鎖含有化合物を処理後、残余の糖鎖末端に１又は２以上の糖転移酵素を用いて新たに糖鎖を結合する工程を備える、糖鎖の生産方法も提供される。
【００７３】
（キット）
本明細書に開示されるキットは、本シアリダーゼを備えることができる。本キットは、本シアリダーゼを用いて糖鎖含有化合物を処理し、糖鎖特性を決定し、又は、糖鎖分解産物を生産等に用いるためのキットである。本キットは、本シアリダーゼを備えるほか、その他のシアリダーゼを含む各種グリコシダーゼをさらに備えていてもよい。また、本キットは、そのほか、本キットの目的に応じて、遊離が予定されるシアル酸残基やシアル酸脱離後の糖鎖含有化合物に特異的に結合する標識されていてもよい抗体やレクチンなどを備えることもできる。本キットは、そのほか、糖鎖研究や糖鎖解析に適用される試薬やデバイスを備えることもできる。
【実施例】
【００７４】
以下、本開示を具現化した実施例について説明するが、本開示は、はこれらの例に限定されるものではない。なお、本明細書において、特に記載しない限り、「％」、「部」等は質量基準である。また、操作手順は特に記載しない限り、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook、 Maniatis ら、Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989))に記載の方法に従った。
【実施例１】
【００７５】
（組換え体シアリダーゼの調製）
配列番号１で表されるアミノ酸配列から分泌シグナルと推定される疎水性領域の配列（１〜１９ａａ（１−５７ｂｐ））を除いたアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ配列（配列番号３）を準備した。このｃＤＮＡ配列を、常法に従い、ｐＥＴ３２ａベクターにクローニングし、このベクターを用いてRosetta-gami2(DE3)（メルク株式会社）を形質転換し、ＬＡプレート上でシングルコロニーを得た。シングルコロニーを５ｍｌ ＬＡ培地に植菌し、３７℃、１６時間振盪培養した。この培養液を２００ｍｌ ＬＡ培地に全量移し、さらに３７℃、２時間振盪培養を行いＯＤ６００が０．４付近になることを確認した。
【００７６】
培養液に終濃度０．４ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトシド）を加え、１５℃、２０時間さらに振盪培養した。培養液を６，０００ｇ、１０分、４℃の遠心分離で菌体を回収し、４０ｍｌ ＰＢＳで洗浄した。洗浄後、２０ｍｌ平衡バッファ(５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）)を加え、さらに終濃度１ｍＭとなるようにＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）、プロテアーゼ阻害剤カクテル(ＰＩＣ：終濃度１μｇ／ｍｌロイペプチン、２μｇ／ｍｌアンチパイン、１０μｇ／ｍｌベンザミジン、１μｇ／ｍｌペプスタチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン)を加え懸濁した。
【００７７】
細胞懸濁液を超音波破砕し、６，０００ｇ、１０分、４℃の遠心分離で上清を粗精製画分として回収した。粗精製画分に終濃度５０ｍＭとなるようにイミダゾールを加え、平衡バッファであらかじめ平衡化した２ｍｌ Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラムに供し、４℃で１５分回転混和した。通過画分（Flow through画分）を回収した後、８．５ｍｌ洗浄バッファ（１０ｍＭイミダゾール、１Ｍ ＮａＣｌ、４０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０））を加え、洗浄して洗浄画分（Wash画分）を回収した。さらに、７ｍｌ溶出バッファ（１００ｍＭイミダゾール，０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０））を加え、ヒスタグ付きタンパク質が溶出される溶出画分（Elute画分）を回収した。最後に８ｍｌストリップバッファ（１Ｍイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０））を加え、ストリップ画分（Strip画分）を回収した。溶出画分はVIVA SPIN20 (MWCO=10000)（ThermoFischer SCIENTIFIC社製）を用いて限外濾過し、０．７５ｍｌまで脱塩濃縮し精製画分（Purified画分）とした。
【００７８】
各画分に含まれるタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行いＣＢＢ染色によって確認した。結果を図２に示す。図２に示すように、タグ付きシアリダーゼは、溶出画分（Purified画分）に５９ｋＤａのタンパク質として精製されたことがわかった。
【００７９】
さらに、精製画分７００μｌに１．９ｕｎｉｔのエンテロカイネースおよび１０×反応バッファを加え、４℃、１６時間回転混和を行い、Ｎ末端側に付加されたヒスタグを切断した。反応液に１０μｌベンズアミドセファロースを加え、４℃、１時間回転混和し、２，０００ｇ、５分、４℃で遠心分離することでエンテロカイネースを沈殿させ除去した。上清に対し、平衡バッファで平衡化したＮｉ−ＮＴＡ アガロース１００μｌを加え、４℃、１時間回転混和し、２，０００ｇ、５分、４℃で遠心分離をすることでタグ付きシアリダーゼを沈殿させ除去した。
【００８０】
この上清をVIVA SPIN20（ＭＷＣＯ＝１００００）を用いて５５０μｌまで濃縮した。濃縮した画分は、１０μｌずつ分注し、−８０℃に保存した。シアリダーゼのタグが外れたことを確認するためＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色によってエンテロカイネース消化前後でシアリダーゼがシフトしていることを確認した。同時に、タンパク質量既知のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＳ ａｎａｌｙｚｅｒ３．０（ＡＴＴＯ、Ｔｏｋｙｏ）を用いて輝度を測定することで検量線を作製し、タグなしシアリダーゼのタンパク質濃度を求めた。結果を図３に示す。
【００８１】
図３に示すように、エンテロカイネース処理により、タグなしのシアリダーゼが４０ｋＤａのタンパク質として精製されたことがわかった。また、タグなしシアリダーゼ濃度は、３．８μｇ／ｍｌであり、タグなしシアリダーゼの収量が２００ｍｌ菌体あたり、５３０μｇであることがわかった。
【実施例２】
【００８２】
２'−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−シアル酸ナトリウム（4MU-Sialic acid）を用いたシアリダーゼ活性測定
【００８３】
（１）ｐＨ依存性
９６穴プレートであるマルチプレート９６Ｆ（住友ベークライト、Ｔｏｋｙｏ）に１０μｌの各種０．５Ｍバッファを加えた。０．５Ｍバッファは、ｐＨ４．０〜６．０の範囲で酢酸ナトリウムバッファ、ｐＨ６．０〜８．０の範囲でＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨバッファ、ｐＨ８．０〜１０．０の範囲でトリス−塩酸バッファを用いた。次に、４０μｌの反応溶液としてＢＳＡ（終濃度１ｎｇ／μｌ）、４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃまたは４ＭＵ−ＫＤＮ（終濃度２０μＭ）、５．７ｎｇの実施例１で調製したタグなしシアリダーゼ（以下、同じ）を加え、室温で３０分間遮光しながら静置した。その後、５０μｌの０．２５Ｍグリシン−ＮａＯＨバッファ（ｐＨ１０．４）を加えて反応を停止させ、プレートリーダーEnspire(PerkinElmer, Waltham, MS, U.S.A.)を用いて、励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４３７ｎｍの条件で遊離した４ＭＵの蛍光を測定した。蛍光強度に基づく相対酵素活性の測定結果を図４に示す。
【００８４】
図４に示すように、双方の基質について、シアリダーゼの至適ｐＨは、６．５以上７．５以下又は６．５以上７．０以下の範囲にあることがわかった。以上のことから、実施例１で得られたシアリダーゼは、従来のシアリダーゼに比してより中性側に至適ｐＨを有していることがわかった。
【００８５】
（２）温度依存性
１．５ｍｌエッペンドルフチューブに５０μｌ反応溶液（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、１ｎｇ／μｌ ＢＳＡ、２０μＭ ４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃまたは４ＭＵ−ＫＤＮ、３．８ｎｇシアリダーゼ）を加え、遮光条件で３０分、４、１５、２５、３０、３７、５０℃で静置した。その後、５０μｌの０．２５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．４）を加え、プレートリーダーEnspireを用いて、励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４３７ｎｍの条件で遊離した４ＭＵの蛍光を測定した。結果を図５に示す。
【００８６】
図５に示すように、基質として４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃを用いるとき、ｐＨ６．５において、シアリダーゼは、２５℃以上４０℃以下、より具体的には、３０℃以上３７℃以下で良好なシアリダーゼ活性を示した。基質として、４ＭＵ−ＫＤＮを用いる場合においても、活性は低いがほぼ同様の結果であった。
【００８７】
（３）基質特異性（シアル酸分子種）
シアリダーゼ３．８４ｎｇ、Arthrobacter ureafaciens(A.u.)シアリダーゼ６２．５μｕｎｉｔ、Clostridium perfringens(C.p.)シアリダーゼ６６７μｕｎｉｔ、Vibrio cholera (V.c.)シアリダーゼ１ｍｕｎｉｔ、Streptococcus pneumoniae(S.p.)シアリダーゼ８ｕｎｉｔを含む１０μlを９６穴プレートに加えた。なお、ユニットの定義は各社のデータシートの定義に基づく。各ウェルに４０μｌ反応溶液（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）または０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）、２０μＭ４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃまたは４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ｇｃまたは４ＭＵ−ＫＤＮ）を加え、遮光条件下で３０分、３７℃で静置した。その後、５０μｌの０．２５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．４）を加え、プレートリーダーEnspireを用いて、励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４３７ｎｍの条件で遊離した４ＭＵの蛍光を測定した。結果を図６に示す。
【００８８】
図６に示すように、本シアリダーゼは、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ、ＫＤＮに対してシアリダーゼ活性を示した。これに対して、A.u.シアリダーゼ、C.p.シアリダーゼ、V.c.シアリダーゼは、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃに対してシアリダーゼ活性を示したが、ＫＤＮに対してはシアリダーゼ活性を示さなかった。また、Ｓ．ｐ．シアリダーゼはＮｅｕ５Ａｃに対してのみシアリダーゼ活性を示した。
【００８９】
（４）シリカゲル薄層クロマトグラフィー（TLC）によるシアリダーゼの結合様式特異性の評価
基質として、α２，３−シアリルラクトサミン、α２，６−シアリルラクトサミン、α２，８−ポリシアル酸、α２，９−ポリシアル酸をそれぞれ５μｇ（Ｎｅｕ５Ａｃ換算）用いた。各基質に対し、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、１ｎｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１．９２μｇシアリダーゼを含む反応液を５０μｌになるように添加し、３０℃、１２時間反応させた。反応液から１μｇ分（シアル酸換算）をＴＬＣプレート上にスポットし、５時間展開した（１−プロパノール：アンモニア水：水＝６：１：２．５）。展開後、レゾルシノール試薬（２ｍｇ／ｍｌレゾルシノール、９．６Ｎ濃塩酸、０．２５ｍＭ硫酸化銅）を噴霧し、１００℃以上で熱し、展開後のスポットを検出した。結果を図７に示す。
【００９０】
図７に示すように、本シアリダーゼは、各種の結合様式、すなわち、α２，３−シアリルガラクトサミン、同２，６−シアリルラクトサミン、同２，８−ポリシアル酸及び同２，９−ポリシアル酸のＮｅｕ５Ａｃをいずれも遊離した。以上のことから、本シアリダーゼは、α（２→９）ｏ−グリコシド結合で結合したシアル酸残基を遊離できるシアリダーゼ活性を有していることがわかった。
【実施例３】
【００９１】
（フローサイトメトリーによるｉｎ ｖｉｖｏにおけるシアリダーゼの利用性の評価）
細胞培養ディッシュ（φ１０ｃｍ）上でＣＨＯ細胞を８０％コンフルエントになるまで培養した。細胞を冷やしたＰＢＳで３回洗浄し、セルスクレイパーにより細胞をはがして回収した。２，０００ｇ、５分、４℃の遠心分離により細胞を回収し、４％パラホルムアルデヒド中で８分、室温で静置し細胞膜を固定した。ＰＢＳで洗浄後、ＰＢＥ（０．５％ＢＳＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ）でブロッキングを行った。次に１９．２μｇ／ｍｌとなるように実施例１で調製した組換え体シアリダーゼを添加し、３７℃、３０分間、揺らしながら反応させた。ＰＢＳで洗浄後、一次抗体として１０μｇ／ｍｌ抗ポリシアル酸抗体（１２Ｅ３）を添加し、３０分、氷上で静置した。さらにＰＢＳで洗浄後、二次抗体として抗マウスＩｇＭ抗体−Ａｌｅｘａ４８８を添加し、３０分、氷上で静置した。ＰＢＳで洗浄後、フローサイトメーターGallios（Beckman coulter,Tokyo）により細胞表面に抗ポリシアル酸抗体が結合した細胞数を計測した。シアリダーゼによる変化を見るため、シアリダーゼ処理をしていない細胞群、抗ポリシアル酸抗体の特異的な結合を見るため、二次抗体のみ添加した細胞群も同時に実施した。結果を図８に示す。
【００９２】
図8に示すように、フローサイトメトリーの結果、シアリダーゼ処理することにより、一次抗体及び二次抗体の結合する細胞数が減少したことがわかった。すなわち、細胞に対するシアリダーゼ処理により、細胞表面のシアル酸残基が遊離し、一次抗体が結合しなくなったことがわかった。以上の結果から、本シアリダーゼは、細胞表層に提示される糖鎖に対して有効に作用することがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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