(57)【要約】【課題】  本発明は、ＧＬＰ−１分泌促進剤に関する。【解決手段】  本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤は、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、パントテン酸、コール酸、３−アミノイソ酪酸、γ−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、ピペコリン酸、オルニチン、シトルリン、チロシンメチルエステル、ピペリジン、タウリン、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキシン、サルコシン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、シトシン、１，３−ジアミノプロパン、ニコチン酸、インドール−３−アセトアミド、Ｄ−アラニン、５−ヒドロキシリシン、１−メチルニコチナミド、チアミン、カルニチン、グルコン酸、プロスタグランジンＥ２、メチオニンスルホキシド、スペルミジン及びスペルミン、からなる群から選択される、１またはそれ以上の化合物を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロピオン酸、酪酸、吉草酸、パントテン酸、コール酸、３−アミノイソ酪酸、γ−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、ピペコリン酸、オルニチン、シトルリン、チロシンメチルエステル、ピペリジン、タウリン、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキシン、サルコシン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、シトシン、１，３−ジアミノプロパン、ニコチン酸、インドール−３−アセトアミド、Ｄ−アラニン、５−ヒドロキシリシン、１−メチルニコチナミド、チアミン、カルニチン、グルコン酸、プロスタグランジンＥ２、メチオニンスルホキシド、スペルミジン及びスペルミン、からなる群から選択される、１またはそれ以上の化合物を含む、ＧＬＰ−１分泌促進剤。
【請求項２】
請求項１に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤を含む、インスリン分泌促進用組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤を含む、血糖値低下用組成物。
【請求項４】
請求項１に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤を含む、糖尿病の予防用組成物又は治療用組成物。
【請求項５】
請求項１に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤を含む、肥満の予防用組成物又は改善用組成物。
【請求項６】
請求項１に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤を含む、食欲を抑制するための組成物。
【請求項７】
請求項１に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤を含む、飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＧＬＰ−１分泌促進剤、ＧＬＰ−１分泌促進剤を含む組成物、及び、ＧＬＰ−１分泌促進剤を含む飲食品、に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＬＰ−１
腸管には、消化管ホルモンを分泌する内分泌細胞が存在し、他の臓器の機能を調節する。腸管内分泌細胞から分泌される消化管ホルモンの一部は、インクレチンとも呼ばれ、食事摂取に伴い血中に分泌され、膵臓のβ細胞（以下、「膵β細胞」）に作用し、インスリン分泌を促進する。このインクレチンは、インスリン分泌を促進するだけでなく、膵β細胞の再生を促し、また迷走神経を介して中枢神経系にも作用し、摂食行動を抑制するため、糖尿病や肥満症の新規治療薬開発のための標的として注目されている。
【０００３】
インクレチンには、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ｇｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ；ＧＩＰ）とグルカゴン様ペプチド−１（ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１；ＧＬＰ−１）の２種類が存在する。
【０００４】
ＧＬＰ−１は下部小腸に存在する小腸内分泌Ｌ細胞（以下、「Ｌ細胞」）から分泌される。Ｌ細胞は、小腸粘膜の基底膜側と小腸管腔側の両方に面しており、「開放型」内分泌細胞と呼ばれる。Ｌ細胞には、ナトリウム依存性グルコーストランスポーターが存在し、細胞外、つまり管腔内のグルコースとナトリウムを細胞内へ共輸送する。その結果、膜電位が脱分極し、電位依存性Ｌ型Ｃａ２＋チャネルが活性化する。この電位依存性Ｌ型Ｃａ２＋チャネルから細胞内へＣａ２＋が流入することにより、ＧＬＰ−１がグルコース依存的に開口放出される。さらにＬ細胞には、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；  ＧＰＣＲ）の脂肪酸受容体、胆汁酸受容体、甘味受容体が発現しており、管腔内の脂質、胆汁酸、グルコースを感受することで、ＧＬＰ−１を開口放出する、と考えられている。しかしながら、詳細については不明である。
【０００５】
糖尿病
糖尿病とは、血糖値やヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）値が一定の基準を超えている状態を指す疾患で、国が医療対策において特に重点をおいている疾病の一つである。１型糖尿病では膵臓のβ細胞が何らかの理由によって破壊されることで、血糖値を調節するホルモンの一つであるインスリンが枯渇してしまい、高血糖、糖尿病へと至る。２型糖尿病は、肥満などを原因として、膵臓のランゲルハンス島（膵島）にあるβ細胞からのインスリン分泌量が減少し、筋肉、脂肪組織へのグルコースの取り込み能が低下（インスリン抵抗性が増大）し、結果として血中のグルコースが肝臓や脂肪組織でグリコーゲンとして貯蔵されず、血中濃度が正常範囲を逸脱して高い血糖値となり、高血糖症、インスリン抵抗性、相対的インスリン不足が特徴の長期的代謝異常である。
【０００６】
糖尿病は、口渇や多飲等の高血糖自体による症状をおこすこともあるが、真に問題となるのは、様々な合併症である。合併症としては、糖尿病神経障害、糖尿病網膜症、および糖尿病腎症が知られており、糖尿病治療の主な目的は、それら合併症を防ぐことにあるともいえる。
【０００７】
糖尿病の治療法としてはインスリン注射が知られているが、これは侵襲性が高く患者の負担が大きい。そのため、服用の負担が少ない様々な経口の糖尿病治療薬が開発されてきた。これまでに、ＧＬＰ−１等のインスリン分泌促進剤、スルホニルウレア剤、グルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ）阻害剤等の薬剤が開発されていた。しかし、副作用の問題や、常用による効果の低減等の問題があった。また、インスリン過剰分泌による低血糖等が問題となっており、そのような問題を解決する医薬の開発が望まれていた。
【０００８】
特開２０１６−１３８０４５は、式（Ｉ）の特定の構造を有する化合物を含むＧＬＰ−１分泌促進剤を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１６−１３８０４５
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】実験医学  Ｖｏｌ．３５、Ｎｏ．２（増刊）  ２０１７、ｐ．１０６−１１０
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２：２３３、２０１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、種々のＧＬＰ−１分泌促進剤、並びに、ＧＬＰ−１分泌促進剤を含む組成物、及び、ＧＬＰ−１分泌促進剤を含む飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
小腸内分泌Ｌ細胞は、小腸を構成する細胞のうち数％ほどしか存在しないため、単離精製し初代培養することが難しい。本発明者らは、ＧＬＰ−１分泌能を持つ、マウス由来小腸内分泌Ｌ細胞株のＧＬＵＴａｇ細胞、及び、マウス小腸内分泌細胞癌由来のＳＴＣ−１細胞を解析に用い、多種多様な物質について、ＧＬＰ−１分泌促進を調べ、種々のＧＬＰ−１分泌促進剤を見出して、本発明を想到した。
【００１３】
限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
プロピオン酸、酪酸、吉草酸、パントテン酸、コール酸、３−アミノイソ酪酸、γ−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、ピペコリン酸、オルニチン、シトルリン、チロシンメチルエステル、ピペリジン、タウリン、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキシン、サルコシン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、シトシン、１，３−ジアミノプロパン、ニコチン酸、インドール−３−アセトアミド、Ｄ−アラニン、５−ヒドロキシリシン、１−メチルニコチナミド、チアミン、カルニチン、グルコン酸、プロスタグランジンＥ２、メチオニンスルホキシド、スペルミジン及びスペルミン、からなる群から選択される、１またはそれ以上の化合物を含む、ＧＬＰ−１分泌促進剤。
［態様２］
態様１に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤を含む、インスリン分泌促進用組成物。
［態様３］
態様１に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤を含む、血糖値低下用組成物。
［態様４］
態様１に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤を含む、糖尿病の予防用組成物又は治療用組成物。
［態様５］
態様１に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤を含む、肥満の予防用組成物又は改善用組成物。
［態様６］
態様１に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤を含む、食欲を抑制するための組成物。
［態様７］
態様１に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤を含む、飲食品。
【発明の効果】
【００１４】
本発明で見出された物質は、非限定的に、〜μＭから〜ｍＭ程度で、ＧＬＰ−１分泌作用を奏するものである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．ＧＬＰ−１分泌促進剤
本発明は、一態様において、ＧＬＰ−１分泌促進剤に関する。
【００１６】
前記ＧＬＰ−１分泌促進剤は、非限定的に、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、パントテン酸、コール酸、３−アミノイソ酪酸、γ−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、ピペコリン酸、オルニチン、シトルリン、チロシンメチルエステル、ピペリジン、タウリン、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキシン、サルコシン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、シトシン、１，３−ジアミノプロパン、ニコチン酸、インドール−３−アセトアミド、Ｄ−アラニン、５−ヒドロキシリシン、１−メチルニコチナミド、チアミン、カルニチン、グルコン酸、プロスタグランジンＥ２、メチオニンスルホキシド、スペルミジン及びスペルミン、からなる群から選択される、１またはそれ以上の化合物を含む。これらの物質を例えばカプセル等の担体を入れて生体に経口投与する態様、あるいは、これらの物質の前駆体を生体に経口投与し、腸内細菌にこれらの物質を産生させる態様、も、前記ＧＬＰ−１分泌促進剤に含まれる。
【００１７】
前記ＧＬＰ−１分泌促進剤は、上記化合物の１つからなってもよいし、あるいは２以上の混合物であってもよい。上記化合物はいずれも単独でも、ＧＬＰ−１分泌促進能を有する。また、腸内細菌により産生されるものも含む。
【００１８】
「ＧＬＰ−１」は、「グルカゴン様ペプチド−１」の略語である。ＧＬＰ−１は、主に、小腸内分泌Ｌ細胞により生成される、消化管ペプチドホルモンである。産生細胞において、プレプログルカゴンからＧＬＰ−１（１−３７）として切り出される。Ｎ−末端側のアミノ酸が切断され、ＧＬＰ−１（７−３７）およびＧＬＰ−１（７−３６）アミドとなり、これが強い生理活性有する。本明細書において、「ＧＬＰ−１」と記載した場合、ＧＬＰ−１（１−３７）、生理活性を有するＧＬＰ−１（７−３７）およびＧＬＰ−１（７−３６）の全て、あるいは、いずれか１つを意味する。ＧＬＰ−１は、膵β細胞に作用し、インスリン分泌を増大し、グルカゴン分泌を減少させる。インスリンの分泌増大により、胃における酸分泌および胃内容排出が阻害され、満腹度を増加することにより食物摂取を減少させる。
【００１９】
「ＧＬＰ−１分泌促進」とは、前記ＧＬＰ−１分泌促進剤を存在しない場合よりも、存在する場合の方が、ＧＬＰ−１分泌細胞からのＧＬＰ−１の分泌が促進されることを意味する。ＧＬＰ−１分泌促進剤を存在しない場合は、ＧＬＰ−１分泌細胞からのＧＬＰ−１の分泌が検出されなかったが、ＧＬＰ−１分泌促進剤の存在により検出できるようになる場合も含む。好ましくは、非限定的に、ＧＬＰ−１分泌促進剤を存在しない場合と比較して、ＧＬＰ−１の分泌が１．０５倍以上、１．１倍以上、１．２倍以上、１．５倍以上、１．８倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、５倍以上となる。
【００２０】
２．ＧＬＰ−１分泌促進剤を含む組成物
本発明は、一態様において、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤を含む組成物に関する。本発明の組成物は、非限定的に、「インスリン分泌促進」、「血糖値低下」、「糖尿病の予防又は治療」、「肥満の予防用又は改善」、「食欲の抑制」の１つまたは複数の用途を有しうる。「ＧＬＰ−１分泌促進剤」の意義は、「１．ＧＬＰ−１分泌促進剤」の項目に記載した通りである。本発明の組成物は、医薬組成物であっても、食品組成物であってもよい。食品組成物には、通常の飲食品の他に、調味料、サプリメント等の態様も含む。
【００２１】
一態様において、本発明は、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤を含む、インスリン分泌促進用組成物、に関する。
【００２２】
「インスリン」という用語は、グルコース代謝を調節するポリペプチドホルモンである。インスリンは、インスリン感受性細胞のインスリン受容体に結合し、グルコース摂取を媒介する。インスリンは、１型糖尿病を治療するために使用され、２型糖尿病を治療するためにも使用される場合がある。
【００２３】
「インスリン分泌促進」とは、前記ＧＬＰ−１分泌促進剤を存在しない場合よりも、存在する場合の方が、膵臓のランゲルハンス島（膵島）にあるβ細胞からのインスリンの分泌が促進されることを意味する。ＧＬＰ−１分泌促進剤を存在しない場合は、β細胞からのインスリンの分泌が検出されなかったが、ＧＬＰ−１分泌促進剤の存在により検出できるようになる場合も含む。好ましくは、非限定的に、ＧＬＰ−１分泌促進剤を存在しない場合と比較して、インスリンの分泌が１．０５倍以上、１．１倍以上、１．２倍以上、１．５倍以上、１．８倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、５倍以上となる。
【００２４】
ＧＬＰ−１はグルコース依存性のインスリン分泌を促進し血糖値を低減させることが知られており、前記ＧＬＰ−１分泌促進剤は、インスリン分泌不足、ＧＬＰ−１分泌不足または高血糖と関連する種々の疾患に対する医薬として用いることができる。当該疾患としては、たとえば、糖尿病、肥満、高血圧、高脂血症等が挙げられる。
【００２５】
一態様において、本発明は、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤を含む、血糖値低下用組成物、に関する。
【００２６】
「血糖値低下用組成物」とは、当該組成物を投与した場合、投与しない場合と比べて、血糖値が低下する（あるいは上昇を抑制する）作用を有する組成物をいう。血糖値とは血液内のグルコース（ブドウ糖）の濃度である。ヒトの場合、空腹時血糖値はおおよそ８０−１２０ｍｇ／ｄＬであるが、食品の摂取により若干増加し、約２０分−４０分後には、健常者で最高で１２０−２００ｍｇ／ｄＬくらいまで上昇する。そして、健常者の場合、食品摂取後１２０分以内に空腹時血糖値レベルまで低下する。本発明において、「血糖値が低下する（あるいは上昇を抑制する）」とは、食品の摂取による血糖値上昇の最高値が減少する、摂取後の最高血糖値と空腹時血糖値との差（食品の摂取による血糖値上昇の最高値−空腹時血糖値）が減少する、血糖値上昇が緩やかになる、血糖値上昇後、空腹時の血糖値レベルに下がるまでの時間が短くなる、などを意味する。
【００２７】
「食品の摂取による血糖値上昇の最高値が減少する」とは、非限定的に、当該組成物を投与した場合、投与しない場合と比べて、上昇した血糖値の最高値が低下すること、好ましくは１ｍｇ／ｄＬ以上、５ｍｇ／ｄＬ以上、１０ｍｇ／ｄＬ以上、２０ｍｇ／ｄＬ以上、３０ｍｇ／ｄＬ、４０ｍｇ／ｄＬ以上低下することを意味する。
【００２８】
「摂取後の最高血糖値と空腹時血糖値との差（食品の摂取による血糖値上昇の最高値−空腹時血糖値）が減少する」とは、非限定的に、当該組成物を投与した場合、投与しない場合と比べて、「食品の摂取による血糖値上昇の最高値−空腹時血糖値」が減少すること、好ましくは１ｍｇ／ｄＬ以上、５ｍｇ／ｄＬ以上、１０ｍｇ／ｄＬ以上、２０ｍｇ／ｄＬ以上、３０ｍｇ／ｄＬ、４０ｍｇ／ｄＬ以上減少することを意味する。
【００２９】
「血糖値上昇後、空腹時の血糖値レベルに下がるまでの時間が短くなる」とは、非限定的に、当該組成物を投与した場合、投与しない場合と比べて短くなること、好ましくは１分以上、５分以上、１０分以上、２０分以上、３０分以上短くなる、６０分以上短くなる、ことを意味する。
【００３０】
一態様において、本発明は、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤を含む、糖尿病の予防用組成物又は治療用組成物、に関する。糖尿病は、１型糖尿病、２型糖尿病のいずれも対象となりうる。糖尿病は、例えば、国立国際医療研究センター病院発行の糖尿病標準診療マニュアルにおいて定義される糖尿病診断基準等により診断することができる。前記ＧＬＰ−１分泌促進剤は、糖尿病と診断された患者だけでなく、血糖値が高めで糖尿病が疑われる患者にも、予防の意味で投与することが可能である。
【００３１】
一態様において、本発明は、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤を含む、肥満の予防用組成物又は改善用組成物、に関する。肥満とは、一般的に、正常な状態に比べて体重が多い状況、あるいは、体脂肪が過剰に蓄積した状態を意味する。体重や体脂肪の増加に伴った症状の有無は問わない。
【００３２】
一態様において、本発明は、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤を含む、食欲を抑制するための組成物、に関する。
【００３３】
前記ＧＬＰ−１分泌促進剤を含む組成物の剤形は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択できる。具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、貼付剤等が挙げられる。
【００３４】
前記ＧＬＰ−１分泌促進剤を含む組成物は、上記特定した物質以外の有効成分を含有していてもよい。たとえば、ＳＵ剤等のインスリン分泌促進剤、ＤＰＰ−４阻害剤、糖吸収遅延剤、またはインスリン抵抗性改善剤等を、上記特定した物質と共に１つの剤に含めてもよいし、両者を別々の剤に配合したものを１つのキットとしてもよい。
また、前記ＧＬＰ−１分泌促進剤を含む組成物の製剤化の際、非限定的に、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、保存剤、矯味矯臭剤、希釈剤等の製剤化に必要な添加剤を加えてもよい。
【００３５】
前記ＧＬＰ−１分泌促進剤を含む組成物、例えば、医薬品の分野の標準的技法に従って、処方することが可能である。例えば、Ａｌｐｈｏｎｓｏ  Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，（１９９０）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａを参照。
【００３６】
前記ＧＬＰ−１分泌促進剤を含む組成物の投与方法は、特に限定されず、経口的投与、非経口投与の何れであってもよい。また、本発明の剤の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等に応じて決定されるが、一般的には、有効成分量として成人一日あたり１μｇ／ｋｇから１０００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲であり、好ましくは、１０μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲、さらに好ましくは１００μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。  ３．飲食品
本発明は、一態様において、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤を含む、飲食品、に関する。
【００３７】
前記ＧＬＰ−１分泌促進剤は、任意の食品又は飲料に添加することが可能であり、食品又は飲料の種類は特に限定されない。
【００３８】
「食品」は、和食、洋食、中華、アジア料理等、あらゆる食品に使用可能である。例えば、和え物、炒め物、煮物、ご飯物、汁物、パスタソース、鍋物、スープ、シチュー等々である。
【００３９】
「飲料」には、例えば、乳飲料、缶入りなどの飲料用スープ、ヨーグルト、豆乳、スポーツ飲料、果汁飲料、酒類、紅茶、コーヒー、緑茶、ココア等が含まれる。
【００４０】
非限定的に、前記ＧＬＰ−１分泌促進剤を、醤油、ソース、つゆ、みりん、料理酒等の、調味料に含ませてもよい。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００４２】
特に記載しない限り、実施例は、以下の材料及び手法によって行った。
【００４３】
細胞培養
マウス由来小腸内分泌Ｌ細胞株であるＧＬＵＴａｇ細胞は、カナダトロント大学のＤａｎｉｅｌ  Ｊ．  Ｄｒｕｃｋｅｒ教授から譲り受けた。ＧＬＵＴａｇ細胞は１００ｍｍディッシュで培養し、１０００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／ＬＬ−グルタミン、３．７ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、１１０ｍｇ／Ｌピルビン酸ナトリウム入りのダルベッコ改変イーグル培地（シグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社、東京、日本）に、非働化した１０％ウシ胎児血清（シグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社、東京、日本）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン・０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（シグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社、東京、日本）を添加したものを培養液として用いた。３７℃、５％  ＣＯ２下で培養し、１００ｍｍディッシュの８０％〜９０％まで細胞が増殖した際にトリプシン処理をして、継代を行った。
【００４４】
マウス由来ＧＬＰ−１産生内分泌細胞株であるＳＴＣ−１細胞は米国カリフォルニア大学（現スイス癌研究所）のＤｏｕｇｌａｓ  Ｈａｎａｈａｎ博士から寄贈して頂いた。ＳＴＣ−１細胞は１００ｍｍディッシュで培養し、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌ  Ｌ−グルタミン、３．７ｇ／Ｌ  炭酸水素ナトリウム、１１０ｍｇ／Ｌ  ピルビン酸ナトリウム入りのダルベッコ改変イーグル培地（シグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社、東京、日本）に、非働化した１０％ウシ胎児血清（シグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社、東京、日本）、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、０．１ｍｇ／ｍ  Ｌストレプトマイシン（シグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社、東京、日本）を添加したものを培養液として用いた。３７℃、５％  ＣＯ２下で培養し、１００  ｍｍディッシュの８０％〜９０％まで細胞が増殖した際にトリプシン処理をして、継代を行った。
【００４５】
試薬
ＧＬＵＴａｇ細胞で実験を行う際は、試験に供する各種物質を、後述のグルコース入りのイメージング記録用溶液に溶解した。
【００４６】
ＳＴＣ−１細胞で実験を行う際は、試験に供する各種物質を、後述のグルコース入りのイメージング記録用溶液に溶解した。
【００４７】
試験に供した各種物質は、いずれも腸内細菌に生成されていることが確認されている物質である（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２：２３３、２０１２）。
【００４８】
実施例１  カルシウム２＋イメージングによるＧＬＰ−１分泌の測定
本実施例では、ＧＬＵＴａｇ細胞またはＳＴＣ−１細胞を、各種物質を含む刺激溶液を添加した培養液中で培養し、カルシウム２＋イメージングによりＧＬＰ−１分泌を観察した。
【００４９】
（１）カルシウム指示薬の導入
ガラスボトムディッシュのカバーガラス上に、細胞を定着させるため、カバーガラスをポリＬ−リジン（シグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社、東京、日本）でコートした。１５分間ＵＶ投射した３５ｍｍガラスボトムディッシュのカバーガラス上に、１ｍｇ／ｍＬ  ＰポリＬ−リジン（シグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社、東京、日本）を２００μＬ滴下し、３０分間静置し、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）で３回洗浄した。
【００５０】
その後、ＧＬＵＴａｇ細胞の懸濁液をカバーガラス上に滴下し、２ｍＬ培養液中で２日間培養した。ＳＴＣ−１細胞の懸濁液も同様にカバーガラス上に滴下した後、２ｍＬ培養液中で２日間培養し、イメージングを行う前日に４５００  ｍｇ／Ｌグルコース入りの培養液２ｍＬに交換した。
【００５１】
ＧＬＵＴａｇ細胞は培養後、５ｍＭグルコース入りのイメージング記録用溶液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．６ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３）で細胞培養ディッシュを２回洗浄した。そして、５ｍＭ  グルコース入りのイメージング記録用溶液１ｍＬに、細胞内カルシウム２＋濃度変化を蛍光強度変化として可視化解析するための蛍光指示薬Ｆｌｕｏ４−ＡＭ（同仁堂、熊本、日本）を２５０  ｎＭとなるように加え、３７℃、５％  ＣＯ２下で２０分間インキュベートした。ＳＴＣ−１細胞は培養後、２．２ｍＭグルコース入りのイメージング記録用溶液で細胞培養ディッシュを２回洗浄した。そして、２．２ｍＭ  グルコース入りのイメージング記録用溶液７５０μＬに、Ｆｌｕｏ４−ＡＭを２．５μＭとなるように加え、３７℃、５％  ＣＯ２下で２０分間インキュベートした。
【００５２】
（２）倒立顕微鏡によるイメージング
Ｆｌｕｏ４−ＡＭを導入したＧＬＵＴａｇ細胞の培養ディッシュを、０．１ｍＭグルコース入りのイメージング記録用溶液で２回洗浄した。その後、０．１ｍＭグルコース入りのイメージング記録用溶液１．９ｍＬに置換して、観察を行った。Ｆｌｕｏ４−ＡＭを導入したＳＴＣ−１細胞の培養ディッシュは、２．２ｍＭグルコース入りの記録用溶液で２回洗浄し、２．２ｍＭ  グルコース入りの記録用溶液２ｍＬに置換して、観察を行った。
【００５３】
プトレシン、スペルミジン、スペルミンで刺激を行う際の撮影は５秒ごと２０分間行い、撮影開始３分後から刺激溶液を還流した。その他の物質で刺激を行う際の撮影は５秒ごと１０分間行い、撮影開始３分後に刺激溶液１００μＬを直接滴下し、倒立顕微鏡でＦｌｕｏ４−ＡＭ由来の蛍光を測定した。滴下後に条件の濃度になるように、刺激溶液は条件の２０倍の濃度に調整した。
【００５４】
観察の際には、倒立顕微鏡（Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｄ１，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、またはＩＸ７１倒立顕微鏡（オリンパス株式会社、東京、日本）を用いた。前者の顕微鏡では、励起光に水銀ランプ（ＨＢＯ１００，  Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用い、青励起にＢＰ４７０／４０の励起フィルターとＦＴ４９５のダイクロイックミラーのセット（Ｂ３８−ＨＥ，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用い、カメラ（ＯＲＣＡ−Ｆｌａｓｈ４．０Ｖ２，Ｃ１１４４０，浜松ホトニクス株式会社、静岡、日本）を用いて撮影した。対物レンズは開口数１．００の油浸４０倍レンズ（ＵＰｌａｎＡｐｏ，オリンパス）を用いた。ＩＸ７１倒立顕微鏡では、キセノンランプ（オリンパス）を用いて励起し、蛍光フィルターを通して、Ｅｖｏｌｖｅ  ＥＭ−ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，  Ｔｕｓｃｏｎ，  Ａｒｉｚｏｎａ，  ＵＳＡ）で撮影し、対物レンズは開口数１．３５の油浸４０倍（オリンパス）を用いた。
【００５５】
（結果）
倒立顕微鏡によるイメージングの結果、刺激溶液投与後の各細胞の細胞内カルシウム２＋濃度変化率の最大値と記録溶液投与後の各細胞の細胞内カルシウム２＋濃度変化率の最大値を統計解析により比較し、有意な差がみられた物質については、ＧＬＰ−１の分泌を誘導した（＋）、有意な差がみられなかった物質については、ＧＬＰ−１の分泌を誘導しない（−）、と判断した。結果を表１に示す。
【００５６】
【表１】
2020097531.tif 000002
表１に示した通り、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、パントテン酸、コール酸、３−アミノイソ酪酸、γ−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、ピペコリン酸、オルニチン、シトルリン、チロシンメチルエステル、ピペリジン、タウリン、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキシン、サルコシン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、シトシン、１，３−ジアミノプロパン、ニコチン酸、インドール−３−アセトアミド、Ｄ−アラニン、５−ヒドロキシリシン、１−メチルニコチナミド、チアミン、カルニチン、グルコン酸、プロスタグランジンＥ２、メチオニンスルホキシド、スペルミジン及びスペルミンの各種物質が、μＭ〜ｍＭ程度の濃度で、ＧＬＰ−１の分泌誘導効果を示す細胞内Ｃａ２＋濃度上昇が見出された。
【００５７】
実施例２  酵素免疫定量によるＧＬＰ−１分泌量の測定
本実施例では、ＧＬＵＴａｇ細胞またはＳＴＣ−１細胞を、各種物質を含む刺激溶液を添加した培養液中で培養し、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）によりＧＬＰ−１濃度を測定し、ＧＬＰ−１分泌の促進を定量した。
【００５８】
（実施例２−１）  ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌の測定
ＧＬＵＴａｇ細胞を用いる際は２４ウェルプレートに１ウェル１．０×１０５個となるように細胞を撒き、培養液中で３７℃、５％  ＣＯ２下で２日間インキュベートした。２日後、各ウェルを０．１ｍＭグルコース入りのイメージング記録用溶液で２回洗浄し、実施例１で用いた物質のうち、ＧＬＰ−１の分泌誘導効果を示す細胞内Ｃａ２＋濃度上昇が見られた物質、すなわち表１で（＋）の物質の含まれた刺激溶液を５００μＬ加え、培養液中で３７℃、５％  ＣＯ２下で３０分間インキュベートした。
【００５９】
その後、細胞培養液を全量１．５ｍＬチューブに移し、１０００×ｇ、４℃で１０分間遠心後、上清を０．１ｍＭグルコース入りのイメージング記録用溶液で２倍希釈した。希釈溶液のＧＬＰ−１濃度をＧＬＰ−１（７−３６）  Ａｃｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  （Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＶａｒｉｏｓｋａｎ  ＬＵＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，  Ａｍｅｒｉｃａ）を用いて測定した。
【００６０】
（実施例２−１）  ＳＴＣ−１細胞におけるＧＬＰ−１分泌の測定
ＳＴＣ−１細胞を用いる際は６ウェルプレートに１ウェル１．０×１０６個となるように細胞を撒き、培養液中で３７℃、５％  ＣＯ２下で２日間インキュベートした。前日に  １０００  ｍｇ／Ｌグルコース入りの培養液に交換した。各ウェルを２．２ｍＭ  グルコース入りのイメージング記録用溶液で２回洗浄し、各条件に対応する刺激溶液を１ｍＬ加え、培養液中で３７℃、５％  ＣＯ２下で１２０分間インキュベートした。その後、細胞培養液を全量１．５ｍＬチューブに回収し、１０００×ｇ、４℃で１０分間遠心後、そのＧＬＰ−１濃度をＧＬＰ−１  ＥＬＩＳＡキットワコー、高感度品（富士フィルム和光純薬株式会社、大阪、日本）およびＶａｒｉｏｓｋａｎ  ＬＵＸを用いて測定した。
【００６１】
結果
ＧＬＵＴａｇ細胞またはＳＴＣ−１細胞を、各種物質を含む刺激溶液を添加した培養液中で培養し、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）によりＧＬＰ−１濃度を測定した結果、非限定的に、少なくとも、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、パントテン酸、コール酸、タウリン、ピリドキサミン、スペルミジン、スペルミンの各種物質が、μＭ〜ｍＭ程度の濃度で、ＧＬＰ−１分泌を誘導または促進した。