(57)【要約】      （修正有）【課題】寛容を誘導することにより免疫拒絶を予防する、ドナーＭＨＣクラスＩＩ分子の多型領域由来の単離されたペプチドの提供。【解決手段】薬剤として使用するための、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は機能保存変異体を含むか、又は、からなる、１５〜４０個のアミノ酸長の単離されたペプチド。前記ペプチドを含む培養培地により、形質細胞様樹状細胞集団の存在下において、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ集団を生成し、移植患者が寛容であるかを判定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は下記ペプチド：
【表１３】
2020055845.tif 000020
を除く、その機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有する、
単離されたペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又はその機能保存変異体を含むか、又は、からなる、１５又は１６個のアミノ酸長のペプチドである、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
ペプチドが、配列番号：１に対して、１、２、３、又は４個のアミノ酸が異なってもよい、請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
ペプチドが、
【表１４】
2020055845.tif 000021
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項５】
アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）もしくはその機能保存変異体を含むか、又は、からなる、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有するペプチドをコードする核酸配列、又は、このような核酸配列を含む発現ベクター、又は、このような発現ベクターを含むホスト細胞。
【請求項６】
アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）もしくはその機能保存変異体を含むか、又は、からなる、１５〜２５個のアミノ酸の範囲の長さを有するペプチドを含む、
ＭＨＣ／ペプチド多量体。
【請求項７】
アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又はその機能保存変異体を含むか、又は、からなる、１５又は１６個のアミノ酸長の単離されたペプチドを、特異的に認識する、
Ｔリンパ球。
【請求項８】
アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又はその機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有する単離されたペプチドを含む培養培地により、形質細胞様樹状細胞集団の存在下において、ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、
ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ法。
【請求項９】
請求項６記載のＭＨＣ／ペプチド多量体を含む培養培地により、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、
ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ法。
【請求項１０】
薬剤として使用するための、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）もしくは機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有する単離されたペプチド、又は、請求項６記載のＭＨＣ／ペプチド多量体。
【請求項１１】
寛容の誘導を必要とする患者において寛容を誘導するのに使用するための、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）もしくは機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有する単離されたペプチド、又は、請求項６記載のＭＨＣ／ペプチド多量体。
【請求項１２】
移植拒絶の予防又は減少を必要とする患者において移植拒絶を予防又は減少させるのに使用するための、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）もしくは機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有する単離されたペプチド、又は、請求項６記載のＭＨＣ／ペプチド多量体。
【請求項１３】
ペプチドが、アミノ酸配列：
【表１５】
2020055845.tif 000022
を含むか、又は、からなる、１５又は１６個のアミノ酸長のペプチドである、請求項１０〜１２のいずれか一項記載の使用のための単離されたペプチド又はＭＨＣ／ペプチド多量体。
【請求項１４】
ａ）アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は下記ペプチド：
【表１６】
2020055845.tif 000023
を除く、その機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有する単離されたペプチド、又は
ｂ）請求項５記載のペプチドをコードする核酸、又は
ｃ）このような核酸を含むベクター、又は
ｄ）このような発現ベクターを含むホスト細胞、又は
ｅ）請求項６記載のＭＨＣ／ペプチド多量体、又は
ｆ）複合体ＭＨＣ分子及びアミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）もしくはその機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有するペプチドを含む抗原提示細胞、又は
ｇ）請求項７記載のペプチドを特異的に認識するＴリンパ球と、
薬学的に許容し得る担体とを含む、
医薬組成物。
【請求項１５】
移植患者が寛容であるかを判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、
前記移植患者から得られた生体サンプル中のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇの存在を、前記生体サンプルと、請求項６記載のＭＨＣ／ペプチド多量体からなり、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇと選択的に相互作用可能な結合パートナーとを接触させることにより判定する工程を含み、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇの存在が寛容を示す、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法分野におけるものである。
【０００２】
特に、本発明は、移植拒絶の予防を必要とする患者において寛容を誘導することにより免疫拒絶を予防する、ドナーＭＨＣクラスＩＩ分子の多型領域由来の単離されたペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
同種のヒト間での移植は、疾患の進行により機能不全となった臓器を置き換えるのに、今でも最良の処置である。レシピエント細胞とドナー細胞との主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子間での不一致が、臓器移植の長期的成功に対する主な障壁である。移植臓器に対する寛容の誘導が、主な目標となっており、特定の寛容戦略が、臨床応用され始めている（１）。種々の集団のＴｒｅｇが、同種臓器に対する寛容を誘導可能であると説明されている。これらのＴｒｅｇの大部分は、ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇである。一方、ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇは、ほとんど十分に画定されていない（２）。
【０００４】
臓器同種移植片生存を長くするのに最も効率的な戦略の一つである、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の同時刺激阻害（３）は、強力なサプレッシブ能を有するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇと呼ばれる）を誘導することが、以前から説明されている（２、４〜６）。天然のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇだけでなく、ドナー特異的ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇが、ナイーブな移植レシピエントに対して、寛容を伝達したことが示されている。加えて、これらの細胞は、移植臓器の生存がインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）のその分泌に依存するような珍しい方法で、樹状細胞（ＤＣ）及び移植片の内皮細胞（ＥＣ）によるインドールアミン  ２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の発現を向上させるように振る舞った（５）。また近年、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇのサプレッシブ活性は、形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）の存在下において主に行われること、及び、フィブリノゲン様タンパク質２（ＦＧＬ２）が、このサプレッションに関与していたことが示されている（６）。
【０００５】
レギュラトリーＴ細胞集団の形をとるＴＣＲ相互作用のための要求は、活発で、進行中の議論である（２、７）。ＴＣＲ特異性及び多様性が、ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇのｉｎ  ｖｉｖｏでの機能及び活性に重要であることが、一部の研究で示唆されている（２、７〜１３）。ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇについての種々のモデルから、抗原特異的Ｔｒｅｇは、制限されていないＴｒｅｇ細胞より強力なサプレッサーであることが示されている（２、１４）。また、ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇについて、ＴＣＲ多様性が胸腺選択及び分化に重要であることも公知であり、Ｔｒｅｇ生成及び機能に対するその影響が、近年説明されている（１５）。高スループットシークエンスから、高いＴＣＲ多様性を有するナイーブなＴｒｅｇが、ＴＣＲ制限Ｔｒｅｇより、効率的に増殖し、養子移植に基づく移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）をサプレッションするのに、ＴＣＲ制限Ｔｒｅｇより、適応でき、効率的であることが示されている（１３、１６）。Immunoscope（登録商標）を使用して、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇが、Ｖβ１１エレメントに対する偏ったレパートリーを蓄積したことが、以前に証明されている（５）。このことは、クローンエクスパンションの可能性を示唆している。今日、このＴｒｅｇ集団又はＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ集団の認識機構は、一般的にはほとんど知られていない。このため、Ｔｒｅｇ活性におけるＴＣＲ／ＭＨＣ／ペプチド相互作用の正確な役割は、今でも議論のトピックである。
【０００６】
さらに、移植物に対する免疫応答（例えば、抗体媒介性拒絶に関連するドナー特異的抗体）のＴｒｅｇ媒介性サプレッションに基づく効率的な治療戦略を提供することにより、日和見感染症（例えば、細菌、ウイルス、又は真菌感染）の罹患率を向上させ、移植患者の死亡率を向上させてしまう欠点を有する、非特異的な免疫抑制剤を使用する必要を回避するための重要な必要性が未だに存在している。
【発明の概要】
【０００７】
第１の態様において、本発明は、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又はその機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有する単離されたペプチドに関する。
【０００８】
第２の態様において、本発明は、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又はその機能保存変異体を含むか、又は、からなる、１５〜２５個のアミノ酸の範囲の長さを有するペプチドを含むＭＨＣ／ペプチド多量体に関する。
【０００９】
第３の態様において、本発明は、本発明の単離されたペプチドを含む培養培地により、形質細胞様樹状細胞集団の存在下において、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ法に関する。
【００１０】
第４の態様において、本発明は、本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体を含む培養培地により、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ法に関する。
【００１１】
第５の態様において、本発明は、薬剤として使用するための、寛容の誘導を必要とする患者において寛容を誘導するのに使用するための、及び、移植拒絶の予防又は減少を必要とする患者において移植拒絶を予防又は減少させるのに使用するための、本発明の単離されたペプチド又はＭＨＣ／ペプチド多量体に関する。
【００１２】
第６の態様において、本発明は、
ａ）本発明の単離されたペプチド、又は
ｂ）本発明のペプチドをコードする核酸、又は
ｃ）このような核酸を含むベクター、又は
ｄ）このような発現ベクターを含むホスト細胞、又は
ｅ）本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体、又は
ｆ）複合体ＭＨＣ分子及び本発明のペプチドを含む抗原提示細胞、又は
ｇ）本発明のペプチドを特異的に認識するＴリンパ球と、
薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物に関する。
【００１３】
第７の態様において、本発明は、移植患者（レシピエント）が寛容であるかを判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、前記移植患者から得られた生体サンプル中のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇの存在を判定する工程を含み、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇの存在が寛容を示す、方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明者らは、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇの優れたＴＣＲ特異性が、Ｔｒｅｇの機能及び移植臓器の生存に影響を及ぼすかどうかを調査し、これにより、誘導されたＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇが、ドナーＭＨＣクラスＩＩ分子の多型領域由来のドミナントなペプチド（Ｄｕ５１と呼ばれる）を認識したことを、移植において初めて証明した。このペプチドは、少なくともｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、ｐＤＣの存在下で、ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇをエクスパンションさせ、ナイーブな移植レシピエントにおいて、更なる処置をすることなく寛容を誘導した。
【００１５】
加えて、本発明者らは、特定の四量体を生成し、ｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ドミナントな寛容が抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇにより発揮されることを証明した。最後に、本発明者らは、このペプチドが、Ｖβ１１及びＶβ１８特異的ＴＣＲを発現しているＴｒｅｇにより認識されたことを証明した。これらのＴＣＲは、脾臓及び移植片において、プライベートであるが制限されたＶβ１１レパートリーを含んだが、脾臓においてプライベートでかつ多様なＶβ１８レパートリーと、移植片においてより制限されたＶβ１８レパートリーとを含んだ。これらにより、アロ反応性の免疫応答における効率的なサプレッションが確保される。
【００１６】
本発明のペプチド
本発明の第１の態様は、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）（本明細書において、５１−１８とも呼ばれる）又はその機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有する単離されたペプチドに関する。
【００１７】
本発明の一実施態様では、本ペプチドは、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は下記ペプチド：
【表１】
2020055845.tif 000002
を除く、その機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有する単離されたペプチドである。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「機能保存変異体」という用語は、参照ペプチド（例えば、配列番号：１）に対して、少なくとも７０％、更により好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％の同一性を含み、かつ、参照ペプチド（例えば、配列番号：１（５１−１８））と実質的に同じ方法で、寛容を誘導することにより、臓器拒絶を予防可能でもある変異体を意味する。
【００１９】
本発明の一実施態様では、前記ペプチドは、ドナーＭＨＣクラスＩＩ分子の多型領域由来である。
【００２０】
特定の実施態様では、前記ペプチドは、アミノ酸配列：ＲＬＬＡＲＬＩＹＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶＴＥＬＧＲＰＳＡＥＹＲＮＫＱ（配列番号：２８）又はその機能保存変異体からなる。
【００２１】
一実施態様において、本発明のペプチドは、配列番号：２８のペプチドに対して、少なくとも７０％、更により好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％の同一性を含み、かつ、配列番号：２８のペプチドと実質的に同じ方法で、寛容を誘導することにより、臓器拒絶を予防可能でもある。
【００２２】
本発明の一実施態様では、前記ペプチドは、最大で１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０個のアミノ酸を含む。
【００２３】
本発明の特定の実施態様では、本ペプチドは、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）（本明細書において、５１−１８とも呼ばれる）又はその機能保存変異体を含むか、又は、からなる、１５又は１６個のアミノ酸長の単離されたペプチドである。
【００２４】
本発明の特定の実施態様では、本ペプチドは、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）（本明細書において、５１−１８とも呼ばれる）又はその機能保存変異体を含むか、又は、からなる、１５又は１６個のアミノ酸長の単離されたペプチドであり、前記変異体が、アミノ酸配列：ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：２）（本明細書において、Ｄｕ５１とも呼ばれる）からなるペプチドではないという条件である。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「ペプチド」という用語は、自然に又は合成的に産生されたかに関わらず、長さを特定しない、ペプチド結合により結合されたアミノ酸残基のポリマーを意味する。ペプチドという用語は、翻訳後修飾を除外しない。翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化等を含むが、これらに限定されるわけではない。また、この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が天然アミノ酸に対応する人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマーと、天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーとにも適用する。
【００２６】
「単離されたペプチド」は、ペプチドが入り混じった細胞成分、例えば、本来ポリペプチドと会合している炭水化物、脂質、又は他のタンパク質性不純物から本質的に遊離していることを意図している。典型的には、単離されたペプチドの調製物は、高度に精製された形態、すなわち、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、９５％超純粋、例えば、９６％、９７％、もしくは９８％以上純粋、又は９９％超純粋な形態において、ペプチドを含有する。特定のタンパク質調製物が単離されたペプチドを含有することを示す１つの方法は、タンパク質調製物のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びゲルのクーマーシー・ブリリアントブルー染色による、単一バンドの出現による。あるいは、他の分析化学技術、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は質量分析法（ＭＳ）も、純度を決定するのに使用することができる。調製物中に存在するプレドミナントな種であるペプチドは、実質的に精製されている。
【００２７】
また、本発明は、上記されたように、配列番号：１を含むペプチドの機能保存変異体であるペプチドを包含する。
【００２８】
一実施態様において、本発明のペプチドは、配列番号：１のペプチドに対して、少なくとも７０％、更により好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％の同一性を含み、かつ、配列番号：１のペプチドと実質的に同じ方法で、寛容を誘導することにより、臓器拒絶を予防可能でもある。
【００２９】
本発明の照会アミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも９５％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドは、対象ペプチド配列が、照会アミノ酸配列のアミノ酸１００個当たりに、最大５個のアミノ酸改変を含む場合があることを除いて、対象ペプチドのアミノ酸配列が、照会配列と同一であることを意図している。すなわち、照会アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するペプチドを得るには、対象配列中の最大５％（１００個中５個）のアミノ酸残基が、挿入、欠失、又は、別のアミノ酸により置換されることができる。
【００３０】
本願の枠組みにおいて、同一性の割合は、グローバルアライメントを使用して算出される（すなわち、２つの配列が、その全長にわたって比較される）。２つ以上の配列の同一性及び相同性を比較するための方法は、当技術分野において周知である。「needle」プログラムは、ニードルマン−ワンチ・グローバルアライメント・アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453）を使用して、２つの配列の最適なアライメント（ギャップを含む）を、その全長を考慮して見出す。例えば、このプログラムを、使用することができる。needleプログラムは、例えば、ebi.ac.ukのワールド・ワイド・ウェブサイトで入手できる。本発明に基づく同一性の割合は、好ましくは、EMBOSS::nedddle（グローバル）プログラムを使用して、１０．０に等しい「Gap Open」パラメータ、０．５に等しい「Gap Extend」パラメータ、及びBlosum62マトリックスで算出される。
【００３１】
一実施態様において、本発明のペプチドは、配列番号：１又は配列番号：２（Ｄｕ５１）に対して、１、２、３、又は４個のアミノ酸が異なってもよい。
【００３２】
このようなペプチドは、例えば、参照配列と比較して置換のみを含んでもよい。この置換は、好ましくは、以下の表に示された保存的置換に相当する。
【表２】
2020055845.tif 000003
【００３３】
典型的には、本発明は、配列番号：１（５１−１８）又は配列番号：２（Ｄｕ５１）からなるペプチドに対して実質的に同一のペプチドを包含する。このペプチドでは、１つ以上の残基が、機能的に類似する残基により保存的に置換されており、このペプチドは、以下に記載されたように、配列番号：１（５１−１８）又は配列番号：２（Ｄｕ５１）からなるペプチドの機能的局面を示す、すなわち、所定のアミノ酸配列からなるペプチド（例えば、ペプチド５１−１８又はＤｕ５１）と実質的に同じ方法で、寛容を誘導することにより、臓器拒絶を予防することもできる。
【００３４】
また、「保存的置換」という用語は、誘導体化されていない残基の代わりに、化学的に誘導体化された残基の使用も含む。「化学的な誘導体」は、機能性側鎖基の反応により化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有するペプチドを意味する。このような誘導体化分子の例は、例えば、遊離アミノ酸基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、又はホルミル基を形成している分子を含む。遊離カルボキシル基は誘導体化されて、塩、メチル及びエチルエステルもしくは他の種類のエステル、又はヒドラジドを形成することができる。遊離ヒドロキシル基は誘導体化されて、Ｏ−アシル又はＯ−アルキルの誘導体を形成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は誘導体化されて、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成することができる。また、化学誘導体は、２０個の標準的なアミノ酸の１つ以上の天然アミノ酸の誘導体を含有するペプチドを含む。例えば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンについて置換することができる。５−ヒドロキシリシンは、リシンについて置換することができる。３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンについて置換することができる。ホモセリンは、セリンについて置換することができる。オルニチンは、リシンについて置換することができる。また、「保存的置換」という用語は、ペプチド又はタンパク質の二次構造を制御及び安定化するのを目的に、非天然アミノ酸の使用も含む。これらの非天然アミノ酸は、以下に記載されるように、化学的に改変されたアミノ酸、例えば、プロリノアミノ酸、ベータ−アミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸、シクロプロピルアミノ酸、アルファ，アルファ−置換アミノ酸である。また、これらの非天然アミノ酸は、フッ化、塩化、臭化、又はヨウ化改変アミノ酸を含んでもよい。
【００３５】
新たに生じたペプチドが、最初に特徴付けられたペプチド５１−１８又はＤｕ５１と同じ生物学的特性を含むかを検証するために、ｉｎ  ｖｉｖｏでのペプチド注入後における、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ活性化分析及び／又は寛容誘導分析（例えば、実施例セクションに記載）を、各ペプチドに行うことができる。さらに、移植臓器モデルにおいて行われるタイムコース及び用量応答から、各ペプチドについての最適条件が決定されるであろう。
【００３６】
一実施態様において、本ペプチドは、
【表３】
2020055845.tif 000004
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。
【００３７】
一実施態様において、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）を有するペプチドは、Ｎ末端にアスパラギン（Ｎ）を有する。
【００３８】
好ましい実施態様では、本ペプチドは、
【表４】
2020055845.tif 000005
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。
【００３９】
本発明に基づいて、本発明のペプチドは、従来の自動ペプチド合成法又はリコンビナント発現により産生することができる。タンパク質を設計及び調製するための全体的な原理は、当業者に周知である。
【００４０】
本発明のペプチドは、従来技術に基づいて、溶液中又は固体支持体上で合成することができる。種々の自動合成機が市販されており、Stewart and Young；Tam et al., 1983；Merrifield, 1986、及びBarany and Merrifield, Gross and Meienhofer, 1979に記載されたように、公知のプロトコールに基づいて使用することができる。また、本発明のペプチドは、例示的なペプチド合成機、例えば、Applied Biosystems Inc.からのモデル４３３Ａを利用する固相技術により合成することができる。自動ペプチド合成又はリコンビナント法により生成された任意の所定のペプチドの純度は、逆相ＨＰＬＣ分析を使用して決定することができる。各ペプチドの化学的信頼性は、当業者に周知の任意の方法により確立することができる。自動ペプチド合成の代替手段として、リコンビナントＤＮＡ技術を利用することができる。この場合、選択されたペプチドをコードするヌクレオチド配列が、発現ベクター内に挿入され、適切なホスト細胞中にトランスフォーメーション又はトランスフェクションされ、以下に記載されたように、発現に適した条件下で培養される。リコンビナント法は、より長いペプチド（ポリペプチド）を産生するのに特に好ましい。
【００４１】
核酸、ベクター、及びリコンビナントホスト細胞
あるいは、本発明のペプチド（例えば、配列番号：１で示されたペプチド）をコードする核酸、このような核酸を含むベクター、又はこのような発現ベクターを含むホスト細胞も、本発明の文脈内で対象となるものである。
【００４２】
一実施態様において、本ペプチドは、上記されたアミノ酸配列からなる。
【００４３】
本発明の核酸は、当技術分野においてそれ自体は公知の任意の技術により産生することができる。同技術は、例えば、任意の化学的、生物学的、遺伝学的、又は酵素的な技術を、単独又は組み合わせのいずれかであるが、これらに限定されるわけではない。
【００４４】
その最も広い意味において、「ベクター」は、核酸の細胞への輸送を促進可能な任意の媒体である。一般的には、本発明に有用なベクターは、対象となる核酸配列の挿入又は包含により操作された、プラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス又は細菌ソースから得られた他の媒体を含むが、これらに限定されるわけではない。ウイルスベクターは、好ましい種類のベクターであり、下記ウイルス：レトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベーマウス肉腫ウイルス、マウス乳ガンウイルス、及びマウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ関連ウイルス；ＳＶ−４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン−バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；ならびにＲＮＡウイルス、例えば、レトロウイルス由来の核酸配列を含むが、これらに限定されるわけではない。命名されていないが、当技術分野において公知の他のベクターを、容易に利用することができる。
【００４５】
好ましいウイルスベクターは、非細胞変性真核生物ウイルスに基づいている。同ウイルスにおいて、必須でない遺伝子が、対象となる遺伝子により置換されている。非細胞変性ウイルスは、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）を含む。同ウイルスのライフサイクルは、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写を含み、ホスト細胞内ＤＮＡへのその後のプロウイルスインテグレーションを伴う。レトロウイルスは、ヒトの遺伝子治療の臨床試験に承認されている。複製欠損の（すなわち、所望のペプチドの合成に向けることができるが、感染性粒子を作製することができない）レトロウイルスが最も有用である。このように遺伝的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける遺伝子の高効率なトランスダクションのための一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的なプロトコール（外来性遺伝子材料のプラスミドへの包含、パッケージング細胞株のプラスミドによるトランスフェクション、パッケージング細胞株によるリコンビナントレトロウイルスの産生、ウイルス粒子の組織培養培地からの回収、及びターゲット細胞のウイルス粒子による感染の工程を含む）は、KRIEGLER（「A Laboratory Manual」, W.H. Freeman C.O., New York, 1990）及びMURRY（「Methods in Molecular Biology」, vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991）に提供されている。
【００４６】
特定の用途に好ましいウイルスは、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスである。これらのウイルスは、遺伝子治療において、ヒトへの使用について既に承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノ関連ウイルスは、複製欠損になるように操作することができ、広い範囲の細胞の種類及び細胞種に感染することができる。さらに、同ウイルスは、熱及び脂肪族溶媒安定性；造血細胞を含む多様な系統の細胞への高トランスダクション頻度；及び重複感染阻害の欠損による複数回のトランスダクションが可能等の利点を有する。報告によれば、アデノ関連ウイルスは、部位特異的な方法において、ヒトの細胞内ＤＮＡにインテグレーションすることにより、レトロウイルス感染の挿入変異誘発の可能性及び挿入された遺伝子発現特性の変異性を最少化することができる。加えて、野生型アデノ関連ウイルスの感染は、選択圧の非存在下において、１００を超える継代における組織培養でフォローされており、アデノ関連ウイルスのゲノムインテグレーションが比較的安定なイベントであることを意味している。また、アデノ関連ウイルスは、染色体外法においても機能することができる。
【００４７】
他のベクターは、プラスミドベクターを含む。プラスミドベクターは、当技術分野において広く説明されており、当業者に周知である。例えば、SANBROOK et al., 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照のこと。この数年の間に、プラスミドベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、抗原コード遺伝子を細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されてきた。プラスミドベクターは、これについて特に有利である。プラスミドベクターは、多くのウイルスベクターが有するのと同じ安全性の懸念を有さないためである。一方で、ホスト細胞に適合性のプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内に操作可能にコードされた遺伝子から、ペプチドを発現することができる。一部の一般的に使用されるプラスミドは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣｌ９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔを含む。他のプラスミドは、当業者に周知である。さらに、プラスミドは、制限酵素及びライゲーション反応を使用し、ＤＮＡの特定フラグメントを除去及び追加して、カスタム設計することができる。プラスミドは、各種の非経口、粘膜、及び局所経路により送達することができる。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、又は他の経路により注入することができる。また、ＤＮＡプラスミドは、鼻内スプレー又は液滴、直腸坐剤、及び経口により投与することができる。また、ＤＮＡプラスミドは、表皮又は粘膜表面に、遺伝子銃を使用して投与することができる。該プラスミドは、水溶液、金粒子上で乾燥させた状態、又は別のＤＮＡ送達システム（リポソーム、デンドリマー、及びマイクロ封入を含むが、これらに限定されるわけではない）と会合した状態で与えることができる。
【００４８】
本発明に基づいて、使用することができるホスト細胞の例は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、ヒト樹状細胞又は単球（特に、処置されるべき患者から得られた細胞）である。
【００４９】
遺伝子を運ぶベクターを細胞内に導入することができる手段は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、又は、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション、リン酸カルシウム、もしくは当業者に公知の他の手法を使用するトランスフェクションを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００５０】
ＭＨＣ／ペプチド多量体
本発明の別の態様は、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）（本明細書において、５１−１８とも呼ばれる）又は上記されたその機能保存変異体を含むか、又は、からなる、１５〜２５個のアミノ酸の範囲の長さを有するペプチドを含む、ＭＨＣ／ペプチド多量体である。
【００５１】
本発明の一実施態様では、前記ペプチドは、最大で１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のアミノ酸を含む。
【００５２】
特定の実施態様では、前記ＭＨＣ／ペプチド多量体は、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）（本明細書において、５１−１８とも呼ばれる）又は上記されたその機能保存変異体を含むか、又は、からなる、１５又は１６個のアミノ酸長のペプチドを含む。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「ＭＨＣ／ペプチド多量体」という用語は、本発明のペプチドがロードされた主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質サブユニットで構成された、安定した多量体複合体を意味する。本発明に基づいて、前記ＭＨＣ／ペプチド多量体（本明細書において、ＭＨＣ／ペプチド複合体とも呼ばれる）は、ＭＨＣ／ペプチド二量体、三量体、四量体、又は五量体を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００５４】
「主要組織適合複合体」（ＭＨＣ）という用語は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を含む種々の種において説明された、組織適合抗原系を包含することを意味する総称である。
【００５５】
本発明の一実施態様では、ＭＨＣ／ペプチド多量体は、ＭＨＣクラスＩ／ペプチド多量体である。
【００５６】
本発明の特定の実施態様では、前記ＭＨＣ／ペプチド多量体は、ラットＭＨＣＲＴ１．Ａａ／ペプチド多量体である。また、非古典的なラットＭＨＣクラスＩ分子も、本発明の文脈内に包含されることにも更に留意する必要がある。
【００５７】
別の特定の実施態様では、ＭＨＣ／ペプチド多量体は、ＭＨＣクラスＩ／ペプチド多量体に対応するＨＬＡである。
【００５８】
ヒトにおいて、ＭＨＣクラスＩ分子をコードする、３種類の主な遺伝的ローカス：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃが存在する（ヒトのＭＨＣ分子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも指定される）。ＨＬＡ−Ａ＊０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２、及びＨＬＡ−Ａ＊１１が、これらのローカスから発現することができる種々のＭＨＣクラスＩアレルの例である。
【００５９】
また、非古典的ヒトＭＨＣクラスＩ分子、例えば、ＨＬＡ−Ｅ（マウスにおける機能性ホモログは、Ｑａ−１ｂと呼ばれる）及びＭＩＣＡ／Ｂ分子も、本発明の文脈内に包含されることも、更に留意する必要がある。
【００６０】
したがって、ＭＨＣ／ペプチド多量体は、ＨＬＡ−Ａ／ペプチド多量体、ＨＬＡ−Ｂ／ペプチド多量体、ＨＬＡ−Ｃ／ペプチド多量体、ＨＬＡ−Ｅ／ペプチド多量体、ＭＩＣＡ／ペプチド多量体、及びＭＩＣＢ／ペプチド多量体からなる群より選択されるＨＬＡ／ペプチド多量体である。
【００６１】
一実施態様において、前記単離されたペプチドは、
【表５】
2020055845.tif 000006
からなる群より選択される。
【００６２】
ＭＨＣ／ペプチド四量体を得るための方法は、国際公開公報第９６／２６９６２号及び同第０１／１８０５３号に記載されている。これらの文献は、参照により組み入れられる。
【００６３】
本発明の一実施態様では、前記ＭＨＣ／ペプチド多量体は、上記されたＭＨＣクラスＩ  ＲＴ１．Ａａ／ペプチド複合体又はＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体に対応するＨＬＡに特異的なＴ細胞集団を可視化するのに使用することができる。
【００６４】
ＭＨＣ／ペプチド多量体は、ＭＨＣの重鎖がビオチン化されている多量体でもよい。このビオチン化により、ストレプトアビジンとの四量体としての組み合わせが可能である。このようなＭＨＣ／ペプチド四量体は、適切なＴＣＲ−担体Ｔリンパ球に対する向上したアビジティを有するため、免疫蛍光法により反応性集団を可視化するのに使用することができる。
【００６５】
本発明の別の実施態様では、前記ＭＨＣ／ペプチド多量体は、上記されたＭＨＣ／ペプチド複合体に特異的なＴ細胞集団をスクリーニングすることにより（フローサイトメトリーにおいて、又は、免疫磁性スクリーニングにより）、検出及び／又は単離に使用することができる。
【００６６】
本発明の特定の実施態様では、ＭＨＣクラスＩ  ＲＴ１．Ａａ／ペプチド多量体又はＭＨＣクラスＩ／ペプチド多量体に対応するＨＬＡは、上記された前記ＭＨＣクラスＩ  ＲＴ１．Ａａ／ペプチド複合体又はＭＨＣクラスＩ／ペプチド多量体に対応する前記ＨＬＡに特異的なＴ細胞集団をスクリーニングすることにより（フローサイトメトリーにおいて、又は、免疫磁性スクリーニングにより）、検出及び／又は単離に使用することができる。
【００６７】
本発明の別の態様は、上記されたＭＨＣ／ペプチド多量体をコートした、ビーズ、マイクロスフェア、又はナノ粒子である。
【００６８】
抗原提示細胞及びその使用
本発明の別の態様は、上記された本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体を含むペプチド提示細胞である。
【００６９】
本発明の一実施態様では、前記ＭＨＣ／ペプチド多量体は、ＭＨＣクラスＩ  ＲＴ１．Ａａ／ペプチド多量体である。
【００７０】
別の特定の実施態様では、ＭＨＣ／ペプチド多量体は、上記で定義されたＭＨＣクラスＩ／ペプチド多量体に対応するＨＬＡである。
【００７１】
したがって、ＭＨＣ／ペプチド多量体は、ＨＬＡ−Ａ／ペプチド多量体、ＨＬＡ−Ｂ／ペプチド多量体、ＨＬＡ−Ｃ／ペプチド多量体、ＨＬＡ−Ｅ／ペプチド多量体、ＭＩＣＡ／ペプチド多量体、及びＭＩＣＢ／ペプチド多量体からなる群より選択されるＨＬＡ／ペプチド多量体である。
【００７２】
一実施態様において、前記ペプチドは、
【表６】
2020055845.tif 000007
からなる群より選択される。
【００７３】
本発明の一実施態様では、前記抗原提示細胞は、処置されるべき患者から得られる。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）という用語は、本明細書において、「ペプチド提示細胞」とも呼ばれ、互換的に使用され、抗原を内部移行及び処理可能な免疫細胞のクラスを意味する。これにより、抗原決定基が、免疫系（例えば、ＭＨＣクラスＩ制限細胞傷害性Ｔリンパ球及び／又はＭＨＣクラスＩＩ制限ヘルパーＴリンパ球）により認識されることができる方法において、ＭＨＣ会合複合体として細胞表面上に提示される。細胞をＡＰＣとして機能させる２つの必須の特性は、細胞内に取り込まれた抗原を処理する能力及びＭＨＣ遺伝子産物の発現である。ＡＰＣの例は、樹状細胞（ＤＣ）、単核食細胞（例えば、マクロファージ）、Ｂリンパ球、皮膚のランゲルハンス細胞、及び、ヒトにおいては、内皮細胞を含む。
【００７５】
本発明の一実施態様では、前記ＡＰＣは、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）である。
【００７６】
本明細書で使用する場合、「形質細胞様樹状細胞」（ｐＤＣ）という用語は、血中を循環し、末梢のリンパ器官に見出される、生来の免疫細胞を意味する。ｐＤＣは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）グループに属する細胞グループを構成する。ヒトｐＤＣは、典型的には、表面マーカーであるＩＬ−３レセプターａ鎖（ＩＬ−３Ｒａ、ＣＤ１２３）、ＢＤＣＡ−２（ＣＤ３０３）、及びＢＤＣＡ−４（ＣＤ３０４）を発現しているが、ＣＤ１１ｃ又はＣＤ１４を発現していない。ｐＤＣは、これらにより従来の樹状細胞又は単球とは区別される。
【００７７】
本発明の一実施態様では、前記ｐＤＣは、成熟ｐＤＣである。成熟ｐＤＣは、典型的には、表面マーカーであるＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６を発現しており、多量のＩＦＮアルファ及びＩＦＮベータを産生する。
【００７８】
本発明のこのようなＡＰＣを調製するために、抗原提示能を有する細胞を、処置されるべき患者から単離し、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、本発明のペプチドによりパルスして、ＭＨＣ分子を有する複合体を形成する。
【００７９】
樹状細胞を使用する場合、本発明のＡＰＣを、以下のようにして調製することができる。リンパ球を、処置されるべき患者の末梢血から、フィコール法により単離する。付着細胞を、付着しなかった細胞から分離する。ついで、この付着細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で培養して、樹状細胞に誘導する。この樹状細胞を、本発明のペプチドと共に培養することによりパルスして、本発明のＡＰＣを得る。樹状細胞を、抗原が内部移行及びこの樹状細胞表面に提示可能な十分な時間、ペプチドに曝す必要がある。ついで、得られた樹状細胞を、処置されるべき患者に再投与することができる。このような方法は、国際公開公報第９３／２０８１８５号及び欧州特許第０５６３４８５号に記載されている。これらの文献は、参照により組み入れられる。
【００８０】
Ｔリンパ球及びその使用
本発明の別の態様は、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は本発明のその機能保存変異体を含むか、又は、からなる、１５又は１６個のアミノ酸長のペプチドを特異的に認識するＴリンパ球である。
【００８１】
一実施態様において、前記ペプチドは、
【表７】
2020055845.tif 000008
からなる群より選択される。
【００８２】
本発明の一実施態様では、前記Ｔリンパ球は、レギュラトリーＴリンパ球（Ｔｒｅｇ）である。本発明の別の実施態様では、前記Ｔリンパ球は、Ｔｒｅｇクローンである。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「レギュラトリーＴ細胞」又は「レギュラトリーＴリンパ球」という用語は、互換的に使用され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、レスポンダーＴ細胞の増殖を優先的にサプレッションし、過剰な免疫応答に関連する、又は、同免疫応用により生じる疾患及び症状、例えば、自己免疫疾患、移植拒絶、又は移植片対宿主病等を防止する能力を有するＴリンパ球の特定集団を意味する。Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞集団として元々特定されたが、フォークヘッドファミリー転写因子であるＦｏｘＰ３の発現によっても特徴付けられる。またごく最近、ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ細胞も、以前に記載されたように特定されている。
【００８４】
特定の実施態様では、前記Ｔｒｅｇは、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇである。
【００８５】
別の実施態様では、前記Ｔリンパ球は、本発明のペプチドを特異的に認識するＴＣＲを発現する、遺伝的に改変されたＴリンパ球である。
【００８６】
したがって、Ｔリンパ球は、偏って制限されたＴＣＲレパートリーを発現している。偏った（ＴＣＲ）は、当業者に周知である。ＴＣＲの偏りの例は、古典的な多型の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）制限免疫応答において観察され、説明されている（６４）。
【００８７】
レギュラトリーＴ細胞集団を得るための方法
別の態様では、本発明は、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は本発明のその機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有する単離されたペプチドを含む培養培地により、樹状細胞集団の存在下において、Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ法に関する。
【００８８】
一実施態様において、前記ペプチドは、アミノ酸配列：ＲＬＬＡＲＬＩＹＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶＴＥＬＧＲＰＳＡＥＹＲＮＫＱ（配列番号：２８）又はその機能保存変異体からなる。
【００８９】
一実施態様において、本発明は、本発明の単離されたペプチドを含む培養培地により、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）集団の存在下において、ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ法に関する。
【００９０】
一実施態様において、ｐＤＣは、成熟ｐＤＣである。
【００９１】
一実施態様において、前記単離されたペプチドは、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）（本明細書において、５１−１８とも呼ばれる）又はその機能保存変異体を含むか、又は、からなる、１５又は１６個のアミノ酸長の単離されたペプチドである。
【００９２】
特定の実施態様において、前記単離されたペプチドは、
【表８】
2020055845.tif 000009
からなる群より選択される。
【００９３】
本明細書で使用する場合、「培養培地」という用語は、Ｔ細胞の増殖及びレギュラトリーＴ細胞への分化を支持可能な任意の培地を意味する。典型的には、培養培地は、栄養（炭素源、アミノ酸）、ｐＨバッファー、及び塩を含有する基礎培地からなり、成長因子及び／又は抗生物質を添加することができる。典型的には、基礎培地は、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ、又はＡＩＭ−Ｖ培地であることができる。これらは全て、市販の標準的な培地である。
【００９４】
ナイーブなＴ細胞の増殖及びレギュラトリーＴ細胞への分化を支持するであろう好ましい培地配合は、合成培地（ＣＤＭ）を含む。本明細書で使用する場合、「合成培地」（ＣＤＭ）という用語は、特定成分、好ましくは、公知の化学構造の成分のみを含有する、細胞を培養するための栄養液を意味する。合成培地は、血清フリー及びフィーダーフリーの培地である。
【００９５】
ｐＤＣ集団の存在下において本発明のペプチドと共にＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ集団を培養する工程は、ｐＤＣによるＣＤ８＋  Ｔｒｅｇに対する前記ペプチドの提示に必要とされる時間行うものとする。
【００９６】
典型的には、ｐＤＣ集団の存在下において本発明のペプチドと共にＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ集団を培養するのは、１日〜１週間以上行うものとする。
【００９７】
特定の実施態様では、前記方法は、レギュラトリーＴ細胞集団を単離することにより、生成する更なる工程を含んでもよい。
【００９８】
あるいは、本発明は、上記で定義された本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体を含む培養培地により、Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ法に関する。
【００９９】
一実施態様において、本発明は、上記で定義された本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体を含む培養培地により、ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ法に関する。
【０１００】
一実施態様において、該多量体は、ナノ粒子上にコートされている。このため、このナノ粒子は、本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体をその表面に提示する。
【０１０１】
本発明の文脈内において、ナノ粒子は、小型で、Ｔｒｅｇにより認識されるのに十分小さいものである。好ましい実施態様では、ナノ粒子は、０．５〜１０nm、より好ましくは１〜２．５nmの平均径を有するコアを有する。
【０１０２】
ナノ粒子のコアは、ポリマー製のコアでもよい。好ましくは、ナノ粒子は、炭水化物系ポリマー（例えば、セルロース系ナノ粒子、キトサン系ナノ粒子）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、及びＰＥＧとＰＰＧとのコポリマー、ＰＥＧとカプロラクトン、ＰＥＧとラクチド、及びＰＥＧと［ラクチド−コ−グリコリド］を含有する分岐コポリマーからなる群より選択されるポリマーを含む。
【０１０３】
また、ナノ粒子のコアは、金属製のコアでもよい。好ましくは、金属製のコアは、Ａｕ、Ａｇ、又はＣｕ、例えば、Ａｕ／Ａｇ、Ａｕ／Ｃｕ、Ａｕ／Ａｇ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｐｔ、Ａｕ／Ｐｄ、Ａｕ／Ａｇ／Ｃｕ／Ｐｄ、Ａｕ／Ｆｅ、Ａｕ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｇｄ、Ａｕ／Ｆｅ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｆｅ／Ｇｄ、又はＡｕ／Ｆｅ／Ｃｕ／Ｇｄから選択される合金を含む。
【０１０４】
好ましくは、ナノ粒子は、大部分の有機溶媒、及び特に、水に可溶性である。ナノ粒子は、当技術分野において周知の技術に基づいて調製することができる。
【０１０５】
一実施態様において、本発明は、上記で定義された本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体でコートしたナノ粒子を含む培養培地により、ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ法に関する。
【０１０６】
別の態様では、本発明は、先に記載された方法のいずれか１つにより得られたＴｒｅｇ集団、特に、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ集団に関する。
【０１０７】
医薬組成物
本発明の別の態様は、
ａ）アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）もしくはその機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有する単離されたペプチド、又は
ｂ）本発明のペプチドをコードする核酸、又は
ｃ）このような核酸を含むベクター、又は
ｄ）このような発現ベクターを含むホスト細胞、又は
ｅ）複合体ＭＨＣ分子及び本発明のペプチド、又は
ｆ）複合体ＭＨＣ分子及び本発明のペプチドを含む抗原提示細胞、又は
ｇ）本発明のペプチドを特異的に認識するＴリンパ球と、
薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物に関する。
【０１０８】
特定の実施態様では、前記ペプチドは、アミノ酸配列：ＲＬＬＡＲＬＩＹＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶＴＥＬＧＲＰＳＡＥＹＲＮＫＱ（配列番号：２８）又はその機能保存変異体からなる。
【０１０９】
一実施態様において、前記医薬組成物は、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又はその機能保存変異体を含むか、又は、からなる、１５又は１６個のアミノ酸長の単離されたペプチドを含む。
【０１１０】
特定の実施態様では、前記医薬組成物は、
【表９】
2020055845.tif 000010
からなる群より選択される単離されたペプチドを含む。
【０１１１】
上記された本発明のいずれかの治療剤は、薬学的許容し得る賦形剤、及び場合により、持続放出性マトリックス、例えば、生分解性ポリマーと組み合わせられて、治療組成物を形成することができる。
【０１１２】
「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」は、哺乳類、特に、ヒトに適切に投与された場合、有害で、アレルギー性又は他の不都合な反応を生じさせない分子実体及び組成を意味する。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤は、任意の種類の、無毒性の固体、半固体、又は液体状の充填材、希釈剤、封入材料、又は配合助剤を意味する。
【０１１３】
医薬組成物の形態、投与経路、用量、及び投与計画は、患者の処置されるべき症状、疾患の重篤さ、年齢、体重、及び性別等により自ずと決まる。
【０１１４】
本発明の医薬組成物は、局所、経口、鼻内、眼内、静脈内、筋肉内、又は皮下投与用に配合することができる。好ましくは、医薬組成物は、注射可能な配合のための薬学的に許容し得る媒体を含有する。これらは、特に、等張性で無菌の生理食塩水（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム、もしくはマグネシウム等、又はこのような塩の混合物）又は、乾燥、特に、凍結乾燥させた組成物でもよい。凍結乾燥組成物の場合には、注射液構成を可能にする滅菌水又は生理食塩水を加えてもよい。
【０１１５】
投与に使用される用量は、種々のパラメータの関数として、特に、使用される投与方式、関連する病理、あるいは、所望の処置期間の関数として採用することができる。例えば、化合物の用量を、所望の治療効果を達成するのに必要とされる用量より低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで、用量を徐々に増大させることは、十分当業者の範囲内である。ただし、製品の日量は、成人１日当たりに、０．０１〜１，０００mgの広い範囲にわたって変動させることができる。好ましくは、本組成物は、処置されるべき対象に対する用量の症候調節のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０、及び５００mg 活性成分を含有する。医薬は、典型的には、約０．０１mg〜約５００mg 活性成分、好ましくは、１mg〜約１００mg 活性成分を含有する。有効量の薬剤は、通常、１日当たり体重１kg当たりに、０．０００２mg〜約２０mg、特に１日当たり体重１kg当たりに、約０．００１mg〜７mgの用量レベルで供給される。
【０１１６】
医薬組成物を調製するために、有効量の本発明のポリペプチド又は核酸を、薬学的に許容し得る担体又は水性媒体中に、溶解又は分散させることができる。
【０１１７】
注射用途に適した薬学的形態は、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性ポリエチレングリコールを含む製剤；及び、無菌注射液又は分散液の即席調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、これらの形態は、無菌でなければならず、容易に注射針を通過する程度に流動性を有しなければならない。これらの形態は、製造及び保管の条件下において安定でなければならず、微生物、例えば、細菌及び真菌の汚染活動に対して保存されなければならない。
【０１１８】
遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩としての活性化合物の溶液を、界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと安定的に混合された水中において調製することができる。また、分散液は、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、それらの混合物中、及び油中においても調製することができる。保存及び使用の通常の条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を防止する保存剤を含有する。
【０１１９】
本発明のペプチド及び本発明の他の治療剤は、中性又は塩の形態で組成物に配合することができる。薬学的に許容し得る塩は、（タンパク質の遊離アミノ基により形成された）酸付加塩を含む。酸付加塩は、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸等、又は、有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等と形成される。また、遊離カルボキシル基により形成された塩は、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは鉄、及び、有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等から得ることができる。
【０１２０】
また、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、及び植物油を含有する、溶媒又は分散媒体でもよい。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散液の場合には、必要とされる粒径の維持により、及び、界面活性剤の使用により維持することができる。微生物活動の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によりもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むのが好ましいであろう。注射組成物の持続性吸収は、吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に使用することによりもたらすことができる。
【０１２１】
無菌注射液は、必要とされる量で活性化合物を、上記列記された他の成分の幾つかと共に適切な溶媒中に包含させ、必要に応じて、ろ過滅菌することにより調製される。一般的には、分散液は、種々の無菌の活性成分を、基礎分散媒体及び上記列記された成分から必要とされる他の成分を含有する無菌の媒体中に包含させることにより調製される。無菌の注射液調製用の無菌粉末の場合には、好ましい調製法は、その予め無菌ろ過された溶液から、任意の更なる所望の成分を含む活性成分の粉末を産生する、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
【０１２２】
また、直接注入のためのより濃縮され、又は、高度に濃縮された溶液の調製も考慮される。この場合、極度に速い浸透、小さい領域への高濃度の活性剤の送達をもたらすために、溶媒としてのＤＭＳＯの使用が想定される。
【０１２３】
配合に基づいて、溶液は、投与製剤に適合する方法において、治療的に有効な量で投与されるであろう。この配合は、各種の剤型、例えば、上記された注射液の剤型で容易に投与される。ただし、薬剤放出カプセル剤等も利用することができる。
【０１２４】
水溶液における非経口投与のために、例えば、この溶液を、適切に緩衝させてもよく、まず、液状の希釈剤を、十分な生理食塩水又はグルコースで等張性にする。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に特に適している。この点について、利用することができる無菌水性媒体は、本開示を考慮して、当業者に公知であろう。例えば、１回分の投与量を、等張性ＮａＣｌ溶液 １mLに溶解させ、皮下点滴流体 １０００mLに加えるか、又は、目的の注入部位に注入するかのいずれかをすることができる（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照のこと）。用量におけるいくらかの変動が、処置される対象の症状に応じて、必然的に生じるであろう。いずれにしても、投与を担う者が、個々の対象に適切な用量を決定するであろう。
【０１２５】
非経口投与、例えば、静脈内又は筋肉内注射用に配合された化合物に加えて、他の薬学的に許容し得る形態は、例えば、錠剤又は経口投与用の他の固体、徐放性カプセル剤、及び現在使用されている任意の他の形態を含む。
【０１２６】
治療法及び用途
本発明は、免疫寛容の誘導を必要とする患者において免疫寛容を誘導するのに使用するための、方法及び組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
【０１２７】
また、本発明は、移植拒絶の予防又は減少を必要とする患者において移植拒絶を予防又は減少させるのに使用するための、方法及び組成物を提供する。
【０１２８】
したがって、本発明は、薬剤として使用するための、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）（本明細書において、５１−１８とも呼ばれる）又は上記で定義されたその機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有する単離されたペプチドに関する。
【０１２９】
一実施態様において、前記ペプチドは、アミノ酸配列：ＲＬＬＡＲＬＩＹＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶＴＥＬＧＲＰＳＡＥＹＲＮＫＱ（配列番号：２８）又はその機能保存変異体からなる。
【０１３０】
一実施態様において、前記ペプチドは、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又はその機能保存変異体を含むか、又は、からなる、１５又は１６個のアミノ酸長の単離されたペプチドである。
【０１３１】
別の態様では、本発明は、免疫寛容の誘導を必要とする患者において免疫寛容を誘導するのに使用するための、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）（本明細書において、５１−１８とも呼ばれる）又は上記で定義されたその機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有する単離されたペプチドに関する。
【０１３２】
一実施態様において、前記ペプチドは、アミノ酸配列：ＲＬＬＡＲＬＩＹＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶＴＥＬＧＲＰＳＡＥＹＲＮＫＱ（配列番号：２８）又はその機能保存変異体からなる。
【０１３３】
一実施態様において、前記ペプチドは、免疫寛容の誘導を必要とする患者において免疫寛容を誘導するのに使用するための、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は機能保存変異体を含むか、又は、からなる、１５又は１６個のアミノ酸長の単離されたペプチドである。
【０１３４】
本明細書で使用する場合、「免疫寛容」という用語は、免疫応答を誘導する能力を有する物質又は組織に対する、免疫系の無応答状態を意味する。本発明のペプチドは、前記移植物の移植に基づく移植物に対する寛容又は部分的な寛容を達成するのに有用である。本明細書で使用する場合、「部分的な寛容」は、免疫応答の低下をもたらす部分的な免疫寛容である。
【０１３５】
本明細書で使用する場合、「免疫応答」という用語は、Ｔ細胞媒介性及び／又はＢ細胞媒介性の免疫応答を含む。例示的な免疫応答は、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生及び細胞性細胞傷害を含む。加えて、免疫応答という用語は、Ｔ細胞活性化により間接的に達成される免疫応答、例えば、抗体産生（体液性応答）及びサイトカイン応答性細胞、例えば、マクロファージの活性化を含む。免疫応答に関与する免疫細胞は、リンパ球、例えば、Ｂ細胞及びＴ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔｈ１、及びＴｈ２細胞）；抗原提示細胞（例えば、プロフェッショナル抗原提示細胞、例えば、樹状細胞）；ナチュラルキラー細胞；骨髄系細胞、例えば、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球を含む。
【０１３６】
例えば、免疫応答は、移植拒絶及び、このような免疫反応に伴う生理学的結果、例えば、間質性線維症、慢性移植片動脈硬化症、又は血管炎等に関与する。
【０１３７】
したがって、本発明のペプチド（及び、本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体、又は、本明細書で定義されたペプチド特異的Ｔｒｅｇ）により処置された患者は、処置されていない患者と比較して、下記の生理学的特徴：ａ）（少なくとも部分的にＢ細胞媒介性免疫応答、特に、ドナー特異的抗体により媒介されると考えられる）移植物に対する免疫応答レベルの低下、ｂ）移植物に対する免疫応答の開始もしくは進行の遅延、又は、ｃ）移植物に対する免疫応答の開始もしくは進行リスクの低下を表わす。
【０１３８】
「それを必要とする患者」は、処置されるべき移植拒絶を患う、又は、同移植拒絶を患う可能性がある個体を意味する。本発明の枠組みにおいて処置されるべき個体は、哺乳類、好ましくは、ヒトである。
【０１３９】
更に別の態様では、本発明は、移植拒絶の予防又は減少を必要とする患者において移植拒絶を予防又は減少させるのに使用するための、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）（本明細書において、５１−１８とも呼ばれる）又は上記で定義されたその機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有する単離されたペプチドに関する。
【０１４０】
一実施態様において、前記ペプチドは、アミノ酸配列：ＲＬＬＡＲＬＩＹＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶＴＥＬＧＲＰＳＡＥＹＲＮＫＱ（配列番号：２８）又はその機能保存変異体からなる。
【０１４１】
一実施態様において、前記ペプチドは、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は機能保存変異体を含むか、又は、からなる、１５又は１６個のアミノ酸長の単離されたペプチドである。
【０１４２】
本明細書で使用する場合、「移植拒絶を予防又は減少させる」という用語は、免疫移植拒絶の予防又は防止、及び、免疫移植拒絶の開始又は進行の遅延を包含するのを意味する。また、この用語は、患者における移植物生存の延長、又は、患者における移植物の機能不全の逆行を包含するのも意味する。さらに、この用語は、例えば、免疫拒絶に関連する免疫学的合併症、例えば、間質性線維症、慢性移植片動脈硬化、又は血管炎等の緩和を含む、免疫移植拒絶兆候の緩和を包含するのも意味する。
【０１４３】
本明細書で使用する場合、「移植拒絶」という用語は、急性及び慢性の移植拒絶を両方とも包含する。「急性拒絶」は、移植された組織が免疫学的に外来性である場合の、組織移植レシピエントの免疫系による拒絶である。急性拒絶は、レシピエントの免疫細胞による移植組織の浸潤により特徴付けられる。同免疫細胞は、そのエフェクター機能を実行し、移植組織を破壊する。急性拒絶の開始は急速であり、一般的には、ヒトにおいて移植手術後数週間以内に生じる。一般的には、急性拒絶は、免疫抑制剤、例えば、ラパマイシン、シクロスポリン等により阻害又はサプレッションすることができる。「慢性拒絶」は、一般的には、ヒトにおいて、急性拒絶の成功した免疫抑制の存在下であっても、移植後数か月〜数年以内に生じる。線維症は、全種類の臓器移植の慢性拒絶に共通する要因である。
【０１４４】
「移植」という用語及びそのバリエーションは、移植が同系（ドナーとレシピエントとが遺伝的に同一である場合）、同種（ドナーとレシピエントとが異なる遺伝的起源であるが、同じ種である場合）、又は異種（ドナーとレシピエントとが異なる種である場合）であるかに関わらず、移植物（移植片とも呼ばれる）のレシピエントへの挿入を意味する。このため、典型的なシナリオにおいて、ホストはヒトであり、移植片は、同じか又は異なる遺伝的起源のヒトから得られた同系移植片である。別のシナリオでは、移植片は、移植される種とは異なる種（系統学的に大きく離れた種の動物を含む）から得られる。例えば、ヒヒの心臓は、ヒトのホストに移植される。
【０１４５】
一実施態様において、移植物のドナーは、ヒトである。移植物のドナーは、生きているドナー又は死亡したドナー、いわゆる、死体ドナーであることができる。
【０１４６】
一実施態様において、移植物は、臓器、組織、又は細胞である。
【０１４７】
本明細書で使用する場合、「臓器」という用語は、生物における特定の機能又は機能群を行う固体血管柄付臓器を意味する。臓器という用語は、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、皮膚、子宮、骨、軟骨、小腸又は大腸、膀胱、脳、乳房、血管、食道、卵管、胆嚢、卵巣、膵臓、前立腺、胎盤、脊髄、上肢及び下肢を含む肢、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿管、尿道、子宮を含むが、これらに限定されるわけではない。本明細書で使用する場合、「組織」という用語は、ヒト又は動物における任意の種類の組織を意味し、血管組織、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、神経組織、泌尿生殖器組織、消化管組織、骨及び軟骨を含む骨格組織、脂肪組織、腱及び靭帯を含む結合組織、羊水組織、絨毛組織、硬膜、心膜、筋肉組織、腺組織、顔組織、眼組織を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１４８】
本発明の特定の実施態様では、移植物は、心臓の移植臓器である。
【０１４９】
本明細書で使用する場合、「細胞」という用語は、対象となる細胞について濃縮された組成物、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６５％の前記細胞を含む組成物を意味する。
【０１５０】
特定の実施態様では、細胞は、骨髄、末梢血、又は臍帯血由来の多分化性造血幹細胞、又は、多能性（すなわち、胚性幹細胞（ＥＳ）又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ））、又は、種々の細胞系統の多能性幹細胞由来の分化細胞、例えば、心筋細胞、ベータ−膵細胞、肝細胞、ニューロン等．．．からなる群より選択される。
【０１５１】
一実施態様において、細胞組成物は、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に使用されるため、通常、骨髄、末梢血、又は臍帯血由来の多分化性造血幹細胞を含む。
【０１５２】
ＨＳＣＴは、白血病及びリンパ腫を患う患者に治癒的であることができる。ただし、同種ＨＳＣＴの重大な制限は、この治療を受けた約３０〜５０％のヒトに重篤な症状で起こる移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の進行である。
【０１５３】
本発明のペプチドは、免疫寛容を誘導することにより、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を予防又は減少させるのに有用である。
【０１５４】
したがって、一実施態様において、それを必要とする患者は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄形成異常症候群（ＭＤＳ）／骨髄増殖症候群、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、及び多発性骨髄腫からなる群より選択される疾患に冒されている。
【０１５５】
別の態様では、本発明は、免疫寛容の誘導を必要とする患者において免疫寛容を誘導するのに使用するための、
ａ）本発明のペプチドをコードする核酸、又は
ｂ）このような核酸を含むベクター、又は
ｃ）このような発現ベクターを含むホスト細胞、又は
ｄ）本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体、又は
ｅ）複合体ＭＨＣ分子及び本発明のペプチドを含む抗原提示細胞、又は
ｆ）本発明のペプチドを特異的に認識するＴリンパ球に関する。
【０１５６】
更に別の態様では、本発明は、移植拒絶の予防又は減少を必要とする患者において移植拒絶を予防又は減少させるのに使用するための、
ａ）本発明のペプチドをコードする核酸、又は
ｂ）このような核酸を含むベクター、又は
ｃ）このような発現ベクターを含むホスト細胞、又は
ｄ）本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体、又は
ｅ）複合体ＭＨＣ分子及び本発明のペプチドを含む抗原提示細胞、又は
ｆ）本発明のペプチドを特異的に認識するＴリンパ球に関する。
【０１５７】
本発明の別の態様は、免疫寛容の誘導を必要とする患者において免疫寛容を誘導するための方法であって、予防的に有効な量の、上記された本発明の単離されたペプチド、又は、本発明の核酸、又は、本発明の発現ベクター、又は、本発明のホスト細胞、又は、本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体、又は、本発明のペプチドを特異的に認識するＴリンパ球を、前記患者に投与する工程を含む、方法に関する。
【０１５８】
本発明の別の態様は、移植拒絶の予防又は減少を必要とする患者において移植拒絶を予防又は減少させるための方法であって、予防的に有効な量の、上記された本発明の単離されたペプチド、又は、本発明の核酸、又は、本発明の発現ベクター、又は、本発明のホスト細胞、本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体、又は、本発明のペプチドを特異的に認識するＴリンパ球を、前記患者に投与する工程を含む、方法に関する。
【０１５９】
本明細書で使用する場合、「予防的に有効な量」という用語は、患者における移植拒絶を予防、減少、緩和、又は遅延させるのに必要な活性剤の最少量を意図している。
【０１６０】
本発明の診断方法
更なる態様では、本発明は、移植患者（レシピエント）が寛容であるかを判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、前記移植患者から得られた生体サンプル中のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇの存在を判定する工程を含み、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇの存在が寛容を示す、方法に関する。
【０１６１】
本明細書で使用する場合、「判定する」という用語は、対照又は所定値に対する参照の有無に関わらず、定性的及び／又は定量的検出（すなわち、検出及び／又は量の測定）を含む。本明細書で使用する場合、「検出する」は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇが生体サンプル中に存在するか否かを判定することを意味する。「測定する」は、生体サンプル中のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇの量を決定することを意味する。
【０１６２】
本明細書で使用する場合、「生体サンプル」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの評価の目的のために、患者から得ることができる任意のサンプルを意味する。好ましい生体サンプルは、血液サンプル（例えば、全血サンプル、血清サンプル、又は血漿サンプル）である。
【０１６３】
例えば、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇの存在の判定は、生体サンプルを、選択試薬、例えば、抗体と接触させることにより、前記生体サンプル中の対象となる細胞の元からの存在を検出し、又は、同細胞量を測定する工程を含んでもよい。接触は、任意の適切な装置、例えば、プレート、マイクロタイターディッシュ、試験管、ウェル、ガラス、カラム等において行うことができる。
【０１６４】
したがって、本発明の方法は、生体サンプルを、前記生体サンプル中のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇと選択的に相互作用可能な結合パートナーと接触させる工程を含む。
【０１６５】
本発明の一実施態様では、結合パートナーは、上記された本発明のペプチドを含むＭＨＣ／ペプチド多量体である。
【０１６６】
好ましい実施態様では、ＭＨＣ／ペプチド多量体は、
【表１０】
2020055845.tif 000011
からなる群より選択されるペプチドを含むＭＨＣ／ペプチド四量体である。
【０１６７】
一実施態様において、患者は、哺乳類、好ましくは、ヒトである。
【０１６８】
本発明は、以下の図面及び実施例により、更に例証されるであろう。ただし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定すると全く解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】ドナー由来ペプチド刺激に対する応答におけるＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ活性化の分析。（Ａ）ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇを、ペプチドの存在下において、同系ＣｐＧ−成熟ｐＤＣと６日間共培養した。各実験について、ｐＤＣとのみ６日間共培養した後のＣＤ２５陽性Ｔｒｅｇの割合を、値１とした。平均値１は、３２．８５±１．９８％に等しい。結果を、ペプチド刺激後のＣＤ２５陽性細胞の割合と、ペプチドなしの対照条件でのＣＤ２５陽性細胞の割合との間の比±ＳＥＭとして表わす。対照条件（値１．０）に対する＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１。各ペプチドについて、ｎ＝４〜１８。（Ｂ）Ｄｕ５１のより短いペプチド誘導体に対する応答におけるＴｒｅｇ活性化の分析。左側に、１８個のＤｕ−５１誘導体が詳細に記載されており、ａａ配列の長さにより、９ａａ〜１５ａａで分類されている。ボックスは、ドナーとレシピエント間でのミスマッチａａを強調している。右側に、Ｄｕ５１誘導体に対する応答におけるＴｒｅｇ活性化を、ＣＤ２５発現により分析した。ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇを、各ペプチドの存在下において、同系ＣｐＧ−成熟ｐＤＣと６日間共培養した。バーは、ペプチド刺激後のＣＤ２５陽性細胞の割合と、ペプチドなしの対照条件でのＣＤ２５陽性細胞の割合との間の比を表わす。Ｄｕ５１条件に対する＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１。各ペプチドについて、ｎ＝３〜１４。
【図２】Ｄｕ５１特異的ＣＤ４０ＩｇＣＤ８＋  Ｔｒｅｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのサプレッシブ活性。（Ａ）ドナーＬＥＷ．１Ｗ（直接的な経路）又はアロ抗原ロードレシピエントＬＥＷ．１Ａ（間接的な経路）のｐＤＣのいずれかにより刺激した、ナイーブなＣＦＳＥラベルＬＥＷ．１Ａ  ＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞の増殖を、１：１のエフェクター：サプレッサー比において、ＬＥＷ．１Ａのナイーブ、トータル、四量体−、又は四量体＋  ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇの非存在又は存在下で、培養の６日後に分析した。ＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞増殖は、約８０％であり、各実験において１００の値を与えた。グラフは、相対的なＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞増殖の平均±ＳＥＭを表わす。＊ｐ＜０．０５。ｎ＝４。（Ｂ）２．５×１０６個のトータル又は四量体−  ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇを、致死量以下で照射したレシピエント（ＬＥＷ．１Ａ）に、心臓のアロ移植（ＬＥＷ．１Ｗ）前日に、ｉ．ｖ注入した。移植片生存を、心拍の腹部触診により評価した。四量体−  ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇ（ｎ＝３）に対して、トータル（ｎ＝４）について、ｐ＜０．０１。
【図３】ｉｎ  ｖｉｖｏでのペプチドＤｕ５１注入後の寛容誘導。（Ａ）レシピエントを、処置しない（ｎ＝９）、移植前−６、−３日目、０日、移植後＋３、及び＋７日における０．５mg ペプチドの５回の単独ｉ．ｖ注入で処置（ｎ＝４）、又は、ｉ．ｐ  ミニ浸透圧ポンプ（ALZET）により、２０．８３μg/時間 単独（Ｄｕ５１  ０．５mg/日：ｎ＝８）において、もしくは、枯渇性抗−ＣＤ８  ｍＡｂ（ＯＸ８）（ｎ＝６）もしくは抗−ＭＨＣクラスＩ  ｍＡｂ（ＯＸ１８）（ｎ＝５）との組み合わせ、又は、４０．６６μg/時間 ＬＥＷ．１Ｗ／ＬＥＷ．１Ａ（Ｄｕ５１  １mg/日：ｎ＝５）もしくはＢＮ／ＬＥＷ．１Ａ（Ｄｕ５１  １mg/日（ＢＮ／１Ａ）：ｎ＝４）株の組み合わせのいずれかを−７日目から２８日間送達する連続的なペプチド注入で処置するかのいずれかをした。未処置動物及び対照ペプチド  ０．５mg/日に対して、Ｄｕ５１  ０．５mg/日について、＊＊ｐ＜０．０１。Ｄｕ５１  ０．５mg/日に対して、Ｄｕ５１  ０．５mg/日＋枯渇性抗−ＣＤ８  ｍＡｂについて、＊ｐ＜０．０５。未処置動物に対して、Ｄｕ５１  １mg/日について、＊＊＊ｐ＜０．００１。ＢＮ／１Ａの組み合わせにおけるＤｕ５１  １mg/日に対して、Ｄｕ５１  １mg/日について、＊＊ｐ＜０．０１。Ｄｕ５１  ０．５mg/日に対して、Ｄｕ５１  １mg/日について、＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）アロ抗体産生を、ナイーブ（ｎ＝３）、同系移植（ｎ＝３）、移植未処置（ｎ＝３）、ＣＤ４０Ｉｇ処置（ｎ＝３）、長期Ｄｕ５１処置（ｎ＝２）、及び拒絶Ｄｕ５１処置（ｎ＝４）の動物において評価した。血清を、拒絶後３０日未満又は移植後１２０日超で収集した。血清を、ドナーの脾細胞とインキュベートし、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、又はＩｇＧ２ｂ  Ａｂ産生について、フローサイトメトリーにより分析した。グラフは、ＭＦＩ±ＳＥＭを表わす。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。（Ｃ）脾臓を、拒絶後又は１２０日目に回収した。細胞集団を染色し、フローサイトメトリーにより分析した。グラフは、いずれか（ｎ＝１２）、長期Ｄｕ５１処置（ｎ＝２）、又は拒絶Ｄｕ５１処置レシピエント（ｎ＝５）からのトータル脾臓における各部分集団の絶対数を表わす。（Ｄ）ナイーブ（ｎ＝４）、長期Ｄｕ５１処置（ｎ＝２）、又は拒絶Ｄｕ５１処置（ｎ＝４）レシピエントの脾臓を、ＰＥ及びＡＰＣにコンジュゲートさせたストレプトアビジンでラベルしたＲＴ１．Ａａ／Ｄｕ５１四量体とインキュベートした。結果を、ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ中の四量体＋  細胞の割合及び脾臓中の四量体＋  ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇの絶対数±ＳＥＭについて、グラフにプロットする。
【図４】Ｄｕ５１ペプチドの単剤治療による寛容の脾細胞媒介性伝達。Ａ．ＬＥＷ．１Ａレシピエントを、−１日目に致死量以下で照射し（４．５Gy）、心臓移植及び、０日目に長期生存レシピエント又はナイーブな動物からの１，５．１０８個の脾細胞のｉ．ｖ．注入を受けさせた。移植片生存を、腹部触診によりモニターした。Ｂ．ＩｇＧアロ抗体産生を、ナイーブ（ｎ  ３）、移植片を拒絶した未処置レシピエント（ｎ＝３）、及び移植後１２０日超の１回目のｓｐｌ−送達長期レシピエントにおいて評価した。
【実施例】
【０１７０】
実施例：ＭＨＣＩＩ＋アロペプチドが誘導する寛容
材料及び方法
動物及び心臓移植モデル
心臓のアロ移植を、以前に説明されたように（５）、全体としてＭＨＣ不一致の、ＬＥＷ．１Ｗ（ドナーとしてのＲＴ１．Ａｕ）及びＬＥＷ．１Ａ（レシピエントとしてのＲＴ１．Ａａ）のメスラット間で行った。実験は、動物実験についての地方倫理委員会により承認された。
【０１７１】
アデノウイルス媒介性遺伝子伝達
ヒトＩｇＧ１の定常ドメインに融合したマウスＣＤ４０の細胞外部分をコードするＡｄ（ＡｄＣＤ４０Ｉｇ）及びリコンビナント非コードアデノウイルス（Ａｄ）Ａｄｄｌ３２４と、移植組織内送達の手法とは、以前に記載されている（５）。簡潔に、アデノウイルス粒子（２．１０１０個の感染性粒子）を、心室壁内の３点にゆっくり注入した。
【０１７２】
ペプチドライブラリ
４ａａのラギングを有する１６mer オーバーラップペプチドライブラリを、以前に公開されたように（１７〜１９）、ＭＨＣ−Ｉ  ＲＴ１．Ａｕ（アルファ１、２、及び３ドメイン）、ＭＨＣ−ＩＩ  ＲＴ１．Ｂｕ（全ドメイン）、及びＭＨＣ−ＩＩ  ＲＴ１．Ｄｕ（アルファ２及びベータ１ドメイン）の多型配列全体をカバーするように設計し、GL Biochem Ltd（Shangai, China）により調製した。凍結乾燥させたペプチドを、０．４％ 無菌ＤＭＳＯ／滅菌水中に溶解させ、−８０℃で保存した。対照ペプチドとして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、種々の同種非活性化ペプチド＃７、２６、及び３９を使用し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ペプチド＃３１を使用した。
【０１７３】
１〜２ａａのラギングを有する変性させた９〜１５mer オーバーラップペプチドを、ポジティブに単離された１６mer ペプチドの配列をカバーするように設計し、GL Biochem Ltd（Shangai, China）により合成した。
【０１７４】
全てのペプチドは、分析用逆相ＨＰＬＣにより、９５％を超える均一性を有することを示し、ａａ配列を確認した。ペプチドを、完全ＲＭＰＩ−１６４０中に、１２０μg/mLの濃度に希釈した。
【０１７５】
細胞精製
Ｔ細胞を、以前に記載されたように（６）精製した。簡潔に、トータル脾細胞を、抗−γδ  Ｔ細胞（Ｖ６５）、抗−ＣＤ４５ＲＡ細胞（ＯＸ３３）、抗−ＣＤ１６１  ＮＫ細胞（３．２．３）、及び抗−ＣＤ１１ｂ／ｃ単球（ＯＸ４２）のカクテルにより、磁性ビーズ（Dynal）を使用して枯渇させた。濃縮されたＴ細胞を、抗−ＣＤ４５ＲＣ−ビオチン（ＯＸ２２）及びストレプトアビジン−ＰＥ−Ｃｙ７、抗−ＣＤ８α−ＰＥ（ＯＸ８）、抗−ＴＣＲαβ−Ａｌｅｘａ  ６４７（Ｒ７３）、ならびに抗−ＣＤ２５−ＦＩＴＣ（ＯＸ３９）  ｍＡｂｓによりラベルした。ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞を、FACSAria（BD Biosciences, Mountain View, CA）によるＴＣＲαβ＋細胞のゲーティング後に分取した。分取した集団の純度は、９９％超であった。
【０１７６】
形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を、以前に記載されたように（６）精製した。簡潔に、コラゲナーゼ消化後に回収した脾細胞を、抗−ＴＣＲ（Ｒ７３及びＶ６５）Ｔ細胞及び抗−ＣＤ４５ＲＡ（ＯＸ３３）Ｂ細胞  ｍＡｂによるネガティブな枯渇により、更に精製した。濃縮された細胞を、抗−ＣＤ４５Ｒ−ＰＥ（Ｈｉｓ２４）、抗−ＣＤ４−ＡＰＣ（ＯＸ３５）、抗−ＴＣＲ−ＦＩＴＣ（Ｒ７３）、及び抗−ＣＤ４５ＲＡ−ＦＩＴＣ（ＯＸ３３）によりラベルした。ＣＤ４５Ｒ及びＣＤ４陽性細胞として規定されたｐＤＣを、ＦＩＴＣ陰性細胞についてゲーティングした後に分取した。
【０１７７】
混合型リンパ球反応
ＭＬＲ共培養アッセイ法のために、ＬＥＷ．１ＡナイーブラットからのｐＤＣ（１．２５×１０４個）、同系ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇ（５×１０４個）、及び１２０μg/mL 同種ペプチドを、丸底９６ウェルプレート中の完全ＲＰＭＩ−１６４０培地 ２００μL中に、トリプリケートで、３７℃、５％ ＣＯ２で６日間蒔いた。ｐＤＣを、０．５μM ＣｐＧ  ＯＤＮ  １８２６で成熟させた。
【０１７８】
直接的なＭＬＲサプレッシブアッセイ法のために、ＬＥＷ．１Ａ起源の分取したＣＦＳＥラベルＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞（５×１０４個）及びドナーＬＥＷ．１Ｗ動物から単離された同種ｐＤＣ（１．２５×１０４個）を、ＦＡＣＳ分取し、新鮮に精製したナイーブなＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ細胞、ペプチドエクスパンションしたＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇ細胞（５×１０４個）、Ｄｕ５１四量体＋又は−ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇを含む、丸底９６ウェルプレート中の完全ＲＰＭＩ−１６４０培地 ２００μL（最終容量）中に、トリプリケートで６日間蒔いた。間接的なＭＬＲサプレッシブアッセイ法のために、ドナーＬＥＷ．１Ｗ動物から単離した脾細胞を凍結融解して、アポトーシスを誘発させた。ついで、アポトーシス細胞を、レシピエントＬＥＷ．１Ａ動物から単離したｐＤＣと、０．６５×１０６個/mL ｐＤＣで一晩培養した（比８：１）。最後に、アロ抗原ロードｐＤＣを洗浄し、直接的なＭＬＲについて先に記載されたように蒔いた。
【０１７９】
抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８刺激のために、丸底９６ウェルプレートを、抗−ＣＤ３（１μg/mL、BD Pharmingen）及び抗−ＣＤ２８（１０μg/mL）ｍＡｂにより、３７℃、５％ ＣＯ２で１時間コートし、ついで、洗浄し、５．１０４個 ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇ細胞を、完全ＲＰＭＩ−１６４０ ２００μL中において各ウェルに、１、２、３、及び６日間加えた。
【０１８０】
ＣＦＳＥラベルしたナイーブなＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞の増殖及びＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇの表現型を、生きた細胞（ＤＡＰＩ陰性）の中から、ＴＣＲ＋ＣＤ４＋細胞又はＴＣＲ＋ＣＤ８＋細胞についてゲーティングした後、FACSCanto IIサイトメーター（BD Biosciences, Mountain View, CA）におけるフローサイトメトリーにより分析した。
【０１８１】
細胞外及び細胞内染色
細胞外染色のために、細胞を、下記ｍＡｂ：抗−ＴＣＲαβ（Ｒ７３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７−コンジュート）、抗−ＣＤ８α（ＯＸ８、ＰＥ−Ｃｙ７−コンジュート、ebiosciences）、抗−ＣＤ４（Ｗ３．２５、ＰＥ−Ｃｙ７−コンジュート）、抗−ＣＤ４５ＲＣ（ＯＸ２２、ＦＩＴＣ−コンジュート）、抗−ＣＤ２８（ＪＪ３１９、ビオチンラベル）、抗−ＣＤ７１（ＯＸ２６、ビオチンラベル）、抗−マウスＶｂ１１（ＫＴ１１、ビオチンラベル、AbD Serotec）、抗−ＣＤ２５（ＯＸ３９、ビオチンラベル）、及び抗−ＭＨＣ−ＩＩ（ＯＸ６、ビオチンラベル）で染色した。
【０１８２】
細胞内染色のために、ついで、細胞を、Ｆｏｘｐ３（ビオチンラベル、ebiosciences）で、BD cytofix/cytopermキット（BD Biosciences）を使用し、製造メーカーの説明書に従って染色した。
【０１８３】
全てのビオチン化ｍＡｂを、ストレプトアビジン−PerCP.Cy5.5（BD Biosciences）を使用して可視化した。FACSCanto IIサイトフルオロメーター（BD Biosciences, Mountain View, CA）を使用して、蛍光を測定した。データを、FlowJoソフトウェア（Tree Star, Inc. USA、バージョン７．６．５）を使用して分析した。まず、細胞を、その形態によりゲーティングした。死んだ細胞を、ＤＡＰＩ陰性の生きた細胞を選択することにより除外した。
【０１８４】
サイトカインアッセイ法
ＩＦＮγ、ＩＬ−１０を、共培養上清中において、BD BiosciencesからのＥＬＩＳＡであるOptEIAを使用して測定し、ＩＬ−１２及びＴＧＦβをそれぞれ、Invitrogen及びR&D SystemからのＥＬＩＳＡを使用して測定した。
【０１８５】
ビオチン化ＲＴ−１−Ａａ−ペプチド複合体の産生
簡潔に、重鎖ＲＴ１−Ａａ及びβ２ミクログロブリン（β２ｍ）を、ｐＥＴ２４中にクローニングし、Escherichia coli BL21-DE3中で産生した。リコンビナントタンパク質を、封入体として産生し、８M 尿素中に溶解させ、ヒトＨＬＡ−Ａ２／ペプチド複合体について以前に記載されたように（６１）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでリフォールディングさせた。ＲＴ１−Ａａ、β２ｍ、及びペプチドＤｕ５１を、０．４M Ｌ−アルギニン、０．１M Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、２mM ＥＤＴＡ、５mM 還元型グルタチオン、及び０．５mM 酸化型グルタチオン中において、４℃で５日間リフォールディングさせた。ついで、この溶液を濃縮し、アミコンメンブラン１０Ｋｄ（Millipore, Bedford, MA）上でバッファー交換した。フォールディングされたＭＨＣ／ペプチド複合体を、BirA酵素（Avidity, Denvers CO）により、３０℃で５時間ビオチン化し、Hiprep 26/10脱塩カラム（GE Healthcare）で脱塩した。ついで、ＭＨＣ／ペプチド複合体を、アニオン交換Q-Sepharoseクロマトグラフィーにより精製した。ビオチン化を、４：１のモル比でのストレプトアビジン（Sigma Aldrich）との四量体化により試験した。
【０１８６】
四量体化及び染色
ＲＴ１．Ａａ／Ｄｕ５１の四量体化を、４：１のモル比での、ストレプトアビジン−ＰＥ（Jackson ImmunoResearch）又はストレプトアビジン−ＡＰＣ（BD Biosciences）を、１５分間隔で加えた４等分アリコートにおいて加えることにより室温で行った。同様に、対照四量体ＲＴ１．Ａａ／ＭＴＦ−Ｅ（ＩＬＦＰＳＳＥＲＬＩＳＮＲ）を、ストレプトアビジン−ＢＶ４２１（Biolegend）にコンジュゲートさせ、Ｄｕ５１−特異的細胞の中でも、１．６＋／−０．７％ 非特異的染色を表わした。これら３つの試薬を混合し、蒔いた細胞に１０μg/mLで４℃において１時間加えた。さらに、細胞を、ＣＤ８及びＣＤ４５ＲＣで染色した。蛍光を、FACSCanto IIサイトメーター（BD Biosciences, Mountain View, CA）で分析した。まず、細胞を、その形態によりゲーティングし、死んだ細胞を、ＤＡＰＩ陰性細胞を選択することにより除外した。
【０１８７】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのペプチド処置
１６mer ペプチドを、注入前に０．４％ ＤＭＳＯ／ＰＢＳ中に溶解させた。１回目のプロトコールについて、単回投与のペプチド（５００μg/注入）を、移植前後の種々の時点である、−６、−３、０、＋３、及び＋７日目に、移植したＬＥＷ．１Ａレシピエント内にｉ．ｖ注入した。２回目のプロトコールについて、ミニ浸透圧ポンプ（ALZET, Cupertino, CA, USA）を、レシピエントの腹腔内（ｉ．ｐ）に埋め込み、２０．８３又は４１．６６μg/時間のいずれかで、１６mer ペプチドを連続的に１４日間送達させた。１回目のポンプを、移植前−７日に埋め込み、＋７日目に２回目のポンプに置き換えた。このポンプは、２８日間連続で動物当たりに１４又は２８mg ペプチドの送達が可能である。枯渇性抗−ＣＤ８α  ｍＡｂ（ＯＸ８、ＩｇＧ１、３mg/kg）又は抗−ＭＨＣクラスＩａ及びＩｂ  ｍＡｂ（ＯＸ１８、３mg/kg）を、−７日目から拒絶までに週２回、ｉ．ｐ注入した。移植臓器を、触診により毎日モニターした。移植臓器拒絶を、触知できる心拍の完全な停止として定義した。
【０１８８】
養子細胞送達
細胞送達を、移植前日に致死量以下で照射（４．５Gy  全身照射）したＬＥＷ．１Ａレシピエントへの、精製し、分取したトータル又はＤｕ５１四量体−  ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇのｉ．ｖ．注入により行った。トータル脾細胞（１，５．１０８個）を、同じ日に４．５Gy 全身照射を受けたナイーブなＬＥＷ−１Ａレシピエントへの心臓移植前日に、養子性にｉ．ｖ．送達した。レシピエントに、Ｄｕ５１処置ラットからの脾細胞（１回目のｓｐｌ送達と定義）、ナイーブなラットからの脾細胞（ナイーブなｓｐｌ送達）、又は細胞無し（未処置照射）を受けさせた。
【０１８９】
移植心の形態計測分析
移植片の上１／３を、パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋した。５μm 冠状切片を、ヘマトキシリン−エオシン−サフランで染色した。組織を、群に対して盲検の病理医（Ｋ．Ｒ．）により分析した。慢性拒絶を、以前に記載されたように（６３）評価した。
【０１９０】
ドナー特異的アロ抗体検出
アロ抗体を、他の箇所で記載されたように（２８）、細胞蛍光測定法により分析した。簡潔に、コラゲナーゼＤによる消化及び赤血球溶解後に、同種の脾細胞を、希釈（１／８）した熱不活性化血清と共にインキュベートし、ついで、ＦＩＴＣ−コンジュゲート  ヤギ抗−ラットＩｇＧ抗体（Ｈ＋Ｌ鎖特異的）（Jackson Laboratories）、マウス抗−ラットＩｇＧ１  ＭＡｂ（ＭＣＡ  １９４、Serotec）、ＩｇＧ２ａ（ＭＣＡ  ２７８、Serotec）、又はＩｇＧ２ｂ（ＭＣＡ  １９５、Serotec）と共にインキュベートした。抗体が結合したことを、ＦＩＴＣ−結合Ｆ（ａｂ）’２  ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Jackson Laboratories）を使用して証明した。細胞を、FACS Canto IIサイトフルオロメーター（BD Biosciences, Mountain View, CA）を使用して分析した。結果を、各血清についての平均チャネル蛍光として表わした。
【０１９１】
統計学的分析
ペプチド活性化試験のために、ノンパラメトリックなウィルコクソンの符号順位検定を、１．０の仮定値に対するカラムメジアンと比較して行った。ＴＣＲ  Ｖβ１１発現、活性化された細胞の表現型、サイトカイン発現、増殖アッセイ法、及び四量体染色についての統計学的有意性を、両側マン・ホイットニーｔ検定により評価した。移植片生存を、カプランマイヤー・ログランク検定により分析した。２要因の分散分析検定及びボンフェローニポストテストを、ドナー特異的抗体分析及び脾細胞表現型特徴決定に使用した。分析を、GraphPad Prism 5.04ソフトウェア（GraphPad, San Diego, CA, USA）により行った。多様性分析のために、クルスカル−ウォリス及びダンの多重比較ポストテストを、GraphPad Prism 6.0cを使用して行った。０．０５未満のＰ値を、有意であるとみなした。
【０１９２】
結果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇ活性化
ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇによる同種ＭＨＣ／ペプチド複合体のＴＣＲ認識、及び、その機能のその後の活性化を特定するために、抗原性刺激に対する曝露に従って、フローサイトメトリーによる分析を可能にする活性化の特異的マーカーを選択する必要があった。したがって、ポリクローナル抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ２８抗体による刺激に基づいて、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇにより、種々の時点で発現された分子をスクリーニングした。新鮮に単離されたＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇにおける分子の発現は、Ｑ  ＲＴ−ＰＣＲにより以前に評価されており（５）、これらの分子の中でも、ＣＤ２５及びＩＦＮγが、他の細胞集団から、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇを区別するマーカーであったことが証明された。ＣＤ７１、ＣＤ２５、及びＩＦＮγの発現を、０、１、２、３、及び６日目において、フローサイトメトリーにより分析した。
【０１９３】
０日目において、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇが、低レベルのＣＤ７１（０．８３±０．１％）、ＣＤ２５（１２．７４±６．１％）、及びＩＦＮγ（５．５７±３．３％）を発現していたことが確認された。ポリクローナル刺激後に、ＣＤ７１、ＣＤ２５、及びＩＦＮγの発現は、初日から有意に増大し、それぞれ８２±４．５％、９８．１±１．９％、及び９１．７±７％の陽性細胞として、６日目に経時的に安定したままであった。
【０１９４】
まとめると、低いベース発現と刺激に基づく有意なアップレギュレーションを有する、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇに対する対象となる３つのマーカーが特定された。ＣＤ２５が、最多であり、最も早くアップレギュレーションされたマーカーであったため、また、ＣＤ２５が、本発明者らにより以前に説明されたマーカーであったため（５、１２）、このマーカーを、この研究の残りの局面について、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇ活性化を評価するのに選択した。
【０１９５】
ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇ細胞は２つのドナーＭＨＣクラスＩＩ由来ペプチドを認識した
ラットのＭＨＣミスマッチ心臓移植臓器モデルにおいて、ドナー（ＲＴ１ｕ）とレシピエント（ＲＴ１ａ）とは、全てのＭＨＣ分子についてミスマッチである。したがって、ドナーとレシピエントとのＭＨＣＩ及びＩＩアミノ酸（ａａ）配列をアライメントし、ドナーＭＨＣＩ及びＩＩ分子の多型ドメインとマッチした８２個のオーバーラップした１６merペプチドを設計した（１７〜１９）。まず、ペプチドを、６〜８個のペプチド（３０μg/mL 各ペプチド）のプールに分類し、未成熟又は成熟した同系のレシピエントｐＤＣとＣＤ４０Ｉｇ処置した長期移植臓器保有レシピエントから分取したＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇを３又は６日間共培養したｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ法で試験した。未成熟ｐＤＣに関して、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇの有意な活性化は、ペプチドの同種プールのいずれについても、３日目又は６日目において観察されなかった。成熟ｐＤＣ及び同種ペプチドプールによる刺激後、３日目に、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇの小集団におけるＣＤ２５発現のわずかなアップレギュレーションが観察され、６日目に、同種刺激により、ＣＤ２５発現の有意なアップレギュレーションが観察された。これらの結果から、一部の同種ペプチドは、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇにより効率的に認識され、この認識により、ＣＤ２５発現の増大がもたらされることが示唆された。また、ｐＤＣは、当該アッセイ法おいて成熟している必要があることも証明された。
【０１９６】
次に、ナイーブで成熟した同系ｐＤＣ及び６日の培養において長期生存細胞から精製したＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇの存在下において、８２個のアロペプチドの個々の刺激能を試験した（図１Ａ）。２つのペプチド：ペプチド＃３１（Ｂｕ３１と呼ばれる、ペプチドなしに対して１．６７±０．０９倍、ｐ＜０．０００１）（ペプチド＃３１の配列は、ペプチド＃３２（ｐ＜０．０５）の配列とオーバーラップする）及びペプチド＃５１（Ｄｕ５１と呼ばれる、ペプチドなしに対して２．０７±０．１８倍、ｐ＜０．００１）が、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇの細胞表面において、ＣＤ２５発現の非常に有意なアプレギュレーションを誘導したことが観察された。Ｄｕ５１は、Ｂｕ３１と比較して、ＣＤ２５発現のより強いアップレギュレーションを誘導した。このことは、Ｄｕ５１が、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇにより認識されるドミナントなペプチドである一方で、Ｂｕ３１はサブドミナントであることを示唆している。これらの結果から、抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇが、２つのペプチドＢｕ３１（ＹＬＲＹＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶＴＥ）及びＤｕ５１（ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ）を、主に認識したことが証明された。これらのペプチドはそれぞれ、ドナーＭＨＣクラスＩＩ  ＲＴ１．Ｂｕ及びＲＴ１．Ｄｕ分子のβ１鎖由来である。
【０１９７】
ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇは異常に長い同種の１５mer ペプチドを認識した
抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇにより認識される天然のドミナントなドナーペプチド配列を決定するために、変性ペプチドのライブラリを使用した。この変性ペプチドは、１つのａａラギングを有する９mer ペプチド〜ドミナントな１６mer Ｄｕ５１由来の２つ以上のａａラギングを有する１５mer ペプチド（＃５１−１〜＃５１−１８でラベル）の範囲とした（図１Ｂ及び表１）。このライブラリ設計は、以前の結果に基づいており、レポートで報告されており（２０〜２３）、上記されたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ法と同様に試験した。興味深いことに、ランダムペプチドライブラリにより、ラットＭＨＣクラスＩ  ＲＴ１−Ａａ分子が、Ｃ末端にアルギニン（Ｒ）を有する９〜１５mer ペプチドに強力な優位性を示したことが確立されている（２３）。
【０１９８】
【表１１】
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【０１９９】
誘導体である９mer ペプチド＃５１−１〜＃５１−８は、１６mer Ｄｕ５１で観察された活性化に匹敵する、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇの活性化を誘導することができなかった。一方、Ｎ末端アスパラギン（Ｎ）を欠いている１５mer 誘導体ペプチド（５１−１８）により、非常に強力で、有意なＣＤ２５アップレギュレーションを誘導することができた（ペプチドなしに対して、２．０４±０．３倍）。他の誘導体とは対照的に、ペプチド＃５１−１８により誘導されたＣＤ２５アップレギュレーションは、Ｄｕ５１により誘導されたのとは、有意には異ならなかった（図１Ｂ）。
【０２００】
要するに、これらの結果から、ドミナントなＭＨＣクラスＩＩ由来の１５mer 天然ペプチド（ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ）が、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇに対して提示され、このような提示が、特定の細胞の活性化を誘導することが示された。
【０２０１】
Ｄｕ５１活性化ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇ細胞は改変された表現型を表わし、抗原特異的活性化Ｔ細胞を効率的にサプレッションした
Ｄｕ５１活性化ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇの表現型を、刺激後６日で分析した。ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇが、高レベルのＩＦＮγの分泌を介して働き、次に、ＤＣ及び移植片ＥＣによりＩＤＯ発現を誘導し、この反応が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの寛容誘導に必須であったことが、以前に証明されている（５）。これらの結果に基づいて、ｐＤＣの存在下におけるペプチドによるＣＤ８＋  Ｔｒｅｇの刺激が、大方活性化されたＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇにより、ＩＦＮγの有意に増大した発現をもたらすことが観察された。同じ培養上清中において、ｐＤＣ起源であろうＩＬ−１２産生の低下が観察されたが、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇ及びｐＤＣの両方により産生することができるＩＬ−１０及びＴＧＦβの発現の改変は観察されなかった。また、ＣＤ７１、ＣＤ２８、及びＭＨＣクラスＩＩのアップレギュレーションも観察されたが、ペプチド刺激の６日後に、Ｆｏｘｐ３発現の改変は観察されなかった。
【０２０２】
同種ｐＤＣ又は同系ｐＤＣ及びドナー細胞ライゼートの存在下において、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇが、同系エフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞の増殖をサプレッションすることができることが、以前に証明されている。このことは、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇが、非自己認識の直接的又は間接的な経路を介して働いたことを示し、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇが、ナイーブなＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇより効率的なサプレッサー細胞であることを示している（６）。ここで、Ｄｕ５１刺激ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇが、エフェクターＴ細胞増殖を、６日の共培養後に効率的にサプレッションすることにより、そのサプレッサー能を維持することができるかを、非活性化対照ペプチドにより刺激されたＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇと比較して調査した。ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇを同系ｐＤＣ及びＤｕ５１又は非活性化ペプチドの存在下で６日間刺激するＭＬＲアッセイ法を行った。ついで、ペプチド刺激ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇを、FACS Ariaを使用して分取し、分取した同種ｐＤＣ及び同系ＣＦＳＥラベルＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞の直接的なＭＬＲアッセイ法に加えた。エクスパンションしたＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇは、直接的な非自己認識経路により刺激されたエフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞の増殖におけるバイスタンダーレギュレーションを発揮するであろうと推定された。エフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞の増殖を、６日後に測定した（２４、２５）。Ｔｒｅｇの非存在下において、８０．５％のＣＤ４＋ＣＤ２５−  エフェクターＴ細胞が増殖した。Ｄｕ５１刺激Ｔｒｅｇの添加は、非活性化ペプチドにより刺激されたＴｒｅｇと比較して、エフェクターＴ細胞増殖の有意な阻害をもたらした。このため、Ｄｕ５１抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化後に効率的なサプレッシブ能を維持した。６日間刺激されないままであったＴｒｅｇは、そのサプレッシブ能を失い、放置により死に始めた。
【０２０３】
ＣＤ４０Ｉｇ処置レシピエントにおけるその濃縮が証明されたＭＨＣクラスＩ四量体を使用するＤｕ５１特異的ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇの特定
移植における重要な課題は、依然として、抗原特異的Ｔｒｅｇの特定である。より活性なサプレッシブ集団を表わすためである。ここまで、非常に少ない天然エピトープしか特定されていない。加えて、今日、ラット及び移植環境において、抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ集団を、直接的に可視化及び検出するのに利用できるツールは存在しない。そのためにも、フィコエリスリン（ＰＥ）及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）でラベルした、ＭＨＣクラスＩ四量体であるＲＴ１．Ａａ／Ｄｕ５１を生成し、脾臓及び移植片中において特定集団を染色した。
【０２０４】
まず、細胞を、ＰＥコンジュゲート、及びＡＰＣコンジュゲートしたＲＴ１．Ａａ／Ｄｕ５１四量体の混合物により、ＢＶ４２１でラベルされた対照四量体であるＲＴ１．Ａａ／ＭＴＦ−Ｅと共に染色した。この二重蛍光色素戦略は、抗原特異的ＣＤ８＋  エフェクターＴ細胞について以前に説明されており、シグナルとノイズの染色の区別が可能である。特異的ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇが、ＲＴ１．Ａａ／Ｄｕ５１四量体の各バージョンに等しく結合する一方で、ランダムなエレメントは結合しないであろうためである（２６）。二重陽性染色イベントの中でも、非ペプチド特異的細胞を可視化し、除外することができる。非ペプチド特異的細胞は、同じ重鎖ＲＴ１．Ａａを有するが会合した不適切なペプチドを有する対照四量体に結合するためである。細胞を、ＣＤ８−ＰｅＣｙ７及びＣＤ４５ＲＣ−ＦＩＴＣにより二次染色して、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ又はＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｈｉｇｈ  Ｔ細胞のいずれかを特定した。このような戦略について、脾臓において２．１９±０．６％、移植片において１．１６±０．２５％のＤｕ５１特異的細胞を、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇの中から特定することができた。ナイーブな脾臓のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ集団において、前駆体頻度を０．７３±０．２％と評価した。このことは、移植及びＣＤ４０Ｉｇ処置後１２０日でも、この頻度は、３倍近くに増大し、ナイーブな動物において、ドナー特異的Ｔｒｅｇのプールを特定することができたことを証明している。この差異は、脾臓における四量体陽性ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇ又はナイーブなＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔ細胞の割合及び絶対数を見た場合に、真であった（脾臓において、割合についてそれぞれ、０．６２４±０．１２８  ｖｓ．  ０．１７３±０．０７１、及び、絶対数について、６２３８００±１２７７００  ｖｓ．  １７２６００±７０５００、ｐ＜０．０５）。また、各集団中の陽性細胞の割合及びトータル脾臓における割合又は絶対数、ならびに移植片における割合の点から、ナイーブ又はＣＤ４０Ｉｇ処置動物からの、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｈｉｇｈ  Ｔ細胞の中からより、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇの中からの方が、多くのＤｕ５１特異的細胞が有意に存在した。脾臓において、ナイーブな動物からのＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗとＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｈｉｇｈとのＴ細胞間に、差異は存在しなかった。興味深いことに、四量体陽性細胞は、移植片及び脾臓の両方において、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  ＴｒｅｇのＣＤ８ｈｉｇｈ部分集合内に局在した。
【０２０５】
要するに、これらの結果から、移植及びＣＤ４０Ｉｇ処置に基づいて有意に増大した集団であるアロ抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇを検出する機能的なＲＴ１Ａａ／Ｄｕ５１四量体を生成することができたことが証明された。
【０２０６】
非自己認識の直接的及び間接的経路により媒介されるＤｕ５１特異的ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇの優れたサプレッシブ能、ならびに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの寛容誘導のための要求
Ｄｕ５１刺激ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇのサプレッシブ能が、以前に証明されている。この実験において、新鮮に分取したＲＴ１Ａａ／Ｄｕ５１四量体特異的ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇのサプレッシブ能を研究しようとした（図２Ａ）。ナイーブなＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ、トータルＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇ、ＲＴ１Ａａ／Ｄｕ５１四量体陰性（四量体−）、及びＲＴ１Ａａ／Ｄｕ５１四量体陽性（四量体＋）のＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇを分取し、同種（直接的経路）又はアロ抗原ロード同系ｐＤＣ（間接的経路）及びナイーブなＣＦＳＥラベル同系ＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞と共に、６日間インキュベートした。このアッセイ法において、ＲＴ１Ａａ／Ｄｕ５１四量体特異的ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇを、四量体結合により活性化させた（データを示さず、及び（２７））。以前に説明されたように、トータルＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇは、アロ抗原定提示の直接的及び間接的経路の両方により誘導されるエフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞の増殖を、ナイーブなＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇより効率的にサプレッションした（図２Ａ）。興味深いことに、非自己認識の直接的経路により媒介される四量体＋  ｖｓ  四量体−  ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇのサプレッシブ活性間に、有意差が観察された。四量体＋  ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇが、最も活性なサプレッサー細胞部分集合であった（図２Ａ）。有意ではなかったが、統計学的な傾向を有して（ｐ＝０．０５７１）、同じ差異が、間接的なアロ抗原提示経路に関して得られた（図２Ａ）。さらに、ＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞増殖のサプレッションが、直接的よりむしろ、間接的なアロ抗原提示経路により誘導された場合、Ｄｕ５１特異的Ｔｒｅｇにより効果的に達成された。興味深いことに、非特異的四量体−  ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇは、トータルＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇより低いサプレッシブ能を有する傾向にある。このことは、トータルＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇプールの全体的なサプレッシブ能における、Ｄｕ５１特異的ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇの重要な寄与を強調している。これらの結果から、Ｄｕ５１抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇが、トータルＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇプールの最も効率的なＴｒｅｇの部分集団であることが示唆された。
【０２０７】
Ｄｕ５１特異的ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇについて観察された差動的なｅｘ  ｖｉｖｏにおけるサプレッシブ効果のｉｎ  ｖｉｖｏでの関連性を研究するために、養子細胞送達実験を行った。トータルＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ又はＲＴ１Ａａ／Ｄｕ５１四量体陰性（四量体−）ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇを分取し、ナイーブな移植照射レシピエントに、養子性に送達した（図２Ｂ）。トータルＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇとは異なり、（Ｄｕ５１抗原特異的細胞を枯渇させた）四量体−ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇは、移植臓器拒絶を防止することができなかった。このことは、移植臓器拒絶を予防し、感染性寛容を促進するトータルＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇプールの免疫寛容誘導活性における、抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇの重要な役割を証明している。
【０２０８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのペプチド処置による寛容誘導はＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ割合の向上及び抗ドナー抗体応答の総体的な阻害に関与した
ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇのｉｎ  ｖｉｖｏでの生成及び移植臓器生存において特定された免疫ドミナントなペプチドの活性を更に決定するために、動物を他の処置をすることなく、２種類のプロトコールのペプチド投与を使用して別々に処置した。第１のプロトコールにおいて、動物に、５００μg ペプチドの静脈内（ｉ．ｖ）注入を、５回受けさせた（図３Ａ）。対照ペプチド又はＤｕ５１のいずれかの注入は、移植臓器生存の有意な延長を誘導するのに十分でなかったことが観察された（それぞれ、１１及び９．５日、ｎ＝４）（図３Ａ）。第２のプロトコールにおいて、このような小型のペプチドがレシピエントの体内から急速に排出されることから、処置の有効性を改善するために、１時間当たりに２０．８μg ペプチドの一定の腹腔内送達のためのミニ浸透圧ポンプを、移植前−７日から開始して２８日間試験した。興味深いことに、このプロトコールは、対照ペプチドと比較して、Ｄｕ５１を使用する２５％の明確でない移植臓器生存を伴って、移植臓器生存の有意な延長を可能にした（対照ペプチド及び未処置と比較して、ｐ＜０．０１）（図３Ａ）。ペプチド注入により誘導された寛容が、ＣＤ＋  Ｔ細胞及びＭＨＣクラスＩ提示に依存することを証明するために、以前説明されたように（５）、レシピエントを、ペプチド注入及び枯渇性抗−ＣＤ８  ｍＡｂ（ＯＸ８）又は阻害性抗−ＭＨＣクラスＩ  ｍＡｂ（ＯＸ１８）により同時処置した（図３Ａ）。両抗体の投与により、移植臓器生存が完全に消滅した。このことは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞によるＭＨＣクラスＩ／抗原の認識が、ペプチド注入により得られる寛容の確立に必要であったことを示している。
【０２０９】
興味深いことに、１時間当たりに４１．６μg ペプチドを送達する浸透圧ポンプにより投与されたＤｕ５１用量の増大により、Ｌｅｗｉｓ  １Ｗ（ＬＥＷ．１Ｗ）ドナー心臓の８０％のレシピエントにおいて、明確でない移植臓器生存が誘導された（図３Ａ）。しかしながら、Brown Norway（BN）という第三者の移植片は、移植後７日目に著しく拒絶された（図３Ａ）。このことは、ペプチドＤｕ５１注入が、ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇにより媒介されるドナー特異的寛容を誘導することを証明している。
【０２１０】
ペプチドＤｕ５１により処置された拒絶している、又は、長期間生存しているレシピエントの移植心及び脾臓を、慢性拒絶のサイン、抗−ドナー抗体の存在、トータル及び四量体陽性ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇの割合、及びＣＤ４＋エフェクターＴ細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏサプレッションについて分析した（図３Ｂ、Ｃ、Ｄ）。長期レシピエントの移植片についての解剖病理学的分析から、以前に確立されたスコア（２８）に基づく慢性拒絶のサインは示されなかった。加えて、早期に移植片を拒絶した未処置又はＤｕ５１処置レシピエントと比較して、脾臓において、トータルＣＤ８＋  Ｔ細胞、特に、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ（図３Ｃ）、及び、長期生存しているペプチドＤｕ５１処置レシピエントにおいて、四量体陽性Ｄｕ５１特異的Ｔｒｅｇ（図３Ｄ）の割合及び絶対数における増大についての傾向が観察された。これらの結果から、抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのペプチド処置により誘導／増幅される一方、他の部分集合は、誘導／増幅されないことが示唆され、抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇは、寛容誘導を担う可能性があった。これらのペプチド誘導活性化ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇは、ｅｘ  ｖｉｖｏでのサプレッシブ能を表わすことが確認された。これらのペプチド誘導活性化ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇが、新鮮に精製されたＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇと同じ方法で、エフェクターＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖を効率的に阻害するためである。最後に、長期間生存しているＤｕ５１処置されたレシピエントにおいて、早期に移植片を拒絶した未処置ラット又はＤｕ５１処置レシピエントと比較して、慢性拒絶の非存在に関連する（２８）、総ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂアロ抗体産生の総体的な阻害が観察された（図３Ｂ）。
【０２１１】
Ｄｕ５１単剤治療による感染性寛容
１mg/日 ｉｎ  ｖｉｖｏでのペプチドＤｕ５１処置により生じた長期移植臓器生存に関与する誘導されたレギュラトリー細胞のドミナントなサプレッシブ活性を評価するために、ナイーブな移植され、致死量以下で照射されたレシピエントへの、長期生存レシピエントの脾細胞を使用する養子細胞送達実験を、先に行ったのと同様に（５）行った（図４Ａ）。二次的でナイーブな移植照射レシピエントへの１５０．１０６個の脾細胞の１回目の養子性送達は、５０％のレシピエントにおける移植臓器生存の十分な延長をもたらした。このことは、ドミナントなレギュラトリー細胞の誘導が、新たに移植され照射されたレシピエントにおいて、移植臓器拒絶を防止可能であったことを証明している。１回目に養子性に送達された長期脾細胞レシピエントの移植片の解剖病理学的状態を調査した。血管病変及び障害が完全に存在しない（すなわち、慢性拒絶のサインがない）ことが観察された。最後に、長期間生存している１回目の養子性に送達されたレシピエントにおいて、高いアロ抗体産生を表わす未処置ラットと比較し、慢性拒絶の非存在に関連する（２８）ナイーブなラットと比較可能な、総ＩｇＧ、ＩｇＧ１、及びＩｇＧ２ｂアロ抗体産生の総体的な阻害が観察された（図４Ｂ）。
【０２１２】
議論
Ｔｒｅｇがペプチドを認識する方法及びこの認識の役割についての現在の知識は、非常に限られており、ほとんどが、ＣＤ４＋  ＴｒｅｇのＴＣＲ遺伝子伝達を使用するトランスジェニックマウスモデル（８、１１）、又は、自己免疫疾患及びガンに関与するマウスＱａ−１制限ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇのいずれかに基づいている。このＱａ−１ペプチドレパートリーは、ここ数年で説明されてきた（２９）。しかしながら、これらの研究からは、抗原特異的Ｔｒｅｇは、長期移植の結果に重要な影響を及ぼし、寛容の確立に寄与することが示唆されている（３０）。現在の研究では、ガン（ヘムオキシゲナーゼ−１由来ペプチド）、自己免疫（Ｖβ由来ペプチド）の間に、又は、妊娠（マイナー抗原由来ペプチド）の間にも、ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇにより認識されるペプチドが特徴決定されているが、移植においてはまだない（２）。移植は、移植片の存在がアロ抗原の連続的な供給源であり、Ｔｒｅｇにより認識される抗原が特定される環境である。このことは、レギュラトリー集団の機能及び維持、このため、移植臓器の生存に最も確かに必須である（３１）。レギュレーションの文脈におけるアロ抗原の認識は、特に、ｐＤＣにより支持される提示の間接的な経路により主に生じることが、本発明者らにより示されている（６、３０、３２）。
【０２１３】
本報告では、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇが、提示の間接的経路を介して、天然のドナーＭＨＣクラスＩＩ分子のβ１ドメイン由来の、Ｄｕ５１と呼ばれる１つのドミナントなアロペプチド（及び、１つのサブドミナント）を認識することができることが、初めて証明された。これらのペプチドは、ヒトＨＬＡクラスＩＩ分子と８０〜９０％ 相同性を共有しているため、ヒトにおいて、特異的ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇを検出するのに使用することができる。ＭＨＣ−Ｉ特異的四量体の使用により、Ｄｕ５１特異的ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇは、ＣＤ４０Ｉｇ処置長期生存レシピエントにおいて濃縮され、偏った制限Ｖβ１１鎖を発現し、ｅｘ  ｖｉｖｏでの強力なサプレッシブ能を表わし、養子送達に基づく寛容誘導における重要な役割を果たすことが示された。最後に、ペプチドＤｕ５１は、ドナー特異的ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇを誘導して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて移植臓器生存の延長を誘導することが示された。
【０２１４】
ここで、ペプチドＤｕ５１は、１５ａａの珍しい長さを表わし、試験したより短いペプチドは、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇによる有意な認識を誘導することができないことが説明された。ほとんどの文献では、ＭＨＣクラスＩに結合する短いペプチド（８〜１０ａａ）に焦点を当てられている。ただし、５〜１０％のペプチドが、ＭＨＣクラスＩ分子により提示されることができる、より長いペプチド（１０ａａ超）であることが公知である（３３、３４）。ここまで、このようなペプチドは、ＣＴＬモデルについて特定されてきており、ほとんどが、ウイルス抗原由来である。知られている限りにおいて、ＲＴ１Ａａ／Ｄｕ５１四量体について示されたように、ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇにより構造的に認識されることができる１５ａａペプチドの最初の説明が提供される。近年の研究から、これらの長いペプチドは、ＴＣＲ認識を、そのペプチドにより焦点を当てさせ（３５）、ＴＣＲが、好ましい長さのＭＨＣクラスＩペプチドを認識する（３６）ことが示唆された。ラットＭＨＣクラスＩ分子であるＲＴ１．Ａａは、特に、Ｐ２におけるＧｌｎ、Ｍｅｔ、もしくはＬｅｕ、Ｐ３におけるＰｈｅ、Ｐ４におけるＰｒｏ、及びＣ末端におけるＡｒｇ等の重要な位置の残基を有する、長いペプチドを収容することが公知である（２１、２２）。Speir et alには、１３個の残基の母系的に伝達されたマイナー組織適合抗原（ＭＴＦ−Ｅ）モデルにおいて、重要なアンカー残基（特に、１３位（Ｐ１３）におけるアルギニン）が、かなりのバルジコンホーメーションと結合可能であることが、以前に証明されている（３７）。また、Ｄｕ５１が、Ｃ末端においてＡｒｇを表わすことにより、ペプチドのＲＴ１．Ａａ収容に役立つことができることも観察された。興味深いことに、本発明者らにより試験されたペプチドの一部は、本発明者らと同じミスマッチ心移植モデル（ＬＥＷ．１ＡへのＬＥＷ．１Ｗ）における拒絶未処置動物（ドミナントペプチドＤｕ５１を含む）から単離されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞について、Ballet et al.によっても試験されていた（１８）。彼らは、本発明者らによりペプチド＃４７及びペプチド＃５５と呼ばれた、２つの免疫ドミナントなペプチドを見出した。これらのペプチドは全て、ＬＥＷ．１Ｗ  ＲＴ１．Ｄｕ分子由来であり、非修飾ＬＥＷ．１Ａレシピエントからの移植片の急性拒絶に関与した。重要なことに、ペプチドＤｕ５１は、このモデルにおいて、急性拒絶に関与しなかった。Ballet et al.により特定された２つの免疫ドミナントなペプチドは、本発明者らのＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇにより認識されなかった。このことは、Ｔｒｅｇ及び非Ｔｒｅｇが、同じ抗原を認識しなかったことを示唆している。
【０２１５】
また、ＲＴ１．Ａａ／Ｄｕ５１四量体を産生することができた。同四量体は、抗原特異的細胞を追跡する有用なツールであるのに加えて、ＴＣＲの優れた特異性及び親和性を決定するのにも使用することができる。この四量体に関して、ナイーブな動物において、約０．７３％ 抗原特異的Ｔｒｅｇ前駆体のプールを特定した。この前駆体は、移植及びＣＤ４０Ｉｇ処置後１２０日までに、約３倍にエクスパンションした。この前駆体頻度は、マウスの関節炎モデルにおいてなされたLeavenworth et al.の観察と関連した。この観察では、彼らは、Ｑａ−１−Ｈｓｐ６０ｐ２１６及びＱａ−１．Ｒ７２Ａ−Ｑｄｍ四量体特異的ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇの出現を分析し、それぞれについて、約１．６５％及び０．４６％ 陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞のナイーブな頻度を説明した（３８）。これらの観察から、Ｔｒｅｇ集団における抗原特異的細胞の前駆体頻度は、所定の抗原反応性非Ｔｒｅｇ  Ｔ細胞の頻度より高かった可能性があったことが示唆される。
【０２１６】
このＭＨＣ−Ｉ四量体の使用により、（四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇにおいて枯渇させた）四量体−ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇの共培養アッセイ法におけるｅｘ  ｖｉｖｏ及び養子送達によるｉｎ  ｖｉｖｏでのＤｕ５１特異的及び非特異的ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇのサプレッシブ能を比較した。四量体−ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇを上回る四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇの優れたサプレッシブ活性が、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて証明された。四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇは、提示の直接的及び間接的経路の両方により刺激されるＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の増殖を有意に阻害し、間接的な非自己認識環境において最も効率的に阻害する。これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける間接的な特異性のＴｒｅｇの優れたサプレッサー活性を証明する幾つかの研究（３９、４０）と一致する。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、トータルＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇを養子性に送達したレシピエントと比較して、四量体−ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇを送達したナイーブな移植照射レシピエントでの急速な移植臓器拒絶が観察された。同様の方法において、（四量体Ｑａ−１／Ｈｓｐ６０ｐ２１６特異的Ｔｒｅｇにおいて枯渇させた）四量体−ＣＤ８αα＋  Ｔｒｅｇの養子送達は、マウスモデルにおける自己免疫性関節炎の進行を予防できなかった（３８）。また、Tsang et al.により、移植寛容における間接的なアロ特異性についてのＣＤ４＋  Ｔｒｅｇの重要な役割が示された。このことは、直接的及び間接的特異性の両方におけるＴＣＲトランスダクションＣＤ４＋  Ｔｒｅｇの養子送達のみが、移植心拒絶を防止することができ、直接的特異性のＣＤ４＋  Ｔｒｅｇでは防止できないことを証明している。
【０２１７】
また、抗原特異的レギュラトリーＴ細胞により発現される可能性のある種々のマーカーを分析した。Ｆｏｘｐ３は、ペプチドにより刺激されない、又は、同ペプチドにより刺激されたＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇの対象となるマーカーであるとは考えられない。ただし、強力な抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８／ＩＬ−２刺激の複数回のラウンドに基づいて、実質的なレベルのＦｏｘｐ３を検出することができた（データを示さず）。また、ペプチド特異的刺激後における、ＩＦＮγ産生の増大及びＩＬ−１２発現の低下も見出された。ＩＦＮγは、本発明者らのモデルにおける重要なサイトカインとして、本発明者らにより既に示されていた（６）。
【０２１８】
誘導されたＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇのレパートリーに関して、これらの細胞により、Ｖβ１１鎖をリコンビネーションし、脾臓において９ａａのＣＤＲ３βを提示するＴＣＲが優先的に使用されることが、以前に示された。このことは、Ｔｒｅｇのオリゴクローン性集団のエクスパンションを示唆している（５）。ただし、６匹の長期生存動物にわたる約７００のＣＤＲ３βのシークエンシングから、全Ｖβ１１＋ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇが、脾臓における比較的多様なレパートリーを表わすことが証明された。それにも関わらず、より高頻度の繰返し配列が、一部の動物において見出された。移植片におけるＴＣＲレパートリーの分析から、２つのＴＣＲ−Ｖβ鎖：Ｖβ１１（脾臓において）及びＶβ１８のプレドミナント性が証明された。脾臓とは異なり、シークエンシングから、長期移植臓器生存誘導のドナー特異的輸血モデルにおけるのと同様に、Ｖβ１８  ＴＣＲについて一部が共有されるクローン形質を伴って、両鎖について偏って、制限されたレパートリーが証明された（４１）。しかしながら、Douillard et al.により説明された公開配列は、本発明者らの研究における１匹の動物において、１回のみ見出され、本発明者らのモデルにおいて、Ｖβ１８レパートリーが表わされなかった。１つの興味深い仮説は、このように偏って制限されたクローン形質を有するＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇは、より強力なサプレッサーであり、早期に移植片に遊走して、その阻害活性を発揮し、ついで、免疫レギュレーションが必要とされる寛容された移植物に局在したままであることであろう（４２）。対照的に、脾臓に留まるが、（Ｖβ１８）制限レパートリーを表わさない、又は、（Ｖβ１１）制限レパートリーをほとんど表わさない（及びその結果として、ナイーブなＴｒｅｇのレパートリーにより近い）トータルＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇは、その後の炎症に基づいてリクルートされる（同じケモカインレパートリーを発現しない可能性がある）区別できるレギュラトリー集団を特定する可能性がある。Ｖβ１１及びＶβ１８両方について一部が共有されるクローン形質（添付の表１）にも関わらず、公開されたＣＤＲ３配列を見出すことができなかった。四量体Ｄｕ５１＋  Ｔｒｅｇに焦点を合わせることにより脾臓における抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇのレパートリーをより正確に分析して、（ナイーブ及びＣＤ４０Ｉｇ処置した脾臓からのトータルＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇと比較し、移植片のＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇと同様に）Ｄｕ５１特異的Ｖβ１１＋ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇのクローン形質多様性の減少を証明した。Ｄｕ５１特異的Ｖβ１８＋ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇでは、同減少は証明されなかった。このため、Ｖβ１８鎖の利用は、この特定の抗原認識については最適でない可能性があった。しかしながら、抗原特異的集団のこの分析によってさえも、このＴｒｅｇ集団について、公開されたクローン形質は明らかにされなかった。個体間で共有されるＴＣＲ配列は、収束性リコンビネーションの過程により効率的に生じる傾向にある（４３）ため、ナイーブなＴ細胞レパートリーにおいて、より高頻度に表われる（４４〜４６）。しかしながら、��体間で共有されるＴＣＲ配列は、抗原に対する免疫応答において、必然的にドミナントではない（４７）。このことは、本発明者らのモデルにおける場合であると考えられる。このことは、この過程が、ＴＣＲエクスパンション又はＴＣＲα鎖ペアリングのいずれかにより修飾することができることを示唆している。ごく最近の公開により、特異的ｐＭＨＣ認識におけるアルファ鎖の重要な寄与と、一部の特異的ＴＣＲ  Ｖαペアリングが要求し、ＭＨＣ制限を改変させるために、どのようにＴＣＲαβ多様性が考慮されるべきであるかが証明されている（４８、４９）。文献において、ナイーブなＣＤ４＋  ＴｒｅｇのＴＣＲ多様性におけるコンセンサスは、多いほど良いという記述が得られた。著者らは、高いＴＣＲ多様性により、最適なＴｒｅｇエクスパンション及び抗原特異的クローン応答性を有する可能性を増大させることによる機能を確保することを証明した（１３、１６、５０、５１）。本発明者らのモデルにおいて、ナイーブなＣＤ８＋  Ｔｒｅｇは、非常に多様なレパートリーを表わした。このレパートリーは、移植及びＣＤ４０Ｉｇ処置後のＤｕ５１特異的ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇのエクスパンションにより、再構築され、偏った。
【０２１９】
最後に、治療的観点から、移植においてレギュラトリーＴ細胞により認識された天然ペプチドの特定は、ヒトの移植において現在試されている、増幅されたＣＤ４＋  Ｔｒｅｇを使用する新たな戦略のための重要な目的である（３０、５２）。非特異的刺激、例えば、抗−ＣＤ３／ＣＤ２８抗体によるポリクローナル法において増幅されたこれらのヒトＣＤ４＋  Ｔｒｅｇが、抗原特異的Ｔｒｅｇよりほとんど効率的でなく（２、５３）、制限されたエクスパンション能を表わし、通常、従来のエフェクターＴ細胞により増殖され過ぎること（５４）が、難点である。短期間の培養において、Ｔｒｅｇをエクスパンションさせる特異的抗原の使用は、確かに臨床状態を改善するであろう。原理の証明として、ドミナントなペプチドＤｕ５１を、免疫サプレッシブ処置をすることなく、ナイーブな移植レシピエントに投与した。移植臓器生存の有意な延長が観察された。この延長した生存が、げっ歯類において、アロペプチド単独で（すなわち、免疫抑制剤なしに）得ることができたのは、初めてである。このことは、寛容誘導におけるこのペプチドの効率性及び提示の間接的経路の関連性の両方を、明らかに証明している。一部の研究では、アロ免疫応答におけるＨＬＡ由来ペプチドのより早期の免疫モデュラトリー効果が説明されている（５５）。特に、アロトラップ（alllotrap）と呼ばれるＨＬＡ−Ｂ７由来ペプチドにより、マウス及びラットそれぞれにおいて、シクロスポリン投与と組み合わせた場合、皮膚及び心臓の移植臓器生存が延長することが示された（５６、５７）。その効果は、ヘムオキシゲナーゼＩ活性のモデュレーションと関連した（５８）。本発明者らのモデルにおいて、ペプチドＤｕ５１との組み合わせにおける抗−ＣＤ８又は抗−ＭＨＣ−Ｉ抗体のいずれかの投与は、移植臓器生存を完全に消滅させた。このため、ペプチドＤｕ５１注入により得られたｉｎ  ｖｉｖｏでの治療効果は、ＭＨＣクラスＩ提示及びＣＤ８＋  Ｔ細胞誘導に直接関連した。さらに、免疫ドミナントなペプチドであるＤｕ５１は、第三者の移植片が即座に拒絶された場合、アロ免疫応答のドナー特異的阻害を誘導した。加えて、ペプチドＤｕ５１誘導移植臓器生存は、アロペプチド注入後の抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇの発生に関連する可能性のある抗−ドナー抗体の総体的な阻害により達成された。この結果は、ペプチド誘導Ｔｒｅｇの活性が急性及び慢性の移植臓器拒絶発生を防止するのを示し、ヒトの移植における新たな可能性を開くため、重要である。加えて、このようにエクスパンションした非常にサプレッシブなＴｒｅｇにより、このような条件により過剰発現した、新しく、ほとんど説明されていない遺伝子についての、より基礎的な情報が提供された。この遺伝子は、バイオマーカーとして使用することができた（６）。最後に、一部のグループの患者におけるこのＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ集団の存在は、疾患の経過中のより良好な予後に関連すると、推測することができた（５９、６０）。
【０２２０】
まとめると、本発明者らの研究から、ＭＨＣクラスＩＩドナー抗原は、抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ生成及び／又は機能をブーストするのに使用することができること、次に、これらのＴｒｅｇは、抗−ドナー免疫応答を防止して、真の寛容の確立を可能にすることが示される。また、抗原特異的ＣＤ８＋  ＴｒｅｇｓのＴＣＲは、プライベートで、制限されたレパートリーを表わすことが証明された。このレパートリーは、アロ反応性免疫応答の効率的なエクスパンション及びサプレッションを確保する。要するに、これらの結果は、ＭＨＣ／ペプチドとのその相互作用におけるＴＣＲの重要性を強調しており、ヒトの環境に対して送達可能なこの集団の生成における新たな可能性を開いている。
【０２２１】
参考文献
本願全体を通して、種々の参考文献が、本発明が属する技術分野の状態を説明している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【表１２】
2020055845.tif 000013
2020055845.tif 000014
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2020055845.tif 000019
【図１Ａ】
2020055845.tif 000024
【図１Ｂ】
2020055845.tif 000025
【図２】
2020055845.tif 000026
【図３Ａ】
2020055845.tif 000027
【図３Ｂ】
2020055845.tif 000028
【図３Ｃ】
2020055845.tif 000029
【図３Ｄ】
2020055845.tif 000030
【図４】
2020055845.tif 000031
【配列表】
2020055845000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月26日(2019.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有するペプチドであって、下記ペプチド：
【表１３】
2020055845.tif 000032
を除く、
単離されたペプチド。
【請求項２】
ペプチドが、
【表１４】
2020055845.tif 000033
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、１５〜２５個のアミノ酸の範囲の長さを有するペプチドを含む、
ＭＨＣ／ペプチド多量体。
【請求項４】
アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、１５又は１６個のアミノ酸長の単離されたペプチドを、特異的に認識する、
Ｔリンパ球。
【請求項５】
請求項３に記載されるＭＨＣ／ペプチド多量体で、ＭＨＣ／ペプチド多量体染色によりＣＤ８+ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ集団を単離する工程を含む、請求項１又は２記載のペプチドを特異的に認識するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ集団を単離するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ法。
【請求項６】
アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有する単離されたペプチドを含む培養培地により、形質細胞様樹状細胞集団の存在下において、ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、
ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ法。
【請求項７】
ペプチドが、アミノ酸配列：ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：２）又は配列番号：２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ法。
【請求項８】
請求項３記載のＭＨＣ／ペプチド多量体を含む培養培地により、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ法。
【請求項９】
薬剤として使用するための、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有する単離されたペプチド、及び薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
寛容の誘導を必要とする患者において寛容を誘導するのに使用するための、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有する単離されたペプチド、及び薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
寛容が、ドナー特異的寛容である、請求項１０記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１２】
医薬組成物が、移植拒絶の予防又は減少を必要とする患者において移植拒絶を予防又は減少させるのに使用するための、請求項１０又は１１記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１３】
ペプチドが、アミノ酸配列：ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：２）又は配列番号：２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９〜１２のいずれか一項記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１４】
単離されたペプチドが、アミノ酸配列：
【表１５】
2020055845.tif 000034
を含む、１５又は１６個のアミノ酸長のペプチドである、請求項９〜１２のいずれか一項記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１５】
ａ）アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有する単離されたペプチドであって、下記ペプチド：
【表１６】
2020055845.tif 000035
を除く、ペプチド、又は
ｂ）該ペプチドをコードする核酸、又は
ｃ）該核酸を含むベクター、又は
ｄ）該発現ベクターを含むホスト細胞、又は
ｅ）請求項３記載のＭＨＣ／ペプチド多量体、又は
ｆ）複合体ＭＨＣ分子、及びアミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、１５〜４０個のアミノ酸の範囲の長さを有するペプチドを含む抗原提示細胞、又は
ｇ）請求項４記載Ｔリンパ球と、
薬学的に許容し得る担体とを含む、
医薬組成物。
【請求項１６】
移植患者が寛容であるかを判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、
前記移植患者から得られた生体サンプル中のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇの存在を、前記生体サンプルと、請求項３記載のＭＨＣ／ペプチド多量体からなり、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇと選択的に相互作用可能な結合パートナーとを接触させることにより判定する工程を含み、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇの存在が寛容を示す、
方法。
【外国語明細書】
2020055845000001.pdf