(57)【要約】      （修正有）【課題】感染初期に過剰な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を特定する異種又は天然の核酸を含んでなる組換えポックスウイルスの提供。【解決手段】感染初期に過剰な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を特定する異種又は天然の核酸を含んでなる組換えポックスウイルスであって、１以上の共刺激分子をコードする異種核酸、及び／又は、１以上の感染性疾患関連抗原又は腫瘍関連抗原をコードする異種核酸を含んでよい。前記組換えポックスウイルスは、過剰な初期ｄｓＲＮＡを特定する異種又は天然の転写単位を欠失した同一の組換えポックスウイルスに比較して、被験対象において天然及び適合性の免疫活性化を増強する。【選択図】図１３
2020072693.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染初期に過剰な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を発現する異種核酸を含んでなる組換えポックスウイルス。
【請求項２】
請求項１に記載の組換えポックスウイルスであって、更に、１以上の共刺激分子をコードする異種配列を含んでなる前記組換えポックスウイルス。
【請求項３】
請求項２に記載の組換えポックスウイルスであって、前記１以上の共刺激分子がＴＲＩＣＯＭ（Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、及びＬＦＡ−３）である前記組換えポックスウイルス。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の組換えポックスウイルスであって、更に、１以上の細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、または腫瘍抗原をコードする異種配列を含んでなる前記組換えポックスウイルス。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の組換えポックスウイルスであって、前記ポックスウイルスがオルソポックスウイルス、パラポックスウイルス、ヤタポックスウイルス、アビポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、カプリポックスウイルス、セルビドポックスウイルス、またはモルシポックスウイルスである前記組換えポックスウイルス。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えポックスウイルスであって、前記オルソポックスウイルスは、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、及びサル痘ウイルスからなる群から選択される前記組換えポックスウイルス。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポックスウイルスであって、前記ワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルス・ウェスタンリザーブ、ワクシニアウイルス・コペンハーゲン、ドライワックス（Ｄｒｙｖａｘ：ワクシニアウイルス・ワイス（Ｗｙｅｔｈ）としても知られる）、ワクシニアウイルス・リスター、ワクシニアウイルス・アカンビス（Ａｃａｍｂｉｓ）２０００及び３０００、家兎痘ウイルス、バッファロー痘ウイルス、修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）、及び修飾ワクシニアウイルス・アンカラ・ババリアンノルディック（ＭＶＡ−ＢＮ）からなる群から選択される前記組換えポックスウイルス。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の組換えポックスウイルスであって、ｄｓＲＮＡを生成する前記異種核酸は、部分的にまたは完全に相補的なＲＮＡ転写物をコードする配列を含んでなり、前記ＲＮＡ転写物の相補的部分は、転写後にアニールしてｄｓＲＮＡを形成する前記組換えポックスウイルス。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えポックスウイルスであって、前記相補的なＲＮＡ転写物は、タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または非タンパク質をコードする遺伝子を含んでなる前記組換えポックスウイルス。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えポックスウイルスであって、前記ＲＮＡ転写物の前記相補的部分は５０以上のヌクレオチドを含んでなる前記組換えポックスウイルス。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えポックスウイルスであって、前記ＲＮＡ転写物の前記相補的部分は、５０〜７００のヌクレオチドを含んでなる前記組換えポックスウイルス。
【請求項１２】
請求項１０に記載の組換えポックスウイルスであって、前記ＲＮＡ転写物の前記相補的部分は、７００を超えるヌクレオチドを含んでなる前記組換えポックスウイルス。
【請求項１３】
請求項１０に記載の組換えポックスウイルスであって、完全にまたは部分的に相補的なＲＮＡ転写産物をコードする前記異種核酸は、前記相補的な領域内において同一であるか、または前記相補的な領域内において９９％超、９５％超、９０％超、８０％超、または７０％超の類似性を有する前記組換えポックスウイルス。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組換えポックスウイルスであって、部分的または完全に相補的な転写物をコードする前記二つの同一または非常に類似した配列が、１以上の必須のウイルス遺伝子によって分離されている前記組換えポックスウイルス。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組換えポックスウイルスであって、センスメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は前記二つの同一または非常に類似した配列の一方から転写され、及びアンチセンスｍＲＮＡは他方の同一または非常に類似した配列から転写される前記組換えポックスウイルス。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組換えポックスウイルスであって、センス及びアンチセンスＲＮＡが、前記同じ異種配列の挿入物の両方の鎖から転写される前記組換えポックスウイルス。
【請求項１７】
請求項１５に記載の組換えポックスウイルスであって、センス及びアンチセンスＲＮＡは、天然ポックスウイルス配列、好ましくは初期遺伝子、より好ましくは即時初期遺伝子の両方の鎖から転写される前記組換えポックスウイルス。
【請求項１８】
請求項１５〜１７の何れか１項に記載の組換えポックスウイルスであって、相補的なＲＮＡ転写物をコードする前記配列の発現は、各々ポックスウイルスプロモータによって指令される前記組換えポックスウイルス。
【請求項１９】
請求項１６に記載の組換えポックスウイルスであって、前記ポックスウイルスプロモータは、初期プロモータまたは即時初期プロモータである前記組換えポックスウイルス。
【請求項２０】
請求項１〜１９に記載の初期ｄｓＲＮＡの発現により、標準的な複製能力をもつワクシニアウイルス株及びチョルドポックスウイルス亜科由来の他の種を弱毒化させる方法。
【請求項２１】
自然免疫の活性化を増強する方法であって、脊椎動物被験対象に請求項１９に記載の組換えポックスウイルスを投与することを含んでなり；前記投与は、前記被験対象におけるＩ型インターフェロン（Ｉ型ＩＦＮ）、サイトカイン及びケモカインの産生を高める方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、Ｉ型ＩＦＮの産生は、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写を含んでなり、該ＩＦＮ−β・ｍＲＮＡの転写が少なくとも２倍増加する前記方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、ＩＦＮ−βをコードするｍＲＮＡの転写が少なくとも１０倍増加する前記方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、ＩＦＮ−βをコードするｍＲＮＡの転写が少なくとも５０倍増加する前記方法。
【請求項２５】
請求項２１に記載の方法であって、Ｉ型ＩＦＮの産生はＩＦＮ−βタンパク質の分泌を含んでなり、該ＩＦＮ−βタンパク質の分泌が少なくとも２倍増加する前記方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、ＩＦＮ−βタンパク質の分泌が少なくとも４倍増加する前記方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、ＩＦＮ−βタンパク質の分泌が少なくとも１０倍増加する前記方法。
【請求項２８】
請求項２１に記載の方法であって、前記投与は、サイトカインＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、及びＩＬ−１８の産生を増強する前記方法。
【請求項２９】
請求項２１に記載の方法であって、前記投与は、ケモカインＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２及びＣＣＬ５の産生を増強する前記方法。
【請求項３０】
請求項２１に記載の方法であって、前記投与は、ベクター特異的ＣＤ８Ｔ細胞の産生を、少なくとも１０％、好ましくは２５％、より好ましくは５０％超増強する前記方法。
【請求項３１】
請求項１９に記載のポックスウイルスであって、ニワトリ線維芽細胞株ＤＦ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１２２０３）において産生される前記ポックスウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ここに提供される発明は、感染初期において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する相補的ＲＮＡをコードする異種核酸を含んでなる組換えポックスウイルスに関する。初期ｄｓＲＮＡは、組換えポックスウイルスの天然遺伝子の両方の鎖を転写することによって生成させることができる。本明細書で提供される組換えポックスウイルスは更に、１以上の共刺激分子をコードする異種核酸、及び／または１以上の感染症関連抗原または腫瘍関連抗原をコードする異種核酸を含んでもよい。これらの組換えポックスウイルスは、初期ｄｓＲＮＡを発現する異種核酸を欠失した同一の組換えポックスウイルスと比較して、被験対象における自然免疫及び獲得免疫の活性化を強化する。ここに提供される組換えポックスウイルスの何れかを含む医薬組成物、並びにそのような組換えポックスウイルスの方法及び使用もまた、本明細書において提供される。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を検出するパターン認識受容体（ＰＲＲ）によって、ウイルスを含む様々な病原体を認識する。ＰＲＲには、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＲＩＧ様ヘリカーゼ（ＲＬＨ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）の科、及びこれまで十分に明らかにされていない他のＰＲＲが包含される（Ｉｗａｓａｋｉ（２０１２），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：１７７−１９６；Ｄｅｓｍｅｔ＆Ｉｓｈｉｉ（２０１２），Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４７９−４９１；Ｍｅｌｃｈｊｏｒｓｅｎ（２０１３），Ｖｉｒｕｓｅｓ．５：４７０−５２７）。ＰＲＲの活性化は、樹状細胞（ＤＣ）を含む種々の免疫細胞の活性化、並びに自然免疫応答及び適応免疫応答の最終的な誘導をもたらす。ＰＲＲの活性化はまた、ＩＦＮ−アルファ（ＩＦＮ−α）及びＩＦＮ−ベータ（ＩＦＮ−β）を含むＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の誘導及び作用を介して、並びに未だ感染していない宿主細胞に警告し免疫応答を調整する他のサイトカイン及びケモカインの誘導及び作用を介して、非免疫細胞における抗ウイルス状態の誘導を導く。Ｉ型ＩＦＮは、例えばＤＣのＭＨＣクラスＩ及びＩＩの発現、の交差提示及び活性化をアップレギュレートすることによって、自然病原体抵抗性のメカニズム、並びに抗体産生及びＴ細胞の活性化を含む免疫応答の多くの側面を調節する（Ｉｗａｓａｋｉ＆Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ（２０１０），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：２９１−２９５；Ｄｅｓｍｅｔ＆Ｉｓｈｉｉ（２０１２），Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２：４７９−４９１）。
【０００３】
生物がウイルスの存在を検出する重要な方法は、正常細胞及び免疫細胞の両方によるウイルスＲＮＡまたはＤＮＡの認識である。ＴＬＲ３、ＴＬＲ７／８、ＴＬＲ９及びＴＬＲ１３は、それぞれ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、ＤＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のための受容体として同定されている。ヘルペスウイルス、アデノウイルス及びポックスウイルスのような二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ゲノムを有するウイルスは、ＴＬＲ９依存性及びＴＬＲ９非依存性の経路によって認識される（Ｈｏｃｈｒｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ  １０１：１１４１６−１１４２１；Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １１８：１７７６−１７８４）。以前の研究によって、ポックスウイルスは、ＴＬＲ９依存性及びＴＬＲ９非依存性の両方の二本鎖ｄｓＤＮＡ認識経路を強力に阻害することが示されている。
【０００４】
ＴＬＲ９を介した免疫細胞によるポックスウイルスＤＮＡの検出は、Ｉ型インターフェロン（即ち、ＩＦＮ−α／β）及びＩＩＩ型インターフェロン（即ち、ＩＦＮ−λ）、並びに他のサイトカイン及びケモカインの産生をもたらす（Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  ２０７：２７０３−２７１７；  Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １１８：１７７６−１７８４）。形質細胞様樹状細胞ＤＣ（ｐＤＣ）は、ＴＬＲ７／８またはＴＬＲ９依存性刺激に応答して、大量のＩＦＮ−Ｉ及びＩＦＮ−ＩＩＩを産生することが選択的に可能である。ｐＤＣにおいて、ＴＬＲ９依存性の刺激はＩＦＮ−Ｉ及びＩＦＮ−ＩＩＩの産生を導く。ＤＮＡ及び他のウイルスの核酸の両方が、感染細胞の細胞質内で認識され、それによってこれらの細胞に対して、他のサイトカインの中でもＩＦＮ−Ｉ及びＩＦＮ−ＩＩＩを生産するように警告を与える。ポックスウイルス認識のＴＬＲ９非依存性経路は主に、従来の樹状細胞（ｃＤＣ）の種々のサブセットによって採用されている（Ｈｏｃｈｒｅｉｎ  ＆  Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ（２００８），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １８３：１５３−１７９）。
【０００５】
ウイルス感染のもう一つの重要なサインはｄｓＲＮＡであり、これはＲＮＡウイルスによる細胞の感染の際に生成されるだけでなく、ｄｓＤＮＡゲノムを有するポックスウイルスによる感染によっても生成される。ポックスウイルス感染におけるｄｓＲＮＡは、二本鎖ｄｓＤＮＡゲノムの上部鎖及び下部鎖の両方に位置する遺伝子からの転写を重ね合わせることにより生成される。特に、中間及び後期遺伝子の転写の終結は厳密には調節されておらず、長さが不均一な長い３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を備えたウイルスｍＲＮＡを導く（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｗｉｔｔｅｋ，ａｎｄ  Ｍｏｓｓ（１９８１），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ３９：７３３−７４５；Ｘｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ７２：７０１２−７０２３）。このような転写物が反対向きの二つの隣接する遺伝子から生じる（即ち、相互に相向かって転写される）とき、転写は、相互のアニール、または初期転写物とのアニールにより、ｄｓＲＮＡを形成する重なった相補的ｍＲＮＡストレッチを生じる（Ｂｏｏｎｅ，Ｐａｒｒ，ａｎｄ  Ｍｏｓｓ  （１９７９），Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．３０：３６５−３７４）。ウイルスｄｓＲＮＡの産生は、ポックスウイルス複製サイクルの後期に大きく限定されるようである（Ｃｏｌｂｙ＆Ｄｕｅｓｂｅｒｇ（１９６９），Ｎａｔｕｒｅ  ２２２：９４０−９４４；Ｄｕｅｓｂｅｒｇ  ＆  Ｃｏｌｂｙ（１９６９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ  ６４：３９６−４０３；Ｍｏｓｓ（２００７），５：２９０５−２９４５）。ウイルス転写からのｄｓＲＮＡが感染初期に見られることが、以前に報告されている（Ｂｏｏｎｅ，Ｐａｒｒ，ａｎｄ  Ｍｏｓｓ（１９７９），Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ３０：３６５−３７４；Ｌｙｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９１：１７７−１８６；Ｗｉｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９４：７３−８１；Ｗｉｌｌｉｓ，Ｌａｎｇｌａｎｄ，ａｎｄ  Ｓｈｉｓｌｅｒ（２０１１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８６：７７６５−７７７８）。しかし、例えば、反対方向に転写される隣接した初期遺伝子転写の効率的な転写終結を確保することにより、細胞認識系をトリガーするための十分な量の初期ｄｓＲＮＡの生成を防止する選択圧が存在するように思える（Ｓｍｉｔｈ，Ｓｙｍｏｎｓ，ａｎｄ  Ａｌｃａｍｉ（１９９８），Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８：４０９−４１８）。ポックスウイルスは、この配列の２０〜５０ヌクレオチド下流の早期転写を終結させる、コード鎖上の配列ＴＴＴＴＴＮＴを伴った特定の早期終了信号を進化させてきた（Ｙｕｅｎ  ＆  Ｍｏｓｓ（１９８７），Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ  ８４：６４１７−６４２１）。相互に対向して転写される初期遺伝子は、典型的には複数の終結信号を含んでおり、感染初期において相補的ＲＮＡの生産を回避するためには、このような遺伝子の即時の初期転写終結の厳密な制御が、ウイルス適応性にとって重要であると思われることを示している。
【０００６】
宿主細胞及び生物は、ウイルス感染を検出するための種々のｄｓＲＮＡ認識受容体を考案してきた。ＴＬＲ３は主に免疫細胞で発現され、細胞外のｄｓＲＮＡを感知できるが、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ−５、ＤＤＸ１／ＤＤＸ２１／ＤＨＸ３６、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、及び２’−５’−オリゴアデニレートシンテターゼ（２’−５’−ＯＡＳ）のような殆どの他のｄｓＲＮＡセンサーは、宿主の器官及び細胞型において遍在的に発現され、細胞質中に局在する。Ｉ型ＩＦＮ誘導に関して、ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ−５は、ウイルス感染を検出するための最も重要な細胞質ゾルｄｓＲＮＡセンサーを表すと考えられている（Ｍｅｌｃｈｊｏｒｓｅｎ（２０１３），Ｖｉｒｕｓｅｓ．  ５：４７０−５２７）。もう一つの重要なｄｓＲＮＡセンサー、即ち、ｄｓＲＮＡ活性化プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）は、主に細胞及びウイルスの翻訳停止をもたらす翻訳伸長因子ｅｌＦ２αのリン酸化を介して抗ウイルス的役割を発揮し、それによってウイルス複製を制限すると考えられている。（Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７０：１０３２−１０６０；Ｗｉｌｌｉａｍｓ（１９９９），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：６１１２−６１２０）。Ｉ型ＩＦＮの誘導においては、ＰＫＲが役割を有するとの証拠も存在する。（Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｊ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．  ９０：１３８２−１３９１；Ｇｉｌｆｏｙ  ＆  Ｍａｓｏｎ（２００７），Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８１：１１１４８−１１１５８）。
【０００７】
ｄｓＲＮＡによりトリガーされる抗ウイルス作用を阻害するために、ポックスウイルスは、少なくとも二つのタンパク質であるＥ３及びＫ３を、重要なｄｓＲＮＡセンサーＰＫＲの阻害に捧げてきた。これら両方のウイルスタンパク質は広く研究されてきた。なかでもＥ３は中心的である思われる。Ｅ３はｄｓＲＮＡに結合して隔離し、ＰＫＲの活性化を阻害する。Ｅ３Ｌ遺伝子（ＶＡＣＶ−ΔＥ３Ｌ）を欠失したワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）変異体は、限定された宿主範囲を有していて、多くの細胞型においてアポトーシスを誘導し（Ｈｏｒｎｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：８３９４−８４０７；Ｋｉｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７１：１９９２−２００３）、ＰＫＲ媒介アポトーシスがＶＡＣＶ感染細胞におけるＰＫＲ活性化の主要な結果であることを示唆している。しかし、ＩＦＮＩ処理に対するＶＡＣＶ−ΔＥ３Ｌのより高い感度（Ｂｅａｔｔｉｅ，Ｐａｏｌｅｔｔｉ，ａｎｄ  Ｔａｒｔａｇｌｉａ（１９９５），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１０：２５４−２６３）、及びＥ３欠失ＶＡＣＶ突然変異体で感染されたプレアポトーシス細胞におけるより高いＩＦＮ−α／β誘導もまた報告されている（Ｈｏｒｎｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：８３９４−８４０７）。ここでは、修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）及び漿尿膜ワクシニアウイルス・アンカラ（ＣＶＡ）を感染させた細胞において、検出可能な細胞死またはアポトーシスを誘導することなく、しかしＩＦＮ−α／β及び他のケモカイン及びサイトカインの大量の放出をトリガーして、ＰＫＲ活性化を誘導する方法を説明する。これは、ＤＮＡ複製の開始前の感染初期にｄｓＲＮＡを発現させることによって達成された。ｄｓＲＮＡの安定な発現は、組換え遺伝子の２つの独立した挿入物からの２つの相補的ｍＲＮＡの転写によって達成された。ＣＶＡの場合、Ｉ型ＩＦＮ誘導はマウスにおいて殆ど非病原性感染を導き、その結果は、機能的なＩ型ＩＦＮシステムの存在に依存した。
【０００８】
ＭＶＡは、完全な複製能を持った天然痘ワクチン株である漿尿膜ワクシニアウイルス・アンカラ（ＣＶＡ）の、ニワトリ胚線維芽細胞での５７０世代を超える継代によって開発された（Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ−Ｈｅｎｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８８：３２４９−３２５９）。複製能力のあるＣＶＡは、ＩＦＮ−Ｉ誘導性に乏しいのに対して、複製が制限されたＭＶＡはむしろ効率的にＩＦＮ−Ｉを誘導することが示された（Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １１８：１７７６−１７８４）。ＩＦＮ−Ｉ産生のＣＶＡ阻害は、Ｂ１９Ｒ遺伝子によりコードされるポックスウイルスのＩＦＮ−Ｉ結合タンパク質（ＩＦＮ−ＩＲ）によって、部分的に媒介された。Ｂ１９タンパク質はＩＦＮ−αに結合し、従ってその生物活性を阻害する。加えて、Ｉ型インターフェロンへのＢ１９の結合はまた、抗体ベースの分析技術によるＩＦＮ−α／βの検出を妨げ、Ｂ１９タンパク質もまたヒトＩＦＮ−βに結合することを示す。ヒトシステムとは対照的に、Ｂ１９はマウスＩＦＮ−βに結合しない。Ｂ１９ＲＯＲＦによりコードされるポックスウイルスＩＦＮ−Ｉ結合タンパク質の相同体は、多くのポックスウイルス種に存在しており、ＩＦＮ−Ｉの活性を阻害するためのこの機構が、ポックスウイルスにおいてより一般的に保存されていることを示唆する。例えば、図１７参照。
【０００９】
Ｂ１９のＩ型ＩＦＮ結合活性は、ＩＦＮ−Ｉエフェクター機能または誘導を抑制するために、ポックスウイルスが用いる唯一の阻害機構ではない。ポックスウイルスは、その宿主のインターフェロンＩ型システムを破壊する多くの因子をコードする。インターフェロンは、それらがＩＦＮ受容体を発現する細胞において抗ウイルス状態を誘導し、宿主の自然免疫応答及び適応免疫応答を調節するので、抗ウイルス防御において極めて重要である。インターフェロン系に対抗する既知のポックスウイルス因子の中には、それぞれ、Ｉ型及びＩＩ型インターフェロンに結合して中和する分泌された受容体様タンパク質Ｂ１９及びＢ８がある。ＶＡＣＶ  Ｅ３、Ｋ７、Ｃ６、Ｎ１、Ｃ７、Ｋ１、Ｋ３及びＨ１のような他のポックスウイルスタンパク質は、Ｉ型インターフェロンの誘導を阻害し、またはインターフェロンシグナリング及びエフェクター経路を遮断する。ポックスウイルスが、インターフェロン系に対抗するためのこのような多数のタンパク質をコードするという事実は、感染した宿主生物によるポックスウイルスの抑制及び最終的なクリアランスのための、この自然免疫防御のシステムの重要性を強調している。インターフェロン系とは別に、オルソポックスウイルスは、ＩＬ−１β、ＩＬ−１８のようなサイトカイン、及びＶＡＣＶ  Ｂ１６Ｒ、ＷＲ０１３、Ｃ２３Ｌ／ｖＣＣＩを含むケモカインの誘導、または機能を妨害する他の免疫調節タンパク質をコードする。これらのサイトカインは、病原体の拡散を制限し、深刻な病原体に誘導された損傷からホストを保護する上で重要である。パターン認識経路を破壊するポックスウイルスタンパク質は、ＩＦＮ、並びに他のサイトカイン及びケモカインの誘導を阻止する上で普遍的に有効である。
【００１０】
従って、本発明の主要な目的は、細胞性ｄｓＲＮＡセンサによるポックスウイルスの認識を高めること、並びに、ＭＶＡにより誘導される自然免疫の活性化を増大させることである。本明細書に開示されるのは、ゲノム内の２つの別々の場所に２つの部分的に同一のＤＮＡを挿入することにより、感染初期にｄｓＲＮＡを生成するように加工された組換えポックスウイルスである。これらのＤＮＡは、一方のＤＮＡが「センス」転写物を産生し、他方が相補的な「アンチセンス」転写物を産生するように指向された強い初期プロモーターに動作可能に連結されている。これら部分的にまたは完全に相補的な二つの転写物は、その後にアニールしてｄｓＲＮＡを生成する。ＩＦＮ−β、即ち、自然免疫活性化の重要なマーカーの効率的な誘導が、広いサイズ範囲に亘り初期ｄｓＲＮＡを用いて観察されたが、相補的な転写物が５０塩基対まで短縮化されるときには効率低下が伴った。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、感染初期に過剰な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を発現する異種核酸を含んでなる組換えポックスウイルスを包含する。一つの実施形態において、本発明は、脊椎動物被験対象に組換えポックスウイルスを投与することを含んでなる自然免疫活性化を増強する方法であって、前記投与は、前記被験対象におけるＩ型インターフェロン（Ｉ型ＩＦＮ）、サイトカイン及びケモカインの産生を増強する方法を包含する。
【００１２】
更なる実施形態において、前記組換えポックスウイルスは天然のポックスウイルス配列、好ましくは初期遺伝子、より好ましくは即時初期遺伝子の両方の鎖から、センス及びアンチセンスＲＮＡを転写する。
【００１３】
更なる実施形態において、前記組換えポックスウイルスは、異種配列の両方の鎖から、センス及びアンチセンスＲＮＡとして異種核酸を転写する。
【００１４】
更なる実施形態において、本発明は、過剰な早期ｄｓＲＮＡの発現によって、チョルドポックスウイルス亜科由来の標準の複製能を有するワクシニアウイルス株及び他の種を弱毒化させる方法を包含する。
【００１５】
種々の実施形態において、ポックスウイルスは更に、１以上の共刺激分子をコードする異種配列を含んでいる。
【００１６】
種々の実施形態において、ポックスウイルスは、１以上の細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、または腫瘍抗原をコードする異種配列を含んでいる。
【００１７】
種々の実施形態において、ポックスウイルスは、オルソポックスウイルス、パラポックスウイルス、ヤタポックスウイルス、アビポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、カプリポックスウイルス、セルビドポックスウイルス（ｃｅｒｖｉｄｐｏｘｖｉｒｕｓ）、またはモルシポックスウイルスである。オルソポックスウイルスは、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、及びサル痘ウイルスからなる群から選択することができる。ワクシニアウイルスは、改変されたワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）、例えば、改変されたワクシニアウイルス・アンカラ・ババリアンノルディック（ＭＶＡ−ＢＮ）であってよい。
【００１８】
種々の実施形態において、ｄｓＲＮＡを生じる異種もしくは内因性の核酸は、部分的もしくは完全に相補的なＲＮＡ転写物をコードする配列を含み、該ＲＮＡ転写物の相補的な部分は転写後にアニールしてｄｓＲＮＡを形成する。
【００１９】
種々の実施形態において、完全にまたは部分的に相補的なＲＮＡ転写物をコードする異種核酸は、相補的領域内において同一であるか、または相補的な領域内において９９％超、９５％超、９０％超、８０％超、または７０％超の類似性を有している。
【００２０】
本発明の追加の目的及び利点は、一部は以下の説明に記載され、また一部は該説明から明らかになるか、または本発明の実施によって知ることができるであろう。本発明の目的及び利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される要素及び組み合わせによって、実現及び達成されるであろう。
【００２１】
上記の一般的説明及び以下の詳細な説明は、何れも例示であって説明に過ぎず、特許請求の範囲に記載の本発明を限定するものでないことが理解されるべきである。
【００２２】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなす添付の図面は、本発明の一つまたは幾つかの実施形態を例示しており、前記説明と共に本発明の原理を説明するために役立つものである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】初期ｄｓＲＮＡを過剰産生するＣＶＡ変異体と、対応する対照突然変異体の概略的表現を図示している。ボックスは、ＯＲＦのＢ１４ＲとＢ２０Ｒの間のゲノム領域におけるＣＶＡ・ＯＲＦを表しており、一定の縮尺では描かれていない。Ｂ１５・ＯＲＦのＣＶＡバージョンを表すボックスは黒で示されているのに対して、Ｂ１５ＲのＭＶＡバージョンはダイヤモンドパターンにより示されている。斜線のボックスは、Ｂ１９Ｒ・ＯＲＦを表す。他の全てのＯＲＦは灰色ボックスとして示される。種々の欠失変異体においてＣＶＡ・ＯＲＦを置換する細菌選択マーカー（ｎｅｏｒ及びｚｅｏｒ）が、特定のマーカーの表示と共に小さいボックスとして示されている。
【図２】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５変異体及び関連のＣＶＡ変異体の病原性を示している。６〜８週齢の３〜５匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、示されたＣＶＡ変異体の精製株５×１０７（Ａ、Ｂ右パネル）または１０７（Ｂ左パネル、Ｃ）のＴＣＩＤ５０を含有する５０μｌの接種菌液で鼻腔内感染させた。Ａ）及びＢ）は異なる組のＣＶＡ変異体を用いた独立の実験結果を示している。動物は毎日検査され、指示された日に計量された。体重データは、第０日の初期平均体重からの各々の群の平均体重＋／−ＳＥＭのパーセンテージとして表される。ダガーはそれぞれの日に死んだ動物の数を示している。Ｃ）１０７ＴＣＩＤ５０の指示されたウイルスの精製株で鼻腔内感染させた６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの肺を、感染後６日目に回収した。肺をホモジナイズし、ＣＶ−１細胞を用いた標準的なＴＣＩＤ５０アッセイによってウイルス力価を決定した。示されているのは、ウイルス当たり合計８匹のマウスを用いた２つの独立した実験での、肺における総ウイルス力価の平均である。＊＊＊はｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定による）である。
【図３】ＩＦＮＡＲ０／０マウスにおける、ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５の病原性を示している。Ａ）９〜１８週齢の雄及び雌の両方の表示された数のＣ５７ＢＬ／６−ＩＦＮＡＲ０／０のマウスを、２×１０６ＴＣＩＤ５０の粗製ウイルス株、またはＣＶＡ及びＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５の１０７ＴＣＩＤ５０の精製株を含有する５０μＬ接種菌液で鼻腔内感染させた。動物は毎日検査され、指示された日に計量された。体重データは、第０日の初期平均体重からのそれぞれの群の平均体重＋／−ＳＥＭのパーセンテージとして表される。Ｂ）Ａに示したマウスの生存率。
【図４】ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５による、ＤＣにおけるＩＦＮ−α及びＩＦＮ−λの誘導を示している。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＦＬ−ＤＣを、１８時間に亘り、指定されたＭＯＩにおいて指示されたウイルスで感染させた。ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−λについて、ＤＣ培養上清をＥＬＩＳＡにより分析した。ＣＶＡ及びＣＶＡ−ΔΒ１５は、検出可能な量のＩＦＮ−αを誘導しなかった。
【図５】ｎｅｏカセット挿入物による、Ａ３１細胞でのＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５によるＩＦＮ−β・ｍＲＮＡ誘導の動力学と、ｎｅｏカセット挿入物の役割を示している。Ａ）マウスＢＡＬＢ／３Ｔ３  Ａ３１細胞はモック感染され、或いはＢＡＣ由来のＭＶＡまたはＣＶＡ野生型の精製株、並びにＣＶＡ変異体であるＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５及びＣＶＡ−ΔＢ１５の精製株で、１０のＭＯＩで指示された時間に亘って感染された。細胞を溶解し、該細胞溶解物からＱＩＡＧＥＮ・ＲＮｅａｓｙキットを使用してＲＮＡを調製した。ゲノムＤＮＡ混入物をＱＩＡＧＥＮ社のＤＮＡ除去（ｇＤＮＡ）カラムを使用して除去し、続いて３７℃で１時間、ターボＤＮＡｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ社）で追加のＤＮＡｓｅ処理を行い、その後、６５℃で１０分間、ＤＮＡｓｅの熱不活性化を行った。ＩＦＮ−β・ｍＲＮＡレベルを、マウスＩＦＮ−βのための商業的遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定した。モック感染細胞におけるＩＦＮ−β・ｍＲＮＡのレベルと比較したときのＩＦＮ−β・ｍＲＮＡの増加倍数として表現された、感染細胞におけるＩＦＮ−β転写物のレベルが示されている。Ｂ）Ａ３１細胞は、１０のＭＯＩで６時間に亘りモック感染され、またはＣＶＡ及び指定されたＣＶＡ変異体の粗製株（概要については図１を参照のこと）で感染された。ＩＦＮ−β・ｍＲＮＡの定量のＲＮＡ調製は、Ａ）に記載したようにして行った。ＩＦＮ−β・ｍＲＮＡの増加倍数として表現された、モック感染細胞におけるＩＦＮ−β・ｍＲＮＡのレベルと比較したときの、感染細胞におけるＩＦＮ−β転写物のレベルが示されている。１：ＣＶＡ；２：ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５／Ｂ１９；３：ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５；４：ＣＶＡ−ΔＢ１５；５：ＣＶＡ−ｚｅｏ−ΔΒ１５；６：ＣＶＡ−ΔｐＢ１５−ｎｅｏ−ΔＢ１５；７：モック。
【図６】ｄｓＲＮＡを産生するＭＶＡ変異体のＥＧＦＰ及びｎｅｏ挿入物の概略図を示している。ｐＳ、ｐＨｙｂまたはｐＢ１５Ｒプロモータによって制御されるｎｅｏ及びＥＧＦＰコード配列の転写方向（黒矢印）が示されている。ＯＲＦ及び他の全ての要素は一定の縮尺で描かれてはいない。Ａ）ｎｅｏ・ＯＲＦは、ＢＡＣカセット（Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ  ２０１０）内のｎｅｏ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ選択カセットの一部である。後者は、遺伝子間領域（ＩＧＲ）Ｉ３Ｌ／Ｉ４Ｌ（ＭＶＡ０６４／０６５）の中に挿入される。ｎｅｏ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰカセットは、ｐＳプロモータ（矢印で示す）の制御下で転写されるのに対して、Ｂ１５Ｒ遺伝子座におけるｎｅｏ／ｒｐｓＬカセットは、Ｂ１５Ｒプロモータの制御下に逆向きに転写される。一ＭＶＡ構築物内のｎｅｏ・ＯＲＦは、単一のミスマッチを伴って、７９２ｎｔ（グレーのボックスによって示される）だけ重複する。ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔΒΙ５／ΔΒΑＣにおいて、ＩＧＲ・Ｉ３Ｌ／Ｉ４Ｌ内の完全なＢＡＣカセットは、Ｃｒｅ／ｌｏｘ組換えを介して削除された。Ｂ）ここでの全てのＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ構築物はＭＶＡ組換え体に基づいており、該組換え体からはＢＡＣカセット内のｎｅｏ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰカセットが削除されていた。ＭＶＡ−ＥＧＦＰでは、ｎｅｏ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰカセットがｎｅｏ遺伝子に置き換えられた。ＭＶＡ−ＥＧＦＰにおいてセンス方向で転写されたＥＧＦＰ・ＯＲＦは、ＯＲＦのＡ２５ＬとＡ２６Ｌの間（ＭＶＡ１３６／１３７）でＩＧＲに挿入されるのに対して、アンチセンスで転写されたＥＧＦＰ・ＯＲＦは、ＩＧＲ・Ｊ２Ｒ／Ｊ３Ｒ（ＭＶＡ０８６／０８７）に挿入される。重複する相補的なＥＧＦＰ転写物によって形成される潜在的ｄｓＲＮＡストレッチは、灰色のバーで示されている。ＭＶＡ−ＥＧＦＰ及びＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰについては、隣接するＯＲＦのみが示されている。アンチセンスＥＧＦＰ転写物の３’末端におけるｌａｃＺα配列はＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰに単独で挿入され、ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５中の相補的ｎｅｏ転写物の集団に一致するように、非相補的な３’オーバーハングとして働く。ＭＶＡ−ＥＧＦＰには、ＥＧＦＰ・ＯＲＦの下流の細菌プロモータの制御下にあるＦＲＴ部位に隣接した、追加のｎｅｏ挿入物が含まれている。ＦＬＰ／ＦＲＴ組換えにより、全てのＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ構築物においてこの選択マーカーは除去された。
【図７】ｄｓＲＮＡを産生するＭＶＡの変異体によるマウスＡ３１細胞でのＩＦＮ−β・ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現の誘導を示している。マウスＢＡＬＢ／３Ｔ３  Ａ３１細胞は、ＭＶＡ−ｗｔの粗製ウイルス標本、またはｎｅｏ（Ａ、Ｂ）もしくはＥＧＦＰ（Ｃ、Ｄ）の単一または重複転写物を発現する指定されたＭＶＡの変異体で、モック感染または感染された。Ａ）及びＣ）における細胞は、ＩＦＮ−βの転写産物の分析のための回収前に、５時間（黒棒）及び７時間（灰色のバー）感染された。ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５感染によるＩＦＮ−β遺伝子の誘導が、Ａ）において示されている。細胞溶解物からＱＩＡＧＥＮ・ＲＮｅａｓｙキットを使用してＲＮＡを調製した。ゲノムＤＮＡ混入物をＱＩＡＧＥＮ社のＤＮＡ除去（ｇＤＮＡ）カラムを使用して除去し、続いて３７℃で１時間、ターボＤＮＡｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ社）で追加のＤＮＡｓｅ処理を行い、その後、６５℃で１０分間、ＤＮＡｓｅの熱不活性化を行った。ＩＦＮ−β・ｍＲＮＡレベルを、マウスＩＦＮ−βのための商業的な遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＲＴ−ｑＰＣＲにより決定した。ＲＴ反応においてＲＴ酵素が省略されたときに、混入ＤＮＡが存在しないことは、ＲＴ−ｑＰＣＲのネガティブな結果によって実証された。モック感染細胞におけるＩＦＮ−β・ｍＲＮＡのレベルと比較したときの、感染細胞におけるＩＦＮ−β転写物のレベルが示されている。ＩＦＮ−βのＣｔ値は、細胞の１８Ｓ・ｒＲＮＡについてのＣｔ値を用いて正規化された。ＩＦＮ−βタンパク質レベルが、１８時間（Ｂ）または２３時間（Ｄ）感染された細胞の上清中で測定された。上清を回収し、市販のＥＬＩＳＡ（ＰＢＬ）を使用して、マウスＩＦＮ−βについて検査した。実験Ａ及びＣに示した感染は一つの実験に由来するのに対して、実験Ｂ）及びＤ）は独立したものであった。Ａ）１：ＭＶＡｗｔ、２：ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５；３、ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５／−ΔＢａｃ、４：ＭＶＡ−ΔＢ１５、５：ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５、６：モック。Ｂ）１：ＭＶＡ  ｗｔ、２：ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔΒ１５、３：ＭＶＡ−ΔΒ１５、４：モック、５：培地。Ｃ）１：ＭＶＡ−ＥＧＦＰ、２：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ、３：モック。Ｄ）１：ＭＶＡ−ＥＧＦＰ、２：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ、３：モック。
【図８】ｄｓＲＮＡ発生のタイミングに応じた、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰによるＩＦＮ−β・ｍＲＮＡ発現の誘導を示している。「ＩＦＮ−β・ｍＲＮＡの増加倍数」として表現された、モック感染細胞におけるＩＦＮ−β・ｍＲＮＡのレベルと比較したときの感染細胞におけるＩＦＮ−β転写物のレベルが示されている。Ａ）ｗｔ−ＭＥＦはモック感染され、またはＭＶＡ−ＥＧＦＰ（センス転写物を生じる唯一のＥＧＦＰ挿入物を含む参照ウイルス）、陽性対照としてのＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−２、またはＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ（ウイルスｄｓＲＮＡ結合性タンパク質Ｅ３をコードする遺伝子を欠失している）の精製株で５時間、１０のＭＯＩにて感染された。細胞は、未処理のまま残されるか（黒棒）、または最終濃度４０μｇ／ｍＬのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、白棒）で処理され、これは初期段階におけるウイルスＤＮＡの複製を妨げて感染を阻止する。図７の凡例に示したようにして、ＲＴ−ｑＰＣＲにより細胞溶解物からＲＮＡを調製し、ＩＦＮ−β・ｍＲＮＡレベルを分析した。Ｂ）ｗｔ−ＭＥＦをモック感染させ、またはＭＶＡ−ＥＧＦＰ、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰもしくはＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−後期の粗製株（これはババリアンノルディックが開発した強力かつ排他的な後期プロモータ（ＳＳＬ）の制御下で、アンチセンスＥＧＦＰカセットを発現する）で５時間感染させた。図７の凡例に示したようにして、ＲＴ−ｑＰＣＲにより細胞溶解物からＲＮＡを調製し、ＩＦＮ−β・ｍＲＮＡレベルを分析した。
【図９】Ａ３１細胞における、ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５及びＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰによるＰＫＲの活性化を示している。マウスＡ３１細胞が播種後の第１日に、１０のＭＯＩにおいて、指示されたウイルスの粗製株で感染された。感染後の示された時間に調製された細胞溶解物中におけるｅｌＦ２aのリン酸化（Ｐ−ｅｌＦ２a）が、１：１０００希釈のｅｌＦ２aのホスホ−エピトープＳｅｒ５１に対する抗体（抗体＃９７２１、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いたイムノブロットによって分析された。ローディング対照として、イムノブロット膜の別々の部分を、マウスβチューブリンアイソタイプＩを検出する抗体を用いて現像した。
【図１０】ＭＥＦにおいてＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰによるＩＦＮ−β・ｍＲＮＡの増大した誘導がＰＫＲに依存することを示している。ｗｔ−ＭＥＦ及びＰＫＲ欠乏（ＰＫＲ０／０）ＭＥＦを、１０のＭＯＩで５時間、ＭＶＡ−ＥＧＦＰまたはＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰの精製株を用いて感染させ、またはモック感染させた。市販のセンダイウイルス（ＳｅＶ）の１：１００希釈標本１ｍＬを、ＰＫＲに依存しないがｄｓＲＮＡに依存するＩＦＮ−β誘導のための陽性対照として使用した。Ａ）図７の凡例に示したようにして、ＲＴ−ｑＰＣＲにより細胞溶解物からＲＮＡを調製し、ＩＦＮ−β・ｍＲＮＡのレベルを分析した。「ＩＦＮ−β・ｍＲＮＡの増加倍数」と表現された、モック感染細胞でのＩＦＮ−β・ｍＲＮＡレベルに対するＩＦＮ−β転写物のレベルが示されている。１：ＭＶＡ、２：ＭＶＡ−ＥＧＦＰ、３：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ、４：センダイウイルス、５：モック。Ｂ）ＩＦＮ−βタンパク質レベルが、２４時間感染させた細胞の上清中で測定された。上清を回収し、市販のＥＬＩＳＡ（ＰＢＬ）を使用することによりマウスＩＦＮ−βについて検査した。１：ＭＶＡ、２：ＭＶＡ−ＥＧＦＰ、３：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ、４：センダイウイルス、５：モック。
【図１１】ｄｓＲＮＡを産生するＭＶＡ組換え体による、ＩＦＮ−βのＰＫＲ依存性誘導の長さ要件を示している。ｗｔ−ＭＥＦ及びＰＫＲ０／０−ＭＥＦは、１０のＭＯＩで３７℃において５時間（Ａ，Ｃ）または２４時間（Ｂ）、ＭＶＡ−ＥＧＦＰまたは次第に短縮されたＥＧＦＰ・ＯＲＦ重複を有する指定されたＥＧＦＰ−ｄｓＲＮＡ変異体（図６Ｂ参照）の粗製株を用いて感染され、またはモック感染された。市販のセンダイウイルス（ＳｅＶ）の１：１００希釈標本１ｍＬを、ｄｓＲＮＡに依存するがＰＫＲに依存しないＩＦＮ−β誘導のための陽性対照として使用した。モックに対するＩＦＮ−β・ｍＲＮＡの誘導倍率は、図７の凡例で記載したようにして細胞から単離された全ＲＮＡを使用して、ＲＴ−ｑＰＣＲにより決定された。ＩＦＮ−β・ｍＲＮＡについてのＣｔ値は、内因性の対照として働く１８Ｓ・ｒＲＮＡのＣｔ値で補正された。Ｂ）ＩＦＮ−βタンパク質レベルが、指示されたＭＶＡ組換え体で２４時間感染させたｗｔＭＥＦ及びＰＫＲ０／０−ＭＥＦの上清中で測定された。上清を回収し、市販のＥＬＩＳＡ（ＰＢＬ）を使用して、マウスＩＦＮ−βについて検査した。ＭＶＡ−ΔＢ１５は、追加の参照として含められた。Ａ）１：ＭＶＡ、２：ＭＶＡ−ＥＧＦＰ、３：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ、４：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−２、５：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−３、６：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−４、７：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−５、８：センダイウイルス、９：モック、Ｂ）１：ＭＶＡ、２：ＭＶＡ−ＥＧＦＰ、３：ＭＶＡ−ΔＢ１５、４：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ、５：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−２、６：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−３、７：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−４、８：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−５、９：センダイウイルス、１０：モック、Ｃ）１：ＭＶＡ−ＥＧＦＰ、２：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ、３：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−６、４：モック。
【図１２】ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰの複製及び表現型の安定性を示している。Ａ）ＭＶＡ−ＥＧＦＰ及びＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰの複製挙動の分析のために、１０６の二次ＣＥＦ細胞の単層に、これらのウイルスを０．０２５のＭＯＩで三重に感染させた（マルチサイクル分析）。示された時間でのウイルスの出力がプロットされており、各データ点は、３つの独立したウエルからの結果を表す。Ｂ）１０６のヒトＨｅＬａ細胞及びＨａＣａＴ細胞、及びサルＣＶ−１細胞の単層に、ＭＶＡ−ＥＧＦＰまたはＭＶＡｄｓ−ＥＧＦＰを、０．０２５のＭＯＩで三重に感染させた。感染後３日におけるウエル当たり５×１０４  ＴＣＩＤ５０の入力に対するウイルス出力の比率がプロットされている。各データ点は、３つの独立したウェルからの単回の滴定結果を表す。Ｃ）本文中に記載されているように、二次ＣＥＦ細胞の単層に、ＤＦ−１細胞中で１回（Ｐ１）または１０回（Ｐ１０）継代された指示されたウイルスを、１０のＭＯＩで５時間感染させた。感染細胞におけるＩＦＮ−β・ｍＲＮＡのモックに対する誘導倍率が、図７の凡例に記載の細胞から単離した全ＲＮＡを用いたＲＴ−ｑＰＣＲにより決定した。１：ＭＶＡ−ＥＧＦＰ−Ｐ１、２：ＭＶＡ−ＥＧＦＰ−Ｐ１０、３：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ  Ｐ１、４：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ  Ｐ１０、５：モック。
【図１３】Ｃ５７ＢＬ／６ｗｔ、ＩＰＳ−１０／０及びＰＫＲ０／０マウスおける、変異体ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰによるサイトカイン発現の誘導を示している。８〜１２週齢の、示された株の５匹のマウスの群（Ｂ６＝Ｃ５７ＢＬ／６ｗｔ）は、マウス当たり１０８ＴＣＩＤ５０の用量で、示されたウイルスを静脈内感染させた。動物は感染後６時間で採血され、血清より、ベンダー・メドシステムズ社（Ｂｅｎｄｅｒ  Ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ）から入手したビーズベースのフローサイトメトリーアッセイを用いて、指定されている選択されたサイトカインの濃度を分析した。Ａ）ＩＦＮ−α。Ｂ）ＩＦＮ−γ。Ｃ）ＩＬ−６。Ｄ）ＩＬ−１８。Ｅ）ＣＸＣＬ１。Ｆ）ＣＣＬ２。Ｇ）ＣＣＬ５。
【図１４】マウスにおける、ＭＶＡ−ＥＧＦＰ及び変異体ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰによるＭＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の誘導を示している。Ａ）８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス３〜５匹のグループが、１０８ＴＣＩＤ５０／マウスの用量で静脈内において１回（Ａ）、示されたウイルスで感染された。感染後７日に脾臓を採取し、Ｂ８２０−２７エピトープ特異的デキストラマーを使用したＭＨＣクラスＩデキストラマー染色によりＭＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を定量するために、単一細胞脾臓細胞懸濁液を使用した。２つの独立した実験からの組み合わされた結果が示されている。星印は、対応のないスチューデントの両側ｔ検定におけるｐ値＜０．０５を示している。
【図１５】ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ変異体による、ヒトＭＲＣ−５細胞でのＩＦＮ−β・ｍＲＮＡ発現の誘導を示している。６ウェルプレート中のＭＲＣ−５細胞（ヒト二倍体肺線維芽細胞）が、ＭＶＡｗｔに対応するＭＶＡ−ＥＧＦＰ及び次第に短くなるＥＧＦＰ・ＯＲＦ重なりを備えた指定された組み換えＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰの粗製株で感染またはモック感染された。これに加えてＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５及びＭＶＡ−ΔＢ１５を使用し、図７の凡例に示したように、感染５時間後の細胞から単離された全ＲＮＡを用いたＲＴ−ｑＰＣＲによりＩＦＮ−β・ｍＲＮＡのモックに対する誘導倍数を測定した。ＩＦＮ−βのＣｔ値は、内因性の対照として働く細胞性１８Ｓ・ｒＲＮＡについてのＣｔ値を用いて正規化した。示されているのは、「ＩＦＮ−β・ｍＲＮＡの誘導倍率」と表現されたモック感染細胞におけるＩＦＮ−β・ｍＲＮＡのレベルと比較した、感染細胞におけるＩＦＮ−β転写物のレベルである。１：ＭＶＡ、２：ＭＶＡ−ＥＧＦＰ、３：ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５、４：ＭＶＡ−ΔＢ１５、５：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ、６：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−２、７：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−３、８：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−４、９：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−５、１０：モック。
【図１６】ＭＶＡ−ｄｓＥ３Ｌ及びＭＶＡ−ｄｓＥ３ＬによるＩＦＮ−β遺伝子誘導の概略図を示している。Ａ）変異体ＭＶＡ−ｄｓＥ３Ｌの模式図。ネイティブｐＥ３Ｌ及び挿入されたｐＨ５ｍプロモータによるＥ３Ｌコード配列の転写方向（黒矢印）が示されている。初期転写終結シグナル（ＥＴＴＳ’ｓ）は垂直灰色バーで示されている。灰色の矢じりは、ＥＴＴＳが潜在的にアクティブである転写方向を示している。Ｅ３Ｌ・ＯＲＦにおけるアンチセンスＥＴＴＳは、Ｅ３のアミノ酸配列を変更することなく、コドン内の不安定位置の部位特異的突然変異誘発により不活性化された。二つの相補的Ｅ３Ｌ転写物によって形成される潜在的ｄｓＲＮＡストレッチが、灰色のバーで示されている。Ｂ）６ウェルプレートでのＭＥＦは、１０のＭＯＩで、指示されたウイルスの粗製株で感染され、またはモック感染された。ＭＶＡ−ＥＧＦＰはＭＶＡｗｔに相当する。モックに対するＩＦＮ−β・ｍＲＮＡの誘導倍率が、感染後５時間において、細胞から単離された全ＲＮＡを用いたＲＴ−ｑＰＣＲにより決定された。ＩＦＮ−β・ｍＲＮＡのＣｔ値は、内因性の対照として働く１８Ｓ・ｒＲＮＡについてのＣｔ値で補正された。１：ＭＶＡ−ＥＧＦＰ、２：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ、３：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−５、４：ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−後期、５：ＭＶＡ−ｄｓＥ３Ｌ。
【図１７】Ｂ１９Ｒ遺伝子のアミノ酸配列が、多くのポックスウイルスに亘って保存されていることを示している。Ａ）、Ｂ）、Ｃ）及びＤ）：デフォルト設定のＣｌｕｓｔａｌＯ，ｖ．１．２．０により作成されたサル痘ウイルス（配列番号１）、ワクシニアウイルス・ウエスタンリザーブ（「ワクシニア−ＷＲ」）（配列番号２）、ワクシニアウイルス・コペンハーゲン（配列番号３）、漿尿膜ワクシニアウイルス・アンカラ（「ＣＶＡ」）（配列番号４）、エクトロメリアウイルス（配列番号５）、牛痘ウイルス（配列番号６）、ラクダ痘ウイルス（配列番号７）、豚痘ウイルス（配列番号８）、及びタナポックスウイルス（配列番号９）によってコードされるＢ１９Ｒ遺伝子及び／またはその相同体のアミノ酸配列アラインメント。Ｅ）は、パートＡ）、Ｂ）、Ｃ）及びＤ）において整列されたＢ１９Ｒ配列及び／またはその相同体のための対でのアミノ酸配列同一性を示す表。（配列の簡単な説明）
【００２４】
配列番号：１［登録番号Ｑ５ＩＸＫ２：ＩＦＮ−α／β受容体様の分泌糖タンパク質；サル痘ウイルス］：
ＭＭＫＭＫＭＭＶＲＩＹＦＶＳＬＳＬＬＬＦＨＳＹＡＩＤＩＥＮＥＩＴＥＦＦＮＫＭＲＤＴＬＰＡＫＤＳＫＷＬＮＰＶＣＭＦＧＧＴＭＮＤＭ  ＡＡＬＧＥＰＦＳＡＫＣＰＰＩＥＤＳＬＬＳＨＲＹＫＤＹＶＶＫＷＥＲＬＥＫＮＲＲＲＱＶＳＮＫＲＶＫＨＧＤＬＷＩＡＮＹＴＳＫＦＳＮＲ  ＲＹＬＣＴＶＴＴＫＮＧＤＣＶＱＧＶＶＲＳＨＶＷＫＰＳＳＣＩＰＫＴＹＥＬＧＴＹＤＫＹＧＩＤＬＹＣＧＩＬＹＡＫＨＹＮＮＩＴＷＹＫＤＮ  ＫＥＩＮＩＤＤＦＫＹＳＱＡＧＫＥＬＩＩＨＮＰＥＬＥＤＳＧＲＹＤＣＹＶＨＹＤＤＶＲＩＫＮＤＩＶＶＳＲＣＫＩＬＴＶＩＰＳＱＤＨＲＦＫＬＩＬ  ＤＰＫＩＮＶＴＩＧＥＰＡＮＩＴＣＳＡＶＳＴＳＬＦＶＤＤＶＬＩＥＷＫＮＰＳＧＷＩＩＧＬＤＦＧＶＹＳＩＬＴＳＲＧＧＩＴＥＡＴＬＹＦＥＮＶＴ  ＥＥＹＩＧＮＴＹＴＣＲＧＨＮＹＹＦＤＫＴＬＴＴＴＶＶＬＥ
【００２５】
配列番号：２［登録番号Ｐ２５２１３：可溶性インターフェロンα／β受容体Ｂ１９； ワクシニアウイルス・ウエスタンリザーブ株］：
ＭＴＭＫＭＭＶＨＩＹＦＶＳＬＬＬＬＬＦＨＳＹＡＩＤＩＥＮＥＩＴＥＦＦＮＫＭＲＤＴＬＰＡＫＤＳＫＷＬＮＰＡＣＭＦＧＧＴＭＮＤＩＡＡＬ  ＧＥＰＦＳＡＫＣＰＰＩＥＤＳＬＬＳＨＲＹＫＤＹＶＶＫＷＥＲＬＥＫＮＲＲＲＱＶＳＮＫＲＶＫＨＧＤＬＷＩＡＮＹＴＳＫＦＳＮＲＲＹＬ  ＣＴＶＴＴＫＮＧＤＣＶＱＧＩＶＲＳＨＩＲＫＰＰＳＣＩＰＫＴＹＥＬＧＴＨＤＫＹＧＩＤＬＹＣＧＩＬＹＡＫＨＹＮＮＩＴＷＹＫＤＮＫＥＩＮＩ  ＤＤＩＫＹＳＱＴＧＫＥＬＩＩＨＮＰＥＬＥＤＳＧＲＹＤＣＹＶＨＹＤＤＶＲＩＫＮＤＩＶＶＳＲＣＫＩＬＴＶＩＰＳＱＤＨＲＦＫＬＩＬＤＰＫＩＮ  ＶＴＩＧＥＰＡＮＩＴＣＴＡＶＳＴＳＬＬＩＤＤＶＬＩＥＷＥＮＰＳＧＷＬＩＧＦＤＦＤＶＹＳＶＬＴＳＲＧＧＩＴＥＡＴＬＹＦＥＮＶＴＥＥＹＩＧ  ＮＴＹＫＣＲＧＨＮＹＹＦＥＫＴＬＴＴＴＶＶＬＥ
【００２６】
配列番号：３［登録番号Ｑ５ＣＡＤ５：ＩＦＮ−α−β受容体様の分泌糖タンパク質； ワクシニアウイルス・コペンハーゲン株］：
ＭＴＭＫＭＭＶＨＩＹＦＶＳＬＬＬＬＬＦＨＳＹＡＩＤＩＥＮＥＩＴＥＦＦＮＫＭＲＤＴＬＰＡＫＤＳＫＷＬＮＰＡＣＭＦＧＧＴＭＮＤＩＡＡＬ  ＧＥＰＦＳＡＫＣＰＰＩＥＤＳＬＬＳＨＲＹＫＤＹＶＶＫＷＥＲＬＥＫＮＲＲＲＱＶＳＮＫＲＶＫＨＧＤＬＷＩＡＮＹＴＳＫＦＳＮＲＲＹＬ  ＣＴＶＴＴＫＮＧＤＣＶＱＧＩＶＲＳＨＩＫＫＰＰＳＣＩＰＫＴＹＥＬＧＴＨＤＫＹＧＩＤＬＹＣＧＩＬＹＡＫＨＹＮＮＩＴＷＹＫＤＮＫＥＩＮＩ  ＤＤＩＫＹＳＱＴＧＫＫＬＩＩＨＮＰＥＬＥＤＳＧＲＹＮＣＹＶＨＹＤＤＶＲＩＫＮＤＩＶＶＳＲＣＫＩＬＴＶＩＰＳＱＤＨＲＦＫＬＩＬＤＰＫＩＮ  ＶＴＩＧＥＰＡＮＩＴＣＴＡＶＳＴＳＬＬＩＤＤＶＬＩＥＷＥＮＰＳＧＷＬＩＧＦＤＦＤＶＹＳＶＬＴＳＲＧＧＩＴＥＡＴＬＹＦＥＮＶＴＥＥＹＩＧ  ＮＴＹＫＣＲＧＨＮＹＹＦＥＫＴＬＴＴＴＶＶＬＥ
【００２７】
配列番号：４［登録番号Ａ９Ｊ１６８：可溶性及び細胞表面インターフェロンα／β受容体； ワクシニアウイルス・アンカラ株（ＣＶＡ）］：
ＭＫＭＴＭＫＭＭＶＨＩＹＦＶＳＬＬＬＬＬＦＨＳＹＡＩＤＩＥＮＥＩＴＥＦＦＮＫＭＲＤＴＬＰＡＫＤＳＫＷＬＮＰＡＣＭＦＧＧＴＭＮＤＩ  ＡＡＬＧＥＰＦＳＡＫＣＰＰＩＥＤＳＬＬＳＨＲＹＫＤＹＶＶＫＷＥＲＬＥＫＮＲＲＲＱＶＳＮＫＲＶＫＨＧＤＬＷＩＡＮＹＴＳＫＦＳＮＲ  ＲＹＬＣＴＶＴＴＫＮＧＤＣＶＱＧＩＶＲＳＨＩＫＫＰＰＳＣＩＰＫＴＹＥＬＧＴＨＤＫＹＧＩＤＬＹＣＧＩＬＹＡＫＨＹＮＮＩＴＷＹＫＤＮＫ  ＥＩＮＩＤＤＩＫＹＳＱＴＧＫＫＬＩＩＨＮＰＥＬＥＤＳＧＲＹＮＣＹＶＨＹＤＤＶＫＩＫＮＤＩＶＶＳＲＣＫＩＬＴＶＩＰＳＱＤＨＲＦＫＬＩＬＤＰ  ＫＩＮＶＴＩＧＥＰＡＮＩＴＣＴＡＶＳＴＳＬＬＩＤＤＶＬＩＥＷＥＮＰＳＧＷＬＩＧＦＤＦＤＶＹＳＶＬＴＳＲＧＧＩＴＥＡＴＬＹＦＥＮＶＴＥＥ  ＹＩＧＮＴＹＫＣＲＧＨＮＹＹＦＥＫＴＬＴＴＴＶＶＬＥ
【００２８】
配列番号：５［登録番号Ｑ９ＪＦＳ５：ＩＦＮ−α／β結合タンパク質；エクトロメリアウイルス］：
ＭＭＫＭＴＭＫＭＭＶＲＩＹＦＶＳＬＳＬＳＬＳＬＬＬＦＨＳＹＡＩＤＩＥＮＥＩＴＥＦＦＮＫＭＲＤＴＬＰＡＫＤＳＫＷＬＮＰＳＣＭＦＧＧ  ＴＭＮＤＭＡＡＬＧＥＰＦＳＡＫＣＰＰＩＥＤＳＬＬＳＨＲＹＮＤＫＤＮＶＶＮＷＥＫＩＧＫＴＲＲＰＬＮＲＲＶＫＮＧＤＬＷＩＡＮＹＴＳ  ＮＤＳＨＲＲＹＬＣＴＶＴＴＫＮＧＤＣＶＱＧＩＶＲＳＨＩＲＫＰＰＳＣＩＰＥＴＹＥＬＧＴＨＤＫＹＧＩＤＬＹＣＧＩＬＹＡＫＨＹＮＮＩＴＷ  ＹＫＮＮＱＥＬＩＩＤＧＴＫＹＳＱＳＧＱＮＬＩＩＨＮＰＥＬＥＤＳＧＲＹＤＣＹＶＨＹＤＤＶＲＩＫＮＤＩＶＶＳＲＣＫＩＬＴＶＩＰＳＱＤＨＲ  ＦＫＬＩＬＤＰＫＩＮＶＴＩＧＥＰＡＮＩＴＣＴＡＶＳＴＳＬＬＶＤＤＶＬＩＤＷＥＮＰＳＧＷＩＩＧＬＤＦＧＶＹＳＩＬＴＳＳＧＧＩＴＥＡＴＬＹＦ  ＥＮＶＴＥＥＹＩＧＮＴＹＴＣＲＧＨＮＹＹＦＤＫＴＬＴＴＴＶＶＬＥ
【００２９】
配列番号：６［登録番号Ｑ５ＣＡＣ３：可溶性インターフェロンα／β受容体； 牛痘ウイルス］：
ＭＫＭＴＭＫＭＭＶＨＩＹＦＶＳＬＳＬＳＬＳＬＬＬＦＨＳＹＡＩＤＩＥＮＥＩＴＥＦＦＮＫＭＫＤＴＬＰＡＫＤＳＫＷＬＮＰＡＣＭＦＧＧＴ  ＭＮＤＭＡＡＩＧＥＰＦＳＡＫＣＰＰＩＥＤＳＬＬＳＨＲＹＫＤＫＤＮＶＶＮＷＥＫＩＧＫＴＲＲＰＬＮＲＲＶＫＮＧＤＬＷＩＡＮＹＴＳＮ  ＤＳＲＲＲＹＬＣＴＶＩＴＫＮＧＤＣＩＱＧＩＶＲＳＨＶＲＫＰＳＳＣＩＰＥＩＹＥＬＧＴＨＤＫＹＧＩＤＬＹＣＧＩＩＹＡＫＨＹＮＮＩＴＷＹＫ  ＤＮＫＥＩＮＩＤＤＩＫＹＳＱＴＧＫＥＬＩＩＨＮＰＡＬＥＤＳＧＲＹＤＣＹＶＨＹＤＤＶＲＩＫＮＤＩＶＶＳＲＣＫＩＬＴＶＩＰＳＱＤＨＲＦＫＬＩ  ＬＤＰＫＩＮＶＴＩＧＥＰＡＮＩＴＣＴＡＶＳＴＳＬＬＶＤＤＶＬＩＥＷＥＮＰＳＧＷＬＩＧＦＤＦＤＶＹＳＶＬＴＳＲＧＧＩＴＥＡＴＬＹＦＥＮ  ＶＴＥＥＹＩＧＮＴＹＫＣＲＧＨＮＹＹＦＥＫＴＬＴＴＴＶＶＬＥ
【００３０】
配列番号：７［登録番号Ｑ５ＣＡ８７：可溶性インターフェロンα／β受容体；ラクダ痘ウイルス］：
ＭＫＭＴＭＫＭＭＶＨＩＹＦＶＳＬＳＬＳＬＬＬＦＨＳＹＡＩＤＩＥＮＥＩＴＤＦＦＮＫＭＫＤＩＬＰＴＫＤＳＫＷＬＮＰＡＣＭＦＧＧＴＴＮＤ  ＭＡＡＩＧＥＰＦＳＡＫＣＰＰＩＥＤＳＬＬＳＨＲＹＫＮＫＤＮＶＶＮＷＥＫＩＧＫＴＫＲＰＬＮＲＲＶＫＮＧＤＬＷＩＡＮＹＴＳＮＤＳＲ  ＲＲＹＬＣＴＡＩＴＫＮＧＤＣＩＱＧＩＩＲＳＨＶＲＫＰＳＳＣＩＰＥＩＹＥＬＧＴＨＤＫＹＧＩＤＬＹＣＧＩＩＹＡＫＨＹＮＮＩＴＷＹＫＤＮＫＥＩ  ＮＩＤＤＩＫＹＳＱＴＧＫＥＬＩＩＨＮＰＡＬＥＤＳＧＲＹＤＣＹＶＨＹＤＤＶＲＩＫＮＤＩＶＶＳＲＣＫＩＬＴＶＴＰＳＱＤＨＲＦＫＬＩＬＤＰＫ  ＩＮＶＴＩＧＥＰＡＮＩＴＣＴＡＶＳＴＳＬＬＶＤＤＶＬＩＥＷＥＮＰＳＧＷＬＩＧＦＤＦＤＶＹＳＶＬＴＳＲＧＧＩＴＥＡＴＬＹＦＥＮＶＴＥＥ  ＹＩＧＮＴＹＫＣＲＧＨＮＹＹＦＥＫＴＬＴＴＴＶＶＬＥ
【００３１】
配列番号：８［登録番号Ｑ８Ｖ３Ｇ４：ＩＦＮ−α／β様結合性タンパク質；豚痘ウイルス、豚／ネブラスカ／１７０７７−９９／１９９９株］：
ＭＩＳＩＫＫＹＮＩＬＬＦＩＩＳＦＩＹＣＳＡＤＮＤＩＤＳＬＹＥＧＹＫＥＦＬＤＰＫＬＫＱＦＬＮＤＮＣＴＹＲＧＹＲＤＦＦＬＹＮＥＥＰＡＮＩＫＣ  ＰＬＬＮＤＩＬＬＲＱＫＹＨＮＹＴＩＬＷＫＫＬＧＥＲＳＳＲＬＬＮＴＨＧＳＩＦＬＤＦＦＰＹＫＳＥＬＲＧＳＶＹＥＣＭＩＩＬＮＮＴＣＤＱＦＩＬ  ＫＬＮＤＩＲＳＮＰＶＣＹＨＮＤＹＫＶＨＴＮＩＥＩＦＣＮＶＩＮＬＱＹＤＹＩＴＷＹＫＮＮＳＥＩＩＩＤＧＹＫＹＳＮＱＳＲＲＬＬＶＹＮＴＴＹ  ＮＤＳＧＩＹＹＣＮＡＹＴＴＨＧＫＮＴＹＩＳＲＲＣＳＳＶＳＩＨＳＨＳＹＹＤＦＹＩＥＨＩＮＮＩＴＹＩＤＰＤＳＥＮＴＱＩＹＣＫＡＩＳＹＳＮＳ  ＳＹＩＬＩＹＷＥＤＥＹＧＧＹＩＹＤＮＧＩＹＱＹＤＮＩＴＬＩＧＮＥＫＶＹＭＳＩＬＶＬＥＫＳＡＹＹＲＹＶＮＮＴＦＴＣＬＡＴＳＶＹＶＥＫＫ  ＴＴＴＴＬＶＩＫＫＴ
【００３２】
配列番号：９［登録番号Ａ７ＸＣＳ４：Ｉ型ＩＦＮ受容体； タナポックス（Ｔａｎａｐｏｘ）ウイルス］：
ＭＫＩＴＹＩＩＬＬＩＣＫＥＩＩＣＤＮＳＧＤＤＭＹＤＹＩＡＮＧＮＩＤＹＬＫＴＩＤＮＤＩＩＮＬＶＮＫＮＣＳＦＲＥＩＫＴＴＬＡＫＥＮＥＶＬＭＬＫ  ＣＰＱＬＤＮＹＩＬＰＷＫＹＭＮＲＳＥＹＴＶＴＷＫＮＩＳＮＳＴＥＹＮＮＴＲＩＥＮＮＭＬＭＦＦＰＦＹＮＬＱＡＧＳＫＹＬＣＴＶＳＴＮ  ＫＳＣＤＱＳＶＶＩＶＫＫＳＦＹＳＮＮＣＭＬＳＥＡＫＥＮＤＮＦＥＩＹＣＧＩＬＨＡＫＹＮＴＩＫＷＦＫＥＥＫＥＩＴＮＮＹＫＹＹＴＫＬＧＧ  ＹＶＫＧＩＮＮＶＴＹＳＤＳＧＫＹＶＣＥＧＹＹＩＤＶＬＫＮＩＴＹＴＡＫＲＣＶＮＬＴＶＩＰＮＴＹＹＤＦＦＩＶＤＩＰＮＶＴＹＡＫＮＮＫＫＬ  ＥＶＮＣＴＳＦＶＤＩＮＳＹＤＹＩＬＴＳＷＬＹＮＧＬＹＬＰＬＧＶＲＩＹＱＬＹＳＴＤＩＦＦＥＮＦＩＹＲＴＳＴＬＶＦＥＮＶＤＩＳＤＤＮＫＴＦ  ＥＣＥＡＬＳＶＴＬＫＫＩＫＹＴＴＩＫＶＥＫ
【発明を実施するための形態】
【００３３】
次に、その例が添付図面に示される例示的実施形態を詳細に参照する。
【００３４】
＜定義＞
特に注記しない限り、本明細書における技術用語は、分子生物学の当業者の従来の用法に従って使用される。分子生物学における共通の用語については従来の用法は標準的な教科書、例えば、オックスフォード大学出版によって発行されたＢｅｎｊａｍｉｎ  ＬｅｗｉｎによるＧｅｎｅｓ  Ｖ、１９９４（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗ等（編）のブラックウェルサイエンス社によって発行されたＴｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９４（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＶＣＨ出版社が発行したＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ編、１９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、特に文脈が明らかに示さない限り、単数形の不定冠詞及び定冠詞は複数への言及を含むものである。従って、例えば「一つのエピトープ」への言及は１以上のエピトープへの言及を含み、また「前記方法」へ言及は、本明細書に提供される方法のために改変されまたは置換され得る、当業者に既知の等価な複数の工程及び複数の方法への言及を含むものである。
【００３６】
別途明記しない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」の用語は、この一連の全ての要素を指すものと理解されるべきである。当業者は、本明細書で提供される本発明の一定の実施形態に対する多くの均等物を、日常的な実験のみを用いて認識し、または確認することができるであろう。このような均等物は、本発明に包含される。
【００３７】
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、別途明記しない限り、単語「含んでなる」、並びにその三人称単数形及び現在進行形等の変化形は「含む」を意味し、従って、述べられた一つの整数もしくはステップ、または複数の整数もしくは工程のグループを含むものであり、他の任意の整数もしくは工程、または複数の整数もしくは工程を排除する。本明細書において使用するとき、「含んでなる」の用語は、「包含する」「含んでいる」または「有する」の用語で置き換えることができる。本発明の態様または実施形態の文脈において本明細書中で使用されるときはいつでも、前述の用語（含んでなる、包含する、含んでいる、有する）の何れかは、「からなる」の用語で置換することができる。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「からなる」という用語は、特許請求の範囲において特定されていない任意の要素、ステップ、または成分を除外する。本明細書で使用する場合、「本質的にからなる」の用語は、特許請求の範囲の残りの部分で定義された製品または方法の「基本的かつ新規な特徴に影響を与えるであろう」如何なるの材料または工程をも除外する。ウォーターテックス社（Ｃｏｒｐ．）対カルコ社（Ｌｔｄ．）、７  Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ．２ｄ  １０９７、１１０２（連邦巡回控訴裁判所、１９８８年）。
【００３９】
本明細書中で使用される、記載された複数の要素の間の接続語「及び／または」は、個々及び組み合わせたオプションの両方を包含すると理解される。例えば、二つの要素が「及び／または」によって結ばれている場合、最初のオプションは、第二の要素を伴わない最初の要素の適用を指す。二番目のオプションは、第一の要素を伴わない第二の要素の適応を指称する。第三のオプションは、第一及び第二の要素を共に適用することを言う。これらのオプションの何れも、本明細書中で使用される意味の範囲内に収まるものと理解され、従って、ここで用いられる「及び／または」の用語の要件を満たすものと理解される。該オプションの複数の同時適用もまた、この意味の範囲内に収まるので、「及び／または」の用語の要件を満たすものと理解される。
【００４０】
本明細書で述べる全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が本明細書の一部として援用される。矛盾する場合には、すべての定義を含めて、本明細書が支配する。
【００４１】
アジュバント：抗原性を高めるために使用される担体。アジュバントは、（１）抗原が吸着された鉱物（ミョウバン、水酸化アルミニウム、またはリン酸）の懸濁液；（２）鉱物油中に抗原溶液が乳化された油中水エマルジョン（フロイント不完全アジュバント）、抗原の分解阻害及び／またはマクロファージの流入、及び／または免疫細胞の活性化により抗原性を更に高めるように、時には死滅したマイコバクテリアが含められる（フロイント完全アジュバント）；（３）例えばＣｐＧモチーフを含むもの等の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを、アジュバントとして使用することができる（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；及び米国特許第６，２０７，６４６号参照）；及び（４）共刺激分子のような精製または組換えタンパク質。例示的なアジュバントには、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、及びＧＭ−ＣＳＦが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
抗原；抗原決定基；エピトープ：動物において抗体の産生またはＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質であって、動物に注射または吸収される組成物を含む。抗原は免疫系と反応して、抗原特異的な体液性または細胞性免疫応答を生じさせる。「抗原」という用語は、特定の化合物、組成物または物質のすべての関連エピトープを含む。「エピトープ」または「抗原決定基」の用語は、単独で、または別のタンパク質、例えば主要組織適合遺伝子複合体（「ＭＨＣ」）タンパク質またはＴ細胞受容体と一緒に、Ｂ細胞及び／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指称する。Ｔ細胞エピトープは、８〜２０のアミノ酸の連続的ストレッチから形成される。Ｂ細胞エピトープは、タンパク質の二次および／または三次折畳みに並置された連続的アミノ酸または非連続的アミノ酸の両方から形成することができる。連続的アミノ酸から形成されたＢ細胞エピトープは、典型的には変性溶媒への露出に際して保持されるのに対して、三次元折畳みにより形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒での処理に際して失われる。Ｂ細胞エピトープは、典型的には、固有の空間的立体構造で、少なくとも５、６、７、８、９、１０以上のアミノ酸、一般には２０未満のアミノ酸を含んでいる。エピトープの空間的立体構造を決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶学及び２次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙのＭｅｔｈｏｄｓにおける“Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，  Ｖｏｌ．  ６６，  Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｅｄ  （１９９６）を参照されたい。
【００４３】
抗原は、組織特異的（または組織関連）抗原、または疾患特異的（または疾患関連）抗原であることができる。組織特異的抗原はまた疾患特異的抗原でもあり得るので、これらの用語は相互に排他的ではない。組織特異的抗原は、限られた数の組織で発現される。組織特異的抗原には、例えば、前立腺特異抗原（「ＰＳＡ」）が含まれる。疾患特異的抗原は疾患プロセスと同時に発現され、ここでの抗原の発現は特定の疾患の発生と相関し、または該疾患の発症を予測させるものである。疾患特異的抗原には、例えば、特定の種類の乳癌と関連したＨＥＲ−２、または前立腺癌と関連したＰＳＡが含まれる。疾患特異的抗原は、Ｔ細胞またはＢ細胞によって認識される抗原であることができる。組織及び／または疾患特異的抗原は、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、もしくは腫瘍関連抗原、またはウイルス抗原を含むことができるが、それらに限定されない。
【００４４】
細菌抗原：１種以上の細菌種またはその株に由来する抗原、例えば、炭疽菌、百日咳菌、ボレリア・ブルグドルフェリ、ウシ流産菌、ブルセラカニス、ブルセラ・メリテンシス、ブルセラ・スイス、カンピロバクター・ジェジュニ、肺炎クラミジア、トラコーマクラミジア、クラミジアオウム病、ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシレ、ウェルシュ菌、破傷風菌、コリネバクテリウム・ジフテリエ、エンテロコッカスフェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、病原性大腸菌、大腸菌１５７：Ｈ７、野兎病菌、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、レジオネラ・ニューモフィラ、レプトスピラ・インターロガンス、リステリア菌、らい菌、結核菌、肺炎マイコプラズマ、淋菌、髄膜炎菌、緑膿菌、リケッチア・リケッチア、チフス菌、ネズミチフス菌、赤痢菌ソンネ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィチカス、ストレプトコッカス・アガラクティエ、肺炎球菌、化膿連鎖球菌、梅毒トレポネーマ、コレラ菌、及びペスト菌に由来する抗原。
【００４５】
真菌抗原：１種以上の真菌種または株に由来する抗原、例えば、アスペルギルス・クラバタス、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・テレウス、ブラストミセスデルマティティディス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ドゥブリニエンシス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ルゴサ、カンジダ・トロピカリス、クリプトコッカス・アルビダス、クリプトコッカス・ガッティ、クリプトコッカスラウレンティ、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、犬小胞子菌、カリニ肺炎、ニューモシスチス・ジロベシ、スポロトリックス・シェンキー、スタキボトリス・カルタルム、白癬性毛瘡、頭部白癬、体部白癬、股部白癬、顔面白癬、異型白癬、白癬黒質、白癬玉虫色、トリコフィトンルブルム及びトリコフィトン・トンズランスに由来する抗原。
【００４６】
寄生虫抗原：１種以上の寄生虫の種または株に由来する抗原、例えば、アニサキス属、バベシア属、アライグマ回虫、クリプトスポリジウム属、シクロスポラ・カイエタネンシス、裂頭条虫属、メジナ虫、赤痢アメーバ、十二指腸鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ・ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ）、腸鞭毛虫、ランブル鞭毛虫、リーシュマニア属、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ・ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、マンソン住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫、日本住血吸虫、テニア属、トキソプラズマ原虫、旋毛虫、及びクルーズトリパノソーマに由来する抗原。
【００４７】
腫瘍関連抗原：特定の腫瘍タイプで過剰発現され、または優勢に発現された抗原例えば、５−α−レダクターゼ、α−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＭ−１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂ黒色腫抗原遺伝子（「ＢＡＧＥ」）、β−カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ−ａｂｌ、ブラキュリ、ＣＡ−１２５、カスパーゼ８（「ＣＡＳＰ−８」、「ＦＬＩＣＥ」としても知られている）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体受容体２（「ＣＲ２」）、ＣＤ２２／ＢＬ−ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体受容体１（「ＣＲ１」）、ＣＤ４４／ＰＧＰ−１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（「ＬＣＡ」）、ＣＤ４６／膜補因子タンパク質（「ＭＣＰ」）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ−１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（「ＤＡＦ」）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ｃ−ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ−２（「ｃｏｘ−２」）、結腸直腸癌に欠失している遺伝子（「ＤＣＣ」）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞増殖因子−８ａ（「ＦＧＦ８ａ」）、線維芽細胞増殖因子−８ｂ（「ＦＧＦ８ｂ」）、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、Ｇ黒色腫抗原遺伝子ファミリー（「ＧＡＧＥ−ｆａｍｉｌｙ」）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（「ＧＤ２」）／ガングリオシド３（「ＧＤ３」）／ガングリオシドモノシアル酸−２（「ＧＭ２」）、ゴナドトロピン放出ホルモン（「ＧｎＲＨ」）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１−６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ  ｔｏ  Ｍａｎ（α１−６）］β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（「ＧｎＴ  Ｖ」）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ−１００−ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質−１（「ｇｐ７５／ＴＲＰ−１」）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（「ｈＣＧ」）、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ヒト乳房腫瘍ウイルス（「ＨＭＴＶ」）、７０キロダルトン熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ７０」）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（「ｈＴＥＲＴ」）、インスリン様増殖因子受容体１（「ＩＧＦＲ−１」）、インターロイキン１３受容体（「ＩＬ−１３Ｒ」）、誘導型一酸化窒素合成酵素（「ｉＮＯＳ」）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、黒色腫抗原コード化遺伝子１（「ＭＡＧＥ−１」）、黒色腫抗原コード化遺伝子２（「ＭＡＧＥ−２」）、黒色腫抗原コード化遺伝子３（「ＭＡＧＥ−３」）、黒色腫抗原コード化遺伝子４（「ＭＡＧＥ−４」）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、メラン−Ａ／Ｔ細胞―１により認識される黒色腫抗原（「ＭＡＲＴ−１」）、メソテリン、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰ、ムチン、精巣特異抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、血小板由来増殖因子（「ＰＤＧＦ」）、μΡΑ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロジェニポエチン（ｐｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎ）、前立腺特異抗原（「ＰＳＡ」）、前立腺特異的膜抗原（「ＰＳＭＡ」）、ＲＡＧＥ−１、��ｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ−１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、トランスフォーミング増殖因子α（「ＴＧＦ−α」）、トランスフォーミング増殖因子β（「ＴＧＦ−β」）、チモシンβ−１５、腫瘍壊死因子α（「ＴＮＦ−α」）、ＴＰ１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４、及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）に由来する抗原。
【００４８】
ウイルス抗原：１以上のウイルス型またはその単離体に由来する抗原、例えば、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）、デング熱ウイルス、エボラウイルス、エプスタイン−バーウイルス（「ＥＢＶ」）、グアナリトウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（「ＨＳＶ−１」）、単純ヘルペスウイルス２型（「ＨＳＶ−２」）、ヒトヘルペスウイルス８型（「ＨＨＶ−８」）、Ａ型肝炎ウイルス（「ＨＡＶ」）、Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）、Ｄ型肝炎ウイルス（「ＨＤＶ」）、Ｅ型肝炎ウイルス（「ＨＥＶ」）、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）、インフルエンザウイルス、フニンウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ムンプスウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス（「ＨＰＶ」）、パラインフルエンザウイルス、パルボウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（「ＲＳＶ」）、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス（「ＳＡＲＳ」）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（「ＭＥＲＳ−ＣｏＶ」）、水痘帯状疱疹ウイルス、天然痘ウイルス、西ナイルウイルス、及び黄熱病ウイルスに由来する抗原。
【００４９】
ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）：内部の非コード化セグメント（イントロン）、並びに転写の開始及び終止のタイミングと場所を決定する調節配列を欠失したＤＮＡ断片。ｃＤＮＡは、細胞から抽出されたメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）の逆転写によって実験室で合成することができる。
【００５０】
保存的変異体：「保存的」変異体は、タンパク質またはその抗原性エピトープの活性または抗原性に実質的に影響せず、または低下させない１以上のアミノ酸置換を有する変異体タンパク質またはポリペプチドである。一般に、保存的置換は、特定のアミノ酸が同一または類似の化学特性を有する別のアミノ酸で置換されたものである。例えば、リジンのような塩基性アミノ酸を、アルギニンまたはグルタミンのような別の塩基性アミノ酸で置換することは保存的置換である。保存的変異体の用語はまた、置換ポリペプチドに対して生じた抗体もまた非置換ポリペプチドと免疫反応し、及び／または置換ポリペプチドが非置換ポリペプチドの機能を保持することを条件に、非置換の親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸の使用を含む。非保存的置換は、特定のアミノ酸を異なる化学的特性を有するアミノ酸に置換するものであり、典型的にはタンパク質またはその抗原性エピトープの活性または抗原性を低下させる。
【００５１】
保存的置換の具体的且つ非限定的な例には、以下の例が含まれる。
【００５２】
元の残基                      保存的置換        
Ａｌａ                        Ｓｅｒ
Ａｒｇ                        Ｌｙｓ
Ａｓｎ                        Ｇｌｎ、Ｈｉｓ
Ａｓｐ                        Ｇｌｕ
Ｃｙｓ                        Ｓｅｒ
Ｇｌｎ                        Ａｓｎ
Ｇｌｕ                        Ａｓｐ
Ｈｉｓ                        Ａｓｎ；Ｇｌｎ
Ｉｌｅ                        Ｌｅｕ；Ｖａｌ
Ｌｅｕ                        Ｉｌｅ；Ｖａｌ
Ｌｙｓ                        Ａｒｇ；Ｇｌｎ；Ｇｌｕ
Ｍｅｔ                        Ｌｅｕ；Ｉｌｅ
Ｐｈｅ                        Ｍｅｔ；Ｌｅｕ；Ｔｙｒ
Ｓｅｒ                        Ｔｈｒ
Ｔｈｒ                        Ｓｅｒ
Ｔｒｐ                        Ｔｙｒ
Ｔｙｒ                        Ｔｒｐ；Ｐｈｅ
Ｖａｌ                        Ｉｌｅ；Ｌｅｕ
【００５３】
ＣＤ４：分化因子集団４、ＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用を媒介するＴ細胞表面タンパク質の集団。ＣＤ４を発現する細胞は「ＣＤ４＋」細胞と称され、多くの場合はヘルパーＴ（例えば、「ＴＨ」、「ＴＨ１」、または「ＴＨ２」）細胞である。
【００５４】
ＣＤ８：分化因子集団８、ＭＨＣクラスＩ分子との相互作用を媒介するＴ細胞表面タンパク質の集団。ＣＤ８を発現する細胞は「ＣＤ８＋」細胞と称され、多くの場合は細胞傷害性Ｔ（「ＣＴＬ」）細胞である。
【００５５】
共刺激分子：Ｔ細胞活性化は、典型的には、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）のペプチドＭＨＣ複合体との結合、並びに共刺激分子のそのリガンドとの相互作用を介して与えられるセカンドシグナルを必要とする。共刺激分子は、それらのリガンドに結合したときに、Ｔ細胞の活性化に必要なセカンドシグナルを提供する分子である。Ｔ細胞で最もよく知られている共刺激分子はＣＤ２８であり、これはＢ７−１またはＢ７−２の何れかに結合する。Ｔ細胞の活性化に必要なセカンドシグナルを提供できる他の共刺激分子には、細胞内接着分子−１（「ＩＣＡＭ−１」）、細胞内接着分子−２（「ＩＣＡＭ−２」）、白血球機能関連抗原１（「ＬＦＡ−１」）、白血球機能関連抗原２（「ＬＦＡ−２」）、及び白血球機能関連抗原３（「ＬＦＡ−３」）が含まれる。Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、及びＬＦＡ−３の組み合わせは、「共刺激分子の三つ組」のための「ＴＲＩＣＯＭ」と呼ばれる。
【００５６】
樹状細胞（ＤＣ）：樹状細胞は、一次免疫応答に関与する主要な抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）である。樹状細胞は、形質細胞様樹状細胞と骨髄様樹状細胞が含まれる。それらの主な機能は、組織中の抗原を得てリンパ器官に遊走し、Ｔ細胞を活性化するために抗原を提示することである。未熟樹状細胞は、骨髄に由来し、未熟細胞として末梢中に存在する。
【００５７】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）：本発明の任意の実施形態によれば、増大した数または量のｄｓＲＮＡを発現する（例えば、過剰のｄｓＲＮＡを発現する）異種または天然の核酸を含む組換えポックスウイルスは、サイトカイン、ケモカイン、エフェクター分子の放出、及び／または共刺激分子の増大した発現をトリガーし、または１以上のパターン認識受容体（複数可）（ＰＲＲ）を活性化し、及び／または細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞または他のタイプの免疫細胞）を活性化して、好ましくは、増強された自然免疫応答をトリガーし、または誘導する。過剰なｄｓＲＮＡは、何れかの適切な方法によって、好ましくは、増強された自然免疫応答を測定する方法を使用して、または実施例に記載の方法、好ましくは実施例１６による方法を使用して測定することができる。好ましくは、過剰なｄｓＲＮＡは、本発明の組換えポックスウイルスベクターを使用するときに、増強された自然免疫応答を生じさせる感染初期におけるｄｓＲＮＡの量として定義できる。更に好ましくは、過剰のｄｓＲＮＡは、対照と比較したときに、ｄｓＲＮＡを発現または生成する異種核酸を含む組換えポックスウイルスを用いて、ウイルス感染初期段階の際に転写されたｄｓＲＮＡの量として定義することができる。過剰なｄｓＲＮＡは、初期活性（例えば即時初期、初期、または初期／後期ポックスウイルスプロモータ）を有するポックスウイルスプロモータを使用することによって、好ましくは長さが少なくとも１００塩基対の、同一または重複する配列ストレッチを有するセンス及びアンチセンスＲＮＡの転写を駆動することによって生成することができる。過剰なｄｓＲＮＡを測定する別の方法は、１以上のＰＲＲ（複数可）の増大した活性化、例えば実施例７に示すように、ＰＫＲ基質（例えば、位置セリン５１でのｅｌＦ２a）のリン酸化の増加によって特定されるＰＫＲを側定することである。好ましくは、ＰＫＲ基質（例えば、位置セリン５１におけるｅｌＦ２a）の増大したリン酸化は、対照に比較して少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍以上増加する。
【００５８】
感染初期：ポックスウイルスの遺伝子発現は、カスケード様式で調節される。ウイルス遺伝子の初期転写は、ウイルス粒子で新たに感染した細胞内に運ばれたウイルス転写機構によって駆動され、初期ウイルス転写複合体により認識される初期ウイルスプロモータの制御下にある。ビリオンと宿主膜が融合してウイルスコアが細胞質に放出されたら、内因性ＲＮＡポリメラーゼ、及びウイルス遺伝子発現を含むキャプシド化された転写因子は、初期プロモータの制御下で、ウイルスｍＲＮＡを合成する初期ウイルス遺伝子発現の最初のカスケードを開始することが周知である。通常、感染における初期、例えば初期段階は、ゲノム複製に先立って約１〜２時間持続する。好ましくは、初期感染における初期は、ウイルス粒子（例えば、組換えポックスウイルス）の宿主細胞への結合と、ウイルスゲノムの複製（例えば、組換えポックスウイルスゲノムの複製）の開始の間の期間である。初期のタンパク質の中には、ウイルスのｄｓＤＮＡゲノムの複製のため、及びウイルスゲノム複製の開始後にだけ開始できる中間体と称される次の転写段階のための転写因子がある。好ましくは、感染初期は、感染の３０分、１時間もしくは２時間以内、または接種後、好ましくはウイルスコアが細胞の細胞質に放出された後である。
【００５９】
発現制御配列：それらが動作可能に連結された異種核酸配列の発現を調節する核酸配列。発現制御配列は、該発現制御配列が核酸配列の転写及び／または翻訳を制御及び調節するときに、核酸配列に対して動作可能に連結される。従って、「発現制御配列」の用語は、プロモータ、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン、イントロンのスプライシング信号、及び停止コドンを包含する。「制御配列」の用語は、最低でも、その存在が異種核酸配列の転写及び／または翻訳に影響を与えることができる構成要素を含み、また、その存在が有利である追加の構成要素、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列を含むことができる。
【００６０】
「発現制御配列」の用語は、プロモータ配列を包含する。プロモータは、同種または異種遺伝子の転写を指示するのに十分な最小限の配列である。また、プロモータ依存性遺伝子発現を、細胞特異的、組織特異的にするために十分なこれらのプロモータ要素、または外部のシグナルまたは薬剤によって誘導可能にするために十分なプロモータ要素が含まれる；このような要素は、当該遺伝子の５’または３’領域に位置することができる。「プロモータ」の用語は、構成的プロモータ及び誘導性プロモータの両方を包含する。例えば文献（Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５１６−５４４（１９８７））を参照されたい。典型的なプロモータ配列としては、レトロウイルスの長い末端反復配列（「ＬＴＲ」）、アデノウイルス主要後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ（「Ｐｒ７．５」）、ワクシニアウイルス合成初期／後期プロモータ（「ｓＥ／Ｌ」）、ＰｒＳｙｎｌｌｍプロモータ、ＰｒＬＥ１プロモータ、ＰｒＨ５ｍプロモータ、ＰｒＳプロモータ、ハイブリッド初期／後期プロモータ、または牛痘ウイルスＡＴＩプロモータが含まれるが、これらに限定されない。他の適切なプロモータには、ＳＶ４０初期プロモータ、アデノウイルス主要後期プロモータ、ヒトＣＭＶ即時初期Ｉプロモータが含まれるが、これらに限定されず、また限定されるものではないが、以下のワクシニアウイルスまたはＭＶＡに由来するプロモータを含む種々のポックスウイルスプロモータが含まれる：３０Ｋプロモータ、Ｉ３プロモータ、ｓＥ／Ｌプロモータ、Ｐｒ７．５Ｋプロモータ、４０Ｋプロモータ、Ｃ１プロモータ、ＰｒＳｙｎｌｌｍプロモータ、ＰｒＬＥ１プロモータ、ＰｒＨ５ｍプロモータ、ＰｒＳプロモータ、ハイブリッド初期／後期プロモータＰｒＨｙｂ、ＰｒＳ５Ｅプロモータ、ＰｒＡ５Ｅプロモータ、Ｐｒ１３．５長プロモータ、及びＰｒ４ＬＳ５Ｅプロモータ；牛痘ウイルスＡＴＩプロモータ、または以下の鶏痘由来のプロモータ：Ｐｒ７．５Ｋプロモータ、Ｉ３プロモータ、３０Ｋプロモータ、または４０Ｋプロモータ。
【００６１】
異種：別々の遺伝源または種を起源とする。修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（「ＭＶＡ」）ゲノム内に含まれていない核酸を起源とする、ＭＶＡに対して異種であるポリペプチド、例えば、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍関連抗原、またはウイルス抗原。この用語は、通常はＭＶＡゲノムによりコードされないＲＮＡまたはタンパク質をコードする非天然の核酸、またはそのような非天然の核酸によってコードされる任意の非天然タンパク質を包含するように広く解釈される。
【００６２】
相同体；変異体：「相同体」または「変異体」の用語は、遺伝子またはタンパク質配列を指称するときは、問題の遺伝子またはタンパク質の天然のアミノ酸配列、宿主において未だ免疫反応を誘発できるタンパク質断片、並びに例えばグリコシル化されたタンパク質またはポリペプチドを含むタンパク質及びタンパク質断片の相同体または変異体を包含する。従って、タンパク質及びポリペプチドは、特定の天然アミノ酸配列に限定されるものではなく、天然配列と同一の配列、並びに欠失、付加、挿入及び置換のような天然配列の改変を包含する。好ましくは、そのような相同体または変異体は、参照タンパク質またはポリペプチドに対して、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％のアミノ酸配列の同一性を有している。相同体または変異体の用語はまた、短縮、欠失、または他の修飾されたヌクレオチドまたはタンパク質配列を包含する。
【００６３】
相同体または変異体の用語は、天然の配列の縮重変異体をも包含する。縮重変異体は、天然のまたは野生型の遺伝子配列とは異なるが同じアミノ酸配列を特定するコドンを含んだ配列を含む、タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドである。遺伝子コードは、その殆どが複数のコドンによってコードされる２０の天然アミノ酸を特定する。従って、それは冗長または縮重したコードである。縮重ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列が変化しないまま残ることを条件として、総ての縮重ヌクレオチド配列が本開示に包含される。
【００６４】
アミノ酸配列間の配列同一性を決定するための技術は、当該技術分野で知られている。２以上の配列は、それらの「パーセント同一性」を決定することによって比較することができる。２配列のパーセント同一性は、２つの整列された配列間の正確な一致数を短い方の配列の長さで割り、１００を乗じたものである。
【００６５】
本明細書に記載のタンパク質、ポリペプチド、抗原性タンパク質断片、抗原及びエピトープに対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列し且つ必要であれば最大のパーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、参照配列（即ち、それが由来するタンパク質、ポリペプチド、抗原性タンパク質断片、抗原またはエピトープ）におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するための整列は、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用して、例えば、当業者の技術レベルの範囲内にある種々の方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００６６】
宿主細胞：その中でベクターを増殖させ、そのＤＮＡを発現できる細胞。細胞は、原核生物（例えば、細菌）または真核生物（例えば、哺乳動物またはヒト）であってよい。この用語は、複製中に起こる突然変異が存在し得るので、全ての子孫が親細胞と同一でないとしても、元の宿主細胞の子孫を包含するものである。
【００６７】
免疫応答：刺激に対する、Ｂ細胞、Ｔ細胞、または単球等の免疫系細胞の適応応答。適応応答は、特定の抗原に対する応答であり、従って「抗原特異的」と記載される。適応免疫応答は、Ｂ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞によるＴ細胞補助により、特定の抗原に対する抗体産生を含むことができ、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球、「ＣＴＬ」）の集団、特定の抗原を発現する細胞に対して指向されるＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞障害活性、または更に別のタイプの抗原特異的な免疫応答を増大させることができる。
【００６８】
免疫原性組成物：明細書で使用する場合、「免疫原性組成物」の用語は、初期二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を発現する異種核酸を含んだ組換えポックスウイルスを含有する組成物を言う。この用語はまた、初期ｄｓＲＮＡを発現する異種核酸、及び異種疾患関連抗原をコードする核酸配列を含んだ組換えポックスウイルスを包含する。一定の実施形態において、前記異種疾患関連抗原は、感染疾患関連抗原または腫瘍関連抗原である。一定の実施形態において、前記疾病関連抗原は感染症抗原である。一定の実施形態において、該感染症抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、または寄生虫抗原である。該組換えポックスウイルスは、必要に応じて、例えば本明細書の他の箇所に記載の１以上の共刺激分子をコードする追加の核酸を含むことができる。このような組成物は、必要に応じて、１以上の医薬的に許容可能な担体と共に製剤化された組換えポックスウイルスを含むことができる。
【００６９】
「それを必要とする」：本明細書中に提供される免疫応答を増強する方法、並びに組換えポックスウイルス、免疫原性組成物、及び医薬組成物の使用に関連して使用する場合、「それを必要とする」被験対象とは、例えば、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫感染症から生じる医学的状態、または新生物状態（即ち、癌）と診断され、または該状態について以前に治療された個体であり得る。予防に関しては、それを必要とする被験対象はまた、医学的状態を発症するリスクのある被験対象であり得る（例えば、該状態の家族歴、該状態のリスク等を示すライフスタイル因子を有する）。
【００７０】
リンパ球：身体の免疫防御に関与している白血球の一種。Ｂ細胞及びＴ細胞はリンパ球の２つの主要なタイプである。
【００７１】
主要組織適合性遺伝子複合体（「ＭＨＣ」）：  ヒト白血球抗原（「ＨＬＡ」）を含む異なる種に記載の組織適合抗原系を包含することを意味する総称。
【００７２】
哺乳類：この用語は、ヒト及び非ヒト哺乳動物の両方を含む。同様に、「被験対象」という用語は、ヒト及び獣医学的被験対象を含む。
【００７３】
オープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）：翻訳されてポリペプチドを産生できる中間の停止コドンを伴わない一連のアミノ酸、または翻訳されてリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）または転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のようなＲＮＡ分子を産生できる中間の停止コドンを伴わない一連のヌクレオチドコドンを特定する真核生物開始コドン（ＡＴＧ）の後に続く一連のヌクレオチドコドン。
【００７４】
動作可能に連結された：第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに、第一の核酸配列は第二の核酸配列に動作可能に連結される。例えば、プロモータは、それがコード配列の転写を指示できる位置に配置されている場合に、コード配列に対して動作可能に連結されている。一般に、動作可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、必要な場合には、同じリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を結合する。
【００７５】
医薬的に許容可能な担体：ここで使用される「医薬的に許容可能な担体」または「医薬的に適切な担体」等の用語は、抽出物と有害に反応しない経腸または非経口での適用に適した医薬賦形剤、例えば医薬的、生理学的に許容可能な有機または無機の担体物質を言う。Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７５）は、本明細書に開示されるベクター及び組成物の投与に適した，従来の医薬的に許容される担体を用いた組成物及び製剤を記載している。一般的に用いられる担体の性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は通常、担体として医薬的または生理学的に許容可能な液体、例えば水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロール等を含む注射可能な流体を含有する。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤）については、従来の非毒性の固体担体には、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれる。医薬組成物は、微量の非毒性の助剤物質、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートのような湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤、ｐＨ緩衝剤等を含有することもできる。
【００７６】
「医薬的有効量」、「治療的有効量」、「有効量」：本明細書で使用される場合、これらの用語（及びその同義語）は、指定された状態（例えば、医学的状態、疾患、感染、または障害）もしくは１以上のその症状についての望ましい薬理学的及び／または生理学的効果をもたらし、及び／または前記状態もしくはその症状の発生を完全にもしくは部分的に予防し、及び／または前記状態及び／または該状態に起因する有害な作用を部分的にもしくは完全に治癒する点において治療的である量を言う。「医薬的有効量」または「治療的有効量」は、投与される組成物、治療／予防される状態、治療もしくは予防されるべき状態の重篤度、個体の年齢及び相対的健康、投与の経路及び形態、担当の医師または獣医師の判断、並びに本明細書で与えられる教示を考慮して当業者が評価できる他の因子に応じて変化するであろう。
【００７７】
ポリヌクレオチド；核酸：ポリヌクレオチドの用語は、リボヌクレオチド（即ち、ＲＮＡ）またはデオキシリボヌクレオチド（即ち、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ）から構成される少なくとも長さ３００塩基の核酸ポリマーを意味し、ポリペプチドまたはタンパク質をコードでき、またはコードできない。この用語には、一本鎖または二本鎖の形態のＤＮＡが含まれる。
【００７８】
ポリペプチドまたはタンパク質：ポリペプチドまたはタンパク質の用語は、長さが少なくとも１００アミノ酸、一般的には長さが３０アミノ酸よりも長いポリマーを意味する。
【００７９】
ポックスウイルス：「ポックスウイルス」の用語は、ポックスウイルス科の２つの亜科、即ち、チョルドポックスウイルス亜科及びエントモポックスウイルス亜科の何れかを意味する。チョルドポックスウイルス亜科のメンバーは、脊椎動物に感染する。エントモポックスウイルス亜科のメンバーは、昆虫（即ち、無脊椎動物）に感染する。用語「ポックスウイルス」はまた、増殖性であるか否かに拘わらず、ヒトに感染する可能性のある４つ（オルソポックスウイルス、パラポックスウイルス、ヤタポックスウイルス、及びモルシポックスウイルス）を含め、チョルドポックスウイルスの属の何れかのメンバー（例えば、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、モルシポックスウイルス、オルソポックスウイルス、パラポックスウイルス、スイポックスウイルス、及びヤタポックスウイルス）を指称するが、好ましくはオルソポックスウイルス及び／またはアビポックスウイルスを指称する。「ポックスウイルス」の用語はまた、エントモポックスウイルスの属（例えば、α−エントモポックスウイルス、β−エントモポックスウイルス、及びγ−エントモポックスウイルス）の何れかのメンバーを指す。
【００８０】
アビポックスウイルスには、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルス、ムクドリ痘ウイルス、鳩痘ウイルス、及びクアイル（ｑｕａｉｌ）痘ウイルスが含まれる。カプリポックスウイルスには、羊痘ウイルス、ヤギ痘ウイルス、及びランピースキン病ウイルスが含まれる。前記レポリポックスウイルスには、粘液腫ウイルス、ショープ線維腫ウイルス（ウサギ線維腫ウイルスとしても知られる）、ノウサギ線維腫ウイルス、及びリス線維腫ウイルスが含まれる。モルシポックスウイルスには、伝染性軟属腫ウイルスが含まれる。オルトポックスウイルスには、バッファロー痘ウイルス、ラクダ痘ウイルス、牛痘ウイルス、エクトロメリアウイルス、サル痘ウイルス、アライグマ痘ウイルス、天然痘ウイルス（痘瘡ウイルスとしても知られる）、及びワクシニアウイルスが含まれる。「ワクシニアウイルス」の用語は、野生型ワクシニアウイルス及び何れかの様々な弱毒化株の両方、またはその後に単離された単離株を指し、例えば、ワクシニアウイルス・ウエスタンリザーブ、ワクシニアウイルス・コペンハーゲン、ドライワックス（Ｄｒｙｖａｘ：ワクシニアウイルス・ワイス（Ｗｙｅｔｈ）としても知られる）、ＡＣＡＭ２０００、漿尿膜ワクシニアウイルス・アンカラ（ＣＶＡ）、修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）、及び修飾ワクシニアウイルス・アンカラ・ババリアンノルディック（「ＭＶＡ−ＢＮ」）が含まれる。パラポックスウイルスには、ウシ丘疹性口内炎ウイルス、ＯＲＦウイルス、ニュージーランドアカシカのパラポックスウイルス、及び偽牛痘ウイルスが含まれる。スイポックスウイルスには豚痘ウイルスが含まれる。ヤタポックスウイルスには、タナポックスウイルス及びヤバサル腫瘍ウイルスが含まれる。
【００８１】
「修飾ワクシニアウイルス・アンカラ」または「ＭＶＡ」の用語は、ニワトリ胚線維芽細胞上において、皮膚ワクシニア株アンカラの５７０超の連続継代により生成されたウイルスを意味する［漿尿膜ワクシニアウイルス・アンカラウイルス（ＣＶＡ）：レビューのために、Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５），Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３：６−１４を参照のこと］。ＣＶＡは、長年にわたって、トルコ、アンカラのＶａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで維持され、ヒトのワクチン接種のための基礎として使用されてきた。しかし、ワクシニアウイルスに関連した頻繁な重篤なワクチン接種後合併症のため、より弱毒化された、より安全な天然痘ワクチンを生成するための幾つかの試みがなされた。
【００８２】
１９７４年から１９６０年の期間に亘って、Ａｎｔｏｎ  Ｍａｙｒ教授は、ＣＥＦ細胞における５７０超の連続継代によって、ＣＶＡの弱毒化に成功した［Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）］。これは、種々の動物モデルにおいて、結果として得られるＭＶＡが非病原性であることを示した［Ｍａｙｒ，Ａ．  ＆  Ｄａｎｎｅｒ，Ｋ．（１９７８）、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．４１：２２５−２３４］。プレ天然痘ワクチンとしてＭＶＡの早期開発の一環として、ワクシニア由来の有害反応のリスクにある被験対象において、Ｌｉｓｔｅｒ  Ｅｌｓｔｒｅｅと組み合わせてＭＶＡ−５１７を使用した臨床試験があった［Ｓｔｉｃｋｌ（１９７４）、Ｐｒｅｖ．Ｍｅｄ．３：９７−１０１；Ｓｔｉｃｋｌ及びＨｏｃｈｓｔｅｉｎ−Ｍｉｎｔｚｅｌ（１９７１）、Ｍｕｎｉｃｈ  Ｍｅｄ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．１１３：１１４９−１１５３］。１９７６年に、ＭＶＡ−５７１種株由来のＭＶＡ（第５７１継代に相当）が、二段階非経口天然痘ワクチン接種プログラムにおけるプライマーワクチンとして、ドイツで登録された。その後、ＭＶＡ−５７２が約１２万人の白人個体において使用されたが、子供の過半数は１歳から３歳であり、被験対象の多くはワクシニアに関連する合併症のリスクが高い集団であったにもかかわらず、重篤な副作用は報告されてなかった（Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）、Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（Ｂ）１６７：３７５−３９０）。ＭＶＡ−５７２は、ＥＣＡＣＣ  Ｖ９４０１２７０７として、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された。
【００８３】
ＭＶＡを弱毒化するために使用された継代の結果、ＣＥＦ細胞における継代数に応じて、そこには多くの異なる株または単離体が存在した。例えば、ＭＶＡ−５７２は、天然痘根絶プログラムの実行中にドイツで使用され、またＭＶＡ−５７５は広く家畜ワクチンとして使用された。ＭＶＡ−５７５は、２０００年１２月７日に、寄託番号Ｖ００１２０７０７でＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託された。弱毒化されたＣＶＡ−ウイルスＭＶＡ（修飾ワクシニアウイルス・アンカラ）が、初代ニワトリ胚線維芽細胞上でのＣＶＡの連続増殖（５７０超の継代）によって得られた。
【００８４】
Ｍａｙｒと彼の同僚が、１９７０年代に、ＭＶＡは高度に弱毒化されており、ヒト及び哺乳動物において非病原性であることを実証したにも関わらず、一定の研究者は、残留複製がこれらの細胞で発生する可能性があるので、ＭＶＡが哺乳動物及びヒト細胞株において完全には弱毒化されていないと報告している［Ｂｌａｎｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１１５９−１１６７；Ｃａｒｒｏｌｌ  ＆  Ｍｏｓｓ（１９９７）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３８：１９８−２１１。米国特許番号第５，１８５，１４６号；Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５５：５６９］。使用されるウイルスは本質的に、特に様々な細胞株におけるそれらの成長挙動におけるそれらの特性が異なるので、これらの刊行物に報告された結果は、ＭＶＡの様々な既知の株で得られたものと思われる。このような残留複製は、ヒトでの使用に関連した安全性の懸念など、種々の理由で望ましくない。
【００８５】
ワクチンや医薬品等、より安全な製品開発のための強化された安全性プロファイルを持つＭＶＡの株が、ババリアンノルディック社によって開発されてきた：ＭＶＡは、ババリアンノルディック社によって更に継代され、ＭＶＡ−ＢＮと命名されている。ＭＶＡと同様にＭＶＡ−ＢＮは、先祖のＣＶＡウイルスに比較してゲノムの約１３％（主に６つの領域から２６．６ｋｂ）を欠失している。欠失は、多くの病原性及び宿主域遺伝子、並びにＡ型封入体を形成するのに必要な遺伝子に影響を与える。第５８３継代に対応するＭＶＡ−ＢＮのサンプルが、２０００年８月３０日に、番号Ｖ０００８３００８の下でＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託された。
【００８６】
ＭＶＡ−ＢＮは人細胞に付着して侵入することができ、そこではウイルスにコードされた遺伝子は非常に効率的に発現する。しかし、子孫ウイルスの組立及び放出は生じない。ＭＶＡ−ＢＮは初代ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）に強く適合されており、ヒト細胞中では複製されない。ヒト細胞ではウイルス遺伝子が発現され、感染性ウイルスは産生されない。ＭＶＡ−ＢＮは、米国の疾病管理予防センター（ＣＤＣ）によると、バイオ安全性レベル１の生物として分類されている。ＭＶＡ−ＢＮ及びその誘導体の製剤は、多くの種類の動物、及び免疫不全の個体を含む４０００以上のヒト被験対象に投与されている。全ての予防接種は、一般的に安全で且つ忍容性が良好であることが証明されている。その高度の弱毒化及び低下された毒性にもかかわらず、前臨床試験において、ＭＶＡ−ＢＮは、ワクシニアに対して、及びＭＶＡゲノムにクローニングされた遺伝子によりコードされる異種遺伝子産物に対して、体液性及び細胞性の両方の免疫応答を誘発することが示されている［Ｅ．Ｈａｒｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．１０（２）：２８５−３００；Ａ．Ｃｏｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２（１）：２１−９；Ｍ．Ｄｉ  Ｎｉｃｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １４（１４）：１３４７−１３６０；Ｍ．Ｄｉ  Ｎｉｃｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１０（１６）：５３８１−５３９０］。
【００８７】
ＭＶＡの「誘導体」または「変異体」の用語は、本明細書に記載されているＭＶＡと本質的に同じ複製特性を示すが、そのゲノムの１以上の部分における相違を示すウイルスを意味する。ＭＶＡ−ＢＮ、並びにＭＶＡ−ＢＮの誘導体または変異体は、ヒト及びマウスにおいて、更に重症免疫抑制マウスにおいてさえも、インビボでの増殖複製に失敗した。より詳細に言えば、ＭＶＡ−ＢＮ、またはＭＶＡ−ＢＮの誘導体または変異体は、好ましくは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）においても増殖の複製能力を有するが、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔ［Ｂｏｕｋａｍｐ等（１９８８），Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０６：７６１−７７１］、ヒトの骨骨肉腫細胞株１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ番号９１１１２５０２）、ヒト胚腎臓細胞株２９３（ＥＣＡＣＣ番号８５１２０６０２）、及びヒト子宮頸部腺癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２）においては増殖の複製能力がない。更に、ＭＶＡ−ＢＮの誘導体または変種は、Ｈｅｌａ細胞及びＨａＣａＴ細胞株において、ＭＶＡ−５７５より少なくとも２倍未満、より好ましくは３倍未満のウイルス増幅率を有している。ＭＶＡ変異体のこれらの性質についての試験及び検定はＷＯ０２／４２４８０（ＵＳ２００３／０２０６９２６）及びＷＯ０３／０４８１８４（ＵＳ２００６／０１５９６９９）に記載されており、これら両者を本明細書の一部として援用する。
【００８８】
ウイルスの増幅または複製は、通常は、まず前記細胞を感染させるために最初に用いられたウイルス量（入力）に対する、感染された細胞から産生されたウイルス（出力）の比として表され、「増幅率」と称される。増幅率「１」は、感染細胞から産生されたウイルスの量が、該細胞を感染させるために最初に用いられた量と同じである増幅状態を定義し、感染された細胞がウイルス感染及び複製を許容することを意味する。対照的に、１未満の増幅率、即ち、入力レベルと比較した出力の低下は、増殖的複製の欠如、従ってウイルスの減衰を示している。
【００８９】
ＭＶＡに基づくワクチンの利点には、その安全性プロファイル、並びに大規模なワクチン生産のための利用可能性が含まれる。前臨床試験により、ＭＶＡ−ＢＮは、他のＭＶＡ株（ＷＯ０２／４２４８０）と比較して優れた弱毒化及び有効性を示すことが明らかになった。ＭＶＡ−ＢＮ株の追加の特性は、ＤＮＡプライム／ワクシニアウイルスブーストレジメンと比較したときに、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブーストレジメンにおいて実質的に同じレベルの免疫を誘導する能力である。
【００９０】
組換えＭＶＡ−ＢＮウイルス、即ち、本明細書に記載の最も好ましい実施形態は、哺乳動物細胞での明確な複製欠損及び十分に確立された非病原性の故に安全と考えられている。更に、その有効性に加えて、工業的規模の生産の実現可能性は、有益であり得る。また、ＭＶＡに基づくワクチンは、複数の異種抗原を送達し、体液性免疫及び細胞性免疫の同時誘導を可能にすることができる。
【００９１】
もう一つの態様では、組換えウイルスを生成するのに適したＭＶＡウイルス株は、株ＭＶＡ−５７２、ＭＶＡ−５７５または任意の同様の弱毒化ＭＶＡ株であってよい。また、欠失された漿尿膜ワクシニアウイルス・アンカラ（ｄＣＶＡ）のような変異体ＭＶＡも適切であり得る。ｄＣＶＡは、欠失Ｉ（ｄｅｌＩ）、欠失ＩＩ（ｄｅｌＩＩ）、欠失ＩＩＩ（ｄｅｌＩＩＩ）、欠失ＩＶ（ｄｅｌＩＶ）、欠失Ｖ（ｄｅｌＶ）、及び削除ＶＩ（ｄｅｌＶＩ）と称する、ＭＶＡゲノムの６つの欠失部位を含んでいる。欠失部位は、特に複数の異種配列の挿入に有用である。ｄＣＶＡは、ヒト細胞株（例えば、ヒト２９３、１４３Ｂ、及びＭＲＣ−５細胞株）において増殖的に（１０を超える増幅率で）複製することができ、次いで、これはウイルスに基づくワクチン接種戦略のために有用な、更なる突然変異または弱毒化による最適化を可能にする（例えば、ＷＯ２０１１／０９２０２９参照）。
【００９２】
プライム・ブーストワクチン接種：「プライム・ブーストワクチン接種」の用語は、特定の抗原を標的とするワクチンの最初のプライミング注射の後に、間隔を置いて、同じワクチン抗原での１回以上のブースト注射を用いるワクチン接種戦略を言う。プライム・ブーストワクチン接種は、ワクチン抗原を送達するワクチンモダリティー（ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、ベクター、ウイルス様粒子）に対して同種または異種であり得る。相同プライム・ブーストワクチン接種は、プライミング注射及び１以上のブースト注射の両方に、同じ免疫原及びベクターを含むワクチンを使用する。異種プライム・ブーストワクチン接種は、プライミング注射及び１以上のブースト注射のための同じ免疫源を含むが、プライミング注射及び１以上のブースト注射のための異なるベクターを含むワクチンを使用する。例えば、相同プライム・ブーストワクチン接種は、プライミング注射及び１以上のブースト注射の両方のために、免疫原及びＴＲＩＣＯＭを発現する核酸を含んだＭＶＡベクターを使用することができる。対照的に、異種プライム・ブーストワクチン接種は、プライミング注射のために免疫原及びＴＲＩＣＯＭを発現する核酸を含むＭＶＡベクターを使用し、また１以上のブースト注射のためには、免疫原及びＴＲＩＣＯＭを発現する核酸を含む鶏痘ベクターを使用することができる。異種プライム・ブーストワクチン接種はまた、プライミング注射では免疫源をコードするプラスミドを使用し、且つ１以上のブースト注射では同じ免疫源をコードするポックスウイルスベクターを使用すること、或いは、プライミング注射では組換えタンパク質免疫源を使用し、且つ１以上のブースト注射では同じタンパク質免疫源をコードするプラスミドもしくはポックスウイルスベクターを使用する等の、種々の組み合わせを包含するものである。
【００９３】
組換え；組換え核酸；組換えベクター；組換えポックスウイルス：核酸、ベクター、ポックスウイルスなどに適用される「組換え」の用語は、２以上の他の異種セグメントの核酸配列の人工的な組み合わせにより作製される核酸、ベクター、またはポックスウイルス、或いは、斯かる２以上の他の異種セグメントの核酸配列の人工的な組み合わせを含んでなる核酸、ベクター、またはポックスウイルスを意味する。この人工的な組み合わせは、最も一般的には、十分に確立された遺伝子工学的手法を用いて、核酸の単離セグメントを人工的に操作することにより達成される。
【００９４】
配列同一性：「配列同一性」の用語は、核酸またはアミノ酸配列間の同一性の程度を言う。配列同一性は、屡々、パーセント同一性（多くの場合、配列「類似性」または「相同性」と記載する）の観点で測定される。パーセント配列同一性が高いほど、その二つの配列は類似している。標準的な方法を用いて整列させたときに、タンパク質免疫原のホモログまたは変異体は、比較的高い配列同一性を有するであろう。
【００９５】
比較のために配列を整列させる方法は、当該分野において周知である。種々のプログラム及び整列アルゴリズムが次の文献に記載されている：Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３：２３７，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：１０８８１，１９８８；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８。加えて、文献Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．６：１１９，１９９４は、配列整列の方法及び相同性計算の詳細な考察を提供している。配列分析プログラムＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮ及びＴＢＬＡＳＴＸに関連して使用するための、ＮＣＢＩ・Ｂａｓｉｃ・Ｌｏｃａｌ・Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ・Ｓｅａｒｃｈ・Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉも参照のこと）を含むいくつかの供給源から入手可能である。
【００９６】
タンパク質免疫原の相同体及び変異体は、デフォルトのパラメータに設定されたｂｌａｓｔｐを使用して、ＮＣＢＩ・Ｂｌａｓｔ  ｖ２．０で調製された野生型免疫源のアミノ酸配列との、典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を全長整列に亘って有している。約３０アミノ酸よりも大きいアミノ酸配列の比較のために、デフォルトのパラメータに設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（１１のギャップ存在コスト、１の残基当たりのギャップコスト）を使用して、Ｂｌａｓｔ２配列関数が用いられる。
【００９７】
被験対象：例えばヒト、非ヒト哺乳動物及び鳥類を含む、生きた多細胞脊椎動物。「被験対象」の用語は、本明細書において、「哺乳動物」または「動物」の用語と互換的に使用され得る。
【００９８】
Ｔ細胞：適応性免疫応答に不可欠なリンパ球または白血球。Ｔ細胞には、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞が含まれるが、これらに限定されない。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、その表面上に分化抗原群４（「ＣＤ４」）として知られるマーカーを有する免疫細胞である。また、ヘルパーＴ細胞としても知られるこれらの細胞は、抗体応答及びＣＴＬ応答の両方を含んだ免疫応答の調整を補助する。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、「分化抗原群８」（「ＣＤ８」）マーカーを担持する。ＣＤ８＋Ｔ細胞は両方のＣＴＬ、即ち、メモリＣＴＬ及びサプレッサーＴ細胞の両方を含んでいる。
【００９９】
治療的に活性なポリペプチド：臨床反応（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＢ細胞の増加、タンパク質発現レベルの増加、腫瘍サイズの測定可能な減少、または転移数の減少）によって測定される、生物学的効果及び／または適応性免疫応答を誘発するタンパク質等のアミノ酸からなる薬剤。また、治療的に活性な分子は核酸から、例えば、発現制御配列に動作可能に連結されたタンパク質またはタンパク質免疫源をコードする核酸を備えたポックスウイルスベクターのような核酸から作製することもできる。
【０１００】
治療的有効量：「治療的有効量」とは、治療される被験対象において望ましい治療的もしくは臨床的効果を達成するために十分な、組成物または細胞の量である。例えば、発現制御配列に動作可能に連結されたタンパク質またはタンパク質免疫原をコードする核酸を含むポックスウイルスベクターの治療的有効量は、生物学的応答または抗原特異的免疫応答を誘発するか、または疾患または障害を有する患者または患者集団における感染または他の疾患の臨床徴候または症状を減少させ、または排除するのに十分な量であろう。ポックスウイルスベクター及びここで提供されるポックスウイルスベクターを含む組成物の治療的有効量は、標的抗原を発現する細胞に対して免疫応答を上昇させるのに十分な量である。免疫応答は、目標である障害をもった患者または患者集団において、疾患の臨床徴候や症状を軽減または排除するために十分な大きさでなければならない。
【０１０１】
形質導入または形質転換：「形質導入」または「形質転換」の用語は、組換え核酸が、標準的な分子生物学的方法により導入された細胞を指称する。本明細書で使用するとき、形質導入の用語は、ウイルスベクターによる感染、プラスミドベクターによる形質転換、並びにエレクトロポレーション、リポフェクション、またはパーティクルガン加速による裸のＤＮＡの導入を含む、核酸分子がそのような細胞に導入され得る全ての技術を包含するものである。
【０１０２】
ＴＲＩＣＯＭ：抗原特異的免疫応答を増大させるために、特定の抗原を発現する組換えウイルスベクター（例えば、ポックスウイルスベクター）に通常含められる、Ｂ７−１（またＣＤ８０としても知られる）、細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１、またＣＤ５４としても知られる）、及びリンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３、またＣＤ５８としても知られる）からなる三つ組の共刺激分子（Ｔｒｉａｄ  ｏｆ  ＣＯｓｔｉｍｌａｔｏｒｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）。ＴＲＩＣＯＭの個々の成分は、同じかまたは異なるプロモータの制御下にあることができ、特定の抗原と同じベクター上に、または別のベクター上に提供することができる。典型的なベクターは、二つの文献［Ｈｏｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｔｒｉａｄ  ｏｆ  Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｓｙｎｅｒｇｉｚｅ  ｔｏ  Ａｍｐｌｉｆｙ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：５８００−５８０７（１９９９）；及び米国特許番号第７，２１１，４３２Ｂ２号］に開示されており、これらの両者を本明細書の一部として援用する。
【０１０３】
ベクター：興味ある核酸分子を宿主細胞に導入し、それによって形質導入または形質転換された宿主細胞を産生する担体。ベクターは、一般に、宿主細胞中でその複製を可能する複製起点のような核酸配列、並びに１以上の選択可能なマーカー遺伝子、発現制御配列、制限エンドヌクレアーゼ認識配列、プライマー配列及び当該技術分野で知られた種々の他の遺伝子要素を含んでいる。普通に使用されるベクターの種類には、細菌（例えば、大腸菌）または酵母（例えば、Ｓ．セレビシエ）の中での発現のためのプラスミド、組換えポックスウイルス、コスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体を構築するためのシャトルベクター、及びウイルスベクターが含まれる。ウイルスベクターには、とりわけ、ポックスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、及びポリオウイルスベクターが含まれる。
【０１０４】
ポックスウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、上記で更に詳細に定義したように、オルソポックスウイルス、アビポックスウイルス、パラポックスウイルス、ヤタポックスウイルス、及びモルシポックスウイルスが含まれ、好ましくは、オルソポックス及び／またはアビポックスウイルスである。オルソポックスウイルスには、天然痘ウイルス（痘瘡ウイルスとしても知られる）、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、及びサル痘ウイルスが含まれる。アビポックスウイルスには、カナリア痘ウイルス及び鶏痘ウイルスが含まれる。「ワクシニアウイルス」の用語は、野生型ワクシニアウイルス及び何れかの様々な弱毒化株の両方、またはその後に単離された単離株を指し、例えば、ワクシニアウイルス・ウエスタンリザーブ、ワクシニアウイルス・コペンハーゲン、Ｄｒｙｖａｘ（ワクシニアウイルス・Ｗｙｅｔｈとしても知られる）、ＡＣＡＭ２０００、修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）、及び修飾ワクシニアウイルス・アンカラ・ババリアンノルディック（「ＭＶＡ−ＢＮ」）が含まれる。
【０１０５】
組換えポックスウイルス：本明細書で提供される一態様は、初期二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を発現する異種核酸を含んだ組換えポックスウイルスである。一定の実施形態において、組換えポックスウイルスは、感染後１または２時間以内に過剰のｄｓＲＮＡを発現する異種核酸を含んでいる。本明細書に提供される一定の実施形態においては、組換えポックスウイルスのゲノム複製に先立って、初期もしくは過剰のｄｓＲＮＡを発現する異種核酸を含んでなる組換えポックスウイルスが提供される。一定の実施形態において、組換えポックスウイルスは、初期ｄｓＲＮＡを感染後１または２時間以内に発現する異種核酸を含む。一定の実施形態において、組換えポックスウイルスは、両方の鎖が転写され、初期ｄｓＲＮＡを産生する単一の異種核酸を含むことができる。一定の実施形態において、組換えポックスウイルスは、初期に転写される天然のポックスウイルス遺伝子の早期アンチセンス転写を指令して、初期ｄｓＲＮＡを発現する追加のプロモータを含むことができる。一定の実施形態において、初期ｄｓＲＮＡを生じる前記組換えポックスウイルスは、更に、異種の疾患関連抗原をコードする核酸配列を含むことができる。一定の実施形態において、当該組換えポックスウイルスは、１以上の共刺激分子をコードする核酸配列を含んでいる。一定の実施形態において、１以上の共刺激分子は、ＴＲＩＣＯＭ（即ち、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３）である。一定の実施形態において、前記異種の疾患関連抗原は感染症関連抗原または腫瘍関連抗原である。一定の実施形態において、前記異種の疾患関連抗原は感染症抗原である。一定の実施形態において、前記感染症抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、または寄生虫抗原である。
【０１０６】
一定の実施形態において、前記感染症抗原はウイルス抗原である。一定の実施形態において、該ウイルス抗原は、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デング熱ウイルス、エボラウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、グアナリトウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、ヒトヘルペスウイルス８型（ＨＨＶ−８）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、パラインフルエンザウイルス、パルボウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ）、水痘帯状疱疹ウイルス、天然痘ウイルス、西ナイルウイルス、及び黄熱病ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する。
【０１０７】
一定の実施形態において、前記感染症抗原は細菌抗原である。一定の実施形態において、該細菌抗原は、炭疽菌、百日咳菌、ボレリア・ブルグドルフェリ、ウシ流産菌、ブルセラカニス、ブルセラ・メリテンシス、ブルセラ・スイス、カンピロバクター・ジェジュニ、肺炎クラミジア、トラコーマクラミジア、クラミジアオウム病、ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシル、ウェルシュ菌、破傷風菌、コリネバクテリウム・ジフテリエ、エンテロコッカスフェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、病原性大腸菌、大腸菌１５７：Ｈ１７、野兎病菌、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、レジオネラ・ニューモフィラ、レプトスピラ・インターロガンス、リステリア菌、らい菌、結核菌、肺炎マイコプラズマ、淋菌、髄膜炎菌、緑膿菌、リケッチア・リケッチア、チフス菌、ネズミチフス菌、赤痢菌ソンネ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ・ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ、肺炎球菌、化膿連鎖球菌、梅毒トレポネーマ、コレラ菌、及びペスト菌からなる群から選択される細菌に由来する。
【０１０８】
一定の実施形態において、前記感染症抗原は真菌抗原である。一定の実施形態において、前記真菌抗原は、アスペルギルス・クラバタス、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・テレウス、ブラストミセスデルマティティディス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ドゥブリニエンシス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ルゴサ、カンジダ・トロピカリス、クリプトコッカス・アルビダス、クリプトコッカス・ガッティ、クリプトコッカスラウレンティ、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、犬小胞子菌、カリニ肺炎、ニューモシスチス・ジロベシ、スポロトリックス・シェンキー、スタキボトリス・カルタルム、白癬性毛瘡、頭部白癬、体部白癬、股部白癬、顔面白癬、異型白癬、白癬黒質、白癬玉虫色、トリコフィトンルブルム及びトリコフィトン・トンズランスからなる群から選択される真菌に由来する。
【０１０９】
一定の実施形態において、前記感染症抗原は寄生虫抗原である。一定の実施形態において、前記寄生虫抗原は、アニサキス属、バベシア属、アライグマ回虫、クリプトスポリジウム属、シクロスポラ・カイエタネンシス、裂頭条虫属、メジナ虫、赤痢アメーバ、十二指腸鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ・ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ）、腸鞭毛虫、ランブル鞭毛虫、リーシュマニア属、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ・ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、マンソン住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫、日本住血吸虫、テニア属、トキソプラズマ虫、旋毛虫、及びクルーズトリパノソーマからなる群から選択される寄生虫に由来する。
【０１１０】
一定の実施形態において、前記異種疾患関連抗原は腫瘍関連抗原である。一定の実施形態において、前記腫瘍関連抗原は、５−α−レダクターゼ、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＭ−１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂ黒色腫抗原遺伝子（ＢＡＧＥ）、β−カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ−ａｂｌ、ブラキュリ、ＣＡ−１２５、カスパーゼ８（ＣＡＳＰ−８、ＦＬＩＣＥとしても知られている）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体受容体２（ＣＲ２）、ＣＤ２２／ＢＬ−ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体受容体１（ＣＲ１）、ＣＤ４４／ＰＧＰ−１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（ＬＣＡ）、ＣＤ４６／膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ−１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｃ−ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ−２（ｃｏｘ−２）、結腸直腸癌に欠失している遺伝子（ＤＣＣ）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞増殖因子−８ａ（ＦＧＦ８ａ）、線維芽細胞増殖因子−８ｂ（ＦＧＦ８ｂ）、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、Ｇ黒色腫抗原遺伝子ファミリー（ＧＡＧＥ−ｆａｍｉｌｙ）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（ＧＤ２）／ガングリオシド３（ＧＤ３）／ガングリオシドモノシアル酸−２（ＧＭ２）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１−６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ  ｔｏ  Ｍａｎ（α１−６）］；β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＧｎＴ  Ｖ）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ−１００−ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質−１（ｇｐ７５／ＴＲＰ−１）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ヒト乳房腫瘍ウイルス（ＨＭＴＶ）、７０キロダルトン熱ショックタンパク質（ＨＳＰ７０）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インスリン様増殖因子受容体１（ＩＧＦＲ−１）、インターロイキン１３受容体（ＩＬ−１３Ｒ）、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、黒色腫抗原コード化遺伝子１（ＭＡＧＥ−１）、黒色腫抗原コード化遺伝子２（ＭＡＧＥ−２）、黒色腫抗原コード化遺伝子３（ＭＡＧＥ−３）、黒色腫抗原コード化遺伝子４（ＭＡＧＥ−４）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、メラン−Ａ／Ｔ細胞―１により認識される黒色腫抗原（ＭＡＲＴ−１）、メソテリン、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰ、ムチン、精巣特異抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、μΡΑ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロジェニポエチン（ｐｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＡＧＥ−１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ−１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、チモシンβ−１５、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、ＴＰ１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４、及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）からなる群から選択される。
【０１１１】
一定の実施形態において、前記組換えポックスウイルスは、チョルドポックスウイルス亜科及びエントモポックスウイルス亜科のメンバーである。一定の実施形態において、前記組換えポックスウイルスは、チョルドポックスウイルス亜科のメンバーである。一定の実施形態において、前記組換えポックスウイルスはアビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、モルシポックスウイルス、オルソポックスウイルス、パラポックスウイルス、スイポックスウイルス、及びヤタポックスウイルスからなる群から選択されるチョルドポックスウイルスの属のメンバーである。一定の実施形態において、前記組換えポックスウイルスはアビポックスウイルスである。一定の実施形態において、該アビポックスウイルスは、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルス、ムクドリ痘ウイルス、鳩痘ウイルス、及びクアイル（ｑｕａｉｌ）痘ウイルスからなる群から選択される。一定の実施形態において、前記組換えポックスウイルスはカプリポックスウイルスである。一定の実施形態において、該カプリポックスウイルスは羊ポックスウイルス、ヤギ痘ウイルス、及びランピースキン病ウイルスからなる群から選択される。一定の実施形態において、前記組換えポックスウイルスはレポリポックスウイルスである。一定の実施形態において、該レポリポックスウイルスは粘液腫ウイルス、ショープ線維腫ウイルス（ウサギ線維腫ウイルスとしても知られる）、ノウサギ線維腫ウイルス、及びリス線維腫ウイルスからなる群から選択される。一定の実施形態において、前記組換えポックスウイルスはモルシポックスウイルスである。一定の実施形態において、モルシポックスウイルスは、伝染性軟属腫ウイルスである。一定の実施形態において、前記組換えポックスウイルスは、オルソポックスウイルスである。一定の実施形態において、該オルソポックスウイルスはバッファロー痘ウイルス、ラクダ痘ウイルス、牛痘ウイルス、エクトロメリアウイルス、サル痘ウイルス、アライグマ痘ウイルス）、天然痘ウイルス（痘瘡ウイルスとしても知られる）、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される。一定の実施形態において、前記オルソポックスウイルスはワクシニアウイルスである。一定の実施形態において、該ワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルス、ウェスタンリザーブ、ワクシニアウイルス・コペンハーゲン、Ｄｒｙｖａｘ（ワクシニアウイルスＷｙｅｔｈとしても知られる）、ＡＣＡＭ２０００、漿尿膜ワクシニアウイルス・アンカラ（「ＣＶＡ」）、修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（「ＭＶＡ」）、及び修飾ワクシニアウイルス・アンカラ・ババリアンノルディック（「ＭＶＡ−ＢＮ」）からなる群から選択される。一定の実施形態において、前記組換えポックスウイルスはパラポックスウイルス属である。一定の実施形態において、該パラポックスウイルス属は、ウシ丘疹性口内炎ウイルス、ＯＲＦウイルス、ニュージーランドアカシカのパラポックスウイルス、及び偽牛痘ウイルスからなる群から選択される。一定の実施形態において、前記組換えポックスウイルスはスイポックスウイルスである。一定の実施形態において、該スイポックスウイルスは豚痘ウイルスである。一定の実施形態において、前記組換えポックスウイルスはヤタポックスウイルスである。一定の実施形態において、該ヤタポックスウイルスはタナポックスウイルス及びヤバサル腫瘍ウイルスからなる群から選択される。
【０１１２】
一定の実施形態において、初期ｄｓＲＮＡを発現する異種核酸は相補的ＲＮＡ転写物をコードする配列を含んでおり、ここでの相補的ＲＮＡ転写物は、転写後にアニールしてｄｓＲＮＡを生成する。一定の実施形態において、前記相補的ＲＮＡ転写物は、タンパク質をコード化するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または非タンパク質コード化遺伝子を含んでいる。一定の実施形態において、前記相補的ＲＮＡ転写物またはＲＮＡ転写物の相補的部分は、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００ヌクレオチドだけ重なる。一定の実施形態において、前記相補的ＲＮＡ転写物は、５０ヌクレオチド超、１００ヌクレオチド超、１５０ヌクレオチド超、２００ヌクレオチド超、２５０ヌクレオチド超、３００ヌクレオチド超、３５０ヌクレオチド超、４００ヌクレオチド超、４５０ヌクレオチド超、５００ヌクレオチド超、５５０ヌクレオチド超、６００ヌクレオチド超、６５０ヌクレオチド超、７００ヌクレオチド超、７５０ヌクレオチド超、８００ヌクレオチド超、８５０ヌクレオチド超、９００ヌクレオチド超、９５０ヌクレオチド超、または１０００ヌクレオチド超だけ重なる。一定の実施形態において、前記相補的ＲＮＡ転写物は、１００〜１０００ヌクレオチド、２００〜１０００ヌクレオチド、３００〜１０００ヌクレオチド、４００〜１０００ヌクレオチド、５００〜１０００ヌクレオチド、６００〜１０００ヌクレオチド、７００〜１０００ヌクレオチド、８００〜１０００ヌクレオチド、９００〜１０００ヌクレオチド、２００〜９００ヌクレオチド、３００〜８００ヌクレオチド、４００〜７００ヌクレオチド、３００〜７５０ヌクレオチド、３００〜７３０ヌクレオチド、または５００〜６００ヌクレオチドだけ重複する。
【０１１３】
一定の実施形態において、異種核酸は、相補的な核酸または好ましくは５０、６０、７０、８０、９０、１００％相補的な配列の相補的配列で、ＲＮＡに転写される。一定の実施形態において、相補的ＲＮＡ転写産物をコードする異種核酸は、二つの相補的配列を含む。一定の実施形態において、前記相補的配列は、１以上の必須のウイルス遺伝子または非相補的核酸によって分離される。一定の実施形態において、部分的にまたは完全に相補的な転写物をコードする同一または非常に類似した配列は、１以上の必須のウイルス遺伝子によって分離される。一定の実施形態において、相補的ＲＮＡ転写物をコードする異種核酸は、別個の転写物または核酸上に２つの相補的配列を含む。一定の実施形態において、センスメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は一方の相補配列から転写され、アンチセンスｍＲＮＡは他方の相補的配列から転写される。一定の実施形態において、センスメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、二つの同一または非常に類似した配列の一方から転写され、アンチセンスｍＲＮＡは、他方の同一または非常に類似した配列から転写される。一定の実施形態において、重複する相補的なＲＮＡ転写物をコードする配列の発現は、１以上のポックスウイルスプロモータによって指令される。一定の実施形態において、この１以上のポックスウイルスプロモータは、初期プロモータまたは即時初期プロモータである。
【０１１４】
一定の実施形態において、相補的ＲＮＡ転写物または該ＲＮＡ転写物の一部は、異なる核酸分子上のヌクレオチドを含む。一定の実施形態において、前記ＲＮＡ転写物の相補的部分は、ｓｉＲＮＡ以外の核酸、または例えば２１〜２３塩基対のような短いストレッチの相補的ＲＮＡ転写物を含む。
【０１１５】
一定の実施形態において、前記ポックスウイルスプロモータは初期プロモータである。一定の実施形態において、該初期プロモータはＰｒ７．５プロモータ及びＰｒＳプロモータからなる群から選択される。一定の実施形態において、前記ポックスウイルスプロモータは、即時初期プロモータである。一定の実施形態において、この即時初期プロモータは、Ｉ３Ｌプロモータ、３０Ｋプロモータ、４０Ｋプロモータ、ＰｒＨｙｂプロモータ、ＰｒＳ５Ｅプロモータ、Ｐｒ４ＬＳ５Ｅプロモータ、及びＰｒ１３．５長プロモータからなる群から選択される。
【０１１６】
＜組成物＞
もう一つの態様において、ここでは、本明細書で与えられる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を発現する異種核酸を含んだ何れかの組換えポックスウイルスと、必要に応じて医薬的に許容可能な担体または賦形剤を含有する免疫原性組成物が提供される。一定の実施形態において、該免疫原性組成物は、本明細書で与えられるｄｓＲＮＡを発現する異種核酸を含む何れかの組換えポックスウイルスを含有し、更に、本明細書中に提供される何れかの異種疾患関連抗原をコードする核酸配列、及び任意に医薬的に許容可能な担体もしくは賦形剤を含有するものである。
【０１１７】
もう一つの態様において、ここでは、本明細書に提供される初期の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を発現する異種核酸を含む何れかの組換えポックスウイルス、及び医薬的に許容可能な担体または賦形剤を含有する医薬組成物が提供される。一定の実施形態において、該医薬組成物は、本明細書で提供されるｄｓＲＮＡを発現する異種核酸を含む何れかの組換えポックスウイルスを含有し、更に、本明細書で提供される何れかの異種疾病関連抗原をコードする核酸配列及び医薬的に許容可能な担体または賦形剤を含有する。
【０１１８】
本明細書で提供される免疫原性組成物及び医薬組成物を調製するために使用される組換えポックスウイルスは、１０４〜１０９ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、１０５〜５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、１０６ 〜１０８ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、または１０７〜１０８ＴＣＩＤ５０／ｍＬの濃度範囲を有する組換えポックスウイルス粒子の懸濁液または溶液を含む。一定の実施形態において、該組成物は、１０６〜１０９ＴＣＩＤ５０を含有し、または１０６ＴＣＩＤ５０、１０７ＴＣＩＤ５０、１０８ＴＣＩＤ５０または５×１０８ＴＣＩＤ５０を含有する単一用量として製剤化される。文献［Ｈ．Ｓｔｉｃｋｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９：２３８６−２３９２（１９７４）］に記載されるように、本明細書に開示された組換えポックスウイルスは、例えば、天然痘に対するワクチン接種のために使用されるポックスウイルスワクチンの製造における経験に基づいて、生理的に許容される形態で提供される。例えば、精製されたポックスウイルスは、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍＬの力価で−８０℃において保存し、ｐＨ  ７．７で約１０ｍＭのトリス、１４０ｍＭの塩化ナトリウム中に処方することができる。一定の実施形態において、ポックスウイルス調製物、例えば１０２〜１０８または１０２〜１０９ポックスウイルス粒子は、２％（ｗ／ｖ）ペプトン及び１％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下に１００ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で凍結乾燥し、またガラス製または他の適切な材料で作られたアンプルに保存することができる。
【０１１９】
或いは、凍結乾燥したポックスウイルス粒子製剤は、例えば、ｐＨ７．７の１０ｍＭトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ、またはＰＢＳプラス２％（ｗ／ｖ）ペプトン及び１％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ等の溶液中で処方されたポックスウイルスの懸濁液を段階的に凍結乾燥することによって調製することができる。一定の実施形態において、該溶液はマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースまたはポリビニルピロリドンのような１以上の追加の添加剤を含有する。一定の実施形態において、前記溶液は、インビボ投与に適した酸化防止剤もしくは不活性ガス、安定剤または組換えタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンまたはＨＳＡ）等の他の補助剤を含有する。次いで、該溶液は、例えばガラスアンプル等の適切な貯蔵容器に等分され、該貯蔵容器は密封される。一定の実施形態において、免疫原性組成物及び／または医薬組成物は、４℃〜室温で数ヶ月間保存される。一定の実施形態において、前記貯蔵容器は−２０℃未満、−４０℃未満、−６０℃未満、または−８０℃未満の温度で保存される。
【０１２０】
一定の実施形態において、医薬的に許容可能な担体または賦形剤は、１種以上の添加剤、抗生物質、防腐剤、アジュバント、希釈剤及び／または安定剤を含む。このような補助物質は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などであることができる。一般的に、使用される担体の性質は、用いられる特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロール等のような医薬的及び生理学的に許容される液体を媒体として含有する注射可能な液体を包含する。適切な担体は、典型的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物等の大きな徐々に代謝される分子である。
【０１２１】
＜方法及び使用＞
もう一つの態様において、ここでは、自然免疫活性化を増強する方法であって、本明細書に提供される医薬組成物または組換えポックスウイルスの何れか一つを、それを必要としている被験者に投与することを含んでなり、ここでの医薬組成物または組換えポックスウイルスは、被験者に投与されたときに自然免疫活性化を増強することを特徴とする方法が提供される。もう一つの態様において、ここでは、ポックスウイルスにより媒介されまたは異種疾患関連抗原によって媒介される状態の治療または予防のための医薬の製造における、本明細書で提供される医薬組成物または組換えポックスウイルスの何れか一つの使用が提供される。もう一つの態様において、ここでは、医薬として使用するための、本明細書で提供されるポックスウイルスまたは医薬組成物の何れか一つが提供される。もう一つの態様において、ここでは、自然免疫活性化の増強に使用するための、またはポックスウイルスによって媒介され、または異種疾患関連抗原により媒介される状態の治療または予防のための、本明細書に提供される医薬組成物の何れかのポックスウイルスが提供される。もう一つの態様において、ここでは、ポックスウイルスによって媒介され、または異種疾患関連抗原によって媒介される状態の治療または予防のための、本明細書に提供される医薬組成物の何れかの使用が提供される。一定の実施形態において、前記被験対象は脊椎動物である。一定の実施形態において、該脊椎動物は哺乳動物である。一定の実施形態において、該哺乳動物はヒトである。
【０１２２】
一定の実施形態において、本明細書で提供される異種疾患関連抗原をコードする核酸配列を更に含む組換えポックスウイルスを含有する医薬組成物の何れかは、被験対象に投与されたときに、過剰な初期ｄｓＲＮＡを発現する異種核酸を欠失した組換えポックスウイルスを含有する同一の医薬組成物に比較して、自然免疫の活性化を増強する（前記組換えポックスウイルスが異種疾患関連抗原をコードする核酸配列を更に含むか否かに拘わらず）。一定の実施形態において、前記被験対象は脊椎動物である。一定の実施形態において、該脊椎動物は哺乳動物である。一定の実施形態において、該哺乳動物はヒトである。
【０１２３】
一定の実施形態において、本明細書で提供される医薬組成物は何れも、当業者に既知の任意の適切な投与経路によって前記被験対象に投与される。一定の実施形態において、前記医薬組成物は、凍結乾燥物として提供される。一定の実施形態において、該凍結乾燥は水溶液中に溶解される。一定の実施形態において、該水溶液は生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、または生理的ｐＨのトリス緩衝液である。一定の実施形態において、前記医薬組成物は、全身的投与される。一定の実施形態において、該医薬組成物は、局所的に投与される。一定の実施形態において、本明細書に提供される医薬組成物の何れかは、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、鼻腔内、経口、局所、非経口的に、または当業者に知られている他の任意の投与経路によって投与される。投与経路、用量、及び治療プロトコルは、当業者によって最適化することができる。
【０１２４】
一定の実施形態において、本明細書において提供される任意の医薬組成物は、単回用量で被験対象に投与される。一定の実施形態において、本明細書に提供される医薬組成物の何れかは、複数回用量で被験対象に投与される。一定の実施形態において、医薬組成物の何れかは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５回以上の用量で被験対象に投与される。一定の実施形態において、本明細書に提供される医薬組成物の何れかは、最初のプライミング用量に続いて、１以上の追加のブースト用量が用投与される（即ち、「プライム・ブースト」ワクチン接種プロトコルで投与される）。一定の実施形態において、該「プライム・ブースト」ワクチン接種プロトコルは、相同プライム・ブーストプロトコルである。一定の実施形態において、該「プライム・ブースト」プロトコルは、異種プライム・ブーストプロトコルである。一定の実施形態において、前記最初の用量またはプライミング用量は、１０７〜１０８ＴＣＩＤ５０のここに提供される何れかの組換えポックスウイルスを含んだ本明細書で提供される医薬組成物の何れかの用量を含有する。一定の実施形態において、２回目以降のブースト用量は、１０７〜１０８ＴＣＩＤ５０のここに提供される何れかの組換えポックスウイルスを含んだ本明細書で提供される医薬組成物の何れかの用量を含有する。一定の実施形態において、二回目の用量またはブースト用量は、最初のまたはプライミング用量の投与後１、２、３、４、５、６、または７日以上たってから投与される。一定の実施形態において、二回目の用量またはブースト用量は、最初のまたはプライミング用量の投与後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週以上たってから投与される。一定の実施形態において、二回目の用量またはブースト用量は、最初のまたはプライミング用量の投与後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２月以上たってから投与される。一定の実施形態において、二回目の用量またはブースト用量は、最初のまたはプライミング用量の投与後１、２、３、４、または５年以上たってから投与される。一定の実施形態において、後続のブースト用量は、最初のブースト用量の投与後１、２、３、４、５、６、または７日以上たってから投与される。一定の実施形態において、後続のブースト用量は、最初のブースト用量の投与後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間以上たってから投与される。一定の実施形態において、後続のブースト用量は、最初のブースト用量の投与後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月以上たってから投与される。一定の実施形態において、後続のブースト用量は、最初のブースト用量の投与後、１、２、３、４、または５年以上たってから投与される。
【０１２５】
一定の実施形態において、前記増強された自然免疫応答は、Ｉ型インターフェロン（Ｉ型ＩＦＮ）、サイトカイン及びケモカインの増強された産生を含む。
【０１２６】
一定の実施形態において、前記増強された自然免疫応答は、Ｉ型ＩＦＮの産生増強を含む。一定の実施形態において、Ｉ型ＩＦＮの産生増強は、インターフェロン・ベータ（ＩＦＮ−β）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の増強された転写を含む。一定の実施形態において、ＩＦＮ−βをコードするｍＲＮＡの転写は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍以上増大する。一定の実施形態において、Ｉ型ＩＦＮの産生増強は、ＩＦＮ−βタンパク質の分泌増強を包含する。一定の実施形態において、ＩＦＮ−βタンパク質の分泌は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍以上増大する。
【０１２７】
一定の実施形態において、Ｉ型ＩＦＮの産生増強は、インターフェロン・アルファ（ＩＦＮ−α）をコードするｍＲＮＡの増強された転写を含み、ＩＦＮ−αをコードするｍＲＮＡの転写は、少なくとも２倍、少なくとも４、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍以上増加する。一定の実施形態において、Ｉ型ＩＦＮの産生増強は、ＩＦＮ−αタンパク質の分泌増強を含み、ＩＦＮ−αタンパク質の分泌は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍以上増大する。
【０１２８】
一定の実施形態において、Ｉ型ＩＦＮの産生増強は、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮ−γ）をコードするｍＲＮＡの転写増強を含み、ＩＦＮ−γをコードするｍＲＮＡは、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍以上増大する。一定の実施形態において、Ｉ型ＩＦＮの産生増強は、ＩＦＮ−γタンパク質の分泌増大を含み、ＩＦＮ−タンパク質の分泌は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍以上増大する。
【０１２９】
一定の実施形態において、自然免疫応答の増強は、サイトカインの産生増強を含んでいる。一定の実施形態において、サイトカインの産生増強は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）をコードするｍＲＮＡの転写増強を含み、ＩＬ−６をコードするｍＲＮＡの転写は、少なくとも１．８倍、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍以上増大する。一定の実施形態において、このサイトカインの産生増強はＩＬ−６タンパク質の分泌増強を含み、ＩＬ−６タンパク質の分泌は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍以上増加する。
【０１３０】
一定の実施形態において、サイトカインの産生増強は、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）をコードするｍＲＮＡの転写増強を含み、ＩＬ−１８をコードするｍＲＮＡの転写は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍以上増加する。一定の実施形態において、サイトカインの産生増強はＩＬ−１８タンパク質の分泌増強を含み、ＩＬ−１８タンパク質の分泌は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０−倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍以上増加する。
【０１３１】
一定の実施形態において、自然免疫応答の増強は、ケモカイン産生増強を含む。一定の実施形態において、ケモカインの産生増強はＣＸＣＬ１をコードするｍＲＮＡの転写増強を含み、ＣＸＣＬ１をコードするｍＲＮＡの転写は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍以上増加する。一定の実施形態において、ケモカインの産生増強はＣＸＣＬ１タンパク質の分泌増強を含み、ＣＸＣＬ１タンパク質の分泌は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍以上増加する。
【０１３２】
一定の実施形態において、前記ケモカインの産生増強はＣＣＬ２をコードするｍＲＮＡの転写増強を含み、ＣＣＬ２をコードするｍＲＮＡの転写は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍以上増加する。一定の実施形態において、ケモカインの産生増強はＣＣＬ２タンパク質の分泌増強を含み、ＣＣＬ２タンパク質の分泌は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍以上増加する。
【０１３３】
一定の実施形態において、ケモカインの産生増強はＣＣＬ５をコードするｍＲＮＡの転写増強を含み、ＣＣＬ５をコードするｍＲＮＡの転写は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍以上増加する。一定の実施形態において、ケモカインの産生増強はＣＣＬ５タンパク質の分泌増強を含み、ＣＣＬ５タンパク質の分泌は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍以上増加する
【実施例】
【０１３４】
実施例１．Ｂ１５を欠失した追加のｎｅｏｒカセットを含むＣＶＡの変異体は高度に弱毒化される
我々は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてクローニングされたＣＶＡゲノムに基づく組換えシステムを使用して、高度に弱毒化されたＣＶＡの変異体を同定し、ここではｎｅｏ／ｒｐｓＬカセットがＣＶＡ−ＢＡＣの突然変異誘発の際に正／負の選択の目的で働いた（Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ−Ｈｅｎｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＣＶＡ野生型ウイルスは、細菌中において、ＢＡＣとしての環状ゲノムの増殖を可能にするために、ＯＲＦＩ３ＬとＩ４Ｌの間の遺伝子間領域に、ＢＡＣ制御配列及び更なるマーカーの挿入を含んでいる。これらの配列は、ポックスウイルスのｐＳプロモータ下で発現されたｎｅｏ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰカセットを含んでいる。このＢＡＣ由来のＣＶＡは、野生型のプラーク精製ＣＶＡと区別できない特性を有することが、以前に実証されている（Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ  ２０１０）。従って、ＢＡＣ由来ＣＶＡは野生型ＣＶＡと区別できないと看做され、以下の実施例ではＣＶＡｗｔと称される。
【０１３５】
驚くべきことに、Ｂ１５Ｒ・ＯＲＦの代わりにｎｅｏ／ｒｐｓＬ選択カセットを保有する変異体ＣＶＡ（ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５、図１参照）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻腔内感染時に著しく弱毒化されたのに対して、ｎｅｏ／ｒｐｓＬ選択カセットを持たないＣＶＡ−ΔＢ１５欠失変異体は中程度に弱毒化されたに過ぎない（図２Ａ）。５×１０７ＴＣＩＤ５０の用量でマウスを鼻腔内接種した後でさえも、ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５は検出可能な体重減少を生じさせず（図２Ａ及び２Ｂ）、また他の疾患徴候も生じさせなかった（データは図示せず）のに対して、野生型ＣＶＡはこの用量において殆ど致命的であった（図２Ａ及び図２Ｂ）。Ｂ１５ＲのＣＶＡバージョンがＢ１５ＲのＭＶＡのバージョンで置き換えられたときは、その後の変異体ＣＶＡ−Ｂ１５ＭＶＡの弱毒化もまた中程度であり（図２Ｂ）、ＣＶＡ−ΔＢ１５について観察された弱毒化（図２Ｂ）に匹敵していた。ＣＶＡ−Ｂ１５ＭＶＡによって発現されたＢ１５タンパク質は、そのＣＶＡホモログよりもＳＤＳ−ＰＡＧＥで僅かに速く移動し、ＣＶＡ−Ｂ１５ＭＶＡが、６個のアミノ酸を欠失したＭＶＡ由来の適正なＢ１５バージョンを発現したことを確認した（データは示さず）。これらの結果は、６アミノ酸ストレッチの内部欠失を有するＢ１５のＭＶＡバージョンは、非機能的であるとの最近公開された観察（ＭｃＣｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９１：２２１６−２２２０）と一致している。このように、ＣＶＡ−Ｂ１５ＭＶＡは、おそらくＢ１５ヌル変異体に相当する。
【０１３６】
ワクシニアウイルス弱毒化のための基準として、我々は分泌されたオルソポックスウイルスのＩ型ＩＦＮ受容体をコードするＢ１９Ｒ遺伝子を欠失させた。ＣＶＡ−ΔＢ１９は、ＣＶＡ−ΔＢ１５より僅かに強く弱毒化されたが、ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５よりも有意に低く弱毒化された（図２Ｂ）。
【０１３７】
マウスの肺における感染性ウイルス力価が、１×１０７ＴＣＩＤ５０の用量での鼻腔内感染の後に分析された。ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５に感染したマウスは、感染後６日に肺に１×１０４ＴＣＩＤ５０未満の非常に低いウイルス力価を示したのに対して、ＣＶＡ感染マウスの肺におけるウイルス力価は、１×１０７ＴＣＩＤ５０を超えた（図２Ｃ、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．００１）。ＣＶＡ−ΔＢ１９及びＣＶＡ−Ｂ１５ＭＶＡに感染したマウスの肺におけるウイルス力価は、ＣＶＡ（図２Ｃ）のそれに比べて概ね一桁低下し（ｐ＜０．００１）、減少はしたが、未だ有意なこれらウイルスの病原性を反映した（図２Ｂ）。従って、鼻腔内感染後の肺における感染性ウイルスの力価は、ＣＶＡ変異体の観察された病原性パターンと非常によく相関し、ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５の強い減衰が確認された。
【０１３８】
その強い弱毒化の原因としてのＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５における不要な変異を排除するために、我々はＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５（２０２，６１５ヌクレオチド）及びＣＶＡ−ΔＢ１５（２０１，２９６ヌクレオチド）の完全なコード領域の塩基配列を決定した。両ウイルスは、意図的にそのコード領域に導入されていた予想された変異のみを含んでいた。従って、ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５の驚くほど強い弱毒化は、ｎｅｏ／ｒｐｓＬカセットの存在に依存するように見えた。
【０１３９】
実施例２．ＩＦＮ−α／β受容体欠損（ＩＦＮＡＲ０／０）マウスにおけるＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５の毒性
Ｉ型ＩＦＮシステムは、マウスにおけるＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５の強い弱毒化に寄与したかどうかを調査するために、機能的ＩＦＮα／β受容体を欠損したＩＦＮＡＲ０／０マウスを、段階的な用量のＣＶＡ及びＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５で感染させた。５×１０７ＴＣＩＤ５０の高用量において、ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５は、ＩＦＮＡＲ０／０マウスにとって一様に致死的であった（データは示さず）。ＩＦＮＡＲ０／０マウスのサブセットは、１×１０７ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５の中間的用量で感染させた後にも生存し、また２×１０６ＴＣＩＤ５０の用量で感染させたときにも、全てのマウスが生存した（図３Ａ及びＢ）。野生型ＣＶＡに感染したＩＦＮＡＲ０／０マウスは、２×１０６ＴＣＩＤ５０の最も低い用量でさえ一様に死亡した（図３Ａ及びＢ）。特に、ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５は、２０％以上の有意な体重減少によって証明されるように（図３Ａ）、２×１０６ＴＣＩＤ５０の使用した最低用量でさえも、ＩＦＮＡＲ０／０マウスにとっては未だ高病原性であった。
【０１４０】
このように、Ｉ型ＩＦＮシステムは、ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５の強い弱毒化に関与する重要な因子であると思われる。野生型ＣＶＡに感染したＩＦＮＡＲ０／０マウスは全て死亡したのに対して、２×１０６及び１×１０７ＴＣＩＤ５０の用量のＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５に感染したＩＦＮＡＲ０／０マウスは部分的または完全に生存したという事実は、Ｉ型ＩＦＮに依存しない因子がＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５の弱毒化に僅かに寄与することを示唆している。Ｂ１５は、ＶＡＣＶ感染細胞におけるＮＦκＢ活性化の阻害剤であることが以前に報告されている（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），ＰＬｏＳ．Ｐａｔｈｏｇ．４：ｅ２２−）。そのため、Ｂ１５の欠乏による増強されたＮＦκＢ活性化の抗ウイルス効果は、ＩＦＮＡＲ０／０マウスにおけるＣＶＡに比較して、ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５の適度な弱毒化の原因である可能性がある。同様に、より効率の低いＮＦκＢ阻害はまた、野生型マウスにおけるＣＶＡ−ΔＢ１５の中程度の弱毒化（Ｂ１５を欠失しているので）についての説明を提供できるかもしれない（図２）。しかし、それはまた、ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５の弱毒化の殆どの原因であるｎｅｏ／ｒｐｓＬカセットを欠失しているので、ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５よりも遥かに少なく弱毒化される。
【０１４１】
実施例３．ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５による、樹状細胞（ＤＣ）でのＩＦＮ−α及びＩＦＮ−λの誘導
ＤＣは、Ｉ型及びＩＩＩ型ＩＦＮ、並びに他のサイトカインの効率的な産生体なので、我々は、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ｆｌｔ３−ＬまたはＦＬ）培養システムを使用して生成されたマウス骨髄由来のＤＣにおいて、本明細書に提供される種々のＣＶＡ構築物がこれらＩＦＮを誘導する能力を評価した。マウスＩＦＮ−βではなくマウスＩＦＮ−αが、オルトポックスウイルスＢ１９によって結合される。この結合は、ＩＦＮ−α特異的ＥＬＩＳＡにおけるＩＦＮ−αの検出を、部分的または完全に妨げる（データは示さず）。ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５によるＩＦＮ−α誘導の解析を容易にするために、ゼオシン耐性遺伝子でＢ１９Ｒ遺伝子を置換することにより、追加の欠失が導入された（図１）。得られたＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５／Ｂ１９二重欠失変異体の弱毒化は、感染したマウスの肺におけるそのウイルス力価が感染後６日目でさえも低かったことを除き、ＢＡＬＢ／ｃ疾患モデルにおけるＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５のものと区別できなかった（データは示さず）。ＩＦＮ−αは、予想通りＣＶＡに感染したＦＬ−ＤＣの上清中には検出されなかったが、ＣＶＡ−ΔＢ１９は検出可能な量のＩＦＮ−αを誘導し（図４）、それにより、野生型ＣＶＡは中程度のＩＦＮ−αを誘導できるが、これは、Ｂ１９によるＥＬＩＳＡベースの検出からはマスクされることが実証された。二重欠失変異体のＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５／Ｂ１９は、ＦＬ−ＤＣにおいてＣＶＡ−ΔＢ１９よりも有意に高いレベルのＩＦＮ−αを誘導し、これはＭＶＡにより誘導されたものに匹敵した（図４）。このことは、ｎｅｏ−ΔＢ１５変異体が、より高いインターフェロン誘導能をＣＶＡに与えることを実証した。ＣＶＡ−ΔＢ１５は検出可能なＩＦＮ−βを誘導しなかったので、Ｂ１５はこの効果には寄与せず、従ってＣＶＡ  ｗｔと同様に挙動した。
【０１４２】
オルトポックスウイルスは、ＩＦＮ−λのための結合タンパク質を発現しないので、我々は、ＦＬ−ＤＣによるＩＦＮ−λ分泌を誘導する能力について、変異体ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５を直接分析することができた。ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５は、ＣＶＡまたはＣＶＡ−ΔＢ１５よりも、ＦＬ−ＤＣの上清中において有意に高いＩＦＮ−λレベルを誘導した（図４）。ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５によって誘導されるＩＦＮ−λレベルは、ＭＶＡによって誘発されるものと非常に類似していた。総合的に考慮すると、上記の結果は、ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５が、多くの免疫調節因子を欠失したＭＶＡ（Ａｎｔｏｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４４：３６５−３９６；Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ−Ｈｅｎｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｊ．Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．８８：３２４９−３２５９）に匹敵するＩＦＮ−α及びＩＦＮ−λの強力な誘導物質であり、その祖先ＣＶＡ（Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １１８：１７７６−１７８４）に比べて増大したＤＣ活性化をもたらすことを示している。
【０１４３】
実施例４．ＣＶＡ及びＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５による、マウス細胞株でのＩＦＮ−βの誘導
ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔΒ１５の増強されたＩ型ＩＦＮ誘導能がＤＣに限られたものであるかどうかを明らかにするために、マウスＢＡＬＢ／３Ｔ３クローンＡ３１（Ａ３１）線維芽細胞を様々なＣＶＡ構築物に感染させ、定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によってＩＦＮ−β・ｍＲＮＡレベルを決定した。ＣＶＡ及びＣＶＡ−ΔＢ１５は非常に低いＩＦＮ−β遺伝子発現しか誘導しないが、ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５の感染は、Ａ３１細胞において増大したレベルのＩＦＮ−β転写産物を刺激した（図５Ａ）。感染後４時間でのＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５によるＩＦＮ−β・ｍＲＮＡの誘導は、この時点においてＭＶＡで得られたものと同様であった（図５Ａ）。ＭＶＡに感染したＡ３１細胞におけるＩＦＮ−β転写産物のレベルは、通常は、感染の４時間後に減少したのに対して、ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５により誘導されたＩＦＮ−β・ｍＲＮＡは更に増加し、感染後６時間以降にＭＶＡによって誘発されるレベルを明らかに超えた（図５Ａ）。これらのデータは、ＩＦＮＡＲ０／０マウスにおけるＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５の弱毒化の概ね完全な反転と併せて、野生型マウスにおけるこのウイルス変異体の非病原性が、強く増強されたＩ型ＩＦＮの誘導によって引き起こされたらしいことを強く示唆する。
【０１４４】
ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５のＢ１５Ｒ遺伝子座におけるｎｅｏ・ＯＲＦが欠失され（ＣＶＡ−ΔＢ１５）、またはゼオシン（ｚｅｏ）耐性カセットで置き換えられたときに（ＣＶＡ−ｚｅｏ−ΔＢ１５）、得られた変異ウイルスのＩＦＮ−β刺激能力は概ね完全に存在しなかった（図５Ｂ）。Ｂ１５Ｒ・ＯＲＦの代わりにネオマイシンＯＲＦが挿入されて、強力な初期Ｂ１５Ｒプロモータ（ｐＢ１５）がそのまま残されたので、我々は、ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５からｐＢ１５を欠失させた。得られた変異体ＣＶＡ−ΔｐＢ１５−ｎｅｏ−ΔΒ１５は、ＣＶＡｗｔレベルのＩＦＮ−β転写物のみを誘導した（図５Ｂ）。このように、ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５変異体におけるｎｅｏ・ＯＲＦの転写は、ＩＦＮ−β刺激能のために必須であると思われた。ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５に感染したＡ３１細胞におけるｎｅｏカセット転写は、ｎｅｏ／ｒｐｓＬ挿入物のｒｐｓＬ部分を標的とするＲＴ−ｑＰＣＲ分析により確認された（データは示さず）。ｎｅｏ及びｒｐｓＬ・ＯＲＦが、Ｂ１５プロモータに対して逆相補的な方向で挿入されおり、このアンチセンスＲＮＡが翻訳機構によって使用されるとすれば、非常に短いＯＲＦだけが該ｎｅｏカセットから翻訳されると予測される。
【０１４５】
ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５変異体は、ＢＡＣ骨格中のＥＧＦＰ／ｎｅｏカセットから、初期／後期プロモータの制御下でセンス方向に第二のｎｅｏ転写物を発現するので、２つの部分的に相補的な転写物内の該ｎｅｏ配列は、部分的に二本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する可能性がある。このｄｓＲＮＡは、恐らくは感染細胞において追加のＰＡＭＰとして作用し、Ｉ型及びＩＩＩ型のＩＦＮの増強された誘導を導いたと思われる。
【０１４６】
実施例５．外来挿入物対の相補的なＲＮＡを発現するＭＶＡベクターは、マウス細胞においてＩＦＮ−βを誘導する
ＭＶＡに対するｄｓＲＮＡの適用可能性の原理を実証するために、ｎｅｏまたはＥＧＦＰ遺伝子の何れかの二つの相補的転写物を発現する２対の組換えＭＶＡベクターを構築した。これは、各々がポックスウイルス初期／後期プロモータの制御下にある、ＭＶＡゲノム内の互いに離れた部位において、ｎｅｏまたはＥＧＦＰ・ＯＲＦの２つのコピーを挿入することにより達成された。ＢＡＣ由来の野生型ＭＶＡは、既に、ＢＡＣ骨格挿入物内にｎｅｏ／ＥＧＦＰカセットの一つのコピーを含んでいた（図６Ａ）。ｎｅｏ／ＥＧＦＰカセットを含むＢＡＣカセットは、ＭＶＡの特性を変化させず、従って野生型ＭＶＡと同等であることが以前に示されている（Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ−Ｈｅｎｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：９９０７−９９１９）。ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５は、第二のｎｅｏ・ＯＲＦを、ｎｅｏ／ｒｐｓＬカセットの一部として、内因性Ｂ１５Ｒプロモータに対して逆向きでＢ１５Ｒ遺伝子座に含んでいた（図６Ａ）。従って、ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５は、上記のＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５変異体におけるｎｅｏ挿入物の配置を正確に再現した。ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰの構築のために、最初に、ｎｅｏ／ＥＧＦＰカセットをＭＶＡ野生型ＢＡＣ挿入物から削除した。次いで、組換えＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰを得るために、ＥＧＦＰ・ＯＲＦを、センスまたはアンチセンスのＥＧＦＰ・ＲＮＡの何れかの転写を指示する初期／後期プロモータの制御下にある離れた部位においてＭＶＡゲノムに二度挿入し、７２０塩基対のｄｓＲＮＡの形成を可能にした（図６Ｂ）。単一のＥＧＦＰ挿入（ＭＶＡ−ＥＧＦＰ）からのセンスＥＧＦＰ転写物のみを発現するＭＶＡ構築物は、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ構築物の全体のための参照として働いた（図６Ｂ）。
【０１４７】
２つの挿入されたｎｅｏ抗原（ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５）の相補的転写物を生成するＭＶＡに感染したマウスＡ３１細胞は、単一のｎｅｏカセットを備えたＢＡＣ由来のＭＶＡｗｔウイルスに比較して、増強されたＩＦＮ―β遺伝子転写を示した（図７Ａ）。ＦＲＴに基づく組換えにより、ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５からセンスｎｅｏ・ＯＲＦを含む全体のＢＡＣカセットが削除されたときには、得られたＭＶＡ−ｎｅｏ−ΔＢ１５／ΔＢＡＣは、野生型レベルのＩＦＮ−β・ｍＲＮＡを誘導したに過ぎなかった（図７Ａ）。Ｂ１５Ｒ遺伝子の欠失（ＭＶＡ−ΔＢ１５）を有し、且つＢＡＣ骨格におけるセンスｎｅｏカセットのみを含有するＭＶＡウイルスもまた、野生型ＩＦＮ−β・ｍＲＮＡレベルを誘導した（図７Ａ）。このことは、ＩＦＮ−βを誘導するＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５の増強された能力が、センス及びアンチセンスの両方のｎｅｏ発現カセットの存在に依存しており、Ｂ１５Ｒ削除自体に起因するものではないことを証明した。ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５並びにＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５は、感染の５時間後に、ＩＦＮ−β・ｍＲＮＡを大量に誘導した（図７Ａ）。ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５により誘導されたＩＦＮ−β・ｍＲＮＡ発現は、感染の５〜７時間後に減少したのに対して、ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５により誘導されるＩＦＮ−β・ｍＲＮＡレベルは、感染の７時間後でも高いままであった（図７Ａ）。従って、ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５により誘発されるＩＦＮ−βのレベルは、全ての更なる実験において、感染の５時間後に決定された。ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５に感染したＡ３１細胞の培養上清は、ＭＶＡｗｔまたは単一のｎｅｏカセットＭＶＡ構築物と比較したときに、感染の１８時間後には増大した量のＩＦＮ−βを含有しており（図７Ｂ）、ＩＦＮ−β・ｍＲＮＡの解析の結果が確認された。
【０１４８】
上記の結果は、２つの別々のＥＧＦＰ挿入物からの相補的な初期転写物の生成を指令する一組のＭＶＡ組換え体を用いて再現された。強力な初期プロモータの制御下にある一つのＥＧＦＰ・ＯＲＦは、センスＥＧＦＰ−ｍＲＮＡの発現を指令し、またＩＧＲ１３６／１３７に挿入された。対応する単一挿入のＭＶＡ組換えＭＶＡ−ＥＧＦＰは、ＥＧＦＰを発現し、またマウスＡ３１細胞において、野生型レベルのＩＦＮ−β・ｍＲＮＡを誘導した（図７Ｃ）。ｐＳプロモータの制御下にアンチセンスＥＧＦＰ転写物の初期／後期発現を駆動するＩＧＲ８６／８７の中に挿入された追加のＥＧＦＰカセットを含むＭＶＡ（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，１９９７）は、強く増加した量のＩＦＮ−β・ｍＲＮＡを誘導した（図７Ｃ）。従って、ＭＶＡゲノム中の異種ＤＮＡ挿入物から誘導された初期ｄｓＲＮＡは、該挿入物の配列とは独立したＩＦＮ−βの分泌を刺激した。
【０１４９】
後者の観察は、タンパク質レベルでのＩＦＮ−β誘導の分析によって確認された。ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５と同様に、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰは、対応するＭＶＡ−ＥＧＦＰよりも有意に高い量のＩＦＮ−βの培養上清中への分泌を刺激した（図７Ｄ）。様々なＭＶＡ組換え体に感染したＡ３１細胞の上清中におけるＩＦＮ−βの量は、恐らくは継代数、細胞密度及び細胞の状態の変化により、実験間でかなり変化した。
【０１５０】
実施例６．初期ウイルス転写は、ＭＶＡ・ｄｓＲＮＡ変異体により増強されたＩＦＮ−βレベルを誘導するのに十分である
ｄｓＲＮＡに媒介されたＩＦＮ−βの誘導は、感染初期に生成されるｄｓＲＮＡに主に依存するであろうと仮定された。ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−２に感染したマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、ウイルスゲノムの複製及び結果的には複製後（中間及び後期）の遺伝子発現を阻止するＡｒａＣで処理することは、増強されたＩＦＮ−β遺伝子発現を低下させず（図８Ａ）、ｄｓＲＮＡの初期転写が増強されたＩＦＮ−β誘導のために十分であることを示した。ＡｒａＣで処理されたＭＶＡｗｔ感染ＭＥＦにおける、ＩＦＮ−βの中程度の増加（図８Ａ）の理由は不明である。ｄｓＲＮＡを認識から隠蔽するｄｓＲＮＡ結合タンパク質をコードするＥ３Ｌ遺伝子が欠失されたＭＶＡ変異体は、ＣＥＦ及び（Ｈｏｒｎｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：８３９４−８４０７）で以前に公表された観察から予測されるように、ＭＥＦにおけるＩＦＮ−β誘導をある程度増強した。ＡｒａＣでＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ感染細胞を処理することは、明らかに、ＩＦＮ−β誘導を減少させた（図８Ａ）。ウイルスｄｓＲＮＡのかなりの量が、感染後〜２時間以降から、ポックスウイルスのライフサイクルの複製後の段階でのみ自然に生成されるので、これは予測されたことである。この概念に一致して、ＡｒａＣ処理されたＭＶＡ−Ｅ３Ｌは、後期遺伝子発現がＡｒａＣ処理によってブロックされたときには、ｗｔＭＶＡよりも多くのＩＦＮ−β・ｍＲＮＡを誘導しなかった（図８Ａ）。
【０１５１】
後期プロモータｐＳＳＬ（ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−後期）の制御化にあるアンチセンスＥＧＦＰ転写物を発現するＭＶＡ変異体は、ＭＶＡｗｔと同様のＩＦＮ−β・ｍＲＮＡのレベルを誘導した（図８Ｂ）。このことは、ＤＮＡ複製開始前の感染初期におけるｄｓＲＮＡの形成が、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰのＩＦＮ誘導剤表現型の前提条件であり、またＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５についてもその可能性が高いことの更なる証拠を提供する。従って、ＭＶＡによるｄｓＲＮＡの初期発現は、感染細胞においてＩＦＮ−βを誘導するのに必要かつ十分である。この同じ原理が、ＣＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔΒΙ５の増大した自然免疫刺激能力の根底にある可能性が非常に高い。
【０１５２】
実施例７．ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５及びＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰは、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）を活性化する。
ＰＫＲは、不活性なキナーゼとして、細胞内において中程度のレベルで構成的に合成され、ｄｓＲＮＡに結合することによって活性化される。ＰＫＲの発現は、Ｉ型ＩＦＮによってアップレギュレートされる。活性化されたＰＫＲの１つの主要な基質は、ＰＫＲによってリン酸化される翻訳開始因子サブユニットｅｌＦ２αである。感染時におけるｅｌＦ２αのリン酸化（Ｐ−ｅｌＦ２α）は、抗ウイルス対策として、感染細胞における翻訳不全を導くと共に、ＰＫＲに媒介されたアポトーシス誘導に関与している可能性がある。ｅｌＦ２αのリン酸化は、マウスＡ３１細胞において、ｄｓＲＮＡによるＰＫＲの活性化の指標として分析された。ワクシニアウイルスＰＫＲ阻害剤Ｅ３（これはｄｓＲＮＡに結合してこれを隔離する）の遺伝子を欠失したＭＶＡ変異体（ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ）を、正の対照として用いた。ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５及びＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰは、Ａ３１細胞の感染後１時間と早期にＰＫＲを活性化したのに対して、ＭＶＡｗｔは感染の全体を通してＰＫＲを検出可能な程度に活性化しなかった（図９）。Ｐ−ｅｌＦ２αの量は、ｎｅｏ及びＥＧＦＰベースの初期ｄｓＲＮＡ産生変異体の両方に感染した細胞中においては、感染後４時間まで更に増加した（図９）。感染後６時間において、ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５及びＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ感染細胞におけるＰ−ｅｌＦ２αの量は減少し始め、ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５については感染後８時間の時点でＰ−ｅｌＦ２αは殆ど検出不能であったのに対して、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ感染細胞では、この時点で未だ弱く検出可能であった（図９）。加えて、ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５感染細胞に比較して、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ感染細胞については、Ｐ−ｅｌＦ２α信号は感染の最初の６時間に亘って一貫して強く（図９）、ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５と比較して、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰのやや強いＰＫＲ活性化作用を示唆した。
【０１５３】
この初期ｄｓＲＮＡ産生変異体とは対照的に、ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌによって誘発されたＰ−ｅｌＦ２α信号は、感染後２時間までは検出不能であり、また感染後２時間〜３時間の間に非常に急激に増加し、感染後８時間までの残りの観察期間は高いままであった（図９）。ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌは、感染後４時間以降から、全ての変異体の最も強いＰ−ｅｌＦ２α信号を誘導した（図９）。これらの動力学は、ｄｓＲＮＡが、中間及び後期ウイルス遺伝子からの部分的に相補的な転写物のアニールにより、ＭＶＡ感染の際の感染後期に形成されることと一致している。Ｅ３不足のために、この後期ｄｓＲＮＡにより誘導されるＰＫＲ活性化は阻止されなかった。これとは対照的に、ｎｅｏ−またはＥＧＦＰ−ｄｓＲＮＡを生成するＭＶＡ組換え体によるＰＫＲの活性化の動力学は、感染細胞における非常に初期の刺激量のｄｓＲＮＡの存在と一致している。これらの組換え体はＥ３タンパク質を発現するので、十分なＥ３タンパク質が感染細胞内に蓄積したときには、ＰＫＲ活性化は感染の後期にダウンレギュレートされると思われる。
【０１５４】
実施例８．ＰＫＲは、増強されたＩＦＮ−β・ｍＲＮＡの誘導及び細胞上清中のＩＦＮ−βの蓄積のために必要とされる。
ｗｔＭＥＦにおいて、ＭＶＡ−ＥＧＦＰは、予想されたようにｗｔＭＶＡと同様に、非常に類似した量のＩＦＮ−β転写物を誘導したのに対して、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰは増強されたＩＦＮ−β・ｍＲＮＡ合成を誘導した（図１０Ａ）。これとは対照的に、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰは、ＰＫＲ欠損したＭＥＦにおいて増強されたＩＦＮ−β遺伝子発現を誘導しなかった（図１０Ａ）。ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰに感染したＭＥＦによるＩＦＮ−βタンパク質の分泌は、同様に、機能的ＰＫＲに強く依存した（図１０Ｂ）。センダイウイルス（ＳｅＶ）、即ち、ＰＫＲ非依存性経路を介してＩＦＮ−βを誘導することが知られているマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、ＩＦＮ−βを分泌するＰＫＲ欠損ＭＥＦの能力についての陽性対照として用いられた。興味深いことに、ｗｔＭＥＦは、センダイウイルスの感染に応答して、ごく僅かな量のＩＦＮ−βのみを分泌したのに対して、ＳｅｖはＩＦＮ−β・ｍＲＮＡ及びタンパク質をＰＫＲ０／０ＭＥＦにおいて効率的に誘導し、ＰＫＴ０／０ＭＥＦはＩＦＮ−βを生成し且つ分泌する完全な能力を有することが確認された（図１０Ａ及びＢ）。総合すると、ＰＫＲは、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰによるＩＦＮ−βの誘導増強に関与する重要な細胞センサであるように思われた。ｗｔＭＥＦにおける、ＭＶＡ及びＭＶＡ−ＥＧＦＰ（ｗｔＭＶＡに対応）によるＩＦＮ−β遺伝子の誘導はＰＫＲにも部分的に依存し（図１０Ａ）、少なくともＭＥＦにおいて、ＭＶＡによる自然免疫活性化のための該ｄｓＲＮＡセンサの一般的役割を示唆した。総合すると、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰによるＩＦＮ−βの誘導増大は、ｄｓＲＮＡセンサーＰＫＲに完全に依存しており、このことは、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰによって生成されるｄｓＲＮＡが、自然免疫活性化において観察された増加の原因であるとの更なる証拠を提供した。
【０１５５】
実施例９．初期ｄｓＲＮＡの刺激効果についての長さ要件
最初のＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ構築物は、アンチセンスＥＧＦＰ転写物の３’末端において、細菌のβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）遺伝子由来の非相補的オーバーハングを含む、ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５構築物を模倣するように設計された。増強されたＩＦＮ−β誘導のためのｄｓＲＮＡの長さ要件を更に特徴付けるために、７２０〜５０ｂｐの間の次第に短くしたＥＧＦＰ・ＯＲＦ重なりを有する変異体のネストされた組が構築された（図６Ｂ）。ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−２及び他のすべてのｄｓＥＧＦＰ変異体は、アンチセンス転写物において余分な３’オーバーハングを欠いていた（図６Ｂ）。ｗｔ−ＭＥＦにおいて、ＥＧＦＰ重なり長さが減少する相補的ＥＧＦＰ転写物を発現するＭＶＡは、減少する量のＩＦＮ−β・ｍＲＮＡ及びタンパク質を誘導した（図１１Ａ及びＢ）ｗｔＭＥＦにおいて、β−ｇａｌの由来の３’オーバーハングは、ＩＦＮ−β増強効果のために必須ではなかった（図１１Ａ）。１００塩基のＥＧＦＰ転写物の重なり（ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−５）は、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰより明らかに少なくＩＦＮ−βを刺激したが、参照ＭＶＡ−ＥＧＦＰと比較すると、やはりＩＦＮ−β応答を増強した（図１１Ａ及びＢ）。ここでも再度、ＰＫＲ０／０ＭＥＦにおいては、ＩＦＮ−β・ｍＲＮＡ及びＩＦＮ−βは種々のＭＶＡ組換え体によって誘導されなかった（図１１Ａ及びＢ）。５０ｂｐのＥＧＦＰ挿入体重なりを有する組換えＭＶＡは、検出可能な過剰なＩＦＮ−β刺激能力を有していなかった。
【０１５６】
このように、５０〜１００ｂｐの２つの相補的組換え転写物の最小重なりは、ＭＥＦにおける増大したＩＦＮ−β誘導のために必要であった（図１１Ｃ）。
【０１５７】
実施例１０．ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ複製特性及び誘導因子表現型の安定性
バルク精製ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ調製物を得るための、二次ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）におけるＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰの増殖は、ＭＶＡｗｔの範囲内での正常なウイルス収量を明らかにした（データは示さず）。多段階増殖の分析により、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰは、ヒト及びマウスの細胞（図１２Ｂ）における複製制限された表現型を保持したが、ＭＶＡｗｔのようにＣＥＦにおいてはわずかに低い効率で複製されることが示された（図１２Ａ）。この僅かに損なわれた複製は、ＣＥＦ細胞から得たＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰのウイルス株の平均収率がＭＶＡ−ＥＧＦＰの収率に関連しているときにも観察された。ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ／ＭＶＡ−ＥＧＦＰの収率の比率は約０．５であったが（表１）、ＭＶＡ−ＥＧＦＰの収率をＭＶＡ−５及びＭＶＡ−６のものと比較したときには、約０．１へと更に低下した（表１）。ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−５及び−６は、僅かに多くのＩＦＮ−を誘導しただけなので、ウイルス複製に対する効果は、おそらく可溶性Ｉ型ＩＦＮを介しては媒介されなかった。ニワトリＤＦ−１細胞をウイルス株の産生のために用いたときは、短いＥＧＦＰ−ｄｓＲＮＡが発現された場合の収率低下の傾向は存在しなかった（表１）。従って、ＤＦ−１細胞は、初期ｄｓＲＮＡを過剰生産するＭＶＡ変異体の増殖のために、ＣＥＦ細胞よりも適した細胞型を表す。
【０１５８】
ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰの増強されたＩＦＮ−β刺激能力が反復継代させた後にも保存されるかどうかを評価するために、我々は約０．０１の低い多重感染（ＭＯＩ）を用いて、インターフェロン能を有するニワトリ細胞株ＤＦ−１において、ＭＶＡ−ＥＧＦＰ及びＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰの１０継代を行った。ＤＦ−１細胞上で１０継代されたＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰは、ＤＦ−１細胞で一度だけ継代された開始ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰウイルスに匹敵する増強されたＩＦＮ−β応答を誘導した（図１２Ｃ）。ＭＶＡ−ＥＧＦＰの基礎的なＩＦＮ−β誘導性は、ＤＦ−１での１０継代後にも変化しなかった（図１２Ｃ）。このように、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰの増強されたインターフェロン刺激能は、ＤＦ−１細胞内での複数の継代後にも維持された。ＭＶＡも、またＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰまたはＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５も、ＤＦ−１細胞またはＣＥＦ細胞においてＩＦＮ−β遺伝子の発現を誘導しなかった（データは示さず）。このことは、ＤＦ−１細胞中では強い反選択圧が働かず、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ複製の際に増強されたＩ型ＩＦＮ誘導を再制限するとの見解を指示し、ＩＦＮ−β誘導因子表現型の観察された安定性のための議論を提供した。ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ変異体の損なわれない収率と総合して考察すると、ＤＦ−１細胞はＣＥＦ細胞よりも、初期ｄｓＲＮＡを過剰発現するＭＶＡ変異体の増殖のために更に適した細胞型を表す。
【０１５９】
実施例１１．インビボにおける増大されたサイトカインの誘導
ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰでのＣ５７ＢＬ／６マウスの感染に応答した全身のサイトカインレベルが、感染の６時間後に分析された。ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ感染後の血中のＩＦＮ−αのレベルは、インビトロでの観察（図９及び１０）と同様に、対照群よりも有意に高かった（図１３Ａ）。ＩＦＮ−γ、炎症性サイトカインＩＬ−１８及びＩＬ−６、並びにケモカインＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、及びＣＣＬ５のレベルもまた、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ感染マウスにおいて有意に増加した。この応答は、ｄｓＲＮＡ認識受容体ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ−５を介したＩ型ＩＦＮ及びサイトカイン誘導のために必要とされる、シグナル伝達アダプター分子ＩＰＳ−１の存在に少なくとも部分的に依存した（図１３）。これとは対照的に、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２及びＣＣＬ５を含むサイトカイン及びケモカインの誘導においては、全ての観察された増加がＰＫＲに依存していた。ＭＶＡ−ＥＧＦＰによるＩＦＮ−α、ＣＸＣＬ１及びＣＣＬ２の基礎誘導は、ＰＫＲ欠乏によって強く影響はされなかったのに対して、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１８及びＣＣＬ５の基礎レベルは、ＰＫＲ欠損マウスで減少しているように見えた（図１３）。これらの結果は、ＭＶＡによる初期ｄｓＲＮＡ産生は、培養細胞においてだけでなく、インビボでも培養細胞におけるような同様の類似したパターン認識分子の活性化に基づいて、Ｉ型ＩＦＮ応答並びに炎症性サイトカイン誘導を増強したことを示している。ＰＫＲ、並びにＩＰＳ−１を介してシグナル伝達する認識受容体は、インビボでのＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰによる増強されたＩ型ＩＦＮ発現の媒介に関与していた。
【０１６０】
実施例１３．マウスにおいてＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰにより増強されたＣＤ８Ｔ細胞応答
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰを用いて異なる経路で免疫感作し、核株のバックグラウンドにおける免疫優性エピトープに対するＣＤ８Ｔ細胞応答を、デキストラマー（ｄｅｘｔｒａｍｅｒ）染色を用いて測定した。ワクシニアウイルスの免疫優性なＢ８Ｒエピトープに向けられた、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓におけるＣＤ８Ｔ細胞の数は、ＭＶＡ−ＥＧＦＰに比較して、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰでの静脈内免疫感作の７日後には有意に増加した（図１４）（対応のないスチューデント両側ｔ検定によるｐ＝０．０４８）。
【０１６１】
実施例１４．ヒト細胞においてＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰにより増強されたＩＦＮ−β遺伝子誘導
組換えＭＶＡによって生成された初期ｄｓＲＮＡの刺激効果は、マウス細胞に限定されるものではないことを実証するために、ヒト二倍体肺線維芽細胞株ＭＲＣ−５の培養物を、初期ｄｓＲＮＡを生成するＭＶＡ組換え体で感染させた。ＭＶＡ−ＥＧＦＰによる基底ＩＦＮ−β遺伝子の誘導は、ヒトＭＲＣ−５細胞においては時々検出不能であった（図１５、データは示さず）のに対して、ＭＶＡ−ｄｓｎｅｏ−ΔＢ１５及びＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰは、ヒトＭＲＣ−５細胞においてＩＦＮ−β・ｍＲＮＡの発現を効率的に誘導した（図１５）。ＩＦＮ−β遺伝子の誘導の効率は、マウス細胞を用いて得られた結果と類似して、ＥＧＦＰ・ＯＲＦ重なりが次第に短くなると共に減少した（図１５）。ＥＧＦＰ・ＯＲＦの重複を３００及び１００ｎｔに短縮することは、それぞれの組換え体ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−４及びＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−５のＩＦＮ−β刺激活性を激しく減少させた（図１５）。従って、ＭＶＡでの感染初期に生成されたｄｓＲＮＡによる増強されたＩＦＮ−β誘導は、マウス細胞に限定されず、少なくともヒト細胞においても顕著であり、従って、相補的なＲＮＡ転写物を発現する組換えポックスウイルスをワクチン接種した初代のヒト細胞及び組織、並びにヒト被験対象においても起きる可能性が非常に高い。
【０１６２】
実施例１５．天然ＭＶＡ遺伝子から初期ｄｓＲＮＡを生成するＭＶＡ−ｄｓＥ３Ｌよる、増強されたＩＦＮ−β誘導
我々は、アンチセンスＥ３Ｌ  ＲＮＡの早期発現を指令するＭＶＡの天然初期Ｅ３Ｌ・ＯＲＦの下流に、強力な初期成分を有する初期／後期Ｈ５ｍプロモータを挿入した（Ｗｙａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｖａｃｃｉｎｅ  １４：１４５１−１４５８）（図１６Ａ）。該Ｅ３Ｌ・ＯＲＦは、オルトポックスウイルス初期転写終結シグナル（ＥＴＴＳ）のＴ５ＮＴコンセンサス配列を含んだアンチセンス鎖の中に、ホモポリマーＴ７ストレッチを含んでいる。Ｅ３Ｌ・ＯＲＦ中のこのアンチセンスＥＴＴＳは、恐らく、初期アンチセンス転写物の長さを、完全なＥ３Ｌ転写物の完全な〜６５０ヌクレオチドの代わりに約２５０〜３００ヌクレオチドに限定するであろう。従って、我々は、Ｅ３のコードされたアミノ酸配列を変更することなく、Ｔ残基をＡに交換することによって、このＥＴＴＳを変異させた（図１６Ａ）。初期の完全長アンチセンスＥ３転写物の終結に適したアンチセンスＥＴＴＳ配列は、Ｅ３Ｌ／Ｅ４Ｌ遺伝子間領域中に天然に存在していた（図１６Ａ）。
【０１６３】
得られた変異ＭＶＡ−ｄｓＥ３ＬはＭＥＦにおいて高レベルのＩＦＮ−β・ｍＲＮＡを誘発したが（図１６Ｂ）、これは利用可能な最善のｄｓＲＮＡベースの誘導因子、即ち、陽性対照としてのトランスフェクトされたポリ（Ｉ：Ｃ）のものに匹敵した（データは示さず）。ＭＶＡ−ｄｓＥ３Ｌは、ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰよりも明らかに高いＩＦＮ−β・ｍＲＮＡレベルを誘導するように見えた（図１６Ｂ）。ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−５及びＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−後期は、参照ウイルスＭＶＡ−ＥＧＦＰと共に、ＩＦＮ−β・ｍＲＮＡ誘導のための陰性対照として用いた（図１６Ｂ）。従って、ＭＶＡベクターからの初期ｄｓＲＮＡの生成はまた、二つの部分的にまたは完全に同一な異種配列を挿入する代わりに、天然の初期ＭＶＡ遺伝子から早期に発現されたアンチセンス転写物の発生によっても達成することができる。
【０１６４】
実施例１６．ＥＧＦＰ・ｄｓＲＮＡ形成
ＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−７２０（ｏ）感染細胞において、ＥＧＦＰ遺伝子のセンス及びアンチセンス転写物からのｄｓＲＮＡの形成を実証するために、我々はＴｒｉｚｏｌ（登録商標）法を用いて、ＡｒａＣ処理された（４０μｇ／ｍＬ）ＢＡＬＢ／３Ｔ３−Ａ３１細胞のウイルス当たり二つの６ウエルから全ＲＮＡを単離し、組み合わせた。ＤＮａｓｅで処理された全ＲＮＡサンプルを、一本鎖特異的リボヌクレアーゼＡ及びＴ１（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、またはＲＮａｓｅＡ／Ｔ１プラスｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼＶ１（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、２０μＬの総容量で３７℃において１時間消化した。消化されたＲＮＡサンプル及び未処理の対照試料（未消化）を、ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、９５℃で３分間変性させた。市販のＥＧＦＰ・ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ｍｒ０４３２９６７６＿ｍｒ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、上記のようにして逆転写及び定量的ＰＣＲを行った。未消化のＲＮＡサンプルの二重のｑＰＣＲ反応から、モックに対するＥＧＦＰ・ＲＮＡ誘導倍率の平均値を計算し、１００％に設定した。残りのＥＧＦＰ・ＲＮＡのパーセンテージを、ＭＶＡ−ＥＧＦＰ及びＭＶＡ−ｄｓＥＧＦＰ−７２０（ｏ）感染細胞から得られた、Ａ／Ｔ１及びＡ／Ｔ１／Ｖ１消化後のＥＧＦＰ・ＲＮＡ誘導倍率値を用いて算出した。
【０１６５】
実施例１７．細胞及びウイルス
ＩＦＮＡＲ０／０及びＩＰＳ−１０／０マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）は、標準的な手順により、１５日齢のＣ５７ＢＬ／６−ＩＦＮＡＲ０／０及び１４日齢のＣ５７ＢＬ／６−ＩＰＳ−１０／０胚から、並びにＰＫＲ０／０ＭＥＦ及び対応するＰＫＲが十分な対照ＭＥＦから調製された。全ての細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｉｄｅｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ／ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において培養された。初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）は、１１日齢の発育鶏卵から調製し、ウイルスストックの産生のためにはＶＰ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で、また複製分析のためには１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で培養した。ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）依存性の樹状細胞（ＧＭ−ＤＣ）は、組換えマウスＧＭ−ＣＳＦ（ｔｅｂｕ−ｂｉｏ，Ｏｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて培養することにより、新たに調製したマウス骨髄から生成された。
【０１６６】
ＭＶＡ野生型（ＭＶＡ）及びＭＶＡ変異体は、文献に記載のＴＣＩＤ５０法（４５：Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ−Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８４：３２４９−３２５９）を使用して、二次ＣＥＦまたはＤＦ−１細胞上で増殖され、ＣＥＦ細胞で滴定した。ＣＶＡ野生型（ＣＶＡ）及びＣＶＡ変異体はＶｅｒｏ細胞上で増殖され、ＴＣＩＤ５０法によりＣＶ−１細胞上で滴定された。ショープ線維腫ウイルスをＡＴＣＣ（ＶＲ−３６４）から入手し、ウサギ角膜ＳＩＲＣ細胞で増殖し、滴定した。センダイウイルス株Ｃａｎｔｅｌｌは、２０００ＨＡ単位／ｍＬでチャールズ・リバー・ラボラトリーズから入手した。動物実験で使用されるすべてのウイルスは、３６％蔗糖クッションを通して２回精製された。
【０１６７】
実施例１８．ＢＡＣ組換え及び感染性ウイルスの再活性化
ＣＶＡ及びＭＶＡ−ＢＡＣの構築は、以前に記載されている（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｅｓｔｅｂａｎ，１９９４．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９：４９１−４９６）。センス及びアンチセンスＥＧＦＰ・ｍＲＮＡ及び対応する全ての対照を発現するＭＶＡ組換え体を生成するために、これらの構築物のＢＡＣ骨格中のｎｅｏ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰカセットを、細菌のテトラサイクリン耐性カセットで置換した。該ＭＶＡ−ＥＧＦＰ組換え体は、強力な初期／後期ｐＨｙｂプロモータの制御下にあるＥＧＦＰ・ＯＲＦの下流に、細菌のカナマイシン耐性カセット（ＮＰＴ  Ｉ）を含んでいた。ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌは、大腸菌における相同組換えにより、ＮＰＴ  Ｉカナマイシン耐性カセットでヌクレオチド４２６９７〜４３２６９（ＯＲＦ・ＭＶＡ０５０Ｌ）を置き換えることにより得られた。
【０１６８】
感染性ウイルスの再活性化のために、Ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、１０６  ＢＨＫ−２１細胞に３μｇのＢＡＣ  ＤＮＡ形質導入し、その６０分後にショープ線維腫ウイルスに感染させて必要とされるヘルパー機能を与えた。再活性化されたウイルスが単離され、以前に記載したようにしてヘルパーウイルスが取り出された（Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ−Ｈｅｎｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｊ．  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８８：３２４９−３２５９）。
【０１６９】
実施例１９．マウスの感染実験
マウス当たり５０μＬの最終容積までＰＢＳ中で希釈した２×１０６、１×１０７、及び５×１０７ＴＣＩＤ５０のＣＶＡ及びＣＶＡ変異体でマウスを鼻腔内感染させる前に、該マウスをケタミン／キシラジン注射により麻酔した。動物を２週間毎日秤量して検査し、病気の兆候について０〜４の任意の尺度で採点した。全身のサイトカインレベルを分析するために、マウスに、２００μＬのそれぞれのウイルス希釈物を静脈注射し、尾静脈から６時間後に採血した。
【０１７０】
実施例２０．サイトメトリービーズアッセイによる全身サイトカインレベルの分析
静脈内感染の６時間後に抜き取ったマウス血清中のサイトカイン濃度を、製造業者の指示に従い、指示されたマウスサイトカインについて、ビーズに基づくＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ検査（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって決定した。治療群間の統計的有意差は、非パラメトリックなマンホイットニーＵ検定を用いて解析された。全体的な有意水準（０．０５）は、群の数（例えば、Ｂ６１２９ＳＦ２／Ｊマウスにおいて試験された１１のサイトカイン及びケモカイン）で除算することにより、ボンフェローニ補正された。即ち、全体のボンフェローニ補正レベルは、Ｂ６１２９ＳＦ／２治療群の間での比較のために、０．０５／１１＝０．００４５５に設定された。
【０１７１】
本発明の他の実施形態は、明細書及びここに開示された本発明の実施を考慮することにより、当業者には明らかであろう。本明細書及び実施例は単なる例示とみなされるべきものであり、本発明の真の範囲及び精神は以下の特許請求の範囲によって示されるものである。
【図１】
2020072693.tif 000003
【図２】
2020072693.tif 000004
【図３】
2020072693.tif 000005
【図４】
2020072693.tif 000006
【図５】
2020072693.tif 000007
【図６】
2020072693.tif 000008
【図７】
2020072693.tif 000009
【図８】
2020072693.tif 000010
【図９】
2020072693.tif 000011
【図１０】
2020072693.tif 000012
【図１１】
2020072693.tif 000013
【図１２】
2020072693.tif 000014
【図１３】
2020072693.tif 000015
【図１４】
2020072693.tif 000016
【図１５】
2020072693.tif 000017
【図１６】
2020072693.tif 000018
【図１７】
2020072693.tif 000019
【配列表】
2020072693000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月23日(2020.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
一定の実施形態において、ケモカインの産生増強はＣＣＬ５をコードするｍＲＮＡの転写増強を含み、ＣＣＬ５をコードするｍＲＮＡの転写は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍以上増加する。一定の実施形態において、ケモカインの産生増強はＣＣＬ５タンパク質の分泌増強を含み、ＣＣＬ５タンパク質の分泌は、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍以上増加する
なお、本願は、特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．感染初期に過剰な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を発現する異種核酸を含んでなる組換えポックスウイルス。
２．上記１に記載の組換えポックスウイルスであって、更に、１以上の共刺激分子をコードする異種配列を含んでなる前記組換えポックスウイルス。
３．上記２に記載の組換えポックスウイルスであって、前記１以上の共刺激分子がＴＲＩＣＯＭ（Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、及びＬＦＡ−３）である前記組換えポックスウイルス。
４．上記１〜３の何れか１項に記載の組換えポックスウイルスであって、更に、１以上の細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、または腫瘍抗原をコードする異種配列を含んでなる前記組換えポックスウイルス。
５．上記１〜４の何れか１項に記載の組換えポックスウイルスであって、前記ポックスウイルスがオルソポックスウイルス、パラポックスウイルス、ヤタポックスウイルス、アビポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、カプリポックスウイルス、セルビドポックスウイルス、またはモルシポックスウイルスである前記組換えポックスウイルス。
６．上記５に記載の組換えポックスウイルスであって、前記オルソポックスウイルスは、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、及びサル痘ウイルスからなる群から選択される前記組換えポックスウイルス。
７．上記６に記載の組換えポックスウイルスであって、前記ワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルス・ウェスタンリザーブ、ワクシニアウイルス・コペンハーゲン、ドライワックス（Ｄｒｙｖａｘ：ワクシニアウイルス・ワイス（Ｗｙｅｔｈ）としても知られる）、ワクシニアウイルス・リスター、ワクシニアウイルス・アカンビス（Ａｃａｍｂｉｓ）２０００及び３０００、家兎痘ウイルス、バッファロー痘ウイルス、修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）、及び修飾ワクシニアウイルス・アンカラ・ババリアンノルディック（ＭＶＡ−ＢＮ）からなる群から選択される前記組換えポックスウイルス。
８．上記１〜７の何れか１項に記載の組換えポックスウイルスであって、ｄｓＲＮＡを生成する前記異種核酸は、部分的にまたは完全に相補的なＲＮＡ転写物をコードする配列を含んでなり、前記ＲＮＡ転写物の相補的部分は、転写後にアニールしてｄｓＲＮＡを形成する前記組換えポックスウイルス。
９．上記８に記載の組換えポックスウイルスであって、前記相補的なＲＮＡ転写物は、タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または非タンパク質をコードする遺伝子を含んでなる前記組換えポックスウイルス。
１０．上記９に記載の組換えポックスウイルスであって、前記ＲＮＡ転写物の前記相補的部分は５０以上のヌクレオチドを含んでなる前記組換えポックスウイルス。
１１．上記１０に記載の組換えポックスウイルスであって、前記ＲＮＡ転写物の前記相補的部分は、５０〜７００のヌクレオチドを含んでなる前記組換えポックスウイルス。
１２．上記１０に記載の組換えポックスウイルスであって、前記ＲＮＡ転写物の前記相補的部分は、７００を超えるヌクレオチドを含んでなる前記組換えポックスウイルス。
１３．上記１０に記載の組換えポックスウイルスであって、完全にまたは部分的に相補的なＲＮＡ転写産物をコードする前記異種核酸は、前記相補的な領域内において同一であるか、または前記相補的な領域内において９９％超、９５％超、９０％超、８０％超、または７０％超の類似性を有する前記組換えポックスウイルス。
１４．上記１３に記載の組換えポックスウイルスであって、部分的または完全に相補的な転写物をコードする前記二つの同一または非常に類似した配列が、１以上の必須のウイルス遺伝子によって分離されている前記組換えポックスウイルス。
１５．上記１４に記載の組換えポックスウイルスであって、センスメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は前記二つの同一または非常に類似した配列の一方から転写され、及びアンチセンスｍＲＮＡは他方の同一または非常に類似した配列から転写される前記組換えポックスウイルス。
１６．上記１５に記載の組換えポックスウイルスであって、センス及びアンチセンスＲＮＡが、前記同じ異種配列の挿入物の両方の鎖から転写される前記組換えポックスウイルス。
１７．上記１５に記載の組換えポックスウイルスであって、センス及びアンチセンスＲＮＡは、天然ポックスウイルス配列、好ましくは初期遺伝子、より好ましくは即時初期遺伝子の両方の鎖から転写される前記組換えポックスウイルス。
１８．上記１５〜１７の何れか１項に記載の組換えポックスウイルスであって、相補的なＲＮＡ転写物をコードする前記配列の発現は、各々ポックスウイルスプロモータによって指令される前記組換えポックスウイルス。
１９．上記１６に記載の組換えポックスウイルスであって、前記ポックスウイルスプロモータは、初期プロモータまたは即時初期プロモータである前記組換えポックスウイルス。２０．上記１〜１９に記載の初期ｄｓＲＮＡの発現により、標準的な複製能力をもつワクシニアウイルス株及びチョルドポックスウイルス亜科由来の他の種を弱毒化させる方法。２１．自然免疫の活性化を増強する方法であって、脊椎動物被験対象に上記１９に記載の組換えポックスウイルスを投与することを含んでなり；前記投与は、前記被験対象におけるＩ型インターフェロン（Ｉ型ＩＦＮ）、サイトカイン及びケモカインの産生を高める方法。
２２．上記２１に記載の方法であって、Ｉ型ＩＦＮの産生は、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写を含んでなり、該ＩＦＮ−β・ｍＲＮＡの転写が少なくとも２倍増加する前記方法。
２３．上記２２に記載の方法であって、ＩＦＮ−βをコードするｍＲＮＡの転写が少なくとも１０倍増加する前記方法。
２４．上記２３に記載の方法であって、ＩＦＮ−βをコードするｍＲＮＡの転写が少なくとも５０倍増加する前記方法。
２５．上記２１に記載の方法であって、Ｉ型ＩＦＮの産生はＩＦＮ−βタンパク質の分泌を含んでなり、該ＩＦＮ−βタンパク質の分泌が少なくとも２倍増加する前記方法。
２６．上記２５に記載の方法であって、ＩＦＮ−βタンパク質の分泌が少なくとも４倍増加する前記方法。
２７．上記２６に記載の方法であって、ＩＦＮ−βタンパク質の分泌が少なくとも１０倍増加する前記方法。
２８．上記２１に記載の方法であって、前記投与は、サイトカインＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、及びＩＬ−１８の産生を増強する前記方法。
２９．上記２１に記載の方法であって、前記投与は、ケモカインＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２及びＣＣＬ５の産生を増強する前記方法。
３０．上記２１に記載の方法であって、前記投与は、ベクター特異的ＣＤ８Ｔ細胞の産生を、少なくとも１０％、好ましくは２５％、より好ましくは５０％超増強する前記方法。３１．上記１９に記載のポックスウイルスであって、ニワトリ線維芽細胞株ＤＦ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１２２０３）において産生される前記ポックスウイルス。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染初期に過剰な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を発現する天然の核酸を含んでなる突然変異または組換えポックスウイルスであって、ｄｓＲＮＡを生成する前記天然核酸が、部分的にまたは完全に相補的なＲＮＡ転写物をコードする配列を含んでなり、相補的なＲＮＡ転写物をコードする前記配列の発現は、各々、初期もしくは即時初期ポックスウイルスプロモータによって指令され、前記ＲＮＡ転写物の相補的部分が転写後にアニールしてｄｓＲＮＡを形成し、前記ＲＮＡ転写物の相補的部分が１００を超えるヌクレオチドで重なる、前記突然変異または組換えポックスウイルス。
【請求項２】
更に、１以上の細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原または腫瘍抗原をコードする異種配列を含んでなる、請求項１に記載のポックスウイルス。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポックスウイルスであって、更に、ＴＲＩＣＯＭ（Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、及びＬＦＡ−３）である１以上の共刺激分子をコードする異種配列を含んでなる前記ポックスウイルス。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１つに記載のポックスウイルスであって、前記ポックスウイルスは、好ましくは、ワクシニアウイルス・ウェスタンリザーブ、ワクシニアウイルス・コペンハーゲン、ドライワックス（Ｄｒｙｖａｘ：ワクシニアウイルス・ワイス（Ｗｙｅｔｈ）としても知られる）、ワクシニアウイルス・リスター、ワクシニアウイルス・アカンビス（Ａｃａｍｂｉｓ）２０００及び３０００、家兎痘ウイルス、修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）、漿尿膜ワクシニアウイルス・アンカラ（ＣＶＡ）及び修飾ワクシニアウイルス・アンカラ・ババリアンノルディック（ＭＶＡ−ＢＮ）からなる群から選択される前記ポックスウイルス。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポックスウイルスであって、前記相補的なＲＮＡ転写物が、タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または非タンパク質をコードする遺伝子を含んでなる前記ポックスウイルス。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポックスウイルスであって、前記ＲＮＡ転写物の前記相補的部分が５００を超える、６００を超える、６５０を超えるヌクレオチド、または７００を超えるヌクレオチドで重なる、前記ポックスウイルス。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポックスウイルスであって、前記ＲＮＡ転写物の前記相補的部分が５００〜１０００、６００〜１０００または７００〜１０００重なる、前記ポックスウイルス。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポックスウイルスであって、前記ＲＮＡ転写物の前記相補的部分が７００を超えるヌクレオチドを含む前記ポックスウイルス。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のポックスウイルスであって、センス及びアンチセンスＲＮＡが、天然のポックスウイルス配列の両方の鎖から転写される前記ポックスウイルス。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の初期ｄｓＲＮＡの発現により、標準的な複製能力をもつワクシニアウイルス株を弱毒化させるｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のポックスウイルスと、医薬的に許容可能な担体または賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項１２】
医薬を製造するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポックスウイルスの使用。
【請求項１３】
ポックスウイルスにより媒介される状態の治療または予防のための医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポックスウイルスの使用。
【請求項１４】
異種疾患関連抗原により媒介される状態の治療または予防のための医薬の製造のための、請求項２〜９のいずれか１項に記載のポックスウイルスの使用。
【請求項１５】
新生物状態、好ましくは癌の治療または予防のための医薬の製造のための、請求項２〜９のいずれか１項に記載のポックスウイルスの使用。
【請求項１６】
自然免疫の活性化を増強するための請求項１１に記載の医薬組成物であって、前記の自然免疫の活性化が、脊椎動物対象に前記医薬組成物を投与することを含み；前記投与が、前記対象におけるＩ型インターフェロン（Ｉ型ＩＦＮ）、サイトカイン及びケモカインの産生を高める、医薬組成物。
【請求項１７】
Ｉ型ＩＦＮの産生は、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写を含んでなり、該ＩＦＮ−β  ｍＲＮＡの転写が少なくとも２倍、少なくとも１０倍または少なくとも５０倍増加する、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
Ｉ型ＩＦＮの産生はＩＦＮ−βタンパク質の分泌を含んでなり、該ＩＦＮ−βタンパク質の分泌が少なくとも２倍、少なくとも４倍または少なくとも１０倍増加する、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のポックスウイルスを含む、ポックスウイルスにより媒介される状態の治療または予防のための医薬。
【請求項２０】
請求項２〜９のいずれか１項に記載のポックスウイルスを含む、異種疾患関連抗原により媒介される状態の治療または予防のための医薬。
【請求項２１】
請求項２〜９のいずれか１項に記載のポックスウイルスを含む、新生物状態、好ましくは癌の治療または予防のための医薬。
【外国語明細書】
2020072693000001.pdf